CN107087416A

CN107087416A - 变体硫酯酶及使用方法

Info

Publication number: CN107087416A
Application number: CN201580040932.1A
Authority: CN
Inventors: R·巴特; D·戴维斯; S·富兰克林; J·L·莫斯利
Original assignee: Tara Rhea Holding Co
Current assignee: Kirbyn Biotech Corp
Priority date: 2014-07-24
Filing date: 2015-07-24
Publication date: 2017-08-22
Also published as: EP3172320A1; BR112017001404A2; US20200131544A1; US20160032332A1; ES2772123T3; EP3172320B1; US20180148747A1; WO2016014968A1; US10760106B2; US20190249208A1; EP3660149A1; US9765368B2; US10570428B2; US10246728B2

Abstract

本发明涉及变体硫酯酶以及其在植物中的用途，例如，用于增加酶活性并促进中链长度脂肪酸(例如8至14个碳)的增加的生产并处于所希望的比。在此进一步披露的是通过生产新颖的三酸甘油酯油，随后将这些油进行化学修饰来生产可再生化学品的方法。还披露了包含脂肪酸链长度为C8、C10、C12或C14的油并且这些油作为在此所描述的方法中的原料是有用的。

Description

变体硫酯酶及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2014年7月24日提交的美国临时申请号62/028,641的权益，出于所有目的将该文献通过引用以其全文结合在此。本申请在技术上与2014年1月29日提交的并且名称为“变体硫酯酶及使用方法(Variant Thioesterases andMethods of Use)”的PCT/US 2014/013676的主题相关，该文献通过引用以其全文结合在此。

发明领域

本发明涉及变体酰基-ACP硫酯酶以及其在产油细胞中的用途，例如以增加对某些酰基-ACP底物的酶活性并且促进增加具有所希望的脂肪酸谱的油的产生。

发明背景

当今，显著地除了通过微生物发酵商业生产ω-3脂肪酸用于婴幼儿配方奶粉及营养补充剂中之外，脂肪和脂肪酸主要来自植物和动物来源。然而，在使用重组微藻商业生产定制油的方向上正取得进展。参见PCT公开物WO 2008/151149、WO 2010/06032、WO 2011/150410、WO 2011/150411、以及国际专利申请PCT/US 12/23696。

用于在产油生物体中生产所希望的脂肪酸谱的一种方法是引入酰基-ACP硫酯酶转基因；例如来自产生所希望的脂肪酸的植物的转基因。

通过终止脂肪酸生物合成，该酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)在功能性地决定了该脂肪酸最终产品的长度和一致性(萨拉斯(Salas)等人，(2002)《生物化学与生物物理集刊》(Archives of Biochemistry and Biophysics)403:25–34)。基于氨基酸序列比对，这些植物TE已经显示集群至两个家族：FatA，其显示显著的对于18:1-ACP的偏爱，它对于18:0-和16:0-ACP具有较小活性；和FatB，其主要水解具有在8–16个碳之间变化的链长度的饱和酰基-ACP(尔克(Voelker)，在《基因工程》(Genetic Engineering)第18卷.由塞特洛(Setlow)JK.编辑纽约，纳姆出版社(Plenum Press)；1996:111-133中；吉娜斯基(Ginalski)，等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)(2003)31:3291-3292；以及琼斯(Jones)，等人，(1995)《植物细胞》(Plant Cell)7:359–371)。FatB TE具有一个保守的疏水性18-氨基酸结构域(法茨乔蒂(Facciotti)和袁(Yuan)(1998)《欧洲脂质科学与技术杂志》(European Journal of Lipid Science and Technology)100:167–172)，以及一个在C-末端催化结构域中的保守的Asn-His-Cys催化三联体(布拉蒂(Blatti)，等人，《公共科学图书馆·综合》(PLoS ONE)(2012)7(9):e42949.doi:10.1371以及迈尔(Mayer)和尚克林(Shanklin)，《BMC植物生物学》(BMC Plant Biology)(2007)7:1-11)。迈尔(Mayer)和尚克林(Shanklin)，《BMC植物生物学》(BMC Plant Biology)(2007)7:1-11，鉴定以包含Cys-His-Asn催化三联体的C-末端热狗式折叠(hot dog fold)为特征的C-末端保守的酰基-ACP硫酯酶催化结构域。

概述

提供了非天然蛋白质，编码该非天然蛋白质的分离的基因，表达该非天然蛋白质的表达盒，或包括该表达盒的宿主细胞。在一些实施例中，该非天然蛋白质与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，并且在对应于SEQ ID NO:1的位置163的位置处包括酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)，和/或在对应于SEQ ID NO:1的位置186的位置处包括脯氨酸(P)、赖氨酸(K)、或丙氨酸(A)。在一些实施例中，该非天然蛋白质进一步地在对应于SEQ ID NO:1的位置228的位置处包括赖氨酸(K)。

在相关方面，提供了用于生产三酸甘油酯油的方法。在不同的实施例中，这些方法包括在宿主细胞中表达上文刚才所提及的蛋白质或如下蛋白质，该蛋白质与SEQ ID NO:3-8之一包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，该蛋白质在对应于SEQ ID NO:1的位置163的位置处具有Y或F，和/或在对应于SEQ IDNO:1的位置186的位置处具有P、K、或A。在一些实施例中，该非天然蛋白质进一步地在对应于SEQ ID NO:1的位置228的位置处包括K。该方法进一步地包括培养该宿主细胞并分离该油。

在另一方面，提供了在由任选的产油宿主细胞产生的油的脂肪酸谱中用于增加C8和/或C10脂肪酸的方法。该方法包括，提供编码FATB酶的亲本基因，使该基因突变以在对应于SEQ ID NO:1的位置163的位置处具有Y或F，和/或在对应于SEQ ID NO:1的位置186的位置处具有P，K或A。在一些实施例中，该非天然蛋白质进一步地在对应于SEQ ID NO:1的位置228的位置处包括K。在不同的实施例中，该方法进一步地包括在该宿主细胞中表达该突变基因并产生该油。因此，相对于该亲本基因，该油的脂肪酸谱在C8和/或C10脂肪酸方面增加了。任选地，编码该FATB酶的基因编码如下蛋白质，该蛋白质与SEQ ID NO:1、13或14具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。

在实施例中，提供了非天然蛋白质，编码该非天然蛋白质的分离的基因，表达该非天然蛋白质的表达盒，或包括该表达盒的宿主细胞。在不同的实施例中，该非天然蛋白质与SEQ ID NO:13具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，并且在对应于SEQ ID NO:13的位置230的位置处具有A或K。用于生产油的方法包括在宿主细胞中表达本文所述的非天然蛋白质，培养细胞并分离油。

在另一方面，提供了非天然蛋白质，编码该非天然蛋白质的分离的基因，表达该非天然蛋白质的表达盒，或包括该表达盒的宿主细胞。在一些实施例中，该非天然蛋白质与SEQ ID NO:45具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，并且在对应于SEQ ID NO:45的位置74的位置(野生型Gm FATA的G96)处包括A、T或V，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置69的位置(野生型Gm FATA的L91)处包括F、K或S，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置134的位置(野生型Gm FATA的T156)处包括F、A、K或V。在一些实施例中，该非天然蛋白质进一步地在对应于SEQ ID NO:45的位置89的位置(野生型Gm FATA的S111)处包括A或V，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置171的位置(野生型GmFATA的V193)处包括A，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置86的位置(野生型Gm FATA的G108)处包括A或V。

在另外的方面，提供了用于生产三酸甘油酯油的方法。在不同的实施例中，该方法包括在宿主细胞中表达权利要求7或权利要求8所述的蛋白质或如下蛋白质，该蛋白质与SEQ ID NO:45和15-29之一包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，并且在对应于SEQ ID NO:45的位置74的位置(野生型Gm FATA的G96)处包括A、T或V，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置69的位置(野生型Gm FATA的L91)处包括F、K、或S，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置134的位置(野生型Gm FATA的G156)处包括F、A、K或V；培养宿主细胞；并分离油。在一些实施例中，该蛋白质进一步地在对应于SEQID NO:45的位置89的位置(野生型Gm FATA的S111)处包括A或V，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置171的位置(野生型Gm FATA的V193)处包括A，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置86的位置(野生型Gm FATA的G108)处包括A或V。

在另一方面，提供了在由任选的产油宿主细胞产生的油的脂肪酸谱中用于增加C18:0脂肪酸的方法。在一些实施例中，该方法进一步包括提供编码FATB酶的亲本基因，使该基因突变以在对应于SEQ ID NO:45的位置74的位置(野生型Gm FATA的G96)处包括A、T或V，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置69的位置(野生型Gm FATA的L91)处包括F、K、或S，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置134的位置(野生型Gm FATA的T156)处包括F、A、K或V；在宿主细胞中表达该突变基因；并产生油，由此相对于亲本基因，脂肪酸谱在C18:0脂肪酸方面增加了。在不同的实施例中，该方法需要进一步地使该基因突变以在对应于SEQ IDNO:45的位置89(野生型Gm FATA的S111)的位置处具有A或V，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置171的位置(野生型Gm FATA的V193)处具有A，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置86的位置(野生型Gm FATA的G108)处具有A或V。在一些实施例中，编码该FATB酶的基因编码如下蛋白质，该蛋白质与SEQ ID NO:45和15-29之一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。

定义

“酰基-ACP硫酯酶”或“酰基-ACP TE”可以互换地指代在脂质合成过程中催化脂肪酸从酰基载体蛋白(ACP)的切割的酶。酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)水解酰基-ACP硫酯键，释放游离脂肪酸和ACP。

该术语“酰基-ACP偏好型TE”是指TE的脂酰基-ACP底物特异性。酰基-ACP偏好型TE优先释放来自酰基-ACP底物的特定脂肪酸。例如，相对于C18:0、C10:0、C12:0、C14:0、C16:0、C18:0、C18:1和C18:2脂肪酸的组中的所有其他脂肪酸，该酰基-ACP偏好型TE可以优先释放给定的脂肪酸。与其他非优选的脂肪酸-ACP底物相比，可以将酰基-ACP偏好型TE的优选项检测为更高的V_max(或更高的k_cat或更高V/K)。该优选项可以从相对于对照细胞(该对照细胞不会过表达酰基-ACP偏好型TE)经基因工程化以过表达酰基-ACP偏好型TE的细胞的脂肪酸谱中的变化进行推断。

当任何给定聚合物组分(例如氨基酸、核苷酸，也通称为“残基”)的位置是通过参照所选择的氨基酸或核酸聚合物中的相同或等效位置(例如基于最优比对或共有序列)而指定，而并非通过在该给定聚合物中该组分的实际编号位置而指定时，给定的氨基酸聚合物或核酸聚合物的编号“对应于”或是“相对于”一种所选择的氨基酸聚合物或核酸聚合物的编号。

“变体”是包括如下序列的多肽，该序列与亲本多肽序列的序列具有一个或多个氨基酸位置差异(例如，通过取代、缺失、或插入)。变体可以包括如下的序列，该序列与亲本多肽序列具有多达40％的该亲本多肽序列残基总数如多达40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的亲本多肽序列残基总数的差异。例如，400个氨基酸多肽序列的变体包括如下的序列，该序列具有多达40％的该亲本多肽序列残基总数的差异，即在该400个氨基酸多肽序列之内具有多达160个氨基酸位置(如在参考序列之内具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、78、79、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、或160个氨基酸位置)的差异。

“天然存在的”当应用于组合物时，该组合物可在自然界中被发现，有别于由人类人工产生的那种。例如，生物体(包括病毒、细菌、原生动物、昆虫、植物或哺乳动物的组织)中存在的、可从自然界中的来源中分离的并且尚未被人类在实验室中有意修饰的多肽或多核苷酸是天然存在的。“非天然存在的”(还称作“合成的”或“人工的”)当应用于一种对象时，意指该对象不是天然存在的-即，该对象不能在自然界中被发现而有别于由人类人工产生的那种。

“细胞油”或“细胞脂肪”应当是指从生物体获得的主要含三酸甘油酯的油，其中该油未经历与另一种天然油或合成油掺混，或分馏以实质上改变该三酸甘油酯的脂肪酸谱。结合一种包括了具有特定区域特异性的三酸甘油酯的油，该细胞油或细胞脂肪未经历酯交换或其他合成工艺以致未获得该区域特异性三酸甘油酯谱，而是由一个细胞或细胞群天然地产生区域特异性。对于由细胞产生的细胞油或细胞脂肪而言，油的固醇谱通常通过细胞产生的固醇来确定，而不是通过添加固醇以便模拟该细胞油进行该油的人工重建来确定。结合细胞油或细胞脂肪，并且如本披露通篇总体上所使用，术语油和脂肪可互换地使用，除非另作注释。因此，“油”或“脂肪”取决于该物质的组成和其他条件，在室温下可以是液体、固体或部分固体的。在此，术语“分馏”表示以相对于由生物体所产生的谱而改变其脂肪酸谱的方式来从该油去除物质，不管用何种方法完成。术语“细胞油”和“细胞脂肪”包括如从生物体获得的油，其中该油已经历最低限度的不实质上改变其三酸甘油酯谱的加工，包括精炼、漂白和/或脱胶。细胞油还可以是“非酯交换的细胞油”，表示该细胞油未经历这样一种加工，其中脂肪酸与甘油的酰基连接被重新分布且基本上保持了与从生物体中回收时相同的构型。

“脂肪酸谱”是在不参考与甘油主链的连接的情况下，该油的三酸甘油酯中脂肪酰基的分布。脂肪酸谱典型地是通过转化成脂肪酸甲酯(FAME)，随后进行气相色谱(GC)分析与火焰离子化检测(FID)来确定。脂肪酸谱可以表示为由一种脂肪酸的曲线下面积测定的总脂肪酸信号中该脂肪酸的一个或多个百分比。FAME-GC-FID测量值近似为这些脂肪酸的重量百分含量。

“微藻”是包含叶绿体或质体并且任选地能够进行光合作用的微生物生物体，或能够进行光合作用的原核微生物生物体。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光能自养生物，以及能够仅以固定碳源为生的异养生物。微藻包括在细胞分裂后不久与姊妹细胞分开的单细胞生物体，如衣藻属，以及微生物，如例如，团藻属，它是由两种不同细胞类型构成的简单多细胞光合微生物。微藻包括真核藻类如小球藻属、杜氏藻属以及无绿藻属。微藻还包括显示出细胞-细胞粘附的其他微生物光合性生物体，例如阿格门氏藻属(Agmenellum)、鱼腥藻属、以及桑椹藻属(Pyrobotrys)。微藻还包括专性异养微生物，它们已经丧失进行光合作用的能力，如某些双鞭甲藻属(dinoflagellate)藻类物种和无绿藻属(Prototheca)物种。

“产油”细胞是天然地或通过重组或经典株系改良能够产生按细胞干重计的至少20％脂质的非人细胞。“产油微生物”或“产油微生物体”是一种微生物，包括产油的微藻。

相对于多肽或多核苷酸，如所使用的术语“分离的”是指已经从典型地具有该多肽或多核苷酸的至少一种其他组分中分离的多肽或多核苷酸。因此，一种天然存在的多肽是分离的，如果它已经从伴随该多肽或多核苷酸天然存在的至少一种其他组分中纯化出来的话。一种重组多肽或多核苷酸是分离的，如果它已经从当产生该多肽或多核苷酸时存在的至少一种其他组分中纯化出来的话。

在此可互换使用术语“多肽”和“蛋白质”，以指代氨基酸的聚合物，并且除非另外限制，否则包括可以按类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的非典型氨基酸。

如结合多肽或核酸聚合物所使用的术语“序列”是指组成聚合物或亚-聚合物的单体的顺序或具有该序列的片段。

氨基酸或核苷酸序列的“子序列”是更大的序列或肽或核酸亚-聚合物的一部分或由该更大的序列的部分表征的片段。

在两个或更多个氨基酸或核苷酸序列的背景下，术语“一致的”或“百分比一致性”是指如使用序列比较算法或通过目测进行测量，当比较和比对最大相应性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。

对于确定核苷酸或氨基酸一致性百分比的序列比较，一个序列一般充当参考序列，检验序列与之比较。当使用序列比较算法时，把测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。基于指定的程序参数，序列比较算法随后相对于参考序列计算检验序列的序列一致性百分比。用于比较的最佳序列比对可以使用设置为默认参数的BLAST来进行。

如关于多肽所使用的术语“野生型”是指任何具有存在于来自天然存在的生物体的多肽中的氨基酸序列的多肽，而不论该分子的来源；即，术语“野生型”是指序列特征，而不论该分子是否从天然来源中纯化；重组表达，随后纯化；或合成。

该术语“突变”意指通过改变编码蛋白质、多肽、或肽的核苷酸中的一个或多个核苷酸而产生的蛋白质、多肽、或肽序列或子序列中的变化，然而该改变是获得的。例如，一种突变可以通过PCR突变、通过整个基因的合成、或任何其他方法随机地产生。

在此使用术语“载体”以描述包含多核苷酸的DNA构建体。这种载体可以稳定地或瞬时地在一种宿主细胞中被繁殖。该载体可以例如是质粒、病毒载体、或简单地一种潜在的基因组插入片段。一旦导入适合的宿主中，该载体可以独立于该宿主基因组复制和起作用，或在一些情况下可以整合到宿主基因组中。

如在此使用的，术语“表达载体”或“表达构建体”或“表达盒”是指重组或合成产生的核酸构建体，带有允许特定核酸在宿主细胞中转录的一系列指定核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒、或核酸片段的部分。“表达盒”包括可操作地连接于启动子和3’UTR的待转录的编码核酸(CDS)。任选地，并在下文的实例中，表达盒的启动子是异源启动子。

“外源基因”是指转化到细胞中的核酸。相对于正在转化的细胞，外源基因可以来自不同的物种(并因而是异源的)，或来自相同的物种(并因而是同源的)。就外源基因来说，其相对于该基因的内源拷贝占据细胞基因组中不同位置。该外源基因可以在细胞中以多于一个拷贝存在。该外源基因可以在细胞中作为基因组中的插入片段或作为游离型分子而维持。

“诱导型启动子”是响应于特定刺激介导可操作地连接的基因的转录的启动子。

如在此使用的，短语“处于可操作连接”是指两个序列(如控制序列(典型地是启动子)和连接序列)之间的功能性连接。如果某启动子可以介导外源基因的转录，则该启动子与这个基因处于可操作的连接。

将“启动子”定义为可指导核酸转录的一段核酸控制序列。如在此使用的，启动子包括转录起始位点附近必需的核酸序列，如，在聚合酶II型启动子的情况下，TATA元件。启动子也任选地包括远端增强子或阻抑物元件，它们可以距转录起始位点远达几千碱基对存在。

如在此使用的，术语“重组”当用于指例如一种细胞、核酸、蛋白或载体时表明该细胞、核酸、蛋白或载体已经通过导入外源核酸或蛋白或者改变天然的核酸或蛋白进行修饰，或者表明该细胞衍生自这样修饰的细胞。因此，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内部找不到的基因，或表达天然基因，否则这些天然基因异常表达、过表达、低表达或根本不表达。如在此使用的“重组核酸”是指最初通过使用实验室方法合成的核酸分子，由此产生通常未发现于自然界中的核酸序列。通过使用实验室方法，实现了与不同序列(例如，启动子、靶向序列等)可操作连接的重组核酸分子。因此，出于本发明的目的，通过连接正常情况下不连接的DNA分子在体外形成的处于线性形式的分离核酸或表达载体均被认为是重组体。应当理解，一旦制备重组核酸并将其重新引入宿主细胞或生物体中，该重组体将非重组地复制，即，使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作；然而，此类核酸一旦重组产生，尽管随后非重组地复制，但仍然被认为是用于本文目的的重组体。类似地，“重组蛋白”是使用重组技术，即，通过表达如上描绘的重组核酸所产生的蛋白质。

“转运肽”是如下氨基酸序列，该氨基酸序列指导融合至信号序列的多肽的运输。关于表达该多肽的质体细胞，该转运肽可以指导该多肽至该质体的运输(即，质体靶向肽)。

术语“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则包括可以按类似于天然存在的核苷酸的方式发挥作用的天然核苷酸的已知类似物。术语“多核苷酸”是指任何形式的DNA或RNA，包括例如基因组DNA；互补性DNA(cDNA)，其是mRNA的DNA表示，通常通过信使RNA(mRNA)的反转录或扩增获得；合成地或通过扩增产生的DNA分子；以及mRNA。术语“多核苷酸”包括双链核酸分子以及单链分子。在双链多核苷酸中，这些多核苷酸链无需是共同延伸的(即，双链多核苷酸无需沿着两条链的整个长度都是双链的)。

术语“宿主细胞”是指能够瞬时地或稳定地维持载体的细胞。宿主细胞包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、藻类细胞(例如微藻细胞)、植物细胞以及哺乳动物细胞。本领域中已知的或变得已知的其他宿主细胞也适合于在本发明中使用。

如在此使用的，术语“互补性”是指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果在核酸分子的给定位置处的核苷酸能够与另一个核酸分子的核苷酸杂交，那么这两个核酸分子被认为在该位置处是彼此互补的。术语“基本上互补”描述了彼此充分互补以允许在严格杂交条件下特异性杂交的序列。在不同的实施例中，可以将编码下文披露的变体FATB基因的变体基因用具有合适活性的基本上互补的基因替换。

短语“严格杂交条件”通常是指在限定的离子强度和pH下，低于特定序列的熔解温度(Tm)大约5℃的温度。适合用于实现大多数序列的特异性杂交的示例性严格条件是在pH7.0下至少约60℃的温度和约0.2摩尔的盐浓度。

附图的简要说明

图1示出了细叶萼距花FATB2与艾薇格萼距花FATB1的序列比对，示出了这些硫酯酶之间在其N-末端特异性结构域内的两个氨基酸差异；

图2A-B示出了(A)从萼距花属基因组分离的FATB硫酯酶的序列比对。突出显示保守的甲硫氨酸相对于催化三联体(Cys、His和Asn)和N-末端特异性结构域的位置；和(B)围绕突出的甲硫氨酸的Cpal FATB1、Ch FATB2和Ca FATB1的序列比较。Ca FATB1是独特的，因为存在赖氨酸而不是甲硫氨酸；并且

图3A-E示出了微藻油的C8-C14脂肪酸谱的直方图，该图具有野生型和位置228变体细叶萼距花FATB2(ChFATB2)、艾薇格萼距花FATB1(CaFATB1)的多个转化体的平均值和中值，这些值偏离基于来自大肠杆菌模型的先前数据的预测。

发明详细说明

引言

在说明性实施例中，本文所述的变体FATB酰基-ACP硫酯酶允许控制酰基-ACP硫酯酶底物特异性。结果，表达酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞产生具有改变的脂肪酸谱的油。在某些实施例中，表达变体酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞产生具有特征为升高的中链脂肪酸如C8:0、C10:0、C12:0、和C14:0脂肪酸的脂肪酸谱的富含甘油三酯的细胞油。具体的实施例包括提供FATB酰基-ACP硫酯酶基因，时该基因突变以改变基因产物中对应于参考细叶萼距花FATB2基因(SEQ ID NO:1)的H163和/或L186的位置处的氨基酸。任选地，将H163和/或L186突变体与M228处的突变组合。

如在实例1中更详细所描述的，通过表达稳定整合在产油质体细胞的细胞核中的这种变体FATB2基因，在C8:0产量、C8:10产量或C8:0和C10:0的产量之和方面，我们产生了超过表达野生型ChFATB2的对照株系的株系，包括产生具有脂肪酸谱的油的株系，其中C8和C10产量超过该谱的9％、11％、14％或18％。在后一种情况下，相对于野生型ChFATb2株系的大约8％C8+C10，C8+C10(即，通过具有FID检测的FAME-GC测定的脂肪酸谱中C8:0和C10:0的产量的总和)水平增加了一倍以上。具有改进的C8+C10产量的具体变体包括具有以下各项的那些：在186位置处的P、K或A；在163位置处的Y或F，或其组合，如186P/163Y、186P/163F、186K/163Y、186K/163F、186A/163Y或186A/163F。在双突变体中，我们发现H163Y/L186P变体产生具有特别高浓度的C8+C10的油。使用单变体或双变体，相对于表达野生型ChFATB2的对照株系，C8:0脂肪酸谱百分比可以增加50％、60％、70％、80％、100％或更多；例如至大于脂肪酸谱的2％、2.5％、3％或3.5％，而对照(参见实例1)为1.5％。

还可以将上面列出的双突变体与对应于湿地萼距花FATB1的230的第三个突变组合。对于许多FATB基因如细叶萼距花FATB2和艾薇格萼距花FATB1，该残基对应于残基228。例如，在产油真核微藻中表达的细叶萼距花FATB2中的M228K突变将油的脂肪酸谱中的C8/C10比从约0.25提高至约1.0。结合上述讨论的位置186和163处的单突变或双重突变，在这个位置上突变至Iso、Val、Phe，和Leu、Ala或Thr也是有利的。

虽然细叶萼距花FATB2用作模型系统，但是制备上述突变的方法，在产油细胞中表达这些突变的方法，以及用这些变体生产油的方法可以应用于任何酰基-ACP硫酯酶基因，该酰基-ACP硫酯酶基因包括与SEQ ID NO:1或缺少该转运肽的SEQ ID NO:1的片段具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的那些。

尽管这些变体基因是使用真核微藻表达系统发现的，但是这些基因在本领域已知的方式中通常更有用，包括它们在高等植物中表达以产生改变的三酸甘油酯油。当被掺入产油细胞(例如，一种油籽植物、藻类(例如微藻))中时，该变体硫酯酶可以改变细胞的脂肪酸谱以产生新颖或更经济的高价值商业产品。

可以使用单、双或三突变体产生具有高C8:0与C10:0脂肪酸比的油。例如，C8/10比可以等于或大于0.3、0.5、0.7、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8或3.0。

这些实施例还涵盖在提取油之后来自此类细胞的残留生物质；由这些油制造的油脂化学品、燃料及食品；以及培养这些细胞的方法。在不同实施例中，这些细胞是微藻细胞(包括异养或专性异养细胞)，以及被分类为绿藻门、共球藻纲、小球藻目、小球藻科、或绿藻纲的细胞。这些细胞还可以是植物细胞或微藻细胞。具有II型脂肪酸合成途径的宿主细胞是优选的。尽管以下给出的实例使用四胞藻纲(Trebouxiophyte)桑椹型无绿藻作为宿主细胞，但所披露的这些基因、构建体和方法披露也可以用于油籽作物中。将这些基因导入至此类作物(如大豆、玉米、油菜籽、红花、向日葵等)中的方法在本领域中是已知的；参见例如美国专利号6331664、5512482、5455167、5667997。油化学品的实例包括表面活性剂和由脂肪酸或油制成的溶剂。

相应地，在实施例中，提供的是非天然蛋白质，编码该非天然蛋白质的分离的基因，表达该非天然蛋白质的表达盒，或包括该表达盒的宿主细胞，其中该非天然蛋白质与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，并且在对应于SEQ ID NO:1的位置163的位置处包括Y或F，和/或在对应于SEQID NO:1的位置186的位置处包括P、K、或A，并且任选地在对应于SEQ ID NO:1的位置228的位置处包括K。

在相关实施例中，有用于生产三酸甘油酯油的方法。该方法包括在宿主细胞中表达上文不久所述的蛋白质或如下蛋白质，该蛋白质与SEQ ID NO:3-8之一包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，该蛋白质在对应于SEQ ID NO:1的位置163的位置处具有Y或F，和/或在对应于SEQ ID NO:1的位置186的位置处具有P、K、或A，并且任选地在对应于SEQ ID NO:1的位置228的位置处具有K。该方法进一步地包括培养该宿主细胞并分离该油。

在另一个实施例中，提供了在由任选的产油宿主细胞产生的油的脂肪酸谱中用于增加C8和/或C10脂肪酸的方法。该方法包括，提供编码FATB酶的亲本基因，使该基因突变以在对应于SEQ ID NO:1的位置163的位置处具有Y或F，和/或在对应于SEQ ID NO:1的位置186的位置处具有P，K或A，并且任选地在对应于SEQ ID NO:1的位置228的位置处具有K。该方法进一步地包括在该宿主细胞中表达该突变基因并产生该油。因此，相对于该亲本基因，该油的脂肪酸谱在C8和/或C10脂肪酸方面增加了。任选地，编码该FATB酶的基因编码如下蛋白质，该蛋白质与SEQ ID NO:1、13或14具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。

如在实例3中详细描述的，与大肠杆菌中的现有技术工作相比，在C8+C10产量和/或增加的C8/C10比方面，发现在Cpal FATB1(SEQ ID NO:13)的位置230处使用Ala或Thr的优点，是新的和意想不到的。这些新颖的突变可单独使用，与位置163处的突变(包括本文公开的有利于C8的突变)组合、与位置186处的突变(包括本文披露的有利于C8的突变)组合、或与位置163和186处的二重突变(包括本文披露的有利于C8的突变)组合使用。相应地，在实施例中，有非天然蛋白质，编码该非天然蛋白质的分离的基因，表达该非天然蛋白质的表达盒，或包括该表达盒的宿主细胞，其中该非天然蛋白质与SEQ ID NO:13具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，并且在对应于SEQID NO:13的位置230的位置处具有A或K。用于生产油的方法包括在宿主细胞中表达本文所述的非天然蛋白质，培养细胞并分离油。

变体酰基-ACP硫酯酶

可以在具有一种或多种外源基因的遗传构建体和基因工程化产油细胞(例如植物、藻类、微藻)中使用该变体TE以产生脂肪酸、酰基甘油、或其衍生物。例如，会天然地或通过基因修饰产生高水平脂质的微藻或油籽作物可以被工程化(或进一步工程化)以表达外源变体脂酰基-ACP硫酯酶，该硫酯酶可以在脂肪酸合成过程中促进脂肪酸从酰基载体蛋白(ACP)的切割。这些合成的脂肪酸可以被掺入到酰基甘油酯(包括三酰甘油酯(TAG，三酸甘油酯))中。这些TAG可以被回收或通过在细胞内、或在体外进一步的酶促加工产生其他有用的化合物。

在实施例中，基于针对正在生长的(在脂肪酸合成期间)具有特定碳链长度的脂酰基所希望的特异性设计这些变体脂酰基-ACP硫酯酶。特异性结构域是基于其对于具体脂酰基ACP底物的偏好和/或针对其影响、增加和/或促进所希望的碳链长度的脂肪酸的生产的能力选择的。通常，这些变体脂酰基-ACP硫酯酶具有用于中链ACP-脂酰基底物(例如以释放C8、C10、C12、和/或C14脂肪酸)的优先的底物特异性。在不同实施例中，酰基-ACP硫酯酶的N-末端中的特异性结构域对于C-末端催化结构域是异源的(例如由于点突变和/或结构域交换)。在某些实施例中，脂肪酸链长度底物特异性和/或特异性结构域的偏好以及催化结构域是相同的或在1-2个碳之内。例如，在不同实施例中，该变体酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)包括：

针对表达的密码子优化

编码待在微生物中表达的多肽(例如变体酰基-ACP硫酯酶和选择标记)的DNA可以是密码子优化的cDNA。再编码用于在微藻中表达的基因的方法描述于美国专利号7,135,290中。密码子优化的额外信息是可获得的，例如，在kazusa.or.jp/codon/的密码子使用数据库处获得。无绿藻属优选的密码子使用的表格也提供于美国专利公开号2012/0283460中，其表1通过引用结合在此。

表达并靶向质体

可以使用质体靶向信号，将无绿藻属的核基因组中表达的蛋白质靶向质体。相对于小球藻为内源的质体靶向序列是已知的，如在小球藻核基因组中编码被靶向至质体的蛋白质的基因；参见例如GenBank登录号AY646197和AF499684，并且在一个实施例中，这样的控制序列用于本文所述的载体中，例如，将蛋白质表达靶向到无绿藻属质体中。

以下实例描述了藻质体靶向序列将异源蛋白质靶向到宿主细胞内正确区室的用途。cDNA文库是使用桑椹型无绿藻和原壳小球藻细胞制得，并且描述于美国专利公开号2012/0283460的实例中以及PCT申请号PCT/US2009/066142中。从重组表达的变体酰基-ACP硫酯酶的有用的质体靶向的cDNA文库中鉴定的藻类质体靶向序列的氨基酸序列提供于美国专利公开号2012/0283460中以及此处。在不同实施例中，该质体转运肽包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRA，SGPRRPARPLPVR，SGPRRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR，RPARPLPVRGRA，RPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR，RCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRA，RCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR，PARPLPVR，PARPLPVRAAIASEVPVATTSPR，RRPARPLPVR，以及RRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR。

当本文披露了新颖的FATB变体时，应当理解，可以使用多种异源质体转运肽。换句话说，非靶向肽结构域是更高度保守的。相应地，本文所述的实施例的特征在于具有或不具有质体靶向序列的新颖的FATB酶促结构域。例如，当本文给出与新颖FATB基因的百分比一致性时，可以将相同的一致性(如果指定)应用于没有靶向肽的相同序列。替代靶向肽可以任选地与这样的序列结合使用。

宿主细胞-生产油或生产脂质的微生物

可以使用生产适合的脂质和/或烃的任何物种的生物体，但优选天然生产高水平的适合的脂质和/或烃的微生物。通过微生物生产烃由梅茨格(Metzger)等人《应用微生物学与生物技术》(Appl Microbiol Biotechnol)(2005)66:486-496以及《美国能源部水生生物计划回顾：来自藻类的生物柴油》(A Look Back at the U.S.Department of Energy'sAquatic Species Program:Biodiesel from Algae)，NREUTP-580-24190，约翰希恩(JohnSheehan)，特里度纳罕(Terri Dunahay)，约翰本曼(John Benemann)以及保罗罗斯勒(PaulRoessler)(1998)综述。

除了产生适合的脂质或烃用于生产油、燃料和油脂化学品之外，微生物选择的考虑事项包括：(1)作为细胞重量百分比的高脂质含量；(2)易于生长；(3)易于进行基因工程；和(4)易于进行生物质加工。在具体实施例中，野生型或基因工程化的微生物产生了含有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％或更多脂质的细胞。优选的生物体(在不存在光时依赖糖)异养生长或可以使用例如在此所披露的方法被工程化以进行异养生长。转化的方便性以及选择性标记和在微生物中有功能的组成型或诱导型启动子的可获得性影响基因工程化的方便性。加工考虑事项可包括例如裂解细胞的有效手段的可用性。

A.藻类

在一个实施例中，该微生物是微藻。可以用于表达变体酰基-ACP硫酯酶的微藻的非限制性实例包括，例如，东方曲壳藻、阿格门氏藻属(Agmenellum)、透明苗形藻(Amphiprora hyaline)、咖啡形双眉藻、咖啡形线状双眉藻、咖啡形双眉藻斑点变种(Amphora coffeiformis punctata)、泰勒氏咖啡形双眉藻、咖啡形细薄双眉藻、优美双眉藻、柔弱头状双眉藻属、双眉藻属、鱼腥藻、纤维藻属、镰形纤维藻、黄金色藻(Boekeloviahooglandii)、波氏藻属(Borodinella sp.)、布朗丛粒藻、苏台德克斯丛粒藻(Botryococcus sudeticus)、米诺尔丛粒藻(Bracteococcus minor)、Bracteococcusmedionucleatus、四鞭藻属、纤细角毛藻、牟氏角毛藻、三角牟氏角毛藻、角毛藻属、无硝小球藻(Chlorella anitrata)、南极洲小球藻、黄绿小球藻、念球菌小球藻、囊状小球藻、干燥小球藻、髓圆形小球藻、浮水小球藻、淡褐小球藻、淡褐小球藻空泡变种、格鲁克特法小球藻(Chlorella glucotropha)、水溪小球藻、水溪海岸螺亚目小球藻变种、水溪小球藻增大变种(Chlorella infusionum var.auxenophila)、纺锤小球藻、匍扇小球藻(Chlorellalobophora)(株系SAG 37.88)、柠檬小球藻、黄绿柠檬小球藻变种、黄衣柠檬小球藻变种、小枝小球藻、极微小球藻、突变小球藻、夜间小球藻、卵圆小球藻(Chlorella ovalis)、微细小球藻、嗜光小球藻、勃氏小球藻、原壳小球藻(包括任何UTEX株系1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25)、原壳小球藻酸居变种、规则小球藻、规则小球藻极小变种、规则小球藻伞状变种、瑞氏小球藻(Chlorella reisiglii)、嗜糖小球藻、海洋小球藻捕圆变种、海水小球藻、单纯小球藻、耐热性小球藻、小球藻属、球抱小球藻、痣苔蛾属小球藻、万尼氏小球藻、普通小球藻、粗皮普通小球藻、普通小球藻自养变体、普通小球藻绿色变种、普通小球藻普通变种、粗皮普通小球藻普通变种、普通小球藻普通变种绿色变型(Chlorella vulgarisvar.vulgaris f.viridis)、黄色小球藻(Chlorella xanthella)、左氏小球藻(Chlorellazofingiensis)、他伯氏小球藻(Chlorella trebouxioides)、普通小球藻、水溪绿球藻、绿球藻属、绿梭藻属、蓝隐藻属、金球藻属、球钙板藻属、寇氏隐甲藻、隐藻属、隐秘小环藻、梅尼小环藻、小环藻属、杜氏藻属、巴氏杜氏藻、双绿球杜氏藻、颗粒状杜氏藻、海生杜氏藻、微小杜氏藻、巴夫杜氏藻、皮尔斯杜氏藻、普林莫杜氏藻(Dunaliella primolecta)、盐生杜氏藻、陆生杜氏藻、杜氏盐藻、绿色杜氏藻、特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)、绿色独球藻、独球藻属、后棘藻属、裸藻属、披剌藻属、绿色脆杆藻、脆杆藻属、蓝鼓藻属、丝藻属、膜胞藻属、等鞭金藻球亲近种(Isochrysis aff.galbana)、球等鞭金藻、鳞孔藻属、微星藻属、微星藻属(UTEX LB 2614)、微小单针藻、单针藻属、侏囊菌属、盐生微绿球藻、微绿球藻属、截形舟形藻、毕氏舟形藻(Navicula biskanterae)、假特氏舟形藻(Naviculapseudotenelloides)、具膜舟形藻(Navicula pelliculosa)、腐生舟形藻(Naviculasaprophila)、舟形藻属、肾鞭藻属、肾藻属、普通菱形藻(Nitschia communis)、亚历山大菱形藻、普通菱形藻(Nitzschia communis)、细端菱形藻、碎片菱形藻、汉氏菱形藻、平庸菱形藻、中型菱形藻、小头菱形藻、微小菱形藻、椭圆微小菱形藻、单刀形微小菱形藻、四边形菱形藻、菱形藻属、棕鞭藻属、小卵囊藻、卵泡藻、卵囊藻属、沼泽颤藻、颤藻属、拟短形颤藻、凯氏拟小球藻(ParaChlorella kessleri)、酸杜氏藻、巴夫藻属、噬菌体属、席藻属、扁藻、颗石藻、齿状颗石藻、颗石藻属、威克海姆无绿藻、雍滞无绿藻(Prototheca stagnora)、波多黎各无绿藻、桑椹型无绿藻、饶氏无绿藻、水生假小球藻(Pseudochlorella aquatica)、塔胞藻属(Pyramimonas sp.)、桑堪藻属(Pyrobotrys)、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)、囊状金藻(Sarcinoid chrysophyte)、被甲栅藻(Scenedesmus armatus)、裂壶藻属(Schizochytrium)、水绵属(Spirogyra)、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、裂丝藻属(Stichococcus sp.)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、四角藻属(Tetraedron)、四月藻属(Tetraselmis sp.)、司西四爿藻(Tetraselmis suecica)、威氏海链藻(Thalassiosiraweissflogii)、以及弗里德里恰氏绿毛藻(Viridiella fridericiana)。

说明性宿主细胞的特征在于产油细胞，这些产油细胞产生改变的脂肪酸谱和/或甘油脂中改变的脂肪酸区域特异性分布；以及由这些细胞产生的产物。产油细胞的实例包括了具有II型脂质生物合成途径的微生物细胞，包括质体产油细胞，如产油藻类的那些。细胞的特定实例包括绿藻门、四胞藻纲、小球藻目或小球藻科的异养或专性真核异养微藻。产油微藻的实例提供于公开的PCT专利申请WO 2008/151149、WO 2010/06032、WO 2011/150410及WO 2011/150411中，包括了小球藻属和无绿藻属(包括专性异养生物的属)的物种。产油细胞可以例如能够产生以细胞重量计25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％或约90％的油，±5％。以上提到的公开物还披露了用于培养此类细胞并提取油(尤其是从微藻细胞提取)的方法；此类方法适用于在此所披露的这些细胞。在此所描述的实施例的任一个中，这些细胞可以是包括外源转化酶基因的异养细胞，以便使这些细胞能够从蔗糖原料中生产油。

宿主细胞的说明性实施例包括表达一种或多种编码脂肪酸生物合成酶的外源基因的重组产油细胞。结果，一些实施例的特征在于在细胞油方面，之前从未获得的细胞油。在一些情况下，从非植物或非种子油无法获得或根本无法获得这些细胞油。

产油细胞产生如下储存油，该油可以被储存在细胞的储存囊泡中。可以由细胞，通过破坏细胞并分离出油来获得粗细胞油。如本领域中所知或如WO 2010/120939中所描述，所产生的油可以进行精炼、漂白并除臭(RBD)。粗油或RBD油可以被用于多种食品、化学品或工业产品或工艺中。在回收油之后，有价值的残留生物质保留下来。残留生物质的用途包括制造纸、塑料、吸收剂、吸附剂、作为动物饲料、用于人类营养或用于肥料。

在给出三酸甘油酯细胞油的脂肪酸谱的情况下，应当理解的是，这是指从细胞提取的储存油的未分级样品，该样品在已经去除磷脂的条件下或用基本上对磷脂的脂肪酸不敏感的分析方法(例如，使用色谱法和质谱法)进行分析。由于这些细胞是产油的，在一些情况下，储存油将构成该细胞中全部TAG的大部分。

在不同实施例中，该宿主细胞是质体细胞，例如，绿藻门(phylum Chlorpophya)、四胞藻纲(class Trebouxiophytae)、小球藻目(order Chlorellales)或小球藻科(familyChlorellacae)的异养微藻。在不同实施例中，该细胞是产油的并且按干细胞重量计能够积累至少40％的油。该细胞可以是专性异养的，如无绿藻属物种，包括桑椹型无绿藻或饶氏无绿藻。编码在此所描述的变体酰基-ACP TE的核酸也可以在自养藻类或植物中表达。任选地，该细胞能够使用蔗糖产生油并且可以引入重组转化酶基因以使蔗糖代谢，如PCT公开物WO 2008/151149、WO 2010/06032、WO 2011/150410、WO 2011/150411；以及国际专利申请PCT/US 12/23696中所描述。该转化酶可以经过密码子优化并且被整合到细胞染色体中，并且在此提到的所有基因也可以进行此操作。针对不同藻类和感兴趣植物物种的密码子使用在本领域中是已知的并且可以例如在kazusa.or.jp/codon/的密码子使用数据库处的因特网上发现。

在此进一步描述的编码变体酰基-ACP TE的多核苷酸可以在多种多样的植物宿主细胞中表达。特别感兴趣的是参与生产用于食用和工业用途的植物油的植物(包括例如温带油籽作物)的植物细胞。感兴趣植物包括但不局限于葡萄籽(卡诺拉(Canola)和高芥酸品种))、向日葵、红花、棉花、萼距花、大豆、花生、椰子和油棕、以及玉米。参见，美国专利号5,850,022；5,723,761；5,639,790；5,807,893；5,455,167；5,654,495；5,512,482；5,298,421；5,667,997；以及5,344,771；5,304,481。

具有非天然存在的脂肪酸谱的油

在此披露的油与其他天然产生的中链脂肪酸含量高的油(如棕榈油、棕榈仁油、以及椰子油)不同。例如，在棕榈油和棕榈仁油中的污染物(如类胡萝卜素)水平远远高于在此所描述的油中的污染物水平。棕榈油和棕榈仁油特别地包含α与β胡萝卜素和番茄红素，其量远远高于它们在此处所描述的油中的量。另外，在棕榈油和棕榈仁油中发现了超过20种不同的类胡萝卜素，而这些实例证明在此所描述的油包含很少的类胡萝卜素种类并且水平很低。另外，在棕榈油、棕榈仁油、以及椰子油中的维生素E化合物(如生育三烯酚)的水平远远高于在此所描述的油中的水平。

通常，无绿藻属株系具有极少或不具有链长C8-C14的脂肪酸。例如，无绿藻属株系桑椹型无绿藻(UTEX 1435)、克鲁格尼无绿藻(UTEX 329)、雍滞无绿藻(UTEX 1442)以及祖菲无绿藻(UTEX 1438)不产生(或产生不可检测量的)C8脂肪酸、0-0.01％之间的C10脂肪酸、0.03％-2.1％之间的C12脂肪酸以及1.0％-1.7％之间的C14脂肪酸。

在一些情况下，包含编码变体脂酰基-ACP硫酯酶的产油细胞(例如无绿藻属株系)具有一种脂肪酸谱，其特征在于5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、或90％-99％的C8、C10、C12、或C14脂肪酸。在其他情况下，这些包含编码脂酰基-ACP硫酯酶(该硫酯酶对于链长C12和C14的脂酰基-ACP底物具有活性)的转基因的无绿藻属株系以1:1+/-20％的比生产链长C12和链长C14的脂肪酸。

在一些情况下，由于具有特定链长的所希望的脂肪酸的增加，在恒定的并且高的选择性压力下保持这些转基因无绿藻属株系以保留外源基因是有利的。还可以通过使用同源重组载体以及在此披露的方法将外源基因插入这些细胞的核染色体中来出现高水平的外源基因保留。还考虑了包含整合到核染色体中的外源基因的重组细胞。

微藻油还可以包含由微藻产生或从培养基中结合到微藻油中的其他组分。这些其他组分可以按不同的量存在，这取决于用于培养微藻的培养条件、微藻的种类、用来从生物质回收微藻油的提取方法和可能影响微藻油组成的其他因素。此类组分的非限制性实例包括从0.1-0.4微克/ml存在的类胡萝卜素、从0-0.02微克/千克油存在的叶绿素、从0.4-0.6微克/100克油存在的γ生育酚、以及从0.2-0.5微克/克油存在的总生育三烯酚。

其他组分可以包括而不限于磷脂、生育酚、生育三烯酚、类胡萝卜素(例如，α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素，等等)、叶黄素(xanthophyll)(例如，叶黄素(lutein)、玉米黄质、α-隐黄质和β-隐黄质)、以及各种有机或无机化合物。

在一些情况下，从无绿藻属物种提取的油包括不超过0.02mg/kg叶绿素。在一些情况下，从无绿藻属物种提取的油包括不超过0.4mcg/ml总类胡萝卜素。在一些情况下，无绿藻属油包括0.40-0.60毫克之间的γ生育酚/100克油。在其他情况下，无绿藻属油包括0.2-0.5毫克之间的总生育三烯酚/克油。

从表达变体酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞中产生的油将具有一种同位素谱(isotopic profile)，该谱将它例如与来自其他来源的共混油区别开。稳定碳同位素值δ13C是相对于标准品(例如PDB，来自美国南卡罗来纳州皮迪组(Peedee formation)的美洲箭石的化石骨架的天然焦)的13C/12C的比的表示。油的稳定碳同位素值δ13C(0/00)可以与所用原料的δ13C值相关。在一些实施例中，这些油衍生自异养地生长于衍生自C4植物(如玉米或甘蔗)的糖上的产油生物体。在一些实施例中，油的δ13C(0/00)是从10到-17 0/00或从13到-16 0/00。

在不同实施例中，表达变体酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞产生以下的油，该变体酰基-ACP硫酯酶包括来自C10-偏好型酰基-ACP硫酯酶(例如，来自细叶萼距花的酰基-ACP硫酯酶)的特异性结构域的所有或特异性决定残基、和来自C12-偏好型酰基-ACP硫酯酶(例如，来自赖特氏萼距花或加州月桂的酰基-ACP硫酯酶)的催化结构域，该油包括至少约10％C12:0脂肪酸，以及至少约10％C14:0脂肪酸。

在不同实施例中，表达变体酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞产生以下的油，该变体酰基-ACP硫酯酶包括具有取代His163→Tyr或Leu186→Pro一者或两者(或在相应于SEQ IDNO:61的His163→Tyr或Leu186→Pro的位置处)的第一酰基-ACP硫酯酶的经修饰的特异性结构域的所有或特异性决定残基、和第二酰基-ACP硫酯酶的催化结构域，该油包括至少约5％例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多C8:0脂肪酸或至少约5％例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多C10:0脂肪酸或一个C8:0/C10:0比，该C8:0/C10:0比是至少约5％例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多。如果适当的话，该特异性结构域可以衍生自C8:0-、C10:0-或C12:0-偏好型酰基-ACP硫酯酶，并且独立地，该催化结构域可以衍生自C8:0-、C10:0-或C12:0-偏好型酰基-ACP硫酯酶。该特异性结构域和该催化结构域可以来自相同或不同的酰基-ACP硫酯酶。在不同实施例中，表达变体酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞产生以下的油，该变体酰基-ACP硫酯酶包括来自C10-偏好型酰基-ACP硫酯酶(例如，来自细叶萼距花具有取代His163→Tyr或Leu186→Pro的一者或两者的酰基-ACP硫酯酶)的经修饰的特异性结构域的所有或特异性决定残基、和来自C10-偏好型酰基-ACP硫酯酶(例如，来自细叶萼距花的酰基-ACP硫酯酶)的催化结构域，该油包括至少约5％例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多C8:0脂肪酸或至少约5％例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多C10:0脂肪酸或一个C8:0/C10:0比，该C8:0/C10:0比是至少约5％例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多。

在不同实施例中，表达变体酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞产生以下的油，该变体酰基-ACP硫酯酶包括来自C14-偏好型酰基-ACP硫酯酶(例如，来自樟树的酰基-ACP硫酯酶)的特异性结构域的所有或特异性决定残基、和来自C12-偏好型酰基-ACP硫酯酶(例如，来自赖特氏萼距花或加州月桂的酰基-ACP硫酯酶)的催化结构域，该油以大约1:1比(例如1:1+/-20％的比)包括C12:0脂肪酸和C14:0脂肪酸。

此外，表达包括从定位至疏水结构域N-末端的接头结构域的C-末端延伸的5个或更多个氨基酸残基的变体酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞，与表达不具有接头结构域的相同酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞相比，产生包括相对升高的中链长度脂肪酸(例如，C8:0、C10:0、C12:0、C14:0)的油。在不同实施例中，表达包括从定位至疏水结构域N-末端的接头结构域的C-末端延伸的5个或更多个氨基酸残基的变体酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞，与表达不具有接头结构域的相同酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞相比，产生包括增加至少1倍、2倍、3倍、或更多的中链长度脂肪酸的油。

在特定实施例中，重组细胞包括可操作表达外源基因的产物的核酸，这些核酸编码变体酰基-ACP硫酯酶外源基因，该外源基因编码有活性的酰基-ACP硫酯酶，该硫酯酶酶催化从ACP切下中链脂肪酸。结果，在一个实施例中，所产生的油的特征可以在于由于这些重组核酸的表达所致的C8、C10、C12、和/或C14脂肪酸升高以及C16、C18、和C18:1脂肪酸降低的脂肪酸谱。在不同实施例中，C8、C10、C12、和/或C14脂肪酸增加是大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、从75％-85％、从70％-90％、从90％-200％、从200％-300％、从300％-400％、从400％-500％、或大于500％。

在一些实施例中，增加细胞或细胞的油中的中链脂肪酸水平的另外一种基因修饰包括编码活性溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的外源溶血磷脂酸酰基转移酶基因的表达，该酶催化中链脂酰基转移到经取代的酰基甘油酯的sn-2位置。在具体的相关实施例中，外源酰基-ACP硫酯酶和LPAAT在细胞中都稳定地表达。由于将重组核酸导入到产油细胞(并且尤其是质体微生物细胞)中，外源中链特异性硫酯酶和催化中链脂酰基转移到经取代的酰基甘油酯的sn-2位置的外源LPAAT可以使该细胞增加它所产生的三酰甘油酯(TAG)中的具体的中链脂肪酸的百分比10、20、30、40、50、60、70、80、90倍或更高倍数。与仅导入外源中链偏好型酰基-ACP硫酯酶相比，导入外源LPAAT可以使在sn-2位置处的中链脂肪酸增加1、2、3、4倍或更高倍数。在实施例中，该中链脂肪酸占由细胞产生的TAG脂肪酸超过30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在不同实施例中，该中链脂肪酸是癸酸、辛酸、月桂酸、肉豆蔻酸、和/或棕榈酸。

在不同实施例中，编码溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的基因选自下组，该组由以下各项组成：拟南芥1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(GenBank登录号AEE85783)、芥菜1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(GenBank登录号ABQ42862)、芥菜1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(GenBank登录号ABM92334)、甘蓝型油菜1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(GenBank登录号CAB09138)、莱茵衣藻溶血磷脂酸酰基转移酶(GenBank登录号EDP02300)、椰溶血磷脂酸酰基转移酶(GenBank登录号AAC49119)、绣线菊溶血磷脂酸酰基转移酶(GenBank登录号EDP02300)、荷包蛋花1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(推定的)(GenBank登录号CAA88620)、荷包蛋花酰基-CoA:sn-1-酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶(GenBank登录号ABD62751)、荷包蛋花1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶(GenBank登录号CAA58239)、蓖麻1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(GenBank登录号EEF39377)。

作为替代方案，或除外源外源LPAAT外，细胞可以包括多个重组核酸，这些核酸可操作以表达外源KASI或KASIV酶并且任选地降低或消除KASII活性，这在表达中链偏好型酰基-ACP硫酯酶时特别有益。将无绿藻属细胞进行工程化以过表达KASI和/或KASIV酶连同中链偏好型酰基-ACP硫酯酶可以产生以下株系，在这些株系中C10-C12脂肪酸的生产是总脂肪酸的至少约40％，例如，总脂肪酸的至少约45％、50％、55％、60％或更多。也可以通过抑制KASI和/或KASII活性(例如使用敲除或敲减)来增加中链的产生。桑椹型无绿藻(UTEX1435)KASI的不同等位基因的染色体敲除连同中链偏好型酰基-ACP硫酯酶的过表达一起可以实现如下脂肪酸谱，这些脂肪酸谱是至少约60％C10-C14脂肪酸，例如，至少约65％、70％、75％、80％、85％或更多C10-C14脂肪酸酸。还可以由于KASI RNA发夹多核苷酸的表达来实现升高的中链脂肪酸。除这些修饰中的任一种外，还可以抑制不饱和或多不饱和脂肪酸产生，(例如通过敲除或敲减)SAD或FAD酶。

在实施例中，将以上所描述的高中链产生细胞之一进一步工程化，通过敲除或敲减一种或多种脂酰基去饱和酶来产生低多不饱和油。因此，所产生的油具有高稳定性。

高中链油或衍生自这些油的水解的脂肪酸可以特别适用于食品、燃料和油化学应用中，包括制造润滑剂和表面活性剂。例如，衍生自这些细胞的脂肪酸可以被酯化、裂化、还原成醛或醇、氨化、硫酸化、磺酸化或经受本领域中已知的其他化学过程。

已经在以上详述的本发明在以下实例中进行了举例说明，提供这些实例旨在说明而不是限制要求保护的发明。

实例

提供以下实例以说明但不限制请求保护的本发明。

例1：细叶萼距花FATB2的诱变

我们使用在酶核内的H163和L186(Ch FATB2中的H163和L186)的定点诱变修饰了最初从细叶萼距花(Ch FATB2，登录号U39834)分离的FATB2硫酯酶的活性和特异性。

对于上述实施例，使用将FATB变体和选择标记靶向至Thi4(硫胺素生物合成)基因座上的表达构建体。使用抗生素抗性基因来选择对G418抗生素的抗性。将UAPA启动子用于驱动FATB。该构建体在SEQ ID NO:9中举例说明。

如PCT/US 2014/013676中所披露的，我们发现将艾薇格萼距花FATB1(Ca FATB1)N-末端特异性结构域(图2B)嫁接到细叶萼距花FATB2(图2A)上提高了活性和C8-C10比。表达Ch FATB2 H163Y，L186P(D3130)突变体的桑椹型无绿藻转化体相对于野生型Ch FATB2(D3042)表现出在平均C8-C10总和的约2倍的增加以及脂肪酸谱特异性的改变。

Ch FATB2(图2A)中位置163处的His在FATB硫酯酶中高度保守。相比之下，Ch FATB中位置186处的Leu是罕见的。在其他FATB中，位置186通常由Pro或Leu占据。由于这些观察以及表达Ch FATB2 H163Y、L186P突变体(D3130)的桑椹型无绿藻株系的活性增加和脂肪酸谱特异性改变，我们将H163和L186鉴定为用于诱变的“热点”，并在H163和L186处进行彻底诱变，以探索氨基酸组合在桑椹型无绿藻模型系统中表达时对Ch FATB2活性的影响。克隆系统的细节在PCT/US 2014/013676中给出。

产生三十八个单独的Ch FATB2变体，并定量它们对C8:0和C10:0脂肪酸积累的影响。将在高于野生型Ch FATB2对照(D3598)的3个标准偏差内具有C8-C10总和的转化体被分类为阳性，并且在低于对照的3个标准偏差内的那些被列为阴性。参见表1。剩余的转化体被分类为中性。如表1所示，用六种Ch FATB2突变体(D3570、D3573、D3582、D3584、D3588和D3599)转化的桑椹型无绿藻，在高于表达野生型Ch FATB2(D3598)对照的转化体的3个标准偏差内，积累C8:0-C10:0脂肪酸。

*每个突变体筛选12个转化体。在低氮条件下脂质生产的长度为3天。

总之，我们已经表明，可以通过在N末端特异性结构域内使用H163和L186的定点诱变，在源自细叶萼距花的C8-C10特异性FATB硫酯酶内增加活性并且改变谱特异性。我们发现了表达变体的细胞，这些变体在C8:0+C10:0生产的总量方面超过亲本ChFATB2序列，包括产生具有脂肪酸谱的油的株系，其中C8和C10产量超过该谱的9、11、14。

例2：FATB中双突变体的鉴定

基于所证明的使用H163和L186的定点诱变来修饰最初从细叶萼距花(Ch FATB2，登录号U39834)中分离的FATB2硫酯酶的活性和特异性的能力，开始第二轮诱变。产生组合来自Rd1的阳性突变(在高于野生型Ch FATB2对照(D3598)的3个标准偏差内的C8+C10)的六个构建体(表2)。

表2

对于上述实施例，使用将FATB变体和选择标记靶向至Thi4(硫胺素生物合成)基因座上的表达构建体。使用抗生素抗性基因来选择对G418抗生素的抗性。UAPA启动子用于驱动FATB。该构建体在SEQ ID NO:9中举例说明。

产生五个单独的Ch FATB2变体，并定量它们对C8:0和C10:0脂肪酸积累的影响。将在高于野生型Ch FATB2对照(D3598)的3个标准偏差内具有C8-C10总和的转化体分类为阳性(表3)，并且在低于对照的3个标准偏差内的那些列为阴性(表3)。剩余的转化体被分类为中性。如表3所示，用三种Ch FATB2突变体(D3875、D3876、和D3885)转化的桑椹型无绿藻，在高于表达野生型Ch FATB2(D3598)对照的转化体的3个标准偏差内，积累C8:0-C10:0脂肪酸。

表3

例3：在FATB位置230处的突变

在下面的实例中，我们证明了使用酶核(在Cpal FATB1内的M230)内保守的Met的定点诱变来修饰最初从细叶萼距花(Ch FATB2，Uniprot登录号U39834)、湿地萼距花(CpalFATB1，Uniprot登录号Q39554，SEQ ID NO:13)和艾薇格萼距花FATB1(Ca FATB1，登录号R4J2L6，SEQ ID NO:14)中分离的三种FATB硫酯酶的活性和特异性的能力。

最近已报道，用Iso、Val、Phe或Leu取代Cpal FATB1内的保守M230将增加该硫酯酶的酶活性。因为这些结果是使用大肠杆菌获得的，我们进行了类似的筛选，以观察当在桑椹型无绿藻微藻中表达时是否可以再次产生这些结果。产生野生型和十三种Cpal FATB1M230突变体，并定量它们对C8:0脂肪酸累积的作用。如表4所示，用六种Cpal FATB1 M230突变体(D3206，D3208，D3211，D3212，D3214和D3215)转化的桑椹型无绿藻显示出与未转化的S6165宿主藻株相似的脂肪酸谱，其可能是因为突变使Cpal FATB1酶失活。相比之下，表达剩余七个Cpal FATB1 M230突变体之一的桑椹型无绿藻转化体累积了C8:0脂肪酸至高于非转化的S6165宿主的不同程度。D3213(M230P)的效力低于野生型Cpal FATB1转化体(D3004)，而D3207(M230L)表现出与野生型Cpal FATB1相同的C8:0脂肪酸水平。D3210(M230A)，D3216(M230T)，和D3217(M230F)都比野生型D3004多积累约1％-1.5％C8:0。最后，与D3004野生型相比，D3132(M230I)和D3209(M230V)表现出C8:0水平的4倍的增加。虽然这些结果与源自大肠杆菌中的表达的公开数据具有一些相似性，但是存在一些显着的例外。例如，与大肠杆菌不同，与野生型Cpal FATB1相比，用Leu取代M230没有改进C8:0脂肪酸积累。此外，用Ala或Thr替换M230相对于野生型Cpal FATB1来说增加了C8:0积累，这是基于基于大肠杆菌的筛选所不曾预料到的。

显示的数据是每个Cpal FATB1表达构建体的12-24个单独转化体的平均值和中值。

由于大肠杆菌和桑椹型无绿藻表达之间的结果中的差异，我们探索了在来自细叶萼距花(Ch FATB2)和艾薇格萼距花(Ca FATB1)的C8-C10特异性FATB硫酯酶内的平行位置处产生突变体的结果。图2显示了在Ch FATB2(D3455，M228I)中用Iso替代Met的结果，和在Ca FATB1(分别为D3458和D3459)中用Met或Iso替代Lys的结果。有趣的是，与野生型ChFATB2(D3042)表达相比，表达Ch FATB2M228I(D3455)突变体的转化体表现出的总C8:0-C14:0脂肪酸减少约50％。与野生型Ca FATB1(D3456)相比，表达K228M Ca FATB1(D3458)的转化体产生了多出约1.5倍的C8:0-C14:0脂肪酸水平，而K228I Ca FATB1(D3459)的效力略低于野生型Ca FATB1表达。重要的是，K228M和K228I Ca FATB1突变体都表现出新颖脂肪酸偏好。与野生型Ca FATB1相比，两种Ca FATB1突变体相对于总C8:0-C14:0累积了较低百分比的C8:0。此外，表达K228I Ca FATB1突变体(D3459)的转化体产生在野生型或K228M CaFATB1的情况下未观察到的C12:0和C14:0脂肪酸。

总之，我们已经表明，从大肠杆菌表达筛选得出的结论仅部分地与我们在我们的桑椹型无绿藻平台中表达Cpal FATB1突变体所得到的数据一致。此外，在取代Ch FATB2和Ca FATB1内的相同氨基酸位置时观察到的表型不是基于原始大肠杆菌表达筛选所预期的。我们的结果表明表达平台和硫酯酶影响诱变研究的结果。

实例4

除了表3中所示的结果，我们发现表达Ch FATB2H163Y，L186P和230K(D3599)突变体的桑椹型无绿藻转化体相对于最佳Ch FATB2突变体(D3599)表现出脂肪酸谱特异性的改变。因此，产生另外一组突变体以改变Ch FATB2的活性和特异性，表5。228K突变对应于湿地萼距花FATB1(SEQ ID NO:13)的位置230。湿地萼距花FATB1的残基230对应于细叶萼距花FATB2和艾薇格萼距花FATB1中的M228。

表5

产生五个单独的Ch FATB2变体，并定量它们对C8:0和C10:0脂肪酸积累的影响。

表6

实例5

在下面的实例中，我们证明了使用靶向酶内六个氨基酸位置的定点诱变来修饰最初从山竹(GmFATA，登录号O04792)分离的FATA硫酯酶的活性和特异性的能力。靶向三个氨基酸(G108，S111，V193)的合理性基于法茨乔蒂(Facciotti)等人，自然生物技术(NatBiotechnol.)(1999)17(6):593-7公开的研究。基于在索拉兹米公司(Solazyme)用其他硫酯酶进行的研究，靶向剩余的三个氨基酸(L91，G96，T156)。

为了测试每个突变对GmFATA活性的影响，将野生型和突变基因克隆到能够在桑椹型无绿藻株系S3150中表达的载体中。表7总结了来自三天脂质分布筛选的结果，这些结果将野生型GmFATA与14个突变体进行比较。与野生型蛋白(D3997)相比，三种GmFATA突变体(D3998，D4000，D4003)将C18:0的量增加了至少1.5倍。D3998和D4003是由法茨乔蒂(Facciotti)等人(自然生物技术(NatBiotech)1999)描述作为增加GmFATA活性的取代的突变。相比之下，D4000突变是基于在索拉兹米公司(Solazyme)的研究，该研究证明该位置影响FATB硫酯酶的活性。

表7

实例6

野生型桑椹型无绿藻储存脂质包括约60％的油酸(C18:1)、约25％-30％的棕榈酸(C16:0)以及约5％-8％的亚油酸(C18:2)，及微量的硬脂酸(C18:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、α-亚麻酸(C18:3α)及棕榈油酸(C16:1)。这一脂肪酸谱由内源脂肪酸生物合成路径的酶的相对活性和底物亲和力引起。将山竹FATA硫酯酶(GarmFATA1)基因引入到桑椹型无绿藻中产生具有增加的硬脂酸酯水平(C18:0)的油。此外，我们证明了G96A和G108A单突变和(S111A，V193A)GarmFATA1中的二重突变，相对于天然GarmFATA1蛋白，增加了C18:0累积。

在本实例中，我们评估了一系列另外的GarmFATA1突变体的硫酯酶活性。这些突变体通过将上述G96A，G108A，S111A和V193A突变组合成二重，三重或四重突变体而产生。具体地，我们测试了GarmFATA1(G96A，G108A)，GarmFATA1(G96A，S111A)，GarmFATA1(G96A，V193A)，GarmFATA1(G108A，S111A)，GarmFATA1(G108A，V193A)，GarmFATA1(G96A，G108A，S111A)，GarmFATA1(G96A，G108A，V193A)，GarmFATA1(G96A，S111A，V193A)，GarmFATA1(G108A，S111A，V193A)和GarmFATA1(G96A，G108A，S111A，V193A)突变体组合。将GarmFATA1(G108A)用作对照，因为在所有早先测试的突变体中，这一个给出了高于天然GARMFATA1蛋白的C18:0水平的最大增加。筛选在S5780中进行，S5780是先前在S5100中构建的株系-高油酸基础株系。通过显性SAD2-1等位基因的靶向缺失产生S5780，降低C18:0转化为C18:1的速率和PmKASII的过表达，增加C16:0至C18:0的延伸。用构建体转化S5780，这些构建体靶向来自可可(T.cacao)(TcLPAT2)的LPAT2基因和上述GarmFATA1定点突变体的与FATA-1基因座的组合。TcLPAT2对于在TAG的sn-2位置并入不饱和脂肪酸是高度特异性的。根据共有申请WO 2010/063031，WO 2011/150411和/或WO 2012/106560中的教导制备包含硬脂酰ACP去饱和酶(SAD)等位基因缺失的S5780株系，所有这些文献通过引用结合在此。

用于在PmFATA1基因座处表达TcLPAT2和GarmFATA1(G96A，G108A)的构建体-(pSZ5990)

在该实例中，产生了用构建体pSZ5990转化的S5780株系，其表达卡尔酵母SUC2基因(允许它们在包含蔗糖的培养基上的选择和生长)，在内源性PmFATA1基因组区处所靶向的可可(T.cacao)LPAT2和山竹FATA1(G96A，G108A)硫酯酶。用于在S5780中表达而引入的构建体pSZ5990可以写为FATA-13’侧翼::CrTub2-ScSUC2-PmPGH:间隔区1:PmG3PDH-1-TcLPAT2-PmATP:间隔区2:PmSAD2-2v2-CpSAD1tp_GarmFATA1(G96A，G108A)_FLAG-PmSAD2-1::FATA-15’侧翼

转化DNA的序列提供于图1中。构建体中相关的限制性位点以小写、带下划线的粗体表示，并且分别来自5'-3'BspQI、KpnI、XbaI、MfeI、BamHI、AvrII、NdeI、NsiI、AflII、EcoRI、SpeI、AscII、ClaI、SacI和BspQI。BspQI位点界定转化用DNA的5’和3’端。粗体、小写字母序列代表来自桑椹型无绿藻的允许通过同源重组在FATA1基因座处靶向整合的基因组DNA。沿5’到3’方向继续向前，驱动酿酒酵母SUC2基因表达的莱氏衣藻微管蛋白2用小写字母、加框文本表示。大写斜体表示SUC2的起始子ATG和终止子TGA，而编码区用小写斜体表示。桑椹型无绿藻磷酸甘油酸脱水酶(PGH)基因3’UTR由小写下划线文本表示，随后缓冲液/间隔区-1DNA序列是由小写粗体斜体文本表示。缓冲核苷酸后紧接着是由加框的小写文本表示的桑椹型无绿藻的内源性G3PDH-1启动子。大写斜体表示可可LPAT2基因的起始子ATG密码子和终止子TGA密码子，而小写斜体表示该基因的其余部分。桑椹型无绿藻腺苷三磷酸(ATP)基因3’UTR由小写下划线文本表示，随后缓冲液/间隔区2核苷酸序列由小写粗体斜体文本表示。间隔区-2序列后紧接着是由加框的小写文本表示的桑椹型无绿藻的内源性PmSAD2-2启动子。大写斜体表示山竹FATA1基因的起始子ATG和终止子TGA，而编码区用小写斜体表示。FATA1基因在N末端(由带下划线的小写斜体文本表示)处经翻译融合至原始小球藻硬脂酰ACP去饱和酶-1(CpSAD1)转运肽，用于适当靶向叶绿体，并且3XFLAG标签在C末端(由双下划线、斜体、粗体小写文本表示)处。在具有CpSAD转运肽和3XFLAG序列的GarmFATA1之后的是由小写下划线文本表示的内源性硬脂酰ACP去饱和酶-1(SAD1)基因3’UTR。内源性FATA1基因的基因组序列由小写粗体文本表示。将最终构建体进行测序以确保正确的阅读框和靶向序列，并且作为SEQ ID NO:46提供。

除了在PmFAFA1基因座(pSZ5990)处所靶向的可可LPAT2和山竹FATA1(G96A，G108A)基因，设计了掺入上述各种突变的几种其他构建体用于转化入S5780中。下表8中汇总这些构建体：

所有这些构建体具有与pSZ5990相同的载体主链、选择标记、启动子、基因和3’UTR，与其仅在GarmFATA1中的突变有所不同。此外，构建体pSZ6019至pSZ6023、pSZ6026和pSZ6028在驱动特定GarmFATA1突变体的启动子方面不同。而在pSZ5990中，GarmFATA1(G96A，G108A)由PmSAD2-2v2启动子驱动，pSZ6019-pSZ6028中的各种GarmFATA1突变体组合由PmACP-P1启动子驱动。在上述构建体中使用的各种GarmFATA1突变体的核苷酸序列示于SEQ ID NO:47-56中。PmACP-P1的启动子序列是pSZ6019-pSZ6028，如示于SEQ ID NO:57中。以粗体文本显示的相关限制性位点分别示为5’-3’。

为了确定它们对脂肪酸谱的影响，将上述所有构建体独立地转化到各S5780中。将初级转化子以克隆方式纯化并使其在pH5.0下于标准脂质产生条件下生长。来自用pSZ5936(D4933)、pSZ5990(D4950)、pSZ5991(D4951)、pSZ5986(D4948)、pSZ5982(4931)、pSZ5983(D4932)、pSZ6005(D4952)、pSZ5984(D4933)、pSZ6004(D4953)、pSZ5985(D4934)、pSZ5987(D4949)、pSZ6018(D4978)、pSZ6019(D4979)、pSZ6020(D4980)、pSZ6021(D4981)、pSZ6022(D4982)、pSZ6023(D4983)、pSZ6026(D4986)、pSZ6028(D4988)转化S5780产生的一组代表性克隆的所得谱图分别示于表9-19中。

表13列出了每组转化体的平均脂肪酸谱和葡萄糖消耗(相对于S7485基础株系)。FATA-1的一个等位基因的破坏使C16:0减少了1％-2％，而TcLPAT2活性在这些株系中表现为C18:2的1％-1.5％的增加。表达GarmFATA1(G108A)突变体的D4993和D4978分别在44.69％至45.33％之间和34.26％至50.94％C18:0之间累积。D4993具有由PmSAD2-2启动子驱动的GarmFATA1(G108A)，而对于D4978，PmACP-P1启动子驱动GarmFATA1(G108A)。具有(G96A，G108A)，(G108A，S111A)和(G108A，V193A)组合的株系一致地累积比(G108A)单个突变体更多的C18:0，具有最小的C16:0的增加。D4950(G96A，G108A)在多个株系中产生超过50％的C18:0。(G96A，G108A，S111A)，(G96A，G108A，V193A)和(G96A，S111A，V193A)三重突变体也产生通常更高的C18:0，但是以增加的C16:0为代价。(G108A，S111A，V193A)三重突变体和(G96A，G108A，S111A，V193A)四重突变体产生比G108单突变体更少的C18:0。PmACP-P1启动子通常比由PmSAD2-2启动子驱动的那些产生更多的C18:0。

表9

表9提供了用D4993(pSZ5936)和D4978(pSZ6018)转化的代表性S5780株系的前3天脂肪酸谱。pSZ5936和pSZ6018都具有分别由PmSAD2-2或PmACP-P1驱动的GarmFATA1(G108)突变体。

表10

表10提供了用D4950(pSZ5990)转化的代表性S5780株系的前3天脂肪酸谱。pSZ5990表达由PmSAD2-2驱动的GarmFATA1(G96A，G108)突变体。

表11

表11提供了用D4951(pSZ5991)和D4986(pSZ6026)转化的代表性S5780株系的前3天脂肪酸谱。pSZ5991和pSZ6026分别表达由PmSAD2-2和PmACP-P1驱动的GarmFATA1(G96A，S111A)突变体。

表12

表12提供了用D4948(pSZ5986)和D4983(pSZ6023)转化的代表性S5780株系的前3天脂肪酸谱。pSZ5986和pSZ6023分别表达由PmSAD2-2和PmACP-P1驱动的GarmFATA1(G96A，V193A)突变体。

表13

表13提供了用D4931(pSZ5982)和D4979(pSZ6019)转化的代表性S5780株系的前3天脂肪酸谱。pSZ5982和pSZ6019分别表达由PmSAD2-2和PmACP-P1驱动的GarmFATA1(G108A，S111A)突变体。

表14

表14提供了用D4932(pSZ5983)和D4980(pSZ6020)转化的代表性S5780株系的前3天脂肪酸谱。pSZ5983和pSZ6020分别表达由PmSAD2-2和PmACP-P1驱动的GarmFATA1(G108A，V193A)突变体。

表15

表15提供了用D4952(pSZ6005)和D4988(pSZ6028)转化的代表性S5780株系的前3天脂肪酸谱。pSZ6005和pSZ6028分别表达由PmSAD2-2和PmACP-P1驱动的GarmFATA1(G96A，G108A，S111A)突变体。

表16

表16提供了用D4933(pSZ5984)和D4981(pSZ6021)转化的代表性S5780株系的前3天脂肪酸谱。pSZ5984和pSZ6021分别表达由PmSAD2-2和PmACP-P1驱动的GarmFATA1(G96A，G108A，V193A)突变体。

表17

表17提供了用D4953(pSZ6004)转化的代表性S5780株系的前3天脂肪酸谱。pSZ6004表达由PmSAD2-2驱动的GarmFATA1(G96A，S111A，V193A)突变体。

表18

表18提供了用D4934(pSZ5985)和D4982(pSZ6022)转化的代表性S5780株系的前3天脂肪酸谱。pSZ5985和pSZ6022分别表达由PmSAD2-2和PmACP-P1驱动的GarmFATA1(G108A，S111A，V193A)突变体。

表19

表19提供了用D4949(pSZ5987)转化的代表性S5780株系的前3天脂肪酸谱。pSZ5985表达由PmSAD2-2驱动的GarmFATA1(G96A，

G108A，S111A，V193A)突变体。

应当理解的是，在此描述的实例和实施例仅是出于说明性目的，并且根据它们进行的不同修改或变更将启发本领域技术人员并且将被包含在本申请的精神与权限范围内和所附权利要求书的范围之内。在此引用的所有公开物、专利和专利申请都出于所有目的以其全部内容而特此结合。

非正式序列表

SEQ ID No.1

野生型细叶萼距花FATB2(“ChFATB2”)氨基酸序列

MVAAAASSAFFPVPAPGASPKPGKFGNWPSSLSPSFKPKSIPNGGFQVKANDSAHPKANGSAVSLKSGSLNTQEDTSSSPPPRTFLHQLPDWSRLLTAITTVFVKSKRPDMHDRKSKRPDMLVDSFGLESTVQDGLVFRQSFSIRSYEIGTDRTASIETLMNHLQETSLNHCKSTGILLDGFGRTLEMCKRDLIWVVIKMQIKVNRYPAWGDTVEINTRFSRLGKIGMGRDWLISDCNTGEILVRATSAYAMMNQKTRRLSKLPYEVHQEIVPLFVDSPVIEDSDLKVHKFKVKTGDSIQKGLTPGWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPTEVLETQELCSLALEYRRECGRDSVLESVTAMDPSKVGVRSQYQHLLRLEDGTAIVNGATEWRPKNAGANGAISTGKTSNGNSVS

SEQ ID NO：2

细叶萼距花C8/C10特异性FATB2 CDS

CTGGATACCATTTTCCCTGCGAAAAAACATGGTGGCTGCTGCAGCAAGTTCCGCATTCTTCCCTGTTCCAGCCCCGGGAGCCTCCCCTAAACCCGGGAAGTTCGGAAATTGGCCCTCGAGCTTGAGCCCTTCCTTCAAGCCCAAGTCAATCCCCAATGGCGGATTTCAGGTTAAGGCAAATGACAGCGCCCATCCAＡAGGCTAACGGTTCTGCAGTTAGTCTAAAGTCTGGCAGCCTCAACACTCAGGAGGACACTTCGTCGTCCCCTCCTCCTCGGACTTTCCTTCACCAGTTGCCTGATTGGAGTAGGCTTCTGACTGCAATCACGACCGTGTTCGTGAAATCTAAGAGGCCTGACATGCATGATCGGAAATCCAAGAGGCCTGACATGCTGGTGGACTCGTTTGGGTTGGAGAGTACTGTTCAGGATGGGCTCGTGTTCCGACAGAGTTTTTCGATTAGGTCTTATGAAATAGGCACTGATCGAACGGCCTCTATAGAGACACTTATGAACCACTTGCAGGAAACATCTCTCAATCATTGTAAGAGTACCGGTATTCTCCTTGACGGCTTCGGTCGTACTCTTGAGATGTGTAAAAGGGACCTCATTTGGGTGGTAATAAAAATGCAGATCAAGGTGAATCGCTATCCAGCTTGGGGCGATACTGTCGAGATCAATACCCGGTTCTCCCGGTTGGGGAAAATCGGTATGGGTCGCGATTGGCTAATAAGTGATTGCAACACAGGAGAAATTCTTGTAAGAGCTACGAGCGCGTATGCCATGATGAATCAAAAGACGAGAAGACTCTCAAAACTTCCATACGAGGTTCACCAGGAGATAGTGCCTCTTTTTGTCGACTCTCCTGTCATTGAAGACAGTGATCTGAAAGTGCATAAGTTTAAAGTGAAGACTGGTGATTCCATTCAAAAGGGTCTAACTCCGGGGTGGAATGACTTGGATGTCAATCAGCACGTAAGCAACGTGAAGTACATTGGGTGGATTCTCGAGAGTATGCCAACAGAAGTTTTGGAGACCCAGGAGCTATGCTCTCTCGCCCTTGAATATAGGCGGGAATGCGGAAGGGACAGTGTGCTGGAGTCCGTGACCGCTATGGATCCCTCAAAAGTTGGAGTCCGTTCTCAGTACCAGCACCTTCTGCGGCTTGAGGATGGGACTGCTATCGTGAACGGTGCAACTGAGTGGCGGCCGAAGAATGCAGGAGCTAACGGGGCGATATCAACGGGAAAGACTTCAAATGGAAACTCGGTCTCTTAGAAGTGTCTCGGAACCCTTCCGAGATGTGCATTTCTTTTCTCCTTTTCATTTTGTGGTGAGCTGAAAGAAGAGCATGTCGTTGCAATCAGTAAATTGTGTAGTTCGTTTTTCGCTTTGCTTCGCTCCTTTGTATAATAATATGGTCAGTCGTCTTTGTATCATTTCATGTTTTCAGTTTATTTACGCCATATAATTTTT

SEQ ID NO：3

Ch FATB2-D3570，psZ4689的氨基酸序列-藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签加粗，且P186残基为小写粗体

SEQ ID NO:4

Ch FATB2-D3573，pSZ4692的氨基酸序列-藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签加粗，且K186残基为小写粗体

SEQ ID NO:5

Ch FATB2-D3582，pSZ4702的氨基酸序列-藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签加粗，且A186残基为小写粗体

SEQ ID NO:6

Ch FATB2-D3584，pSZ4704的氨基酸序列-藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签加粗，且Y163残基为小写粗体

SEQ ID NO:7

Ch FATB2-D3588，pSZ4709的氨基酸序列-藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签加粗，且F163残基为小写粗体

SEQ ID NO:8

野生型Ch FATB2-D3598，pSZ4243的氨基酸序列-藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签加粗，且H163和L186残基为小写粗体

SEQ ID NO:9

ChFATB2表达筛选载体的核苷酸序列，以pSZ4243为实例。使能够靶向整合到Thi4基因座中的5'和3'同源臂用小写字符标注；CrTUB2启动子以大写斜体标注，其驱动用小写斜体标注的新霉素抗性基因的表达，随后是以大写突出显示的PmPGH 3'UTR终止子。PmUAPA1启动子(以粗体标注)驱动密码子优化的ChFATB2的表达(用小写粗体文本标注)，并以下划线、小写粗体标注的CvNR 3'UTR终止。限制性克隆位点和间隔区DNA片段标注为带下划线的大写无格式字体。

SEQ ID NO:10

野生型Cpal FATB1(D3004，pSZ4241)的氨基酸序列。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签加粗，且M230残基为小写粗体。

SEQ ID NO:11

野生型Chook FATB2(D3042，pSZ4243)的氨基酸序列。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签加粗，且M228残基为小写粗体。

SEQ ID NO:12

野生型Ca FATB1(D3456，pSZ4532)的氨基酸序列。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签加粗，且K228残基为小写粗体。

SEQ ID NO:13

湿地萼距花FATB1的氨基酸序列

MVAAAASSACFPVPSPGASPKPGKLGNWSSSLSPSLKPKSIPNGGFQVKANASAHPKANGSAVTLKSGSLNTQEDTLSSSPPPRAFFNQLPDWSMLLTAITTVFVAPEKRWTMFDRKSKRPNMLMDSFGLERVVQDGLVFRQSFSIRSYEICADRTASIETVMNHVQETSLNQCKSIGLLDDGFGRSPEMCKRDLIWVVTRMKIMVNRYPTWGDTIEVSTWLSQSGKIGMGRDWLISDCNTGEILVRATSVYAMMNQKTRRFSKLPHEVRQEFAPHFLDSPPAIEDNDGKLQKFDVKTGDSIRKGLTPGWYDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPTEVLETQELCSLTLEYRRECGRDSVLESVTSMDPSKVGDRFQYRHLLRLEDGADIMKGRTEWRPKNAGTNGAISTGKT

SEQ ID NO:14

艾薇格萼距花FATB1的氨基酸序列

MVAAAASSAFFSVPVPGTSPKPGKFRIWPSSLSPSFKPKPIPNGGLQVKANSRAHPKANGSAVSLKSGSLNTQEDTSSSPPPRTFLHQLPDWSRLLTAITTVFVKSKRPDMHDRKSKRPDMLMDSFGLESIVQEGLEFRQSFSIRSYEIGTDRTASIETLMNYLQETSLNHCKSTGILLDGFGRTPEMCKRDLIWVVTKMKIKVNRYPAWGDTVEINTWFSRLGKIGKGRDWLISDCNTGEILIRATSAYATMNQKTRRLSKLPYEVHQEIAPLFVDSPPVIEDNDLKLHKFEVKTGDSIHKGLTPGWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPTEVLETQELCSLALEYRRECGRDSVLESVTAMDPTKVGGRSQYQHLLRLEDGTDIVKCRTEWRPKNPGANGAISTGKTSNGNSVS

SEQ ID NO:15

Gm FATA野生型亲本基因的氨基酸序列；D3997，pSZ5083。藻类转运肽加下划线，并且FLAG表位标签为大写粗体

SEQ ID NO:16

Gm FATA S111A，V193A突变基因的氨基酸序列；D3998，pSZ5084。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签为大写粗体，且S111A，V193A残基为小写粗体。

SEQ ID NO:17

Gm FATA S111V，V193A突变基因的氨基酸序列；D3999，pSZ5085。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签为大写粗体，且S111V，V193A残基为小写粗体。

SEQ ID NO:18.-Gm FATA G96A突变基因的氨基酸序列；D4000，pSZ5086。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签为大写粗体，且G96A残基为小写粗体。

SEQ ID NO:19-Gm FATA G96T突变基因的氨基酸序列；D4001，pSZ5087。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签为大写粗体，且G96T残基为小写粗体。

SEQ ID NO:20-Gm FATA G96V突变基因的氨基酸序列；D4002，pSZ5088。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签为大写粗体，且G96V残基为小写粗体。

SEQ ID NO:21-Gm FATA G108A突变基因的氨基酸序列；D4003，pSZ5089。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签为大写粗体，且G108A残基为小写粗体。

SEQ ID NO:22-Gm FATA L91F突变基因的氨基酸序列；D4004，pSZ5090。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签为大写粗体，且L91F残基为小写粗体。

SEQ ID NO:23-Gm FATA L91K突变基因的氨基酸序列；D4005，pSZ5091。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签为大写粗体，且L91K残基为小写粗体。

SEQ ID NO:24-Gm FATA L91S突变基因的氨基酸序列；D4006，pSZ5092。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签为大写粗体，且L91S残基为小写粗体。

SEQ ID NO:25-Gm FATA G108V突变基因的氨基酸序列；D4007，pSZ5093。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签为大写粗体，且G108V残基为小写粗体。

SEQ ID NO:26-Gm FATA T156F突变基因的氨基酸序列；D4008，pSZ5094。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签为大写粗体，且T156F残基为小写粗体。

SEQ ID NO:27-Gm FATA T156A突变基因的氨基酸序列；D4009，pSZ5095。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签为大写粗体，且T156A残基为小写粗体。

SEQ ID NO:28-Gm FATA T156K突变基因的氨基酸序列；D4010，pSZ5096。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签为大写粗体，且T156K残基为小写粗体。

SEQ ID NO:29-Gm FATA T156V突变基因的氨基酸序列；D4011，pSZ5097。藻类转运肽加下划线，FLAG表位标签为大写粗体，且T156V残基为小写粗体。

SEQ ID NO:30-GmFATA野生型亲本基因表达载体(D3997，pSZ5083)的核苷酸序列。使能够靶向整合到Thi4基因座中的5’和3’同源臂用小写字符标注；CrTUB2启动子以大写斜体标注，其驱动用小写斜体标注的新霉素选择标记的表达，随后是以大写突出显示的PmPGH 3'UTR终止子。PmSAD2-1启动子(以粗体标注)驱动GmFATA基因(用小写粗体文本标注)的表达，并以下划线、小写粗体标注的CvNR 3'UTR终止。限制性克隆位点和间隔区DNA片段标注为带下划线的大写无格式字体。

SEQ ID NO:31-GmFATA S111A，V193A突变体基因(D3998，pSZ5084)的核苷酸序列。启动子、3'UTR、选择标记和靶向臂与SEQ ID NO:30中所述的相同。

SEQ ID NO:32-GmFATA S111V，V193A突变体基因(D3999，pSZ5085)的核苷酸序列。启动子、3'UTR、选择标记和靶向臂与SEQ ID NO:30中所述的相同。

SEQ ID NO:33-GmFATA G96A突变体基因(D4000，pSZ5086)的核苷酸序列。启动子、3'UTR、选择标记和靶向臂与SEQ ID NO:30中所述的相同。

SEQ ID NO:34-GmFATA G96T突变体基因(D4001，pSZ5087)的核苷酸序列。启动子、3'UTR、选择标记和靶向臂与SEQ ID NO:30中所述的相同。

SEQ ID NO:35-GmFATA G96V突变体基因(D4002，pSZ5088)的核苷酸序列。启动子、3'UTR、选择标记和靶向臂与SEQ ID NO:30中所述的相同。

SEQ ID NO:36-GmFATA G108A突变体基因(D4003，pSZ5089)的核苷酸序列。启动子、3'UTR、选择标记和靶向臂与SEQ ID NO:30中所述的相同。

SEQ ID NO:37-GmFATA L91F突变体基因(D4004，pSZ5090)的核苷酸序列。启动子、3'UTR、选择标记和靶向臂与SEQ ID NO:30中所述的相同。

SEQ ID NO:38-GmFATA L91K突变体基因(D4005，pSZ5091)的核苷酸序列。启动子、3'UTR、选择标记和靶向臂与SEQ ID NO:30中所述的相同。

SEQ ID NO:39-GmFATA L91S突变体基因(D4006，pSZ5092)的核苷酸序列。启动子、3'UTR、选择标记和靶向臂与SEQ ID NO:30中所述的相同。

SEQ ID NO:40-GmFATA G108V突变体基因(D4007，pSZ5093)的核苷酸序列。启动子、3'UTR、选择标记和靶向臂与SEQ ID NO:30中所述的相同。

SEQ ID NO:41-GmFATA T156F突变体基因(D4008，pSZ5094)的核苷酸序列。启动子、3'UTR、选择标记和靶向臂与SEQ ID NO:30中所述的相同。

SEQ ID NO:42-GmFATA T156A突变体基因(D4009，pSZ5095)的核苷酸序列。启动子、3'UTR、选择标记和靶向臂与SEQ ID NO:30中所述的相同。

SEQ ID NO:43-GmFATA T156K突变体基因(D4010，pSZ5096)的核苷酸序列。启动子、3'UTR、选择标记和靶向臂与SEQ ID NO:30中所述的相同。

SEQ ID NO:44-GmFATA T156V突变体基因(D4011，pSZ5097)的核苷酸序列。启动子、3'UTR、选择标记和靶向臂与SEQ ID NO:30中所述的相同。

SEQ ID NO:45

Gm FATA野生型亲本基因的氨基酸序列；去除信号肽

IPPRIIVVSSSSSKVNPLKTEAVVSSGLADRLRLGSLTEDGLSYKEKFIVRCYEVGINKTATVETIANLLQEVGCNHAQSVGYSTGGFSTTPTMRKLRLIWVTARMHIEIYKYPAWSDVVEIESWGQGEGKIGTRRDWILRDYATGQVIGRATSKWVMMNQDTRRLQKVDVDVRDEYLVHCPRELRLAFPEENNSSLKKISKLEDPSQYSKLGLVPRRADLDMNQHVNNVTYIGWVLESMPQEIIDTHELQTITLDYRRECQHDDVVDSLTSPEPSEDAEAVFNHNGTNGSANVSANDHGCRNFLHLLRLSGNGLEINRGRTEWRKKPTR

SEQ ID NO:46

转化到S5780中的质粒pSZ5990中包含的转化DNA的核苷酸序列

SEQ ID NO:47-与pSZ5936和pSZ 6018中的GarmFATA1(G108A)基因和3X FLAG标签融合的CpSAD转运肽的核苷酸序列

SEQ ID NO:48-与pSZ5991和pSZ6026中的GarmFATA1(G96A，S111A)基因和3X FLAG标签融合的CpSAD转运肽的核苷酸序列

SEQ ID NO:49-与pSZ5986和pSZ6023中的GarmFATA1(G96A，V193A)基因和3X FLAG标签融合的CpSAD转运肽的核苷酸序列

SEQ ID NO:50-与pSZ5982和pSZ6019中的GarmFATA1(G108A，S111A)基因和3X FLAG标签融合的CpSAD转运肽的核苷酸序列

SEQ ID NO:51-与pSZ5983和pSZ6020中的GarmFATA1(G108A，V193A)基因和3X FLAG标签融合的CpSAD转运肽的核苷酸序列

SEQ ID NO:52-与pSZ6005和pSZ6028中GarmFATA1(G96A，G108A，S111A)基因和3X FLAG标签融合的CpSAD转运肽的核苷酸序列

SEQ ID NO:53-与pSZ5984和pSZ6021中的GarmFATA1(G96A，G108A，V193A)基因和3XFLAG标签融合的CpSAD转运肽的核苷酸序列

SEQ ID NO:54-与pSZ6004中的GarmFATA1(G96A，S111A，V193A)基因和3X FLAG标签融合的CpSAD转运肽的核苷酸序列

SEQ ID NO:55-与pSZ5985和pSZ6022中GarmFATA1(G108A，S111A，V193A)基因和3XFLAG标签融合的CpSAD转运肽的核苷酸序列

SEQ ID NO:56-与pSZ5987中的GarmFATA1(G96A，G108A，S111A，V193A)基因和3X FLAG标签融合的CpSAD转运肽的核苷酸序列

SEQ ID NO:57-pSZ6019-pSZ6023、pSZ6026和pSZ6028中的PmACP-P1启动子的核苷酸序列

Claims

1.一种非天然蛋白质，一种编码该非天然蛋白质的分离的基因，一种表达该非天然蛋白质的表达盒，或一种包括该表达盒的宿主细胞，其中该非天然蛋白质与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，并且在对应于SEQ ID NO:1的位置163的位置处包括Y或F，和/或在对应于SEQ ID NO:1的位置186的位置处包括P、K、或A，并且任选地在对应于SEQ ID NO:1的位置228的位置处包括K。

2.一种用于生产三酸甘油酯油的方法，该方法包括在宿主细胞中表达如权利要求1所述的蛋白质或如下蛋白质，该蛋白质与SEQ ID NO:3-8之一包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，并且在对应于SEQ ID NO:1的位置163的位置处包括Y或F，和/或在对应于SEQ ID NO:1的位置186的位置处包括P、K、或A，并且任选地在对应于SEQ ID NO:1的位置228的位置处包括K；培养该宿主细胞；并分离该油。

3.一种在由任选地产油宿主细胞产生的油的脂肪酸谱中用于增加C8和/或C10脂肪酸的方法，该方法包括提供编码FATB酶的亲本基因，使该基因突变以在对应于SEQ ID NO:1的位置163的位置处具有Y或F，和/或在对应于SEQ ID NO:1的位置186的位置处具有P、K、或A，并且任选地在对应于SEQ ID NO:1的位置228的位置处具有K；在该宿主细胞中表达该突变基因；并产生该油，由此相对于该亲本基因，该油的脂肪酸谱在C8和/或C10脂肪酸方面增加。

4.如权利要求3所述的方法，其中该编码FATB酶的基因编码如下蛋白质，该蛋白质与SEQ ID NO:1、13或14具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。

5.一种非天然蛋白质，一种编码该非天然蛋白质的分离的基因，一种表达该非天然蛋白质的表达盒，或一种包括该表达盒的宿主细胞，其中该非天然蛋白质与SEQ ID NO:13具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，并且在对应于SEQ ID NO:13的位置230的位置处具有A或K。

6.一种用于生产三酸甘油酯油的方法，该方法包括在宿主细胞中表达如权利要求5所述的蛋白质，培养该细胞并分离该油。

7.一种非天然蛋白质，一种编码该非天然蛋白质的分离的基因，一种表达该非天然蛋白质的表达盒，或一种包括该表达盒的宿主细胞，其中该非天然蛋白质与SEQ ID NO:45具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，并且在对应于SEQ ID NO:45的位置74的位置(G96)处包括A、T或V，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置69的位置(L91)处包括F、K、或S，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置134的位置(T156)处包括F、A、K或V。

8.如权利要求7所述的非天然蛋白质，一种编码该非天然蛋白质的分离的基因，一种表达该非天然蛋白质的表达盒，或一种包括该表达盒的宿主细胞，进一步地其中该非天然蛋白质在对应于SEQ ID NO:45的位置89的位置(S111)处包括A或V，和/或在对应于SEQ IDNO:45的位置171的位置(V193)处包括A，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置86的位置(G108)处包括A或V。

9.一种用于生产三酸甘油酯油的方法，该方法包括在宿主细胞中表达如权利要求7或权利要求8所述的蛋白质或如下蛋白质，该蛋白质与SEQ ID NO:45和15-29之一包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，并且在对应于SEQ ID NO:45的位置74的位置(G96)处包括A、T或V，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置69的位置(L91)处包括F、K、或S，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置134的位置(G156)处包括F、A、K或V；培养该宿主细胞；并分离该油。

10.一种在由任选地产油宿主细胞产生的油的脂肪酸谱中用于增加C18:0脂肪酸的方法，该方法包括提供编码FATB酶的亲本基因，使该基因突变以在对应于SEQ ID NO:45的位置74的位置(G96)处具有A、T或V，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置69的位置(L91)处具有F、K、或S，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置134的位置(T156)处具有F、A、K或V；在该宿主细胞中表达该突变基因；并产生该油，由此相对于该亲本基因，该油的脂肪酸谱在C18:0脂肪酸方面增加。

11.如权利要求10所述的方法，进一步地使该基因突变以在对应于SEQ ID NO:45的位置89的位置(S111)处具有A或V，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置171的位置(V193)处具有A，和/或在对应于SEQ ID NO:45的位置86的位置(G108)处具有A或V。

12.如权利要求10或权利要求11所述的方法，其中该编码FATB酶的基因编码如下蛋白质，该蛋白质与SEQ ID NO:45和15-29之一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。