KR0178871B1

KR0178871B1 - 케토기 도입 효소, 그를 암호화하는 dna 및 케토카로테노이드를제조하는방법

Info

Publication number: KR0178871B1
Application number: KR1019960702115A
Authority: KR
Inventors: 스스무 가지와라; 노리히코 마자와; 게이지 곤도
Original assignee: 게이사쿠 마나베; 기린비루주식회사
Priority date: 1994-08-23
Filing date: 1995-08-18
Publication date: 1999-04-01
Also published as: NO961604D0; EP0725137A1; WO1996006172A1; AU689629B2; NO961604L; EP0725137B2; AU3231095A; EP0725137A4; EP0725137B1

Abstract

본 발명은 베타-이오논 고리를 포함하는 화합물에서 베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드; 베타-이오논 고리를 포함하는 화합물에서 베타-이오논의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 염기 배열을 포함하는 DNA; 전기 DNA와 혼성화되며, 베타-이오논 고리를 포함하는 화합물에서 베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 염기 배열을 포함하는 DNA; 베타-이오온 고리를 포함하는 화합물에서 베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 염기 배열을 포함하며, 플라스미드 내로 삽입된 DNA; 전기 DNA를 포함하는 재조합 벡터; 전기 DNA가 도입된 미생물; 및, DNA가 도입된 미생물을 배지에서 배양하고, 배양액으로부터 케토카로티노이드를 수득하는 방법을 포함하는 케토카로티노이드의 제조방법에 관한 것이다.

베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화하는 DNA를 외부 유전자로서 대장균 등의 미생물 내로 도입시키고 그를 발현시킴으로써, 대장균 등의 미생물은 아스타크산틴, 4-케토지아크산틴, 칸타크산틴, 에치네논 및 기타 케토기를 포함하는 케토카로티노이드를 생합성할 수 있게 된다. 케토기를 포함하는 케토카로티노이드를 생합성할 수 있는 대장균 등의 미생물을 이용함으로써, 적은 노력과 비용으로 케토기를 포함하는 케토카로티노이드를 대량 제조할 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

케토기 도입 효소, 그를 암호화하는 DNA 및 케토카로티노이드를 제조하는 방법

[발명의 상세한 설명]

[발명의 분야]

본 발명은 양식어류 및 갑각류(도미, 연어 및 새우 등)가 붉은 기를 띠도록 하는데 사용되고, 착색제 또는 항산화제로서 식품에 이용되는 케토카로티노이드, 예를 들면 아스타크산틴(astaxanthin) 등의 합성에 필요한 케토기 도입 효소; 그를 암호화하는 DNA; 전기 DNA를 포함하는 재조합 벡터; 전기 DNA를 함유하는 미생물; 및, 전기 미생물을 이용하여 케토카로티노이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

[배경 기술]

케토카로티노이드는 케토기를 포함하고 있는 카로티노이드 색소의 일반적인 명칭이다. 카로티노이드는 스테로이드 및 기타 이소프레노이드 합성경로의 전반부를 공유하는 이소프레노이드 염기성 생합성 경로를 통하여 출발물질인 메발론산(mevalonic acid)으로부터 합성된다(참조 : 제6도), 이소프레노이드 염기성 생합성 경로에서 생성된 탄소수 5개의 이소펜테닐 피로포스페이트(IPP)는 하나의 기본단위로서 그의 이성질체 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP)와 축합하여, 탄소수 10개의 제라닐(geranyl) 피로포스페이트(GPP)를 생성하고, 이는 다시 IPP와 축합하여 탄소수 15개의 파르네실(farnesyl) 피로포스페이트(FPP)를 생성한다. FPP는 IPP와 축합하여 탄소수 20개의 제라닐제라닐 피로포스페이트(GGPP)를 생성한다. 이어, GGPP는 자기들끼리 축합하여 최초의 카로티노이드인 무색의 피토엔(phytoene)을 생성한다. 피토엔은 일련의 불포화반응을 통하여 피토플루엔(phytofluene), ζ-카로틴, 뉴로스포렌(neurosporene), 결국에는 리코펜(lycopene)으로 전환된다. 다시 리코펜은 고리화 반응(cyclization reaction)을 통하여 2개의 베타-이오논(β-ionone) 고리를 포함한 베타-카로틴으로 전환된다. 결국, 케토기, 히드록시기 등이 베타-카로틴으로 도입됨으로써 아스타크산틴 및 지아크산틴(zeaxanthin) 등이 합성된다(참조 : Britton, G., Biosynthesis of Carotenoids, Plant Pigments, Goodwin, T.W(ed.), London, Academic Press, 1988, pp.133-182).

최근에, 본 발명자들은 황색 생성을 지표로 사용하여 대장균(E. coli)의 게놈 DNA 라이브러리로부터, 식물에 존재하는 비광합성 박테리아 어위니아 우레도보라(Erwinia uredovora)의 카로티노이드 생합성 유전자들을 클로닝하였다. 아울러, 본 발명자들은 전기 유전자들을 다양하게 조합하고 그를 대장균 등의 미생물에서 발현시킴으로써, 피토엔, 리코펜, 베타-카로틴 및 노란색의 카로티노이드 색소이면서 히드록시기가 베타-카로틴에 도입된 지아크산틴을 생성할 수 있게 되었다(참조 : 제7도; Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K., and Harashima, K., Elucidation of the Erwinia uredovora Carotenoid Biosynthetic Pathway by Functional Analysis of Gene Products Expressed in Escherichia coli, J. Bacteriol., 172, pp. 6704-6712, 1990; Misawa, N., Yamano, S., Ikenage, H., Production of β-carotene in Zymomonas mobilis and Agrobac terium tumefaciens by Introduction of the Biosynthesis Genes from Erwinia uredovora, Appl. Environ. Environ. Microbiol., 57, pp. 1847-1849, 1991; 및 일본특허공개 제3-58786호).

한편, 붉은색의 케토카로티노이드인 아스타크산틴은 도미 및 연어 등의 홍색어류와 게 및 새우 등의 갑각류와 같은 바다생물에 널리 존재하는 대표적인 동물성 카로티노이드이다. 일반적으로, 동물은 카로티노이드를 생합성할 수 없기 때문에 미생물이나 식물에서 합성된 카로티노이드를 외부에서 섭취해야 한다. 따라서, 아스타크산틴은 양식어류 및 도미, 연어, 새우 등 갑각어류의 붉은색 착색을 목적으로 폭넓게 사용되어 왔다.

아스타크산틴은 또한 식료품의 착색제로도 이용된다. 더구나, 아스타크산틴은 체내에서 생성되어 암을 유발하는 활성 산소를 제거하기 위한 항산화제로서 더욱 관심을 끌고 있다(참조 : Takao Matuno and Wataru Inui, Physiological Functions and Biological Activities of Carotenoids in Animals, KAGAKU TO SEIBUTU (Chemistry and Organisms), 28, pp. 219-227, 1990).

남극 지방의 크릴(krill)과 같은 갑각류, 파피아(Phaffia) 효모의 배양물, 해마토코커스(Haematococcus) 녹조류의 배양물 및 유기합성에 의해 얻어진 화합물 등이 아스타크산틴을 제공하는 원천으로 알려져 있다. 그러나, 남극지방의 크릴과 같은 갑각류를 이용하는 경우에는 아스타크산틴의 회수와 추출공정에서 지질과 같은 다양한 오염물질로부터 아스타크산틴을 분리하는 것이 용이하지 않아, 많은 노력과 비용이 요구된다. 또한, 파피아 효모의 배양물을 이용하는 경우에는, 파피아 효모의 세포벽이 단단하기 때문에 아스타크산틴의 회수와 추출에 또한 많은 비용이 요구되고, 아스타크산틴의 제조 수준이 낮다. 해마토코커스 녹조류 배양물을 이용하는 경우에는 녹조류를 배양하는 동안 아스타크산틴 합성에 필수적인 약간의 빛을 녹조류에 제공하는 것이 필요하다. 따라서, 햇빛이 들어오는 위치에 대한 적당한 조건 또는 인공적으로 빛을 제공할 수 있는 배양시설이 요구된다. 이외에도, 제조된 아스타크산틴을 클로로필과 부산물(에스테르 지방산)의 혼합물로부터 분리하는 것이 어렵다는 문제점이 있다. 그러한 이유로, 전술한 생물체에서 생성되는 아스타크산틴은 유기합성에 의해 얻어지는 아스타크산틴과는 비용면에서 비교할 수 없는 것이 사실이다. 그러나, 아스타크산틴이 어류와 갑각류(shellfishes)의 먹이로, 그리고 식품 첨가물로 사용된다는 것을 고려하면, 유기 합성으로 제조되는 아스타크산틴은 반응 도중 부산물을 생성한다는 점에 약간의 문제점을 가지며, 그러한 아스타크산틴은 자연산을 선호하는 소비자들의 기호에 반하는 것으로 볼 수 있다.

따라서, 안전하면서도 자연산을 요구하는 소비자의 기호에 맞출 수 있는 생물체에서 생성되는 값싼 아스타크산틴을 제조하는 방법의 개발이 절실히 요구되어 있다.

미생물 자체의 아스타크산틴 생성여부에 상관없이, 미생물에 아스타크산틴 생합성 유전자를 도입하여 발현시킴으로써 아스타크산틴 생성능력을 갖게 하고, 식료품으로서의 안정성을 갖게 할 수 있으므로, 아스타크산틴의 생합성에 관여하는 유전자들을 획득하는 것은 매우 유용한 일로서 여겨지고 있다. 이 경우에 부산물이 혼합되는 문제는 발생하지 않을 것이다. 이외에도, 고도로 진보된 유전공학 기술을 이용함으로써, 아스타크산틴 제조량을 유기합성에 의한 제조량을 능가하는 수준까지 증가시키는 것은 어렵지 않을 것이다. 상술한 바와 같이, 지아크산틴까지 합성하는 유전자들은 이미 본 발명자들에 의해 비광합성 세균, 어위니아 우레도보라에서 이미 수득되었다. 그러나, 상술한 아스타크산틴의 상업적인 유용성 때문에 많은 연구기관에서 있었던 여러번의 시도에도 불구하고, 어느 누구도 아스타크산틴을 합성하는데 필요한 케토기 도입 효소를 암호화하는 유전자를 얻는데 성공하지 못하였다. 그 이유로서는, 케토기 도입 효소와 같이 하류에 위치하고 카로티노이드 생합성에 관여한 효소들이 막단백질이며, 이러한 효소들의 활성 측정과 정제가 불가능하기 때문이다; 따라서, 이러한 효소들은 발견되지 않았다. 특히, 케토기 도입 효소는 효소 그 자체에 대한 발견뿐만 아니라, 효소를 암호화하는 유전자에 관한 발견도 전혀 보고되지 않았다. 따라서, 오늘날까지 유전공학 기술을 이용하여 미생물 등에서 아스타크산틴을 제조하는 것은 불가능하였다.

[발명의 개시]

결국, 본 발명의 목적은 아스타크산틴과 같이 케토기를 가진 케토카로티노이드를 제조하는데 필요한 케토기 도입 효소의 유전자를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 케토기 도입 효소를 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 케토기 도입 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.

또한, 발명의 또다른 목적은 케토기 도입 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 미생물을 제공하는데 있다.

더 나아가, 본 발명의 또다른 목적은 케토기 도입 효소를 암호화하는 유전자를 함유하는 상기 미생물을 이용하여 케토카로티노이드를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명자들은 상기한 연구과제를 해결하기 위하여, 광범위하고 심도있는 연구를 수행한 결과, 녹조류 해마토코커스의 cDNA로부터 케토기 도입 효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 전기 유전자를 포함하는 벡터 DNA를 제조하며, 전기 벡터 DNA를 대장균 내로 도입하고, 그 대장균을 배양하여 배지로부터 세포를 수득하고, 에치네논(echinenone), 칸타크산틴(canthaxanthin), 아스타크산틴, 4-케토지아크산틴 등의 케토카로티노이드를 추출하는데 성공하였다. 본 발명은 이렇게 달성되었다. 다시 말해서, 본 발명은 베타-이오논 고리 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 염기배열을 포함하는 DNA를 제공한다. 아울러, 본 발명은 전기 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 상기한 DNA가 도입된 미생물을 제공한다. 이외에도, 본 발명은 DNA가 도입된 미생물을 배지에서 배양하고, 배양세포로부터 케토카로티노이드를 수득하는 것을 포함하는 케토카로티노이드의 제조방법을 제공한다.

하기에서, 본 발명은 더욱 상세하게 설명한다.

1. 케토기 도입 효소

본 발명의 케토기 도입 효소는 베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있는 효소활성을 갖는 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 서열표의 SEQ ID NO: 1에 나타낸 아미노산 배열(제1도에 나타낸 A에서 D까지의 아미노선 배열)과 실질적으로 동일한 아미노산, SEQ ID NO: 2에 나타낸 아미노산 배열(제2도에 나타낸 B에서 D까지의 아미노산 배열)과 실질적으로 동일한 아미노산 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 아미노산 배열(제3도에 나타낸 C에서 D까지의 아미노산 배열)과 실질적으로 동일한 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이다. 본 발명에서, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 아미노산 배열과 실질적으로 동일한 아미노산은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 아미노산 배열 뿐만 아니라, 베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있는 효소활성을 갖는 한, 서열표의 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 배열에서 아미노산 잔기의 일부분이 결실, 치환, 부가 등의 변형이 가해진 아미노산 배열을 의미한다. 예를 들면, 서열표의 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3에서 첫 번째 아미노산 잔기(Met)가 결실된 아미노산 배열은 상기의 표현에 포함된다.

일실시 태양으로서, 본 발명의 케토기 도입 효소는 기질로서 베타-카로틴을 이용하고 에치네논을 경유하여 칸타크산틴을 합성할 수 있다. 또한, 본 발명의 효소는 3-히드록시-베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있다. 상기의 구체적인 예로서, 본 발명의 효소는 기질로서 지아크산틴을 이용하고 4-케토지아크산틴을 경유하여 아스타크산틴을 합성할 수 있다(참조 : 제8도). 카로티노이드인 베타-카로틴과 지아크산틴은 한분자에 베타-이오논 고리 두 분자를 포함하기 때문에 베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 첫 번째 메틸렌기가 케토기로 전환되어 각각 에치네논과 4-케토지아크산틴을 생성하고, 다른 베타-이오논 고리의 4' 위치(위치 4와 등가)에 있는 메틸렌기가 케토기로 전환되어 각각 칸타크산틴과 아스타크산틴을 생성한다.

2. 케토기 도입 효소의 유전자(bkt)

본 발명의 케토기 도입 효소를 암호화하는 유전자(이하, bkt라 함)는 베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있는 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 염기 배열을 포함하는 DNA이다. 이 유전자의 전형적인 예는 녹조류 해마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis, NIES-114)로부터 클로닝할 수 있는 bkt 유전자이다. 이 유전자는 제1도의 A에서 D까지 나타낸 아미노산 배열(서열표의 SEQ ID NO: 1에 나타낸 아미노산 배열), 제2도의 B에서 D까지 나타낸 아미노산 배열(서열표의 SEQ ID NO: 2에서 나타낸 아미노산 배열) 또는 제3도의 C에서 D까지 나타낸 아미노산 배열(서열표의 SEQ ID NO: 3에 나타낸 아미노산 배열)을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 염기배열을 포함하는 DNA이다. 서열표의 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3에서 나타낸 아미노산을 암호화하는 염기배열은 각각 SEQ ID NOS: 4와 5, 6 및 7에 나타낸다. SEQ ID NO: 4에 나타낸 염기배열은 코딩영역인 SEQ ID NO: 5에 나타낸 염기배열의 상류에 있는 비코딩영역을 포함한다. 물론, 본 발명의 bkt 유전자는 SEQ ID NOS: 4, 5, 6 및 7에 나타낸 염기배열을 포함하는 DNA 뿐만 아니라, 단지 축퇴 코돈(degenerate condon)만이 다르고 같은 폴리펩티드를 암호화하는 축퇴 이성질체를 포함하는 DNA를 포함한다.

bkt 유전자 생성물(이하, BKT라 한다) 즉, 본 발명의 케토기 도입 효소는 상술한 바와 같이, 베타-이오논 고리를 포함한 화합물에 있는 베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있는 효소 활성을 갖는다. 일실시 태양으로, BKT는 기질로서 베타-카로틴을 이용하여 에치네논을 경유하여 칸타크산틴을 합성할 수 있다(참조 : 제8도). 또한 BKT는 3-히드록시-베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있다. 예를 들면, BKT는 기질로서 지아크산틴을 이용하고 4-케토지아크산틴을 경유하여 아스타크산틴을 합성할 수 있다(참조 : 제8도). 이러한 효소 활성을 갖는 폴리펩티드와 그것을 암호화하는 DNA는 알려져 있지 않았다. 이 폴리펩티드와 그를 암호화하는 DNA는 지금까지 알려진 폴리펩티드 및 DNA와 전체적인 상동성(homology)을 나타내지 않는다. 더욱이, 베타-이오논 고리 또는 3-히드록시-베타 이오논 고리에서의 전환에만 한정하지 않더라도, 메틸렌기를 케토기로 즉시 전환하는 효소는 아직 발견되지 않고 있다.

한편, 비광합성 박테리아 어위니아(Erwinia)에서 유래한 crtE. crtB, crtI 및 crtY의 카로티노이드 합성 유전자들을 이용하여, 대장균과 같은 미생물에 베타-카로틴을 생성하는 능력을 부여하는 것이 가능하다. 전기 네 개의 유전자들 이외에 crtz 유전자를 추가로 이용하여, 대장균과 같은 미생물에 지아크산틴을 생성하는 능력을 제공할 수 있다(참조 : 제7도와 WO91/13078).

따라서, 본 발명의 DNA(bkt 유전자)가 어위니아 유래의 crt 유전자를 갖고 있는 대장균 등의 미생물에 도입될 때, 베타-카로틴과 지아크산틴(BKT에 대한 기질)이 어위니아 유래의 전기 crt 유전자들에 의해 제공될 수 있기 때문에, 베타-카로틴 생성 미생물은 에치네논을 경유하여 칸타크산틴을 생성할 수 있고, 지아크산틴 생성 미생물은 4-케토지아크산틴을 경유하여 아스타크산틴을 생성할 수 있다(참조 : 제8도). 그러나, 지아크산틴 생성 미생물에서, 베타-크립토크산틴이 중간체로서 극소량 포함된다. 따라서, 상기에서 기술한 주대사경로 이외에, 베타-크립토크산틴으로부터 3-히드록시에치네논 및 4-케토지아크산틴을 경유하여 아스타크산틴을 생성하는 다른 경로가 있을 수 있으며, 베타-크립토크산틴으로부터 3-히드록시에치네논 또는 3'-히드록시에치네논을 경유하여 포에니코크산틴(phoenicoxanthin)을 생성하는 또다른 경로가 있을 수 있다. 이러한 부경로의 생성물은 3'-히드록시에치네논, 3-히드록시에치네논 및 포에니코크산틴이라고 여겨진다(참조 : 제9도).

3. DNA의 획득

본 발명의 케토기 도입 효소(BKT)의 아미노산 배열을 암호화하는 염기배열을 포함하는 DNA를 얻기 위하여, 종래의 핵산 합성방법에 따라 적어도 DNA사슬의 일부분을 화학적으로 합성한다. 그러나, 배열의 길이를 고려하면, 화학적 합성보다는 녹조류인 해마토코커스(Haematococcus pluvialis와 Haematococcus lacustris가 대표적인 변이체이다)로부터 mRNA를 얻고, 대장균을 이용하여 그로부터 cDNA 라이브러리를 제조한 다음, 적당한 프로브로 혼성화하는 방법이나 본 발명자들이 적용한 발현 클로닝 방법과 같이 유전공학 분야에서 이용되는 통상적인 방법으로 전기 라이브러리로부터 DNA를 수득한다.

특히, 해마토코커스 플루비알스의 전체 RNA를 분리하고, 올리고텍스-dT30 슈퍼(Takara Shuzo)를 이용하여 폴리 A⁺RNA를 정제한다. 폴리 A⁺RNA를 주형으로 하고 역전사효소 슈퍼스크립트 RT(Gibco BRL)를 이용하여 cDNA를 합성한 다음, 대장균 DNA 연결효소(ligase), 대장균 DNA 중합효소 및 대장균 DNA RNase H(모두 Gibco BRL의 제품)를 이용하여 이중나선의 cDNA를 합성한다. 이렇게 합성된 cDNA를 대장균 발현벡터 pSPORT1(Gibco BRL)에 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제조한다. cDNA 라이브러리를 이용하여 베타-카로틴 생성 대장균(상기에서 기술한 어위니아 유래의 crt 유전자를 갖고 있는 대장균)을 형질절환시킨다. 형질전환체의 색상변화를 지표로 하여, 케토기 도입 효소 유전자를 포함한 미생물을 탐색한다. 이 방법은 노란색의 베타-카로틴에 케토기가 도입되어 케토카로티노이드 중의 하나인 붉은 색의 칸타크산틴이 합성되므로, 형질전환된 대장균의 색상이 노란색에서 붉은 색으로 변하는 현상을 이용한 것이다. 이렇게 하여 선별한 붉은 색의 형질전환체로부터 목적하는 cDNA를 가진 플라스미드를 분리하고, 그 cDNA를 대장균 벡터 pBluescript II SK+ 및 pBlu escript II KS+(Stratagene)에 연결시킨다. 이러한 플라스미드들을 이용하여, 다양한 길이의 결실이 유발된 결실 변이체들을 생성하고, 그 변이체의 염기 배열을 결정한다.

4. bkt 유전자와 혼성화되는 DNA

현재까지, 녹조류 해마토코커스의 몇가지 변이체들이 분리되고 동정되었으며, 그들 모두는 아스타크산틴과 같은 케토카로티노이드를 합성하는 것으로 여겨지고 있다. 진핵세포인 파피아 로도지마의(Phaffia rhodozyma) 효모는 아스타크산틴과 같은 케토카로티노이드를 합성하는 것으로 보고되었다(참조 : Johnson, E. A. and An, G.-Hwan, Astaxanthin from Microbial Source, Critical Reviews in Biotechnology, 11, pp. 297-326, 1991). 상술한 해마토코커스 플루비알리스 NIES-144 bkt 유전자를 프로브로 이용하고, 유전자의 상동성을 이용한 혼성화를 수행하여, 전기 아스타크산틴 생성 조류 또는 미생물로부터 케토기 도입 효소의 다른 유전자를 수득하는 것이 가능하다. 본 발명자들은 아스타크산틴을 합성할 수 있는 전기 해마토코커스로부터, 동화능력 및 빛에 대한 표현형에 있어서 해마토코커스 플루비알리스 NIES-144와는 상이한 두가지 변이체를 선별하였다. 이들은 해마토코커스 라쿠스트리스(Haematococcus lacustris) UTEX 294(텍사스대학 오스틴 분교의 Culture Collection of Algae로부터 분양) 및 해마토코커스 라쿠스트리스 C-392(동경대학의 응용미생물연구소(현재의 분자세포생물학연구소) 부설 미생물 및 미조류 센터로부터 분양)이다. 이러한 변이체들로부터 게놈 DNA를 제조한 다음, 해마토코커스 플루비알리스 NIES-144 bkt 유전자를 프로브로 사용하여 서던(Southern) 혼성화를 수행하였다. 그 결과는 본 발명자들이 예측한 바와 동일하였다. bkt 프로브는 상기 두 변이체의 게놈 DNA로부터 유래한 특정 DNA 단편들과 강하게 혼성화하였다. 따라서, 본 발명은 상술한 DNA와 혼성화하는 DNA를 포함한다(SEQ ID NOS: 4, 5, 6 및 7).

5. 대장균과 같은 미생물의 형질전환

박테리아(예를 들면, E. coli, Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaci ens), 효모(예를 들면, Saccharomyces cerevisiae) 등과 같은 적당한 미생물 내에 외부유전자로서 본 발명의 DNA를 도입하여 그를 발현시킴으로써, 다양한 케토카로티노이드를 생성할 수 있다.

적절한 미생물 내로 외부유전자를 도입하는 방법을 하기에 간단하게 설명한다. 대장균과 같은 미생물 내로 외부유전자를 도입하고 그를 발현시키는 과정이나 방법은 본 발명에서 상술한 과정뿐만 아니라, 유전공학분야에서 통상적으로 사용되는 과정이나 방법이 이용된다. 예를 들면, Vectors for Cloning Genes, Methods in Enzymo logy, 216, pp. 469-631, 1992, Academic Press 및 Other Bacterial Systems, Methods in Enzymology, 204, pp. 305-636, 1991, Academic Press에 기재된 과정이나 방법이 이용된다.

[대장균으로의 유전자 도입]

외부 유전자를 도입시키는 방법에는 하나한(Hanahan)의 방법 및 루비듐(rubidium) 방법과 몇가지 확립된 효과적인 방법들이 있다(참조 : 예를 들면, Chapter 1, pp. 74-84, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, A Labora tory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989). 외부 유전자를 대장균에서 발현시키기 위하여, 예를 들면, 외부유전자가 통상의 방법에 따라 삽입된 lac 프로모터 함유 대장균 발현벡터를 대장균에 도입하는 것이 바람직하다(참조 : 예를 들면, Chapter 17, pp. 3-41, Molecular Cloning, A Laboratory Manual supra). 본 발명자들은 해마토코커스 bkt 유전자를 lac프로모터 등을 가지는 대장균 cDNA 발현벡터 pSPORT1(Gibco BRL)에 lac 프로모터의 전사방향과 일치하도록 삽입하고, 이렇게 제조된 벡터를 대장균에 도입하였다.

[효모로의 유전자 도입]

외부유전자를 효모인 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae )에 도입시키는 방법에는 리튬방법과 같은 확립된 방법이 있다(참조 : 이가쿠 슈판 센터 발간의 아키야마(Y. Akiyama)의 감수하에 생물산업협회에서 편집한 KOHBONO NYUHBAIOTEKUNOROJIH(New Biotechnology of Yeast). 외부 유전자를 효모에서 발현시키기 위하여, 프로모터와 PGK 및 GPD 등의 종결인자(terminator)를 사용하고, 그 사이에 외부 유전자가 프로모터의 전사방향과 일치하는 방향으로 삽입된 발현 카셋트를 구축하는 것이 바람직하다. 이 발현 카셋트는 사카로마이세스 세레비시애의 발현벡터, 예를 들면 YR_P시스템 벡터(복제 기원으로서 효모의 염색체에 ARS 서열을 제공하는 효모의 다수복제 벡터), YE_P시스템 벡터(효모의 복제기원 2㎛ DNA를 가지는 효모의 다수복제 벡터), YI_P시스템 벡터(효모의 복제기원을 가지지 않으면서 효모 염색체에 삽입되는 벡터) 등의 벡터에 삽입되고, 그 벡터는 다시 효모에 도입된다(참조 : New Biotechnology of Yeast, supra; Japan Agricultural Horticultural Chem istry Association ABC Series BUSSHITU SEISAN NOTAMENO IDEN SHIKOUGAKU(Genetic Engineering for the Production of Substances), Asak ura Shoten Co., Ltd.; 및, Yamano, S., Ishii, T., Nakagawa, M., Ikenaga, H., and Misawa, N., Metabolic Engineering for Production of β-carotene and Lycopene in Saccharomyces cerevisiae, Biosci. Biotech. Biochem., 58, pp. 1112-1114, 1994).

[자이모모나스 모빌리스로의 유전자 도입]

외부 유전자를 에탄올 생산 세균인 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobil is)에 도입시키는 방법은 그람-음성 박테리아에서 흔히 사용되는 공액이동방법(conjugative transfer method)에 따른다. 외부 유전자를 자이모모나스 모빌리스에서 발현시키기 위하여, 예를 들면, 외부 유전자가 삽입된 발현벡터(예를 들면, 자이모모나스 모빌리스의 벡터 pZA22)를 자이모모나스 모빌리스에 도입시키는 것이 바람직하다(참조 : Nakamura, K., Molecular Breeding of Zymomonas Bacteria, Journal of Japan Agricultural Horticultural Chemistry Association, 63, pp. 1016-1018, 1989; 및, Misawa, N., Yamano, S, Ikenaga, H., Production of β-carotene in Zymo monas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by Introduction of the Biosyn thesis Genes from Erwinia uredovora, Appl. Environ. Microbiol., 57, pp. 1847 -1849, 1991).

[아그로박테리움 투메파시엔스로의 유전자 도입]

외부 유전자를 식물 병원균인 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 도입시키는 방법은 그람-음성 박테리아에서 흔히 사용되는 공액이동방법에 따른다. 외부 유전자를 아그로박테리움 투메파시엔스에서 발현시키기 위하여, 예를 들면, 외부 유전자가 삽입된 발현 벡터(예를 들면, 아그로박테리움 투메파시엔스의 벡터 pBI121)를 아그로박테리움 투메파시엔스에 도입시키는 것이 바람직하다(참조 : Misawa, N., Yamano, S., Ikenaga, H., Prodution of β-carotene in Zymo monas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by Introduction of the Biosyn thesis Genes from Erwinia uredovora, Appl. Environ. Microbiol., 57, pp. 1847 -1849, 1991).

6. 미생물에 의한 케토카로티노이드의 생성(bkt 유전자의 발현)

상술한 바와 같이 미생물 내로 외부 유전자를 도입하는 기술이나 방법을 이용하여, 해마토코커스 유래의 케토카로티노이드(아스타크산틴을 포함) 합성 유전자를 미생물내로 도입하고 그들을 발현하는 것이 가능하다.

파르네실 피로포스페이트(FPP)는 카로티노이드의 기질일뿐만 아니라, 세스퀴테르펜(sesquiterpene), 트리테르펜(triterpene), 스테롤(sterol), 호파놀(hopanol) 등과 같은 다른 이소프레노이드의 공통적인 기질이다. 일반적으로, 카로티노이드를 합성할 수 없는 미생물들은 다른 이소프레노이드를 합성한다. 따라서, 기본적으로 모든 미생물은 중간 대사물질로서 FPP를 가질 것으로 추정된다. 한편, 기질로서 FPP를 이용하면, 비광합성 어위니아 유래의 카로티노이드 합성 유전자는 해마토코커스 bkt 유전자 생성물, 즉, 베타-카로틴과 지아크산틴까지의 기질을 합성할 수 있다(참조 : 제7도). 본 발명자들은 어위니아 crt 유전자들을 대장균뿐만 아니라, 상술한 미생물들내로 도입하였으며(즉, 효모 Saccharomyces cerevisiae, 에탄올 생성 세균 Zymomonas mobilis 및 식물 병원균 Agrobacterium tumefaciens), 이러한 미생물이 기대한 바와 같이 베타-카로틴과 같은 카로티노이드를 생성할 수 있다는 것을 확인하였다(참조 : Yamano, S., Ishii, T., Nakagawa, N., Ikenaga, H., 및 Misawa, N., Metabolic engineering for production of β-carotene and lycopene in Saccharomyces cerevisiae, Biosci., Biotech. Biochem., 58, p. 1112-1114, 1994; Misawa, N., Yamano, S., Ikenaga, H., Prodution of β-carotene in Zymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by Introduction of the Biosynthesis Genes from Erwinia uredovora, Appl. Environ. Microbiol., 57, pp. 1847-1849, 1991; 일본공개특허 제 3-58786호).

따라서, 본 발명의 DNA(전형적인 해마토코커스 유래의 카로티노이드 합성 유전자 bkt) 및 어위니아 유래의 카로티노이드 합성 유전자를 조합하고 그를 동일 미생물 내로 동시에 도입함으로써, 유전자 도입/발현계가 확립된 모든 미생물에서 아스타크산틴과 같은 케토카로티노이드를 생성할 수 있게 된다. 또는, 카로티노이드 합성 유전자가 이미 도입된 미생물이나 카로티노이드 합성 유전자를 선천적으로 가지고 있는 미생물 내로 본 발명의 DNA를 도입함으로써, 상기한 미생물에서 케토카로티노이드를 생성할 수 있게 된다. 하기에서는 미생물에 의한 다양한 케토카로티노이드의 제조에 대해서 설명하고자 한다.

[칸타크산틴과 에치네논의 생성]

베타-카로틴의 합성에 필수적인 어위니아 우레도보라 crtE, crtB, crtI와 crtY 유전자 및 케토기 도입 효소 유전자인 해마토코커스 bkt 유전자를 동일 대장균 등의 미생물 내로 도입하고, 그들을 발현시킴으로써, 미생물이 최종산물로서 칸타크산틴을 생성할 수 있게 된다. 아울러, bkt 유전자 등의 발현 수준을 조절함으로써, 합성 중간체인 에치네논을 수득할 수 있다. 예를 들면, 대장균에서 칸타크산틴과 에치네논을 생성하기 위해, 어위니아 우레도보라 crtE, crtB, crtI와 crtY 유전자를 함유하는 DNA 단편을 대장균 벡터(예를 들면, pACYC184)에 삽입하여 제조한 첫 번째 플라스미드(예를 들면, pACCAR16△crtX) 및 해마토코커스 bkt 유전자를 함유하는 DNA 단편을 대장균 벡터(예를 들면, pBluescript II KS+)에 삽입하여 제조한 두 번째 플라스미드(예를 들면, pHP51(참조 : 제10도)를 모두 대장균(예를 들면, JM101)내로 도입한다. 이러한 대장균을 30-37℃의 배양 조건으로 앰피실린(ampicillin)과 클로람페니콜(chloramphenicol)을 포함한 LB배지, 2YT배지 등에서 정지기까지 배양된다. 그런 다음, 세포를 수집하고, 아세톤과 같은 유기용매를 사용하여 카로티노이드 색소를 추출한다. 칸타크산틴 및 에치네논은 추출된 카로티노이드 색소내에 함유되어 있다.

[아스타크산틴과 4-케토지아크산틴의 생성]

지아크산틴의 합성에 필수적인 어위니아 우레도보라 crtE, crtB, crtI, crtY와 crtZ 유전자 및 케토기 도입 효소 유전자인 해마토코커스 bkt 유전자를 동일 대장균 등의 미생물내로 도입하고, 그들을 발현시킴으로써, 미생물이 최종산물로서 아스타크산틴을 생성할 수 있게 된다. 아울러, bkt 유전자 등의 발현 수준을 조절함으로써, 합성 중간체인 4-케토지아크산틴을 수득할 수 있다. 예를 들면, 대장균에서 아스타크산틴과 4-케토지아크산틴을 생성하기 위해, 어위니아 우레도보라 crtE, crtB, crtI, crtY와 crtZ 유전자를 함유하는 DNA 단편을 대장균 벡터(예를 들면, pACYC184)에 삽입하여 제조한 첫 번째 플라스미드(예를 들면, pACCAR25△crtX) 및 해마토코커스 bkt 유전자를 함유하는 DNA 단편을 대장균 벡터(예를 들면, pBluescript II KS+)에 삽입하여 제조한 두 번째 플라스미드(예를 들면, pHP51)를 모두 대장균(예를 들면, JM101)내로 도입한다. 이러한 대장균을 30-37℃의 배양 조건으로 앰피실린과 클로람페니콜을 포함한 LB배지, 2YT배지 등에서 정지기까지 배양한다. 그런 다음, 세포를 수집하고, 아세톤과 같은 유기용매를 사용하여 카로티노이드 색소를 추출한다. 아스타크산틴과 4-케토지아크산틴은 추출된 카로티노이드 색소내에 함유되어 있다.

[3'-히드록시에치네논, 3-히드록시에치네논 및 포에니코크산틴의 생성]

지아크산틴의 합성에 필수적인 어위니아 우레도보라 crtE, crtB, crtI, crtY와 crtZ 유전자 및 케토기 도입 효소 유전자인 해마토코커스 bkt 유전자를 동일 대장균 등의 미생물내로 도입하고, 그들을 발현시킴으로써, 미생물이 주산물로서 아스타크산틴 및 4-케토지아크산틴을 생성할 수 있게 된다. 그러나, 부차적인 중간 대사산물로서는 3'-히드록시에치네논, 3-히드록시에치네논 및 포에니코크산틴이 생성된다.

이와 같은 색소를 수득하는 방법은 상기에서 기술한 방법과 유사하다. 실시예에서는 이를 상세히 설명하고 있다.

7. 미생물기탁

분리된 bkt 유전자(즉, 본 발명의 DNA)가 삽입된 플라스미드 pHP51를 포함하는 대장균 DH5α는 통상산업성 공업기술된 생명공학공업기술연구소에 다음과 같이 기탁되었다:

기탁자가 부여한 식별표시 : DH5α(pHP51)

기탁번호 : FERM BP-4757

기탁날짜 : 1994년 7월 26일

[도면의 간단한 설명]

제1도는 녹조류 해마토코커스 플루비알리스 NIES-144로부터 유래한 케토기 도입 효소 유전자(bkt)의 염기배열 및 그에 의해 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 배열을 나타낸다.

제2도는 녹조류 해마토코커스 플루비알리스 NIES-114로부터 유래한 케토기 도입 효소 유전자(bkt)의 염기배열 및 그에 의해 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 배열을 나타낸다.

제3도는 녹조류 해마토코커스 플루비알리스 NIES-114로부터 유래한 케토기 도입 효소 유전자(bkt)의 염기배열 및 그에 의해 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 배열을 나타낸다.

상기 제1도 내지 제3도에서, 개시코돈은 다르다.

제4도는 녹조류 해마토코커스 플루비알리스 NIES-144로부터 유래한 케토기 도입 효소 유전자(bkt)를 포함하는 DNA 사슬의 염기배열을 나타낸다. 제4도에서 A, B 및 C는 개시코돈의 위치를 나타낸다.

제5도는 제4도에서 나타낸 염기배열에 이어 계속되는 배열을 나타낸다.

제6도는 베타-카로틴까지의 카로티노이드 생합성 경로를 나타낸다.

제7도는 카로티노이드 합성 유전자들의 역할뿐만 아니라, 비광합성 어위니아 우레도보라의 카로티노이드 생합성 경로를 나타낸다.

제8도는 녹조류 해마토코커스 플루비알리스 NIES-144로부터 유래한 케토기 도입 효소 유전자(bkt)의 역할, 비광합성 어위니아 우레도보라로부터 유래한 히드록시기 도입 효소 유전자(crtz)의 역할 및 케토카로티노이드 생합성의 주요 경로를 나타낸다.

제9도는 녹조류 해마토코커스 플루비알리스 NIES-144로부터 유래한 케토기 도입 효소 유전자(bkt)의 역할, 비광합성 어위니아 우레도보라로부터 유래한 히드록시기 도입 효소 유전자(crtz)의 역할 및 케토카로티노이드 생합성의 부경로를 나타낸다.

제10도는 녹조류 해마토코커스 플루비알리스 NIES-144로부터 유래한 케토기 도입 효소 유전자(bkt)를 포함하는 두가지 플라스미드 pHP5와 pHP51을 나타낸다.

pHP5 및 pHP51에서는 bkt 유전자가 lac 프로모터의 전사방향과 일치하도록 pSPORT I 및 pBluescript II KS+에 각각 삽입되어 있다. 제한효소에 의해 절단되는 부위는 다음과 같이 약어로 표시한다: S, SalI; Ss, SstI; P, PstI; Sp, SphI; N, NotI; X, XbaI; K, KpnI; Sa, SacI.

제11도는 녹조류 해마토코커스 플루비알리스 NIES-114로부터 유래한 케토기 도입 효소 유전자(bkt)의 개시코돈을 포함하는 영역에 대한 염기배열 및 여러 가지 결실 플라스미드의 개시위치를 나타낸다.

제12도는 녹조류 해마토코커스 플루비알리스 NIES-144 bkt 유전자의 1.7kb DNA 단편을 프로브로 사용하여 서던분석한 결과(전기영동 사진)를 나타낸다.

레인 1-3 : 해마토코커스 플루비알리스 NIES-144

레인 4-6 : 해마토코커스 라쿠스트리스 UTEX 294

레인 7-9 : 해마토코커스 라쿠스트리스 C392

레인 1, 4 및 7 : HindIII 절단체

레인 2, 5 및 8 : PstI 절단체

레인 3, 6 및 9 : Xbal 절단체

[본 발명의 바람직한 실시태양]

본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 이들은 본 발명의 범주를 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

생물체와 배지 조성물

유전자를 수득하기 위해 사용된 해마토코커스 플루비알리스는 세계 환경 포럼협회(Foundation Global Environmental Forum)에 등록된 NIES-144 균주이다. 해마토코커스 플루비알리스를 기본배지(0.1% 효모추출물; 0.12% 아세트산나트륨; 0.04 % L-아스파라긴; 0.02% 염화마그네슘 육수화물; 0.001% 황화철(II) 칠수화물; 0.002% 염화칼슘 이수화물)에서 20℃, 12시간 광조건/12시간 암조건의 주기(20μE/㎡·s)로 4일동안 배양하였다. 아울러, 해마토코커스 플루비알리스에서 아스타크산틴의 합성을 유도하기 위하여, 해마토코커스 플루비알리스 NIES-144 균주에 아세트산 및 황화철(II) 칠수화물을 최종농도가 각각 45mM 및 450㎛되도록 첨가한 다음, 약 12시간동안 125μE/㎡·s의 광도 및 20℃의 조건에서 배양하여 균주에서의 낭(cyst) 생성을 유도하였다.

[실시예 2]

해마토코커스 플루비알리스로부터 전체 DNA의 제조

해마토코커스 플루비알리스 NIES-144 균주를 기본배지 400ml에 접종하고, 약 4일동안 12시간 광조건 및 12시간 암조건의 주기하에 광도 20μE/㎡·s, 온도 20℃의 조건에서 배양하였다. 그런 다음, 세포들을 배양액으로부터 수집하여 액화질소로 열리고, 세포가 분말화될 때까지 막자사발에서 분쇄시켰다. 분말화된 세포에 추출용 완충용액(0.1M Tris-HCl pH 8.0, 0.1M EDTA, 0.25M NaCl, 0.1mg/ml Proteinase K) 15ml를 첨가하였고, 2시간동안 55℃를 유지하면서 강하게 교반하였다. 이어, 전기 혼합용액을 10분동안 4℃에서 6000xg의 조건으로 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상등액에 이소프로판올을 0.6배 부피로 가하고, 30분동안 -20℃에서 냉각시켰다. 그런 다음, 그 혼합물을 4℃에서 15분동안 7500xg의 조건으로 원심분리하였다. DNA 함유 침전물을 TE 완충용액(10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA) 2ml에 용해시키고, 동일 부피의 페놀/클로로포름 혼합용액(페놀:클로로포름=1:1)을 첨가하여, 상충액 추출을 위한 원심분리를 수행하였다. 이어, 5M 염화나트륨 80㎕와 에탄올 5ml를 상충액에 첨가하고, 30분동안 -20℃에서 냉각시켜, 4℃에서 15분동안 12000xg의 조건으로 원심분리하였다. 침전물을 70% 에탄올로 세척하고 건조시켰다. 이어, 침전물을 TE 완충용액(10mM, Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA) 0.5ml에 용해시키고, RNaseA (10mg/ml) 2.5㎕를 가하여, 해마토코커스 플루비알리스의 전체 DNA 용액을 제조하였다.

[실시예 3]

PCR에 의한 해마토코커스 플루비알리스로부터의 crtZ 동질영역의 분리

어위니아 우레도보라와 어위니아 허르비콜라(Erwinia herbicola) 유래의 crtZ 유전자들에 의해 암호화된 아미노산 배열을 비교했을 때(Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K., and Harashima, K., Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli, J. Bacteriol., 172, pp. 6704-6712, 1990; Hundle, B. S., Beyer, P., Kleinig, H., Englert, G. and Hearst, J. E., Carotenoids of Erwinia herbicola and an Escherichia coli HB101 strain carrying the Erwinia herbicola Carotenoid Gene Cluster, Phytochem. Phytobiol., 54, pp. 89-93, 1991), 상동성이 높은 영역이 발견되었다. 이러한 영역의 아미노산 배열의 관점에서 사용될 것으로 기대되는 코돈을 조합함으로써, 혼합된 프라이머들을 제조하기 위해 다음의 3가지 프라이머를 합성하였다.

NO. 1 5' -GGNTGGGGNTGGCAYAARTCNCAYCA-3'

NO. 2 5'- CANCGYTGRTGNACNAGNCCRTCRTG-3'

NO. 3 5'- GCRTASATRAANCCRAARCTNACRCA-3'

[N : A,G,C 또는 T, R: A 또는 G, Y: C 또는 T; S: A,G 또는 T]

NO.1과 NO.2로 이루어진 혼합된 프라이머 및 NO.1과 NO.3로 이루어진 혼합된 다른 프라이머를 제조하였고, 해마토코커스 플루비알리스의 전체 DNA용액을 주형으로 사용하여 PCR(중합효소 연쇄반응)을 실시하였다. 하기와 같은 최종농도를 갖도록 하기 물질들을 혼합하였다: 해마토코커스 플루비알리스의 전체 DNA용액 약 100ng ; 혼합된 프라이머들 각각 100㎛; lxVent 완충용액[10mM 염화칼륨, 20mM Tris-HCl(pH 8.8), 10mM(NH₄)₂SO₄, 2mM MgSO₄, 0.1% 트리톤 X-100]; 250μM dNTP; 및 2U Vent 중합효소(New England Biolabs, Inc.). PCR은 94℃에서 30초동안, 55℃에서 30초동안, 60℃에서 30초동안, 72℃에서 30초동안이라는 조건dmf 30회 반복함으로써 이루어졌다. 그런 다음, 전기영동하여 반응 생성물의 존재를 확인하였다. 그러나, 어떤 경우에도 명확한 단일 생성물은 검출되지 않았다.

[실시예 4]

해마토코커스 플루비알리스로부터 전체 RNA의 제조

해마토코커스 플루비알리스 NIES-144 균주를 기본배지 800ml에 접종하고, 약 4일동안 12시간 광조건 및 12시간 암조건의 주기하에 광도 20μE/㎡·s, 온도 20℃의 조건에서 배양하였다. 이어, 아세트산 및 황화철(II) 칠수화물을 최종농도가 각각 45mM 및 450㎛되도록 첨가한 다음, 약 12시간동안 125μE/㎡·s의 광도 및 20℃의 조건에서 배양하였다. 그런 다음, 세포들을 배양액으로부터 수집하여 액화질소로 열리고, 세포가 분말화될 때까지 막자사발에서 분쇄시켰다. 분말화된 세포에 3ml의 ISOGEN-LS(Nippon Gene)을 첨가하여 실온에서 5분동안 방치하였다. 여기에 0.8 ml의 클로로포름을 첨가하였다. 그런 다음, 혼합물을 15초동안 강하게 교반하고, 3분동안 실온에서 방치하였다. 상층액을 추출하기 위해, 그렇게 얻은 전기 혼합물을 4℃에서 15분동안 12000xg으로 원심분리하였다. 이어, 해마토코커스 플루비알리스의 전체 RNA 용액을 수득하기 위하여, 침전물을 70% 에탄올로 세척하고 건조시켜, 1ml의 TE 완충용액(10mM, Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해시켰다. 이와 같은 과정으로 4.1mg의 전체 RNA를 수득하였다.

[실시예 5]

해마토코커스 플루비알리스 cDNA 발현 라이브러리의 제조

올리고텍스-dT30 슈퍼(Oligotex-dT30 Super, Takara Shuzo)를 이용하여, 제조자에 의해 첨부된 프로토콜에 따라 1mg의 해마토코커스 플루비알리스의 전체 RNA로부터 폴리 A⁺RNA를 정제하였다. 대략 14㎍의 폴리 A⁺RNA를 이 방법으로 정제하였다.

첨부 프로토콜에 부분적인 변형을 가한 다음과 같은 방법으로, 슈퍼스크립트 TM 플라스미드 시스템(Gibco BRL)을 이용하여 cDNA를 제조하였다. 약 5㎍의 폴리 A⁺RNA를 사용하여, NotI 제한효소 인식부위를 포함하는 합성 DNA와 프라이머로서 15-머(ver)의 올리고-dT를 가지고서 상보적 DNA 사슬을 합성하였다. 그런 다음, 대장균 DNA 연결효소, 대장균 DNA 중합효소 및 대장균 DNA RNase H를 이용하여 이중나선 cDNA를 합성하였다. 전기 cDNA에 제한효소 SalI의 링커(linker)를 T₄DNA 연결효소로 연결하여, 최종적으로 cDNA의 상류 끝에 SalI 인식부위가 위치하고, poly A의 하류에 NotI 인식부위가 위치하도록 하였다. 수득된 cDNA를 전기영동에 의해 크기별로 분획하여, 0.7kb에서 3.5kb 범위까지의 단편들을 포함하는 분획을 수집하였다. 상기 분획의 cDNA 약 28ng과, NotI과 SalI으로 절단된 cDNA 발현벡터 pSPORT I(Gibco BRL) 35ng을 전술한 키트에 함유된 연결용 완충용액(50mM 트리스-HCl, pH 7.6, 10mM MgCl₂, 1mM ATP, 1mM DTT, 5% PEG 8000)과 T₄DNA 연결효소로 연결하였다. 이 cDNA 발현벡터 pSPORT I는 SalI 부위의 상류에 lac 프로모터를 갖는 벡터인데, 이는 대장균에서 cDNA를 발현할 수 있다. 그런 다음, 연결된 DNA 용액 모두를 이용하여, 당업계의 통상의 방법에 따라 대장균 DH5α의 형질전환을 수행하였다(참조 : Molecular Cloning(2판): Cold Spring Harbor Laboratory, 1.21-1.41, 1989). 형질전환체 약 40,000 균주가 수득되었다. 이러한 형질전환체 모두를 수집하고 당업계의 통상적인 방법에 따라 플라스미드 DNA를 제조하였다(참조 : Molecular Cloning(2판): Cold Spring Harbor Laboratory, 1.21-1.41, 1989). 그 결과, 플라스미드 DNA 0.6mg을 수득하였고, 이것은 해마토코커스 플루비알리스의 cDNA 발현 라이브러리가 되었다.

[실시예 6]

색상변화를 이용한 케토기 도입 효소 유전자를 포함하는 대장균의 탐색

(1) 베타-카로틴을 생성하는 대장균의 제조

crtZ를 제외한 어위니아 우레도보라 카로티노이드 합성 유전자(crtE, crtX, crtY crtI 및 crtB) 모두를 포함하는 플라스미드 pCAR16을(참조 : Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K., and Harashima, K., Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli, J. Bacteriol., 172, pp. 6704-6712, 1990; 및 일본특허공개 제3-58786호) BstEII로 절단하고, 클레노우효소를 처리하여 연결효소 반응시킴으로써, crtX 유전자는 프레임이동(frameshift)에 의해 불활성화되었다. 베타-카로틴 생성에 필요한 crtE, crtY, crtI 및 crtB 유전자를 포함하고 있는 6.0kb의 Asp718(KpnI)-EcoRI 단편을 잘라내었다. 이 단편을 대장균 벡터 pACYC184(ATCC 37033으로부터 수득된)의 EcoRV 부위로 삽입하여 목적하는 플라스미드(pACCAR16△crtX라 명명)를 제조하였다. 이 플라스미드 pACCAR16△crtX를 포함하는 대장균은 클로람페니콜에 대하여 저항성을 나타내고, 베타-카로틴을 생성할 수 있다.

(2) 케토기 도입 효소 유전자의 탐색

해마토코커스 플루비알리스에서, 케토카로티노이드는 베타-카로틴을 경유하여 생합성되는 것으로 여겨지고 있다(참조 : Britton, G., Biosynthesis of carotenoids, Plant Pigments, Goodwin, W.W.(ed.). London Academic Press, 1988, pp. 133-182). 상술한 플라스미드 pACCAR16△crtX를 함유하는 대장균 JM101이 베타-카로틴(노란색)을 생성하는 현상을 이용하여, 상기에서 수득된 cDNA 발현 라이브러리를 상기 대장균에 도입하였다. 이어, 케토기 도입 효소 유전자를 함유하는 대장균은 형질전환체의 색상변화로 탐색하였다. 케토기가 도입되고 칸타크산틴(케토카로티노이드의 일종)이 생성되기 시작할 때, 대장균의 색깔이 베타-카로틴의 노란색에서 칸타크산틴의 붉은색으로 변할 것으로 예상되었다.

우선, 당업계의 통상적인 방법에 따라서 pACCAR16△crtX를 함유하는 대장균 JM101의 형질전환체를 제조하였다(참조 : Molecular Cloning(2판): Cold Spring Harbor Laboratory, 1.21-1.41, 1989).

그런 다음, 1ml의 형질전환체에 100ng의 cDNA 발현 라이브러리를 도입하고, 약 40,000 형질전환체를 대상으로 탐색을 실시하여, 붉은 색을 띠면서 색깔이 다른 것들과 약간 다른 하나의 균주를 분리하였다(이 균주의 색소는 실시예 7에서 칸타크산틴으로 동정되었다). 또한, 상기한 균주에 의해 운반된 cDNA 발현 플라스미드는 pHP5로 명명되었다. 플라스미드 pHP5의 구축은 제10도에 나타내었다.

[실시예 7]

케토기 도입 효소 유전자의 염기배열 결정

pPH5에 삽입된 해마토코커스 플루비알리스 유래의 1.7kb cDNA를 제한효소 SalI 및 XbaI으로 절단하여 분리하였다. 이 단편은 대장균 벡터 pBluscript II KS+과 대장균 벡터 pBluescript II SK+의 SaiI/XbaI 위치에 삽입되어, 두 개의 플라스미드(pHP51과 pHP52)를 수득하였다. 상기한 플라스미드의 pHP51에 대한 제한 효소 지도는 제10도에 나타내었다. pHP51과 pHP52에 삽입된 상기 cDNA 단편의 삽입방향이 다르다. 전자의 플라스미드에 삽입된 cDNA 단편은 lac 프로모터의 전사방향과 일치하나, 후자의 플라스미드에 삽입된 cDNA 단편은 일치하지 않는다.

수득된 플라스미드 pHP51과 pHP52를 시용하여 다양한 길이의 결실이 유발된 결실 변이체를 하기와 같은 방법으로 제조하고, 그들의 염기서열을 결정하였다. pHP51은 SacI 및 XbaI으로, pHP52는 KpnI과 SalI으로 각각 절단하였다. 이어, 페놀/클로로포름 추출을 수행하고, DNA를 에탄올 침전으로 회수하였다. 각 DNA는 100㎕의 ExoⅢ 완충용액(50mM Tris-HCl, 100mM 염화나트륨, 10mM 2-머캡토에탄올, pH 8.0)에서 용해시키고, 180단위의 ExoⅢ 핵산분해효소를 첨가하여 37℃에서 방치시켰다. 매 30초마다 10㎕ 반응용액을 취하여, 각 샘플을 얼음상의 10㎕ MB 완충용액(40mM 염화나트륨, 2mM 염화아연, 10% 글리세롤, pH 4.5)을 포함하는 시험관에 넣었다. 샘플 채취가 끝낸 후, 수득된 10개의 시험관은 효소를 불활성화하기 위하여 10분동안 65℃에 방치하였다. 5단위의 멍빈(mung bean) 핵산분해 효소를 첨가하고, 30분동안 37℃에서 방치하였다. 반응이 완결된 후, 하나의 플라스미드당 다양한 정도의 결실을 갖는 10종류의 DNA 단편들을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 회수되었다. 회수된 DNAs는 클레노우 효소로 평활말단화하고, 16℃에서 밤새 연결반응시켜, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 플라스미드는 상기와 같이 수득된 다양한 클론에 대하여 제조되었고, 서열반응은 서열결정 키트(fluorescent primer cycle sequence kit manufac tured by Applied Biosystems)를 이용하여 수행하였다. 각 플라스미드의 염기배열은 자동 배열 결정기로 결정하였다.

이렇게 결정된 1677bp의 염기 배열은 제4도 및 5도(SEQ ID NO: 4)에 나타내었다. 개방해독틀(open reading frame)에 대한 조사결과, 대장균에서의 발현에 필요한 개시코돈의 상류에 리보좀 결합부위를 개별적으로 갖는 3개의 개방해독틀이 발견되었다. 상기한 세 개의 개방해독틀은 각각 제1도의 A-D(SEQ ID NO: 5), 제2도의 B-D(SEQ ID NO: 6), 제3도의 C-D(SEQ ID NO: 7)에 나타내었다. 하기 실시예 8에서 예시된 바와 같이, C-D보다 더 짧은 폴리펩티드는 대장균에서 효소활성을 잃으므로, C의 하류에는 개시코돈이 존재하지 않은 것으로 여겨진다. 따라서, 제3도의 C 하류에 위치한 영역은 상술한 바와 같은 개방해독틀에 대한 조사에서 제외되었다.

[실시예 8]

케토기 도입 효소 유전자에 대한 개시코돈의 결정

제11도는 상술한 개방해독틀의 상류 부분에 대한 염기배열을 나타낸다. 5개의 잠정적인 부위(염기위치 168-170, 189-191, 264-266, 348-350 및 423-425; 이러한 부위들은 제11도의 네모칸에 나타내었다)가 있다. 제11도에 나타난 개시코돈 중에서, 168, 189 및 264 위치의 염기는 각각 제1도의 A, 제2도의 B 및 제3도의 C에 해당한다. 단백질의 활성에 필요한 최소한의 영역을 결정하기 위하여, pHP51의 결실 변이체를 실시예 5와 동일한 방법으로 제조함으로써, 상류 영역이 결실된 몇 개의 플라스미드를 얻었다. 제11도는 그러한 결실 플라스미드 및 그들의 상류말단 각각에 대한 수를 나타낸다. 이러한 플라스미드는 실시예 6에서 설명한 바와 같이 pACCAR16△crtX를 운반하는 대장균 JM101내로 각각 삽입하고, 생성된 색소를 확인하였다. 그 결과, 결실 플라스미드 30번, 27번, 31번, 37번 및 12번을 운반하는 대장균은 칸타크산틴을 생성하는 것으로 관찰되었으나, 결실 플라스미드 10번, 6번 및 38번을 운반하는 대장균은 칸타크산틴을 생성하지 않는 것으로 관찰되었다. 염기위치 264-266에서 개시코돈 ATG 중의 A가 결핍된 결실 플라스미드 12번에 대하여, 결실 변이체가 생성될 때 전기 ATG가 GTG로 되었다. 대장균은 GTG를 개시코돈으로 인식할 수 있기 때문에, 펩티드의 합성은 이 위치의 개시코돈에서 시작하는 것으로 여겨진다. 따라서, 264-266 위치의 개시코돈으로부터 시작하는 개방해독틀에 의해 암호화되는 폴리펩티드는[제3도의 C-D(SEQ ID NO: 7)] 케토기 도입의 효소활성을 충분히 나타낸다.

[실시예 9]

케토카로티노이드 색소의 동정

(1) 칸타크산틴의 동정

pHP5 또는 pHP51이 도입된 베타-카로틴 생성 대장균 JM101(대장균 pACC AR16△crtX, pHP5 또는 pHP51)(오렌지색)은 150㎍/ml 클로람페니콜(Cm, Sankyo, Co.), 1mM IPTG, 7mg FeSO₄·7H₂O 및 9.3mg Na₂·EDTA를 함유하는 2YT 배지(1.6% 트립톤, 1% 효모 추출액, 0.5% NaCl) 2리터에서 24-30시간동안 30℃에서 배양하였다. 배양액에서 수집한 세포는 300ml의 아세톤으로 추출하였고, 농축 후 200ml의 클로로포름/메탄올(9/1)로 두 번 추출한 다음, 농축/건조/고형화하였다. 이렇게 수득된 물질은 소량의 클로로포름/메탄올(9/1)에서 용해시켰고, 정제용 실리카겔 플레이트(Merck)를 이용하고 클로로포름/메탄올(50/1)로 전개하는 얇은 막 크로마토그라피(TLC)를 수행하였다. TLC를 사용함으로써, 처음의 오렌지색은 세 개의 Rf값 0.53, 0.78 및 1에서 3개의 스폿으로 분리되었다. 전체 색소의 75%를 나타내는 가장 진한 붉은 색소(Rf값 0.53)를 TLC 플레이트로부터 회수하였다. 이 붉은 색소를 소량의 클로로포름/메탄올(9/1)에서 용해시키고, Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(15×300mm)한 다음, 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 클로로포름/메탄올(1/1)을 이용하여 2mg의 순수한 색소를 용출하였다. UV 스펙트럼,¹H-NMR, FD-MS 스펙트럼(m/e 564) 및 실리카겔 TLC에서의 이동도(클로로포름/메탄올(50/1)로 전개할 때 Rf값이 0.53이었다) 모두에서, 상기의 순수한 색소는 칸타크산틴 표준물질(BASF)의 결과와 일치하였으므로, 이 물질은 칸타크산틴(참조 : 제8도에 나타낸 구조식)으로 동정하였다.

아울러, 최초에 추출된 전체 색소의 10%를 나타내는 붉은 색소(TLC에서 Rf값 0.78을 갖는)를 TLC 플레이트로부터 회수하고, 소량의 메탄올에 용해시켰다. 이 색소의 UV 스펙트럼, 실리카겔 TLC에서의 이동도(클로로포름/메탄올(50/1)로 전개할 때 Rf값이 0.78이었다) 및 노바팩(Novapack) HR6μC₁₈(3.9×300mm)(Waters)을 이용한 HPLC에서의 이동도(유속 1.0ml/min에서 아세토니트릴/메탄올/2-프로판올(90/6/4)로 전개할 때, RT는 16분이었다)로부터, 이 물질은 에치네논(참조 : 제8도에 나타낸 구조식)으로 동정하였다.

또한, 최초에 추출된 전체 색소의 15%를 나타내는 노란색 색소(TLC에서 Rf값 1을 갖는다)를 TLC 플레이트로부터 회수하고, 소량의 메탄올에서 용해시켰다. 이 색소의 UV 스펙트럼 및 노바팩(Novapack) HR6μC₁₈(3.9×300mm)(Waters)을 이용한 HPLC에서의 이동도(유속 1.0ml/min에서 아세토니트릴/메탄올/2-프로판올(90/6/4)로 전개할 때, RT는 62분이었다)는 베타-카로틴 표준물질(모두 트란스형, Sigma)의 결과와 일치하였으므로, 이 물질은 미반응 베타-카로틴(참조 : 제8도에 나타낸 구조식)으로 동정하였다.

(2) 아스타크산틴과 4-케토지아크산틴의 동정

지아크산틴 생성 대장균은 다음과 같이 제조하였다. 어위니아 우레도보라 유래의 카로티노이드 합성 유전자 모두를 가지는 플라스미드 pCAR25(참조 : Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K., and Harashima, K., Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli, J. Bacteriol., 172, pp. 6704-6712, 1990; 및 일본특허공개 제3-58786호)를 BstEII로 절단하고, 클레노우효소를 처리하여 연결효소 반응시킴으로써, crtX 유전자는 프레임이동(frameshift)에 의해 불활성화되었다. 지아크산틴 생성에 필요한 crtE, crtB, crtI, crtY 및 crtZ 유전자를 포함하고 있는 6.5kb의 Asp718(KpnI)-EcoRI 단편을 잘라내었다. 이 단편을 대장균 벡터 pACYC184의 EcoRV 부위로 삽입하여 목적하는 플라스미드(pACCAR25△crtX라 명명)를 제조하였다.

pHP5 또는 pHP51이 도입된 지아크산틴 생성 대장균 JM101(대장균 pACCAR25△crtX, pHP5 또는 pHP51)(오렌지색) 150㎍/ml Ap, 30㎍/ml Cm, 1mM IPTG, 7mg FeSO₄·7H₂O 및 9.3mg Na₂·EDTA를 함유하는 2YT 배지(1.6% 트립톤, 1% 효모 추출액, 0.5% NaCl) 2리터에서 24-30시간동안 30℃에서 배양하였다. 배양액에서 수집한 세포는 300ml의 아세톤으로 추출하였고, 농축 후 200ml의 클로로포름/메탄올(9/1)로 두 번 추출한 다음, 농축/건조/고형화하였다. 이렇게 수득된 물질은 소량의 클로로포름/메탄올(9/1)에서 용해시켰고, 정제용 실리카겔 플레이트(Merck)를 이용하고 클로로포름/메탄올(15/1)로 전개하는 얇은 막 크로마토그라피(TLC)를 수행하였다. TLC를 사용함으로써, 처음의 오렌지색은 세 개의 Rf값 0.40, 0.54 및0.72에서 3개의 스폿으로 분리되었다. 이들 색소를 TLC 플레이트로부터 회수하고, 소량의 클로로포름/메탄올(9/1)에서 용해시키고, Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(15×300mm)한 다음, 클로로포름/메탄올(9/1) 또는 메탄올을 이용하여 약 1mg, 1mg 및 2mg의 3가지 순수한 색소를 얻었다.

추출된 전체 색소의 약 50%를 나타내는 Rf값 0.72의 색소는 UV 스펙트럼,¹H-NMR 및 FD-MS스펙트럼(m/e 596)에서 아스타크산틴의 결과와 일치하는 평면구조를 나타내었다.

이어, 전기 색소를 디에틸에테르:2-프로판올:에탄올(5:5:2)에 용해시키고, CD 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과, 이 물질은 3S, 3'S의 입체구조를 가지는 것으로 확인되었다. 따라서, 이 물질은 아스타크산틴(참조 : 제8도에 나타낸 구조식)으로 동정하였다. Rf값 0.54의 또다른 색소는 UV 스펙트럼,¹H-NMR 및 FD-MS스펙트럼(m/e 582) 및 실리카겔 TLC에서의 이동도(클로로포름/메탄올(15/1)로 전개할 때 Rf값이 0.54이었다)에서 4-케토지아크산틴의 동정되었다. Rf값 0.40의 색소는 UV 스펙트럼, 실리카겔 TLC에서의 이동도(클로로포름/메탄올(50/1)로 전개할 때 Rf값이 0.40이었다) 및 노바팩(Novapack) HR6μC₁₈(3.9×300mm)(Waters)을 이용한 HPLC에서의 이동도(유속 1.0ml/min에서 아세토니트릴/메탄올/2-프로판올(90/6/4)로 전개할 때, RT는 6.5분이었다)에서 지아크산틴 표준물질(BASF)의 결과와 일치하였으므로, 이 물질은 미반응의 지아크산틴(참조 : 제8도에 나타낸 구조식)으로 동정하였다.

상기에서 기술한 내용으로부터, 케토기 도입 효소 유전자의 역할은 다음과 같을 것으로 여겨진다.

실시예 9의 (1)에서, 해마토코커스 유래의 케토기 도입 효소 유전자(bkt)는 에치네논을 경유하여 베타-카로틴(기질)을 칸타크산틴으로 전환하는데 있어(참조 : 제8도) 촉매작용을 하는 케토기 도입 효소(베타-카로틴 케톨라아제)를 암호화하는 것이 확실하다. 이것은 하나의 효소, 즉 BKT가 베타-이오논 고리의 4와 4' 위치에 있는 메틸렌기를 직접 케토기로 전환하는 것을 나타낸다. 이러한 기능을 갖는 효소는 지금까지 알려져 있지 않다. 또한, 실시예 9의 (2)에서, 해마토코커스 유래의 bkt 유전자는 4-케토지아크산틴을 통하여 지아크산틴(기질)을 아스타크산틴으로 전환하는데 있어((참조 : 제8도) 촉매작용을 하는 다른 케토기 도입 효소(지아크산틴 케톨라아제)를 암호화하는 것이 확실하다. 이것은 하나의 효소, 즉 BKT가 3 및 3'-히드록시-베타-이오논 고리의 4와 4' 위치에 있는 메틸렌기를 직접 케토기로 전환하는 것을 나타낸다. 이러한 기능을 갖는 효소는 지금까지 알려져 있지 않다. 따라서, 해마토코커스 유래의 케토기 도입 효소 유전자 bkt는 3(3') 위치에의 히드록시기 부가 유무에 상관없이, 4(4') 위치에 있는 메틸렌기를 직접 케토기로 전환하는 베타-이오논 또는 3-히드록시-베타 이오논 고리 케토기 도입 효소(베타-이오논 또는 3-히드록시-베타-이오논 고리 케톨라아제)를 암호화하는 것으로 여겨진다. 베타-이오논 고리 또는 3-히드록시-베타 이오논 고리에만 한정하지 않더라도, 한가지 효소가 메틸렌기를 케토기로 직접 전환하는 경우는 아직까지 보고되지 않고 있다.

한편, 식물에 존재하는 박테리아 어위니아와 광합성 박테리아인 로도박터(Rhodobacter)로부터 유래한 카로티노이드 합성 유전자를 이용한 본 발명자들의 연구 결과에 따르면, 카로티노이드 생합성 효소가 기질인 카로티노이드 분자의 절반만을 인식하고, 그것에 작용하는 것이 확실하다. 예를 들면, 리코펜 고리 생성 효소 유전자인 crtY는 리코펜 분자의 절반만을 인식하고, 고리를 형성한다. 따라서, 로도박터 유래의 피토엔 불포화 효소(desaturase) 유전자인 crtI를 이용하여, 대장균은 리코펜 대신에 뉴로스포렌을 생성하는 것이 가능하다. 또한, 생성된 뉴로스포렌이 어위니아 유래의 crtY로 처리될 때, crtY 유전자 생성물은 리코펜외에도 뉴로스포렌 분자의 절반만을 인식하여, 환화의 베타-지아카로틴이 50% 생성된다(참조 : Linden, H., Misawa, N., Chamovitz, D., Pecker, I., Hirschberg, J., and Sandmann, G., Functional complementation in Escherichia coli of different phytoene desaturase genes and analysis of accumulated carotenes), Z. Naturforsch., 46c, pp. 1045-1051, 1991). 또한 본 발명에서 베타-카로틴이 BKT로 처리될 때, 하나의 케토기가 도입된 에치네논이 먼저 합성되고, 지아크산틴이 BKT로 처리될 때, 하나의 케토기가 도입된 4-케토지아크산틴이 먼저 합성된다. 이것은 BKT가 기질 분자의 절반을 인식하고 4위치에 케토기를 도입한다는 것을 의미한다. 한편, 어위니아 유래의 crtE, crtB, crtI,와 crtY 및 crtZ 유전자를 운반하는 대장균은 상기에서 설명한 바와 같이 지아크산틴을 생성하지만, 하나의 히드록시기가 베타-카로틴에 도입된 베타-크립토크산틴은 중간 대사물질로서 검출될 수 있다. 이것은 BKT가 존재한다면 3'-히드록시에치네논과 3-히드록시에치네논이 베타-크립토크산틴과 함께 기질로서 생성될 수 있다는 것을 의미한다. 또한, BKT는 전기 생성물에 작용하여 포에니코크산틴을 합성할 수 있다. 본 발명의 조건하에서는 전기 물질들이 극소량 존재하므로, 이 시점에서 본 발명자들은 배양액에 있는 전기물질의 동정작업을 하지 않았다. 사실, 해마토코커스와 비교할 수 있는 전형적인 아스타크산틴 생성 미생물인 파피아 로도자마(Phaffia rhodoayma)에서, 3-히드록시에치네논 및 포에니코크산틴이 아스타크산틴의 중간 대사물질로서 검출된다(참조 : Andrewes, A. G., Phaff, H. J. and Starr, M. P., Carotenoids of Phaffia rho dozyma, a red-pigmented fermenting yeast, Phytochemistry, 15, pp. 1003 -1007, 1976). 지금까지의 설명으로부터, 제8도에 나타낸 아스타크산틴의 주대사경로외에 제9도에 나타낸 부대사경로가 있다고 생각할 수 있다.

[실시예 10]

다른 녹조류 해마토코커스의 게놈 DNA의 서던 분석

bkt와 상동성을 나타내는 영역이 다른 녹조류 해마토코커스의 염색체에 존재하는지를 알아보고자 하였다. 해마토코커스 플루비알리스 NIES-144의 전체 DNA를 제조하는 실시예 2와 동일한 방법으로, 해마토코커스 루쿠스트리스 UTEX 294 및 해마토코커스 루쿠스트리스 C-392의 총 DNA를 제조하였다. 이렇게 제조한 DNAs를 해마토코커스 플루비알리스 NIES-144의 총 DNA와 함께 제한효소 HindIII, PstI 또는 XbaI로 절단하고, 아가로오스겔 전기영동에 의해 분리하였다. 분리된 DNA 단편들을 0.5N NaOH/1.5M NaCl의 알카리 용액으로 변성시켰고, 밤새 나일론막으로 이동시켰다. 예혼성화를 위하여, DNA를 흡착한 나일론막은 55℃에서 혼성화 용액(6xDenhardt, 5xSSC, 0.2% SDS, 100㎍/ml ssDNA)에 4시간동안 담궜다. 이어, 메가프라임(Megaprime^TM) DNA 표지 시스템(Amersham)과 [α-³²P]dCTP(110TBq/mmol까지)를 이용하여 bkt 유전자의 1.7kb DNA 단편을 표지하고, 55℃에서 16시간동안의 혼성화를 위하여 상기의 혼성화 용액에 첨가하였다. 혼성화 후, 반응용액을 60℃에서 1시간동안 2xSSC와 0.1% SDS로 세척하고, 상동성을 나타내는 신호를 검출하기 위하여 방사선 자동사진을 찍었다. 그 결과, 해마토코커스 플루비알리스 NIES-144에 대하여는 HindIII 절단체의 15kb, 10kb 및 1.9kb에서, PstI 절단체의 6.1kb, 3.3kb, 2.8kb, 2.3kb, 2.0kb, 1.4kb 및 0.8kb에서, XbaI 절단체의 5.1kb에서 강한 신호가 있었다. 해마토코커스 루쿠스트리스 UTEX 294에 대하여는 HindIII 절단체의 15kb, 7.7kb 및 1.9kb에서, PstI 절단체의 10kb, 5.0kb, 4.0kb, 3.4kb, 2.9kb, 1.5kb 및 0.82kb에서, XbaI 절단체의 20kb보다 약간 높은 한군데 위치에서 강한 신호가 있었다. 해마토코커스 루쿠스트리스 C-392에 대하여는 HindIII 절단체의 15kb, 12kb 및 1.9kb에서, PstI 절단체의 6.5kb, 3.0kb, 2.3kb, 2.0kb, 1.4kb 및 0.8kb에서, XbaI 절단체의 5.3kb 위치에서 강한 신호가 있었다(참조 : 제12도).

[산업상 이용분야]

베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화하는 본 발명의 DNA를 외부 유전자로서 대장균 등의 미생물 내로 도입시키고 그를 발현시킴으로써, 대장균 등의 미생물은 아스타크산틴, 4-케토지아크산틴, 칸타크산틴, 에치네논 및 기타 케토기를 포함하는 케토카로티노이드를 생합성할 수 있게 된다. 케토기를 포함하는 케토카로티노이드를 생합성할 수 있는 대장균 등의 미생물을 이용함으로써, 적은 노력과 비용으로 케토기를 포함하는 케토카로티노이드를 대량 제조 할 수 있다.

Claims

베타-이오논(β-ionone) 고리를 포함하는 화합물에서 베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있는 효소활성을 가지고 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 아미노산 배열과 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 베타-이오논 고리를 포함하는 화합물은 베타-카로틴인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 베타-이오논 고리를 포함하는 화합물은 베타-이오논 고리의 3위치에 있는 하나의 수소 원자가 히드록시기를 치환된 화합물인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제3항에 있어서, 3위치에 있는 하나의 수소 원자가 히드록시기로 치환된 베타-이오논 고리를 포함하는 화합물은 지아크산틴(zeaxanthin)인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
베타-이오논(β-ionone) 고리를 포함하는 화합물에서 베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있는 효소활성을 가지고 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 아미노산 배열과 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 염기 배열을 포함하는 DNA.
제5항에 있어서, SEQ ID NO: 1에 나타낸 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 염기 배열은 SEQ ID NO: 4에 나타낸 염기 배열인 것을 특징으로 하는 DNA.
제5항에 있어서, SEQ ID NO: 1에 나타낸 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 염기 배열은 SEQ ID NO: 5에 나타낸 염기 배열인 것을 특징으로 하는 DNA.
제5항에 있어서, SEQ ID NO: 2에 나타낸 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 염기 배열은 SEQ ID NO: 6에 나타낸 염기배열인 것을 특징으로 하는 DNA.
제5항에 있어서, SEQ ID NO: 3에 나타낸 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 염기 배열은 SEQ ID NO: 7에 나타낸 염기배열인 것을 특징으로 하는 DNA.
제5항 내지 제9항의 어느 한 항에 있어서, 베타-이오논 고리를 포함하는 화합물인 베타-카로틴인 것을 특징으로 하는 DNA.
제5항 내지 제9항의 어느 한 항에 있어서, 베타-이오논 고리를 포함하는 화합물은 배타-이오논 고리의 3 위치에 있는 하나의 수소 원자가 히드록시기로 치환된 화합물인 것을 특징으로 하는 DNA.
제11항에 있어서, 3 위치에 있는 하나의 수소 원자가 히드록시기로 치환된 베타-이오논 고리를 포함하는 화합물은 지아크산틴인 것을 특징으로 하는 DNA.
제5항 내지 제12항의 어느 한 항의 DNA와 혼성화되며, 베타-이오논 고리를 포함하는 화합물에서 베타-이오논 고리의 4 위치에 있는 메틸렌기를 케토기로 전환시킬 수 있는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 염기 배열을 포함하는 DNA.
플라스미드 pHP51에 삽입되어 있는, 해마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis NIES-114) 유래의 1.7kb cDNA.
제5, 13 또는 14항의 DNA를 포함하는 재조합 벡터.
제5, 13 또는 14항의 DNA가 도입된 미생물.
제16항의 미생물을 배지에서 배양하고, 배양액으로부터 케토카로티노이드를 수득하는 것을 포함하는 케토카로티노이드의 제조방법.
제17항에 있어서, 케토카로티노이드는 에치네논 및 칸타크산틴으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 카로티노이드의 제조방법.
제17항에 있어서, 케토카로티노이드는 4-케토지아크산틴과 아스타크산틴으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 카로티노이드의 제조방법.
제17항에 있어서, 제16항의 미생물은 박테리아 또는 효모인 것을 특징으로 하는 카로티노이드의 제조방법.