CN1360637A - 含有改变水平的固醇化合物和生育酚的转基因植物 - Google Patents

Abstract

提供了重组构建体,其含有编码在改变固醇化合物和生育酚在转基因植物中生物合成和积累方面有效的酶的DNA序列。也提供了使用这些构建体生产转基因植物的方法,这些转基因植物的种子含有水平提高的谷甾烷醇和/或谷甾烷醇酯,和α－生育酚,以及水平降低的菜油甾醇和菜油甾烷醇及其相应的酯。这些种子也含有新的固醇—菜子甾烷醇。也提供了由这些植物的种子获得的油。这种油能用来制备在降低血清低密度脂蛋白胆固醇水平中有效的食用和药用组合物。另外,也公开了编码植物固醇5－α还原酶的新DNA序列。

Description

含有改变水平的固醇化合物和生育酚的转基因植物

相关申请的交叉引用

本申请要求对1999年4月12日申请的临时申请60/128,995的优先权，为所有目的在此完全引用作为参考。

                         发明背景发明领域

本发明涉及具有改进的营养特性的转基因植物。更具体而言，本发明涉及转基因植物、果实和植物部分，其含有水平改变的固醇化合物，如提高水平的有益植物甾醇类，如谷甾醇、植物甾烷醇(phytostanols)，如谷甾烷醇(sitostanol)，及其酯。这些转基因植物也可含有提高水平的生育酚，如α-生育酚。另外，这些转基因植物也能在果实和植物部分中含有降低水平的菜油甾醇和菜油甾烷醇(campestanol)，及其各自的酯。也提供编码可影响植物中固醇化合物和生育酚生物合成和积累的多种不同酶的核酸序列，和用这些序列生产这些转基因植物的方法。这些方法包括，例如，向植物中导入一种3-羟基类固醇氧化酶如胆固醇氧化酶，任选地与一种类固醇5α-还原酶组合，进一步任选地与至少一种生育酚生物合成酶组合，分别提高谷甾烷醇和生育酚的水平，特别是在种子中。相关技术描述

植物甾醇类和植物甾烷醇类

众所周知，植物甾醇类和植物甾烷醇类有利于降低血清胆固醇(Ling等人(1995)生命科学(Life Sciences)57：195-206)，并降低患心脏病的危险。这些化合物在肝脏中极少吸收，阻断饮食胆固醇的吸收。然而，植物甾醇和植物甾烷醇在双子叶植物如大豆、棉花等的种子中只少量存在。最近，已经获得了有力证据，证明植物甾烷醇(植物甾醇的氢化形式，例如谷甾烷醇)在降低人体血清胆固醇中的作用(Ling等人，同上文)。谷甾烷醇的阿魏脂和脂肪酰酯以低水平自然存在于谷粒中(Seitz(1989)农业食品化学杂志(J.Agric.Food Chem.)37：662-667；Dyas等人(1993)植物化学(Phytochem.)34：17-29)。除植物甾醇和植物甾烷醇之外，谷粒和种子中也含有生育酚和生育三烯酚。生育酚用作抗氧化剂，并在保护细胞免受自由基损伤中起主要作用(Halliwell(1997)营养综述(Nutrition Review)55：44-60)。

表达3-羟基类固醇氧化酶的昆虫抗性转基因植物

美国专利号5,518,908公开了一种防止植物被昆虫侵害的方法，包括在这些植物的细胞中，或在能应用于植物的植物定居微生物中，表达一种编码3-羟基类固醇氧化酶的结构编码序列，而赋予前者昆虫抗性。对于转基因植物，目的在于提供单子叶植物和双子叶植物，它们在植物部分如叶、花中，对于棉花在棉桃中，组成型表达杀虫有效量的3-羟基类固醇氧化酶。该发明者表达了对使用组成型启动子如nos、ocs、CaMV 19S和35S、ssRUBISCO和FMV 35S启动子达到这一目的的偏爱。公开了3-羟基类固醇氧化酶在细胞质中的表达，利用分泌型信号序列在胞外间隙中，利用合适的导向序列在液泡和叶绿体中的表达。然而，没有生产表达3-羟基类固醇氧化酶转基因的转基因植物。因此，美国专利号5,518,908中公开的发明明显不同于此处提供的，通过以下描述将是明显的。

美国专利号5,554,369，’908专利的分案申请，要求保护一种防止植物被鳞翅目或棉铃象鼻虫昆虫侵害的方法，包括提供3-羟基类固醇氧化酶供昆虫摄取。

授予同一发明者的美国专利号5,558,862要求保护一种防止植物被昆虫侵害的方法，是通过向植物环境或植物种子施用一种表达编码3-羟基类固醇氧化酶的异源DNA的植物定居微生物。

也是授予同一发明者的美国专利号5,763,245要求保护一种防止植物被昆虫侵害的方法，包括提供3-羟基类固醇氧化酶和杀虫苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)蛋白供鳞翅目昆虫摄取。也要求保护一种生产遗传转化的、能产生杀虫有效量的Bt蛋白和3-羟基类固醇氧化酶的植物的方法，包括向植物细胞基因组中插入一种含有编码这两种蛋白质的核酸序列的重组载体，以及一种对于蛋白质编码序列异源的启动子，其可有效地引起蛋白质编码序列在遗传转化的植物中以杀虫有效的量表达。在上文中的’908、’369和’862专利中，发明者强调应用组成型启动子引起在植物开花部分中的一致表达。公开了单独或与3-羟基类固醇氧化酶即胆固醇氧化酶一起表达Bt蛋白的转基因玉米。通过将经受胆固醇氧化酶转化事件的植物与经受Bt转化事件的植物杂交，产生了表达这两种蛋白质的两群F1代植物。

最后，也是授予同一发明者的，要求对美国专利申请’908优先权的欧洲专利EP 0 706 320 B1(相当于PCT国际公开文本WO95/01098)，公开了在组成型FMV35启动子控制下表达3-羟基类固醇氧化酶的转基因烟草。在上述其他专利中，发明者再次强调应用植物组成型启动子表达3-羟基类固醇氧化酶转基因，生产昆虫抗性植物。

因此，这些专利的公开内容的一个共同特征是强调应用组成型植物启动子，实现在植物开花部分中表达杀虫有效量的3-羟基类固醇氧化酶，以防止昆虫侵害。种子特异的、胚芽特异的和质体特异的表达既未公开也未建议。而且，没有给出解释为什么希望这种表达的原因，也未给出任何动机。

除了上述专利外，在技术资料中有几则关于3-羟基类固醇氧化酶基因在转基因植物中表达的报道。Corbin等人(1994)应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)60：4239-4244公开了应用组成型FMV 35S启动子，来自链霉菌属(Streptomyces)的杀虫choM胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达，及其在烟草原生质体中的瞬时表达。Cho等人(1995)应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)44：133-138公开了链霉菌属胆固醇氧化酶基因choA在组成型CaMV 35S启动子控制下在转化烟草愈伤组织中的表达。Corbin等人(1996)HortScience 31：699，摘要号786，公开了胆固醇氧化酶基因在转基因烟草植物中的克隆与表达，产生对棉铃象鼻虫有高活性的植物组织。Estruch等人(1997)自然生物技术(Naturebiotechnology)15：137-141是关于转基因植物中害虫防治方法的综述，主要集中于苏云金芽孢杆菌内毒素。也讨论了胆固醇氧化酶作为杀虫蛋白质的用途。作者指出，在天然胆固醇氧化酶基因转化的烟草原生质体提取物中检测到酶活性胆固醇氧化酶，引用1994Corbin等人和1995Cho等人论文，同上文。作者讨论了昆虫抗性转基因植物领域的未来方向，设想了“严紧型组织特异性启动子”的应用，而未给予任何具体实施例或建议。Jouanin等人(1998)植物科学(Plant Science)131：1-11，另一篇综述文章，集中于用苏云金芽孢杆菌δ-内毒素和植物来源的基因如编码酶抑制剂和凝聚素的基因产生昆虫抗性转基因植物。作者指出了链霉菌属胆固醇氧化酶基因的杀虫活性，以及大多数现有的昆虫抗性植物表达置于组成型启动子控制下的一种抗性基因的事实。在讨论保留对转基因植物中表达的苏云金芽孢杆菌基因的昆虫敏感性的策略时，作者指出了组成型、组织特异的和诱导型启动子的应用。他们建议，当在转基因植物中使用组成型毒素表达时，一种避免由高选择压力引起的昆虫抗性发展的方法是利用组织特异性启动子限制昆虫接触昆虫所攻击的某些植物部分中的毒素。然而，对于任何特定组织或组织特异的启动子，未公开具体实施例或建议。有趣的是，作者指出，杀虫基因在转基因植物中的导向表达能确保其公众接受性，一个实施例是，在马铃薯植物叶中而不是在块茎中表达昆虫毒素来防治科罗拉多马铃薯甲虫。这提示，只在需要防治昆虫害虫时才在植物中如可能时在非食用植物部分中表达毒素。最后，Corbin等人(1998)HortScience 33：614-617综述了鉴定和发展用于转基因作物昆虫防治的新杀虫蛋白质的策略。除了讨论苏云金芽孢杆菌δ-内毒素外，作者也综述了对胆固醇氧化酶的研究。他们没有提供任何实验细节，指出在转基因烟草中表达了来自链霉菌A19249的胆固醇氧化酶基因，并证明了该组织对棉铃象甲幼虫的杀虫活性。他们也指出，他们目前正在表征转基因棉花植物中产生的胆固醇氧化酶的表达和生物活性，也未提供实验细节。

总之，上述专利和杂志文章表明，迄今为止通常使用的通过重组方法赋予植物昆虫抗性的方法是在转基因植物中组成型表达一种杀虫蛋白质。尽管提出组织特异性表达可能具有某些优点，但这些公开文本未提供具体实施例或策略。已经提出利用合适的信号肽与组成型启动子向质体导向参与昆虫抗性的酶。例如，参见美国专利5,518,908。组织特异性启动子如种子特异性启动子为此目的及引导质体直接转化的应用，特别是在种子组织中，尚未公开或提出。但是，该文献提出，昆虫攻击的植物部分如叶的有限表达，及避免用作食物或食物产品或成分来源的植物部分如马铃薯块茎的表达是希望的。因此，这些参考文献讲述不同于在能作为食物和食物产品或成分如油和面粉来源的植物部分如种子中表达杀虫蛋白如胆固醇氧化酶的概念。这些参考文献均未讲述或提出用这些基因转化的植物中内源植物甾烷醇水平的改变，或者使用这些基因这些改变甚至是可能的。因此，这些参考文献未提供使用胆固醇氧化酶改变植物中植物甾醇/植物甾烷醇水平的动机，也未提出其在植物中过量表达改变植物甾醇/植物甾烷醇分布是成功的合理预期。

植物油的营养价值

植物油和糠油(bran oil)是植物甾醇和植物甾烷醇的最佳天然来源。然而，这些油中植物甾烷醇的含量相对于其他固醇化合物较低。因此提高植物油中的植物甾烷醇(如谷甾烷醇)含量在本领域中是希望的。目前，大多数谷甾烷醇是通过加工豆油并通过氢化将β-谷甾醇转化为谷甾烷醇而生产的。已知这些修饰可提高这些植物甾醇的抗动脉粥样化活性。但是，除了增加成本外，这些化学干涉还可导致不希望的异构体的形成。因此，在植物中通过双键的转酯和/或还原修饰植物甾醇是生产希望的植物甾醇衍生物(包括植物甾醇酯、植物甾烷醇和植物甾烷醇酯)的经济、有效的方法。将植物甾醇自然转化为植物甾烷醇酯的能力将显著增加谷粒和种子的营养价值。此外，自然提高谷甾烷醇、谷甾烷醇酯和生育酚的水平不仅将提高谷粒和种子的营养价值，而且也能促进营养重要的生物活性分子的组合在单一的、方便的来源中的“堆积”。这样，含有具有优良生物利用率和效能的生物活性分子的食物和食物产品能用来改善人体营养和心血管健康。

                         发明概述

因此，本发明提供许多不同方法，来提高植物中希望的植物甾醇和植物甾烷醇化合物(如谷甾烷醇和谷甾烷醇酯)以及生育酚化合物的水平。这通过在植物中表达可提高这些重要养分水平的基因或其他DNA或RNA编码序列来实现。在一个优选实施方案中，利用种子特异的或质体特异的启动子通过种子或谷粒特异的增强实现谷甾烷醇和生育酚化合物水平的提高。这包括种子油质量的改善，如在棉花和芸苔属(Brassica)种中。

此处公开的提高植物中植物甾烷醇如谷甾烷醇和生育酚化合物水平的方法通常利用在植物细胞中导入和表达3-羟基类固醇氧化酶(如胆固醇氧化酶)，任选地与类固醇5α-还原酶如拟南芥DET2基因编码的酶组合。同时，导入和表达生育酚生物合成途径中的一种或多种基因也能提高生育酚水平。也公开了编码可增强希望的植物甾醇、植物甾烷醇、其酯和生育酚化合物的生物合成和积累的酶的其他核苷酸序列的应用。例如，能用固醇酰基转移酶提高谷甾烷醇和其他植物甾烷醇酯的水平；能用固醇甲基转移酶降低菜油甾醇、菜油甾烷醇和其相应的酯的水平。

因此，在第一方面，本发明提供重组DNA构建体，其含有选自下列的一员作为5’-3’方向有效连接的成分：

一种种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，一种编码3-羟基类固醇氧化酶的DNA序列，和一种转录终止信号序列；

一种种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，一种编码类固醇5α-还原酶的DNA序列，和一种转录终止信号序列；

一种种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，一种编码3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA序列，和一种转录终止信号序列；

一种种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，一种编码固醇甲基转移酶的DNA序列，和一种转录终止信号序列；

一种种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，一种编码固醇酰基转移酶的DNA序列，和一种转录终止信号序列；和

一种种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，一种编码S-腺苷甲硫氨酸依赖的γ-生育酚甲基转移酶的DNA序列，和一种转录终止信号序列。

当该启动子是种子特异的启动子时，重组构建体能进一步含有一种能引导酶向质体中转运的转运肽编码区，它与所述DNA序列有效连接。当该启动子是在植物质体中起作用的启动子时，重组构建体能进一步含有一种编码选择性标记的基因，用于筛选含有表达该标记的质体的植物细胞，和与该质体基因组同源的DNA区，其中同源区侧翼于质体功能启动子，DNA序列，转录终止信号序列，和编码选择性标记的基因。另外，重组构建体能进一步含有一个与质体启动子连接的核糖体结合位点。

在第二方面，本发明提供包含上述任一种重组构建体的重组载体，包括植物表达载体。

另一方面，本发明提供包含上述任一种重组构建体或载体的转化的宿主细胞，包括植物细胞。

另一方面，本发明提供含有至少一种上述转化宿主细胞的植物和种子。

另一方面，本发明提供一种植物，其基因组含有导入的DNA，该DNA选自：

编码3-羟基类固醇氧化酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的谷甾烷醇，至少一种谷甾烷醇酯，或其混合物；

编码类固醇5α-还原酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的谷甾烷醇，至少一种谷甾烷醇酯，或其混合物；

编码3-羟基类固醇氧化酶和类固醇5α-还原酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的谷甾烷醇，至少一种谷甾烷醇酯，或其混合物；

编码3-羟基类固醇氧化酶和生育酚生物合成酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的谷甾烷醇，至少一种谷甾烷醇酯，或其混合物，和至少一种生育酚化合物；

编码类固醇5α-还原酶和生育酚生物合成酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的谷甾烷醇，至少一种谷甾烷醇酯，或其混合物，和至少一种生育酚化合物；

编码3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶和生育酚生物合成酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的谷甾烷醇，至少一种谷甾烷醇酯，或其混合物，和至少一种生育酚化合物；

编码3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物；

编码3-羟基类固醇氧化酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物；

编码类固醇5α-还原酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物；

编码3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物；

编码3-羟基类固醇氧化酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和固醇甲基转移酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物，以及水平降低的菜油甾醇、菜油甾烷醇或菜油甾醇和菜油甾烷醇两者；

编码类固醇5α-还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和固醇甲基转移酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物，以及水平降低的菜油甾醇、菜油甾烷醇或水平降低的菜油甾醇和菜油甾烷醇两者；和

编码3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和固醇甲基转移酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物，以及水平降低的菜油甾醇、菜油甾烷醇或水平降低的菜油甾醇和菜油甾烷醇两者。

另一方面，本发明提供上述任一种植物，其中所述基因组进一步含有编码固醇酰基转移酶的导入DNA，该导入DNA与引起该导入DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇(当导入编码3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA时)，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，及其混合物。

再一方面，本发明提供上述任一种植物，其中所述基因组进一步含有编码S-腺苷甲硫氨酸依赖的γ-生育酚甲基转移酶的导入DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇(当导入编码3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA时)，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物，以及水平提高的α-生育酚。

另一方面，本发明提供上述任一种植物，其种子含有菜子甾烷醇(brassicastanol)、菜子甾烷醇酯、豆甾烷醇(stigmastanol)或豆甾烷醇酯。

另一方面，本发明提供一种植物，其基因组含有至少一种导入DNA序列，该DNA序列编码可影响至少一种固醇、至少一种植物甾醇、至少一种植物甾醇酯、至少一种植物甾烷醇、至少一种植物甾烷醇酯或其组合的生物合成和积累的肽、多肽或蛋白质，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与不含该导入DNA的相应转基因或非转基因植物相比，该植物产生含有水平提高的至少一种固醇、至少一种植物甾醇、至少一种植物甾醇酯、至少一种植物甾烷醇、至少一种植物甾烷醇酯或其组合的种子。植物甾烷醇或植物甾烷醇酯可以是谷甾烷醇，或至少一种谷甾烷醇酯。此外，也可存在其混合物。

再一方面，本发明提供一种植物，与不含编码可影响植物甾醇或植物甾烷醇在相应植物中生物合成和积累的肽、多肽或蛋白质的导入DNA的相应转基因或非转基因植物相比，其产生的种子含有水平提高的选自植物甾醇、至少一种植物甾醇酯、植物甾烷醇、至少一种植物甾烷醇酯或其混合物的化合物，以及水平降低的选自菜油甾醇、菜油甾醇酯、菜子甾醇、菜子甾醇酯、菜油甾烷醇、菜油甾烷醇酯、菜子甾烷醇、菜子甾烷醇酯或其混合物的化合物。本发明也提供一种植物，与不含编码可影响植物甾醇或植物甾烷醇在相应植物中生物合成和积累的肽、多肽或蛋白质的导入DNA的相应转基因或非转基因植物相比，其产生的种子含有水平降低的选自菜油甾醇、菜油甾醇酯、菜子甾醇、菜子甾醇酯、菜油甾烷醇、菜油甾烷醇酯、菜子甾烷醇、菜子甾烷醇酯或其混合物的化合物。

另一方面，本发明提供上述植物，其中所述种子含有水平提高的α-生育酚。这些种子也可含有选自菜子甾烷醇、至少一种菜子甾烷醇酯、豆甾烷醇、至少一种豆甾烷醇酯或其混合物的化合物。

另一方面，本发明提供上述植物，其中所述调节信号引起该导入DNA的种子特异表达，该导入DNA的每一种进一步与能引导所编码的酶向质体中转运的转运肽编码区有效连接。此外，上述植物中的调节信号能引起该导入DNA的质体特异表达，该基因组于是可以是一种质体基因组。

再一方面，本发明提供上述任一种植物的种子，以及这些植物中任一种的后代。

再一方面，本发明提供上述任一种植物的细胞，以及含有这些细胞的细胞培养物。

另一方面，本发明提供一种生产含谷甾烷醇或谷甾烷醇酯的油的方法，包括在可生产含谷甾烷醇或谷甾烷醇酯的油的时间内和条件下，培养上述细胞，并回收产生的含谷甾烷醇或谷甾烷醇酯的油。

另一方面，本发明提供一种生产谷甾烷醇或谷甾烷醇酯的方法，包括在可生产谷甾烷醇或谷甾烷醇酯的时间内和条件下，培养上述细胞，并回收产生的谷甾烷醇或谷甾烷醇酯。

另一方面，本发明提供一种由上述任一种种子产生的植物。

另一方面，本发明提供一种生产植物的方法，与不含编码可影响植物甾醇或植物甾醇酯或植物甾烷醇或植物甾烷醇酯生物合成和积累的肽、多肽或蛋白质的导入DNA的相应植物相比，该植物的种子中积累水平提高的选自谷甾醇、至少一种谷甾醇酯、谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的化合物，该方法包括使上述任一种植物与所述相应植物有性杂交。本发明也包括用该方法产生的植物，这些植物产生的种子，和这些及其他上述任一种植物的一致性群体。

另一方面，本发明提供一种生产植物的方法，该植物积累水平提高的选自谷甾醇、至少一种谷甾醇酯、谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的化合物，并且是无性生殖的，以及由本发明的无性生殖植物与保育栽培品种杂交产生的种子。

另一方面，本发明包括一种在种子中生产选自至少一种植物甾醇、至少一种植物甾醇酯、至少一种植物甾烷醇、至少一种植物甾烷醇酯或其混合物的化合物的方法，包括获得一种产生该种子的转化植物，其中该植物含有并表达选自下列的基因组DNA：

编码3-羟基类固醇氧化酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码类固醇5α-还原酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码3-羟基类固醇氧化酶和类固醇5α-还原酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码3-羟基类固醇氧化酶和生育酚生物合成酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码类固醇5α-还原酶和生育酚生物合成酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶和生育酚生物合成酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码3-羟基类固醇氧化酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码类固醇5α-还原酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码3-羟基类固醇氧化酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和固醇甲基转移酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码类固醇5α-还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和固醇甲基转移酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；和

编码3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和固醇甲基转移酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；和

回收至少一种植物甾醇、至少一种植物甾醇酯、至少一种植物甾烷醇、至少一种植物甾烷醇酯或其混合物。在一个优选实施方案中，回收谷甾烷醇、谷甾烷醇酯或其混合物。

这些植物在其基因组中能进一步含有并表达编码固醇酰基转移酶的DNA，该DNA与引起该酰基转移酶-编码DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接。而且，这些和上述植物也能在其基因组中含有并表达编码S-腺苷甲硫氨酸依赖的γ-生育酚甲基转移酶的DNA，该DNA与引起该DNA甲基转移酶-编码DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接。

在上述方法中，当所述调节信号引起酶编码DNA的种子特异表达时，每一种酶编码DNA都能进一步与可引导编码的酶向质体中转运的转运肽编码区有效连接，该基因组是核基因组。当所述调节信号引起酶编码DNA的质体特异表达时，该基因组是质体基因组。

另一方面，本发明提供一种生产谷甾烷醇或至少一种谷甾烷醇脂肪酸酯的方法，包括种植上述任一种植物，并回收产生的谷甾烷醇或谷甾烷醇脂肪酸酯。

再一方面，本发明提供一种生产菜子甾烷醇、至少一种菜子甾烷醇酯、豆甾烷醇或至少一种豆甾烷醇酯的方法，包括种植上述任一种植物，并回收产生的菜子甾烷醇、至少一种菜子甾烷醇酯、豆甾烷醇或至少一种豆甾烷醇酯。

另一方面，本发明提供上述任一种转基因植物的一部分，而不是种子。这些部分包括这些植物的果实和植物部分。

另一方面，本发明提供含有选自至少一种固醇、至少一种植物甾醇、至少一种植物甾醇酯、至少一种植物甾烷醇、至少一种植物甾烷醇酯或其混合物的化合物的油，这些油是从上述任一种植物的种子中提取，或是通过上述任一种方法生产的。

另一方面，本发明提供一种从上述任一种植物的种子中提取，或通过上述任一种方法生产的谷甾烷醇酯组合物。

再另一方面，本发明提供降胆固醇组合物，其包含上述任一种油或谷甾烷醇酯组合物。这些组合物可采用食物、食物成分、食用组合物、食品添加剂、饮食添加物或药用组合物的形式。

再一方面，本发明提供降低低密度脂蛋白胆固醇的血浆浓度或治疗或预防低密度脂蛋白胆固醇血浆浓度升高的方法，包括使人或动物患者口服有效量的上述任一种油、谷甾烷醇酯组合物、食物、食物成分、食用组合物、食品添加剂、饮食添加物或药用组合物。

另一方面，本发明提供一种实现宿主有效吸收谷甾烷醇的方法，包括用此处所述的任何方法生产至少一种谷甾烷醇酯，并向该宿主施用至少一种谷甾烷醇。

再一方面，本发明提供一种制造食品添加剂的方法，包括从根据本发明的转基因植物的种子中获得含有选自谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的植物甾烷醇化合物的油，并将该油与食用增溶剂、有效量的抗氧化剂和有效量的分散剂混合。此外，食品添加剂也可通过下列方法制造，包括从根据本发明的转基因植物的种子中获得含有至少一种生育酚和选自谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的植物甾烷醇化合物的油，并将该油与食用增溶剂和有效量的分散剂混合。也提供按照这些方法制造的食用添加剂，以及含有这些食品添加剂的组合物，如食用组合物。

另一方面，本发明提供新的固醇—菜子甾烷醇，以及新的菜子甾烷醇酯。

另一方面，本发明提供新的固醇—豆甾烷醇，以及新的豆甾烷醇酯。

再另一方面，本发明提供一种分离的DNA分子，其含有选自下列的核苷酸序列：

(a)分别SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4，或这些核苷酸序列的互补序列；

(b)在相当于0.5×SSC-2×SSC，0.1％SDS，55-65℃的洗涤严格性下，可与(a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其编码一种具有分别基本类似于拟南芥(Arabidopsis thaliana)或玉蜀黍(Zea mays)的类固醇5α-还原酶活性的多肽；

(c)编码与(a)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列；或

(d)编码与(b)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供一种分离的DNA分子，其编码类固醇5α-还原酶或其片段，包含选自下列的核酸序列：

(a)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列，或这些核苷酸序列的互补序列；

(b)在相当于0.5×SSC-2×SSC，0.1％SDS，55-65℃的洗涤严格性下，可与(a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其编码一种具有基本类似于大豆(Glycine max)类固醇5α-还原酶的类固醇5α-还原酶活性的多肽；

(c)编码与(a)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列；和

(d)编码与(b)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列。

再一方面，本发明提供一种重组构建体，其包含种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，上述编码具有类固醇5α-还原酶活性的多肽的分离DNA分子，或其片段，和转录终止信号序列，作为以5’至3’方向有效连接的成分。

另一方面，本发明提供一种分离的DNA分子，其编码垅牛儿基垅牛儿焦磷酸氢化酶或其片段，包含选自下列的核酸序列：

(a)SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列，或其互补序列；

(b)在相当于0.5×SSC-2×SSC，0.1％SDS，55-65℃的洗涤严格性下，可与(a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其编码一种具有基本类似于玉米垅牛儿基垅牛儿焦磷酸氢化酶的酶活性的多肽；

(c)编码与(a)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列；和

(d)编码与(b)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列。

再一方面，本发明提供一种重组构建体，其包含种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，上述编码具有垅牛儿基垅牛儿焦磷酸氢化酶活性的多肽的分离DNA分子，或其片段，和转录终止信号序列，作为以5’至3’方向有效连接的成分。

另一方面，本发明提供含有该重组构建体的重组载体，其包含编码具有类固醇5α-还原酶或垅牛儿基垅牛儿焦磷酸氢化酶活性的多肽或其片段的分离DNA分子。

另一方面，本发明提供包含上述任一种重组构建体或载体的转化的宿主细胞，其包含编码具有类固醇5α-还原酶或垅牛儿基垅牛儿焦磷酸氢化酶活性的多肽或其片段的分离DNA分子。

另一方面，本发明提供一种生产类固醇5α-还原酶的方法，包括在可生产该类固醇5α-还原酶或其酶活性片段的时间内和条件下培养上述任何转化宿主细胞，并回收产生的类固醇5α-还原酶或其酶活性片段。

通过以下的详细描述和附图，本发明适用性的范围将成为显然的。然而，应当理解，以下的详述和实施例，尽管表示本发明的优选实施方案，但以实例说明的形式给出，这仅仅是因为通过详细叙述，本领域技术人员将明白本发明精神和范围内的多种变化和修改。

                         附图简述

通过以下的详述，结合附图，本发明的上述及其他目的、特征和优点将更易理解，所有附图都只是以举例说明的方式给出，并非限制本发明，其中：

图1-11是分别显示质粒pMON30423、pMON29141、pMON43007、pCGN5139、pMON43011、pMON29920、pMON43800、pMON23616、pMON43818、pMON43039和pMON43008的结构的图谱。

这些质粒的描述和质粒图谱中使用的缩写的解释如下：

图1：pMON30423

美国专利5,518,908中公开的携带链霉菌A19249 3-羟基类固醇氧化酶基因(“胆固醇氧化酶基因”)的重组穿梭载体，由增强的35S启动子驱动。Ori-M13：M13噬菌体复制起点；P-e35S：来自花椰菜花叶病毒的增强的35S RNA启动子；HSP70内含子：来自热休克蛋白70的内含子；P-MaizeSSu：玉米RUBISCO小亚基叶绿体靶肽；chox：来自吸湿链霉菌(Streptomyces hygroscopicns)A19249的胆固醇氧酶基因；NOS 3’：胭脂氨酸合酶编码区的3’终止末端；ori-pUC：大肠杆菌中的质粒复制起点；AMP：β-内酰胺酶蛋白的启动子和编码序列，提供氨苄青霉素、青霉素和羧苄青霉素抗性。

图2：pMON29141

携带集胞蓝细菌属(Synechocystischlp)基因的重组穿梭载体，由napinB启动子驱动。Ori-M13：M13噬菌体复制起点；p-napB：油菜(Brassica campestris)napin B基因的启动区；PEA SSU CTP，SOY SSU：与成熟大豆小亚基N端融合的豌豆RUBISCO小亚基叶绿体转运肽；chlp：集胞蓝细菌属PCC6803种chlp基因(X97972)；NOS 3’：胭脂氨酸合酶编码区的3’终止末端；ori-pUC：大肠杆菌中的质粒复制起点；AMP：β-内酰胺酶蛋白的启动子和编码序列，提供氨苄青霉素、青霉素和羧苄青霉素抗性。

图3：pMON43007

携带吸湿链霉菌A19249胆固醇氧化酶基因的重组穿梭载体，由napinB启动子驱动。Ori-M13：M13噬菌体复制起点；p-napB：油菜napin B基因的启动区；PEA SSU CTP，SOY SSU：与成熟大豆小亚基N端融合的豌豆RUBISCO小亚基叶绿体转运肽；chox：来自吸湿链霉菌A19249的胆固醇氧化酶基因；NOS 3’：胭脂氨酸合酶编码区的3’终止末端；ori-pUC：大肠杆菌中的质粒复制起点；AMP：β-内酰胺酶蛋白的启动子和编码序列，提供氨苄青霉素、青霉素和羧苄青霉素抗性。

图4：pCGN5139

用于农杆菌介导芸苔转化的二元载体，含有来自原核转座子Tn5的卡那霉素抗性基因，由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子驱动。Tn5：转座子Tn5；35S：来自花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子；Tn5 kan：来自转座子Tn5的卡那霉素抗性基因；Tml 3’：T-DNA基因座“肿瘤形态学大”的3’终止末端；LB片段：农杆菌T-DNA左边界序列；oripRi：农杆菌复制起点。

图5：pMON43011

用于农杆菌介导芸苔转化的重组二元载体，含有吸湿链霉菌A19249胆固醇氧化酶基因盒。胆固醇氧化酶基因由napin B启动子驱动，蛋白质用SSU CTP，SOY SSU导向叶绿体。p-napB：油菜napinB基因的启动区；PEA SSU CTP，SOY SSU：与成熟大豆小亚基N端融合的豌豆RUBISCO小亚基叶绿体转运肽；chox：来自吸湿链霉菌A19249的胆固醇氧化酶基因；NOS 3’：胭脂氨酸合酶编码区的3’终止末端；LB缺刻位点：在植物中切割农杆菌左边界序列的位点，用于向植物基因组中插入T-DNA；其余的缩写同pCGN5139(图4)。

图6：pMON29920

P-7S/E9 3’盒和KAN基因，侧翼为二元转化载体中的两个边界，其中P-7S是大豆α’β伴大豆球蛋白(conglycinin)蛋白的启动子，E93’是豌豆rbc E9基因的3’末端，KAN是提供卡那霉素抗性的NPTII的编码序列。NPTII基因由花椰菜花叶病毒的35S启动子驱动。Spc.Str是提供壮观霉素和链霉素抗性的Tn7腺苷酰转移酶的编码区；ori-V：植物复制起点；rop：引物阻遏物的编码区；ori-322：功能复制起点所需的最小已知序列；NOS 3’：胭脂氨酸合酶编码区的3’终止末端。

图7：pMON43800

用于农杆菌介导的转化的重组二元载体，携带橡胶HMGR1基因盒。HMGR1基因由大豆7Sα’β伴大豆球蛋白启动子驱动。P-7S：7S启动子；橡胶HMGR1基因：来自三叶胶(Hevea brasiliensis)的3-羟基-3-甲基戊二酰还原酶的编码序列；E9 3’：豌豆rbcS E9基因的3’末端；P-35S：花椰菜花叶病毒35S启动子；KAN：提供卡那霉素抗性的NPTII基因的编码区；NOS 3’：胭脂氨酸合酶编码区的3’终止末端；左边界：来自章鱼氨酸Ti质粒pTiA6的octapine左边界；ori-V：植物复制起点；rop：引物阻遏物的编码区；Spc/Str：提供壮观霉素和链霉素抗性的Tn7腺苷酰转移酶的编码区。

图8：pMON23616

含有P-NOS/ORF-7/KAN/NOS 3’的植物表达质粒。P-NOS：来自根瘤农杆菌pTiT37的NOS启动子；ORF-7：减弱植物中KAN表达的短开放阅读框；KAN：提供卡那霉素和新霉素抗性的NPTII基因的编码序列；ble：提供博来霉素抗性；NOS 3’：胭脂氨酸合酶编码区的3’终止末端；左边界：来自章鱼氨酸Ti质粒pTiA6的章鱼氨酸左边界；ori-V：植物复制起点；rop：引物阻遏物的编码区；Spc/Str：提供壮观霉素和链霉素抗性的Tn7腺苷酰转移酶的编码区。

图9：pMON43818

用于农杆菌介导的转化的重组二元载体，携带橡胶HMGR1基因盒。HMGR1基因由大豆7Sα’β伴大豆球蛋白启动子驱动。P-7S：7S启动子；橡胶HMGR1基因：来自三叶胶的3-羟基-3-甲基戊二酰还原酶的编码序列；E9 3’：豌豆rbcS E9基因的3’末端；P-NOS：来自根瘤农杆菌pTiT37的NOS启动子；KAN：提供卡那霉素抗性的NPTII基因的编码区；NOS 3’：胭脂氨酸合酶编码区的3’终止末端；左边界：来自章鱼氨酸Ti质粒pTiA6的章鱼氨酸左边界；ori-V：植物复制起点；rop：引物阻遏物的编码区；Spc/Str：提供壮观霉素和链霉素抗性的Tn7腺苷酰转移酶的编码区。

图10：pMON43039

用于农杆菌介导的转化的重组二元载体，携带橡胶HMGR1和拟南芥SMT2基因盒。HMGR1和SMT2基因由大豆7Sα’β伴大豆球蛋白启动子驱动。拟南芥SMT2：编码拟南芥C-24固醇甲基转移酶2酶的cDNA；P-7S：7S启动子；橡胶HMGR1基因：来自三叶胶的3-羟基-3-甲基戊二酰还原酶的编码序列；E9 3’：豌豆rbcS E9基因的3’末端；P-NOS：来自根瘤农杆菌pTiT37的NOS启动子；KAN：提供卡那霉素抗性的NPTII基因的编码区；NOS 3’：胭脂氨酸合酶编码区的3’终止末端；左边界：来自章鱼氨酸Ti质粒pTiA6的章鱼氨酸左边界；ori-V：植物复制起点；rop：引物阻遏物的编码区；Spc/Str：提供壮观霉素和链霉素抗性的Tn7腺苷酰转移酶的编码区。

图11：pMON43008

用于农杆菌介导的转化的重组二元载体，携带吸湿链霉菌A19249胆固醇氧化酶基因盒。胆固醇氧化酶基因由大豆7Sα’β伴大豆球蛋白启动子驱动。P-7S：7S启动子；chox：来自吸湿链霉菌A19249的胆固醇氧化酶基因；E9 3’：豌豆rbcS E9基因的3’末端；P-35S：来自花椰菜花叶病毒的35S启动子；KAN：提供卡那霉素抗性的NPTII基因的编码区；NOS 3’：胭脂氨酸合酶编码区的3’终止末端；左边界：来自章鱼氨酸Ti质粒pTiA6的octapine左边界；ori-V：植物复制起点；rop：引物阻遏物的编码区；Spc/Str：提供壮观霉素和链霉素抗性的Tn7腺苷酰转移酶的编码区。

基因分离、分子克隆、载体构建等的常规方法在本领域公知，总结于例如：Sambrook等人(1989)《分子克隆：实验室手册》，第二版，冷泉港实验室出版社，和Ausubel等人(1989)《现代分子生物学方法》，John Wiley & Sons，Inc.。本领域技术人员能容易地繁殖上述质粒载体，或类似质粒，而不需使用这些方法和附图提供的克隆信息的不恰当实验。为此目的必需的不同DNA序列、片段、接头等可作为商品质粒的组分获得，或者在本领域中周知，并可公开获得。

图12显示如实施例10所述生产的转基因芸苔(Brassica napus)(油菜籽；芸苔)的种子的植物甾醇和植物甾烷醇组成，这些植物表达美国专利5,518,908所公开的链霉菌A19249 3-羟基类固醇氧化酶基因，包括新的植物甾烷醇——菜子甾烷醇的存在。1是非转基因对照；2-27是独立转基因事件(植物)，其中分析每株植物10个R1种子的固醇组成。Sitosta：谷甾烷醇；Sito：谷甾醇；Campesta：菜油甾烷醇；Campe：菜油甾醇；Brassicast：菜子甾烷醇；Brassica：菜子甾醇。

                         发明详述

为帮助本领域技术人员实施本发明，提供以下详细描述。虽然如此，此详细描述不应被视为过度限制本发明，因为本领域技术人员能在不背离本发明发现的精神和范围的情况下进行此处所述实施方案的修改和变化。

此处引用的每一参考文献的内容在此完全引用作为参考。

在此使用时，术语“结构编码序列”是指编码肽、多肽或蛋白质的DNA序列，它们可由细胞在将DNA转录为mRNA后产生，随后翻译为希望的肽、多肽或蛋白质。

术语“固醇”用于植物时是指任何手性四环类异戊烯，它可由氧化角鲨烯环化形成，通过具有类似于反-顺-反-对-反-对构型即原类固醇阳离子的立体化学的过渡态，它在C-3保留一个极性基团(羟基或酮基)，环系统中的一个别-反-对立体化学，和一个侧链20R构型(Parker等人(1992)于：Nes等人编《类异戊烯代谢的调节》ACS会议系列号497，110页；美国化学学会，Washington，D.C.)。典型固醇(胆固醇)的碳原子的编号在以下的结构中显示：

胆固醇

固醇可含有或可以不含C-5-C-6双键，这是在生物合成途径后期引入的一个特征(注意以下的方案1)。如上所述，固醇在C-17位含有C₈-C₁₀侧链。

术语“植物甾醇”在应用于只在植物中发现的固醇时，是指一种含有C-5，有时含有C-22双键的固醇。植物甾醇的特征在于带有C-24位的甲基或乙基取代基的C-17侧链烷基化。主要的植物甾醇包括但不限于：谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜子甾醇等。缺乏C-24甲基或乙基侧链的胆固醇在植物中发现，但不是唯一的，因此不是“植物甾醇”。

“植物甾烷醇”是植物甾醇的饱和形式，其中C-5和C-22双键(存在时)被还原，包括但不限于：谷甾烷醇、菜油甾烷醇和22-二氢菜子甾烷醇。

“植物甾醇酯”和“植物甾烷醇酯”的特征在于C-3位上存在脂肪酸或酚酸部分而不是羟基。

术语“固醇化合物”包括固醇、植物甾醇、植物甾醇酯、植物甾烷醇和植物甾烷醇酯。

术语“植物甾醇化合物”是指至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，或其混合物。

术语“植物甾烷醇化合物”是指至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物。

上述定义在文献中经常见到，本领域技术人员理解生物合成前体和中间物可具有与其相关的其他独特的结构特征。

术语“组成型启动子”是指在细胞中连续作用并且不进行定量调节的启动子。与这种启动子有关的基因总是“开启的”。

术语“种子特异的”、“果实特异的”、“质体特异的”等，当用于启动子时，是指这些启动子分别在这些器官或细胞器中的优先的或唯一的活性。“优先表达”是指在特定器官或细胞器中比在植物中其他部分大大提高的启动子活性。“大大提高”可理解为只在特定器官或细胞器中发生的，或在其他组织、器官或细胞器中发生，但在特定器官或细胞器中明显提高的表达。“种子特异的”可理解为在种子的糊粉层、胚乳和/或胚芽中的表达。

为了生产谷甾烷醇生物合成增强的种子，用3-羟基类固醇氧化酶基因转化植物是足够的。引入类固醇5α-还原酶基因能进一步提高谷甾烷醇和谷甾烷醇酯的水平。谷甾烷醇和生育酚生物合成都增强的转基因植物可通过用3-羟基类固醇氧化酶基因和任选的类固醇5α-还原酶基因以及至少一种生育酚生物合成基因转化植物产生。其他酶编码DNA也能被引入植物中，以进一步提高希望的植物甾烷醇、植物甾烷醇酯和生育酚的水平。

因此，预期用于本发明的DNA序列，如下所述它们能单独或以不同组合使用，包括但不限于编码下列酶的DNA序列：3-羟基类固醇氧化酶；类固醇5α-还原酶；3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(HMGCo-A还原酶)；固醇甲基转移酶；固醇酰基转移酶；和S-腺苷甲硫氨酸依赖的γ-生育酚甲基转移酶。在所有情况中，编码这些酶的序列可含有一种表达盒，其包含以5’至3’方向有效连接的一个种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，酶编码序列，和在植物细胞中起作用的转录终止信号序列，使得酶能成功表达。当启动子是种子特异的启动子时，表达盒或重组构建体可进一步含有一种有效连接的能引导酶向质体中转运的转运肽编码区。当启动子是在植物质体中起作用的启动子时，表达盒或重组构建体可进一步含有一种编码选择性标记的基因，用于选择含有表达该标记的质体的植物细胞，和与质体基因组同源的DNA区，其中该同源区侧翼于启动子、酶编码序列、转录终止信号序列和编码该选择性标记的基因。另外，重组构建体或表达盒可进一步含有一个与质体启动子连接的核糖体结合位点。核糖体结合位点能从来自质体、细菌的前导序列或噬菌体前导序列获得，例如基因10前导区的结合位点或rbcLRBS位点。

为在此处公开的方法中使用，重组构建体或表达盒能被导入一种载体如植物表达载体中。这些载体能转化宿主细胞，如细菌细胞——例如在制备或修饰重组构建体中，和植物细胞。因此，本发明包括含有这些转化植物细胞的植物和种子。

为了获得产生含水平提高的植物甾烷醇和植物甾烷醇酯(如谷甾烷醇和谷甾烷醇酯)和生育酚(如α-生育酚)的油的种子，可通过本领域周知的多种常规方法将这些重组构建体或表达盒导入植物细胞中，并再生为能育的转基因植物。这些植物的基因组因而单独或组合地含有编码不同酶的导入DNA，达到希望的提高其种子的油中植物甾烷醇、植物甾烷醇酯，其混合物和生育酚水平的作用。优选地，基因组能含有编码选自下列的酶的导入DNA：

1.3-羟基类固醇氧化酶；

2.类固醇5α-还原酶；

3.3-羟基类固醇氧化酶和类固醇5α-还原酶；

4.3-羟基类固醇氧化酶和生育酚生物合成酶；

5.类固醇5α-还原酶和生育酚生物合成酶；

6.3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶和生育酚生物合成酶；

7.3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶；

8.3-羟基类固醇氧化酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶；

9.类固醇5α-还原酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶；

10.3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶；

11.3-羟基类固醇氧化酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和固醇甲基转移酶；

12.类固醇5α-还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和固醇甲基转移酶；

13.3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和固醇甲基转移酶。

通过进一步向这些植物的基因组中导入编码一种固醇酰基转移酶的DNA，植物甾醇和/或植物甾烷醇酯的水平能得到提高。进一步向这些植物的基因组中导入编码S-腺苷甲硫氨酸依赖的γ-生育酚甲基转移酶的DNA，将提高其种子的油中α-生育酚的水平。

在所有情况中，上述导入的DNA能与引起种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接。当调节信号引起种子特异的表达时，每种导入的DNA能与可引导其编码的酶向质体中转运的转运肽编码区有效连接。

本发明不仅包括这些转基因植物，而且包括转化的植物细胞，包括这些植物的细胞和种子，以及这些植物的后代，例如由种子产生的后代。

此处所述的转化的植物细胞和转基因植物的细胞能在可产生含有水平提高的植物甾醇和/或植物甾烷醇、其相应的酯和生育酚的时间内和适当条件下培养生长。此外，植物甾醇、植物甾烷醇、其相应的酯和/或生育酚能直接从培养物中分离。

另外，当然，在使用本领域周知的提取和加工方法获得含有植物甾醇、植物甾醇酯、植物甾烷醇、植物甾烷醇酯或其混合物的油的方法中，也能使用从此处公开的转基因、后代、杂种等植物获得的种子。在这方面，参见，Kochhar(1983)脂类研究进展(Prog.Lipid Res.)22：161-188。

本发明也包括一种生产植物的方法，与不含编码可影响固醇、植物甾醇、植物甾醇酯、植物甾烷醇、植物甾烷醇酯或其组合生物合成的多肽或蛋白质的导入DNA的相应植物相比，该植物的种子中积累水平提高的谷甾醇、至少一种谷甾醇酯、谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其组合，该方法包括使本发明的转基因植物与所述相应植物有性杂交。后者可以是非转基因植物，或含有编码不影响固醇、植物甾醇等生物合成的性状的导入DNA的转基因植物。例如，这种性状可以是昆虫或除草剂抗性。用该方法产生的植物也构成本发明的部分。

也包括如下植物，与不含编码可影响固醇、植物甾醇、植物甾醇酯、植物甾烷醇、植物甾烷醇酯或其组合生物合成的多肽或蛋白质的导入DNA的相应植物相比，该植物的种子中积累水平提高的谷甾醇、至少一种谷甾醇酯、谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其组合，该植物是无性生殖的。无性生殖是一种遗传控制的植物繁殖方法，其中形成胚芽不需要卵和精子的结合。有三种基本类型的无性生殖：1)无孢子生殖，其中由来自珠心的胚囊中的染色体未减少的卵发育为胚芽，2)倍数孢子形成，其中由来自大孢子母细胞的胚囊中未减少的卵发育为胚芽，和3)不定胚生殖，其中由体细胞直接发育为胚芽。在大多数无性生殖形式中，极核产生胚乳的psuedogamy或受精对于种子生存力是必要的。对于无孢子生殖，“保育”栽培品种能用作种子中胚乳形成的花粉源。保育栽培品种不影响无孢子生殖的无性生殖栽培品种的遗传学，因为培养品种的未减少的卵单性生殖地发育，但能产生胚乳。无性生殖在经济上是重要的，特别是在转基因植物中，因为它引起任何基因型，而与对于纯育如何杂合无关。因此，通过无性生殖，杂合转基因植物能在重复的生命周期中保留其遗传保真度。生产无性生殖植物的方法在本领域中公知。参见，美国专利号5,811,636和此处引用的参考文献，它们在此引用作为参考。

本发明也包括此处所述的任何植物的一致性群体。

除了种子之外，也能在此处包括的植物的其他部分中发现水平升高的固醇、植物甾醇如谷甾醇、植物甾烷醇如谷甾烷醇、其酯，和生育酚，如α-生育酚。尽管本发明预期的种子特异启动子优先在种子组织中起作用，但根据特定启动子的特异性，也可预期在其他植物部分中的表达。此外，也能预期在植物质体中起作用的启动子，来驱动此处公开的重组构建体或表达盒在除种子之外的组织和器官中存在的质体中表达。例如，能在果实以及除种子之外的植物部分中预期水平提高的固醇、植物甾醇等。植物的植物部分包括，例如：花粉、花序、顶芽、侧芽、茎、叶、块茎和根。因此，本发明也包括此处公开的植物的这些和其他部分，其含有水平提高的希望的植物甾醇、植物甾烷醇等和生育酚化合物。

当然，向植物中导入此处公开的编码序列的一个重要作用是对于种子油的植物甾醇/植物甾烷醇及其酯的含量。因此，本发明的其他方面包括可从在此所述的植物种子获得的油，和生产这些植物和油的方法。提取和加工种子油的方法在本领域中周知。

由此处公开的细胞、植物和方法产生的油在植物甾醇/植物甾烷醇组成方面优于普通油。本发明的油可含有水平提高的至少一种固醇、至少一种植物甾醇、至少一种植物甾醇酯、至少一种植物甾烷醇、至少一种植物甾烷醇酯或其混合物。优选的化合物包括谷甾醇、谷甾烷醇及其酯。出人意料的是，也发现本发明的油含有新化合物—菜子甾烷醇。在本发明之前，不知道生产这种植物甾烷醇的方法。合适的基因工程植物的油，即用一种或多种编码生育酚生物合成酶的DNA转化的植物的油，也含有水平提高的至少一种生育酚化合物，如α-生育酚。

本发明的油含有谷甾烷醇，至少一种谷甾烷醇酯，或其混合物，其量为油中总固醇化合物重量的至少约57％，优选地为总固醇化合物重量的约57％-90％，更优选地为总固醇化合物重量的约57％-65％。以种子的百分干重表示，本发明的油含有谷甾烷醇，至少一种谷甾烷醇酯，或其混合物，其量为种子干重的至少约0.08％，优选地为种子干重的约0.08％-0.8％，更优选地为种子干重的约0.08％-0.4％。这些油可进一步含有一种生育酚化合物，如α-生育酚，其量为种子干重的至少约0.02％，优选地为种子干重的约0.02％-0.2％，更优选地为种子干重的约0.02％-0.025％。本发明的油可进一步含有新植物甾烷醇—菜子甾烷醇，或至少一种菜子甾烷醇酯。

含有并表达编码固醇甲基转移酶的导入DNA的植物种子所产生的油有利地含有水平降低的菜油甾醇，至少一种菜油甾醇酯，菜油甾烷醇，至少一种菜油甾烷醇酯，或其混合物。固醇甲基转移酶编码DNA可单独导入，或与编码可影响此处所述固醇化合物生物合成的酶的其他导入DNA一起导入。菜油甾醇/菜油甾烷醇及其酯被认为是不希望的，因为它们容易被肠吸收，而其在血液中的安全性还不知。使用此处公开的植物和方法，能获得含有油总固醇化合物重量约0％-19％、优选地约0％-12％、更优选地约5％-9％的菜油甾醇、至少一种菜油甾醇酯、菜油甾烷醇、至少一种菜油甾烷醇酯或其混合物的种子油。(这些化合物的水平难以用百分干重表示，因为不同的种子含有以此表示的不同百分数的这些化合物)这些值代表这些化合物的量与普通油相比降低约10％-100％。

向植物细胞中导入上述酶编码DNA序列改变了用这些方法在此处公开的细胞、植物和种子中施行的固醇化合物的生物合成。特别是，固醇酰基转移酶与这些DNA序列在表达预期将引起油中植物甾醇酯和植物甾烷醇酯分布的改变，因为在主链中含有2-22个碳原子的脂肪酸可以是提高的固醇酰基转移酶活性的底物。这样产生的新植物甾烷醇酯组合物，如谷甾烷醇酯组合物，构成本发明的另一方面。

如在“相关技术叙述”中所述，植物甾烷醇如谷甾烷醇有利于降低血清胆固醇(Ling等人(1995)生命科学57：195-206)并预防心脏病。生育酚作为抗氧化剂，并在保护细胞免受自由基损害中起主要作用(Halliwell(1997)营养综述55：44-60)。由于普通植物油和糠油中谷甾烷醇的量较其他固醇化合物为低，本发明的油特别可用于降低血浆中低密度脂蛋白胆固醇浓度。此外，本发明的油，除植物甾烷醇和植物甾烷醇酯外含有水平提高的生育酚如α-生育酚，提供在改善人体营养和心血管健康中具有优良生物可用性和效能的生物活性化合物组合的单一方便来源。

因此，本发明的其他方面包括下列：

降胆固醇组合物含有此处公开的油和谷甾烷醇酯组合物。这些降胆固醇组合物可采用含有油和/或脂肪的食物、食物产品、加工食品、食品成分、食品添加剂或饮食添加物的形式，或在其中使用。非限定性实例包括：人造黄油、黄油、酥油、烹饪油、煎油、调味品如色拉调味料、涂抹食品、蛋黄酱和维生素/矿物质添加物。与这些组合物有关的专利文献包括：美国专利4,588,717和5,244,887，和PCT国际公开号WO 96/38047，WO 97/42830，WO 98/06405和WO 98/06714。其他非限定性实例包括饭后点心、乳制品如干酪和加工的干酪、加工的肉类、pastas、酱油、谷类食物、甜点包括冷冻的和贮存稳定的甜点、浸汤、薄片、焙烤食品、油酥面糕点、小甜饼、快餐条、蜜饯、巧克力、饮料、未提取的种子，和已被研磨、破碎、碾磨、滚轧、挤压、压丸、脱脂、脱水或经其他加工，但仍含有此处公开的油等的未提取的种子。

本发明的食品添加剂可用一种方法制造，该方法包括从本发明的培养细胞或植物种子中获得含有选自谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的植物甾烷醇或植物甾烷醇酯的油，并以细碎形式将油或希望的植物甾烷醇化合物均匀分布于食物产品或食品添加剂中，通过在乳剂中溶解或悬浮而加入其中。例如，油或植物甾烷醇化合物能溶解于食用增溶剂中，或能与食用增溶剂、有效量的分散剂和任选地有效量的抗氧化剂混合。有用的食用增溶剂的例子包括但不限于：单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、植物油、生育酚、醇、多元醇或其混合物。有用的抗氧化剂的例子包括但不限于：生育酚，如α-生育酚、抗坏血酸、便宜合成的抗氧化剂和其混合物。制备乳剂或悬液的有效载体包括水、醇、多元醇、油或植物甾烷醇化合物在其中可溶或不溶的其他食用化合物，和其混合物。有用的分散剂的例子包括但不限于：卵磷脂、其他磷脂、月桂烷硫酸钠、脂肪酸、脂肪酸盐、脂肪酸酯、其他去污剂样分子及其混合物。此外，食用添加剂能用下列方法制造，包括从本发明的培养细胞或植物种子中获得含有至少一种生育酚和选自谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的植物甾烷醇或植物甾烷醇酯的油，并将该油与食用增溶剂和有效量的分散剂混合。另外，食用增溶剂也可包括但不限于：单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、植物油、生育酚、醇、多元醇或其混合物，而分散剂包括但不限于：卵磷脂、其他磷脂、月桂烷硫酸钠、脂肪酸、脂肪酸盐、脂肪酸酯、其他去污剂样分子及其混合物。

降胆固醇组合物也可采取药物组合物的形式，包含降胆固醇有效量的油或此处公开的谷甾烷醇酯组合物，以及一种药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。这些药用组合物可以是液体或固体形式。液体可以是溶液或悬液；固体可以是粉末、颗粒、丸剂、片剂、胶体或挤出物形式。美国专利5,270,041涉及含固醇的药用组合物。

上述任一种降胆固醇组合物都能单独使用或与方法结合使用，以降低低密度脂蛋白胆固醇血浆浓度升高的危险，降低低密度脂蛋白胆固醇血浆浓度，或治疗或预防低密度脂蛋白胆固醇血浆浓度升高。这些方法包括使人或动物患者口服有效量的降胆固醇组合物。有效量的降胆固醇组合物的组成可由经验确定，并且部分取决于多种因素，包括年龄、体重、性别、饮食、患者的总体病情和高胆固醇血症的严重程度。可通过常规测定血清胆固醇水平监测用此处公开的降胆固醇组合物治疗的患者，以确定治疗的效果。连续分析这样获得的数据可在治疗中改变治疗方案，以便能施用最佳有效量的本发明的降胆固醇组合物，并且也能确定治疗的持续时间。这样，能在治疗过程中合理改变治疗方案/剂量日程，以达到该组合物导致满意的抗胆固醇血症效果的最低降胆固醇有效量，并且只要是成功治疗该病症所需，即连续施用这些组合物。通常，作为含植物甾烷醇或植物甾烷醇酯组合物形式的本发明的降胆固醇组合物的有效量是约0.1gm/天-4.5gm/天。例如，植物甾烷醇酯组合物，如谷甾烷醇酯组合物，能以约0.1gm/天-4.5gm/天、优选地约1gm/天-4.5gm/天、更优选地约2gm/天-4.5gm/天的量施用。植物甾烷醇组合物，如谷甾烷醇酯组合物，能以约0.1gm/天-3gm/天、优选地约1gm/天-3gm/天、更优选地约2gm/天-3gm/天的量施用。

可按照多种不同方案每日对患者施用本发明的降胆固醇组合物。基本地，这些组合物应当以降胆固醇有效的量施用，持续能有效发挥其抗高胆固醇血症预防、减少或反作用的一段时间。应继续该降胆固醇组合物的施用，直到高胆固醇血病情得到控制或排除。

本发明涉及的另一种方法是实现或改善宿主有效吸收谷甾烷醇的方法，包括通过此处公开的方法生产至少一种谷甾烷醇酯，并对宿主施用该谷甾烷醇酯，宿主可以是人或动物。谷甾烷醇酯可通过选自口服途径、肠胃外途径或局部途径的途径施用。可每日施用的剂量能高达每千克体重约10毫克谷甾烷醇酯。美国专利5,202,045涉及甾烷醇脂肪酸酯降低血清胆固醇的用途。

本发明再另一方面是意外地发现了新化合物菜子甾烷醇，它在用此处公开的方法获得的油中具有以下所示的结构。

菜子甾烷醇

本发明也包括菜子甾烷醇的酯，其中菜子甾烷醇上C-3羟基的氢被替换为主链中含有2-22个碳原子的直链或支链脂肪酸。

本发明另一方面是意外地发现了新化合物豆甾烷醇，它在用此处公开的方法获得的油中具有以下所示的结构。

豆甾烷醇

本发明也包括豆甾烷醇的酯，其中豆甾烷醇C-3羟基的氢被替换为主链中含有2-22个碳原子的直链或支链脂肪酸。

为了促进此处所述的固醇生物合成和积累的改变，本发明也提供一种分离的DNA分子，其具有选自下列的核苷酸序列：

(a)分别SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4，或这些核苷酸序列的互补序列；

(b)在相当于0.5×SSC-2×SSC，0.1％SDS，55-65℃的洗涤严格性下，可与(a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其编码一种具有分别基本类似于拟南芥或玉蜀黍的类固醇5α-还原酶活性的多肽；

(c)编码与(a)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列；或

(d)编码与(b)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列。

本发明也提供一种分离的DNA分子，其编码类固醇5α-还原酶或其片段，具有选自下列的核酸序列：

(a)分别SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8，或这些核苷酸序列的互补序列；

(b)在相当于0.5×SSC-2×SSC，0.1％SDS，55-65℃的洗涤严格性下，可与(a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其编码一种具有基本类似于大豆类固醇5α-还原酶的类固醇5α-还原酶活性的多肽；

(c)编码与(a)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列；和

(d)编码与(b)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列。

这些编码类固醇5α-还原酶或其片段的分离的DNA分子能掺入重组构建体中，该构建体含有以5’至3’方向有效连接的成分：一个种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，分离的DNA分子，和一个转录终止信号序列。当启动子是种子特异的启动子时，该重组构建体可进一步含有一种能引导类固醇5α-还原酶或其片段向质体中转运的转运肽编码区，与分离的DNA分子有效连接。当启动子是在植物质体中起作用的启动子时，该重组构建体可进一步含有一种编码选择性标记的基因，用于筛选含有表达该标记的质体的植物细胞，和与质体基因组同源的DNA区，其中该同源区侧翼于在植物质体中起作用的启动子、DNA序列、转录终止信号序列和编码选择性标记的基因。另外，当启动子是在植物质体中起作用的启动子时，该重组构建体可进一步含有一个与质体启动子连接的核糖体结合位点。核糖体结合位点能从选自质体、细菌的前导序列或噬菌体前导序列位点的前导序列中获得，例如基因10前导区的结合位点或rbcLRBS位点。

上述任一种重组构建体都能掺入含有这些重组构建体的重组载体中，这些重组构建体包含编码具有类固醇5α-还原酶活性的多肽的分离DNA分子。这些载体可以是细菌或植物表达载体。

另一方面，本发明包括包含上述任一种重组构建体或载体的转化的宿主细胞，其中含有编码具有类固醇5α-还原酶活性的多肽的分离的DNA分子。宿主细胞可以是细菌细胞或植物细胞。类固醇5α-还原酶或其具有类固醇5α-还原酶活性的片段的生产方法包括：在可生产类固醇5α-还原酶或其酶活性片段的时间内和条件下，培养这些转化的细菌或植物宿主细胞的任一种，并回收产生的具有类固醇5α-还原酶活性的肽、多肽或蛋白质。

为了帮助读者理解本发明，下面列出了固醇化合物和生育酚生物合成途径的描述。这些描述确定了在改变此处所述的固醇化合物和生育酚生物合成和积累中有用的酶，并确定了编码这些酶的核酸序列的来源。

植物中的固醇化合物生物合成途径

下面的方案1中列出了植物中固醇化合物生物合成途径的不同步骤。箭头上的数字是指如表1所示的植物固醇化合物生物合成途径酶和基因。

 方案1植物中固醇化合物生物合成途径的步骤

                     表1

               植物固醇化合物途径酶和基因

             酶           途径中的步骤     GenBank基因号乙酰乙酰基-CoA硫解酶                 1           X78116HMG-CoA合酶                          2           X83882HMG-CoA还原酶                        3           X15032

                                             L19262甲羟戊酸激酶                         4           X77793磷酸甲羟戊酸激酶                     5           不可得甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶                 6           Y14325异戊烯二磷酸异构酶                   7           U49259

                                             U47324法呢基焦磷酸合酶                     8           X75789角鲨烯合酶                           9           AF004560角鲨烯环氧酶                         10          不可得角鲨烯环化酶                         11          U87266固醇C-24甲基转移酶                   12，18      U71400固醇C-4脱甲基酶                      13，19      不可得Cycloeucalenol-obtusifoliol异构酶    14          不可得固醇C-14脱甲基酶                     15          U74319固醇C-14还原酶                       16          PCT WO

                                             97/48793固醇C-8异构酶                        17          AF030357固醇C-5去饱和酶                      20          X90454固醇C-7还原酶                        21          U49398固醇C-24异构酶                       22          Klahel等人(1998)植

                                             物细胞，10：1677-1690固醇C-24还原酶                       23          同22固醇C-22去饱和酶                     24          不可得固醇C-5还原酶                        25          本发明

植物固醇化合物生物合成途径具有两个不同的部分。早期途径反应，由乙酰CoA通过甲羟戊酸产生角鲨烯，与其他类异戊二烯相同。后期途径反应，由角鲨烯产生主要植物固醇化合物如谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇，是定向生物合成反应。

已经在真菌和植物中研究了早期途径反应(Lees等人，《固醇的生物化学和功能》，Nes和Parish编，CRC出版社，85-99(1997)；Newman和Chappell，《固醇的生物化学和功能》，Nes和Parish编，CRC出版社，123-134(1997)；Bach等人，《固醇的生物化学和功能》，Nes和Parish编，CRC出版社，135-150(1997))。

乙酰乙酰基CoA硫解酶(EC 2.3.1.9)催化第一个报道的反应，包括由两分子乙酰CoA形成乙酰乙酰基CoA(Dixon等人，类固醇生物化学与分子生物学杂志(J.Steroid Biochem.Mol.Biol.)62：165-171(1997))。该酶已经从萝卜中提纯。已经在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中通过功能互补分离萝卜cDNA(GeneBank保藏号X78116)。也已经对拟南芥cDNA文库筛查了萝卜cDNA(Vollack和Bach，植物生理学111：1097-1107(1996))。

HMGCoA合酶(EC 4.1.3.5)催化HMGCoA的产生。该反应缩合乙酰CoA与乙酰乙酰基CoA产生HMGCoA。HMGCoA合酶已经从酵母中提纯。植物HMGCoA合酶cDNA已经从拟南芥中分离(Montamat等人，基因167：197-201(1995))。

HMGCoA还原酶，也称作3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(EC1.1.1.34)催化HMGCoA还原转化为甲羟戊酸(MVA)。据报道，该反应被认为在控制植物类异戊二烯生物合成中起作用(Gray，Adv.Bot.Res.14：25-91(1987)；Bach等人，脂类26：637-648(1991)；Stermer等人，脂类研究杂志(J.Lipid Res.)35：1133-1140(1994))。植物HMGCoA还原酶基因通常由多基因家族编码。含有每种多基因家族的基因数量依物种而不同，范围从拟南芥中的2个到马铃薯中的至少7个。植物HMGCoA还原酶基因在转基因烟草植物中的过量表达已经报道可导致植物甾醇的过量产生(Schaller等人，植物生理学109：761-770(1995))。

甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)催化甲羟戊酸的磷酸化，产生甲羟戊酸5-磷酸。已经报道甲羟戊酸激酶在控制类异戊二烯生物合成中起作用(Lalitha等人，印度生物化学与生物物理学杂志(Indian.J.Biochem.Biophys.)23：249-253(1986))。来自拟南芥的甲羟戊酸激酶基因已经克隆(GeneBank保藏号X77793；Riou等人，基因148：293-297(1994))。

磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)(MVAP激酶)是一种与异戊二烯和麦角甾醇生物合成有关的酶，它利用ATP将甲羟戊酸-5-磷酸转化为甲羟戊酸5-焦磷酸(Tsay等人，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)11：620-631(1991))。

甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(“MVAPP脱羧酶”)(EC 4.1.1.33)催化甲羟戊酸焦磷酸转化为异戊烯二磷酸(“IPP”)。据报道该反应是水解ATP并需要Mg²⁺的脱羧/脱水反应。编码拟南芥MVAPP脱羧酶的cDNA已经分离(Toth等人，生物化学杂志271：7895-7898(1996))。据报道分离的拟南芥MVAPP脱羧酶基因能补充酵母MVAPP脱羧酶。

异戊烯二磷酸异构酶(“IPP：DMAPP”)(EC 5.3.3.2)催化由异戊烯焦磷酸(IPP)形成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。对于该酶已经报道了植物IPP：DMAPP异构酶基因序列。曾经报道，IPP：DMAPP异构酶参与三叶胶属(Hevea)乳胶提取液中橡胶的生物合成(Tangpakdee等人，植物化学(Phytochemistry)45：261-267(1997))。

法呢基焦磷酸合酶(EC 2.5.1.1)是一种异戊烯基转移酶，据报道其在为固醇化合物生物合成以及许多其他途径提供聚类异戊二烯中起作用(Li等人，基因17：193-196(1996))。法呢基焦磷酸合酶将DMAPP与IPP结合，产生垅牛儿基焦磷酸(℃PP”)。该酶将GPP与第二分子的IPP缩合，产生法呢基焦磷酸(“FPP”)。FPP是一种能沿该途径至固醇化合物生物合成，或能通过其他途径穿梭，导致醌或倍半萜合成的分子。

角鲨烯合酶(EC 2.5.1.21)在Mg²⁺和NADPH存在下使两分子FPP缩合，形成角鲨烯。该反应包括头对头缩合，形成一种稳定的中间体，前角鲨烯二磷酸。该酶类似于HMGCoA还原酶进行固醇需求调节。已经报道角鲨烯合酶活性对用作其前体的固醇和其他化合物中掺入FPP具有调节作用(Devarenne等人，生物化学与生物物理学学报(Arch.Biochem.Biophys.)349：205-215(1998))。

角鲨烯环氧酶(EC 1.14.99..7)(也称作角鲨烯单加氧酶)催化角鲨烯转化为环氧角鲨烯(2，3-环氧角鲨烯)——固醇化合物生物合成途径中初始固醇分子环阿屯醇的前体。这是报道的该途径的第一步，其中氧是活性必需的。角鲨烯环氧酶的形成也是动物、真菌和植物固醇生物合成中最后的共同步骤。

固醇化合物生物合成步骤的后一途径由环氧角鲨烯的环化开始，结束于植物中Δ5-24烷基固醇的形成。

2，3-环氧角鲨烯环阿屯醇环化酶(EC 5.4.99.8)(也称为环阿屯醇合酶)是植物特异的固醇化合物途径的第一步。2，3-环氧角鲨烯的环化在动物和真菌中产生羊毛甾醇，在植物中的产物是环阿屯醇。环阿屯醇含有9，19-环丙基环。据报道环化由椅-船-椅-船序列中环氧末端开始，由过渡C-20碳正离子中间物介导。

S-腺苷-L-甲硫氨酸：固醇C-24甲基转移酶(“SMT1”)(EC2.1.1.41)催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基向固醇侧链C-24中心的转移(Nes等人(1991)生物化学杂志266(23)：15202-15212)。这是两个甲基转移反应的第一个，据报道是植物中产固醇化合物途径的专有和限速步骤。第二个甲基转移反应发生在该途径后期，在Δ^8-7异构酶之后。负责第二个甲基转移反应的酶被称为SMT2(Bouvier-Nave，P.等人(1997)欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)246：518-529)。一种同工型，SMTII，催化环阿屯醇转化为Δ²³⁽²⁴⁾-24-烷基固醇，cyclosadol(Guo等人(1996)Tetrahed.Lett.37(38)：6823-6826)。

固醇C-4脱甲基酶催化几个脱甲基反应的第一个，导致C-4位两个甲基的去除。在动物和真菌中，两个C-4甲基的去除连续发生，而报道在植物中在第一个和第二个C-4脱甲基之间存在其他步骤。C-4脱甲基作用由微粒体酶复合体催化，该复合体由一个单加氧酶、一个NAD^--依赖的固醇4-脱羧酶和一个NADPH^--依赖的3-酮类固醇还原酶组成。

Cycloeucalenol-obtusifoliol异构酶(“COI”)催化环丙基环在C-9位的打开。环丙环在C-9位的打开在C-8位产生一个双键。

固醇C-14脱甲基酶催化C-14位的脱甲基，这去除C-14位的甲基，并在该位置产生一个双键。在真菌和动物中，这都是固醇合成途径的第一步。固醇14-脱甲基由细胞色素P-450复合体介导。

固醇C-14还原酶催化C-14脱甲基，导致在C-14位形成一个双键(Ellis等人，通常微生物学(Gen.Microbiol.)137：2627-2630(1991))。该双键由Δ¹⁴还原酶去除。正常底物是4α-甲基-8，14，24(24¹)-三烯-3β-醇。NADPH是正常还原剂。

固醇C-8异构酶催化一种包括四元环或侧链进一步修饰的反应(Duratti等人，生物化学与药理学(Biochem.Pharmacol.)34：2765-2777(1985))。固醇异构酶催化的反应的动力学趋于产生Δ⁷基的Δ⁸→Δ⁷异构酶反应。

固醇C-5去饱和酶催化通常在Δ⁷-固醇水平发生的Δ⁵-双键的插入，从而形成Δ^5，7-固醇(Parks等人，脂类30：227-230(1995))。据报道，该反应包括分别由(+)和(-)R-甲羟戊酸的4pro-R和5pro-S氢生物合成产生的5α和6α氢原子的立体特异去除。该反应是专性需氧的，需要NADPH或NADH。去饱和酶据报道是微粒体中存在的一种多酶复合体。它由去饱和酶本身、细胞色素b₅和吡啶核苷酸依赖的黄素蛋白组成。Δ⁵-去饱和酶据报道是一种单加氧酶，它通过细胞色素b₅利用来源于还原的吡啶核苷酸的电子。

固醇C-7还原酶催化Δ^5，7-固醇中Δ⁷-双键的还原，产生相应的Δ⁵-固醇。已经报道这种机制象其他许多固醇酶一样，包括通过质子的亲电攻击”形成碳正离子中间物。

固醇C-24(28)异构酶催化Δ²⁴⁽²⁸⁾-Δ²⁴的还原，修饰侧链的转化。产物是Δ²⁴⁽²⁵⁾-24-烷基固醇。固醇C-24还原酶催化C-24位的Δ²⁴⁽²⁵⁾双键的还原，产生谷甾醇。最近，Klahre等人((1998)植物细胞10：1677-1690)发现，异构和还原步骤都由同一基因即DIM/DWF1编码的酶催化。

固醇C-22去饱和酶(EC 2.7.3.9)催化侧链上C-22位双键的形成。侧链上C-22位双键的形成标志固醇化合物生物合成途径的结束，导致豆甾醇的形成(Benveniste(1986)植物生理学年述37：275-308)。酵母中的C-22去饱和酶，是该生物中麦角甾醇生物合成的最后一步，需要NADPH和分子氧。另外，报道该反应也涉及细胞色素P450，其不同于参与脱甲基反应的细胞色素P450(Lees等人(1995)脂类30：221-226)。

植物甾醇是菜子类固醇(brassinosteroid)、类固醇生物碱、类固醇皂苷、蜕皮类固醇和类固醇激素的生物起源前体。植物甾醇的这种前体作用通常被描述为“代谢”功能。维管植物组织中游离固醇的普通转化是固醇的3-羟基与长链脂肪酸结合，形成甾基(steryl)酯，或与糖通常是一分子β-D-葡萄糖结合，形成甾基糖苷。某些甾基糖苷在糖部分的6-羟基处另外被长链脂肪酸酯化，形成酰化的甾基糖苷。

已经报道了存在与结合固醇的合成和分解特别有关的几种酶(Wojciechowski，《固醇的生理学与生物化学》，Patterson，Nes编，AOCS出版社，361(1991))。参与该过程的酶包括：UDPGIc：固醇葡糖基转移酶、磷酸(半乳糖)甘油酯甾基葡糖苷酰基转移酶和甾基糖苷和甾基酯水解酶。

UDPGIc：固醇葡糖基转移酶(EC 2.4.1.173)催化植物甾醇通过从UDP-葡萄糖(“UDPGI”)转移葡萄糖的葡糖基化。甾基糖苷的形成能用UDP-[¹⁴C]葡萄糖作为底物测量。尽管其特异性模式有一定的差异，但报道的所有UDPGIc：固醇葡糖基转移酶只优先糖基化含有C-3羟基、β-构型并显示平面环的固醇或固醇样分子。曾有报道，UDPGIc：固醇葡糖基转移酶位于微粒体中。

磷酸(半乳糖)甘油酯甾基葡糖苷酰基转移酶催化通过由某些膜极性酰脂向甾基糖苷分子转移酰基，由底物甾基糖苷形成酰化甾基糖苷。

酰基甘油：固醇酰基转移酶(EC 2.3.1.26)催化某些酰基甘油在植物甾醇酯化中用作酰基供体的反应。在植物中，酰基甘油：固醇酰基转移酶的活性据报道与膜部分有关。对于在植物中研究的所有酰基转移酶制品报道了短链不饱和脂肪酸的显著特异性。例如，来自菠菜叶和芥菜根的酰基甘油：固醇酰基转移酶能酯化多种植物甾醇。

甾基糖苷和甾基酯水解酶(“SG-水解酶”)催化甾基糖苷的酶促水解，形成游离固醇。在成熟、未发芽的种子中未发现SG-水解酶活性，据报道只在发芽三天后出现，主要在子叶中发现。据报道，磷酸(半乳糖)甘油酯：SG酰基转移酶可催化一种可逆反应。据报道，萌发的芥菜、大麦和玉米种子中的甾基酯酶促水解在休眠种子中较低，但在萌发的前10天中增高。该活性与同一时间段内甾基酯的减少和游离固醇的增多一致。

菜子类固醇

菜子类固醇是具有植物生物调节性质，包括细胞扩展调节和光形态发生的甾族化合物(Artecal，《植物激素：生理学、生物化学和分子生物学》，Davies和Kluwer编，Academic Publishers，66(1995)；Yakota，植物科学趋势(Trends in Plant Science)2：137-143(1997))。菜子交酯(Brassinolide)(2α，3α，22α，23α-四羟基-24-甲基-B-高-7-噁-5α-胆甾-6-酮)是一种生物活性菜子类固醇。已经报道了40种以上的菜子交酯的天然类似物，这些类似物主要在A/B环系统置换和侧链C-17位的不同(Fujioka和Sakurai，自然产物报道(Natural ProductsReport)14：1-10(1997))。

产生菜子交酯的途径从菜油甾醇处其他固醇的合成和分解代谢分支。已经报道了菜油甾醇、(24R)-24-甲基胆甾-4-烯-3-酮、(24R)-24-5α-甲基胆甾烷-3-酮、菜油甾烷醇、长春甾酮(cathasterone)、茶甾酮(teasterone)、3-脱氢茶甾酮、香蒲甾醇、长春甾酮(castasterone)、菜子交酯的合成途径(Fujioka等人，植物细胞9：1951-1962(1997))。也报道了一条从菜油甾醇分支的备选途径，其中6-噁基缺乏，并且直到连续转化过程的后期才引入。6-脱氧菜子类固醇具有低生物活性，并且可以是分解代谢产物。然而，将6-脱氧栗甾酮转化为栗甾酮的酶活性已经报道，因而使该备选途径与生物活性菜子交酯的生产相联系。

编码BR生物合成酶的两种基因已经从拟南芥中克隆。最早起作用的基因是DET2，它编码一种与哺乳动物类固醇5α-还原酶同源的类固醇5α-还原酶(Li等人，科学272：398-401(1996))。菜子交酯途径中唯一的还原步骤发生在菜油甾醇与菜油甾烷醇之间。据报道det2突变阻断了BR(24R)-24-甲基胆甾-4-烯-3-酮到(24R)-24-5-甲基胆甾烷-3-酮转化的第二步(Fujioka等人，植物细胞9：1951-1962(1997))。

第二种基因CPD编码具有与哺乳动物类固醇羟化酶同源的结构域的一种细胞色素P450(Szekeres等人，细胞85：171-182(1996))。CPD被报道为一种茶甾酮-23-羟化酶。该基因的突变阻断长春甾酮向茶甾酮转化。其他细胞色素P450酶也可参与菜子交酯生物合成，包括编码与CPD有38％同一性的P450细胞色素的番茄DWARF基因(Bishop，植物细胞8：959-969(1996))。

编码在改变植物中固醇化合物生物合成和积累中有用的酶的核酸序列的来源

3-羟基类固醇氧化酶

3-羟基类固醇氧化酶催化3-羟基类固醇的3-羟基氧化，产生酮类固醇和过氧化氢。它们能催化不同3-羟基类固醇如胆固醇的氧化。大多数以前所知的3-羟基类固醇氧化酶都称为“胆固醇氧化酶”(酶目录EC 1.1.3.6)，但胆固醇只是这些酶的3-羟基类固醇底物之一。所有3-羟基类固醇氧化酶和编码这些蛋白质的核酸为提高植物中植物甾烷醇如谷甾烷醇的应用都属于本发明范围内。

本发明中有用的3-羟基类固醇氧化酶包括由微生物如链霉菌属的种、短杆菌属(Brevibacterium spp.)的种、假单胞菌属(Pseudomonasspp.)的种、分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)的种、普通裂褶菌(Schizophyllum commune)、诺卡氏菌属(Nocardia spp.)的种和红球菌属(Rhodococcus spp.)的种自然产生的酶(Smith等人(1976)类固醇生物化学杂志7：705-713；Long等人，PCT国际公开文本WO90/05788；Corbin等人(1994)应用环境微生物学60：4239)。编码3-羟基类固醇氧化酶的基因已经从链霉菌属种SA-COO株(Murooka等人(1986)应用环境微生物学  52：1382)和瘤胃短杆菌(Brevibacterium sterolicum)ATCC 21387(Fujishiro等人(1990)生物化学与生物物理学研究通讯172：721)中克隆。

通过美国专利5,518,908中公开的分光光度计测量法测定培养滤液或各蛋白质的3-羟基类固醇氧化酶活性，能鉴定本发明中有用的产3-羟基类固醇氧化酶的其他生物。

控制3-羟基类固醇氧化酶表达的新链霉菌基因已经分离并测序。美国专利5,518,908公开了从马达加斯加分离的链霉菌A19249中获得的3-羟基类固醇氧化酶基因的序列。任何3-羟基类固醇氧化酶基因、cDNA、合成DNA、质粒衍生的DNA等都能插入用来转化植物的转化载体盒中。这些核酸能掺入植物基因组中，植物然后产生水平升高的植物甾烷醇或植物甾烷醇酯，如谷甾烷醇或谷甾烷醇酯。

类固醇5α-还原酶

本发明中有用的类固醇5α-还原酶包括可从任何来源如藻类、细菌、真菌、植物或哺乳动物细胞中获得的酶。非限定性实例是由拟南芥DET2基因编码的酶(Fujioka等人(1997)植物细胞9：1951-1962)。其他植物来源的序列包括以下所示来自拟南芥、玉米和大豆的全长cDNA。此处使用的核苷酸的标准IUPAC密码是：

B＝C，G或T      Y＝C或T

D＝A，G或T      K＝G或T

H＝A，C或T      M＝A或C

V＝A，C或G      S＝G或C

R＝A或G         W＝A或T

                N＝任何碱基

下面的序列是推断的类固醇5α-还原酶或其片段，基于与哺乳动物序列的同源性。这些序列最初根据与具有N端氨基酸序列MKVTVQTRSGRELIKGGIELHDSATVTDLQEAIYIKTKKYYRA(SEQ ID NO：1).的希蒙得木微粒体膜蛋白的同源性鉴定。该序列用来检索来自拟南芥、玉米和大豆的EST数据库，搜索与希蒙得木N端序列类似的编码肽的cDNA。确定了拟南芥和玉米cDNA序列，用由其编码的ORF的蛋白质序列检索GenPept。这表明这些蛋白质序列与参与固醇生物合成的哺乳动物类固醇5α-还原酶有相似性。以此类推，这些植物蛋白质应当催化类似的反应。人类固醇5α-还原酶的序列可自GenBank保藏号338476获得。

拟南芥类固醇5α-还原酶的全长cDNA序列是：ACCCACGCGTCCGCTCTATCTCTCTCAATTTCCTCATCTGGGTCTTCCTCGTTTGCTCCGCTTAAGCACCATGAAGGTCACCGTCGTCTCCCGCAGCGGCAGAGAAGTCCTCAAAGCTCCCCTTGACCTCCCCGATTCGGCGACTGTTGCTGATCTGCAAGAAGCGTTTCATAAGAGAGCTAAGAAGTTTTACCCGTCGAGGCAAAGACTGACTCTTCCCGTGACTCCTGGATCGAAGGACAAACCTGTTGTCCTCAATAGCAAGAAATCACTGAAGGAGTACTGTGATGGAAACAACAACTCCTTAACTGTAGTCTTCAAAGACCTGGGGGCACAAGTTTCCTACCGCACACTCTTCTTCTTCGAGTATCTTGGCCCTCTCCTTATCTACCCTGTCTTTTACTACTTCCCTGTTTACAAGTTTCTTGGTTATGGAGAGGACTGTGTGATCCATCCGGTCCAGACGTACGCTATGTACTACTGGTGCTTTCACTACTTCAAACGGATCTTAGAAACGTTTTTCGTACATCGGTTCAGCCACGCAACCTCCCCAATCGGGAATGTGTTCAGGAACTGTGCTTATTACTGGAGCTTTGGTGCTTACATTGCTTATTACGTCAACCATCCCTTGTACACTCCAGTTAGTGACCTTCAGATGAAGATTGGTTTCGGGTTTGGTTTGGTTTGCCAAGTCGCAAACTTTTACTGTCACATATTGCTGAAGAATCTGAGGGACCCCAGTGGGGCTGGAGGCTACCAGATTCCACGCGGTTTCCTCTTCAACATTGTTACATGTGCCAATTACACTACCGAGATTTACCAATGGCTAGGATTCAACATCGCTACTCAGACCATTGCAGGATATGTTTTCCTCGCTGTTGCTGCTCTAATCATGACTAATTGGGCTCTTGGAAAGCACAGCCGTYTGAGAAAGATATTTGATGGAAAAGATGGAAAGCCAAAGTATCCAAGAAGATGGGTGATACTTCCTCCATTCCTTTAGAAGCCATTGTTGCTTATCAGTAAAAGCTCTTAATAAAGCTGAAAATGAGACTTTCTTTGGGTTCTCTGTATCGTTTCCTTTTTTGTTCGGTCTATGTATTGGTTATAACATGTTTATTCCTTTTGTTTCAATATGTTTTGATTTTTGAAGTTAGAGAGATTTAGAAATGTACTTGTGTAGTTGTTTCTCACGCAAACCAATTCCTCTTTATGTATCGCATACATGAGTCAATAATAAATATGATTACTAGTAAAA(SEQ ID NO：2).拟南芥类固醇5α-还原酶的推断的氨基酸序列是：MKVTVVSRSGREVLKAPLDLPDSATVADLQEAFHKRAKKFYPSRQRLTLPVTPGSKDKPVVLNSKKSLKEYCDGNNNSLTVVFKDLGAQVSYRTLFFFEYLGPLLIYPVFYYFPVYKFLGYGEDCVIHPVQTYAMYYWCFHYFKRLLETFFVHRFSHTSPIGNVFRNCAYYWSFGAYIAYYVNHPLYTPVSDLQMKIGFGFGLVCQVANFYCHILLKNLRDPSGAGGYQIPRGFLFNIVTCANYTTEIYQWLGFNIATQTIAGYVFLAVAALIMTNWALGKHSRLRKIFDGKDGKPKYPRRWVILPPFL(SEQ ID NO：3).玉蜀黍类固醇5α-还原酶的全长cDNA序列是：GAATTCGGCTCGAGCTCTCCTCTCCTCTCCTCTCCCCCGCATCCACGGCCGCAGGCAGCAGGCAGCCACTCGACGATCTAGTCGTCTCTCTCCCCGCTCTGCCGCCTCGCTGCCGCGGCTTCCCGTCGGCGGGAGGATGAAGGTCACGGTCGTGTCCCGGAGCGGCCGGGAGGTCGTCAAGGGCGGCATCGACCTCAAGGACTCGGCCAAGGTCGCGGACCTGCAGGAGGCCATCCATGCCAGGACTAAGAAGTATTATCCTTCTAGGCAGCGGCTCACCCTCCCCCTTCAACCTGGAAAAGGCGGGAAGCCAGTTGTCCTCAGTCCGAAGGCCAGCCTGCTAGAATACTGCGAGAAGGGTTCTGGGTCACTGACAGTGGTCTTCAAAGATTTAGGGCCACAGGTCTACTACAGCACACTGTTCTTCTTCGAGTACCTGGGTCCTCTCATCATCTACCCCATGTTCTACTATCTGCCCGTCTACAAGTACTTCGGGCACGAGGGGGAGCGGGCCATGCACCCTGTCCAGACCTACGCAATGTACTACTGGTGCTTCCACTACTTCAAGCGGATCATGGAGACGTTCTTCGTGCACCGCTTCAGCCACGCGACGTCGCCGCTCTCGAACGTCTTCAGGAACTGTGCCTACTACTGGACCTTCGGCGCTTACATTGCTTACTACTGCAACCACCCGCTGTACACCCCAGTGAGTGATCTGCAGATGAAGATTGGGTTTGGTTTTGGGGTCGTCTGCCAGGTCGCGAACTTCTACTGCCACATCCTGCTGCGGAACCTCAGGAGCCCAAGCGGCAGCGGCGGGTACCAGATCCCCCGCGGTTTCTTGTTCAACATCGTGACCTGCGCCAATTACACCACCGAGATCTACCAGTGGGTCGGCTTCAACATCGCCACACAGACCGTGGCAGGTTACGTCTTCCTTGTCGTGGCGGCGGGCATCATGACCAACTGGGCGCTCGGCAAGCACAGCCGTCTGAAGAAGCTGTTTGACGGCAAGGATGGGAGGCCCAAGTACCCTCGCCGGTGGGTGATTCTCCCTCCGTTCCTGTGAAGAGGCGGTGGTGGTGGCTCACTGTTGGTGGTCGGCCCATTGTGATTCGATGTCTACAGACAGTTGTACTGTACTAATCGTGCCTGTTTAGCGGTTGAACTTGGATTCCGTTGTCCGAAGTTTCTAATCCGAAAGATGGATTTCATTTTCTTCTTCTTCTTCTTAGCATTATGTCACTGTCTCACGTCGTCCTGTCTCAATACAGTCTAAGGTTCATGTGATGTTATCCCCATTTGTCCACGCAGAAGTGAAGTGAATGCAGTCACTATTTCGATTCGACAAAAAAAAAAAA(SEQID NO：4).玉蜀黍类固醇5α-还原酶的推断的氨基酸序列是：MKVTVVSRSGREVVKGGIDLKDSAKVADLQEAIHARTKKYYPSRQRLTLPLQPGKGGKPVVLSPKASLLEYCEKGSGSLTVVFKDLGPQVYYSTLFFFEYLGPLIIYPMFYYLPVYKYFGHEGERAMHPVQTYAMYYWCFHYFKRIMETFFVHRFSATSPLSNVFRNCAYYWTFGAYIAYYCNHPLYTPVSDLQMKIGFGFGVVCQVANFYCHILLRNLRSPSGSGGYQIPRGFLFNIVTCANYTTEIYQWVGFNIATQTVAGYVFLVVAAGIMTNWALGKHSRLKKLFDGKDGRPKYPRRWVILPPFL(SEQ ID NO：5).第一种大豆类固醇5α-还原酶的cDNA序列是：GAATTCGGCTCGAGCGGGGATGTCAGTGATAAGCCTTGTGTCACTGGCTAATGCTGGCTTCTCAGAGATTAGAGGGAAGCATTTGAACTATTCAAAGTTTTGGAATGCTAATCCCTCTGCAGAAAAGCAGGTCAAGTTGTCTAGCAAAGCTGGCATGCTTTTGCTGTACACTCCTGCTTTTCTTGCTGGCCTTGCATCCTTCTGGATCTTTCCTCATCAAGGCCTCAGATCCACCCTCCTTCAGTCTGCAGTTACCCTGCATTTCTTCAAGAGGGTCTTTGAGGTTGTGTTTATTCACAAATATAGTGGTGCCATGCTTCTTGATTCTGCAATCCCCATCACTCTGAGTTATTTCCTATCAACTGCAACTATGATCTATGCTCAACACTTAACACAAGGGCTTCCAGAACCACCAATCGATCTGTTGTATCCTGGCATTGTTTTGTTTGTGGTGGGCATCATTGGCAACTTCTACCACCACTACCTTCTATCCAACTTAAGGGGAAAGGGTGAAAAGGAGTACAAGATTCCAAAGGGTGGCATGTTTGAGCTTGTCATATGTCCCCACTACCTGTTTGAGATTATTGAGTTTTATGGGTTCTCCTTCATTTCGCAGACGCTATATGCATTCTCTTTCACCGTAGGCACTACTTTATACTTGCTAGGTAGGAGTTATTCAACTAGGAAATGGTATCTTTCTAAGTTTGAAGATTTCCCTGAGCATGTTAAGGCTATCATCCCATTTGTCTTCTAGAAATGTTGGAAGGAATAACTAATTTTACTTTCATTTCTCAGACGCTATATGCATTATCTTTCACTGTAGGCGCTACTTTGTACTTGCTATGTAGGAGTGATTCGACTAGGAAATGGTATCTTTCTAGGTTTGAAGATTTCCCTAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGGCCGCCG(SEQ IDNO：6)SEQ ID NO：6的推断的氨基酸序列是：MSVISLVSLANAGFSEIRGKHLNYSKFWNANPSAEKQVKLSSKAGMLLLYTPAFLAGLASFWIFPHQGLRSTLLQSAVTLHFFKRVFEVVFIHKYSGAMLLDSAIPITLSYFLSTATMIYAQHLTQGLPEPPIDLLYPGIVLFVVGIIGNFYHHYLLSNLRGKGEKEYKIPKGGMFELVICPHYLFEIIEFYGFSFISQTLYAFSFTVGTTLYLLGRSYSTRKWYLSKFEDFPEHVKAIIPFVF^*(SEQ ID NO：7).第二种大豆类固醇5α-还原酶的cDNA序列是：GAATTCGGCTCGAGAACAAGCAAACACCATGGTGATTAAGTCTGTGTTGTTCAGCTTCATTTTCCCCCCGCCACCTTCTCTGGTGGTTTGGGGGTTGACTGTGACAAGCTTCCTGATACTGGCTAATGCTTTCTTGTCAGAAATTAGAGGGAAGCATTTGAACTATTCAAAGTTTTGGAATGCTAATCCCTCTGCAGAAAAGCAGGTCAAGTTGTCTAGCAAAGCTGGCATGCTTTTGCTGTACACTCCTGCTTTTCTTGCTGGCCTTGCATCCTTCTGGGTCTTTCCTCATCAAGGGCTCAGATTCACCATCCTTCAATCTGCTGTTACTCTGCACTACTTCAAGAGGGTCTTTGAGGGTCTGTTTATTCACAAATATAGTGGAGGCATGACACTTGAATCTGCAATCCCCATCACTCTGAGTTATTTCCTCTCAGCTGTAACTATGGTCTATTCTCAACACCTAACAAAAGGGTTTCCAGAACCACCAATCAATCTGTTCTACCCTGGCATTGTGTTGTTTCTAGTTGGCATCATTGGCAACTTCTACCACCATTACCTTCTGTCCAAATTGAGGGGAAAGGGTGAAAAGGAGTACAAGATTCCAAAGGGTGGCTTTTTTGAGCTTGTGATTTGCCCCCACTACTTCTTTGAGATTACTGTGTTTTATGGGATCTTCTTCATTTCTCAGACATTATATTCATTCGCTTTCGCTGTAGGCACTACTATGTACTTGGTGGGTAGGAGTTACTCAACTAGGAAATGGTATCTTTCTAAGTTTGAAGATTTCCCTAAGCATGTTAAGGCTGTCATCCCATTTGTCTTCTAAATGTTGTAATGAACATCTAATTCTACTTGAGTTGTAAGTGTGCTGCTAGATTGTGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGCCGG(SEQ ID NO：8)SEQ ID NO：8的推断的氨基酸序列是：MVIKSVLFSFIFPPPPSLVVWGLTVTSFLILANAFLSEIRGKHLNYSKFWNANPSAEKQVKLSSKAGMLLLYTPAFLAGLASFWVFPHQGLRFTILQSAVTLHYFKRVFEGLFIHKYSGGMTLESAIPITLSYFLSAVTMVYSQHLTKGFPEPPINLFYPGIVLFLVGIIGNFYHHYLLSKLRGKGEKEYKIPKGGFFELVICPHYFFEITVFYGIFFISQTLYSFAFAVGTTMYLVGRSYSTRKWYLSKFEDFPKHVKAVIPFVF(SEQ IDNO：9)

HMG-CoA还原酶

Chye等人(1991)植物分子生物学16：567-577公开了编码三叶胶HMG-CoA还原酶的核酸序列。编码拟南芥HMG-CoA还原酶的核酸序列已由Caelles等人(1989)植物分子生物学13：627-638公布，并可从GenBank保藏号L19261获得。美国专利号5,306,862和5,365,017公开了编码HMG-CoA还原酶的其他DNA序列。

固醇酰基转移酶

固醇O-酰基转移酶如酰基CoA：胆固醇酰基转移酶(EC 2.3.1.26；ACAT)催化由胆固醇和长链脂肪酸形成胆固醇酯。这些酶能在本发明中用来产生水平提高的植物甾醇和/或植物甾烷醇酯。

下面列出了编码全长ACAT或ACAT样酶的核酸序列或EST的实例，包括来自拟南芥、Caenorhabditis elegans、大豆、人、Mortierellaalpina、小鼠、大鼠和玉蜀黍(玉米)的。

全长拟南芥ACAT DNA序列是：CTCTCGTGAATCCTTTTTCCTTTCTTCTTCTTCTTCTCTTCAGAGAAAACTTTGCTTCTCTTTCTATAAGGAACCAGACACGAATCCCATTCCCACCGATTTCTTAGCTTCTTCCTTCAATCCGCTCTTTCCCTCTCCATTAGATTCTGTTTCCTCTTTCAATTTCTTCTGCATGCTTCTCGATTCTCTCTGACGCCTCTTTTCTCCCGACGCTGTTTCGTCAAACGCTTTTCGAAATGGCGATTTTGGATTCTGCTGGCGTTACTACGGTGACGGAGAACGGTGGCGGAGAGTTCGTCGATCTTGATAGGCTTCGTCGACGGAAATCGAGATCGGATTCTTCTAACGGACTTCTTCTCTCTGGTTCCGATAATAATTCTCCTTCGGATGATGTTGGAGCTCCCGCCGACGTTAGGGATCGGATTGATTCCGTTGTTAACGATGACGCTCAGGGAACAGCCAATTTGGCCGGAGATAATAACGGTGGTGGCGATAATAACGGTGGTGGAAGAGGCGGCGGAGAAGGAAGAGGAAACGCCGATGCTACGTTTACGTATCGACCGTCGGTTCCAGCTCATCGGAGGGCGAGAGAGAGTCCACTTAGCTCCGACGCAATCTTCAAACAGAGCCATGCCGGATTATTCAACCTCTGTGTAGTAGTTCTTATTGCTGTAAACAGTAGACTCATCATCGAAAATCTTATGAAGTATGGTTGGTTGATCAGAACGGATTTCTGGTTTAGTTCAAGATCGCTGCGAGATTGGCCGCTTTTCATGTGTTGTATATCCCTTTCGATCTTTCCTTTGGCTGCCTTTACGGTTGAGAAATTGGTACTTCAGAAATACATATCAGAACCTGTTGTCATCTTTCTTCATATTATTATCACCATGACAGAGGTTTTGTATCCAGTTTACGTCACCCTAAGGTGTGATTCTGCTTTTTTATCAGGTGTCACTTTGATGCTCCTCACTTGCATTGTGTGGCTAAAGTTGGTTTCTTATGCTCATACTAGCTATGACATAAGATCCCTAGCCAATGCAGCTGATAAGGCCAATCCTGAAGTCTCCTACTACGTTAGCTTGAAGAGCTTGGCATATTTCATGGTCGCTCCCACATTGTGTTATCAGCCAAGTTATCCACGTTCTGCATGTATACGGAAGGGTTGGGTGGCTCGTCAATTTGCAAAACTGGTCATATTCACCGGATTCATGGGATTTATAATAGAACAATATATAAATCCTATTGTCAGGAACTCAAAGCATCCTTTGAAAGGCGATCTTCTATATGCTATTGAAAGAGTGTTGAAGCTTTCAGTTCCAAATTTATATGTGTGGCTCTGCATGTTCTACTGCTTCTTCCACCTTTGGTTAAACATATTGGCAGAGCTTCTCTGCTTCGGGGATCGTGAATTCTACAAAGATTGGTGGAATGCAAAAAGTGTGGGAGATTACTGGAGAATGTGGAATATGCCTGTTCATAAATGGATGGTTCGACATATATACTTCCCGTGCTTGCGCAGCAAGATACCAAAGACACTCGCCATTATCATTGCTTTCCTAGTCTCTGCAGTCTTTCATGAGCTATGCATCGCAGTTCCTTGTCGTCTCTTCAAGCTATGGGCTTTTCTTGGGATTATGTTTCAGGTGCCTTTGGTCTTCATCACAAACTATCTACAGGAAAGGTTTGGCTCAACGGTGGGGAACATGATCTTCTGGTTCATCTTCTGCATTTTCGGACAACCGATGTGTGTGCTTCTTTATTACCACGACCTGATGAACCGAAAAGGATCGATGTCATGAAACAACTGTTCAAAAAATGACTTTCTTCAAACATCTATGGCCTCGTTGGATCTCCGTTGATGTTGTGGTGGTTCTGATGCTAAAACGACAAATAGTGTTATAACCATTGAAGAAGAAAAGACAATTAGAGTTGTTGTATCGCA(SEQ ID NO：10).由上述DNA序列推断的氨基酸序列是：MAILDSAGVTTVTENGGGEFVDLDRLRRRKSRSDSSNGLLLSGSDNNSPSDDVGAPADVRDRIDSVVNDDAQGTANLAGDNNGGGDNNGGGRGGGEGRGNADATFTYRPSVPAHRRARESPLSSDAIFKQSHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMKYGWLIRTDFWFSSRSLRDWPLFMCCISLSIFPLAAFTVEKLVLQKYISEPVVIFLHIIITMTEVLYPVYVTLRCDSAFLSGVTLMLLTCIVWLKLVSYAHTSYDIRSLANAADKANPEVSYYVSLKSLAYFMVAPTLCYQPSYPRSACIRKGWVARQFAKLVIFTGFMGFIIEQYINPIVRNSKHPLKGDLLYAIERVLKLSVPNLYVWLCMFYCFFHLWLNILAELLCFGDREFYKDWWNAKSVGDYWRMWNMPVHKWMVRHIYFPCLRSKIPKTLAIIIAFLVSAVFHELCIAVPCRLFKLWAFLGIMFQVPLVFITNYLQERFGSTVGNMIFWFIFCIFGQPMCVLLYYHDLMNRKGSMS(SEQID NO：11).Caenorhabditis elegans ACAT5’cDNA EST是：TGCAAATGCGTCAACAAACGGGACGACGGCGGCGTCAGCCTTCGGNAAACATCTAATGGTTCTTTGGCTTCCAGTAGACGCTCCTCATTTGCACAAAATGGTAATTCGTCAAGGGAAAAGTTCAGAAATGAGAGGACCTTGCGAGAAAGTGGTACATACTGCTCAAGATTCATTGTTTTCGACGAGTTCTGGATGGACAAATTTCCGTGGATTCTTCAATTTGTCTATTTTACTTTTGGTACTTTCAAATGGACGCGTGGCACTTGAAAATGTGATCAAATATGGTATTTTGATAACACCCCTTCAGTGGATCTCAACGTTTGTTGAGCATCACTACTCAATTTGGAGCTGGCCAAATCTTGCTCTCATCCTATGCTCAAA(SEQ ID NO：12).Caenorhabditis elegans ACAT3’cDNA EST是：TTTGATATGTACGGTAAATGGAAAAAAGGTATTCATGTATGGCAAGGTGGTAATAAATGGCACTAAATATGTTTCAAAAGTGTGAGCAAACGTATGTGAGAGACGAGAAAAATAAGAAAACGACCTGTAATACATGAAAAATATCAATAGGAATTTTGAGATAATTTGGCAACATGCAATATAATGATTATAATAAAAAACTTGTCTTAAGACTAGAGAACTGCTAATTCAAAAAAAACAAATTGAGATAAATCAAATACCAACGGTTTGGTTTTGAACTGCTGAAACACCAAAGTTCAA(SEQ ID NO：13).Caenorhabditis elegans ACAT蛋白质序列是：MRQQTGRRRRQPSETSNGSLASSRRSSFAQNGNSSRKSSEMRGPCEKVVHTAQDSLFSTSSGWTNFRGFFNLSILLLVLSNGRVALENVIKYGILITPLQWISTFVEHHYSIWSWPNLALILCSNIQILSVFGMEKILERGWLGNGFAAVFYTSLVIAHLTIPVVVTLTHKWKNPLWSVVMMGVYVIEALKFISYGHVNYWARDARRKITELKTQVTDLAKKTCDPKQFWDLKDELSMHQMAAQYPANLTLSNIYYFMAAPTLCYEFKFPRLLRIRKHFLIKRTVELIFLSFLIAALVQQWVVPTVRNSMKPLSEMEYSRCLERLLKLAIPNHLIWLLFFYTFFHSFLNLIAELLRFADREFYRDFWNAETIGYFWKSWNIPVHRFAVRHIYSPMMRNNFSKMSAFFVVFFVSAFFHEYLVSVPLKIFRLWSYYGMMGQIPLSIITDKVVRGGRTGNIIVWLSLIVGQPLAILMYGHDWYILNFGVSAVQNQTVGI(SEQ ID NO：14).大豆ACAT EST DNA序列I是：AACGGAATTGAGACTCCAGAGAATATGCCAAAATGTATTAATAATTGTCACAACTTGGAAGGCTTTTGGAAAAACTGGCATGCTTCCTTCAACAAGTGGCTTGTGAGGTATATATACATTCCTCTTGGGGGATCTAAGAAAAAGCTACTAAATGTGTGGGTTGTTTTCACATTTGTTGCAATCTGGCATGATTTAGAGTGGAAGCTTCTTTCATGGGCATGGTTGACGTGTTTATTCTTCATCCCTGAGTTGGTTTT(SEQID NO：15).大豆ACAT EST DNA序列II是：GTAAGCTTCAAGAGCTTAGCATANTTCCTGGTTGCCCCTANCATTATGTTACCAGCCAANCTATCCTCGCACACCTTATATTCGAAAGGGTTGGCTGTTTCGCCAACTTGTCAACTGATAATATTTACAGGAGTTATGGGATTTATAATAGAACAATACATTAATCCCATTGTACAAAATTCACAGCATCCTCTCAAGGGAAACCTTCTTTACGCCATCGAGAGAGTTCTGAAG(SEQ ID NO：16).大豆ACAT EST DNA序列III是：GTGGAATGCCAAAACTGTTGAAGATTATTGGAGGATGTGGAATATGCCTGTTCACAAATGGATGATCCGCCACCTATATTTTCCATGTTTAAGGCACGGTATACCAAAGGCCGTTGCTCTTTTAATTGCCTTCCTGGTTCTGCTTTATTCCATGAGCTGTGCATCGCTGTTCCTTGCCCACATATTCAAGTNGTGGGTTTCNGNGGAATTNAGTTTCAGGTNCCTTGGGTTTCNACCNNAATTNNTNGGCNAAAAAATTCCNNGAACCCCGGGGG(SEQ ID NO：17).大豆ACAT EST DNA序列IV是：CTGCTTTTGTATCTGGTGTCACGTTGATGCTATTAACTTGCATTGTGTGGTTAAAATTGGTGTCATATGCACATACAAACTATGATATGAGAGCACTTACTGTTTCGAATGAAAAGGGAGAAACATTACCCAATACTTTGATATGGAGTATCCGTACACTGTGACCTTCAGGAGTTTGGCATACTTCATGGTTGCTCCTACATTATGCTATCAGACAAGCTATCCTCGCACACCTTCAGTTCGAAAGGGTTGGGTGTTTCGTCAACT(SEQ ID NO：18).全长人ACAT DNA序列是：GTCTGGTGTGATGGGGACAGGGAGGGACTTCCCCTTACCCAGCACTGGTGTTGGCTGAGGTGGGTGCTGAGTCTCAGAGCTTGGCATGGAGACCAGACAGGGCTGGGTCTGCAAGCCTGAGGCTGCCGCCCTGAGCTCGGGCTGGGACGTGCCCAGAGGTGTTGGGAGGATCTGGGGTGAGTACCCTGTGGCCAGGACTAAAGGGGCTNCACCCTCCTGTCCATCCCTCGCAGATCTTGAGCAATGCCCGGTTATTTCTGGAGAACCTCATCAAGTATGGCATCCTGGTGGACCCCATCCAGGTGGTTTCTCTGTTCCTGAAGGATCCCTATAGCTGGCCCGCCCCATGCCTGGTTATTGCGGCCAATGTCTTTGCTGTGGCTGCATTCCAGGTTGAGAAGCGCCTGGCGGTGGGTGCCCTGACGGAGCAGGCGGGACTGCTGCTGCACGTGGCCAACCTGGCCACCATTCTGTGTTTCCCAGCGGCTGTGGTCTTACTGGTTGAGTCTATCACTCCAGTGGGCTCCCTGCTGGCGCTGATGGCGCACACCATCCTCTTCCTCAAGCTCTTCTCCTACCGCGACGTCAACTCATGGTGCCGCAGGGCCAGGGCCAAGGCTGCCTCTGCAGGGAAGAAGGCCAGCAGTGCTGCTGCCCCGCACACCGTGAGCTACCCGGACAATCTGACCTACCGCGATCTCTACTACTTCCTCTTCGCCCCCACCTTGTGCTACGAGCTCAACTTTCCCCGCTCTCCCCGCATCCGGAAGCGCTTTCTGCTGCGACGGATCCTTGAGATGCTGTTCTTCACCCAGCTCCAGGTGGGGCTGATCCAGCAGTGGATGGTCCCCACCATCCAGAACTCCATGAAGCCCTTCAAGGACATGGACTACTCACGCATCATCGAGCGCCTCCTGAAGCTGGCGGTCCCCAATCACCTCATCTGGCTCATCTTCTTCTACTGGCTCTTCCACTCCTGCCTGAATGCCGTGGCTGAGCTCATGCAGTTTGGAGACCGGGAGTTCTACCGGGACTGGTGGAACTCCGAGTCTGTCACCTACTTCTGGCAGAACTGGAACATCCCTGTGCACAAGTGGTGCATCAGACACTTCTACAAGCCCATGCTTCGACGGGGCAGCAGCAAGTGGATGGCCAGGACAGGGGTGTTCCTGGCCTCGGCCTTCTTCCACGAGTACCTGGTGAGCGTCCCTCTGCGAATGTTCCGCCTCTGGGCGTTCACGGGCATGATGGCTCAGATCCCACTGGCCTGGTTCGTGGGCCGCTTTTTCCAGGGCAACTATGGCAACGCAGCTGTGTGGCTGTCGCTCATCATCGGACAGCCAATAGCCGTCCTCATGTACGTCCACGACTACTACGTGCTCAACTATGAGGCCCCAGCGGCAGAGGCCTGAGCTGCACCTGAGGGCCTGGCTTCTCACTGCCACCTCACACCCGCTGCCAGAGCCCACCTCTCCTCCTAGGCCTCGAGTGCTGGGGATGGGCCTGGCTGCACAGCATCCTCCTCTGGTCCCAGGGAGGCCTCTCTGCCCCTATGGGGCTCTGTCCTGCACCCCTCAGGGATGGCGACAGCAGGCCAGACACAGTCTGATGCCAGCTGGGAGTCTTGCTGACCCTGCCCCGGGTCCGAGGGTGTCAATAAAGTGCTGTCCAGTGACCTCTTCAGCCTGCCAGGGGCCTGGGGCCTGGTGGGGGGTATGGCCACACCCACAAGGGCGAGTGCCAGAGCTGTGTGGACAGCTGTCCCAGGACCTGCCGGGGAGCAGCAGCTCCACTGCAGCAGGGCGGGCATGGCCGGTAGGGGGAGTGCAAGGCCAGGCAGACGCCCCCATTCCCCACACTCCCCTACCTAGAAAAGCTCAGCTCAGGCGTCCTCT(SEQ ID NO：19).Mortierella alpina ACAT EST DNA序列是：GAGNNNNGNAACGTTTAGCCTNCCGTAGCCGCCAAAATCCAAGGGNCNACCNACCCTNCGTTANACTNAATTNGAAAATNCNNNCCCAACTTNAGGNACTTNNAGNCCCCCCNACTTGACAACGGAGCACTATATTTACCCCGTGGTNGTTCAACCCAGCCATCTCACCCTTGCGAGCATTGGTGCTGCTCTTGATACCCTTCATGCTTAACTATCTCATGATCTTTTACATCATTTTCGAGTGCATCTGCAACGCCTTTGCGGAACTAAGTTGCTTTGCGGATCGCAACTTTTACGAGGATTGGTGGAACTGCGTCAGCTTTGATGAGTGGGCACGCAAATGGAACAAGCCTGTGCAACACTTCTTGCTCCGCCACGTGTACGACTCGAGCATCCGAGTCCTTCCACTTGTCCGAAATCCAATGCCGCNAATTGCAAACGTTCCTTCCCGGTCGTCAATGCGTTCAACGAACCTGGGTGAAGAATGGGTGGTGACAACGTTAAAGTGCGCCCGGTATC(SEQ ID NO：20).小鼠ACAT EST DNA序列I是：TGGAGGACAACGCGGGGTCTGATACGACTCACTATAGGGAATTTGGCCCTCGAGCAGTAGATTCGGCACGATGGGCACGAGGACTCCATCATGTTCCTCAAGCTTTATTCCTACCGGGATGTCAACCTGTGGTGCCGCCAGCGAAGGGTCAAGGCCAAAGCTGTCTCTACAGGGAAGAAGGTCAGTGGGGCTGCTGCGAGCAAGCTGTGAGCTATCCAGACAACCTGACCTACCGAGATCTCGATTACTTCATCTTTGCTCCTACTTTGTGTTATGAACTCAACTTTCCTCGGTCCCCCCGAATACGAGAGCGCTTTCTGCTACGACGAGTTCTTGAGATGCTCTTTTTTACCCAGCTTCAAGTGGGGCTGATCCAACAGTGGATGGTCCCTACTATCCAGAACTCCATGGAAGCCCTTTCAAGAGCTTCTGCAGTTTTGGAGACCGCGAGTTCTACAGAGATTGGTGGAATGCTGAGTCTGTCACCGACTTTTGGCAGAACTGGAATATCCCCGTGG(SEQ ID NO：21)小鼠ACAT EST DNA序列II是：CCATGATGGCTCAGGTCCCACTGGCCTGGATTGTGGGCCGATTCTTCCAAGGGAACTATGGCAATGCAGCTGTGTGGGTGACACTCATCATTGGGCAACCGGTGGCTGTCTCATGTATGTCCACGACTACTACGTGCTCAACTACGATGCCCCAGTGGGTCATGAGCTACTGCCAAAGGCAGCCCTCCCTAACCTGGGCCTGGAGTTCTGGAGGGGTTCCTGGCTGCCTGCACACTCCTCCTAGTCTGGGAGGCCTCTCTGCCCCTATGCGCTACTCCTGCTCTTGGGGATGGCATTTG(SEQ IDNO：22)全长大鼠ACAT DNA序列是：CACGACTGGGCCGCGACGTGGTGCGGGCCGAAGCCATGGGCGACCGCGGAGGCGCGGGAAGCTCTCGGCGTCGGAGGACCGGCTCGCGGGTTTCCATCCAGGGTGGTAGTGGGCCCATGGTAGACGAAGAGGAGGTGCGAGACGCCGCTGTGGGCCCCGACTTGGGCGCCGGGGGTGACGCTCCGGCTCCGGCTCCGGTTCCGGCTCCAGCCCACACCCGGGACAAAGACCGGCAGACCAGCGTGGGCGACGGCCACTGGGAGCTGAGGTGCCATCGTCTGCAAGACTCTTTGTTCAGCTCAGACAGCGGTTTCAGCAATTACCGTGGTATCCTGAATTGGTGCGTGGTGATGCTGATCCTGAGTAATGCAAGGTTATTTTTAGAGAATCTTATCAAGTATGGCATCCTGGTGGATCCCATCCAGGTGGTGTCTCTGTTTCTGAAGGACCCCTACAGCTGGCCTGCCCCATGCTTGATCATTGCATCCAATATCTTTATTGTGGCTACATTTCAGATTGAGAAGCGCCTGTCAGTGGGTGCCCTGACAGAGCAGATGGGGCTGCTGCTACATGTGGTTAACCTGGCCACAATTATCTGCTTCCCAGCAGCTGTGGCCTTACTGGTTGAGTCTATCACTCCAGTGGGTTCCCTGTTTGCTCTGGCATCATACTCCATCATCTTCCTCAAGCTTTTCTCCTACCGGGATGTCAATCTGTGGTGCCGCCAGCGAAGGGTCAAGGCCAAAGCTGTGTCTGCAGGGAAGAAGGTCAGTGGGGCTGCTGCCCAGAACACTGTAAGCTATCCGGACAACCTGACCTACCGAGATCTCTATTACTTCATCTTTGCTCCTACTTTGTGTTATGAACTCAACTTTCCTCGATCCCCCCGAATACGAAAGCGCTTTCTGCTACGGCGGGTTCTTGAGATGCTCTTTTTCACCCAGCTTCAAGTGGGGCTGATCCAGCAGTGGATGGTCCCTACTATCCAGAACTCCATGAAGCCCTTCAAGGACATGGACTATTCACGAATCATTGAGCGTCTCTTAAAGCTGGCGGTCCCCAACCATCTGATATGGCTCATCTTCTTCTATTGGCTTTTCCACTCATGTCTCAATGCTGTGGCAGAGCTCCTGCAGTTTGGAGACCGCGAGTTCTACAGGGACTGGTGGAATGCTGAGTCTGTCACCTACTTTTGGCAGAACTGGAATATCCCCGTGCACAAGTGGTGCATCAGACACTTCTACAAGCCTATGCTCAGACTGGGCAGCAACAAATGGATGGCCAGGACTGGGGTCTTTTTGGCGTCAGCCTTCTTCCATGAGTACCTAGTGAGCATTCCCCTGAGGATGTTCCGCCTCTGGGCATTCACAGCCATGATGGCTCAGGTCCCACTGGCCTGGATTGTGAACCGCTTCTTCCAAGGGAACTATGGCAATGCAGCTGTGTGGGTGACACTCATCATTGGGCAACCGGTGGCTGTGCTCATGTATGTCCACGACTACTACGTGCTCAACTATGATGCCCCAGTGGGGGCCTGAGCTACTGCCAAAGGCCAGCCCTCCCTAACCTGGGCCTGGAGTTCTGGAGGGCTTCCTGGCTGCCTGCACACTCCTCCTAGTCTGGGAGGCCTCTCTGCCCCTATGGGGCCTACTCCTGCTCTTGGGGATGGCACCTGAGTCCAGCTGGTATGAGCCAGTGCTGGGAGTCTGTGCTGACCAGGGGCTGAGGATATCAATAAAGAGCTATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：23).大鼠ACAT蛋白质序列是：MGDRGGAGSSRRRRTGSRVSIQGGSGPMVDEEEVRDAAVGPDLGAGGDAPAPAPVPAPAHTRDKDRQTSVGDGHWELRCHRLQDSLFSSDSGFSNYRGILNWCVVMLILSNARLFLENLIKYGILVDPIQVVSLFLKDPYSWPAPCLIIASNIFIVATFQIEKRLSVGALTEQMGLLLHVVNLATIICFPAAVALLVESITPVGSLFALASYSIIFLKLFSYRDVNLWCRQRRVKAKAVSAGKKVSGAAAQNTVSYPDNLTYRDLYYFIFAPTLCYELNFPRSPRIRKRFLLRRVLEMLFFTQLQVGLIQQWMVPTIQNSMKPFKDMDYSRIIERLLKLAVPNHLIWLIFFYWLFHSCLNAVAELLQFGDREFYRDWWXNAESVTYFWQNWNIPVHKWCIRHFYKPMLRLGSNKWMARTGVFLASAFFHEYLVSIPLRMFRLWAFTAMMAQVPLAWIVNRFFQGNYGNAAVWVTLIIGQPVAVLMYVHDYYVLNYDAPVGA(SEQ ID NO：24).玉蜀黍ACAT EST DNA序列I是：TAATCNAACCTCGNTNCNGGTTCAGCTGTATNCCATGAGATATGTAATGCGGTGCCGTGCCACATANTCANATCTNGGCATNNCNGGGATCATNGTTCAGATACCGNTGGNATTCTTGACAAGATATCTCCATGCTACGTTCAAGCATGTAATGGTGGGCAACATGATANTTTGGNTCTNCAGTATAGTCGGACAGCCGATGTNNNNNNATCTATACTACCATGACGTCATGAACAGGCAGGCCCAGGCAAGTAGATAGTNCGGCAGAGACATGTACTTCAACATCGANCATCAGNAGCANACNGAGCGAGCGGCANGAANCAGC(SEQ ID NO：25).玉蜀黍ACAT EST DNA序列II是：GAAGTATGGCTTATTAATAAGATCTGGCTTTTGGTTTAATGCTACATCATTGCGAGACTGGCCACTGCTAATGTGTTGCCTTAGTCTACCCATATTTCCCCTTGGTGCATTTGCAGTCGAAAAGTTGGCATTCAACAATCTCATTAGTGATCCTGCTACTACCTGTTTTCACATCCTTTTTACAACATTTGAAATTGTATATCCAGTGCTCGTGATTCTTAAGTGTGATTCTGCAGTTTTACAGGCTTTGTGTTGATGTTTA(SEQ ID NO：26).玉蜀黍ACAT EST DNA序列III是：AGAAAATGGAACATGCCTGTGCATAAATGGATTGTTCGTCATATATATTTTCCTTGCATGCGAAATGGTATATCAAAGGAAGTTGCTGTTTTTATATCGTTCTTGTTTCTGCTGTACTTCATGAGTTATGTGTTGCTGTTCCCTGCCACATACTCAAGTTCTGGGCTTTTTTTAGGAATCATGCTTCAGATTCCCCTCATCATATTGACATCATACCTCAAAAATAAATTCAGTGACACAATGGTTGGCAATA(SEQID NO：27).玉蜀黍ACAT EST DNA序列IV是：TGAAGTATGGCTTATTAATAAGATCTGGCTTTTGGTTTAATGCTACATCATTGCGAGACTGGCCACTGCTAATGTGTTGCCTTAGTCTACCCATATTTCCCCTTGGTGCATTTGCAGTCGAAAAGTTGGCATTCAACAATCTCATTAGTGATCCTGCTACTACCTGTTTTCACATCCTTTTTACAACATTTGAAATTGTATATCCAGTGCTCGTGATTCTTAAGTGTGATTCTGCAGTTTTATCAGGCTTTGTG(SEQID NO：28).

除了上述之外，GenBank保藏号z68131的核苷酸11702-15557编码对应于GenBank保藏号3873754的ACAT蛋白质。GenBank保藏号z75526的核苷酸937-10600编码对应于GenBank保藏号3874043的ACAT蛋白质。

S-腺苷-L-甲硫氨酸-固醇-C24-甲基转移酶

Husselstein等人(1996)FEBS Letters 381：87-92公布了编码拟南芥S-腺苷-L-甲硫氨酸-固醇-C24-甲基转移酶的核酸序列。植物中的生育酚生物合成

植物生育酚生物合成途径能分为四部分：

1.由莽草酸途径衍生的对羟苯丙酮酸形成尿黑酸，这产生生育酚的芳环；

2.由类异戊二烯途径合成植基焦磷酸，这产生生育酚的侧链，和植基部分向芳环的异戊烯基转移；

3.环化，在维生素E家族的手性和色原烷醇亚结构中起主要作用；

4.芳环的S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基化，这决定产生的维生素E家族的组成质量(α-、β-、γ-或δ-母育酚)。

不同地参与这些生物化学步骤的酶如下。

1)尿黑酸的合成

尿黑酸众所周知是叶绿体中生育酚生物合成的芳族前体，由芳族莽草酸代谢物对羟苯丙酮酸形成。芳族氨基酸苯丙氨基、酪氨酸和色氨酸由一种反应序列形成，由两个碳水化合物前体D-赤藓糖4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸通过莽草酸进一步产生前芳族和芳族化合物(Bentley1990生物化学与分子生物学评述(Critical Rev.Biochem.Mol.Biol.)25：307-384)。绿色植物固定的总碳的约20％是通过莽草酸途径，终产物是芳族氨基酸和其他芳族二级代谢物，如类黄酮、维生素、木质素、生物碱和酚(Herrmann1995，植物生理学107：7-12，Kishore和Shah 1988，生物化学年述57：67-663)。莽草酸途径的不同方面已经综述(Bentley 1990，生物化学与分子生物学评述25：307-384，Herrmann 1995，植物生理学107：7-12，Kishore和Shah 1988，生物化学年述57：67-663)。

莽草酸途径中的第一个定向反应由3-脱氧-D-阿糖基-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHP合酶，EC 4.1.2.15)催化，它控制向莽草酸途径中的碳流。定位于质体的DAHP合酶催化通过缩合D-赤藓糖-4-磷酸与磷酸烯醇丙酮酸形成3-脱氧-D-阿糖基-庚酮糖酸-7-磷酸。该酶已从植物来源包括胡萝卜和马铃薯中分离并很好表征，对D-赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸有最高底物特异性，是Mr＝53000亚基的二聚体，由Mg²⁺激活(Herrmann 1995，植物生理学107：7-12，770)。芳族氨基酸不是反馈调节剂：纯化的酶由色氨酸激活，酪氨酸以一种疯狂的方式较低程度地激活(Suzich等人，1985，植物生理学79：765-770)。

莽草酸途径中的下一种酶3-脱氢奎尼酸合酶(EC 4.6.1.3)催化由D-赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸形成脱氢奎尼酸——芳族氨基酸生物合成中的第一个碳环型代谢物。该酶反应包括NAD辅因子依赖的氧化还原、β-消除和分子内羟醛缩合。3-脱氢奎尼酸合酶已从Phaseolusmungo幼苗和豌豆幼苗中提纯，二聚体亚基具有66000的天然分子量(Yamamoto，1980，植物化学19：779，Pompliano等人，1989，美国化学学会杂志111：1866)。

3-脱氢奎尼酸脱水酶(EC 4.2.1.10)催化脱氢奎尼酸向脱氢莽草酸的立体特异的共脱水，通过引入芳环系统三个双键的第一个负责起始芳构化过程。3-脱氢奎尼酸脱水酶尚未在植物来源中深入研究，但已经从大肠杆菌中克隆(Duncan等人，1986，生物化学杂志238：485)。

莽草酸脱氢酶(EC 1.1.1.25)催化脱氢莽草酸盐向莽草酸盐的NADPH-依赖的转化。双功能脱氢奎尼酸脱水酶(EC 4.2.1.10)-莽草酸脱氢酶已经在菠菜、豌豆幼苗和玉米中较好研究(Bentley 1990，生物化学与分子生物学评述25：307-384，Kishore和Shah 1988，生物化学年述57：67-663)。大肠杆菌酶是一种Mr 32000的单体、单功能蛋白质(Chaudhuri和Coggins，1985，生物化学杂志226：217-223)。

莽草酸激酶(EC 2.7.1.71)催化莽草酸盐向莽草酸-3-磷酸的磷酸化。莽草酸激酶在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)中以同工型存在，植物莽草酸激酶只是从绿豆和高粱中部分提纯(Bentley 1990，生物化学与分子生物学评述25：307-384，Kishore和Shah 1988，生物化学年述57：67-663)。

5-烯醇丙酮基-莽草酸-3-磷酸合酶催化磷酸烯醇丙酮酸的羧基乙烯基部分向莽草酸-3-磷酸的可逆转移，产生5-烯醇丙酮基-莽草酸-3-磷酸，并且是芳族途径中表征最多的酶之一。5-烯醇丙酮基-莽草酸-3-磷酸合酶被认为相当重要，因为该酶是广谱、非选择性、萌后除草剂草甘膦的主要目标。化学修饰研究表明，Lys、Arg和His残基是酶活性所必需的(Kishore和Shah 1988，生物化学年述57：67-663)。

5-烯醇丙酮基-莽草酸-3-磷酸合酶已经从微生物和植物来源包括番茄、牵牛花、拟南芥和芸苔中分离，并且化学和动力学表征(Kishore和Shah 1988，生物化学年述57：67-663)。

分支酸合酶(EC 4.6.1.4)催化5-烯醇丙酮基-莽草酸-3-磷酸向分支酸的转化，并在无机磷的反式-1，4-消旋中引入芳环的第二个双键。分支酸是芳族化合物经莽草酸途径生物合成的最后一个共同中间物。对于植物分支酸合酶所知极少。尽管该酶促反应不引起底物氧化态的改变，但不同来源的分支酶合酶在因催化活性需要还原的黄素辅因子FMNH₂或FADH₂中不平常(Bentley 1990，生物化学与分子生物学评述25：307-384，Kishore和Shah 1988，生物化学年述57：67-663)。

生育酚生物合成途径的下一种酶是分支酸变位酶(EC 5.4.99.5)，它催化分支酸向预苯酸的转化。分支酸是参与芳族化合物生物合成的多种酶的底物。植物分支酸变位酶以两种同工型存在：分支酸变位酶-1和分支酸变位酶-2，它们在芳族氨基酸反馈调节方面不同(Singh等人，1985，生物化学与生物物理学学报243：374-384，Goers等人，1984，植物162：109-116，和117-124)。有人提议，叶绿体分支酸变位酶-1可能在芳族氨基酸生物合成中起中心作用，因为该酶被Tyr和Phe激活。胞质同工酶分支酸变位酶-2不被芳族氨基酸调节，可在为芳族次级代谢物包括生育酚提供芳基核中起作用(d’Amato等人，1984，植物162：104-108)。

从预苯酸分支是广泛的，不仅产生Phe和Tyr，而且产生大量次级代谢物。酪氨酸由预苯酸酯通过4-羟苯基丙酮酸或arogenate合成。这两种途径都已在植物中确定，但通过arogenate参与酪氨酸生物合成的酶尚未克隆或纯化为同质(Bentley 1990，生物化学与分子生物学评述25：307-384)。

由预苯酸根形成4-羟苯基丙酮酸由预苯酸脱氢酶(EC 1.3.1.12(NAD特异的)和EC 1.3.1.13(NADP特异的))催化。

用于生育酚生物合成的4-羟苯基丙酮酸也可通过酪氨酸转氨酶(EC 2.6.1.5)或L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)来源于酪氨酸集合。酪氨酸转氨酶催化L-酪氨酸向4-羟苯基丙酮酸的吡哆醛-磷酸-依赖的转化。该可逆酶促反应将酪氨酸的氨基转移给2-酮戊二酸，形成4-羟苯基丙酮酸和谷氨酸。L-氨基酸氧化酶催化酪氨酸向4-羟苯基丙酮酸的转化，作用于酪氨酸的氨基，以氧作为受体。该酶对酪氨酸非特异。在大肠杆菌中，可将4-羟苯基丙酮酸转化为酪氨酸的芳族氨基酸氨基转移酶(EC 2.6.1.57)在Phe和Tyr生物合成中起主要作用。Asp氨基转移酶或转氨酶A(EC 2.6.1.1)具有广泛特异性，将利用对羟苯丙酮酸的苯基丙酮酸分别形成Phe和Tyr。

前体分子尿黑酸由莽草酸途径中间物对羟苯丙酮酸产生。对羟苯丙酮酸双加氧酶(EC 1.13.11.27)催化由羟苯基丙酮酸盐通过底物2-酮酸侧链的氧化脱羧形成尿黑酸盐，伴随有芳环的羟基化和羧基甲基的1，2-迁移。Norries等人报道，确定pdsI基因功能编码对羟苯丙酮酸双加氧酶(Norries等人，1995，植物细胞7：2139-2149)。对羟苯丙酮酸双加氧酶已经从拟南芥和胡萝卜中克隆(GenBank保藏号U89267，AF000228，U87257)。Fiedler等人报道了该酶在分离的菠菜叶绿体和过氧化物酶体中的定位和存在(Fiedler等人，1982，植物，155：511-515)。Garcia等人从培养的胡萝卜叶绿体中提纯并克隆了细胞质形式的羟苯基丙酮酸双加氧酶(Garcia等人，1997，生物化学杂志325：761-769)。这些报道提示，在叶绿体和过氧化物酶体中存在两种形式的羟苯基丙酮酸双加氧酶；叶绿体同工型参与异戊二烯醌的生物合成，过氧化酶体和细胞质同工型参与酪氨酸的降解。

2)植基焦磷酸盐的合成和向尿黑酸盐的植基/异戊烯基转移

向植醇的碳流通过质体、非甲羟戊酸(Rohmer)和细胞质、甲羟戊酸途径发生。垅牛儿基垅牛儿焦磷酸合酶(EC 2.5.1.29)催化通过异戊二烯部分的缩合形成垅牛儿基垅牛儿焦磷酸酯。编码垅牛儿基垅牛儿焦磷酸合酶的基因已经从拟南芥和Cantharanthus roseus中克隆(Zhu等人，1997，植物细胞生理学38：357-361；Bantignies等人，1995，植物生理学110：336-336)。合成该酶的垅牛儿基垅牛儿焦磷酸酯集合物分开用于类胡萝卜素和生育酚生物合成，以及用于其他类异戊二烯化合物。

垅牛儿基垅牛儿焦磷酸酯的NADPH-依赖的氢化由垅牛儿基垅牛儿焦磷酸氢化酶催化(EC号不可获得，也称为垅牛儿基垅牛儿焦磷酸还原酶)，形成植基焦磷酸酯(Soll等人，1983，植物生理学71：849-854)。该酶似乎位于两个部位：一个是叶绿体外被，用于垅牛儿基垅牛儿焦磷酸酯氢化为植基部分，另一个位于类囊体，用于垅牛儿基垅牛儿醇酯化的叶绿素逐步还原为植醇酯化的叶绿素。位于叶绿体外被的垅牛儿基垅牛儿焦磷酸氢化酶已知在生育酚和叶绿醌合成中起作用。通过在类球红细菌(Rhodobactor sphaeroides)中互补，已经将从集胞蓝细菌属中克隆的Chlp基因功能确定为催化垅牛儿基垅牛儿醇向植醇部分的逐步氢化(Addlesse等人，1996，FEBS Lett.389：126-130)。

尿黑酸：植基转移酶(EC号不可获得)催化尿黑酸的脱羧，随后与植基焦磷酸酯植醇部分缩合，形成2-甲基-6-植基-苯并醌醇。在菠菜叶绿体中已经证明了该异戊烯基转移酶活性的存在，该活性被认为位于叶绿体被膜中(Fiedler等人，1982，植物，155：511-515)。一种可能的异戊烯基转移酶基因，被称为pdsII突变体，对生育酚生物合成特异，已由Norris等人从T-DNA-标记的拟南芥群体中鉴定(Norris等人，1995，植物细胞7：2139-2149)。

3)环化

生育酚环化酶催化2，3-二甲基-5-植基-苯并醌醇的环化，形成γ-生育酚，并在维生素E家族对映选择性色原烷醇亚结构的生物合成中起主要作用(Stocker等人，1996，生物组织医学化学(Nioorg.Medic.Chem.)4：1129-1134)。关于其底物特异性，还不清楚该酶是优选2，3-二甲基-5-植基苯并醌醇还是2-甲基-6-植基苯并醌醇。如果该酶对前一底物特异，则由异戊烯基转移酶形成的2-甲基-6-植基苯并醌醇在环化之前需要用S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶甲基化。生育酚环化酶已经从绿藻Chlorella protothecoides和盐生杜氏藻(Dunaliella salina)和小麦叶中提纯(美国专利5,432,069)。

4)甲基化

由2-甲基-6-植基苯并醌醇合成γ-生育酚通过两种途径发生，以δ-生育酚或2，3-二甲基-5-植基苯并醌醇为中间物。然后在用S-腺苷甲硫氨酸的最后甲基化步骤中，由γ-生育酚合成α-生育酚。α-生育酚生物合成的所有步骤都位于高等植物的叶绿体膜中。由其他生育酚产生α-生育酚由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖的γ-生育酚甲基转移酶(EC2.1.1.95)引发。该酶已经从辣椒属(Capsicum)和纤细裸藻(Euglenagracilis)中部分提纯(Shigeoka等人，1992，生物化学与生物物理学学报1 128：220-226，d’Harlingue和Camara，1985，生物化学杂志260：15200-15203)。生育三烯酚的生物合成

生育三烯酚除在类异戊二烯侧链中存在三个双键外，在分子结构上类似于生育酚。尽管生育三烯酚在大豆中不可检测，但它们广泛分布于植物王国中。生育三烯酚生物合成途径类似于生育酚，直到尿黑酸的形成；随后的产生生育三烯酚的生物合成途径不知。两种可能性之一是，植基/异戊烯基转移酶能向尿黑酸转移GGPP(垅牛儿基垅牛儿焦磷酸盐)，另一种可能性是，在向尿黑酸盐中加入植基焦磷酸盐后侧链去饱和。然而，Stocker的研究的证据表明，侧链双键的还原在生物合成早期阶段发生，即，植基焦磷酸盐或GGPP(垅牛儿基垅牛儿焦磷酸盐)与HGA(尿黑酸)缩合，产生不同的氢醌前体，它们可被同一酶环化(Stocker，A.，Fretz，H.，Frick，H.，Ruttimann和Woggon，W.-D.生物组织医学化学1996，4：1129-1134)。生育酚的分解代谢

植物中生育酚的分解代谢还未充分研究，没有表征该分解代谢途径中的酶。在人类中，摄取的生育酚在肝脏中代谢。生育酚的初级氧化产物是生育酚醌，它能在预先还原为氢醌之后结合产生葡糖醛酸盐。葡糖醛酸盐能分泌到胆汁中，或者在肾脏中进一步分解代谢为生育酸，并加工用于尿排泄(Traber和Sies，营养学年述(Ann.Rev.Nutr.1996：16：321-347))。

在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中，芳族氨基酸分解代谢包括尿黑酸的形成，随后是尿黑酸双加氧酶(EC 1.13.11.5)对芳环的切割，在异构化步骤后产生延胡索酰乙酰乙酸，它被延胡索酰乙酰乙酸酶分解(Fernandez-Canon和Penalva，1995，生物化学杂志270：21199-21205)。尿黑酸双加氧酶使用重要的生育酚生物合成代谢物尿黑酸进行水解。因此，以反义模式使用该基因能用来提高尿黑酸集合。生育酚生物合成的调节

生育酚水平在不同植物、组织和发育阶段不同，表明是一种高度调节的生物合成途径。对羟苯丙酮酸双加氧酶产生尿黑酸可能是通过该途径的大流量的一个关键调节点，因为不可逆酶作用，并且因为尿黑酸产生是生育酚生物合成中的第一个定向步骤(Norris等人，1995，植物细胞7：2139-2149)。生育酚生物合成中的其他关键调节步骤是植基焦磷酸盐集合的可用性。红花愈伤组织中的饲养研究(Fury等人，1987，植物化学26：2741-2747)证明供给尿黑酸盐和植醇分别使生育酚生物合成提高1.8倍和18倍。在草地拯救叶中，在叶衰老的最初阶段，当从叶绿素中去除植醇，和可获得游离植醇时，维生素E增多(Peskier等人，1989，植物生理学杂志135：428-432)。这些报道提示生育酚生物合成与尿黑酸和植醇可用性的紧密偶联。

表2中列出了参与生育酚生物合成的酶的概述。

                          表2

               生育酚生物合成途径的酶

               酶                          EC号3-脱氧-D-阿糖基-庚酮糖酸-7-P合酶(DAHP         4.1.2.15合酶)3-脱氢奎尼酸合酶                              4.6.1.33-脱氢奎尼酸脱水酶                            4.2.1.10莽草酸脱氢酶                                  1.1.1.25莽草酸激酶                                    2.7.1.715-烯酰丙酮酰-莽草酸-3-P-合酶(EPSPS)           2.5.1.19分支酸合酶                                    4.6.1.4分支酸变位酶                                  5.4.99.5预苯酸脱氢酶                                  1.3.1.12预苯酸脱氢酶                                  1.3.1.13酪氨酸转氨酶                                  2.6.1.5芳族氨基酸转氨酶                              2.6.1.57转氨酶A                                       2.6.1.1L-氨基酸氧化酶                                1.4.3.24-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPD或OHPP)             1.13.11.27尿黑酸双加氧酶                               1.13.11.5垅牛儿基垅牛儿焦磷酸合酶(GGPP合酶)           2.5.1.29垅牛儿基垅牛儿焦磷酸氢化酶(GGH)              无EC号尿黑酸：植基转移酶(植基/异戊烯基转移酶)      无EC号2-甲基-6-植基苯并醌醇甲基酶                  无EC号生育酚环化酶                                 无EC号S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖的γ-生育酚甲         2.1.1.95基转移酶(GTMT或生育酚O-甲基转移酶)

编码以上表2列出的酶的核酸(基因组DNA、质粒DNA、cDNA、合成DNA、mRNA等)或纯化的酶的氨基酸序列，其允许设计核酸探针以利于其DNA编码序列的分离，在本领域中周知，并可用于本发明的方法，如表3列出的GenBank保藏所示。

                         表31.DAHP合酶(EC 4.1.2.15)拟南芥3-脱氧-D-阿糖基-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DHS1)mRNA，完整cdsgi|166687|gb|M74819大肠杆菌DAHP合酶(Tyr)aroF基因，完整编码序列gi|145361|gb|K01989酿酒酵母DAHP合酶(EC 4.1.2.15)aro4基因gi|416186|emb|X611072.3-脱氢奎尼酸合酶(EC 4.6.1.3)铜绿假单胞菌脱氢奎尼酸合酶(aroB)基因，部分cdsgi|309861|gb|L13886大肠杆菌3-脱氢奎尼酸合酶(EC 4.6.1.3)aroB基因gi|40967|emb|X038673.3-脱氢奎尼酸脱水酶(4.2.1.10)烟草(克隆：SP-3)脱氢奎尼酸脱水酶/莽草酸脱氢酶(aroD-E)mRNA，3’端gi|535770|gb|L32794淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)脱氢奎尼酸脱水酶(aroD)基因和recA基因，部分cdsgi|143313|gb|U398034.莽草酸脱氢酶(EC 1.1.1.25)大肠杆菌莽草酸脱氢酶(EC 1.1.1.25)aroE基因gi|40977|emb|Y00710脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)莽草酸脱氢酶(aroE)基因，完整cdsgi|1785881|gb|U828355.莽草酸激酶(EC 2.7.1.71)大肠杆菌莽草酸激酶I(aroK)基因，完整cdsgi|662834|gb|L39822大肠杆菌莽草酸激酶II(EC 2.7.1.71)aroL基因L.esculentum莽草酸激酶前体mRNAgi|19348|emb|X635606.EPSPS合酶(EC 2.5.1.19)牵牛花5-烯酰丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)基因，5’端gi|69212|gb|M37029大肠杆菌5-烯酰丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶，EC 2.5.1.19，另一名称为3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基转移酶)aroA基因gi|40965|emb|X00557芸苔5-烯酰丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因gi|17814|emb|X51475玉蜀黍EPSP合酶mRNAgi|1524382|emb|X633747.分支酸合酶(EC 4.6.1.4)L.esculentum分支酸合酶2前体gi|410483|emb|Z21791L.esculentum分支酸合酶1前体gi|410481|emb|Z21796大肠杆菌分支酸合酶(EC 4.6.1.4)aroC基因gi|40969|emb|Y007208.分支酸变位酶(5.4.99.5)拟南芥分支酸变位酶mRNAgi|429152|emb|Z26519大肠杆菌分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(pheA)基因，cds的5’端，和前导肽，完整cdsgi|147178|gb|M580249.预苯酸脱氢酶(1.3.1.12和1.3.1.13)草生欧文菌(Erwinia herbicola)预苯酸脱氢酶(tyrA)基因，部分cdsgi|415009|gb|M7413510.酪氨酸转氨酶(2.6.1.5)编码氨基转移酶的大肠杆菌K12tyrB基因，完整cdsgi|148084|gb|M12047人类(H.Sapiens)酪氨酸转氨酶mRNAgi|37501|emb|X5567511.4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(1.13.11.27)Hordeum vulgare 4-羟苯基丙酮酸双加氧酶mRNAgi|2695709|emb|AJ000693人类4-羟苯基丙酮酸双加氧酶mRNAgi|288104|emb|X72389胡萝卜(Daucus carota)4-羟苯基丙酮酸双加氧酶mRNA，完整cdsgi|2231614|gb|U87257Mycosphaerella graminicola 4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)基因，完整cdsgi|2708689|gb|AF03815212.垅牛儿基垅牛儿基脱氢酶集胞蓝细菌属PCC6803种chlp基因gi|1332618|emb|X9797213.垅牛儿基垅牛儿焦磷酸合酶(2.5.1.29)拟南芥垅牛儿基垅牛儿焦磷酸合酶mRNA，部分cdsgi|1944370|dbj|D85029草生欧文菌八氢番茄红素合酶(crtE)基因，完整cdsgi|148399|gb|M38424

除了上述之外，也应注意下列GenBank保藏：P20049、P20692、P43901、415010、683582、S52579、1653053和2634679(预苯酸脱氢酶蛋白质序列)；M74135、X78413、X60420、D90888、D90910、D89213、Z99115和AE000638(预苯酸脱氢酶核苷酸编码序列)；S10887、XNECY、XNRTY和S33857(酪氨酸转氨酶蛋白质序列)；Q00667、Q93099和2708690(4-羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白质序列)；U63008、AJ001836、U30797、Z75048、U58988和AF000573(4-羟苯基丙酮酸双加氧酶核苷酸编码序列)；JC5197和XNECY(芳族氨基酸转氨酶蛋白质序列)；A05068、XNECD、XNRTDM和XNHUDM(转氨酶A蛋白质序列)；684996、S62687、S62692和2370457(氨基酸氧化酶蛋白质序列)；Z48565、AF027868、Z99114和U78797(氨基酸氧化酶核苷酸编码序列)。PCT国际公开文本WO97/27285公开了编码拟南芥4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPD或OHPP)的cDNA。其他来源包括Fuqua等人(1991)基因109：131-136，和Ruzafa等人(1994)FEMS微生物学信件124：179-184。美国专利5,432,069公开了从Chlorella protothecoides、盐生杜氏藻和小麦叶中分离的纯化的、匀质的生育酚环化酶。

编码玉米垅牛儿基垅牛儿焦磷酸脱氢酶的DNA序列(SEQ IDNO：29)如下：GAATTCGGCTCGAGGGCGGCGGCTGCGGGTGGCGGTGGTGGGAGGCGGCCCCGCCGGTGGCGCCGCGGCGGAGGCGCTGGCCAAGGGCGGCGTGGAGACGGTGCTGATCGAGCGGAAGATGGACAACTGCAAGCCCTGCGGCGGCGCTATCCCGCTGTGCATGGTGTCGGAGTTCGACCTGCCGCTCGACCTCGTGGACCGCAAGGTGAGGAAGATGAAGATGATTTCGCCGTCCAACGTCGCCGTCGACATCGGCCGCACGCTCGCGCCCCACGAGTACATCGGGATGGTCAGGCGCGAGGTGCTCGACGCCTACCTCCGCTCACGGGCACAGTCCGTCGGCGCGGAGGTCGTCAACGGCCTCTTCCTAAGGTACGAGGCGCCCAAAGAGCCGAACGGCTCGTACGTGGTGCACTACAACCACTACGACGGCAGCAACGGCAAGGTCGGCGGCGAGAAGCGGTCGTTCGAGGTGGACGCGATCGTGGGCGCGGACGGCGCCAACTCTCGCGTGGCCAACGACATGGGCGCGGGCGACTACGAGTACGCCATCGCGTTCCAGGAGCGCGTCAAGATCCCCGACGACAAGATGGTGTACTACGAGGAGCGCGCGGAGATGTACGTCGGCGACGACGTCTCTCCCGACTTCTACGGCTGGGTGTTCCCCAAGTGCGACCACGTCGCCGTCGGCACCGGCACCGTCACGCACAAGGCCGACATCAAGAAGTTTCAGGCCGCCACGCGCCTCCGCGCCAAGGACAAGATTGAGGGCGGCAAGATCATCCGCGTCGAGGCGCACCCCATCCCCGAGCACCCCAGGCCTAAGAGGGTGTCCGGGCGGGTGACGCTTGTGGGCGATGCCGCGGGGTACGTGACCAAGTGCTCTGGCGAGGGCATCTACTTCGCGGCGAAGAGCGGGCGGATGTGCGCCGAGGCCATCGTGGCGGGCTCCGCCAACGGGACGCGGATGGTGGAGGAGAGCGACCTGCGCAAGTACCTGGCCGAGTTCGACCGCCTCTACTGGCCCACTTACAAGGTGCTGGACATCCTGCAGAAGGTGTTCTACCGCTCCAACGCGGCGCGCGAGGCCTTCGTGGAGATGTGCGCCGACGACTACGTGCAGAAGATGACCTTCGACAGCTACCTCTACAAGCGCGTCGTGCCGGGCAACCCGCTCGACGACATCAAGCTCGCCGTCAACACCATCGGCAGCCTCGTCAGGGCCACCGCACTGCGCCGGGAGATGGAGAAGGTCACCTTGTGAGCCGCCGCCCGCCACCTCATTGCCGTCGAAATGGTGTCGCAGCTGATCGGCCGGTGTATTAGTAGAGATTTGCGGCTGATCGGGTTAATTTAGGCCAACATGCGTGGGCAGTGGGCGCGGAGAGGAAGAGAAACAAGTTGTGCAAGTGCAGCAAGTAGATCAAAAGTGCTGCCTGTTTGTATCGATGGATCCTGCAACATATAGCATCTGGIGATGTTGAGAATTCGGAGCAGTTCATCGACTGGATTCTGACGCCGGCAAGCATCGACGTCAATGAATGTCTAATACTTAGTACATCAAGACATGTAATAAAACTGAAACTCCCCCGTTCTGGTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC由SEQ ID NO：29推断的氨基酸序列是：LRVAVVGGGPAGGAAAEALAKGGVETVLIERKMDNCKPCGGAIPLCMVSEFDLPLDLVDRKVRKMKMISPSNVAVDIGRTLAPHEYIGMVRREVLDAYLRSRAQSVGAEVVNGLFLRYEAPKEPNGSYVVHYNHYDGSNGKVGGEKRSFEVDAIVGADGANSRVANDMGAGDYEYAIAFQERVKIPDDKMVYYEERAEMYVGDDVSPDFYGWVFPKCDHVAVGTGTVTHKADIKKFQAATRLRAKDKIEGGKIIRVEAHPIPEHPRPKRVSGRVTLVGDAAGYVTKCSGEGIYFAAKSGRMCAEAIVAGSANGTRMVEESDLRKYLAEFDRLYWPTYKVLDILQKVFYRSNAAREAFVEMCADDYVQKMTFDSYLYKRVVPGNPLDDIKLAVNTIGSLVRATALRREMEKVTL^*AAARDVIAVEMVSQLIGRCISRDLRLIGLI^*ANMRGQWARRGRETSCASAASRSKVLPVCIDGSCNI^*HLVMLRIRSSSSTGF^*RRQASTSMNV^*YLVHQDM^**N^*NSPVLVQKKKKKKKKKKKGGR(SEQ ID NO：30)

SEQ ID NO：29的DNA序列能在本发明所述的任何植物中使用，特别可用于生育酚水平的改变。除了上述固醇化合物和生育酚生物合成酶DNA编码序列外，本发明中有用的DNA编码序列可来源于藻类、真菌、细菌、哺乳动物来源、植物等。用对应于酶活性位点的签名序列同源性检索现有数据库，能用来从其他来源如植物和微生物中分离相当的、相关的基因。也能使用EST数据库检索。此外，本发明也包括使用编码此处公开的酶的DNA序列，或编码与目前公开的酶酶促功能相当的酶的DNA。例如由于遗传密码简并性是此处公开的核酸序列简并类似物的DNA序列。用这些方法任一鉴定的编码序列的功能性能通过缺乏特异生物化学反应或已被突变的适当生物如集胞蓝细菌属、希瓦氏菌属(Shewanella)、酵母、假单胞菌属、红细菌属(Rhodobacteria)等的突变体的互补进行证明。为在特定宿主中最大表达，根据密码子使用，能通过基因重新合成优化DNA编码区的序列。

本发明也包括与此处公开的序列生物功能相当的核苷酸序列，其编码目前公开的酶的氨基酸序列内的保守氨基酸改变，产生“沉默”改变。这些核苷酸序列含有相对于编码此处公开的酶的核苷酸序列，根据遗传密码的相应的碱基置换。此处公开的酶序列内的氨基酸置换能选自天然存在的氨基酸所属的其他类成员。氨基酸能分为下列四组：(1)酸性氨基酸；(2)碱性氨基酸；(3)中性极性氨基酸；和(4)中性非极性氨基酸。这些不同组的代表性氨基酸包括但不限于：(1)酸性(带负电的)氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电的)氨基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；和(4)中性非极性氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。

用允许酶过量表达的结构DNA编码序列转化植物——其可增加有助于生育酚和生育三烯酚的生育酚和植醇部分的底物库，能用来提高生育酚途径的生物合成活性，并能提高特定生育酚异构体如α-生育酚等的产量。例如，一个目的在于在植物的积累油组织中表达可提高形成尿黑酸盐和植醇的碳流量的编码序列，以及编码甲基转移酶的序列。由其他生育酚产生α-生育酚通过S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖的甲基转移酶如γ-生育酚甲基转移酶发生。甲基转移酶的过量表达与此处所述的其他方法结合也为本方法所涉及。因此，上述编码生育酚生物合成途径的酶的任何DNA均可在本发明中使用。用早期生育酚生物合成基因转化植物足以产生含有水平升高的生育酚的种子。“早期生育酚生物合成基因”是指编码垅牛儿基垅牛儿焦磷酸合酶、垅牛儿基垅牛儿焦磷酸氢化酶、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶和植基/异戊烯基转移酶的DNA。编码在生育酚生物合成后期步骤中有活性的酶的DNA(“次级生育酚生物合成基因”)能够表达，以进一步提高通过生育酚途径的碳流量，并产生特异的生育酚异构体。这样，生育酚生物合成途径能得以改变，提高任一目的生育酚化合物如α-生育酚的产量。如上所述，多种来源可用于早期生育酚生物合成基因(和其他生育酚生物合成基因)，并能使用来自任何这些来源的基因。如果当用靶宿主植物天然的植物基因提高特定酶的表达时发生共抑制，能用来自另一来源的编码序列作为备选物。

能从种子中提取含有用此处公开的方法生产的生育酚的油，从而提供有价值的生育酚来源。此外，生育酚水平升高的种子，或生育酚水平升高的果实和植物，能直接使用。用于导入植物中改变生育酚含量/质量的优选基因包括3-脱氧-D-阿糖基-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHP合酶)、莽草酸激酶、预苯酸脱氢酶的任一种或两种、4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(OHPP或HPD)、γ-生育酚甲基转移酶(GTMT)、垅牛儿基垅牛儿焦磷酸合酶(GGPP合酶)、植基/异戊烯基转移酶、2-甲基-6-植基苯并醌醇甲基酶和生育酚环化酶。4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶和垅牛儿基垅牛儿焦磷酸氢化酶将分别提高尿黑酸盐和植醇集合。众所周知，控制通过途径的流量的酶在高等生物如植物中受到调节。因此，在植物中未受调节的微生物来源的4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶和垅牛儿基垅牛儿焦磷酸氢化酶基因，或解除调节的来自高等生物(植物、藻类、真菌等)的基因，在这方面特别有吸引力。如3-脱氧-D-阿糖基-庚酮糖酸-7-P(DAHP)合酶、预苯酸脱氢酶和莽草酸激酶的酶的表达将导致尿黑酸盐水平的提高。编码此处所述的任一种生育酚生物合成酶的DNA能单独或以不同组合导入，来提高生育酚含量和/或改变生育酚质量。当希望导入多种酶时，优选的组合包括但不限于：4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(OHPP或HPD)加垅牛儿基垅牛儿焦磷酸氢化酶(GGH)，和垅牛儿基垅牛儿焦磷酸合酶(GGPP合酶)加垅牛儿基垅牛儿焦磷酸氢化酶(GGH)。

为了提高生育三烯酚水平，反义垅牛儿基垅牛儿焦磷酸氢化酶能导致增多的垅牛儿基垅牛儿焦磷酸盐集合。这样增多的垅牛儿基垅牛儿焦磷酸盐集合能被植基/异戊烯基转移酶使用，提高生育三烯酚的产量。产生水平改变的固醇和生育酚化合物的转基因植物的产生

谷甾烷醇、谷甾烷醇酯和生育酚在植物中的生物合成和积累能按照本发明，如此处所述，通过单独或组合表达上述核酸编码序列而改变。编码固醇甲基转移酶的序列的表达促进植物的产生，其中菜油甾醇、菜油甾烷醇及其酯可减少，因为这些酶使固醇中间物远离菜油甾醇，而转向谷甾醇和谷甾烷醇。注意植物中的方案1，步骤18。其方法在以下讨论。

植物载体

在植物中，能导入参与固醇化合物和生育酚生物合成的编码DNA的转化载体易于设计，一般含有一种或多种处于5’和3’调节序列转录控制下的目的DNA编码序列。这些载体一般含有序列以5’至3’方向有效连接的一种启动子序列，其引导植物中下游异源结构DNA的转录；任选地，5’非翻译前导序列；编码目的蛋白质的核苷酸序列；和3’非翻译区，其编码在植物细胞中起作用的聚腺苷酸化信号，引起转录终止和向编码该蛋白质的mRNA的3’端添加聚腺苷酸核苷酸。植物转化载体一般也含有一种选择性标记。5’-3’调节序列一般包含一个转录起始位点，一个核糖体结合位点，一个RNA加工信号，一个转录终止位点，和/或一个聚腺苷酸化信号。植物转化载体已经在Rodriguez等人(1988)《载体：分子克隆载体及其应用概述》，Butterworths，Boston；Glick等人(1993)《植物分子生物学和生物技术方法》，CRC出版社，Boca Raton，Fla；和Croy(1993)《植物分子生物学实验室传真》Hames和Rickwood编，BIOS Scientific Publishers Limited，Oxford，UK。本发明中有用的植物转化载体的非限制性实例包括pMON30423、pMON29141、pMON43007、pMON5139和pMON43011，分别在图1-5中列出。

靶组织

用于增加生产固醇化合物如谷甾醇、谷甾醇酯、谷甾烷醇、谷甾烷醇酯和生育酚，和减少生产菜油甾醇、菜油甾烷醇及其酯的合适的植物靶组织包括但不限于：果实、花、种子、根、块茎、叶、茎、芽和植物的其他植物部分。在种子中，合适的器官区室包括胚芽、胚乳和糊粉层。在所指的任何靶组织中，合适的细胞区室包括但不限于细胞质和质体(例如原质体、叶绿体、色质体、白色体、造粉体等)。

启动子

本发明中有用的启动子包括提供表达的适当的细胞和时间特异性的启动子。这些启动子包括组成型或诱导型的，环境或发育调节的，或细胞器、细胞或组织特异的。

常用的组成型启动子包括CaMV35S启动子(Odell等人(1985)自然，313：810)、增强的CaMV 35S启动子、玄参花叶病毒(FMV)启动子(Richins等人(1987)NAR 20：8451)、甘露氨酸合酶(mas)启动子、胭脂氨酸合酶(nos)启动子，和章鱼氨酸合酶(ocs)启动子。

有用的诱导型启动子包括热休克启动子(Ou-Lee等人(1986)美国国家科学院院报83：6815；Ainley等人(1990)植物分子生物学14：949)、来自菠菜亚硝酸盐还原酶基因的硝酸盐诱导的启动子(Back等人(1991)植物分子生物学17：9)、激素诱导的启动子(Yamaguchi-Shinozaki等人(1990)植物分子生物学15：905；Kares等人(1990)植物分子生物学15：905)，和与RuBP羧化酶和LHCP基因家族小亚基有关的光诱导型启动子(Kuhlemeier等人(1989)植物细胞1：1471；Feinbaum等人(1991)分子普通遗传学226：449；Weisshaar等人(1991)EMBO J.10：1777；Lam和Chua(1990)科学248：471；Castresana等人(1988)EMBO J.7：1929；Schulze-Lefert等人(1989)EMBO J.8：651)。

有用的组织特异性、发育调节的启动子的实例包括：果实特异的启动子，如E4启动子(Cordes等人(1989)植物细胞1：1025)、E8启动子(Deikman等人(1988)EMBO J.7：3315)、猕猴桃碱启动子(Lin等人(1993)PNAS 90：5939)、2A11启动子(Houck等人，美国专利4,943,674)和番茄pZ130启动子(美国专利5,175,095和5,530,185)；β-conglycinin 7S启动子(Doyle等人(1986)生物化学杂志261：9228；Slighton和Beachy(1987)植物(Planta)172：356)，和种子特异的启动子(Knutzon等人(1992)美国国家科学院院报89：2624；Bustos等人(1991)EMBO J.10：1469；Lam和Chua(1991)生物化学杂志266：17131；Stayton等人(1991)澳大利亚植物生理学杂志(Aust.J.Plant Physiol.)18：507)。美国专利5,753,475中叙述了果实特异的基因调节。其他有用的种子特异的启动子包括但不限于：napin、云扁豆蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、7S、ADR12、ACP、硬脂酰-ACP去饱和酶、油质蛋白、Lasquerella羟化酶和大麦醛醣还原酶启动子(Bartels(1995)植物杂志7：809-822)、EA9启动子(美国专利5,420,034)和Bce4启动子(美国专利5,530,194)。有用的胚芽特异的启动子包括玉米球蛋白1和油质蛋白启动子。有用的胚乳特异的启动子包括水稻谷蛋白-1启动子、低pIα-淀粉酶基因启动子(Amy32b)(Rogers等人(1984)生物化学杂志259：12234)、高pIα-淀粉酶基因启动子(Amy64)(Khurseed等人(1988)生物化学杂志263：18953)和大麦硫醇蛋白酶基因启动子(“aleurain”)(Whittier等人(1987)核酸研究15：2515)。用于在种子质体中优先表达的植物功能启动子包括来自植物贮藏蛋白基因和含油种子中参与脂肪酸生物合成的基因的启动子。这些启动子的例子包括来自这些基因如napin(Kridl等人(1991)种子科学研究(Seed Sci.Res.)1：209)、云扁豆蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、ACP、硬脂酰-ACP去饱和酶和油质蛋白的5’调节区。EP 0 255 378 B1和美国专利5,420,034和5,608,152中叙述了种子特异的基因调节。启动子杂种被认为也能提高转录活性(Hoffman，美国专利号5,106,739)，或结合希望的转录活性与组织特异性。

植物转化和再生

能使用多种不同方法向植物原生质体、细胞、愈伤组织、叶盘、分裂组织等中导入转化/表达载体，产生转基因植物。这些方法包括，例如：农杆菌介导的转化、粒子枪运送、显微注射、电穿孔、聚乙二醇介导的原生质转化、脂质体介导的转化等(综述见Potrykus(1991)植物生理学与植物分子生物学年报(Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.)42：205)。

通常，包含含有并表达此处所述的促进固醇化合物和生育酚生物合成改变的核酸编码酶的细胞的转基因植物能如下产生：通过上述任一种方法用如上所述的DNA构建体转化植物细胞；在选择性培养基上筛选已被转化的植物细胞；再生已被转化的植物细胞，产生分化的植物；筛选已转化植物，它以谷甾醇、谷甾醇酯、谷甾烷醇、谷甾烷醇酯、生育酚化合物和菜油甾醇/菜油甾烷醇及其酯的量处于此处所述范围内的水平表达酶编码核苷酸序列。

能以单个转化事件(同一载体上存在的所有必需DNA)、共转化事件(被同时导入植物或植物细胞中的不同载体上存在的所有必需DNA)或通过独立的转化事件(被独立导入植物或植物细胞中的不同载体上存在的所有必需DNA)导入编码DNA。随后可用传统培育方法将希望的酶组合导入一种植物中，产生本发明的植物的杂种后代。

转化多种双子叶植物并获得转基因植物的特异方法在文献中有述(Gasser和Fraley(1989)科学244：1293；Fisk和Dandekar(1993)Scientia Horticulturae 55：5；Christou(1994)农业食品工业高技术(Agro Food Industry Hi Tech)第7页；和在此引用的参考文献)。

成功转化和植物再生已经在如下的单子叶植物中实现：芦笋(Asparagus officinalis；Bytebier等人(1987)美国国家科学院院报84：5345)；大麦(Hordeum vulgarae；Wan和Lemaux(1994)植物生理学104：37)；玉米(玉蜀黍(Zea mays)；Rhodes等人(1988)科学240：204；Gordon-Kamm等人(1990)植物细胞2：603；Fromm等人(1990)生物/技术(Bio/Technology)8：833；Koziel等人(1993)生物/技术11：194)；燕麦(Avena sativa；Somers等人(1992)生物/技术10：1589)；鸭茅(Dactylis glomerata；Horn等人(1988)植物细胞报道(Plant Cell Rep.)7；469)；水稻(Oryza sativa；包括indica和japonica变种；Toriyama等人(1988)生物/技术6：10；Zhang等人(1988)植物细胞报道7：379；Luo和Wu(1988)植物分子生物学报道6：165；Zhang和Wu(1988)理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)76：835；Christou等人(1991)生物/技术9：957)；黑麦(Secalecereale；De la Pena等人(1987)自然325：274)；高粱(Sorghumbicolor；Cassas等人(1993)美国国家科学院院报90：11212)；甘蔗(Saccharum的种；Bower和Birch(1992)植物杂志2：409)；牛尾覃(Festuca arundinacea；Wang等人(1992)生物/技术10：691)；草坪草(匍匐剪股颖(Agrostis palustris)；Zhong等人(1993)植物细胞报道13：1)；和小麦(Triticum aestivum；Vasil等人(1992)生物/技术10：667；Weeks等人(1993)植物生理学102：1077；Becker等人(1994)植物杂志5：299)。

宿主植物

对于此处所述的固醇和生育酚改变特别有吸引力的植物包括那些产生能用于这些化合物合成的碳底物的植物。这些植物的非限定性实例包括多种单子叶和双子叶植物，包括高油种子植物，如高油种子芸苔属(Brassica)(例如，幽芥(Brassica nigra)、芸苔(Brassica napus)、白芥(Brassica hirta)、芜菁(Brassica rapa)、油菜、Brassica carinata和雪里蕻(Brassica juncea))、大豆(Glycine max)、蓖麻(Ricinuscommunis)、棉花、红花(Carthamus tinctorius)、向日葵(Helianthusannuus)、亚麻(Linum usitatissimum)、玉米(玉蜀黍)、椰子(Cocosnucifera)、棕榈(油椰(Elaeis guineensis))、冠梨树如橄榄(齐墩果(Olea europaea))、芝麻和花生(Arachis hypogaea)，以及拟南芥、烟草、小麦、大麦、燕麦、苋属植物、马铃薯、水稻、番茄和豆荚科植物(例如，豌豆、菜豆、小扁豆、紫花苜蓿等)。

通过此处所述的方法提高谷甾烷醇产量预期将导致谷甾烷醇、谷甾烷醇酯或其混合物的产量为种子油中存在的总固醇化合物的至少约57％，优选地约57％-90％，更优选地约57％-65％重量百分比。以种子干重表达，谷甾烷醇、谷甾烷醇酯或其混合物预计含量为种子干重的至少约0.08％，优选地约0.08％-0.8％，更优选地约0.08％-0.4％。

通过此处所述的方法提高生育酚产量预期将导致生育酚的产量为种子干重的至少约0.02％，优选地约0.02％-0.2％，更优选地约0.02％-0.025％。

菜油甾醇、菜油甾烷醇和/或其酯的减少程度预计为正常存在的量的约10％至约100％。表达用于固醇和生育酚生物合成的酶的质体导向

通过此处所述的方法在细胞质中或在质体中表达合适的酶，能在植物中引起此处所述的固醇化合物和生育酚生物合成和积累的改变。由于在质体中具有乙酰CoA的高碳流通量，特别是在积累油植物如油菜(Brassica napus)、芸苔(芜菁，油菜，Brassica carinata和雪里蕻)、大豆(Glycine max)、亚麻(Linum usitatissimum)和向日葵(Helianthus annuus)的种子中，希望的编码DNA的基因产物向种子质体如白色体的导向，或种子质体的转化和这些编码DNA在其中的表达，是在植物中生产高水平谷甾醇/谷甾烷醇和/或其酯和生育酚化合物的有吸引力的策略。这些策略也能用来降低菜油甾醇/菜油甾烷醇和/或其酯在植物质体中的生物合成和表达。

利用植物细胞核转化构建体，能为质体导向修饰此处所述的所有酶，构建体中目的DNA编码序列与任何有效的转运肽序列融合，这些转运肽序列能促进编码的酶向植物质体中转运，并利用合适的启动子如上述任一种启动子驱动表达。通过将编码质体如叶绿体、白色体、造粉体等的DNA、转运肽序列与编码可影响这些化合物生物合成和积累的酶的DNA的5’-ATG融合，能实现参与改变固醇化合物和生育酚数量和/或质量的酶向质体的导向。编码转运肽区的这些序列可获自，例如：植物核编码的质体蛋白质，如核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(SSU)、EPSP合酶、植物脂肪酸生物合成相关基因，包括脂肪酰基-ACP硫酯酶、酰基载体蛋白(ACP)、硬脂酰-ACP去饱和酶、β-酮酰基-ACP合酶和酰基-ACP硫酯酶或LHCPII基因等。质体转运肽序列也能获自编码类胡罗卜素生物合成酶如GGPP合酶、八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素去饱和酶的核酸序列。Von Heijne等人(1991)植物分子生物学报道9：104；Clark等人(1989)生物化学杂志264：17544；della-Cioppa等人(1987)植物生理学84：965；Romer等人(1993)生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)196：1414；和Shah等人(1986)科学233：478中公开了在本发明中有用的其他转运肽序列。在本发明中有用的植物固醇化合物/生育酚生物合成酶编码序列能使用天然或异源转运肽。在运输中有效的转运肽的编码序列可包括特定转运肽的所有或部分编码序列，也可含有与特定转运肽有关的成熟蛋白质编码序列的部分。具有能用来向质体中运输靶蛋白质的转运肽的大量例子，在本发明中有用的特定转运肽编码序列不是必需的，只要能获得向质体中的运输。然后质体内的蛋白水解加工产生成熟的酶。利用参与聚羟基链烷酸酯生物合成的酶(Nawrath等人(1994)美国国家科学院院报91：12760)，和新霉素磷酸转移酶II(NPT-II)和CP4 EPSPS(Padgette等人(1995)作物科学(Crop Sci.)35：1451)，均已经证明该技术成功。

特别有意义的是来自已知将向种子白色体中输入的酶的转运肽序列。含有有用的转运肽的酶的例子包括与脂类生物合成有关的，例如质体导向的双子叶植物乙酰CoA羧化酶、生物素羧化酶、生物素羧基载体蛋白、α-羧基-转移酶、质体导向的单子叶植物多功能乙酰CoA羧化酶(Mr 220000)的亚基；脂肪酸合酶复合物的质体亚基(例如，酰基载体蛋白(ACP)、丙二酰-ACP合酶、KASI、KASII、KASIII等)；硬脂酰-ACP去饱和酶；硫酯酶(对于短、中、长链酰基ACP特异的)；质体导向的酰基转移酶(例如，甘油-3-磷酸；酰基转移酶)；参与天冬氨酸家族氨基酸生物合成的酶；八氢番茄红素合酶；赤霉酸生物合成(例如ent-贝壳杉烯合酶1和2)；和类胡罗卜素生物合成(例如番茄红素合酶)。

与目的转运肽的实际翻译融合对于蛋白质向质体中的输入可能不是最佳的。通过将所述任一种酶与自然输入蛋白质的前体形式或其C端缺失融合，预期这些翻译融合将有助于质体对工程前体蛋白质的摄取。例如，Nawrath等人((1994)美国国家科学院院报91：12760)使用一种类似的方法，产生用来向拟南芥中导入多羟基本酸生物合成基因的载体。

因此充分地预期，通过与转运肽基因序列融合，此处所述的酶向果实叶绿体或色质体、叶子叶绿体或种子质体如白色体中的导向将进一步改善在此处所述的植物组织中改变固醇化合物和生育酚生物合成和积累的体内条件。质体的转化，用于参与固醇化合物和生育酚生物合成和积累的酶的表达

此外，促进固醇化合物如谷甾烷醇和谷甾烷醇酯及生育酚生物合成和积累，并降低所述菜油甾醇、菜油甾烷醇和/或其酯的生物合成和积累的酶，通过用合适的重组表达构建体转化这些细胞器，能在质体内原位表达。稳定转化高等植物质体的构建体和方法在本领域中周知(Svab等人(1990)美国国家科学院院报87：8526；Svab等人(1993)美国国家科学院院报90：913；Staub等人(1993)EMBO J.12：601；Maliga等人，美国专利号5,451,513；Maliga等人，PCT国际公开文本WO 95/16783，WO 95/24492和WO 95/24493；和Daniell等人，美国专利号5,693,507)。这些方法一般依靠粒子枪输送除导入的用于表达的DNA序列外含有选择性标记的DNA，和通过同源重组向质体基因组中导向DNA。通过粒子枪轰击对多种不同单子叶植物和双子叶植物的转化在本领域中是常规(Hinchee等人(1994)于：《植物细胞和组织培养》I.Vasil和T.Thorpe(编)，Kluwer AcademicPublishers，荷兰，231页；Walden和Wingender(1995)TIBS 13：324)。

用于质体转化的DNA构建体一般含有一个导向片段，其包含与预定的质体基因组序列基本同源的侧翼DNA序列，该导向片段使得能通过与预定序列同源重组向质体基因组中插入目的DNA编码序列；一种选择性标记序列，如编码一种壮观霉素或链霉素抗性质体6S核糖体RNA形式的序列，或编码可灭活壮观霉素或链霉素的蛋白质的序列(如aadA基因)，置于导向片段内，其中选择性标记序列赋予植物细胞可选择表型，基本上全部质体均被该DNA构建体转化；一种或多种目的DNA编码序列，相对于选择性标记序列置于导向片段内，使得不干扰产生选择性表型。另外，质体表达构建体一般也含有一个在植物质体中起作用的启动区，和一个能终止在植物质体中转录的转录终止区，其中这些区与目的DNA编码序列有效连接。

PCT国际公开文本WO95/16783和美国专利5,576,198描述了有利于控制导入DNA编码序列在植物质体基因组中表达时限和组织模式的叶绿体转化/表达技术的进一步改良。该方法包括向植物细胞中导入用于引起病毒单亚基RNA聚合酶表达的核转化的构建体，和通过与质体转运肽融合向质体中导向该聚合酶。用含有病毒单亚基RNA聚合酶特异启动子——对于由核表达构建体表达的RNA聚合酶特异——的DNA构建体转化，允许以组织和/或发育特异的方式在包含核聚合酶构建体和质体表达构建体的植物中控制质体表达构建体。核RNA聚合酶编码序列的表达能置于组成型启动子或组织-或发育阶段-特异启动子的控制之下，从而使这种控制延伸到对质体导向、核编码病毒RNA聚合酶响应的质体表达构建体。导入的DNA编码序列可以是单一编码区，或者可含有许多表达为工程或合成操纵子的连续编码序列。在本发明中，当希望向质体中导入多基因生物化学途径时，后者特别有吸引力。该方法尚未用植物核转化技术付诸实施，因为导入的每种基因必须被构建为单顺反子，包括编码的转运肽和合适的启动子和终止子信号。个体基因表达水平可能在不同顺反子之间十分不同，因此可能负面影响总体生物合成过程。这可通过叶绿体转化方法避免。含有用于改变固醇化合物和生育酚生物合成的导入DNA序列的转基因植物的产生

通过公认的方法能容易地设计可输送编码植物衍生的或其他酶的DNA(基因组DNA、质粒DNA、cDNA或合成DNA)的植物转化载体，这些酶可影响植物中的固醇化合物和生育酚的生物合成和积累，用于优化谷甾醇、谷甾烷醇、其酯和生育酚集合，降低菜油甾醇、菜油甾烷醇和/或其酯的水平。能用不同策略向植物中导入这些编码DNA，以产生可生物合成并积累希望水平的不同固醇化合物和生育酚的转基因植物，包括：

1.用一种目的编码DNA转化个体植物。两个或多个转基因植物，均含有这些DNA之一，然后能生长并异花受粉，以产生含有这两种DNA的杂种植物。然后将杂种与其余转基因植物杂交，获得在基因组中含有所有目的DNA的杂种植物。

2.分别用含有目的编码DNA每一种的质粒连续转化植物。

3.分别用含有编码DNA每一种的质粒同时共转化植物。

4.用含有两种或多种目的编码DNA的一种质粒转化植物。

5.通过上述任何技术的组合转化植物，以获得表达希望组合的目的编码DNA的植物。

按照上述任一种方法通过连续几轮杂交产生的转化植物的传统栽培然后可进行在一种纯合植物系中掺入所有希望的编码DNA(Nawrath等人(1994)美国国家科学院院报91：12760；PCT国际公开文本WO 93/02187)，或产生杂种后代。

在方法2和3中，使用含有不同选择性标记基因的载体促进筛选含有两种或多种不同编码DNA的植物是有利的。有用的选择性标记基因的例子包括提供卡那霉素、潮霉素、磺胺、草甘膦、bialaphos和膦丝菌素抗性的基因。转基因表达的稳定性

由于产生最佳水平的固醇化合物和生育酚生物合成的底物可能需要几种过量表达的酶，共抑制现象可影响转化植物中的转基因表达。能使用几种策略避免这一潜在问题(Finnegan和McElroy(1994)生物/技术12：883)。

一种常用的方法是筛选和/或筛查含有一个完整拷贝的转基因或其他编码DNA的转基因植物(Assaad等人(1993)植物分子生物学22：1067；Vaucheret(1993)C.R.Acad.Sci.Paris，Science de la vie/lifeScience 316：1471；McElroy和Brettell(1994)TIBTECH 12：62)。在此优选农杆菌介导的转化技术。

含有位于转基因侧翼的核支架或基质附着区(MAR)可提高水平并降低与植物中转基因表达有关的变化性(Stief等人(1989)自然341：343；Breyne等人(1992)植物细胞4：463；Allen等人(1993)植物细胞5：603；Mlynarova等人(1994)植物细胞6：417；Spiker和Thompson(1996)植物生理学110：15)。用MRA元件侧翼为转基因或其他编码DNA可克服与这些转基因或编码DNA与整合位点之间的差异碱基组成有关的问题，和/或与转基因整合位点相邻的序列的不利影响。

使用来自组织特异的或发育调节基因的增强子可确保连接的转基因或其他编码DNA的表达以适当调节的方式发生。

使用启动子、质体导向序列和选择性标记的不同组合导入转基因或其他编码DNA，当希望在一种植物内不同转基因成金字塔形排列时，能避免由反式激活引起的潜在问题。

最后，通过筛选大量独立转基因植物，确定始终过量表达特定导入编码DNA的植物，能避免共抑制灭活(Register等人(1994)植物分子生物学25：951)。内源拷贝基因被替换为同一基因，但具有改变的表达特性的位点特异性重组应能避免这一问题(Yoder和Goldsbrough(1994)生物/技术12：263)。

上述任何方法都能单独或组合使用，以确保在本发明的转基因植物中转基因表达的稳定性。

下列非限定性实施例说明本发明的不同方面。

                         实施例1

        3-羟基类固醇氧化酶的种子特异过量表达

          使转基因植物种子中谷甾烷醇含量提高

为了提高目的植物种子中的谷甾烷醇水平，能用至少一种含有重组、双链DNA分子的表达盒转化植物，该分子含有以5’-3’序列有效连接的转录和翻译起始区，包含在植物细胞中起作用、引起RNA序列产生的启动子；编码3-羟基类固醇氧化酶的结构编码序列；在植物中起作用的3’转录和翻译终止区。优选的植物包括含油种子，如芸苔、玉米、棉花、向日葵和大豆。该启动子可以是种子特异的或胚芽特异的启动子，如napin、大豆7S、玉米glob1或Lesquerella羟化酶启动子，或胚乳特异的启动子，如玉米谷蛋白启动子或玉米醇溶蛋白启动子。该启动子对于结构编码序列可以是同源的或异源的。有用的3-羟基类固醇氧化酶结构编码序列的一个例子是美国专利5,518,908中公开的链霉菌A19249序列。而且，3-羟基类固醇氧化酶结构编码序列能与质体转运肽如豌豆或大豆RUBP羧化酶小亚基叶绿体转运肽融合。3’终止区可以是一种在植物细胞中起作用、导致向RNA序列3’端添加聚腺苷酸核苷酸的非翻译区，例如nos或E9终止信号。表达盒可包含于一种可有效转化植物细胞的载体如pCGN5139(图4)中。表达盒或载体能含有一种选择性标记，如抗生素抗性基因(例如，提供卡那霉素或潮霉素抗性)或除草剂抗性基因。

表达盒或载体能被导入植物原生质体、植物细胞、愈伤组织、叶盘、分生组织等，其使用本领域常规的任何方法，包括，例如：农杆菌Ti或Ri质粒介导的转化、微粒轰击、显微注射、电穿孔、可诱导游离DNA摄取的化学试剂，如聚乙二醇、脂质体介导的转化、通过病毒或花粉的转化，等等。

在导入表达盒或载体后，能在合适的选择培养基上筛选已被转化的植物细胞。在选择中存活的已转化植物细胞能再生，产生分化的植物，并能通过合适的筛选方法筛选以希望的水平表达3-羟基类固醇氧化酶活性的转化植物，例如用气相色谱法测量谷甾醇/谷甾烷醇水平，或通过使用抗3-羟基类固醇氧化酶抗体的Western印迹分析。优选的植物是如下植物，其种子产生谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物，产量为从种子提取的油的总固醇化合物的至少约57％、优选地约57％-90％、更优选地约57％-65％重量百分比。以种子的百分干重表示，优选的植物是如下植物，其产生含有谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的种子，含量为种子干重的至少约0.08％，优选地为种子干重的约0.08％-0.8％，更优选地约0.08％-0.4％。

                         实施例2

    3-羟基类固醇氧化酶与类固醇5α-还原酶共表达

       使转基因植物种子中谷甾烷醇含量提高

能按照与实施例1所述相同的方法，另外使用一种含有类固醇5α-还原酶编码DNA的表达盒或载体。这些DNA的非限定性例子有拟南芥DET2基因(Fujioka等人(1997)植物细胞9：1951-1962)，和分别来自拟南芥、玉米和大豆的cDNA(SEQ ID NO：2、4、6、8)。人类类固醇5α-还原酶的序列可从GenBank保藏号G338476获得。

通过合适的筛选方法如气相色谱法能筛选种子中含有水平提高的谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的已转化植物。优选的植物是种子以实施例所述的量产生谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的植物。

                         实施例3

        HMG-CoA还原酶(HMGR)的种子特异过量表达

         使转基因植物种子中植物甾醇含量提高

在本发明的另一个实施方案中，植物HMG-CoA还原酶的过量表达能提高植物种子中固醇化合物的水平，包括谷甾醇、谷甾烷醇、菜油甾醇、豆甾醇和每种固醇化合物的至少一种酯及其混合物。使用与实施例1相同的方法，能用含有编码显示3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶或HMGR)活性的多肽的DNA的表达盒或载体转化目的植物。来自橡胶和拟南芥的HMGR cDNA已经成功用于提高植物组织中的植物固醇水平(Schaller等人(1995)植物生理学109：761-770和Gonzalez等人(1997)第三届欧洲植物类异戊二烯网络Terpnet会议摘要，摘要号33，33页)，但它们没有被具体用于提高种子中的固醇水平。

为了检测HMGR过量表达提高种子中固醇化合物水平的能力，在大豆中进行下列实验。使用7S启动子，在发育的大豆种子中表达来自橡胶基因组DNA的全长HMGR基因。这通过用EcoRI酶切来自质粒pHEV15(Schaller等人(1995)植物生理学109：761-770)的橡胶HMGR基因实现。将3.8kb片段插入pMON29920(图6)的EcoRI位点中，使得HMGR基因的侧翼为5’端的7S启动子和E9 3’终止子，产生pMON43800(图7)。然后用SalI和NotI消化，释放7.7kb片段，然后使SalI末端成为平端，之后与预先用SmaI和NotI酶切的pMON23616(图8)连接。这产生pMON43818(图9)二元载体，其含有由7S启动子驱动的橡胶HMGR基因，和由NOS启动子驱动的NPTII基因作为选择性标记，和3’NOS终止子。pMON43818用来转化根瘤农杆菌，并转化大豆子叶外植体。

用于转化的外植体如下制备：灭菌的种子在28℃光照5-6天下在萌芽培养基上发芽。发芽的种子在剪切前置于暗处4℃24小时。除去种子外皮，将每个幼苗的胚轴修整为0.5cm-1.0cm的长度。然后切开子叶，使子叶在中段以下切开。除去每个子叶的初生叶和顶端区，以暴露创伤区。用3-7浅手术刀与胚轴成一直线划刻进行创伤，确保顶芽被损伤。损伤的外植体在含pMON43008的根瘤农杆菌培养物中温育。温育为室温下1小时。然后将嫁接外植体转移到协同培养基中，置于光下23℃3-4天。此时将外植体转移到延迟培养基中，置于25℃光生长室中4天。

延迟4天后，将外植体转移到186ppm卡那霉素选择培养基，置于25℃光生长室中2周。在两周末，将外植体转移到186ppm WPM培养基中，再置于25℃光生长室中2周。每两周将培养物转移到新鲜培养基中约18-21周。在6周转移时，从外植体中除去子叶和任何死亡物质，并切下叶柄。在每次随后的2周转移时，切下叶柄以使新鲜细胞接触培养基。

选择长度约为1/2”、具有两个节、1个开放三叶和一个活跃生长点的转基因苗，切下并转移到生根培养基中。一旦发育良好的根系统，即将植物送到温室中在盆土中长大。

成熟时收获来自15株转基因植物和一株非转基因对照植物的种子。每株植物10个种子称重并用电磨研磨成细粉。向大约50mg每种粉末样品中加入已知量的胆甾烷(通常100μg溶于100μl乙醇中)。通过在60℃下回流材料30分钟，用2ml 10％KOH甲醇溶液皂化，直接由研磨的组织水解固醇化合物。回流的样品冷却到室温，通过玻璃纤维过滤。向每一滤液中加入等体积的水，通过用等体积的己烷分配抽提不可皂化物。合并己烷相并蒸发。残余物重悬浮于1ml丙酮中，定量转移到玻璃GC瓶中，立即加盖。固醇用GC-FID分析，使用下列条件：入口温度220℃，探测器温度320℃，柱式加热炉温度编程为220℃-320℃，初始温度1分钟，终温度16分钟，提升率为8℃/分钟。使用的柱是50m长、320μm直径、膜厚度0.25μm的玻璃毛细管DB-5柱。载气是流速为1.0ml/min的氦。结果显示在表4中。

为了充分表征转基因种子中存在的固醇化合物，也通过对固醇化合物构象的GC-MS分析代表性样品。GC-MS条件如下：入口温度250℃，探测器320℃，炉温度编程为180℃-325℃，初始平衡温度1.0分钟，以4℃/分钟提升到310℃，然后以20℃/分钟提升到325℃。柱子是类似于GC-FID所用的DB-5毛细管玻璃柱。

总固醇在最佳实施的植物(转基因事件3和4)中提高3.2和3.9倍。这两个事件也显示个体固醇的最大提高。在事件3中，菜油甾醇提高2.7倍，谷甾醇提高3.4倍，谷甾烷醇3.2倍，其他固醇6.5倍，而在事件4中豆甾醇提高2.3倍。说明总固醇最大提高的其他固醇是途径中间物，包括角鲨烯、环阿屯醇、24-亚甲基环阿屯醇、obtusifoliol、异岩藻甾醇和豆甾-7-烯醇。这些途径中间物通常构成种子固醇组成的较少组分。然而，在转基因种子中，可能是由于通过途径的碳流量提高，它们以显著的量积累。这提示在植物中有固醇生物合成的其他控制点，如角鲨烯环氧酶、C-24固醇甲基转移酶和C-14 obtusifoliol脱甲基酶。

                    表4

事件	菜油甾醇	豆甾醇	谷甾醇	谷甾烷醇	其他	总量
								ug/g	ug/g	ug/g	ug/g	ug/g	ug/g
1	161.9	148.2	551.3	36.8	264.8	1163
							2	241.6	287.9	1128.8	96.6	1489.8	3244.5
3	442.4	320.1	1876.6	117.3	1728.4	4484.8
							4	311.2	345.6	1645.6	113.8	1307.5	3723.6
5	395.5	323.0	1592.1	83.1	933.8	3327.5
							6	370.5	301.6	1735.8	97.2	990.5	3495.6
7	351.0	307.0	1457.3	101.1	885.3	3101.7
							8	248	172.4	1270.1	74.3	428.8	2193.6
9	221.1	140.7	1149	76.7	652.6	2240.1
							10	234.2	184.8	1306.8	64.1	669.4	2459.3
11	156.5	125.4	679.2	38.8	142.3	1142.2
							12	311.2	242.9	1457.3	67	418.6	2497
13	165.4	135.4	1320.1	59.7	1645.8	3326.4
							14	190.8	152	1121.3	51.4	1040.7	2556.2
15	182.9	157.4	1118.5	55.2	376.6	1890.6
							16	197.9	151.7	946.6	61.7	225.3	1583.2

                         实施例4

     HMG-CoA还原酶(HMGR)与3-羟基类固醇氧化酶共表达

      使转基因植物种子中谷甾醇和谷甾烷醇含量提高

在本发明的另一个实施方案中，通过共表达HMG-CoA还原酶与3-羟基类固醇氧化酶能提高植物种子中的固醇化合物水平，包括谷甾醇，至少一种谷甾醇酯，及其混合物。使用与实施例1相同的方法，除了含有3-羟基类固醇氧化酶编码序列的表达盒或载体之外，能用一种表达盒或载体转化目的植物，该表达盒或载体含有编码显示3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶或HMGR)活性的多肽的DNA。来自橡胶和拟南芥的HMGR cDNA已经成功用于提高植物组织中的植物谷甾醇水平(Schaller等人(1995)植物生理学109：761-770和Gonzalez等人(1997)第三届欧洲植物类异戊二烯网络Terpnet会议摘要，摘要号33，33页)。可用于提高谷甾醇水平的其他HMGR包括选自已知能过量产生谷甾醇的植物组织的基因突变形式，和已经通过定点诱变改变、解调其活性、导致不被反馈调节的变异酶的HMGR基因。

                         实施例5

         HMG-CoA还原酶与固醇甲基转移酶共表达

           使转基因植物种子中谷甾醇含量提高

在本发明的另一个实施方案中，能提高植物种子中的谷甾醇、至少一种谷甾醇酯及其混合物的水平。使用与实施例4相同的方法，除了含有编码固醇甲基转移酶(SMTII)的DNA的表达盒或载体之外，能用一种表达盒或载体转化目的植物，该表达盒或载体含有编码显示3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶活性的多肽的DNA。有用的SMTII编码序列的一个例子是来自拟南芥的序列(Bouvier-Nave等人(1997)欧洲生物化学杂志246：518-529)。向其中导入两种酶编码序列的植物预期含有水平提高的谷甾醇，至少一种谷甾醇酯，谷甾烷醇，至少一种谷甾烷醇酯，或其混合物，以及水平降低的24-甲基固醇，如菜油甾醇，至少一种菜油甾醇酯，菜油甾烷醇，至少一种菜油甾烷醇酯，及其混合物。Schaller等人((1997)第三届欧洲植物类异戊二烯网络Terpnet会议摘要，摘要号44，44页)证明，组成型过量表达拟南芥SMTII基因的转基因烟草的菜油甾醇水平降低。

用大豆进行实验证明这一方面。用来获得在发育胚芽中表达橡胶(三叶胶)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因和拟南芥固醇甲基转移酶(SMTII)基因的转基因大豆植物的策略如下：

构建二元载体pMON43039(图10)，使之含有橡胶HMGR和拟南芥SMTII，均由种子特异的启动子7S驱动。HMGR基因含有来自豌豆rbc E9基因的E9 3’终止子，而SMTII基因含有来自胭脂氨酸合酶基因的NOS 3’终止子。选择标记基因是卡那霉素抗性的NPTII基因，由来自根瘤农杆菌pTiT37的NOS启动子和同样来自根瘤农杆菌pTiT37的NOS 3’终止序列驱动，用pMON43039转化根瘤农杆菌。

大豆外植体的转化如实施例3所述。产生7个转基因事件。来自每一事件的10个种子分别用实施例3所述的方法分析植物甾醇。数据显示在表5中，其中植物1是非转基因对照，植物2-8是独立的转基因事件。数据代表每一事件10个种子的结果的平均值。总固醇有1.5倍(事件5和7)到2倍(事件2、3、4)的提高。个别地，谷甾醇(事件3中可达2.6倍)和谷甾烷醇(事件6中可达10倍)有更大的提高。同时，事件6和7中菜油甾醇有可达5.6倍的降低。另外，在转基因事件中，植物甾醇生物合成途径中间物积累至较高程度。这些固醇是obtusifoliol、豆甾-7-烯醇、环阿屯醇和24-亚甲基环阿屯醇。

菜油甾醇含量的降低与预期的SMTII酶的活性一致。该酶催化方案1中的反应18。该反应的底物24-亚甲基-4-甲基-7-烯胆烷醇，也能经历反应18b，该反应是C-4脱甲基。后一途径导致24-甲基固醇如菜油甾醇的形成。假定由于导入的拟南芥SMTII基因有更高表达而提高的SMTII活性引起通过产生谷甾醇的途径的碳流量增加，从而降低24-亚甲基4-甲基-7-烯胆烷醇对反应18b的可用性，这降低形成的菜油甾醇的量。

如实施例3所述，总固醇含量的提高是由于HMGR酶活性的提高。

表5

植物号	菜油甾醇	豆甾醇	Oblusifoliol	谷甾醇	谷甾烷醇	豆甾-7-烯醇	未知1	环阿屯醇	24-亚甲基环阿屯醇	总固醇
												ug/g	ug/g	ug/g	ug/g	ug/g	ug/g	ug/g	ug/g	ug/g	ug/g
1	186.0	138.5	0.0	493.6	7.2	0.0	0.0	7.4	25.7	858.4
											2	305.7	241.9	0.0	1278.6	52.0	26.0	26.8	35.7	37.2	2003.9
3	268.5	212.8	0.0	1293.7	50.3	41.2	16.7	35.2	45.8	1964.3
											5   4	110.1	209.5	10.1	1275.0	67.4	47.6	38.8	49.0	49.9	1857.6
5	55.0	138.1	7.9	835.3	54.6	35.5	21.4	34.3	44.2	1226.4
											6	33.4	166.6	31.7	1054.5	72.1	52.9	13.2	52.3	23.2	1499.8
7	33.7	135.1	13.2	841.9	48.2	46.1	8.7	36.3	31.3	1194.5
											8	75.4	111.5	5.4	645.5	39.2	26.9	12.5	21.4	16.1	953.9

                         实施例6

       3-羟基类固醇氧化酶与生育酚生物合成酶共表达

       使转基因植物种子中谷甾烷醇和生育酚含量提高

为了生产种子或其他部分含有水平升高的谷甾烷醇、谷甾烷醇酯或其混合物，以及水平升高的至少一种生育酚化合物的转基因植物，能施行与实施例1所述相同的方法，另外使用一种含有至少一种生育酚生物合成酶编码DNA的表达盒或载体。候选生育酚生物合成酶包括表2列出的酶。优选的生育酚生物合成酶编码DNA包括编码选自下列的酶的DNA：3-脱氧-D-阿糖基-庚酮糖酸-7-P合酶、莽草酸激酶、预苯酸脱氢酶、4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶、垅牛儿基垅牛儿焦磷酸合酶、垅牛儿基垅牛儿焦磷酸氢化酶、植基/异戊烯基转移酶、2-甲基-6-植基苯并醌醇甲基转移酶、γ-生育酚甲基转移酶和1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶。

通过合适的筛选方法如气相色谱法，能筛选一种转化植物，其种子或其他植物或果实部分含有水平提高的谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯和其混合物，以及水平升高的至少一种生育酚化合物。优选的植物是其种子含有谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的植物，其含量为从种子提取的油的总固醇化合物的至少约57％、优选地约57％-90％、更优选地约57％-65％重量百分比。以种子的百分干重表示，优选的植物是产生含有谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的种子的植物，其含量为种子干重的至少约0.08％，优选地为种子干重的约0.08％-0.8％，更优选地约0.08％-0.4％。

生育酚化合物，可以是α-、β-、γ-、δ-或ε-生育酚或其混合物，能以种子干重的至少约0.02％、优选地约0.02％-0.2％、更优选约0.02％-0.025％的量存在。优选的生育酚是α-生育酚。

                         实施例7

  3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶与生育酚生物合成酶共表达使

           转基因植物种子中固醇化合物和生育酚含量提高

能施行与实施例6所述相同的方法，另外使用一种含有类固醇5α-还原酶编码DNA的表达盒或载体。

通过合适的筛选方法如气相色谱法，能筛选一种转化植物，其种子或其他植物或果实部分含有水平提高的谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯和其混合物，以及水平升高的至少一种生育酚化合物。优选的植物是其种子含有谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的植物，其含量为从种子提取的油的总固醇化合物的至少约57％、优选地约57％-90％、更优选地约57％-65％重量百分比。以种子的百分干重表示，优选的植物是产生含有谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的种子的植物，其含量为种子干重的至少约0.08％，优选地为种子干重的约0.08％-0.8％，更优选地约0.08％-0.4％。

生育酚化合物，可以是α-、β-、γ-、δ-或ε-生育酚或其混合物，能以种子干重的至少约0.02％、优选地约0.02％-0.2％、更优选约0.02％-0.025％的量存在。优选的生育酚是α-生育酚。

                         实施例8

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖的γ-生育酚甲基转移酶在上述任何实施

           例中的共表达，将γ-生育酚转化为α-生育酚

提高植物种子或其他植物或果实部分中生育酚化合物水平的另一种方法包括与上述任一实施例所述相同的方法，另外使用一种含有S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖的γ-生育酚甲基转移酶编码DNA的表达盒或载体，用于将γ-生育酚转化为α-生育酚。自辣椒属(Shigeoka等人(1992)生物化学与生物物理学学报1128：220-226)和纤细裸藻(d-Harlingue等人(1985)生物化学杂志260：15200-15203)提纯的酶的氨基酸序列能用来设计核酸探针，用于分离编码这些酶的DNA序列。来自集胞蓝细菌属PCC6803和拟南芥的γ-生育酚甲基转移酶编码DNA序列的鉴定已经由Shintani等人报道((1998)科学282：2098-2100)。

通过合适的筛选方法如气相色谱法，能筛选一种转化植物，其种子或其他植物或果实部分含有水平提高的谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯和其混合物，以及水平升高的至少一种生育酚化合物。优选的植物是其种子含有谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的植物，其含量为从种子提取的油的总固醇化合物的至少约57％、优选地约57％-90％、更优选地约57％-65％重量百分比。以种子的百分干重表示，优选的植物是产生含有谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的种子的植物，其含量为种子干重的至少约0.08％，优选地为种子干重的约0.08％-0.8％，更优选地约0.08％-0.4％。

生育酚化合物，可以是α-、β-、γ-、δ-或ε-生育酚或其混合物，能以种子干重的至少约0.02％、优选地约0.02％-0.2％、更优选约0.02％-0.025％的量存在。优选的生育酚是α-生育酚。

                         实施例9

       影响固醇化合物和生育酚生物合成和积累的酶

能生产重组植物，其中只有叶绿体DNA改变，掺有本发明涉及的固醇化合物和生育酚酶编码序列。在叶绿体中起作用的启动子在本领域中周知(Hanley-Bowden等人(1987)生物化学科学趋势12：67-70)。获得含有插入异源DNA的叶绿体的细胞的方法和组合物已经由例如Maliga等人(美国专利号5,451,513)和Daniell等人(美国专利号5,693,507)描述。能构建一种载体，其含有一种能产生影响固醇和生育酚化合物生物合成和积累的肽、多肽或蛋白质的表达盒。一种表达盒能含有一种叶绿体可操作的启动子序列，引导如3-羟基类固醇氧化酶基因的表达，使用PCR方法、限制性内切核酸酶消化、连接等，以与此处所述的其他重组构建体相同的方法构建。可叶绿体表达的编码序列能含有一种来自异源基因或叶绿体基因如psbA的启动子和5’非翻译区，其可引起编码一种影响叶绿体中固醇化合物和/或生育酚生物合成的肽、多肽或蛋白质的DNA序列的转录和翻译；编码肽、多肽或蛋白质的DNA序列；转录和翻译终止区，如叶绿体基因的3’反向重复区，它能稳定编码这种肽的表达的mRNA，等等。自叶绿体内的表达将增强表达产物的积累。含有叶绿体或其他质体的宿主细胞能用表达盒转化，能培育得到的含有转化质体的细胞，以表达编码的酶。表达盒除酶之外也能含有抗生素、除草剂耐受或其他选择性标记基因。表达盒侧翼可为例如从叶绿体DNA获得的DNA序列，这些有利于表达盒向叶绿体基因组中的稳定整合，特别是通过同源重组。此外，表达盒也许不整合，但通过含有一个从叶绿体DNA获得的复制起点，能引起例如酶编码DNA基因在叶绿体或其他质体内的复制。

能由含有转化叶绿体或其他质体的细胞产生植物，然后可培育，产生能产生基因植物的种子。这些转化方法，特别是通过向叶绿体基因组中整合实现叶绿体转化的方法，具有叶绿体基因通常母系遗传的优点。这产生环境“安全”的转基因植物，实际上消除了逃自环境的可能性。此外，叶绿体和其他质体能多次转化，产生可表达多种希望的重组蛋白质的功能质体基因组。因此用叶绿体或质体转化能避免分离事件。另外，不同于植物核基因组表达，叶绿体或其他质体中的表达能只从一个启动子开始，并通过多顺反子区继续，由一种mRNA产生多种肽。

表达盒能以与构建其他植物转化载体几乎相同的方法产生。植物质体可操作的DNA序列能插入细菌质粒中，并与表达希望的酶产物如3-羟基类固醇氧化酶等的DNA序列连接，使得该酶在叶绿体或其他质体内产生，不需要核调节基因或叶绿体或质体导向序列的核基因调节、加帽、剪切或聚腺苷酸化。一种表达盒，其含有可影响类固醇化合物和/或生育酚生物合成和积累的肽、多肽或蛋白质，可能是合成构建的或是一种天然基因，能插入为转化叶绿体或其他质体构建的载体的限制位点中。该盒的上游侧翼可以是叶绿体或质体功能启动子，下游是叶绿体或质体功能转录和翻译终止序列。产生的盒能通过众所周知的同源重组方法掺入叶绿体或质体基因组中。

此外，叶绿体或其他质体的转化能利用自主复制质粒或能在这些细胞器内繁殖的其他载体获得。实现该方法的一种方法是使用叶绿体或质体复制起始所需的一部分叶绿体或其他质体基因组，作为在转化的叶绿体或其他质体中保留质粒或载体的一种方法。能使叶绿体或质体外遗传元件稳定复制的序列可通过下列方法容易地鉴定：将叶绿体或其他质体基因组随机克隆到也含有叶绿体或其他质体选择性标记基因的标准细菌载体中，随后转化叶绿体或其他质体，在合适的选择培养基上筛选转化的细胞。向可在叶绿体或其他质体复制的外遗传元件中导入此处所述的表达盒将提供一种将酶编码DNA序列定位于叶绿体或其他质体中的有效方法。

通过合适的筛选方法如气相色谱法，能筛选一种转化植物，其种子或其他植物或果实部分含有水平提高的谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯和其混合物，以及水平升高的至少一种生育酚化合物。优选的植物是其种子含有谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的植物，其含量为从种子提取的油的总固醇化合物的至少约57％、优选地约57％-90％、更优选地约57％-65％重量百分比。以种子的百分干重表示，优选的植物是产生含有谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的种子的植物，其含量为种子干重的至少约0.08％，优选地为种子干重的约0.08％-0.8％，更优选地约0.08％-0.4％。

生育酚化合物，可以是α-、β-、γ-、δ-或ε-生育酚或其混合物，能以种子干重的至少约0.02％、优选地约0.02％-0.2％、更优选约0.02％-0.025％的量存在。优选的生育酚是α-生育酚。

                         实施例103-羟基类固醇氧化酶基因的种子特异表达使转基因芸苔的油的固醇化

                      合物组成改变

芸苔(油菜籽；芸苔)种子通常含有三种主要固醇化合物，即占总固醇化合物的百分比，菜子甾醇(～11％)、菜油甾醇(～34％)和谷甾醇(～50％)。菜籽油是菜子甾醇的主要来源，菜子甾醇在其他植物油如大豆和棉籽油中不存在(Gunstone等人(1994)《脂类手册》，Chapman & Hall，伦敦，125页)。菜子甾醇、菜油甾醇和谷甾醇以及相应还原植物甾烷醇的结构如下：

菜子甾醇                                       菜子甾烷醇菜油甾醇                                       菜油甾烷醇

谷甾醇                                         谷甾烷醇

                芸苔的主要固醇化合物

进行一个实验，其中用胚芽特异的napin启动子，在芸苔中过量表达美国专利5,518,908公开的链霉菌A19249 3-羟基类固醇氧化酶，以确定对植物油固醇化合物组成的影响。如下所示，除了正常存在的谷甾醇、菜油甾醇和菜子甾醇外，这还导致谷甾烷醇、菜油甾烷醇和菜子甾烷醇的产生和积累。菜子甾烷醇是一种新的植物甾烷醇。还原的甾烷醇的出现是由于谷甾醇、菜油甾醇和菜子甾醇中C-5双键的还原，可能是由于向转基因植物中导入的3-羟基类固醇氧化酶的活性。

用下列策略获得在发育的胚芽中表达链霉菌3-羟基类固醇氧化酶基因的转基因芸苔。

通过用限制酶AatII和NcoI消化，从质粒pMON30423(图1)中切下链霉菌3-羟基类固醇氧化酶基因。这释放一条约4kb的片段，其含有完整的3-羟基类固醇氧化酶基因(chox)、NOS3’末端、细菌氨苄青霉素选择性标记和pUC复制起点。质粒pMON29141(图2)是napin启动子和叶绿体导向信号序列的来源。用AatII和SpeI消化pMON29141，释放2.2kb片段，其含有M13-ori位点、napin启动子和融合的豌豆RUBISCO小亚基叶绿体转运肽/大豆小亚基叶绿体转运肽，它们具有下列氨基酸序列(SEQ ID NO：31)：Met-Ala-Ser-Ser-Met-Ile-Ser-Ser-Pro-Ala-Val-Thr-Thr-Val-Asn-Arg-Ala-Gly-Ala-Gly-[-----------------------------PEA SSU CTP---------------------------------------Met-Val-Ala-Pro-Phe-Thr-Gly-Leu-Lys-Ser-Met-Ala-Gly-Phe-Pro-Phe-Thr-Gly-Leu-Lys-------------------------------PEA SSU CTP---------------------------------------Ser-Met-Ala-Gly-Phe-Pro-Thr-Arg-Lys-Thr-Asn-Asn-Asp-Ile-Thr-Ser-Ile-Ala-Ser-Asn-------------------------------PEA SSU CTP---------------------------------------Gly-Gly-Arg-Val-Gln-Cys-Met-Gln-Val-Trp-Pro-Pro-Ile-Gly-Lys-Lys-Lys-Phe-Glu-Thr------------------------][-----SOY SSU CTP--------------------------------------]

从pMON30423获得的含3-羟基类固醇氧化酶基因的4kb片段，从pMON29141获得的2.2kb napin片段，和SpeI-NcoI接头(LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，MD)，在三连接混合物中连接，产生质粒pMON43007(图3)。该质粒用NotI部分消化，释放含napin启动子、融合叶绿体转运肽、3-羟基类固醇氧化酶基因和NOS3’终止信号序列的盒。将该盒克隆到二元载体pCGN5139(图4)的NotI位点，产生pMON43011(图5)，用它来转化根瘤农杆菌。芸苔胚轴与含pMON43011的农杆菌细胞共培育，用来按照Radke等人((1992)植物细胞报道11：499-505)转化；MS-1、B5-1和B5-BZ培养基含有0.7％Phytagar。根据卡那霉素抗性筛选转基因植物，在适当选择后在温室中生长，并实现生根。

在成熟时收获来自27株转基因植物和一株非转基因对照的种子。如实施例3所述研磨种子并抽提，用于固醇分析。结果显示在表6和图12中。为了充分表征转基因种子中存在的固醇化合物，如实施例3所述，也用对存在的固醇化合物构象的GC-MS分析代表性样品——转基因事件9号。质谱分析鉴定菜子甾醇、菜子甾烷醇、菜油甾醇、菜油甾烷醇、谷甾醇和谷甾烷醇为转基因芸苔种子中的主要固醇化合物。

如表6和图12图解所示，除了正常存在的植物甾醇谷甾醇、菜油甾醇、菜子甾醇之外，显著含量的植物甾烷醇谷甾烷醇、菜油甾烷醇和菜子甾烷醇在种子特异的napin启动子控制下表达3-羟基类固醇氧化酶基因的转基因芸苔种子中积累。计算为总固醇化合物的重量百分比，在最高甾烷醇积累的植物中，约18％-22％的谷甾醇被转化为谷甾烷醇(转基因事件3、9、10、20、23、25号)，约17％-24％的菜油甾醇被转化为菜油甾烷醇(转基因事件3、8、9、10、15、20、23、24和25号)，约26％-43％的菜子甾醇被转化为菜子甾烷醇(转基因事件3、8、9、10、15、20、23、24和25号)。因此，在转基因植物种子中产生并积累通常在芸苔种子中不存在的显著含量的植物甾烷醇。

迄今为止尚未报道自然存在菜子甾烷醇(Akihisa等人(1992)在《固醇生理学和生物化学》，Patterson等人，编，美国油类化学家协会，Champaign，IL，第172-228页)。本结果证明，除了由相应的含C-5双键的植物甾醇产生甾烷醇之外，由于导入的3-羟基类固醇氧化酶，转基因植物中产生新的植物甾烷醇。在这些转基因种子中发现的其他植物甾烷醇，即谷甾烷醇和菜油甾烷醇通常存在，尽管它们是大多数含油种子的少量成分。

植物甾烷醇如谷甾烷醇和菜油甾烷醇能通过油的氢化商业生产。然而，利用该方法，菜子甾醇将被氢化为22-二氢-菜子甾烷醇，其中C-5和C-22双键都被还原。因此，通过含菜子甾醇的油的氢化生产菜子甾烷醇在商业上是不可行的。因此，在本发明的转基因植物中存在菜子甾烷醇是意外的，并且具有特别的商业重要性。

表达3-羟基类固醇氧化酶的本发明的转基因油菜籽中出现菜子甾烷醇证明，该酶特异还原植物甾醇的C-5双键，其催化活性不受植物甾醇侧链结构变化的影响。芸苔种子中存在的三种主要的植物甾醇，即谷甾醇、菜油甾醇和菜子甾醇，其侧链不同。谷甾醇具有C-24乙基侧链，菜油甾醇具有C-24α甲基侧链，菜子甾醇具有C-24β甲基侧链和C-22双键。注意该实施例中早期存在的结构。在所有三种情况中，转基因种子的这些植物甾醇中的C-5双键都被还原，而菜子甾烷醇的C-22双键仍然完整。以下是3-羟基类固醇氧化酶和固醇C-5还原酶(类固醇5α-还原酶)催化的植物甾醇(菜子甾醇和β-谷甾醇)向植物甾烷醇(分别为菜子甾烷醇和β-谷甾烷醇)酶促转化的方案。

3-羟基类固醇氧化酶和固醇C-5还原酶催化的植物甾醇向植物甾

                烷醇转化的方案

能用本领域周知的特异高效液相色谱(HPLC)法从固醇混合物中分离菜子甾烷醇。这可包括使用反相柱。根据结构特性，如环和侧链中的双键数，也根据侧链上的甲基数，即24-甲基与24-乙基，能将植物甾醇和植物甾烷醇彼此分离。24-甲基差向异构体(24α与24β)如菜油甾烷醇和菜子甾烷醇也能用使用甲醇∶异丙醇(4∶1，v/v)溶剂系统的特异反相柱如TSK-Gel ODS柱分离。这些方法及其实施例在Goad L.J.和Akihisa T.的专著《固醇分析》(第4章，91-114页，Chapman & Hall，伦敦，UK，1997)中有详尽描述。

                     表6

 在napin启动子控制下表达3-羟基类固醇氧化酶基因的转基因芸苔的

             植物甾醇和植物甾烷醇组成¹

植物2	菜子甾醇	菜子甾烷醇	％菜子甾烷醇3	菜油甾醇	菜油甾烷醇	％菜油甾烷醇4	谷甾醇	谷甾烷醇	％谷甾烷醇5
										1	10.9	-	-	34.1	-	-	50.0	-	-
2	8.3	2.1	20	32.0	2.1	6	46.9	3.7	7
										3	5.6	3.3	37	25.9	6.4	20	43.5	9.6	18
4	8.4	2.5	23	30.3	5.2	15	43.8	2.9	6
										5	8.0	2.4	23	28.7	5.0	15	45.5	3.7	8
6	9.7	1.4	13	30.2	0.8	3	51.5	1.7	3
										7	9.4	1.6	15	33.3	1.0	3	48.3	1.7	3
8	6.1	3.5	36	25.4	7.2	22	42.1	7.9	16
										9	7.6	4.4	37	26.6	7.4	22	39.3	8.8	18
10	5.5	4.1	43	25.5	8.1	24	40.9	11.8	22
										11	9.0	2.4	21	28.6	1.8	6	49.5	2.7	5
12	8.4	2.6	24	30.1	2.1	7	46.2	3.4	7
										13	12.1	-	-	36.0	-	-	46.6	0.4	1
14	12.5	-	-	30.8	-	-	50.3	-	-

                         表6(续)

15	7.4	3.5	32	23.1	5.4	19	46.4	8.8	16
										16	9.1	2.0	18	31.7	1.2	4	48.5	1.0	2
植物2	菜子甾醇	菜子甾烷醇	％菜子甾烷醇3	菜油甾醇	菜油甾烷醇	％菜油甾烷醇4	谷甾醇	谷甾烷醇	％谷甾烷醇5
										17	9.8	2.4	20	31.3	1.8	3	47.9	-	--
18	14.6	0.3	2	30.6	-	-	48.5	-	--
										19	9.9	2.4	20	28.2	1.3	4	49.3	2.0	4
20	7.3	3.1	30	25.9	6.1	19	41.8	9.3	18
										21	11.2	0.4	3	29.8	-	-	53.1	-	--
22	9.2	-	-	34.1	-	-	51.7	0.7	1
										23	7.0	4.4	39	24.9	6.9	22	39.4	10.5	21
24	8.7	3.1	26	26.3	5.2	17	46.2	3.8	8
										25	6.7	3.6	35	26.1	7.4	22	40.5	8.7	18
26	8.7	2.2	20	31.1	1.4	4	50.3	1.8	3
										27	9.0	2.5	22	33.5	1.5	4	45.9	2.7	6

¹计算为总固醇化合物的百分数；²1是非转基因对照；2-27是独立的转基因事件(植物)，其中分析每株植物10个R1种子的固醇化合物组成；³表示为菜子甾烷醇/菜子甾醇+菜子甾烷醇x100；⁴表示为菜油甾烷醇/菜油甾醇+菜油甾烷醇x100；⁵表示为谷甾烷醇/谷甾醇+谷甾烷醇x100

                         实施例113-羟基类固醇氧化酶基因的种子特异表达使转基因大豆油的固醇化合

                         物组成改变

大豆的种子通常含有三种主要的固醇化合物，即即占总固醇化合物的百分比，菜子甾醇(～20％)、豆甾醇(～18％)和谷甾醇(～57％)。豆甾醇和豆甾烷醇的结构如下：

豆甾醇                           豆甾烷醇

进行一种实验，其中使用胚芽特异的7S启动子，在大豆中过量表达美国专利5,518,908公开的链霉菌A19249 3-羟基类固醇氧化酶，以确定对植物油固醇化合物组成的影响。如下所示，除了正常存在的菜油甾醇、豆甾醇和谷甾醇外，这还导致菜油甾烷醇、豆甾烷醇和谷甾烷醇的产生和积累。豆甾烷醇是一种新的植物甾烷醇。还原的甾烷醇的出现是由于菜油甾醇、豆甾醇和谷甾醇中C-5双键的还原，可能是由于向转基因植物中导入的3-羟基类固醇氧化酶的活性。

用下列策略获得在发育的胚芽中表达链霉菌3-羟基类固醇氧化酶基因的转基因大豆。质粒pMON43007(图3)如实施例10所述产生。该质粒用BglII和BamHI消化，释放一条约1.8kb的片段，其含有融合的叶绿体转运肽和3-羟基类固醇氧化酶基因。将该盒克隆到二元载体pMON29920(图6)的BglII位点，产生pMON43008(图11)，用它来转化根瘤农杆菌。大豆外植体如实施例3所述转化。

在成熟时收获来自30株转基因植物和一株非转基因对照的种子。分别将每株植物的10个种子研磨成细粉。向约50mg每种粉末样品中加入已知量的胆甾烷(通常100μg溶于100μl乙醇中)。如实施例3所述提取并分析固醇化合物。结果显示在表7中。

                                     表7

植物	菜油甾醇	菜油甾烷醇	％菜油甾烷醇	豆甾醇	豆甾烷醇	％豆甾烷醇	谷甾醇	谷甾烷醇	％谷甾烷醇
										1	19.5	0	0.0	18.2	0	0.0	58.1	4.2	6.7
2	4.4	11.2	71.8	6.9	7.8	53.1	26.2	43.4	62.4
										3	6.2	9.4	60.3	7.8	7.5	49.0	32.4	36.7	53.1
4	18.7		0.0	13.7		0.0	62.8	4.7	7.0
										5	3.2	13.8	81.2	6.3	11.7	65.0	16.6	48.4	74.5
6	23.4		0.0	16.1		0.0	55.9	4.6	7.6
										7	21.1		0.0	15		0.0	59.6	4.3	6.7
8	20.9		0.0	15.3		0.0	60.4	3.4	5.3
										9	7.2	13	64.4	7.5	8.4	52.8	25.5	38.5	60.2
10	2.8	14.8	84.1	4	11.6	74.4	13.3	53.5	80.1
										11	8.3	10.6	56.1	8.1	5.7	41.3	30.9	36.4	54.1
12	19.2		0.0	13.4		0.0	64.8	2.6	3.9
										13	19.5		0.0	14.8		0.0	63.1	2.6	4.0
14	20.4		0.0	14.4		0.0	62.8	2.4	3.7
										15	11	7.7	41.2	9.1	5.5	37.7	38.7	28	42.0
16	6.8	11.1	62.0	6.9	7.8	53.1	26.5	40.9	60.7
										17	10.7	7.9	42.5	10.3	6.4	38.3	34.1	30.4	47.1
18	16		0.0	13.9		0.0	64.7	5.4	7.7
										19	6.1	8.9	59.3	6.9	6	46.5	31.6	40.4	56.1
20	7	8.1	53.6	6.9	5.6	44.8	38.1	34.2	47.3
										21	15.4		0.0	12.3		0.0	66.5	5.8	8.0
22	5.6	9.3	62.4	5.8	6.2	51.7	31.7	41.3	56.6

表7(续)

23	6.6	9	57.7	7.3	5.5	43.0	33.4	38.1	53.3
										24	7.3	7.9	52.0	7.6	4.9	39.2	37	35.3	48.8
25	6.8	9.4	58.0	6.7	6	47.2	31.4	39.6	55.8
										26	5.4	9.6	64.0	6.4	6.9	51.9	30.3	41.2	57.6
27	8.2	7.2	46.8	8.4	5.1	37.8	39.8	31.3	44.0
										28	9.5	6.1	39.1	8.8	3.7	29.6	44.1	27.9	38.8
29	5.3	8.8	62.4	5.8	5.6	49.1	31.2	43.4	58.2
										30	15.5		0.0	14.4		0.0	65.3	4.8	6.8
31	4.3	9.2	68.1	6.6	8	54.8	25.4	46.4	64.6

除了正常存在的植物甾醇谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇之外，显著含量的植物甾烷醇谷甾烷醇、菜油甾烷醇和豆甾烷醇在种子特异的7S启动子控制下表达3-羟基类固醇氧化酶基因的转基因大豆种子中积累。计算为总固醇化合物的重量百分比，在最高植物甾烷醇积累的植物中，约60％-80％的谷甾醇被转化为谷甾烷醇(转基因事件2、5、9、10、16和31号)，约51％-74％的豆甾醇被转化为豆甾烷醇(转基因事件2、5、9、10、16、22、26和31号)，约60％-84％的菜油甾醇被转化为菜油甾烷醇(转基因事件2、3、5、9、10、16、22、26、29和31号)。因此，在转基因植物种子中产生并积累通常在大豆种子中不存在的显著含量的植物甾烷醇。

豆甾烷醇是在这些转基因植物中产生的一种新的植物甾烷醇。在这些转基因种子中发现的其他植物甾烷醇，即谷甾烷醇和菜油甾烷醇通常存在，尽管它们是大多数含油种子的少量成分。植物甾烷醇如谷甾烷醇和菜油甾烷醇能通过氢化由谷甾醇和菜油甾醇商业生产。然而，利用该方法，豆甾醇将被氢化为谷甾烷醇，其中C-5和C-22双键都被还原。因此，通过含豆甾醇的油的氢化生产豆甾烷醇在商业上是不可行的。因此，在本发明的转基因植物中存在豆甾烷醇是意外的，并且具有特别的商业重要性。

表达3-羟基类固醇氧化酶的本发明的转基因油菜籽中出现豆甾烷醇证明，该酶特异还原植物甾醇的C-5双键。这一发现连同实施例9所述的在油菜籽中形成菜子甾烷醇的发现，证明该酶的催化活性不受植物甾醇侧链结构变化的影响。菜子甾醇具有C-24甲基侧链和C-22双键，而豆甾醇具有C-24乙基侧链和C-22双键。菜子甾烷醇和豆甾烷醇的形成表明3-羟基类固醇氧化酶在这两种情况中都能还原C-5双键。3-羟基类固醇氧化酶和固醇C-5还原酶(类固醇5α-还原酶)催化的豆甾醇向豆甾烷醇酶促转化的方案显示如下：豆甾醇               24-乙基-4-烯-3-酮             豆甾烷醇

这30个转基因事件(事件2、3、5、9、10、11和15)中的7个被遗传给下一代。将每一事件的30个种子种植于温室的盆中，在成熟时收获种子。在生长早期也收集每一植物的叶样品。通过用商品试剂盒进行NPTII ELISA测定，用叶样品筛查标记基因表达。在种子收获后，将每株植物的5个种子研磨为细粉，一部分称重，并且如实施例9所述进行固醇提取和分析。叶ELISA和固醇分析的数据显示在表8中。

每个事件的几株植物在温室中不能存活，因此收集每一事件不到30株植物的种子。在每一事件中，存在阳性转基因植物及阴性转基因植物，这由NPTII ELISA数据可以看出。阳性与阴性将表明每一事件中基因插入的数量。当只插入一个拷贝的转基因时，应当是3∶1的分离比。因此，在7个事件中，有3个具有1个以上的插入拷贝。它们是事件3、5、10号。其余的具有一个插入拷贝。另外，在所有事件中，在NPTII阳性的植物与植物甾醇向植物甾烷醇的转化之间具有良好的相关性。这一证据进一步支持植物甾烷醇形成取决于植物基因组中存在3-羟基类固醇氧化酶基因这一事实。该性状因此是可遗传的。

表8

事件#	植物#	NPTH	菜油甾醇	菜油甾烷醇	％菜油甾烷醇	豆甾醇	豆甾烷醇	％豆甾烷醇	谷甾醇	谷甾烷醇	％谷甾烷醇
												1(Control)	1	-	19.8	0	0.0	18.8	0	0.0	61.4	0	0.0
2	1	-	18.2	0	0.0	14.9	0	0.0	66.8	0	0.0
													2	+	3.4	11.1	76.6	5.8	7.7	57.0	28.4	43.7	60.6
	3	+	5.7	9.1	61.5	7	5.5	44.0	43.1	29.6	40.7
													4	+	3.9	11.8	75.2	6	6.7	52.8	31.3	40.3	56.3
	5	+	3.7	12	76.4	6.3	7.3	53.7	28.4	42.3	59.8
													6	-	18.9	0	0.0	14.5	0	0.0	66.6	0	0.0
	7	+	2.3	11.5	83.3	3.8	7.9	67.5	24.6	49.9	67.0
													8	-	19.2	0	0.0	14.1	0	0.0	66.7	0	0.0
	9	-	19	0	0.0	13.3	0	0.0	67.7	0	0.0
													10	+	4	12.1	75.2	7.2	7.8	52.0	27.9	41	59.5
	11	+	10.3	6.3	38.0	7.6	2.9	27.6	46	26.8	36.8
													12	+	3.1	12.1	79.6	6	8.6	58.9	21.9	48.3	68.8
	13	-	16.6	0	0.0	13.3	0	0.0	70.1	0	0.0
													14	+	2.8	11	79.7	5	8	61.5	25.2	48	65.6
	15	+	5.3	10.2	65.8	6.6	7.1	51.8	32.7	38	53.7
													16	+	2.4	12.4	83.8	4.1	8.3	66.9	23.7	49	67.4
	17	+	6.3	10.2	61.8	8.4	6.2	42.5	35.4	33.5	48.6
													18	+	1.9	12.7	87.0	4.8	8.6	64.2	24.1	47.8	66.5

表8(续)

	19	-	19.6	0	0.0	12.8	0	0.0	67.6	0	0.0
													20	-	16.1	0	0.0	13.7	0	0.0	70.2	0	0.0
	25	+	9.1	7	43.5	8.9	5	36.0	41.9	28.1	40.1
												3	1	+	2.5	12.2	83.0	5.3	9.6	64.4	21.8	48.6	69.0
	2	+	12.5	5.5	30.6	11.1	4.4	28.4	44	22.4	33.7
													3	+	4.3	11.9	73.5	5.5	7.6	58.0	27.3	43.5	61.4
	4	-	18.4	0	0.0	14	0	0.0	67.6	0	0.0
													5	+	7.2	8.5	54.1	8.4	6.5	43.6	38.3	31	44.7
	6	-	17	0	0.0	13.5	0	0.0	69.5	0	0.0
													9	+	14.9	3.7	19.9	11.4	3.2	21.9	53.4	13.3	19.9
	10	+	1.8	13.2	88.0	4.3	9.8	69.5	20.1	50.8	71.7
													11	+	6.9	9.1	56.9	8.9	6.4	41.8	36.8	31.9	46.4
	12	+	3.2	12.4	79.5	6	12.1	66.9	22.2	46.4	67.6
													13	+	6.7	8	54.4	8.8	5.1	36.7	41	30.3	42.5
5	1	+	3.8	12	75.9	5.8	7.4	56.1	27.1	43.8	61.8
													2	+	3.3	11.3	77.4	5.6	7.2	56.3	28.4	44.1	60.8
	3	+	2.9	11.8	80.3	5.9	9	60.4	23.3	47.2	67.0
													4	-	18.5	0	0.0	12.7	0	0.0	68.8	0	0.0
	5	+	7.6	9.1	54.5	8.4	6.7	44.4	38.1	30.1	44.1
													6	+	3	11.2	78.9	5.7	10.9	65.7	24.4	44.7	64.7
	7	+	1.8	12.5	87.4	4.2	13.2	75.9	18.5	49.8	72.9
													8	+	14	4.5	24.3	13.7	3.8	21.7	48.7	15.3	23.9

表8(续)

	9	+	8.7	8.4	49.1	10	6.7	40.1	38.8	27.2	41.2
													11	+	3.1	12.5	80.1	5.9	11.3	65.7	22.3	45	66.9
	12	+	7.8	5.7	42.2	10.6	3.9	26.9	48.3	23.7	32.9
													14	+	5.4	11.9	68.8	7.9	7.7	49.4	29.1	38.1	56.7
	15	-	20.7	0	0.0	13.7	0	0.0	65.4	0	0.0
													16	+	3.9	11	73.8	6.1	9.4	60.6	25.8	43.9	63.0
9	1	+	6.1	9.9	61.9	8.2	7.8	48.8	33	34.9	51.4
													2	+	6.7	10	59.9	8.5	6.5	43.3	34.3	34	49.8
	3	+	11.7	5.1	30.4	13.7	4.4	24.3	46.8	18.1	27.9
													4	+	3.4	13.1	79.4	7.6	12	61.2	14.7	49.2	77.0
	6	+	10.5	6.4	37.9	11.4	5	30.5	45.4	21.2	31.8
													7	+	4.4	9.2	67.6	7.6	7.6	50.0	32.6	38.5	54.1
	8	-	18.1	0	0.0	16.4	0	0.0	65.6	0	0.0
													9	+	12.9	4.7	26.7	12.2	3.5	22.3	50.3	16.3	24.5
	10	+	3	12.9	81.1	6.2	10.2	62.2	22.2	45.6	67.3
													11	-	17.3	0	0.0	16.5	0	0.0	66.3	0	0.0
	12	+	8.6	8.3	49.1	9.8	5.5	35.9	40.9	26.9	39.7
													13	-	17.8	0	0.0	18.9	0	0.0	63.2	0	0.0
	14	-	19	0	0.0	17	0	0.0	64	0	0.0
													15	+	10.3	4.8	31.8	12.2	4.5	26.9	49.1	19	27.9
	16	+	8.4	8.6	50.6	10.3	6.6	39.1	37.8	28.4	42.9
													17	+	12	2.1	14.9	10.9	2.6	19.3	60.7	11.6	16.0

表8(续)

	18	-	17.5	0	0.0	17.4	0	0.0	63.3	1.8	2.8
													19	+	5.6	10.5	65.2	8.6	7.2	45.6	32.6	35.3	52.0
	22	+	4.6	10.6	69.7	8.1	7.6	48.4	32	37.2	53.8
													27	+	7	9	56.3	11.5	7.2	38.5	35.9	29.3	44.9
10	1	+	2.5	10.8	81.2	5.8	9.2	61.3	25.5	46.2	64.4
													2	+	4.9	5	50.5	7.1	5.6	44.1	50.9	26.5	34.2
	3	+	2.6	6.6	71.7	4.9	6.9	58.5	37.8	41.3	52.2
													5	+	0	15.1	100.0	5.7	12	67.8	15.6	51.6	76.8
	6	+	2.2	12.5	85.0	4.7	10.7	69.5	19.1	50.8	72.7
													8	+	3.9	11.6	74.8	6.9	8.8	56.1	24.9	43.9	63.8
	9	+	5.4	9.4	63.5	7.1	7.3	50.7	32.1	38.7	54.7
													10	+	0	11.5	100.0	3.4	10.7	75.9	20.2	54.2	72.8
	11	-	17.4	0	0.0	15.6	0	0.0	67	0	0.0
													12	+	8.6	7.3	45.9	9	6.9	43.4	38.7	29.4	43.2
	14	+	2.6	11.6	81.7	5.3	9.9	65.1	25.5	44.9	63.8
													16	+	6.7	7.2	51.8	9.8	6.3	39.1	39	31	44.3
	17	+	3.1	10.9	77.9	6.3	9.1	59.1	26.2	44.3	62.8
													18	+	8	7.5	48.4	10.9	6.1	35.9	39.3	28.2	41.8
	19	+	2.7	11.4	80.9	5.8	10.1	63.5	22.8	47.2	67.4
													20	+	3.6	11.2	75.7	7.8	9.9	55.9	27.1	40.4	59.9
	21	+	1.8	10.6	85.5	4.8	10.8	69.2	25	47	65.3
													23	+	2.6	12.2	82.4	4.9	9.4	65.7	23.2	47.6	67.2

表8(续)

	25	+	7.5	8.4	52.8	8.8	6.7	43.2	37.1	31.5	45.9
													30	+	2	12.5	86.2	4.7	10.9	69.9	19	50.8	72.8
11	1	-	19.6	0	0.0	17.2	0	0.0	63.2	0	0.0
													2	+	6.8	9.7	58.8	8.1	7.6	48.4	33.2	34.6	51.0
	3	+	10.6	7.6	41.8	10.1	5.9	36.9	38.1	27.6	42.0
													4	-	16.6	0	0.0	18.7	0	0.0	61.8	0	0.0
	5	+	3.5	12.2	77.7	6.2	8.7	58.4	25.3	44.1	63.5
													6	+	3.7	6.4	63.4	6.4	5.5	46.2	44.5	33.5	42.9
	7	+	11.8	4.4	27.2	12.9	3.7	22.3	50.5	16.7	24.9
													8	+	5.8	8.8	60.3	9.6	6.5	40.4	38.1	31.3	45.1
	9	+	3.2	11.8	78.7	6	8.7	59.2	26.8	43.4	61.8
													10	+	13.2	5.3	28.6	11.5	4.1	26.3	45.8	20.1	30.5
	11	-	20.6	0	0.0	15.5	0	0.0	63.8	0	0.0
													14	+	2.6	11.7	81.8	5.5	9.8	64.1	22.8	47.6	67.6
	15	-	14	0	0.0	14	0	0.0	71.9	0	0.0
													16	+	0	12.7	100.0	4.2	8.5	66.9	21.2	53.4	71.6
	17	+	0	11.1	100.0	5.2	7.4	58.7	28.9	47.4	62.1
													19	+	12.5	6.7	34.9	11.2	0	0.0	47.8	22.3	31.8
	20	+	6.9	10.1	59.4	7.3	5.5	43.0	35.3	34.9	49.7
													21	+	7.4	9.3	55.7	8.8	5.8	39.7	36.8	32.4	46.8
	22	+	6.2	10.8	63.5	7.7	6.2	44.6	30.9	38.1	55.2
													23	+	12	6.5	35.1	10.2	3.6	26.1	45.4	22.4	33.0

表8(续)

	24	-	17.6	0	0.0	15.9	0	0.0	66.5	0	0.0
													25	+	0	10.8	100.0	8.1	6.8	45.6	33.8	40.5	54.5
	26	+	0	9.7	100.0	6.9	6.9	50.0	31.9	44.4	58.2
												15	1	+	6.3	11	63.6	5.5	5.9	51.8	32.9	38.4	53.9
	2	-	18.8	0	0.0	13.2	0	0.0	68.3	0	0.0
													3	+	8.3	9.6	53.6	7.4	5.2	41.3	36.5	33	47.5
	4	-	20	0	0.0	15.2	0	0.0	65.2	0	0.0
													5	+	3.8	13.5	78.0	5.4	6.9	56.1	27.3	43.1	61.2
	6	-	19.5	0	0.0	13.7	0	0.0	67.1	0	0.0
													7	+	10.8	7.1	39.7	9.5	3.4	26.4	46.4	22.7	32.9
	8	+	10.5	7.5	41.7	9.1	3.5	27.8	42.2	27.3	39.3
													9	+	0	11	100.0	5.3	6.3	54.3	31.6	45.8	59.2
	10	+	7	11.5	62.2	6.2	7.8	55.7	26.7	40.3	60.1
													11	+	0	14.3	100.0	0	9.9	100.0	18.7	57.7	75.5
	12	+	15.6	6	27.8	10.5	0	0.0	48.2	20.1	29.4
													13	-	20.7	0	0.0	15.2	0	0.0	64.1	0	0.0
	14	+	6.9	10.8	61.0	5.9	11.5	66.1	30	34.6	53.6
													17	+	6.1	11.1	64.5	6.1	7.3	54.5	32.7	36.1	52.5
	18	+	9.3	8.9	48.9	8.3	5.2	38.5	38.4	29.9	43.8
													19	+	7.1	10.5	59.7	6.5	5.8	47.2	34.7	35.4	50.5
	20	+	12.3	5.8	32.0	9	3.3	26.8	47.3	22.2	31.9
													21	+	4.9	12.3	71.5	5.3	6.7	55.8	27.1	43.7	61.7

表8(续)

	22	+	8	10.4	56.5	7.7	4.3	35.8	37.1	32.1	46.4
													23	+	6.6	8.8	57.1	5.7	25.7	81.8	25.7	27.4	51.6
	25	+	0	16.1	100.0	0	6.7	100.0	19.5	57.7	74.7
													26	+	6.6	10.4	61.2	6.3	4.8	43.2	37.1	34.8	48.4
	28	-	20	0	0.0	14.4	0	0.0	65.5	0	0.0

根据本发明的详述和以上的实施例，应当理解可实现本发明的几个方面。

应当理解，已经利用例证和实施例详述了本发明，以使本领域技术人员熟悉本发明、其原理及其实际应用。本发明的具体程式和方法不限于具体实施方案所述，而是应当根据所附的权利要求书等了解这些描述和实施例。尽管以上某些实施例和描述包括关于本发明可施行方法的某些结论，但本发明者并非意在束缚于这些结论和功能，而只是提出它们作为可能的解释。

应当进一步理解，如上所述的本发明的具体实施方案并非是本发明的完全的或限制性的，根据上述实施例和详述，许多选择、修改和变化对于本领域技术人员将是显然的。因此，本发明意在包括属于下列权利要求书精神和范围之内的所有这些选择、修改和变化。

Claims (89)

1.一种重组构建体，其含有选自下列的一员作为5’-3，方向有效连接的成分：

一种种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，一种编码3-羟基类固醇氧化酶的DNA序列，和一种转录终止信号序列；

一种种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，一种编码类固醇5α-还原酶的DNA序列，和一种转录终止信号序列；

一种种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，一种编码3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA序列，和一种转录终止信号序列；

一种种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，一种编码固醇甲基转移酶的DNA序列，和一种转录终止信号序列；

一种种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，一种编码固醇酰基转移酶的DNA序列，和一种转录终止信号序列；和

一种种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，一种编码S-腺苷甲硫氨酸依赖的γ-生育酚甲基转移酶的DNA序列，和一种转录终止信号序列。

2.权利要求1的重组构建体，当所述启动子是种子特异的启动子时，其进一步含有一种能引导酶向质体中转运的转运肽编码区，与所述DNA序列有效连接。

3.权利要求1的重组构建体，当所述启动子是在植物质体中起作用的启动子时，其进一步含有：

一种编码选择性标记的基因，用于筛选含有表达该标记的质体的植物细胞；和

与该质体基因组同源的DNA区，其中同源区侧翼于植物质体中有功能的启动子，DNA序列，转录终止信号序列，和编码选择性标记的基因。

4.权利要求1的重组构建体，当所述启动子是在植物质体中起作用的启动子时，其进一步含有一个与该质体启动子连接的核糖体结合位点。

5.权利要求4的重组构建体，其中所述核糖体结合位点可从选自来源于质体、细菌或噬菌体前导序列的位点的前导序列获得。

6.权利要求5的重组构建体，其中所述核糖体结合位点选自基因10前导区的结合位点和rbcLRBS位点。

7.包含权利要求1-6任一项的重组构建体的重组载体。

8.权利要求7的重组载体，它是一种植物表达载体。

9.一种被转化的宿主细胞，其含有权利要求1-6任一项的重组构建体。

10.权利要求9的转化的宿主细胞，它是一种植物细胞。

11.一种被转化的宿主细胞，其含有权利要求7的重组载体。

12.权利要求11的转化的宿主细胞，它是一种植物细胞。

13.一种被转化的宿主细胞，其含有权利要求8的重组载体。

14.权利要求13的转化的宿主细胞，它是一种植物细胞。

15.一种植物，它含有至少一种根据权利要求10、12或14任一项的转化宿主细胞。

16.一种种子，其含有至少一种根据权利要求10、12或14任一项的转化宿主细胞。

17.一种植物，其基因组含有选自下列的引入的DNA：

编码3-羟基类固醇氧化酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的谷甾烷醇，至少一种谷甾烷醇酯，或其混合物；

编码类固醇5α-还原酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的谷甾烷醇，至少一种谷甾烷醇酯，或其混合物；

编码3-羟基类固醇氧化酶和类固醇5α-还原酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的谷甾烷醇，至少一种谷甾烷醇酯，或其混合物；

编码3-羟基类固醇氧化酶和生育酚生物合成酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的谷甾烷醇，至少一种谷甾烷醇酯，或其混合物，和至少一种生育酚化合物；

编码类固醇5α-还原酶和生育酚生物合成酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的谷甾烷醇，至少一种谷甾烷醇酯，或其混合物，和至少一种生育酚化合物；

编码3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶和生育酚生物合成酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的谷甾烷醇，至少一种谷甾烷醇酯，或其混合物，和至少一种生育酚化合物；

编码3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物；

编码3-羟基类固醇氧化酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物；

编码类固醇5α-还原酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物；

编码3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物；

编码3-羟基类固醇氧化酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和固醇甲基转移酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物，以及水平降低的菜油甾醇、菜油甾醇酯、菜油甾烷醇、菜油甾烷醇酯或其混合物；

编码类固醇5α-还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和固醇甲基转移酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物，以及水平降低的菜油甾醇、菜油甾醇酯、菜油甾烷醇、菜油甾烷醇酯或其混合物；和

编码3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和固醇甲基转移酶的DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇，至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物，以及水平降低的菜油甾醇、菜油甾醇酯、菜油甾烷醇、菜油甾烷醇酯或其混合物。

18.权利要求17的植物，其中所述基因组进一步含有编码固醇酰基转移酶的导入DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇当向该植物中导入编码3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA时，含有至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物。

19.权利要求17或18的植物，其中述基因组进一步含有编码S-腺苷甲硫氨酸依赖的γ-生育酚甲基转移酶的导入DNA，其中该导入DNA与引起该导入DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与基因组中不含该导入DNA的相同植物的种子相比，该植物的种子含有水平提高的至少一种固醇当向该植物中导入编码3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA时，含有至少一种植物甾醇，至少一种植物甾醇酯，至少一种植物甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯，或其混合物，以及水平提高的α-生育酚。

20.权利要求17、18或19任一项的植物，其种子含有菜子甾烷醇、菜子甾烷醇酯、豆甾烷醇或豆甾烷醇酯。

21.一种植物，其基因组含有至少一种导入DNA序列，该DNA序列编码可影响至少一种固醇、至少一种植物甾醇、至少一种植物甾醇酯、至少一种植物甾烷醇、至少一种植物甾烷醇酯或其混合物的生物合成和积累的肽、多肽或蛋白质，

其中该导入DNA与引起该导入DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接，与不含该导入DNA的相应转基因或非转基因植物相比，该植物产生含有水平提高的至少一种固醇、至少一种植物甾醇、至少一种植物甾醇酯、至少一种植物甾烷醇、至少一种植物甾烷醇酯或其混合物的种子。

22.权利要求21的植物，其中至少一种植物甾烷醇是谷甾烷醇，至少一种植物甾烷醇酯是谷甾烷醇酯。

23.一种植物，与不含编码可影响植物甾醇或植物甾烷醇在相应植物中生物合成和积累的肽、多肽或蛋白质的导入DNA的相应转基因或非转基因植物相比，其产生的种子含有水平提高的选自谷甾醇、至少一种谷甾醇酯、谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的化合物，以及水平降低的选自菜油甾醇、菜油甾醇酯、菜子甾醇、菜子甾醇酯、菜油甾烷醇、菜油甾烷醇酯、菜子甾烷醇、菜子甾烷醇酯或其混合物的化合物。

24.一种植物，与不含编码可影响植物甾醇或植物甾烷醇在相应植物中生物合成和积累的肽、多肽或蛋白质的导入DNA的相应转基因或非转基因植物相比，其产生的种子含有水平降低的选自菜油甾醇、菜油甾醇酯、菜子甾醇、菜子甾醇酯、菜油甾烷醇、菜油甾烷醇酯、菜子甾烷醇、菜子甾烷醇酯或其混合物的化合物。

25.权利要求21、22、23或24的植物，其中所述种子含有水平提高的α-生育酚。

26.权利要求21、22、23或24的植物，其中所述种子也可含有选自菜子甾烷醇、至少一种菜子甾烷醇酯、豆甾烷醇、至少一种豆甾烷醇酯或其混合物的化合物。

27.权利要求17-26任一项的植物，其中所述调节信号引起该导入DNA的种子特异表达，该导入DNA的每一种进一步与能引导所编码的酶向质体中转运的转运肽编码区有效连接。

28.权利要求17-26任一项的植物，其中所述调节信号能引起该导入DNA的质体特异表达，该基因组于是可以是一种质体基因组。

29.根据权利要求15或17-28任一项的植物的种子。

30.根据权利要求15或17-28任一项的植物的后代。

31.一种转化植物细胞或根据权利要求15或17-28任一项的植物的细胞。

32.一种细胞培养物，其含有根据权利要求31的细胞。

33.一种生产含谷甾烷醇或谷甾烷醇酯的油的方法，包括在可生产含谷甾烷醇或谷甾烷醇酯的油的时间内和条件下，培养根据权利要求31的细胞，并回收产生的含谷甾烷醇或谷甾烷醇酯的油。

34.一种生产谷甾烷醇或谷甾烷醇酯的方法，包括在可生产谷甾烷醇或谷甾烷醇酯的时间内和条件下，培养根据权利要求31的细胞，并回收产生的谷甾烷醇或谷甾烷醇酯。

35.由根据权利要求29的种子产生的植物。

36.一种生产植物的方法，与不含编码可影响植物甾醇或植物甾醇酯或植物甾烷醇或植物甾烷醇酯生物合成和积累的肽、多肽或蛋白质的导入DNA的相应植物相比，该植物的种子中积累水平提高的选自谷甾醇、至少一种谷甾醇酯、谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的化合物，该方法包括使根据权利要求15或17-28任一项的植物与所述相应植物有性杂交。

37.用权利要求36的方法产生的植物。

38.根据权利要求15或17-28任一项的植物，其中该植物是无性生殖的植物。

39.由权利要求38的植物与一种保育栽培品种杂交产生的种子。

40.根据权利要求15、17-28、37或38任一项的植物的一致性群体。

41.一种在种子中生产选自至少一种植物甾醇、至少一种植物甾醇酯、至少一种植物甾烷醇、至少一种植物甾烷醇酯或其混合物的化合物的方法，包括获得一种产生该种子的转化植物，其中该植物在其基因组中含有并表达选自下列的DNA：

编码3-羟基类固醇氧化酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码类固醇5α-还原酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码3-羟基类固醇氧化酶和类固醇5α-还原酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码3-羟基类固醇氧化酶和生育酚生物合成酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码类固醇5α-还原酶和生育酚生物合成酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶和生育酚生物合成酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码3-羟基类固醇氧化酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码类固醇5α-还原酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码3-羟基类固醇氧化酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和固醇甲基转移酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；

编码类固醇5α-还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和固醇甲基转移酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；和

编码3-羟基类固醇氧化酶、类固醇5α-还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和固醇甲基转移酶的DNA，其中该DNA与引起该DNA种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接；和

回收至少一种植物甾醇、至少一种植物甾醇酯、至少一种植物甾烷醇、至少一种植物甾烷醇酯或其混合物。

42.权利要求41的方法，其中所述植物在其基因组中进一步含有并表达编码固醇酰基转移酶的DNA，与引起该酰基转移酶-编码DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接。

43.权利要求41或42的方法，其中所述植物在其基因组中含有并表达编码S-腺苷甲硫氨酸依赖的γ-生育酚甲基转移酶的DNA，该DNA与引起该DNA甲基转移酶-编码DNA的种子特异或质体特异表达的调节信号有效连接。

44.权利要求41-43任一项的方法，其中，当所述调节信号引起酶编码DNA的种子特异表达时，每一种酶编码DNA都能进一步与可引导编码的酶向质体中转运的转运肽编码区有效连接。

45.权利要求41-43任一项的方法，其中，当所述调节信号引起酶编码DNA的种子特异表达时，该基因组是核基因组。

46.权利要求41-43任一项的方法，其中，当所述调节信号引起酶编码DNA的质体特异表达时，该基因组是质体基因组。

47.一种生产谷甾烷醇或至少一种谷甾烷醇脂肪酸酯的方法，包括种植权利要求15、17-28、30、35、37或38任一项的植物，并回收产生的谷甾烷醇或谷甾烷醇脂肪酸酯。

48.一种生产菜子甾烷醇、至少一种菜子甾烷醇酯、豆甾烷醇或至少一种豆甾烷醇酯的方法，包括种植权利要求15、17-28、30、35、37或38任一项的植物，并回收产生的菜子甾烷醇、至少一种菜子甾烷醇酯、豆甾烷醇或至少一种豆甾烷醇酯。

49.利用权利要求36的方法产生的植物的种子。

50.根据权利要求15、17-28、30、35、37或38任一项的植物的一部分，而不是种子。

51.含有选自至少一种固醇、至少一种植物甾醇、至少一种植物甾醇酯、至少一种植物甾烷醇、至少一种植物甾烷醇酯或其混合物的化合物的油，这些油是从权利要求15、17-28、30、35、37或38任一项的植物的种子中提取。

52.含有选自至少一种固醇、至少一种植物甾醇、至少一种植物甾醇酯、至少一种植物甾烷醇、至少一种植物甾烷醇酯或其混合物的化合物的油，这些油是通过权利要求33或41-48任一项的方法生产的。

53.根据权利要求51或52的油，其中谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物至少占该油总固醇化合物的约57％(重量)。

54.根据权利要求51或52的油，其中谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物占至少该种子干重的约0.08％。

55.根据权利要求51或52的油，其进一步含有种子干重至少约0.02％的量之生育酚化合物。

56.根据权利要求51-55的油，其进一步含有菜子甾烷醇，至少一种菜子甾烷醇酯，豆甾烷醇或至少一种豆甾烷醇酯。

57.根据权利要求51-56的油，其中油中存在的菜油甾醇、至少一种菜油甾醇酯、菜油甾烷醇、至少一种菜油甾烷醇酯或其混合物的量减少。

58.根据权利要求57的油，其中菜油甾醇、至少一种菜油甾醇酯、菜油甾烷醇、至少一种菜油甾烷醇酯或其混合物的量的减少为约10％-100％。

59.从权利要求15、17-28、30、35、37或38任一项的植物的种子中提取的一种谷甾烷醇酯组合物。

60.通过权利要求33或41-48任一项的方法生产的一种谷甾烷醇酯组合物。

61.权利要求59或60的谷甾烷醇酯组合物，其中酯化的脂肪酸在主链中含有2-22个碳原子。

62.一种降胆固醇组合物，其含有权利要求51-58任一项的油。

63.一种食物、食物成分或食物组合物，其含有权利要求51-58任一项的油。

64.一种药物组合物，其含有降胆固醇有效量的权利要求51-58任一项的油，和一种药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

65.一种降低低密度脂蛋白胆固醇血浆浓度的方法，包括向人或动物患者口服施用有效量的根据权利要求62-64任一项的组合物。

66.一种治疗或预防低密度脂蛋白胆固醇血浆浓度升高的方法，包括向人或动物患者口服施用有效量的根据权利要求62-64任一项的组合物。

67.一种实现宿主有效吸收谷甾烷醇的方法，包括：

用权利要求33、34或41至48中任一项的方法生产至少一种谷甾烷醇酯；和

对该宿主施用至少一种所述谷甾烷醇。

68.权利要求67的方法，其中所述宿主是人或动物。

69.一种制造食品添加组合物的方法，包括：

从根据权利要求15、17-28、30、35、37或38任一项的转基因植物的种子中获得含有选自谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯及其混合物的植物甾烷醇化合物的油；和

将该油与食用增溶剂、有效量的分散剂和任选的有效量的抗氧化剂混合。

70.一种制造食品添加组合物的方法，包括：

从根据权利要求15、17-28、30、35、37或38任一项的转基因植物的种子中获得含有至少一种生育酚和选自谷甾烷醇、至少一种谷甾烷醇酯或其混合物的植物甾烷醇化合物的油；和

将该油与食用增溶剂和有效量的分散剂混合。

71.菜子甾烷醇，其具有结构：

菜子甾烷醇

72.权利要求71的菜子甾烷醇的酯，其中C-3羟基的氢被替换为主链中含有2-22个碳原子的直链或支链脂肪酸。

73.一种分离的DNA分子，其含有选自下列的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：2，或其互补序列；

(b)在相当于0.5×SSC-2×SSC，0.1％SDS，55-65℃的洗涤严格性下，可与(a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其编码一种具有分别基本类似于拟南芥的类固醇5α-还原酶活性的多肽；

(c)编码与(a)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列；或

(d)编码与(b)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列。

74.一种分离的DNA分子，其含有选自下列的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：4，或其互补序列；

(b)在相当于0.5×SSC-2×SSC，0.1％SDS，55-65℃的洗涤严格性下，可与(a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其编码一种具有分别基本类似于玉蜀黍的类固醇5α.-还原酶活性的多肽；

(c)编码与(a)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列；或

(d)编码与(b)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列。

75.一种编码类固醇5α-还原酶或其片段的分离的DNA分子，其含有选自下列的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：6，或其互补序列；

(b)在相当于0.5×SSC-2×SSC，0.1％SDS，55-65℃的洗涤严格性下，可与(a)的互补序列杂交的核苷酸序列，其编码一种具有基本类似于大豆类固醇5α-还原酶的类固醇5α-还原酶活性的多肽；

(c)编码与(a)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列；和

(d)编码与(b)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列。

76.一种编码类固醇5α-还原酶或其片段的分离的DNA分子，其含有选自下列的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：8，或其互补序列；

(b)在相当于0.5×SSC-2×SSC，0.1％SDS，55-65℃的洗涤严格性下，可与(a)的互补序列杂交的核苷酸序列，其编码一种具有基本类似于大豆类固醇5α-还原酶的类固醇5α-还原酶活性的多肽；

(c)编码与(a)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列；和

(d)编码与(b)的核苷酸序列相同的遗传信息，但因遗传密码的简并性而简并的核苷酸序列。

77.一种重组构建体，其包含种子特异的启动子或在植物质体中起作用的启动子，权利要求73、74、75或76的分离DNA分子，和转录终止信号序列，作为以5’至3’方向有效连接的成分。

78.权利要求77的重组构建体，其中，当所述启动子是种子特异的启动子时，其进一步含有一种能引导类固醇5α-还原酶向质体中转运的转运肽编码区，与所述所述DNA序列有效连接。

79.权利要求77的重组构建体，其中，当所述启动子是在植物质体中起作用的启动子时，其进一步含有：

一种编码选择性标记的基因，用于筛选含有表达该标记的质体的植物细胞；和

与该质体基因组同源的DNA区，其中同源区侧翼于在植物质体中起作用的启动子，DNA序列，转录终止信号序列，和编码选择性标记的基因。

80.权利要求77的重组构建体，当所述启动子是在植物质体中起作用的启动子时，其进一步含有一个与该质体启动子连接的核糖体结合位点。

81.权利要求80的重组构建体，其中所述核糖体结合位点可从选自来源于质体、细菌或噬菌体前导序列的位点的前导序列获得。

82.权利要求81的重组构建体，其中所述核糖体结合位点选自基因10前导区的结合位点和rbcLRBS位点。

83.包含权利要求77的重组构建体的一种重组载体。

84.权利要求83的重组载体，它是一种植物表达载体。

85.一种被转化的宿主细胞，其含有权利要求77的重组构建体。

86.权利要求85的转化的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种植物细胞。

87.一种生产类固醇5α-还原酶的方法，包括在可生产该类固醇5α-还原酶的时间内和条件下培养权利要求85的转化宿主细胞，并回收产生的类固醇5α-还原酶。

88.豆甾烷醇，其具有结构：豆甾烷醇

89.权利要求88的豆甾烷醇的酯，其中豆甾烷醇的C-3羟基的氢被替换为主链中含有2-22个碳原子的直链或支链脂肪酸。

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