ES2742527T3 - Fabricación de aceites personalizados en microorganismos heterotróficos recombinantes - Google Patents

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Aravind Somanchi
Karen Espina
George Rudenko
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Abstract

Una composición de aceite de triglicéridos producida cultivando una población de células de Prototheca recombinantes y extraída de dichas células mediante extracción con solvente o usando una prensa de expulsión, en donde las células comprenden un gen exógeno que codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa, en donde la composición de aceite comprende un perfil lipídico de: (a) al menos 4% C8-C14; y (b) uno o más de los siguientes atributos: i. 0,1-0,4 microgramos/ml de carotenoides totales; ii. menos de 0,4 microgramos/ml de carotenoides totales; iii menos de 0,001 microgramos/ml de licopeno; y iv. menos de 0,02 microgramos/ml de betacaroteno.

Description

DESCRIPCIÓN
Fabricación de aceites personalizados en microorganismos heterotróficos recombinantes
REFERENCIA CRUZADA A APLICACIONES RELACIONADAS
[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio bajo 35 USC 119 (e) de la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. N° 6l/118.590, presentada el 28 de noviembre de 2008, la solicitud de patente provisional de EE.UU. N° 61/118.994, presentada el 1 de diciembre de 2008, Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. N° 61/174,357, presentada el 30 de abril de 2009, y Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos N° 61/219,525, presentada el 23 de junio de 2009.
REFERENCIA A UNA LISTA DE SECUENCIAS
[0002] Esta solicitud incluye una lista de secuencias como se muestra en las páginas 1-72, adjunta a la presente.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0003] La presente inveniton se refiere a la producción de aceites, combustibles y productos oleoquímicos elaborados a partir de microorganismos. En particular, la descripción se refiere a microalgas que contienen aceite, métodos para cultivarlas para la producción de compuestos útiles, incluidos lípidos, ésteres de ácidos grasos, ácidos grasos, aldehidos, alcoholes y alcanos, y métodos y reactivos para alterarlos genéticamente para mejorar la eficiencia de producción y alterar el tipo y composición de los aceites producidos por ellos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0004] El combustible fósil es un término general para los depósitos geológicos combustibles enterrados de materiales orgánicos, formados a partir de plantas y animales en descomposición que han sido convertidos a petróleo crudo, carbón, gas natural, o aceites pesados por la exposición a calor y presión en la corteza terrestre durante cientos de millones de años. Los combustibles fósiles son un recurso finito, no renovable.
[0005] La mayor demanda de energía por parte de la economía global también ha ejercido una presión creciente sobre el costo de los hidrocarburos. Además de la energía, muchas industrias, incluidos los fabricantes de plásticos y productos químicos, dependen en gran medida de la disponibilidad de hidrocarburos como materia prima para sus procesos de fabricación. Las alternativas rentables a las fuentes de suministro actuales podrían ayudar a mitigar la presión al alza sobre la energía y los costos de estas materias primas.
[0006] PCT Pub. N° 2008/151149 describe métodos y materiales para el cultivo de microalgas para la producción de petróleo y ejemplifica particularmente la producción de combustible diesel a partir del aceite producido por los Chlorella prototecoides de microalgas. Sigue existiendo la necesidad de métodos mejorados para producir aceite en microalgas, particularmente para métodos que producen aceites con una longitud de cadena más corta y un mayor grado de saturación y sin pigmentos, con mayor rendimiento y eficiencia. La presente invención satisface esta necesidad.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0007] Una realización de la invención es una composición de aceite triglicérido producida mediante el cultivo de una población de células Prototheca recombinantes y extraída de dichas células a través de la extracción con disolvente o usando una prensa de expulsor, en la que las células comprenden un gen exógeno que codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa, en donde la composición de aceite comprende un perfil lipídico de:
(a) al menos 4% C8-C14; y
(b) uno o más de los siguientes atributos:
i. 0,1-0,4 microgramos/ml de carotenoides totales;
ii. menos de 0,4 microgramos/ml de carotenoides totales;
iii. menos de 0,001 microgramos/ml de licopeno; y
iv. menos de 0.02 microgramos/ml de betacaroteno.
[0008] Otra realización de la invención es un método para preparar un aceite mezclado, en el que la composición de aceite de triglicérido producida por dichas células Prototheca recombinantes y se extrajo a partir de dichas células a través de la extracción con disolvente o usando una prensa de expulsor se mezcla con un aceite seleccionado del grupo que consiste en aceite de soja, aceite de colza, aceite de canola, aceite de palma, aceite de almendra de palma, aceite de coco, aceite de maíz, aceite vegetal residual, aceite de sebo chino, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de semilla de algodón, grasa de pollo, sebo de res, sebo porcino, aceite de microalgas, aceite de macroalgas, aceite de Cuphea, aceite de lino, aceite de maní, grasa blanca de elección, manteca de cerdo, aceite de camelina sativa, aceite de semilla de mostaza, aceite de anacardo, aceite de avena, aceite de lupino, aceite de kenaf, aceite de caléndula, aceite de cáñamo, aceite de café, aceite de linaza (lino), aceite de avellana, aceite de euforbio, aceite de semilla de calabaza, aceite de cilantro, aceite de camelina, aceite de sésamo, aceite de cártamo, aceite de arroz, aceite de árbol de tung, aceite de cacao, aceite de copra, aceite de adormidera, aceite de ricino, aceite de nuez, aceite de jojoba, aceite de jatropha, aceite de macadamia, aceite de nuez de Brasil, aceite de aguacate, petróleo y una fracción de destilado de los mismos.
[0009] Otra realización de la invención es un método de fabricación de un compuesto químico, el método que comprende las etapas de realizar una o más reacciones químicas seleccionadas del grupo que consiste en (a) transesterificación, hidrogenación, hidrocraqueo, desoxigenación, isomerización, interesterificación, hidroxilación, hidrólisis para producir ácidos grasos libres y saponificación, en las composiciones oleosas reivindicadas, o (b) hidroprocesamiento, desoxigenación y eliminación de gases en la composición oleosa producida por dichas células Prototheca recombinantes y extraídas de dichas células a través de extracción con solvente o usando una prensa de expulsión.
[0010] Otra realización de la invención es un método de fabricación de un compuesto químico, comprendiendo el método los pasos de
(i) mezclar la composición de aceite de triglicéridos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 con un aceite seleccionado del grupo que consiste en aceite de soja, aceite de colza, aceite de canola, aceite de palma, aceite de almendra de palma, aceite de coco, aceite de maíz, aceite vegetal residual, sebo chino aceite, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de semilla de algodón, grasa de pollo, sebo de ternera, sebo porcino, aceite de microalgas, aceite de macroalgas, aceite de Cuphea, aceite de lino, aceite de maní, grasa blanca de elección, manteca de cerdo, aceite de camelina sativa, aceite de semilla de mostaza, aceite de anacardo, aceite de avena, aceite de lupino, aceite de kenaf, aceite de caléndula, aceite de cáñamo, aceite de café, aceite de linaza (lino), aceite de avellana, aceite de euforbio, aceite de semilla de calabaza, aceite de cilantro, aceite de camelina, aceite de sésamo, aceite de cártamo, aceite de arroz, aceite de árbol de tung, aceite de cacao, aceite de copra, aceite de adormidera, aceite de ricino, aceite de nuez, aceite de jojoba, aceite de jatropha, aceite de macadamia, aceite de nuez de Brasil, aceite de aguacate, petróleo y una fracción de destilado de los mismos; y
(ii) realizar una o más reacciones químicas seleccionadas del grupo que consiste en (a) transesterificación, hidrogenación, hidrocraqueo, desoxigenación, isomerización, interesterificación, hidroxilación, hidrólisis para producir ácidos grasos libres y saponificación, en la composición de aceite obtenida en (i), o (b) hidroprocesamiento, desoxigenación y eliminación de gas en la composición de aceite obtenida en (i).
[0011] La presente divulgación proporciona células del género Prototheca que comprenden un gen exógeno, y en algunas realizaciones la célula es una cepa de la especie Prototheca moriformis, Prototheca krugani, Prototheca stagnora o Prototheca zopfii y en otra realización, la célula tiene una secuencia ARNr 23S con al menos 70, 75, 80, 85 o 95% de identidad de nucleótidos con una o más de SEQ ID NO: 11-19. En algunas células, el gen exógeno es una secuencia codificante y está en enlace operable con un promotor, y en algunas realizaciones el promotor es de un gen endógeno a una especie del género Prototheca. En realizaciones adicionales, la secuencia de codificación codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en una sacarosa invertasa, una tioesterasa de acil-ACP grasa, una reductasa acil-CoA/aldehído grasa, una reductasa acil-CoA grasa, una reductasa aldehído grasa, un aldehído graso descarbonilasa, una proteína transportadora de acilo y una proteína que imparte resistencia a un antibiótico. Algunas realizaciones de una tioesterasa de acil-ACP grasa que tiene actividad de hidrólisis hacia uno o más sustratos de acil-ACP graso de longitud de cadena C8, C10, C12 o C14, incluyendo tioesterasas de acil-ACP con al menos 50, 60, 70, 80 o 90% de identidad de aminoácidos con una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 59, 61, 63 y 138-140. En realizaciones adicionales, la secuencia codificante comprende una secuencia de plastidios dirigida de microalgas, y en algunas realizaciones la microalga es una especie del género Prototheca o Chlorella, así como otros géneros de la familia Chlorellaceae. En algunas realizaciones, la secuencia de direccionamiento de plastidios tiene al menos 20, 25, 35, 45 o 55% de identidad de secuencia de aminoácidos con una o más de las s Eq ID NO: 127-133 y es capaz de dirigirse a una proteína codificada por un gen exógeno no ubicado en el genoma del plastidio al plastidio. En otras realizaciones, el promotor está regulado positivamente en respuesta a la reducción o eliminación de nitrógeno en los medios de cultivo de la célula, tal como al menos una regulación ascendente de 3 veces según lo determinado por la abundancia de transcripción en una célula del género Prototheca cuando el entorno extracelular cambia de que contiene al menos 10 mM o 5 mM de nitrógeno hasta que no contiene nitrógeno. En realizaciones adicionales, el promotor comprende un segmento de 50 o más nucleótidos de una de las SEQ ID NO: 91-102. En otras realizaciones, la célula tiene una secuencia de ARNr 23S con al menos 70, 75, 80, 85 o 95% de identidad de nucleótidos con una o más de las SEQ ID NO: 11-19. En otras realizaciones, el gen exógeno se integra en un cromosoma de la célula.
[0012] En realizaciones adicionales de células de la presente descripción, la célula es del género Prototheca y comprende una tioesterasa acil-ACP exógena grasa de genes y un perfil de lípidos de por lo menos 4% C8-C14 de los lípidos totales de la célula, una cantidad de C8 que es al menos 0,3% de los lípidos totales de la célula, una cantidad de C10 que es al menos 2% de los lípidos totales de la célula, una cantidad de C12 que es al menos 2% de los lípidos totales de la célula, una cantidad de C14 que es al menos 4% de los lípidos totales de la célula, y una cantidad de C8-C14 que es 10-30%, 20-30%, o al menos 10, 20 o 30% de los lípidos totales de la célula. En algunas realizaciones, la célula comprende además un gen exógeno de sacarosa invertasa. En algunas realizaciones, la célula es una cepa de la especie Prototheca moriformis, Prototheca krugani, Prototheca stagnora o Prototheca zopfii, y en otra realización, la célula tiene una secuencia de ARNr 23S con al menos 70, 75, 80, 85 o 95% de identidad de nucleótidos a una o más de las SEQ ID NO: 11-19. En otras realizaciones, el gen de tioesterasa de acil-ACP grasa exógena se integra en un cromosoma de la célula. Otras realizaciones de la presente descripción comprenden métodos para preparar composiciones de triglicéridos de un perfil lipídico de al menos 4% C8-C14 p/p o porcentaje de área de la composición de triglicéridos, una cantidad de C8 que está en al menos 0,3% p/p o porcentaje de área, una cantidad de C10 que es al menos 2% p/p o porcentaje de área, una cantidad de C12 que es al menos 2% p/p o porcentaje de área, una cantidad de C14 que es al menos 4% p/p o porcentaje de área, y una cantidad de C8-C14 que es 10-30%, 20-30%, o al menos 10, 20 o 30% p/p o porcentaje de área. La invención también comprende métodos para preparar composiciones de triglicéridos que comprenden cultivar las células anteriores, en donde las células también comprenden un gen exógeno que codifica una invertasa de sacarosa y se proporciona sacarosa como fuente de carbono. En una descripción, la sacarosa invertasa tiene al menos 50, 60, 70, 80 o 90% de identidad de aminoácidos con una o más de las SEQ ID NO: 3, 20-29 y 90.
[0013] Las realizaciones de la divulgación incluyen composiciones de aceite de triglicéridos producidas cultivando una población de células de Prototheca recombinantes y extraídas de dichas células mediante extracción con disolvente o usando una prensa de expulsión como se describe en las reivindicaciones, así como células que contienen composiciones de aceite de triglicéridos que comprenden un perfil lipídico de al menos 4% de C8-C14 y uno o más de los siguientes atributos: 0,1-0,4 microgramos/ml de carotenoides totales, menos de 0,4 microgramos/ml de carotenoides totales, menos de 0,001 microgramos/ml de licopeno; menos de 0,02 microgramos/ml de betacaroteno, menos de 0,02 miligramos de clorofila por kilogramo de aceite; 0,40-0,60 miligramos de gamma tocoferol por 100 gramos de aceite; 0,2-0,5 miligramos de tocotrienoles totales por gramo de aceite, menos de 0,4 miligramos de tocotrienoles totales por gramo de aceite, 4-8 |jg por 100 gramos de aceite de campesterol y 40-60 |jg por 100 gramos de aceite de estigmasterol. En algunas realizaciones de la descripción, las composiciones de aceite de triglicéridos tienen un perfil de lípidos de al menos 4% C8-C14 p/p o porcentaje de área de la composición de triglicéridos, una cantidad de C8 que es al menos 0,3% p/p o porcentaje de área, una cantidad de C10 que es al menos 2% p/p o porcentaje de área, una cantidad de C12 que es al menos 2% p/p o porcentaje de área, una cantidad de C14 que es al menos 4% p/p o porcentaje de área, y una cantidad de C8-C14 que es 10-30%, 20-30%, o al menos 10, 20 o 30% p/p o porcentaje de área. En otras realizaciones, la composición de aceite de triglicéridos se mezcla con al menos otra composición seleccionada del grupo que consiste en soja, colza, canola, palma, almendra de palma, coco, maíz, vegetales de desecho, sebo chino, oliva, girasol, semilla de algodón. grasa de pollo, sebo de res, sebo porcino, microalgas, macroalgas, Cuphea, lino, maní, grasa blanca de elección, manteca de cerdo, Camelina sativa, anacardo de semilla de mostaza, avena, lupino, kenaf, caléndula, cáñamo, café, linaza (lino), avellana, euforbio, semilla de calabaza, cilantro, camelia, sésamo, cártamo, arroz, tung, cacao, copra, amapola, ricino, nuez, jojoba, jatropha, macadamia, nueces de Brasil, aguacate, petróleo o una fracción destilada de cualquiera de los aceites anteriores.
[0014] Los métodos de la divulgación también incluyen el procesamiento de los aceites antes mencionados realizando una o más reacciones químicas de la lista que consiste en transesterificación, hidrogenación, hidrocraqueo, desoxigenación, isomerización, interesterificación, hidroxilación, hidrólisis para producir ácidos grasos libres y saponificación. La presente descripción también incluye combustibles de hidrocarburos hechos de hidrogenación e isomerización de los aceites mencionados anteriormente y ésteres de alquilo de ácido graso hechos de transesterificación de los aceites mencionados anteriormente. En una descripción, el combustible de hidrocarburos está hecho de triglicéridos aislados de células del género Prototheca en donde el rango de destilación ASTM D86 T10-T90 es al menos 25°C. En otra descripción, el combustible de éster alquílico de ácido graso está hecho de triglicéridos aislados de células del género Prototheca, en donde la composición tiene un tiempo de remojo en frío ASTM D6751 A1 de menos de 120 segundos.
[0015] La presente descripción también incluye composición que comprende (a) polisacárido que comprende uno o más monosacáridos de la lista que consiste en 20-30 por ciento en moles de galactosa; 55-65 por ciento en moles de glucosa; y 5-15 por ciento en moles de manosa; (b) proteína; y (c) ADN que comprende una secuencia de ARNr 23S con al menos 70, 75, 80, 85 o 95% de identidad de nucleótidos con una o más de las SEQ ID NO: 11-19; y (d) un gen exógeno. En algunas realizaciones, el gen exógeno se selecciona de una sacarosa invertasa y una tioesterasa de acil-ACP grasa, y en realizaciones adicionales la composición comprende además lípidos con un perfil lipídico de al menos 4% de C8-C14. En otras realizaciones, la composición está formulada para el consumo como alimento para animales.
[0016] La presente descripción incluye los ácidos nucleicos recombinantes que codifican promotores que están regulados por incremento en respuesta a la reducción o eliminación de nitrógeno en el medio de cultivo de una célula del género Prototheca, tal como al menos una regulación por incremento de 3 veces como se determina por la abundancia de transcripción cuando el entorno extracelular cambia de contener al menos 10 mM o 5 mM de nitrógeno a no contener nitrógeno. En una divulgación, el ácido nucleico recombinante comprende un segmento de 50 o más nucleótidos de una de las SEQ ID NO: 91-102. La presente descripción también incluye vectores de ácido nucleico que comprenden un casete de expresión que comprende (a) un promotor que es activo en una célula del género Prototheca; y (b) una secuencia de codificación en enlace operable con el promotor en la que la secuencia de codificación contiene los codones más preferidos o más preferidos en segundo lugar de la Tabla 1 para al menos 20, 30, 40, 50, 60 u 80% de los codones de la secuencia de codificación. En algunos vectores, la secuencia de codificación comprende una secuencia de direccionamiento de plastidio en marco con una tioesterasa de acil-ACP grasa, que incluye tioesterasa que tiene actividad de hidrólisis hacia uno o más sustratos de acil-ACP graso de longitud de cadena C8, C10, C12 o C14. Algunos vectores incluyen secuencias de direccionamiento de plastidios que codifican péptidos que son capaces de dirigir una proteína al plastidio de una célula del género Prototheca, incluidos los de microalgas y aquellos en los que la secuencia de direccionamiento de plastidios tiene al menos 20, 25, 35, 45 o identidad de secuencia de aminoácidos del 55% con una o más de SEQ ID NO. 127-133 y es capaz de dirigir una proteína al plastidio de una célula del género Prototheca. Los vectores adicionales de la presente descripción comprenden secuencias de ácido nucleico endógenas al genoma nuclear de una célula del género Prototheca, en donde la secuencia tiene al menos 200 nucleótidos de longitud, y algunos vectores comprenden secuencias de ácido nucleico primera y segunda endógenas al genoma nuclear de una célula del género Prototheca, en donde las secuencias primera y segunda (a) tienen cada una al menos 200 nucleótidos de longitud; (b) flanquear el casete de expresión; y (c) se encuentran en el mismo cromosoma Prototeca a no más de 5, 10, 15, 20 y 50kB de distancia.
[0017] La presente descripción también incluye un ácido nucleico recombinante con al menos 80, 90, 95 o 98% de identidad de nucleótidos con una o ambas de SEQ ID NOs: 134-135 y un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína con al menos 80, 90, 95 o 98% de identidad de aminoácidos con una o ambas de SEQ ID NO: 136-137.
[0018] La presente descripción también comprende métodos para producir composiciones de triglicéridos, que comprenden (a) cultivar una población de células del género Prototheca en presencia de una fuente de carbono fijo, en donde: (i) las células contienen un gen exógeno; (ii) las células acumulan al menos 10, 20, 30, 40, 60 o 70% de su peso de células secas como lípidos; y (iii) la fuente de carbono fija se selecciona del grupo que consiste en sorgo y material celulósico despolimerizado; y (b) aislar componentes lipídicos de los microorganismos cultivados. En una descripción, la fuente de carbono fija es material celulósico despolimerizado seleccionado del grupo que consiste en rastrojo de maíz, Miscanthus, sorgo forrajero, pulpa de remolacha azucarera y bagazo de caña de azúcar, opcionalmente que ha sido lavado con agua antes de la etapa de cultivo. En algunos métodos, la fuente de carbono fija es material celulósico despolimerizado y el nivel de glucosa del material celulósico despolimerizado se concentra a un nivel de al menos 300 g/litro, al menos 400 g/litro, al menos 500 g/litro, o al menos 600 g/litro antes del paso de cultivo y se alimenta al cultivo con el tiempo a medida que las células crecen y acumulan lípidos. En algunos métodos, el gen exógeno codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa que tiene actividad de hidrólisis hacia uno o más sustratos de acil-ACP graso de longitud de cadena C8, C10, C12 o C14, y en algunos métodos el triglicérido tiene un perfil lipídico de al menos 4% de C8-C14 y uno o más de los siguientes atributos: 0,1-0,4 microgramos/ml de carotenoides totales; menos de 0,02 miligramos de clorofila por kilogramo de aceite; 0,40-0,60 miligramos de gamma tocoferol por 100 gramos de aceite; 0,2-0,5 miligramos de tocotrienoles totales por gramo de aceite, 4-8 |jg por 100 gramos de aceite de campesterol y 40-60 jg por 100 gramos de aceite de estigmasterol.
[0019] Otras realizaciones de la presente descripción incluyen la producción de una composición de triglicéridos, que comprende: (a) cultivar una población de microorganismos en presencia de material celulósico despolimerizado, en el que: (i) el material celulósico despolimerizado se somete a lavado con agua antes de la etapa de cultivo; (ii) las células acumulan al menos 10, 20, 30, 40, 60 o 70% de su peso de células secas como lípidos; y (iii) el material celulósico despolimerizado se concentra en al menos 300, 400, 500 o 600 g/litro de glucosa antes de la etapa de cultivo; (iv) los microorganismos se cultivan en una reacción discontinua alimentada en la que se alimenta a los microorganismos de material celulósico despolimerizado de al menos 300, 400, 500 o 600 g/litro de glucosa; y (b) aislar componentes lipídicos de los microorganismos cultivados. En algunas realizaciones, la fuente de carbono fija es material celulósico despolimerizado seleccionado del grupo que consiste en rastrojo de maíz, Miscanthus, sorgo forrajero, pulpa de remolacha azucarera y bagazo de caña de azúcar. En realizaciones adicionales, los microorganismos son una especie del género Prototheca y contienen un gen exógeno, que incluye una tioesterasa de acil-ACP grasa que tiene actividad de hidrólisis hacia uno o más sustratos de acil-ACP graso de longitud de cadena C8, C10, C12 o C14. Un método adicional de la presente descripción comprende la fabricación de aceite de triglicéridos que comprende cultivar una célula que tiene una secuencia de ARNr 23S con al menos 90 o 96% de identidad de nucleótidos con la SEQ ID NO: 30 en presencia de sacarosa como fuente de carbono.
[0020] La presente descripción también incluye métodos de fabricación de un producto químico que comprende realizar una o más reacciones químicas a partir de la lista que consiste en la transesterificación, hidrogenación, hidrocraqueo, desoxigenación, isomerización, interesterificación, hidroxilación, hidrólisis, y la saponificación en un aceite de triglicérido, en donde el aceite tiene un perfil lipídico de al menos 4% de C8-C14 y uno o más de los siguientes atributos: 0,1-0,4 microgramos/ml de carotenoides totales; menos de 0,02 miligramos de clorofila por kilogramo de aceite; 0,10-0,60 miligramos de gamma tocoferol por 100 gramos de aceite; 0,1-0,5 miligramos de tocotrienoles totales por gramo de aceite, 1-8 jg por 100 gramos de aceite de campesterol y 10-60 jg por 100 gramos de aceite de estigmasterol. Algunos métodos se realizan fabricando el aceite cultivando una célula del género Prototheca que comprende un gen de tioesterasa de acil-ACP grasa exógena que codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa que tiene actividad de hidrólisis hacia uno o más sustratos de acil-ACP graso de longitud de cadena C8, C10, C12 o C14. En algunos métodos, la reacción de hidrólisis se selecciona del grupo que consiste en saponificación, hidrólisis ácida, hidrólisis alcalina, hidrólisis enzimática, hidrólisis catalítica e hidrólisis de agua comprimida en caliente, incluida una reacción de hidrólisis catalítica en la que el aceite se divide en glicerol y ácidos grasos. En otros métodos, los ácidos grasos experimentan una reacción de aminación para producir compuestos de nitrógeno graso o una reacción de ozonólisis para producir ácidos mono y dibásicos. En algunas realizaciones, el aceite se somete a un método de división de triglicéridos seleccionado del grupo que consiste en división enzimática y división a presión. En algunos métodos, una reacción de condensación sigue a la reacción de hidrólisis. Otros métodos incluyen realizar una reacción de hidroprocesamiento en el aceite, opcionalmente en el que el producto de la reacción de hidroprocesamiento experimenta una reacción de desoxigenación o una reacción de condensación antes o simultáneamente con la reacción de hidroprocesamiento. Algunos métodos incluyen adicionalmente una reacción de eliminación de gas. Los métodos adicionales incluyen el procesamiento de los aceites antes mencionados mediante la realización de una reacción de desoxigenación seleccionada del grupo que consiste en: una reacción de hidrogenólisis, hidrogenación, una reacción consecutiva de hidrogenación-hidrogenólisis, una reacción consecutiva de hidrogenólisis-hidrogenación y una reacción combinada de hidrogenación-hidrogenólisis. En algunos métodos, una reacción de condensación sigue a la reacción de desoxigenación. Otros métodos incluyen realizar una reacción de esterificación en los aceites mencionados anteriormente, opcionalmente una reacción de interesificación o una reacción de transesterificación. Otros métodos incluyen realizar una reacción de hidroxilación en los aceites mencionados anteriormente, opcionalmente en donde una reacción de condensación sigue a la reacción de hidroxilación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0021]
Las Figuras 1 y 2 ilustran las curvas de crecimiento de las especies de Prototheca y la cepa Chlorella luteoviridis SAG 2214 cultivadas en sorgo como fuente de carbono.
La Figura 3 muestra el crecimiento en el transcurso del tiempo de SAG 2214 en glucosa y sacarosa.
La Figura 4 muestra mapas de los casetes que se usan en transformaciones de Prototheca, como se describe en el Ejemplo 3.
La Figura 5 muestra los resultados del análisis de transferencia Southern en tres transformantes de la cepa UTEX 1435, como se describe en el Ejemplo 3.
La Figura 6 muestra un esquema de la construcción transgénica cod2 optimizada y no codificada optimizada suc2 (levadura sacarosa invertasa (yInv)). Se indican los sitios de clonación de restricción relevantes y las flechas indican la dirección de la transcripción.
La Figura 7a muestra los resultados de Prototheca moriformis cultivados en azúcares derivados de la celulosa (pasta de maíz, pulpa de remolacha, caña de sorgo, Miscanthus y control de glucosa). El crecimiento se expresa en mediciones de densidad óptica (lecturas de A750).
La Figura 7b muestra los resultados de los experimentos de crecimiento utilizando Prototheca moriformis utilizando diferentes niveles de azúcar celulósico derivado de la mazorca de maíz en comparación con el control de glucosa/xilosa.
La Figura 7c muestra el impacto que tiene la xilosa en la producción de lípidos en cultivos de Prototheca. La Figura 7d muestra el impacto de la concentración de sal (Na2SO4) y antiespumante en el crecimiento (en peso de células secas (DCW)) de Prototheca.
La Figura 8 muestra el impacto del tratamiento hidrotérmico de diversos materiales celulósicos (bagazo de caña de azúcar, caña de sorgo, miscanthus y pulpa de remolacha) y la corriente de azúcar resultante en el crecimiento de Prototheca.
La Figura 9 muestra niveles decrecientes de hidroximetil furfurales (HMF) y furfurales en biomasa celulósica (bagazo de caña de azúcar, caña de sorgo, miscanthus y pulpa de remolacha) después de ciclos repetidos de tratamiento hidrotérmico.
La Figura 10 muestra un esquema de un proceso de sacarificación de materiales celulósicos para generar corrientes de azúcar adecuadas para su uso en la producción de aceite heterotrófico en un fermentador. La Figura 11 muestra niveles decrecientes de h Mf y furfural en el bagazo de caña de azúcar explotado después de ciclos repetidos de tratamiento hidrotérmico.
La Figura 12 muestra un esquema de construcciones de tioesterasa usadas en las transformaciones de Prototheca. Los promotores heterólogos de beta-tubulina (NeoR) y glutamato deshidrogenasa se derivan de Chlamydomonas reinhardtii y Chlorella sorokiniana, respectivamente. La reductasa de nitrato 3'UTR se deriva de Chlorella vulgaris. Se indican los sitios de clonación de restricción relevantes y las flechas indican la dirección de la transcripción.
La Figura 13 muestra un cromatograma de diesel renovable producido a partir de aceite de triglicéridos Prototheca.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0022] La presente invención surge del descubrimiento de que Prototheca y ciertos microorganismos relacionados tienen propiedades inesperadamente ventajosas para la producción de aceites, combustibles, y otras composiciones de hidrocarburos o de lípidos económicamente y en grandes cantidades, así como desde el descubrimiento de métodos y reactivos para alterar genéticamente estos microorganismos para mejorar estas propiedades. Los aceites producidos por estos microorganismos se pueden usar en las industrias de combustible de transporte, petroquímica y/o alimentaria y cosmética, entre otras aplicaciones. La transesterificación de lípidos produce ésteres de ácidos grasos de cadena larga útiles como biodiesel. Se pueden adaptar otros procesos enzimáticos y químicos para producir ácidos grasos, aldehídos, alcoholes, alcanos y alquenos. En algunas aplicaciones, se producen diesel renovable, combustible para aviones u otros compuestos de hidrocarburos. La presente descripción también proporciona métodos para cultivar microalgas para una mayor productividad y un mayor rendimiento de lípidos, y/o para una producción más rentable de las composiciones descritas aquí.
[0023] Esta descripción detallada de la invención se divide en secciones para la comodidad del lector. La Sección I proporciona definiciones de los términos utilizados en este documento. La sección 2 proporciona una descripción de las condiciones de cultivo útiles en los métodos de la invención. La Sección 3 proporciona una descripción de los métodos y materiales de ingeniería genética. La Sección 4 proporciona una descripción de la ingeniería genética de Prototheca para permitir la utilización de sacarosa. La Sección 5 proporciona una descripción de la ingeniería genética de Prototheca para modificar la biosíntesis de lípidos. La Sección 6 describe los métodos para fabricar combustibles y productos químicos. La sección 7 describe ejemplos y realizaciones de la invención. La descripción detallada de la invención es seguida por ejemplos que ilustran los diversos aspectos y realizaciones de la invención.
I. DEFINICIONES
[0024] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan a una persona con habilidad con una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed. 1994); El Cambridge Dictionary of Science and Technology (Ed. Walker, 1988); The Glossary of Genetics, 5a ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Como se usa en este documento, los siguientes términos tienen el significado que se les atribuye a menos que se especifique lo contrario.
[0025] "Activo en microalgas" se refiere a un ácido nucleico que es funcional en microalgas. Por ejemplo, un promotor que se ha utilizado para impulsar un gen de resistencia a antibióticos para impartir resistencia a antibióticos a una microalga transgénica es activo en microalgas.
[0026] La "proteína portadora de acilo" o "ACP" es una proteína que se une a una cadena de acilo en crecimiento durante la síntesis de ácidos grasos como un éster de tiol en el tiol distal del resto 4'-fosfopanteteína y comprende un componente del complejo de ácido graso sintasa.
[0027] "Molécula de acil-CoA" o "acil-CoA" es una molécula que comprende un resto acilo unido covalentemente a la coenzima A a través de un enlace éster de tiol en el tiol distal de la fracción 4'-fosfopanteteína de la coenzima A.
[0028] "Porcentaje de área" se refiere al área de picos observada usando los métodos de detección FAME GC/FID en los que cada ácido graso en la muestra se convierte en un éster metílico de ácido graso (FAME) antes de la detección. Por ejemplo, se observa un pico separado para un ácido graso de 14 átomos de carbono sin insaturación (C14:0) en comparación con cualquier otro ácido graso como C14:1. El área del pico para cada clase de FAME es directamente proporcional a su composición porcentual en la mezcla y se calcula en función de la suma de todos los picos presentes en la muestra (es decir, [área bajo el pico específico/área total de todos los picos medidos] X 100). Cuando se hace referencia a los perfiles lipídicos de aceites y células de la invención, "al menos 4% C8-C14" significa que al menos 4% de los ácidos grasos totales en la célula o en la composición de glicerolípidos extraídos tienen una longitud de cadena que incluye 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono.
[0029] "Axénico" es un cultivo de un organismo libre de contaminación por otros organismos vivos.
[0030] "Biodiesel" es un éster de alquilo de ácido graso producido biológicamente adecuado para su uso como combustible en un motor diesel.
[0031] La "biomasa" es un material producido por crecimiento y/o propagación de células. La biomasa puede contener células y/o contenido intracelular, así como el material extracelular, incluye, pero no se limita a, compuestos secretados por una célula.
[0032] El "biorreactor" es un recinto o recinto parcial en el que se cultivan células, opcionalmente en suspensión.
[0033] El "catalizador" es un agente, tal como una molécula o complejo macromolecular, capaz de facilitar o promover una reacción química de un reactivo a un producto sin convertirse en parte del producto. Un catalizador aumenta la velocidad de una reacción, después de lo cual, el catalizador puede actuar sobre otro reactivo para formar el producto. Un catalizador generalmente reduce la energía de activación global requerida para la reacción, de modo que se desarrolla más rápidamente o a una temperatura más baja. Por lo tanto, se puede lograr un equilibrio de reacción más rápidamente. Los ejemplos de catalizadores incluyen enzimas, que son catalizadores biológicos; calor, que es un catalizador no biológico; y metales utilizados en procesos de refinación de petróleo fósil.
[0034] El "material celulósico" es el producto de la digestión de la celulosa, que incluye glucosa y xilosa, y opcionalmente compuestos adicionales tales como disacáridos, oligosacáridos, lignina, furfural y otros compuestos. Ejemplos no limitantes de fuentes de material celulósico incluyen bagazos de caña de azúcar, pulpa de remolacha azucarera, rastrojo de maíz, astillas de madera, aserrín y hierba de interruptor.
[0035] El "cocultivo" y sus variantes, tales como "cocultivo" y "co-fermentación", se refieren a la presencia de dos o más tipos de células en el mismo biorreactor. Los dos o más tipos de células pueden ser microorganismos, como microalgas, o pueden ser células microalgales cultivadas con un tipo celular diferente. Las condiciones de cultivo pueden ser aquellas que fomentan el crecimiento y/o la propagación de los dos o más tipos de células o aquellas que facilitan el crecimiento y/o la proliferación de una, o un subconjunto, de las dos o más células mientras se mantiene el crecimiento celular para el resto.
[0036] "Cofactor" es cualquier molécula, distinta de la del sustrato, que se requiere para una enzima para llevar a cabo su actividad enzimática.
[0037] "ADN complementario" o "ADNc" es una copia de ADN de ARNm, generalmente obtenida por transcripción inversa de ARN mensajero (ARNm) o amplificación (p. ej., mediante reacción en cadena de la polimerasa ("PCR")).
[0038] "Cultivado", y sus variantes, tales como "cultivado" y "fermentado", se refieren al fomento intencional del crecimiento (aumentos en el tamaño celular, contenido celular y/o actividad celular) y/o propagación (aumentos en números de células por mitosis) de una o más células mediante el uso de condiciones seleccionadas y/o controladas. La combinación de crecimiento y propagación puede denominarse proliferación. Los ejemplos de condiciones seleccionadas y/o controladas incluyen el uso de un medio definido (con características conocidas como pH, fuerza iónica y fuente de carbono), temperatura especificada, tensión de oxígeno, niveles de dióxido de carbono y crecimiento en un biorreactor. Cultivar no se refiere al crecimiento o propagación de microorganismos en la naturaleza o de otro modo sin intervención humana; Por ejemplo, el crecimiento natural de un organismo que finalmente se fosiliza para producir petróleo crudo geológico no es cultivo.
[0039] La "citólisis" es la lisis de células en un entorno hipotónico. La citólisis es causada por una ósmosis excesiva o movimiento de agua hacia el interior de una célula (hiperhidratación). La célula no puede soportar la presión osmótica del agua en el interior, por lo que explota.
[0040] La "comida delipidada" y la "biomasa microbiana delipidada" es biomasa microbiana después de que el aceite (incluidos los lípidos) ha sido extraído o aislado de él, ya sea mediante el uso de mecánica (es decir, ejercida por una prensa de expulsión) o extracción con solvente o ambos. La comida delipidada tiene una cantidad reducida de aceite/lípidos en comparación con antes de la extracción o aislamiento de aceite/lípidos de la biomasa microbiana, pero contiene algo de aceite/lípido residual.
[0041] "Vector de expresión" o "construcción de expresión" o "plásmido" o "construcción de ADN recombinante" se refieren a un ácido nucleico que se ha generado mediante intervención humana, incluso por medios recombinantes o síntesis química directa, con una serie de elementos de ácido nucleico específicos que permiten la transcripción y/o traducción de un ácido nucleico particular en una célula huésped. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, el vector de expresión incluye un ácido nucleico para ser transcrito operativamente unido a un promotor.
[0042] El "gen exógeno" es un ácido nucleico que codifica la expresión de un ARN y/o proteína que se ha introducido ("transformado") en una célula. Una célula transformada se puede denominar célula recombinante, en la que se pueden introducir genes exógenos adicionales. El gen exógeno puede ser de una especie diferente (y tan heteróloga), o de la misma especie (y tan homóloga), en relación con la célula que se está transformando. Por lo tanto, un gen exógeno puede incluir un gen homólogo que ocupa una ubicación diferente en el genoma de la célula o está bajo un control diferente, en relación con la copia endógena del gen. Un gen exógeno puede estar presente en más de una copia en la célula. Un gen exógeno puede mantenerse en una célula como una inserción en el genoma o como una molécula episomal.
[0043] "Proporcionado exógenamente" se refiere a una molécula proporcionada a los medios de cultivo de un cultivo celular.
[0044] El "prensado del expulsor" es un método mecánico para extraer aceite de materias primas tales como soja y colza. Una prensa de expulsión es una máquina de tipo tornillo, que presiona el material a través de una cavidad en forma de barril enjaulada. Las materias primas entran por un lado de la prensa y la torta gastada sale por el otro lado mientras el aceite se filtra entre las barras de la jaula y se recoge. La máquina utiliza la fricción y la presión continua de las unidades de tornillo para mover y comprimir la materia prima. El aceite se filtra a través de pequeñas aberturas que no permiten el paso de sólidos. A medida que se presiona la materia prima, la fricción generalmente hace que se caliente.
[0045] La "tioesterasa de acil-ACP grasa" es una enzima que cataliza la escisión de un ácido graso de una proteína portadora de acilo (ACP) durante la síntesis de lípidos.
[0046] La "reductasa acil-CoA/aldehído grasa" es una enzima que cataliza la reducción de una molécula de acil-CoA a un alcohol primario.
[0047] La "reductasa acil-CoA grasa" es una enzima que cataliza la reducción de una molécula de acil-CoA a un aldehido.
[0048] La "descarbonilasa de aldehído graso" es una enzima que cataliza la conversión de un aldehído graso en un alcano.
[0049] La "reductasa de aldehído graso" es una enzima que cataliza la reducción de un aldehído a un alcohol primario.
[0050] La "fuente de carbono fija" es una molécula que contiene carbono, típicamente una molécula orgánica, que está presente en temperatura ambiente y presión en forma sólida o líquida en un medio de cultivo que puede ser utilizado por un microorganismo cultivado en el mismo.
[0051] El "homogenado" es biomasa que ha sido alterada físicamente.
[0052] El "hidrocarburo" es (a) una molécula que contiene solo átomos de hidrógeno y carbono en donde los átomos de carbono son unidos covalentemente para formar una cadena principal lineal, ramificada, cíclica o parcialmente cíclica a la que están unidos los átomos de hidrógeno. La estructura molecular de los compuestos de hidrocarburos varía desde la más simple, en forma de metano (CH4), que es un componente del gas natural, hasta la muy pesada y muy compleja, como algunas moléculas como los asfaltenos que se encuentran en el petróleo crudo, el petróleo y betunes. Los hidrocarburos pueden estar en forma gaseosa, líquida o sólida, o cualquier combinación de estas formas, y pueden tener uno o más enlaces dobles o triples entre átomos de carbono adyacentes en la cadena principal. En consecuencia, el término incluye alcanos, alquenos, lípidos y parafina lineales, ramificados, cíclicos o parcialmente cíclicos. Los ejemplos incluyen propano, butano, pentano, hexano, octano y escualeno.
[0053] La "relación hidrógeno:carbono" es la relación de átomos de hidrógeno a átomos de carbono en una molécula en una base de átomo a átomo. La relación puede usarse para referirse al número de átomos de carbono e hidrógeno en una molécula de hidrocarburo. Por ejemplo, el hidrocarburo con la relación más alta es metano CH4(4:1).
[0054] La "fracción hidrófoba" es la porción, o fracción, de un material que es más soluble en una fase hidrófoba en comparación con una fase acuosa. Una fracción hidrófoba es sustancialmente insoluble en agua y generalmente no polar.
[0055] "Aumentar el rendimiento de lípidos" se refiere a un aumento en la productividad de un cultivo microbiano, por ejemplo, aumentando el peso seco de las células por litro de cultivo, aumentando el porcentaje de células que constituyen lípidos, o aumentando la cantidad total de lípidos por litro de volumen de cultivo por unidad de tiempo.
[0056] El "promotor inducible" es un promotor que media en la transcripción de un gen unido operativamente en respuesta a un estímulo particular.
[0057] "En unión operativa" es un enlace funcional entre dos secuencias de ácido nucleico, una secuencia tal control (típicamente un promotor) y la secuencia ligada (típicamente una secuencia que codifica una proteína, también llamada una secuencia de codificación). Un promotor está en enlace operable con un gen exógeno si puede mediar la transcripción del gen.
[0058] "In situ" significa "en el lugar" o "en su posición original".
[0059] "Limitar la concentración de un nutriente" es una concentración de un compuesto en un cultivo que limita la propagación de un organismo cultivado. Una "concentración no limitante de un nutriente" es una concentración que soporta la propagación máxima durante un período de cultivo dado. Por lo tanto, el número de células producidas durante un período de cultivo dado es menor en presencia de una concentración limitante de un nutriente que cuando el nutriente no es limitante. Se dice que un nutriente está "en exceso" en una cultivo, cuando el nutriente está presente en una concentración mayor que la que soporta la propagación máxima.
[0060] La "lipasa" es una enzima soluble en agua que cataliza la hidrólisis de enlaces éster en sustratos lípidos insolubles en agua. Las lipasas catalizan la hidrólisis de los lípidos en gliceroles y ácidos grasos.
[0061] La "enzima de modificación de lípidos" se refiere a una enzima que altera la estructura covalente de un lípido. Los ejemplos de enzimas de modificación de lípidos incluyen una lipasa, una tioesterasa de acil-ACP grasa, una reductasa acil-CoA/aldehído grasa, una reductasa acil-CoA grasa, una reductasa aldehído grasa y una descarbonilasa aldehído grasa.
[0062] La "enzima de la ruta de los lípidos" es cualquier enzima que desempeña un papel en el metabolismo de los lípidos, es decir, síntesis, modificación o degradación de los lípidos, y cualquier proteína que modifique químicamente los lípidos, así como las proteínas transportadoras.
[0063] Los "lípidos" son una clase de moléculas que son solubles en solventes no polares (tales como éter y cloroformo) y son relativamente o completamente insolubles en agua. Las moléculas de lípidos tienen estas propiedades, ya que consisten principalmente en colas largas de hidrocarburos que son de naturaleza hidrófoba. Los ejemplos de lípidos incluyen ácidos grasos (saturados e insaturados); glicéridos o glicerolípidos (tales como monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos o grasas neutras, y fosfoglicéridos o glicerofosfolípidos); no glicéridos (esfingolípidos, lípidos de esteroles que incluyen colesterol y hormonas esteroides, lípidos de prenol que incluyen terpenoides, alcoholes grasos, ceras y policétidos); y derivados de lípidos complejos (lípidos ligados al azúcar, o glicolípidos, y lípidos ligados a proteínas). Las "grasas" son un subgrupo de lípidos llamados "triacilglicéridos".
[0064] El "lisado" es una solución que contiene el contenido de las células lisadas.
[0065] "Lisis" es la rotura de la membrana plasmática y opcionalmente la pared celular de un organismo biológico suficiente para liberar al menos algo de contenido intracelular, a menudo por mecanismos mecánicos, virales u osmóticos que comprometen su integridad.
[0066] La "lisis" altera la membrana celular y opcionalmente la pared celular de un organismo biológico o célula suficiente para liberar al menos algo de contenido intracelular.
[0067] "Microalgas" es un organismo microbiano eucaritótico que contiene un cloroplasto o plastidio, y, opcionalmente, que es capaz de realizar la fotosíntesis, o un organismo microbiano procariota capaz de realizar la fotosíntesis. Las microalgas incluyen fotoautótrofos obligados, que no pueden metabolizar una fuente fija de carbono como energía, así como los heterotróficos, que pueden vivir únicamente de una fuente fija de carbono. Las microalgas incluyen organismos unicelulares que se separan de las células hermanas poco después de la división celular, como Chlamydomonas, así como microbios como, por ejemplo, Volvox, que es un microbio fotosintético multicelular simple de dos tipos de células distintas. Las microalgas incluyen células como Chlorella, Dunaliella y Prototheca. Las microalgas también incluyen otros organismos fotosintéticos microbianos que exhiben adhesión célula-célula, como Agmenellum, Anabaena y Pyrobotrys. Las microalgas también incluyen microorganismos heterotróficos obligados que han perdido la capacidad de realizar fotosíntesis, como ciertas especies de algas dinoflageladas y especies del género Prototheca.
[0068] El "microorganismo" y el "microbio" son organismos unicelulares microscópicos.
[0069] "Coexpresado naturalmente" con referencia a dos proteínas o genes significa que las proteínas o sus genes son coexpresados naturalmente en un tejido u organismo del que derivan, por ejemplo, porque los genes que codifican las dos proteínas están bajo el control de una secuencia reguladora común o porque se expresan en respuesta al mismo estímulo.
[0070] El "choque osmótico" es la ruptura de las células en una solución después de una reducción repentina de la presión osmótica. El choque osmótico a veces se induce para liberar componentes celulares de tales células en una solución.
[0071] La "enzima que degrada el polisacárido" es cualquier enzima capaz de catalizar la hidrólisis, o sacarificación, de cualquier polisacárido. Por ejemplo, las celulasas catalizan la hidrólisis de la celulosa.
[0072] "Polisacáridos" o "glicanos" son carbohidratos compuestos de monosacáridos unidos entre sí por enlaces glicosídicos. La celulosa es un polisacárido que forma ciertas paredes celulares de las plantas. La celulosa puede ser despolimerizada por enzimas para producir monosacáridos como xilosa y glucosa, así como disacáridos y oligosacáridos más grandes.
[0073] "Promotor" es una secuencia de control de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Como se usa en el presente documento, un promotor incluye secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción, tal como, en el caso de un promotor de tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor también incluye opcionalmente elementos potenciadores o represores distales, que pueden ubicarse hasta varios miles de pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción.
[0074] "Recombinante" es una célula, ácido nucleico, proteína o vector, que se ha modificado debido a la introducción de un ácido nucleico exógeno o la alteración de un ácido nucleico nativo. Por lo tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos de manera diferente que esos genes son expresados por una célula no recombinante. Un "ácido nucleico recombinante" es un ácido nucleico originalmente formado in vitro, en general, mediante la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, usando polimerasas y endonucleasas, o de otra manera está en una forma que normalmente no se encuentra en la naturaleza. Se pueden producir ácidos nucleicos recombinantes, por ejemplo, para colocar dos o más ácidos nucleicos en enlaces operables. Por lo tanto, un ácido nucleico aislado o un vector de expresión formado in vitro ligando moléculas de ADN que normalmente no están unidas en la naturaleza, ambos se consideran recombinantes para los fines de esta invención. Una vez que se produce un ácido nucleico recombinante y se introduce en una célula u organismo huésped, puede replicarse usando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped; sin embargo, dichos ácidos nucleicos, una vez producidos de forma recombinante, aunque posteriormente replicados intracelularmente, todavía se consideran recombinantes para los fines de esta invención. De manera similar, una "proteína recombinante" es una proteína hecha usando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante.
[0075] El "diésel renovable" es una mezcla de alcanos (como C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 y C18:0) producidos a través de hidrogenación y desoxigenación de lípidos.
[0076] La "sacarificación" es un proceso de conversión de biomasa, generalmente biomasa celulósica o lignocelulósica, en azúcares monoméricos, tales como glucosa y xilosa. El material celulósico o biomasa "sacarificado" o "despolimerizado" se refiere al material celulósico o biomasa que se ha convertido en azúcares monoméricos a través de la sacarificación.
[0077] La "sonicación" es un proceso de alteración de materiales biológicos, como una célula, mediante el uso de energía de onda de sonido.
[0078] "Especies de furfural" es 2-furancarboxaldehído o un derivado que conserva las mismas características estructurales básicas.
[0079] "Rastrojo" comprende los tallos y hojas secas de un cultivo que quedan después de que un grano ha sido cosechado.
[0080] El "gen de utilización de sacarosa" es un gen que, cuando se expresa, ayuda a la capacidad de una célula a utilizar sacarosa como fuente de energía. Las proteínas codificadas por un gen de utilización de sacarosa se denominan en el presente documento "enzimas de utilización de sacarosa" e incluyen transportadores de sacarosa, invertasas de sacarosa y hexoquinasas tales como glucocinasas y fructoquinasas.
II. CULTIVO
[0081] La presente invención se refiere en general al cultivo de cepas Prototheca, particularmente cepas Prototheca recombinantes, para la producción de lípidos. Para conveniencia del lector, esta sección se subdivide en subsecciones. La subsección 1 describe las especies y cepas de Prototheca y cómo identificar nuevas especies y cepas de Prototheca y las microalgas relacionadas mediante la comparación del ADN genómico. La subsección 2 describe biorreactores útiles para el cultivo. La subsección 3 describe los medios para el cultivo. La subsección 4 describe la producción de aceite de acuerdo con los métodos ilustrativos de cultivo de la invención.
1. Especies y cepas de Prototheca
[0082] La prototeca es un microorganismo notable para su uso en la producción de lípidos, ya que puede producir altos niveles de lípidos, particularmente lípidos adecuados para la producción de combustible. El lípido producido por Prototheca tiene cadenas de hidrocarburos de menor longitud de cadena y un mayor grado de saturación que el producido por otras microalgas. Además, los lípidos de Prototheca generalmente están libres de pigmento (niveles bajos o indetectables de clorofila y ciertos carotenoides) y, en cualquier caso, contienen mucho menos pigmento que los lípidos de otras microalgas. Además, las células de Prototheca recombinantes proporcionadas por la invención se pueden usar para producir lípidos con mayor rendimiento y eficiencia, y con un costo reducido, en relación con la producción de lípidos a partir de otros microorganismos. Las cepas ilustrativas de Prototheca para su uso en los métodos de la invención incluyen Además, esta microalga crece heterotróficamente y puede modificarse genéticamente como Prototheca wickerhamii, Prototheca stagnora (incluyendo UTEX 327), Prototheca portoricensis, Prototheca moriformis (incluidas las cepas UTEX 1441, 1435), y Prototheca zopfii. Las especies del género Prototheca son heterótrofos obligados.
[0083] Especies de Prototheca para su uso en la invención pueden ser identificadas mediante la amplificación de ciertas regiones diana del genoma. Por ejemplo, la identificación de una especie o cepa específica de Prototheca se puede lograr a través de la amplificación y secuenciación de ADN nuclear y/o cloroplasto usando cebadores y metodología usando cualquier región del genoma, por ejemplo usando los métodos descritos en Wu et al., Bot. Bull. Acad. Sin. (2001) 42: 115-121 Identificación de aislamientos Chlorella spp. utilizando secuencias de ADN ribosomal. Los expertos en la técnica pueden utilizar métodos bien establecidos de análisis filogenético, como la amplificación y secuenciación del espaciador transcrito interno ribosómico (ADNr ITS1 e ITS2), ARNr 23S, ARNr 18S y otras regiones genómicas conservadas para identificar especies no solo Prototheca, pero otros organismos productores de hidrocarburos y lípidos con perfiles lipídicos y capacidad de producción similares. Para ejemplos de métodos de identificación y clasificación de algas, véase también Genetics, 2005 Agosto; 170 (4): 1601-10 y RNA, 2005 Abr; 11 (4): 361-4.
[0084] Por lo tanto, la comparación de ADN genómico se puede utilizar para identificar las especies adecuadas de microalgas para ser usadas en la presente invención. Las regiones de a Dn genómico conservado, tales como, pero sin limitarse a, ADN que codifica para ARNr 23S, pueden amplificarse a partir de especies de microalgas y compararse con secuencias de consenso para detectar especies de microalgas que están taxonómicamente relacionadas con las microalgas preferidas utilizadas en la presente invención. A continuación se muestran ejemplos de dicha comparación de secuencias de ADN para especies dentro del género Prototheca. La comparación del ADN genómico también puede ser útil para identificar especies de microalgas que se han identificado erróneamente en una colección de cepas. A menudo, una colección de cepas identificará especies de microalgas basadas en características fenotípicas y morfológicas. El uso de estas características puede conducir a una categorización errónea de la especie o el género de una microalga. El uso de la comparación del ADN genómico puede ser un mejor método para clasificar las especies de microalgas en función de su relación filogenética.
[0085] Las microalgas para uso en la presente invención típicamente tienen secuencias de ADN genómico que codifican para 23S ARNr que tienen al menos 99%, al menos 95%, al menos 90% o al menos 85% de identidad de nucleótidos con al menos una de las secuencias enumeradas en SEQ ID NOs: 11-19.
[0086] Para la comparación de secuencias para determinar el porcentaje de nucleótidos o de identidad de aminoácidos, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, a la que las secuencias de prueba se comparan. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y referencia se ingresan en una computadora, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Luego, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, en función de los parámetros de programa designados.
[0087] La alineación óptima de secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, p. ej., por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU. 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección visual (ver generalmente Ausubel et al., supra).
[0088] Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLa St , que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (en la dirección web www.ncbi.nlm.nih.gov). Este algoritmo implica primero identificar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen una puntuación de umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se conoce como el umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul et al., Supra). Estas coincidencias iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Luego, las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que se pueda aumentar la puntuación de alineación acumulativa. Los puntajes acumulativos se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntaje de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N (puntaje de penalización para residuos que no coinciden; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae en la cantidad X de su valor máximo alcanzado; el puntaje acumulativo va a cero o menos debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos con puntaje negativo; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Para identificar si un ácido nucleico o polipéptido está dentro del alcance de la invención, los parámetros predeterminados de los programas BLAST son adecuados. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62. El programa TBLATN (que usa la secuencia de proteínas para la secuencia de nucleótidos) utiliza como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y una matriz de puntuación BLOSUM 62, (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 10915 (1989)).
[0089] Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, e. G, Karlin y Altschul, Proc Nat'l Acad Sci EE.UU. 90: 5873­ 5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor que aproximadamente 0,01, y lo más preferiblemente menor que aproximadamente 0,001.
[0090] Otras consideraciones que afectan a la selección de microorganismos para uso en la invención incluyen, además de la producción de lípidos o hidrocarburos adecuados para la producción de aceites, combustibles y productos oleoquímicos: (1) alto contenido de lípidos como un porcentaje del peso de la célula; (2) facilidad de crecimiento; (3) facilidad de ingeniería genética; y (4) facilidad de procesamiento de biomasa. En realizaciones particulares de la divulgación, el microorganismo de tipo salvaje o genéticamente modificado produce células que son al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, o al menos 70% o más de lípidos. Los organismos preferidos crecen heterotróficamente (en azúcares en ausencia de luz).
2. Biorreactor
[0091] Los microorganismos se cultivan tanto para realizar manipulaciones genéticas como para producir hidrocarburos (por ejemplo, lípidos, ácidos grasos, aldehídos, alcoholes y alcanos). El primer tipo de cultivo se realiza a pequeña escala e inicialmente, al menos, en condiciones en las que el microorganismo inicial puede crecer. El cultivo para fines de producción de hidrocarburos generalmente se realiza a gran escala (por ejemplo, biorreactores de 10,000 L, 40,000 L, 100,000 L o más grandes) en un biorreactor. Las prototecas se cultivan típicamente en los métodos de divulgación en medios líquidos dentro de un biorreactor. Típicamente, el biorreactor no permite la entrada de luz.
[0092] El biorreactor o fermentador se usa para células de cultivo de microalgas a través de las diversas fases de su ciclo fisiológico. Los biorreactores ofrecen muchas ventajas para su uso en métodos de propagación y crecimiento heterotróficos. Para producir biomasa para su uso en alimentos, las microalgas se fermentan preferiblemente en grandes cantidades en líquido, como en cultivos en suspensión como ejemplo. Los biorreactores tales como los fermentadores de acero pueden acomodar volúmenes de cultivo muy grandes (se usan biorreactores de 40.000 litros y de mayor capacidad en varias realizaciones de la divulgación). Los biorreactores también suelen permitir el control de condiciones de cultivo tales como temperatura, pH, tensión de oxígeno y niveles de dióxido de carbono. Por ejemplo, los biorreactores son típicamente configurables, por ejemplo, utilizando puertos unidos a la tubería, para permitir componentes gaseosos, como oxígeno o nitrógeno, ser burbujeados a través de un cultivo líquido. Otros parámetros de cultivo, como el pH de los medios de cultivo, la identidad y concentración de oligoelementos y otros constituyentes de los medios también pueden manipularse más fácilmente utilizando un biorreactor.
[0093] Los biorreactores se pueden configurar para que fluyan medios de cultivo a través del biorreactor a lo largo del período de tiempo durante el cual las microalgas se reproducen y aumentan en número. En algunas realizaciones, por ejemplo, los medios pueden infundirse en el biorreactor después de la inoculación pero antes de que las células alcancen la densidad deseada. En otros casos, un biorreactor se llena con medios de cultivo al comienzo de un cultivo, y no se infunden más medios de cultivo después de inocular el cultivo. En otras palabras, la biomasa de microalgas se cultiva en un medio acuoso durante un período de tiempo durante el cual las microalgas se reproducen y aumentan en número; sin embargo, las cantidades de medio de cultivo acuoso no fluyen a través del biorreactor durante todo el período de tiempo. Así, en algunas realizaciones, el medio de cultivo acuoso no fluye a través del biorreactor después de la inoculación.
[0094] Los biorreactores equipados con dispositivos tales como palas giratorias e impulsores, mecanismos de balanceo, barras agitadoras, medios para infusión de gas a presión pueden usarse para someter a cultivos de microalgas a mezcla. La mezcla puede ser continua o intermitente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, no se mantiene un régimen de flujo turbulento de entrada de gas y entrada de medios para la reproducción de microalgas hasta que se haya logrado un aumento deseado en el número de dichas microalgas.
[0095] Los puertos de biorreactor pueden usarse para introducir, o extraer, gases, sólidos, semisólidos y líquidos, en la cámara del biorreactor que contiene las microalgas. Si bien muchos biorreactores tienen más de un puerto (por ejemplo, uno para entrada de medios y otro para muestreo), no es necesario que solo una sustancia ingrese o salga de un puerto. Por ejemplo, un puerto puede usarse para hacer fluir medios de cultivo en el biorreactor y luego usarse para muestreo, entrada de gas, salida de gas u otros fines. Preferiblemente, un puerto de muestreo puede usarse repetidamente sin alterar comprometiendo la naturaleza axénica del cultivo. Se puede configurar un puerto de muestreo con una válvula u otro dispositivo que permita detener e iniciar el flujo de muestra o para proporcionar un medio de muestreo continuo. Los biorreactores generalmente tienen al menos un puerto que permite la inoculación de un cultivo, y dicho puerto también se puede usar para otros fines, como la entrada de medios o gases.
[0096] Los puertos de biorreactores permiten manipular el contenido de gas del cultivo de microalgas. Para ilustrar, parte del volumen de un biorreactor puede ser gas en lugar de líquido, y las entradas de gas del biorreactor para permitir el bombeo de gases en el biorreactor. Los gases que se pueden bombear beneficiosamente en un biorreactor incluyen aire, mezclas de aire/CO2 , gases nobles, como el argón y otros gases. Los biorreactores generalmente están equipados para permitir al usuario controlar la velocidad de entrada de un gas en el biorreactor. Como se señaló anteriormente, puede usarse el aumento del flujo de gas en un biorreactor para aumentar la mezcla del cultivo.
[0097] El aumento del flujo de gas afecta también a la turbidez del cultivo. La turbulencia se puede lograr colocando un puerto de entrada de gas por debajo del nivel de los medios de cultivo acuosos para que el gas que ingresa al biorreactor burbujee hacia la superficie del cultivo. Uno o más puertos de salida de gas permiten que el gas escape, evitando así la acumulación de presión en el biorreactor. Preferiblemente, un puerto de salida de gas conduce a una válvula "unidireccional" que evita que los microorganismos contaminantes entren en el biorreactor.
3. Medios
[0098] Los medios de cultivo de microalgas típicamente contienen componentes tales como una fuente de nitrógeno fija, una fuente de carbono fija, oligoelementos, opcionalmente un tampón para el mantenimiento del pH y fosfato (típicamente proporcionado como una sal de fosfato). Otros componentes pueden incluir sales como el cloruro de sodio, particularmente para las microalgas de agua de mar. Las fuentes de nitrógeno incluyen fuentes de nitrógeno orgánico e inorgánico, que incluyen, por ejemplo, nitrógeno molecular, nitrato, sales de nitrato, amoníaco (puro o en forma de sal, como (N H ^S O 4 y NH4OH), proteínas, harina de soya, licor de maíz y extracto de levadura. Los ejemplos de elementos traza incluyen zinc, boro, cobalto, cobre, manganeso y molibdeno en, por ejemplo, las formas respectivas de ZnCl2 , H3BO3, CoCh ^ O, CuCh ^ O, MnCh ^ O y (NH4)6MoyO24 '4H2O.
[0099] Los microorganismos útiles de acuerdo con los métodos de la presente invención se encuentran en varios lugares y entornos en todo el mundo. Como consecuencia de su aislamiento de otras especies y su divergencia evolutiva resultante, el medio de crecimiento particular para el crecimiento óptimo y la generación de componentes de lípidos y/o hidrocarburos puede ser difícil de predecir. En algunos casos, ciertas cepas de microorganismos pueden ser incapaces de crecer en un medio de crecimiento particular debido a la presencia de algún componente inhibidor o la ausencia de algún requerimiento nutricional esencial requerido por la cepa particular de microorganismo.
[0100] Los medios de crecimiento sólidos y líquidos generalmente están disponibles en una amplia variedad de fuentes, y las instrucciones para la preparación de medios particulares que son adecuados para una amplia variedad de cepas de microorganismos se pueden encontrar, por ejemplo, en línea en http://www.utex.org/, un sitio mantenido por la Universidad de Texas en Austin, 1 University Station A6700, Austin, Texas, 78712-0183, para su colección de cultivo de algas (UTEX). Por ejemplo, varios medios de agua dulce y agua salada incluyen los descritos en PCT Pub. N° 2008/151149.
[0101] En un ejemplo particular, el Medio de Proteosa es adecuado para cultivos axénicos, y se puede preparar un volumen de 1 L del medio (pH ~ 6,8) mediante la adición de 1 g de proteosa peptona a 1 litro de Medio de Bristol. Medio Bristol comprende 2,94 mM NaNO3 , 0,17 mM CaCl2 -2H2O, 0,3 mM MgsO4 '7H2O, 0,43 mM, 1,29 mM KH2PO4 , y 1,43 mM NaCl en una solución acuosa. Para 1,5% de medio de agar, se pueden agregar 15 g de agar a 1 L de la solución. La solución se cubre y se esteriliza en autoclave, y luego se almacena a una temperatura refrigerada antes de su uso. Otro ejemplo es el medio de aislamiento Prototheca (PIM), que comprende 10 g/L de ftalato de hidrógeno postasio (KHP), 0,9 g/L de hidróxido de sodio, 0,1 g/L de sulfato de magnesio, 0,2 g/L de hidrógeno fosfato de potasio, 0,3 g/L de cloruro de amonio, 10 g/L de glucosa 0,001 g/L de hidrocloruro de tiamina, 20 g/L de agar, 0,25 g/L de 5-fluorocitosina, a un pH en el rango de 5,0 a 5,2 (ver Pore, 1973, App. Microbiology 26: 648-649). Se pueden identificar fácilmente otros medios adecuados para usar con los métodos de la invención consultando la URL identificada arriba, o consultando a otras organizaciones que mantienen cultivos de microorganismos, como SAG, CCAP o CCALA. SAG se refiere a la Colección de Cultivo de Algas en la Universidad de Gottingen (Gottingen, Alemania), CCAP se refiere a la colección de cultivo de algas y protozoos gestionada por la Asociación Escocesa de Ciencias del Mar (Escocia, Reino Unido), y CCALA se refiere a la colección de cultivo de laboratorio de algas en el Instituto de Botánica (Trebon, República Checa). Además, la Patente de EE.UU. N° 5,900,370 describe formulaciones de medios y condiciones adecuadas para la fermentación heterotrófica de especies de Prototheca.
[0102] Para la producción de petróleo, la selección de una fuente fija de carbono es importante, ya que el costo de la fuente fija de carbono debe ser lo suficientemente bajo para que la producción de petróleo sea económica. Por lo tanto, aunque las fuentes de carbono adecuadas incluyen, por ejemplo, acetato, floridosido, fructosa, galactosa, ácido glucurónico, glucosa, glicerol, lactosa, manosa, N-acetilglucosamina, ramnosa, sacarosa y/o xilosa, la selección de las materias primas que contienen esos compuestos es un aspecto importante de los métodos de divulgación. Las materias primas adecuadas útiles de acuerdo con los métodos de la divulgación incluyen, por ejemplo, licor negro, almidón de maíz, material celulósico despolimerizado, suero de leche, melaza, patata, sorgo, sacarosa, remolacha azucarera, caña de azúcar, arroz y trigo. Las fuentes de carbono también se pueden proporcionar como una mezcla, como una mezcla de sacarosa y pulpa de remolacha azucarera despolimerizada. La o las fuentes de carbono se pueden suministrar a una concentración de al menos aproximadamente 50 pM, al menos aproximadamente 100 pM, al menos aproximadamente 500 pM, al menos aproximadamente 5 mM, al menos aproximadamente 50 mM, y al menos aproximadamente 500 mM, de una o más fuentes de carbono fijas proporcionadas exógenamente. Las fuentes de carbono de particular interés para los propósitos de la presente divulgación incluyen celulosa (en una forma despolimerizada), glicerol, sacarosa y sorgo, cada uno de los cuales se trata en más detalle a continuación.
[0103] De acuerdo con la presente descripción, los microorganismos se pueden cultivar usando biomasa celulósica despolimerizada como materia prima. La biomasa celulósica (p. ej., rastrojo, como el rastrojo de maíz) es económica y está fácilmente disponible; sin embargo, los intentos de utilizar este material como materia prima para la levadura han fallado. En particular, se ha encontrado que tales materias primas son inhibitorias para el crecimiento de la levadura, y la levadura no puede usar los azúcares de 5 carbonos producidos a partir de materiales celulósicos (por ejemplo, xilosa de hemicelulosa). Por el contrario, las microalgas pueden crecer en material celulósico procesado. Los materiales celulósicos generalmente incluyen aproximadamente 40-60% de celulosa; aproximadamente 20-40% de hemicelulosa; y 10-30% de lignina.
[0104] Los materiales celulósicos adecuados incluyen residuos de plantas herbáceas y cultivos energéticos leñosos, así como los cultivos agrícolas, es decir, las partes de la planta, principalmente tallos y hojas, que no se retiran de los campos con la comida principal o producto de fibra. Los ejemplos incluyen desechos agrícolas tales como bagazo de caña de azúcar, cáscaras de arroz, fibra de maíz (incluidos tallos, hojas, cáscaras y mazorcas), paja de trigo, paja de arroz, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de cítricos, cáscaras de cítricos; desechos forestales tales como adelgazamiento de madera dura y blanda, y residuos de madera dura y blanda de operaciones de madera; desechos de madera tales como desechos de aserraderos (astillas de madera, aserrín) y desechos de aserraderos; desechos urbanos, como fracciones de papel de desechos sólidos municipales, desechos urbanos de madera y desechos verdes urbanos, como recortes municipales de césped; y residuos de construcción de madera. Los productos celulósicos adicionales incluyen cultivos celulósicos dedicados, como zacate, madera de álamo híbrida y miscanto, caña de fibra y sorgo de fibra. Los azúcares de cinco carbonos que se producen a partir de dichos materiales incluyen la xilosa.
[0105] Los materiales celulósicos se tratan para aumentar la eficiencia con la que el microbio puede utilizar los azúcares contenidos en los materiales. La presente descripción proporciona métodos novedosos para el tratamiento de materiales celulósicos después de la explosión ácida, de modo que los materiales son adecuados para su uso en un cultivo heterotrófico de microbios (por ejemplo, microalgas y levadura oleaginosa). Como se discutió anteriormente, la biomasa lignocelulósica se compone de varias fracciones, incluida la celulosa, un polímero cristalino de glucosa unida a beta 1,4 (un azúcar de seis carbonos), hemicelulosa, un polímero más débilmente asociado compuesto principalmente de xilosa (un azúcar de cinco carbonos) y, en menor medida, manosa, galactosa, arabinosa, lignina, un polímero aromático complejo compuesto por alcohol sinapílico y sus derivados, y pectinas, que son cadenas lineales de un ácido poligalacturónico unido a alfa 1,4. Debido a la estructura polimérica de la celulosa y la hemicelulosa, los azúcares (p. ej., glucosa monomérica y xilosa) que contienen no están en una forma que muchos microbios puedan usar (metabolizar) de manera eficiente. Para tales microbios, el procesamiento adicional de la biomasa celulósica para generar los azúcares monoméricos que forman los polímeros puede ser muy útil para garantizar que los materiales celulósicos se utilicen eficientemente como materia prima (fuente de carbono).
[0106] La celulosa o biomasa celulósica se somete a un proceso, denominado "explosión", en el que la biomasa se trata con ácido sulfúrico diluido (u otro) a temperatura y presión elevadas. Este proceso condiciona la biomasa de manera que pueda someterse eficientemente a la hidrólisis enzimática de las fracciones celulósicas y hemicelulósicas en monómeros de glucosa y xilosa. Los azúcares monoméricos resultantes se denominan azúcares celulósicos. Los azúcares celulósicos pueden ser utilizados posteriormente por microorganismos para producir una variedad de metabolitos (por ejemplo, lípidos). La etapa de explosión ácida da como resultado una hidrólisis parcial de la fracción de hemicelulosa a monosacáridos constituyentes. Estos azúcares pueden liberarse completamente de la biomasa con un tratamiento adicional. En algunas realizaciones, el tratamiento adicional es un tratamiento hidrotérmico que incluye lavar el material explotado con agua caliente, que elimina contaminantes tales como sales. Este paso no es necesario para las fermentaciones de etanol celulósico debido a las concentraciones de azúcar más diluidas utilizadas en tales procesos. En otras realizaciones, el tratamiento adicional es un tratamiento ácido adicional. En otras realizaciones más, el tratamiento adicional es hidrólisis enzimática del material explotado. Estos tratamientos también se pueden usar en cualquier combinación. El tipo de tratamiento puede afectar el tipo de azúcares liberados (por ejemplo, cinco azúcares de carbono versus seis azúcares de carbono) y la etapa en la que se liberan en el proceso. Como consecuencia, se pueden crear diferentes corrientes de azúcares, ya sean predominantemente de cinco o seis carbonos. Estas corrientes enriquecidas de cinco o seis carbonos pueden, por lo tanto, dirigirse a microorganismos específicos con diferentes capacidades de utilización de carbono.
[0107] Los métodos de la presente invención típicamente implican fermentación a densidades celulares más altas que las que se consiguen en la fermentación de etanol. Debido a las mayores densidades de los cultivos para la producción de aceite celulósico heterotrófico, la fuente de carbono fija (p. ej., la(s) corriente(s) de azúcar derivada(s) de la celulosa) está preferiblemente en forma concentrada. El nivel de glucosa del material celulósico despolimerizado es preferiblemente al menos 300 g/litro, al menos 400 g/litro, al menos 500 g/litro o al menos 600 g/litro antes de la etapa de cultivo, que es opcionalmente un cultivo discontinuo alimentado en el que el material se alimenta a las células con el tiempo a medida que las células crecen y acumulan lípidos. Las corrientes de azúcar celulósicas no se usan en o cerca de este intervalo de concentración en la producción de etanol celulósico. Por lo tanto, con el fin de generar y mantener las densidades celulares muy altas durante la producción de aceite lignocelulósico, la(s) materia(s) de carbono debe(n) entregarse en los cultivos heterotróficos en una forma altamente concentrada. Sin embargo, cualquier componente en la corriente de alimentación que no sea un sustrato y no sea metabolizado por el microorganismo oleaginoso se acumulará en el biorreactor, lo que puede generar problemas si el componente es tóxico o inhibidor de la producción del producto final deseado. Mientras que los subproductos derivados de la ligina y la lignina, los subproductos derivados de los carbohidratos, como el furfural y el hidroximetilfurfural y las sales derivadas de la generación de los materiales celulósicos (tanto en el proceso de explosión como en el posterior proceso de neutralización), e incluso la pentosa no metabolizada/los azúcares de hexosa pueden presentar problemas en las fermentaciones etanólicas, estos efectos se amplifican significativamente en un proceso en el que su concentración en la materia prima inicial es alta. Para lograr concentraciones de azúcar en el intervalo de 300 g/L (o más) para azúcares de seis carbonos que pueden usarse en la producción a gran escala de aceite lignocelulósico descrito en la presente descripción, la concentración de estos materiales tóxicos puede ser 20 veces mayor que las concentraciones típicamente presentes en fermentaciones etanólicas de biomasa celulósica.
[0108] El tratamiento del proceso de explosión del material celulósico utiliza cantidades significativas de ácido sulfúrico, el calor y la presión, liberando de este modo subproductos de hidratos de carbono, a saber, furfurales y furfurales hidroximetilo. Los furfurales e hidroximetilfurfurales se producen durante la hidrólisis de la hemicelulosa a través de la deshidratación de la xilosa en furfural y agua. En algunas realizaciones de la presente descripción, estos subproductos (por ejemplo, furfurales e hidroximetilfurfurales) se eliminan del material lignocelulósico sacarificado antes de la introducción en el biorreactor. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el proceso para la eliminación de los subproductos de carbohidratos es el tratamiento hidrotérmico de los materiales celulósicos explotados. Además, la presente descripción proporciona métodos en los que se usan cepas capaces de tolerar compuestos tales como furfurales o hidroximetilfurfurales para la producción de aceite lignocelulósico. En otra realización, la presente descripción también proporciona métodos y microorganismos que no solo son capaces de tolerar furfurales en los medios de fermentación, sino que en realidad son capaces de metabolizar estos subproductos durante la producción de aceite lignocelulósico.
[0109] El proceso de explosión también genera niveles significativos de sales. Por ejemplo, las condiciones típicas de explosión pueden dar lugar a conductividades superiores a 5 mS/cm cuando la biomasa celulósica explotada se resuspende en una proporción de 10:1 agua: sólidos (peso seco). En ciertas realizaciones de la presente descripción, la biomasa explotada diluida se somete a sacarificación enzimática, y el sobrenadante resultante se concentra hasta 25 veces para su uso en el biorreactor. El nivel de sal (medido por la conductividad) en la(s) corriente(s) de azúcar concentrada(s) puede ser inaceptablemente alto (hasta 1,5 M equivalentes de Na+). Se generan sales adicionales tras la neutralización de los materiales explotados para el posterior proceso de sacarificación enzimática también. La presente descripción proporciona métodos para eliminar estas sales para que la(s) corriente(s) de azúcar celulósica concentrada(s) resultante(s) se pueda(n) usar en procesos heterotróficos para producir aceite lignocelulósico. En algunas realizaciones, el método para eliminar estas sales es la desionización con resinas, tales como, pero sin limitación, DOWEX Marathon MR3. En ciertas realizaciones, la etapa de desionización con resina ocurre antes de la concentración de azúcar o el ajuste de pH y el tratamiento hidrotérmico de biomasa antes de la sacarificación, o cualquier combinación de lo anterior; en otras realizaciones, el paso se realiza después de uno o más de estos procesos. En otras realizaciones, el proceso de explosión en sí mismo se cambia para evitar la generación de sales a niveles inaceptablemente altos. Por ejemplo, una alternativa adecuada a la explosión de ácido sulfúrico (u otro ácido) de la biomasa celulósica es la producción de pulpa mecánica para hacer que la biomasa celulósica sea receptiva a la hidrólisis enzimática (sacarificación). En otras realizaciones más, se usan cepas nativas de microorganismos resistentes a altos niveles de sales o cepas genéticamente modificadas con resistencia a altos niveles de sales.
[0110] Una forma de realización preferida para el proceso de preparación de biomasa celulósica explotada para su uso en la producción de aceite lignocelulósico heterotrófico utilizando microbios oleaginosos se muestra en la Figura 10. El paso I comprende ajustar el pH de la biomasa celulósica explotada resuspendida al intervalo de 5,0-5,3 seguido de lavar la biomasa celulósica tres veces. Este paso de lavado puede llevarse a cabo por una variedad de medios que incluyen el uso de resinas de desalinización e intercambio iónico, omosis inversa, tratamiento hidrotérmico (como se describió anteriormente), o simplemente resuspensión y centrifugación repetidas en agua desionizada. Este paso de lavado da como resultado una corriente celulósica cuya conductividad está entre 100-300 pS/cm y la eliminación de cantidades significativas de furfurales e hidroximetilfurfurales. Los decantes de este paso de lavado se pueden guardar para concentrar azúcares de cinco carbonos liberados de la fracción de hemicelulosa. El paso II comprende la sacarificación enzimática de la biomasa celulósica lavada. En una realización preferida, se usa Acelerasa (Genencor). El paso III comprende la recuperación de azúcares mediante centrifugación o decantación y enjuague de la biomasa sacarificada. La biomasa resultante (sólidos) es un componente rico en energía y rico en lignina que puede usarse como combustible o enviarse a la basura. Se recoge la corriente de azúcar recuperada en el proceso de centrifugación/decantación y enjuague. El paso IV comprende microfiltración para eliminar los sólidos contaminantes con la recuperación del permeado. El paso V comprende un paso de concentración que se puede lograr usando un evaporador de vacío. Este paso puede incluir opcionalmente la adición de agentes antiespumantes como P'2000 (Sigma/Fluka), que a veces es necesario debido al contenido de proteínas de la materia prima de azúcar resultante.
[0111] En otra realización de los métodos de la divulgación, la fuente de carbono es glicerol, que incluye subproducto de glicerol acidulado y no acidulado de la transesterificación de biodiesel. En una realización, la fuente de carbono incluye glicerol y al menos otra fuente de carbonos. En algunos casos, todo el glicerol y al menos otra fuente fija de carbono se proporcionan al microorganismo al comienzo de la fermentación. En algunos casos, el glicerol y la al menos otra fuente de carbono fija se proporcionan al microorganismo simultáneamente en una proporción predeterminada. En algunos casos, el glicerol y la al menos otra fuente de carbono fija se alimentan a los microbios a una velocidad predeterminada durante el transcurso de la fermentación.
[0112] Algunas microalgas experimentan división celular más rápido en presencia de glicerol que en presencia de glucosa (véase la publicación PCT N° 2008/151149). En estos casos, los procesos de crecimiento en dos etapas en los que las células se alimentan primero con glicerol para aumentar rápidamente la densidad celular y luego se alimentan con glucosa para acumular lípidos que pueden mejorar la eficiencia con la que se producen los lípidos. El uso del subproducto de glicerol del proceso de transesterificación proporciona ventajas económicas significativas cuando se vuelve a poner en el proceso de producción. También se proporcionan otros métodos de alimentación, como mezclas de glicerol y glucosa. La alimentación de tales mezclas también captura los mismos beneficios económicos. Además, la divulgación proporciona métodos para alimentar azúcares alternativos a microalgas tales como sacarosa en varias combinaciones con glicerol.
[0113] En otra realización de los métodos de la invención, la fuente de carbono es sacarosa, que incluye una materia prima compleja que contiene sacarosa, tal como jugo de caña espeso procedente del procesamiento de caña de azúcar. En una realización, el medio de cultivo incluye además al menos una enzima de utilización de sacarosa. En algunos casos, el medio de cultivo incluye una sacarosa invertasa. En una realización, la enzima sacarosa invertasa es una enzima secretada sacarosa invertasa codificada por un gen exógeno de sacarosa invertasa expresado por la población de microorganismos. Por lo tanto, en algunos casos, como se describe con más detalle en la Sección IV, a continuación, la microalga ha sido modificada genéticamente para expresar una enzima de utilización de sacarosa, como un transportador de sacarosa, una invertasa de sacarosa, una hexoquinasa, una glucoquinasa o una fructoquinasa.
[0114] materias primas complejas que contienen sacarosa incluyen melazas residuales de procesamiento de caña de azúcar; El uso de este producto de desecho de bajo valor en el procesamiento de la caña de azúcar puede proporcionar importantes ahorros de costos en la producción de hidrocarburos y otros aceites. Otra materia prima compleja que contiene sacarosa que es útil en los métodos de la invención es el sorgo, que incluye jarabe de sorgo y sorgo puro. El jarabe de sorgo se produce a partir del jugo de la caña de sorgo dulce. Su perfil de azúcar consiste principalmente en glucosa (dextrosa), fructosa y sacarosa.
4. Producción de aceite
[0115] Para la producción de aceite de acuerdo con los métodos de la invención, es preferible cultivar células en la oscuridad, como es el caso, por ejemplo, cuando se usan fermentadores extremadamente grandes (40.000 litros y más) que no permiten que la luz golpee el cultivo. Las especies de Prototheca se cultivan y propagan para la producción de petróleo en un medio que contiene una fuente fija de carbono y en ausencia de luz; dicho crecimiento se conoce como crecimiento heterotrófico.
[0116] Como un ejemplo, un inóculo de células de microalgas de lípidos productoras se introducen en el medio; hay un período de retraso (fase de retraso) antes de que las células comiencen a propagarse. Después del período de retraso, la tasa de propagación aumenta de manera constante y entra en la fase logarítmica o exponencial. La fase exponencial a su vez es seguida por una disminución de la propagación debido a la disminución de nutrientes como el nitrógeno, el aumento de sustancias tóxicas y los mecanismos de detección de quórum. Después de esta ralentización, la propagación se detiene y las células entran en una fase estacionaria o en un estado de crecimiento estable, dependiendo del entorno particular proporcionado a las células. Para obtener biomasa rica en lípidos, el cultivo generalmente se cosecha mucho después del final de la fase exponencial, que se puede terminar temprano al permitir que el nitrógeno u otro nutriente clave (que no sea carbono) se agote, lo que obliga a las células a convertir las fuentes de carbono, presenten en exceso, en lípidos. Los parámetros de las condiciones de cultivo pueden manipularse para optimizar la producción total de aceite, la combinación de especies de lípidos producidos y/o la producción de un aceite específico.
[0117] Como se discutió anteriormente, un biorreactor o fermentador se utiliza para permitir que las células se sometan a las diversas fases de su ciclo de crecimiento. Como ejemplo, se puede introducir un inóculo de células productoras de lípidos en un medio seguido de un período de retraso (fase de retraso) antes de que las células comiencen a crecer. Después del período de retraso, la tasa de crecimiento aumenta de manera constante y entra en la fase logarítmica o exponencial. La fase exponencial a su vez es seguida por una desaceleración del crecimiento debido a la disminución de nutrientes y/o aumentos de sustancias tóxicas. Después de esta ralentización, el crecimiento se detiene y las células entran en una fase estacionaria o en un estado estable, dependiendo del entorno particular proporcionado a las células. La producción de lípidos por las células descritas en el presente documento puede ocurrir durante la fase logarítmica o posteriormente, incluida la fase estacionaria en la que se suministran nutrientes, o aún están disponibles, para permitir la continuación de la producción de lípidos en ausencia de división celular.
[0118] Preferiblemente, los microorganismos cultivados usando las condiciones descritas en el presente documento y conocidas en la técnica comprenden al menos aproximadamente 20% en peso de lípidos, preferiblemente al menos aproximadamente 40% en peso, más preferiblemente al menos aproximadamente 50% en peso, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 60% en peso. Las condiciones del proceso se pueden ajustar para aumentar el rendimiento de los lípidos adecuados para un uso particular y/o para reducir el costo de producción. Por ejemplo, en ciertas realizaciones de la divulgación, una microalga se cultiva en presencia de una concentración limitante de uno o más nutrientes, como, por ejemplo, nitrógeno, fósforo o azufre, mientras se proporciona un exceso de energía de carbono fija como glucosa. La limitación de nitrógeno tiende a aumentar el rendimiento de lípidos microbianos sobre el rendimiento de lípidos microbianos en un cultivo en el que se proporciona nitrógeno en exceso. En realizaciones particulares, el aumento en el rendimiento de lípidos es al menos aproximadamente: 10%, 50%, 100%, 200% o 500%. El microbio puede cultivarse en presencia de una cantidad limitante de un nutriente durante una parte del período de cultivo total o durante todo el período. En realizaciones particulares, la concentración de nutrientes se cicla entre una concentración limitante y una concentración no limitante al menos dos veces durante el período de cultivo total. El contenido de lípidos de las células puede aumentarse continuando el cultivo durante períodos de tiempo incrementados mientras se proporciona un exceso de carbono, pero limitando o sin nitrógeno.
[0119] En otra realización, el rendimiento de lípidos se incrementa cultivando un microbio productor de lípidos (por ejemplo, microalgas) en presencia de uno o más cofactores para una enzima de la ruta de lípidos (por ejemplo, una enzima sintética de ácido graso). Generalmente, la concentración de los cofactores es suficiente para aumentar el rendimiento de lípidos microbianos (por ejemplo, ácidos grasos) sobre el rendimiento de lípidos microbianos en ausencia de los cofactores. En una realización particular, los cofactores se proporcionan al cultivo al incluir en el cultivo un microbio (por ejemplo, microalgas) que contiene un gen exógeno que codifica el (los) cofactor(es). Alternativamente, se pueden proporcionar cofactores a un cultivo incluyendo un microbio (por ejemplo, microalgas) que contiene un gen exógeno que codifica una proteína que participa en la síntesis del cofactor. En ciertas realizaciones, los cofactores adecuados incluyen cualquier vitamina requerida por una enzima de la ruta de lípidos, tal como, por ejemplo: biotina, pantotenato. Los genes que codifican cofactores adecuados para su uso en la invención o que participan en la síntesis de dichos cofactores son bien conocidos y pueden introducirse en microbios (por ejemplo, microalgas), utilizando estructuras y técnicas como las descritas anteriormente.
[0120] Los ejemplos específicos de biorreactores, condiciones de cultivo y métodos de crecimiento y propagación heterotróficos descritos en el presente documento se pueden combinar de cualquier manera adecuada para mejorar la eficacia del crecimiento microbiano y la producción de lípidos y/o proteínas.
[0121] La biomasa de microalgas con un alto porcentaje de acumulación de aceite/lípidos por peso seco se ha generado utilizando diferentes métodos de cultivo, que son conocidos en la técnica (ver PCT Pub. N° 2008/151149). La biomasa de microalgas generada por los métodos de cultivo descritos en este documento y útil de acuerdo con la presente descripción comprende al menos 10% de aceite de microalgas en peso seco. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas comprende al menos 25%, al menos 50%, al menos 55% o al menos 60% de aceite de microalgas en peso seco. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas contiene de 10 a 90% de aceite de microalgas, de 25 a 75% de aceite de microalgas, de 40 a 75% de aceite de microalgas o de 50 a 70% de aceite de microalgas en peso seco.
[0122] El aceite de microalgas de la biomasa se describe aquí, o extraído de la biomasa para uso en los métodos y composiciones de la presente divulgación pueden comprender glicerolípidos con una o más distintas cadenas laterales éster de ácido graso. Los glicerolípidos están compuestos por una molécula de glicerol esterificada a una, dos o tres moléculas de ácido graso, que pueden tener diferentes longitudes y tener diferentes grados de saturación. Las características de longitud y saturación de las moléculas de ácido graso (y los aceites de microalgas) pueden manipularse para modificar las propiedades o proporciones de las moléculas de ácidos grasos en los aceites de microalgas de la presente descripción a través de condiciones de cultivo o mediante ingeniería de la ruta de los lípidos, como se describe en más detalle en la Sección IV, más abajo. Por lo tanto, se pueden preparar mezclas específicas de aceite de algas dentro de una sola especie de algas mezclando juntas la biomasa o el aceite de algas de dos o más especies de microalgas, o mezclando el aceite de algas de la invención con aceites de otras fuentes como la soja, colza, canola, palma, palmiste, coco, maíz, residuos vegetales, sebo chino, oliva, girasol, algodón, grasa de pollo, sebo de res, sebo porcino, microalgas, macroalgas, microbios, Cuphea, lino, maní, grasa blanca de elección, manteca de cerdo, Camelina sativa, semilla de mostaza, anacardo, avena, lupino, kenaf, caléndula, café, linaza (lino), avellana, euforbio, semilla de calabaza, cilantro, camelia, sésamo, cártamo, arroz, tung, cacao, copra, amapola, ricino, nuez, jojoba, macadamia, nueces de Brasil, aguacate, petróleo o una fracción de destilado de cualquiera de los aceites anteriores.
[0123] La composición de aceite, es decir, las propiedades y proporciones de los constituyentes de ácidos grasos de los glicerolípidos, también pueden manipularse combinando biomasa o aceite de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunas realizaciones, al menos dos de las especies distintas de microalgas tienen diferentes perfiles de glicerolípidos. Las distintas especies de microalgas se pueden cultivar juntas o por separado como se describe aquí, preferiblemente bajo condiciones heterotróficas, para generar los aceites respectivos. Diferentes especies de microalgas pueden contener diferentes porcentajes de distintos componentes de ácidos grasos en los glicerolípidos de la célula.
[0124] En general, las cepas de Prototheca tienen muy pocos o ningún ácido graso con la longitud de cadena C8-C14. Por ejemplo, Prototheca moriformis (UTEX 1435), Prototheca krugani (UTEX 329), Prototheca stagnora (UTEX 1442) y Prototheca zopfii (UTEX 1438) no contienen (o cantidades indeseables) de ácidos grasos C8, entre 0-0,01% de ácidos grasos C10, entre 0,03-2,1% de ácidos grasos C12 y entre 1,0-1,7% de ácidos grasos C14.
[0125] En algunos casos, las cepas de Protheca que contienen un transgen que codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa que tiene actividad hacia el sustrato de acil-ACP graso de longitudes de cadena C8-10 tiene al menos 0,3%, al menos 0,8%, al menos 1,5% o más ácidos grasos de longitud de cadena C8 y al menos 0,3%, al menos 1,0%, al menos 3,0%, al menos 5% o más ácidos grasos de longitud de cadena C10. En otros casos, las cepas de Prototheca que contienen un transgen que codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa que tiene actividad hacia el sustrato de acil-ACP graso de longitud de cadena C12 tiene al menos 3,0%, al menos 5%, al menos 7%, al menos 10%, al menos 13% o más ácidos grasos de la longitud de cadena C12 y al menos 1,5%, al menos 2%, o al menos 3% o más ácidos grasos de la longitud de la cadena C14. En otros casos, las cepas de Prototheca que contienen un transgen que codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa que tiene actividad hacia el sustrato de acil-ACP graso de longitud de cadena C14 tiene al menos 4,0%, al menos 7%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25% o más ácidos grasos de la longitud de cadena C14, y al menos 0,4%, al menos 1%, al menos 1,5% o más ácidos grasos de la longitud de cadena C12.
[0126] En ejemplos no limitativos, las cepas de Prototheca que contienen un transgen que codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa que tiene actividad hacia el sustrato de acil-ACP graso de longitud de cadena C8 y C10 tiene entre 0. 3-1,58% de ácidos grasos de longitud de cadena C8 y entre 0,35-6,76% de ácidos grasos de la longitud de la cadena C10. En otros ejemplos no limitantes, las cepas de Prototheca que contienen un transgen que codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa que tiene actividad hacia el sustrato de acil-ACP graso de longitud de cadena C12 tiene entre 3,9-14,11% de ácidos grasos de la longitud de cadena C12 y entre 1,95-3,05 % de ácidos grasos de la longitud de la cadena C14. En otros ejemplos no limitantes, las cepas de Prototheca que contienen un transgen que codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa que tiene actividad hacia el sustrato de acil-ACP graso de longitud de cadena C14 tiene entre 4,40-17,35% de ácidos grasos de la longitud de cadena C14 y entre 0,4-1,83 Área % de ácidos grasos de la longitud de la cadena C12. En algunos casos, las cepas de Prototheca que contienen un transgen que codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa que tiene actividad hacia el sustrato de acil-ACP graso de longitudes de cadena entre C8 y C14 tienen entre 3,5-20% de ácidos grasos de cadena media (C8-C14). En algunos casos, mantener las cepas transgénicas de Prototheca bajo presión selectiva constante y alta para retener genes exógenos es ventajoso debido al aumento del ácido graso deseado de una longitud de cadena específica. En un ejemplo no limitante, el Ejemplo 5 demuestra un aumento de dos veces en los ácidos grasos de longitud de cadena C14 (más del 30% de ácidos grasos de longitud de cadena C8-C14) cuando se retiene el cultivo de Prototheca moriformis que contiene un gen exógeno de tioesterasa que prefiere C14. También se pueden lograr altos niveles de retención de genes exógenos insertando genes exógenos en los cromosomas nucleares de las células usando vectores de recombinación homólogos y métodos descritos en este documento. Las células recombinantes que contienen genes exógenos integrados en cromosomas nucleares son un objeto de la invención.
[0127] El aceite de microalgas también puede incluir otros constituyentes producidos por las microalgas, o incorporados en el aceite de microalgas del medio de cultivo. Estos otros componentes pueden estar presentes en cantidades variables dependiendo de las condiciones de cultivo utilizadas para cultivar las microalgas, las especies de microalgas, el método de extracción utilizado para recuperar el aceite de microalgas de la biomasa y otros factores que pueden afectar la composición del aceite de microalgas. Ejemplos no limitantes de tales componentes incluyen carotenoides, presentes de 0,1-0,4 microgramos/ml, clorofila presente de 0-0,02 miligramos/kilogramo de aceite, gamma tocoferol presente de 0,4-0,6 miligramos/100 gramos de aceite, y tocotrienoles totales presentes de 0,2-0,5 miligramos/gramo de aceite.
[0128] Los otros constituyentes pueden incluir, sin limitación, fosfolípidos, tocoferoles, tocotrienoles, carotenoides (p. ej., alfa-caroteno, beta-caroteno, licopeno, etc.), xantofilas (p. ej., luteína, zeaxantina, alfa-criptoxantina y betacrioxantina), y varios compuestos orgánicos o inorgánicos.
[0129] En algunos casos, el aceite extraído de las especies de Prototheca comprende no más de 0,02 mg/kg de clorofila. En algunos casos, el aceite extraído de las especies de Prototheca comprende no más de 0,4 mcg/ml de carotenoides totales. En algunos casos, el aceite de Prototheca comprende entre 0,40-0,60 miligramos de tocoferol gamma por 100 gramos de aceite. En otros casos, el aceite de Prototheca comprende entre 0,2-0,5 miligramos de tocotrienoles totales por gramo de aceite.
III. MÉTODOS Y MATERIALES DE INGENIERÍA GENÉTICA
[0130] La presente invención proporciona métodos y materiales para modificar genéticamente células Prototheca y células huésped recombinantes útiles en los métodos de la presente invención, que incluyen, pero no se limitan a, células huésped recombinantes de Prototheca moriformis, Prototheca zopfii, Prototheca krugani y Prototheca stagnora. La descripción de estos métodos y materiales se divide en subsecciones para la conveniencia del lector. En la subsección 1, se describen los métodos de transformación. En la subsección 2, se describen los métodos de ingeniería genética que usan recombinación homóloga. En la subsección 3, se describen los vectores y componentes de expresión.
1. Métodos de ingeniería - Transformación
[0131] Las células pueden transformarse mediante cualquier técnica adecuada que incluya, por ejemplo, biolística, electroporación (véase Maruyama et al. (2004), Biotechnology Techniques 8: 821-826), transformación de perlas de vidrio y transformación de carburo de silicio. Otro método que se puede usar implica la formación de protoplastos y el uso de CaChy polietilenglicol (PEG) para introducir ADN recombinante en las células de microalgas (ver Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4: 63-73, que informa el uso de este método para la transformación de Chorella ellipsoidea). La co-transformación de microalgas se puede usar para introducir dos moléculas de vector distintas en una célula simultáneamente (ver, por ejemplo, Protist 2004 Dic; 155 (4): 381-93).
[0132] Métodos biolísticos (véase, por ejemplo, Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6: 299302, Patente de EE.UU. N° 4,945,050; electroporación (Fromm et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (EE.UU.) (1985) 82: 5824 5828); el uso de un rayo láser, microinyección o cualquier otro método capaz de introducir ADN en una microalga también se puede usar para la transformación de una célula Prototheca.
2. Métodos de ingeniería - Recombinación homóloga
[0133] La recombinación homóloga es la capacidad de las secuencias de ADN complementarias para alinear y regiones de cambio de homología. El ADN transgénico ("donante") que contiene secuencias homólogas a las secuencias genómicas a las que se dirige ("plantilla") se introduce en el organismo y luego se recombina en el genoma en el sitio de las secuencias homólogas genómicas correspondientes. Los pasos mecanicistas de este proceso, en la mayoría de los casos, incluyen: (1) emparejamiento de segmentos de ADN homólogos; (2) introducción de roturas bicatenarias en la molécula de ADN del donante; (3) invasión de la molécula de ADN molde por los extremos de ADN del donante libre seguido de síntesis de ADN; y (4) resolución de eventos de reparación de rotura de doble cadena que dan como resultado productos de recombinación finales.
[0134] La capacidad para llevar a cabo la recombinación homóloga en un organismo huésped tiene muchas implicaciones prácticas para lo que puede ser llevado a cabo a nivel genético molecular y es útil en la generación de un microbio oleaginosa que pueden producir aceites adaptados. Por su propia naturaleza, la recombinación homóloga es un evento preciso de selección de genes, por lo tanto, la mayoría de las líneas transgénicas generadas con la misma secuencia de selección serán esencialmente idénticas en términos de fenotipo, lo que necesitará la detección de muchos menos eventos de transformación. La recombinación homóloga también se dirige a eventos de inserción de genes en el cromosoma del huésped, lo que resulta en una excelente estabilidad genética, incluso en ausencia de selección genética. Debido a que diferentes loci cromosómicos tendrán un impacto similar en la expresión génica, incluso de promotores heterólogos/UTR, la recombinación homóloga puede ser un método para consultar loci en un entorno genómico desconocido y evaluar el impacto de estos entornos en la expresión génica.
[0135] Aplicaciones de ingeniería genética particularmente útiles que usan recombinación homóloga consisten en cooptar elementos reguladores específicos del huésped tales como promotores/UTR para impulsar la expresión de genes heterólogos de una manera altamente específica. Por ejemplo, podría esperarse que la ablación precisa del gen de estearoil ACP desaturasa endógeno con un casete de gen FATB (tioesterasa) específico de C12:0 heterólogo y un marcador selectivo adecuado disminuya drásticamente los niveles endógenos de ácidos grasos C18:1 concomitantes con niveles elevados de ácidos grasos C12:0. El ejemplo 13 describe la construcción de direccionamiento de recombinación homóloga que es adecuada para la eblación de un gen de destaurasa de ACP estearoílo Prototheca moriformis endógeno.
[0136] Debido a que la recombinación homóloga es un evento de direccionamiento génico preciso, puede usarse para modificar con precisión cualquier nucleótido dentro de un gen o región de interés, siempre que se hayan identificado suficientes regiones flanqueantes. Por lo tanto, la recombinación homóloga se puede usar como un medio para modificar secuencias reguladoras que afectan la expresión génica de ARN y/o proteínas. También se puede utilizar para modificar las regiones de codificación de proteínas en un esfuerzo por modificar las actividades enzimáticas, como la especificidad del sustrato, las afinidades y Km, y así afectar el cambio deseado en el metabolismo de la célula huésped. La recombinación homóloga proporciona un medio poderoso para manipular el genoma gost, lo que resulta en la orientación del gen, la conversión del gen, la deleción del gen, la duplicación del gen, la inversión del gen y el intercambio de elementos reguladores de la expresión del gen, tales como promotores, potenciadores y 3'UTR.
[0137] La recombinación homóloga se puede lograr usando construcciones de direccionamiento que contienen fragmentos de secuencias endógenas para "apuntar" al gen o región de interés dentro del genoma de la célula huésped endógena. Dichas secuencias de direccionamiento pueden ubicarse 5' del gen o región de interés, 3' del gen/región de interés o incluso flanquear el gen/región de interés. Tales construcciones de direccionamiento pueden transformarse en la célula huésped ya sea como un ADN plasmídico superenrollado con una cadena principal adicional del vector, un producto de PCR sin cadena principal del vector o como una molécula linealizada. En algunos casos, puede ser ventajoso exponer primero las secuencias homólogas dentro del ADN transgénico (ADN donante) con una enzima de restricción. Este paso puede aumentar la eficiencia de recombinación y disminuir la ocurrencia de eventos no deseados. Otros métodos para aumentar la eficiencia de la recombinación incluyen el uso de la PCR para generar ADN transgénico transformante que contiene extremos lineales homólogos a las secuencias genómicas a las que se dirige.
3. Vectores y componentes vectoriales
[0138] Los vectores para la transformación de microorganismos de acuerdo con la presente divulgación pueden prepararse mediante técnicas conocidas familiares para los expertos en la técnica a la vista de la divulgación en el presente documento. Un vector generalmente contiene uno o más genes, en los que cada gen codifica la expresión de un producto deseado (el producto genético) y está operativamente vinculado a una o más secuencias de control que regulan la expresión génica o dirigen el producto génico a una ubicación particular en la célula recombinante. Para ayudar al lector, esta subsección se divide en subsecciones. La subsección A describe secuencias de control típicamente contenidas en vectores, así como secuencias de control novedosas proporcionadas por la presente descripción. La subsección B describe genes típicamente contenidos en vectores, así como nuevos métodos de optimización de codones y genes preparados usando los proporcionados por la presente descripción.
A. Secuencias de control
[0139] Las secuencias de control son ácidos nucleicos que regulan la expresión de una secuencia codificante o dirigen un producto génico a una ubicación particular dentro o fuera de una célula. Las secuencias de control que regulan la expresión incluyen, por ejemplo, promotores que regulan la transcripción de una secuencia de codificación y terminadores que terminan la transcripción de una secuencia de codificación. Otra secuencia de control es una secuencia 3' no traducida ubicada al final de una secuencia de codificación que codifica una señal de poliadenilación. Las secuencias de control que dirigen productos génicos a ubicaciones particulares incluyen aquellas que codifican péptidos señal, que dirigen la proteína a la que están unidas a una ubicación particular dentro o fuera de la célula.
[0140] Por lo tanto, un diseño de vector ejemplar para la expresión de un gen exógeno en una microalga contiene una secuencia codificante para un producto génico deseado (por ejemplo, un marcador seleccionable, una enzima de modificación de la ruta de lípidos o una enzima de utilización de sacarosa) en un enlace operable con un promotor activo en microalgas. Alternativamente, si el vector no contiene un promotor en un enlace operable con la secuencia de codificación de interés, la secuencia de codificación puede transformarse en las células de modo que se una operativamente unida a un promotor endógeno en el punto de integración del vector. Se ha demostrado que el método de transformación sin promotor funciona en microalgas (véase, por ejemplo, Plant Journal 14: 4, (1998), págs. 441­ 447).
[0141] Muchos promotores son activos en microalgas, incluidos los promotores que son endógenos a las algas que se están transformando, así como los promotores que no son endógenos a las algas que se están transformando (es decir, promotores de otras algas, promotores de plantas superiores, y promotores de virus de plantas o virus de algas). En PCT Pub 2008/151149 y referencias citadas se describen promotores exógenos y/o endógenos ilustrativos que son activos en microalgas (así como genes de resistencia a antibióticos funcionales en microalgas).
[0142] El promotor usado para expresar un gen exógeno puede ser el promotor unido naturalmente a ese gen o puede ser un gen heterólogo. Algunos promotores están activos en más de una especie de microalgas. Otros promotores son específicos de la especie. Los promotores ilustrativos incluyen promotores como la p-tubulina de Chlamydomonas reinhardtii, utilizada en los Ejemplos a continuación, y los promotores virales, como el virus del mosaico de coliflor (CMV) y el virus de la Chlorella, que han demostrado ser activos en múltiples especies de microalgas (ver por ejemplo Plant Cell Rep. 2005 Mar; 23 (10-11): 727-35; J Microbiol. 2005 Ago; 43 (4): 361-5; Mar Biotechnol (NY). 2002 Ene; 4 (1): 63-73). Otro promotor que es adecuado para uso para la expresión de genes exógenos en Prototheca es el promotor de glutamato deshidrogenasa de Chlorella sorokiniana/5VTR (SEQ ID NO: 69). Opcionalmente, se usan al menos 10, 20, 30, 40, 50 o 60 nucleótidos o más de estas secuencias que contienen un promotor. Los promotores ilustrativos útiles para la expresión de genes exógenos en Prototheca se enumeran en la lista de secuencias de esta aplicación, como el promotor del gen Chlorella HUP1 (SEQ ID NO: 1) y el promotor Chlorella ellipsoidea nitrato reductasa (SEQ ID NO: 2). Los promotores del virus Chlorella también se pueden usar para expresar genes en Prototheca, tales como las SEQ ID NO: 1-7 de la Patente de EE.UU. 6,395,965. Se pueden encontrar promotores adicionales activos en Prototheca, por ejemplo, en Biochem Biophys Res Commun. 14 de octubre de 1994; 204 (1): 187-94; Plant Mol Biol. Octubre de 1994; 26 (1): 85-93; Virology. 15 de agosto de 2004; 326 (1): 150-9; y Virology. 5 de enero de 2004; 318 (1): 214-23.
[0143] Un promotor generalmente puede caracterizarse como constitutivo o inducible. Los promotores constitutivos son generalmente activos o funcionan para impulsar la expresión en todo momento (o en ciertos momentos del ciclo de vida celular) al mismo nivel. Los promotores inducibles, por el contrario, están activos (o se vuelven inactivos) o se regulan significativamente hacia arriba o hacia abajo solo en respuesta a un estímulo. Ambos tipos de promotores encuentran aplicación en los métodos de divulgación. Los promotores inducibles útiles en la divulgación incluyen aquellos que median la transcripción de un gen unido operativamente en respuesta a un estímulo, tal como una molécula pequeña proporcionada exógenamente (por ejemplo, glucosa, como en la SEQ ID NO: 1), temperatura (calor o frío), falta de nitrógeno en medios de cultivo, etc. Los promotores adecuados pueden activar la transcripción de un gen esencialmente silencioso o regular al alza, preferiblemente sustancialmente, la transcripción de un gen unido operativamente que se transcribe a un nivel bajo.
[0144] La inclusión de la secuencia de control de la región de terminación es opcional, y si se emplea, entonces la elección es principalmente una de conveniencia, ya que la región de terminación es relativamente intercambiable. La región de terminación puede ser nativa de la región de iniciación de la transcripción (el promotor), puede ser nativa de la secuencia de ADN de interés o puede obtenerse de otra fuente. Ver, por ejemplo, Chen y Orozco, Nucleic Acids Res. (1988) 16: 8411.
[0145] La presente descripción también proporciona secuencias de control y genes recombinantes y vectores que los contienen que proporcionan la expresión compartimentada de un gen de interés. Los orgánulos para apuntar son cloroplastos, plastidios, mitocondrias y retículo endoplásmico. Además, la presente descripción proporciona secuencias de control y genes y vectores recombinantes que los contienen que proporcionan la secreción de una proteína fuera de la célula.
[0146] Las proteínas expresadas en el genoma nuclear de Prototheca pueden dirigirse al plastidio usando señales de direccionamiento de plastidio. Se conocen secuencias dirigidas a plastidios endógenas a Chlorella, como los genes en el genoma nuclear de Chlorella que codifican proteínas que se dirigen al plastidio; véanse, por ejemplo, los números de acceso de GenBank AY646197 y AF499684, y en una realización, tales secuencias de control se usan en los vectores de la presente divulgación para dirigir la expresión de una proteína a un plastidio Prototheca.
[0147] Los ejemplos siguientes describen el uso de secuencias de direccionamiento de plástidios de algas a proteínas diana heterólogas al compartimiento correcto en la célula huésped. Las bibliotecas de ADNc se hicieron usando prototeca moriformis y células de prototipos de Chlorella y se describen en los ejemplos 12 y ejemplo 11 a continuación. Se secuenciaron las secuencias y se analizaron en busca de homología con proteínas conocidas que trafican al plastidio/cloroplasto. Los ADNc que codifican estas proteínas se clonaron y las secuencias de direccionamiento de plastidios se aislaron de estos ADNc. Las secuencias de aminoácidos de las secuencias dirigidas a plastidios de algas identificadas a partir de las bibliotecas de ADNc y las secuencias de aminoácidos de las tioesterasas acil-ACP graso vegetales que se usan en la expresión heteróloga. Los ejemplos a continuación se enumeran en las SEQ ID NO: 127­ 133.
[0148] En otra realización de la presente descripción, la expresión de un polipéptido en Prototheca se dirige al retículo endoplásmico. La inclusión de una señal de retención o clasificación apropiada en un vector de expresión asegura que las proteínas se retengan en el retículo endoplásmico (ER) y no entren aguas abajo en Golgi. Por ejemplo, el vector iMpACTVECTOR1,3, de Wageningen UR- Plant Research International, incluye la conocida señal de retención o clasificación de KDEL. Con este vector, la retención ER tiene una ventaja práctica, ya que se ha informado que mejora los niveles de expresión 5 veces o más. La razón principal de esto parece ser que el ER contiene concentraciones más bajas y/o diferentes proteasas responsables de la degradación postraduccional de las proteínas expresadas que están presentes en el citoplasma. Se conocen señales de retención de ER funcionales en microalgas verdes. Por ejemplo, vea Proc Natl Acad Sci EE.UU.. 26 de abril de 2005; 102 (17): 6225-30.
[0149] En otra realización de la presente descripción, un polipéptido está dirigido a la secreción fuera de la célula en los medios de cultivo. Ver Hawkins et al., Current Microbiology vol. 38 (1999), pp. 335-341 para ejemplos de señales de secreción activas en Chlorella que pueden usarse, de acuerdo con los métodos de la presente divulgación, en Prototheca.
B. Optimización de genes y codones
[0150] Típicamente, un gen incluye un promotor, una secuencia de codificación y secuencias de control de terminación. Cuando se ensambla mediante tecnología de ADN recombinante, un gen puede denominarse un casete de expresión y puede estar flanqueado por sitios de restricción para una inserción conveniente en un vector que se usa para introducir el gen recombinante en una célula huésped. El casete de expresión puede estar flanqueado por secuencias de ADN del genoma u otro objetivo de ácido nuclei
expresión en el genoma mediante recombinación homóloga. Alternativamente, el vector y su casete de expresión pueden permanecer no integrados, en cuyo caso, el vector típicamente incluye un origen de replicación, que es capaz de proporcionar la replicación del ADN del vector heterólogo.
[0151] Un gen común presente en un vector es un gen que codifica una proteína, cuya expresión permite que la célula recombinante que contiene la proteína se diferencie de las células que no expresan la proteína. Tal gen, y su producto genético correspondiente, se llama marcador seleccionable. Se puede emplear cualquiera de una amplia variedad de marcadores seleccionables en una construcción transgénica útil para transformar Prototheca. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de resistencia G418, el gen de nitrato reductasa (ver Dawson et al. (1997), Current Microbiology 35: 356-362), el gen de higromicina fosfotransferasa (HPT; ver Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4: 63-73), el gen de neomicina fosfo-transferasa y el gen ble, que confiere resistencia a la fleomicina (Huang et al. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol. 72: 197-205). Los métodos para determinar la sensibilidad de las microalgas a los antibióticos son bien conocidos. Por ejemplo, Mol Gen Genet. 16 de octubre de 1996; 252 (5): 572­ 9.
[0152] Para los propósitos de la presente descripción, el vector de expresión usado para preparar una célula huésped recombinante incluirá al menos dos, y a menudo tres genes, si uno de los genes es un marcador seleccionable. Por ejemplo, una Prototheca genéticamente modificada se puede hacer por transformación que comprende, además de un marcador seleccionable, uno o más genes exógenos, tales como, por ejemplo, el gen de sacarosa invertasa o el gen acil-ACP-tioesterasa. Uno o ambos genes pueden expresarse usando un promotor inducible, que permite controlar el tiempo relativo de expresión de estos genes para mejorar el rendimiento de lípidos y la conversión a ésteres de ácidos grasos. La expresión de los dos o más genes exógenos puede estar bajo el control del mismo promotor inducible o bajo el control de diferentes promotores inducibles (o constitutivos). En la última situación, la expresión de un primer gen exógeno puede ser inducida por un primer período de tiempo (durante el cual la expresión de un segundo gen exógeno puede o no ser inducido) y la expresión de un segundo gen exógeno puede ser inducida por un segundo período de tiempo (durante el cual la expresión de un primer gen exógeno puede o no ser inducida).
[0153] En otras realizaciones de la descripción, los dos o más genes exógenos (además de cualquier marcador seleccionable) son: una tioesterasa de acil-ACP grasa y una reductasa de acil-CoA/aldehído grasa, cuya acción combinada produce un alcohol producto. Además se proporcionan otras combinaciones de genes exógenos, que incluyen, sin limitación, una tioesterasa de acil-ACP grasa y una reductasa acil-CoA grasa para generar aldehídos. En una realización, el vector proporciona la combinación de una tioesterasa de acil-ACP grasa, una reductasa acil-CoA grasa y una descarbonilasa de aldehído graso para generar alcanos. En cada una de estas realizaciones, uno o más de los genes exógenos pueden expresarse usando un promotor inducible.
[0154] Otros vectores ilustrativos de la descripción que expresan dos o más genes exógenos incluyen los que codifican tanto un transportador de sacarosa como una enzima invertasa de sacarosa y los que codifican tanto un marcador seleccionable como una sacarosa invertasa secretada. La Prototheca recombinante transformada con cualquier tipo de vector produce lípidos a un costo de fabricación más bajo debido a la capacidad de ingeniería para usar la caña de azúcar (y azúcares derivados de la caña de azúcar) como fuente de carbono. La inserción de los dos genes exógenos descritos anteriormente se puede combinar con la interrupción de la biosíntesis de polisacáridos a través de mutagénesis dirigida y/o aleatoria, que conduce a un flujo de carbono cada vez mayor en la producción de lípidos. Individualmente y en combinación, la conversión trófica, la ingeniería para alterar la producción de lípidos y el tratamiento con enzimas exógenas alteran la composición lipídica producida por un microorganismo. La alteración puede ser un cambio en la cantidad de lípidos producidos, la cantidad de una o más especies de hidrocarburos producidas en relación con otros lípidos, y/o los tipos de especies de lípidos producidos en el microorganismo. Por ejemplo, las microalgas se pueden diseñar para producir una mayor cantidad y/o porcentaje de TAG.
[0155] Para la expresión óptima de una proteína recombinante, es beneficioso emplear secuencias codificantes que producen ARNm con codones utilizados preferentemente por la célula huésped para la transformación. Por lo tanto, la expresión adecuada de los transgenes puede requerir que el uso de codones del transgen coincida con el sesgo de codones específico del organismo en el que se expresa el transgen. Los mecanismos precisos que subyacen a este efecto son muchos, pero incluyen el equilibrio adecuado de los grupos de ARNt aminoacilados disponibles con proteínas que se sintetizan en la célula, junto con una traducción más eficiente del ARN mensajero transgénico (ARNm) cuando se satisface esta necesidad. Cuando el uso de codones en el transgen no está optimizado, los conjuntos de ARNt disponibles no son suficientes para permitir la traducción eficiente del ARNm heterólogo que da como resultado el estancamiento y la terminación ribosómica y la posible inestabilidad del ARNm transgénico.
[0156] La presente invención proporciona ácidos nucleicos con codones optimizados útiles para la expresión exitosa de proteínas recombinantes en Prototheca. El uso de codones en especies de Prototheca se analizó mediante el estudio de secuencias de ADNc aisladas de Prototheca moriformis. Este análisis representa la interrogación sobre 24.000 codones y dio como resultado la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1. Uso de codón preferido en cepas de Prototheca.
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(continúa)
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[0157] En otras realizaciones, el gen en el vector recombinante se ha optimizado con codones con referencia a una cepa de microalgas que no sea una cepa de Prototheca. Por ejemplo, los métodos de recodificación de genes para la expresión en microalgas se describen en la Patente de EE.UU. 7,135,290. Información adicional para la optimización de codones está disponible, por ejemplo, en la base de datos de uso de codones de GenBank.
[0158] Si bien los métodos y materiales de la invención permiten la introducción de cualquier gen exógeno en Prototeca, los genes relacionados con la utilización de sacarosa y la modificación de la ruta de los lípidos son de particular interés, como se discute en las siguientes secciones.
IV. UTILIZACIÓN DE SUCROSA
[0159] En la realización, la célula de Prototheca recombinante de la descripción contiene además uno o más genes de utilización de sacarosa exógenos. En diversas realizaciones, el uno o más genes codifican una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en una fructoquinasa, una glucoquinasa, una hexoquinasa, una sacarosa invertasa, un transportador de sacarosa. Por ejemplo, la expresión de un transportador de sacarosa y una invertasa de sacarosa permite a Prototheca transportar sacarosa a la célula desde los medios de cultivo e hidrolizar sacarosa para producir glucosa y fructosa. Opcionalmente, una fructoquinasa puede expresarse también en casos en los que la actividad de hexoquinasa endógena es insuficiente para la fosforilación máxima de fructosa. Ejemplos de transportadores de sacarosa adecuados son los números de acceso de Genbank CAD91334, CAB92307 y CAA53390. Ejemplos de fructoquinasas adecuadas son los números de acceso de Genbank P26984, P26420 y CAA43322.
[0160] En una realización, la presente invención proporciona una célula huésped de Prototheca que secreta una invertasa de sacarosa. La secreción de una invertasa de sacarosa elimina la necesidad de expresión de un transportador que pueda transportar sacarosa a la célula. Esto se debe a que una invertasa secretada cataliza la conversión de una molécula de sacarosa en una molécula de glucosa y una molécula de fructosa, las cuales pueden ser transportadas y utilizadas por los microbios proporcionados por la invención. Por ejemplo, la expresión de una invertasa de sacarosa (como SEQ ID NO: 3) con una señal de secreción (como la SEQ ID NO: 4 (de levadura), SEQ ID NO: 5 (de plantas superiores), SEQ ID NO: 6 (señal de secreción de consenso eucariota), y la SEQ ID NO: 7 (combinación de secuencia de señal de plantas superiores y consenso eucariota) genera actividad de invertasa fuera de la célula. Expresión de dicha proteína, según lo habilitado por la metodología de ingeniería genética aquí revelada, permite que las células ya capaces de utilizar glucosa extracelular como fuente de energía utilicen sacarosa como fuente de energía extracelular.
[0161] Las especies de prototheca que expresan una invertasa en medios que contienen sacarosa son una especie de microalgas preferida para la producción de aceite. El ejemplo 3 ilustra cómo los métodos y los reactivos de la presente descripción pueden usarse para expresar una invertasa de levadura recombinante y secretarla de una célula de Prototheca recombinante. La expresión y el direccionamiento extracelular de esta proteína completamente activa permite que las células huésped resultantes crezcan en sacarosa, mientras que sus contrapartes no transformadas no pueden. Por lo tanto, la presente descripción proporciona a las células recombinantes de Prototheca un gen de invertasa optimizado con codón, que incluye pero no se limita al gen de invertasa de levadura, integrado en su genoma de modo que el gen de invertasa se expresa según lo evaluado por la actividad de invertasa y la hidrólisis de sacarosa. La presente descripción también proporciona genes de invertasa útiles como marcadores seleccionables en células recombinantes de Prototheca, ya que tales células pueden crecer en sacarosa, mientras que sus contrapartes no transformadas no pueden; y métodos para seleccionar células huésped recombinantes usando una invertasa como un marcador potente y seleccionable para la genética molecular de algas.
[0162] La expresión exitosa de una sacarosa invertasa en Prototheca también ilustra otro aspecto de la presente divulgación, ya que demuestra que las proteínas heterólogas (recombinantes) pueden expresarse en la célula de alga y transitar con éxito fuera de la célula y al medio de cultivo en una forma totalmente activa y funcional. Por lo tanto, la presente descripción proporciona métodos y reactivos para expresar una amplia y diversa gama de proteínas heterólogas en microalgas y secretarlas fuera de la célula huésped. Dichas proteínas incluyen, por ejemplo, enzimas industriales como, por ejemplo, lipasas, proteasas, celulasas, pectinasas, amilasas, esterasas, oxidorreductasas, transferasas, lactasas, isomerasas e invertasas, así como proteínas terapéuticas como, por ejemplo, factores de crecimiento, citocinas, anticuerpos de longitud completa que comprenden dos cadenas ligeras y dos pesadas, Fabs, scFvs (fragmento variable de cadena sencilla), anticuerpos de tipo camélido, fragmentos de anticuerpos, fusiones de fragmentos de anticuerpos, fusiones de receptores de anticuerpos, insulina, interferones e insulina como factores de crecimiento
[0163] La expresión con éxito de una invertasa de sacarosa en Prototheca ilustra también otro aspecto de la presente descripción en que proporciona métodos y reactivos para el uso de péptidos de tránsito de hongos en las algas para dirigir la secreción de proteínas en Prototheca; y métodos y reactivos para determinar si un péptido puede funcionar, y la capacidad de éste para funcionar, como péptido de tránsito en las células de Prototheca. Los métodos y reactivos de la divulgación pueden usarse como una herramienta y plataforma para identificar otros péptidos de tránsito que pueden traficar con éxito proteínas fuera de una célula, y que la invertasa de levadura tiene una gran utilidad en estos métodos. Como se demostró en este ejemplo, la eliminación del péptido de tránsito de la invertasa de levadura endógena y su reemplazo por otros péptidos de tránsito, ya sea endógeno al alga huésped o de otras fuentes (eucariotas, procariotas y virales), puede identificar si algún péptido de interés puede funcionar como un péptido de tránsito en la salida de la proteína guía de la célula.
[0164] Los ejemplos de invertasas de sacarosa adecuadas incluyen las identificadas por los números de acceso de Genbank CAB95010, NP_012104 y CAA06839. Los ejemplos no limitantes de las invertasas adecuadas se enumeran a continuación en la Tabla 2. Las secuencias de aminoácidos para cada invertasa enumerada se incluyen en el Listado de Secuencias a continuación. En algunos casos, el gen de utilización de sacarosa exógena adecuado para uso en los métodos y vectores de la descripción codifica una invertasa de sacarosa que tiene al menos 40, 50, 60, 75 o 90% o más de identidad de aminoácidos con una sacarosa invertasa seleccionada de Tabla 2.
Tabla 2. Invertasas de sacarosa.
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[0165] La secreción de una invertasa al medio de cultivo por Prototheca permite que las células se cultiven tan bien en la melaza de desecho de procesamiento de caña de azúcar como en glucosa pura de grado reactivo; el uso de este producto de desecho de bajo valor del procesamiento de la caña de azúcar puede proporcionar ahorros significativos en la producción de lípidos y otros aceites. Por lo tanto, la presente descripción proporciona un cultivo microbiano que contiene una población de microorganismos Prototheca, y un medio de cultivo que comprende (i) sacarosa y (ii) una enzima sacarosa invertasa. En diversas realizaciones, la sacarosa en el cultivo proviene de sorgo, remolacha azucarera, caña de azúcar, melaza o material celulósico despolimerizado (que opcionalmente puede contener lignina). En otro aspecto, los métodos y reactivos de la divulgación aumentan significativamente el número y tipo de materias primas que pueden ser utilizadas por Prototheca recombinante. Si bien los microbios ejemplificados aquí se alteran de manera que puedan utilizar sacarosa, los métodos y reactivos de la divulgación se pueden aplicar de manera que las materias primas como la celulósica sean utilizables por un microbio huésped de ingeniería de la divulgación con la capacidad de secretar celulasas, pectinasas, isomerasas, o similares, de modo que los productos de descomposición de las reacciones enzimáticas ya no se toleren simplemente, sino que el huésped los utilice como fuente de carbono.
V. INGENIERÍA DE LA RUTA LÍPIDA
[0166] La presente invención también proporciona Prototheca recombinante que han sido modificados para alterar las propiedades y/o proporciones de lípidos producidos. La ruta puede modificarse adicionalmente, o alternativamente, para alterar las propiedades y/o proporciones de diversas moléculas de lípidos producidas a través del procesamiento enzimático de lípidos e intermedios en la ruta de los ácidos grasos. En diversas realizaciones, las células de Prototheca recombinantes de la invención tienen, en relación con sus contrapartes no transformadas, rendimiento optimizado de lípidos por unidad de volumen y/o por unidad de tiempo, longitud de la cadena de carbono (por ejemplo, para la producción de diesel renovable o para aplicaciones químicas industriales que requieren materia prima de lípidos), número reducido de enlaces dobles o triples, opcionalmente a cero, y aumentando la relación hidrógeno:carbono de una especie particular de lípidos o de una población de lípidos distintos.
[0167] En realizaciones particulares, una o más enzimas clave que controlan los puntos de ramificación en el metabolismo para la síntesis de ácidos grasos se han regulado hacia arriba o hacia abajo para mejorar la producción de lípidos. La regulación ascendente se puede lograr, por ejemplo, transformando células con construcciones de expresión en las que se expresa un gen que codifica la enzima de interés, por ejemplo, usando un fuerte promotor y/o elementos potenciadores que aumentan la transcripción. Tales construcciones pueden incluir un marcador seleccionable de modo que los transformantes puedan someterse a selección, lo que puede dar como resultado la amplificación de la construcción y un aumento en el nivel de expresión de la enzima codificada. Los ejemplos de enzimas adecuadas para la regulación positiva de acuerdo con los métodos de la divulgación incluyen deshidrogenasa de piruvato, que desempeña un papel en la conversión de piruvato en acetil-CoA (los ejemplos, algunos de microalgas, incluyen los números de acceso de Genbank NP_415392; AAA53047; Q1XDM1; y CAF05587). La regulación positiva de deshidrogenasa de piruvato puede aumentar la producción de acetil-CoA y, por lo tanto, aumentar la síntesis de ácidos grasos. La acetil-CoA carboxilasa cataliza el paso inicial en la síntesis de ácidos grasos. En consecuencia, esta enzima se puede regular para aumentar la producción de ácidos grasos (ejemplos, algunos de microalgas, incluyen los números de acceso de Genbank BAA94752; AAA75528; AAA81471; YP_537052; YP_536879; NP_045833; y BAA57908). La producción de ácidos grasos también se puede aumentar mediante la regulación positiva de la proteína portadora de acilo (ACP), que transporta las cadenas de acilo en crecimiento durante la síntesis de ácidos grasos (ejemplos, algunos de microalgas, incluyen los números de acceso de Genbank A0T0F8; P51280; NP_849041; y P_874433). La glicerol-3-fosfato aciltransferasa cataliza el paso limitante de la síntesis de ácidos grasos. La regulación positiva de esta enzima puede aumentar la producción de ácidos grasos (ejemplos, algunos de microalgas, incluyen los números de acceso de Genbank AAA74319; AAA33122; AAA37647; p44857 y ABO94442).
[0168] La regulación hacia arriba y/o hacia abajo de los genes se puede aplicar a los reguladores globales que controlan la expresión de los genes de las rutas biosintéticas de los ácidos grasos. En consecuencia, uno o más reguladores globales de la síntesis de ácidos grasos pueden regularse de manera ascendente o descendente, según corresponda, para inhibir o mejorar, respectivamente, la expresión de una pluralidad de genes sintéticos de ácidos grasos y, en última instancia, para aumentar la producción de lípidos. Los ejemplos incluyen proteínas de unión a elementos reguladores de esteroles (SREB-Ps), como SREBP-1a y SREBP-1c (para ejemplos, consulte los números de acceso de Genbank NP_035610 y Q9WTN3).
[0169] La presente descripción también proporciona células de Prototheca recombinantes que se han modificado para contener uno o más genes exógenos que codifican enzimas de modificación de lípidos tales como, por ejemplo, tioesterasas acil-ACPs grasas (ver Tabla 3), reductasa acil-CoA/aldehídos grasos (consulte la Tabla 4), reductasas acil-CoA grasas (consulte la Tabla 5), descarbonilasa de aldehído graso (consulte la Tabla 6), reductasas de aldehído graso y sintasas de escualeno (consulte el número de registro de GenBank AF205791). En algunas realizaciones, los genes que codifican una tioesterasa de acil-ACP grasa y una proteína portadora de acilo coexpresada naturalmente se transforman en una célula Prototheca, opcionalmente con uno o más genes que codifican otras enzimas de modificación de lípidos. En otras realizaciones, el ACP y la tioesterasa de acil-ACP grasa pueden tener una afinidad recíproca que confiere una ventaja cuando los dos se usan juntos en los microbios y métodos de la presente descripción, independientemente de si son o no naturalmente co-expresados en un tejido u organismo particular. Por lo tanto, la presente descripción contempla tanto pares coexpresados naturalmente de estas enzimas como aquellos que comparten una afinidad por interactuar entre sí para facilitar la escisión de una cadena de carbono de longitud específica del ACP.
[0170] En aún otras realizaciones de la descripción, un gen exógeno que codifica una desaturasa se transforma en la célula Prototheca junto con uno o más genes que codifican otras enzimas de modificación de lípidos para proporcionar modificaciones con respecto a la saturación de lípidos. Desaturasa de estearoílo-ACP (ver, por ejemplo, números de acceso de GenBank a Af 15308; ABM45911; y AAY86086), por ejemplo, cataliza la conversión de estearoil-ACP a oleoil-ACP. La regulación positiva de este gen puede aumentar la proporción de ácidos grasos monoinsaturados producidos por una célula; mientras que la baja regulación puede reducir la proporción de monoinsaturados. De manera similar, la expresión de una o más desaturasas de glicerolípidos se puede controlar para alterar la proporción de ácidos grasos insaturados a saturados, tales como la desaturasa de ácido graso u>-6, la desaturasa de ácido graso w-3 o la desaturasa de w-6-oleato desatasa. En algunas realizaciones, la desaturasa se puede seleccionar con referencia a una longitud de cadena de carbono deseada, de modo que la desaturasa sea capaz de realizar modificaciones específicas de ubicación dentro de un sustrato de longitud de carbono específico, o sustratos que tengan una longitud de carbono dentro de un intervalo especificado.
[0171] Por lo tanto, en realizaciones particulares, los microbios de la presente descripción están diseñados genéticamente para expresar uno o más genes exógenos seleccionados de una tioesterasa de acil-ACP, una reductasa de acil-CoA/aldehído, una reductasa de acil-CoA graso, un aldehído graso reductasa, una descarbonilasa de aldehído graso o una proteína transportadora de acilo coexpresada naturalmente. Los métodos de expresión adecuados se describen anteriormente con respecto a la expresión de un gen de lipasa, que incluye, entre otros métodos, la expresión inducible y la expresión compartimentada. Una tioesterasa de acil-ACP grasa escinde un ácido graso de una proteína portadora de acilo (ACP) durante la síntesis de lípidos. A través de un procesamiento enzimático adicional, el ácido graso escindido se combina con una coenzima para producir una molécula de acil-CoA. Este acil-CoA es el sustrato para la actividad enzimática de una reductasa acil-CoA grasa para producir un aldehído, así como para una reductasa acil-CoA/aldehído grasa para producir un alcohol. El aldehído producido por la acción de la reductasa acil-CoA grasa identificada anteriormente es el sustrato para una actividad enzimática adicional por una reductasa aldehído graso para producir un alcohol, o una descarbonilasa de aldehído graso para producir un alcano o alqueno.
[0172] En algunas realizaciones, los ácidos grasos, los glicerolípidos o los alcoholes primarios, aldehídos, alcanos o alquenos correspondientes, generados por los métodos descritos en este documento, contienen 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono. Los ácidos grasos preferidos para la producción de diesel, biodiesel, diesel renovable o combustible para reactores, o los alcoholes primarios, aldehídos, alcanos y alquenos correspondientes, para aplicaciones industriales contienen de 8 a 14 átomos de carbono. En ciertas realizaciones, los ácidos grasos anteriores, así como las otras moléculas de hidrocarburos correspondientes, están saturadas (sin enlaces dobles o triples carbono-carbono); mono insaturados (enlace doble simple); poli no saturados (dos o más dobles enlaces); son lineales (no cíclicos) o ramificados. Para la producción de combustible, se prefiere una mayor saturación.
[0173] Las enzimas descritas directamente anteriormente tienen una especificidad preferencial para la hidrólisis de un sustrato que contiene un número específico de átomos de carbono. Por ejemplo, una tioesterasa de acil-ACP grasa puede tener preferencia por escindir un ácido graso que tiene 12 átomos de carbono del ACP. En algunas realizaciones, el ACP y la tioesterasa de longitud específica pueden tener una afinidad entre sí que los hace particularmente útiles como una combinación (por ejemplo, los genes de ACP y tioesterasa exógenos pueden coexpresarse naturalmente en un tejido u organismo particular a partir del cual se derivan) Por lo tanto, en diversas realizaciones, la célula de Prototheca recombinante de la descripción puede contener un gen exógeno que codifica una proteína con especificidad para catalizar una actividad enzimática (por ejemplo, escisión de un ácido graso de un ACP, reducción de un acil-CoA a un aldehído o un alcohol, o la conversión de un aldehído a un alcano) con respecto al número de átomos de carbono contenidos en el sustrato. La especificidad enzimática puede ser, en diversas realizaciones, para un sustrato que tiene de 8 a 34 átomos de carbono, preferiblemente de 8 a 18 átomos de carbono, y más preferiblemente de 8 a 14 átomos de carbono. Una especificidad preferida es para un sustrato que tiene menos, es decir, 12, en lugar de más, es decir, 18 átomos de carbono.
[0174] En ejemplos no limitativos pero ilustrativos, la presente descripción proporciona vectores y células huésped de Prototheca que expresan una tioesterasa exógena y, en consecuencia, producen lípidos enriquecidos, en relación con el perfil lipídico de las células de Prototheca no transformadas, en la longitud de la cadena para la cual la tioesterasa es específica. Las tioesterasas ilustradas son (i) Cinnamomum camphorum FatB1 (GenBank Accension N° Q39473, la secuencia de aminoácidos está en SEQ ID NO: 59, la secuencia de aminoácidos sin secuencia de direccionamiento de plástidos (PTS) está en SEQ ID NO: 139, y el codón la secuencia de ADNc optimizada basada en la Tabla 1 está en SEQ ID NO: 60), que tiene preferencia por sustrato de acil-ACP graso con una longitud de cadena de carbono de 14; (ii) Cuphea hookeriana FatB2 (Accensión GenBank N° AAC49269, la secuencia de aminoácidos está en SEQ ID NO: 61, la secuencia de aminoácidos sin PTS está en SEQ ID NO: 138, y la secuencia de ADNc optimizada por codón basada en la Tabla 1 está en SEQ ID NO: 62), que tiene preferencia por un sustrato de acil-ACP graso con una longitud de cadena de carbono de 8-10; y (iii) Umbellularia Fat B1 (N° de acceso de GenBank Q41635, la secuencia de aminoácidos se incluye en SEQ ID NO: 63, la secuencia de aminoácidos sin PTS está en SEQ ID NO: 139, y se incluye la secuencia de ADNc optimizada con codón basada en la Tabla 1 en SEQ ID NO: 64), que tiene preferencia por un sustrato de acil-ACP graso con una longitud de cadena de carbono de 12.
[0175] Otras tioesterasas de acil-ACP graso adecuadas para uso con los microbios y los métodos de la divulgación incluyen, sin limitación, los enumerados en la Tabla 3.
Tabla 3. Tioesterasas de acil-ACP graso y números de acceso a GenBank.
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(continúa)
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[0176] Los ejemplos a continuación describen el direccionamiento exitoso y la expresión de tioesterasas acil-ACP graso heterólogas de Cuphea hookeriana, Umbellularia californica, Cinnamomun camphora en especies de Prototheca. Además, se confirmaron alteraciones en los perfiles de ácidos grasos en la expresión de las células huésped en estas tioesterasas acil-ACP graso heterólogas. Estos resultados fueron bastante inesperados dada la falta de identidad de secuencia entre algas y tioesterasas de plantas superiores en general, y entre la tioesterasa de acil-ACP grasa Prototheca moriformis y las tioesterasas acil-ACP graso heterólogas mencionadas anteriormente. Se aislaron y secuenciaron dos tioesterasas de acil-ACP de Prototheca moriformis. Las secuencias de los dos ADNc mostraron un alto grado de identidad entre ellas, que diferían en solo 12 posiciones a nivel de nucleótidos y cinco posiciones a nivel de aminoácidos, cuatro de ellas en el péptido de tránsito de los plástidos. Un análisis posterior de la secuencia genómica de Prototheca moriformis confirmó que estos dos ADNc se codificaron en contigs separados y, aunque son muy homólogos, están codificados por dos genes distintos. El ADNc y la secuencia de aminoácidos de las dos tioesterasas de acil-ACP graso de Prototheca moriformis, la tioesterasa de acil-ACP grasa de P.moriformis -1 y la tioesterasa de acil-ACP grasa de P.moriformis-2, se enumeran como SEQ ID NO: 134-137.
[0177] Cuando a las secuencias de aminoácidos de estos dos ADNc se les aplicó BLAST contra la base de datos NCBI, las dos secuencias más homólogas fueron las tioesterasas acil-ACP graso de Chlamydomonas reinhardtii y Arabidopsis thaliana. Sorprendentemente, el nivel de identidad de aminoácidos entre las tioesterasas de acil-ACP graso de Prototheca moriformis y las tioesterasas de plantas superiores fueron bastante bajas, con solo 49 y 37% de identidad. Además, también hay una sutil diferencia en las secuencias que rodean la porción amino terminal de la tríada catalítica (NXHX36C) entre estas tioesterasas acil-ACP grasos. Treinta y nueve de cuarenta tioesterasas acil-ACP graso vegetales superiores estudiadas mostraron la secuencia LDMNQH que rodea los residuos N y H en el extremo amino de la tríada, mientras que todas las secuencias de algas identificadas tenían la secuencia MDMNGH. Dada la baja identidad de la secuencia de aminoácidos y las diferencias que rodean la tríada catalítica de las tioesterasas, los resultados exitosos de la expresión de tioesterasas acil-ACP graso exógenas obtenidas y descritas en los Ejemplos fueron inesperadas, particularmente dado el hecho de que la actividad de las tioesterasas acil-ACP graso exógenas dependía de una interacción funcional proteína-proteína con la proteína portadora de acilo Prototheca endógena.
[0178] Las reductasas acil-CoA/aldehídos grasos adecuadas para uso con los microbios y los métodos de la divulgación incluyen, sin limitación, los enumerados en la Tabla 4.
Tabla 4. Grasas reductasa acil-CoA/aldehídos enumeradas por los números de acceso de GenBank
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[0179] Las reductasas de acil-CoA grasas adecuadas para uso con los microbios y los métodos de la divulgación incluyen, sin limitación, los que se enumeran en la Tabla 5.
Tabla 5. Reductasas de acil-CoA grasas enumeradas por los números de acceso de GenBank.
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[0180] Las descarbonilasas de aldehído graso adecuadas para uso con los microbios y los métodos de la divulgación incluyen, sin limitación, los enumerados en la Tabla 6.
Tabla 6. Descarbonilasas de aldehído graso enumeradas por números de acceso de GenBank
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[0181] Las combinaciones de tioesterasas de acil-ACP graso coexpresadas naturalmente y proteínas transportadoras de acilo son adecuadas para uso con los microbios y los métodos de la invención.
[0182] Ejemplos adicionales de enzimas de modificación de hidrocarburos o lípidos incluyen secuencias de aminoácidos contenidas, referenciadas o codificadas por secuencias de ácido nucleico contenidas o referenciadas en cualquiera de las siguientes patentes de EE.UU.: 6,610,527; 6,451,576; 6,429,014; 6,342,380; 6,265,639; 6,194,185; 6,114,160; 6,083,731; 6,043,072; 5,994,114; 5,891,697; 5,871,988; 6,265,639, y se describe adicionalmente en los números de acceso de GenBank: AAO18435; ZP_00513891; Q38710; AAK60613; AAK60610; AAK60611; NP_113747; CAB75874; AAK60612; AAF20201; BAA11024; AF205791; y CAA03710.
[0183] Otras enzimas adecuadas para uso con los microbios y los métodos de la divulgación incluyen aquellas que tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos con una de las proteínas enumeradas en las Tablas 3-6, y que exhiben la actividad enzimática deseada correspondiente (p. ej., escisión de un ácido graso de una proteína portadora de acilo, reducción de un acil-CoA en un aldehído o un alcohol, o conversión de un aldehído en un alcano). En realizaciones adicionales, la actividad enzimática está presente en una secuencia que tiene al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% identidad con una de las secuencias descritas anteriormente.
[0184] Al seleccionar la combinación deseada de genes exógenos a expresar, se puede adaptar el producto generado por el microbio, que luego se puede extraer de la biomasa acuosa. Por ejemplo, el microbio puede contener: (i) un gen exógeno que codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa; y, opcionalmente, (ii) una proteína portadora de acilo coexpresada de forma natural o una proteína portadora de acilo que tiene afinidad por la tioesterasa de acil-ACP grasa (o viceversa); y, opcionalmente, (iii) un gen exógeno que codifica una reductasa acil-CoA/aldehído grasa o una reductasa acil-CoA grasa; y, opcionalmente, (iv) un gen exógeno que codifica una reductasa de aldehído graso o una descarbonilasa de aldehído graso. El microbio, en las condiciones de cultivo descritas en el presente documento, sintetiza un ácido graso unido a un ACP y la tioesterasa de acil-ACP grasa cataliza la escisión del ácido graso del ACP para producir, mediante un procesamiento enzimático adicional, una molécula de acil-CoA graso. Cuando está presente, la reducatasa de acil-CoA/aldehído graso cataliza la reducción de la acil-CoA a un alcohol. De forma similar, la reductasa acil-CoA grasa, cuando está presente, cataliza la reducción de la acil-CoA a un aldehído. En aquellas realizaciones en las que un gen exógeno que codifica una reductasa acil-CoA grasa está presente y se expresa para producir un producto aldehído, una reductasa aldehído grasa, codificada por el tercer gen exógeno, cataliza la reducción del aldehído a un alcohol. De manera similar, una descarbonilasa de aldehído graso cataliza la conversión del aldehído en un alcano o un alqueno, cuando está presente.
[0185] Los genes que codifican tales enzimas pueden obtenerse de células que ya se sabe que exhiben una producción significativa de lípidos tales como los Chlorella protothecoides. Los genes que ya se sabe que desempeñan un papel en la producción de lípidos, por ejemplo, un gen que codifica una enzima que satura los dobles enlaces, pueden transformarse individualmente en células receptoras. Sin embargo, para practicar la invención no es necesario hacer suposiciones a priori en cuanto a qué genes se requieren. Los métodos para identificar genes que pueden alterar (mejorar) la producción de lípidos en microalgas se describen en PCT Pub. N° 2008/151149.
[0186] Por lo tanto, la presente descripción proporciona una célula de Prototheca que ha sido modificada genéticamente para expresar una enzima de la ruta de los lípidos a un nivel alterado en comparación con una célula de tipo salvaje de la misma especie. En algunos casos, la célula produce más lípidos en comparación con la célula de tipo salvaje cuando ambas células crecen en las mismas condiciones. En algunos casos, la célula ha sido modificada genéticamente y/o seleccionada para expresar una enzima de la ruta de los lípidos a un nivel más alto que la célula de tipo salvaje. En algunos casos, la enzima de la ruta de los lípidos se selecciona del grupo que consiste en deshidrogenasa de piruvato, acetil-CoA carboxilasa, proteína portadora de acilo y aciltransferasa de glicerol-3 fosfato. En algunos casos, la célula ha sido modificada genéticamente y/o seleccionada para expresar una enzima de la ruta de los lípidos a un nivel más bajo que la célula de tipo salvaje. En al menos una realización en la que la célula expresa la enzima de la vía lipídica a un nivel inferior, la enzima de la vía lipídica comprende citrato sintasa.
[0187] En algunas realizaciones de la divulgación, la célula ha sido modificada genéticamente y/o seleccionada para expresar un regulador global de la síntesis de ácidos grasos a un nivel alterado en comparación con la célula de tipo salvaje, por lo que los niveles de expresión de una pluralidad de grasas. Los genes sintéticos ácidos se alteran en comparación con la célula de tipo salvaje. En algunos casos, la enzima de la ruta de los lípidos comprende una enzima que modifica un ácido graso. En algunos casos, la enzima de la ruta de los lípidos se selecciona entre una desaturasa de estearoil-ACP y una desaturasa glicerolipídica.
[0188] En otras realizaciones, la presente descripción se dirige a un microbio productor de aceite que contiene uno o más genes exógenos, en donde los genes exógenos codifican proteínas seleccionadas del grupo que consiste en una tioesterasa de acil-ACP grasa, una reductasa acilo-CoA graso, una reductasa de aldehído grasa, una reductasa acil-CoA/aldehído grasa, una descarbonilasa de aldehído graso y una proteína portadora de acilo. En una realización, el gen exógeno está en enlace operable con un promotor, que es inducible o reprimible en respuesta a un estímulo. En algunos casos, el estímulo se selecciona del grupo que consiste en una molécula pequeña proporcionada de manera exógena, calor, frío y nitrógeno limitado o nulo en los medios de cultivo. En algunos casos, el gen exógeno se expresa en un compartimento celular. En algunas realizaciones, el compartimento celular se selecciona del grupo que consiste en un cloroplasto, un plastidio y una mitocondria. En algunas realizaciones, el microbio es Prototheca moriformis, Prototheca krugani, Prototheca stagnora o Prototheca zopfii.
[0189] En una realización, el gen exógeno codifica una tioesterasa de acil-ACP de ácido graso. En algunos casos, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 8 a 18 carbonos de una proteína portadora de acilo (ACP). En algunos casos, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 10 a 14 carbonos de un ACP. En una realización, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 12 carbonos de un ACP.
[0190] En una realización de la descripción, el gen exógeno codifica una reductasa acil-CoA/aldehído grasa. En algunos casos, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 8 a 18 carbonos a un alcohol primario correspondiente. En algunos casos, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 10 a 14 carbonos a un alcohol primario correspondiente. En una realización, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 12 carbonos a dodecanol.
[0191] La presente descripción también proporciona una célula Prototheca recombinante que contiene dos genes exógenos, en donde un primer gen exógeno codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa y un segundo gen exógeno codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste de una reductasa acil-CoA grasa, una reductasa acil-CoA/aldehído grasa y una proteína transportadora de acilo. En algunos casos, los dos genes exógenos están cada uno en un enlace operable con un promotor, que es inducible en respuesta a un estímulo. En algunos casos, cada promotor es inducible en respuesta a un estímulo idéntico, como nitrógeno limitado o nulo en los medios de cultivo. La limitación o la falta total de nitrógeno en los medios de cultivo estimula la producción de petróleo en algunos microorganismos, como las especies de Prototheca, y puede usarse como un desencadenante para inducir la producción de aceite a altos niveles. Cuando se usa en combinación con los métodos de ingeniería genética descritos en este documento, el lípido como porcentaje del peso de la célula seca se puede llevar a niveles altos, como al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70% y al menos 75%; los métodos descritos en este documento proporcionan células con estos niveles de lípidos, en donde el lípido es al menos 4% de C8-C14, al menos 0,3% de C8, al menos 2% de C10, al menos 2% de C12 y al menos 2% de C14. En algunas realizaciones de la descripción, las células tienen más del 25% de lípidos por peso de células secas y contienen lípidos que son al menos 10% de C8-C14, al menos 20% de C8-C14, al menos 30% de C8-C14, 10-30% de C8-C14 y 20-30% de C8-C14.
[0192] Los nuevos aceites descritos en este documento son distintos de otros aceites de origen natural que son altos en ácidos grasos de cadena mic, tales como aceite de palma, aceite de almendra de palma y aceite de coco. Por ejemplo, los niveles de contaminantes como los carotenoides son mucho más altos en el aceite de palma y el aceite de almendra de palma que en los aceites de la divulgación. Los aceites de palma y almendra de palma en particular contienen carotenos alfa y beta y licopeno en cantidades mucho más altas que en los aceites de la divulgación. Además, se encuentran más de 20 carotenoides diferentes en el aceite de palma y almendra de palma, mientras que los ejemplos demuestran que los aceites de la descripción contienen muy pocas especies de carotenoides y niveles muy bajos. Además, los niveles de compuestos de vitamina E como los tocotrienoles son mucho más altos en la palma, el grano de palma y el aceite de coco que en los aceites de la divulgación.
[0193] En una realización, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 8 a 18 carbonos de un ACP. En algunas realizaciones de la descripción, el segundo gen exógeno codifica una reductasa acil-CoA/aldehído grasa que cataliza la reducción de una acil-CoA grasa de 8 a 18 carbonos a un alcohol primario correspondiente. En algunos casos, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 10 a 14 carbonos de un ACP, y la reductasa codificada por el segundo gen exógeno cataliza la reducción de un acilo graso de 10 a 14 carbonos. CoA al alcohol primario correspondiente, en el que la tioesterasa y la reductasa actúan sobre la misma longitud de la cadena de carbono. En una realización, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 12 carbonos de un ACP, y la reductasa codificada por el segundo gen exógeno cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 12 carbonos a dodecanol. En algunas realizaciones de la descripción, el segundo gen exógeno codifica una reductasa acil-CoA grasa que cataliza la reducción de una acil-CoA grasa de 8 a 18 carbonos a un aldehído correspondiente. En algunas realizaciones, el segundo gen exógeno codifica una proteína portadora de acilo que se coexpresa naturalmente con la tioesterasa de acil-ACP grasa.
[0194] En algunas realizaciones de la divulgación, el segundo gen exógeno codifica una reductasa acil-CoA grasa, y el microbio contiene además un tercer gen exógeno que codifica una descarbonilasa de aldehído graso. En algunos casos, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 8 a 18 carbonos de un ACP, la reductasa codificada por el segundo gen exógeno cataliza la reducción de un acil-CoA graso de 8 a 18 carbonos a un aldehído graso correspondiente, y la descarbonilasa codificada por el tercer gen exógeno cataliza la conversión de un aldehído graso de 8 a 18 carbonos en un alcano correspondiente, en el que la tioesterasa, la reductasa y la descarbonilasa actúan sobre la misma cadena de carbono longitud.
[0195] En algunas realizaciones de la descripción, el segundo gen exógeno codifica una proteína transportadora de acilo, y el microbio contiene además un tercer gen exógeno que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en una reductasa acil-CoA grasa y una acil-CoA grasa/reductasa aldehído. En algunos casos, el tercer gen exógeno codifica una reductasa acil-CoA grasa, y el microbio contiene además un cuarto gen exógeno que codifica una descarbonilasa de aldehído graso.
[0196] La presente descripción también proporciona métodos para producir un alcohol que comprende cultivar una población de células de Prototheca recombinantes en un medio de cultivo, en el que las células contienen (i) un primer gen exógeno que codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa, y (ii) segundo gen exógeno que codifica una reductasa acil-CoA/aldehído grasa, y las células sintetizan un ácido graso unido a una proteína transportadora de acilo (ACP), la tioesterasa de acil-ACP grasa cataliza la escisión del ácido graso del ACP para producir, a través de procesamiento adicional, un acil-CoA graso y la reductasa acil-CoA/aldehído grasa catalizan la reducción del acil-CoA a un alcohol.
[0197] La presente descripción también proporciona métodos para producir una molécula de lípidos en una célula de Prototheca. En una realización, el método comprende cultivar una población de células Prototheca en un medio de cultivo, en el que las células contienen (i) un primer gen exógeno que codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa, y (ii) un segundo gen exógeno que codifica una reductasa de acil-CoA grasa, y en donde los microbios sintetizan un ácido graso unido a una proteína portadora de acilo (ACP), la tioesterasa de acil-ACP grasa cataliza la escisión del ácido graso del ACP para producir, a través de un procesamiento adicional, un acil graso CoA, y la reductasa acil-CoA grasa cataliza la reducción del acil-CoA a un aldehído.
[0198] La presente descripción también proporciona métodos para producir una molécula de ácido graso que tiene una longitud de cadena de carbono especificado en un Prototheca celular. En una realización, el método comprende cultivar una población de células Prototheca productoras de lípidos en un medio de cultivo, en el que los microbios contienen un gen exógeno que codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa que tiene una actividad específica o preferencial a una determinada longitud de la cadena de carbono, como 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono, y en donde los microbios sintetizan un ácido graso unido a una proteína portadora de acilo (ACP) y la tioesterasa cataliza la escisión del ácido graso del ACP cuando el ácido graso se ha sintetizado en el longitud de la cadena de carbono.
[0199] En las diversas realizaciones descritas anteriormente, la célula Prototheca puede contener al menos un gen exógeno que codifica una enzima de la ruta de los lípidos. En algunos casos, la enzima de la ruta de los lípidos se selecciona del grupo que consiste en una desaturasa de estearoílo-ACP, una desaturasa glicerolipídica, una deshidrogenasa de piruvato, una acetil-CoA carboxilasa, una proteína portadora de acilo y una aciltransferasa de glicerol-3 fosfato. En otros casos, la célula de Prototheca contiene una enzima de modificación de lípidos seleccionada del grupo que consiste en una tioesterasa de acil-ACP grasa, una reductasa de acil-CoA/aldehído grasa, una reductasa de acil-CoA grasa, una reductasa aldehído grasa, una descarbonilasa de aldehído grasa, y/o una proteína portadora de acilo.
VI. PRODUCCION DE COMBUSTIBLES Y QUIMICOS
[0200] Para la producción de combustible de acuerdo con los métodos de la divulgación, los lípidos producidos por las células de la divulgación se cosechan, o se recogen de otro modo, por cualquier medio conveniente. Los lípidos pueden aislarse mediante extracción celular completa. Las células se rompen primero, y luego los lípidos intracelulares y asociados a la membrana celular/pared celular, así como los hidrocarburos extracelulares se pueden separar de la masa celular, tal como mediante el uso de centrifugación como se describió anteriormente. Los lípidos intracelulares producidos en microorganismos se extraen, en algunas realizaciones, después de lisar las células del microorganismo. Una vez extraídos, los lípidos se refinan aún más para producir aceites, combustibles u oleoquímicos.
[0201] Después de completar el cultivo, los microorganismos pueden separarse del caldo de fermentación. Opcionalmente, la separación se efectúa por centrifugación para generar una pasta concentrada. La centrifugación no elimina cantidades significativas de agua intracelular de los microorganismos y no es un paso de secado. La biomasa se puede lavar opcionalmente con una solución de lavado (por ejemplo, agua desionizada) para eliminar el caldo de fermentación y los desechos. Opcionalmente, la biomasa microbiana lavada también se puede secar (secar en horno, liofilizar, etc.) antes de la disrupción celular. Alternativamente, las células se pueden lisar sin separación de parte o la totalidad del caldo de fermentación cuando se completa la fermentación. Por ejemplo, las células pueden estar en una proporción de menos de 1:1 v:v células a líquido extracelular cuando las células se lisan.
[0202] Los microorganismos que contienen un lípido se pueden lisar para producir un lisado. Como se detalla aquí, el paso de lisar un microorganismo (también conocido como lisis celular) se puede lograr por cualquier medio conveniente, incluida la lisis inducida por calor, agregando una base, agregando un ácido, usando enzimas tales como proteasas y enzimas de degradación de polisacáridos tales como amilasas, usando ultrasonido, lisis mecánica, usando choque osmótico, infección con un virus lítico y/o expresión de uno o más genes líticos. La lisis se realiza para liberar moléculas intracelulares que han sido producidas por el microorganismo. Cada uno de estos métodos para lisar un microorganismo se puede usar como un método único o en combinación simultánea o secuencial. La extensión de la disrupción celular se puede observar mediante análisis microscópico. Usando uno o más de los métodos descritos aquí, típicamente se observa más del 70% de rotura celular. Preferiblemente, la rotura celular es más del 80%, más preferiblemente más del 90% y lo más preferido aproximadamente el 100%.
[0203] En realizaciones particulares de la divulgación, el microorganismo se lisa después del crecimiento, por ejemplo para aumentar la exposición de lípidos y/o hidrocarburos celulares para extracción o procesamiento adicional. El momento de la expresión de lipasa (por ejemplo, a través de un promotor inducible) o la lisis celular se puede ajustar para optimizar el rendimiento de lípidos y/o hidrocarburos. A continuación se describen una serie de técnicas de lisis. Estas técnicas se pueden usar individualmente o en combinación.
[0204] En una realización de la presente descripción, la etapa de lisar un microorganismo comprende el calentamiento de una suspensión celular que contiene el microorganismo. En esta realización, el caldo de fermentación que contiene los microorganismos (o una suspensión de microorganismos aislados del caldo de fermentación) se calienta hasta que los microorganismos, es decir, las paredes celulares y las membranas de los microorganismos se degradan o descomponen. Típicamente, las temperaturas aplicadas son de al menos 50°C. Temperaturas más altas, tales como, al menos 30°C, al menos 60°C, al menos 70°C, al menos 80°C, al menos 90°C, al menos 100°C, al menos 110°C, al menos 120°C, al menos 130°C o más se utilizan para una lisis celular más eficiente. Las células de lisis por tratamiento térmico pueden realizarse hirviendo el microorganismo. Alternativamente, el tratamiento térmico (sin ebullición) se puede realizar en autoclave. El lisado tratado térmicamente puede enfriarse para un tratamiento adicional. La disrupción celular también puede realizarse mediante tratamiento con vapor, es decir, mediante la adición de vapor a presión. El tratamiento con vapor de microalgas para la disrupción celular se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N° 6,750,048. En algunas realizaciones, el tratamiento con vapor se puede lograr rociando vapor en el fermentador y manteniendo el caldo a una temperatura deseada durante menos de aproximadamente 90 minutos, preferiblemente menos de aproximadamente 60 minutos, y más preferiblemente menos de aproximadamente 30 minutos.
[0205] En otra realización de la presente descripción, la etapa de lisar un microorganismo comprende añadir una base a una suspensión celular que contiene el microorganismo. La base debe ser lo suficientemente fuerte como para hidrolizar al menos una parte de los compuestos proteicos de los microorganismos utilizados. Las bases que son útiles para solubilizar proteínas son conocidas en la técnica de la química. Las bases ejemplares que son útiles en los métodos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, hidróxidos, carbonatos y bicarbonatos de litio, sodio, potasio, calcio y mezclas de los mismos. Una base preferida es KOH. El tratamiento base de las microalgas para la disrupción celular se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos N° 6,750,048.
[0206] En otra realización de la presente descripción, la etapa de lisar un microorganismo comprende añadir un ácido a una suspensión celular que contiene el microorganismo. La lisis ácida se puede efectuar usando un ácido a una concentración de 10-500 mN o preferiblemente 40-160 nM. La lisis ácida se realiza preferiblemente a temperatura ambiente superior (por ejemplo, a 40-160°, y preferiblemente a una temperatura de 50-130°. Para temperaturas moderadas (por ejemplo, temperatura ambiente a 100°C y particularmente temperatura ambiente a 65°, tratamiento con ácido) puede combinarse de manera útil con sonicación u otros métodos de disrupción celular.
[0207] En otra realización de la presente divulgación, la etapa de lisar un microorganismo comprende lisar el microorganismo usando una enzima. Las enzimas preferidas para lisar un microorganismo son proteasas y enzimas degradadoras de polisacáridos como la hemicelulasa (p. ej., hemicelulasa de Aspergillus niger; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; n° H2l25), pectinasa (p. ej., pectinasa de Rhizopus sp.; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; n° P2401), Mannaway 4,0 L (Novozymes), celulasa (p. ej., Celulosa de Trichoderma viride; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; n° C9422), y driselasa (p. ej., Driselasa de Basidiomycetes sp.; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; n° D9515.
[0208] En otras realizaciones de la presente descripción, la lisis se lleva a cabo usando una enzima tal como, por ejemplo, una celulasa tal como una enzima que degrada el polisacárido, opcionalmente de Chlorella o un virus Chlorella, o una proteasa, tal como proteasa Streptomyces griseus, quimotripsina, proteinasa K, proteasas enumeradas en Degradación de polilactida por proteasas comerciales, Oda Yet al., Journal of Polymers and the Environment, Volumen 8, Número 1, enero de 2000, págs. 29-32 (4), Alcalasa 2,4 FG (Novozymes) y Flavourzyme 100 L (Novozymes). También se puede usar cualquier combinación de una proteasa y una enzima que degrada el polisacárido, incluida cualquier combinación de las proteasas anteriores y las enzimas que degradan el polisacárido.
[0209] En otra realización de la descripción, la lisis se puede realizar usando una prensa de expulsión. En este proceso, la biomasa es forzada a través de un dispositivo de tipo tornillo a alta presión, lisando las células y haciendo que el lípido intracelular se libere y se separe de la proteína y la fibra (y otros componentes) en la célula.
[0210] En otra realización de la presente descripción, el paso de lisar un microorganismo se realiza usando ultrasonido, es decir, sonicación. Por lo tanto, las células también pueden lisarse con sonido de alta frecuencia. El sonido puede producirse electrónicamente y transportarse a través de una punta metálica a una suspensión celular adecuadamente concentrada. Esta sonicación (o ultrasonicación) altera la integridad celular en función de la creación de cavidades en la suspensión celular.
[0211] En otra realización de la presente descripción, la etapa de lisar un microorganismo se realiza mediante lisis mecánica. Las células pueden ser lisadas mecánicamente y opcionalmente homogeneizadas para facilitar la recolección de hidrocarburos (por ejemplo, lípidos). Por ejemplo, se puede usar un interruptor de presión para bombear una célula que contiene lodo a través de una válvula de orificio restringido. Se aplica alta presión (hasta 1500 bar), seguida de una expansión instantánea a través de una boquilla de salida. La interrupción de la célula se logra mediante tres mecanismos diferentes: impacto en la válvula, alto cizallamiento del líquido en el orificio y caída repentina de presión al descargar, lo que provoca una explosión de la célula. El método libera moléculas intracelulares. Alternativamente, se puede usar un molino de bolas. En un molino de bolas, las células se agitan en suspensión con pequeñas partículas abrasivas, como perlas. Las células se rompen debido a las fuerzas de corte, el molido entre cuentas y las colisiones con cuentas. Las cuentas interrumpen las células para liberar contenido celular. Las células también pueden ser interrumpidas por fuerzas de corte, como el uso de mezclas (como con una mezcladora de alta velocidad o Waring como ejemplos), la prensa francesa, o incluso la centrifugación en caso de paredes celulares débiles, para romper las células.
[0212] En otra realización de la presente descripción, la etapa de lisar un microorganismo se realiza aplicando un choque osmótico.
[0213] En otra realización de la presente descripción, la etapa de lisar un microorganismo comprende la infección del microorganismo con un virus lítico. Se sabe que una amplia variedad de virus lisan microorganismos adecuados para su uso en la presente descripción, y la selección y uso de un virus lítico particular para un microorganismo particular está dentro del nivel de habilidad en la técnica. Por ejemplo, el virus de paramecium bursaria chlorella (PBCV-1) es el prototipo de un grupo (familia Phycodnaviridae, género Chlorovirus) de virus de ADN grandes, icosaédricos, formadores de placa, de doble cadena que se replican y lisan ciertas algas eucariotas unicelulares verdes parecidas a Chlorella. En consecuencia, cualquier microalga susceptible se puede lisar infectando el cultivo con un virus de Chlorella adecuado. Se conocen métodos para infectar especies de Chlorella con un virus de Chlorella. Ver por ejemplo Adv. Virus Res. 2006; 66: 293-336; Virology, 25 de abril de 1999; 257 (1): 15-23; Virology, 5 de enero de 2004; 318 (1): 214-23; Nucleic Acids Symp. Ser. 2000; (44): 161-2; J. Virol. 2006 Mar; 80 (5): 2437-44; y Annu Rev. Microbiol.
1999; 53: 447-94.
[0214] En otra realización de la presente descripción, la etapa de lisar un microorganismo comprende autólisis. En esta realización, un microorganismo según la descripción está genéticamente modificado para producir una proteína lítica que lisará el microorganismo. Este gen lítico puede expresarse usando un promotor inducible para que las células puedan crecer primero a una densidad deseable en un fermentador, seguido de la inducción del promotor para expresar el gen lítico para lisar las células. En una realización, el gen lítico codifica una enzima que degrada el polisacárido. En ciertas otras realizaciones, el gen lítico es un gen de un virus lítico. Así, por ejemplo, un gen lítico de un virus Chlorella puede expresarse en una célula de alga; ver Virology 260, 308-315 (1999); FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45-53; Virology 263, 376-387 (1999); y Virology 230, 361-368 (1997). La expresión de genes líticos se realiza preferiblemente usando un promotor inducible, tal como un promotor activo en microalgas que es inducido por un estímulo tal como la presencia de una molécula pequeña, luz, calor y otros estímulos.
[0215] Varios métodos están disponibles para separar los lípidos de los lisados celulares producidos por los métodos anteriores. Por ejemplo, los lípidos y derivados de lípidos como los aldehídos grasos, los alcoholes grasos y los hidrocarburos como los alcanos se pueden extraer con un solvente hidrófobo como el hexano (ver Frenz et al. 1989, Enzyme Microb. Technol., 11: 717). Los lípidos y los derivados de lípidos también se pueden extraer usando licuefacción (véase, por ejemplo, Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17: 33-39 e Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6 (4): 269-274); licuefacción de aceite (véase, por ejemplo, Minowa et al. 1995, Fuel 74 (12): 1735­ 1738); y extracción supercrítica de CO2 (véase, por ejemplo, Mendes et al. 2003, Inorganica Chimica Acta 356: 328­ 334). Miao y Wu describen un protocolo de recuperación de lípidos microalgales de un cultivo de prototeocoides de Chlorella en el que las células se cosecharon por centrifugación, se lavaron con agua destilada y se secaron por liofilización. El polvo celular resultante se pulverizó en un mortero y luego se extrajo con n-hexano. Miao y Wu, Biosource Technology (2006) 97: 841-846.
[0216] Por lo tanto, los lípidos, derivados de lípidos e hidrocarburos generados por los microorganismos de la presente descripción pueden recuperarse mediante extracción con un disolvente orgánico. En algunos casos, el disolvente orgánico preferido es el hexano. Típicamente, el disolvente orgánico se agrega directamente al lisado sin separación previa de los componentes del lisado. En una realización, el lisado generado por uno o más de los métodos descritos anteriormente se pone en contacto con un disolvente orgánico durante un período de tiempo suficiente para permitir que los componentes lipídicos y/o hidrocarbonados formen una solución con el disolvente orgánico. En algunos casos, la solución se puede refinar aún más para recuperar los componentes específicos deseados de lípidos o hidrocarburos. Los métodos de extracción con hexano son bien conocidos en la técnica.
[0217] Los lípidos y derivados de lípidos tales como aldehídos grasos, alcoholes grasos e hidrocarburos tales como alcanos producidos por células como se describe en el presente documento pueden modificarse mediante el uso de una o más enzimas, incluyendo una lipasa, como se describió anteriormente. Cuando los hidrocarburos se encuentran en el entorno extracelular de las células, se pueden agregar una o más enzimas a ese entorno en condiciones en las que la enzima modifica el hidrocarburo o completa su síntesis a partir de un precursor de hidrocarburos. Alternativamente, los hidrocarburos pueden aislarse parcial o completamente del material celular antes de la adición de uno o más catalizadores tales como enzimas. Dichos catalizadores se agregan exógenamente y su actividad se produce fuera de la célula o in vitro.
[0218] Por lo tanto, los lípidos e hidrocarburos producidos por células in vivo, o modificados enzimáticamente in vitro, como se describe en el presente documento, pueden procesarse adicionalmente opcionalmente por medios convencionales. El procesamiento puede incluir "craqueo" para reducir el tamaño, y así aumentar la relación hidrógeno:carbono, de las moléculas de hidrocarburos. Los métodos de craqueo catalítico y térmico se usan rutinariamente en el procesamiento de hidrocarburos y triglicéridos. Los métodos catalíticos implican el uso de un catalizador, como un catalizador ácido sólido. El catalizador puede ser sílice-alúmina o una zeolita, lo que da como resultado la rotura heterolítica o asimétrica de un enlace carbono-carbono para dar como resultado un carbocatión y un anión hidruro. Estos intermedios reactivos se someten a reordenamiento o transferencia de hidruro con otro hidrocarburo. Las reacciones pueden así regenerar los intermedios para dar como resultado un mecanismo de cadena autopropagante. Los hidrocarburos también se pueden procesar para reducir, opcionalmente a cero, el número de enlaces dobles o triples de carbono-carbono en el mismo. Los hidrocarburos también se pueden procesar para retirar o eliminar un anillo o estructura cíclica en el mismo. Los hidrocarburos también se pueden procesar para aumentar la relación hidrógeno:carbono. Esto puede incluir la adición de hidrógeno ("hidrogenación") y/o el "craqueo" de hidrocarburos en hidrocarburos más pequeños.
[0219] Los métodos térmicos implican el uso de temperatura y presión elevadas para reducir el tamaño de hidrocarburo. Se puede usar una temperatura elevada de aproximadamente 800°Cy una presión de aproximadamente 700kPa. Estas condiciones generan "luz", un término que a veces se usa para referirse a las moléculas de hidrocarburos ricas en hidrógeno (a diferencia del flujo de fotones), mientras que también generan, por condensación, moléculas de hidrocarburos más pesados que están relativamente agotados de hidrógeno. La metodología proporciona rotura homolítica o simétrica y produce alquenos, que pueden estar opcionalmente saturados enzimáticamente como se describe anteriormente.
[0220] Los métodos catalíticos y térmicos son estándar en plantas para procesamiento de hidrocarburos y refinación de petróleo. Por lo tanto, los hidrocarburos producidos por las células como se describe en el presente documento se pueden recoger y procesar o refinar por medios convencionales. Ver Hillen et al. (Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIV: 193-205 (1982)) para un informe sobre hidrocraqueo de hidrocarburos producidos por microalgas. En realizaciones alternativas, la fracción se trata con otro catalizador, tal como un compuesto orgánico, calor y/o un compuesto inorgánico. Para el procesamiento de lípidos en biodiesel, se usa un proceso de transesterificación como se describe en la Sección IV de este documento.
[0221] Los hidrocarburos producidos mediante los métodos de la presente divulgación son útiles en una variedad de aplicaciones industriales. Por ejemplo, la producción de alquilbencenosulfonato lineal (LAS), un tensioactivo aniónico utilizado en casi todos los tipos de detergentes y preparaciones de limpieza, utiliza hidrocarburos que generalmente comprenden una cadena de 10-14 átomos de carbono. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos: 6,946,430; 5,506,201; 6,692,730; 6,268,517; 6,020,509; 6,140,302; 5,080,848; y 5,567,359. Los tensioactivos, tales como LAS, pueden usarse en la fabricación de composiciones y detergentes para el cuidado personal, tales como los descritos en las patentes de los Estados Unidos Nos: 5,942,479; 6,086,903; 5,833,999; 6,468,955; y 6,407,044.
[0222] El interés creciente se dirige al uso de componentes de hidrocarburos de origen biológico en combustibles, tales como biodiesel, diesel renovable y combustible para aviones, ya que los materiales de partida biológicos renovables que pueden reemplazar a los materiales de partida derivados de combustibles fósiles están disponibles, y el uso de esto es deseable. Hay una necesidad urgente de métodos para producir componentes de hidrocarburos a partir de materiales biológicos. La presente divulgación satisface esta necesidad al proporcionar métodos para la producción de biodiesel, diesel renovable y combustible para aviones utilizando los lípidos generados por los métodos descritos aquí como material biológico para producir biodiesel, diesel renovable y combustible para aviones.
[0223] Los combustibles diesel tradicionales son destilados de petróleo ricos en hidrocarburos parafínicos. Tienen rangos de ebullición tan amplios como 370° a 780°F, que son adecuados para la combustión en un motor de encendido por compresión, como un vehículo con motor diesel. La Sociedad Estadounidense de Pruebas y Materiales (ASTM) establece el grado de diésel de acuerdo con el rango de ebullición, junto con los rangos permitidos de otras propiedades del combustible, como el número de cetano, el punto de enturbiamiento, el punto de inflamación, la viscosidad, el punto de anilina, el contenido de azufre, el agua contenido, contenido de cenizas, corrosión de la tira de cobre y residuos de carbono. Técnicamente, cualquier material destilado de hidrocarburos derivado de la biomasa o de otro tipo que cumpla con la especificación ASTM adecuada se puede definir como combustible diesel (ASTM D975), combustible para aviones (ASTM D1655) o como biodiesel si es un éster metílico de ácido graso (ASTM D6751).
[0224] Después de la extracción, los componentes de lípidos y/o hidrocarburos recuperados de la biomasa microbiana descrita en el presente documento pueden someterse a tratamiento químico para fabricar un combustible para uso en vehículos diesel y motores a reacción.
[0225] El biodiesel es un líquido que varía en color, entre dorado y marrón oscuro, dependiendo de la materia prima de producción. Es prácticamente inmiscible con agua, tiene un alto punto de ebullición y baja presión de vapor. El biodiesel se refiere a un combustible procesado equivalente a diesel para su uso en vehículos con motor diesel. El biodiesel es biodegradable y no tóxico. Un beneficio adicional del biodiesel sobre el combustible diesel convencional es el menor desgaste del motor. Típicamente, el biodiesel comprende ésteres de alquilo C14-C18. Varios procesos convierten la biomasa o un lípido producido y aislado como se describe aquí en combustibles diesel. Un método preferido para producir biodiesel es por transesterificación de un lípido como se describe en este documento. Un éster alquílico preferido para usar como biodiesel es un éster metílico o un éster etílico.
[0226] El biodiesel producido por un método descrito en este documento puede usarse solo o mezclado con combustible diesel convencional a cualquier concentración en la mayoría de los vehículos modernos con motor diesel. Cuando se mezcla con combustible diesel convencional (diesel de petróleo), el biodiesel puede estar presente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 99,9%. Gran parte del mundo utiliza un sistema conocido como el factor "B" para indicar la cantidad de biodiesel en cualquier mezcla de combustible. Por ejemplo, el combustible que contiene 20% de biodiesel está etiquetado como B20. El biodiesel puro se conoce como B100.
[0227] El biodiesel también se puede usar como combustible de calefacción en calderas domésticas y comerciales. Las calderas de aceite existentes pueden contener piezas de goma y pueden requerir conversión para funcionar con biodiesel. El proceso de conversión suele ser relativamente simple, e implica el intercambio de piezas de goma por piezas sintéticas debido a que el biodiesel es un solvente fuerte. Debido a su fuerte poder disolvente, la quema de biodiesel aumentará la eficiencia de las calderas. El biodiesel se puede usar como un aditivo en formulaciones de diesel para aumentar la lubricidad del combustible diesel ultra bajo en azufre (ULSD) puro, lo cual es ventajoso porque prácticamente no tiene contenido de azufre. El biodiesel es un mejor solvente que el petrodiésel y se puede usar para descomponer los depósitos de residuos en las líneas de combustible de los vehículos que se han utilizado previamente con petrodiésel.
[0228] El biodiesel se puede producir por transesterificación de triglicéridos contenidos en biomasa rica en petróleo. Por lo tanto, en otro aspecto de la presente descripción se proporciona un método para producir biodiesel. En una realización preferida, el método para producir biodiesel comprende los pasos de (a) cultivar un microorganismo que contiene lípidos usando los métodos descritos en este documento (b) lisar un microorganismo que contiene lípidos para producir un lisado, (c) aislar lípidos del microorganismo lisado y (d) transesterificar la composición lipídica, mediante la cual se produce biodiesel. Los métodos para el crecimiento de un microorganismo, la lisis de un microorganismo para producir un lisado, el tratamiento del lisado en un medio que comprende un disolvente orgánico para formar una mezcla heterogénea y la separación del lisado tratado en una composición lipídica se han descrito anteriormente y también se pueden usar en el método de producción de biodiesel.
[0229] El perfil de lípidos de la biodiesel es generalmente muy similar al perfil de lípidos de la materia prima de aceite. Otros aceites proporcionados por los métodos y composiciones de la descripción pueden someterse a transesterificación para producir biodiésel con perfiles lipídicos que incluyen (a) al menos 4% de C8-C14; (b) al menos 0,3% de C8; (c) al menos 2% de C10; (d) al menos 2% de C12; y (3) al menos 30% de C8-C14.
[0230] Las composiciones lipídicas pueden someterse a transesterificación para producir ésteres de ácidos grasos de cadena larga útiles como biodiésel. Las reacciones de transesterificación preferidas se describen a continuación e incluyen la transesterificación catalizada por bases y la transesterificación usando lipasas recombinantes. En un proceso de transesterificación catalizado por bases, los triacilglicéridos se hacen reaccionar con un alcohol, como metanol o etanol, en presencia de un catalizador alcalino, típicamente hidróxido de potasio. Esta reacción forma ésteres metílicos o etílicos y glicerina (glicerol) como subproducto.
[0231] Los aceites animales y vegetales están hechos típicamente de triglicéridos que son ésteres de ácidos grasos libres con el alcohol trihidroxilado, el glicerol. En la transesterificación, el glicerol en un triacilglicérido (TAG) se reemplaza con un alcohol de cadena corta como metanol o etanol. Un esquema de reacción típico es el siguiente:
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Triglicérido
En esta reacción, el alcohol se desprotona con una base para convertirlo en un nucleófilo más fuerte. Comúnmente, el etanol o metanol se usa en un gran exceso (hasta 50 veces). Normalmente, esta reacción procederá ya sea extremadamente lenta o en absoluto. Se puede usar calor, así como un ácido o una base para ayudar a que la reacción avance más rápidamente. El ácido o la base no son consumidos por la reacción de transesterificación, por lo tanto no son reactivos sino catalizadores. Casi todo el biodiésel se ha producido utilizando la técnica catalizada por bases, ya que solo requiere bajas temperaturas y presiones y produce un rendimiento de conversión superior al 98% (siempre que el aceite de partida sea bajo en humedad y ácidos grasos libres).
[0232] La transesterificación también se ha llevado a cabo, como se discutió anteriormente, usando una enzima, tal como una lipasa en lugar de una base. La transesterificación catalizada por lipasa se puede llevar a cabo, por ejemplo, a una temperatura entre la temperatura ambiente y 80°C, y una relación molar de la TAG al alcohol inferior de más de 1:1, preferiblemente aproximadamente 3:1. Las lipasas adecuadas para su uso en la transesterificación incluyen, entre otras, las enumeradas en la Tabla 7. Otros ejemplos de lipasas útiles para la transesterificación se encuentran, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos 4,798,793; 4,940,845 5,156,963; 5,342,768; 5,776,741 y WO89/01032. Tales lipasas incluyen, pero no se limitan a, lipasas producidas por microorganismos de Rhizopus, Aspergillus, Candida, Mucor, Pseudomonas, Rhizomucor, Candida y Humicola y lipasa de páncreas.
Tabla 7. Lipasas adecuadas para uso en transesterificación.
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[0233] Un desafío para usar una lipasa para la producción de ésteres de ácidos grasos adecuados para biodiesel es que el precio de la lipasa es mucho más alto que el precio del hidróxido de sodio (NaOH) utilizado por el proceso de base fuerte. Este desafío se ha abordado utilizando una lipasa inmovilizada, que puede reciclarse. Sin embargo, la actividad de la lipasa inmovilizada debe mantenerse después de ser reciclada durante un número mínimo de ciclos para permitir que un proceso basado en lipasa compita con el proceso base fuerte en términos del costo de producción. Las lipasas inmovilizadas están sujetas a envenenamiento por los alcoholes inferiores típicamente utilizados en la transesterificación. La Patente de los Estados Unidos Núm. 6,398,707 (expedida el 4 de junio de 2002 a Wu et al.) Describe métodos para mejorar la actividad de las lipasas inmovilizadas y regenerar las lipasas inmovilizadas que tienen actividad reducida. Algunos métodos adecuados incluyen sumergir una lipasa inmovilizada en un alcohol que tiene un número de átomos de carbono no inferior a 3 durante un período de tiempo, preferiblemente de 0,5 a 48 horas, y más preferiblemente de 0,5 a 1,5 horas. Algunos métodos adecuados también incluyen lavar una lipasa inmovilizada desactivada con un alcohol que tiene un número de átomos de carbono no inferior a 3 y luego sumergir la lipasa inmovilizada desactivada en un aceite vegetal durante 0,5-48 horas.
[0234] En realizaciones particulares de la descripción, una lipasa recombinante se expresa en los mismos microorganismos que producen el lípido sobre el que actúa la lipasa. Las lipasas recombinantes adecuadas incluyen las enumeradas anteriormente en la Tabla 7 y/o que tienen números de acceso GenBank enumerados anteriormente en la Tabla 7, o un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad de aminoácidos con una de las lipasas enumeradas anteriormente en la Tabla 7 y que exhibe actividad de lipasa. En realizaciones adicionales, la actividad enzimática está presente en una secuencia que tiene al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% identidad con una de las secuencias descritas anteriormente. El ADN que codifica la lipasa y el marcador seleccionable es preferiblemente un ADNc con codón optimizado. Los métodos de recodificación de genes para la expresión en microalgas se describen en la patente de los Estados Unidos 7,135,290.
[0235] El estándar internacional común para biodiesel es EN 14214. ASTM D6751 es el estándar de biodiesel más común referenciado en los Estados Unidos y Canadá. Alemania utiliza la norma DIN EN 14214 y el Reino Unido exige el cumplimiento de la norma BS EN 14214. Las pruebas industriales básicas para determinar si los productos cumplen con estos estándares suelen incluir cromatografía de gases, HPLC y otros. El biodiésel que cumple con los estándares de calidad es muy no tóxico, con un índice de toxicidad (LD50) de más de 50 ml/kg.
[0236] Aunque el biodiesel que cumple con los estándares ASTM no debe ser tóxico, puede haber contaminantes que tienden a cristalizarse y/o precipitarse y caerse de la solución como sedimento. La formación de sedimentos es particularmente un problema cuando el biodiesel se usa a temperaturas más bajas. El sedimento o los precipitados pueden causar problemas tales como disminución del flujo de combustible, obstrucción de las líneas de combustible, obstrucción de los filtros, etc. Los procesos son bien conocidos en la técnica que tratan específicamente con la eliminación de estos contaminantes y sedimentos en el biodiesel para producir una mayor calidad. producto. Los ejemplos para tales procesos incluyen, pero no se limitan a, pretratamiento del aceite para eliminar contaminantes tales como fosfolípidos y ácidos grasos libres (por ejemplo, desgomado, refinación cáustica y filtración de adsorbente de sílice) y filtración en frío. La filtración en frío es un proceso que se desarrolló específicamente para eliminar las partículas y sedimentos que están presentes en el biodiesel después de la producción. Este proceso enfría el biodiesel y filtra cualquier sedimento o precipitado que pueda formarse cuando el combustible se usa a una temperatura más baja. Tal proceso es bien conocido en la técnica y se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 2007-0175091. Los métodos adecuados pueden incluir enfriar el biodiesel a una temperatura de menos de aproximadamente 38°C para que las impurezas y contaminantes precipiten como partículas en el líquido de biodiesel. Luego se puede agregar tierra de diatomeas u otro material filtrante al biodiesel enfriado para formar una suspensión, que luego se puede filtrar a través de una hoja de presión u otro tipo de filtro para eliminar las partículas. El biodiésel filtrado se puede pasar a través de un filtro de pulido para eliminar los sedimentos restantes y la tierra de diatomeas, a fin de producir el producto final de biodiésel.
[0237] El Ejemplo 14 describió la producción de biodiesel usando aceite de triglicéridos de Prototheca moriformis. La capacidad de filtración en remojo en frío mediante el método ASTM D6751 A1 del biodiésel producido en el Ejemplo 14 fue de 120 segundos para un volumen de 300 ml. Esta prueba implica la filtración de 300 pl de B100, enfriado a 40° F durante 16 horas, se deja calentar a temperatura ambiente y se filtra al vacío utilizando un filtro de fibra de vidrio de 0,7 micras con soporte de acero inoxidable. Los aceites de la descripción se pueden transesterificar para generar biodiesel con un tiempo de remojo en frío de menos de 120 segundos, menos de 100 segundos y menos de 90 segundos.
[0238] También se pueden usar procesos posteriores si el biodiesel se usará en temperaturas particularmente frías. Dichos procesos incluyen acondicionamiento para el invierno y fraccionamiento. Ambos procesos están diseñados para mejorar el flujo en frío y el rendimiento invernal del combustible al reducir el punto de enturbiamiento (la temperatura a la cual el biodiesel comienza a cristalizar). Hay varios enfoques para preparar el biodiesel para el invierno. Un enfoque es mezclar el biodiesel con diesel de petróleo. Otro enfoque es utilizar aditivos que puedan reducir el punto de nube del biodiesel. Otro enfoque es eliminar los ésteres metílicos saturados indiscriminadamente mezclando aditivos y permitiendo la cristalización de los saturados y luego filtrando los cristales. El fraccionamiento separa selectivamente los ésteres metílicos en componentes o fracciones individuales, lo que permite la eliminación o inclusión de ésteres metílicos específicos. Los métodos de fraccionamiento incluyen fraccionamiento de urea, fraccionamiento de solventes y destilación térmica.
[0239] Otro combustible valioso proporcionado por los métodos de la presente descripción es el diesel renovable, que comprende alcanos, tales como C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 y C18:0 y, por lo tanto, se distinguen del biodiesel. El diesel renovable de alta calidad cumple con el estándar ASTM D975. Los lípidos producidos por los métodos de la presente descripción pueden servir como materia prima para producir diesel renovable. Por lo tanto, en otro aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para producir diesel renovable. El diesel renovable puede ser producido por al menos tres procesos: procesamiento hidrotérmico (hidrotratamiento); hidroprocesamiento; y licuefacción indirecta. Estos procesos producen destilados sin éster. Durante estos procesos, los triacilglicéridos producidos y aislados como se describe aquí, se convierten en alcanos.
[0240] En una realización de la divulgación, el método para producir diésel renovable comprende (a) cultivar un microorganismo que contiene lípidos usando los métodos descritos aquí (b) lisar el microorganismo para producir un lisado, (c) aislar el lípido del microorganismo lisado, y (d) desoxigenando e hidrotratando el lípido para producir un alcano, por el cual se produce diesel renovable. Los lípidos adecuados para la fabricación de diesel renovable se pueden obtener mediante extracción a partir de biomasa microbiana utilizando un disolvente orgánico como el hexano, o mediante otros métodos, como los descritos en la Patente de EE.UU. 5,928,696. Algunos métodos adecuados pueden incluir prensado mecánico y centrifugación.
[0241] En algunos métodos, el lípido microbiano se rompe primero junto con el hidrotratamiento para reducir la longitud de la cadena de carbono y saturar los dobles enlaces, respectivamente. El material es luego isomerizado, también en combinación con hidrotratamiento. La fracción de nafta se puede eliminar a través de la destilación, seguida de una destilación adicional para vaporizar y destilar los componentes deseados en el combustible diesel para cumplir con el estándar ASTM D975, dejando componentes que son más pesados de lo deseado para cumplir con el estándar D975. Los métodos de hidrotratamiento, hidrocraqueo, desoxigenación e isomerización de aceites que modifican químicamente, incluidos los aceites triglicéridos, son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las solicitudes de patente europea EP1741768 (A1); EP1741767 (A1); EP1682466 (A1); EP1640437 (A1); EP1681337 (A1); EP1795576 (A1); y Patentes de EE.UU. 7,238,277; 6,630,066; 6,596,155; 6,977,322; 7,041,866; 6,217,746; 5,885,440; 6,881,873.
[0242] En una realización del método para producir diesel renovable, el tratamiento del lípido para producir un alcano se realiza mediante hidrotratamiento de la composición lipídica. En el procesamiento hidrotérmico, típicamente, la biomasa se hace reaccionar en agua a una temperatura y presión elevadas para formar aceites y sólidos residuales. Las temperaturas de conversión son típicamente de 300° a 660°F, con presión suficiente para mantener el agua principalmente en forma líquida, de 100 a 170 atmósferas estándar (atm). Los tiempos de reacción son del orden de 15 a 30 minutos. Después de que se completa la reacción, los orgánicos se separan del agua. De este modo se produce un destilado adecuado para diesel.
[0243] En algunos métodos de fabricación de diesel renovable, el primer paso para tratar un triglicérido es el hidroprocesamiento para saturar los dobles enlaces, seguido de la desoxigenación a temperatura elevada en presencia de hidrógeno y un catalizador. En algunos métodos, la hidrogenación y la desoxigenación ocurren en la misma reacción. En otros métodos, la desoxigenación ocurre antes de la hidrogenación. La isomerización se realiza opcionalmente, también en presencia de hidrógeno y un catalizador. Los componentes de nafta se eliminan preferiblemente por destilación. Para ejemplos, véanse las patentes de los Estados Unidos 5,475,160 (hidrogenación de triglicéridos); 5,091,116 (desoxigenación, hidrogenación y eliminación de gases); 6,391,815 (hidrogenación); y 5,888,947 (isomerización).
[0244] Un método adecuado para la hidrogenación de triglicéridos incluye la preparación de una solución acuosa de sales de cobre, zinc, magnesio y lantano y otra solución de metal alcalino o preferiblemente, carbonato de amonio. Las dos soluciones pueden calentarse a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 85°C y dosificarse juntas en un recipiente de precipitación a velocidades tales que el pH en el recipiente de precipitación se mantenga entre 5,5 y 7,5 para formar un catalizador. Se puede usar agua adicional inicialmente en el recipiente de precipitación o agregarse simultáneamente con la solución salina y la solución de precipitación. El precipitado resultante se puede lavar a fondo, secar, calcinar a aproximadamente 300°C y activar en hidrógeno a temperaturas que varían de aproximadamente 100°C a aproximadamente 400°C. Uno o más triglicéridos pueden ponerse en contacto y reaccionar con hidrógeno en presencia del catalizador descrito anteriormente en un reactor. El reactor puede ser un reactor de lecho de goteo, un reactor de gas sólido de lecho fijo, un reactor de columna de burbujas empaquetadas, un reactor de tanque con agitación continua, un reactor de fase en suspensión o cualquier otro tipo de reactor adecuado conocido en la técnica. El proceso puede llevarse a cabo por lotes o de manera continua. Las temperaturas de reacción están típicamente en el rango de aproximadamente 170°C a aproximadamente 250°C, mientras que las presiones de reacción están típicamente en el rango de aproximadamente 300 psig a aproximadamente 2000 psig. Además, la relación molar de hidrógeno a triglicéridos en el proceso de la presente descripción está típicamente en el intervalo de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 700:1. El proceso se lleva a cabo típicamente a una velocidad espacial por hora en peso (WHSV) en el rango de aproximadamente 0,1 hr-1 a aproximadamente 5 hr-1. Un experto en la materia reconocerá que el período de tiempo requerido para la reacción variará de acuerdo con la temperatura utilizada, la relación molar de hidrógeno a triglicéridos y la presión parcial de hidrógeno. Los productos producidos por tales procesos de hidrogenación incluyen alcoholes grasos, glicerol, trazas de parafinas y triglicéridos sin reaccionar. Estos productos se separan típicamente por medios convencionales tales como, por ejemplo, destilación, extracción, filtración, cristalización y similares.
[0245] Las refinerías de petróleo utilizan el hidroprocesamiento para eliminar las impurezas tratando las alimentaciones con hidrógeno. Las temperaturas de conversión de hidroprocesamiento son típicamente de 300° a 700°F. Las presiones son típicamente de 40 a 100 atm. Los tiempos de reacción son típicamente del orden de 10 a 60 minutos. Los catalizadores sólidos se emplean para aumentar ciertas velocidades de reacción, mejorar la selectividad para ciertos productos y optimizar el consumo de hidrógeno.
[0246] Los métodos adecuados para la desoxigenación de un aceite incluyen calentar un aceite a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 350°F a aproximadamente 550°F y contactar continuamente el aceite calentado con nitrógeno bajo al menos una presión que varía de aproximadamente atmosférica a superior durante al menos unos 5 minutos.
[0247] Los métodos adecuados para la isomerización incluyen el uso de isomerización alcalina y otras isomerizaciones de aceite conocidas en la técnica.
[0248] El hidrotratamiento y el hidroprocesamiento conducen finalmente a una reducción en el peso molecular de la alimentación de triglicéridos. La molécula de triglicéridos se reduce a cuatro moléculas de hidrocarburos en condiciones de hidroprocesamiento: una molécula de propano y tres moléculas de hidrocarburos más pesadas, típicamente en el rango de C8 a C18.
[0249] Por lo tanto, en una realización, el producto de una o más reacciones químicas realizadas en las composiciones lipídicas de la descripción es una mezcla de alcanos que comprende diesel renovable ASTM D975. Metzger et al. Revisaron la producción de hidrocarburos por microorganismos. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66: 486-496 y una mirada retrospectiva al Programa de Especies Acuáticas del Departamento de Energía de EE.UU.: Biodiesel de algas, NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann y Paul Roessler (1998).
[0250] Las propiedades de destilación de un combustible diesel se describen en términos de T10-T90 (temperatura a 10% y 90%, respectivamente, el volumen de destilado). Se produjo diesel renovable a partir de aceite de triglicéridos de Prototheca moriformis y se describe en el Ejemplo 14. La T10-T90 del material producido en el Ejemplo 14 fue 57,9°C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos aquí, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos aquí, pueden emplearse para generar composiciones diesel renovables con otros rangos T10-T90, como 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 y 65°C usando aceites triglicéridos producidos de acuerdo con los métodos descritos aquí.
[0251] El T10 del material producido en el Ejemplo 14 era 242,1°C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos aquí, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos aquí, pueden emplearse para generar composiciones diesel renovables con otros valores de T10, como T10 entre 180 y 295, entre 190 y 270, entre 210 y 250, entre 225 y 245, y al menos 290.
[0252] El T90 del material producido en el Ejemplo 14 fue 300°C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos en este documento, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos en este documento pueden emplearse para generar composiciones diesel renovables con otros valores de T90, como T90 entre 280 y 380, entre 290 y 360, entre 300 y 350, entre 310 y 340, y al menos 290.
[0253] La FBP del material producido en el Ejemplo 14 fue 300°C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos aquí, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos aquí, pueden emplearse para generar composiciones diesel renovables con otros valores de FBP, como f Bp entre 290 y 400, entre 300 y 385, entre 310 y 370, entre 315 y 360, y al menos 300.
[0254] Otros aceites proporcionados por los métodos y composiciones de la descripción pueden someterse a combinaciones de hidrotratamiento, isomerización y otra modificación covalente que incluye aceites con perfiles lipídicos que incluyen (a) al menos 4% de C8-C14; (b) al menos 0,3% de C8; (c) al menos 2% de C10; (d) al menos 2% de C12; y (3) al menos 30% de C8-C14.
[0255] Se puede producir un diesel tradicional ultra bajo en azufre a partir de cualquier forma de biomasa mediante un proceso de dos pasos. Primero, la biomasa se convierte en gas de síntesis, una mezcla gaseosa rica en hidrógeno y monóxido de carbono. Luego, el gas de síntesis se convierte catalíticamente en líquidos. Típicamente, la producción de líquidos se logra utilizando la síntesis de Fischer-Tropsch (FT). Esta tecnología se aplica al carbón, gas natural y aceites pesados. Por lo tanto, en otra realización preferida del método para producir diesel renovable, el tratamiento de la composición lipídica para producir un alcano se realiza por licuefacción indirecta de la composición lipídica.
[0256] La presente descripción también proporciona métodos para producir combustible para aviones. El combustible para aviones es de color claro a paja. El combustible más común es un combustible sin plomo/a base de aceite de parafina clasificado como Avión A-1, que se produce con un conjunto de especificaciones estandarizadas internacionalmente. El combustible para aviones es una mezcla de una gran cantidad de hidrocarburos diferentes, posiblemente hasta mil o más. El rango de sus tamaños (pesos moleculares o números de carbono) está restringido por los requisitos para el producto, por ejemplo, punto de congelación o punto de humo. El combustible para aviones tipo Kerosone (incluidos el Jet A y el Jet A-1) tiene una distribución de números de carbono entre aproximadamente 8 y 16 números de carbono. El combustible de avión de corte ancho o tipo nafta (incluido el Jet B) generalmente tiene una distribución de número de carbono entre aproximadamente 5 y 15 carbonos.
[0257] Ambos aviones (Jet A y Jet B) pueden contener varios aditivos. Los aditivos útiles incluyen, entre otros, antioxidantes, agentes antiestáticos, inhibidores de corrosión y agentes inhibidores de la formación de hielo en el sistema de combustible (FSII). Los antioxidantes evitan el engomado y, por lo general, se basan en fenoles alquilados, por ejemplo, AO-30, AO-31 o AO-37. Los agentes antiestáticos disipan la electricidad estática y evitan las chispas. Un ejemplo es Stadis 450 con ácido dinonilnaftilsulfónico (DINNSA) como ingrediente activo. Inhibidores de corrosión, por ejemplo, DCI-4A se usa para combustibles civiles y militares y DCI-6A se usa para combustibles militares. Los agentes de FSII incluyen, por ejemplo, Di-EGME.
[0258] En una realización de la descripción, se produce un combustible para aviones mezclando combustibles de algas con combustible para aviones existente. Los lípidos producidos por los métodos de la presente descripción pueden servir como materia prima para producir combustible para aviones. Por lo tanto, en otro aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para producir combustible para aviones. A continuación se proporcionan dos métodos para producir combustible para aviones a partir de los lípidos producidos por los métodos de la presente descripción: craqueo catalítico fluido (FCC); e hidrodesoxigenación (HDO).
[0259] El fluido de craqueo catalítico (FCC) es un método que se utiliza para producir olefinas, especialmente propileno a partir de fracciones de crudo pesado. Los lípidos producidos por el método de la presente descripción pueden convertirse en olefinas. El proceso implica hacer fluir los lípidos producidos a través de una zona FCC y recoger una corriente de producto compuesta de olefinas, que es útil como combustible para aviones. Los lípidos producidos se ponen en contacto con un catalizador de craqueo en condiciones de craqueo para proporcionar una corriente de producto que comprende olefinas e hidrocarburos útiles como combustible para aviones.
[0260] En una realización de la divulgación, el método para producir combustible para reactores comprende (a) cultivar un microorganismo que contiene lípidos usando los métodos descritos aquí, (b) lisar el microorganismo que contiene lípidos para producir un lisado, (c) aislar lípidos del lisado, y (d) tratar la composición lipídica, por lo que se produce combustible para aviones. En una realización del método para producir un combustible para reactores, la composición lipídica puede fluir a través de una zona de craqueo catalítico fluido, que, en una realización, puede comprender poner en contacto la composición lipídica con un catalizador de craqueo en condiciones de craqueo para proporcionar una corriente de producto que comprende C2-C5 olefinas.
[0261] En ciertas realizaciones de este método, puede ser deseable eliminar cualquier contaminante que pueda estar presente en la composición lipídica. Por lo tanto, antes de hacer fluir la composición lipídica a través de una zona de craqueo catalítico fluido, la composición lipídica se trata previamente. El pretratamiento puede implicar poner en contacto la composición lipídica con una resina de intercambio iónico. La resina de intercambio iónico es una resina de intercambio iónico ácida, como AmberlystTM-15 y puede usarse como un lecho en un reactor a través del cual fluye la composición lipídica, ya sea flujo ascendente o flujo descendente. Otros pretratamientos pueden incluir lavados ácidos suaves al poner en contacto la composición lipídica con un ácido, como ácido sulfúrico, acético, nítrico o clorhídrico. El contacto se realiza con una solución de ácido diluido, generalmente a temperatura ambiente y presión atmosférica.
[0262] La composición lipídica, opcionalmente pretratada, fluye a una zona de FCC donde los componentes hidrocarbonados se rompen en olefinas. El craqueo catalítico se logra poniendo en contacto la composición lipídica en una zona de reacción con un catalizador compuesto de material en partículas finamente dividido. La reacción es el craqueo catalítico, a diferencia del hidrocraqueo, y se lleva a cabo en ausencia de hidrógeno agregado o el consumo de hidrógeno. A medida que avanza la reacción de craqueo, se depositan cantidades sustanciales de coque en el catalizador. El catalizador se regenera a altas temperaturas quemando coque del catalizador en una zona de regeneración. El catalizador que contiene coque, denominado en la presente memoria como "catalizador coqueado", se transporta continuamente desde la zona de reacción a la zona de regeneración para ser regenerado y reemplazado por un catalizador regenerado esencialmente libre de coque desde la zona de regeneración. La fluidización de las partículas de catalizador por diversas corrientes gaseosas permite el transporte de catalizador entre la zona de reacción y la zona de regeneración. Los expertos en la técnica de los procesos de FCC conocen bien los métodos para craquear hidrocarburos, como los de la composición lipídica descrita en el presente documento, en una corriente de catalizador fluidizada, transportar el catalizador entre las zonas de reacción y regeneración y coque de combustión en el regenerador. Ejemplos de aplicaciones de FCC y catalizadores útiles para el craqueo de la composición lipídica para producir olefinas C2-C5 se describen en la patente de EE.UU. Nos 6,538,169, 7,288,685.
[0263] Catalizadores de FCC adecuados generalmente comprenden al menos dos componentes que pueden o no pueden estar en la misma matriz. En algunas realizaciones, los dos componentes pueden circular por todo el recipiente de reacción. El primer componente generalmente incluye cualquiera de los catalizadores conocidos que se usan en la técnica del craqueo catalítico fluidizado, como un catalizador activo de tipo arcilla amorfo y/o un tamiz molecular cristalino de alta actividad. Los catalizadores de tamiz molecular pueden preferirse sobre los catalizadores amorfos debido a su selectividad muy mejorada para los productos deseados. En algunas realizaciones preferidas, se pueden usar zeolitas como tamiz molecular en los procesos de FCC. Preferiblemente, el primer componente catalítico comprende una zeolita de poro grande, tal como una zeolita de tipo Y, un material de alúmina activa, un material aglutinante, que comprende sílice o alúmina y una carga inerte tal como caolín.
[0264] En una realización, el craqueo de la composición lipídica de la presente descripción, tiene lugar en la sección ascendente o, alternativamente, la sección de elevación, de la zona FCC. La composición lipídica se introduce en el elevador mediante una boquilla que da como resultado la rápida vaporización de la composición lipídica. Antes de poner en contacto el catalizador, la composición lipídica normalmente tendrá una temperatura de aproximadamente 149°C a aproximadamente 316°C (300°F a 600°F). El catalizador fluye desde un recipiente de mezcla al tubo ascendente donde entra en contacto con la composición lipídica durante un tiempo de aborto de 2 segundos o menos.
[0265] El catalizador mezclado y se hace reaccionar de lípidos vapores composición se descargan desde la parte superior de la columna ascendente a través de una salida y se separan en una corriente de vapor de producto craqueado que incluye las olefinas y una colección de partículas del catalizador cubiertas con cantidades sustanciales de coque y generalmente se hace referencia como "catalizador coqueado". En un esfuerzo por minimizar el tiempo de contacto de la composición lipídica y el catalizador que puede promover una mayor conversión de los productos deseados en otros productos indeseables, se puede usar cualquier disposición de separadores, como una disposición de brazo giratorio, para eliminar el catalizador coquizado de la corriente del producto rápidamente. El separador, por ejemplo, el separador de brazo giratorio, está ubicado en una porción superior de una cámara con una zona de separación situada en la porción inferior de la cámara. El catalizador separado por la disposición del brazo giratorio cae en la zona de extracción. La corriente de vapor del producto craqueado que comprende hidrocarburos craqueados que incluyen olefinas ligeras y algo de catalizador sale de la cámara a través de un conducto que está en comunicación con los ciclones. Los ciclones eliminan las partículas de catalizador restantes de la corriente de vapor del producto para reducir las concentraciones de partículas a niveles muy bajos. La corriente de vapor del producto luego sale de la parte superior del recipiente de separación. El catalizador separado por los ciclones se devuelve al recipiente de separación y luego a la zona de separación. La zona de separación elimina los hidrocarburos adsorbidos de la superficie del catalizador por contacto a contracorriente con vapor.
[0266] Bajo hidrocarburo presión parcial opera para favorecer la producción de olefinas ligeras. En consecuencia, la presión del elevador se establece en aproximadamente 172 a 241 kPa (25 a 35 psia) con una presión parcial de hidrocarburo de aproximadamente 35 a 172 kPa (5 a 25 psia), con una presión parcial de hidrocarburo preferida de aproximadamente 69 a 138 kPa (10 a 20 psia). Esta presión parcial relativamente baja para el hidrocarburo se logra usando vapor como diluyente en la medida en que el diluyente es del 10 al 55% en peso de la composición lipídica y preferiblemente aproximadamente el 15% en peso de la composición lipídica. Se pueden usar otros diluyentes como el gas seco para alcanzar presiones parciales de hidrocarburos equivalentes.
[0267] La temperatura de la corriente agrietada en la salida del tubo ascendente será de aproximadamente 510°C a 621°C (950°F a 1150°F). Sin embargo, las temperaturas de salida del elevador por encima de 566°C (1050°F) producen más gas seco y más olefinas. Mientras que las temperaturas de salida del elevador por debajo de 566°C (1050°F) producen menos etileno y propileno. Por consiguiente, se prefiere ejecutar el proceso de FCC a una temperatura preferida de aproximadamente 566°C a aproximadamente 630°C, presión preferida de aproximadamente 138 kPa a aproximadamente 240 kPa (20 a 35 psia). Otra condición para el proceso es la relación de catalizador a composición de lípidos que puede variar de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 y preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 15.
[0268] En una realización del método para producir un combustible para aviones, la composición lipídica se introduce en la sección de elevación de un reactor FCC. La temperatura en la sección de elevación será muy alta y oscilará entre aproximadamente 700°C (1292°F) y aproximadamente 760°C (1400°F) con una relación de catalizador a composición de lípidos de aproximadamente 100 a aproximadamente 150. Se anticipa que La introducción de la composición lipídica en la sección de elevación producirá cantidades considerables de propileno y etileno.
[0269] En otra realización del método para producir un combustible para reactores usando la composición lipídica o los lípidos producidos como se describe en el presente documento, la estructura de la composición lipídica o los lípidos se rompe mediante un proceso denominado hidrodesoxigenación (HDO). HDO significa la eliminación de oxígeno por medio de hidrógeno, es decir, el oxígeno se elimina mientras se rompe la estructura del material. Los enlaces dobles olefínicos se hidrogenan y se eliminan los compuestos de azufre y nitrógeno. La eliminación de azufre se llama hidrodesulfuración (HDS). El pretratamiento y la pureza de las materias primas (composición lipídica o lípidos) contribuyen a la vida útil del catalizador.
[0270] Generalmente en la etapa HDO/HDS, el hidrógeno se mezcla con el material de alimentación (composición lipídica o los lípidos) y luego la mezcla se pasa a través de un lecho de catalizador como un flujo de co-corriente, ya sea como una sola fase o dos alimentación de fase de stock. Después de la etapa HDO/MDS, la fracción del producto se separa y se pasa a un reactor de isomerización separado. Un reactor de isomerización para material de partida biológico se describe en la literatura (FI 100248) como un reactor co-corriente.
[0271] El proceso para producir un combustible mediante la hidrogenación de una alimentación de hidrocarburos, por ejemplo, la composición lipídica o los lípidos en el presente documento, también se puede realizar haciendo pasar la composición lipídica o los lípidos como un flujo co-corriente con gas hidrógeno a través de una primera hidrogenación zona, y posteriormente el efluente de hidrocarburo se hidrogena adicionalmente en una segunda zona de hidrogenación haciendo pasar gas hidrógeno a la segunda zona de hidrogenación como un flujo a contracorriente con respecto al efluente de hidrocarburo. Ejemplos de aplicaciones HDO y catalizadores útiles para el craqueo de la composición lipídica para producir olefinas C2-C5 se describen en la patente de EE.UU. N° 7,232,935.
[0272] Típicamente, en la etapa de hidrodesoxigenación, la estructura del componente biológico, tal como la composición lipídica o los lípidos en este documento, se descompone, se eliminan los compuestos de oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre, y los hidrocarburos ligeros como gas, y el los enlaces olefínicos se hidrogenan. En el segundo paso del proceso, es decir, en el llamado paso de isomerización, se lleva a cabo la isomerización para ramificar la cadena de hidrocarburos y mejorar el rendimiento de la parafina a bajas temperaturas.
[0273] En el primer paso, es decir, el paso HDO, del proceso de craqueo, el gas hidrógeno y la composición lipídica o los lípidos en el presente documento que se van a hidrogenar se pasan a un sistema de lecho de catalizador HDO, ya sea como flujos a contracorriente o contracorriente, dicho sistema de lecho de catalizador comprende uno o más lecho(s) de catalizador, preferiblemente 1-3 lechos de catalizador. El paso HDO generalmente se opera de manera co-corriente. En el caso de un sistema de lecho de catalizador HDO que comprende dos o más lechos de catalizador, uno o más de los lechos pueden funcionar utilizando el principio de flujo a contracorriente. En la etapa HDO, la presión varía entre 20 y 150 bares, preferiblemente entre 50 y 100 bares, y la temperatura varía entre 200 y 500°C, preferiblemente en el rango de 300-400°C. En la etapa HDO, se pueden usar catalizadores de hidrogenación conocidos que contienen metales del Grupo VII y/o VIB del Sistema Periódico. Preferiblemente, los catalizadores de hidrogenación son catalizadores Pd, Pt, Ni, NiMo o CoMo soportados, siendo el soporte alúmina y/o sílice. Típicamente, se usan catalizadores NiMo/A^Oa y CoMo/A^Oa.
[0274] Antes de la etapa de HDO, la composición lipídica o los lípidos en el presente documento pueden tratarse opcionalmente por prehidrogenación en condiciones más suaves evitando así reacciones secundarias de los dobles enlaces. Dicha prehidrogenación se lleva a cabo en presencia de un catalizador de prehidrogenación a temperaturas de 50400°C y a presiones de hidrógeno de 1200 bar, preferiblemente a una temperatura entre 150 y 250°C y a una presión de hidrógeno entre 10 y 100 bar. El catalizador puede contener metales del Grupo VIII y/o VIB del Sistema Periódico. Preferiblemente, el catalizador de prehidrogenación es un catalizador de Pd, Pt, Ni, NiMo o CoMo soportado, siendo el soporte alúmina y/o sílice.
[0275] Se enfría una corriente gaseosa de la etapa HDO que contiene hidrógeno y luego se eliminan los monóxido de carbono, dióxido de carbono, nitrógeno, fósforo y azufre, hidrocarburos ligeros gaseosos y otras impurezas. Después de comprimir, el hidrógeno purificado o el hidrógeno reciclado se devuelve al primer lecho de catalizador y/o entre los lechos de catalizador para compensar la corriente de gas retirada. El agua se elimina del líquido condensado. El líquido se pasa al primer lecho de catalizador o entre los lechos de catalizador.
[0276] Después de la etapa HDO, el producto se somete a una etapa de isomerización. Es importante para el proceso que las impurezas se eliminen lo más completamente posible antes de que los hidrocarburos entren en contacto con el catalizador de isomerización. La etapa de isomerización comprende una etapa de separación opcional, en la que el producto de reacción de la etapa HDO puede purificarse mediante extracción con vapor de agua o un gas adecuado tal como hidrocarburo ligero, nitrógeno o hidrógeno. El paso de extracción opcional se lleva a cabo en contracorriente en una unidad aguas arriba del catalizador de isomerización, en donde el gas y el líquido se ponen en contacto entre sí, o antes del reactor de isomerización real en una unidad de extracción por separado que utiliza el principio de contracorriente.
[0277] Después de la etapa de separación, el gas hidrógeno y la composición lipídica o lípidos hidrogenados en este documento, y opcionalmente una mezcla de n-parafina, se pasan a una unidad de isomerización reactiva que comprende uno o varios lecho(s) de catalizador. Los lechos de catalizador de la etapa de isomerización pueden operar de manera co-corriente o contracorriente.
[0278] Es importante para el proceso que el principio de flujo a contracorriente se aplique en la etapa de isomerización. En el paso de isomerización, esto se lleva a cabo llevando a cabo el paso de separación opcional o el paso de reacción de isomerización o ambos a contracorriente. En la etapa de isomerización, la presión varía en el rango de 20 150 bar, preferiblemente en el rango de 20 100 bar, la temperatura está entre 200 y 500°C, preferiblemente entre 300 y 400°C. En la etapa de isomerización, se pueden usar catalizadores de isomerización conocidos en la técnica. Los catalizadores de isomerización adecuados contienen un tamiz molecular y/o un metal del Grupo VII y/o un vehículo. Preferiblemente, el catalizador de isomerización contiene SAPO-11 o SAPO41 o ZSM-22 o ZSM-23 o ferrierita y Pt, Pd o Ni y Al2Oa o SiO2. Los catalizadores de isomerización típicos son, por ejemplo, Pt/SAPO-11/Al2Oa, Pt/ZSM-22/Al2Oa, Pt/ZSM-23/Al2Oa y Pt/SAPO-11/SiO2. El paso de isomerización y el paso de HDO pueden llevarse a cabo en el mismo recipiente a presión o en recipientes a presión separados. La prehidrogenación opcional se puede llevar a cabo en un recipiente a presión separado o en el mismo recipiente a presión que e1 HDO y las etapas de isomerización. '
[0279] Por lo tanto, en una realización de la divulgación, el producto de la una o más reacciones químicas es una mezcla de alcanos que comprende combustible para aviones ASTM D1655. En algunas realizaciones, la composición que cumple con la especificación de combustible para aviones ASTM 1655 tiene un contenido de azufre que es inferior a 10 ppm. En otras realizaciones, la composición conforme a la especificación del combustible para aviones ASTM 1655 tiene un valor T10 de la curva de destilación de menos de 205°C. En otra realización, la composición conforme a la especificación del combustible para aviones ASTM 1655 tiene un punto de ebullición final (FBP) de menos de a00°C. En otra realización, la composición conforme a la especificación del combustible para aviones ASTM 1655 tiene un punto de inflamación de al menos a8°C. En otra realización, la composición conforme a la especificación del avión ASTM 1655 El combustible tiene una densidad entre 775K/Ma y 840K/Ma. En otra realización más, la composición conforme a la especificación de combustible para aviones ASTM 1655 tiene un punto de congelación que está por debajo de -47°C. En otra realización, la composición que se ajusta a la especificación de combustible para aviones ASTM 1655 tiene un calor neto de combustión que es al menos 42,8 MJ/K. En otra realización, la composición conforme a la especificación de combustible para aviones ASTM 1655 tiene un contenido de hidrógeno que es al
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menos 13,4% en masa. En otra realización, la composición conforme a la especificación del combustible para aviones ASTM 1655 tiene una estabilidad térmica, según lo probado por JFTOT gravimétrico cuantitativo a 260°C, que está por debajo de 3 mm de Hg. En otra realización, la composición conforme a la especificación del combustible para aviones ASTM 1655 tiene una goma existente que está por debajo de 7 mg/dl.
[0280] Por lo tanto, la presente descripción describe una variedad de métodos en los que se lleva a cabo la modificación química del lípido microalgal para producir productos útiles en una variedad de aplicaciones industriales y de otro tipo. Los ejemplos de procesos para modificar el aceite producido por los métodos aquí descritos incluyen, pero no se limitan a, hidrólisis del aceite, hidroprocesamiento del aceite y esterificación del aceite. La modificación del aceite de microalgas produce oleoquímicos básicos que pueden modificarse aún más en derivados oleoquímicos seleccionados para una función deseada. De manera similar a la descrita anteriormente con referencia a los procesos de producción de combustible, estas modificaciones químicas también se pueden realizar en aceites generados a partir de los cultivos microbianos descritos aquí. Los ejemplos de productos oleoquímicos básicos incluyen, entre otros, jabones, ácidos grasos, ésteres metílicos de ácidos grasos y glicerol. Los ejemplos de productos oleoquímicos derivados incluyen, entre otros, nitrilos grasos, ésteres, ácidos dímeros, quats, tensioactivos, alcanolamidas grasas, sulfatos de alcoholes grasos, resinas, emulsionantes, alcoholes grasos, olefinas y alcanos superiores.
[0281] La hidrólisis de los constituyentes de ácidos grasos a partir de los glicerolípidos producidos por los métodos de la presente descripción produce ácidos grasos libres que pueden derivatizarse para producir otros productos químicos útiles. La hidrólisis ocurre en presencia de agua y un catalizador que puede ser un ácido o una base. Los ácidos grasos libres liberados pueden derivatizarse para producir una variedad de productos, como se informa a continuación: Patentes de los Estados Unidos Nos 5,304,664 (ácidos grasos altamente sulfatados); 7,262,158 (composiciones limpiadoras); 7,115,173 (composiciones suavizantes de telas); 6,342,208 (Emulsiones para tratar la piel); 7,264,886 (composiciones repelentes de agua); 6,924,333 (aditivos de pintura); 6,596,768 (materia prima de rumiantes enriquecida con lípidos); y 6,380,410 (Tensioactivos para detergentes y limpiadores).
[0282] Con respecto a la hidrólisis, en una realización de la presente descripción, un aceite de triglicéridos se hidroliza opcionalmente primero en un medio líquido tal como agua o hidróxido de sodio para obtener glicerol y jabones. Existen varios métodos adecuados de hidrólisis de triglicéridos, que incluyen, entre otros, saponificación, hidrólisis ácida, hidrólisis alcalina, hidrólisis enzimática (denominada en este documento división) e hidrólisis utilizando agua comprimida en caliente. Un experto en la materia reconocerá que un aceite triglicérido no necesita hidrolizarse para producir un producto oleoquímico; más bien, el aceite puede convertirse directamente al oleoquímico deseado por otro proceso conocido. Por ejemplo, el aceite de triglicéridos puede convertirse directamente en un ácido graso de éster metílico mediante esterificación.
[0283] En algunas realizaciones de la descripción, la hidrólisis catalítica del aceite producido por los métodos descritos en la presente memoria se produce dividiendo el aceite en glicerol y ácidos grasos. Como se discutió anteriormente, los ácidos grasos pueden procesarse luego a través de varias otras modificaciones a los derivados oleoquímicos derivados. Por ejemplo, en una realización, los ácidos grasos pueden experimentar una reacción de aminación para producir compuestos de nitrógeno graso. En otra realización, los ácidos grasos pueden sufrir ozonólisis para producir ácidos mono y dibásicos.
[0284] En otras realizaciones, la hidrólisis puede ocurrir a través de la división de aceites producidos aquí para crear productos oleoquímicos. En algunas realizaciones preferidas de la divulgación, un aceite de triglicéridos puede dividirse antes de que se realicen otros procesos. Un experto en la materia reconocerá que hay muchos métodos de división de triglicéridos adecuados, que incluyen, pero no se limitan a, división enzimática y división por presión.
[0285] En general, los métodos de división enzimática de aceite usan enzimas, lipasas, como biocatalizadores que actúan sobre una mezcla de agua/aceite. La división enzimática luego divide el aceite o la grasa, respectivamente, en glicerol y ácidos grasos libres. El glicerol luego puede migrar a la fase acuosa, mientras que la fase orgánica se enriquece con ácidos grasos libres.
[0286] Las reacciones de división enzimáticos generalmente tienen lugar en el límite de fase entre orgánica y fase acuosa, donde la enzima está presente solo en el límite de la fase. Los triglicéridos que cumplen con el límite de fase luego contribuyen o participan en la reacción de división. A medida que avanza la reacción, la densidad de ocupación o la concentración de ácidos grasos aún unidos químicamente como glicéridos, en comparación con los ácidos grasos libres, disminuye en el límite de fase, de modo que la reacción se ralentiza. En ciertas realizaciones, la división enzimática puede ocurrir a temperatura ambiente. Un experto en la materia conocerá las condiciones adecuadas para dividir el aceite en los ácidos grasos deseados.
[0287] A modo de ejemplo, la velocidad de reacción se puede acelerar mediante el aumento de la superficie límite de la interfaz. Una vez que se completa la reacción, los ácidos grasos libres se separan de la fase orgánica liberados de la enzima, y el residuo que todavía contiene ácidos grasos unidos químicamente como glicéridos se retroalimenta o recicla y se mezcla con aceite o grasa fresca para someterlos a división. De esta manera, los glicéridos reciclados se someten a un proceso de división enzimática adicional. En algunas realizaciones, los ácidos grasos libres se extraen de un aceite o grasa divididos parcialmente de tal manera. De esa manera, si los ácidos grasos unidos químicamente (triglicéridos) se devuelven o retroalimentan en el proceso de división, el consumo de enzimas puede reducirse drásticamente.
[0288] El grado de división se determina como la relación del valor ácido medido dividido por el valor ácido teóricamente posible que puede calcularse para un aceite o grasa dado. Preferiblemente, el índice de acidez se mide mediante valoración de acuerdo con métodos comunes estándar. Alternativamente, la densidad de la fase acuosa de glicerol puede tomarse como una medida para el grado de división.
[0289] En una realización, el proceso de corte como se describe en el presente documento también es adecuado para dividir el mono-, di- y triglicérido que están contenidos en el denominado stock de jabón a partir de los procesos de refinación alcalina de los aceites producidos. De esta manera, el caldo de jabón se puede convertir cuantitativamente sin saponificación previa de los aceites neutros en los ácidos grasos. Para este propósito, los ácidos grasos que se unen químicamente en los jabones se liberan, preferiblemente antes de dividirse, a través de una adición de ácido. En ciertas realizaciones, se usa una solución tampón además del agua y la enzima para el proceso de división.
[0290] En una realización, los aceites producidos de acuerdo con los métodos de la divulgación también pueden someterse a saponificación como un método de hidrólisis. Los aceites animales y vegetales generalmente están hechos de triacilgliceroles (TAG), que son ésteres de ácidos grasos con el alcohol trihídrico, el glicerol. En una reacción de hidrólisis alcalina, se elimina el glicerol en un TAG, dejando tres aniones de ácido carboxílico que pueden asociarse con cationes de metales alcalinos como el sodio o el potasio para producir sales de ácidos grasos. En este esquema, los constituyentes del ácido carboxílico se separan del resto glicerol y se reemplazan con grupos hidroxilo. La cantidad de base (por ejemplo, KOH) que se usa en la reacción está determinada por el grado deseado de saponificación. Si el objetivo es, por ejemplo, producir un producto de jabón que comprenda algunos de los aceites originalmente presentes en la composición de TAG, se introduce una cantidad de base insuficiente para convertir todos los TAG en sales de ácidos grasos en la mezcla de reacción. Normalmente, esta reacción se realiza en una solución acuosa y avanza lentamente, pero se puede acelerar mediante la adición de calor. La precipitación de las sales de ácidos grasos se puede facilitar mediante la adición de sales, tales como haluros de metales alcalinos solubles en agua (por ejemplo, NaCl o KCl), a la mezcla de reacción. Preferiblemente, la base es un hidróxido de metal alcalino, tal como NaOH o KOH. Alternativamente, otras bases, tales como alcanolaminas, que incluyen, por ejemplo, trietanolamina y aminometilpropanol, pueden usarse en el esquema de reacción. En algunos casos, se pueden preferir estas alternativas para producir un producto de jabón transparente.
[0291] En algunos métodos, el primer paso de la modificación química puede ser el hidroprocesamiento para saturar los dobles enlaces, seguido de la desoxigenación a temperatura elevada en presencia de hidrógeno y un catalizador. En otros métodos, la hidrogenación y la desoxigenación pueden ocurrir en la misma reacción. En otros métodos, la desoxigenación ocurre antes de la hidrogenación. La isomerización se puede realizar opcionalmente, también en presencia de hidrógeno y un catalizador. Finalmente, los componentes de gases y nafta se pueden eliminar si se desea. Por ejemplo, véanse las patentes de los Estados Unidos 5,475,160 (hidrogenación de triglicéridos); 5,091,116 (desoxigenación, hidrogenación y eliminación de gases); 6,391,815 (hidrogenación); y 5,888,947 (isomerización).
[0292] En algunas realizaciones de la presente descripción, los aceites triglicéridos se desoxigenan parcial o completamente. Las reacciones de desoxigenación forman los productos deseados, que incluyen, entre otros, ácidos grasos, alcoholes grasos, polioles, cetonas y aldehídos. En general, sin estar limitados por ninguna teoría en particular, las reacciones de desoxigenación implican una combinación de varias vías de reacción diferentes, que incluyen, entre otras: reacciones combinadas de hidrogenólisis, hidrogenación, hidrogenación-hidrogenolisis consecutiva, hidrogenolisis-hidrogenación consecutiva e hidrogenación-hidrogenolisis, que resultan en al menos la eliminación parcial de oxígeno del ácido graso o éster de ácido graso para producir productos de reacción, tales como alcoholes grasos, que pueden convertirse fácilmente en los productos químicos deseados mediante un procesamiento adicional. Por ejemplo, en una realización, un alcohol graso puede convertirse en olefinas a través de la reacción FCC o en alcanos superiores a través de una reacción de condensación.
[0293] Una de estas modificaciones químicas es la hidrogenación, que es la adición de hidrógeno a dobles enlaces en los constituyentes de los ácidos grasos de los glicerolípidos o de los ácidos grasos libres. El proceso de hidrogenación permite la transformación de aceites líquidos en grasas semisólidas o sólidas, que pueden ser más adecuadas para aplicaciones específicas.
[0294] La hidrogenación del aceite producido por los métodos descritos en el presente documento puede realizarse junto con uno o más de los métodos y/o materiales proporcionados en el presente documento, según se informa en lo siguiente: Patentes de los Estados Unidos Nos 7,288,278 (aditivos alimentarios o medicamentos); 5,346,724 (productos de lubricación); 5,475,160 (alcoholes grasos); 5,091,116 (aceites comestibles); 6,808,737 (grasas estructurales para margarina y productos para untar); 5,298,637 (sustitutos de grasas reducidas en calorías); 6,391,815 (catalizador de hidrogenación y adsorbente de azufre); 5,233,099 y 5,233,100 (alcoholes grasos); 4,584,139 (catalizadores de hidrogenación); 6,057,375 (agentes supresores de espuma); y 7,118,773 (extensiones de emulsión comestible).
[0295] Un experto en la materia reconocerá que pueden usarse diversos procesos para hidrogenar carbohidratos. Un método adecuado incluye poner en contacto el carbohidrato con hidrógeno o hidrógeno mezclado con un gas adecuado y un catalizador en condiciones suficientes en un reactor de hidrogenación para formar un producto hidrogenado. El catalizador de hidrogenación generalmente puede incluir Cu, Re, Ni, Fe, Co, Ru, Pd, Rh, Pt, Os, Ir y aleaciones o cualquier combinación de los mismos, ya sea solo o con promotores como W, Mo, Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, B, P, Bi y aleaciones o cualquier combinación de los mismos. Otros materiales catalizadores de hidrogenación efectivos incluyen níquel soportado o rutenio modificado con renio. En una realización, el catalizador de hidrogenación también incluye cualquiera de los soportes, dependiendo de la funcionalidad deseada del catalizador. Los catalizadores de hidrogenación pueden prepararse por métodos conocidos por los expertos en la materia.
[0296] En algunas realizaciones, el catalizador de hidrogenación incluye un catalizador metálico del Grupo VIII soportado y un material de esponja metálica (por ejemplo, un catalizador de esponja de níquel). El níquel Raney proporciona un ejemplo de un catalizador de níquel esponja activado adecuado para usar en esta descripción. En otra realización, la reacción de hidrogenación en la descripción se realiza usando un catalizador que comprende un catalizador de níquel-renio o un catalizador de níquel modificado con tungsteno. Un ejemplo de un catalizador adecuado para la reacción de hidrogenación de la descripción es un catalizador de níquel-renio soportado en carbono.
[0297] En una realización de la descripción, se puede preparar un catalizador de níquel Raney adecuado tratando una aleación de cantidades aproximadamente iguales en peso de níquel y aluminio con una solución alcalina acuosa, por ejemplo, que contiene aproximadamente 25% en peso de hidróxido de sodio. El aluminio se disuelve selectivamente por la solución alcalina acuosa dando como resultado un material en forma de esponja que comprende principalmente níquel con pequeñas cantidades de aluminio. La aleación inicial incluye metales promotores (es decir, molibdeno o cromo) en una cantidad tal que queda aproximadamente 1 a 2% en peso en el catalizador de esponja de níquel formado. En otra realización, el catalizador de hidrogenación se prepara usando una solución de nitrosilnitrato de rutenio (III), cloruro de rutenio (III) en agua para impregnar un material de soporte adecuado. La solución se seca luego para formar un sólido que tiene un contenido de agua de menos de aproximadamente 1% en peso. El sólido puede entonces reducirse a presión atmosférica en una corriente de hidrógeno a 300°C (no calcinado) o 400°C (calcinado) en un horno de bolas rotatorio durante 4 horas. Después de enfriar y hacer que el catalizador sea inerte con nitrógeno, se pasa 5% en volumen de oxígeno en nitrógeno sobre el catalizador durante 2 horas.
[0298] En ciertas realizaciones de la descripción, el catalizador descrito incluye un soporte de catalizador. El soporte del catalizador estabiliza y soporta el catalizador. El tipo de soporte de catalizador utilizado depende del catalizador elegido y las condiciones de reacción. Los soportes adecuados para la divulgación incluyen, pero no se limitan a, carbono, sílice, sílice-alúmina, circonia, titania, ceria, vanadia, nitruro, nitruro de boro, heteropoliácidos, hidroxiapatita, óxido de zinc, cromia, zeolitas, nandubos de carbono, fullereno de carbono y cualquier combinación de los mismos.
[0299] Los catalizadores usados en esta descripción pueden prepararse usando métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, humectación incipiente, impregnación por evaporación, deposición química de vapor, recubrimiento de lavado, técnicas de pulverización de magnetrón y similares.
[0300] Las condiciones para llevar a cabo la reacción de hidrogenación variarán en función del tipo de material de partida y los productos deseados. Un experto en la materia, con el beneficio de esta divulgación, reconocerá las condiciones de reacción apropiadas. En general, la reacción de hidrogenación se lleva a cabo a temperaturas de 80°C a 250°C, y preferiblemente a 90°C a 200°C, y lo más preferiblemente a 100°C a 150°C. En algunas realizaciones, la reacción de hidrogenación se realiza a presiones de 500 KPa a 14000 KPa.
[0301] El hidrógeno utilizado en la reacción de hidrogenólisis de la divulgación actual puede incluir hidrógeno externo, hidrógeno reciclado, generado in situ de hidrógeno, y cualquier combinación de los mismos. Como se usa en este documento, el término "hidrógeno externo" se refiere al hidrógeno que no se origina en la reacción de biomasa en sí, sino que se agrega al sistema desde otra fuente.
[0302] En algunas realizaciones de la descripción, es deseable convertir el carbohidrato de partida en una molécula más pequeña que se convertirá más fácilmente en los hidrocarburos superiores deseados. Un método adecuado para esta conversión es a través de una reacción de hidrogenolisis. Se conocen varios procesos para realizar la hidrogenolisis de carbohidratos. Un método adecuado incluye poner en contacto un carbohidrato con hidrógeno o hidrógeno mezclado con un gas adecuado y un catalizador de hidrogenolisis en un reactor de hidrogenolisis en condiciones suficientes para formar un producto de reacción que comprende moléculas o polioles más pequeños. Como se usa en el presente documento, el término "moléculas o polioles más pequeños" incluye cualquier molécula que tenga un peso molecular más pequeño, que puede incluir un número menor de átomos de carbono u átomos de oxígeno que el carbohidrato de partida. En una realización, los productos de reacción incluyen moléculas más pequeñas que incluyen polioles y alcoholes. Alguien de habilidad ordinaria en la técnica podría elegir el método apropiado para llevar a cabo la reacción de hidrogenolisis.
[0303] En algunas realizaciones de la descripción, un azúcar de 5 y/o 6 carbonos o alcohol de azúcar se puede convertir en propilenglicol, etilenglicol y glicerol usando un catalizador de hidrogenolisis. El catalizador de hidrogenolisis puede incluir Cr, Mo, W, Re, Mn, Cu, Cd, Fe, Co, Ni, Pt, Pd, Rh, Ru, Ir, Os y aleaciones o cualquier combinación de los mismos, ya sea solo o con promotores tales como Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, Bi, B, O y aleaciones o cualquier combinación de los mismos. El catalizador de hidrogenolisis también puede incluir un catalizador de piropolímero carbonoso que contiene metales de transición (p. ej., cromo, molibdeno, tungsteno, renio, manganeso, cobre, cadmio) o metales de Grupo VIII (p. ej., hierro, cobalto, níquel, platino, paladio, rodio, rutenio, iridio y osmio). En ciertas realizaciones, el catalizador de hidrogenolisis puede incluir cualquiera de los metales anteriores combinados con un óxido de metal alcalinotérreo o adherido a un soporte catalíticamente activo. En ciertas realizaciones, el catalizador descrito en la reacción de hidrogenolisis puede incluir un soporte de catalizador como se describió anteriormente para la reacción de hidrogenación.
[0304] Las condiciones para llevar a cabo la reacción de hidrogenolisis variarán en función del tipo de material de partida y los productos deseados. Un experto habitual en la técnica, con el beneficio de esta divulgación, reconocerá las condiciones apropiadas para usar para llevar a cabo la reacción. En general, la reacción de hidrogenolisis se lleva a cabo a temperaturas de 110°C a 300°C, y preferiblemente de 170°C a 220°C, y lo más preferiblemente de 200°C a 225°C. En algunas realizaciones, la reacción de hidrogenolisis se lleva a cabo en condiciones básicas, preferiblemente a un pH de 8 a 13, e incluso más preferiblemente a un pH de 10 a 12. En algunas realizaciones, la reacción de hidrogenolisis se realiza a presiones en un rango entre 60 KPa y 16500 KPa, y preferiblemente en un rango entre 1700 KPa y 14000 KPa, e incluso más preferiblemente entre 4800 KPa y 11000 KPa.
[0305] El hidrógeno utilizado en la reacción de hidrogenólisis de la divulgación actual puede incluir hidrógeno externo, hidrógeno reciclado, generado in situ de hidrógeno, y cualquier combinación de los mismos.
[0306] En algunas realizaciones de la descripción, los productos de reacción discutidos anteriormente pueden convertirse en hidrocarburos superiores a través de una reacción de condensación en un reactor de condensación (mostrado esquemáticamente como el reactor de condensación 110 en la Figura 1). En tales realizaciones, la condensación de los productos de reacción se produce en presencia de un catalizador capaz de formar hidrocarburos superiores. Si bien no tiene la intención de estar limitado por la teoría, se cree que la producción de hidrocarburos superiores se realiza a través de una reacción de adición gradual que incluye la formación de enlaces carbono-carbono o carbono-oxígeno. Los productos de reacción resultantes incluyen cualquier número de compuestos que contienen estos restos, como se describe con más detalle a continuación.
[0307] En ciertas realizaciones de la descripción, los catalizadores de condensación adecuados incluyen un catalizador ácido, un catalizador base o un catalizador ácido/base. Como se usa en el presente documento, el término "catalizador ácido/base" se refiere a un catalizador que tiene tanto una funcionalidad ácida como una base. En algunas realizaciones, el catalizador de condensación puede incluir, sin limitación, zeolitas, carburos, nitruros, zirconia, alúmina, sílice, aluminosilicatos, fosfatos, óxidos de titanio, óxidos de zinc, óxidos de vanadio, óxidos de lantano, óxidos de itrio, óxidos de escandio, óxidos de magnesio., óxidos de cerio, óxidos de bario, óxidos de calcio, hidróxidos, heteropoliácidos, ácidos inorgánicos, resinas modificadas con ácido, resinas modificadas con base y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el catalizador de condensación también puede incluir un modificador. Los modificadores adecuados incluyen La, Y, Sc, P, B, Bi, Li, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el catalizador de condensación también puede incluir un metal. Los metales adecuados incluyen Cu, Ag, Au, Pt, Ni, Fe, Co, Ru, Zn, Cd, Ga, In, Rh, Pd, Ir, Re, Mn, Cr, Mo, W, Sn, Os, aleaciones y cualquier combinación de los mismos.
[0308] En ciertas realizaciones, el catalizador descrito en la reacción de condensación puede incluir un soporte de catalizador como se describe anteriormente para la reacción de hidrogenación. En ciertas realizaciones, el catalizador de condensación es autoportante. Como se usa en este documento, el término "autoportante" significa que el catalizador no necesita otro material para servir como soporte. En otras realizaciones, el catalizador de condensación se usa junto con un soporte separado adecuado para suspender el catalizador. En una realización, el soporte del catalizador de condensación es sílice.
[0309] Las condiciones en que la reacción de condensación se produce variará en función del tipo de material de partida y los productos deseados. Un experto habitual en la técnica, con el beneficio de esta divulgación, reconocerá las condiciones apropiadas para usar para llevar a cabo la reacción. En algunas realizaciones, la reacción de condensación se lleva a cabo a una temperatura a la que la termodinámica para la reacción propuesta es favorable. La temperatura para la reacción de condensación variará dependiendo del poliol o alcohol de partida específico. En algunas realizaciones, la temperatura para la reacción de condensación está en un intervalo de 80°C a 500°C, y preferiblemente de 125°C a 450°C, y lo más preferiblemente de 125°C a 250°C. En algunas realizaciones, la reacción de condensación se lleva a cabo a presiones en un rango entre 0 Kpa y 9000 KPa, y preferiblemente en un rango entre 0 KPa y 7000 KPa, y aún más preferiblemente entre 0 KPa y 5000 KPa.
[0310] Los alcanos superiores formados por la descripción incluyen, pero no se limitan a, alcanos de cadena ramificada o lineal que tienen de 4 a 30 átomos de carbono, alquenos de cadena ramificada o lineal que tienen de 4 a 30 átomos de carbono, cicloalcanos que tienen de 5 a 30 átomos de carbono, cicloalquenos que tienen de 5 a 30 átomos de carbono, arilos, arilos fusionados, alcoholes y cetonas. Los alcanos adecuados incluyen, pero no se limitan a, butano, pentano, penteno, 2-metilbutano, hexano, hexeno, 2-metilpentano, 3-metilpentano, 2,2, -dimetilbutano, 2,3-dimetilbutano, heptano, hepteno, octano, octeno, 2,2,4-trimetilpentano, 2,3-dimetil hexano, 2,3,4-trimetilpentano, 2,3-dimetilpentano, nonano, ninguno, decano, deceno, undecano, undeceno, dodecano, dodeceno, tridecano, trideceno, tetradecano, tetradeceno, pentadecano, pentadeceno, nonildecano, nonildeceno, eicosano, eicoseno, uneicosano, uneicosene, doecosano, doeicosene, trieicosane, trieicoseneno, tetraeicosane, tetraeicosene e isómeros de los mismos. Algunos de estos productos pueden ser aptos para su uso como combustibles.
[0311] En algunas realizaciones de la descripción, los cicloalcanos y los cicloalquenos no están sustituidos. En otras realizaciones, los cicloalcanos y cicloalquenos están monosustituidos. En otras realizaciones más, los cicloalcanos y cicloalquenos están multisustituidos. En las realizaciones que comprenden los cicloalcanos y cicloalquenos sustituidos, el grupo sustituido incluye, sin limitación, un alquilo de cadena ramificada o lineal que tiene de 1 a 12 átomos de carbono, un alquileno de cadena ramificada o lineal que tiene de 1 a 12 átomos de carbono, un fenilo y cualquier combinación de los mismos. Los cicloalcanos y cicloalquenos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexeno, metilciclopentano, metil-ciclopenteno, etil-ciclopentano, etilciclopenteno, etil-ciclohexano, etil-ciclohexeno, isómeros y cualquier combinación de los mismos.
[0312] En algunas realizaciones, los arilos formados no están sustituidos. En otra realización, los arilos formados están monosustituidos. En las realizaciones que comprenden los arilos sustituidos, el grupo sustituido incluye, sin limitación, un alquilo de cadena ramificada o lineal que tiene de 1 a 12 átomos de carbono, un alquileno de cadena ramificada o lineal que tiene de 1 a 12 átomos de carbono, un fenilo y cualquier combinación de los mismos. Los arilos adecuados para la divulgación incluyen, pero no se limitan a, benceno, tolueno, xileno, etilbenceno, paraxileno, metaxileno y cualquier combinación de los mismos.
[0313] Los alcoholes producidos en la descripción tienen de 4 a 30 átomos de carbono. En algunas realizaciones, los alcoholes son cíclicos. En otras realizaciones, los alcoholes son ramificados. En otra realización, los alcoholes son de cadena lineal. Los alcoholes adecuados para la divulgación incluyen, pero no se limitan a, butanol, pentanol, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, decanol, undecanol, dodecanol, tridecanol, tetradecanol, pentadecanol, hexadecanol, heptildecanol, octildecanol, no-nildecanol, eicosanol, uneicosol., doeicosanol, trieicosanol, tetraeicosanol e isómeros de los mismos.
[0314] Las cetonas producidas en la descripción tienen de 4 a 30 átomos de carbono. En una realización, las cetonas son cíclicas. En otra realización, las cetonas están ramificadas. En otra realización, las cetonas son de cadena lineal. Las cetonas adecuadas para la divulgación incluyen, pero no se limitan a, butanona, pentanona, hexanona, heptanona, octanona, nonanona, decanona, undecanona, dodecanona, tridecanona, tetradecanona, pentadecanona, hexadecanona, heptilodecanona, octildecanona, nonildecanona, eicosanona, eicosanona, doeicosanona, trieicosanona, tetraeicosanona e isómeros de las mismas.
[0315] Otra de estas modificaciones químicas es la interesterificación. Los glicerolípidos producidos naturalmente no tienen una distribución uniforme de los componentes de los ácidos grasos. En el contexto de los aceites, la interesterificación se refiere al intercambio de radicales acilo entre dos ésteres de diferentes glicerolípidos. El proceso de interesterificación proporciona un mecanismo por el cual los constituyentes de ácidos grasos de una mezcla de glicerolípidos pueden reorganizarse para modificar el patrón de distribución. La interesterificación es un proceso químico bien conocido, y generalmente comprende calentar (hasta aproximadamente 200°C) una mezcla de aceites durante un período (por ejemplo, 30 minutos) en presencia de un catalizador, como un alquilato de metal alcalino o alcalino (por ejemplo, metóxido de sodio). Este proceso puede usarse para aleatorizar el patrón de distribución de los constituyentes de ácidos grasos de una mezcla de aceites, o puede dirigirse para producir un patrón de distribución deseado. Este método de modificación química de los lípidos se puede realizar en los materiales proporcionados en este documento, como la biomasa microbiana con un porcentaje de peso de células secas como lípidos al menos 20%.
[0316] La interesterificación dirigida, en la que se busca un patrón de distribución específico de ácidos grasos, se puede realizar manteniendo la mezcla de aceite a una temperatura por debajo del punto de fusión de algunos TAG que pueden ocurrir. Esto da como resultado una cristalización selectiva de estos TAG, que los elimina efectivamente de la mezcla de reacción a medida que cristalizan. El proceso puede continuar hasta que la mayoría de los ácidos grasos en el aceite hayan precipitado, por ejemplo. Se puede usar un proceso de interés dirigido, por ejemplo, para producir un producto con un contenido calórico más bajo mediante la sustitución de ácidos grasos de cadena más larga con contrapartes de cadena más corta. La interesterificación dirigida también puede usarse para producir un producto con una mezcla de grasas que puede proporcionar las características de fusión deseadas y las características estructurales buscadas en aditivos alimentarios o productos (por ejemplo, margarina) sin recurrir a la hidrogenación, que puede producir isómeros trans no deseados.
[0317] La interesterificación de aceites producidos por los métodos descritos en el presente documento puede realizarse en conjunción con uno o más de los métodos y/o materiales, o para producir productos, como se informa a continuación: Patentes de los Estados Unidos Nos 6,080,853 (sustitutos de grasas no digestibles); 4,288,378 (estabilizador de mantequilla de maní); 5,391,383 (aceite en aerosol comestible); 6,022,577 (grasas comestibles para productos alimenticios); 5,434,278 (grasas comestibles para productos alimenticios); 5,268,192 (productos de nueces bajos en calorías); 5,258,197 (composiciones comestibles reducidas en calorías); 4,335,156 (producto graso comestible); 7,288,278 (aditivos alimentarios o medicamentos); 7,115,760 (proceso de fraccionamiento); 6,808,737 (grasas estructurales); 5,888,947 (lubricantes para motores); 5,686,131 (mezclas de aceites comestibles); y 4,603,188 (composiciones de uretano curables).
[0318] En una realización de acuerdo con la descripción, la transesterificación del aceite, como se describe anteriormente, es seguida por la reacción del producto transesterificado con poliol, como se informa en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6,465,642, para producir poliésteres de ácidos grasos de poliol. Tal proceso de esterificación y separación puede comprender los pasos siguientes: hacer reaccionar un éster de alquilo inferior con poliol en presencia de jabón; eliminar el jabón residual de la mezcla del producto; lavar con agua y secar la mezcla del producto para eliminar las impurezas; blanqueo de la mezcla del producto para su refinamiento; separar al menos una porción del éster de alquilo inferior sin reaccionar del poliéster de ácido graso de poliol en la mezcla de productos; y reciclar el éster de alquilo inferior sin reaccionar separado.
[0319] La transesterificación también se puede realizar en biomasa microbiana con ésteres de ácidos grasos de cadena corta, como se informa en la Patente de EE.UU. 6,278,006. En general, la transesterificación puede realizarse agregando un éster de ácido graso de cadena corta a un aceite en presencia de un catalizador adecuado y calentando la mezcla. En algunas realizaciones, el aceite comprende aproximadamente 5% a aproximadamente 90% de la mezcla de reacción en peso. En algunas realizaciones, los ésteres de ácidos grasos de cadena corta pueden ser de aproximadamente 10% a aproximadamente 50% en peso de la mezcla de reacción. Ejemplos no limitantes de catalizadores incluyen catalizadores básicos, metóxido de sodio, catalizadores ácidos que incluyen ácidos inorgánicos como ácido sulfúrico y arcillas acidificadas, ácidos orgánicos como ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico y ácido toluenosulfónico, y resinas ácidas como Amberlyst 15. Metales tales como sodio y magnesio, e hidruros metálicos también son catalizadores útiles.
[0320] Otra de estas modificaciones químicas es la hidroxilación, que implica la adición de agua a un doble enlace que da como resultado la saturación y la incorporación de un resto hidroxilo. El proceso de hidroxilación proporciona un mecanismo para convertir uno o más constituyentes de ácidos grasos de un glicerolípido en un ácido graso hidroxilado. La hidroxilación se puede realizar, por ejemplo, a través del método descrito en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,576,027. Los ácidos grasos hidroxilados, incluido el aceite de ricino y sus derivados, son útiles como componentes en varias aplicaciones industriales, incluidos aditivos alimentarios, tensioactivos, agentes humectantes de pigmentos, agentes antiespumantes, aditivos impermeables, agentes plastificantes, agentes emulsionantes y/o desodorantes cosméticos. como en electrónica, productos farmacéuticos, pinturas, tintas, adhesivos y lubricantes. Un ejemplo de cómo se puede llevar a cabo la hidroxilación de un glicérido es el siguiente: la grasa se puede calentar, preferiblemente a aproximadamente 30-50°C combinada con heptano y mantenerse a temperatura durante treinta minutos o más; A continuación, se puede agregar ácido acético a la mezcla seguido de una solución acuosa de ácido sulfúrico seguido de una solución acuosa de peróxido de hidrógeno que se agrega en pequeños incrementos a la mezcla durante una hora; después del peróxido de hidrógeno acuoso, la temperatura puede aumentarse hasta al menos aproximadamente 60°C y agitarse durante al menos seis horas; después de la agitación, la mezcla se deja sedimentar y se puede eliminar una capa acuosa inferior formada por la reacción, mientras que la capa superior de heptano formada por la reacción se puede lavar con agua caliente que tiene una temperatura de aproximadamente 60°C; la capa de heptano lavada puede neutralizarse con una solución acuosa de hidróxido de potasio a un pH de aproximadamente 5 a 7 y luego eliminarse por destilación al vacío; el producto de reacción se puede secar al vacío a 100°C y el producto seco se desodoriza al vapor en condiciones de vacío y se filtra a aproximadamente 50° a 60°C usando tierra de diatomeas.
[0321] La hidroxilación de aceites microbianos producidos por los métodos descritos en el presente documento se puede realizar en conjunción con uno o más de los métodos y/o materiales, o para producir productos, como se informa a continuación: Patentes de los Estados Unidos Núms. 6,590,113 (a base de aceite recubrimientos y tinta); 4,049,724 (proceso de hidroxilación); 6,113,971 (mantequilla de aceite de oliva); 4,992,189 (lubricantes y aditivos lubricantes); 5,576,027 (leche hidroxilada); y 6,869,597 (cosméticos).
[0322] Glicerolípidos hidroxilados se pueden convertir a estólidos. Los estólidos consisten en un glicerolípido en el que un componente de ácido graso hidroxilado se ha esterificado a otra molécula de ácido graso. La conversión de glicerolípidos hidroxilados en estólidos se puede llevar a cabo calentando una mezcla de glicerolípidos y ácidos grasos y poniendo en contacto la mezcla con un ácido mineral, como lo describen Isbell et al., JAOCS 71 (2): 169-174 (1994). Los estólidos son útiles en una variedad de aplicaciones, incluidas, entre otras, las que se mencionan a continuación: Patentes de los Estados Unidos Nos 7,196,124 (Materiales elastoméricos y revestimientos para suelos); 5,458,795 (Aceites espesados para aplicaciones de alta temperatura); 5,451,332 (Fluidos para aplicaciones industriales); 5,427,704 (Aditivos de combustible); y 5,380,894 (Lubricantes, grasas, plastificantes y tintas de impresión).
[0323] Otras reacciones químicas que pueden realizarse en aceites microbianos incluyen la reacción de triacilgliceroles con un agente de ciclopropagación para mejorar la fluidez y/o la estabilidad oxidativa, como se informa en la Patente de EE.UU. 6,051,539; fabricación de ceras a partir de triacilgliceroles, como se informa en la patente de los Estados Unidos 6,770,104; y epoxidación de triacilgliceroles, como se informa en "El efecto de la composición de ácidos grasos en la cinética de acrilación de triacilgliceroles epoxidados", Journal of the American Oil Chemists' Society, 79: 1, 59-63, (2001) y Free Radical Biology and Medicine 37: 1, 104-114 (2004).
[0324] La generación de biomasa microbiana a base de petróleo para combustible y productos químicos como se describe anteriormente da como resultado la producción de harina de biomasa delipidada. La comida delipidada es un subproducto de la preparación de aceite de algas y es útil como alimento para animales de granja, por ejemplo, rumiantes, aves, cerdos y acuicultivo. La comida resultante, aunque tiene un contenido reducido de aceite, todavía contiene proteínas de alta calidad, carbohidratos, fibra, cenizas, aceite residual y otros nutrientes apropiados para la alimentación animal. Debido a que las células se lisan predominantemente por el proceso de separación de aceite, la comida delipidada es fácilmente digerible por dichos animales. La comida delipidada se puede combinar opcionalmente con otros ingredientes, como el grano, en un alimento para animales. Debido a que la comida delipidada tiene una consistencia en polvo, puede prensarse en gránulos usando una extrusora o expansora u otro tipo de máquina, que están disponibles comercialmente.
[0325] La invención, que se ha descrito en detalle anteriormente, se ejemplifica en los siguientes ejemplos, que se ofrecen para ilustrar la invención reivindicada.
VII. EJEMPLOS
EJEMPLO 1: Métodos para cultivar Prototheca
[0326] Las cepas de Prototheca se cultivaron para lograr un alto porcentaje de aceite por peso de células secas. Las células crioconservadas se descongelaron a temperatura ambiente y se añadieron 500 ul de células a 4,5 pl de medio (4,2 g/LK2HPO4, 3,1 g/L NaH2PO4, 0,24 g/L MgSO4'7H2O, 0,25 g/L de ácido cítrico monohidrato, 0,025 g/L CaCh2H2O, extracto de levadura 2g/L) más 2% de glucosa y cultivado durante 7 días a 28°C con agitación (200 rpm) en una placa de 6 pocillos. Los pesos de las células secas se determinaron centrifugando 1 pl de cultivo a 14.000 rpm durante 5 minutos en un tubo Eppendorf pesado previamente. El sobrenadante de cultivo se desechó y el sedimento celular resultante se lavó con 1 pl de agua desionizada. El cultivo se centrifugó nuevamente, se descartó el sobrenadante y los sedimentos celulares se colocaron a -80°C hasta que se congelaron. Las muestras se liofilizaron durante 24 horas y se calcularon los pesos de las células secas. Para la determinación del lípido total en cultivos, se retiraron 3 pl de cultivo y se sometieron a análisis usando un sistema Ankom (Ankom Inc., Macedonia, NY) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las muestras se sometieron a extracción con solvente con un extractor Amkom XT10 según el protocolo del fabricante. El lípido total se determinó como la diferencia en masa entre las muestras secas hidrolizadas con ácido y las muestras secas extraídas con disolvente. Las mediciones de porcentaje de peso de células secas de aceite se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8. Porcentaje de aceite por peso de células secas
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[0327] Las muestras de microalgas de las cepas enumeradas en la Tabla 22 anterior se genotiparon. El ADN genómico se aisló de la biomasa de algas como sigue. Las células (aproximadamente 200 mg) se centraron a partir de cultivos líquidos 5 minutos a 14.000 x g. Las células se volvieron a suspender en agua destilada estéril, se centrifugaron 5 minutos a 14.000 x g y se desechó el sobrenadante. Se añadió una sola cuenta de vidrio de ~ 2 mm de diámetro a la biomasa y los tubos se colocaron a -80°C durante al menos 15 minutos. Se retiraron las muestras y se añadieron 150 pl de tampón de molienda (Sarkosyl al 1%, sacarosa 0,25 M, NaCl 50 mM, EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, RNasa A 0,5 pg/ul). Los pellets se resuspendieron mediante agitación vorticial brevemente, seguido de la adición de 40 pl de NaCl 5M. Las muestras se sometieron a vórtice brevemente, seguido de la adición de 66 pl de 5% de CTAB (bromuro de cetil trimetilamonio) y un breve vórtice final. A continuación, las muestras se incubaron a 65°C durante 10 minutos, después de lo cual se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se extrajo una vez con 300 pl de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 12: 12: 1, seguido de centrifugación durante 5 minutos a 14.000 x g. La fase acuosa resultante se transfirió a un tubo nuevo que contenía 0,7 vol de isopropanol (~ 190 ml), se mezcló por inversión y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos o durante la noche a 4°C. El ADN se recuperó por centrifugación a 14.000 x g durante 10 minutos. El sedimento resultante se lavó dos veces con etanol al 70%, seguido de un lavado final con etanol al 100%. Los pellets se secaron al aire durante 20-30 minutos a temperatura ambiente seguido de resuspensión en 50 pl de TrisCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0).
[0328] Se diluyeron cinco pl de ADN de algas totales, preparado como se describió anteriormente, 1:50 en Tris 10 mM, pH 8,0. Las reacciones de PCR, volumen final 20 ml, se prepararon como sigue. Ten pl de 2 x mezcla maestra iProof HF (BIO-RAD) se añadió a 0,4 pl SZ02613 de cebador (5'TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3' (SEQ ID NO: 9) en 10 mM de concentración de reserva). Esta secuencia de cebador se ejecuta desde la posición 567-588 en el número de registro de Gen Bank. L43357 y está altamente conservado en plantas superiores y genomas de plastidios de algas. Esto fue seguido por la adición de 0,4 |jl de cebador SZ02615 (5'-CAGTGAGCTATTACGCACTC-3' (SEQ ID NO: 10) a una concentración de stock de 10 mM). Esta secuencia de cebador es complementaria a la posición 1112­ 1093 en el número de registro de Gen Bank. L43357 y está altamente conservado en plantas superiores y genomas de plastidios de algas. A continuación, 5 j l de ADN total diluido y 3,2 j l dH2O se añadieron. Las reacciones de PCR se realizaron de la siguiente manera: 98°C, 45”; 98°C, 8"; 53°C, 12”; 72°C, 20" durante 35 ciclos seguidos de 72°C durante 1 minuto y manteniéndose a 25°C. Para la purificación de los productos de PCR, se agregaron 20 j l de Tris 10 mM, pH 8,0, a cada reacción, seguido de extracción con 40 j l de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 12:12:1, agitación en vórtex y centrifugación a 14.000 x g durante 5 minutos. Las reacciones de PCR se aplicaron a columnas S-400 (GE Healthcare) y se centrifugaron durante 2 minutos a 3.000 x g. Los productos de PCR purificados se clonaron posteriormente con TOPO en PCR8/GW/TOPO y se seleccionaron clones positivos para placas LB/Spec. El ADN plasmídico purificado fue secuenciado en ambas direcciones usando cebadores M13 hacia adelante y hacia atrás. En total, se seleccionaron doce cepas de Prototheca para secuenciar su ADN de ARNr 23S y las secuencias se enumeran en el Listado de secuencias. A continuación se incluye un resumen de las cepas y los números de listado de secuencias. Las secuencias se analizaron para la divergencia global de la secuencia UTEX 1435 (SEQ ID NO: 15). Surgieron dos pares (UTEX 329/UTEX 1533 y UTEX 329/UTEX 1440) como los más divergentes. En ambos casos, la alineación por pares resultó en una identidad de secuencia por pares del 75,0%. El porcentaje de identidad de secuencia para UTEX 1435 también se incluye a continuación.
Especies Cepa % identidad nt SEQ ID NO.
Prototheca kruegani UTEX 329 75.2 SEQ ID NO: 11
Prototheca wickerhamii UTEX 1440 99 SEQ ID NO: 12
Prototheca stagnora UTEX 1442 75.7 SEQ ID NO: 13
Prototheca moriformis UTEX 288 75.4 SEQ ID NO: 14
Prototheca moriformis UTEX 1439; 1441; 1435; 1437 100 SEQ ID NO: 15
Prototheca wikerhamii UTEX 1533 99.8 SEQ ID NO: 16
Prototheca moriformis UTEX 1434 75.9 SEQ ID NO: 17
Prototheca zopfii UTEX 1438 75.7 SEQ ID NO: 18
Prototheca moriformis UTEX 1436 88.9 SEQ ID NO: 19
[0329] Las muestras de lípidos de un subconjunto de las cepas mencionadas anteriormente se analizaron para el perfil de lípidos usando HPLC. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 9.
Tabla 9. Diversidad de cadenas lipídicas en especies de microalgas
Figure imgf000051_0001
[0330] Los péptidos de tránsito de plastidios de algas se identificaron mediante el análisis de bibliotecas de ADNc de UTEX 1435 (Prototheca moriformis) o UTEX 250 (Prototecoides de Chlorella) como se describe en los Ejemplos 12 y Ejemplo 11 a continuación. Los ADNc que codifican proteínas potencialmente dirigidas a plastidios basadas en la homología de BLAST hit con otras proteínas conocidas de plastidios dirigidos fueron sometidos a análisis adicionales por los programas de sowftawre PSORT (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html), ChloroP (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/) son TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/). Los péptidos de tránsito de plastidios candidatos identificados a través de al menos uno de estos tres programas se amplificaron por PCR a partir del ADN genómico apropiado. A continuación se muestra un resumen de las secuencias de aminoácidos de secuencias de direccionamiento de plastidios de algas (PTS) que se identificaron en esta pantalla. También se incluyen las secuencias de aminoácidos de las tioesterasas acil-ACP graso vegetales que se usan en los ejemplos de expresión heterólogos a continuación.
ADNc SEQ ID NO.
P.moriformis isopentenil difosfato sintasa PTS SEQ ID NO: 127
P.moriformis delta 12 ácido graso desaturasa PTS SEQ ID NO: 128
P.moriformis estearoil ACP desaturasa PTS SEQ ID NO: 129
C.protothecoides estearoil ACP desaturasa PTS SEQ ID NO: 130
Cuphea hookeriana acil graso-ACP tioesterasa (C8-10) SEQ ID NO: 131
Umbelularia californica acil graso-ACP tioestera C12) SEQ ID NO: 132
Cinnamomum camphora tioesterasa grasa acil-ACP SEQ ID NO: 133
(C14)
EJEMPLO 2: Cultivar Prototheca en varias materias primas
A. Sorgo
[0331] Las siguientes cepas mostraron ser capaces de utilizar sorgo como única fuente de carbono: cepas Prototheca moriformis UTEX 1435, UTEX 1437, UTEX 288, UTEX 1439, UTEX 1441 y UTEX 1434, y cepa Prototheca stagnora UTEX 1442. La designación “UTEX" indica el número de cepa de la colección de cultivo de algas de la Universidad de Texas, 1 Universidad Estado A6700, Austin, Texas 78712-0183.
[0332] Se adquirió sorgo puro de Maasdam Sorghum Mills (Lynnville, Iowa) con un perfil de azúcar de fructosa 21,0% p/p, dextrosa 28,0% p/p, sacarosa 16,0% p/p y maltosa <0,5% p/p. Los cultivos se cultivaron en medio líquido que contenía sorgo puro al 2%, 5% o 7% (v/v) (diluido de la reserva pura) como la única fuente de carbono y los cultivos se cultivaron heterotróficamente en la oscuridad, agitando a ~ 350 rpm. Se tomaron muestras de los cultivos a las 24, 40, 48, 67 y 89 horas y se midió el crecimiento usando lecturas de A750 en un espectrofotómetro. Se observó crecimiento para cada una de las cepas probadas como se muestra en las Figuras 1-2.
B. Celulosa
[0333] El Laboratorio Nacional de Energía Renovable (Golden, CO) preparó un rastrojo húmedo, explotado, Miscanthus, sorgo forrajero, pulpa de remolacha y bagazo de caña de azúcar, cocinando en una solución de ácido sulfúrico al 1,4% y deshidratando la suspensión resultante. El porcentaje de sólidos se determinó gravimétricamente por secado y fueron los siguientes: mazorca de maíz, 25% de sólidos; Miscanthus, 28,7% de sólidos; sorgo forrajero, 26,7% de sólidos; y bagazo de caña de azúcar, 26% de sólidos.
[0334] Se resuspendieron muestras húmedas de 100 gramos de materiales celulósicos explotados (rastrojos de maíz o hierba de cambio) en agua desionizada a un volumen final de 420 pl y el pH se ajustó a 4,8 usando NaOH 10N. Para la pulpa de remolacha, se llevaron 9,8 gramos de sólidos secos a 350 pl con agua desionizada y el pH se ajustó a 4,8 con NaOH 10 N. Para todas las materias primas anteriores, se usó Acelerasa 1000 (Genencor, Nueva York) en una proporción de 0,25 pl de enzima por gramo de biomasa seca para la sacarificación de los materiales celulósicos. Las muestras se incubaron con agitación (110 rpm) a 50°C durante 72 horas. El pH de cada una de las muestras se ajustó a 7,0 con NaOH (con un cambio de volumen insignificante), se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,22 pMy se usó en los procesos detallados a continuación. Para procesos a mayor escala, se siguió el mismo procedimiento para la sacrificación, excepto que se realizó un paso adicional de filtración de flujo tangencial (TFF) o un paso de microfiltración para ayudar en la esterilización por filtración de las materias primas. Se reservó una muestra de cada una de las materias primas preparadas para la determinación de la concentración de glucosa y xilosa usando un sistema basado en HPLC/ELSD o un kit basado en hexoquinasa (Sigma). Además, para la pulpa de remolacha, el material se llevó inicialmente al volumen al igual que con las otras materias primas, el pH se ajustó a 4,0 y se realizó un tratamiento con pectinasa a 50°C durante 24 horas. El pH se ajustó luego a 4,8 si no se realizaron pasos de lavado o 5,3 si se realizaron pasos de lavado. La sacarificación enzimática se realizó luego con el mismo procedimiento utilizado para las otras materias primas como se describió anteriormente.
[0335] La cepa de microalgas Prototheca moriformis UTEX 1435 se evaluó por su capacidad para crecer en una serie de materias primas celulósicas preparadas como se describe anteriormente (rastrojo de maíz, pulpa de remolacha, caña de sorgo, Miscanthus y control de glucosa). El cultivo de microalgas se cultivó en las condiciones descritas en el Ejemplo 1 anterior con la excepción de la fuente de carbono. La fuente de carbono era glucosa al 4% (para condiciones de control) o glucosa al 4% según la glucosa disponible en los materiales celulósicos. El crecimiento se evaluó mediante lecturas de A750 y el tiempo de cultivo fue de 168 horas, con lecturas de A750 a las 48, 72, 96, 120, 144 y 168 horas después del inicio del cultivo. Como se puede ver en la Figura 7a, el cultivo de Prototheca moriformis creció mejor en la cosecha de maíz. Las otras materias primas celulósicas utilizadas, Miscanthus, caña de sorgo y pulpa de remolacha, exhibieron inhibición del crecimiento.
[0336] En base a los resultados anteriores con azúcares celulósicos derivados de la mazorca de maíz, la acumulación de lípidos también se evaluó en Prototheca moriformis usando diferentes niveles de azúcares celulósicos derivados de la mazorca de maíz y glucosa reactiva como control. Los cultivos se cultivaron en 18 g/L de glucosa que era completamente de azúcares celulósicos derivados de la mazorca de maíz (condición de 100% de la mazorca de maíz en la Figura 7b), 9 g/L de glucosa de azúcares celulósicos derivados de la mazorca de maíz suplementado con 9 g/L de glucosa reactiva (50% de maiz suplementado con glucosa a una condición de 18 g/L en la Figura 7b), glucosa a 9 g/L de azúcares celulósicos derivados de la mazorca de maíz (50% de mazorca de maíz, sin suplementar; glucosa a una condición de 9 g/L en la Figura 7b) y un cultivo de control de 42 g/L reactivo glucosa y 13 g/L reactivo xilosa para el control de la osmolaridad. Todos los cultivos se alimentaron con azúcares celulósicos para mantener la concentración de glucosa a 20 g/L, excepto el cultivo de control, que se alimentó con glucosa reactiva para mantener la concentración de glucosa a 20 g/L. El crecimiento se midió en base al peso celular seco del cultivo y la productividad de los lípidos se determinó como un porcentaje de peso celular seco. Los lípidos totales se determinaron gravimétricamente usando un sistema de extracción por hidrólisis/disolvente de ácido Ankom como se describe en el Ejemplo 1 anterior.
[0337] Como se puede ver en la Figura 7b, en base a la acumulación de biomasa (medida por DCW), todas las concentraciones de celulósicas derivadas de la mazorca de maíz superaron (DCW más alto) al medio de control que se alimentó con glucosa sola. La producción de lípidos como porcentaje de DCW también se calculó para todas las condiciones. Además de la mayor acumulación de biomasa observada para el crecimiento en la mazorca de maíz, la acumulación de lípidos también fue mayor en las condiciones celulósicas derivadas de la mazorca de maíz en comparación con la condición de control de glucosa. Estos datos demuestran que, además de proporcionar azúcares derivados de la celulosa, la mazorca de maíz proporciona nutrientes/componentes adicionales que contribuyen a una mayor acumulación de biomasa (crecimiento) y un mayor rendimiento del producto.
[0338] Debido a que las materias primas celulósicas contienen componentes además de glucosa, algunos de estos componentes adicionales pueden acumularse a niveles indeseables durante el cultivo a medida que se alimentan más azúcares derivados celulósicos como fuente principal de carbono (generalmente, pero no limitado a, glucosa) se consume. Por ejemplo, la xilosa presente en la materia prima de azúcar derivada de la celulosa puede acumularse durante el cultivo de alta densidad de microalgas a niveles inhibidores del crecimiento y la producción del producto final. Para probar los efectos de la acumulación de xilosa durante el cultivo de Prototheca, los cultivos se cultivaron con glucosa al 4% en los medios y se suplementaron con 0, 10 g/L, 25 g/L, 50 g/L y 100 g/L de xilosa. Después de 6 días de cultivo, se evaluó el crecimiento y la acumulación de lípidos utilizando los métodos descritos anteriormente. Como se ve en la Figura 7c, sorprendentemente, las concentraciones más altas de xilosa probadas no inhibieron la capacidad de Prototheca moriformis para crecer y acumular lípidos, y el cultivo en realidad creció mejor y acumuló más lípidos a las concentraciones más altas de xilosa. Para explorar este fenómeno, se llevó a cabo un experimento similar con sacarosa, una fuente de carbono que Prototheca moriformis de tipo salvaje no puede metabolizar. No se observó ningún impacto positivo con la sacarosa, lo que sugiere que el aumento del crecimiento y la acumulación de lípidos observados con la xilosa es atribuible a un mecanismo diferente al estrés osmótico de las altas concentraciones de componentes no metabolizados en los medios y es específico de la xilosa.
[0339] Además de los azúcares no metabolizados, las sales pueden acumularse a niveles inhibitorios como resultado de la concentración de azúcares derivados de la lignocelulosa. Debido a la etapa de hidrólisis ácida con H2SO4durante la preparación típica de materiales celulósicos, seguido por neutralización del ácido con NaOH, Na2SO4se forma durante la generación de azúcares lignocelulósicos. Para evaluar el impacto de la concentración de sal en crecimiento y la producción de lípidos, cultivos Prototheca moriformis se desarrollaron a concentraciones Na2SO4que variaban de 0-700 mM en medios suplementados con 4% de glucosa. Como se muestra en la Figura 7d, se observó una inhibición significativa del crecimiento, medida por la acumulación de DCW, donde concentraciones Na2SO4 superó 25 mM, específicamente a la 80 mM, 240 mM y las concentraciones de 700 mM. Además, el impacto del antiespumante P2000 se evaluó en la misma prueba. El compuesto antiespumante tuvo un impacto positivo significativo en la productividad de la biomasa. La productividad de los lípidos también se evaluó para cada condición, y las concentraciones de Na2SO4 superiores a 80 mM, específicamente 240 mM y 700 mM, fueron inhibitorias, mientras que la adición de antiespumante P2000 aumentó significativamente la productividad de los lípidos. Por lo tanto, en una realización, los pasos de cultivo de los métodos de la presente descripción incluyen el cultivo en medios que contienen un agente antiespumante.
[0340] En base a los resultados discutidos anteriormente y resumidos en la Figura 7a, los inhibidores probablemente estaban presentes en las materias primas celulósicas que exhibían un crecimiento deficiente. La presente descripción proporciona medios para eliminar tales compuestos lavando los materiales con agua caliente (tratamiento hidrotérmico). La Figura 8 resume los resultados de crecimiento, medidos por A750, usando azúcar derivado de materia prima celulósica con un solo lavado con agua caliente. Las condiciones de cultivo fueron idénticas a las utilizadas en los procesos resumidos en la Figura 7a. En comparación con los resultados mostrados en la Figura 7a, después de un solo lavado con agua caliente, los cultivos de Prototheca moriformis crecieron mejor en todas las materias primas celulósicas probadas, específicamente en la bagazo de caña de azúcar, caña de sorgo, Miscanthus y pulpa de remolacha, en comparación con el control de glucosa. La productividad de los lípidos también se evaluó en cada una de las condiciones. Excepto por la condición de pulpa de remolacha, que era comparable al control de glucosa, los cultivos cultivados en azúcares derivados de materiales celulósicos sometidos a un lavado con agua caliente exhibieron una mejor productividad de lípidos que el control de glucosa.
[0341] Un impacto potencial del tratamiento hidrotérmico (lavado con agua caliente) de biomasa celulósica es la eliminación de furfurales e hidroximetil furfurales liberados por la explosión ácida del material. La presencia de furfurales e hidroximetilfurfurales puede haber contribuido al crecimiento limitado observado en algunos de los procesos resumidos en la Figura 7a. Para evaluar cómo el tratamiento hidrotérmico afectó los niveles de furfurales (FA) e hidroximetil furfurales (HMF), sobrenadantes resultantes de uno a tres lavados de biomasa celulósica derivada del bagazo de caña de azúcar (B), caña de sorgo (S), miscanto (M) o remolacha pulpa (BP) se analizaron para FA y HMF por HPLC. Como se muestra en la Figura 8, los niveles de FA y HMF disminuyen significativamente con cada paso de lavado. Este resultado es consistente con la observación de que FA y HMF pueden inhibir el crecimiento de microalgas (como se ve en la Figura 7a) y que el tratamiento hidrotérmico elimina estos compuestos y produce un mejor crecimiento de microalgas, incluso mejor que el crecimiento en las condiciones de control de glucosa (como visto en la Figura 8).
[0342] Se evaluó el impacto sobre el perfil lipídico de los cultivos de Prototheca moriformis cultivados en los diversos azúcares derivados de la lignocelulosa tratados hidrotermalmente. Los cultivos de Prototheca moriformis se cultivaron en las siguientes materias primas celulósicas lavadas 4 veces: Miscanthus, bagazo de caña de azúcar y caña de sorgo, con niveles de glucosa mantenidos a 20 g/L mediante la alimentación de azúcares celulósicos. Al concluir el cultivo, se analizó el perfil lipídico de la biomasa de microalgas de cada condición utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 1. Los resultados del análisis del perfil lipídico (expresado en % de área) se resumen en la Tabla 10 a continuación. Cada condición se ensayó por duplicado, y se incluyen los resultados de cada una de las condiciones de prueba duplicadas. El crecimiento en las materias primas celulósicas resultó en una redistribución significativa en el perfil lipídico en comparación con el control de glucosa. Por ejemplo, hubo un aumento significativo en el% de área C18:0 en todas las condiciones de la materia prima celulósica en comparación con la condición de control de glucosa.
Tabla 10. Perfil lipídico de Prototheca moriformis cultivado en azúcares derivados de glucosa y celulósicos.
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[0343] Se generó una corriente de azúcar celulósica a partir de la mazorca de maíz explotada, se sacarificó usando la enzima Acelerasa y se concentró usando la evacuación al vacío. Esta corriente de azúcar se ensayó en ensayos de crecimiento de Prototheca moriformis a una concentración de glucosa del 4%. Los resultados de los ensayos de crecimiento mostraron un crecimiento muy pobre y la corriente de azúcar celulósica se sometió a prueba de conductividad (contenido de sal). La conductividad fue muy alta, mucho mayor que 700 mM de equivalentes de sodio, un nivel que se demostró que inhibía el crecimiento como se describió anteriormente y se muestra en la Figura 7d. Los métodos de la divulgación incluyen métodos en los que la sal se reduce o se elimina de los azúcares derivados de la lignocelulosa antes de utilizar estas materias primas en la producción de aceite de microalgas derivado de la lignocelulosa. Sorprendentemente, sin embargo, uno no puede usar resinas para desalar corrientes de azúcar concentradas, primero debe diluir la corriente de azúcar concentrada. Para demostrar esta realización de la divulgación, los azúcares celulósicos derivados del material de la mazorca de maíz se diluyeron ocho veces antes de eliminar las sales contaminantes con la resina. La conductividad inicial del material de partida concentrado fue de 87 mS/cm, mientras que la de la corriente diluida ocho veces fue de 10990 pS/cm a un pH de 5,61. Estudios previos habían indicado que el hecho de no diluir el flujo de azúcar concentrado antes de la desionización resultó en una incapacidad para eliminar las sales cuantitativamente, así como una pérdida significativa de glucosa de la corriente de azúcar. Se usaron tres volúmenes diferentes de lecho de resina IEX (DOWEX Marathon MR3) (1:2, 1:4 y 1:10). La Tabla 11 resume los resultados que demuestran la capacidad de una resina de intercambio iónico de lecho mixto (IEX) para reducir las sales (según lo medido por la conductividad) significativamente en una corriente de azúcar celulósica derivada de la mazorca de maíz previamente concentrada en materias primas diluidas.
Tabla 11. Capacidad de la resina IEX para reducir sales.
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[0344] Un proceso que emplea un volumen de lecho de 1:4: materia prima celulósica y la re-concentración del material ocho veces daría como resultado una concentración de sodio que está dentro del rango para la acumulación normal de biomasa y lípidos. Alternativamente, la desionización o eliminación de sal se puede realizar antes de la sacarificación o después de la sacarificación, pero antes de la concentración de la corriente de azúcar. Si la eliminación de sal se realiza antes de la concentración de la corriente de azúcar, es probable que no sea necesario un paso de dilución de la corriente de azúcar antes de la eliminación de la sal.
[0345] Este ejemplo demuestra la eficacia del lavado de material celulósico explotado para el uso en la producción de aceite celulósico. Como se describió anteriormente, la concentración de azúcares derivados de la celulosa sin la eliminación de sales (inherentes a la producción de material celulósico explotado y tratamiento posterior) da como resultado fermentaciones menos que óptimas. Los materiales tratados en el proceso descrito a continuación tenían el pH apropiado para la posterior sacarificación. Además, la conductividad de este material se redujo significativamente (más de 100 veces) de la materia prima de partida. Por lo tanto, los azúcares concentrados subsecuentes que se usarán en las fermentaciones no fueron inhibidores debido a la presencia de sales excesivas. Se ve una ventaja adicional mediante la eliminación de furfurales del material celulósico. Cualquier xilosa o glucosa eliminada en la fracción hemicelulósica puede desecharse o preferiblemente volver a concentrarse para usarse en fermentaciones.
[0346] Bagazo de caña de azúcar explotado húmedo (NREL, Colorado) con una masa inicial de 65 kg de peso húmedo y una conductividad de 15.000 pS/cm, el pH 2,4 se llevó a 128 kg con agua desionizada y el pH se ajustó a 4,6 con NaOH 10 N, haciendo que la conductividad resultante sea de 6,800 pS/cm). El porcentaje de sólidos se evaluó mediante la eliminación de una parte alícuota de los materiales suspendidos en una bandeja de aluminio tarada (peso = t), registrando el peso húmedo (peso = w) seguido de secado durante tres horas a 110°C. Después de secar las muestras, se retiraron a un desecador y se dejó que alcanzaran la temperatura ambiente (25°C), en cuyo punto, se pesaron nuevamente (peso = d). El porcentaje de sólidos se calculó como:% de sólidos = [(dt/wt)] x 100. Las conductividades se midieron en un medidor de conductividad de estrella Thermo Electron Orion 3.
[0347] El bagazo de caña de azúcar se lavó de forma semicontinua mezclando continuamente la suspensión celulósica (porcentaje inicial de sólidos del 8,2%) a una temperatura de 50°C en un reactor de acero inoxidable (capacidad de 150 l). Los celulósicos eran descargados desde el recipiente del reactor a través de una bomba de carga giratoria a un caudal de 1,9-3,8 kg/min a una centrífuga decantadora Sharples Modelo 660. El permeado líquido se retuvo por lotes (alícuotas de aproximadamente 35-175 kg, consulte la Tabla 12 a continuación) y las alícuotas homogéneas se eliminaron para evaluar los azúcares totales (glucosa y xilosa) y el porcentaje de sólidos como se describe en la Tabla 12. Conductividad y pH del El material celulósico se controló mediante la adición de agua desionizada y NaOH 10 N, respectivamente. Las muestras 1-10 en la Tabla 12 representan permeado de centrífuga decantado, y como tal, los sólidos y azúcares presentes en estas fracciones se eliminan de los materiales celulósicos finales lavados. Un cálculo del balance de masa de los sólidos totales en comparación con los sólidos eliminados menos los sólidos perdidos más los sólidos finales para la sacarificación, dio como resultado una recuperación del 99% en el proceso anterior. La Figura 8 resume la concentración de furfural e hidroximetil furfural (mg/L) en cada uno de los 11 permeados de centrífuga recolectados y descritos en la Tabla 12. Estos datos demuestran una eliminación clara de furfural e hidroximetil furfural del bagazo de caña de azúcar.
Tabla 12. Balance de masa para el tratamiento hidrotérmico semicontinuo del bagazo de caña de azúcar.
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[0348] En otra demostración de la capacidad de Prototheca para utilizar materia prima derivada de celulosa, Prototheca moriformis (UTEX 1435) se cultivó en biorreactores de tres litros usando azúcar derivado de celulosa como materia prima de carbono fija. El inóculo se preparó a partir de células crioconservadas, que se descongelaron a temperatura ambiente y se añadieron 1 pl de células a 300 pl de medio de inóculo basado en el medio de microalgas basal descrito en el Ejemplo 1 con 1 g/L (NH^SO4, 4 g/L de extracto de levadura y una solución de oligoelementos, más 4% de glucosa y se cultiva durante 1 día a 28°C con agitación (200 rpm). Este cultivo se utilizó para inocular un biorreactor de tres litros que contenía 1 l de medio más 0,26 pl de Antifoam 204 (Sigma, EE.UU.). El fermentador se controló a 28°C y el pH se mantuvo a 6,8 mediante la adición de KOH. El oxígeno disuelto se mantuvo a una saturación del 30% mediante agitación en cascada y flujo de aire. La materia prima de azúcar celulósica de la mazorca de maíz se alimentó al cultivo para mantener 0-10 g/L de glucosa. La desalinización de las materias primas de azúcar celulósicas a menos de 300 mM de sal fue esencial para asegurar un peso similar de las células secas y un rendimiento de acumulación de lípidos en comparación con los controles de las materias primas de azúcar purificadas. La desalinización de la materia prima de azúcar celulósica se realizó utilizando los métodos descritos anteriormente. Se extrajeron muestras de fermentador para controlar el rendimiento de la fermentación. La acumulación de masa celular se controló por densidad óptica y peso celular seco. Las concentraciones de glucosa, xilosa, amoníaco, potasio, sodio y furfural también se determinaron y monitorearon durante el transcurso del tiempo de fermentación. La concentración de lípidos se determinó por métodos gravimétricos discutidos anteriormente.
EJEMPLO 3: Métodos para transform ar Prototheca
A. Método general para la transformación biolística de Prototheca
[0349] Portadores de oro S550d de Seashell Tecnología se prepararon de acuerdo con el protocolo del fabricante. El plásmido linealizado (20 pg) se mezcló con 50 pl de tampón de unión y 60 pl (30 mg) de vehículos de oro S550d y se incubaron en hielo durante 1 minuto. Se añadió tampón de precipitación (100 pl) y la mezcla se incubó en hielo durante otro minuto. Después de agitar en vórtex, las partículas recubiertas con ADN se sedimentaron girando a 10.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf 5415C durante 10 segundos. El sedimento de oro se lavó una vez con 500 pl de etanol frío al 100%, se granuló por centrifugación breve en la microcentrífuga y se resuspendió con 50 pl de etanol helado. Después de una breve sonicación (1-2 segundos), 10 pl de partículas recubiertas de ADN se transfirieron inmediatamente a la membrana del vehículo.
[0350] Las cepas de Prototheca se cultivaron en medio de proteosa (extracto de levadura 2g/L, NaNO3 2,94mM, CaCl2 0,17mM • 2H2O, MgSO4 0,3mM • 7H2O, K2HPO4 0,4mM, KH2PO4 1,28mM, NaCl 0,43mM) en un agitador giratorio hasta alcanzar una densidad celular de 2x106 células/ml. Las células se cosecharon, se lavaron una vez con agua destilada estéril y se resuspendieron en 50 pl de medio. 1 x 107 células se extendieron en el tercio central de una placa de medios de proteosa no selectiva. Las células fueron bombardeadas con el sistema de suministro de partículas biolísticas PDS-1000/He (Bio-Rad). Se usaron discos de ruptura (1100 y 1350 psi), y las placas se colocaron 9 y 12 cm debajo del ensamblaje de la pantalla/macroportador. Se permitió que las células se recuperaran a 25°C durante 12-24 h. Tras la recuperación, las células se rasparon de las placas con una espátula de goma, se mezclaron con 100 |jl de medio y se extendieron sobre placas que contenían la selección de antibióticos apropiada. Después de 7-10 días de incubación a 25°C, las colonias que representan las células transformadas eran visibles en las placas desde discos de ruptura de 1100 y 1350 psi y desde distancias de 9 y 12 cm. Las colonias se recogieron y se detectaron en placas de agar selectivo para una segunda ronda de selección.
B. Transformación de Prototheca con el gen de resistencia G418
[0351] Prototheca moriformis y otras cepas de Prototheca sensibles a G418 pueden transformarse usando los métodos descritos a continuación. G418 es un antibiótico aminoglucósido que inhibe la función de los ribosomas 80S y, por lo tanto, inhibe la síntesis de proteínas. El gen de resistencia correspondiente funciona mediante fosforilación, lo que resulta en la inactivación de G418. Las cepas de Prototheca UTEX 1435, UTEX 1439 y UTEX 1437 fueron seleccionadas para la transformación. Las tres cepas de Prototheca se genotiparon utilizando los métodos descritos anteriormente. Las tres cepas de Prototheca tenían secuencias genómicas de ARNr 23s idénticas (SEQ ID NO: 15).
[0352] Todos los casetes de transformación se clonaron como fragmentos EcoRI-SacI en pUC19. Se usaron técnicas estándar de biología molecular en la construcción de todos los vectores de acuerdo con Sambrook y Russell, 2001. El promotor de beta-tubulina C. reinhardtii/5'UTR se obtuvo del plásmido pHyg3 (Berthold et al., (2002) Protist: 153 (4), pp 401-412) por PCR como un fragmento EcoRI-Ascl. La reductasa nitrato 3'UTR de Chlorella vulgaris se obtuvo del ADN genómico aislado de la cepa UTEX 1803 mediante PCR utilizando los siguientes pares de cebadores:
Delantero:
5'TGACCTAGGTGATTAATTAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCG 3' (SEQ ID NO: 35)
Trasero:
5' CTACGAGCTCAAGCTTTCCATTTGTGTTC CCATCCCACTACTTCC 3' (SEQ ID NO: 36)
[0353] El promotor glutamato deshidrogenasa Chlorella sorokiniana/UTR se obtuvo a través de PCR de ADN genómico aislado de UTEX cepa 1230 a través de PCR usando los siguientes pares de cebadores:
Delantero: 5' GATCAGAATTCCGCCTGCAACGCAAGG GCAGC 3' (SEQ ID NO: 37)
Trasero: 5' GCATACTAGTGGCGGGACGGAGAGA GGGCG 3' (SEQ ID NO: 38)
[0354] La optimización de codones se basó en los codones de la Tabla 1 para Prototheca moriformis. La secuencia del casete de neomicina fosfotransferasa (nptII) sin codón optimizado se sintetizó como un fragmento AscI-XhoI y se basó en la secuencia de Genbank Accession N° YP_788126. El casete nptII optimizado con codón también se basó en este número de acceso de Genbank.
[0355] Las tres cepas de Prototheca se transformaron usando métodos biolísticos descritos anteriormente. Brevemente, las cepas Prototheca se cultivaron heterofílicamente en medio líquido que contiene 2% de glucosa hasta que llegaron a la densidad celular deseada (1x107 células/ml a 5x107 células/ml). Las células se cosecharon, se lavaron una vez con agua destilada estéril y se resuspendieron a 1x108 células/ml. Luego se extendieron 0,5 j l de células en una placa de medio sólido no selectiva y se dejaron secar en una campana estéril. Las células fueron bombardeadas con el PDS-1000/He Biolistic Particle Delivery System (BioRad). Se permitió que las células se recuperaran a 25°C durante 24 horas. Tras la recuperación, las células se eliminaron lavando las placas con 1 j l de medio estéril y transfiriéndolas a placas nuevas que contenían 100 jg/m l de G418. Se dejaron secar las células en una campana estéril y se dejó que se formaran colonias en la placa a temperatura ambiente durante hasta tres semanas. Las colonias de UTEX 1435, UTEX 1439 y UTEX 1437 se recogieron y se detectaron en placas de agar selectivo para una segunda ronda de selección.
[0356] Un subconjunto de colonias que sobrevivieron a una segunda ronda de selección descrita anteriormente, se cultivaron en pequeño volumen y se extrajeron ADN y ARN genómico usando métodos estándar de biología molecular. Las transferencias Southern se realizaron sobre ADN genómico extraído de transformados (WT), los transformantes y el ADN plasmídico. El ADN de cada muestra se procesó en geles de agarosa al 0,8% después de los siguientes tratamientos: no digerido (U), digerido con AvrII (A), digerido con NcoI (N), digerido con SacI (S). El ADN de estos geles se transfirió a membranas de nylon (Amersham). Estas membranas se sondearon con un fragmento correspondiente a la región de codificación completa del gen nptII (sonda NeoR). La Figura 4 muestra mapas de los casetes utilizados en las transformaciones. La Figura 5 muestra los resultados del análisis de transferencia Southern en tres transformantes (todos generados en la cepa 1435 de UTEX) (1, 2 y 3) transformados con la beta-tubulina:: neo:: nit (SEQ ID NO: 39) (transformantes 1 y 2) o glutamato deshidrogenasa: neo: nit (SEQ ID NO: 40) (transformante 3). El plásmido transformante glutamato deshidrogenasa: neo: nit se ejecutó como control y se cortó con NcoI y SacI. AvrII no corta en este plásmido. El ADN genómico aislado de la cepa UTEX no transformada 1435 no muestra hibridación con la sonda NeoR.
[0357] Los transformantes adicionales que contienen la glutamato deshidrogenasa optimizada por codón: neo: nit (SEQ ID NO: 41) y la construcción de p-tubulina:: neo:: nit (SEQ ID NO: 42) optimizada por codón se seleccionaron y analizaron mediante Southern análisis de transferencia. Como se esperaba, solo los resúmenes con SacI muestran Idealización del ADN transformante. Estos eventos de transformación son consistentes con los eventos de integración que ocurren en forma de oligómeros del plásmido transformante. Solo después de la digestión con enzimas de restricción que cortan dentro del ADN plasmídico transformante, estas moléculas colapsan por el tamaño del plásmido transformante.
[0358] El análisis de transferencia de Southern se realizó también en los transformantes generados después de la transformación de Prototheca cepas UTEX 1437 y UTEX 1439 con la glutamato deshidrogenasa:: neo:: casete nit. La transferencia se sondeó con la sonda de sonda NeoR y los resultados son similares a los transformantes UTEX 1435. Los resultados son indicativos de eventos de integración caracterizados por oligomerización e integración del plásmido transformante. Se sabe que este tipo de evento de integración ocurre con bastante frecuencia en Dictyostelium discoideum (véase, por ejemplo, Kuspa, A. y Loomis, W. (1992) PNAS, 89: 8803-8807 y Morio et al., (1995) J. Plant Res,108: 111-114).
[0359] Para confirmar aún más la expresión del plásmido transformante, se realizaron análisis de transferencia Northern y análisis de RT-PCR en transformantes seleccionados. La extracción de ARN se realizó utilizando el reactivo Trizol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de transferencia Northern se realizó de acuerdo con los métodos publicados en Sambrook y Russel, 2001. El ARN total (15 |jg) aislado de cinco transformantes UTEX 1435 y UTEX 1435 no transformado (carriles de control) se separó en gel de agarosa-formaldehído al 1% y se secó sobre nylon. membrana. La transferencia se hibridó con la sonda neo-no optimizada específica para secuencias transgénicas en los transformantes 1 y 3. Los otros dos ARN transformantes expresan la versión optimizada por codones del neo-transgen y, como se esperaba, en base a la homología de secuencia entre los Los genes neo optimizados y no optimizados mostraron una señal de hibridación significativamente menor.
[0360] Se extrajo ARN (1 jg ) de la cepa Prototheca no transformada UTEX 1435 y dos transformantes UTEX 1435 representativos y se transcribió inversamente usando un cebador oligio dT o un cebador específico de gen. Posteriormente, estos ADNc (por duplicado) se sometieron a análisis qPCR en ABI Veriti Thermocycler utilizando la química SYBR-Green qPCR utilizando los siguientes cebadores (nptlI):
Delantero: 5' GCCGCGACTGGCTGCTGCTGG 3' (SEQ ID NO: 43)
Trasero: 5' AGGTCCTCGCCGTCGGGCATG 3' (SEQ ID NO: 44)
[0361] La posible contaminación de ADN genómico se descartó mediante una muestra de control negativo sin transcriptasa inversa. Los resultados indicaron que los genes NeoR utilizados para transformar estas cepas se transcriben activamente en los transformantes.
C. Transformación de Prototheca con invertasa de sacarosa heteróloga secretada
[0362] Todos los siguientes experimentos se realizaron usando medio líquido/placas de agar basadas en el medio basal descrito en Ueno et al., (2002) J Bioscience and Bioengineering 94 (2): 160-65, con la adición de minerales traza descrito en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,900,370, y 1x DAS Vitamin Cocktail (solución 1000x): tricina: 9 g, tiamina HCL: 0,67 g, biotina: 0,01 g, cianocabalamina (vitamina B12): 0,008 g, pantotenato de calcio: 0,02 g y ácido p-aminobenzoico: 0,04 g).
[0363] Se ensamblaron dos construcciones de plásmidos usando técnicas estándar de ADN recombinante. Los genes de la sacarosa invertasa de sacarosa (un codón optimizado y uno no codificado optimizado), suc2, estaban bajo el control del promotor de beta-tubulina Chlorella reinhardtii/5'UTR y tenían la nitrato reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris. Las secuencias (incluidas las secuencias 5'UTR y 3'UTR) para el constructo no codificado optimizado (Cr ptub:: NCO-suc2:: CvNitRed), SEQ ID NO: 57 y codón optimizado (Cr p-tub:: CO-suc2:: CvNitRed), SEQ ID NO: 58, se enumeran en el Listado de Secuencias. La optimización del codón se basó en la Tabla 1 para Prototheca sp. La Figura 6 muestra un esquema de las dos construcciones con los sitios de restricción de clonación y flechas que indican la dirección de la transcripción. La selección fue proporcionada por Neo R (codón optimizado usando la Tabla 1).
[0364] Preparación del microportador de ADN/oro: los microportadores de ADN/oro se prepararon inmediatamente antes de su uso y se almacenaron en hielo hasta su aplicación en macroportadores. El A d N plasmídico (en tampón TE) se añadió a 50 j l de tampón de unión. La saturación de las perlas de oro se logró a 15 jg de ADN plasmídico para 3 jg de portador de oro. El tampón de unión y el ADN se mezclaron bien mediante vórtice. El ADN y el tampón de unión deben mezclarse previamente antes de la adición de oro para asegurar la unión uniforme del plásmido a las partículas transportadoras de oro. Se añadieron 60 j l de portador de oro S550d (Seashell Technologies, San Diego, CA) a la mezcla de ADN/tampón de unión. Para un stock de oro a 50 mg/ml, la adición de 60 j l produce una proporción óptima de 15 jg de ADN/3 jg de portador de oro. La mezcla de portador de oro/ADN se dejó incubar en hielo durante 1 minuto y luego se añadieron 100 j l de tampón de precipitación. La mezcla se dejó incubar nuevamente en hielo durante 1 minuto y luego se agitó brevemente en vórtex y se centrifugó a 10.000 rpm a temperatura ambiente durante 10 segundos para sedimentar el portador de oro. El sobrenadante se eliminó cuidadosamente con una pipeta y el sedimento se lavó con 500 j l de hielo al 100% de etanol. Las partículas de oro se volvieron a sedimentar mediante centrifugación nuevamente a 10.000 rpm durante 10 segundos. Se eliminó el etanol y se añadieron 50 j l de etanol helado a la mezcla de oro. Inmediatamente antes de aplicar el oro a los macroportadores, el oro/etanol se resuspendió con un breve pulso de 1-2 segundos en el nivel 2 en un sonicador MISONIX utilizando la micro punta. Inmediatamente después de la resuspensión, 10 j l de las partículas de oro dispersas se transfirieron al macroportador y se dejaron secar en una campana estéril.
[0365] Las dos cepas de Prototheca moriformis (UTEX 1435 y 1441) se cultivaron heterotróficamente en medio líquido que contenía glucosa al 2% de viales crioconservados. Cada cepa se cultivó a una densidad de 107 células/ml. Este cultivo de semillas se diluyó luego con medios frescos hasta una densidad de 105 células/ml y se dejó crecer durante 12-15 horas para lograr una densidad celular final de aproximadamente 106 células/ml. Las microalgas se dividieron en alícuotas en tubos cónicos de 50 j l y se centrifugaron durante 10 minutos a 3500 rpm. Las células se lavaron con medio nuevo y se centrifugaron nuevamente durante 10 minutos a 3500 rpm. Las células se resuspendieron luego a una densidad de 1,25 x 108 células/ml en medio nuevo.
[0366] En una campana estéril, se retiraron 0,4 j l de las células preparadas anteriormente y se colocaron directamente en el centro de una placa de agar (sin agente de selección). La placa se agitó suavemente con un movimiento circular nivelado para distribuir uniformemente las células a un diámetro de no más de 3 cm. Las células se dejaron secar sobre las placas en la campana estéril durante aproximadamente 30-40 minutos y luego se bombardearon a una presión de disco de ruptura de 1350 psi y una distancia de placa a macroportadora de 6 cm. Las placas se cubrieron y se envolvieron con parafilm y se dejaron incubar con poca luz durante 24 horas.
[0367] Después de la recuperación de 24 horas, se añadió 1 j l de medio estéril (sin glucosa) para el césped de células. Las células se resuspendieron usando un asa estéril, se aplicaron en un movimiento circular al césped de las células y las células resuspendidas se recogieron usando una pipeta estéril. Las células se colocaron en una placa de agar nueva con glucosa al 2% y 100 jg/m l de G418. La aparición de colonias ocurrió 7-12 días después del enchapado. Se recogieron colonias individuales y se cultivaron en medio selectivo con 2% de glucosa y 100 jg/m l de G418. Luego se analizaron las células de tipo salvaje (no transformadas) y transgénicas para la introducción, integración y expresión exitosas del transgen.
[0368] El ADN genómico de transformada Prototheca moriformis UTEX 1435 y 1441 y su tipo salvaje (no transformadas) homólogos fueron aislados utilizando métodos estándar. Brevemente, las células se centrifugaron durante 5 minutos a 14.000 rpm en una centrífuga Eppendorf de sobremesa estándar (modelo 5418) y se congelaron rápidamente antes de la extracción de ADN. Los sedimentos celulares se lisaron agregando 200 j l de tampón de lisis (Tris HC1 100 mM, pH 8,0, lauril sarcosina al 1%, NaCl 50 mM, EDTA 20 mM, sacarosa 0,25 M, 0,5 mg/ml de RNasa A) por cada 100-200 mg. de células (peso húmedo) y agitación vorticial durante 30-60 segundos. El bromuro de cetil trimetilamonio (CTAB) y el NaCl se llevaron al 1% y 1 M, respectivamente, y los extractos celulares se incubaron a 60-65°C durante 10 minutos. Posteriormente, los extractos se clarificaron por centrifugación a 14.000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante resultante se extrajo con un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25: 24:1). Luego se centrifugaron las muestras durante 5 minutos a 14.000 rpm y se eliminó la fase acuosa. El ADN se precipitó con 0,7 volúmenes de isopropanol. Se sedimentó el ADN mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 10 minutos y se lavó dos veces con etanol al 80% y una vez con etanol. Después del secado, el ADN se resuspendió en Tris HCl 10 mM, se determinaron las concentraciones de ADN y pH 8,0 utilizando el ensayo de cuantificación de fluorescencia PicoGreen (sondas moleculares).
[0369] El ARN de Prototheca moriformis transformada UTEX 1435 y 1441 y sus contrapartes de tipo salvaje (sin transformar) se aislaron usando métodos estándar. Brevemente, las células se centrifugaron durante 5 minutos a 14.000 rpm en una centrífuga Eppendorf de sobremesa estándar (modelo 5418) y se congelaron rápidamente antes de la extracción de ARN. Los sedimentos celulares se lisaron mediante la adición de 1 j l de reactivo Trizol (Sigma) por cada 100 mg de células (peso húmedo) y mediante agitación vorticial durante 1-2 minutos. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos y posteriormente se ajustaron con 200 pl de cloroformo por 1 j l de reactivo Trizol. Después de una agitación extensa, las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego se sometieron a centrifugación a 14000 rpm durante 15 minutos en una microcentrífuga de mesa refrigerada. La separación de ARN a la fase acuosa superior se eliminó y precipitó mediante la adición de isopropanol (500 j l por 1 j l de reactivo Trizol). El ARN se recogió por centrifugación durante 10 minutos y el sedimento resultante se lavó dos veces con 1 j l de etanol al 80%, se secó y se resuspendió en agua libre de ARNasa. La concentración de ARN se estimó mediante el ensayo de cuantificación de fluorescencia RiboGreen (Molecular Probes).
[0370] La expresión del gen de neomicina fosfotransferasa que confiere resistencia a antibióticos G418 y la invertasa de levadura se ensayó en Prototheca moriformis UTEX 1435 y 1441 no transformada y los transformantes T98 (transformante UTEX 1435) y T97 (transformante UTEX 1441) usando análisis de PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR). Se sometieron 20 ng de ARN total (aislado como se describió anteriormente) a un análisis RT-qPCR de un paso usando Kit de iScript SYBR Green RT-PCR (BioRad Laboratories) y pares de cebadores dirigidos al gen de resistencia a la neomicina (cebador directo 5'CCGCCGTGCTGGACGTGGTG 3' y cebador inverso 5' GGTGGCGGGGTCCAGGGTGT 3' ; SEQ ID NOs: 65 y 66, respectivamente) y transcripciones de invertasa suc2 (cebador directo 5' CGGCCGGCGGCTCCTTCAAC 3' y cebador inverso 5' GGCGCTCCCGTAGGTCGGGT 3'; SEQ ID NO: 67 y 68, respectivamente). Las transcripciones endógenas de beta-tubulina sirvieron como control positivo interno para la amplificación por PCR y como referencia de normalización para estimar los niveles relativos de transcripción.
[0371] Tanto las construcciones optimizadas con codón como las no optimizadas con codón se transformaron en células UTEX 1435 y 1441 Prootheca moriformis como se describió anteriormente. Inicialmente, los transformantes se obtuvieron con ambas construcciones y la presencia del transgen se verificó mediante análisis de transferencia Southern seguido de RTPCR para confirmar la presencia del ADN y ARNm del transgen. Para el análisis de transferencia Southern, el ADN genómico aislado como se describió anteriormente se sometió a electroforesis en geles de agarosa al 0,7% en 1x tampón TAE. Los geles se procesaron como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Las sondas se prepararon mediante cebado aleatorio y las hibridaciones se llevaron a cabo como se describe en Sambrook et al. Los transformantes de las construcciones optimizadas con codón y sin codón mostraron la presencia del casete de invertasa, mientras que el control no transformado fue negativo. El ARNm de invertasa también se detectó en transformantes con construcciones optimizadas tanto con codón como sin codón.
[0372] Para confirmar que los transformantes expresaban una proteína invertasa activa, los transformantes se colocaron en placas de sacarosa. Los transformantes que contenían el casete optimizado sin codón no pudieron crecer en las placas que contenían sacarosa, lo que indica que, mientras el gen y el ARNm que codifica la proteína SUC2 estaban presentes, la proteína (1) no estaba siendo traducida o (2) se traducen, pero no se acumulan a niveles suficientes para permitir el crecimiento de la sacarosa como única fuente de carbono. Los transformantes con el casete optimizado con codón crecieron en las placas que contienen sacarosa. Para evaluar los niveles de invertasa expresados por estos transformantes, dos clones (T98 y T97) se sometieron a un ensayo de invertasa de células enteras raspadas de medio sólido y muestreo directo y cuantificación de azúcares en los sobrenadantes de cultivo después de 48 horas de crecimiento en líquido. medio que contiene 2% de sacarosa como única fuente de carbono.
[0373] Para el ensayo de invertasa, las células (T98 y T97) se cultivaron en placas que contenían sacarosa al 2%, se rascaron y se evaluó la actividad de la invertasa. Se mezclaron 10 pl de las células raspadas con 40 pl de NaOAc 50 mM pH 5,1. Se añadieron 12,5 pl de sacarosa 0,5 M a la mezcla celular y se incubaron a 37°C durante 10-30 minutos. Para detener la reacción, se añadieron 75 pl de 0,2MK2HPO4. Para analizar la glucosa liberada, se agregaron 500 pl de reactivo reconstituido (glucosa oxidasa/peroxidasa o-Dianisidina) de Sigma (kit de análisis GAGO-20) a cada tubo y se incubaron a 37°C durante 30 minutos. También se creó una curva estándar de glucosa en este momento (rango: 25 pg a 0,3 pg de glucosa). Después de la incubación, se añadieron 500 pl de 6N HCl para detener la reacción y desarrollar el color. Las muestras se leyeron a 540 nm. La cantidad de glucosa liberada se calculó a partir de la curva estándar de glucosa usando la fórmula y = mx c, donde y es la lectura de 540 nm, y x es pg de glucosa. El peso de la glucosa se convirtió en moles de glucosa, y dada la relación equimolar entre los moles de sacarosa hidrolizada en moles de glucosa generada, los datos se expresaron como nmoles de sacarosa hidrolizada por unidad de tiempo. El ensayo mostró que tanto los clones T98 como los T97 podían hidrolizar sacarosa, lo que indica que las células producían y secretaban una invertasa de sacarosa funcional.
[0374] Para el análisis de azúcar en medios de cultivo líquidos después de 48 horas de crecimiento de algas, las células T97 y T98 se cultivaron en medio que contenía sacarosa al 2% durante 48 horas y los medios de cultivo se procesaron para análisis de azúcar. Los caldos de cultivo de cada transformante (y control celular negativo no transformado) se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante resultante se eliminó y se sometió a HPLC/ELSD (detección de dispersión de luz por evaporación). La cantidad de azúcar en cada muestra se determinó utilizando estándares externos y análisis de regresión de revestimiento. Los niveles de sacarosa en los medios de cultivo de los transformantes fueron muy bajos (menos de 1,2 g/L, y en la mayoría de los casos 0 g/L). En los controles negativos, los niveles de sacarosa se mantuvieron altos, a aproximadamente 19 g/L después de 48 horas de crecimiento.
[0375] Estos resultados fueron consistentes con los resultados de la actividad de la invertasa, y en conjunto, indicaron que los transformantes optimizados con codón, T97 y T98, secretaban una invertasa activa de sacarosa que permitía a las microalgas utilizar sacarosa como la única fuente de carbono en contraste con (1) los transformantes optimizados sin codones y (2) las microalgas de tipo salvaje no transformadas, que no podían utilizar sacarosa como única fuente de carbono en el medio de cultivo.
[0376] Las cepas de Prototheca moriformis, T98 y T97, que expresan un transgén funcional, secretado de sacarosa invertasa (SUC2) se analizaron para determinar el crecimiento y la producción de lípidos usando sacarosa como única fuente de carbono.
[0377] Las cepas de tipo salvaje (sin transformar), T98 y T97 se cultivaron en medios de crecimiento (como se describió anteriormente) que contenían glucosa al 4% o sacarosa al 4% como la única fuente de carbono en condiciones heterotróficas durante aproximadamente 6 días. Crecimiento, según lo determinado por A750, se tomaron lecturas de densidad óptica de las cuatro muestras cada 24 horas y se determinó el peso celular seco de los cultivos y los perfiles de lípidos después de los 6 días de crecimiento. Las lecturas de densidad óptica de las cepas transgénicas cultivadas tanto en condiciones de glucosa como de sacarosa fueron comparables a las cepas de tipo salvaje cultivadas en condiciones de glucosa. Estos resultados indican que las cepas transgénicas pudieron crecer en glucosa o sacarosa como la única fuente de carbono a una velocidad igual a las cepas de tipo salvaje en condiciones de glucosa. Las cepas de tipo salvaje no transformadas no crecieron en la condición de solo sacarosa.
[0378] La biomasa para la cepa de tipo salvaje cultivada en glucosa y cepa T98 crecido en sacarosa se analizó para el perfil de lípidos. Las muestras de lípidos se prepararon a partir de biomasa seca (liofilizada) utilizando un sistema de hidrólisis ácida (Ankom Technology, NY) según las instrucciones del fabricante. Las determinaciones del perfil de lípidos se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 4. El perfil de lípidos para la cepa UTEX 1435 de Prototheca moriformis no transformada, cultivada en glucosa como única fuente de carbono y dos cepas T98 colonales (UTEX 1435 transformada con un transgen invertasa de sacarosa), cultivadas sobre sacarosa como única fuente de carbono, se describen en la Tabla 13 (tipo salvaje UTEX 1435 y T98 clon 8 y clon 11 a continuación. Se usó lípido C: 19:0 como control de calibración interno.
Tabla 13. Perfil de lípidos de clones UTEX 1435 y UTEX 1435 de tipo salvaje con transgén suc2.
Figure imgf000061_0001
[0379] El aceite extraído de Prototheca moriformis UTEX 1435 de tipo salvaje (mediante extracción con disolvente o usando una prensa de expulsión (ver métodos en el Ejemplo 44 anterior) se analizó para carotenoides, clorofila, tocoferoles, otros esteroles y tocotrienoles. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 14.
Tabla 14. Análisis de carotenoides, clorofila, tocoferol/esteroles y tocotrienoles en aceite extraído de Prototheca moriformis (UTEX 1435).
Figure imgf000062_0001
[0380] La capacidad de usar sacarosa como la única fuente de carbono como factor de selección para clones que contienen la construcción transgénica suc2 en lugar de G418 (u otro antibiótico) se evaluó usando los transformantes positivos del gen suc2. Se cultivó un subconjunto de los transformantes positivos en placas que contenían sacarosa como única fuente de carbono y sin selección de antibióticos para 24 duplicaciones. Los clones fueron desafiados con placas que contenían glucosa como única fuente de carbono y G418. Hubo un subconjunto de clones que no crecieron en la condición de glucosa G418, lo que indica una pérdida de expresión del transgén. Se realizó un experimento adicional usando una placa que contenía sacarosa como la única fuente de carbono y sin G418 y dejando un clon que expresa transgén suc2 en la mitad de la placa y Prototheca moriformis de tipo salvaje en la otra mitad de la placa. Se observó crecimiento con las células Prototheca moriformis de tipo salvaje y transgénicas. La Prototheca moriformis de tipo salvaje no ha demostrado la capacidad de crecer con sacarosa, por lo tanto, este resultado muestra que, a diferencia de la resistencia a los antibióticos, el uso de la selección de sacarosa/invertasa no es autónomo en las células. Es muy probable que los transformantes estuvieran secretando suficiente sacarosa invertasa en la placa/medio para soportar el crecimiento de tipo salvaje a medida que la sacarosa se hidrolizaba en fructosa y glucosa.
EJEMPLO 4: Prototeca recombinante con gen TE exógeno
[0381] Como se describió anteriormente, las cepas de Prototheca se pueden transformar con genes exógenos. Prototheca moriformis (UTEX 1435) se transformó, utilizando los métodos descritos anteriormente, con el gen de tioesterasa C12 de Umbellularia californica o el gen de tiotesterasa Cinnamomum camphora C14 (ambos codones optimizados de acuerdo con la Tabla 1). Cada una de las construcciones de transformación contenía un promotor de glutamato deshidrogenasa de Chlorella sorokiniana/región 5'UTR (SEQ ID NO: 69) para impulsar la expresión del transgen de tioesterasa. Las regiones de codificación de transgenes de tioesterasa de la tioesterasa C12 de Umbellularia californica (SEQ ID NO: 70) o la tioesterasa C14 Cinnamomum camphora (SEQ ID NO: 71), cada una con la secuencia de direccionamiento de plastidio putativo nativo. Inmediatamente después de la secuencia de codificación de tioesterasa está la secuencia de codificación para una etiqueta 3x-FLAG c-terminal (SEQ ID NO: 72), seguida de la nitrato reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris (SEQ ID NO: 73). En la Figura 9 se muestra un diagrama de las construcciones de tioesterasa que se usaron en las transformaciones de Prototheca moriformis.
[0382] La preparación de las células de ADN, microportador de oro y Prototheca moriformis (UTEX 1435) se realizaron usando los métodos descritos anteriormente en el Ejemplo 3. Las microalgas se bombardearon usando la mezcla de microportadores de oro y ADN y se sembraron en placas de selección que contenían 2% de glucosa y 100 |jg/ml de G418. Se permitió que las colonias se desarrollaran durante 7 a 12 días y las colonias se recogieron de cada placa de transformación y se seleccionaron para la incorporación de construcciones de ADN usando ensayos de transferencia Southern y la expresión de las construcciones de tioesterasa se seleccionaron usando RT-PCR.
[0383] Los clones positivos se recogieron de placas de transformación de tioesterasa tanto C12 como C14 y se seleccionaron para la incorporación de constructo usando ensayos de transferencia Southern. Los ensayos de transferencia Southern se llevaron a cabo usando métodos estándar (y descritos anteriormente en el Ejemplo 3) usando sondas c optimizadas, basadas en la secuencia en SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 71. El ADN plasmídico transformante se ejecutó como un control positivo. De los clones que fueron positivos para la incorporación de constructo, se seleccionó un subconjunto para el análisis de PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) para la expresión de tioesterasa C12 y tioesterasa C14.
[0384] El aislamiento de ARN se realizó usando los métodos descritos en el Ejemplo 3 anterior y se realizó RT-qPCR de los clones positivos usando 20 ng de ARN total de cada clon usando el par de cebadores descrito a continuación y el kit de RT-p Cr iBR SYBR Green (Bio-Rad Laboratories) según el protocolo del fabricante. El ARN total de Prototheca moriformis de tipo salvaje (no transformado) se incluyó como control negativo. La expresión de ARNm se expresó como expresión de pliegue relativo (RFE) en comparación con el control negativo. Los cebadores que se usaron en la detección de RT-qPCR de transformación de tioesterasa C12 fueron:
[0385] Cebadores PCR tioesterasa C12 U. californica:
Delantero: 5' CTGGGCGACGGCTTCGGCAC 3' (SEQ ID NO: 74)
Trasero: 5' AAGTCGCGGCGCATGCCGTT 3' (SEQ ID NO: 75)
[0386] Los cebadores que se usaron en la detección de RT-qPCR de transformación de tioesterasa C14 fueron: Cebadores PCR de tioesterasa C14 Cinnamomum camphora:
Delantero: 5' TACCCCGCCTGGGGCGACAC 3' (SEQ ID NO: 76)
Reverso: 5' CTTGCTCAGGCGGCGGGTGC 3' (SEQ ID NO: 77)
[0387] Los resultados de RT-qPCR para la expresión de tioesterasa C12 en los clones positivos mostraron un aumento de RFE de aproximadamente 40 veces a más de 2000 veces mayor expresión en comparación con el control negativo. Se observaron resultados similares con la expresión de tioesterasa C14 en los clones positivos con un aumento de RFE de aproximadamente 60 veces a más de 1200 veces mayor expresión en comparación con el control negativo.
[0388] Se seleccionó un subconjunto de los clones positivos de cada transformación (como se seleccionó mediante ensayos de transferencia Southern y RT-qPCR) y se cultivó en condiciones repletas de nitrógeno y se analizó la producción y el perfil de lípidos totales. Se prepararon muestras de lípidos a partir de biomasa seca de cada clon. 20­ 40 mg de biomasa seca de cada clon transgénico se resuspendió en 2 ml de 3% de H2SO4 en MeOH, y 200 ul de tolueno que contiene una cantidad apropiada de un patrón interno adecuado (C19:0) se añadió. La mezcla se sonicó brevemente para dispersar la biomasa, luego se calentó a 65-70°C durante dos horas. Se añadió 2 ml de heptano para extraer los ésteres metílicos de ácidos grasos, seguido de la adición de 2 ml de 6% K2CO3 (ac) para neutralizar el ácido. La mezcla se agita vigorosamente, y una porción de la capa superior se transfirió a un vial que contenía Na2SO4 (anhidro) para el análisis de cromatografía de gases usando métodos estándar FAME GC/FID (éster metílico de detección de cromatografía de gases de ionización de llama ácido graso). El perfil de lípidos (expresado como % de área) de los clones positivos en comparación con el control negativo de tipo salvaje se resume en las Tablas 15 y 16 a continuación. Como se muestra en la Tabla 15, el aumento de la producción de C12 en los transformantes de C12 varió de aproximadamente un aumento de 5 veces (clon C12-5) a un aumento de más de 11 veces (clon C12-1). El aumento de la producción de C14 en los transformantes de C14 varió de aproximadamente un aumento de 1,5 veces a un aumento de aproximadamente 2,5 veces.
Tabla 15. Resumen del perfil lipídico total de los transformantes de tioesterasa C12 de Prototheca moriformis.
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(continúa)
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Tabla 16. Resumen del perfil lipídico total de los transformantes de tioesterasa C14 de Prototheca moriformis.
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[0389] Los experimentos descritos anteriormente indican la transformación exitosa de Prototheca moriformis (UTEX 1435) con construcciones transgénicas de dos tioesterasas diferentes (C12 y C14), que implicaron no solo la expresión exitosa del transgen, sino también el direccionamiento correcto del proteína expresada en el plastidio y un efecto funcional (el cambio esperado en el perfil lipídico) como resultado de la transformación. El mismo experimento de transformación se realizó usando una construcción de expresión que contiene una región codificante de tioesterasa C8-10 Cuphea hookeriana C8-10 optimizada con codón (según la Tabla 1) con la secuencia de direccionamiento de plastidios nativa (SEQ ID NO: 78) no produjo ningún cambio en el perfil lipídico. Si bien la introducción del transgén Cuphea hookeriana C8-10 en Prototheca moriformis (UTEX 1435) fue exitosa y se confirmó mediante análisis de transferencia Southern, no se detectaron cambios en la producción de ácidos grasos C8 o C10 en los transformantes en comparación con la cepa de tipo salvaje.
EJEMPLO 5: Generación de la cepa Prototheca m oriform is con TE de plantas exógenas con secuencia de selección de plastidios de algas
[0390] Con el fin de investigar si el uso de secuencias de selección de cloroplasto/plastidio de algas mejoraría la expresión de tioesterasa de cadena media (C8-C14) y la posterior producción de lípidos de cadena media en Prototheca moriformis (UTEX 1435), se clonaron varias secuencias de selección de plastidio de algas putativas de Chlorella protothecoides y Prototheca moriformis. Las construcciones de tioesterasa basadas en tioesterasa Cuphea hookeriana C8-10, tioesterasa Umbellularia californica C12 y tioesterasa Cinnamomum camphora C14 se hicieron usando un promotor de deshidrogenasa de glutamato Chlorella sorokiniana/5'UTR y una reductasa de nitrato de Chlorella vulgaris 3'UTR. Las secuencias de codificación de tioesterasa se modificaron eliminando las secuencias de direccionamiento de plastidios nativos y reemplazándolas por secuencias de direccionamiento de plastidios de los prototecoides de Chlorella y los genomas de Prototheca moriformis. Las construcciones de expresión de tioesterasa y sus correspondientes números de identificación de secuencia se enumeran a continuación. Cada plásmido de transformación también contenía una construcción de resistencia a Neo que era idéntica a las descritas en el Ejemplo 3 anterior. Además, otro promotor derivado de algas, el promotor de p-tubulina Chlamydomonas reinhardtii, también se ensayó junto con las construcciones de tioesterasa. La secuencia de direccionamiento de plastidio "nativo" se refiere a la secuencia de direccionamiento de plastidio de tioesterasa de planta superior. A continuación se proporciona un resumen de las construcciones utilizadas en estos experimentos:
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(continúa)
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[0391] Cada construcción se transformó en G418 usando los métodos descritos en el Ejemplo 4 anterior. Se seleccionaron y cribaron varios clones positivos de cada transformación para detectar la presencia del transgén tioesterasa usando análisis de transferencia Southern. La expresión del transgen de tioesterasa se confirmó usando RT-PCR. Se seleccionó un subconjunto de los clones positivos (según lo confirmado por análisis de transferencia Southern y RT-PCR) de cada transformación y se hizo crecer para el análisis del perfil lipídico. Las muestras de lípidos se prepararon a partir de muestras de biomasa seca de cada clon y el análisis del perfil de lípidos se realizó utilizando los métodos de hidrólisis ácida descritos en el Ejemplo 4. Los cambios en el porcentaje de área del ácido graso correspondiente al transgen tioesterasa se compararon con los niveles de tipo salvaje, y los clones se transformaron con un tioesterasa con la secuencia de direccionamiento de plastidios nativos.
[0392] Como se ha mencionado en el Ejemplo 4, los clones transformados con constructos de tioesterasa 8-10 de Cuphea hookeriana con la secuencia nativa del plástido de orientación tenía el mismo nivel de ácidos grasos C8 y C10 como de tipo salvaje. Los clones transformados con construcciones de tioesterasa C8-10 de Cuphea hookeriana (Construcciones 1-3) con secuencias de direccionamiento de plastidios de algas tuvieron un aumento de más de 10 veces en ácidos grasos C10 para la Construcción 3 y un aumento de más de 40 veces en ácidos grasos C10 para las Construcciones 1 y 2 (en comparación con el tipo salvaje). Los clones transformados con construcciones de tioesterasa C12 de Umbellularia califomica con la secuencia de selección de plastidios nativos tuvieron un aumento modesto de 6 a 8 veces en los niveles de ácido graso C12 en comparación con el tipo salvaje. Los clones transformados con las construcciones de tioesterasa C12 de Umbellularia californica con las construcciones de selección de plásmidos de algas (Construcciones 4-7) tuvieron un aumento de más de 80 veces en el nivel de ácidos grasos C12 para la Construcción 4, aproximadamente un aumento de 20 veces en el nivel de ácidos grasos C12 para Constructo 6, aproximadamente un aumento de 10 veces en el nivel de ácido graso C12 para el Constructo 7 y aproximadamente un aumento de 3 veces en el nivel de ácido graso C12 para el Constructo 5 (todo en comparación con el tipo salvaje). Los clones transformados con tioesterasa C14 de Cinnamomum camphora con la secuencia de direccionamiento de plastidios nativos o la construcción 8 (con la secuencia de direccionamiento de plastidios esteroilina ACP desaturasa de Chlorella protothecoides) tuvieron un aumento de aproximadamente 2-3 veces en los niveles de ácidos grasos C14 en comparación con el tipo salvaje. En general, los clones transformados con una secuencia diana de plastidios de algas, las construcciones de tioesterasa tuvieron un aumento de veces mayor en los niveles de ácidos grasos de longitud de cadena correspondientes que cuando se usó la secuencia diana de plantas más alta nativa.
A. Promotor de B-tubulina de Clamydomonas reinhartii
[0393] Construcciones de expresión de tioesterasa heterólogas adicionales se prepararon usando el promotor de ptubulina Chlamydomonas reinhardtii en lugar del promotor de deshidrogenasa de glutamato de C. sorokinana. Los elementos de construcción y la secuencia de las construcciones de expresión se enumeran anteriormente. Cada construcción se transformó en células huésped Prototheca moriformis UTEX 1435 usando los métodos descritos anteriormente. Los perfiles de lípidos se generaron a partir de un subconjunto de clones positivos para cada construcción con el fin de evaluar el éxito y la productividad de cada construcción. Los perfiles de lípidos comparan los niveles de ácidos grasos (expresados en % de área) con las células huésped de tipo salvaje. La columna "Media" representa el promedio numérico del subconjunto de clones positivos. La columna "Muestra" representa el mejor clon positivo que se analizó (mejor definido como la muestra que produjo el mayor cambio en el % de área de la producción de ácidos grasos de longitud de cadena correspondiente). La columna "bajo-alto" representa el % de área más bajo y el % de área más alto del ácido graso de los clones que se cribaron. Los resultados de los perfiles lipídicos de los constructos 9-23 se resumen a continuación.
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(continúa)
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[0394] Los Constructos 9-13 eran vectores de expresión que contenían la construcción de tioesterasa C8-10 de Cuphea hookeriana. Como se puede ver en los resúmenes de datos anteriores, los mejores resultados se observaron con Constructo 11, con el ácido graso de la muestra C8 siendo 1,57% de área (en comparación con 0 en el tipo salvaje) y el ácido graso C10 siendo 6,76% de área (en comparación con 0 en tipo salvaje). También hubo un aumento modesto en los ácidos grasos C12 (aumento de aproximadamente 2-5 veces). Mientras que la secuencia dirigida a plastos nativos no produjo ningún cambio cuando bajo el control del promotor glutamato deshidrogenasa C.sorokinana, la misma construcción de expresión impulsada por el promotor p-tubulina C.reinhardtii produjo cambios significativos en ácidos grasos C8-10 en la célula huésped. Esta es una prueba más de las idiosincrasias de la expresión heteróloga de tioesterasas en especies de Prototheca. Todos los clones que contienen el constructo de promotor C8-10 tioesterasa C.reinhardtii de p-tubulina tenían mayores incrementos en los ácidos grasos C8-10 que los clones que contienen el constructo de promotor glutamato deshidrogenasa C8-10 tioesterasa C.sorokinana. Los datos del perfil de lípidos para el Constructo 13 no se obtuvieron y, por lo tanto, no se incluyeron anteriormente.
[0395] Los Constructos 14-18 eran vectores de expresión que contenían el constructo de tioesterasa C12 de Umbellularia californica. Como se puede ver en los resúmenes de datos anteriores, los mejores resultados se observaron con los constructos 15 (secuencia de direccionamiento de plastidios de plastidina isopentenil difosfato sintasa de P.moriformis) y 17 (secuencia de direccionamiento de plastidios de desaturasa de esteroil ACP C.protothecoides). El mayor cambio en la producción de ácidos grasos C12 se observó con Constructo 17, con niveles de ácidos grasos C12 de hasta 14,11% de área, en comparación con 0,04% de área en el tipo salvaje. También se observaron cambios moderados (aproximadamente 2 veces) con los niveles de ácido graso C14. En comparación con las mismas construcciones con el promotor de glutamato deshidrogenasa C.sorokinana, las mismas tendencias fueron ciertas con el promotor de p-tubulina C.reinhardtii-desaturasa de estearoil ACP C.protothecoides y las secuencias de direccionamiento de plastidios de isopentenil difosfato sintasa de P.moriformis produjeron el mayor cambio en los niveles de ácido graso C12 con ambos promotores.
[0396] Los Constructos 19-23 eran vectores de expresión que contenían el constructo de tioesterasa Cinnamomum camphora C14. Como se puede ver en los resúmenes de datos anteriores, los mejores resultados se observaron con Constructos 22 y Constructo 23. El mayor cambio en la producción de ácidos grasos C14 se observó con Constructo 22, con niveles de ácidos grasos C14 de hasta 17,35% de área (cuando el los valores para C140 y C141 se combinan), en comparación con 1,40% en tipo silvestre. También se observaron cambios en los ácidos grasos C12 (5-60 veces). Cuando se compara con las mismas construcciones con el promotor glutamato deshidrogenasa C.sorokinana, las mismas tendencias fueron ciertas con promotor de p-tubulina C.reinhardtii-las secuencias de direccionamiento de plastidio de estearoil ACP desaturasa C.protothecoides y plastidio de estearoil ACP desaturasa P.moriformis produjeron el mayor cambio en los niveles de ácidos grasos C14 con ambos promotores. De forma coherente con todos los constructos de expresión de tioesterasa, los constructos del promotor de la p-tubulina C. reinhardtii produjeron mayores cambios en los niveles de ácido graso C8-14 que la deshidrogenasa de glutamato de C. sorokiniana.
[0397] Se seleccionaron dos clones positivos del Constructo 22 y se hicieron crecer a alta presión selectiva (50 mg/L G418). Después de 6 días en cultivo, se recogieron los clones y se determinó su perfil lipídico utilizando los métodos descritos anteriormente. Los datos del perfil lipídico se resumen a continuación y se expresan en % de área.
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[0398] Ambos clones, cuando crecieron bajo una presión constante y alta selectiva, produjeron una mayor cantidad de ácidos grasos C14 y C12, aproximadamente el doble de los niveles observados con el Constructo 22 anterior. Estos clones produjeron más del 30% de área de ácidos grasos C12-14, en comparación con el 1,5% de área de ácidos grasos C12-14 observados en las células de tipo salvaje.
EJEMPLO 6: Expresión heteróloga de Tioesterasa Cuphea palustris y Ulmus americanca en Prototheca
[0399] Dado el éxito de las tioesterasas de expresión heterólogas descritas anteriormente en especies de Prototheca, se construyeron y describieron a continuación casetes de expresión que contienen secuencias optimizadas por codones (según la Tabla 1) que codifican tioesterasas de acil-ACP graso de Cuphea palustris y Ulmus americana.
Nombre de Promotor/5'UTR Seq de selección Gen 3'UTR SEQ ID NO. constructo_____________________ de plastidios____________________________________________ Constructo 27 C.reinhardtii p- C.protothecoides Cuphea C. vulgaris SEQ ID NO:
tubulina estearoil ACP palustris nitrato 107
desaturasa tioesterasa reductasa
[0400] El Ulmus americana (secuencia de codificación optimizada por codón) puede insertarse en el casete de expresión. La secuencia de codificación optimizada por codón sin la secuencia de direccionamiento de plastidios nativa para la tioesterasa de Ulmus americana se enumera como SEQ ID NO: 108 y puede fusionarse con cualquier secuencia de direccionamiento de plastidios deseada y elemento de expresión (es decir, promotor/5'UTR y 3'UTR).
[0401] Estos casetes de expresión pueden transformarse en especies de Prototheca usando los métodos descritos anteriormente. Los clones positivos pueden seleccionarse con la inclusión de un gen de resistencia a antibióticos (por ejemplo, neoR) en el constructo de expresión y seleccionarse en placas/medios que contienen G418. Los clones positivos pueden confirmarse usando ensayos de transferencia Southern con sondas específicas para la región de codificación de tioesterasa heteróloga y la expresión del constructo también puede confirmarse usando RT-PCR y cebadores específicos para la región de codificación de la tioesterasa heteróloga. La confirmación secundaria de clones positivos se puede lograr buscando cambios en los niveles de ácidos grasos en el perfil lipídico de la célula huésped. Como se ve en los ejemplos anteriores, la expresión heteróloga en especies de tioesterasa de Prototheca puede ser idiosincrásica a la tioesterasa particular. Los elementos promotores y las secuencias de direccionamiento de plastidios (y otros elementos reguladores de la expresión) pueden intercambiarse hasta que la expresión de la tioesterasa (y el aumento posterior en el ácido graso correspondiente) alcance el nivel deseado.
EJEMPLO 7: Transformantes duales: expresión simultánea de dos proteínas heterólogas
[0402] La cepa de microalgas Prototheca moriformis (UTEX 1435) se transformó usando los métodos descritos anteriormente con una construcción de expresión que contiene el gen de sacarosa invertasa sucasa suc2 que codifica la forma secretada de la S. cerevisiae invertasa. La expresión exitosa de este gen y la focalización en el periplasma da como resultado la capacidad de la célula huésped para crecer (y utilizar) sacarosa como única fuente de carbono en condiciones heterotróficas (como se demostró en el Ejemplo 3 anterior). El segundo conjunto de genes expresados son las tioesterasas que son responsables de la escisión del resto acilo de la proteína portadora de acilo. Específicamente, tioesterasas de Cuphea hookeriana (una tioesterasa que prefiere C8-10), Umbellularia californica (una tioesterasa que prefiere C12) y Cinnamomum camphora (una tioesterasa que prefiere C14). Estos casetes de expresión de tioesterasa se clonaron como fusiones con secuencias de direccionamiento de plastidios de microalgas N-termiales de Prototheca moriformis o Chlorella protothecoides, que se ha demostrado (en los ejemplos anteriores) que son más óptimas que las secuencias de direccionamiento de plastidios de plantas superiores nativas. La expresión exitosa de los genes de tioesterasa y el direccionamiento al plastidio dieron como resultado cambios medibles en los perfiles de ácidos grasos dentro de la célula huésped. Estos cambios en los perfiles son consistentes con la especificidad enzimática o preferencia de cada tioesterasa. A continuación se muestra un resumen de los constructos de expresión dual que se ensamblaron y transformaron en Prototheca moriformis (UTEX 1435). Cada constructo contenía el gen de levadura suc2 bajo el control de p-tubulina 5'UTR/promotor C.reinhardtii y contenía el nitrato reductasa 3'UTR C. vulgaris y una tioesterasa de plantas superiores con una secuencia dirigida a plastos de microalgas sustituyendo la secuencia nativa bajo el control de glutamato deshidrogenasa 5'UTR C. sorokinana y contenía el nitrato reductasa 3'UTR C. vulgaris. A continuación se muestra un resumen de la porción de tioesterasa de los constructos que se ensamblaron y transformaron en Prototheca moriformis (UTEX 1435). El casete de expresión dual completo con el gen suc2 y el gen de tioesterasa y el se enumera en el Listado de Identificación de Secuencias.
Nombre de Promotor/5'UTR Seq de selección Gen 3'UTR SEQ ID constructo de plastidios NO.
Constructo C. sorokiniana C.protothecoides Cuphea C. vulgaris SEQ ID 24 glutamato estearoil ACP hookeriana nitrato NO: 109
deshidrogenasa desaturasa C8-10 TE reductasa Constructo C. sorokinana P. moriformis Umbellularia C. vulgaris SEQ ID 25 glutamato isopentenil californica C12 nitrato NO: 110
deshidrogenasa difosfato sintasa TE reductasa Constructo C. sorokinana C.protothecoides Cinnamomum C. vulgaris SEQ ID 26 glutamato estearoil ACP camphora C14 nitrato NO: 111
deshidrogenasa desaturasa TE reductasa
Similares constructos de expresión dual con los casetes de tioesterasa descritos en el Ejemplo 5 (por ejemplo, bajo el control de un diferente promotor tal como promotor de p-tubulina C. Reinhardtii/5’ UTR) también se pueden generar usando métodos de biología molecular estándar y los métodos descritos en el presente documento.
[0403] Los clones positivos que contienen cada uno de los constructos de expresión se cribaron usando su capacidad para crecer en placas que contienen sacarosa, donde la sacarosa es la única fuente de carbono, como factor de selección. Se seleccionó un subconjunto de estos clones positivos de cada transformación de construcción y se confirmó la presencia del constructo de expresión usando ensayos de transferencia Southern. La función de la levadura sacarosa invertasa también se confirmó usando un ensayo de hidrólisis de sacarosa. Los clones positivos se seleccionaron y crecieron en medios que contenían sacarosa como la única fuente de carbono a una concentración inicial de 40 g/L. También se incluyó un control negativo de Prototheca moriformis de tipo salvaje (UTEX 1435) cultivado en medios que contienen glucosa como la única fuente de carbono a la misma concentración inicial de 40 g/L. La utilización de sacarosa se midió durante el transcurso del experimento midiendo el nivel de sacarosa en los medios usando un Analizador de Bioquímica YSI 2700 con una membrana específica de sacarosa. Después de seis días en cultivo, los cultivos se cosecharon y procesaron para obtener un perfil lipídico utilizando los mismos métodos que se describen anteriormente. Los resultados del perfil lipídico se resumen a continuación en la Tabla 17 y se muestran en % de área.
Tabla 17. Perfiles lipídicos de transformantes duales con suc2 sacarosa invertasa y tioesterasa.
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[0404] Todos los clones positivos seleccionados para el ensayo de utilización de sacarosa pudieron hidrolizar la sacarosa en los medios y al final del período de cultivo de 6 días, no hubo niveles medibles de sacarosa en los medios. Estos datos, además del uso exitoso de la sacarosa como herramienta de selección para clones positivos, indican que el gen de la invertasa de sacarosa suc2 de levadura exógena se apuntó correctamente y se expresó en los transformantes. Como se muestra en la Tabla 17 anterior, los clones que expresan el constructo 24 (tioesterasa C8-10) tuvieron un aumento medible en los ácidos grasos C10 (hasta un aumento de ocho veces). Del mismo modo, hubo aumentos medibles en los clones que expresan el Constructo 25 (tioesterasa C12) y Constructo 26 (tioesterasa C14) en los ácidos grasos de cadena media correspondientes. En conjunto, los datos muestran la expresión simultánea exitosa en Prototheca moriformis de dos proteínas recombinantes (p. ej., sacarosa invertasa y una tioesterasa de acil-ACP de ácido graso), que confieren cambios fenotípicos útiles y cuantificables en el organismo huésped.
EJEMPLO 8: Efectos del glicerol sobre la producción de ácidos grasos C10-C14 en transformantes de tioesterasa C14
[0405] Se seleccionaron los clones de todas las transformaciones tioesterasa y se evaluaron adicionalmente. Un clon que expresaba el Constructo 8 (Cinnamomum camphora C14 TE) se cultivó heterotróficamente utilizando diferentes fuentes de carbono: solo glucosa, solo fructosa y solo glicerol. La condición de solo glucosa dio como resultado un mayor crecimiento celular y una producción total de lípidos en comparación con las condiciones de solo fructosa y solo glicerol. Sin embargo, la proporción de ácidos grasos C12-14 producidos en la condición de solo glicerol fue dos veces mayor que la alcanzada en la condición de solo glucosa.
EJEMPLO 9: Expresión de invertasa de Arabidopsis thaliana en Protoheca m oriform is
[0406] La cepa de microalgas Prototheca moriformis (UTEX 1435) se transformó usando los métodos descritos anteriormente, con una construcción de expresión que contiene una invertasa asociada a la pared celular optimizada por codón (de acuerdo con la Tabla 1) de Arabidosis thaliana. La secuencia de la invertasa de Arabidoposis se modificó para incluir los 39 aminoácidos N-terminales de la invertasa de levadura (proteína SUC2) para asegurar un direccionamiento eficiente al ER y finalmente al periplasma. Para ayudar a la detección, se añadió un epítopo Flag al extremo C de la proteína recombinante. El transgen se clonó en un vector de expresión con un promotor de glutamato deshidrogenasa de Chlorella sorokinianna/región 5'UTR y una región 3'UTR de nitrato reductasa de Chlorella vulgaris. La secuencia de ADN de este casete transgénico se enumera como SEQ ID NO: 89 y la secuencia de aminoácidos traducida se enumera como SEQ ID NO: 90. Los clones positivos se seleccionaron y cribaron usando medios/placas que contienen sacarosa. Se confirmó la presencia del transgen y la expresión de la invertasa en un subconjunto de los clones positivos usando análisis de transferencia Southern y análisis de transferencia Western para la invertasa marcada con Flag. De estas pantallas, se eligieron 10 clones positivos para la productividad de lípidos y los ensayos de utilización de sacarosa. Los 10 clones se cultivaron en medios que contenían sacarosa como la única fuente de carbono y también se incluyó un transformante de invertasa de suc2 de control positivo. El control negativo, tipo salvaje Prototheca moriformis, también se cultivó pero en medios que contenían glucosa. Después de seis días, las células se cosecharon y se secaron y se determinó el porcentaje total de lípidos por peso de células secas. Los medios también se analizaron para el consumo total de sacarosa.
[0407] Todos los diez clones positivos fueron capaces de hidrolizar la sacarosa, sin embargo, la mayoría de clones crecieron sobre medio, así como cualquiera de los dos de tipo salvaje o el control SUC2 positivo transformante invertasa de levadura como se determina por peso de células secas al final del experimento. De manera similar, los diez clones positivos produjeron aproximadamente la mitad de los lípidos totales en comparación con el tipo salvaje o el transformante de control positivo. Estos datos demuestran la exitosa expresión heteróloga de diversas inversiones de sacarosa en Prototheca.
EJEMPLO 10: Expresión heteróloga de la invertasa de levadura (suc2) en Prototheca krugani, Prototheca stagnora y Prototheca zopfii
[0408] Para ensayar la aplicabilidad general de los métodos de transformación para el uso en especies del género Prototheca, otros tres Prototheca se seleccionaron las especies: Prototheca krugani (UTEX 329), Prototheca stagnora (UTEX 1442) y Prototheca zopfii (UTEX 1438). Estas tres cepas se cultivaron en los medios y condiciones descritos en el Ejemplo 1 y sus perfiles de lípidos se determinaron usando los métodos descritos anteriormente. A continuación se resume un resumen de los perfiles lipídicos de las tres cepas de Prototheca en % de área.
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[0409] Estas tres cepas se transformaron con un casete de expresión de levadura invertasa (suc2) (SEQ ID NO: 58) usando los métodos descritos en el Ejemplo 3 anterior. Se ha demostrado que este casete de expresión de invertasa de levadura (suc2) funciona en Prototheca moriformis (UTEX 1435) anterior en el Ejemplo 3. Los transformantes se cribaron usando placas/medios que contienen sacarosa. Se seleccionó un subconjunto de los clones positivos para cada especie de Prototheca y se confirmó la presencia del transgen mediante análisis de transferencia Southern. Se seleccionaron diez clones positivos confirmados de cada especie para el análisis de hidrólisis de sacarosa y la productividad de los lípidos. Los clones se cultivaron en medios que contenían sacarosa como única fuente de carbono y se compararon con su contraparte de tipo salvaje cultivada en glucosa. Después de 6 días, los cultivos se cosecharon y se secaron y se evaluó el porcentaje total de lípidos y el peso de las células secas. Los medios de cada cultivo también se analizaron para la hidrólisis de sacarosa usando un Analizador de Bioquímica YSI2700 para el contenido de sacarosa en el transcurso del experimento. Los clones de las tres especies pudieron hidrolizar sacarosa, con Prototheca stagnora y Prototheca zopfii transformantes capaces de hidrolizar sacarosa más eficientemente que Prototheca krugani. La producción total de lípidos y el peso de las células secas de las tres especies de transformantes fueron comparables a su contraparte de tipo salvaje cultivada en glucosa. Estos datos demuestran la exitosa transformación y expresión de genes exógenos en múltiples especies del género Prototheca.
EJEMPLO 11: Promotores y genes derivados de algas para uso en microalgas
A. 5'UTR y secuencias promotoras de Chlorella prototecoides
[0410] Se generó una biblioteca de ADNc a partir de Chlorella prototecoides cultivados mixotróficamente (UTEX 250) usando técnicas estándar. Sobre la base de las secuencias de ADNc, los cebadores se diseñaron en ciertos genes de limpieza conocidos para "caminar" aguas arriba de las regiones de codificación utilizando el kit de ADN para caminar de Seegene (Rockville, MD). Las secuencias aisladas incluyen un promotor/UTR de actina (SEQ ID NO: 31) y factor de elongación la (EF1a) (SEQ ID NO: 32), que contienen intrones (como se muestra en minúscula) y exones (mayúscula en cursiva)) y el sitio de inicio previsto (en negrita) y dos elementos promotores de beta-tubulina/elementos UTR: Isoforma A (SEQ ID NO: 33) e Isoforma B (SEQ ID NO: 34).
B. Enzima de biosíntesis de lípidos y secuencias de dirección al plástido de C. prototecoides
[0411] A partir de la biblioteca de ADNc descrita anteriormente, se clonaron tres ADNc que codifican proteínas funcionales en el metabolismo de los lípidos en Chlorella prototecoides (UTEX 250) usando los mismos métodos descritos anteriormente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para una acil ACP desaturasa (SEQ ID NO: 45 y 46) y dos sintasas de difosfato de geranilo geranilo (SEQ ID NO: 47-50) se incluyen en el Listado de Secuencias a continuación. Además, también se clonaron tres ADNc con secuencias de señal putativas dirigidas al plastidio. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para una deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (SEQ ID NOs: 51 y 52), una proteína compleja de evolución de oxígeno OEE33 (SEQ ID NOs: 53 y 54) y una proteasa Clp (SEQ ID NOs: 55 y 56) están incluidos en el Listado de Secuencias a continuación. La supuesta secuencia de direccionamiento de plastidios ha sido subrayada tanto en la secuencia de nucleótidos como de aminoácidos. Las secuencias de direccionamiento de plastidios pueden usarse para dirigir los productos de transgenes al plastidio de microbios, como las enzimas de modificación de lípidos.
EJEMPLO 12: 5'UTR/promotores que responden al nitrógeno de Prototheca m oriform is
[0412] Se generó una biblioteca de ADNc a partir de Prototheca moriformis (UTEX 1435) usando técnicas estándar. Las células de Prootheca moriformis se cultivaron durante 48 horas en condiciones de repleción de nitrógeno. Luego se transfirió un inóculo al 5% (v/v) a nitrógeno bajo y las células se cosecharon cada 24 horas durante siete días. Después de aproximadamente 24 horas en cultivo, el suministro de nitrógeno en los medios se agotó por completo. Las muestras recogidas se congelaron inmediatamente usando hielo seco e isopropanol. El ARN total se aisló posteriormente de las muestras de gránulos de células congeladas y una porción de cada muestra se mantuvo en reserva para estudios de RT-PCR. El resto del ARN total recolectado de las muestras se sometió a selección de poliA. Las cantidades equimolares de ARN seleccionado con poliA de cada condición se agruparon y se usaron para generar una biblioteca de ADNc en el vector ADNpc 3,0 (Invitrogen). Aproximadamente 1200 clones se seleccionaron al azar de la biblioteca de ADNc agrupada resultante y se sometieron a secuenciación en ambas cadenas. Se seleccionaron aproximadamente 68 ADNc diferentes entre estas 1200 secuencias y se usaron para diseñar cebadores específicos de ADNc para su uso en estudios de RT-PCR en tiempo real.
[0413] El ARN aislado de las muestras de sedimento celular que se mantuvieron en reserva se usó como sustrato en los estudios de RT-PCR en tiempo real usando los conjuntos de cebadores específicos de ADNc generados anteriormente. Este ARN reservado se convirtió en ADNc y se usó como sustrato para RT-PCR para cada uno de los conjuntos de cebadores específicos de 68 gne. Los umbrales de ciclo o Ct se usaron para indicar la abundancia relativa de transcripción para cada uno de los 68 ADNc dentro de cada muestra de ARN recolectada a lo largo del transcurso del tiempo. Los ADNc que muestran un aumento significativo (más de tres veces) entre las condiciones de repleción de nitrógeno y de agotamiento de nitrógeno se marcaron como genes potenciales cuya expresión estaba regulada por el agotamiento de nitrógeno. Como se discute en la especificación, el agotamiento/limitación de nitrógeno es un inductor conocido de lipogénesis en microorganismos oleaginosos.
[0414] Para identificar los supuestos promotores/secuencias 5'UTR de los ADNc cuya expresión se reguló durante el agotamiento/limitación de nitrógeno, se aisló el ADN total de Prototheca moriformis (UTEX 1435) cultivado bajo condiciones repletas de nitrógenos y luego se sometieron a secuenciación usando tecnología de secuenciación 454 (Roche). Los ADNc marcados como regulados por los resultados de RT-PCR anteriores se compararon usando BLAST contra contigs ensamblados que surgen de las 454 lecturas de secuenciación genómica. Los extremos 5' de los ADNc se mapearon en contigs específicos y, cuando fue posible, se usaron más de 500 pb de ADN flanqueante 5' para identificar supuestamente promotores/UTR. La presencia de promotores/5'UTR se confirmó posteriormente y se clonó usando amplificación por PCR de ADN genómico. Se usaron extremos 5' de ADNc individuales para diseñar cebadores 3' y se usaron extremos 5' de los conjuntos contig 454 para diseñar cebadores específicos de gen 5'.
[0415] Como primer cribado, uno de los supuestos promotores, el 5'UTR/promotor aislado de Aat2 (transportador de amonio, SEQ ID NO: 99), se clonó en el constructo de tioesterasa C14 Cinnamomum camphora con el péptido de tránsito de ACP desaturasa estearoilo Chlorella protothecoides descrito en el Ejemplo 5 anterior, que reemplaza al promotor de glutamato deshidrogenasa C.sorokinana. Este constructo se enumera como SEQ ID NO: 112. Para ensayar el supuesto promotor, el constructo de tioesterasa se transforma en células Prototheca moriformis para confirmar la actividad real del promotor mediante la detección de un aumento en los ácidos grasos C14/C12 en condiciones bajas/sin nitrógeno, utilizando los métodos descritos anteriormente. Se pueden realizar pruebas similares de los supuestos promotores regulados por nitrógeno aislados del ADNc/cribado genómico utilizando los mismos métodos.
[0416] Otros supuestos promotores regulados por nitrógeno/5'UTR que se aislaron de las pruebas de ADNc/genómico fueron:
Promotor/5'UTR SEQ ID NO. Pliegue aumentado FatB/A promotor/5'UTR SEQ ID NO: 91 n/a
NRAMP promotor del transportador de metal/5'UTR SEQ ID NO: 92 9,65
Promotor de proteína/5'UTR asociado a Flap Flagelar SEQ ID NO: 93 4,92
SulfRed Sulfito reductasa promotor/5'UTR SEQ ID NO: 94 10,91
SugT Transportador del azúcar promotor/5'UTR SEQ ID NO: 95 17,35
Amt03-transportador de amonio 03 promotor/5'UTR SEQ ID NO: 96 10,1
Amt02-transportador de amonio 02 promotor/5'UTR SEQ ID NO: 97 10,76
Aat01-transportador de aminoácidos 01 promotor/5'UTR SEQ ID NO: 98 6,21
Aat02-transportador de aminoácidos 02 promotor/5'UTR SEQ ID NO: 99 6,5
Aat03-transportador de aminoácidos 03 promotor/5'UTR SEQ ID NO 100 7,87
Aat04-transportador de aminoácidos 04 promotor/5'UTR SEQ ID NO 101 10,95
Aat05-transportador de aminoácidos 05 promotor/5'UTR SEQ ID NO 102 6,71
Aumento de pliegue se refiere al aumento de pliegue en abundancia de ADNc después de 24 horas de cultivo en medio de bajo nitrógeno.
EJEMPLO 13: Recombinación homóloga en especies de Prototheca
[0417] La recombinación homóloga de transgenes tiene varias ventajas sobre los métodos de transformación descritos en los ejemplos anteriores. Primero, la introducción de transgenes sin recombinación homóloga puede ser impredecible porque no hay control sobre el número de copias del plásmido que se introduce en la célula. Además, la introducción de transgenes sin recombinación homóloga puede ser inestable porque el plásmido puede permanecer episomal y se pierde en las divisiones celulares posteriores. Otra ventaja de la recombinación homóloga es la capacidad de "eliminar" dianas genéticas, introducir etiquetas de epítopo, cambiar promotores de genes endógenos y alterar de otra manera las dianas genéticas (por ejemplo, la introducción de mutaciones puntuales.
[0418] Se construyeron dos vectores usando una región específica del genoma de Prototheca moriformis (UTEX 1435), designado KE858. KE858 es un fragmento genómico de 1,3 kb que abarca parte de la región de codificación de una proteína que comparte homología con la familia de proteínas de transferencia de ARN (ARNt). Las transferencias Southern han demostrado que la secuencia KE858 está presente en una sola copia en el genoma de Prototheca moriformis (UTEX 1435). El primer tipo de vector que se construyó, designado SZ725 (SEQ ID NO: 103), consistió en el fragmento KE858 completo de 1,3 kb clonado en un esqueleto de vector pUC19 que también contiene el gen optimizado de la invertasa de levadura (suc2) usado en el Ejemplo 3 anterior. El fragmento KE858 contiene un sitio SnaB 1 único que no aparece en ningún otro lugar en el constructo de orientación. El segundo tipo de vector que se construyó, designado SZ726 (SEQ ID NO: 126), consistía en la secuencia KE858 que había sido interrumpida por la inserción del gen de la invertasa de levadura (suc2) en el sitio SnaB1 dentro de la secuencia genómica KE858. Todo el fragmento de ADN que contiene las secuencias de KE858 que flanquean el gen de la invertasa de levadura puede extirparse del esqueleto del vector mediante digestión con EcoRI, que corta en cualquier extremo de la región de KE858.
[0419] Ambos vectores se usaron para dirigir la recombinación homóloga del gen de la invertasa de levadura (suc2) en la región KE858 correspondiente del genoma de Prototheca moriformis (UTEX 1435). Los extremos lineales de ADN homólogos a la región genómica que estaba siendo objetivo de la recombinación homóloga se expusieron al digerir el constructo del vector SZ725 con SnaB1 y el constructo del vector SZ726 con EcoRI. Los constructos del vector digerido se introdujeron luego en los cultivos de Prototheca moriformis usando los métodos descritos anteriormente en el Ejemplo 3. Los transformantes de cada construcción de vector se seleccionaron luego usando placas de sacarosa. Se analizaron diez transformantes independientes, clonalmente puros de cada transformación de vector para determinar la recombinación exitosa del gen de la invertasa de levadura en la ubicación genómica deseada (usando transferencias Southern) y para la estabilidad transgénica.
[0420] El análisis de transferencia Southern de los transformantes SZ725 mostró que 4 de los 10 transformantes seleccionados para el análisis contenían las bandas recombinantes predichas, lo que indica que se había producido un único evento de cruce entre las secuencias KE858 en el vector y las secuencias KE858 en el genoma. En contraste, los diez transformantes SZ726 contenían las bandas recombinantes predichas, lo que indica que se habían producido eventos cruzados dobles entre el fragmento EcoRI de pSZ726 que portaba la secuencia KE858 que flanqueaba el transgen de la invertasa de levadura y la región KE858 correspondiente del genoma.
[0421] La expresión de invertasa de sacarosa y la estabilidad transgénica se evaluaron haciendo crecer los transformantes durante más de 15 generaciones en ausencia de selección. Se seleccionaron los cuatro transformantes SZ725 y los diez transformantes SZ276 que fueron positivos para el transgén por transferencia Southern y se cultivaron 48 colonias individuales de cada uno de los transformantes en serie: primero sin selección en medios que contienen glucosa y luego con selección en medios que contienen sacarosa como la única fuente de carbono. Los diez transformantes SZ276 (100%) conservaron su capacidad de crecer en sacarosa después de 15 generaciones, mientras que aproximadamente el 97% de los transformantes SZ725 conservaron su capacidad de crecer en sacarosa después de 15 generaciones. Los transgenes introducidos por un evento cruzado doble (vector SZ726) tienen una estabilidad extremadamente alta sobre las duplicaciones de generación. En contraste, los transgenes introducidos por un solo evento cruzado (vector SZ725) pueden ocasionar cierta inestabilidad sobre la generación de duplicaciones porque se introdujeron copias en tándem de los transgenes, las regiones homólogas repetidas que flanquean a los transgenes pueden recombinarse y eliminar el ADN transgénico localizado entre ellos.
[0422] Estos experimentos demuestran el uso exitoso de la recombinación homóloga para generar transformantes de Prototheca que contienen un gen heterólogo de sacarosa invertasa que se integra de manera estable en los cromosomas nucleares del organismo. El éxito de la recombinación homóloga permite otras alteraciones genómicas en Prototheca, que incluyen deleciones genéticas, mutaciones puntuales y epítopos que marcan el producto genético deseado. Estos experimentos también demuestran el primer sistema documentado para la recombinación homóloga en el genoma nuclear de una microalga eucariota.
A. Uso de la recombinación homóloga para elim inar un gen endógeno de Prototheca moriform is
[0423] En el análisis de ADNc/genómico de Prototheca moriformis descrito en el Ejemplo 11 anterior, se identificó un ADNc de estearoil ACP desaturasa (SAPD) endógeno. Las enzimas estearoil ACP desaturasa son parte de la vía de síntesis de lípidos y funcionan para introducir dobles enlaces en las cadenas de acilo graso. En algunos casos, puede ser ventajoso eliminar o reducir la expresión de las enzimas de la ruta de los lípidos para alterar un perfil de ácidos grasos. Se creó una construcción de recombinación homóloga para evaluar si la expresión de una enzima estearoil ACP desaturasa endógena se puede reducir (o eliminar) y si se puede observar una reducción correspondiente en los ácidos grasos insaturados en el perfil lipídico de la célula huésped. Se identificó y se clonó una secuencia codificante de aproximadamente 1,5 kb de un gen estearoil ACP desaturasa de Prototheca moriformis (UTEX 1435) (SEQ ID NO: 104). El constructo de recombinación homóloga se construyó utilizando 0,5 kb de la secuencia de codificación de SAPD en el extremo 5' (sitio de direccionamiento 5'), seguido por el promotor Chlamydomonas reinhardtii p-tubulina que impulsa un gen de sucrosa invertasa suc2 de levadura optimizada por codón con Chlorella vulgaris 3'UTR. El resto (~ 1kb) de la secuencia de codificación de Prototheca moriformis SAPD se insertó luego después de C. vulgaris 3'UTR para formar el sitio de orientación 3'. La secuencia para este casete de recombinación homóloga se enumera en SEQ ID NO: 105. Como se muestra arriba, la tasa de éxito para la integración del casete de recombinación homóloga en el genoma nuclear se puede aumentar linealizando el casete antes de transformar las microalgas, dejando los extremos expuestos. El casete de recombinación homólogo dirigido a una enzima SAPD endógena en Prototheca moriformis se linealiza y luego se transforma en la célula huésped (Prototheca moriformis, UTEX 1435). Una integración exitosa eliminará la región de codificación de enzima de SAPD endógeno del genoma del huésped a través de un evento de recombinación recíproca doble, mientras que la expresión del gen recién insertado de SUC2 será regulada por el promotor p-tubulina C.reinhardtii. Los clones resultantes pueden seleccionarse usando placas/medios que contienen sacarosa como única fuente de carbono. Los clones que contienen una integración exitosa del casete de recombinación homóloga tendrán la capacidad de crecer en sacarosa como la única fuente de carbono y los cambios en la saturación general de los ácidos grasos en el perfil lipídico servirán como un factor de confirmación secundario. Además, los ensayos de transferencia Southern que usan una sonda específica para el gen suc2 de sacarosa invertasa de levadura y RT-PCR también pueden confirmar la presencia y expresión del gen de invertasa en clones positivos. Como alternativa, la misma construcción sin el promotor de p-tubulina puede usarse para escindir la región codificante de la enzima SAPD endógena. En este caso, el gen suc2 recién insertado de sacarosa invertasa de levadura estará regulado por el promotor endógeno de SAPD/5'UTR.
EJEMPLO 14: Producción de combustible
A. Extracción de aceite de microalgas utilizando una prensa de expulsión y un auxiliar de prensa
[0424] La biomasa de microalgas que contenía 38% de aceite por DCW se secó usando un secador de tambor, dando como resultado un contenido de humedad resultante de 5-5,5%. La biomasa se alimentó en una prensa French L250. Se alimentaron 30,4 kg (67 lbs.) de biomasa a través de la prensa y no se recuperó aceite. La misma biomasa microbiana seca combinada con un porcentaje variable de hierba de cambio como una ayuda de prensa se alimentó a través de la prensa. La combinación de biomasa microbiana seca y 20% p/p de hierba de cambio produjo el mejor porcentaje general de recuperación de petróleo. Las tortas prensadas se sometieron luego a extracción con hexano y el rendimiento final para la condición de 20% de hierba de cambio fue del 61,6% del total de aceite disponible (calculado en peso). La biomasa con un peso de células secas de aceite superior al 50% no requería el uso de un agente de presión como el pasto de cambio para liberar el aceite.
B. Composición de monosacárido de biomasa prototecas m oriform is sin lípidos
[0425] Prototheca moriformis (UTEX 1435) se cultivó en condiciones y medios nutrientes (con glucosa al 4%) como se describe en el Ejemplo 45 anterior. La biomasa microalgal se cosechó y se secó utilizando un secador de tambor. La biomasa de algas secas se lisó y el aceite se extrajo usando una prensa de expulsión como se describe en el Ejemplo 44 anterior. El aceite residual en la biomasa prensada se extrajo con solvente usando éter de petróleo. El éter de petróleo residual se evaporó de la comida delipidada usando un Rotovapor (Buchi Labortechnik AG, Suiza). El análisis de la composición de glucosilo (monosacárido) se realizó luego en la comida delipidada usando cromatografía de gases combinada/espectrometría de masas (GC/MS) de los derivados de per-O-trimetilsililo (TMS) de los metilglicósidos de monosacárido producidos a partir de la muestra por metanólisis ácida. Una muestra de comida delipidada se sometió a metanolisis en 1 M HCl en metanol a 80°C durante aproximadamente 20 horas, seguido de re-N-acetilación con piridina y anhídrido acético en metanol (para la detección de amino azúcares). Las muestras fueron luego per-O-trimetilsiladas por tratamiento con Tri-Sil (Pierce) a 80°C durante 30 minutos (ver métodos en Merkle y Poppe (1994) Methods Enzymol. 230: 1-15 y York et al., (1985) Methods Enzymol. 118: 3-40). El análisis por GC/MS de los metilglicósidos TMS se realizó en un GC HP 6890 conectado a un MSD 5975b, usando una columna capilar de sílice fundida All Tech EC-1 (30 mx 0,25 mm ID). Los monosacáridos se identificaron por sus tiempos de retención en comparación con los estándares, y el carácter de carbohidratos de estos se autentica por sus espectros de masas. Se agregaron 20 microgramos por muestra de inositol a la muestra antes de la derivatización como patrón interno. El perfil de monosacáridos de la biomasa Prototheca moriformis delipidada (UTEX 1435) se resume en la Tabla 18 a continuación. El porcentaje total de carbohidratos de la muestra se calculó en 28,7%.
Tabla 18. Análisis de la composición de monosacáridos (glicosilo) de la biomasa delipidada Prototheca moriformis
(UTEX 1435).
Figure imgf000082_0001
[0426] El contenido de carbohidratos y la composición de monosacáridos de la comida delipidada lo hace adecuado para su uso como alimento para animales o como parte de una formulación de alimento para animales. Por lo tanto, en un aspecto, la presente descripción proporciona comida delipidada que tiene el contenido del producto establecido en la tabla anterior.
C. Producción de biodiesel a partir del aceite de Prototheca.
[0427] El aceite desgomado de Prototheca moriformis UTEX 1435, producido según los métodos descritos anteriormente, se sometió a transesterificación para producir ésteres metílicos de ácidos grasos. Los resultados se muestran a continuación:
El perfil lipídico del aceite fue:
C10:00,02
C12:00,06
C14:0 1,81
C14,1 0,07
C16:024,53
C16:1 1,22
C18:02,34
C18:1 59,21
C18:28,91
C18:30,28
C20:00,23
C20:1 0,10
C20:1 0,08
C21:00,02
C22:00,06
C24:00,10
Tabla 19. Perfil de biodiesel del aceite de triglicéridos Prototheca moriformis.
Figure imgf000083_0001
(continúa)
Figure imgf000084_0001
[0428] El perfil lipídico del biodiesel fue muy similar al perfil lipídico del aceite de alimentación. Otros aceites proporcionados por los métodos y composiciones descritos pueden someterse a transesterificación para producir biodiésel con perfiles lipídicos que incluyen (a) al menos 4% de C8-C14; (b) al menos 0,3% de C8; (c) al menos 2% de C10; (d) al menos 2% de C12; y (3) al menos 30% de C8-C14.
[0429] La capacidad de filtración en frío mediante el método ASTM D6751 A1 del biodiesel producido fue de 120 segundos para un volumen de 300 ml. Esta prueba implica la filtración de 300 ml de B100, enfriado a 40°F durante 16 horas, se deja calentar a temperatura ambiente y se filtra al vacío utilizando un filtro de fibra de vidrio de 0,7 micras con soporte de acero inoxidable. Los aceites de la descripción se pueden transesterificar para generar biodiesel con un tiempo de remojo en frío de menos de 120 segundos, menos de 100 segundos y menos de 90 segundos.
D. Producción de diésel renovable
[0430] El aceite desgomado de Prototheca moriformis UTEX 1435, producido de acuerdo con los métodos descritos anteriormente y que tiene el mismo perfil de lípidos que el aceite usado para hacer biodiesel en el Ejemplo X anterior, se sometió a transesterificación para producir diesel renovable.
[0431] El aceite se hidrotrató primero para eliminar el oxígeno y la cadena principal de glicerol, produciendo nparafinas. Las n-parafinas fueron sometidas a craqueo e isomerización. En la Figura 13 se muestra un cromatograma del material. El material se sometió a filtración en frío, que eliminó aproximadamente el 5% del material C18. Después de la filtración en frío, el material del volumen total se cortó hasta el punto de inflamación y se evaluó el punto de inflamación, la distribución de destilación ASTM D-86, el punto de turbidez y la viscosidad. El punto de inflamación fue 63°C; la viscosidad fue de 2,86 cSt (centistokes); el punto de nubosidad fue de 4°C. Los valores de destilación ASTM D86 se muestran en la Tabla 20:
Tabla 20. Lecturas en° C:
Volumen Temperatura
IBP 173
5 217,4
10 242,1
15 255,8
20 265,6
30 277,3
40 283,5
50 286,6
60 289,4
70 290,9
80 294,3
90 300
95 307,7
FBP 331,5
[0432] El T10-T90 del material producido fue 57,9°C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos aquí, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos aquí, pueden emplearse para generar composiciones de diesel renovables con otros intervalos T10-T90, como 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 y 65°C usando aceites triglicéridos producidos de acuerdo con los métodos descritos aquí.
[0433] La T10 del material producido fue de 242,1°C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos aquí, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos aquí, pueden emplearse para generar composiciones diesel renovables con otros valores de T10, como T10 entre 180 y 295, entre 190 y 270, entre 210 y 250, entre 225 y 245, y al menos 290.
[0434] La T90 del material producido fue de 300°C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos en este documento, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos en este documento pueden emplearse para generar composiciones diesel renovables con otros valores de T90, como T90 entre 280 y 380, entre 290 y 360, entre 300 y 350, entre 310 y 340, y al menos 290.
[0435] La FBP del material producido fue de 300°C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos aquí, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos aquí, pueden emplearse para generar composiciones de diesel renovables con otros valores de FBP, como FBP entre 290 y 400, entre 300 y 385, entre 310 y 370, entre 315 y 360, y al menos 300.
[0436] Otros aceites proporcionados por los métodos y composiciones de la descripción pueden someterse a combinaciones de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes que incluyen aceites con perfiles lipídicos que incluyen (a) al menos 4% de C8-C14; (b) al menos 0,3% de C8; (c) al menos 2% de C10; (d) al menos 2% de C12; y (3) al menos 30% de C8-C14.
EJEMPLO 15: Utilización de sacarosa por Chlorella luteovirid is
A. Crecimiento de SAG 2214 en glucosa y sacarosa
[0437] SAG 2214 (designado como Chlorella luteoviridis) se ensayó para el crecimiento en la oscuridad en medios que contienen glucosa o sacarosa. Los cultivos líquidos heterotróficos se iniciaron usando inóculo de un vial congelado en cualquier medio que contenga 4% de glucosa o 4% de sacarosa como única fuente de carbono. Los cultivos se cultivaron en la oscuridad, agitando a 200 rpm. Se tomaron muestras de los cultivos a 0, 24, 48 y 72 horas y el crecimiento se midió por absorbancia relativa a 750 nm (UV Mini1240, Shimadzu). SAG 2214 creció igualmente bien en glucosa que en sacarosa, lo que demuestra que esta microalga puede utilizar sacarosa tan eficazmente como la glucosa como única fuente de carbono. El resultado de este experimento se representa gráficamente en la Figura 3.
B. Productividad lipídica y perfil de ácidos grasos para SAG 2214
[0438] La cepa de microalgas SAG 2214 se cultivó en medio líquido que contenía glucosa o sacarosa como la única fuente de carbono en condiciones similares a las descritas en el Ejemplo 32 anterior. Después de 7 días, las células se cosecharon para calcular el peso de la célula seca. Las células se centrifugaron y se liofilizaron durante 24 horas. Los gránulos de células secas se pesaron y se calculó el peso de las células secas por litro. Las células para el análisis de lípidos también se cosecharon y se centrifugaron a 4000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se desechó y las muestras se procesaron para el análisis de lípidos y el perfil de ácidos grasos utilizando procedimientos de cromatografía de gases (Gc /FID) estándar. Los resultados se resumen a continuación en las Tablas 21 y 22.
Tabla 21. Productividad lipídica y DCW para SAG 2214.
Figure imgf000086_0001
Tabla 22. Perfil de ácidos grasos para SAG 2214.
Figure imgf000086_0002
C. Comparación genómica de SAG 2214 con otras cepas de Chlorella luteovirid is
[0439] La cepa de microalgas SAG 2214 demostró ser de interés general debido a su capacidad para crecer en sacarosa como fuente de carbono (ilustrado anteriormente). Además de las características de crecimiento de esta cepa, su relación taxonómica con otras especies de microalgas también fue de interés. Designado por la colección SAG como una cepa de Chlorella luteoviridis, el gen 23s ARNr de SAG 2214 fue secuenciado y comparado con la secuencia genómica 23s ARNr de otras nueve cepas también identificadas por las colecciones SAG y UTEX como Chlorella luteoviridis. Estas cepas fueron UTEX 21, 22, 28, 257 y 258, y las cepas SAG 2133, 2196, 2198 y 2203. Los métodos de genotipado de ADN utilizados fueron los mismos que los descritos anteriormente en el Ejemplo 1. Se generaron alineamientos de secuencia y árboles no enraizados utilizando software de análisis de ADN Geneious. De las otras nueve cepas que eran genotipos, UTEX 21,22, 28 y 257 tenían una secuencia de ADN de ARNr 23s idéntica (SEQ ID NO: 106). Las otras cinco cepas de Chlorella luteoviridis tenían 23 secuencias de ARNr que eran altamente homólogas a UTEX 21, 22, 28 y 257.
[0440] La secuencia del gen 23s ARNr de SAG 2214 (SEQ ID NO: 30) es decididamente diferente de la del las otras nueve cepas de C. luteoviridis, que tienen una inserción grande que no se encontró en las otras cepas. Un análisis adicional de esta secuencia del gen de ARNr 23s usando BLASt indicó que compartía la mayor homología con miembros del género Leptosira y Trebouxia (miembros de la porción de líquenes de phycobiont). Estos resultados indican que SAG 2214 puede no ser una cepa de Chlorella luteoviridis según la clasificación de la colección de cepas, sino que comparte una identidad significativa de nucleótidos de ARNr 23S con los simbiontes de algas encontrados en líquenes. El análisis genómico junto con las características de crecimiento indican que SAG 2214 puede ser una fuente de genes y proteínas involucradas en el metabolismo de la sacarosa, así como de los péptidos de señalización y tránsito responsables de la correcta localización de tales enzimas. SAG 2214 y otras cepas con un alto grado de similitud genómica también pueden ser cepas útiles para la producción de petróleo utilizando sacarosa como fuente de carbono fijo.
[0441] Aunque esta invención se ha descrito en relación con realizaciones específicas de la misma, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales. Esta aplicación está destinada a cubrir cualquier variación, uso o adaptación de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo tales desviaciones de la presente divulgación que se encuentran dentro de la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invención y como se puede aplicar a las características esenciales aquí expuestas anteriormente.
[0442] Las publicaciones mencionadas en este documento se citan con el propósito de describir y divulgar reactivos, metodologías y conceptos que pueden usarse en conexión con la presente invención. Nada en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que estas referencias son de la técnica anterior en relación con las invenciones descritas en el presente. Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 60/941,581, presentada el 1 de junio de 2007, titulada "Producción de Hidrocarburos en Microorganismos"; Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 60/959,174, presentada el 10 de julio de 2007, titulada "Producción de Hidrocarburos en Microorganismos"; Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 60/968,291, presentada el 27 de agosto de 2007, titulada "Producción de Hidrocarburos en Microorganismos"; Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm.
61/024,069, presentada el 28 de enero de 2008, titulada "Producción de hidrocarburos en microorganismos"; Solicitud PCT N° PCT/US08/65563, presentada el 2 de junio de 2008, titulada "Producción de petróleo en microorganismos"; Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 12/131,783, presentada el 2 de junio de 2008, titulada "Uso de material celulósico para el cultivo de microorganismos"; Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 12/131,773, presentada el 22 de junio de 2008, titulada "Diesel renovable y combustible para reactores de fuentes microbianas"; Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 12/131,793, presentada el 2 de junio de 2008, titulada "Utilización de materia prima de sacarosa para la fabricación de combustible a base de petróleo"; Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 12/131,766, presentada el 2 de junio de 2008, titulada "Utilización de materias primas de glicerol para la fabricación de combustible a base de petróleo"; Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 12/131,804, presentada el 2 de junio de 2008, titulada "Modificación de la ruta de los lípidos en microorganismos que contienen petróleo"; Solicitud de Patente de EE.UU. N° 61/118,590, presentada el 28 de noviembre de 2008, titulada "Producción de aceite en microorganismos"; Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos Núm. 61/118,994, presentada el 1 de diciembre de 2008, titulada "Producción de Aceite en Microorganismos"; Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos Núm. 61/174,357, presentada el 3 de abril de 2009, titulada "Producción de Aceite en Microorganismos"; Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos Núm. 61/219,525, presentada el 23 de junio de 2009, titulada "Producción de Aceite en Microorganismos"; y la Solicitud PCT N° PCT/US09/66142, presentada el 30 de noviembre de 2009, titulada "Producción de aceites a medida en microorganismos heterotróficos" a la que se hace referencia.
SEQ ID NO: 1
Promotor HUP de Chlorella (subsecuencia del número de acceso GenBank X55349)
gatcagacgggcctgacctgcgagataatcaagtgctcgtaggcaaccaactcagcagctgcttggtgttgggtctgcaggatagtgtt gcagggccccaaggacagcaggggaacttacaccttgtccccgacccagttttatggagtgcattgcctcaagagcctagccggagc gctaggctacatacttgccgcaccggtatgaggggatatagtactcgcactgcgctgíctagtgagatgggcagtgctgcccataaac aactggctgctcagccatttgttggcggaccattctgggggggccagcaatgcctgactttcgggtagggtgaaaactgaacaaagac taccaaaacagaatttcttcctccttggaggtaagcgcaggccggcccgcctgcgcccacatggcgctccgaacacctccatagctgt aagggcgcaaacatggccggactgttgtcagcactctttcatggccatacaaggtcatgtcgagattagtgctgagtaagacactatca ccccatgttcgattgaagccgtgacttcatgccaacctgcccctgggcgtagcagacgtatgccatcatgaccactagccgacatgcg ctgtcttttgccaccaaaacaactggtacaccgctcgaagtcgtgccgcacacctccgggagtgagtccggcgactccíccccggcg ggccgcggccctacctgggtagggtcgccatacgcccacgaccaaacgacgcaggaggggattggggtagggaatcccaaccag cctaaccaagacggcacctataataataggtggggggactaacagccctatatcgcaagctttgggtgcctatcttgagaagcacgag ttggagtggctgtgtacggtcgaccctaaggtgggtgtgccgcagcctgaaacaaagcgtctagcagctgcttctataatgtgtcagcc gttgtgtttcagítatattgtatgctattgtttgttcgtgctagggtggcgcaggcccacctactgtggcgggccattggttggtgcttgaatt gcctcaccatctaaggtctgaacgctcactcaaacgcctttgtacaactgcagaactttccttggcgctgcaactacagtgtgcaaacca gcacatagcactcccttacatcacccagcagtacaaca
SEQ ID NO: 2
Promotor de nitrato reductasa de Chlorella ellipsoidea de AY307383
cgctgcgcaccagggccgccagctcgctgatgtcgctccaaatgcggtcccccgattttttgttcttcatcttctccaccttggtggccttc ttggccagggccttcagctgcatgcgcacagaccgttgagctcctgatcagcatcctcaggaggccctttgacaagcaagcccctgtg caagcccattcacggggtaccagtggtgctgaggtagatgggtttgaaaaggattgctcggtcgattgctgctcatggaattggcatgt gcatgcatgttcacaatatgccaccaggctttggagcaagagagcatgaatgccttcaggcaggttgaaagttcctgggggtgaaga£ gcagggccgaggattggaggaggaaagcatcaagtcgtcgctcatgctcatgttttcagtcagagtttgccaagctcacaggagcag agacaagactggctgctcaggtgttgcatcgtgtgtgtggtgggggggggggggttaatacggtacgaaatgcacttggaattcccac ctcatgccagcggacccacatgcttgaattcgaggcctgtggggtgagaaatgctcactctgccctcgttgctgaggtacttcaggccj ctgagctcaaagtcgatgccctgctcgtctatcagggcctgcacctctgggctgaccggctcagcctccttcgcgggcatggagtagg cgccggcagcgttcatgtccgggcccagggcagcggtggtgccataaatgtcggtgatggtggggaggggggccgtcgccacaci attgccgttgctggctgacgcatgcacatgtggcctggctggcaccggcagcactggtctccagccagccagcaagtggctgttcag gaaagcggccatgttgttggtccctgcgcatgtaattccccagatcaaaggagggaacagcttggatttgatgtagtgcccaaccgga ctgaatgtgcgatggcaggtccctttgagtctcccgaattactagcagggcactgtgacctaacgcagcatgccaaccgcaaaaaaat gattgacagaaaatgaagcggtgtgtcaatatttgctgtatttattcgttítaatcagcaaccaagttcgaaacgcaactatcgtggtgatc: agtgaacctcatcagacttacctcgttcggcaaggaaacggaggcaccaaattccaatttgatattatcgcttgccaagctagagctgat ctttgggaaaccaactgccagacagtggactgtgatggagtgccccgagtggtggagcctcttcgattcggttagtcattactaacgtg aaccctcagtgaagggaccatcagaccagaaagaccagatctcctcctcgacaccgagagagtgttgcggcagtaggacgacaag
SEQ ID NO: 3
Levadura sacarosa invertasa
M T N E T S D R P L V H F T P N K G W M N D P N G L W Y D E K D A K W H L Y F Q Y N P N D T V W G T P L F
W G H A T S D D L T N W E D Q P IA IA P K R N D S G A F S G S M V V D Y N N T S G F F N D T ID P R Q R C V A I
W T Y N T P E S E E Q Y IS Y S L D G G Y T F T E Y Q K N P V L A A N S T Q F R D P K V F W Y E P S Q K W IM T
A A K S Q D Y K IE IY S S D D L K S W K L E S A F A N E G F L G Y Q Y E C P G L IE V P T E Q D P S K S Y W V M
F IS 1N P G A P A G G S F N Q Y F V G S F N G T H F E A F D N Q S R V V D F G K D Y Y A L Q T F F N T D P T Y G S
A L G IA W A S N W E Y S A F V P T N P W R S S M S L V R K F S L N T E Y Q A N P E T E L IN L K A E P IL N IS N
A G P W S R F A T N T T L T K A N S Y N V D L S N S T G T L E F E L V Y A V N T T Q T IS K S V F A D L S L W F K
G L E D P E E Y L R M G F E V S A S S F F L D R G N S K V K F V K E N P Y F T N R M S V N N Q P F K S E N D L S Y
Y K V Y G L L D Q N IL E L Y F N D G D V V S T N T Y F M T T G N A L G S V N M T T G V D N L F Y ID K F Q V R
E V K
SEQ ID NO: 4
Señal de secreción de levadura
MLLQAFLFLLAGFAAKISAS
SEQ ID NO: 5
Señal de secreción de plantas superiores
MANKSLLLLLLLGSLASG
SEQ ID NO: 6
Consenso de la señal de secreción eucariota
MARLPLAALG
SEQ ID NO: 7
Combinación de señal de secreción de planta/eucariota superior
MANKLLLLLLLLLLPLAASG
SEQ ID NO: 8
S. cerevisiae sacarosa invertasa NP 012104
gaattccccaacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgaga cttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaag gtggcacctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggaccccc acccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgaacatggtggagcacgac actctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaac ctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccatcattgcgat aaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaaga agacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgca agacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctggcgcgcc atatcaATGCTTCTTCAGGCCTTTCTTTTTCTTCTTGCTGGTTTTGCTGCCAAGATCAG
CGCCTCTATGACGAACGAAACCTCGGATAGACCACTTGTGCACTTTACACCAAAC
AAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACGAAAAAGATGCCAAG
TGGCATCTGTACTTTCAATACAACCCGAACGATACTGTCTGGGGGACGCCATTGT
TTTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAATTGGGAGGACCAACCAATAG
CTATCGCTCCGAAGAGGAACGACTCCGGAGCATTCTCGGGTTCCATGGTGGTTGA
CTACAACAATACTTCCGGCTTTTTCAACGATACCATTGACCCGAGACAACGCTGC
GTGGCCATATGGACTTACAACACACCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCGTAT
AGCCTGGACGGTGGATACACTTTTACAGAGTATCAGAAGAACCCTGTGCTTGCTG
CAAATTCGACTCAGTTCCGAGATCCGAAGGTCTTTTGGTACGAGCCCTCGCAGAA
GTGGATC ATG AC AGCGGC A A AGTC AC AGG ACT AC AAG ATCG A A ATTT ACTCGTC
TGACGACCTTAAATCCTGGAAGCTCGAATCCGCGTTCGCAAACGAGGGCTTTCTC
GGCT ACC A AT ACGAATGCCC AGGCCTG AT AG AGGTCCC A AC AG AGC A AGATCCC
AGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTTATTTCCATTAATCCAGGAGCACCGGCAGGAG
GTTCTTTTAATCAGTACTTCGTCGGAAGCTTTAACGGAACTCATTTCGAGGCATTT
GATAACCAATCAAGAGTAGTTGATTTTGGAAAGGACTACTATGCCCTGCAGACTT
TCTTCAATACTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGCATTGCGTGGGCTTCTAA
CTGGGAGTATTCCGCATTCGTTCCTACAAACCCTTGGAGGTCCTCCATGTCGCTC
GTGAGGAAATTCTCTCTCAACACTGAGTACCAGGCCAACCCGGAAACCGAACTC
AT A AACCTGA A AGCCGA ACCGATCCTGAACATT AGCAACGCTGGCCCCTGG AGC
CGGTTTGCAACCAACACCACGTTGACGAAAGCCAACAGCTACAACGTCGATCTTT
CG AAT AGCACCGGT AC ACTTGAATTTGA ACTGGTGT ATGCCGTC A AT ACC ACCCA
AACGATCTCGAAGTCGGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTTAAAGGCCTGGAA
GACCCCGAGGAGTACCTCAGAATGGGTTTCGAGGTTTCTGCGTCCTCCTTCTTCCT
TG ATCGCGGG AAC AGC A AAGT A AA ATTTGTT AAGG AG A ACCC AT ATTTT ACC A A
CAGGATGAGCGTTAACAACCAACCATTCAAGAGCGAAAACGACCTGTCGTACTA
CAAAGTGTATGGTTTGCTTGATCAAAATATCCTGGAACTCTACTTCAACGATGGT
GATGTCGTGTCCACCAACACATACTTCATGACAACCGGGAACGCACTGGGCTCCG
TGAACATGACGACGGGTGTGGATAACCTGTTCTACATCGACAAATTCCAGGTGA
GGGAAGTCAAGTGAgatctgtcgatcgacaagctcgagtttctccataataatgígtgagtagttcccagataagggaatta gggttcctatagggtttcgctcatgtgttgagcatataagaaacccttagtatgtatttgtatttgtaaaatacttctatcaataaaatttctaatt cctaaaaccaaaatccagtactaaaatccagatcccccgaattaa
SEQ ID NO: 9
TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC
SEQ ID NO: 10
CAGTGAGCTATTACGCACTC
SEQ ID NO: 11
UTEX 329 Prototheca kruegani
TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAGTTAAAAAGAGTGGCATGGTTAAAGAAAATACT
CTGGAGCCATAGCGAAAGCAAGTTTAGTAAGCTTAGGTCATTCTTTTTAGACCCG
AAACCGAGTGATCTACCCATGATCAGGGTGAAGTGTTAGTAAAATAACATGGAG
GCCCG AACCG ACT AATGTTGA A A A ATT AGCGG ATG A ATTGTGGGT AGGGGCG A A
AAACCAATCGAACTCGGAGTTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTTAGGCGCAGC
AGTAGCAGTACAAATAGAGGGGTAAAGCACTGTTTCTTTTGTGGGCTTCGAAAGT
TGTACCTCAAAGTGGCAAACTCTGAATACTCTATTTAGATATCTACTAGTGAGAC
CTTGGGGGATAAGCTCCTTGGTCAAAAGGGAAACAGCCCAGATCACCAGTTAAG
GCCCC A AA ATG AA A ATGAT AGTG ACT A AGG ATGTGGGT ATGT C A AA ACCTCC AG
C AGGTT AGCTT AG A AGC AGC A ATCCTTTCA AG AGTGCGT A AT AGCTCACTG
SEQ ID NO: 12
UTEX 1440 Prototheca wickerhamii
TGTTG AAGA ATG AGCCGGCG ACTT AA AAT A AATGGC AGGCT A AG AG ATTT AATA
ACTCGAAACCTAAGCGAAAGCAAGTCTTAATAGGGCGTCAATTTAACAAAACTT
TAAATAAATTATAAAGTCATTTATTTTAGACCCGAACCTGAGTGATCTAACCATG
GTCAGGATGAAACTTGGGTGACACCAAGTGGAAGTCCGAACCGACCGATGTTGA
AAAATCGGCGGATGAACTGTGGTTAGTGGTGAAATACCAGTCGAACTCAGAGCT
AGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTGAGGCGCAGCAATATATCTCGTCTATCTAGG
GGTAAAGCACTGTTTCGGTGCGGGCTATGAAAATGGTACCAAATCGTGGCAAAC
TCTGAAT ACT AGA AATG ACG AT AT ATT AGTGAG ACT ATGGGGG AT A AGCTCC AT
AGTCGAGAGGGAAACAGCCCAGACCACCAGTTAAGGCCCCAAAATGATAATGAA GTGGT AA AGGAGGTG A A A ATGC A A AT AC A ACC AGGAGGTTGGCTT AGA AGC AGC CATCCTTTA A AG AGTGCGT AAT AGCTCACTG
SEQ ID NO: 13
UTEX 1442 Prototheca stagnora
TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAGTTAAAAAAAATGGCATGGTTAAAGATATTTCT
CTG A AGCC AT AGCG A A AGC A AGTTTT AC A AGCT AT AGTC ATTTTTTTT AG ACCCG
AAACCGAGTGATCTACCCATGATCAGGGTGAAGTGTTGGTCAAATAACATGGAG
GCCCGAACCGACTAATGGTGAAAAATTAGCGGATGAATTGTGGGTAGGGGCGAA
AAACCAATCGAACTCGGAGTTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTTAGGCGCAGC
AGTAGCAACACAAATAGAGGGGTAAAGCACTGTTTCTTTTGTGGGCTTCGAAAGT
TGTACCTCAAAGTGGCAAACTCTGAATACTCTATTTAGATATCTACTAGTGAGAC
CTTGGGGG AT AAGCTCCTTGGTCA AA AGGG A A ACAGCCC AG ATC ACCAGTT AAG
GCCCCAAAATGAAAATGATAGTGACTAAGGACGTGAGTATGTCAAAACCTCCAG
CAGGTTAGCTTAGAAGCAGCAATCCTTTCAAGAGTGCGTAATAGCTCACTG
SEQ ID NO: 14
UTEX 288 Prototheca moriformis
TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAGTTAAAAAGAGTGGCATGGTTAAAGATAATTCT CTGGAGCCATAGCGAAAGCAAGTTTAACAAGCTAAAGTCACCCTTTTTAGACCCG AAACCGAGTGATCTACCCATGATCAGGGTGAAGTGTTGGTAAAATAACATGGAG GCCCGAACCGACTAATGGTGAAAAATTAGCGGATGAATTGTGGGTAGGGGCGAA AAACCAATCGAACTCGGAGTTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTTAGGCGCAGC AGTAGCAACACAAATAGAGGGGTAAAGCACTGTTTCTTTTGTGGGCTTCGAAAGT TGTACCTCAAAGTGGCAAACTCTGAATACTCTATTTAGATATCTACTAGTGAGAC CTTGGGGG AT AAGCTCCTTGGTCAAAAGGGA AACAGCCCAGATCACCAGTT AAG GCCCCAAAATGAAAATGATAGTGACTAAGG ATGTGGGTATGTTAAAACCTCCAG
CAGGTT AGCTT AGA AGC AGC A ATCCTTTCA AG AGTGCGT AAT AGCTCACTG SEQ ID NO: 15
UTEX 1439, UTEX 1441, UTEX 1435, UTEX 1437 Prototheca moriformis
TGTTGAAGA ATG AGCCGGCGACTT AA AAT A AATGGC AGGCT A AGAGA ATT A AT A
ACTCG A A ACCT A AGCG A A AGC AAGTCTT A AT AGGGCGCT A ATTT A AC A A AAC AT
T AA AT A A A ATCT A AAGTC ATTT ATTTT AG ACCCGAACCTG AGTGATCT A ACC ATG
GTCAGGATGAAACTTGGGTGACACCAAGTGGAAGTCCGAACCGACCGATGTTGA
AAAATCGGCGGATGAACTGTGGTTAGTGGTGAAATACCAGTCGAACTCAGAGCT
AGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTG AGGCGC AGC A AT ATATCTCGTCT ATCT AGG
GGTAAAGCACTGTTTCGGTGCGGGCTATGAAAATGGTACCAAATCGTGGCAAAC
TCTGA AT ACT AGAAATG ACG ATAT ATT AGTG AGACT ATGGGGG AT AAGCTCC AT
AGTCG AG AGGGAA AC AGCCC AGACC ACC AGTT A AGGCCCC A AA ATGAT AATG AA
GTGGTAAAGGAGGTGAAAATGCAAATACAACCAGGAGGTTGGCTTAGAAGCAGC
C ATCCTTT A A AG AGTGCGTA AT AGCTCACT G
SEQ ID NO: 16
UTEX 1533 Prototheca wickerhamii
TGTTG A AG AATGAGCCGTCGACTT A A AAT A AATGGC AGGCT AAG AG AATT A ATA
ACTCG A A ACCT A AGCG A A AGC AAGTCTT AAT AGGGCGCT A ATTT A ACA A AAC AT
TAAATAAAATCTAAAGTCATTTATTTTAGACCCGAACCTGAGTGATCTAACCATG
GTCAGGATGAAACTTGGGTGACACCAAGTGGAAGTCCGAACCGACCGATGTTGA
AAAATCGGCGGATGAACTGTGGTTAGTGGTGAAATACCAGTCGAACTCAGAGCT
AGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTGAGGCGCAGCAATATATCTCGTCTATCTAGG
GGTAAAGCACTGTTTCGGTGCGGGCTATGAAAATGGTACCAAATCGTGGCAAAC
TCTGA AT ACT AG A AAT GACGAT AT ATT AGTG AGACT ATGGGGG ATA AGCTCCAT
AGTCG AG AGGGAA AC AGCCC AGACC ACCAGTT A AGGCCCC A AAATGAT AATG A A GTGGTAAAGGAGGTGAAAATGCAAATACAACCAGGAGGTTGGCTTAGAAGCAGC CATCCTTT A A AGAGTGCGT AAT AGCTC ACTG
SEQ ID NO: 17
UTEX 1434 Prototheca moriformis
TGTTGAAGA ATGAGCCGGCGAGTT AA A A AG AGTGGCGTGGTT AA AG A A AATTCT
CTGGAACCATAGCGAAAGCAAGTTTAACAAGCTTAAGTCACTTTTTTTAGACCCG
AAACCGAGTGATCTACCCATGATCAGGGTGAAGTGTTGGTAAAATAACATGGAG
GCCCGAACCGACT AATGGTGA AAA ATT AGCGGATG AATTGTGGGT AGGGGCGAA
AAACCAATCGAACTCGGAGTTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTTAGGCGCAGC
AGTAGCAACACAAATAGAGGGGTAAAGCACTGTTTCTTTTGTGGGCTCCGAAAG
TTGTACCTCA A AGTGGC A A ACTCTGAATACTCT ATTT AG AT ATCT ACT AGTG AG A
CCTTGGGGGATAAGCTCCTTGGTCGAAAGGGAAACAGCCCAGATCACCAGTTAA
GGCCCC A AA ATG A A A ATGAT AGTGACT A AGG ATGTG AGT ATGTCA A A ACCTCC A
GCAGGTT AGCTT AGAAGC AGC AATCCTTTC A AGAGTGCGT AAT AGCTC ACTG
SEQ ID NO: 18
UTEX 1438 Prototheca zopfii
TGTTGA AG A ATGAGCCGGCG AGTT A A A AAG AGTGGC ATGGTT AA AG AA AATTCT
CTGGAGCCAT AGCG AAAGCAAGTTT A AC A AGCTT AAGTCACTTTTTTT AGACCCG
AAACCGAGTGATCTACCCATGATCAGGGTGAAGTGTTGGTAAAATAACATGGAG
GCCCGAACCGACT A ATGGTGAAAA ATT AGCGGATGAATTGTGGGT AGGGGCGA A
AAACCAATCGAACTCGGAGTTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTTAGGCGCAGC
AGTAGCAACACAAATAGAGGGGTAAAGCACTGTTTCTTTCGTGGGCTTCGAAAG
TTGT ACCTC A A AGTG GC A A ACTCTG A AT ACTCT ATTT AG AT ATCT ACT AGTG AG A
CCTTGGGGGATAAGCTCCTTGGTCAAAAGGGAAACAGCCCAGATCACCAGTTAA
GGCCCCAAAATGAAAATGATAGTGACTAAGGATGTGAGTATGTCAAAACCTCCA
GCAGGTTAGCTTAGAAGCAGCAATCCTTTCAAGAGTGCGTAATAGCTCACTG
SEQ ID NO: 19
UTEX 1436 Prototheca moriformis
TGTTGAAGAATGAGCCGGCGACTTAGAAAAGGTGGCATGGTTAAGGAAATATTC
CG AAGCCGT AGC A A AAGCG AGTCTG A AT AGGGCG AT A A AAT ATATT A AT ATTT A
G AATCT AGTCATTTTTTCT AGACCCG AACCCGGGTGATCT AACC ATGACC AGGAT
GAAGCTTGGGTGATACCAAGTGAAGGTCCGAACCGACCGATGTTGAAAAATCGG
CGGATGAGTTGTGGTTAGCGGTGAAATACCAGTCGAACCCGGAGCTAGCTGGTT
CTCCCCGAAATGCGTTGAGGCGCAGCAGTACATCTAGTCTATCTAGGGGTAAAGC
ACTGTTTCGGTGCGGGCTGTG AGAACGGT ACC A AATCGTGGCA A ACTCTG A AT AC
TAGAAATGACGATGTAGTAGTGAGACTGTGGGGGATAAGCTCCATTGTCAAGAG
GGAAACAGCCCAGACCACCAGCTAAGGCCCCAAAATGGTAATGTAGTGACAAAG
GAGGTGAAAATGCAAATACAACCAGGAGGTTGGCTTAGAAGCAGCCATCCTTTA
AAGAGTGCGTAATAGCTCACTG
SEQ ID NO: 20
Chicorium intybus invertase: N° de acceso Genbank Y11124
MSNSSNASESLFPATSEQPYRTAFHFQPPQNWMNDPNGPMCYNGVYHLFYQYNPFG
PLWNLRMYWAHSVSHDLINWIHLDLAFAPTEPFDINGCLSGSATVLPGNKPIMLYTG
IDTENRQVQNLAVPKDLSDPYLREWVKHTGNPIISLPEEIQPDDFRDPTTTWLEEDGT
WRLLVGSQKDKTGIAFLYHSGDFVNWTKSDSPLHKVSGTGMWECVDFFPVWVDST
NGVDTSITNPSNRVKHVLKLGIQDHGKDCYLIGKYSADKENYVPEDELTLSTLRLDY
GMYYASKSFFDPVKNRRIMTAWVNESDSEADVIARGWSGVQSFPRSLWLDKNQKQ
LLQWPIEEIEMLHQNEVSFHNKKLDGGSSLEVLGITASQADVKISFKLANLEEAEELD
PSWVDPQLICSENDASKKGKFGPFGLLALASSDLREQTAIFFRVFRKNGRYVVLMCS
DQSRSSMKNGIEKRTYGAFVDIDPQQDEISLRTLIDHSIVESFGGRGKTCITTRVYPTL
AIGEQARLFAFNHGTESVEISELSAWSMKKAQMKVEEP
SEQ ID NO: 21
Schizosaccharomyces pombe Invertasa: N° de acceso Genbank AB011433
MFLKYILASGICLVSLLSSTNAAPRHLYVKRYPVIYNASNITEVSNSTTVPPPPFVNTT
APNGTCLGNYNEYLPSGYYNATDRPKIHFTPSSGFMNDPNGLVYTGGVYHMFFQYS
PKTLTAGEVHWGHTVSKDLIHWENYPIAIYPDEHENGVLSLPFSGSAVVDVHNSSGL
FSNDTIPEERIVLIYTDHWTGVAERQAÍAYTTDGGYTFKKYSGNPVLDINSLQFRDPK
VIWDFDANRWVMIVAMSQNYGIAFYSSYDLIHWTELSVFSTSGYLGLQYECPGMAR
VPVEGTDEYKWVLFISINPGAPLGGSVVQYFVGDWNGTNFVPDDGQTRFVDLGKDF
YASALYHSSSANADVIGVGWASNWQYTNQAPTQVFRSAMTVARKFTLRDVPQNPM
TNLTSLIQTPLNVSLLRDETLFT APVINSSSSLSGSPITLPSNT AFEFN VTLSIN YTEGCT
TGYCLGRIIIDSDDPYRLQSISVDVDFAASTLVINRAKAQMGWFNSLFTPSFANDIYIY
GNVTLYGIVDNGLLELYVNNGEKTYTNDFFFLQGATPGQISFAAFQGVSFNNVTVTP
LKTIWNC
SEQ ID NO: 22
Picha anomala beta-fructofuranosidasa (invertasa): N° de acceso Genbank X80640
MIQLSPLLLLPLFSVFNSIADASTEYLRPQIHLTPDQGWMNDPNGMFYDRKDKLWHV
YFQHNPDKKSIWATPVTWGHSTSKDLLTWDYHGNALEPENDDEGIFSGSVVVDRNN
TSGFFNDSTDPEQRIV AIYTNN AQLQTQEIA YSLDKG YSFIK YDQNPVEN VN S SQQRD
PKVLWHDESNQWIMVVAKTQEFKVQÍYGSPDLKKWDLKSNFTSNGYLGFQYECPG
LFKLPIENPLNDT VTS KWVLLLAINPGSPLGGSINEYFIGDFDGTTFHPDDG ATRFMDI
GKDFYAFQSFDNTEPEDGALGLAWASNWQYANTVPTENWRSSMSLVRNYTLKYVD
VNPENYGLTLIQKPVYDTKETRLNETLKTLET1NEYEVNDLKLDKSSFVATDFNTERN
ATGVFEFDLKFTQTDLKMGYSNMTTQFGLYIHSQTVKGSQETLQLVFDTLSTTWYID
RTTQHSFQRNSPVFTERISTYVEKIDTTDQGNVYTLYGVVDRNILELYFNDGSIAMTN
TFFFREG KIPT SFEV V CDSEKS FFFIDELS VRELARK
SEQ ID NO: 23
Debaryomyces occidentalis Invertasa: N° de acceso Genbank X17604
MVQVLSVLVIPLLTLFFGYVASSS1DLSVDTSEYNRPLIHFTPEKGWMNDPNGLFYDK
TAKLWHLYFQYNPNATAWGQPLYWGHATSNDLVHWDEHEIAIGPEHDNEGIFSGSI
VVDHNNTSGFFNSSIDPNQRIVAIYTNNIPDLQTQDIAFSLDGGYTFTKYENNPVIDVS
SNQFRDPKVFWHERFKSMDHGCSELARVKIQIFGSANLKNWVLNSNFSSGYYGNQY
GMSRLIEVPIENSDKSKWVMFLA1NPGSPLGGSINQYFVGDFDGFQFVPDDSQTRFVD
IGKDFY AFQTFSE VEHG VLGLA W ASN WQ YADQVPTNPWRS STS LARNYTLRYVIQM
LKLTANIDKSVLPDSINVVDKLKKKNVKLTNKKPIKTNFKGSTGLFDFNITFKVLNLN
VSPGKTHFDILINSQELNSSVDSIKIGFDSSQSLFYIDRHIPNVEFPRKQFFTDKLAAYL
EPLDYDQDLRVFSLYGIVDKNI1ELYFNDGTVAMTNTFFMGEGKYPHDIQIVTDTEEP
LFELESVIIRELNK
SEQ ID NO: 24
Oryza sativa Invertasa: N° de acceso de Genbank AF019113
MATSRLTPAYDLKNAAAAVYTPLPEQPHSAEVEIRDRKPFKIISAIILSSLLLLALILVA
VNYQAPPSHSSGDNSQPAAVMPPSRGVSQGVSEKAFRGASGAGNGVSFAWSNLMLS
WQRTSYHFQPVKNWMNDPNGPLYYKGWYHLFYQYNPDSAVWGNITWGHAVSTD
LINWLHLPFAMVPDQWYDVNGVWTGSATILPDGRIVMLYTGDTDDYVQDQNLAFP
ANLSDPLLVDWVKYPNNPVIYPPPGIGVKDFRDPTTAGTAGMQNGQRLVTIGSKVG
KTGISLVYETTNFTTFKLLYGVLHAVPGTGMWECVDLYPVSTTGENGLDTSVNGLG
VKHVLKTSLDDDKHDYYALGTYDPVKNKWTPDNPDLDVGIGLRLDYGKYYAARTF
YDQNKQRRILWGWIGETDLEAVDLMKGWASLQAIPRTIVFDKKTGTNVLQRPEEEV
ESWSSGDPITQRRIFEPGSVVPIHVSGATQLDrrASFEVDETLLETTSESHDAGYDCSN
SGGAGTRGSLGPFGLLVVADEKLSELTPVYLYVAKGGDGKAKAHLCAYQTRSSMAS
GVEKEVYGSAVPVLDGENYSARILIDHSIVESFAQAGRTCVRSRDYPTKDIYGAARCF
FFNNATEASVRASLKAWQMKSFIRPYPFIPDQKS
SEQ ID NO: 25
Allium cepa Invertasa: N° de acceso Genbank AJ006067
M SSD D L E SPPS SY L PIPPSD E FH D Q PPPL R SW L R L L SIPL A L M FL L FL A T FL S N LE S PPSD
SG L V SD PV T FD V N PA V V R R G K D A G V SD K T SG V D SG FV L D PV A V D A N SV V V H R G K D
A G V SD K TSG V D SG L L K D SPL G PY PW T N Q M L SW Q R T G FH FQ PV K N W M N D PN G PL Y Y
K G W Y H FFY Q Y N PEG A V W G N IA W G H A V SR D L V H W T H L PL A M V PD Q W Y D IN G V W T
G SA T1LPD G Q 1V M LY TG A TN ESV Q V Q N LA V PA D Q SD TLLLR W K K SEA N PB LV PPPG IG
D K D FR D PTTA W Y E PSD D T W R IV IG SK D SSH SG IA IV Y ST K D FIN Y K L IPG IL H A V E R V G
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A Q N TW V PD D A SV D V G IG L R Y D W G K FY A SK T FY D H A K K R R IL W SW IG E T D SE T A D IA
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H SIV ESFA Q G G R A SA T SR V Y PTE A IY N N A R V FV FN N A TG A K V T A Q SL K V W H M ST A I
N EIY D PA TSV M
SEQ ID NO: 26
Beta vulgaris subsp. vulgaris Invertasa; N° de acceso a Genbank AJ278531
LF Y Q YNPNG VIWGPP V W GHSTS KDLVN W VPQPLTMEPEMA ANINGS W SGS ATILPG NKPAILFTGLDPKYEQVQVLAYPKDTSDPNLKEW FLAPQNPVM FPTPQNQINATSFR DPTTAW RLPDGVW RLLIGSKRGQRGLSLLFRSRDFVHW VQAKHPLYSDKLSGM W E CPDFFPVYANGDQM GVDTSIIGSHVKHVLKNSLDITKHDIYTIGDYNIKKDAYTPDIG YM NDSSLRYDYGKYYASKTFFDDAKKERILLGW ANESSSVEDDIKKGW SGIHTIPRK IW LDKLGKQLIQW PIANIEKLRQKPVNIYRKVLKGGSQIEVSGITAAQADVEISFKIKD LKNVEKFDASW TSPQLLCSKKGASVKGGLGPFGLLTLASXGLEEYTAVFFRIFKAYD NKFVVLM CSDQSRSSLNPTNDKTTYGTFVDVNPIREGLSLRVLIDHSVVESFGAKGK NVITARVYPTLAINEKAHLYVFNRGTSNVEITGLTAW SM KKANIA
SEQ ID NO: 27
Bifidobacterium breve UCC2003 beta-fructofuranosidasa (invertasa): N° de acceso Genbank AAT28190
MTDFTPETPVLTPIRDHAAELAKAEAGVAEMAAKRNNRWYPKYHIASNGGW1NDPN
GLCFYKGRWHVFYQLHPYGTQWGPMHWGHVSSTDMLNWKREPIMFAPSLEQEKD
GVFSGSAVIDDNGDLRFYYTGHRWANGHDNTGGDWQVQMTALPDNDELTSATKQ
GMIIDCPTDKVDHHYRDPKVWKTGDTWYMTFGVSSEDKRGQMWLFSSKDMVRWE
YERVLFQHPDPDVFMLECPDFFPIKDKDGNEKWVIGFSAMGSKPSGFMNRNVNNAG
YMIGTWEPGGEFKPETEFRLWDCGHNYYAPQSFNVDGRQIVYGWMSPFVQPIPMED
DGWCGQLTLPREITLDDDGDVVTAPVAEMEGLREDTLDHGSITLDMDGEQVIADDA
EAVEIEMTIDLAASTADRAGLKIHATEDGAYTYVAYDDQIGRVVVDRQAMANGDH
GYRAAPLTDAELASGKLDLRVFVDRGSVEVYVNGGHQVLSSYSYASEGPRAIKLVA
EFGNLKVESLKLHHMKSIGLE
SEQ ID NO: 28
Saccharomyces cerevisiae Invertasa: N° de acceso Genbank NP_012104
MLLQAFLFLLAGFAAKISASMTNETSDRPLVHFTPNKGWMNDPNGLWYDEKDAKW
HLYFQYNPNDTVWGTPLFWGHATSDDLTNWEDQPIA1APKRNDSGAFSGSMVVDY
NNTSGFFNDTIDPRQRCVAIWTYNTPESEEQYISYSLDGGYTFTEYQKNPVLAANSTQ
FRDPKVFWYEPSQKWIMTAAKSQDYKIEIYSSDDLKSWKLESAFANEGFLGYQYECP
GLIEVPTEQDPSKSYWVMFISÍNPGAPAGGSFNQYFVGSFNGTHFEAFDNQSRVVDFG
KDYYALQTFFNTDPTYGSALGIAWASNWEYSAFVPTNPWRSSMSLVRKFSLNTEYQ
ANPETELINLKAEPILNISNAGPWSRFATNTTLTKANSYNVDLSNSTGTLEFELVYAV
NTTQTISKSVFADLSLWFKGLEDPEEYLRMGFEVSASSFFLDRGNSKVKFVKENPYFT
NRMSVNNQPFKSENDLSYYKVYGLLDQNILELYFNDGDVVSTNTYFMTTGNALGSV
NMTTGVDNLFYLDKFQVREVK
SEQ ID NO: 29
Zymomonas mobilis Invertasa A; N° de acceso de Genbank AY171597
MESPSYKNLIKAEDAQKKAGKRLLSSEWYPGFHVTPLTGWMNDPNGLIFFKGEYHL
FYQYYPFAPVWGPMHWGHAKSRDLVHWETLPVALAPGDLFDRDGCFSGCAVDNN
GVLTLIYTGHIVLSNDSPDAIREVQCMATSIDGIHFQKEGIVLEKAPMPQVAHFRDPR
VWKENDHWFMVVGYRTDDEKHQGIGHVALYRSENLKDWIFVKTLLGDNSQLPLGK
RAFMWECPDFFSLGNRSVLMFSPQGLKASGYKNRNLFQNGYILGKWQAPQFTPETS
FQELDYGHDFYAAQRFEAKDGRQILIAWFDMWENQKPSQRDGWAGCMTLPRKLDL
IDNKIVMTPVREMEILRQSEKIESVVTLSDAEHPFTMDSPLQEIELIFDLEKSSAYQAG
LALRCNGKGQETLLYIDRSQNRIILDRNRSGQNVKGIRSCPLPNTSKVRLHIFLDRSSIE
IFVGDDQTQGLYSISSR1FPDKDSLKGRLFAIEGYAVFDSFKRWTLQDANLAAFSSDA
C
SEQ ID NO: 30
SAG 2214 Chlorella luteoviridis
TGTTG A AGA ATG AGCCGGCG ACTT AT AGG A AGTGGCTTGGTT AAGG AT ACTTTCC
GAAGCCTAAGCGAAAGCAAGTTGTAACAATAGCGATATACCTCTTTGTAGGTCA
GTCACTTCTTATGGACCCGAACCCGGGTGATCTAACCATGACCAGGATGAAGCTT
GGGTAACACCAAGTGAAGGTCCGAACTCTTCGATCTTTAAAAATCGTGAGATGA
GTTATGGTTAGGGGTAAATCTGGCAGTTTTGCCCCGCAAAAGGGTAACCTTTTGT
AATT ACTG ACTCAT A ACGGTG AAGCCT AAGGCGTT AGCT ATGGT A ATACCGTGGG
AAGTTTCAATACCTTCTTGCATATTTTTTATTTGCACCTTTAGTGCAAACAGTGTA
AAGAAAGCGTTTTGAAACCCCTT AACGACT AATTTTTTGCTTTTGCAAG AACGTC
ATATATTTTATAGCTTTAATCATAAAACTATGTTAGCACTTCGTGCTAATGTGCTA
ATGTGCTAATCAAATGAAAAGTGTTCTTAAAAGTGAGTTGAAGGTAGAGTCTAAT
CTTGCCTGAAAGGGCAAGCTGCACATTTTTTTTTGAATGTGCAACAATGGAAATG
CCAATCGAACTCGGAGCTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGTGTTGAGGCGCAGCGAT
TCATGATTAGTACGGTGTAGGGGTAAAGCACTGTTTCGGTGCGGGCTGTGAAAAC
GGT ACC AA ATCGTGGC AA ACT AAG AAT ACT ACGCTTGT AT ACC ATGGATC AGTG
AGACT ATGGGGGAT AAGCTCCATAGTCA AG AGGGAA AC AGCCCAGATC ACC AGT
TAAGGCCCCAAAATGACAGCTAAGTGGCAAAGGAGGTGAAAGTGCAGAAACAA
CC AGGAGGTTTGCCC AG AAGC AGCC ATCCTTT AAAG AGTGCGT AAT AGCTCACTG
SEQ ID NO: 31
Promotor de actina Chlorella prototecoides endógeno y 5'UTR
GAATTCGAGTTTAGGTCCAGCGTCCGTGGGGGGGGACGGGCTGGGAGCTTGGGC
CGGGAAGGGCAAGACGATGCAGTCCCTCTGGGGAGTCACAGCCGACTGTGTGTG
TTGCACTGTGCGGCCCGCAGCACTCACACGCAAAATGCCTGGCCGACAGGCAGG
CCCTGTCCAGTGCAACATCCACGGTCCCTCTCATCAGGCTCACCTTGCTCATTGAC
ATAACGGAATGCGTACCGCTCTTTCAGATCTGTCCATCCAGAGAGGGGAGCAGG
CTCCCCACCGACGCTGTCAAACTTGCTTCCTGCCCAACCGAAAACATTATTGTTT
GAGGGGGGGGGGGGGGGGGCAGATTGCATGGCGGGATATCTCGTGAGGAACAT
CACTGGGACACTGTGGAACACAGTGAGTGCAGT ATGCAGAGCATGT ATGCTAGG
GGTCAGCGCAGGAAGGGGGCCTTTCCCAGTCTCCCATGCCACTGCACCGTATCCA
CGACTCACCAGGACCAGCTTCTTGATCGGCTTCCGCTCCCGTGGACACCAGTGTG
TAGCCTCTGGACTCCAGGTATGCGTGCACCGCAAAGGCCAGCCGATCGTGCCGAT
TCCTGGGGTGGAGGATATGAGTCAGCCAACTTGGGGCTCAGAGTGCACACTGGG
GCACGATACGAAACAACATCTACACCGTGTCCTCCATGCTGACACACCACAGCTT
CGCTCCACCTGAATGTGGGCGCATGGGCCCGAATCACAGCCAATGTCGCTGCTGC CATAATGTGATCCAGACCCTCTCCGCCCAGATGCCGAGCGGATCGTGGGCGCTGA
ATAGATTCCTGTTTCGATCACTGTTTGGGTCCTTTCCTTTTCGTCTCGGATGCGCG
TCTCGAAACAGGCTGCGTCGGGCTTTCGGATCCCTTTTGCTCCCTCCGTCACCATC CTGCGCGCGGGC A AGTTGCTTGACCCTGGGCTGGT ACC AGGGTTGGAGGGT ATT A
CCGCGTCAGGCCATTCCCAGCCCGGATTCAATTCAAAGTCTGGGCCACCACCCTC
CGCCGCTCTGTCTGATCACTCCACATTCGTGCATACACTACGTTCAAGTCCTGATC CAGGCGTGTCTCGGGACAAGGTGTGCTTGAGTTTGAATCTCAAGGACCCACTCCA GCACAGCTGCTGGTTGACCCCGCCCTCGCAACTCCCTACCArGrcrGCrGgtaggtcca gggatctttgccatgcacacaggaccccgtttgtgggggtccccggtgcatgctgtcgctgtgcaggcgccggtgtggggcctgggc cccgcgggagctcaactcctccccatatgcctgccgtccctcccacccaccgcgacctggccccctttgcag AGGAAGGCGA AGTCAGCGCCATCGTGTGCGATAATGGATCCGC
SEQ ID NO: 32
promotor de EFla Chlorella protothecoides endógeno y 5'UTR
GAATTCGCCCTTGAGTTTAGGTCCAGCGTCCGTGGGGGGGGCGTGAGACTCCCCC CTGACCTTCGT ATGGCAGGG ACTCCT ACTTGCCA AGT AATCAGTTG AC A AT GCC A CTTCAATGCTCGTTGTGGTACACTGACGCGGGTCTAACATACTGGGAAGCATGAA TTGCCGACATGGACTCAGTTGGAGACAGTAACAGCTCTTTGTGTTCTATCTTCAG G AAC ACATTTGGCAGCGC ACCC AT AC AGTGGCGCAC ACGCAGCTGT ACCTG ATG
TGGCTCTATTCCCACATGTTTCAACTTGATCCAAAAGTCACTCAGACTCTCAGCA
GCTAGACTTGATCGCATCTTTGGCCATGAAGATGCTTGCGCAACTCTAGGAATGG GACGAGAAAAGAGCCTGCTCTGATCGGATATTTCCATTCTCTGGATGGGACTGAG ATGATTCTGAAGAAATGCTGCTCGACTTATTTGGAAGAACAGCACCTGACGCATG
CTTTGAGGCTGCTGTGGCTGGGATGTGCTGTATTTGTCAGCATTGAGCATCTACG
GGT AG ATGGCC AT A ACC ACGCGCTGCCT ATC ATGCGGTGGGTTGTGTGG A A A AC
GTACAATGGACAGAAATCAATCCCATTGCGAGCCTAGCGTGCAGCCATGCGCTC
CCTCTGTAGCCCCGCTCCAAGACAAAGCCAGCCAATGCCAGAACCCACATAGAG AGGGT ATCTTCCT AATGACCTCGCCC ATC ATTTCCTCC A A ATT A ACT AT AATGCCT
TGATTGTGGAGTTGGCTTTGGCTTGCAGCTGCTCGCGCTGGCACTTTTGTAGGCA
GCACAGGGTATGCCAGCGCCGAACTTTGTGCCCTTGAGCAGGCCACAAGGGCAC AAG ACT AC ACC ATGCAGCTGGT ATACTTGGA ACTG AT ACC ATTCTT ACC A AGCAA GGCACAGCACAGCCTGCACCGACTCACTTTGCTTGAGCGGGGCACAGCGCCGCG ACTGATCCTGCGAGCTGTGGGGAGTTCCGACTGTTCTGGACCTCGGTCTCTGAAA GATGTGTACGATGGGATCAAGTCATTCAAGTATGCTCTTCACATGAGCAATCGGG GGAGACACGGTGGCCCTAAAGGTGTTCATCTGATTCAAGTGTAGTGGGGGGGTG
CTGTTTGTCCCGGGGCGCCCCCCGCTCCCCGACCCCGGAGAAGGGCCCCAGAGG
ACTCGGCCGCCCACAGAGGAATAACCGGGCGTGGCTCGGCCCTGCGCCTCCCTCT TTCA AT ATTTCACCTGGTGTTC AGTGC ACGG ACACGT AA AG A ACTAG AT ACAA TG GCCGAGGGAAAGACGgtgagagcttggcgttggtggaccgggcagcatcagaaactcctcttccccgcccgccttgaaa ctcactgtaactccctcctcttccccctcgcagCA'TC7GrC7’ATCGTTA7'Cgtgagtgaaagggactgccatgtgtcgggt cgttgaccacggtcggctcgggcgctgctgcccgcgtcgcgaacgttccctgcaaacgccgcgcagccgtccctttttctgccgccg ccccaccccctcgctccccccttcaatcacaccgcagrGCGGACA7GTCGA7TCCGGCAAG7’CCACC
SEQ ID NO: 33
Promotor de beta-tubulina de Chlorella prototecoides endógeno (isoterma A)
GAATTCCCTGCAGGAAGAAGGCCGGCAGCAGCTGGTACTTGTCCTTCACCTCCTT GATCGGCTGGGTGAGCTTGGCCGGGTCGCAGTCGTCGATGCCGGCATCGCCCAG CACGCTGTGCGGGGAGCCGGCATCGACAACCTTGGCACTGCTCACCTTGGTCACC GGCATGGGGTCATGGCGCTGCAGACCAGCGGCCTGTCAGCATGCTGCAGGCATC TGTGTTTTGT AGT AGAT ACTTTCTGATGCATC ACCAC ACGTTTGGAAGGT CCCCA AGCCCCTTCAACAGTCTCGACATATGACACTCGCGCCCTCTTCCTCGTCCCGTGG CCTGATGAGGGTACGCAGGTACCGCAGCTGCGCCCCGTCCCGCCAGTTGCCCTGG CCCCGCCGGGCCCAATCTGTTCATTGCCGCTCCCTGGCAGCCGTGAACTTCACAC TACCGCTCTCTGTGACCTTCAGCACAGCAGGAATCGCCATTTCACCGGCGGTCGT TGCTGCGGAGCCTCAGCTGATCTCGCCTGCGAGACCCCACAGTTTGAATTTGCGG TCCCCACACAACCTCTGACGCC
SEQ ID NO: 34
Promotor de beta-tubulina Chlorella protothecoides endógeno (isoterma B)
G AATTCCCTCAG G AAG AAG G CCG G CAG CAG CTG G TACTTG TCCTTCACCTCCTTG
ATCGGCTGG GTGAGCTTCGCAGG ATCGCAGTCGTCGATGCCGGCATCGCCCAGC
ACGCTGTGCGG GGAG CCGG CATCNACAACCTTG GCACTGCTCCCCTTGG TCACCG
GCATGG GGTCATGGCGCTGCAG CCCAG CG GCCTGTCAG CATGCTGCAGGCATCT
G TG TATTG TAG TAG G TAC TTC C TG ATG C ATC AAC AC AC G TTTG G AAG C TC C C C AA
GCCCCTTCAACAGTCTCGACGTATGACACTCGCGCCCTCTTCCTCGCCCCG TG GC
CTGATGAGGGTACG CAGGTACCACAGCTG CG CCCCGTCCCGCCAGTTGCCCTGGC
CCGGCCG G G CCCAATCTG TTCATTG CCG CTCCCTG G TAG CCG TG AACTCACATTA
CCGCTCTCTG TG ACCTTCAG CACAG CAG G AATCG CCATTTCACCG G CG G TCG TTG
CTGCGGAG CCTCAGCTGATCTCGCCTGCGAGACCCCACAG TTTGAATTTGCGGTC
CCCACACAACCTCTG ACG CC
SEQ ID NO: 35
TGACCTAGGTGATTAATTAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCG
SEQ ID NO: 36
CTACGAGCTCAAGCTTTCCATTTGTGTTCCCATCCCACTACTTCC
SEQ ID NO: 37
GATCAGAATTCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGC
SEQ ID NO: 38
GCATACTAGTGGCGGGACGGAGAGAGGGCG
SEQ ID NO: 39
Beta-tubulina:: neo:: nit
gaattcctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgat gcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgocgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggccccc gattgcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatc gcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacggcgcgccatatcaafgattgaacaagatggattg cacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgt tceggctgtcagegcaggggegcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgc ggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgg gcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgca tacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtc gatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcg aggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggfggaaaatggccgcM c^attcatcgactgtggccggc. tgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcct cgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctaagatctgtcgatcgacaagt gactcgaggcagcagcagctcggatagtatcgacacactctggacgcíggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttg acctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatt tgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcg ctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactg caatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaaagcttgagctc
SEQ ID NO: 40
Glutamato deshidrogenasa:: neo:: nit
gaattccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgggcgcctgccgcctgcct gccgcatgcttgtgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaagcttatgtgtgtgctgggct tgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggacgtgccgcggtgcctccaggtggttcaatcgcggc agccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagígtcagcaaaggtagcagtttgccagaatgatcggttcagctg ttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggagtggaatggcaccacc aagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggcígtttcagctacaacggcaggagtcatccaactaaccatagctgatcaacactgcaa tcatcggcggctgatgcaagcatcctgcaagacacatgctgtgcgatgctgcgctgctgcctgctgcgcacgccgttgagttggcagc agctcagccatgcactggatcaggctgggctgccactgcaatgíggtggataggatgcaagtggagcgaataccaaaccctctggct gcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagggactggccccatgcacgccatgccaaaccggagcg caccgagtgtccacactgtcaccaggcccgcaagctttgcagaaccatgctcatggacgcatgtagcgctgacgtcccttgacggcg
ctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcggcggcagcagagcggcggcagcagcggcgggggcc acccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcnnnccaaacgagttcacattcatttgcagcctggagaagcg aggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcgggaccgccaggctagcagcaaaggcgcctcccctactccgcat cgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggccggctgtttctttcgtgttgcaaaacgcgccacgtcagcaacctgtcc egtgggtecccegtgcegatgaaategtgtgcacgcegateagetgattgeccggetegegaagtaggGgGGCtetttctgetegcct: tctctccgtcccgccactagtggcgcgccatatcaflfgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagag gctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttcttt ttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccac^acgggcgttcctt gcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctc accttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccac caagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggg gctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgct tgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggacGgctatcaggacatagcg ttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcag cgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctaagatctgtcgatcgacaagtgactcgaggcagcagcagctcggatagtatcg acacactctggacgctggtcgtgígatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagc ctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgt ttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacag ccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatggg aacacaaatggaaagcttgagctc
SEQ ID NO: 41
Glutamato deshidrogenasa:: neo-opt:: nit
gaattccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgggcgcctgccgcctgcctgccgcat gcttgtgctggtgaggctgggcaglgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaagcttatgtgtgígctgggcttgcatgccgggcaa tgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggacgtgccgcggtgcctccaggtggttcaatcgcggcagccagagggatttcagatga tcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtttgccagaatgateggtticagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtc aagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggagtggaatggcaccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgttt cagctacaacggcaggagtcatccaactaaccatagctgatcaacactgcaatcatcggcggctgatgcaagcatcctgcaagacacatgctgtg cgatgctgcgctgctgcctgctgcgcacgccgttgagttggcagcagctcagccatgcactggatcaggctgggctgccactgcaatgtggtgg ataggatgcaagtggagcgaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagggactg gccccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgtcaccaggcccgcaagctttgcagaaccatgctcatggacgcatg tagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcggcggcagcagagcggcggca gcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcnnnccaaacgagttcacattcaUtgcagcct ggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaalggaatgcgggaccgccaggctagcagcaaaggcgcctcccctactccg catcgatgttccatagtgcattggactgcattígggtggggcggccggctgtttctttcgtgttgcaaaacgcgccacgtcagcaacctgícccgtg ggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcaegccgatcagclgattgcccggctcgcgaagtaggcgccctctttctgctcgccctctctccgtccc ge cactag tg gcgcgcc at atcafltoatcgaacaggacsgcctccacaccggctcccccgccgcctgegtggagcgcctgttcggctacgact gggcccagcagaccatcggctgctccgacgccgccgtgitccgcctgtccgcccagggccgccccgtgctgttcgtgaagaccgacctgtccg gcgccctgaacgagctgcag eacgag gccgccc gcctgtcctg gctg gccaccaccg gcgtgccct ge gccgccetactggacgtggtgac cgaggccggccgcgactggctectgctgggcgaggtacccggccaggacctgctgtcctcccacctggcccccgccgagaaggtgtccatca tggccgacgccatgcgccgcctgcacaccctggaccccgccacctgccccttcgaccaccaggccaagcaccgcatcgagcgcacccgcac ccgcatggaggccggcctggtgaaccaggacgacctggacgaagagcaccaaggcctggcccccgccgagctgttcficccgcctgaaagc ccgcatgcccgacggcgaggacctgatggtgacccacggcgacgcctEcctgcccaacatcatggtggagaacggccgcttctccggcUeat cgactgcggccEcctgggcgtggccgaccgctaccaggacatcgccctggccacccgcgaeatcgccgaggagctgggcggcgagtgBEC cgaccgcttcctggtactgtacggcatcgccgcccccgactcccagcgcatcgccttctaccgcctgctggacgagttcttctgactcgaggcaa cagcagctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgítgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgc ttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttc cctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacítatctacgctgtcctgctaLccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagc
cttggtltgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgclgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaat ggaaagcttgagctc
SEQ ID NO: 42
Beta-tubulina:: neo-opt:: nit
gaaítcctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgat gcttcgaccccccgaagctccttcggggctgeatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgttlaaatagccaggccccc gattgcaaagacatlatagcgagctaccaaagccataítcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatc gcactccgctaagegggcgcctcttcclctlcetttcagtcacaacccgcaaacggcgcgccatatcaafgatcgagcaggacggcct cüacgccggctcccccgccgcctgggtggagcgcctgttcggctacgaclgggcccagcagaccatcggctgctccgacgccgcc gtgttccgcctgtccgcccagggcceccccgtgctgttcgtgaagaccgacctgtccggcgccctgaacgagctgcaggacgaggc cgcccgcctgtcciggctggccaccaccggcgtgccctgcgccgccgtgctggacgtggtgaccgaggccggccgcgactggctg ctactgggcgaggtgcccggccaggacctgctgtcctcccacctggcccccgccgaaaaggtgtccatcatggccgacgccalgcg ccgcctgcacaccctggaccccgccacctgccccttcgaccaccaggccaaacaccgcatcgagcgcgcccgcacccgcatgga ggccggcctggtggaccaggacgacctggacgaggagcaccagggcctggcccccgccgagctgttcgcccgcctgaaggccc gcatgcccgacggcgaggacctggtggtgacccacggcgacgcctgcctgcccaacatcatggtggagaacggccgcttctccgg cttcatcgactgcggccgcctgggcgtggccgaccgctaccaggacatcgccctggccacccgcgacatcgccgaggagctgggc ggcgagtgggccgaccgcttcctggtgctgtacggcatcgccgcccccgactcccagcgcatcgccttctaccgcctgctggacga gttcttctgactcgaggcagcagcagctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgc tgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtilgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgctt gtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatcc ctcagcgctgctcctgcícctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaacc agcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaaagcttgagctc
SEQ ID NO: 43
GCCGCGACTGGCTGCTGCTGG
SEQ ID NO: 44
AGGTCCTCGCCGTCGGGCATGC
SEQ ID NO: 45
Acil ACP desaturasa
atcaaaggcatagattcacatttgttggeatígcagagcaatcatcgcgcaggacgaacatcgctcaccaagcacgtactgggcatcc ggaggcctccgcaaattcctgcaacaggactcgctgatcagttcgcccaaggtctacgacgctccctatcggcgctagacttcaacac atatttcactgtcacagcctcggcATGCATCAGGCCTCAGTCTCCACCATGAAGACCATCCAGTC
TCGGCACGCCGGTCCCATCGGACATGTGCAGTCGGGTCGCCGATCGGCGGGGCG
CGCGGGATCCCGCATGGCGACCCCCGTGGCCGCAGCTACCGTCGCAGCCCCTCGC
TCGGCCCTCAACCTCTCCCCCACCATCATTCGACAGGAGGTGCTCCACTCCGCCA
GCGCCCAGCAACTAGACTGCGTGGCCTCCCTGGCGCCCGTCTTCGAGTCCCAGAT
CCTCCCCCTCCTGACGCCCGTGGACGAGATGTGGCAGCCCACCGACTTCCTCCCC
GCCTCGAACTCGGAGGCATTCTTCGACCAGATCGGCGACCTGCGGGCGCGATCG
GCGGCCATCCCCGACGACCTGCTGGTCTGCCTGGTGGGGGACATGATCACGGAG
GAGGCCCTGCCCACCTACATGGCCATGCTGAACACCCTGGACGTCGTGCGCGATG
AGACAGGGCACAGCCAGCACCCCTACGCCAAGTGGACCAGGGCTTGGATCGCGG
AGGAGAACCGCCATGGCGACCTGCTGAACAAGTACATGTGGCTGACGGGGCGGG
TGGGACATGCTGGCGGTGGAGCGCACCATCCAGCCATGCTGGCGGTGGAGCGCA
CCATCCAGCGCCTCATCTCATCGGGCATGGACCCGGGCACGGAGAACCACCCCT
ACCACGCCTTTGTGTTCACCAGCTTCCAGGAGCGCGCCACCAAGCTGAGCCACGG
CTCCACCGCCCGCCTGGCGGTCGCCGCCGGGGACGAGGCCCTGGCCAAGATCTG
CGGGACCATTGCGCGGGACGAGTCGCGCCACGAGGCGGCGTACACGCGGACCAT
GGATGCCATCTTCCAGCGCGACCCCAGCGGGGCCATGGTGGCGTTTGCGCACATG
ATGATGCGCAAGATCACCATGCCCGCCCACCTCATGGACGACGGCCAGCACGGC
GCGCGCAACGGGGGGGCGCAACTTGTTCGACGACTTTGCGGCAGTGGCGGAGCG
GGCAGGGGTGTACACCGCCGGCGACTACATCGGCATCCTGCGCCACCTCATCCG
GCGCTGGGACGTGGAGGG
SEQ ID NO: 46
Acil ACP desaturasa
MHQASVSTMKTIQSRHAGPIGHVQSGRRSAGRAGSRMATPVAAATVAAPRSALNLS
PTIIRQEVLHSASAQQLDCVASLAPVFESQILPLLTPVDEMWQPTDFLPASNSEAFFDQ
IGDLRARSAAIPDDLLVCLVGDMITEEALPTYMAMLNTLDVVRDETGHSQHPYAKW
TRAWIAEENRHGDLLNKYMWLTGRVGHAGGGAHHPAMLAVERTIQRLISSGMDPG
TENHPYHAFVFTSFQERATKLSHGSTARLAVAAGDEALAKICGTIARDESRHEAAYT
RTMDAIFQRDPSGAMVAFAHMMMRKITMPAHLMDDGQHGARNGGAQLVRRLCGS
GGAGRGVHRRRLHRHPAPPHPALGRGG
SEQ ID NO: 47
Sintasa de difosfato geranilo geranilo
attatacatcggcatcgtctcaggtttcacgatctgcatgctatctatgggactgtgactccgccggccaggítgtggtgcgcgagaatc cfccccgctcctgccttctcatttccctgacgggagtcgccgctgagcaccgggcggatcATGGGCGTCGGCACACT
CCAAACCCCATATACATGTGGTCGTGCATTCACGCATAGCGCACGGTATGTCCCG
CGACGCGCGGCTCGAAGCCGTGGCCATCCGACGCGCTGCACGGCCGAGGTGAGG
GCACGCCCCTCCGCCAATGGCGCGCAGCCCATGACCGCCTTCGACTTCCGGCAGT
ACATGCAGCAGCGCGCCGCGCTGGTGGACGCAGCGCTGGACCTGGCAGTGCCGC
TGCAGTACCCCGAGAAGATCAACGAGGCCATGCGGTACAGCCTGCTGGCCGGGG
GCAAGCGCGTGCGCCCCGCGCTCTGCCTCGCTGCCTGCGAGCTCGTGGGCGGCCC
CCTGGAGGCGGCCATGCCCGCCGCCTGCGCCATGGAGATGATCCACACCATGAG
CCTCATCCACGACGACCTCCCCGCCATGGACAACGACGACTTCCGGCGCGGCCA
GCCCGCCAACCACAAGGCCTATGGCGAGGAGATTGCGATCCTGGCGGGCGACGC
GCTGCTGTCGCTGAGCTTTGAGCACATCGCGCGCGAGACGCGAGGCGTGGACCC
GGTGCGCGTCCTGGCCGCCATCTCGGAGTGGCGCGCGGTGGGCAGCCGCGGGCT
GGTGGCGGGGCAGGTGGTGGACCTGGGTTTCGAGGGCGGCGGCGTGGGGCTGGC
CCCGCTGCGCTACATCCACGAGCACAAAACCGCGGCGCTGCTGGAGGCGGCGGT
GGTGTCCGGCGCGCTGCTGGGCGGCGCGGAGGAGGCGGACCTGGAGCGCCTGCG
CACCTACAACCGCGCCATCGGCCTCGCTTTCCAGGTGGTGGGGGACATCCTGGAC
ATCCCGGGGACCAGCGAGGAGCTGGGCAAGACCGCGGGCAAGGACCTGAGCTCC
CCCAAAACCCCCTACCCGTCCCTGGTGGGGCTGGCCAGGTCCAAAAAAATTGCG
GACGAACTGATTGAGGACGCGAAAACCCAACTCACCCAGTACGAGCCGGCCCGA
GCGGCGCCCCTCGTAACCCTGGCCGAAAACATTTGAaaccggaagaactgactgggggcccccc ctgcccccagatacggcggggctcctccatccagttttgggatgggaggagcgacaaccgaccccgtaaccctgtgacgcgtttgcc ttgcatacgtacgcatgccttgaaacccatccatgaccctcaacaatacctggttgtgtgtagcttggtcctgaaaaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaa
SEQ ID NO: 48
Sintasa de difosfato geranilo geranilo
MG VGTLQTP YTCGRAFTHS AR YVPRR A ARSRGHPTRCTAEVR ARPS ANG AQPMT AF
DFRQYMQQRAALVDAALDLAVPLQYPEKINEAMRYSLLAGGKRVRPALCLAACEL
VGGPLEAAMPAACAMEMIHTMSLIHDDLPAMDNDDFRRGQPANHKAYGEEIAILAG
DALLSLSFEHIARETRGVDPVRVLAAISEWRAVGSRGLVAGQVVDLGFEGGGVGLA
PLRYIHEHKTAALLEAAVVSGALLGGAEEADLERLRTYNRAIGLAFQVVGDILDIPGT
SEELGKTAGKDLSSPKTPYPSLVGLARSKKIADELIEDAKTQLTQYEPARAAPLVTLA
ENI
SEQ ID NO: 49
Sintasa de difosfato geranilo geranilo
cagatgccATGCGCCCTCGGGCCGCGGGCCTGAGGGTCCACGCAGCGTCCTCGGTGG
CCCAGACGCACCAGGCCGCCCCCCCGGCGGACAGGAGGTTCGACGACTACCAGC
CCCGCACCGCCATCCTCTTCCCCGGCCAGGGCGCGCAGAGCGTGGGCATGGCGG
GAGAGCTGGCGAAGGCCGTCCCCGCCGCCGCGGCGCTGTTCGACGCCGCCTCCG
ACCAGCTCGGCTATGACCTGCTCCGCGTGTGCGTTGAGGGCCCCAAGGCGCGCCT
GGACAGCACCGCCGTCAGCCAGCCCGCCATCTACGTGGCCAGCCTGGCGGCGGT
GGAGAAGCTGCGCGCGGAGGGCGGGGAGGAGGCACTGGCCGCCATCGACGTCG
CTGCCGGTCTGTCCTTGGGCGAGT ACACCGCGCTGGCCTTTGCCGGCGCCTTCTC
CTTCGCCGACGGGCTGCGCCTGGTGGCCCTGCGCGGCGCCAGCATGCAGGCCGC
CGCCGACGCCGCACCCTCGGGCATGGTCTCCGTCATCGGTCTGCCCTCCGACGCG
GTGGCCGCGCTGTGCGAGGCCGCCAACGCGCAGGTGGCCCCCGACCAGGCCGTG
CGC ATCGCC A ACT ACCTCTGCG ACGGCA ACT ACGCCGTCAGCGGTGGGCT GGAG
GGCTGCGCGGCGGTGGAGGGCCTGGCCAAGGCCCACAAGGCGCGCATGACGGTG
CGCCTGGCGGTGGCGGGCGCCTTCCACACCCCCTTCATGCAGCCGGCGGTGGAG
GCGCTGAGCGCGGGCGCTGGCGGACACGCCGCTGGTCGCGCCGCGCATCCCCGT
GGTCAGCAACGGGACGCC
SEQ ID NO: 50
Sintasa de difosfato geranilo geranilo
M RPRAAG LRVH AASSVAQ THQ AAPPADRRFDDYQ PRTAILFPG Q GAQSVG M AGEL A K AVPA AAALFDA ASD Q LG YDLLRVCV EG PK ARLDSTAVSQ PAIYVA SLAAV EK LR AEGGEEALA AIDV A AGLSLGEYT ALAFAG AFSFADGLRLV ALRGASM Q A A AD A APS G M VSVIG LPSDAVAALCEAANAQ VAPDQ AVRLANYLCDG NYAVSG G LEG CAAVEG LAK AH K ARM TVRLAVAG AFH TPFM Q PAVEALSAGAGG H AAG RAAH PRG QQ RDA
SEQ ID NO: 51
Secuencia de ADNc de gilceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa
TGTCCATCTCCCCCCACCCTCCATCCAACCATCGTCGACGGCATGCAGGCGCTGT GTTCTCACCCCGCGTCCCTCACGGCGCGTGCGGTACCCCATGGGCGGGCCAGCCC AGCACAGCGGGTGTCCAGCGCCGGCCCGGCCTACACCGGCCTGTCCCGGCACAC CCTGGGCTGCCCCAGCACCCCCACCCTCCAGTCCCGCGCCGCGGTCCAGACCCGC GGCTCCTCCTCCGGCTCCACCACGCGCATGACCACCACCGCCCAGCGCAAGATCA AGGTGGCCATCAACGGGTTCGGCCGCATCGGCCGCCAGTTCCTGCGCTGCGTGGA GGGGCGCGAGGACTCGCTGCTGGAGATCGTGGCCGTGAACGACTCCGGCGGCGT GAAGCAGGCCAGCCACCTGCTCAAGTACGACTCCACCATGGGCACCTTCAACGC CGACATCAAGATCTCGGGCGAGGGCACCTTCTCCGTCAACGGCCGCGACATCCG CGTCGTCTCCTCCCGCGACCCCCTGGCCCTGCCCTGGGGCGAGCTGGGCGTGGAC CTGGTGATCGAGGGGACGGGAGTGTTTGTGGACCGCAAGGGTGCCAGCAAGCAC
CTGCAGGCGGGGGCCAAGAAGGTCATCATCACCGCGCCGGCCAAGGGCTCCGAC GTGCCCACCT ACGTC ATGGGCGTG AACGCGGACC AGT ACTCC AACTCCG ACG AC ATCATCTCCAACGCCTCCTGCACCACCAACTGCCTGGCGCCCTTTGTCAAGGTGC TCAACGACCGCTTCGGCATCGTGA
SEQ ID NO: 52
Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa
MQALCSHPASLTARAVPHGRASPAQRVSSAGPAYTGLSRHTLGCPSTPTLQSRAAVQ TRGSSSGSTTRMTTTAQRKIKVAINGFGRIGRQFLRCVEGREDSLLEIVAVNDSGGVK QASHLLKYDSTMGTFNADIKISGEGTFSVNGRDIRVVSSRDPLALPWGELGVDLVIEG TGVFVDRKGASKHLQAGAKKVIITAPAKGSDVPTYVMGVNADQYSNSDDIISNASCT TNCLAPFVKVLNDRFGIV SEQ ID NO: 53
Secuencia de ADNc de la proteína del complejo evolutivo de oxígeno (OEE33)
gatgttgagaatagtagcttgc tgccttgtc geeatgeagag cgtgtgcgcgcagtcggtttc atgcaag ggggc cttcacccagtccc tgcggaccccccgatgcagcaggagccagctcgtctgccgggctgatggcaaggccggagccttcatcaagaccgtaaagagcgg tgctgccgctctggctgcctccctcctcctgtctgggggtgcgggcgcactgacctttgatgagctgcagggcctgacctacctgcag gtgaagggctctggcatcgccaacacctgccccaccctgtctggcggctcctccaacatcaaggacctgaagagcgggacctactcc gtcaacaagatgtgcctggagcccacgtccttcaaggtcaaggaggaggcacagttcaagaacggcgaggccgactttgtgcccac caagctcgtcacgcgtctgacctacaccctggacgagatctctggccagatgaagatcgacggcagcggcggcgtggagttcaagg aggaggatggcatcgactatgctgcagtcaccgtgcagcttccgggcggggagcgcgtgcccttcctcttcaccatcaaggagcttg acgccaaggggactgccgacggcttcaagggcgagttcaccgtgccctcctaccgtgggtcctccttcctggaccccaagggccgc ggcgcctccaccggctacgaeaaegccgtggccctgcccgccgccggcgattccgaggagttggagaaggagaacaacaagtcc accaaggctctgaagggggaggccatcttctccatcgccaaggtggacgccgggacaggggaggtggcgggcatctttgagt
SEQ ID NO: 54
Proteína del complejo evolutivo de oxígeno (OEE33)
MQS VC AQS VSCKGAFTQSLRTPRCSRSQLVC RADG KAG AFIKT VKSG A A ALA ASLL
LSGGAG ALT FDELQGLTYLQ VKGSGIANTCPTLSGGS SNIKDLKSGTY S VNKMCLEP
TSFKVKEEAQFKNGEADFVPTKLVTRLTYTLDEISGQMKIDGSGGVEFKEEDGiDYA
AVTVQLPGGERVPFLFTIKELDAKGTADGFKGEFTVPSYRGSSFLDPKGRGASTGYD
NAVALPAAGDSEELEKENNKSTKALKGEAIFSTAKVDAGTGEVAGIFE
SEQ ID NO: 55
Secuencia de ADNc de proteasa Clp
ataatcggaacccagctgcacgcaccatcagtgcggcagcatgcagaccgtcgcagccagctatggcgtattggcgccctccggct ccagcgtgacccggggctcgaccagcagcaagcagcacttcaccaccctcactcccttttccggcttcaggcgcctgaatcatgtgga tcgggcggggcaggcggggtctgggagcccccagaccctgcagcaggccgtgggcaaggccgtgcgccggtcgcggggccgc accaccagcgccgtgcgcgtgacccgcatgatgtttgagcggttcaccgagaaggccatcaaggtggtcatgctcgcgcaggagga ggctcgccgtctgggccacaacíícgtggggacggagcaaatcctgctggggttgattggggagtccacaggcatcgccgccaagg tcctcaagtcgatgggcgtcacgctgaaagatgcgcgtgtggaggtcgagaagatcatcggccgggggagcggctttgtggccgtg gagatccccttcaccccccgcgccaagcgígtgctggagctgtccctggaggaggctcgccagctcggccacaactacattggcac ggagcacatcctgctgggcctgctgcgcgagggtgagggcgtggcctcccgcgtgctggagaccctgggcgccgacccccagaa gatccgcactcaggtggtacgcatggtgggtgagtcgcaggagcccgtgggcaccacggtgggcggagggíccaccggcíccaa caagatgcccaccctggaggagtacggcaccaaccígaccgcccaggccg
SEQ ID NO: 56
Proteasa clp
MQTVAASYGVLAPSGSSVTRGSTSSKQHFTTLTPFSGFRRLNHVDRAGQAGSGSPQT
LQQAVGKAVRRSRGRTTSAVRVTRMMFERFTEKAIKVVMLAQEEARRLGHNFVGT
EQILLGLIGESTGIAAKVLKSMGVTLKDARVEVEKIIGRGSGFVAVEIPFTPRAKRVLE
LSLEEARQLGHNYIGTEHILLGLLREGEGVASRVLETLGADPQKIRTQVVRMVGESQ
EPVGTTVGGGSTGSNKMPTLEEYGTNLTAQA
SEQ ID NO: 57
Crp-tub:: NCO-suc2:: CvNitRed
CTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTT CCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGG CTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCC
CCCGATTGC AA AGAC ATT AT AGCG AGCT ACCAAAGCCATATTC AAACACCT AGA
TCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGG
GCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATATCAATG
CTTCTTCAGGCCTTTCTTTTTCTTCTTGCTGGTTTTGCTGCCAAGATCAGCGCCTCT
ATGACGAACGAAACCTCGGATAGACCACTTGTGCACTTTACACCAAACAAGGGC
TGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACGAAAAAGATGCCAAGTGGCAT
CTGT ACTTT CA AT AC A ACCCG AACG AT ACTGTCTGGGGG ACGCCATTGTTTTGGG
GCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAATTGGGAGGACCAACCAATAGCTATCG
CTCCGA AGAGG AACG ACTCCGGAGCATTCTCGGGTTCCATGGTGGTTGACT ACAA CAATACTTCCGGCTTTTTCAACGATACCATTGACCCGAGACAACGCTGCGTGGCC
ATATGGACTT AC A AC AC ACCGG AGTCCGAGGAGC AGT AC ATCTCGT AT AGCCTG
G ACGGTGGAT AC ACTTTT AC AG AGT ATC AGAAGA ACCCTGTGCTTGCTGC A A ATT CGACTCAGTTCCGAGATCCGAAGGTCTTTTGGTACGAGCCCTCGCAGAAGTGGAT
CATGACAGCGGCAAAGTCACAGGACTACAAGATCGAAATTTACTCGTCTGACGA
CCTTAAATCCTGGAAGCTCGAATCCGCGTTCGCAAACGAGGGCTTTCTCGGCTAC C A AT ACG A ATGCCC AGGCCTG AT AGAGGTCCC AAC AG AGC AAG ATCCCAGC AAG
TCCTACTGGGTGATGTTTATTTCCATTAATCCAGGAGCACCGGCAGGAGGTTCTT
TT AATCAGTACTTCGTCGGA AGCTTT A ACGG AACTC ATTT CG AGGCATTTG AT AA
CCAATCAAGAGTAGTTGATTTTGGAAAGGACTACTATGCCCTGCAGACTTTCTTC
AATACTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGCATTGCGTGGGCTTCTAACTGGG
AGTATTCCGCATTCGTTCCTACAAACCCTTGGAGGTCCTCCATGTCGCTCGTGAG
GAAATTCTCTCTCAACACTGAGTACCAGGCCAACCCGGAAACCGAACTCATAAA
CCTGAAAGCCGAACCGATCCTGAACATTAGCAACGCTGGCCCCTGGAGCCGGTTT
GCAACCAACACCACGTTGACGAAAGCCAACAGCTACAACGTCGATCTTTCGAAT
AGCACCGGTACACTTGAATTTGAACTGGTGTATGCCGTCAATACCACCCAAACGA TCT CGAAGTCGGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTT AAAGGCCTGG AAGACCC CGAGGAGTACCTCAGAATGGGTTTCGAGGTTTCTGCGTCCTCCTTCTTCCTTGATC GCGGGAACAGCAAAGTAAAATTTGTTAAGGAGAACCCATATTTTACCAACAGGA
TGAGCGTT AACAACCAACCATTCAAGAGCGAAAACGACCTGTCGTACT ACAAAG
TGTATGGTTTGCTTGATCAAAATATCCTGGAACTCTACTTCAACGATGGTGATGT
CGTGTCCACCAACACATACTTCATGACAACCGGGAACGCACTGGGCTCCGTGAA
CATGACGACGGGTGTGGATAACCTGTTCTACATCGACAAATTCCAGGTGAGGGA
AGTCAAGTGAGATCTGTCGATCGACAAGCTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGT ATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTG CCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATC TTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCAC
CCCC AGCATCCCCTTCCCTCGTTT C AT ATCGCTTG C AT CCC A ACCGC A ACTT ATCT ACGCTGTCCTGCT ATCCCTCAGCGCTGCTCCT GCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCAC
AGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGC
ACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTT
SEQ ID NO: 58 Cr p-tub:: CO-suc2:: CvNitRed
CTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTT
CCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGG
CTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCG AGCGCTGTTT AA AT AGCC AGGCC
CCCGATTGC A AAG AC ATT ATAGCGAGCT ACC A A AGCCATATTCA A ACACCT AGA
TCACT ACCACTTCT ACAC AGGCC ACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCT A AGGGG
GCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTG
CAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGA
CGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGA
TGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGT
ACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCA
CGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCC
GAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAA
CACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATC
TGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGAC
GGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCC
ACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCA
TGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCT
GAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCA
GTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTC
CTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTC
AACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACC
AGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAA
CACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGA
GTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCA
AGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACC
TGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCG
CCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACA
GCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGA
TCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCC
CGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGAC
CGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGC
ATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAG
GTGT ACGGCTTGCTGG ACCAGA AC ATCCTGG AGCTGT ACTTC AACGACGGCGAC
GTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGA
AC ATG ACG ACGGGGGTGG AC AACCT GTTCT AC ATCGAC A AGTTCC AGGT GCGCG
AGGTCAAGTGATTAATTAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACA
CTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCT
GTG AATATCCCTGCCGCTTTT ATCA AAC AGCCTC AGTGTGTTT GATCTTGTGTGT A
CGCGCTTTTGCGAGTTGCT AGCTGCTTGTGCT ATTTGCGAAT ACC ACCCCC AGC AT
CCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCC
TGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGT
TTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATG
CTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGA
SEQ ID NO: 59
Cinnamomum camphorum FatBI (Q39473)
MATTSLASAFCSMKAVMLARDGRGMKPRSSDLQLRAGNAQTSLKMINGTKFSYTES
LKKLPDWSMLFAVITTIFSAAEKQWTNLEWKPKPNPPQLLDDHFGPHGLVFRRTFAI
RSYEVGPDRSTSIVAVMNHLQEAALNHAKSVGILGDGFGTTLEMSKRDLIWVVKRT
HVAVERYPAWGDTVEVECWVGASGNNGRRHDFLVRDCKTGEILTRCTSLSVMMNT
RTRRLSKIPEEVRGEIGPAFIDNVAVKDEEIKKPQKLYDSTADYIQGGLTPRWNDLD1
NQH VNNIKY VDWILET VPDSIFESHHIS SFTIE YRRECTMDS VLQS LTTVSGGS S E AG L
VCEHLLQLEGGSEVLRAKTEWRPKLTDSFRG1SVIPAESSV
SEQ ID NO: 60
Cinnamomum camphorum FatB 1 codón optimizado para Prototheca
ggcgcgccatggccaccacctccctggcctccgccttctgcagcatgaaggccgtgatgctggcccgcgacggcc gcggcatgaagccccgctccagcgacctgcagctgcgcgccggcaacgcccagacctccctgaagatgatcaacg gcaccaagttctcctacaccgagagoctgaagaagctgcccgactggtccatgctgttcgccgtgatcaccacca tcttctccgccgccgagaagcagtggaccaacctggagtggaagcccaagcccaaccccccccagctgctggacg accacttcggcccccacggcctggtgttccgccgcaccttcgccatccgcagctacgaggtgggccccgaccgct ccaccagcatcgtggccgtgatgaaccacctgcaggaggccgccctgaaccacgccaagtccgtgggcatcctgg gcgacggcttcggcaccaccctggagatgtccaagcgcgacctgatctgggtggtgaagcgcacccacgtggccg tggagcgctaccccgcctggggcgacaccgtggaggtggagtgctgggtgggcgcctccggcaacaacggccgcc gccacgacttcctggtgcgcgactgcaagaccggcgagatcctgacccgctgcacctccctgagcgtgatgatga acacccgcacccgccgcctgagcaagatccccgaggaggtgcgcggcgagatcggccccgccttcatcgacaacg tggccgtgaaggacgaggagatcaagaagccccagaagctgaacgactccacogccgactacatccagggcggcc tgaccccccgctggaacgacctggacatcaaccagcacgtgaacaacatcaagtacgtggactggatcctggaga ccgtgcccgacagcatcttcgagagccaccacatctcctccttcaccatcgagtaccgccgcgagtgcaccatgg acagcgtgctgcagtccctgaccaccgtgagcggcggctcctccgaggccggcctggtgtgcgagcacctgctgc agctggagggcggcagcgaggtgctgcgcgccaagaccgagtggcgccccaagctgaccgactccttccgcggca tcagcgtgatccccgccgagtccagcgtgatggactacaaggaccacgacggcgactacaaggaccacgacatcg actacaaggacgacgacgacaagtgactcgagttaattaa
SEQ ID NO: 61
Cuphea hookeriana FatB2 (GenBank AAC49269)
MVAAAASSAFFPVPAPGASPKPGKFGNWPSSLSPSFKPKSIPNGGFQVKANDSAHPK
ANGSAVSLKSGSLNTQEDTSSSPPPRTFLHQLPDWSRLLTAITTVFVKSKRPDMHDRK
SKRPDMLVDSFGLESTVQDGLVFRQSFSIRSYEIGTDRTASIETLMNHLQETSLNHCK
STGILLDGFGRTLEMC KRDLIW V VIKMQIKVNRYPAW GDT V EIN TRFSRLGKIGMGR
DWLISDCNTGEILVRATSAYAMMNQKTRRLSKLPYEVHQEIVPLFVDSPVIEDSDLK
VHKFKVKTGDSIQKGLTPGWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPTEVLETQELCSLA
LEYRRECGRDSVLESVTAMDPSKVGVRSQYQHLLRLEDGTA1VNGATEWRPKNAGA
NGAISTGKTSNGNSVS
SEQ ID NO: 62
Codón Cuphea hookeriana FatB2 optimizado para Prototheca
GGCGCGCCATGGTGGCCGCCGCCGCCTCCAGCGCCTTCTTCCCCGTGCCCGCCCC
CGGCGCCTCCCCCAAGCCCGGCAAGTTCGGCAACTGGCCCTCCAGCCTGAGCCCC
TCCTTCAAGCCCAAGTCCATCCCCAACGGCGGCTTCCAGGTGAAGGCCAACGAC
AGCGCCCACCCCAAGGCCAACGGCTCCGCCGTGAGCCTGAAGAGCGGCAGCCTG
AACACCCAGGAGGACACCTCCTCCAGCCCCCCCCCCCGCACCTTCCTGCACCAGC
TGCCCGACTGGAGCCGCCTGCTGACCGCCATCACCACCGTGTTCGTGAAGTCCAA
GCGCCCCGACATGCACGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACAG
CTTCGGCCTGGAGTCCACCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCCAGTCCTTCTCC
ATCCGCTCCTACGAGATCGGCACCGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCCTGATG
AACCACCTGCAGGAGACCTCCCTGAACCACTGCAAGAGCACCGGCATCCTGCTG
GACGGCTTCGGCCGCACCCTGGAGATGTGCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTG
ATCAAGATGCAGATCAAGGTGAACCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAG
ATCAACACCCGCTTCAGCCGCCTGGGCAAGATCGGCATGGGCCGCGACTGGCTG
ATCTCCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGGTGCGCGCCACCAGCGCCTACGCC
ATGATGAACCAGAAGACCCGCCGCCTGTCCAAGCTGCCCTACGAGGTGCACCAG
GAGATCGTGCCCCTGTTCGTGGACAGCCCCGTGATCGAGGACTCCGACCTGAAG
GTGCACAAGTTCAAGGTGAAGACCGGCGACAGCATCCAGAAGGGCCTGACCCCC
GGCTGG A ACGACCT GGACGTGAACC AGC ACGTGTCC AACGTG A AGT AC ATCGGC
TGG ATCCTGG AGAGCAT GCCC ACCG AGGTGCTGG AG ACCC AGG AGCTGTGCTCC
CTGGCCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTGCTGGAGAGCGTG
ACCGCCATGGACCCCAGCAAGGTGGGCGTGCGCTCCCAGTACCAGCACCTGCTG
CGCCTGGAGGACGGCACCGCCATCGTGAACGGCGCCACCGAGTGGCGCCCCAAG
AACGCCGGCGCCAACGGCGCCATCTCCACCGGCAAGACCAGCAACGGCAACTCC
GTGTCC ATGGACT ACA AGGACC ACGACGGCG ACT AC A AGG ACC ACG AC ATCG AC
TACAAGGACGACGACGACAAGTGACTCGAGTTAATTAA
SEQ ID NO: 63
Umbellularia FatBI (GenBank Q41635)
MATTSLASAFCSMKAVMLARDGRGMKPRSSDLQLRAGNAPTSLKMLN'GTKFSYTES
LKRLPDWSMLFAVITTIFSAAEKQWTNLEWKPKPKLPQLLDDHFGLHGLVFRRTFAI
RSYEVGPDRSTSILAVMNHMQEATLNHAKSVGILGDGFGTTLEMSKRDLMWVVRR
TH V A VERYPTWGDTVEVECWIGAS GNNGMRRDFLVRDCKTGE1LTRCTS LSVLMNT
RTRRLSTIPDEVRGEÍGPAFIDNVAVKDDEIKKLQKLNDSTADYIQGGLTPRWNDLDV
NQHVNNLKYVAWVFETVPDSIFESHHISSFTLEYRRECTRDSVLRSLTTVSGGSSEAG
LVCDHLLQLEGGSEVLRARTEWRPKLTDSFRGISVIPAEPRV
SEQ ID NO: 64
Umbellularia FatBI codon optimizado para Prototheca
GGCGCGCCATGGCCACCACCAGCCTGGCCTCCGCCTTCTGCTCCATGAAGGCCGT
GATGCTGGCCCGCGACGGCCGCGGCATGAAGCCCCGCAGCTCCGACCTGCAGCT
GCGCGCCGGCAACGCCCCCACCTCCCTGAAGATGATCAACGGCACCAAGTTCAG
CTACACCGAGAGCCTGAAGCGCCTGCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATC
ACCACCATCTTCAGCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCC
AAGCCCAAGCTGCCCCAGCTGCTGGACGACCACTTCGGCCTGCACGGCCTGGTGT
TCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCTCCTACGAGGTGGGCCCCGACCGCAGCACCTC
CATCCTGGCCGTGATGAACCACATGCAGGAGGCCACCCTGAACCACGCCAAGAG
CGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGA
CCTGATGTGGGTGGTGCGCCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCACCTGG
GGCGACACCGTGGAGGTGGAGTGCTGGATCGGCGCCAGCGGCAACAACGGCATG
CGCCGCGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGC
ACCTCCCTGAGCGTGCTGATGAACACCCGCACCCGCCGCCTGAGCACCATCCCCG
ACGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTGAAGG
ACGACGAGATCAAGAAGCTGCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCC
AGGGCGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGAACA
ACCTGAAGTACGTGGCCTGGGTGTTCGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAGTC
CCACCACATCAGCTCCTTCACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCACCCGCGACTCC
GTGCTGCGCAGCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCAGCTCCGAGGCCGGCCTGGTG
TGCGACCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCCGCACC
GAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCG
AGCCCCGCGTGATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACA
TCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGACTCGAGTTAATTAA
SEQ ID NO: 65
Cebador delantero NeoR
CCGCCGTGCTGGACGTGGTG
SEQ ID NO: 66
Cebador inverso NeoR
GGTGGCGGGGTCCAGGGTGT
SEQ ID NO: 67
Levadura invertasa suc2 cebador directo
CGGCCGGCGGCTCCTTCAAC
SEQ ID NO: 68
Levadura invertasa suc2 cebador inverso
GGCGCTCCCGTAGGTCGGGT
SEQ ID NO: 69
5'UTR/promotor Chlorella sorokiniana glutamato deshidrogenasa
C G C CTG CAACG CAAG G G CAG CCACAG CCG CTCCCACCCG CCG CTG AACCG ACAC
GTGCTTGGGCGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCATGCTTGTGCTG GTGAG GCTG GGCA
G TG CTG C C ATG C TG ATTG AG G C TTG G TTC ATC G G G TG G AAG CTTATG TG TG TG CT
G G G CTTG CATG CCG G G CAATG CG CATG G TG G CAAG AG G G CG G CAG CACTTG CTG
G AG CTG CCG CG G TG CCTCCAG G TG G TTCAATCG CG G CAG CCAG AG G G ATTTCAG
ATG ATCG CG CG T A C A G G TTG AG C A G C AG TG TC AG C A AA G G T AG CAG TTTG C CAG
A A TG A TC G G TTC A G C TG T T A A T C A A T G C C A G C A A G A G A A G G G G T C A A G T G C A A A
CAC G G G CATG C CAC AG C AC G G G C AC CG G G G AG TG G AATG G C ACC AC C AAG TG TG
TG C G AG CC AG C ATC G C CG CC TG G C TG TTTC AG C TAC AAC G G C AG G AG TC ATC C AA
C G TAAC C ATG AG C TG ATC AA C AC TG C AATC ATC G G G C G G G C G TG A TG C A AG C A T
G CCTG G CG AAG ACACATG G TG TG CG G ATG CTG CCG G CTG CTG CCTG CTG CG CAC
G C CG TTG AG TTG G CAG CAG G CTCAG CCATG CACTG G ATG G CAG CTG G G CTG CCA
C TG C AATG TG G TG G ATA G G A TG C A AG TG G AG C G A ATAC C AA AC C C TC TG G C TG C
TTG C TG G G TTG C ATG G CATCG CAC CATCAG C AG G AG C G C ATG C G AAG G G AC TG G
C C C C ATG C ACG CC ATG CC AAAC C G G AG C G C AC C G AG TG TC C AC ACTG TC AC C AG
G C C C G C AAG CTTTG C AG AAC C ATG C TC ATG G ACG CATG TAG C G C TG ACG TC C C TT
G ACG G CG CTCCTC TC G G G TG TG G G AAACG CAATG C AG CAC AG G C AG C AG AG G C G
GCGGCAGCAGAGCGGCGGCAG CAGCGGCGG GGGCCACCCTTCTTGCGGGG TCGC
G C C C CAG C CAG C G G TG ATG C G C TG ATC C C AAAC G AG TTC AC ATTC ATTTG C ATG C
CTG G AG AAG CG AG G CTG G G G CCTTTG G G CTG G TG CAG CCCG CAATG G AATG CG G
G ACC G C C AG G C TAG C AG C AAAG G C G C CTC C CC TAC TC C G C ATC G ATG TTC C ATAG
TG C ATTG G AC TG CATTTG G G TG G G G C G G C C G G C TG TTTC TTTCG TG TTG CAAAAC
G C G CCAG CTCAG CAACCTG TCCCG TG G G TCCCCCG TG CCG ATG AAATCG TG TG CA
CG CCG ATCAG CTG ATTG CCCG G CTCG CG AAG TAG G CG CCCTCCTTTCTG CTCG CC
CTCTCTCCG TCCCGCCACTAGTGGCGCGCC
SEQ ID NO: 70
Umbelularia californica región de codificación de tioesterasa C12
ATG G CC ACC ACC AG C C TG G C C TC C G C C TTC TG C TC C ATG AAG G C C G TG ATG C TG G
CCCG CG ACG G CCG CG G CATG AAG CCCCG CAG CTCCG ACCTG CAG CTG CG CG CCG
G C A A C G C C C C C A C C TC C C TG A A G A TG A TC A A C G G C A C C A A G TTC A G C TA C A C C G
AG AG C C TG AAG C G C C TG C C C G AC TG G TC C ATG C TG TTC G C C G TG ATC AC C AC C AT
C TTC A G C G C C G C C G A G A A G C A G TG G A C C A A C C TG G A G TG G A A G C C C A A G C C C A A
G CTGCCCC AG CT GCT GG ACG AC C AC TTCG G CCTG C ACG G CCTGGTG TTCCGCCGC
AC C TTCG CC ATC C G C TC CTACG AG G TG G G C CC C G ACC G C AG C AC CTC C ATC C TG G
C C G TG ATG A AC C AC ATG C A G G A G G C C A C C C TG A A C C A C G C C A A G A G C G TG G G C A
TC C TG G G C G AC G G C TTC G G C AC C AC C C TG G AG ATG TC C AAG C G C G AC C TG ATG TG
G G TG G TG CG CCG CAC CC AC G TG G C CG TG G AG C G C TAC C C C AC CTG G G G C G ACAC
C G TG G A G G TG G AG TG C TG G ATC G G C G C C AG C G G C AAC AAC G G C ATG C G C C G C G A
C TTC C TG G TG C G C G AC TG C AAG AC C G G C G AG ATC C TG AC C C G C TG C AC C TC C C TG
AG C G TG C TG ATG AA C AC C C G C A C C C G C C G C C TG AG C AC C ATC C C C G A C G AG G TG
C G C G G C G A G ATC G G C C C C G C C TTC ATC G AC AA C G TG G C C G TG AA G G A C G AC G AG
ATC AA G AA G C TG C A G A A G C TG A A C G A C TC C A C C G C C G A C TA C A TC C A G G G C G G C
C T G A C C C C C C G C TG G A A C G A C C TG G A C G TG A A C C A G C A C G TG A A C A A C C TG A A G
TAC G TG G C C TG G G TG TTC G A G AC C G TG C C C G AC AG C A TC TTC G AG TC C C AC C AC A
TC AG C TC CTTC AC C C TG G AG TACC G C C G C G AG TG C AC C CG CG AC TCC G TG C TG C G
C AG C C TG AC C AC C G TG AG C G G C G G C AG CTC C G AG G C CG G C CTG G TG TG C G AC C A
C C TG CTG CAG CTG G AG G G CG G CAG CG AG G TG CTG CG CG CCCG CACCG AG TG G CG
C C C C AA G C TG AC C G AC TC C TTC C G C G G C ATC AG CG TG ATC C CC G C C G AG CC C C G C
GTG
SEQ ID NO: 71
Cinnamomum camphora región de codificación de tioesterasa C14
ATG G C C A C C A C C TC C C TG G C C TC C G C C TTC TG C AG C ATG A AG G C C G TG A TG C TG G
C C CG CG AC G G C C G C G G C ATG AAG C C C C G C TC C AG C G AC C TG C AG C TG C G C G C C G
G C A A C G C C C A G A C C TC C C T G A A G A T G A T C A A C G G C A C C A A G T T C T C C T A C A C C G
A G A G C C T G A A G A A G C TG C C C G A C T G G T C C A T G C T G T T C G C C G T G A T C A C C A C C A T
C T T C T C C G C C G C C G A G A A G C A G T G G A C C A A C C T G G A G T G G A A G C C C A A G C C C A A
C C CC C C CC AG C TG CTG G AC G AC C AC TTC G G C C C C C AC G G C C TG G TG TTC C G C C G C
A C C TTC G C C A TC C G C AG C TA C G AG G TG G G C C C C G A C C G C TC C AC C A G C ATC G TG G
C C G T G A T G A A C C A C C TG C A G G A G G C C G C C C TG A A C C A C G C C A A G TC C G TG G G C A
TC C TG G G C G AC G G C TTC G G C A C C A C C C TG G A G A TG TC C A A G C G C G A C C TG A TC TG
G G TG G TG AAG C G C AC C C A C G TG G C C G TG G AG C G C TA C C C C G C C TG G G G C G A C A C
C G TG G AG G TG G A G TG C TG G G TG G G C G C C TC C G G C A AC AAC G G C C G C C G C C AC G A
C TTC C TG G TG C G C G A C TG C A AG A C C G G C G AG A TC C TG A C C C G C TG C AC C TC C C TG
A G C G TG A TG A TG A A C A C C C G C A C C C G C C G C C T G A G C A A G A T C C C C G A G G A G G T G
C G C G G C G A G A TC G G C C C C G C C TTC A TC G A C A A C G TG G C C G TG A A G G A C G A G G A G
A T C A A G A A G C C C C A G A A G C T G A A C G A C T C C A C C G C C G A C T A C A T C C A G G G C G G C
C T G A C C C C C C G C T G G A A C G A C C T G G A C A T C A A C C A G C A C G T G A A C A A C A T C A A G
T AC G TG G A C TG G ATC C TG G A G AC C G TG C C C G AC AG C A TC TTC G AG AG C C A C C AC
A T C TCC TC C TTC ACC A T C G A G T AC C G C C G C G AG T GC ACC A T G G A C AG CG TG CTG C
AG TC C C TG AC C AC C G TG AG C G G C G G C TC C TC C G AG G C C G G C C TG G TG TG C G AG C
AC C TG C TG C AG C TG G A G G G C G G C A G C G AG G TG C TG C G C G C C A AG A C C G A G TG G C
G C C C C A A G C TG A C C G A C TC C TTC C G C G G C A TC A G C G TG ATC C C C G C C G A G TC C A G
CGTG
SEQ ID NO: 72
Secuencia de etiqueta FLAG
A TG G A C TA C A A G G A C C AC G A C G G C G AC TAC A AG G A C C A C G AC ATC G A C TA C A AG
G A C G AC G AC G A C AAG TG A
SEQ ID NO: 73
3' UTR Chlorella vulgaris nitrato reductasa
CTCG AGGC AGC AG CAGCTCG GAT A G T ATCG ACACACTCTG G ACGCTGGTCGTGT
G ATG G ACTGTTGCCGCCACACTTG CTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTT
TATCAAACAG CCTCAG TG TG TTTG ATCTTG TG TG TACG CG CTTTTG CG AG TTG CTA
G CTG CTTG TG CTATTTG CG AATACCACCCCCAG CATCCCCTTCCCTCG TTTCATAT
CGCTTG CATCCCAACCG CAACTTATCTACGCTG TCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCT
CCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCT
CCTG G TAC TG C AAC C TG TAAAC C AG C AC TG C AATG C TG ATG C AC G G G AAG TAG T
G G G ATG G G AAC AC AAATG G A
SEQ ID NO: 74
Cebador directo de tioesterasa C12
5' CTGGGCGACGGCTTCGGCAC 3'
SEQ ID NO: 75
Cebador inverso de tioesterasa C12
5' AAGTCGCGGCGCATGCCGTT 3'
SEQ ID NO: 76
Cebador directo de tioesterasa C14
5' TACCCCGCCTGGGGCGACAC 3'
SEQ ID NO: 77
Cebador inverso de tioesterasa C14
5' CTTGCTCAGGCGGCGGGTGC 3'
SEQ ID NO: 78
Región de codificación de tioesterasa C8-10 optimizada por codón de Cuphea hookeriana con secuencia de selección de plastidios nativos con etiqueta 3x FLAG
ATGGTGGCCGCCGCCGCCTCCAGCGCCTTCTTCCCCGTGCCCGCCCCCGGCGCCT
CCCCCAAGCCCGGCAAGTTCGGCAACTGGCCCTCCAGCCTGAGCCCCTCCTTCAA
GCCCAAGTCCATCCCCAACGGCGGCTTCCAGGTGAAGGCCAACGACAGCGCCCA
CCCCAAGGCCAACGGCTCCGCCGTGAGCCTGAAGAGCGGCAGCCTGAACACCCA
GGAGGACACCTCCTCCAGCCCCCCCCCCCGCACCTTCCTGCACCAGCTGCCCGAC
TGGAGCCGCCTGCTGACCGCCATCACCACCGTGTTCGTGAAGTCCAAGCGCCCCG
ACATGCACGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACAGCTTCGGCC
TGGAGTCCACCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCCAGTCCTTCTCCATCCGCTC
CTACGAGATCGGCACCGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCCTGATGAACCACCT
GCAGGAGACCTCCCTGAACCACTGCAAGAGCACCGGCATCCTGCTGGACGGCTT
CGGCCGCACCCTGGAGATGTGCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGATCAAGAT
GCAGATCAAGGTGAACCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGATCAACAC
CCGCTTCAGCCGCCTGGGCAAGATCGGCATGGGCCGCGACTGGCTGATCTCCGAC
TGCAACACCGGCGAGATCCTGGTGCGCGCCACCAGCGCCTACGCCATGATGAAC
CAGAAGACCCGCCGCCTGTCCAAGCTGCCCTACGAGGTGCACCAGGAGATCGTG
CCCCTGTTCGTGGACAGCCCCGTGATCGAGGACTCCGACCTGAAGGTGCACAAGT
TCAAGGTGAAGACCGGCGACAGCATCCAGAAGGGCCTGACCCCCGGCTGGAACG
ACCTGGACGTGAACCAGCACGTGTCCAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGG
AGAGC AT GCCCACCGAGGTGCTGG AG ACCCAGG AGCTGTGCTCCCTGGCCCTGG
AGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTGCTGGAGAGCGTGACCGCCATGG
ACCCCAGCAAGGTGGGCGTGCGCTCCCAGTACCAGCACCTGCTGCGCCTGGAGG
ACGGCACCGCCATCGTGAACGGCGCCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCG
CCAACGGCGCCATCTCCACCGGCAAGACCAGCAACGGCAACTCCGTGTCCATGG
ACT ACA AGG ACCACG ACGGCG ACTAC AAGGACCACG AC ATCGACT ACA AGGACG
ACGACGACAAGTGA
SEQ ID NO: 79
Región de codificación de tioesterasa C8-10 de Cuphea hookeriana y etiqueta 3x FLAG, con secuencia de direccionamiento de plastidios de esteroilol ACP desaturasa de Chlorella protothecoides
ATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTC
GCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGC
GCGCCCAGCTGCCCGACTGGAGCCGCCTGCTGACCGCCATCACCACCGTGTTCGT
GAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCACGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCT
GGTGGACAGCTTCGGCCTGGAGTCCACCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCCA
GTCCTTCTCCATCCGCTCCTACGAGATCGGCACCGACCGCACCGCCAGCATCGAG
ACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCTCCCTGAACCACTGCAAGAGCACCGGC
ATCCTGCTGGACGGCTTCGGCCGCACCCTGGAGATGTGCAAGCGCGACCTGATCT
GGGTGGTGATCAAGATGCAGATCAAGGTGAACCGCTACCCCGCCTGGGGCGACA
CCGTGGAGATCAACACCCGCTTCAGCCGCCTGGGCAAGATCGGCATGGGCCGCG
ACTGGCTGATCTCCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGGTGCGCGCCACCAGCG
CCT ACGCCATG ATGA ACC AGAAG ACCCGCCGCCTGTCCAAGCTGCCCT ACG AGG
TGCACCAGGAGATCGTGCCCCTGTTCGTGGACAGCCCCGTGATCGAGGACTCCGA
CCTGAAGGTGCACAAGTTCAAGGTGAAGACCGGCGACAGCATCCAGAAGGGCCT
GACCCCCGGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGTCCAACGTGAAGTA
CATCGGCTGGATCCTGGAGAGCATGCCCACCGAGGTGCTGGAGACCCAGGAGCT
GTGCTCCCTGGCCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTGCTGGAG
AGCGTGACCGCCATGGACCCCAGCAAGGTGGGCGTGCGCTCCCAGTACCAGCAC
CTGCTGCGCCTGGAGGACGGCACCGCCATCGTGAACGGCGCCACCGAGTGGCGC
CCCAAGAACGCCGGCGCCAACGGCGCCATCTCCACCGGCAAGACCAGCAACGGC
AACTCCGTGTCCATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGAC
ATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGA
SEQ ID NO: 80
Región de codificación de tioesterasa C8-10 de Cuphea hookeriana y etiqueta 3x FLAG, con secuencia de direccionamiento de plastidios de ácidos grasos desaturasa de Prototheca moriformis delta 12
ATG G CTATCAAG ACG AACAG G CAG CCTG TG G AG AAG CCTCCG TTCACG ATCG G G
ACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTGGGC
GCGCCCAGCTGCCCGACTGGAGCCGCCTGCTGACCGCCATCACCACCGTGTTCGT
G AAG TCCAAG CG CCCCG ACATG CACG ACCG CAAG TCCAAG CG CCCCG ACATG CT
GGTG GACAGCTTCGGCCTGGAGTCCACCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCCA
G TCCTTCTCCATCCGCTCCTACGAGATCG GCACCGACCGCACCGCCAGCATCGAG
ACCCTG ATG AACCACCTG CAG G AG ACCTCCCTG AACCACTG CAAG AG CACCG G C
ATCCTG CTG GACGG CTTCGGCCGCACCCTG GAGATGTGCAAG CG CG ACCTG ATCT
G G G TG G TG ATCAAG ATG CAG ATCAAG G TG AACCG CTACCCCG CCTG G G G CG ACA
CCGTGGAG ATCAACACCCGCTTCAGCCGCCTGG GCAAG ATCGGCATGG GCCG CG
ACTGGCTGATCTCCGACTGCAACACCG GCGAGATCCTGG TG CG CG CCACCAG CG
CCTACG CCATG ATG AACCAG AAG ACCCG CCG CCTG TCCAAG CTG CCCTACG AG G
TG CACCAGG AGATCGTG CCCCTG TTCGTGG ACAGCCCCGTGATCGAG GACTCCG A
CCTG AAG G TG CAC AAG TTCAAG G TG AAG AC C G G C G AC AG C ATC CAG AAG G G C C T
G ACCCCCG G CTG G AACG ACCTG G ACG TG AACCAG CACG TG TCCAACG TG AAG TA
CATCGGCTGGATCCTG G AG AG CATG CCCACCG AG G TG CTG G AG ACCCAG G AG CT
GTGCTCCCTGGCCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTGCTGGAG
AG CG TG ACCGCCATGGACCCCAGCAAGGTGGG CG TGCGCTCCCAGTACCAG CAC
CTGCTGCGCCTGGAGGACGGCACCGCCATCGTGAACGGCGCCACCGAGTGGCGC
CCCAAGAACGCCGGCGCCAACGG CG CCATCTCCACCG GCAAG ACCAGCAACGGC
A ACTCCGTGTCC ATGG ACT AC AAG G AC C ACG ACGGCG ACT A C A AGG ACC ACG AC
ATCG ACT AC A AGG ACG ACG ACG AC A AG TG A
SEQ ID NO: 81
Región de codificación de tioesterasa C8-10 de Cuphea hookeriana y etiqueta 3x FLAG, con secuencia de direccionamiento de plastidios de isopentenil difosfato de Prototheca moriformis
ATGACGTTCGGGGTCGCCCTCCCGGCCATGGGCCGCGGTGTCTCCCTTCCCCGGC
CC AGGGTCGCGGTGCGCGCCCAGTCGGCG AGTG AG G TTTTG G AG AGCGGGCGCG
CCCAGCTGCCCGACTGGAGCCGCCTGCTGACCGCCATCACCACCGTGTTCGTGAA
GTCCAAG CG CCCCGACATG CACG ACCGCAAG TCCAAGCGCCCCGACATGCTGGT
GGACAGCTTCGGCCTGGAGTCCACCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCCAGTCC
TTCTCCATCCGCTCCTACGAGATCGGCACCGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCC
TGATG AACCACCTG CAG G AG ACCTCCCTG AACCACTG CAAG AG CACCG G CATCC
TGCTGGACGGCTTCGGCCGCACCCTGGAGATGTGCAAGCGCGACCTGATCTGGGT
GGTG ATCAAG ATG CAG ATCAAG G TG AACCG CTACCCCG CCTG G G G CG ACACCG T
GGAGATCAACACCCGCTTCAGCCGCCTGGGCAAGATCGGCATGGGCCGCGACTG
GCTGATCTCCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGGTGCGCGCCACCAGCGCCTAC
GCCATGATG AACCAG AAG ACCCG CCGCCTGTCCAAGCTGCCCTACG AGG TG CAC
CAGG AGATCGTG CCCCTG TTCGTGG ACAGCCCCGTGATCGAG GACTCCG ACCTG A
AG G TG CACAAG TTCAAG G TG AAG ACCG G CG ACAG CATCCAG AAG G G CCTG ACCC
CCG G CTG G AACG ACCTG G ACG TG AACCAG CACG TG TCCAACG TG AAG TACATCG
GCTGGATCCTGGAGAG CATGCCCACCGAGGTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCT
CCCTGGCCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTGCTGGAGAGCG
TG ACCGCCATGGACCCCAG CAAGG TG GGCGTGCGCTCCCAG TACCAGCACCTGC
TGCGCCTG GAG GACGGCACCGCCATCGTGAACGGCGCCACCGAGTG GCGCCCCA
AG AACG CCG G CG CCAACG G CG CCATCTCCACCG G CAAG ACCAG CAACG G CAACT
C C G TG TCC ATG G AC TAC AAG G ACC ACG AC G G C G ACTACAAG G AC C AC G AC ATC G
A C TA C A AG G A C G AC G A C G AC AAG TG A
SEQ ID NO: 82
R eg ión de cod ifica c ión de t io e s te ra sa C 12 U m b e lu la ria ca lifo rn ica y e tiq ue ta 3x FLAG , con se cu e n c ia de se lecc ió n de p la s tid io s de d ifo s fa to de iso pe n ten il P ro to th e ca m o rifo rm is
ATG AC G TTCG G G G TC G C C CTC C C G G C C ATG G G C C G C G G TG TC TC C CTTC C CC G G C
C C AG G G TC G C G G TG C G C G C C C AG TC G G C G AG TC AG G TTTTG G AG AG C G G G C G C G
C C C C C G A C TG G TC C ATG C TG TTC G C C G TG ATC AC C AC C ATC TTC AG C G C C G C C G A
G A A G C A G TG G A C C A A C C T G G A G T G G A A G C C C A A G C C C A A G C T G C C C C A G C T G C T
G G A C G AC C AC TTC G G C C TG C AC G G C C TG G TG TTC C G C C G C AC C TTC G C C ATC C G C
TC C TA C G A G G TG G G C C C C G A C C G C A G C A C C TC C A TC C TG G C C G TG A TG A A C C A C A
TG C AG G AG G C C AC C C TG A A C C A C G C C A A G A G C G TG G G C A TC C TG G G C G A C G G C T
TC G G C A C C A C C C TG G AG A TG TC C A AG C G C G A C C TG A TG TG G G TG G TG C G C C G C A
C C C A C G TG G C C G TG G AG C G C TA C C C C AC C TG G G G C G A C AC C G TG G AG G TG G A G T
G C TG G A TC G G C G C C A G C G G C AA C A AC G G C A TG C G C C G C G A C TTC C TG G TG C G C G
A C T G C A A G A C C G G C G A G A TC C TG A C C C G C TG C A C C TC C C TG A G C G TG C TG A TG A
AC ACC C G C AC C C G C C G C C TG A G C AC C A TC C C C G AC G A G G TG C G C G G C G AG A TC G
G C C C C G C C T T C A T C G A C A A C G T G G C C G T G A A G G A C G A C G A G A T C A A G A A G C T G C
A G A A G C TG A A C G A C TC C A C C G C C G A C TA C A TC C A G G G C G G C C TG A C C C C C C G C T
G G A A C G A C C T G G A C G T G A A C C A G C A C G T G A A C A A C C T G A A G T A C G T G G C C T G G G
TG T T C G A G A C C G TG C C C G A C A G C A T C T TC G A G T C C C A C C A C A TC A G C TC C T T C A C
C C TG G AG TA C C G C C G C G A G TG C AC C C G C G AC TC C G TG C TG C G C AG C C TG A C C A C C
G TG AG C G G C G G C AG C TC C G AG G C C G G C C TG G TG TG C G AC C AC C TG C TG C AG C TG
G A G G G C G G C AG C G AG G TG C TG C G C G C C C G C AC C G AG TG G C G C C C C AAG C TG AC C
G AC TC C TTC C G C G G C AT C AG C G TG ATC C C C G C C G AG CCCCG CG TG A TG G A C T A C A
A G G A C C A C G A C G G C G A C T A C A A G G A C C A C G A C A T C G A C T A C A A G G A C G A C G A C
G A C A A G T G A
SEQ ID NO: 83
Región de codificación de tioesterasa C12 Umbelularia californica y etiqueta 3x FLAG, con secuencia de selección de plastidios de estearoil ACP desaturasa Prototheca moriformis
ATG G C TTC C G C G G C ATTC AC C ATG TC G G C G TG C C C C G C G ATG AC TG G C AG G G C C C
CTG G G G CACG TCG CTC C G G ACG G C CAG TC G C CACC C G C C TG AG G G G G C G C G C C C
C C G AC TG G TC C ATG C TG TTC G C C G TG A T C ACC A C C A T C T T C AG CG CCG CCG AG A A
G C A G TG G A C C A A C C T G G A G TG G A A G C C C A A G C C C A A G C TG C C C C A G C TG C TG G A
C G AC C AC TTC G G C C TG C AC G G C C TG G TG TTC C G C C G C AC C TTC G C C ATC C G C TC C
TAC G AG G TG G G C C C C G AC C G C AG C A C C TC C A T CCTG G CCG TG A TG A ACC A C A TG
C AG G AG G C C AC C C TG A A C C A C G C C A A G A G C G TG G G C A TC C TG G G C G A C G G C TTC
G G C ACC ACC C TG G A G ATG TC C A A G C G C G AC C TG A T G TG G GTGGTGCGCCGC ACC
C AC G TG G C C G TG G AG C G C TAC C C C AC C TG G G G CG AC AC C G TG G AG G TG G AG TG C
TG G A TC G G C G C C A G C G G C AA C A AC G G C A TG C G C C G C G A C TTC C TG G TG C G C G A C
T G C A A G A C C G G C G A G A TC C TG A C C C G C TG C A C C TC C C TG A G C G TG C TG A TG A A C
AC C C G C AC C C G C C G C C TG AG C AC C ATC C C C G AC G AG G TG C G C G G C G AG ATC G G C
C C C G C C T T C A T C G A C A A C G T G G C C G T G A A G G A C G A C G A G A T C A A G A A G C T G C A G
A A G C TG A A C G A C TC C A C C G C C G AC TAC A TC C AG G G C G G C C TG AC C C C C C G C TG G
A A C G A C C T G G A C G T G A A C C A G C A C G TG A A C A A C C T G A A G TA C G T G G C C TG G G T G
T T C G A G A C C G T G C C C G A C A G C A TC TTC G A G TC C C A C C A C A TC A G C TC C TTC A C C C
TG G AG TAC C G C C G C G AG TG C A C C C G C G AC TC C G TG C TG C G C AG C C TG AC C AC C G T
G AG C G G C G G C AG C TC C G AG G C C G G C C TG G TG TG C G AC C AC C TG C TG C AG C TG G A
G G G CG G C AG C G AG G TG C TG C G C G C C C G C AC C G AG TG G C G C C C C AAG C TG AC C G A
C TC C TTC C G C G G C ATC AG C G TG A TC C C C G C C G AG C C C C G C G TG ATG G A C TA C A AG
G A C C A C G A C G G C G A C T A C A A G G A C C A C G A C A T C G A C T A C A A G G A C G A C G A C G A
C A A G T G A
SEQ ID NO: 84
R eg ión de co d ifica c ió n de tio e s te ra sa C 12 de U m b e llu la ria ca lifo rn ica y e tiq ue ta 3x FLA G , con secu en c ia de d ire cc io n a m ie n to de p la s tid io s de e s te ro ílo A C P d e sa tu ra sa de C h lo re lla p ro to th e c o id e s
ATG G C C A C C G C A TC C AC TTTC TC G G C G TTC AA TG C C C G C TG C G G C G A C C TG C G TC
GCTCGGCGGG CTCCGG G CCCCG G CG CCCAG CG AG G CCCCTCCCCG TG CG CG G G C
G C G C C C C C G A C TG G TC C A TG C TG TTC G C C G TG ATC AC C AC C ATC TTC A G C G C C G C
C G A G A A G C A G TG G A C C A A C C TG G A G T G G A A G C C C A A G C C C A A G C T G C C C C A G C T
G C TG G AC G AC C AC TTC G G C C TG C AC G G C C TG G TG TTC C G C C G C AC C TTC G C C ATC
CGCT C C T ACG AG G TG G G CCCCG AC C G C AG C AC C TC C A TC C TG G C C G TG ATG A AC C
AC A TG C A G G A G G C C A C C C TG A A C C A C G C C A A G A G C G TG G G C A TC C TG G G C G A C G
G C TTC G G C AC C AC C C TG G AG A TG TC C AA G C G C G AC C TG ATG TG G G TG G TG C G C C
G C AC C C AC G TG G C C G TG G AG C G C TAC C C C AC C TG G G G C G AC AC C G TG G AG G TG G
AG TG C TG G ATC G G C G C C AG C G G C A AC AA C G G C ATG C G C C G C G AC TTC C TG G TG C
G C G A C TG C A A G A C C G G C G AG A TC C TG AC C C G C TG C AC C TC C C TG AG C G TG C TG A T
G AAC AC C C G C AC C C G C C G C C TG AG C A C C ATC C C C G AC G AG G TG C G C G G C G A G AT
C G G C C C C G C C TTC A TC G A C A A C G TG G C C G TG A A G G A C G A C G A G A TC A A G A A G C T
G C AG AAG C TG A AC G A C TC C AC C G C C G AC TAC ATC C AG G G C G G C C TG AC C C C C C G
C TG G A A C G A C C T G G A C G T G A AC C AG C AC G TG A A C A A C C T G A A G T ACG TG G CCT G
G G TG TTC G A G A C C G TG C C C G A C A G C A TC TTC G A G TC C C A C C A C A TC A G C TC C TTC
AC C C TG G AG TAC C G C C G C G AG TG C AC C C G C G AC TC C G TG C TG C G C AG C C TG AC C
AC C G TG AG C G G C G G C AG C TC C G AG G C C G G C C TG G TG TG C G AC C AC C TG C TG C AG
C TG G AG G G C G G C AG C G AG G TG CTG CG CG CC C G C AC C G AG TG G C G C CC C AAG C TG
AC C G A C TC C TTC C G C G G C A TC A G C G TG ATC C C C G C C G A G C C C C G C G TG A TG G AC T
A C A A G G A C C A C G A C G G C G A C T A C A A G G A C C A C G A C A T C G A C T A C A A G G A C G A C
G A C G A C A A G T G A T G A
SEQ ID NO: 85
Región codificante de tioesterasa C12 de Umbelularia californica y etiqueta 3x FLAG, con secuencia de direccionamiento de plastidios de ácido graso desaturasa Prototheca moriformis delta 12
ATG G C TA TC A AG A C G AAC A G G C AG C C TG TG G A G AA G C C TC C G TTC AC G ATC G G G
ACG CTG CG CAAG G CCATCCCCG CG CACTG TTTCG AG CG CTCG G CG CTTCG TG G G C
G CG CCCCCG ACTG G TCCATG CTG TTCG CCG TG ATCACCACCATCTTCAG CG CCG C
C G AG AAG C A G TG G AC C AAC C TG G AG TG G AAG C C C AAG C C C AAG C TG C C C C AG C T
G CTG G ACG ACCACTTCG G CCTG CACG G CCTG G TG TTCCG CCG CACCTTCG CCATC
CG CTCCT ACG AG GTGGGCCCCG ACCGC AGC ACCTCC ATC CTG G CCG TG ATG AACC
AC A TG C A G G A G G C C AC C CTG AAC C AC G C C AAG AG C G TG G G C ATC CTG G G C G AC G
G C TTCG G CACCACCCTG G AG ATG TCCAAG CG CG ACCTG ATG TG G G TG G TG CG CC
G CACCC ACGTGGCCGTGG AG CG CT ACCCC ACCT GGGGCG AC ACCGTGGAGGTGG
AG TG CTG G ATCG G CG CCAG CG G CAACAACG G CATG CG CCG CG ACTTCCTG G TG C
G C G ACTG CAAG ACCG G CG AG ATCCTG ACCCG CTG CACCTCCCTG AG CG TG CTG AT
G AACACCCG CACCCG CCG CCTG AG CACCATCCCCG ACG AG G TG CG CG G CG AG AT
C G G C C C C G C C TTC ATC G AC AAC G TG G C C G TG AAG G AC G AC G AG ATC AAG AAG C T
G C AG AAG CTG AACG ACTCCACCG CCG ACTACATCCAG G G CG G CCTG ACCCCCCG
CTGG AA C G ACCTGG AC G TG A AC C AG C A C G TG AAC AAC C TG AAG TAC G TG G C C TG
G G TG TTC G AG AC C G TG C C CG AC AG C ATC TTC G AG TC C C AC C AC ATC AG C TC CTTC
ACCCTG G AG TACCG CCG CG AG TG CACCCG CG ACTCCG TG CTG CG CAG CCTG ACC
ACCGTGAGCGG CG G CAG CTCCG AG G CCG G CCTG G TG TG CG ACCACCTG CTG CAG
CTG GAG GGCGGCAGCGAGG TG CTG CG CG CCCGCACCGAG TG GCGCCCCAAGCTG
ACCG ACTCCTTCCG CG G CATCAG CG TG ATCCCCG CCG AG CCCCG CG TG ATG G ACT
AC A AG G A C C A C G AC G G C G A C TA C A A G G A C C A C G A C A TC G A C TA C A A G G A C G A C
G A C G A C A A G TG A
SEQ ID NO: 86
R eg ión de cod ifica c ión de tio e s te ra sa C 14 de C in n a m o m u m ca m p h o ru m y e tiq ue ta 3x FLAG , con secu en c ia de d ire cc io n a m ie n to de p las tid ios es te ro ilo l A C P d e sa tu ra sa de C h lo re lla p ro to th e c o id e s
ATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTC
GCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGC
GCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCTCCGCCGC
CGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAACCCCCCCCAGCT
GCTGGACGACCACTTCGGCCCCCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATC
CGCAGCTACGAGGTGGGCCCCGACCGCTCCACCAGCATCGTGGCCGTGATGAAC
CACCTGCAGGAGGCCGCCCTGAACCACGCCAAGTCCGTGGGCATCCTGGGCGAC
GGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGAAG
CGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGGTG
GAGTGCTGGGTGGGCGCCTCCGGCAACAACGGCCGCCGCCACGACTTCCTGGTG
CGCGACTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGATG
ATGAACACCCGCACCCGCCGCCTGAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGCGCGGCGAG
ATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTGAAGGACGAGGAGATCAAGAAG
CCCCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGCCTGACCCCC
CGCTGGAACGACCTGGACATCAACCAGCACGTGAACAACATCAAGTACGTGGAC
TGGATCCTGGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAGAGCCACCACATCTCCTCCT
TCACCATCGAGTACCGCCGCGAGTGCACCATGGACAGCGTGCTGCAGTCCCTGAC
CACCGTGAGCGGCGGCTCCTCCGAGGCCGGCCTGGTGTGCGAGCACCTGCTGCA
GCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCAAGACCGAGTGGCGCCCCAAGCT
GACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGTCCAGCGTGATGGAC
T AC AAGG ACC ACG ACGGCGACT AC A AGG ACCACGAC AT CG ACTAC A AGGACGAC
GACGACAAGTGATGA
SEQ ID NO: 87
C. reinhardtii p-tubulina:: Tioesterasa C14 de C. camphora con secuencia de direccionamiento de plastidios de estearoil ACP desaturasa C.protothecoides Tar:: 3xFLAG:: C. elemento de constructo de expresión vulgaris NitRed
gaattcctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgat gcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctcceatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggccccc pattgcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtpatc gcactccgctaagggggcgcctcltcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacactagtATGGCCACCGCATCCACT
TTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGC
CCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCAT
GCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCTCCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAAC
CTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAACCCCCCCCAGCTGCTGGACGACCACTTCGGC
CCCCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCAGCTACGAGGTGGGCC
CCGACCGCTCCACCAGCATCGTGGCCGTGATGAACCACCTGCAGGAGGCCGCCC
TGAACCACGCCAAGTCCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGG
AGATGTCCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGAAGCGCACCCACGTGGCCGTGG
AGCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGGTGGAGTGCTGGGTGGGCGCCT
CCGGCAACAACGGCCGCCGCCACGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGGCG
AGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGATGATGAACACCCGCACCCGCCG
CCTGAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGA
CAACGTGGCCGTGAAGGACGAGGAGATCAAGAAGCCCCAGAAGCTGAACGACT
CCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACA
TCAACCAGCACGTGAACAACATCAAGTACGTGGACTGGATCCTGGAGACCGTGC
CCGACAGCATCTTCGAGAGCCACCACATCTCCTCCTTCACCATCGAGTACCGCCG
CGAGTGCACCATGGACAGCGTGCTGCAGTCCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCTC
CTCCGAGGCCGGCCTGGTGTGCGAGCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGA
GGTGCTGCGCGCCAAGACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGG
CATCAGCGTGATCCCCGCCGAGTCCAGCGTGATGGACTACAAGGACCACGACGC.
CGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGATGActc gaggcagcagcagctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgügccgccacacttgctgccttgacctgt gaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtetgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcga ataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctetcctgctatccctcagcgctgct cctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatg ctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaaagctt
SEQ ID NO: 88
C. reinhardtii p-tubulina:: tioesterasa C14 de C. camphora con P.moriformis secuencia de direccionamiento de plastidios de estearoil ACP desaturasa:: 3xFLAG:: elemento de constructo de expresión de NitRed C. vulgaris
gaattcctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgat gcttc gacccccc gaagctccttc gg g gct gcatgggcgctcc gatgccgctccag g gcgagcgctgtttaaatagcc aggccccc gattgcaaagacatiatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatc gcactccgctaagggggcgcctcHcclcilcgtttcagtcacaacccgcaaacacíagtATGGCTTCCGCGGCATTC
ACCATGTCGGCGTGCCCCGCGATGACTGGCAGGGCCCCTGGGGCACGTCGCTCC
GGACGGCCAGTCGCCACCCGCCTGAGGGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTG
TTCGCCGTGATCACCACCATCTTCTCCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGG
AGTGGAAGCCCAAGCCCAACCCCCCCCAGCTGCTGGACGACCACTTCGGCCCCC
ACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCAGCTAGGAGGTGGGCCCCGA
CCGCTCCACCAGCATCGTGGCCGTGATGAACCACCTGCAGGAGGCCGCCCTGAA
CCACGCCAAGTCCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGAT
GTCCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGAAGCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCG
CTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGGTGGAGTGCTGGGTGGGCGCCTCCGG
CAACAACGGCCGCCGCOACGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGGCGAGAT
CCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGATGATGAACACCCGCACCCGCCGCCTG
AGCAAGATCCCCGAGGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAAC
GTGGCCGTGAAGGACGAGGAGATCAAGAAGCCCCAGAAGCTGAACGACTCCACC
GCCGACTACATCCAGGGCGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACATCAAC
CAGCACGTGAACAACATCAAGTACGTGGACTGGATCCTGGAGACCGTGCCCGAC
AGCATCTTCGAGAGCCACCACATCTCCTCCTTCACCATCGAGTACCGCCGCGAGT
GCACCATGGACAGCGTGCTGCAGTCCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCTCCTCCG
AGGCCGGCCTGGTGTGCGAGCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGC
TGCGCGCCAAGACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCA
GCGTGATCCCCGCCGAGTCCAGCGTGATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACT
ACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGATGActcgaggcag cagcagctcggatagtatcgacacaclctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatcc ctgcc gcttttatc aaacagcctcagtgtgtttgatctígtglgtacgcgc ttttgc gagttgctagctgcttgtgctatttgc gaataccacc cccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcct gctcactgcccctcgc acagccttggtttgggctccgcct gtattctcctg gtactgcaacc tgtaaaccagcactgcaat gctgat gca cgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaaagctt
SEQ ID NO: 89
Secuencia de invertasa Arabidopsis thaliana (con señal de orientación de SUC2 de levaduras: promotor de deshidrogenasa de glutamato de C. Sorokiniana y 3'UTR nitrato reductasa C. Vulgaris: 3xFLAG) GAATTCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGCCACAGCCGCTCCCACCCGCCGCTGAAC CGACACGTGCTTGGGCGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCATGCTTGTGCTGGTGAGGC TGGGCAGTGCTGCCATGCTGATTGAGGCTTGGTTCATCGGGTGGAAGCTTATGTG TGTGCTGGGCTTGCATGCCGGGCAATGCGCATGGTGGCAAGAGGGCGGCAGCAC TTGCTGGAGCTGCCGCGGTGCCTCCAGGTGGTTCAATCGCGGCAGCCAGAGGGA TTTCAGATGATCGCGCGTACAGGTTGAGCAGCAGTGTCAGCAAAGGTAGCAGTTT GCCAGAATGATCGGTTCAGCTGTTAATCAATGCCAGCAAGAGAAGGGGTCAAGT GCAAACACGGGCATGCCACAGCACGGGCACCGGGGAGTGGAATGGCACCACCA AGTGTGTGCGAGCCAGCATCGCCGCCTGGCTGTTTCAGCTACAACGGCAGGAGTC ATCCAACGTAACCATGAGCTGATCAACACTGCAATCATCGGGCGGGCGTGATGC AAGCATGCCTGGCGAAGACACATGGTGTGCGGATGCTGCCGGCTGCTGCCTGCT GCGCACGCCGTTGAGTTGGCAGCAGGCTCAGCCATGCACTGGATGGCAGCTGGG CTGCCACTGCAATGTGGTGGATAGGATGCAAGTGGAGCGAATACCAAACCCTCT GGCTGCTTGCTGGGTTGCATGGCATCGCACCATCAGCAGGAGCGCATGCGAAGG GACTGGCCCCATGCACGCCATGCCAAACCGGAGCGCACCGAGTGTCCACACTGT CACCAGGCCCGCAAGCTTTGCAGAACCATGCTCATGGACGCATGTAGCGCTGAC. GTCCCTTGACGGCGCTCCTCTCGGGTGTGGGAAACGCAATGCAGCACAGGCAGC AGAGGCGGCGGCAGCAGAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGGGGCCACCCTTCTTGCG GGGTCGCGCCCCAGCCAGCGGTGATGCGCTGATCCCAAACGAGTTCACATTCATT TGCATGCCTGGAGAAGCGAGGCTGGGGCCTTTGGGCTGGTGCAGCCCGCAATGG AATGCGGGACCGCCAGGCT AGC AGCAAAGGCGCCTCCCCT ACTCCGCATCGATG TTCCATAGTGCATTGGACTGCATTTGGGTGGGGCGGCCGGCTGTTTCTTTCGTGTT GCAAAACGCGCCAGCTCAGCAACCTGTCCCGTGGGTCCCCCGTGCCGATGAAAT CGTGTGCACGCCGATCAGCTGATTGCCCGGCTCGCGAAGTAGGCGCCCTCCTTTC TGCTCGCCCTCTCTCCGTCCCGCCACTAGTATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCT GCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGA CCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGGGGCGCGCCAGCCACCA CGTGTACAAGCGCCTGACCCAGAGCACCAACACCAAGTCCCCCAGCGTGAACCA GCCCTACCGCACCGGCTTCCACTTCCAGCCCCCCAAGAACTGGATGAACGACCCC A ACGGCCCC ATGATCT AC AAGGGC ATCT ACC ACCTGTTCT ACCAGTGG AACCCCA AGGGCGCCGTGTGGGGCAACATCGTGTGGGCCCACTCCACCAGCACCGACCTGA
TCAACTGGGACCCCCACCCCCCCGCCATCTTCCCCAGCGCCCCCTTCGACATCAA
CGGCTGCTGGTCCGGCAGCGCCACCATCCTGCCCAACGGCAAGCCCGTGATCCTG
TACACCGGCATCGACCCCAAGAACCAGCAGGTGCAGAACATCGCCGAGCCCAAG
AACCTGTCCGACCCCTACCTGCGCGAGTGGAAGAAGAGCCCCCTGAACCCCCTG
ATGGCCCCCGACGCCGTGAACGGCATCAACGCCTCCAGCTTCCGCGACCCCACCA
CCGCCTGGCTGGGCCAGGACAAGAAGTGGCGCGTGATCATCGGCTCCAAGATCC
ACCGCCGCGGCCTGGCCATCACCTACACCAGCAAGGACTTCCTGAAGTGGGAGA
AGTCCCCCGAGCCCCTGCACTACGACGACGGCAGCGGCATGTGGGAGTGCCCCG
ACTTCTTCCCCGTGACCCGCTTCGGCAGCAACGGCGTGGAGACCTCCAGCTTCGG
CGAGCCCAACGAGATCCTGAAGCACGTGCTGAAGATCTCCCTGGACGACACCAA
GCACGACTACTACACCATCGGCACCTACGACCGCGTGAAGGACAAGTTCGTGCC
CGACAACGGCTTCAAGATGGACGGCACCGCCCCCCGCTACGACTACGGCAAGTA
CTACGCCAGCAAGACCTTCTTCGACTCCGCCAAGAACCGCCGCATCCTGTGGGGC
TGGACCAACGAGTCCTCCAGCGTGGAGGACGACGTGGAGAAGGGCTGGTCCGGC
ATCCAGACCATCCCCCGCAAGATCTGGCTGGACCGCAGCGGCAAGCAGCTGATC
CAGTGGCCCGTGCGCGAGGTGGAGCGCCTGCGCACCAAGCAGGTGAAGAACCTG
CGCAACAAGGTGCTGAAGTCCGGCAGCCGCCTGGAGGTGTACGGCGTGACCGCC
GCCCAGGCCGACGTGGAGGTGCTGTTCAAGGTGCGCGACCTGGAGAAGGCCGAC
GTGATCGAGCCCTCCTGGACCGACCCCCAGCTGATCTGCAGCAAGATGAACGTGT
CCGTGAAGTCCGGCCTGGGCCCCTTCGGCCTGATGGTGCTGGCCAGCAAGAACCT
GGAGGAGTACACCTCCGTGTACTTCCGCATCTTCAAGGCCCGCCAGAACAGCAA
CAAGTACGTGGTGCTGATGTGCTCCGACCAGTCCCGCAGCTCCCTGAAGGAGGA
CAACGACAAGACCACCTACGGCGCCTTCGTGGACATCAACCCCCACCAGCCCCT
GAGCCTGCGCGCCCTGATCGACCACTCCGTGGTGGAGAGCTTCGGCGGCAAGGG
CCGCGCCTGCATCACCTCCCGCGTGTACCCCAAGCTGGCCATCGGCAAGTCCAGC
C ACCTGTTCGCCTT CA ACT ACGGCT ACC AGTCCGTGG ACGTGCTG A ACCTG A ACG
CCTGGAGCATGAACTCCGCCCAGATCAGCATGGACTACAAGGACCACGACGGCG
ACT ACAAGG ACCACG AC ATCG ACT ACAAGGACGACG ACGAC A AGTG ATT A ATT A
ACCGGCTCGAGGG4 OCA GCAGCTCGGA TA GTATCGA C ACACTCTGG ACGCTGGTCG
TGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCG
CTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTT
GCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTC
ATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGC
TGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTA
TTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGT
AGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTTGAGCTC
SEQ ID NO: 90
Secuencia de aminoácidos traducida del constructo de expresión de invertasa de Arabidopsis thaliana
MLLQAFLFLLAGFAAKISASMTNETSDRPLVHFTPNKGWGRASHHVYKRLTQSTNT
KSPSVNQPYRTGFHFQPPKNWMNDPNGPMIYKGIYHLFYQWNPKGAVWGNIVWAH
STSTDLINWDPIIPPAÍFPSAPFDINGCWSGSATILPNGKPVTLYTGIDPKNQQVQNIAEP
KNLSDPYLREWKKSPLNPLMAPDAVNGINASSFRDPTTAWLGQDKKWRVIIGSKIHR
RGLAITYTSKDFLKWEKSPEPLHYDDGSGMWECPDFFPVTRFGSNGVETSSFGEPNEI
LKHVLKISLDDTKHDYYTIGTYDRVKDKFVPDNGFKMDGTAPRYDYGKYYASKTFF
DSAKNRRILWGWTNESSSVEDDVEKGWSGIQTIPRKIWLDRSGKQLIQWPVREVERL
RTKQVKNLRNKVLKSGSRLEVYGVTAAQADVEVLFKVRDLEKADVIEPSWTDPQLI
CSKMNVSVKSGLGPFGLMVLASKNLEEYTSVYFRIFKARQNSNKYVVLMCSDQSRS
SLKEDNDKTTYGAFVDINPHQPLSLRALIDHSVVESFGGKGRACITSRVYPKLA1GKS
SHLFAFNYGYQSVDVLNLNAWSMNSAQISMDYKDHDGDYKDHD1DYKDDDDK
SEQ ID NO: 91
Prototheca moriformis FatB/A promotor/5'UTR
CCTG TCG ATCG AAG AG AAG G AG ACATG TG TACATTATTG G TG TG AG G G CG CTG A
ATCG G CCATTTTTTAAAATG ATC AC G C TC ATG C C AATAG AC G C G G CAC ATAACG A
CGTTCAAACCCCCGCCAAAGCCGCGGACAACCCCATCCCTCCACACCCCCCACAC
A A AG AACCCGCCACCGCTTACCTTGCCCACG AGGT AGGCCTTTCGTTGCGC A A A A
CCGGCCTCGGTGATGAATGCATGCCCGTTCCTGACGAGCGCTGCCCGGGCCAACA
CGCTCTTTTGCTGCGTCTCCTCAGGCTTGGGGGCCTCCTTGGGCTTGGGTGCCGCC
ATGATCTG CG CG CATCAGAG AAACG TTG CTGG TAAAAAG GAG CG CCCGGCTGCG
CAATATATATATAG G CATG CCAACACAG CCCAACCTCACTCG G G AG CCCG TCCCA
CCACCCCCAAGTCG CG TG CCTTGACG GCATACTGCTGCAGAAGCTTCATGAG AAT
GATG CCGAACAAG AG G G G CACG AG G ACCCAATCCCG G ACATCCTTG TCG ATAAT
GATCTCGTGAGTCCCCATCGTCCGCCCGACGCTCCGGGGAGCCCGCCGATGCTCA
AGACGAGAGGGCCCTCGACCAGGAGGGGCTGGCCCGGGCGGGCACTGGCGTCG
AAGGTGCGCCCGTCG TTCGCCTGCAGTCCTATGCCACAAAACAAGTCTTCTGACG
GGGTGCGTTTGCTCCCGTGCGGGCAGGCAACAGAGGTATTCACCCTGGTCATGGG
G AG ATCG G CG ATCG AG CTG G G ATAAG AG ATACTTCTG G CAAG CAATG ACAACTT
GTCAGGACCGGACCGTGCCAT ATATTTC TC AC CT AG CG CCGCAAA ACCT A A C A AT
TTGGGAGTCACTGTGCCACTGAGTTCGACTGGTAGCTGAATGGAGTCGCTGCTCC
ACTAAACGAATTGTCAGCACCGCCAGCCGGCCGAG GACCCG AGTCATAGCGAGG
GTAGTAGCGCGCC
SEQ ID NO: 92
Prototheca moriformis promotor de transportador de metal NRAMP/5'UTR
ACTAATTG CAATC G TG C AG TAATC ATC G ATATG G TC AC AAG TAG ATC C C CTACTG
ACACCCTCTCGTACATGTAGGCAATGTCATCGGCGCCGTCCTGCTGACCGATGCC
GACGTAGCAGAGCAGACCCGGGCCGATCTGGGATACGAGCCGGCCCTCCACCTG
C G C TC G AG G TG G AATC AAG TAAATAAC CAATAC AC TTTTCG AC AC C AC AC AG AG
TTGCACGGACGGTGGCGTACCTCTACGCTCGCGCTCTTCACGCGCTGGACGACCG
CACG CATGAGCCCG GGTGGCTTGGTCTGGGCTGCAAAAATGCACAACAAACAAG
TATCAG ACG CTCATG G ATG CACACG CG CTCCCAAG CACG CTCAG ACTAAAT ATT A
C AG T AGCTCGT ATC TG AT AAG A T ATCGAG AC AT ACCGCTC A ACTC ACCCGC A AAC
TGCGCCCCGCCAGGTGATGCGCACAGGGCCCCACCATGCGATCCATCGCATCGCT
CCTCGAGGGCGCTATCACGTGGCCGGAGAGCGTTCACAGCGTACGCCACTGTATC
TGGGCGGTATGCGGTCCGTC AAC ATG G AG ACAG ATACCCG C ACCACCACCTTGC
AAG CTCTTCCAT ATTGG AAG T A G A A A A TT GT A ATTG TATCATCG C ACG AGGGGCC
AACTTGCCGTCGGCGAGCTGGGCGACGAACACCACCTGGACGTTGTCGAGACTC
GCTCGTGCCGTGCGCCGGGCCGCTGGGTATCCAGACCGTCGCC
SEQ ID NO: 93
Prototheca moriformis Promotor de proteínas asociado a flagelar FLAP/5'UTR
C AA C G AC AAC C AG C A G G C AA C TC G G TC A G C G AC C C AAC A C G C G AG TC AA ATTG T
TG C G TG TTC TTG C C TTG TC TA TTTA C TG TG ATAG C A AG A C TG TC G G TC A G TC A ATA
CCG CG G TG CGCACGTCGGG GTGCCAAGCCTAGCAGAGCACG GGACGG CTGG TGC
TG TG C G C C AG C TC AG C TC G C TTC G C G AC CAATTG TAG G AC C G G C AAAG TC AC C AA
A A C A TG C C A G C G G TG C G A TTC A ATTG G TC ATG A G C TC TA C A AAA TTG TTTTG TG C
G TC G C G C AG G TATC C AAC G G C G C G G C AG AG AAAG TTTG AC AG C TC TC G ATTTC AT
C TC G G AA AAA TG G G G AG AATTTATG AC AC AC AAG TG C G C AG G C G G C C C AG G C G G
C C AG C ATATTC TG G C G TG AC C TG G G C C G C C C AC AAAATG C TTG G ATG C AC TC TAA
A A TA A TTA TA T TT G C C A T G A A C A A G G G A A G A G T T A C C G C A C C C A G C C C T A G A C T T
G G G CG CC C G AG CAAG G TTACG TCAAG CCACCTTCG CCCATCG CCCAACTCCG TAT
TC CC C G ACAG CCG CACG TG G CCCTCG CCG G AATG AACCCTG AATCG G CATCACG
CCACG CG TTCG CCAATCG TTCCG CTCTCTG G CTTCATCG G CCTG CG CCTTCACG TC
G TG G TC A C G AC AG TG C A TTC ATA C TTC C ATTTG C AC C TC G G C A C A C AC TTTTA C G
C ATC G C CTACCCTTG CTG CG G CAG TCTAG G G TCACTTTG CAG CCATG G G ACAG TG
C TA C A C C A C C G TC G G TG C G C AA AG C TATTTC A AG TG AAC C G TG G G C G G AA AAA A
G G A A T G T AC A C TG TC TC A ACCG AC TC C T AC A ATTG TTTAC C ATG C AG ATC AG AG C
TCGACGGCCATCATCGAGCAGGTG TG GGGCCTTGGTGGCGCGG CG CG GGGCCCC
AG G G C G TC G C AG G CATTG ATG G C AC TC TG AG AC TTTC G C AC G C G C ATG AG G G AC
C C C A TC A A G A G A AG AG TG T G TC TTT ATGTCCCC ATTC A T G A TG ATG T AT CTTGTG
ATTG TCG CAG TTTG G CAAG TTTAACCG G ATCG CCG CTCCAG G TG TG G CG TG G CG G
ATTTTTCTAG G G G TG C TTG AG C AG TC G
SEQ ID NO: 94
Prototheca moriformis SulfRed promotor de reductasa de sulfito/5'UTR
GGCCCAGG GCCCTGCGGATGGCCCACACCAGATCTAG CCTCTCTTATG CCATG CC
CGCCTCGCTGCCCGTCGTATCCCCCCGCCGATCCGCGCGTAGGGGACCGCGGCCT
G A C C C AC G C C AC G AAAG AG C TTTG C TC C TC AATTTC TC G C C AAC AG AAC CG TATC
A A ACGCTC A ACGCCT ATC C C G AAC AA TC C G T ATTC AC A C C A A A TC G A G TA T ACCG
G ACTG G TTTG C C TAG TC TTG AAG G AAATG ATCC C G TC C ATG C TCG G AAG G G G G A
G C G G G CG G AG G ATCCTACTCATCTCTG AAATG G G ATTG G TCCG AAG ATG G G TTG
G G C AAG CACG TG CCAAACCCCAG CG AG TTG CTG ACG AG CAG G CTCATCCAATCC
CCCG GCGAATCCTCCCTCACGCCCCGCATG CATACAAGTCCCTCCCACACG CCCC
CTCCCATCCATTTTCGCCTGGTCCGAACG CG AGCGG CG TCGAGGCGGACCACTTG
CTCCGCAGCGCCG TCTGGG TCTCCACCCCACAGCGGCTTTG CTG CCAG AGG CACC
CCCCTTGCCCCACCTCCTCTTGCAGCC
SEQ ID NO: 95
Prototheca moriformis Promotor del transportador de azúcar SugT/5”UTR
C C AG G C A G G C G G T AG G G TTG C C G A T T G C T T G A G C G A A T T G G A A G A T A T A A T T T T T
TG TG G TG TC C C TG G A C G C T G T T T G T G G C G C T C C T T T T T G G A G A A G A T T G C G T G G G
G G A G C T T TC C A T G T A C C A C G C T T C C TT C T G A A A G G A T T C TG G C C G A G T C C TG A T G
A G C C C A A A G A A A A C A C C T G C C T T T C A G T G C T G G C A C T C T G A A A A C G T C A A C A G A
TG A T T A T AC A T G T C A C A A A AG G C A G C C G A T T AG G A AC G G G AG C TC TG G C C G TTC
G T T T G G C T G C C TG G G C T G A T T G A A G T G A T C C A C C C T G T T C G A A T G A A G G C G G T C G
A G T C G A A T T A T C G A C C G G A G C T G T G G G G A A G G C G T C C G G G G C A G A G T G A G G T G C
T G C G G C C T G G T T G T C G T T C A A A A A G A C C C C G G T A G C C C A A C A A T C A C G A A C G A A
A G G A A T A T A A T T G C T T G C A T A C T A T A C A T T C A G T T T C T A T G T G G C G G G T A G A C A A
G T C T C A T G G G C T T C T A A A G G C T G T C C C T T G A A G G C T A C T T A T A A A A A C T T G C T G C
G C C A T G G C A C G G A T C G C G C T T G C G C A G G C T G C A A C C C T G C G C G C A A G G T C A A A T
A C A C A G C A A A A G A T A C T A A C A G A A T T T C T A A A A A C A T T T A A A T A T T T G T T T C G A C
C A G C C A A T T G T G G T C G T A G G C A C G C A A A A G A C T T T G T T T T G C G C C C A C C G A G C A T
C C A C G C T G G C A G T C A A G C C A G T C C G A T G T G C A T T G C G T G G C A G C A T C G A G G A G C
A T C A A A A A C C T C G T G C A C G C T T T T C T G T C A A T C A T C A T C A A C C A C T C C A C C A T G T
A T AC C C G A TG C A TC G C G G TG C G C AG CG CG CC AC G C G T CCC A G AC C C G C C C A A A A
A C C C A G C A G C G G C G A A A G C A A A T C T T C A C T T G C C C G A A A C C C C G A G C A G C G G C A
T T C A C AC G TG G G C G A A A A C C C C A C TT G C C C T A A C AG G C G T A T G TC TG C TG TC AC G
ATG C C TG A C A A C G G T A T T A T A G A T A T A C A C TG A T T A A T G T T T G A G TG TG T GCG AG
TCG CG A A T C AG G A A T G A A T T G C T A G T AG G C AC TC C G ACCG G G CG G G G G CCG AG G
G A C C A
SEQ ID NO: 96
Prototheca moriformis Amt03 Promotor de transportador de amonio/5'UTR
G G C C G ACAG G ACG CG CG TCAAAG G TG CTG G G CG TG TATG CCCTG G TCG G CAG G T
C G TTG C TG TTG CTG CG CTC G TG G TTC C G C AAC C C TG ATTTTG G C G TC TTATTC TG G
CG TG G CAAG CG CTG ACG CCCG CG AG CCG G G CCG G CG G CG ATG CG G TG TCTCACG
G C TG C C G AG C TC C AAG G G AG G C AAG AG C G C C C G G ATC AG C TG AAG G G C TTTAC A
C G C AAG G TAC AG CC G C TC C TG CAAG G CTG C G TG G TG G AC TTG AAC CTG TAG G TC C
TC TG C TG AAG TTC C TC C A C TA C C TC AC C AG G C C C AG C A G AC C AAA G C AC AG G C TT
TTC A G G TC C G TG TC ATC C A C TC TAA AA C A C TC G A C TA C G AC C TA C TG ATG G C C C T
A G A T T C T T C A T C A A C A A T G C C T G A G A C A C T T G C TC A G A A TT G A A A C T C C C TG A A G
G G ACCAC CAG AG G C CC TG AG TTG TTC C TTCC C C CC G TG G C G AG C TG C C AG C C AG G
C TG TAC C TG TG ATC G AG G C TG G C G G G A AA ATAG G C TTC G TG TG C TC AG G TC ATG G
G A G Ü TG C A G G A C A G C T C A T G A A A C G C C A A C A A T C G C A C A A TT C A T G T C A A G C T A
ATC AG CT A T T T CCTCTT C ACG AG C TG T A ATTG TC C C A A A ATTC TG G TC T ACCGGGG
G TG ATCC TTC G TG TAC G G G CC C TTCC C TCAAC C C TAG G TATG CG CG CATG C G G TC
G C C G C G C AACTC G C G C G AG G G C C G AG G G TTTG G G ACG G G C C G TC CC G AAATG CA
GTTG C AC C CG G ATG CG CG G CG CCTTTCTTG CG AT A A T T T A T G C A ATG G ACTGCTC
TG C A A A TTTC TG G G TC TG TC G C C AA C C C TAG G ATC AG C G G C G TA G G A TTTC G TAA
TC ATTC G TC C TG ATG G G G AG C T AC C G A C T ACCCT A A T ATC AG CCCG G CTG CCTG A
C G C C A G C G TC C A C TTTTG C G TA C A C A TTC C ATTC G TG C C C AAG AC ATTTC A TTG TG
G TG C G AAG C G TC C CC AG TTAC G C TCACC TG TTTC CC G AC CTC C TTAC TG TTC TG TC
G ACAG AG CG G G CCCACAG G CCG G TCG CAG CC
SEQ ID NO: 97
Prototheca moriformis Amt02 Promotor del transportador de amonio/5'UTR
T C A C C A G C G G A C A A A G C A C C G G T G T A T C A G G T C C G T G T C A T C C A C T C T A A A G A G
C T C G A C T A C G A C C T A C T G A T G G C C C T A G A T T C T T C A T C A A A A A C G C C T G A G A C A C
TTG C C C A G G A T T G A A A C T C C C T G A A G G G A C C A C C AG G G G C C C TG A G T T G T T C C TT
C C C C C C G TG G C G A G C TG C C A G C C A G G C TG TA C C TG TG A TC G G G G C TG G C G G G A A
A A C A G G C TT C G T G T G C T C A G G T T A T G G G AG GTGC AG G AC A G C T C A T T A AA C G C C
A A C A A T C G C A C A A T T C A T G G C A A G C T A A T C A G T T A T T T C C C A T T A A C G A G C T A T A
A T T G T C C C A A A A T T C T G G T C T A C C G G G G G T G A T C C T T C G T G T A C G G G C C C T T C C C T
C A A C C C TA G G TA T G C G C A C A T G C G G T C G C C G C G C A A C G C G C G C G A G G G C C G A G G
G TTT G G G A C G G G C C G T C C C G A A A TG C A G T T G C A C C C G G A T G C G T G G C A C C T T T T T
TG C G A T A A T T T A T G C A A T G G A C TG C TC TG C A A A ATTC TG G C TC TG TC G C C A ACCC
T A G G A T C A G C G G T G T A G G A T T T C G T A A T C A T T C G T C C T G A T G G G G A G C T A C C G A C
T G CCCT A G T A T CAG C C C G A C T G C C T G AC G C C AG CG TC C A C T T T T G T G C A C AC A T T
C C A T T C G T G C C C A A G A C A T T T C A T T G T G G T G C G A A G C G T C C C C A G T T A C G C T C A C
C T G A T C C C C A A C C T C C T T A T T G T T C T G T C G A C A G A G TG G G C C C A G A G G C C G G T C G
C AG C C
SEQ ID NO: 98
Protoheca moriformis Aat-01 Promotor del transportador de aminoácidos/5'UTR
CG AAG G G G TCTG CATC G ATTC G C G C G G TCTG G AG G C C AG CG TG AC TG C TCG CG A
AAATG CTCTG CC G TG TC G G G C TC TG G CTG G G G C G G C C AG AG ATC TC AC C G TG C CA
C AC G C AACTG CCG CACTCTG TG CCCG CCACCTG G CG CG CACATG CG ACCTCTTCC
C C G TCATAC C CTC TC CTC ATG TG ATCTTTC C AC AC G AG TG AC G C AG G TG C G C G G A
G TG G AG G G AATC AG G AC G TTTTC A AG G TA C C TG C TC G AG C C G TA C C A AC AG C TG
CCGCCCGGC A AG G A AG A G ATC G AG G C AG AG ATTGCCCGGCTGGAGGCCCG G A T A
AC G G AG C TC AAG AG C AAG C TG TC C G AG TG AG AC C G C C C AG G TG C AC G TG TC G AC
TC G C TA T G A C A T G TA C TC G A C A C A A C A TG A G G A A T T C A T C G A A T TT G TA G G A A G C
G G G CATTG G TAC G G G AG TG G G AA AG C G A AAA AA C C TC C C TC C G G C AG TG C C ATC
TG C C G G AG TCG AAC G TTG ATAG G G TTC TC G TG AC AG G G TG TG AC C TC TC AG C C TT
GC A T C A A T T A A ACG CT A T A G A C A T T A TC A G T A AC C G TG A ATCCCGC ATTG G ATG C
C AC C C G C G C G AC C ATTG G G G AC C TG C A TTA C AG A TC TAG G TG AG ATG AC A G C G A
G G C AAC TTC G G CC C G C G G C C C AG C TTG C G G C G C AC C AATATTG G TC AC G G G AAG
C C A C A C A C C G A C C A T A A A T G A A T A C T T G T A A G C T A T G T C A A C C G A TC A A T G G C G T
C G AAAG TG TG CC AC G AG G ATCC ATC TG G C G G G G C G G C G TG G CG CAC AAG CG CAG
TC G C AATTTC TCG G AC C CATCTG AC CTAG G C C CAG C G C C G C G G G AG AAATC CC C G
GCGGGTCCTCC ACGC A G T A AC C C T A A T G A G T ATCG AGCGCCG ACC A T T T A C A C C A
T C G C C C C C G A A A TC C TTC C G A C A TTA TTA TTA TC TTTTA G A TC TTG G A A C A G A C TC
TG C C AAC C
SEQ ID NO: 99
Prototheca moriformis Aat02-Promotor del transportador de aminoácidos/5'UTR
A G A G A G C G G A G G T G G G G T TG TG A G G TG G G G T T G C T G A C C A G G A G C T C G C G T C G C
C G A G C G C G A C T C G C A C A C G G T C C A G T T A C C C C C C C C T C C G C C C A A A C G C A A G C C T
C C C A T C T T G ATG C C TTTC C G G C C A C C T A T A C T A T T T C T T A G TT C G C T G T A AC A TC C
A G A C C G T C C T G A A T A A T A A C A A T G C C C T G T G T C A A G T G C A T T C C T A A A A A A A T T C
T G T C C C A A C C A A C A A T C C C A C C T G A A A T A C C A C C A G C C C T G C C C A G T A C A C T C T T
C C A A T A C C A T C T C C C T A C C T C C A C G C G C A A G C G A C C C C C A T G C G C G A C C A G G C T C
G A A A G TG A T T T A T G AC TTG AG A C G A G C G AG TG G C G G C G C G G T CG A C T G C C TTTTC
A T C A C G TG C C G T AC G TC G G C G AC C G C TA G G G C TTTG C AC G G C A A C G C AC G G C TTC
G C C A A C C C G A C C A G C C A G G A C C T C G A C T A C T C T A C C G C G A A T T C G C C T C A A G A A
G T C G C C A A A T G T G C C A T A C A C C A T T C C T T A C A G C A C T G T T C A A A C T T G A T G C C A A
T T T TG AC A TTC G G G TTG C TC G TTG G C TG C G C C C A C ATC G G C C G TG A G TG C AG C AG
G C G G G A T C G G A C A C G G A G G A C G C G G C G T C A C G C C C C G A A C G C A G C C C G T A A C T C
T A C A T C A A C A C G A C G T G T T G C G T A A T C C C G C C C G G C T G C G C A T C G T G C C A A C C C A
T T C G C G A T G G A T G G T C G G A A A A T G G T G T G C C A A C T G C C C T G A G G G A G G C T C T C G
C G A A A C G G G C A C G T C C C T G A A A C C G A A A C T G T G G C C T T G T C G T C G G C C A C G C A A
GC A C G T G G A C C C T A A AC A C C A A G A A A A T C A G T A A A C A A G G T T G A C A T C C T C T AC
G G G C G A A T T G T T T G C C C A A C C C T T C A T C G C A C A C T G C C A T T A T A A T G C A T C T AG C
T C G G C G A C A A G T T T A G A A A A G G C A G G C T G C A T T G T T C C A T T T C G C C G T G G C G G C G
T G G G TG C C C A T T T T A C G A G G T T TG G G C T C C C G G G C A G C G A C C G A G C C A G G T C G A
G T C C C T C T C G C C C G T C G A C A A T G T T G C G A A C C C C A C A A G C G G C T A A C A A C A A C T T
G A T G G T A C C T G T AC AC TG C C A A T T C C TT C T T C C C C G G C C G A G G T T T AC A C G T G A T
G G C C A T G G C T T C G C A T T C A G G C C G A C TT C C C A T T C C G A C TT T C C A G A G G G T C C G C
G G A C G C TG G G G G TT G G C TG C C TG A G G C C C A C C C TTTG TTC C C C G C G TC C C G A C A A
A C A C A A T T G C G T T A C A T A A G G G G G A G C C G C C C C C G T T C A G A G T G C A G A A A T C T T T
C A C T A T A T T T T C C A G T C G T C A G C G A A A T C A A G T
SEQ ID NO: 100
Prototheca moriformis Aat03-Promotor transportador de aminoácidos/5”UTR
G A TG G TG G G G TG TC TG C C TTG G G C TG G G TG ATG G A G G C TG G TG G TG C G C G G G TTT
C C T G A T G C A T T C T A T C T A C G C A G T G T C A T G G T G T C C A T T C C A C A C A C C A G T A C A C
C C TT A C A C T A A G G A T C C A T C C C T C C T T C C C T C T T C A G G A C T A C A T G G A C C C C A C G
AG C TA C C G A C C G G G C TTTC TC A A A A A C G TC A A G G TC A TG TTTG A C A TG C G G G A C G
TG G TG G AC G AC G TG C A AG G TG C G TC C G G A G TG C G C G C AA ATG AG C A AG TC G G G C
AA TG TG TC G G G G TG G G C AC C G G G G C TG G AG A TC C G C G A TC C C C G AG A AA AC G C C
G TACC ACCCCCCG CG CTATTCCCTCG ATTG CG CG C AG A T G 1G G TG AC CG AC ACGG
G G G AC AAC C TG G C G G AC ATG G G G C G C C G G AC C TG G A AG C AC G C C AA G TC G C AC A
C G G G G AG G CTC G TG C AG TC C C C CC C ATC G TAC C TCAAG G G TC TC TTTG G TC G C G A
TC C A A A G TA C G C T G G T G G C A TG G C A T G C C C G A A A T G A A C A T C A T G T G T G A T C T C C
G A TTG C C A A TG G C C A C C TC C AC G G AC C AC C TTG C A G G C G G A AG C G C AA TC C A G G
G CCCG AG C C TG AC G AG G ACG G AG AC TC C TC G TCC AG C G C G G G G TC C C CG AC C CG
A C G C A G C AG C C G AC C C C TG C TAA C C C G G C A AC G A TC G G AC C AG C AA C C TTG C TG
TAG TTC C G ATC C G TG ATG A C G G G C ATTG C C G C C G C TC G ATC C G C TTTG ATG AC TG
TC T A T T ATTTG C G C G G AG C C CC C TCG G A A C C C T ACCCCG CTCTTG C A AG CCCCTTG
C ATC G G AG ATC C TC G TG C G C C C G C C ATG AC C C C AC TG G ATTG C C C AAC A TC C TTC
TTTATC G TG TA A A A TG TG A TTC C TC G G C TG C A A TC G A C TG G C C TTC G C TTC TG G C C
C C A AG AG G G C TCG AAC G TG CG G C AG C G AG G G C G C TG AC AC ACC C A A G C C C T AG G
G C TTTC AAC G TC G G C TG C C AG G C C G G ATAG G G G G ATC G C C TC C TTTC C AC C AC C C
AC C TAC G AG G G ATTC G AG TC G G C TTC C AG C TC AG C TATTC G G C C G C G C C C C C G G C
C C TG CAG AC G TC C TC C A G TTTC C G AA C AG G TC G C TC TC A G AA C A C C TG C C G C G G C
TGCG A T ACG G C AG G C TC T CA A AG CG TCG AC
SEQ ID NO: 101
Prototheca moriformis Aat04-Promotor del transportador de aminoácidos/5'UTR
CG CG TG GAGCGGTGCGTGCGG ATGCCGCGCGCCTGCCAAGGCCTTTTGTATG CCT
G G C C TG G G AAG TTTC C TG AC TG AAG C ATC TTC AAG ATG CTC TC TC ACG AC C AG C G
AC AC C AAC AC C G TCAC TTTTTG C C CC TC CTG CC G C AG G TG C C AC TTTC TAC TTTG A
C G TC TTC TC CAG G C G G TAC ATTG C G G G ACTG AG C G C C AATTC G G C C AAG AACAG
CGCTG TCG ACTTG AG G AG G CAG G G G TCCG TCG ACTCTG CCG AG TG ACACG CCTTC
GACCCG ACTG TACTACG G CCTG CTG AAG AG TG G G TCTCG CCG G CCG G CG TG ACC
G G CCCTG TG C CC ACAATC G AC C ATC TATTC G C TC C TTG TC ATC TG G C G C CG TC AAT
TG C C C G C G AC TTG AC G G C AAC TG G C TC G ATC G AG TC G TATTG AAAAAG C AC G TTT
TG TCCT ACAGGGCCGCGGTCCGTT A C C A ACG TG G TTCTCG TT AG G TTTTCG TCG G
G C G G TG G TG CG CG AACTG TCCG ATG CCATCCCG G CAAACCCCAG CAAG G TCG CC
AG TC TG G TTC TG AC G C A ATAG A G TG C G TTTTG G G C C AG TC TAA AAA TTC G TC TG G
C ATG AC G TG G C TC CACATCG T ACCCGG AG CCTGCCTTG GT A ATG TG AG G CACCG G
TG C C AAC T C C ATT ATGGC AGGC ATCGAGCGCGC AG G TG AG T AC A TG AC C TT CCGT
G AATTG G G AAG G CG AG C TTG TG TAACG CC TG C G ATC G TG CC AG TG AG G CATCG T
AA AC TC AAA ATATTTTG TA G A A A G TG TC TG A TG C C TG G TG A G G C TG C G TA G G G C A
AG G G C AA G C C C TTG G C AG ATG G G TAATG G G TCC G G AC C TC ACAAC AG C AAC C CC
GCGTCCCCCTTAGGG CCCCTGAGG CTCGATGGCAGG GCCAGCGAG CCCGCGGCC
AAAG G G C G C CATCC C AC G G TC G C C C AAC G AC TC C AC G G G TCC TATACC TC ATC TT
G A A TG G C A C TAA AA AC TATAG A ATATC G G G C AC TG G TG G G C G TC TG G G G TAC AG
CTG G CCG AG CG CAG TG G CAAACCCTAG G TCCCG CCTCAAG G G CG ATTCCCG G G T
CAATG AC AC G C AAG C AAG ATC AC ATG G CG CG G TCC G C C TC G C G G C TCC ACACC C
AG GCCCT AG TTTCG C AAC C C A T A A AT ATCGCCCCG ATA C C ATC A T A AG C C A G C AA
ATA ATTTTTTATC AG AG TTC C A A A C C TC C TC A G C TG TG G G A A A C C A G C C C A C TC T
GAACG
SEQ ID NO: 102
Prototheca moriformis Aat05-Promotor del transportador de aminoácidos/5'UTR
CCG AG CAG TTCATG G CCAAG TACAAG G ACTAG AG ACCG G AG G TCG G TAG G CTG A
ATGGAGCTGGCGTCGTCGTGCGCGACGTGCACGCGATGCGATACTACGACCCCA
C A AACG C ATGCCTCCCATCTTG AT GCCTTTCCGGCC ATTT AT ACT ATTTCTC ATTT
C G C TG TAAC A TC TTG AATAATAG AATTG C C C TG TG TC AAG TG G ATTC C AAG AAAT
ATTC TG TC CC AAC AAA AC AA C C C AA C C TG A AA AC AA C C TC AAA TAC C AC C AG C C
CTGCCCACCTGCCCAGTACACTTTTCCAATACCATCTCCCTACCTTCACGCGCAAG
CGGCACCCATGCGCGACCAG GCTCG AAAGGATTTCACGACTCAG GACGAGCGAG
TGGCGGCGCGACCGCCTGCCTGTTCGTCACGTGCCGTACGTCGGCGACCGCTAGA
GCTTTGCCTGGCAACCCCCGGCTTCGTCAACCCGGCCAGCCAGGATCTCGACCAC
TCTACCG CG AAATCG CCTCAAG AAG TCG CCAAAAG TG CCG TACACCATG CTTCG C
AG CG CTG TTCAAACTTG ATG CCAATCTTG ACAATCAG G TTG CTCG TTG G CTG CG T
CCACATCGGCCGTGATTGCAGCAGGCGGGGATCGGACACGGAGGACGCGGCGTC
ACGCCGCG AACGC AGCCCGT AA C TC T ACATC A ACGCGAT ATG TT GCGT AATCCCG
CCCG G CTG CG CATTG TGACAACCCATTCGCGATG GATGGTCGG AAAATGGTGTG C
CAACTGCCCTGAGG GACTCTCTCGCGAAACGGG CACGTCCCTGTATCCGAAACTG
TG G CATG G CCTTG TCG ACCACG CAAG CACG TG G ACCCTAACACCACG AAAATAA
G TAAAAAAG G TTG AC ATC C TCTACG AG C G AATTG TTTG CTC G ACC C TTCATCG CA
C AC TG TC ATTATAATG C ATC TAG C TCG G C G AC AAG TTTAAAAAAG G C AG G C TG C A
TTATTCCATTTTGCCGTGGCGG CATGGGTGCCCATTTTATGAG GTTTG GGCTCTTG
GGCAGCGACCGAG CCAGGTTGAG TCCCTCTCGCCCG TCG ACAACGTTCCAAAGC
C C ATAA G TG G C TAATAAAC AAC TTG ATG G TACC TG TAC ACTG C C AG TTC C TTCTT
CCCCGGCCGAGGTTTACACGTGATGGCCATGGCTTCGCGTTTCAGGCTGACTTCC
CATTCCGACTTTCCAGAGGGTCCGCGGACGCCGGGGGTTGGCTGCGTGAGGCCC
ACCCCTTG TTCCCCG CG TCCCG ACAAACACAATTG CG TTACATAAG G G G G AAG CC
G C C C CC C G TTC AG AG TG C AAAC ATC TTTC ATTATATTTTTC AG TC G TC AG C G AAAT
C AAG TATG TCG CTG ACAG G CATG AAG G CC
SEQ ID NO: 103
KE858 constructo de recombinación homologa SZ725
GCCCTTTG TCATCG TTG G CATG CTTTTTG CG TATG TACCATATG TTG AATG TATAA
TACGAACGGTTGACCGTCTGAGATGCGAGCTTTGGGTCTTGTCAAATGCGTGGCC
GCACGGCTCCCTCGCACCCAGCCCCGAGGCGTCGCGCACCTGGCGAGGAGCAGA
C C CACG CCAAG AAAG TCTAG TCCAG CATG TAACAACATCAG G CAATG TG ACG TT
TTCGGTTCCCGATTTCTCTGCCGCTCTTTGACGGCAGGCACGGGCGAGCAACCGG
CGGCGCTCGCGTCAGGCACGATGGATGCGGCGCTGCCCACCTGTCAATGTACCCC
ACCAG TCTGTCGATCGCTACAAGCAACCTTGTGCTCCACATTCCCACTTGCAGAC
AG TCTAG TCG ATTTTG CCAAGCTGGATG TG AGG ATTGGCCATATCTTGGAG GCCA
AGATTCACCCGGATGCTGATGGGTACGTACGCGAGCCAGGCAGGCAGCTGCGTT
GACTTTCTGATTGGC AC AAAG CTTTG G CT ACTCTCA AT ACC A ACC ACGTGCCCCT
TCTGCACACCTGCTTCCTTCTGATGACCACTCGCCACGCATGTCGCAGTCTGTACG
TCGAGCAGATCGACCTCGGCGAGGAGGGGGGCCCTCGCACCATCGTGAGTGGCC
TGGTCCGGCACGTGACCCTGGAGGACCTTGTCGGCCGGCGGGTGGTGGTGCTGG
CCAACCTCAAGCCTCGGAGCATGCGCGGGGTCAAATCGGCTGGGATGCTGCTCT
GCGCCGCCAACGCGGATCACACCGCGGTGGAGCCGCTGCGGGTCCCGGACGCCG
CCGTGACGGGGGAGCGGGTCTGGGCGGGGGACGAGGCACTCCTGTCCACGGAGC
CTGCCACACCCAATCAGGTAAGG ACACGTTATTGGTGCGCATG GTGCGAATGCGT
GGTCTGACCTGCTGTGGGTATGTGTTGTGGGATTGGAAACCGAATGAGGGCCGTT
CAGGATTGAGCCCTTGGCCCCACCCTGCTCATCCTCTCACGCCCGCAGGTCCAGA
AG AAG AAAATCTGGGAGGCAG TACAGCCGCTGCTG AGAGTGAACGCCCAG GGG
A T C G C TA C TG TG G C A G G A G A G G C TA TG G TG A C C A G TG C G G G G C C A C TG A C C G C G
C C C A C G C TG G TTG A C G C C G C G A TTTC C TG A C G C G A G C G A C TG A TTC TTG A C C TTT
G A G A A G C C A C C A C A G C A C C A T T T T C A T T G T T C A T C C T T G A T T T C A G T A C G A C T T C T
C A C C A T T T C A G T A C T G T A G G A C C C C C A A A A T A G T G T G A T C A C G C T C G C A A G G C A C
C T G T G T G A T C A C G G G G A A G G G C G A A T T C C TT T C T T G C G C TA T G A C A C T T C C A G C A
A A A G G TA G G G C G G G C T G C G A G A C G G C T T C C C G G C G C T G C A T G C A A C A C C G A T G A
TG C TTC G AC C C C C C G AA G C TC C TTC G G G G C TG C ATG G G C G C TC C G A TG C C G C TC C
AG G G C G AG CG CT G T T T A A A T AG CC AG G C C C C C G ATTG C A A A G AC A T T A T AG CG A
G C T AC C A A A G C C A T A T T C A A AC A C C T A G A T C A C T A C C A C T T C T AC AC A G G C C A C T
C G A G C TTG TG A TC G C A C TC C G C TA A G G G G G C G C C TC TTC C TC TTC G TTTC A G TC A C
AAC C C G C AA AC G G C G C G C C ATG C TG C TG C AG G C C TTC C TG TTC C TG C TG G C C G G C
T T C G C C G C C A A G A T C A G C G C C TC C A TG A C G A A C G A G A C G TC C G A C C G C C C C C TG
G T G C A C T T C A C C C C C A A C A A G G G C T G G A T G A A C G A C C C C A A C G G C C T G T G G TA C
G A C G A G A A G G A C G C C A A G T G G C A C C T G T A C T T C C A G T A C A A C C C G A A C G A C A C C
G TC TG G G G G AC G C C C TTG TTC TG G G G C C A C G C C A C G TC C G A C G A C C TG A C C A A C T
G G G AG G AC C A G C C C A TC G C C A TC G C C C C G A A G C G C A A C G A C TC C G G C G C C TTC T
C C G G C T C C A TG G T G G T G G A C TA C A A C A A C A C C TC C G G C T T C T TC A A C G A C A C C A T
C G AC C C G C G C C A G C G C TG C G TG G C C A TC TG G A C C TA C A A C A C C C C G G A G TC C G A
G G A G C A G T A C A T C T C C T A C A G C C T G G A C G G C G G C T A C A C C T T C A C C G A G T A C C A
G A AG A AC C C C G TG C TG G C C G C C A A C TC C A C C C A G TTC C G C G A C C C G A A G G TC TTC
T G G T A C G A G C C C T C C C A G A A G T G G A T C A T G A C C G C G G C C A A G T C C C A G G A C T A C
A A G A T C G A G A T C T A C T C C T C C G A C G A C C T G A A G T C C TG G A A G C T G G A G TC C G C G T T C G C C A A C G A G G G C TTC C TC G G C TA C C A G TA C G A G TG C C C C G G C C TG A TC G A G G T
C C C C A C C G A G C A G G A C C C C A G C A A G T C C T A C T G G G T G A T G T TC A TC T C C A T C A A C
C C C G G C G C C C C G G C C G G C G G C TC C TTC A AC C A G TAC TTC G TC G G C AG C TTC A AC G
G C AC C C A C TTC G A G G C C TTC G A C A A C C A G TC C C G C G TG G TG G A C TTC G G C A A G G
A C T A C T AC G C C C TG C A G A C C TTC TTC A A C A C C G A C C C G AC C T AC G G G AG C G C C C T
G G G C A TC G C G TG G G C C TC C A AC TG G G A G TAC TC C G C C TTC G TG C C C AC C AA C C C C
TG G C G C TC C TC C A TG TC C C TC G TG C G C A A G TTC TC C C TC A A C A C C G A G TA C C A G G
C C A A C C C G G A G A C G G A G C T G A T C A A C C T G A A G G C C G A G C C G A T C C T G A A C A T C A
G C A A C G C C G G C C C C T G G A G C C G G TTC G C C A C C A A C A C C A C G TTG A C G A A G G C C A
A C A G C T A C A AC G TC G A C C TG TC C A A C AG C AC C G G C AC C C TG G AG TTC G AG CTG G
T G T A C G C C G T C A A C A C C A C C C A G A C G A T C T C C A A G T C C G T G T T C G C G G A C C T C T C
C C TC T G G TTC A A G G G C C TG G A G G A C C C C G A G G A G TA C C TC C G C A TG G G C TTC G A
G G T G TC C G C G T C C TC C TTC TTC C TG G A C C G C G G G A A C A G C A A G G TG A A G TTC G TG
A A G G A G A AC C C CT A C T T C A C C A AC C G C A T G AG C G TG A AC A A C C AG C C C TTC A AG
A G C G A G A A C G A C C T G T C C T A C T A C A A G G T G T A C G G C T T G C T G G A C C A G A A C A T C
CTG G A G C T G T A C T T C AA C G A C G G C G A C G TC G TG TC C A C C A A C A C C T A C T T C A T G A
C C A C C G G G A A C G C C C T G G G C TC C G TG A A C A TG A C G A C G G G G G TG G A C A A C C TG T
T C T A C A T C G A C A A G T T C C A G G T G C G C G A G G T C A A G T G A T T A A T T A A C T C G A G G C A G C A G C A G C T C G G A T A G T A T C G A C A C A C T C T G G A C G C T G G TC G T G TG A T G G A C T G T T G C C G C C A C A C T TG C T G C C T T G A C C T G T G A A T A T C C C T G C C G C T TT T A TC A A A C A G
C C TC A G T G T G T T T G A T C T T G T GT G T AC G C G C TTTTG C G A G TT G C T AG C TG C TTG T G
C T A T T T G C G A A TA C C A C C C C C A G C A T C C C C T T C C C T C G T T T C A T A T C G C TT G C A T C
C C AA C C G C A A C TTA TC TA C G C TG TC C TG C TA TC C C TC A G C G C TG C TC C TG C TC C TG
C TC AC TG C C C C TC G C AC AG C C TT G G TTTG G G CTC C G C C TG T A TTC TC C TG G T AC TG
C A A C C T G T A A A C C A G C A C T G C A A T G C T G A T G C A C G G G A A G T A G T G G G A T G G G A A
C A C A A A T G G A A A G C T T
SEQ ID NO: 104
R e co m b in a c ió n hom ó loga : case te de o rie n ta c ió n pa ra la in te rru p c ió n de la reg ió n c o d ific a n te de la de sa tu ra sa A C P d e sa tu ra sa de P ro to th e ca m o rifo rm is (ca se te suc2 im p u lsa do po r p -tu b u lin a j
TTTGGCCCCGCTTTCCAGCTCCGGATCTGCTGGCGTCCGCCGCGAGACGTGACAT CGCACGTCGCCGGGAGCGCCAGCTTGATCACTTGGCAGGGGGCCGTGCTCTACA AATACCAGGCCCCGCGGCGGTCAGTTCGCACATCCAATACCTGCCGAGCCATCTT GCCTACACTTTTT ATCGACTCCTCT ACTCTGTTCGCGAGAGCGCTCGGTCCAGGCT TGG A ATTCGCCGA ATTC AGCTCG ATC AGTCGCTTCTGC A ACTG ATCTCGGCCGTT CGC AG ACTGCCTTTTCTCAGCTTGTC AGGT AGCGAGTTGTTGTTTT AT ATTT ATTC GATTTCATCTGTGTTGCATGTCTTGTTCGTGCTGTGCGTTCTTTCTGGGCCGCGCT GTCGGGTCGC AT GGGCTAGCTGTACTCATGTT AGTCATGCCGGTCCGACCTTGTT CGAGGAAGGCCCCACACTGAGCGTGCCCTCTTTCTACACCCCTTGTGCAGAAATT AGATAGA A AGCAGA ATTCCTTTCTTGCGCT AT G AC ACTTCC AGC AAAAGGT AGG GCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGAC CCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGC GCTGTTTA A AT AGCC AGGCCCCCG ATTGC AAAG AC ATT AT AGCGAGCT ACC A A A GCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGT GATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCA AACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGC CAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTC ACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAG GACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGG ACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGAC CAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCA TGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCG CCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTA CATCTCCT AC AGCCTGG ACGGCGGCT AC ACCTTCACCG AGT ACC AG A AGAACCCC GTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGC CCTCCCAGA AGTGGATC ATG ACCGCGGCCAAGTCCCAGGACT AC AAG AT CGAGA TCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGA GGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAG CAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCC CGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTT CGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGC CCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCG TGGGCCTCC AACTGGG AGT ACTCCGCCTT CGTGCCC ACC AACCCCTGGCGCTCCT CCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGA GACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGG CCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAA CGTCGACCTGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTC AAC ACCACCCAGACG ATCTCCA AGTCCGT GTTCGCGG ACCTCTCCCT CTGGTTCA AGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGT CCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACC CCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACG ACCTGTCCT ACT AC A AGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAAC ATCCTGG AGCTGT A CTTC A ACG ACGGCG ACGTCGTGTCCACCAAC ACCTACTTC ATGACC ACCGGGA AC GCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGAC AAGTTCCAGGTGCGCGAGGTC AAGTG ATT AATT A ACTCGAGGCAGC AGCAGCTC GGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACA CTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTG
T T T G A T C T T G T G T G T A C G C G C T T T T G C G A G T T G C T A G C T G C T T G T G C T A T T T G C G A
A T A C C A C C C C C A G C A T C C C C T T C C C T C G T T T C A T A T C G C T T G C A T C C C A A C C G C A A
C T TA T C T A C G C T G TC C T G C T A T C C C T C A G C G C T G C T C C T G C T C C TG C T C A C T G C C C
C TCG C A C A G C C T T G G T T T G G G C TC C G C C TG T A T T C T C C T G G T A C TG C A A C C T G T A A
A C C A G C A C T G C A A T G C T G A T G C A C G G G A A G T A G T G G G A T G G G A A C A C A A A T G G A
C C G A C A C G C C C C C G G C C C A G G T C C A G T TC T C C TG G G T C T TC C A G A G G C C C G T C G C
C A T G T A A A G T G G C A G A G A T T G G C G C C T G A T T C G A T T T G G A T C C A A G G A T C T C C A A
T C G G T G A T G G G G A C T G A G T G C C C A A C T A C C A C C C T T G C A C T A T C G T C C T C G C A C T
A T T T A T T C C C A C C T T C T G C TC G C C C T G C C G G G C G A T T G C G G G C G T TT C T G C C C T T G
A C G T A T C A A T T T C G C C C C TG C TG G C G C G A G G A T T C T T C A T T C T A A T A A G A A C T C A
C T C C C G C C A G C T C T G T A C T TT T C C T G C G G G G C C C C TG C A T G G C T T G T TC C C A A TG C
T T G C T C G A T C G A C G G C G C C C A T T G C C C A C G G C G C T G C C G C A T C C A T G T G A A G A A A
C A C G G A A G A G T G C G A A G A C T G G A A G T G A A T T A A G A G T A T A A G A A G A G G T A C C A
A G G G A T T C T C A G G T G C T C T T A G G A A C G G C T T T T C C T T C G C C A A G A G A A A C T G C T A
C T G C T C G T G T C G C C A C G G T G G T C A A G C C G C C C C A T C T G C G A T C C A C C A G G C C C A T
C C G C G G A C T C G C G A T C A G C C T G C T G G A T C C G G A C T G C C G A C C T G A C C G C T C G C A T
C C A C C A T T A C A AC C C TC C A A T T G G A C A C C AC TC C C A C G T C C T A A A G T T C A C C A T G
C A A G C T G A T C G A T C G C A T T C G C C G A T G C A C T C G C C T G C C A C A G A G G T G T G C G C T T
C G G A C T A G C G T G C A G G C G C C C C G A G G C C A C C A G C A T G C A C C G A T G G A A G C G G G C
A C G G C C G C T G C T C C A G G T C G C T G G C T C G C TC A G A C C C A T A G C A A C C T C C G C T G C G
T C C C T A A A T G T C A C A C A G A G C G T C T T T G A T G G G T A C G G A T GGG A G AG A A T C T G A T
T G G G C A T T G C T G G T G C A G T G C A G G A A G A T G G C A A G T G C A C A G T C A G T C A T G C T G
T A C A A A C T GGT G C C TC G T A G T A T T G A C T C G T A T A G TG C A T A G T A T C A T G C A T G G T
C G T T A C T T G C A A
SEQ ID NO: 105
Recombinación homóloga: casete de orientación para la interrupción de la región codificante de la desaturasa ACP desaturasa de Prototheca moriformis (casete suc2 solo)
T T T G G C C C C G C T T T C C A G C T C C G G A T C T G C T G G C G T C C G C C G C G A G A C G T G A
C A T C G C A C G T C G C C G G G A G C G C C A G C T T G A T C A C T T G G C A G G G G G C C G T G C T
C T A C A A A T A C C A G G C C C C G C G G C G G T C A G T T C G C A C A T C C A A T A C C T G C C G A
G C C A T C T T G C C T A C A C T T T T T A T C G A C T C C T C T A C T C T G T T C G C G A G A G C G C T C
G G T C C A G G C T T G G A A T T C G C C G A A T T C A G C T C G A T C A G T C G C T T C T G C A A C T
G A T C T C G G C C G T T C G C A G A C T G C C T T T T C T C A G C T T G T C A G G T A G C G A G T T G T
T G T T T T A T A T T T A T T C G A T T T C A T C T G T G T T G C A T G T C T T G T T C G T G C T G T G C G T
T C T T T C T G G G C C G C G C T G T C G G G T C G C A T G G G C T A G C T G T A C T C A T G T T A G T C
A T G C C G G T C C G A C C T T G T T C G A G G A A G G C C C C A C A C T G A G C G T G C C C T C T T T
C T A C A C C C C T T G T G C A G A A A T T A G A T A G A A A G C A A T G C T G C T G C A G G C C T T C
C T G T T C C T G C T G G C C G G C T T C G C C G C C A A G A T C A G C G C C T C C A T G A C G A A C G
A G A C G T C C G A C C G C C C C C T G G T G C A C T T C A C C C C C A A C A A G G G C T G G A T G A
A C G A C C C C A A C G G C C T G T G G T A C G A C G A G A A G G A C G C C A A G T G G C A C C T G T
A C T T C C A G T A C A A C C C G A A C G A C A C C G T C T G G G G G A C G C C C T T G T T C T G G G G
C C A C G C C A C G T C C G A C G A C C T G A C C A A C T G G G A G G A C C A G C C C A T C G C C A T
C G C C C C G A A G C G C A A C G A C T C C G G C G C C T T C T C C G G C T C C A T G G T G G T G G A C
T A C A A C A A C A C C T C C G G C T T C T T C A A C G A C A C C A T C G A C C C G C G C C A G C G C T
G C G T G G C C A T C T G G A C C T A C A A C A C C C C G G A G T C C G A G G A G C A G T A C A T C T
CCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCG
TGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGA
GCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGAT
CGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTC
GCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAG
GTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCA
TCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAG
CTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGAC
TTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCT
ACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTT
CGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCC
TCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGG
CCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCA
CCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACA
GCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGA
CGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAG
GACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTT
CCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTT
CACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCT
GTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTAC
TTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGA
ACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACAT
CGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGACCGACACGCCCCCGGCCCAG
GTCCAGTTCTCCTGGGTCTTCCAGAGGCCCGTCGCCATGTAAAGTGGCAGAG
ATTGGCGCCTGATTCGATTTGGATCCAAGGATCTCCAATCGGTGATGGGGAC
TGAGTGCCCAACTACCACCCTTGCACTATCGTCCTCGCACTATTTATTCCCAC
CTTCTGCTCGCCCTGCCGGGCGATTGCGGGCGTTTCTGCCCTTGACGTATCAA
TTTCGCCCCTGCTGGCGCGAGGATTCTTCATTCTAATAAGAACTCACTCCCGC
CAGCTCTGTACTTTTCCTGCGGGGCCCCTGCATGGCTTGTTCCCAATGCTTGCT
CGATCGACGGCGCCCATTGCCCACGGCGCTGCCGCATCCATGTGAAGAAAC
ACGGAAGAGTGCGAAGACTGGAAGTGAATTAAGAGTATAAGAAGAGGTAC
CAAGGGATTCTCAGGTGCTCTTAGGAACGGCTTTTCCTTCGCCAAGAGAAAC
TGCTACTGCTCGTGTCGCCACGGTGGTCAAGCCGCCCCATCTGCGATCCACC
AGGCCCATCCGCGGACTCGCGATCAGCCTGCTGGATCCGGACTGCCGACCTG
ACCGCTCGCATCCACCATTACAACCCTCCAATTGGACACCACTCCCACGTCC
TAAAGTTCACCATGCAAGCTGATCGATCGCATTCGCCGATGCACTCGCCTGC
CACAGAGGTGTGCGCTTCGGACTAGCGTGCAGGCGCCCCGAGGCCACCAGC
ATGCACCGATGGAAGCGGGCACGGCCGCTGCTCCAGGTCGCTGGCTCGCTC
AGACCCATAGCAACCTCCGCTGCGTCCCTAAATGTCACACAGAGCGTCTTTG
ATGGGTACGGATGGGAGAGAATCTGATTGGGCATTGCTGGTGCAGTGCAGG
AAGATGGCAAGTGCACAGTCAGTCATGCTGTACAAACTGGTGCCTCGTAGTA
TTG ACTCGT ATAGTGC ATAGT ATCATGCATGGTCGTTACTTGC A A
SEQ ID NO: 106
UTEX 21,22, 28, 257
TGTTGAAGAATGAGCCGGCGACTTATAGGAAGTGGCGTGGTTAAGGAATTTTCC
GAAGCCCAAGCGAAAGCAAG'ITTTAAAAATAGCGATA'nTGTCACITnTATGGA
CCCGAACCCGGGTGATCTAACCGTGACCAGGATGAAGCTTGGGTAACACCAAGT
GAAGGTCOGAACTCTTCGATCTTTAAAAATCGTGAGATGAGTTGCGGTTAGTAGG
TGAAATGCCAATCGAACTCGGAGCTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGTGTTGAGGCG
C AGCG ATG A ATG AC A A A AC A A AT AGT ACGGTGT AGGGGT A A AGC ACTGTTTCGG
TGCGGGCTGCG A A AGCGGT ACCAA ATCGTGGCAA ACTC AG A AT ACT ACGCTTGT
ATACCATTCATCAGTGAGACTGTGGGGGATAAGCTCCATAGTCAAGAGGGAAAC
AGCCCAGATCACCAGTT A AGGCCCC AA A ATGACAGCT AAGTGGC AAAGG AGGTG
AAAGTGCAGAAACAACCAGGAGGTTTGCCCAGAAGCAGCCATCCTTTAAAGAGT
GCGTAATAGCTCACTG
SEQ ID NO: 107
Casete de expresión de tioesterasa de Cuphea palustris
G A ATTCCTTTCTTGCGCT ATGAC ACTTCCAGCA AA AGGT AGGGCGGGCTGCGAG A CGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCT TCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGC CAGGCCCCCG ATTGCA A AG ACATT AT AGCG AGCT ACC A A AGCC AT ATTCA AACA CCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCT A AGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCAC A ACCCGCA AACACT AGT ATGGC CACCGCATCCACITTCTCGGCG'ITCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCG GCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCC AGCATGCTGCTGTCGGCGGTGACCACGGTCTTCGGCGTGGCCGAGAAGCAGTGG CCCATGCTGGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTCGAGCCCCTGGGC GTGGACCGCATCGTCTACGACGGCGTGAGCTTCCGCCAGTCGTTCTCCATCCGCA GCTACGAGATCGGCGCCGACCGCACCGCCTCGATCGAGACGCTGATGAACATGT TCCAGGAGACCTCCCTGAACCACTGCAAGATCATCGGCCTGCTGAACGACGGCTT CGGCCGCACGCCCGAGATGTGCAAGCGCGACCTGATCTGGGTCGTGACCAAGAT GCAGATCGAGGTGAACCGCTACCCCACGTGGGGCGACACCATCGAGGTCAACAC GTGGGTGAGCGCCTCGGGCAAGCACGGCATGGGCCGCGACTGGCTGATCTCCGA CTGCCACACCGGCGAGATCCTGATCCGCGCGACGAGCGTCTGGGCGATGATGAA CCAGAAGACCCGCCGCCTGTCGAAGATCCCCTACGAGGTGCGCCAGGAGATCGA GCCCCAGTTCGTCGACTCCGCCCCCGTGATCGTGGACGACCGCAAGTTCCACAAG CTGGACCTGAAGACGGGCGACAGCATCTGCAACGGCCTGACCCCCCGCTGGACG GACCTGGACGTGAACCAGCACGTCAACAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTG CAGTCGGTCCCCACCGAGGTGTTCGAGACGCAGGAGCTGTGCGGCCTGACCCTG G AGT ACCGCCGCG AGTGCGGCCGCG ACT CCGTGCTGG AGAGCGTC ACGGCCATG GACCCCTCGAAGGAGGGCGACCGCTCCCTGTACCAGCACCTGCTGCGCCTGGAG GACGGCGCGGACATCGTGAAGGGCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGC GCCAAGGGCGCCATCCTGACGGGCAAGACCAGCAACGGCAACTCGATCTCCTGA CTCGAGTrAATrAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGG ACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAAT ATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCT TTTGCGAGTTGCrAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTT CCCTCGTTTC AT ATCGCTTGCATCCC A ACCGCA ACTT ATCT ACGCTGTCCTGCT AT CCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGC
T C C G C C T G T A T T C T C C T G G T A C T G C A A C C T G T A A A C C A G C A C T G C A A T G C T G A T G
C A C G G G A A G T A G T G G G A T G G G A A C A C A A A T G G A A A G C T T
SEQ ID NO: 108
Ulmus americana tioesterasa optimizada con codón
G G C G C G C C C A G C T G C C C G A C T G G A G C A T G C T G C T G G C C G C G A T C A C C A C C C T G T T
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C G T G G T G G A C G T G C C C G C C A A G A C C A G C T G A C T C G A G
SEQ ID NO: 109
Construcción de transformación dual: suc2 sacarosa invertasa:: Cuphea hookeriana C8-10 tioesterasa
ggtaccctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatg atgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggccc ccgattgcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagctt gtgatcgcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaactctagaatatcaATGCTGCTGCAG
GCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCG
ACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACG
ACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGC
CCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGC
CCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGC
TTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGT
CCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACC
CCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAA
GTG G ATCATG ACCGCGG CCAAGTCCCAGG ACTACAAG AT CG AG AT CT ACT CCT CCG ACG ACCTG AA
GTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGG
CCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAAC
CCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCG
AGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTT
CAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGC
CTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGT ACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACG CCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACC TGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTC CAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGC ATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTG AAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGAC CTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCG ACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGAC GGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGAcaattggcogcagc ogctcggatogtotcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccocacttgctgccttgocctgtgoototc cctgccgctttto tcoaocogcctcogtg tg tttgatcttg tg tg tacgcgcttttgcgogttgctagctgcttg tgctatttgcgao taccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaocttatctocgctgtcctgctotccctcogcgct gctcctgctcctgctcactgcccctcgcocagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaocctgtoaaccogcoct gcoatgctgotgcacgggaagtagtgggotgggaacacaaatggogggtcccgcgtctcgaocagogcgcgcogaggaa cgctgaaggtctcgcctctgtcgcacctcagcgcggcatococcacootaoccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccatt agcgaagcgtccggttcacacacgtgccocgttggcgaggtggcoggtgacaotgatcggtggogctgatggtcgoaacgtt ccrcagccfogggofofcgaattccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgg gcgcctgccgcctgcctgccgcatgcttgtgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaa gcttatgtgtgtgctgggcttgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcct ccaggtggttcaatcgcggcagccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtt tgccagaatgatcggttcagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggca ccggggagtggaatggcaccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaa cgtaaccatgagctgatcaacactgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgct gccggctgctgcctgctgcgcacgccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgt ggtggataggatgcaagtggagcgaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgca tgcgaagggactggccccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgtcaccaggcccgcaagctttgcag aaccatgctcatggacgcatgtagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagc agaggcggcggcagcagagcggcggcagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgct gatcccaaacgagttcacattcatttgcatgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcg ggaccgccaggctagcagcaaaggcgcctcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggcc ggctgtttctttcgtgttgcaaaacgcgccagctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgat cagctgattgcccggctcgcgaagtaggcgccctcctttctgctcgccctctctccgtcccgccactagtATGGCCACCGCATC CACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGC CCAGCGAGGCCCCTCCCCGT6CGCGGGCGCGCCCAGCTGCCCGACTGGAGCCGCCTGCTGACCGCC ATCACCACCGTGTTCGTGAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCACGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACA TGCTGGTGGACAGCTTCGGCCTGGAGTCCACCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCCAGTCCTTCTC CATCCGCTCCTACGAGATCGGCACCGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAG GAGACCTCCCTGAACCACTGCAAGAGCACCGGCATCCTGCTGGACGGCTTCGGCCGCACCCTGGAG ATGTGCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGATCAAGATGCAGATCAAGGTGAACCGCTACCCCGCC TGGGGCGACACCGTGGAGATCAACACCCGCTTCAGCCGCCTGGGCAAGATCGGCATGGGCCGCGA CTGGCTGATCTCCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGGTGCGCGCCACCAGCGCCTACGCCATGATG AACCAGAAGACCCGCCGCCTGTCCAAGCTGCCCTACGAGGTGCACCAGGAGATCGTGCCCCTGTTC GTGGACAGCCCCGTGATCGAGGACTCCGACCTGAAGGTGCACAAGTTCAAGGTGAAGACCGGCGA CAGCATCCAGAAGGGCaGACCCCCGGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGTCCAACGT GAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGAGCATGCCCACCGAGGTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCTC CCTGGCCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTGCTGGAGAGCGTGACCGCCATGG ACCCCAGCAAGGTGGGCGTGCGCTCCCAGTACCAGCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCACCGCCA T CGTG AACGGCGCCACCG AGT GGCGCCCCAAG AACGCCGGCGCCAACGGCGCCATCT CCACC6GCA AGACCAGCAACGGCAACTCCG1GJCCATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACG ACATCGACTACAAGGACGACG ACGACAAG TGAocgaggcagcogcagctcggatogtotcgacacactctgga cgctggtcgtg tga tggactg ttgccgccacacttgctgccttgocctg tgao tatccc tgccgctttto tcoaacagcctcag tg t g tttg a tc ttg tg tg tacg cg c ttttg cgag ttg c tagc tgc ttg tgc to tttg cgaa taccacccccagca tccccttccc tcg tttc atatcgcttgcatcccaaccgcoacttatctocgctgtcctgctatccctcogcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcaco gccttggtttgggctccgcctg to ttctcctgg tactgcoacctg tooaccagcoctgcaatgctgotgcocgggoogtog tggg atQ Q Q aacacoaotaaaztRcXi
SEQ ID NO: 110
Construcción de transformación dual: suc2 sacarosa invertasa:: Umbellularia californica C12 tioesterasa
ggtaccctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatg atgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggccc ccgattgcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagctt gtgatcgcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaactctagaatatcaATGCTGCTGCAG GCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCrTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCG
ACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACG
ACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGC CCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGC CCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGC TTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGT CCGAGGAGCAGTACATaCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACC CCGTGCTGGCCGCCAACrCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAA GTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAA GTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGG
CaGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAAC CCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCG AGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTT CAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGC CTT CGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCT CCATGTCCCT CGTGCGCAAGTT CT CCCT CAACACCG AGT ACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACG CCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACC T GT CCAACAGCACCGGC ACCCT GG AGTT CG AGCTGGTGTACGCCGT CAACACCACCCAG ACG AT CT C CAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGC
ATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTG
AAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGAC CTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCG ACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGAC GGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGAcaattgQCOQCOO cogctcggatagtotcgocacactctggocgctggtcgtgtgotggoctgttgccgccocacttgctgccttgacctgtgaotot ccc tg ccg c tttta tcao acag cctcag tg tg tttg atc ttg tg tg tacg cgcttttg cg og ttgc tag ctg cttg tg c ta tttgcg a ataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcogcgc tgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacogccttggtttgggctccgcctgtottctcctggtoctgcaocctgtaoaccagcac fqcoofQcfqotQcocQqQOOQfootflqaofooooococoqofoqoggatcccgcKtctcgaacagagcgcgcaKaggaac gctgaaggtctcgcctctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcg aagcgtccggttcacacacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcct agggatatcgaattccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgggcgcctgc cgcctgcctgccgcatgcttgtgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaagcttatgtg tgtgctgggcttgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcctccaggtggt tcaatcgcggcagccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtttgccagaat gatcggttcagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggag tggaatggcaccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaacgtaacca tgagctgatcaacactgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgctgccggctg ctgcctgctgcgcacgccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgtggtggata ggatgcaagtggagcgaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagg gactggccccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgtcaccaggcccgcaagctttgcagaaccatgc tcatggacgcatgtagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcgg cggcagcagagcggcggcagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcccaa acgagttcacattcatttgcatgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcgggaccgcc aggctagcagcaaaggcgcctcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggccggctgtttc tttcgtgttgcaaaacgcgccagctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgatcagctgatt gcccggctcgcgaagtaggcgccctcctttctgctcgccctctctccgtcccgccactagtATGACGTTCGGGGTCGCCCTC CCGGCCATGGGCCGCGGTGTCTCCCTTCCCCGGCCCAGGGTCGCGGTGCGCGCCCAGTCGGCGAGT CAGGTTTTGGAGAGCGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCA
GCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAAGCTGCCCCAGCTGCTG
GACGACCACTTCGGCCTGCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCTCCTACGAGGTGG
GCCCCGACCGCAGCACCTCCATCCTGGCCGTGATGAACCACATGCAGGAGGCCACCCTGAACCACG
CCAAGAGCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGA TGTGGGTGGTGCGCCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCACCTGGGGCGACACCGTGGAG
GTGGAGTGCTGGATCGGCGCCAGCGGCAACAACGGCATGCGCCGCGACTTCCTGGTGCGCGACTG
CAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGCTGATGAACACCCGCACCCGCCGC CTGAGCACCATCCCCGACGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTG AAGGACGACGAGATCAAGAAGCTGCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGG CCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGAACAACCTGAAGTACGTGGCCTG GGTGTTCGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAGTCCCACCACATCAGCTCCTTCACCCTGGAGTAC CGCCGCGAGTGCACCCGCGACTCCGTGCTGCGCAGCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCAGCTCCGAG GCCGGCCTGGTGTGCGACCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCCGCAC
CGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGCCCCGCGT
GATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGA CAAGTGActCRae.e.caocoacaactcaaataa ta tcaacacoctctaaacactaa tcata taataaocta ttaccaccacoc ttgc tgccttgacctg tgaoto tccctgccgctttta tcoaocogcctcagtgtg tttgatcttg tg tg tacgcgcttttgcgagttg ctagctgcttgtgctatttgcgoataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccoaccgcaacttotctac gctgtcctgctatccctcogcgctgctcctgctcctgctcoctgcccctcgcocogccttggtttgggctccgcctgtottctcctggt ac tacaacc tQ to aacco acactaco atQ ctaa tacacaaaaoataa taaaataaaaacacaaataaaadRcXX
SEQ ID NO: 111
Construcción de transformación dual: suc2 sacarosa invertasa:: Cinnamomum camphora C14 tioesterasa
ggtaccctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatg atgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggccc ccgattgcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagctt gtgatcgcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaactctagaatatcaATGCTGCTGCAG GCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCG ACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACG ACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGC CCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGC CCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGC TTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGT CCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACC CCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAA GTGG AT CATG ACCGCGGCCAAGT CCCAGG ACT ACAAG AT CG AG AT CT ACT CCT CCG ACG ACCT G AA GTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGG CCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAAC CCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCG AGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTT CAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGC CTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGT ACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACG CCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACC TGTCC AACAGCACCGGCACCCT GG AGTTCG AGCTGGT GT ACGCCGTCAACACCACCCAG ACG AT CT C CAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGC ATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCrGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTG AAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGAC CTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCG ACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGAC GGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGAcaattp.ecoocoQC agctcggotagtatcgacocactctggocgctggtcgtgtgotggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgoatatc cctgccgctttto tcaoacogcctcogtg tgtttgatc ttg tg tg tacgcgcttttgcgogttgctagctgcttg tgctatttgcgaa taccocccccogcatccccttccctcgtttcototcgcttgcotcccaoccgcaacttatctacgctgtcctgctotccctcogcgct gctcctgctcctgctcoctgcccctcgcacogccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtooaccagcoct gcootgctgatgcacgggoogtogtgggotgggaacocaootggaggatcccgcgtctcgaacagogcgcgcagaggao cgctgaaggtctcgcctctgtcgcacctcagcgcggcotacoccacaatoaccocctgacgaatgcgcTtggttcttcgtccatt ogcgoagcgtccggttcacacacgtgccocgttggcgoggtggcoggtgocoatgatcggtggagctgotggtcgoaacgtt cocQQCctoQqoofQfcgaattccgcctgcaacgcaaeeecagccacagccgctcccaccceccectgaaccgacacgtgcttgg gcgcctgccgcctgcctgccgcatgcttgtgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaa gcttatgtgtgtgctgggcttgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcct ccaggtggttcaatcgcggcagccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtt tgccagaatgatcggttcagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggca ccggggagtggaatggcaccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaa cgtaaccatgagctgatcaacactgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgct gccggctgctgcctgctgcgcacgccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgt ggtggataggatgcaagtggagcgaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgca tgcgaagggactggccccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgtcaccaggcccgcaagctttgcag aaccatgctcatggacgcatgtagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagc agaggcggcggcagcagagcggcggcagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgct gatcccaaacgagttcacattcatttgcatgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcg ggaccgccaggctagcagcaaaggcgcctcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggcc ggctgtttctttcgtgttgcaaaacgcgccagctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgat cagctgattgcccggctcgcgaagtaggcgccctcctttctgctcgccctctctccgtcccgccacta^tATGGCCACCGCATC CACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGC CCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCA CCAT CTT CT CCGCCGCCG AG AAGCAGTGG ACCAACCTGGAGTGG AAGCCCAAGCCCAACCCCCCCCA GCTGCTGG ACG ACCACTT CGGCCCCCACGGCCTGGT GTT CCGCCGCACCTT CGCCAT CCGCAGCTAC GAGGTGGGCCCCGACCGCTCCACCAGCATCGTGGCCGTGATGAACCACCTGCAGGAGGCCGCCCTG AACCACGCCAAGTCCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGC GACCTGATCTGGGTGGTGAAGCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACC GTGGAGGTGGAGTGCTGGGTGGGCGCCTCCGGCAACAACGGCCGCCGCCACGACTTCCTGGTGCG CG ACTGCAAG ACCGG CG AG AT CCTG ACCCGCT GCACCT CCCTG AGCGT G ATG ATG AAC ACCCGCAC CCGCCGCCTGAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGT GGCCGTGAAGGACGAGGAGATCAAGAAGCCCCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCC AGGGCGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACATCAACCAGCACGTGAACAACATCAAGTACG TGGACTGGATCCTGGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAGAGCCACCACATCTCCTCCTTCACCATC GAGTACCGCCGCGAGTGCACCATGGACAGCGTGCTGCAGTCCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCTCC TCCGAGGCCGGCCTGGTGTGCGAGCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGC CAAGACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGTCC AGCGTGATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGTGAcXCMEgcagcogcagctcggotagtatcgocococtctggacgctggtcgtgtgatggoctgttgcc gccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgctttta tcaaacagcctcogtgtg tttgatcttg tg tg tacgcgcttttg cgogttgctagctgcttgtgctatttgcgaotoccocccccagcotccccttccctcgtttcototcgcttgcatcccooccgcoact tatctocgctgtcctgctotccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattc tcctggtactgcaacctgtaaoccogcactgcaotgctgotgcacgggaogtagtgggotgggaacacaoatggaa¿£c\t
SEQ ID NO: 112
P.moriformis Aat02 promotor/5'UTR:: C. protothecoides estearoil ACP desaturasa PTS:: Cinnamomum camphora C14 tioesterasa:: C. vulgaris nitrato reductasa 3”UTR AGAGAGCGGAGGTGGGGTTGTGAGGTGGGGTTGCTGACCAGGAGCTCGCGTCGC CGAGCGCGACTCGCACACGGTCCAGTTACCCCCCCCTCCGCCCAAACGCAAGCCT CCC ATCTTG ATGCCTTTCCGGCC ACCT AT ACT ATTTCTT AGTTCGCTGT A ACATCC AGACCGTCCTGAATAATAACAATGCCCTGTGTCAAGTGCATTCCTAAAAAAATTC TGTCCCAACCAACAATCCCACCTGAAATACCACCAGCCCTGCCCAGTACACTCTT CCAATACCATCTCCCTACCTCCACGCGCAAGCGACCCCCATGCGCGACCAGGCTC GAAAGTGATTTATGACTTGAGACGAGCGAGTGGCGGCGCGGTCGACTGCCTTTTC ATCACGTGCCGTACGTCGGCGACCGCTAGGGCITTGCACGGCAACGCACGGC'ITG GCCAACCCGACCAGCCAGGACCTCGACTACTCTACCGCGAATTCGCCTCAAGAA GTCGCCAAATGTGCCATACACCATTCCTTACAGCACTGTTCAAACTTGATGCCAA
nTrGACATTCGGGTTGCTCGTTGGCTGCGCCCACATCGGCCGTGAGTGCAGCAG GCGGGATCGGACACGGAGGACGCGGCGTCACGCCCCGAACGCAGCCCGTAACTC TACATCAACACGACGTGTTGCGTAATCCCGCCCGGCTGCGCATCGTGCCAACCCA TTCGCGATGGATGGTCGGAAAATGGTGTGCCAACTGCCCTGAGGGAGGCTCTCG CGAAACGGGCACGTCCCTGAAACCGAAACTGTGGCCTTGTCGTCGGCCACGCAA GCACGTGGACCCTAAACACCAAGAAAATCAGTAAACAAGGTTGACATCCTCTAC GGGCGA ATTGTTrGCCCAACCCITCATCGCAC ACTGCCATT AT A ATGCATCT AGC TCGGCGACAAGTTTAGAAAAGGCAGGCTGCATTGTTCCATTTCGCCGTGGCGGCG TGGGTGCCCATTTTACGAGGTTTGGGCTCCCGGGCAGCGACCGAGCCAGGTCGA GTCCCTCTCGCCCGTCGACAATGTTGCGAACCCCACAAGCGGCTAACAACAACTT GATGGTACCTGTACACTGCCAATTCCTTCTTCCCCGGCCGAGG'nTACACGTGAT GGCCATGGCrTCGCATrCAGGCCGACTTCCCA'lTCCGAdTTCCAGAGGGTCCGC GGACGCTGGGGGTTGGCTGCCTGAGGCCCACCCTTTGTTCCCCGCGTCCCGACAA ACACAATTGCGTTACATA AGGGGGAGCCGCCCCCGTTCAGAGTGCAGAAATCTTT CACTATATTTTCCAGTCGTCAGCGAAATCAAGTACTAGTATGGCCACCGCATCCA CTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGG
GCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCCCGACTGGTC
CATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCTCCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACC
AACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAACCCCCCCCAGCTGCTGGACGACCACTTC
GGCCCCCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCAGCTACGAGGTGG
GCCCCGACCGCTCCACCAGCATCGTGGCCGTGATGAACCACCTGCAGGAGGCCG
CCCTGAACCACGCCAAGTCCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCT GGAGATGTCCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGAAGCGCACCCACGTGGCCGT GG AGCGCT ACCCCGCCTGGGGCG AC ACCGTGG AGGTGG AGTGCTGGGT GGGCGC CTCCGGCAACAACGGCCGCCGCCACGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGG CGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGATGATGAACACCCGCACCCGC CGCCTGAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATC GACAACGTGGCCGTGAAGGACGAGGAGATCAAGAAGCCCCAGAAGCTGAACGA
CTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGA
CATCAACCAGCACGTGAACAACATCAAGTACGTGGACTGGATCCTGGAGACCGT GCCCGACAGCATCTTCGAGAGCCACCACATCTCCTCCITCACCATCGAGTACCGC CGCGAGTGCACCATGGACAGCGTGCTGCAGTCCCrGACCACCGTGAGCGGCGGC TCCTCCGAGGCCGGCCTGGTGTGCGAGCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGC GAGGTGCTGCGCGCCAAGACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGC GGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGTCCAGCGTGATGGACTACAAGGACCACGAC GGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGACTC GAGTTAATTAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGAC GCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATAT CCCTGCCGCmTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTT TGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTrGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCC CTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCA ACCGCAACTTATCT ACGCTGTCCTGCT ATCC CTC AGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCrrGG ITIGGGCIC CGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACI'GCAATGCTGATGCA CGGG A AGT AGTGGG ATGGG A AC AC A A ATGG A A AGCTT
SEQ ID NO: 113
C.reinhartii promotor de p-tubulina:: PTS nativo:: Cuphea hookeriana C8-10 tioesterasa:: C.vulgaris nitrato reductasa 3'UTR ggtacccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgggcgcctgccgcctgcctg ccgcatgcttgtgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaagcttatgtgtgtgctggg cttgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcctccaggtggttcaatcgc ggcagccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtttgccagaatgatcggtt cagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggagtggaatgg caccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaacgtaaccatgagctga tcaacactgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgctgccggctgctgcctgct gcgcacgccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgtggtggataggatgcaa gtggagcgaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagggactggcc ccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgtcaccaggcccgcaagctttgcagaaccatgctcatggac gcatgtagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcggcggcagc agagcggcggcagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcccaaacgagttc acattcatttgcatgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcgggaccgccaggctagc agcaaaggcgcctcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggccggctgtttctttcgtgtt gcaaaacgcgccagctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgatcagctgattgcccggct cgcgaagtaggcgccctcctttctgctcgccctctctccgtcccgcctctagaatatcaATGATCGAGCAGGACGGCCTCC ACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCG GCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGA CCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGG CGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCG AGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCG ACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCG CATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGC ACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACC TGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCT TCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACA TCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCG ACT CCCAGCGCAT CGCCTT CT ACCGCCTGCT GG ACG AGTT CTT CTGAcaattfigcoqcaqcoqcfcqqqfoaf otcgacocactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccocacttgctgccttgacctgtgaotatccctgccgcttttat caaacagcctcogtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgoataccacccccagc otccccttccctcgtttcotatcgcttgcatcccaoccgcaacttatctocgctgtcctgctotccctcagcgctgctcctgctcctgct cactgcccctcgcacogccttggtttgggctccgcctgtottctcctggtactgcoacctgtoaaccagcoctgcoatgctgatgc ocgggoogrogfgggofgggoococooofggaggatcccgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcc tctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcac acacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatgglcgaaacgttcacagcctagggatatcgaattc ctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgctt cgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgatt gcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatc gcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacggcgcgccATGGTGGCCGCCGCCGCCT CCAGCGCCTTCTTCCCCGTGCCCGCCCCCGGCGCCTCCCCCAAGCCCGGCAAGTTCGGCAACTGGCC CTCCAGCCTGAGCCCCTCCTTCAAGCCCAAGTCCATCCCCAACGGCGGCTTCCAGGTGAAGGCCAAC GACAGCGCCCACCCCAAGGCCAACGGCTCCGCCGTGAGCCTGAAGAGCGGCAGCCTGAACACCCAG GAGGACACCTCCTCCAGCCCCCCCCCCCGCACCTTCCTGCACCAGCTGCCCGACTGGAGCCGCCTGCT G ACCGCCAT CACCACCGTGTT CGT G AAGTCC AAGCGCCCCG ACATGCACG ACCGCAAGT CCAAGCG CCCCGACATGCTGGTGGACAGCTTCGGCCTGGAGTCCACCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCCA GT CCTT CT CCAT CCGCT CCTACG AG AT CGGCACCG ACCG CACCG CCAGCATCG AG ACCCTG ATG AAC CACCTGCAGGAGACCTCCCTGAACCACTGCAAGAGCACCGGCATCCTGCTGGACGGCTTCGGCCGC ACCCTGGAGATGTGCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGATCAAGATGCAGATCAAGGTGAACCGC TACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGATCAACACCCGCTTCAGCCGCCTGGGCAAGATCGGCATG GGCCGCGACTGGCTGATCTCCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGGTGCGCGCCACCAGCGCCTAC GCCATGATGAACCAGAAGACCCGCCGCCTGTCCAAGCTGCCCTACGAGGTGCACCAGGAGATCGTG CCCCTGTTCGTGGACAGCCCCGTGATCGAGGACTCCGACCTGAAGGTGCACAAGTTCAAGGTGAAG ACCGGCGACAGCATCCAGAAGGGCCTGACCCCCGGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGT GTCCAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGAGCATGCCCACCGAGGTGCTGGAGACCCAGGA GCTGTGCTCCCTGGCCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTGCTGGAGAGCGTGAC CGCCATGGACCCCAGCAAGGTGGGCGTGCGCTCCCAGTACCAGCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGG CACCGCCATCGTGAACGGCGCCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCGCCAACGGCGCCATCTC CACCGGCAAGACCAGCAACGGCAACTCCGTGTCCArGGACTACAAGGACCACGACGGCGACMCAA GGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGAacRüRRcoQcaacaactcQQQtaatotcaac ococtctggocgctggtcgtgtgotggactgttgccgccococttgctgccttgacctgtgaotatccctgccgctttto tcoooc agcctcagtgtg tttgo tcrtg tg tg tocgcgcttttgcgag ttgc tagctgcttg tgcto tttgcgaataccacccccagco tcccc ttccctcgtttcatotcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctotccctcagcgctgctcctgctcctgctcactg cccctcgcacogccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtoctgcoacctgtoaoccagcactgcoatgctgotgcocggg a a a to a ta a a a ta a a o a c a c a a a ta a a ñBRctx
SEQ ID NO: 114
C.reinhartii promotor de p-tubulina:: P.moriformis isopentenil difosfato sintasa PTS:: Cuphea hookeriana C8-10 tioesterasa:: C.vulgaris nitrato reductasa 3'UTR
ggtacccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgggcgcctgccgcctgcctg ccgcatgcttgtgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaagcttatgtgtgtgctggg cttgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcctccaggtggttcaatcgc ggcagccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtttgccagaatgatcggtt cagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggagtggaatgg caccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaacgtaaccatgagctga tcaacactgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgctgccggctgctgcctgct gcgcacgccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgtggtggataggatgcaa gtggagcgaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagggactggcc ccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgtcaccaggcccgcaagctttgcagaaccatgctcatggac gcatgtagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcggcggcagc agagcggcggcagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcccaaacgagttc acattcatttgcatgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcgggaccgccaggctagc agcaaaggcgcctcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggccggctgtttctttcgtgtt gcaaaacgcgccagctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgatcagctgattgcccggct cgcgaagtaggcgccctcctttctgctcgccctctctccgtcccgcctctagaatatcaATGATCGAGCAGGACGGCCTCC ACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCG GCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGA CCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGG CGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCG AGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCG ACGCCATGC6CCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCG CATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGC ACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACC TGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCT TCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACA TCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCG ACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGAcaattggcoocoQCQOCfCQOOtoof otcgocococtctggocgctggtcgtgtgotggoctgttgccgccacocttgctgccttgocctgtgoatatccctgccgcttttot caaacagcctcagtg tg tttgatc ttg tg tg tocgcgcttttgcgagttgctogctgcttg tgcta tttgcgaotoccacccccagc otccccttccctcgtttcotatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctocgctgtcctgctotccctcagcgctgctcctgctcctgct cactgcccctcgcacogccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaocctgtaaoccagcactgcoatgctgatgc ocgggoogfogfgggofgggoococooofggaggatcccgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcc tctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcac acacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatcgaattc ctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgctt cgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgatt gcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatc gcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacactagtATGACGTTCGGGGTCGCCCTC CCGGCCATGGGCCGCGGTGTCTCCCTTCCCCGGCCCAGGGTCGCGGTGCGCGCCCAGTCGGCGAGT CAGGTTTTGGAGAGCGGGCGCGCCCAGCTGCCCGACTGGAGCCGCCTGCrGACCGCCATCACCACC GTGTTCGTGAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCACGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTG GACAGCTTCGGCCTGGAGTCCACCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCCAGTCCTTCTCCATCCGCT CCTACGAGATCGGCACCGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCT CCCTGAACCACTGCAAGAGCACCGGCATCCTGCTGGACGGCTTCGGCCGCACCCTGGAGATGTGCA AGCGCGACCrGATCTGGGTGGTGATCAAGATGCAGATCAAGGTGAACCGCTACCCCGCCTGGGGCG ACACCGTGGAGATCAACACCCGCTTCAGCCGCCTGGGCAAGATCGGCATGGGCCGCGACTGGCTGA TCTCCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGGTGCGCGCCACCAGCGCCTACGCCATGATGAACCAGA AGACCCGCCGCCTGTCCAAGCTGCCCTACGAGGTGCACCAGGAGATCGTGCCCCTGTTCGTGGACA GCCCCGTGATCGAGGACTCCGACCTGAAGGTGCACAAGTTCAAGGTGAAGACCGGCGACAGCATCC AGAAGGGCCTGACCCCCGGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGTCCAACGTGAAGTACA TCGGCTGGATCCTGGAGAGCATGCCCACCGAGGTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCTCCCTGGCCC TGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTGCTGGAGAGCGTGACCGCCATGGACCCCAGC AAGGTGGGCGTGCGCTCCCAGTACCAGCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCACCGCCATCGTGAAC GGCGCCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCGCCAACGGCGCCATCTCCACCGGCAAGACCAG CAACGGCAAaCCGJGICCATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGA CTACAAGGACGACGACGACAAGTGActcp,ap.pxo acaQ caactcaaataata tcaacacactc taaacactaatca tg tgo tggoctg ttgccgccococttgctgccttgacctg tgaato tccctgccgctttto tcaoacagectcogtg tgtttgatc tt g tg tg tocgcgcttttgcgagttgctagctgcttg tgcto tttgcgaataccocccccagcotccccttccctcg tttcatatcgctt gcatcccaaccgcoocttotctacgctgtcctgctotccctcogcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcocagccttggtt tgggctccgcctg to ttc tcctggtactgcaacctg toaaccagcactgcaotgctgotgcacgggaagtagtgggatgggaa cocooorqqaaagctt
SEQ ID NO: 115
C.reinhartii promotor de p-tubulina:: P.moriformis delta 12 ácido graso desaturasa PTS:: Cuphea hookeriana C8-10 tioesterasa:: C.vulgaris nitrato reductasa 3'UTR
ggtacccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgggcgcctgccgcctgcctg ccgcatgcttgtgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaagcttatgtgtgtgctggg cttgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcctccaggtggttcaatcgc ggcagccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtttgccagaatgatcggtt cagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggagtggaatgg caccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaacgtaaccatgagctga tcaacactgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgctgccggctgctgcctgct gcgcacgccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgtggtggataggatgcaa gtggagcgaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagggactggcc ccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgtcaccaggcccgcaagctttgcagaaccatgctcatggac gcatgtagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcggcggcagc agagcggcggcagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcccaaacgagttc acattcatttgcatgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcgggaccgccaggctagc agcaaaggcgcctcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggccggctgtttctttcgtgtt gcaaaacgcgccagctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgatcagctgattgcccggct cecgaagtaggcgccctcctttctgctcgccctctctccgtcccgcctctaeaatatcaATGATCGAGCAGGACGGCCTCC ACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCG GCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGA CCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGG CGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCG AGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCG ACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCG CATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGC ACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACC TGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCT TCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACA TCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCG ACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGAcaattp.ecoocoocoQCfCQQOfoof atcgacococtctggocgctggtcgtgtgotggactgttgccgccacacttgctgccttgocctgtgoototccctgccgcttttat coaocagcctcogtgtgtttgotcttgtgtgtacgcgcttttgcgogttgctagctgcttgtgctotttgcgoataccocccccagc atccccttccctcgtttcatotcgcttgcatcccaaccgcaocttotctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgct coctgcccctcgcocogccttggtttgggctccgcctgtottctcctggtactgcoacctgtaaaccagcoctgcaotgctgotgc ocQQQOQQfoQtQQqofoQQOococooofQQaegatcccgcgtctceaacaeagcgcecaeaggaacgcteaagfitctcgcc tctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcac acacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatcgaattc ctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgctt cgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgatt gcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatc gcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacactagtATGGCTATCAAGACGAACAG GCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTT CGAGCGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCCCAGCTGCCCGACTGGAGCCGCCTGCTGACCGCCATCAC CACCGTGTTCGTGAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCACGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCT GGTGGACAGCTTCGGCCTGGAGTCCACCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCCAGTCCTTCTCCATC CGCTCCTACGAGATCGGCACCGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAG ACCTCCCTGAACCACTGCAAGAGCACCGGCATCCTGCTGGACGGCTTCGGCCGCACCCTGGAGATGT GCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGATCAAGATGCAGATCAAGGTGAACCGCTACCCCGCCTGGG GCGACACCGTGGAGATCAACACCCGCTTCAGCCGCCTGGGCAAGATCGGCATGGGCCGCGACTGGC TGATCTCCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGGTGCGCGCCACCAGCGCCTACGCCATGATGAACCA GAAGACCCGCCGCCTGTCCAAGCTGCCCTACGAGGTGCACCAGGAGATCGTGCCCCTGTTCGTGGA
c a g c c c c g t g a t c g a g g a c t c c g a c c t g a a g g t g c a c a a g t t c a a g g t g a a g a c c g g c g a c a g c a t CCAGAAGGGCCTGACCCCCGGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGTCCAACGTGAAGTA CATCGGCTGGATCCTGGAGAGCATGCCCACCGAGGTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCTCCCTGGC CCTGGAGTACC6CCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTGCTGGAGAGCGTGACCGCCATGGACCCCA GCAAGGTGGGCGTGCGCTCCCAGTACCAGCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCACCGCCATCGTGA ACGGCGCCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCGCCAACGGCGCCATCTCCACCGGCAAGACCA GCAACGGCAACTCCGTGJCCATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCG ACTACAAGGACGACGACGACAAGTGAclcgaggcagcagcagctcggotogtotcgacacactctggacgctggtc gtg tgotggoctgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgoatatccctgccgctttto tcaaacagcctcagtgtgtttgatc ttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaotoccocccccagcotccccttccctcgtttcatotcgct tgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcocagccttggt ttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaocctgtoaoccogcactgcoatgctgotgcocgggaogtogtgggotggga acacaaa fooaaaectt
SEQ ID NO: 116
C.reinhartii p-tubulina promotor:: C.protothecoides estearoil ACP desaturasa PTS:: Cuphea hookeriana C8-10 thioesterase:: C. vulgaris nitrato reductasa 3'UTR
ggtacccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgggcgcctgccgcctgcctg ccgcatgcttgtgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaagctta tgtgtgtgctggg cttgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcctccaggtggttcaatcgc ggcagccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtttgccagaatgatcggtt cagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggagtggaatgg caccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaacgtaaccatgagctga tcaacactgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgctgccggctgctgcctgct gcgcacgccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgtggtggataggatgcaa gtggagcgaataccaaaecctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagggactggcc ccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgt cacea ggcccgcaagctttgcagaaccatgctcatggac gcatgtagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcggcggcagc agagcggcggcagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcccaaacgagttc acattcatttgcatgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcgggaccgccaggctagc agcaaaggcgcctcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggccggctgtttctttcgtgtt gcaaaacgcgccagctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgatcagctgattgcccggct cgcgaagtaggcgccctcctttctgctcgccctctctccgtcccgcctctagaatatcaATGATCGAGCAGGACGGCCTCC
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SEQ ID NO: 117
C.reinhartii promotor de p-tubulina:: P.moriformis estearoil ACP desaturasa PTS:: Cuphea hookeriana C8-10 tioesterasa:: C.vulgaris nitrato reductasa 3'UTR
ggtacccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgggcgcctgccgcctgcctg ccgcatgcttgtgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaagcttatgtgtgtgctggg cttgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcctccaggtggttcaatcgc ggcagccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtttgccagaatgatcggtt cagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggagtggaatgg caccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaacgtaaccatgagctga tcaacactgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgctgccggctgctgcctgct gcgcacgccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgtggtggataggatgcaa gtggagcgaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagggactggcc ccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgtcaccaggcccgcaagctttgcagaaccatgctcatggac gcatgtagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcggcggcagc agagcggcggcagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcccaaacgagttc acattcatttgcatgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcgggaccgccaggctagc agcaaaggcgcctcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggccggctgtttctttcgtgtt gcaaaacgcgccagctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgatcagctgattgcccggct cgcgaagtaggcgccctcctttctgctcgccctctctccgtcccgcctctagaatatcaATGATCGAGCAGGACGGCCTCC ACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCG GCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGA CCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGG
c g t g c c c t g c g c c g c c g t g c t g g a c g t g g t g a c c g a g g c c g g c c g c g a c t g g c t g c t g c t g g g c g AGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCG ACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCG CATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGC ACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACC
TGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCT
TCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACA
TCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCG ACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGAcaattggcoqcoocoQCfcOQOtoqf atcgocacoctctggocgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaototccctgccgcttttot caaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagc atccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccooccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgct coctgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtottctcctggtactgcaocctgtaaoceogcoctgcootgctgatgc qqjggaogfogfgggafgggaqcqcaqqtggaggatcccgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcc tctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcac acacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatcgaáüs ctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgctt cgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgatt gcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatc gcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacactagtATGGCTTCCGCGGCATTCACC ATGTCGGCGTGCCCCGCGATGACTGGCAGGGCCCCTGGGGCACGTCGCTCCGGACGGCCAGTCGCC
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TCGGCACCGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCTCCCTGAACC
ACTGCAAGAGCACCGGCATCCTGCTGGACGGCTTCGGCCGCACCCTGGAGATGTGCAAGCGCGACC TGATCTGGGTGGTGATCAAGATGCAGATCAAGGTGAACCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGG
AGATCAACACCCGCTTCAGCCGCCTGGGCAAGATCGGCATGGGCCGCGACTGGCTGATCTCCGACT
GCAACACCGGCGAGATCCTGGTGCGCGCCACCAGCGCCTACGCCATGATGAACCAGAAGACCCGCC GCCTGTCCAAGCTGCCCTACGAGGTGCACCAGGAGATCGTGCCCCTGTTCGTGGACAGCCCCGTGAT CG AGG ACT CCG ACCTG AAGGTGCACAAGTTCAAGGTG AAG ACCGGCG ACAGCAT CCAG AAGGGCC TGACCCCCGGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGTCCAACGTGAAGTACATCGGCTGGA TCCTGGAGAGCATGCCCACCGAGGTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCTCCCTGGCCCTGGAGTACC GCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTGCTGGAGAGCGTGACCGCCATGGACCCCAGCAAGGTGGGC GTGCGCTCCCAGTACCAGCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCACCGCCATCGTGAACGGCGCCACC
GAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCGCCAACGGCGCCATCTCCACCGGCAAGACCAGCAACGGCAA
CTCCG1G1CCATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGA
CGACGACGACAAGTGAcU£aggcagcagcagctcggatogtatcgacocactctggacgctggtcgtgtgatggactg ttgccgccocacttgctgccttgocctgtgaotatccctgccgcttttatcoaocogcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgc ttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaatoccacccccagcotccccttccctcgtttcatatcgcttgcotcccoaccgc aacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgt a ttctcctgg tactacaacctataaaccaacactacaatactaatacacaaaaaatoataaaataaaoacacoaataaaaaR Ct1
SEQ ID NO: 118
C.reinhartii S-tubulin promotor:: PTS nativo:: Umbellularia californica C12 tioesterasa:: C.vulgaris nitrato reductasa 3'UTR
ggtacccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgggcgcctgccgcctgcctg ccgcatgcttgtgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaagcttatgtgtgtgctggg cttgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcctccaggtggttcaatcgc ggcagccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtttgccagaatgatcggtt cagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggagtggaatgg caccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaacgtaaccatgagctga tcaacactgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgctgccggctgctgcctgct gcgcacgccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgtggtggataggatgcaa gtggagcgaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagggactggcc ccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgtcaccaggcccgcaagctttgcagaaccatgctcatggac gcatgtagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcggcggcagc agagcggcggcagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcccaaacgagttc acattcatttgcatgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcgggaccgccaggctagc agcaaaggcgcctcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggccggctgtttctttcgtgtt gcaaaacgcgccagctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgatcagctgattgcccggct cgcgaagtaggcgccctcctttctgctcgccctctctccgtcccgcctctagaatatcaATGATCGAGCAGGACGGCCTCC ACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCG GCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGA CCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGG CGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCG AGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCG ACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCG CATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGC ACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACC TGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCT TCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACA TCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCG ACT CCCAGCGCAT CGCCTTCT ACCGCCTGCTGG ACG AGTT CTT CT G kcaallggcagcagcagctcggotagt otcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggoctgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgoatatccctgccgcttttot caaacagcctcogtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttg tgctotttgcgoataccacccccagc atccccttccctcgtttcatotcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgct coctgcccctcgcacogccttggtttgggctccgcctgtottctcctggtactgcaocctgtaoaccogcoctgcaatgctgotgc ocgggoogrogfgggofgggoococooofggaggatcccgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcc tctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcac acacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatcgaattc ctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgctt cgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgatt gcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatc gcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacggcgcgccATGGCCACCACCAGCCTGG CCTCCGCCTTCTGCTCCATGAAGGCCGTGATGCTGGCCCGCGACGGCCGCGGCATGAAGCCCCGCA GCTCCGACCTGCAGCTGCGCGCCGGCAACGCCCCCACCTCCCTGAAGATGATCAACGGCACCAAGTT CAGCTACACCGAGAGCCTGAAGCGCCTGCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATC TTCAGCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAAGCTGCCCCAGCTG CTGG ACG ACCACTT CGGCCT GCACGGCCT GGTGTTCCGCCGCACCTT CGCCAT CCGCTCCTACGAGG TGGGCCCCGACCGCAGCACCTCCATCCTGGCCGTGATGAACCACATGCAGGAGGCCACCCTGAACC ACGCCAAGAGCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACC TGATGTGGGTGGTGCGCCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCACCTGGGGCGACACCGTG GAGGTGGAGTGCTGGATCGGCGCCAGCGGCAACAACGGCATGCGCCGCGACTTCCTGGTGCGCGA CTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGCTGATGAACACCCGCACCCGC CGCCTGAGCACCATCCCCGACGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCC GTGAAGGACGACGAGATCAAGAAGCTGCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGG CGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGAACAACCTGAAGTACGTGGC CTGGGT GTT CG AG ACCGTGCCCG ACAG C AT CTT CG AGT CCC ACCACAT CAGCT CCTT CACCCTGG AG TACCGCCGCGAGTGCACCCGCGACTCCGTGCTGCGCAGCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCAGCTCC GAGGCCGGCCTGGTGTGCGACCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCCG CACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGCCCCGC GTGATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGAC G A C A A G TG A TG A ctcgaggcogcagcogctcggatagtatcgocacoctctggacgctggtcgtgtgatggactgttgcc g cc ac acttg c tg ccttg acc tg tg o ato tccc tgccgc tttto tcaao cag cctco g tg tg tttg o tc ttg tg tg tacg cg cttttg cgogttgc tagctgcttg tgctatttgcgaotaccocccccogcatccccttccctcg tttcatatcgcttgcatcccoaccgcoact tatctocgctgtcctgetatccctcagcgctgetcetgctcctgctcoctgcccctcgcacogccttggtttgggctccgcctgtattc tcc tg g tac tg c ao c c tg ta o ac ca g co c tg c o a tg c tg o tg ca cg g g aa g ta g tg g g a tg g g ao c ac aa o tg g a& g g x
SEQ ID NO: 119
C.reinhartii promotor de p-tubulina:: P.moriformis isopentenil difosfato sintasa PTS:: Umbellularia californica C12 tioesterasa:: C.vulgaris nitrato reductasa 3'UTR
ggtacccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgggcgcctgccgcctgcctg ccgcatgcttgtgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaagcttatgtgtgtgctggg cttgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcctccaggtggttcaatcgc ggcagccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtttgccagaatgatcggtt cagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggagtggaatgg caccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaacgtaaccatgagctga tcaacactgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgctgccggctgctgcctgct gcgcacgccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgtggtggataggatgcaa gtggagcgaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagggactggcc ccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgtcaccaggcccgcaagctttgcagaaccatgctcatggac gcatgtagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcggcggcagc agagcggcggcagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcccaaacgagttc acattcatttgcatgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcgggaccgccaggdagc agcaaaggcgcctcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggccggctgtttctttcgtgtt gcaaaacgcgccagctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgatcagctgattgcccggct cgcgaagtaggcgccctcctttctgctcgccctctctccgtcccgcctctagaatateaATGATCGAGCAGGACGGCCTCC ACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCG GCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGA CCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGG CGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCG AGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCG ACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCG CATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGC ACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACC TGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCT TCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACA TCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCG ACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGAcaattRgcoQCOQCQQCfCQQOfoot atcgacacactc tggacgctggtcgtg tgatggoctg ttgccgccacacttgctgccttgacctg tgaotatccctgccgcntta t coaocagcctcagtg tg tttgatc ttg tg tg tocgcgcttttgcgagttgctagctgcttg tgcto tttgcgoataccacccccogc otccccttccctcgtttcatotcgcttgcatcccaaccgcoacttatctacgctgtcctgctatccctcogcgctgctcctgctcctgct coctgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtoctgcoacctgtoaaccogcoctgcaotgctgotgc ocgggoogíogfgggofgggoococooofggaggatcccgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcc tctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcac acacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatcgaattc ctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgctt cgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgatt gcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatc gcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacactagtATGACGTTCGGGGTCGCCCTC CCGGCCATGGGCCGCGGTGTCTCCCTTCCCCGGCCCAGGGTCGCGGTGCGCGCCCAGTCGGCGAGT C AGGTTTTGG AG AGCGGGCGCGCCCCCG ACTGGTCCAT GCT GTTCGCCGTG AT CACCACCAT CTT CA GCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAAGCTGCCCCAGCTGCTG GACGACCACTTCGGCCTGCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCTCCTACGAGGTGG GCCCCGACCGCAGCACCTCCATCCTGGCCGTGATGAACCACATGCAGGAGGCCACCCTGAACCACG CCAAGAGCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGA TGTGGGTGGTGCGCCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCACCTGGGGCGACACCGTGGAG GTGGAGTGCTGGATCGGCGCCAGCGGCAACAACGGCATGCGCCGCGACTTCCTGGTGCGCGACTG CAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGCTGATGAACACCCGCACCCGCCGC CTGAGCACCATCCCCGACGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTG AAGGACGACGAGATCAAGAAGCTGCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGG CCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGAACAACCTGAAGTACGTGGCCTG GGTGTTCGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAGTCCCACCACATCAGCTCCTTCACCCTGGAGTAC CGCCGCGAGTGCACCCGCGACTCCGTGCTGCGCAGCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCAGCTCCGAG GCCGGCCTGGTGTGCGACCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCCGCAC CGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGCCCCGCGT GA TGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACA TCGACTACAAGGACGACGACGA CAAG TG ATG Actc£a¿¡gcogcagcogctcggotogtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgcc o cacttg c tgccttgacctg tgoata tccc tgccgctttto tcooacagcctcog tg tg tttga tc ttg tg tg tocgcgcttttgcga g ttgctagctgcttg tgctatttgcgaataccocccccagcatccccttccctcg tttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttat ctacgctgtcctgctatccctcogcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcc tgg toctgcaacctg taoaccagcactgcaotgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaococoaatggaaag£t¿
SEQ ID NO: 120
C.reinhartii S-tubulina promotor:: P.moriformis delta 12 ácido graso desaturasa PTS:: Umbellularia califomica C12 tioesterasa:: C.vulgaris nitrato reductasa 3'UTR
ggtacccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgggcgcctgccgcctgcctg ccgcatgcttgtgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaagcttatgtgtgtgctggg cttgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcctccaggtggttcaatcgc ggcagccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtttgccagaatgatcggtt cagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggagtggaatgg caccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaacgtaaccatgagctga tcaacactgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgctgccggctgctgcctgct gcgcacgccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgtggtggataggatgcaa gtggagcgaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagggactggcc ccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgtcaccaggcccgcaagctttgcagaaccatgctcatggac gcatgtagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcggcggcagc agageggcggcagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcccaaacgagttc acattcatttgcatgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcgggaccgccaggctagc agcaaaggcgcctcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggccggctgtttctttcgtgtt gcaaaacgcgccagctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgatcagctgattgcccggct cgcgaagtaggcgccctcctttctgctcgccctctctccgtcccgcctctagaatatcaATGATCGAGCAGGACGGCCTCC ACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCG GCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGA CCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGG CGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCG AGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCG ACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCG CATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGC ACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACC T GGTGGT G ACCCACGGCG ACGCCTGCCTGCCCAACAT CATGGTGG AG AACGGCCGCTTCTCCGGCT TCATCGACTGCGGCCGCCrGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACA TCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCG ACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGAcaattegcoQCOQCOQCfCQQOtOQt otcgococactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgocctgtgaatatccctgccgctm at caaacagcctcagtgtgtttgatcttg tgtgtacgcgcttttgcgagttgctogctgcttg tgctatttgcgoataccocccccogc otccccttccctcgtttcotatcgcttgcatcccaoccgcaacttotctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgct cactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaocctgtoaaccagcoctgcootgctgatgc ocgggoogfogfgggoígggoococooofggaggatcccgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcc tctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcac acacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatcgaails ctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgctt cgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgatt gcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatc gcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacactagtATGGCTATCAAGACGAACAG GCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTT CGAGCGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCCCCCGACT6GTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATC TTCAGCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAAGCTGCCCCAGCTG CTGGACGACCACTTCGGCCTGCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCTCCTACGAGG TGGGCCCCGACCGCAGCACCTCCATCCTGGCCGTGATGAACCACATGCAGGAGGCCACCCTGAACC ACGCCAAGAGCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCT6GAGATGTCCAAGCGCGACC TGATGTGGGTGGTGCGCCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCACCTGGGGCGACACCGTG GAGGTGGAGTGCTGGATCGGCGCCAGCGGCAACAACGGCATGCGCCGCGACTTCCTGGTGCGCGA CTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGCTGATGAACACCCGCACCCGC CGCCTGAGCACCATCCCCGACGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCC GTGAAGGACGACGAGATCAAGAAGCTGCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGG CGGCCTGACCCCCCGCrGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGAACAACCrGAAGTACGTGGC CTGGGT GTTCG AG ACCGTGCCCG ACAGCAT CTT CG AGTCCCACCACAT CAGCT CCTT CACCCTGG AG TACCGCCGCGAGTGCACCCGCGACTCCGTGCTGCGCAGCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCAGCTCC GAGGCCGGCCTGGTGTGCGACCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCCG CACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGCCCCGC GTGA TGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACCACA TCGACTACAAGGACGACGAC G ACAAG TG ATGActcgaggcagcogcogctcggatogtotcgocacoctctggocgctggtcgtgtgatggactgttgcc gccocacttgctgccttgacctgtgaototccctgccgcttttotcaaacogcctcogtgtgtttgatcttg tgtgtacgcgcttttg cgogttgctagctgcttgtgctatttgcgootaccocccccogcotccccttccctcgtttcotatcgcttgcotcccooccgcoact totctocgctgtcctgctatccctcogcgctgctcctgctcctgctcoctgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattc tc c ta a to c ta c a o c c ta ta aa c ca ac o c tac ao tac taa ta ca ca aa a aa ta a ta aa a taa aa a ca ca aa ta a a aa£c.n
SEQ ID NO: 121
C.reinhartii promotor de p-tubulina:: C.protothecoides estearoil ACP desaturasa PTS:: Umbellularia californica C12 tioesterasa:: C.vulgaris nitrato reductasa 3'UTR
ggta^ccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgggcgcctgccgcctgcctg ccgcatgcttgtgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaagcttatgtgtgtgctggg cttgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcctccaggtggttcaatcgc ggcagccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtttgccagaatgatcggtt cagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggagtggaatgg caccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaacgtaaccatgagctga tcaacactgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgctgccggctgctgcctgct gcgcacgccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgtggtggataggatgcaa Btggagcgaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagggactggcc ccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgt cacea ggcccgcaagctttgcagaaccatgctcatggac gcatgtagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcggcggcagc agagcggcggcagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcccaaacgagttc acattcatttgcatgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcgggaccgccaggctagc agcaaaggcgcctcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggccggctgtttctttcgtgtt gcaaaacgcgccagctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgatcagctgattgcccggct cgceaagtaegceccctcctttctgctceccctctctccgtcccgcctctaeaatatcaATGATCGAGCAGGACGGCCTCC ACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCG GCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGA CCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGG CGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCG AGGTGCCCGGCCAGG ACCTGCTGT CCT CCCACCTGGCCCCCGCCG AG AAGGTGT CCAT CAT GGCCG ACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCG CATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGC ACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACC TGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCT T CAT CGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCG ACCGCT ACCAGG ACAT CGCCCTGGCCACCCGCG ACA TCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCG ACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGGrGGACGAGTTCTTCTGAcaattggcQQCOOCOQCtCQQQfoat otcgacococtctggocgctggtcgtgtgotggoctgttgccgccacacttgctgccttgocctgtgoatatccctgccgcttttat caaocagcctcagtgtgtttgotcttg tgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaotaccocccccagc otccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaoccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcogcgctgctcctgctcctgct cactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtottctcctggtactgcoacctgtaaaccagcoctgcoatgctgatgc ocgggoogíogtgggofgggoococooofggaggatcccgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcc tctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcac acacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatcgaattc ctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgctt cgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgatt gcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatc gcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacactagtATGGCCACCGCATCCACTTTCT CGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGA GGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTT CAGCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAAGCTGCCCCAGCTGCT GGACGACCACTTCGGCCTGCACGGCCTG6TGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCTCCTACGAGGTG GGCCCCGACCGCAGCACCTCCATCCTGGCCGTGATGAACCACATGCAGGAGGCCACCCTGAACCAC GCCAAGAGCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTG ATGTGGGTGGTGCGCCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCACCTGGGGCGACACCGTGGA GGTGGAGTGCTGGATCGGCGCCAGCGGCAACAACGGCATGCGCCGCGACTTCCTGGTGCGCGACT GCAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCaGAGCGTGCTGATGAACACCCGCACCCGCC GCCTGAGCACCATCCCCGACGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCG TGAAGGACGACGAGATCAAGAAGCTGCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGC GGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGAACAACCTGAAGTACGTGGCC TGGGTGTTCGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAGTCCCACCACATCAGCTCCTTCACCCTGGAGT ACCGCCGCGAGTGCACCCGCGACTCCGTGCTGCGCAGCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCAGCTCCG AGGCCGGCCTGGTGTGCGACCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCCGC ACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGCCCCGC GTG ATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGAC GACAAG TG ATG Ac\c¿d£&cagcagcagctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggoctgttgcc gccacacttgctgccttgacctgtgaotatccctgccgctttta tcoaacogcctcagtg tgtttgo tcttg tg tg tocgcgcttttg cgagttgctagctgcttgtgctotttgcgaataccacccccagcotccccttccctcgtttcatatcgcttgcotcccaaccgcaact tatctocgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcocogccttggtttgggctccgcctgtottc tcctggtactgcaacctg taoaccogcactgcoatgctgatgcacgggoagtagtgggatgggaacacaaatggaadE£ll
SEQ ID NO: 122
C.reinhartii S-tubulina promotor:: P.moriformis estearoil ACP desaturasa PTS:: Umbellularia califomica C12 tioesterasa:: C.vulgaris nitrato reductasa 3'UTR
ggtacccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgggcgcctgccgcctgcctg ccgcatgcttgtgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaagcttatgtgtgtgctggg cttgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcctccaggtggttcaatcgc ggcagccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtttgccagaatgatcggtt cagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggagtggaatgg caccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaacgtaaccatgagctga tcaacactgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgctgccggctgctgcctgct gcgcacgccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgtggtggataggatgcaa gtggagcgaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagggactggcc ccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgt cacea ggcccgcaagctttgcagaaccatgctcatggac gcatgtagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcggcggcagc agagcggcggcagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcccaaacgagttc acattcatttgcatgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcgggaccgccaggctagc agcaaaggcgcctcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggccggctgtttctttcgtgtt gcaaaacgcgccagctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgatcagctgattgcccggct cgcgaagtaggcgccctcctttctgctcgccctctctccgtcccgcctctagaatatcaATGATCGAGCAGGACGGCCTCC ACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTG6GTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCG GCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGA CCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGG CGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCG AGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCG ACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCG CATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGC ACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACC TGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCT TCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACA TCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCG ACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGAcaattggcogcagcogcfcggofogf otcgocococtctggacgctggtcgtgtgatggoctgttgccgccacocttgctgccttgacctgtgaatotccctgccgcttttat caaacagcctcagtgtgtttgotcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctotttgcgaotoccacccccagc atccccttccctcgtttcototcgcttgcatcccaaccgcaacttotctocgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgct cactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcoacctgtoaoccagcoctgcaatgctgatgc ocgggoogíogfgggofgggoococooofggaggatcccgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcc tctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcac acacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatcgaattc ctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgctt cgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgatt gcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttg tgatc gcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacactagtATGGCTTCCGCGGCATTCACC ATGTCGGCGTGCCCCGCGATGACTGGCAGGGCCCCTGGGGCACGTCGCTCCGGACGGCCAGTCGCC ACCCGCCTGAGGGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCAGCG CCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAAGCTGCCCCAGCTGCTGGAC GACCACTTCGGCCTGCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCTCCTACGAGGTGGGCC CCG ACCGCAGCACCT CCAT CCTGGCCGT G AT G AACCACATGCAGG AGGCCACCCTG AACCACGCCA AGAGCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGATGT GGGTGGTGCGCCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCACCTGGGGCGACACCGTGGAGGTG GAGTGCTGGATCGGCGCCAGCGGCAACAACGGCATGCGCCGCGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAA GACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGCTGATGAACACCCGCACCCGCCGCCTG AGCACCATCCCCGACGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTGAAG GACGACGAGATCAAGAAGCTGCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGCCTG ACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGAACAACCTGAAGTACGTGGCCTGGGTG TTCGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAGTCCCACCACATCAGCTCCTTCACCCTGGAGTACCGCCG CGAGTGCACCCGCGACTCCGTGCTGCGCAGCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCAGCTCCGAGGCCG GCCTGGTGTGCGACCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCCGCACCGAG TGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGCCCCGCGTGATC GACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAG TGATGAg£g2£gcogcagcagctcggatagtatcgacacactctggacgetggtcgtgtgatggactgUgccgccacoct tgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaoacogcctcogtgtgtttgotcttgtgtgtacgcgcttttgcgogttgc tagctgcttg tgctatttgcgaa taccacccccagcatcccct tccctcgtttca to tcgcttgca tcccaaccgcaactto tctacg ctgtcctgctotccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcocagccttggtttgggctccgcctgtottctcctggta ctgcaacctgtaaoccagcactgcoatgctgotgcacgggaagtagtgggotgggaacocaootggaaajgxt
SEQ ID NO: 123
C.reinhartii S-tubulin promotor:: PTS nativo:: Cinnamomum camphora C14 tioesterasa:: C.vulgaris nitrato reductasa 3'UTR
Figure imgf000153_0001
tgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcctccaggtggtlcaatcgcggc agccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtttgccagaatgatcggttcagc tgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggagtggaatggcacca ccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaacgtaaccatgagctgatcaaca ctgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgctgccggctgctgcctgctgcgcac gccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgtggtggataggatgcaagtggagc gaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagggactggccccatgcac gccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgtcaccaggcccgcaagctttgcagaaccatgctcatggacgcatgtagc gctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcggcggcagcagagcggcgg cagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcccaaacgagttcacattcatttgc atgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcgggaccgccaggctagcagcaaaggcgcc tcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggccggctgtttctttcgtgttgcaaaacgcgcca gctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgatcagctgattgcccggctcgcgaagtaggcgc cctcctttctgctcgccctctctccgtcccgcctctagaatatcaATGATCGAGCAGGACGGCCTCCACGCCGGCTCCC CCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACG CCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGC CCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGC CGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCC AGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCG CCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCC CGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGC CCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCA CGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGC CGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTG GGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCGACTCCCAGCGCATC GCCTT CT ACCGCCTGCTGG ACG AGTT CTT CJG Acaatt£gcagcagcagctcggatagtatcgacacoctctggac gctggtcgtgtgatggactQttQccgccacacttgctgccngacctgtgaatotccctgccgcttttatcaoacagcctcagtgtg tttgotcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgoatoccacccccogcatccccttccctcgtttco tatcgcttgcatcccaaccgcoacttotctocgctgtcctgctotccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacag ccttggtttgggctccgcctgtottctcctggtoctgcaocctgtaooccogcactgcootgctgatgcocgggaogtogtgggo fgggoococooofggaggál££Cgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcctctgtcgcacctcagcgc ggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcacacacgtgccacgnggc eaBEtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatcgaattcctttcttgcgctatgaca cttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgcttcgaccccccgaagctcctt cggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgcaaagacattatagcgag ctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatcgcactccgctaagggggcgc ctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacggcgcgccATGGCCACCACCTCCCTGGCCTCCGCCTTCTGCAGC ATGAAGGCCGTGATGCTGGCCCGCGACGGCCGCGGCATGAAGCCCCGCTCCAGCGACCTGCAGCTG CGCGCCGGCAACGCCCAG ACCT CCCT G AAG AT G AT CAACGGCACCAAGTT CTCCTACACCG AG AGCC TGAAGAAGCTGCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCTCCGCCGCCGAGAA GCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAACCCCCCCCAGCTGCTGGACGACCACTTCGG CCCCCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCAGCTACGAGGTGGGCCCCGACCGCTCC ACCAGCATCGTGGCCGTGATGAACCACCTGCAGGAGGCCGCCCTGAACCACGCCAAGTCCGTGGGC ATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGAAG CGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGGTGGAGTGCTGGGT GGGCGCCTCCGGCAACAACGGCCGCCGCCACGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGGCGAGAT CCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGATGATGAACACCCGCACCCGCCGCCTGAGCAAGATCCCC GAGGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTGAAGGACGAGGAGAT CAAGAAGCCCCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGCCTGACCCCCCGCTG GAACGACCTGGACATCAACCAGCACGTGAACAACATCAAGTACGTGGACTGGATCCTGGAGACCGT GCCCG ACAGCAT CTT CG AG AGCCACCACAT CTCCT CCTT CACCAT CG AGTACCGCCGCG AGT GCACC ATGGACAGCGTGCTGCAGTCCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCTCCTCCGAGGCCGGCCTGGTGTGC GAGCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCAAGACCGAGTGGCGCCCCAA GCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGTCCAGCGTGArGGAC7ACAAGGA CCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGATGA&CRaR gcagcagcagctcggatog tatcgacacactctggacgctgg tcg tg tgatggactg ttgccgccacacttgctgccttgacct g tg aa ta tc cc tg c cg c tttto tco a ac ag c c tco g tg tg tttg a tc ttg tg tg tac g cg c ttttg c g a g ttg c ta g c tg c ttg tg c t atttgcgaataccacccccogcatccccttccctcg tttcata tcgcttgcatcccoaccgcaactto tctacgctg tcctgcta tcc ctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacogccttggtttgggctccgcctgtottctcctggtactgcoacctgtoa a cc ag c ac tg caa tg c tg a tg cacg g gaag tag tg g go tg g gaacacaaa tg g aaag cti
SEQ ID NO: 124
C.reinhartii promotor de p-tubulina:: P.moriformis isopentenil difosfato sintasa PTS:: Cinnamomum camphora C14 tioesterasa:: C.vulgaris nitrato reductasa 3'UTR
ggtacccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgggcgcctgccgcctgcctg ccgcatgcttgtgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttcatcgggtggaagcttatgtgtgtgctggg cttgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcctccaggtggttcaatcgc ggcagccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtttgccagaatgatcggtt cagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggagtggaatgg caccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaacgtaaccatgagctga tcaacactgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgctgccggctgctgcctgct gcgcacgccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgtggtggataggatgcaa gtggagcgaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagggactggcc ccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgt cacea ggcccgcaagctttgcagaaccatgctcatggac gcatgtagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcggcggcagc agagcggcggcagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcccaaacgagttc acattcatttgcatgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcgggaccgccaggctagc agcaaaggcgcctcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggccggctgtttctttcgtgtt gcaaaacgcgccagctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgatcagctgattgcccggct cgcgaagtaggcgccctcctttctgctcgccctctctccgtcccgcctctagaatatcaATGATCGAGCAGGACGGCCTCC ACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCG GCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGA CCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGG CGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTG6TGACCGAGGCC6GCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCG AGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCG ACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCG CATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGC ACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACC TGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCT TCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACA TCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCG ACT CCCAGCG CAT CGCCTT CT ACCGCCTGCTGG ACG AGTTCTT CT GAcaattRRcoqcqqcoqcfcqqqfoqf atcgocococtctggocgctggtcgtg tgatggactg ttgccgccacacttgctgccttgacctg tgaato tccctgccgctttto t caoacagcctcogtgtgtttgatcttgtgtgtocgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaatoccocccccogc otccccttccctcgtttcatatcgcttgcotcccoaccgcaacttatctocgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgct cactgcccctcgcacogccttggtttgggctccgcctgtottctcctggtoctgcoocctgtaaaccagcoctgcoatgctgatgc ocgggoagtogfgggotgggoacococafggaggatcccgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcc tctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatecgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcac acacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatcgááüc ctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgctt cgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgatt gcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatc gcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacactagtATGACGTTCGGGGTCGCCCTC
CCGGCCATGGGCCGCGGTGTCTCCCTTCCCCGGCCCAGGGTCGCGGTGCGCGCCCAGTCGGCGAGT
CAGGTTTTGGAGAGCGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCT
CCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAACCCCCCCCAGCTGCTGG ACGACCACTTCGGCCCCCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCAGCTACGAGGTGGG
CCCCGACCGCTCCACCAGCATCGTGGCCGTGATGAACCACCTGCAGGAGGCCGCCCTGAACCACGC
CAAGTCCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGAT
CTGGGTGGTGAAGCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGG
TGGAGTGCTGGGTGGGCGCCTCCGGCAACAACGGCCGCCGCCACGACTTCCTGGTGCGCGACTGCA AGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGATGATGAACACCCGCACCCGCCGCCT
GAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTGA
AGGACGAGGAGATCAAGAAGCCCCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGC
CTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACATCAACCAGCACGTGAACAACATCAAGTACGTGGACTGG
AT CCTGG AG ACCGTGCCCG ACAGCAT CTTCG AG AGCCACCAC AT CT CCT CCTT CACCATCG AGTACCG
CCGCGAGTGCACCATGGACAGCGTGCTGCAGTCCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCTCCTCCGAGGC
CGGCCTGGTGTGCGAGCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCAAGACCG AGTGGCGCCCCAAGCT G ACCG ACTCCTT CCGCGGCAT CAGCGTG AT CCCCGCCG AG T CCAGCGTG A T GGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAA GTGATGActcgaggcagcagcagctcggatagtatcgacacoctctggocgctggtcgtgtgatggactgttgccgccaca cttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcoaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtocgcgcttttgcgogtt gctagctgcttgtgctatttgcgoataccacccccagcotccccttccctcgtttcatotcgcttgcatcccaaccgcaacttatcta cgctgtcctgctotccctcogcgctgctcctgctcctgctcoctgcccctcgcacagccttggmgggctccgcctgtattctcctgg tactgcoacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggoogtogtgggatgggoocacaaatggaadgctX
SEQ ID NO: 125
C.reinhartii S-tubulina promotor:: P.moriformis delta 12 ácido graso desaturasa PTS:: Cinnamomum camphora C14 tioesterasa:: C.vulgaris nitrato reductasa 3'UTR
ggtacccgcctgcaacgcaagggcagccacagccgctcccacccgccgctgaaccgacacgtgcttgggcgcctgccgcctgcctg ccgcatgcttg tgctggtgaggctgggcagtgctgccatgctgattgaggcttggttca tcgggtggaagctta tgtgtg tgctggg cttgcatgccgggcaatgcgcatggtggcaagagggcggcagcacttgctggagctgccgcggtgcctccaggtggttcaatcgc ggcagccagagggatttcagatgatcgcgcgtacaggttgagcagcagtgtcagcaaaggtagcagtttgccagaatgatcggtt cagctgttaatcaatgccagcaagagaaggggtcaagtgcaaacacgggcatgccacagcacgggcaccggggagtggaatgg caccaccaagtgtgtgcgagccagcatcgccgcctggctgtttcagctacaacggcaggagtcatccaacgtaaccatgagctga tcaacactgcaatcatcgggcgggcgtgatgcaagcatgcctggcgaagacacatggtgtgcggatgctgccggctgctgcctgct gcgcacgccgttgagttggcagcaggctcagccatgcactggatggcagctgggctgccactgcaatgtggtggataggatgcaa gtggagcgaataccaaaccctctggctgcttgctgggttgcatggcatcgcaccatcagcaggagcgcatgcgaagggactggcc ccatgcacgccatgccaaaccggagcgcaccgagtgtccacactgtcaccaggcccgcaagctttgcagaaccatgctcatggac gcatgtagcgctgacgtcccttgacggcgctcctctcgggtgtgggaaacgcaatgcagcacaggcagcagaggcggcggcagc agagcggcggcagcagcggcgggggccacccttcttgcggggtcgcgccccagccagcggtgatgcgctgatcccaaacgagttc acattcatttgcatgcctggagaagcgaggctggggcctttgggctggtgcagcccgcaatggaatgcgggaccgccaggctagc agcaaaggcgcctcccctactccgcatcgatgttccatagtgcattggactgcatttgggtggggcggccggctgtttctttcgtgtt gcaaaacgcgccagctcagcaacctgtcccgtgggtcccccgtgccgatgaaatcgtgtgcacgccgatcagctgattgcccggct cgcgaagtaggcgccctcctttctgctcgccctctctccgtcccgcctctagaatatcaATGATCGAGCAGGACGGCCTCC ACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCG GCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGA CCTGT CCGGCGCCCTG AACG AGCTGCAGG ACG AGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGG CGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCG AGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCG ACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCG CATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGC ACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACC TGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCT TCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACA TCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCG ACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGAcaattggcoocoQCQQCtcoQOfoQf otcgacacoctctggocgctggtcgtgtgotggactgttgccgccococttgctgccttgocctgtgaotatccctgccgcttttat caaacagcctcag tg tg tttgatc ttg tg tg tacgcgcttttgcgag ttgctagctgcttg tgcta tttgcgaotaccacccccagc atccccttccctcgtttcatotcgcttgcotcccaoccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgct cactgcccctcgcocogccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcoacctgtoaaccogcactgcaotgctgatgc ocgggoogfogígggoígggoococooofggaggatcccgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcc tctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcac acacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatcgaáiiS ctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgctt cgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgatt gcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatc gcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacactagtATGGCTATCAAGACGAACAG GCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTT CGAGCGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATC TTCTCCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAACCCCCCCCAGCTG CTGGACGACCACTTCGGCCCCCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCAGCTACGAGG TGGGCCCCGACCGCTCCACCAGCATCGTGGCCGTGATGAACCACCTGCAGGAGGCCGCCCTGAACC ACGCCAAGTCCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACC TGATCTGGGTGGTGAAGCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTG GAGGTGGAGTGCTGGGTGGGCGCCTCCGGCAACAACGGCCGCCGCCACGACTTCCTGGTGCGCGA CT GC AAG ACCGGCG AG AT CCTG ACCCGCTGCACCT CCCT G AGCGTG AT G ATG AACACCCGCACCCGC CGCCTGAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCC GTGAAGGACGAGGAGATCAAGAAGCCCCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGG CGGCCTG ACCCCCCGCT GG AACG ACCTGG ACAT C AACCAGCACGTG AACAACAT CAAGTACGTGG A CTGGATCCTGGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAGAGCCACCACATCTCCTCCTTCACCATCGAGT ACCGCCGCGAGTGCACCATGGACAGCGTGCTGCAGTCCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCTCCrCCG AGGCCGGCCTGGTGTGCGAGCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCAAG ACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGTCCAGC GJGATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGAC GACAAGTGATGAcicRaRRcaacaacaactcaaataa ta tcaacocactc taaacac iQ atC Q tataa taaacta ttacc gccocacttgctgccttgacctgtgaatotccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgotcttgtgtgtocgcgcttttg cgogttgctogctgcttgtgcta(ttgcgaatoccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcotcccaaccgcoact tatctocgctgtcctgctotccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattc tcctggtactgcoacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaogtagtgggatgggaacacaoatgga^gcxx
SEQ ID NO: 126
Constructo de recombinación homóloga SZ726
CCCGTGATCACACAGGTGCCTTGCGAGCGTGATCACACTATTTTGGGGGTCCrAC AGTACTGAAATGGTGAGAAGTCGTACTGAAATCAAGGATGAACAATGAAAATGG TGCTGTGGTGGCTTCTCAAAGGTCAAGAATCAGTCGCTCGCGTCAGGAAATCGCG GCGTCAACCAGCGTGGGCGCGGTCAGTGGCCCCGCACTGGTCACCATAGCCTCTC CTGCC AC AGT AGCG ATCCCCT GGGCGTTC ACTCTC AGC AGCGGCTGT ACTGCCTC CCAGATTTTCTTCTTCTGGACCTGCGGGCGTGAGAGGATGAGCAGGGTGGGGCCA AGGGCTCAATCCTGAACGGCCCICATTCGGTTTCCAATCCCACAACACATACCCA
c a g c a g g t c :ag.a c c a c g c a t t c g c a c c a t g c g c a c c a a a t a a c g t g t c c t t a c c t GATTGGGTGTGGCAGGCTCCGTGGACAGGAGTGCCTCGTCCCCCGCCCAGACCC GCTCCCCCGTCACGGCGGCGTCCGGGACCCGCAGCGGCTCCACCGCGGTGTGATC CGCGTTGGCGGCGCAGAGCAGCATCCCAGCCGATTTGACCCCGCGCATGCTCCG AGGCTTGAGGTTGGCCAGCACCACCACCCGCCGGCCGACAAGGTCCTCCAGGGT CACGTGCCGGACCAGGCCACTCACGATGGTGCGAGGGCCCCCCTCCTCGCCGAG GTCGATCTGCTCGACGTACAGACTGCGACATGCGTGGCGAGTGGTCATCAGAAG G A AGCAGGTGTGCAG A AGGGGCACGTGCiTTGGT ATTG AG AGT AGCC A A AGCTTT GTGCCAATCAGAAAGTCAACGCAGCTGCCTGCCTGGC1-CGCGTACAAITCCrrrC TTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCrGCGAGACGGCTTCCCG GCGCTGCATGCAACACCG ATG ATGC n CG ACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGC ATGGGCGCTCCG ATGCCGCTCC AGGGCG AGCGCTGTTT AAAT AGCC AGGCCCCC GATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCA CTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGA'rC:GCACTCCGCTAAGGGGGCG CCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCCíCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAG GCCrrCCrrCíTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCX'ATGACGA ACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGC1-CíCiATGA ACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACT
t c c a g t a c a a c c c g a a c :g a c a c c g t c t g c íg g g a c g c c c t t g t t c t g g g g c c a c g c CACGTCCGACGACCIGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAA GCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACrACAACAACACC TCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCrGCGTGGCCATCTGGA CCT AC A AC ACCCX-GG AGTCCX3 AGG AGC AGT AC ATCTCCT AC AGCCT GG ACGGCG GCTACACCrrCACCGAG'I'ACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCA GTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACC GCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTAC1-CCTCCGACGACCTGAAG TCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCITCCTCGGCTACCAGTACG AGTGCCCCGGCCTG ATCG AGGTCCCC ACCG AGCAGGACCCCAGC AAGTCCT ACT GGGTGATGTrCATC1-CCAlCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCA GTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCC CGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCn'CrrCAACACCG ACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACT CCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTC TCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAG GCCGAGCCGAICCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACC AACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACAGCACC GGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCA AGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGA GTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGG AACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAAC'CCCTACTTCACCAACCGCATGAGC GTGAACAACCAGCCrrrCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTAC GGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGT CCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGAC GACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAA GTGATT AATTAACTCGAGGCAGCAGC AGCTCGG AT AGTATCG ACACACTCTGGA CGCTGGTCGTGTGATGGACrG'n'GCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATA TCCC1-CíCCGCITrrA'rCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTT TTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTC CCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTüCTATC CCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCT CCGCCIG IA rrC ICCICíG IACTGCA ACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGC ACGGGA AGT AGTGGG ATGGG A ACACA AATGG A AAGCTTG AGCTCGGT ACCCGT A CCCATCAGCATCCGGGTGAATCTTGGCCTCCAAGATATGGCCAATCCTCACATCC AGCTTGGCAAAATCGACTAGACTGTCTGCAAGTGGGAATGTGGAGCACAAGGTT GCTTGTAGCGAICGACAGACTGGTGGGGTACATTGACAGGTGGGCAGCGCCGCA TCCATCGTGCCTGACGCGAGCGCCGCCGGTTGCTCGCCCGTGCCTGCCGTCAAAG AGCGGCAGAGAAATCGGGAACCGAAAACGTCACATTGCX.TGATG’n'GTTACATG CTGGACTAGACTTTCTTGGCGTGGGTCTGCTCCTCGCCAGGTGCGCGACGCCTCG GGGCTGGGTGCGAGGGAGCCGTGCGGCCACGCATTTGACAAGACCCAAAGCTCG CATCTCAG ACGGTCAACCGTTCGT ATT AT ACATTCA ACAT ATGGT AC AT ACGCAA AAAGCATG
SEQ ID NO: 127
P.moriformis isopentenil difosfato sintasa secuencia de selección de plastidios MTFGVALPAMGRGVSLPRPRVAVRAQSASQVLESGRAQL
SEQ ID NO: 128
P.moriformis delta 12 secuencia de direccionamiento de plastidios desaturasa de ácidos grasos MAIKTNRQPVEKPPFTIGTLRKAIPAHCFERSALRGRAQL
SEQ ID NO: 129
P.moriformis estearoil ACP desaturasa secuencia de selección de plastidios MASAAFTMSACPAMTGRAPGARRSGRPVATRLRGRA
SEQ ID NO: 130
C.protothecoides estearoil ACP desaturasa secuencia de selección de plastidios MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRAQL
SEQ ID NO: 131
Secuencia de direccionamiento de plastidios de tioesterasa de acil-ACP grasasa Cuphea hookeriana (C8-10)
MVAAAASSAFFPVPAPGASPKPGKFGNWPSSLSPSFKPKSIPNGGFQVKANDSAMPK ANGSAVSLKSGSLNTQEDTSSSPPPRTFLH
SEQ ID NO: 132
Umbellularia californica secuencia de direccionamiento de plastidio de tioesterasa de acil-ACP grasa (C12)
MATrSLASAFCSMKAVMLARDGRGMKPRSSDLQI.RAGNAPTSLKMINGTKFSYTES LKRL
SEQ ID NO: 133
Cinnamomum camphora tioesterasa de acil-ACP grasa (C14) secuencia de selección de plastidios
MATTSLASAFCSMKAVMLARDGRGMKPRSSDLQLRAGNAQTSLKM1NGTKFSYTES LKKI.
SEQ ID NO: 134
Secuencia de cDNA de P.moriformis tioesterasa de acil-ACP grasa-1
ATGGCACCGACCAGCCTGCTTGCCAGTACTGGCGTCTCTTCCGCTTCTCTGTGGTC CTCTGCGCGCTCCAGCGCGTGCGCTTTTCCGGTGGATCATGCGGTCCGTGGCGCA CCGCAGCGGCCGCTGCCCATGCAGCGCCGCTGCTTCCGAACAGTGGCGGTCAGG GCCGCACCCGCGGTAGCCGTCCGTCCGGAACCCGCCCAAGAGTTTTGGGAGCAG CTTGAGCCCTGCAAGATGGCGGAGGACAAGCGCATCTTCCTGGAGGAGCACCGC AITCGGGGCAACGAGGTGGGCCCCTCGCAGCGGCTGACGATCACGGCGGTGGCC AACATCCTGCAGGAGGCGGCGGGCAACCACGCGGTGGCCATGTGGGGCCGGAGC TCGGAGGGTTTCGCGACGGACCCGGAGCTGCAGGAGGCGGGTCTCATCTTTGTG AIGACGCGCATGCAGATCCAAATGTACCGCTACCCGCGCTGGGGCGACCTGATG CAGGTGGAGACCTGGTTCCAGACGGCGGGCAAGCTAGGCGCGCAGCGCGAGTGG GTGCTGCGCGACAAGCTGACCGGCGAGGCGCTGGGCGCGGCCACCTCCAGCTGG GTCATGATCAACATCCGCACGCGCCGGCCGTGCCGCATGCCCGAGCTCGTCCGCG TCAAGTCGGCCn’CrrCGCGCGCGAGCCGCCGCGCCTGGCGCTGCCGCCCACGGT CACGCGCGCCAAGCTGCCCAACATCGCGACGCCGGCGCCGCTGCGCGGGCACCG CCAGGTCGCGCGCCGCACCGACATGGACATGAACGGGCACGTGAACAACGTGGC CTACCTGGCCTGGTGCCTGGAGGCCGTGCCCGAGCACGTCTTCAGCGACTACCAC CTCTACCAGATGGAGATCGACTTCAAGGCCGAGTGCCACGCGGGCGACGTCATC TCCTCCCAGGCCGAGCAGATCCCGCCCCAGGAGGCGCTCACGCACAACGGCGCC GGCCGCAACCCCTCCTGCTTCGTCCATAGCATTCTGCGCGCCGAGACCGAGCTCG TCCGCGCGCGAACCACATGGTCGGCCCCCATCGACGCGCCCGCCGCCAAGCCGC CCAAGGCGAGCCACTGA
SEQ ID NO: 135
Secuencia de ADNc de P.moriformis tioesterasa de acil-ACP grasa-2
AIXiGCACCGACCAGCCTGCTTGCCCGTACTGGCGTCTCTTCCGCTTCTCTGTGCTC C r CT ACGCGCTCCGGCGCGT GCGCTTTT CCGGTGG ATC AT GCGGTCCGTGGCGC A
CCGCAGCGGCCGCTGCCCATGCAGCGCCGCTGCTTCCGAACAGTGGCTGTCAGG
GCCGCACCCGCAGTAGCCGTCCGTCCGGAACCCGCCCAAGAGTTTTGGGAGCAG
CTTGAGCCCTGCAAGATGGCGGAGGACAAGCGCATCTTCCTGGAGGAGCACCGC ATTCGTGGCAACGAGGTGGGCCCCTCGCAGCGGCTGACGATCACGGCGGTGGCC
a a c a 'Ic:c ig c :a g g a g c k :g g c g g g c a a c c a c :g c g g t g g c c a t g t g g g g t c g g a g c
TCGGAGGGTTTCGCGACGGACCCGGAGCTGCAGGAGGCGGGCCTCATCTTTGTG ATGACGCGCATGCAGATCCAAATGTACCGCTACCCGCGCTGGGGCGACCTGATG CAGGTGGAGACCTGGTTCCAGACGGCGGGCAAGCTAGGCGCGCAGCGCGAGTGG GTGCTGCGCGACAAGCTGACCGGCGAGGCGCTGGGCGCGGCCACCTCCAGCTGG GTCATGATCAACATCCGCACGCGCCGGCCGTGCCGCATGCCCGAGCTCGTCCGCG TCAAGTCGGCCITCITCGCGCGCGAGCCGCCGCGCCTGGCGCTGCCGCCCGCGGT CACGCGTGCCAAGCTGCCCAACATCGCGACGCCGGCGCCGCTGCGCGGGCACCG CCAGGTCGCGCGCCGCACCGACATGGACATGAACGGCCACGTGAACAACGTTGC CTACCTGGCCTGGTGCCTGGAGGCCGTGCCCGAGCACG'rCrrCAGCGACTACCAC CTCTACCAGATGGAGATCGACTTCAAGGCCGAGTGCCACGCGGGCGACGTCATC TCCTCCCAGGCCGAGCAGA'I’CCCGCCCCAGGAGGCGCTCACGCACAACGGCGCC GGCCGCAACCCCTCCTGCTTCGTCCATAGCATTCTGCGCGCCGAGACCGAGCTCG TCCGCGCGCGAACCACATGGTCGGCCCCCATCGACGCGCCCGCCGCCAAGCCGC CCAAGGCGAGCCACTGA
SEQ ID NO: 136
Secuencia de aminoácidos de P.moriformis tioesterasa de acil-ACP grasa-1
MAPTSLLASTGVSSASLWSSARSSACAFPVDHAVRGAPQRPLPMQRRCFRTVAVRA APAVAVRPEPAQEFWEQLEPCKMAEDKRIFLEEHRIRGNEVGPSQRLTITAVANILQE AAGNHAVAMWGRSSEGFATDPELQEAGLIFVMTRY1QIQMYRYPRWGDI.MQVKTW FQTAG KLG AQREW VLR DKLTGEALGA ATSSW VMINIRTRRPCRMPELVRVKS AFFA REPPRLALPPTVTRAKLPNIATPAPLRGHRQVARRTDMDMNGHVNNVAYLAWCLE AVPEHVFSDYHLYQMEIDFKAECHAGDVISSQAEQIPPQEALTHNGAGRNPSCFVHSI LRAETELVRARTTWSAPIDAPAAKPPKASH
SEQ ID NO: 137
Secuencia de aminoácidos de P.moriformis tioesterasa de acil-ACP grasa-2
MAPTSLLARTGVSSASLCSSTRSGACAFPVDHAVRGAPQRPLPMQRRCFRTVAVRA APAVAVRPhl’AQFFAVHQI-hl’CKMAEDKRIFLEEHRIRGNEVGPSQRLTITAVANILQE AAGNHAVAMWGRSSEGFATDPELQEAGLIFVMTR.Y1QIQMYRYPRWGDLMQVETW FQTAGKLGAQREWVLRDKLTGEALGAATSSWVMLNIRTRRPCRMPELVRVKSAFFA REPPRLAL.PPAVTRAKLPNIATPAP1.RGHROVARRTDMDMNGHVNNVAYLAWCI.H AVPEHVFSDYHLYQMEIDFKAE£HAGDVlSSQAEQIPPQKAi;iHNGAGRNPSCFVHSI LRAETELVRARTTWSAPIDAPAAKPPKASH
SEQ ID NO: 138
Secuencia de aminoácidos de la tioesterasa de acil-ACP grasa C.hookeriana sin PTS
QLPDWSRI.LTAnTVFVKSKRPD.VIHDRKSKRPDMLVDSFGLESTVQDGLVFRQSFSI RSYHIGTDRTASlhTLMNHI.QhTSLNHCKSTGlLLDGFGRTLEMCKRDLIWVVIKMQI KVNRYPAWGDTVEINTRFSRLGKIGMGRDWLISDCNTGEILVRATSAYAMMNQKTR RLSKLPYEVHQEIVPLFVDSPVIEDSDLKVHKFKVKTGDSIQKGLTPGWNDLDVNQH VSN V K YIGWILESMPTEVLETQELCSLALEYRRECGRDS VLESVTAMDPSKVGVRSQ YQHI.I RLFDGTAIVNGATEWRPKNAGANGA1STGKTSNGNSVS
SEQ ID NO: 139
Secuencia de aminoácidos de tioesterasa de acil-ACP grasa U.californica sin PTS
PDWS.MLFAVnTIFSAAEKQWTNLEWKPKPKLPQLLDDHFGLHGLVFRRTFAIRSYE VGPDRSTSILAVMNHMQEATLNHAKSVGII.GDGFGTTLEMSKRDLMWVVRRTHVA VERYPTWGDTVEVECWIGASGNNGMRRDFLVRDCKTGEILTRCTSLSVLMNTRTRR LSTIPDEVRGEIGPAFIDNVAVKDDHIKKLQKLNDSTADYIQGGLTPRWNDLDVNQH VNNLKYVAWVFETVPDSIFESHHISSFTLEYRRECTRDSVLRSLTTVSGGSSEAGLVC DHLLQLHGGSEVLRARTEWRPKLTDSFRGISVIPAEPRV
SEQ ID NO: 140
Secuencia de aminoácidos de tioesterasa de acil-ACP grasa Cinnamomum camphora sin STP
PDWSMLFAVrTTIFSAAEKQWTNLEWKPKPNPPQLI.DDHFGPHGLVFRRTFAlRSYE VGPDRSTSIVAVMNHLQEAALNHAKSVGILGDGFGTTLEMSKRDLIWVVKRTHVAV ERYPAWGDTVEVECWVGASGNNGRRHDFLVRDCKTGEILTRCTSLSVMMNTRTRR LSK1PEEVRGHIGPAF1DNVAVKDEEIKKPQKLNDSTADYIQGGLTPRWNDLDINQIIV NNIKYVDWILETVPDSIFESHHISSFTIEYRRECTMDSVLQSLTTVSGGSSEAGLVCKH LLOI.FGGSFVLRAKTFWRPKLTDSFRGISVIPAESSVMDYKDHDGDYKDHDIDYKD DDDK

Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Una composición de aceite de triglicéridos producida cultivando una población de células de Prototheca recombinantes y extraída de dichas células mediante extracción con solvente o usando una prensa de expulsión, en donde las células comprenden un gen exógeno que codifica una tioesterasa de acil-ACP grasa, en donde la composición de aceite comprende un perfil lipídico de:
(a) al menos 4% C8-C14; y
(b) uno o más de los siguientes atributos:
i. 0,1-0,4 microgramos/ml de carotenoides totales;
ii. menos de 0,4 microgramos/ml de carotenoides totales;
iii menos de 0,001 microgramos/ml de licopeno; y
iv. menos de 0,02 microgramos/ml de betacaroteno.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde las células se cultivan en presencia de una fuente de carbono fija seleccionada del grupo que consiste en sacarosa, glucosa, fructosa, jugo de caña y material celulósico despolimerizado, en donde dicho material celulósico es opcionalmente pulpa de remolacha azucarera.
3. La composición de la reivindicación 1, en donde las células comprenden además un gen exógeno que codifica una invertasa de sacarosa.
4. La composición de la reivindicación 3, en donde las células se cultivan en presencia de sacarosa.
5. La composición de la reivindicación 4, en donde las células se cultivan en presencia de sacarosa obtenida de sorgo, caña de azúcar o remolacha azucarera.
6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que las células tienen un ARNr 23S que comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad de nucleótidos con las secuencias de nucleótidos de una o más de las SEQ ID NO: 11-19.
7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el gen exógeno o los genes exógenos están optimizados con codones para la expresión en Prototheca.
8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que las células se seleccionan del grupo que consiste en Prototheca moriformis, Prototheca krugani, Prototheca stagnora, Prototheca wickerhamii y Prototheca zopfii.
9. La composición de la reivindicación 8, en donde las células son Prototheca moriformis.
10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el gen exógeno comprende además una secuencia dirigida a plastidios de microalgas.
11. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el gen exógeno que codifica la grasa-acil-ACP-tioesterasa es un codón optimizado para la expresión en Prototheca, en donde la secuencia codificante del gen exógeno contiene el codón más o el segundo más preferido de la Tabla 1 para al menos el 60% de los codones de la secuencia codificante.
12. Un método para preparar un aceite mezclado mezclando la composición de aceite de triglicéridos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 con un aceite seleccionado del grupo que consiste en aceite de soja, aceite de colza, aceite de canola, aceite de palma, aceite de almendra de palma, aceite de coco, maíz. aceite, aceite vegetal de desecho, aceite de sebo chino, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de semilla de algodón, grasa de pollo, sebo de res, sebo porcino, aceite de microalgas, aceite de macroalgas, aceite de Cuphea, aceite de lino, aceite de maní, grasa blanca, manteca de cerdo, Aceite de camelina sativa, aceite de semilla de mostaza, aceite de anacardo, aceite de avena, aceite de lupino, aceite de kenaf, aceite de caléndula, aceite de cáñamo, aceite de café, aceite de linaza (lino), aceite de avellana, aceite de euforbio, aceite de semilla de calabaza, aceite de cilantro, camelina aceite, aceite de sésamo, aceite de cártamo, aceite de arroz, aceite de árbol de tung, aceite de cacao, aceite de copra, aceite de adormidera, aceite de ricino, aceite de nuez, aceite de jojoba, aceite de jatropha, aceite de macadamia, aceite de nuez de Brasil, aceite de aguacate, petróleo y una fracción destilada de los mismos.
13. Un método para fabricar un compuesto químico, que comprende las etapas de realizar una o más reacciones químicas seleccionadas del grupo que consiste en (a) transesterificación, hidrogenación, hidrocraqueo, desoxigenación, isomerización, interesterificación, hidroxilación, hidrólisis para producir grasa libre ácidos y saponificación, en la composición de aceite de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o (b) hidroprocesamiento, desoxigenación y eliminación de gases en la composición de aceite de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
14. Un método para fabricar un compuesto químico, comprendiendo el método los pasos de
(i) mezclar la composición de aceite de triglicéridos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 con un aceite seleccionado del grupo que consiste en aceite de soja, aceite de colza, aceite de canola, aceite de palma, aceite de almendra de palma, aceite de coco, aceite de maíz, aceite vegetal residual, sebo chino aceite, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de semilla de algodón, grasa de pollo, sebo de ternera, sebo porcino, aceite de microalgas, aceite de macroalgas, aceite de Cuphea, aceite de lino, aceite de maní, grasa blanca de elección, manteca de cerdo, aceite de camelina sativa, aceite de semilla de mostaza, aceite de anacardo, aceite de avena, aceite de lupino, aceite de kenaf, aceite de caléndula, aceite de cáñamo, aceite de café, aceite de linaza (lino), aceite de avellana, aceite de euforbio, aceite de semilla de calabaza, aceite de cilantro, aceite de camelina, aceite de sésamo, aceite de cártamo, aceite de arroz, aceite de árbol de tung, aceite de cacao, aceite de copra, aceite de adormidera, aceite de ricino, aceite de nuez, aceite de jojoba, aceite de jatropha, aceite de macadamia, aceite de nuez de Brasil, aceite de aguacate, petróleo y una fracción de destilado de los mismos; y
(ii) realizar una o más reacciones químicas seleccionadas del grupo que consiste en (a) transesterificación, hidrogenación, hidrocraqueo, desoxigenación, isomerización, interesterificación, hidroxilación, hidrólisis para producir ácidos grasos libres y saponificación, en la composición de aceite obtenida en (i), o (b) hidroprocesamiento, desoxigenación y eliminación de gas en la composición de aceite obtenida en (i).
15. El método de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que la una o más reacciones químicas se seleccionan de hidrogenación, hidrocraqueo y desoxigenación.
16. El método de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que en uno o más reacciones químicas inhiben la hidrólisis para producir ácidos grasos libres.
17. El método de la reivindicación 16, en el que la reacción de hidrólisis de la composición de aceite se selecciona del grupo que consiste en hidrólisis ácida, hidrólisis alcalina, hidrólisis enzimática, hidrólisis catalítica e hidrólisis de agua comprimida en caliente, que incluye una reacción de hidrólisis catalítica en la que el aceite es dividido en glicerol y ácidos grasos.
18. El método de la reivindicación 16, en el que dichos ácidos grasos se someten a una reacción química adicional seleccionada del grupo que consiste en aminación y ozonólisis.
19. El método de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en donde la una o más reacciones químicas es el hidroprocesamiento.
20. El método de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en donde la una o más reacciones químicas es la desoxigenación.
21. El método de la reivindicación 16, en el que en la reacción de desoxigenación se selecciona del grupo que consiste en hidrogenólisis, hidrogenación, hidrogenación consecutiva-lisis de hidrógeno, hidrólisis-lisis consecutivahidrogenación e hidrogenación combinada de hidrogenólisis.
22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21, en el que se realiza una reacción de condensación antes de, simultáneamente con, o posteriormente a dicha reacción química.
23. El método de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que la una o más reacciones químicas es la transesterificación.
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