CN102712858B - 在重组异养型微生物中制备特制油 - Google Patents

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Abstract

提供了用于在原藻细胞中生产油类、燃料、油脂化学品和其他化合物的方法和组合物，包括产油微生物和低成本培养这种微生物方法。包含编码例如脂酶、蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、果糖激酶、多糖降解酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和/或酰基载体蛋白之外源基因的原藻细胞可以用于制备运输燃料，例如可再生柴油、生物柴油和可再生喷气燃料。

Description

在重组异养型微生物中制备特制油
相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C.119(e)，本发明要求享有2008年11月28日递交的第61/118,590号美国临时专利申请、2008年12月1日递交的第61/118,994号美国临时专利申请、2009年4月30日递交的第61/174,357号美国临时专利申请和2008年6月23日递交的第61/219,525号美国临时专利申请的优先权。每个申请为了所有目的作为整体通过引用并入本文。
序列表文献
本发明包括第1-72页所显示的序列表，在此附上这些文献。
技术领域
本发明涉及从微生物中生产油类、燃料和油脂化学品。特别地，本文公开的内容涉及产油微藻、对其进行培养用以生产有用化合物(包括脂类、脂肪酸酯、脂肪酸、醛、醇和烷烃)的方法，以及对其进行遗传学改造用以提高生产效率和改变由其生产之油类类型和组分的方法和试剂。
背景技术
化石燃料是埋葬之有机材料的可燃地质沉积物的通用术语，其由腐烂的动植物形成，所述动植物通过数亿年间暴露于地壳中的热和压力已经转化成为原油、煤、天然气或者重油。化石燃料是有限的、不可再生的资源。
全球经济带来的能源需求增加还使得碳氢化合物的成本压力逐渐增加。除了能源之外，很多工业，包括塑料业和化学品生产商，主要依赖于获得碳氢化合物作为其生产过程的给料。对目前供给来源的具有成本效益的替代品可以帮助减轻能源和这些原材料成本的不断增加的压力。
PCT公开No.2008/151149描述了为了生产油类而培养藻类的方法和材料，并且特别地举例说明从由微藻原壳小球藻(Chlorella protothecoides)生产的油类中生产柴油。仍然需要提供在微藻中生产油类的改进型方法，特别是以较高产率和效率生产链长度较短、饱和度较高并且没有色素的油类的方法。本发明符合这种需求。
发明概述
本发明提供了原藻(Prototheca)属的细胞，其包含外源基因，在一些实施方案中，细胞是Prototheca moriformis、Prototheca krugani、Protothecastagnora或者Prototheca zopfii菌种的细胞株，在其他实施方案中，细胞具有与SEQ ID NO:11-19中一种或者多种序列具有至少70、75、80、85或者95％核苷酸一致性的23S rRNA序列。在一些细胞中，外源基因是编码序列并且与启动子处于可操作连接，在一些实施方案中，启动子来源于原藻属菌种的内源性基因。在进一步的实施方案中，编码序列编码选自由蔗糖转化酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶、酰基载体蛋白和赋予抗生素抗性的蛋白组成的组中的蛋白。对链长度为C8、C10、C12或者C14的一种或者多种脂肪酰基-ACP底物具有水解活性之脂肪酰基-ACP硫酯酶的一些实施方案包括与SEQ ID NO:59、61、63和138-140中一种或者多种序列具有至少50、60、70、80或者90％氨基酸一致性的酰基-ACP硫酯酶。在进一步的实施方案中，编码序列包含微藻质体靶向序列，在一些实施方案中，微藻是原藻属或者小球藻属或者小球藻科其他属的菌种。在一些实施方案中，质体靶向序列与SEQ ID NO:127-133中一种或者多种序列具有至少20、25、35、45或者55％的氨基酸序列一致性，并且能够靶向由没有定位于质体基因组的外源基因所编码的蛋白。在其他实施方案中，启动子响应于细胞培养基中氮气的减少或者消失而上调，例如上调至少3倍，其通过测定当胞外环境从含有至少10mM或者5mM氮气变成不含氮气时原藻属细胞中转录子丰度而得到。在进一步的实施方案中，启动子包含SEQID NO:91-102中一种序列的50个或者更多核苷酸片段。在其他实施方案中，细胞具有与SEQ ID NO:11-19中一种或者多种序列具有至少70、75、80、85或者95％核苷酸一致性的23S rRNA序列。在其他实施方案中，外源基因整合到细胞染色体中。
在本发明细胞的附加实施方案中，细胞是原藻属的细胞，并且包含外源脂肪酰基-ACP硫酯酶基因和C8-C14含量为细胞总脂量之至少4％的脂类特性，其中C8含量是细胞总脂量的至少0.3％，C10含量是细胞总脂量的至少2％，C12含量是细胞总脂量的至少2％，C14含量是细胞总脂量的至少4％，C8-C14含量是细胞总脂量的10-30％、20-30％或者至少10、20或30％。在一些实施方案中，细胞是Prototheca moriformis、Protothecakrugani、Prototheca stagnora或者Prototheca zopfii菌种的细胞株，在其他实施方案中，细胞具有与SEQ ID NO:11-19中一种或者多种序列具有至少70、75、80、85或者95％核苷酸一致性的23S rRNA序列。在其他实施方案中，外源脂肪酰基-ACP硫酯酶基因整合到细胞染色体中。本发明的其他实施方案包括制备甘油三酯组合物的方法，所述甘油三酯组合物具有C8-C14含量为甘油三酯组合物之至少4％w/w或者面积百分比的脂类特性，其中C8含量是至少0.3％w/w或者面积百分比，C10含量是至少2％w/w或者面积百分比，C12含量是至少2％w/w或者面积百分比，C14含量是至少4％w/w或者面积百分比，C8-C14含量是10-30％、20-30％或者至少10、20或30％w/w或者面积百分比。本发明还包括制备甘油三酯的方法，其包括培养上述细胞，其中所述细胞还包含编码蔗糖转化酶的外源基因，并且蔗糖作为碳源供给。在一些实施方案中，蔗糖转化酶与SEQ ID NO:3,20-29和90中一种或者多种序列具有至少50、60、70、80或者90％的氨基酸一致性。
本发明的实施方案包括甘油三酯组合物以及含有甘油三酯组合物的细胞，所述组合物具有C8-C14含量为至少4％的脂类特性和一种或者多种下列属性：0.1-0.4微克/ml的总类胡卜素、少于0.4微克/ml的总类胡卜素、少于0.001微克/ml的番茄红素；少于0.02微克/ml的β-胡萝卜素、每千克油中少于0.02毫克的叶绿素；每100克油中0.40-0.60毫克的γ-生育酚；每克油中0.2-0.5毫克的总生育三烯酚、每克油中少于0.4毫克的总生育三烯酚、每100克油中4-8mg的菜油甾醇，每100克油中40-60mg的豆甾醇。在本发明的一些实施方案中，甘油三酯油类组合物具有C8-C14含量为甘油三酯组合物之至少4％w/w或者面积百分比的脂类特性，其中C8含量是至少0.3％w/w或者面积百分比，C10含量是至少2％w/w或者面积百分比，C12含量是至少2％w/w或者面积百分比，C14含量是至少4％w/w或者面积百分比，C8-C14含量是10-30％、20-30％或者至少10、20或30％w/w或者面积百分比。在其他实施方案中，甘油三酯油类组合物与至少另外一种组合物混合，所述另外一种组合物选自由下列物质组成的组：大豆、油菜籽、加拿大油菜、棕榈叶、棕仁、椰子、玉米、废植物、乌桕油、橄榄、向日葵、棉花籽、鸡脂肪、牛脂、微藻、大型藻类、萼距花(Cuphea)、亚麻、花生、精选白色动物油脂、猪油、亚麻芥油(Camelina sativa)、芥菜籽、腰果、燕麦、羽扇豆、洋麻、金盏花、大麻、咖啡豆、亚麻仁(亚麻籽)、榛子、大戟属、南瓜籽、香菜、山茶、芝麻、红花、稻米、油桐树、可可、干椰子肉、罂粟花、蓖麻籽、碧根果、加州希蒙得木、麻风树、夏威夷果、巴西坚果、鳄梨、石油或者上述任意一种油类的馏分。
本发明的方法还包括通过进行一个或者多个化学反应来对前面涉及的油类进行加工，用以产生游离脂肪酸和进行皂化作用，所述化学反应选自以下反应：转酯基作用、氢化作用、加氢裂解作用、脱氧作用、异构化作用、酯交换作用、羟基化作用、水解作用。本发明还包括从前面涉及之油类的氢化作用制备的碳氢化合物燃料。在一些实施方案中，从分离自原藻属细胞的甘油三酯中制备碳氢化合物燃料，其中ASTM D86 T10-T90蒸馏范围是至少25℃。在其他实施方案中，从分离自原藻属细胞的甘油三酯中制备脂肪酸烷基酯，其中组合物具有少于120秒的ASTM D6751 A1低温适应时间。
本发明还包括一种组合物，其包含：(a)包含一种或者多种单糖的多糖，所述单糖由20-30摩尔百分比的半乳糖、55-65摩尔百分比的葡萄糖和5-15摩尔百分比的甘露糖组成；(b)蛋白质；和(c)包含与SEQ ID NO:11-19中一种或者多种序列具有至少70、75、80、85或者95％核苷酸一致性之23S rRNA序列的DNA；和(d)外源基因。在一些实施方案中，所述外源基因选自蔗糖转化酶和脂肪酰基-ACP硫酯酶，在进一步的实施方案中，组合物进一步包含脂类，所述脂类具有C8-C14含量为至少4％的脂类特性。在其他实施方案中，组合物以用作动物饲料而制备。
本发明包括编码启动子的重组核苷酸，所述启动子响应于原藻属细胞培养基中氮气的减少或者消失而上调，例如上调至少3倍，其通过测定当胞外环境从含有至少10mM或者5mM氮气变成不含氮气时原藻属细胞中的转录子丰度而得到。在一些实施方案中，重组核苷酸包含SEQ ID NO:91-102中一种序列的50个或者更多核苷酸片段。本发明还包括包含表达盒的核苷酸载体，所述表达盒包含(a)在原藻属细胞中具有活性的启动子；和(b)与启动子处于可操作连接的编码序列，其中所述编码序列含有表1中最优选或者第二最优选的密码子，其占编码序列中密码子的至少20、30、40、50、60或者80％。在一些载体中，编码序列包含与脂肪酰基-ACP硫酯酶读码框相同的质体靶向序列，所述脂肪酰基-ACP硫酯酶包括对链长度为C8、C10、C12或C14的一种或者多种脂肪酰基-ACP底物具有水解活性的硫酯酶。一些载体包含编码能够使蛋白靶向原藻属细胞质体之多肽的质体靶向序列，包括微藻质体靶向序列和与SEQ ID Nos.127-133中一种或者多种序列具有至少20、30、35、45或者55％氨基酸序列一致性并且能够使蛋白靶向原藻属细胞质体的质体靶向序列。本发明额外的载体包含原藻属细胞核基因组外源性核酸序列，其中所述序列的长度是至少200个核苷酸，一些载体包含原藻属细胞核基因组外源性第一和第二核酸序列，其中所述第一和第二序列(a)长度均是至少200个核苷酸；(b)处于表达盒侧翼；和(c)位于相同的原藻染色体上，其间隔不大于5、10、15、20和50kB。
本发明还包括与SEQ ID NO:134-135中一种或者两种序列具有至少80、90、95或者98％核苷酸一致性的重组核酸和编码与SEQ ID NO:136-137中一种或者两种序列具有至少80、90、95或者98％氨基酸一致性之蛋白的重组核酸。
本发明还包括制备甘油三酯组合物的方法，其包括：(a)在固定碳源存在下培养原藻属细胞群，其中(i)所述细胞含有外源基因；(ii)所述细胞积累至少10、20、30、40、60或者70％细胞干重的脂类；和(iii)所述固定碳源选自由高粱和经解聚的纤维素类物质组成的组；和(b)从培养的微生物中分离脂类组分。在一些实施方案中，固定碳源是经解聚的纤维素类物质，其选自由玉米秸秆、芒草(Miscanthus)、饲用高粱、甜菜渣和甘庶渣组成的组，可选地在培养步骤前用水对这些材料进行清洗。在一些方法中，固定碳源是经解聚的纤维素类物质，并且在培养步骤前使经解聚的纤维素类物质中的葡萄糖水平浓缩至至少300g/升、至少400g/升、至少500g/升或者至少600g/升，并随着细胞生长和积累脂质的时间供给到培养基中。在一些方法中，外源基因编码对链长度为C8、C10、C12或C14的一种或者多种脂肪酰基-ACP底物具有水解活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶，在一些方法中甘油三酯具有C8-C14含量为至少4％的脂类特性和一种或者多种下列属性：0.1-0.4微克/ml的总类胡卜素、每千克油中少于0.02毫克的叶绿素；每100克油中0.40-0.60毫克的γ-生育酚；每克油中0.2-0.5毫克的总生育三烯酚、每100克油中4-8mg的菜油甾醇和每100克油中40-60mg的豆甾醇。
本发明中进一步的方法包括制备甘油三酯组合物，其包括：(a)在经解聚的纤维素类物质存在下培养微生物群；其中(i)在培养步骤前用水对经解聚的纤维素类物质进行清洗；(ii)细胞积累至少10、20、30、40、60或者70％细胞干重的脂类；和(iii)在培养步骤前使经解聚的纤维素类物质中的葡萄糖水平浓缩至至少300、400、500或者600g/升；(iv)以分批补料反应方式培养微生物，其中用葡萄糖水平为至少300、400、500或者600g/升的经解聚的纤维素类物质供给微生物；和(b)从培养的微生物中分离脂类组分。在一些实施方案中，固定碳源是经解聚的纤维素类物质，其选自由玉米秸秆、芒草、饲用高粱、甜菜浆和甘蔗渣组成的组。在进一步的实施方案中，微生物是原藻属的菌种并且含有一种外源基因，所述外源基因包括对链长度为C8、C10、C12或C14的一种或者多种脂肪酰基-ACP底物具有水解活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶。本发明中进一步的方法包括生产甘油三酯油类，其包括在蔗糖作为碳源存在下培养具有与SEQ ID NO:30具有至少90或者96％核苷酸一致性之23S rRNA序列的细胞。
本发明还包括制备化学品的方法，其包括对甘油三酯油类进行一种或者多种化学反应和皂化作用，所述化学反应选自以下反应：转酯基作用、氢化作用、加氢裂解作用、脱氧作用、异构化作用、酯交换作用、羟基化作用、水解作用，其中所述油类具有C8-C14含量为至少4％的脂类特性和一种或者多种下列属性：0.1-0.4微克/ml的总类胡卜素、每千克油中少于0.02毫克的叶绿素；每100克油中0.10-0.60毫克的γ-生育酚；每克油中0.1-0.5毫克的总生育三烯酸、每克油中少于0.4毫克的总生育三烯酸、每100克油中1-8mg的菜油甾醇，每100克油中10-60mg的豆甾醇。一些方法通过培养包含外源脂肪酰基-ACP硫酯酶基因的原藻属细胞来生产油类而进行，所述基因编码对链长度为C8、C10、C12或C14的一种或者多种脂肪酰基-ACP底物具有水解活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶。在一些方法中，水解反应选自由皂化作用、酸水解、碱水解、酶促水解、催化水解和热压水水解组成的组，其包括将油类分解为甘油和脂肪酸的催化水解反应。在进一步的方法中，使脂肪酸发生氨基化反应，以产生脂肪族含氮化合物，或者发生臭氧分解反应，以产生一元和二元酸。在一些实施方案中，对油类使用甘油三酯分解方法，所述方法选自由酶促分解和压力分解组成的组。在一些方法中，水解反应之后进行缩合反应。其他方法包括对油类进行氢化处理反应，可选地其中在氢化处理反应之前或者同时使氢化处理反应的产物进行脱氧反应或者缩合反应。一些方法额外地包括气体脱除反应。额外的方法包括通过进行脱氧反应对前面涉及的油类进行加工，所述反应选自由氢解反应、氢化作用、连续性氢化-氢解反应、连续性氢解-氢化反应和氢化-氢解联合反应组成的组。在一些方法中，脱氧反应之后进行缩合反应。其他方法包括对前面涉及的油类进行酯化反应，可选地进行酯交换反应或者转酯基反应。其他方法包括对前面涉及的油类进行羟基化反应，可选地其中在羟基化反应之后进行缩合反应。
附图说明
图1和图2显示以高粱作为碳源生长之原藻菌种和Cholorellaluteoviridis菌株SAG 2214的生长曲线。
图3显示SAG 2214在葡萄糖和蔗糖中生长的时间进程。
图4显示如实施例3中所描述在原藻转化中使用的表达盒。
图5显示如实施例3中所描述UTEX菌株1435 3个转化子的Southern印迹分析结果。
图6显示经密码子优化和未经密码子优化之suc2(酵母蔗糖转化酶(yInv))转基因质粒的图解。示出相关限制性克隆位点，箭头表示转录方向。
图7a显示在纤维素来源的糖类(玉米秸秆、甜菜浆、高粱蔗、芒草和葡萄糖对照)中生长之Prototheca moriformis的结果。以光学密度测定(A750读值)表示生长。
图7b显示与葡萄糖/木糖对照相比，利用不同水平的玉米秸秆来源之纤维素糖类进行Prototheca moriformis生长实验的结果。
图7c显示木糖对在原藻培养物中生产脂类的影响。
图7d显示盐浓度(Na2SO4)和防沫剂对原藻生长(以细胞干重(DCW)表示)的影响。
图8显示对多种纤维素类物质(甘蔗渣、高粱蔗、芒草和甜菜浆)进行热水处理和得到的糖蒸汽对原藻生长的影响。
图9显示重复循环进行热水处理后纤维素类生物质(甘蔗渣、高粱蔗、芒草和甜菜浆)中羟甲基糠醛(HMF)和糠醛水平不断减少。
图10显示纤维素类物质糖化过程的图解，其产生适用于在发酵罐中进行异养型油类生产的糖蒸汽。
图11显示重复循环进行热水处理后在经汽爆的甘蔗渣中HMF和糠醛水平不断减少。
图12显示原藻转化中使用之硫酯酶质粒的图解。异源β-微管蛋白(驱动NeoR)和谷氨酸脱氢酶启动子分别来源于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)和Chlorella sorokiniana。硝酸盐还原酶3’UTR来源于普通小球藻(Chlorella vulgaris)。示出相关限制性克隆位点，箭头显示转录方向。
图13显示由原藻甘油三酯油类生产之可再生柴油的色谱图。
发明详述
本发明起因于发现原藻和某些相关微生物出乎意料地具有能够经济并且大量地生产油类、燃料和其他碳氢化合物或者脂类组合物的优势特性，以及发现对这些微生物进行遗传学改造用以促进这些特性的方法和试剂。除了其他应用之外，由这些微生物生产的油类可以用于运输燃料、石油化学品和/或食品和化妆品工业中。脂类的转酯基作用产生可用作生物柴油的长链脂肪酸酯。可以对其他酶促和化学过程进行调整，用以产生脂肪酸、醛、醇、烷烃和烯烃。在一些应用中，可以生产可再生柴油、喷气燃料或者其他碳氢化合物。本发明还提供了培养微藻的方法，用以增加产量和脂类产率，和/或更具成本效率地生产本文中描述的组合物。
为了便于阅读，发明的详细描述分为几个章节。第1章提供了本文中使用之术语的定义。第2章描述了本发明方法中使用的培养条件。第3章描述了遗传工程方法和材料。第4章描述了使原藻能够利用蔗糖的遗传工程。第5章描述了使原藻调整脂类生物合成的遗传工程。第6章描述了制备燃料和化学品的方法。第7章公开了本发明的实施例和实施方案。发明详述后面是实施例，其阐述了发明的多个方面和实施方案。
1.定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术性和学术性术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的含义。下列参考文献为技术人员提供本发明中使用之许多术语的一般定义：Singleton等，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology(2nd ed.1994)；The Cambridge Dictionary of Science andTechnology(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger等，(eds.),Springer Verlag(1991)；和Hale&Marham，The Harper CollinsDictionary of Biology(1991)。除非另有说明，本文中使用的下列术语具有赋予其的含义。
“在微藻中具有活性”是指在微藻中具有功能的核酸。例如，用于驱动抗生素抗性基因以赋予转基因微藻抗生素抗性的启动子在微藻中具有活性。
“酰基载体蛋白”或者“ACP”是脂肪酸合成过程中作为硫酯在4’-磷酸泛酰巯基乙胺基团的远端硫醇基处与生长的酰基链结合的蛋白，其包含脂肪酸合成酶复合体组分。
“酰基-CoA分子”或者“酰基-CoA”是包含酰基基团的一种分子，所述酰基基团在辅酶A 4’-磷酸泛酰巯基乙胺基团的远端硫醇基处通过硫酯键连接与辅酶A共价连接。
“面积百分比”是指利用FAME GC/FID检测方法观察到的峰面积，在所述检测方法中，检测前将样品中的每个脂肪酸均转化成为脂肪酸甲酯(FAME)。例如，与其他任何脂肪酸例如C14:1相比，对于14个碳原子的饱和脂肪酸(C14:0)可以观察到单独的峰。每种FAME的峰面积与其在混合物中的百分含量是成比例的，其可以基于样品中存在之所有峰的总和来计算(即[特异性峰的面积/所有被测峰的总面积]×100)。当涉及本发明之油类和细胞的脂类特性时，“C8-C14含量为至少4％”是指细胞中或者提取的甘油脂组合物中总脂肪酸的至少4％具有包括8、10、12或者14个碳原子的链长度。
“无菌的”是无其他有生命的生物体污染的生物体培养物。
“生物柴油”是利用生物学方法产生的脂肪酸酰酯，其适于在柴油发动机中用作燃料。
“生物质”是通过细胞生长和/或繁殖产生的物质。生物质可以包含细胞和/或胞内内含物以及胞外物质，其包括但不限于由细胞分泌的化合物。
“生物反应器”是封闭或者半封闭腔体，细胞培养于其中，可选地以悬浮形式。
“催化剂”是一种试剂，例如分子或者大分子复合体，其能够帮助或者促进反应物至产物的化学反应而不会成为产物的一部分。催化剂使反应速率增加，接着催化剂可以作用于另一个反应物，以生成产物。催化剂一般使反应所需的总活化能降低，以使反应更快地或者在较低温度下进行。因此，可以更快地到达反应平衡。催化剂的示例包括酶，其是生物催化剂；热，其是非生物催化剂；和在化石油类提炼过程中使用的金属。
“纤维素类物质”是纤维素的消化产物，其包括葡萄糖和木糖，以及可选地额外的化合物(例如二糖、寡糖、木质素、糠醛和其他化合物)。纤维素类物质来源的非限定性示例包括甘蔗渣、甜菜浆、玉米秸秆、木片、锯末和柳枝稷。
“共培养”和其变体例如“共培育”和“共发酵”是指在相同的生物反应器中存在两种或者多种类型的细胞。两种或者多种类型的细胞可以均是微生物，例如微藻，或者可以是微藻细胞与一种不同的细胞类型培养。培养条件可以是刺激两种或者多种类型细胞生长和/或繁殖的条件，或者是促进两种或者多种细胞中的一种或者其子代生长和/或繁殖同时使剩余细胞保持生长的条件。
“辅助因子”是除底物之外的任何分子，是酶发挥其酶促活性所需的分子。
“互补DNA”或者“cDNA”是mRNA的DNA拷贝，一般通过信使RNA(mRNA)的逆转录或者扩增(例如通过聚合酶链式反应(“PCR”))获得。
“培育”或者其变体例如“培养”和“发酵”是指通过使用可选和/或可控条件有意地刺激一种或者多种细胞的生长(细胞大小、细胞内含物和/或细胞活性增加)和/或繁殖(通过有丝分裂使细胞数量增加)。生长和繁殖的组合可以称作增殖。可选和/或可控条件的示例包括使用限定性培养基(具有已知特性，例如pH值、离子强度和碳源)、指定温度、氧压、二氧化碳水平和在生物反应器中生长。培育不是指自然界中微生物的生长或繁殖或者除此之外无人为干涉；例如，最终变成化石以产生地质原油之生物体的自然生长不是培育。
“细胞裂解”是低渗环境中细胞的裂解。细胞裂解是由过度渗透或者水向细胞内侧运动(水分过多)引起。细胞不能承受内侧水的渗透压，因此发生爆炸。
“脱脂粉(Delipidated meal)”和“脱脂的微生物生物质”是油类被提取或者分离后的微生物生物质，其通过利用机械(即通过压榨机实施)，或者溶剂萃取，或者二者同时使用。与从微生物生物质中提取或者分离油类/脂类之前相比，脱脂粉中油类/脂类含量减少，但是其含有一些残留的油类/脂类。
“表达载体”或者“表达构建体”或者“质粒”或者“重组DNA构建体”是指通过人为干涉制备的核酸，包括利用使得宿主细胞中特定核酸进行转录和/或翻译的一系列特定核酸元件通过重组方法或者直接的化学合成来制备。表达载体可以是质粒、病毒或者核酸片段的一部分。表达载体通常包含需要转录的核酸，其与启动子可操作地连接。
“外源基因”是编码被引入(“转化”)细胞中之RNA和/或蛋白表达的核酸。经转化的细胞可以被称为重组细胞，其中可以引入额外的外源基因。相对于被转化的细胞，外源基因可以来源于不同物种(因而是异源的)，或者来源于相同物种(因而是同源的)。因此，外源基因可以包括相对于基因的内源拷贝在细胞基因组中占据不同位置或者处于不同控制下的同源基因。外源基因可以在细胞中存在多于一个拷贝。外源基因可以通过插入基因组或者作为附加分子存在于细胞中。
“外源提供”是指提供到细胞培养之培养基中的分子。
“压榨”是从原材料(例如大豆和油菜籽)中提取油类的一种机械方法。压榨机是一种螺旋型机器，其挤压材料使其通过封闭桶样的腔。原材料进入压榨机的一侧，废饼从另一侧挤出，而油从箱体柱子之间渗出并被收集。该机器使用由螺杆转动产生的摩擦力和持续压力来移动并挤压原材料。油通过不能使固体通过的小开口渗出。由于原材料被挤压，通常摩擦力使得其变热。
“脂肪酰基-ACP硫酯酶”是在脂类合成过程中催化从酰基载体蛋白中切割下脂肪酸的酶。
“脂肪酰基-CoA/醛还原酶”是催化酰基-CoA还原成为伯醇的酶。
“脂肪酰基-CoA还原酶”是催化酰基-CoA还原成为醛的酶。
“脂肪醛脱羰基酶”是催化脂肪醛转化成为烷烃的酶。
“脂肪醛还原酶”是催化醛还原成为伯醇的酶。
“固定碳源”是一种含碳分子，通常是有机分子，其在环境温度和压力下以固体或者液体形式存在于培养基中，可以被培养于培养基中的微生物使用。
“匀浆物”是被物理破坏的生物质。
“碳氢化合物”是仅含有氢原子和碳原子的分子，其中碳原子共价连接形成直链、支化、环状或者部分环状的主链，氢原子连接到主链上。碳氢化合物的分子结构从最简单的甲烷(CH4)(天然气成分)形式到非常大并且非常复杂的结构(例如在原油中发现的沥青质、石油和沥青)之间变化。碳氢化合物可以是气态、液态或者固态形式，或者这些形式的任意组合，并且主链中相邻的碳原子之间具有一个或者多个双键或三键。因此，该术语包括直链、支化、环状或者部分环状的烷烃、烯烃、脂类和石蜡。其示例包括丙烷、丁烷、戊烷、己烷、辛烷和鲨烯。
“碳:氢比”是分子中氢原子和碳原子的比率(基于原子对原子)。该比率可以用于指碳氢化合物分子中碳原子和氢原子的数量。例如，具有最高比率的碳氢化合物是甲烷CH4(4:1)。
“疏水组分”是材料的一部分或者片段，其在疏水相中比在水相中可溶性更高。疏水组分在水中基本上是不可溶的并且一般是非极性的。
“脂类产率增加”是指微生物培养物产量增加，例如通过增加每升培养物的细胞干重、增加生产脂类之细胞的百分比或者增加单位时间内每升培养物体积的脂类总量。
“诱导型启动子”是响应于特定刺激物而介导可操作连接之基因进行转录的启动子。
“可操作连接”是两个核酸序列之间的功能性连接，所述核酸序列例如控制序列(通常是启动子)和相连序列(通常是编码蛋白的序列，也被称为编码序列)。如果启动子可以介导外源基因转录，那么启动子与外源基因处于可操作连接。
“原位”是指“在适当位置”或者“在其原始位置”。
“营养物质的限制性浓度”是培养基中化合物的浓度，其限制培养之微生物的繁殖。“营养物质的非限制性浓度”是在特定培养期间提供最大繁殖的浓度。因此，在营养物质限定性浓度存在下，特定培养期间产生的细胞数低于当营养物质是非限定性时。当营养物质的浓度大于提供最大繁殖的浓度时，该营养物质在培养基中被称为是“过量”的。
“脂酶”是一种水溶性酶，其催化水不溶性脂类底物的酯键发生水解。脂酶催化脂类水解成为甘油和脂肪酸。
“脂类修饰酶”是指一种改变脂类共价结构的酶。脂修饰酶的示例包括脂酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶和脂肪醛脱羰基酶。
“脂类途径酶”是在脂类代谢(即脂类合成、修饰或者降解)中发挥作用的任何酶，和对脂类进行化学修饰的任何蛋白以及载体蛋白。
“脂类”是溶于非极性溶剂(例如醚和氯仿)并且相对或者完全不溶于水的一类分子。脂类分子具有这些特性，因为其大部分由天然疏水性长烃尾组成。脂类的示例包括脂肪酸(饱和的和不饱和的)、甘油酯或者甘油脂(例如甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯或者中性脂肪，和磷酸甘油酯或者甘油磷酸脂)、非甘油酯(鞘脂类、甾醇脂(包括胆甾醇和甾类激素)、异戊烯醇脂(包括萜类)、脂肪醇、蜡和聚酮类)和复合脂类衍生物(连接糖的脂类，或者糖脂，和连接蛋白的脂类)。“脂肪”是脂类的亚族，其被称为“甘油三酯”。
“裂解物”是含有已裂解细胞之内含物的溶液。
“裂解”是生物体的质膜以及可选地细胞壁发生破裂，其足以释放至少部分胞内内含物，通常通过机械、病毒或者渗透机制损伤其完整性。
“溶解”是生物体或者细胞的细胞膜和可选的细胞壁被破坏，其足以释放至少部分胞内内含物。
“微藻”是含有叶绿体和或者质体并且可选地能够进行光合作用的真核微生物，或者是能够进行光合作用的原核微生物。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光能自养生物以及完全依靠固定碳源生存的异养生物。微藻包括细胞分裂后即刻与姐妹细胞分离的单细胞生物(例如衣藻(Chlamydomonas))以及例如团藻(Volvox，两种不同细胞类型简单多细胞光合微生物)的微生物。微藻包括例如小球藻、杜氏藻(Dunaliella)和原藻细胞。微藻还包括显示细胞-细胞粘附的其他光合微生物，例如阿格门氏藻(Agmenellum)、鱼腥藻(Anabaena)和桑椹藻(Pyrobotrys)。微藻还包括丧失进行光合作用的能力的专性异常微生物，例如某些双鞭甲藻和原藻属中的菌种。
“微生物”是用显微镜可以看见的单细胞生物体。
对于两种蛋白或者基因的“天然共表达”是指蛋白或者其基因天然共表达于其来源的组织或者生物体中，例如由于编码这两种蛋白的基因处于共同调控序列的控制下，或者由于其响应于相同刺激物而表达。
“渗透压休克”是渗透压突然减少后溶液中细胞的破裂。有时诱导发生渗透压休克，以使这些细胞的细胞内含物释放到溶液中。
“多糖降解酶”是能够催化多糖水解或者糖化的任意酶。例如，纤维素酶催化纤维素水解。
“多糖”或者“聚糖”是由通过糖苷键连接到一起的单糖组成的碳水化合物。可以利用酶使纤维素解聚，以产生单糖(例如木糖和葡萄糖)以及较大的二糖和寡糖。
“启动子”是指导核酸转录的核酸控制序列。本文中使用的启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如对于II型聚合酶启动子来说是TATA元件。可选地，启动子还包括远端的增强子或者抑制子元件，其可以位于离转录起始位点远至数千碱基对的位置。
“重组”是由于引入外源核酸或者改变天然核酸而被修饰细胞、核酸、蛋白或者载体。因此，例如重组细胞表达细胞天然形式中没有的基因或者表达与由非重组细胞表达的那些基因不同的天然基因。“重组核酸”是一般通过对核酸进行处理(例如利用聚合酶和核酸内切酶)最初于体外形成的核酸，或者除此之外以通常天然不存在的形式。可以产生重组核酸，例如用以使两种或者多种核酸处于可操作连接。因此，就本发明的目的而言，认为通过使通常天然不会连接的DNA分子相连接而于外体形成的分离的核酸或者表达载体是重组的。重组核酸一经制备并引入到宿主细胞或者生物体中，其可以利用宿主细胞体内的细胞体系进行复制；但是，这种核酸一经重组产生，尽管其随后在胞内进行复制，就本发明的目的而言仍然认为其是重组的。类似地，“重组蛋白”是利用重组技术制备的蛋白，即通过重组核酸的表达。
“可再生柴油”是烷烃(例如C10:0、C12:0、C14:0、C16:0和C18:0、)的混合物，其通过脂类的加氧作用和脱氧作用产生。
“糖化”是使生物质(通常是纤维素类生物质或者木质纤维素类生物质)转化成为单糖(例如葡萄糖和木糖)的过程。“经糖化的”或者“经解聚的”是指通过糖化作用已经转化成为单糖的纤维素类物质或者生物质。
“声波作用”是利用声波能量破坏生物材料(例如细胞)的过程。
“糠醛种类”是保持相同的基本结构特性的2-呋喃羧基醛或者其衍生物。
“干草”是收集谷粒后作物的经干燥的茎和叶。
“蔗糖利用基因”是当表达时帮助细胞能够利用蔗糖作为能量来源的基因。本文中由蔗糖利用基因编码的蛋白被称为“蔗糖利用酶”，其包括蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶和己糖激酶(例如葡糖激酶和果糖激酶)。
II.培养
本发明总体涉及原藻菌株的培养，特别是重组原藻菌株的培养，用以生产脂类。为了便于阅读，本章分为几节。第1节描述了原藻菌种和菌株，以及如何通过基因组DNA的比较来鉴定新的原藻菌种和菌株以及相关微藻。第2节描述了用于培养的生物反应器。第3节描述了培养基。第4节描述了依照本发明中阐述性培养方法生产油类。
1.原藻菌种和菌株
原藻是用于生产脂类的标志性微生物，因为其可以产生大量脂类，特别是适用于生产燃料的脂类。与由其他微藻生产的脂类相比，由原藻生产的脂类具有较短长度和较高饱和度的碳氢链。此外，原藻脂类一般不含色素(叶绿素和某些类胡萝卜素低至不可检出水平)，而且在任何情况下其色素含量远远少于来源于其他微藻的脂类。此外，相对于由其他微藻生产脂类，本发明中提供的重组原藻细胞可以以较高产率和效率以及较低成本生产脂类。本发明方法中使用的阐述性原藻菌株包括此外，这种微藻可以异养生长并且可以经遗传工程改造成为Prototheca wickerhamii、Protothecastagnora(包括UTEX 327)、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis(包括UTEX菌株1441,1435)和Prototheca zopfii。原藻属的菌株是专性异养型。
可以通过扩增基因组的特定靶区域来鉴定本发明中使用的原藻菌种。例如，可以通过利用引物和利用基因组任意区域的方法(例如利用Wu等，Bot.Bull.Acad.Sin.(2001)42:115-121 Identification of Chlorella spp中描述的方法)对核和/或质体DNA进行扩增和测序，来鉴定特定的原藻菌种或者菌株。使用核糖体DNA序列分离。本领域技术人员使用公认的系统发生学分析方法(例如对核糖体内转录间隔区(ITS1和ITS2rDNA)、23SrRNA、18S rRNA和其他保守的基因组区域进行扩增和测序)，不仅可以鉴定原藻菌种，还可以鉴定具有相似脂类特性和生产能力的生产碳氢化合物和脂类的其他生物体。对藻类进行鉴定和分类的方法示例还可以见于例如Genetics,2005 Aug；170(4):1601-10和RNA,2005 Apr；11(4):361-4。
因此，可以利用基因组DNA比较来鉴定本发明中使用的适宜微藻菌种。可以从微藻菌种中扩增基因组DNA的保守区域(例如但不限于编码23S rRNA的DNA)，并比较共有序列，用以筛选与本发明中使用的优选微藻在分类学上相关的微藻菌种。对于原藻属菌种的这种DNA序列比较的示例显示于下面。基因组DNA比较还可以用于鉴定菌株保藏中错误鉴定的微藻菌种。菌株保藏通常基于表型特征和形态特征鉴定微藻菌种。使用这些特征可能导致对微藻属或者菌种进行错误分类。使用基因组DNA比较是基于系统发生学关系对微藻菌种进行分类的较好方法。
本发明中使用的微藻通常具有编码与SEQ ID NO:11-19具有至少99％、至少90％或者至少85％核苷酸一致性之23S rRNA的基因组DNA序列。
对于使用序列比较来确定核苷酸或者氨基酸一致性，通常以一种序列作为参照序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果需要)，并且指定序列算法的程序参数。随后基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
可以例如通过局部同源性算法(Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981))、同源性比对算法(Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970))、相似性搜索方法(Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444(1988))、计算机实施的这些方法(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)或者通过目检(一般见于上文Ausubel等)来进行比较序列的最佳比对。
适于确定序列一致性和序列相似性百分比的另外一种算法示例是BLAST算法，其描述于Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。进行BLAST分析的软件可以在National Center for BiotechnologyInformation上(网址是www.ncbi.nlm.nih.gov)公开获得。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短词来鉴定高分数序列对(HSPs)，所述短词在与数据库序列中具有相同长度的词比对时匹配或满足某些正值的阈值分数T。T是指邻域词分数阈值(上文Ausubel等)。这些初始邻域词命中作为种子启动搜索，用以寻找含有它们的较长HSPs。接着该词命中沿着每条序列在两个方向延伸，远至能够提高累积比对分数。对于核苷酸序列，利用参数M(一对匹配残基的奖励分数，通常>0)和N(非配对残基的罚分，通常<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用分数矩阵计算累积分数。每个方向上词命中的延伸在下列情况时停止：当累积比对分数由其达到的最大值降低数量X；由于一个或者多个残基比对负值的积累而使累积分数降至0或者以下；或者达到任一序列的末端。对于鉴定核酸或者多肽是否在本发明的范围内，BLAST程序的默认参数是合适的。BLAST程序(对于核苷酸序列)使用的默认值是词长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4和进行两条链的比较。对于氨基酸序列，BLAST程序使用的默认值是词长(W)为3，期望值(E)为10和BLOSUM62分数矩阵。TBLATN程序(对于核苷酸序列，利用其蛋白序列)使用的默认值是词长(W)为3，期望值(E)为10和BLOSUM62分数矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
除了计算序列一致性百分比之外，BLAST算法还可以进行两个序列之间相似性的统计学分析(例如参见Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测定是最小总和概率(P(N))，其表示通过两个核苷酸或者核酸序列之间偶然发生配对的概率。例如，如果测试核酸与参照核酸比较的最小总和概率小于大约0.1，更优选小于大约0.01，最优选小于大约0.001，则认为该核酸与参照序列是相似的。
除了生产合适的脂类或者碳氢化合物以生产油类、燃料和油脂化工产品之外，影响对本发明中使用的微生物进行选择的其他考虑因素包括：(1)脂类含量高(以细胞重量计算)；(2)易于生长；(3)易于进行遗传工程化；(4)易于对生物质进行处理。在特定的实施方案中，野生型或者经遗传工程化的微生物生产具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或者至少70％或者更多的脂类。优选生物体是异养生长型(不存在光下生长于糖类中)。
2.生物反应器
以进行遗传学操作和生产碳氢化合物(例如脂类、脂肪酸、醛、醇和烷烃)为目的培养微生物。前面一种类型的培养以小规模并且最初至少在起始微生物可以生长的条件下进行。以生产碳氢化合物为目的的培养通常以大规模(例如10,000L、40,000L、100,000L或者更大的生物反应器)在生物反应器中进行。通常利用本发明的方法在生物反应器内的液体培养基中对原藻进行培养。生物反应器通常不允许光进入。
使用生物反应器或者发酵罐来培养微藻细胞，至其生理周期的多个阶段。在异养生长和繁殖方法中使用生物反应器提供很多优势。为了生产用于食品中的生物质，优选在液体中(例如在悬浮培养基中)大量发酵微藻。生物反应器(例如不锈钢发酵罐)可以容纳非常大的培养体积(本发明的多个实施方案中使用具有40,000升和更大能力的生物反应器)。生物反应器通常还使得可以控制培养条件，例如温度、pH值、氧压和二氧化碳水平。例如，生物反应器通常是可配置的，例如利用与管道连接的接口，以允许气体组分(例如氧气或者氮气)通过液体培养物起泡。利用生物反应器还可以更容易地对其他培养参数(例如培养基的pH值、微量元素的类型和浓度以及其他培养基组分)进行控制。
生物反应器可以配置成使培养基在微藻复制和数量增加期间流过生物反应器。例如在一些实施方案中，可以在接种后但是在细胞达到期望密度之前将培养基注入生物反应器中。在其他情况下，培养初始即将培养基充满生物反应器，并且在接种培养物后不再注入培养基。换言之，使微藻生物质在液体培养基中培养一段时间，其间微藻复制并且数量增加；但是，在这期间没有大量的液体培养基流过生物反应器。因此在一些实施方案中，接种后没有液体培养基流过生物反应器。
可以利用装配有例如旋转刀和旋桨、振荡器、搅拌棒、用于将气体增压注入的装置等设备的生物反应器使微藻培养物混合。混合可以是连续性的或者周期性的。例如，在一些实施方案中，没有维持气体进入和培养基进入的紊流条件以使微藻复制，直至所述微藻数量的增加达到期望水平。
可以使用生物反应器接口引入或者提取气体、固体、半固体和液体至含有微藻的生物反应室中。由于很多生物反应器具有多于一个接口(例如一个用于培养基进入，另一个用于取样)，仅使一种物质进入或者保留一个接口是没有必要的。例如，可以使用一个接口使培养基流入生物反应器中并且随后用于取样、进气、排气或者其他目的。优选可以重复使用取样口，不会改变妥协培养物的无菌性质。取样口可以配置成具有阀门或者具有使样品停止和开始流动或者提供连续取样装置的其他设备。通常生物反应器具有能够接种培养物的至少一个接口，其还可以用于其他目的，例如培养基进入或者气体进入。
生物反应器接口使得可以控制微藻培养物的气体含量。例如，生物反应器的部分体积可以是气体而非液体，并且生物反应器的气体入口允许将气体泵入生物反应器中。可以有益地泵入生物反应器中的气体包括空气、空气/CO2混合物、隋性气体(例如氩气)和其他气体。通常生物反应器装配成使得使用者能够控制气体进入生物反应器的速率。如上面提到，可以通过增加流入生物反应器的气体来促进培养物混合。
气体流动增加还影响培养物的浊度。通过在液体培养基层下放置一个进气口以使进入生物反应器的气体在培养物表面起泡，可以产生紊流。一个或者多个排气口使气体可以泄漏，因此防止生物反应器中压力累积。优选排气口通向防止杂质微生物进入生物反应器的止回管道。
3.培养基
微藻培养基通常含有例如固定氮源、固定碳源、微量元素、可选地维持pH值的缓冲液和磷酸类物质(通常以磷酸盐提供)等组分。其他组分可以包括盐(例如氯化钠)，特别是对于海水微藻。氮源包括有机和无机氮源，其例如包括但不限于分子氮、硝酸、硝酸盐、氨(纯氨水或者盐形式，例如(NH4)2SO4和NH4OH)、蛋白、大豆粉、玉米浆和酵母提取物。微量元素的示例包括锌、硼、钴、铜、锰和钼，例如分别以ZnCl2、H3BO3、CoCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、MnCl2·4H2O和(NH4)6Mo7O24·4H2O的形式提供。
根据本发明的方法使用的微生物可以在全世界多个地点和环境中发现。由于其与其他菌种分离和其发生的进化趋异，因此难以预测提供最佳生长以及生产脂类和/或碳氢化合物成分的特定生长培养基。在某些情况下，特定的微生物菌株可能不能生长于特定的生长培养基中，因为存在某些抑制组分或者缺少该特定微生物菌株需要的某些关键性营养需求。
一般可以从多种来源获得固体和液体生长培养基，而且可以例如在线适用于多种微生物菌株之特定培养基的制备方法可以在http://www.utex.org/(University of Texas at Austin,1 University Station A6700,Austin,Texas,78712-0183站点)中的藻类培养物保藏中心在线找到。例如，多种淡水和盐水培养基包括描述于PCT公开号为2008/151149中的培养基，其作为参考引入本文。
在一个特定的实施例中，Proteose培养基适用于进行无菌培养，并且可以通过将加入1g蛋白胨加入到1升Bristol培养基中来制备1L体积的培养基(pH～6.8)。Bristol培养基包含1L溶液中的2.94mM NaNO3、0.17mMCaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.43mM、1.29mM KH2PO4和1.43mMNaCl。对于1.5％的琼脂培养基，可以将15g琼脂加入到1L溶液中。将培养基盖好并进行高压灭菌，随后在使用前储存于冷藏温度中。另一个示例是原藻分离培养基(PIM)，其包含10g/L苯二甲酸氢钾(KHP)、0.9g/L氢氧化钠、0.1g/L硫酸镁、0.2g/L磷酸氢钾、0.3g/L氯化铵、10g/L葡萄糖、0.001g/L盐酸硫胺素、20g/L琼脂、0.25g/L 5-氟胞嘧啶，pH值范围是5.0至5.2(参见Pore,1973,App.Microbiology,26:648-649)。通过咨询上面显示的URL或者通过咨询保藏微生物培养物的其他组织(例如SAG、CCAP或者CCALA)，可以容易地鉴定适用于本发明方法中的其他培养基。SAG是the University of(Germany)的Culture Collection ofAlgae，CCAP是由Scottish Association for Marine Science(Scotland,UnitedKingdom)管理的藻类和原生动物培养物保藏中心，CCALA是the Instituteof Botany(Czech Republic)的藻类培养物保藏实验室。此外，美国专利第5,900,370号描述了适合原藻菌种异养发酵的培养基配方和条件。
对于油类生产，选择固定碳源十分重要，因为固定碳源的成本必须足够低，以经济地进行油类生产。因此，当适宜碳源包括例如醋酸酯、红藻糖苷、果糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、鼠李糖、蔗糖和/或木糖时，选择含有这些化合物的给料是本发明方法中的一个重要方面。根据本发明使用的适宜给料包括例如黑液、玉米淀粉、经解聚的纤维素类物质、奶浆、糖蜜、马铃薯、高粱、蔗糖、甜菜、甘蔗、稻米和小麦。还可以以混合物形式提供碳源，例如蔗糖和经解聚之甜菜浆的混合物。外源供给之一种或者多种固定碳源的浓度可以是至少大约50M、至少大约100M、至少大约500M、至少大约5mM、至少大约50mM和至少大约500mM。本发明目的中特别优选的碳源包括纤维素(以解聚形式)、甘油、蔗糖和高粱，下面对其中的每一种进行更加详细地讨论。
根据本发明，可以利用经解聚的纤维素类生物质作为给料培养微生物。纤维素类生物质(例如干草，例如玉米干草)是廉价并且易于获得的；但是，使用该材料作为给料的尝试失败了。具体地，已经发现这种给料可以抑制酵母生长，而且酵母不能利用纤维素类物质中产生的5-碳糖(例如从半纤维素中生产的木糖)。相反地，微藻可以生长于经加工的纤维素类物质中。纤维素类物质一般包括大约40-60％的纤维素、大约20-40％的半纤维素和10-30％的木质素。
适宜的纤维素类物质包括来源于草本和木本能源作物以及农作物的剩余物(不是从主要的食物或者纤维产品田地中取下的)，即植物器官、初生茎和初生叶。示例包括农业废弃物(例如甘蔗渣、稻米壳、玉米纤维(包括茎、叶、壳和棒)、小麦秸秆、稻米秸秆、甜菜浆、柑橘浆、柑橘皮)、林业废弃物(例如硬木和软木间伐材以及木材处理时的硬木和软木剩余物)、木材废弃物(例如锯木厂废弃物(木片、锯末)和纸浆厂废弃物)、城市废弃物(例如城市固体废弃物的纸质部分、城市木质废弃物和城市绿色废弃物(例如城市剪草))和木材建筑废弃物。其他纤维素类物质包括专门的纤维素作物，例如柳枝稷、杂交白杨木和芒草、纤维甘蔗和纤维高粱。从这些材料中生产的五碳糖包括木糖。
对纤维素类物质进行处理，以增加微生物利用这些材料中所含糖类的效率。本发明提供了酸汽爆后对纤维素类物质进行处理的新方法，以使材料适用于微生物(例如微藻和产油酵母)的异养培养。如上面所讨论，木质纤维素类生物质由多种组分组成，包括纤维素(β-1,4连接之葡萄糖(一种六碳糖)的一种晶体多聚物)、半纤维素(较松散连接的多聚物，主要由木糖(一种五碳糖)组成并且含有少量的甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖)、木质素(一种复杂的芳香族多聚物，由芥子醇和其衍生物组成)和果胶(α-1,4连接的直链多聚半乳糖醛酸)。由于纤维素和半纤维素具有多聚结构，其中所含糖类(例如单糖葡萄糖和木糖)的形式不能被很多微生物有效利用。对于这些微生物，对纤维素类生物质进行进一步加工以产生构成多聚物的单糖有助于保证纤维素类物质作为给料(碳源)能够被有效利用。
纤维素或纤维素类生物质需要经过称为“汽爆”的过程，其中在高温和高压下用稀硫酸(或者其他)处理生物质。该过程使得生物质中的纤维素和半纤维素组分能够被有效地酶促水解成为葡萄糖和木糖单体。所得到的单糖被称为纤维素糖。随后纤维素糖被微生物利用，产生大量代谢物(例如脂类)。酸汽爆步骤使得半纤维素组分部分水解成为组成其的单糖。进一步处理后，这些糖类可以完全从生物质中释放出来。在一些实施方案中，进一步处理是热水处理，其包括用热水对经汽爆的材料进行清洗，去除杂质(例如盐)。该步骤对于纤维素乙醇发酵来说是不必要的，因为该过程中使用较高稀释度的糖浓度。在其他实施方案中，进一步处理是额外的酸处理。在其他实施方案中，进一步处理是对经汽爆的材料进行酶促水解。这些处理还可以结合使用。处理类型可以影响释放的糖类型(例如五碳糖对六碳糖)和处理过程中糖类释放的阶段。因此，可以产生不同的糖流，无论其主要是五碳糖或者六碳糖。这些经富集的五碳糖或者六碳糖流因而可以针对具有不同碳利用能力的特定微生物。
本发明的方法通常包括发酵以产生较高的细胞密度(高于乙醇发酵中达到的细胞密度)。由于用于异养纤维素油类生产的培养物密度较高，优选固定碳源(例如纤维素来源的糖流)以浓缩形式。在培养步骤前经解聚的纤维素类物质中的葡萄糖水平优选是至少300g/升、至少400g/升、至少500g/升或者至少600g/升，所述培养步骤可选地是分批补料式培养，其中随着细胞生长和积累脂类的时间将物质供给到细胞中。纤维素乙醇的生产过程中不使用该浓度范围或者与该浓度范围接近的纤维素糖流。因此，为了在生产木质纤维素油类过程中产生并且保持非常高的细胞密度，碳给料必须以高度浓缩形式递送至异养培养物中。但是，不是产油微生物之作用物或者不能被产油微生物代谢的任何给料流组分会在生物反应器中积累，如果这些组分是毒性的或者能够抑制期望终产物的产生，这将会带来难题。而由于在乙醇发酵中，木质素和木质素来源的副产物、碳水化合物来源的副产物(例如糠醛和羟甲基糠醛)和来源于纤维素类物质产生过程中(汽爆过程中和其后的中和过程中)的盐以及甚至未代谢的戊糖/己糖都会带来难题，在其在初始给料中浓度很高的过程中，这些影响会显著放大。为了使本发明中描述的木质纤维素油类大量生产中使用的六碳糖达到大约300g/L(或进更高)的糖浓度，这些毒性材料的浓度可以比通常存在于纤维素类生物质乙醇发酵过程中的浓度高20倍。
纤维素物质的汽爆处理过程利用大量的硫酸、热和压力，因而释放碳水化合物的副产物，称为糠醛和羟甲基糠醛。糠醛和羟甲基糠醛通过木糖降解成为糠醛和水在半纤维素水解过程中产生。在本发明的一些实施方案中，引入生物反应器前，从经糖化的木质纤维素物质中去除这些副产物(例如糠醛和羟甲基糠醛)。在本发明的某些实施方案中，去除碳水化合物之副产物的过程是对经汽爆的纤维素物质进行热水处理。此外，本发明提供了使用能够耐受例如糠醛和羟甲基糠醛的化合物以生产木质纤维素油类的方法。在另一个实施方案中，本发明还提供了不仅能够耐受发酵培养基中的糠醛而且还真正能够代谢木质纤维素油类生产过程中之这些副产物的方法和微生物。
汽爆过程还产生大量盐。例如，当经汽爆的纤维素类生物质以10:1的水:油比率(干重)重悬时，汽爆的通常条件可以使传导性超过5mS/cm，在本发明的某些实施方案中，对稀释的经汽爆生物质进行酶促糖化，将得到的上清液浓缩至25倍，以用于生物反应器中。经浓缩之糖流中的盐水平(通过传导性测定)出乎意料地高(至与1.5M Na+等价)。对经汽爆物质进行中和作用以进行随后的糖化过程也产生了额外的盐。本发明提供了去除这些盐的方法，以使得到的经浓缩之纤维素糖流可以用于生产木质纤维素油类的异养过程中。在一些实施方案中，去除这些盐的方法是用树脂(例如但不限于DOWEX Marathon MR3)进行去离子化。在某些实施方案中，糖浓缩或者调整pH值和糖化前对生物质进行热水处理之前进行树脂去离子化过程，或者上述步骤的任意组合；在其他实施方案中，这些步骤中的一个或者多个之后进行该步骤。在其他实施方案中，汽爆过程自身发生变化，以避免产生出乎意料地高水平的盐。例如，纤维素类生物质硫酸(或者其他酸)汽爆的适宜替代步骤是机械浆化，以使纤维素类生物质能够进行酶促水解(糖化)。在其他实施方案中，使用能够抵抗高水平盐的微生物天然菌株或者能够抵抗高水平盐的经遗传工程化的菌株。
经汽爆之纤维素类生物质(用于利用产油微生物进行异养型木质纤维素油类的生产中)的制备过程的一个优选实施方案图示于图10中。步骤I包括将经汽爆之纤维素类生物质的重悬液的pH值调整至5.0-5.3范围内，随后清选纤维素类生物质3次。可以通过多种方法完成该清洗步骤，包括利用脱盐树脂和离子交换树脂、反渗透、热水处理(如上面所描述)或者仅仅在去离子水中重复进行重悬和离心步骤。该清洗步骤产生传导性在100-300μS/cm之间的纤维素流，并且去除大量的糠醛和羟甲基糠醛。可以保留该清洗步骤倒出物，以对从半纤维素组分中释放的五碳糖进行浓缩。步骤II包括经清洗之纤维素类生物质的酶促糖化。在一个优选的实施方案中，使用Accellerase(Genencor)。步骤III包括通过离心或者倾倒回收糖和对经糖化的生物质进行冲洗。得到的生物质(固体)是高能量富含木质素的组分，其可用作燃料或者丢弃。收集离心/倾倒和冲洗过程中的经回收之糖流。步骤IV包括进行微孔过滤，以去除杂质固体，回收渗透物。步骤V包括浓缩步骤，其可以利用真空蒸发器来完成。可选地，该步骤可以包括加入防沫剂例如P’2000(Gigma/Fluka)，有时该步骤是必需的，因为得到的糖给料中含有蛋白。
在本发明方法的另一个实施方案中，碳源是甘油，包括生物柴油转酯基作用产生的经酸化和未经酸化的甘油副产物。在一个实施方案中，碳源包括甘油和至少一种其他碳源。在某些情况下，在发酵初始将所有的甘油和所述至少一种其他固定碳源供给微生物。在某些情况下，将甘油和所述至少一种其他固定碳源以预定比率同时供给微生物。在某些情况下，在发酵过程中将甘油和所述至少一种其他固定碳源以预定比率供给微生物。
某些微藻在甘油存在下比在葡萄糖存在下细胞分裂更快(参见PCT公开第2008/151149号)。在这些情况下，两阶段生长过程(其中首先用甘油供给细胞，以使其细胞密度快速增长，随后用葡萄糖供给细胞，以积累脂类)可以提高脂类生产的效率。利用转酯基过程中产生的甘油副产物具有显著的经济优势，当其回到生产过程中时。还提供了其他供给方法，例如将甘油和葡萄糖混合。供给这种混合物也具有相同的经济益处。此外，本发明提供了以替代糖类(例如蔗糖与甘油的多种组合物)供给微藻的方法。
在本发明方法的另一个实施方案中，碳源是蔗糖，包括含有蔗糖的给料复合物，例如甘蔗加工后的浓甘蔗汁。在一个实施方案中，培养基进一步包含至少一种蔗糖利用酶。在某些情况下，培养基包含蔗糖转化酶。在一个实施方案中，蔗糖转化酶是可分泌的蔗糖转化酶，其由微生物群表达的蔗糖转化酶基因编码。因此，在某些情况下，如下面第IV章中更加详细的描述，微藻已经经遗传工程化，以表达蔗糖利用酶，例如蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、己糖激酶、葡糖激酶或者果糖激酶。
含有蔗糖的给料复合物包括甘蔗加工过程中的废糖蜜；利用甘蔗加工过程中的该低价废弃物产品可以显著节省碳氢化合物和其他油类生产的成本。本发明方法中使用的另一种含有蔗糖的给料复合物是高粱，包括高粱糖浆和纯高粱。高粱糖浆从甜高粱的汁液中产生。其糖类谱主要由葡萄糖(右旋糖)、果糖和蔗糖组成。
4.油类生产
根据本发明的方法，对于油类生产，优选在黑暗中培养细胞，例如当使用不允许光照射培养基的极大(40,000升或者更大)发酵罐时。原藻菌种在含有固定碳源且没有光的培养基中生长和繁殖，以生产油类；已知这种生长是异养生长。
作为示例，将产脂微藻细胞的接种物引入培养基中；细胞开始繁殖前存在延迟时期(延迟期)。延迟期后，繁殖速率平稳增加，进入对数期或者指数期。指数期后，由于营养物质(例如氮)减少、毒性物质增加以及群体感应机制，繁殖减慢。减慢后，繁殖停止，依赖于向细胞提供的特定环境，细胞进入静止期或者平稳生长状态。为了获得脂类富集的生物质，通常在指数期末期之后收集培养基，可以通过使氮或者另一种关键营养物质(除了碳之外)耗尽从而迫使细胞将过量存在的碳源转化成为脂类，使指数期较早终止。可以控制培养条件参数，以使总体油类生产、所产生的脂类组合物和/或特定油类的生产达到最佳。
如上面所讨论，使用生物反应器或者发酵罐，以使细胞进入其生长循环的多个时期。作为示例，将产脂细胞的接种物引入培养基中，随后在细胞开始生长前进入延迟时期(延迟期)。延迟期后，繁殖速率平稳增加，进入对数期或者指数期。指数期后，由于营养物质减少和/或毒性物质增加，生长减慢。减慢后，生长停止，依赖于向细胞提供的特定环境，细胞进入静止期或者平稳状态。本文公开之细胞的脂类生产可以发生于对数期过程中或者其后，包括静止期，其中提供或者仍然可获得营养成分，以使细胞在不分裂的情况下能够持续生产脂类。
优选利用本文中描述的条件生长并且本领域已知的微生物包含至少大约20％重量的脂类，优选至少大约40％重量，更优选至少大约50％重量，最优选至少大约60％重量。可以调整过程中的条件，以增加适合特定用途之脂类的产率和/或减少生产成本。例如，在某些实施方案中，在具有限定性浓度的一种或者多种营养物质(例如氮、磷或者硫)存在下培养微藻，同时提供过量的固定碳能(例如葡萄糖)。与在过量提供氮的培养基中微生物的脂类产率相比，限制氮倾向于使微生物的脂类产率增加。在特定的实施方案中，脂类产率增加至少大约：10％、50％、100％、200％或者500％。可以在总培养时期的一部分或者整个时期中在限定量的营养物质存在下培养微生物。在特定的实施方案中，在总培养时期期间，营养物质的浓度在限定性浓度和非限定性浓度之间至少循环2次。可以通过在延长的时期内持续加入培养基同时提供过量碳但是提供限定性氮或者不提供氮，使细胞的脂类含量增加。
在另一个实施方案中，通过在脂类途径酶(例如脂肪酸合成酶)的一种或者多种辅助因子存在下培养产脂微生物(例如微藻)，使脂类产率增加。一般来讲，辅助因子的浓度足以使微生物脂类(例如脂肪酸)产率与不存在辅助因子时的微生物脂类产率相比增加。在特定的实施方案中，通过将含有编码辅助因子之外源基因的微生物(例如微藻)加入到培养基中，向培养基提供辅助因子。可选地，可以通过加入含有编码参与辅助因子合成之蛋白的外源基因的微生物(例如微藻)向培养基提供辅助因子。在某些实施方案中，合适的辅助因子包括脂类途径酶所需的任何维生素，例如：生物素、泛酸盐。编码适用于本发明中之辅助因子的基因或者参与这些辅助因子合成的基因是已知的，并且可以利用例如上面描述的质粒和技术引入到微生物(例如微藻)中。
可以以任何合适的方式将本文中描述的生物反应器、培养条件以及异养生长和繁殖方法的特定示例进行组合，以促进微生物生长以及提高脂类和/或蛋白生产的效率。
已经利用不同的培养方法产生了具有高比率之油类/脂类积累(干重)的微藻生物质，其是本领域已知的(参见PCR公开第2008/151149号)。利用本文中描述的培养方法产生并且根据本发明使用的微藻生物质包含至少10％的微藻油(干重)。在一些实施方案中，微藻生物质包含至少25％、至少50％、至少55％或者至少60％的微藻油(干重)。在一些实施方案中，微藻生物质含有10-90％的微藻油、25-75％的微藻油、45-75％的微藻油或者50-70％的微藻油(干重)。
用于本发明的方法和组合物中的本文中描述之生物质的微藻油或者从生物质中提取的微藻油可以包含具有一个或者多个不同脂肪酸酯支链的甘油脂。甘油脂由与一个、两个或者三个脂肪酸分子发生酯化的甘油分子组成，所述脂肪酸分子可以具有不同的长度和不同的饱和度。通过如下面第IV章更加详细描述的培养条件或者脂类途径工程，可以控制脂肪酸分子(和微藻油)的长度和饱和度性质，以对本发明微藻油中之脂肪酸分子的特性或者比例进行修饰。因此，可以通过将来源于两个或者多个微藻菌种的生物质或者藻油混合，在单个微藻菌种内制备特定的藻油混合物，或者通过将本发明的藻油与其他来源的油类混合来制备特定的藻油混合物，所述其他来源例如大豆、油菜籽、加拿大油菜、棕榈叶、棕仁、椰子、玉米、废植物、乌桕油、橄榄、向日葵、棉花籽、鸡脂肪、牛脂、微藻、大型藻类、微生物、萼距花、亚麻、花生、精选白色动物油脂、猪油、亚麻芥油、芥菜籽、腰果、燕麦、羽扇豆、洋麻、金盏花、大麻、咖啡豆、亚麻仁(亚麻籽)、榛子、大戟属、南瓜籽、香菜、山茶、芝麻、红花、稻米、油桐树、可可、干椰子肉、pium poppy、蓖麻籽、碧根果、加州希蒙得木、夏威夷果、巴西坚果、鳄梨、石油或者上述油类中任意一种的馏分。
还可以通过将来源于至少两种不同之微藻菌种的生物质或者油类混合，来控制油类组成，即甘油脂中脂肪酸成分的性质和比例。在一些实施方案中，至少两种不同的微藻菌种具有不同的甘油脂谱。如本文中所描述，优选在异养条件下对不同的微藻菌种进行共同培养或者分离培养，以产生各自的油类。不同微藻菌种细胞的甘油脂中可以含有不同比例的不同脂肪酸成分。
一般来讲，原藻菌株几乎没有或者没有链长度为C8-C14的脂肪酸。例如Prototheca moriformis(UTEX 1435)、Prototheca krugani(UTEX 329)、Prototheca stagnora(UTEX 1442)和Prototheca zopfii(UTEX 1438)不含(或者不可检出量的)C8脂肪酸，含有0-0.001％之间的C10脂肪酸、0.03-2.1％之间的C12脂肪酸和1.0-1.7％之间的C14脂肪酸。
在一些情况下，含有编码对链长度为C8-C10的脂肪酰基-ACP底物具有活性之脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因原藻菌株具有至少0.3％、至少0.8％、至少1.5％或者更多的链长度为C8的脂肪酸以及至少0.3％、至少1.0％、至少3.0％、至少5％或者更多的链长度为C10的脂肪酸。在其他情况下，含有编码对链长度为C12的脂肪酰基-ACP底物具有活性之脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻菌株具有至少3.0％、至少5％、至少7％、至少10％、至少13％或者更多的链长度为C12的脂肪酸以及至少1.5％、至少2％或者至少3％或者更多的链长度为C14的脂肪酸。在其他情况下，含有编码对链长度为C14的脂肪酰基-ACP底物具有活性之脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻菌株具有至少4.0％、至少7％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％或者更多的链长度为C14的脂肪酸以及至少0.4％、至少1％、至少1.5％或者更多的链长度为C12的脂肪酸。
在非限定性实施例中，含有编码对链长度为C8和C10的脂肪酰基-ACP底物具有活性之脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻菌株具有0.3-1.58％之间的链长度为C8的脂肪酸以及0.35-6.76％之间的链长度为C10的脂肪酸。在其他非限定性实施例中，含有编码对链长度为C12的脂肪酰基-ACP底物具有活性之脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻菌株具有3.9-14.11％之间的链长度为C12的脂肪酸以及1.95-3.05％之间的链长度为C14的脂肪酸。在其他非限定性实施例中，含有编码对链长度为C14的脂肪酰基-ACP底物具有活性之脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻菌株具有4.40-17.35％之间的链长度为C14的脂肪酸以及0.4-1.83面积％之间的链长度为C12的脂肪酸。在某些情况下，含有编码对链长度在C8和C14之间的脂肪酰基-ACP底物具有活性之脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻菌株具有3.5-20％之间的中等链(C8-C14)脂肪酸。在某些情况下，由于具有特定链长度的期望脂肪酸增加，在持续且高度的选择压力下保存转基因原藻菌株以保留外源基因是有利的。在一个非限定性实施例中，实施例5描述了当培养含有优选C14之硫酯酶外源基因的Prototheca moriformis时，链长度为C14的脂肪酸增加了2倍(链长度为C14的脂肪酸大于30％)。还可以通过利用本文中公开的同源重组载体和方法将外源基因插入到细胞的染色体中，使外源基因保持高水平。含有整合到核染色体中之外源基因的重组细胞是本发明的一个目的。
微藻油还可以包括由微藻产生的或者培养基中与微藻油混合的其他成分。这些其他成分可以以不同量存在，这取决于培养微藻时使用的培养条件、微藻菌种、从生物质中回收微藻油时使用的提取方法和可能影响微藻油组合物的其他因素。这些成分的非限定性示例包括以0.1-0.4微克/ml存在的类胡萝卜素、以0-0.02毫克/千克油存在的叶绿素、以0.4-0.6毫克/100克油存在的γ-生育酚和以0.2-0.5毫克/克油存在的总生育三烯酚。
其他成分可以包括但不限于磷脂、生育酚、生育三烯酚、类胡萝卜素(例如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素等)、叶黄素(例如叶黄素、玉米黄质、α-隐黄质和β-隐黄质)和多种有机或者无机化合物。
在一些情况下，从原藻菌种中提取的油类包含不多于0.02mg/kg的叶绿素。在一些情况下，从原藻菌种中提取的油类包含不多于0.4mg/ml的类胡萝卜素。在一些情况下，每100克原藻油中包含0.40-0.60毫克之间的γ-生育酚。在其他情况下，每克原藻油中包含0.2-0.5毫克之间的总生育三烯酚。
III.遗传工程方法和材料
本发明提供了对本发明方法中使用的原藻细胞和重组宿主细胞进行遗传修饰的方法和材料，所述重组宿主细胞包括但不限于Protothecamoriformis、Prototheca zopfii、Prototheca krugan和Prototheca stagnora宿主细胞。为了便于阅读，对这些方法和材料的描述分为几节。在第1节中描述了转化方法。在第2节中描述了利用同源重组的遗传工程方法。在第3节中描述了表达载体和组分。
1.工程方法-转化
可以通过任何合适的技术转化细胞，所述技术包括例如基因枪法、电穿孔(参见Maruyama等，(2004),Biotechnology Techniques 8:821-826)、玻璃珠转化法和碳化硅晶须转化法。可以使用的另一种方法涉及形成原生质体以及利用CaCl2和聚乙二醇(PEG)将重组DNA引入微藻细胞中(参见Kim等，(2002),Mar.Biotechnol.4:63-73，其报道利用这种方法转化Chorella ellipsoidea)。可以通过共转化微藻将两种不同的载体分子同时引入细胞中(参见例如Protist 2004 Dec；155(4):381-93)。
还可以使用基因枪法(参见例如Sanford,Trends In Biotech.(1988)6:299 302，美国专利第4,945,050号)、电穿孔(Fromm等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.(USA)(1985)82:5824 5828)、使用激光束、显微注射或者能够将DNA引入微藻中的任何其他方法转化原藻细胞。
2.工程方法-同源重组
同源重组是互补DNA序列匹配并交换同源区域的能力。将转基因DNA(“供体”)引入生物体中，所述DNA含有与被靶向的基因组序列同源的序列，并接着在相应的基因组同源序列位点重组到基因组中。在大多数情况下，该过程的机械步骤包括：(1)使同源DNA片段配对；(2)使供体DNA分子发生双链断裂；(3)使供体DNA的游离末端插入到模板DNA分子中，随后进行DNA合成；和(4)发生双链断裂修复事件，其产生最终的重组产物。
在宿主生物体中进行同源重组的能力具有许多实践意义，其可以在分子遗传学水平进行并且可以用于制备能够生产特制油的产油微生物。同源重组本质上是精确的基因靶向事件，因此，由相同的靶向序列制备的大多数转基因株在表型上是基本一致的，需要筛选极少的转化事件。同源重组还将基因插入到宿主染色体中，产生极好的遗传稳定性，甚至在不存在遗传选择的情况下。由于不同的染色体座位可能影响基因表达，甚至是异源启动子/UTRs介导的基因表达，同源重组可以是在未知基因组环境中查找座位和评估这些环境对基因表达之影响的方法。
利用同源重组的特别有用的遗传工程应用是选择特异的宿主调控元件(例如启动子/UTRs)以高度特异的方式驱动异源基因的表达。例如，预期用异源C12:0特异性FATB(硫酯酶)基因盒和合适的筛选标志物去除内源性硬脂肪酰基ACP去饱和酶基因能够显著地降低C18:1脂肪酸的内源水平，同时使C12:0脂肪酸的水平增加。实施例13描述了适于去除Prototheca moriformis内源性硬脂肪酰基ACP去饱和酶基因的同源重组靶向质粒。
由于同源重组是精确的基因靶向事件，其可以用于对目的基因或者目的区域内的任意核苷酸进行精确修饰，只要已经鉴定出足够的侧翼区域。因此，可以利用同源重组方法对影响RNA和/或蛋白表达的调控序列进行修饰。在对酶活性(例如底物特异性、亲和性和Km)进行修饰的尝试中，其还可以用于修饰蛋白编码区域，因而使宿主细胞的代谢发生期望变化。同源重组提供了控制宿主基因组的强效方法，其导致发生基因靶向、基因转换、基因缺失、基因复制、基因倒置和交换基因表达调控元件(例如启动子、增强子和3’UTR)。
可以通过利用含有内源序列片段的靶向质粒靶向宿主细胞内源基因组内部的目的基因或者目的区域来完成同源重组。这种靶向序列可以位于目的基因或者目的区域的5’端、目的基因/区域的3’端或者甚至目的基因/区域的侧翼。这种靶向质粒可以以具有额外的载体骨架的超螺旋质粒DNA形式或者无载体骨架的PCR产物形式或者线性分子形式转化到宿主细胞中。在一些情况下，首先利用限制性酶使转基因DNA(供体DNA)内部的同源序列暴露是有利的。该步骤可以增加重组效率并且减少不期望有的事件的发生。增加重组效率的其他方法包括利用PCR产生转化转基因DNA，所述DNA含有与被靶向的基因组序列同源的线性末端。
3.载体和载体组成
根据本文中公开的内容，可以通过本领域技术人员熟悉的已知技术制备本发明中用于转化微生物的载体。载体通常含有一个或者多个基因，其中每个基因编码期望产物(基因产物)的表达，并且与调控基因表达或者使基因产物靶向重组细胞内部特定位点的控制序列处于可操作连接。为了有助于阅读，该节分为几个小节。A小节描述了载体中通常含有的控制序列以及本发明提供的新型控制序列。B小节描述了载体中通常含有的基因以及本发明提供的新型密码子优化方法和利用其制备的基因。
A.控制序列
控制序列是调控编码序列的表达或者指导基因产物至细胞内部或者外部特定位点的核酸。调控基因的控制序列包括例如调控编码序列转录的启动子和使编码序列转录终止的终止子。另一个控制序列是位于编码多聚腺苷酸尾链信号之编码序列末端的3’非翻译序列。指导基因产物至特定位点的控制序列包括编码信号肽的序列，其指导与其连接的蛋白至细胞内部或者外部的特定位点。
因此，设计用于在微藻中表达外源基因的示例性载体含有期望基因产物(例如可筛选的标志物、脂途径修饰酶或者蔗糖利用酶)的编码序列，其与在微藻中具有活性的启动子处于可操作连接。可选地，如果载体不含与目的编码序列处于可操作连接的启动子，可以将编码序列转化到细胞中，以使其在载体整合点处与内源性启动子可操作连接。已经证明可以在微藻中实施这种无启动子的转化方法(参见例如Plant Journal 14:4,(1998),pp.441-447)。
许多启动子在微藻中具有活性，包括被转化之微藻的内源性启动子以及被转化之藻类的非内源性启动子(即其他藻类的启动子、高等植物的启动子和植物病毒或者藻类病毒的启动子)。在微藻中具有活性的阐述性外源和/或内源启动子(以及在微藻中具有功能的抗生素抗性基因)描述于PCT公开第2008/151149号和其中引用的参考文献中。
用于表达外源基因的启动子可以是与该基因天然连接的启动子或者可以是异源基因。一些启动子在多于一种微藻菌种中具有活性。其他启动子是菌种特异性的。阐述性启动子包括例如下面实施例中使用的莱茵衣藻β-微管蛋白的启动子和病毒启动子，例如已经表明在多个微藻菌种中具有活性的花椰菜花叶病毒(CMV)启动子和小球藻病毒启动子(参见例如Plant Cell Rep.2005 Mar；23(10-11):727-35；J Microbiol.2005Aug；43(4):361-5；Mar Biotechnol(NY).2002 Jan；4(1):63-73)。适用于在原藻中表达外源基因的另一个启动子是Chlorella sorokiniana谷氨酸脱氢酶启动子/5’UTRs(SEQ ID NO:69)。可选地，使用这些序列中含有启动子的至少10、20、30、40、50或者60个或者更多核苷酸。用于在原藻中表达外源基因的阐述性启动子列于本申请的序列表中，例如小球藻HUP1基因的启动子(SEQ ID NO:1)和椭圆形小球藻(Chlorella ellipsoidea)硝酸还原酶启动子(SEQ ID NO:2)。还可以利用小球藻病毒启动子在原藻中表达基因，例如美国专利第6,395,965号中的SEQ ID NO:1-7。还可以在例如Biochem Biophys Res Commun.1994 Oct 14；204(1):187-94、Plant Mol Biol.1994 Oct；26(1):85-93；Virology.2004 Aug 15；326(1):150-9和Virology.2004Jan 5；318(1):214-23中发现在原藻中具有活性的额外的启动子。
启动子一般可以表征为组成型或者诱导型。组成型启动子一般在所有时间(或者在细胞生命周期的某些时间)均具有相同水平的驱动表达之活性或者功能。相反，诱导型启动子仅响应于刺激物而具有活性(或使其失活)，或者显著上调或下调。这两种类型的启动子均可以用于本发明的方法中。用于本发明中的诱导型启动子包括响应于刺激物而介导可操作连接之基因转录的启动子，所述刺激物例如外源提供的小分子(例如SEQ IDNO:1中的葡萄糖)、温度(热或者冷)、培养基中缺少氮等。合适的启动子可以激活基本沉默之基因的转录，或者优选大幅度上调低水平转录之可操作连接基因的转录。
可选含有终止区控制序列，如果使用该序列，那么首先选择便利的序列，因为终止区相对可以交叉使用。终止区可以与转录起始区(启动子)同源、可以与目标DNA序列同源或者可以从其他来源获得。参见例如Chen和Orozco,Nucleic Acids Res.(1988)16:8411。
本发明还提供了控制序列和重组基因以及含有二者并且使目的基因分隔表达的载体。被靶向的细胞器是叶绿体、质体、线粒体和内质网。此外，本发明提供了控制序列和重组基因以及含有二者并且使蛋白分泌到细胞外的载体。
可以利用质体靶向信号使原藻核基因组中表达的蛋白靶向质体。小球藻内源性质体靶向序列是已知的，例如小球藻核基因组中编码靶向质粒之蛋白的基因，参见例如GenBank登录号AY646197和AF499684。在一个实施方案中，本发明的载体中使用这种控制序列，以使表达蛋白靶向原藻质体。
下面的实施例描述了使用藻类质体靶向序列使异源蛋白靶向宿主细胞中的正确间室。利用Prototheca moriformis和原壳小球藻细胞制备cDNA文库，其描述于下面的实施例12和实施例11中。序列经BLAST比对，并分析与运输至质体/叶绿体之已知蛋白的同源性。对编码这些蛋白的cDNA进行克隆，并且从这些cDNAs中分离质体靶向序列。从cDNA文库中鉴定之藻类质体靶向序列的氨基酸序列和下面异源表达实施例中使用之脂肪酰基-ACP硫酯酶的氨基酸序列列于SEQ ID NO:127-133中。
在本发明的另一个实施方案中，使原藻中表达的多肽靶向内质网。表达载体中含有合适的滞留或者分选信号确保蛋白滞留于内质网(ER)中，不进入下游的高尔基体。例如，Wageningen UR-Plant Research International的载体IMPACTVECTOR1.3包含熟知的KDEL滞留或者分选信号。利用该载体使滞留于ER中具有实践优势，因为已报道其可以使表达水平提高5倍或者更多。主要原因似乎是与细胞质相比，ER中含有较低浓度和/或不同的负责已表达蛋白翻译后降解的蛋白酶。在绿微藻中具有功能的ER滞留信号是已知的。例如参见Proc Natl Acad Sci U S A.2005 Apr26；102(17):6225-30。
在本发明的另一个实施方案中，使多肽靶向分泌到细胞外至培养基中。参见例如Hawkins等，Current Microbiology Vol.38(1999),pp.335–341中在小球藻中具有活性的分泌信号，根据本发明的方法，其可以在原藻中使用。
B.基因和密码子优化
通常基因包含启动子、编码序列和终止控制序列。当通过重组DNA技术组装时，基因被称为表达盒，其侧面具有限制性位点，以便于插入到用于将重组基因引入宿主细胞中的载体中。表达盒侧翼可以具有帮助表达盒通过同源重组稳定融入到基因组中的基因组DNA序列或者其他核酸。可选地，载体和其表达盒可以保持未整合状态，在这种情况下，载体通常含有能够使异源载体DNA进行复制的复制起点。
载体中存在的共有基因是编码一种蛋白的基因，所述蛋白的表达使得能够将含有该蛋白的重组细胞与没有表达该蛋白的细胞区别开来。这种基因和其相应的基因产物称为可筛选标志物。用于转化原藻的转基因质粒中可以使用多种可筛选标志物。合适的可筛选标志物的示例包括G418抗性基因、硝酸还原酶基因(参见Dawson等，(1997),Current Microbiology35:356-362)、潮霉素磷酸转移酶基因(HPT；参见Kim等(2002),Mar.Biotechnol.4:63-73)、新霉素磷酸转移酶基因和赋予脉霉素抗性的ble基因(Huang等(2007),Appl.Microbiol.Biotechnol.72:197-205)。测定微藻对抗生素之敏感性的方法是已知的。例如，Mol Gen Genet.1996 Oct16；252(5):572-9。
对于本发明，用于制备本发明之重组宿主细胞的表达载体包含至少2个、通常是3个基因，如果其中一个基因是可筛选标志物。例如，可以通过用本发明中的载体进行转化来制备本发明中经遗传工程化的原藻，所述载体除了可筛选标志物外还包含一种或者多种外源基因，例如蔗糖转化酶基因或者酰基ACP硫酯酶基因。可以利用诱导型启动子使一个或者两个基因表达，所述启动子使得能够控制这些基因表达的相对时机，以提高脂类产率和促进其转化成为脂肪酸酯。两种或者多种外源基因的表达可以处于相同诱导型启动子的控制下，或者处于不同诱导型(或者组成型)启动子的控制下。在后者情况下，可以诱导第一外源基因表达第一时间段(其间第二外源基因可以被诱导或者不被诱导)并且可以诱导第二外源基因表达第二时间段(其间第一外源基因可以被诱导或者不被诱导)。
在其他实施方案中，两种或者多种外源基因(除了任意可筛选标志物之外)是：脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂肪酰基-CoA/醛还原酶，二者结合作用能够产生醇类产物。进一步提供了外源基因的其他组合，包括但不限于脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂肪酰基-CoA还原酶，以产生醛类。在一个实施方案中，载体提供脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA还原酶和脂肪醛脱羰基酶的组合，以产生烷烃。在这些实施方案的每个中，可以利用诱导型启动子表达一种或者多种外源基因。
本发明中表达两种或者多种外源基因的其他阐述性载体包括同时编码蔗糖载体蛋白和蔗糖转化酶的载体以及同时编码可筛选标志物和分泌型蔗糖转化酶的载体。经任何一种类型的载体转化的重组原藻由于具有利用甘蔗(和甘蔗衍生糖类)作为碳源的工程化能力，因而能够以较低的生产成本生产脂类。插入上面描述的两种外源基因与通过定向和/或随机突变破坏多糖生物合成相结合，使得更多碳流进行脂类生产。单独地和组合利用营养改变、改变脂类生产的工程化和用外源酶进行处理，使得由微生物生产的脂类组合物发生改变。这种改变可以是所生产的脂类量、生产之一种或者多种碳氢化合物的量(相对于其他脂类)和/或微生物中生产之脂类类型的变化。例如，可以对微藻进行工程化，以生产较高量和/或百分比的TAG。
为了使重组蛋白最佳表达，使用具有被转化宿主细胞优先使用之密码子的产生mRNA的编码序列是有益的。因此，转基因的适当表达需要转基因的密码子使用与转基因表达之生物体中的特异性密码子偏倚性相符。这种作用精确的潜在机制有许多，包括可用的氨基酰tRNA库与细胞中合成的蛋白之间的适当平衡，以及需要时使转基因信使RNA(mRNA)更加有效地翻译。当转基因中的密码子使用未经优化时，可用的tRNA库不足以使异源mRNA有效翻译，导致核糖体中止和终止以及转基因mRNA可能不稳定。
本发明提供了经密码子优化的核酸，其使得原藻中的重组蛋白成功表达。通过研究从prototheca moriformis分离的cDNA序列，对原藻菌种中的密码子使用进行分析。该分析对超过24,000密码子进行查询，其结果显示于下面表1中。
表1.原藻菌株中的优选密码子使用
      
      
在其他实施方案中，根据非原藻菌株的另一种微藻菌株对重组载体中的基因进行密码子优化。例如，使基因重编码以在微藻中表达的方法描述于美国专利第7,135,290号中。可以在例如GenBank的密码子使用数据库中获得密码子优化的附加信息。
由于本发明的方法和材料使得可以将任何外源基因引入到原藻中，如下面几章所讨论，特别感兴趣的是与蔗糖利用和脂类途径修饰相关的基因。
IV.蔗糖利用
在实施方案中，本发明的重组原藻细胞进一步含有一种或者多种外源的蔗糖利用基因。在多个实施方案中，所述一种或者多种基因编码一种或者多种蛋白，所述蛋白选自由果糖激酶、葡萄糖激酶、己糖激酶、蔗糖转化酶、蔗糖转运蛋白组成的组。例如，蔗糖转运蛋白和蔗糖转化酶的表达使得原藻将蔗糖从培养基转运到细胞中并且将其水解，以产生葡萄糖和果糖。可选地，在内源性己糖激酶的活性不足以最大程度地使果糖磷酸化的情况下，还可以表达果糖激酶。适宜的蔗糖转运蛋白的示例是GenBank登录号CAD91334、CAB92307和CAA53390。适宜的果糖激酶的示例是GenBank登录号P26984、P26420和CAA43322。
在一个实施方案中，本发明提供了分泌蔗糖转化酶的原藻宿主细胞。蔗糖转化酶的分泌使得不需要表达能够将蔗糖转运到细胞中的载体蛋白。这是因为分泌的转化酶催化一分子蔗糖转化成为一分子葡萄糖和一分子果糖，二者均可以被本发明提供的微生物转运并利用。例如，具有分泌信号(例如SEQ ID NO:4(来源于酵母)、SEQ ID NO:5(来源于高等植物)、SEQ ID NO:6(真核细胞共有序列的分泌信号)和SEQ ID NO:7(高等植物信号序列和真核细胞共有序列之信号序列的组合))的蔗糖转化酶(例如SEQ ID NO:3)的表达使得在细胞中产生转化酶活性。这种蛋白的表达(通过本文中公开的遗传工程方法使其表达)使得细胞已经能够利用胞外葡萄糖作为能量来源，以利用蔗糖作为胞外能量来源。
在含有蔗糖的培养基中表达转化酶的原藻菌种是生产油类的优选微藻菌种。实施例3描述了如何使用本发明的方法和试剂来表达重组酵母转化酶并且使其从重组原藻细胞中分泌出来。该具有完全活性之蛋白的表达和胞外靶向使得得到的宿主细胞能够在蔗糖中生长，而其未经转化的对应物则不能。因此，本发明提供了具有经密码子优化之转化酶基因的原藻重组细胞，所述转化酶基因包括但不限于酵母转化酶基因，其整合到细胞基因组中以使转化酶基因表达(如通过转化酶活性和蔗糖水解所测定)。本发明还提供了在原藻重组细胞中用作可筛选标志物的转化酶基因(由于这些细胞能够在蔗糖中生长，而其未经转化的对应物则不能)和利用转化酶作为藻类分子遗传学的强效可筛选标志物对重组宿主细胞进行筛选的方法。
本发明的另一个方面是原藻中蔗糖转化酶的成功表达，其中显示异源(重组)蛋白可以在藻类细胞中表达，并且以完全活性和功能性形式成功转移到细胞外至培养基中。因此，本发明提供了在微藻中表达多种异源蛋白并且将其分泌到宿主细胞外的方法和试剂。所述蛋白包括例如工业酶(例如脂酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、酯酶、氧化还原酶、转移酶、乳糖酶、异构酶和转化酶)以及治疗性蛋白(例如生长因子、细胞因子、含有两条轻链和两条重链的全长抗体、Fabs、scFvs(单链可变片段)、camellid型抗体、抗体片段、抗体片段融合蛋白、抗体受体融合蛋白、胰岛素、干扰素和胰岛素样生长因子)。
本发明的另一个方面还是原藻中蔗糖转化酶的成功表达，其中提供了利用藻类中的真菌转运肽指导原藻中蛋白分泌的方法和试剂，以及确定作为转运肽其是否能够在原藻细胞中发挥作用和其作用能力的方法和试剂。本发明的方法和试剂可以用作鉴定能够成功将蛋白运送到细胞外之其他转运肽的工具和平台，在这些方法中大量使用酵母转化酶。如本实施例中所显示，去除内源性酵母转化酶转运肽并且将其替换为其他转运肽(或者是宿主藻类内源性的，或者是其他来源的(真核细胞、原核细胞和病毒))可以鉴定任意目标肽是否可以作为转运肽发挥作用，指导蛋白从细胞中分泌出去。
适宜蔗糖转化酶的示例包括由GenBank登录号CAB95010、NP_012104和CAA06839鉴定的蔗糖转化酶。适宜转化酶的非限定性示例列于下面表2中。下面序列表中包含每个所列转化酶的氨基酸序列。在一些情况下，适用于本发明的方法和载体中的外源蔗糖利用基因编码与选自表2的蔗糖转化酶具有至少40、50、60、75或者90％或者更高氨基酸一致性的蔗糖转化酶。
表2.蔗糖转化酶
      
      
原藻中的转化酶分泌到培养基中使得细胞还能够在甘蔗加工过程中产生的废糖蜜中生长，如其在纯试剂级葡萄糖中生长。利用甘蔗加工过程中的这种低价废弃物产品可以显著节省脂类和其他油类生产中的成本。因此，本发明提供了含有原藻微生物群的微生物培养基，所述培养基包含(i)蔗糖和(ii)蔗糖转化酶。在多个实施方案中，培养基中的蔗糖来源于高粱、甜菜、甘蔗、糖蜜或者经解聚的纤维素类物质(可选地其可以含有木质素)。在另一个方面中，本发明的方法和试剂可以显著增加可以被重组原藻利用之给料的数量和类型。由于本文中示例的微生物经改变以使其可以利用蔗糖，因而可以利用本发明的方法和试剂使给料(例如纤维素)被本发明中能够分泌纤维素酶、果胶酶、异构酶或者类似物的经工程化宿主微生物利用，以使酶促反应的分解产物不再仅仅单纯地被耐受，而是作为碳源被宿主利用。
V.脂类途径工程
除了改变原藻利用给料(例如含有蔗糖的给料)的能力之外，本发明还提供了经修饰以改变所生产脂类之性质和/或比例的重组原藻。可以进一步或者可选地对该途径进行修饰，以改变通过对脂肪酸途径中的脂类和中间产物进行酶促加工而产生之多种脂类分子的性质和/或比例。在多个实施方案中，本发明的重组原藻细胞相对于其未经转化的对应物能够优化单位体积和/或单位时间的脂类产率、碳链长度(例如对于可再生柴油生产或者需要脂类给料的工业化学品应用)，使双键或者三键数量减少(可选地至零)，增加特定脂类型或者不同脂类群的氢:碳比率。
在特定的实施方案中，控制代谢中的分支点向脂肪酸合成进行的一种或者多种关键酶被上调或者下调，以促进脂类生产。可以例如通过用表达质粒转化细胞来完成上调，所述表达质粒中利用强启动子和/或使转录增加的增强子元件使编码目标酶的基因表达。这种质粒可以包括可筛选标志物，以能够对转化子进行筛选，使得质粒扩增和所编码之酶的表达水平增加。根据本发明的方法，适于上调的酶的示例包括丙酮酸脱氢酶，其使丙酮酸转化成为酰基-CoA(例如来源于微藻的酶，包括GenBank登录号NP_415392、AAA53047、Q1XDM1和CAF05587)。丙酮酸脱氢酶的上调可以增加酰基-CoA的产生，因而增加脂肪合成。酰基-CoA羧化酶催化脂肪酸合成的起始步骤。因此，可以使该酶上调，以增加脂肪酸的产生(例如来源于微藻的酶，包括GenBank登录号BAA94752、AAA75528、AAA81471、YP_537052、YP_536879、NP_045833和BAA57908)。还可以通过上调酰基载体蛋白(ACP)增加脂肪酸的产生，所述ACP在脂肪酸合成过程中运载正在延长的酰基链(例如来源于微藻的蛋白，包括GenBank登录号A0T0F8、P51280、NP_849041、YP_874433)。甘油-3-磷酸酰基转移酶催化脂肪酸合成的限速步骤。该酶上调可以增加脂肪酸的产生(例如来源于微藻的酶，包括GenBank登录号AAA74319、AAA33122、AAA37647、P44857和ABO94442))。
基因的上调和/或下调可以应用于控制脂肪酸生物合成途径之基因表达的全局调控因子。因此，脂肪酸合成中的一种或者多种全局调控因子可以适宜地被上调或者下调，以分别抑制或者增强多种脂肪酸合成基因的表达并最终增加脂类的产生。其示例包括甾醇调控元件结合蛋白(SREBP)，例如SREBP-1a和SREBP-1c(例如参见GenBank登录号NP_035610和Q9WTN3)。
本发明还提供了经修饰以含有一种或者多种外源基因的重组原藻细胞，所述外源基因编码脂类修饰酶，例如脂肪酰基-ACP硫酯酶(参见表3)、脂肪酰基-CoA/醛还原酶(参见表4)、脂肪酰基-CoA还原酶(参见表5)、脂肪醛脱羰基酶(参见表6)、脂肪醛还原酶和鲨烯合成酶(参见GenBank登录号AF205971)。在一些实施方案中，将编脂肪酰基-ACP硫酯酶和天然共表达的酰基载体蛋白的基因以及可选地编码其他脂类修饰酶的一种或者多种基因转化到原藻细胞中。在其他实施方案中，ACP和脂肪酰基-ACP硫酯酶相互具有亲和性，当二者一起用于本发明的微生物和方法中时具有优势，不管其在特定组织或者生物体中是否天然共表达。因此，本发明研究了天然共表达的这些酶对，以及具有相互作用的亲和性以帮助从ACP中切割下长度特异性碳链的那些酶。
在其他实施方案中，将编码去饱和酶的外源基因与编码对脂类饱和度进行修饰之其他脂类修饰酶的一种或者多种基因一起转化到原藻细胞中。例如硬脂肪酰基-ACP去饱和酶(参见例如GenBank登录号AAF15308、ABM45911和AAY86086)催化将硬脂肪酰基-ACP转化成为油酰-ACP。该基因的上调可以增加细胞产生之单不饱和脂肪酸的比例；而其下调可以减少单不饱和脂肪酸的比例。类似地，可以控制一种或者多种甘油脂去饱和酶的表达，以改变不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率，例如ω-6-脂肪酸去饱和酶、ω-3-ω脂肪酸去饱和酶或者ω-6-油酸去饱和酶。在一些实施方案中，可以根据期望的碳链长度选择去饱和酶，以使去饱和酶能够在指定碳链长度的底物中或者具有指定范围之碳链长度的底物中进行位点特异性修饰。
因此，在特定的实施方案中，对本发明的微生物进行遗传工程，以表达一种或者多种外源基因，所述外源基因选自由酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶或者天然共表达之酰基载体蛋白组成的组。与脂酶基因表达相关的适宜表达方法描述于上面，除了其他方法之外，其包括诱导型表达和分隔型表达。脂肪酰基-ACP硫酯酶在脂类合成过程中从酰基载体蛋白(ACP)中切割下脂肪酸。通过进一步的酶促加工，切割下的脂肪酸接着与辅酶相结合，以产生酰基-CoA分子。该酰基-CoA分子是脂肪酰基-CoA还原酶酶活性的底物(产生醛)以及脂肪醛还原酶酶活性的底物(产生醇)。上面鉴定之脂肪酰基-CoA还原酶作用产生的醛进一步是脂肪醛还原酶酶活性的底物(产生醇)或者是脂肪醛脱羰基酶酶活性的底物(产生烷烃或者烯烃)。
在一些实施方案中，利用本文中描述的方法产生的脂肪酸、甘油脂或者相应的一元醇、醛、烷烃或者烯烃含有8、10、12或者14个碳原子。优选用于生产柴油、生物柴油、可再生柴油或者喷气燃料的脂肪酸或者应用于工业中的相应一元醇、醛、烷烃或者烯烃含有8至14个碳原子。在某些实施方案中，上述脂肪酸以及其他相应的碳氢化合物分子是饱和的(没有碳-碳双键或者三键)、单不饱和的(单个双键)、多不饱和的(两个或者多个双键)，是直链(不是环状)或者支化的。对于燃料生产，优选较大的饱和度。
上面描述的酶具有优先水解含有特定数量之碳原子的底物的特异性。例如，脂肪酰基-ACP硫酯酶能够从ACP中优先切割下具有12个碳原子的脂肪酸。在一些实施方案中，ACP和长度特异性硫酯酶相互具有亲和性，使得其特别地作为组合物使用(例如外源的ACP和硫酯酶基因可以在其来源的特定组织或者生物体中天然共表达)。因此，在多个实施方案中，本发明的重组原藻细胞可以含有外源基因，所述外源基因编码根据底物中所含碳原子数量特异性催化酶促活性(例如从ACP中切割下脂肪酸、将酰基-CoA还原成为醛或者醇、或者将醛转化成为烷烃)的蛋白。在多个实施方案中，酶促特异性可以是针对具有8至34个碳原子的底物，优选8至18个碳原子，更优选8至14个碳原子。优选特异性是针对具有较少(即12个)而不是较多(即18个)碳原子的底物。
在非限定性而是阐述性的实施例中，本发明提供了表达外源硫酯酶并且因此产生富含硫酯酶特异性链长度之脂类的载体和原藻宿主细胞。所示硫酯酶是(i)樟FatB1(GenBank登录号Q39473，其氨基酸序列是SEQ IDNO:59，无质体靶向序列(PTS)的氨基酸序列是SEQ ID NO:139，基于表1经密码子优化的cDNA序列是SEQ ID NO:60)，其对碳链长度为14的脂肪酰基-ACP底物具有优先性；(ii)萼距花FatB2(GenBank登录号AAC49269，其氨基酸序列是SEQ ID NO:61，无PTS的氨基酸序列是SEQID NO:138，基于表1经密码子优化的cDNA序列是SEQ ID NO:62)，其对碳链长度为8-10的脂肪酰基-ACP底物具有优先性；和(iii)伞桂属FatB1(GenBank登录号Q41635，其氨基酸序列是SEQ ID NO:63，无PTS的氨基酸序列是SEQ ID NO:139，基于表1经密码子优化的cDNA序列是SEQID NO:64)，其对碳链长度为12的脂肪酰基-ACP底物具有优先性。
适用于本发明的微生物和方法中的其他脂肪酰基-ACP硫酯酶包括但不限于列于表3中的酶。
表3.脂肪酰基-ACP硫酯酶和GenBank登录号
加州月桂(Umbellularia californica)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAC49001)
樟(Cinnamomum camphora)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#Q39473)
加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#Q41635)
肉豆寇(Myristica fragrans)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAB71729)
肉豆寇脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAB71730)
油棕榈(Elaeis guineensis)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#ABD83939)
油棕榈脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAD42220)
毛白杨(Populus tomentosa)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#ABC47311)
拟南芥(Arabidopsis thaliana)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#NP_172327)
拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#CAA85387)
拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#CAA85388)
陆地棉(Gossypium hirsutum)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#Q9SQI3)
披针叶萼距花(Cuphea lanceolata)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#CAA54060)
Cuphea hookeriana脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAC72882)
Cuphea calophylla subsp.mesostemon脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#ABB71581)
披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#CAC19933)
油棕榈脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAL15645)
Cuphea hookeriana脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#Q39513)
陆地棉脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAD01982)
葡萄(Vitis vinifera)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#CAN81819)
山竹子(Garcinia mangostana)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAB51525)
芥菜(Brassica juncea)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#ABI18986)
长叶紫荆木(Madhuca longifolia)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAX51637)
欧洲油菜(Brassica napus)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#ABH11710)
稻(Oryza sativa)(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#EAY86877)
稻(粳稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#NP_001068400)
稻(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#EAY99617)
Cuphea hookeriana脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAC49269)
Ulmus Americana脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAB71731)
披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#CAB60830)
Cuphea palustris脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAC49180)
德国鸢尾(Iris germanica)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAG43858)
Cuphea palustris fatty acyl-ACP硫酯酶(GenBank#AAC49179)
肉豆寇脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAB71729)
Cuphea hookeriana脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#U39834)
加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#M94159)
樟脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#U31813)
下面的实施例描述了来源于萼距花、加州月桂、樟的异源脂肪酰基-ACP硫酯酶在原藻菌种中的成功靶向和表达。此外，证实表达这些异源脂肪酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞中脂肪酸谱发生改变。由于一般藻类和高等植物的硫酯酶之间以及Prototheca moriformis脂肪酰基-ACP硫酯酶和上面所列的脂肪酰基-ACP硫酯酶之间缺乏序列一致性，这些结果非常出乎意料。分离了两种Prototheca moriformis酰基-ACP硫酯酶并对其进行测序。两个cDNAs序列之间显示高度的一致性，核苷酸水平上仅有12个位点不同，氨基酸水平上仅有5个位点不同，其中4个位于质体转运肽中。对Prototheca moriformis脂肪酰基-ACP硫酯酶基因组序列的进一步分析证实这两个cDNAs确实在分离的重叠群上编码，并且虽然高度同源，却由两个不同的基因编码。这两个Prototheca moriformis脂肪酰基-ACP硫酯酶，P.moriformis脂肪酰基-ACP硫酯酶-1和P.moriformis脂肪酰基-ACP硫酯酶-2的cDNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO:134-137中。
当对这两个cDNA的氨基酸序列在NCBI数据库中进行BLAST时，最同源的两个序列是来源于莱茵衣藻和拟南芥的脂肪酰基-ACP硫酯酶。令人惊奇的是，Prototheca moriformis脂肪酰基-ACP硫酯酶和高等植物的硫酯酶之间氨基酸一致性水平非常低，仅有49和37％的一致性。此外，这些脂肪酰基-ACP硫酯酶之间催化三联体(NXHX36C)氨基末端部分附近的序列也存在微小差异。所研究的40个高等植物脂肪酰基-ACP硫酯酶中有39个显示三联体氨基末端N和H残基附近的序列是LDMNQH，而所有经鉴定的藻类序列具有序列MDMNGH。由于氨基酸序列一致性较低以及硫酯酶催化三联体附近序列不同，获得并描述于实施例中的外源脂肪酰基-ACP硫酯酶表达的成功结果是出乎意料的，特别是由于事实上外源脂肪酰基-ACP硫酯酶的活性依赖于其与内源原藻酰基载体蛋白的功能性蛋白-蛋白相互作用。
适用于本发明的微生物和方法中的脂肪酰基-CoA/醛还原酶包括但不限于列于表4中的酶。
表4.以GenBank登录号列出的脂肪酰基-CoA/醛还原酶
      
适用于本发明的微生物和方法中的脂肪酰基-CoA还原酶包括但不限于列于表5中的酶。
表5.以GenBank登录号列出的脂肪酰基-CoA还原酶
      
适用于本发明的微生物和方法中的脂肪醛脱羰基酶包括但不限于列于表6中的酶。
表6.以GenBank登录号列出的脂肪醛脱羰基酶
      
天然共表达之脂肪酰基-ACP硫酯酶和酰基载体蛋白的组合物适用于本发明的微生物和方法中。
碳氢化合物或者脂类修饰酶的额外示例包括任意下列US专利包含或者引用的氨基酸序列，或者由任意下列US专利包含或者引用之核酸序列编码的氨基酸序列：第6,610,527号、第6,451,576号、第6,429,014号、第6,342,380号、第6,265,639号、第6,194,185号、第6,114,160号、第6,083,731号、第6,043,072号、第5,994,114号、第5,891,697号、第5,871,988号、第6,265,639号，并且以GenBank登录号进一步进行描述：AAO18435、ZP_00513891、Q38710、AAK60613、AAK60610、AAK60611、NP_113747、CAB75874、AAK60612、AAF20201、BAA11024、AF205791和CAA03710。
适用于本发明的微生物和方法中的其他酶包括与表3-6中所列一种蛋白具有至少70％氨基酸一致性的酶以及显示相应的期望酶活性(例如从酰基载体蛋白中切割下脂肪酸、将酰基-CoA还原成为醛或者醇或者将醛转化成为烷烃)的酶。在额外的实施方案中，在与上述描述的序列之一具有至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、或者至少大约99％一致性的序列中存在酶活性，所有这些序列在此通过引用并入本文，如同被完全公开。
通过选择要表达之外源基因的期望组合物，可以控制微生物产生的产物，接着从液态生物质中提取产物。例如，微生物可以含有：(i)编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的外源基因；和可选地(ii)天然共表达的酰基载体蛋白或者与脂肪酰基-ACP硫酯酶具有亲和性的其他酰基载体蛋白(或者相反地)；和可选地(iii)编码脂肪酰基-CoA/醛还原酶或者脂肪酰基-CoA还原酶的外源基因；和可选地(iv)编码脂肪醛还原酶或者脂肪醛脱羰基酶的外源基因。在本文中描述的培养条件下，该微生物合成与ACP连接的脂肪酸，并且脂肪酰基-ACP硫酯酶催化从ACP中切割下脂肪酸，以通过进一步酶促加工产生脂肪酰基-CoA分子。脂肪酰基-CoA/醛还原酶存在时催化将酰基-CoA还原成为醇。类似地，脂肪酰基-CoA还原酶存在时催化将酰基-CoA还原成为醛。在存在编码脂肪酰基-CoA还原酶的外源基因并且使其表达以产生醛类产物的那些实施方案中，由第三外源基因编码的脂肪醛还原酶催化将醛还原成为醇。类似地，脂肪醛脱羰基酶存在时催化将醛转化成为烷烃或者烯烃。
可以从已知能够大量生产脂类的细胞(例如原壳小球藻)中获得编码这些酶的基因。可以将已知在脂类生产中发挥作用的基因(例如编码使双键饱和之酶的基因)单独转化到受体细胞中。但是，对于实施本发明，不需要对基因进行预先假设。能够改变(或者促进)微藻中脂类生产之基因的鉴定方法描述于PCT公开第2008/151149号中。
因此，本发明提供了经遗传工程化以表达脂途径酶的原藻细胞，所述脂途径酶的表达水平与相同菌种的野生型细胞相比发生改变。在一些情况下，当两种细胞在相同条件下生长时，该细胞与野生型细胞相比生产更多脂类。在一些情况下，对细胞进行遗传工程和/或筛选，以使其以高于野生型细胞的水平表达脂途径酶。在一些情况下，脂途径酶选自由丙酮酸脱氢酶、酰基-CoA羧化酶、酰基载体蛋白和甘油-3-磷酸酰基转移酶组成的组。在一些情况下，对细胞进行遗传工程和/或筛选，以使其以低于野生型细胞的水平表达脂途径酶。在细胞以较低水平表达脂途径酶的至少一个实施方案中，脂途径酶包括柠檬酸合成酶。
在一些实施方案中，对细胞进行遗传工程和/或筛选，以使其表达脂肪酸合成中的全局调控因子，所述全局调控因子的表达水平与野生型细胞相比发生改变，因而多种脂肪酸合成基因的表达水平与野生型细胞相比发生改变。在一些情况下，脂途径酶包括修饰脂肪酸的酶。在一些情况下，脂途径酶选自由硬脂肪酰基-ACP去饱和酶和甘油脂去饱和酶组成的组。
在其他实施方案中，本发明涉及含有一种或者多种外源基因的产油微生物，其中所述外源基因编码选自由脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和酰基载体蛋白组成的组中的蛋白。在一个实施方案中，外源基因与响应于刺激物而可诱导或者可抑制的启动子处于可操作连接。在一些情况下，所述刺激物选自由外源提供的小分子、热、冷和培养基中限制氮或者没有氮组成的组。在一些情况下，外源基因在细胞间室中表达。在一些实施方案中，细胞间室选自由叶绿体、质体和线粒体组成的组。在一些实施方案中，微生物是Prototheca moriformis,Prototheca krugani,Prototheca stagnora或者Prototheca zopfii。
在一个实施方案中，外源基因编码脂肪酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，由外源基因编码的硫酯酶催化从酰基载体蛋白(ACP)中切割下8至18个碳原子的脂肪酸。在一些情况下，由外源基因编码的硫酯酶催化从ACP中切割下10至14个碳原子的脂肪酸。在一个实施方案中，由外源基因编码的硫酯酶催化从ACP中切割下12个碳原子的脂肪酸。
在一个实施方案中，外源基因编码脂肪酰基-CoA/醛还原酶。在一些情况下，由外源基因编码的还原酶催化将8至18个碳原子的脂肪酰基-CoA还原成为相应的一元醇。在一些情况下，由外源基因编码的还原酶催化将10至14个碳原子的脂肪酰基-CoA还原成为相应的一元醇。在一个实施方案中，由外源基因编码的还原酶催化将12个碳原子的脂肪酰基-CoA还原成为相应的十二烷醇。
本发明还提供了含有两种外源基因的重组原藻细胞，其中第一外源基因编码脂肪酰基-ACP硫酯酶，第二外源基因编码选自由脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶和酰基载体蛋白组成的组中的蛋白。在一些情况下，两种外源基因中的每个均与响应于刺激物而可诱导或者可抑制的启动子处于可操作连接。在一些情况下，每个启动子响应于相同的刺激物而可诱导，例如培养基中限制氮或者没有氮。培养基中限制氮或者完全缺少氮刺激一些微生物(例如原藻菌种)中的油类生产，其可用作刺激物以诱导高水平的油类生产。当与本文中公开的遗传工程方法结合使用时，脂类(以细胞干重的百分比计算)可以达到高水平，例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、和至少75％；本文中公开的方法使得细胞生产这些水平的脂类，其中所述脂类包含至少4％C8-C14、至少0.3％C8、至少2％C10、至少2％C12和至少2％C14。在一些实施方案中，细胞中的脂类大于25％(以细胞干重计算)并且含有的脂类是至少10％C8-C14、至少20％C8-C14、至少30％C8-C14、10-30％C8-C14和20-30％C8-C14。
本文中公开的新型油类与其他天然产生的油类(富含中等链脂肪酸，例如棕榈油、棕榈坚果油和椰子油)不同。例如，棕榈油和棕榈坚果油中杂质(例如类胡萝卜素)的水平远远高于本发明的油类。具体地，棕榈油和棕榈坚果油中α和β胡萝卜素以及番茄红素的含量远远高于本发明的油类。此外，在棕榈油和棕榈坚果油中发现了超过20种不同的类胡萝卜素，而实施例显示本发明的油类中含有的类胡萝卜素种类极少并且水平很低。此外，棕榈油、棕榈坚果油和椰子油中维他命E化合物(例如生育三烯酚)的水平远远高于本发明的油类。
在一个实施方案中，由第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP中切割下8至18个碳原子的脂肪酸。在一些实施方案中，第二外源基因编码脂肪酰基-CoA/醛还原酶，其催化将8至18个碳原子的脂肪酰基-CoA还原成为相应的一元醇。在一些情况下，由第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP中切割下10至14个碳原子的脂肪酸，由第二外源基因编码的还原酶催化将10至14个碳原子的脂肪酰基-CoA还原成为相应的一元醇，其中硫酯酶和还原酶作用于相同的碳链长度。在一个实施方案中，由第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP中切割下12个碳原子的脂肪酸，由第二外源基因编码的还原酶催化将12个碳原子的脂肪酰基-CoA还原成为十二烷醇。在一些实施方案中，第二外源基因编码脂肪酰基-CoA还原酶，其催化将8至18个碳原子的脂肪酰基-CoA还原成为相应的醛。在一些实施方案中，第二外源基因编码与脂肪酰基-ACP硫酯酶天然共表达的酰基载体蛋白。
在一些实施方案中，第二外源基因编码脂肪酰基-CoA还原酶，并且微生物进一步含有编码脂肪醛脱羰基酶的第三外源基因。在一些情况下，由第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP中切割下8至18个碳原子的脂肪酸，由第二外源基因编码的还原酶催化将8至18个碳原子的脂肪酰基-CoA还原成为相应的脂肪醛，由第三外源基因编码的脱羰基酶催化将8至18个碳原子的脂肪醛转化成为相应的烷烃，其中硫酯酶、还原酶和脱羰基酶作用于相同的碳链长度。
在一些实施方案中，第二外源基因编码酰基载体蛋白，并且微生物进一步含有第三外源基因，其编码选自由脂肪酰基-CoA还原酶和脂肪酰基-CoA/醛还原酶组成的组中的蛋白。在一些情况下，第三外源基因编码脂肪酰基-CoA还原酶，并且微生物进一步含有编码脂肪醛脱羰基酶的第四外源基因。
本发明还提供了生产醇的方法，其包括在培养基中培养重组原藻细胞群，其中所述细胞含有：(i)编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的第一外源基因和(ii)编码脂肪酰基-CoA/醛还原酶的第二外源基因，并且所述细胞合成与酰基载体蛋白(ACP)连接的脂肪酸，脂肪酰基-ACP硫酯酶催化从ACP中切割下脂肪酸，以通过进一步加工产生脂肪酰基-CoA，脂肪酰基-CoA/醛还原酶催化将酰基-CoA还原成为醇。
本发明还提供了在原藻细胞中生产脂类分子的方法。在一个实施方案中，该方法包括在培养基中培养原藻细胞群，其中所述细胞含有：(i)编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的第一外源基因和(ii)编码脂肪酰基-CoA还原酶的第二外源基因，并且所述细胞合成与酰基载体蛋白(ACP)连接的脂肪酸，脂肪酰基-ACP硫酯酶催化从ACP中切割下脂肪酸，以通过进一步加工产生脂肪酰基-CoA，脂肪酰基-CoA还原酶催化将酰基-CoA还原成为醛。
本发明还提供了在原藻细胞中生产具有特定碳链长度之脂肪酸分子的方法。在一个实施方案中，该方法包括在培养基中培养产油原藻细胞群，其中所述微生物含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的第一外源基因，所述脂肪酰基-ACP硫酯酶特异地或者优先地对特定碳链长度(例如8、10、12或者14个碳原子)具有活性，并且所述微生物合成与酰基载体蛋白(ACP)连接的脂肪酸，当脂肪酸被合成为具有特定碳链长度时，硫酯酶催化从ACP中切割下脂肪酸。
在上面描述的多个实施方案中，原藻细胞可以含有编码脂途径酶的至少一种外源基因。在一些情况下，脂途径酶选自由硬脂肪酰基-ACP去饱和酶、甘油脂去饱和酶、丙酮酸脱氢酶、酰基-CoA羧化酶、酰基载体蛋白和甘油-3-磷酸酰基转移酶组成的组。在其他情况下，原藻细胞含有脂类修饰酶，其选由脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和/或酰基载体蛋白组成的组。
VI.燃料和化学品生产
对于根据本发明的燃料生产，除收集之外通过任何便利的方法获得由本发明的细胞产生的脂类。可以通过全细胞提取分离脂类。首先将细胞破坏，接着可以从细胞质中分离出胞内的脂类和与细胞膜/细胞壁相连的脂类以及胞外的碳氢化合物，例如通过利用上面描述的离心作用。在一些实施方案中，使微生物的细胞裂解之后提取微生物中产生的胞内脂类。一经提取，对脂类进行进一步提炼，以产生油类、燃料或者油化学品。
培养结束后，可以从发酵液中分离微生物。可选地，通过离心以产生浓缩膏来达到分离。离心不能从微生物中去除大量的胞内水分，不是干燥步骤。接着可选地用清洗液(例如DI水)对生物质进行清洗，以去除发酵液和碎片。可选地，在细胞破坏前还可以使经清洗的微生物生物质干燥(干燥炉干燥、冷冻干燥等)。可选地，当发酵完成时，细胞无需从一些或者所有发酵液中分离就可以进行裂解。例如，当裂解细胞时，细胞与胞外液体的v:v比率可以小于1:1。
可以使含有脂类的微生物裂解，以产生裂解物。如本文中所详细描述，可以通过任意便利的方法来完成裂解微生物的步骤，包括热诱导的裂解、加入碱、加入酸、利用酶(例如蛋白酶和多糖降解酶(例如淀粉酶))、利用超声作用、机械裂解、利用渗透压休克、用溶解性病毒感染和/或表达一种或者多种裂解基因。进行裂解，以释放由微生物产生的胞内分子。裂解微生物的这些方法中的每一种可以作为单独的方法使用，或者同时或依次组合使用。可以通过显微镜分析来观察细胞破裂的程度。利用本文描述的一种或者多种方法，通常可以观察到大于70％的细胞破裂。优选细胞破裂大于80％、更优选大于90％，最优选大约100％。
在特定的实施方案中，使微生物在生长后裂解，例如以增加细胞脂类和/或碳氢化合物的暴露，将其提取或者进一步加工。可以调整脂酶表达(例如通过诱导型启动子)或者细胞裂解的时机，以优化脂类和/或碳氢化合物的产率。下面描述了一些裂解技术。这些技术可以单独使用或者组合使用。
在本发明的一个实施方案中，裂解微生物的步骤包括对含有微生物的细胞悬液进行加热。在该实施方案中，对含有微生物的发酵液(或者从发酵液中分离的微生物悬液)进行加热直至微生物即微生物的细胞壁和细胞膜降解或者分解。通常所使用的温度是至少50℃。更有效的细胞裂解使用较高温度，例如至少30℃、至少60℃、至少70℃、至少80℃、至少90℃、至少100℃、至少110℃、至少120℃、至少130℃或者更高温度。可以通过煮沸微生物进行通过热处理的细胞裂解。可选地，可以在高压灭菌锅中进行热处理(不煮沸)。可以使经过热处理的裂解物冷却，以用于进一步处理。还可以通过蒸汽处理进行细胞破裂，即通过加入加压蒸汽。使细胞破裂的微藻蒸汽处理描述于例如美国专利第6,750,048号中。在一些实施方案中，可以通过向发酵罐中喷射蒸汽并且使发酵液在期望温度保持少于大约90分钟、优选少于大约60分钟、更优选少于大约30分钟来进行蒸汽处理。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的步骤包括向含有微生物的细胞悬液中加入碱。该碱应该足够强效，以使所用微生物的至少一部分蛋白质类化合物水解。用于溶解蛋白的碱是化学领域已知的。用于本发明方法中的示例性碱包括但不限于锂、钠、钾、钙的氢氧化物、碳酸盐和重碳酸盐以及其混合物。优选的碱是KOH。使细胞破裂的微藻碱处理描述于例如美国专利第6,750,048号中。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的步骤包括向含有微生物的细胞悬液中加入酸。可以利用浓度为10-500mN或者优选40-160nM的酸完成酸裂解。优选在高于室温的温度下(例如40-160℃，优选50-130℃的温度)进行酸裂解。对于中等温度(例如室温至100℃，具体地室温至65℃，酸处理可以与声波处理或者其他细胞破裂方法结合使用。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的步骤包括利用酶使微生物裂解。优选用于裂解微生物的酶是蛋白酶和多糖降解酶，例如半纤维素酶(例如来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的半纤维素酶，Sigma Aldrich,St.Louis,MO；#H2125)、果胶酶(例如来源于根霉(Rhizopus sp.)的果胶酶，Sigma Aldrich,St.Louis,MO；#P2401)、Mannaway 4.0L(Novozymes)、纤维素酶(例如来源于绿色木霉(Trichoderma viride)的纤维素酶；SigmaAldrich,St.Louis,MO；#C9422)和崩溃酶(例如来源于担子菌种(Basidiomycetes sp.)的崩溃酶，Sigma Aldrich,St.Louis,MO；#D9515)。
在本发明的其他实施方案中，利用酶来完成裂解，所述酶例如纤维素酶(例如可选地来源于小球藻或者小球藻病毒的多糖降解酶)、或者蛋白酶(例如灰色链球菌(Streptomyces griseus)蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、列于Degradation of Polylactide by Commercial Proteases,Oda Yet al.,Journal of Polymers and the Environment,Volume 8,Number 1,January 2000,pp.29-32(4)中的蛋白酶、Alcalase 2.4FG(Novozymes)和Flavourzyme 100L(Novozymes)。还可以使用蛋白酶和多糖降解酶的任意组合物，包括上述蛋白酶和多糖降解酶的任意组合物。
在另一个实施方案中，可以利用压榨机进行裂解。在该过程中，在高压力下挤压生物质通过一种螺旋型设备，以使细胞裂解并使胞内质粒从细胞中的蛋白和纤维(以及其他组分)中释放并分离出来。
在本发明的另一个实施方案中，通过利用超声波(即声波作用)进行裂解微生物的步骤。因此，还可以利用高频率声波裂解细胞。可以电动产生声波，并通过金属件运送至经适当浓缩的细胞悬液中。这种声波作用(或者超声作用)基于在细胞悬液中产生气泡而破坏细胞的完整性。
在本发明的另一个实施方案中，通过机械裂解进行裂解微生物的步骤。可以机械地裂解细胞，可选地进行匀浆，以帮助收集碳氢化合物(例如脂类)。例如，可以使用压力破碎器将含有浆液的细胞泵入限制性阻尼阀中。使用高压(高至1500巴，接着通过出口喷嘴瞬间扩散。通过三种不同的机制完成细胞破裂：对阀门的冲击、阻尼的高液体切力和流出时压力的突然下降，这使得细胞爆裂。该方法使胞内分子释放。可选地，可以使用球磨机。在球磨机中，用小研磨颗粒(例如珠)搅动细胞悬液。由于切力、珠之间的研磨和与珠碰撞，细胞破裂。珠使细胞破裂，以释放细胞内含物。还可以通过切力使细胞破裂，例如利用混合(例如用高速度或者Waring混合器)、弗氏细胞压碎器，或者甚至当细胞壁脆弱时使用离心使细胞破裂。
在本发明的另一个实施方案中，通过使用渗透压休克进行裂解微生物的步骤。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的步骤包括用溶解性病毒感染微生物。已知多种病毒适用于本发明中以使微生物裂解，对于特定的微生物，选择和利用特定的溶解性病毒在本领域的技术水平内。例如，绿昌履虫绿球藻(paramecium bursaria chlorella)病毒(PBCV-1)是大型二十面体成斑双链DNA病毒组(藻类DNA病毒(Phycodnaviridae)科，绿藻病毒属)的原型，其可以在某些单细胞真核小球藻样绿藻中复制并使其裂解。因此，通过用合适的小球藻病毒感染，可以裂解任何易感的微藻。用小球藻病毒感染小球藻菌种的方法是已知的。参见例如Adv.Virus Res.2006；66:293-336；Virology,1999 Apr 25；257(1):15-23；Virology,2004 Jan5；318(1):214-23；Nucleic Acids Symp.Ser.2000；(44):161-2；J.Virol.2006Mar；80(5):2437-44和Annu.Rev.Microbiol.1999；53:447-94。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的步骤包括自溶。在该实施方案中，根据本发明的微生物经遗传工程化，以产生裂解微生物的裂解蛋白。可以利用诱导型启动子使裂解基因表达，以使细胞可以首先在发酵罐中生长至合适密度，随后诱导启动子，使裂解基因表达，以裂解细胞。在一个实施方案中，裂解基因编码多糖降解酶。在某些其他的实施方案中，裂解基因是来源于溶解性病毒的基因。因此，例如可以使来源于小球藻病毒的裂解基因在藻类细胞中表达，参见Virology 260,308-315(1999)；FEMSMicrobiology Letters 180(1999)45-53；Virology 263,376-387(1999)和Virology 230,361–368(1997)。优选利用诱导型启动子使裂解基因表达，例如在微藻中具有活性并且可被刺激物(例如小分子的存在、光、热和其他刺激物)诱导的启动子。
可以使用多种方法将脂类从由上述方法中产生的细胞裂解物中分离出来。例如，可以用疏水性溶剂(例如己烷，参见Frenz et al.1989,EnzymeMicrob.Technol.,11:717)提取脂类和脂类衍生物，例如脂肪醛、脂肪醇和碳氢化合物(例如烷烃)。还可以利用液化(参见例如Sawayama等，1999,Biomass and Bioenergy 17:33-39和Inoue等，1993,Biomass Bioenergy6(4):269-274)、油类液化(参见例如Minowa等，1995,Fuel74(12):1735-1738)和超临界CO2提取法(参见例如Mendes等，2003,Inorganica Chimica Acta 356:328-334)提取脂类和脂类衍生物。Mial和Su描述了从Chlorella prototheocoides培养物中回收微藻脂类的方法，其中通过离心收集细胞，用蒸馏水清洗并使其冷冻干燥。得到的细胞粉在研钵中磨碎，接着用n-己烷进行提取。Miao和Wu,Biosource Technology(2006)97:841-846。
因此，可以通过用有机溶剂萃取对由本发明的微生物生产的脂类、脂类衍生物和碳氢化合物进行回收。在一些情况下，优选的有机溶剂是己烷。通常将有机溶剂直接加入到裂解物中，不需要提前分离裂解物组分。在一个实施方案中，使上面描述的一种或者多种方法中产生的裂解物与有机溶剂接触一段时间，所述时间足以使脂类和/或碳氢化合物组分与有机溶剂形成溶液。在一些情况下，接着可以进一步提炼溶液，以回收特定的期望脂类或者碳氢化合物组分。己烷提取方法是本领域熟知的。
可以利用一种或者多种酶(包括如上面描述的脂酶)对由本文中描述的细胞生产的脂类和脂类衍生物(例如脂肪醛、脂肪醇和碳氢化合物(例如烷烃))进行修饰。当碳氢化合物处于细胞胞外环境中时，可以在一定条件下将一种或者多种酶加入到该环境中，在所述一定条件中，酶可以对碳氢化合物进行修饰，或者由碳氢化合物前体完成其合成。可选地，加入一种或者多种催化物(例如酶)之前，可以将碳氢化合物部分地或者完全地从细胞材料中分离。这种催化物是外源加入的，其活性发生于细胞外或者体外。
因此，可选地，可以通过常规方法对如本文中所描述由细胞体内生产的或者经体外酶促修饰的脂类和碳氢化合物进行进一步加工。所述加工可以包括“裂化”以减少大小，因而增加碳氢化合物分子的氢:碳比率。碳氢化合物和甘油三酯油类加工中常规使用催化和热学裂化方法。催化方法涉及利用催化剂，例如固体酸催化剂。催化剂可以是硅-铝或者沸石，其导致碳-碳键发生异裂或者不对称断裂，产生碳阳离子和氢阴离子。这些反应的中间产物随后发生重排或者与另一种碳氢化合物发生氢转移。因此，反应重新产生中间产物，形成自我繁殖链机制。还可以对碳氢化合物进行加工，以将其中碳-碳双键或者三键的数量减少，可选地至零。还可以对碳氢化合物进行加工，以去除或者消除其中的环或者环状结构。还可以对碳氢化合物进行加工，以增加氢:碳比率，其包括将氢(“氢化作用”)和/或裂化的碳氢化合物加到较小的碳氢化合物中。
热学方法涉及利用高温和高压，以减少碳氢化合物的大小。可以使用大约800℃的高温和大约700Kpa的高压。这些条件产生“轻”烃，有时该术语用于指富含氢的碳氢化合物分子(与光子通量不同)，其还可以通过缩合产生氢含量相对减少的较大碳氢化合物分子。该方法提供均裂或者对称断裂并且产生烯烃，所述烯烃可选地可以如上面所描述被酶促饱和。
催化方法和热学方法是植物中对碳氢化合物进行加工和提炼油的标准方法。因此，可以通过常规方法对如本文中所描述由细胞产生的碳氢化合物进行收集和加工或者提炼。参见Hillen等(Biotechnology andBioengineering,Vol.XXIV:193-205(1982)关于对微藻产生的碳氢化合物进行加氢裂化的报道。在可选的实施方案中，用另一种催化剂处理组分，例如有机化合物、加热和/或无机化合物。对于将脂类加工成为生物柴油，如本文中第IV章所描述使用转酯基过程。
通过本发明的方法产生的碳氢化合物可以用于多种工业应用中。例如，直链烷基苯磺酸(LAS)，用于几乎所有的去污剂和清洁制品类型中的一种阴离子表面活化剂，利用一般包含10-14个碳原子链的碳氢化合物。参见例如美国专利第6,946,430号、第5,506,201号、第6,692,730号、第6,268,517号、第6,020,509号、第6,140,302号、第5,080,848号和第5,567,359号。表面活性剂(例如LAS)可以用于生产个人护理组合物和去污剂，例如描述于美国专利第5,942,479号、第6,086,903号、第5,833,999号、第6,468,955号和第6,407,044号的表面活性剂。
由于可以获得能够取代化石燃料起始材料的可再生生物起始材料并且其用途是理想的，对生物来源的碳氢化合物组分在燃料(例如生物柴油、可再生柴油和喷气燃料)中的用途的兴趣不断增加。迫切需要从生物材料中生产碳氢化合物组分的方法。本发明通过利用由本文中描述的方法产生的脂类作为生物材料以生产生物柴油、可再生柴油和喷气燃料，提供了生产生物柴油、可再生柴油和喷气燃料的方法，满足了这种需要。
传统的柴油燃料是富含石蜡烃的石油馏出物。其具有370°至780°F的宽沸点范围，适用于在压缩点火发动机(例如柴油发动机车辆)中燃烧。The American Society of Testing and Materials(ASTM)根据沸点范围以及其他燃料性质(例如十六烷数量、浊点、燃烧点、粘度、苯胺点、含硫量、含水量、含灰量、铜片腐蚀度和炭渣)的可允许范围建立了柴油级别。可以将符合ASTM适当规格的、来源于生物质或者其他物质的任何碳氢化合物馏出物质定义为柴油燃料(ASTM D975)、喷气燃料(ASTM D1655)，或者如果是脂肪酸甲酯则定义为生物柴油(ASTM D6751)。
提取后，可以对从本文中描述的微生物生物质中回收的脂类和/或碳氢化合物组分进行化学处理，以生产用于柴油车和喷气式发动机的燃料。
生物柴油是一种颜色在金色和深棕色之间变化的液体，所述变化取决于生产原料。其几乎不可与水混合，具有高沸点和低蒸汽压。生物柴油是指与柴油等同加工的燃料，可以用于柴油发动机车辆中。生物柴油是生物可降解的并且无毒的。生物柴油与传统柴油相比的额外益处是发动机磨损较低。通常生物柴油包含C14-C18烷基酯。多个过程使如本文中所描述产生并分离的生物质或者脂类转化成为柴油燃料。生产柴油的优选方法是通过如本文中所描述脂类的转酯基作用。用作生物柴油的优选烷基酯是甲酯或者乙酯。
通过本文中描述的方法产生的生物柴油可以在大多数现代柴油发动机车中以任意浓度单独使用或者与传统柴油燃料混合使用。当与传统柴油燃料(石化柴油)混合使用时，生物柴油可以以从大约0.1％至大约99.9％存在。世界上大多数地方使用称为“B”因子的系统来表示生物柴油在任何燃料混合物中的量。例如，将含有20％生物柴油的燃料标记为B20。纯生物柴油被称为B100。
生物柴油还可以在家用和商用锅炉中用作加热燃料。现有的的燃油锅炉可能含有橡胶部件，需要进行转换以使其利用生物柴油运转。该转换过程通常相对简单，其涉及将橡胶部件换成合成部件，因为生物柴油是强效溶剂。由于其溶解力很强，燃烧生物柴油将会增加锅炉的效率。生物柴油可以用作柴油制剂的添加剂，以增加纯超低硫柴油(ULSD)燃料的润滑性，这是有利的，因为其几乎不含硫。与石化柴油相比，生物柴油是较好的溶剂，其可用于分解之前利用石化柴油运转之车辆燃料管中的残留沉积物。
可以通过富含油类的生物质中含有的甘油三酯的转酯基作用生产生物柴油。因此，在本发明的另一个方面中提供了生产生物柴油的方法。在一个优选的实施方案中，生产生物柴油的方法包括以下步骤(a)利用本文中公开的方法培养含脂微生物；(b)使含脂微生物裂解，以产生裂解物；(c)从已裂解的微生物中分离脂类；和(d)使脂类组合物转酯基化，从而产生生物柴油。上面已经描述了微生物生长的方法、使微生物裂解以产生裂解物的方法、在含有有机溶剂的介质中处理裂解物以形成异源混合物的方法和使经处理的裂解物分离成为脂类组合物的方法，这些方法也可以用于生产生物柴油的方法中。
生物柴油的脂类特性通常与给料油的脂类特性高度类似。可以使由本发明的方法和组合物提供的其他油类进行转酯基作用，以产生脂类特性包含(a)至少4％C8-C14；(b)至少0.3％C8；(c)至少2％C10；(d)至少2％C12；和(3)至少30％C8-C14的生物柴油。
可以使脂类组合物进行转酯基作用，以产生用作生物柴油的长链脂肪酸酯。优选的转酯基反应概述于下面，其包括碱催化的转酯基作用和利用重组脂酶的转酯基作用。在碱催化的转酯基过程中，在碱性催化剂(通常是氢氧化钾)存在下，甘油三酯与醇(例如甲醇或者乙醇)反应。该反应形成甲酯或者乙酯，以及副产物丙三醇(甘油)。
动物油和植物油通常由甘油三酯构成，其是游离脂肪酸与三元醇甘油形成的酯。在转酯基作用中，甘油三酯(TAG)中的甘油被短链醇(例如甲醇或者乙醇)取代。通常反应图解如下：
      
在该反应中，用碱使醇去质子化，以使其成为较强的亲核物质。通常过量(至50倍)使用乙醇或者甲醇。一般该反应进行地非常慢或者不进行。可以通过加热以及使用酸或者碱帮助反应进行得更快。转酯基反应不会消耗酸或者碱，因此其不是反应物而是催化剂。几乎所有的生物柴油均利用碱催化技术生产，因为其仅仅需要低温和低压，并且能够产生超过98％的产率(在起始油类具有低水平的湿度和游离脂肪酸的情况下)。
如上面所讨论，还可以利用酶(例如脂酶)代替碱进行转酯基反应。例如可以在室温和80℃的温度下进行脂酶催化的转酯基反应，其中TAG对低级醇的摩尔比率大于1:1，优选大约3:1。适用于转酯基反应中的脂酶包括但不限于列于表7中的脂酶。用于转酯基反应中的其他脂酶示例描述于例如美国专利第4,798,793号、第4,940,845号、第5,156,963号、第5,342,768号、第5,776,741号和WO89/01032中。这些脂酶包括但不限于由微生物酒曲菌、曲霉菌、假丝酵母、毛霉菌、假单胞菌、根毛霉、假丝醇母和腐质霉产生的脂酶以及胰脂酶。
表7.适用于转酯基反应的脂酶
黑曲霉脂酶ABG73614、南极洲假丝酵母(Candida antarctica)脂酶B(novozym-435)CAA83122、固定化柱状假丝酵母(Candida cylindracea)脂酶AAR24090、溶脂假丝酵母(Candida lipolytica)脂酶(Lipase L；AmanoPharmaceutical Co.,Ltd.)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)脂酶(例如Lipase-OF；Meito Sangyo Co.,Ltd.)、米黑毛霉(Mucor miehei)脂酶(Lipozyme IM 20)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)脂酶AAA25882、日本根霉(Rhizopus japonicas)脂酶(Lilipase A-10FG)Q7M4U7_1、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂酶B34959、稻根霉(Rhizopus oryza)脂酶(Lipase F)AAF32408、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)脂酶(SM Enzyme)ABI13521、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosa)脂酶CAB58509、Lipase P(Nagase ChemteX Corporation)和Lipase QLM(Meito Sangyo Co.,Ltd.,Nagoya,Japan)。
利用脂酶生产适用于柴油中之脂肪酸酯的一个挑战是脂酶的价格远远高于强碱过程中使用的氢氧化钠(NaOH)的价格。已经利用可以回收的固定化脂酶来应对这种挑战。但是，进行最小数量的回收循环后必须保持固定化脂酶的活性，以使基于脂酶的过程在生产成本方面能够与强碱过程竞争。通常用于转酯基反应中的低级醇对固定化脂酶有害。美国专利第6,398,707号描述了增强固定化脂酶的活性并且使活性降低的固定化脂酶再生的方法。一些适宜的方法包括将固定化脂酶在碳原子数不少于3的低级醇中浸泡一段时间，优选0.5-48小时，更优选0.5-1.5小时。一些适宜的方法还包括用碳原子数不少于3的低级醇对失活的固定化脂酶进行清洗，并随后将失活的固定化脂酶在植物油中浸泡0.5-48小时。
在特定的实施方案中，重组脂酶表达于生产脂酶所作用之脂类的相同微生物中。适宜的重组脂酶包括列于上面表7中的脂酶和/或具有上面表7中所列GenBank登录号的脂酶，或者与上面表7中列出的一种脂酶具有至少70％氨基酸一致性的多肽以及显示脂酶活性的多肽。在附加的实施方案中，酶活性存在于与上面描述的序列之一具有至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％或者至少大约99％一致性的序列中，所有这些序列在此通过引用并入，如同被完全公开。编码脂酶和可筛选标志物的DNA优选是经密码子优化的cDNA。重新编码基因以在微藻中表达的方法描述于美国专利第7,135,290号中。
生物柴油的通用国际标准是EN 14214.ASTM D6751，是美国和加拿大参考的最常用的生物柴油标准。德国使用DIN EN 14214，英国要求符合BS EN 14214。确定产品是否符合这些标准的基本工业测试通常包括气相色谱、HPLC和其他。符合质量标准的生物柴油是无毒的，其毒性度(LC50)大于50mL/kg。
尽管符合ASTM标准的生物柴油应该是无毒的，仍然存在杂质，其可能结晶和/或析出以及作为沉淀物从溶液中落下。当在较低温度下使用柴油时，沉淀物的形成尤其成为难题。沉淀物或者析出物可以引起很多问题，例如降低燃料流动、堵塞燃料管、堵塞过滤器等。专门去除生物柴油中这些杂质和沉淀物以产生质量较高之产物的过程是本领域熟知的。这种过程的示例包括但不限于对油进行预处理以去除杂质(例如磷酸脂和游离脂肪酸)(例如水洗、碱法净化和二氧化硅吸附过滤)和冷却过滤。冷却过滤是专门开发用以去除生产后生物柴油中存在之任何微粒和沉淀物的过程。该过程使生物柴油冷却并过滤出较低温度下使用柴油时可能形成的任何沉淀物或者析出物。这种过程是本领域熟知的，其描述于美国专利申请公开第2007-0175091号中。适宜的方活可以包括使生物柴油冷却至低于大约38℃的温度，以使污染物和杂质在生物柴油液体中以微粒形式析出。接着将硅藻土或者其他过滤材料加入到经冷却的生物柴油中，以形成浆液，随后通过加压叶片或者其他类型的过滤器对浆液进行过滤，以去除微粒。随后使经过滤的生物柴油通过精密过滤器，以去除任何残留的沉淀物和硅藻土，产生最终的生物柴油产品。
实施例14描述了利用来源于Prototheca moriformis的甘油三酯油类生产生物柴油。通过ASTM D6751 A1方法测定，实施例14中生产的生物柴油的低温适应过滤性是300ml体积120秒。该测试包括过滤300ml的B100，冷却至40°F 16小时，加热至室温，并利用具有不锈钢支撑的0.7微米玻璃纤维过滤器在真空条件下进行过滤。可以对本发明的油类进行转酯基作用，以产生低温适应时间少于120秒、少于100秒和少于90秒的生物柴油。
如果在特别低的温度下使用生物柴油，还可以使用后续步骤。这些步骤包括防冻处理和分馏。设计这两种过程，以通过降低浊点(生物柴油开始结晶的温度)提高燃料的冷流和冰冻性能。有几种使生物柴油防冻的方法。一种方法是将生物柴油与石化柴油混合。另一种方法是使用能够使生物柴油浊点降低的添加剂。另一种方法是任意地通过加入添加剂使饱和物结晶并随后过滤出结晶体来去除饱和的甲酯。分馏选择性地将甲酯分离成为单独的组分或者部分，使得能够去除或者含有特定的甲酯。分馏方法包括尿素分馏、溶剂分馏和热蒸馏。
由本发明方法提供的另一种有价值的燃料是可再生柴油，其包含烷烃，例如C10:0、C12:0、C14:0、C16:0和C18:0，因此其不同于生物柴油。高质量的可再生柴油符合ASTM D975标准。通过本发明的方法产生的脂类可以用作生产可再生柴油的原料。因此，在本发明的另一个方面中提供了生产可再生柴油的方法。可以通过至少3个过程生产可再生柴油：热水处理(加氢处理)、氢化处理和间接液化。这些过程产生非酯馏出物。在这些过程中，如本文中描述产生并分离的甘油三酯被转化成为烷烃。
在一个实施方案中，生产可再生柴油的方法包括(a)利用本文中公开的方法培养含脂微生物(b)使微生物裂解，以产生裂解物，(c)从已裂解的微生物中分离脂类和(d)对脂类进行脱氧和加氢处理，以产生烷烃，从而生产可再生柴油。可以通过利用有机溶剂(例如己烷)或者通过其他方法(例如描述于美国专利第5,928,696号中的方法)从微生物生物质中提取从而获得适于生产可再生柴油的脂类。一些适宜的方法可以包括机械加压和离心。
在一些方法中，首先使微生物脂类裂化并进行加氢处理，以分别减少碳链长度和使双键饱和。随后使材料异构化，同时进行加氢处理。接着可以通过蒸馏法去除石脑油组分，随后通过额外蒸馏使柴油燃料中的期望组分汽化并蒸馏，以使其符合ASTM D975标准，而剩余比符合D975标准的期望组分更重的组分。对经化学修饰的油类(包括甘油三酯油类)进行加氢处理、加氢裂化、脱氧和异构化的方法是本领域熟知的。参见例如欧洲专利申请EP1741768(A1)、EP1741767(A1)、EP1682466(A1)、EP1640437(A1)、EP1681337(A1)、EP1795576(A1)和美国专利第7,238,277号、第6,630,066号、第6,596,155号、第6,977,322号、第7,041,866号、第6,217,746号、第5,885,440号、第6,881,873号。
在生产可再生柴油的方法的一个实施方案中，通过对脂类组合物进行加氢处理来对脂类进行处理，以产生烷烃。在热水处理中，通常生物质在高温和高压下在水中反应，以形成油灰和残留固体。转化温度通常是300°至660°F，压力是100至170个标准大气压(atm)，其足以使水基本保持液态。反应时间是15至30分钟。反应完成后，从水中分离有机物。从而产生适用于柴油的蒸馏物。
在制备可再生柴油的一些方法中，对甘油三酯进行处理的第一个步骤是进行氢化处理，以使双键饱和，随后在氢和催化剂存在下于高温发生脱氧作用。在一些方法中，氢化作用和脱氧作用发生在同一反应中。在其他方法中，氢化作用之前发生脱氧作用。接着可选地还在氢和催化剂存在下进行异构化作用。优选通过蒸馏去除石脑油组分。例如参见美国专利第5,475,160号(甘油三酯的氢化作用)、第5,091,116号(脱氧作用、氢化作用和脱气)、第6,391,815号(氢化作用)和第5,888,947号(异构化作用)。
甘油三酯氢化作用的一种适宜方法包括制备铜、锌、镁和镧盐的液体溶液以及另一种碱金属溶液或者优选地是碳酸铵。可以将这两种溶液加热至大约20℃至大约85℃的温度，以一定比率在沉淀容器中混合，使沉淀容器中的pH值保持在5.5和7.5之间，以形成催化剂。在沉淀容器中最初使用水或者使水与盐溶液和沉淀溶液顺流加入。接着对得到的沉淀物进行彻底清洗、干燥、于大约300℃煅烧并在大约100℃至大约400℃的温度范围下用氢活化。随后在反应器中存在上面描述之催化物的情况下使一种或者多种甘油三酯与氢接触并与其反应。反应器可以是喷淋床反应器、固定床气固反应器、鼓泡塔反应器、连续搅拌槽反应器、浆液反应器或者本领域已知的任何其他适宜的反应器类型。该过程可以以分批式或者以连续性方式进行。反应温度通常在大约170℃至大约250℃的范围内，而反应压力通常在大约300psig至大约2000psig的范围内。此外，在本发明的反应过程中，氢对甘油三酯的摩尔比率通常在大约20:1至大约700:1的范围内。该过程通常在大约0.1hr-1至大约5hr-1范围内的质量时空速度(WHSV)下进行。本领域技术人员知晓反应所需的时间根据所使用的温度、氢对甘油三酯的摩尔比率和氢分压而变化。由这种氢化过程产生的产物包括脂肪醇、甘油、微量的石蜡油和未反应的甘油三酯。通常通过常规方法分离这些产物，例如蒸馏、萃取、过滤、结晶和类似。
石油提炼利用氢化处理，通过用氢对补料进行处理来去除杂质。氢化处理的转化温度通常是300°至700°F。压力通常是40至100atm。反应时间通常是10至60分钟。使用固体催化剂，以增加某个反应的速率，增强对某些产物的选择性，并且优化氢的消耗。
油类脱氧作用的适宜方法包括使油类加热至大约350°至大约550°F范围内的温度，并在至少大约上述大气压范围的压力下使经加热的油与氮接触至少大约5分钟。
异构化的适宜方法包括利用碱的异构化作用和本领域已知的其他油类异构化方法。
加氢处理和氢化处理最终使甘油三酯原料的分子量减少。在氢化处理条件下甘油三酯分子减少至4个碳氢化合物分子：1个丙烷分子和3个较重的碳氢化合物分子，通常在C8至C18范围内。
因此，在一个实施方案中，对本发明的脂类组合物进行之一种或者多种化学反应的产物是烷烃混合物，其中包含ASTM D975可再生柴油。微生物的碳氢化合物生产综述于Metzger等，Appl Microbiol Biotechnol(2005)66:486–496和A Look Back at the U.S.Department of Energy’s AquaticSpecies Program:Biodiesel from Algae,NREL/TP-580-24190,John Sheehan,Terri Dunahay,John Benemann和Paul Roessler(1998)中。
柴油燃料的蒸馏性质以T10-T90描述(分别是指蒸馏体积为10％时和90％时的温度)。可再生柴油从Prototheca moriformis甘油三酯油类中产生并且描述于实施例14中。实施例14中产生之材料的T10-T90是57.9℃。可以实施加氢处理方法、异构化方法和本文中公开的对油类进行其他共价修饰的方法以及本文中公开的蒸馏和分馏(例如冷却过滤)方法，以利用根据本文中公开的方法产生的甘油三酯油类产生具有其他T10-T90范围(例如20、25、30、35、40、45、50、60和65℃)的可再生柴油组合物。
实施例14中产生之材料的T10是242.1℃。可以实施加氢处理方法、异构化方法和本文中公开的对油类进行其他共价修饰的方法以及本文中公开的蒸馏和分馏(例如冷却过滤)方法，以产生具有其他T10值的可再生柴油组合物，例如T10值在180和295之间、在190和270之间、在210和250之间、在225和245之间以及至少290。
实施例14中产生之材料的T90是300℃。可以实施加氢处理方法、异构化方法和本文中公开的对油类进行其他共价修饰的方法以及本文中公开的蒸馏和分馏(例如冷却过滤)方法，以产生具有其他T90值的可再生柴油组合物，例如T90值在280和380之间、在290和360之间、在300和350之间、在310和340之间以及至少290。
实施例14中产生之材料的FBP是300℃。可以实施加氢处理方法、异构化方法和本文中公开的对油类进行其他共价修饰的方法以及本文中公开的蒸馏和分馏(例如冷却过滤)方法，以产生具有其他FBP值的可再生柴油组合物，例如FBP值在290和400之间、在300和385之间、在310和370之间、在315和360之间以及至少300。
可以对由本发明的方法和组合物提供的其他油类联合进行加氢处理、异构化和其他共价修饰，包括脂类特性包含(a)至少4％C8-14、(b)至少0.3％C8、(c)至少2％C10、(d)至少2％C12和(3)至少30％C8-C14的油类。
可以通过两个步骤的过程从任何形式的生物质中生产传统的超低硫柴油。首先，将生物质转化成为合成气(一种富含氢和一氧化碳的气体混合物)。接着将合成气催化转化成为脂类。通常利用Fisher-Tropsch(FT)合成法生产脂类。该技术可以应用于煤、天然气和重油中。因此，在生产可再生柴油之方法的另一个优选实施方案中，通过使脂类组合物间接液化对脂类组合物进行处理，以产生烷烃。
本发明还提供了生产喷气燃料的方法。喷气燃料是清澈的淡黄色。最常用的燃料是不含铅/基于石蜡油的燃料，其被分类为Aeroplane A-1，根据一组国际标准规格生产。喷气燃料是大量不同碳氢化合物的混合物，可能多至上千种或者更多。其大小(分子量或者碳原子数量)范围受到产品需要的限制，例如凝固点或者发烟点。Kerosone型Aeroplane燃料(包括JetA和Jet A-1)具有大约8至16个碳原子数量之间的碳原子数量分布。宽馏分或者石脑油型Aeroplane燃料(包括Jet B)通常具有大约5至15个碳原子之间的碳原子数量分布。
两种Aeroplane(Jet A和Jet B)可以含有一些添加剂。可用的添加剂包括但不限于抗氧化剂、抗静电试剂、阻蚀剂和燃料系统防冰(FSII)试剂。抗氧化剂防止结胶，通常基于经烷基化的苯酚，例如AO-30或者AO-37。抗静电剂消除静电并且防止产生火花，例如以二壬基萘磺酸(DINNSA)作为活性成分的Stadis 450。阻蚀剂，例如DCI-4A，用于居民和军用燃料，DCI-6A用于军用燃料。FSII试剂包括例如Di-EGME。
在本发明的一个实施方案中，通过将藻类燃料与现有的喷气燃料混合来生产喷气燃料。通过本发明的方法产生的脂类可以用作生产喷气燃料的原料。因此，在本发明的另一个方面中提供了生产喷气燃料的方法。在此提供了两种从由本发明的方法产生的脂类中生产喷气燃料的方法：流化催化裂化(FCC)和加氢脱氧作用(HDO)。
流化催化裂化(FCC)是一种用于生产烯烃的方法，特别是重质原油组分中的丙烯。通过本发明的方法产生的脂类可以转化成为丙烯。该过程包括使产生的脂类流过FCC区并收集包含用作喷气燃料之丙烯的产物流。产生的脂类在裂化条件下与裂化催化剂接触，以提供包含用作喷气燃料之丙烯和碳氢化合物的产物流。
在一个实施方案中，生产喷气燃料的方法包括(a)利用本文中公开的方法培养含脂微生物，(b)使含脂微生物裂解，以产生裂解物，(c)从裂解物中分离脂类和(d)对脂类组合物进行处理，从而生产喷气燃料。在生产喷气燃料的方法的一个实施方案中，可以使脂类组合物流过流化催化裂化区，在一个实施方案中，其可以包括使脂类组合物在裂化条件下与裂化催化剂接触，以提从包含C2-C5丙烯的产物流。
在该方法的某些实施方案中，去除脂类组合物中存在的任何杂质是理想的。因此，使脂类组合物流过流化催化裂化区之前，对脂类组合物进行预处理。预处理可以包括使脂类组合物与离子交换树脂接触。离子交换树脂可以是酸性离子交换树脂(例如AmberlystTM-15，其可以在脂类组合物向上或者向下流过的反应器中用作床体。其他预处理可以包括通过使脂类组合物与酸(例如硫酸、醋酸、硝酸或者盐酸)接触进行弱酸清洗。一般在环境温度和大气压下用稀释的酸溶液进行接触。
可选地使经预处理的脂类组合物流至FCC区，在此处含烃组分裂化成为烯烃。通过使脂类组合物在反应区中与包含微粒材料的催化剂接触来完成催化裂化。该反应是催化裂化，其与加氢裂化相对，在不加入氢或者不消耗氢的情况下进行。随着裂化反应的进行，大量焦炭沉积在催化剂上。通过在再生区中使催化剂上的焦炭燃烧，在高温下使催化剂再生。含有焦炭的催化剂(在本文中被称为“焦炭催化剂”)持续地从反应区运送至再生区，以使其再生并被再生区中基本不含焦炭的再生催化剂取代。通过多种气流对催化剂颗粒进行的流化使得催化剂能够在反应区和再生区之间运送。在催化剂的流化流中使碳氢化合物(例如本文中描述的脂类组合物)裂化的方法、在反应区和再生区之间运送催化剂的方法以及在再生器中燃烧焦炭的方法是FCC过程领域的技术人员熟知的。示例性FCC应用和用于使脂类组合物裂化以产生C2-C5烯烃的催化剂描述于美国专利第6,538,169号和第7,288,685号中，其作为整体通过引用并入本文。
适宜的FCC催化剂一般包含处于或者没有处于相同基质上的至少两种组分。在一些实施方案中，两种组分均在整个反应管中循环。第一种组分一般包括用于流化催化裂化领域的任何已知催化剂，例如活性非晶态粘土型催化剂和/或高活性晶态分子筛。分子筛催化剂优先于非晶态催化剂，因为其大大提高了对期望产物的选择性。在一些优选的实施方案中，在FCC过程中可以使用沸石作为分子筛。优选第一种催化剂组分包含大孔径的沸石(例如Y型沸石)、活性氧化铝材料、包含二氧化硅或者氧化铝的粘结材料和隋性填料(例如高岭土)。
在一个实施方案中，本发明之脂类组合物的裂化发生在FCC区的提升段或者上升段中。通过使脂类组合物快速汽化的喷嘴将脂类组合物引入提升段中。在与催化剂接触之前，通常脂类组合物具有大约149℃至大约316℃(300°F至600°F)的温度。催化剂从混合管流至提升段，在此处其与脂类组合物接触大约2秒或者更短时间。
接着通过出口将催化剂混合物和已反应的脂类组合物从提升段顶端排出，并分离成为包含烯烃的裂化产物蒸汽流和覆盖大量焦炭一般称为“焦炭催化剂”的催化剂颗粒收集物。在使脂类组合物和催化剂的接触时间(可能促进期望产物进一步转化成为不期望的其他产物)最小化的尝试中，可以使用分离器装置(例如旋转臂装置)，以从产物流中快速去除焦炭催化剂。分离器(例如旋转臂分离器)位于反应室的上部，所述反应室的下部具有提馏区。由旋转臂装置分离的催化剂滴落入提馏区中。包含经裂化之碳氢化合物(含有轻烯烃)的裂化产物蒸汽流和一些催化剂通过与旋流器相连的管道排出反应室。旋流器去除产物蒸汽流中的残留催化剂颗粒，使颗粒浓度降至极低水平。随后产物蒸汽流从分离器顶端排出。由旋流器分离的催化剂返回至分离器中，随后进入提馏区。提馏区通过与蒸汽逆流接触去除催化剂表面吸附的碳氢化合物。
运行碳氢化合物的低分压，以使有利于轻烯烃的产生。因此，将提升段压力设定为大约172至241kPa(25至35psia)，其中碳氢化合物的分压是大约35至172kpa(5至25psia)，优选碳氢化合物的分压是大约69至138kpa(10至20psia)。通过利用蒸汽作为稀释剂并且使稀释剂占脂类组合物的10-55wt-％，优选脂类组合物的大约15wt-％，来达到碳氢化合物相对低的分压。可以使用其他稀释剂(例如干燥气体)来达到相同的碳氢化合物分压。
提升段出口处的裂化流温度是大约510℃至621℃(950°F至1150°F)。但是，提升段出口温度高于566℃(1050°F)使得产生更多干燥气体和更多烯烃。而提升段出口温度低于566℃(1050°F)使得产生较少乙烯和丙烯。因此，优选在大约566℃至大约630℃的优选温度以及大约138kPa至大约240kPa(20至35psia)的优选压力下下进行FCC过程。该过程的另一个条件是催化剂对脂类组合物的比率，其可以在大约5至大约20之间变化，优选大约10至大约15。
在生产喷气燃料之方法的一个实施方案中，将脂类组合物引入FCC反应器的上升段。上升段中的温度非常高，其范围是大约700℃(1292°F)至大约760℃(1400°F)，催化剂对脂类组合物的比率是大约100至大约150。可以预期将脂类组合物引入上升段中会产生大量的丙烯和乙烯。
在利用如本文中所描述产生的脂类组合物和脂类生产喷气燃料之方法的另一个实施方案中，脂类组合物或者脂类的结构被称为脱氧加氢(HDO)的过程破坏。HDO是指利用氢去除氧，即去除氧的同时破坏材料的结构。使烯烃的双键加氢，并去除任何硫和氮的化合物。硫的去除被称为加氢脱硫(HDS)。对原材料(脂类组合物或者脂类)进行预处理和纯化有助于延长催化剂的使用寿命。
一般在HDO/HDS步骤中，将氢与给料(脂类组合物或者脂类)混合，接着使混合物以单相进料或者双向进料方式顺流通过催化剂床。HDO/MDS步骤后，分离产物组分，并且将其运送至单独的异构化反应器。生物起始材料的异构化反应器描述于文献(FI 100 248)中(顺流反应器)。
还可以通过使脂类组合物或者脂类与氢气顺流通过第一加氢区，并随后通过将氢气顺流(相对于碳氢化合物流出液)送至第二加氢区在第二加氢区中对碳氢化合物流出液进行进一步加氢，从而进行通过使碳氢化合物给料(例如本文中的脂类组合物或者脂类)加氢来生产燃料的过程。示例性HDO应用和用于使脂类组合物裂化以产生C2-C5烯烃的催化剂描述于美国专利第7,232,935号中，其作为整体通过引用并入本文。
通常在加氢脱氧步骤中，使生物组分(例如本文中的脂类组合物或者脂类)的结构分解，去除氧、氮、磷和硫化合物和轻碳氢化合物，并使烯烃键加氢。在该过程的第二个步骤中，即在异构化步骤中，进行异构化，以使碳氢化合物的链支化，并且提高低温下石蜡油的性能。
在裂化过程的第一个步骤即HDO步骤中，将氢气和需要加氢的本文中的脂类组合物或者脂类顺流或者逆流运送至HDO催化剂床系统，所述催化剂床系统包含一个或者多种催化剂床，优选1-3个催化剂床。通常以顺流方式进行HDO步骤。在HDO催化剂床系统包含两种或者更多催化剂床的情况下，利用逆流原则对一个或者多个床进行操作。在HDO步骤中，压力在20和150bar之间变化，优选在50和100bar之间，温度在200至500℃之间变化，优选300-400℃的范围内。在HDO步骤中，可以使用含有元素周期表中第VII族和/或第VIB族金属的已知加氢催化剂。优选加氢催化剂是负载型Pd、Pt、Ni、NiMo或者CoMo催化剂，所述负载是氧化铝和/或二氧化硅。通常使用NiMo/Al2O3和CoMo/Al2O3催化剂。
HDP步骤之前，可选地通过在较温和条件下进行预加氢，对本文中的脂类组合物或者脂类进行处理，从而避免双键的副反应。在预加氢催化剂存在下，在50-400℃的温度和1200bar的氢气压下进行这种预加氢过程，优选温度在150和250℃之间，氢气压在10和100bar之间。催化剂可以含有元素周期表中第VII族和/或第VIB族的金属。优选预加氢催化剂是负载型Pd、Pt、Ni、NiMo或者CoMo催化剂，所述负载是氧化铝和/或二氧化硅。
使HDO步骤中含有氢的气流冷却，并接着从中去除一氧化碳、二氧化碳、氮、磷和硫化合物、气态轻碳氢化合物和其他杂质。压缩后，经纯化的氢或者经回收的氢返回至第一催化剂床和/或催化剂床之间，以补偿释放的气流。从压缩的液体中去除水。将液体运送至第一催化剂床或者催化剂床之间。
HDO步骤后，使产物进行异构化步骤。在碳氢化合物与异构化催化剂接触之前尽可能去除杂质对于该过程是重要的。异构化步骤包括可选的洗脱步骤，其中通过用水蒸汽或者适宜气体(例如轻碳氢化合物气体、氮气或者氢气)洗脱，对HDO步骤中的反应产物进行纯化。以逆流方式在异构化催化剂的上游装置中进行可选的洗脱步骤，其中气体和液体相互接触，或者利用逆流原则在实际的异构化反应器之前在单独的洗脱装置中进行可选的洗脱步骤。
洗脱步骤后，将氢气和经加氢的本文中的脂类组合物或者脂类以及可选地n-石蜡油混合物运送至包含一个或者数个催化剂床的异构化反应装置中。异构化步骤的催化剂床可以以顺流或者逆流方式运行。
在异构化步骤中应用逆流原则对于该过程是重要的。在异构化步骤中，这通过以逆流方式进行可选的洗脱步骤或者异构化反应步骤或者这两个步骤来进行。在异构化步骤中，压力在20-150bar的范围内变化，优选在20-100bar范围内，温度在200和500℃之间，优选在300和400℃之间。在异构化步骤中，可以使用本领域已知的异构化催化剂。适宜的异构化催化剂含有分子筛和/或第VII族的金属和/或载体。优选异构化催化剂含有SAPO-11或者SAPO41或者ZSM-22或者ZSM-23或者镁碱沸石以及Pt、Pd或者Ni以及Al2O3或者SiO2。通常异构化催化剂是例如Pt/SAPO-11/Al2O3、Pt/ZSM-22/Al2O3、Pt/ZSM-23/Al2O3和Pt/SAPO-11/SiO2。可以在相同的压力容器或者单独的压力容器中进行异构化步骤和HDO步骤。在单独的压力容器中或者在与HDO和异构化步骤中使用的相同压力容器中进行可选的预加氢步骤。
因此，在一个实施方案中，一个或者多个化学反应的产物是包含ASTMD1655喷气燃料的烷烃混合物。在一些实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规格的组合物含有少于10ppm的硫。在其他实施方案中，符合ASTM1655喷气燃料规格的组合物具有低于205℃的分馏曲线T10值。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规格的组合物具有低于300℃的终沸点(FBP)。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规格的组合物具有至少38℃的燃烧点。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规格的组合物具有775K/M3和840K/M3之间的密度。而在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规格的组合物具有低于-47℃的凝固点。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规格的组合物具有至少42.8MJ/K的净燃烧热。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规格的组合物具有至少13.4质量％的氢含量。在另一个实施方案中，如通过重量定量JFTOT于260℃所测定，符合ASTM 1655喷气燃料规格的组合物具有低于3mm Hg的热稳定性。在另一个实施方案中，符合ASTM1655喷气燃料规格的组合物具有低于7mg/dl的实际胶质。
因此，本发明公开了多种方法，其中对微藻脂类进行化学修饰，以产生用于多种工业和其他应用中的产物。对由本文中公开的方法产生的油类进行修饰的过程示例包括但不限于油类的水解、油类的氢化处理和油类的酯化。微藻油的修饰产生基本的油脂化工产品，其可以进一步修饰成为指定的衍生型油脂化工产品，以具有期望功能。以与上面描述的燃料生产过程类似的方式，还可以对从本文中描述的微生物培养物中产生的油类进行这些化学修饰。基本油脂化工产品的示例包括但不限于脂肪酸盐、脂肪酸、脂肪酸甲酯和甘油。衍生型油脂化工产品包括但不限于脂族腈、酯、二聚酸、季铵盐、表面活性剂、脂肪酸链烷醇酰胺、脂肪醇硫酸盐、树脂、乳化剂、脂肪醇、烯烃和高级烷烃。
通过本发明方法产生之甘油脂中的脂肪酸成分水解产生游离脂肪酸，可以使其衍生化，以产生其他有用的化学品。在水和催化剂(或者是酸或者是碱)存在下发生水解。可以使释放的游离脂肪酸衍生化，以产生如下列文献报道的多种产物：美国专利第5,304,66号(高度硫酸化的脂肪酸)；第7,262,158号(清洁组合物)；第7,115,173号(织物柔软剂组合物)；第6,342,208号(用于皮肤的乳化剂)；第7,264,886号(防水组合物)；第6,924,333号(涂料添加剂)；第6,596,768号(富含脂类的反刍动物原料)和第6,380,410号(用于洗涤剂和清洁剂的表面活性剂)。
对于水解，在本发明的一个实施方案中，可选地，首先在液体介质(例如水或者氢氧化钠)中使甘油三酯油类水解，以获得甘油和脂肪酸盐。有多种适宜的甘油三酯水解方法，其包括但不限于皂化、酸水解、碱水解、酶促水解(本文中称为分裂)和利用热压缩水的水解。本领域技术人员应当知晓为了生产油脂化工产品，不需要对甘油三酯进行水解，而是可以通过其他已知的过程将油类直接转化成为期望的油脂化工产品。例如，可以通过酯化作用将甘油三酯油类直接转化成为脂肪酸甲酯。
在一些实施方案中，通过将油类分裂成为甘油和脂肪酸，对通过本文中公开的方法产生的油类进行催化水解。如上面所讨论，接着通过几种其他的修饰作用对脂肪酸进行进一步加工，以获得衍生型油脂化工产品。例如在一个实施方案中，使脂肪酸进行胺化反应，以产生含氮的脂肪族化合物。在另一个实施方案中，使脂肪酸进行臭氧分解作用，以产生一元酸和二元酸。
在其他实施方案中，通过使本文中产生的油类分裂来进行水解，以产生油脂化工产品。在本发明一些优选的实施方案中，在进行其他过程前使甘油三酯油类分裂。本领域技术人员应当知晓有很多使甘油三酯分裂的适宜方法，其包括但不限于酶促分裂和压力分裂。
通常油类的酶促分解方法使用酶，脂酶，作为作用于水/油混合物的生物催化剂。接着酶促分解使油类或者脂肪分别分解成为甘油和游离脂肪酸。随后甘油迁移至水相中，而有机相富含游离脂肪酸。
酶促分解反应一般发生在有机相和水相之间的相界面中，其中酶仅存在于相界面中。到达相界面的甘油三酯随后进行或者参与分解反应。随着反应的进行，与游离脂肪酸相比，相界面中仍然以甘油酯形式化学结合之脂肪酸的占有密度或者浓度减少，以使反应减慢。在某些实施方案中，在室温下发生酶促分解。本领域技术人员应当知晓使油类分解成为期望脂肪酸的适宜条件。
作为示例，可以通过增加界面表面使反应速度加快。反应一经完成，接着从不含酶的有机相中分离游离脂肪酸，将仍然含有以甘油酯形式化学结合之脂肪酸的残余物送回或者回收，并且与即将进行分解的新鲜油类或者脂肪混合。用这种方法，接着使回收的甘油酯进行进一步酶促分解过程。在一些实施方案中，用这种方法从从部分分解的油类或者脂肪中提取游离脂肪酸。以那种方法，如果将化学结合的脂肪酸(甘油三酯)返回或者送回至分解过程，可以使酶的消耗显著减少。
用对于特定油类或者脂肪计算出的理论上可能的酸值除以所测定的酸值得到的比率来确定分解程度。优选根据标准的常用方法通过滴定测定酸值。可选地，可以用液态甘油相的密度测定分解程度。
在一个实施方案中，本文中所描述的分解过程还适用于使所产生油类的碱提炼过程中产生的皂料中含有的一元、二元和甘油三酯分解。用这种方法，可以使皂料定量转化，不需要将中性油类事先皂化成为脂肪酸。为此目的，优选在分解过程之前通过加入酸使在脂肪酸盐中化学结合的脂肪酸释放。在某些实施方案中，除了水和酶之外，分解过程中使用缓冲溶液。
在一个实施方案中，还可以对根据本发明的方法产生的油类进行皂化作用(一种水解方法)。动物油和植物油通常由甘油三酯(TAGs)组成，其是脂肪酸与三元醇甘油形成的酯。在碱水解反应中，TAG中的甘油被去除，剩余3个羧酸阴离子，其可以与碱金属阳离子(例如钠或者钾)结合，以产生脂肪酸盐。在这种方案中，从甘油基中切割下羧酸成分，并用羟基代替。通过期望的皂化程度确定反应中使用的碱(例如KOH)量。如果例如目的是生产包含最初TAG组合物中存在之一些油类的皂化产品，将不足以使所有TAGs转化成为脂肪酸盐的碱量加入到反应混合物中。通常在水溶液中进行该反应，反应缓慢进行，但是可以通过加热使其加快。通过向反应混合物中加入盐(例如水溶性碱金属卤化物(例如NaCl或者KCl))可以帮助脂肪酸盐析出。优选碱是碱金属氢氧化物，例如NaOH或者KOH。可选地，反应方案中可以使用其他碱，例如链烷醇胺，其包括例如三乙醇胺和氨甲基丙醇。在一些情况下，优选使用这些替代品生产纯净的皂化产品。
在一些方法中，化学修饰的第一个步骤可以是氢化处理，以使双链饱和，随后在氢和催化剂存在下于高温进行脱氧作用。在其他方法中，氢化作用和脱氧作用发生在同一反应中。在其他方法中，氢化作用之前发生脱氧作用。接着可选地也在氢和催化剂存在下进行异构化。最后，如果需要，可以去除气体和石脑油组分。例如参见美国专利第5,475,160号(甘油三酯的氢化作用)、第5,091,116号(脱氧作用、氢化作用和脱气)、第6,391,815号(氢化作用)和第5,888,947号(异构化作用)。
在本发明的一些实施方案中，使甘油三酯油类部分或者完全脱氧。脱氧反应形成期望产物，其包括但不限于脂肪酸、脂肪醇、多元醇、酮或者醛。一般来讲，不受任何特定理论的限制，脱氧反应包括多种不同反应途径的组合，包括但不限于：水解、加氢、连续性氢化-氢解反应、连续性氢解-氢化反应和氢化-氢解联合反应，使得从脂肪酸或者脂肪酸酯中至少部分地去除氧，以产生反应产物，例如脂肪醇，其通过进一步加工可以容易地转化成为期望的化学品。例如在一个实施方案中，可以通过FCC反应将脂肪醇转化成为烯烃或者通过缩合反应转化成为高级烷烃。
这种化学修饰之一是氢化作用，其将氢加入到甘油脂或者游离脂肪酸之脂肪酸成分的双键中。加氢过程使得可以将液体油类转化成为半固体或者固体脂肪，其更适用于特定应用中。
通过本文中描述的方法产生之油类的氢化作用可以与本文中提供的一种或者多种方法和/或材料结合使用，如下列文献所报道：美国专利第7,288,278号(食品添加剂或者药物)、第5,346,724号(润滑产品)、第5,475,160号(脂肪醇)、第5,091,116号(食用油)、第6,808,737号(用于人造黄油和涂抹品的结构脂肪)、第5,298,637号(低卡路里脂肪成分)、第6,391,815号(加氢催化剂和硫吸附剂)、第5,233,099号和第5,233,100号(脂肪醇))、第4,584,139号(加氢催化剂)、第6,057,375号(防沫剂)和第7,118,773号(食用乳液)。
本领域技术人员应当知晓可以使用多个过程使碳水化合物加氢。一种适宜的方法包括在加氢反应器中足以形成加氢产物的条件下使碳水化合物与氢或者与适宜气体和催化剂混合的氢接触。加氢催化剂一般可以包含Cu、Re、Ni、Fe、Co、Ru、Pd、Rh、Pt、Os、Ir以及合金或者其任意组合，其以单独形式或者具有促进剂，例如W、Mo、Au、Ag、Cr、Zn、Mn、Sn、B、P、Bi以及合金或者其任意组合。其他有效的加氢催化剂材料包括负载型镍或者用铼修饰的钌。在一个实施方案中，取决于催化剂期望的功能，加氢催化剂还包含任意一种负载。可以用本领域普通技术人员已知的方法制备加氢催化剂。
在一些实施方案中，加氢催化剂包括负载型第VIII族金属催化剂和金属海绵材料(例如海绵镍催化剂)。适用于本发明的经活化的海绵镍催化剂的一个示例是Raney镍。在其他实施方案中，利用包含镍-铼催化剂或者经钨修饰之镍催化剂的催化剂进行本发明的加氢反应。用于本发明的加氢反应的适宜催化剂的一个示例是碳负载型镍-铼催化剂。
在一个实施方案中，可以通过用碱性水溶液(例如含有大约25重量％的氢氧化钠)对镍和铝大约等重的合金进行处理，来制备适宜的Raney镍催化剂。铝选择性地被碱性水溶液溶解，产生海绵形材料，其主要包含镍，还包括少量铝。初始合金包含促进剂金属(即钼或者铬)，其含量使其在所形成的海绵镍催化剂中剩余大约1至2重量％。在另一个实施方案中，通过将亚硝酰硝酸钌(III)水溶液、氯化钌(III)水溶液注入适宜的支持材料中来制备加氢催化剂。接着使溶液干燥，以形成水含量少于大约1％的固体。随后该固体在旋转式圆形炉中在氢气流气压下于300℃(未锻烧)或者400℃(锻烧)还原4小时。冷却并用氮使催化剂隋化后，使氮气中的5％体积的氧气通过催化剂2小时。
在某些实施方案中，所描述的催化剂包含催化剂载体。该催化剂载体使催化剂稳定并且提供支持。所使用的催化剂载体的类型取决于所选择的催化剂和反应条件。用于本发明的适宜载体包括但不限于碳、二氧化硅、二氧化硅-氧化铝、氧化锆、二氧化钛、二氧化铈、氧化钒、氮化物、氮化硼、杂多酸、羟磷灰石、氧化锌、chromia、沸石、碳钠米管、碳富勒烯和其任意组合。
可以利用本领域技术人员已知的常规方法制备用于本发明的催化剂。适宜的方法可以包括但不限于初期润湿、蒸汽式注入、化学气相沉积、防水涂层、磁控溅射技术和类似。
进行加氢反应的条件基于起始材料和期望产物的类型而变化。本领域普通技术人员在本公开的利益下应当知晓合适的反应条件。一般来讲，在80℃至250℃的温度下进行加氢反应，优选90℃至200℃，最优选100℃至150℃。在一些实施方案中，在500Kpa至14000Kpa的压力下进行加氢反应。
本发明的氢解反应中使用的氢可以包括外部氢、回收的氢、原位产生的氢和其任意组合。如本文中所使用，术语“外部氢”是指不是来源于生物质反应本身而是从另一种来源加入到系统中的氢。
在本发明的一些实施方案中，使起始碳水化合物转化成为较小分子是理想的，所述较小分子更易于转化成为期望的高级碳氢化合物。用于这种转化的一种适宜方法是通过氢解反应。已知多种过程可以进行碳水化合物的氢解作用。一种适宜的方法包括在氢解反应器中，在足以形成包含较小分子或者多元醇之反应产物的条件下，使碳水化合物与氢或者与适宜气体和氢解催化剂接触。如本文中所使用，术语“较小分子或者多元醇”包括具有较小分子量(包括碳原子数量或者氧原子数量少于起始碳水化合物)的任何分子。在一个实施方案中，反应产物包含较小分子，所述较小分子包括多元醇和醇。本领域普通技术人员能够选择合适的方法来进行氢解反应。
在一些实施方案中，利用氢解催化剂可以将5和/或6碳糖或者糖醇转化成为丙二醇、乙二醇和甘油。氢解催化剂可以包括Cr、Mo、W、Re、Mn、Cu、Cd、Fe、Co、Ni、Pt、Pd、Rh、Ru、Ir、Os以及合金或者其任意组合，其以单独形式或者具有促进剂，例如Au、Ag、Cr、Zn、Mn、Sn、Bi、B、O以及合金或者其任意组合。氢解催化剂还可以包括含有过渡金属(例如钼、铬、钨、铼、锰、铜、镉)或者第VIII族金属(例如铁、钴、镍、铂、钯、铑、钌、铱和锇)的碳焦化聚合物催化剂。在某些实施方案中，氢解催化剂可以包括与碱土金属氧化物结合的或者附着在经催化活化的载体中的上面任意一种金属。在某些实施方案中，氢解反应中描述的催化剂可以包括上面加氢反应中描述的催化剂载体。
进行氢解反应的条件基于起始材料和期望产物的类型而变化。本领域普通技术人员在本公开的利益下应当知晓用于进行该反应的合适的反应条件。一般来讲，在110℃至300℃的温度下进行氢解反应，优选170℃至220℃，最优选200℃至225℃。在一些实施方案中，在60Kpa和16500Kpa之间范围内的压力下进行氢解反应，优选在1700Kpa和14000Kpa之间范围内，更优选在4800Kpa和11000Kpa之间范围内。
本发明的氢解反应中使用的氢可以包括外部氢、回收的氢、原位产生的氢和其任意组合。
在一些实施方案中，可以在缩合反应器(在图1中图解显示为缩合反应器110)中通过缩合反应将上面讨论的反应产物转化成为高级碳氢化合物。在这些实施方案中，在能够形成高级碳氢化合物的催化剂存在下对反应产物进行缩合。不受理论限制，据信通过逐步式加入反应产生高级碳氢化合物，包括碳-碳键或者碳-氧键的形成。得到的反应产物包括任意数量的化合物，其含有下面更加详细描述的基团。
在某些实施方案中，适宜的缩合催化剂包括酸催化剂、碱催化剂或者酸/碱催化剂。如本文中所使用，术语“酸/碱催化剂”是指同时具有酸功能和碱功能的催化剂。在一些实施方案中，缩合催化剂可以包括但不限于沸石、碳化物、氮化物、氧化锆、氧化铝、二氧化硅、铝硅酸盐、磷酸盐、氧化钛、氧化锌、氧化钒、氧化镧、氧化钇、氧化钪、氧化镁、氧化铈、氧化钡、氧化钙、氢氧化物、杂多酸、无机酸、酸修饰的树脂、碱修饰的树脂和其任意组合。在一些实施方案中，缩合催化剂还可以包含一种修饰剂。适宜的修饰剂包括La、Y、Sc、P、B、Bi、Li、Na、K、Rb、Cs、Mg、Ca、Sr、Ba和其任意组合。在一些实施方案中，缩合催化剂还可以包含一种金属。适宜的金属包括Cu、Ag、Au、Pt、Ni、Fe、Co、Ru、Zn、Cd、Ga、In、Rh、Pd、Ir、Re、Mn、Cr、Mo、W、Sn、Os、合金和其任意组合。
在某些实施方案中，缩合反应中描述的催化剂可以包含上面加氢反应中描述的催化剂载体。在某些实施方案中，缩合催化剂是自身负载的。如本文中所描述，术语“自身负载”是指催化剂不需要其他材料作为载体。在其他实施方案中，缩合催化剂与适于支持催化剂的单独载体结合使用。在一个实施方案中，缩合催化剂的载体是二氧化硅。
进行缩合反应的条件基于起始材料和期望产物的类型而变化。本领域普通技术人员在本公开的利益下应当知晓用于进行该反应的合适的反应条件。在一些实施方案中，在对计划进行之反应的热力学有利的温度下进行缩合反应。缩合反应的温度根据特定起始多元醇或者醇而变化。在一些实施方案中，缩合反应的温度在80℃至500℃的范围内，优选125℃至450℃，最优选125℃至250℃。在一些实施方案中，在0Kpa和9000Kpa之间范围内的压力下进行缩合反应，优选在0Kpa和7000Kpa之间范围内，更优选在0Kpa和5000Kpa之间范围内。
本发明中形成的高级烷烃包括但不限于具有4至30个碳原子的支化或者直链烷烃、具有4至30个碳原子的支化或者直链烯烃、具有5至30个碳原子的环烷烃、具有5至30个碳原子的环烯烃、芳香族、稠合芳香族、醇和酮。适宜的烷烃包括但不限于丁烷、戊烷、戊烯、2-甲基丁烷、己烷、己烯、2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷、庚烷、庚烯、辛烷、辛烯、2,2,4-三甲基戊烷、2,3-二甲基己烷、2,3,4-三甲基戊烷、2,3-二甲基戊烷、壬烷、壬烯、癸烷、癸烯、十一烷、十一烯、十二烷、十二烯、十三烷、十三烯、十四烷、十四烯、十五烷、十五烯、十九烷、十九烯、二十烷、二十烯、二十一烷、二十一烯、二十二烷、二十二烯、二十三烷、二十三烯、二十四烷、二十四烯和其异构体。这些产物中的一些适用作燃料。
在一些实施方案中，环烷烃和环烯烃是未取代的。在其他实施方案中，环烷烃和环烯烃是单取代的。在其他实施方案中，环烷烃和环烯烃是多取代的。在包含经取代的环烷烃和环烯烃的实施方案中，取代基团包括但不限于具有1至12个碳原子的支化或者直链烷基、具有1至12个碳原子的支化或者直链烃基、苯基和其任意组合。适宜的环烷烃和环烯烃包括但不限于环戊烷、环戊烯、环己烷、环己烯、甲基-环戊烷、甲基-环戊烯、乙基-环戊烷、乙基-环戊烯、乙基-环己烷、乙基-环己烯、其异构体和其任意组合。
在一些实施方案中，所形成的芳香族化合物是未取代的。在另一个实施方案中，所形成的芳香族化合物是单取代的。在包含经取代的芳香族化合物的实施方案中，取代基团包括但不限于具有1至12个碳原子的支化或者直链烷基、具有1至12个碳原子的支化或者直链烃基、苯基和其任意组合。用于本发明的适宜芳香族化合物包括但不限于苯、甲苯、二甲苯、乙基苯、对二甲苯、间二甲苯和其任意组合。
本发明中产生的醇具有4至30个碳原子。在一些实施方案中，醇是环状的。在其他实施方案中，醇是支化的。在另一个实施方案中，醇是直链的。用于本发明的适宜醇包括但不限于丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、十二醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、十七醇、十八醇、十九醇、二十醇、二十一醇、二十二醇、二十三醇、二十四醇和其异构体。
本发明中产生的酮具有4至30个碳原子。在一些实施方案中，酮是环状的。在其他实施方案中，酮是支化的。在另一个实施方案中，酮是直链的。用于本发明的适宜酮包括但不限于于丁酮、戊酮、己酮、庚酮、辛酮、壬酮、癸酮、十一酮、十二酮、十三酮、十四酮、十五酮、十六酮、十七酮、十八酮、十九酮、二十酮、二十一酮、二十二酮、二十三酮、二十四酮和其异构体。
另一种这种化学修饰是酯交换作用。天然产生的甘油脂中脂肪酸成分分布不一致。对于油类，酯交换作用是指将不同甘油脂的两个酯基之间的酰基进行交换。转酯基过程提供了一种机制，其中甘油脂混合物中的脂肪酸成分可以重新排列，以对分布格局进行修饰。酯交换是熟知的化学过程，一般包括在催化剂(例如碱金属或者碱金属烷基化物(例如甲氧基钠))存在下将油类混合物加热(至大约200℃)一段时间。该过程可以用于使油类混合物中脂肪酸成分的分布格局随机化，或者可以指导产生期望的分布格局。可以对本文中提供的材料(例如脂类百分比(以细胞干重计算)为至少20％的微生物生物质)进行这种对脂类进行化学修饰的方法。
可以通过使油类混合物保持在可能发生熔化之一些TAGs的熔点以下的温度，来进行以脂肪酸的特定分布格局为目的的定向酯交换作用。这使得这些TAGs选择性结晶，随着TAGs结晶有效地从反应混合物中将其去除。该过程可以持续直至例如油中的大部分脂肪酸已经析出。定向酯交换作用可以用于例如通过用短链脂肪酸取代长链脂肪酸来生产具有较低卡路里含量的产品。定向酯交换作用还可以用于生产具有脂肪混合物的产品，所述脂肪混合物可以提供食品添加剂或者产品(例如人造黄油)中期望的熔化特性和结构性质，而无需进行可以产生不期望的反式异构体的氢化作用。
通过本文中描述的方法产生之油类的酯交换作用可以与一种或者多种方法和/或材料同时使用，或者用于生产产品，例如下列文献中所报道：美国专利第6,080,853号(不易消化之脂肪的替代品)、第4,288,378号(花生酱稳定剂)、第5,391,383号(食用喷淋油)、第6,022,577号(用于食品的食用脂肪)、第5,434,278号(用于食品的食用脂肪)、第5,268,192号(低卡路里的坚果产品)、第5,258,197号(卡路里减少的食用组合物)、第4,335,156号(食用脂肪产品)、第7,288,278号(食品添加剂或者药物)、第7,115,760号(分馏过程)、第6,808,737号(结构脂肪)、第5,888,947号(发动机润滑剂)、第5,686,131号(食用油混合物)和第4,603,188号(可治愈的尿烷组合物)。
根据本发明，在一个实施方案中，如上面所描述的油类转酯基作用后使经转酯基的产物与多元醇发生反应，如美国专利第6,465,642号中所报道，以产生多元醇脂肪酸多聚酯。这种酯化和分离过程可以包括下列步骤：在皂料存在下使低级烷基酯与多元醇反应、从产物混合物中去除剩余的皂料、对产物混合物进行水洗并使其干燥以去除杂质、将产物混合物预煮以用于提炼、将产物混合物中的多元醇脂肪酸多聚酯和至少一部分未反应的低级烷基酯分离开来和对经分离的未反应的低级烷基酯进行回收。
还可以对具有短链脂肪酸酯的微生物生物质进行转酯基作用，如美国专利6,278,006中所报道。一般来讲，可以通过在适宜催化剂存在下将短链脂肪酸酯加入到油中并对该混合物进行加热，来进行转酯基作用。在一些实施方案中，油类占反应混合物的至少5％至至少90％(以重量计算)。在一些实施方案中，短链脂肪酸酯可以是反应混合物的大约10％至大约50％(以重量计算)。催化剂的非限定性示例包括碱催化剂、甲氧基钠、酸催化剂(包括无机酸(例如硫酸和经酸化的粘土)、有机酸(例如甲磺酸、苯磺酸和甲苯磺酸)和酸性树脂(例如Amberlyst 15))。金属(例如钠和镁)和金属氢化物也是有用的催化剂。
另一种这种化学修饰是羟基化作用，其包括将水加入到双键中，以使其饱和并引入羟基基团。羟基化过程提供了将甘油脂的一个或者多个脂肪酸成分转化成为羟基脂肪酸的机制。例如可以通过美国专利第5,576,027号中报道的方法进行羟基化作用。经羟基化的脂肪酸，包括蓖麻油和其衍生物，可以用作几种工业应用(包括食品添加剂、表面活性剂、颜料润湿剂、防沫剂、耐水添加剂、增塑剂、美容乳化剂和/或除臭剂)以及电学、制药学、涂料、墨水、黏合剂和润滑剂中的组分。如何进行甘油酯的羟基化作用的一个示例如下：可以将脂肪与庚烷一起加热，优选至大约30-50℃，并在室温下保持30分钟或者更长时间；接着将醋酸加入到混合物中，随后加入硫酸水溶液，随后以较小增量在1小时内将过氧化氢水溶液加入到混合物中；加入过氧化氢水溶液后，接着将温度增加至至少大约60并搅拌至少6小时；搅拌后，使溶液静置，去除反应中形成的较低水层，而用温度为60℃的热水对反应中形成的上部庚烷层进行清洗；接着用氢氧化钾中和已清洗的庚烷层至pH值为大约5至7，并随后在真空中通过蒸馏将其去除；接着在真空下于100℃使反应产物干燥，已干燥的产物在真空条件下蒸汽除臭，并利用硅藻土于大约50℃至60℃进行过滤。
通过本文中描述的方法产生之微生物油类的羟基化作用可以与一种或者多种方法和/或材料同时使用，或者用于生产产品，例如下列文献中所报道：美国专利第6,590,113号(基于油的涂层和墨水)、第4,049,724号(羟基化过程)、第6,113,971号(橄榄油脂)、第4,992,189号(润滑剂和润滑油添加剂)、第5,576,027号(经羟基化的牛奶)和第6,869,597号(美容产品)。
经羟基化的甘油脂可以转化成为酸酐。酸酐包含甘油脂，在所述甘油脂中，经羟基化的脂肪酸成分酯化至另一个脂肪酸分子。可以通过对甘油脂和脂肪酸混合物进行加热并使该混合物与无机酸接触，来使经羟基化的甘油脂转化成为酸酐，如Isbell等，JAOCS 71(2):169-174(1994)中所描述。酸酐可以用于多种应用中，包括但不限于下列文献中所报道的应用：美国专利第7,196,124号(弹性体材料和楼面覆盖层)、第5,458,795号(用于高温应用中的厚油)、第5,451,332号(用于工业应用的液体)、第5,427,704号(燃料添加剂)和第5,380,894号(润滑剂、润滑脂、增塑剂和印刷油墨)。
可以对微生物油类进行的其他化学反应包括使甘油三酯与环丙烷化试剂反应以增加流动性和/或氧化稳定性，如美国专利第6,051,539号中所报道；从甘油三酯中生产蜡，如美国专利第6,770,104号中所报道；和甘油三酯的环氧化作用，如在"The effect of fatty acid composition on theacrylation kinetics of epoxidized triacylglycerols",Journal of the American OilChemists'Society,79:1,59-63,(2001)和Free Radical Biology and Medicine,37:1,104-114(2004)中所报道。
如上面所描述，用于燃料和化学产品之含油微生物生物质的产生使得能够产生脱脂生物质粉。脱脂粉是制备藻油中的副产物，其可以用作耕畜动物(例如反刍动物、家禽、猪和水产养殖动物)的饲料。得到的粉虽然其油类含量减少，但是仍然含有高质量的蛋白、碳水化合物、纤维、灰、残留油类和适用于动物饲料中的其他营养物质。由于通过油类分离过程使细胞绝大多数裂解，脱脂粉易于被这些动物消化。可选地，在动物饲料中，脱脂粉可以与其他成分结合，例如谷物。由于脱脂粉具有粉末状的稠度，可以利用市售的压出机或者扩张器或者另一种类型的机器挤压成丸状。
在下列实施例中对上面详细描述的本发明举例说明，其仅用于说明，并不对本发明的权项构成限制。
VII实施例
实施例1：培养原藻的方法
对原藻菌株进行培养，以产生高百分比(以细胞干重计算)的油类。使低温保藏的细胞于室温解冻，并将500μl细胞和2％葡萄糖加入到4.5ml培养基(4.2g/L K2HPO4、3.1g/L NaH2PO4、0.24g/L MgSO4·7H2O、0.25g/L柠檬酸一水化合物、0.025g/L CaCl2·2H2O、2g/L酵母提取物)中，并使细胞在6孔板中于28℃振荡(200rpm)生长7天。通过使培养物在预称重的Eppendorf管中于14,000rpm离心5min来测定细胞干重。弃去培养物上清液，用1ml去离子水清洗细胞沉淀。再将使培养物离心，弃去上清液，并将细胞沉淀置于-80℃直至冷冻。接着使样品冷冻干燥24小时并计算细胞干重。为了确定培养物中的总脂量，取出3ml培养物并利用Ankom系统(Ankom Inc.,Macedon,NY)根据厂商的说明进行分析。利用AmkomXT10萃取器根据厂商说明对样品进行溶剂萃取。以经酸水解的干燥样品与经溶剂萃取的干燥样品之间的质量差异确定总脂量。以细胞干重计算的油类百分比测定显示于表8中。
表8.以细胞干重计算的油类百分比
      
菌种 菌株 ％油类
Prototheca stagnora UTEX 327 13.14
Prototheca moriformis UTEX 1441 18.02
Prototheca moriformis UTEX 1435 27.17
对来源于上面表22中列出之菌株的微藻样品进行基因型测定。用下列方法从藻类生物质中分离基因组DNA。将液体培养物中的细胞(大约200mg)以14,000×g离心5分钟。接着在无菌蒸馏水中重悬细胞，以14,000×g离心5分钟并弃去上清液。将直径～2mm的单个玻璃珠加入到生物质中，并且试管于-80℃放置至少15分钟。移出样品，并加入150μl研磨缓冲液(1％肌氨酰、0.25M蔗糖、50mM NaCl、20mM EDTA、100mMTris-HCl(pH 8.0)、RNase A 0.5ug/ul)。通过简短振荡使沉淀重悬，随后加入40μl 5M NaCl。简短振荡样品，随后加入66μl 5％CTAB(溴代十六烷基三甲铵)并进行最后的简短振荡。接着使细胞于65℃孵育10分钟，其后以14,000×g离心10分钟。将上清液转移至新管中并用300μl 12:12:1的苯:氯仿:异戊醇萃取一次，随后以14,000×g离心5分钟。将得到的水相转移至含有0.7体积异丙醇(～190μl)的新管中，颠倒混合并于室温孵育30分钟或者于4℃过夜。通过以14,000×g离心10分钟回收DNA。接着得到的沉淀用70％乙醇清洗两次，随后用100％乙醇进行最后的清洗。将沉淀于室温风干20-30分钟，随后重悬于50μl 10mM TrisCl，1mM EDTA(pH 8.0)中。
将如上面所描述制备的5μl总藻类DNA在10mM Tris(pH8.0)中以1:50稀释。终体积为20μl的PCR反应设定如下。将10μl 2×iProof HF mastermix(BIO-RAD)加入到0.4μl引物SZ02613(5’-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3’(SEQ ID NO:9)，储存液浓度为10mM)中。该引物序列在Gen Bank登录号L43357中的567-588位点。L43357在高等植物和藻类质体基因组中高度保守。随后加入0.4μl引物SZ02615(5’-CAGTGAGCTATTACGCACTC-3’(SEQ ID NO:10)储存液浓度为10mM)。该引物序列与Gen Bank登录号L43357的1112-1093位互补，并且在在高等植物和藻类质体基因组中高度保守。接着加入5μl经稀释的总DNA和3.2μl dH2O。PCR反应运行如下：98℃，45”；98℃，8”；53℃，12”；72℃，20”进行35个循环，随后72℃1min并保存于25℃。为了纯化PCR产物，每个反应中加入20μl 10mM Tris(pH 8.0)，随后用40μl 12:12:1的苯:氯仿:异戊醇进行萃取，振荡并以14,000×g离心5分钟。在S-400柱(GE Healthcare)中进行PCR反应，并以3,000×g离心2分钟。随后将经纯化的PCR产物TOPO克隆成为PCR8/GW/TOPO，并在LB/Spec板上筛选阳性克隆。利用M13正向和反向引物对经纯化的质粒DNA进行双向测序。总共对12个原藻菌株进行筛选，对其23S rRNA DNA进行测序，这些序列列于序列表中。下面包括菌株和序列表序号的概览。对这些序列与UTEX 1435(SEQ IDNO:15)序列的总体差异进行分析。出现了两对差异最大的序列(UTEX329/UTEX 1533和UTEX 329/UTEX 1440)。在这两种情况下，成对比对的结果是75.0％的成对序列一致性。下面也包括与UTEX 1435的序列一致性百分比。
      
利用HPLC对上面所列菌株之子代的脂类样品进行脂类特性分析。结果显示于下面表9中。
表9.微藻菌种中脂链的多样性
      
      
如下实施例12和实施例11中所描述，通过对UTEX 1435(Protothecamoriformis)或者UTEX 250(原壳小球藻)cDNA文库进行分析，鉴定出藻类质体转运肽。利用软件程序PSORT(http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html)、ChloroP(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)和TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)。对编码与其他已知质体靶蛋白同源之潜在质体靶蛋白(基于BLAST命中)的cDNAs进行进一步分析。接着从合适的基因组DNA中对通过这三种程序的至少一种鉴定出的候选质体转运肽进行PCR扩增。下面是从该筛选中鉴定出之藻类质体靶向序列(PTS)的氨基酸序列概览。还包括下面异源表达实施例中使用之植物脂肪酰基-ACP硫酯酶的氨基酸序列。
      
实施例2：在多种给料中培养原藻
A.高粱
下列菌株显示能够利用高粱作为唯一碳源：Prototheca moriformis菌株UTEX 1435、UTEX 1437、UTEX 288、UTEX 1439、UTEX 1441和UTEX1434以及Prototheca stagnora菌株UTEX 1442。“UTEX”命名显示theUniversity of Texas,1 University State A6700,Austin,Texas 78712-0183藻类培养物保藏中心的菌株号。
纯高粱购自Maasdam Sorghum Mills(Lynnville,Iowa)，其具有21.0％w/w果糖、28.0％w/w右旋糖、16.0％w/w蔗糖和<0.5％w/w麦芽糖的糖类谱。培养物在含有2％、5％或者7％(v/v)纯高粱(从纯储存液稀释)作为唯一碳源的液体培养基中生长，并且培养物在黑暗中以～350rpm振荡异养生长。在24、40、48、67和89小时从培养基中取样，并利用分光光度计的A750读值测定生长情况。如图1-2所显示，对于每一个受试菌株均观察到生长。
B.纤维素
湿的并经汽爆的玉米秸秆、芒草、饲用高粱、甜菜和甘蔗渣由TheNational Renewable Energy Laboratory(Golden,CO)通过在1.4％硫酸溶液中煮并使得到的浆液脱水来制备。经干燥后测定固体百分比，其结果如下：玉米秸秆，25％固体；芒草，28.7％固体；饲用高粱，26.7％固体和甘蔗渣，26％固体。
经汽爆的纤维素类物质(玉米秸秆或者柳枝稷)重悬于去离子水中至终体积为420mL，并用10N NaOH将pH值调至4.8。对于甜菜，将9.8克干固体用去离子水加至350mL，并用10N NaOH将pH值调至4.8。对于所有上述给料，利用Accellerase 1000(Genencor,New York)以每克干生物质0.25mL酶的比率使纤维素类物质糖基化。样品于50℃振荡(110rpm)孵育72小时。用NaOH(体积变化可以忽略)将每个样品的pH值调至7.0，通过0.22m过滤器过滤除菌，并用于下面详细描述的过程中。对于大规模过程，按照与糖基化相同的步骤进行，除了进行额外的正切流动过滤(TFF)或者微孔过滤步骤以辅助对给料进行过滤除菌。从制备的每种给料中保留一份样品，利用基于HPLC/ELSD的系统或者基于己糖激酶的试剂盒(Sigma)测定葡萄糖和木糖浓度。此外，对于甜菜，最初将该材料加至与其他给料相同的体积，接着将pH值调至4.0，并于50℃用果胶酶处理24小时。将pH值调至4.8(如果没有清洗步骤)或者5.3(如果进行清洗步骤)。接着用与如上面所描述用于其他给料的相同步骤进行酶促糖基化。
对微藻Prototheca moriformis菌株UTEX 1435在如上面所描述制备的一系列纤维素类物质(玉米秸秆、甜菜、甘蔗、芒草和葡萄糖对照)中生长的能力进行评估。微藻培养物在如上面实施例1中描述的条件中生长，除了碳源与其不同。碳源或者是4％葡萄糖(对照条件)或者是由纤维素类物质中可用的葡萄糖测定的4％葡萄糖。通过A750读值评估生长情况，培养时间是168小时，培养开始后48、72、96、120、144和168小时测定A750读值。如图7a中所见，Prototheca moriformis培养物在玉米秸秆中生长最好。所使用的所有其他纤维素类物质均显示抑制生长。
基于上面玉米秸秆来源的纤维素糖类得到的结果，还利用不同水平的玉米秸秆来源之纤维素糖类并以试剂级葡萄糖作为对照对Protothecamoriformis中的脂类积累进行评估。培养物生长于完全来源于玉米秸秆来源之纤维素糖类的18g/L葡萄糖(图7b中100％玉米秸秆的条件)、来源于玉米秸秆来源之纤维素糖类的9g/L葡萄糖加9g/L试剂级葡萄糖(图7b中50％玉米秸秆加葡萄糖至18g/L的条件)、来源于玉米秸秆来源之纤维素糖类的9g/L葡萄糖(50％玉米秸秆，未添加其他；图7b中9g/L葡萄糖的条件)以及含有42g/L试剂级葡萄糖和13g/L试剂级木糖(作为同渗容摩对照)的对照培养基中。除了对对照培养物供给试剂级葡萄糖以使葡萄糖浓度保持在20g/L之外，对所有培养物供给纤维素糖类以使葡萄糖浓度保持在20g/L。基于培养物的细胞干重测定生长情况，并且以细胞干重百分比测定脂类产量。利用如上面实施例1中描述的Ankom酸水解/溶剂萃取系统测定总脂重量。
如图7b中所见，基于生物质的积累(通过DCW测定)，所有浓度的玉米秸秆来源之纤维素表现均优于(DCW较高)仅供给葡萄糖的对照培养物。还对所有条件下脂类的产生(DCW百分比)进行计算。除了在生长于玉米秸秆中观察到较高的生物质积累之外，与葡萄糖对照条件相比，在玉米秸秆来源之纤维素条件中的脂类积累也较高。这些数据表明，除了提供纤维素来源的糖类外，玉米秸秆还提供有助于增加生物质积累和增加产率的额外营养物质/组分。
由于纤维素给料含有除葡萄糖之外的其他组分，在培养过程中随着主要碳源(通常但不限于葡萄糖)被消耗，更多纤维素来源的糖类供给到培养基中，这些额外组分中的一些会积累至不期望的水平。例如，在微藻高密度培养过程中，存在于纤维素来源之糖类给料中的木糖会积累至抑制生长和终产物产生的水平。为了测试原藻培养过程中木糖积累的影响，培养物生长于含有4％葡萄糖的培养基中，并添加0、10g/L、25g/L、50g/L和100g/L木糖。培养6天后，利用上面描述的方法评估生长和脂类积累情况。如图7c中所见，令人惊奇的是，受试的木糖最高浓度不会抑制Protothecamoriformis生长和积累脂类的能力，实际上培养物在最高木糖浓度中生长较好并且积累较多脂类。为了研究这种现象，用野生型Protothecamoriformis不能代谢的蔗糖进行类似实验。用蔗糖时没有观察到阳性影响，表明用木糖时观察到的生长和脂类积累增加不是由于培养基中高浓度之未代谢组分的渗透压机制，而是木糖特异性机制。
除了未代谢的糖类之外，由于对木质纤维素来源的糖类进行浓缩，盐类可以积累至抑制水平。由于在通常制备纤维素类物质的过程中用H2SO4进行酸水解步骤并随后用NaOH中和酸，因此在生产木质纤维素糖类时会形成Na2SO4。为了评估盐浓度对生长和脂类产生的影响，Protothecamoriformis培养物生长于Na2SO4浓度范围为0-700mM且添加了4％葡萄糖的培养基中。如图7d所显示，通过DCW积累所测定，当Na2SO4浓度超过25mM具体地是80mM、240mM和700mM时观察到显著抑制生长。此外，在同一测试中对防沫剂P2000的影响进行评估。防沫剂化合物对生物质产量具有显著的阳性影响。还对每种条件下的脂类产量进行评估，Na2SO4浓度高于80mM具体地是80mM、240mM和700mM时是抑制性的，而加入防沫剂P2000使脂类产量显著增加。因此，在一个实施方案中，本发明之方法的培养步骤包括培养于含有防沫剂的培养基中。
基于上面讨论并且在图7a中总结的结果，纤维素给料中很可能存在抑制物，显示出生长缓慢。本发明提供了通过用热水清洗材料(热水处理)去除这些化合物的方法。图8总结了利用经过一次热水清洗的来源于纤维素给料之糖类通过A750测得的生长结果。培养条件与图7a总结的过程中使用的条件相同。与图7a中显示的结果相比，经过仅一次热水清洗后，Prototheca moriformis培养物在所有受试纤维素给料中均生长较好，特别是甘蔗渣、高粱蔗、芒草和甜菜(与葡萄糖对照相比)。还对每种条件中的脂类产量进行评估。除了与葡萄糖对照相当的甜菜之外，生长于经过一次热水清洗的来源于纤维素给料之糖类中的培养物与葡萄糖对照相比显示脂类产量较好。
对纤维素类生物质热水处理(热水清洗)的一个潜在影响是去除了材料酸汽爆中释放的糠醛和羟甲基糠醛。糠醛和羟甲基糠醛的存在可能是导致在图7a中总结的一些过程中观察到之生长受限的原因。为了评估热水处理如何影响糠醛(FA)和羟甲基糠醛(HMF)的水平，通过HPLC对来源于甘蔗渣(B)、高粱蔗(S)、芒草(M)和甜菜(BP)的纤维素类生物质进行1次或者3次清洗后得到之上清液中的FA和HMF进行测定。如图8中所显示，每次清洗步骤后FA和HMF水平显著降低。该结果与发现FA和HFM可以抑制微藻生长(如图7a中所见)和发现热水处理能够去除这些化合物并且能够促进微藻生长，甚至比在对照葡萄糖条件中生长更好(如图8中所见)的结果一致。
对生长于多种经热水处理的木质纤维素来源之糖类中的Protothecamoriformis培养物脂类特性的影响进行评估。Prototheca moriformis培养物生长于下列经4次清洗的纤维素给料中：芒草、甘蔗渣和高粱蔗，其中通过供给纤维素糖类使葡萄糖水平保持在20g/L。培养结束时，利用实施例1中描述的方法对每种条件下微藻生物质中的脂类特性进行分析。脂类特性分析的结果(以面积％表示)总结于下面表10中。每种条件测试两次，每两次测试条件的结果均包括在内。与葡萄糖对照相比，生长于纤维素给料中使得脂类特性显著地重新分布。例如，与葡萄糖对照条件相比，所有纤维素给料条件中的C18:0面积％均显著增加。
表10.生长于葡萄糖和纤维素来源的糖类中的Prototheca moriformis脂类特性。
      
      
从经汽爆的玉米秸秆中产生纤维素糖流，并利用Accellerase酶使其糖基化，并利用真空蒸发器使其浓缩。在4％葡萄糖浓度的Protothecamoriformis生长测定中对该糖流进行测试。生长测定结果显示生长非常缓慢，并对纤维素糖流的传导性(盐类含量)进行测试。传导性非常高，远远高于700mM钠等价物，显示其水平抑制生长(如上面所描述且图7d中所显示)。本发明的方法包括在木质纤维素来源之微藻油的生产过程中在利用这些给料之前使木质纤维素来源之糖类中的盐类减少或者将其去除的方法。令人惊奇的是，然而不能利用树脂使经浓缩的糖流脱盐，必须首先将经浓缩的糖流稀释。为了描述本发明的该实施方案，在用树脂去除杂质盐类之前，将来源于玉米秸秆材料的纤维素糖类稀释8倍。经浓缩之起始材料的初始传导性是87mS/cm，而经8倍稀释之糖流在pH值为5.61时的传导性是10990μS/cm。先前的研究已经表明去离子化之前没有使经浓缩的糖流稀释使得不能定量去除盐类并且葡萄糖从糖流中大量流失。使用3种不同床体积的IEX树脂(DOWEX Marathon MR3)(1:2、1:4和1:10)。表11总结了显示混合床离子交换(IEX)树脂能够使经稀释的给料中先前经浓缩的玉米秸秆来源之纤维素糖流中的盐类显著减少(通过传导性所测定)的结果。
表11. IEX树脂使盐类减少的能力
      
利用1:4的床体积:纤维素给料的过程和使材料浓缩8倍使得产生钠浓度处于产生正常生物质和脂类积累的范围内。可选地，可以在糖基化之前或者糖基化之后但是在糖流浓缩之前进行去离子化或者去除盐类。如果在糖流浓缩之前去除盐类，在去除盐类之前可能没有必要进行糖流稀释步骤。
该实施例描述了用于纤维素油类生产的经汽爆之纤维素类物质的清洗效率。如上面所描述，使纤维素来源的糖类浓缩而不去除盐类(经汽爆的纤维素类物质生产和随后处理过程中固有的)使得少于最佳发酵。在下面描述的过程中处理的材料具有适用于随后糖基化作用的pH值。此外，该材料的传导性比起始给料显著减少(超过100倍)。因此，由于存在过量盐类，随后用于发酵的经浓缩之糖类是非抑制性的。从纤维素类物质中去除糠醛具有额外优势。半纤维素组分中去除的任何木糖或者葡萄糖可以或者被丢弃或者优选再浓缩用于发酵中。
最初起始质量为65kg湿重、传导性为15,000μS/cm、pH值为2.4的经汽爆之湿甘蔗渣用去离子水加至128kg，并用10N NaOH将pH调至4.6，使得到的传导性为6,800μS/cm。通过下列方法对固体百分比进行测定：将一部分悬液材料移至配平(重量＝t)铝盘中，记录湿重(重量＝w)，随后于110℃干燥3小时，干燥中的样品移至干燥器并使其处于室温中(25℃)后，此时对其再次称重(重量＝d)。固体百分比计算如下：％固体＝[(d-t/w-t)]×100。在Thermo Electron Orion 3Star Conductivity仪表上测定传导性。
通过在不锈钢容器(150L容量)中在50℃的温度下不断使纤维素浆液(初始固体百分比为8.2％)混合，以半连续性方式对甘蔗渣进行清洗。通过旋转负荷泵将纤维素从反应器中以1.9-3.8kg/min的流速排出至Sharples Model 600沉降式离心机中。分批保留液体透过物(大约35-175kg，见下面表12)，并吸取同质物用于测定如表12中所描述的总糖量(葡萄糖和木糖)和固体百分比。通过加入去离子水和10N NaOH分别控制纤维素类物质的传导性和pH值。表12中的样品1-10代表沉降离心的透出物，并且从最后经清洗的纤维素类物质中去除这些组分中存在的固体和糖类。通过用除去的固体减去流失的固体加上最后用于糖基化的固体进行总固体的质量平衡计算，得出上述过程中的回收率为99％。图8总结了收集并描述于表12中之11种离心透出物中每种的糠醛和羟甲基糠醛浓度(mg/L)。这些数据清楚地显示从甘蔗渣中去除了糠醛和羟甲基糠醛。
表12.甘蔗渣经半连续性热水处理的质量平衡计算。
      
在原藻利用纤维素来源之给料的能力的另一个阐述中，Protothecamoriformis(UTEX 1435)培养于3升的生物反应器中并利用纤维素来源的糖类作为固定碳给料。从低温保藏的细胞中制备接种物，所述细胞于室温解冻，并将1mL细胞加入到基于实施例1中描述的微藻基础培养基并含有1g/L(NH4)2SO4、4g/L酵母提取物和微量元素溶液以及4％葡萄糖的300mL接种培养基中，并于28℃振荡(200rpm)生长1天。将该培养物接种到含有1L培养基以及0.26mL Antifoam 204(Sigma,USA)的3L生物反应器中。将发酵罐控制在28℃并通过加入KOH使pH值保持在6.8。通过级联振荡和空气流动使溶解氧保持在30％的饱和度。用来源于玉米秸秆的纤维素糖类给料供给培养物，以保持0-10/L的葡萄糖。使纤维素糖类给料脱盐至少于300mM盐类对于确保其与经纯化的糖类给料对照相比表现出类似的细胞干重和脂类积累十分重要。利用上面描述的方法使纤维素糖类给料脱盐。吸取发酵罐样品，以监测发酵情况。通过光密度和细胞干重监测细胞质积累。在整个发酵期间还对葡萄糖、木糖、氨、钾、钠和糠醛浓度进行测定和监测。通过上面讨论的重量测定方法确定脂类浓度。
实施例3：转化原藻的方法
A.基因枪转化原藻的一般方法
根据厂商说明制备SeaShell Technology的S550d金载体。使线性化质粒(20μg)与50μl结合缓冲液以及60μl(30mg)S550d金载体混合，并于冰上孵育1min。加入沉淀缓冲液(100μl)，并将混合物于冰上再孵育1min。振荡后，通过在Eppendorf 5415C微量离心管中以10,000rpm旋转10秒钟，使包裹DNA的颗粒沉淀。用500μl冰冻100％乙醇清洗金沉淀物一次，在微量管中简短旋转使其沉淀，并用50μl冰冻乙醇重悬。简短(1-2秒)超声后，立刻将10μl包裹DNA的颗粒转移至载体膜上。
原藻菌株在回转振荡器中生长于朊间质培养基(2g/L酵母提取物、2.94mM NaNO3、0.17mM CaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.4mMK2HPO4、1.28mM KH2PO4、0.43mM NaCl)中直至其细胞密度达到2×106细胞/ml。收集细胞，用无菌蒸馏水清洗一次，并重悬于50μl培养基中。将1×107个细胞涂于非选择性朊间质培养板的中间三分之一区域。用PDS-1000/He Biolistic Particle Delivery系统(Bio-Rad)轰击细胞。使用爆破片(1100和1350psi)，并将板置于屏/巨载体配件的下面9和12cm处。使细胞于25℃复苏12-24h。复苏后，用橡皮刮从板上将细胞刮下，与100培养基混合，并涂于含有合适抗生素筛选的板上。于25孵育7-10天后，在1100和1350psi爆破片上和9和12cm距离的板上可以看到代表细胞被转化的菌落。挑取菌落，并点样于选择性琼脂板上进行第二轮筛选。
B.用G418抗性基因转化原藻
可以利用下面描述的方法对Prototheca moriformis和其他对G418敏感的原藻菌株进行转化。G418是抑制80S核糖体功能从而抑制蛋白合成的氨基糖苷类抗生素。其对应的抗性基因通过磷酸化发挥功能，使得G418失活。选择原藻菌株UTEX 1435、UTEX 1439和UTEX 1437进行转化。利用上面描述的方法测定所有3个原藻菌株的基因型。所有3个原藻菌株具有相同的23S rRNA基因组序列(SEQ ID NO:15)。
所有转化盒均以EcoRI-SacI片段克隆到pUC19中。在所有载体的构建中使用标准的分子生物学技术(按照Sambrook和Russell，2001)。通过PCR从pHyg3质粒(Berthold等，(2002)Protist:153(4),pp 401-412)中获得EcoRI-AscI片段形式的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR。通过PCR从分离自UTEX菌株1803的基因组DNA中获得普通小球藻硝酸还原酶3’UTR，其中利用下列引物对：
正向：
5’TGACCTAGGTGATTAATTAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCG 3’(SEQ ID NO:35)
反向：
5’CTACGAGCTCAAGCTTTCCATTTGTGTTC CCATCCCACTACTTCC3’(SEQ ID NO:36)
通过对分离自UTEX菌株1230的基因组DNA进行PCR获得Chlorellasorokiniana谷氨酸脱氢酶启动子/UTR，其中利用下列引物对：
正向：5’GATCAGAATTCCGCCTGCAACGCAAGG GCAGC 3’(SEQ IDNO:37)
反向：5’G催化剂CTAGTGGCGGGACGGAGAGA GGGCG 3’(SEQ IDNO:38)
基于表1中Prototheca moriformis的密码子进行密码子优化。以AscI-XhoI片段形式合成未经密码子优化之新霉素磷酸转移酶(nphII)表达盒的序列，其基于GenBank登录号YP_788126的序列。经密码子优化的nptII表达盒也是基于GenBank登录号。
利用上面描述的基因枪方法对3个原藻菌株进行转化。简单地讲，原藻菌株异养生长于含有2％葡萄糖的液体培养基中，直至其达到期望的细胞密度(1×107个细胞/mL至5×107个细胞/mL)。收集细胞，用无菌蒸馏水清洗一次，并重悬至1×108个细胞/mL。接着将0.5mL细胞涂于非选择性固体培养板上，并在无菌罩中使其干燥。用PDS-1000/He Biolistic ParticleDelivery系统(Bio-Rad)轰击细胞。使细胞于25℃复苏24h。复苏后，通过用1mL无菌培养基清洗板将细胞移去，并转移至含有100μg/mL G418的新鲜板上。在无菌罩中使细胞干燥，并于室温使克隆形成于板上至3周。挑取UTEX 1435、UTEX 1439和UTEX 1437菌落，并点样于选择性琼脂板上进行第二轮筛选。
小体积培养在上面描述的第二轮筛选中存活之菌落的子代，并利用标准的分子生物学方法提取基因组DNA和RNA。对从未经转化的菌株(WT)、转化子和质粒DNA中提取的基因组DNA进行Southern印迹。经过下列处理后，每个样品的DNA在0.8％琼脂糖凝胶上跑胶：经消化(U)、用AvrII消化(A)、用NcoI消化(N)、用SacI消化(S)。使这些胶中的DNA在尼龙膜(Amersham)上印迹。用对应于nptII基因整个编码区的片段(NeoR探针)与这些膜杂交。图4显示转化中使用的表达盒图谱。图5显示用β-微管蛋白::neo::nit(SEQ ID NO:39)(转化子1和2)或者谷氨酸脱氢酶:neo:nit(SEQ ID NO:40)进行转化之(转化子3)3个转化子(所有均在UTEX菌株1435中产生)(1、2和3)的Southern印迹分析结果。用谷氨酸脱氢酶:neo:nit转化质粒作为对照，并同时用NcoI和SacI进行酶切。AvrII不能酶切该质粒。从未经转化的UTEX菌株1435中分离的基因组DNA显示不能与NeoR探针杂交。
挑取含有经密码子优化之谷氨酸脱氢酶:neo:nit(SEQ ID NO:41)质粒和经密码子优化之β-微管蛋白:neo:nit(SEQ ID NO:32)质粒的额外的转化子，并通过Southern印迹分析进行分析。如所预期，只有用SacI消化时显示转化DNA的线性化。这些转化事件与转化质粒寡聚体形成中发生的整合事件一致。只有用对转化质粒DNA内部进行酶切的限制性酶进行消化，这些分子才能使转化质粒分解。
还对用谷氨酸脱氢酶::neo::nit表达盒转化原藻菌株UTEX 1437和UTEX 1439产生的转化子进行Southern印迹分析。印迹与NeoR探针杂交，结果与UTEX 1435转化子类似。结果显示发生以转化质粒寡聚化和整合为特征的整合事件。已知在Dictyostelium discoideum中这种整合事件非常普遍(参见例如Kuspa,A.和Loomis,W.(1992)PNAS,89:8803-8807以及Morio等，(1995)J.Plant Res.108:111-114)。
为了进一步证实转化质粒的表达，对所筛选的转化子进行Northern印迹分析和RT-PCR分析。利用Trizol试剂按照厂商说明进行RNA提取。按照Sambrook和Russel 2001年公开的方法进行Northern印迹分析。在1％琼脂糖-甲醛凝胶上使从5个UTEX 1435转化子和未经转化的UTEX 1435(对照泳道)中分离的总RNA分离开来，并印迹于尼龙膜上。使印迹与neo未经优化的探针杂交，所述探针是转化子1和3中转基因序列特异性的。另外两个转化子RNA表达经密码子优化的neo-转基因，如所预期，基于经优化和未经优化的neo基因之间的序列同源性，其显示出明显较低的杂交信号。
从未经转化的原藻菌株UTEX 1435和两个代表性UTEX 1435转化子中提取RNA(1μg)，并利用寡聚dT引物或者基因特异性引物进行逆转录。随后在ABI Verti Thermocycler上利用SYBR-Green qPCR化学法对这些cDNA(一式两份)进行qPCR分析，其中利用下列引物(nptII)：
正向：5’GCCGCGACTGGCTGCTGCTGG 3’(SEQ ID NO:43)
反向：5’AGGTCCTCGCCGTCGGGCATG 3’(SEQ ID NO:44)
通过无逆转录酶的对照样品将可能的基因组DNA污染排除。结果表明，用于转化这些菌株的NeoR基因在转化子中具有转录活性。
C.用分泌的异源蔗糖转化酶转化原藻
所有下列实验均利用基于Ueno等(2002)J Bioscience andBioengineering 94(2):160-65中描述之基础培养基的液体培养基/琼脂板进行，其中加入了美国专利第5,900,370中描述的微量矿物质以及1×DASVitamin Cocktai(1000×溶液：9g三甲基甘氨酸、0.67g盐酸硫胺、0.01g生物素、0.008g钴胺素(维他命B12)、0.02g泛酸钙和0.04g p-氨基苯甲酸)。
利用标准的重组DNA技术构建两个质粒。酵母蔗糖转化酶基因(一个经密码子优化，另一个未经密码子优化)suc2处于莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR的控制下并且具有普通小球藻硝酸还原酶3’UTR。未经密码子优化的(Crβ-tub::NCO-suc2::CvNitRed)质粒序列SEQ ID NO:57和经密码子优化的(Crβ-tub::CO-suc2::CvNitRed)质粒序列SEQ ID NO:58(包括5’UTR和3’UTR序列)列于序列表中。密码子优化基于表1中的原藻菌种。图6显示两个质粒的图解，其中含有相关的限制性克隆位点，箭头表示转录方向。由Neo R(利用表1进行密码子优化)提供筛选标记。
DNA/金微载体的制备：使用前即刻制备DNA/金微载体，并储存于冰上直至应用于巨载体中。将质粒DNA(在TE缓冲液中)加入到50μl结合缓冲液中。对于3mg金载体加入15μg质粒DNA使金珠达到饱和。通过振荡使结合缓冲液和DNA彻底混合。应当在加入金之间使DNA和结合缓冲液预混合，以确保质粒与金载体颗粒均匀结合。将60μl S550d(SeashellTechnologies,San Diego,CA)金载体加入到DNA/结合缓冲液混合物中。对于50mg/ml的金储存液，加入60μl可以获/得15μg质粒DNA/3mg金载体的最佳比率。使金载体/DNA混合物于冰上孵育1分钟，接着加入100μl沉淀缓冲液。使混合物再次于冰上孵育1分钟，接着简短振荡，并于室温以10,000rpm离心10秒，以使金载体沉淀。用移液器仔细移去上清液，并用500μl冰冻100％乙醇清洗沉淀。通过再次以10,000rpm离心10秒使金颗粒再次沉淀。移去乙醇，并将50μl冰冷乙醇加入到金混合物中。将金应用于巨载体之前，在MISONIX超声发生器中利用微型机头以第2水平进行1-2秒的简短脉冲，使金/乙醇重悬。重悬后即刻将10μl分散的金颗粒转移至巨载体上，并在无菌罩中使其干燥。
低温保藏瓶中的两个Prototheca moriformis菌株(UTEX 1435和1441)异养生长于含有2％葡萄糖的液体培养基中。每个菌株生长至密度为107个细胞/ml。接着用新鲜培养基将该种子培养物稀释至密度为105个细胞/ml并使其生长12-15小时，以使终细胞密度达到大约106个细胞/ml。将这些微藻等分到50ml圆锥管中，并以3500rpm离心10分钟。用新鲜培养基清洗细胞，并再次以3500rpm离心10分钟。接着在新鲜培养基中以1.25×108个细胞/ml的密度使细胞重悬。
在无菌罩中，取出0.4ml上面制备的细胞，并直接置于琼脂板(无筛选试剂)中央。以水平圆形运动缓慢地旋转该板，以使细胞均匀地分布在直径不大于3cm的区域内。在无菌罩中使细胞在板上干燥大约30-40分钟，接着在1350psi的爆破片压力下和板至巨载体的距离为6cm时轰击细胞。接着将板盖好，用封口膜缠绕并在弱光下孵育24小时。
复苏24小时后，将1ml无菌培养基(无葡萄糖)加入到细胞菌苔中。利用无菌环对细胞菌苔作圆形运动，使细胞重悬，并利用无菌移液器收集重悬的细胞。接着将细胞置于含有2％葡萄糖和100μg/ml G418的新鲜琼脂板上。放置后7-12天出现菌落。挑取单个菌落，并使其生长于含有2％葡萄糖和100μg/ml G418的选择性培养基中。接着对野生型(未经转化)和转基因细胞的成功引入、整合和表达进行分析。
利用标准方法分离经转化之Prototheca moriformis UTEX 1435和1441以及其野生型(未经转化)菌株的基因组DNA。简单地讲，细胞在标准的桌面Eppendorf离心机(型号5418)中以14,000rpm离心5分钟，并在提取DNA前快速冷冻。通过对于每100-200mg细胞(湿重)加入200μL裂解缓冲液(100mM Tris HCl(pH 8.0)、1％十二烷基肌氨酸、50mM NaCl、20mM EDTA、0.25M蔗糖、0.5mg/ml RNase A)并振荡30-60秒，使细胞沉淀裂解。使溴代十六烷基三甲铵(CTAB)和NaCl分别成为1％和1M，并使细胞提取物于60-65℃孵育10分钟。随后通过以14,000rpm离心10分钟使提取物分层，并用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)萃取上清液。接着样品以14,000rpm离心5分钟，并移去水相。用0.7体积的异丙醇使DNA析出。通过以14,000rpm离心10分钟使DNA沉淀，并用80％乙醇清洗2次，用乙醇清洗1次。干燥后，DNA重悬于10mM Tris HCl(pH8.0)中，并利用PicoGreen荧光定量试验(Molecular Probes)测定DNA浓度。
利用标准方法分离经转化之Prototheca moriformis UTEX 1435和1441以及其野生型(未经转化)菌株的RNA。简单地讲，细胞在标准的桌面Eppendorf离心机(型号5418)中以14,000rpm离心5分钟，并在提取RNA前快速冷冻。通过对于每100mg细胞(湿重)加入1mL Trizol试剂(Sigma)并振荡1-2分钟，使细胞沉淀裂解。样品于室温孵育5分钟，并随后以每1mL Trizol试剂加入200μL氯仿进行处理。充分摇动后，细胞于室温孵育15分钟，接着在冷冻桌面微型离心机中以14000rpm离心15分钟。取出上层水相中的RNA，并通过加入异丙醇(每1ml Trizol试剂加入500μL)使其析出。通过离心10分钟收集RNA，并得到的沉淀用1mL 80％乙醇清洗2次、干燥并重悬于无RNAse的水中。通过RiboGreen荧光定量试验(Molecular Probes)测定RNA浓度。
利用逆转录定量PCR分析(RT-qPCR)对未经转化的Protothecamoriformis UTEX 1435和1441以及转化子T98(UTEX 1435转化子)和T97(UTEX 1441转化子)中赋予G418抗性之新霉素磷酸转移酶基因和酵母转化酶的表达进行检测。利用iScript SYBR Green RT-PCR试剂盒(BioRad Laboratories)以及靶向新霉素抗性基因的引物对(正向引物：5’CCGCCGTGCTGGACGTGGTG 3’和反向引物5’GGTGGCGGGGTCCAGGGTGT 3’；分别是SEQ ID NO:65和66)和suc2转化酶转录子的引物对(正向引物：5’CGGCCGGCGGCTCCTTCAAC 3’和反向引物5’GGCGCTCCCGTAGGTCGGGT 3’；分别是SEQ ID NO:67和68)对20ng总RNA(如上面所描述而分离)进行一步式RT-qPCR分析。用内源β-微管蛋白转录子作为PCR扩增的内部阳性对照以及评估相对转录水平的标准参考。
如上面所描述将经密码子优化和未经密码子优化的质粒转化到UTEX1435和1441Prototheca moriformis细胞中。最初获得两种质粒的转化子，并通过Southern印迹分析证实存在转基因，随后通过RTPCR证实存在转基因的DNA和mRNA。对于Southern印迹分析，如上面所描述分离基因组DNA，并使其在1×TAE缓冲液中进行0.7％琼脂糖凝胶电泳。如Sambrook等(Molecular Cloning；A Laboratory Manual,2nd Edition.Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所描述对凝胶进行加工。通过如Sambrook等所描述进行随机引物选择和杂交，来制备探针。经密码子优化和未经密码子优化之质粒的转化子显示存在转化酶表达盒，而未经转化的对照显示阴性结果。还对经密码子优化和未经密码子优化之质粒的转化子中的转化酶mRNA进行检测。
为了证实转化子能够表达活性转化酶蛋白，将转化子置于蔗糖板上。含有未经密码子优化之表达盒的转化子不能在含有蔗糖的板上生长，表明当存在编码SUC2蛋白的基因和mRNA时，蛋白或者(1)不被翻译，或者(2)被翻译，但是不能积累至足以使在蔗糖作为唯一碳源中生长的水平。具有经密码子优化之表达盒的转化子能够在含有蔗糖的板上生长。为了测定由这些转化子表达的转化酶水平，对两个克隆(T98和T97)进行全细胞转化酶试验，其中从固体培养基上刮下细胞，直接取样，并使其在含有2％蔗糖作为唯一碳源的液体培养基中生长48小时后对培养基上清液中的糖类进行定量。
对于转化酶试验，细胞(T98和T97)在含有2％蔗糖的板上生长，将其刮下并测定转化酶活性。将10μl刮下的细胞与40μl 50mM NaOAc(pH5.1)混合。将12.5μl 0.5M蔗糖加入细胞混合物中，并于37℃孵育10-30分钟。为了终止反应，加入75μl 0.2M K2HPO4。为了测定所释放的葡萄糖，每管中加入50μl再生试剂(葡萄糖氧化酶/过氧化酶+o-邻联茴香胺)(Sigma，GAGO-20测定试剂盒)，并于37℃孵育30分钟。还在该时间创建葡萄糖标准曲线(范围：25μg至0.3μg葡萄糖)。孵育后，加入500μl 6NHCl使反应终止并显色。在540nm下对样品进行读值。利用公式y＝mx+c根据葡萄糖标准曲线计算所释放的葡萄糖量，其中y是540nm的读值，x是葡萄糖μg量。将葡萄糖的重量转化成为葡萄糖的摩尔数，由于水解的蔗糖摩尔数和产生的葡萄糖摩尔数之间具有等摩尔关系，因此数据以单位时间内水解的蔗糖摩尔数表示。试验显示T98和T97克隆均能够使蔗糖水解，表明细胞产生并分泌了功能性蔗糖转化酶。
对于藻类生长48小时后液体培养基中的糖类分析，T97和T98细胞在含有2％蔗糖的培养基中生长48小时，并对培养基进行糖类分析。使每个转化子(和未转化细胞的阴性对照)的肉汤培养物以14,000rpm离心5分钟。取出得到的上清液并进行HPLC/ELSD(蒸发光散射检测)。利用外标法和线性回归分析测定每个样品中的糖量。转化子培养基中的蔗糖水平非常低(小于1.2g/L，大多数情况下是0g/L)。在阴性对照中，蔗糖水平保持很高，生长48小时后大约为19g/L。
这些结果与转化酶活性结果一致，总之表明经密码子优化的转化子T97和T98能够分泌使微藻利用蔗糖作为唯一碳源的活性蔗糖转化酶，这与(1)未经密码子优化的转化子和(2)未转化的野生型微藻相反，二者不能利用培养基中作为唯一碳源的蔗糖。
对表达功能性分泌型蔗糖转化酶(SUC2)转基因的Protothecamoriformis菌株T98和T97利用蔗糖作为唯一碳源的生长和脂类生产情况进行测定。
野生型(未经转化)、T98和T97在异养条件下在含有4％葡萄糖或者4％蔗糖作为唯一碳源的生长培养基(如上面所描述)中生长大约6天。每24小时通过A750光密度读数获取所有4个样品的生长情况，并在生长6天后测定培养物的细胞干重和脂类特性。生长于葡萄糖和蔗糖条件中之转基因菌株的光密度读数与生长于葡萄糖条件中的野生型菌株相当。这些结果表明转基因菌株能够以与在葡萄糖条件中的野生型菌株相同的速度在葡萄糖或者蔗糖作为唯一碳源的条件中生长。未经转化的野生型菌株不能在仅存在蔗糖的条件中生长。
对生长于葡萄糖中之野生型菌株和生长于蔗糖中之T98菌株的生物质进行脂类特性分析。利用Acid Hydrolysis System(Ankom Technology,NY)根据厂商说明从经干燥的生物质(冷冻干燥)中制备脂类样品。如实施例4中所描述进行脂类特性测定。生长于葡萄糖作为唯一碳源中未经转化之UTEX 1435菌株的脂类特性和生长于蔗糖作为唯一碳源中UTEX 1435菌株之两个克隆(经蔗糖转化酶转基因转化的UTEX 1435)的脂类特性公开于表13中(下同野生型UTEX 1435和T98克隆8和克隆11)。C:19:0脂类用作内部校准对照。
表13.野生型UTEX 1435和具有suc2转基因之UTEX 1435克隆的脂类特性。
      
      
对从野生型Prototheca moriformis UTEX 1435中提取之油类(通过溶剂萃取或者利用压榨机(参见上面实施例44中的方法))中的类胡萝卜素、叶绿素、生育酚、其他甾醇和生育三烯酚进行分析。结果总结于下面表14中。
表14.从野生型Prototheca moriformis(UTEX 1435)中提取之油类中的类胡萝卜素、叶绿素、生育酚/甾醇和生育三烯酚分析。
      
      
利用阳性suc2基因转化子对用唯一碳源蔗糖代替G418(或者另一种抗生素)作为含有suc2转基因质粒筛选因子的能力进行测定。阳性转化子的子代在含有蔗糖作为唯一碳源且不含抗生素筛选标记的板上生长24代。接着使克隆在含有葡萄糖作为唯一碳源和G418的板上生长。有菌落克隆不能在葡萄糖+G418的条件中生长，表明转基因的表达丧失。进行附加实验，其中利用含有蔗糖作为唯一碳源且不含G418的板，将表达suc2转基因的克隆划线于一半板上并将野生型Prototheca moriformis划线于另一半板上。野生型和含有转基因的Prototheca moriformis细胞均可见生长。野生型Prototheca moriformis没有显示具有在蔗糖中生长的能力，因此该结果显示，与抗生素抗性不同，利用蔗糖/转化酶进行筛选不是细胞自发性的。很可能转化子分泌足够的蔗糖转化酶到板/培养基中，随着蔗糖被水解成为果糖和葡萄糖而帮助野生型生长。
实施例4：具有外源TE基因的重组原藻
如上面所描述，可以用外源因基对原藻菌株进行转化。利用上面描述的方法用加州月桂C12硫酯酶基因或者樟C14硫酯酶基因(均根据表1进行密码子优化)对Prototheca moriformis(UTEX 1435)进行转化。每个转化质粒含有谷氨酸脱氢酶启动子/5’UTR区(SEQ ID NO:69)，以驱动硫酯酶转基因的表达。加州月桂C12硫酯酶(SEQ ID NO:70)或者樟C14硫酯酶(SEQ ID NO:71)的硫酯酶转基因编码区均具有天然的假定性质体靶向序列。紧随硫酯酶编码序列之后是c-末端3FLAG标签的编码序列(SEQID NO:72)，其后是普通小球藻硝酸还原酶3’UTR(SEQ ID NO:73)。Prototheca moriformis转化中使用之硫酯酶质粒的图解显示于图9中。
利用上面实施例3中描述的方法制备DNA、金载体和Protothecamoriformis(UTEX 1435)细胞。利用金微载体-DNA混合物对轰击微藻，并将其置于含有2％葡萄糖和100μg/ml G418的筛选板上。使克隆生长7至12天，从每个转化板上挑取菌落，并利用Southern印迹试验对DNA质粒的融入进行筛选，并利用RT-PCR对硫酯酶质粒的表达进行筛选。
从C12和C14硫酯酶转化板上挑取阳性克隆，并利用Southern印迹试验对质粒的融入进行筛选克隆。利用标准方法(和上面实施例3中所描述)用基于序列SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71的经优化c探针进行Southern印迹试验。用转化质粒DNA作为阳性对照。从质粒融入阳性的克隆中利用逆转录定量PCR(RT-qPCR)对菌落进行C12硫酯酶和C14硫酯酶表达的筛选。
利用上面实施例3中描述的方法进行RNA分离，并利用每个克隆的20mg总RNA和下面描述的引物对以及iScript SYBR Green RT-PCR试剂盒(Bio-Rad Laboratories)根据厂商的方法对阳性克隆进行RT-qPCR。用野生型(未经转化的)Prototheca moriformis总RNA作为阴性对照。mRNA的表达以与阴性对照相比的相对表达倍数(RFE)表示。C12硫酯酶转化RT-qPCR筛选中使用的引物是：
加州月桂C12硫酯酶PCR引物：
正向：5’CTGGGCGACGGCTTCGGCAC 3’(SEQ ID NO:74)
反向：5’AAGTCGCGGCGCATGCCGTT 3’(SEQ ID NO:75)
C12硫酯酶转化RT-qPCR筛选中使用的引物是：
樟C14硫酯酶PCR引物：
正向：5’TACCCCGCCTGGGGCGACAC 3’(SEQ ID NO:76)
反向：5’CTTGCTCAGGCGGCGGGTGC 3’(SEQ ID NO:77)
阳性克隆中C12硫酯酶表达的RT-qPCR结果显示与阴性对照相比增加的RFE是表达量增加大约40倍至超过2000倍。阳性克隆中C14硫酯酶表达中也观察到类似结果，其中与阴性对照相比增加的RFE是表达量增加大约60倍至超过1200倍。
筛选每个转化中的阳性克隆菌落，使其在氮充足的条件下生长，并对总脂类产生和总脂类特性进行分析。从每个克隆的干燥生物质中制备脂类样品。每个转基因克隆的20-40mg干燥生物质重悬于MeOH中的2mL 3％H2SO4，并加入200μl含有合适量适宜内部标准(C19:0)的甲苯。对混合物进行简短超声，以使生物质分散，接着于65-70℃加热2小时。加入2mL庚烷萃取脂肪酸甲酯，随后加入2mL 6％K2CO3(aq)中和酸。剧烈振荡混合物，并将上层部分转移至含有(无水)的瓶中，以利用标准的FAMEGC/FID(脂肪酸甲酯气相色谱火焰电离检测)方法进行气相色谱分析。阳性克隆与野生型阴性对照相比的脂类特性(以面积％表示)总结于下面表15和16中。如表15中所显示，C12转化子中C12产生的增加倍数在大约增加5倍(克隆C12-5)至增加超过11倍(克隆C12-1)的范围内。C14转化子中C14产生的增加倍数在大约增加1.5倍至大约增加2.5倍的范围内。
表15. Prototheca moriformis C12硫酯酶转化子总脂类特性的总结。
      
野生型 C12-1 C12-2 C12-3 C12-4 C12-5 C12-6 C12-7 C12-8
C6:0 0.03 nd nd nd nd nd nd nd nd
C8:0 0.11 0.09 nd 0.11 nd nd nd nd nd
C10:0 nd nd nd 0.01 0.01 nd nd 0.01 nd
C12:0 0.09 1.04 0.27 0.72 0.71 0.50 0.67 0.61 0.92
C14:0 2.77 2.68 2.84 2.68 2.65 2.79 2.73 2.56 2.69
C14:1 0.01 nd nd 0.02 nd nd nd 0.01 nd
C15:0 0.30 0.09 0.10 0.54 0.19 0.09 0.13 0.97 0.09
C15:1 0.05 nd nd 0.02 nd nd nd nd nd
C16:0 24.13 23.12 24.06 22.91 22.85 23.61 23.14 21.90 23.18
C16:1 0.57 0.62 0.10 0.52 0.69 0.63 0.69 0.49 0.63
C17:0 0.47 0.24 0.27 1.02 0.36 0.17 0.26 2.21 0.19
C17:1 0.08 nd 0.09 0.27 0.10 0.05 0.09 0.80 0.05
C18:0 nd nd 2.14 1.75 2.23 2.16 2.38 1.62 2.47
C18:1 22.10 23.15 24.61 21.90 23.52 19.30 22.95 20.22 22.85
C18:1 nd 0.33 0.24 nd nd 0.09 0.09 nd 0.11
C18:2 37.16 34.71 35.29 35.44 35.24 36.29 35.54 36.01 35.31
C18:3α 11.68 11.29 9.26 11.62 10.76 13.61 10.64 11.97 10.81
C20:0 0.15 0.16 0.19 0.16 0.16 0.14 0.18 0.14 0.18
C20:1 0.22 0.17 0.19 0.20 0.21 0.19 0.21 0.20 0.21
C20:2 0.05 nd 0.04 0.05 0.05 0.05 0.04 0.05 0.04
C22:0 nd nd nd 0.01 nd nd nd 0.02 nd
C22:1 nd nd nd nd nd 0.01 nd 0.01 nd
C20:3 0.05 nd 0.07 0.06 0.06 0.10 0.07 0.05 0.06
C20:4 nd nd nd nd nd 0.02 nd nd nd
C24:0 nd nd 0.24 0.01 0.20 0.19 0.19 0.14 0.20
      
表16. Prototheca moriformis C14硫酯酶转化子总脂类特性的总结。
      
野生型 C14-1 C14-2 C14-3 C14-4 C14-5 C14-6 C14-7
C6:0 0.03 nd nd nd nd nd nd nd
C8:0 0.11 nd nd nd nd nd nd nd
C10:0 nd 0.01 nd 0.01 nd 0.01 nd nd
C12:0 0.09 0.20 0.16 0.25 0.21 0.19 0.40 0.17
C14:0 2.77 4.31 4.76 4.94 4.66 4.30 6.75 4.02
C14:1 0.01 nd 0.01 nd nd 0.01 nd nd
C15:0 0.30 0.43 0.45 0.12 0.09 0.67 0.10 0.33
C15:1 0.05 nd nd nd nd nd nd nd
C16:0 24.13 22.85 23.20 23.83 23.84 23.48 24.04 23.34
C16:1 0.57 0.65 0.61 0.60 0.60 0.47 0.56 0.67
C17:0 0.47 0.77 0.76 0.21 0.19 1.11 0.18 0.54
C17:1 0.08 0.23 0.15 0.06 0.05 0.24 0.05 0.12
C18:0 nd 1.96 1.46 2.48 2.34 1.84 2.50 2.06
C18:1 22.10 22.25 19.92 22.36 20.57 19.50 20.63 22.03
C18:1 nd nd nd nd nd nd 0.10 nd
C18:2 37.16 34.97 36.11 34.35 35.70 35.49 34.03 35.60
C18:3α 11.68 10.71 12.00 10.15 11.03 12.08 9.98 10.47
C20:0 0.15 0.16 0.19 0.17 0.17 0.14 0.18 0.16
C20:1 0.22 0.20 0.12 .019 0.19 0.19 0.17 0.20
C20:2 0.05 0.04 0.02 0.03 0.04 0.05 0.03 0.04
C22:0 nd nd nd nd 0.02 0.01 nd nd
C22:1 nd 0.01 nd nd nd nd nd 0.01
C20:3 0.05 0.08 0.03 0.06 0.09 0.05 0.05 0.07
C20:4 nd 0.01 nd nd nd nd 0.02 nd
C24:0 nd 0.17 0.14 0.19 0.20 0.16 0.22 0.17
上面描述的实验表明用两个不同硫酯酶(C12和C14)的转基因质粒成功地转化了Prototheca moriformis(UTEX 1435)，其不仅包括转基因的成功表达，还包括由于转化而表达的蛋白正确靶向质体并且发挥作用(期望的脂类特性变化)。利用含有经密码子优化(根据表1)之萼距花C8-10硫酯酶编码区(具有天然质体靶向序列，SEQ ID NO:78)的表达质粒进行相同的转化实验，脂类特性没有变化。在将萼距花C8-10转基因成功引入Prototheca moriformis(UTEX 1435)中并经Southern印迹分析证实的情况下，与野生型菌株相比，转化子中没有检测到C8或者C10脂肪酸产生的变化。
实施例5：含有具有藻类质体靶向序列之外源植物TE的Protothecamoriformis菌株的产生
为了研究利用藻类叶绿体/质体靶向序列是否能够促进Protothecamoriformis(UTEX 1435)中中等链(C8-C14)硫酯酶的表达和随后中等链脂类的产生，从原壳小球藻和Prototheca moriformis中克隆出几种假定性藻类质粒靶向序列。利用Chlorella sorokiniana谷氨酸脱氢酶启动子/5’UTR和普通小球藻硝酸还原酶3’UTR制备基于萼距花C8-C10硫酯酶、加州月桂C12硫酯酶和樟C14硫酯酶的硫酯酶构建体。通过去除天然质粒靶向序列并用原壳小球藻和Prototheca moriformis基因组的质粒靶向序列将其替换，对硫酯酶编码序列进行修饰。硫酯酶表达质粒和其相应的序列识别号列于下面。每个转化质粒还含有Neo抗性构建体，其与上面实施例3中所描述的构建体相同。此外，还与硫酯酶构建体一起对另一种藻类来源的启动子莱茵衣藻β-微管蛋白启动子进行测试。“天然”质体靶向序列是指高等植物硫酯酶质体靶向序列。下面总结了这些实验中使用的构建体。
      
      
      
将每个质粒转化到Prototheca moriformis(UTEX 1435)中并利用上面实施例4中描述的方法用G418进行筛选。挑取每个转化中的几个阳性克隆，并利用Southern印迹分析对其进行存在硫酯酶转基因的筛选。利用RT-PCR证实硫酯酶转基因的表达。选择每个转化中阳性克隆的菌落(通过Southern印迹分析和RT-PCR证实)，并使其生长以进行脂类特性分析。从每个克隆的干燥生物质样品中制备脂类样品，并利用实施例4中描述的酸水解方法进行脂类特性分析。将对应于硫酯酶转基因之脂肪酸的面积百分比变化与野生型水平和用具有天然质粒靶向序列的硫酯酶转化的克隆相比较。
如实施例4中所提及，用具有天然质粒靶向序列的萼距花C8-10硫酯酶质粒转化的克隆中具有与野生型相同水平的C8和C10脂肪酸。在用具有藻类质粒靶向序列的萼距花C8-10硫酯酶质粒(质粒1-3)转化的克隆中，对于质粒3，C10脂肪酸增加超过10倍，对于质粒1和2，C10脂肪酸增加超过40倍(与野生型相比)。与野生型相比，用具有天然质粒靶向序列的加州月桂C12硫酯酶质粒转化的克隆中C12脂肪酸中度增加6-8倍。在用具有藻类质粒靶向序列的加州月桂C12硫酯酶质粒(质粒4-7)转化的克隆中，对于质粒4，C12脂肪酸水平增加超过80倍，对于质粒6，C12脂肪酸水平增加大约20倍，对于质粒5，C12脂肪酸水平增加大约3倍(所有均与野生型相比)。与野生型相比，用具有天然质体靶向序列的樟C14硫酯酶或者质粒8(具有硬脂肪酰基ACP去饱和酶质体靶向序列)转化的克隆中C14脂肪酸水平增加大约2-3倍。总之，用具有藻类质体靶向序列的硫酯酶质粒转化的克隆中相应链长度脂肪酸水平的增加倍数高于利用高等植物天然靶向序列时。
A.莱茵衣藻β-微管蛋白启动子
利用莱茵衣藻β-微管蛋白启动子代替C.sorokinana谷氨酸脱氢酶启动子制备额外的异源硫酯酶表达质粒。质粒元件和表达质粒的序列列于上面。利用上面描述的方法将每个质粒转化到Prototheca moriformis UTEX1435宿主细胞中。从每个质粒的阳性克隆菌落中产生脂类特性，以对每个质粒的成功转化和产量进行测定。将脂类特性中的脂肪酸水平(以面积％表示)与野生型宿主细胞相比较。“平均值”列代表阳性克隆菌落的数值平均值。“样品”列代表被筛选的最佳阳性克隆(最佳定义为相应链长度脂肪酸产生的面积％中发生最大变化的样品)。“低-高”列代表被筛选的克隆中脂肪酸的最低面积％和最高面积％。质粒9-23的脂类特性结果总结于下面。
      
      
      
      
      
      
      
      
      
      
      
      
      
      
      
      
      
      
      
      
      
构建体9-13是含有硫酯酶结构的表达载体。如上面数据总结中所见，构建体11中观察到最佳结果，其中样品C8脂肪酸为1.57面积％(与野生型中的0相比)，C10脂肪酸为6.76面积％(与野生型中的0相比)。C12脂肪酸还有中度增加(增加大约2-5倍)。处于C.sorokinana谷氨酸脱氢酶启动子控制下时利用天然质体靶向序列没有产生变化，而由莱茵衣藻β-微管蛋白启动子驱动的相同表达质粒使宿主细胞中C8-10脂肪酸发生显著变化。这进一步证明原藻菌种中硫酯酶异源表达的特性。含有莱茵衣藻β-微管蛋白启动子C8-10硫酯酶质粒的所有克隆中C8-10脂肪酸的增加高于含有C.sorokinana谷氨酸脱氢酶启动子C8-10硫酯酶质粒的克隆。没有获得构建体13的脂类特性数据，因此上面没有包括该构建体。
构建体14-18是含有加州月桂C12硫酯酶结构的表达载体。如上面数据总结中所见，异戊烯基二磷酸酯15(P.moriformis异戊烯基二磷酸酯合成酶质体靶向序列)和17(原壳小球藻硬脂肪酰基ACP去饱和酶质体靶向序列)中观察到最佳结果。异戊烯基二磷酸酯17中C12脂肪酸产生的变化最大，其中C12脂肪酸水平与野生型中0.04面积％相比高达14.11面积％。还观察到C14脂肪酸水平的中度变化(大约2倍)。当与具有C.sorokinana谷氨酸脱氢酶启动子的相同质粒相比时，具有莱茵衣藻β-微管蛋白启动子的构建体显示相同趋势—利用两种启动子时原壳小球藻硬脂肪酰基ACP去饱和酶和P.moriformis异戊烯基二磷酸酯合成酶质体靶向序列均产生C12脂肪酸水平的最大变化。
异戊烯基二磷酸酯19-23是含有樟C14硫酯酶结构的表达载体。如上面数据总结中所见，异戊烯基二磷酸酯22和23中观察到最佳结果。异戊烯基二磷酸酯22中C14脂肪酸产生的变化最大，其中C14脂肪酸水平与野生型中1.40％相比高达17.35面积％(当将C140和C141数值结合时)。还观察到C12脂肪酸的变化(5-60倍)。当与具有C.sorokinana谷氨酸脱氢酶启动子的相同构建体相比时，具有莱茵衣藻β-微管蛋白启动子的异戊烯基二磷酸酯显示相同趋势—利用两种启动子时原壳小球藻硬脂肪酰基ACP去饱和酶和P.moriformis异戊烯基二磷酸酯合成酶质体靶向序列均产生C14脂肪酸水平的最大变化。与所有硫酯酶表达质粒一致，莱茵衣藻β-微管蛋白启动子异戊烯基二磷酸酯产生的C8-14脂肪酸水平变化大于C.sorokinana谷氨酸脱氢酶。
选择构建体22的两个阳性克隆，并使其在高选择压力(50mg/L G418)下生长。培养6天后，收集克隆，并利用上面描述的方法测定其脂类特性。脂类特性数据总结于下面并以面积％表示。
      
      
当在持续的高选择压力下生长时，两个克隆均产生增加量的C14和C12脂肪酸，大约是上面质粒22中观察到的水平的两倍。与野生型细胞中观察到的1.5面积％的C12-14脂肪酸相比，这些克隆产生超过30面积％的C12-14脂肪酸。
实施例6：原藻中Cuphea palustris和Ulmus americanca硫酯酶的异源表达
由于在原藻菌株中上面描述的异源硫酯酶成功表达，构建含有编码Cuphea palustris和Ulmus americana脂肪酰基-ACP硫酯酶之经密码子优化(根据表1)序列的表达盒，并描述于下面。
      
可以将Ulmus americana(经密码子优化的编码序列)插入到表达盒中。不含有天然质体靶向序列的经密码子优化的Ulmus americana硫酯酶编码序列以SEQ ID NO:108列出，并可以与任何期望的质体靶向序列和表达元件(例如启动子/5’UTR和3’UTR)融合。
可以利用上面描述的方法将这些表达盒转化到原藻菌种中。可以通过使表达质粒含有抗生素抗性基因(例如neoR)在含有G418的板/培养基中筛选阳性克隆。可以利用异源硫酯酶编码区特异性探针通过Southern印迹试验对阳性克隆进行确认，并且还可以利用RT-PCR和异源硫酯酶编码区特异性引物确认质粒表达。可以通过寻找宿主细胞脂类特性中脂肪酸水平的变化，进一步筛选阳性克隆。如上面实施例中所见，原藻菌种中硫酯酶的异源表达可以是特异于特定硫酯酶的。可以交叉使用启动子元件和质体靶向序列(以及其他表达调控元件)，直至硫酯酶的表达(和随后相应脂肪酸的增加)达到期望水平。
实施例7：双重转化子—两种异源蛋白的同时表达
利用含有酵母蔗糖转化酶suc2基因(编码分泌形式的转化酶)的表达质粒通过上面公开的方法对微藻菌株Prototheca moriformis(UTEX 1435)进行转化。该基因的成功表达和靶向外周质使得宿主细胞能够在异养条件中在蔗糖作为唯一碳源中生长(并利用)(如上面实施例3中所描述)。表达的第二组基因是硫酯酶，其负责从酰基载体蛋白中切割下酰基基团。具体地是萼距花硫酯酶(C8-10优先性硫酯酶)、加州月桂硫酯酶(C12优先性硫酯酶)、樟硫酯酶(C14优先性硫酯酶)。以与Prototheca moriformis或者原壳小球藻的N-末端微藻质体靶向序列(已经显示其比天然的高等植物质体靶向序列更合适)融合的方式来克隆这些硫酯酶表达盒。这些硫酯酶基因的成功表达和靶向质体使得宿主细胞中的脂肪酸谱发生显著变化。脂肪酸谱中的这些变化与每种硫酯酶的酶促特异性或者优先性相符。下面总结了制备并转化到Prototheca moriformis(UTEX 1435)中的双重表达质粒。每个质粒含有处于莱茵衣藻β-微管蛋白5’UTR/启动子控制下并且含有普通小球藻硝酸还原酶3’UTR的酵母suc2基因，以及处于C.sorokinana谷氨酸脱氢酶5’UTR控制下并用微藻质体靶向序列取代天然序列并且含有普通小球藻硝酸还原酶3’UTR的高等植物硫酯酶。下面总结了制备并转化到Prototheca moriformis(UTEX 1435)中之质粒的硫酯酶部分。Suc2基因和硫酯酶基因的整个双重表达盒列于序列识别表中。
      
      
还可以利用标准分子生物学方法和本文中描述的方法制备具有实施例5中描述之硫酯酶盒(例如处于不同启动子(例如莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR)控制下)的类似双重表达质粒。
利用在含有蔗糖的板上生长的能力筛选含有每种表达质粒的阳性克隆，其中所述板中蔗糖是唯一碳源，将其作为筛选因子。筛选每种质粒转化后阳性克隆的菌落，并利用Southern印迹试验证实存在表达质粒。还利用蔗糖水解试验证实酵母蔗糖转化酶具有功能。选择阳性克隆，并使其在含有起始浓度为40g/L的蔗糖作为唯一碳源的培养基中生长。还用在含有起始浓度同样为40g/L的蔗糖作为唯一碳源的培养基中生长的野生型Prototheca moriformis(UTEX 1435)作为阴性对照。通过利用具有蔗糖特异性膜的YSI 2700Biochemistry Analyzer测定培养基中的蔗糖水平，在实验期间对蔗糖的利用情况进行测定。培养6天后，收集培养物，并利用与上面所描述相同的方法测定脂类特性。脂类特性结果总结于下面表17中，并以面积％表示。
表17.具有suc2蔗糖转化酶和硫酯酶之双重转化子的脂类特性
      
      
蔗糖利用试验中筛选出的所有阳性克隆均能够使培养基中的蔗糖水解，并且在6天培养期结束时，培养基中不能测出蔗糖水平。除了成功利用蔗糖作为阳性克隆的筛选工具之外，该数据还表明外源酵母suc2蔗糖转化酶基因能够正确靶向并在转化子中表达。如上面表17中所显示，表达构建体24(C8-10硫酯酶)的克隆中C10脂肪酸显著增加(增加高达8倍)。同样地，表达构建体25(C12硫酯酶)和构建体26(C14硫酯酶)的克隆中相应中等链脂肪酸也显著增加。总之，数据显示Prototheca moriformis中两种重组蛋白(例如蔗糖转化酶和脂肪酰基-ACP硫酯酶)同时成功表达，所述两种重组蛋白均赋予宿主体有益且可量化的表型变化。
实施例8：甘油对C14硫酯酶转化子中C10-C14脂肪酸产生的作用
选择所有硫酯酶转化后的克隆并进行进一步评估。表达质粒8(樟C14TE)的克隆利用不同碳源异养生长：只有葡萄糖、只有果糖和只有甘油。与只有果糖和只有甘油的条件相比，只有葡萄糖的条件使得细胞生长较快，总脂类产生较多。但是，只有甘油的条件中产生的C12-C14脂肪酸比例比只有葡萄糖的条件中获得的比例高2倍。
实施例9：Prototheca moriformis中拟南芥转化酶的表达
利用上面描述的方法用含有经密码子优化(根据表1)的拟南芥细胞壁相关转化酶对微藻菌株Prototheca moriformis(UTEX 1435)进行转化。对Arabidopsis转化酶序列进行修饰，使其包含酵母转化酶(SUC2蛋白)N-末端的30个氨基酸，以保证其有效靶向ER并最终靶向外周质。为了帮助检测，将Flag表位加入到重组蛋白的C-末端。将该转基因克隆到含有Chlorella sorokinianna谷氨酸脱氢酶启动子/5’UTR区和普通小球藻硝酸还原酶3’UTR区的表达载体中。该转基因盒的DNA序列以SEQ ID NO:89列出，其翻译的氨基酸序列以SEQ ID NO:90列出。利用蔗糖的培养基/板筛选并选择阳性克隆。通过对带有Flag标签的转化酶进行Southern印迹分析和Western印迹分析，确认阳性克隆菌落中转基因的存在和转化酶的表达。从这些筛选中选择10个阳性克隆进行脂类产量和蔗糖利用情况的试验。所有10个克隆均生长于含有蔗糖作为唯一碳源的培养基中，并且还包括阳性对照suc2转化酶转化子。阴性对照野生型Prototheca moriformis生长于含有葡萄糖的培养基中。6天后，收集细胞，使其干燥，并测定脂类的总百分比(以细胞干重计算)。还对培养基的总蔗糖消耗进行分析。
所有10个阳性克隆均能够使蔗糖水解，但是通过在实验结束时测定细胞干重，大多数克隆的生长是野生型或者阳性对照suc2酵母转化酶转化子的一半。类似地，与野生型或者阳性对照转化子相比，所有10个阳性克隆产生的总脂量是其一半。这些数据表明原藻中多种蔗糖转化酶成功异源表达。
实施例10：Prototheca krugani、Prototheca stagnora和Prototheca zopfii中酵母转化酶(suc2)的异源表达
为了测试转化方法用于原藻属菌种中的综合应用性，选择其他3种原藻菌种：Prototheca krugani(UTEX 329)、Prototheca stagnora(UTEX 1442)和Prototheca zopfii(UTEX 1438)。使这3种菌株在实施例1中描述的培养基和条件中生长，并利用上面描述的方法对其脂类特性进行测定。这3种原藻菌株的脂类特性以面积％总结于下面。
      
利用上面实施例3中描述的方法用酵母转化酶(suc2)表达盒(SEQ IDNO:58)对这3种菌株进行转化。上面实施例3中已经显示酵母转化酶(suc2)表达盒可以在Prototheca moriformis(UTEX 1435)中运行。利用含有蔗糖的板/培养基对转化子进行筛选。对每个原藻菌种的阳性克隆菌落进行筛选，并通过Southern印迹分析证实转基因的存在。对于每个菌种，选择10个经证实的阳性克隆进行蔗糖水解分析和脂类产量测定。使这些克隆在含有蔗糖作为唯一碳源的培养基中生长，并与其在葡萄糖中生长的野生型对应物相比较。6天后，收集培养物，使其干燥，并测定脂类的总百分比(以细胞干重计算)。还在实验期间利用YSI2700 BiochemistryAnalyzer测定蔗糖含量，对每种培养物的培养基进行蔗糖水解分析。所有3个菌种的克隆均能够使蔗糖水解，其中Prototheca stagnora和Protothecazopfii转化子比Prototheca krugani能够更有效地水解蔗糖。3个菌种转化子的总脂类产量和细胞干重与其在葡萄糖中生长的野生型对应物相当。该数据表明原藻属多个菌种中外源基因成功转化并表达。
实施例11：用于微藻中的藻类来源的启动子和基因
A.来源于原壳小球藻的5’UTR和启动子序列
利用标准技术从兼养生长的原壳小球藻(UTEX 250)中制备cDNA文库。基于cDNA序列，利用Seegene’s DNA Walking试剂盒(Rockville,MD)在某些已知的看家基因中设计引物，使其在编码区域上游“步移”。所分离的序列包括肌动蛋白(SEQ ID NO:31)和延长因子-1a(EF1a)(SEQID NO:32)启动子/UTR(二者均含有内含子(以小写字母显示)和外显子(以大写字母)以及预期起始位点(粗体))和两个β-微管蛋白启动子/UTR元件：同工型A(SEQ ID NO:33)和同工型B(SEQ ID NO:34)。
B.来源于原壳小球藻的脂类生物合成酶和质体靶向序列
利用上面描述的相同方法从上面描述的cDNA文库中克隆编码在原壳小球藻(UTEX 250)脂类代谢中发挥功能之蛋白的3个cDNAs。酰基ACP去饱和酶的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO:45和46)以及两种香叶基香叶基二磷酸合成酶的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO:47-50)包含于下面序列表中。此外，还克隆了含有假定性靶向质体之信号序列的3个cDNAs。甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO:51和52)、放氧复合体蛋白OEE33的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO:53和54)以及Clp蛋白酶的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO:55和56)包含于下面序列表中。在核苷酸和氨基酸序列中均以下划线显示假定性质体靶向序列。可以利用质体靶向序列使转基因产物靶向微生物的质体，例如脂类修饰酶。
实施例12：来源于Prototheca moriformis的氮响应性5’UTR/启动子
利用标准技术从Prototheca moriformis(UTEX 1435)中制备cDNA文库。使Prototheca moriformis细胞在氮充足的条件下生长48小时。接着将5％接种物(v/v)转移至低氮中，并在7天内每24小时收集细胞。培养大约24小时后，使培养基中的氮供应完全停止。利用干冰和异丙醇将所收集的样品快速冷冻。随后从冷冻的细胞沉泻样品中分离总RNA，并保留每个样品的一部分总RNA以用于RT-PCR研究。对从样品中获得之总RNA的余下部分进行polyA筛选。接着使每种条件中等摩尔量的经polyA筛选的RNA混合，并用于在载体pcDNA 3.0(Invitrogen)中制备cDNA文库。从得到的混合cDNA文库中随机挑选大约1200个克隆，并进行双向测序。从这些1200个序列中选择大约68个不同的cDNA，并用于设计实时RT-PCR研究中使用的cDNA特异性引物。
从细胞沉淀样品中分离的备用RNA在利用上面制备之cDNA特异性引物组的实时RT-PCR研究中用作底物。将该备用RNA转化成为cDNA，并用作RT-PCR中68个基因特异性引物组中每组引物的底物。利用循环阈值或者CT数值表示时间期内所收集的每个RNA样品中60个cDNA中每个cDNA的相对转录丰度。将在氮充足和氮缺乏条件之间显示显著增加(大于3倍)的cDNA作为其表达被氮缺乏上调的潜在基因。如说明书中所讨论，已知氮缺乏/限制是产油微生物中脂肪生成的诱导因素。
为了鉴定氮缺乏/限制时表达被上调的cDNA中的假定性启动子/5’UTR序列，从在氮充足条件下生长的Prototheca moriformis(UTEX 1435)中分离总DNA，接着利用454测序技术(Roche)进行测序。利用BLAST将上面RT-PCR结果中被上调的cDNAs与454基因组序列读取中产生的拼接重叠群相对比。将cDNAs的5’末端定位至特定的重叠群，如果可能，利用大于500bp的5’侧翼DNA鉴定启动子/UTRs。随后通过对基因组DNA进行PCR扩增，证实启动子/5’UTR的存在。利用各个cDNA的5’末端设计3’引物，并利用454重叠群组装的5’末端设计5’基因特异性引物。
作为第一次筛选，将一个假定性启动子即从Aat2(铵转运蛋白，SEQID NO:99)中分离的5’UTR/启动子克隆到上面实施例5中描述的具有原壳小球藻硬脂肪酰基ACP去饱和酶转运肽的樟C14硫酯酶质粒中，取代C.sorokinana谷氨酸脱氢酶启动子。该质粒以SEQ ID NO:112列出。为了测试该假定性启动子，将硫酯酶质粒转化到Prototheca moriformis细胞中，通过利用上面描述的方法对低/无氮条件下C14/C12脂肪酸增加进行筛选，证实具有启动子活性。可以利用相同方法对从cDNA/基因组筛选中分离出的假定性氮调控型启动子进行类似测试。
从cDNA基因组筛选中分离出的其他假定性氮调控型启动子/5’UTRs是：
      
增加倍数是指在低氮培养基中培养24小时后cDNA丰度的增加倍数。
实施例13：原藻菌种中的同源重组
转基因的同源重组比上面实施例中描述的转化方法具有几点优势。首先，不利用同源重组而将转基因引入是不可预测的，因为不能控制引入细胞中的质粒拷贝的数量。此外，不利用同源重组而将转基因引入是不稳定的，因为质粒可能保持游离状态并在随后细胞分裂过程中丢失。同源重组的另一个优势是能够“敲除”靶基因，引入表位标签，转变内源基因的启动子和改变靶基因(例如引入点突变)。
利用命名为KE858的Prototheca moriformis(UTEX 1435)基因组特定区域构建两个载体。KE858是1.3kb的基因组片段，其包含与转运RNA(tRNA)家族蛋白具有同源性之蛋白的部分编码区域。Southern印迹试验已经显示KE858序列以单拷贝形式存在于Prototheca moriformis(UTEX1435)基因组中。构建第一种类型的载体，将其命名为SZ725(SEQ IDNO:103)，其由整个1.3kb KE858片段克隆到pUC19载体骨架中而制备，所述pUC19载体骨架还含有上面实施例3中使用的经优化的酵母转化酶(suc2)基因。KE858片段含有唯一的SnaB1位点，并且靶向质粒的任何位置均不存在该位点。构建第二种类型的载体，将其命名为SZ726(SEQ IDNO:126)，其中的KE858序列通过在KE858基因组序列内部的SnaB1位点处插入酵母转化酶基因(suc2)而被破坏。可以通过用切割KE858区域两端的EcoRI消化，从载体骨架中将含有酵母转化酶基因侧翼之KE858序列的整个DNA片段切除。
使用这两个载体将酵母转化酶基因(suc2)直接同源重组到Protothecamoriformis(UTEX 1435)基因组相应的KE858区域中。通过用SnaB1消化载体质粒SZ725和用EcoRI消化载体质粒SZ716，暴露与同源重组靶基因组区域同源的线性DNA末端。接着利用上面实施例3中描述的方法将经消化的载体质粒引入到Prototheca moriformis培养物中。接着利用蔗糖板对每个载体质粒的转化子进行筛选。对每个质粒转化中产生的10个单独的、纯克隆性转化子进行酵母转化酶基因成功重组到期望基因组位点的分析(利用Southern印迹分析)和转基因稳定性分析。
SZ725转化子的Southern印迹分析显示，所挑选的用于分析的10个转化子中，4个转化子含有预期的重组条带，表明载体中的KE858序列与基因组中的KE858序列发生单次交换事件。相反，所有10个SZ726转化子均含有预期的重组条带，表明KE858序列位于酵母转化酶转基因侧翼之pSZ726的EcoRI片段和基因组中相应的KE858区域之间发生两次交换事件。
通过使转化子在没有筛选标记的条件下生长15代，对蔗糖转化酶的表达和转基因的稳定性进行测定。选择在Southern印迹分析中显示转基因阳性的4个SZ725转化子和10个SZ726转化子，并使每个转化子的49个菌落连续生长：首先在没有筛选标记的含有葡萄糖的培养基中生长，接着在具有筛选标记的含有蔗糖作为唯一碳源的培养基中生长。所有10个SZ726转化子(100％)在15代后均保持其在蔗糖中生长的能力，而大约97％的SZ725转化子在15代后保持其在蔗糖中生长的能力。通过两次交换事件引入的转基因(SZ726载体)在传代中具有极高的稳定性。相反，通过单次交换事件引入的转基因(SZ725载体)在传代中显示一定的不稳定性，因为所引入的是转基因的随机拷贝，转基因侧翼的重复性同源区域可能发生重组并切除位于其之间的转基因DNA。
这些实验表明，利用同源重组成功地制备了含有稳定整合到生物体核基因组中之异源蔗糖转化酶基因的原藻转化子。成功进行同源重组使得能够发生原藻中的其他基因组变化，包括基因缺失、点突变和使期望基因产物带有表位标签。这些实验还首次公开了在真核微藻核基因组中进行同源重组的系统。
A.利用同源重组敲除Prototheca moriformis内源性基因
在上面实施例11中描述的Prototheca moriformis cDNA/基因组筛选中，鉴定出了内源性硬脂肪酰基-ACP去饱和酶(SAPD)cDNA。硬脂肪酰基-ACP去饱和酶是脂类合成途径的一部分，其功能是使脂肪酰基链中引入双键。在一些情况下，为了改变脂肪酸谱，敲除脂类途径酶或者减少其表达是有利的。制备同源重组质粒，以检测内源性硬脂肪酰基-ACP去饱和酶的表达是否减少(或者敲除)以及宿主细胞脂类特性中的不饱和脂肪酸是否相应减少。鉴定出Prototheca moriformis(UTEX 1435)硬脂肪酰基-ACP去饱和酶基因的大约1.5kb编码序列并对其进行克隆(SEQ IDNO:104)。利用5’端0.5kb的SAPD编码序列(5’靶位点)构建同源重组质粒，所述SAPD编码序列后面是莱茵衣藻β-微管蛋白启动子，其驱动含有普通小球藻3’UTR的经密码子优化的酵母蔗糖转化酶suc2基因。接着将余下的(～1kb)Prototheca moriformis SAPD编码序列插入到普通小球藻3’UTR后面，以产生3’靶位点。该同源重组盒的序列列于SEQ ID NO:105中。如上面所显示，可以通过在转化微藻之前使同源重组盒线性化从而产生暴露的末端，增加同源重组盒整合到核基因组中的成功率。使靶向Prototheca moriformis内源性SAPD酶的重组同源盒线性化，并接着转化到宿主细胞(Prototheca moriformis，UTEX 1435)中。成功的整合能够通过两次交互重组事件从宿主基因组中去除SAPD酶编码区，而新插入的suc2基因的表达会受莱茵衣藻β-微管蛋白启动子的调控。利用含有蔗糖作为唯一碳源的板/培养基对所得到的克隆进行筛选。同源重组盒成功整合的克隆能够在蔗糖作为唯一碳源中生长，并且将脂类特性中脂肪酸总体饱和度的变化作为次级确认因素。此外，还可以通过Southern印迹试验(利用酵母蔗糖转化酶suc2基因特异性探针)和RT-PCR证实阳性克隆中转化酶基因的存在和表达。可选地，可以使用不含β-微管蛋白启动子的相同质粒，以切除内源性SAPD酶的编码区。在这种情况下，而新插入的suc2基因会受内源性SAPD启动子/5’UTR的调控。
实施例14：燃料生产
A.利用压榨机和压榨辅助物从微藻中提取油类
利用转鼓式干燥器使含有38％油类(以DCW计算)的微藻生物质干燥，使得得到的含水量为5-5.5％。将该生物质加入到French L250压榨机中。使30.4kg(67Ibs.)生物质通过压榨机，不回收油类。将相同的干燥微生物生物质与不同百分比的柳枝稷(作为压榨辅助物)结合，并使其通过压榨机。将干燥微生物生物质与20％w/w的柳枝稷结合能够产生油类回收的最佳总体百分比。接着用己烷萃取压榨饼，对于20％柳枝稷的情况，最终产率是61.6％的总可用油(以重量计算)。含有50％以上油类(以细胞干重计算)的生物质不需要使用压榨辅助物(例如柳枝稷)来释放油类。
B.脱脂Prototheca moriformis生物质的单糖组合物
Prototheca moriformis(UTEX 1435)生长于上面实施例45中描述的条件下和营养培养基(含有4％葡萄糖)中。接着收集微藻生物质，并利用转鼓式干燥器使其干燥。使干燥的藻类生物质裂解，并如上面实施例44所描述利用压榨机提取油类。接着利用石油醚对经压榨生物质中的剩余油类进行溶剂萃取。利用Rotovapor(Buchi Labortechnik AG,Switzerland)使剩余石油醚从脱脂粉中蒸发。随后利用气相色谱/质谱联用法(GC/MS)分析通过样品的酸性甲醇分解作用产生之单糖甲基糖苷的全-O-三甲基硅烷(TMS)衍生物，对脱脂粉进行糖基(单糖)组合物分析。在甲醇中的1MHCl中对脱脂粉样品进行甲醇分解作用，于80℃进行大约20小时，随后用甲醇中的嘧啶和乙酸酐使其重新N-乙酰化(用于检测氨基糖)。接着通过用Tri-Sil(Pierce)于80℃处理30分钟，使样品全-O-三甲基硅烷化(参见Merkle和Poppe(1994)Methods Enzymol.230:1-15以及York等，(1985)Methods Enzymol.118:3-40中的方法)。利用All Tech EC-1熔融石英毛细管柱(30mm×0.25mm ID)在HP 6890 GC与5975b MSD结合的仪器上对TMS甲基糖苷进行GC/MS分析。通过将滞留时间与标准相比，对单糖进行鉴定，并通过其质谱鉴定其碳水化合物性质。在衍生化之前在每个样品加入20微克肌醇，用其作为内部标准。Prototheca moriformis(UTEX 1435)脱脂生物质的单糖谱总结于下面表18中。经过计算，样品中碳水化合物的总百分比是28.7％。
表18.Prototheca moriformis(UTEX 1435)脱脂生物质的单糖(糖苷)组合物分析。
      
质量(μg) 摩尔％(总碳水化合物的)
阿拉伯糖 0.6 1.2
木糖 n.d. n.d.
半乳糖醛酸(GalUA) n.d. n.d.
甘露糖 6.9 11.9
半乳糖 14.5 25.2
葡萄糖 35.5 61.7
N-乙酰半乳糖胺(GalNAc) n.d. n.d.
N-乙酰葡糖胺(GlcNAc) n.d. n.d.
庚糖 n.d. n.d.
3-脱氧-2-甘露-2-辛酮糖酸(KDO) n.d. n.d.
      
      
总和 57 100
脱脂粉中的碳水化合物含量和单糖组合物使其适用作动物饲料或者作为动物饲料配方的一部分。因此，在一个方面中，本发明提供了具有上面表中所列产物含量的脱脂粉。
C.从原藻油类中生产生物柴油
对根据上面描述的方法从Prototheca moriformis UTEX 1435中产生的脱胶油进行转酯基作用，以产生脂肪酸甲酯。结果显示于下面：
油类的脂类特性是：
      
表19. Prototheca moriformis甘油三酯油类的生物柴油特性
      
      
生物柴油的脂类特性与给料油的脂类特性高度相似。可以对本发明的方法和组合物提供的其他油类进行转酯基作用，以产生脂类特性包含(a)至少4％C8-C14、(b)至少0.3％C8、(c)至少2％C10、(d)至少2％C12和(3)至少30％C8-C14的生物柴油。
通过ASTM D6751 A1方法测定，所生产的生物柴油的低温适应过滤性是300ml体积120秒。该测试包括过滤300ml的B100，冷却至40°F 16小时，加热至室温，并利用具有不锈钢支撑的0.7微米玻璃纤维过滤器在真空条件下进行过滤。可以对本发明的油类进行转酯基作用，以产生低温适应时间少于120秒、少于100秒和少于90秒的生物柴油。
D.可再生柴油的生产
对根据本发明的方法从Prototheca moriformis UTEX 1435中产生并且脂类特性与上面实施例X中生产生物柴油的油类相同的脱胶油进行转酯基作用，以生产可再生柴油。
首先对油类进行热水处理，以去除氧和甘油主链，产生n-石蜡油。接着使n-石蜡油裂化和异构化。该物质的色谱图显示于图13中。接着对该物质进行冷却过滤，去除大约5％的C18物质。冷却过滤后，将该物质的总体积减少至闪点体积并且对闪点、ASTM D-86蒸馏分布、浊点和粘度进行评估。闪点是63℃；粘度是2.86cSt(厘沱)；浊点是4℃。ASTM D86蒸馏值显示于表20中。
表20. ℃读值
      
      
所产生之物质的T10-T90是57.9℃。可以实施加氢处理方法、异构化方法和本文中公开的对油类进行其他共价修饰的方法以及本文中公开的蒸馏和分馏(例如冷却过滤)方法，以利用根据本文中公开的方法产生的甘油三酯油类产生具有其他T10-T90范围(例如20、25、30、35、40、45、50、60和65℃)的可再生柴油组合物。
所产生之物质的T10是242.1℃。可以实施加氢处理方法、异构化方法和本文中公开的对油类进行其他共价修饰的方法以及本文中公开的蒸馏和分馏(例如冷却过滤)方法，以产生具有其他T10值的可再生柴油组合物，例如T10值在180和295之间、在190和270之间、在210和250之间、在225和245之间以及至少290。
所产生之物质的T90是300℃。可以实施加氢处理方法、异构化方法和本文中公开的对油类进行其他共价修饰的方法以及本文中公开的蒸馏和分馏(例如冷却过滤)方法，以产生具有其他T90值的可再生柴油组合物，例如T90值在280和380之间、在290和360之间、在300和350之间、在310和340之间以及至少290。
所产生之物质的FBP是300℃。可以实施加氢处理方法、异构化方法和本文中公开的对油类进行其他共价修饰的方法以及本文中公开的蒸馏和分馏(例如冷却过滤)方法，以产生具有其他FBP值的可再生柴油组合物，例如FBP值在290和400之间、在300和385之间、在310和370之间、在315和360之间以及至少300。
可以对由本发明的方法和组合物提供的其他油类联合进行热水处理、异构化和其他共价修饰，包括脂质谱包含(a)至少4％C8-C14、(b)至少0.3％C8、(c)至少2％C10、(d)至少2％C12和(3)至少30％C8-C14的油类。
实施例15：Chlorella luteoviridis对蔗糖的利用
A.SAG 2214在葡萄糖和蔗糖中的生长
对SAG 2214(命名为Chlorella luteoviridis)在黑暗中在含有葡萄糖或者蔗糖的培养基中的生长情况进行测试。利用冷冻管中的接种物在含有4％葡萄糖或者4％蔗糖作为唯一碳源的培养基中开始进行异养液体培养。培养物在黑暗中以200rpm振荡生长。在0、24、48和72小时的时间点从培养物中取样，并且通过750nm处的相对吸光度(UV Mini 1240,Shimadzu)测定生长情况。SAG 2214在葡萄糖和在蔗糖中生长情况同样良好，表明该微藻可以与利用葡萄糖同样有效地利用蔗糖作为唯一碳源。该实验的结果以图表方式显示于图3中。
B. SAG 2214的脂类产量和脂肪酸谱
在与上面实施例32中所描述类似的条件下，在含有葡萄糖或者蔗糖作为唯一碳源的液体培养基中对微藻菌株SAG 2214进行培养。7天后，收集细胞，计算细胞干重。使细胞离心，并冷冻干燥24小时。对干燥的细胞沉淀进行称重，并计算每升的细胞干重。还收集用于脂类分析的细胞，并于室温以4,000×g离心10分钟。弃去上清液，并利用标准的气相色谱(GC/FID)方法对样品进行脂类分析和脂肪酸谱分析。结果总结于下21和22中。
表21. SAG 2214的脂类产量和DCW。
      
表22. SAG 2214的脂肪酸特性
      
脂肪酸 百分比(w/w)
C:16:0 21
C:18:1 38
C:18:2 41
C. SAG 2214与其他Chlorella luteoviridis菌株的基因组比较
由于能够在蔗糖作为唯一碳源中生长(如上面所显示)，微藻菌株SAG2214引起公众兴趣。除了该菌株的生长特性之外，还对其与其他微藻菌种的分类学关系特别有兴趣。对被SAG保藏中心命名为Chlorella luteoviridis菌株之SAG 2214的23s rRNA基因进行测序，并与也被SAG和UTEX保藏中心鉴定为的Chlorella luteoviridis其他9个菌株进行比较。这些菌株是UTEX 21、22、28、257和258，以及SAG菌株2133、2196、2198和2203。所使用的测定DNA基因型的方法与上面实施例1中描述的方法相同。利用Geneious DNA分析软件对序列进行比对并建立无根树。在进行基因型测定的9个其他菌株中，UTEX 21、22、28和257具有一致的23s rRNA DNA序列(SEQ ID NO:106)。其他5个Chlorella luteoviridis菌株具有与UTEX21、22、28和257高度同源的23s rRNA序列。
SAG 2214的23s rRNA基因序列(SEQ ID NO:30)与其他9个Chlorellaluteoviridis菌株的序列明显不同，其具有其他菌株中没有的大插入片段。利用BLAST对该23s rRNA基因序列的进一步分析表明，其与钩端螺旋体(Leptosira)和共球藻(Trebouxia)属(地衣中藻类部分的成员)成员的同源性最高。这些结果表明，SAG 2214可能不是如该菌株保藏中心所分类的Chlorella luteoviridis菌株，而是与地衣中的藻类共生体具有显著的23S rRNA核苷酸一致性。基因组分析以及生长特性表明，SAG 2214可能是参与蔗糖代谢之基因和蛋白的来源以及负责使这些酶正确定位之信号肽和转运肽的来源。SAG 2214和具有高度基因组相似性的其他菌株还可以用于利用蔗糖作为固定碳源生产油类。
虽然已经对本发明连同其特定实施方案进行了描述，但是应当理解，能够对其进行进一步修饰。本申请旨在覆盖依照本发明的原理并且包括偏离本文公开内容的本发明的任何变化、用途或者调整，本发明所属领域中已知或者惯例以及适用于上文中阐述的重要特征。
本文中引用的所有参考文献，包括专利、专利申请和出版物在此作为整体通过引用并入本文，不管之前是否具体并入。引用本文中涉及的出版物目的是描述并公开用于本发明的试剂、方法和概念。本文中这些参考文献是与本文中描述的本发明相关的现有技术。特别地，下列专利申请在此为了所有目的作为整体通过引用并入本文：2007年6月1日提交的美国临时申请第60/941,581号，名称为“Production of Hydrocarbons inMicroorganisms”；2007年7月10日提交的美国临时申请第60/959,174号，名称为“Production of Hydrocarbons in Microorganisms”；2007年8月27日提交的美国临时申请第60/968,291号，名称为“Production of Hydrocarbonsin Microorganisms”；2008年1月28日提交的美国临时申请第61/024,069号，名称为“Production of Hydrocarbons in Microorganims”；2008年6月2日提交的PCT申请第PCT/US08/65563号，名称为“Production of Oil inMicroorganisms”；2008年6月2日提交的美国专利申请第12/131,783号，名称为“Use of Cellulosic Material for Cultivation of Microorganisms”；2008年6月2日提交的美国专利申请第12/131,773号，名称为“Renewable Dieseland Jet Fuel from Microbial Sources”；2008年6月2日提交的美国专利申请第12/131,793号，名称为“Sucrose Feedstock Utilization for Oil-Based FuelManufacturing”；2008年6月2日提交的美国专利申请第No.12/131,766号，名称为“Glycerol Feedstock Utilization for Oil-Based FuelManufacturing”；2008年6月2日提交的美国专利申请第No.12/131,804号，名称为“Lipid Pathway Modification in Oil-Bearing Microorganisms”；2008年11月28日提交的美国专利申请第61/118,590号，名称为“Productionof Oil in Microorganisms”；2008年12月1日提交的美国临时专利申请第61/118,994号，名称为“Production of Oil in Microorganisms”；2009年4月3日提交的美国临时专利申请第61/174,357号，名称为“Production of Oil inMicroorganisms”；2009年6月23日提交的美国临时专利申请第61/219,525号，名称为“Production of Oil in Microorganisms”和2009年11月30日提交的PCT申请第__________号[[代理案第026172-005010PC号]]，名称为“Production of Tailored Oils in Heterotrophic Microorganisms”。

Claims (7)

1.一种通过在培养基中培养原藻属细胞群来制备甘油三酯油类组合物的方法，所述细胞包含与启动子可操作连接的外源基因，其中所述方法包括下列步骤：
(a)提供所述原藻属细胞群，其包含外源基因，其中所述外源基因编码ω-6-脂肪酸去饱和酶、ω-3-脂肪酸去饱和酶、ω-6-油酸去饱和酶或硬脂肪酰基-ACP去饱和酶，且其中外源基因整合到细胞的核染色体中；
(b)向所述培养基中加入固定碳源，所述固定碳源选自醋酸酯、红藻糖苷、果糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、鼠李糖、蔗糖、木糖、黑液、玉米淀粉、经解聚的纤维素类物质、蔗汁、高粱糖浆、马铃薯、高粱、甜菜和甘蔗；
(c)培养所述细胞群直到所述细胞积累的脂类为至少10％它们的干细胞重量；以及
(d)从所述培养的细胞中分离所述甘油三酯油类组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述固定碳源选自蔗糖、葡萄糖、果糖、蔗汁和经解聚的纤维素类物质。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述细胞还包含下述外源基因，所述外源基因编码选自下列的蛋白：蔗糖转化酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶、酰基载体蛋白和赋予抗生素抗性的蛋白。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述细胞包含编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的外源基因。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述细胞进一步包含编码蔗糖转化酶的外源基因。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞选自Prototheca moriformis,Prototheca krugani,Prototheca stagnora和Prototheca zopfii。
7.一种通过权利要求1-5中任一项所述的方法制备的甘油三酯油类组合物，其中所述甘油三酯油类组合物具有下列脂质特性：
a.至少4％C8-C14；和
b.一种或者多种下列属性：
i.少于0.4微克/ml的总类胡萝卜素；
ii.少于0.001微克/ml的番茄红素；
iii.少于0.02微克/ml的β-胡萝卜素；
iv.每千克油中少于0.02毫克的叶绿素；
v.每100克油中0.40-0.60毫克的γ-生育酚；
vi.每100克油中3至9mg的菜油甾醇；以及
vii.每克油中少于0.5毫克的总生育三烯酚。
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