CN1423693A - 生产维生素a的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了转化细菌、真菌(包括酵母)、动物、和植物细胞、种子、组织、和完整植株以产生能够表达新型β-胡萝卜素(15,15’)双加氧酶并积累维生素A醛的转化体的手段和方法。本发明还提供了通过生物技术使用天然或转化后积累β-胡萝卜素或者由培养基摄取β-胡萝卜素的细胞、组织、器官、或完整植株生产类视黄质的手段和方法。本发明还提供了编码衍生自不同来源和分类群的存活生物体的β-胡萝卜素(15,15’)双加氧酶且设计适用于进行本发明方法的DNA分子,及包含所述分子的质粒或载体系统。另外,本发明提供了展示改良的营养品质或生理状况且包含这些DNA分子和/或使用本发明方法生成的转基因细菌、真菌(包括酵母)、动物、和植物细胞、种子、组织、和完整植株。
Description
本发明涉及转化细菌、酵母、真菌、昆虫、动物、和植物细胞、种子、组织、和完整生物体的领域。更具体的说,本发明涉及将编码类视黄质(retinoid)生物合成途径的一种或多种特定酶的重组核酸序列整合到合适宿主细胞或生物体中,它们在转化之后展示期望表型,而且可用于例如商业生产。另外,本发明提供了通过生物技术来实现氧化切割C40类胡萝卜素而产生C20类异戊二烯如维生素A(视黄醇)及其衍生物的手段和方法。
发明背景
维生素A(视黄醇)及其衍生物(视黄醛、视黄酸)(在说明书全文中使用术语“类视黄质”)代表在动物中涉及广泛基础生理过程的一组化学类化合物。它们在例如视觉、生殖、代谢、细胞分化、骨骼发育、和胚胎形成过程中的图式形成中是必不可少的。为了研究维生素A的作用,已经使用了几种物种(如小鼠、大鼠、鸡、和猪)作为脊椎动物模型生物体,而在无脊椎动物中大多数研究是用黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)进行的。蝇视觉系统数十年来一直作为使用电生理学、光化学、遗传学、和分子生物学研究受体多样性和维生素A利用的模型。
维生素A及其最重要的衍生物视黄醛和视黄酸(RA)由20个碳原子组成(C20)且属于化学类的类异戊二烯。动物通常不能从头合成类视黄质。动物的类视黄质生物合成依赖于由食物摄取具有维生素A原活性的类胡萝卜素。在那些能够由类胡萝卜素合成类视黄质的动物中,必须酶促切割维生素原。例如在哺乳动物中,已经在衍生自小肠和肝的粗提物中描述了这种酶活性。该酶催化对称氧化切割β-胡萝卜素而形成两个分子视黄醛,在生化上表征为15,15’-β-胡萝卜素双加氧酶(β-diox)。这些酶在整个动物界中参与类视黄质形成。例如,图1图解了在哺乳动物中描述的类视黄质形成的生物合成途径。除了β-胡萝卜素,还可以切割叶黄素(含氧类胡萝卜素),只要它们具有未取代β-芷香酮环(如β-隐黄素)即可;而且在不同的动物物种中,已经报导了对不同于β-胡萝卜素的类胡萝卜素进行代谢而形成羟化类视黄质的能力(如昆虫纲中的玉米黄质和黄体素)。为了进一步代谢,必须酶促修饰产生的视黄醛而形成视黄醇(维生素A)或视黄酸。
在细菌和植物中也发现了对类胡萝卜素的酶促氧化切割。在高等植物中发现了偏心切割类胡萝卜素的许多范例。这些范例包括番红花(crocus)中saffron的形成、柑橘水果中柠乌素和其它阿朴类胡萝卜素的形成,最有趣的是植物激素脱落酸(ABA,参与例如秋季落叶和种子休眠的一种生长调节剂)。ABA衍生自在11-12碳双键处氧化切割9-顺式-环氧-类胡萝卜素。最近,对ABA生物合成缺陷的玉米突变体vp14的研究提供了对这种切割反应更好的分子理解,并克隆和分子表征了第一种类胡萝卜素切割酶(β-diox I)。由该发现提出了问题,即相似的酶是如何参与动物的类视黄质代谢,催化氧化切割具有维生素A原活性的类胡萝卜素。
在动物中,已经在体外对这些重要类型的酶在类视黄质形成中的功能研究了近40年。然而,试图分离并纯化这样的蛋白质和鉴定它们的分子结构的所有尝试都失败了。这些酶的分子结构的公开(包括它们的核苷酸序列(cDNA)和它们的氨基酸序列)对于研究维生素A在动物和在医学中的作用的多个领域而言将是重要的。另外,该遗传物质可用于转化完整的存活生物体,从而得以在例如植物和微生物中生成维生素A,以增加它们的营养价值。
在人中,正如普遍知道的,视黄醛(即这种酶的切割产物)是视觉的决定性因素。同样清楚的是,决定完整生物体或单个细胞中视黄酸直接前体可利用性的酶对视黄酸信号途径及由此介导的细胞应答将具有广泛影响。
类视黄质具有几种医学应用,如癌症治疗。作为(预防性或治疗性)药物制剂中的活性成份,类视黄质可用于预防和/或治疗不同类型的癌症。例如,动物模型显示类视黄质可调控细胞生长、分化、和凋亡,并在几种组织(诸如肺、皮肤、乳腺、前列腺、和膀胱)中遏制癌发生。后者还应用于对展示口腔、子宫颈、支气管上皮、皮肤、及其它组织和器官恶变前或恶性损伤的患者的临床研究。有些类视黄质在体外甚至对高度恶性细胞显示抗肿瘤活性,正如通过抑制增殖和诱导分化或凋亡所证明的。治疗效果的突出范例是全-反式视黄酸引起前髓细胞白血病细胞分化成粒细胞,全-反式视黄酸目前成功的用于治疗这类癌症(Nason-Burchenal和Dmitrovsky,在《Retinoids》(类视黄质)中,第301页,1990;Xu和Lotan,在《Retinoids》(类视黄质)中,第323页,1999)。
本发明首次提供了参与动物类视黄质代谢、催化氧化切割具有维生素A原活性的类胡萝卜素的酶的完整分子表征。本发明的成就,包括编码这些基因类型的完整核苷酸序列的发现,能够通过提供依照本发明转化的植物或其部分来改进营养状况,尤其是在不发达国家。
例如,维生素A缺乏是以谷物为生(诸如以稻米作为主要或几乎唯一主食)的世界人口部分中导致严重临床症状的很严重健康问题。仅在东南亚,估计每年有500万儿童形成眼疾干眼病,其中25万最终失明。另外,虽然维生素A缺乏不是死亡的终极决定因素,但是它与潜在致命的苦恼诸如腹泻、呼吸道疾病、和儿童疾病(诸如麻疹)的易感性升高有关联。依照UNICEF汇编的统计结果,改进维生素原营养每年能够在1-4岁儿童中防止100-200万人的死亡,还能防止稍后的孩童时期中25-50万人的死亡。出于这些原因,非常希望提高主食中的维生素A水平。
在发达国家,维生素缺乏不再形成普遍问题,因为植物食品提供了足够的维生素A原,而且可以由动物产品直接获得维生素A。然而,出于预防原因或者在困扰例如再吸收或将维生素原正确切割成维生素A的某些临床和/或遗传紊乱或功能失常时,可能希望提供类视黄质作为例如所谓“功能食品”的功能成份。
尽管涉及视黄醇及其类似物的完全化学合成有许多发表物和专利,但仍强烈需要在营养和药物应用中具有高度价值的这些物质的生物技术生产。
发明概述
本发明提供了转化细菌、酵母、真菌、昆虫、动物、和植物细胞、种子、组织、和完整生物体以产生能够表达15,15’-β-胡萝卜素双加氧酶(β-diox)多肽或其功能片段并积累维生素A和/或其衍生物的转化体的手段和方法。本发明还提供了通过生物技术使用天然或转化后积累β-胡萝卜素或者由培养基摄取β-胡萝卜素的细胞、组织、器官、或完整生物体生产类视黄质的手段和方法。本发明还提供了编码衍生自不同来源和分类群的存活生物体的15,15’-β-胡萝卜素双加氧酶且设计适用于进行本发明方法的DNA分子,及包含所述分子的质粒或载体系统。另外,本发明提供了展示改良的营养品质或生理状况且包含上述DNA分子和/或使用本发明方法生成的转基因细菌、酵母、真菌、昆虫、动物、和植物细胞、种子、组织、和完整生物体。另外,本发明提供了展示针对β-diox多肽的特异免疫反应性且适用于诊断和筛选目的以及分离并纯化所述多肽的抗体。最后,本发明提供了在基因疗法领域使用依照本发明的DNA分子的手段和方法。
因而,本发明提供了切割β-胡萝卜素的酶在本身不含类视黄质的生物体(诸如植物材料、真菌、和细菌)中的从头导入和表达,以及修饰现有的类视黄质生物合成以调控某些目的类视黄质的积累。另外,本发明提供了DNA探针和序列信息,使得本领域技术人员能够由其它来源(诸如动物物种,包括人)克隆相应基因和/或cDNA。
另外,本发明提供了包含基因产物或其功能活性片段作为活性成份的药物制剂,以及简单且合适的诊断测试系统以进一步证明这些分子的功能性。
图的简述
图1显示了动物中类视黄质形成的主要步骤。以粗箭头强调维生素A形成中的关键步骤;只显示了类视黄质的全-反式异构体。
图2显示了生成并积累β-胡萝卜素的大肠杆菌(大肠杆菌(+)菌株)中因表达黑腹果蝇β-胡萝卜素双加氧酶而引起的相对于对照(大肠杆菌(-)菌株)由黄色(β-胡萝卜素)至几乎白色(类视黄质)的颜色变化。
图3给出了在用表达果蝇β-胡萝卜素双加氧酶cDNA的质粒转化的生成β-胡萝卜素的大肠杆菌(大肠杆菌(+)菌株)中形成的类视黄质相对于用载体对照(pBAD-TOPO)转化的大肠杆菌9(-)菌株的HPLC分析和光谱鉴定。刻度条指示360nm吸光度0.01。 A.大肠杆菌(+)菌株(上线)和大肠杆菌(-)菌株(下线)的甲醛/氯仿提取物。B.由相应视黄醛异构体产生相应肟(顺式和反式)的羟胺/甲醇提取物。在上线中,真实标准物是分开的。在中线中显示了大肠杆菌(+)菌株提取物的异构组成。在下线中显示了大肠杆菌(-)菌株提取物的HPLC图谱。
图4图解了由大肠杆菌(+)菌株提取的主要物质相对于真实标准物(点线)的吸收光谱(正己烷)。
图5展示了β-diox-gex融合蛋白在不同条件下的酶活性。将融合蛋白β-diox-gex在不同条件下在含50mM Tricine/NaOH(pH7.6)和100mM NaCl的缓冲液中保温。加入5μl β-胡萝卜素(80μM,溶于乙醇)开始反应。于30℃保温2小时后终止反应并抽提。进行HPLC分析并显示360nm的HPLC图谱。刻度条指示360nm吸光度0.005。A.在存在5μMFeSO4和10mM L-抗坏血酸时保温;B.在不存在FeSO4/抗坏血酸时保温;C.在存在10mM EDTA时保温;D.在保温前将融合蛋白于95℃保温10分钟。
图6描述了来自黑腹果蝇的β-diox的cDNA序列和推导氨基酸序列。
图7是vp14(玉米)、RPE65(视网膜色素上皮,牛)、和β-dioxI(果蝇,SEQ ID NO:2)的推导氨基酸序列的线性比对。以黑色指示同一性,以灰色指示依照PAM250矩阵的保守氨基酸。我们使用目视比对和程序比对。可以在例如β-diox序列的第549-570位找到高度保守区。迄今为止鉴定的所有β-diox同系物均享有这一共有基元,它是依照本发明的酶的特征。
图8图解了身体不同部分中β-diox的mRNA水平。通过RT-PCR分析β-diox mRNA的表达模式。只在头部可检测到β-diox mRNA。由衍生自成年果蝇(雌性和雄性)头、胸、和腹的总RNA制剂合成cDNA。使用一组跨越内含子的引物研究相同RNA样品中核糖体蛋白质rp49(FLYBASE编号FBgn0002626)的mRNA水平作为对照。
图9是果蝇(果蝇β-diox,SEQ ID NO:2)、小鼠-1(小家鼠,GenBank编号AJ278064)、人-1(人,GenBank编号AF294900)、鸡-1(Gallus gallus,GenBank编号AJ271386)、斑马鱼-2(Daniorerio,SEQ ID NO:17)和蠕虫(C.elegans,GenBank编号AF098992/AAC67462.1)的推导氨基酸序列的线性比对。以黑色指示同一性。箭头指示与果蝇β-diox具有假设同源性的区域。可以在例如β-diox序列的第549-570位找到高度保守区。迄今为止鉴定的所有β-diox同系物享有这一共有基元,它是依照本发明的酶的特征。应当指出,若省略蠕虫的序列而进行比较时,这种比对甚至可以有更好的序列同一性。这可能是因为C.elegans和脊椎动物在进化期间很早就分离了。
发明详述
本发明提供了具有特异切割β-胡萝卜素形成维生素A醛(视黄醛)的生物学活性的分离新型β-胡萝卜素双加氧酶(β-diox)多肽或其功能片段。依照本发明的一个优选实施方案,所述β-diox多肽或其功能片段包含选自下组的一种或多种氨基酸序列:SEQ ID NO:2的第71-79位、第128-147位、第386-393位、和第549-570位的氨基酸序列,其中优选第二项和第四项。对这些区域特别是SEQ ID NO:2的第128-147位、和第549-570位所列区域特别感兴趣是因为已经证明它们在基本上是高度保守的。因此,本领域技术人员可以容易的设计、生成、并使用衍生自SEQ ID NO:1所列DNA序列且包含选自下组的一种或多种核酸序列的相应核酸探针:SEQ ID NO:1的第211-237位、第382-441位、第1156-1179位、和第1645-1710位核酸序列,其中优选第二项和第四项,作为合适筛选工具进行表达分析或用于揭示具有上文所述酶活性因而为本发明所涵盖的这种新型酶的其它成员。显然,如图9的序列比对所述,这同样可应用于本文提供或提及的同源β-diox序列。例如,所述β-diox多肽或其功能片段包含选自例如SEQ ID NO:17的第30-38位、第87-106位、第352-359位、和第448-467位的一种或多种氨基酸序列,其中优选第二项和第四项。因此,可如上所述容易的设计、生成、并使用衍生自SEQ ID NO:16所列DNA序列且包含选自下组的一种或多种核酸序列的相应核酸探针:SEQ ID NO:16的第181-207位、第352-411位、第1147-1170位、和第1435-1494位的核酸序列,其中优选第二项和第四项。关于由其它合适来源如小鼠、人、鸡和C.elegans等鉴定合适序列,本发明提供了相应的编号,使本领域技术人员能够实施本发明。依照本发明的原理,可以容易的鉴定并使用所有这些β-diox同系物以及来自还有一些不同来源的其它同系物,因而它们均包括在本发明范围内。
本发明部分基于基本上所有植物、真菌、和细菌本身不含类视黄质的事实。虽然所有植物、有些真菌、和许多细菌能够合成β-胡萝卜素,但是它们通常不具有能够将β-胡萝卜素切割成类视黄质的酶。这些生物体因而可依照本发明用作β-胡萝卜素的来源,从而在导入例如编码15,15’-β-胡萝卜素双加氧酶的cDNA后合成类视黄质。另外,积累香叶基-香叶基-二磷酸(GGPP)但天然或因其它原因缺乏下游酶而基本上不生成β-胡萝卜素的这些生物体也可用于本发明的内容。β-胡萝卜素的合成需要八氢番茄红素合酶(psy),它参与包含两步反应的第一个类胡萝卜素特异反应,导致两分子GGPP头头缩合而形成第一种尚无颜色的胡萝卜素产物八氢番茄红素。另外,进一步的酶促途径必需另外三种植物酶的互补:各自催化导入两个双键的八氢番茄红素去饱和酶(PDS)和ζ-胡萝卜素去饱和酶(ZDS),以及番茄红素β-环化酶。为了减少转化工作,可以在本发明的一个优选实施方案中使用能够导入完全去饱和序列所需要的所有四个双键并将八氢番茄红素直接转变成番茄红素的细菌胡萝卜素去饱和酶,诸如衍生自欧文氏菌的CrtI(参阅Xudong Ye等人,“Engineering the Provitamin A(β-Carotene)Biosynthetic Pathway into(Carotenoid-Free)RiceEndosperm”(将维生素A原(β-胡萝卜素)生物合成途径导入(不含类胡萝卜素的)稻胚乳),Science,287:303-305,2000)。例如,可以将能够优选表达植物八氢番茄红素合酶(psy)(GenBank编号X78814)和细菌八氢番茄红素去饱和酶(crtI)(GenBank编号D90087)二者的载体用于指导在例如通常基本上不合类胡萝卜素的质体中形成番茄红素。另外,可以容易的设计能够表达番茄红素β-环化酶(GenBank编号X98796)的第二种载体并用于共转化。然而,正如转化实验可以证明的,导入编码所述番茄红素β-环化酶的核酸序列可能并不是必不可少的,因为使用包含psy和crtI联合表达盒的一次转化产生的转化体显示积累β-胡萝卜素以及黄体素和玉米黄质。为了使该途径进行至形成维生素A,可以单独导入编码依照本发明的多肽或其功能片段的核酸序列,或者联合任何上述其它酶一起导入。因而,本发明能够在依照本发明适当选择的指定宿主中完全导入或补足维生素A生物合成途径。
说明书全文中用于区分某些靶细胞或组织的术语“包含类胡萝卜素”或“基本上不含类胡萝卜素”指未依照本发明转化的相应植物或其它材料已知通常基本上不含类胡萝卜素,如贮存器官(诸如稻胚乳等)也是如此。不含类胡萝卜素并不排除那些以几乎检测不到的量积累类胡萝卜素的细胞或组织。优选的是,该术语应当定义为具有类胡萝卜素含量0.001%w/w或更低的质体包含物质。
关于选择合适来源用于生成切割类胡萝卜素的酶,应当理解,除了本文公开的来自果蝇的β-diox I和斑马鱼(Danio rerio)的β-diox序列,本领域技术人员通过例如常规筛选可以容易的找到、分离、并适当使用所有功能等同DNA分子及其片段,诸如关于SEQ ID NO:1和/或16所列序列的等位基因变体、同系、或合成修饰(人为的)的序列,来自现有生物体、编码展示相同的期望活性即将β-胡萝卜素切割成类视黄质的酶或其功能片段的序列,和与黑腹果蝇(SEQ ID NO:1)、和/或Danio rerio(SEQ ID NO:16)的部分或完整序列基本上同源的序列,从而确保具有期望生物学或酶活性即特异切割β-胡萝卜素而形成维生素A醛的β-diox多肽或其功能片段的表达,或用于测定所述多肽或其功能片段的特征性核酸的存在。例如,通过使用黑腹果蝇(SEQID NO:1)的序列信息,可以通过本领域知道的且下文进一步详细描述的常规筛选流程鉴定来自人(GenBank编号AF294900)、Musmusculus(GenBank编号AJ278064,AF294899,AF271298),Gallusgallus(GenBank编号AJ271386)和C.elegans(GenBank编号AF098992)的脊椎动物β-diox同系物,它们也为本发明所涵盖。
因而,这些DNA序列优选选自下组:(1)SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:16中所列DNA序列或其互补链;和(2)GenBank编号AF294900,AJ278064,AF294899,AF271298,AJ271386和AF098992代表的DNA序列或其互补链;和(3)SEQ ID NO:1的第211-237位、第382-441位、第1156-1179位、和第1645-1710位DNA序列或其互补链;和(4)SEQ ID NO:16的第181-207位、第352-411位、第1147-1170位、和第1435-1494位的DNA序列或其互补链;和(5)在高严谨度条件下与(1)、(2)、(3)、和(4)中所定义的DNA序列或其互补链发生杂交的DNA序列或其功能片段;和(6)若非遗传密码的简并性将与(1)、(2)、(3)、(4)、和(5)中所定义的DNA序列发生杂交的DNA序列。
杂交严谨度指核酸杂合体表现稳定的条件。这些条件对于本领域普通技术人员而言是显然的。正如本领域技术人员所知道的,杂合体的稳定性由杂合体的解链温度(Tm)反映,序列同源性每降低1%,解链温度降低大约1-1.5℃。杂合体的稳定性通常是钠离子浓度和温度的函数。通常在较高严谨条件下进行杂交反应,随后是不同严谨度的清洗。
在用于本文时,高严谨度指只允许在1M Na+中、于65-68℃形成稳定杂合体的那些核酸序列发生杂交的条件。可以通过例如在含6xSSC、5x Denhardt氏液、1%SDS(十二烷基磺酸钠)、0.1M焦磷酸钠、和0.1mg/ml变性鲑鱼精DNA(作为非特异竞争剂)的水溶液中的杂交来提供高严谨条件。杂交后,可以在几个步骤中进行高严谨度的清洗,最后一次清洗(大约30分钟)是于杂交温度下、在0.2-0.1x SSC、0.1%SDS中进行的。
中严谨度指相当于在上述溶液中、但于大约60-62℃杂交的条件。在这种情况中,最后一次清洗是于杂交温度下、在1x SSC、0.1%SDS中进行的。
低严谨度指相当于在上述溶液中、但于大约50-52℃杂交的条件。在这种情况中,最后一次清洗是于杂交温度、在2x SSC、0.1%SDS中进行的。
应当理解,可以使用多种缓冲液(如基于甲醛的缓冲液)和温度来修改和重复这些条件。Denhardt氏液和SSC对于本领域技术人员而言是众所周知的,其它合适杂交缓冲液也如此(参阅例如Sambrook等人,《Molecular Cloning》(分子克隆),冷泉港实验室出版社,1989;或Ausubel等人编的《Current Protocols in Molecular Biology》(分子生物学通用方案),John Wiley & Sons公司,1990)。必须凭经验确定最佳杂交条件,因为探针的长度和GC含量也有一定影响。
在本文中应当提到,术语与β-diox编码DNA序列“基本上同源的DNA序列”指编码与SEQ ID NO:2和17中分别所列的黑腹果蝇和/或Danio rerio β-diox氨基酸序列至少45%、优选至少60%、更优选至少75%、最优选至少90%同一的氨基酸序列的DNA序列,和编码代表具有特异切割β-胡萝卜素而形成维生素A醛的生物学活性和/或具有特异结合针对本发明多肽或其功能片段所制备的抗体的能力的多肽或其功能片段的DNA序列。例如,本文提及的来自鸡、小鼠、人和蠕虫的DNA序列即是基本同源的序列,因此均包含在本发明范围内。
依照一个优选实施方案,这些DNA序列是cDNA、基因组、或人造(合成)DNA序列的形式,而且可以如本领域所知道的(参阅例如Sambrook等人,同上)或下文具体所述进行制备。
通过本文提供的指导,可以依照本领域众所周知的方法获得本发明的核酸。例如,可以通过化学合成、使用聚合酶链式反应(PCR)、或者通过筛选由认定具有β-diox或以可检测水平表达β-diox的来源构建的基因组文库或合适cDNA文库而获得本发明的DNA。
用于合成目的核酸的化学法在本领域是知道的,包括三酯、亚磷酸酯、亚磷酰胺、和H-磷酸酯方法,PCR和其它自身引物法,以及固相支持物上的寡核苷酸合成。若知道核酸的完整序列,或者可以获得与编码链互补的核酸序列,则可以使用这些方法。或者,若知道目标氨基酸序列,则可以使用每种氨基酸残基的已知和优选编码残基来推断可能的核酸序列。
用于分离β-diox编码基因的其它方法是如(Sambrook等人,第14章,1989)所述使用PCR技术。该方法需要使用能够与β-diox核酸发生杂交的寡核苷酸探针。下文描述了选择寡核苷酸的策略。
用设计用于鉴定目的基因或其编码的蛋白质的探针或分析工具筛选文库。对于cDNA表达文库,合适方法包括识别并特异结合β-diox的单克隆或多克隆抗体;长度为大约20-80个碱基、编码来自相同或不同物种的已知或可疑β-diox cDNA的寡核苷酸;和/或编码相同或杂交基因的互补或同源cDNA或其片段。适用于筛选基因组DNA文库的探针包括但不限于寡核苷酸、编码相同或杂交DNA的cDNA或其片段、和/或同源基因组DNA或其片段。
可以通过在合适杂交条件下用探针即本文公开或提及的核酸(包括可衍生自SEQ ID NO:1和/或16中所列序列或者本文提供的由鸡、小鼠、人和蠕虫的相应GenBank编号代表的序列的寡核苷酸)筛选合适cDNA或基因组文库来分离编码β-diox的核酸。合适文库可以由商业途径获得,或者可以由例如细胞系、组织样品、等等制备。
在用于本文时,探针指例如所具有的核苷酸序列所包含的10-50、优选15-30、最优选至少大约20个连续碱基与例如SEQ ID NO:1和/或16中所列的等同或更多数目的连续碱基相同(或互补)的单链DNA或RNA。选择作为探针的核酸序列的长度和确定性应足以将假阳性结果降至最小。核苷酸序列可以基于上文所述β-diox中保守或高度同源的核苷酸序列或区域。用作探针的核酸在一个或多个位置可以是简并的。在不知道所筛选文库的来源物种的偏爱密码子用法时,简并寡核苷酸的使用可能是特别重要的。
用于构建探针的优选区域包括5’和/或3’编码序列、预测编码配体结合位点的序列、等等。例如,本文公开的或GenBank编号AF294900、AJ278064、AF294899、AF271298、AJ271386和AF098992(基因组粘粒克隆)所代表的全长cDNA克隆或其片段可用作探针。优选的是,用杂交后易于检测的合适标记物手段标记本发明的核酸探针。例如合适标记物手段是放射性标记物。标记DNA片段的优选方法是在随机引发反应中用DNA聚合酶的Klenow片段掺入α32PdATP,正如本领域众所周知的。通常用γ32P标记的ATP和多核苷酸激酶末端标记寡核苷酸。然而,也可以使用其它方法(如非放射性)来标记寡核苷酸或片段,包括例如酶标记、合适荧光团的荧光标记、和生物素化。
例如用包含基本上完整β-diox编码序列的DNA一部分或基于所述或等同DNA一部分的合适寡核苷酸筛选文库之后,通过检测杂交信号来鉴定阳性克隆;通过限制酶作图和/或DNA序列分析来表征所鉴定的克隆;然后通过例如与本文所列序列的比较来进行检验,以确定它们是否包含编码完整β-diox的DNA序列(即它们是否包含转录起始和终止密码子)。若所选择克隆是不完整的,则可将它们用于再次筛选相同或不同文库以获得交叠克隆。若文库是基因组文库,则交叠克隆可能包含外显子和内含子。若文库是cDNA文库,则交叠克隆将包含开放读码框。在这两种情况中,可以通过与本文提供的DNA和推导氨基酸序列的比较来鉴定完整克隆。
为了检测内源β-diox的任何异常,可以使用本发明的核苷酸序列作为杂交探针进行遗传筛选。同样,根据本文提供的核酸序列,可以设计反义或核酶型治疗剂。
设想可以通过核苷酸替代、核苷酸删除、核苷酸插入、或核苷酸片段的倒置及其任意联合而容易的修饰本发明的核酸。这些突变体可用于例如生成具有与自然界中发现的β-diox序列不同的氨基酸序列的β-diox突变体。诱变可以是预先确定的(位点特异的)或随机的。非沉默突变的突变不应改变序列的读码框,而且优选不产生可发生杂交而形成二级mRNA结构(诸如环或发夹)的互补区。
另外,本发明设想并能够使用本文提供的序列数据进行亲缘和功能基因组研究。亲缘研究被作为测序和作图的辅助活动进行,并设计用于提供关于生物学功能(包括例如同源性搜索、二级结构关联、差异cDNA筛选、表达克隆、遗传连锁分析、定位克隆、和诱变分析)的有趣且可能重要的线索。与亲缘研究相反,功能研究通常使用细胞或动物来试图了解序列与生物学功能的更直接关联,包括例如筛选诸如酵母、果蝇、线粒体、人组织、小鼠、和蛙等系统中的表型变化,使用旨在控制基因表达或蛋白质作用的基因“敲除”或其它方法以提供将序列与功能相联系的有用信息。这些技术在本领域是众所周知的。
上述方法的使用应当优选达到一条或多条如下标准:(1)对基因序列的抑制应当具有序列特异性,从而基本上消除假阳性结果;(2)应当具有广泛的应用性,即它应当有可能对高丰度和低丰度两类基因,以及产物是胞内、膜结合、或胞外的序列有效;(3)应当可应用于预测目的(人)状况的模型;(4)应当能够进行剂量-应答研究以测定目标最受影响的剂量;(5)目标确认研究所需要的信息量应当优选最小的,即该技术能够直接研究EST,而无需获得全长基因序列、启动子和其它调控信息、或蛋白质序列/结构的前提条件;(6)应当可用于高通量模式。
因此,本发明提供了应用上述所有方法和技术(包括“敲除”、胞内抗体、aptamer、反义寡核苷酸、和核酶)的足够指导。在本发明的一个优选实施方案中,衍生自任何上述β-diox序列(诸如SEQ ID NO:1和/或16中所列序列)的β-diox特异反义寡核苷酸可用于生物体发育任何阶段的维生素A缺陷相关模型中的剂量-应答研究。在另一个优选实施方案中,使用特别设计的核酶,以通过操作其作用机制固有的元件来进行优化后的序列特异抑制。例如,可以设计只结合它们的靶的核酶,并且通过选择15个核苷酸(完全属于典型ESR的信息限制之内)的靶序列,在统计学上确保靶序列在基因组中将只出现一次。因此,本发明一般性地提供了特别设计的核酶,只与它的靶(预计在基因组中只出现一次)相互作用,高度确保只抑制特定靶。更具体的说,本发明提供了独特装备的核酶,以进行能够证实特定mRNA靶的抑制是由β-diox介导的状况或表型的改变的真实起因的几类重要控制。例如,已知将核酶的催化核心突变使之不能够进行切割但就高度特异结合它的靶而言仍发挥功能。这些“灭活”的核酶相对于有活性的核酶不产生或只产生基本上降低的靶向抑制-使之成为很有效的阴性对照。或者,可以使催化核心维持活性形式,但是修饰靶向臂,使得它们不再结合靶序列。若发生非特异切割,则这种构建物应当显示活性。既然核酶包含不连续的结合臂,那么核酶两个结合臂将分开结合,并在维持特异性的同时为核酶增加选择性。由于这种不连续结合臂的结合强度相对低于例如连续反义结合,所以核酶与靶序列之间的任何错配预计不能有效结合,从而使靶在切割前就脱落。
对于上文例示的方法和技术,可以使用完整序列及其(功能性)片段,特别是上文所述片段。
如果需要,可以依照确立流程使用衍生自β-diox的探针由细胞或组织克隆编码β-diox相关蛋白质或多肽的核酸。具体而言,可以如下制备这些DNA:1)由合适细胞或组织分离mRNA,例如通过DNA探针的杂交或者通过在合适表达系统中的表达和期望多肽表达的筛选来选择期望mRNA,制备与mRNA互补的单链cDNA并由此制备双链cDNA,或2)例如使用DNA探针或者使用合适表达系统并筛选期望多肽的表达,由cDNA文库分离cDNA并筛选期望cDNA,或3)将步骤1)或2)的双链DNA掺入合适表达载体,4)用载体转化合适宿主细胞并分离期望DNA。
通过已知方法分离聚腺苷酸化mRNA(步骤1)。分离方法包括例如在存在去污剂和核糖核酸酶抑制剂(例如肝素、异硫氰酸胍、或巯基乙醇)时将细胞匀浆,用氯仿/酚混合液抽提mRNA(任选存在盐和缓冲液、去污剂、和/或阳离子螯合剂),并用乙醇、异丙醇、等由剩余含盐水相沉淀mRNA。通过氯化铯梯度离心及随后的乙醇沉淀和/或层析法(例如亲和层析,例如寡(dT)纤维素或寡(U)sepharose层析),将分离的mRNA进一步纯化。优选的是,通过梯度(例如线性蔗糖梯度)离心或合适大小分级分离柱(例如琼脂糖凝胶)的层析将这些纯化的mRNA依照大小分开。
通过用DNA探针直接筛选mRNA或者通过在合适细胞或无细胞系统中翻译并筛选获得的多肽来选择期望mRNA。优选使用DNA杂交探针来实现期望mRNA的选择,由此避免翻译的额外步骤。合适DNA探针是核苷酸序列已知、由编码β-diox或相关蛋白质的DNA衍生的至少17个核苷酸组成的DNA。或者,可以使用EST序列信息来生成合适DNA探针。
合成DNA探针是依照下文详述的已知方法合成的,优选使用固相磷酸三酯、亚磷酸三酯、或亚磷酰胺方法的逐步缩合,例如通过磷酸三酯法缩合二核苷酸偶联单位。如(IkeY等人,Nucleic Acids Research,11:477,1983)所述,通过在适当缩合步骤中使用受保护形式的两种、三种、或四种核苷酸dA、dC、dG、和/或dT的混合物或相应二核苷酸偶联单位,使这些方法适用于合成期望寡核苷酸的混合物。
为了杂交,标记DNA探针,例如通过众所周知的激酶反应进行放射性标记。依照已知流程进行大小分离后的mRNA与含标记物的DNA探针的杂交,即在含添加剂(例如钙螯合剂、粘度调节化合物、蛋白质、无关DNA、等)的缓冲液和盐溶液中、于有利于选择性杂交的温度(例如0-80℃,例如25-50℃或65℃左右,优选比杂交双链DNA解链温度低20℃左右)进行杂交。
可以在细胞(例如蛙卵母细胞)或无细胞系统(例如网织红细胞裂解物或麦胚提取物)中翻译分级分离后的mRNA。对获得的多肽筛选β-diox活性或与针对β-diox或其相关蛋白质制备的抗体的反应(例如在免疫测定法中,例如放射性免疫测定法、酶免疫测定法、或荧光标记物免疫测定法)。这些免疫测定法及多克隆和单克隆抗体的制备在本领域是众所周知的并相应应用。依照本发明,提供了多克隆抗体。
由选择的mRNA模板制备单链cDNA在本领域是众所周知的,由单链DNA制备双链DNA也一样。将mRNA模板与脱氧核苷三磷酸(任选放射性标记的脱氧核苷三磷酸,从而能够筛选反应结果)、引物序列(诸如能够与mRNA的聚(A)尾发生杂交的寡dT残基)、和合适酶(诸如逆转录酶,例如来自鸟类成髓细胞性白血病病毒(AMV))的混合液一起保温。例如通过碱性水解降解模板mRNA之后,将cDNA与脱氧核苷三磷酸和合适酶的混合液一起保温,以产生双链DNA。合适的酶是例如逆转录酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、或T4 DNA聚合酶。通常,由单链cDNA自发形成的发夹环结构作为合成第二条链的引物。通过S1核酸酶的消化除去该发夹结构。或者,在水解mRNA模板之前首先通过均聚脱氧核苷酸尾延伸单链DNA的3’端,随后合成第二条cDNA链。
或者,由cDNA文库分离双链DNA并筛选期望cDNA(步骤2)。cDNA文库是如下构建的:如上所述由合适细胞(例如鸡胚细胞、人单核白细胞、或人胚肺上皮细胞)分离mRNA并由此制备单链和双链cDNA。遵循确立流程用合适限制性内切核酸酶消化该cDNA并掺入λ噬菌体(例如λcharon4A或λgt11)。如上所述使用DNA探针筛选复制在硝酸纤维素膜上的cDNA文库,或者在合适表达系统中进行表达并对获得的多肽筛选与针对期望β-diox的特异抗体的反应。
本领域知道多种方法可以将双链DNA掺入适当载体(步骤3)。例如,可以通过在存在相应脱氧核苷三磷酸和酶(诸如末端脱氧核苷酸转移酶)时的保温而向双链DNA和载体DNA添加互补均聚物。然后通过互补均聚尾之间的碱基配对将载体和双链DNA连接到一起,最后通过特定连接酶(诸如连接酶)进行连接。其它可能性是向双链DNA的末端添加合成接头,或者通过平端或粘端连接将双链DNA掺入载体。
用获得的杂合载体转化适当宿主细胞(步骤4)和选择转化的宿主细胞(步骤5)在本领域是众所周知的。杂合载体和宿主细胞可能特别适用于生成DNA或生成期望的β-diox。
除了可用于生成重组β-diox蛋白质,这些核酸还可用作探针,从而使本领域技术人员易于鉴定和/或分离编码β-diox的核酸。核酸可以是未标记的,或者已用可检测模块标记。另外,依照本发明的核酸可用于例如测定β-diox特异核酸的存在甚至数量的方法,所述方法包括将β-diox的编码(或互补)DNA(或RNA)与待测样品核酸进行杂交,并测定β-diox的存在和(任选的)数量。另一方面,本发明提供了与编码β-diox的核酸序列互补或在严谨条件下发生杂交的核酸序列。这些寡核苷酸可有效用于反义和/或核酶方法,包括基因疗法。
本发明还提供了用于扩增核酸待测样品的方法,包括用β-diox的编码(或互补)核酸(DNA或RNA)引发核酸聚合酶(链式)反应。
因此,本发明的DNA序列可作为标准,确定用于由其它来源克隆基本上同源的DNA序列的新PCR引物。另外,可以通过本领域知道的、例如Sambrook等人(同上)描述的方法将它们和这些同源DNA序列整合到载体中,从而在适当宿主系统中表达或过度表达编码的多肽。然而,本领域技术人员知道,DNA序列自身也可用于转化本发明的合适宿主系统以获得所编码多肽的过度表达。
如上所述,本发明由此提供了特异DNA分子,以及包含所述DNA分子的质粒或载体系统,它们在可操作表达盒内包含能够指导在功能上有活性(即指导由β-胡萝卜素生成类视黄质)的β-胡萝卜素双加氧酶II生成的DNA序列。优选的是,所述DNA分子还包含至少一种选择标记基因或cDNA,它可操作连接允许其在细菌、酵母、真菌、昆虫、动物、或植物细胞、种子、组织、或完整生物体中表达的组成性、诱导性、或组织特异性启动子序列。若选择含质体材料进行转化,则优选将编码核苷酸序列融合合适质体运输肽编码序列,二者都优选在组织特异性或组成性启动子的控制下表达。
依照本发明的多肽包括β-diox及其衍生物,所述衍生物保留了β-diox的至少一种共有结构决定簇。
“共有结构决定簇”指研究的衍生物具有β-diox的至少一种结构特征。结构特征包括具有能够与针对天然发生的或变性的β-diox多肽或其片段制备的抗体发生交叉反应的表位或抗原性位点、具有与β-diox的氨基酸序列同一性、和具有共有的结构/功能关联。因而,由本发明提供的β-diox包括由初级转录本的其它剪接产生的mRNA编码的剪接变体、氨基酸突变体、糖基化变体、和保留了β-diox的生理学和/或物理学特性的其它β-diox共价衍生物。例示性衍生物包括通过替代、化学、酶促、或其它适当手段用非天然发生氨基酸的模块共价修饰本发明蛋白质获得的分子。这种模块可以是可检测模块,诸如酶或放射性同位素。还包括由特定物种(优选哺乳动物)发现的β-diox天然发生变体或同系物。这种变体或同系物可能是由相同基因家族的相关基因、特定基因的等位基因变体编码的,或者代表β-diox基因的其它方式剪接的变体。
保留共有结构特征的衍生物可以是β-diox的片段。β-diox的片段包括它的单个结构域,以及衍生自结构域的更小多肽。优选的是,衍生自依照本发明的β-diox的更小多肽确定了β-diox的一个特征性特征。在理论上,片段可以是几乎任何大小,只要它们保留β-diox的一个特征即可。优选的是,片段的长度是5-200个氨基酸。将较长的片段看作全长β-diox的截短型,通常为术语“β-diox”所涵盖。β-diox多肽的例示性片段分别是SEQ ID NO:2的第71-79位、第128-147位、第386-393位、和第549-570位,以及SEQ ID NO:17的第30-38位、第87-106位、第352-359位、和第448-467位代表的氨基酸序列。其它例示性片段可以由来自其它来源(包括人、鸡、小鼠和蠕虫)的相应同源序列衍生得到。
β-diox的衍生物还包括它们的突变体,可以包含氨基酸删除、添加、或替代,只要满足维持β-diox的至少一个特征性特征的要求即可。因而,可以进行保守氨基酸替代而基本上不改变β-diox的本性,5’或3’端截短的形式也一样。此外,可以对本发明所包括的β-diox片段进行删除和替代。可以由编码β-diox的DNA生成β-diox突变体,即对所述DNA进行体外诱变,导致例如一个或多个氨基酸的添加、交换、和/或删除。例如,可以通过重组方法制备β-diox的替代、删除、或插入变体,并筛选与天然形式β-diox的免疫交叉反应性。
本发明还提供了β-diox多肽及其衍生物,所述衍生物保留了β-diox的至少一种共有抗原决定簇。
“共有抗原性决定簇”指研究的衍生物具有β-diox的至少一种抗原性功能。抗原性功能包括具有能够与针对天然发生的或变性的β-diox多肽或其片段制备的抗体发生交叉反应的表位或抗原性位点。
保留共有抗原性决定簇的衍生物可以是β-diox的片段。β-diox的片段包括它的单个结构域,以及衍生自结构域的更小多肽。优选的是,衍生自依照本发明的β-diox的更小多肽确定了β-diox的一个特征性表位。在理论上,片段可以是几乎任何大小,只要它们保留β-diox的一个特征即可。优选的是,片段的长度是5-500个氨基酸。将较长的片段看作全长β-diox的截短型,通常为术语“β-diox”所涵盖。
本发明提供了用于生产β-diox多肽的方法,包括(1)在合适宿主中表达由上文所述DNA编码的多肽,并(2)依照本领域众所周知的常规技术分离所述β-diox多肽。另外,提供了通过上述过程获得或可获得的蛋白质。
优选的是,本发明的蛋白质或其衍生物是以分离形式提供的。“分离的”指蛋白质或其衍生物经鉴定不含其天然环境中的一种或多种成份。分离的β-diox包括重组细胞培养物中的β-diox。表达重组β-diox基因的生物体中存在的β-diox,无论β-diox蛋白质是“分离的”或其它形式的,都包括于本发明的范围之内。
如果需要,在任何所述系统(细菌、真菌、植物、动物、等)中形成的维生素A醛可以进一步代谢成视黄醇、视黄酯、视黄酸、及其相应立体异构体。那些修饰可用于改进切割反应的效率和/或积累期望的类视黄质。特定类视黄质的积累可能是有用的,因为类视黄质根据其氧化状态(醇、醛、和酸)和立体异构形式而发挥不同生物学功能,例如视黄醛/视黄醇在视觉中的功能,视黄酸在发育过程和分化中的功能,而视黄酯是动物体内维生素A的正常贮存物。可以通过类视黄质修饰酶与β-diox的共表达来实现期望类视黄质衍生物的积累。通过那些功能联合,例如可以在作为饲料、食品、和/或饲料和食品添加剂的植物和/或细菌中实现视黄酯的积累,或者可以实现特定类视黄质(例如9-顺式视黄酸,即RXR转录因子的配体)的生物合成。另外,动物起源的类视黄质结合蛋白的共表达可以改进期望类视黄质的产量。
依照本发明的一个优选实施方案,将下列酶或酶组合与β-diox一起共表达。例如,若希望将视黄醛转变成视黄醇,可以使用醇脱氢酶(如AF059256)和/或视黄醛脱氢酶/还原酶(如AW211228)。在意欲由视黄醇生成视黄酯的情况中,可以使用视黄醇酰基转移酶(如AF071510)。若应当由视黄醛生成视黄酸,则将选择视黄醛氧化酶(如AB017482)。另外,若希望共表达类视黄质结合蛋白,则可设想选择视黄醇结合蛋白(如AJ236884)。最后,可以共表达将上述化合物的全-反式结构转变成13-顺式、11-顺式、9-顺式、或7-顺式异构体的不同异构酶。
依照本发明,提供了转化植物细胞、种子、组织、或完整植株以及用于转化微生物(诸如酵母、真菌、和细菌)以生成能够介导类视黄质合成的转化体的手段和方法。依照本发明的另一方面,所述方法还可用于修饰动物中的类视黄质代谢。
选择用于转化的宿主材料应当表达导入的基因,而且它们的表达优选是纯合的。通常,基因将可操作连接在特定植物、昆虫、动物、或微生物(诸如包括酵母在内的真菌和细菌)的靶向宿主细胞中在功能上有活性的启动子。其表达水平应当足以获得期望来自该基因的特征。例如,选择标记基因的表达应当提供对依照本发明方法产生的转化体的适当选择。相似的,展示将β-胡萝卜素切割成类视黄质的期望活性、用于增强营养品质的酶的编码基因的表达应当导致转化体相对于未进行本发明转化方法的相同物种具有相对较高含量的所编码基因产物。另一方面,通常希望限制目的基因的过度表达以避免显著不利的影响植物、昆虫、真菌、动物、或微生物的正常生理,即其表达程度不至于使得它们的培养变得困难。
可以在用于在转化的原核或真核宿主细胞、种子、组织、或完整生物体中表达的表达盒中使用编码β-胡萝卜素双加氧酶的基因。为了实现本发明的目的,即在目的靶宿主中导入切割β-胡萝卜素而形成类视黄质的能力,优选使用包含转录起始区(与编码β-胡萝卜素双加氧酶的基因相连)的可操作表达盒进行转化。
转录起始区对宿主而言可以是天然或类似的,或者是外源或异源的。外源指在转录起始区所导入的野生型宿主中未曾发现有该转录起始区。
在植物材料中,对与贮存蛋白(诸如谷蛋白、patatin、napin、cruciferin、β-conglycinin、菜豆蛋白、等)有关的那些转录起始区特别感兴趣。
转录盒将包含(以转录的5’-3’方向)转录和翻译起始区、编码β-胡萝卜素双加氧酶或其功能片段(保留其特异的酶促、免疫原性、或生物学活性)的DNA序列、及在靶向宿主材料(诸如植物或微生物)中有功能的转录和翻译终止区。终止区可以是相对于转录起始区是天然的,可以是相对于目的DNA序列是天然的,或者可以衍生自其它来源。可以由根癌土壤杆菌的Ti质粒获得适用于植物材料的合适终止区,诸如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区(参阅Guerineau等人,Mol.Gen.Genet.,262:141-144,1991;Proudfoot,Cell,64:671-674,1991;Sanfacon等人,Genes Dev.,5:141-149,1991;Mogen等人,Plant Cell,2:1261-1272,1990;Munroe等人,Gene,91:151-158,1990;Ballas等人,Nucl.Acids Res.,17:7891-7903,1989;Joshi等人,Nucl.Acids Res.,15:9627-9639,1987)。
为了在植物或含质体材料中表达β-胡萝卜素双加氧酶,优选将编码序列融合编码运输肽的序列,它在表达和翻译后指导将切除运输肽的蛋白质转运至发生类胡萝卜素生物合成的(植物)质体,诸如叶绿体。例如,可以在翻译水平将β-diox cDNA融合编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(核糖体二磷酸羧化酶-加氧酶)小亚基运输肽的序列或编码其它质体蛋白运输肽的序列。这些运输肽在本领域是知道的(参阅例如Von Heijne等人,Plant Mol.Biol.Rep.,9:104-126,1991;Clark等人,J.Biol.Chem.,264:17544-17550,1989;Della-Cioppa等人,Plant Physiol.,84:965-968,1987;Romer等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,196:1414-1421,1993;和Shah等人,Science,233:478-48 1,1986)。可用于进行本发明的任何基因可以利用天然或异源运输肽。
构建物还可包含任何其它必需调节基因,诸如植物翻译共有序列(Joshi,1987,同上)、内含子(Luehrsen和Walbot,Mol.Gen.Genet.,225:81-93,1991)、等,它们可操作连接编码β-胡萝卜素双加氧酶的核苷酸序列。希望导入的编码基因内的内含子序列可以通过稳定转录本并使之有效转运至细胞核外而提高表达水平。在已知的这些内含子序列中包括植物遍在蛋白基因的内含子(Cornejo,Plant Mol.biol.,23:567-581,1993)。另外,已经观察到将相同构建物插入基因组的不同基因座可以改变植物中的表达水平。据认为这种影响部分由于基因在染色体上的位置所致,即不同隔离群将具有不同的表达水平(参阅例如Hoever等人,Transgenic Res.,3:159-166,1994)。可用于构建表达盒的其它调控DNA序列包括例如能够调控(诱导或遏制)相连DNA序列在植物组织中的转录的序列。
已知例如某些植物基因受到多种内部或外部因素的诱导,诸如植物激素、热休克、化学药品、病原体、缺氧、光、应激、等。
另一组可被调控的DNA序列包括存在于烟草PR(发病相关)蛋白基因中且由化学调节剂(诸如EP-A 0 332 104中所述)方式诱导的化学驱动序列。
在植物、动物、昆虫、真菌、或微生物中表达外源基因的另一个考虑事项是转基因基因组的稳定水平,即外源基因由群体分离的趋向。若将选择标记与目的基因或表达盒连接,则可以施加选择以维持转基因宿主生物体或其部分。
在表达盒构建物中包含5’前导序列可能是有利的。这些前导序列可以增强翻译。翻译前导序列在本领域是知道的,包括:微小RNA病毒前导序列,例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区;Elroy-Stein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:6126-6130,1989);马铃薯Y病毒组,例如TEV前导序列(烟草蚀刻病毒;Allisson等人,Virology,154:9-20,1986);人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP;Macejak和Sarnow,Nature,353:90-94,1991);来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4;Jobling和Gehrke,Nature,325:622-625,1987);烟草花叶病毒前导序列(TMV;Gallie等人,Molecular Biology of RNA,237-256,1989);和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV;Lommel等人,Virology,81:382-385,1991;Della-Cioppa等人,1987,同上)。
根据在哪里表达编码β-胡萝卜素双加氧酶的DNA序列,可能希望合成具有宿主偏爱密码子或者叶绿体或质体偏爱密码子的序列。可以由具体目的植物物种中最大表达量的蛋白质中的最高频率密码子确定植物偏爱密码子(参阅EP-A 0 359 472;EP-A 0 386 962;WO 91/16432;Perlak等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:324-3328,1991;和Murray等人,Nucl.Acids Res.,17:477-498,1989)。这样,可以优化核苷酸序列用于在任何靶向宿主中表达。应当认识到,可以优化或合成基因序列的所有或任何部分。即也可以使用合成或部分优化的序列。关于叶绿体偏爱基因的构建,参阅USPN 5,545,817。
编码β-diox的表达系统可用于研究β-diox活性,特别是在转基因细胞、组织、或动物中。优选已经削弱了β-diox表达的系统,特别是通过转座子插入手段来实现这种削弱的系统。依照本发明的突变细胞、组织、或动物其β-diox表达受损。尤其是那些表达严重削弱但不受限制的表达突变体可用于研究β-diox活性。它们显示对推定上游信号剂与β-diox特定靶结构域的受调相互作用以及对预测介导其生物学应答的下游靶的修饰的敏感性增加。因此,本发明还提供了用于评估试剂靶向β-diox活性的能力的方法,包括将本文所述β-diox突变体暴露于该试剂,并判断对β-diox生物学活性的影响。
在制备转录盒时,可以操作多种DNA片段以提供处于正确取向和正确读码框的DNA序列。为此目的,可以采用衔接头或接头来连接DNA片段,或者可以包括其它操作以提供方便的限制性位点、除去多余DNA、除去限制性位点、等。为此目的,可以采用体外诱变、引物修复、限制性消化、退火、切除、连接、等,其中可能涉及插入、删除、或替代(如转换和颠换)。
可以通过标准方法将携带编码天然或突变β-胡萝卜素双加氧酶的cDNA或基因组DNA的表达盒置于表达载体中。在用于本文时,载体(或质粒)指用于将异源DNA导入细胞以进行表达或复制的离散元件。这些载体的选择和使用完全属于本领域技术范围之内。可以获得许多载体,而且适当载体的选择将依赖于载体的意欲用途(即它是用于DNA扩增还是用于DNA表达)、将插入载体的DNA的大小、将用载体转化的宿主的类型(植物、动物、昆虫、真菌、或微生物)、和将表达载体导入宿主细胞的方法。根据其功能(DNA扩增或DNA表达)和相容宿主细胞,每种载体都包含多种元件。典型表达载体通常包含但不限于编码细菌复制起点和抗生素抗性基因的原核DNA元件,提供表达载体在细菌宿主中的生长和选择;克隆位点,用于插入外源DNA序列,在本文中是编码能够切割β-胡萝卜素而形成类视黄质的酶的DNA序列;控制外源基因转录起始的真核DNA元件,诸如启动子;和控制转录本加工的DNA元件,诸如转录终止/聚腺苷酸化序列。它还可包含最终将载体整合到靶向宿主染色体中所需要的序列。
在一个优选的实施方案中,表达载体还包含编码选择标记的基因(在功能上连接启动子),诸如潮霉素磷酸转移酶(van den Elzen等人,Plant Mol.Biol.,5:299-392,1985)。赋予抗生素抗性因而适合于作为选择标记的基因的其它范例包括新霉素磷酸转移酶基因(Velten等人,EMBO J,3:2723-2730,1984);衍生自Tn5的卡那霉素抗性(NPT II)基因(Bevan等人,Nature,304:184-187,1983);PAT基因(Thompson等人,EMBO J.,6:2519-2523,1987);和氯霉素乙酰基转移酶基因。关于适用于本发明的植物表达载体和选择标记基因的一般描述参阅Gruber等人,《Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology》(植物分子生物学和生物技术的方法),第89-119页,CRC出版社,1993。至于适用于酵母的选择标记,可以使用因标记基因的表型表达而便于选择转化体的任何标记基因。适用于酵母的标记是例如赋予抗生素G418、潮霉素、或博来霉素抗性的基因,或者在营养缺陷型酵母突变体中提供原养型的基因(例如URA3、LEU2、LYS2、TRP1、或HIS3基因)。
适用于哺乳动物细胞的选择标记是能够鉴定有能力摄取β-diox核酸的细胞的基因,诸如二氢叶酸还原酶(DHFR,氨甲蝶呤抗性)、胸苷激酶,或者赋予G418或潮霉素抗性的基因。将哺乳动物细胞转化体置于只有已经摄取并表达标记的转化体唯一适合于存活的选择压力下。在以DHFR或谷氨酰胺合酶(GS)作为标记的情况中,可以通过在逐渐提高压力的条件下培养转化体来施加选择压力,由此导致选择基因和编码β-diox的相连DNA二者的扩增(在其染色体整合位点)。扩增指生成生长所必需的蛋白质更加需要的基因与编码期望蛋白质的密切相连基因在重组细胞染色体内重复串联的过程。期望蛋白质的增量通常是由因此扩增的DNA合成的。
用于分别控制目的基因和标记基因的表达的启动子元件可以是任何植物相容启动子。它们可以是植物基因启动子,诸如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(核糖体二磷酸羧化酶-加氧酶)小亚基的启动子或来自根癌土壤杆菌肿瘤诱导质粒的启动子,像胭脂碱合酶和章鱼碱合酶启动子;或者是病毒启动子,诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子或玄参花叶病毒35S启动子。关于适用于本发明的已知植物启动子的回顾,参阅例如国际申请WO 91/19806。
“组织特异性”启动子提供期望基因产物在表达类胡萝卜素或叶黄素生物合成途径产物的组织中特别高的积累;尽管在植物的其它部分也可以发生一些表达。已知的组织特异性启动子的范例包括谷蛋白1启动子(Kim等人,Plant Cell Pysiol.,34:595-603,1993;Okita等人,J.Biol.Chem.,264:12573-12581,1989;Zheng等人,PlantJ.,4:357-366,1993)、针对块茎的I型patatin启动子(Bevan等人,Nucl.Acids Res.,14:4625-4638,1986);与马铃薯块茎ADPGPP基因相连的启动子(Muller等人,Mol.Gen.Genet.,224:136-146,1990);β-conglycinin(也称为7S蛋白质,驱动种子定向转录)的大豆启动子(Bray,Planta,172:364-370,1987);和来自玉米胚乳玉米蛋白基因的种子定向启动子(Pedersen等人,Cell,29:1015-1026,1982)。可用于本发明的另一类启动子是植物遍在蛋白启动子。植物遍在蛋白启动子在本领域是众所周知的,正如Kay等人,Science,236:1299,1987和EP-A 0 342 926所证明的。同样适用于本发明的是肌动蛋白启动子、组蛋白启动子、和微管蛋白启动子。EP-A0 332 104描述了优选的化学诱导启动子的范例,诸如烟草PR-1a启动子。另一类优选启动子是创伤诱导型启动子。这一类的优选启动子包括下列所述:Stanford等人,Mol.Gen.Genet.,215:200-208,1989;Xu等人,Plant Mol.Biol.,22:573-588,1993;Logemann等人,Plant Cell,1:151-158,1989;Rohrmeier和Lehle,PlantMol.Biol.,22:783-792,1993;Firek等人,Piant Mol.Biol.,22:192-142,1993;和Warner等人,Piant J.,3:191-201,1993。
依照一个优选实施方案,用于表达β-胡萝卜素双加氧酶的盒包含β-diox cDNA,并在翻译水平融合了编码用于质体输入的运输肽的序列、聚腺苷酸化信号、和转录终止子,它们都可操作连接允许期望蛋白质在植物细胞、种子、组织、或完整植株中表达的合适组成性、诱导性、或组织特异性启动子。
此外,依照本发明的β-diox基因优选包含分泌序列以便于由细菌宿主分泌多肽,使之以可溶性天然肽而非包涵体的形式生成。根据情况,可以由细菌周质间隙或培养基回收肽。
适用于酵母宿主的启动序列可以是受控或组成性的,而且优选衍生自高度表达的酵母基因,尤其是酿酒酵母基因。因而可以使用TRP1基因、ADHI或ADHII基因、酸性磷酸酶(PHO5)基因的启动子;编码α或a因子的酵母交配信息素基因的启动子;衍生自编码糖酵解酶的基因的启动子,诸如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、或葡萄糖激酶基因的启动子;或来自TATA结合蛋白(TBP)基因的启动子。另外,有可能使用包含一种酵母基因的上游激活序列(UAS)和另一种酵母基因的下游启动子元件(包括功能性TATA盒)的杂合启动子,例如包含PHO5基因的UAS和酵母GAP基因包含功能性TATA盒的杂合启动子(PHO5-GAP杂合启动子)。合适组成性PHO5启动子是例如缺乏上游调控元件(UAS)、诸如PHO5(-173)启动子元件(由PHO5基因的第-173位核苷酸开始,至第9位核苷酸结束)的缩短型酸性磷酸酶PHO5启动子。
可以通过衍生自病毒(诸如多瘤病毒、腺病毒、禽痘病毒、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、逆转录病毒、和猿猴病毒40(SV40))基因组、衍生自异源哺乳动物启动子(诸如肌动蛋白启动子或很强的启动子如核糖体蛋白质启动子)、或者衍生自通常与β-diox序列相连的启动子的启动子来控制哺乳动物宿主中由载体转录β-diox基因,条件是这些启动子与宿主细胞系统是相容的。
可以通过将增强子序列插入载体来提高编码β-diox的DNA在高等真核生物中的转录。增强子相对不依赖于取向和定位。已知来自哺乳动物基因(如弹性蛋白酶和珠蛋白)的许多增强子序列。然而,通常采用来自真核细胞病毒的增强子。范例包括位于复制起点(第100-270位bp)晚期一侧的SV40增强子和CMV早期启动子增强子。可以将增强子剪接到载体中,位于β-diox DNA的5’或3’,但是优选位于启动子的5’位点。
有利的是,编码β-diox的真核表达载体可以包含基因座控制区(LCR)。LCR能够指导整合到宿主细胞染色质中的转基因的高水平整合位点独立性表达,这尤其对在永久转染的真核细胞系(其中载体发生了染色体整合)中表达β-diox基因时、在设计用于基因疗法应用的载体时、或者在本文公开的或本领域已知的转基因动物或其它宿主中是重要的。
依照本发明的一个优选实施方案,本文公开的表达盒和质粒或载体系统额外包含编码特异性类视黄质修饰酶和/或类视黄质结合蛋白的核酸序列,优选与依照本发明的多肽共表达,正如上文所述。
适用于表达β-diox的真核宿主细胞,包括真菌(包括酵母)、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞,还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。通常可以由真核或病毒DNA或cDNA的5’和3’非翻译区获得这些序列。这些区域包括转录成编码β-diox的mRNA非翻译部分中的聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。
可以通过几种方法获得本发明涵盖的原核或真核宿主细胞、种子、组织、和完整生物体。本领域技术人员将领会,可以根据转化所靶向的宿主的类型(诸如植物,即单子叶或双子叶)来选择方法。这些方法通常包括直接基因转移、化学诱导基因转移、电穿孔、显微注射(Crossway等人,BioTechniques,4:320-334,1986;Neuhaus等人,Theor.Appl.Genet.,75:30-36,1987)、由土壤杆菌介导的基因转移、使用例如可以由Agracetus公司(麦迪逊,威斯康星)和Dupont公司(威尔明顿,特拉华)获得的装置的微弹加速法(参阅例如Sanford等人,美国专利号4,945,050;和Mc Cabe等人,Biotechnology,6:923-926,1988)、等。
用于获得本发明转化植物或其部分的一种方法是直接基因转移,其中在存在包含希望导入植物或其部分的核苷酸序列的DNA寡核苷酸时在合适条件下培养植物细胞或以其它方式生长。供体DNA来源通常是包含期望基因的质粒或其它合适载体。为了方便,这里参考了质粒,应当理解,也涵盖了包含期望基因的其它合适载体。
可以通过直接基因转移处理摄取质粒的任何合适植物组织。这些植物组织包括例如处于发育早期,特别是减数分裂前,尤其是减数分裂前1-2周的生殖结构。通常,将减数分裂前的生殖器官浸泡在质粒溶液中,诸如通过将质粒溶液直接注射到植物中生殖器官处或附近。然后将植物自花授粉或与来自以相同方式处理的另一株植物的花粉交叉授粉。质粒溶液通常在用于每个花结构的大约0.1-10ml中包含大约10-50μg DNA,但是根据具体花结构的大小可以高于或低于这个范围。溶剂通常是无菌的水、盐水、或缓冲液,或者是常规的植物培养基。如果需要,质粒溶液还可以包含试剂,以化学诱导或增强质粒摄取,诸如PEG、Ca2+、等。
在将生殖器官暴露于质粒后,使花结构生长至成熟并收获种子。根据质粒标记,通过植物在标记敏感或优选标记抗性培养基中的发芽或生长来选择具有标记基因的转化植物。例如,由用具有卡那霉素抗性基因的质粒处理的植物获得的种子将保持绿色,而不具有这种标记基因的植物是白化体。可以通过常规的Southern、Northern、和Western印迹技术进一步证明期望基因的mRNA转录和肽表达的存在。
在适用于进行本发明的另一种方法中,处理植物原生质体以诱导依照本发明的质粒或载体系统的摄取。原生质体的制备在本领域是众所周知的,通常包括用纤维素酶和其它酶消化植物细胞足够时间以除去细胞壁。通常通过过筛和清洗由消化混合物分离原生质体。然后将原生质体悬浮于适当培养基,诸如F培养基、CC培养基、等,浓度通常是104-107个细胞/ml。然后向此悬浮液中加入上文所述质粒溶液和诱导剂(诸如聚乙二醇、Ca2+、仙台病毒、等)。或者,可以将质粒包裹到脂质体中。然后将质粒与原生质体的溶液于大约25℃保温适当时间,通常是大约1小时。在有些情况中,可能希望通过短时加热至大约45℃例如2-5分钟并迅速冷却至保温温度而对混合物进行热休克。然后克隆处理后的原生质体,并通过例如标记基因的表达和常规的印迹技术来选择期望基因的表达。然后以常规方式由克隆再生完整植株。
电穿孔技术是相似的,只是通常在电穿孔槽中在不存在或存在聚乙二醇、Ca2+、等时对裸露质粒和原生质体的混合物应用电流。典型电穿孔包括1-10个脉冲的40-10,000DC伏特,持续时间1-2000微秒,各脉冲之间的间隔通常是0.2秒。也可以使用相似强度的交流脉冲。更具体的说,将带电电容器在含质粒和原生质体悬浮液的电穿孔槽中放电。这种处理导致生物膜通透性的可逆升高,从而能够插入依照本发明的DNA。电穿孔后的植物原生质体再生它们的细胞壁,分裂,并形成愈伤组织(参阅例如Riggs等人,1986)。
适用于转化靶细胞的另一种方法涉及土壤杆菌的使用。在这种方法中,将包含具有期望基因或基因盒的质粒的土壤杆菌用于感染植物细胞并将质粒插入靶细胞基因组。然后如上所述选择并克隆表达期望基因的细胞。例如,通过质粒(如Ri质粒)和土壤杆菌(如发根土壤杆菌或根癌土壤杆菌)的手段将目的基因导入靶组织(如块茎、根、谷粒、或豆荚)的一种方法是利用适用于在大肠杆菌中克隆的小型重组质粒,其中已经经剪接了T-DNA片段。在T-DNA内的一个位点处切开这种重组质粒,并在开口处剪接一段“过客”DNA。过客DNA由将要导入植物DNA的本发明基因和选择标记(如抗生素抗性的基因)组成。然后将这种质粒再次克隆到大型质粒中,并导入携带未修饰Ri质粒的土壤杆菌菌株。在细菌的生长过程中,有时会发生罕见的双重重组,导致细菌中的T-DNA包含插入片段即过客DNA。通过在含抗生素的培养基上的存活来鉴定并选择这些细菌。将这些细菌用于将它们的T-DNA(经过客DNA修饰)插入植物基因组。利用发根土壤杆菌或根癌土壤杆菌的这种流程产生了可再生成健康、有活力植株的转化植物细胞(参阅例如Hinchee等人,1988)。
另一种合适方法是用微弹轰击细胞,所述微弹包被了转化DNA(Wang等人,Plant Mol.Blol.,11:433-439,1988),或者通过压力冲击在含DNA的溶液中以待转化细胞的方向加速,由此因压力冲击而与溶液细微散布成雾状(EP-A 0 434 616)。
微弹轰击已经发展成用于细胞(包括植物细胞)的有效转化技术。Sanford等人(Particulate Science and Technology,5:27-37,1987)报导了利用微弹轰击将核酸有效投递至洋葱(Allium cepa)植物细胞的细胞质。Christou等人(Platn Physiol.,87:671-674,1988)报导了通过微弹轰击用卡那霉素抗性基因稳定转化大豆愈伤组织。相同作者报导了大约0.1-5%细胞被穿透,并发现可观测水平的NPTII酶活性和转化愈伤组织中高达400mg/L的卡那霉素抗性。McCabe等人(1988,同上)报导了使用微弹轰击稳定转化大豆(Glycine max)。McCabe等人还报导了由R0嵌合植物回复转化R1植物的发现(还可参阅Weissinger等人,Annual Rev.Genet.,22:421-477,1988;Datta等人,Biotechnology,8:736-740,1990(稻);Klein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:4305-4309,1988(玉米);Klein等人,Plant Physiol.,91:440-444,1988(玉米);Fromm等人,Biotechnology,8:833-839,1990;和Gordon-Kamm等人,Plant Cell,2:603-618,1990(玉米))。
或者,可以直接转化植物质体。已经在高等植物中报导了叶绿体的稳定转化(参阅例如Svab等人,Proc.Natl.Acad Sci.USA,90:913-917,1993;Staub和Maliga,EMBO J.,12:601-606,1993)。该方法依赖于包含选择标记的DNA的微粒枪投递和通过同源重组将DNA打靶至质体基因组。在这些方法中,可以通过质体基因启动子的使用或通过所处位置便于由选择性启动子序列(诸如由T7 RNA聚合酶识别的启动子序列)的沉默的质体传播转基因的转录激活来实现质体基因表达。沉默质体基因是通过由细胞核表达构建物表达的特定RNA聚合酶激活的,并通过运输肽的使用将聚合酶靶向质体。可以这种方法通过由合适植物组织特异性启动子表达的细胞核编码、质体定向的特异性RNA聚合酶来获得组织特异性表达。McBride等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:7301-7305,1994)已经报导了这种系统。
所有植物转化系统都产生转基因和非转基因植物的混合物。可以通过导入抗生素或除草剂基因使之能够在含相应有毒化合物的培养基上选择来实现转基因植物细胞的选择。除了那些用于选择转基因植物的标记系统,新的所谓“阳性选择系统”已经成功用于植物转化(PCT/EP94/00575、WO 94/20627)。与抗生素或除草剂抗性选择系统(其中转基因细胞获得在选择培养基上存活的能力,而杀死非转基因细胞)相反,这种方法有利于转基因植物细胞的再生和生长,并饿死而非杀死非转基因植物细胞。因此,将这种选择策略称为“阳性选择”。已经构建了用于由土壤杆菌介导的转化的载体系统,并成功用于例如转化马铃薯、烟草、和番茄(Haldrup A、Petersen SG、和Ollels FT,Platn Mol.Biol.,37:287-296,1998)。基于这种阳性选择系统的转化系统依照本发明可用于导入包含β-diox的构建物以获得表达β-diox多肽的植物并由此能够酶促切割β-胡萝卜素而形成维生素A醛。另外,那些选择系统的使用将具有优点,即克服了在选择系统中使用抗生素或除草剂基因的缺点,诸如基因产物的毒性或变应原性以及抗生素处理的干涉,正如本领域普遍知道的。
上文以例示方式列出的可能转化方法并没有宣称是完全的,而且并非意欲以任何方式限制本发明的主题。
因此,本发明还包括以适当方式用上文所列依照本发明的DNA分子或者用质粒或载体系统转化或转染的原核或真核宿主细胞、种子、组织、或完整生物体,所述方式使得所述宿主细胞、种子、组织、或完整生物体能够表达具有特异切割β-胡萝卜素而形成维生素A醛的生物学活性和/或具有特异结合针对所述多肽或其功能片段所制备的抗体的能力的多肽或其功能片段。
依照本发明,原核或真核宿主细胞、种子、组织、或完整生物体选自下组:细菌、酵母、真菌、昆虫、动物、和植物细胞、种子、组织、或完整生物体。关于原核分类群,宿主可以选自下组:原细菌(proteobacteria),包括α、β、γ、δ、和ε亚门的成员;革兰氏阳性细菌,包括放线菌纲(Actinomycetes)、硬壁菌门(Firmicutes)、梭菌属(Clostridium)及其亲缘、黄细菌(flavobacteria)、蓝细菌(cyanobacteria)、绿色硫细菌(greensulfur bacteria)、绿色非硫磺细菌(green non-sulfur bacteria)、和古细菌(archaea)。属于α亚门的合适原细菌可以选自下组:土壤杆菌属(Agrobacterium)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红细菌属(Rhodobacter)、红微菌属(Rhodomicrobium)、红球形菌属(Rhodopila)、根瘤菌属(Rhizobium)、硝化杆菌属(Nitrobacter)、水螺菌属(Aquaspirillum)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、醋杆菌属(Acetobacter)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)、副球菌属(Paracoccus)、和假单胞菌属(Pseudomonas),优选土壤杆菌属和红细菌属,分别最优选金黄色土壤杆菌(Agrobacterium aureus)和荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)。属于β亚门的合适原细菌可以选自下组:红环菌属(Rhodocyclus)、红育菌属(Rhodopherax)、RhodovivaX、螺菌属(Spirillum)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、球衣菌属(Spherotilus)、硫杆菌属(Thiobacillus)、产碱菌属(Alcaligenes)、假单胞菌属(Pseudomonas)、博德特氏菌属(Bordetella)、和奈瑟氏球菌属(Neisseria),优选氧化氨的细菌诸如亚硝化单胞菌属,最优选亚硝化单胞菌ENI-11。属于γ亚门的合适原细菌可以选自下组:着色菌属(Chromatium)、硫螺旋菌属(Thiospirillum)、贝日阿托氏菌属(Beggiatoa)、亮发菌属(Leucothrix)、埃希氏菌属(Escherichia)、和固氮菌属(Azotobacter),优选肠杆菌科(Enterobacteriaceae)诸如大肠埃希氏菌(Escherichiacoli),最优选大肠杆菌K12菌株诸如M15(描述为DZ 291,Villarejo等人,J.Bacteriol.,120:466-474,1974)、HB101(ATCC编号33649)、和大肠埃希氏菌SG13009(Gottesman等人,J.Bacteriol.,148:265-273,1981)。属于δ亚门的合适原细菌可以选自下组:蛭弧菌属(Bdellovibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、脱硫单胞菌属(Desulfuromonas)、和粘细菌(Myxobacteria)诸如粘球菌属(Myxococcus),优选黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)。属于ε亚门的合适原细菌可以选自下组:卵硫菌属(Thiorulum)、沃林氏菌属(Wolinella)、和弯曲杆菌属(Campylobacter)。合适的革兰氏阳性细菌可以选自下组:放线菌(Actinomycetes)诸如放线菌属(Actinomyces)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、游动放线菌属(Actinoplanes)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、小单孢菌属(Micromonospora)、弗兰克氏菌属(Frankia)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、和短杆菌属(Brevibacterium),硬壁菌门(Firmicutes)包括梭菌属及其亲缘诸如梭菌属、芽孢杆菌属(Bacillus)、脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)、芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、瘤胃球菌属(Rominococcus)、动性球菌属(Planococcus)、枝原体属(Mycoplasma)、无胆甾原体属(Acheoleplasma)、和螺原体属(Spiroplasma),优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。合适的黄细菌类可以选自下组:拟杆菌属(Bacteroides)、噬纤维菌属(Cytophaga)、和黄杆菌属(Flavobacterium),优选黄杆菌属诸如黄杆菌ATCC 21588。合适的蓝细菌类可以选自下组:Chlorococcales,包括集胞蓝细菌属(Synechocystis)和聚球蓝细菌属(Synechococcus),优选集胞蓝细菌之种(Synechocystis sp.)和聚球蓝细菌之种(Synechococcus sp.)PS717。合适的绿色硫磺细菌可以选自下组:绿菌属(Chlorobium),优选泥生绿菌嗜硫代硫酸盐小种(Chlorobium limicola f.thiosulfatophilum)。合适的绿色非硫磺细菌可以选自下组:绿屈挠菌科(Chloroflexaceae)诸如绿屈挠菌属(Chloroflexus),优选橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)。合适的古细菌类可以选自下组:盐杆菌科(Halobacteriaceae)包括盐杆菌属(Halobacterium),优选盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarum)。
关于真菌(包括酵母)的真核分类群,宿主可以选自下组:子囊菌门(Ascomycota)包括酵母纲(Saccharomycetes)诸如毕赤酵母属(Pichia)和酵母属(Saccharomyces),和变形子囊菌门(anamorphicAscomycota)包括曲霉属(Aspergillus),优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和黑曲霉(Aspergillus niger)(如ATCC 9142)。
真核宿主系统包括优选选自下组的昆虫细胞:SF9、SF21、Trychplusiani、和MB21例如,可以在昆虫细胞系统中有利的表达依照本发明的多肽。适用于本发明方法的昆虫细胞原则上包括能够用表达载体转化并表达由其编码的异源蛋白的任何鳞翅目(lepidopteran)细胞。具体而言,优选使用Sf细胞系诸如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞系IPBL-SF-21 AE(Vaughn等人,In Vitro,13:213-217,1977)。特别优选衍生细胞系Sf9。然而,也可以采用其它细胞系,诸如粉纹(粉)夜蛾(Trichoplusia ni)368(Kurstack和Marmorosch,《Invertebrate Tissue Culture Applications inMedicine,Biology and Agriculture》(无脊椎动物组织培养在医学、生物学、和农业中的应用),Academic出版社,纽约,美国,1976)。这些细胞系以及适用于本发明的其它昆虫细胞系可以由商业途径获得(如Stratagene,拉霍亚,加利福尼亚,美国)。与在培养的昆虫细胞中表达一样,本发明还包括在完整昆虫生物体中表达异源蛋白诸如β-diox。病毒载体诸如杆状病毒的使用能够感染完整昆虫,这在某些方面比培养细胞易于生长,因为它们对特殊生长条件的要求较少。大型昆虫诸如蚕蛾能够提供高产量的异源蛋白。可以依照常规提取技术由昆虫提取蛋白质。适用于本发明的表达载体包括能够在昆虫细胞系中表达外源蛋白的所有载体。一般而言,可用于哺乳动物和其它真核细胞的载体同样可应用于昆虫细胞培养物。尤其优选明确意欲用于昆虫细胞培养物的杆状病毒载体,而且可以通过商业途径广泛获得(如Invitrogen和Clontech)。还知道能够感染昆虫细胞的其它病毒载体,诸如Sindbis病毒(Hahn等人,PNAS USA,89:2679-2683,1992)。选择的杆状病毒载体(回顾见Miller,Ann.Rev.Microbiol.,42:177-179,1988)是苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核型多角体病毒(AcMNPV)。通常用异源基因取代AcMNPV的多角体蛋白基因的至少部分,因为多角体蛋白不是病毒繁殖所必需的。为了插入异源基因,使用转移载体比较有利。优选在大肠杆菌宿主中制备转移载体,然后通过同源重组过程将DNA插入片段转移至AcMNPV。
真核宿主系统还包括动物细胞,优选选自下组:幼仓鼠肾(BHK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、和COS细胞,最优选3T3和293细胞。
在本公开书中提到的宿主细胞包括体外培养的细胞和宿主生物体内的细胞。
本发明还提供了选自下组的转基因植物材料:原生质体、细胞、愈伤组织、组织、器官、种子、胚、胚珠、合子、等,尤其是通过依照本发明方法进行了转化并包含可表达形式的本发明重组DNA的完整植株,以及用于生成所述转基因植物材料的方法。
在用于本文时,术语“植物”通常包括真核藻类、有胚植物包括苔藓植物门(Bryophyta)、蕨类植物门(Pteridophyta)、和种子植物门(Spermatophyta)诸如裸子植物亚门(Gymnospermae)和被子植物亚门(Angiospermae),后者包括Magnoliopsida、Rosopsida(真-“双子叶植物”)、和百合纲(Liliopsida)(“单子叶植物”)。代表性和优选范例包括谷物种子,如稻、小麦、大麦、燕麦、苋属植物、亚麻、黑小麦、黑麦、玉米、和其它草类;油料种子,诸如芸苔种子、棉花种子、大豆、红花、向日葵、椰子、棕榈、等;其它可食用种子或含可食用部分的种子,包括西葫芦、南瓜、芝麻、罂粟、葡萄、绿豆、花生、豌豆、菜豆、萝卜、苜蓿、可可、咖啡、大麻;树生坚果,诸如胡桃、巴旦杏、山核桃、鹰嘴豆、等。其它范例包括马铃薯、胡萝卜、甘薯、制糖甜菜、番茄、胡椒、木薯、柳、栎、榆、槭、苹果、和香蕉。通常,本发明可应用于栽培用于食品、药物、饮料、等的物种。优选的是,选择用于转化的靶植物栽培用于食品,诸如谷物、根、豆类、坚果、蔬菜、块茎、水果、调味品、等。
可以遵循本领域众所周知的如下流程将依照本发明生成的阳性转化体再生成植株(参阅例如McCormick等人,Plant Cell Reports,5:81-84,1986)。然后栽培这些植株,在用相同转化种或不同种授粉后可以对后代评估期望特性的存在和/或期望特性的表达程度,并鉴定具有期望表型特征的所得杂合体。第一项评估可以包括例如转化植物的细菌/真菌抗性水平。可以栽培两代或更多代以确保目的表型特征得到稳定维持和遗传,然后收获种子以确保已经实现了期望表型或其它特性。
本发明的范围还包括转基因植物,特别是通过本发明方法转化的转基因可育植物及其无性繁殖和/或有性繁殖后代,它们仍然展示因母本植物的转化而引起的新的和期望的特性。
术语“后代”理解为包括“无性繁殖”和“有性繁殖”产生的转基因植物的后代。该定义还意欲包括可通过已知方法(诸如细胞融合体或突变体选择)获得的所有突变体和变体,所述突变体和变体仍然展示最初转化植物的特征性特性,以及转化植物材料的所有杂交和融合产物。
由先前通过本发明方法转化的转基因植物或其后代起源、因而至少部分由转基因细胞组成的植物部分,诸如花、茎、果实、叶、根,也是本发明的对象。本发明的另一方面涉及用于测量、分析、和评估依照本发明的核酸和/或氨基酸分子固有的定性和定量性质的诊断手段和方法。例如,适当设计的寡核苷酸(本文公开的序列的代表性例子)使之能够进行例如组织分型、表达作图、和等位基因测定(SNP分析),优选在高通量装置(诸如DNA和蛋白质微阵)中进行,诸如此类。其它应用领域包括生成特定构建物作为基因治疗工具,和生成抗体用于例如纯化、治疗、或诊断目的。
依照本发明的还有一个实施方案,提供了特异识别并结合β-diox的抗体。例如,可以生成针对具有SEQ ID NO:2或17中所列氨基酸序列的β-diox蛋白质的这些抗体。或者,将β-diox或诸如上文所述β-diox片段(也可以通过体外方法合成)融合(通过重组表达或体外肽键)免疫原性多肽,继而将这种融合多肽用于制备针对β-diox表位的抗体。
可以由免疫动物的血清回收抗β-diox多肽。可以常规方式由来自免疫动物的细胞制备单克隆抗体。
本发明的抗体可用于研究β-diox的定位、筛选表达文库以鉴定编码β-diox或功能性结构域的核酸、以及纯化β-diox等。
依照本发明的抗体可以是天然类型的完整抗体,诸如IgE和IgM抗体,但是优选IgG抗体。另外,本发明包括抗体片段,诸如Fab、F(ab’)2、Fv、和scFv。由于尺寸小即因此组织分布优越,小片段(诸如Fv和scFv)具有用于诊断和治疗应用的有利特性。
尤其指出依照本发明的抗体的诊断和治疗应用。因此,它们可以是改变后包含效应蛋白诸如毒素或标记物的抗体。尤其优选能够在体内将肿瘤中的抗体分布成像的标记物。这些标记物可以是易于在患者体内显影的放射性标记物或不透射线标记物,诸如金属微粒。另外,它们可以是能够在取自患者的组织样品上显影的荧光标记物或其它标记物。
重组DNA技术可用于改进本发明的抗体。因而,可以构建嵌合抗体以降低它们在诊断或治疗应用中的免疫原性。另外,可以通过CDR移植(参阅EP-A-239 400,Winter)和任选的框架修饰(参阅WO 90/07861,Protein Design Lab)将抗体人源化而将免疫原性最小化。
可以由动物血清获得依照本发明的抗体,或者在单克隆抗体或其片段的情况下,可以在细胞培养物中生成。依照已确立流程,重组DNA技术可用于在细菌或优选哺乳动物细胞培养物中生成抗体。选择的细胞培养物系统优选分泌抗体产物。
因此,本发明包括用于生成依照本发明的抗体的方法,包括培养已经用包含表达盒的杂合载体转化的宿主(如大肠杆菌或哺乳动物细胞),所述表达盒包含启动子,以及与之可操作连接的编码信号肽的第一种DNA序列,并正确读码框中连接编码抗体的第二种DNA序列,以及分离所述抗体。
杂交瘤细胞或哺乳动物宿主细胞的体外增殖是在合适培养基中进行,它们是常规的标准培养基,例如Dulbecco氏修改的Eagle氏培养基(DMEM)或RPMI 1640培养基,任选补充哺乳动物血清(如胎牛血清)或痕量元素和生长维持补充物(如饲养细胞,诸如正常小鼠腹膜渗出细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞、2-氨基乙醇、胰岛素、转铁蛋白、低密度脂蛋白、油酸、等)。作为宿主细胞的细菌细胞或酵母细胞的增殖同样是在本领域知道的合适培养基中进行的,例如对于细菌而言使用培养基LB、NZCYM、NZYM、NZM、Terrific肉汤、SOB、SOC、2xYT、或M9基本培养基,对于酵母而言使用培养基YPD、YEPD、基本培养基、或完全基本Dropout培养基。
体外生产可提供相对较纯的抗体制剂,并能够扩大规模以产生大量的期望抗体。用于细菌细胞、酵母、或哺乳动物细胞培养的技术在本领域是知道的,包括均相悬浮培养(如气升式反应器或连续搅拌反应器)、固定化或截留细胞培养(如中空纤维、微囊、琼脂糖微珠、或陶柱)。
还可通过哺乳动物细胞的体内增殖来获得大量的期望抗体。为此目的,将生成期望抗体的杂交瘤细胞注射到组织相容哺乳动物中,引起抗体生成肿瘤的生长。任选的是,在注射前用烃尤其是矿物油诸如降植烷(四甲基十五烷)对动物进行引发。1-3周后,由那些哺乳动物的体液分离抗体。例如,将通过合适骨髓瘤细胞与来自Balb/c小鼠的抗体生成脾细胞的融合获得的杂交瘤细胞、或衍生自杂交瘤细胞系Sp2/0且生成期望抗体的转染细胞腹膜内注射到Balb/c小鼠体内(该小鼠任选用降植烷预处理),1-3周后,由动物采集腹水。
对细胞培养物上清液筛选期望抗体,优选通过表达β-diox的细胞的免疫荧光染色、通过免疫印迹、通过酶免疫测定法(如三明治测定法或斑点测定法)、或放射性免疫测定法进行。
为了分离抗体,可以浓缩培养物上清液或腹水中的免疫球蛋白,例如通过硫酸铵沉淀、在吸湿材料诸如聚乙二醇中的透析、通过选择性膜过滤、等。如果必需和/或希望,可通过常规的层析法纯化抗体,例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE-纤维素层析、和/或免疫亲和层析,如使用β-diox蛋白质或A蛋白进行亲和层析。
本发明还涉及分泌本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞。本发明的优选杂交瘤细胞在遗传上是稳定的,分泌具有期望特异性的本发明单克隆抗体,并能够通过解冻和再次克隆由深层冷冻培养物活化。
本发明还涉及用于制备分泌针对β-diox的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法,其特征是用纯化的β-diox蛋白质、含纯化的β-diox的抗原载体、或携有β-diox的细胞免疫合适哺乳动物(例如Balb/c小鼠),将免疫动物的抗体生成细胞融合合适骨髓瘤细胞系的细胞,克隆在融合中获得的杂合体细胞,并选择分泌期望抗体的细胞克隆。例如,将用携有β-diox的细胞免疫的Balb/c小鼠的脾细胞融合骨髓瘤细胞系PAI或骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14的细胞,对获得的杂合体细胞筛选期望抗体的分泌,并克隆阳性杂交瘤细胞。
优选用于制备杂交瘤细胞系的方法,其特征是通过在几个月(如2-4个月)里几次(如4-6次)皮下和/或腹膜内注射107-108个人肿瘤起源且表达含合适佐剂的β-diox的细胞来免疫Balb/c小鼠,最后一次注射后2-4天由免疫小鼠采集脾细胞,并在存在融合促进剂(优选聚乙二醇)时融合骨髓瘤细胞系PAI的细胞。优选的是,骨髓瘤细胞在含大约30-50%分子量4000左右的聚乙二醇的溶液中融合3-20倍过量的来自免疫小鼠的脾细胞。融合后,在上文所述合适培养基中扩增细胞,以规则时间间隔添加选择性培养基(例如HAT培养基)以防止正常骨髓瘤细胞相对于期望杂交瘤细胞的过度生长。
本发明还涉及包含编码针对β-diox蛋白质的抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的插入片段的重组DNA。根据定义,这些DNA包括编码单链DNA、由所述编码DNA及其互补DNA组成的双链DNA、或这些互补(单链)DNA自身。
另外,编码针对β-diox的抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的DNA可以是具有编码重链可变结构域和/或轻链可变结构域的真实DNA序列或其突变体的酶促或化学合成DNA。真实DNA的突变体是编码上述抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的DNA,其中一个或多个氨基酸被删除或用一个或多个其它氨基酸替代。优选的是,所述修饰位于抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的CDR以外。这种突变DNA还可以是沉默突变体,其中一个或多个核苷酸被其它核苷酸替代,而新的密码子编码相同的氨基酸。这种突变体序列也是简并序列。简并序列在遗传密码的含义内是简并的,即其中有不限数目的核苷酸被其它核苷酸替代,而不改变最初编码的氨基酸序列。这些简并序列是有用的,因为它们具有不同的限制性位点和/或特定宿主(特别是大肠杆菌)优选的特定密码子频率,从而获得重链鼠可变结构域和/或轻链鼠可变结构域的最佳表达。
术语“突变体”意欲包括通过依照本领域已知方法由真实DNA的体外诱变获得的DNA突变体。
为了装配完整的四聚体免疫球蛋白分子和表达嵌合抗体,将编码重链和轻链可变结构域的重组DNA插入片段融合编码重链和轻链恒定结构域的相应DNA,然后转移到适当宿主细胞中,例如在掺入杂合体载体后进行这种转移。
在诊断组合物的情况中,优选抗体与用于检测抗体的手段一起提供,它可以是酶促、荧光、放射性同位素、或其它手段。可以在意欲用于诊断的诊断试剂盒中提供同时、同时但分开、或顺序使用的抗体和检测手段。
例如,本发明提供了特征为指定受试者或个体中β-diox水平的升高或降低的病理学的诊断方法。例如,获取测试样品,并在合适条件下接触能够特异结合β-diox的试剂或能够结合编码β-diox的核酸分子的核苷酸序列,所述条件允许所述试剂或所述核苷酸序列与所述β-diox靶氨基酸或核酸序列之间的特异结合。随后,可以将所述测试样品中所述特异结合的量与对照样品中特异结合的量进行比较,其中由所述测试样品中所述特异结合量相对于所述对照样品的升高或降低即可诊断与由β-diox诱导的途径有关的病理学。
本发明还提供了升高或降低细胞或组织中β-diox的量的方法,这可以调控维生素A或其它类视黄质的水平。例如,可以通过将包含编码β-diox或其功能性片段的核酸序列的核酸分子导入细胞或组织来升高指定靶细胞或组织中β-diox的量。细胞或组织中β-diox的量的升高可以诱导或促进维生素A积累,这不仅将有利于人类,还将有利于频繁给予维生素制剂以改进营养品质的动物和饲料。
生物学材料的保藏
携带衍生自黑腹果蝇的β-胡萝卜素双加氧酶编码基因的大肠杆菌细胞已经根据布达佩斯条约保藏于德国不伦瑞克的DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ),鉴定参考号为“β-diox”,编号DSM 13304。
如下实施例是例示性的,而非限制本发明。
实施例质粒构建物积累β-胡萝卜素的大肠杆菌菌株的构建
使用载体pFDY297构建携带来自草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)的β-胡萝卜素生物合成基因的质粒。pFDY297是导入了pBluescriptSK的第1-485位bp的pACYC177(第486-3130位bp)衍生物。为了克隆来自草生欧文氏菌的β-胡萝卜素生物合成基因,在PCR产物的两端导入合适的内切核酸酶限制性位点。首先将crtE基因插入pFDY297。使用引物:5’-GCGTCGACCGCGGTCTACGGTTAACTG-3’(SEQ IDNO:3)和5’-GGGGTACCCTTGAACCCAAAAGGGCGG-3’(SEQ ID NO:4)及Expand PCR System即扩增PCR系统(Boehringer,曼海姆,德国),通过PCR由pBL376(Hundle BS等人,Mol.Gen.Genet.,245:406-416,1994)扩增crtE,该质粒编码来自草生欧文氏菌的整个类胡萝卜素生物合成基因簇。用KpnI和SalI消化PCR产物,并连接到pFDY297的适当位点中,产生质粒pCRTE。使用引物:5’-GCTCTAGACGTCTGGCGACGGCCCGCCA-3’(SEQ ID NO:5)和5’-GCGTCGACACCTACAGGCGATCCTGCG-3’(SEQ ID NO:6)及Expand PCRSystem即扩增PCR系统(Boehringer,曼海姆,德国),通过PCR由pBL376扩增基因crtB、crtI、和crtY。用XbaI和SalI消化PCR产物,并连接到pCRTE的适当位点中,产生质粒pORANGE。将质粒转化到大肠杆菌JM109中之后,得到的菌株能够合成β-胡萝卜素。由黑腹果蝇克隆β-diox
我们由通过手工解剖得到的成年果蝇的头部分离总RNA。使用寡(T)-衔接头引物5’-GACCACGCGTATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTT TTTTTT-3’(SEQ ID NO:7)及Superscript逆转录酶(Gibco,德国)进行逆转录。为了克隆全长cDNA,使用衍生自已发表EST片段(编号AI063857)的特异上游引物5’-GCAGCCGGTGTCTTCAAGA G-3’(SEQ ID NO:8)和3’端的锚定引物5’-GACCACGCGTATCGATGTCG A-3’(SEQ ID NO:9)及ExpandPCR System即扩增PCR系统(Boehringer,曼海姆,德国)进行PCR。0.8%琼脂糖凝胶电泳之后,分离得到的PCR产物,直接连接到载体pBAD-TOPO(Invitrogen,荷兰)中,并转化到积累β-胡萝卜素的大肠杆菌菌株中。使用这种克隆策略,将果蝇cDNA在翻译水平上融合载体的短开放读码框,并受到可由L-阿拉伯糖诱导的正调控启动子的控制。将细菌涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)、和L-阿拉伯糖(0.2%)的LB琼脂上。通过由黄色褪至几乎白色来鉴定阳性菌落。为了分析得到的质粒pβdiox并确认其结构,将两条链完整测序。β-diox-gex的表达、纯化、和酶活性
为了表达β-diox,使用Gex上游引物5’-GGAATTCGCAGCCGGTGTCTTCAAGAG-3’(SEQ ID NO:10)和Gex下游引物5’-CCTCGAGGTAGTCTTCCCATATAAGG-3’(SEQ ID NO:11)及Expand PCR System即扩增PCR系统(Boehringer,曼海姆,德国)扩增cDNA。通过寡核苷酸引物在PCR产物的两端导入了合适的限制性位点。EcoRI和NcoI的限制性消化之后,将PCR产物克隆到表达载体pGEX-4T-1(Pharmacia,弗赖堡,德国)的合适位点中。将得到的质粒pβdiox-gex转化到大肠杆菌菌株JM109中。如制造商的方案所述,进行融合蛋白β-diox-gex在大肠杆菌中的表达和随后在谷胱甘肽sepharose 4B(Pharmacia,弗赖堡,德国)上的纯化。β-diox酶活性的测定
将纯化的蛋白质在300μl含50mM Tricine/NaOH(pH7.6)和100mMNaCl及0.05%屈立通X100的缓冲液中保温。加入5μl β-胡萝卜素(80μM,溶于乙醇)开始反应。分别加入FeSO4和L-抗坏血酸至终浓度5μM和10mM。于30℃保温2小时后,加入100μl2M NH2OH(pH6.8)和200μl甲醇终止反应。如上所述进行抽提和HPLC分析。通过RT-PCR测定身体不同部分的mRNA水平
由成年果蝇(雄性和雌性)分离总RNA。通过手工解剖获得头、胸、和腹部(事先已经除去腿和翅)。为了测量β-diox的稳定状态mRNA的量,如(von Lintig J等人,Plant J.,12:625-634,1997)所述进行RT-PCR。使用寡(dT17)引物及Superscript逆转录酶(Gibco,德国)进行逆转录。使用β-diox的上游引物5’-CTGCAAACGGACCGACCACGT-3’(SEQ ID NO:12)和下游引物5’-GCAAATCTATCGAAGATCGAG-3(SEQ ID NO:13)及Taq聚合酶(Pharmacia,弗赖堡,德国)进行PCR。使用跨越内含子的上游引物5’-GACTTCATCCGCCACCAGTC-3’(SEQ ID NO:14)和下游引物5’-CACCAGGAACTTCTTGAATCCG-3’(SEQ ID NO:15)研究组成性表达的核糖体蛋白质rp49的mRNA水平作为内部对照。作为β-diox和rp49的两个单独引物测定法进行PCR,并在一个测定法中联合所有四种引物。由大肠杆菌提取β-胡萝卜素和类视黄质及HPLC分析
在安全红光下在50ml烧瓶中在LB培养基中培养大肠杆菌菌株直至培养物的OD600达到1。加入L-阿拉伯糖(0.2%w/v)诱导β-diox的表达达6小时或16小时。然后离心收获细菌。通过如下方案抽提沉淀:A.将沉淀重悬于200μl6M甲醛,并于30℃保温2分钟,然后加入2ml二氯甲烷。用4ml正己烷萃取胡萝卜素和类视黄质3次。将收集的有机相蒸发,并溶于HPLC溶剂。B.将沉淀重悬于2ml 1M NH2OH(溶于50%甲醇),并于30℃保温10分钟。用石油醚萃取3次。将收集的有机相在N2流下干燥,并溶于HPLC溶剂。在配备multi-diode-array即多重二极管阵列(166型,Beckman)和System Gold Nouveau软件(Beckman,美国)的System Gold(Beckman)上的Hypersil 3μm(Knaur,德国)上进行HPLC分析。HPLC溶剂A(正己烷/乙醇99.75∶0.25)用于视黄醛,溶剂B(正己烷/乙醇99.5∶0.5)用于视黄醛肟。参照物全-反式、13-顺式、和9-顺式视黄醛购自Sigma(德国);11-顺式视黄醛由适应黑暗的牛眼分离。分别通过NaBH4的还原或与NH2OH的反应来获得相应的视黄醇和肟。为了将摩尔量量化,用确定量的参照物衡量峰积分。
由Danio rerio克隆β-diox
使用来自黑腹果蝇的β-diox的cDNA序列信息,我们对公共数据库检索了zebrafish Danio rerio的同源cDNA序列。可以鉴定到GenBank编号AW128477的EST等等。
基本如本文所述,由来自成年动物的肝样品分离总RNA,使用推断引物将其转变成cDNA,然后扩增。
为获得全长cDNA克隆,利用特异引物5’-CCTGAATGGGTGCAGGGAACA-3’(SEQ ID NO:18)和特异于mRNA 3’末端的寡(dT)锚定引物进行3’-RACE PCR。将所得PCR产物克隆到适当载体中,利用特异引物对两条cDNA链完全测序,揭示出列于SEQ ID NO:16的序列。
在公共数据库中检索其它β-diox同源物
随后进行的数据库检索揭示出来自人(AF294900)、鼠(AJ278064、AF294899、AF271298)、鸡(AJ271386)和C.elegans(AF098992)的其它β-diox同源物。结果
搜索昆虫EST库以寻找vp14即植物类胡萝卜素切割酶的同源物,发现了来自黑腹果蝇的已发表EST片段(编号AI063857)。为了克隆全长cDNA和直接测试β-胡萝卜素双加氧酶活性,通过导入来自细菌草生欧文氏菌的一套β-胡萝卜素生物合成基因(Hundle BS等人,s.a.)来构建能够合成并积累β-胡萝卜素的大肠杆菌。该方法能够通过菌落由黄色(β-胡萝卜素)褪至几乎白色(类视黄质)来检测类视黄质的形成,并提供了一种用于鉴定β-胡萝卜素双加氧酶活性的快速且有效的体外测试系统。为此目的,由果蝇头部分离总RNA并合成cDNA。使用衍生自EST片段的特异寡核苷酸和dT17锚定寡核苷酸进行RACE-PCR。将得到的PCR产物直接克隆到表达载体pBAD-TOPO中,并转化到所述大肠杆菌菌株中。将细胞涂布在含0.2%L-阿拉伯糖的LB培养基上以诱导推定β-胡萝卜素双加氧酶的表达之后,找到几个几乎白色的菌落并进行进一步分析(图2)。在安全红光下进行过夜培养,以使光氧化作用引起的β-胡萝卜素的异构化作用和非特异切割最小化。提取β-胡萝卜素和类视黄质并进行HPLC分析。仅用载体转化的对照菌株缺乏切割β-胡萝卜素的能力,而且连痕量的类视黄质都检测不到。但是表达果蝇cDNA的细菌除了β-胡萝卜素以外还包含显著量的类视黄质(图3a)。通过停留时间(retention time)以及与真实标准物的共层析和通过它们的吸收光谱来鉴定类视黄质(图4)。占优势的视黄醛异构体是全-反式形式,只有大约20%的13-顺式形式。根据诱导后细菌的培养时间,还可能检测到显著量的全-反式视黄醇和13-顺式视黄醇以及这些视黄醇异构体的酯。所发现的类视黄质异构体与它们的β-胡萝卜素前体的异构组成是一致的,后者是通过分开的HPLC系统来鉴定的。为了确认视黄醛的形成和改进类视黄质的产量以及分离它们的异构体,还在存在羟胺时进行抽提。图3b显示,这种处理导致全-反式和13-顺式视黄醛肟的形成,伴随其吸收光谱的相应蓝移。分析证明,除了视黄醛以外,大肠杆菌中还形成显著量的视黄醇和视黄基酯(表1)。问题是,大肠杆菌是否还能够由视黄醛生成视黄酸。为了分析视黄酸的形成,裂解细胞并使用已确立方案(Thaller C和Eichele G,Nature,327:625-62814,1987)在HPLC系统上分析提取物。结果揭示,在这些条件下,在大肠杆菌中能够检测到显著量的视黄醛和视黄醇,但是没有形成视黄酸。
表1
大肠杆菌(-)菌株 大肠杆菌(+)菌株
全-反式视黄醛n.d. 4.7
13-顺式视黄醛n.d. 1.5
全-反式视黄醇n.d. 8.0
13-顺式视黄醇n.d. 2.4
n.d. 1.8
∑类视黄质 - 18.4
β-胡萝卜素 56.0 21.4
n.d.:检测不到来自细菌培养物(于28℃培养16小时)的大肠杆菌(+)菌株和大肠杆菌(-)菌株中β-胡萝卜素和类视黄质的摩尔量(pmol/mg于重)。
总之,这些结果证明克隆的cDNA编码β-胡萝卜素双加氧酶,相应的,将其命名为β-diox。既然在大肠杆菌测试系统中唯独发现类视黄质即C20化合物,因而可以推测对β-胡萝卜素的中央切割得到催化,导致两个分子视黄醛的形成。
为了进一步分析β-diox的酶特性,将cDNA克隆到表达载体pGEX-4T-1中并表达成融合蛋白。为了排除与谷胱甘肽-S-转移酶的N端融合会消除酶活性的可能性,将构建物(β-diox-gex)转化到合成β-胡萝卜素的大肠杆菌菌株中。使用上文所述测试法,可以显示类视黄质的形成程度与未融合β-diox相同(未显示数据)。在大肠杆菌中表达β-diox-gex之后,通过亲和层析纯化蛋白质。无需加入去污剂就可实现纯化,说明融合蛋白是可溶的,而且与膜不是紧密相连的。为了测试体外酶活性,将1μg纯化蛋白质在含0.05%屈立通X100的测定法中在存在β-胡萝卜素时保温2小时。为了分析形成的产物,加入羟胺/甲醇终止反应,并在抽提后通过HPLC分析产物。分析揭示了视黄醛的形成(图5)。在测定法中加入FeSO4/抗坏血酸导致切割产物的形成增加(图5A),而加入EDTA可以抑制β-胡萝卜素向视黄醛的转变(图5C)。这些结果指示,双加氧酶的酶促活性依赖铁,正如在动物来源的几种体外系统中所报导的。总之,迄今为止在大肠杆菌中鉴定的β-diox酶活性同样可以在体外用纯化蛋白质进行测量,并导致相同产物的形成。
序列分析揭示,该cDNA编码620个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO:2),计算分子量69.9kDa(图6)。推导氨基酸序列与植物类视黄质双加氧酶vp14、来自少动假单胞菌(Pseudomonas paucimobilis)的木质素芪合酶、和蓝细菌集胞蓝细菌属(Synechocystis)中功能未知的几种蛋白质享有序列同源性。然而,发现与RPE65(来自脊椎动物视网膜色素上皮的一种蛋白质,首次描述于牛眼)有最高序列同源性。RPE65与β-diox展示36.7%的整体序列同一性。使用程序Map进行的β-diox推导氨基酸序列、RPE65、与vp14的比对显示独特样式的保守区(图7)。与RPE65和vp14相比,昆虫蛋白质接近C端具有长延伸。植物蛋白质vp14相对于其动物同源物的N端延伸很有可能归因于用于质体输入的靶序列。β-diox与细菌和植物双加氧酶的序列同源性说明,我们正在研究存在于细菌、植物、和动物中的一种新型双加氧酶。随后的实验和数据库检索揭示出来自不同来源诸如人、鸡、小鼠和蠕虫的其它同源物,暗示本发明原理的普通适用性。
通过RT-PCR研究β-diox mRNA的表达模式。如图8所示,mRNA唯独限于头部,而通过这种方法在胸部和腹部检测不到β-diox mRNA。虽然果蝇将3-羟基视黄醛用于视觉,但据显示除了3-羟基类视黄质(玉米黄质和黄体素)以外,β-胡萝卜素也可作为合适前体。另外,已经证明果蝇能够在β-芷香酮环第3位羟化视黄醛并形成非常见对映体(3S)-3-羟基视黄醛,它是环裂cyclorrhaph果蝇的独特发色团。这些结果证明,在果蝇中,β-胡萝卜素切割和类视黄质的进一步代谢以及视觉循环都位于身体的相同部分。
果蝇β-diox是在分子水平上鉴定的第一种β-胡萝卜素双加氧酶。本文公开的信息提供了打开进一步研究动物中维生素A代谢的广阔领域的钥匙。
β-diox I编码620个氨基酸的蛋白质,计算分子量69.9kDa。序列比较揭示β-diox属于迄今为止只在细菌和植物中发现的新型双加氧酶。可以在关于植物类胡萝卜素切割酶vp14所报导的相同条件下测量β-diox I的酶活性,前者在ABA生物合成途径中负责切割9-顺式-新黄素。在动物中,已经报导了β-胡萝卜素双加氧酶活性依赖铁。向测定法中加入FeSO4/抗坏血酸导致酶活性升高,而加入EDTA显著减少视黄醛的形成。可以不加入辅因子诸如硫醇试剂或电子受体而测量酶活性。这指示β-diox依赖Fe2+,而且酶活性不需要其它辅因子,正如关于植物vp14所报导的。既然β-胡萝卜素在水性环境下是不溶的,就在存在0.05%屈立通X100时进行酶活性的测试。在体内,β-胡萝卜素是不能自由扩散的,而是必须结合亲脂性结构诸如膜或结合蛋白。因此,问题是β-diox是否结合膜而与其亲脂性底物发生相互作用。可以无需加入去污剂而纯化β-diox融合蛋白,这针对的是它的可溶状态而非膜结合拓扑学。但是融合蛋白的谷胱甘肽-S-转移酶部分也可能有助于它的可溶性。既然果蝇的视觉发色团是3-羟基视黄醛,我们测试了β-diox是否能够使用玉米黄质作为底物而直接形成这种羟化类视黄质,但是在我们所应用的条件下,该酶未能催化这种反应。另外,我们在积累玉米黄质的大肠杆菌菌株中表达β-diox,但是只能够检测到未羟化类视黄质的形成。在这种大肠杆菌菌株中,发现了显著量的β-胡萝卜素即玉米黄质的直接前体,它可以作为β-diox的底物。这一结果的解释可能在于果蝇能够在β-芷香酮环第3位羟化视黄醛的事实。总之,我们能够显示β-diox催化对β-胡萝卜素的切割,但是仍需进一步研究精确的酶促机制、底物特异性和膜对于底物的送递是否必需等等。
β-diox基因位于果蝇基因组中3号染色体的87F。已经通过细胞学方法将果蝇突变体ninaB正好定位在这一区域(FlyBase Map section87)。在所有类型的光受体中,突变体表型具有降低的视紫质含量。但是可以通过饮食添加视黄醛来挽救突变体表型,但是甚至高剂量的β-胡萝卜素却不能。视觉色素发色团的有效性和视黄酸对视觉色素蛋白质模块(视蛋白)的转录调控二者都依赖β-diox酶活性。因此,似乎有可能ninaB表型是由β-diox中的突变引起的。
发现β-diox与RPE65(首次描述于牛眼的一种蛋白质)有最高序列同源性。因此,问题是RPE65是否是β-diox的脊椎动物相应物。虽然尚不知道RPE65的准确功能,已经有人提出它在维生素A代谢中发挥作用,最近发现该基因中的突变对人早期发作视黄醛营养不良的严重形式负有责任。在破坏了RPE65基因的小鼠眼中,全-反式维生素A发生积累。由此得出结论,RPE65参与哺乳动物视觉循环中维生素A全-反式向11-顺式的异构化。但是由RPE-膜级分除去RPE65之后,全-反式视黄醇向11-顺式视黄醇的异构化不受影响。根据我们的知识,在RPE中从未报导过β-胡萝卜素双加氧酶活性,在脊椎动物的眼中也从未测量到显著量的它的底物β-胡萝卜素。我们在所述测试系统中表达了通过RT-PCR由牛RPE克隆的RPE65,但是未能检测到类视黄质的形成或偏心切割产物诸如阿朴胡萝卜素醛的形成。因此,RPE65的准确功能仍需进一步研究,我们推测其它尚未发现的具有不同组织特异性(小肠、肝)的该家族成员负责脊椎动物β-胡萝卜素双加氧酶活性。β-diox与RPE65以及植物和细菌双加氧酶的序列同源性说明我们正在研究催化切割共轭碳双键的新型双加氧酶。这种反应类型涉及对类胡萝卜素的切割以及多种其它化合物。所述大肠杆菌测试系统提供了鉴定涉及类视黄质形成的新基因和筛选本发明酶的潜在激动剂或拮抗剂的有力工具。另外,生成类视黄质的大肠杆菌菌株可成功的用于鉴定维生素A代谢的其它步骤。
最近几年,对类视黄质受体及其配体以及它们在发育和细胞分化中的各种作用的理解有了极大进步。凭借本发明的发现,切割反应对组织分布的影响、类视黄质的异构特异性、和维生素A摄取的调控不久可能得到进一步阐明。
另外,编码15,15’-β-胡萝卜素双加氧酶的cDNA的鉴定对医学、制药学、和生物技术的应用具有极大影响。在医学中,由人或哺乳动物克隆相应基因能够更详细的在生理学上表征哺乳动物维生素A代谢,并将影响由维生素A及其衍生物引起的多种作用,由此可提供几种治疗性应用。
已知维生素A缺乏是一个严重问题。编码本发明β-diox的DNA序列可以与必需调控序列结合,用于在不含类视黄质的生物体诸如大多数植物、大多数细菌、和真菌中进行表达。因此,依照本发明可以在用于食品工艺的农作物和微生物中实现维生素A生产,或更常说的,在至今不含类视黄质但能够合成维生素A原(β-胡萝卜素)的生物体中生产维生素A。
显然,根据上文传授,本发明的许多修改和变异是可能的。因此,应当理解,在所附权利要求的范围内,可以不同于本文具体所述而实践本发明。
序列表
序列表<110>greenovation Pflanzenbiotechnologie GmbH<120>生产维生素A的方法<130>生产维生素A的方法<140><141><150>00105822.1<151>2000-03-20<150>99125895.5<151>1999-12-24<160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2037<212>DNA<213>黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)<220><221>CDS<222>(1)..(1860)<400>1atg gca gcc ggt gtc ttc aag agt ttt atg cgc gac ttc ttt gcg gtg48Met Ala Ala Gly Val Phe Lys Ser Phe Met Arg Asp phe phe Ala Val1 5 10 15aaa tac gat gag cag cga aat gat ccg caa gcg gaa cga cag gat ggc96Lys Tyr Asp Glu Gln Arg Asn Asp Pro Gln Ala Glu Arg Leu Asp Gly
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580 585 590atg acc gag ctg ggc cgt tgt gat ttc cat acc aat gga ccc gtg ccc1824Met Thr Glu Leu Gly Arg Cys Asp Phe His Thr Asn Gly Pro Val Pro
595 600 605aag tgt ctc cat gga tgg ttt gca ccc aat gcc att tagatacgga1870Lys Cys Leu His Gly Trp phe Ala pro Asn Ala Ile
610 615 620actccttata tgggaagact acttagctta ggagataggg taaagcatat gcccagtatt1930acgtttagat ttagactaga gcatttaatc ttagaactta gaattttgga ttcaagacat1990tcgcaataaa ctcctgccac ttgcgctgga acaaaaaaaa aaaaaaa2037<210>2<211>620<212>PRT<213>黑腹果蝇<400>2Met Ala Ala Gly Val Phe Lys Ser Phe Met Arg Asp Phe phe Ala Val1 5 10 15Lys Tyr Asp Glu Gln Arg Asn Asp Pro Gln Ala Glu Arg Leu Asp Gly
20 25 30Asn Gly Arg Leu Tyr Pro Asn Cys Ser Ser Asp Val Trp Leu Arg Ser
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610 615 620<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:衍生自草生欧文氏菌(Erwinia
herbicola)的CrtE上游引物<400>3gcgtcgaccg cggtctacgg ttaactg27<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:衍生自草生欧文氏菌的CrtE下游引物<400>4ggggtaccct tgaacccaaa agggcgg27<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:衍生自草生欧文氏菌的CrtI上游引物<400>5gctctagacg tctggcgacg gcccgcca28<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:衍生自草生欧文氏菌的CrtI下游引物<400>6gcgtcgacac ctacaggcga tcctgcg27<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:寡(T)-衔接头引物<400>7gaccacgcgt atcgatgtcg actttttttt tttttttttt40<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:衍生自EST(编号AI063857)的特异上游
引物<400>8gcagccggtg tcttcaagag20<210>9<211>21<212>DNA<213>A工序列<220><223>人工序列的描述:锚定引物<400>9gaccacgcgt atcgatgtcg a21<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:衍生自黑腹果蝇的Gex上游引物<400>10ggaattcgca gccggtgtct tcaagag27<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:衍生自黑腹果蝇的Gex下游引物<400>11cctcgaggta gtcttcccat ataagg26<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:衍生自黑腹果蝇的β-diox RT-PCR上游引物<400>12ctgcaaacgg accgaccacg t 21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:衍生自黑腹果蝇的β-diox RT-PCR下游引物<400>13gcaaatctat cgaagatcga g21<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:衍生自核糖体蛋白质rp49的rp49 RT-PCR上游引物<400>14gacttcatcc gccaccagtc20<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:衍生自核糖体蛋白质rp49的rp49 RT-PCR下游引物<400>15caccaggaac ttcttgaatc cg22<210>16<211>1773<212>DNA<213>Danio rerio<220><221>CDS<222>(94) ..(1641)<400>16gtcttacctg cgaagcttta atagcagttg tttcgagtac tgatgtcact tcttatcact60ttcttggaga acttgaagaa agcatctgaa agg atg cag tac gac tat ggc aaa114
Met Gln Tyr Asp Tyr Gly Lys
1 5aac aag gaa gaa cat ccg gag ccc atc aaa act gaa gta aag ggc tcg162Asn Lys Glu Glu His Pro Glu Pro Ile Lys Thr Glu Val Lys Gly Ser
10 15 20att cct gaa tgg gtg cag gga aca cta ata cgc aat gga ccc ggc atg210Ile Pro Glu Trp Val Gln Gly Thr Leu Ile Arg Asn Gly Pro Gly Met
25 30 35ttc tct gtt gga gag acg aca tac aac cat tgg ttt gat gga atg gca258Phe Ser Val Gly Glu Thr Thr Tyr Asn His Trp Phe Asp Gly Met Ala40 45 50 55ctt ttg cac agt ttt gca att aat aaa gga gag gtg acg tac agg agc306Leu Leu His Ser Phe Ala Ile Asn Lys Gly Glu Val Thr Tyr Arg Ser
60 65 70aga tat ctt cga ggt gac acc tat aac tcc aac atg cag gcc aac aga354Arg Tyr Leu Arg Gly Asp Thr Tyr Asn Ser Asn Met Gln Ala Asn Arg
75 80 85ata gta gtc tcg gag atg ggg acc atg gcg tac ccg gac cca tgc aaa402Ile Val Val Ser Glu Met Gly Thr Met Ala Tyr Pro Asp Pro Cys Lys
90 95 100aac ata ttc tcc aaa gtg atc acc ttc ctc agc cac acc atc cca gac450Asn Ile Phe Ser Lys Val Ile Thr Phe Leu Ser His Thr Ile Pro Asp
105 110 115ttc act gac aac tgt ggg aat aac ata atc aaa tat gga aat gac ttc498Phe Thr Asp Asn Cys Gly Asn Asn Ile Ile Lys Tyr Gly Asn Asp Phe120 125 130 135cat gct acg tct gaa acc aat tat att cgg aaa att gac cct gtt act546His Ala Thr Ser Glu Thr Asn Tyr Ile Arg Lys Ile Asp Pro Val Thr
140 145 150tta gag act cag gaa aag att gac tac ctg aaa tac ctt cct gtg agt594Leu Glu Thr Gln Glu Lys Ile Asp Tyr Leu Lys Tyr Leu Pro Val Ser
155 160 165atc gtg gct tct cat aca cat tat gac aaa gag gga aac agc tac agt642Ile Val Ala Ser His Thr His Tyr Asp Lys Glu Gly Asn Ser Tyr Ser
170 175 180atg gga aca tgc atc gcg gag aag ggc aaa acc aaa tac atg ttg ttc690Met Gly Thr Cys Ile Ala Glu Lys Gly Lys Thr Lys Tyr Met Leu Phe
185 190 195aag gtc cca gga gga agc agg cca gat gga tct cca cct ttg aaa agc738Lys Val Pro Gly Gly Ser Arg Pro Asp Gly Ser Pro Pro Leu Lys Ser200 205 210 215gct gag gct gtg tgc acc ctg ccc tgc cgt tcc ctc ctc acg cca agt786Ala Glu Ala Val Cys Thr Leu Pro Cys Arg Ser Leu Leu Thr Pro Ser
220 225 230tac tac cac agc ttt ggc atg acc gac aac tac ttc atc ttc atc gag834Tyr Tyr His Ser Phe Gly Met Thr Asp Asn Tyr Phe Ile Phe Ile Glu
235 240 245caa ccc ttg aag ctg gat atc cta aaa atg gcc acg gct tat ttg agg882Gln Pro Leu Lys Leu Asp Ile Leu Lys Met Ala Thr Ala Tyr Leu Arg
250 255 260agg gtg agc tgg gcc agc tgc atg aag ttt cac cct gaa gac agt aca930Arg Val Ser Trp Ala Ser Cys Met Lys Phe His Pro Glu Asp Ser Thr
265 270 275ctc att cat ctt att gac cga aac aca aaa aag gag gtt gcg acc aaa978Leu Ile His Leu Ile Asp Arg Asn Thr Lys Lys Glu Val Ala Thr Lys280 285 290 295ttc tac act gat gca atg acc gtc tac cat caa gtc aat gcc ttt gaa1026Phe Tyr Thr Asp Ala Met Thr Val Tyr His Gln Val Asn Ala Phe Glu
300 305 310gat gat ggg cat gtt gtt ttt gat gtg att gcc tat gat gac aac aac1074Asp Asp Gly His Val Val Phe Asp Val Ile Ala Tyr Asp Asp Asn Asn
315 320 325ttg tat gaa ttc ttt tac ctg aac aaa ctg aag gag acg atg gga gca1122Leu Tyr Glu Phe Phe Tyr Leu Asn Lys Leu Lys Glu Thr Met Gly Ala
330 335 340aca aat ttg tac tgc aaa ccc aag ttc aca aga ttt gtg ttt ccc ctt1170Thr Asn Leu Tyr Cys Lys Pro Lys Phe Thr Arg Phe Val Phe Pro Leu
345 350 355agt gac cag ggt gag aca ggt gag gat ctg gtc aaa ctt aaa tac aca1218Ser Asp Gln Gly Glu Thr Gly Glu Asp Leu Val Lys Leu Lys Tyr Thr360 365 370 375aca gca agt gct gtg aag gag aaa gat ggg aaa ata atg tgt cag gga1266Thr Ala Ser Ala Val Lys Glu Lys Asp Gly Lys Ile Met Cys Gln Gly
380 385 390gag gtt cta tgt gaa ggt gtg gaa ctt cca aga att aat tac aac ttc1314Glu Val Leu Cys Glu Gly Val Glu Leu Pro Arg Ile Asn Tyr Asn Phe
395 400 405aat gga aag aag tac aga tat tca tac atg tgt tgt gta gac gaa tcc1362Asn Gly Lys Lys Tyr Arg Tyr Ser Tyr Met Cys Cys Val Asp Glu Ser
410 415 420cca gtg gcc aca agg att gtg aag ttt gat gct gac aca aag cag cag1410Pro Val Ala Thr Arg Ile Val Lys Phe Asp Ala Asp Thr Lys Gln Gln
425 430 435att gag tgg aaa gga gat gac ggt ttt gca tca gag ccc gtt ttc att1458Ile Glu Trp Lys Gly Asp Asp Gly Phe Ala Ser Glu Pro Val Phe Ile440 445 450 455ccc agg cct ggt gca gtt gat gaa gat gat ggt gta gtt ctg aca gtt1506Pro Arg Pro Gly Ala Val Asp Glu Asp Asp Gly Val Val Leu Thr Val
460 465 470atc att aat aac aaa cct ctg cag ggt ggc ttt cta ctg gtg ctt gat1554Ile Ile Asn Asn Lys Pro Leu Gln Gly Gly Phe Leu Leu Val Leu Asp
475 480 485gcc aag tct ttc aaa gag att gcc cgg gca tgc tta gat gta gaa att1602Ala Lys Ser Phe Lys Glu Ile Ala Arg Ala Cys Leu Asp Val Glu Ile
490 495 500cac atg gac atg cat gga tacttc ata cca ggc agc agc tgagggtttg1651His Met Asp Met His Gly Tyr Phe Ile Pro Gly Ser Ser
505 510 515atgtctgcca gctgtatagc tatatatata tattaaacat gaatgttaaa tgttagtccc1711tttttttact gtaaatgcag taataataaa gataagttat tactgtcaaa aaaaaaaaaa1771aa1773<210>17<211>516<212>PRT<213>Danio rerio<400>19Met Gln Tyr Asp Tyr Gly Lys Asn Lys Glu Glu His Pro Glu Pro Ile1 5 10 15Lys Thr Glu Val Lys Gly Ser Ile Pro Glu Trp Val Gln Gly Thr Leu
20 25 30Ile Arg Asn Gly Pro Gly Met Phe Ser Val Gly Glu Thr Thr Tyr Asn
35 40 45His Trp Phe Asp Gly Met Ala Leu Leu His Ser Phe Ala Ile Asn Lys
50 55 60Gly Glu Val Thr Tyr Arg Ser Arg Tyr Leu Arg Gly Asp Thr Tyr Asn65 70 75 80Ser Asn Met Gln Ala Asn Arg Ile Val Val Ser Glu Met Gly Thr Met
85 90 95Ala Tyr Pro Asp Pro Cys Lys Asn Ile Phe Ser Lys Val Ile Thr Phe
100 105 110Leu Ser His Thr Ile Pro Asp Phe Thr Asp Asn Cys Gly Asn Asn Ile
115 120 125Ile Lys Tyr Gly Asn Asp Phe His Ala Thr Ser Glu Thr Asn Tyr Ile
130 135 140Arg Lys Ile Asp Pro Val Thr Leu Glu Thr Gln Glu Lys Ile Asp Tyr145 150 155 160Leu Lys Tyr Leu Pro Val Ser Ile Val Ala Ser His Thr His Tyr Asp
165 170 175Lys Glu Gly Asn Ser Tyr Ser Met Gly Thr Cys Ile Ala Glu Lys Gly
180 185 190Lys Thr Lys Tyr Met Leu Phe Lys Val Pro Gly Gly Ser Arg Pro Asp
195 200 205Gly Ser Pro Pro Leu Lys Ser Ala Glu Ala Val Cys Thr Leu Pro Cys
210 215 220Arg Ser Leu Leu Thr Pro Ser Tyr Tyr His Ser Phe Gly Met Thr Asp225 230 235 240Asn Tyr Phe Ile Phe Ile Glu Gln Pro Leu Lys Leu Asp Ile Leu Lys
245 250 255Met Ala Thr Ala Tyr Leu Arg Arg Val Ser Trp Ala Ser Cys Met Lys
260 265 270Phe His Pro Glu Asp Ser Thr Leu Ile His Leu Ile Asp Arg Asn Thr
275 280 285Lys Lys Glu Val Ala Thr Lys Phe Tyr Thr Asp Ala Met Thr Val Tyr
290 295 300His Gln Val Asn Ala Phe Glu Asp Asp Gly His Val Val Phe Asp Val305 310 315 320Ile Ala Tyr Asp Asp Asn Asn Leu Tyr Glu Phe Phe Tyr Leu Asn Lys
325 330 335Leu Lys Glu Thr Met Gly Ala Thr Asn Leu Tyr Cys Lys Pro Lys Phe
340 345 350Thr Arg Phe Val Phe Pro Leu Ser Asp Gln Gly Glu Thr Gly Glu Asp
355 360 365Leu Val Lys Leu Lys Tyr Thr Thr Ala Ser Ala Val Lys Glu Lys Asp
370 375 380Gly Lys Ile Met Cys Gln Gly Glu Val Leu Cys Glu Gly Val Glu Leu385 390 395 400Pro Arg Ile Asn Tyr Asn Phe Asn Gly Lys Lys Tyr Arg Tyr Ser Tyr
405 410 415Met Cys Cys Val Asp Glu Ser Pro Val Ala Thr Arg Ile Val Lys Phe
420 425 430Asp Ala Asp Thr Lys Gln Gln Ile Glu Trp Lys Gly Asp Asp Gly Phe
435 440 445Ala Ser Glu pro Val Phe Ile Pro Arg Pro Gly Ala Val Asp Glu Asp
450 455 460Asp Gly Val Val Leu Thr Val Ile Ile Asn Asn Lys Pro Ieu Gln Gly
465 470 475 480Gly Phe Leu Leu Val Leu Asp Ala Lys Ser phe Lys Glu Ile Ala Arg
485 490 495Ala Cys Leu Asp Val Glu Ile His Met Asp Met His Gly Tyr phe Ile
500 505 510Pro Gly Ser Ser
515<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:Danio rerio特异性3′RACEPCR下游引物<400>18cctgaatggg tgcagggaac a21
Claims (37)
1.具有特异切割β-胡萝卜素而形成维生素A醛的生物学活性的分离β-胡萝卜素双加氧酶(β-diox)多肽或其功能片段。
2.依照权利要求1的β-diox多肽或其功能片段,其包含选自下组的一种或多种氨基酸序列:SEQ ID NO:2的第71-79位、第128-147位、第386-393位、和第549-570位,SEQ ID NO:17的第30-38位、第87-106位、第352-359位、和第448-467位的氨基酸序列。
3.依照权利要求1或2的β-diox多肽或其功能片段,其具有与SEQ ID NO:2或17中所列氨基酸序列至少45%同一,或者与GenBank编号AF294900,AJ278064,AF294899,AF271298,AJ271386和AF098992代表的DNA序列所编码的任一氨基酸序列至少45%同一的氨基酸序列。
4.依照权利要求1或2的β-diox多肽或其功能片段,其具有与SEQ ID NO:2或17中所列氨基酸序列至少60%同一,或者与GenBank编号AF294900,AJ278064,AF294899,AF271298,AJ271386和AF098992代表的DNA序列所编码的任一氨基酸序列至少60%同一的氨基酸序列。
5.依照权利要求1或2的β-diox多肽或其功能片段,其具有与SEQ ID NO:2或17中所列氨基酸序列至少75%同一,或者与GenBank编号AF294900,AJ278064,AF294899,AF271298,AJ271386和AF098992代表的DNA序列所编码的任一氨基酸序列至少75%同一的氨基酸序列。
6.依照权利要求1或2的β-diox多肽或其功能片段,其具有与SEQ ID NO:2或17中所列氨基酸序列至少90%同一,或者与GenBank编号AF294900,AJ278064,AF294899,AF271298,AJ271386和AF098992代表的DNA序列所编码的任一氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列。
7.依照权利要求1或2的β-diox多肽或其功能片段,其具有SEQID NO:2或17中所列氨基酸序列,或者GenBank编号AF294900,AJ278064,AF294899,AF271298,AJ271386和AF098992代表的DNA序列所编码的任一氨基酸序列,或者其部分。
8.依照权利要求1或2的β-diox多肽或其功能片段,其具有由选自下组的DNA序列编码的氨基酸序列:
(1)SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:16中所列DNA序列或其互补链;和
(2)GenBank编号AF294900,AJ278064,AF294899,AF271298,AJ271386和AF098992代表的DNA序列或其互补链;和
(3)SEQ ID NO:1的第211-237位、第382-441位、第1156-1179位、和第1645-1710位DNA序列或其互补链;和
(4)SEQ ID NO:16的第181-207位、第352-411位、第1147-1170位、和第1435-1494位的DNA序列或其互补链;和
(5)在高严谨度条件下与(1)、(2)、(3)、和(4)中所定义的DNA序列或其互补链发生杂交的DNA序列或其功能片段;和
(6)若非遗传密码的简并性将与(1)、(2)、(3)、(4)、和(5)中所定义的DNA序列发生杂交的DNA序列。
9.包含编码依照权利要求1-8任一项的β-diox多肽或其功能片段的DNA序列的DNA分子。
10.包含用于保证具有特异切割β-胡萝卜素而形成维生素A醛的生物活性的β-diox多肽或其功能片段的表达或者用于测定所述多肽或其功能片段的特征性核酸的存在的DNA序列的DNA分子,其选自下组:
(1)SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:16中所列DNA序列或其互补链;和
(2)GeneBank编号AF294900,AJ278064,AF294899,AF271298,AJ271386和AF098992代表的DNA序列或其互补链;和
(3)SEQ ID NO:1的第211-237位、第382-441位、第1156-1179位、和第1645-1710位DNA序列或其互补链;和
(4)SEQ ID NO:16的第181-207位、第352-411位、第1147-1170位、和第1435-1494位的DNA序列或其互补链;和
(5)在高严谨度条件下与(1)、(2)、(3)、和(4)中所定义的DNA序列或其互补链发生杂交的DNA序列或其功能片段;和
(6)若非遗传密码的简并性将与(1)、(2)、(3)、(4)、和(5)中所定义的DNA序列发生杂交的DNA序列。
11.依照权利要求9或10的DNA分子,其所包含的DNA序列是cDNA、基因组、或人造DNA序列。
12.依照权利要求9-11任一项的DNA分子,其包含至少一种选择标记基因或cDNA,该基因或cDNA可操作连接允许其在细菌、真菌包括酵母、昆虫、动物、或植物细胞、种子、组织、或完整生物体中表达的组成性、诱导性、或组织特异性启动子序列。
13.依照权利要求9-12任一项的DNA分子,其中编码核苷酸序列融合合适的质体运输肽编码序列,二者都优选在组织特异性或组成性启动子的控制下表达。
14.包含依照权利要求9-13任一项的一种或多种DNA分子的质粒或载体系统。
15.用于生成β-diox多肽的方法,包括下列步骤:
(1)在合适宿主中表达由依照权利要求9-14任一项的DNA编码的多肽,并
(2)分离所述β-diox多肽。
16.由权利要求15的方法获得的蛋白质产物。
17.以适当方式用依照权利要求9-13任一项的DNA分子或者用依照权利要求14的质粒或载体系统转化或转染的原核或真核宿主细胞、种子、组织、或完整生物体,所述方式使得所述宿主细胞、种子、组织、或完整生物体能够表达具有特异切割β-胡萝卜素而形成维生素A醛的生物学活性和/或具有特异结合针对所述多肽或其功能片段所产生的抗体的能力的多肽或其功能片段。
18.依照权利要求17的原核或真核宿主细胞、种子、组织、或完整生物体,其选自下组:细菌、真菌包括酵母、昆虫、动物、和植物细胞、种子、组织、或完整生物体。
19.依照权利要求18的原核宿主细胞或完整生物体,其是选自下组的细菌:原细菌,包括α、β、γ、δ、和ε亚门的成员;革兰氏阳性细菌,包括放线菌纲(Actinomycetes)、硬壁菌门(Firmicutes)、梭菌属(Clostridium)及其亲缘、黄细菌、蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫磺细菌、和古细菌。
20.依照权利要求19的原核宿主细胞或完整生物体,其属于选自下组的原细菌类:土壤杆菌属(Agrobacterium)、红细菌属(Rhodobacter)、氧化氨的细菌诸如亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、粘细菌(Myxobacteria)诸如粘球菌属(Myxococcus),优选金黄色土壤杆菌(Agrobacterium aureus)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、亚硝化单胞菌(Nitrosomonassp.)ENI-11、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、和黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)。
21.依照权利要求19的原核宿主细胞或完整生物体,其属于选自下组的革兰氏阳性细菌:放线菌纲(Actinomycetes)和厚壁菌门(Firmicutes)包括梭菌属(Clostridium)及其亲缘,诸如芽孢杆菌属(Bacillus)和乳球菌属(Lactococcus),优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
22.依照权利要求19的原核宿主细胞或完整生物体,其属于选自下组的黄细菌:拟杆菌属(Bacteroides)、噬纤维菌属(Cytophaga)、和黄杆菌属(Flavobacterium),优选黄杆菌诸如黄杆菌ATCC 21588。
23.依照权利要求19的原核宿主细胞或完整生物体,其属于选自下组的蓝细菌:Chlorococcales,包括集胞蓝细菌属(Synechocystis)和聚球蓝细菌属(Synechococcus),优选集胞蓝细菌之种和聚球蓝细菌之种PS717。
24.依照权利要求19的原核宿主细胞或完整生物体,其属于选自下组的绿色硫磺细菌或绿色非硫磺细菌:分别是绿菌属(Chlorobium)或绿屈挠菌科(Chloroflexaceae)诸如绿屈挠菌属(Chloroflexus),分别优选泥生绿菌嗜硫代硫酸盐小种(Chlorobium limicolaf.thiosulfatophilum)和橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)。
25.依照权利要求19的原核宿主细胞或完整生物体,其属于选自下组的古细菌:盐杆菌科(Halobacteriaceae)诸如盐杆菌属(Halobacterium),优选盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarum)。
26.依照权利要求18的真核宿主细胞或完整生物体,其是选自下组的真菌包括酵母:子囊菌门(Ascomycota)包括酵母纲(Saccharomycetes)诸如毕赤酵母属(Pichia)和酵母属(Saccharomyces),和变形子囊菌门(anamorphic Ascomycota)包括曲霉属(Aspergillus),优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和黑曲霉(Aspergillus niger)。
27.依照权利要求18的真核宿主细胞,其是选自下组的昆虫细胞:SF9、SF21、Trychplusiani、和MB21。
28.依照权利要求18的真核宿主细胞,其是选自下组的动物细胞:幼仓鼠肾(BHK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、和COS细胞,最优选3T3和293细胞。
29.依照权利要求18的真核宿主细胞、种子、组织、或完整生物体,其是选自下组的植物细胞、种子、组织、或完整生物体:真核藻类、有胚植物包括苔藓植物门(Bryophyta)、蕨类植物门(Pteridophyta)、和被子植物门(Spermatophyta)诸如裸子植物亚门(Gymnospermae)和被子植物亚门(Angiospermae),后者包括Magnoliopsida、Rosopsida、和百合纲(Liliopsida)(“单子叶植物”)。
30.依照权利要求29的真核宿主细胞、种子、组织、或完整生物体,其选自下组:谷物种子,优选稻、小麦、大麦、燕麦、苋属植物、亚麻、黑小麦、黑麦、和玉米;油料种子,优选芸苔种子、棉花种子、大豆、红花、向日葵、椰子、和棕榈;选自下组的其它可食用种子或含可食用部分的种子:西葫芦、南瓜、芝麻、罂粟、葡萄、绿豆、花生、豌豆、菜豆、萝卜、苜蓿、可可、咖啡、大麻;树生坚果,优选胡桃、巴旦杏、山核桃、和鹰嘴豆;马铃薯、胡萝卜、甘薯、制糖甜菜、番茄、胡椒、木薯、柳、栎、榆、槭、苹果、和香蕉。
31.转化细菌、真菌、酵母、昆虫、动物、或植物细胞、种子、组织、或完整生物体以产生能够表达β-胡萝卜素双加氧酶(β-diox)多肽或其功能片段的转化体的方法,所述多肽或其功能片段具有特异切割β-胡萝卜素而形成维生素A醛的生物学活性和/或具有特异结合针对所述多肽或其功能片段所产生的抗体的能力,该方法包括用依照权利要求9-13任一项的DNA分子或者用依照权利要求14的质粒或载体系统转化所述细菌、真菌包括酵母、昆虫、动物、或植物细胞、种子、组织、或完整生物体。
32.由依照权利要求31产生的转化体提供或再生的转化细胞、真菌包括酵母、昆虫、动物、或植物细胞、种子、组织或完整生物体。
33.依照权利要求32的转化植物细胞、种子、组织、或完整生物体,其选自下组:真核藻类、有胚植物包括苔藓植物门(Bryophyta)、蕨类植物门(Pteridophyta)、和种子植物门(Spermatophyta)诸如裸子植物亚门(Gymnospermae)和被子植物亚门(Angiospermae),后者包括Magnoliopsida、Rosopsida、和百合纲(Liliopsida)(“单子叶植物”)。
34.依照权利要求33的转化植物细胞、种子、组织、或完整生物体,其选自下组:谷物种子,优选稻、小麦、大麦、燕麦、苋属植物、亚麻、黑小麦、黑麦、和玉米;油料种子,优选芸苔种子、棉花种子、大豆、红花、向日葵、椰子、和棕榈;选自下组的其它可食用种子或含可食用部分的种子:西葫芦、南瓜、芝麻、罂粟、葡萄、绿豆、花生、豌豆、菜豆、萝卜、苜蓿、可可、咖啡、大麻;树生坚果,优选胡桃、巴旦杏、山核桃、和鹰嘴豆;马铃薯、胡萝卜、甘薯、制糖甜菜、番茄、胡椒、木薯、柳、栎、榆、槭、苹果、和香蕉。
35.对权利要求1-8和16任一项的多肽具有特异免疫反应性的抗体。
36.依照权利要求35的抗体用于分离权利要求1-8和16任一项的多肽的用途。
37.依照权利要求35的抗体用于权利要求1-8和16任一项的多肽的量化的用途。
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EP99125895 | 1999-12-24 | ||
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