KR101849367B1 - 지질이 풍부한 미세조류 가루 식품 조성물 - Google Patents

지질이 풍부한 미세조류 가루 식품 조성물 Download PDF

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다나 즈다니스
레스리 엠. 노리스
왈트 라키트스키
비타 크람크진스카
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솔라자임, 로케트 뉴트리셔널스, 엘엘씨
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Abstract

조류의 가루 또는 조류의 바이오매스를 개시한다. 지질 함량이 높은 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루를 포함하는 식품 조성물을 개시한다.

Description

지질이 풍부한 미세조류 가루 식품 조성물{LIPID-RICH MICROALGAL FLOUR FOOD COMPOSITIONS}
서열 목록에 대한 언급
본 출원은 발명의 상세한 설명의 끝에 첨부된 서열 목록을 포함한다.
발명의 분야
본 발명은 미생물, 식품 조제물, 및 인간과 동물 영양소 분야에 속한다.
인구가 지속적으로 증가하기 때문에, 부가적인 식품 공급원 (source), 특히 저렴하게 생산할 수 있지만 영양가 있는 식품 공급원에 대한 요구는 커지고 있다. 더우기, 적어도 대부분의 선진국에서 많은 식단의 기본 식품으로써 육류에 대한 현재 의존도는 온난화 가스의 방출에 있어서 상당한 원인이 되며, 생산하는 것이 환경에 덜 유해하면서 맛과 영양에 있어서 균등한 새로운 식재료가 필요하다.
성장하기 위하여 오로지 “물과 햇빛”만을 필요로 하기 때문에 조류(algae)는 잠재적인 식품의 공급원으로 오랫동안 주목을 받아왔었다. 특정 유형의 조류, 주로 해초(seaweed)는 인간 소비용으로 중요한 식재료를 제공하였지만, 식재료로써 조류의 전망은 실현되지 못하였다. 야외 못 또는 광생물반응기에서 광합성에 의해 성장한 조류로 만든 조류의 분말은 시판되지만 (클로로필로부터 유래한) 짙은 녹색을 띄고, 강하고 불쾌한 맛을 가지고 있다. 식품 또는 영양 보충제로 조제하였을 때, 이러한 조류의 분말은 식품 또는 영양 보충제에 시각적으로 끌리지 않는 녹색을 부여하고 불쾌한 비린내 또는 해초 향을 띄게 만는다.
현재 식재료로 이용되는 몇 가지 종류의 조류들이 있는데, 대부분은 켈프(kelp), 김(purple laver) (Porphyra, 말려눌린 해초에 이용됨), 덜스(dulse) (Palmaria palmate) 및 파래 (Ulva lactuca)와 같은 해조류이다. 스피루니아 (Arthrospira platensis)와 같은 미세조류는 영양 보충제로 이용하거나 스무디 또는 쥬스 음료에 소량(보통 0.5% w/w 미만)으로 첨가하기 위하여 개방 연못(광합성적으로)에서 상업적으로 키운다. 몇몇 종류의 클로레라를 포함한 기타 미세조류는 아시아 국가들에서 영양 보충제로 인기있다.
이들 제품에 추가하여, 도코사헥사논산 (DHA) 함량이 높은 조류 오일은 유아식의 성분으로 이용된다. DHA는 불포화결합이 상당히 많은 오일이다. DHA는 항-염증 성질을 보유하며, 잘 알려진 보충제일 뿐 아니라 식재료의 조제에 이용되는 첨가제다. 그러나 DHA는 열 처리에 의해 산화되기 때문에 조리된 식품에 적합하지 않다. 또한, DHA는 항산화제 존재하에 실온에서 조차도 산소에 노출되면 불안정하다. DHA의 산화는 비린내 및 불쾌한 향이 나게 한다.
조류로부터 식재료, 특히 맛있고, 영양이 되는 식재료를 대규모로, 저렴하고 효과적으로 만드는 방법에 대한 요구가 남아있다. 본 발명은 이러한 요구들을 충족시킨다.
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본 발명의 요약
지질 함량이 높은 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스를 포함하는 식품 조성물을 개시한다. 지질 함량이 높은 또는 단백질 함량이 높은 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스를 포함하는 식품 조성물을 또한 개시한다. 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스 및 지방을 제거한 바이오매스의 식품 조성물을 또한 개시한다.
제 1 측면에서, 본 발명은 20 건중량% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함하는 대부분 또는 완벽하게 용해된 세포들을 포함하는 미세조류의 바이오매스의 균질물인 조류의 가루, (b) 적어도 하나의 추가적인 식용 성분, 및 임의 선택적으로 적어도 하나의 추가 성분, 및 (c) 가스를 포함하는 식품 조성물에 관한 것으로, 여기서 조류의 가루와 적어도 하나의 추가 식용 성분은 연속 상(phase)을 포함하며, 이 가스는 불연속 상을 포함하며, 식품에서 가스에 의한 용적 백분율은 1% 내지 50%이다. 일부 경우들에서, 식품에서 가스에 의한 용적 백분율은 약 10% 내지 약 60%이다. 일부 경우들에서, 이 가스는 공기이다. 일부 경우들에서, 가스에 의한 식품의 용적 백분율은 10% 내지 50%이다. 일부 구체예들에서, 이 식품은 냉동 식품이다. 일부 경우들에서, 이 연속 상은 약 0 내지 약 30 중량%의 당, 또는 다른 천연 또는 인공 감미제를 포함한다.
일부 구체예들에서, 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 20 건중량% 내지 70 건중량%의 트리글리세리드 오일을 포함한다. 일부 경우들에서, 트리글리세리드 오일의 60%-75%는 글리세로리피드 형태의 18:1 지질이다. 일부 구체예들에서, 이 트리글리세리드 오일은 (a) 2% 미만의 14:0, (b) 13-16%의 16:0, (c) 1-4%의 18:0, (d) 64-70%의 18:1, (e) 10-16%의 18:2, (f) 0.5-2.5%의 18:3, 또는 (g) 2% 미만의 탄소쇄 길이가 20 또는 그 초과인 오일이다.
일부 구체예들에서, 이 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 5%-70% 건중량의 탄수화물이다. 일부 경우들에서, 이 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 25%-40 건중량%의 탄수화물이다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스의 탄수화물 성분은 약 25%-70 건중량%, 임의 선택적으로 25%-35 건중량%의 식이섬유와 약 2%-10 건중량%, 임의 선택적으로 2%-8 건중량%의 슈크로즈를 포함하는 유리당(free sugar)이다. 일부 구체예들에서, 이 바이오매스의 식이섬유 성분의 단당류 조성물은 (a) 3-17%의 아라비노즈, (b) 7-43%의 만노즈, (c) 18-77%의 갈락토즈, 및 (d) 11-60%의 글루코오즈이다. 일부 구체예들에서, 이 바이오매스의 식이섬유 성분의 단당류 조성물은 (a) 0.1-4%의 아라비노즈, (b) 5-15%의 만노즈, (c) 15-35%의 갈락토즈, 및 (d) 50-70%의 글루코오즈이다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스 또는 조류의 가루는 미세조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 20-70 ㎍의 루테인을 포함하는 미세조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 약 0㎍ 내지 약 115 ㎍의 총 카로티노이드를 보유한다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스 또는 조류의 가루는 미세조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 10 ㎍ 미만 또는 20 ㎍ 미만의 총 카로티노이드를 보유한다. 일부 구체예들에서, 이 바이오매스의 클로로필 함량은 500 ppm 미만이다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스 또는 조류의 가루 내의 오일은 미세조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 100 g 당 2-6 ㎎ 알파 토코페롤을 포함하는, 미세조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 100 g 당 1-8 ㎎의 총 토코페롤을 보유한다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스 또는 조류의 가루는 미세조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 0.10-0.25㎎의 알파 토코트리에놀을 포함한, 미세조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 약 0.05-0.30㎎의 총 토코트리에놀을 보유한다.
일부 구체예들에서, 이 바이오매스는 클로레라 속(genus)의 종인 조류로부터 유래된다. 일부 경우들에서, 이 조류는 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)이다. 일부 구체예들에서, 이 바이오매스는 이것이 유도된 균주와 비교하여 감소된 착색을 가진 색 돌연변이체인 조류로부터 유도된다.
일부 구체예들에서, 이 조류의 바이오매스 및 조류의 가루는 우수 제조 관리 기준 (GMP) 조건하에서 배양되고, 처리된 조류로부터 유도된다.
일부 경우들에서, 적어도 하나의 추가적인 식용 성분은 당, 물, 우유, 크림, 과일 쥬스, 과일 쥬스 농축물, 온전한 계란, 계란 흰자, 곡물 및 동물 지방 또는 기타 지방으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 경우들에서, 이 조성물은 아이스크림, 젤라토, 샤벗, 무스, 치즈크림, 커스터드, 머랭, 고기파이, 구운 것들, 무스, 거품을 낸 유제품 토핑들, 냉동 요거트, 거품을 낸 필링 및 소스로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
제 2 측면에서, 본 발명은 (a) 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스, 물 및 적어도 하나의 기타 식용 성분을 혼합하여, 분산물을 만드는 단계로서, 이 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 약 0.5% 내지 약 10% w/w의 분산물을 포함하는 단계, 및 (b) 가스를 이 분산물에 통합시켜 안정적인 불연속 상 가스 버블을 만들고, 이에 의해 통성(aerated) 식품을 만드는 단계에 의해 통성 식품을 만드는 방법에 관한 것이다. 이 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 2.5%, 또는 약 0.5% 내지 약 1%의 분산물을 포함할 수 있다.
제 3 측면에서, 본 발명은 가루로 빻은 또는 다진 고기, 및 적어도 약 0.5% w/w 조류의 가루의 매트릭스를 포함하는 육가공품에 관한 것인데, 이때 조류 가루는 적어도 약 20 건중량%의 트리글리세리드 오일을 포함하는, (대부분 또는 완벽하게) 용해된 세포들을 함유하는 미세조류의 바이오매스 균질물이며, 여기에서 고기와 조류의 가루는 이 매트릭스에 균질하게 분산된다.
일부 구체예들에서, 이 고기는 10% 이하의 동물 지방, 또는 30% 이하의 동물 지방을 함유한다. 일부 경우들에서, 이 고기는 7% 이하의 동물 지방을 함유한다. 일부 경우들에서, 이 고기는 3% 이하의 동물 지방 또는 약 1% 이하의 동물 지방을 함유한다. 일부 구체예들에서, 이 육가공품은 약 0.5% 내지 약 2.5% w/w 조류의 가루, 또는 약 0.5% 내지 약 10% w/w의 조류의 가루를 함유한다. 일부 경우들에서, 이 조류의 가루는 약 20-60% 또는 25%-70 건중량%의 조류의 오일을 함유한다. 일부 경우들에서, 이 조류의 가루는 클로레라 속의 미세조류로 만든다. 일부 경우들에서, 이 조류의 가루는 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 종의 미세조류로 만든다. 일부 구체예들에서, 이 육가공품은 연육(comminuted) 고기다. 일부 경우들에서, 이 육가공품은 개량육(reformed meat)이다. 일부 구체예들에서, 이 조류의 가루는 관찰되는 녹색 또는 노란색이 없다. 일부 경우들에서, 이 조류의 가루는 500ppm 미만의 클로로필을 보유한다. 일부 구체예들에서, 이 고기는 소, 유럽들소, 새끼양(lamb), 양고기(mutton), 양(sheep), 사슴고기, 물고기, 닭, 돼지고기, 햄 및 칠면조로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
제 4 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 유제품 성분, 및 조류의 가루를 포함하는 유제품 식품 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 조류의 가루는 적어도 약 20 건중량%의 트리글리세리드 오일을 포함하는 대부분 또는 완벽하게 용해된 세포들을 함유하는 미세조류의 바이오매스 균질물이며, 여기에서 상기 식품에서 지방의 약 0.1% 내지 약 100%, 바람직하게는 10% 내지 100%, 15% 내지 95%, 20% 내지 90%, 25% 내지 85%, 30% 내지 80%, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 대략 10%, 대략 20%, 대략 30%, 대략 40%, 대략 50%, 대략 60%, 대략 70%, 대략 80%, 대략 90%, 및 대략 100%는 이 조류의 가루에 의해 제공된다. 일부 경우들에서, 이 유제품 식품 조성물은 치즈, 우유, 탈지유, 크림, 버터, 스프레드 및 요거트로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
추가 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 비-유제품 성분, 및 적어도 20 건중량%의 트리글리세리드 오일을 포함하는 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스를 포함하는 비-유제품 식품 조성물에 관한 것이며, 여기에서 비-유제품 식품 조성물에서 지방의 10% 내지 100%, 15% 내지 95%, 20% 내지 90%, 25% 내지 85%, 30% 내지 80%, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 대략 10%, 대략 20%, 대략 30%, 대략 40%, 대략 50%, 대략 60%, 대략 70%, 대략 80%, 대략 90%, 및 대략 100%는 이 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스에 의해 제공된다. 비-유제품 성분은 예를 들면 콩, 나무 너트, 콩과식물 꼬투리(legumes), 곡물, 과일, 야채, 및 이와 유사한 것들을 포함하는 비-유제품 공급원으로부터 유도된 성분이다. 일부 경우들에서, 이 식품 조성물은 마가린, 두유, 아몬드 우유, 대마 우유, 쌀 우유, 비-유제품 냉동 디저트, 비-유제품 커피크림, 타피오카 함유 식품, 비-유제품 치즈 및 비-유제품 요거트로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 약 10 건중량% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함하는 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스를 제공한다. 이 조류의 가루와 조류의 바이오매스는 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 약 0 ㎍ 내지 약 115 ㎍의 총 카로티노이드, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 100 g 당 약 1 ㎎ 내지 약 8 ㎎의 토코페롤, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 약 0.05 ㎎ 내지 약 0.30 ㎎의 총 토코트리에놀 및 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 약 0.1 ㎎ 내지 약 10 ㎎의 인지질로 구성된 군에서 선택된 화합물들을 추가로 포함하고, 바람직하게는 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스 g 당 약 0.25% 내지 약 1.5%를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 식품 조성물의 식감(mouth feeling)을 개선시키는 방법을 제공한다. 이 식품 조성물의 식감은 이 식품 조성물에 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스를 추가하여 개선시킨다. 이 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 약 20 건중량% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함한다.
일부 경우들에서, 식품 조성물의 식감을 개선시키는 방법은 a) 식품 조성물을 제공하는 단계; 및 b) 약 20 건중량% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함하는 조류 가루의 지정된 양을 상기 식품 조성물에 추가하는 단계를 포함한다. 일부 경우들에서, 이 조류의 가루는 약 40wt% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함한다. 일부 경우들에서, 이 조류의 가루는 상기 식품 조성물의 약 0.1% 내지 약 20% w/w로 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 식품 조성물의 식감을 개선시키는 방법을 제공한다. 이 식품 조성물의 식감은 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스와 우유, 카제인, 유장 또는 콩을 이 식품 조성물에 추가함으로써 개선된다. 이 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 약 20 건중량% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함한다.
일부 경우들에서, 식품 조성물의 식감을 개선시키는 방법은 a) 우유, 콩, 카제인 또는 유장을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 단계; 및 b) 약 10 건중량% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함하는 지정된 양의 조류 가루를 상기 식품 조성물에 추가하는 단계를 포함한다. 일부 경우들에서, 이 조류의 가루는 약 40wt% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함한다. 일부 경우들에서, 이 조류의 가루는 상기 식품 조성물의 약 0.1% 내지 약 20% w/w로 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 식품 조성물의 유지 기간을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 식품 조성물의 유지 기간은 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스를 이 식품 조성물에 추가함으로써 개선된다. 이 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 약 20 건중량% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함한다.
일부 경우들에서, 식품 조성물의 유지 기간을 개선시키는 방법은 a) 식품 조성물을 제공하는 단계; 및 b) 약 20 건중량% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함하는 지정된 양의 조류 가루를 상기 식품 조성물에 추가하는 단계를 포함한다. 일부 경우들에서, 이 조류의 가루는 약 40wt% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함한다. 일부 경우들에서, 이 조류의 가루는 상기 식품 조성물의 약 0.1% 내지 약 20% w/w로 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 적어도 하나의 비-유제품 성분; 및 (b) 적어도 20 건중량%의 트리글리세리드 오일을 포함하는 조류 가루를 포함하는 비-유제품 조성물을 제공하고, 여기에서 상기 식품내 지방의 약 0.1% 내지 약 100%는 이 조류의 가루에 의해 제공된다. 일부 경우들에서, 비-유제품 성분은 콩, 아몬드, 대마, 쌀 및 귀리로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 경우들에서, 비-유제품 조성물은 마가린, 두유, 아몬드 우유, 대마 우유, 쌀 우유, 비-유제품 냉동 디저트, 비-유제품 커피크림, 비-유제품 치즈 및 비-유제품 요거트로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 조류의 가루 입자를 포함하는 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스 입자를 포함하는 조류의 바이오매스를 제공하는데, 상기 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 각각 약 10 건중량% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함하며, 여기에서 상기 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스의 g 당 약 0 ㎍ 내지 약 115 ㎍의 총 카로티노이드, 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스의 100 g 당 약 1 ㎎ 내지 약 8 ㎎의 토코페롤, 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스 g 당약 0.05 ㎎ 내지 약 0.30 ㎎의 총 토코트리에놀 및 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스 g 당약 0.1 ㎎ 내지 약 10 ㎎의 인지질로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물들을 추가로 포함한다. 일부 경우들에서, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 총 카로티노이드는 10 ㎍ 미만이다. 일부 경우들에서, 조류의 가루 입자 또는 조류의 바이오매스 입자의 평균 입자 크기는 10 ㎛ 미만이다.
일부 구체예들에서, 이 조류의 가루 입자는 덩어리로 되어 있다. 일부 경우들에서, 덩어리로 되어 있는 조류의 가루 입자의 평균 입자 크기는 약 1,000 ㎛ 미만이다. 일부 경우들에서, 덩어리로 되어 있는 조류의 가루 입자의 평균 입자 크기는 약 500 ㎛ 미만이다. 일부 경우들에서, 덩어리로 되어 있는 조류의 가루 입자의 평균 입자 크기는 약 250 ㎛ 미만이다. 일부 경우들에서, 덩어리로 되어 있는 조류의 가루 입자의 평균 입자 크기는 약 100 ㎛ 미만이다.
일부 경우들에서, 이 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 비-미세조류의 오염 미생물을 추가로 포함한다. 일부 경우들에서, 이 오염 미생물은 g 당 10,000의 CFU 미만 또는 이와 동등한 총 일반 세균 수(aerobic plate count); g 당 200 CFU 미만 또는 이와 동등한 효모; g 당 200 CFU 미만 또는 이와 동등한 균류; g 당 10 CFU 미만 또는 이와 동등한 장내 세균(coliform); g 당 6 CFU 미만의 또는 이와 동등한 대장균(Escherichia coli); 및 g 당 20 CFU 미만의 또는 이와 동등한 스타필로코카이(Staphylococci) - coag. 포지티브로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 경우들에서, 이 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 약 20 건중량% 미만의 트리글리세리드 오일을 포함한다. 일부 경우들에서, 이 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 약 10 건중량% 미만의 트리글리세리드 오일을 포함한다.
본 발명의 이들 측면과, 기타 측면들 및 구체예들은 바로 이어서 오는 첨부 도면과 이의 간단한 설명, 및 하기 본 발명의 상세한 설명에서 설명하고 및 하기 실시예에서 예시된다. 위에서 논의하고, 출원을 통하여 논의되는 임의의 또는 모든 특징은 본 발명의 다양한 구체예들에 조합될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 이 상세한 설명은 독자의 편의를 위하여 단락들과 하위 단락들로 나뉘어져있다. 단락 I은 여기에서 이용된 다양한 용어들에 대한 정의를 제공한다. 단락 II, A-E 부분은 적합한 유기체를 포함하는 미세조류의 바이오매스를 준비하는 방법(A), 상당히 감소된 착색 또는 착색이 없는 미세조류 균주를 생산하는 방법 (B) 배양 조건들 (C), 농도 조건들 (D), 및 본 발명에 따라 생산된 이 바이오매스의 화학적 조성물 (E)을 개시한다. 단락 III은 이 미세조류의 바이오매스를 본 발명의 조류의 가루와 지방을 제거한 조류의 가루로 가공하는 방법들을 개시한다. 단락 IV는 본 발명의 다양한 식품들과 미세조류의 바이오매스를 기타 식품 성분들에 복합시키는 방법들을 개시한다.
여기에서 설명된 모든 공정은 GMP 또는 동등한 규정에 따라 실행할 수 있다. 미국에서, 사람이 섭취하는 식품의 제조, 포장 또는 보관에 대한 GMP 규정은 21 C.F.R. 110에 성문화되어 있다. 이들 조항 뿐만 아니라, 여기에서 언급된 부속 조항들은 모든 목적을 위하여 이들 전문이 여기에 참고자료로 통합된다. 미국에서 GMP 약관들, 및 다른 사법권에서 등가의 약관들은 식품이 규정에 맞지 않는지 (이 식품이 식품에 부적합한 조건들하에서 제조되었는지) 또는 오염이 시작되었을 수 있거나 건강에 유해함을 줄 수 있는 비위생적인 조건하에서 제조, 포장 또는 보관되었는 지를 판단하는데 적용된다. GMP 조건들은 질병 관리; 청결 및 직원 훈련; 건물 및 설비들의 유지 및 위생적 운용; 적합한 위생 설비 및 부대시설의 제공; 장비 및 용구들의 디자인, 제작, 유지 및 청결; 임의의 원천으로부터 오염을 예방하기 위하여 적합한 위생 원칙에 따라 식품의 수취, 검사, 운반, 분리, 준비, 제조, 포장 및 저장에 모든 합리적인 주의를 취하였는 지를 확실하게 하기 위한 적절한 품질 관리 과정을 제공하고; 물리적, 화학적 또는 바람직하지 못한 미생물 오염에 대해 식품을 보호할 뿐만 아니라, 이 식품의 상함 및 용기로부터 식품을 보호하게 될 조건들에서 최종 식품을 보관하고 운반하는 것을 관리하는 규정을 포함할 수 있다.
I. 정의
하기에서 달리 정의되지 않는 한, 여기에서 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자가 통상적으로 이해하는 의미를 가진다. 여기에서 이용된 많은 용어들의 일반적인 정의는 Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)에서 찾아볼 수 있을 것이다.
“영역 백분율(Area Percent)”은 실험하는 동안 생성된 크로마토그래피, 분광광도 및 기타 피크의 영역 백분율을 결정하는 것을 말한다. 피크의 곡선 아래 영역과 특정 피크의 영역 백분율의 결정은 당업계 숙련자에 의해 통상적으로 실시된다. 예를 들면, 시료 내의 지방산 분자가 지방산 메틸 에스테르 (FAME)로 전환되는 FAME GC/FID 탐지 방법에서 C14:1과 같은 임의의 기타 지방산과 비교하여 불포화가 없는(C14:0) 14개 탄소 원자들의 지방산의 경우 분리 피크가 관찰된다. FAME의 각 부류의 피크 영역은 혼합물에서 이의 조성 백분율에 직접 비례하고, 시료 내에 존재하는 모든 피크의 합에 근거하여 계산된다(즉, [특정 피크 아래 영역/측정된 모든 피크의 총 영역] X 100). 본 발명의 오일 및 세포들을 언급할 때, “적어도 4%의 C8-C14”란 세포 또는 추출된 글리세로리피드 조성물에서 총 지방산의 적어도 4%는 8개, 10개, 12개 또는 14개의 탄소 원자를 포함하는 쇄 길이를 보유한다는 의미다.
“통성(Aerated) 식품”은 연속 상과 불연속 상으로 구성된 임의의 식품을 말하는데, 여기에서 연속 상은 일반적으로 수성 용액이며 불연속 상은 일반적으로 가스 (공기)이다. 통성 식품의 연속 상은 안정화 성질을 보유하여, 이 식품 안에 가스 (공기) 버블의 안정적인 형성을 허용한다. 통성 식품의 비-제한적인 예로는 무스, 아이스크림 및 샤벗을 포함한다.
“무균(Axenic)”이란 다른 살아있는 유기체에 의해 오염되지 않은 유기체의 배양물을 의미한다.
“구운 제품(baked good)”이란 오븐을 이용하여 준비하고, 보통 이스트(leavening agent)를 함유하는 베이커리에서 흔히 볼 수 있는 식품 품목이다. 구운 제품들은 브라우니, 쿠키, 파이, 케이크 및 패스트리를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
“생물반응기” 및 “발효기”는 발효 탱크 또는 용기와 같은, 현탁 상태로 일반적인 세포들이 배양되는, 에워싸인 또는 부분적으로 에워쌓인 공간을 의미한다.
“빵(Bread)”은 밀가루, 액체, 및 보통 이스트를 함유하는 식품 품목이다. 빵은 다른 조리 방법들 또한 사용가능하지만, 보통 오븐에서 구워서 준비된다. 이스트는 천연 화학물질 또는 유기/생물학적 물질일 수 있다. 일반적으로, 유기 이스트는 효모다. 이스트가 천연 화학물질(가령, 베이킹 파우드 및/또는 베이킹 소다)인 경우, 이들 식품은 “이스트를 넣어 방금구운 빵(quick breads)”이라고 한다. 크래커 및 기타 크래커-유사 제품은 이스트를 함유하지 않은 빵의 예이다.
“셀룰로오스의 재료”는 셀룰로오스, 특히 글루코오즈 및 크실로오스의 분해 산물을 의미한다. 셀룰로오스 분해는 일반적으로 이당류, 올리고당류, 리그닌, 푸르푸랄(furfurals) 및 기타 화합물들과 같은 추가 화합물들을 만든다. 셀룰로오스 재료의 원천은 예를 들면, 사탕수수 버개스(사탕수수찌꺼지), 사탕무 과육, 옥수수 여물, 나무 칩, 톱밥, 및 스위치글래스(switchgrass)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
“공동-배양”및 “공동-재배하다”그리고 “공동-발효시키다”와 같은 이의 변형은 배양 조건하에서 동일한 생물반응기 안에 두 가지 이상 유형의 세포들이 존재한다는 것을 의미한다. 두 가지 이상 유형의 세포들은 본 발명의 목적에 맞게 일반적으로 둘 다 미생물, 일반적으로 둘 다 미세조류이지만, 일부 경우에서는 한 가지의 비-미세조류의 세포 유형을 포함할 수 있다. 공동-배양에 적합한 배양 조건들은 일부 경우들에서 두 가지 이상의 세포 유형들의 성장 및/또는 분화를 촉진하는 것들을 포함하고, 다른 경우들에서, 두 가지 이상의 세포들 중 오직 하나만 또는 오직 한 부분만의 성장 및/또는 증식을 용이하게 하고, 나머지에 대해서는 세포 성장을 유지시키는 것들을 포함한다.
“공인자”는 효소 활성을 실행하기 위하여 효소에 요구되는 기질 이외의 분자를 의미한다.
“연육(Comminuted meat)”이란 고기 조각의 크기를 줄여서, 분쇄된 고기가 서로 결합할 수 있도록 하는 염 가용성 단백질의 추출을 촉진시킴으로써 형성된 육가공품을 말한다. 분쇄(Comminution)는 또한 지방, 근육 및 연결 조직이 균질하게 분포되게 한다. 연육의 비-제한적인 예로는 고기 패티, 소세지, 및 핫도그를 포함한다.
“개량육(Reformed meat)”은 연육에 관련된 것으로써, 잘게 분쇄된 고기를 추가하거나 또는 추가하지 않고 다진 고기를 “굴려서(tumbling)” 만든 이 분리된 고기의 컷, 슬라이스 또는 일부의 외양을 가진 가공품으로, 다진 고기의 가용 단백질들은 작은 조각들로 서로 결합된다. 치킨 너겟(Chicken nuggets)은 개량육의 비-제한적 예이다.
“일반(Conventional) 식품”은 조류의 바이오매스 또는 기타 조류의 성분들이 없고, 보통 식품, 특히 식물성 오일, 동물 지방, 및/또는 달걀과 관련된 성분과 함께 기타 식용 성분들을 포함하는, 예를 들어 인간에 의해 소비되록 의도된 조성물을 의미한다. 일반 식품은 가게 및 식당에서 판매하는 식품과 가정에서 만든 식품을 포함한다. 일반 식품은 비-조류의 원천 및/또는 달걀로부터 얻은 오일 또는 지방과 함께 기타 식용 성분(들)의 함유를 특징으로 하는 일반 조리법에 따라 흔히 만든다.
“조리된 식품(Cooked product)”은 일정 시간 동안 가령, 오븐에서 가열된 식품을 말한다.
“크리미 샐러드 드레싱(Creamy salad dressing)”은 높은 점성 및 느린 따름-속도(pour rate)를 가진 안정적인 분산의 샐러드 드레싱을 말한다. 일반적으로, 크리미 샐러드 드레싱은 불투명하다.
“기르다(Cultivate)”,“배양하다(culture)” 및 “발효시키다(ferment)”및 이의 변형들은 하나 또는 초과의 세포들, 일반적으로 미세조류을 배양 조건을 이용하여 의도적으로 성장 및/또는 증식시키는 것을 의미한다. 의도된 조건은 (직접적인 인간의 중재없이) 자연적인 미생물의 성장 및/또는 증식시키는 것을 제외한다.
"세포용해(Cytolysis)"는 저삼투성 환경에서 세포들의 용해를 의미한다. 세포용해는 세포 내부의 삼투 또는 물의 이동으로 과수화상태가 되어, 이 세포가 내부 물의 삼투압을 견디지 못하고, 파열되는 것에 기인한다.
“지방을 제거한 조류의 가루”는 추출 프로세스 전의 바이오매스와 비교하여 오일이 적게 함유된 조류 가루를 만들기 위하여, 조류의 가루로 가공하고, 극성 및/또는 비-극성 추출 프로세스를 이용한 오일 추출 프로세스 또는 CO2와 같은 기체를 이용한 오일 추출 프로세스를 거친 조류의 바이오매스를 의미한다. 지방을 제거한 조류의 가루 안의 세포들은 대부분 또는 완벽하게 용해되었고, 이 지방을 제거한 조류의 가루는 식이섬유 형태를 포함한 탄수화물을 함유하고, 단백질 및 소량의 잔류 오일을 함유할 수 있다. 지방을 제거한 조류의 가루는 추출 방법에 따라 인지질을 함유하거나 또는 함유하지 않을 수 있다. 일반적으로, 이 지방을 제거한 조류의 가루에 남아있는 지질의 양은 약 1% 내지 약 15wt%이다.
“식이 섬유(dietary fiber)”는 미세조류를 포함하는, 세포 벽을 가지고 있는 식물 및 기타 유기체에서 볼 수 있는 비-전분 탄수화물을 의미한다. 식이 섬유는 가용성(물에 용해) 또는 불용성(물에 용해되지 않음)일 수 있다. 가용성 및 불용성 섬유가 전체 식이섬유를 구성한다.
“지방을 제거한(delipidated) 식사” 또는 “지방을 제거한 조류의 식사/바이오매스”는 오일 추출 프로세스를 거쳐서 오일 추출 전의 바이오매스와 비교하여 오일 함량이 적은 조류의 바이오매스를 의미한다. 지방을 제거한 식사내 세포는 대부분 용해된다. 지방을 제거한 식사는 용매 (가령, 헥산) 추출된 조류의 바이오매스를 포함한다.
“소화가능한 미정제 단백질”은 위의 효소로 소화된 후 유리 질소(아미노산)으로 전환될 수 있는 또는 이용 가능한 단백질의 일부다. 소화가능한 미정제 단백질의 시험관내 측정은 펩신과 같은 위의 효소를 이용하여, 시료를 분해한 후, 분해후 유리 아미노산을 측정하여 실시한다. 소화가능한 미정제 단백질의 생체내 측정은 사료/식품 시료 안에 단백질 수준을 측정하고, 이 시료를 동물에게 먹이고, 동물의 대소변에서 수거한 질소의 양을 측정하여 이루어진다.
“분산(Dispersion)”은 적어도 하나의 물질의 미세 입자가 또 다른 물질에 분산된 혼합물을 의미한다. 상이한 조성물의 연속 상을 통하여 분산된 임의의 입자를 의미할 수 있지만, 여기에서 이용된 용어, 분산은 또 다른 물질, 통상적으로 액체에 분산된 또는 분포된 한 가지 물질의 미세 고형을 말한다. 에멀전(emulsion)은 두 가지 시앙의 혼합할 수 없는 액체의 혼합물을 포함하는 특정 유형의 분산이다.
“건중량(dry weight)”과 “건조 세포 중량”은 물의 상대적 부재하에 측정한 중량을 의미한다. 예를 들면, 특정 성분의 특정 건중량 백분율을 포함하는 미세조류의 바이오매스에 대한 언급은, 이 백분율이 실질적으로 모든 물을 제거한 후, 이 바이오매스의 중량에 근거하여 계산된다는 것을 의미한다.
“식용(Edible) 성분”은 먹기에 적합한 임의의 물질 또는 조성물을 의미한다. "식용 성분들"은 곡물, 과일, 야채, 단백질, 허브, 양념, 탄수화물, 당, 및 지방을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어“성분(ingredient)”은 식품 및/또는 식품 조성물에 이용된 성분들을 의미한다. “성분”은 보존제, 향신료, 식품 첨가제, 식품 발색제, 당 대체물 및 다양한 식품에서 발견되는 기타 성분들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
“외부에서 제공된(Exogenously provided)”이란 세포로 제공된 분자를 의미한다(세포 배양 배지에 제공된 것을 포함).
“지방(Fat)”은 통상의 실온 및 압력에서 일반적으로 고체인 지질 또는 지질 혼합물을 의미한다. “지방”은 라드(lard) 및 버터를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
“섬유(Fiber)”는 다당류 형태의 비-전분 탄수화물을 의미한다. 섬유는 물에 가용성이거나 물에 불용성일 수 있다. 많은 미세조류는 세포 벽에 일반적으로 존재하는 가용성 섬유와 불용성 섬유를 모두 만든다.
“완제 식품” 및 “완제 식품 성분”은 포장, 사용 또는 소비용으로 채비가 끝난 식품 조성물을 의미한다. 예를 들면, “완제 식품”은 조리되었을 수 있고 "완제 식품”을 포함하는 성분들은 또 다른 성분과 혼합되었거나 또는 다른 방법으로 통합되었을 수 있다. “완제 식품 성분”은 일반적으로 식품을 만들기 위하여 다른 성분들과 조합하여 이된한다.
“고정된 탄소 원천”은 주위 온도 및 압력에서 고체 또는 액체 형태로 존재하는 탄소를 함유하는 분자(들), 일반적으로 유기 분자들을 의미한다.
“식품”, “식품 조성물”, “식품” 및 “식재료”는 영양소 및/또는 칼로리의 공급원으로써 인간이 섭취할 것으로 의도되거나 예상되는 임의의 조성물을 의미한다. 식품 조성물은 주로 탄수화물, 지방, 물 및/또는 단백질로 구성되며 및 실질적으로 모든 인간의 일일 칼로리 섭취를 구성한다. “식품 조성물”은 전형적인 태블릿 또는 캡슐의 중량의 적어도 10배인 최저 중량을 보유할 수 있다 (전형적인 태블릿/캡슐 중량 범위는 100 ㎎ 미만 또는 이와 대등하고, 최대 1500 ㎎이다). “식품 조성물”은 캡슐화되거나 또는 태블릿 형태로 존재하지 않는다.
“글리세로리피드 프로파일”은 바이오매스 또는 오일의 특정 시료 내의 글리세로리피드의 상이한 탄소쇄 길이 및 포화 수준 분포를 의미한다. 예를 들면, 시료는 시료에서 글리세로리피드의 대략 60%는 C18:1, 20%는 C18:0, 15%는 C16:0, 및 5%는 C14:0인, 글리세로리피드 프로파일을 보유할 수 있다. 탄소 길이는 "C:18"과 같이 총괄적으로 언급되는데, 이러한 언급은 임의의 포화량을 포함할 수 있고; 예를 들면, C:18로써 20% (중량/질량)의 지질을 함유하는 미세조류의 바이오매스는 C18:0, C18:1, C18:2, 및 이와 유사한 것들을 동량으로 또는 다양한 양으로 함유할 수 있는데, 이들의 총 합이 이 바이오매스의 20%를 이룬다. “18:1 글리세로리피드 형에서 적어도 50% 단일불포화된(monounsaturated)”과 같이 특정 포화 유형의 백분율을 언급하는 것은 글리세로리피드의 지방족 측쇄가 적어도 50% 18:1이라는 것을 의미하지만, 이 트리글리세리드의 적어도 50%가 트리올레인 (단일 글리세롤 골격에 부착된 3개의 18:1 쇄)을 필수적으로 의미하지는 않고; 이러한 프로파일은 총 측쇄의 적어도 50%가 18:1이라면 18:1과 기타 측쇄의 혼합물을 가진 글리세로리피드를 포함할 수 있다.
“우수 제조 관리 기준” 및 “GMP”는 21 C.F.R. 110 (인간 식품의 경우) 및 111 (음식 보충물의 경우)에서 제시한 규정 또는 미국 밖의 지역에서 확립된 필적하는 규제 제도에 의해 확립된 조건을 의미한다. U.S. 규정은 인간 소비용 식품 및 음식 보충물의 제조업자, 가공업자 및 포장업자를 관리하기 위하여 연방 식품, 약품 및 화장품 법령하에 미국 식품 의약청(FDA)에 의해 선포된다.
“성장”은 고정된 탄소원이 세포내 오일로의 전환으로 인하여 세포 중량이 증가하는 것을 포함하는, 개별 세포의 세포 크기, 총 세포 함량 및/또는 세포량 또는 중량의 증가를 의미한다.
“유기영양 배양(Heterotrophic cultivation)” 및 “유기영양 배양(heterotrophic culture)” 및 “유기영양 발효”와 같은 이의 변형은 고정된 탄소원의 존재하에 의도적 성장 촉진(세포 크기, 세포의 함량, 및/또는 세포의 활성의 증가)를 의미한다. 유기영양 배양은 빛 없이 실시한다. 빛 없는 배양은 완벽하게 빛이 없거나 거의 완벽하게 빛이 없는 상태에서 미생물 세포들의 배양을 의미하는데, 여기에서 상기 세포들이 빛으로부터 이들의 에너지의 상당량(즉, 0.1% 초과)을 유도하지 않는다.
“유기영양 증식(Heterotrophic propagation)”및 이의 변형은 고정된 탄소원의 존재하에 의도적인 증식을 촉진(유사분열을 통한 세포 수의 증가)하는 것을 의미한다. 유기영양 증식은 빛 없이 실시한다. 빛 없는 증식은 완벽하게 빛이 없거나 거의 완벽하게 빛이 없는 상태에서 미생물 세포들의 증식을 의미하는데, 여기에서 상기 세포들이 빛으로부터 이들의 에너지의 상당량(즉, 0.1% 초과)을 유도하지 않는다.
“균질물(Homogenate)”이란 물리적으로 파열된 바이오매스를 의미한다. 균질화는 입자 또는 덩어리를 더 작고 더 균질한 크기로 재분할하는, 추가 프로세싱을 겪게 될 수 있는 분산물을 형성하는 유체 기계적 프로세스다. 균질화는 안정성, 유지 기간, 소화력, 및 맛을 개선시키기 위하여 몇 가지 식품 및 유제품의 처리에 이용된다.
“증가된 지질 수율”은 예를 들면, 배양물 리터 당 세포의 건중량을 증가시키거나, 지질을 함유하는 세포의 백분율을 증가시키고/거나, 단위 시간당 배양물 용적 리터당 지질의 전체 양을 증가시킴으로써 얻어지는 미생물 배양물의 지질/오일 생산성의 증가를 의미한다.
“원 위치(In situ)”는 “적소(in place)” 또는 “고유 위치(in its orignal position)”를 의미한다. 예를 들면, 배양물은 촉매를 분비하는 제 1 미세조류의 세포 유형과 기질을 분비하는 제 2 미생물 세포 유형을 함유할 수 있고,여기에서 제 1 과 제 2 세포 유형들은 재료들의 추가 분리 또는 프로세스의 요구없이, 공동-배양물내 원위치에서 특정 화학 반응이 일어나는데 필요한 성분들을 만든다.
“지질”은 비극성 용매들 (에테르 및 헥산과 같은)에서는 가용성이며, 물에서는 상대적으로 또는 완전하게 불용성인 분자의 임의의 종류를 의미한다. 지질 분자들은 자연상태에서 소수성인 긴 탄화수소 꼬리로 대개 구성되기 때문에 이러한 성질들을 보유한다. 지질의 예는 지방산 (포화된 및 불포화된); 글리세리드 또는 글리세로리피드 (예를 들면, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드 또는 중성 지방, 및 포스포글리세리드 또는 글리세로인지질); 및 비-글리세리드 (스핑고리피드, 토코페롤, 토코트리에놀, 콜레스테롤 및 스테로이드 호르몬을 포함하는 스테롤 지질, 테르페노이드를 포함하는 프레놀 지질, 지방 알코올, 왁스 및 폴리케티드)를 포함한다.
“용해물(Lysate)”은 용해된 세포들의 내용물을 함유하는 용액을 의미한다.
“용해(Lysis)”는 혈장 막과 임의 선택적으로 적어도 세포내 내용물의 일부를 방출하는데 충분한 미생물의 세포 벽의 파괴를 의미하고, 이러한 파괴는 세포의 온전성을 파괴하는 기계적 또는 삼투 기전에 의해 흔히 이루어진다.
“용해하는(Lysing)”는 적어도 세포내 내용물의 일부를 방출하는데 충분한 생물학적 유기체 또는 세포의 세포 막과 임의 선택적으로 세포 벽을 파열하는 것을 의미한다.
“미세조류(Microalgae)”는 엽록체를 함유하고, 광합성을 할 수 있거나 또는 할 수 없는 진핵세포성 미생물 유기체를 의미한다. 미세조류는 에너지로 고정된 탄소원을 대사시킬 수 없는 절대적 광합성적 독립영양 생물(photoautotrophs), 뿐만 아니라 광합성을 실시할 수 없는 절대적 유기영양생물(heterotrophs)을 포함하는 고정된 탄소원으로만 살아갈 수 있는 유기영양생물을 포함한다. 미세조류는 세포 분할 직후 자매 세포(sister cell)로부터 분리된 단세포 유기체, 가령, 클라미도모나스(Chlamydomonas), 뿐만 아니라 두 개의 별개 세포 유형의 단순 다세포 광합성 미생물, 예를 들면, 볼복스(Volvox)와 같은 미생물을 포함한다. “미세조류”는 클로레라(Chlorella), 파라클로레라(Parachlorella) 및 두나리엘라(Dunaliella)와 같은 세포들을 또한 포함한다.
“미세조류의 바이오매스”, “조류의 바이오매스” 및 “바이오매스”는 미세조류의 세포들의 성장 및/또는 증식에 의해 만들어진 물질을 의미한다. 바이오매스는 세포들 및/또는 세포내 내용물 뿐만 아니라 세포외 물질을 함유할 수 있다. 세포외 물질은 세포에 의해 분비되는 화합물들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
“미세조류의 오일”및 “조류의 오일”은 트리아실글리세롤을 포함하는, 미세조류의 세포들에 의해 생산된 임의의 지질 성분들을 의미한다.
“미분화된(Micronized)”은 세포들이 파열된 바이오매스를 의미한다. 예를 들면, 세포들은 고압, 기계적, 전단(shear), 초음파분쇄(또는 동등한 프로세스)를 포함하는 공지의 방법들에 의해 파열되어, 입자 크기의 적어도 50%(입자의 중간 크기)는 이들의 최장 직경 또는 대등한 체적의 구(sphere)의 직경에서 10㎛ 이하이다. 일반적으로, 이러한 입자의 적어도 50% 내지 90% 또는 그 초과는 이들의 최장 직경 또는 대등한 체적의 구의 직경에서 5 ㎛ 미만이다. 임의의 경우에서, 미분화된 바이오매스의 평균 입자 크기는 고유의 미세조류 세포보다 더 작다. 언급되는 입자 크기는 균질화로 인한 것들을 말하며, 균질화가 일어난 후 최대한 빨리, 그리고 건조 과정에서 일어날 수 있는 입자의 응집화에 의한 가능한 변형을 피하기 위하여 건조 전에 측정하는 것이 바람직하다. 입자 크기를 측정하는 일부 기술, 가령 레이져 회절은 개별 입자보다는 덩어리를 형성한 입자의 크기를 탐지하고, 건조 후 더 큰 겉보기 입자 크기를 나타낼 수 있다(가령, 평균 입자 크기 1-100 ㎛). 이 입자는 일반적으로 대략 모양이 구형이기 때문에, 입자의 최장 크기와 등가 용적의 구의 직경은 대략 동일하다.
“미생물(microorganism)” 및 “세균(microbe)”은 임의의 미시적인 단세포의 유기체를 의미한다.
여기에서 이용된 “식감(Mouthfeel)”은 입 안에서 식품 조성물의 느낌을 의미한다. 식감은 당업계의 숙련자들에 의해 이용되고 및 인지되는 용어다. 식감은 이 식품 조성물을 입안에 넣었을 때, 결합력(cohesiveness), 밀도, 수렴성(astringency), 건조감(dryness), 깨짐성(fracturability), 입자성(graininess), 끈적임(gumminess), 견고성(hardness), 무게감(heaviness), 수분 흡수(moisture absorption), 수분 방출(release), 구강코팅(mouthcoating), 거침(roughness), 미끄럼성(slipperiness), 부드러움(smoothness), 균일성, 한 입 깨무는 균일성(uniformity of bite), 씹는 균일성(uniformity of chew), 점성 및 축축함(wetness)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 느낌을 의미한다.
“영양 보충제(nutritional supplement)”는 벌크 칼로리와는 반대로 특정 영양소를 제공함으로써 식사를 보충하려는 의도의 조성물을 의미한다. 영양 보충제는 다음중 임의의 하나 또는 초과의 성분들을 함유할 수 있다: 비타민, 미네랄, 허브, 아미노산, 필수 지방산 및 기타 물질들. 영양 보충물은 일반적으로 테블릿화되거나 캡슐화된다. 단일 테블릿화된 또는 캡슐화된 영양 보충제는 일반적으로 일일 15g 이하의 수준으로 복용된다. 영양 보충물은 식사에 보충하기 위하여 요거트 또는 “스무디”와 같은 식품 조성물에 혼합될 수 있는 바로-혼합되는 사셋(sachet)으로 제공될 수 있고, 일일 25g 이하의 수준으로 일반적으로 복용된다.
“오일(Oil)”은 미세조류를 포함하는 유기체, 다른 식물들, 및/또는 동물에 의해 만들어지는 임의의 트리아실글리세리드 (또는 트리글리세리드 오일)을 의미한다. “지방”과 구별되는 "오일"은 다른 언급이 없는 한, 통상의 실온 및 압력에서 일반적으로 액체인 지질을 지칭한다. 그러나, 코코넛 오일은 일부 야자나무 오일과 야자나무 커넬 오일과 같이 실온에서 일반적으로 고체다. 예를 들면, “오일”은 콩, 평지씨, 캐놀라, 야자나무, 야자나무 커넬, 코코넛, 옥수수, 올리브, 해바라기, 목화씨, 쿠페아(cuphea), 땅콩, 카멜리나 사티바(camelina sativa), 겨자씨, 캐슈 너트, 귀리, 루핀, 케나프, 금잔화, 대마, 커피, 아마씨, 헤이즐너트, 등대풀, 호박씨, 고수(coriander), 카멜리나, 참깨, 잇꽃, 쌀, 유동나무 오일, 코코아, 코프라, 양귀비꽃, 피마자씨, 피칸, 호호바, 자트로파, 마카다미아, 브라질 너트, 및 아보카도, 뿐만 아니라 이의 조합으로부터 유래된 오일을 포함하는, 식물로부터 유도된 식물성 또는 씨앗 오일을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
“삽투압 충격(Osmotic shock)”은 삼투압의 급작스러운 감소후 용액 내에서 세포들의 파열을 의미하고, 이는 세포들의 세포 성분을 용액으로 방출하는 것을 유도하는데 이용할 수 있다.
“저온살균(Pasteurization)”은 식품에서 미생물의 성장을 지연시키려는 의도의 가열 프로세스를 의미한다. 일반적으로 저온살균은 짧은 시간 동안 고온(그러나 끓는 점 아래)에서 실시한다. 여기에서 설명된 것과 같이, 저온살균은 식품내 원치 않는 미생물의 수를 감소시킬 뿐만 아니라, 이 식품내에 존재하는 특정 효소들을 비활성화시킬 수 있다.
“다당류”및 “글리칸”은 글리코시드 결합에 의해 함께 결합된 단당류로 만들어진 임의의 탄수화물을 의미한다. 셀룰로오스는 특정 식물 세포 벽을 만드는 다당류의 예다.
“포트(Port)”는 가스, 액체, 및 세포들과 같은 물질의 유입 또는 유출을 허용하는 생물 반응기에 있는 개구부(opening)을 의미한다; 이 포트는 통상 튜브에 연결되어 있다.
“대부분 캡슐화된”이란 언급된 성분, 가령, 조류의 오일의 50% 초과 및 일반적으로 75% 내지 90%는 언급된 용기에서 격리되며, 여기에는 가령, 미세조류의 세포를 포함할 수 있다.
“대부분 온전한(intact) 세포들” 및 “대부분 온전한 바이오매스”는 50% 초과, 종종 75%, 90%, 및 98% 초과 온전한 세포들을 포함하는 세포들의 집단을 의미한다. 이 문맥에서“온전한”은 배양물내 세포막의 침투성을 초과하는 수준으로 세포의 세포내 성분을 방출시키는 임의의 방식으로 세포의 세포내 성분들을 에워싸는 세포 막 및/또는 세포 벽의 물리적 연속성이 파열되지 않았음을 의미한다.
“대부분 용해된”이란 세포의 50% 초과, 및 일반적으로 75% 내지 90% 초과가 파괴되어, 세포의 세포내 성분이 세포 막 내에 더 이상 완벽하게 에워싸여 있지 않는 세포 집단을 말한다.
“확산(Proliferation)”은 성장 및 증식의 조합을 의미한다.
“증식”은 유사분열 또는 기타 세포 분열을 통하여 세포 수의 증가를 의미한다.
“근사 분석(Proximate analysis)”은 지방, 질소/단백질, 미정제 섬유 (주요 성분들로 셀룰로오스 및 레그닌), 수분 및 재에 대하여 식재료의 분석을 의미한다. 탄수화물 (총 식이섬유 및 유리당들)은 100으로부터 근사분석의 총 공지 값을 공제함으로써 계산할 수 있다(탄수화물 차이).
여기에서 사용된 것과 같이,“유지 기간(Shelf-life)”은 식품 조성물이 용인되는 것으로 간주되는 시간의 길이를 의미한다. 조성물의 질감, 식감, 맛, 향, 무균상태 및 기타 성질들을 포함하는 식품 조성물의 성질들은 시간이 경과함에 따라 손상된다. 식품 조성물의 유지 기간 동안, 이 식품 조성물의 성질들은 손상될 수 있지만, 이 조성물은 식품 조성물로써 여전히 수용가능한 것으로 결정될 수 있다.
“초음파분해(Sonication)”는 음파 에너지에 의해 세포와 같은 생물학적 물질들을 파괴시키는 것을 말한다.
“푸르푸랄(furfural) 종”은 2-푸란카르복사알데히드 및 동일한 기본 구조적 특징들을 유지하는 이의 유도체들을 의미한다.
“여물(Stover)”는 농작물로부터 곡물을 수확한 후 남은 농작물의 건조된 줄기와 잎을 말한다.
“인간 소비에 적합한”이란 건강에 나쁜 영향없이 인간이 음식으로 섭취할 수 있는 조성물을 의미하고, 이 조성물은 위장관에서 소화된 물질로 흡수되기 때문에 상당한 칼로리 섭취를 제공할 수 있다.
“조리안된 산물”은 가열 대상이 되지 않았던 조성물을 의미하지만, 이미 가열된 하나 또는 초과의 성분들을 포함할 수 있다.
용적 비율과 관련하여“V/V” 또는 "v/v"는 조성물의 용적에 대해 이 조성물내 한 물질의 용적 비율을 의미한다. 예를 들면, 5% v/v 미세조류의 오일을 포함하는 조성물에 대한 기재는 조성물의 용적의 5%는 미세조류의 오일로 구성되고 (가령, 100 ㎣의 용적을 가지는 이러한 조성물은 5 ㎣의 미세조류의 오일을 함유할 수 있고), 및 이 조성물의 나머지 용적(이 예의 경우 가령, 95 ㎣)은 다른 성분들로 구성된다는 의미이다.
중량에 의한 비율과 관련하여“W/W” 또는 "w/w"는 조성물의 중량에 대해 이 조성물내 한 물질의 중량 비율을 의미한다. 예를 들면, 5% w/w 미세조류의 바이오매스를 포함하는 조성물에 대한 기재는 조성물의 중량의 5%는 미세조류의 바이오매스로 구성되고 (가령, 100 ㎎의 중량을 가지는 이러한 조성물은 5 ㎎의 미세조류의 바이오매스를 함유할 수 있고), 및 이 조성물의 나머지 중량(이 예의 경우 가령, 95 ㎎)은 다른 성분들로 구성된다는 의미다.
II. 미세조류의 바이오매스를 준비하는 방법들
본 발명은 지질 및/또는 단백질 구성성분들을 포함하는 영양가가 풍부한 인간 소비에 적합한 조류의 바이오매스, 이를 식용 성분들과 조합하는 방법들, 및 이를 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명은 높은 오일 함량을 가지고 및/또는 우수한 기능을 가지는 조류의 바이오매스를 준비할 수 있고, 생성된 바이오매스를 식품에 통합시킬 수 있다는 발견으로부터 부분적으로 비롯되었다. 추가적으로, 지방을 제거한 조류의 바이오매스 (지방을 제거한 조류의 가루의 형태)는 독특하고 놀라운 기능을 부여할 수 있고, 식품에 통합될 수 있다. 이 바이오매스는 오일 및/또는 단백질에 추가하여, 가령 조류-유도된 식이섬유 (모두 가용성 및 불용성 탄수화물 모두), 인지질, 당단백질, 식물스테롤, 토코페롤, 토코트리에놀, 및 셀레늄과 같은 몇 가지 유익한 미세-영양소를 또한 제공한다. 조류의 바이오매스는 여기에서 설명한 것과 같이, 또는 당업계 숙련자들에게 공지되어 있는 조건하에 성장, 배양 또는 증식된 조류의 세포들을 포함한다.
이 단락은 우선 본 발명의 방법에 이용하는데 적합한 미세조류의 유형을 검토하고(A 편), 착색이 결여되거나 착색이 상당히 감소된 미세조류 균주를 만드는 방법들(B 편), 그 다음 이 바이오매스를 증식시키는데 이용되는 배양 조건(C 편), 그 다음 추가 프로세싱을 위하여 이 바이오매스를 준비하는데 이용되는 농축 단계들 (D 편), 및 본 발명의 방법들에 따라 준비된 바이오매스의 화학 조성을 설명하는 것(E 편)으로 종결한다.
A. 본 발명의 방법에 이용하기 위한 미세조류
높은 수준의 적합한 오일 및/또는 지질 및/또는 단백질을 자연적으로 생산하는 미세조류가 바람직하지만, 적합한 오일 및/또는 지질 및/또는 단백질을 생산하는 다양한 종류의 미세조류를 본 발명의 방법에 따라 이용할 수 있다. 본 발명에 이용하기 위한 미세조류를 선택하는데 영향을 주는 고려사항들은 식품의 생산을 위한 적합한 오일, 지질, 또는 단백질의 생산에 추가하여: (1) 세포 중량의 백분율로서 높은 지질(또는 단백질) 함량 ; (2) 성장의 용이함; (3) 증식의 용이함; (4) 바이오매스 프로세싱의 용이함; (5) 글리세로리피드 프로파일; 및 (6) 조류의 독소가 없거나 또는 거의 없음 (하기 실시예 4는 건조된 미세조류의 바이오매스와 탐지가능한 조류의 독소가 없는 이 바이오매스로부터 추출된 오일 또는 지질을 개시한다).
일부 구체예들에서, 미세조류의 세포 벽은 기능성 성분들이 방출할 수 있도록하기 위하여 식품 프로세싱(가령, 조리)하는 동안 파괴되어야만 하고, 이들 구체예에서, 동물, 가령, 인간 또는 기타 단위동물(monogastrics)의 위장관에서의 소화력에 민감한 세포벽을 가진 미세조류 균주들이 바람직하고, 특히, 조류의 바이오매스를 조리안된 식품에 이용할 경우에 바람직하다.
소화성(Digestibility)은 세포 벽에 셀룰로오스/반(hemi)-셀룰로오스의 함량이 높은 미세조류 균주의 경우 일반적으로 감소된다. 소화성은 예를 들면, 펩신 소화성 분석과 같이 당업계의 숙련자에게 공지되어 있는 표준 분석을 이용하여 평가할 수 있다.
특정 구체예들에서, 이 미세조류는 적어도 10 건중량% 또는 그 초과의 오일인 세포를 포함한다. 다른 구체예들에서, 이 미세조류는 적어도 25-35 건중량% 또는 그 초과의 오일을 함유한다. 일반적으로, 이들 구체예들에서, 이 미세조류에 더 많은 오일이 함유되면, 이 바이오매스는 영양분이 더 많고, 따라서 적어도 40 건중량%, 적어도 50%, 75%, 또는 그 초과의 오일을 함유하도록 배양된 미세조류가 특히 바람직하다. 본 발명의 방법에 이용하기 위한 바람직한 미세조류는 유기영양적으로 성장할 수 있고(빛 없이 당에서) 또는 절대적 유기영양생물이다. 모든 유형의 지질이 식품 및/또는 기능식품에 사용하는데 바람직하지는 않는데, 그 이유는 바람직하지 못한 맛 또는 불쾌한 냄새를 가질 수 있고, 뿐만 아니라 열악한 안정성을 나타내거나 또는 저질의 식감을 제공할 수 있기 때문이며, 이러한 고려사항들은 본 발명의 방법들에 이용하기 위한 미세조류의 선택에 또한 영향을 준다.
클로레라 속의 미세조류가 본 발명의 방법들에 있어서 일반적으로 유용하다. 클로레라는 클로로파이타(Chlorophyta) 문(phylum)에 속하는 단세포의 녹조류 속(genus)이다. 클로레라 세포들은 일반적으로 직경이 약 2 내지 10 ㎛ 인 구형 모양을 하고 있으며, 편모(flagella)가 없다. 클로레라의 일부 종들은 천연적으로 유기영양성이다. 바람직한 구체예들에서, 본 발명의 방법들에 이용된 이 미세조류들은 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides), 클로레라 엘리프소이데(Chlorella ellipsoidea), 클로레라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로레라 조피니에네시(Chlorella zofinienesi), 클로레라 루테오비리디스(Chlorella luteoviridis), 클로레라 케실레리(Chlorella kessleri), 클로레라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 클로레라 푸스카 바르. 바큘로라타 클로레라 종(Chlorella fusca var. vacuolata Chlorella sp.), 클로레라 cf. 미누티시마(Chlorella minutissima) 또는 클로레라 에메르소니(Chlorella emersonii)이다. 클로레라, 특히 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)가 이의 지질의 높은 조성으로 인하여 본 발명의 방법들에 이용하기 위한 바람직한 미생물이다. 본 발명의 방법들에 이용하기 위한 특히 바람직한 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 종은 하기 실시예들에서 구체화된 것들을 포함한다.
본 발명의 방법들에 이용하기에 적합한 클로레라의 기타 종들은 아니트라타(anitrata), 안타락티카(Antarctica), 아우레오비리디스(aureoviridis), 칸디다(candida), 캡슐레이트(capsulate), 데시케이트(desiccate), 엘립소이데아(ellipsoidea) (균주 CCAP 211/42를 포함), 에메르소니(emersonii), 푸스카(fusca) (바르. 바큘로라타(var. vacuolata)포함), 글루코트로파(glucotropha), 인푸시오늄(infusionum) (바르 악토필라(var. actophila) 및 바르 옥세노필라(var. auxenophila) 포함), 케실레리(kessleri) (임의의 UTEX 균주들 397,2229,398을 포함), 로보포라(lobophora) (균주 SAG 37.88 포함), 루테오비리디스(luteoviridis) (균주 SAG 2203 및 바르 아우레오비리디스(var. aureoviridis) 및 투레센스(lutescens) 포함), 미니아타(miniata), 미누티시마(cf. minutissima), 미누티시마(minutissima) (UTEX 균주 2341 포함), 무타빌리스(mutabilis), 녹투르나(nocturna), 오발리스(ovalis), 파르바(parva), 포토필라(photophila), 프링세이미(pringsheimii), 프로토테코이드(protothecoides)(임의의 UTEX 균주들 1806, 411, 264, 256, 255, 250, 249, 31, 29, 25 또는 CCAP 211/8D, 또는 CCAP 211/17 및 바르. 악시디코라(var. acidicola) 포함), 레귤라리스(regularis) (바르 미니마(var. minima) 및 움브리카타(umbricata) 포함), 레이시글리(reisiglii) (균주 CCP 11/8을 포함), 사카로필라(saccharophila) (균주 CCAP 211/31, CCAP 211/32 및 바르. 엘립소이데(var. ellipsoidea) 포함), 살리나(salina), 심플렉스(simplex), 소로키니아나(sorokiniana) (균주 SAG 211.40B 포함), sp. (UTEX 균주 2068 및 CCAP 211/92 포함), 스페리카(sphaerica), 스티그마토포라(stigmatophora), 트레보우시오이데스(trebouxioides), 반니엘리(vanniellii), 불가리스(vulgaris) (균주 CCAP 211/11K, CCAP 211/80 및 f. 테르티아(f. tertia) 및 바르. 오토트로피카(var. autotrophica), 비리디스(viridis), 불가리스(vulgaris), 불가리스. f. 테르티아(vulgaris f. tertia), 불가리스 f. 비리디스(vulgaris f. viridis)), 산테라(xanthella), 및 조핑기엔시스(zofingiensis)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 종을 포함한다.
본 발명에서 사용하기 위한 클로레라 종(그리고 다른 미세조류 속(genera)의의 종)은 이들 게놈의 특정 표적 영역들과 여기에서 동정된 종의 동일 영역과 비교하여 동정할 수 있다; 바람직한 종은 여기에서 동정된 종과 동일한 또는 적어도 매우 높은 상동성을 나타내는 것들이다. 예를 들면, 특이적 클로레라 종 또는 균주의 동정은 프라이머들과 이 게놈의 적합한 영역들을 이용하는 방법론, 예를 들면 Wu et al., Bot. Bull. Acad. Sin. 42:115-121 (2001), Identification of Chlorella spp. isolates using ribosomal DNA sequences에서 설명한 방법들에 따라 핵 및/또는 엽록체 DNA의 증폭 및 서열화를 통하여 이루어질 수 있다. 잘 확립된 계통발생학적 분석 방법들, 가령, 리보좀 내부 전사된 스페이서 (ITS1 및 ITS2 rDNA), 23S RNA, 18S rRNA, 및 다른 보존된 게놈 영역들의 증폭 및 서열화는 클로레라 종의 확인 뿐만 아니라, 여기에서 설명된 방법들에 사용하기에 적합한 다른 오일 및 지질을 생산하는 미세조류의 종을 동정하기 위하여 당업계 숙련자들에 의해 이용될 수 있다. 조류의 동정 및 분류의 예시적인 방법들은 Genetics, 170(4):1601-10 (2005) and RNA, 11(4):361-4 (2005)을 참고한다.
따라서, 게놈 DNA 비교를 이용하여 본 발명에 이용되는 적합한 종의 미세조류를 동정할 수 있다. 이에 한정되지는 않으나, 23S rRNA을 코딩하는 DNA와 같은 보존된 게놈 DNA의 영역들을 포함하나 이에 한정되지 않는 것들, 예를 들면, 본 발명에서 이용된 바람직한 미세조류와 분류학적으로 관련된 것일 수 있는 미세조류 종으로부터 증폭시키고, 이들 바람직한 종의 대응하는 영역들과 비교할 수 있다. 그 다음, 본 발명의 방법들에 이용하기 위해 높은 수준의 유사성을 나타내는 종을 선택한다. 클로레라 속의 종 간의 이러한 DNA 서열 비교의 실증적인 예시가 하기에 개시된다. 일부 경우들에서, 본 발명에서 사용하는데 바람직한 미세조류는 서열 번호: 1-23 및 26-27에 열거된 서열중 적어도 한 가지와 적어도 65% 뉴클레오티드 동일성을 보유한 23S rRNA를 인코드하는 게놈 DNA 서열을 보유한다. 다른 경우들에서, 본 발명에서 사용하는데 바람직한 미세조류는 서열 번호: 1-23 및 26-27에서 열거된 서열중 적어도 하나 또는 초과의 서열에 대해 적어도 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 뉴클레오티드 동일성을 보유한 23S rRNA를 인코드하는 게놈 DNA 서열을 보유한다. 식품 조성물을 만들기 위하여 기타 성분들과 복합하기 전, 식품 조성물 및/또는 조류의 바이오매스의 유전자형확인(Genotyping)은 조류의 바이오매스가 미세조류의 하나 초과의 균주로부터 유래되었는 지를 판단하는 신뢰할 수 있는 방법이다.
뉴클레오티드 또는 아미노산 동일성 백분율을 결정하기 위한 서열 비교에서, 일반적으로 하나의 서열은 테스트 서열을 비교할 참고 서열로 삼는다. 서열 비교 알고리즘을 적용시키는데 있어서, 테스트 서열과 참고 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요하다면 후속 배위를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수들을 지정한다. 그 다음 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수들에 근거하여 참고 서열과 비교하여 테스트 서열에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다. 비교를 위한 서열들의 최적 배열은 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 배열 알고리즘, Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 방법의 연구에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행에 의해(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 시각적 관찰(일반적으로 Ausubel et al., supra 참고)에 의해 실행할 수 있다, 서열 동일성 비율 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 적합한 또 다른 예시적인 알고리즘은 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)에서 설명된 BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석을 실행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information (at the web address www.ncbi.nlm.nih.gov)을 통하여 공개적으로 이용가능하다.
클로레라에 추가하여, 다른 미세조류 속(genera)을 본 발명에서 또한 사용할 수 있다. 바람직한 구체예들에서, 이 미세조류는 파라클로레라 케실레리(Parachlorella kessleri), 파라클로레라 베이예르닉키(Parachlorella beijerinckii), 네오클로리스 올에아분단스(Neochloris oleabundans), B. 그란디스(B. grandis), B. 씨나바리나스(B. cinnabarinas), 및 B. 에어리우스(B. aerius)를 포함하는, 브탁테아코쿠스(Bracteacoccus), 브라세토코커스 종(Bracteococcus sp.) 또는 쎄네데스무스 레베신스(Scenedesmus rebescens)로 구성된 그룹으로부터 선택된 종이다. 미세조류 종의 기타 비제한적인 예들은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택 종 및 속의 군들을 포함한다: 아차난테스 오리엔탈리스(Achnanthes orientalis); 아그레넬룸(Agmenellum); 암피프로라 히알린(Amphiprora hyaline); A.c. 리네아(A.c. linea), A.c. 펀타타(A.c. punctata), A.c. 타이로리(A.c. taylori), A.c. 테누이스(A.c. tenuis), A.c. 델리카티시마(A.c. delicatissima), 델리카티시마 카피타타(A.c. delicatissima capitata)를 포함하는 A. 코페이포르미스(A. coffeiformis)를 포함한 암포라(Amphora); 아나베나(Anabaena); A. 팔리카투스(A. falcatus)를 포함하는 앙키스트로데무스(Ankistrodesmus); 보에켈로비아 호글란디(Boekelovia hooglandii); 보로디네라(Borodinella); B. 수데티쿠스(B. sudeticus)를 포함하는 부트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii); B. 에리우스(B. aerius), B. 그란디스(B. grandis), B. 씨나바리나스(B. cinnabarinas), B. 미노르(B. minor), 및 B. 메디오뉴클레아투스(B. medionucleatus)를 포함하는 브락테오코투스(Bracteoccocus); 카르테리아(Carteria); C. 그라시리스(C. gracilis), C. 무엘레리(C. muelleri), 및 C. 무엘레리 서브살숨(C. muelleri subsalsum)을 포함하는 케토세로스(Chaetoceros); C. 인푸시오늄(C. infusionum)을 포함하는 클로로코쿰(Chlorococcum); 클로로고니움(Chlorogonium); 클로로모나스(Chroomonas); 키로소스페라(Chrysosphaera); 크리코스페라(Cricosphaera); 크립테코디니움 코니(Crypthecodinium cohnii); 크립토모나스(Cryptomonas); C. 크립티카(C. cryptica) 및 C. 메네기니아나(C. meneghiniana)를 포함하는 사이클로테라(Cyclotella); D. 바르다빌(D. bardawil), D. 바이오쿨라타(D. bioculata), D. 그래뉼레이트(D. granulate), D. 마리타임(D. maritime), D. 미누타(D. minuta), D. 파르바(D. parva), D. 페이르세이(D. peircei), D. 프리모렉타(D. primolecta), D. 살리나(D. salina), D. 테르코라(D. terricola), D. 테르티오렉타(D. tertiolecta), 및 D. 비리디스(D. viridis)를 포함하는 두나리엘라(Dunaliella); E. 비리디스(E. viridis)를 포함하는 에르모스페라(Eremosphaera); 엘립소이돈(Ellipsoidon); 유글레나(Euglena); 프란세이아(Franceia); F. 크로코넨시스(F. crotonensis)를 포함하는 프라길라리아(Fragilaria); 글레오캅사(Gleocapsa); 글레오탐니온(Gloeothamnion); 하이메노모나스(Hymenomonas); I. aff. 갈바나(I. aff. galbana) 및 I. 갈바나(I. galbana)를 포함하는 이소크리시스(Isochrysis); 렙토신클리스(Lepocinclis); 미크락티니움(Micractinium)(UTEX LB 2614를 포함); M. 미누튬(M. minutum)을 포함하는 모노라피디움(Monoraphidium); 모노라피디움(Monoraphidium); 나노클로리스(Nannochloris); N. 살리나(N. salina)를 포함하는 나노클로롭시스(Nannochloropsis); N. 아셉타타(N. acceptata), N. 바스칸테레(N. biskanterae), N. 슈도테넬로이데스(N. pseudotenelloides), N. 페리쿠로사(N. pelliculosa), 및 N. 사프로피라(N. saprophila)를 포함하는 나비쿨라(Navicula); 네오클로리스 올레아분단스(Neochloris oleabundans); 네프로클로리스(Nephrochloris); 네프로셀미스(Nephroselmis); 니트쉬아 코무니스(Nitschia communis); N. 알렉산드리나(N. alexandrina), N. 코무니스(N. communis), N. 디시파타(N. dissipata), N. 프루스투룸(N. frustulum), N. 한츠쉬아나(N. hantzschiana), N. 인콘스피쿠아(N. inconspicua), N. 인테르메디아(N. inter배지), N. 마이크로세파라(N. microcephala), N. 푸실라(N. pusilla), N. 푸실라 엘립티카(N. pusilla elliptica), N. 푸실라 모노엔시스(N. pusilla monoensis), 및 N. 퀀드라굴라(N. quadrangular)를 포함하는 니츠쉬아(Nitzschia); 오크로모나스(Ochromonas); O. 파르바(O. parva) 및 O. 푸실라(O. pusilla)를 포함하는 오오시스티스(Oocystis); O. 림네티카(O. limnetica) 및 O. 수브브레비스(O. subbrevis)를 포함하는 오실라토리아(Oscillatoria); P. 베이예르닉키(P. beijerinckii)(균주 SAG 2046을 포함) 및 P. 케셀레리(P. kessleri)를 포함하는 파라클로레라(Parachlorella) (SAG 균주 11.80, 14.82, 21.11H9중 임의의 것을 포함); P. 악시도피라(acidophila)를 포함하는 파쉐리아(Pascheria); 파브로바(Pavlova); 파구스(Phagus); 포르미디움(Phormidium); 플라티모나스(Platymonas); P. 카르테라(P. carterae) 및 P. 덴타테(P. dentate)를 포함하는 플로오로크리시스(Pleurochrysis); P. 스타그노라(P. stagnora) (UTEX 327을 포함), P. 포스토리센시스(P. portoricensis) 및 P. 모르포르미스(P. moriformis) (UTEX 균주 1441,1435, 1436, 1437, 1439를 포함)를 포함하는 프로토테카(Prototheca); 슈도클로레라 아부아티카(Pseudochlorella aquatica); 피라미모나스(Pyramimonas); 피로보트리(Pyrobotrys); 로도코쿠스 오파쿠스(Rhodococcus opacus); 사르시노이드 크리소파이트(Sarcinoid chrysophyte); S. 마르마투스(S. armatus) 및 S. 루베센스(S. rubescens)를 포함하는 쎄네데스무스(Scenedesmus); 쉬조키트리움(Schizochytrium); 스피로기라(Spirogyra); 스피루니아 플라텐시스(Spirulina platensis); 스키코코쿠스(Stichococcus); 시네코코쿠스(Synechococcus); 테트라에드론(Tetraedron); T. 수에시카(T. suecica)를 포함하는 테트라셀미스(Tetraselmis); 탈라시오시라 웨이스플로기(Thalassiosira weissflogii); 및 비리디엘라 프리데리카나(Viridiella fridericiana).
모든 발효 프로세스는 기타 다른 미생물에 의한 오염의 대상이 된다. 본 발명의 바이오매스 및 이 조류의 가루는 오염을 최소화시키는 조건하에 성장되고 처리된다. 그럼에도 불구하고, 오염을 완벽하게 예방할 수 없다. 오염은 배양 및 증식하는 동안, 이 미세조류의 수거, 이 조류의 가루의 준비 및 이 조류의 가루 및 조류의 바이오매스의 운반 및 저장 동안을 포함한, 작업의 모든 단계 동안 일어날 수 있다. 오염 미생물 종은 확인되거나 확인되지 않을 수 있다.
이 조류의 바이오매스와 조류의 가루는 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 10,000 콜로니 형성 단위 (CFU) 미만 또는 이와 대등한, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 7,500 CFU 미만 또는 이와 대등한, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 5,000 CFU 또는 이와 대등한, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 2,500 CFU 또는 이와 대등한 오염 미생물을 포함할 수 있다.
이 조류의 바이오매스와 조류의 가루는 오염 미생물을 포함할 수 있는데, 여기에서 상기 오염 미생물은 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 200 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 효모, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 150 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 효모, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 100 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 효모, 또는 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 50 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 효모로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 이 조류의 바이오매스 및 조류의 가루는 오염 미생물을 포함할 수 있는데, 여기에서 상기 오염 미생물은 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 200 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 균류, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 150 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 균류, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 100 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 균류, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 50 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 균류로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 이 조류의 바이오매스 및 조류의 가루는 오염 미생물을 포함할 수 있는데, 여기에서 상기 오염 미생물은 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 10 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 장내 세균, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 8 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 장내 세균, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 5 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 장내 세균으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 이 조류의 바이오매스와 조류의 가루는 오염 미생물을 포함할 수 있는데, 여기에서 상기 오염 미생물은 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 10 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 대장균(Escherichia coli), 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 8 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 대장균, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 6 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 대장균, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 4 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 대장균으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 이 조류의 바이오매스 및 조류의 가루는 오염 미생물을 포함할 수 있는데, 여기에서 상기 오염 미생물은 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 20 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 스타필로코카이(Staphyococci), 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 15 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 스타필로코카이, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 10 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 스타필로코카이, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g 당 5 CFU 미만 또는 이와 대등한 오염 스타필로코카이로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 이 조류의 바이오매스 및 조류의 가루는 오염 미생물을 포함할 수 있는데, 여기에서 오염 살모넬라(Salmonella), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 또는 리스테리아( Listeria)는 50 g의 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루에서 탐지불가능하며, 25 g의 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루에서 탐지불가능하며, 20 g의 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루에서 탐지불가능하며, 15 g의 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루에서 탐지불가능하며, 10 g의 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루에서 탐지불가능하다.
오염 미생물의 양은 당업계의 숙련자들에게 공지되어 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들면, 총 일반 세균 수, 장내세균(coliform) 및 대장균(E. coli), 살모넬라(Salmonella), 및 리스테리아(Listeria) 오염은 각각 AOAC 966.23, 966.24, 2004.03 및 999.06으로 측정할 수 있다. 효모 및 균류 오염은 FDA-BAM, 7th edition에 공개된 방법들을 이용하여 측정할 수 있고; 스타필로코카이(Staphylococci) 및 슈노모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)는 USP31, NF26, 2008를 이용하여 측정할 수 있고; 이와 유사한 것들도 같다.
일부 구체예들에서, 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스와 같은 식품 조성물 및 식품 성분들은 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10, 서열 번호:11, 서열 번호:12, 서열 번호:13, 서열 번호:14, 서열 번호:15, 서열 번호:16, 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:26 및 서열 번호:27로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 초과의 서열에 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 23S rRNA 게놈 서열 동일성을 보유하는 조류로부터 유도된다.
B. 착색이 없거나 또는 착색이 상당히 감소된 미세조류 균주를 만드는 방법들
클로레라(Chlorella)와 같은 미세조류는 광합성 또는 유기영양 성장을 할 수 있다. 탄소원은 고정된 탄소 원천이며 빛이 없는 유기 영양 조건하에서 성장하였을 때, 정상적인 녹색을 띈 미세조류는 노란 색을 가지고, 녹색 착색은 없거나 또는 상당히 감소된다. 녹색 착색이 감소된 (또는 없는) 미세조류는 식품 성분으로 유익할 것이다. 녹색 착색이 감소된 (또는 없는) 미세조류의 한 가지 장점은 이 미세조류의 클로로필 풍미가 감소되었다는 점이다. 녹색 착색이 감소된 (또는 없는) 미세조류의 또 다른 장점은 식품 성분으로써, 이 미세조류를 식재료에 추가해도 소비자들에게 비호감일 수 있는 녹색을 부여하지 않을 것이라는 점이다. 유기영양 조건하에 성장한 미세조류의 감소된 녹색 착색은 일시적인 것이다. 광영양성 성장으로 되돌아갈 때, 광영양성 성장 및 유기영양 성장을 모두 할 수 있는 미세조류는 다시 녹색 착색을 얻게 될 것이다. 추가적으로, 녹색 착색이 감소되었더라도, 유기영양적으로 성장한 미세조류는 노란색이며, 이는 소비자들이 식재료의 색은 흰색 또는 옅은 색이라고 기대하는 일부 식품 분야에는 적합하지 않을 수 있다. 따라서, 유기영양 성장(따라서 녹색 착색이 감소되거나 또는 없다)을 할 수 있고, 또한 노란색 착색도 감소된(따라서 식품에 적용하기 위한 중성 색) 미세조류 균주를 생산하는 것이 유익하다.
이러한 착색이 없는 또는 착색이 상당히 감소된 미세조류 균주를 생산하는 한 가지 방법은 돌연변이생성 및 원하는 표현형을 스크리닝하는 것을 통한다. 몇 가지 돌연변이 생성 방법들이 공지되어 있으며, 당업계에서 실시된다. 예를 들면, Urano et al., (Urano et al., J Bioscience Bioengineering (2000) v. 90(5): pp. 567-569)은 UV 조사(irradiation)를 이용하여 생성된 클로레라 엘립소이데(Chlorella ellipsoidea)의 노란색 및 흰색 돌연변이체를 개시한다. Kamiya (Kamiya, Plant Cell Physiol. (1989) v. 30(4): 513-521)는 클로레라 불가리스(Chlorella vulgaris)의 무색 균주 11h (M125)를 개시한다.
UV 조사에 의한 돌연변이 생성에 추가하여, 착색이 감소된 (또는 없는) 미세조류를 만들기 위하여 화학적 돌연변이 생성을 적용할 수 있다. 에틸 메탄술포네이트 (EMS) 또는 N-메틸-N’니트로-N-니트로구아니딘(NTG)과 같은 화학적 돌연변이 유도물질은 효모, 균류, 미코박테리움 및 미세조류를 포함한 다양한 미생물에서 효과적인 화학 돌연변이 유도물질임을 보여주었다. 돌연변이생성은 몇 차례 과정으로 실행될 수 있는데, 이때 이 미세조류는 돌연변이 유도물질 (UV 또는 화학물질 또는 둘다)에 노출되고, 그 다음 원하는 감소된 착색 표현형을 가진 것을 스크리닝한다. 그 다음, 원하는 표현형을 가진 콜로니를 플레이트상에 도말하고, 다시 분리하여 돌연변이가 한 세대에서 다음 세대까지 안정적인지 그리고, 콜로니는 순수한지, 혼합 집단이 아닌지를 확인한다.
특정 예에서, 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)를 UV 및 화학적 돌연변이생성을 복합 이용하여 착색이 없거나 감소된 균주를 만들기 위해 사용하였다. 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)는 NTG로 화학적 돌연변이 생성 과정에 노출시키고, 색 돌연변이체에 대해 콜로니를 스크리닝하였다. 색 돌연변이를 나타내지 않는 콜로니는 그 다음 UV 조사 단계의 대상이 되었고, 다시 색 돌연변이체에 대해 스크리닝하였다. 한 구체예에서, 착색이 없는 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 균주를 단리하였고, Budapest Treaty에 따라 2009년 10월 13일 the American Type Culture Collection at 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209에 기탁하여, 특허 기탁 번호 PTA-10397를 부여받은 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 33-55이다. 또 다른 구체예에서, 감소된 착색을 가진 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 균주를 단리하였고, Budapest Treaty에 따라 2009년 10월 13일 the American Type Culture Collection at 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209에 기탁하여, 특허 기탁 번호 PTA-10396을 부여받은 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 25-32이다.
C. 미세조류를 위한 배지 및 배양 조건들
미세조류는 본 발명의 방법에 따라 바이오매스를 증식하기 위하여 액체 배지에 배양한다. 본 발명의 방법들에서, 미세조류의 종은 빛 없이 고정된 탄소 및/또는 고정된 질소 원천을 함유하는 배지에서 성장한다. 이러한 성장은 유기영양 성장으로 알려져 있다. 일부 미세조류 종의 경우, 예를 들면, 제한된 질소 조건하에 10 내지 15일 또는 그 초과와 같은 연장된 시간 동안의 유기 영양 성장은 세포 내에 높은 지질 함량의 축적을 가져온다.
미세조류의 배양 배지는 고정된 탄소 원천 (하기에서 논의함), 고정된 질소 원천 (가령, 단백질, 대부 식사, 효모 추출물, 옥수수 침출액(cornsteep liquor), 암모니아 (순수 또는 염의 형태), 질산 또는 질산염), 미량 원소들 (예를 들면, 아연, 붕소, 코발트, 구리, 망간 및 몰리브덴, 가령, ZnCl2, H3BO3, CoCl2·6H2O, CuCl2·2H2O, MnCl2·4H2O 및 (NH4)6Mo7O24·4H2O의 형태로), 임의 선택적으로 pH 유지를 위한 완충액, 및 인산염 (인의 원천; 다른 인산염 염 형태를 이용할 수 있다)과 같은 성분들을 일반적으로 함유한다. 기타 성분들은 특히, 해수 미세조류를 위하여 염화나트륨과 같은 염을 포함한다.
특정 실시예에서, 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)를 배양하는데 적합한 배지는 Proteose Medium를 포함한다. 이 배지는 무균 배양에 적합하며, 배지 1 L 용적(pH ~6.8)은 1g의 프로테오즈 펩톤을 1 리터의 Bristol Medium에 추가하여 만들 수 있다. Bristol 배지는 수성 용액 안에 2.94 mM NaNO3, 0.17 mM CaCl2·2H2O, 0.3 mM MgSO4·7H2O, 0.43 mM, 1.29 mM KH2PO4, 및 1.43 mM NaCl을 포함한다. 1.5% 한천 배지의 경우, 15 g의 한천을 용액 1L에 추가할 수 있다. 이 용액을 회수하고, 오토클레이브(autoclave)하고, 그 다음 사용 전까지 냉장보관한다. 건중량 백분율로서 높은 오일 수준으로 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)를 성장 및 증식시키는 다른 방법들은 설명되어 있다 (예를 들면, Miao and Wu, J. Biotechnology, 2004, 11:85-93 and Miao and Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846 (55% 건조 세포 중량의 오일을 수득하기 위한 발효 방법을 설명). 질소 제한 하에 과량의 탄소원을 제공하면서 발효 기간을 늘림으로써 오일 함량이 높은 조류를 일반적으로 생성시킬 수 있다.
고체 및 액체 성장 배지는 광범위한 다양한 원천으로부터 일반적으로 이용가능하며, 광범위한 유기체 균주에 적합한 특정 배지의 조제에 관한 지침은 오스틴 텍사스 대학, 조류의 배양 수집(UTEX)에서 관리하는 사이트, http://www.utex.org/에서 찾아볼 수 있다. 예를 들면, 다양한 담수 배지는 1/2, 1/3, 1/5, 1X, 2/3, 2X CHEV Diatom Medium; 1:1 DYIII/PEA + Gr+; Ag Diatom Medium; Allen Medium; BG11-1 Medium; Bold 1NV 및 3N Medium; Botryococcus Medium; Bristol Medium; Chu's Medium; CR1, CR1-S, 및 CR1+ Diatom Medium; Cyanidium Medium; Cyanophycean Medium; Desmid Medium; DYIII Medium; Euglena Medium; HEPES Medium; J Medium; Malt Medium; MES Medium; 변형된 Bold 3N Medium; 변형된 COMBO Medium; N/20 Medium; Ochromonas Medium; P49 Medium; Polytomella Medium; Proteose Medium; Snow Algae Media; Soil Extract Medium; Soilwater: BAR, GR-, GR-/NH4, GR+, GR+/NH4, PEA, Peat, 및 VT Medium; Spirulina Medium; Tap Medium; Trebouxia Medium; Volvocacean Medium; Volvocacean-3N Medium; Volvox Medium; Volvox-Dextrose Medium; Waris Medium; and Waris+Soil Extract Medium를 포함한다. 다양한 해수 배지는 다음을 포함한다: 1%, 5%, 및 1X F/2 Medium; 1/2, 1X, and 2X Erdschreiber’s Medium; 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1X, 5/3, 및 2X Soil+Seawater Medium; 1/4 ERD; 2/3 Enriched Seawater Medium; 20% Allen + 80 % ERD; Artificial Seawater Medium; BG11-1 +.36% NaCl Medium; BG11-1 + 1% NaCl Medium; Bold 1NV:Erdshreiber (1:1) 및(4:1); Bristol-NaCl Medium; Dasycladales Seawater Medium; 1/2 and 1X Enriched Seawater Medium, ES/10, ES/2, 및 ES/4 포함; F/2+NH4; LDM Medium; 변형된 1X and 2X CHEV; 변형된 2X CHEV + Soil; 변형된 Artificial Seawater Medium; Porphridium Medium; 및 SS Diatom Medium.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 기타 적합한 배지는 상기에서 확인된 URL에 자문하거나 또는 미생물 배양물을 유지하는 다른 기관, 가령, SAG, CCAP, 또는 CCALA에 자문하여 바로 확인할 수 있다. SAG는 Culture Collection of Algae at the University of G(G, Germany)를 말하며, CCAP는 스코틀랜드의 해양 과학 협회(Scotland, United Kingdom)에서 관리하는 Culture Collection of Algae and protozoa을 말하며, CCALA는the Culture Collection of Algal laboratory at the Institute of Botany (T, Czech Republic)을 말한다.
본 발명의 방법들에 따른 유용한 미생물은 전세계적으로 다양한 지역 및 환경들에서 찾을 수 있다. 다른 종으로부터 그들의 고립 및 이들의 결과적인 진화론적 다양성의 결과로, 최적의 성장 및 임의의 특정 미생물 종으로 부터의 및 오일 및/또는 지질 및/또는 단백질을 생성하기 위한 특정 성장 배지는 예측하기가 곤란하거나 또는 불가능할 수 있지만, 당업계 숙련자들은 여기에서 설명된 것을 바탕으로 일상적인 테스트를 통하여 적합한 배지를 용이하게 찾을 수 있을 것이다. 일부 경우들에서, 특정 미생물 균주는 이 특정 미생물 균주에서 요구하는 일부 필수 영양 요구물질이 없거나, 일부 억제 성분이 존재하기 때문에 특정 성장 배지에서 성장하지 못할 수도 있다. 하기 실시예들은 건조 세포 중량의 백분율로써 높은 수준의 지질을 축적시키기 위하여 다양한 종의 미세조류를 배양하는 예시적인 방법들을 제공한다.
고정된 탄소원은 배지의 주요 성분이다. 본 발명의 목적에 맞은 적합한 고정된 탄소 원천은 예를 들면, 글루코오즈, 푸락토즈, 슈크로즈, 갈락토즈, 크실로오스, 만노즈, 람노오스, 아라비노즈, N-아세틸글루코사민, 글리세롤, 플로리도시드, 글루쿠론산, 및/또는 아세테이트를 포함한다. 본 발명에 따라 미세조류를 배양하기 위한 기타 탄소원은 글리세롤과 글루코오즈의 혼합물, 글루코오즈와 크실로오스의 혼합물, 푸락토즈와 글루코오즈의 혼합물, 및 슈크로즈 및 해중합된(depolymerized) 사탕무 과육의 혼합물과 같은 혼합물을 포함한다. 미세조류를 배양하는데 이용되는 적합한 기타 탄소원은 흑액(black liquor), 옥수수 전분, 해중합된 셀룰로오스 물질 (예를 들면, 옥수수 여물, 사탕무 과육, 및 스위치글래스로부터 유도된), 락토오즈, 우유 유장, 당밀, 감자, 쌀, 수수, 슈크로즈, 사탕무, 사탕수수, 및 밀을 포함한다. 하나 또는 초과의 탄소원(들)은 적어도 약 50 μM, 적어도 약 100 μM, 적어도 약 500 μM, 적어도 약 5 mM, 적어도 약 50 mM, 및 적어도 약 500 mM의 농도로 공급될 수 있다.
따라서, 다양한 구체예들에서, 성장 배지에 이용된 고정된 탄소 에너지 원은 글리세롤 및/또는 5- 및/또는 6-탄당, 가령, 글루코오즈, 푸락토즈, 및/또는 크실로오스를 포함하는데, 이들은 슈크로즈 및/또는 해중합된 셀룰로오스 물질을 포함한 셀룰로오스 물질로부터 유도할 수 있다. 다양한 클로레라 종 및 이 종안의 다양한 균주는 미국 특허 출원 공개 번호 20090035842, 20090011480, 20090148918, 및 PCT 특허 출원 공개 번호 2008/151149(이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다)에서 설명된 것과 같이, 슈크로즈, 해중합된 셀룰로오스 물질, 및 글리세롤 존재하에 성장할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 미생물은 공급원료로서 해중합된 셀룰로오스 바이오매스를 이용하여 배양한다. 다른 공급원료 가령, 옥수수 전분 또는 사탕수수 또는 사탕무의 슈크로즈와는 반대로, 셀룰로오스 바이오매스 (해중합된 또는 다른 방법으로)는 인간 소비용으로 적합하지 않고, 저비용으로 이용가능할 수 있으며, 이는 본 발명의 목적에 유익하다. 미세조류는 해중합된 셀룰로오스 물질에서 증식할 수 있다. 셀룰로오스 물질들은 일반적으로 40-60 건중량%의 셀룰로오스; 20-40 건중량%의 반-셀룰로오스; 및 10-30 건중량%의 리그닌을 포함한다. 적합한 셀룰로오스 물질들은 풀 및 목재 에너지 곡물의 잔류물 뿐만 아니라 농업용 수확물, 가령, 1차 식품 및 섬유 제품 분야에서 제거되지 않은 식물 부분, 주로 줄기와 잎에 잔류물을 포함한다. 실시예들은 농업용 폐기물 가령, 사탕수수 버개스, 쌀 겉껍질, 옥수수 섬유 (줄기(대), 잎, 깍지, 및 옥수수속을 포함), 밀 짚, 쌀 짚, 사탕무 과육, 감귤류 과육, 감귤류 껍질; 산림 폐기물 가령, 경질목재 및 연질목재 판(thinnings), 및 목재 작업으로부터 경질목재 및 연질목재 잔류물; 나무 폐기물 가령, 제재소 폐기물(나무 조각들, 톱밥) 및 펄프 공장 폐기물; 도시 폐기물 가령, 지방자치 고형 폐기물의 종이 조각들, 도시 나무 폐기물 및 도시 녹색 폐기물, 가령, 지방자치 단체의 풀 깍기; 및 목조 건축물 폐기물을 포함한다. 추가적인 셀룰로오스는 전용 셀룰로오스 수확물 가령, 스위치글래스, 하이브리드 포플라 나무(hybrid poplar wood), 및 미스칸투스(miscanthus), 섬유 줄기(cane), 및 섬유 수수를 포함한다. 이러한 물질들로부터 만들어진 오탄당은 크실로오스를 포함한다. 예를 들면, 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)는 옥수수 여물 및 사탕무 과육으로부터 셀룰로오스-유도된 당을 이용하여 유기영양 조건하에 성공적으로 재배될 수 있다.
일부 미생물은 셀룰로오스 물질로 가공할 수 있고, 셀룰로오스 물질들을 직접적으로 탄소원으로 이용할 수 있다. 그러나, 셀룰로오스 물질은 일반적으로 접근가능한 표면 영역을 증가시키기 위하여 처리를 요하거나 또는 탄소원으로 미생물의 이용을 위하여 셀룰로오스가 조제물로 우선 분해될 수 있도록 처리를 요한다. 효소 분해를 위해 셀룰로오스 물질을 준비하거나 또는 전-처리하는 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 이 방법들은 두 가지 주요 범주로 나뉜다: (1) 접근가능한 표면 영역을 증가시키기 위하여 셀룰로오스 물질을 더 작은 입자로 분해; 및 (2) 효소 분해를 위한 이용가능한 기질을 만들기 위하여 이 셀룰로오스 물질을 화학적으로 처리.
접근가능한 표면 영역을 증가시키는 방법들은 스팀 폭발(steam explosion)을 포함하는데, 이는 셀룰로오스 물질들을 분해하기 위하여 고온의 스팀을 이용하는 것이다. 이 프로세스의 고온 요구조건 때문에, 셀룰로오스 물질의 일부 당은 손실될 수 있고, 따라서 효소 분해를 위하여 이용가능한 탄소원이 감소된다(예를 들면, Chahal, D.S. et al., Proceedings of the 2nd World Congress of Chemical Engineering; (1981) and Kaar et al., Biomass and Bioenergy (1998) 14(3): 277-87 참고). 암모니아 폭발은 더 낮은 온도에서 셀룰로오스 물질의 폭발을 허용하나, 실행하는데 더 비용이 들고, 암모니아가 뒤이은 효소 분해 프로세스를 간섭할 수 있다(예를 들면, Dale, B.E. et al., Biotechnology and Bioengineering (1982); 12: 31-43). 또 다른 폭발 기술은 셀룰로오스 물질을 더 작은 단편들로 파괴하기 위하여 초임계 이산화탄소 폭발을 이용하는 것과 관련있다(예를 들면, Zheng et al., Biotechnology Letters (1995); 17(8): 845-850).
효소 분해를 위한 이용가능한 기질을 만들기 위하여 셀룰로오스 물질을 화학적으로 처리하는 방법들 또한 당업계에 공지되어 있다. 미국 특허 제7,413,882호는 발효 브로스(broth)에 베타-글루코시다제를 분비하는 유전으로 조작된 미생물의 이용과 셀룰로오스 물질을 이 발효 브로스로 처리하여 셀룰로오스 물질이 글루코오즈로 가수분해를 강화시키는 것을 개시한다. 셀룰로오스 물질은 후속 효소 분해를 지원하기 위하여 강산 및 강염기로 또한 처리할 수 있다. 미국 특허 제3,617,431호는 알칼리 분해를 이용하여 셀룰로오스 물질들을 분해시키는 것을 개시한다.
클로레라(Chlorella)는 크실로오스 및 글루코오즈의 조합, 가령, 해중합된 셀룰로오스 물질을 포함하는 배지에서 증식할 수 있고, 놀랍게도, 일부 종은 글루코오즈 또는 크실로오스 단독으로 배양하였을 때보다 글루코오즈와 크실로오스의 조합에서 배양하였을 때 더 높은 생산성을 나타내었다. 따라서, 특정 미세조류는 탄소원으로써 셀룰로오스 물질 (또는 전-처리된 셀룰로오스 물질) 또는 글리세롤과 같은 먹을 수 없는 다른 공급원료를 이용할 수 있고, 식용 오일을 생산할 수 있다. 이는 일반적으로 인간의 식품 사슬의 일부가 되지 않는 먹을 수 없는 셀룰로오스와 글리세롤(사탕수수 및 사탕무로부터 옥수수 글루코오즈 및 슈크로즈와 반대로)을 고영양소의, 식용 오일로의 전환을 허용하고, 인간의 일일 식사의 일부분으로 영양소 및 칼로리를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 먹을 수 없는 공급원료를 고영양소의 식용 오일, 식품, 및 식품 조성물로 전환시키는 방법들을 제공한다.
분비가능한 슈크로즈 전환효소(invertase)를 발현시키는 유기체와 공동 배양된 미세조류 또는 슈크로즈 전환효소를 함유하는 배지에서 배양된 미세조류 또는 외생성 슈크로즈 전환효소 유전자를 발현시키는 미세조류 (이때 전환효소는 분비되거나 또는 이 유기체가 슈크로즈 수송자(transporter)를 또한 발현시킨다)는 사탕수수의 폐기물 당밀 또는 슈크로즈의 다른 원천에서 증식할 수 있다. 식용 오일의 생산에 있어서 이러한 저급의, 슈크로즈 함유 폐기물의 사용은 상당한 비용 절감을 제공할 수 있다. 따라서, 여기에서 설명된 것과 같이, 슈크로즈 공급원료 상에서 미세조류를 배양하는 방법들, 및 식품 조성물 및 영양 보충제를 제조하는 방법들은 낮은 영양소의 슈크로즈를 높은 영양소의 오일 (올레산, DHA, ARA, 등) 및 이러한 오일을 함유하는 바이오매스로 전환시키는 수단을 제공한다.
상기 언급한 특허 공보에서 상세하게 설명된 것과 같이, 다양한 별개의 클로레라(Chlorella) 종 및 균주들은 정제된 시약-등급의 글리세롤에서 뿐만 아니라, 바이오디젤 에스테르교환반응의 산성(acidulated) 및 비-산성(non-acidulated) 글리세롤 부산물에서도 또한 잘 증식한다. 놀랍게도, 일부 클로레라(Chlorella) 균주들은 글루코오즈가 존재할 경우보다 글리세롤이 존재할 때 더 신속하게 세포 분열을 한다. 세포들은 우선 글리세롤을 공급받아 세포 밀도를 신속하게 증가시키고, 그 다음 글루코오즈를 공급받아 지질을 축적하는 2단계 성장 프로세스는 이의 지질 생산 효율을 개선시킬 수 있다.
건세포 중량의 백분율로서 지질을 증가시키는 또 다른 방법은 이 미세조류를 위한 공급원료로 아세테이트의 이용과 관련되어 있다. 아세테이트는 지방산 합성을 시작하는 대사점에 직접적으로 공급한다 (가령, 아세틸-CoA); 따라서 배지에 아세테이트의 공급은 지방산 생산을 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 이 미생물은 미생물의 지질 및/또는 지방산 수율을 증가시키기 위하여, 특히, 아세테이트가 없을 경우의 수율과 비교하여 미생물의 지질 및/또는 지방산 수율을 증가시키기 위하여, 충분한 양의 아세테이트 존재하에 배양한다. 아세테이트 공급은 건세포 중량의 높은 백분율로 지질을 보유한 미세조류의 바이오매스를 생산하기 위하여 여기에서 제시하는 방법의 유용한 성분이다.
또 다른 구체예에서, 지질 경로 효소 (가령, 지방산 합성 효소)에 대한 하나 또는 초과의 보조인자(cofactor) 존재하에 지질-생산 미세조류를 배양함으로써 지질 수율dl 증가된다. 일반적으로, 보조인자의 농도는 이 공인자(들)가 없을 경우 미생물의 지질 수율을 넘어서서 미생물의 지질(가령, 지방산) 수율을 증가시키는데 충분하다. 특정 구체예들에서, 이 보조인자(들)은 이 보조인자(들)을 분비하는 미생물을 배양물에 포함시키거나 또는 배양 배지에 이 보조인자(들)을 추가함으로써 배양물에 제공된다. 대안으로, 보조인자의 합성에 참여하는 단백질을 인코드하는 외생 유전자를 발현시키도록 이 미세조류를 조작할 수 있다. 특정 구체예들에서, 적합한 보조인자들은 지질 경로 효소에 필요한 임의의 비타민, 예를 들면, 바이오틴 또는 판토텐산염을 포함한다.
미세조류로부터 얻은 지질 함량이 높은 바이오매스는 지질 함량이 낮은 바이오매스와 비교하여 식품에 첨가하기에 유익한 물질인데, 그 이유는 식품 조성물에 동량의 지질을 통합시키기 위하여 더 적은 양의 미세조류의 바이오매스를 추가할 수 있기 때문이다. 지질 함량이 높은 미세조류로 부터의 건강에 좋은 오일은 지질 함량이 낮은 바이오매스와 비교하였을 때, 질감 및 맛과 같은 다른 속성의 변경없이 식품에 추가할 수 있기 때문에 유익하다. 본 발명의 방법들에 의해 제공되는 지질 함량이 높은 바이오매스는 일반적으로 건세포 중량의 적어도 25%의 지질을 보유한다. 프로세스 조건들은 지질의 세포 중량 백분율을 증가시키도록 조정할 수 있다. 예를 들면, 특정 구체예들에서, 미세조류는 글루코오즈와 같은 고정된 탄소원을 과량으로 공급하면서, 예를 들면, 질소, 인, 또는 황과 같은 하나 또는 초과의 영양소의 제한된 농도 존재하에서 배양한다. 질소 제한은 질소가 과량으로 제공된 배양물에서의 미생물의 지질 수율을 넘어서도록 미생물의 지질 수율을 증가시키는 경향이 있다. 특정 구체예들에서, 지질 수율의 증가는 적어도 약 10%, 50%, 100%, 200%, 또는 500%이다. 이 미생물은 총 배양 시간의 일부 동안 또는 전체 기간 동안 제한된 양의 영양소의 존재하에 배양될 수 있다. 일부 구체예들에서, 영양소 농도는 총 배양 기간 동안 제한 농도와 비-제한 농도 사이를 적어도 2회 순환된다.
안정 성장 상태(steady state)에서, 이 세포들은 오일을 축적하지만, 세포 분열을 하지는 않는다. 본 발명의 한 구체예에서, 이 성장 상태는 (단, 고정된 질소원을 제외하고) 고유 성장 배지의 모든 성분들을 이 세포들에게 지속적으로 제공함으로써 유지된다. 연장된 시간 동안 세포들에게 고정된 질소원을 제외한 원래 공급된 모든 영양소를 공급하여 미세조류의 세포들을 배양하면, 건세포 중량의 높은 지질 비율을 초래한다.
다른 구체예들에서, 지질 함량이 높은 바이오매스는 적어도 1주 또는 2주와 같이 연장된 시간 동안 모든 고정된 질소가 소비된 후, 이 세포들에게 고정된 탄소원을 공급하여 만든다. 일부 구체예들에서, 세포들은 20일 초과 동안 고정된 탄소원 존재하에, 및 고정된 질소원 부재하에 오일을 축적하는 것이 허용된다. 여기에서 설명된 또는 당업계에 공지되어 있는 조건을 이용하여 성장시킨 미세조류는 적어도 약 20 건중량%의 지질을 포함할 수 있고, 종종 35 건중량%, 45%, 55%, 65%, 및 심지어 75% 또는 그 초과의 지질을 포함한다. 따라서, 미생물의 지질 생산에서 지질의 건세포 중량 백분율은 유기영양 성장 상태 - 이때 이들 세포는 탄소를 소비하고, 오일을 축적하지만, 세포 분할은 하지 않는 - 에 세포를 유지시킴으로써 개선될 수 있다.
조류로 부터의 고단백질 바이오매스는 식품 함유물로 또 다른 유익한 물질이다. 본 발명의 방법들은 이의 건세포 중량으로 적어도 30%의 단백질을 보유한 바이오매스를 또한 제공할 수 있다. 단백질의 세포 중량 백분율을 증가시키기 위하여 성장 조건들을 조정할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 미세조류는 질소가 풍부한 환경과, 글루코오즈 또는 상기에서 논의한 기타 임의의 탄소 원천과 같은 고정된 탄소 에너지의 과량 존재하에 배양한다. 과량의 질소가 있는 조건은 질소가 과량으로 제공되지 않은 배양물에서의 미생물의 단백질 수율보다 미생물의 단백질 수율을 증가시키는 경향이 있다. 최대 단백질 생산을 위하여, 이 미생물은 총 배양 기간 동안 과량의 질소 존재하에 바람직하게 배양된다. 미세조류를 위한 적합한 질소원은 유기 질소원 및/또는 무기 질소원으로부터 유래할 수 있다. 고단백질 바이오매스의 지질 함량은 30wt% 미만, 20% 미만 또는 10% 미만의 지질이다.
1900년대 초기이후로 미생물 배양에 유기 질소원이 이용되어왔었다. 옥수수 침출액과 같은 유기 질소원의 이용은 균류로부터 페니실린의 생산과 함께 대중화되었다. 연구자들은 배양 배지에 옥수수 침출액을 포함시키면 미생물의 성장이 증가되었고, (페니실린과 같은) 산물의 수율도 증가되는 것을 발견했다. 옥수수 침출액의 분석은 질소 및 비타민 가령, 복합 B 비타민, 리보플라빈 판토테닌산, 니아신, 이노시톨 및 미네랄 영양소 가령, 칼슘, 철, 마그네슘, 인, 및 칼륨의 풍부한 원천이었다는 것을 측정하였다(Ligget and Koffler, Bacteriological Reviews (1948);12(4): 297-311). 유기 질소 원천, 가령, 옥수수 침출액을 효모, 박테리아, 균류 및 기타 미생물의 발효 배지로 이용하여왔었다. 유기 질소원의 비-제한적 예는 효모 추출물, 펩톤, 옥수수 침출액 및 옥수수 스팁(steep) 분말이다. 바람직한 무기 질소원의 비-제한적 예는, 예를 들어 (NH4)2SO4 및 NH4OH를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 본 발명을 실행하기 위한 배양 배지는 오직 무기 질소원만을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명을 실행하기 위한 배양 배지는 오직 유기 질소원만을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명을 실행하기 위한 배양 배지는 유기 및 무기 질소원 혼합물을 포함한다.
본 발명의 방법들에서, 세포들의 생리학적 주기의 다양한 단계를 통하여 미세조류의 세포들을 배양하는데 생물반응기 또는 발효기를 이용한다. 예를 들면, 지질-생산하는 미세조류의 세포들의 접종물(inoculum)을 배지로 도입시킨다; 이 세포들이 증식을 시작하기 전 지체(lag) 기간(지체 단계)이 있다. 지체 기간에 이어서, 증식율은 꾸준하게 증가하고, 로그(log) 또는 기하급수적(exponential) 단계로 진입한다. 기하급수적 단계 이후 다시, 증식이 느려지는데, 이는 질소와 같은 영양소의 감소, 독성 물질들의 증가, 및 정족수 감지 기전(quorum sensing mechanisms) 때문이다. 이렇게 느려진 후, 증식은 중단되고, 이 세포들은 세포에 제공되는 특정 환경에 따라 정체 단계(stationary phase) 또는 성장 안정 상태(steady state)로 진입한다. 단백질이 풍부한 바이오매스를 얻기 위하여, 배양물은 기하급수적 단계 동안 또는 종료 직후 일반적으로 수거된다. 지질이 풍부한 바이오매스를 수득하기 위하여, 배양물은 기하급수적 단계 종료 후에 일반적으로 수거하는데, 이 기하급수적 단계는 질소 또는 또 다른 주요 영양소 (탄소이외의)가 고갈되게 하고, 세포들이 과량으로 존재하는 탄소원을 지질로 전환하도록 강제함으로써 조기에 종료될 수 있다. 배양 조건 매개변수들은 총 오일 생산, 생산된 지질 종의 조합, 및/또는 특이적 오일의 생산을 최적화시키기 위하여 조절될 수 있다.
생물반응기는 유기영양 성장 및 증식 방법들에 사용함에 있어서 많은 장점을 제공한다. 인지하는 것과 같이, 여기에서 설명된 유기영양 성장 및 증식 방법에서 고정된-탄소 원천을 이용할 때, 광합성 성장 방법들에서 세포들이 빛을 이용하도록 만든 설비는 불필요하다. 식품에 사용하기 위한 바이오매스를 생산하기 위하여, 미세조류는 예를 들면, 현탁 배양물과 같은 액체에 다량으로 발효시키는 것이 바람직하다. 강철 발효기와 같은 생물반응기 (5000 리터, 10,000 리터, 40,000 리터, 및 그 초과의 용량이 본 발명의 다양한 구체예들에서 이용된다)는 매우 큰 배양 용적을 수용할 수 있다. 생물반응기는 일반적으로 온도, pH, 산소 압력(oxygen tension), 및 이산화탄소 수준과 같은 배양 조건의 조절을 또한 허용한다. 예를 들면, 생물반응기는 예를 들면, 산소 또는 질소와 같은 가스 성분들이 액체 배양물을 통하여 기포를 형성하는 것을 허용하도록 튜브에 부착된 포트를 이용하여 일반적으로 만들 수 있다.
생물반응기들은 이 미세조류가 재생산되고, 그 수가 증가되는 기간 동안 생물반응기를 통하여 배양 배지가 흐르도록 설계할 수 있다. 일부 구체예들에서, 예를 들면, 세포들을 접종한 후, 그러나 이 세포들이 원하는 밀도에 도달하기 전, 생물반응기 안으로 배지를 주입시킬 수 있다. 다른 경우들에서, 배양 시작시에 생물반응기에 배양 배지를 채우고, 배양물이 접종된 후, 추가의 배양 배지를 주입하지 않는다. 환언하면, 이 미세조류의 바이오매스는 이 미세조류가 재생산하고 그 수가 증가하는 기간 동안 수성 배지에서 배양되지만; 그러나, 이 기간 동안 생물반응기를 통하여 수성 배양 배지의 양이 흐르지는 않는다. 따라서 일부 구체예들에서, 수성 배양 배지는 접종 후 이 생물반응기를 통하여 흐르지 않는다.
스피닝 블레이드(spinning blades) 및 임펠러(impellers), 로킹 기전(rocking mechanisms), 휘젓기 막대(stir bar), 가압 가스 주입을 위한 수단과 같은 장치가 갖추어진 생물반응기는 대상 미세조류의 배양물을 혼합되도록 사용될 수 있다. 혼합은 연속적이거나 또는 간헐적일 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 상기 미세조류의 수에서 원하는 증가에 이를 때까지 미세조류의 재생산을 위하여 가스 유입 및 배지 유입의 난류 이동 체제를 유지하지 않는다.
상기에서 간단하게 언급한 것과 같이, 생물반응기는 미세조류의 배양물의 가스 함량을 조절할 수 있도록 하는 다양한 포트를 종종 갖추고 있다. 설명하자면, 생물반응기의 용적의 일부는 액체라기 보다는 가스일 수 있고, 이 생물반응기의 가스 주입구는 가스를 생물반응기 안으로 펌프하도록 한다. 생물반응기 안으로 유익하게 펌핑될 수 있는 가스는 공기, 공기/CO2 혼합물, 아르곤과 같은 영족기체(noble gases), 및 기타 가스들을 포함한다. 생물반응기들은 사용자가 일반적으로 이 생물반응기 안으로 가스의 진입 속도를 조절할 수 있도록 되어있다. 상기에서 언급한 것과 같이, 생물반응기 안으로 가스 흐름의 증가를 이용하여 이 생물반응기 배양물의 혼합을 증가시킬 수 있다.
증가된 가스 흐름은 배양물의 탁도(turbidity)에도 영향을 준다. 생물반응기 안으로 진입하는 가스는 배양물의 표면에 기포를 형성하도록 수성 배양 배지의 수준 아래로 가스 진입 포트를 배치함으로써, 난류(Turbulence)를 얻을 수 있다. 하나 또는 초과의 가스 배출 포트는 가스가 빠져나가도록 하고, 이로 인하여 생물반응기 내에 압력의 증가를 방지한다. 바람직하게는, 가스 배출 포트는 오염 미생물이 생물반응기 안으로 진입되는 것을 방지하는 “원-웨이”벨브로 이어진다.
여기에서 설명된 생물반응기, 배양 조건, 및 유기영양 성장 및 증식 방법들의 특이적 실시예들을 임의의 적절한 방식으로 조합하여 미생물의 성장 및 지질 및/또는 단백질 생산의 효과를 개선시킬 수 있다.
D. 발효 후 미세조류의 농도
상기에서 설명한 방법에 따라 생성된 미세조류의 배양물은 발효 배지에서 미세조류의 바이오매스를 만든다. 식품 조성물용으로 바이오매스를 준비하기 위하여, 이 바이오매스를 발효 배지로부터 농축 또는 수거한다. 발효 배지로부터 이 미세조류의 바이오매스를 수거하는 시점에서, 이 바이오매스는 수성 배양 배지에 현탁된 대부분 온전한 세포들을 주로 포함한다. 이 바이오매스를 농축시키기 위하여, 탈수 단계를 실시한다. 탈수(dewatering) 또는 농축은 발효 브로스 또는 기타 액체 배지로부터 이 바이오매스를 분리, 즉, 고액 분리를 말한다. 따라서, 탈수 동안, 바이오매스로부터 배양 배지를 제거하고(예를 들면, 이 바이오매스를 남기는 필터를 통하여 발효 브로스를 배수시킴으로써), 또는 다른 방법으로, 배양 배지로부터 이 바이오매스를 제거한다. 탈수의 통상적인 프로세스는 원심분리, 여과 및 물리적인 압력의 이용을 포함한다. 이들 프로세스를 개별적으로 또는 임의의 조합으로 이용할 수 있다.
원심분리는 혼합물을 분리하기 위하여 원심력을 이용하는 것과 관련된다. 원심분리 하는 동안, 혼합물에서 좀더 조밀한 성분들은 원심분리 축으로부터 멀리 이동하고, 혼합물에서 덜 조밀한 성분들은 축을 향하여 이동한다. 유효 중력(effective gravitational force)을 증가시킴으로써 (가령, 원심분리 속도를 증가시킴으로써), 좀더 조밀한 물질, 가령, 고체는 덜 조밀한 물질, 가령, 액체로부터 분리되고, 밀도에 따라 분리된다. 바이오매스 및 브로스 또는 기타 수성 용액의 원심분리는 이 미세조류의 세포들을 포함하는 농축된 페스트(paste)를 형성한다. 원심분리는 세포내 상당한 양의 물을 제거하지는 않는다. 사실, 원심분리 후, 이 바이오매스 안에 실질적으로 표면 수분 또는 자유 수분은 여전히 존재할 것이고 (가령, 70% 초과), 따라서, 원심분리를 건조 단계로 간주하지 않는다.
탈수에 여과(Filtration)를 또한 이용할 수 있다. 본 발명에 적합한 여과의 한 예는 횡류 여과(cross-flow filtration)로도 알려진 접선 흐름 여과(tangential flow filtration (TFF))이다. 접선 흐름 여과는 액체로부터 고체를 분리하기 위하여 막 시스템과 흐름력(flow force)을 이용하는 분리 기술이다. 예시적인 적합한 여과 방법을 위하여, Geresh, Carb. Polym. 50; 183-189 (2002)을 참고하는데, 여기에서 MaxCell A/G Technologies 0.45uM 중공 섬유 필터의 사용을 개시한다. 또한, 예를 들면, 100kD, 300kD, 1000 kD (catalog number P2C01MC01), 0.1uM (catalog number P2VVPPV01), 0.22uM (catalog number P2GVPPV01), 및 0.45uM 막 (catalog number P2HVMPV01)과 함께 이용된 Millipore Pellicon 장치를 참고하라. 보류액(retentate)은 상당 수준에서 필터를 통과하지 못하는 것이 바람직하고, 이 보류액 내 산물은 바람직하게는 여과 물질에 흡착하지 않는 것이 바람직하다. TFF는 중공 섬유 여과 시스템을 이용하여 또한 실행할 수 있다. 적어도 약 0.1 ㎛, 예를 들면 약 0.12㎛, 0.14㎛, 0.16㎛, 0.18㎛, 0.2㎛, 0.22㎛, 0.45㎛, 또는 적어도 약 0.65 ㎛의 포어 크기를 가진 필터가 적합하다. TFF의 바람직한 포어 크기는 발효 브로스내 용질 및 찌꺼기들의 통과를 허용하나, 미생물의 세포들의 통과는 허용하지 않는다.
미생물의 바이오매스로부터 액체 발효 브로스를 분리하기 위하여, 탈수는 또한 이 바이오매스에 직접적으로 제공되는 이 바이오매스를 탈수하기에 충분하지만, 세포들의 주된 용해를 야기하지 않는 물리적 압력에 영향을 받을 수 있다. 미생물의 바이오매스를 탈수하기 위한 물리적 압력은 예를 들면, 벨트 필터 프레스를 이용하여 제공할 수 있다. 벨트 필터 프레스는 직경이 감소되는 롤의 세르펜틴을 통하여 두 개의 긴장된 벨트 사이를 통과하는 슬러리(가령, 발효기 또는 생물반응기로부터 바로 꺼낸 미생물의 바이오매스)에 물리적 압력을 제공하는 탈수 장치다. 벨트 필터 프레스는 3개 구역으로 실질적으로 분할될 수 있다: 중력 구역, 다공 벨트를 통하여 중력에 의해 자유 배수 물/액체가 배수된다; 웨지 구역(wedge zone), 압력 적용을 위한 고체가 준비되어 있다; 및 압력 구역, 중력에 의해 배출된 고체에 조정가능한 압력이 적용된다.
농축 후, 미세조류의 바이오매스는 하기에서 설명하는 것과 같이 처리되어 진공-팩 케이크, 조류의 플레이크(flakes), 조류의 균질물, 조류의 분말, 조류의 가루, 또는 조류의 오일을 만들 수 있다.
E. 미세조류의 바이오매스의 화학적 조성물
여기에서 설명된 배양 방법에 의해 생성된 이 미세조류의 바이오매스는 미세조류의 오일 및/또는 단백질 뿐만 아니라, 발효 동안 배양 배지의 미생물에 의해 통합된 또는 미생물에 의해 생성된 기타 구성성분들을 포함한다.
오일/지질 축적의 높은 백분율(건중량)을 가진 미세조류의 바이오매스는 당업계에 공지되어 있는 방법등을 포함하는 상이한 배양 방법들을 이용하여 만들었다. 축적된 오일/지질의 높은 백분율을 가진 미세조류의 바이오매스는 본 발명에 유용하다. 고농도의 철(Fe)을 이용한 독립영양 조건하에 성장한 정체(stationary) 배양물 안에 최대 56.6% (건조 세포 중량(DCW))의 지질을 함유한 클로레라 불가리스(Chlorella vulgaris) 배양물이 개시되었다(Li et al., Bioresource Technology 99(11):4717-22 (2008). 질소 결핍 조건하에 광 생물반응기에서 각각 성장한 60% DCW의 지질과 39.8% DCW의 지질을 함유한 나노클로로프시스(Nanochloropsis sp). 및 케토세로스 칼씨트란스(Chaetoceros calcitrans)가 또한 설명되었다(Rodolfi et al., Biotechnology & Bioengineering (2008)). 광합성적으로 및 낮은 질소 조건하에 성장하였을 때 대략 30% DCW 지질을 함유한 파리에토클로리스 인사이스(Parietochloris incise) 배양물이 설명되었다(Solovchenko et al., Journal of Applied Phycology 20:245-251 (2008)). 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)는 질소 결핍과 특정 유기영양 조건하에 성장하였을 때, 최대 55% DCW의 지질을 생산할 수 있다(Miao and Wu, Bioresource Technology 97:841-846 (2006)). 클로레라 에메르소니(Chlorella emersonii), 클로레라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 및 클로레라 미누티시마(Chlorella minutissima)를 포함하는 기타 클로레라 종은 낮은-질소 배지 조건하에서 교반된 탱크 생물반응기에서 성장하였을 때 최대 63% DCW의 축적된 오일을 보유하였다고 설명하였다(Illman et al., Enzyme and Microbial Technology 27:631-635 (2000)). 증가된 NaCl 조건하에 성장한 두말리엘라 테르티오렉타(Dumaliella tertiolecta)내에 70% 지질(Takagi et al., Journal of Bioscience and Bioengineering 101(3): 223-226 (2006))과 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii) 배양물에서 75% 지질 (Banerjee et al., Critical Reviews in Biotechnology 22(3): 245-279 (2002))을 포함하는, 여전히 더 높은 지질 비율(DCW)이 보고되었다.
유기영양 성장은 상대적으로 낮은 클로로필 함량을 초래한다 (개방된 연못 또는 닫힌 광생물반응기 시스템과 같은 광영양성 시스템과 비교하였을 때). 감소된 클로로필 함량은 일반적으로 미세조류의 감각자극에 반응하는(organoleptic) 성질들을 개선시키고, 따라서 식품으로 더 많은 조류의 바이오매스(또는 이로부터 준비된 오일)의 통합을 허용한다. 유기영양적으로 성장한 미세조류 (가령, 클로레라)에서 발견되는 감소된 클로로필 함량은 광영양적으로 성장한 미세조류와 비교하였을 때, 이 바이오매스에서 녹색을 또한 감소시킨다. 따라서, 감소된 클로로필 함량은 광영양적으로 성장한 미세조류를 함유하는 식품에 관련된 원하지 않는 녹색을 피하게 하고, 식품에 조류의 바이오매스의 통합 또는 통합의 증가를 허용한다. 적어도 하나의 구체예에서, 이 식품은 광영양적으로 성장한 미세조류와 비교하였을 때, 감소된 클로로필 함량을 가진 유기영양적으로 성장한 미세조류를 함유한다. 일부 구체예들에서, 미세조류 분말 또는 조류의 바이오매스의 클로로필 함량은 500ppm 미만, 400ppm 미만, 300ppm 미만, 200ppm 미만, 100ppm 미만, 50ppm 미만, 10ppm 미만, 2ppm 미만, 또는 1ppm 미만이다.
여기에서 설명된 배양 방법들에 의해 만들어진 오일이 풍부한 미세조류의 바이오매스와 조류의 가루는 본 발명에 유용하며, 적어도 10%(DCW) 미세조류의 오일을 포함한다. 일부 구체예들에서, 이 미세조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 적어도 15%(DCW), 25-35%, 30-50%, 50-55%, 50-65%, 54-62%, 56-60%, 적어도 75% 또는 적어도 90%의 미세조류의 오일을 포함한다.
여기에서 설명된 (또는 이 바이오매스 또는 조류의 가루로부터 추출된) 바이오매스의 미세조류의 오일은 하나 또는 초과의 별개의 지방산 에스테르 측쇄들을 가진 글리세로리피드를 포함할 수 있다. 글리세로리피드는 하나, 둘 또는 세 개의 지방산 분자들에 에스테르화된 글리세롤 분자로 구성되는데, 이들 분자들은 길이가 다양할 수 있고, 다양한 수준의 포화도를 보유할 수 있다. 조류의 오일의 특정 블렌드(blend)는 단일 종의 조류로 준비하거나, 또는 두 가지 또는 초과의 종의 미세조류의 바이오매스(또는 조류의 오일)를 함께 혼합하여 준비할 수 있다.
따라서, 이 오일 조성물, 가령, 글리세로리피드의 지방산 구성성분들의 성질 및 비율은 미세조류의 적어도 2가지 별개 종의 바이오매스(또는 오일)을 복합함으로써 조절할 수 있다. 일부 구체예들에서, 미세조류의 적어도 2개의 별개 종은 상이한 글리세로리피드 프로파일을 보유한다. 별개의 종의 미세조류는 여기에서 설명된 것과 같이 함께 또는 따로 배양할 수 있는데, 바람직하게는 유기영양 조건하에서 해당 오일을 생산하도록 배양할 수 있다. 상이한 종의 미세조류는 세포의 글리세로리피드에 상이한 백분율의 별개의 지방산 구성성분들을 함유할 수 있다.
일부 구체예들에서, 이 미세조류의 오일은 18:1 (올레) 오일과 같은, 특히 트리글리세리드 형태의, 단일불포화된(monounsatureated) 오일로 주로 구성된다. 일부 경우들에서, 이 조류의 오일은 적어도 20wt%의 단일불포화된 오일이다. 다양한 구체예들에서, 이 조류의 오일은 적어도 25(wt 또는 용적) %, 50%, 75% 또는 그 초과의 단일불포화된 오일(가령, 18:1)이다. 일부 구체예들에서, 이 단일불포화된 오일은 18:1, 16:1, 14:1 또는 12:1이다. 일부 경우들에서, 이 조류의 오일은 60-75%, 64-70%, 또는 65-69%의 18:1 오일이다. 일부 구체예들에서, 이 미세조류의 오일은 적어도 10%(wt 또는 용적), 20%, 25%, 또는 50% 또는 그 초과의 에스테르화된 올레산 또는 에스테르화된 알파-리놀렌산(특히 트리글리세리드형태의)을 포함한다. 적어도 하나의 구체예에서, 이 조류의 오일은 10%(wt 또는 용적) 미만, 5% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만의 에스테르화된 도코사헥사논산 (DHA (22:6)) (특히 트리글리세리드형태의)을 포함하거나, 또는 실질적으로 포함하지 않는다. 예를 들면, 고함량의 DHA 함유 미세조류, 가령, 크립테코디니움 코니(Crypthecodinium cohnii)의 생산은 미국 특허 제7,252,979호, 제6,812,009호 및 제6,372,460호를 참고한다. 일부 구체예들에서, 추출된 오일 미세조류 분말 또는 조류의 바이오매스의 오일의 지질 프로파일은 2% 미만의 14:0; 13-16%의 16:0; 1-4%의 18:0; 64-70%의 18:1; 10-16%의 18:2; 0.5-2.5%의 18:3; 및 2% 미만의, 탄소쇄 길이가 20 또는 그 초과의 오일인, 오일이다.
미세조류의 바이오매스 (및 이로부터 추출된 오일)는 이 미세조류에 의해 만들어진 다른 구성성분들, 또는 배양 배지로부터 이 바이오매스에 통합된 다른 구성성분들을 또한 포함할 수 있다. 이러한 기타 구성성분들은 이용된 배양 조건들, 미세조류의 종(그리고 가능하다면, 이 바이오매스로부터 미세조류의 오일을 회수하기 위하여 이용한 추출 방법)에 따라, 그 양은 다양하게 존재할 것이다. 일반적으로, 단백질 함량이 높은 미세조류의 바이오매스에서 클로로필 함량은 지질 함량이 높은 미세조류의 바이오매스에서의 클로로필 함량보다 더 높다. 일부 구체예들에서, 이 미세조류의 바이오매스 내의 클로로필 함량은 200 ppm 미만 또는 100 ppm 미만이다. 기타 구성성분들은 인지질 (가령, 조류의 레시틴), 탄수화물, 가용성 및 불용성 섬유, 당단백질, 식물스테롤 (가령, β-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 및 브라시카스테롤), 토코페롤, 토코트리에놀, 카로티노이드 (가령, α-카로틴, β-카로틴, 및 리코펜), 크산토필 (가령, 루테인, 제아산틴, α-크립토산틴, 및 β-크립토산틴), 단백질, 다당류 (가령, 아라비노즈, 만노즈, 갈락토즈, 6-메틸 갈락토즈 및 글루코오즈) 및 다양한 유기 또는 무기 화합물들 (가령, 셀레늄)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 경우들에서, 이 바이오매스 또는 조류의 가루는 적어도 10 ppm의 셀레늄을 포함한다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스 또는 조류의 가루는 적어도 25% w/w의 조류의 다당류를 포함한다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스 또는 조류의 가루는 적어도 15% w/w의 조류의 당단백질을 포함한다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스, 이 바이오매스로부터 유도된 조류의 가루 또는 오일은 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 g당 0-200mcg, 0-115mcg, 또는 50-115 mcg 총 카로티노이드를 포함하고, 특이적 구체예들에서, 총 카로티노이드 함량의 20-70mcg 또는 50-60 mcg은 루테인이다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스 또는 조류의 가루는 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스 g 당 적어도 0.5% 조류의 인지질 또는 약 0.25% 내지 약 1.5%의 총 인지질을 포함한다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스, 이 바이오매스로부터 유도된 조류의 가루 또는 오일은 적어도 0.10㎎/g, 0.02-0.5㎎/g, 또는 0.05-0.3 ㎎/g의 총 토코트리에놀을 함유하고, 특이적 구체예들에서, 0.05-0.25 ㎎/g은 알파토코트리에놀이다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스, 이 바이오매스로부터 유도된 조류의 가루 또는 오일은 0.125 ㎎/g 내지 0.35 ㎎/g의 총 토코트리에놀을 함유한다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스로부터 유도된 조류의 가루 또는 오일은 적어도 5.0, 1-8, 2-6 또는 3-5 ㎎/100 g의 총 토코페롤을 함유하고, 특이적 구체예에서 2-6 ㎎/100 g은 알파 토코페롤이다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스로부터 유도된 조류의 가루 또는 오일은 5.0㎎/100 g 내지 10㎎/100 g의 토코페롤을 함유한다.
일부 경우들에서, 미세조류의 바이오매스의 기타 성분들의 조성은 지질 함량이 높은 바이오매스와 비교하여 단백질 함량이 높은 바이오매스에서 상이하다. 특이적 구체예들에서, 단백질 함량이 높은 바이오매스, 이 조류의 가루 또는 오일은 0.18-0.79 ㎎/100 g의 총 토코페롤을 함유하고, 특이적 구체예들에서, 단백질 함량이 높은 바이오매스, 이 조류의 가루 또는 오일은 약 0.01-0.03 ㎎/g의 토코트리에놀을 함유한다. 일부 경우들에서, 단백질 함량이 높은, 이 조류의 가루 또는 오일 바이오매스는 또한 1-3g/100 g의 총 스테롤을 함유하고, 특이적 구체예들에서, 1.299-2.46g/100 g의 총 스테롤을 함유한다. 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)에서 토코트리에놀 및 토코페롤 조성물의 상세한 설명은 하기 실시예들에 포함된다.
일부 구체예들에서, 이 미세조류의 바이오매스 또는 이 조류의 가루는 20-45 건중량%의 탄수화물을 포함한다. 다른 구체예들에서, 이 바이오매스 또는 이 조류의 가루는 25-40 건중량% 또는 30-35%의 탄수화물을 포함한다. 탄수화물은 식이섬유 뿐만 아니라 슈크로즈와 글루코오즈와 같은 유리당일 수 있다. 일부 구체예들에서, 미세조류의 바이오매스내 유리당은 1-10 건중량%, 2-8%, 또는 3-6%이다. 특정 구체예들에서, 유리당 성분은 슈크로즈를 포함한다.
일부 경우들에서, 이 미세조류의 바이오매스 또는 이 조류의 가루는 적어도 5%의 가용성 섬유를 포함한다. 기타 구체예들에서, 이 미세조류의 바이오매스 또는 이 조류의 가루는 적어도 10%의 가용성 섬유 또는 적어도 20% 내지 35% 가용성 섬유를 포함한다. 일부 구체예들에서, 이 미세조류의 바이오매스 또는 이 조류의 가루는 적어도 5%의 불용성 섬유를 포함한다. 기타 구체예들에서, 이 미세조류의 바이오매스 또는 이 조류의 가루는 적어도 5% 내지 적어도 10%, 또는 적어도 10% 내지 25%, 또는 적어도 25% 내지 50%의 불용성 섬유를 포함한다. 전체 식이섬유는 가용성 섬유와 불용성 섬유의 합이다. 일부 구체예들에서, 이 미세조류의 바이오매스 또는 이 조류의 가루는 적어도 20%의 총 식이섬유를 포함한다. 기타 구체예들에서, 이 미세조류의 바이오매스 또는 이 조류의 가루는 적어도 25%, 50%, 55%, 60%, 75%의 총 식이섬유를 포함한다.
한 구체예에서, 총 섬유의 단당류 함량(총 탄수화물에서 유리당을 뺌)은 1-20%의 아라비노즈; 5-50%의 만노즈; 15-80%의 갈락토즈; 및 10-70%의 글루코오즈이다. 기타 구체예들에서, 총 섬유의 단당류 함량은 약 1-2%의 아라비노즈; 약 10-15%의 만노즈; 약 20-30%의 갈락토즈; 및 55-65%의 글루코오즈이다.
III. 미세조류의 바이오매스를 조류의 가루 및 완제 식품 성분들로 프로세싱
본 발명의 방법들에 따라 생산된 농축된 미세조류의 바이오매스는 그 자체가 완제 식품 성분이며, 추가의 변형 없이, 또는 단지 최소한의 변형으로 식재료에 이용할 수 있다. 예를 들면, 케이크는 진공-포장되거나 냉동될 수 있다. 대안으로, 이 바이오매스는 동결건조(lyophilization), "냉동-건조" 프로세스를 통하여 건조시킬 수 있는데, 여기에서 상기 바이오매스는 진공 상태가 적용되는 냉동-건조 챔버 안에서 냉동된다. 냉동-건조 챔버에 진공을 적용하면 이 바이오매스로부터 물의 순화(1차 건조) 및 탈리(제 2 건조)가 일어난다. 그러나, 본 발명은 농축된 미세조류의 바이오매스에 적용할 수 있는 본 발명의 처리 방법으로부터 야기된 강화된 성질을 가진 미세조류 유래의 다양한 완제 식품 성분들을 제공한다. 조류의 가루는 여기에서 설명된 또는 당업계에 공지되어 있는 조건들하에서 성장하거나, 배양되거나 증식되고 여기에서 설명된 조류의 가루로 가공될 이 조류의 세포들을 포함한다.
대부분 온전한 또는 균질한 형태의 미세조류의 바이오매스의 건조는 여기에서 설명된 방법들 및 조성물에 이 바이오매스를 이용하거나 추가 프로세스를 수월하게 하는 데에 유익하다. 건조는 대부분 온전한 바이오매스로부터 자유 또는 표면 수분/물의 제거 또는 균질화된 (가령, 미분화(micronization)에 의해) 바이오매스의 슬러리로부터 표면의 물을 제거하는 것을 말한다. 이 조류의 바이오매스가 건조되었는지, 및 건조되었다면, 건조 방법에 따라 상이한 질감 및 향이 식품에 부여될 수 있다. 여기에서 설명된 배양된 미세조류로부터 생성된 바이오매스의 건조로 완제 식품 또는 식품 성분들의 바람직하지 않는 성분일 수 있는 물을 제거한다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스의 건조는 좀더 효과적인 미세조류의 오일 추출 프로세스를 실행시킬 수 있다.
한 구체예에서, 농축된 미세조류의 바이오매스는 우선 파괴되고, 그 다음 분무 또는 플래쉬 건조 (가령, 공압 건조 프로세스를 거치게 된)되어 대부분 용해된 세포들을 함유하는 분말을 형성하고, 조류의 가루를 만든다. 또 다른 구체예에서, 이 조류의 가루에 포함된 실질적으로 모든 오일은 추출되고, 탄수화물 (식이섬유 형태를 포함), 단백질 및 잔류 오일 또는 지질로 대부분 구성된 지방을 제거한 조류의 가루가 남는다
일부 구체예들에서, 이 미세조류의 바이오매스, 또는 조류의 가루는 건조 후 15wt% 또는 미만, 10% 또는 미만, 5% 또는 미만, 2-6%, 또는 3-5% 수분을 가진다.
A. 조류의 가루
본 발명의 조류의 가루는 기계적으로 용해되고 균질화된 농축된 미세조류의 바이오매스로부터 준비되고, 이 균질물은 분무 또는 플래쉬 건조되어 분말 형이 된다(또는 또 다른 공압 건조 시스템을 이용하여 건조된다). 조류의 가루의 생산은 세포들이 용해되어 세포의 오일이 방출되어야 하고, 세포 벽과 세포내 성분들은 미분화되거나 또는 입자 크기로 적어도 줄어드는 것을 요구한다. 균질화 직후 또는 균질화 후 실제 곧장 측정한 입자의 평균 크기는 바람직하게는 10㎛ 이하, 25㎛ 이하, 또는 100㎛ 이하이다. 일부 구체예들에서, 평균 입자 크기는 1-10㎛, 1-15㎛, 10-100㎛ 또는 1-40 ㎛이다. 일부 구체예들에서, 평균 입자 크기는 10 ㎛ 초과에서 최대 100㎛이다. 일부 구체예들에서, 평균 입자 크기는 0.1-100㎛이다.
클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 세포의 평균 크기는 약 5 내지 15㎛이다. 여기에서 설명된 조류의 가루로 조제시, 평균 입자 크기는 10 ㎛ 미만이다. 실시예 8에서 교시한 것과 같이, 균질화 조건들을 다양하게 하면, 상이한 크기의 입자가 만들어진다. 당업계 숙련자는 상이한 입자 크기를 얻기 위하여 균질화 조건들을 변화시킬 수 있음을 인지할 것이다.
이 바이오매스 (조류의 바이오매스 입자) 또는 이 조류의 가루 입자를 포함하는 개별 세포들은 다양한 수준으로 응집한다. 한 구체예에서, 덩어리로 되어 있는 조류의 가루 입자 또는 덩어리로 되어 있는 조류의 바이오매스 입자의 크기는 약 1,000 ㎛ 미만, 750 ㎛ 미만, 500 ㎛ 미만, 250 ㎛ 미만, 또는 100 ㎛ 미만이다.
미분화에서 명시한 것과 같이, 특히 개별 입자보다는 덩어리를 측정하는 레이져 회절과 같은 기술에 의해 측정하였을 때, 입자의 평균 크기는 바람직하게는 균질화가 일어난 직후, 또는 실질적으로 균질화 후 곧장(가령, 2주 이내) 측정함으로써, 덩어리형성(clumping)으로 인하여 입자 크기 측정에 잠재적인 외곡을 회피하거나 최소화시킨다. 실질적으로, 균질화로 인한 유액은 입자 크기의 재료 변화없이 냉장고에서 통상 적어도 2주간 보관할 수 있다. 입자 크기를 측정하는 일부 기술들, 가령, 레이져 회절과 같은 기술들은 개별 입자보다는 입자의 덩어리의 크기를 측정한다. 측정된 입자의 덩어리는 개별 입자보다 평균 크기가 더 크다(가령, 1-100 마이크론). 물에 분산된 미세조류 분말의 광 현미경에서 개별 입자와 입자의 덩어리 모두가 나타난다. 충분한 블렌딩(가령, 핸드 블렌드로)과 함께 그러나, 고유 균질화의 반복 없이, 물에 조류의 가루를 분산시키면, 덩어리는 부서질 수 있고, 레이져 회절에 의해 10 ㎛ 이하의 평균 입자 크기를 통상 탐지할 수 있다. 전자 현미경으로부터 입자의 자동화된 크기 분석 소프트웨어는 시판되고 있으며, 입자 크기를 측정하는데 또한 이용할 수 있다. 여기에서 때로, 평균 입자 크기는 평균, 기하학적 평균, 중앙값 또는 최빈값(mode)과 같은 임의의 당업계에서 인식하는 평균의 측정을 지칭할 수 있다. 입자 크기는 입자의 최장 크기, 또는 동등한 용적의 입자의 직경을 포함하는 임의의 당업계에서 인지하는 측정에 의해 측정할 수 있다. 입자가 일반적으로 대략 구형이기 때문에, 이러한 측정은 기본적으로 동일할 것이다.
균질화에 이어서, 오일이 건조 전 분산으로부터 오일이 분리되지 않도록, 생성된 오일, 물, 및 미분화된 입자는 유화된다. 예를 들면, 압력 교란기(disrupter)를 이용하여 세포들을 용해시키기 위하여 좁은 구멍의 벨브를 통하여 세포를 함유하는 슬러리를 펌프할 수 있다. 고압(최대 1500 bar)을 적용하고, 배출 노즐을 통하여 순간 팽창시킨다. 세포 파괴는 벨브상에서 충돌, 구멍에서 고액체 전단(shear) 및 방출시 급작스런 압력 강하의 3가지 상이한 기전에 의해 이루어지고, 이는 세포 폭발을 야기한다. 이 방법은 세포내 분자들을 방출한다. Niro (Niro Soavi GEA) 균질화기 (또는 임의의 기타 고압 균질화기)를 이용하여 대부분 길이가 0.2 내지 5 마이크론인 입자로 세포들을 프로세스할 수 있다. 고압 (대략 1000 bar) 하에서 조류의 바이오매스를 프로세스하면 90% 초과의 세포가 일반적으로 용해되고, 입자 크기는 5 마이크론 미만으로 감소한다.
대안으로, 볼 밀(ball mill)을 이용할 수 있다. 볼 밀에서, 세포들은 비드와 같은 작은 마찰성 입자가 있는 현탁액에서 교반된다. 전단력, 비드 사이에서 갈림 및 비드와의 충돌에 의해 세포들은 파괴된다. 비드는 세포들을 파열시켜, 세포 내용물을 방출시킨다. 한 구체예에서, 조류의 바이오매스가 파괴되고, Dyno-mill ECM Ultra (CB Mills) 볼 밀을 이용하여 안정적인 유액이 형성된다. 블렌딩 (고속 또는 예를 들어 Waring 블렌더를 이용하여)을 이용하는 것과 같이 전단력, 프렌치 프레서 또는 약한 세포벽의 경우 원심분리에 의해 세포들을 파열시킬 수 있다. 특정 볼 크기 및 블레이드를 포함하는 적합한 볼 밀은 미국 특허 제5,330,913호에서 개시한다.
균질화 후의 생성물은 오일 및 물에 현탁된 원래 세포들보다 더 작은 크기의 입자 슬러리다. 이 입자는 세포의 잔해다. 세포로부터 오일과 물이 방출된다. 균질화 전, 세포들을 함유하는 수성 배지에 의해 추가 물이 제공될 수 있다. 이 입자는 미분화된 균질물의 형태가 바람직하다. 방치해두면, 일부 더 작은 입자들이 연합할 수 있다. 그러나, 작은 입자의 고른 분산은 미정질 셀룰로오스와 같은 미정질 안정화제의 씨딩(seeding)에 의해 보존할 수 있다.
이 조류의 가루를 만들기 위하여, 슬러리는 분무 또는 플래쉬 건조되어, 물은 제거되고, 세포의 잔해 및 오일을 함유하는 건조 분말-유사 물질이 남겨진다. 이 가루(즉, 분말과 유사한 물질로써 파괴된 세포들)의 오일 함량은 이 건조 분말 중량의 적어도 10wt%, 25wt% 또는 50wt%일 수 있지만, 이 분말은 기름진 느낌 및 외양이라기 보다는 건조(가령, 눈에 보이는 오일이 없는)하고, 또한 흔들었을 때 자유롭게 유동할 수 있다. 다양한 유동 물질들(침전된 실리카, 훈증된 실리카, 실리케이트 칼슘, 및 실리케이트 나트륨 알루미늄과 같은 실리카-유도된 산물들을 포함)을 또한 포함할 수 있다. 지방 함량이 높은, 흡습성의 또는 찐득한 분말에 이들 물질을 제공하면, 건조후 케이킹(caking)을 막고, 포장에서 건조 분말의 자유-유동을 촉진시키고, 끈적거림을 감소시키고, 건조기 표면에 물질들의 축적 및 산화를 감소시킬 수 있다. FDA 지정된 최대 수준에서 식품 용도로 모두 승인된 것들이다. 건조 후, 분말의 물 또는 수분 함량은 일반적으로 10wt% 미만, 5wt% 미만, 3wt% 미만 또는 1wt% 미만이다. 기타 건조기 가령, 공압 건조기 또는 펄스 연소 건조기를 또한 이용하여 조류의 가루를 만들 수 있다.
조류의 가루의 오일 함량은 이 조류의 바이오매스의 오일 백분율에 따라 다변할 수 있다. 조류의 가루는 다양한 오일 함량을 가진 조류의 바이오매스로부터 만들 수 있다. 특정 구체예들에서, 이 조류의 가루는 동일한 오일 함량의 조류의 바이오매스로부터 만든다. 기타 구체예들에서, 이 조류의 가루는 상이한 오일 함량을 가진 조류 바이오매스로부터 만든다. 후자의 경우, 다양한 오일 함량을 가진 조류의 바이오매스를 복합하고, 균질화 단계를 실행할 수 있다. 기타 구체예들에서, 다양한 오일 함량을 가진 조류의 가루를 우선 만들고, 원하는 최종 오일 함량을 함유하는 조류의 가루를 얻기 위하여 다양한 비율로 함께 블렌드한다. 추가 구체예에서, 상이한 지질 프로파일의 조류의 바이오매스를 함께 복합하고, 그 다음 균질화하여 조류의 가루를 만들 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상이한 지질 프로파일의 조류의 가루를 먼저 만들고, 그 다음 원하는 최종 지질 프로파일을 함유하는 조류의 가루를 얻기 위하여 다양한 비율로 함께 블렌드한다.
본 발명의 이 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 광범위한 식품 조제에 유용하다. 오일 함량, 섬유 함량 및 미분화된 입자 때문에, 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 다기능성 식품 성분이다.
B. 지방을 제거한 조류의 가루
일부 경우들에서, 조류의 가루 (또는 임의의 파괴된 미세조류의 바이오매스)는 오일 추출 프로세스를 거쳐 지방을 제거한 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스를 만들 수 있다. 미세조류의 오일은 액화 (예를 들면 Sawayama et al., Biomass and Bioenergy 17:33-39 (1999) 및 Inoue et al., Biomass Bioenergy 6(4):269-274 (1993) 참고); 오일 액화 (예를 들면 Minowa et al., Fuel 74(12):1735-1738 (1995) 참고); 또는 초임계 CO2 추출(예를 들면 Mendes et al., Inorganica Chimica Acta 356:328-334 (2003) 참고)을 이용하여 추출할 수 있다. 초임계 CO2 추출을 이용하여 실질적으로 모든 오일이 추출된 지방을 제거한 조류의 가루는 보통 추출 프로세스의 함수로써 인지질을 함유할 것이다. 극성 및 비-극성 용매 모두의 사용을 포함하는 기타 오일 추출 방법들은 이 미세조류 분말로부터 모든 오일을 실질적으로 추출할 뿐만 아니라, 인지질도 또한 추출할 것이다. 지방을 제거한 조류의 가루는 추출전 조류의 가루의 단백질 및 탄수화물을 여전히 보유한다. 지방을 제거한 조류의 가루에 함유된 탄수화물은 식이섬유 (불용성 및 가용성 섬유) 형태의 탄수화물을 포함한다.
인지질을 가진, 또는 인지질이 없는, 지방을 제거한 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 기능성 식품 성분으로 유용하다. 인지질을 함유하는 지방을 제거한 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 높은 유화 능력을 보유한다. 인지질을 가진 및 인지질이 없는, 지방을 제거한 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 상당한 물 유지 능력을 보유하고, 따라서, 다양한 식품 용도에 유용하다. 지방을 제거한 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 불용성 및 가용성 섬유 모두의 형태로 탄수화물을 함유하고 있기 때문에 식이섬유의 우수한 원천이 될 수 있다.
IV . 미세조류의 바이오매스 또는 이로부터 유도된 물질과 다른 식품 성분들과의 복합
한 측면에서, 본 발명은 적어도 0.1% w/w 조류의 바이오매스, 및 하나 초과의 식용 성분들을 포함하는 하나 초과의 기타 성분들을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 조류의 바이오매스는 적어도 10 건중량% 오일을 포함하고, 임의 선택적으로 여기에서 상기 오일의 적어도 90%는 글리세로리피드이다. 일부 구체예들에서, 이 조류의 바이오매스는 적어도 25 건중량%, 40%, 50% 또는 60%의 오일을 함유한다. 일부 경우들에서, 이 조류의 바이오매스는 10-90 건중량%, 25-75%, 40-75% 또는 50-70%의 오일을 함유하고, 임의 선택적으로 여기에서 상기 오일의 적어도 90%는 글리세로리피드이다. 적어도 하나의 구체예에서, 오일의 적어도 50wt%는 단일불포화된 글리세로리피드 오일이다. 일부 경우들에서, 이 오일의 적어도 50wt%는 글리세로리티드 형태의 18:1 지질이다. 일부 경우들에서, 이 오일의 5wt% 미만은 도코사헥사논산 (DHA) (22:6)이다. 적어도 하나의 구체예에서, 이 오일의 1wt% 미만은 DHA이다. 낮은 수준의 다중(poly)불포화된 지방산 (PUFA)을 가진 조류의 지질 함량은 이 바이오매스의 화학 안정성을 확보하는데 바람직하다. 바람직한 구체예들에서, 이 조류의 바이오매스는 유기영양 조건하에 성장하고, 감소된 녹색 착색을 보유한다. 기타 구체예들에서, 이 미세조류는 착색이 없거나 또는 감소된 색 돌연변이체다. 또 다른 구체예에서, 이 식품 조성물은 적어도 0.1% w/w 조류의 바이오매스와 하나 또는 초과의 기타 식용 성분들, 및 임의 선택적으로, 하나 또는 초과의 기타 성분들을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 0.1% w/w 조류의 바이오매스와 하나 또는 초과의 식용 성분들을 포함하는 하나 또는 초과의 기타 성분들을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 조류의 바이오매스는 적어도 30 건중량%의 단백질, 적어도 40 건중량%의 단백질, 적어도 45 건중량%의 단백질, 적어도 50 건중량%의 단백질, 적어도 55 건중량%의 단백질, 적어도 60 건중량%의 단백질 또는 적어도 75 건중량%의 단백질을 포함한다. 일부 경우들에서, 이 조류의 바이오매스는 30-75 건중량% 또는 40-60%의 단백질을 함유한다. 일부 구체예들에서, 미정제 단백질의 적어도 40%는 소화가능하거나, 미정제 단백질의 적어도 50%는 소화가능하거나, 미정제 단백질의 적어도 60%는 소화가능하거나, 미정제 단백질의 적어도 70%는 소화가능하거나, 미정제 단백질의 적어도 80%는 소화가능하거나, 미정제 단백질의 적어도 90%는 소화가능하다. 일부 경우들에서, 이 조류의 바이오매스는 유기영양 조건들 하에서 성장한다. 적어도 하나의 구체예에서, 이 조류의 바이오매스는 질소 풍부한 조건들 하에서 성장한다. 기타 구체예들에서, 이 미세조류는 착색이 없거나 또는 감소된 색 돌연변이체다. 또 다른 구체예에서, 이 식품 조성물은 적어도 0.1% w/w 조류의 바이오매스와 하나 또는 초과의 기타 식용 성분들, 및 임의 선택적으로, 하나 또는 초과의 기타 성분들을 포함한다.
일부 경우들에서, 이 조류의 바이오매스는 대부분 온전한 세포들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 이 식품 조성물은 이 바이오매스의 세포 내부에 대부분 또는 완벽하게 캡슐화된 오일을 포함한다. 일부 경우들에서, 이 식품 조성물은 대부분 온전한 미세조류의 세포들을 포함한다. 일부 경우들에서, 이 조류의 오일은 이 바이오매스의 세포들 안에서 대부분 캡슐화된다. 기타 경우들에서, 이 바이오매스는 대부분 용해된 세포들 (가령, 균질물)을 포함한다. 상기에서 논의한 바와 같이, 이러한 균질물은 슬러리, 플레이크, 분말, 또는 가루로 제공할 수 있다.
이 식품 조성물의 일부 구체예들에서, 이 조류의 바이오매스는 적어도 10 ppm의 셀레늄을 추가로 포함한다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스는 적어도 15% w/w의 조류의 다당류를 추가로 포함한다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스는 적어도 5% w/w의 조류의 당단백질을 추가로 포함한다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스는 바이오매스 g 당 0 내지 115 mcg의 총 카로티노이드를 포함한다. 일부 경우들에서, 이 바이오매스는 적어도 0.5% w/w의 조류의 인지질을 포함한다. 모든 경우들에서, 상기 명시한 것과 같이, 이들 성분들은 진정한 세포의 성분들이며 세포외 성분들이 아니다.
일부 경우들에서, 이 식품 조성물의 조류의 바이오매스는 항산화 성질을 보유한 성분들을 함유한다. 강력한 항산화 성질은 카로티노이드, 필수 미네랄 가령, 아연, 구리, 마그네슘, 칼슘 및 망간을 포함하나 이에 한정되지 않는 이 조류의 바이오매스에 존재하는 다중 항산화제로 인한 것일 수 있다. 조류의 바이오매스는 또한 토코트리에놀 및 토코페롤과 같은 기타 항산화제를 함유하는 것으로 알려져 있다. 비타민 E 패밀리의 이들 구성성분들은 중요한 항산화제이며, 발작-유도된 손상에 대항하는 보호 효과, 동맥 차단의 복원, 유방 및 전립선 암 세포들의 성장 억제, 콜레스테롤 수준의 감소, 유형 II 당뇨병의 감소된 위험 및 녹내장 손상에 대항하는 보호 효과와 같은 기타 건강에 유익한 점들을 보유한다. 토코트리에놀 및 토코페롤의 천연 원천은 야자나무, 해바라기, 옥수수, 대두에서 만들어진 오일 및 올리브 오일에서 찾을 수 있지만, 그러나 여기에서 제공된 조성물은 지금까지 알려진 물질들보다 상당히 더 높은 수준의 토코트리에놀을 보유한다.
일부 경우들에서, 본 발명의 식품 조성물은 적어도 5㎎/100 g, 적어도 7㎎/100 g 또는 적어도 8㎎/100 g의 총 토코페롤을 포함하는 조류의 오일을 함유한다. 일부 경우들에서, 본 발명의 식품 조성물은 적어도 0.15㎎/g, 적어도 0.20㎎/g 또는 적어도 0.25㎎/g의 총 토코트리에놀을 포함하는 조류의 오일을 함유한다.
여기에서 설명된 조성물 및/또는 방법들의 특정 구체예들에서, 이 미세조류는 카로티노이드를 만들 수 있다. 일부 구체예들에서, 미세조류에 의해 만들어진 카로티노이드는 이 미세조류에 의해 만들어진 오일 또는 지질 (가령, 이 오일 또는 지질은 카로티노이드를 함유할 것이다)과 공동-추출될 수 있다. 일부 구체예들에서, 미세조류에 의해 만들어진 카로티노이드는 크산토필이다. 일부 구체예들에서, 미세조류에 의해 만들어진 카로티노이드는 카로틴이다. 일부 구체예들에서, 미세조류에 의해 만들어진 카로티노이드는 카로틴과 크산토필의 혼합물이다. 다양한 구체예들에서, 미세조류에 의해 만들어진 카로티노이드는 아스타산틴, 루테인, 지아산틴, 알파-카로틴, 트란스-베타 카로틴, 시스-베타 카로틴, 리코펜 및 이의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 카로티노이드를 포함한다. 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)로부터 오일의 카로티노이드 프로파일의 비-제한적 예는 하기 실시예에 포함된다.
이 식품 조성물의 일부 구체예들에서, 이 조류의 바이오매스는 우수 제조 관리 기준 (GMP) 조건들 하에서 성장하고 건조된 조류로부터 유래된다. 일부 경우들에서, 이 조류의 바이오매스는 곡물, 과일, 식물, 단백질, 지질, 허브 및/또는 양념 성분들을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 또는 초과의 기타 식용 성분들과 복합된다. 일부 경우들에서, 이 식품 조성물은 샐러드 드레싱, 계란제품, 구운 제품들, 빵, 바(bar), 파스타, 소스, 스프 드링크, 음료, 냉동 디저트, 버터 또는 스프레드이다. 특정 구체예들에서, 이 식품 조성물은 알약 또는 분말이 아니다. 일부 경우들에서, 본 발명에 따른 이 식품 조성물은 적어도 50 g, 또는 적어도 100 g의 무게가 나간다.
바이오매스는 하나 또는 초과의 기타 식용 성분들과 복합하여, 식품을 만들 수 있다. 이 바이오매스는 단일한 조류의 원천 (가령, 균주) 또는 다중 원천(가령, 상이한 균주들)의 조류의 바이오매스일 수 있다. 이 바이오매스는 또한 단일한 조류의 종으로부터 유래되나, 상이한 조성물 프로파일을 가질 수 있다. 예를 들면, 제조업자는 완제 식품에서 원하는 정확한 오일 및 단백질 함량으로 단백질 함량이 높은 미세조류와 오일 함량이 높은 미세조류를 블렌드할 수 있다. 소매 또는 식품 서비스 용의 완제품을 만들기 위하여 식품 제조업자에 의해 이러한 조합이 실시될 수 있다. 대안으로, 제조업자는 조류의 바이오매스를 제품으로 판매할 수 있고, 소비자는 예를 들면, 일반 조리법의 변형에 의해 이 조류의 바이오매스를 식품에 첨가할 수 있다. 어느 경우든 간에, 이 조류의 바이오매스는 오일, 지방, 계란, 또는 많은 일반 식품에 이용되는 이와 유사한 것들의 전부 또는 일부를 대체하는데 일반적으로 이용할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 0.1% w/w의 조류의 바이오매스와 하나 또는 초과의 기타 식용 성분들을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 조류의 바이오매스는 원하는 백분율의 단백질 및 지질 건중량의 블렌드를 얻기 위하여, 40 건중량%의 지질을 함유하는 조류의 바이오매스와 적어도 40 건중량%의 단백질을 함유하는 조류의 바이오매스를 완전히 블랜딩함으로써, 조제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 바이오매스는 동일한 균주의 조류로부터 유래된다. 대안으로, DHA를 지질의 1% 미만으로 함유하는 적어도 40 건중량%의 지질을 함유하는 조류의 바이오매스는 DHA를 지질의 5% 이상으로 함유하는 적어도 20 건중량%의 지질을 함유하는 조류의 바이오매스와 블랜드하여, 적어도 10 건중량%의 지질과 1 건중량%의 DHA를 응집물에 함유하는 건조 바이오매스 블랜드를 수득한다.
한 측면에서, 본 발명은 GMP 조건들 하에서 적어도 15 건중량%의 오일을 포함하는 조류의 바이오매스를 제공하기 위하여 조류 배양물을 건조함으로써 조류의 바이오매스를 준비하는 방법에 관한 것으로써, 여기에서 조류의 오일은 50% 초과가 단일불포화된 지질이다.
한 측면에서, 본 발명은 GMP 조건들 하에서 제조된 적어도 15 건중량% 오일을 포함하는 조류의 바이오매스에 관한 것으로써, 여기에서 조류의 오일은 50% 초과가 18:1 지질이다. 한 측면에서, 본 발명은 GMP 조건들 하에서 제조된 적어도 40 건중량%의 오일을 포함하는 조류의 바이오매스에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 GMP 조건들 하에서 제조된 적어도 55 건중량%의 오일을 포함하는 조류의 바이오매스에 관한 것이다. 일부 경우들에서, 이 조류의 바이오매스는 바이오매스의 단위 복용량을 제공하기 위하여 태블릿으로 포장된다. 일부 경우들에서, 이 조류의 바이오매스는 기타 식용 성분들과 이 조류의 바이오매스를 복합하기 위한 지침이 제시된 라벨이 부착된, 또는 다른 방법으로 라벨을 보유한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기에서 설명한 것과 같이, 미세조류의 바이오매스 및/또는 이로부터 유래된 물질들과 하기에서 설명하는 것과 같이, 적어도 하나의 기타 완제 식품 성분을 복합하여 식품 조성물 또는 식재료를 만드는 방법들에 관한 것이다. 다양한 구체예들에서, 본 발명의 방법들에 의해 만들어진 식품 조성물은 계란 제품(분말로된 또는 액체), 파스타 제품, 드레싱 제품, 마요네즈 제품, 케이크 제품, 빵 제품, 에너지 바, 우유 제품, 쥬스 제품, 스프레드, 또는 스무디를 포함한다. 일부 경우들에서, 이 식품 조성물은 알약 또는 분말이 아니다. 다양한 구체예들에서, 이 식품 조성물은 적어도 10 g, 적어도 25 g, 적어도 50 g, 적어도 100 g, 적어도 250 g, 또는 적어도 500 g 또는 그 초과의 무게를 가진다. 일부 구체예들에서, 미세조류의 바이오매스 및/또는 이로부터 유래된 제품의 조합에 의해 형성된 식품 조성물은 조리되지 않은 제품이다. 기타 경우들에서, 이 식품 조성물은 조리된 제품이다.
기타 경우들에서, 이 식품 조성물은 조리된 제품이다. 일부 경우들에서, 이 식품 조성물은 조류의 바이오매스에 의해 제공되는 오일을 제외하고, 25wt% 미만의 오일 또는 지방을 함유한다. 포화된 트리글리세리드 (TAGs 또는 트란스 지방) 형태의 지방은 마가린과 같은 스프레드를 만들때 실시되는 것과 같이, 식물성 오일을 수소로 처리하여 만든다. 조류의 바이오매스에 함유된 지방은 트랜스 지방을 보유하지 않는다. 일부 경우들에서, 이 식품 조성물은 바이오매스에 의해 제공되는 오일을 제외하고, 10wt% 미만의 오일 또는 지방을 함유한다. 적어도 하나의 구체예에서, 이 식품 조성물은 바이오매스에 의해 제공되는 오일을 제외하고, 오일 또는 지방이 없다. 일부 경우들에서, 이 식품 조성물은 바이오매스에 의해 제공되는 오일 이외의 기타 오일은 없다. 일부 경우들에서, 이 식품 조성물은 계란 또는 계란 제품은 없다.
한 측면에서, 본 발명은 식품 조성물을 만드는 방법에 관한 것으로, 이때 일반 식품 안의 지방 또는 오일은 적어도 10wt%의 오일을 함유하는 조류의 바이오매스로 완전하게 또는 부분적으로 대체된다. 한 구체예에서, 이 방법은 이 바이오매스 안의 조류의 오일 비율을 이용하여 대체용 조류의 바이오매스의 양 및 일반 식품내 오일 또는 지방의 양을 측정하고, 이 조류의 바이오매스와 적어도 하나의 기타 식용 성분과 일반 식품에 함유된 오일 또는 지방의 양보다 적은 양으로 복합시켜, 식품 조성물을 만드는 것을 포함한다. 일부 경우들에서, 적어도 하나의 기타 성분과 복합되는 조류의 바이오매스의 양은 일반 식품 안의 오일 및/또는 지방의 중량 또는 용적의 1-4배이다.
일부 구체예들에서, 상기에서 설명된 방법은 오일 또는 지방과 복합되는 적어도 하나의 기타 식용 성분을 함유하는 일반 식품을 위한 조리법을 제공하고, 적어도 하나의 기타 식용 성분과 일반 식품 안의 지방 또는 오일의 양 또는 용적의 1~4배의 양 또는 용적의 조류의 바이오매스를 복합시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우들에서, 이 방법은 GMP 조건들 하에서 조류의 바이오매스를 준비하는 것을 추가로 포함한다.
일부 경우들에서, 미세조류의 바이오매스 및/또는 이로부터 유래된 제품의 조합에 의해 형성된 식품 조성물은 적어도 0.1%(w/w 또는 v/v), 적어도 0.5%, 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 25%, 또는 적어도 50%의 미세조류의 바이오매스 또는 미세조류의 오일을 포함한다. 일부 구체예들에서, 여기에서 설명한 것과 같이 만들어진 식품 조성물은 적어도 2(w/w)%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 미세조류의 바이오매스 또는 이로부터 유래된 제품을 포함한다. 일부 경우들에서, 이 식품 조성물은 5-50% (중량 또는 용적), 10-40%, 또는 15-35%의 조류의 바이오매스 또는 이로부터 유래된 제품을 포함한다.
상기에서 설명한 것과 같이, 미세조류의 바이오매스는 식품에 일반적으로 포함된 기타 성분들을 대체할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 식품 조성물은 이 바이오매스에 의해 또는 미세조류의 원천으로부터 제공되는 미세조류의 오일을 제외하고, 50wt% 미만, 40% 미만, 또는 30% 미만의 오일 또는 지방을 함유한다. 일부 경우들에서, 이 식품 조성물은 이 바이오매스에 의해 또는 미세조류의 원천으로부터 제공되는 미세조류의 오일을 제외하고, 25wt% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만의 오일 또는 지방을 함유한다. 적어도 하나의 구체예에서, 이 식품 조성물은 이 바이오매스에 의해 또는 미세조류의 원천으로부터 제공되는 미세조류의 오일을 제외하고, 오일 또는 지방이 없다. 일부 경우들에서, 이 식품 조성물은 계란, 버터 또는 기타 지방/오일 또는 필적가능한 일반 식품에 일반적으로 포함되는 적어도 하나의 기타 성분이 없다. 일부 식품은 유제품(가령, 버터, 크림 및/또는 치즈)을 포함하지 않는다.
식품 조성물을 만드는데 이용되는 조류의 바이오매스의 양은 일반 식품에서 대체될 비-조류의 오일, 지방, 계란, 또는 이와 유사한 것들의 양과 이 조류의 바이오매스 안의 오일의 백분율에 따라 달라진다. 따라서, 적어도 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 이 바이오매스 안의 오일 비율과 일반 식품 안에 적어도 하나의 기타 식용 성분과 일반적으로 복합되는 오일 및/또는 지방의 비율로부터 적어도 하나의 기타 식용 성분과 복합되는 조류의 바이오매스의 양을 측정하는 것을 포함한다. 예를 들면, 이 조류의 바이오매스가 50% w/w의 미세조류의 오일이며, 일반 조리법에서 오일 또는 지방을 완전하게 대체하는 것을 원한다면, 이 오일은 예를 들면 2:1 비율로 대체될 수 있다. 비율은 중량에 의해 측정될 수 있지만, 실질적인 목적에서 계량 컵 또는 스푼을 이용하여 용적을 측정하는 것이 때로 더 용이할 수 있고, 용적을 기준으로 대체가 일어날 수 있다. 일반적인 경우에서, 대체될 오일 또는 지방의 용적 또는 양은 조류의 바이오매스의 (100/100-X) 용적 또는 양으로 대체되고, X 는 이 바이오매스 안에 있는 미세조류의 오일 백분율이다. 일반적으로, 일반 조리법에서 대체될 오일과 지방은 조류의 바이오매스에 의해 전체적으로 대체될 수 있는데, 전체 대체가 필수적인 것은 아니며, 임의의 원하는 비율의 오일 및/또는 지방은 유지시키고, 맛 및 영양 요구에 따라 나머지를 대체시킬 수 있다. 이 조류의 바이오매스는 유화제 기능을 하는 단백질과 인지질을 함유하기 때문에, 계란과 같은 품목은 조류의 바이오매스로 전체적으로 또는 부분적으로 대체할 수 있다. 계란이 바이오매스 또는 조류의 가루와 전체적으로 대체된다면, 계란에 의해 제공될 수 있는 이들 성분들의 상실을 보상하기 위하여 이 식품 조성물 안의 유화 물질은 추가 유화제, 및/또는 물 또는 기타 액체를 추가하는 것이 때때로 바람직하거나 필요하다. 일부 구체예들에서, 추가 유화제를 첨가하는 것이 필요할 수 있다. 대안으로, 이 식품 조성물에 따라, 추가 유화제를 첨가하는 것이 불필요할 수 있다.
간단함을 위하여, 대체 비율은 바이오매스 또는 이 조류의 가루의 양 또는 용적으로 대체될 오일, 지방 및/또는 계란의 양 또는 용적의 관점에서 또한 제공할 수 있다. 일부 방법들에서, 일반 조리법에서 오일, 지방 및/또는 계란의 양 또는 용적은 오일, 지방 및/또는 계란의 양 또는 용적의 5-150%, 25-100% 또는 25-75%로 대체된다. 대체 비율은 식품, 식품의 원하는 영양소 프로파일, 식품의 전반적인 질감 및 외양, 및 바이오매스 또는 이 조류의 가루의 오일 함량 등과 같은 인자들에 따라 달라진다.
조리된 식품에서, 조리 전 또는 조리 후에 백분율(즉, 중량 또는 용적)을 측정할 수 있다. 요리 프로세스 동안에 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 백분율은 액체의 손실로 인하여 증가될 수 있다. 일부 조류의 바이오매스 세포들은 요리 프로세스 과정에서 용해될 수 있기 때문에, 조리된 제품에서 직접적으로 조류의 바이오매스의 함량을 측정하는 것이 어려울 수 있다. 그러나, 이 함량은 가공하지 않은 제품에 들어가는 바이오매스의 양 또는 용적으로부터 완제 제품의 중량 또는 용적의 백분율(바이오매스 건조 고체 기준에서)로 간접적으로 측정할 수 있고, 뿐만 아니라 게놈 서열들 또는 이 조류의 바이오매스에 의해서만 전달되는 화합물들, 가령 특정 카로티노이드와 같이 이 조류의 바이오매스에 독특한 성분들을 분석하는 방법에 의해 측정할 수 있다.
일부 경우들에서, 조류의 바이오매스 또는 이 조류의 가루는 일반 식품에 존재하는 오일, 지방, 계란 또는 이와 유사한 것들의 비례 양을 초과하는 양으로 적어도 하나의 기타 식용 성분과 복합시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 일반 식품 안의 오일 및/또는 지방의 양 또는 용적은 0.25배, 0.5배, 0.75배, 1배, 2배, 3배, 4배, 또는 그 초과의 조류의 바이오매스 또는 이 조류의 가루로 대체할 수 있다. 본 발명의 방법들의 일부 구체예들은 오일 또는 지방이 복합된 적어도 하나의 기타 식용 성분을 함유하는 일반 식품에 대한 조리법을 제공하고, 0.25-4 배의 조류의 바이오매스 또는 이 조류의 가루의 양 또는 용적을 일반 식품 안에 있는 지방 또는 오일의 양 또는 용적으로 적어도 하나의 기타 식용 성분과 복합시키는 것을 포함한다.
조류의 바이오매스 또는 이 조류의 가루 (대부분 온전한 또는 균질화된 또는 미분화된) 및/또는 조류의 오일은 적어도 하나의 기타 식용 성분과 복합되어 식품을 만든다. 일부 식품에 있어서, 상기 조류의 바이오매스 및/또는 조류의 오일은 1-20개, 2-10개, 또는 4-8개의 기타 식용 성분들과 복합된다. 식용 성분들은 과일, 야채, 콩과식물 꼬투리, 고기, 물고기, 곡물 (가령, 밀, 쌀, 귀리, 옥수가루(cornmeal), 보리), 허브, 양념, 물, 식물성 브로스, 쥬스, 와인, 및 식초를 포함하나 이에 한정되지 않는 모든 주요 식품 군으로부터 선택할 수 있다. 일부 식품 조성물에서, 적어도 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 식품 군이 대표되고, 뿐만 아니라 조류의 바이오매스 또는 조류의 오일이 대표된다.
오일, 지방, 계란 및 이와 유사한 것들을 또한 식품 조성물로 복합할 수 있지만, 상기에서 논의한 것과 같이, 일반 식품과 비교하여 오일, 지방 또는 계란의 양 또는 용적은 감소(가령, 50% 미만, 25% 미만, 또는 10% 미만)된 양으로 존재한다. 본 발명의 일부 식품은 조류의 바이오매스 및/또는 조류의 오일에 의해 제공되는 것 이외의 오일을 함유하지 않는다. 일부 식품은 조류의 바이오매스에 의해 제공되는 것 이외의 오일을 함유하지 않는다. 일부 식품은 조류의 바이오매스 또는 조류의 오일에 의해 제공되는 것 이외의 지방을 함유하지 않는다. 일부 식품 조류의 바이오매스에 의해 제공되는 것 이외의 지방을 함유하지 않는다. 일부 식품은 조류의 바이오매스 또는 조류의 오일에 의해 제공되는 것 이외의 오일 및 지방을 모두 함유하지 않는다. 일부 식품은 조류의 바이오매스에 의해 제공되는 것 이외의 오일 및 지방을 모두 함유하지 않는다. 일부 식품은 계란을 함유하지 않는다. 일부 구체예들에서, 이 미세조류에 의해 생산된 오일은 특정 지방산 성분(들) 또는 수준을 포함하도록 배양 조건 또는 균주 선택에 의해 맞출 수 있다.
일부 경우들에서, 식품 조성물을 만드는데 이용된 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 미세조류의 적어도 두 가지 별개의 종의 혼합물을 포함한다. 일부 경우들에서, 적어도 두 가지의 별개의 종의 미세조류는 별도로 배양되었다. 적어도 하나의 구체예에서, 적어도 두 가지의 별개의 종의 미세조류는 상이한 글리세로리피드 프로파일을 보유한다. 일부 경우들에서, 상기에서 설명된 방법은 유기영양 조건들 하에서 조류를 배양하고, 이 조류로부터 바이오매스를 준비하는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우들에서, 적어도 두 가지 별개의 종의 미세조류는 모두 적어도 10 건중량%, 또는 적어도 15%의 오일을 함유한다. 일부 경우들에서, 식품 조성물은 동일한 종의 바이오매스의 두 가지 별개의 조제물의 블랜드를 함유하고, 조제물중 하나는 적어도 30 건중량%의 오일을 함유하고, 두 번째 것은 15 건중량% 미만의 오일을 함유한다. 일부 경우들에서, 식품 조성물은 동일한 종의 바이오매스의 두 가지 별개의 조제물의 블랜드를 함유하고, 조제물중 하나는 적어도 50 건중량%의 오일을 함유하고, 두 번째 것은 15 건중량% 미만의 오일을 함유하고, 추가로, 여기에서 종은 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)이다.
다른 일반 식품에서 오일, 지방 또는 계란 대용물로써 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루를 이용하는 것과 마찬가지로, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 스무디와 같은 일반적으로 오일을 함유하지 않은 식품에 보충제로 이용할 수 있다. 주로 탄수화물인 제품에 오일의 복합으로 오일과 관련된 잇점을 가질 수 있고, 탄수화물의 당지수를 감소시킴으로써 오일과 탄수화물의 조합으로부터 잇점을 가질 수 있다. 바이오매스내 캡슐화된 오일의 제공은 산화로부터 오일을 보호하는 장점이 있으며, 스무디의 맛과 질감을 또한 개선시킬 수 있다.
조류의 바이오매스 또는 이 조류의 가루로부터 추출된 오일은 일반 조리법에서 오일, 지방, 계란 또는 이와 유사한 것들의 대용물과 같이, 바이오매스 자체와 동일한 방식으로 이용할 수 있다. 이 오일은 약 1:1 중량/중량 또는 용적/용적 기반으로 일반 오일 및/또는 지방을 대체하는데 이용할 수 있다. 이 오일은 임의 선택적으로 추가 물 및/또는 유화제와 복합하여, 계란 하나당 약 1 티스푼의 조류 오일로 대체하는데 이용할 수 있다(평균 58g의 계란은 약 11.2% 지방을 보유하며, 조류의 오일은 약 0.915 g/㎖의 밀도를 보유하고, 티스푼은 약 5㎖의 용적을 보유한다 = 1.2 티스푼의 조류의 오일/계란). 이 오일은 드레싱, 소스, 스프, 마가린, 커피크림, 쇼트닝 및 이와 유사한 것들에 또한 통합될 수 있다. 이 오일은 이 오일과 기타 식품 성분들의 조합이 원하는 맛, 질감 및/또는 외양을 제공하는데 필요한 식품에 특히 유용하다. 식품에서 오일(중량 또는 용적)의 함량은 적어도 5%, 10%, 25%, 40% 또는 50%일 수 있다.
적어도 하나의 구체예에서, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루로부터 추출된 오일은 식품 제조업자, 식당 및/또는 소비자가 요리 오일로 또한 이용할 수 있다. 이러한 경우들에서, 조류의 오일은 잇꽃 오일, 카놀라 오일, 올리브 오일, 포도씨 오일, 옥수수 오일, 해바라가 오일, 코코넛 오일, 야자나무 오일, 또는 임의의 기타 일반적으로 이용되는 요리 오일과 같은 일반 요리 요일을 대체할 수 있다. 조류의 바이오매스 또는 이 조류의 가루로부터 수득한 오일은 기타 유형들의 오일과 같이 요리에 적합성(가령, 발연점의 증가)을 증가시키기 위하여 추가 정제할 수 있다. 오일은 자유 지방산을 제거하기 위하여 가성 소다로 중화시킬 수 있다. 자유 지방산은 제거가능한 비누 물질(soap stock)을 형성한다. 오일의 색은 카본 블랙 및 표백용 점토와 같은 화학물질로 표백시켜 제거할 수 있다. 표백용 점토 및 화학물질은 여과에 의해 오일로부터 분리시킬 수 있다.
오일은 증기 처리에 의해 또한 탈색시킬 수 있다. 대부분 온전한 바이오매스, 균질화된 또는 미분화된 바이오매스 (슬러리, 플레이크, 분말 또는 가루 형으로) 및 정제된 조류의 오일은 모두 식품을 만들기 위하여 기타 식품 성분들과 복합시킬 수 있다. 모두 유익한 영양 프로파일 (상대적으로 높은 단일불포화된 함량)을 가진 오일 원천들이다. 대부분 온전한, 균질화된, 및 미분화된 바이오매스는 또한 상기에서 논의한 바와 같이, 고품질의 단백질 (균형잡힌 아미노산 조성물), 탄수화물, 섬유 및 기타 영양소를 공급한다. 이들 제품에 통합되는 식품은 완전 채식주의 또는 채식주의 형으로 만들 수 있다. 미세조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 (대부분 온전한 또는 균질화된 (또는 미분화된) 또는 이 둘 모두)를 단백질 원천으로 이용하는 또 다른 장점은 콩, 계란 또는 유제품과 같은 주요 알레르기 원인 물질로 부터가 아닌 완전 채식주의/채식주의 단백질 원천이라는 것이다.
조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 및/또는 조류의 오일과 본 발명에 따라 복합될 기타 식용 성분들은 곡물, 과일, 야채, 단백질, 고기, 허브, 양념, 탄수화물, 및 지방을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 및/또는 조류의 오일과 복합되어 식품 조성물을 형성하게 되는 기타 식용 성분들은 생산되는 식품, 이 식품의 원하는 맛, 질감 및 식품의 기타 성질들에 따라 달라진다.
일반적으로 조류의 오일의 임의의 원천은 임의의 식품에 이용될 수 있지만, 바람직한 원천은 식품의 질감, 외양 또는 맛 보다는 주로 영양소 또는 칼로리 목적으로 이 오일이 식품에 존재하는지에 따라 부분적으로 달라지며, 또는 기타 식품 성분들과 복합된 이 오일이 식품의 원하는 맛, 질감 또는 외양에 기여하도록 하는 의도인지 또는 식품의 영양소 또는 칼로리 프로파일을 개선시키려는 의도인지에 따라 달라진다.
이 식품은 원하는 일반 과정에 따라 조리될 수 있다. 길이와 온도에 따라, 요리 프로세스는 일부 세포 벽을 파괴하고, 오일을 방출하여, 이 오일이 기타 성분들과 복합될 수 있다. 그러나, 요리에서 적어도 일부 조류의 세포들은 종종 온전하게 살아남는다. 대안으로, 식품은 요리 없이 이용할 수 있다. 이 경우, 이 조류의 벽은 온전한 상태를 유지하고, 산화로부터 오일을 보호한다.
대부분 온전한 세포들의 형태, 또는 균질물 분말의 형태로 제공될 경우, 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 건조 성분으로 제공되므로, 가루와 같은 기타 건조 성분들과 혼합을 용이하게 한다는 점에서 오일, 지방 또는 계란과 상이하고자. 한 구체예에서, 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 25 건중량% 내지 40%의 오일을 함유하는 건조 균질물로 제공된다. 바이오매스 균질물은 또한 슬러리로 제공될 수 있다. 건조 성분들의 혼합 후(그리고 이용된다면, 바이오매스 균질물 슬러리), 물과 같은 액체를 추가할 수 있다. 일부 식품에서 요구되는 액체의 양은 일반 식품에서 요구되는 양보다 다소 더 높은데, 그 이유는 이 바이오매스의 비-오일 성분 때문이고/거나 계란과 같은 기타 성분들에 의해 물이 공급되지 않기 때문이다. 그러나, 일반 요리에서와 같이 물의 양을 쉽게 결정할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 10 건중량%의 조류의 오일과 적어도 하나의 기타 식용 성분을 함유하는 적어도 0.5% w/w의 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루를 포함하는 식품 성분 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 식품 성분은 액체를 이 식품 성분 조성물에 추가하여 개량된 식품으로 전환될 수 있다. 한 구체예에서, 액체는 물이다.
균질화된 또는 미분화된 오일 함량이 높은 바이오매스는 특히 액체, 및/또는 유화된 식품 (유중수 및 수중유 에멀전), 가령, 소스, 스프, 드링크, 샐러드 드레싱, 버터, 스프레드 및 이와 유사한 것들에 특히 유익한데, 여기에서 바이오매스에 의해 제공되는 오일은 기타 액체들과 함께 에멀전을 형성한다. 개선된 유동학으로 이익을 얻은 제품들, 예를 들자면 드레싱, 소스 및 스프레드들은 하기 실시예에서 설명된다. 균질화된 바이오매스를 이용하여, 원하는 질감 (가령, 식감), 맛 및 외양 (가령, 불투명성)을 가진 에멀전은 일반 오일을 이용한 일반 제품의 경우보다 더 낮은 오일 함량(전체 제품의 중량 또는 용적 기준)에서 형성할 수 있고, 따라서 지방 증량제(extender)로 이용될 수 있다. 이는 저칼로리(가령, 다이어트) 제품에 유용하다. 정제된 조류의 오일은 이러한 액체 및/또는 유화된 제품에 또한 유익하다. 균질화된 또는 미분화된 오일 함량이 높은 바이오매스 및 정제된 조류의 오일은 모두 구운 제품에서 기타 식용 성분들과 잘 복합되어, 일반 오일, 지방 및/또는 계란으로 만든 것들과 유사한 또는 더 나은 맛, 외양 및 질감을 제공하면서, 개선된 영양소 프로파일을 갖는다(가령, 더 높은 함량의 단포화된 오일, 및/또는 더 높은 함량 또는 품질의 단백질, 및/또는 더 높은 함량의 섬유 및/또는 기타 영양소).
대부분 온전한 바이오매스는 식품의 영양소 프로파일을 변화 또는 증가 (가령, 더 높은 오일 함량, 상이한 오일 함량 (가령, 더 많은 단일불포화된 오일), 더 높은 단백질 함량, 더 높은 칼로리 함량, 더 높은 함량의 기타 영양소들)시키는 것이 바람직한 상황에 특히 유용하다. 이러한 식품은 예를 들면, 운동선수 또는 소모성 질환을 앓고 있는 환자들에게 유용할 것이다. 대부분 온전한 바이오매스는 벌크제(bulking agent)로 이용할 수 있다. 벌크제는 고가의 식품 (가령, 고기 헬퍼 및 이와 유사한 것들)의 양을 증대시키는데 이용하거나 또는 채식주의 고기 대용품과 같은 모의 또는 모방 식품에 이용할 수 있다. 모의 또는 모방 식품은 풍미제 및 벌크제가 상이한 원천에 의해 제공된다는 점에서 천연 식품과는 상이하다. 예를 들면, 천연 식품, 가령, 고기의 풍미는 풍미를 유지시키는 벌크제로 부여할 수 있다. 대부분 온전한 바이오매스를 이러한 식품의 벌크제로 이용할 수 있다. 대부분 온전한 바이오매스는 또한 건조 식품 가령, 파스타에 특히 유용한데, 그 이유는 이것이 양호한 물 결합 성질을 보유하고, 따라서, 이러한 식품의 재수화를 용이하게 하기 때문이다. 대부분 온전한 바이오매스는 예를 들면, 구운 제품들에서 보존제로 유용하다. 대부분 온전한 바이오매스는 물 유지를 개선시키고, 따라서 유지 기간을 개선시킨다.
파열된 또는 미분화된 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 또한 결합제, 벌크제로 유용하여, 식품의 영양 프로파일을 변화 또는 증가시킬 수 있다. 파열된 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 또 다른 단백질 원천 예를 들자면, 고기, 콩 단백질, 유장 단백질, 밀 단백질, 콩 단백질, 쌀 단백질, 완두콩 단백질, 우유 단백질, 등과 복합될 수 있고, 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 결합제 및/또는 벌크제로 기능을 한다. 파열된 또는 미분화된 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 물 보유를 개선시킬 수 있고, 따라서 유지 기간도 개선시킬 수 있다. 증가된 수분 보유는 글루텐-없는 제품, 가령, 글루텐-없는 구운 제품들에서 특히 바람직하다. 파열된 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루를 이용한 글루텐-없는 쿠키 제조 및 후속적으로 유지 기간 연구에 대한 상세한 설명은 하기 실시예에서 개시한다.
일부 경우들에서, 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 계란 조제물에 이용할 수 있다. 일부 구체예들에서, 더 부드러운 스크램블된 계란을 만들기 위하여 일반 건조 분말 계란 조제물에 첨가된 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 (가령, 조류의 가루)는 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 없이 만들어진 건조 분말화된 계란보다 더 많은 수분을 함유하고, 더 나은 질감을 가진다. 기타 구체예들에서, 준비되고, 스팀 테이블위에 유지된 계란의 전체적인 질감 및 수분을 개선시키기 위하여 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루를 전체 액체 계란에 추가한다. 전술한 조제물의 특이적 실시예들은 하기 실시예에서 설명된다.
조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 (대부분 온전한 및/또는 균질화된 또는 미분화된) 및/또는 조류의 오일은 실질적으로 임의의 식품 조성물에 통합될 수 있다. 일부 예로는 구운 제품들, 예를 들다면 케이크, 브라우니, 옐로우 케이크, 브리오슈를 포함하는 빵, 슈가 쿠키를 포함하는 쿠키, 비스킷 및 파이를 포함한다. 기타 예로는 파스타 또는 분말로된 드레싱, 건조된 커피크림, 다짐육 및 고기 대용물질과 같은 흔히 건조된 형태로 제공되는 제품을 포함한다. 이러한 제품에 대부분 온전한 바이오매스를 결합제 및/또는 벌크제로 통합시키면 대부분 온전한 바이오매스의 물 결합 능력으로 인하여 수화를 개선시키고, 수율을 증가시킨다. 재수화된 식품, 가령, 건조 분말로된 계란으로 만든 스크램블된 계란은 개선된 질감 및 영양 프로파일을 또한 보유할 수 있다. 기타 예로는 액체 식품, 예를 들자면 소스, 스프, 드레싱 (인스턴트인), 커피크림, 우유 드링크, 쥬스 드링크, 스무디, 커피크림을 포함한다. 기타 액체 식품은 식사 대용물 또는 조류 우유로 기능을 하는 영양 음료를 포함한다. 기타 식품은 쇼트닝, 마가린/스프레드, 너트 버터, 및 치즈 제품들, 예를 들자면 나쵸 소스를 포함하는, 버터 또는 치즈 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 기타 식품은 에너지 바(bars), 초콜릿 당과(confections)-레시틴 대용물, 식사 대용 바, 그래뉼라 바-타입 제품들을 포함한다. 식품의 또 다른 유형은 반죽(batters) 및 코팅이다. 식품을 에워싸는 오일 층을 제공함으로써, 대부분 온전한 바이오매스 또는 균질물은 추가 오일이 요리 매체로부터 식품으로 침투하는 것을 물리친다. 따라서, 이 식품은 다소 덜 바람직한 오일 (가령, 트란스 지방, 포화된 지방, 및 요리 오일의 부산물)을 취하지 않고, 코팅의 고 함량의 단일불포화된 오일의 장점을 유지할 수 있다. 바이오매스의 코팅은 식품에 바람직한 질감(가령, 바삭거리는) 및 요리 오일 및 이의 부산물이 덜 흡수됨으로 인하여 더 깨끗한 풍미를 제공할 수 있다.
조리안된 식품에서, 이 바이오매스 안의 대부분 조류의 세포들은 온전하게 유지된다. 이는 산화로부터 이 조류의 오일을 보호하는 장점을 가지고, 이는 더 긴 유지 기간을 부여하고, 기타 성분들과의 부정적인 상호작용을 최소화시킨다. 이 식품의 성질에 따라서, 세포들에 의해 부여되는 보호는 냉장, 진공 포장 또는 이와 유사한 것들의 필요성을 감소시키거나, 피할 수 있게 할 수 있다. 세포들을 온전하게 유지하는 것은 또한 소비자의 입 안에 오일이 직접 접촉하는 것을 막고, 이는 바람직하지 않을 수도 있는 기름진 또는 지방 느낌을 줄여준다. 오일이 영양 보충제로 더 이용되는 식품에서, 이러한 것은 제품의 감각자극에 반응하는 성질들을 개선시키는데 유익할 것이다. 따라서, 대부분 온전한 바이오매스는 이러한 제품들에 사용하기에 적합하다. 그러나 조리안된 제품들, 예를 들자면, 오일은 원하는 식감을 부여하는 샐러드 드레싱(가령, 식초와 같은 수성 용액과의 에멀전)에서, 정제된 조류의 오일 또는 미분화된 바이오매스의 사용은 바람직하다. 조리된 식품에서, 고유의 온전한 바이오매스의 일부 조류의 세포들은 용해될 수 있지만, 기타 조류의 세포들은 온전하게 유지될 수 있다. 온전한 세포에 대한 용해된 세포들의 비율은 이 요리 프로세스의 온도 및 시간에 따라 달라진다. 기타 성분들과 균질한 방식으로 오일이 분산되는 것이 맛, 질감 및/또는 외양 (가령, 구운 제품들)에 바람직한 조리된 식품의 경우, 미분화된 바이오매스 또는 정제된 조류의 오일의 이용이 바람직하다. 오일 및/또는 단백질 및 기타 영양소를 공급하는 데에 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루를 이용하는 조리된 식품의 경우, 질감보다는 이들의 영양 또는 칼로리 가치에 대해 주로 공급한다.
조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 없이 만들어진 다른 방법의 유사한 일반 식품과 비교하여, 식품의 포만 지수(가령, 식사-대용 드링크 또는 스무디)를 증가시키는데 또한 유용할 수 있다. 포만 지수는 상이한 식품의 동일한 칼로리 수치가 식욕을 만족시키는 정도의 측정이다. 이러한 지수는 테스트할 식품을 공급하고, 고정된 시간 경과후 다른 식품에 대한 식욕을 측정함으로써, 측정할 수 있다. 이때 다른 식품에 대한 식욕이 낮을수록 포만 지수는 더 높다. 흰 빵을 100으로 하여 등급으로 표현할 수 있다. 포만 지수가 더 큰 식품이 다이어트에 유용하다. 기전의 이해에 의존적이지는 않지만, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 주어진 양의 칼로리에 대해 이 식품의 단백질 및/또는 섬유 함량을 증가시킴으로써, 식품의 포만 지수를 증가시키는 것으로 보인다.
조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 (대부분 온전한 및 균질화된 또는 미분화된) 및/또는 조류의 오일은 또한 영양 또는 음식 보충체로 제조할 수 있다. 예를 들면, 조류의 오일은 물고기 오일과 유사한 방식으로 소화가능한 캡슐 안에 캡슐화시킬 수 있다. 이러한 캡슐은 병에 포장되어, 매일 단위로 섭취할 수 있다(가령, 하루에 1-4개 캡슐 또는 태블릿). 캡슐은 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 또는 조류의 오일의 단위 복용량을 함유할 수 있다. 유사하게, 바이오매스는 임의 선택적으로 약제학적 또는 기타 부형제들과 함께 태블릿으로 압착될 수 있다. 이 태블릿은 예를 들면, 병 또는 블리스터 팩(blister pack)으로 포장될 수 있고, 가령, 일일 1-4개 태블릿의 용량으로 매일 복용될 수 있다. 일부 경우들에서, 태블릿 또는 기타 투약 제제는 바이오매스 또는 조류의 오일의 단위 용량을 포함한다. 캡슐 및 태블릿 제품들 및 기타 보충물의 제조는 21 C.F.R. 111에서 성문화된 또는 타지역의 관할권에 의해 확립된 필적하는 규정에 의해 성문화된 영양 보충제에 적합한 GMP 조건하에 실행하는 것이 바람직하다. 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 기타 분말과 혼합될 수 있고, 즉석 혼합 물질 (가령, 물, 쥬스, 우유 또는 기타 액체들)로서 소낭(작은 주머니)에 담아 제공될 수 있다. 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 제품들 예를 들자면 요거트와 또한 혼합할 수 있다.
조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 및/또는 조류의 오일은 영양 보충제에 통합될 수 있지만, 상기에서 논의한 기능성 식품은 알약, 캡슐, 또는 분말 형태인 전형적인 영양 보충제와는 구별된다. 이러한 식품의 제공량(serving size)은 중량과 공급되는 칼로리 측면에서 모두 영양 보충제 보다 일반적으로 훨씬 더 크다. 예를 들면, 식품은 흔히 한번 포장되거나 소비될 때 100 g 초과 되고/거나 적어도 100 칼로리를 공급한다. 일반적으로 식품은 단백질, 탄수화물 또는 액체중 적어도 하나의 성분을 함유하고, 이러한 기타 성분들이 2개 또는 3개 함유하기도 한다. 식품에서 단백질 또는 탄수화물은 이 식품의 칼로리의 대개 적어도 30%, 50%, 또는 60%를 공급한다.
상기에서 논의한 바와 같이, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 제조업자에 의해 만들어지고, 소비자, 예를 들자면, 상업적 환경 또는 가정에서 사용하기 위하여 식당 또는 개인에게 판매된다. 이러한 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 식품용 우수한 제조 관리(GMP) 조건들 하에서 제조되고 포장되는 것이 바람직하다. 대부분 온전한 형태 또는 분말과 같은 균질화된 또는 미분화된 형태의 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 공기 밀봉 용기, 예를 들자면 밀봉된 백 안에 건조한 상태로 포장된다. 슬러리 형태로 균질되거나 미분화된 바이오매스는 다른 용기들 가운데 튜브에 편리하게 포장될 수 있다. 선택적으로, 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 유지 기간을 증가시키기 위하여 진공에서 포장될 수 있다. 포장된 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루를 냉장할 필요는 없다. 포장된 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 상기에서 논의한 바와 같이, 일반 조리법에서 주어진 양의 오일, 지방 또는 계란을 대체하기 위하여 어느 정도 양의 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루를 이용해야 하는 지에 대한 지침을 포함하는 사용 설명서를 포함할 수 있다. 단순화시키기 위하여, 이 지침에서 오일 또는 지방은 2:1 비율로 바이오매스의 양 또는 용적으로 대체되고, 계란은 계란 하나 당 11g의 바이오매스 또는 1 티스푼의 조류 오일 비율로 대체된다고 명시할 수 있다. 상기에서 논의한 바와 같이, 기타 비율도 가능한데, 예를 들면, 일반 조리법에서 오일 및/또는 지방 및/또는 계란의 양 또는 용적에 대해 10-175%의 양 또는 용적의 바이오매스의 비율을 이용한다. 밀봉된 포장의 개봉시, 이 지침은 사용자에게 예를 들자면, 일반 시장에 광범위하게 이용되는 것과 같은 공기 밀폐 용기들(가령, Glad) 안에 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루를 넣어두고, 임의 선택적으로 냉장보관하라고 지시할 수 있다.
조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 (대부분 온전한 또는 균질화된 또는 미분화된 분말)는 기타 건조 성분들 (가령, 슈가, 가루, 건조 과일, 향신료)과 복합된 형태로 포장될 수 있고, 최종 제품에서 균질성을 유지하도록 부분 포장될 수 있다. 이 혼합물은 소비자 또는 식품 공급 회사가 액체, 예를 들자면 물 또는 우유를 추가하고, 임의 선택적으로 오일 또는 지방 없이 혼합 및/또는 조리하여 식품으로 전환될 수 있다. 일부 경우들에서, 이 액체를 추가하여 건조된 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 조성물을 개량한다. 요리는 임의 선택적으로 전자렌지, 대류 오븐, 일반 오븐, 또는 쿡탑을 이용하여 실시할 수 있다. 이러한 혼합물을 이용하여 케이크, 빵, 팬케이크, 와플, 드링크, 소스 및 이와 유사한 것들을 만들 수 있다. 이러한 혼합물은 소비자가 사용하기에 편리하고 뿐만 아니라 냉장보관없이 장기 유지 기간을 가지는 장점이 있다. 이러한 혼합물은 일반적으로 액체를 추가하여 혼합물을 식품으로 전환시키는 지침을 포함하는 밀봉된 용기내에 포장된다.
식품 성분으로 사용하기 위한 조류의 오일은 식품용 GMP 조건하에 제조 및 포장하는 것이 바람직하다. 이 조류의 오일은 일반적으로 사용되는 오일과 유사한 방식으로 병 또는 기타 용기에 포장된다. 이 용기는 식품에서 일반 오일, 지방 또는 계란의 대용물로, 및 요리 오일로서 이 오일을 사용하는 지침이 기재된 부착된 라벨을 포함할 수 있다. 밀봉된 용기에 포장될 때, 이 오일은 실질적인 변질없이 장기적인 유지 기간(적어도 일 년)을 가진다. 개봉 후, 단일불포화된 오일로 주로 구성된 조류의 오일은 실질적으로 산화에 민감하지 않다. 그러나, 오일의 미 사용 부분은 이를 차갑게 유지하고/거나 직사광선을 피하도록(가령, 둘러쌓인 공간 내, 예를 들자면, 찬장)보관한다면 더 오래 보관하고, 산화가 덜 되게 할 수 있다. 이 오일에 포함된 지침은 이러한 바람직한 보관 정보를 포함할 수 있다.
선택적으로, 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 및/또는 이 조류의 오일은 유지 기간을 최대화시키기 위하여 식품으로 승인된 보존제/항산화제를 함유할 수 있는데, 카로티노이드 (가령, 아스타산틴, 루테인, 지아산틴, 알파-카로틴, 베타-카로틴 및 리코펜), 인지질 (가령, N-아실포스파티딜에탄올아민, 포스파티딘산, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨 및 리소포스파티딜콜린), 토코페롤 (가령, 알파 토코페롤, 베타 토코페롤, 감마 토코페롤 및 델타 토코페롤), 토코트리에놀 (가령, 알파토코트리에놀, 베타 토코트리에놀, 감마 토코트리에놀 및 델타 토코트리에놀), 부틸화된 하이드록시톨루엔, 부틸화된 하이드록시아니솔, 폴리페놀, 로스마린산, 프로필 갈레이트, 아스코르브산, 아스코르브산 나트륨염, 소르브산, 벤조산, 메틸 파라벤, 레불린산, 아니스산, 아세트산, 구연산 및 바이오플라보노이드를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
대부분 온전한 바이오매스, 균질화된, 또는 미분화된 바이오매스 (슬러리, 플레이크, 분말, 또는 가루) 또는 조류의 오일을 인간 영양을 위한 식품으로 통합하는 것에 대한 설명은 비-인간 동물용 식품에도 일반적으로 적용할 수 있다.
이 바이오매스는 이러한 식품에 고품질의 오일 또는 단백질 또는 이 둘 모두를 부여한다. 조류의 오일 함량은 조류의 단백질의 함량과 마찬가지로 적어도 10wt% 또는 20wt%가 바람직하다. 대부분 온전한 바이오매스로부터 이 조류의 오일 및/또는 단백질의 적어도 일부를 얻는 것은 예를 들자면 스포츠 동물 또는 말과 같은 움직임이 많은 동물에 흔히 유익하다. 대부분 온전한 바이오매스는 또한 보존제로 유용하다. 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 또는 오일은 동물 식품에서 일반적으로 볼 수 있는 기타 성분들 (가령, 고기, 고기 풍미, 지방산, 식물성, 과일, 전분, 비타민, 미네랄, 항산화, 프로바이오틱) 및 이의 임의의 조합과 복합된다. 이러한 식품은 반려 동물, 특히 활발한 생활 스타일을 가진 동물들에게 또한 적합하다. 고양이 식품으로 타우린 함유를 권장한다. 일반 동물 식품과 함께, 이 식품은 의도된 동물에 적합한 한입-크기 입자로 제공할 수 있다.
지방을 제거한 식사는 조류의 단백질 농축물 및/또는 단리물(isolate)의 생산, 특히 단백질 함량이 높은-조류의 바이오매스 또는 조류의 가루로부터 지방을 제거한 식사의 생산을 위한 공급 원료로 유용하다. 이 조류의 단백질 농축물 및/또는 단리물은 콩 단백질 농축물/단리물을 만드는데 이용되는 표준 프로세스를 이용하여 만들 수 있다. 조류의 단백질 농축물은 지방을 제거한 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 또는 식사로부터 가용성 당을 제거함으로써, 준비할 수 있다. 나머지 성분들은 주로 단백질 및 불용성 다당류일 것이다. 지방을 제거한 식사로부터 가용성 당을 제거함으로써, 단백질 함량은 증가되고, 따라서 조류의 단백질 농축물이 만들어진다. 조류의 단백질 농축물은 적어도 45 건중량% 단백질을 함유할 것이다. 바람직하게는, 조류의 단백질 농축물은 적어도 50%-75 건중량%의 단백질을 함유할 것이다. 조류의 단백질 단리물은 콩 단백질 단리물을 만드는데 이용된 표준 프로세스를 이용하여 또한 만들 수 있다. 이 프로세스는 보통 NaOH를 이용한 염기성 pH 추출 단계 및 온도와 관련된다. 이 추출 단계 후, 액체와 고체를 분리하고, HCl를 이용하여 액체 분획으로부터 단백질을 침전시킨다. 고체 분획물은 다시 추출될 수 있고, 생성된 액체 분획물을 HCl로 침전시키기 전 모을 수 있다. 그 다음, 이 단백질은 중화되고, 분무 건조되어 단백질 단리물을 만든다. 조류의 단백질 단리물은 일반적으로 적어도 90 건중량%의 단백질을 함유한다.
지방을 제거한 식사는 농장 동물, 가령, 반추동물, 가금류, 돼지 및 수산양식물의 동물 사료로 유용하다. 지방을 제거한 식사는 식품 또는 기타 목적으로 정제된 조류 오일의 준비 부산물이다. 오일 함량이 감소되기는 하였지만, 생성된 식사는 여전히 동물 사료에 적합한 고품질의 단백질, 탄수화물, 섬유, 재 및 기타 영양소를 함유한다. 세포들이 대부분 용해되었기 때문에, 지방을 제거한 식사는 이러한 동물에 의해 용이하게 소화된다. 지방을 제거한 식사는 동물 사료내 기타 성분들, 예를 들자면 곡물과 임의 선택적으로 복합될 수 있다. 지방을 제거한 식사는 가루성 점도를 보유하기 때문에, 상업적으로 이용가능한 압출기 또는 신장기를 이용하여 펠렛으로 압착시킬 수 있다.
A. 통성 식품( Areated Food )
통성 식품은 디저트에 보통 적용하는 용어이지만, 동일한 원리로 조제된 비-디저트 식품에도 적용할 수 있다. 통성 디저트는 무스, 아이스크림, 거품을 낸 토핑, 샤벗, 등과 같은 디저트를 말한다. 통성 식품은 2개 상; 연속 상과 불연속 상으로 구성된다. 불연속 상은 이 식품에 공기 구멍(cell) 또는 공기 버블로 유지되는 공기다. 연속 상은 물, 용해된 고체를 가진 물(예를 들자면 우유), 콜로이드성 고체, 단백질, 등으로 구성될 수 있다. 통성 식품은 불연속 공기 상으로 구성되기 때문에, 이 식품 내부에 공기를 잡아두는 능력이 통성 식품의 성공적인 제조에 관건이 된다. 유화제들은 불연속 상으로 공기 세포를 형성하는 것을 돕고, 안정화제는 이 식품내에 공기 세포들이 온전하게 유지되는 것을 돕는다. 통성 식품의 조제에 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 (특히 지질 풍부한 미세조류 분말)의 추가에 있어서 놀랍고, 기대초과의 효과는 이 바이오매스의 공기를 잡고 있는 능력이다. 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루, 특히 지질 풍부한 미세조류 분말은 공기를 잡아두거나 안정화하는 능력이 뛰어나다. 본 발명의 미세조류 분말 또는 조류의 바이오매스는 또한 상당한 유화 능력을 보유하고, 따라서 통성 식품에 사용하기에 적합하다.
구운 제품들, 예를 들자면 케이크에서, 지질 풍부한 미세조류 분말 또는 조류의 바이오매스에 의해 제공되는 지질을 포함하는 지방은 몇 가지 중요한 역할을 실행한다: (1) 이 지방은 케이크에서 효모로부터 형성된 작은 공기 버블을 잡아두거나 안정화시킴으로써 가볍고, 가뿐한(airy) 질감을 부분적으로 담당한다 (이는 빵에서도 마찬가지일 것이다); (2) 지방은 가루 단백질을 코팅하고, 글루텐 형성을 억제함으로써 "입안에서 녹는" 질감과 기타 감각자극에 반응하는 성질을 만든다; (3) 고체 지방 (포화도가 높은 수준의)은 보통 액체 지방 보다 공기를 잡아두거나 안정화시키는 능력이 더 크고, 이는 더 가벼운 질감을 만든다; 그리고 (4) 유화제 (예를 들자면, 모노글리세리드 및 디글리세리드)는 반죽에서 지방 분포를 돕고, 이는 반죽에서 공기 버블을 더 잘 분포시키고, 이로써 케이크 또는 구운 제품들의 가볍고, 가뿐한 질감으로 이어진다. 지질 풍부한 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 모노글리세리드 및 디글리세리드를 함유하지만, 포화된 지방 (고형 지방, 예를 들자면 버터/라드와는 달리)을 함유하지 않는다. 따라서, 버터 및/또는 계란 노른자를 대체하기 위하여, 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스만을 이용하였을 때, 구운 제품들에서 지질 풍부한 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스가 이러한 우수한 공기 유지/안정화 능력을 보유하고, 동일한 가뿐한/가벼운 질감을 만든다고 예상하지 못한다.
통성 식품의 또 다른 예는 아이스크림 (또는 샤벗 및 젤라토, 등)이다. 아이스크림은 보통 공기 함량이 20% 또는 초과(불연속 상)인 부분적 냉동 포말로 정의될 수 있다. 연속 상은 용해된 콜로이드성 고체, 가령, 휴화된 형태의 당, 단백질, 안정화제, 및 지방 상을 함유한다. 전자 현미경하에서, 아이스크림의 구조는 연속 상을 구성하는 얼음 결정중에서 지방 소립에 의해 코팅된 공기 세포들로 구성된 것으로 보인다. 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스의 유화 능력 및 지질 함량으로 인하여 아이스크림의 제조에 사용하기에 적합하다. 통성 식품의 기타 비-제한 예는 무스 (세이버리(savory) 및 스위트 모두), 거품을 낸 토핑/크림, 및 머랭을 포함한다. 통성(Aeration)은 또한 일부 케이크 (가령, 엔젤 식품 케이크), 쿠키, 빵 또는 소스에서 볼 수 있는 가벼움을 제공한다.
B. 분쇄 및 개량육( Comminuted and Reformed Meats )
분쇄육은 근본적으로 고체 및 액체의 분산으로 구성된 기본적으로 2개 상 시스템으로, 이때 고체는 혼합되지 않는다. 이 액체는 염의 수성 용액이며, 동시에 고기(고체)의 근육 섬유, 지방, 및 연결 조직의 불용성 단백질(및 기타 성분들)이 분산되고, 매트릭스를 형성하는 매질이다. 비록 이 두 가지 상 시스템은 기술적으로 에멀전은 아니지만, 이 시스템은 고기 “에멀전(emulsion)”의 성분 및 구조적 측면을 가진다. 이 고기 에멀전의 안정적 상태는 분쇄되고 개량된 고기의 일체성의 원인이 된다. 분쇄된 고기의 고체 상은 외력이 가해진 고기(forced meat)에서 볼 수 있는 밀도로 다져진 또는 분쇄된 가공육 (기타 성분들 중 근육 섬유, 결합 조직 및 지방을 포함하는)로 구성된다. 그 다음, 고체 상은 액체 상에 통합되어 고기 에멀전을 만든다. 분쇄된 고기의 통상적인 예로는 소세지, 프랑크푸르트소세지, 볼로냐(bologna), 고기 패티 (가령, 햄버거 패티) 및 통조림 고기를 포함한다.
개량된 고기는 기계적으로 분리되고, 모양을 개량한 고기를 말한다. 이 고기는 “개량(reformed)”되었기 때문에, 이 육가공품은 붕괴된(disrupted) 컷, 슬라이스 또는 고기의 일부분의 외양을 갖는 가공품을 보유할 수 있는데, 이는 잘게 분쇄된 고기를 추가 또는 추가하지 않은 다진 고기를 “텀블링”시켜 만들고, 이에 의해 다진 고기의 가용성 단백질은 서로 작은 조각에 결합한다. 고기의 기계적인 분리는 쳐서 다지기(chopping), 글라인딩(grinding) 또는 더 작은 조각으로 고기로 프로세스하여, 근육 섬유를 짧게 하는 기타 형태를 포함한다. 고유의 고기 섬유가 파괴되었기 때문에, 부분적인 고기 에멀전(분쇄된 고기와 유사한)의 형성은 개량된 육가공품을 유지하는데 필수적이다. 개량육 제품들의 비-제한적 예는 치킨 너겟, 포장된 콜드컷(가령, 햄, 칠면조 등) 및 생선 스틱이다.
본 발명의 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루를 분쇄되고 개량된 고기에 재료를 추가할 수 있다. 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루는 이러한 고기 제품들에 다기능 효과를 보유할 수 있다. 한 측면은, 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루가 벌크제 또는 충전제품일 수 있다는 것이다. 또 다른 측면은 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루의 지질, 탄수화물 및 단백질은 분쇄된/개량육에서 기타 성분들을 위한 결합제로 작용할 수 있다는 것이다. 놀랍고 예상치 못한 또 다른 장점은 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루 (특히, 지질 풍부한 조류의 가루)는 분쇄된 고기 및/또는 개량육 제품들, 특히 이 육가공품이 저지방 함유 고기로 만든 경우, 제품들의 질감 및 풍미를 개선시킬 수 있다는 점이다. 저지방 (4% 지방) 가루로 빻은 소고기 및 가루로 빻은 칠면조(3% 지방)는 질기고(resistatant), 잘 씹히지 않으며 건조한 질감을 가질 수 있고, 생고기와 유사한(liver-like) "특징지을 수 없는” 고기 풍미를 가질 수 있다. 지질 풍부한 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스를 추가하면 이러한 저지방 고기로 만든 분쇄된 및/또는 개량된 고기의 질감 및 풍미 모두 개선할 수 있다. 이러한 경우에, 저지방 육가공품은 지질 풍부한 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스를 추가하지 않은 경우보다 더 풍부하고 더 고기같은 더 부드러운 맛과 수분 감이 더 많은 질감을 가질 것이고, 저지방 육가공품에 지방이 더 많은 가루로 빻은 소고기 (20% 지방) 또는 가루로 빻은 칠면조(15% 지방)와 유사한 질감을 제공할 것이다. 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루를 분쇄된 및/또는 개량된 고기에 추가하면 지방이 더 많은 고기 제품의 질감 및 맛을 보유하면서, 더 건강한 육가공품(지방이 낮음)을 만들 수 있다.
C. 유제품 모방체( dairy mimetics )
조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 유제품 모방체 또는 유제품 대체제(버터를 대신하여 조류 가루를 이용한 예를 포함)로 이용할 수 있다. 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 효소 변형된 치즈 (치즈 풍미 또는 치즈 소스에서)와 블렌드되었을 때 증량제로도 또한 이용할 수 있다. 추가적으로, 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스를 또한 이용하여 음료, 예를 들자면 조류의 우유를 만들 수 있다. 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 식품 (식품에 부드럽고 매끄러운 질감을 제공하기 위하여 유제품들이 추가된 식품)의 예를 들자면 마카로니 및 치즈, 두유, 쌀 우유, 아몬드 우유, 요거트, 아이스크림, 거품을 낸 크림, 등과 같은 크림성을 또한 증가시킬 수 있다.
지방을 제거한 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 또한 유제품 모방체로 이용할 수 있다. 지방을 제거한(defatted) 또는 지질을 제거한(delipidated) 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 추출 후 실질적인 양의 오일을 함유하지 않는다. 프로세싱 방법에 따라, 지방을 제거한 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 이 조류의 바이오매스 또는 조류의 가루의 성분인 인지질을 포함할 수 있다. 지방을 제거한 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 비-유제품이며 및 지방이 잠재적으로 매우 낮다(비-유제품 커피크림을 만드는데 현재 이용되는 수소화된 오일을 함유한 트란스-지방과 비교하여). 커피에 추가되었을 때, 지방을 제거한 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 커피의 쓴 맛을 감소시킬 수 있고, 부드럽고 매끄러운 식감(풍부함)을 부여할 수 있다. 이 제품은 커피크림으로 적합하거나 또는 모카, 핫 초코릿, 프라페(frappe) 및 기타 커피-관련 드링크에 적합하다
다음의 실시예들은 설명을 위하여 제공되고, 청구된 발명을 제한시키지 않는다.
V. 실시예
실시예 1
높은 오일 함량을 얻기 위한 미세조류의 배양
미세조류 균주들을 20%(건조세포중량) 초과의 오일을 얻는 것을 목표로 진탕배양 플라스크(shake flasks)에서 배양하였다. 이용된 플라스크 배지는 다음과 같다: K2HPO4: 4.2 g/L, NaH2PO4: 3.1g/L, MgSO4·7H2O: 0.24g/L, 구연산 일수화물: 0.25g/L, CaCl2 2H2O: 0.025g/L, 효모 추출물: 2g/L, 및 2% 글루코오즈. 냉동보존된 세포들을 실온에서 해동시키고, 500 ㎕의 세포들을 4.5 ㎖의 배지에 추가하였고, 6-웰 플레이트에서 교반시키면서(200rpm) 28℃에서 7일간 성장시켰다. 건조 세포 중량은 사전-무게를 측정한 Eppendorf 튜브에서 5분간 14,000rpm에서 1㎖ 배양물을 원심분리하여 측정하였다. 배양 상청액을 버리고, 생성된 세포 펠렛을 1㎖의 탈이온수로 세척하였다. 배양물을 다시 원심분리하고, 상청액을 버리고, 세포 펠렛을 -80℃에 두고 냉동시켰다. 그 다음 시료들을 24시간 동안 동결건조시키고, 건조 세포 중량을 계산하였다. 배양물에서 총 지질을 측정하기 위하여, 3 ㎖의 배양물을 빼내고, 제조업자의 프로토콜에 따라 Ankom 시스템(Ankom Inc., Macedon, NY)을 이용하여 분석하였다. 시료는 제조업자의 프로토콜에 따라 Amkom XT10 추출기로 용매 추출하였다. 총 지질은 산 가수분해된 건조된 시료와 용매 추출된, 건조된 시료간의 차이로 측정하였다. 오일 백분율(건조 세포 중량) 값은 표 1에 표시된다.
표 1. 건조 세포 중량에 대한 오일 비율
Figure 112012091988967-pct00001
클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)의 추가 균주를 상기에서 설명한 조건들 하에서 성장시키고, 표준 기체 크로마토그래피(GC/FID) 과정을 이용하여 이들 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 균주 각각에 대한 지질 프로파일을 결정하였다. 지질 프로파일의 요약은 하기에 포함된다. 값은 총 지질의 영역 백분율로 나타낸다. UTEX의 수집 번호는 UTEX Algae Collection at the Univeristy of Texas, Austin (1 University Station A6700, Austin, Texas 78712-0183)의 조류 균주들이다. CCAP의 수집 번호는 Culture Collection of Algae and Protozoa (SAMS Research Services, Ltd. Scottish Marine Institute, OBAN, Argull PA37 1QA, Scotland, United Kingdom)의 조류 균주들이다. SAG의 수집 ㅂ버번호는 Culture Collection of Algae at Goettingen University (Nikolausberger Weg 18, 37073 Gottingen, Germany)의 조류 균주들이다.
Figure 112012091988967-pct00002
이들 데이터는 상기 모든 균주들이 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)이지만, 일부 균주 간에는 지질 프로파일의 차이가 있음을 보여준다.
실시예 2
오일 함량이 높은 조류의 바이오매스를 만드는 것을 목적으로 세 가지 상이한 배지 제형으로 3가지 발효 프로세스를 실행하였다. 제 1 제형(배지 1)은 Wu et al. (1994 Science in China, vol. 37, No. 3, pp. 326-335)에서 설명한 배지에 근거하고, L당 다음으로 구성된다: KH2PO4, 0.7g; K2HPO4, 0.3g; MgSO4-7H2O, 0.3g; FeSO4-7H2O, 3㎎; 티아민 하이드로클로라이드, 10 ㎍; 글루코오즈, 20 g; 글리신, 0.1g; H3BO3, 2.9㎎; MnCl2-4H2O, 1.8㎎; ZnSO4-7H2O, 220㎍; CuSO4-5H2O, 80㎍; 및 NaMoO4-2H2O, 22.9㎎. 제 2 배지(배지 2)는 실시예 1에서 설명한 플라스크 배지로부터 유도되었으며, L 당 다음으로 구성된다: K2HPO4, 4.2g; NaH2PO4, 3.1g; MgSO4-7H2O, 0.24g; 구연산 일수화물, 0.25g; 염화칼슘 탈수화물, 25㎎; 글루코오즈, 20 g; 효모 추출물, 2g. 제 3 배지 (배지 3)는 하이브리드이며, L당 다음으로 구성된다: K2HPO4, 4.2g; NaH2PO4, 3.1g; MgSO4-7H2O, 0.24g; 구연산 일수화물, 0.25g; 염화칼슘 탈수화물, 25㎎; 글루코오즈, 20 g; 효모 추출물, 2g; H3BO3, 2.9㎎; MnCl2-4H2O, 1.8 ㎎; ZnSO4-7H2O, 220㎍; CuSO4-5H2O, 80㎍; 및 NaMoO4-2H2O, 22.9㎎. 3가지 배지 제형 모두 준비하였고, 실험실 규모의 발효 용기에서 121℃에서 30분간 오토클레이브 살균하였다. 오토클레이브 살균 후 냉각시킨 후 멸균 글루코오즈를 추가하였다.
각 발효기의 접종물은 접종된 발효기의 배지 및 온도 조건들을 이용하여 두 개 플라스크 단계에서 준비된 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) (UTEX 250)이었다. 각 발효기에 10% (v/v)의 중간 로그(mid-log) 배양물을 접종하였다. 3가지 실험실 규모 발효기fmf 실험 기간 동안 28℃에서 유지시켰다. 배지 1에서 조류의 세포 성장은 23℃에서 또한 평가하였다. 모든 발효기 평가를 위하여 pH를 6.6-6.8로 유지시켰고, 교반은 500rpm, 기류는 1vvm이었다. 발효 배양물은 11일간 배양하였다. 바이오매스 축적은 750 nm에서 광학 밀도 및 건조 세포 중량으로 측정하였다.
지질/오일 농도를 표준 기체 크로마토그래피 방법과 함께 직접적인 에스테르교환반응을 이용하여 측정하였다. 간략하게 설명하자면, 바이오매스를 갖는 발효 브로스 시료를 블랏팅 페이퍼에 블랏시키고, 원심분리 튜브로 이동시키고, 65-70℃에서 1시간 동안 진공 오븐에서 건조시켰다. 시료를 건조시킬 때, 2mL의 메탄올 내 5% H2SO4을 튜브에 추가하였다. 그 다음 튜브들을 65-70℃의 히팅 블록에서 3.5시간 동안 가열하였고, 가열하는 동안 간헐적으로 볼텍스하거나 초음파파쇄하였다. 그 후 2㎖의 헵탄을 추가하였고, 이들 튜브를 활발하게 흔들었다. 2㎖의 6% K2CO3를 추가하였고, 이들 튜브를 활발하게 흔들어 혼합시키고, 2분간 800rpm에서 원심분리시켰다. 그 다음 상청액을 Na2SO4 건조제를 함유하는 GC 바이알로 옮기고, 표준 기체 크로마토그래피 방법을 이용하여 이동시켰다. 오일/지질 백분율은 건조 세포 중량에 기초하였다. 배지 1을 이용하여, 23℃에서 성장한 세포들의 건조세포 중량은 9.4g/L이었다; 배지 1을 이용하여, 28℃에서 성장한 세포들의 건조세포 중량은 1.0 g/L이었고, 배지 2를 이용하여, 28℃에서 성장한 세포들의 건조세포 중량은 21.2g/L이었고; 배지 3을 이용하여, 28℃에서 성장한 세포들의 건조세포 중량은 21.5g/L이었다. 배지 1을 이용하여, 23℃에서 성장한 세포들의 지질/오일 농도는 3g/L이었고; 배지 1을 이용하여, 28℃에서 성장한 세포들의 지질/오일 농도는 0.4g/L이었고; 배지 2를 이용하여, 28℃에서 성장한 세포들의 지질/오일 농도는 18 g/L이었고; 배지 3을 이용하여, 28℃에서 성장한 세포들의 지질/오일 농도는 19g/L이었다. 배지 1을 이용하여, 23℃에서 성장한 세포들의 건조 세포 중량에 근거한 오일 백분율은 32%이었고; 배지 1을 이용하여, 28℃에서 성장한 세포들의 건조 세포 중량에 근거한 오일 백분율은 40%이었고; 배지 2를 이용하여, 28℃에서 성장한 세포들의 건조 세포 중량에 근거한 오일 백분율은 85%이었고; 배지 3을 이용하여, 28℃에서 성장한 세포들의 건조 세포 중량에 근거한 오일 비율은 88%이었다. 28℃에서 3가지 상이한 배지 제형을 이용하여 만든 조류 바이오매스의 지질 프로파일(내부 표준에 표준화시킨 후, 영역 %)을 하기 표 2에 요약한다.
표 2. 상이한 배지 조건하에 성장한 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides )의 지질 프로파일
Figure 112012091988967-pct00003
실시예 3
식품용 바이오매스의 조제
실시예 1-2중 임의의 하나에서 설명한 것과 같이 미세조류를 배양하여 미세조류의 바이오매스를 만들었다. 이 미세조류의 바이오매스를 발효기, 플라스크, 또는 기타 생물반응기로부터 수거하였다.
GMP 과정은 다음과 같다. 건강진단 또는 관리 관찰에 의해 병, 화끈거림(boils), 또는 감염된 상처를 포함하는 개방 병소, 또는 임의의 기타 비정상적인 미생물 오염의 원천을 가진 것으로 나타나는 또는 가진 것으로 보이는 임의의 사람은 이로 인하여 식품, 식품-접촉 표면, 또는 식품 포장 물질들이 오염되기 시작할 합당한 가능성이 있기 때문에 이러한 상태가 바로잡힐 때까지 이러한 오염을 초래할 것으로 예상할 수 있는 임의의 작업으로부터 배제된다. 인사부는 그들의 감독관에게 이러한 건강 상태를 보고해야 한다. 이 미세조류의 바이오매스, 바이오매스-접촉 표면, 및 바이오매스-포장 물질들과 직접 접하는 모든 작업자는 근무 중에 이 미세조류의 바이오매스의 오염으로부터 보호하는데 필요한 범위로 위생 실시에 부합한다. 청결을 유지하는 방법들은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: (l) 바이오매스, 바이오매스-접촉 표면, 또는 바이오매스 포장 물질들의 오염으로부터 보호하는 방식으로 작업에 적합한 겉옷을 착용. (2) 적절한 개인 청결을 유지. (3) 작업을 시작하기 전, 작업 단계로부터 매번 벗어날 때, 및 손이 더럽혀지거나 또는 오염되기 시작할 수 있는 임의의 기타 시기에 적절한 손 세척 설비에서 손을 깨끗하게 씻기(그리고 바람직하지 않은 미생물로의 오염에 대해 보호할 필요가 있을 때 위생적으로 한다). (4) 바이오매스, 장비 또는 용기로 떨어질 수 있는 모든 거추장스런 장신구 및 기타 물질을 제거하고, 손으로 바이오매스를 다루는 동안 적절하게 위생처리할 수 없는 손 장신구를 제거. 만일 이러한 손 장신구를 제거할 수 없다면, 온전하고, 깨끗하고, 위생 상태로 유지될 수 있으며, 이러한 물질에 의한 이 바이오매스, 바이오매스-접촉 표면, 또는 바이오매스-포장 물질들의 오염으로부터 효과적으로 보호할 수 있는 물질로 덮을 수 있다. (5) 바이오매스를 취급할 때 이용한다면, 장갑을 온전하고, 깨끗하고, 위생 상태로 유지. 이 장갑은 불투성 물질이어야 한다. (6) 적절한 곳에, 헤어 네트(hair nets), 헤드밴드, 캡(caps), 수염 덮개, 또는 기타 효과적인 털 가리재(restraint)를 효과적인 방식으로 착용. (7) 바이오매스에 노출되는 지역 이외의 영역 또는 장비 또는 기구가 세척되는 지역 이외의 영역에 옷 또는 기타 개인 소지품의 보관. (8) 바이오매스에 노출될 수 있는 지역 이외의 영역 또는 장비 또는 기구가 세척되는 지역 이외의 영역에서는 다음을 제한한다: 바이오매스를 섭취, 껌 씹기, 음료 마시기 또는 흡연. (9) 바이오매스, 바이오매스-접촉 표면, 또는 바이오매스-포장 물질들이 미생물 또는 발한, 털, 화장품, 담배, 화학물질, 피부에 바르는 의약품을 포함하나 이에 한정되지 않는 외부 물질로의 오염으로부터 보호하기 위한 임의의 기타 필요한 주의를 취한다, 이 미세조류의 바이오매스는 임의 선택적으로 용해물을 만들기 위하여 세포 파괴 과정을 거치고/거나 미세조류의 바이오매스 조성물을 만들기 위하여 임의 선택적으로 건조될 수 있다.
실시예 4
건조된 클로렐라 프로토테코이드( Chlorella protothecoides ) 바이오매스 안에 조류의 독소 부재
실시예 1에서 설명한 방법을 이용하여 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) (UTEX 250) 바이오매스의 시료를 성장시키고, 준비하였다. 건조된 바이오매스는 오염시키는 조류 및 남세균(cyanobacterial) 독소의 존재에 대하여 액체 크로마토그래피-질량 분광광도/질량 분광광도(LC-MS/MS) 분석을 이용하여 분석하였다. 이 분석은 문헌에서 공개된 그리고 국제 식품 규정에 언급된 모든 집단의 조류 및 남세균 독소를 포괄하였다. 이 결과들에서, 이 바이오매스 시료는 테스트한 임의의 탐지가능한 수준의 임의의 조류 또는 남세균 독소를 함유하지 않음을 보여준다. 표 3에 결과를 요약한다.
표 3. 해조류 및 남세균 독소의LC-MS/MS 분석 결과
Figure 112012091988967-pct00004
실시예 5
클로렐라 프로토테코이드( Chlorella protothecoides ) 바이오매스내 식이 섬유의 함량
Offical Methods of ACOC International (AOAC 방법 991.43)에 따라 실시예 1에서 설명한 방법들을 이용하여 성장하고, 준비된 건조된 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) (UTEX 250) 바이오매스의 시료에서 근접(Proximate) 분석을 실시하였다. 두 시료 모두에서 총 지방 함량 (지질/오일)에 대한 산 가수분해를 실행하였고, 지질 함량이 높은 조류의 바이오매스의 지방 함량은 대략 50%이었고, 단백질 함량이 높은 조류의 바이오매스의 지방 함량은 대략 15%이었다. 미정제 섬유 함량은 지질 함량이 높은 조류의 바이오매스와 단백질 함량이 높은 조류의 바이오매스 모두 2%이었다. 수분 (중력측정에 의해 측정됨)은 지질 함량이 높은 조류의 바이오매스와 단백질 함량이 높은 조류의 바이오매스 모두에서 5%이었다. 재 함량(도가니 연소 및 무기 재의 분석에 의해 측정됨)은 지질 함량이 높은 조류의 바이오매스의 경우 2%였고, 단백질 함량이 높은 바이오매스의 경우 4%이었다. 각 바이오매스의 연소로부터 방출된 질소의 양에 의해 측정된 미정제 단백질은 지질 함량이 높은 바이오매스의 경우 5%이었고, 단백질 함량이 높은 바이오매스의 경우 50%이었다. 탄수화물 함량은 지방, 미정제 섬유, 수분, 재 및 미정제 단백질에 대한 상기 공지의 값을 취하고, 100에서 이들의 총합을 빼, 차이로 계산하였다. 지질 함량이 높은 바이오매스에 대한 계산된 탄수화물 함량은 36% 이었고, 단백질 함량이 높은 바이오매스에 대한 탄수화물의 함량은 24%이었다.
두 가지 조류의 바이오매스의 탄수화물 함량의 추가 분석에서 시료에는 대략 4-8% (w/w)의 유리당 (대부분 슈크로즈)이 함유된 것으로 나타났다. 유리당(푸락토즈, 글루코오즈, 슈크로즈 말토즈 및 락토오즈에 대한 분석)에 대해 지질 함량이 높은 조류의 바이오매스의 다중 로트(lot)를 테스트하였고, 슈크로즈의 양은 2.83% 내지 5.77% 범위였고; 말토즈는 미탐지 내지 0.6% 범위였고; 글루코오즈는 미탐지 내지 0.6% 범위였다. 기타 당들, 즉 푸락토즈, 말토즈 및 락토오즈는 분석된 임의의 로트에서 탐지되지 않았다. 단백질 함량이 높은 조류의 바이오매스의 다중 로트를 또한 유리당에 대해 테스트하였고, 임의의 로트에서 오직 슈크로즈만 6.93% 내지 7.95%의 범위로 탐지되었다.
두 가지 조류의 바이오매스 모두의 총 식이섬유 함량 (조류의 바이오매스의 탄수화물 분획물 내) 분석은 Offical Methods of ACOC International (AOAC 방법 991.43)에 따른 방법들을 이용하여 실행하였다. 지질 함량이 높은 바이오매스는 19.58%의 가용성 섬유 및 9.86%의 불용성 섬유를 함유하였고, 총 식이섬유는 29.44%이었다. 단백질 함량이 높은 바이오매스는 10.31%의 가용성 섬유와 4.28%의 불용성 섬유를 함유하였고, 총 식이섬유는 14.59%이었다.
조류의 바이오매스의 단당류 분석
실시예 4에서 설명한 방법들을 이용하여 성장시키고, 준비한, 대략 50%(건조 세포 중량)의 지질을 가진 건조된 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) (UTEX 250) 바이오매스의 시료를 액시디드 메타놀로지이스(acidid methanologyis)에 의해 시료로부터 생산된 단당류 메틸 글리코시드의 퍼-O-트리메틸실일(TMS) 유도체의 복합 기체 크로마토그래피/질량 분광광도계(GC/MS)를 이용하여 단당류(글리코실) 조성물에 대해 분석하였다. 간략하게 설명하자면, 메틸 글리코시드를 건조된 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 시료로부터 80℃에서 18-22℃ 동안 메탄올 내 1M HCl에 메탄용해에 의해 준비하였고, 이어서 메탄올내 피리딘과 아세트산 무수물로 재-N-아세틸화하였다(아미노 당의 탐지를 위하여). 그 다음 시료를 80℃에서 30분간 Tri-Sil (Pierce)으로 처리하여 퍼-O-트리메틸실릴화하였다. 이러한 과정은 Merkle and Poppe (1994) methods Enzymol. 230:1-15 and York et al. (1985) methods Enzymol. 118:3-40에서 이미 설명되었다. TMS 메틸 글리코시드의 GC/MS 분석을 All Tech EC-1 융합된 실리카 모세 컬럼(30m x 0.25 mm ID)을 이용하여, 5975b MSD에 연결된 HP 6890 GC에서 실행하였다. 단당류들은 표준에 대한 이들의 정체(retention) 시간으로 확인하였고, 이들 탄수화물 특징은 이들의 질량 스펙트럼으로 증명하였다. 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)의 단당류(글리코실) 조성물은 다음과 같다: 1.2 mole %의 아라비노즈, 11.9 mole %의 만노즈, 25.2 mole %의 갈락토즈 및 61.7 mole %의 글루코오즈. 이들 결과들은 총 탄수화물의 몰 백분율로 나타낸다.
실시예 6
조류의 바이오매스의 아미노산 프로파일
실시예 1에서 설명한 방법들을 이용하여 성장시키고, 준비한, 대략 50%(건조 세포 중량)의 지질을 가진 건조된 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) (UTEX 250) 바이오매스의 시료를 Official Methods of AOAC International (트립토판 분석: AOAC 방법 988.15; 메티오닌 및 시스틴 분석: AOAC 방법 985.28 및 기타 아미노산: AOAC 방법 994.12)에 따라 아미노산 함량에 대해 분석하였다. 건조된 조류의 바이오매스의 아미노산 프로파일(총 단백질의 백분율로 표현됨)을 건조된 온전한 계란 (Whole Egg, Protein Factory Inc., New Jersey의 제품 명세 쉬트에 있는 프로파일)의 아미노산 프로파일과 비교하였고, 그 결과들은 두 가지 원천이 필적할 수준의 단백질 영양 가치를 보유한다는 것을 보여준다. 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)의 시료의 상대적인 아미노산 프로파일 결과는 이 바이오매스가 메티오닌 (2.25%), 시스테인 (1.69%), 리신 (4.87%), 페닐알라닌 (4.31%), 류신(8.43%), 이소류신(3.93%), 트레오닌(5.62%), 발린(6.37%), 히스티딘(2.06%), 아르기닌(6.74%), 글리신 (5.99%), 아스파르트산(9.55%), 세린(6.18%), 글루타민산(12.73%), 프롤린(4.49%) 하이드록시프롤린(1.69%), 알라닌(10.11%), 티로신 (1.87%), 및 트립토판 (1.12%)을 함유한다는 것을 보여준다.
실시예 7
클로렐라 프로토테코이드( Chlorella protothecoides ) UTEX 250 바이오매스, 클로렐라 프로토테코이드( Chlorella protothecoides ) 조류의 가루, 클로렐라 프로토테코이드( Chlorella protothecoides ) 색 돌연변이체 (균주 BM1320)의 카로티노이드, 인지질, 토코트리에놀 및 토코페롤 조성물 및 클로렐라 프로토테코이드( Chlorella protothecoides ) 색 돌연변이체 (균주 BM1320)로부터 추출한 오일
실시예 4에서 설명한 방법들을 이용하여 만든 조류의 바이오매스의 시료를 표준 상 HPLC, AOCS 방법 Ce 8-89를 이용하여 토코트리에놀 및 토코페롤 함량에 대해 분석하였다. 이 바이오매스의 토코트리에놀 및 토코페롤 함유 분획물을 헥산 또는 또 다른 비-극성 용매를 이용하여 추출하였다. 완전한 토코트리에놀 및 토코페롤 조성물 결과를 표 4에 요약한다.
표 4. 조류 바이오매스내 토코트리에놀 및 토코페롤 함량
Figure 112012091988967-pct00005
이 바이오매스의 카로티노이드 함유 분획물을 단리하였고, HPLC 방법들을 이용하여 카로티노이드에 대해 분석하였다. 카로티노이드 함유 분획물을 동결건조된 조류의 바이오매스 (실시예 3에서 설명된 방법들을 이용하여 만들어진)와 알루미늄 몰타르 안에서 탄화규소와 혼합하여 준비하고, 몰타르와 절구로 매번 1분간 4회 가루로 빻았다. 가루로 빻은 바이오매스와 실리콘 혼합물을 테트라하이드로퓨란(THF)으로 헹구고, 상청액을 수거하였다. 상청액이 무색이 될 때 까지 이 바이오매스의 추출을 반복하였고, 모든 추출의 THF 상청액을 모아서, 표준 HPLC 방법을 이용하여 카로티노이드 함량에 대해 분석하였다. 드럼 건조기를 이용하여 건조된 조류의 바이오매스에서 카로티노이드 함량은 상기에서 설명하는 방법들을 이용하여 분석하였다.
냉동 건조된 조류의 바이오매스의 카로티노이드 함량은 다음과 같았다: 총 루테인 (66.9-68.9mcg/g: 시스-루테인은 12.4-12.7mcg/g이었으며, 트란스-루테인은 54.5-56.2mcg/g이었다); 트란스-지아산틴 (31.427-33.451mcg/g); 시스-지아산틴 (1.201-1.315mcg/g); t-알파 크립토산틴 (3.092-3.773mcg/g); t-베타 크립토산틴 (1.061-1.354mcg/g); 15-시스-베타 카로틴 (0.625-.0675mcg/g); 13-시스-베타 카로틴 (.0269-.0376mcg/g); t-알파 카로틴 (0.269-.0376mcg/g); c-알파 카로틴 (0.043-.010mcg/g); t-베타 카로틴 (0.664-0.741mcg/g); 및 9-시스-베타 카로틴 (0.241-0.263mcg/g). 보고된 총 카로티노이드는 105.819mcg/g 내지 110.815mcg/g의 범위였다.
드럼-건조된 조류의 바이오매스의 카로티노이드 함량은 상당히 더 낮았다: 총 루테인 (0.709mcg/g: 트란스-루테인은 0.091mcg/g이었고, 시스-루테인은 0.618mcg/g이었다); 트란스-지아산틴 (0.252mcg/g); 시스-지아산틴 (0.037mcg/g); 알파-크립토산틴 (0.010mcg/g); 베타-크립토산틴 (0.010mcg/g) 및 t-베타-카로틴 (0.008mcg/g). 보고된 총 카로티노이드는 1.03mcg/g이었다. 이러한 데이터는 조류의 바이오매스를 건조하는데 이용된 방법이 카로티노이드 함량에 상당한 영향을 줄 수 있음을 암시한다.
인지질 분석을 이 조류의 바이오매스에서 또한 실행하였다. 인지질 함유 분획물은 Folch 추출방법 (클로로포름, 메탄올 및 물 혼합물)을 이용하여 추출하였고, 오일 시료는 인지질 함량에 대해 AOCS Official Method Ja 7b-91, 가수분해된 레시틴 (International Lecithin and Phopholipid Society 1999)의 HPLC 측정, 및 빛 분산 탐지와 함께 인지질의 HPLC 분석(International Lecithin and Phopholipid Society 1995) 방법들을 이용하여 분석하였다. 전체 인지질(w/w%)은 1.18%이었다. 조류 오일의 인지질 프로파일은 포스파티딜콜린 (62.7%), 포스파티딜에탄올아민 (24.5%), 리소포스파티딜콜린(1.7%) 및 포스파티딜이노시톨 (11%)이었다. 이 조류의 바이오매스로부터 인지질 함유 분획물의 헥산 추출을 이용한 유사한 분석을 또한 실행하였다. 전체 인지질(w/w%)은 0.5%이었다. 인지질 프로파일은 포스파티딜에탄올아민 (44%), 포스파티딜콜린 (42%) 및 포스파티딜이노시톨 (14%)이었다.
상기에서 논의한 바와 같이, 인지질 함량에 대해 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 조류의 가루의 시료를 테스트하였다. 이 시료의 총 인지질 함량은 0.8% w/w으로 결정되었다. 개별 인지질 함량(w/w 기준)은 다음과 같다: <0.01 % N-아실포스파티딜에탄올아민, <0.01% 포스파티딘산; 0.25% 포스파티딜에탄올아민, 0.48% 포스파티딜콜린, 0.07% 포스파티딜이노시톨 및 <0.01% l리소포스파티딜콜린.
상기에서 논의한 바와 같이, 인지질 함량에 대해 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)의 색 돌연변이체, 균주 BM320로부터 만든 조류 가루 시료를 테스트하였다. 이 시료의 총 인지질 함량은 0.62% w/w으로 결정되었다. 개별 인지질 함량(w/w 기준)은 다음과 같다: <0.01 % N-acyl포스파티딜에탄올아민, <0.01% 포스파티딘산; 0.21% 포스파티딜에탄올아민, 0.36% 포스파티딜콜린, 0.05% 포스파티딜이노시톨 및 <0.01% 리소포스파티딜콜린.
클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)의 색 돌연변이체, 균주 BM320로부터 추출된 오일은 다양한 성분들에 대해 분석하였다. 오일을 용매 추출(아세톤 및 액체 CO2)에 의해 추출하였다. 이 오일은 정제, 표백 또는 탈취하지 않았다. 이 오일은 0.19(w/w)% 모노글리세리드 및 5.77% 디글리세리드를 포함한다. 이 오일은 100 g 오일 당 3.24 ㎎의 알파 토코페롤과 100 g 오일 당 0.95 ㎎의 감마 토코페롤을 포함한다. 이 오일은 100 g 오일당 191 ㎎의 에르고스테롤, 100 g 오일당 5.70 ㎎의 캄페스테롤, 100 g 오일당 10.3 ㎎의 스티그마스테롤, 100 g 오일당 5.71 ㎎의 β-시토스테롤, 및 100 g 오일당 204 ㎎의 기타 스테롤을 포함한다. 이 오일의 총 토코트리에놀은 100 g 오일당 0.25 ㎎(0.22 ㎎의 알파토코트리에놀, <0.01 ㎎의 베타 토코트리에놀 및 0.03 ㎎의 델타 토코트리에놀)이었다.
실시예 8
조류의 가루 (지질 함량이 높은)의 생산
실시예 1에서 설명된 발효 방법들과 조건들을 이용하여 배양한 높은 지질 함량을 함유하는 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)를 지질 함량이 높은 조류의 가루로 프로세스되었다. 미세조류의 바이오매스를 조류의 가루로 프로세스하기 위하여, 수거한 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 바이오매스를 원심분리를 이용하여 배양물 배지로부터 분리하였다. 40% 초과의 수분을 함유하는 생성된 농축된 바이오매스를 이 바이오매스의 평균 입자 크기가 10 ㎛ 미만이 될 때까지 1000-1200 Bar의 압력 수준에서 작동하는 고압 균질화기 ((GEA model NS1001)를 이용하여 미분화하였다. 그 다음 이 조류의 균질물을 표준 방법들을 이용하여 분무 건조시켰다. 생성된 조류의 가루 (분말형으로 분무 건조된 미분화된 조류의 세포)를 포장하고, 사용할 때까지 보관하였다.
지질 함량이 높은 가루의 시료를 입자 크기에 대해 분석하였다. 물 분산내 조류 가루를 만들었고, 이 조류의 가루 입자 크기를 Hydro 2000S 부착을 이용한 MalvernMastersizer 2000 기계에서 레이져 분절을 이용하여 측정하였다. 대조군 분산은 부드럽게 혼합하여 만들었고, 기타 분산은 100 bar, 300 bar, 600 bar 및 1000 bar의 압력을 이용하여 만들었다. 결과에서 이 조류의 가루의 평균 입자의 크기는 압력이 더 높은 조건에서 더 작아짐을 보여준다(부드러운 혼합 조건에서 3.039㎛이었고, 1000 bar 조건에서 2.484㎛이었다). 이 입자 크기 분포는 더 높은 압력 조건에서 변화되었는데, 크기가 더 큰 (10 ㎛ 초과) 입자는 감소되고, 더 작은 입자(1㎛ 미만)는 증가된다.
실시예 9
고지질 (지질 풍부한) 조류의 가루를 이용한 식품 조성물
다음의 식품 조합물(formulation)은 실시예 8에서 설명한 방법들을 이용하여 만든 고지질(high-lipid)의 조류 가루를 포함하고, 대략 50% 지질을 함유하였다.
조류의 우유/냉동 디져트
조류의 우유를 위한 조합물을 지질 함량이 높은 조류의 가루를 이용하여 만들었다. 이 조류의 우유는 다음 성분들을 함유한다(중량 기준): 88.4%의 물, 6.0%의 조류의 가루, 3.0%의 유장 단백질 농축물, 1.7%의 당, 0.6%의 바닐라 추출물, 0.2%의 소금과 0.1%의 안정화제. 이 성분들을 복합하고, 휴대용 균질화기를 이용하여 저압에서 균질화시켰다. 생성된 조류의 우유는 나누어주기 전에 냉각하였다. 식감은 전유(whole milk)의 것과 필적하였고, 양호한 불투성(opacity)을 가졌다. 이용된 이 조류의 가루는 약 50%의 지질을 함유하였고, 따라서 생성된 조류의 우유는 약 3%의 지방을 함유하였다. 바닐라 풍미의 두유 (Silk)와 비교하였을 때, 이 조류의 우유는 필적할 수준의 식감 및 불투성을 가졌고, 두유의 날콩(beany) 풍미는 없었다.
그 다음 이 조류의 우유를 추가 당 및 바닐라 추출물과 복합하고, 블렌드에서 2-4분간 균질화될 때까지 혼합하였다. 이 혼합물을 원하는 밀도에 도달할 때까지 1-2시간 동안 사전-냉각된 아이스크림 제조기 (Cuisinart) 안에 두었다. 325 grams의 반반 혼합물, 220 grams의 2% 우유와 1개의 계란 노란자로 만든 일반 조리 아이스크림을 비교용으로 준비하였다. 일반 조리 아이스크림은 제공된 소프트 아이스크림과 필적하는 밀도를 보유하였고, 풍부한 맛과, 부드러운-질감의 아이스크림이었다. 조류의 우유로 만든 아이스크림은 일반 조리 아이스크림의 전반적인 크림성과 식감은 부족하였지만, 밀도 및 식감은 풍부한 맛의 아이스 밀크와 필적하였다. 전체적으로, 냉동 디저트 적용에 조류 우유의 사용은 성공적이었다: 만들어진 냉동 디저트 조류의 우유는 일반 아이스크림의 저지방 대체물이었다.
조류의 가루 파운드 케이크
파운드 케이크를 구운 제품들에서 공기 버블(aeration)을 잡고 있거나 안정화시키는 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스의 능력을 설명하기 위하여 구운 제품 조합물의 예로써 지질 함량이 높은 조류의 가루를 이용하여 만들었다. 이 조류의 가루 파운드 케이크의 조합물은 다음과 같다: 바닐라 추출물 (6.0 g); 분말화된 당 (122.0 g); 온전한 계란 (122.0 g); 물 (16.0 g); 다목적용 밀가루 (122 g); 소금 (1.5 g); 잔탄 검(Xanthan gum) (Keltrol F) (0.2 g); 베이킹 파우더 (4 g); 지질 함량이 높은 조류의 가루 (45 g). 계란을 밀집된, 옅은, 크림이 될 때 까지 거품을 내고, 그 다음 당을 추가하고 잘 혼합하였다. 그 다음 바닐라 추출물을 추가하고 혼합한 후, 이 조류의 가루를 넣고, 당/계란 혼합물로 만들었다. 그 다음 건조 성분들을 블렌드하였고, 당/계란 혼합물에 물과 교대로 첨가하였다. 그 후 잘 혼합될 때까지 반죽을 섞었다. 그 다음 반죽은 종이를 댄 머핀 팬에 붓고, 8-9분간 325℉에서 구웠다. 팬을 회전시키고, 다시 8-10분간 굽는다.
이 케이크는 버터를 이용한 파운드 케이크와 동일하게, 잘-발달된 크럼(crumb) 구조를 가진 가볍고, 가뿐한 질감을 가졌다. 버터 대신, 10% (w/w)의 지질 함량이 높은 조류의 가루를 이용한 이 파운드 케이크는 구운 제품 내에 공기 버블을 잡아두거나 또는 안정화시키는 이 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스의 능력을 보였주었다.
마카로니(Macaroni) 및 치즈
고-지질 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스 및 지방을 제거한 조류의 가루 (지질 함량이 높은 조류의 가루의 CO2 추출을 통하여 만듦)의 유제품의 치즈 풍미 와 유제품의 크림성(효소 변형된 치즈 (EMC) 및 버터/우유)을 증가시키는 능력을 검사하기 위하여 마카로니 및 치즈를 만들었다. 이 마카로니 및 치즈의 조합물은 다음과 같다(최종 제품의 중량%로 나타냄): EMC 치즈 분말 (6.35%); 물 (21.27%); 소금 (0.21%); 지질 함량이 높은 조류의 가루 (3.81%); 지방을 제거한 조류의 가루 (0.32%); 조리된 마카로니 누들 (67.95%); 및 50%의 아세트산 (0.10%). 건조 성분들 (누들을 제외하고)을 복합하고, 이 건조 성분들에 물을 추가하였다. 그 다음 이 치즈 혼합물을 누들과 복합하였다.
지질 함량이 높은 조류의 가루 및 지방을 제거한 조류의 가루로 만든 마카로니와 치즈는 EMC 분말 (포장된 마카로니와 치즈)로 만든 마카로니와 치즈 제품들과 비슷한 맛을 내었다. 지질 함량이 높은 조류의 가루/지방을 제거한 조류의 가루를 함유하는 마카로니와 치즈는 포장의 지침에 따라(우유 및 버터와 함께) 만들어진 마카로니와 치즈와 유사한 부드러운 질감 및 식감을 가졌다. 이 실시예는 어떻게 지질 함량이 높은 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스 및 지방을 제거한 조류의 가루가 버터 및 우유의 대용품으로 부드럽고, 강화된 치즈 풍미를 부여할 수 있는 지를 성공적으로 개시한다. 이 조류의 가루 함유 마카로니와 치즈의 전체 지방 함량은 2% 미만이었다.
지질 함량이 높은 조류의 가루를 가진 두유
두유의 부드러운 식감 및 풍부함을 증가시키는 능력을 다음의 조합물로 테스트하였다: 0.5%, 1% 또는 2%의 지질 함량이 높은 조류의 가루 (최종 제품의 중량비로 나타냄)를 함유하는 두유. 또한 음성 대조군으로 조류의 가루가 추가되지 않은 두유를 테스트하였다. 이 조류의 가루를 완전하게 통합될 때까지 두유에 블랜드하였다. 조류의 가루가 추가된 모든 경우에서, 두유는 더 풍부하고, 더 “지방이 가득한” 우유와 유사한 질감을 보유하였다. 추가적으로, 조류의 가루 (심지어 최저 농도에서도)를 함유한 두유는 “날콩(beany)” 맛이 적었다.
저-지방 고기 패티
가루로 분쇄된 비프 패티에서 지질 함량이 높은 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스의 효과를 다음의 조합물에서 테스트하였다: 0, 0.5%, 1% 또는 2%의 지질 함량이 높은 조류의 가루 (최종 제품의 중량 비율)를 함유하는 96%의 무지방, 가루로 빻은 비프. 80%의 무지방 가루로 분쇄된 비프를 양성 대조군으로 이용하였다. 가루로 분쇄된 비프를 잘 혼합될 때까지 이 조류의 가루와 혼합하여, 패티 모양으로 만들었다. 추가 성분들을 추가하지 않았다. 그 다음 패티를 충분히 조리될 때까지 뜨거운 냄비에서 조리하였다. 94%의 무지방 음성 대조군 패티는 건조하였고, 비린 날고기 맛이 있었다. 80%의 무지방 양성 대조군 패티는 더 촉촉하였고, 더 부드러운 질감을 가졌고, 비린 날고기(gamey/liver) 맛은 덜 하였다. 0.5%, 1% 내지 2%의 지질 함량이 높은 조류의 가루와 함께 96%의 무지방의 가루로 분쇄된 비프로 만든 패티는 음성 대조군 패티보다 더 촉촉하였고, 더 부드러운 질감을 보유하였다. 2%의 지질 함량이 높은 조류의 가루 패티는 양성 대조군과 유사한 조직감을 보유하였고, 동일하게 감소된 비린 날고기 맛이 감소하였다.
0, 0.5%, 1% 또는 2% 지질 함량이 높은 조류의 가루 (최종 제품의 중량 백분율)가 통합된 99%의 무지방, 가루로 분쇄된 칠면조로 만든 칠면조 패티를 또한 테스트하였다. 양성 대조군으로써, 93%의 무지방, 가루로 분쇄된 칠면조로 만든 칠면조 패티를 또한 만들었다. 가루로 분쇄된 칠면조를 이 조류의 가루와 잘 블랜드될 때까지 혼합하였고, 패티 모양으로 만들었다. 그 다음 패티는 충분히 조리될 때까지 뜨거운 냄비에서 조리하였다. 97%의 무지방, 칠면조 패티는 건조하고, 단단하고, 질겼다. 93%의 무지방, 양성 대조군 칠면조 패티는 육즙이 더 많았고, 구운 칠면조 맛을 가졌다. 0.5%, 1% 내지 2%의 지질 함량이 높은 조류의 가루를 함유한 이 패티는 음성 대조군 패티보다 더 수분감이 있고, 육즙이 많은 질감을 가졌다. 추가로, 2%의 지질 함량이 높은 조류의 가루 패티는 양성 대조군과 유사한 구운 칠면조 맛이 났다.
실시예 10
식품으로 이용하기에 적합한 기타 미세조류 균주를 확인하기 위한 유전자형 확인
조류의 유전자형확인(Genotyping)
조류의 바이오매스로부터 게놈 DNA를 다음과 같이 단리하였다. 14,000 x g에서 5분간 액체 배양물로부터 세포들(대략 200㎎)을 원심분리하였다. 그 다음 세포를 멸균 증류수에 재현탁시키고, 14,000 x g에서 5분간 원심분리하였고, 상청액은 버렸다. 직경이 ~2mm인 단일 유리 비드를 이 바이오매스에 추가하였고, 튜브를 -80℃에서 최소 15분간 두었다. 시료를 빼내고, 연마 완충액 150㎕(1% Sarkosyl, 0.25 M 슈크로즈, 50 mM NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, RNase A 0.5 ㎍/㎕)을 추가하였다. 펠렛은 간단하게 볼텍스하여 재현탁시키고, 이어서 40㎕의 5M NaCl를 추가하였다. 시료를 간단하게 볼텍스한 후, 66㎕의 5% CTAB (쎄틸 트리메틸암모늄 브롬화물)을 추가하였고, 최종적으로 간단히 볼텍스하였다. 그 다음 시료를 65℃에서 10분간 항온처리하였고, 그 다음 14,000 x g, 10분간 원심분리하였다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, 300㎕의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 12:12:1로 1회 추출한 후, 14,000 x g에서 5분간 원심분리하였다. 생성된 수성 상을 0.7 vol의 이소프로판올(~190㎕)을 함유하고 있는 새로운 튜브로 옮기고, 튜브를 아래위로 뒤집어 혼합하고, 실온에서 30분 또는 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. DNA를 14,000 x g에서 10분간 원심분리에 의해 회수하였다. 생성된 펠렛을 70% 에탄올로 2회 세척하였고, 이어서, 100% 에탄올로 최종 세척하였다. 펠렛을 실온에서 20-30분간 대기 건조시키고, 이어서 50 ㎕의 10mM TrisCl, 1mM EDTA (pH 8.0)에 재현탁하였다.
상기에서 설명한 것과 같이 준비한, 5㎕의 총 조류의 DNA를 10 mM Tris, pH 8.0에 1:50으로 희석시켰다. PCR 반응물-최종 용적 20 ㎕-은 다음과 같이 셋업하였다. 10㎕의 2 x iProof HF master mix (Bio-Rad)를 0.4 ㎕ 프라이머 SZ02613 (5’-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3’ (서열 번호:24), 10mM 스톡(stock) 농도)에 추가하였다. 이 프라이머 서열은 Gen Bank accession no. L43357의 위치 567-588에 진행하고, 고등 식물 및 조류의 플라스미드 게놈에서 상당히 보존된다. 이어서 0.4 ㎕ 프라이머 SZ02615 (5’-CAGTGAGCTATTACGCACTC-3’ (서열 번호:25), 10 mM 스톡 농도)를 추가하였다. 이 프라이머 서열은 Gen Bank accession no. L43357의 위치 1112-1093에 상보적이며, 고등 식물 및 조류의 플라스미드 게놈에서 상당히 보존된다. 그 다음, 5 ㎕의 희석된 총 DNA 와 3.2 ㎕의 dH2O를 추가하였다. PCR 반응은 다음과 같이 진행하였다: 98℃, 45초; 98℃, 8초; 53℃, 12초; 72℃, 20초를 35회, 이어서 72℃에서 1분, 및 25℃에서 유지. PCR 생성물의 정제를 위하여, 20 ㎕의 10 mM Tris, pH 8.0를 각 반응물에 추가하였고, 이어서 40 ㎕의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 12:12:1로 추출한 후, 볼텍스하고, 5분간 14,000 x g에서 원심분리하였다. PCR 반응물을 S-400 컬럼(GE Healthcare)에 공급하고, 3,000 x g에서 2분간 원심분리하였다. 정제된 PCR 산물은 후속적으로 PCR8/GW/TOPO으로 TOPO 클론시켰고, LB/Spec 플레이트에서 양성 클론을 선택하였다. 정제된 플라스미드 DNA를 M13 포워드 및 리버스 프라이머를 이용하여 양 방향 모두에서 서열 분석하였다. Geneious DNA 분석 소프트웨어를 이용하여 서열 배열 및 루트가 결정되지 않은 트리(unrooted trees)를 만들었다. 균주 1-23의 서열들(실시예 1에서 명시한)은 각각 첨부된 서열 목록에서 서열 번호: 1-23으로 열거한다(즉, 균주 1은 서열 번호:1에 대응, 균주 2는 서열 번호:2에 대응하는 방식으로).
클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)의 9개 균주로부터 23S rRNA의 게놈 DNA 분석
8가지 클로렐라 프로토테코이드 균주(Chlorella protothecoides) (UTEX 25, UTEX 249, UTEX 250, UTEX 256, UTEX 264, UTEX 411, SAG 211 10d, CCAP 211/17, 및 CCAP 211/8d)의 게놈 DNA를 단리하였고, 상기에서 설명된 것과 같은 방법에 따라 23S rRNA의 게놈 DNA 분석을 실행하였다. 테스트한 모든 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 균주는 UTEX 25를 제외하고 서열이 동일하였다. 8가지 모든 균주의 서열은 첨부된 서열 목록에서 서열 번호: 26 및 27로 열거한다.
시중 구입한 클로레라 시료의 유전자형확인 분석
3가지 시중 구입한 클로레라 시료, 클로레라 레구라리스(Chlorella regularis) (New Chapter, 390㎎/gelcap), Whole Foods Broken Cell Wall Chlorella(Whole Foods, 500㎎/압착된 태블릿) 및 NutriBiotic CGF Chlorella(NutriBiotic, 500㎎/압착된 태블릿)를 여기에서 설명된 방법들을 이용하여 유전자형을 확인하였다. 각 시중 구입한 클로레라 시료의 대략 200 ㎎을 게놈 DNA 단리를 위하여 멸균 증류수에서 재현탁시켰다.
생성된 PCR 산물을 단리하고, 벡터에 클론시키고, M13 포워드 및 리버스 프라이머를 이용하여 서열 분석하였다. BLAST 검색을 이용하여 공지 서열과 이 서열을 비교하였다.
23s rRNA DNA 서열들의 비교에서, 3가지 시중 구입한 클로레라 시료중 2개는 Whole Foods Broken Wall Chlorella 및 NutriBiotic CGF에 존재하는 링바야 에스투아리(Lyngbya aestuarii)와 일치하는 DNA 서열들을 보유한다. 링바야 에스투아리(Lyngbya aestuarii)는 해양종 남세균(cynobacteria)이다. 이 결과는 일부 상업적으로 이용가능한 클로레라는 독소를 만드는 것으로 알려진 링바야(Lyngbya)와 같은 종의 유기체를 포함하는 오염 미생물의 다른 종을 함유한다는 것을 보여준다(예를 들면 Teneva et. al, Environmental Toxicology, 18(1)1, pp. 9 - 20 (2003); Matthew et al., J Nat Prod., 71(6):pp. 1113-6 (2008); and Carmichael et al., Appl Environ Microbiol, 63(8): pp. 31043110 (1997) 참고).
실시예 11
식품으로 사용하는데 적합한 미세조류의 바이오매스의 색 돌연변이체
색 돌연변이체를 만들기 위한 화학 돌연변이생성
클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) (UTEX 250)를 실시예 1에서 설명한 방법들 및 조건들에 따라 배양하였다. N-메틸-N’-니트로-N-니트로구아니딘(NTG)를 이용하여 이 조류의 균주에서 화학 돌연변이생성을 진행하였다. 이 조류의 배양물은 돌연변이 유도물질 (NTG)을 거치고, 그 다음 2.0%의 글루코오즈 한천 플레이트 상에서 재단리 과정을 통하여 선별하였다. 색 돌연변이체에 대한 콜로니를 스크리닝하였다. 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) (야생형)는 유기영양적(heterotophical)으로 성장하였을 때 금색을 띈다. 한천 플레이트 상에서 백색을 띄는 한 개 균주가 스크리닝되었다. 이 색 돌연변이체는 33-55로 명명하였다(부다페스트 조약에 따라 American Type Culture Collection at 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, 특허 기탁 번호 PTA-10397로 2009년 10월 13일자로 기탁됨). 또 다른 콜로니를 단리하였고, 이 돌연변이가 안정적인지를 확인하기 위하여 3차례 재단리를 거쳤다. 이 돌연변이체는 한천 플레이트 상에서 옅은 노란색을 띄는데, 이는 25-32로 명명하였다 (부다페스트 조약에 따라 American Type Culture Collection at 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, 특허 기탁 번호 PTA-10396로 2009년 10월 13일자로 기탁됨).
클로렐라 프로토테코이드( Chlorella protothecoides ) 33-55의 지질 프로파일
클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 33-55와 부모계 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) (UTEX 250)는 실시예 1에서 설명한 방법들과 조건들에 따라 성장하였다. 이 두 균주에서 지질 백분율(건조 세포 중량)을 측정하였다: 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 33-55는 68%의 지질을, 부모계 균주는 62%의 지질을 보유하였다. 이 두 균주의 지질 프로파일을 측정하였고, 이는 다음과 같다(영역 %으로 표현): 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 33-55, C14:0 (0.81); C16:0 (10.35); C16:1 (0.20); C18:0 (4.09); C18:1 (72.16); C18:2 (10.60); C18:3 (0.10); 및 기타(1.69); 부모계 균주, C14:0 (0.77); C16:0 (9.67); C16:1 (0.22); C18:0 (4.73); C18:1 (71.45); C18:2 (10.99); C18:3 (0.14); 및 기타 (2.05).
실시예 12
식품으로 사용하기에 적합한 미세조류의 바이오매스의 배양을 위한 셀룰로오스 공급 원료
클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) (UTEX 250)를 비-식품 탄소 원천으로 이용할 수 있는지를 평가하기 위하여, 셀룰로오스 물질들 (분해된 옥수수 여물)을 선행 실시예들에서 설명한 임의의 식품 용도에 사용하기에 적합한 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)의 유기영양 배양을 위한 탄소원으로 이용하기 위하여 준비하였다.
National Renewable Energy Laboratory (Golden, CO)에서 1.4% 황산 용액에 옥수수 여물을 조리하고, 생성된 슬러리를 탈수하여 젖은 분해된 옥수수 여물을 준비하였다. Mettler Toledo Moisture 분석기를 이용하여, 젖은 옥수수 여물에서 건조 고체가 24%임을 측정하였다. 100 g의 젖은 시료를 최종 용적이 420㎖이 되도록 탈이온수에 재현탁시키고, 10 N NaOH을 이용하여 pH를 4.8로 조정하였다. Celluclast™(Novozymes) (셀룰라제)는 최종 농도가 4%가 되도록 첨가하고 생성된 슬러리를 72시간동안 50℃에서 교반 항온처리하였다. 이 물질의 pH는 NaOH을 이용하여 7.5로 조정하였고(무시할 수준의 용적 변화), 0.22㎛ 필터를 통하여 멸균 여과시키고, -20℃에 보관하였다. 하기에서 설명하는 것과 같이, Sigma사의 헥소키나제 기반 키트를 이용하여 시료에서 글루코오즈 농도를 측정하기 위하여 시료를 남겨두었다.
Sigma Glucose Assay Reagent #G3293을 이용하여 글루코오즈 농도를 측정하였다. 상기에서 설명한 것과 같이 처리된 시료를 400배 희석시키고, 반응물에 40㎕를 추가하였다. 옥수수 여물 셀룰로오스 조제물은 대략 23 g/L 글루코오즈를 함유하는 것으로 측정되었다.
효소 처리와 셀룰로오스를 글루코오즈, 크실로오스, 및 기타 단당류 당으로 당화(saccharification)한 후, 상기에서 준비된 물질을 실시예 1에서 설명한 배지를 이용하여 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) (UTEX 250)의 성장을 위한 공급원료로 평가하였다. 순수 글루코오즈와 혼합된 다양한 농도의 셀룰로오스 당을 테스트하였다(0%, 12.5%, 25%, 50% 및 100% 셀룰로오스 당). 다양한 농도의 셀룰로오스 당에서 28℃에서 흔들면서(300rpm), 암(dark) 상태에서, 세포를 항온처리하였다. UV 분광광도계에서 750nm에서 흡수도를 측정하여 성장을 평가하였다. 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 배양물은 100% 발효가능한 당이 셀룰로오스-유도된 배지 조건들을 포함한, Celluclast로 준비된 옥수수 여물 물질에서 성장하였다. 셀룰로오스 공급원료로 Accellerase로 처리한 사탕무 과육을 이용하여 또한 유사한 실험들을 수행하였다. 옥수수 여물 물질에서 얻은 결과와 유사하게, 모든 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 배양물은 탄소 원천으로 셀룰로오스-유도된 당을 이용할 수 있었다.
실시예 13
조류의 가루는 식품 조성물의 식감을 개선시키고 , 질감을 강화시킨다.
쇼트브레이크( Shortbreak ) 쿠키
대략 20%의 총 지방을 포함하는 조류의 가루를 함유하는 쇼트브레드 쿠키는 다음의 조리법으로 만들었다. 또한 조류의 가루를 함유하지 않고, 대략 20% 총 지방을 포함하는 쇼트브레드 쿠키 또한 다음의 조리법으로 준비하였다(대조군). 조류의 가루로 만든 쿠키는 조류의 가루 없이 만든 쿠키보다 버터를 더 많이 바른 것 같고 풍미에서 더 풍부하다고 평가단(panel)들이 판단하였다.
쇼트브레드 쿠키
Figure 112012091988967-pct00006
쿠키는 대류 오븐, 325℉에서 7분간 구웠다.
초콜릿 아이스크림
조류 가루를 함유하고, 대략 10%의 총 지방을 포함하는 초콜릿 아이스크림을 다음의 조리법으로 준비하였다. 조류의 가루 없이, 대략 10%의 총 지방을 포함하는 초콜릿 아이스크림 또한 다음의 조리법으로 준비하였다(대조군), 조류의 가루로 만든 초콜릿 아이스크림은 조류의 가루없이 만든 초콜릿 아이스크림보다 더 풍부하고, 더 매끄럽고, 더 부드럽다고 평가단이 판단하였다. 평가단은 조류의 가루로 만든 아이스크림에 지방이 더 높다고 인식하였다. 하기에 나타낸 미량의 추가 성분들을 추가하였다.
조류 가루를 함유하는 초콜릿 아이스크림
Figure 112012091988967-pct00007
요리법( Directions )
1. 모든 성분들을 다음의 순서로 혼합하였다. 패스트리 나이프를 이용하여 블렌드 조류의 가루, 안정화제, 및 슈가를 블랜드하였다. 그 다음, 코코아를 추가하고, 이 혼합물은 옆에 두었다.
2. 옥수수 시럽, 탈지 우유 및 고형 우유를 함께 혼합하고, 상기 (1)의 건조 믹스(Mix)에 블랜드하였다. 끝으로 크림을 추가하였다.
3. 이 혼합물을 전자렌지에서 뚜껑이 있는 유리 믹싱 볼안에 넣고 180℉로 가열하였다. 매 2분마다 온도를 점검하고, 혼합물을 교반하였다. 일단 이 혼합물이 180℉에 도달하면, 전자렌지를 껐다. 대안으로, 이 혼합물을 150℉에 도달할 때까지 이중 냄비에서 가열시킬 수 있다.
4. 그 다음, 이 혼합물을 GEA NiroSoavi Panda 균질화기를 이용하여 180/30 bar에서 균질화시켰다.
5. 그 다음 이 혼합물을 일반적으로 하룻밤 동안 냉장하고, 풍미제를 추가하고, 아이스크림 기계를 작동시켰다.
조류 가루없는 초코렛 아이스크림
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요리법
이 아이스크림은 이 조류의 가루를 추가하는 것을 제외하고, 상기와 같이 만들었다.
마요네즈
다음의 조리법을 이용하여 조류 가루를 함유한 마요네즈를 만들었다. 조류 가루를 함유하지 않은 마요네즈도 다음의 조리법을 이용하여 또한 만들었다(대조군). 조류의 가루로 만든 마요네즈는 조류 가루가 함유되지 않은, 일반적으로 이용가능한 마요네즈와 유사한 부드러운 질감을 가진 것으로 평가단은 판단하였다. 조류 가루를 함유한 마요네즈의 용융, 풍미 및 바디(body)는 고르게 분해되었고, 조류 가루를 포함하지 않는 마요네즈 보다 더 오래 유지되었다.
조류 가루 포함된 마요네즈(73% 지방)
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요리법
1. 조류의 가루를 물과 혼합하여 분산물을 만들고, 옆에 두었다.
2. 나머지 건조 성분(당, 건조 머스타드, 소금)들을 함께 혼합하고, 옆에 두었다.
3. 별도의 볼에 계란 노른자를 우선 깨고, 그 다음 상기 2의 건조 성분들과 혼합하였다.
4. 단계 1의 조류의 가루 분산물을 단계 3의 혼합물에 넣었다.
5. 식초와 50%의 레몬 쥬스를 먼저 별도의 볼에서 복합시키고, 거품을 내서 단계 4의 혼합물에 넣었다.
6. 단계 5의 혼합물을 블랜드하고, 혼합물이 농후해질 때까지 한 번에 몇 방울씩 오일을 서서히 추가하였다.
7. 에멀전이 일단 형성되었다면, 나머지 오일 (대략 50%)을 넣고, 에멀전을 더 혼합하였다. 그 다음 나머지 레몬 쥬스를 넣고, 에멀전을 더 혼합하였다. 에멀전이 너무 진하면, 선택적으로, 뜨거운 물을 소량으로 추가할 수 있다.
8. 이 마요네즈를 하룻밤 동안 냉장보관하였다.
조류 가루없는 대조군 마요(75% 지방)
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요리법
이 마요네즈는 이 조류의 가루를 추가하는 것을 제외하고, 상기와 같이 만들었다.
샐러드 드레싱
조류의 가루를 함유하는 샐러드 드레싱은 다음의 조리법을 이용하여 준비하였다. 판매되는 드레싱에 1% 또는 3% 조류의 가루를 추가하였다. 조류의 가루를 함유하지 않은 판매되는 드레싱은 대조군 드레싱이다. 조류의 가루로 만든 샐러드 드래싱은 조류의 가루를 함유하지 않은 샐러드 드레싱보다 더 풍부하고, 더 부드럽고, 강화된 드레싱 풍미를 갖는다고 평가단이 평가하였다. 조류의 가루를 함유하는 샐러드 드레싱은 조류의 가루를 함유하지 않은 샐러드 드레싱보다 지방이 더 높은 것으로 인식되었다.
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실시예 14
우유 단백질과의 상호작용
우유에 함유된 단백질은 카제인과 유장이다. 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스는 우유 및 우유 단백질과 상호작용하여 특정 식품의 개선된 식감을 제공한다.
유장과 복합하여 조류의 가루를 이용하면 실시예 9의 조류 음료의 식감이 개선되었다. 실시예 9에서 설명한 음료는 하기에서 설명한 것과 같이 변형되었다. 이 조류의 음료에 유장을 추가하면 이 음료수의 식감이 개선되었다. 기타 단백질 예를 들자면, Golden Chlorella High Protein(상업적으로 이용가능) 또한 식감을 개선시키는 것으로 나타났다. 대조적으로, 대두 단백질, 완두콩 단백질을 추가해도 조류 음료수의 식감은 개선되지 않았다.
유사하게, 조류의 가루 또는 조류의 바이오매스와 우유와의 상호작용은 우유를 포함하는 식품, 예를 들면, 크림 기반 스프, 커피 및 차의 커피크림, 유제품 기반 음료수, 요거트, 아이스크림, 아이스 밀크, 셔벗(sherbet), 샤벗(sorbet) 및 이와 유사한 것들의 식품 조성물의 개선된 식감을 제공한다.
조류 우유 음료
Figure 112012091988967-pct00012
요리법
물을 용기에 넣고, 블랜딩하는 동안 나머지 성분들을 열거된 순서로 물에 추가하였다. 이 액체를 bach 균질화기, 300-400 barr에서 1회 통과로 균질화하였다. 이 균질화된 액체를 적절한 용기로 옮기고, 냉장하였다.
실시예 15
조류의 가루를 함유하는 식품 조성물의 유지 기간( Shelf Life )의 연장
슈가 쿠키
조류의 가루를 함유하는 슈가 쿠키를 다음의 조리법으로 준비하였다. 조류의 가루를 함유하지 않은 슈가 쿠키 또한 다음의 조리법으로 준비하였다. 3% 조류의 가루 슈가 쿠키 조합물은 계란 노른자를 빼고, 일반 쿠키 조합물에서 버터를 줄이는 것으로 조정하여 쿠기를 만드는데, 이때 두 조합물의 총 지방 함량은 동일하였다. 이 쿠키는 포일 포장에서 일정 시간 보관하였고, 3일 후 및 3개월 후 미각 평가단에 의해 평가하였다. 조류의 가루를 함유하지 않은 쿠키는 3일 후 퀴퀴한 냄새가 나고, 점착성이 있었으며, 3개월 후에는 먹을 수 없었다. 조류의 가루를 함유하는 쿠키는 3일과 3개월 후 모두 바삭함을 유지하였고, 두 시점에 모두 먹을 수 있었다.
슈가 쿠키
Figure 112012091988967-pct00013
요리법
1. 건조 성분들, 밀가루, 염 베이킹 소다 및 베이킹 파우더를 블랜드하고, 옆에 두었다.
2. 패들이 부착된 Kitchen Aid 믹서에서 조류의 가루 및 당을 서서히 넣으면서 쇼트닝을 크림화하였다.
3. 저속(1 또는 2)의 믹서에 물과 바닐라 추출물을 천천히 넣었다. 일단 물과 바닐라 추출물을 모두 넣은 후, 혼합 속도를 중간으로 증가시키고, 2분간 혼합하였다.
4. 그 다음, 계란을 넣고, 혼합물은 2분간 중간 속도에서 혼합하였다.
5. 단계 1의 블렌드된 건조 성분들을 단계 4의 혼합물에 서서히 넣는데, 처음 혼합 속도는 느리고, 그 다음 도우를 만들기 위하여 약 2-3분간 6-8로 속도를 증가시켰다.
6. 베이킹 쉬트에 오일을 분무하고, 단계 6의 도우를 8 mm의 두께로 말고, 350℉에서 7-9분간 구웠다.
크래커
다음의 조리법을 이용한 American Baking Institute를 조류의 가루를 함유하는 크래커를 만들었다. 조류의 가루를 함유하지 않은 크래커 또한 다음의 조리법을 이용하여 만들었다. 조류의 가루를 함유하는 크래커를 만들 때, 쇼트닝 및 조류의 가루의 이용 수준을 조정하여, 조류의 가루를 함유하지 않은 완전 지방 대조군 조합물과 비교하여 추가된 지방이 약 33% 또는 약 50% 감소된 크래커를 제조하였다. 도우 특징에 미치는 영향을 평가하기 위하여 혼합 과정을 테스트하였다. 혼합 프로세스 동안 도우에 조류 가루를 넣는 것을 지연시키면, 도우에 추가되는 총 물의 양이 감소되는 결과를 가져왔다. 이 과정을 변형시켜 믹싱 볼에 조류 가루를 제외한 모든 성분을 추가하고, 이 성분들을 함께 블렌드하기 위하여 2분간 속도 1에서 혼합하였다. 그 다음 혼합 속도를 속도 2로 변경하고, 4분간 혼합하였다. 그 다음, 이 조류의 가루를 혼합하고, 추가적으로 8분간 혼합하였다.
이 조류의 가루를 함유하는 크래커의 질감은 온전한 지방, 비-조류의 가루 함유 크래커와 동등하였다. 평가단은 이 조류의 가루와 함께 조제된 크래커가 “더 바삭거린다”고 설명하였고, 조류의 가루 없이 조제된 크래커보다 풍미 및 질감을 선호했다.
이 크래커를 포일 포장에서 일정 시간 보관하였고, 30일 후 및 4달 후 평가단이 평가하였다. 조류의 가루를 함유하지 않은 크래커는 30일 후 퀴퀴한 냄새가 나고, 점착성이 있었으며, 4개월 후에는 먹을 수 없었다. 조류의 가루를 함유하는 크래커는 4개월 후에도 바삭함을 유지하였고, 먹을 수 있었다.
크래커
Figure 112012091988967-pct00014
조리법
이 조류의 가루를 제외한 모든 성분은 패달이 있는 Hobart 밀가루 혼합기에서, 제 1 속도로 2분간 함께 혼합하여 도우를 만들었다. 믹서의 속도를 제 2 속도로 높이고, 4분간 혼합하였다. 그 다음 도우에 이 조류의 가루를 넣고, 제 2 속도에서 추가 8분간 혼합하였다. 이 도우는 오븐안, 1구역 (상부 450℃/하부 430℃ w/댐퍼 닫힘/닫힘), 2구역(상부 425℃/하부 400℃ w/댐퍼 개방/개방) 또는 3구역 (상부 415℃/하부 375℃ w/댐퍼 개방/개방)의 그물 망 상에서 황갈색이 될 때까지 구웠다. 이 크래커의 수분 함량은 약 3%이었다.
실시예 16
조류의 가루를 함유하는 펴바를 수 있는(spreadable) 버터 제품과 조류의 가루를 함유하는 펴바를 수 있는 마가린을 하기의 조리법에 따라 준비하였다. 믹서기에서 고속으로 버터와 조류 가루를 휘핑하고, 그 다음 고속으로 혼합하면서 이 조류의 가루 버터 혼합물에 물을 서서히 추가하여, 펴바를 수 있는 버터를 만들었다. 펴바를 수 있는 마가린은 고속의 믹서에서 야자나무 오일과 조류의 가루를 휘핑하여 만들었다. 그 다음 소금을 물에 용해시켜, 소금물을 준비하였다. 그 다음, 고속에서 혼합하면서, 이 조류의 가루와 야자나무 오일 혼합물에 소금물을 서서히 넣었다. 이 조류의 가루를 함유하는 스프레드의 질감 및 풍미는 조류의 가루가 포함되지 않은 온전한 지방 버터 및 마가린 스프레드와 유사하였다.
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마아가린 스프레드
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실시예 17
조류의 오일과 지방을 제거한 조류의 가루의 복합
하기에서 나타낸 쿠키 조합물에서, 조류의 가루를 이용하는 대신, 동량의 지방을 제거한 조류의 가루와 조류의 오일을 이용하여 쿠키를 만들었다. 지방을 제거한 조류의 가루와 조류의 오일로 만든 쿠키를 조류의 가루로 만든 쿠키와 비교하였다. 평가단이 쿠키를 평가하였다. 조류의 가루로 만든 쿠키는 맛이 더 좋고, 더 달콤하다고 기록되었고, 씹는 질감이 더 하고, 더 강한 풍미와 버터 풍미가 더 강하였다. 추가적으로, 지방을 제거한 조류의 가루와 조류의 오일로 만든 쿠키의 색은 조류의 가루로 만든 쿠기와 상이한 색을 띄었다. 비-균질화된 식품에서, 조류의 가루를 이용한 경우와 비교하였을 때, 지방을 제거한 조류의 가루와 조류의 오일을 이용하면 품질이 떨어지는 제품이 만들어졌다.
조류 슈가 쿠키: 계란 및 버터 포함안됨 (대략 3.5% 총합 지방)
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요리법
1. 블렌드 밀가루, 소금, 베이킹 소다, 베이킹 파우더 및 에그스탠드(eggstend)를 함께 혼합하고, 옆에 두었다.
2. 당과 조류의 가루는 wisk 부착된 Kitchen Aid 믹서에서 5분간 혼합하였다.
3. 저속(1-2)의 믹서에서 상기 단계 2의 혼합물에 물을 서서히 넣었다.
4. 저속(1-2)의 믹서에서 바닐라 추출물을 단계 3의 혼합물에 서서히 넣어 도우를 만들었다.
5. 이 도우를 1시간 동안 냉장보관하였다. 대안으로, 이 도우를 최대 2-4일을 포함한 더 오랜 기간동안 냉장보관할 수 있거나, 또는 나중 사용을 위하여 냉동할 수 있다.
6. 쿠키 쉬트에 오일을 분무하였다.
7. 이 도우를 떠내고, 원판으로 말고, 쿠키 쉬트에 두었다. 각 쿠키는 대략 15 grams이었다.
8. 이 쿠키를 325℉에서 대략 6 내지 9분간 구웠다. 약 6분 구운 쿠키는 질감이 “부드러운” 쿠키를 만들었다. 더 오래 구운 쿠키는 더 바삭거리고, 색은 더 진했다.
실시예 9의 조류 음료 조합물에서, 조류의 가루를 이용하는 대신, 균질화된 음료수를 만드는 데에 동량의 지방을 제거한 조류의 가루와 조류의 오일을 이용하였다. 평가단은 지방을 제거한 조류의 가루와 조류의 오일로 만든 음료수는 조류의 가루로 만든 음료수와 대등하다고 판단하였다.
실시예 18
비-조류의 오일과 비-조류의 섬유의 복합
실시예 17에서 설명한 쿠키와 음료수를 카놀라 오일과 귀리 섬유를 이용하여 만들었다. 음료수와 쿠키 모두의 경우, 카놀라 오일과 귀리 섬유의 복합으로는 조류의 가루를 이용하여 만든 음료수와 쿠키의 결과를 재현하지 못하였다. 카놀라 오일와 귀리 섬유를 이용하면 질이 떨어지는 음료수와 쿠키가 만들어 졌다.
PCT 출원 번호 PCT/US2009/060692, (2009년 10월 14일자 제출) “Food Compositions of Microalgal Biomass,” PCT 출원 번호 PCT/US10/31088, (2010년 4월 14일자 제출), “Novel Microalgal Food Compositions” 및 미국 가출원 번호 61/324,285, (2010년 4월 14일자 제출), “Oleaginous Yeast Food Compositions”는 모든 목적으로 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
특허, 특허 출원, 및 공개를 포함하는 여기에서 언급된 모든 참고자료는 이미 명시적으로 통합되던 또는 아니던 이들 전문이 여기에 참고자료로 통합된다. 여기에서 언급된 공개자료는 본 발명과 연관하여 이용할 수 있는 시약들, 방법들 및 개념을 설명하고, 상술하는 목적으로 언급된다. 여기의 어느 것도 여기에서 설명된 본 발명과 관련하여 이들 참고 자료가 선행 기술로 인정하는 것으로 간주되는 것은 없다.
본 발명은 이의 특이적 구체예들과 연관하여 설명되고 잇지만, 추가 변형이 가능하다는 것을 인지할 것이다. 본 출원은 본 발명의 일반적인 원리에 따른 본 발명의 임의의 변이, 사용 또는 각색을 포함하는 것으로 의도되며, 본 내용에서 이러한 이탈은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지의 또는 통상적인 실시로 간주되는 범위내에 있기 때문에, 이러한 이탈을 포함하는 것으로 의도된다.
여기에서 설명된 실시예 및 구체예들은 오로지 설명을 위함이며, 이의 견지에서 다양한 변형 또는 변화는 당업자에게 제안될 것이며, 본 출원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> SOLAZYME, INC. <120> LIPID-RICH MICROALGAL FLOUR FOOD COMPOSITIONS <130> 058190-404538 <140> PCT/US2011/032588 <141> 2011-04-14 <150> 61/324,294 <151> 2010-04-14 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 565 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 1 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cggtgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaacacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565 <210> 2 <211> 546 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 2 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aagcttcatc gtcaagaggg 420 aaacagccca gatcaccagc taaggcccca aaatggtcgt taagtggcaa aggaggtgag 480 aatgctgaaa caaccaggag gtttgcttag aagcagccac cctttaaaga gtgcgtaata 540 gctcactg 548 <210> 8 <211> 548 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 8 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaga agtggcttgg ttaaggataa ctatccggag 60 ccagagcgaa agcaagtctg aatagggcgc ttaaaggtca ctttttctag acccgaaccc 120 gggtgatcta accatgacca ggatgaagct tgggtaacac cacgtgaagg tccgaaccga 180 ccgatgttga aaaatcggcg gatgagttgt ggttagcggt gaaataccaa tcgaactcgg 240 agctagctgg ttctccccga aatgcgttga ggcgcagcgg tttatgaggc tgtctagggg 300 taaagcactg tttcggtgcg ggctgcgaaa gcggtaccaa atcgtggcaa actctgaata 360 ctagatatgc tattcatgag ccagtgagac ggtgggggat aagcttcatc gtcaagaggg 420 aaacagccca gatcaccagc taaggcccca aaatggtcgt taagtggcaa aggaggtgag 480 aatgctgaaa caaccaggag gtttgcttag aagcagccac cctttaaaga gtgcgtaata 540 gctcactg 548 <210> 9 <211> 565 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 9 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cggtgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaacacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565 <210> 10 <211> 541 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 10 tgttgaagaa tgagccggcg agttaaaaaa aatggcatgg ttaaagatat ttctctgaag 60 ccatagcgaa agcaagtttt acaagctata gtcatttttt ttagacccga aaccgagtga 120 tctacccatg atcagggtga agtgttggtc aaataacatg gaggcccgaa ccgactaatg 180 gtgaaaaatt agcggatgaa ttgtgggtag gggcgaaaaa ccaatcgaac tcggagttag 240 ctggttctcc ccgaaatgcg tttaggcgca gcagtagcaa cacaaataga ggggtaaagc 300 actgtttctt ttgtgggctt cgaaagttgt acctcaaagt ggcaaactct gaatactcta 360 tttagatatc tactagtgag accttggggg ataagctcct tggtcaaaag ggaaacagcc 420 cagatcacca gttaaggccc caaaatgaaa atgatagtga ctaaggacgt gagtatgtca 480 aaacctccag caggttagct tagaagcagc aatcctttca agagtgcgta atagctcact 540 g 541 <210> 11 <211> 573 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 11 tgttgaagaa tgagccggcg acttaaaata aatggcaggc taagagaatt aataactcga 60 aacctaagcg aaagcaagtc ttaatagggc gctaatttaa caaaacatta aataaaatct 120 aaagtcattt attttagacc cgaacctgag tgatctaacc atggtcagga tgaaacttgg 180 gtgacaccaa gtggaagtcc gaaccgaccg atgttgaaaa atcggcggat gaactgtggt 240 tagtggtgaa ataccagtcg aactcagagc tagctggttc tccccgaaat gcgttgaggc 300 gcagcaatat atctcgtcta tctaggggta aagcactgtt tcggtgcggg ctatgaaaat 360 ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact agaaatgacg atatattagt gagactatgg 420 gggataagct ccatagtcga gagggaaaca gcccagacca ccagttaagg ccccaaaatg 480 ataatgaagt ggtaaaggag gtgaaaatgc aaatacaacc aggaggttgg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 12 <211> 573 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 12 tgttgaagaa tgagccggcg acttaaaata aatggcaggc taagagaatt aataactcga 60 aacctaagcg aaagcaagtc ttaatagggc gctaatttaa caaaacatta aataaaatct 120 aaagtcattt attttagacc cgaacctgag tgatctaacc atggtcagga tgaaacttgg 180 gtgacaccaa gtggaagtcc gaaccgaccg atgttgaaaa atcggcggat gaactgtggt 240 tagtggtgaa ataccagtcg aactcagagc tagctggttc tccccgaaat gcgttgaggc 300 gcagcaatat atctcgtcta tctaggggta aagcactgtt tcggtgcggg ctatgaaaat 360 ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact agaaatgacg atatattagt gagactatgg 420 gggataagct ccatagtcga gagggaaaca gcccagacca ccagttaagg ccccaaaatg 480 ataatgaagt ggtaaaggag gtgaaaatgc aaatacaacc aggaggttgg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 13 <211> 565 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 13 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cggtgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaacacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565 <210> 14 <211> 565 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 14 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cggtgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaacacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565 <210> 15 <211> 546 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 15 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa cgtggcaagg ttaaggacat gtatccggag 60 ccgaagcgaa agcaagtctg aatagggcgc ctaagtcatt ttttctagac ccgaacccgg 120 gtgatctaac catgaccagg atgaagcttg ggtgacacca agtgaaggtc cgaaccgacc 180 gatgttgaaa aatcggcgga tgagttgtgg ttagcggtga aataccagtc gaactcggag 240 ctagctggtt ctccccgaaa tgcgttgagg cgcagcggtt cataaggctg tctaggggta 300 aagcactgtt tcggtgcggg ctgcgaaagc ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact 360 agatatgcta tttatgagcc agtgagacgg tgggggataa gcttcatcgt cgagagggaa 420 acagcccaga tcactagcta aggcccctaa atgatcgtta agtgacaaag gaggtgagaa 480 tgcagaaaca accaggaggt ttgcttagaa gcagccaccc tttaaagagt gcgtaatagc 540 tcactg 546 <210> 16 <211> 550 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 16 tgttgaagaa tgagccggcg acttatagga agtggcaggg ttaaggaaga atctccggag 60 cccaagcgaa agcgagtctg aaaagggcga tttggtcact tcttatggac ccgaacctgg 120 atgatctaat catggccaag ttgaagcatg ggtaacacta tgtcgaggac tgaacccacc 180 gatgttgaaa aatcggggga tgagctgtga ttagcggtga aattccaatc gaattcagag 240 ctagctggat ctccccgaaa tgcgttgagg cgcagcggcg acgatgtcct gtctaagggt 300 agagcgactg tttcggtgcg ggctgcgaaa gcggtaccaa gtcgtggcaa actccgaata 360 ttaggcaaag gattccgtga gccagtgaga ctgtggggga taagcttcat agtcaagagg 420 gaaacagccc agaccatcag ctaaggcccc taaatggctg ctaagtggaa aaggatgtga 480 gaatgctgaa acaaccagga ggttcgctta gaagcagcta ttccttgaaa gagtgcgtaa 540 tagctcactg 550 <210> 17 <211> 548 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 17 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaga agtggcttgg ttaaggataa ctatccggag 60 ccagagcgaa agcaagtctg aatagggcgc ttaaaggtca ctttttctag acccgaaccc 120 gggtgatcta accatgacca ggatgaagct tgggtaacac cacgtgaagg tccgaaccga 180 ccgatgttga aaaatcggcg gatgagttgt ggttagcggt gaaataccaa tcgaactcgg 240 agctagctgg ttctccccga aatgcgttga ggcgcagcgg tttatgaggc tgtctagggg 300 taaagcactg tttcggtgcg ggctgcgaaa gcggtaccaa atcgtggcaa actctgaata 360 ctagatatgc tattcatgag ccagtgagac ggtgggggat aagcttcatc gtcaagaggg 420 aaacagccca gatcaccagc taaggcccca aaatggtcgt taagtggcaa aggaggtgag 480 aatgctgaaa caaccaggag gtttgcttag aagcagccac cctttaaaga gtgcgtaata 540 gctcactg 548 <210> 18 <211> 556 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 18 tgttgaagaa tgagccggcg acttataggg ggtggcgtgg ttaaggaagt aatccgaagc 60 caaagcgaaa gcaagttttc aatagagcga ttttgtcacc ccttatggac ccgaacccgg 120 gtgatctaac cttgaccagg atgaagcttg ggtaacacca agtgaaggtc cgaactcatc 180 gatcttgaaa aatcgtggga tgagttgggg ttagttggtt aaatgctaat cgaactcgga 240 gctagctggt tctccccgaa atgtgttgag gcgcagcgat taacgaaata ttttgtacgg 300 tttaggggta aagcactgtt tcggtgcggg ctgcgaaagc ggtaccaaat cgtggcaaac 360 tctgaatact aagcctgtat accgttagtc agtgagagta taggggataa gctctatact 420 caagagggaa acagcccaga tcaccagcta aggccccaaa atgacagcta agtggcaaag 480 gaggtgaaag tgcagaaaca accaggaggt tcgcttagaa gcagcaaccc tttaaagagt 540 gcgtaatagc tcactg 556 <210> 19 <211> 548 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 19 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaga agtggcttgg ttaaggataa ctatccggag 60 ccagagcgaa agcaagtctg aatagggcgc ttaaaggtca ctttttctag acccgaaccc 120 gggtgatcta accatgacca ggatgaagct tgggtaacac cacgtgaagg tccgaaccga 180 ccgatgttga aaaatcggcg gatgagttgt ggttagcggt gaaataccaa tcgaactcgg 240 agctagctgg ttctccccga aatgcgttga ggcgcagcgg tttatgaggc tgtctagggg 300 taaagcactg tttcggtgcg ggctgcgaaa gcggtaccaa atcgtggcaa actctgaata 360 ctagatatgc tattcatgag ccagtgagac ggtgggggat aagcttcatc gtcaagaggg 420 aaacagccca gatcaccagc taaggcccca aaatggtcgt taagtggcaa aggaggtgag 480 aatgctgaaa caaccaggag gtttgcttag aagcagccac cctttaaaga gtgcgtaata 540 gctcactg 548 <210> 20 <211> 565 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 20 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cggtgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaacacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565 <210> 21 <211> 573 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 21 tgttgaagaa tgagccggcg acttataggg ggtggcttgg ttaaggacta caatccgaag 60 cccaagcgaa agcaagtttg aagtgtacac acattgtgtg tctagagcga ttttgtcact 120 ccttatggac ccgaacccgg gtgatctatt catggccagg atgaagcttg ggtaacacca 180 agtgaaggtc cgaactcatc gatgttgaaa aatcgtggga tgagttgtga ataggggtga 240 aatgccaatc gaactcggag ctagctggtt ctccccgaaa tgtgttgagg cgcagcgatt 300 cacgatctaa agtacggttt aggggtaaag cactgtttcg gtgcgggctg ttaacgcggt 360 accaaatcgt ggcaaactaa gaatactaaa cttgtatgcc gtgaatcagt gagactaaga 420 gggataagct tcttagtcaa gagggaaaca gcccagatca ccagctaagg ccccaaaatg 480 acagctaagt ggcaaaggag gtgagagtgc agaaacaacc aggaggtttg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 22 <211> 573 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 22 tgttgaagaa tgagccggcg acttataggg ggtggcttgg ttaaggacta caatccgaag 60 cccaagcgaa agcaagtttg aagtgtacac acgttgtgtg tctagagcga ttttgtcact 120 ccttatggac ccgaacccgg gtgatctatt catggccagg atgaagcttg ggtaacacca 180 agtgaaggtc cgaactcatc gatgttgaaa aatcgtggga tgagttgtga ataggggtga 240 aatgccaatc gaactcggag ctagctggtt ctccccgaaa tgtgttgagg cgcagcgatt 300 cacgatctaa agtacggttt aggggtaaag cactgtttcg gtgcgggctg ttaacgcggt 360 accaaatcgt ggcaaactaa gaatactaaa cttgtatgcc gtgaatcagt gagactaaga 420 gggataagct tcttagtcaa gagggaaaca gcccagatca ccagctaagg ccccaaaatg 480 acagctaagt ggcaaaggag gtgagagtgc agaaacaacc aggaggtttg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 23 <211> 573 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 23 tgttgaagaa tgagccggcg acttataggg ggtggcttgg ttaaggacta caatccgaag 60 cccaagcgaa agcaagtttg aagtgtacac acattgtgtg tctagagcga ttttgtcact 120 ccttatggac ccgaacccgg gtgatctatt catggccagg atgaagcttg ggtaacacca 180 agtgaaggtc cgaactcatc gatgttgaaa aatcgtggga tgagttgtga ataggggtga 240 aatgccaatc gaactcggag ctagctggtt ctccccgaaa tgtgttgagg cgcagcgatt 300 cacgatctaa agtacggttt aggggtaaag cactgtttcg gtgcgggctg ttaacgcggt 360 accaaatcgt ggcaaactaa gaatactaaa cttgtatgcc gtgaatcagt gagactaaga 420 gggataagct tcttagtcaa gagggaaaca gcccagatca ccagctaagg ccccaaaatg 480 acagctaagt ggcaaaggag gtgagagtgc agaaacaacc aggaggtttg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 24 tgttgaagaa tgagccggcg ac 22 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 25 cagtgagcta ttacgcactc 20 <210> 26 <211> 546 <212> DNA <213> Chlorella protothecoides <400> 26 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa cgtggcaagg ttaaggaaac gtatccggag 60 ccgaagcgaa agcaagtctg aacagggcga ttaagtcatt ttttctagac ccgaacccgg 120 gtgatctaac catgaccagg atgaagcttg ggtgacacca agtgaaggtc cgaaccgacc 180 gatgttgaaa aatcggcgga tgagttgtgg ttagcggtga aataccagtc gaactcggag 240 ctagctggtt ctccccgaaa tgcgttgagg cgcagcggtt cataaggctg tctaggggta 300 aagcactgtt tcggtgcggg ctgcgaaagc ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact 360 agatatgcta tttatgggcc agtgagacgg tgggggataa gcttcatcgt cgagagggaa 420 acagcccaga tcactagcta aggccccaaa atgatcgtta agtgacaaag gaggtgagaa 480 tgcagaaaca accaggaggt ttgcttagaa gcagccaccc tttaaagagt gcgtaatagc 540 tcactg 546 <210> 27 <211> 565 <212> DNA <213> Chlorella protothecoides <400> 27 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cggtgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaacacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565

Claims (62)

  1. (a) 500 ppm 미만의 클로로필 및 20 건중량% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함하는 클로레라 (Chlorella) 속(genus)의 종으로부터 수득한 유기영양적으로 생산된 조류 세포로서, 상기 오일의 5 중량% 미만이 도코사헥사논산 (DHA)이고, 조류 세포의 50% 초과가 용해된, 유기영양적으로 생산된 조류 세포;
    (b) 적어도 하나의 추가 성분; 및
    (c) 가스를 포함하는 식품 조성물로서, 상기 식품 조성물은 연속 상과 불연속 가스 상을 포함하고, 식품에서 가스에 의한 용적 백분율은 1% 내지 50%인, 식품 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 식품 조성물은 통성 (aerated) 식품인, 식품 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 식품은 냉동된, 식품 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 식품 조성물은 20% 또는 초과의 공기 함량을 갖는 아이스크림, 샤벗(sorbet) 또는 젤라토인, 식품 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조류 세포는 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)인, 식품 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 조류 세포는 상기 조류 세포가 유도된 균주와 비교하여 감소된 착색을 가진 색 돌연변이체인 조류로부터 유래되거나; 상기 조류 세포는 녹색 착색이 없고 노란색 착색이 감소되거나; 상기 조류 세포는 상기 조류 세포가 유도된 균주와 비교하여 감소된 착색을 가진 색 돌연변이체인 조류로부터 유래되고 상기 조류 세포는 녹색 착색이 없고 노란색 착색이 감소된, 식품 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 조성물은 아이스크림, 젤라토, 샤벗, 무스, 치즈크림, 커스터드, 머랭, 고기파이, 구운 제품들, 무스, 거품을 낸 유제품 토핑, 냉동 요거트, 거품을 낸 필링 및 소스로 구성된 그룹으로부터 선택된, 식품 조성물.
  8. (a) 500 ppm 미만의 클로로필 및 20 건중량% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함하는 클로레라 (Chlorella) 속(genus)의 종으로부터 수득한 유기영양적으로 생산된 조류 세포로서, 상기 오일의 5 중량% 미만이 도코사헥사논산 (DHA)이고, 조류 세포의 50% 초과가 용해된, 유기영양적으로 생산된 조류 세포;
    (b) 물; 및
    (c) 적어도 하나의 추가 성분을 혼합하여 분산물을 만드는 단계로서, 상기 조류 세포는 상기 분산물의 0.5 내지 10% w/w를 포함하는, 단계; 및
    가스를 상기 분산물에 통합시켜, 안정적인 불연속 가스 상 버블을 만드는 단계를 포함하는 통성(aerated) 식품을 만드는 방법으로서, 상기 식품은 연속 상과 불연속 가스 상을 포함하고, 가스에 의한 식품의 용적 백분율은 1% 내지 60%인, 통성 식품을 만드는 방법.
  9. (a) 가루로 빻거나 다진 고기; 및
    (b) 500 ppm 미만의 클로로필 및 20 건중량% 이상의 트리글리세리드 오일을 포함하는 클로레라 (Chlorella) 속(genus)의 종으로부터 수득한 0.5% w/w 이상의 유기영양적으로 생산된 조류 세포로서, 상기 오일의 5 중량% 미만이 도코사헥사논산 (DHA)이고, 조류 세포의 50% 초과가 용해된, 유기영양적으로 생산된 조류 세포
    의 매트릭스를 포함하고,
    상기 고기와 조류 세포는 매트릭스를 통하여 분산되어 있는, 육가공품 (meat product).
  10. (a) 적어도 하나의 유제품 성분; 및
    (b) 500 ppm 미만의 클로로필 및 20 건중량% 이상의 트리글리세리드 오일을 포함하는 클로레라 (Chlorella) 속(genus)의 종으로부터 수득한 유기영양적으로 생산된 조류 세포로서, 상기 오일의 5 중량% 미만이 도코사헥사논산 (DHA)이고, 조류 세포의 50% 초과가 용해된, 유기영양적으로 생산된 조류 세포를 포함하고,
    식품에서 지방의 0.1% 내지 100%는 조류 세포에 의해 제공되는, 유제품 식품 조성물.
  11. (a) 식품 조성물을 제공하는 단계; 및
    (b) 500 ppm 미만의 클로로필 및 20 건중량% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함하는 클로레라 (Chlorella) 속(genus)의 종으로부터 수득한 유기영양적으로 생산된 조류 세포의 지정된 양을 식품 조성물에 추가하는 단계로서, 상기 오일의 5 중량% 미만이 도코사헥사논산 (DHA)이고, 조류 세포의 50% 초과가 용해된, 단계를 포함하는, 식품 조성물의 식감을 개선시키는 방법.
  12. (a) 식품 조성물을 제공하는 단계; 및
    (b) 500 ppm 미만의 클로로필 및 20 건중량% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함하는 클로레라 (Chlorella) 속(genus)의 종으로부터 수득한 유기영양적으로 생산된 조류 세포의 지정된 양을 식품 조성물에 추가하는 단계로서, 상기 오일의 5 중량% 미만이 도코사헥사논산 (DHA)이고, 조류 세포의 50% 초과가 용해된, 단계를 포함하는, 식품 조성물의 유지 기간(shelf life)을 개선시키는 방법.
  13. (a) 적어도 하나의 비-유제품 성분; 및
    (b) 500 ppm 미만의 클로로필 및 20 건중량% 이상의 트리글리세리드 오일을 포함하는 클로레라 (Chlorella) 속(genus)의 종으로부터 수득한 유기영양적으로 생산된 조류 세포로서, 상기 오일의 5 중량% 미만이 도코사헥사논산 (DHA)이고, 조류 세포의 50% 초과가 용해된, 유기영양적으로 생산된 조류 세포를 포함하는, 비-유제품 식품 조성물로서,
    식품에서 지방의 0.1% 내지 100%는 조류 세포에 의해 제공되고, 상기 식품 조성물은 마가린, 두유, 아몬드 우유, 대마 우유, 쌀 우유, 비-유제품 냉동 디저트, 비-유제품 커피크림, 비-유제품 치즈 및 비-유제품 요거트로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 비-유제품 식품 조성물.
  14. 클로레라 (Chlorella) 속(genus)의 종으로부터 수득한 유기영양적으로 생산된 조류 세포로서, 상기 세포는 덩어리로 되어있고, 상기 조류 세포는 500 ppm 미만의 클로로필 및 10 건중량% 초과의 트리글리세리드 오일을 포함하고, 상기 오일의 5 중량% 미만이 도코사헥사논산 (DHA)이고, 조류 세포의 50% 초과가 용해되고, 상기 조류 세포는 조류 세포 g 당 0 ㎍ 내지 115 ㎍의 총 카로티노이드, 세포 100 g 당 1 mg 내지 8 mg의 토코페롤, 조류 세포 g 당 0.05 ㎎ 내지 0.30 ㎎의 총 토코트리에놀 및 조류 세포 g 당 0.1 mg 내지 10 mg의 인지질로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물을 추가로 포함하는, 유기영양적으로 생산된 조류 세포.
  15. (a) 가루로 빻거나 다진 고기; 및
    (b) 500 ppm 미만의 클로로필을 포함하는 클로레라 (Chlorella) 속(genus)의 종으로부터 수득한 0.5% w/w 이상의 유기영양적으로 생산된 조류 세포의 매트릭스를 포함하고,
    상기 조류 세포는 상기 조류 세포가 유도된 균주와 비교하여 감소된 착색을 가진 색 돌연변이체인 균주이고, 상기 조류 세포는 20 건중량% 이상의 트리글리세리드 오일을 추가로 포함하고, 상기 오일의 5 중량% 미만이 도코사헥사논산 (DHA)이고, 조류 세포의 50% 초과가 용해되고,
    상기 고기와 조류 세포는 매트릭스를 통하여 분산되어 있는, 육가공품.
  16. (a) 적어도 하나의 유제품 성분; 및
    (b) 500 ppm 미만의 클로로필을 포함하는 클로레라 (Chlorella) 속(genus)의 종으로부터 수득한 유기영양적으로 생산된 조류 세포로서, 상기 조류 세포는 상기 조류 세포가 유도된 균주와 비교하여 감소된 착색을 가진 색 돌연변이체인 균주이고, 상기 조류 세포는 20 건중량% 이상의 트리글리세리드 오일을 추가로 포함하고, 상기 오일의 5 중량% 미만이 도코사헥사논산 (DHA)이고, 조류 세포의 50% 초과가 용해된, 유기영양적으로 생산된 조류 세포를 포함하고,
    식품에서 지방의 0.1% 내지 100%는 상기 조류 세포에 의해 제공되는, 유제품 식품 조성물.
  17. (a) 식품 조성물을 제공하는 단계; 및
    (b) 500 ppm 미만의 클로로필을 포함하는 클로레라 (Chlorella) 속(genus)의 종으로부터 수득한 유기영양적으로 생산된 조류 세포의 지정된 양을 추가하는 단계로서, 상기 조류 세포는 상기 조류 세포가 유도된 균주와 비교하여 감소된 착색을 가진 색 돌연변이체인 균주이고, 상기 조류 세포는 20 건중량% 이상의 트리글리세리드 오일을 추가로 포함하고, 상기 오일의 5 중량% 미만이 도코사헥사논산 (DHA)이고, 조류 세포의 50% 초과가 용해된, 단계를 포함하는, 식품 조성물의 식감을 개선시키는 방법.
  18. (a) 식품 조성물을 제공하는 단계; 및
    (b) 500 ppm 미만의 클로로필을 포함하는 클로레라 (Chlorella) 속(genus)의 종으로부터 수득한 유기영양적으로 생산된 조류 세포의 지정된 양을 추가하는 단계로서, 상기 조류 세포는 상기 조류 세포가 유도된 균주와 비교하여 감소된 착색을 가진 색 돌연변이체인 균주이고, 상기 조류 세포는 20 건중량% 이상의 트리글리세리드 오일을 추가로 포함하고, 상기 오일의 5 중량% 미만이 도코사헥사논산 (DHA)이고, 조류 세포의 50% 초과가 용해된, 단계를 포함하는, 식품 조성물의 유지 기간(shelf life)을 개선시키는 방법.
  19. (a) 적어도 하나의 비-유제품 성분; 및
    (b) 500 ppm 미만의 클로로필을 포함하는 클로레라 (Chlorella) 속(genus)의 종으로부터 수득한 유기영양적으로 생산된 조류 세포로서, 상기 조류 세포는 상기 조류 세포가 유도된 균주와 비교하여 감소된 착색을 가진 색 돌연변이체인 균주이고, 상기 조류 세포는 20 건중량% 이상의 트리글리세리드 오일을 추가로 포함하고, 상기 오일의 5 중량% 미만이 도코사헥사논산 (DHA)이고, 조류 세포의 50% 초과가 용해된, 유기영양적으로 생산된 조류 세포를 포함하는, 비-유제품 식품 조성물로서,
    식품에서 지방의 0.1% 내지 100%는 조류 세포에 의해 제공되고, 상기 식품 조성물은 마가린, 두유, 아몬드 우유, 대마 우유, 쌀 우유, 비-유제품 냉동 디저트, 비-유제품 커피크림, 비-유제품 치즈 및 비-유제품 요거트로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 비-유제품 식품 조성물.
  20. 조류 세포를 포함하는 클로레라 (Chlorella) 속(genus)의 종으로부터 수득한 유기영양적으로 생산된 조류 세포로서, 상기 세포는 덩어리로 되어있고, 상기 조류 세포는 500 ppm 미만의 클로로필을 포함하고, 상기 조류 세포는 상기 조류 세포가 유도된 균주와 비교하여 감소된 착색을 가진 색 돌연변이체인 균주이고, 상기 조류 세포는 10 건중량% 초과의 트리글리세리드 오일을 추가로 포함하고, 상기 오일의 5 중량% 미만이 도코사헥사논산 (DHA)이고, 조류 세포의 50% 초과가 용해되고, 상기 조류 세포는 조류 세포 g 당 0 ㎍ 내지 115 ㎍의 총 카로티노이드, 세포 100 g 당 1 mg 내지 8 mg의 토코페롤, 조류 세포 g 당 0.05 ㎎ 내지 0.30 ㎎의 총 토코트리에놀 및 조류 세포 g 당 0.1 mg 내지 10 mg의 인지질로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물을 추가로 포함하는, 유기영양적으로 생산된 조류 세포.
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