CN1735686A - 通过培养基因修饰生物制备酮类胡萝卜素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过培养基因修饰生物制备酮类胡萝卜素的方法，与野生型相比，其具有改变的酮酶活性。本发明还涉及基因修饰生物，以及其作为人和动物食品和在制备酮类胡萝卜素提取物方面的应用。

Description

通过培养基因修饰生物制备酮类胡萝卜素的方法

本发明涉及一种通过培养基因修饰生物制备酮类胡萝卜素(ketocarotenoid)的方法，同野生型相比，所述基因修饰生物具有改变的酮酶活性；本发明还涉及基因修饰生物，及其作为人和动物的食品、制备酮类胡萝卜素提取物方面的应用。

酮类胡萝卜素主要存在于细菌、一些真菌中，并且作为次生类胡萝卜素存在于绿色藻类中。除了β-胡萝卜素的4-单酮衍生物海胆酮(echinenone)之外，也会形成相应对称的二酮化合物角黄素(canthaxanthin)。此外，以上提到的几个生物类群中，已知有几个物种被发现是以虾青素(astaxanthin，即3，3’-二羟基-4，4’-二酮基-β-胡萝卜素)作为生物合成的最终产物(带有少量相应的中间体)(Goodwin，T.W.(1980)The Biochemistry of the Carotenoids，Vol.1：Plants，2nd edn.Chapman&Hall，New York.；Johnson，E.A.&An G.-H.(1991)astaxanthin from microbial sources.Critical Rev.Biotechnol.11，297-326.；3.Lorenz，R.T.&Cysewski，G.R.(2000)Commercialpotential for Haematococcus microalgae as a natural source ofastaxanthin.Trend Biotechn.18，160-167)。

因为它们具有着色性能，酮类胡萝卜素，特别是虾青素在牲畜营养中用作色素辅助剂，特别用于饲养鳟鱼、鲑鱼和虾。

虾青素目前主要采用化学合成方法制备。目前通过生物技术方法可获得少量天然酮类胡萝卜素，例如天然虾青素，采用方法为培养藻类，如雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)或者发酵基因优化的微生物然后分离。

因此，发明一种经济的生物技术方法来制备天然酮类胡萝卜素就显得非常重要。

已经从细菌Agrobacterium aurantiacum(EP 735137，AccessionNo.D58420)，和Paracoccus marcusii(Accession No.Y15112)中成功克隆了crtW型特异酮酶基因并进行了功能识别，并且从红球藻(Haematococcus)(Haematococcus pluvialis Flotow em.Wille和Haematoccus pluvialis，NIES-144(EP 725137，WO 98/18910和Lotan etal，FEBS Letters 1995，364，125-128，Accession No.X86782和D45881))中克隆得到了其cDNA。

其他生物中也存在一些ORF，由于氨基酸同源，它们也被称作酮酶基因，例如来源于以下生物的编码酮酶的核酸：产碱菌属种(Alcaligenes sp.)PC-1(EP 735137，Accession No.D58422)，集胞蓝细菌属种(Synechocystis sp.)菌株PC6803(Accession No.NP_442491)，慢生根瘤菌属种(Bradyrhizobium sp.)(Accession No.AF218415)，念珠蓝细菌属种(Nostoc sp.)PCC 7120(Kaneko et al，DNA Res.2001，8(5)，205-213；Accession No.AP003592，BAB74888)和Brevundimonasaurantiaca(WO 02079395).

只有从A.aurantiacum和产碱菌属种中分离的酮酶进行了生化鉴定(Fraser P.D.，Shimada H.& Misawa N.(1998)Enzymic confirmation ofreactions involved in routes to astaxanthin formation，elucidatedusing a direct substrate in vitro assay.Eur.J.Biochem.252，229-236.)。还有一种类型的β-胡萝卜素酮酶基因，来源于蓝细菌Synechocystis的crtO，其与crtW没有相似性而与细菌去饱和酶有关(Fernandez-Gonzalez，B.，Sandmann，G.& Vioque，A(1997)A new typeof asymmetricaily acting β-carotene ketolase is required for thesynthesis of echinenone in the cyanobacterium Synechocystis sp.PCC 6803.J.Biol.Chem.272，9728-9733.)

所有已知的酮酶都可以在β-胡萝卜素的4位引入一个酮基。crtO基因编码单酮酶，可将β-胡萝卜素催化生成海胆酮作为最终产物。crtW基因家族(来源于红球藻的bkt基因也属于该家族)编码二酮酶，可将β-胡萝卜素至多转化成角黄素。该反应似乎是向虾青素方向转化的第一步修饰，随后就是3位的羟基化。然后在第二紫罗酮环(9)上有相同的反应顺序。另有酶证据表明，3-羟基-β-胡萝卜素衍生物只能微弱地在4位上发生酮基化。同样还发现，只有特定细菌的羟化酶，比如来源于噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)(Breitenbach，J.，Misawa，N.，Kajiwara，S.&Sandmann，G.(1996)Expression in Escherichia coli and propertiesof the carotene ketolase from Haematococcus pluvialis.FEMSMicrobiol.Lett.140，241-246)或A.aurantiacum的羟化酶，才能转换酮基化中间体。结构与之不同的蓝细菌羟化酶不能催化这一反应(Albrecht，M.，Steiger，S.& Sandmann，G.(2001)Expression of aketolase gene mediates the synthesis of canthaxanthin inSynechococcus leading to resistance against pigmentphotodegradation and UV-B sensitivity of photosynthesis.Photochem.Photobiol.73，551-555)。这种类型的羟化酶不与酮酶协同作用，基本得不到虾青素产物。

EP 735 137记载了通过将来源于Agrobacterium aurantiacum或产碱菌属种PC-1的酮酶基因引入微生物例如大肠杆菌(Escherichia coli)中，而在微生物中制备叶黄素的方法。

EP 725 137，WO 98/18910，Kajiwara等(Plant Mol.Biol.1995，29，343-352)和Hirschberg等(FEBS Letters 1995，364，125-128)公开了通过将雨生红球藻来源的酮酶基因(crtW，crtO或bkt)引入大肠杆菌中制备虾青素的方法。

Hirschberg等(FEBS Letters 1997，404，129-134)记载了通过引入雨生红球藻来源的酮酶基因(crtO)在聚球蓝细胞属(Synechococcus)中制备虾青素的方法。Sandmann等(Photochemistry and Photobiology 2001，73(5)，551-55)记载了类似的方法，然而却制备出角黄素，以及微量的虾青素。

WO 98/18910和Hirschberg等(Nature Biotechnology 2000，18(8)，888-892)记载了通过将雨生红球藻来源的酮酶基因(crtO)引入烟草中而在烟草花蜜腺中合成酮类胡萝卜素的方法。

WO 01/20011记载了使用种子特异性启动子和雨生红球藻来源的酮酶，以在含油种子作物如油菜、向日葵、大豆和芥菜的种子中生产酮类胡萝卜素，特别是虾青素的DNA构建体。

现有技术中所有制备酮类胡萝卜素的方法，特别是制备虾青素的方法都有一个缺点，就是转基因生物产生虾青素的量太少。

本发明的目的是提供一种通过培养基因修饰生物制备酮类胡萝卜素的方法，进一步提供可产生酮类胡萝卜素的基因修饰生物，将以上所述现有技术的缺点减小或消除。

我们发现本发明的目的可以通过一种培养基因修饰生物制备酮类胡萝卜素的方法实现，所述基因修饰生物同野生型相比具有改变的酮酶活性，其改变的酮酶活性是由一种酮酶所导致，该酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

本发明的生物，例如微生物或植物，优选作为起始的生物即能自然产生类胡萝卜素，例如β-胡萝卜素或玉米黄质，也可通过基因修饰，例如对代谢途径的再调节或互补作用，使之可以产生类胡萝卜素，例如β-胡萝卜素或玉米黄质。

一些生物，作为起始的或野生型生物，就已经可以产生酮类胡萝卜素，例如虾青素或角黄素。这些生物，例如雨生红球藻，Paracoccus marcusii，Xanthophyl lomyces dendrorhous，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，绿球藻属(Chlorococcum)，红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)，侧金盏花属种(Adonis sp.)，Neochloris wimmeri，Protosiphon botryoides，Scotiellopsis oocystiformis，Scenedesmus vacuolatus，Chlorelazofingiensis，Ankistrodesmus braunii，血红裸藻(Euglena sanguinea)，萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)，布拉霉菌属(Blakeslea)，作为起始的或野生型生物已经具有酮酶活性。

因此，本发明方法的一个实施方式中，使用的起始的生物是那些作为野生型或起始的生物已经具有酮酶活性的生物。在本实施方式中，同野生型或起始的生物相比，基因修饰带来酮酶活性的提高。

酮酶活性是指酮酶的酶活性。

酮酶是指一种具有将酮基引入可任选取代的类胡萝卜素β-紫罗酮环上的酶活性的蛋白质。

酮酶特别指一种具有催化β-胡萝卜素生成角黄素的酶活性的蛋白质。

因此，酮酶活性是指在一定时间内经酮酶蛋白催化转化β-胡萝卜素的量或生成角黄素的量。

因此，当同野生型相比酮酶活性提高时，在一定时间内经酮酶蛋白催化转化β-胡萝卜素的量或生成角黄素的量，同野生型相比增加。

酮酶活性提高的量，优选至少为野生型酮酶活性的5％，更优选至少20％，更优选至少50％，更优选至少100％，优选至少300％，更优选至少500％，特别优选至少600％。

术语“野生型”是指本发明中的相应起始的生物。

根据上下文，术语“生物”可以指起始的生物(野生型)或本发明的基因修饰生物，或兼指两者。

“野生型”是指，优选并且特别是在生物或野生型不能明确区分的情况下，在每种情况下为表示酮酶活性提高或新产生、如下文所述的羟化酶活性提高、如下文所述的β-环化酶活性提高、以及酮类胡萝卜素的含量提高而使用的基准生物。

作为野生型已经具有酮酶活性的微生物的基准生物优选为雨生红球藻。

作为野生型不具有酮酶活性的微生物的基准生物优选为布拉霉菌属。

作为野生型已经具有酮酶活性的植物的基准生物优选为夏侧金盏花(Adonis aestivalis)，Adonis flammeus或Adonis annuus，特别优选夏侧金盏花。

作为野生型花瓣中不具有酮酶活性的植物的基准生物优选为万寿菊(Tagetes erecta)，孔雀草(Tagetes patula)，甜万寿菊(Tagetes lucida)，Tagetes pringlei，Tagetes palmeri，Tagetes minuta或Tagetescampanulata，特别优选万寿菊。

对本发明的基因修饰生物、野生型和基准生物进行酮酶活性测定，优选在以下条件下进行：

对植物或微生物材料进行酮酶活性测定基于Frazer等(J.Biol.Chem.272(10)：6128-6135，1997)的方法。对植物或微生物提取物进行酮酶活性测定，使用β-胡萝卜素和角黄素做底物，并有脂质(大豆卵磷脂)和洗涤剂(胆酸钠)存在。酮酶检测的底物/产物比率使用HPLC测定。

多种途径可以实现提高酮酶活性，例如在翻译和蛋白水平上切断抑制性调节机制，或者同野生型相比，增强编码酮酶的核酸的基因表达，例如使用激活因子诱导酮酶基因，或将编码酮酶的核酸引入生物中。

本实施方式中，提高编码酮酶的核酸的基因表达还指根据本发明对具有内源酮酶的生物的表达进行操纵。这可以通过例如修饰酮酶编码基因的启动子DNA序列来实现。这种修饰导致至少一个内源性酮酶基因的表达率改变或者优选是增加，该修饰还可以通过DNA序列的缺失或插入来达到效果。

如上所述，还可通过使用外源刺激来改变至少一个内源酮酶的表达。这可以通过特殊的生理条件，即加入外来物质的方式实现。

另一种可能实现至少一个内源酮酶基因表达增强的途径是依赖调节蛋白，其不存在于野生型生物中，或者经修饰后与这些基因的启动子互相作用。

这种调节蛋白可以是包括DNA结合区和转录激活区的嵌合蛋白，例如WO 96/06166中所述。

在优选的实施方式中，与野生型相比，通过提高编码酮酶的核酸的基因表达来提高酮酶活性，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

在进一步优选的实施方式中，通过将编码酮酶的核酸引入该生物来提高编码酮酶的核酸的基因表达，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

因此在本实施方式中，同野生型相比，本发明的转基因生物存在至少另一个编码酮酶的酮酶基因，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

因此在本实施方式中，本发明的基因修饰生物具有至少一个外源(＝异源)的编码酮酶的核酸，或至少两个内源的编码酮酶的核酸，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

在本发明方法的另一优选的实施方式中，用作起始生物的生物作为野生型没有酮酶活性。

在此优选的实施方式中，基因修饰使生物产生酮酶活性。因此在此优选的实施方式中，同未进行基因修饰的野生型相比，本发明的基因修饰生物具有酮酶活性，可优选地转基因表达酮酶，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

在此优选的实施方式中，与上文所述的提高编码酮酶的核酸的基因表达相类似，优选通过将编码酮酶的核酸引入起始生物来产生编码酮酶的核酸的基因表达，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

在这两个实施方式中，原则上可以为此目的使用所有编码酮酶的核酸，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

本发明方法中，使用本发明的编码酮酶的核酸比使用现有技术中的酮酶基因，可惊人地使酮类胡萝卜素的产量特别是虾青素的产量提高。

说明书中提及的所有核酸可以是，例如RNA，DNA或cDNA序列。

如果真核生物来源的基因组酮酶序列包含内含子，宿主生物本身不能或无法使之能表达相应的酮酶，优选使用经过加工的核酸序列，如相应的cDNA。

能较好地应用于本发明方法的编码酮酶的核酸及其相应的酮酶，举例来说，是以下所述来源的序列，其中所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SE9.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同：

点型念珠蓝细菌(Nostoc punctiforme)PCC73102 ORF 38，核酸：Acc.No.NZ AABCO1000195，碱基对55,604到55,392(SEQ ID NO：1)；蛋白：Acc.No.ZP_00111258(SEQ ID NO：2)(注释为推测蛋白)或者

点型念珠蓝细菌PCC73102ORF 148，核酸：Acc.No.NZ_AABC01000196，碱基对140,571到139,810(SEQID NO：3)，蛋白：(SEQ ID NO：4)(未注释)

或者由这些序列衍生的酮酶序列。

图1显示来自点型念珠蓝细菌的ORF 38和ORF 148的更多核酸序列。

为了制备虾青素，特别优选使用来自点型念珠蓝细菌PCC73102ORF148，核酸：Acc.No.NZ AABC01000196，碱基对140,571到139,810(SEQID NO：3)，蛋白(SEQ ID NO：4)的酮酶，或者由此序列衍生的序列。

可以从多种基因组序列已知的生物中容易地找到更多可用于本发明方法的天然酮酶和酮酶基因，方法是将数据库中的氨基酸序列或对应的反译(back-translated)核酸序列与以上所述的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4序列进行相同性比较。

可以从多种基因组序列未知的生物中容易地找到更多天然酮酶和酮酶基因，由以上核酸序列起始，特别地由序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3起始，方法是使用杂交技术，具体过程已为公知。

杂交可在中等(低严格度)条件下或优选地严格(高严格度)条件下进行。

此类杂交的条件在例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，：Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pages 9.31-9.57或Current Protocols in Molecular Biology，John Wi ley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中有所记载。

例如冲洗步骤的条件可以从低严格度杂交限制的条件(2×SSC，50℃)中选择，也可以从高严格度杂交限制的条件(0.2×SSC，50℃，优选65℃)(20×SSC：0.3M柠檬酸钠，3M氯化钠，pH 7.0)中选择。

另一种可能性是在冲洗步骤中，将温度由中等条件下的室温，22℃，升高到严格条件下的65℃。

盐浓度和温度这两个参数可以同时变动，也可以固定一个参数，只变动另外一个。还可以在杂交过程中使用变性剂，例如甲酰胺或SDS。在50％甲酰胺存在的条件下，杂交优选在42℃进行。

下面给出杂交和冲洗步骤所选用的条件的范例：

(1)杂交条件的范例

(i)4×SSC，65℃，或

(ii)6×SSC，45℃，或

(iii)6×SSC，68℃，100mg/ml变性的鱼精子DNA，或

(iv)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性的、片断化的鲑鱼精子DNA，68℃，或

(v)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性的、片断化的鲑鱼精子DNA，50％甲酰胺，42℃，或

(vi)50％甲酰胺，4×SSC，42℃，或

(vii)50％(体积比)甲酰胺，0.1％牛血清清蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，42℃，或

(viii)2×或4×SSC，50℃(中等条件)，或

(ix)30到40％甲酰胺，2×或4×SSC，42℃(中等条件)。

(2)冲洗步骤的条件范例，均为10分钟

(i)0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，50℃，或

(ii)0.1×SSC，65℃，或

(iii)0.1×SSC，0.5％SDS，68℃，或

(iv)0.1×SSC，0.5％SDS，50％甲酰胺，42℃，或

(v)0.2×SSC，0.1％SDS，42℃，或

(vi)2×SSC，65℃(中等条件)。

在本发明方法优选的实施方式中，要引入编码酮酶的核酸，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少50％相同，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，特别优选至少98％相同。

酮酶序列可以是如上所述通过与其他生物来源的序列进行相同性对比而发现的天然序列，也可以是由序列SEQ ID NO：2起始经人工变异修饰的人工序列，例如经过氨基酸的替换、插入或缺失。

说明书中使用的术语“替换”是指一个或多个氨基酸被一个或多个氨基酸替换。优选发生的是所谓保守性替换，其中替换氨基酸和原氨基酸有相似的性质，例如Glu被Asp，Gln被Asn，Val被Ile，Leu被Ile以及Ser被Thr替换。

缺失是氨基酸直接被连接键取代。缺失的优选位置是多肽末端和单个蛋白区的连接处。

插入是在多肽链上引入氨基酸，直接的连接键被一个或多个氨基酸取代。

两个蛋白的相同性是指每个蛋白全长上的氨基酸的相同性，特别地，相同性是采用聚类方法(clustal method)(Higgins DG，Sharp PM.Fastand sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989Apr；5(2)：151-1)，使用Informax(USA)提供的vector NTI suite 7.1软件对比计算得到的，其中设置以下参数：

多条比较排列参数：

间隔开放罚分(Gap opening penalty)                 10

间隔延伸罚分(Gap extension penalty)               10

间隔分离罚分范围(Gap separation penalty range)    8

间隔分离罚分(Gap separat ion penalty)             关(off)

排列延迟相同百分率(％ identity for alignment delay)    40

残基特异间隔(Residue specific gaps)                    关(off)

亲水残基间隔(Hydrophilic residue gap)                  关(off)

转换权重(Transition weight)                            0

成对比较排列参数：

FAST算法(FAST algorithm)                               开(on)

K-tuple大小(K-tuple size)                              1

间隔罚分(Gap penalty)                                  3

窗大小(Window size)                                    5

最佳对角数(Number of best diagonals)                   5

因此，酮酶同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同，意思是，酮酶序列和序列SEQ.ID.NO.2相比，特别是使用上述程序算法并使用上述参数设置，至少42％相同。

例如，使用上述程序算法并使用上述参数设置，点型念珠蓝细菌PCC73102ORF 148(SEQ ID NO：4)来源的酮酶序列同点型念珠蓝细菌PCC73102ORF 38(SEQ ID NO：2)来源的酮酶序列相比，结果为64％相同。

适合的核酸序列可以通过例如根据遗传密码反译多肽序列的方法得到。

此方法优选使用的密码子与常用的生物特异性的密码子选择相一致。使用计算机对相关生物中的其他已知基因进行分析，可以很容易地发现密码子选择。

在特别优选的实施方式中，将包含序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸引入生物中。

所有以上提到的酮酶基因还可以从核苷酸单元使用公知的化学合成方法制备，如通过双螺旋的互补核酸单元，单个重叠的片段缩合。寡核苷酸的化学合成可以使用例如亚磷酰胺法(Voet，Voet，2nd edition，WileyPress New York，pages 896-897)。合成的寡核苷酸延伸、填充间隔使用DNA聚合酶的Klenow片段和连接反应(ligation reaction)，以及常用克隆方法，这些方法记载在Sambrook et al.(1989)，Molecular cloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press.

点型念珠蓝细菌PCC73102ORF 38(SEQ ID NO：2)来源的酮酶序列与现有技术中使用的酮酶序列相比，有38％相同(Agrobacteriumaurantiacum(EP 735 137)，Accession No.D58420)，38％相同(产碱菌属种PC-1(EP 735137)，Accession No.D58422)，以及19～21％相同(雨生红球藻Flotow em.Wille和雨生红球藻，NIES 144(EP 725137，WO 98/18910和Lotan et al，FEBS Letters 1995，364，125128)，Accession No.X86782和D45881).

在优选的实施方式中，培养的生物与野生型相比，除了酮酶活性提高外，羟化酶活性和/或-环化酶活性也有提高。

羟化酶活性是指羟化酶的酶活性。

羟化酶是指一种具有将羟基引入可任选取代的类胡萝卜素的β-紫罗酮环上的酶活性的蛋白质。

羟化酶特别指一种具有催化β-胡萝卜素生成玉米黄质或催化角黄素生成虾青素的酶活性的蛋白质。

因此，羟化酶活性是指经羟化酶蛋白催化转化β-胡萝卜素或角黄素的量或生成的玉米黄质或虾青素的量。

因此，当同野生型相比羟化酶活性提高时，在一定时间内经羟化酶蛋白催化转化β-胡萝卜素或角黄素的量，或生成的玉米黄质或虾青素的量，同野生型相比增加。

羟化酶活性提高的量，优选至少为野生型羟化酶活性的5％，更优选至少20％，更优选至少50％，更优选至少100％，更优选至少300％，更优选至少500％，特别优选至少600％。

β-环化酶活性是指β-环化酶的酶活性。

β-环化酶是指一种具有将终端为线性的番茄红素(lycopene)残基转化为β-紫罗酮环的酶活性的蛋白质。

β-环化酶特别指一种具有催化γ-胡萝卜素生成β-胡萝卜素的酶活性的蛋白质。

因此，β-环化酶活性是指在一定时间内经β-环化酶蛋白催化转化γ-胡萝卜素的量或生成β-胡萝卜素的量。

因此，当同野生型相比β-环化酶活性提高时，在一定时间内经β-环化酶蛋白催化转化番茄红素或γ-胡萝卜素的量，或者，从番茄红素生成γ-胡萝卜素或从γ-胡萝卜素生成β-胡萝卜素的量，同野生型相比增加。

β-环化酶活性提高的量，优选至少为野生型β-环化酶活性的5％，更优选至少20％，更优选至少50％，更优选至少100％，更优选至少300％，更优选至少500％，特别优选至少600％。

对本发明的基因修饰生物、野生型和基准生物进行羟化酶活性测定，优选在以下条件下进行：

羟化酶活性测定使用Bouvier等(Biochim.Biophys.Acta 1391(1998)，320-328)的方法在体外进行，在一定量的生物提取物中，加入铁氧还蛋白、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶、过氧化氢酶、NADPH和β-胡萝卜素，以及单-、二半乳糖甘油酯。

羟化酶活性测定特别优选在以下文献中限定的条件下进行：Bouvier，Keller，d’Harlingue and Camara(Xanthophyll biosynthesis：molecularand functional characterization of carotenoid hydroxylases frompepper fruits(Capsicum annuum L.)；Biochim.Biophys.Acta 1391(1998)，320-328)：

体外检测在0.250ml的体系内进行。混合物含有50mM磷酸钾(pH 7.6)，0.025mg菠菜铁氧还蛋白，0.5单位菠菜铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶，0.25mM NADPH，0.010mg β-胡萝卜素(在0.1mg Tween 80中乳化)，0.05mM单-、二半乳糖甘油酯混合物(1∶1)，1单位过氧化氢酶，0.2mg牛血清清蛋白，以及体积不等的生物提取物。反应混合物在30℃保温2小时。反应产物使用有机溶剂如丙酮或氯仿/甲醇(2∶1)萃取，并用HPLC测定。

对本发明的基因修饰生物、野生型和基准生物进行β-环化酶活性测定，优选在以下条件下进行：

β-环化酶活性测定使用Fraser和Sandmann(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)915)的方法在体外进行。在一定量的生物提取物中加入磷酸钾作为缓冲液(pH 7.6)，番茄红素作为底物，以及辣椒基质蛋白(paprika stromal protein)，NADP+，NADPH和ATP。

β-环化酶活性测定特别优选在以下文献中限定的条件下进行；Bouvier，d’Harlingue and Camara(Molecular Analysis of carotenoid cyclaseinhibition；Arch.Biochem.Biophys.346(1)(1997)53-64)：

体外检测在250μl的体系内进行。混合物含有50mM磷酸钾(pH 7.6)，不同量的生物提取物，20nM番茄红素，250μg辣椒有色体基质蛋白(paprika chromoplastid stromal protein)，0.2mM NADP+，0.2mM NADPH和1mM ATP。NADP/NADPH和ATP溶于加有1mg Tween 80的10ml乙醇中，然后立即加入保温介质中。30℃下反应60分钟，加入氯仿/甲醇(2∶1)以中止反应。反应产物使用氯仿萃取并使用HPLC分析。

另一种使用放射性底物进行检测的方法记载在Fraser和Sandmann(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)9-15)。

多种途径可以实现提高羟化酶活性和/或β-环化酶活性，例如在表达和蛋白水平上切断抑制性调节机制，或者同野生型相比，增强编码羟化酶的核酸，和/或编码β-环化酶的核酸的基因表达。

同样可以使用多种方法实现，同野生型相比，编码羟化酶的核酸的基因表达和/或编码β-环化酶的核酸的基因表达的提高，例如，使用激活因子诱导羟化酶基因和/或β-环化酶基因，或通过将一个或多个羟化酶基因拷贝和/或β-环化酶基团拷贝引入生物中，即引入至少一个编码羟化酶的核酸，和/或至少一个编码β-环化酶的核酸。

提高编码羟化酶和/或β-环化酶的核酸的基因表达还指根据本发明对具有内源羟化酶和/或β-环化酶的生物的表达进行操纵。

这可以通过例如修饰编码羟化酶和/或β-环化酶的基因的启动子DNA序列米实现。这种修饰导致该基因的表达率增加，可以通过例如DNA序列的缺失或插入来达到效果。

如上所述，还可通过使用外源刺激来改变内源羟化酶和/或β-环化酶的表达。这可以通过特殊的生理条件，即加入外来物质的方式实现。

另一种可能实现内源羟化酶和/或β-环化酶基因表达改变或增强的途径是通过将该基因启动子与调节蛋白相互作用，该蛋白不存在于未转化的生物中。

这种调节蛋白可以是包括DNA结合区和转录激活区的嵌合蛋白，例如WO 96/06166中所述。

在优选的实施方式中，通过将至少一个编码羟化酶的核酸，和/或将至少一个编码β-环化酶的核酸引入生物中，来提高编码羟化酶的核酸的基因表达，和/或编码β-环化酶的核酸的基因表达。

为此目的原则上可以使用任何羟化酶基因或任何β-环化酶基因，即任何编码羟化酶的核酸和任何编码β-环化酶的核酸。

如果真核生物来源的基因组羟化酶或β-环化酶核酸序列包含内含子，宿主生物本身不能或无法使之能表达相应的羟化酶或β-环化酶，优选使用经过加工的核酸序列，如相应的cDNA。

羟化酶基因的例子之一是来自雨生红球藻(Accession AX038729，WO 0061764)；(核酸：SEQ ID NO：5，蛋白：SEQ ID NO：6)的编码羟化酶的核酸。

β-环化酶基因的例子之一是来自番茄(Accession X86452)(核酸：SEQID NO：7，蛋白：SEQ ID NO：8)的编码β-环化酶的核酸。

因此，在此优选的实施方式中，本发明优选的转基因生物与野生型相比，存在至少另外一个羟化酶基因和/或β-环化酶基因。

在此优选的实施方式中，基因修饰生物具有例如至少一个外源编码羟化酶的核酸，或至少两个内源编码羟化酶的核酸，和/或至少一个外源编码β-环化酶的核酸，或至少两个内源编码β-环化酶的核酸。

以上所述优选的实施方式中使用的羟化酶基因为编码蛋白的核酸，所述蛋白包括氨基酸序列SEQ.ID.NO：6，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO：6相比在氨基酸水平上至少30％相同，优选至少50％相同，更优选至少70％相同，更优选至少90％相同，最优选至少95％相同，并且具有羟化酶的酶属性。

如上所述，可以从多种基因组序列已知的生物中容易地发现更多羟化酶和羟化酶基因的实例，方法是将数据库中的氨基酸序列或对应的反译核酸序列与SEQ ID NO：6序列进行相同性比较。

如上所述，可以以已知方式从多种基因组序列未知的生物中容易地发现更多羟化酶和羟化酶基因的实例，例如由序列SEQ ID NO：5起始，方法是使用杂交和PCR技术。

在更特别优选的实施方式中，将编码蛋白的核酸引入生物中以提高羟化酶活性，该蛋白包括序列SEQ ID NO：6的羟化酶氨基酸序列。

适合的核酸序列可以通过例如根据遗传密码反译多肽序列的方法得到。

此方法优选使用的密码子与常用的生物特异性的密码子选择相一致。使用计算机对相关生物中的其他已知基因进行分析，可以很容易地发现密码子选择。

在特别优选的实施方式中，将包括序列SEQ.ID.NO：5的核酸引入生物中。

以上所述优选的实施方式中使用的β-环化酶基因为编码蛋白的核酸，所述蛋白包括氨基酸序列SEQ.ID.NO：8，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO：8相比在氨基酸水平上至少30％相同，优选至少50％相同，更优选至少70％相同，更优选至少90％相同，最优选至少95％相同，并且具有β-环化酶的酶属性。

如上所述，可以从多种基因组序列已知的生物中容易地发现更多β-环化酶和β-环化酶基因的实例，方法是将数据库中的氨基酸序列或对应的反译核酸序列与SEQ ID NO：8序列进行相同性比较。

可以以已知方式从多种基因组序列未知的生物中容易地发现更多β-环化酶和β-环化酶基因的实例，例如由序列SEQ ID NO：7起始，方法是使用杂交和PCR技术。

在更特别优选的实施方式中，将编码蛋白的核酸引入生物中以提高β-环化酶活性，该蛋白包括序列SEQ ID NO：8的β-环化酶氨基酸序列。

适合的核酸序列可以通过例如根据遗传密码反译多肽序列的方法得到。

此方法优选使用的密码子与常用的生物特异性的密码子选择相一致。使用计算机对相关生物中的其他已知基因进行分析，可以很容易地发现密码子选择。

在特别优选的实施方式中，将包括序列SEQ.ID.NO：7的核酸引入生物中。

所有以上提到的羟化酶基因或β-环化酶基因还可以从核苷酸单元使用公知的化学合成方法制备，如通过双螺旋的互补核酸单元，单个重叠的片段缩合。寡核苷酸的化学合成可以使用例如亚磷酰胺法(Voet，Voet，2nd edition，Wiley Press New York，pages 896-897)等已知方式进行。合成的寡核苷酸延伸、填充间隔使用DNA聚合酶的Klenow片段和连接反应(ligation reaction)，以及常用克隆方法，这些方法记载在Sambrook etal.(1989)，Molecular cloning：A laboratory manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press.

本发明方法特别优选使用的基因修饰生物具有下列基因修饰的组合：

与野生型相比，具有提高的或产生的酮酶活性和提高的羟化酶活性的基因修饰生物，

与野生型相比，具有提高的或产生的酮酶活性和提高的β-环化酶活性的基因修饰生物，以及

与野生型相比，具有提高的或产生的酮酶活性和提高的羟化酶活性和提高的β-环化酶活性的基因修饰生物。

如下文所述，可以通过例如引入单个核酸构建体(表达盒，expressioncassette)或引入包括两到三个所述活性的复合构建体，来产生这些基因修饰生物。

生物优选指根据本发明作为野生型或起始生物天然地或通过遗传互补和/或代谢途径再调节，能够产生类胡萝卜素，特别是β-胡萝卜素和/或玉米黄质和/或新黄素(neoxanthin)和/或紫黄质(violaxanthin)和/或黄体素(lutein)的生物。

进一步优选的生物作为野生型或起始生物已经具有羟化酶活性，因此作为野生型或起始生物即能够产生玉米黄质。

优选的生物为植物或微生物，例如细菌、酵母、藻类或真菌。

可以使用的细菌包括两类，一类是由于引入来源于可产生类胡萝卜素的生物的类胡萝卜素生物合成基因而能够合成叶黄素的细菌，例如，埃希氏菌属(Escherichia)的细菌，其中包括例如来源于欧文氏菌属(Erwinia)的crt基因；另一类是原本即能合成叶黄素的细菌，例如欧文氏菌属，土壤杆菌属(Agrobacterium)，黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属，副球菌属(Paracoccus)，念珠蓝细菌属的细菌或集胞蓝细菌属的蓝细菌。

优选的细菌为大肠杆菌，草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)，噬夏孢欧文氏菌，Agrobacterium aurantiacum，产碱菌属种PC-1，黄杆菌属菌株R1534，蓝细菌集胞蓝细菌属种PCC6803，Paracoccus marcusii或Paracoccus carotinifaciens.

优选的酵母为假丝酵母属(Candida)，酵母属(Saccharomyces)，汉逊酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)或发夫酵母属(Phaffia)。特别优选的酵母为Xanthophyllomyces dendrorhous或红发夫酵母。

优选的真菌为曲霉菌属(Aspergillus)，木霉菌属(Trichoderma)，Ashbya，链孢霉属(Neurospora)，布拉霉菌属(Blakeslea)，须霉属(Phycomyces)，镰胞菌属(Fusarium)或者记载在Indian Chem.Engr.Section B.Vol.37，No.1，2(1995)第15页表6中的其他真菌。

优选的藻类为绿色藻类，例如属红球藻属，Phaedactylumtricornatum，团藻属(Volvox)或Dunaliell中的藻类。特别优选的藻类为雨生红球藻或杜氏藻属巴德威藻(Dunaliella bardawil)。

可用于实施本发明方法的更多微生物及其制备公开在例如DE-A-19916140，该文献以参考文献的形式引入本文。

特别优选的植物是选自以下科的植物：毛茛科(Ranunculaceae)，小檗科(Berberidaceae)，罂粟科(Papaveraceae)，大麻科(Cannabaceae)，蔷薇科(Rosaceae)，蝶形花科(Fabaceae)，亚麻科(Linaceae)，葡萄科(Vitaceae)，十字花科(Brassicaceae)，葫芦科(Cucurbitaceae)，报春花科(Primulaceae)，石竹科(Caryophyllaceae)，苋科(Amaranthaceae)，龙胆科(Gentianaceae)，牻牛儿苗科(Geraniaceae)，忍冬科(Caprifoliaceae)，木犀科(Oleaceae)，金莲花科(Tropaeolaceae)，茄科(Solanaceae)，玄参科(Scrophulariaceae)，菊科(Asteraceae)，百合科(Liliaceae)，石蒜科(Amaryllidaceae)，禾本科(Poaceae)，兰科(Orchidaceae)，锦葵科(Malvaceae)，Illiaceae或唇形科(Lamiaceae)。

极特别优选的植物是选自以下一组的植物：金盏花(Marigold)，万寿菊，孔雀草，金合欢属(Acacia)，乌头属(Aconitum)，侧金盏花属(Adonis)，山金车属(Arnica)，耧斗菜属(Aquilegia)，紫菀属(Aster)，黄芪属(Astragalus)，紫葳属(Bignonia)，金盏花属(Calendula)，驴蹄草属(Caltha)，风铃草属(Campanula)，美人蕉属(Canna)，矢车菊属(Centaurea)，桂竹香属(Cheiranthus)，菊属(Chrysanthemum)，柑桔属(Citrus)，还阳参属(Crepis)，番红花属(Crocus)，南瓜属(Curcurbita)，金雀儿属(Cytisus)，Delonia，翠雀属(Delphinium)，石竹属(Dianthus)，异果菊属(Dimorphotheca)，多榔菊属(Doronicum)，花菱草属(Eschscholtzia)，连翘属(Forsythia)，佛里蒙特属(Fremontia)，杂色菊属(Gazania)，钩吻属(Gelsemium)，染料木属(Genista)，龙胆属(Gentiana)，老鹳草属(6eranium)，大丁草属(Gerbera)，水杨梅属(Geum)，银桦属(Grevillea)，堆心菊属(Helenium)，向日葵属(Helianthus)，獐耳细辛属(Hepatica)，独活属(Heracleum)，木槿属(Hibiscus)，赛菊芋属(Heliopsis)，金丝桃属(Hypericum)，毛耳菊属(Hypochoeris)，风仙花属(Impatiens)，鸢尾属(Iris)，兰花楹属(Jacaranda)，中国棣棠属(Kerria)，金链花属(Laburnum)，山黧豆属(Lathyrus)，蒲公英属(Leontodon)，百合属(Lilium)，亚麻属(Linum)，莲属(Lotus)，番茄属(Lycopersicon)，排草属(Lysimachia)，Maratia，苜蓿属(Medicago)，沟酸浆属(Mimulus)，水仙属(Narcissus)，月见草属(Oenothera)，木犀属(Osmanthus)，矮牵牛属(Petunia)，石楠属(Photinia)，酸浆属(Physalis)，牧根草属(Phyteuma)，委陵菜属(Potentilla)，火棘属(Pyracantha)，毛茛属(Ranunculus)，杜鹃花属(Rhododendron)，蔷薇属(Rosa)，金花菊属(Rudbeckia)，千里光属(Senecio)，麦瓶草属(Silene)，松香草属(Silphium)，Sinapsis，花楸属(Sorbus)，鹰爪豆属(Spartium)，黄钟花属(Tecoma)，蝴蝶草属(Torenia)，婆罗门参属(Tragopogon)，金莲花属(Trollius)，旱金莲属(Tropaeolum)，郁金香属(Tulipa)，款冬属(Tussilago)，荆豆属(Ulex)，堇菜属(Viola)或百日菊属(Zinnia)，特别优选选自以下一组植物金盏花，万寿菊，孔雀草，番茄属，蔷薇属，金盏花属，酸浆属，苜蓿属，向日葵属，菊属，紫菀属，郁金香属，水仙属，矮牵牛属，老鹳草属，旱金莲属或侧金盏花属。

在本发明制备酮类胡萝卜素的方法中，培养基因修饰生物步骤之后，优选进行生物的收获步骤，接下来还优选从生物中分离酮类胡萝卜素。

生物的收获要依据特定的生物使用公知的适宜方法进行。在液体营养基上发酵培养的微生物，如细菌、酵母、藻类或真菌，或者植物细胞，可以使用例如离心、倾析或过滤等方法分离。植物种植在营养基上，并用公知的适宜方法收获。

基因修饰微生物优选在氧存在的条件下，在至少大约20℃，比如20℃到40℃的培养温度下，以及pH值大约6到9的条件下培养。基因修饰微生物优选初始培养条件为有氧存在，复合培养基例如TB或LB培养基，培养温度大约20℃或更高，pH值大约6到9，一直培养到达到足够大的细胞密度。为了能够更好地控制氧化反应，优选使用可诱导的启动子。诱导酮酶表达后继续在氧存在的条件下培养例如12小时到3天时间。

通过已知的方法从收获的生物中分离酮类胡萝卜素，例如通过萃取，以及适宜的情况下进一步的化学或物理纯化方法，例如沉淀法、结晶法、热分离方法如精馏法或物理分离方法如层析法。

如以下所述，在本发明的基因修饰植物中生产酮类胡萝卜素，优选特异地在几种植物组织中进行，例如种子、叶、果实、花，特别是在花瓣中。

使用公知的方法从收获的花瓣中分离酮类胡萝卜素，例如烘干和随后的提取，以及适宜的情况下进一步的化学或物理纯化方法，例如沉淀法、结晶法、热分离方法如精馏法或物理分离方法如层析法。从花瓣中分离酮类胡萝卜素优选使用例如有机溶剂方法，如丙酮、己烷、乙醚或甲基叔丁基醚。

分离酮类胡萝卜素，特别是从花瓣中分离的更多方法，记载在例如Egger和Kleinig(Phytochemistry(1967)6，437-440)以及Egger(Phytochemistry(1965)4，609-618)中。

〔P21〕酮类胡萝卜素优选选自虾青素、角黄素、海胆酮、3-羟基海胆酮、3’-羟基海胆酮、金盏花红素(adonirubin)和金盏花黄质(adonixanthin)。

虾青素为特别优选的酮类胡萝卜素。

根据使用的生物不同，以自由状态或以脂肪酸酯的形式获得酮类胡萝卜素。

在植物花瓣中，本发明方法以脂肪酸的单酯或二酯的形式获得酮类胡萝卜素。已经检测到的脂肪酸的例子有豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸和月桂酸(Kamata and Simpson(1987)Comp.Biochem.Physiol.Vol.86B(3)，587-591)。

酮类胡萝卜素可以在整个植物体中产生，或者在优选的实施方式中，只在含色质体的特定植物组织中产生。优选的植物组织的例子有根、种子、叶、果实、花，特别是蜜腺和花瓣。

在本发明方法特别优选的实施方式中，使用在花中酮酶表达率最高的基因修饰植物。

这一目的优选通过使用花特异性启动子控制酮酶基因表达的方法实现。例如为实现此目的，将以上所述核酸引入植物中，如以下所详细叙述，将核酸置于与花特异性启动子功能性连接的核酸构建体中。

在本发明方法另一个特别优选的实施方式中，使用在果实中酮酶表达率最高的基因修饰植物。

这一目的优选通过使用果实特异性启动子控制酮酶基因表达的方法实现。例如为实现此目的，将以上所述核酸引入植物中，如以下所详细叙述，将核酸置于与果实特异性启动子功能性连接的核酸构建体中。

在本发明方法另一个特别优选的实施方式中，使用在种子中酮酶表达率最高的基因修饰植物。

这一目的优选通过使用种子特异性启动子控制酮酶基因表达的方法实现。例如为实现此目的，将以上所述核酸引入植物中，如以下所详细叙述，将核酸置于与种子特异性启动子功能性连接的核酸构建体中。

以色质体为目标可以通过功能性连接的质体转运肽来实现。

生成具有提高的或产生的酮酶活性的基因修饰植物的方法在以下实施例中叙述。其他活性，例如羟化酶活性和/或β-环化酶活性可以使用类似的方法提高，使用编码羟化酶或β-环化酶的核酸序列代替编码酮酶的核酸序列即可。转化可以通过单个基因修饰的组合或通过多个构建体来实现。

优选通过使用核酸构建体转化起始植物的方法生成转基因植物，所述核酸构建体包括如上所述的编码酮酶的核酸，其与一个或多个调节信号功能性连接，以确保在植物中可以转录和翻译。

这些核酸构建体，其中编码核酸序列与一个或多个调节信号功能性连接，以确保在植物中可以转录和翻译，以下也称为表达盒。

调节信号优选包括一个或多个启动子，确保在植物中可以转录和翻译。

表达盒包括调节信号，即控制宿主细胞中编码序列表达的调节性核酸序列。在优选的实施方式中，表达盒包括上游即编码序列5’端的启动子，和下游即3’端的多腺苷酸化信号，以及合适的情况下还存在与编码序列有效连接的更多调节元件，它位于以上所述的至少一个基因之间。有效连接是指启动子、编码序列、终止子以及合适的情况下还存在的更多调节元件的顺序排列方式使得每一调节元件均能在编码序列的表达中起到预定作用。

优选的植物核酸构建体、表达盒和载体，制备转基因植物的方法以及转基因植物本身，将在以下实施例中叙述。

有效连接使用的序列优选但不限于确保在质外体、液泡、质体、线粒体、内质网(ER)、细胞核、造油体和其他部位进行亚细胞定位的靶向序列，以及翻译增强子如来自烟草花叶病毒的5’前导序列(Gallie et al.，Nucl.Acids Res.15(1987)，8693-8711)。

表达盒的适宜的启动子原则上是任何能够控制植物中外来基因表达的启动子。

“组成型”启动子是指能够确保在植物多种组织中，优选全部组织中表达，在植物发育过程中相对较长时间，优选植物发育的所有阶段均表达的启动子。

特别优选使用植物启动子或植物病毒来源的启动子。特别优选花椰菜花叶病毒的35S转录物的CaMV启动子(Franck et al.(1980)Cell21：285-294；Odell et al.(1985)Nature 313：810-812；Shewmaker etal.(1985)Virology 140：281-288；Gardner et al.(1986)Plant MolBiol 6：221-228)，19S CaMV启动子(US 5，352，605；WO 84/02913；Benfeyet al.(1989)EMBO J 8：2195-2202)，来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)Acc.No.AB006698，碱基对53242到55281的丙糖磷酸易位体(TPT)启动子，从bp55282开始的基因被称为“磷酸/丙糖磷酸易位体”，或者来自玄参花叶病毒Acc.No.X16673，碱基对1到554的34S启动子。

更适合的组成型启动子是pds启动子(Pecker et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci USA 89：4962-4966)或rubisco小亚基(SSU)启动子(US 4,962,028)，豆球蛋白B启动子(GenBank Acc.No.X03677)，土壤杆菌胭脂碱合酶(agrobacterium nopaline synthase)启动子，TR双启动子，土壤杆菌OCS(真蛸碱合酶，octopine synthase)启动子，泛素(ubiquitin)启动子(Holtorf S et al.(1995)Plant Mol Biol29：637-639)，泛素1启动子(Christensen et al.(1992)Plant Mol Biol18：675-689；Bruce et al.(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86：9692-9696)，Smas启动子，肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase)启动子(US 5,633,439)，小麦中液泡ATP酶亚基(vacuolar ATPase subunit)启动子或富含脯氨酸蛋白(proline-rich protei n)启动子(WO 91/13991)，Pnit启动子(Y07648.L，Hillebrand et al.(1998)，Plant.Mol.Biol.36，89-99，Hillebrand et al.(1996)，Gene，170，197-200)和更多技术人员已知的在植物中组成型表达的基因启动子。

表达盒还可以包括化学诱导的启动子(综述文章：Gatz et al.(1997)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48：89-108)，由此，植物中的酮酶基因表达可以被控制在特定时间。同样可以使用这一类启动子，例如，PRPl启动子(Ward et al.(1993)Plant Mol Biol 22：361-366)，水杨酸诱导启动子(WO 95/19443)，苯磺酰胺诱导启动子(EP 0388186)，四环素诱导启动子(Gatz et al.(1992)Plant J 2：397-404)，脱落酸诱导启动子(EP 0335528)或乙醇或环已酮诱导启动子(WO 93/21334)。

更优选使用的启动子为受生物或非生物胁迫诱导的启动子，例如病原体诱导的PRPl基因启动子(Ward et al.(1993)Plant Mol Biol22：361-366)，热诱导的番茄hsp70或hsp80启动子(US 5,187,267)，冷诱导的马铃薯α-淀粉酶启动子(WO 96/12814)，光诱导的PPDK启动子或者损伤诱导的pinII启动子(EP375091)。

病原体诱导的启动子包括由于病原体入侵而诱导的基因的启动子，例如RP蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等的基因。例如Redolfi等(1983)Neth J Plant Pathol 89：245-254；Uknes等(1992)The PlantCell 4：645-656；Van Loon(1985)Plant Mol Viral 4：111-116；Marineau等(1987)Plant Mol Biol 9：335-342；Matton等(1987)MolecularPlant-Microbe Interactions 2：325-342；Somssich等(1986)Proc NatlAcad Sci USA 83：2427-2430；Somssich等(1988)Mol Gen Genetics2：93-98；Chen等(1996)Plant J 10：955-966；Zhang和Sing(1994)ProcNatl Acad Sci USA 91：2507-2511；Warner等(1993)Plant J 3：191-201；Siebertz等(1989)Plant Cell 1：961-968(1989).

同时也包括损伤诱导的启动子，如pinII基因启动子(Ryan(1990)AnnRev Phytopath 28：425-449；Duan etal.(1996)Nat Biotech14：494-498)，wun1和wun2基因启动子(US 5,428,148)，win1和win2基因启动子(Stanford et al.(1989)Mol Gen Genet 215：200-208)，系统素(systemin)基因启动子(McGurl et al.(1992)Sci ence255：1570-1573)，WIP1基因启动子(Rohmeier et al.(1993)Plant MolBiol 22：783-792；Ekelkamp et al.(1993)FEBS Letters 323：73-76)，MPI基因启动子(Corderok et al.(1994)The Plant J 6(2)：141-150)等。

更适宜的启动子的例子是果实成熟特异性启动子，例如番茄果实成熟特异性启动子(WO 94/21794，EP 409625)。发育依赖的启动子包括一些组织特异性启动子，因为一些组织的形成自然要依赖于发育。

进一步特别优选的启动子是确保在植物组织或某部分中表达的启动子，例如，在这些部位进行酮类胡萝卜素或其前体的生物合成。优选的例子为对花药、子房、花瓣、萼片、花、叶、茎、种子和根和其组合有特异性的启动子。

对块茎、贮藏根或根有特异性的启动子的例子有patatin classI启动子(B33)或马铃薯组织蛋白酶D抑制启动子。

对叶有特异性的启动子的例子有马铃薯胞质FBP酶(cytosolicFBPase)启动子(WO 97/05900)，rubisco(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶)SSU启动子(小亚基)或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等(1989)EMBO J8：2445-2451)。

对花有特异性的启动子的例子有八氢番茄红素合酶启动子(WO 92/16635)或P-rr基因启动子(WO 98/22593)，拟南芥AP3启动子(参见实施例5)，CHRC启动子(色质体特异性与类胡萝卜素有关的蛋白(CHRC)基因启动子，来自黄瓜(Cucumis sativus)Acc.No.AF099501，碱基对1到1532)，EPSP合酶启动子(5-烯醇基丙酮基莽草酸酯-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate)合酶基因启动子，来自碧冬茄(Petunia hybrida)，Acc.No.M37029，碱基对1到1788)，PDS启动子(八氢番茄红素去饱和酶启动子，来自番茄(Solanum lycopersicum)，Acc.No.U46919，碱基对1到2078)，DFR-A启动子(二氢黄酮醇4-还原酶基因A启动子，来自碧冬茄，Acc.No.X79723，碱基对32到1902)或FBP1启动子(成花结合蛋白(floral binding protein)1基因启动子，来自碧冬茄，Acc.No.L10115，碱基对52到1069)。

对花药有特异性的启动子的例子有5126启动子(US 5,689,049，US 5,689,051)，glob-1启动子或g-zein启动子。

对种子有特异性的启动子的例子有ACP05启动子(酰基转运蛋白基因，WO 9218634)，拟南芥属(Arabidopsis)AtS1和AtS3启动子(WO 9920775)，蚕豆(Vicia faba)LeB4启动子(WO 9729200和US 06403371)，油菜(Brassica napus)napin启动子(US 5608152；EP 255378；US 5420034)，蚕豆SBP启动子(DE 9903432)或玉米End1和End2启动子(WO 0011177)。

更多适合在植物中表达的启动子记载在Rogers等(1987)Meth inEnzymol 153：253-277；Schardl等(1987)Gene 61：1-11和Berger等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86：8402-8406.

本发明方法中特别优选的启动子是组成型、种子特异性、果实特异性、花特异性、特别是花瓣特异性启动子。

因此，本发明特别涉及一种核酸构建体，包括功能性连接的花特异性或者特别是花瓣特异性启动子，以及一编码酮酶的核酸，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

优选制备表达盒的方法是通过将合适的启动子与如上所述编码酮酶的核酸融合，并且优选与插在启动子和核酸序列之间的编码质体特异性转运肽的核酸融合，并且与多腺苷酸化信号融合，以上均使用常规重组和克隆技术，记载在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman and L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1984)和Ausubel，F.M.et al.，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.andWiley-Interscience(1987).

优选插入的编码质体转运肽的核酸负责在质体中，特别是在色质体中的定位。

也可以使用另一种表达盒，其核酸序列编码酮酶融合蛋白，融合蛋白的一部分为控制多肽迁移的转运肽。该转运肽对色质体有特异性，在酮酶被迁移入色质体内后，由酶将转运肽部分从酮酶部分除去。

特别优选的转运肽来源于烟草(Nicotiana tabacum)质体转酮酶(plastid transketolase)或其他转运肽(如rubisco小亚基(rbcS)转运肽或铁氧还蛋白NADP+氧化还原酶转运肽，还有异戊烯-焦磷酸异构酶2转运肽)或其功能性等价物。

特别优选具有三个表达盒的核酸序列，其中包括三个读框中的烟草质体转酮酶的质体转运肽，即在Ncol裂解位点带有ATG密码子的KpnI/BamHI片段：

pTP09

KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGT

TCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCC

GGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCC

GCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACT

GAGACTGCGGGATCC_BamHI

pTP10

KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGT

TCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCC

GGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCC

GCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACT

GAGACTGCGCTGGATCC_BamHI

pTP11

KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGT

TCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCC

GGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCC

GCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACT

GAGACTGCGGGGATCC_BamHI

质体转运肽的更多例子有拟南芥质体异戊烯-焦磷酸异构酶2(IPP-2)转运肽，以及核酮糖二磷酸羧化酶(rbcS)小亚基转运肽，其来源于豌豆(Guerineau，F，Woolston，S，Brooks，L，Mullineaux，P(1988)Anexpression cassette for targeting foreign proteins into thechloroplasts.Nucl.Acids Res.16：11380)。

本发明的核酸可以用合成方法制备或由天然途径获得，或者包括合成的和天然的核酸组分的混合，并且由来自不同生物的多种异源基因组成。

如上所述，优选合成核苷酸序列，带有优选的植物密码子。这些优选的植物密码子可以从在大多数感兴趣的植物物种中表达频率最高的蛋白的密码子识别。

为制备表达盒，可以操纵不同的DNA片段以使获得的核苷酸序列以正确的方向方便地阅读，并且具有正确的读框。接头或连接序列附加于片段上，以使DNA片段互相连接。

启动子和终止子区可以而且是很方便地在转录方向提供连接序列或多连接序列，其包括一个或多个限制位点，以插入此序列。连接序列一般具有1到10，通常1到8，优选2到6个限制位点。连接序列在调节区内，小于100bp，常常小于60bp，但至少5bp。对宿主植物来说，启动子既可以是自身或同源的，也可以是外来或异源的。表达盒优选包括，以5’-3’的转录方向，编码核酸序列或核酸构建体，和转录终止区。各种终止区必要时可以互换。

终止子的例子有35S终止子(Guerineau et al.(1988)Nucl Acids Res.16：11380)，nos终止子(Depicker A，Stachel S，Dhaese P，Zambryski P，Goodman HM.Nopal ine synthase：transcript mapping and DNA sequence.J Mol Appl Genet.1982；1(6)：561-73)或ocs终止子(Gielen，J，deBeuckeleer，M，Seurinck，J，Debroek，H，de Greve，H，Lemmers，M，vanMontagu，M，Schell，J(1984)The complete sequence of the TL-DNA ofthe Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiAch5.EMBO J.3：835-846)。

还可以通过操纵提供恰当的限制酶切位点或去除冗余DNA或限制酶切位点。关于插入、缺失或替换，例如转换和颠换，可使用体外诱变、引物修复、限制或连接。

可以通过使用恰当的操纵，例如，限制、回咀嚼(chewing back)或填充平端的突出(overhang)，为连接片段提供互补性末端。

优选的多腺苷酸化信号为植物多腺苷酸化信号，优选与来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA多腺苷酸化信号基本对应的多腺苷酸化信号，特别优选Ti质粒pTiACH5的T-DNA(真蛸碱合酶)的基因3的多腺苷酸化信号(Gielen et al.，EMBO J.3(1984)，835ff)或其功能性等价物。

外来基因进入植物基因组被称为转化。

为此目的可以使用公知的从植物组织或植物细胞转化和再生植物的方法，以实现瞬时或稳定转化。

合适的转化植物的方法有通过聚乙烯乙二醇诱导的DNA摄取进行的原生质体转化，使用基因枪的生物弹法(biolistic method)——叫做粒子轰击法——电穿孔，含DNA溶液的干胚胎保温法，微注射，以及由以上所述土壤杆菌介导的基因迁移。所述方法记载在例如B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，in：Transgenic Plants，Vol.1，Engineering and Utilization，编著者：S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)，128-143和Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMolec.Biol.42(1991)，205-225。

要表达的构建体优选克隆在适合转化根癌土壤杆菌的载体上，例如pBinl9(Bevan et al.，Nucl.Acids Res.12(1984)，8711)或者特别优选地，pSUN2，pSUN3，pSUN4或pSUN5(WO 02/00900)。

表达质粒转化的土壤杆菌可以公知的方式用于转化植物，如将损伤的叶或叶碎片浸泡在土壤杆菌溶液中，然后在合适的培养基上培养。

优选制备基因修饰植物(下文也称转基因植物)的方法，是将可表达酮酶的融合表达盒克隆到载体中，如pBin19或者特别是pSUN5和pSUN3，这些载体适合转化进入根癌土壤杆菌。用这样的载体转化的土壤杆菌然后可以公知的方式用于转化植物，特别是作物植物，方法是通过将损伤的叶或叶碎片浸泡在土壤杆菌溶液中，然后在合适的培养基上培养。

土壤杆菌转化植物的方法公开在如F.F.White，Vectors for GeneTransfer in Higher Plants；Transgenic Plants，Vol.1，Engineeringand Utilization，编著者：S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，15-38页。从损伤的叶或叶碎片的转化细胞可以公知的方式再生转基因植物，该转基因植物包括一基因，嵌入表达盒中促使编码酮酶的核酸的表达。

为了用编码酮酶的核酸转化宿主细胞，将表达盒引入并插入重组载体中，其载体DNA包括另外的功能调节信号，如复制或整合序列。合适的载体记载在如”Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology”(CRC Press)，6/7章，71-119页(1993).

使用以上引用的重组和克隆技术，可将表达盒克隆到合适的载体中，可使其有可能在例如大肠杆菌中复制。合适的克隆载体有pJIT117(Guerineau et al.(1988)Nucl.Acids Res.16：11380)，pBR322，pUC系列，M13mp系列和pACYC184。能在大肠杆菌和土壤杆菌中复制的二元载体尤其适合。

制备本发明基因修饰微生物的方法将在以下详细叙述：

以上所述的编码酮酶或羟化酶或β-环化酶的核酸，优选整合进入表达构建体中，所述表达构建体包括，在调节性核酸序列的遗传控制之下的编码本发明的酶的核酸序列和包括至少这些表达构建体之一的载体。

本发明的此构建体优选包括上游即特定编码序列5’端的启动子，和下游即在3’端的终止子序列，以及合适的情况下存在的更多常见调节元件，这些元件在每种情况下均与编码序列有效连接。有效连接是指启动子、编码序列、终止子以及合适的情况下存在的其他调节元件的顺序排列方式使得每一调节元件均能在编码序列的表达中起到预定作用。

有效连接序列的例子有靶向序列和翻译增强子，多腺苷酸化信号等。更多调节元件包括选择标记、扩增信号、复制起点等。

除了人工调节序列，天然调节序列也可能存在于实际结构基因之前。这种天然调节可以通过基因修饰在合适的时候切断，可以引起基因表达的增强或减弱。然而这种基因构建体可以有更简单的结构，也就是说，没有附加的调节信号插在结构基因之前，没有去除天然启动子及其调节。相反地，天然调节序列产生突变，以致调节不复存在，基因表达增强或减弱。核酸序列可以在基因构建体中存在一个或多个拷贝。

可以使用的启动子的例子有cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λPL启动子，这些启动子最适合用于格兰氏阴性细菌；格兰氏阳性细菌启动子amy和SP02，或者酵母启动子ADC1，MF，AC，P-60，CYC1，GAPDH。特别优选使用可诱导启动子，如光诱导，特别是，温度诱导启动子，如PrP1启动子。

原则上可以使用所有本身带有调节序列的天然启动子。另外，也可能使用合成启动子有更大的优越性。

所述调节序列可以使特定的核酸序列的表达和蛋白表达成为可能。这可以指，例如，根据宿主生物不同，只在诱导之后基因被表达或过度表达，或者立刻表达和/或过度表达。

调节序列或因子还可以优选地正面影响表达，即增强或减弱表达。因此通过使用强转录信号如启动子和/或增强子，在转录水平上可能发生有益的调节元件增强。然而也可以使翻译增强，例如通过提高mRNA的稳定性。

制备表达盒的方法是通过将合适的启动子与如上所述的编码酮酶、β-羟化酶或β-环化酶的核酸序列融合，以及与终止子信号或多腺苷酸化信号融合。为此目的可使用常规重组和克隆技术，记载在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman and L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusiohs，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)。

为了在合适的宿主生物中表达，重组核酸构建体或基因构建体优选插入宿主特异性载体中，这可以使基因在宿主中最理想地表达。技术人员均熟知这些载体，也可以在例如以下文献中找到：″Cloning Vectors″(Pouwels P.H.et al.，eds，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)。同时，载体不仅仅指质粒，也指技术人员熟知的所有其他载体，例如噬菌体，病毒如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒，转座子，IS元件，噬粒，粘粒，以及线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自身复制或通过染色体复制。

可以提到的合适的表达载体的例子有：

常规融合表达载体，例如pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.and Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)，pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，谷胱苷肽S-转移酶(GST)，麦芽糖E-结合蛋白和蛋白A分别通过这些载体与重组目标蛋白融合。

非融合蛋白表达载体如pTrc(Amann et al.，(1988)Gene 69：301-315)和pET 11d(Studier et al.Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89).

在啤酒酵母(S.cerevisiae)中表达的酵母表达载体，如pYepSecl(Baldari et al.，(1987)Embo J.6：229-234)，pMF(Kurjan andHerskowitz(1982)Cell 30：933-943)，pJRY88(Schultz et al.(1987)Gene 54：113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA).

构建可用于其他真菌如丝状真菌的载体的载体和方法，包括以下文献中所详细记载的：van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)“Genetransfer systems and vector development for filamentous fungi，见：Applied Molecular Genetics of Fungi，J.F.Peberdy et al.，eds，pp.1-28，Cambridge University Press：Cambridge。

可用于在培养的昆虫细胞(如Sf9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith et al.，(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow and Summers(1989)Virology 170：31-39)。

更多合适的原核细胞和真核细胞表达系统记载在以下文献第16和17章：Sambrook，J.，Fritsch，E.F和Maniatis，T.，Molecular cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989。

本发明的表达构建体或载体可用于制备基因修饰微生物，该微生物被例如本发明的至少一个载体转化。

如上所述本发明的重组构建体优选引入合适的宿主系统中表达。优选使用技术人员熟悉的克隆和转染方法，例如，共沉淀、原生质体融合、电穿孔、反转录病毒转染等，以使所述核酸在特定表达系统中表达。合适的系统记载在例如Current Protocols in Molecular Biology，F.Ausubelet al.，eds，Wiley Interscience，New York 1997。

成功转化的生物可通过同样存在于载体或表达盒中的标记基因来筛选。此类标记基因的例子有产生抗生素抗性的基因，以及催化颜色形成反应的酶的基因，此反应可使转化的细胞着色。然后通过自动细胞分类来筛选。

被载体成功转化并且具有适当的抗生素抗性基因(如G418或潮霉素)的微生物，可通过适当的含抗生素培养基或营养培养基筛选。细胞表面存在的标记蛋白可用于亲和层析法筛选。

宿主生物和适于该生物的载体(如质粒、病毒或噬菌体)的组合形成表达系统，例如，质粒同RNA聚合酶/启动子系统，噬菌体8或其他温和噬菌体或转座子和/或其他较佳调节序列。

本发明进一步涉及制备基因修饰生物的方法，包括在起始生物的基因组中或染色体外引入核酸构建体，该构建体包括功能性连接的启动子、编码酮酶的核酸，合适的情况下还包括终止子，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

本发明进一步涉及基因修饰生物，其中

A、如果野生型生物已经具有酮酶活性，基因修饰导致与野生型相比酮酶活性提高，和

B、如果野生型生物不具有酮酶活性，基因修饰导致产生酮酶活性，

并且A中提高的酮酶活性或B中产生的酮酶活性是由酮酶引起的，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

如上所述，与野生型相比，酮酶活性的提高或产生是由于编码酮酶的核酸的基因表达的增强或产生引起的，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

在进一步优选的实施方式中，如上所述，编码酮酶的核酸的基因表达的增强或产生是通过将编码酮酶的核酸引入植物中实现的，并且优选编码酮酶的核酸的过度表达或转基因表达，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

本发明进一步涉及包括至少一个编码酮酶的转基因核酸的基因修饰生物，其中所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。起始生物没有酮酶或内源性酮酶，转基因酮酶过度表达时属于这种情况。

本发明进一步涉及包括至少两个编码酮酶的内源性核酸的基因修饰生物，其中所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。起始生物具有内源性酮酶，并且内源性酮酶过度表达时属于这种情况。

如上所述，特别优选的基因修饰生物与野生型生物相比，另外具有提高的羟化酶活性和/或β-环化酶活性。进一步优选的实施方式在以上本发明方法中记载。

生物优选指根据本发明，作为野生型或起始生物天然地，或通过遗传互补和/或代谢途径再调节能够产生类胡萝卜素，特别是β-胡萝卜素和/或玉米黄质和/或新黄质和/或紫黄质和/或黄体素的生物。

进一步优选的生物作为野生型或起始生物已经具有羟化酶活性，因此作为野生型或起始生物能够产生玉米黄质。

优选的生物为植物或微生物，例如细菌、酵母、藻类或真菌。

可以使用的细菌包括两类，一类是由于引入来源于可产生类胡萝卜素的生物的类胡萝卜素生物合成基因而能够合成叶黄素的细菌，例如，埃希氏菌属的细菌，其中包括例如来源于欧文氏菌属的crt基因；另一类是原本即能合成叶黄素的细菌，例如欧文氏菌属，土壤杆菌属，黄杆菌属，产碱菌属，副球菌属，念珠蓝细菌属的细菌或集胞蓝细菌属的蓝细菌。

优选的细菌为大肠杆菌，草生欧文氏菌，噬夏孢欧文氏菌，Agrobacterium aurantiacum，产碱菌属种PC-1，黄杆菌属菌株R1534，蓝细菌集胞蓝细菌PCC6803，Paracoccus marcusii或Paracoccuscarotinifaciens.

优选的酵母为假丝酵母属，酵母属，汉逊酵母属，毕赤酵母属或发夫酵母属。特别优选的酵母为Xanthophyllomyces dendrorhous或红发夫酵母。

优选的真菌为曲霉菌属，木霉菌属，Ashbya，链孢霉属，布拉霉菌属，须霉属，镰胞菌属或者记载在Indian Chem.Engr.SectionB.Vol.37，No.1，2(1995)15页表6中的其他真菌。

优选的藻类为绿色藻类，例如红球藻属，Phaedactylum tricornatum，团藻属或Dunaliell的藻类。特别优选的藻类为雨生红球藻或杜氏藻属巴德威藻。

可用于实施本发明方法的更多微生物及其制备公开在例如DE-A-19916140，该文献以参考文献的形式引入本文。

特别优选的植物是选自以下科的植物：毛茛科，小檗科，罂粟科，大麻科，蔷薇科，蝶形花科，亚麻科，葡萄科，十字花科，葫芦科，报春花科，石竹科，苋科，龙胆科，牻牛儿苗科，忍冬科，木犀科，金莲花科，茄科，玄参科，菊科，百合科，石蒜科，禾本科，兰科，锦葵科，Illiaceae或唇形科。

极特别优选的植物是选自以下一组的植物：金盏花，万寿菊，孔雀草，金合欢属，乌头属，侧金盏花属，山金车属，耧斗菜属，紫菀属，黄芪属，紫葳属，金盏花属，驴蹄草属，风铃草属，美人蕉属，矢车菊属，桂竹香属，菊属，柑桔属，还阳参属，番红花属，南瓜属，金雀儿属，Delonia，翠雀属，石竹属，异果菊属，多榔菊属，花菱草属，连翘属，佛里蒙特属，杂色菊属，钩吻属，染料木属，龙胆属，老鹳草属，大丁草属，水杨梅属，银桦属，堆心菊属，向日葵属，獐耳细辛属，独活属，木槿属，赛菊芋属，金丝桃属，毛耳菊属，凤仙花属，鸢尾属，兰花楹属，中国棣棠属，金链花属，山黧豆属，蒲公英属，百合属，亚麻属，莲属，番茄属，排草属，Maratia，苜蓿属，沟酸浆属，水仙属，月见草属，木犀属，矮牵牛属，石楠属，酸浆属，牧根草属，委陵菜属，火棘属，毛茛属，杜鹃花属，蔷薇属，金花菊属，千里光属，麦瓶草属，松香草属，Sinapsis，花楸属，鹰爪豆属，黄钟花属，蝴蝶草属，婆罗门参属，金莲花属，旱金莲属，郁金香属，款冬属，荆豆属，堇菜属或百日菊属，特别优选选自以下一组植物金盏花，万寿菊，孔雀草，番茄属，蔷薇属，金盏花属，酸浆属，苜蓿属，向日葵属，菊属，紫菀属，郁金香属，水仙属，矮牵牛属，老鹳草属，旱金莲属或侧金盏花属。

极特别优选的基因修饰植物选自植物金盏花，万寿菊，孔雀草，侧金盏花属，番茄属，蔷薇属，金盏花属，酸浆属，苜蓿属，向日葵属，菊属，紫菀属，郁金香属，水仙属，矮牵牛属，老鹳草属或旱金莲属，这些基因修饰植物包括至少一个编码酮酶的转基因核酸。

本发明进一步涉及转基因植物，其增殖材料，以及其植物细胞，组织或部分，特别是其果实、种子、花和花瓣。

如上所述，基因修饰植物可用于制备酮类胡萝卜素，特别是虾青素。

本发明可被人或动物食用的基因修饰生物，特别是植物或植物的一部分，特别是花瓣，其中酮类胡萝卜素(特别是虾青素)含量提高，还可直接作为或以公知的方式加工后作为人或动物的食品，或作为人和动物的食品增补剂。

基因修饰生物还可用于制备含酮类胡萝卜素的生物提取物，和/或制备人和动物的食品增补剂。

基因修饰生物与野生型相比，其酮类胡萝卜素含量提高。

酮类胡萝卜素含量提高通常指酮类胡萝卜素的总含量提高。

然而，酮类胡萝卜素含量提高也特别指优选的酮类胡萝卜素的含量改变，无需类胡萝卜素的总含量提高。

在特别优选的实施方式中，本发明的基因修饰植物与野生型相比，虾青素的含量提高。

这种情况下所述的含量提高也指新出现的酮类胡萝卜素如虾青素。

本发明进一步涉及新酮酶，以及编码新酮酶的新核酸。

本发明特别涉及一种酮酶，包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少70％相同，优选至少75％，特别优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％相同，条件为不存在氨基酸序列SEQ.ID.NO.2。如上所述的序列SEQ.ID.NO.2在数据库中被注释为推测蛋白(putative protein)。

本发明进一步涉及一种酮酶，包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.4，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.4相比在氨基酸水平上至少70％相同。如上所述的序列SEQ.ID.NO.4在数据库中没有注释。

本发明进一步涉及编码如上所述蛋白的核酸，条件为该核酸不包括序列SEQ.ID.NO.1或3。

一种蛋白，包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少70％相同，优选至少75％，特别优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％相同，并且该序列具有酮酶属性，这种蛋白很意外地被发现具有作为酮酶的属性。

因此，本发明也涉及一种蛋白作为酮酶的应用，所述蛋白包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少70％相同，优选至少75％，特别优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％相同，并且具有酮酶属性。

一种蛋白，包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.4，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.4相比在氨基酸水平上至少65％相同，优选至少70％，优选至少75％，特别优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％相同，并且该序列具有酮酶属性，这种蛋白很意外地被发现具有作为酮酶的属性。

因此，本发明也涉及一种蛋白作为酮酶的应用，所述蛋白包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.4，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.4相比在氨基酸水平上至少65％相同，优选至少70％，优选至少75％，特别优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％相同，并且具有酮酶属性。

与现有工艺方法相比，本发明方法提供更大量的酮类胡萝卜素，特别是虾青素。

本发明通过下列实施例解释，但不限于此：

实施例1：

cDNA扩增，其编码来源于点型念珠蓝细菌PCC73102 ORF 38，contig501(SEQ ID NO：1)和ORF 148，contig 502(SEQ ID NO：3)的酮酶的全部一级序列。

使用溶菌酶(2mg/ml)裂解点型念珠蓝细菌细胞，根据厂商说明在GenElute Plant genomic DNA kit(Sigma)的帮助下分离基因组DNA。

然后扩增点型念珠蓝细菌基因组DNA的ORF148(762bp)，扩增时使用引物148-Start(SEQID NO：9；5‘ATG ATC CAG TTA GAA CAA CCA C-3‘)和148-End(SEQ ID NO：10；5‘CTA TTT TGC TTT GTA AAT TTC TGG-3‘)，退火温度60℃，进行30个循环。

使用引物38-Start(SEQ ID NO：11；5‘ATG AAT TTT TGT GAT AAA CCAGTT AG-3‘)和38-End(SEQ ID NO：12；5‘ACG AAT TGG TTA CTG AAT TGTTG-3‘)扩增ORF38。

PCR片段经亚克隆进入XcmI-cut载体pMON 38201(Borokov，A.Y.andRivkin，M.I.(1997)XcmI containing vector for direct cloning ofpcr products.BioTech.22，812-814)。

将连接产物转化进入XL1 blue MRF1′之后通过蓝白筛选选择阳性克隆。分离出的质粒使用HindIII切割以检测PCR扩增子是否克隆进入T突出载体(T overhang vector)。对选择的克隆进行测序表明，pMONT-148中的ORF148和pMONT-38中的ORF38的方向均与载体阅读方向相反。可以使用HindIII切下插入片段，因为T突出载体不仅在多位点接头有HindIII酶切位点，还会在多位点接头插入时生成另一个酶切位点。

实施例2：

制备表达载体以在宿主生物中表达点型念珠蓝细菌PCC73102酮酶ORF148和ORF38。

使用HindIII对pMONT148和pMONT38限制消化之后，产生的DNA插入片段克隆进入pPQE32载体(Qiagen，Hilden；按以下文献略作调整：Verdoes，J.，Krubasik，P.，Sandmann，G.&van Ooyen，M.(1999)Isolation and functional characterisation of a novel type ofcarotenoid biosynthetic gene from Xanthophyllomyces dendrorhous.Molec.Gen.Genet.262，453-461)，该载体同样已经被HindIII消化并脱去磷酸。

转化进入XL1MRF1′之后所获得的克隆，使用引物QEF(5‘CCC TTT CCTCTT CTC-3‘)和148-end或38-end，通过测试PCR(check PCR)的方法检测。对相应克隆进行测序表明ORF148和ORF38已经被克隆进入pPQE32载体框内。通过这种途径获得的质粒在图2B和2C中示出。图2表示从pPQE32(A.)构建pPQE32-ORF 148(B.)和pPQE32-ORF 38(C.)。

实施例3：

在能够产生β-胡萝卜素和玉米黄质的大肠杆菌菌株中表达点型念珠蓝细菌PCC73102酮酶ORF148和ORF38，并分析类胡萝卜素曲线

3.1.在能够产生β-胡萝卜素的大肠杆菌菌株中表达点型念珠蓝细菌PCC73102酮酶ORF148和ORF38

为确定ORF148和ORF38形成的基因产物的功能特性，将构建体pPQE32-148和pPQE32-38转化进入能够产生β-胡萝卜素的大肠杆菌转化体JM101/pACCAR16crtX中(Misawa，N.，Satomi，Y.，Kondo，K.，Yokoyama，A.，Kajiwara，S.，Saito，T.Ohtani，T.&Miki，W.(1995)Structureand functional analysis of a marine bacterial carotenoidbiosynthesis gene cluster and astaxanthin biosynthetic pathwayproposed at the gene level.J.Bacteriol.22，6575-6584)。

转化体在50ml LB培养基中，28℃暗处培养16到48小时。使用甲醇提取类胡萝卜素，加入50％乙醚/石油醚摇动所获得的提取物使用HPLC分馏(柱HypurityC18，流动相：乙腈/甲醇/2-丙醇85∶10∶5，温度32℃)。使用二级管阵列检测器在线记录波谱，根据吸收峰并与标准对比可识别类胡萝卜素。

如图3A所示pPQE32-38和图3B所示pPQE32-148，除了初始底物β-胡萝卜素外，在两种提取物中都可以检测到酮类胡萝卜素海胆酮和角黄素(在没有pPQE32-38或pPQE32-148的对照组中，只发现β-胡萝卜素没有发现酮类胡萝卜素)。

类胡萝卜素总含量中产生的角黄素(二酮基化合物)的比例，在pPQE32-148互补组为81％，在pPQE32-38互补组为40％。两种互补组中，海胆酮的比例均为4％左右。

3.2.在能够产生玉米黄质的大肠杆菌菌株中表达点型念珠蓝细菌PCC73102酮酶ORF148和ORF38

为了研究由ORF148和ORF38编码的酮酶能够合成酮类胡萝卜素虾青素的程度，将pPQE32-38(图3C)和pPQE32-148(图3D)转化进入能够产生玉米黄质的大肠杆菌转化体JM101/pACCAR25crtX中(Misawa，N.，Satomi，Y.，Kondo，K.，Yokoyama，A.，Kajiwara，S.，Saito，T.Ohtani，T.&Miki，W.(1995)Structure and functional analysis of a marinebacterial carotenoid biosynthesis gene cluster and astaxanthinbiosynthetic pathway proposed at the gene level.J.Bacteriol.22，6575-6584)。

转化体的培养，类胡萝卜素的提取和HPLC分离均按照3.1中所述步骤进行。从pPQE32-38互补组得到的提取物中只检测到初始底物玉米黄质和β-胡萝卜素，分别占类胡萝卜素总含量的85％和5％，pPQE32-148互补组提取物中，主要有酮类胡萝卜素海胆酮、角黄素和虾青素。虾青素占类胡萝卜素总含量的比例为50％。虾青素合成的中间体海胆酮和角黄素分别占类胡萝卜素总量的12％和8％。β-胡萝卜素的比例大约为30％。

图3表示在能够产生β-胡萝卜素的大肠杆菌中使用pPQE32-38(A)或pPQE32-148(B)转化的互补组中获得的类胡萝卜素，以及在能够产生玉米黄质的大肠杆菌中使用pPQE32-38(C)或pPQE32-148(D)转化的互补组中获得的类胡萝卜素的HPLC分离情况。

使用共同色谱分析法，通过对比物质及其波谱，所述类胡萝卜素被识别为：

1角黄素

2海胆酮

3β-胡萝卜素

4玉米黄质

5虾青素

6β-隐黄质(β-Cryptoxanthin)

7链孢红素(Neurosporin)

1‘，3‘，4‘和5‘表示相应的顺式异构体。

                   序列表

<110>BASF 公司

<120>通过培养基因修饰生物制备酮类胡萝卜素的方法

<130>AE 20020904

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>789

<212>DNA

<213>念珠蓝细菌属种 PCC73102

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(789)

<223>

<400>1

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Leu Asn Phe Cys Asp Lys Pro Val Ser Tyr Tyr Val Ala Ile Glu Gln

1               5                   10                  15

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Leu Ser Ala Lys Glu Asp Thr Val Trp Gly Leu Val Ile Val Ile Val

            20                  25                  30

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        35                  40                  45

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    50                  55                  60

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            100                 105                 110

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        115                 120                 125

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            180                 185                 190

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        195                 200                 205

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    210                 215                 220

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225                 230                 235                 240

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                245                 250                 255

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Ash Ser Val Thr Asn Ser

            260

<210>2

<211>262

<212>PRT

<213>念珠蓝细菌属种 PCC73102

<400>2

Leu Asn Phe Cys Asp Lys Pro Val Ser Tyr Tyr Val Ala Ile Glu Gln

1               5                   10                  15

Leu Ser Ala Lys Glu Asp Thr Val Trp Gly Leu Val Ile Val Ile Val

            20                  25                  30

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        35                  40                  45

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    50                  55                  60

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65                  70                  75                  80

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                85                  90                  95

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            100                 105                 110

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        115                 120                 125

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    130                 135                 140

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145                 150                 155                 160

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                165                 170                 175

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        195                 200                 205

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            260

<210>3

<211>762

<212>DNA

<213>念珠蓝细菌属种 PCC73102

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(762)

<223>

<400>3

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1               5                   10                  15

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    50                  55                  60

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                245                 250

<210>4

<211>253

<212>PRT

<213>念珠蓝细菌属种PCC73102

<400>4

Val Ile Gln Leu Glu Gln Pro Leu Ser His Gln Ala Lys Leu Thr Pro

1               5                   10                   15

Val Leu Arg Ser LyS Ser Gln Phe Lys Gly Leu Phe Ile Ala Ile Val

            20                  25                  30

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        35                  40                  45

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    50                  55                  60

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                85                  90                  95

Leu Thr Leu Ser Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Gln Lys Leu Leu Lys

            100                 105                 110

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        115                 120                 125

Phe His Asn Gly Lys His Gln Ser Phe Phe Ala Trp Tyr Phe His Phe

    130                 135                 140

Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln Ile Ile Ala Leu Thr Ile Ile

145                 150                 155                 160

Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr Ile Leu His Ile Pro Ser Asp Asn Leu Thr

                165                 170                 175

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            180                 185                 190

Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Ile Gly Gly Tyr Val Gln

        195                 200                 205

Pro His Cys Ala Gln Thr Ile Ser Arg Pro Ile Trp Trp Ser Phe Ile

    210                 215                 220

Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His Glu Tyr Pro His

225                 230                 235                 240

Ile Ser Trp Trp Gln Leu Pro Glu Ile Tyr Lys Ala Lys

                245                 250

<210>5

<211>1608

<212>DNA

<213>雨生红球藻

<220>

<221>CDS

<222>(3)..(971)

<223>

<400>5

Ct aca ttt cac aag ccc gtg agc ggt gca agc gct ctg ccc cac atc   47

   Thr Phe His Lys Pro Val Ser Gly Ala Ser Ala Leu Pro His Ile

   1               5                   10                  15

ggc cca cct cct cat ctc cat cgg tca ttt gct gct acc acg atg ctg   95

Gly Pro Pro Pro His Leu His Arg Ser Phe Ala Ala Thr Thr Met Leu

                20                  25                  30

tcg aag ctg cag tca atc agc gtc aag gcc cgc cgc gtt gaa cta gcc  143

Ser Lys Leu Gln Ser Ile Ser Val Lys Ala Arg Arg Val Glu Leu Ala

            35                  40                  45

cgc gac atc acg cgg ccc aaa gtc tgc ctg cat gct cag cgg tgc tcg  191

Arg Asp Ile Thr Arg Pro Lys Val Cys Leu His Ala Gln Arg Cys Ser

        50                  55                  60

tta gtt cgg ctg cga gtg gca gca cca cag aca gag gag gcg ctg gga  239

Leu Val Arg Leu Arg Val Ala Ala Pro Gln Thr Glu Glu Ala Leu Gly

    65                  70                  75

acc gtg cag gct gcc ggc gcg ggc gat gag cac agc gcc gat gta gca  287

Thr Val Gln Ala Ala Gly Ala Gly Asp Glu His Ser Ala Asp Val Ala

80                  85                  90                  95

ctc cag cag ctt gac cgg gct atc gca gag cgt cgt gcc cgg cgc aaa  335

Leu Gln Gln Leu Asp Arg Ala Ile Ala Glu Arg Arg Ala Arg Arg Lys

                100                 105                 110

cgg gag cag ctg tca tac cag gct gcc gcc att gca gca tca att ggc  383

Arg Glu Gln Leu Ser Tyr Gln Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ser Ile Gly

            115                 120                 125

gtg tca ggc att gcc atc ttc gcc acc tac ctg aga ttt gcc atg cac  431

Val Ser Gly Ile Ala Ile Phe Ala Thr Tyr Leu Arg Phe Ala Met His

        130                 135                 140

atg acc gtg ggc ggc gca gtg cca tgg ggt gaa gtg gct ggc act ctc  479

Met Thr Val Gly Gly Ala Val Pro Trp Gly Glu Val Ala Gly Thr Leu

    145                 150                 155

ctc ttg gtg gtt ggt ggc gcg ctc ggc atg gag atg tat gcc cgc tat  527

Leu Leu Val Val Gly Gly Ala Leu Gly Met Glu Met Tyr Ala Arg Tyr

160                 165                 170                 175

gca cac aaa gcc atc tgg cat gag tcg cct ctg ggc tgg ctg ctg cac  575

Ala His Lys Ala Ile Trp His Glu Ser Pro Leu Gly Trp Leu Leu His

                180                 185                 190

aag agc cac cac aca cct cgc act gga ccc ttt gaa gcc aac gac ttg  623

Lys Ser His His Thr Pro Arg Thr Gly Pro Phe Glu Ala Asn Asp Leu

            195                 200                 205

ttt gca atc atc aat gga ctg ccc gcc atg ctc ctg tgt acc ttt ggc  671

Pne Ala Ile Ile Asn Gly Leu Pro Ala Met Leu Leu Cys Thr Phe Gly

        210                 215                 220

ttc tgg ctg ccc aac gtc ctg ggg gcg gcc tgc ttt gga gcg ggg ctg  719

Phe Trp Leu Pro Asn Val Leu Gly Ala Ala Cys Phe Gly Ala Gly Leu

    225                 230                 235

ggc atc acg cta tac ggc atg gca tat atg ttt gta cac gat ggc ctg  767

Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Met Ala Tyr Met Phe Val His Asp Gly Leu

240                 245                 250                 255

gtg cac agg cgc ttt ccc acc ggg ccc atc gct ggc ctg ccc tac atg  815

Val His Arg Arg Phe Pro Thr Gly Pro Ile Ala Gly Leu Pro Tyr Met

                260                 265                 270

aag cgc ctg aca gtg gcc cac cag cta cac cac agc ggc aag tac ggt  863

Lys Arg Leu Thr Val Ala His Gln Leu His His Ser Gly Lys Tyr Gly

            275                 280                 285

ggc gcg ccc tgg ggt atg ttc ttg ggt cca cag gag ctg cag cac att  911

Gly Ala Pro Trp Gly Met Pne Leu Gly Pro Gln Glu Leu Gln His Ile

        290                 295                 300

cca ggt gcg gcg gag gag gtg gag cga ctg gtc ctg gaa ctg gac tgg  959

Pro Gly Ala Ala Glu Glu Val Glu Arg Leu Val Leu Glu Leu Asp Trp

    305                 310                 315

tcc aag cgg tag ggtgcggaac caggcacgct ggtttcacac ctcatgcctg        1011

ser Lys Arg

320

tgataaggtg tggctagagc gatgcgtgtg agacgggtat gtcacggtcg actggtctga  1071

tggccaatgg catcggccat gtctggtcat cacgggctgg ttgcctgggt gaaggtgatg  1131

cacatcatca tgtgcggttg gaggggctgg cacagtgtgg gctgaactgg agcagttgtc  1191

caggctggcg ttgaatcagt gagggtttgt gattggcggt tgtgaagcaa tgactccgcc  1251

catattctat ttgtgggagc tgagatgatg gcatgcttgg gatgtgcatg gatcatggta  1311

gtgcagcaaa ctatattcac ctagggctgt tggtaggatc aggtgaggcc ttgcacattg  1371

catgatgtac tcgtcatggt gtgttggtga gaggatggat gtggatggat gtgtattctc  1431

agacgtagac cttgactgga ggcttgatcg agagagtggg ccgtattctt tgagagggga  1491

ggctcgtgcc agaaatggtg agtggatgac tgtgacgctg tacattgcag gcaggtgaga  1551

tgcactgtct cgattgtaaa atacattcag atgcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa     1608

<210>6

<211>322

<212>PRT

<213>雨生红球藻

<400>6

Thr Phe His Lys Pro Val Ser Gly Ala Ser Ala Leu Pro His Ile Gly

1               5                   10                  15

Pro Pro Pro His Leu His Arg Ser Phe Ala Ala Thr Thr Met Leu Ser

            20                  25                  30

Lys Leu Gln Ser Ile Ser Val Lys Ala Arg Arg Val Glu Leu Ala Arg

        35                  40                  45

Asp Ile Thr Arg Pro Lys Val Cys Leu His Ala Gln Arg Cys Ser Leu

    50                  55                  60

Val Arg Leu Arg Val Ala Ala Pro Gln Thr Glu Glu Ala Leu Gly Thr

65                  70                  75                  80

Val Gln Ala Ala Gly Ala Gly Asp Glu His Ser Ala Asp Val Ala Leu

                85                  90                  95

Gln Gln Leu Asp Arg Ala Ile Ala Glu Arg Arg Ala Arg Arg Lys Arg

            100                 105                 110

Glu Gln Leu Ser Tyr Gln Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ser Ile Gly Val

        115                 120                 125

Ser Gly Ile Ala Ile Phe Ala Thr Tyr Leu Arg Phe Ala Met His Met

    130                 135                 140

Thr Val Gly Gly Ala Val Pro Trp Gly Glu Val Ala Gly Thr Leu Leu

145                 150                 155                 160

Leu Val Val Gly Gly Ala Leu Gly Met Glu Met Tyr Ala Arg Tyr Ala

                165                 170                 175

His Lys Ala Ile Trp His Glu Ser Pro Leu Gly Trp Leu Leu His Lys

            180                 185                 190

Ser His His Thr Pro Arg Thr Gly Pro Phe Glu Ala Asn Asp Leu Phe

        195                 200                 205

Ala Ile Ile Asn Gly Leu Pro Ala Met Leu Leu Cys Thr Phe Gly Phe

    210                 215                 220

Trp Leu Pro Asn Val Leu Gly Ala Ala Cys Phe Gly Ala Gly Leu Gly

225                 230                 235                 240

Ile Thr Leu Tyr Gly Met Ala Tyr Met Phe Val His Asp Gly Leu Val

                245                 250                 255

His Arg Arg Phe Pro Thr Gly Pro Ile Ala Gly Leu Pro Tyr Met Lys

            260                 265                 270

Arg Leu Thr Val Ala His Gln Leu His His Ser Gly Lys Tyr Gly Gly

        275                 280                 285

Ala Pro Trp Gly Met Phe Leu Gly Pro Gln Glu Leu Gln His Ile Pro

    290                 295                 300

Gly Ala Ala Glu Glu Val Glu Arg Leu Val Leu Glu Leu Asp Trp Ser

305                 310                 315                 320

Lys Arg

<210>7

<211>1650

<212>DNA

<213>番茄

<220>

<221>CDS

<222>(112)..(1614)

<223>

<400>7

ggcacgagga aacttttctc tcttcactag ctgtttacat gcttgaaatt tcaagatttt  60

aggaccccat ttgaagtttt cttgaaacaa atattaccct gttggaaaaa g atg gat  117

                                                         Met Asp

                                                         1

act ttg ttg aaa acc cca aat aac ctt gaa ttt ctg aac cca cat cat  165

Thr Leu Leu Lys Thr Pro Asn Asn Leu Glu Phe Leu Asn Pro His His

        5                   10                  15

ggt ttt gct gtt aaa gct agt acc ttt aga tct gag aag cat cat aat  213

Gly Phe Ala Val Lys Ala Ser Thr Phe Arg Ser Glu Lys His His Asn

    20                  25                  30

ttt ggt tct agg aag ttt tgt gaa act ttg ggt aga agt gtt tgt gtt  261

Phe Gly Ser Arg Lys Phe Cys Glu Thr Leu Gly Arg Ser Val Cys Val

35                  40                  45                  50

aag ggt agt agt agt gct ctt tta gag ctt gta cct gag acc aaa aag  309

Lys Gly Ser Ser Ser Ala Leu Leu Glu Leu Val Pro Glu Thr Lys Lys

                55                  60                  65

gag aat ctt gat ttt gag ctt cct atg tat gac cct tca aaa ggg gtt  357

Glu Asn Leu Asp Phe Glu Leu Pro Met Tyr Asp Pro Ser Lys Gly Val

            70                  75                  80

gtt gtg gat ctt gct gtg gtt ggt ggt ggc cct gca gga ctt gct gtt  405

Val Val Asp Leu Ala Val Val Gly Gly Gly Pro Ala Gly Leu Ala Val

        85                  90                  95

gca cag caa gtt tct gaa gca gga ctc tct gtt tgt tca att gat ccg  453

Ala Gln Gln Val Ser Glu Ala Gly Leu Ser Val Cys Ser Ile Asp Pro

    100                 105                 110

aat cct aaa ttg ata tgg cct aat aac tat ggt gtt tgg gtg gat gaa  501

Asn Pro Lys Leu Ile Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val Asp Glu

115                 120                 125                 130

ttt gag gct atg gac ttg tta gat tgt cta gat gct acc tgg tct ggt  549

Phe Glu Ala Met Asp Leu Leu Asp Cys Leu Asp Ala Thr Trp Ser Gly

                135                 140                 145

gca gca gtg tac att gat gat aat acg gct aaa gat ctt cat aga cct  597

Ala Ala Val Tyr Ile Asp Asp Asn Thr Ala Lys Asp Leu His Arg Pro

            150                 155                 160

tat gga agg gtt aac cgg aaa cag ctg aaa tcg aaa atg atg cag aaa  645

Tyr Gly Arg Val Asn Arg Lys Gln Leu Lys Ser Lys Met Met Gln Lys

        165                 170                 175

tgt ata atg aat ggt gtt aaa ttc cac caa gcc aaa gtt ata aag gtg  693

Cys Ile Met Asn Gly Val Lys Phe His Gln Ala Lys Val Ile Lys Val

    180                 185                 190

att cat gag gaa tcg aaa tcc atg ttg ata tgc aat gat ggt att act  741

Ile His Glu Glu Ser Lys Ser Met Leu Ile Cys Asn Asp Gly Ile Thr

195                 200                 205                 210

att cag gca acg gtg gtg ctc gat gca act ggc ttc tct aga tct ctt  789

Ile Gln Ala Thr Val Val Leu Asp Ala Thr Gly Phe Ser Arg Ser Leu

                215                 220                 225

gtt cag tat gat aag cct tat aac ccc ggg tat caa gtt gct tat ggc  837

Val Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Asn Pro Gly Tyr Gln Val Ala Tyr Gly

            230                 235                 240

att ttg gct gaa gtg gaa gag cac ccc ttt gat gta aac aag atg gtt  885

Ile Leu Ala Glu Val Glu Glu His Pro Phe Asp Val Asn Lys Met Val

        245                 250                 255

ttc atg gat tgg cga gat tct cat ttg aag aac aat act gat ctc aag  933

Phe Met Asp Trp Arg Asp Ser His Leu Lys Asn Asn Thr Asp Leu Lys

    260                 265                 270

gag aga aat agt aga ata cca act ttt ctt tat gca atg cca ttt tca  981

Glu Arg Asn Ser Arg Ile Pro Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro Phe Ser

275                 280                 285                 290

tcc aac agg ata ttt ctt gaa gaa aca tca ctc gta gct cgt cct ggc  1029

Ser Asn Arg Ile Phe Leu Glu Glu Thr Ser Leu Val Ala Arg Pro Gly

                295                 300                 305

ttg cgt ata gat gat att caa gaa cga atg gtg gct cgt tta aac cat  1077

Leu Arg Ile Asp Asp Ile Gln Glu Arg Met Val Ala Arg Leu Asn His

            310                 315                 320

ttg ggg ata aaa gtg aag agc att gaa gaa gat gaa cat tgt cta ata  1125

Leu Gly Ile Lys Val Lys Ser Ile Glu Glu Asp Glu His Cys Leu Ile

        325                 330                 335

cca atg ggt ggt cca ctt cca gta tta cct cag aga gtc gtt gga atc  1173

Pro Met Gly Gly Pro Leu Pro Val Leu Pro Gln Arg Val Val Gly Ile

    340                 345                 350

ggt ggt aca gct ggc atg gtt cat cca tcc acc ggt tat atg gtg gca  1221

Gly Gly Thr Ala Gly Met Val His Pro Ser Thr Gly Tyr Met Val Ala

355                 360                 365                 370

agg aca cta gct gcg gct cct gtt gtt gcc aat gcc ata att caa tac  1269

Arg Thr Leu Ala Ala Ala Pro Val Val Ala Asn Ala Ile Ile Gln Tyr

                375                 380                 385

ctc ggt tct gaa aga agt cat tcg ggt aat gaa tta tcc aca gct gtt  1317

Leu Gly Ser Glu Arg Ser His Ser Gly Asn Glu Leu Ser Thr Ala Val

            390                 395                 400

tgg aaa gat ttg tgg cct ata gag agg aga cgt caa aga gag ttc ttc  1365

Trp Lys Asp Leu Trp Pro Ile Glu Arg Arg Arg Gln Arg Glu Phe Phe

        405                 410                 415

tgc ttc ggt atg gat att ctt ctg aag ctt gat tta cct gct aca aga  1413

Cys Phe Gly Met Asp Ile Leu Leu Lys Leu Asp Leu Pro Ala Thr Arg

    420                 425                 430

agg ttc ttt gat gca ttc ttt gac tta gaa cct cgt tat tgg cat ggc  1461

Arg Phe Phe Asp Ala Phe Phe Asp Leu Glu Pro Arg Tyr Trp His Gly

435                 440                 445                 450

ttc tta tcg tct cga ttg ttt cta cct gaa ctc ata gtt ttt ggg ctg  1509

Phe Leu Ser Ser Arg Leu Phe Leu Pro Glu Leu Ile Val Phe Gly Leu

                455                 460                 465

tct cta ttc tct cat gct tca aat act tct aga ttt gag ata atg aca  1557

Ser Leu Phe Ser His Ala Ser Ash Thr Ser Arg Phe Glu Ile Met Thr

            470                 475                 480

aag gga act gtt cca tta gta aat atg atc aac aat ttg tta cag gat  1605

Lys Gly Thr Val Pro Leu Val Asn Met Ile Asn Asn Leu Leu Gln Asp

        485                 490                 495

aaa gaa tga atccgagtaa ttcggaatct tgtccaatct cgtgcc              1650

Lys Glu

    500

<210>8

<211>500

<212>PRT

<213>番茄

<400>8

Met Asp Thr Leu Leu Lys Thr Pro Asn Asn Leu Glu Phe Leu Asn Pro

1               5               10                      15

His His Gly Phe Ala Val Lys Ala Ser Thr Phe Arg Ser Glu Lys His

            20                  25                  30

His Asn Phe Gly Ser Arg Lys Phe Cys Glu Thr Leu Gly Arg Ser Val

        35                  40                  45

Cys Val Lys Gly Ser Ser Ser Ala Leu Leu Glu Leu Val Pro Glu Thr

    50                  55                  60

Lys Lys Glu Asn Leu Asp Phe Glu Leu Pro Met Tyr Asp Pro Ser Lys

65                  70                  75                  80

Gly Val Val Val Asp Leu Ala Val Val Gly Gly Gly Pro Ala Gly Leu

                85                  90                  95

Ala Val Ala Gln Gln Val Ser Glu Ala Gly Leu Ser Val Cys Ser Ile

            100                 105                 110

Asp Pro Asn Pro Lys Leu Ile Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val

        115                 120                 125

Asp Glu Phe Glu Ala Met Asp Leu Leu Asp Cys Leu Asp Ala Thr Trp

    130                 135                 140

Ser Gly Ala Ala Val Tyr Ile Asp Asp Asn Thr Ala Lys Asp Leu His

145                 150                 155                 160

Arg Pro Tyr Gly Arg Val Asn Arg Lys Gln Leu Lys Ser Lys Met Met

                165                 170                 175

Gln Lys Cys Ile Met Asn Gly Val Lys Phe His Gln Ala Lys Val Ile

            180                 185                 190

Lys Val Ile His Glu Glu Ser Lys Ser Met Leu Ile Cys Asn Asp Gly

        195                 200                 205

Ile Thr Ile Gln Ala Thr Val Val Leu Asp Ala Thr Gly Phe Ser Arg

    210                 215                 220

Ser Leu Val Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Asn Pro Gly Tyr Gln Val Ala

225                 230                 235                 240

Tyr Gly Ile Leu Ala Glu Val Glu Glu His Pro Phe Asp Val Asn Lys

                245                 250                 255

Met Val Phe Met Asp Trp Arg Asp Ser His Leu Lys Asn Asn Thr Asp

            260                 265                 270

Leu Lys Glu Arg Asn Ser Arg Ile Pro Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro

        275                 280                 285

Phe Ser Ser Asn Arg Ile Phe Leu Glu Glu Thr Ser Leu Val Ala Arg

    290                 295                 300

Pro Gly Leu Arg Ile Asp Asp Ile Gln Glu Arg Met Val Ala Arg Leu

305                 310                 315                 320

Asn His Leu Gly Ile Lys Val Lys Ser Ile Glu Glu Asp Glu His Cys

                325                 330                 335

Leu Ile Pro Met Gly Gly Pro Leu Pro Val Leu Pro Gln Arg Val Val

            340                 345                 350

Gly Ile Gly Gly Thr Ala Gly Met Val His Pro Ser Thr Gly Tyr Met

        355                 360                 365

Val Ala Arg Thr Leu Ala Ala Ala Pro Val Val Ala Asn Ala Ile Ile

    370                 375                 380

Gln Tyr Leu Gly Ser Glu Arg Ser His Ser Gly Asn Glu Leu Ser Thr

385                 390                 395                 400

Ala Val Trp Lys Asp Leu Trp Pro Ile Glu Arg Arg Arg Gln Arg Glu

                405                 410                 415

Phe Phe Cys Phe Gly Met Asp Ile Leu Leu Lys Leu Asp Leu Pro Ala

            420                 425                 430

Thr Arg Arg Phe Phe Asp Ala Phe Phe Asp Leu Glu Pro Arg Tyr Trp

        435                 440                 445

His Gly Phe Leu Ser Ser Arg Leu Phe Leu Pro Glu Leu Ile Val Phe

    450                 455                 460

Gly Leu Ser Leu Phe Ser His Ala Ser Asn Thr Ser Arg Phe Glu Ile

465                 470                 475                 480

Met Thr Lys Gly Thr Val Pro Leu Val Asn Met Ile Asn Asn Leu Leu

                485                 490                 495

Gln Asp Lys Glu

            500

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(22)

<223>148-Start

<400>9

atgatccagt tagaacaacc ac                                               22

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(24)

<223>148-End

<400>10

ctattttgct ttgtaaattt ctgg                                             24

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(26)

<223>38-Start

<400>11

atgaattttt gtgataaacc agttag                                           26

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(23)

<223>38-End

<400>12

acgaattggt tactgaattg ttg                                              23

Claims (43)

1.一种通过培养基因修饰生物制备酮类胡萝卜素的方法，其中，所述生物与野生型相比具有改变的酮酶活性，并且改变的酮酶活性由酮酶导致，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，使用的生物作为野生型已经具有酮酶活性，基因修饰导致与野生型相比酮酶活性增加。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，酮酶活性提高是通过相对野生型增强编码酮酶的核酸的基因表达实现的，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，基因表达增强是通过将编码酮酶的核酸引入生物中实现的，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，使用的生物作为野生型不具有酮酶活性，与野生型相比，基因修饰产生酮酶活性。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，使用转基因表达酮酶的基因修饰生物，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，通过将编码酮酶的核酸引入生物中以产生基因表达，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

8.根据权利要求5或7所述的方法，其中，引入包括序列SEQ.ID.NO.1的核酸。

9.根据权利要求1到8任一项所述的方法，其中，与野生型相比，生物另外具有提高的羟化酶活性和β-环化酶活性中至少一种。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，编码羟化酶的核酸和编码β-环化酶的核酸中，至少一种核酸的基因表达与野生型相比增强，以另外提高所述酶活性中至少一种。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，通过将编码羟化酶的核酸和编码β-环化酶的核酸中至少一种核酸引入生物，增强基因表达。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，引入编码羟化酶的核酸，所述羟化酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO：6，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO：6相比在氨基酸水平上至少20％相同，以作为编码羟化酶的核酸。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，引入包括序列SEQ ID NO：5的核酸。

14.根据权利要求11所述的方法，其中，引入编码β-环化酶的核酸，所述β-环化酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO：8，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO：8相比在氨基酸水平上至少20％相同，以作为编码β-环化酶的核酸。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，引入包括序列SEQ ID NO：7的核酸。

16.根据权利要求1到15任一项所述的方法，其中，培养之后收获基因修饰生物，然后从生物中分离酮类胡萝卜素。

17.根据权利要求1到16任一项所述的方法，其中，使用作为起始生物天然地或通过遗传互补或代谢途径再调节而能够产生类胡萝卜素的生物作为生物。

18.根据权利要求1到17任一项所述的方法，其中，使用微生物或植物作为生物。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，使用细菌、酵母、藻类或真菌作为微生物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，微生物选自以下组：埃希氏菌属，欧文氏菌属，土壤杆菌属，黄杆菌属，产碱菌属，副球菌属，念珠蓝细菌属，蓝细菌集胞蓝细菌属，假丝酵母属，酵母属，汉逊酵母属，发夫酵母属，毕赤酵母属，曲霉菌属，木霉菌属，Ashbya，链孢霉属，布拉霉菌属，须霉属，镰胞菌属，红球藻属，Phaedactylumtricornatum，团藻属或Dunaliella。

21.根据权利要求18所述的方法，其中，使用植物作为生物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，使用选自毛茛科，小檗科，罂粟科，大麻科，蔷薇科，蝶形花科，亚麻科，葡萄科，十字花科，葫芦科，报春花科，石竹科，苋科，龙胆科，牻牛儿苗科，忍冬科，木犀科，金莲花科，茄科，玄参科，菊科，百合科，石蒜科，禾本科，兰科，锦葵科，Illiaceae或唇形科的植物作为植物。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，使用选自植物金盏花，万寿菊，孔雀草，金合欢属，乌头属，侧金盏花属，山金车属，耧斗菜属，紫菀属，黄芪属，紫葳属，金盏花属，驴蹄草属，风铃草属，美人蕉属，矢车菊属，桂竹香属，菊属，柑桔属，还阳参属，番红花属，南瓜属，金雀儿属，Delonia，翠雀属，石竹属，异果菊属，多榔菊属，花菱草属，连翘属，佛里蒙特属，杂色菊属，钩吻属，染料木属，龙胆属，老鹳草属，大丁草属，水杨梅属，银桦属，堆心菊属，向日葵属，獐耳细辛属，独活属，木槿属，赛菊芋属，金丝桃属，毛耳菊属，凤仙花属，鸢尾属，兰花楹属，中国棣棠属，金链花属，山黧豆属，蒲公英属，百合属，亚麻属，莲属，番茄属，排草属，Maratia，苜蓿属，沟酸浆属，水仙属，月见草属，木犀属，矮牵牛属，石楠属，酸浆属，牧根草属，委陵菜属，火棘属，毛茛属，杜鹃花属，蔷薇属，金花菊属，千里光属，麦瓶草属，松香草属，Sinapsis，花楸属，鹰爪豆属，黄钟花属，蝴蝶草属，婆罗门参属，金莲花属，旱金莲属，郁金香属，款冬属，荆豆属，堇菜属或百日菊属的植物作为植物。

24.根据权利要求1到23任一项所述的方法，其中，酮类胡萝卜素选自以下组：虾青素、角黄素、海胆酮、3-羟基海胆酮、3’-羟基海胆酮、金盏花红素和金盏花黄质。

25.一种基因修饰生物，其中

A，如果野生型生物已经具有酮酶活性，基因修饰导致与野生型相比酮酶活性提高，和

B，如果野生型生物不具有酮酶活性，基因修饰导致产生酮酶活性，并且A中提高的酮酶活性或B中产生的酮酶活性均由酮酶导致，该酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

26.根据权利要求25所述的基因修饰生物，其中，酮酶活性的提高或产生是由编码酮酶的核酸的基因表达与野生型相比增强或产生导致的，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

27.根据权利要求26所述的基因修饰生物，其中，为了提高或产生基因表达，将编码酮酶的核酸引入生物中，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

28.一种基因修饰生物，包括至少一种编码酮酶的转基因核酸，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

29.一种基因修饰生物，包括至少两种编码酮酶内源性核酸，所述酮酶包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少42％相同。

30.根据权利要求25到29任一项所述的基因修饰生物，其中，与野生型相比，基因修饰另外提高羟化酶活性和β-环化酶活性中至少一种。

31.根据权利要求25到30任一项所述的基因修饰生物，其中，所述生物作为起始生物天然地或通过遗传互补产生类胡萝卜素。

32.根据权利要求25到31任一项所述的基因修饰生物，其中，所述生物选自微生物或植物。

33.根据权利要求32所述的基因修饰生物，其中，所述微生物选自细菌、酵母、藻类或真菌。

34.根据权利要求33所述的基因修饰微生物，其中，所述微生物选自以下组：埃希氏菌属，欧文氏菌属，土壤杆菌属，黄杆菌属，产碱菌属，副球菌属，念珠蓝细菌属，蓝细菌集胞蓝细菌属，假丝酵母属，酵母属，汉逊酵母属，毕赤酵母属，曲霉菌属，木霉菌属，Ashbya，链孢霉属，布拉霉菌属，须霉属，镰胞菌属，红球藻属，Phaedactylumtricornatum，团藻属或Dunaliella。

35.根据权利要求32所述的基因修饰植物，其中，所述植物选自以下科：毛茛科，小檗科，罂粟科，大麻科，蔷薇科，蝶形花科，亚麻科，葡萄科，十字花科，葫芦科，报春花科，石竹科，苋科，龙胆科，牻牛儿苗科，忍冬科，木犀科，金莲花科，茄科，玄参科，菊科，百合科，石蒜科，禾本科，兰科，锦葵科，Illiaceae或唇形科。

36.根据权利要求35所述的基因修饰植物，其中，所述植物选自以下植物：金盏花，万寿菊，孔雀草，金合欢属，乌头属，侧金盏花属，山金车属，耧斗菜属，紫菀属，黄芪属，紫葳属，金盏花属，驴蹄草属，风铃草属，美人蕉属，矢车菊属，桂竹香属，菊属，柑桔属，还阳参属，番红花属，南瓜属，金雀儿属，Delonia，翠雀属，石竹属，异果菊属，多榔菊属，花菱草属，连翘属，佛里蒙特属，杂色菊属，钩吻属，染料木属，龙胆属，老鹳草属，大丁草属，水杨梅属，银桦属，堆心菊属，向日葵属，獐耳细辛属，独活属，木槿属，赛菊芋属，金丝桃属，毛耳菊属，凤仙花属，鸢尾属，兰花楹属，中国棣棠属，金链花属，山黧豆属，蒲公英属，百合属，亚麻属，莲属，番茄属，排草属，Maratia，苜蓿属，沟酸浆属，水仙属，月见草属，木犀属，矮牵牛属，石楠属，酸浆属，牧根草属，委陵菜属，火棘属，毛茛属，杜鹃花属，蔷薇属，金花菊属，千里光属，麦瓶草属，松香草属，Sinapsis，花楸属，鹰爪豆属，黄钟花属，蝴蝶草属，婆罗门参属，金莲花属，旱金莲属，郁金香属，款冬属，荆豆属，堇菜属或百日菊属。

37.根据权利要求25到36任一项所述的基因修饰生物作为动物或人的食品的用途。

38.根据权利要求25到36任一项所述的基因修饰生物在制备含酮类胡萝卜素提取物或制备动物和人的食品增补剂中的用途。

39.一种酮酶，包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少70％相同，条件是氨基酸序列SEQ.ID.NO.2不存在。

40.一种酮酶，包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.4，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.4相比在氨基酸水平上至少70％相同。

41.一种编码如权利要求39或40所述的蛋白的核酸，条件为序列SEQ.ID.NO：1或SEQ.ID.NO：3不存在。

42.一种蛋白作为酮酶的用途，所述蛋白包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.2，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.2相比在氨基酸水平上至少70％相同，并且该序列具有酮酶属性。

43.一种蛋白作为酮酶的用途，所述蛋白包括氨基酸序列SEQ.ID.NO.4，或者由此序列通过氨基酸的替换、插入或缺失得到的序列，并且该序列同序列SEQ.ID.NO.4相比在氨基酸水平上至少65％相同，并且该序列具有酮酶属性。

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