CN1275166A - 在植物种子中产生类胡萝卜素化合物及特制油的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过用一种构建体转化宿主植物而生产具有改变的类胡萝卜素组成的植物和种子的方法,所述的构建体具有来自植物种子中表达的基因的转录起始区、质体转运肽、衍生自至少一种类胡萝卜素生物合成基因编码区的DNA序列以及转录终止区。所述方法特别适用于增加油料种子植物中的类胡萝卜素含量。

Description

在植物种子中产生类胡萝卜素化合物及特制油的方法
本发明是1997年8月8日申请的08/908,758号申请的部分继续申请，而08/908,758号申请是1996年8月9日申请的60/024,145号申请的部分继续申请。
发明领域
本发明涉及植物、植物细胞和种子的遗传学修饰，特别是改变类胡萝卜素的生物合成，以及脂肪酸组成。
发明背景
类胡萝卜素是广泛应用的色素，当存在于绿色植物、某些霉菌、酵母和细菌中时，它们是黄-橙-红色脂类。类胡萝卜素烃类被称为胡萝卜素，而其氧化衍生物被称为叶黄素类物质(xanthophylls)。类胡萝卜素是较大的类异戊二烯生物合成途径的一部分，该途径除产生类胡萝卜素之外还产生叶绿素和生育酚、维生素E活性剂等化合物。植物中的类胡萝卜素途径产生胡萝卜素，如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和番茄红素，以及叶黄素类物质，如叶黄素(lutein)。
类胡萝卜素的生物合成涉及两个分子的C20前体香叶基PPi的缩合产生第一个C40烃八氢番茄红素。在一系列的依次去饱和作用后，八氢番茄红素产生番茄红素，番茄红素是环状胡萝卜素β-胡萝卜素和α-胡萝卜素的前体。叶黄素类物质的玉米黄质和叶黄素分别通过β-胡萝卜素和α-胡萝卜素的羟基化作用形成。
β-胡萝卜素是色谱范围为黄色至橙色的胡萝卜素，其大量存在于胡萝卜的根部及植物的绿叶中。β-胡萝卜素可用作着色物质并也是哺乳动物中维生素A的前体。目前商业生产β-胡萝卜素的方法包括从胡萝卜中分离、化学合成和微生物生产。
某些农作物和一种油料种子作物已知具有可观水平的类胡萝卜素，已表明摄入这些类胡萝卜素的天然来源可以提供各种保健作用，下表中提供了已报道的各种植物种类中的类胡萝卜素水平。
                各种作物的类胡萝卜素含量
                        (μg/g)作物        β-胡萝卜素    α-胡萝卜素     番茄红素     叶黄素       总计胡萝卜        30-110         10-40           0-0.5        0-2        65-120胡椒(绿)      2              -               -            2          8胡椒(红)      15             1               -            -          200南瓜          16             0.3             痕量         26         100番茄          3-6            -               85           -          98西瓜          1              痕量            19           -          25金盏花瓣      5              4               -            1350       1500红棕榈油      256            201             8            -          545
已研究了各种生物体中类胡萝卜素的生物合成途径并已阐明了从细菌至高等植物等各种生物体的该生物合成途径，例如参见Britton，G.(1988)类胡萝卜素的生物合成，p.133-182，在T.W.Goodwin编辑的植物色素一书中，1988，学术出版公司(伦敦)有限公司，伦敦。已从各种生物体中克隆了类胡萝卜素生物合成基因，所述生物体包括噬夏孢欧文氏杆菌(Misawa等(1990)，细菌学杂志172：6704-6712)；草生欧文氏杆菌(国际申请WO91/13078，Armstrong等(1990)，美国科学院院刊87：9975-9979)；R.capsulatus(Armstrong等(1989)，分子普通遗传学216：254-268，Romer等(1993)，生物化学生物物理研究通讯196：1414-1421)；Thermus thermophilus(Hoshino等(1993)，应用环境微生物学59：3150-3153)；蓝细菌Synechococcus(Genbank登录号X63873)。还参见国际申请WO96/13149及其中引述的参考文献。
尽管已阐明了基因，但是基因在植物中的应用却所知甚少。研究表明植物八氢番茄红素合酶(Psyl)基因在转基因植物中的表达的过量或抑制均可改变果实中的类胡萝卜素的水平，见Bird等(1991)，生物工程9：635-639；Bramley等(1992)，植物2：343-349；以及Fray and Grierson(1993)，植物分子生物学22：589-602。另外，如Fray等(1995)，植物8：693-701报道，在转基因番茄中果实八氢番茄红素合酶基因的组成型表达通过再次介导来自赤霉素途径的代谢物而导致矮态。
国际申请WO96/13149中报道了在遗传工程化的植物的储存器官如块茎和根部增加类胡萝卜素的积累。该申请涉及在特异的预定的非光合储存器官中增加有色的天然类胡萝卜素的产生。该申请的实施例涉及在转化的胡萝卜根部和橙肉马铃薯块茎中增加有色类胡萝卜素。这些组织均是营养组织而非种子，并天然地具有高水平的类胡萝卜素。
类胡萝卜素可用于各种应用。通常，类胡萝卜素可用作补剂特别是维生素补剂、植物油基食品和食品成分、动物饲料中的饲料添加剂以及着色剂。具体地，八氢番茄红素可用于治疗皮肤病。例如，参见美国专利4,642,318。番茄红素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素可用作食品着色剂。食用β-胡萝卜素和番茄红素也已提示具有预防某些类型的癌症的效果。另外，食用叶黄素也可预防眼睛的斑点退化。
植物油可用于各种工业应用和食用中。目前需要新的植物油组合物和/或改进的从生物合成或天然植物来源获得油组合物的方法。根据油的应用，需要各种不同的脂肪酸组成。特别需要具有特殊的脂肪酸组成的改性油，特别是油酸含量高的油。参见Haumann，B.F.(1996)INFORM 7：320-334。如Haumann报道，理想的用于油炸的油是低饱和的高油酸含量及低亚油酸含量的。另外，近年的研究已确立了作为饮食组成的单不饱和脂肪酸值。
近年来已进行了尝试以改善特定油的脂肪酸曲线。例如，植物油的氧化稳定性与其脂肪酸中的双键数相关，即，据认为具有几个双键的分子是更不稳定的。因此，科学家已尝试降低α-亚油酸的含量以改善储存时间和氧化稳定性，特别是在加热下的氧化稳定性。
显然需要在作物植物特别是植物种子中产生显著水平的类胡萝卜素化合物的方法。另外有利的是改变植物和种子的脂肪酸含量。这种改变的种子产物具有营养学应用并可作为产生更稳定的油的来源。目前没有报道过大大改变植物种子中产生的类胡萝卜素的水平和组成、特别是增加类胡萝卜素的产生水平的方法。因此，需要改变植物特别是种子中的类胡萝卜素的水平并生产具有改良的类胡萝卜素组成和/或含量的油的有用方法。
发明概述
本发明提供了具有改变的类胡萝卜素水平和/或改良的脂肪酸组成的转化的植物、植物细胞和种子。所述的植物、植物细胞和种子用至少一个类胡萝卜素生物合成基因或基因的组合转化。本发明还提供了制备和使用本发明的组合物的方法。所述方法可用于改变植物特别是种子中的类胡萝卜素水平，以及增加用于分子农学的特定化合物，如生产特定的类胡萝卜素。同时转化的组合物特别是种子提供了改性油的来源，所述的油可从该种子中提取出以提供一种包含各种类胡萝卜素的天然来源的油制品，即类胡萝卜素混合物。在本发明的一个特定方面中，转化的种子可以提供特定类胡萝卜素化合物的来源，和/或具有改变的类胡萝卜素组成和/或改变的脂肪酸组成的改性特制油的来源，特别是具有增加水平的油酸以及降低水平的亚油酸和亚麻酸的特制油的来源。
附图简述
图1示出SSU/crtB融合序列的核苷酸序列。
图2示出用于在植物种子中表达类胡萝卜素生物合成基因的构建体。图2A示出含有与SSU/crtB序列可操纵连接的napin启动子的质粒pCGN3390。图2B示出含有与SSU/crtE序列可操纵连接的napin启动子的质粒pCGN3392。图2C示出含有与SSU/crtI序列可操纵连接的napin启动子的质粒pCGN9010。图2D示出含有与SSU/crtB序列可操纵连接的napin启动子及与SSU/crtI序列可操纵连接的napin启动子的质粒pCGN9009。图2E示出含有与SSU/crtB序列可操纵连接的napin启动子及与反义ε-环化酶序列可操纵连接的napin启动子的质粒pCGN9002。图2F示出含有与SSU/crtB序列可操纵连接的napin启动子及与反义β-环化酶序列可操纵连接的napin启动子的质粒pCGN9017。图2G示出含有与SSU/crtB序列可操纵连接的napin启动子及与SSU/crtW序列可操纵连接的napin启动子的质粒pCGN6204。图2H示出含有与SSU/crtB序列可操纵连接的napin启动子及与SSU/crtZ序列可操纵连接的napin启动子的质粒pCGN6205。图2I示出含有与SSU/crtB序列可操纵连接的napin启动子，与crtW序列可操纵连接的napin启动子以及与crtZ序列可操纵连接的napin启动子的质粒pCGN6206。
图3示出对照种子的皂化样品的分析结果。
图4示出pCGN3390转化的种子的皂化样品的分析结果。
图5示出pCGN3390转化的种子中的脂肪酸分析曲线，证明18∶1脂肪酸的增加与18∶2和18∶3脂肪酸的降低相关。
图6示出pCGN3390转化的种子中的脂肪酸分析曲线，证明18∶1脂肪酸的增加与18∶0和20∶0脂肪酸的降低相关，但是在16∶0脂肪酸中未见效果。
图7示出pCGN3390转化的种子中的脂肪酸分析曲线，证明18∶0脂肪酸的增加与20∶0脂肪酸的增加非常相关。
图8示出类胡萝卜素生物合成途径。
图9提供了欧洲油菜的ε-环化酶cDNA克隆9-4的序列。
图10提供了欧洲油菜的ε-环化酶cDNA克隆7-6的序列。
图11提供了欧洲油菜的β-环化酶cDNA克隆的序列。
图12提供了3390转化的欧洲油菜植物的T2种子分析。
图13提供了3390转化的欧洲油菜植物的T3种子分析。
图14提供了9002转化的欧洲油菜植物的T2种子分析。
图15示出SSU/crtZ融合序列的核苷酸序列。
图16示出SSU/crtW融合序列的核苷酸序列。
图17示出用于检测来自6204转基因株系的种子的抽提物中的叶黄素的HPLC痕量分析。
发明详述
根据本发明，提供了用于在植物特别是植物种子中增加类胡萝卜素化合物产量以及改变脂肪酸组成的方法。所述方法涉及用至少一个类胡萝卜素生物合成基因转化植物。所述方法具有改变类胡萝卜素生物合成、特别是增加下游产物的产量以及提供具有希望的脂肪酸组成的新的种子油的效果。
令人惊奇地，已发现用早期类胡萝卜素生物合成基因转化植物可以导致经过类胡萝卜素途径的通量增加，导致特定类胡萝卜素的增加。即，代谢活性增加，其可以进一步操作以产生特异的类胡萝卜素。另外，转化的种子可由于类胡萝卜素基因表达而改变脂肪酸组成，例如从本文描述的由用八氢番茄红素合酶基因转化的植物的种子可见这一现象。
因此，使用本发明的方法，提供了产生高水平特定类胡萝卜素和/或产生具有所需的脂肪酸组成的特制油的种子。例如，在油料种子Brassica中，用早期类胡萝卜素生物合成基因转化导致种子具有显著增加水平的α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和叶黄素。另外，Brassica种子具有改变的脂肪酸组成并产生具有增加的油酸含量和降低的亚油酸和亚麻酸含量的植物油。因此，转化的种子可提供类胡萝卜素产物以及修饰的种子油的来源。以这种方式，可产生修饰的特制油并提供用于提取和纯化类胡萝卜素的新来源。
本发明的油还提供了与类胡萝卜素的两种主要植物来源金盏花瓣和红棕榈油(中果皮)相比大大改善的稳定性。尽管在室温储存于空气中的种子中观察到不稳定性，即储存4周后总类胡萝卜素约丧失20-30％，但储存1-2周后仅丧失10％。相反，棕榈中果皮必须在收获后1或2天内加工以避免大部分类胡萝卜素的丧失。另外，本发明种子中的类胡萝卜素的分解可通过将种子在氮气下储存而显著降低。
为生产具有增加的类胡萝卜素生物合成的种子，用一个早期类胡萝卜素生物合成基因转化植物就足够了。早期类胡萝卜素生物合成基因是指香叶基香叶基焦磷酸合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、异戊烯基二磷酸(IPP)异构酶。早期类胡萝卜素生物合成基因有各种来源，基本上可使用任意来源的基因。但是，应认识到，当希望增加特定酶的表达时，由于其共抑制作用，使用靶宿主天然植物基因可能是不希望的。
已分离了若干个早期类胡萝卜素生物合成基因，本文也指从类胡萝卜素生物合成基因编码区衍生的DNA序列，它们可用于本发明方法中。例如：
IPP异构酶已分离自：R.Capsulatus(Hahn等(1996)，细菌学杂志178：619-624及其所引述的参考文献)，GenBank登录号U48963和X82627，Clarkia xantiana GenBank登录号U48962，拟南芥(Arabidopsis thaliana)GenBank登录号U48961，粟酒裂殖糖酵母GenBank登录号U21154，人GenBank登录X17025，乳克鲁维氏酵母GenBank登录号X14230。
香叶基香叶基焦磷酸合酶来自E.Uredovora，Misawa等(1990)，细菌学杂志172：6704-6712和国际申请WO91/13078；以及来自植物来源，如白羽扇豆(Aitken等(1995)植物生理学108：837-838)，bell pepper(Badillo等(1995)植物分子生物学27：425-428)和拟南芥属(Scolnik and Bartely(1994)植物生理学104：1469-1470；Zhu等(1997)植物细胞生理学38：357-361)。
各种来源的八氢番茄红素合酶包括E.Uredovora，Rhodobactercapsulatus和植物来源，Misawa等(1990)，细菌学杂志172：6704-6712，GenBank登录号D90087，国际申请WO91/13078，Armstrong等(1989)，分子普通遗传学216：254-268，Arrnstrong，G.A.“类胡萝卜素生物合成的遗传分析和调节”，见R.C.Blankenship，M.T.Madigan和C.E.Bauer编辑，《不产氧光合细菌；光合作用进展》，Kluwer学术出版社，Dordrecht，荷兰，Armstrong等(1990)，美国科学院院刊87：9975-9979，Armstrong等(1993)酶学方法214：297-311，Bartley和Scolnik(1993)，生物化学杂志268：27518-27521，Bartley等(1992)，生物化学杂志267：5036-5039，Bramley等(1992)，植物2：291-343，Ray等(1992)植物分子生物学19：401-404，Ray等(1987)，核酸研究15：10587，Romer等(1994)，生物化学生物物理研究通讯196：1414-1421，Karvouni等(1995)植物分子生物学27：1153-1162，GenBank登录号U32636，Z37543，L37405，X95596，D58420，U32636，Z37543，X78814，X82458，S71770，L27652，L23424，X68017，L25812，M87280，M38424，X69172，X63873和X60441，Armstrong，G.A.(1994)，细菌学杂志176：4795-4802及其引述的参考文献。
细菌来源的八氢脱氢酶包括来自E.uredovora，Misawa等(1990)，细菌学杂志172：6704-6712，和国际申请WO91/13078(GenBank登录号L37405，X95596，D58420，X82458，S71770和M87280)；以及植物来源的八氢脱氢酶包括来自玉米(Li等(1996)，植物分子生物学30：269-279)，番茄(Pecker等(1992)，美国科学院院刊89：4962-4966，Aracri等(1994)，植物生理学106：789)，和Capisumannum(bell peppers)(Hugueney等(1992)，生物化学杂志209：399-407)，GenBank登录号U37285，X59948，X78271和X68058。
总之参见Misawa等(1990)，细菌学杂志172：6704-6712，欧洲专利0393690B1，美国专利5,429,939，Bartley等(1992)生物化学杂志267：5036-5039，Bird等(1991)生物工程9：635-639，和美国专利5,304,478，这些均引入本文作参考。
用早期类胡萝卜素基因(本文称作初级基因)的转化增加了类胡萝卜素途径的生物合成活性，并能导致特定类胡萝卜素如α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的产量增加。如下述实施例详细描述的，通过以初级基因表达八氢番茄红素合酶，在转化植物的种子中获得总类胡萝卜素含量大大增加、特别是α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的水平大大增加。如此产生的包含类胡萝卜素的油可从种子中提取以提供α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的有价值的来源。这种油可用作食用色素如向人造黄油中添加色素，或用作食用油。具有高α-胡萝卜素和β-胡萝卜素水平的食用油对于防止可导致夜盲症的维生素A缺乏很有用，因此在夜盲症高发区如印度和亚洲特别希望产生转化植物并提取高α-胡萝卜素和β-胡萝卜素油以提供有用的食用油。
除了高α-胡萝卜素和β-胡萝卜素水平外，本文举例的油中其它类胡萝卜素的水平也提高，例如，来自用八氢番茄红素合酶基因转化的植物以及用GGPP合酶基因crtE(3392)或用八氢番茄红素脱氢酶crt(9010)I转化的植物的种子中叶黄素水平增加。
另外，也可表达其它的初级基因以提供更高的类胡萝卜素途径通量。例如，在用本文所述八氢番茄红素合酶基因转化的油料种子作物芥属种子中，观察到增加水平的八氢番茄红素。因此，增加八氢番茄红素脱氢酶以及八氢番茄红素合酶的表达可导致所产生的类胡萝卜素如α-胡萝卜素和β-胡萝卜素和叶黄素水平的进一步提高。对于类胡萝卜素组合物的这种进一步的修饰在本文中在用pCGN9009转化以表达crtB和crtI基因的转基因植物种子中得以证实。另外，既表达八氢番茄红素合酶又表达GGPP合酶基因的植物也是希望的，这种植物能导致类胡萝卜素途径更高的通量，如在本发明植物中观察到叶绿素产量的提高，所述植物已被转化以在不存在crtB过量表达时表达GGPP合酶基因(crtE)。
令人感兴趣地，表达GGPP合酶基因的植物不具有对生育酚含量的显著改变。因为GGPP是植物中类胡萝卜素、叶绿素和生育酚途径的分支点，因此这些观察提示由GGPP氢化酶催化的生育酚生物合成的下一酶学步骤是生育酚产生的限速步骤。因此，假如单独或与增加GGPP合酶表达一起增加GGPP氢化酶的表达将预期导致经过生育酚途径的通量增加。
还令人感兴趣的是表达三种早期类胡萝卜素生物合成基因crtB，crtE和crtI的转化植物。表达两或三种不同类胡萝卜素生物合成基因的植物可通过用表达所需基因的多基因构建体转化植物或经多个构建体共转化或经与含有不同所需基因的植物杂交而产生。
除了产生本文所述类胡萝卜素之外，一旦生物合成活性通过表达初级类胡萝卜素生物合成基因而增加，该途径可以转变为产生特殊的化合物。这种转变涉及至少一个感兴趣的第二种基因(次级基因)的作用。次级基因可编码一种酶以驱动特定化合物的产生，或者可以编码一种基因以终止途径导致特定化合物的累积。对于驱动特定化合物的产生，使用希望的类胡萝卜素化合物途径的类胡萝卜素生物合成基因的表达。在这类方法中可使用对靶植物宿主天然的或外源的基因，包括例如来自非高等植物来源如细菌(如欧文氏杆菌和红色杆菌)的类胡萝卜素生物合成基因。对于终止途径以累积特定类胡萝卜素化合物，次级基因将提供对靶宿主植物天然基因的转录的抑制，其中由抑制基因编码的酶能修饰所需的类胡萝卜素化合物。通过以与该基因的有义(共抑制)或反义方向转录待抑制的天然基因可以实现抑制。
例如，为了改变类胡萝卜素组合物以利于高水平β-胡萝卜素衍生的类胡萝卜素如玉米黄质、玉米黄质二糖苷、角黄素和虾青素的累积，希望的是抑制番茄红素ε环化酶以防止α-胡萝卜素及其衍生的类胡萝卜素如叶黄素的累积。另外，番茄红素β环化酶的过量表达可用于增加β-胡萝卜素衍生的类胡萝卜素的累积。因此，反义番茄红素ε环化酶以及番茄红素β环化酶是用于本发明的感兴趣的次级基因构建体的序列的例子。另外，与抑制番茄红素ε环化酶一起增加另外的次级基因的表达有利于增加特定β-胡萝卜素衍生的类胡萝卜素的累积。例如，增加β-胡萝卜素羟化酶表达可用于产生玉米黄质，而增加β-胡萝卜素羟化酶和酮导入酶(keto-introducing enzyme)表达可用于产生虾青素。或者，为了累积番茄红素需抑制番茄红素β环化酶或番茄红素ε环化酶以及番茄红素β环化酶以降低番茄红素转化为α-胡萝卜素和β-胡萝卜素。
因此，可通过表达类胡萝卜素生物合成基因对类胡萝卜素途径进行操作以增加特定类胡萝卜素的产生，或通过用反义DNA序列转化来降低特定类胡萝卜素的水平，所述的反义DNA序列能防止选定的前体化合物转化成途径中下一个类胡萝卜素。
本申请中感兴趣的次级基因包括但不限于：
β-胡萝卜素羟化酶或crtZ(Hundle等(1993)FEBS通信315：329-334，GenBank登录号M87280)，用于产生玉米黄质；
编码酮导入酶的基因，如crtW(Misawa等(1995)，细菌学杂志177：6575-6584，WO95/18220，WO96/06172)或β-C-4-氧化酶(crtO；Harker and Hirschberg(1997)FEBS通信404：129-134)，以产生角黄素；
crtZ和crtW或crtO，以产生虾青素；
ε-环化酶和ε-羟化酶，以产生叶黄素；
ε-羟化酶和crtZ，以产生叶黄素和玉米黄质；
番茄红素β-环化酶(crtY)(Hugueney等(1995)，植物8：417-424，Cunningham FX Jr(1996)，植物细胞8：1613-1626，Scolnik andBartley(1995)，植物生理学108：1343，GenBank登录号X86452，L40176，X81787，U50739和X74599)，以增加β-胡萝卜素产生；
反义番茄红素ε-环化酶(GenBank登录号U50738)，以增加β-胡萝卜素产生；
反义番茄红素ε-环化酶和番茄红素β-环化酶，以产生番茄红素；
反义植物八氢番茄红素脱氢酶，以产生八氢番茄红素；等等。
以这种方式，可以修饰途径以增加任何感兴趣的特定类胡萝卜素化合物的产量，或者类胡萝卜素化合物的特定亚集合，如叶黄素类物质。这种化合物包括但不限于上述特定化合物以及α-隐黄素，β-隐黄素，ζ-胡萝卜素，六氢番茄红素，四氢番茄红素，阿东黄质(adonixanthin)，海胆酮，羟基角黄素等。对于叶黄素类物质产生的综述，见Misawa等(1995)，文献同上。使用本发明方法，可以在种子中以高水平生产类胡萝卜素途径这感兴趣的任何化合物。
也可以选择次级基因以改变植物的脂肪酸含量以生产特制油。例如，可以使用具有对特定脂肪酸链长的特异性的酰基-ACP硫酯酶基因。参见例如USPN5,304,481，USPN5,455,167，WO95/13390，WO94/10288，WO92/20236，WO91/16421，WO97/12047和WO96/36719。感兴趣的其它脂肪酸生物合成基因包括但不限于β-酮酰基-ACP合酶(USPN5,510,255)，脂酰辅酶A合酶(USPN5,455,947)脂酰还原酶(USPN5,370,996)和硬脂酰氧基-ACP脱氢酶(WO91/13972)。
特别感兴趣的是用山竹果酰基-ACP硫酯酶作为次级基因以进行脂肪酸含量修饰。如WO96/36719和WO97/12047所述，通过表达莽吉柿酰基-ACP硫酯酶可在种子中获得高硬脂酸含量。为了将本文所述的3390植物的高油酸性状与WO97/12047所述的5266高硬脂酸植物结合，在3390-1和5266-35以及3390-1和5266-5之间进行杂交。从这些杂交获得的种子含有具高硬脂酸、低亚油酸、低亚麻酸和高类胡萝卜素表型的油。
生产包含初级基因或初级和次级基因的植物的任何方式均包括在本发明内。例如，感兴趣的次级基因可用于与初级基因同时转化植物，所用方式可以是将两个表达构建体包括在一个转化载体中，或者使用单独的载体，每个载体各自表达所需的初级或次级基因。次级基因可被导入已用初级基因转化的植物，或者可将表达初级基因的转化植物与表达次级基因的转化植物杂交以使基因存在于一个植物中。
通过将基因与组织特异性启动子结合，可以改变植物特定组织中的类胡萝卜素水平。因此，通过使用种子特异性转录起始区可以改变种子包括胚胎和胚乳中的类胡萝卜素水平，这种区域例如在美国专利5,420,034中公开，该专利引入本文作参考。
以这种方式，转化的种子提供了生产改性油的加工地。可以使用改性的油或可以分离油中的化合物。因此，本发明使得能生产感兴趣的特定化合物以及特制油。
编码感兴趣的酶的初级和次级基因可以用于表达盒中以在转化植物组织中表达。为改变感兴趣植物中的类胡萝卜素或脂肪酸水平，用包含与感兴趣基因相连的转录起始区的至少一个表达盒转化植物，这种表达盒提供有多个限制性位点以用于插入感兴趣的基因以使之受调控区的转录调控。
转录起始可是宿主天然或类似的，或者是宿主外源或异源的。外源是指在导入该转录起始区的野生型宿主中未发现的转录起始区。
特别感兴趣的是与储存蛋白质如napin，cruciferin，β-伴大豆球蛋白，菜豆蛋白等，以及参与脂肪酸生物合成的蛋白质如酰基载体蛋白(ACP)相关的转录起始区。参见美国专利5,420,034，引入本文作参考。
转录盒包括5′-3′转录方向的转录和翻译起始区，感兴趣的DNA序列，以及在植物中有功能的转录和翻译终止区。终止区可以是转录起始区天然的，可以是感兴趣的DNA序列天然的，或可以是其它来源的。方便的终止区可得自根癌农杆菌的Ti质粒，如章鱼氨酸合酶和胭脂氨酸合酶终止区。另外参见Guerineau等(1991)，分子普通遗传学262：141-144；Proudfoot(1991)，细胞64：671-674；Sanfacon等(1991)，基因发育5：141-149；Mogen等(1990)，植物细胞2：1261-1272；Munroe等(1990)，基因91：151-158；Ballas等(1989)，核酸研究17：7891-7903；Joshi等(1987)核酸研究15：9627-9639。
通常本发明的感兴趣的基因将定位于质体如叶绿体以进行表达，因此一个或多个类胡萝卜素生物合成基因可以用合适的质体构建体和调控元件插入质体以进行表达。或者，可使用细胞核转化，其中表达盒含有编码转运肽的基因以介导感兴趣的类胡萝卜素生物合成基因到达质体，这种转运肽是现有技术中已知的，例如参见VonHeijne等(1991)，植物分子生物学9：104-126；Clark等(1989)，生物化学杂志264：17544-17550；della-Cioppa等(1987)，植物生理学84：965-968；Romer等(1993)，生物化学生物物理研究通讯196：1414-1421；以及Shah等(1986)，科学233：478-481。用于本发明的植物类胡萝卜素基因可使用天然的或异源的转运肽。
应注意到当感兴趣的基因或DNA序列是反义DNA时不需定位至质体。另外，当需要对给定的类胡萝卜素生物合成基因进行反义抑制时，从该类胡萝卜素生物合成基因衍生的完整DNA序列也不需要。
构建体还可包括任何其它所需调控因子如植物翻译共有序列(Joshi，C.P.，(1987)，核酸研究15：6643-6653)，内含子(Luehrsen andWalbot，(1991)，分子普通遗传学225：81-93)等，它们与感兴趣的核苷酸序列可操纵连接。
可能有利的是在表达盒中包括5′前导序列，其可以增强翻译，翻译前导序列是现有技术中已知的并包括：细小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)(Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.，and Moss，B.(1989)PNAS USA86：6126-6130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(马铃薯蚀刻病毒)(Allison等(1986))，MDMV前导序列(玉米矮态花叶病毒)(病毒学154：9-20)，以及人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak，D.G.，andSamow，P.，(1991)自然353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的包膜蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列(Jobling，S.A，and Gehrke，L.，(1987)，自然325：622-625)；烟草花叶病毒(TMV)前导序列(Gallie，D.R.等(1989)，RNA分子生物学，第237-256页)；以及玉米萎黄病斑纹病毒前导序列(MCMV)(Lommel，S.A.等(1991)，病毒学81：382-385)。还参见Della-Cioppa等(1987)，植物生理学84：965-968。
根据感兴趣的DNA序列的表达地点，希望的是用植物优选密码子合成序列，或者用叶绿体优选密码子合成序列。植物优选密码子可根据在特定的感兴趣植物物种中以最大量表达的蛋白质中最高频率出现的密码子确定，见EPA 0359472；EPA 0385962；WO91/16432；Perlak等(1991)，美国科学院院刊88：3324-3328；Murray等(1989)，核酸研究17：477-498。以这种方式，可优化核苷酸序列以在任何植物中表达。应认识到可以优化基因的全部或任何部分，或者可合成之。即，也可使用合成的或部分优化的序列。对于构建叶绿体优选的基因，参见USPN 5,545,817。
在制备转录盒时，可操作各种DNA片段以提供合适方向以及在合适阅读框中的DNA序列。为此，可采用衔接子或接头以连接DNA片段，或者进行其它操作以提供方便的限制性位点，除去多余的DNA，除去限制性位点，等等。为此，可采用体外诱变、引物修复、限制、退火、切除、连接等，其中可涉及插入、缺失或取代，例如转换和颠换。
本发明的重组DNA分子可以各种现有技术已知的方式导入植物细胞，本领域技术人员应理解方法的选择取决于用于转化的植物的类型，即单子叶或双子叶植物。转化植物细胞的合适方法包括微注射(Crossway等(1986)，生物技术4：320-334)，电穿孔(Riggs等(1986)，美国科学院院刊83：5602-5606)，农杆菌介导的转化(Hinchee等(1988)，生物工程6：915-921)以及弹道粒子加速(例如见Sanford等，美国专利4,945,050；McCabe等(1988)，生物工程6：923-926)。另外，参见Weissinger等(1988)，遗传学年度综述22：421-477；Sanford等(1987)，粒子科学和技术5：27-37(洋葱)；Christou等(1988)，植物生理学87：671-674(大豆)，McCabe等(1988)，生物/工程6：923-926(大豆)；Datta等(1990)，生物工程8：736-740(水稻)；Klein等(1988)，美国科学院院刊85：4305-4309(玉米)；Klein等(1988)，生物工程6：559-563(玉米)；Klein等(1988)，植物生理学91：440-444(玉米)；Fromm等(1990)，生物工程8：833-839；Gordon-Kamm等(1990)，植物细胞2：603-618(玉米)。
或者，植物质体可直接转化。高等植物中的叶绿体的稳定转化已有报道，参见例如，Svab等(1990)，美国科学院院刊87：8526-8530；Svab&Maliga(1993)，美国科学院院刊90：913-917；Staub&Maliga(1993)，EMBO J12：601-606。该方法依赖于粒子枪输送含有选择标记的DNA并将DNA通过同源重组定位于质体基因组。在这类方法中，质体基因表达可通过使用质体基因启动子或反式活化静止的质体携带的转基因而完成，所述的质体携带的转基因的定位是能够从由T7 RNA聚合酶识别的选择性启动子序列开始表达。该静止的质体基因通过从细胞核表达构建体表达特异的RNA聚合酶并将该聚合酶用转运肽定位至质体而活化。在这种方法中，通过使用从合适的植物组织特异性启动子表达核编码的和质体介导的特异RNA聚合酶而获得组织特异性表达。这种系统已由McBride等(1994)在美国科学院院刊91：7301-7305中报道。
已转化的细胞可根据常规方法生长成植物，例如，参见McCormick等，植物细胞报道(1986)5：81-84。这些植物然后可进行培养，自交或与不同的植物株系杂交，并鉴别具有所需的表型特征的得到的合子或杂种。可培养两代或更多代以保证表型特征可稳定保持和遗传，然后收获种子以保证所需表型特征或其它性质已得到。
可采用各种植物种类作为宿主细胞，特别感兴趣的是提供感兴趣的种子的植物物种。通常，会选择产生大量种子的植物，涉及感兴趣的种子特异性产物的植物，或者种子或种子部分可食的植物。感兴趣的种子包括油料种子如油料作物芥属种子，棉花种子，大豆，红花，向日葵，椰子，棕榈等；谷物种子如小麦，大麦，燕麦，苋菜，亚麻，裸麦，triticale，水稻，玉米等；其它可食种子或具有可食部分的种子包括南瓜，西葫芦(squash)，芝麻，罂粟，葡萄，绿豆，花生，豌豆，菜豆，辣根，苜蓿，可可，咖啡，树坚果如核桃，杏仁，美洲山核桃，鹰嘴豆等。
应注意到本发明方法已被证实在具有绿色胚胎的油料种子芥属以及具有白色胚胎的棉花中提供增加的类胡萝卜素产量。
在用八氢番茄红素合酶转化的棉花的种子中，可获得总类胡萝卜素水平10-300倍的增加。观察到类胡萝卜素水平增加的绝大部分，在这一情况中是80％，是八氢番茄红素水平的增加。在这一情况中也获得了叶黄素水平的增加，增加1.5-5倍。另外，α-胡萝卜素和β-胡萝卜素水平也增加10-100倍，其中β-胡萝卜素水平比α-胡萝卜素水平高20倍。因此，如用芥属植物所见，第二种早期类胡萝卜素生物合成基因如八氢番茄红素脱氢酶基因可与crtB一起使用以增加棉花中经类胡萝卜素/类异戊二烯途径的代谢通量以产生特定的类胡萝卜素。
另外，应注意到本发明的方法在本文中也已证明在其它植物物种中如在拟南芥属中增加类胡萝卜素的产量。
在用八氢番茄红素合酶转化的拟南芥属植物的种子中，可获得总类胡萝卜素水平3倍至至少约20倍的增加。在转基因拟南芥属植物的种子中观察β-胡萝卜素水平的大大增加，从10倍至70倍。在这一情况中也获得叶黄素水平的增加，从1.5倍至3倍。另外，八氢番茄红素、α-胡萝卜素和番茄红素水平也增加，但是这种α-胡萝卜素、八氢番茄红素和番茄红素水平的增加很难定量，因为在未转化的对照植物中这些水平太低而不能测定。因此，如用芥属和棉花所见，第二种早期类胡萝卜素生物合成基因可与crtB一起使用以增加棉花中流经类胡萝卜素/类异戊二烯途径的代谢通量以产生特定的类胡萝卜素并降低八氢番茄红素增加的水平。
在本发明的一个实施方案中，种子转录起始区与至少一个类胡萝卜素生物合成基因结合应用，这增加了类胡萝卜素途径的活性并改变了转化种子中类胡萝卜素的水平。以这种方式，可选择特定的基因以促进感兴趣化合物的形成。当所选基因是早期类胡萝卜素生物合成基因时，由于流经该途径的通量的增加使得转化的种子具有明显增加的类胡萝卜素生物合成。用早期类胡萝卜素生物合成基因转化的芥属种子，在种子油中获得了明显增加的α-胡萝卜素，β-胡萝卜素产量以及稍稍增加的叶黄素产量，以及改变的油的脂肪酸组成。
当早期类胡萝卜素生物合成基因是八氢番茄红素合酶时，特定类胡萝卜素的显著增加包括增加10-50倍，优选至少50-100倍增加，更优选地至少50-200倍增加，如所见到的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素水平的增加。这一情况中叶黄素也增加，但是增加1.5-2倍。同时，总类胡萝卜素水平可增加至少10-25倍，优选地25-60倍，更优选地25-100倍。因此，用八氢番茄红素合酶基因转化的本发明的种子具有大大增加的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素及总类胡萝卜素水平，以及稍稍增加的叶黄素和其它类胡萝卜素包括八氢番茄红素的水平。在某些情况下，很难定量给定的类胡萝卜素化合物的增加倍数，因为在相应的未转化的对照植物种子中这些水平太低而不能测定。在欧洲油菜(Brassica napus)中，例如在用crtB基因转化的种子中可检测到各种水平的α-隐黄素、番茄红素、八氢番茄红素和六氢番茄红素，但是在未转化的欧洲油菜的种子中未检测到这些化合物。
当早期类胡萝卜素生物合成基因是GGPP合酶或八氢番茄红素脱氢酶时，在每个基因的至少一个转基因植物中获得增加1.5-2倍的叶黄素和β-胡萝卜素。在用crtE(GGPP合酶)基因转化的欧洲油菜的种子中也检测到番茄红素。crtE或crtI转化子中的总类胡萝卜素也增加约2倍。在表达crtE基因的欧洲油菜转基因植物中叶绿素水平也增加，提示香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)水平的增加，GGPP是类胡萝卜素、叶绿素和生育酚生物合成的分支点底物。在发育和成熟种子中可获得增加1.5-2倍的叶绿素水平。因此已被工程化以表达增加水平的crtB和crtE的植物也是感兴趣的类胡萝卜素的来源。
如本文所证实的，一个早期类胡萝卜素生物合成基因对流经类胡萝卜素途径的代谢能量通量的作用可被添加第二种早期类胡萝卜素生物合成基因而进一步影响。因此，添加第二种早期类胡萝卜素生物合成基因以增加经过类胡萝卜素生物合成途径的代谢流量也是本发明的内容之一，其可用于在次级类胡萝卜素生物合成基因存在或不存在下生产特定的类胡萝卜素。
当早期类胡萝卜素生物合成基因八氢番茄红素合酶与第二种早期类胡萝卜素生物合成基因八氢番茄红素脱氢酶共转化欧洲油菜时，特定类胡萝卜素的显著增加包括α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和叶黄素的增加，如通过仅表达crtB所观察到的。另外，在这种植物中番茄红素和八氢番茄红素水平也增加，但是这种番茄红素和八氢番茄红素水平的增加很难定量，因为在未转化的欧洲油菜中这些水平太低而不能测定。
另外，当crtI和crtB均表达时，可获得比仅表达crtB所观察到的高的总类胡萝卜素水平。在至少一种植物中获得是crtB植物中观察到的1.5倍的总类胡萝卜素水平。番茄红素水平也比仅用crtB转化的植物种子中获得的水平高，番茄红素水平可比纯合crtB植物种子中获得的水平高4-15倍。另外，也获得了降低的八氢番茄红素与总类胡萝卜素比率，其结果是α-胡萝卜素和β-胡萝卜素水平与仅用crtB获得的水平相比高1.2-1.8倍。在仅用八氢番茄红素合酶转化的植物种子中，八氢番茄红素水平占总类胡萝卜素的20％，而在八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素脱氢酶共转化的植物中，八氢番茄红素水平仅占总类胡萝卜素的4-7％。
由用一种早期类胡萝卜素基因的转化实现的这一代谢能量可通过用第二种基因转化而导入所选的代谢化合物中。如上所述，该第二种基因设计用于促进特定类胡萝卜素的合成，这种促进作用是通过促进感兴趣的类胡萝卜素的形成或终止途径以累积化合物而实现的。因此，在本发明的转化种子中可产生显著量的感兴趣的类胡萝卜素。
当初级类胡萝卜素生物合成基因八氢番茄红素合酶与次级类胡萝卜素生物合成基因β-胡萝卜素酮酶共转化时，可获得α-胡萝卜素，β-胡萝卜素和八氢番茄红素水平的增加，如仅用crtB转化所见一样。另外，海胆酮和角黄素水平也增加，但是这种增加很难定量，因为海胆酮和角黄素要么在欧洲油菜中不产生，要么在仅表达八氢番茄红素合酶的欧洲油菜和未转化的对照植物中水平太低而不能检测到。因此，为了产生特殊的类胡萝卜素如角黄素，本发明中可添加第三种类胡萝卜素生物合成基因如β-胡萝卜素羟化酶(crtZ)。另外，本发明中也可添加第四种类胡萝卜素生物合成基因如八氢番茄红素脱氢酶。
应理解的是类胡萝卜素海胆酮是从β-胡萝卜素产生角黄素的反应中间体。β-胡萝卜素酮酶(crtW)可与α-胡萝卜素或β-胡萝卜素的β环反应，β-胡萝卜素中的一个β环反应生成海胆酮，β-胡萝卜素中的两个β环反应生成角黄素，α-胡萝卜素中的一个β环反应生成4-酮-α-胡萝卜素。这一酶不能与α-胡萝卜素的ε环反应。因此，HPLC色谱上的两个附加峰以类似量产生，一个代表海胆酮，另一个代表4-酮-α-胡萝卜素。
当初级类胡萝卜素生物合成基因八氢番茄红素合酶与反义次级类胡萝卜素生物合成基因ε-环化酶共转化时，可获得α-胡萝卜素，β-胡萝卜素和八氢番茄红素水平的大大增加，如仅用crtB转化所见一样。观察到β-胡萝卜素与α-胡萝卜素的比率与仅用crtB转化的植物中的这一比率相比有一些不同，但仍观察到α-胡萝卜素和β-胡萝卜素水平均有较大增加。相反，叶黄素水平与未转化对照植物种子相比或者不变，或者增加，或者在某些情况下降低80％。
类胡萝卜素生物合成的起始大约在开花期后约15天在欧洲油菜种子中开始，而使用napin启动子的转化基因的表达在开花期后约18天开始。因此，为了用反义ε-环化酶更严格控制α-胡萝卜素途径以使得β-胡萝卜素途径类胡萝卜素积累，可使用一种早期启动子如Lesquerellaκ羟化酶启动子(见1997年7月18日申请的美国在审申请08/898,038)。因此，为了用反义技术增加特定类胡萝卜素的水平，可将一种早期种子特异性转录起始区与次级类胡萝卜素生物合成基因一起应用。
已用初级早期类胡萝卜素生物合成基因转化的本发明的种子还提供了新的油组合物的来源。使用八氢番茄红素合酶作为初级基因，例如，导致种子油中油酸含量大幅度增加。大幅度增加是指增加约5-40％，特别是增加约20-40％，更特别是增加约30-40％。因此，已用初级早期类胡萝卜素生物合成基因转化的本发明的种子提供了具有高油酸含量的改性油的来源。即，类胡萝卜素生物合成基因特别是早期类胡萝卜素生物合成基因可用于产生具有重量百分比至少70％油酸的种子。用本发明方法可改变任何种子中的油酸含量，甚至是天然具有高油酸含量的种子。用本发明方法改变天然具有高油酸含量的种子可导致总油酸含量高达80％。
重要的是亚油酸和亚麻酸含量也同时降低。亚油酸含量降低是指降低约10-25％，优选地降低25-40％，更优选地降低35-60％。亚麻酸含量降低是指降低约10-30％，优选地降低30-60％，更优选地降低50-75％。因此，本发明方法产生比天然油的氧化稳定性更高的油。本发明的改性油是低饱和、高油酸和低亚麻酸的。另外，本发明提供了单不饱和脂肪酸高的油，其是重要的饮食组成部分。
基于本文所公开的方法，可改性种子油以生产具有高油酸含量以及高水平感兴趣类胡萝卜素的油。高油酸和高α-胡萝卜素和β-胡萝卜素油的储存时间更长，因为油酸以及α-胡萝卜素和β-胡萝卜素含量均有助于提高稳定性。还应理解的是这种油是比天然红棕榈油(含有高水平饱和脂肪酸的油)更希望的类胡萝卜素来源。
本发明的转化的种子因此能提供类胡萝卜素产品以及改性脂肪酸的来源。当需生产感兴趣的特定类胡萝卜素化合物时，现有技术中有现成的纯化类胡萝卜素化合物的方法。以相同方式，可用现有技术中的方法生产提纯了类胡萝卜素的油。参见WO96/13149和Favati等(1988)，食品科学53：1532及其引述的参考文献。
转化的种子和胚胎还可用作筛选标记，即可基于增加的类胡萝卜素含量导致的颜色肉眼确定和选择转化的种子和胚胎。由于类胡萝卜素水平增加，转化的种子和胚胎呈现从黄至橙至红色的颜色。因此，当植物转化方法涉及在胚胎发生阶段时，如在棉花或大豆的转化中，在植物转化实验中类胡萝卜素基因可用作标记基因以使得能肉眼选择转化子。类似地，如在下述实施例中所述的，可容易地鉴别性状分离的种子。
下述实施例仅举例示出而非限制本发明。
                          实验实施例1  表达构建体和植物转化A.  SSU与E.uredovora类胡萝卜素生物合成基因的融合(1)八氢番茄红素合酶
经PCR连接SSU前导序列和crtB基因序列，SSU/crtB融合体的序列如图1所示。如下所述将crtB基因的5057-5363位核苷酸序列(根据Misawa等(1990)，文献同上)与SSU前导序列相连。在SSU前导序列的上游包括一BglII位点以利于克隆。crtB的第5057位胸苷被改变成腺苷以使SSU前导序列/crtB交界处的第一个氨基酸是蛋氨酸，并使剪接位点为cys-met-asn。SSU的天然剪接位点是cys-met-gln。注意Misawa等(1990，文献同上)指出crtB编码区的起始位点是在第5096位核苷酸，因此，在crtB/SSU融合体中在SSU剪接位点之后在crtB的编码区的公布的起点的上游有13个氨基酸。这些氨基酸中的12个是从欧文氏杆菌crtB上游序列翻译的，另一个是添加的蛋氨酸。然后将crtB的5363(EcoRV)至6009(EcoRI)位核苷酸序列附着于SSU-crtB融合体以获得完整的SSU-crtB融合构建体，命名为pCGN3373(图1)。(2)八氢番茄红素脱氢酶
Misawa等(植物(1993)4：833-840)描述了包含与豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基的转运肽序列融合的噬夏孢欧文氏杆菌crtI基因的质粒，克隆这一质粒的含有SSU-crtI融合体和nos 3′终止区的约2.1kb XbaI/EcoRI片段以从napin 5′启动子表达。(3)GGPP合酶
获得含有与噬夏孢欧文氏杆菌crtE基因融合的SSU转运肽的类似构建体，该SSU-crtE融合体存在于pCGN3360的约1.2kbBglII/BamHI片段中。B.  SSU与A.auriantiacum类胡萝卜素生物合成基因的融合(4)β-胡萝卜素羟化酶(crtZ)
经PCR连接SSU前导序列和crtZ基因序列。重新合成crtZ基因(Misawa等(1995)，文献同上)核苷酸序列以调整使用植物密码子。如下所述经PCR将重新合成的crtZ基因与SSU前导序列相连。在SSU前导序列翻译起始位点的上游包括一BglII位点并在crtZ终止密码子的下游包括一XhoI位点以利于克隆入napin表达盒。完整的ssu：crtZ融合体的核苷酸序列见图15所示。(5)β-胡萝卜素酮酶(crtW)
经PCR连接SSU前导序列和crtW基因序列。重新合成crtW基因(Misawa等(1995)，文献同上)核苷酸序列以调整使用植物密码子。如下所述经PCR将重新合成的crtW基因与SSU前导序列相连。在SSU前导序列翻译起始位点的上游包括一BglII位点并在终止密码子的下游包括-XhoI位点以利于克隆入napin表达盒。完整的ssu：crtW融合体的核苷酸序列见图16所示。C.用于植物转化的表达构建体(1)八氢番茄红素合酶
用BglII和BamHI酶切携带完整SSU/crtB融合体的pCGN3373，以切下SSU/crtB融合体，将得到的片段连接进pCGN3223的napin表达盒的BamHI位点(napin表达盒的描述见WO94/10288)。用HindIII消化得到的构建体pCGN3389以切下napin 5′-SSU/crtB-napin 3′片段，随后将该片段克隆进HindIII酶切的pCGN1559PASS，得到pCGN3390。pCGN1559PASS是用于农杆菌介导的二元载体，如McBride等(植物分子生物学(1990)14：269-276)所述，其是通过用含有下述限制性消化位点：Asp718/AscI/PacI/XbaI/BamHI/SwaI/Sse8387(PstI)/HindIII的接头区取代pCGN1559接头区而从pCGN1559制备的。pCGN3390的图谱见图2A。(2)八氢番茄红素脱氢酶
将上述含napin 5′/SSU-crtI融合体/nos 3′构建体的片段克隆进用于植物转化的二元载体，得到pCGN9010，pCGN9010的图谱见图2C。(3)GGPP合酶
用BglII和BamHI酶切携带完整SSU/crtE融合体的pCGN3360，以切下SSU/crtE融合体，将得到的1.2kb片段连接进pCGN3223的napin表达盒的BamHI位点。用HindIII消化得到的构建体pCGN3391以切下napin启动子-SSU/crtE napin 3′片段，随后将该片段克隆进HindIII酶切的pCGN1559PASS，得到pCGN3392，pCGN3392的图谱见图2B。(4)八氢番茄红素合酶+八氢番茄红素脱氢酶
将来自pCGN3389的napin 5′-SSU/crtB-napin 3′片段以及pCGN9010中的napin 5′/SSU-crtI融合体/nos 3′插入二元载体中，得到pCGN9009，pCGN9009的图谱见图2D。(5)反义ε-环化酶+八氢番茄红素合酶
用从拟南芥属ε-环化酶基因(Cunningham FX Jr(1996)，植物细胞8：1613-1626)设计的引物经PCR分离欧洲油菜的ε-环化酶基因。欧洲油菜的ε-环化酶基因的序列见图9(克隆9-4)和图10(克隆7-6)。通过将cDNA克隆9-4的XhoI/BamHI片段克隆进用XhoI和BglII消化的napin表达盒(pCGN3223)而制备反义构建体。将napin5′-反义ε-环化酶-napin 3′片段与napin 5′-SSU/crtB-napin 3′片段一起克隆进用于植物转化的二元载体，得到pCGN9002，如图2E所示。(6)反义β-环化酶+八氢番茄红素合酶
用从拟南芥属β-环化酶基因(Cunningham FX Jr(1996)，植物细胞8：1613-1626)设计的引物经PCR分离欧洲油菜的β-环化酶基因。欧洲油菜的β-环化酶基因cDNA 32-3的序列见图11。通过将β-环化酶cDNA克隆的XhoI片段克隆进用XhoI消化的napin表达盒(pCGN3223)而制备反义构建体。选择含有反义方向的β-环化酶的克隆。将napin 5′-反义β-环化酶-napin 3′片段与napin 5′-SSU/crtB-napin 3′片段一起克隆进用于植物转化的二元载体，得到pCGN9017，如图2F所示。(7)β-胡萝卜素羟化酶+八氢番茄红素合酶
通过除去crtB编码序列和napin 3′序列之间的限制性位点构建载体pCGN9003，通过用ClaI和XhoI消化，用Klenow补平末端，产生载体pCGN9000。用Asp718消化pCGN9000，并将含有napin5′/SSU：crtB/napin 3′的片段连接进二元载体pCGN5139。
用于植物转化的二元载体pCGN5139是用由CAMV 35S转录终止区(35S 5′)和转录终止(35S 3′)序列(Fraley等，美国科学院院刊(1983)80：4803-4807，Gardner等(1986)，植物分子生物学6：221-228)驱动的新霉素磷酸转移酶(nptII)卡那霉素抗性基因构建的。然后将35S5′-nptII-35S 3′片段作为-XhoI片段克隆进含有ori322，右边界(0.5kb)，lacZ，左边界(0.58kb)的载体中的右边界-lacZ和左边界序列之间。从pCGN1532(McBride and Summerfelt，植物分子生物学(1990)，14：269-276)的衍生物获得复制的ColEI和pRi源点以及庆大霉素抗性基因。最后，合成含有单切限制性位点的接头并克隆进Asp718/HindIII(在lacZ序列内)位点以产生二元载体pCGN5139。
将定位于质体的ssu：crtZ融合体作为BglII-XhoI片段克隆进napinpCGN3223种子表达盒以产生pCGN6203。用NotI消化携带具有ssu：crtZ的完整napin盒的质粒pCGN6203以切下含有ssu：crtZ编码区的napin盒。将切下的片段连接于携带napin SSU：crtB构建体的二元pCGN9003的NotI位点，得到的构建体pCGN6205(图2H)是用于农杆菌介导的转化的二元载体，如McBride等(植物分子生物学(1990)14：269-276)所述，其是通过用含有下述限制性消化位点：Asp718/AscI/PacI/XbaI/BamHI/SwaI/Sse8387(PstI)/HindIII的接头区取代pCGN1559接头区而从pCGN1559制备的。pCGN6205的图谱见图2H。(8)β-胡萝卜素酮酶+八氢番茄红素合酶
将定位于质体的ssu：crtW融合体作为BglII-XhoI片段克隆进napinpCGN3223种子表达盒以产生质粒pCGN6202。
用NotI消化携带具有ssu：crtW的napin盒的质粒pCGN6202以切下含有具ssu：crtZ的napin盒的DNA片段。将得到的片段连接于携带SSU：crtB napin构建体的二元pCGN9003的NotI位点，得到的构建体pCGN6204(图2G)是用于农杆菌介导的转化的二元载体，如McBride等(植物分子生物学(1990)14：269-276)所述，其是通过用含有下述限制性消化位点：Asp718/AscI/PacI/XbaI/BamHI/SwaI/Sse8387(PstI)/HindIII的接头区取代pCGN1559接头区而从pCGN1559制备的。pCGN6204的图谱见图2G。(9)八氢番茄红素合酶+β-胡萝卜素羟化酶+β-胡萝卜素酮酶
含有napin盒和ssu：crtZ的构建体pCGN6203用HindIII消化以切下含有napin ssu：crtZ的片段，将得到的HindIII片段克隆进pCGN6204的HindIII位点以产生含有napin ssu：crtB+napinssu：crtW+napin ssu：crtZ的三联crt基因二元pCGN6206(图2I)。D.植物转化
根据Radke等(理论及应用遗传学(1988)75：685-694和植物细胞报道(1992)11：499-505)所述获得含有上述构建体的转化的欧洲油菜植物。
用授权的美国专利5,004,863和5,159,135以及Umbeck等(1987)，生物/工程5：263-266所述方法或如共同在审申请08/539,176所述可获得含有八氢番茄红素合酶的转化的棉花植物陆地棉(Gossypium hirsutum)。
如Valverkens等(美国科学院院刊(1988)85：5536-5540)所述或如Bent等((1994)，科学265：1865-1860)或Bechtold等((1993)，C.R.Acad.Sci，Life Sciences 316：1194-1199)所述，用农杆菌介导的转化可获得含有八氢番茄红素合酶的转基因拟南芥菜(Arabidopsisthaliana)植物。实施例2  转基因植物的分析A.肉眼观察和分离比率
在开花后第21、28和35天标记napin-SSU前导序列/crtB植物，当在第28天收获第一种植物3390-1时，一些种子明显呈橙色。在35dpa，橙色已足以能获得分离比率。橙色种子这一趋势持续存在并且所获得的每17个收获株系可见1个。分离比率的表见表3。
                       表3
代次    植物#      橙色   绿色    比率      Chi平方
T2      3390-1     291    88      3∶1      0.64
T2      3390-2     150    22      不适合
T2      3390-8     293    87      3∶1      0.90
T2      3390-4     277    82      3∶1      0.89
T2      3390-5     243    62      3∶1      1.90
T2      3390-7     236    89      3∶1      0.99
T2      3390-6     307    5       63∶1     0.00
T2      3390-3     121    50      不适合    1.64
T2      3390-11    294    105     3∶1      0.37
T2      3390-15    287    83      3∶1      1.30
T2      3390-16    187    65      3∶1      0.08
T2      3390-17    105    104     不适合
T2      3390-12    119    28      3∶1      2.78
T2      3390-14    283    107     3∶1      1.23
T2      3390-19    238    94      3∶1      1.94
T2      3390-20    251    4       63∶1     0.00
T2      3390-27    229    4       63∶1     0.04B.发育种子的类胡萝卜素分析
如下所述从约开花后35天收获的种子中提取类胡萝卜素。在200微升70％丙酮/30％甲醇中研磨来自转基因植物橙色种子的8个种子样品以及212/86品种油菜对照植物的8个种子样品，然后将磨碎的种子混合物在微离心机中旋转约5分钟并取出上清。将沉淀的种子材料再进行两次70％丙酮/30％甲醇提取，合并三次上清并标记为A/M提取物。
在此步提取中，对照种子沉淀是白色的，而来自转基因种子的种子沉淀是黄色。随后将沉淀用乙醚提取两次，合并得到的上清并标记为E提取物。然后如下将A/M提取物转移至乙醚中：向提取物中加入450微升乙醚和600微升水，随后除去乙醚层。然后用400微升乙醚再洗涤A/M提取物两次，合并来自3次A/M洗涤的乙醚组分。上述E提取物用400微升水洗1次并与A/M乙醚组分合并。用氮气将合并的乙醚组分的体积吹拂至约300微升并用针筒微量过滤器过滤。用约100微升乙醚洗样品管并类似过滤洗涤液，然后与最初的滤液合并，得到的总体积约150微升。50微升等份储存在-20℃直至进一步分析，其余的100微升样品如下皂化。向每个100微升样品中加入100微升在甲醇中的10％氢氧化钾(KOH)并将混合物于室温在黑暗处保存约2小时。然后向样品中加入400微升水并取出乙醚相，为了更好地实现相分离，用饱和氯化钠代替水。然后用100微升乙醚提取两次水溶液，合并乙醚样品并用水洗。
随后在Rainin微吸附C18柱(25厘米长，4.6毫米外径)上以1.5ml/min的流速经HPLC分析来分析该皂化样品。所用洗脱梯度为：
A＝乙腈
B＝己烷/二氯甲烷(1∶1)
C＝甲醇初始溶液为70∶20∶10(A∶B∶C)。在2.5分钟时，在5分钟内将溶液梯度转变至65∶25∶10(A∶B∶C)并保持12.5分钟，然后在2分钟内将溶液梯度转变至70∶20∶10(A∶B∶C)，接着延迟3分钟，之后再注射下一样品。在450和280nm持续监测洗脱样品的吸收值，并用已知的化学和生物学标准以鉴别各种吸收峰。
在图3和图4中分别提供了对照和pCGN3390转化的种子的皂化样品的分析结果。在转基因植物种子中清楚地观察到α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和八氢番茄红素水平的增加，以及羟化的类胡萝卜素叶黄素水平的稍稍增加。C.来自crtB转基因植物的成熟种子的类胡萝卜素和生育酚分析
将成熟3390T2种子送至一分析实验室用现有技术已知的标准HPLC方法进行定量分析。这些分析的结果见下表4。化合物水平以μg/g表示。
标为“Maroon”的种子基于种子颜色而选择，具有橙色胚胎的种子在成熟时呈栗色，相反这一栽培品种的野生型植物的种子表观是深棕色。标为“Random”的种子没有选择颜色。由于3390-1的分离比率是3∶1，所以“Random”群中包括了一定比例的无效。Maroon群只含有转基因样品，由于努力从这一群体中除去无效，包括纯合子可能是有利的。
                      表4
化合物              对照        3390-1      3390-1
                                RANDOM      MAROON
叶黄素              7.2         18          26
玉米黄质            nd*        nd          nd
α-隐黄素           nd          8           15
β-隐黄素           nd          nd          nd
番茄红素            nd          2.3         5.1
顺番茄红素          nd          2.9         5.4
α-胡萝卜素         0.6         124         244
β-胡萝卜素         0.9         177         338
顺-β-胡萝卜素      0.2         12          26
其它                6           34          51
总有色类胡萝卜素    14.9        378.2       710.5
八氢番茄红素        nd          62          139
六氢番茄红素        nd          24          54
总全部类胡萝卜素    14.9        464.2       903.5
α-生育酚           74          93          109
γ-生育酚           246         188         95
δ-生育酚           3           5           5*nd＝未测
在非转基因样品中，“其它”大多包括极性非常大的化合物如新黄素、堇菜黄素等。在转基因样品中“其它”包括这些化合物及其它化合物，如ζ-胡萝卜素、四氢番茄红素和单环状类胡萝卜素。
来自欧洲油菜品种Quantum(SP30021)的转化植物的3390 T2种子的类胡萝卜素分析结果见图12所示。
来自欧洲油菜品种212/86(SP001)的转化植物的3390 T3种子的类胡萝卜素分析结果见图13所示。
上述结果证实由于表达crtB基因而在成熟种子中α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的水平显著增加。通常，类胡萝卜素的总增加相当高，有色类胡萝卜素水平增加50倍，如果包括八氢番茄红素和六氢番茄红素则增加高达60倍。清楚的是经过类异戊二烯途径的通量大大增加。另外注意到α-生育酚(维生素E)水平也增加近50％。D.萌发研究
将10个成熟3390-1种子和10个212/86对照种子种植在土壤中并在人进得去的培养室中培养。转基因种子萌发迟于对照种子1-2天，但全部10个种子均萌发。转基因种子刚萌发时呈黄粉色，但在1-2天内变为绿色。当出现第一片真叶时，没有观察到颜色差异。从转基因和对照种子萌发的植物均发育正常。E.脂肪酸分析
通过对从转基因植物3390-1和3390-8收获的单个T2种子进行GC分析确定成熟种子的脂肪酸组成。分析来自Random(R)和Maroon(M)群(如上所述)的单个种子，并与来自212/86对照(SP001-1)的种子相比。这些分析的结果示于下表5，表示为％(重量)总脂肪酸。
                                                                            表5
                                                               3390-1和3390-8株系的脂肪酸组成
     样品   10∶0  12∶0     14∶0  16∶0  16∶1  18∶0     18∶1 18∶2   18∶3   20∶0   20∶1   20∶2     22∶0
对照对照对照对照对照3390-1-R3390-1-R*3390-1-R3390-1-R*3390-1-R3390-1-R3390-1-R3390-1-R3390-1-R3390-1-R3390-1-R*3390-1-R3390-1-R3390-1-R3390-1-R3390-1-R3390-1-R3390-1-R3390-1-R*3390-1-R*3390-1-R*3390-1-R3390-1-R3390-1-R3390-1-R*3390-1-R3390-1-R*3390-1-R3390-1-R3390-1-R*3390-1-M3390-1-M3390-1-M3390-1-M3390-1-M3390-1-M3390-1-M3390-1-M3390-1-M3390-1-M   1.51.82.02.21.62.81.53.51.52.21.92.51.71.92.51.52.81.81.71.72.72.01.80.91.41.42.21.51.61.32.11.32.11.51.22.82.01.51.51.81.51.51.81.52.3     000000000000000000000000000000000000000000000     0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1     5.15.15.05.24.74.84.74.24.74.44.54.24.44.24.24.74.64.04.44.64.24.54.94.54.84.54.53.84.56.24.35.04.44.54.74.04.94.44.54.24.74.54.44.44.3     0.40.40.40.40.40.50.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.40.30.30.40.30.30.40.30.40.30.30.30.30.50.30.30.30.30.30.30.40.30.30.30.30.30.30.30.3     1.71.71.61.61.83.61.52.61.93.12.43.42.62.32.71.73.72.32.72.62.83.03.41.71.71.72.52.72.61.42.41.63.33.31.92.83.33.22.83.12.93.22.92.63.0     59.960.160.557.262.769.958.171.161.073.672.771.773.572.472.058.571.872.473.971.472.172.571.855.957.157.873.475.971.953.672.357.872.772.659.969.870.373.472.773.571.672.672.073.673.0 17.116.616.218.215.310.619.39.617.88.910.610.010.09.910.118.59.111.19.910.99.99.710.418.818.018.59.78.110.621.710.718.89.210.117.110.611.19.510.09.610.710.210.410.09.7   12.012.112.012.711.34.812.35.810.44.44.75.14.56.35.112.64.25.24.25.55.04.64.215.614.413.54.64.65.513.25.113.04.84.612.67.14.94.35.14.75.14.35.24.54.5   0.60.60.60.60.61.20.51.00.71.20.91.11.00.91.00.61.30.91.01.01.11.21.20.50.60.60.91.01.00.50.90.51.21.20.60.91.21.31.11.11.11.21.11.11.1   1.21.21.21.31.21.11.2.1.21.31.11.31.01.21.21.21.21.21.31.21.31.31.31.21.31.21.31.21.41.31.11.21.31.21.11.31.21.21.31.31.21.21.31.21.21.2   0.10.10.10.10.10.00.10.00.10.00.10.00.10.10.10.10.00.10.10.10.00.10.00.10.10.10.00.00.10.10.00.10.00.10.10.00.10.00.00.00.10.00.10.10.0     0.30.30.30.40.30.60.30.60.30.70.60.60.60.50.60.30.70.50.60.60.60.70.70.30.30.30.50.60.60.30.60.30.70.70.40.40.70.80.70.60.70.80.60.70.6
样品   10∶0   12∶0   14∶0   16∶0   16∶1   18∶0   18∶1   18∶2   18∶3   20∶0   20∶1   20∶2   22∶0
3390-8-R*3390-8-R3390-8-R3390-8-R*3390-8-R*3390-8-R3390-8-R*3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R3390-8-R*3390-8-R3390-8-R3390-8-R*3390-8-R*3390-8-M3390-8-M3390-8-M3390-8-M3390-8-M3390-8-M3390-8-M3390-8-M3390-8-M3390-8-M   1.02.11.51.21.51.81.12.21.72.41.92.01.51.52.02.12.21.81.71.71.51.51.71.41.51.41 41.71.01.11.81.51.91.61.32.12.11.62.11.6   0000000000000000000000000000000000000000   0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.00.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1   4.94.24.44.94.74.24.74.64.64.74.64.44.34.44.94.55.14.24.74.64.54.44.44.54.85.84.44.64.64.64.74.34.54.44.44.33.94.64.84.5   0.30.30.30.30.30.30.30.30.40.30.40.30.30.30.40.40.40.30.30.40.30.40.30.40.40.40.30.40.30.30.40.30.40.30.30.30.30.30.40.3   1.62.72.31.71.62.91.53.02.42.93.02.82.62.73.33.62.92.63.02.83.01.92.52.83.02.92.72.81.61.43.33.03.72.53.03.21.62.83.22.9   59.271.972.559.758.773.456.971.472.574.072.773.271.872.671.173.067.673.572.573.774.770.071.873.372.654.071.272.659.656.570.173.073.173.473.774.071.671.070.372.7   18.910.210.418.218.59.219.310.011.08.49.79.710.710.510.48.812.39.99.99.58.511.811.19.710.620.010.810.018.520.411.110.38.99.79.68.911.911.810.79.9   11.95.65.711.612.25.214.15.24.84.04.84.55.84.94.94.36.54.84.64.14.27.25.24.94.113.06.05.112.313.45.54.34.25.14.44.15.74.85.24.8   0.51.00.90.60.61.10.51.10.91.11.01.01.01.01.11.31.11.01.21.11.20.81.01.11.10.81.01.00.50.51.21.11.31.01.11.20.71.01.21.1   1.21.21.41.31.31.31.11.21.31.21.21.31.31.31.11.21.21.31.31.31.21 41.31.21.21.11.31.21.21.31.11.21.21.31.31.21.51.31.21.3   0.10.10.10.10.10.00.10.10.10.00.00.00.10.10.10.00.10.10.10.10.00.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.00.10.00.10.10.10.10.0   0.30.60.60.40.40.60.20.70.50.70.60.60.60.60.60.70.70.60.70.70.70.50.60.60.70.40.60.60.30.30.70.70.70.70.70.60.50.60.70.7
上述数据证实在来自每个转基因株系的种子中油酸(18∶1)的大幅度增加，油酸的增加是以消耗亚油酸和亚麻酸得到的，后两者在转基因株系中均降低。还观察到18∶0和20∶0脂肪酸的增加。基于这些数据，可鉴别Random群中的无效种子，并在表5中以星号(*)标记。来自每个转基因株系的Maroon群的所有种子均观察到有改变的脂肪酸组成，证实改变的脂肪酸组成是表达crtB基因所致。
图5-7提供了转基因种子中脂肪酸数据的趋势，其提示脂肪酸组成变化与观察到的18∶1水平增加的正相关性和负相关性。18∶1的增加与18∶2和18∶3的降低相关(图5)，18∶1的增加也与18∶0和20∶0的增加相关，但是对16∶0的影响甚小(图6)。18∶0的增加也与20∶0的增加相关(图7)。F.来自crtE转基因植物的成熟种子的类胡萝卜素分析
分析转化后表达噬夏孢欧文氏杆菌crtE基于的3392欧洲油菜植物的成熟T2种子中的类胡萝卜素。在植物3392-SP30021-16的种子中观察到叶黄素和β-胡萝卜素水平增加约2倍。在这些种子中也检测到番茄红素，但在未转化的对照植物中未检测到。来自7个另外的3392转化子的种子的分析未揭示类胡萝卜素水平的显著增加。G.  crtE转基因植物中叶绿素和生育酚水平的分析
用分光光度分析(Bruinsma，J.1961，叶绿素的分光光度法测定评价，生物化学生物物理杂志52：576-578)分析转基因3392欧洲油菜植物的成熟T2种子中的叶绿素水平。将3392转基因植物的水平与表达八氢番茄红素合酶(crtB)的转基因欧洲油菜植物的种子和未转化的对照植物的种子中的水平进行比较，结果示于下表6。
                        表6
                                     色素浓度(μg/gFW)
 基因和样品            总类胡萝卜素    总叶绿素
 八氢番茄红素合酶
 27 DPA SP001              53             676
 27 DPA T4 3390-1-6        354            282
 40 DPA SP001对照          47             471
 40 DPA T4 3390-1-6        534            179
 50 DPA SP001对照          16             125
 50 DPA T4 3390-1-6        648            125GGPP合酶
 35 DPA SP30021对照        68             407
 35 DPAT2 3392-4           65             660
 35 DPA T2 3392-16         73             648
 成熟SP30021对照           21             35
 成熟T2 3392-4             25             31
 成熟T2 3392-16            50             60
两个株系的35DPA种子中的叶绿素浓度与对照植物的水平相比增加约60％。该初步结果证实在种子发育期间GGPP合酶基因增加了用于叶绿素生物合成的GGPP底物的可利用性。3392-16株系的成熟种子具有比对照高的叶绿素和类胡萝卜素浓度。H.来自crtI转基因植物的成熟种子的类胡萝卜素分析
分析转化以表达反义番茄红素ε-环化酶基因的9010欧洲油菜植物的成熟T2种子中的类胡萝卜素。分析了9个转基因植物的种子的类胡萝卜素含量。在一个株系9010-SP30021-10的种子中观察到与对照植物相比增加约2倍的叶黄素、β-胡萝卜素和总类胡萝卜素水平。I.来自crtB+crtI转基因植物的成熟种子的类胡萝卜素分析
如下提取成熟9009 T2种子的类胡萝卜素水平并在HPLC上定量。在研钵中将约100毫克种子在带有0.2毫升内标的3毫升提取溶剂(己烷/丙酮/7醇(50/25/25v/v))中研磨，内标为在乙腈/二氯甲烷/甲醇(50/40/10v/v)中的5mg/ml β-脱辅基-8′-胡萝卜醛(溶于100微升己烷中)。将提取液转移至一新玻璃管，用提取溶剂再次提取留下的种子并与第一次提取溶液合并。重复提取直至肉眼观察提取溶液为无色。短暂涡旋混和合并的提取物然后离心约5分钟，得到的上清转移至一新管中并在氮气下干燥，残渣重悬于2毫升己烷中。加入在甲醇中的氢氧化钾至终浓度为5％，将溶液在4℃于黑暗中保温过夜。然后向溶液中加入2毫升己烷和1毫升饱和氯化钠。短暂涡旋混和溶液然后离心约5分钟，将上层己烷层转移至一新玻璃管中，将该上层相与先前的己烷相混和。重复此过程直至己烷相无色。合并的己烷相在氮气下干燥，残渣溶解于2.0毫升乙腈/二氯甲烷/甲醇(50/40/10v/v)中。将该溶液经0.45微米滤膜过滤并收集在棕色自动取样管中。在惠普1050高效液相色谱(HPLC)上测定类胡萝卜素浓度，类胡萝卜素的等度分离在惠普反相C-18(5μ)柱(4.6mm×20cm)上在30℃进行。流动相为乙腈/二氯甲烷/甲醇(80/10/10v/v)，流速为1.0ml/min，样品注射体积为20微升(操作时间为20分钟)。有色类胡萝卜素的常规检测是在450nm，八氢番茄红素在280nm，六氢番茄红素在365nm。在250nm和600nm进行峰纯度的光谱扫描。校正上斜度、顶点和下斜度的峰光谱并重叠，重叠的光谱是峰纯度的证据。结果示于下表7，其中类胡萝卜素水平以μg/gFW表示。
                                    表7
                                                  β-
样品ID#          叶黄素  番茄红素  α-胡萝卜素  胡萝卜素  八氢番茄红素    总计
SP30021对照        36      ND        ND           4         ND            40
3390-SP001-1-6-15
(T5 Homo)          54      4         552          638       277           1525
9009-SP30021-1     44      44        336          691       42            1157
9009-SP30021-6     53      87        689          1118      152           2099
9009-SP30021-9     48      34        487          798       194           1561
9009-SP30021-10    33      25        248          489       34            829
9009-SP30021-12    31      ND        ND           2         ND            33
9009-SP30021-14    42      37        404          791       81            1355
9009-SP30021-15    37      15        137          278       ND            467
9009-SP30021-16    50      38        428          828       65            1409
结果表明与转化表达crtB的植物相同，表达crtB和crtI的植物含有显著增加的总类胡萝卜素水平。另外，很明显crtI和crtB的表达导致在crtB转化子中累积的八氢番茄红素集合的进一步修饰。在仅用crtB转化的株系中八氢番茄红素水平降低至总类胡萝卜素的约20％，在crtB+crtI株系中降低至总类胡萝卜素的4-7％。这表明八氢番茄红素脱氢酶在增加经过类胡萝卜素/类异戊二烯途径的代谢通量方面与八氢番茄红素合酶有一协同效应，并提供了比仅表达crtB所获得的所需类胡萝卜素化合物如α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的更高的增加。除了八氢番茄红素的组成转变之外，增加的通量看起来也导致总类胡萝卜素产量的增加，例如，9009-10的分离的T2种子群中的类胡萝卜素水平明显高于3390-1-6-15的3390纯合种子群中检测到的水平。J.来自crtB+反义ε-环化酶转基因植物的成熟种子的类胡萝卜素分析
使用上述实施例2I中描述的方法提取并分析9002转化子的成熟种子的类胡萝卜素。结果示于图14。
初步结果示出β-胡萝卜素与α-胡萝卜素的比率改变，另外与非转基因对照相比有几个株系显示明显降低的叶黄素水平。在9002T2株系，β-胡萝卜素与α-胡萝卜素的比率平均为1.5，范围为1.1-2.5，相比之下，含有crtB的T2 3390株系的β-胡萝卜素与α-胡萝卜素的比率平均为1.9，范围为1.5-2.4。K.来自crtB转基因棉花植物的成熟种子的类胡萝卜素分析
从棉花中收集成熟3390 T2种子并根据上述实施例2I中描述的方法制备并分析类胡萝卜素。结果示于下表8，其中类胡萝卜素水平以μg/gFW表示。
                              表8样品ID#        叶黄素  番茄红素  α-胡萝卜素  β-胡萝卜素  八氢番茄红素  总计C130对照       2       ND        ND           ND           ND            23390-C130-5-1  7       ND        486          420          517
在3390-C130-5-1植物的种子中观察到叶黄素水平增加约3倍，在这一株系中也观察到α-胡萝卜素，β-胡萝卜素和八氢番茄红素，而在未转化的对照植物中没有检测到。β-胡萝卜素水平比α-胡萝卜素水平高20倍。总类胡萝卜素水平增加超过250倍，八氢番茄红素约占总类胡萝卜素水平的80％。L.来自crtB+crtW转基因植物的成熟种子的类胡萝卜素分析
如下提取成熟6204 T2种子的类胡萝卜素水平并在HPLC上定量。在研钵中将约100毫克种子在带有0.3毫升内标的3毫升提取溶剂(己烷/丙酮/乙醇(50/25/25v/v))中研磨，内标为在乙腈/二氯甲烷/甲醇(50/40/10v/v)中的5mg/ml β-脱辅基-8′-胡萝卜醛(溶于100微升己烷中)。将提取液转移至一新玻璃管，用2毫升提取溶剂再次提取留下的种子并与第一次提取溶液合并。重复提取直至肉眼观察提取溶液为无色。短暂涡旋混和合并的提取物然后离心约5分钟，得到的上清转移至一新管中并在氮气下干燥，干燥样品在4℃于黑暗中储存过夜。残渣重悬于3毫升己烷和1毫升甲醇中，加入1毫升饱和氯化钠并混和。短暂离心样品，将上层相转移至一新管中。用2毫升己烷再次提取下层相并离心。将该上层相与先前的己烷相混和。重复此过程直至己烷相无色。合并的己烷相在氮气下干燥，残渣溶解于2.0毫升乙腈/二氯甲烷/甲醇(50/40/10v/v)中。将该溶液经0.45微米滤膜过滤并收集在棕色自动进样管中。在惠普1100高效液相色谱(HPLC)上测定类胡萝卜素浓度，类胡萝卜素的等度分离在Spherisorb ODS2反相C-18(5μ)柱(4.6mm×20cm)上在30℃进行。流动相为含有150mM 7酸铵/0.1三甲胺的82 7腈/10二噁烷/8甲醇(v/v)，流速为1.0ml/min，样品注射体积为20微升(操作时间为46分钟)。有色类胡萝卜素的常规检测是在450nm，八氢番茄红素在280nm，六氢番茄红素在365nm。在250nm和600nm进行峰纯度的光谱扫描。校正上斜度、顶点和下斜度的峰光谱并重叠，重叠的光谱是峰纯度的证据。结果示于下表10，HPLC色谱示于图17。下表9描述了图17所示的相关峰保留时间，其中类胡萝卜素水平以μg/gFW表示。表9保留时间    面积          Amt/面积      量          化合物名称[min]       [mAU*s]                    [ug/gFW]3.500                                                虾青素5.428       721.34        4.3×10-3     59.33       叶黄素5.831       169.38        4.26×10-3    13.81       玉米黄质6.533       527.83        4.45×10-3    44.88       角黄素7.651       553.82        3.59×10-3    38.02       内标14.403                                               海胆酮18.453      68.21         7.02×10-3    9.16        番茄红素22.278                                               四氢番茄红素31.363      2966.38       3.52×10-3    199.36      α-胡萝卜素33.870      2854.27       3.86×10-3    210.64      β-胡萝卜素44.166      524.14        1.59×10-2    158.86      八氢番茄红素总计：                                   734.05
                                      表10
                                                      (μg/gFWt.)样品ID          分离比率  叶黄素  角黄素  番茄红素   α-       β-  八氢番茄红素    总计
                                              胡萝卜素  胡萝卜素SP30021           纯合      21      ND      ND       ND        ND       ND           213390-SP30021-12   纯合      44      ND      9        416       578      279          13266204-SP30021-1    3∶1      41      22      9        223       252      192          7446204-SP30021-2    15∶1     43      24      9        231       283      236          8316204-SP30021-3    3∶1      51      8       6        165       268      65           5686204-SP30021-5    63∶1     56      25      11       292       296      305          9926204-SP30021-6    不适合    61      47      9        206       218      165          7206204-SP30021-7    3∶1      41      13      8        180       232      160          6346204-SP30021-8    3∶1      41      16      6        68        108      54           2996204-SP30021-9    ＞63∶1   57      39      10       233       245      245          8376204-SP30021-10   不适合    33      9       7        165       24       103          3436204-SP30021-11   3∶1      39      7       9        198       266      145          6626204-SP30021-12   15∶1     40      15      10       212       281      172          7346204-SP30021-13   15∶1     52      44      9        207       223      247          7886204-SP30021-15   不适合    54      20      8        205       291      160          7386204-SP30021-21   3∶1      44      11      8        142       216      126          5516204-SP30021-24   3∶1      47      9       9        149       202      89           5096204-SP30021-25   15∶1     37      33      8        235       257      243          8196204-SP30021-28   15∶1     46      11      9        225       288      123          7076204-SP30021-29   无效      18      ND      ND       ND        ND       ND           186204-SP30021-30   3∶1      33      11      8        203       246      154          6596204-SP30021-36   15∶1     31      17      7        197       275      95           6286204-SP30021-37   3∶1      38      10      7        137       181      117          4906204-SP30021-41   3∶1      42      9       8        250       339      170          8216204-SP30021-42   3∶1      32      4       6        178       216      103          5396204-SP30021-43   15∶1     54      25      10       242       304      151          7926204-SP30021-44   不适合    48      27      7        226       249      129          692
结果表明与转化表达crtB的植物相同，表达crtB和crtW的植物含有显著增加的总类胡萝卜素水平。另外，结果显示与仅用crtB转化的植物的种子以及未转化的对照植物的种子获得水平相比，角黄素水平增加。另外在表达crtB和crtW的植物中也产生其它产物。一种反应中间体海胆酮以及可能的4-酮-α-胡萝卜素的水平也增加(图17)。M.来自crtB转基因拟南芥属植物的成熟种子的类胡萝卜素分析
从拟南芥属中收集成熟3390 T2种子并根据上述实施例2I中描述的方法制备并分析类胡萝卜素提取物。结果示于下表11，其中类胡萝卜素水平以μg/gFW表示。表11用crtB转化的T2拟南芥属种子的类胡萝卜素
                        类胡萝卜素浓度(μg/gFW)
            收获
                     叶黄素  番茄  α-胡萝 β-胡萝  八氢       总计样品ID          日期
                             红素  卜素    卜素     番茄红素AT001-50 VAR    6/4/98   18      ND     ND      2       ND          203390-AT001-1    6/4/98   24      ND     7       20      7           583390-AT001-2    6/17/98  57      5      68      139     98          368
初步结果显示来自用napin-crtB转化的拟南芥属一个株系的种子的总类胡萝卜素浓度增加18倍，这一株系的β-胡萝卜素水平也增加约70倍(表11)。实施例3 crtB植物的杂交A.转基因油类性状
为了评价napin-crtB转基因植物的高油酸性状和其它油类性状的表达，制备3390-1-6-8与山竹果硫酯酶(5266)和肉豆蔻硫酯酶(3854，见WO96/23892)的杂交种。还与两种低亚油酸(LPOO4和LP30108)品种杂交。在分离的种子上进行类胡萝卜素和脂肪酸组成的半数种子分析，半数种子平均值示于下表12和表13。
                      表12
         从3390杂交产生的半数种子中的类胡萝卜素水平
                                             八氢番    α-       β-杂交                                    叶黄素
                                             茄红素    胡萝卜素  胡萝卜素  总计F1 3390-SP001-1-6-8×SP30021  21.6       26.2    271.5     413.1     732.4F1 3390-SP001-1-6-8×5266-SP30021-5-26   18.0    21.7      187.9     284.1     511.7F1 3390-SP001-1-6-8×5266-SP30021-35-2   16.2    22.1      223.0     318.4     579.7F1 3390-SP001-1-6-8×5266-SP30021-35-12  19.5    22.9      196.8     312.8     552.0F1 3390-SP001-1-6-8×LP30108-19          23.7    22.7      213.4     355.0     614.8F1 LP30108-19×F1 3390-SP001-1-6-8       16.4    19.6      156.7     224.5     417.2
                                  表13
                 从3390杂交产生的半数种子中的脂肪酸组成株系_ID
                ％14∶0     ％16∶0     ％18∶0     ％18∶1     ％18∶2     ％18∶3     ％20∶0(3390-SP001-1-6-8×     0.05        3.55         1.70       74.78       11.29       5.71         0.73SP30021)(3390-SP001-1-6-8×     0.06        3.84         11.37      62.86       11.06       5.08         3.385266-SP30021-35-12)(3390-SP001-1-6-8×     0.06        3.68         11.27      64.80       9.81        5.16         3.045266-SP30021-35-2)3390-SP001-1-6-8×      0.06        3.66         15.36      60.78       9.30        4.77         3.875266-SP30021-5-26(3390-SP001-1-6-1×     2.69        9.80         3.65       64.62       9.72        4.57         1.513854-SP30021-20-3)(3390-SP001-1-6-1×     6.14        16.35        5.12       54.91       8.23        4.23         2.033854-SP30021-20-1)(3390-SP001-1-6-1×     0.07        3.82         11.67      64.52       11.46       3.14         3.085266-LP004-2-31)(3390-SP001-1-6-8×     0.05        3.80         1.44       73.66       14.02       3.93         0.67LP30108-19)(LP30108-19×                 0.04        3.31         1.79       79.69       9.26        2.97         0.753390-SP001-1-6-8)SP001-4-10           0.07        4.44         0.99       56.06       21.79       14.31        0.443390-SP001-1-6-8     0.04        3.46         1.44       77.26       9.30        5.71         0.63
上述结果证实，转化植物以在植物种子组织中优势表达的启动子调控下表达一种早期类胡萝卜素生物合成基因可以获得α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的大幅度增加(100-200倍)，总类胡萝卜素也增加60倍。这一通量的增加引发了生产上述特制产品的途径，并还导致α-生育酚(维生素E)的产量增加。
另外，明显的是转基因植物种子中的脂肪酸组成也能改变，以这种方式，可用种子生产新的产品，提供特定类胡萝卜素的生产，提供高油酸油等。
说明书中提到的所有出版物和专利申请指示了本发明所涉及的领域的技术人员的知识水平。所有出版物和专利申请均引入本文作参考，正象所具体指明的各出版物和专利申请引入本文作参考。
尽管为清楚起见经举例和实施例描述了本发明，但显然在所附权利要求书范围内可作某些改变和修改。

Claims (35)

1、一种用于改变宿主植物种子中的叶黄素类物质含量的方法，所述方法包括如下步骤：
用一种构建体转化宿主植物的细胞，所述构建体包含作为可操纵元件的来自在植物种子中优势表达的基因的转录起始区、质体转运肽、衍生自类胡萝卜素生物合成基因编码区的DNA序列以及转录终止区，
从所述的转化细胞产生转化的宿主植物，以及
培养含有所述构建体的所述转化的宿主植物或其子代，培养条件是能产生具有改变的叶黄素类物质含量的种子。
2、权利要求1的方法，其中在所述种子中产生一新的叶黄素类物质以实现所述改变。
3、权利要求1的方法，其中所述种子产生的至少一种叶黄素类物质的水平增加以实现所述改变。
4、权利要求1的方法，其中所述种子产生的至少一种叶黄素类物质的水平降低以实现所述改变。
5、权利要求1的方法，其中所述的DNA序列通过反义作用或共抑制作用降低所述宿主植物的天然类胡萝卜素生物合成基因的表达。
6、权利要求5的方法，其中所述的类胡萝卜素生物合成基因是番茄红素ε-环化酶。
7、权利要求1的方法，其中所述叶黄素类物质含量的改变是通过从所述类胡萝卜素生物合成基因DNA序列表达的蛋白质作用于所述植物种子中存在的至少一种类胡萝卜素底物而实现的。
8、权利要求7的方法，其中所述的类胡萝卜素底物选自α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、玉米黄质、角黄素、海胆酮、羟基角黄素、β-隐黄素、阿东黄质、α-隐黄素和虾青素。
9、权利要求1的方法，其中所述的类胡萝卜素生物合成基因选自八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、β-胡萝卜素羟化酶、番茄红素β-环化酶和β-胡萝卜素酮酶。
10、权利要求1的方法，其中所述的类胡萝卜素生物合成基因不是所述宿主植物天然存在的。
11、权利要求1的方法，其中所述的类胡萝卜素生物合成基因来自原核生物。
12、权利要求1的方法，其中所述的宿主植物是油料作物芥属植物。
13、权利要求1的方法，其中所述的宿主植物是棉花。
14、权利要求1的方法，其中所述的转录起始区来自在芥属种子组织中优势表达的一个基因。
15、权利要求14的方法，其中所述的转录起始区来自napin基因。
16、种子中具有改变的叶黄素类物质含量的转化的宿主植物，其根据权利要求1的方法产生。
17、权利要求15的转化的宿主植物的种子。
18、一种在来自宿主植物的种子中产生增加水平的叶黄素类物质的方法，所述方法包括用下述表达盒转化宿主植物：以及1)包含作为可操纵元件的来自在植物种子中优势表达的基因的转录起始区、质体转运肽、衍生自第一种类胡萝卜素生物合成基因编码区的DNA序列以及转录终止区的表达盒，2)包含作为可操纵元件的来自在植物种子中优势表达的基因的转录起始区、质体转运肽、衍生自第二种类胡萝卜素生物合成基因编码区的DNA序列以及转录终止区的表达盒，其中所述的第一种基因和第二种基因是选自八氢番茄红素合酶、β-胡萝卜素羟化酶和β-胡萝卜素酮酶的类胡萝卜素生物合成基因。
19、权利要求18的方法，其中所述的第一种和第二种类胡萝卜素生物合成基因编码β-胡萝卜素羟化酶和β-胡萝卜素酮酶。
20、权利要求19的方法，其中在所述种子中虾青素含量增加。
21、权利要求18的方法，进一步包括用3)包含作为可操纵元件的来自在植物种子中优势表达的基因的转录起始区、质体转运肽、衍生自第三种类胡萝卜素生物合成基因编码区的DNA序列以及转录终止区的表达盒转化所述的宿主植物，其中所述的第三种类胡萝卜素生物合成基因编码选自八氢番茄红素合酶、β-胡萝卜素羟化酶和β-胡萝卜素酮酶的类胡萝卜素生物合成基因。
22、权利要求18的方法，其中所述的第一种和第二种类胡萝卜素生物合成基因编码八氢番茄红素合酶和β-胡萝卜素羟化酶。
23、权利要求21的方法，其中所述的第一种和第二种类胡萝卜素生物合成基因编码八氢番茄红素合酶和β-胡萝卜素羟化酶，所述的第三种类胡萝卜素生物合成基因编码八氢番茄红素脱氢酶。
24、权利要求19的方法，其中在所述种子中玉米黄质含量增加。
25、权利要求18的方法，其中所述的第一种和第二种类胡萝卜素生物合成基因编码八氢番茄红素合酶和β-胡萝卜素酮酶。
26、权利要求21的方法，其中所述的第一种和第二种类胡萝卜素生物合成基因编码八氢番茄红素合酶和β-胡萝卜素酮酶，所述的第三种类胡萝卜素生物合成基因编码八氢番茄红素脱氢酶。
27、权利要求25的方法，其中在所述种子中角黄素含量增加。
28、权利要求26的方法，其中在所述种子中角黄素含量增加。
29、权利要求25的方法，其中在所述种子中海胆酮含量增加。
30、权利要求26的方法，其中在所述种子中海胆酮含量增加。
31、权利要求21的方法，进一步包括用4)包含作为可操纵元件的来自在植物种子中优势表达的基因的转录起始区、质体转运肽、衍生自第四种类胡萝卜素生物合成基因编码区的DNA序列以及转录终止区的表达盒转化所述的宿主植物，其中所述的第四种类胡萝卜素生物合成基因编码选自八氢番茄红素脱氢酶、八氢番茄红素合酶、β-胡萝卜素羟化酶和β-胡萝卜素酮酶。
32、权利要求31的方法，其中在所述种子中虾青素含量增加。
33、权利要求21的方法，其中从所述第三种DNA序列的转录导致对编码番茄红素ε-环化酶的内源性植物基因的转录的抑制。
34、权利要求1、16、21、31或33任一项所述的转化的种子，其中所述的种子产生增加含量的至少一种感兴趣的叶黄素类物质化合物，所述的感兴趣化合物选自玉米黄质、角黄素、海胆酮、羟基角黄素、β-隐黄素、阿东黄质、α-隐黄素和虾青素。
35、权利要求1的方法，其中所述叶黄素类物质含量的改变是通过从所述类胡萝卜素生物合成基因DNA序列表达的蛋白质作用于所述植物种子中存在的一种类胡萝卜素底物的化合物而实现的。
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