BRPI0616096A2

BRPI0616096A2 - polinucleotìdeo, vetor, célula hospedeira, método para a fabricação de um polipeptìdeo, polipeptìdeo, anticorpo, organismo não humano transgênico, e, métodos para a fabricação de um lipìdeo ou um ácido graxo, e para a fabricação de uma planta tendo uma quantidade modificada de um composto de armazenagem de semente

Info

Publication number: BRPI0616096A2
Application number: BRPI0616096-4A
Authority: BR
Inventors: Heiko A Hortel; Jermaine Gibson; Jeffrey A Brown
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2005-09-20
Filing date: 2006-09-18
Publication date: 2011-06-07
Also published as: US20080229453A1; AR055644A1; WO2007039442A2; EP1928908A2; CA2623259A1; WO2007039442A3; US8513490B2

Abstract

POLINUCLEOTìDEO, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, METODO PARA A FABRICAçãO DE UM POLIPEPTìDEO, POLIPEPTìDEO, ANTICORPO, ORGANISMO NãO HUMANO TRANSGêNICO, E, METODOS PARA A FABRICAçãO DE UM LIPìDEO OU UM áCIDO GRAXO, E PARA A FABRICAçãO DE UMA PLANTA TENDO UMA QUANTIDADE MODIFICADA DE UM COMPOSTO DE ARMAZENAGEM DE SEMENTE A presente invenção diz respeito a seqúências de ácido nucleico semelhantes à resposta tripla constitutiva (semelhante a CTR]) e as proteínas reguladoras do metabolismo de açúcar e lipídeo codificadas pelas ditas seqúências de ácido nucleico. Além disso, a presente invenção diz respeito ao uso das seqúências de ácido nucleico já mencionadas e proteínas em plantas transgénicas. Em particular, a invenção é direcionada a métodos para manipular compostos relacionados com açúcar e para aumentar o nível de óleo e alterar a composição de ácido graxo em plantas e sementes. A invenção ainda diz respeito a métodos de usar estes novos polipeptideos vegetais para estimular o desenvolvimento vegetal e/ou aumentar o rendimento e/ou composição de compostos de armazenagem de semente.

Description

"POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOPARA A FABRICAÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, POLIPEPTÍDEO,ANTICORPO, ORGANISMO NÃO HUMANO TRANSGÊNICO, E,MÉTODOS PARA A FABRICAÇÃO DE UM LIPÍDEO OU UM ÁCIDOGRAXO, E PARA A FABRICAÇÃO DE UMA PLANTA TENDO UMAQUANTIDADE MODIFICADA DE UM COMPOSTO DEARMAZENAGEM DE SEMENTE"

Aqui, são descritas invenções no campo da engenhariagenética de plantas, incluindo moléculas de ácido nucleico isoladas quecodificam polipeptídeos semelhantes à Resposta Tripla Constitutiva(semelhante à CTRl) para melhorar características agronômicas, agrícolas, dehorticultura e de qualidade. Esta invenção, no geral, diz respeito a proteínasque codificam seqüências de ácido nucleico que são relacionadas com apresença de compostos de armazenagem de sementes em plantas. Maisespecificamente, a presente invenção diz respeito as seqüências de ácidonucleico semelhantes a CTRl que codifica proteínas reguladoras dometabolismo do açúcar e lipídeo e o uso destas seqüências em plantastransgênicas. Em particular, a invenção é direcionada a métodos paramanipular compostos relacionados com açúcar e para aumentar o nível deóleo e alterar a composição de ácido graxo em plantas e sementes. A invençãoainda diz respeito a métodos de usar estes novos polipeptídeos vegetais paraestimular o desenvolvimento vegetal e/ou aumentar o rendimento e/oucomposição de compostos de armazenagem de semente.

O estudo e a manipulação genética de plantas tem uma longahistória que começou ainda antes dos estudos famosos de Gregor Mendel. Noaperfeiçoamento desta ciência, os cientistas realizaram a modificação dascaracterísticas particulares de plantas que variam de tubérculos de batatatendo teor de amido aumentado a plantas de semente oleosa, tais como canolae girassol tendo teor de ácido graxo aumentado ou alterado. Como consumo eo uso aumentado de óleos vegetais, a modificação do teor de óleo de sementee dos níveis de óleo de semente têm se tornado aumentadamente difundido(por exemplo, Tõpfer et al. 1995, Science 268:681-686). A manipulação decaminhos biossintéticos em plantas transgênicas fornece diversasoportunidades para biólogos moleculares e bioquímicos vegetais para afetar ometabolismo vegetal dando origem à produção de produtos de valor mais altoespecífico. A produção ou a composição do óleo de semente foi alterada emdiversas plantas de semente oleosas tradicionais, tais como soja (Patente U. S.N0 5.955.650), canola (Patente U. S. N0 5.955.650), girassol (Patente U. S. N06.084.164) e semente de colza (Tõpfer et al. 1995, Science 268:681-686) eplantas de semente oleosa não tradicionais, tais como o tabaco (Cahoon et al.1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:11184-11188).

Os óleos de semente vegetal compreendem tanto lipídeosneutros quanto polares (ver a Tabela 1). Os lipídeos neutros contêm,primariamente, triacilglicerol, que é o principal lipídeo de armazenagem quese acumula em corpos oleosos nas sementes. Os lipídeos polares são,principalmente encontrados nas diversas membranas das células de sementes,por exemplo, o retículo endoplásmico, membranas microssômicas e amembrana celular. Os lipídeos neutros e polares contém diversos ácidosgraxos comuns (ver a Tabela 2) e uma variação de ácidos graxos menoscomuns. A composição de ácido graxo de lipídeos de membrana é altamenteregulada e apenas um número seleto de ácidos graxos são encontrados emlipídeos de membrana. Por outro lado, um grande número de ácidos graxosnão usuais pode ser incorporado no lipídeos de armazenagem neutros emsementes de muitas espécies vegetais (Van de Loo FJ. et al. 1993, UnusualÁcidos graxos in Lipid Metabolism in Plants pp. 91-126, editor TS Moore Jr.CRC Press; Millar et al. 2000, Trends Plant Sei. 5:95-101).

Os lipídeos são sintetizados a partir dos ácidos graxos e suasíntese pode ser dividida em duas partes: o caminho procariótico e o caminhoeucariótico (Browse et ai. 1986, Biochemical J. 235:25-31; Ohlrogge &Browse 1995, Plant Cell 7:957-970). O caminho procariótico está localizadoem plastídeos que são o local primário da biossíntese de ácido graxo. Asíntese de ácido graxo começa com a conversão de acetil-CoA à malonil-CoApor acetil-CoA carboxilase (ACCase). O Malonil-CoA é convertido à proteínacarregadora de malonil-acila (ACP) por malonil-CoA:ACP transacilase. Aenzima beta-ceto-acil-ACP-sintase III (KAS III) catalisa uma reação decondensação, em que o grupo acila do acetil-CoA é transferido ao malonil-ACP para a formação de 3-cetobutiril-ACP. Em uma série subseqüente dereações de condensação, redução e desidratação, a cadeia de ácido graxonascente no cofator ACP é alongada pela adição passo a passo (condensação)de dois átomos de carbono doados por malonil-ACP até uma cadeia de ácidograxo saturada com 16 a 18 carbonos ser formada. A plastidial delta-9 acil-ACP desaturase introduz a primeira ligação dupla insaturada no ácido graxo.

As tioesterases clivam os ácidos graxos a partir do cofator ACP e os ácidosgraxos livres são exportados ao citoplasma onde estes participam comoésteres de acil-CoA graxos no caminho eucariótico. Deste caminho, os ácidosgraxos são esterificados pela glicerol-3-fosfato aciltransferase e ácidolisofosfatídico acil-transferase às posições sn-1 e sn-2 de glicerol-3-fosfato,respectivamente, para a produção de ácido fosfatídico (PA). O PA é oprecursor para outros lipídeos polares e neutros, o último sendo formado nocaminho de Kennedy (Voelker 1996, Genetic Engineering ed.: Setlow18:111-113; Shanklin & Cahoon 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.Biol. 49:611-641; Frentzen 1998, Lipids 100:161-166; Millar et al. 2000,Trends Plant Sei. 5:95-101).

Os lipídeos de armazenagem em sementes são sintetizados apartir de precursores derivados de carboidrato. As plantas têm um caminhoglicolítico complexo no citosol (Plaxton 1996, Annu. Rev. Plant Physiol.Plant Mol. Biol. 47:185-214) e foi mostrado que um caminho completotambém existe nos plastídeos de sementes de colza (Kang & Rawsthorne1994, Plant J. 6:795-805). A sacarose é a fonte primária de carnono e energia,transportada das folhas para as sementes em desenvolvimento. Durante a faede armazenagem das sementes, a sacarose é convertida no citosol parafornecer os precursores metabólicos glicose-6-fosfato e piruvato. Estes sãotransportados nos plastídeos e convertidos em acetil-CoA, que serve como oprecursor primário para a síntese de ácidos graxos. O Acetil-CoA nosplastídeos é o precursor central para a biossíntese de lipídeo. O Acetil-CoApode ser formado nos plastídeos pelas reações diferentes e a contribuiçãoexata de cada reação ainda está sendo debatida (Ohlrogge & Browse 1995,Plant Cell 7:957-970).

Entretanto, é aceito que uma grande parte do acetil-CoA é derivado de glicose-6-fosfato e piruvato que são importados docitoplasma para os plastídeos. A sacarose é produzida nos órgão fonte (folhasou qualquer lugar que a fotossíntese ocorra) e é transportada às sementes emdesenvolvimento que também são denominadas órgãos coletores. Nassementes em desenvolvimento, a sacarose é o precursor para todos ocompostos de armazenagem, isto é, amido, lipídeos e parcialmente, asproteínas de armazenagem em semente. Portanto, está claro que ometabolismo do carboidrato, em que a sacarose desempenha um papel centralé muito importante para o acúmulo de compostos de armazenagem desemente.

Embora o teor de lipídeo e de ácido graxo e/ou a composiçãodo óleo da semente possa ser modificado pelos métodos tradicionais degeração vegetal, o advento da tecnologia de DNA recombinante permitiu amanipulação mais fácil do teor de óleo da semente de uma planta e, em algunscasos, permitiu a alteração dos óleos de semente de maneiras que não podemser realizadas pela geração apenas (ver, por exemplo, Tõpfer et al., 1995,Science 268:681-686). Por exemplo, a introdução de uma seqüência de ácidonucleico de A12-hidroxilase no tabaco transgênico resultou na introdução deum novo ácido graxo, ácido ricinoléico no óleo de semente de tabaco (Van deLoo et al. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:6743-6747). As plantas detabaco também foram projetadas para produzir baixos níveis de ácidopetrosselínico pela introdução e expressão de um acil-ACP desaturase a partirdo coriandro (Cahoon et al. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:11184-11188).

A modificação do teor de óleo de semente em plantas temramificações médicas, nutricionais e econômicas significantes. Com respeitoàs ramificações médicas, os ácidos graxos de cadeia longa (Cl8 e maislongas) encontrados em muitos óleos de semente foram ligados às reduçõesna hipercolesterolemia e outros distúrbios clínicos relacionados com a doençacardíaca da coronária (Brenner 1976, Adv. Exp. Med. Biol. 83:85-101).Portanto, o consumo de uma planta tendo níveis aumentados destes tipos deácidos graxos pode reduzir o risco de doença cardíaca. Níveis intensificadosde teor de óleo de semente também aumenta a produção em grande escala deóleo de semente e, desse modo, reduzem o custo destes óleos.

A fim de aumentar ou alterar os níveis os níveis de compostos,tais como óleos de semente em plantas, seqüências de ácido nucleico elipídeos que regulam proteínas e o metabolismo do ácido graxo devem ser

identificados. Como mencionado antes, diversos ácido nucleicos de

6 * * 12desaturase tais como o ácido nucleico de Δ -desaturase, ácido nucleico de Δ -

desaturase e ácido nucleico de acil-ACP desaturase foram clonados e

demonstraram codificar as enzimas requeridas para a síntese de ácido graxo

em várias espécies vegetais. As seqüências de ácido nucleico de oleosina de

tais espécies diferentes como canola, soja, cenoura, pinheiro e Arabidopsis

thaliana também foram clonadas e determinadas codificar as proteínas

associadas com a membrana de monocamada de fosfolipídeo dos corpos

oleosos naquelas plantas.

Também foi determinado que dois fito-hormônios, ácidogiberélico (GA) e ácido dibásico (ABA), estão envolvidos em todos osprocessos reguladores no desenvolvimento de semente (por exemplo, Ritchie& Gilroy, 1998, Plant Physiol. 116:765-776; Arenas-Huertero et al., 2000,Genes Dev. 14:2085-2096). Tanto o caminho GA quanto o ABA são afetadospelo ácido okadáico, um inibidor da fosfatase da proteína (Kuo et al. 1996,Plant Cell. 8:259-269). A regulação da fosforilação da proteína pelas quinasese pelas fosfatases é aceita como um mecanismo universal de controle celular(Cohen, 1992, Trends Biochem. Sei. 17:408-413. Da mesma maneira, oetileno dos hormônios vegetais (por exemplo, Zhou et al., 1998, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 95:10294-10299; Beaudoin et al., 2000, Plant Cell2000:1103-1115) e a auxina (por exemplo, Colon-Carmona et al., 2000, PlantPhysiol. 124:1728-1738) também estão envolvidos no controle dodesenvolvimento vegetal.

Embora diversos compostos sejam conhecidos afetar odesenvolvimento da planta e da semente, existe uma necessidade clara quantoa identificar especificamente os fatores que são mais específicos para aregulação do desenvolvimento de acúmulo do composto de armazenagem eidentificar os genes que tem a capacidade de conferir a produção de óleoalterada ou aumentada a esta planta hospedeira e a outras espécies de plantas.

Desta maneira, o problema técnico básico da presente invenção pode ser visto como o fornecimento de meios para a satisfação dasnecessidades mencionadas acima. O problema técnico é resolvido pelasformas de realização caracterizadas nas reivindicações e mis abaixo. Emprincípio, esta invenção divulgas seqüências de ácido nucleico de Arabidopsisthaliana e Brassica napus. Estas seqüências de ácido nucleico podem serusadas para alterar ou aumentar os níveis de compostos de armazenagem desemente, tais como proteínas, açúcares e óleos, em plantas, incluindo asplantas transgênicas, tais como canola, linhaça, soja, girassol, milho, aveia,centeio, cevada, trigo, arroz, pimenta, tagetes, algodão, óleo de palma, cocode palma, linho, rícino e amendoim, que são plantas de semente oleosascontendo altas quantidades de compostos de lipídeo.

Especificamente, a presente invenção diz respeito a umpolinucleotídeo que compreende as seqüências de ácido nucleico selecionadasdo grupo que consiste de:

(a) uma seqüência de ácido nucleico como mostrado na SEQIDN°: 1 ou 3;

(b) uma seqüência de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido como mostrado na SEQ ED N°: 2;

(c) uma seqüência de ácido nucleico que é pelo menos 70 %idêntica à seqüência de ácido nucleico de (a) ou (b), em que a dita seqüênciade ácido nucleico codifica um polipeptídeo ou porção biologicamente ativadeste tendo atividade de serina/treonina proteína quinase e em que o ditopolipeptídeo compreende pelo menos uma das seqüências de aminoácidomostradas em qualquer uma das SEQ ID N°: 7 a 9 e

(d) uma seqüência de ácido nucleico sendo um fragmento dequalquer um de (a) a (c), em que o dito fragmento codifica um polipeptídeoou porção biologicamente ativa deste tendo atividade de serina/treoninaproteína quinase e em que o dito polipeptídeo compreende pelo menos umadas seqüências de aminoácido mostradas em qualquer uma das SEQ ID N°: 7 a 9.

O termo "polinucleotídeo" como usado de acordo com apresente invenção diz respeito a um polinucleotídeo que compreende umaseqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo atividade deserina/treonina quinase. Mais preferivelmente, o polipeptídeo codificado pelopolinucleotídeo da presente invenção tendo atividade de serina/treoninaquinase deve ser capaz de aumentar a quantidade de compostos dearmazenagem de semente, preferivelmente, ácidos graxos ou lipídeos, quandopresente nas sementes de plantas. O polipeptídeos codificados pelopolinucleotídeo da presente invenção também são referidos como proteínas dometabolismo de lipídeo (LMP) a seguir. Os Ensaios adequados para medir asatividades mencionadas anteriormente são descritos nos Exemplos anexos.Preferivelmente, o polinucleotídeo da presente invenção na expressão de umasemente de planta deve ser capaz de aumentar significantemente aarmazenagem de sementes de lipídeos em mutantes crtl como descrito noW02003014376.

Preferivelmente, o polinucleotídeo da presente invenção naexpressão na semente de uma planta transgênica é capaz de aumentarsignificantemente a quantidade em peso de pelo menos um composto dearmazenagem de semente. Mais preferivelmente, um tal aumento comoreferido de acordo com a presente invenção é um aumento da quantidade empeso de pelo menos 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5 ou 25 % emcomparação com um controle. O quanto um aumento é significante pode serdeterminado pelos testes estatísticos bem conhecidos na técnica incluindo, porexemplo, t-teste de Student. As taxas de aumento percentuais de um compostode armazenagem de semente são, preferivelmente, determinados emcomparação a um controle de vetor vazio. Um controle de vetor vazio é umaplanta transgênica, que foi transformada com o mesmo vetor ou construçãocomo uma planta transgênica de acordo com a presente invenção de acordocom a presente invenção exceto para um tal vetor ou construção estádesprovido do polinucleotídeo da presente invenção. Alternativamente, umaplanta não tratada (isto é, uma planta que não foi geneticamente manipulada)pode ser usada como um controle.

Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo umaatividade biológica como especificado acima foi obtido de acordo com apresente invenção a partir da Brassica napus. Os polinucleotídeoscorrespondentes, preferivelmente, compreendem a seqüência de ácidonucleico mostrada na SEQ ID N°: 1 ou 3 que codifica um polipeptídeo tendoa seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 2. Deve ser entendido que umpolipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido como mostrado na SEQ IDN°: 2 também pode ser codificado devido ao código genético tambémdegenerado por outros polinucleotídeos.

Além disso, o termo "polinucleotídeo" como usado de acordocom a presente invenção ainda abrange variantes dos polinucleotídeosespecíficos mencionados acima, as ditas variantes podem representarortólogos, parálogos ou outros homólogos do polinucleotídeo da presenteinvenção.

O polinucleotídeo variantes, preferivelmente, tambémcompreende uma seqüência de ácido nucleico caracterizado em que aseqüência pode ser derivada das seqüências de ácido nucleico específicasmencionadas acima mostradas na SEQ ED N°: 1 ou 3 por pelo menos umasubstituição, adição e/ou anulação de nucleotídeo, desse modo, a seqüência deácido nucleico variante ainda deve codificar um polipeptídeo tendo umaatividade biológica como especificado acima. As variantes também abrangempolinucleotídeos que compreendem uma seqüência de ácido nucleico que écapaz de hibridizar às seqüências de ácido nucleico específicas mencionadasacima, preferivelmente, sob condições de hibridização estringentes. Estascondições estringentes são conhecidas pelo trabalhador habilitado e podemser observadas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, Ν. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. um exemplo preferido para as condições dehibridização estringentes são as condições de hibridização em 6 χ cloreto desódio/citrato de sódio (= SSC) em aproximadamente 45° C, seguido por umaou mais etapas de lavagem em 0,2 χ SSC, 0,1 % de SDS de 50 a 65° C. Otrabalhador habilitado conhece que estas condições de hibridização diferemdependendo do tipo de ácido nucleico e, por exemplo, quando os solventesorgânicos estão presentes, com respeito à temperatura e concentração dotampão. Por exemplo, sob "condições de hibridização padrão" a temperaturadifere dependendo do tipo de ácido nucleico entre 42° C e 58° C em tampãoaquoso com uma concentração de 0,1 a 5 χ SSC (pH 7,2). Se o solventeorgânico estiver presente no tampão mencionado acima, por exemplo 50 % deformamida, a temperatura sob condições padrão é de aproximadamente 42° C.As condições de hibridização para híbridos de DNA:DNA são,preferivelmente, 0,1 χ SSC e 20° C a 45° C, preferivelmente entre 30° C e45° C. As condições de hibridização para híbridos de DNA:RNA são,preferivelmente, 0,1 χ SSC e 30° C a 55° C, preferivelmente entre 45° C e55° C. As temperaturas de hibridização mencionadas acima são determinadas,por exemplo, para um ácido nucleico com aproximadamente 100 bp (= paresde base) de comprimento e um teor de G + C de 50 % na ausência deformamida. O trabalhador habilitado conhece como determinar as condiçõesde hibridização requeridas por referência aos livros-texto, tais como o livro-texto mencionado acima ou os seguintes livro-texto: Sambrook et al.,"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames andHiggins (Ed.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach",IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Ed.) 1991, "EssentialMolecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford UniversityPress, Oxford. Alternativamente, as variantes de polinucleotídeo são obtidaspor técnicas com base em PCR, tais como amplificação com base eminiciador de oligonucleotídeo misto de DNA5 isto é, usando-se iniciadoresdegenerados contra os domínios conservados dos polipeptídeos da presenteinvenção, os domínios conservados do polipeptídeo da presente invençãopodem ser identificados por uma comparação de seqüência das seqüências deácido nucleico dos polinucleotídeos ou as seqüências de aminoácido dospolipeptídeos da presente invenção. Os oligonucleotídeos adequados comoiniciadores de PCR bem como as condições de PCR adequadas são descritosnos Exemplos anexos. Como um padrão, o DNA ou cDNA de bactérias,fungos, plantas ou animais podem ser usados. Além disso, as variantesincluem polinucleotídeos que compreendem seqüências de ácido nucleico quesão pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %,pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 %idênticas às seqüências de ácido nucleico mostradas na SEQ ID N°: 1 ou 3retendo uma atividade biológica como especificado acima. Maispreferivelmente, os ditos polinucleotídeos variantes codificam umpolipeptídeo que compreende, pelo menos dois ou todos os padrões deseqüência de aminoácido mostrados em qualquer uma das SEQ ED N°: 7 a 9.Além disso, também são abrangidos os polinucleotídeos que compreendemseqüências de ácido nucleico que codificam seqüências de aminoácido quesão pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %,pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 %idênticas às seqüências de aminoácido mostradas na SEQ ID N°: 2 em que opolipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido retêm uma atividadebiológica como especificado acima. Mais preferivelmente, o dito polipeptídeovariante compreende, pelo menos dois ou todos os padrões de seqüência deaminoácido mostrados em qualquer uma das SEQ ID N°: 7 a 9. Os valores deidentidade percentuais, preferivelmente, calculados sobre a região deaminoácido ou seqüência de ácido nucleico totais. Uma série de programascom base em uma variedade de algoritmos está disponível para o trabalhadorhabilitado na para a comparação de seqüências diferentes. Neste contexto, osalgoritmos de Needleman e Wunsch ou Smith and Waterman são resultadosparticularmente confiáveis. Para a realização dos alinhamentos de seqüência,o programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al.,CABIOS, 5 1989: 151-153) ou os programas Gap e BestFit (Needleman andWunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)) e Smith and Waterman (Adv.Appl. Math. 2; 482-489 (1981))), que são parte do pacote da GCG software[Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711 (1991)] devem ser usados. Os valores de identidade de seqüênciarelatados acima em porcentagem (%) devem ser determinados,preferivelmente, usando-se o programa GAP na região de seqüência total comos seguintes ajustes: Fenda Weighf. 50, Length Weight: 3, Acerto Médio:10,000 e Erro Médio: 0,000, que, a não ser que especificado de outra maneira,deve sempre ser usado como ajustes padrão para os alinhamentos deseqüência. Para os propósitos da invenção, a identidade de seqüênciapercentual entre duas seqüências de ácido nucleico ou polipeptídeo tambémpode ser determinada usando-se o pacote de software Vector NTI 7.0 (PC)(InforMax, 7600 Wisconsin Ave., Bethesda, MD 20814). Uma penalidade deabertura de fenda de 15 e uma penalidade de extensão de fenda de 6,66 sãousadas para a determinação da identidade percentual de dois ácidos nucleicos.Uma penalidade de abertura de fenda de 10 e uma penalidade de extensão defenda de 0,1 são usados para a determinação da identidade percentual de doispolipeptídeos. Todos os outros parâmetros são ajustados como os ajustes depadrão. Para os propósitos de um alinhamento múltiplo (algoritmo ClustalW), a penalidade de abertura de fenda é 10 e a penalidade de extensão defenda é de 0,05 com a matriz blosum62. Deve ser entendido que para ospropósitos de determinar a identidade de seqüência quando compara-se umaseqüência de DNA com uma seqüência de RNA, uma seqüência denucleotídeo de timidina é equivalente a um nucleotídeo uracila. Além disso,os polinucleotídeos variantes mencionados acima, preferivelmente, codificamos polipeptídeos que compreendem pelo menos um, pelo menos dois ou todosos seguintes padrões de seqüência de aminoácido:SEQ ID N°: 7:

AX1RX2X3X4X5X6X7X8X9X1 oPX 11X12X 13X14X15X1βΧ 17X1 sX 19X20X21X22X23X24XX26X27X28SLX29SAX30X31NX32X33X34X35NX36X37SX38SX39X4&X41X42X43HHPSX44X45X40X47X48X49X50PX51X52X53AX54X55X56X57SX58X59X60X01X02X63X64X65X66X67X68X69X70X71X72X73X74X75X76X77X78X79X80X81VX82X83X84X85X86X87GX88X89X90X91ΜΧ92Χ93 Χ94Χ95Χ96Χ97 VX98LX99X1OO S X ι ο 1MX102 Xi03GM

em que cada Xi a X103 representa um aminoácidoindividualmente selecionado do grupo que consiste de: A, V, L, I, F, Ρ, M, S,T, C, W, Υ, N, Q, D, E, KjR5He G.

SEQ ID N°: 8:

TDX1X2X3X4X5X6X7X8X9X1 oX 11X12X13NX14X15X1 ÔX 17X1 δΧ 19X20X21X22X23X24X25X26IX27X28X29X30X31X32X33X34X35X36X37LX38X39X40X41VX42X43X44X45X46X47X48X49X50X51X52X53X54X55X56X57X58X59X60X61X62X63X64X05X66X67X68X69X70X71X72X73X74X75X76X77X78X79SX80X81X82X83X84X85X86X87X88X89X90X91X92X93X94X95NX96X97X98X99C

em que cada Xi a X99 representa um aminoácidoindividualmente selecionado do grupo que consiste de: A, V, L, I, F, Ρ, M, S,T, C, W, Υ, N, Q, D, Ε, K, R, H e G.SEQIDN0: 9:

TX1X2X3X4X5X6X7X8X9X1 oX 11X12RX13X14X15X10X17X1 δΧ] 9X20X21EX22X23X24X25X26X27TX28X29EX30X31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X411X42X43X44X45X46X47X48X49X50X51X52X53GSX54X55X56X57X58X59X60VX61X62GX63X64X65X66X67X68X691X70X71X72X73X74X75'VQDX76VX77IX78X79X8OX8IX82NX83X84X85VX86X87X88X89X90D

em que cada Xi a X90 representa um aminoácidoindividualmente selecionado do grupo que consiste de: A, V, L, I, F, Ρ, M, S,T, C, W, Υ, N, Q, D, Ε, K, R, H e G.

Um polinucleotídeo que compreende um fragmento dequalquer uma das seqüências de ácido nucleico mencionadas acima também éabrangido como um polinucleotídeo da presente invenção. O fragmento devecodificar um polipeptídeo que ainda tem uma atividade biológica comoespecificado acima. Conseqüentemente, o polipeptídeo pode compreender ouconsistir dos domínios do polipeptídeo da presente invenção conferindo a ditaatividade biológica. Um fragmento como entendido aqui, preferivelmente,compreende pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 250ou pelo menos 500 nucleotídeos consecutivos de qualquer uma das seqüênciasde ácido nucleico já mencionadas ou codifica uma seqüência de aminoácidoque compreende pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 50, pelo menos80, pelo menos 100 ou pelo menos 150 aminoácidos consecutivos de qualqueruma das seqüências de aminoácido mencionadas acima. Maispreferivelmente, os ditos polinucleotídeos variantes codificam umpolipeptídeo que compreende, pelo menos dois ou todos os padrões deseqüência de aminoácido mostrados em qualquer uma das SEQ ID N°: 7 a 9.

Os polinucleotídeos variantes ou fragmentos referidos acima,preferivelmente, codificam polipeptídeos que retêm pelo menos 10 %, pelomenos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelomenos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 % ou pelo menos 90 % daatividade de serina/treonina apresentada pelo polipeptídeo mostrado na SEQID N°: 2. A atividade pode ser testada como descrito nos Exemplos anexos.

Os polinucleotídeos da presente invenção, essencialmente,consistem das seqüências de ácido nucleico já mencionadas ou compreendemas seqüências de ácido nucleicos já mencionadas. Desta maneira, estestambém podem conter seqüências de ácido nucleico adicionais.

Preferivelmente, o polinucleotídeo da presente invenção pode compreendemalém da estrutura de leitura aberta, a seqüência não traduzida adicional noterminal 3' e no 5' da região do gene codificador: pelo menos 500,preferivelmente 200, mais preferivelmente 100 nucleotídeos da seqüência amontante do terminal 5' da região codificadora e pelo menos 100,preferivelmente 50, mais preferivelmente 20 nucleotídeos da seqüência ajusante do terminal 3' da região de gene codificador. Por exemplo, a SEQ IDN°: 1 mostra a estrutura de leitura aberta que codifica a seqüência deaminoácido mostrada na SEQ ID N°: 2. SEQ ID N°: 3 mostra uma seqüênciade ácido nucleico que compreende as estruturas de leitura abertas jámencionadas e ainda contém nucleotídeo 5' e 3' adicionais, isto é, umaseqüência de cDNA. Além disso, os polinucleotídeos da presente invençãopodem codificar as proteínas de fusão em que um parceiro da proteína defusão é um polipeptídeo sendo codificado por uma seqüência de ácidonucleico relatado acima. Tais proteínas de fusão podem compreender comoparte adicional, outras enzimas dos caminhos de biossíntese de ácido graxo oulipídeo, polipeptídeos para a monitoração da expressão (por exemplo,proteínas fluorescentes verdes, amarelas, azuis ou vermelhas, fosfatasealcalina e outros) ou os denominados "rótulos" que podem servir como ummarcador detectável ou como uma medida auxiliar para os propósitos depurificação. Os rótulos para os propósitos diferentes são bem conhecidos natécnica e compreendem rótulos FLAG, rótulos de 6-histidina, rótulos de MYCe outros.

Os polinucleotídeos variantes como referidos de acordo com apresente invenção podem ser obtidos por várias fontes naturais, bem comoartificiais. Por exemplo, os polinucleotídeos podem ser obtidos por métodosde mutagênese in vitro e in vivo usando-se também os polinucleotídeosespecíficos mencionados acima como uma base. Além disso, ospolinucleotídeos sendo homólogos e ortólogos podem ser obtidos a partir devárias espécies de animais, plantas, bactérias ou fungos. Os parálogos podemser identificados a partir da Brassica napus.

O polinucleotídeo da presente invenção deve ser fornecido,preferivelmente, como um polinucleotídeo isolado (isto é, isolado a partir deseu contexto natural como um local de gene) ou na forma geneticamentemodificada exogeneamente (isto é, artificialmente) manipulada. Umpolinucleotídeo isolado pode, por exemplo, compreender menos do queaproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de seqüênciasde nucleotídeo que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico noDNA genômico da célula cujo ácido nucleico é derivado. O polinucleotídeo,preferivelmente, é o DNA de filamento duplo ou simples DNA incluindocDNA ou RNA. O termo abrange polinucleotídeos de filamento simples, bemcomo duplo. Além disso, também estão compreendidos polinucleotídeoquimicamente modificados incluindo os polinucleotídeos modificados deocorrência natural, tal como os polinucleotídeos glicosilados ou metilados ouuns modificados artificiais, tais como os polinucleotídeos biotinilados.

O polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo umaatividade biológica como especificado abrangido pela presente invençãotambém é, preferivelmente, um polinucleotídeo tendo uma seqüência de ácidonucleico que foi adotada para o uso de códon específico do organismo, porexemplo, as espécies vegetais, em que o polinucleotídeo deve ser expressado(isto é, o organismo alvo). Isto é, no geral,, atingido pela mudança dos códonsde uma seqüência de ácido nucleico obtida a partir do primeiro organismo(isto é, o organismo doador) que codifica uma dada seqüência de aminoácidonos códons normalmente usados pelo organismo alvo, desse modo, aseqüência de aminoácido é retida. Está no princípio conhecido que o códigogenético é redundante (isto é, degenerado). Especificamente, 61 códons sãousados para a codificação de apenas 20 aminoácidos. Desta maneira, amaioria dos 20 aminoácidos será codificada por mais do que um códon. Oscódons para os aminoácidos são bem conhecidos na técnica e são universaispara todos os organismos. Entretanto, entre os códons diferentes que podemser usados para a codificação de um dado aminoácido, cada organismo pode,preferivelmente usar certos códons. A presença de códons raramente usadosem uma seqüência de ácido nucleico resultará na anulação dos grupos detRNA respectivos e, desse modo, diminuirá a eficácia de tradução. Destamaneira, pode ser vantajoso fornecer um polinucleotídeo que compreendeuma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo como referidoacima em que a dita seqüência de ácido nucleico é otimizada para a expressãono organismo alvo com respeito ao uso do códon. A fim de otimizar o uso docódon para um organismo alvo, uma pluralidade de genes conhecidos do ditoorganismo pode ser investigada quanto aos códons mais comumente usadosque codificam os aminoácidos. Em uma etapa subseqüente, os códons de umaseqüência de ácido nucleico do organismo doador serão otimizados pelasubstituição dos códons na seqüência doadora pelos códons mais comumentesuados pelo organismo alvo para codificar os mesmos aminoácidos. Deve serentendido que se o mesmo códon for usado, preferivelmente por ambosorganismos, nenhuma substituição será necessária. Para vários organismoalvo, as tabelas com os usos de códon preferidos já são conhecidas na técnica;ver, por exemplo, http://www.kazusa.or.jp/Kodon/E.html. Além disso, osprogramas de computador existem para a otimização, por exemplo, o softwareLeto, versão 1.0 (Entelechon GmbH, Germany) ou o GeneOptimizer (GeneartAG, Germany). Para a otimização de uma seqüência de ácido nucleico,diversos critérios podem ser levados em consideração. Por exemplo, para umdado aminoácido, sempre o códon mais comumente usado pode serselecionado para cada códon a ser trocado. Alternativamente, os códonsusados pelo organismo alvo podem substituir aqueles em uma seqüênciadoadora de acordo com sua freqüência natural. Conseqüentemente, emalgumas posições, mesmo os códons menos comumente usados do organismoalvo aparecerão na seqüência de ácido nucleico otimizado. A distribuição doscódons de substituição diferentes do organismo alvo à seqüência de ácidonucleico doadora pode ser aleatória. Os organismos alvo preferidos de acordocom a presente invenção são espécies de soja ou canola (Brassica).Preferivelmente, o polinucleotídeo da presente invenção tem um ácidonucleico otimizado para o uso de códon no organismo alvo considerado emque pelo menos 20 %, pelo menos 40 %, pelo menos 60 %, pelo menos 80 %ou todos os códons relevantes são adotados. Mais preferivelmente, umpolinucleotídeo otimizado de acordo com a presente invenção compreendeuma seqüência de ácido nucleico como mostrado na SEQ ID N°: 10 ou 11 ouuma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo umaseqüência de aminoácido como mostrado na SEQ ID N°: 12.

Foi observado nos estudos básicos que os polipeptídeos sendocodificados pelos polinucleotídeos da presente invenção têm atividade deserina/treonina. Além disso, os polipeptídeos codificados pelospolinucleotídeos da presente invenção são, vantajosamente, capazes deaumentar a quantidade de compostos de armazenagem de semente em plantasde maneira significante. Desta maneira, os polinucleotídeos da presenteinvenção são, em princípio, útil para a síntese de compostos de armazenagemde semente tais como ácidos graxos ou lipídeos. Além disso, estes podem serusados para a geração de plantas transgênicas ou sementes destes tendo umaquantidade aumentada, preferivelmente modificada de compostos dearmazenagem de semente. Tais plantas ou sementes transgênicas podem serusadas para a fabricação de óleo de semente ou outros lipídeos e/oucomposições contendo ácido graxo.

Além disso, a presente invenção diz respeito ao vector quecompreende o polinucleotídeo da presente invenção. Preferivelmente, o vetoré um vetor de expressão.

O termo "vector", preferivelmente, abrange vetores de fago,plasmídeo, virais ou retrovirais bem como cromossomos artificiais, tais comocromossomos artificiais bacterianos e de levedura. Além disso, o termotambém diz respeito a construções de alvejamento que permitem a integraçãoaleatória ou direta ao local da construção alvejadora no DNA genômico. Taisconstruções alvo, preferivelmente, compreendem o DNA de comprimentosuficiente para a recombinação homóloga ou inserção heteróloga comodescrito em detalhes abaixo. O vetor abrange os polinucleotídeos da presenteinvenção, preferivelmente, além disso compreende marcadores selecionáveispara a propagação e/ou seleção em um hospedeiro. O vetor pode serincorporado em uma célula hospedeira por várias técnicas bem conhecidas natécnica. Se introduzido em uma célula hospedeira, o vetor pode residir nocitoplasma ou pode ser incorporado no genoma. No último caso, deve serentendido que o vetor pode, além disso compreender as seqüências de ácidonucleico que permitem a recombinação homóloga ou a inserção heteróloga,ver abaixo. Os vetores podem ser introduzidos em células procarióticas oueucarióticas por intermédio das técnicas de transformação ou de transfecçãoconvencionais. Um "vetor de expressão" de acordo com a presente invenção écaracterizada em que este compreende uma seqüência de controle deexpressão, tal como a seqüência promotora e/ou intensificadoraoperacionalmente ligada ao polinucleotídeo da presente invenção. Os vetorespreferidos, vetores de expressão e técnicas de transformação ou transfecçãosão especificadas em outra parte neste pedido em detalhes.

Além disso, a presente invenção abrange uma célulahospedeira que compreende o polinucleotídeo ou vetor da presente invenção.

As células hospedeiras são células primárias ou linhascelulares derivadas de organismos multicelulares, tais como plantas ouanimais. Além disso, as células hospedeiras abrangem organismos celularessimples procarióticos ou eucarióticos (também referidos comomicroorganismos), por exemplo, bactérias ou fungos incluindo levedura oubactérias. As células primárias ou as linhas celulares devem ser usadas comocélulas hospedeiras de acordo com a presente invenção podem ser derivadasdos organismos multicelulares, preferivelmente de plantas. Especificamenteas células hospedeiras, microorganismos ou organismos multicelularespreferidos dos quais as células hospedeiras podem ser obtidas são divulgadosabaixo.

Os polinucleotídeos ou vetores da presente invenção podemser incorporados em uma célula hospedeira ou uma célula de um organismohumano não transgênico pela inserção heteróloga ou recombinação homóloga."Heterólogo" como usado no contexto da presente invenção refere-se a umpolinucleotídeo que é inserido (por exemplo, por ligação) ou é manipuladopara tornar-se inserido em um contexto de seqüência de ácido nucleico quenão abrange naturalmente o dito polinucleotídeo, por exemplo, uma seqüênciade ácido nucleico artificial em um genoma de um organismo. Desta maneira,um polinucleotídeo heterólogo não é endógeno para a célula em que éintroduzido, mas foi obtido a partir de uma outra célula. No geral, embora nãonecessariamente, tais polinucleotídeos heterólogos codificam proteínas quesão normalmente não produzidas pela expressão celular do ditopolinucleotídeo heterólogo. Uma seqüência de controle de expressão comousada em uma construção alvejante ou o vetor de expressão é considerado ser"heterólogo" com relação a uma outra seqüência (por exemplo, que codificauma seqüência marcadora ou uma característica agronomicamente relevante)se as ditas duas seqüências não são combinadas ou operacionalmente ligadasde uma maneira diferente sem eu ambiente natural. Preferivelmente, as ditasseqüências não são operacionalmente ligadas em seu ambiente natural (isto é,originam-se dos genes diferentes). Mais preferivelmente, a dita seqüênciareguladora é covalentemente unida (isto é, ligada) e adjacente a um ácidonucleico ao qual este não é adjacente em seu ambiente natural. "Homólogo"como usado de acordo com a presente invenção diz respeito à inserção de umpolinucleotídeo no contexto de seqüência em que o dito polinucleotídeoocorre naturalmente. Usualmente, um polinucleotídeo heterólogo também éincorporado em uma célula pela recombinação homóloga. Para este fim, opolinucleotídeo heterólogo é flanqueado pelas seqüências de ácido nucleicosendo homólogas a uma seqüência alvo no genoma de uma célula hospedeiraou um organismo não humano. A recombinação homóloga, agora ocorre entreas seqüências homólogas. Entretanto, como um resultado da recombinaçãohomóloga das seqüências de flanqueamento, o polinucleotídeo homólogotambém será inserido. Como preparar as construções alvo adequadas para arecombinação homóloga e como realizar a dita recombinação homóloga ébem conhecido na técnica.

Também é fornecido, de acordo com a presente invenção, ummétodo para a fabricação de um polipeptídeo tendo atividade deserina/treonina proteína quinase que compreende:

(a) expressar o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação1 ou 2 em uma célula hospedeira e

(b) obter o polipeptídeo codificado pelo dito polinucleotídeo apartir da célula hospedeira.

O polipeptídeo pode ser obtido, por exemplo, por todas astécnicas de purificação convencional incluindo a cromatografia por afinidade,cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia líquida de alta pressão(HPLC) e técnicas de precipitação incluindo a precipitação de anticorpo.

Deve ser entendido que o método pode - embora preferido - nãonecessariamente, produzir uma preparação essencialmente pura dopolipeptídeo. Deve ser entendido que, dependendo da célula hospedeira que éusada para o método já mencionado, os polipeptídeos produzidos desse modopodem se tornar pós-translacionalmente modificados ou processados de outramaneira.

A presente invenção, além disso, diz respeito a umpolipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo da presente invenção ou que éobtenível pelo método já mencionado da presente invenção.

O termo "polipeptídeo" como usado aqui, abrange ospolipeptídeos ou preparações de polipeptídeos essencialmente purificados quecompreendem outras proteína, além disso. Além disso, o termo também dizrespeito Às proteínas de fusão ou a fragmentos de ou polipeptídeo sendo pelomenos parcialmente codificados pelo polinucleotídeo da presente invençãoreferidos acima. Além disso, este inclui polipeptídeos quimicamentemodificados. Tais modificações podem ser modificações artificiais oumodificações de ocorrência natural, tais como a fosforilação, glicosilação,miristilação e outros. Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" ou "proteína" sãousados de maneira intercambiável por todo este relatório descritivo. Opolipeptídeo da presente invenção deve apresentar as atividades biológicasreferidas acima, isto é, atividade de serina/treonina quinase e, maispreferivelmente, deve ser capaz de aumentar a quantidade de compostos dearmazenagem de semente, preferivelmente, ácidos graxos ou lipídeos, quandopresente nas sementes de plantas como referido acima. Mais preferivelmente,se presente nas sementes de plantas, o polipeptídeo deve ser capaz deaumentar significantemente a armazenagem de sementes de lipídeos emmutantes de crtl como descrito no W02003014376.

Abrangido pela presente invenção está, além disso, umanticorpo que reconhece especificamente o polipeptídeo da invenção.

Os anticorpos contra os polipeptídeos da invenção podem serpreparados pelos métodos bem conhecidos usando-se um polipeptídeopurificado de acordo com a invenção ou um fragmento adequado derivadodeste como um antígeno. Um fragmento que é adequado como um antígenopode ser identificado pelos algoritmos determinantes da antigenicidade bemconhecidos na técnica. Tais fragmentos podem ser obtidos a partir dopolipeptídeo da invenção pela digestão proteolítica ou pode ser um peptídeosintético. Preferivelmente, o anticorpo da presente invenção é um anticorpomonoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo de cadeia simples, umanticorpo humano ou humanizado ou primatizado, quimerizado ou fragmentodeste. Também compreendidos como anticorpos pela presente invenção estãoum anticorpo biespecífico, um anticorpo sintético, um fragmento deanticorpo, tais como fragmentos Fab, Fv ou scFv etc. ou um derivadoquimicamente modificado de qualquer um destes. O anticorpo da presenteinvenção deve ligar-se especificamente (isto é, não reage significantemente demaneira cruzada com outros polipeptídeos ou peptídeos) ao polipeptídeo dainvenção. A ligação específica pode ser testada por várias técnicas bemconhecidas. Os anticorpos ou fragmentos destes podem ser obtidos usando-semétodos que são descritos, por exemplo, em Harlow and Lane "Antibodies, ALaboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Os anticorposmonoclonais podem ser preparados pela técnicas originalmente descritas emKõhler and Milstein, Nature 256 (1975), 495, and Galfré, Meth. Enzymol. 73(1981), 3, que compreende a fusão de células de mieloma de camundongo àcélulas de baço derivadas de mamíferos imunizados. Os anticorpos podem serusados, por exemplo, para a imunoprecipitação, imunolocalizção oupurificação (por exemplo, pela cromatografia por afinidade) dos polipeptídeosda invenção bem como para o monitoramento da presença dos ditospolipeptídeos variantes, por exemplo, em organismos recombinantes e para aidentificação de compostos que interagem com as proteínas de acordo com ainvenção.

A presente invenção também diz respeito a um organismo nãohumano transgênico que compreende o polinucleotídeo, o vetor ou a célulahospedeira da presente invenção. Preferivelmente, o dito organismotransgênico não humano é uma planta.

O termo "organismo transgênico não humano",preferivelmente, diz respeito a uma planta, um animal ou um organismomulticelular. O polinucleotídeo ou o vetor podem estar presentes nocitoplasma do organismo ou pode ser incorporado no genoma heterólogo oupor recombinação homóloga. As células hospedeiras, em particular aquelasobtidas a partir de plantas ou animais, podem ser introduzidas em umdesenvolvimento de embrião a fim de obter organismos mosáicos ouquiméricos, isto é, os organismos transgênico não humanos que m as célulashospedeiras da presente invenção. Preferivelmente, o organismo transgêniconão humano expressa o polinucleotídeo da presente invenção a fim deproduzir o polipeptídeo em uma quantidade que resulta em uma atividadedetectável de serina/treonina quinase. Os organismos transgênicos adequadossão, preferivelmente, aqueles organismos que são capazes de sintetizar osácidos graxos ou lipídeos. Os organismos e os métodos para a transgênese sãodivulgados em detalhes abaixo. Um organismo ou tecido transgênico podemcompreender uma ou mais células transgênicas. Preferivelmente, o organismoou tecido que consiste substancialmente de células transgênicas (isto é, maisdo que 80 %, preferivelmente 90 %, mais preferivelmente 95 %, maispreferivelmente 99 % das células no dito organismo ou tecido sãotransgênicos). O termo "transgene" como usado neste refere-se a qualquerseqüência de ácido nucleico, que é introduzido no genoma de uma célula ouque foi manipulada pelas manipulações experimentais incluindo técnicas, taiscomo a quimerablastia. Preferivelmente, a dita seqüência é resultante em umgenoma que é significantemente diferente do genoma total de um organismo(por exemplo, a dita seqüência, se endógena ao dito organismo, é introduzidaem uma locação diferente de sua locação natural ou seu número de cópia éaumentado ou diminuído). Um transgene pode compreender umpolinucleotídeo endógeno (isto é, um polinucleotídeo tendo uma seqüência deácido nucleico obtida do mesmo organismo ou célula hospedeira) ou pode serobtido a partir de um organismo diferente ou célula hospedeira, em que o ditoorganismo diferente é, preferivelmente, um organismo de uma outra espécie ea dita célula hospedeira é, preferivelmente, um microorganismo diferente,uma célula hospedeira de uma origem diferente ou derivada de um organismode uma espécie diferente.

Particularmente preferido como uma planta a ser usada deacordo com a presente invenção são espécies vegetais que produzem óleo.Mais preferivelmente, a dita planta é selecionada do grupo que consiste decanola, linhaça, soja, girassol, milho, aveia, centeio, cevada, trigo, arroz,pimenta, tagetes, algodão, óleo de palma, coco de palma, linho, rícino eamendoim.

A presente invenção diz respeito a um método para afabricação de um lipídeo e/ou um ácido graxo que compreende as etapas de:

(a) cultivar (i) a célula hospedeira ou o organismo humanonão transgênico da presente invenção ou (ii) uma célula hospedeira ou umorganismo transgênico não humano que expressa um polinucleotídeo que

compreende uma seqüência de ácido nucleico como mostrado na SEQ ID N°:4 ou 6 ou uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeotendo uma seqüência de aminoácido como mostrado na SEQ ED N°: 5 sob ascondições que permitem a síntese do dito lipídeo ou ácido graxo e

(b) obter o dito lipídeo e/ou ácido graxo a partir da célulahospedeira ou do organismo humano não transgênico.

O termo "lipídeo" e "ácido graxo" como usado neste refere-se,preferivelmente, àquele recitado na Tabela 1 (para lipídeos) e Tabela 2 (paraácidos graxos), abaixo. Entretanto, os termos, em princípio, tambémabrangem outros lipídeos ou ácidos graxos que podem ser obtidos pelo mtabolismo de lipídeo em uma célula hospedeira ou um organismo referidode acordo com a presente invenção.

Uma célula hospedeira ou um organismo transgênico nãohumano que expressa um polinucleotídeo que compreende uma seqüência deácido nucleico como mostrado na SEQ ID N°: 4 ou 6 ou uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência deaminoácido como mostrado na SEQ ID N°: 5 pode ser obtida por qualqueruma das técnicas de recombinação referidas em qualquer lugar deste relatóriodescritivo. Preferivelmente, é considerado que o polinucleotídeo é umpolinucleotídeo heterólogo com respeito à célula hospedeira ou o organismonão humano. Os polinucleotídeos que compreendem uma seqüência de ácidonucleico como mostrado na SEQ ID N°: 4 ou 6 codifica um polipeptídeotendo uma seqüência de aminoácido como mostrado na SEQ ID N0: 5.Aquelas seqüências foram obtidas a partir de Arabidopsis thaliana erepresenta homólogos distancialmente relacionados. Entretanto, foi observadoque estas seqüências também são capazes de modificar e, preferivelmente,aumentar a quantidade de compostos de armazenagem de sementes emplantas. Conseqüentemente, estes polinucleotídeos bem como as variantestambém podem ser usados nos métodos da presente invenção embora menoseficazmente. A definição do termo "variante" feito em conexão com ospolinucleotídeos da presente invenção aplica-se mutatis mutandis às variantesdos polinucleotídeos já mencionados (isto é, SEQ ID N°: 4 ou 6).

Em uma forma de realização preferida do método mencionadoacima da presente invenção, o dito lipídeo e/ou ácidos graxos constituem oóleo de semente.

Além disso, a presente invenção diz respeito a um método paraa fabricação de uma planta tendo uma quantidade modificada de umcomposto de armazenagem de semente, preferivelmente um lipídeo ou umácido graxo, que compreende as etapas de:

(a) introduzir o polinucleotídeo ou o vetor da presenteinvenção ou um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de ácidonucleico como mostrado na SEQ ID N°: 4 ou 6 ou uma seqüência de ácidonucleico que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidocomo mostrado na SEQ ID N°: 5 em uma célula vegetal e

(b) geração de uma planta transgênica a partir da dita célulavegetal, em que o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo modifica aquantidade do dito composto de armazenagem de semente na plantatransgênica.

O termo "composto de armazenagem de semente" como usadoneste, preferivelmente, refere-se aos compostos sendo um açúcar, umaproteína ou, mais preferivelmente, um lipídeo ou um ácido graxo.Preferivelmente, a quantidade do dito composto de armazenagem de sementeé significantemente aumentada em comparação com um controle,preferivelmente, um controle de vetor vazio como especificado acima. Oaumento é, mais preferivelmente, um aumento em uma quantidade em pesode pelo menos 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5 ou 25 % emcomparação com um controle.

Deve ser entendido que os polinucleotídeos ou o vetor referidode acordo com o método acima da presente invenção pode ser introduzido nacélula vegetal por qualquer um de técnicas de inserção ou recombinação jámencionadas.

O método já mencionado da presente invenção também podeser suado para a fabricação de uma planta tendo um teor de óleo total alteradoem suas semente ou uma planta tendo um teor de óleo de semente totalalterado e níveis alterados de compostos de armazenagem de semente em suassementes. Tais plantas são fontes adequadas para óleo de semente e pode serútil para a fabricação em grande escala deste.

Além disso, as formas de realização preferidas formas derealização dos compostos, métodos e usos de acordo com a presente invençãosão descritos a seguir. Além disso, os termos usados acima serão explicadosem mais detalhes.

A presente invenção fornece ácido nucleico isolado eseqüências de aminoácido novos, isto é, os polinucleotídeos e ospolipeptídeos da presente invenção, associados com o metabolismo decompostos de armazenagem de semente in plantas, em particular comseqüências que são semelhantes ao CTRl (isto é, sendo capazes decomplementar geneticamente quanto ao gene crtl em mutantes de crtl).

Preferivelmente, é fornecido um polinucleotídeo quecompreende um ácido nucleico do Brassica napus que codifica o polipeptídeoda presente invenção, isto é, uma Proteína de Metabolismo de Lipídeo (LMP)ou uma porção desta. Estas seqüências podem ser usadas para modificar ouaumentar lipídeos e ácidos graxos, cofatores e enzimas em microorganismos eplantas.As plantas de Arabidopsis são conhecidas produzirquantidades consideráveis de ácidos graxos como ácido linoléico e linolênico(ver, por exemplo, Tabela 2) e para a sua similaridade próxima e muitosaspectos (homologia genética, etc.) com a planta de lavoura de óleo Brassica.

Portanto, as moléculas de ácido nucleico originam-se de uma plantasemelhante à Arabidopsis thaliana ou Brassica napus ou organismosrelacionados (isto é, os polinucleotídeos da presente invenção) sãoespecialmente adequados para a modificação do metabolismo de lipídeo e doácido graxo em um hospedeiro, tal como as células hospedeiras ouorganismos não humanos transgênicos da presente invenção, especialmenteem microorganismos e plantas. Além disso, os ácidos nucleicos da plantaArabidopsis thaliana ou Brassica napus ou organismo relacionados podemser usados para a identificação daquelas seqüências de DNA e enzimas emoutras espécies, que são úteis para a modificação da biossíntese das moléculasprecursoras de ácidos graxos nos organismos respectivos.

A presente invenção, além disso, fornece um ácido nucleicoisolado que compreende um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos de umpolinucleotídeo da presente invenção, preferivelmente, um polinucleotídeoque compreende um ácido nucleico de uma planta que codifica ospolipeptídeos da presente invenção.

A presente invenção, desta maneira, também abrangem umoligonucleotídeo que ligase especificamente aos polinucleotídeos da presenteinvenção. A ligação como entendida neste contexto refere-se à hibridizaçãopela formação de pares de base de Watson-Crick debatida em qualquer lugarneste relatório descritivo em detalhes. Um oligonucleotídeo como usado nestetem um comprimento de quando muito 100, quando muito 50, quando muito40, quando muito 30 ou quando muito 20 nucleides de comprimento que sãocomplementares à seqüência de ácido nucleico dos polinucleotídeos dapresente invenção. A seqüência do oligonucleotídeo é, preferivelmente,selecionada de modo que um união perfeita pela formação de pares de base deWatson-Crick será obtida. Os oligonucleotídeos da presente invenção podemser adequados como iniciadores para as técnicas de amplificação com base emPCR. Além disso, os oligonucleotídeos podem ser usados para a interferênciade métodos de RNA (RNAi) a fim de modular e, preferivelmente, sub-regular,a atividade dos polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos da presenteinvenção. Desse modo, um organismo pode ser anulado dos ácidos graxose/ou lipídeos e, especificamente, uma semente vegetal pode ser anulada de,pelo menos alguns de seus compostos de armazenagem de semente. Comousado neste, o termo "interferência de RNA (RNAi)" refere-se à degradaçãointracelular seletiva de RNA usado para silenciar a expressão de um gene alvoselecionado, isto é, o polinucleotídeo da presente invenção. O RNAi é umprocesso de silenciamento de gene pós-transcripcional específico deseqüência em organismos iniciado pelo RNA de filamento duplo (dsRNA)que é homólogo na seqüência ao gene a ser silenciado. A técnica de RNAienvolve pequena interferência de RNAs (siRNAs) que são complementaresaos RNAs alvo (que codificam um gene de interesse) e especificamentedestroem o mRNA conhecido, desse modo diminuindo ou abolindo aexpressão de gene. O RNAi é, no geral usado para silenciar a expressão de umgene de interesse alvejando-se o mRNA, entretanto, qualquer tipo de RNA éabrangido pelos métodos de RNAi da invenção. Resumidamente, o processode RNAi na célula é iniciado por RNAs de filamento duplo longos (dsRNAs)sendo clivados por uma ribonuclease, desta maneira produzindo duplexes desiRNA. O siRNA liga-se a um outro complexo de enzima intracelular que é,desse modo ativado a um alvo por mais que as moléculas de mRNA sejamhomólogas (ou complementares) à seqüência de siRNA. A função docomplexo alvejar o mRNA homólogo através das interações de pares de baseentre um dos filamentos de siRNA e o mRNA alvo. O mRNA é então clivadoaproximadamente 12 nucleotídeos a partir do terminal 3' do siRNA edegradado. Desta maneira, os mRNAs específicos podem ser alvejados edegradados, desse modo, resultando em uma perda de expressão de proteínado mRNA alvejado. Uma seqüência de nucleotídeo complementar comousado neste refere-se à região no filamento de RNA que é complementar àtranscrição de RNA de uma porção do gene alvo. O termo "dsRNA" refere-seao RNA tendo uma estrutura dupla que compreende dois filamentos de ácidonucleico complementares e anti-paralelos. Nem todos os nucleotídeos de umdsRNA necessariamente apresentam pares de base de Watson-Crickcompletos; os dois filamentos de RNA podem ser substancialmentecomplementares. Os filamentos de RNA que formam o dsRNA pode ter omesmo número ou diferente de nucleotídeos, com o número máximo de paresde base sendo o número de nucleotídeos no filamento mais curto do dsRNA.

Preferivelmente, o dsRNA não é maior do que 49, mais preferivelmentemenos do que 25 e mais preferivelmente entre 19 e 23, nucleotídeos decomprimento. Os dsRNAs deste comprimento são particularmente eficazes nainibição da expressão do gene alvo usando-se técnicas de RNAi. Os dsRNAssão subseqüentemente degradados por uma enzima ribonuclease nos RNAs deinterferência curta (siRNAs). O RNAi é mediado por RNAs de interferênciapequenos (siRNAs). O termo "RNA de interferência pequeno" ou "siRNA"refere-se a uma molécula de ácido nucleico que é um agente de RNA defilamento duplo que é complementar a, isto é, capaz de formar pares de basecom uma porção de um RNA alvo (no geral mRNA), isto é, o polinucleotídeoda presente invenção sendo RNA. O siRNA atua para guiar especificamenteas enzimas nas células hospedeiras para a clivagem do RNA alvo. Em virtudeda especificidade da seqüência de siRNA e sua homologia ao alvo de RNA, osiRNA é capaz de causar a clivagem do filamento de RENA alvo, dessemodo, inativando a molécula de RNA alvo. Preferivelmente, o siRNA que ésuficiente para mediar o RNAi compreende uma seqüência de ácido nucleicoque compreende um fragmento de repetição invertido do gene alvo e a regiãocodificadora do gene de interesse (ou porção deste). Também,preferivelmente, uma seqüência de ácido nucleico que codifica um siRNAque compreende uma seqüência suficientemente complementar a um genealvo é operacionalmente ligada a uma seqüência de controle de expressão.Desta maneira, a mediação de RNAi para inibir a expressão do gene alvopode ser modulada pela dita seqüência de controle de expressão. Asseqüências de controle de expressão preferidos são aquelas que podem serreguladas por um estímulo exógeno, tal como o operador tem cuja atividadepode ser regulada pela tetraciclina ou promotores indutíveis por calor.

Alternativamente, uma seqüência de controle de expressão pode ser suadapermitindo a expressão específica de tecido do siRNA. As regiõescomplementares do siRNA permite a hibridização suficiente do siRNA aoRNA alvo RNA e desta maneira, media o RNAi. Em células de mamífero, ossiRNAs são de aproximadamente 21 a 25 nucleotídeos de comprimento (verTuschl et ai. 1999 and Elbashir et al. 2001). A seqüência de siRNA necessitaser de comprimento suficiente para colocar o siRNA e o RNA alvo juntos,através das interações de formação de pares de base complementares. OsiRNA usado com o sistema de expressão Tet da invenção pode ser decomprimentos variantes. O comprimento do siRNA é preferivelmente maiordo que ou igual a dez nucleotídeos e de comprimento suficiente para interagirestavelmente com o RNA alvo RNA; especificamente 15 a 30 nucleotídeos;mais especificamente qualquer número inteiro entre 15 e 30 nucleotídeos,mais preferivelmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29e 30. Por "comprimento suficiente" é um oligonucleotídeo maior do que ouigual a 15 nucleotídeos que é de um comprimento grande o bastante para ofornecimento da função pretendida sob a condição esperada. Por "interageestavelmente" é entendida a interação do RNA de interferência pequeno comoácido nucleico alvo (por exemplo, pela formação de ligações de hidrogêniocom os nucleotídeos complementares no alvo sob condições fisiológicas). Nogeral, tal complementaridade é de 100 % entre o siRNA e o RNA alvo, maspode ser menor se desejado, preferivelmente 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %,96 %, 97 %, 98 % ou 99 %. Por exemplo, 19 bases fora de 21 bases podemser formados pares de base. Em alguns exemplos, quando a seleção entre asvárias variantes alélicas for desejada, 100 % de complementaridade ao genealvo é requerido a fim de discernir eficazmente a seqüência alvo a partir deoutra seqüência alélica. Quando seleciona-se entre alvos alélicos, a escolha docomprimento também é um fator importante porque este é o outro fatorenvolvido na complementaridade percentual e na capacidade de diferenciação10 entre as diferenças alélicas. Os métodos que relacionam-se com o uso deRNAi para silenciar os genes em organismos, incluindo C. elegans,Drosophila, plantas e mamíferos, são conhecidos na técnica (ver, porexemplo, Fire et ai, Nature (1998) 391:806-811; Fire, Trends Genet. 15, 358-363 (1999); Sharp, RNA interference 2001. Genes Dev. 15,485-490 (2001);Hammond et al. Nature Rev. Genet. 2, 1110-1119 (2001); Tuschl, Chem.Biochem. 2, 239-245 (2001); Hamilton et al., Science 286, 950-952 (1999);Hammond et al., Nature 404, 293-296 (2000); Zamore et al., Cell 101, 25-33(2000); Bernstein et al., Nature 409, 363-366 (2001); Elbashir et al., GenesDev. 15, 188-200 (2001); WO 0129058; WO 09932619 e Elbashir et al., 2001Nature 411: 494-498).

Também são fornecidos pela presente invenção, ospolipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos e os polipeptídeosheterólogos que compreendem os polipeptídeos codificados pelo ácidosnucleicos e anticorpos para aqueles polipeptídeos.

Adicionalmente, a presente invenção diz respeito a e fornece ouso dos polinucleotídeos da presente invenção na produção de plantatransgênicas tendo um nível ou composição modificados de um composto dearmazenagem de semente. Com respeito a uma composição alterada, apresente invenção pode ser usada, por exemplo, para aumentar a porcentagemde ácido oléico com relação a outros óleos vegetais. Um método de produziruma planta transgênica com um nível modificado ou composição de umcomposto de armazenagem de semente inclui as etapas de transformar umacélula vegetal com um vetor de expressão que compreende umpolinucleotídeo da presente invenção, e geração de uma plant com um nívelmodificado ou composição do composto de armazenagem de semente a partirda célula vegetal. Em uma forma de realização preferida, a planta é umaespécie que produz óleo selecionada do grupo que consiste de canola, linhaça,soja, girassol, milho, aveia, centeio, cevada, trigo, arroz, pimenta, tagetes,algodão, óleo de palma, coco de palma, linho, rícino e amendoim, porexemplo.

De acordo com a presente invenção, as composições emétodos descritos nestes podem ser usados para a alteração da composição deum LMP em uma planta transgênica e para aumentar ou diminuir o nível deum LMP em uma planta transgênica que compreende aumentar ou diminuir aexpressão de um ácido nucleico de LMP na planta. A expressão aumentada oudiminuída do ácido nucleico de LMP pode ser atingida através da super-expressão transgênicas, métodos de co-suppressão, métodos anti-sentido emutagênese in vivo do ácido nucleico de LMP. A presente invenção tambémpode ser usada para aumentar ou diminuir o nível de um lipídeo em um óleode semente, para aumentar ou diminuir o nível de um ácido graxo em um óleode semente ou para aumentar ou diminuir o nível de um amido em umasemente ou planta.

Mais especificamente, a presente invenção inclui fornece ummétodo para alterar (aumentar ou diminuir ou mudar o perfil específico) doteor de óleo total em uma semente que compreende: Transformar uma plantacom uma construção de ácido nucleico que compreende como componentesoperacionalmente ligados, um promotor e seqüências de ácido nucleicocapazes de modular o nível dos polinucleotídeos ou polipeptídeos da presenteinvenção e desenvolvimento da planta. Além disso, a presente invenção incluie fornece um método para alterar (aumentar ou diminuir) o nível de ácidooléico que compreende: transformar uma planta com uma construção de ácidonucleico que compreende, como os componente operacionalmente ligados,um promotor, uma seqüência de ácido nucleico estrutural capaz de alterar(aumentar ou diminuir) o nível de ácido oléico e desenvolver a planta.

Também, está incluído neste é uma semente produzida poruma planta transgênica transformada pelos polinucleotídeos da presenteinvenção, em que a semente contém o dito polinucleotídeo e em que a plantaé de criação verdadeira para um nível modificado de um composto dearmazenagem de semente. A presente invenção, adicionalmente, inclui umóleo de semente produzido pela semente já mencionada.

Além disso, são fornecidos pela presente invenção os vetoresque compreendem os polinucleotídeos da presente invenção, célulashospedeiras contendo os vetores e os materiais vegetais descendentesproduzidos pela transformação de uma célula vegetal com os ácidos nucleicose/ou vetores.

De acordo com a presente invenção, os compostos,composições e métodos descritos nestes podem ser usados para aumentar oudiminuir as porcentagens relativas de um lipídeo em um óleo de semente,aumenta ou diminui o nível de um lipídeo em um óleo de semente ou paraaumentar ou diminuir o nível de um ácido graxo em um óleo de semente oupara aumentar ou diminuir o nível de um amido ou outro carboidrato em umasemente ou planta ou para aumentar ou diminuir o nível de proteínas em umasemente ou planta. As manipulações descritas nestes também podem serusadas para melhorar a germinação de semente e desenvolvimento de mudasjovens e plantas e para intensificar o rendimento de planta de compostos dearmazenagem de semente.

Além disso, é fornecido um método de produzir um nível maisalto ou mais baixo do que o normal ou típico do composto de armazenagemem uma planta transgênica que expressa os polinucleotídeos da presenteinvenção a partir da Arabidopsis thaliana ou Brassica napus na plantatransgênica, em que a planta transgênica é Arabidopsis thaliana, Brassicanapus, Glyeine max, Oryza sativa, Zea mays, Tritieum aestivum, Helianthusanuus ou Beta vulgaris ou uma espécie diferente de Arabidopsis thaliana,Brassiea napus, Glyeine max, Oryza sativa, Zea mays, Tritieum aestivum,Helianthus anuus ou Beta vulgaris. Também estão incluídas aqui,composições e métodos da modificação da eficiência de produção de umcomposto de armazenagem de semente. Como usado neste, quando a fraseArabidopsis thaliana, Brassiea napus, Glyeine max, Oryza sativa, Zea mays,Tritieum aestivum, Helianthus anuus ou Beta vulgaris é usada, isto tambémsignifica Arabidopsis thaliana e/ou Brassiea napus e/ou Glyeine max e/ouOryza sativa e/ou Tritieum aestivum e/ou Zea mays e/ou Helianthus anuuse/ou Beta vulgaris.

Conseqüentemente, é um objetivo da presente invençãofornecer novos polinucleotídeos que codificam LMPs bem como ospolipeptídeos correspondentes de Brassica napus bem como fragmentosativos, análogos e ortólogos destes e ortólogos destes. Aqueles fragmentosativos, análogos e ortólogos também podem ser espécies vegetais diferentescomo uma pessoa habilitada na técnica estimará que outras espécies vegetaistambém contenham aqueles ácidos nucleicos ou relacionados.

É um outro objetivo da presente invenção para fornecer asplanta transgênicas tendo níveis modificados de compostos de armazenagemde semente e em particular, níveis modificados de um lipídeo, um ácido graxoou um açúcar.

Os polinucleotídeos e os polipeptídeos da presente invenção,incluindo agonistas e/ou fragmentos destes, também tem usos que incluem amodulação de desenvolvimento de planta e, potencialmente rendimento deplanta, preferivelmente aumentando o desenvolvimento da planta sobcondições adversas (seca, frio, luz, UV). Além disso, os antagonistas dapresente invenção podem ter usos que incluem modular o desenvolvimentoe/ou rendimento da planta, través, preferivelmente aumentando odesenvolvimento e o rendimento da planta. Ainda, em uma outra forma derealização, a super-expressão de polipeptídeos da presente invenção usando-se um promotor constitutivo pode ser útil para aumentar o rendimento daplanta sob condições de tensão (seca, luz, frio, UV) modulando a eficácia deutilização de luz. Além disso, os polinucleotídeos e os polipeptídeos dapresente invenção melhorarão a germinação da semente e a dormência dasemente, em conseqüência, melhorará o desenvolvimento e/ou o rendimentoda planta de compostos de armazenagem de semente.

Os polinucleotídeos da presente invenção pode, além disso,compreender um promotor operacionalmente ligado ou região de promotorparcial. O promotor pode ser um promotor constitutivo, um promotorindutível ou um promotor específico de tecido. O promotor constitutivo podeser,, por exemplo, o superpromotor (Ni et al., Plant J. 7:661-676, 1995;US5955646) ou o promotor PtxA (PF 55368-2 US, Song H. et al., 2004, ver oExemplo 11). O promotor específico de tecido pode ser ativo no tecidovegetativo ou tecido reprodutivo. O promotor específico de tecido ativo notecido reprodutivo pode ser um promotor específico de semente. O promotorespecífico de semente ativo no tecido vegetativo pode ser um promotorespecífico de raiz, específico de broto, específico de meristema ou específicode folha. Os polinucleotídeos da presente invenção ainda podem, além disso,compreender uma seqüência não traduzida 5', seqüência não traduzida 3',íntrons ou a combinação destes.

A presente invenção também fornece um método para alterar(aumentar ou diminuir) o número ou o tamanho de um ou mais órgãosvegetais de uma planta que expressa um polinucleotídeo da presenteinvenção, preferivelmente, da Brassica napus que codifica um polipeptídeoda presente invenção. Mais especificamente, o tamanho da semente e/ou onúmero de semente e/ou o peso devem ser manipulados. Além disso, ocomprimento da raiz pode ser aumentado. Raízes mais longas podem aliviarnão apenas os efeitos da anulação da água a partir do solo mas tambémmelhora o apoio/sustentabilidade da planta, desta maneira, reduzindo oalojamento. Também, raízes mais longas tem a capacidade de cobrir umgrande volume de solo e melhorar a absorção de nutrientes. Todas estasvantagens de arquitetura de raiz alterada tem o potencial de aumentar orendimento da lavoura. Adicionalmente, o número e o tamanho das folhasdeve ser aumentado pelas seqüências de ácido nucleico fornecidas nestepedido. Isto terá a vantagem de melhorar a eficácia de utilização dacapacidade de captura da luz fotossintética aumento de eficiênciafotossintética.

Além disso, é um objetivo da presente invenção fornecermétodos para a produção de tais plantas transgênicas já mencionadas.

É um outro objetivo da presente invenção fornecer sementes eóleos de sementes a partir de tais plantas transgênicas já mencionadas.

Antes dos presentes compostos, composições, métodos eformas de realização preferidas destes serem divulgadas e descritas em maisdetalhes, deve ser entendido que esta invenção não é limitada apolinucleotídeos específicos, polipeptídeos específicos, tipos celularesespecíficos, células hospedeiras específicas, condições específicas ou métodosespecíficos, etc., como tais, pode, é claro, variar e as modificações e asvariações numerosas destes estarão evidentes para aqueles habilitados natécnica. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste é para opropósito de descrever as formas de realização particulares apenas e não épretendida ser limitante. Como usado no relatório descritivo e nasreivindicações, "um" ou "uma" pode significar um ou mais, dependendo docontexto em que este é usado. Desta maneira, por exemplo, referência a "umacélula" pode significar que pelo menos uma célula até uma pluralidade decélulas pode ser usada.

A presente invenção é fundamentada, em parte, no isolamentoe na caracterização de moléculas de ácido nucleico que codificam LMPscomo CTRl das plantas incluindo canola (Brassica napus) e outras espéciesde lavouras relacionadas como milho, cevada, linhaça, beterraba de açúcar ougirassol.

De acordo com os propósitos desta invenção, comoincorporado e amplamente descrito neste, esta invenção, em um aspecto,fornece um ácido nucleico isolado de uma planta (.Brassica napus) quecodifica uma Proteína do Metabolismo de Lipídeo (LMP) ou uma porçãodestes.

Um aspecto da invenção diz respeito a moléculas de ácidonucleico isoladas que codificam os polipeptídeos de LMP ou porçõesbiologicamente ativas destes, bem como fragmentos de ácido nucleicosuficientes para o uso como sondas de hibridização ou iniciadores para aidentificação ou amplificação de um ácido nucleico que codifica LMP (porexemplo, LMP DNA). Como usado neste, o termo "molécula de ácidonucleico" é pretendido incluir moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ouDNA genômicos) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos doDNA ou RNA gerados usando-se análogos de nucleotídeo. Este termotambém abrange seqüência não traduzida localizada nas extremidades 3' e 5'da região codificadora de um gene: pelo menos cerca de 1000 nucleotídeos deseqüência a montante da extremidade 5' da região codificadora e pelo menoscerca de 200 nucleotídeos de seqüência a jusante do terminal 3' da regiãocodificadora do gene. A molécula de ácido nucleico pode ser de filamentosimples ou de filamento duplo, mas preferivelmente é DNA de filamentoduplo. Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma que ésubstancialmente separada das outras moléculas de ácido nucleico que estãopresentes na fonte natural do ácido nucleico. Preferivelmente, um ácidonucleico "isolado" é substancialmente isento de seqüências que flanqueiamnaturalmente o ácido nucleico (isto é, seqüências localizadas nasextremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo, apartir do qual o ácido nucleico é derivado. Por exemplo, em várias formas derealização, a molécula de ácido nucleico de LMP isolada pode conter menosdo que cerca de 5 kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de seqüências denucleotídeo que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico noDNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico é derivado (porexemplo, uma célula de Brassica napus). Além disso, uma molécula de ácidonucleico "isolada", tal como uma molécula de cDNA, pode sersubstancialmente isenta de outro material celular ou meio de cultura quandoproduzido pelas técnicas recombinantes ou precursores químicos ou outrosprodutos químicos quando quimicamente sintetizados. Uma molécula deácido nucleico da presente invenção, por exemplo, uma molécula de ácidonucleico tendo uma seqüência de nucleotídeo do polinucleotídeo da presenteinvenção, ou uma porção destes, pode ser isolada usando-se técnicas debiologia molecular padrão e a informação de seqüência fornecida neste. Porexemplo, um cDNA de LMP de Brassica napus pode ser isolado de umabiblioteca de Brassica napus usando-se todos ou uma porção de uma dasseqüências do polinucleotídeo da presente invenção como uma sonda dehibridização técnicas de hibridização padrão (por exemplo, como descrito noSambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2o ed., ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY). Além disso, uma molécula de ácido nucleico queabrange todos ou uma porção de uma das seqüência da SEQ ID N°: 1, 3, 4 ou6 pode ser isolada pela reação de cadeia de polimerase usando-se iniciadoresde oligonucleotídeo projetados com base nesta seqüência (por exemplo, umamolécula de ácido nucleico que abrange todos ou uma porção de uma dasseqüências da SEQ ED N°: 1, 3, 4 ou 6 podem ser isolados pela reação dacadeia de polimerase usando-se iniciadores de oligonucleotídeo projetadoscom base nesta mesma seqüência da SEQ ED N°: 1, 3, 4 ou 6). Por exemplo,mRNA pode ser isolado a partir de células vegetais (por exemplo, peloprocedimento de extração de guanidínio-tiocianato de Chirgwin et al. 1979,Biochemistry 18:5294-5299) e o cDNA pode ser preparado usando-se atranscriptase reversa (por exemplo, transcriptase reversa de Moloney MLV,disponível da Gibco/BRL, Bethesda, MD ou transcriptase reversa de AMV, disponível da Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Iniciadores deoligonucleotídeo sintéticos para a amplificação da reação da cadeia depolimerase podem ser projetados com base nas seqüências de nucleotídeomostradas na SEQ ED N°: 1, 3, 4 ou 6. Um ácido nucleico da invenção podeser amplificado usando-se cDNA ou, alternativamente, DNA genômico, comoum padrão e iniciadores de oligonucleotídeo apropriados de acordo comtécnicas de amplificação de PCR padrão. O ácido nucleico amplificado destamaneira pode ser clonado em um vetor apropriado e caracterizado pela análiseda seqüência de DNA. Além disso, os oligonucleotídeos correspondentes auma seqüência de nucleotídeo de LMP podem ser preparados pelas técnicassintéticas padrão, por exemplo, usando-se um sintetizador de DNAautomatizado.

Em uma forma de realização preferida, um ácido nucleicoisolado da invenção compreende uma das seqüências de nucleotídeomostradas do polinucleotídeo da presente invenção. As seqüências da SEQ IDN°: 1 ou 3 correspondem aos cDNAs de LMP de Brassica da invenção. EstescDNAs compreendem LMPs que codificam seqüências (isto é, a "regiãocodificadora", indicada na SEQ ID N°: 1 ou 3), bem como as seqüências 5'não traduzidas e as seqüências 3' não traduzidas. Alternativamente, asmoléculas de ácido nucleico podem compreender apenas a regiãocodificadora de qualquer uma das seqüências na SEQ ID N°: 1 ou 3 ou podeconter fragmentos genômicos totais isolados do DNA genômico.

Para os propósitos deste pedido, será entendido que cada umadas seqüências apresentadas na SEQ ID N°: 1 a 6 tem um número de entradade identificação (por exemplo, BN42541212). Cada uma destas seqüênciaspode, no geral, compreender três partes: uma região 5' a montante, umaregião codificadora e uma região a jusante. Uma região codificadora destasseqüência é indicada como a "posição ORF" (Tabela 3).

Em uma outra forma de realização preferida, uma molécula deácido nucleico isolado da invenção compreende uma molécula de ácidonucleico, que é um complemento de uma das seqüências de nucleotídeomostrado na SEQ ID N°: 1 ou 3 ou uma porção destes. Uma molécula deácido nucleico que é que é complementar a uma das seqüências denucleotídeo mostradas SEQ ID N°: 1 ou 3 é um que é suficientementecomplementar a uma das seqüências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID N°:1 ou 3 tal que esta pode se hibridizar a uma das seqüências de nucleotídeomostradas na SEQ ID N°: 1 ou 3, desse modo formando um duplex estável.Ainda, em uma outra forma de realização preferida, uma molécula de ácidonucleico isolado da invenção compreende uma seqüência de nucleotídeo que épelo menos cerca de 50 a 60 %, preferivelmente pelo menos cerca de 60 a 70%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 70 a 80 %, 80 a 90 %, ou 90 a95 %, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95 %, 96 %, 97 %,98 %, 99 % ou mais homóloga a uma seqüência de nucleotídeo mostrada naSEQ ID N°: 1 ou 3 ou uma porção destes. Os algoritmos específicos para aidentificação do grau de identidade são observados em qualquer lugar nesterelatório descritivo. Em uma forma de realização adicional preferida, umamolécula de ácido nucleico isolado da invenção compreende uma seqüênciade nucleotídeo que hibridiza-se, por exemplo, hibridiza-se sob condiçõesestringentes, a uma das seqüências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID N°: 1ou 3 ou uma porção destes. Estas condições de hibridização incluem alavagem com uma solução tendo uma concentração de sal de cerca de 0,02molar em pH 7 em torno de 60° C. as condições de hibridização específicasdevem ser observadas em qualquer lugar neste relatório descritivo. Alémdisso, a molécula de ácido nucleico da invenção pode conter apenas umaporção da região codificadora de uma das seqüências na SEQ ID N°: 1 ou 3,por exemplo um fragmento, que pode ser usado como uma sonda ou iniciadorou um fragmento que codifica uma porção biologicamente ativa de um LMP.

As seqüências de nucleotídeo determinados a partir da clonagem dos genes deLMP da Arabidopsis thaliana ou Brassica napus permite a geração de sondase iniciadores projetados para o uso na identificação e/ou clonagem dehomólogos de LMP em outros tipos celulares e organismos, bem como oshomólogos de LMP de outras plantas ou espécies relacionadas. Portanto, estainvenção também fornece os compostos que compreendem os ácidosnucleicos divulgados nestes ou fragmentos destes. Estes compostos incluemos ácidos nucleicos ligados a uma porção. Estas porções incluem, mas nãolimitam-se à, porções de detecção, porções de hibridização, porções depurificação, porções de liberação, porções de reação, porções de ligação eoutros. A sonda/iniciador tipicamente compreendem oligonucleotídeosubstancialmente purificadas. O oligonucleotídeo tipicamente compreendeuma região de seqüência de nucleotídeo que hibridiza-se sob condiçõesestringentes a pelo menos cerca de 12, preferivelmente cerca de 25, maispreferivelmente cerca de 40, 50 ou 75 nucleotídeos consecutivos de umfilamento sentido de uma das seqüências apresentadas na SEQ ID N°: 1 ou 3,uma seqüência anti-sentido de uma das seqüências apresentadas na SEQ IDN°: 1 ou 3 ou mutantes de ocorrência natural destes. Os iniciadores com baseem uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 1 ou 3 pode ser usado emreações de PCR para clonar homólogos de LMP. As sondas com base nasseqüências de nucleotídeo LMP podem ser usadas para a detecção deseqüências transcritas ou genômicas que codificam as mesmas proteínas ouhomólogas. Em formas de realização preferidas, a sonda, além disso,compreende um grupo de rótulo ligado a este, por exemplo, o grupo de rótulopode ser um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou umcofator de enzima. Tais sondas podem ser usadas como uma parte de umconjunto de teste de marcador genômico para a identificação das células queexpressam um LMP, tal como pela medição de um nível de um ácido nucleicoque codifica LMP em uma amostra de células, por exemplo, detectar níveis demRNA de LMP ou determinar se um gene de LMP genômico foi mutado ouanulado. Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico dainvenção codifica uma proteína ou porção deste que inclui uma seqüência deaminoácido que é suficientemente homóloga a um amino ácido codificado poruma seqüência da SEQ ID N°: 2 tal que a proteína ou a porção destamantenha a mesma função ou similar com a proteína do tipo selvagem. Comousado neste, a linguagem "suficientemente homólogo" refere-se à proteínas ouporções destes que tenham seqüências de aminoácido que incluem um númeromínimo de resíduos de aminoácido idênticos ou equivalentes (por exemplo,um resíduo de aminoácido, que tem uma cadeia secundária similar como umresíduo de aminoácido em um dos ORFs de uma seqüência da SEQ ID N°: 2)a uma seqüência de aminoácido, tal que a proteína ou porção desta seja capazde participar no metabolismo de compostos necessários para a produção decompostos de armazenagem de semente em plantas, construção demembranas celulares em microorganismos ou plantas ou no transporte demoléculas através destas membranas. A maneira de determinar o grau deidentidade de aminoácidos idênticos ou equivalentes entre as duas seqüênciasé apresentada em qualquer lugar neste relatório descritivo em detalhes. Asproteínas reguladoras, tais como proteínas de ligação de DNA, fatores detranscrição, quinases, fosfatases ou membranas de proteína de caminhometabólicos, tais como o caminhos biossintéticos de lipídeo, amido e proteínaou sistemas de transporte de membrana, pode desempenhar um papel nabiossíntese de compostos de armazenagem de semente. Os exemplos de taisatividades são descritos neste (ver anotações putativas na Tabela 3). Osexemplos de seqüências de ácido nucleico que codificam LMP sãoapresentados na SEQ ID N°: 1 ou 3.

Como a produção de açúcar e/ou ácido graxo alterada ouaumentada é uma característica geral desejada ser inerente em uma amplavariedade de plantas como milho, trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada,soja, amendoim, algodão, canola, manihot, pimenta, girassol, beterraba deaçúcar e tagetes, planta solanáceas como batata, tobaco, berinjela e tomate,espécies Vicia, ervilha, alfalfa, plantas arbustivas (café, cacau, chá), espéciesSalix, árvores (óleo de palma, coco) e gramas perenes e lavouras de forragem,estas plantas de lavoura também são plantas alvo preferidas para engenhariagenética como uma outra forma de realização da presente invenção.

As porções de proteína codificadas pelas moléculas de ácidonucleico de LMP da invenção são preferivelmente porções biologicamenteativas de um dos LMPs. Como usado neste, o termo "porção biologicamenteativa de um LMP" é pretendido incluir uma porção, por exemplo, umdomínio/motivo, de um LMP que participa do metabolismo de compostosnecessários para a biossíntese de lipídeos de armazenagem de semente ou aconstrução de membranas celulares em microorganismos ou plantas ou notransporte de moléculas através destas membranas ou tem uma atividadecomo apresentada na Tabela 3 ou referido acima. Para determinar como umLMP ou uma porção biologicamente ativa deste pode participar nometabolismo de compostos necessários para a produção de compostos dearmazenagem de semente e membranas celulares, um ensaio de atividadeenzimática pode ser realizado. Tais métodos de ensaio são bem conhecidospor aqueles habilitados na técnica e como descrito no Exemplo 14 daExemplificação.As porção biologicamente ativas de um LMP inclui peptídeosque compreende seqüências de aminoácido derivadas da seqüência deaminoácido de um LMP (por exemplo, uma seqüência de aminoácidocodificada por um ácido nucleico da SEQ ID N°: 1 ou 3 ou a seqüência deaminoácido de uma proteína homóloga a um LMP5 que inclui menosaminoácidos do que um LMP de comprimento total ou a proteína decomprimento total que é homóloga a um LMP) e apresentam pelo menos umaatividade de um LMP. Tipicamente, as porções biologicamente ativas(peptídeos, por exemplo, peptídeos que são, por exemplo, de 5, 10, 15, 20, 30,35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 ou mais aminoácidos de comprimento)compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade de umLMP. Além disso, outras porções biologicamente ativas, em que outrasregiões da proteína são anuladas, podem ser preparadas por técnicasrecombinantes e avaliados por uma ou mais das atividades descritas neste.Preferivelmente, as porções biologicamente ativas de um LMP incluem um oumais domínios/motivos selecionados ou porções destes tendo atividadebiológica. Os fragmentos de ácido nucleico adicionais que codificam porçõesbiologicamente ativas de um LMP podem ser preparadas pelo isolamento deuma porção de uma das seqüências, que expressam a porção codificada doLMP ou peptídeo (por exemplo, pela expressão recombinante in vitro) eestimando a atividade da porção codificada do LMP ou peptídeo.

A invenção, além disso, abrange moléculas de ácido nucleicoque difere de uma das seqüências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID N°: 1ou 3 (e porções destas) devido à degeneração do código genético e, destamaneira, codificar o mesmo LMP como aquele codificado pelas seqüências denucleotídeo mostradas na SEQ ID N°: 1 ou 3. Além disso, em uma forma derealização, a molécula de ácido nucleico da invenção codifica uma proteína decomprimento total que é substancialmente homóloga a uma seqüência deaminoácido da um polipeptídeo codificado por uma estrutura de leitura abertana SEQ ID N°: 1. Em uma forma de realização, o ácido nucleico decomprimento total ou proteína ou fragmento do ácido nucleico ou proteína éde Arabidopsis thaliana ou Brassica napus. Além das seqüências denucleotídeo de LMP de Arabidopsis thaliana ou Brassica napus mostradas naSEQ ID N°: 1 a 6, será estimado por aqueles habilitados na técnica que ospolimorfismos da seqüência de DNA que leva às mudanças nas seqüências deaminoácido de LMPs pode existir dentro de uma população (por exemplo,uma população Arabidopsis thaliana ou Brassica napus). Tal polimorfismogenético no gene de LMP pode existir entre os indivíduos dentro de umapopulação devido à variação natural. Como usado neste, os termos "gene" e"gene recombinante" refere-se às moléculas de ácido nucleico quecompreende uma estrutura de leitura aberta que codifica um LMP,preferivelmente um LMP de Arabidopsis thaliana ou Brassiea napus. Taisvariações naturais podem, tipicamente, resultar de 1 a 40 % de variação naseqüência de nucleotídeo do gene de LMP. Qualquer uma e todas as taisvariações de nucleotídeo e os polimorfismos de aminoácido resultantes noLMP que são o resultado da variação natural e que não altera a atividadefuncional dos LMPs são pretendidos estarem dentro do escopo da invenção,as moléculas de ácido nucleico que correspondem às variantes naturais eortólogos que não de Brassiea napus do cDNA de LMP de Brassiea napus dainvenção podem ser isolados com base em sua homologia com relação aoácido nucleico de LMP de Brassiea napus divulgados nestes usando-se ocDNA de Brassiea napus ou uma porção destes, como uma sonda dehibridização de acordo com as técnicas de hibridização padrão sob condiçõesde hibridização estringentes. Como usado neste, o termo "ortólogos" refere-seaos dois ácidos nucleicos de espécies diferentes, mas que se desenvolveram apartir de um gene ancestral comum evolução. Normalmente, os ortólogoscodificam as proteína tendo as mesmas funções ou similares.Conseqüentemente, em uma outra forma de realização, uma molécula deácido nucleico isolado da invenção é de pelo menos 15 nucleotídeos decomprimento e hibridiza-se sob condições estringentes a uma molécula deácido nucleico que compreende uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N0:1 ou 3. Em outras formas de realização, o ácido nucleico é de pelo menos 30,50, 100, 250 ou mais nucleotídeos de comprimento. Como usado neste, otermo "hibridiza-se sob condições estringentes" é pretendido descrever ascondições para a hibridização e lavagem sob as quais as seqüências denucleotídeo pelo menos 60 % homólogas uma com relação à outratipicamente permanecem hibridizados uma com relação à outra.Preferivelmente, as condições são, tais que as seqüências de pelo menos cercade 65 %, mais preferivelmente pelo menos cerca de 70 %, e ainda maispreferivelmente pelo menos cerca de 75 % ou mais homólogos um comrelação ao outro tipicamente permanecem hibridizados um com relação aooutro. Tais condições estringentes são conhecidas por aqueles habilitados natécnica e podem ser observados em Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons, N.Y., 1989: 6.3.1-6.3.6. Um exemplo não limitantepreferidos de condições de hibridização estringentes são a hibridização em 6X de cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em cerca de 45° C, seguido poruma ou mais lavagens em 0,2 X SSC, 0,1 % de SDS em 50 a 65° C.Preferivelmente, uma molécula de ácido nucleico isolado da invenção quehibridiza-se sob condições estringentes a uma seqüência de SEQ ID N°: 1 ou3 corresponde a uma molécula de ácido nucleico de ocorrência natural. Comousado neste, uma molécula de ácido nucleico "de ocorrência natural" refere-sea uma molécula RNA ou DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo queocorre na natureza (por exemplo, codifica uma proteína natural). Em umaforma de realização, o ácido nucleico codifica um LMP de Arabidopsisthaliana ou Brassica napus natural. Além das variantes de ocorrência naturalda seqüência de LMP que pode existir na população, o técnico habilitado,além disso, estimará que as mudanças podem ser introduzidas por mutaçãoem uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 1 ou 3, desse modo levandoà mudanças na seqüência de aminoácido do LMP codificado, sem alterar acapacidade funcional do LMP. Por exemplo, as substituições de nucleotídeoque levam à substituições de aminoácido em resíduos de aminoácido "nãoessenciais" podem ser feitas em uma seqüência da SEQ ID N°: 2. Um resíduode aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir daseqüência do tipo selvagem de um dos LMPs (SEQ ID N°: 2) sem alterar aatividade do dito LMP, visto que um resíduo de aminoácido "essencial" érequerido para a atividade de LMP. Outros resíduos de aminoácido,entretanto, (por exemplo, aqueles que não são conservados ou apenas semi-conservados no domínio tendo atividade de LMP) pode não ser essencial paraa atividade e, desta maneira devem ser, provavelmente responsáveis pelaalteração sem alterar a atividade de LMP.

Conseqüentemente, um outro aspecto da invenção diz respeitoàs moléculas de ácido nucleico que codificam LMPs que contém mudançasem resíduos de aminoácidos que não são essenciais para a atividade de LMP.

Tais LMPs diferem na seqüência de aminoácido de uma seqüência que aindaretém pelo menos uma da atividades de LMP descritas neste. Em uma formade realização, a molécula de ácido nucleico isolada compreende umaseqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína, em que a proteínacompreende uma seqüência de aminoácido de pelo menos cerca de 50 %homóloga a uma seqüência de aminoácido codificada por um ácido nucleicoda SEQ ID N°: 1 ou 3 e é capaz de participar no metabolismo de compostosnecessários para a produção de compostos de armazenagem de semente naArabidopsis thaliana ou Brassica napus ou membranas celulares ou tem umaou mais atividades apresentadas na Tabela 3. Preferivelmente, a proteínacodificada pela molécula de ácido nucleico é, pelo menos cerca de 50 a 60 %homóloga a uma das seqüências codificadas por um ácido nucleico da SEQID N°: 1 ou 3, mais preferivelmente pelo menos cerca de 60 a 70 % homólogaa uma das seqüências codificadas por um ácido nucleico da SEQ ID N°: 1 ou3, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 70 a 80 %, 80 a 90 %, 90 a95 % homólogas a uma das seqüências codificadas por um ácido nucleico daSEQ LD N°: 1 ou 3 e mais preferivelmente pelo menos cerca de 96 %, 97 %,98 % ou 99 % homólogas a uma das seqüências codificadas por um ácido

nucleico da SEQ ID N°: 1 ou 3.

Para determinar a homologia percentual das duas seqüênciasde aminoácido (por exemplo, uma das seqüências codificadas por um ácidonucleico da SEQ ID N°: 1 ou 3 e uma forma mutante destes) ou de doisácidos nucleicos, as seqüências são alinhadas para os propósitos decomparação ótimas (por exemplo, fendas podem ser introduzidas naseqüência de uma porção de ácido nucleico para o alinhamento ótimo com aoutra proteína ou ácido nucleico). Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeosnas posições de aminoácido correspondentes ou posições de nucleotídeo sãoentão comparadas. Quando uma posição em uma seqüência (por exemplo,uma das seqüências codificadas por um ácido nucleico da SEQ ID N°: 1 ou 3)está ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo como aposição correspondente na outra seqüência (por exemplo, uma forma mutanteda seqüência selecionada do polipeptídeo codificado por um ácido nucleico daSEQ ID N°: 1 ou 3), então as moléculas são homólogas naquela posição (istoé, como usado neste "homologia" de aminoácido ou de ácido nucleico éequivalente a "identidade" de aminoácido ou ácido nucleico). A homologiapercentual entre as duas seqüências é uma função do número de posiçõesidênticas divididas pelas seqüências (isto é, % de homologia = números deposições idênticas / números totais de posições χ 100).

Uma molécula de ácido nucleico isolado que codifica umhomólogo de LMP a uma seqüência de proteína codificada por um ácidonucleico da SEQ ID N°: 1 ou 3 pode ser criada pela introdução de uma oumais substituições, adições ou anulações de nucleotídeo em uma seqüência denucleotídeo da SEQ ID N°: 1 ou 31-6 tal que uma ou mais substituições,adições ou anulações de aminoácido são introduzidos na proteína codificada.As mutações podem ser introduzidas em uma ou mais das seqüências de SEQED N°: 1 a 3 pelas técnicas padrão, tais como mutagênese direcionada ao locale mutagênese mediada por PCR. Preferivelmente, as substituições eaminoácido conservativas são feitas em um ou mais resíduos de aminoácidonão essenciais preditos. Uma "substituição de aminoácido conservativa" éuma em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo deaminoácido tendo uma cadeia secundária similar. As famílias de resíduos deaminoácido tendo cadeias secundárias similares foram definidas na técnica.Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias secundárias básicas (porexemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias secundárias ácidas (por exemplo,ácido aspártico, ácido glutâmico), as cadeias secundárias polares nãocarregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina,tirosina, cisteína), cadeias secundárias polares (por exemplo, alanina, valina,leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeiassecundárias beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) ecadeias secundárias aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina,triptofano, histidina). Desta maneira, um resíduo de aminoácido não essencialem um LMP é preferivelmente substituído por um outro resíduo deaminoácido a partir da mesma família de cadeia secundária. Alternativamente,em uma outra forma de realização, as mutações podem ser introduzidasaleatoriamente ao longo de toda ou em parte da seqüência codificadora deLMP, tal como pela mutagênese de saturação e os mutantes resultantes podemser avaliados quanto a uma atividade de LMP descrita aqui para aidentificação de mutantes que retêm a atividade de LMP. Seguindo amutagênese de uma das seqüências da SEQ ID N°: 1 a 3, a proteínacodificada pode ser expressada aleatoriamente e a atividade da proteína podeser determinada usando-se, por exemplo, os ensaios descritos nestes (ver osExemplos 11 a 13 da Exemplificação).

Os LMPs são preferivelmente produzidos palas técnicas deDNA recombinante. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico quecodifica a proteína é clonada em um vetor de expressão (como descritoacima), o vetor de expressão é introduzido em uma célula hospedeira (comodescrito neste) e o LMP é expressado na célula hospedeira. O LMP pode serentão isolados a partir das células por um esquema de purificação adequadousando-se as técnicas de purificação de proteína padrão. Alternativo àexpressão recombinante, um LMP ou peptídeo deste pode ser sintetizadoquimicamente usando-se as técnicas de síntese de peptídeo padrão. Alémdisso, o LMP natural pode ser isolado das células, por exemplo, usando-se umanticorpo anti-LMP, que pode ser produzido por técnicas padrão utilizando-seLMP ou seu fragmento desta invenção.

A invenção também fornece proteínas quiméricas ou de fusãode LMP. Como usado neste, uma "proteína quimérica" ou "proteína de fusão"de LMP compreende um LMP polipeptídeo operacionalmente ligado a umpolipeptídeo que não de LMP. Um "polipeptídeo LMP" refere-se a umpolipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que corresponde a um LMP,desse modo, um "polipeptídeo que não de LMP" refere-se a um polipeptídeotendo uma seqüência de aminoácido que corresponde a uma proteína que nãoé substancialmente homóloga ao LMP, por exemplo, uma proteína que édiferente do LMP e que é derivado do mesmo organismo ou diferente. Dentroda proteína de fusão, o termo "operacionalmente ligado" é pretendido indicarque o polipeptídeo de LMP e o polipeptídeo que não de LMP são fundidos umcom o outro de modo que ambas as seqüências preenchem a função propostaatribuída à seqüência usada. O polipeptídeo que não de LMP podem serfundidos ao polipeptídeo de terminal N ou de terminal C do polipeptídeo deLMP. Por exemplo, em uma forma de realização, a proteína de fusão é umaproteína de fusão de GST-LMP (glutationa S-transferase) em que asseqüências de LMP são fundidas ao terminal C das seqüências de GST. Taisproteínas de fusão podem facilitar a purificação de LMPs recombinantes. Emuma outra forma de realização, a proteína de fusão é um LMP contendo umaseqüência de sinal heterólogos em seu terminal N. Em certas célulashospedeiras (por exemplo, células hospedeiras de mamífero), expressão e/ousecreção de um LMP pode ser aumentado através do uso de uma seqüência desinal heterólogo.

Preferivelmente, uma proteína quimérica ou de fusão de LMPda invenção é produzida pelas técnicas de DNA recombinante padrão. Porexemplo, os fragmentos de DNA codificam quanto às seqüências depolipeptídeo diferentes são ligadas juntas na estrutura de acordo com astécnicas convencionais, por exemplo, utilizando-se os terminais de finalbrusco ou de final escalonado para a ligação, digestão da enzima de restriçãopara fornecer os terminais apropriados, enchimento de terminais coesivosquando apropriadas, o tratamento de fosfatase alcalina para evitar a uniãoindesejada e ligação enzimática. Em uma outra forma de realização, o gene defusão pode ser sintetizado pelas técnicas convencionais incluindo ossintetizadores de DNA automatizados. Alternativamente, a amplificação dePCR de fragmentos genéticos pode ser realizada usando-se os iniciadoresâncora que dão origem à projeções complementares entre dois fragmentos degenes consecutivos, que podem ser subseqüentemente recozido ereamplificado para a geração de uma seqüência genética quimérica (ver, porexemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., JohnWiley & Sons: 1992). Além disso, muitos vetores de expressão estãocomercialmente disponíveis já codificando uma porção de fusão (porexemplo, um polipeptídeo de GST). Um ácido nucleico que codifica LMPpode ser clonado em um tal vetor de expressão, tal que a porção de fusão éligada na estrutura ao LMP.

Além das moléculas de ácido nucleico que codificam LMPsdescritas acima, um outro aspecto da invenção dizem respeito às moléculas deácido nucleico isoladas que são anti-sentido a este. Um ácido nucleico "anti-sentido" compreende uma seqüência de nucleotídeo que é complementar a umácido nucleico "sentido" que codifica uma proteína, por exemplo,complementar ao filamento de codificação de uma molécula de cDNA defilamento duplo ou complementar com uma seqüência de mRNA.Conseqüentemente, um ácido nucleico anti-sentido pode ser a ligação dehidrogênio a um ácido nucleico anti-sentido. O ácido nucleico anti-sentidopode ser complementar a um filamento de codificação de LMP inteiro ou,apenas uma porção deste. Em uma forma de realização, uma molécula deácido nucleico anti-sentido é anti-sentido a uma "região codificadora" dofilamento codificador de uma seqüência de nucleotídeo que codifica um LMP.

O termo "região codificadora" refere-se à região da seqüência de nucleotídeoque compreende códons que são traduzidos em resíduos de aminoácido (porexemplo, a região codificadora inteira de BN42541212 compreendenucleotídeos 206-2683). Em uma outra forma de realização, a molécula deácido nucleico anti-sentido é anti-sentido a uma "região não codificadora" dofilamento codificador de uma seqüência de nucleotídeo que codifica LMP. Otermo "região não codificadora" refere-se a seqüências 5' e 3' que flanqueiama região codificadora que não são traduzidas em aminoácidos (isto é, tambémreferido como regiões não traduzidas 5' e 3').

Dando-se as seqüências de filamento de codificação quecodificam LKlP divulgam neste (por exemplo, as seqüências apresentadas naSEQ ID N0:1 a 6), os ácidos nucleicos anti-sentidos da invenção podem serprojetadas de acordo com as regras de formação de pares de base de Watson eCrick. A molécula de ácido nucleico anti-sentido podem ser complementaresà região codificadora inteira de mRNA de LMP, mas, mais preferivelmente, éum oligonucleotídeo que é anti-sentido a apenas uma porção da regiãocodificadora ou não codificadora de mRNA de LMP. Por exemplo, ooligonucleotídeo anti-sentido pode ser complementar à região que circunda olocal de início de tradução de mRNA de LMP. Um oligonucleotídeo anti-sentido pode ser, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50nucleotídeos de comprimento. Um ácido nucleico anti-sentido ou sentido dainvenção pode ser construído usando-se a síntese química e reações de ligaçãoenzimática usando procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, umácido nucleico anti-sentido (por exemplo, um oligonucleotídeo anti-sentido)pode ser quimicamente sintetizado usando-se nucleotídeos de ocorrêncianatural ou nucleotídeos variadamente modificados projetados para aumentar aestabilidade a estabilidade biológica das moléculas ou para aumentar aestabilidade física do duplex formado entre os ácidos nucleicos anti-sentido esentido, por exemplo, os derivados fosforotioato e nucleotídeos substituídospor acridina podem ser usados. Os exemplos de nucleotídeos modificados quepodem ser usados para a geração de ácido nucleico anti-sentido incluem 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-clorouracila, 5-iodouracila, hipoxantina,xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxiidroxilmetil) uracila, 5-carboximetilamino-metil-2-tiouridina, 5-carboximetilamino-metiluracila,diidro-uracila, beta-D-galactosilqueosina, inosina, Ν-6-isopenteniladenina, 1-metil-guanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metil-citosina, Ν-6-adenina, 7-metilguanina,5 -metil-aminometiluracila, 5 -metoxiamino-metil-2-tiouracil, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetil-uracila, 5-metoxiuracila, 2-metiltio-Ν-6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina,pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, éster metílico do ácido uracil-5-oxiacético, ácidouracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracila, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracila, (acp3)w e 2,6-diamino-purina. Alternativamente, o ácido nucleicoanti-sentido pode ser biologicamente produzido usando-se um vetor deexpressão em que um ácido nucleico foi sub-clonado em uma orientação anti-sentido (isto é, RNA transcrito a partir do ácido nucleico inserido será de umaorientação anti-sentido a um ácido nucleico alvo de interesse, descrito, alémdisso, na seguinte sub-seção).

Em uma outra variação da tecnologia anti-sentido, umaconstrução de RNA de interferência de filamento duplo pode ser usada paracausar a sub-regulação do nível de mRNA de LMP e da atividade de LMP emplantas transgênicas. Isto requer a transformação das plantas com umaconstrução quimérica contendo uma porção da seqüência de LMP naorientação sentido fundida com a seqüência anti-sentido da mesma porção daseqüência de LMP. Uma região ligadora de DNA de comprimento variávelpode ser usada para a separação dos fragmentos sentido e anti-sentido deseqüência de LMP na construção.

As moléculas de ácido nucleico anti-sentido da invenção sãotipicamente administradas a uma célula ou geradas in situ tal que estashibridizem com ou liguem-se ao mRNA celular e/ou DNA genômico quecodifica um LMP para, desse modo, inibir a expressão da proteína, porexemplo, pela inibição da transcrição e/ou tradução. A hibridização podeocorrer pela complementaridade de nucleotídeo convencional para a formaçãode um duplex estável ou, por exemplo, no caso de uma molécula de ácidonucleico anti-sentido que liga-se aos duplexes de DNA, através da interaçõesespecíficas no sulco principal da hélice dupla. A molécula anti-sentido podeser modificada, tal que esta ligue-se especificamente a um receptor ou umantígeno expressado em uma superfície celular selecionada, por exemplo, pelaligação à molécula de ácido nucleico anti-sentido a um peptídeo ou umanticorpo que liga-se a um receptor ou antígeno de superfície celular. Amolécula de ácido nucleico anti-sentido também pode ser liberada às célulasusando-se os vetores descritos neste. Para atingir as concentraçõesintracelulares suficientes das moléculas anti-sentido, as construções de vetorem que a molécula de ácido nucleico anti-sentido é colocada sob o controle depromotores vegetais incluindo procarióticos, virais ou eucarióticos fortes sãopreferidos.

Ainda, em uma outra forma de realização, a molécula de ácidonucleico anti-sentido da invenção é uma molécula de ácido nucleicoanomérica. Uma molécula de ácido nucleico anomérica forma híbridos defilamento duplo específicos com RNA complementar em que, ao contráriodas unidades visuais, os filamentos correm em paralelo um com relação aooutro (Gaultier et al. 1987, Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). A molécula deácido nucleico anti-sentido também pode compreender um 2'-o-metil-ribonucleotídeo (Inoue et al. 1987, Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) ou umanálogo de RNA-DNA quimérico (Inoue et al. 1987, FEBS Lett. 215:327-330).

Ainda, em uma outra forma de realização, um ácido nucleicoanti-sentido da invenção é uma ribozima. As ribozimas são moléculas deRNA catalíticas com atividade de ribonuclease, que são capazes de clivar umácido nucleico de filamento simples, tal como um mRNA, ao qual estes têmuma região complementar. Desta maneira, as ribozimas (por exemplo,ribozimas cabeça de martelo (descritas em Haselhoff & Gerlach 1988, Nature334:585-591)) podem ser usadas para clivar cataliticamente as transcrições demRNA de LMP para, desse modo, inibir a tradução do mRNA de LMP. Umaribozima tendo especificidade quanto a um ácido nucleico que codifica LMPpode ser projetado com base na seqüência de nucleotídeo de um cDNA deLMP divulgada neste (isto é, BN42541212 na SEQ ID N°: 1 a 6) ou na basede uma seqüência heteróloga a ser isolada de acordo com os métodosexplicados nesta invenção. Por exemplo, um derivado de um Tetrahymena L-19 IVS RNA pode ser construído em que a seqüência de nucleotídeo do localativo é complementar à seqüência de nucleotídeo a ser clivada em um mRNAque codifica LMP (ver, por exemplo, Cech et al., Patente U. S. N0 4.987.071e Cech et al., Patente U. S. N0 5.116.742). Alternativamente, o mRNA deLMP pode ser usado para selecionar um RNA catalítico tendo uma atividadede ribonuclease específica a partir de um grupo de moléculas de RNA (ver,por exemplo, Bartel, D. & Szostak J.W. 1993, Science 261:1411-1418).

Alternativamente, a expressão do gene de LMP pode se inibidaalvejando-se as seqüências de nucleotídeo complementares à regiãoreguladora de uma seqüência de nucleotídeo de LMP (por exemplo, umpromotor e/ou intensificadores de LMP) uma forma de estruturas hélicastriplas que evitam a transcrição de um gene de LMP nas células alvo (ver, nogeral, Helene C. 1991, Anticancer Drug Des. 6:569-84; Helene C. et al. 1992,Ann. N.Y. Acad. Sei. 660:27-36 e Maher, L.J. 1992, Bioassays 14:807-15).

Um outro aspecto da invenção diz respeito a vetores,preferivelmente, um vetor de expressão, contendo um ácido nucleico quecodifica um LMP (ou uma porção destes). Como usado neste, o termo"vetores" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar umoutro ácido nucleico ao qual este foi ligado. Um tipo de vetor é um"plasmídeo," que refere-se a um arco de DNA de filamento duplo circular emque os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo devetor é um vetor viral, em que os segmentos de DNA adicionais podem serligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônomaem uma célula hospedeira em que estes são introduzidos (por exemplo,vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetoresmamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos nãoepissomais) são integrados no genoma de uma célula hospedeira naintrodução na célula hospedeira e, desse modo, são replicadas juntos com agenoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar aexpressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados. Tais vetores sãoreferidos aqui como "vetores de expressão." No geral, os vetores de expressãode utilidade nas técnicas de DNA recombinante estão freqüentemente naforma de plasmídeos. No presente pedido, "plasmídeo" e "vetor" podem serusados de maneira intercambiável assim como o plasmídeo é a forma maiscomumente usada de vetor. Entretanto, a invenção é pretendida incluir taisformas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo,retrovírus, adenovírus e vírus adeno associados com defeito de replicação),que servem para funções equivalentes.

Os vetores de expressão recombinantes da invençãocompreendem um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para aexpressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, significando que osvetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais seqüênciasreguladoras, selecionadas na base das células hospedeiras a serem usadas paraa expressão, que é operacionalmente ligado à seqüência de ácido nucleico aser expressada. Dentro de um vetor de expressão recombinante,"operacionalmente ligado" é pretendido significar que a seqüência denucleotídeo de interesse é ligada às seqüências reguladoras de uma maneiraque permita a expressão da seqüência de nucleotídeo e ambas as seqüênciassão fundidas uma à outra de modo que cumpra sua função proposta (porexemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célulahospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). O termo"seqüência reguladora" é pretendida incluir promotores, intensificadores eoutros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais depoliadenilação). Tais seqüências reguladoras são descritas, por exemplo, emGoeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego, CA (1990) ou ver: Gruber and Crosby, em:Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, BocaRaton, Florida, eds.: Glick & Thompson, Chapter 7, 89-108 incluindo asreferências nestes. As seqüências reguladoras incluem aqueles que direcionama expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeo em muitos tipos decélula hospedeiras e aqueles que direcionam a expressão da seqüência denucleotídeo apenas em certas células hospedeiras ou sob certas condições.Será estimado por aqueles habilitados na técnica que o projeto do vetor deexpressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira aser transformada, do nível de expressão da proteína desejada, etc. Os vetoresde expressão da invenção podem ser introduzida em células hospedeiras para,desse modo produzir as proteínas ou peptídeos, incluindo as proteínas oupeptídeos de fusão, codificados pelos ácidos nucleicos como descrito neste(por exemplo, LMPs, formas mutantes de LMPs, proteínas de fusão, etc.).

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem serprojetados para a expressão de LMPs em células procarióticas ou eucarióticas.Por exemplo, os genes de LMP podem ser expressados em célulasbacterianas, células de insetos (usando-se vetores de expressão debaculovírus), levedura e outras células fungicas (ver Romanos M. A. et al.1992, Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8:423-488; van denHondel, C.A.M.J.J. et al. 1991, Heterologous gene expression in filamentousfungi, in: More Gene Manipulations in Fungi, Bennet & Lasure, eds., p. 396-428:Academic Press: an Diego e van den Hondel & Punt 1991, Gene transfersystems and vector development for filamentous fungi, in: Applied MolecularGenetics of Fungi, Peberdy et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press:Cambridge), algas (Falciatore et al. 1999, Marine Biotechnology 1:239-251),ciliados dos tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria,Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus,Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella e Stylonychia, especialmentedo gênero Stylonychia lemnae com vetores seguindo um método detransformação como descrito no WO 98/01572 e células vegetaismulticelulares (ver Schmidt & Willmitzer 1988, High efficiencyAgrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thalianaIeaf and cotyledon plants, Plant Cell Rep.:583-586); Plant Molecular Biologyand Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, chapter 6/7, S.71-119(1993); White, Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: TransgenicPlants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung and Wu, AcademicPress 1993, 128-43; Potrykus 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.Biol. 42:205-225 (e referências citadas nestes) ou células de mamíferos. Ascéluls hospedeiras adequadas são debatidas, além disso, em Goeddel, GeneExpression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, SanDiego, CA 1990). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante podeser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo usando-se as seqüênciasreguladoras de promotor T7 e polimerase T7.

A expressão de proteínas em procariotas é maisfreqüentemente realizada com os vetores contendo promotores constitutivosou indutíveis que direcionam a expressão de proteínas de fusão ou que não defusão. Os vetores de fusão adicionam diversos amino ácidos a uma proteínacodificada neste, usualmente ao terminal amino da proteína recombinante,mas também ao terminal C ou fundido em regiões adequadas nas proteínas.Tais vetores de fusão, tipicamente, servem para um ou mais dos seguintespropósitos: 1) um aumento na expressão da proteína recombinante; 2) umaumento na solubilidade da proteína recombinante e 3) um auxílio napurificação da proteína recombinante pela ação como um ligando napurificação por afinidade. Freqüentemente, na fusão de vetores de expressão,um local de clivagem proteolítica é introduzida na junção da porção de fusãoe a proteína recombinante para permitir a separação da proteína recombinanteda porção de fusão subseqüente à purificação da proteína de fusão. Taisenzimas e suas seqüências de recognição cognata, incluem Factor Xa,trombina e enteroquinase.

Os vetores de expressão de fusão típicos incluem pGEX(Pharmacia Biotech Inc; Smith & Johnson 1988, Gene 67:31-40), pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)que fundem glutationa S-transferase (GST), proteína que liga-se à maltose Eou proteína A, respectivamente, à proteína alvo recombinante. Em uma formade realização, a seqüência codificadora do LMP é clonada em um vetor deexpressão pGEX para a criação de um vetor que codifica uma proteína defusão que compreende, do terminal N ao terminal C, proteína X do local declivagem de trombina GST. A proteína de fusão pode ser purificada pelacromatografia por afinidade usando-se a resina de glutationa-agarose. O LMPrecombinante não fundido ao LMP pode ser recuperado pela clivagem daproteína de fusão com trombina.

Os exemplos de vetores de expressão de E. coli que não defusão indutíveis adequados incluem pTrc (Amann et al. 1988, Gene 69:301-315) e pET Ild (Studier et al. 1990, Gene Expression Technology: Methodsin Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia 60-89). Aexpressão de gene alvo do vetor pTrc conta com a transcrição de polimerasede RNA hospedeira a partir de um promotor de fusão de trp-lac híbrido. Aexpressão do gene alvo do vetor pET Ild conta com a transcrição de umpromotor de fusão T7 gnl O-Iac mediado por uma RNA polimerase viralcoexpressada (T7 gnl). Esta polimerase viral é fornecida pelas cepashospedeiras BL21 (DE3) ou HMS174 (DE3) de um pró-fago residente queabriga um gene T7 gnl sob o controle transcripcional do promotor de IacUV5.

Uma estratégia para maximizar a expressão de proteínarecombinante é expressar a proteína em uma bactéria hospedeira com umacapacidade prejudicada para clivar proteoliticamente a proteína recombinante(Gottesman S. 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology185:119-128, Academic Press, San Diego, Califórnia). Uma outra estratégia éalterar a seqüência de ácido nucleico do ácido nucleico a ser inserida em umvetor de expressão de modo que os códons individuais para cada aminoácidosejam aqueles preferivelmente utilizados na bactéria de escolha para aexpressão (Wada et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Tal alteraçãode seqüências de ácido nucleico da invenção pode ser realizada pelas técnicasde síntese de DNA padrão.

Em uma outra forma de realização, o vetor de LMP deexpressão é um vetor de expressão de levedura. Os exemplos de vetores paraa expressão na levedura S. cerevisiae inclui pYepSecl (Baldari et al. 1987,Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan & Herskowitz 1982, Cell 30:933-943),pJRY88 (Schultz et al. 1987, Gene 54:113-123) e pYES2 (InvitrogenCorporation, San Diego, CA). Os vetores e os métodos para a construção devetores apropriados para o uso em outros fungos, tais como os fungosfilamentosos, incluem aqueles detalhados em: van den Hondel & Punt 1991,"Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi," em:Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy et al., eds., p. 1-28, CambridgeUniversity Press: Cambridge.

Alternativamente, os LMPs da invenção podem serexpressados em células de inseto usando-se vetores de expressão debaculovírus. Os vetores de baculovírus disponíveis para a expressão deproteínas em células de inseto cultivadas (por exemplo, células Sf 9 cells)incluem a série pAc (Smith et al. 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) e a sérieρVL (Lucklow & Summers 1989, Virology 170:31-39).

Ainda, em uma outra forma de realização, um ácido nucleicoda invenção é expressado em células de mamíferos usando-se um vetor deexpressão de mamífero. Os exemplos de vetores de expressão de mamíferosincluem pCDM8 (Seed 1987, Nature 329:840) e pMT2PC (Kaufman et al.1987, EMBO J. 6:187-195). Quando usado em células de mamífero, asfunções de controle de vetor de expressão são freqüentemente fornecidas porelementos reguladores virais. Por exemplo, os promotores comumente usadossão derivados de polioma, Adenovírus 2, citomegalovírus e Simian Vírus 40.Para outros sistemas de expressão adequados tanto para célula procarióticasquanto eucarióticas ver os capítulos 16 e 17 de Sambrook, Fritsh andManiatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY, 1989.

Em uma outra forma de realização, os LMPs da invençãopodem ser expressados em células vegetais unicelulares (tais como algas, verFalciatore et al. (1999, Marine Biotechnology 1:239-251 e referências nestes)e células vegetais a partir de plantas superiores (por exemplo, osespermatófitos, tais como plantas de lavoura). Os exemplos de vetores deexpressão vegetais incluem aqueles detalhados em: Becker, Kemper, Schelland Masterson (1992 "New plant binary vectors with selectable markerslocated proximal to the Ieft border," Plant Mol. Biol. 20:1195-1197) e Bevan(1984 "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation," NucleicAcids Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in:Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung und R.Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38).

Um cassete de expressão vegetal contém seqüênciasreguladoras capazes de conduzir a expressão genética em células vegetais eque são operacionalmente ligadas de modo que cada seqüência possasatisfazer sua função, tal como a terminação da transcrição, incluindo ossinais de poliadenilação. Os sinais de poliadenilação preferidos são aquelesque originam-se de t-DNA de Agrobaeterium tumefaeiens tal como o gene 3conhecidos como octopina sintase do Ti-plasmídeo pTiACH5 (Gielen et al.1984, EMBO J. 3:835) ou seus equivalentes funcionais mas também todos osoutros termiandores funcionalmente ativos em plantas são adequados.

Como a expressão do gene vegetal freqüentemente não é muitolimitada nos níveis transcricionais, um cassete de expressão vegetalpreferivelmente contém outras seqüências operacionalmente ligadas como osintensificadores de tradução, tais como a seqüência multiplicadora contendo aseqüência líder não traduzida 5' do vírus mosaico do tabaco que intensifica aproteína pela taxa do RNA (Gallie et al. 1987, Nucleic Acids Res. 15:8693-8711).

A expressão do gene vegetal deve ser operacionalmente ligadaa um promotor apropriado que confere a expressão genética de uma maneiraespecífica de célula ou de tecido adequada. São preferidos os promotores que5 conduzem a expressão constitutiva (Benfey et al. 1989, EMBO J. 8:2195-2202) como aqueles derivados de vírus vegetais como o 35S CAMV (Francket al. 1980, Cell 21:285-294), o 19S CaMV (ver também US 5.352.605 e WO84/02913) ou promotores vegetais como aqueles de subunidade pequena daRubisco descritos na US 4.962.028. Ainda mais preferidos são os promotores10 específicos de semente que conduzem a expressão de proteínas LMP durantetodos os estágios ou selecionados de desenvolvimento de semente. Ospromotores vegetais específicos de semente são conhecidos por aqueles dehabilidade comum na técnica e são identificados e caracterizados usando-sebibliotecas de mRNA específicas de semente e técnicas de formação de perfil15 de expressão. Os promotores específicos de semente incluem o promotor dogene de napina da semente de colza (US 5.608.152), o promotor USP da Viciafaba (Baeumlein et al. 1991, Mol. Gen. Genetics 225:459-67), o promotor deoleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), o promotor de faseolina daPhaseolus vulgaris (US 5.504.200), o promotor Bce4 da Brassica20 (W09113980) ou o promotor de legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al. 1992,Plant J. 2:233-239) bem como os promotores que conferem a expressãoespecífica de semente em plantas de monocotiledônea como o milho, cevada,trigo, centeio, arroz etc. Os promotores adequados de nota são o promotor degene de lpt2 ou Iptl da cevada (WO 95/15389 e WO 95/23230) ou aqueles25 descritos em WO 99/16890 (promotores do gene de hordeína da cevada, ogene gluteína do arroz, o gene orizina do arroz, o gene prolamina do arroz, ogene gliadina do trigo, o gene glutelina do trigo, o gene zeína do milho, ogene glutelina de aveia, o gene casirina do sorgo e o gene secalina docenteio).A expressão do gene vegetal também pode ser facilitada porum promotor indutível (para uma revisão, ver Gatz 1997, Annu. Rev. PlantPhysiol. Plant Mol. BioL 48:89-108). Os promotores quimicamente indutíveissão especificamente adequados se a expressão genética for desejada de umamaneira específica. Os exemplos de tais promotores são um promotorindutível de ácido salicílico (WO 95/19443), um promotor indutível detetraciclina (Gatz et al. 1992, Plant J. 2:397-404), e um promotor indutível deetanol (WO 93/21334).

Os promotores que respondem às condições de tensão bióticaou abiótica também são promotores adequados como o promotor de genePRP-I indutível por patógeno (Ward et al., 1993, Plant. Mol. Biol. 22:361-366), o promotor hsp80 indutível por calor de tomate (US 5.187.267),promotor de alfa-amilase indutível por frio da batata (WO 96/12814) ou opromotor de pinll indutível por ferimento (EP 375091).

Outras seqüências preferidas para o uso nos cassetes deexpressão de gene vegetal são seqüências alvejadoras necessárias paradirecionar o produto genético em seu compartimento celular adequado (pararevisão ver Kermode 1996, Crit. Rev. Plant Sei. 15:285-423 e referênciascitadas neste) tais como o vacúolo, o núcleo, todos os tipos de plastídeoscomo os amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, o espaço extracelular,mitocôndria, o retículo endoplásmico, corpos oleosos, peroxissomas e outroscompartimentos de células vegetais. Também são especialmente adequados ospromotores que conferem a expressão genética específica de plastídeo, comoos plastídeos são o compartimentos onde os precursores e alguns produtos dabiossíntese de lipídeo são sintetizados. Os promotores adequados, tais como opromotor da polimerase de RNA viral são descritos no WO 95/16783 e WO97/06250 e o promotor de clpP da Arabidopsis descrito no WO 99/46394.

A invenção, além disso fornece um vetor de expressãorecombinante que compreende uma molécula de DNA da invenção clonadono vetor de expressão em uma orientação anti-sentido. Isto é, a molécula deDNA é operacionalmente ligada a uma seqüência reguladora de uma maneiraque segue a expressão (pela transcrição da molécula de DNA) de umamolécula de RNA que é anti-sentido com relação ao mRNA de LMP. Asseqüências reguladoras operacionalmente ligadas a um ácido nucleico clonadona orientação anti-sentido pode ser escolhido direcionando a expressãocontínua da molécula de RNA anti-sentido em uma variedade de tiposcelulares, por exemplo, os promotores e/ou intensificadores virais ouseqüências reguladoras podem ser escolhidas direcionando a expressãoespecífica de tecido ou específica do tipo celular constitutivado RNA anti-sentido. O vetor de expressão anti-sentido pode estar na forma de umplasmídeo recombinante, fagomida ou vírus atenuado em que os ácidosnucleicos anti-sentido são produzidos sob o controle de uma região reguladorade alta eficiência, cuja atividade pode ser determinada pelo tipo celular emque o vetor é introduzido. Para um debate da regulação do gene de expressãousando-se genes anti-sentido, ver Weintraub et al. (1986, Antisense RNA as amolecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1) andMol et al. (1990, FEBS Lett. 268:427-430).

Um outro aspecto da invenção diz respeito a célulashospedeiras em que um vetor de expressão recombinante da invenção foiintroduzido. Os termos "célula hospedeira" e "célula hospedeirarecombinante" são usado de maneira intercambiável neste. Deve serentendido que tais termos referem-se não apenas à célula de objetivoparticular mas também à progênie ou progênie potencial de uma tal célula.Pela razão de que certas modificações podem ocorrer nas gerações sucessorasdevido às influências de mutação ou ambientais, tal progênie, de fato, podenão ser idêntica à célula precursora, mas ainda estarão incluídas dentro doescopo do termo como usado neste. Uma célula hospedeira pode ser qualquercélula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, um LMP pode ser expressadoem células bacterianas, célula de inseto, células fóngicas, células de mamífero(tais como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de COS),algas, ciliados ou células vegetais. Outras células hospedeiras adequadas sãoconhecidas por aqueles habilitados na técnica.

O DNA do vetor pode ser introduzido nas células procarióticasou eucarióticas por intermédio das técnicas de transformação ou transfecçãoconvencionais. Como usado neste, os termos "transformação" e"transfecção," "conjugação" e "transdução" são pretendidos referir-se a umavariedade de técnicas reconhecidas na técnica para a introdução de ácidonucleico estranho (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira, incluindo aco-precipitação de fosfato de cálcio ou fosfato ou cloreto de cálcio,transfecção mediada por DEAE-dextrano, lipofecção, competência naturaltransferência mediada química ou eletroporação. Os métodos adequados paraa transformação ou transfecção de células hospedeiras, incluindo célulasvegetais também podem ser encontrados em Sambrook et al. (1989,Molecular Cloníng: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)e outros manuais de laboratório, tais como Methods in Molecular Biology1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland and Davey, HumanaPress, Totowa, New Jersey.

Para a transfecção estável de células de mamíferos e vegetais,é conhecido que, dependendo do vetor de expressão e da técnica detransfecção usados, apenas uma fração pequena de células pode integrar oDna estranho em seu genoma. A fim de identificar e selecionar estesintegrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo,resistência a antibióticos) é, no geral, introduzido nas células hospedeirasjunto com o gene de interesse. Os marcadores selecionáveis preferidosincluem aqueles que conferem resistência a medicamentos, tais como G418,higromicina, canamicina, e metotrexato ou em plantas que conferemresistência com respeito a um herbicida, tal como glifosato ou glifosinato. Umácido nucleico que codifica um marcador selecionável pode ser introduzidoem uma célula hospedeira no mesmo vetor como aquele que codifica umLMP ou pode ser introduzido em um vetor separado. As células estavelmentetransfectadas com o ácido nucleico introduzido pode ser identificada, porexemplo, pela seleção de medicamento (por exemplo, as células que foramincorporadas no gene marcador selecionável sobreviverão, enquanto as outrascélulas morrerão).

Para criar um microorganismo recombinante homólogo, umvetor é preparado contendo pelo menos uma porção de um gene de LMP emque uma anulação, adição ou substituição foi introduzida para, desse modo,alterar, por exemplo, interromper funcionalmente, o gene de LMP.Preferivelmente, este gene de LMP é um gene de LMP de Arabidopsisthaliana ou Brassica napus, mas este pode ser homólogo a partir de umaplanta relacionada ou ainda a partir de uma fonte de mamífero, levedura ouinseto. Em uma forma de realização preferida, o vetor é projetado, tal que, narecombinação homóloga, o gene LMP endógeno é funcionalmenteinterrompido (isto é, não codifica mais uma proteína funcional; tambémreferido como um vetor nocaute). Alternativamente, o vetor pode serprojetado tal que, na recombinação homóloga, o gene LMP endógeno émutado ou, de outra maneira, alterado ainda codifica a proteína funcional (porexemplo, a região reguladora a montante pode ser alterada, para, desse modo,alterar a expressão do LMP endógeno). Para criar um ponto de mutação porintermédio da recombinação homóloga, os híbridos de DNA-RNA podem serusados em uma técnica conhecida como quimeraplastia (Cole-Strauss et al.1999, Nucleic Acids Res. 27:1323-1330 and Kmiec 1999, American Scientist87:240-247). Os procedimentos de recombinação homóloga em Arabidopsisthaliana ou outras lavouras também são conhecidas na técnica e sãoabrangidos para o uso neste.Em um vetor de recombinação homóloga, a porção alterada dogene de LMP é flanqueada em seus terminais 5' e 3' pelo ácido nucleicoadicional do gene de LMP para permitir que a recombinação homóloga ocorraentre o gene LMP exógeno realizado pelo vetor e um gene de LMP homólogoem um microorganismo vegetal. O ácido nucleico de LMP de flanqueamentoadicional é de comprimento suficiente para a recombinação homóloga bemsucedida como gene endógeno. Tipicamente, diversas centenas de pares debase até quilobases de flanqueamento de DNA (tanto nos terminais 5' quanto3') estão incluídos no vetor (ver por exemplo, Thomas & Capecchi 1987, Cell51:503, para a descrição de vetores de recombinação homóloga). O vetor éintroduzido em um microorganismo ou uma célula vegetal (por exemplo, porintermédio do DNA mediado por polietilenoglicol). As células em que o genede LMP introduzido foi homologamente recombinado com o gene LMPendógeno são selecionados usando-se técnicas conhecidas na técnica.

Em uma outra forma de realização, os microorganismosrecombinantes podem ser produzidos contendo sistemas selecionados quepermitem a expressão regulada do gene introduzido. Por exemplo, inclusão deum gene de LMP em um vetor colocando-o sob o controle dos Iac óperonpermite a expressão do gene de LMP apenas na presença de IPTG. Taissistemas reguladores são bem conhecidos na técnica.

Uma célula hospedeira da invenção, tal como uma célulahospedeira procariótica ou eucariótica na cultura pode ser usada paraproduzir, (isto é, expressar) um LMP. Conseqüentemente, a invenção alémdisso fornece métodos para produzir LMPs usando-se as células hospedeirasda invenção. Em uma forma de realização, o método compreende cultivaruma célula hospedeira da invenção (em que um vetor de expressãorecombinante que codifica um LMP foi introduzido, ou que contém um genede LMP do tipo selvagem ou alterado em seu genoma) em um meio adequadoaté o LMp ser produzido. Em uma outra forma de realização, o método, alémdisso compreende isolar os LMPs a partir do meio ou da célula hospedeira.

Um outro aspecto da invenção diz respeito a LMPs isolados eporções biologicamente ativas destes, uma proteína "isolada" ou "purificada"ou porção biologicamente ativa desta é substancialmente isenta de materialcelular quando produzido pelas técnicas de DNA recombinantes ouprecursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamentesintetizados. A linguagem "substancialmente isento de material celular" incluipreparações de of LMP em que a proteína é separada dos componentescelulares das células em que este é natural ou recombinantemente produzido.Em uma forma de realização, a linguagem "substancialmente isento dematerial celular" inclui preparações de LMP tendo menos do que cerca de 30% (em peso seco) de não-LMP (também referido aqui como uma "proteínacontaminante"), mais preferivelmente menos do que cerca de 20 % de não-LMP, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10 % de não-LMP emais preferivelmente menos do que cerca de 5 % de não-LMP. Quando oLMP ou porção biologicamente ativa deste é recombinantemente produzida,este também é, de maneira preferível, substancialmente isento de meio decultura, isto é, o meio de cultura representa menos do que cerca de 20 %, maispreferivelmente menos do que cerca de 10 % e mais preferivelmente menosdo que cerca de 5 % do volume da preparação de proteína. A linguagem"substancialmente isento de precursores químicos ou outros produtosquímicos" inclui as preparações de LMP em que a proteína é separada dosprecursores químicos ou outros produtos químicos que estão envolvidos nasíntese da proteína. Em uma forma de realização, a linguagem"substancialmente isento de precursores químicos ou outros produtosquímicos" inclui preparações de LMP tendo menos do que cerca de 30 % (empeso seco) de precursores químicos ou produtos químicos que não LMP5 maispreferivelmente menos do que cerca de 20 % de precursores químicos ouprodutos químicos que não LMP, ainda mais preferivelmente menos do quecerca de 10 % de precursores químicos ou produtos químicos que não LMP e,mais preferivelmente menos do que cerca de 5 % de precursores químicos ouprodutos químicos que não LMP. Nas formas de realização preferidas, asproteínas isoladas ou as porções biologicamente ativas destes carecem deproteínas contaminantes do mesmo organismo a partir do qual o LMP éderivado. Tipicamente, tais proteínas são produzidas pela expressãorecombinante de, por exemplo, um LMP de Arabidopsis thaliana ou Brassicanapus em outras plantas que não Arabidopsis thaliana ou Brassica napus oumicroorganismos, algas ou fungos.

Um LMP isolado ou uma porção destes da invenção podeparticipar do mtabolismo dos compostos necessários para a produção decompostos de armazenagem de semente em Arabidopsis thaliana ou Brassicanapus ou de membranas celulares ou tem uma ou mais das atividadesapresentadas na Tabela 3. Nas formas de realização preferidas, a proteína ouporção destes compreende uma seqüência de aminoácido que é suficientehomóloga a uma seqüência de aminoácido codificada por um ácido nucleicoda SEQ ID N°: 1 ou 3 tal que a proteína ou porção desta mantenha acapacidade de participar do metabolismo de compostos necessários para aconstrução de membranas celulares celular em Arabidopsis thaliana ouBrassiea napus, ou no transporte de moléculas através destas membranas. Aporção da proteína é, preferivelmente, a porção biologicamente ativa comodescrito neste. Em uma outra forma de realização preferida, um LMP dainvenção tem uma seqüência de aminoácido codificada por um ácido nucleicoda SEQ ID N°: 1 ou 3. Ainda, em uma outra forma de realização preferida, oLMP tem uma seqüência de aminoácido que é codificada por uma seqüênciade nucleotídeo que, por exemplo, hibridiza-se sob condições estringentes, auma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 1 ou 3. Ainda, em uma outraforma de realização preferida, o LMP tem uma seqüência de aminoácido queé codificada por uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos cerca de 50a 60 %, preferivelmente pelo menos cerca de 60 a 70 %, mais preferivelmentepelo menos cerca de 70 a 80 %, 80 a 90 %, 90 a 95 %, e ainda maispreferivelmente pelo menos cerca de 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou maishomóloga a uma das seqüências de aminoácido codificadas por um ácidonucleico da SEQ ID N°: 1 ou 3. Os LMPs preferidos da presente invençãotambém, preferivelmente possuem, pelo menos uma das atividades de LMPdescritas neste. Por exemplo, um LMP preferido da presente invenção incluiuma seqüência de aminoácido codificada por uma seqüência de nucleotídeoque hibridiza-se, por exemplo, hibridiza-se sob condições estringentes, a umaseqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 1 ou 3 e que pode participar dometabolismo de compostos necessários para a construção de membranascelulares em Arabidopsis thaliana ou Brassica napus ou no transporte demoléculas através destas membranas ou, que tem uma ou mais das atividadesapresentadas na Tabela 3.

Em outras formas de realização, o LMP é substancialmentehomólogo a uma seqüência de aminoácido codificada por um ácido nucleicoda SEQ ID N°: 1 ou 3 e retêm a atividade funcional da proteína de uma dasseqüências codificadas por um ácido nucleico da SEQ ID N°: 1 ou 3 aindadifere na seqüência de aminoácido devido à variação natural ou mutagênese,como descrito em detalhes acima. Conseqüentemente, em uma outra forma derealização, o LMP é uma proteína que compreende uma seqüência deaminoácido que é pelo menos cerca de 50 a 60 %, preferivelmente pelo menoscerca de 60 a 70 % e mais preferivelmente pelo menos cerca de 70 a 80, 80 a90, 90 a 95 % e mais preferivelmente pelo menos cerca de 96 %, 97 %, 98 %,99 % ou mais homóloga a uma seqüência de aminoácido total e que tem pelomenos uma das atividades de LMP descritas neste. Em uma outra forma derealização, a invenção diz respeito a uma proteína de Brassica napus total queé substancialmente homóloga a uma seqüência de aminoácido total codificadapor uma ácido nucleico da SEQ ID N°: 1 ou 3.As mutações negativas dominantes ou a supressãotransdominante pode ser suada para a redução da atividade de um LMP emsementes transgênicas a fim de mudar os níveis dos compostos dearmazenagem de semente. Para atingir isto, uma mutação que abole aatividade do LMP é criada e o gene de LMP não funcional inativo é super-expressado na planta transgênica. A proteína de LMP trans-dominante inativacompete com a proteína de LMP endógena para o substrato ou interações comoutras proteínas diminui a atividade do LMP ativo. Desta maneira, a atividadebiológica do LMP é reduzida sem modificar realmente a expressão do gene deLMP endógeno. Esta estratégia como usada por Pontier et al para modular aatividade dos fatores de transcrição vegetal (Pontier D, Miao ZH, Lam E,Plant J 2001 Sep. 27(6): 529-38, Trans-dominant suppression of plant TGAfactors reveals their negative and positive roles in plant defense responses).

Os homólogos do LMP pode ser gerado pela mutagênese, porexemplo, mutação ou truncação do ponto distinto do LMP. Como usado neste,o termo "homólogo" refere-se a uma forma variante do LMP que atua comoum agonista ou antagonista da atividade do LMP. Um agonista do LMP podereter substancialmente o mesmo ou uma sub-série das atividades biológicasdo LMP. Um antagonista do LMP pode inibir uma ou mais das atividades daforma de ocorrência natural do LMP, por exemplo, pela ligação competitiva aum membro a jusante ou a montante da cascata metabólica de componentecelular da membrana que inclui o LMP ou a ligação a um LMP que media otransporte dos compostos através de tais membranas, desse modo, evitandoque a translocação aconteça.

Em uma forma de realização, os homólogos do LMP podemser identificados pela avaliação das bibliotecas combinatórias de mutantes,por exemplo, mutantes de truncação, do LMP para a atividade de agonista ouantagonista de LMP. Em uma forma de realização, uma biblioteca variada devariantes de LMP é gerada pela mutagênese combinatória no nível de ácidonucleico e é codificada por uma biblioteca genética variada. Uma bibliotecavariada de variantes de LMP pode ser produzida, por exemplo, pela ligaçãoenzimática de uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos às seqüênciasgenéticas, tal que uma série degenerada de seqüências de LMP potenciais sejaexpressável como polipeptídeos individuais ou alternativamente, como umasérie de proteínas de fusão maiores (por exemplo, para apresentação de fago)contendo a série de seqüências de LMP destes. Existe uma variedade demétodos que podem ser usados para a produção de bibliotecas de homólogosde LMP potenciais a partir de uma seqüência de oligonucleotídeo degenerada.A síntese química de uma seqüência genética degenerada pode ser realizadaem um sintetizador dè DNA automático e o gene sintético então ligado em umvetor de expressão apropriado. O uso de uma série degenerada de genespermite o fornecimento, em uma mistura, de todas as seqüências quecodificam a série desejada de seqüências de LMP potenciais. Os métodos parasintetizar os oligonucleotídeos degenerados são conhecidos na técnica (ver,por exemplo, Narang 1983, Tetrahedron 39:3; Itakura et al. 1984, Annu. Rev.Biochem. 53:323; Itakura et al. 1984, Science 198:1056; Ike et al. 1983,Nucleic Acids Res. 11:477).

Além disso, as bibliotecas de fragmentos das seqüênciascodificadoras de LMP podem ser usadas para a geração de uma populaçãovariada de fragmentos de LMP para a avaliação e seleção subseqüentes dehomólogos de um LMP. Em uma forma de realização, uma biblioteca decodificação de fragmentos de seqüência pode ser gerada pelo tratamento deum fragmento de PCR de filamento duplo de uma seqüência codificadora deLMP com uma nuclease sob condições em que cortes ocorrem apenas umavez por molécula, a desnaturação do DNA de filamento duplo DNA, arenaturação do DNA para a formação do DNA de filamento duplo que podeincluir pares sentido/anti-sentido a partir dos produtos cortados diferentes,remoção das porções de filamento simples reformaram o duplexes pelotratamento com a Sl nuclease e ligação da biblioteca de fragmento resultanteem um vetor de expressão. Por este método, uma biblioteca de expressão podeser derivada codificando o terminal N, terminal C e fragmentos internos detamanhos variados de LMP.

Diversas técnicas são conhecidas na técnica para a avaliaçãodos produtos genéticos de bibliotecas combinatórias feitas por mutação outruncação de ponto e para a avaliação de bibliotecas de cDNA para produtosgenéticos tendo uma propriedade selecionada. Tais técnicas são adaptáveispara a avaliação rápida das bibliotecas genéticas pela mutagênesecombinatória de homólogos de LMP. As técnicas mais amplamente usadas,que são responsáveis pela análise através de resposta para a avaliação debibliotecas genéticas grandes incluem a clonagem de biblioteca genética emvetores de expressão replicáveis, transformando as células apropriadas com abiblioteca resultante de vetores e expressando os genes combinatórios sobcondições em que a detecção de um atividade desejada facilita o isolamentodo gene cujo produto foi detectado. A mutagênese de conjunto recursiva(REM), uma nova técnica que intensifica a freqüência de mutantes funcionaisnas bibliotecas, pode ser usada em combinação com os ensaios de avaliaçãopara a identificação dos homólogos de LMP (Arkin & Yourvan 1992, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. 1993, ProteinEngineering 6:327-331).

Em uma outra forma de realização, os ensaios com base emcélulas podem ser explorados para analisar uma biblioteca de LMP variada,usando-se métodos bem conhecidos na técnica.

As moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos deproteína, proteínas de fusão, iniciadores, vetores e células hospedeirasdescritas neste podem ser usadas em um ou mais dos seguintes métodos:identificação de Arabidopsis thaliana ou Brassica napus e organismosrelacionados; mapeamento dos genomas de organismos relacionados comArabidopsis thaliana ou Brassica napus; identificação e localização deseqüências de Arabidopsis thaliana ou Brassica napus de interesse; estudosevolucionários; determinação de regiões de LMP requeridos para a função;modulação da atividade de LMP; modulação do metabolismo de uma ou maisfunções celulares; modulação do transporte transmembrana de um ou maiscompostos e modulação do acúmulo de composto de armazenagem desemente.

A planta Arabidopsis thaliana representa um membro deplanta (ou semente) superior. Esta está relacionada com outras plantas, taiscomo Brassica napus, que requer luz para a realização da fotossíntese edesenvolvimento. Plantas como a Arabidopsis thaliana ou Brassiea napusdividem um alto grau de homologia na seqüência de DNA e nível depolipeptídeo, permitindo o uso da avaliação heteróloga de moléculas de DNAcom sondas que evoluem a partir de outras plantas ou organismos, destamaneira permitindo a derivação de uma seqüência de consenso adequada paraa avaliação heteróloga ou anotação ou predição funcional de funçõesgenéticas na terceira espécie. A capacidade de identificar tais funções pode,portanto, ter relevância significante, por exemplo, predição da especificidadedas enzimas. Além disso, estas moléculas de ácido nucleico podem revircomo pontos de referência para o mapeamento de genomas de Arabidopsis oude genomas de organismos relacionados.

As moléculas de ácido nucleico de LMP da invenção em umavariedade de usos. primeiro, o ácido nucleico e as moléculas de proteína dainvenção podem servir como marcadores para regiões específicas do genoma.Esta tem a utilidade não apenas no mapeamento do genoma, mas tambémpara os estudos funcionais de proteínas de Arabidopsis thaliana ou Brassieanapus. Por exemplo, para identificar a região do genoma, ao qual umaproteína de ligação de DNA de Arabidopsis thaliana ou Brassiea napusparticular liga-se, o genoma de Arabidopsis thaliana ou Brassiea napus podeser digerido e os fragmentos incubados com a proteína de ligação de DNA.

Aqueles que ligam-se à proteína podem ser adicionalmente sondados com asmoléculas de ácido nucleico da invenção, preferivelmente com rótulosfacilmente detectáveis; a ligação de uma tal molécula de ácido nucleico aosfragmentos de genoma permite a localização do no mapa do genoma deArabidopsis thaliana ou Brassica napus e, quando realizado múltiplas vezescom enzimas diferentes, facilita uma determinação rápida da seqüência deácido nucleico, à qual a proteína liga-se. Além disso, as moléculas de ácidonucleico da invenção podem ser suficientemente homólogas às seqüências deespécies relacionadas, tal que estas moléculas de ácido nucleico tal que estasmoléculas de ácido nucleico possam servir como marcadores para aconstrução de um mapa genômico em plantas relacionadas.

As moléculas de ácido nucleico de LMP da invenção tambémsão úteis para os estudos estruturais e evolucionários da proteína. Osprocessos metabólicos e de transporte em que as moléculas da invençãoparticipam são utilizados por uma ampla variedade de células procarióticas eeucarióticas; pela comparação das seqüências das moléculas de ácido nucleicoda presente invenção àquelas enzimas codificadoras similares de outrosorganismos, um parentesco evolucionário dos organismos pode ser estimada.

Similarmente, uma tal comparação permite uma estimativa de quais regiõesda seqüência são conservadas e quais não são, que pode auxiliar nadeterminação daquelas regiões da proteína que são essenciais para ofuncionamento da enzima. Este tipo de determinação é de valor para osestudos de projeto de proteína e podem dar uma indicação do que a proteínapode tolerar em termos de mutagênese sem a perda de função.

A manipulação das moléculas de ácido nucleico de LMP dainvenção pode resultar na produção de LMPs tendo diferenças funcionais apartir dos LMPs do tipo selvagem. Estas proteínas podem ser melhoradas emeficiência ou atividade, pode estar presente em números maiores na célula doque é usual ou pode ser diminuído em eficiência ou atividade.

Existem diversos mecanismos pelos quais a alteração de umLMP da invenção pode afetar diretamente o acúmulo e/ou composição decompostos de armazenagem de semente. No caso de plantas que expressam osLMPs, o transporte aumentado pode levar ao acúmulo alterado de compostose/ou divisão de soluto dentro do tecido e órgãos vegetais que, ultimamentepodem ser usados para afetar o acúmulo de um ou mais compostos dearmazenagem de semente durante o desenvolvimento de semente. Umexemplo é fornecido por Mitsukawa et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sei. USA94:7098-7102), onde a superexpressão de um gene transportador de fosfato dealta afinidade de Arabidopsis no desenvolvimento de células cultivadas detabaco sob condições limitadas por fosfato. A disponibilidade do fosfatotambém afeta significantemente a produção de açúcares e de intermediáriosmetabólicos (Hurry et al. 2000, Plant J. 24:383-396) e a composição de15 lipídeo nas folhas e raízes (Hártel et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. USA97:10649-10654). Também, a atividade da planta ACCase foi demonstradaser regulada pela fosforilação (Savage & Ohlrogge 1999, Plant J. 18:521-527)e alterações na atividade das quinases e fosfatases (LMPs) que atua naACCase pode levar aos níveis aumentados ou diminuídos de acúmulo de20 lipídeo na semente. Além disso, a presença de atividades de lipídeo quinaseem membranas de envelope de cloroplasto sugere que os caminhos detransdução do sinal e/ou regulação da proteína da membrana ocorra nosenvelopes (ver, por exemplo, Müller et al. 2000, J. Biol. Chem. 275:19475-19481 e literatura citada neste). Os genes ABIl e ABI2 codificam duas25 proteínas serina/treonina fosfatases 2C, que são reguladores no caminho desinalização do ácido abscísico e, desse modo no desenvolvimento de sementeprecoce ou atrasado (por exemplo, Merlot et al. 2001, Plant J. 25:295-303).Para mais exemplo, ver também a seção 'fundamentos da invenção'.

A presente invenção também fornece anticorpos que ligam-seespecificamente a um polipeptídeo LMP ou uma porção destes, quandocodificado por um ácido nucleico divulgado neste ou como descrito neste.

Os anticorpos podem ser feitos por muitos métodos bemconhecidos (ver, por exemplo, Harlow and Lane, "Antibodies; A LaboratoryManual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,1988). Resumidamente, os antígeno purificado pode ser injetado em umanimal em uma quantidade e em intervalos suficientes para evocar umaresposta imune. Os anticorpos podem ser purificados diretamente ou ascélulas do baço podem ser obtidas a partir do animal. As células podem serentão fundidas com uma linha celular imortal e avaliado quanto à secreção deanticorpo. Os anticorpos podem ser usados para a avaliação de bibliotecas declonagem de ácido nucleico para células que secretam o antígeno. Aquelesclones positivos podem ser então seqüenciados (ver, por exemplo, Kelly et al.1992, Bio/Technology 10:163-167; Bebbington et al. 1992, Bio/Technology10:169-175).

A frase "liga-se seletivamente" com o polipeptídeo refere-se àreação de ligação, que é determinante da presença da proteína em umapopulação heterogênea de proteínas e outros biológicos. Desta maneira, sobcondições de imunoensaio designadas, os anticorpos específicos ligados auma proteína particular não liga-se em uma quantidade significante a outrasproteínas na amostra. A ligação seletiva a um anticorpo sob tais condiçõespode requerer que um anticorpo seja selecionado quanto à sua especificidadecom relação a uma proteína particular. Uma variedade de formatos deimunoensaio pode ser usada para selecionar os anticorpos que ligam-seseletivamente com uma proteína particular. Por exemplo, imuno-ensaiosELISA de fase sólida são rotineiramente usados para selecionar anticorposseletivamente imunorreativos com uma proteína. Ver Harlow and Lane"Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, NewYork (1988), para a descrição de formatos de imunoensaio e condições quepodem ser usadas para determinar a ligação seletiva.

Em alguns exemplos, é desejável preparar os anticorposmonoclonais a partir de vários hospedeiros. Uma descrição de técnicas para apreparação de tais anticorpos monoclonais podem ser observados em Stites etal., editors, "Basic and Clinicai Immunology," (Lange Medicai Publications,Los Altos, Calif., Fourth Edition) e referências citadas nestes e em Harlowand Lane ("Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring HarborPublications, New York, 1988).

Por todos este pedido, várias publicações são referidas. Asdivulgações de todas estas publicações e aquelas referências citadas dentrodaquelas publicações em suas totalidades são, desse modo, incorporados nestepor referência em seu pedido a fim de descrever mais totalmente o estado datécnica à qual esta invenção diz respeito.

Estará evidente para aquele habilitado na técnica que váriasmodificações podem ser feitas na presente invenção sem divergir do escopo edo espírito da invenção. Outras formas de realização da invenção estarãoevidentes para aqueles habilitados na técnica a partir da consideração daespecificação e da prática da invenção divulgada neste. É pretendido que aespecificação e os Exemplos sejam considerados como apenas exemplares,com um escopo e espírito da invenção verdadeiros sendo indicados pelasreivindicações incluídas neste.

FIGURAS:

As Figuras IA a C: Polinucleotídeos são mostradosrepresentando a seqüência de ácido nucleico (SEQ ID N0:3), estrutura deleitura aberta da seqüência de ácido nucleico (SEQ ID N°: 1 e a seqüência deaminoácido da estrutura de leitura aberta (SEQ ID N°: 2) do gene semelhanteao CTRl Brassica napus (.BN42541212).

As Figuras 2A a C: Os polinucleotídeos são mostradosrepresentar a seqüência de ácido nucleico (SEQ ID N0:6), estrutura de leituraaberta da seqüência de ácido nucleico (SEQ ID N°: 4) e a seqüência deaminoácido da estrutura de leitura aberta (SEQ ID N°: 5) do gene CTRl de

Arabidopsis thaliana (AtCTROl).

As Figuras 3A a C: os polinucleotídeos otimizados sãomostrados representar a seqüência de ácido nucleico (SEQ ID N°: 11) e aestrutura de leitura aberta da seqüência de ácido nucleico (SEQ ID N°: 10). Aseqüência de aminoácido da estrutura de leitura aberta é mostrada na Figura3C (SEQ ID N°: 12).

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Processos Gerais

a) Processos de Clonagem Gerais. Os processos de clonagemtais como, por exemplo, clivagens de restrição, eletroforese em gel deagarose, purificação de fragmentos de DNA, transferência de ácidos nucleicospara nitrocelulose e membranas de náilon, ligação de fragmentos de DNA,transformação de Escherichia coli e células de levedura, cultivo de bactérias eanálise de seqüência de DNA recombinante foram realizados como descritoem Sambrook et ai. (1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN O-87969-309-6) ou Kaiser, Michaelis e Mitchell (1994, "Methods in YeastGenetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-451-3).

b) Produtos Químicos. Os produtos químicos usados foramobtidos, se não de outro modo mencionado no texto, em qualidade p.a. dascompanhias Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva(Heidelberg) e Sigma (Deisenhofen). As soluções foram preparadas usandoágua purificada, isenta de pirogênio, designada como H2O no texto seguinte, apartir de uma instalação de purificação de água da Milli-Q water system(Millipore, Eschborn). As endonucleases de restrição, enzimas modificadorasdo DNA e kits de biologia molecular foram obtidos das companhias AGS(Heidelberg), Amersham (Braunschweig), Biometra (Gõttingen), Boehringer(Mannheim), Genomed (Bad Oeynnhausen), New England Biolabs(Schwalbach/ Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer(Weiterstadt), Pharmacia (Freiburg), Qiagen (Hilden) e Stratagene(Amsterdam, Países Baixos). Estes foram usados, se não de outro modomencionado, de acordo com as instruções do fabricante.

c) Material Vegetal e cultivo: Plantas Arabidopsis. Para esteestudo, material de raiz, folhas, silíquas e sementes de plantas do tiposelvagem e mutantes de Arabidopsis thaliana foram usados. O mutante ctrlfoi isolado do ecotipo Columbia como descrito (Kieber JJ et ai., Cell 72: 427-441). Sementes de Arabidopsis do tipo selvagem e ctrl foram pré incubadaspor três dias no escuro a 4o C antes de colocá-las em um incubador (AR-75,Percival Scientific, Boone, IA) a uma densidade de fluxo de fóton de 60 a 80μπιοί m"2 s"1 e um período de luz de 16 horas (22° C), e um período de escurode 8 horas (18° C). Todas as plantas foram iniciadas em meio MS a meia-concentração (Murashige & Skoog, 1962, Physiol. Plant. 15, 473-497), pH6,2, 2 % de sacarose e 1,2 % de ágar. As sementes foram esterilizadas por 20minutos em 20 % de alvejante 0,5 % de triton X100 e enxaguado 6 vezes comágua estéril em excesso. As plantas foram cultivadas como descrito acima ouno solo sob condições padrão como descrito no Focks & Benning (1998, PlantPhysiol. 118: 91-101).

Material Vegetal e cultivo: Brassica napus. Brassica napusvariedades AC Excel e Cresor foram usadas para este estudo para criarbibliotecas de cDNA. O tecido de semente, vagem de semente, flor, folha,haste e raiz foram coletados das plantas que foram em alguns casos tratadasno escuro, sal, calor e seca. Entretanto, este estudo focalizou no uso de tecidosde semente e vagem de semente para bibliotecas de cDNA. As plantas foramrotuladas para colher as sementes coletadas 60 a 75 dias depois de plantar apartir de dois pontos no tempo: 1 a 15 dias e 15 a 25 dias depois da antese. Asplantas foram cultivadas em Metromix (Scotts, Marysville, OH) a 71° F sobum fotoperíodo de 14 horas. Seis tecidos de semente e vagem de semente deinteresse neste estudo foram coletados para criar as seguintes bibliotecas decDNA: sementes imaturas, sementes maduras, vagens de semente imaturas,vagens de semente maduras, vagens de semente colhidas e as sementes davariedade Cresor (ácido erúcico alto). As amostras de tecido foram coletadasdentro de pontos de tempo específicos para cada tecido em desenvolvimento eamostras múltiplas dentro de um tempo reunidas juntas para extração eventualde RNA total. As amostras de sementes imaturas foram tiradas entre 1 a 25dias depois da antese (daa), sementes maduras entre 25 a 50 daa, vagens desemente imaturas entre 1 a 15 daa, vagens de semente maduras entre 15 a 50daa, vagens de semente colhidas à noite entre 1 a 50 daa e sementes Cresor 5a 25 daa.

Exemplo 2 - Isolação de DNA Total das plantas.

Os detalhes para a isolação de DNA total dizem respeito aotrabalho de 1 grama de peso fresco de material vegetal.

Tampão CTAB: 2 % (p/v) de brometo de N-cetil-N,N,N-trimetilamônio (CTAB); 100 mM de Tris HCl pH 8,0; 1,4 M de NaCl; 20 mMde EDTA. Tampão de N-Laurilsarcosina: 10 % (p/v) de N-laurilsarcosina;100 mM de Tris HCl pH 8,0; 20 mM de EDTA.

O material vegetal foi triturado sob nitrogênio líquido em umalmofariz para dar um pó fino e transferido para vasos de Eppendorf de 2 ml.O material vegetal congelado foi depois coberto com uma camada de 1 ml detampão de decomposição (1 ml de tampão CTAB, 100 μΐ de tampão de N-laurilsarcosina, 20 μΐ de β-mercaptoetanol e 10 μΐ de solução de proteinase K,10 mg/ml) e incubados a 60° C por uma hora com agitação contínua. Ohomogenado obtido foi distribuído em dois vasos Eppendorf (2 ml) eextraídos duas vezes pela agitação com o mesmo volume declorofórmio/álcool isoamílico (24:1). Para a separação de fase, acentrifugação foi realizada a 8000g e temperatura ambiente por 15 min emcada caso. O DNA foi depois precipitado a -70° C por 30 min usandoisopropanol gelado. O DNA precipitado foi sedimentado a 4o C e 10.000 gpor 30 min e recolocado em suspensão em 180 μΐ de tampão TE (Sambrook etai. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Parapurificação adicional, o DNA foi tratado com NaCl (1,2 M concentraçãofinal) e precipitado mais uma vez a -70° C por 30 min usando duas vezes ovolume de etanol absoluto. Depois de uma etapa de lavagem com 70 % deetanol, o DNA foi secado e subseqüentemente absorvido em 50 μΐ de H2O +RNAse (50 mg/ml de concentração final ). O DNA foi dissolvido durante anoite a 4o C e a digestão de RNAse foi subseqüentemente realizada a 37° Cpor 1 h. A armazenagem do DNA ocorreu a 4o C.

Exemplo 3 - Isolação de RNA Total e poli-(A)+ RNA dasplantas: Arabidopsis thaliana.

Para a investigação de transcritos, tanto o RNA total quanto opoli-(A)+ RNA foram isolados.

O RNA é isolado de silíquas de plantas de Arabidopsis deacordo com o seguinte procedimento:

Preparação de RNA a partir de sementes de Arabidopsis -extração a "quente":

1. Tampões, enzimas e solução 2 M de KCl

Proteinase K

Fenol (para o RNA)

Clorofórmio:álcool isoamílico

(Fenolxlorofórmio 1:1; pH ajustado para o RNA)

4 M LiCl, tratado com DEPC

água tratada com DEPC

3 M NaOAc, pH 5, tratado com DEPC

Isopropanol

Etanol a 70 % (fabricada com água tratada com DEPC)tampão de recolocação em suspensão: 0,5 % de SDS, 10 mMde Tris pH 7,5, 1 mM de EDTA completado com água tratada com DEPCvisto que esta solução não pode ser tratada com DEPC

Tampão de Extração:

0,2 M de Borato de Na

30 mM de EDTA

30 mM de EGTA

1 % de SDS (250 μΐ de solução a 10 % de SDS por 2,5 ml de

tampão)

1 % de Desoxicolato (25 mg por 2,5 ml de tampão)

2 % de PVPP (insolúvel - 50 mg por 2,5 ml de tampão)

2 % de PVP 40K (50 mg por 2,5 ml de tampão)

10mMdeDTT

100 mM de β-MercaptoetanoI (fresco, manuseado sobcapela - usar 35 μΐ de solução 14,3 M para 5 ml de tampão)

2. Extração. Tampão de extração térmica até 80° C. Triturar otecido em almofariz esfriado com nitrogênio líquido, transferir o pó de tecidopara tubo de 1,5 ml. O tecido deve ser mantido congelado até que o tampãoseja adicionado de modo a transferir a amostra com espátula pré esfriada emanter o tubo em nitrogênio líquido todo o tempo. Adicionar 350 μΐ detampão de extração a um tubo pré aquecido (aqui para 100 mg de tecido, ovolume de tampão pode ser tanto quanto 500 μΐ para amostras maiores),turbilhonar e aquecer o tubo a 80° C por ~1 min. Manter depois sobre gelo.Turbilhonar a amostra, triturar adicionalmente com almofariz elétrico.

3. Digestão. Adicionar Proteinase K (0,15 mg/100 mg detecido), turbilhonar e manter a 37° C por uma hora.

Primeira Purificação. Adicionar 27 μΐ de KCl 2 M. Congelarem gelo por 10 min. Centrifugar a 12.000 rpm por 10 minutos na temperaturaambiente. Transferir o sobrenadante para tubo fresco, isento de RNAase erealizar um extração com fenol, seguida por uma extração comclorofórmio: álcool isoamílico. Adicionar 1 vol. de isopropanol aosobrenadante e congelar em gelo por 10 min. Pelotizar o RNA porcentrifugação (7000 rpm por 10 min na temperatura ambiente). Dissolver apelota em 1 ml de LiCl 4 M por 10 a 15 min turbilhonando. Pelotizar o RNApor centrifugação de 5 min.

Segunda Purificação. Recolocar em suspensão a pelota em 500μΐ de tampão de recolocação em suspensão. Adicionar 500 μΐ de fenol eturbilhonar. Adicionar 250 μΐ de clorofórmio:álcool isoamílico e turbilhonar.Girar por 5 min. e transferir o sobrenadante para tubo fresco. Repetir aextração com clorofórmio:álcool isoamílico até que a interface esteja clara.Transferir o sobrenadante para tubo fresco e adicionar 1/10 vol de NaOAc 3M, pH 5 e 600 μΐ de isopropanol. Manter a -20 por 20 min ou mais tempo.Pelotizar o RNA pela centrifugação de 10 min. Lavar a pelota uma vez cometanol a 70 %. Remover todo o álcool remanescente antes de dissolver apelota com 15 a 20 μΐ de DEPC-água. Determinar a quantidade e qualidademedindo-se a absorbância de uma diluição 1:200 a 260 e 280 nm. 40 μg de

RNA/ml = 10D260

O RNA do tipo selvagem e o mutante wril de Arabidopsis sãoisolados como descrito (Hosein, 2001, Plant Mol Biol. Rep., 19, 65a-65e;Ruuska, S. A., Girke,T., Benning, C., & Ohlrogge, J. B., 2002, Plant Cell, 14,1191-1206).

O mRNA é preparado a partir do RNA total, usando o kit depurificação de mRNA da Amersham Pharmacia Biotech, que utiliza colunasde oligo(dT)-celulose.

A isolação de Poli-(A)+ RNA foi isolada usando Dyna BeadsR(Dynal, Oslo, Noruega) seguindo as instruções do protocolo do fabricante.Depois de determinar a concentração do RNA ou do poli(A)+ RNA, o RNAfoi precipitado pela adição de 1/10 volumes de acetato de sódio 3 M pH 4,6 e2 volumes de etanol e armazenados a -70° C.Brassica napus. As sementes de Brassica napus foramseparadas das vagens para criar materiais homogêneos para a semente ebibliotecas de cDNA de vagem de semente. Os tecidos foram triturados em pófino sob N2 líquido usando um almofariz e pistilo e transferidos para um tubode 50 ml. As amostras de tecido foram armazenadas a -80° C até que asextrações pudessem ser realizadas.

O RNA total foi extraído a partir dos tecidos usando o kitRNeasy Maxi (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante e o mRNAfoi processado a partir do RNA total usando o kit Oligotex mRNAPurification System kit (Qiagen), também de acordo com o protocolo dofabricante. O mRNA foi enviado para a Hyseq Pharmaceuticals Incorporated(Sunnyville, CA) para processamento adicional do mRNA de cada tipo detecido em bibliotecas de cDNA e para o uso nos seus processos patenteadosem que insertos similares em plasmídeos são agrupados com base nos padrõesde hibridização.

Exemplo 4 - Construção de Biblioteca de cDNA.

Para a construção de biblioteca de cDNA, a síntese de primeirofilamento foi obtida usando a transcriptase reversa do Vírus da leucemia deMurino (Roche, Mannheim, Alemanha) e iniciadores de oligo-d(T), a síntesedo segundo filamento pela incubação com DNA polimerase I, enzima Klenowe digestão com RNAseII a 12° C (2 h), 16° C (1 h) e 22° C (1 h). A reação foiinterrompida pela incubação a 65° C (10 min) e transferida subseqüentementepara gelo. As moléculas de DNA de filamento duplo foram enfraquecidas pelaT4-DNA-polimerase (Roche, Mannheim) a 37° C (30 min). Os nucleotídeosforam removidos pela extração de fenol/clorofórmio e colunas giratóriasSephadex G50. Adaptadores EcoRI (Pharmacia, Freiburg, Alemanha) foramligados às extremidades do cDNA pela T4-DNA-ligase (Roche, 12° C,durante a noite) e fosforilados pela incubação com quinase de polinucleotídeo(Roche, 37° C, 30 min). Esta mistura foi submetida à separação em um gel deagarose de baixa fusão. As moléculas de DNA maiores do que 300 pares debase foram eluídas do gel, extraídas com fenol, concentradas em colunasElutip-D (Schleicher e Schuell, Dassel, Alemanha) e foram ligadas aos ramosdo vetor e empacotadas em fagos lambda ZAPII ou fagos lambda ZAP-Express usando o kit Gigapack Gold (Stratagene, Amsterdam, Países Baixos)usando o material e seguindo as instruções do fabricante.

As bibliotecas de cDNA de Brassica napus foram geradas naHyseq Pharmaceuticals Incorporated (Sunnyville, CA) nenhuma etapa deamplificação foi usada na produção da biblioteca para reter a informação deexpressão. O método genômico da Hyseq envolve agrupar os genes emgrupos e depois seqüenciar membros representativos de cada grupo. Asbibliotecas de cDNA foram geradas a partir de mRNA purificado em colunade oligo dT. As colônias de transformação da biblioteca de cDNA na E. coliforam aleatoriamente escolhidas e o inserto de cDNA foi amplificado pelaPCR e manchadas sobre membranas de náilon. Um conjunto deoligonucleotídeos radiorrotulados com 33T foram hibridizados aos clones e opadrão de hibridização resultante determinado a qual grupo um cloneparticular pertenceu. Os clones de cDNA e suas seqüências de DNA foramobtidos para o uso na superexpressão em plantas transgênicas e em outrosprocessos da biologia molecular aqui descritos.

Exemplo 5 - Identificação de Genes LMP de Interesse que sãoequivalentes a CTR1.

Mutante ctrl de Arabidopsis thaliana. O mutante ctrl deArabidopsis foi usado para testar a funcionalidade de genes LMP que sãoequivalentes a CTRl. O mutante ctrl é caracterizado por uma redução de 20% em lipídeos de armazenagem de semente (W02003014376). O gene CTRlfoi clonado e descrito (Kieber JJ et al., Cell 72: 427-441).

Brassica napus. Este exemplo ilustra como clones de cDNAque codificam polipeptídeos equivalentes a CTRl de Brassica napus foramidentificados e isolados.

De modo a identificar genes equivalentes a CTRl em bases dedados patenteadas, uma análise de similaridade usando o software BLAST(Basic Local Alignment Search Tool, versão 2.2.6, Altschul et aL, 1997,Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402) foi realizada. Os ajustes de valor padrãoforam usados exceto para o corte de valor e (Ie-10) e todas as pesquisas deproteína foram feitas usando a matriz BLOSUM62. A seqüência deaminoácido do polipeptídeo CTRl de Arabidopsis foi usada como umaquestão para as bases de dados de DNA de procura e alinhamento de Brassicanapus que foram traduzidas em todas as seis matrizes de leitura, usando oalgoritmo TBLASTN. Tal análise de similaridade das bases de dados internasde BPS resultou na identificação de numerosos ESTs e contíguos de cDNA.

Os dados de perfil de expressão de RNA obtidos do processode formação de grupo da Hyseq foram usados para determinar aespecificidade de órgão. Os clones que mostram uma expressão maior embibliotecas de semente comparados com as outras bibliotecas de tecido foramselecionadas como genes candidatos de LMP. Os clones de Brassica napusforam selecionados quanto a superexpressão em Arabidopsis com base no seuperfil de expressão.

Exemplo 6 - Clonagem de cDNAs de tamanho natural eortólogos de genes LMP identificados.

Os clones que correspondem às seqüências de tamanho naturale cDNAs parciais de Arabidopsis thaliana ou Brassica napus foramidentificados nas bases de dados patenteadas internas da Hyseq. Os clones daHyseq de Brassiea napus foram seqüenciados na DNA Landmarks usando umseqüenciador de gel em placas ABI 377 e os kits BigDye Terminator ReadyReaction (PE Biosystem, Foster City, CA). Os alinhamentos de seqüênciaforam feitos para determinar se os clones Hyseq foram de tamanho natural ouclones parciais. Nos casos onde os clones da Hyseq foram determinados sercDNAs parciais o seguinte procedimento foi usado para isolar as seqüênciasde tamanho natural. Os cDNAs de tamanho natural foram isolados pelaRACE PCR usando o kit de amplificação de cDNA SMART RACE daClontech permitindo a amplificação rápida tanto de 5' quanto 3' dasextremidades do cDNA (RACE). Os iniciadores da RACE PCR foramplanejados com base nas seqüências de clone da Hyseq. A isolação de cDNAsde tamanho natural e o protocolo RACE PCR usado foram fundamentadosnas condições do fabricante. Os fragmentos de produto RACE foramextraídos dos géis de agarose com um Kit de Extração em Gel QIAquick(Qiagen) e ligados no vetor TOPO pCR 2.1 (Invitrogen) seguindo asinstruções do fabricante. Os vetores recombinantes foram transformados nascélulas TOPlO (Invitrogen) usando as condições padrão (Sambrook et al.1989). As células transformadas foram cultivadas durante a noite a 37° C emLB ágar contendo 50 μg/ml de canamicina e espalhada com 40 μΐ de umasolução de estoque de 40 mg/ml de X-gal em dimetilformamida para a seleçãoazul-branco. As colônias brancas únicas foram selecionadas e usadas parainocular 3 ml de LB líquido contendo 50 μg/ml de canamicina e cultivadasdurante a noite a 37° C. O DNA plasmídico é extraído usando o kit QIAprepSpin Miniprep (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. A análisesubseqüente de clones, e o mapeamento de restrição, foi realizada de acordocom as técnicas de biologia molecular padrão (Sambrook et al. 1989).

Os cDNAs de tamanho natural foram isolados e clonados emvetores binários pelo uso do seguinte procedimento: Iniciadores específicosde gene foram planejados usando as seqüências de tamanho natural obtidasdos clones da Hyseq ou produtos de amplificação RACE subseqüentes. Asseqüências de tamanho natural e os genes foram amplificados utilizandoclones Hyseq ou bibliotecas de cDNA como padrão de DNA usando a PCRtouch-down. Em alguns casos, iniciadores foram planejados para adicionaruma seqüência equivalente a Kozak "AACA" exatamente a montante docódon de partida do gene e duas bases a jusante foram, em alguns casos,trocadas para GC para facilitar os níveis de expressão de gene aumentados(Chandrashekhar et ai. 1997, Plant Molecular Biology 35: 993-1001). Osciclos de reação de PCR foram: 94° C, 5 min; 9 ciclos de 94° C, 1 min, 6o C,1 min, 72°C, 4 min e em que a temperatura de recozimento foi diminuída em1°C a cada ciclo; 20 ciclos de 94° C, 1 min, 55° C, 1 min, 72° C, 4 min e ociclo de PCR foi terminado com 72° C, 10 min. os produtos de PCRamplificados foram purificados em gel a partir de géis de agarose a 1 %usando colunas giratórias GenElute -EtBr (Sigma) e depois da digestãoenzimática padrão, foram ligados no vetor binário vegetal pBPS-GBl para atransformação de Arabidopsis. O vetor binário foi amplificado pelo cultivodurante a noite em E. coli DH5 em meio LB e antibiótico e plasmídeoapropriados foram preparados para as etapas a jusante usando o kit depreparação de DNA Qiagen MiniPrep. O inserto foi verificado por todas asvárias etapas de clonagem pela determinação do seu tamanho através dadigestão de restrição e os insertos foram seqüenciados para garantir que ogene esperado fosse usado na transformação da Arabidopsis.

As seqüências de gene podem ser usadas para identificar geneshomólogos ou heterólogos (ortólogos, o mesmo gene LMP de uma outraplanta) de cDNA ou bibliotecas genômicas. Isto pode ser feito peloplanejamento de iniciadores de PCR para seqüências conservadasidentificadas pelos alinhamentos de seqüência múltiplos. Os ortólogos sãofreqüentemente identificados pelo planejamento de iniciadores degeneradospara as seqüências de tamanho natural ou parciais dos genes de interesse.

As seqüências de gene podem ser usadas para identificarhomólogos ou ortólogos de cDNA ou bibliotecas genômicas. Geneshomólogos (por exemplo, clones de cDNA de tamanho natural) podem serisolados por intermédio da hibridização de ácido nucleico usando porexemplo bibliotecas de cDNA: Dependendo da abundância do gene deinteresse, 100.000 até 1.000.000 de bacteriófagos recombinantes sãoplaqueados e transferidos para membranas de náilon. Depois da desnaturaçãocom álcali, o DNA é imobilizado nas membranas e.g. pela reticulação comUV. A hibridização é realizada em condições de alta severidade. Ahibridização e lavagem da solução aquosa é realizada em uma concentraçãoiônica de NaCl 1 M e uma temperatura de 68° C. As sondas de hibridizaçãosão geradas por exemplo, pela rotulação de transcrição de entalhe radioativo(32P) (High Prime, Roche, Mannheim, Alemanha). Os sinais são detectadospela auto-radiografia.

Os genes parcialmente homólogos ou heterólogos que estãorelacionados mas não idênticos podem ser identificados em um procedimentoanálogo ao procedimento descrito acima usando condições de hibridização elavagem de severidade baixa. Para a hibridização aquosa, a concentraçãoiônica é normalmente mantida a 1 M de NaCl enquanto uma temperatura éprogressivamente diminuída de 68 para 42° C.

A isolação de seqüências de gene com homologias (ouidentidade/similaridade de seqüência) apenas em um domínio distinto de (porexemplo 10 a 20 aminoácidos) pode ser realizada usando-se sondas deoligonucleotídeo radio rotuladas sintéticas. Oligonucleotídeos radio rotuladossão preparados pela fosforilação da extremidade 5' de dois oligonucleotídeoscomplementares com a T4 polinucleotídeo quinase. Os oligonucleotídeoscomplementares são recozidos e ligados para formar concatêmeros. Osconcatêmeros de filamento duplo são depois radio-rotulados por exemplo pelatranscrição de entalhe. A hibridização é normalmente realizada em condiçõesde baixa severidade usando altas concentrações de oligonucleotídeo.

Solução de hibridização de oligonucleotídeo:6 χ SSC

0,01 M de fosfato de sódio1 mM de EDTA (pH 8)0,5 % de SDS100 μ§/πι1 de DNA esperma de salmão desnaturado0,1 % de leite em pó desnatado

Durante a hibridização, a temperatura é diminuídaescalonadamente para 5 a 10° C abaixo da Tm do oligonucleotídeo estimadaou abaixo da temperatura ambiente seguido pelas etapas de lavagem e auto-radiografia. A lavagem é realizada com baixa severidade tal como 3 etapas delavagem usando 4x SSC. Outros detalhes são descritos por Sambrook et al.(1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring HarborLaboratory Press) ou Ausubel et al. (1994, "Current Protocols in MolecularBiology," John Wiley & Sons).

Exemplo 7 - Identificação de Genes de Interesse pela Triagemde Bibliotecas de Expressão com Anticorpos.

Os clones de c-DNA podem ser usados para produzir proteínarecombinante por exemplo na E. coli (por exemplo, sistema QiagenQIAexpress pQE). As proteínas recombinantes são depois normalmentepurificadas por afinidade por intermédio da cromatografia de afinidade Ni-NTA (Qiagen). As proteínas recombinantes podem ser usadas para produziranticorpos específicos por exemplo pelo uso de técnicas padrão para aimunização de coelhos. Os anticorpos são purificados por afinidade usandouma coluna Ni-NTA saturada com o antígeno recombinante como descritopor Gu et al. (1994, BioTechniques 17: 257-262). O anticorpo pode ser depoisusado para triar bibliotecas de cDNA de expressão para identificar geneshomólogos ou heterólogos por intermédio de uma triagem imunológica(Sambrook et al. 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," ColdSpring Harbor Laboratory Press ou Ausubel et al. 1994, "Current Protocols inMolecular Biology," John Wiley & Sons).

Exemplo 8 - Hibridização de Northern.

Para a hibridização de RNA, 20 μg de RNA total ou 1 μg depoli-(A)+ RNA são separados pela eletroforese em gel em géis de agarose a1,25 % usando formaldeído como descrito em Amasino (1986, Anal.Biochem. 152: 304), transferidos pela atração capilar usando 10 χ SSC àsmembranas de náilon positivamente carregadas (Hybond N+, Amersham,Braunschweig), imobilizados pela luz UV e pré-hibridizados por 3 horas a68° C usando tampão de hibridização (10 % de sulfato de dextrano p/v, NaCl1 Μ, 1 % de SDS, 100 μg/ml de DNA de esperma de arenque). A rotulação dasonda de DNA com o kit de rotulação de DNA Highprime (Roche,Mannheim, Alemanha) é realizada durante a pré-hibridização usando alpha-32P dCTP (Amersham, Braunschweig, Alemanha). A Hibridização érealizada depois da adição da sonda de DNA rotulada no mesmo tampão a 68°C durante a noite. As etapas de lavagem são realizadas duas vezes por 15 minusando 2 χ SSC e duas vezes por 30 min usando 1 χ SSC, 1 % de SDS a 68°C. A exposição dos filtros selados é realizada a -70° C por um período de 1dia a 14 dias.

Exemplo 9 - Seqüenciamento e Análise FuncionalComputacional de DNA.

As bibliotecas de cDNA podem ser usadas para oseqüenciamento de DNA de acordo com métodos padrão, em particular pelométodo da terminação de cadeia usando o Kit ABI PRISM Big DyeTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer, Weiterstadt,Alemanha). O seqüenciamento aleatório pode ser realizado subseqüente àrecuperação do plasmídeo preparativo a partir de bibliotecas de cDNA porintermédio da excisão de massa in vivo, retransformação, e plaqueamentosubseqüente de DHlOB em placas de ágar (detalhes de material e protocolo daStratagene, Amsterdam, Países Baixos). O DNA plasmídico pode serpreparado a partir do cultivo durante a noite de culturas de E. coli cultivadasem meio de Caldo de Luria contendo ampicilina (ver Sambrook et ai. (1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) em um robô depreparação de DNA Qiagene (Qiagen, Hilden) de acordo com os protocolosdo fabricante). As seqüências podem ser processadas e anotadas usando opacote de software EST-MAX comercialmente fornecido pela Bio-Max(Munich, Alemanha). O programa incorpora métodos de bioinformáticaimportantes para a caracterização funcional e estrutural de seqüências deproteína. Para referência ver http://peda.nt.mips.biochem. mpg.de.

Os algoritmos mais importantes incorporados no EST-MAXsão: FASTA: Pesquisas de base de dados de seqüência de proteína muitosensível com estimativas de significância estatística (Pearson W. R. 1990,Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP e FASTA. MethodsEnzymol. 183:63-98). BLAST: Pesquisas de base de dados de seqüência deproteína muito sensível com estimativas de significância estatística (AltschulS. F., Gish W., Miller W., Myers E. W. e Lipman D. J. Basic local alignmentsearch tool. J. Mol. Biol. 215:403-410). PREDATOR: Prognóstico deestrutura secundária de alta precisão de seqüências únicas e múltiplas.(Frishman & Argos 1997, 75 % accuracy in proteína secondary structureprediction. Proteins 27: 329-335). CLUSTALW: Alinhamento de seqüênciamúltipla (Thompson, J. D., Higgins, D. G. e Gibson, T. J. 1994, CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignmentthrough sequence weighting, positions-specific gap penalties and weightmatrix choice, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680). TMAP: prognóstico deregião de transmembrana de seqüências multiplamente alinhadas (Persson B.& Argos P. 1994, Prediction of transmembrane segments in proteins utilizingmultiple sequence alignments, J. Mol. Biol. 237: 182-192). ALOM2:prognóstico de região de transmembrana de seqüências isoladas (Klein P.,Kanehisa M., e DeLisi C. 1984, Prediction of protein function from sequenceproperties: A discriminant analysis of a database. Biochim. Biophys. Acta787: 221-226. Versão 2 pelo Dr. K. Nakai). PROSEARCH: Detecção depadrões de seqüência de proteína PROSITE. Kolakowski L. F. Jr., LeunissenJ. Α. Μ. e Smith J. Ε. 1992, ProSearch: fast searching of protein sequenceswith regular expression patterns related to protein structure and function.Biotechniques 13: 919-921). BLIMPS: Pesquisa de similaridade contra umabase de dados de blocos não abertos (Wallace & Henikoff 1992, PATMAT: Asearching and extraction program for sequence, pattern and block queries anddatabases, CABIOS 8: 249-254. Escrito por Bill Alford).

Exemplo 10 - Plasmídeos para a Transformação Vegetal.

Para a transformação vegetal, vetores binários tais comopBinAR podem ser usados (Hõfgen & Willmitzer 1990, Plant Sei. 66: 221-230). A construção dos vetores binários pode ser realizada pela ligação docDNA na orientação de sentido ou anti-sentido no T-DNA. 5' em relação aocDNA um promotor vegetal ativa a transcrição do cDNA. Uma seqüência depoliadenilação está localizada 3' em relação ao cDNA. A expressão específicade tecido pode ser obtida pelo uso de um promotor específico de tecido. Porexemplo, expressão específica de semente pode ser obtida pela clonagem dospromotores napin ou LeB4 ou USP 5' em relação ao cDNA. Tambémqualquer outro elemento promotor específico de semente pode ser usado. Paraa expressão constitutiva dentro da planta inteira o promotor CaMV 35S podeser usado. A proteína expressada pode ser alvejada a um compartimentocelular usando um peptídeo de sinal, por exemplo para plastídeos,mitocôndria, ou retículo endoplasmático (Kermode 1996, Crit. Rev. Plant Sei.15: 285-423). O peptídeo de sinal é clonado 5-prime na matriz em relação aocDNA para se obter a localização subcelular da proteína de fusão.

Além disso, os exemplos para vetores binários vegetais são osvetores pBPS-GBl, pSUN2-GW ou pBPS-GB047 nos quais os candidatos agene LMP são clonados. Estes vetores binários contêm um gene de resistênciaa antibiótico acionado sob o controle do promotor AtAct2-I e um promotorespecífico de semente USP ou o promotor PtxA em frente do gene candidatocom o terminador NOSpA ou o terminador OCS. O cDNA de LMP parcial oude tamanho natural são clonados no sítio de clonagem múltipla do vetorbinário vegetal na orientação de sentido ou anti-sentido atrás dos promotoresUSP específico de semente ou PtxA. O vetor recombinante contendo o genede interesse é transformado em células ToplO (Invitrogen) usando condiçõespadrão. As células transformadas são selecionadas em LB ágar contendo 50μg/ml de canamicina cultivada durante a noite a 37° C. o DNA plasmídico éextraído usando o Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) seguindo asinstruções do fabricante. A análise de clones subseqüentes e o mapeamento derestrição são realizados de acordo com técnicas da biologia molecular padrão(Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2a Edição.Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY).

Exemplo 11 - Transformação Vegetal Mediada porA grobacterium.

A transformação vegetal mediada por Agrobacterium com osácidos nucleicos de LMP aqui descritos pode ser realizada usando técnicas detransformação e regeneração padrão (Gelvin, Stanton B. & Schilperoort R. A,Plant Molecular Biology Manual, 2a ed. Kluwer Academic Publ., Dordrecht1995 em Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BTl 1-P; Glick, Bernard R. eThompson, John E. Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,S. 360, CRC Press, Boca Raton 1993). Por exemplo, a transformação mediadapor Agrobacterium pode ser realizada usando o GV3 (pMP90) (Koncz &Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396) ou a cepa LBA4404 deAgrobacterium tumefaciens (Clontech).

Arabidopsis thaliana pode ser cultivada e transformada deacordo com condições padrão (Bechtold 1993, Acad. Sei. Paris. 316: 1194-1199; Bent et al. 1994, Science 265: 1856-1860). Adicionalmente, a sementede colza pode ser transformada com os ácidos nucleicos de LMR da presenteinvenção por intermédio da transformação de cotilédone ou hipocotilo(Moloney et al. 1989, Plant Cell Report 8: 238-242; De Block et al. 1989,Plant Physiol. 91: 694-701). O uso de antibiótico para Agrobacterium eseleção vegetal depende do vetor binário e da cepa de Agrobaeterium usadospara transformação. A seleção de colza é normalmente realizada usando ummarcador vegetal selecionável. Adicionalmente, a transferência de genemediada por Agrobaeterium para linho pode ser realizada usando, porexemplo, uma técnica descrita por Mlynarova et ai. (1994, Plant Cell Report13: 282-285).

O gene equivalente a CTRl ou CTRl de Arabidopsis foiclonado em um vetor binário e expressado sob o promotor USP ou o promotorPtxA (o promotor do gene PtxA de Pisum sativum), que é um promotor ativovirtualmente em todos os tecidos vegetais. Entretanto, em sementes e flores,não existe nenhuma atividade de expressão detectável pelo tingimento GUS eatividade de expressão baixa detectável com o método mais sensível de RT-PCR (Song, H-S. et ai, 2004, PF 55368-2 US). Apenas nas linhagensvegetais que compreendem cópias múltiplas de uma construção de promotorptxA transgênico/expressão GUS alguma expressão pôde ser detectada emparte das flores e das silíquas (para mais detalhes ver Song, H-S. et al., 2004,PF 55368-2 US). Alternativamente, o superpromotor, que é um promotorconstitutivo (Stanton B. Gelvin, USP# 5.428.147 e USP#5.217.903) oupromotores específicos de semente como USP (proteína de sementedesconhecida) de Vicia faba (Baeumlein et al. 1991, Mol. Gen. Genetics 225:459-67), ou o promotor B4 de legumina (LeB4; Baeumlein et al. 1992, PlantJ. 2: 233-239) assim como promotores que conferem a expressão específicade semente em plantas monocot como milho, cevada, trigo, centeio, arroz etc.foram usados.

A transformação de soja pode ser realizada usando porexemplo uma técnica descrita na EP 0424 047, Patente U. S. N0 5.322.783(Pioneer Hi-Bred International) ou na EP 0397 687, Patente U. S. N05.376.543, ou Patente U. S. N0 5.169.770 (University Toledo), ou porqualquer um de vários outros procedimentos de transformação conhecidos natécnica. As sementes de soja são esterilizadas na superfície com etanol a 70 %por 4 minutos na temperatura ambiente com agitação contínua, seguido por 20% (v/v) de Clorox suplementado com 0,05 % (v/v) de tween por 20 minutoscom agitação contínua. Depois as sementes são enxaguadas 4 vezes com águadestilada e colocada em papel de filtro estéril umedecido em uma placa dePetri na temperatura ambiente por 6 a 39 horas. As cascas das sementes sãodescascadas, e os cotilédones são descolados do eixo embrionário. O eixoembrionário é examinado para assegurar que a região meristemática não foidanificada. Os eixos embrionários excisados são coletados em uma placa dePetri estéril meia aberta e secada ao ar até um teor de umidade menor do que20 % (peso fresco) em uma placa de Petri selada até uso posterior.

O método de transformação vegetal também é aplicável aBrassica napus e outras safras. Em particular, as sementes de canola são15 esterilizadas na superfície com etanol a 70 % por 4 minutos na temperaturaambiente com agitação contínua, seguido por 20 % (v/v) de Cloroxsuplementados com 0,05 % (v/v) de Tween por 20 minutos, na temperaturaambiente com agitação contínua. Depois, as sementes são enxaguadas 4 vezescom água destilada e colocada em papel de filtro estéril umedecido em uma20 placa de Petri na temperatura ambiente por 18 horas. As cascas das sementessão removidas e as sementes são secadas ao ar durante a noite em uma placade Petri estéril semi-aberta. Durante este período, as sementes perdemaproximadamente 85 % do seu teor de água. As sementes são depoisarmazenadas na temperatura ambiente em uma placa de petri selada até uso25 posterior.

A cultura de Agrobacterium tumefaciens é preparada a partirde uma colônia individual em meio sólido LB mais os antibióticosapropriados (por exemplo, 100 mg/l de estreptomicina, 50 mg/l decanamicina) seguido pelo cultivo da colônia individual em meio LB líquido auma densidade óptica a 600 nm de 0,8. Depois, a cultura de bactérias épelotizada a 7000 rpm por 7 minutos na temperatura ambiente, e recolocadaem suspensão em meio MS (Murashige & Skoog 1962, Physiol. Plant. 15:473-497) suplementado com 100 mM de acetossiringona. As culturas de bactérias são incubadas neste meio de pré-indução por 2 horas na temperaturaambiente antes do uso. O eixo de embriões de semente zigótica de soja aaproximadamente 44 % de teor de umidade é embebido por 2 h natemperatura ambiente com a cultura de suspensão de Agrobacterium pré-induzida. (A embebeção de embriões secos com uma cultura deAgrobaeterium também é aplicável aos eixos de embrião de milho). Osembriões são removidos da cultura de embebeção e são transferidos paraplacas de Petri contendo meio MS sólido suplementado com 2 % de sacarosee incubados por 2 dias, no escuro na temperatura ambiente. Alternativamente,os embriões são colocados no topo de papel de filtro estéril umedecido (meioMS líquido) em uma placa de Petri e incubados sob as mesmas condiçõesdescritas acima. Depois deste período, os embriões são transferidos para meioMS sólido ou líquido suplementado com 500 mg/l de carbenicilina ou 300mg/l de cefotaxima para matar as agrobactérias. O meio líquido é usado paraumedecer o papel de filtro estéril. Os embriões são incubados durante 4semanas a 25° C, sob 440 μηιοί m-2s-l e 12 horas de fotoperíodo. Uma vez asmudas tenham produzido raízes, elas são transferidas para solo metromixestéril. O meio das plantas in vitro é lavada antes da transferência das plantaspara o solo. As plantas são mantidas sob uma cobertura plástica por 1 semanapara favorecer o processo de aclimatização. Depois as plantas são transferidaspara um ambiente de cultivo onde elas são incubadas a 25° C, sob 440 μηιοίm-2s-l de intensidade de luz e 12 h de fotoperíodo por cerca de 80 dias.

As amostras das plantas transgênicas primárias (T0) sãoanalisadas pela PCR para confirmar a presença de T-DNA. Estes resultadossão confirmados pela hibridização em que o DNA é submetido à eletroforeseem um gel de agarose a 1 % e transferido a uma membrana de náilonpositivamente carregada (Roche Diagnostics). O kit PCR DIG ProbeSynthesis (Roche Diagnostics) é usado para preparar uma sonda rotulada comdigoxigenina pela PCR como recomendado pelo fabricante.

No geral, um gene CTRl do arroz (ou outro monocot) ou geneequivalente a CTR1 sob um promotor vegetal como PtxA pode sertransformado no milho, ou uma outra planta de safra, para gerar efeitos degenes CTRl monocot em outros monocots, ou genes CTRl dicot em outrosdicots, ou genes monocot em dicots, ou vice e versa. Os plasmídeos contendoestas seqüências codificadoras CTRl ou equivalentes a CTRl, 5' de umpromotor e 3' de um terminador pode ser construído de uma maneira similaràquelas descritas para a construção de outros plasmídeos aqui.

Exemplo 12 - Mutagênese In vivo.

A mutagênese in vivo de microorganismos pode ser realizadapela incorporação e passagem do DNA plasmídico (ou outro vetor) através daE. coli ou outros microorganismos (por exemplo, Bacillus spp. ou levedurastais como Saccharomyces eerevisiae) que são prejudicadas em suascapacidades para manter a integridade de sua informação genética. As cepasmutadoras típicas têm mutações nos genes para o sistema de reparo do DNA(por exemplo, mutHLS, mutD, mutT, etc.; por referência, ver Rupp W. D.1996, DNA repair mechanisms, em: Eseheriehia coli e Salmonella, p. 2277-2294, ASM: Lavarington.) Tais cepas são bem conhecidas por aqueleshabilitados na técnica. O uso de tais cepas é ilustrado, por exemplo, emGreener e Callahan 1994, Strategies 7: 32-34. A transferência de moléculas deDNA mutadas em plantas é preferivelmente feita depois da seleção e teste emmicroorganismos. As plantas transgênicas são geradas de acordo com váriosexemplos dentro da exemplificação deste documento.

Exemplo 13 - Avaliação da Expressão e Atividade de mRNAde um Produto de Gene Recombinante no Organismo Transformado.A atividade de um produto de gene recombinante noorganismo hospedeiro transformado pode ser medido ao nível transcricionalou/e ao nível traducional. Um método útil para averiguar o nível detranscrição do gene (um indicador de uma quantidade de mRNA disponívelpara a tradução do produto de gene) é realizar uma Northern blot (parareferência ver, por exemplo, Ausubel et al. 1988, Current Protocols inMolecular Biology, Wiley: Nova Iorque), em que um iniciador planejado paraligar ao gene de interesse é rotulado com um rótulo detectável (usualmenteradioativo ou quimioluminescente), tal que quando o RNA total de umacultura do organismo é extraído, conduzido em gel, transferido para umamatriz estável e incubada com esta sonda, a ligação e quantidade de ligaçãoda sonda indica a presença e também a quantidade de mRNA para este gene.Esta informação pelo menos parcialmente demonstra o grau de transcrição dogene transformado. O RNA celular total pode ser preparado a partir decélulas, tecidos ou órgãos vegetais pelos diversos métodos, todos bemconhecidos na técnica, tais como aquele descrito em Bormann et al. (1992,Mol. Microbiol. 6: 317-326).

Para avaliar a presença ou quantidade relativa de proteínatraduzida a partir deste mRNA, técnicas padrão, tais como um Western blot,podem ser utilizadas (ver, por exemplo, Ausubel et al. 1988, CurrentProtocols in Molecular Biology, Wiley: Nova Iorque). Neste processo, asproteínas celulares totais são extraídas, separadas pela eletroforese em gel,transferidas para uma matriz tal como nitrocelulose, e incubadas com umasonda, tal como um anticorpo, que especificamente se liga à proteínadesejada. Esta sonda é no geral rotulada com rótulo quimioluminescente oucolorimétrico, que podem ser facilmente detectados. A presença e quantidadede rótulo observadas indicam a presença e quantidade da proteína mutantedesejada presente na célula.

A atividade de LMPs que se ligam ao DNA pode ser medidapelos diversos métodos bem estabelecidos, tais como ensaios de mudança defaixa de DNA (também chamados de ensaios de retardo de gel). O efeito detal LMP sobre a expressão de outras moléculas pode ser medido usandoensaios de gene repórter (tais como aquele descrito em Kolmar H. et ai. 1995,EMBO J. 14: 3895-3904 e referências aí citadas). Os sistemas de teste degene repórter são bem conhecidos e estabelecidos para aplicações tanto emcélulas procarióticas quanto eucarióticas, usando enzimas tais como beta-galactosidase, proteína fluorescente verde, e várias outras.

A determinação da atividade das proteínas de transporte demembrana do metabolismo de lipídeo pode ser realizada de acordo comtécnicas tais como aquelas descritas em Gennis R. B. (1989 Pores, Channelsand Transporters, em Biomembranes, Molecular Structure and Function,Springer: Heidelberg, pp. 85-137, 199-234 e 270-322).

Exemplo 14 - Análise in vitro da Função de Genes CTRl eEquivalentes a CTRl de Arabidopsis thaliana ou Brassica napus em PlantasTransgênicas.

A determinação de atividades e parâmetros cinéticos deenzimas é bem estabelecido na técnica. Experimentos para determinar aatividade de qualquer enzima alterada dada deve ser feito de encomenda paraa atividade específica da enzima do tipo selvagem, o que está bem dentro dacapacidade de uma pessoa habilitada na técnica. Resumos a cerca das enzimasno geral, assim como detalhes específicos com respeito à estrutura, cinéticas,princípios, métodos, aplicações e exemplos para a determinação de muitasatividades de enzima podem ser encontrados, por exemplo, nas seguintesreferências: Dixon, M. & Webb, E. C. 1979, Enzymes. Longmans: Londres;Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: Nova Iorque;Walsh (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco;Price, N. C., Stevens, L. (1982) Fundamentais of Enzymology. Oxford Univ.Press: Oxford; Boyer, P. D., ed. (1983) The Enzymes, 3a ed. Academic Press:Nova Iorque; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2a ed. VCH: Weinheim(ISBN 3527300325); Bergmeyer, H. U., Bergmeyer, J., GraBl, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3a ed., vol. I-XII, Verlag Chemie:Weinheim and Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol.A9, Enzymes. VCH: Weinheim, p. 352-363.

Exemplo 15 - Análise do Impacto de Proteínas Recombinantessobre a Produção de um Composto de Armazenagem de Semente Desejado.

O efeito da modificação genética em plantas sobre umcomposto de armazenagem de semente desejado (tal como um açúcar, lipídeoou ácido graxo) pode ser avaliado cultivando-se a planta modificada sobcondições adequadas e analisando as sementes ou qualquer outro órgãovegetal quanto à produção aumentada do produto desejado (isto é, um lipídeoou um ácido graxo). Tais técnicas de análise são bem conhecidas por umapessoa habilitada na técnica, e incluem espectroscopia, cromatografia decamada fina, métodos de tingimento de vários tipos, métodos enzimáticos emicrobiológicos, e cromatografia analítica tal como a cromatografia líquidade alto desempenho (ver, por exemplo, Ullman 1985, Encyclopedia ofIndustrial Chemistry, vol. A2, pp. 89-90 e 443-613, VCH: Weinheim; Fallon,A. et al. 1987, Applications of HPLC in Biochemistry in: LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al.,1993 Product recovery and purification, Biotechnology, vol. 3, Capítulo III,pp. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P. A. et al., 1988 Bioseparations:downstream processing for biotechnology, John Wiley & Sons; Kennedy J. F.& Cabral J. M. S. 1992, Recovery processes for biological materiais, JohnWiley and Sons; Shaeiwitz J. A. & Henry J. D. 1988, Biochemical separationsin: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Separations andpurifications techniques in biotechnology, vol. B3, Capítulo 11, pp. 1-27,VCH: Weinheim e Dechow F. J. 1989).

Além dos métodos mencionados acima, os lipídeos vegetaissão extraídos do material vegetal como descrito por Cahoon et al. (1999,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96, 22: 12935-12940) e Browse et al. (1986,Anal. Biochemistry 442: 141-145). A análise qualitativa e quantitativa delipídeo ou ácido graxo está descrita em Christie, William W., Advances inLipid Methodology. Ayr/Scotland: Oily Press. - (Oily Press Lipid Library;Christie, William W., Gas Chromatography and Lipides. A Practical Guide -Ayr, Scotland: Oily Press, 1989 Repr. 1992. - IX.307 S. - (Oily Press LipidLibrary e "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) -16 (1977) Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipides CODEN.

A prova inequívoca da presença de produtos de ácido graxopode ser obtido pela análise de plantas transgênicas seguindo procedimentosanalíticos padrão: GC, GC-MS ou TLC como variegadamente descrito porChristie e referências neste (1997 em: Advances on Lipid Methodology 4aed.: Christie, Oily Press, Dundee, pp. 119-169; 1998). Métodos detalhadossão descritos para folhas por Lemieux et al. (1990, Theor. Appl. Genet. 80:234-240) e para sementes por Focks & Benning (1998, Plant Physiol. 118:91-101).

A análise posicionai da composição de ácido graxo nasposições sn-1, sn-2 ou sn-3 da cadeia principal de glicerol é determinada peladigestão de lipase (ver, por exemplo, Siebertz & Heinz 1977, Z. Naturforsch.32c: 193-205, e Christie 1987, Lipid Analysis 2a Edição, Pergamon Press,Exeter, ISBN 0-08-023791-6).

Os níveis de óleo de semente totais podem ser medidos porqualquer método apropriado. A quantificação dos teores de óleo de semente éfreqüentemente realizada com métodos convencionais, tais como a análisepróxima ao infravermelho (NIR) ou a formação de imagem pela ressonânciamagnética nuclear (NMR). A espectroscopia NIR tem se tornado um métodopadrão para a triagem de amostras de semente sempre que as amostras deinteresse sejam acessíveis para esta técnica. As amostras estudadas incluemcanola, soja, milho, trigo, arroz e outros. A análise NIR de sementes isoladaspode ser usada (ver por exemplo, Velasco et al., "Estimation of seed weight,oil content and fat acid composition in intact single seeds of rapeseed"CBrassica napus L.) by near-infrared reflectance spectroscopy, "Euphytica,"Vol. 106, 1999, pp. 79-85). A RMN também foi usada para analisar o teor deóleo em sementes (ver por exemplo, Robertson & Morrison, "Analysis of oilcontent of sunflower seed by wide-line NMR," Journal of the American OilChemists Society, 1979, Vol. 56, 1979, pp. 961-964, que é aqui incorporadapor referência em sua totalidade).

Um modo típico para se obter informação com respeito àinfluência de atividades de proteína aumentadas ou diminuídas nos caminhosbiossintéticos de lipídeo e açúcar é por exemplo por intermédio da análise dosfluxos de carbono pelos estudos de rotulação com folhas ou sementes usando14C-acetato ou 14C-piruvato (ver, por exemplo, Focks & Benning 1998, Plant Physiol. 118: 91-101; Eccleston & Ohlrogge 1998, Plant Cell 10: 613-621). A distribuição de carbono 14 em lipídeos e componentes solúveisaquosos pode ser determinada pela contagem de cintilação líquida depois darespectiva separação (por exemplo nas placas de TLC) incluindo padrõescomo 14C-sacarose e 14C-malato (Eccleston & Ohlrogge 1998, Plant Cell 10:613-621).

O material a ser analisado pode ser desintegrado porintermédio da sonicação, moagem em vidro, nitrogênio líquido e trituração oupor intermédio de outros métodos aplicáveis. O material deve ser centrifugadodepois da desintegração. O sedimento é recolocado em suspensão em águadestilada, aquecido por 10 minutos a 100° C, esfriado em gelo e centrifugadomais uma vez seguido pela extração em ácido sulfurico 0,5 M em metanolcontendo 2 % de dimetoxipropano por 1 hora a 90° C levando ao óleohidrolisado e compostos de lipídeo que resultam em lipídeos transmetilados.Estes ésteres metílicos do ácido graxo são extraídos em éter de petróleo efinalmente submetido à análise pela GC usando uma coluna capilar(Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0,32 mm) em umgradiente de temperatura entre 170° C e 240° C por 20 minutos e 5 min. a240° C. A identidade de ésteres metílicos do ácido graxo resultantes éefinida pelo uso de padrões disponíveis de fontes comerciais (isto é, Sigma).

No caso de ácidos graxos onde padrões não estão disponíveis,a identidade da molécula é mostrada por intermédio da derivatização e análiseGC-MS subseqüente. Por exemplo, a localização de ácidos graxos de ligaçãotripla é mostrada por intermédio da GC-MS depois da derivatização porintermédio de derivados de 4,4-Dimetóxi-oxazolina (Christie, Oily Press,Dundee, 1998).

Um método padrão comum para analisar açúcares,especialmente amido, é publicado por Stitt M., Lilley R. Mc. C., Gerhardt R.e Heldt M. W. (1989, "Determination of metabolite leveis in specific cells and15 subcellular compartments of plant leaves," Methods Enzymol. 174: 518-552;para outros métodos ver também Hartel et ai. 1998, Plant Physiol. Biochem.36: 407-417 e Focks & Benning 1998, Plant Physiol. 118: 91-101).

Para a extração de açúcares e amido solúveis, 50 sementes sãohomogeneizadas em 500 μΐ de etanol a 80 % (v/v) em um tubo de teste de20 polipropileno de 1,5 ml e incubados a 70° C por 90 min. Seguindo acentrifugação a 16.000 g por 5 min, o sobrenadante é transferido para umnovo tubo de teste. A pelota é extraída duas vezes com 500 μΐ de etanol a 80%. O solvente dos sobrenadantes combinados é evaporado na temperaturaambiente sob um vácuo. O resíduo é dissolvido em 50 μΐ de água,25 representando a fração de carboidrato solúvel. A pelota deixada da extraçãocom etanol, que contém os carboidratos insolúveis incluindo amido, éhomogeneizada em 200 μΐ de KOH 0,2 N, e a suspensão é incubada a 95° Cpor 1 h para dissolver o amido. Seguindo a adição de 35 μΐ de ácido acético 1N e centrifugação por 5 min a 16.000 g, o sobrenadante é usado para aquantificação de amido.

Para quantificar os açúcares solúveis, 10 μΐ do extrato deaçúcar são adicionados a 990 μl de tampão de reação contendo 100 raM deimidazol, pH 6,9, 5 mM de MgCl2, 2 mM de NADP, 1 mM de ATP, e 2unidades de 2 ml"1 de Glicose-6-P-desidrogenase. Para a determinaçãoenzimática de glicose, frutose e sacarose, 4,5 unidades de hexoquinase, 1unidade de fosfoglicoisomerase, e 2 μl de uma solução saturada de frutosidasesão adicionadas em sucessão. A produção de NADPH é fotometricamentemonitorada em um comprimento de onda de 340 nm. Similarmente, o amido éensaiado em 30 μΐ da fração de carboidrato insolúvel com um kit daBoehringer Mannheim.

Um exemplo para analisar o teor de proteína em folhas esementes pode ser encontrado em Bradford Μ. M. (1976, "A rapid andsensitive method for the quantification of microgram quantities of proteinusing the principie of protein dye binding" Anal. Biochem. 72: 248-254). Paraa quantificação de proteína de semente total, 15 a 20 sementes sãohomogeneizadas em 250 μΐ de acetona em um tubo de teste de polipropilenode 1,5 ml. Seguindo a centrifiigação a 16.000 g, o sobrenadante é descartado ea pelota secada a vácuo é recolocada em suspensão em 250 μΐ de tampão deextração contendo 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 250 mM de NaCl, 1 mM deEDTA, e 1 % (p/v) de SDS. Seguindo a incubação por 2 h a 25° C, ohomogenado é centrifugado a 16.000 g por 5 min e 200 ml do sobrenadanteserá usado para as medições de proteína. No ensaio, γ-globulina é usada paraa calibração. Para as medições de proteína, o ensaio de proteína Lowry DC(Bio-Rad) ou o ensaio Bradford (Bio-Rad) é usado.

Os ensaios enzimáticos de hexoquinase e frutoquinase sãorealizados espectrofotometricamente de acordo com Renz et ai. (1993, Plant190: 156-165), de fosfoglico-isomerase, 6-fosfofrutoquinase dependente deATP, 6-fosfo-frutoquinase dependente de pirofosfato, Frutose-1,6-bisfosfatoaldolase, triose fosfato isomerase, gliceral-3-Ρ desidrogenase, fosfogliceratoquinase, fosfoglicerato mutase, enolase e piruvato quinase são realizados deacordo com Burrell et al. (1994, Plant 194: 95-101) e de UDP-Glicose-pirofosforilase de acordo com Zrenner et al. (1995, Plant J. 7: 97-107).

Os intermediários do metabolismo de carboidrato, comoGlicose-I-fosfato, Glicose-6-fosfato, Frutose-6-fosfato, Fosfoenolpiruvato,Piruvato, e ATP são medidos como descrito no Hartel et al. (1998, PlantPhysiol. Biochem. 36: 407-417) e metabólitos são medidos como descrito emJelitto etal. (1992, Plant 188: 238-244).

Além das medições do composto final de armazenagem desemente (isto é, lipídeo, amido ou proteína de armazenagem) também épossível analisar outros componentes dos caminhos metabólicos utilizadospara a produção de um composto de armazenagem de semente desejado, talcomo intermediários e produtos colaterais, para determinar a eficiência globalde produção do composto (Fiehn et al. 2000, Nature Biotech. 18: 1447-1161).

Por exemplo, vetores de expressão de levedura quecompreende os ácidos nucleicos aqui divulgados, ou fragmentos destes,podem ser construídos e transformados em Saccharomyces eerevísiae usandoprotocolos padrão. As células transgênicas resultantes podem ser depoisensaiadas quanto as alterações nos teores de açúcar, óleo, lipídeo ou ácidograxo.

Similarmente, os vetores de expressão vegetal quecompreendem os ácidos nucleicos aqui divulgados, ou fragmentos destes,podem ser construídos e transformados em uma célula vegetal apropriada talcomo Arabidopsis, soja, semente de colza, arroz, milho, trigo, Medieagotruneatula, etc., usando protocolos padrão. As células transgênicas resultantese/ou plantas derivadas destas podem ser depois ensaiadas quanto as alteraçõesnos teores de açúcar, óleo, lipídeo ou ácido graxo.

Adicionalmente, as seqüências aqui divulgadas, ou fragmentosdestas, podem ser usadas para gerar mutações silenciadas nos genomas devários organismos, tais como bactérias, células de mamífero, células delevedura, e células vegetais (Girke et al. 1998, Plant J. 15: 39-48). As célulassilenciadas resultantes podem ser depois avaliadas quanto a sua composição econteúdo em compostos de armazenagem de semente, e o efeito sobre ofenótipo e/ou genótipo da mutação. Outros métodos de inativação de geneincluem a US 6004804 "Non-Chimeric Mutational Vectors" e Puttaraju et al.(1999, "Spliceosome-mediated RNA ír<ms-splicing as a tool for gene therapy"Nature Biotech. 17: 246-252).

Exemplo 16 - Purificação do Produto Desejado de OrganismosTransformados.

Uma LMP pode ser recuperada a partir do material vegetal porvários métodos bem conhecidos na técnica. Órgãos de plantas podem sermecanicamente separados de outros tecidos ou órgãos antes da isolação docomposto de armazenagem de semente a partir do órgão vegetal. Seguindo ahomogeneização do tecido, fragmentos celulares são removidos pelacentrifugação e a fração sobrenadante contendo as proteínas solúveis é retidapara purificação posterior do composto desejado. Se o produto é secretado dascélulas cultivadas em cultura, depois as células são removidas da cultura pelacentrifugação em velocidade baixa e a fração de sobrenadante é retida parapurificação posterior.

A fração de sobrenadante do método de purificação ésubmetida à cromatografia com uma resina adequada, em que a moléculadesejada é retida em uma resina de cromatografia enquanto muitas dasimpurezas na amostra não o são, ou onde as impurezas são retidas pela resina,enquanto a amostra não é. Tais etapas de cromatografia podem ser repetidascomo necessário, usando as mesmas resinas de cromatografia ou diferentes.Uma pessoa habilitada na técnica seria bem versada na seleção de resinas decromatografia apropriadas e em sua aplicação mais eficaz para uma moléculaparticular a ser purificada. O produto purificado pode ser concentrado pelafiltração ou ultrafiltração, e armazenado a uma temperatura na qual aestabilidade do produto seja maximizada.

Existe uma ampla série de métodos de purificação conhecidana técnica e o método precedente de purificação não é intencionado a serlimitante. Tais técnicas de purificação são descritas, por exemplo, em BaileyJ. E. & Ollis D. F. 1986, Biochemical Engineering Fundamentais, McGraw-Hill: Nova Iorque).

A identidade e pureza dos compostos isolados podem seravaliadas pelas técnicas padrão no ramo. Estas incluem a cromatografialíquida de alto desempenho (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos detingimento, cromatografia de camada fina, cromatografia analítica tal como acromatografia líquida de alto desempenho, NIRS, ensaio enzimático oumicrobiologicamente. Tais métodos de análise são revisados em: Patek et al.(1994, Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140), Malakhova et al. (1996,Biotekhnologiya 11: 27-32) e Schmidt et al. (1998, Bioprocess Engineer 19:67-70), Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996, Vol. A27,VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-54Ó, p. 540-547, p. 559-566, 575-581 e p.581-587) e Michal G. (1999, Biochemical Pathways: A Atlas of Biochemistryand Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. 1987,Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology, vol. 17).

Exemplo 17 - Triagem para Aumentar O Comprimento deRaiz: análise de raiz in vitro.

Para a análise de raiz in vitro placas quadradas medindo 12 cmχ 12 cm foram usadas. Para cada placa, 52 ml de meio MS (0,5X sais de MS,0,5 % de sacarose, 0,5 g/L de tampão MES, 1 % de Phytagar) sem seleçãoforam usados. As placas foram deixadas secar na capela estéril por uma horapara reduzir condensação futura.As alíquotas de semente foram esterilizadas em frascos devidro com etanol por 5 minutos, o etanol foi removido, e as sementes foramdeixadas secar na capela estéril por uma hora.

As sementes foram manchadas nas placas usando o VacuseedDevice (Lehle). Depois as sementes foram manchadas nas placas, as placasforam enroladas com Ventwrap e colocadas verticalmente em prateleiras noescuro a 4o C por quatro dias para estratificar as sementes. As placas foramtransferidas a uma câmara de cultivo C5 Percival e colocada verticalmente.As condições da câmara de cultivo foram 23° C dia/210 C noite e 16 h dia/8 hnoite.

Para a coleta de dados um escaner de leito plano de altaresolução foi usado. A análise das raízes foi feita usando o pacote de softwareWinRhizo.

A superexpressão de genes CTRl ou equivalentes a CTRl emfundo do tipo selvagem pode melhorar a germinação de semente, aumentar ocomprimento da raiz e aumentar a velocidade do desenvolvimento da folha eo número de folhas. O último pode melhorar o desempenho fotossintético deplantas que resultam no rendimento aumentado de biomassa e em quantidadesaumentadas e/ou tamanho de sementes associadas com as quantidadesaumentadas de compostos de armazenagem de semente como óleo, proteína eaçúcares.

Triagem quanto ao Tamanho de Raiz Aumentado: Análise deraiz no solo. Para a análise de raiz no solo sementes podem ser embebidas a4o C por 2 dias em água e plantada diretamente no solo sem nenhuma seleção.Depósitos (Hummert D40) foram usados com uma pelota de turfa saturada(Jiffy 727) na base e enchido com Metromix saturado em água. Depois deplantar, os vasos foram cobertos com lençol plástico para impedir a secagem.As plantas podem ser cultivadas usando apenas a água presente na preparaçãodo meio, visto que a água no solo nestes vasos grandes é suficiente para 3semanas de cultivo, e encoraja o crescimento de raiz rápido. O envoltórioplástico dos vasos será removido depois de 12 dias e os dados morfológicosdocumentados. No dia 17 as partes aéreas da planta serão colhidas, secadas(65° C por 2 dias) e o peso seco medido. Para examinar as raízes a pelota deturfa será puxada na direção do topo do vaso para remover o solo e as raízescomo uma unidade. O solo depois será separado das raízes em uma bandeja eo comprimento de raiz máximo será medido. O comprimento da raiz de todasas plantas para todas as linhagens transgênicas será calculado em média ecomparado contra a média das plantas do tipo selvagem.

Tabela 1: Classes de Lipídeo Vegetal

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Tabela 2. Ácidos Graxos Vegetais Comuns

<table>table see original document page 114</column></row><table>

Estes ácidos graxos não ocorrem normalmente em óleos desemente vegetal, mas a sua produção em óleo de semente de plantatransgênica é de importância na biotecnologia vegetal.Tabela 3. Uma tabela das funções das LMPs equivalentes aCTRl (as seqüências de ácido nucleico de tamanho natural e as seqüências deaminoácido correspondentes podem ser encontradas na SEQ ID N°: 1 a 6usando os códigos de seqüência)

<table>table see original document page 115</column></row><table>

Aqueles habilitados na técnica reconhecerão, ou serão capazesde averiguar usando não mais do que experimentação de rotina, muitosequivalentes para as formas de realização específicas da invenção aquidescritas. Tais equivalentes são intencionados a serem abrangidos pelasreivindicações de uma invenção aqui divulgada e reivindicada.LISTAGEM Dl SEQÜÊNCIA

<110> BASF PTatit Science GmbH

<120> Moléculas de ácido nuoleico codificando polipeptídxos tipo

resposta 1 triplos constitutivos e métodos de uso das mesmas

<130> BPS64465PC

<150> US GO/596,376

<151> 2005-09-20

<160> 12

<170> Patentxn version 3-3

<210> 1

<211> 2478

<212> ONA

<213> Brassica napus

<400> 1 atggaaatgc ccggcgctag aagatccaat tacactctgc ttagtcaatt tcccgacgac 60caggtctccg tctccgtcac cggagctcct ccgcctcact atgactcctc cttttccagc 120gcgagcaaca acaacagcgg gaacaacgga aaatccaaag gcggattcga ttgggatcat 180catcctagcg gcggcggtgg tgatcâcagg ccttcgaatc gggctgggaa tatgtattct 240tcgtcgcttg gtttgcagag gcaatcgagc gggagcagct tcggcgagag ctcgttgtcc 300ggggattact atgtgcctac gctctctgcg gcgggtaácg agatcgaaat ggttgggttt 360cctcaagatg átm r» I"" * Ίτ* acggcgggtt ITlJiI oá % 1" "♦*· ί^ΛΫ^ Ziii taggctcggg ttaggtgatt rrf^fftnnaân SnffftflnfOii cgaggatgca aacaaacaaá gatggcgacg ggagagttat 420 480gautcygcxg cagctgcagc ggggttxgtc ttgcgttggc gttgaggctt tcctcggagg ctacttgcgc tgacgatccg 540aactttctgg atcctgtacc ggacgagtct gctttgcgta cttcgccgag ttcagctgaa 600accgtttcac atcgcttctg ggtaaatgga tgcttatcgt actatgataa agttcctgat 660gggttttata tgattgatgg cctggatcca tatatttgga ccttatgcat tgatctaaat 720gaaagtggcc gcatcccttc aattgaatcg ttgagagcta ttgattctgg tgttgactct 780tcgctggaag ccatcttagt cgatcggegt gttgatcçag ccttcaagga acttcacaat 84Όagagtccacg acatatcttg tagctgcata accacaaaag aggttgttga ccàgctggca 900aaactaatct gcaatcgtat gggaggtcca gttatcatgg gggaagatga gttggttccc 960atctgcaacc gtatgggagg tccagttatç atgggggaag atgagttggt tcccatgtgg 1020aaggagtgca ttaatggtct aaaagaatgc tttaaagtgg tggttcctat aggtagcctc 1080tctgttggac tctgcagaca tcgagcttta ctcttcaaag tactggctga cataattgat 1140ttaccctgtc cttgtcâggt gaattgcaaa ttgggcttga agggtgcaag tattgtgata tagggagtat ctggttgatt gagacgatgc tâgtcggaaa tgcatcgtgc gcctggtCac 1200 1260ttgtgggagc ccgactcctt gctaaatggt ccctcaacta tctcaatttc ttcacctttg 1320çggtttccgc ggcccaggcc agttgaacct gcagttgatt ataggtcact agccaaacaa 1380tacttcaccg acagtcaagc tctgaatctt gttttcgatc ctgcatcaga tgatatggga 1440ttctcaatgt ttcatagggg tggagaaaat gaegttatgg cagaaaatgg gggtgggtct 1500ttccctccca gtgetaatat gcctccacag aacatgatgc gtgcgtcaag tcaactccaa 1560gaagcagtac ctataagtgc tccaccaacc aatcagccgg ttctgaacag ggctaacagg 1620gaacttggac ttgatggtga tgatatggac atcccatggt gtgatctcaa tataaaagag 1680aggattggag caggttcctt tggtactgtt caccgtgctg agtggcatgg ctcggatgtt 1740gctgtgaaaa ttcteatgga gcaggacttc catgctgagc gtgtcaatga gttcttgaga 1800gaggttgcaa taatgaaacg ccttcgccac cctaatattg ttctcttcat gggtgctgtc 1860actcaacccc eaaatttgtc aatagtgaca gaatatttgt cgagaggaag tttatacaga 1920cttttgcata aaagtggagc aagggagcaa ttggatgaga gacgccgctt gagtatggça 1980tatgatgtgg ccaaagggat gaattatctt cataatcgca atcctccgat tgtacataga 2040gatctaaaat ctccaaaett gctggtcgac aaaaaataca ccgtcaaggt ttgtgatttt 2100ggtctctcgc ggttaaaggc cagcacgttc ctttcatcaa agtcggcagc tggaactccc 2160gagtggatgg eaccagaggt cctgcgggat gagcaatcta atgagaagtc agacgtgtac 2220agctttgggg tcatcttgtg ggagcttgct acattgeagc aaccatgggg taatttgaat 2280cctgctcagg ttgtagctgc ggttggtttc aagaataaac ggcttgagat ccctcggaac 2340ctgaaccctc aagttgcagc aataatcgag ggttgttgga caaatgagcc gtggaagcgt 2400ccatcatttg caacaattat ggacttgcta agaccattga tcaaateagc ggttcctcca 2460cccaaccgct tggatctg 2478

<210> 2<211> 803<212> PRT

<213> Brassica napus<400> 2

Met Glu Met Pro Gly Ala Arg Arg Ser Asn Tyr Thr Leu Leu Ser Gln1 5 10 15

Phe Pro Asp Asp Gln Val Ser Val Ser Val Thr GTy Ala Pro Pro Pro20 25 30

His Tyr Asp ser Ser Leu ser ser Ala Ser Asn Asn Asn ser Gly Asn35 40 45

Asn Gly Lys Ser Lys ser GTy Phe Asp Trp Asp His His Pro Ser GTy50 55 60

GTy GTy Gly Asp His Arg Pro Pro Asn Arg Ala Gly Asn Met Tyr Ser65 70 75 80

ser Ser Leu Gly Leu Gln Arg Gln Ser ser Gly ser Ser Phe Gly Glu85 90 95Ser Ser Leu Ser Gly Asp Tyr Tyr Val Pro Thr Leu ser Ala Ala Gly100 105 110

Asn Glu Ile Glu Met Val Gly Phe Pro Gln Asp Val Gly Leu Gly Asp115 120 125ser Arg Met Gln Met Gly Met Asp ser Ala Gly Gly ser ser Ser Gly130 135 140

Lys ser Trp Ala Gln Gln Thr Glu Glu Ser Tyr Gln Leu Gln Leu Ala145 150 ISS 160

Leu Ala Leu Arg Leu Ser Ser Glu Ala Thr Cys Ala Asp Asp Pro Asn165 170 175

Phe Leu Asp Pro vai Pro Asp Glu ser Ala Leu Arg Thr ser Pro ser180 185 190

ser Ala Glu Thr vai ser His Arg Phe Trp vai Asn Gly Cys Leu Ser195 200 205

Tvr Tvr Asp Lys vai Pro Asp Gly Phe Tyr Met Thr Asp Gly Leu Asp210 215 220

Pro Tyr Ile Trp Thr Leu Cys lie Asp Leu Asn Glu Ser Gly Arg Ile225 230 235 240

Pro Ser Ile Glu ser Leu Arg Ala Ile Asp ser Gly vai Asp Ser ser245 250 255

Leu Glu Ala Ile Leu vai Asp Arg Arg Val Asp Pro Ala Phe Lys Glu260 265 270

Leu His Asn Arg vai His Asp Ile Ser Cys Ser Cys Ile Thr Thr Lys275 280 285

Glu Val Val Asp Gln Leu Ala Lys Leu He Cys Asn Arg Met Gly Gly290 295 300

Ser vai Ile Met Gly Glu Asp Glu Leu Val Pro Met Trp Lys Glu Cys305 310 315 320

Ile Asn Gly Leu Lys Glu Cys Phe Lys Val Val Val Pro Ile Gly Ser325 330 335

Leu Ser Val Gly Leu Cys Arg His Arg Ala Leu Leu Phe Lys Val Leu340 345 350

Ala Asp Ile Ile Asp Leu Pro Cys Arg Ile Ala Lys Gly Cys Lys Tyr355 360 365

cys Asn Arg Asp Asp Ala Ala Ser Cys Leu vai Arg Phe Gly Leu Asp370 375 380

Arg Glu Tyr Leu Val Asp Leu Val Gly Lys Pro Gly His Leu Trp Glu385 390 395 400

Pro Asp Ser Leu Leu Asn Gly Pro Ser Thr Ile ser lie Ser Ser Pro405 410 415

Leu Arq Phe Pro Arq Pro Arg pro Val Glu Pro Ala vai Asp Phe Arg420 425 430

Glu Leu Ala Lys Gln Tyr Phe Thr Asp ser Glu ser Leu Asn Leu Val435 440 445

Phe Asp Pro Ala Ser Asp Asp Ile Gly Phe Ser Met Phe His Arg Gly450 455 460

Gly Glu Asn Asp Gly ser Ala Glu Asr* Gly Gly Gly ser vai Pro Pro465 470 475 480

Gly Ala Asn Met Pro Pro Gln Asn Ile Met Arg Ala Ser Asn Gln Val485 490 495

Gln Asp Ala vai Pro Ile Asn Ala Pro Pro Ile Asn Gln Pro Val Val500 505 510

Asn Arg Ala Asn Arg Asp Leu Gly Leu Asp Gly Asp Asp Met Asp Xle515 520 525

Pro Trp cys Asp Leu Asn Ile Lys Glu Lys Ile Gly Ala Gly ser Phe530 535 540

Gly Thr vai Hls Arg Ala Glu Trp His Gly ser Asp vai Ala Val Lys545 550 555 560

Ile Leu Met Glu Gln Asp Phe His Ala Glu Arg Val Asn Glu Phe Leu565 570 575

Arg Glu Val Ala Ile wet Lys Arg Leu Arg m"s Pro Asn lie vai Leu580 585 590

Phe Met Gly Ala vai Thr Gln Pro Pro Asn Leu ser Ile vai Thr Glu595 600 605

Tyr Leu Ser Arg Gly Ser Leu Phe Arg Leu Leu His Lys Ser Gly Ala610 615 620

Arg Glu Gln Leu Asp Glu Arg Arg Arg Leu ser Met Ala Tyr Asp Val625 630 635 640

Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu His Asn Arg Asn Pro Pro lie Val His645 650 655ΑΓΟ ASp Leu Lys ser Pro Asn Leu Leu vai Asp Lys Lys Tyr Hir vai660 665 670

Lvs Val Cys Asp Phe Gly Leu ser Arg Leu Lys Ala ser Thr Phe Leu675 680 685

ser ser Lys Ser Ala Ala Gly Thr Pro Glu Trp Met Ala Pro Glu Val690 695 700

Leu Arg Asp Glu Gln ser Asn Glu Lys ser Asp vai Tyr ser phe Gly705 710 715 720

vai lie Leu Trp Glu Leu Ala Thr Leu Gln Gln Pro Trp Gly Asn Leu725 730 735

Asn Pro Ala Gln Val Val Ala Ala Val Gly Phe Lys Asn Lys Arg Leu740 745 750

Glu Ile Pro Arg Asn Leu Asn Pro Gln vai Ala Ala ile Ile Glu Gly755 760 765

Cys Trp Thr Asn Glu Pro Trp Lys Arg Pro ser Phe Ala Thr Ile Met770 775 780

Asp Leu Leu Arg Pro Leu He Lys ser Ala Val Pro Pro Pro Asn Arg785 790 795 800

Leu Asp Leu

<210> 3 <211> 3217 <212> DNA <213> Brassi ca napus <400> 3 gaattcgccc ttctaatacg actcactata gggcaagcag tggtatcaac gcagagtacg 60cgggaggaaa acgagagaga gagagagaga ggaaaacaag tggctagcta gctcgccgaa 120ctttgttcaa caatggcggt ttcttagggt tccagctcat atttgatcgg aagaaaagtc 180tctcgtctag atcgcgaatc ttcccatgga aatgcccggc gctagaagat ccaattacac 240tctgcttágt caatttcccg acgaccaggt ctccgtctcc gtcaccggag ctcctccgcc 300tcactatgac tCCtCCtttt ccagcgcgag caacaacaac agcgggaaca acggaaaatc 360caaaggcgga ttcgattggg atcatcatcc tagcggcggc ggtggtgatc acaggccttc 420gaatcgggct gggaatatgt attcttcgtc gcttggtttg cagaggcaat cgagcgggag 480cagcttcggc gagagctcgt tgtccgggga ttactatgtg cctacgctct ctgcggcggg 540taacgagatc gaaatggttg ggtttcctca agatgacggc gggtttaggc tcgggttagg 600tgattcgagg atgcagatgg cgacggattc ggctgggggt tcgtcgtccg ggaagagctg 660ggcgcagcag acggaggaga gttatcagct gcagcttgcg ttggcgttga ggctttcctc 720ggaggctact tgcgctgacg atccgaactt tctggatcct gtaccggacg agtctgcttt 780gcgtacttcg ccgagttcag ctgaaaccgt ttcacatcgc ttctgggtaa atggatgctt 840atcgtactat gataaagttc ctgatgggtt ttatatgatt gatggcctgg atccatatat 900ttggacctta tgcattgatc taaatgaaag tggccgcatc ccttcaattg aatcgttgag 960agctattgat tctggtgttg actcttcgct ggaagccatc ttagtcgatc ggcgtgttga 1020tccagccttc aaggaacttc acaatagagt ccacgacata tcttgtagct gcataaccac 1080aaaagaggtt gttgaccagc tggcaaaact aatctgcaat cgtatgggag gtccagttat 1140catgggggaa gatgagttgg ttcccatctg caaccgtatg ggaggtccag ttatcatggg 1200ggaagatgag ttggttccca tgtggaagga gtgcattaat ggtctaaaag aatgctttaa 1260agtggtggtt cctataggta gcctctctgt tggactctgc agacatcgag ctttactctt 1320caaagtactg gctgacataa ttgatttacc ctgtcgaatt gcaaaagggt gcaagtattg 1380tgatagagac gatgctgcat cgtgccttgt caggtttggg cttgataggg agtatctggt 1440tgatttagtc ggaaagcctg gtcacttgtg ggagcccgac tccttgctaa atggtccctc 1500aactatctca atttcttcac ctttgcggtt tccgcggccc aggccagttg aacctgcagt 1560tgattatagg tcactagcca aacaatactt caccgacagt caagctctga atcttgtttt 1620cgatcctgca tcagatgata tgggattctc aatgtttcat aggggtggag aaaatgacgt 1680tatggcagaa aatgggggtg ggtctttccc tcccagtgct aatatgcctc cacagaacat 1740gatgcgtgcg tcaagtcaac tccaagaagc agtacctata agtgçtccac caaccaatca 1800gccggttctg aacagggcta acagggaact tggacttgat ggtgatgata tggacatccc 1860atggtgtgat ctcaatataa aagagaggat tggagcaggt tcctttggta ctgttcaccg 1920tgctgagtgg catggctcgg atgttgctgt gaaaattctc atggagcagg acttccatgç 1980tgágcgtgtc aatgagttct tgagagaggt tgcaataatg aaacgccttc gccaccctaa 2040tattgttctc ttcatgggtg ctgtcactca acccccaaat ttgtcaatag tgacagaata 2100tttgtcgaga ggaagtttat acagactttt gcataaaagt ggagcaaggg agcaattgga 2160tgagagacgc cgcttgagta tggcatatga tgtggccaaa gggatgaatt atcttcataa 2220tcgcaatcct ccgattgtac atagagatct aaaatçtcca aacttgctgg tcgacaaaaa 2280atacaccgtc aaggtttgtg attttggtct ctcgcggtta aaggccagca cgttcctttc 2340atcaaagtcg gcagctggaa ctcccgagtg gatggcacca gaggtcctgc gggatgagca 2400atctaatgag aagtcagacg tgtacagctt tggggtcatc ttgtgggagc ttgctacatt 2460gcagcaacca tggggtaatt tgaatcctgc tcaggttgta gctgcggttg gtttcaagaa 2520taaacggctt gagatccctc ggaacctgaa ccctcaagtt gcagcaataa tcgagggttg 2580ttggâcaaat. gagccgtgga agcgtccatc atttgcaaca attatggact tgctaagacc 2640attgatcaaa tcagcggttc ctccacccaa ccgcttggat ctgtgaaaça ccggcccact 2700tggaaacacg atattaataa ttgatgatgt gcacatatac tctcagcatt attttgctgc 2760

ccaggaggga gacactagtt aagatagctg taagggaagg aaaaaaagta aatcaagtag 2820

taagtggaaa cagtaaggga tattctatta tctacctccg aggggtgtga geaatatatt 2880

gttgtaagcc ttttgtagta gtgacacttt aagctatctt tttttgtcta atccttcatg 2940

tgatatgttt cttttaagtt accttgttgt acatttaagc tactaaatta gtagctccta 3000

gtaactaaga gaglxcaaac caagaaaaaa gagtcgtgtg tcagtgtggt tttgcaaatt 3060

cagtatgatt cattggattg tacattgtat ttgtcaagtg tgtaattcac acgagattat 3120

catgaggatt tgcgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagt actctgcgtt gataccactg 3180

cttgccctat agtgagtcgt attagaaggg cgaattc 3217

<210> 4<211> 2463<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 4

atggaaatgc ccggtagaag atctaattae actttgctta gtcaattttc tgacgatcag 60

gtgtcagttt ccgtcaccgg agctectccg cctcactatg attccttgtc gagcgaaaac 120

aggagcaacc ataacagcgg gaacaccggg aaagctaagg cggagagagg cggatttgat 180

tgggatccta gcggtggtgg tggtggtgat cataggttga ataatcaacc gaatcgggtt 240

gggaataata tgtatgcttc gtctctaggg ttgcaaaggc aatccagtgg gagtagtttc 300

ggtgagagct ctttgtctgg ggattattac atgcctacgc tttctgcggc ggctaacgag 360

atcgaatctg ttggatttcc tcaagatgat gggtttaggc ttggatttgg tggtggtgga 420

ggagatttga ggatacagat ggcggcggac tccgctggag ggtcttcatc tgggaagagc 480

tgggcgcagc agacggagga gagttatcag ctgcagcttg cattggcgtt aaggetttcg 540

tcggaggcta cttgtgccga cgatccgaac tttctggatc ctgtaccgga cgagtctgct 600

ttacggactt cgccaagttc agccgaaacc gtttcacatc gtttctgggt taatggctgc 660

ttatcgtact stgataaagt tcctgatggg ttttatatga tgaatggtct ggatccctat 720

atttggacct tatgcatcga cctgcatgaa agtggtcgca tcccttcaat tgaatcatta 780

agagctgttg attctggtgt tgattcttcg cttgaagcga tcatagttga taggcgtagt 840gatccagcct tcaaggaact tcacaataga gtccacgaca tatcttgtag ctgcattacc

900

acaaaagagg ttgttgatca gctggcaaag cttatctgca atcgtatggg gggtccagtt 960

atcatggggg aagatgagtt ggttcccatg tggaaggagt gcattgatgg tctaaaagaa 1020

atctttaaag tggtggttcc cataggtagc ctctctgttg gactctgcag acatcgagct 1080

ttactcttca aagtactggc tgacataatt gatttaccct gtcgaattgc caaaggatgt 1140

aaatáttgta atagagâcga tgccgcttcg tgccttgtca ggtttgggct tgatagggag 1200

tacctggttg atttagtagg aaagccaggt cacttatggg agcctgattc cttgctaaat 1260

ggtccttcat ctatctcaat ttcttctcct ctgcggtttc cacgaccaaa gccagttgaa 1320cccgcagteg attttaggtt actagccaaa caatatttct ccgatagcca gtctcttaat 1380cttgttttcg atcctgcatc agatgatatg ggattctcaa tgtttcatag gcaatatgat 1440aatccgggtg gagagaatga cgcattggca gaaaatggtg gtgggtcttt gccacccagt 1500gctaatatgc ctccacagaa catgatgcgt gcgtcaaatc aaattgaagc agcacctatg 1560aatgccccac caatcagtca gccagttcca aacagggcaa atagggaact tggacttgat 1620ggtgatgata tggacatccc gtggtgtgat cttaatataa aagaaaagat tggagcaggt 1680tcctttggca etgtccaccg tgctgagtgg catggctcgg atgttgctgt gaaaattctc 1740atggagcaag acttccatgc tgagcgtgtt aatgagttct taagagaggt tgcgataatg 1800aaacgccttc gccaecctaa cattgttctc ttcatgggtg cggtcactca acctccaaat 1860ttgtcaatag tgacagaata tttgtcaaga ggtagtttat acagactttt gcataaaagt 1920ggagcaaggg agcaattaga tgagagacgt cgcctgagta tggcttatga tgtggctaag 1980ggaatgaatt atcttcacaa tcgcaatcct ccaattgtgc atagagatct aaaatctcca 2040aacttattgg ttgacaaaaa atatacagtc aaggtttgtg attttggtct ctcgcgattg 2100aaggccagca cgtttctttc ctcgaagtca gcagctggaa cccccgagtg gatggcacca 2160gaagtcctgc gagatgagcc gtctaatgaa aagtcagatg tgtacagctt cggggtcatc 2220ttgtgggagc ttgctacatt gcaacaacca tggggtaact taaatccggc- tcaggttgta 2280gctgcggttg gtttcaagtg taaacggctg gagatcccgc gtaatctgaa tcctcaggtt 2340gcagccataa tcgagggttg ttggaccaat gagccatgga agcgtccatc atttgcaact 2400ataatggact tgctaagacc attgatcaaa tcagcggttc ctccgcccaa ccgctcggat 2460ttg 2463

<210> 5

<211> 821

<2Χ2> PRT

<21Β> Arabidopsis thaliana

<400> 5

Met Glu Met Pro Glv Arg Arg Ser Asn Tyr Thr Leu Leu Ser Gln Phe1 S * * * 10 15

Ser Asp Asp Gln Val Ser Val Ser Val Thr Gly Ala Pro Pro Pro His20 25 30

Tyr Asp ser Leu ser ser gTu Asn Arg ser Asn His Asn ser Gly Asn7 35 40 45

Thr Gly Lys Ala Lys Ala Glu Arg Gly Gly Phe Asp Trp Asp Pro SerSO 55 60

Gly Gly Gly Gly Gly Asp His Arg Leu Asn Asn Gln Pro Asn Arg vai65 70 75 80

Gly Asn Asn Met Tyr Ala ser ser Leu Gly Leu Gln Arg Gln ser SerGly ser ser Phe Gly Glu Ser Ser Leu Ser Gly Asp Tyr Tyr Met Pro100 105 HO

Thr Leu Ser Ala Ala Ala Asn Glu lie Glu Ser vai Gly Phe Pro Gln

Asp Asp Gly Phe Arg Leu Gly Phe Gly Gly Gly Gly Gly Asp Leu Arg130 135 140

Ile Gln Met Ala Ala Asp Ser Ala Gly Gly ser Ser Ser Gly Lys Ser145 150 155 160

Trp Ala Gln Gln Thr Glu Glu Ser Tyr Gln Leu Gln Leu Ala Leu Ala165 170 175

Leu Arg Leu Ser Ser Glu Ala Thr cys Ala Asp Asp Pro Asn Phe Leu180 185 190

Asp Pro vai Pro Asp Glu ser Ala Leu Arg Thr ser Pro ser ser Ala195 200 205

Glu Thr Val Ser His Arg Phe Trp Val Asn Gly Cys Leu Ser Tyr Tyr210 215 220

Asp Lys Val Pro Asp Gly Phe Tyr Met Met Asn Gly Leu Asp Pro Tyr225 230 235 240

xle Trp Thr Leu Cys Ile Asp Leu His Glu ser Gly Arg Ile Pro ser245 250 255

Ile Glu Ser Leu Arg Ala Val Ásp Ser Gly vai Asp ser Ser Leu Glu260 265 270

Ala Ile Ile vai Asp Arg Arg Ser Asp Pro Ala Phe Lys Glu Leu His275 280 285

Asn Arg Val His Asp Ile Ser Cys Ser cys lie Thr Thr Lys Glu Val290 295 300

vai Asp Gln Leu Ala Lys Leu Ile cys Asn Arg Met Gly Gly Pro vai305 310 315 320

Ile Met Gly Glu Asp Glu Leu Val Pro Met Trp Lys Glu Cys Ile Asp325 330 335

Gly Leu Lys Glu ile Phe Lys vai Val vai Pro Ile Gly ser Leu ser340 345 350

vai Gly Leu cys Arg His Arg Ala Leu Leu Phe Lys vai Leu Ala Asp

115

125

355

360

365Xle Ile Asp Leu Pro Cys Arg lie Ala Lys Gly cys Lys Tyr Cys Asn370 375 380

Ara Asp Asp Ala Ala ser cys Leu Val Arg Phe Gly Leu Asp Arg Glu385 390 395 400

Tyr Leu Val Asp Leu Val Gly Lys Pro Gly His Leu Trp Glu Pro Asp405 410 415

ser Leu Leu Asn Gly Pro ser ser Ile ser Ile ser ser Pro Leu Arg420 425 430

Phe Pro Arg Pro Lys Pro vai Glu Pro Ala Val Asp Phe Arg Leu Leu435 440 445

Ala Lys Gln Tyr Phe Ser Asp Ser Gln Ser Leu Asn Leu Val Phe Asp450 455 460

Pro Ala ser Asp Asp Met Gly Phe ser Met Phe His Arg Glrt Tyr Asp465 470 475 480

Asn Pro Gly Gly Glu Asn Asp Ala Leu Ala Glu Asn Gly Gly Gly Ser485 490 495

Leu Pro Pro ser Ala Asn Met Pro Pro Gln Asn Met Met Arg Ala ser500 505 510

Asn Gln Ile Glu Ala Ala Pro Met Asn Ala Pro Pro Ile ser Gln Pro515 520 525

Val Pro Asn Arg Ala Asn Arg Glu Leu Gly Leu Asp Gly Asp Asp Met530 535 540

Asp Ile Pro Trp Cys Asp Leu Asn Ile Lys Glu Lys Ile Gly Ala Gly545 550 555 560

ser Phe Gly Thr Val His Arg Ala Glu Trp His Gly ser Asp Val Ala565 570 575

Val Lys Ile Leu Met Glu Gln Asp Phe His Ala Glu Arg vai Asn Glu580 585 590

Phe Leu Arg Glu vai Ala Ile Met Lys Arg Leu Arg His Pro Asn Ile595 600 605

vai Leu Phe Met Gly Ala Val Thr Gln Pro Pro Asn Leu ser Ile Val610 615 620

Thr Glu Tyr Leu ser Arg Gly ser Leu Tyr Arg Leu Leu His Lys ser625 630 635 640Gly Ala Arg Glu Gln Leu Asp Glu Arg Arg Arg Leu Ser Met Ala Tyr645 650 655

Asp vai Ala Lys 6ly Met Asn Tyr Leu His Asn Arg Asn Pro Pro Ile660 665 670

Val Mis Arg Asp Leu Lys Ser pro Asn Leu Leu Val Asp Lys Lys Tyr675 680 685

Thr vai Lys Val Cys Asp Phe Gly Leu ser Arg Leu Lys Ala Ser Thr690 695 700

Phe Leu ser Ser Lys ser Ala Ala Gly Thr Pro Glu Trp Met Ala Pro705 710 715 720

Glu Val Leu Arg Asp Glu Pro Ser Asn Glu Lys ser Asp vai Tyr ser725 730 735

Phe Gly vai Ile Leu Trp Glu Leu Ala Thr Leu Gln Gln Pro Trp Gly740 745 750

Asn Leu Asn Pro Ala Gln vai vai Ala Ala Val Gly Phe Lys Cys Lys755 760 765

Arg Leu Glu Ile Pro Arg Asn Leu Asn Pro Gln vai Ala Ala Ile Ile770 775 780

Glu Gly Cys Trp Thr Asn Glu Pro Trp Lys Arg Pro ser Phe Ala Thr785 790 795 800

Ile Met Asp Leu Leu Arg Pro Leu Ile Lys ser Ala Val Pro Pro Pro805 810 81S

Asn Arg ser Asp Leu820

<210> 6

<211> 2466

<212> DKA

<213> Arabidopsis thaliana

atggaaatgc ccggtagaag atctaattac actttgctta gtcaattttc tgacgatcag 60gtgtcagttt ccgtcaccgg agctcctccg cctcactatg attccttgtc gagcgaaaac 120aggagcaacc ataacagcgg gaacaccggg aaagctaagg cggagagagg cggatttgat 180tgggatccta gcggtggtgg tggtggtgat cataggttga ataatcaacc gaatcgggtt 240gggaataata tgtatgcttc gtctctaggg ttgcaaaggc aatccagtgg gagtagtttc 300ggtgagagct ctttgtctgg ggattattac atgcctacgc tttctgcggc ggctaacgag 360atcgaatctg ttggatttcc tcaagatgat gggtttaggc ttggatttgg tggtggtgga 420ggagâtttga ggâtacagat ggcggcggactgggcgcagc agacggagga gagttatcagtcggaggcta cttgtgccga cgatccgaacttacggactt cgccaagttc agccgaaaccttatcgtact atgataaagt tcctgatgggatttggacct tatgcatcga cctgcatgaaagagctgttg attctggtgt tgattcttcggatccagcct tcaaggaact tcacaatagaacaaaagagg ttgttgatca gctggcaaagatcatggggg aagatgagtt ggttcccatgatctttaaag tggtggttcc cataggtagcttactcttca aagtactggc tgacataattaaatattgta atagagacga tgccgcttcgtacctggttg atttagtagg aaagccaggtggtccttcat etatctcaat ttcttctcctcccgcagtcg attttaggtt actagccaaacttgttttcg atcctgcatc agatgatatgaatccgggtg gagagaatga cgcattggcagctaatatgc ctccacagaa catgatgcgtaatgccccac caatcagtca gccagttccaggtgatgara tggacatccc gtggtgtgattcçtttggca ctgtccaccg tgctgagtggatggagcaag acttccatgc tgagcgtgttaaacgccttc gccaccctaa cattgttctcttgtcaatag tgacagaata tttgtcaagaggagcaaggg agcaattaga tgagagacgtggaatgaatt atcttcacaa tcgcaatcctaacttattgg ttgacaaaaa atatacagtcaaggccagca cgtttctttc ctcgaagtcagaagtcctgc gagatgagcc gtctaatgaattgtgggagc ttgctacatt gcaacaaccagctgcggttg gtttcaagtg taaacggctggcagccataa tcgagggttg ttggaccaatataatggact tgctaagacc attgatcaaattgtaa

tccgctggag ggtcttcatc tgggaagagc 480ctgcagcttg cattggcgtt aaggctttcg 540tttctggatc ctgtaccgga cgagtctgct 600gtttcacatc gtttctgggt taatggctgc 660ttttatatga tgaatggtct ggatccctat 720agtggtcgca tcccttcaat tgaatcatta 780cttgaagcga tcatagttga taggcgtagt 840gtccacgaca tatcttgtag ctgcattacc 900cttatctgca atcgtatggg gggtccagtt 960tggaaggagt gcattgatgg tctaaaagaa 1020ctctctgttg gactctgcag acatcgagct 1080gatttâccct gtcgaattgc caaaggatgt 1140tgccttgtca ggtttgggct tgatagggag 1200cacttatggg agcctgattc cttgctaaat 1260ctgcggtttc cacgaccaaa gccagttgaa 1320caatatttct ccgatagcca gtctcttaat 1380ggattctcaa tgtttcatag gcaatatgat 1440gaaaatggtg gtgggtcttt gccacccagt 1500gcgtcaaatc aaattgaagc agcacctatg 1560aacagggcaa atagggaact tggacttgat 1620cttaatataa aagaaaagat tggagcaggt 1680catggctcgg atgttgctgt gaaaattctc 1740aatgagttct taagagaggt tgcgataatg 1800ttcatgggtg cggtcactca acctccaaat 1860ggtagtttát acagactttt gcataaaagt 1920cgcctgagta tggcttatga tgtggctaag 1980ccaattgtgc atagagatct aaaatctcca 2040aaggtttgtg attttggtct ctcgcgattg 2100gcagctggaa cccccgagtg gatggcacca 2160aagtcagatg tgtacagctt cggggtcatc 2220tggggtaact taaatccggc tcaggttgta 2280gagatcccgc gtaatctgaa tcctcaggtt 2340gagccatgga agcgtccatc atttgcaact 2400tcagcggttc ctccgcccaa ccgctcggat 2460 2466<210> 7

<211> 130

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Padrão de seqüência

<220>

<221> misc_feature

<222> (2),.C2)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> misc-feature

<222> (4)..(12)<223>

Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(31)

<223> xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(34)<223>

Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<220>

<221> nrísc_feature

<222> (37)..(38)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<220>

<2 21> misc_featü re

<222> (40)..(43)

<223> xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<220>

<221> mis c_feature

<222> (45)..(46)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<220>

<221> mi 5c_feature

<222> (48)..(48)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<2 2 !> mi s c_feature

<222> (50)..(54)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<220>

<221> mi s c_feature

<222> (59)..(65)

<223> xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> misc_feature

<222> (67)..(69)

<223> xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> mi sc^featu re

<222> (71)..(74)<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> misc_feature

<222> (76)..(99)

<22S> Xaa pode ser qualquer amino ácido de ocorrência natural<220>

<221> mi5c_feature

<222> ClOD.. (106)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> mi sc_feature

<222> (108) ,. (111)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(118)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> rnisc_feature

<222> (120)..(120)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<2 21> mi scjFeat υ r e

<222> (122)..(123)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> mi sc_feature

<222> (125)..(125)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<220>

<221> mi sc_feature

<222> (127),.(128)

<22 3> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<400> 7

Al a Xaa Arg Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xâa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa ser20 25 30

Leu xaa ser Ala Xaa xaa Asn xaa xaa xaa xaa Asn xaa xaa ser xaa35 40 45

ser xaa xaa xaa xaa xaa His His Pro Ser xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa50 55 60

Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa xaa xaa65 70 75 80

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa85 90 95

Xaa xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Metxaa Xaa Xaa Xãã xaa Xaa vai Xaa Leu Xaa Xaa ser Xaa Met Xaa Xaa115 120 125

Gly MetIBO

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Padrão de seqüência

<220>

<221> mi sc_feature

<222> (3)..(15)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<220>

<221> mi sc_feature

<222> (17)..(29)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(41)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> mi sc_feature

<222> (43)..(46)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<220>

<221> misc_feature

<222> (48).,(85)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<220>

<221> mi sc_f eatu re

<222> (87)..(102)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> mi sc_f eature

<222> (104)..(107)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<400> 8

Thr ASD Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn15 10 15

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa lie xaa xaa20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa Leu xaa xaa xaa xaa Val xaa3S 40 45Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa50 55 60

Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa65 70 75 80

xaa xaa xaa xaa xaa ser xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa85 90 95

xaa xaa Xaa xaa Xaa xaa Asn xaa xaa xaa xaa Cys100 105

<2 ICb- 9

<Z11> 109

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Padrão de seqüência

<220>

<2 21> mi sc_featu re

<222> (2)..(13)

<223> Xaa pode ser qualquer

<220>

<221> misc-feature

<222> (15)..(23)

<223> Xaa pode ser qualquer

<220>

<221> misc„feature

<222> (25)..(30)

<223> Xaa pode ser qualquer

<220>

<2 21> misc_feature

<222> (32)..(33)

<223> Xaa pode ser qualquer<220>

<221> misc_feature

<222> (35)..(46)

<223> Xaa pode ser qualquer

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(59)

<223> Xaa pode ser qualquer

<220>

<2 21> misc_fe at u r e

<222> (62)..(68)

<223> Xaa pode ser qualquer

<220>

<221> misc_feature

<222> (70) . . (71)

<223> Xaa pode ser qualquer

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(79)

<223> Xaa pode ser qualquer

aminoácido de ocorrência natural

aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> misc_feature

<222> (81)..(86)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> misc_feature

<222> (90).. (90)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrencxa natural<220>

<221> trrisc_feature

<222> (92)..(92)

<223> Xaa pode ser ^ialquer amino ácido de ocorrência natural<220>

<221> mi sc_feature

<222> C94)..(98)

<223> Xaa pode ser qualquer amino ácido de ocorrência natural<220>

<221> misc^feature

<222> (100)..(102)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> misc_feature

<222> (104)..(108)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<400> 9

Thr Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa1 5 10 15

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Glu Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa20 25 30

Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa35 40 45

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly ser Xaa xaa Xaa50 SS 60

xaa xaa xaa xaa vai Xaa xaa Gly xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Ile65 70 75 80

xaa xaa xaa xaa xaa xaa vai Gln Asp xaa Val Xaa Ile Xaa xaa xaa85 90 95

Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp100 105

<210> 10

<211» 2412

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Padrão de seqüência<400> 10 atggaaatgc cgggggctag gaggtcaaat tacacacttc ttagccagtt cccagatgac 60caggtgagcg tgtcagttac aggagcgcca ccgccacact acgatagttc tctttctagt 120gcaagcaaca ataactcagg taataacggg aaaagcaaga gtggatttga ttgggatcat 180cacccatctg gtggaggggg agatcatcgt ccccctaaca gagctggtaa catgtactcc 240agttcgctcg gactccagcg ccaaagttcc ggtagctcat tcggggaatc tteccteagt 300ggagactact acgttccaac tcttagtgct gcgggaaacg aaatcgaaat ggtcggattt 360ccacaagacg ttgggcttgg cgattctagg atgcaaatgg gaatggattc tgccgggggc 420tcctcaagcg gaaagtcttg ggctcagcaa acagaagaga getaccagct tcaacttgct 480ttggccttga gactctctag tgaggctacg tgtgctgatg accctaactt cttggatect 540gtgccagacg aatcggcttt gaggacctct ccctctagtg ctgagacagt ttctcacagg 600ttctgggtta atggctgtct ctcatattac gacaaggtgc cagatggatt ttacatgact 660gacgggctgg atccctatat ttggactttg tgtatagatt tgaatgaatc aggacggatc 720ccttctattg agtctcttag agctatagat agtggegtgg atagctcttt ggaagctatc 780ctcgtggatc Qtcgggtcga tcctgctttc aaagagcttc acaatcgcgt ccacgacata 840tcttgttcat gtatcactac caaagaagtg gttgatcaat tggcaaagct gatttgcaat 900cgtatgggag gctccgttat tatgggtgag gacgagcttg tcecaatgtg gaaagagtgc 960ataaacgggc tcaaagaatg ttttaaagtt gtggttccta ttggtagtct gtccgtggga 1020ctctgtcgtc acagagccct CCtgtttaaa gttttggctg atattattga cctgccctgc 1080cgcattgcta aaggatgcaa atactgtaat cgtgacgaeg cagcctcatg ccttgttagg 1140ttcggtttgg atagggagta tttggttgat ctcgtcggta aaccaggaca cctctgggaa 1200ccggatagct tgcttaatgg gccttecaet atatcaatct cgtcaccact gaggtttccc 1260agacccagac cagtcgaacc ggctgttgac ttcagggagt tggcaaagca gtattttacc 1320gacagtgaaa gtctgaatet tgtgttcgat cccgcctctg acgatattgg tttttctatg 1380ttccacaggg gaggtgaaaa cgatggctca gccgagaatg gtggcggttc tgtccctcca 1440ggtgcaaata tgcctccaca aaatattatg agggcttcta atcaagttca ggatgctgtg 1500cctataaaeg cgcctccaat taatcaaccc gtggttaata gagccaacag ggatctggga 1560ctggacgggg atgacatgga cataccttgg tgcgatctta acattaagga aaagataggt 1620gcaggttcgt 'ttggcacagt tcacagagca gagtggcacg gttctgatgt ggcagttaag 1680attcttatgg agcaggattt tcacgcagaa agagtcaatg agtttttgcg tgaggtggca 1740attatgaaga agaccaagca ccctaacgtg gttgtgagga tgggtaccgt caceeaaccg 1800cctaatcttt ctattgttac cgagttcctt tcaaggggct ctctgttcag gcttctgcat 1860aagtctggcg ctcgtgaaca attggacgag cgcagaccac tctctatggc ttatgatgtg 1920gctaagggta tgaactattt gcacaataga aatcctccca ttgttcacaa ggagcttagg 1980tctcctaacc ttgtggttga gaagaaatat acggttaggg tgtgcgagtt cggtttgtcc 2040aagttcaagg catccagctt cctgtcgagt aaaagcgega- ccggaactcc cgaatggatg 2100

gctcctgagg ttcttaggga cgaaccatca aacgagagga ccgacgtgtg gactatgggg 2160

gttgttctgt gggaaagcgc gagcctccag caaccttggg gcaatcttaa tcctgcacag 2220

gttgtggcag ccgtgggatt caagaacaag cgcttggaaa tcccaaggaa cttgaaccca 2280

caggtggctg caattatcga gggctgctgg actaacgaac cttggaaaag gccatcattt 2340

gccacaatta tggatctttt gcggcctctt attaagtccg ccgtcccacc tcccaaccgc 2400

ctcgatcttt ga 24

<210> 11<211> 2412<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<2Ζ3> Padrão de seqüência

<400> 11 eft

atggaaatgc cgggggctag gaggtcaaat tacacacttc ttagccagtt cccagatgac 60

caggtgagcg tgtcagttac aggagcgcca ccgccacact acgatagttc tctttctagt 120

geaagcaaca ataactcagg taataacggg aaaagcaaga gtggatttga ttgggatcat 180

cacccatctg gtggaggggg agatcatcgt ccccctaaca gagctggtaa catgtactcc 240

agttcgctcg gaetccagcg ccaaagttcc ggtagctcat tcggggaatc ttccctcagt 300

ggagactact acgttccaac tcttagtgct gcgggaaacg aaatcgaaat ggtcggattt 360

ccacaagacg ttgggcttgg cgattctagg atgcaaatgg gaatggattc tgecgggggc 420

tccteaagcg gaaagtcttg ggctcagcaa acagaagaga gctaccagct tcaacttgct 480

ttggccttga gactctctag tgaggctacg tgtgctgatg accctaactt cttggatcct 540

gtgcçagacg aateggcttt gaggacctct ccctctagtg ctgagacagt ttctcacagg 600

ttctgggtta atggctgtct ctcatattac gacaaggtgc cagatggatt ttacatgact 660

gacgggctgg atccctatat ttggactttg tgtatagatt tgaatgaatc aggacggatç 720

ccttctattg agtctcttag agctatágat agtggcgtgg atagetcttt ggaagetatc 780

ctcgtggatc gtcgggtcga tcctgctttc aaagagcttc acaatcgcgt ccacgacata 840

tcttgttcat gtatcactac caaagaagtg gttgatcaat tggcaaagct gatttgcaat 900

cgtatgggag gctccgttat tatgggtgag gacgagcttg tcccaatgtg gaaagagtgc 960

ataaacgggc tcaaagaatg ttttaaagtt gtggttccta ttggtagtct gtccgtggga 1020

ctctgtcgtc acagagccct cctgtttaaa gttttggctg atattattga cctgccctgc 1080

cgcattgcta aaggatgcaa atactgtaat cgtgacgacg cagcctcatg ccttgttagg 1140

ttcggtttgg atagggagta tttggttgat ctcgtcggta aaccaggaca cctctgggaa 1200

ccggatagct tgcttaatgg gccttccact atatcaatct cgtcaccact gaggtttccc 1260

agacccagac cagtcgaacc ggctgttgac ttcagggagt tggcaaagca gtattttacc 1320

gacagtgaaa gtctgaatct tgtgttcgat cccgcctctg acgatattgg tttttctatg 1380ttccacaggg gaggtgaaaa cgatggctca gccgagaatg gtggcggttc tgtccctcca 1440ggtgcaaata tgcctccaca aaatattatg agggcttcta atcaagttca ggatgctgtg 1500cctataaacg cgcctccaat taatcaaccc gtggttaata gagccaacag ggatctggga 1560ctggacgggg atgacatgga cataccttgg tgcgatctta acattaagga aaagataggt 1620gcaggttcgt ttggcacagt tcacagagca gagtggcacg gttctgatgt ggcagttaag 1680attcttatgg agcaggattt tcacgcagaa agagtcaatg agtttttgcg tgaggtggca 1740attatgaaga agaccaagca ccctaacgtg gttgtgagga tgggtaccgt cacccaaccg 1800cctaatcttt ctattgttac cgagttcctt tcaaggggct ctctgttcag gcttctgcat 1860aagtctggcg ctcgtgaaca attggacgag cgcagaccac tctctatggc ttatgatgtg 1920gctaagggta tgaactattt gcacaataga aatcctccca ttgttcacaa ggagcttagg 1980tctcctaacc ttgtggttga gaagaaatat acggttaggg tgtgcgagtt cggtttgtcc 2040aagttcaagg catccagctt cctgtcgagt aaaagcgcga ccggaactcc cgaatggatg 2100gctcctgagg ttcttaggga cgaaccatca aacgagagga ccgacgtgtg gactatgggg 2160gttgttctgt gggaaagcgc gagcctccag caaccttggg gcaatcttaa tcctgcacag 2220gttgtggcag ccgtgggatt caagaacaag cgcttggaaa tcccaaggaa cttgaaccca 2280caggtggctg caattatcga gggctgctgg actaacgaac cttggaaaag gccatcattt 2340gccacaatta tggatctttt gcggcctctt attaagtccg ccgtcccacc tcccaaccgc 2400ctcgatcttt ga 2412

<Ζ10> 12

<211> 803

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Padrão de seqüência

<40Q> 12

Met Glu Met Pro Gly Ala Arg Arg ser Asn Tyr Thr Leu Leu Ser Gln1 5 10 15

Phe Pro Asp Asp Gln Val Ser Val ser Val Thr Gly Ala Pro Pro Pro20 25 30

His Tyr Asp Ser ser Leu Ser Ser Ala Ser Asn Asn Asn ser Gly Asn35 40 45

Asn Gly Lys ser Lys ser Gly Phe Asp Trp Asp His His Pro ser Gly50 55 60

Gly Gly Gly Asp His Arg Pro Pro Asn Arg Ala Gly Asn Met Tyr Ser65 70 75 80

ser Ser teu Gly Leu Gln Arg Gln Ser Ser Gly Ser ser Phe Gly Gluk.Ser ser Leu ser Gly Asp Tyr Tyr vai Pro Thr Leu Ser Ala Ala Gly100 105 HO

Asn Glu Ile Glu Met Val Gly Phe Pro Gln Asp vai Gly Leu Gly Asp115 120 125

ser Arg Met Gln Met Gly Met Asp ser Ala Gly Gly ser ser ser Gly130 135 140

Lys Ser Trp Ala Gln Glri Thr Glu Glu ser Tyr Gln Leu Gln Leu Ala145 150 155 160

Leu Ala Leu Arg Leu ser Ser Glu Ala Thr Cys Ala Asp Asp Pro Asn165 170 175

Phe Leu Asp Pro Val Pro Asp Glu Ser Ala Leu Arg Thr Ser Pro Ser180 185 190

Ser Ala Glu Thr Val Ser His Arg Phe Trp Val Asn Gly Cys Leu Ser195 200 205

Tvr Tyr Asp Lys vai Pro Asp Gly Phe Tyr Met Thr Asp Gly Leu Asp210 215 220

Pro Tyr Ile Trp Thr Leu cys Ile Asp Leu Asn Glu ser Gly Arg Ile225 230 235 240

Pro ser Ile Glu Ser Leu Arg Ala Xle Asp ser Gly Val Asp ser ser245 250 255

Leu Glu Ala Ile Leu Val Asp Arg Arg Val Asp Pro Ala Phe Lys Glu260 265 270

Leu His Asn Arg vai His Asp Ile ser cys Ser Cys Ile Thr Thr Lys275 280 285

Glu vai vai Asp Gln Leu Ala Lys Leu Ile Cys Asn Arg Met Gly Gly290 295 300

Ser Val Ile Met Gly Glu Asp Glu Leu vai Pro Met Trp Lys Glu Cys305 310 315 320

Ile Asn Gly Leu Lys Glu cys Phe Lys vai Val Val Pro Ile Gly ser325 330 335

Leu ser vai Gly Leu Cys Arg Mis Arg Ala Leu Leu Phe Lys Val Leu340 345 350

Ala Asp Ile Ile Asp Leu Pro Cys Arg Ile Ala Lys Gly Cys Lys Tyr355 360 365Cvs Asn Arg Asp Asp Ala Ala Ser Cys Leu Val Arg Phe Gly Leu Asp370 375 380

Arg Glu Tyr Leu vai Asp Leu Val Gly Lys Pro Gly His Leu Trp Glu385 390 395 400

pro Asp ser Leu Leu Asn Gly Pro ser Thr Ile ser Ile Ser Ser Pro405 410 415

Leu Arg Phe Pro Arg Pro Arg Pro Val Glu Pro Ala Val Asp Phe Arg420 425 430

Glu Leu Ala Lys Gln Tyr Phe Thr Asp ser Glu ser Leu Asn Leu vai435 440 445

Phe Asp Pro Ala ser Asp Asp Ile Gly Phe ser Met Phe His Arg Gly450 455 460

Gly Glu Asn Asp Gly ser Ala Glu Asn Gly Gly Gly Ser Val Pro Pro465 470 475 480

Gly Ala Asn Met Pro Pro Gln Asn lie Met Arg Ala ser Asn Gln Vãl485 490 495

Gln Asp Ala Val Pro Ile Asn Ala Pro Pro lie Asn Gln Pro Val vai500 505 510

Asn Ara Ala Asn Arg Asp Leu Gly Leu Asp Gly Asp Asp Met Asp Ile515 520 525

pro Trp Cys Asp Leu Asn Ile Lys Glu Lys Ile Gly Ala Gly Ser Phe530 535 540

Gly Thr Val His Arg Ala Glu Trp His Gly Ser Asp vai Ala vai Lys545 550 S55 560

Ile Leu Met Glu Gln Asp Phe His Ala Glu Arg vai Asn Glu Phe Leu565 570 575

Arg Glu vai Ala Ile Met Lys Lys Thr Lys His Pro Asn Val Val vai580 585 590

Arg Met Gly Thr vai Thr Gln Pro Pro Asn Leu Ser Ile vai Thr Glu595 600 605

Phe Leu Ser Arg Gly Ser Leu Phe Arg Leu Leu His Lys ser Gly Ala610 615 620

Arg Glu Gln Leu Asp Glu Arg Arg Pro Leu ser Met Ala Tyr Asp vai625 630 635 640Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu His Asn Arg Asn Pro Pro Ile Val His645 650 655

Lys Glu Leu Arg Ser Pro Asn Leu vai vai Glu Lys Lys Tyr Thr Val660 665 670

Ara vai Cys Glu Phe Gly Leu ser Lys Phe Lys Ala ser ser Phe Leu675 680 685

ser Ser Lys ser Ala Thr Gly Thr Prd Glu Trp Met Ala Pro Glu Val690 695 700

Leu Arq Asp Glu Pro Ser Asn Glu Arg Thr Asp vai Trp Thr Met Gly705 710 715 720

vai vai Leu Trp Glu ser Ala ser Leu Gln Gln Pro Trp Gly Asn Leu725 730 735

Asn Pro Ala Gln Val vai Ala Ala vai Gly Phe Lys Asn Lys Arg Leu740 745 750

Glu Ile Pro Arg Asn Leu Asn Pro Gln Val Ala Ala lie lie Glu Gly755 760 765

Cys Trp Thr Asn Glu Pro Trp Lys Arg Pro ser Phe Ala Thr Ile Met770 775 780

Asp Leu Leu Arg Pro Leu Ile Lys ser Ala vai Pro Pro Pro Asn Arg785 790 795 800

Leu Asp Leu

Claims

1. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreendeas seqüências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste de:(a) uma seqüência de ácido nucleico como mostrado na SEQIDN°: Iou 3;(b) uma seqüência de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido como mostrado na SEQ IDN°: 2;(c) uma seqüência de ácido nucleico que é pelo menos 70 %idêntica à seqüência de ácido nucleico de (a) ou (b), em que a dita seqüênciade ácido nucleico codifica um polipeptídeo tendo atividade de serina/treoninaproteína quinase e em que o dito polipeptídeo compreende pelo menos umadas seqüências de aminoácido mostradas em qualquer uma das SEQ ID N°: 7a 9 e(d) uma seqüência de ácido nucleico sendo um fragmento dequalquer um de (a) a (c), em que o dito fragmento codifica um polipeptídeoou porção biologicamente ativa deste tendo atividade de serina/treoninaproteína quinase e em que o dito polipeptídeo compreende pelo menos umadas seqüências de aminoácido mostradas em qualquer uma das SEQ ID N0: 7 a 9.

2. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotídeo é DNA ou RNA.

3. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende opolinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 2.

4. Vector de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que o dito vetor é um vetor de expressão.

5. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de quecompreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, o vetorcomo definido na reivindicação 3 ou 4.

6. Método para a fabricação de um polipeptídeo tendoatividade de serina/treonina proteína quinase, caracterizado pelo fato de quecompreende:(a) expressar o polinucleotídeo como definido na reivindicação-1 ou 2 em uma célula hospedeira e(b) obter o polipeptídeo codificado pelo dito polinucleotídeo apartir da célula hospedeira.

7. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que é codificadopelo polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 2 ou que éobtenível pelo método como definido na reivindicação 6.

8. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que reconheceespecificamente polipeptídeo como definido na reivindicação 7.

9. Organismo não humano transgênico, caracterizado pelo fatode que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 2,o vetor como definido na reivindicação 3 ou 4 ou a célula hospedeira comodefinida na reivindicação 5.

10. Organismo não humano transgênico de acordo com areivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito organismo transgêniconão humano é uma planta.

11. Método para a fabricação de um lipídeo ou um ácidograxo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) cultivar (i) a célula hospedeira como definida nareivindicação 5 ou o organismo não humano transgênico como definido nareivindicação 9 ou 10 (ii) uma célula hospedeira ou um organismotransgênico não humano que expressa um polinucleotídeo que compreendeuma seqüência de ácido nucleico como mostrado na SEQ ID N°: 4 ou 6 ouuma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo umaseqüência de aminoácido como mostrado na SEQ ID N°: 5 sob condições quepermitem a síntese do dito lipídeo ou ácido graxo; e(b) obter o dito lipídeo ou ácido graxo a partir da célulahospedeira ou o organismo não humano transgênico.

12. Método para a fabricação de uma planta tendo umaquantidade modificada de um composto de armazenagem de semente,caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) introduzir o polinucleotídeo como definido nareivindicação 1 ou 2 ou o vetor como definido na reivindicação 3 ou 4 ou umpolinucleotídeo que compreende uma seqüência de ácido nucleico comomostrado na SEQ ID N°: 4 ou 6 ou uma seqüência de ácido nucleico quecodifica um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido como mostradona SEQ ID N°: 5 em uma célula vegetal; e(b) geração de uma planta transgênica a partir da dita célulavegetal, em que o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo modifica aquantidade do dito composto de armazenagem de semente na plantatransgênica.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que a quantidade do dito composto de armazenagem de semente éaumentada em comparação com uma planta de controle não transgênica.

14. Método de acordo com a reivindicação' 12 ou 13,caracterizado pelo fato de que o dito composto de armazenagem de semente éum lipídeo ou um ácido graxo.