KR20080087849A

KR20080087849A - 식물에서의 카로티노이드의 증강

Info

Publication number: KR20080087849A
Application number: KR1020087017991A
Authority: KR
Inventors: 빌로 모라왈라 디알. 패텔; 헨자라파 자가디쉬 바다마라나할리; 벤카테쉬 무르티 바순드라데비 난디; 엠. 피. 바비타; 스리드할 벤카타라맨
Original assignee: 아베스타겐 리미티드
Priority date: 2008-07-22
Filing date: 2005-12-23
Publication date: 2008-10-01

Abstract

본 발명은 식물, 식물 세포, 캘러스(callus), 조직, 열매, 뿌리 또는 식물의 다른 부분에서 카로티노이드 및 다른 아이소프레노이드, 특히 라이코펜 및/또는 β-카로틴의 함량을 증강시키는 방법, 및/또는 식물의 높이를 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 생성된 식물, 식물 세포, 캘러스, 조직, 뿌리 또는 열매에 관한 것이며, 카로티노이드, 특히 라이코펜 및/또는 β-카로틴의 수득 방법, 핵산 구조물 및 상기 핵산 구조물의 용도에 관한 것이다.

카로티노이드, 라이코펜, β-카로틴, 활성 산소, 토마토

Description

식물에서의 카로티노이드의 증강{ENHANCEMENT OF CAROTENOIDS IN PLANTS}

현대의 질환 및 질병 가운데 암과 심혈관질환은 최상위에 가까운 순위를 차지하며, 상당한 인구 비율에 영향을 미친다. 이들 질환들은 세포막, DNA 및 다른 세포 기능에 손상을 가져오는 활성 산소종과 같은 인자들과 관련이 있다. 따라서, 항산화제가 모든 연령층에 매우 인기있는 식이 보조제이며, 신선한 과일, 주스, 식물 추출물 및 태블릿과 같은 많은 제품들이 시판되고 있으며 건강 유지를 위해 매일 소비되고 있다. 상기와 같은 제품 내의 화학물질의 종류는 비타민 C와 비타민 E, 폴리페놀, 플라보놀 및 카로티노이드를 포함한다. 인간은 이들 화합물을 합성하지 않기 때문에 이들은 미생물 공급원의 식물로부터 수득된다. 활성 산소 소거에 관여하는 주요한 원자단들 중 하나는 폴리-올(poly-ol) 및 폴리-엔(poly-ene)이다. β-카로틴의 비환식(acyclic) 이성질체인 라이코펜(lycopene)은 가장 강력한 항산화제들 중 하나로 알려져 있는데, 일중항 산소(singlet oxygen)의 소거 능력이 β-카로틴의 2배, α-토코페롤의 10배로 알려져 있다. 또한, 라이코펜은 인간 혈장 내에 가장 널리 퍼져있는 카로티노이드이다(Kaliora et al, 2005).

혈청 내의 라이코펜의 안정성 및 이의 탁월한 소거 능력으로 인해 라이코펜의 생산 및 질환 치료의 관점에서 이 화합물을 광범위하게 연구해오고 있다. 라이코펜의 11개의 공액 이중결합 및 2개의 비공액 이중결합은 적색을 띄는 특성을 갖게 한다(472-476㎚에서 최고 흡광도를 보임). 또한, 가능한 1056 개의 이성질체들 중 가장 안정적인, 선형이면서 전부 트랜스 형태인 이성질체 약 12개가 자연에서 발견되었는데, 그 하나는 식물에서 발견되었다. 상기 화합물은 고도 불포화 탄화수소이며, 친유성(lipophylic)이고 빛과 열 및 산화에 민감하다(Faulks and Southon, 2005).

라이코펜 및 식품

라이코펜은 그레이프프루트, 구아바 주스, 수박 및 토마토와 같은 몇몇 과일 및 채소에 풍부하게 존재한다. 토마토의 적색 색소는 대개 라이코펜에 기인한 것으로 설명되는데, 라이코펜 함량이 높은 과일은 적색의 강도가 증가함을 보여준다. 식물에서 라이코펜은 모두 트랜스 형태에 있는 것으로 발견되며 조리를 하지 않으면 식품으로부터 흡수가 잘 되지 않는다. 기름을 사용하여 가열하면 보다 추출이 잘되는 것으로 확인되었으며, 주스, 퓌레(puree), 페이스트 및 소스와 같은 특정 토마토 제품들은 훨씬 라이코펜을 많이 함유하는 것으로, 즉, 비교적 고함량의 라 이코펜을 가지는 것으로 확인되었다. 조리를 하게 되면, 라이코펜이 시스-구성으로 이성화하여 생체 이용률이 증가됨을 보여주었다. 또한, 혈청 내에서 라이코펜의 대다수는 시스 형태이다. 하루에 35㎎의 라이코펜이 요구되며, 소비자들이 현재 섭취하는 보편적인 요소는 아닌 것으로 추정된다(Faulks and Southon, 2005).

라이코펜 및 건강

활성 산소종(ROS)은 다수의 경로들에 의해 생성되는데, 바닥상태의 삼중항 산소에 에너지가 전달되어 매우 반응성이 높은 일중항 산소가 형성된다. 이러한 종들은 지질, 단백질 및 DNA를 손상할 수 있다. 따라서, ROS는 노화 증상, 암 및 심혈관질환과 관련이 있다. 카로티노이드 분자들의 경우, 이들 결합이 불포화도 및 컨주게이션(conjugation) 정도가 높기 때문에, 이들 분자들은 일중항 산소로부터 에너지를 소거할 수 있다. 이와 동시에, 상기 카로티노이드 분자는 여기 상태가 되고 이후, 주위 용매와의 상호작용에 의하여 열로써 방출된다. 하나의 소거 반응이 완료된 후, 카로티노이드는 또 다른 반응을 위해서 재생된다. 어떤 조사 결과에 의하면 카로티노이드들은 그들이 분해되기까지 약 1000 개의 일중항 산소를 소거할 수 있다고 보고된다(Krinsky, 1998, Bhuvaneswari and Nagini 2005, Gruszecki and Strzalka, 2005).

ROS는 산화적인 손상에 기인한 다수의 만성적인 질환들과 관련이 있다. 역으로, 항산화제들은 지질, 막, 저밀도 리포단백질, 단백질 및 DNA가 손상되는 것을 보호하는 것과 관련이 있다. 보다 구체적으로, 라이코펜이 암 및 심혈관질환을 예방한다는 사실이 입증되었다. 몇몇 조사결과, 라이코펜이 친유성 부분에 결합함으 로써 상기 복합체들을 산화적 손상으로부터 보호한다는 사실이 밝혀졌다. 또한, 라이코펜이 p53 및 Rb 암억제 유전자의 발암원에 의한 인산화를 방지하고, 세포 분할을 G0-G1 단계로 중단시킨다는 사실이 제기되었다. 아울러, 이는 콜레스테롤 생합성 단계에 관련된 물질인 HMG CoA 환원효소의 억제제이기도 하다. 또한, LDL 및 VLDL과 결합함으로써 콜레스테롤 산화물의 형성을 방지하여 심혈관질환(CVD)을 예방한다(Kaliora et al 2005, Agarwal and Rato 2000).

다수의 형질변환 시도가 토마토 내의 라이코펜 증강을 가져왔지만, 자연적인 고함량 라이코펜 변종은 거의 발견되지 않았다. 1917년 Campbell Soup사에 의해 동정된 역사적으로 유명한 토마토 내의 자연 돌연변이(hp -1), San Marzano 변종에서 개량된 hp -2(1975) 및 dg(Manapal 변종 1973)는 라이코펜 함량을 증가시키는 것과 관련이 있으며 따라서 품종 개량 프로그램에 사용되어 왔다(Bramley 2002).

대사 식물 공학( Metabolic plant engineering )

우수한 영양식을 위한 카로티노이드, 특히 라이코펜이 증강된 식물 및 식물 생산물에 대한 추구는 식물 생물학을 매우 신규하고 획기적인 과학으로 나아가게 하였다. 카로티노이드 생합성의 경로를 이해하고 관련 유전자를 염색체상에 위치시킨 것(Fraser et al, 1994, Hirschberg 2001, Fraser et al, 2002 및 Bramley 2002)은 식물의 대사 공학으로 하여금 카르티노이드 생산을 증강할 수 있게 하는 많은 정보를 제공하였다. 최근 기술 개발에 대한 핵심은, 다른 유기체와는 달리 식물은 메발론산 경로가 아닌 1-디옥시-D-자일룰로스-5-인산(DOXP: 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate) 경로를 통하여 카르티노이드를 합성한다는 사실이었다. 두 경로가 모두 아이소펜테닐 피로인산을 생성하지만, 메발론산 경로는 탄소를 스테롤, 세스퀴테르페노이드 및 트리테르페노이드 경로로 유도하는 반면, DOXP는 카로티노이드, 파이톨(phytol), 플라스토퀴논-9 및 디테르펜 형성으로 유도한다(Bramley 2002, Romer and Fraser 2005).

우선, IPP는 디메틸알릴 피로인산(DMAPP)으로 이성화되는데, 상기 DMAPP는 C40 카로티노이드, 및 경로 내의 최초 화합물, 파이토인(phytoene)의 전구체인 제라닐 제라닐 피로인산으로 결국 올리고머화되는 활성화된 단량체이다. 상기 파이토인은 파이토인 불포화효소에 의하여 파이토플루인으로 불포화되며 계속 불포화되어 ζ-카로틴이 된다. 이후, ζ-카로틴 불포화효소에 의한 뉴로스포린(neurosporene)을 거쳐 라이코펜이 생성된다. 흥미롭게도, 박테리아의 crt1(Erwinia uredovora 유래)은 파이토인을, 모두 트랜스 형태인 라이코펜으로 전환한다(Ye et al 2000, Bramley 2002). 본 발명의 범주를 벗어나지만, 모두 트랜스 형태인 라이코펜은 다시 α- 및 β-카로틴으로 전환되는데, 상기 β-카로틴은 프로비타민 A이다.

건강에 도움이 된다는 관점에서 식물을 공학적으로 응용하고 라이코펜이 증강된 식물을 동정하는 것은 수십년간 이루어지고 있는데 가장 초창기에 수행된 일부는 Campbell soup사가 매우 색소가 많은 토마토의 돌연변이체로 hp -1을 동정한 1917년으로 거슬러 올라간다(Reynard 1956). hp -1 현상의 확장은 Liu et al(2004)에 의해 예시되었는데, 그들은 hp -1 유사 유전자(homolog)인 DDB1, LeHY5 및 LeCOP1LIKE의 조절이 카로티노이드 생합성에 영향을 미친다는 것을 밝혔다(Bramley 1997).

hp -2 및 dg 또한 자연적인 개체군으로부터 동정되었으며 증강된 카로티노이드 양과 관계가 있었다(Levin). 이들 결과로부터 유추해 보면, hp2 및 dg는 애기장대(Arabidopsis ) DET1(DE-ETIOLATED1)의 토마토 유사 유전자인 것으로 판명되었다. 상기 유전자의 구조적 침묵(silencing)은 토마토 내의 β-카로틴 및 라이코펜의 농도를 증가시키는 결과를 가져왔다(Davuluri et al 2004). hp -2를 가진 경우, 이들 돌연변이체들은 성장이 저해되고 털이 많으며 왜소하다는 점에서 심각한 성장 결점들이 있었다. 또한, Davuluri 및 동료들(2005)은 RNA 간섭 방법을 사용하여 DET1의 양을 감소시켰더니 카로티노이드의 양이 현저히 증가하였는데, 라이코펜은 2배 증가하였으며 β-카로틴은 10배가 증가하였다. 유사한 방법으로, 청색광 수용체 cry2의 과발현은 라이코펜 β 사이클레이즈의 발현을 감소시켜 라이코펜 함량을 증가시켰다(Gilberto et al, 2004).

카로티노이드의 생합성 경로에 관여하는 효소들의 조절은 혼합된 결과들을 산출하였다. Fray et al(1995)은 토마토 내의 토마토 파이토인 합성효소 유전자를 과발현하였는데 그 결과 라이코펜이 증가하였으며 동시에 지베렐린산 생합성의 감소로 인하여 성장이 위축되었다. 또한, Fraser et al(2002)은 폴리갈락튜로나제(polygalacturonase) 프로모터를 사용하여 파이토인 합성효소(Erwinia uredovora 유래의 crtB)의 과실 한정적인(fruit specific) 과발현을 한 결과, 파이토인과 함께 라이코펜이 1.8배 증가하였으며, β-카로틴 및 루테인도 증가하였다(각각 2.4배, 2.4배 증가). 그러나, 토마토 내에서 박테리아의 파이토인 불포화효소(Erwinia uredovora 유래의 crtI)를 과발현한 것은 β-카로틴이 3배로 증가 되었지만 라이코 펜 함량은 반으로 감소하는 결과를 가져왔다. Mehta 등(2002)은 과실성숙을 유도하는 E8 프로모터에 의해 작동되는 효모 S-아데노실메티오닌 탈탄산효소를 사용하여 토마토 내의 폴리아민 축적을 설계하였다. 과실 추출물 내에는 120㎍/㎎의 라이코펜이 생산되었다(약 300% 증가). Rosati et al(2000)은 안티센스(antisense) 기술로 라이코펜 사이클레이즈를 비활성화하는 다른 접근 방법으로 라이코펜을 증가시켰다.

품종 개량가들은 고함량의 라이코펜을 위한 품종 개발에 오랜 기간 애를 쓰고 있는데, Liu et al(2003)은 라이코퍼시콘 페넬리이(Lycopersicon pennellii) 및 M82(L. esculentum) 사이의 75개의 유전자 이입 라인을 관찰하여 약 16개의 양적형질 유전자좌(QTL)들이 토마토의 색 및 라이코펜을 결정한다는 사실을 보고하였다. 라이코펜은 그의 유용한 특성으로 인해 건강 전문가들 및 식물 과학자들의 주목을 받아왔다. 토마토 내의 카로티노이드 양을 증가시키기 위한 새로운 방법을 개발하려는 90년 정도의 관심은 이의 중요성을 보여주고 있으며, 현재의 요구들은 계속적으로 라이코펜에 대한 관심을 가지도록 한다.

발명의 개요

본 발명의 목적은 식물 및/또는 식물의 일부 내의 카로티노이드 양을 증강시키는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 식물 및/또는 식물의 일부 내에서 함량이 증강된 카로티노이드, 특히 함량이 증강된 라이코펜을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 함량이 증강된 카로티노이드, 특히 함량이 증강된 라이코펜을 갖는 식물 또는 식물의 일부를 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 목적은 식물, 식물 세포, 캘러스, 조직, 열매, 뿌리 또는 식물의 다른 부분에서의 카로티노이드 및 다른 아이소프레노이드, 특히 라이코펜 및/또는 β-카로틴의 함량을 증강시키는 방법 및/또는 식물의 높이를 증가시키는 방법에 의해 달성되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 상기 식물, 식물 세포, 캘러스, 조직, 열매, 뿌리 또는 식물의 다른 부분에서의 미토콘드리아 기능, 바람직하게는 미토콘드리아 복합체 I, Ⅱ, Ⅲ 및/또는 Ⅳ, 보다 바람직하게는 미토콘드리아 복합체 I을 손상(impairment)시키는 단계.

본 발명에 따른 방법의 일 구현예에서, 상기 손상은 상기 식물 세포의 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분, 바람직하게는, 편집되지 않은(unedited) 코딩 서열의 유전암호해독(translation) 산물인 미토콘드리아 복합체 I의 단백질 성분을 사용하여 일어난다.

바람직하게는, 상기 손상은 하기의 방법들로 일어나는데, 상기 식물 세포를 핵산 구조물, 바람직하게는 DNA 구조물로 형질전환(trnasformation)하거나, 아그로박테리움(Agrobacterium) 종, 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 매개로 한 형질전환에 의해 핵산 구조물로 상기 식물 세포를 형질전환하거나, 또는 담배 모자이크 바이러스와 같은 적절한 식물 바이러스를 사용하여 바이러스 트랜스펙션(transfection)하거나 또는 원형질체 형질전환으로 인하여 상기 손상을 일으킨다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 핵산 구조물, 바람직하게는 상기 DNA-구조물 또는 상기 아그로박테리움은, 바람직하게는 이원(binary) 벡터 내에 상기 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분을 인코딩하는 핵산을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분은 상기 식물 세포 이외의 다른 식물 종 유래의 기능장애 단백질이거나 상기 식물 세포와 동일한 식물 종의 기능장애 단백질이다.

본 발명에 따른 방법의 다른 구현예에서, 상기 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분은 NAD 1, 2, 3, 4, 4L, 5, 6, 7, 9, 핵의 미토콘드리아 단백질 76Kda, 55Kda, 28.5Kda, 22Kda 및 아실 운반체 단백질(acyl carrier protein)로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능장애 단백질이다.

바람직하게는, 상기 변형된 단백질 성분을 인코딩하는 상기 핵산은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명에 따른 방법의 일 구현예에서, 상기 핵산 구조물, 바람직하게는 상기 DNA-구조물, 또는 상기 아그로박테리움, 바람직하게는 상기 아그로박테리움 이원 벡터는 상기 미토콘드리아 복합체 I의 상기 변형된 단백질 성분을 인코딩하는 상기 핵산과 작동가능하게 연결된, 미토콘드리아 과도 펩타이드(transit peptide)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 핵산 구조물, 바람직하게는 상기 DNA-구조물, 또는 상기 아그로박테리움, 바람직하게는 상기 아그로박테리움 이원 벡터는 프로모터 및 종결자(terminator)를 추가로 포함하며, 상기 프로모터 및 종결자는 상기 미토콘드리아 복합체 I의 상기 변형된 단백질 성분을 인코딩하는 상기 핵산과 작동가능하게 연결되어 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 핵산 구조물, 바람직하게는 상기 DNA-구조물, 또는 상기 아그로박테리움, 바람직하게는 상기 아그로박테리움 이원 벡터는 상술한 바와 같이, 상기 프로모터 및 상기 종결자, 상기 미토콘드리아 과도 펩타이드를 인코딩하는 핵산 및 상기 미토콘드리아 복합체 I의 상기 변형된 단백질 성분을 인코딩하는 상기 핵산을 모두 포함하는데, 이들 모두는 작동가능하게 연결되어 있다.

바람직하게는, 상기 손상은 상기 식물 세포 내의 상기 미토콘드리아 복합체 I의 요소들 중 적어도 하나에 대하여 상기 식물 세포를 돌연변이시켜 일어난다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 돌연변이는 동일 식물 중 적어도 하나의 식물 세포, 바람직하게는 복수의 식물 세포에 적용되는 화학적 및/또는 물리적 돌연변이 유도물질을 사용하여 상기 식물세포를 무작위로 돌연변이시켜 일어나며, 상기 화학적 돌연변이 유도물질은 에틸메탄설폰산을 포함하는 군으로부터 바람직하게 선택되며, 상기 물리적 돌연변이 유도물질은 고속 중성자 투사, X-선, 감마선 및 다른 돌연변이 유발 광선으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명에 따른 방법의 일 구현예에서, 상기 방법은 돌연변이 단계 후에 상기 식물 세포 또는 복수의 식물 세포들에서 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분 또는 상기 식물 세포의 다른 미토콘드리아 기능들을 선별하는 부가적인 단계를 추가로 포함한다.

본 발명에 따른 방법의 일 구현예에서, 상기 손상은, 미토콘드리아 기능의 화학적 저해제, 바람직하게는 상기 식물 세포의 미토콘드리아 복합체 I의 화학적 저해제를 상기 식물 세포, 식물, 캘러스, 조직, 상기 식물의 일부, 상기 식물 전체, 열매, 뿌리 및/또는 다른 식물 기관에 적용함으로써 일어난다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 화학적 저해제는 로테논(rotenone), 안티마이신 A(antimycin A), 옥시플루오르펜(oxyfluorfen), 비올라크산틴(violaxanthin), 피에리시딘(piericidin), 피에리시딘 A, 피라졸(pyrazole), 피리다벤(pyridaben), 퀴나졸린(quinazoline), 아세토제닌(acetogenin), 티안가졸(thiangazole) 및 페나자(fenaza)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 손상은 상기 미토콘드리아 복합체 I의 억제(inhibition)이다.

본 발명에 따른 방법의 일 구현예에서, 상기 방법은 식물 캘러스, 조직, 식물, 뿌리 및/또는 열매를 생산하기 위하여, 상술한 것들 중 어느 하나의 방법을 적용한 상기 식물 세포, 식물 일부, 조직, 종자 또는 기관을 재배하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 상기 목적은 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 식물 세포, 캘러스, 조직, 식물, 뿌리 또는 열매에 의하여 달성된다.

바람직하게는, 상기 식물 세포, 캘러스, 조직, 식물, 뿌리 또는 열매는 토마토, 후추, 고추, 감자, 페튜니아(petunia) 및/또는 담배를 포함하는 가지과(solanaceous) 종들로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 근원에서 유래한 것이다.

바람직하게는, 식물 세포, 캘러스, 조직, 식물, 뿌리 또는 열매 내의 카로티노이드, 특히 라이코펜의 양은, 미건조 상태의 식물 세포, 캘러스, 조직, 식물, 뿌리 및/또는 열매 100g당 > 10㎎, 바람직하게는 > 15㎎, 보다 바람직하게는 > 16㎎, 가장 바람직하게는 > 20㎎으로 증강된다.

바람직하게는, 식물 세포, 캘러스, 조직, 식물, 뿌리 또는 열매 내의 카로티노이드, 특히 라이코펜의 양은, 본 발명에 따른 방법을 사용하지 않은 식물 세포/캘러스/조직/식물, 뿌리 또는 열매와 비교하여 적어도 2배, 바람직하게는 3배 이상 증강된다.

본 발명의 목적은 하기 단계들을 포함하는, 카로티노이드, 특히 라이코펜 및/또는 β-카로틴을 수득하는 방법으로 달성된다:

본 발명에 따른 식물 세포, 캘러스, 조직, 식물, 뿌리 또는 열매를 생산하는 단계; 및

상기 식물 세포, 캘러스, 조직, 식물, 뿌리 또는 열매로부터 카로티노이드, 특히 라이코펜 및/또는 β-카로틴을, 용매 추출 및 정제, 또는 초임계 이산화탄소 추출, 또는 당업자들이 통상적으로 사용하는 다른 방법에 의하여 정제하는 단계.

본 발명의 목적은 또한 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조물에 의하여 달성된다.

바람직하게는, 상기 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분은 NAD 1, 2, 3, 4, 4L, 5, 6, 7 및 9 또는 상기 복합체의 다른 단백질성 요소로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명에 따른 핵산 구조물의 일 구현예에서, 상기 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분은 토마토, 감자, 담배, 쌀, 옥수수, 페튜니아, 애기장대(Arabidopsis) 및/또는 연(Lotus), 개자리(Medicago), 밀 및/또는 수수로 이루어진 군으로부터 선택되는 종들에서 유래한 것이다.

바람직하게는, 상기 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분은 서열번호 4, 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는다.

본 발명의 목적은, 식물 세포, 식물, 캘러스, 조직, 열매, 뿌리 또는 상기 식물의 다른 부분에서의 카로티노이드 및 다른 아이소프레노이드, 특히 라이코펜 및/또는 β-카로틴의 함량 증강 및/또는 식물의 높이를 증가시키기 위한, 본 발명에 따른 핵산 구조물의 사용으로 달성된다.

용어의 정의

"유전자 이식( transgenic ) 또는 형질전환된 식물"이란 형질전환에 의하여 도입된 재조합 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 식물을 말한다. 형질전환은 뉴클레오타이드 서열의 안정적인 통합을 가져오거나 상기 서열을 일시적으로 발현시키기 위한 방법으로 식물 내에 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입하는 것을 의미한다. 이는 유전자 투사(biolistic), 아그로박테리움 매개의 형질전환(적절히 개발된 플라스미드 벡터 사용), 바이러스 DNA 또는 벡터를 사용한 트랜스펙션, 전기천공법(electroporation) 또는 리포펙션(lipofection)에 의한 DNA의 도입에 의하여 이루어진다. 식물 형질전환은 식물 세포, 꽃가루, 식물 종자 또는 기타 종류의 식물 조직, 원형상태의 식물 또는 식물의 일부에 멸균 또는 비멸균 조건하에서 이루어질 수 있다. 형질전환된 식물이란 전체 식물, 식물의 일부, 식물 세포, 식물 기관, 식물 조직, 종자, 뿌리, 꽃, 열매, 뿌리 또는 새순을 의미할 수 있다. 또한, 이는 상기의 자손(progeny)들을 의미할 수 있다.

"벡터( vector )"는 유전자, 단백질, 프로모터, 종결자 및 과도 펩타이드들을 인코딩할 수 있는 핵산 요소를 포함하는, 재조합으로, 인공적으로 또는 화학적으로 생성된 폴리핵산 구조물이다. 상기 단편들은 인코딩된 유전자의 발현을 가능하게 하거나 인코딩 처리 과정을 완전하게 실행하기 위하여 작동가능하게 연결될 것이다. 상기 프로모터 구역은 이에 제한되지는 않지만, 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터, 카사바 엽맥 모자이크 바이러스(cassava vein mosaic virus) 프로모터 또는 옥수수 유비퀴틴(maize ubiquitin) 프로모터와 같은, 구조적 또는 조직-특이적이거나, 조직-활성적이거나, 발생 단계-활성/특이적이거나 또는 발현 유도적인 프로모터들을 포함할 수 있다.

유전자 서열에 의해 인코딩된 세포적/생물학적 기능을 가능하게 하기 위하여, 인접한 DNA 서열의 단편들이 연결되어 있는 경우, 뉴클레오타이드 서열이 "작동가능하게 연결된( operably linked )" 상태라고 한다.

카로티노이드

카로티노이드는 탄화수소 계열(카로틴)이며 이들의 산화된 유도체(크산토필)는 8개의 아이소프레노이드 단위로 구성되는데, 이들 단위들은 2개의 중심 메틸기들이 1,6-위치 관계에 있고, 나머지 비-말단 메틸기들과는 1,5-위치 관계에 있도록, 분자 중심에서 아이소프레노이드 단위들의 배열이 역으로 진행되는 방식으로 결합되어 있다. 모든 카로티노이드들은 (ⅰ) 수소화, (ⅱ) 탈수소화, (ⅲ) 고리화 또는 (ⅳ) 산화 또는 이들 반응들의 조합에 의하여, 공액 이중결합의 긴 중심 사슬을 갖는 비고리 C₄₀H₅₆ 구조로부터 체계적으로 유도될 수 있다.

손상( impairment )

손상이란 세포 기관, 기능적 복합체, 효소 또는 다른 기능적 통일체의 기능이 부분적으로 또는 완전히 소실된 것을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 기능의 완전한 소실은 때로는 억제(inhibition)로 언급되기도 한다.

미토콘드리아 복합체( mitochondrial complex )

미토콘드리아 복합체는 각각 I, Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ로 불리는 미토콘드리아의 4개의 전자 전달 사슬 복합체를 의미하는데, 상기 복합체 I은 NADH-탈수소효소, 복합체 Ⅱ는 숙신산 탈수소효소, 복합체 Ⅲ은 사이토크롬 c 환원효소 및 복합체 Ⅳ는 사이토크롬 c 산화효소이다. 이들은 NADH+H⁺ 및 FADH₂가 각각 NAD+ 및 FAD와 물로 산화됨에 의한 ATP 생성에 관여하는 다중폴리펩타이드 복합체이다.

미토콘드리아 복합체 I 단백질

본 복합체는 미토콘드리아에 의해 인코딩된 nad1, nad2, nad3, nad4, nad4Lm, nad5, nad6, nad7, nad9 및 핵에 의해 인코딩된 76Kda, 55Kda, 28.5Kda, 22Kda 및 아실 운반 단백질을 포함하는 약 43개의 폴리펩타이드 사슬을 포함한다.

"변형된 단백질 성분"이란 아미노산 서열, 구조 또는 기능에 있어 천연의 기능적 단백질과는 다르며 비기능적일 수 있는 단백질 성분을 의미한다. 식물 미토콘드리아에서는, 하나 이상의 유전암호해독 후 RNA 편집 과정으로 인하여 천연의 (기능적) 단백질의 아미노산 서열이 상기 단백질을 인코딩하는 천연의 유전자 서열로 인한 이론적인 유전암호해독 산물과는 다르다는 것에 주목해야 한다.

"편집되지 않은"이란 미토콘드리아 게놈 내에 자연적으로 존재하는 유전자 서열과 동일한 유전자 서열을 의미한다. 유전암호해독 후 RNA 편집으로 인하여 천연의 (기능적) 단백질을 인코딩하는 mRNA 산물과는 때로 다른데, 어떤 C 리보뉴클레오타이드는 U 리보뉴클레오타이드로 변형되고, 드물게는 어떤 U 리보뉴클레오타이드는 C 리보뉴클레오타이드로 변형된다. 예를 들어, "편집되지 않은 코딩 서열의 유전암호해독 산물"은 유전암호해독 후 단계에서 편집 과정이 일어나지 않는다면 생산될 것으로 기대되는 단백질이다.

기능장애( dysfunctional ): 부분적으로 또는 완전히 비기능적인 것을 의미한다.

과도 펩타이드는 N-말단의 전서열(presequence)을 의미하는데, 이는 핵에 의해 인코딩된 미토콘드리아 결합 단백질을 미토콘드리아로 인도한다. 상기 과도 펩타이드는 세포질 내에 단백질이 합성된 장소로부터 관련된 막을 통과하여 이러한 단백질이 수송되도록 하는데 요구된다.

미토콘드리아의 저해제들은 이에 제한되지는 않지만, 로테논, 안티마이신 A, 시아나이드, 말론산(숙신산 탈수소효소 저해제), 2,4-디니트로페놀(DNP), 카보닐 시아나이드 p-[트리플루오로메톡시]-페닐-하이드라존(FCCP), 올리고마이신, 옥시플루오르펜, 비올라크산틴, 피에리시딘 A, 피라졸, 피리다벤, 퀴나졸린, 아세토제닌, 티안가졸, 페나자, 테녹실트리플루오로아세톤(thenoxyltrifluoroacetone), 카프복신(carfboxin), 옥시카복신(oxycarboxin), 펜퓨란(fenfuran), DDT, 클로로프로함(chloroproham), 프로파닐(propanil), 디노세브(dinoseb), 이옥시닐(ioxynil), 사이클로디엔(cyclodiene), 파라콰트(paraquat), 디노세브, 디아펜티우론(diafenthiuron), 메소밀(methomyl), 봉크레크산(Bongkrekic acid) 및 하이드라메틸논(hydramethylnon)을 포함한다.

아그로박테리움이란 적절한 재조합 아그로박테리움 이원 벡터를 이용하여 관심 대상 유전자(들)를 식물에 형질전환하는데 사용되는 아그로박테리움 종의 박테리아를 의미한다. 또한, 아그로박테리움 이원 벡터는 아그로박테리움 세포 내로 관심 대상인 다른 유전자(들)와 함께 형질전환될 재조합 DNA 구조물을 의미한다. 또한, 이들 세포들은 식물 세포, 식물의 일부, 종자 또는 원형상태의 전체 식물의 형질전환을 위하여 사용될 수 있을 것이다.

본 발명자들은 유전 공학 또는 다른 방법을 사용하여 식물 내의 미토콘드리아 기능을 손상시킴으로써 카로티노이드의 증강된 양을 수득할 수 있음을 놀랍게도 발견하였다. 본 발명을 사용하는 경우, 발명자들은 본 발명에 따른 방법을 수행하지 않은 식물과 비교할 때, 식물 내에서 놀랄 만큼 높은 카로티노이드 양, 특히 높은 라이코펜의 양을 수득할 수 있었다(표 1 참조). 이와 유사한 양의 카로티노이드는 케첩이나 농축된 토마토 페이스트와 같은, 가공되고 인위적으로 강화시킨 식품들에서만 찾아 볼 수 있다(표 2 참조).

예를 들어, 상기 목적들은 옥수수 유비퀴틴 프로모터(서열번호 7 참조), 애기장대 At-mRBP1a 미토콘드리아 표적의 과도 펩타이드(서열번호 8-뉴클레오타이드 서열, 서열번호 9-폴리펩타이드 서열 참조), 쌀의 미토콘드리아 펩타이드 유래의 편집되지 않은 nad9 유전자(서열번호 1-뉴클레오타이드 서열, 서열번호 2-폴리펩타이드 서열 참조) 및 노팔린 합성효소(NOS) 종결자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 구조물을 조립하여 달성할 수 있다. 상기 조립은 상기 구조물이 식물 내에서 전사 및 합성되기에 충분하도록 하고, 추가적으로 단백질 생성물이 미토콘드리아로 이동하도록 조립될 수 있다. 상기와 같은 또는 이와 유사한 구조물에 의해 형질전환된 식물 세포/식물/식물 일부는 상술한 높은 양의 카르티노이드, 특히 높은 양의 라이코펜 및/또는 β-카로틴을 확인하기 위하여 관찰될 수 있다.

이와 같이 본 발명은 고함량의 카로티노이드를 갖는 식물, 식물 세포, 조직 또는 식물 일부(잎, 줄기, 뿌리, 열매 및 꽃을 포함)를 개발하는 방법에 관한 것이다.

또, 본 발명은 증강된 양의 라이코펜 및/또는 β-카로틴을 갖는 식물들을 개발하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 지베렐린산(gibberellic acid), 앱시스산(abscisic acid), 색소, 스테롤에 제한되지 않고 이를 포함하는, 아이소프레노이드 경로로부터 유래된 식물 화합물의 양을 증강시키는 방법에 관한 것이다.

이항, 도 1 내지 도 5를 참조하여, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니라 본 발명을 예시하고자 하는 실시예들을 설명한다.

도 1은 형질전환을 위한 기본 구조물로 사용되는 플라스미드 pBS(SK-) 구조물을 도시한다. 표적 서열은 SacI 및 XbaI 제한효소 부위 사이에 복제될 At-mRBP1a의 코딩 영역을 가리키며, 이 결과 pNG1이 얻어진다.

도 2는 형질전환을 위한 기본 구조물로 사용되는 플라스미드 pBS(SK-) 구조물을 도시한다. TS 및 편집되지 않은 nad9은, At-mRBP1a의 코딩 영역 및 XbaI 및 BamHI 제한효소 부위 사이에 복제될 편집된 nad9 유전자의 코딩 영역을 가리키며, 이 결과 pNG3이 얻어진다.

도 3은 형질전환을 위한 기본 구조물로 사용되는 플라스미드 pBS(SK-) 구조물을 도시한다. TP 및 편집되지 않은 nad9으로 명명된 박스는 pBS(SK-) 벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입된 At-mRBP1a 및 편집되지 않은 nad9의 코딩 영역을 가리킨다. 상기 키메릭(chimeric) 유전자들은 유비퀴틴 프로모터 및 Nos 종결자의 조절하에 있다.

도 4는 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 프로모터(CVMV) 및 NOS 종결자에 의해 작동되는, 하이그로마이신(hygromycin) 내성 유전자(hph)를 인코딩하는 플라스미드 pLAU6.hph를 도시한다.

도 5는 본 발명의 일 구현예에서 라이코펜 함량을 측정하는데 사용한 라이코펜에 대한 표준 곡선을 도시한다.

도 6은 본 명세서에 기술한 바와 같은 라이코펜 추출물을 분석하여 수득한 대표적인 크로마토그램을 도시한다.

참고로, 서열목록에 대한 설명은 다음과 같다:

서열번호 1: 쌀(Oryza sativa)의 NADH 탈수소효소 소단위체 9에 대한 미토콘드리아 nad9 유전자(GenBank 접속번호 D50099[RICMTNAD9]).

서열번호 2: 감자(Solanum tuberosum)의 NADH 탈수소효소 소단위체 9에 대한 미토콘드리아 nad9 유전자(GenBank 접속번호 X79774[STMINAD9]).

서열번호 3: 담배(Nicotiana tabacum)의 NADH 탈수소효소 소단위체 9에 대한 미토콘드리아 nad9 유전자(GenBank 접속번호 YP 173479[YP 173479]).

서열번호 4: 쌀(Oryza sativa)의 NADH 탈수소효소 소단위체 9에 대한 미토콘드리아 nad9 단백질(서열번호 1의 유전암호해독).

서열번호 5: 감자(Solanum tuberosum)의 NADH 탈수소효소 소단위체 9에 대한 미토콘드리아 nad9 단백질(서열번호 2의 유전암호해독).

서열번호 6: 담배(Nicotiana tabacum)의 NADH 탈수소효소 소단위체 9에 대한 미토콘드리아 nad9 단백질(서열번호 3의 유전암호해독).

서열번호 7: 옥수수(Zea mays) 폴리유비퀴틴 프로모터 서열(GenBank 접속번호 S94464[S94464]).

서열번호 8: 애기장대(Arabidopsis thaliana) AT-mRBP1a 과도 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열.

서열번호 9: 애기장대(Arabidopsis thaliana) AT-mRBP1a 과도 펩타이드(아미노산 서열).

pNG1 : 미토콘드리아 과도 펩타이드

표준 방법을 사용하여 미토콘드리아를 단리하였다. 즉, 벼의 잎을 수확하여 추출 완충액(0.4M 슈크로스, pH 7.5) 내에 균질화하고, 1000 g로 원심분리하여 맑은 균질액을 수득하였다. 상기 맑은 분액을 퍼콜(Percoll) 구배 상에 놓고 원심분리하였다. 원형상태의 미토콘드리아를 퍼콜 구배로부터 회수하고 0.5M 슈크로스 완충액으로 세척하였다. 미토콘드리아를 펠렛화하여 다음 용도를 위해 -80℃에 동결하였다.

추출 완충액

0.4M 슈크로스

50.0mM Tris HCl pH 7.5

3.0mM EDTA

0.1% BSA

4.0mM 2-머캅토에탄올

2mM DTT

세척 완충액( BSA 및 DTT 무첨가 추출 완충액 )

2 X 구배 완충액

0.5M 슈크로스

100mM Tris HCl pH 7.5

6.0mM EDTA

퍼콜 구배는 2 X 구배 완충액으로 제조하였다.

쌀 미토콘드리아(약 75㎍)를 현탁용 완충액으로 재현탁시키고, 1/4 부피의 세포 용해 완충액(lysis buffer)으로 세포를 용해하였다. 조심스럽게 뒤집어서 잘 혼합한 후 페놀을 가하고, 이어서 클로로포름을 가하였다. 페놀 클로로포름 추출을 3번 수행한 후, 클로로포름 추출을 하였다. 2.5부피의 에탄올 및 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨을 가하고, -20℃에서 30분간 정치한 후 13,000rpm으로 20분간 원심분리하여 수상(aqueous phase)으로부터 DNA를 침전시켰다. 상기 DNA 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 건조하였으며 물에 용해시켰다.

미토콘드리아 표적 서열(At-mRBP1a, 서열번호 8-DNA, 서열번호 9-펩타이드 참조)을 애기장대(Arabidopsis thaliana) cDNA로부터 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 복제하였으며, 하기 프라이머 쌍을 사용하였다:

정방향 프라이머: 5' AAGAGCTCCCATGGTCTTCTGTAACAAACTCG 3'

역방향 프라이머: 5' AATCTAGACTTGGTAGACATCAACCGG 3'.

상기 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 그 내부에 SacI 및 XbaI 부위를 갖고 있어, PCR 산물이 pBS(SK-) 내로 용이하게 클로닝되도록 하였으며, 수득된 벡터를 pNG1이라 명명하였다(도 1 참조).

미토콘드리아의 용해( lysis )

쌀 미토콘드리아(약 75㎍)를 현탁용 완충액으로 재현탁시키고, 1/4 부피의 세포 용해 완충액으로 미토콘드리아를 용해하였다. 조심스럽게 뒤집어서 잘 혼합한 후 페놀을 가하고, 이어서 클로로포름을 가하였다. 페놀 클로로포름 추출을 3번 수행한 후, 클로로포름 추출을 하였다. 2.5부피의 에탄올 및 1/10 부피의 3M 아세트 산나트륨을 가하고, -20℃에서 30분간 정치한 후 13,000rpm으로 20분간 원심분리하여 수상으로부터 DNA를 침전시켰다. 상기 DNA 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 건조하였으며 물에 용해시켰다.

pNG3 : 미토콘드리아로 유도되는, 편집되지 않은 NAD9

편집되지 않은 nad9(서열번호 1-DNA, 서열번호 4-펩타이드 참조)를 쌀 미토콘드리아 DNA로부터 PCR에 의해 수득하였다. 증폭을 위해 하기 프라이머 조합을 사용하였다:

정방향 프라이머: 5' AATCTAGAATGGATAACCAATCCATTTTCCAA 3'

역방향 프라이머: 5' AAGGATCCGGGATTATCCGTCGCTACG 3'.

상기 정방향 프라이머는 Xba I 부위를 가지며 상기 역방향 프라이머는 BamHI 부위를 가지므로, 상기 편집되지 않은 nad9 유전자는 미토콘드리아 표적 서열과 인접한 위치에 복제되었으며, 상기 벡터를 pNG3로 명명하였다(도 2 참조).

pNG11:

상기 편집되지 않은 nad9 유전자를 pNG3로부터 SacI 및 BamHI로 처리하여 잘라내고, 상부의 유비퀴틴 프로모터(서열번호 7 참조) 및 하부의 Nos 종결자와 함께 결합시켰다. 수득된 구조물을 pNG11으로 명명하였다(도 3 참조).

기본적인 형질전환 작업을 수행하고, 토마토(Lycopersicon esculentum)에 대하여 실험실 수준에서의 조직 배양 절차를 표준화하였으며 형질변환 절차는 다음과 같다:

토마토의 형질변환을 위한 절차:

종자:

토마토(Lycopersicon esculentum Mill, 변종 S-22(Arka Vikas)) 종자를 방가로르, 헤사르가타에 소재된 인도 원예 리서치 연구소(IIHR: Indian Institute of Horticultural Research)로부터 수득하였다.

ㆍ상기 종자들을 2차 증류된 멸균수로 2번 세척하였다.

ㆍ상기 종자들을 70% 에탄올로 2분간 헹구었다.

ㆍ상기 종자들을 진탕기 내에서 30분간 70%의 시판 표백 용액에 담가두었다.

ㆍ모든 표백 자취가 제거될 때까지 상기 종자들을 세척하였다.

ㆍ상기 종자들을 고압 멸균된 티슈 페이퍼 상에서 건조하였다.

ㆍ단계 'd' 및 'e'는 오염을 방지하기 위하여 라미나 후드 내에서 수행하였다.

유전자 투사( bombardment )를 위한 이식편의 제조:

상기 종자들은 절반 농도의 MS 배지에서 기내 발아하였다. 10일된 묘목을 뿌리째 뽑아 떡잎을 절단하였으며 잎의 중심 부위를 유전자 투사를 위해 사용하였다. 약 40개의 이러한 이식편을 삼투 조절 배지를 포함하는 페트리 플레이트의 중심에 놓아두었다. 상기 배지 상에서 4시간을 배양한 후, 입자 가속기, PDS-1000/He을 사용하여 캘러스를 즉시 미세주입 유전자 투사가 되도록 하였다.

금 현탁액의 제조:

사용되는 금 입자들의 크기는 1.5 내지 3.0㎛이었으며, 6㎎의 금 입자를 0.5㎖ 에펜도르프 튜브 내에서 칭량하였다. 100㎕의 멸균된 2차 증류수를 상기 금 입 자에 가하고 30초간 볼텍싱하였다. 미세원심분리기(microfuge)에서 30초간 원심분리를 하였다. 100㎕의 100% 에탄올을 가하고 1분간 볼텍싱하였다. 이를 미세원심분리기 내에서 10000rpm으로 30초간 원심분리하였다. 상등액을 피펫으로 취해 제거하였다. 상기와 같은 에탄올 세척을 다시 반복하였다. 100㎕의 멸균 증류수를 펠릿에 가하였다. 볼텍싱을 하고 50㎕의 현탁액을 다른 0.5㎖ 튜브에 옮겼다. 이들 각 튜브들은 50㎕의 금 현탁액을 포함하며, DNA 코팅이 이루어질 때까지 실온 또는 4℃에 보관하였다.

입자 코팅 절차:

50㎕의 금 현탁액에, 관심 대상 유전자를 포함하는 플라스미드(편집되지 않은 nad9 유전자 또는 편집된 nad9 유전자 또는 안티센스 서열을 갖는 편집되지 않은 nad9 유전자를 포함하는 플라스미드) 및 pLAU6hph(하이그로마이신 선별 표지를 포함하는 플라스미드)로 이루어진 2개의 플라스미드를 3:1의 비율로, 전체 DNA의 농도가 10㎍이 되도록 첨가하였다. 여기에 20㎕의 0.1M 스페르미딘(spermidine)(시그마, 알드리치)을 첨가하고 볼텍스 상에서 낮은 속도로 혼합하였다. 그 후, 50㎕의 2.5M CaCl₂를 가하고 잘 혼합하였다. 상기 혼합물을 10분간 실온에 방치하였다. 그 후, 미세원심분리기에서 30초간 원심분리하였다. 라미나 후드에서 상등액을 제거하였다.

유전자 투사( biolistic )를 이용한 형질전환을 위한 마이크로운반체( microcarrier ), 파열 디스크 및 스크린의 제조:

매크로운반체( macrocarrier )

샘플 세포/조직의 유전자 투사를 실시하기 전에 매크로운반체 홀더 내에 미리 조립되고 미리 멸균된 매크로운반체를 준비하였다. 먼저 상기 매크로운반체를 100% 에탄올 내에 담그고 나서 고압 멸균된 티슈 페이퍼 상에서 건조하였다. 그 후, 매크로운반체를 라미나 후드 내에서 표면 멸균을 위하여 10분간 UV광 아래 두었다.

파열 디스크( rupture disk )

보다 용이한 취급을 위하여, 선택된 파열 디스크를 각각의 페트리 접시로 옮겼다. 상기 파열 디스크를 보관용 캡 내에 삽입하기 바로 전에 70% 아이소프로판올 내에 살짝 담가 멸균하였다. 수 초 이상으로는 적시지 않아야 한다. 광범위하게 적시는 경우에는 디스크가 얇은 조각으로 갈라질 수 있어, 너무 이른 파열이 일어난다. 450, 650 및 1,100psi로 정해진 디스크들을 제외한 모든 디스크들은 적층된(laminated) 것들이다. 오토클레이브(autoclave)는 디스크 층이 갈라질 수 있기 때문에 권장하지 않는다.

정지 스크린( stopping screen )

보다 용이한 취급을 위하여, 선택된 정지 스크린을 각각의 페트리 접시로 옮겼다. 오토클레이브에 의한 멸균이 권장된다. 대안적으로, 이들 요소들은 70% 에탄올에 담그고나서 멸균 환경 내에서 건조함으로써 멸균될 수 있다. 상기 정지 스크린은 2번 오토클레이브해서 재사용할 수 있다.

매크로운반체 상에 마이크로운반체의 코팅:

DNA 코팅된 금 입자들로부터 상등액을 제거하였다. 유전자 투사될 플레이트의 수에 기초하여, 무수에탄올을 DNA 코팅된 금 펠릿에 가하였는데 - 코팅될 모든 매크로운반체, 즉 유전자 투사될 모든 플레이트에 대하여 10.0㎕를 가하였다. 상기 혼합물을 균일한 현탁액이 얻어질 때까지 볼텍싱하였으며 10.0㎕를 피펫으로 제거하고 매크로운반체 디스크의 중심 상에 코팅하였다. 상기 에탄올이 증발되도록 하여 상기 매크로운반체 디스크 상에 금 입자들이 남아있도록 하였다.

유전자 투사의 실행:

유전자 투사 전

1. 파열 디스크 보관용 캡 및 마이크로운반체의 조립체 사이의 간격 거리에 대한 유전자 투사의 변수들을 선택하고 조절한다. 유전자 투사는 900-psi 파열 압력 및 9cm의 거리에서 이루어진다. 정지 스크린은 마이크로운반체 발사 조립체의 고정된 네스트(nest) 내부의 적당한 위치에서 지지된다.

2. 헬륨 공급을 원하는 파열 압력보다 200psi 크도록 조절한다.

3. 파열 디스크 보관용 캡, 마이크로운반체 발사 조립체 및 전체 장비를 70% 에탄올로 깨끗이 닦는다.

4. 매크로운반체를 DNA로 코팅하고 실험 당일에 멸균된 매크로운반체 홀더 위에 장착한다.

장비의 점화( firing )

1. 주 장치의 전원 코드를 콘센트에 꼽는다.

2. 전원을 ON 위치에 놓는다.

3. 챔버의 벽을 70% 에탄올로 멸균한다.

4. 멸균된 파열 디스크를 멸균된 보관용 캡에 장착한다.

5. 보관용 캡을 기체 가속 튜브의 말단에 고정시키고(투사 챔버의 내부, 상부), 토크 렌치로 죈다.

6. 매크로운반체 및 정지 스크린을 마이크로운반체 발사 조립체 내에 장착시킨다.

7. 챔버 내에 마이크로운반체 발사 조립체 및 목표 세포를 위치시키고 문을 닫는다.

8. 챔버를 진공상태로 만들고 원하는 수준으로 진공상태를 유지한다(최소 5인치의 수은주 압력).

9. 샘플 투사: 파열 디스크가 파열되고 헬륨 압력이 0으로 떨어질 때까지 점화 버튼을 계속하여 누른다.

10. 점화 버튼을 놓는다.

유전자 투사 후

1. 챔버로부터 진공상태를 해제한다.

2. 챔버로부터 목표 세포를 제거한다.

3. 매크로운반체 점화 조립체로부터 매크로운반체 및 정지 스크린을 해체한다.

4. 사용된 파열 디스크를 해체한다.

5. 시스템으로부터 헬륨 압력을 제거한다(그날의 모든 실험들이 완료된 후).

유전자 투사된 세포들의 성장 및 선별:

16시간 후, 선별을 위하여 캘러스를 BAP(4.5㎎/ℓ) 및 IBA(0.2㎎/ℓ - 하이그로마이신 10㎎/ℓ를 포함하는 선별 배지)를 포함하는 토마토 재분화 배지에 옮기고 15일간 빛을 조사하면서 25℃에서 배양하였다. 내성이 있는 캘러스를 15일마다 신선한 배지에서 계대배양하였다. 재분화한 후 새순(shoot)을 절단하고, 새순이 재분화 배지에서 신장(elongation)되지 않은 경우에 한하여 신장을 위하여, BAP(4.5㎎/ℓ), IBA(0.2㎎/ℓ) 및 GA(1.0㎎/ℓ)를 포함하는 MS 배지에 놓아두었다. 상기 신장된 새순의 발근(rooting)을 위하여 IAA(0.1㎎/ℓ)를 포함하는 MS 배지로 옮겼다. 뿌리를 내린 유식물체(plantlet)를 경화(hardening)를 위하여 한 이틀간 멸균 증류수로 옮긴 후, 질석(vermiculite)으로 옮겼다. 그 후, 상기 유식물체를 적토(red soil)로 옮겼다.

식물 성장

적토 상의 유식물체를 온실로 옮겼다. 변종을 위한 표준 조건하에서 식물을 재배하고 열매를 수확하였다. 실험 목적 또는 품종 개량 목적으로 타가 교배(cross-fertilization)를 실시하였다. 온실 내 식물에 대한 유전적인 조사도 이루어졌다.

HPLC 방법에 의한 토마토 샘플 내 라이코펜 함량의 정량 분석

크로마토그래프 시스템:

1. 자동 샘플 공급기(auto sampler), 탈기장치(degasser), PDA 검출기 및 Millennium 32 소프트웨어가 장착된 Waters 2695 XE 분리 모듈

2. HPLC급 용매 - 메탄올, 다이클로로메탄(0.22㎛ 막 여과기로 여과됨)

3. HPLC 샘플 바이알

샘플 제조용 장비:

회전식 증발기, 칭량 저울, 원심분리기, 튜브, 시험관 스탠드 및 여과기

추출 용매: 2.5% BHT를 함유한, 헥산:아세톤:메탄올(2:1:1)

샘플 용매: 다이클로로메탄:메탄올(45:55)

토마토 샘플로부터 라이코펜의 추출:

(온실로부터 수확된) 미건조의 토마토 샘플 1g을 칭량하고, 10㎖ 추출 용매에 넣어 모터 및 유봉(pestle)을 사용하여 분쇄하였다. 원심분리용 튜브에 옮기고 6분간 초음파 처리한 후, 7500rpm에서 5분간 원심분리하였다. 투명한 유기층을 조심스럽게 회수하고 회전식 증발기 내에서 건조시킨 후, 사용시까지 -20℃에 보관하였다. 모든 조작들은 약한 빛에서 이루어졌다. 직사광선 및 고온을 피하도록 하였다.

샘플 제조:

상기 건조된 샘플을 1㎖의 샘플 용매에 다시 용해시키고, 이를 저장 용액(stock)으로 하여 1:10으로 희석하였다. 상기 희석된 샘플을 HPLC 분석용으로 사용하기 전에 0.22㎛ 여과기로 통과시켰다. 용매의 손실을 방지하기 위하여 신속하게 샘플을 제조하였다.

크로마토그래프 조건:

이동상: 메탄올:다이클로로메탄(95:5)

메탄올(HPLC 분석을 위한 HPLC급 용매를 사용함)

펌프 방식: 등용매(isocratic)(MeOH:DCM = 95:5)

컬럼: Bondapak^TM C18, 4.6 × 150㎜, 5㎛

검출기: Waters 2996 PDA 검출기

유속: 1.5㎖/분

주입 부피: 20㎕

주입 횟수: 2회

작동 시간: 15분

검출 파장: 476㎚

샘플로부터 라이코펜을 분리하기 위하여, 메탄올:메틸렌클로라이드(95:5)의 이원 용매 시스템을 15분간 사용하였다. 보다 많은 샘플을 처리하기 위하여 작동 시간을 15분으로 줄이고, 유속을 1.5㎖/분으로 하였다. 라이코펜에 대한 검출 파장은 476㎚이며, 표준 곡선을 사용하여 이를 정량하였다.

표준 곡선: 10 내지 80㎍/㎖의 범위를 갖는 표준 라이코펜(Sigma)을 0.1% BHT가 포함된 HPLC급 샘플 용매로 제조하고 분석에 사용하였다. 검정(calibration) 곡선을 표시하였다 - 'Lycopene 17Jun05' Calibration ID 1729, Date: 17/06/2005, R=0.9948 and R2=0.9897(표준 곡선에 대해서는 도 5, 대표적인 크로마토그래프 프로파일은 도 6 참조).

토마토의 유전자 이식주 및 시판의 개량품종으로부터 수득한 라이코펜의 함량: 토마토 열매 100g당 라이코펜의 양을 ㎎으로 표시
번호	토마토 공급원의 종류	샘플 이름	라이코펜 함량 (미건조중량 100g당 라이코펜의 양, ㎎/100g)
1	유전자 이식주	T11T1A101	26.9
2	유전자 이식주	T11T1A102	16.5
3	유전자 이식주	T11T1C107	17.4
4	유전자 이식주	T11T1B107	14.3
5	유전자 이식주	T11T1G115	23.5
6	유전자 이식주	T11T1B104	16.7
7	시판의 개량품종	아르카 비카스(Arka Vikas)(대조군)	5.5
8	시판의 개량품종	아르카 비카스(대조군)	6.2
9	시판의 개량품종	므루툰야얌(Mruthunjayam) M-2	5.8
10	시판의 개량품종	아그니(Agni)	6.7
11	시판의 개량품종	아브히나바(Abhinava)	4.1

본 발명에 따라 수득된 카로티노이드, 특히 라이코펜의 양에서 알 수 있듯이, 라이코펜의 양을 최대 6.5배(26.9:4.1) 수득할 수 있었으며, 2.1배(14.3:6.7) 내지 6.5배의 범위를 가지는데, 예컨대 4.2배(17.4:4.1), 3.0배(16.7:5.5) 및 5.7배(23.5:4.1)와 같은 비율을 포함한다.

명백하게도, 상기와 같은 높은 함량은 하기 표 2에서 알 수 있는 바와 같은 농축된 토마토 소스와 같은 가공 식품에서만 찾아볼 수 있다.

식품 및 식품 제조물에서의 라이코펜 함량(Nguyen, M.L., Schwartz, S.J. 1999. Lycopene: Chemical and biological properties. Food Technol. 53: 38-45. 참조)
식품	식품 형태	(㎎/100g)
살구(apricot)	미가공	0.005
살구	통조림, 고형분	0.065
살구	건조	0.86
칠레고추(chili)	가공	1.08-2.62
그레이프프루트	핑크색, 미가공	3.36
구아바	핑크색, 미가공	5.40
구아바 주스	핑크색, 가공	3.34
케첩	가공	16.60
파파야	적색, 미가공	2.00-5.30
피자 소스	통조림	12.71
피자 소스	피자 유래	32.89
로즈힙(rosehip) 퓌레	통조림	0.78
살사(salsa)	가공	9.28
스파게티 소스	가공	17.50
토마토	적색, 미가공	3.1-7.74
토마토	전체, 껍질 벗김, 가공	11.21
토마토 주스	가공	7.83
토마토 수프	통조림, 농축	3.99
토마토 페이스트	통조림	30.07
수박	적색, 미가공	4.10
야채 주스	가공	7.28

<참고 문헌>

<110> AVESTHAGEN LIMITED <120> ENHANCEMENT OF CAROTENOIDS IN PLANTS <150> PCT/IB2005/003995 <151> 2005-12-23 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 573 <212> DNA <213> Rice <220> <221> CDS <222> (1)..(570) <400> 1 atg gat aac caa tcc att ttc caa tat agt tgg gag att tta ccc aag 48 Met Asp Asn Gln Ser Ile Phe Gln Tyr Ser Trp Glu Ile Leu Pro Lys 1 5 10 15 aaa tgg gta cat aaa atg aaa aga tcg gaa cat ggg aat aga tct tat 96 Lys Trp Val His Lys Met Lys Arg Ser Glu His Gly Asn Arg Ser Tyr 20 25 30 acc aat act gac tac cca ttt cca ttg ttg tgc ttt cta aaa tgg cat 144 Thr Asn Thr Asp Tyr Pro Phe Pro Leu Leu Cys Phe Leu Lys Trp His 35 40 45 acc tat aca agg gtt caa gtt tcg atc gat att tgc gga gtg gat cat 192 Thr Tyr Thr Arg Val Gln Val Ser Ile Asp Ile Cys Gly Val Asp His 50 55 60 ccc tct cga aaa cga aga ttt gaa gtt gtc cat aat tta ctg agt act 240 Pro Ser Arg Lys Arg Arg Phe Glu Val Val His Asn Leu Leu Ser Thr 65 70 75 80 cgg tat aac tca cgc att cgt gta caa aca agt gca gac gaa gta aca 288 Arg 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Phe Pro Leu Leu Cys Phe Leu Lys Trp His 35 40 45 Thr Tyr Thr Arg Val Gln Val Ser Ile Asp Ile Cys Gly Val Asp His 50 55 60 Pro Ser Arg Lys Arg Arg Phe Glu Val Val His Asn Leu Leu Ser Thr 65 70 75 80 Arg Tyr Asn Ser Arg Ile Arg Val Gln Thr Ser Ala Asp Glu Val Thr 85 90 95 Arg Ile Ser Pro Val Val Ser Pro Phe Pro Ser Ala Gly Arg Trp Glu 100 105 110 Arg Glu Val Trp Asp Met Ser Gly Val Ser Ser Ile Asn His Pro Asp 115 120 125 Leu Arg Arg Ile Ser Thr Asp Tyr Gly Phe Glu Gly His Pro Leu Arg 130 135 140 Lys Asp Phe Pro Leu Ser Gly Tyr Val Glu Val Arg Tyr Asp Asp Pro 145 150 155 160 Glu Lys Arg Val Val Ser Glu Pro Ile Glu Met Thr Gln Glu Phe Arg 165 170 175 Tyr Phe Asp Phe Ala Ser Pro Trp Glu Gln Arg Ser Asp Gly 180 185 190 <210> 5 <211> 190 <212> PRT <213> Potato <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(190) <400> 5 Met Asp Asn Gln Phe Ile Phe Lys Tyr Ser Trp Glu Thr Leu Pro Lys 1 5 10 15 Lys Trp Val Lys Lys Met Glu Arg Ser Glu His Gly Asn Arg Ser Asp 20 25 30 Thr Asn Thr Asp Tyr Leu Phe Gln Leu Leu Cys Phe Met Lys Leu His 35 40 45 Thr Tyr Thr Arg Val Gln Val Ser Ile Asp Ile Cys Gly Val Asp Tyr 50 55 60 Pro Ser Arg Lys Gln Arg Phe Glu Val Val Tyr Asn Leu Leu Ser Ile 65 70 75 80 Arg Tyr Asn Ser Arg Ile Arg Val Gln Thr Ser Ala Asp Glu Val Thr 85 90 95 Arg Ile Ser Pro Val Val Ser Leu Phe Pro Ser Ala Gly Arg Trp Glu 100 105 110 Arg Glu Val Trp Asp Met Phe Gly Val Ser Ser Ile Asn His Pro Asp 115 120 125 Leu Arg Arg Ile Ser Thr Asp Tyr Gly Phe Glu Gly His Pro Leu Arg 130 135 140 Lys Asp Leu Pro Leu Ser Gly Tyr Val Glu Val Arg Tyr Asp Asp Pro 145 150 155 160 Glu Lys Arg Val Val Ser Glu Pro Ile Glu Met Thr Gln Glu Phe Arg 165 170 175 Tyr Phe Asp Phe Ala Ser Pro Trp Glu Gln Arg Ser Asp Gly 180 185 190 <210> 6 <211> 190 <212> PRT <213> Tobacco <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(190) <400> 6 Met Asp Asn Gln Phe Ile Phe Lys Tyr Ser Trp Glu Thr Leu Pro Lys 1 5 10 15 Lys Trp Val Lys Lys Met Glu Arg Ser Glu His Gly Asn Arg Ser Asp 20 25 30 Thr Asn Thr Asp Tyr Leu Phe Gln Leu Leu Cys Phe Leu Lys Leu His 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gagaatcata taaatgaaca gttagacatg gtctaaagga caattgagat 240 ttttgacaac aggactctac agttttatct ttttagtgtg catgtgttct cctttttttt 300 tgcaaatagc ttcacctata taatacttca tccattttat tagtacatcc atttagggtt 360 tagggttaat ggtttttata gactaatttt tttagtacat ctattttatt ctattttagc 420 ctctaaatta agaaaactaa aactctattt tagttttttt atttaataat ttagatataa 480 aatagaataa aataaagtga ctaaaaatta aacaaatacc ctttaagaaa ttaaaaaaac 540 taaggaaaca tttttcttgt ttcgagtaga taatcgcagc ctgttaaacg ccgtcgagtc 600 taacggacac caaccagcga accagcagcg tcgcgtcggg ccaagcgaag cagacggcac 660 ggcatctctg tcgctgcctc tggacccctc tcgagagttc cgctccaccg ttggacttgc 720 tccgctgtcg gcatccgaaa attgcgtggc ggagcggcag acgtgagccg gcacggcagg 780 cggcctcctc ctcctctcac ggcacggcag ctacggggga ttcctttccc accgctcctt 840 cgctttccct tcctcgcccg ccgtaataaa tagacacccc ctccacaccc tctttcccca 900 acctcgtgtt gttcggagcg cacacacaca caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg 960 gcacctccgc ttcaaggtac gccgctcgtc ctcccccccc ccccctctct accttctcta 1020 gatcggcgtt ccggtccatg 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gcagctatat gtggattttt ttagccctgc cttcatacgc 1920 tatttatttg cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac cctgttgttt ggtgttactt 1980 ctgcagatg 1989 <210> 8 <211> 111 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> transit_peptide <222> (1)..(111) <400> 8 atggctttct gtaacaaact cggtggtcta ttgagacaaa acatttcttc taacggaaat 60 gttccggtta cgtctatgct cggatctctc cggttgatgt ctaccaagtc t 111 <210> 9 <211> 37 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> TRANSIT <222> (1)..(37) <400> 9 Met Ala Phe Cys Asn Lys Leu Gly Gly Leu Leu Arg Gln Asn Ile Ser 1 5 10 15 Ser Asn Gly Asn Val Pro Val Thr Ser Met Leu Gly Ser Leu Arg Leu 20 25 30 Met Ser Thr Lys Ser 35

Claims

식물, 식물 세포, 캘러스, 조직, 열매, 뿌리 또는 식물의 다른 부분에서의 카로티노이드 및 다른 아이소프레노이드, 바람직하게는 라이코펜 및/또는 β-카로틴의 함량을 증강시키고/증강시키거나 식물의 높이를 증가시키는 방법에 있어서,

a. 식물, 식물 세포, 캘러스, 조직, 열매, 뿌리 또는 식물의 다른 부분에서의 미토콘드리아 기능, 바람직하게는 미토콘드리아 복합체 I, Ⅱ, Ⅲ 및/또는 Ⅳ, 보다 바람직하게는 미토콘드리아 복합체 I을 손상시키는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 손상은 상기 식물 세포의 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분, 바람직하게는 편집되지 않은 코딩 서열의 유전암호해독 산물인 미토콘드리아 복합체 I의 단백질 성분을 사용하여 일어나는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 손상은 상기 식물 세포를 핵산 구조물, 바람직하게는 DNA 구조물로 형질전환하거나, 아그로박테리움(Agrobacterium) 종, 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 매개로 한 형질전환에 의해 핵산 구조물로 상기 식물 세포를 형질전환하거나, 또는 담배 모자이크 바이러스와 같은 적절한 식물 바이러스를 사용하여 바이러스 트랜스펙션(transfection)하거나 또는 원형질체 형질전환으로 인하여 일어나는 것인 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 핵산 구조물, 바람직하게는 상기 DNA-구조물 또는 상기 아그로박테리움은 바람직하게는 이원 벡터 내에 상기 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분을 인코딩하는 핵산을 포함하는 것인 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분은 상기 식물 세포 이외의 다른 식물 종 유래의 기능장애 단백질이거나 상기 식물 세포와 동일한 식물 종의 기능장애 단백질인 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분은 NAD 1, 2, 3, 4, 4L, 5, 6, 7, 9, 핵의 미토콘드리아 단백질 76Kda, 55Kda, 28.5Kda, 22Kda 및 아실 운반체 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능장애 단백질인 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 변형된 단백질 성분을 인코딩하는 상기 핵산은 서열번호 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 구조물, 바람직하게는 상기 DNA-구조물 또는 상기 아그로박테리움, 바람직하게는 상기 아그로박테리움 이원 벡터는 상기 미토콘드리아 복합체 I의 상기 변형된 단백질 성분을 인코딩하는 상기 핵산과 작동가능하게 연결된, 미토콘드리아 과도 펩타이드(transit peptide) 를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 방법.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 구조물, 바람직하게는 상기 DNA-구조물, 또는 상기 아그로박테리움, 바람직하게는 상기 아그로박테리움 이원 벡터는 프로모터 및 종결자를 추가로 포함하며, 상기 프로모터 및 종결자는 상기 미토콘드리아 복합체 I의 상기 변형된 단백질 성분을 인코딩하는 상기 핵산과 작동가능하게 연결되어 있는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 핵산 구조물, 바람직하게는 상기 DNA-구조물, 또는 상기 아그로박테리움, 바람직하게는 상기 아그로박테리움 이원 벡터는 제 9항에 따른 상기 프로모터 및 상기 종결자, 제8항에 따른 상기 미토콘드리아 과도 펩타이드를 인코딩하는 상기 핵산, 및 제4항에 따른 상기 미토콘드리아 복합체 I의 상기 변형된 단백질 성분을 인코딩하는 상기 핵산을 포함하며, 이들 모두는 작동가능하게 연결되어 있는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 손상은 상기 식물 세포 내의 상기 미토콘드리아 복합체 I의 요소들 중 적어도 하나에 대하여 상기 식물 세포를 돌연변이시켜 일어나는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 돌연변이는 동일 식물 중 적어도 하나의 식물 세포, 바람직하게는 복수의 식물 세포에 적용되는 화학적 및/또는 물리적 돌연변이 유도물질을 사용하여 상기 식물세포를 무작위로 돌연변이시켜 일어나며, 상기 화학적 돌연변이 유도물질은 에틸메탄설폰산을 포함하는 군으로부터 바람직하게 선택되며, 상기 물리적 돌연변이 유도물질은 고속 중성자, X-선, 감마선 및 다른 돌연변이 유발 광선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 돌연변이 단계 후에 상기 식물 세포 또는 복수의 식물 세포들에서 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분 또는 상기 식물 세포의 다른 손상된 미토콘드리아 기능들을 선별하는 부가적인 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 손상은 미토콘드리아 기능의 화학적 저해제, 바람직하게는 상기 식물 세포의 미토콘드리아 복합체 I의 화학적 저해제를 상기 식물 세포, 식물, 캘러스, 조직, 상기 식물의 일부, 상기 식물 전체, 열매, 뿌리 및/또는 다른 식물 기관에 적용함으로써 일어나는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 화학적 저해제는 로테논, 안티마이신 A, 옥시플루오르펜, 비올라크산틴, 피에리시딘, 피에리시딘 A, 피라졸, 피리다벤, 퀴나졸린, 아세토제닌, 티안가졸 및 페나자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 손상은 상기 미토콘드리아 복합체 I의 억제인 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 캘러스, 조직, 식물, 뿌리 및/또는 열매를 생산하기 위하여, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법을 적용한 상기 식물 세포, 식물 일부, 기관 또는 종자를 재배하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 생산된 식물 세포, 캘러스, 조직, 식물, 뿌리 또는 열매.
제18항에 있어서, 토마토, 후추, 고추, 감자, 페튜니아 및/또는 담배를 포함하는 가지과(solanaceous) 종들로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 근원에서 유래한 것인 식물 세포, 캘러스, 조직, 식물, 뿌리 또는 열매.
제18항 또는 제19항에 있어서, 카로티노이드, 특히 라이코펜의 양은 미건조 상태의 식물 세포, 캘러스, 조직, 식물, 뿌리 및/또는 열매 100g당 > 10㎎, 바람직하게는 > 15㎎, 보다 바람직하게는 > 16㎎, 가장 바람직하게는 > 20㎎으로 증강된 것인 식물 세포, 캘러스, 조직, 식물, 뿌리 또는 열매.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카로티노이드, 특히 라이코펜의 양은 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법을 적용하지 않은 식물 세포/캘러스/조직/식물/뿌리 또는 열매와 비교하여 적어도 2배, 바람직하게는 3배 이상 증강된 것인 식물 세포, 캘러스, 조직, 식물 또는 열매.
a. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 식물 세포, 캘러스, 조직, 식물, 뿌리 또는 열매를 생산하는 단계; 및

b. 상기 식물 세포, 캘러스, 조직, 식물, 뿌리 또는 열매로부터 카로티노이드, 특히 라이코펜 및/또는 β-카로틴을, 바람직하게는 용매 추출 및 정제 또는 초임계 이산화탄소 추출에 의하여 정제하는 단계

를 포함하는 카로티노이드, 특히 라이코펜 및/또는 β-카로틴을 수득하는 방법.
미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분을 인코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 구조물.
제23항에 있어서, 상기 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분은 NAD 1, 2, 3, 4, 4L, 5, 6, 7 및 9 또는 상기 복합체의 다른 단백질성 요소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 구조물.
제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분은 토마토, 감자, 담배, 쌀, 옥수수, 페튜니아, 애기장대(Arabidopsis), 연(Lotus), 개자리(Medicago), 밀 및/또는 수수로 이루어진 군으로부터 선택되는 종들에서 유래한 것인 핵산 구조물.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미토콘드리아 복합체 I의 변형된 단백질 성분은 서열번호 4, 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 것인 핵산 구조물.
식물 세포, 식물, 캘러스, 조직, 열매, 뿌리 또는 상기 식물의 다른 부분에서의 카로티노이드 및 다른 아이소프레노이드, 특히 라이코펜 및/또는 β-카로틴의 함량을 증강시키고/시키거나 식물의 높이를 증가시키기 위한, 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구조물의 용도.