BR112012026241A2 - composição alimentícia, método para preparar um alimento aerado, produto de carne, métodos para melhorar a textura na boca e a vida de prateleira de uma composição alimentícia, e, farinha de algas - Google Patents

composição alimentícia, método para preparar um alimento aerado, produto de carne, métodos para melhorar a textura na boca e a vida de prateleira de uma composição alimentícia, e, farinha de algas Download PDF

Info

Publication number
BR112012026241A2
BR112012026241A2 BR112012026241A BR112012026241A BR112012026241A2 BR 112012026241 A2 BR112012026241 A2 BR 112012026241A2 BR 112012026241 A BR112012026241 A BR 112012026241A BR 112012026241 A BR112012026241 A BR 112012026241A BR 112012026241 A2 BR112012026241 A2 BR 112012026241A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
algae
flour
biomass
seaweed
oil
Prior art date
Application number
BR112012026241A
Other languages
English (en)
Inventor
Klamczynska Beata
Zdanis Dana
Piechocki John
M Norris Leslie
Rakitsky Walt
Original Assignee
Solazyme Roquette Nutritionals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Solazyme Roquette Nutritionals Inc filed Critical Solazyme Roquette Nutritionals Inc
Publication of BR112012026241A2 publication Critical patent/BR112012026241A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C11/00—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions
    • A23C11/02—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins
    • A23C11/06—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing non-milk proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L17/00—Food-from-the-sea products; Fish products; Fish meal; Fish-egg substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L17/60—Edible seaweed
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D2/00—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking
    • A21D2/08—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking by adding organic substances
    • A21D2/14—Organic oxygen compounds
    • A21D2/16—Fatty acid esters
    • A21D2/165—Triglycerides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D2/00—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking
    • A21D2/08—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking by adding organic substances
    • A21D2/24—Organic nitrogen compounds
    • A21D2/26—Proteins
    • A21D2/264—Vegetable proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D2/00—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking
    • A21D2/08—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking by adding organic substances
    • A21D2/36—Vegetable material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C11/00—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions
    • A23C11/02—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins
    • A23C11/10—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G9/00—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor
    • A23G9/32—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G9/36—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds containing microorganisms or enzymes; containing paramedical or dietetical agents, e.g. vitamins
    • A23G9/363—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds containing microorganisms or enzymes; containing paramedical or dietetical agents, e.g. vitamins containing microorganisms, enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
    • A23L11/60—Drinks from legumes, e.g. lupine drinks
    • A23L11/65—Soy drinks
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • A23L13/40—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof containing additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • A23L13/40—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof containing additives
    • A23L13/42—Additives other than enzymes or microorganisms in meat products or meat meals
    • A23L13/422—Addition of natural plant hydrocolloids, e.g. gums of cellulose derivatives or of microbial fermentation gums
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • A23L13/40—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof containing additives
    • A23L13/45—Addition of, or treatment with, microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • A23L13/40—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof containing additives
    • A23L13/45—Addition of, or treatment with, microorganisms
    • A23L13/46—Addition of, or fermentation with fungi, e.g. yeasts; Enrichment with dried biomass other than starter cultures
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • A23L13/50—Poultry products, e.g. poultry sausages
    • A23L13/52—Comminuted, emulsified or processed products; Pastes; Reformed or compressed products from poultry meat
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • A23L13/60—Comminuted or emulsified meat products, e.g. sausages; Reformed meat from comminuted meat product
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/60—Salad dressings; Mayonnaise; Ketchup
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/065—Microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
    • A23L29/206—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin
    • A23L29/256—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin from seaweeds, e.g. alginates, agar or carrageenan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3571—Microorganisms; Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/20—Reducing nutritive value; Dietetic products with reduced nutritive value
    • A23L33/21—Addition of substantially indigestible substances, e.g. dietary fibres
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/10—Cereal-derived products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G2200/00—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF containing organic compounds, e.g. synthetic flavouring agents
    • A23G2200/02—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF containing organic compounds, e.g. synthetic flavouring agents containing microorganisms, enzymes, probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/10—Gas
    • A23V2250/101—Air
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/18—Lipids
    • A23V2250/194—Triglycerides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/20—Natural extracts
    • A23V2250/202—Algae extracts

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Dairy Products (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Beans For Foods Or Fodder (AREA)
  • Edible Oils And Fats (AREA)
  • General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
  • Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
  • Confectionery (AREA)
  • Seeds, Soups, And Other Foods (AREA)
  • Edible Seaweed (AREA)
  • Grain Derivatives (AREA)
  • Non-Alcoholic Beverages (AREA)
  • Seasonings (AREA)

Abstract

composição alimentícia, método para preparar um alimento aerado, produto de carne, métodos para melhorar a textura na boca e a vida de prateleira de uma composição alimentícia, e, farinha de algas. são descritas farinha de algas e biomassa de algas. são descritas composições alimentícias compreendendo biomassa de algas ou farinha de algas com alto teor lipídico.

Description

} “COMPOSIÇÃO ALIMENTÍCIA, MÉTODO PARA PREPARAR UM 4 ALIMENTO AERADO, PRODUTO DE CARNE, MÉTODOS PARA MELHORAR A TEXTURA NA BOCA E A VIDA DE PRATELEIRA DE UMA COMPOSIÇÃO ALIMENTÍCIA, E, FARINHA DE ALGAS”
REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
Este pedido inclui uma Listagem de Sequências, acrescentada ao final da Descrição Detalhada da Invenção.
CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção reside nos campos de microbiologia, a preparação 10 de alimentos e nutrição humana e animal.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Como a população humana continua a aumentar, há uma necessidade crescente de fontes de alimentos adicionais, especialmente fontes de alimentos que são baratas para produzir, porém nutritivas. Além disso, a 15 dependência atual na carne como o grampo de muitas dietas, pelo menos nos países mais desenvolvidos, contribui significativamente para a emissão de gases de efeito estufa, e há uma necessidade de novos gêneros alimentícios que são igualmente saborosos e nutritivos e ainda menos prejudiciais ao ambiente quando produzidos.
Com apenas “água e luz do sol” para crescer, as algas têm sido vistas como uma fonte de alimento potencial. Embora certos tipos de algas, principalmente as algas marinhas, de fato forneçam alimentos importantes para o consumo humano, a promessa de algas como um gênero alimentício não se realizou. Os pós de algas feitos com algas crescidas fotossinteticamente em tanques ao ar livre ou fotobiorreatores estão disponíveis comercialmente, mas têm uma cor verde-escuro (da clorofila) e um sabor forte e desagradável. Quando formulados em produtos alimentícios ou como suplementos nutricionais, estes pós de algas conferem uma cor verde visualmente desagradável para o produto alimentício ou suplemento nutricional e têm um sabor desagradável de peixe ou de algas marinhas.
Há várias espécies de algas que são utilizadas nos gêneros alimentícios atuais, a maioria sendo macroalgas, como alga marinha, purple laver (Porphyra, usada em nori), dulse (Palmaria palmate) e alface do mar (Uiva lactucá). Microalgas, tais como Spirulina (Arthrospira platensis) são crescidas comercialmente em tanques abertos (fotossinteticamente) para o uso como um suplemento nutricional ou são incorporadas em pequenas quantidades em bebidas de suco ou cremosos (geralmente menos de 0,5% p/p). Outras microalgas, incluindo algumas espécies de Chlorella são populares em países asiáticos como um suplemento nutricional.
Em adição a estes produtos, óleo de algas com teor de ácido docosahexanóico elevado (DHA) é usado como um ingrediente em fórmulas infantis. DHA é um óleo altamente polinsaturados. DHA tem propriedades anti-inflamatórias e é um suplemento bem conhecido, assim como um aditivo usado na preparação de gêneros alimentícios. No entanto, o DHA não é adequado para alimentos cozinhados, pois oxida com o tratamento térmico. Além disso, o DHA é instável quando exposto ao oxigênio, mesmo à temperatura ambiente, na presença de antioxidantes. A oxidação de DHA resulta em um gosto de peixe e aroma desagradável.
Há ainda uma necessidade de métodos para a produção de gêneros alimentícios a partir de algas de forma barata e eficiente, em grande escala, em particular, gêneros alimentícios que são saborosos e nutritivos. A presente invenção satisfaz estas e outras necessidades.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
As composições alimentícias que compreendem a farinha de algas ou biomassa de algas com alto conteúdo de lipídios são divulgadas. As composições alimentícias que compreendem a farinha de algas ou biomassa de algas com teor de proteínas elevado ou lipídico elevado são também divulgadas. As composições alimentícias com farinha de algas ou biomassa de algas e biomassa desengordurada são também divulgadas.
Em um primeiro aspecto, a presente invenção é dirigida a uma composição alimentícia compreendendo (a) farinha de algas, que é um homogeneizado de biomassa de microalgas contendo predominantemente ou totalmente as células lisadas com mais de 20% por peso seco de óleo de triglicerídeo, (b) pelo menos um ingrediente comestível adicional e, opcionalmente, pelo menos um ingrediente adicional, e (c) o gás, em que a farinha de algas, e pelo menos um ingrediente comestível adicional, compreendem uma fase contínua, o gás compreende uma fase descontínua, e em que a porcentagem do volume do alimento contribuído pelo gás está entre 1 e 50%. Em alguns casos, o volume de alimentos contribuído pelo gás está entre cerca de 10% e cerca de 60%. Em alguns casos, o gás é o ar. Em alguns casos, a porcentagem do volume de alimentos contribuído pelo gás está entre 10 e 50%. Em algumas modalidades, a comida é congelada. Em alguns casos, a fase contínua compreende cerca de 0 a cerca de 30% de açúcar, ou de outro agente edulcorante natural ou artificial, em peso.
Em algumas modalidades, a farinha de algas ou biomassa de algas compreende entre 20% e 70% em peso seco de óleo de triglicerídeo. Em alguns casos, 60% - 75% do óleo de triglicerídeo é um lipídio 18:1 em uma forma de glicerolipídio. Em algumas modalidades, o óleo de triglicerídeo é (a) menos de 2% 14:0, (b) 13-16% 16:0, (c) 1-4% 18:0, (d) 64-70% 18: 1, (e) ΙΟΙ 6% 18:2, (f) 0,5-2,5% 18:3, ou (g) menos que 2% de óleo de um comprimento de cadeia de carbono de 20 ou mais.
Em algumas modalidades, a farinha de algas ou biomassa de algas está entre 5% a 70% de carboidratos, em peso seco. Em alguns casos, a farinha de algas ou biomassa de algas está entre 25% - 40% de carboidratos por peso seco. Em alguns casos, o componente de carboidrato da biomassa está entre cerca de 25% a 70%, opcionalmente, 25% - 35%, de fibra dietética e cerca de 2% a 10%, opcionalmente, de 2% - 8%, de açúcar livre, incluindo a sacarose, por peso seco. Em algumas modalidades, a composição de monossacarideos do componente de fibra dietética da biomassa é (a) 3-17% de arabinose, (b) 7-43% de manose, (c) 18-77% de galactose, e (d) 11-60 % de glicose. Em algumas modalidades, a composição de monossacarideos do componente de fibra dietética da biomassa é (a) 0,1-4% de arabinose, (b) 515% de manose, (c) 15-35% de galactose, e (d) 50-70 % de glicose. Em alguns casos, a biomassa de algas ou de farinha tem entre cerca de 0 a cerca de 115 pg de carotenoides totais por grama de biomassa de microalgas ou farinha de algas, incluindo 20-70 pg de luteina por grama de biomassa de microalgas ou farinha de algas. Em alguns casos, a biomassa ou farinha de algas tem menos de 10 pg ou menos do que 20 pg de carotenoides totais por grama de biomassa de microalgas ou farinha de algas. Em algumas modalidades, o teor de clorofila da biomassa é menos de 500 ppm. Em alguns casos, o óleo no interior da biomassa ou farinha de algas tem 1-8 mg de tocoferóis totais por 100 grama de biomassa de microalgas ou farinha de algas, incluindo 2-6 mg de alfa-tocoferol por 100 gramas de biomassa de microalgas ou farinha de algas. Em alguns casos, a biomassa de algas ou farinha tem cerca de 0,05-0,30 mg de tocotrienóis totais por grama de biomassa de microalgas ou farinha de algas, incluindo 0,10-0,25 mg de alfa tocotrienol por grama de biomassa de microalgas ou farinha de algas.
Em algumas modalidades, a biomassa é derivada a partir de uma alga que é uma espécie do gênero Chlorella. Em alguns casos, as algas é Chlorella protothecoides. Em algumas modalidades, a biomassa é derivada de uma alga que é um mutante de cor com pigmentação de cor reduzida, em comparação com a cepa a partir da qual foi derivada.
Em algumas modalidades, a biomassa de algas e farinha de algas é derivada de algas cultivadas e processadas em condições de boas práticas de fabricação (GMP).
Em alguns casos, pelo menos um ingrediente comestível adicional é selecionado a partir do grupo consistindo em açúcar, água, leite, creme, suco de fruta, concentrado de suco de fruta, ovos inteiros, claras de ovos, grãos e gordura animal ou outra gordura. Em alguns casos, a composição é selecionada a partir do grupo consistindo em sorvete, gelados, sorbets, musse, flã, pudim, merengue, pasta, produtos cozidos, musse, coberturas batidas de leite, iogurte congelado, recheios e molhos espumantes.
Em um segundo aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de fabricação de um alimento aerado por (a) mistura de farinha de algas ou biomassa de algas, água e pelo menos um outro ingrediente comestível para fazer uma dispersão, em que a farinha de algas ou biomassa de algas compreende de cerca de 0,5% a cerca de 10% p/p de dispersão, e (b) incorporação de gás na dispersão para formar bolhas de gás de fase descontínua estável, fazendo, assim, um alimento aerado. A farinha de algas ou biomassa de algas pode compreender entre cerca de 0,5% a cerca de 5%, a partir de cerca de 0,5% a cerca de 2,5%, ou desde cerca de 0,5% a cerca de 1% da dispersão.
Em um terceiro aspecto, a presente invenção é dirigida a um produto de carne que compreende uma matriz de carne moída ou picada e pelo menos cerca de 0,5% p/p da farinha de algas, que é um homogeneizado de biomassa de microalgas contendo predominantemente ou totalmente células lisadas que compreendem pelo menos cerca de 20% por peso seco do óleo de triglicerídeo, em que a carne e farinha de algas estão homogeneamente dispersas por toda a matriz.
Em algumas modalidades, a carne contém no máximo 10% de gordura animal, ou no máximo 30% de gordura animal. Em alguns casos, a carne contém no máximo 7% de gordura animal. Em alguns casos, a carne contém no máximo 3% de gordura animal ou, no máximo cerca de 1% de gordura animal. Em algumas modalidades, o produto de carne contém cerca de 0,5% a cerca de 2,5% p/p de farinha de algas, ou a partir de cerca de 0,5% a cerca de 10% p/p de farinha de algas. Em alguns casos, a farinha de algas contém cerca de 20-60% ou 25% a 70% de óleo de algas em peso seco. Em alguns casos, a farinha de algas é feita a partir de microalgas do gênero Chlorella. Em alguns casos, a farinha de algas é feita a partir de microalgas da espécie Chlorella protothecoides. Em algumas modalidades, o produto de carne é uma carne triturada. Em alguns casos, o produto de carne é uma carne reformada. Em algumas modalidades, a farinha de algas não tem cor verde ou amarelo visível. Em alguns casos, a farinha de algas tem menos do que 500 ppm de clorofila. Em algumas modalidades, a carne é selecionada a partir do grupo consistindo em carne, bisão, cordeiro, carneiro, ovelha, carne de veado, peixe, frango, porco, presunto e peru.
Em um quarto aspecto, a presente invenção é dirigida a uma composição alimentícia láctea compreendendo pelo menos um ingrediente lácteo, farinha de algas e, em que a farinha de algas é um homogeneizado de biomassa de microalgas contendo predominantemente ou totalmente células lisadas compreendendo pelo menos 20% por peso seco do óleo de triglicerídeo, em que entre cerca de 0,1% até cerca de 100%, preferencialmente entre 10% e 100%, entre 15% e 95%, entre 20% e 90%, entre 25% e 85%, entre 30% e 80 %, acima de 25%, acima de 30%, acima de 35%, acima de 40%, acima de 45%, acima de 50%, aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90% e aproximadamente 100% da gordura nos alimentos é fornecida pela farinha de algas. Em alguns casos, a composição alimentícia láctea é selecionada a partir do grupo consistindo em queijos, leite, coalhada, creme, manteiga, pasta e iogurte.
Em um aspecto adicional, a presente invenção é dirigida a uma composição alimentícia não de laticínio compreendendo pelo menos um ingrediente não de laticínio, e farinha de algas ou biomassa de algas, compreendendo pelo menos 20% por peso seco do óleo de triglicerídeo, em que entre 10% e 100%, entre 15% e 95%, entre 20% e 90%, entre 25% e 85%, entre 30% e 80%, acima de 25%, acima de 30%, acima de 35%, acima de 40%, acima de 45 %, acima dos 50%, aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90% e aproximadamente 100% da gordura na composição alimentícia não de laticínio é fornecida pela farinha de algas ou biomassa de algas. Um ingrediente não de laticínio é uma substância derivada de uma fonte não de laticínio, incluindo, por exemplo, soja, nozes, legumes, cereais, frutas, vegetais, e semelhantes. Em alguns casos, a composição alimentícia é selecionada do grupo consistindo em margarina, leite de soja, leite de amêndoa, leite de cânhamo, leite de arroz, sobremesa congelada não de laticínio, creme não de laticínio, queijo não de laticínio e iogurte não de laticínio.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma farinha de algas ou biomassa de algas que compreende mais do que cerca de 10% de óleo de triglicerídeo em peso seco. A farinha de algas e biomassa de algas compreende ainda os compostos selecionados a partir do grupo consistindo em cerca de 0 pg a cerca de 115 pg de carotenoides totais por grama de biomassa de algas ou de farinha de algas, entre cerca de 1 mg até cerca de 8 mg de tocoferóis por 100 g de farinha de algas ou biomassa de algas, a partir de cerca de 0,05 mg até cerca de 0,30 mg de tocotrienóis totais por grama de farinha de algas ou biomassa de algas e cerca de 0,1 mg até cerca de 10 mg de fosfolipídios, preferencialmente, entre cerca de 0,25% a cerca de 1,5%, por grama de farinha de algas ou biomassa de algas.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de melhorar a sensação na boca de uma composição alimentícia. A sensação na boca da composição alimentícia é melhorado através da adição de farinha de algas ou biomassa de algas à composição alimentícia. A farinha de algas ou biomassa de algas compreende mais do que cerca de 20% por peso seco de óleo de triglicerídeo.
Em alguns casos, o método de melhorar a sensação na boca de uma composição alimentícia compreende as etapas de: a) fornecer uma composição alimentícia, e b) adicionar uma determinada quantidade de farinha de algas que compreende mais do que cerca de 20% por peso seco de óleo de triglicerídeo da referida composição alimentícia. Em alguns casos, a farinha de algas compreende mais do que cerca de 40% em peso de óleo de triglicerídeo. Em alguns casos, a farinha de algas compreende de cerca de 0,1% a cerca de 20% p/p da referida composição alimentícia.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de melhorar a sensação na boca de uma composição alimentícia. A sensação na boca da composição alimentícia é melhorado através da adição de farinha de algas ou biomassa de algas e leite, caseína, soro de leite, ou soja à composição alimentícia. A farinha de algas ou biomassa de algas compreende mais do que cerca de 20% por peso seco de óleo de triglicerídeo.
Em alguns casos, o método de melhorar a sensação na boca de uma composição alimentícia compreende as etapas de: a) fornecer uma composição alimentícia compreendendo leite, soja, caseína, ou soro de leite, e
b) adicionar uma determinada quantidade de farinha de algas que compreende mais do que cerca de 10% por peso seco de óleo de triglicerídeo da referida composição alimentícia. Em alguns casos, a farinha de algas compreende mais do que cerca de 40% em peso de óleo de triglicerídeo. Em alguns casos, a farinha de algas compreende de cerca de 0,1% a cerca de 20% p/p da referida composição alimentícia.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para aumentar a vida de prateleira de uma composição alimentícia. A vida de prateleira da composição alimentícia é melhorada através da adição de farinha de algas ou biomassa de algas à composição alimentícia. A farinha de algas ou biomassa de algas compreende mais do que cerca de 20% por peso seco de óleo de triglicerídeo.
Em alguns casos, o método para melhorar a vida de prateleira 5 de uma composição alimentícia compreende as etapas de: a) fornecer uma composição alimentícia, e b) adicionar uma determinada quantidade de farinha de algas que compreende mais do que cerca de 20% em peso seco óleo de triglicerídeo da referida composição alimentícia. Em alguns casos, a farinha de algas compreende mais do que cerca de 40% em peso de óleo de 10 triglicerídeo. Em alguns casos, a farinha de algas compreende de cerca de 0,1% a cerca de 20% p/p da referida composição alimentícia.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição alimentícia não de laticínio compreendendo: (a) pelo menos um ingrediente não de laticínio, e (b) farinha de algas, compreendendo pelo 15 menos 20% por peso seco do óleo de triglicerídeo, em que entre cerca 0,1% e cerca de 100% da gordura nos alimentos é fornecida pela farinha de algas. Em alguns casos, o ingrediente não de laticínio é selecionado a partir do grupo consistindo em soja, amêndoa, linho, aveia e arroz. Em alguns casos, a composição alimentícia não de laticínio é selecionada a partir do grupo 20 consistindo em margarina, leite de soja, leite de amêndoa, leite de cânhamo, leite de arroz, sobremesa congelada não de laticínio, creme não de laticínio, queijo não de laticínio e iogurte não de laticínio.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma farinha de algas compreendendo partículas de farinha de algas ou uma biomassa de algas 25 compreendendo partículas de biomassa de algas, referida farinha de algas ou biomassa de algas, cada uma compreendendo mais do que cerca de 10% de óleo de triglicerídeo em peso seco, em que a referida farinha de algas ou biomassa de algas compreende ainda os compostos selecionados a partir do grupo consistindo em cerca de 0 pg a cerca de 115 pg de carotenoides totais por grama de biomassa de algas ou de farinha de algas, entre cerca de 1 mg até cerca de 8 mg de tocoferóis por 100 g de farinha de algas ou biomassa de algas, a partir cerca de 0,05 mg até cerca de 0,30 mg tocotrienóis totais por grama de farinha de algas ou biomassa de algas e de cerca de 0,1 mg até cerca 5 de 10 mg de fosfolipídios por grama de farinha de algas ou biomassa de algas.
Em alguns casos, os carotenoides totais por grama de biomassa de algas ou farinha de algas é menos de 10 pg. Em alguns casos, o tamanho médio de partícula de partícula de farinha de algas ou partícula de biomassa de algas é menos de 10 μΜ.
Em algumas modalidades, as partículas de farinha de algas são aglomeradas. Em alguns casos, o tamanho médio das partículas dos aglomerados de partículas de farinha de algas é menos de cerca de 1.000 μΜ. Em alguns casos, o tamanho médio das partículas dos aglomerados de partículas de farinha de algas é menos de cerca de 500 μΜ. Em alguns casos, 15 o tamanho médio das partículas dos aglomerados de partículas de farinha de algas é menos de cerca de 250 μΜ. Em alguns casos, o tamanho médio das partículas dos aglomerados de partículas de farinha de algas é menos de cerca de 100 μΜ.
Em alguns casos, a biomassa de algas ou farinha de algas 20 compreende adicionalmente micróbios contaminantes de não microalgas. Em alguns casos, o micróbio contaminante é selecionado a partir do grupo consistindo em: uma contagem de placa aeróbica total menor ou igual a 10.000 CFU por grama; levedura menor ou igual a 200 CFU por grama; mofo menor ou igual a 200 CFU por grama; coliforme menor ou igual a 10 CFU 25 por grama; Escherichia coli menor ou igual a 6 CFU por grama; e Stafilococos-co&g. positivo menor ou igual a 20 CFU por grama. Em alguns casos, a farinha de algas ou biomassa de algas compreende menos do que cerca de 20% de óleo de triglicerídeo em peso seco. Em alguns casos, a farinha de algas ou biomassa de algas compreende menos do que cerca de
10% de óleo de triglicerídeo em peso seco.
Estes e outros aspectos e modalidades da invenção são descritas nos desenhos anexos, uma breve descrição dos quais segue imediatamente, e na descrição detalhada da invenção abaixo, e são exemplificados nos exemplos abaixo. Qualquer uma ou todas as características discutidas anteriormente e ao longo do pedido podem ser combinadas em várias modalidades da presente invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A descrição detalhada da invenção é dividida em seções e subseções para a conveniência do leitor. A seção I fornece definições para vários termos usados neste documento. A seção II, em partes A-E, descreve métodos para a preparação de biomassa de microalgas, incluindo organismos adequados (A), métodos de geração de uma cepa de microalgas sem ou tendo pigmentação significativamente reduzida (B) condições de cultura (C), condições de concentração (D), e composição química da biomassa produzida de acordo com a invenção (E). A seção III, descreve métodos para o processamento da biomassa de microalgas em farinha de algas e farinha de algas desengordurada da invenção. A seção IV descreve vários alimentos da presente invenção e os métodos de combinação de biomassa de microalgas com outros ingredientes alimentícios.
Todos os processos aqui descritos podem ser realizados em conformidade com as normas de GMP ou equivalente. Nos Estados Unidos, as normas de GMP para fabricação, embalagem, ou conservação de alimento humano são codificadas em 21 C.F.R. 110. Estas disposições, bem como disposições acessórias aqui citadas são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins. As condições de GMP nos Estados Unidos, e condições equivalentes em outras jurisdições, se aplicam na determinação de se um alimento é adulterado (o alimento foi fabricado em tais condições de modo que o mesmo é impróprio para alimentos) ou foi preparado, embalado, ou conservado em condições insalubres de tal forma que ele pode ter sido contaminado ou, de outra forma, pode causar prejuízo para a saúde. As condições de GMP podem incluir adesão aos regulamentos que governam: o controle da doença; limpeza e treinamento de pessoal, operação de manutenção e sanitária de edifícios e instalações, fornecimento de instalações e acomodações sanitárias adequadas, projeto, construção, manutenção e limpeza dos equipamentos e utensílios; fornecimento de procedimentos de controle de qualidade adequados para assegurar que todas as precauções razoáveis são tomadas no recebimento, inspeção, transporte, segregação, preparação, fabricação, embalagem e armazenamento de produtos alimentícios de acordo com os princípios de saneamento adequados para evitar a contaminação de qualquer origem, e armazenamento e transporte de alimentos acabado em condições que irão proteger o alimento contra contaminação física, química, ou microbiana indesejável, assim como contra a deterioração dos alimentos e do recipiente.
I. DEFINIÇÕES
A menos que definido de outro modo abaixo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o significado normalmente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Definições gerais de muitos dos termos utilizados no presente documento podem ser encontradas em Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5a Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); e Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991).
A “porcentagem de área” refere-se à determinação da porcentagem de área dos picos cromatográficos, espectroscópicos e outros produzidos durante a experimentação. A determinação da área sob a curva de um pico e a porcentagem de área de um pico particular é rotineiramente realizada por um versado na técnica. Por exemplo, nos métodos de detecção FAME GC/FID em que as moléculas de ácidos graxos na amostra são convertidas em um metil éster de ácido graxo (FAME), um pico separado é observado por um ácido graxo com 14 átomos de carbono com nenhuma insaturação (Cl4:0) em comparação com qualquer outro ácido graxo tal como o Cl4:1. A área de pico para cada classe de FAME é diretamente proporcional à sua composição percentual na mistura e é calculada com base na soma de todos os picos presentes na amostra (isto é, [área sob o pico específico/área total de todos os picos medidos] X 100). Ao se referir aos perfis lipídicos de óleos e células da invenção, “pelo menos 4% de C8-C14” significa que, pelo menos 4% dos ácidos graxos totais na célula ou na composição de glicerolipídio extraída têm um comprimento de cadeia que inclui 8, 10, 12 ou 14 átomos de carbono.
O “alimento aerado” significa qualquer produto alimentício composto de uma fase contínua e descontínua, onde a fase contínua é normalmente uma solução aquosa e a fase descontínua é normalmente um gás (ar). A fase contínua do alimento aerado tem uma propriedade de estabilização, o que permite a formação estável de bolhas de gás (ar) dentro do alimento. Exemplos não limitativos de alimentos aerados incluem musses, sorvetes e sorbets.
“Axênico” significa uma cultura de um organismo que não está contaminado por outros organismos vivos.
“Produtos assados” significa um item alimentar, normalmente encontrado em uma padaria, que é preparado por uso de um forno e, geralmente, contém um agente de fermentação. Produtos assados incluem, mas não estão limitados a brownies, biscoitos, tortas, bolos e doces.
“Biorreator” e “fermentador” significam um invólucro ou invólucro parcial, tal como um tanque ou vaso de fermentação, no qual as células são cultivadas tipicamente em suspensão.
“Pão” significa um alimento que contém farinha, líquido e, geralmente, um agente de fermentação. Pães são geralmente preparados por assadura em um forno, embora outros métodos de cozimento também sejam aceitáveis. O agente de fermentação pode ser químico ou orgânico/biológico por natureza. Tipicamente, o agente de fermentação orgânica é a levedura. No caso em que o agente de fermentação é de natureza química (por exemplo, o fermento em pó e/ou fermento de soda), estes produtos alimentícios são referidos como “os pães rápidos”. Biscoitos e outros produtos de tipo biscoito são exemplos de pães que não contêm um agente de fermentação.
“Material celulósico” significa os produtos de digestão de celulose, em especial, glicose e xilose. A digestão de celulose tipicamente produz compostos adicionais, tais como dissacarídeos, oligossacarídeos, lignina, furfurais e outros compostos. Fontes de material celulósico incluem, por exemplo, e sem limitação, o bagaço de cana de açúcar, polpa de beterraba, resíduos de milho, lascas de madeira, serradura, e grama de ponta.
“Cocultura” e suas variantes, tais como “cocultivo” e “cofermentação” significam que dois ou mais tipos de células estão presentes no biorreator mesmo em condições de cultura. Os dois ou mais tipos de células são, para os fins da presente invenção, geralmente ambos os microrganismos, tipicamente ambas as microalgas, mas podem, em alguns casos incluir um tipo de célula de não microalgas. As condições de cultura adequadas para a cocultura incluem, em alguns casos, as que promovem o crescimento e/ou a propagação dos dois ou mais tipos de células, e, em outros casos, as que facilitam o crescimento e/ou proliferação de apenas uma, ou somente de um subconjunto, das duas ou mais células mantendo ao mesmo tempo o crescimento celular para o restante.
“Cofator” significa uma molécula, diferente do substrato, necessária para uma enzima realizar a sua atividade enzimática.
“Carne triturada” significa um produto de carne que é formado através da redução do tamanho dos pedaços de carne, promovendo assim a extração de proteínas de sais solúveis, que permitem que a carne moída se ligue em conjunto. A trituração também resulta numa distribuição uniforme do músculo, gordura e tecido conjuntivo. Os exemplos não limitantes de carne triturada incluem, rodelas de carne, linguiça e cachorros-quentes.
“Carne reformada” está relacionada com a came triturada e tem um artefato de ter a aparência de um corte, uma fatia ou porção da carne que tenha sido rompida, que é formada por “queda” de carne picada, com ou sem a adição de came finamente triturada, em que as proteínas solúveis do carne picada ligam os pequenos pedaços em conjunto. Os nuggets são um exemplo não limitativo de carnes reformadas.
“Produto alimentício convencional” significa uma composição destinada ao consumo, por exemplo, por um humano, que carece de biomassa de algas ou de outros componentes de algas e inclui ingredientes normalmente associados com o produto alimentício, em particular um óleo vegetal, gordura animal, e/ou ovo(s), juntamente com outros ingredientes alimentícios. Produtos alimentícios convencionais incluem os produtos alimentícios vendidos em lojas e restaurantes e aqueles feitos em casa. Produtos alimentícios convencionais são muitas vezes feitos seguindo receitas convencionais que especificam a inclusão de um óleo ou gordura a partir de uma fonte de não algas e/ou de ovo(s) juntamente com outro(s) ingrediente comestível.
“Produto cozido” significa um alimento que foi aquecido, por exemplo, em um forno, durante um período de tempo.
“Molho de salada cremoso” significa um molho de salada que é uma dispersão estável com uma viscosidade elevada e uma lenta taxa de fluidez. Geralmente, molhos de salada cremosos são opacos.
“Cultivar”, “cultura” e “fermentar”, e suas variantes, significam a promoção intencional do crescimento e/ou propagação de uma ou mais células, normalmente microalgas, por uso de condições de cultura. As condições destinadas excluem o crescimento e/ou propagação de microrganismos na natureza (sem intervenção humana direta).
“A citólise” significa a lise das células em um ambiente hipotônico. A citólise resulta de osmose, ou do movimento da água, para o interior de uma célula para um estado de hiper-hidratação, de tal forma que a célula não pode suportar a pressão osmótica no interior da água, e assim explode.
A “farinha de algas desengordurada” significa a biomassa das algas que foi transformada em uma farinha de algas e, em seguida, foi submetida a um processo de extração de óleo utilizando o processo de extração polar e/ou não polar ou gases, tais como o CO2 para produzir farinha de algas que contêm menos azeite, em relação à biomassa antes do processo de extração. As células em farinha de algas desengordurada são predominantemente ou totalmente lisadas e a farinha de algas desengordurada contém carboidratos, incluindo sob a forma de fibra dietética e podem conter proteínas e pequenas quantidades de óleo residual. A farinha de algas desengordurada pode conter fosfolipídios ou não, dependendo do método de extração. Tipicamente, a quantidade de lipídio que permanece na farinha desengordurada de algas é de cerca de 1% a cerca de 15% em peso.
A “fibra dietética” designa carboidratos não amiláceos encontrados em plantas e outros organismos que contenham paredes celulares, incluindo microalgas. A fibra dietética pode ser solúvel (dissolvida em água) ou insolúvel (não pode ser dissolvida em água). A fibra solúvel e insolúvel constitui a fibra dietética total.
A “refeição deslipidada” ou “biomassa/farinha de algas desengordurada” significa biomassa das algas que foi submetida a um processo de extração do óleo e, assim, contém menos óleo, em relação à biomassa antes da extração do óleo. As células na refeição deslipidada são predominantemente lisadas. As refeições deslipidadas incluem biomassa das algas que foram extraídas do solvente (por exemplo, hexano).
A “proteína bruta digestível” é a porção da proteína que está disponível ou pode ser convertida em nitrogênio livre (aminoácidos), após digestão com as enzimas gástricas. A medição de proteína bruta digestível in vitro é realizada usando enzimas gástricas, tais como pepsina e digerindo uma amostra e medindo o aminoácido livre após a digestão. A medição de proteína bruta digestível in vivo é realizada através da medição dos níveis de proteína em uma amostra alimentícia de animal/humana e alimentando a amostra a um animal e medindo a quantidade de nitrogênio nas fezes recolhidas do animal.
A “dispersão” significa uma mistura em que as partículas finas de pelo menos uma substância estão espalhadas por toda outra substância. Embora uma dispersão possa significar qualquer partícula que é dispersa durante toda a fase contínua de uma composição diferente, o termo dispersão como utilizado aqui se refere a um sólido fino de uma substância que é espalhada ou dispersa através de outra substância, normalmente um líquido. Uma emulsão é um tipo especial de dispersão para englobar uma mistura de dois ou mais líquidos imiscíveis.
O “peso seco” e “peso seco de células” significa o peso determinado na ausência relativa de água. Por exemplo, a referência a biomassa de microalgas como compreendendo uma porcentagem especificada de um determinado componente, em peso seco significa que a porcentagem é calculada com base no peso da biomassa após substancialmente toda a água ter sido removida.
O “ingrediente comestível” significa qualquer substância ou composição que está apta para ser comida. “Ingredientes comestíveis” incluem, sem limitação, grãos, frutas, verdura, proteínas, ervas, especiarias, carboidratos, açúcar e gorduras.
O termo “ingrediente” tal como usado aqui, significa ingredientes usados em produtos alimentícios e/ou composições alimentícias. “Ingrediente” inclui, sem limitação, conservantes, aromatizantes, aditivos de alimentos, corantes de alimentos, substitutos de açúcar e outros ingredientes encontrados em vários alimentos.
“Fornecido exogenamente” significa uma molécula fornecida a uma célula (incluindo fornecida aos meios uma célula em cultura).
“Gordura” significa uma mistura de lipídios ou lipídios, que é geralmente sólida em temperatura ambiente e pressões ordinárias. “Gordura” inclui, sem limitação a banha e manteiga.
“Fibra” significa carboidrato de não amido na forma de polissacarídeo. A fibra pode ser solúvel em água ou insolúvel em água. Muitas microalgas produzem a fibra solúvel e insolúvel, normalmente residentes na parede celular.
O “produto alimentício acabado” e “ingrediente alimentício acabado” significa uma composição alimentícia que está pronta para embalagem, uso, ou consumo. Por exemplo, um “produto alimentício acabado” pode ter sido cozido ou os ingredientes que compreendem o “produto alimentício acabado” podem ter sido misturados ou, de outro modo, integrados com outro. O “ingrediente alimentício acabado” é normalmente utilizado em combinação com outros ingredientes para formar um produto alimentício.
A “fonte de carbono fixo” significa molécula(s) contendo carbono, tipicamente as moléculas orgânicas, que se encontram presentes à temperatura e pressão ambientes sob a forma sólida ou líquida.
“Comida”, “composição alimentícia”, “produto alimentício” e “gênero alimentício” significa qualquer composição destinada a ser ou que deve ser ingerida por humanos como fonte de alimentação e/ou calorias. As composições alimentícias são compostas principalmente de carboidratos, gorduras, água e/ou de proteínas e constituem substancialmente toda a ingestão calórica diária de uma pessoa. A “composição alimentícia” pode ter um mínimo de peso que é pelo menos dez vezes o peso de um comprimido ou cápsula típica (faixas de peso típicas de comprimido/cápsula de são menores ou iguais a 100 mg até 1500 mg). A “composição alimentícia” não é encapsulada ou na forma de comprimido.
O “perfil de glicerolipídio” significa a distribuição de comprimentos de cadeia de carbono diferentes e níveis de saturação de glicerolipídios em uma amostra particular de biomassa ou óleo. Por exemplo, uma amostra pode ter um perfil de glicerolipídio em que aproximadamente 60% do glicerolipídio é C18:l, 20% é C18:0, 15% é C16:0, 5% e é C14:0. Quando um comprimento de carbono é referenciado genericamente, como “C:18”, tal referência pode incluir qualquer quantidade de saturação, por exemplo, biomassa de microalgas que contém lipídios a 20% (em peso/massa) como C: 18 pode incluir Cl8:0, Cl8:1, Cl8:2, e afins, em quantidades iguais ou diferentes, a soma dos quais constituindo 20% da biomassa. Referência à porcentagem de saturação de um tipo determinado, por exemplo, “pelo menos 50% monoinsaturado em uma forma de glicerolipídio 18:1” significa que as cadeias laterais alifáticas dos glicerolipídios são, pelo menos 50% 18:1, mas, não significa necessariamente que pelo menos 50% dos triglicerídeos são trioleína (três cadeias de 18:1 ligadas a um esqueleto de glicerol único); tal perfil pode incluir glicerolipídios com uma mistura de cadeias laterais de 18:1 e outros, desde que pelo menos 50% das cadeias laterais totais sejam 18:1.
As “Boas Práticas de Fabricação” e “GMP” significa as condições estabelecidas pelas normas estabelecidas no 21 C.F.R. 110 (para a alimentação humana) e 111 (para suplementos alimentares), ou esquemas regulatórios comparáveis estabelecidos em locais fora dos Estados Unidos. Os regulamentos dos EUA são promulgados pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos sob a autoridade da Lei Federal de Alimentos, Medicamentos e Cosméticos para regular os fabricantes, processadores, e empacotadores de produtos alimentícios e suplementos alimentares para consumo humano.
O “crescimento” significa um aumento no tamanho da célula, do total de conteúdos celulares, e/ou a massa celular ou do peso de uma célula individual, incluindo aumento de peso das células, devido à conversão de uma fonte de carbono fixo em óleo intracelular. /
O “cultivo heterotrófico” e suas variantes, tais como “cultura heterotrófica” e “fermentação heterotrófica” referem-se à promoção intencional de crescimento (aumento do tamanho da célula, conteúdos celulares, e/ou atividade celular), na presença de uma fonte de carbono fixo. O cultivo heterotrófico é realizado na ausência de luz. O cultivo na ausência de luz significa cultura de células microbianas para a ausência completa ou quase completa ausência de luz, onde as células não derivam uma quantidade significativa da sua energia da luz (ou seja, acima de 0,1%).
A “propagação heterotrófica” e suas variantes referem-se à promoção intencional de propagação (aumento do número de células através de mitose), na presença de uma fonte de carbono fixo. A propagação heterotrófica é realizada na ausência de luz. A propagação, na ausência de luz quer dizer a propagação de células microbianas para a ausência completa ou ausência quase completa de luz, onde as células não derivam uma quantidade significativa da sua energia dea luz (ou seja, acima de 0,1%).
“Homogeneizado” significa a biomassa que foi fisicamente rompida. A homogeneização é um processo mecânico fluido, que envolve a subdivisão de partículas ou aglomerados em tamanhos menores e mais uniformes, formando uma dispersão que pode ser submetida a processamento adicional. A homogeneização é utilizada no tratamento de vários alimentos e produtos de laticínio para melhorar a estabilidade, a vida de prateleira, a digestão, e gosto.
O “rendimento lipídico aumentado” significa um aumento na produtividade de lipídio/óleo de uma cultura microbiana que pode ser conseguido, por exemplo, aumentando o peso seco de células por litro de cultura, aumentando a porcentagem de células que contêm lipídios, e/ou aumentando a quantidade total de lipídio por litro de volume de cultura por unidade de tempo.
“In situ” significa “no lugar” ou “em sua posição original”. Por exemplo, uma cultura pode conter um primeiro tipo de célula de microalgas que secreta um catalisador e um segundo tipo de célula de microrganismo que secreta um substrato, em que os primeiro e segundo tipos de células produzem os componentes necessários para uma reação química particular ocorrer in situ na cocultura sem a necessidade de uma separação ou processamento adicional dos materiais.
“Lipídio” significa qualquer uma de uma classe de moléculas que são solúveis em solventes não polares (por exemplo, éter e hexano) e relativamente ou completamente insolúveis em água. Moléculas lipídicas têm essas propriedades, porque elas são, em grande parte, compostas de caudas longas de hidrocarbonetos que são de natureza hidrofóbica. Exemplos de lipídios incluem ácidos graxos (saturados e insaturados), glicerídeos ou glicerolipídios (tais como os monoglicerídeos, diglicerídeos, triglicerídeos ou gorduras neutras, e fosfoglicerídeos ou glicerofosfolipídios) e não glicerídeos (esfingolipídios, tocoferóis, tocotrienóis, lipídios de esterol, incluindo hormônios esteróides e colesterol, lipídios de prenol incluindo terpenóides, álcoois graxos, ceras, e policetídeos).
“Lisado” significa uma solução que contém o conteúdo de células lisadas.
A “lise” significa a ruptura da membrana plasmática e, opcionalmente, da parede celular de um microrganismo suficiente para liberar, pelo menos algum conteúdo intracelular, a qual é geralmente conseguida por mecanismos mecânicos ou osmóticos que comprometem a sua integridade.
A “lisagem” significa ruptura da membrana celular e, opcionalmente, da parede celular de uma célula ou organismo biológico suficiente para liberar, pelo menos algum conteúdo intracelular.
“Microalgas” significa um organismo microbiano eucariótico que contém um cloroplasto, e que pode ou não ser capaz de realizar a fotossíntese. As microalgas incluem fotoautotótrofos obrigatórios, os quais não podem metabolizar uma fonte de carbono fixo, tal como a energia, bem como heterotrófos, que podem viver apenas fora de uma fonte de carbono fixo, incluindo heterotrófos obrigatórios, os quais não podem realizar a fotossíntese. As microalgas incluem os organismos unicelulares que se separam de suas células irmãs, logo após a divisão celular, como Chlamydomonas, assim como micróbios, tais como, por exemplo, Volvox, que é um micróbio fotossintético multicelular simples de dois tipos de células diferentes. As “microalgas” também incluem células, tais como Chlorella, Dunaliella e ParaChlorella.
A “biomassa de microalgas”, “biomassa de algas” e “biomassa” significa um material produzido pelo crescimento e/ou propagação de células de microalgas. A biomassa pode conter células e/ou conteúdos intracelulares, bem como material extracelular. O material extracelular inclui, mas não está limitado a, compostos secretados pela célula.
“Óleo de microalgas” e “óleo de algas” significa qualquer um dos componentes lipídicos produzidos por células de microalgas, incluindo os triacilgliceróis.
“Micronizado” significa a biomassa em que as células foram rompidas. Por exemplo, as células podem ser rompidas através de métodos bem conhecidos, incluindo alta pressão, mecânicos, cisalhamento, ultrassons (ou por um processo equivalente) de modo que pelo menos 50% do tamanho de partícula (o tamanho médio de partícula) não é mais que 10 μΜ na sua dimensão ou diâmetro maior de uma esfera de volume equivalente. Tipicamente, pelo menos 50% a 90% ou mais de tais partículas são menores do que 5 pm em sua dimensão ou diâmetro maior de uma esfera de volume equivalente. Em qualquer caso, o tamanho médio de partículas de biomassa micronizada é menor do que a célula de microalgas intacta. As dimensões das partículas referidas são as que resultam da homogeneização e são preferencialmente medidas logo que possível após a homogeneização ter ocorrido e antes da secagem, para evitar possíveis distorções causadas por aglomeração de partículas, que podem ocorrer no decurso da secagem. Algumas técnicas de medição de tamanho de partícula, tais como a difração a laser, detectam o tamanho de partículas aglomeradas em vez de partículas individuais e podem mostrar um maior tamanho de partícula aparente (por exemplo, o tamanho médio de partículas de 1-100 pm) após a secagem. Uma vez que as partículas são, tipicamente aproximadamente esféricas, o diâmetro de uma esfera de volume equivalente e a maior dimensão da partícula são aproximadamente os mesmos.
“Microrganismos” e “micróbio” significa qualquer organismo microscópico unicelular.
“Sensação na boca”, como aqui usado, significa a percepção da composição alimentícia na boca. A sensação na boca é um termo usado e compreendido pelos versados na técnica. A sensação na boca inclui percepções selecionadas a partir do grupo consistindo em coesão, densidade, adstringência, secura, fraturabilidade, granulação, gomosidade, dureza, peso, absorção de umidade, liberação de umidade, revestimento da boca, rugosidade, escorregadiço, lisura, uniformidade, uniformidade da mordida, uniformidade da mastigação, viscosidade e umidade da composição alimentícia, quando colocado na boca.
“Suplemento nutricional” significa uma composição destinada a suplementar a dieta, fornecendo nutrientes específicos em vez de calorias em massa. Um suplemento nutritivo pode conter qualquer um ou mais dos seguintes ingredientes: uma vitamina, um mineral, uma erva, um aminoácido, um ácido graxo essencial, e outras substâncias. Suplementos nutricionais são normalmente comprimidos ou encapsulados. Um suplemento nutricional encapsulado ou de comprimido único é geralmente ingerido a um nível não acima de 15 gramas por dia. Os suplementos nutricionais podem ser fornecidos em sachês prontos para mistura que podem ser misturados com composições alimentícias, tais como o iogurte ou um “cremoso”, para suplementar a dieta, e são tipicamente ingeridos a um nível não acima de 25 gramas por dia.
“Óleo” significa qualquer triacilglicerídeo (ou óleo de triglicerídeo), produzido por um organismo, incluindo microalgas, outras plantas, e/ou animais. “Óleo”, como distinto de “gordura”, refere-se, salvo indicação em contrário, a lipídios que são geralmente líquidos à temperatura ambiente e pressões ordinárias. No entanto, o óleo de coco é normalmente sólido à temperatura ambiente, como são alguns óleos de palma e óleos de dendê. Por exemplo, “óleo” inclui óleos vegetais ou de sementes derivadas de plantas, incluindo, sem limitação, um óleo derivado de soja, sementes de colza, canola, palma, semente de palma, coco, milho, oliva, girassol, semente de algodão, cuphea, amendoim, camelina sativa, semente de mostarda, castanha de caju, aveia, tremoço, kenaf, calêndula, cânhamo, café, avelã, semente de linhaça, euphorbia, semente de abóbora, coentro, camelina, gergelim, açafrão, arroz, árvore de óleo de tungue, cacau, copra, papoula Pium, mamona, noz-peçã, jojoba, jatropha (pinhão manso), macadâmia, castanha do Brasil, e abacate, bem como suas combinações.
“Choque osmótico” significa a ruptura de células em uma solução depois de uma redução súbita da pressão osmótica e pode ser utilizado para induzir a liberação de componentes celulares de células de uma solução.
“Pasteurização” significa um processo de aquecimento que se destina a reduzir o crescimento microbiano em produtos alimentícios. Tipicamente, a pasteurização é realizada a uma temperatura elevada (mas abaixo do ponto de ebulição) durante um curto período de tempo. Tal como aqui descrito, a pasteurização pode não só reduzir o número de micróbios indesejados em produtos alimentícios, mas também pode inativar certas enzimas presentes no produto alimentício.
“Polissacarídeo” e “glicano” significa qualquer carboidrato feito de monossacarídeos unidos por ligações glicosídicas. A celulose é um exemplo de um polissacarídeo que constitui determinadas paredes celulares de plantas.
“Porta” significa uma abertura em um biorreator que permite influxo ou efluxo de materiais, tais como gases, líquidos e células; uma porta geralmente é conectada à tubulação.
“Predominantemente encapsulado” significa que mais de 50% e, tipicamente, mais de 75% a 90% de um componente referenciado, por exemplo, óleo de algas, é armazenado em um recipiente referenciado, o que pode incluir, por exemplo, uma célula de microalgas.
“Células predominantemente intactas” e “Biomassa predominantemente intacta” significa uma população de células que compreende mais do que 50, e muitas vezes mais do que 75, 90, e 98% de células intactas. “Intactas”, neste contexto, significa que a continuidade física da membrana celular e/ou da parede celular que envolve os componentes intracelulares da célula não foi rompida em qualquer forma que possa liberar os componentes intracelulares das células de uma forma que ultrapassa a permeabilidade da membrana celular em cultura.
“Predominantemente lisada” significa uma população de células em que mais de 50%, e tipicamente mais do que 75 a 90%, das células foram rompidas de tal modo que os componentes intracelulares das células já não são completamente fechados dentro da célula membrana.
“Proliferação” significa uma combinação tanto do crescimento quanto da propagação.
“Propagação” significa um aumento no número de células através de mitose ou outra divisão celular.
“Análise aproximada” significa a análise de gêneros alimentícios para gordura, nitrogênio/proteína, fibra bruta (celulose e lignina como componentes principais), umidade e cinzas. Carboidratos (fibra dietética total e açúcares livres) podem ser calculados subtraindo-se a soma dos valores conhecidos de análise aproximada de 100 (carboidratos por diferença).
“Vida de prateleira”, tal como aqui utilizado, significa o período de tempo em que a composição alimentícia é considerada aceitável. As propriedades de uma composição alimentícia, incluindo a sua textura, sensação na boca, o gosto, o aroma, a esterilidade e outras propriedades degradam ao longo do tempo. Durante a vida de prateleira de uma composição alimentícia, as propriedades da composição alimentícia podem degradar, mas a composição pode ainda ser determinada como sendo aceitável como uma composição alimentícia.
“Sonicação” significa a ruptura de materiais biológicos, tais como uma célula, pela energia de ondas sonoras.
“Espécies de furfural” significa 2-furancarboxaldeído e derivados do mesmo que conservam as mesmas características estruturais.
“Forragem” significa folhas e caules secos de uma cultura remanescente após um grão ter sido cultivado a partir dessa cultura.
“Adequado para o consumo humano” significa uma composição pode ser consumida por humanos como ingestão dietética sem efeitos adversos à saúde e pode fornecer ingestão calórica significativa devido à absorção de material digerido no trato gastrointestinal.
“Produto não cozido” significa uma composição que não tenha sido submetida a um aquecimento, mas pode incluir um ou mais componentes previamente submetidos a aquecimento.
“V/V” ou “v/v”, em referência a proporções em volume, significa a razão do volume de uma substância em uma composição para o volume da composição. Por exemplo, a referência a uma composição que compreende entre 5% v/v de óleo de microalgas significa que 5% do volume da composição são compostos de óleo de microalgas (por exemplo, uma tal composição que tem um volume de 100 mm iria conter 5 mm de óleo de microalgas) e o restante do volume da composição (por exemplo, 95 mm no exemplo) é composta por outros ingredientes.
“P/P” ou “p/p”, em referência às proporções em peso, significa a razão entre o peso de uma substância em uma composição para o peso da composição. Por exemplo, a referência a uma composição que compreende de 5% p/p de biomassa de microalgas significa que 5% do peso da composição são compostos de biomassa de microalgas (por exemplo, uma tal composição com um peso de 100 mg iria conter 5 mg de biomassa de microalgas) e o restante do peso da composição (por exemplo, 95 mg, no exemplo) é composto por outros ingredientes.
II. MÉTODOS PARA A PREPARAÇÃO DE BIOMASSA DE MICROALGAS
A presente invenção fornece a biomassa de algas adequada para o consumo humano, que é rica em nutrientes, incluindo lipídios e/ou constituintes de proteínas, métodos para combinar os mesmos com os ingredientes alimentícios e composições alimentícias que contêm os mesmos. A presente invenção surgiu em parte pelas verificações de que a biomassa de algas pode ser preparada com um elevado teor de óleo e/ou com uma excelente funcionalidade e a biomassa resultante incorporada nos produtos alimentícios. Além disso, a biomassa de algas desengorduraria (sob a forma de farinha de algas desengordurada) pode conferir funcionalidade única e surpreendente e pode ser incorporada em produtos alimentícios. A biomassa também fomece vários micronutrientes benéficos em adição ao óleo e/ou proteínas, tais como fibras dietéticas derivadas de algas (tanto solúveis quanto insolúveis em carboidratos), fosfolipídios, glicoproteína, fitoesteróis, tocoferóis, tocotrienóis, e selênio. A biomassa de algas compreende as células de algas crescidas, cultivadas ou propagadas como aqui descrito ou, em condições bem conhecidas dos versados na técnica.
Esta primeira seção revisa os tipos de microalgas adequadas para uso nos métodos da invenção (parte A), métodos de geração de uma cepa de microalgas sem pigmentação ou pigmentação significativamente reduzida (parte B), em seguida, as condições de cultura (parte C) que são utilizadas para propagar a biomassa, em seguida, as etapas de concentração, que são usadas para preparar a biomassa para posterior processamento (parte D), e termina com uma descrição da composição química da biomassa preparada de acordo com os métodos da invenção (parte E).
A. Microalgas para Uso nos Métodos da Invenção
Uma variedade de espécies de microalgas produtoras de óleos e/ou lipídios e/ou proteínas adequados pode ser utilizada em conformidade com os métodos da presente invenção, apesar das microalgas que produzem naturalmente níveis elevados de óleos e/ou lipídios e/ou proteína adequados serem preferenciais. Considerações que afetam a seleção de microalgas para uso na presente invenção incluem, além da produção de óleos, lipídios ou proteínas adequados para a produção de produtos alimentícios: (1) elevado teor de lipídios (ou proteína) como uma porcentagem do peso da célula; (2) facilidade de crescimento; (3) facilidade de propagação; (4) facilidade de processamento da biomassa; (5) perfil de glicerolipídio, e (6) ausência ou quase ausência de toxinas de algas (Exemplo 4 abaixo demonstra a biomassa de microalgas seca e óleos ou lipídios extraídos a partir da biomassa de algas não apresentam toxinas detectáveis).
Em algumas modalidades, a parede celular da microalga deve ser rompida durante o processamento de alimentos (por exemplo, cozimento) para liberar os componentes funcionais, e, nestas modalidades, as cepas de microalgas, com paredes de células sensíveis à digestão no trato gastrointestinal de um animal, por exemplo, um r humano ou outro monogástrico, são as preferidas, especialmente se a biomassa de algas deve ser utilizada em produtos alimentícios crus.
A digestibilidade é geralmente diminuída para as cepas de microalgas, que têm um elevado teor de celulose/hemicelulose nas paredes celulares. A digestibilidade pode ser avaliada usando ensaios padronizados conhecidos dos versados na técnica, por exemplo, o ensaio de digestibilidade de pepsina.
Em modalidades particulares, as microalgas compreendem células que têm pelo menos 10% ou mais de óleo por peso seco. Em outras modalidades, as microalgas contêm, pelo menos 25-35% ou mais óleo por peso seco. Geralmente, nestas modalidades, quanto mais óleo contido nas microalgas, mais nutritiva é a biomassa, de modo que as microalgas que são cultivadas para conter pelo menos 40%, pelo menos 50%, 75%, ou mais de óleo por peso seco são especialmente preferidas. Microalgas preferidas para uso nos métodos da presente invenção podem crescer heterotroficamente (em açúcares na ausência de luz) ou são heterotróficas obrigatórias. Nem todos os tipos de lipídios são desejáveis para uso em produtos alimentícios e/ou de produtos nutracêuticos, uma vez que podem ter um sabor indesejável ou odor desagradável, como também exibem fraca estabilidade ou fornecem um sabor pobre, e essas considerações também influenciam a seleção de microalgas para uso nos métodos da invenção.
As microalgas do gênero Chlorella são geralmente úteis nos métodos da presente invenção. Chlorella é um gênero de algas verdes unicelulares, pertencente ao filo Chlorophyta. As células de Chlorella são geralmente esféricas na forma, de cerca de 2 a 10 pm de diâmetro, e sem flagelos. Algumas espécies de Chlorella são naturalmente heterotróficas. Em modalidades preferidas, as microalgas utilizadas nos métodos da presente invenção são Chlorella protothecoides, Chlorella ellipsoidea, Chlorella minutissima, Chlorella zofinienesi, Chlorella luteoviridis, Chlorella kessleri, Chlorella sorokiniana, Chlorella fusca var. vacuolata Chlorella sp., Chlorella cf. minutissima ou Chlorella emersonii. Chlorella, particularmente Chlorella protothecoides, é um microrganismo preferido para uso nos métodos da presente invenção por causa da sua elevada composição de lipídios. Espécies particularmente preferidas de Chlorella protothecoides para uso nos métodos da invenção incluem as exemplificadas nos exemplos abaixo.
Outras espécies de Chlorella adequadas para uso nos métodos da invenção incluem as espécies selecionadas do grupo consistindo em anitrata, Antarctica, aureoviridis, Candida, capsulate, desidratar, ellipsoidea (incluindo cepa CCAP 211/42), emersonii, fusca (incluindo var. vacuolata), glucotropha, infusionum (incluindo var. actophila e var. auxenophila), kessleri (incluindo qualquer uma das cepas UTEX 397.2229.398), Lobophora (incluindo cepa SAG 37.88), luteoviridis (incluindo cepa SAG 2203 e var. aureoviridis e lutes cens), miniata, cf. minutissima, minutissima (incluindo cepa UTEX 2341), mutabilis, nocturna, ovalis, parva, photophila, pringsheimii, protothecoides (incluindo qualquer uma das cepas UTEX 1806, 411, 264, 256, 255, 250, 249, 31, 29, 25 ou CCAP 211/8D ou CCAP 211/17 e var. acidicola), regularis (incluindo var. minima, e umbricatd), reisiglii (incluindo cepa CCP 11/8), saccharophila (incluindo cepa CCAP 211/31, CCAP 211/32 e var. ellipsoidea), salina, simplex, sorokiniana (incluindo cepa SAG 211.40B), sp. (Incluindo cepa UTEX 2068 e CCAP 211/92), sphaerica, stigmatophora, trebouxioides, vanniellii, vulgaris (incluindo cepas CCAP
211/1 IK, CCAP 211/80 e f tertia e var. Autotrophica, viridis, vulgaris, f vulgaris. Tertia, f vulgaris, viridis), xanthella e zofingiensis.
As espécies de Chlorella (e espécies de outros gêneros de microalgas) para uso na presente invenção podem ser identificadas por comparação de regiões alvos determinadas de seu genoma com essas mesmas regiões das espécies identificadas no presente documento, as espécies preferidas são as que exibem identidade ou pelo menos um nível muito elevado de homologia com as espécies identificadas no presente documento. Por exemplo, a identificação de uma determinada espécie ou cepa Chlorella pode ser alcançada através de amplificação e sequenciação de DNA do cloroplasto e/ou nuclear, utilizando iniciadores e metodologias que utilizam as regiões adequadas do genoma, por exemplo, utilizando os métodos descritos em Wu et al., Bot. Bull. Acad. Sin. 42:115-121 (2001), Identificação de isolados de Chlorella spp. usando sequências de DNA de ribossoma. Métodos bem estabelecidos da análise filogenética, tais como a amplificação e sequenciação do espaçador interno transcrito ribossomal (ITS1 e ITS2 rDNA), RNA 23S, 18S rRNA e de outras regiões genômicas conservadas podem ser utilizadas por aqueles versados na técnica de identificar as espécies não só de Chlorella, mas outros microalgas que produzem óleos e lipídios adequados para uso nos métodos aqui descritos. Para exemplos de métodos de identificação e de classificação das algas ver Genetics, 170(4):1601-10 (2005) e RNA, 11(4):361-4 (2005).
Assim, a comparação de DNA genômico pode ser utilizada para identificar as espécies adequadas de microalgas a serem usadas na presente invenção. As regiões de DNA genômico conservadas, como e não limitadas a codificação de DNA para 23 S rRNA, podem ser amplificadas a partir de espécies de microalgas que podem ser, por exemplo, taxonomicamente relacionadas com a microalga preferida utilizada na presente invenção e em comparação com as regiões correspondentes daquelas espécies preferidas. As espécies que exibem um elevado nível de similaridade são então selecionadas para uso nos métodos da invenção. Exemplos ilustrativos de tal comparação da sequência de DNA entre as espécies dentro do gênero Chlorella são apresentados a seguir. Em alguns casos, as microalgas que são preferidas para uso na presente invenção têm sequências de DNA genômico que codificam 23S rRNA, que têm pelo menos 65% de identidade de nucleotídeos com pelo menos uma das sequências listadas nas SEQ ID NO: 1-23 e 26-27. Em outros casos, as microalgas que são preferidas para uso na presente invenção têm sequências de DNA genômico que codificam 23 S rRNA, que têm, pelo menos 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de nucleotídeos com pelo menos uma ou mais das sequências referidas nas SEQ ID NOs: 1-23 e 26-27. A genotipagem de uma composição alimentícia e/ou de biomassa de algas antes de ser combinada com outros ingredientes para a formulação de uma composição alimentícia é também um método confiável para determinar se a biomassa de algas é de mais do que de uma única cepa de microalgas.
Por comparação da sequência para determinar a porcentagem de identidade de nucleotídeos ou aminoácidos, tipicamente uma sequência atua como sequência de referência, em que as sequências de teste são comparadas. Na aplicação de um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são introduzidas em um computador, são designadas as coordenadas de subsequência, se necessário, e os parâmetros do programa de algoritmo de sequência são designados. O algoritmo de comparação de sequências calcula então a porcentagem de identidade de sequência para a(s) sequência de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados. O alinhamento de sequências ótimo para comparação pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman &
Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de pesquisa de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no pacote de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção visual (ver geralmente Ausubel et al., supra). Outro exemplo o algoritmo que é adequado para determinar a porcentagem de identidade de sequência e de similaridade de sequência é o algoritmo BLAST, que está descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). O software para realização de análises BLAST está publicamente disponível através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (no www.ncbi.nlm.nih.gov endereço web).
Além de Chlor ella, outros gêneros de microalgas podem também ser utilizados nos métodos da presente invenção. Em modalidades preferidas, a microalga é uma espécie selecionada a partir do grupo que consiste em Parachlorella kessleri, Parachlorella beijerinckii, Neochloris oleabundans, Bracteacoccus, incluindo B. grandis, B. cinnabarinas, e B. aerius, Bracteococcus sp. ou Scenedesmus rebescens. Outros exemplos não limitativos de espécies de microalgas incluem aquelas espécies do grupo de espécies e gêneros consistindo em Achnanthes orientalis; Agmenellum; Amphiprora hyaline; Amphora, including A. coffeiformis incluindo A. c. linea,
A. c. punctata, A.c. taylori, A.c. tenuis, A.c. delicatissima, A.c. delicatissima capitata; Anabaena; Ankistrodesmus, incluindo A. falcatus; Boekelovia hooglandii; Borodinella; Botryococcus braunii, incluindo B. sudeticus; Bracteoccocus, incluindo B. aerius, B.grandis, B.cinnabarinas, B.minor, and
B. medionucleatus; Carteria; Chaetoceros, incluindo C. gracilis, C. muelleri, and C. muelleri subsalsum; Chlorococcum, incluindo C. infusionum; Chlorogonium; Chroomonas; Chrysosphaera; Cricosphaera; Crypthecodinium cohnii; Cryptomonas; Cyclotella, incluindo C. cryptica and
C. meneghiniana; Dunaliella, incluindo D. bardawil, D. bioculata, D. granulate, D. maritime, D. minuta, D. parva, D. peircei, D. primolecta, D. salina, D. terricola, D. tertiolecta, and D. viridis; Eremosphaera, incluindo E. viridis; Ellipsoidon; Euglena; Franceia; Fragilaria, incluindo F. crotonensis; Gleocapsa; Gloeothamnion; Hymenomonas; Isochrysis, incluindo I. off. galbana and I. galbana; Lepocinclis; Micractinium (inckiindo UTEX LB 2614); Monoraphidium, incluindo M. minutum; Monoraphidium; Nannochloris; Nannochloropsis, incluindo N. salina; Navicula, incluindo N acceptata, N. biskanterae, N. pseudotenelloides, N. pelliculosa, and N. saprophila; Neochloris oleabundans; Nephrochloris; Nephroselmis; Nitschia communis; Nitzschia, incluindo N. alexandrina, N. communis, N. dissipata, N. frustulum, N. hantzschiana, N. inconspicua, N. intermedia, N. microcephala, N. pusilia, N. pusilia elliptica, N. pusilia monoensis, and N. quadrangular; Ochromonas; Oocystis, incluindo O. parva and O. pusilia; Oscillatoria, incluindo O. limnetica and O. subbrevis; ParaChlorella, incluindo P. beijerinckii (incluindo cepa SAG 2046) and P. kessleri (incluindo any of SAG strains 11.80, 14.82, 21.11H9); Pascheria, incluindo P. acidophila; Pavlova; Phagus; Phormidium; Platymonas; Pleurochrysis, incluindo P. carterae and P. dentate; Prototheca, incluindo P. stagnora (incluindo UTEX 327), P. portoricensis, and P. moriformis (incluindo UTEX strains 1441,1435, 1436, 1437, 1439); PseudoChlorella aquatica; Pyramimonas; Pyrobotrys; Rhodococcus opacus; Sarcinoid chrysophyte; Scenedesmus, incluindo S. armatus and S. rubescens; Schizochytrium; Spirogyra; Spirulina platensis; Stichococcus; Synechococcus; Tetraedron; Tetraselmis, incluindo T. suecica; Thalassiosira weissflogii; and Viridiella fridericiana.
Todos os processos de fermentação são sujeitos à contaminação por outros microrganismos. A biomassa e a farinha de algas da presente invenção são crescidas e processadas em condições para minimizar a contaminação. No entanto, a contaminação não pode ser totalmente evitada. A contaminação pode ocorrer durante todas as fases de operação, incluindo durante o cultivo e propagação, a colheita das microalgas, a preparação da farinha de algas e durante o transporte e armazenamento da farinha de algas e biomassa de algas. As espécies microbianas contaminantes podem ou não ser identificadas.
A biomassa de algas e farinha de algas podem compreender microrganismos contaminantes de valor menor ou igual a 10.000 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, menor ou igual a 7.500 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, menor ou igual a 5.000 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas ou a menos do que ou igual a 2.500 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas.
A biomassa de algas e farinha de algas podem compreender microrganismos contaminantes, onde o micróbio contaminante é selecionado a partir do grupo consistindo em levedura contaminante com valor menor ou igual a 200 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, menor ou igual a 150 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, menor ou igual a 100 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, ou menor ou igual a 50 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas. A biomassa de algas e farinha de algas podem compreender microrganismos contaminantes, onde o micróbio contaminante é selecionado a partir do grupo consistindo em contaminação do mofo por um valor menor ou igual a 200 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, menor ou igual a 150 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, menor ou igual a 100 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, menor ou igual a 50 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas. A biomassa de algas e farinha de algas podem compreender microrganismos contaminantes, onde o micróbio contaminante é selecionado a partir do grupo consistindo em contaminação de bactérias coliformes de valor menor ou igual a 10 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, contaminação de bactérias coliform.es de menor ou igual a 8 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, contaminação de bactérias coliformes de valor menor ou igual a 5 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas. A biomassa de algas e farinha de algas podem compreender microrganismos contaminantes, onde o micróbio contaminante é selecionado a partir do grupo consistindo em contaminação de Escherichia coli de valor menor ou igual a 10 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, menor ou igual a 8 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, menor ou igual a 6 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, menor ou igual a 4 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas. A biomassa de algas e farinha de algas podem compreender microrganismos contaminantes, onde o micróbio contaminante é selecionado a partir do grupo consistindo em contaminação de Staphylococci de menor ou igual a 20 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, menor ou igual a 15 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, menor ou igual a 10 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas ou menor ou igual a 5 CFU por grama de biomassa de algas ou farinha de algas. A biomassa de algas e farinha de algas podem compreender microrganismos contaminantes, em que a contaminação de Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, ou Listeria é indetectável em 50 gramas de biomassa de algas ou farinha de algas, indetectável em 25 gramas de biomassa de algas ou farinha de algas, indetectável em 20 gramas de algas biomassa ou a farinha de algas, indetectável em 15 gramas de biomassa de algas ou farinha de algas, indetectável em 10 gramas de biomassa de algas e de farinha de algas.
A quantidade de micróbios contaminantes pode ser medida por testes conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, a contagem de placa aeróbica total, de contaminação de coliformes e E. coli, Salmonella, e Listeria pode ser determinada por AOAC 966.23, 966.24, 2004.03 e 999.06, respectivamente. A contaminação de Levedura e de mofo pode ser medida por métodos descritos em FDA-BAM, 7a edição, e os Staphylococci e Pseudomonas aeruginosa por USP31, NF26, 2008, e semelhantes.
Em algumas modalidades, as composições alimentícias e os ingredientes alimentícios, tais como a farinha de algas ou biomassa de algas são derivadas a partir de algas com pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência de rRNA 23S genômico de uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27.
B. Métodos de Geração uma Cepa de Microalgas sem Pigmentação ou que Reduziu Significativamente a Pigmentação
As microalgas como Chlorella podem ser capazes de crescimento tanto fotossintético quanto heterotrófico. Quando crescidas em condições heterotróficas onde a fonte de carbono é uma fonte de carbono fixo, e na ausência de luz, as microalgas normalmente de cor verde têm uma cor amarela, sem pigmentação ou é significativamente reduzida na pigmentação verde. Microalgas de pigmentação verde reduzida (ou sem pigmentação verde) podem ser vantajosas como um ingrediente alimentício. Uma vantagem de microalgas de pigmentação verde reduzida (ou sem pigmentação verde) é que a microalga tem um sabor de clorofila reduzida. Outra vantagem de microalgas de pigmentação verde reduzida (ou sem pigmentação verde) é que, como um ingrediente alimentício, a adição de microalgas para gêneros alimentícios não irá dar uma cor verde que pode ser desagradável para o consumidor. A pigmentação verde reduzida de microalgas crescidas em condições heterotróficas é transitória. Quando retoma para o crescimento fototrófico, as microalgas capazes de crescimento tanto fototrófico quanto heterotrófíco vai recuperar a pigmentação verde. Além disso, mesmo com pigmentos verdes reduzidos, as microalgas cultivadas heterotroficamente têm uma cor amarela e isto pode não ser adequado para algumas aplicações alimentícias em que o consumidor espera que a cor do produto alimentício seja branca ou de cor clara. Assim, é vantajoso gerar uma cepa de microalgas que seja capaz de um crescimento heterotrófíco (de modo que tenha reduzida pigmentação verde ou sem pigmentação verde) e também pigmentação amarela reduzida (de modo que tenha uma cor neutra para aplicações em alimentos).
Um método para a geração de cepas de microalgas, sem pigmentação ou com pigmentação significativamente reduzida é através de mutagênese e então rastreio para o fenótipo desejado. Vários métodos de mutagênese são conhecidos e praticados na técnica. Por exemplo, Urano et al., (Urano et al., J Bioscience Bioengineering (2000) v. 90(5): pp. 567-569) descreve mutantes de cor amarela e branca de Chlorella ellipsoidea gerados utilizando irradiação UV. Kamiya (Kamiya, Plant Cell Physiol. (1989) v. 30(4): 513-521) descreve uma cepa incolor de Chlorella vulgaris, llh (M125).
Além de mutagênese por irradiação UV, a mutagênese química pode também ser empregada de forma a gerar microalgas com pigmentação reduzida (ou sem pigmentação). Mutagenes químicos, tais como metanossulfonato de etila (EMS), ou N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG) têm-se mostrado eficazes mutagenes químicos em uma variedade de micróbios, incluindo leveduras, fungos, micobactérias e microalgas. A mutagênese pode também ser realizada em várias fases, em que a microalga é exposta ao agente mutagênico (seja UV ou química ou ambas) e depois rastreada para o fenótipo de reduzida pigmentação desejado. As colônias com o fenótipo desejado são então semeadas em placas e isoladas novamente para garantir que a mutação é estável a partir de uma geração para a seguinte e que a colônia é pura e não de uma população mista.
Em um exemplo particular, Chlorella protothecoides foi usada 5 para gerar cepas sem ou com pigmentação reduzida usando uma combinação de mutagênese UV e química. Chlorella protothecoides foi exposta a um ciclo de mutagênese química com NTG e as colônias foram rastreadas para os mutantes de cor. As colônias que não apresentam mutações de cor foram depois submetidas a um ciclo de radiação UV e foram novamente testadas 10 para mutantes de cor. Em uma modalidade, uma linhagem celular de Chlorella protothecoides sem pigmentação foi isolada e é Chlorella > protothecoides 33-55, depositada em 13 de Outubro de 2009 na American Type Culture Collection em 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em conformidade com o Tratado de Budapeste, com uma 15 denominação de depósito de patente de PTA-10397. Em uma outra modalidade, uma cepa de Chlorella protothecoides com pigmentação reduzida foi isolada e é Chlorella protothecoides 25-32, depositada em 13 de Outubro de 2009 na American Type Culture Collection em 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em conformidade com o Tratado de 20 Budapeste, com uma denominação depósito de patente de PTA-10396.
C. Condições de Cultivo e Meio para Microalgas
As microalgas são cultivadas em meios líquidos para propagar a biomassa de acordo com os métodos da presente invenção. Nos métodos da invenção, as espécies de microalgas são cultivadas em um meio contendo um 25 carbono fixo e/ou fonte de nitrogênio fixo, na ausência de luz. Esse crescimento é conhecido como crescimento heterotrófico. Para algumas espécies de microalgas, por exemplo, o crescimento heterotrófico por longos períodos de tempo, tais como 10 a 15 ou mais dias, em condições limitadas de nitrogênio resulta na acumulação de elevado teor de lipídios nas células.
Os meios de cultura contêm tipicamente componentes de microalgas, tais como uma fonte de carbono fixo (discutido abaixo), uma fonte de nitrogênio fixo (tal como uma proteína, farinha de soja, extrato de levedura, licor de amido de milho, amônia, (pura ou na forma de sal), nitrato, ou sal de nitrato), elementos traços (por exemplo, zinco, boro, cobre, cobalto, manganês, molibdênio e, por exemplo, nas respectivas formas de ZnCl2, H3BO3, CoC12-6H2O, CuC12-2H2O, MnCl2-4H2O e (NH4)6Mo7O24-4H2O), opcionalmente, um tampão para a manutenção do pH, e fosfato (de uma fonte de fósforo; outros sais de fosfato podem ser utilizados). Outros componentes incluem sais, tais como cloreto de sódio, particularmente, para microalgas marinhas.
Em um exemplo particular, um meio adequado para a cultura de Chlorella protothecoides compreende meio de proteose. Este meio é adequado para culturas axênicas, e um volume de 1 L de meio de cultura (pH ~ 6,8) pode ser preparado por adição de 1 g de peptona proteose para 1 litro de meio de Bristol. O meio de Bristol compreende 2,94 mM NaNO3, 0,17 mM CaCl2-2H2O, 0,3 mM MgSO4-7H2O, 0,43 mM, 1,29 mM KH2PO4, e 1,43 mM NaCl em solução aquosa. Por meio de agar a 1,5%, 15 g de agar podem ser adicionados a 1 L de solução. A solução é coberta e autoclavada e, em seguida, armazenada a uma temperatura de refrigeração antes do uso. Outros métodos para o crescimento e propagação de Chlorella protothecoides a níveis elevados de óleo como uma porcentagem de peso seco foram descritos (ver, por exemplo, Miao and Wu, J Biotechnology, 2004, 11:85-93 and Miao and Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846 (demonstrando métodos de fermentação para a obtenção de óleo de 55% de peso seco de células)). Algas ricas em óleo podem geralmente ser geradas através do aumento do comprimento de uma fermentação, fornecendo um excesso de fonte de carbono sob limitação de nitrogênio.
Meios de crescimento sólido e líquido estão geralmente disponíveis a partir de uma ampla variedade de fontes, e as instruções para a preparação do meio particular que é adequado para uma ampla variedade de cepas de microrganismos podem ser encontradas, por exemplo, online em http://www.utex.org/, um site mantido pela Universidade do Texas em Austin 5 para sua coleção de culturas de algas (UTEX). Por exemplo, os vários meios de água doce incluem 1/2, 1/3, 1/5, IX, 2/3, 2X Meio CHEV Diatom, 1:1 DYIII/PEA + Gr +; Meio Ag Diatom; Meio Allen; Meio BG11-1; Meio Bold 1NV e 3N; Meio Botryococcus; Meio de Bristol; Meio de Chu; Meio CRI, CR1-S, e CR1+ Diatom; Meio Cyanidium; Meio Cyanophycean; Meio 10 Desmid; Meio DYIII; Meio Euglena; Meio HEPES; Meio J; Meio Malt; Meio MES; Meio Bold 3N Modificado; Meio COMBO Modificado; Meio N/20; Meio Ochromonas; Meio P49; Meio de Polytomella; Meio de Proteose; Meio Snow Algae; Meio de extrato de solo; Agua do solo: Meio BAR, GR-, GRZNH4, GR+, GR+/NH4, PEA, Peat, e Meio VT; Meio Spirulina; Meio Tap; 15 Meio Trebouxia; Meio Volvocacean; Meio Volvocacean-3N; Meio Volvox;
Meio Volvox-Dextrose; Meio Waris; e Meio Waris+Extrato de solo. Vários Meios de Água Salgada incluem: Meio 1%, 5% e IX F/2; Meio de Erdschreiber; 1/2, IX e 2X; Meio de Solo + Água do mar */>, 1/3, %, 1/5, IX e 2X; 1/4 ERD; Meio de Água Salgada Enriquecido 2/3; 20% Allen + 80 % 20 ERD; Meio Artificial de Água Salgada; Meio BG11-1 + 0,36% NaCl; Meio BG11-1 + 1% NaCl; Meio Bold lNV:Erdshreiber (1:1) e (4:1); Bristol-NaCl; Meio Dasycladales de Água Salgada; Meio de Água Salgada Enriquecido 1/2 e IX, incluindo Meio ES/10, ES/2, e ES/4; F/2+NH4; LDM; CHEV Modificado IX and 2X; CHEV Modificado 2X + Solo; Meio de Água 25 Salgada Artificial Modificado; Meio de Porfrídio; e Meio Diatom SS.
Outros meios adequados para uso com os métodos da presente invenção podem ser facilmente identificados através do URL acima identificado, ou consultando outras organizações que mantêm culturas de microrganismos, tais como SAG, CCAP, ou CCALA. SAG refere-se à
Coleção de Culturas de Algas na Universidade de Gottingen (Gottingen, Alemanha), CCAP refere-se à coleção de culturas de algas e protozoários gerida pela Associação Escocesa de Ciência Marinha (Escócia, Reino Unido), e CCALA refere-se à coleção de culturas de laboratório de algas no Instituto de Botânica (Trebon, República Checa).
Os microrganismos úteis de acordo com os métodos da presente invenção são encontrados em vários locais e ambientes em todo o mundo. Como consequência do seu isolamento a partir de outras espécies e da sua divergência evolutiva resultante, o meio de crescimento particular para o crescimento ótimo e geração de óleo e/ou lipídios e/ou proteína de uma espécie particular de micróbios pode ser difícil ou impossível de prever, mas aqueles versados na técnica podem facilmente encontrar meios adequados por meio de testes de rotina, tendo em conta a descrição. Em alguns casos, algumas cepas de microrganismos podem ser incapazes de crescer em meio de crescimento, em particular, devido à presença de um componente de inibição ou ausência de alguma exigência nutricional essencial exigida pela cepa particular de microrganismo. Os exemplos abaixo fornecem exemplos de métodos de cultura de várias espécies de microalgas para acumular níveis altos de lipídios, como uma porcentagem do peso seco de células.
A fonte de carbono fixa é um componente chave do meio. As fontes de carbono fixo adequadas para fins da presente invenção incluem, por exemplo, glicose, frutose, sacarose, galactose, xilose, manose, ramnose, arabinose, N-acetilglucosamina, glicerol, floridosida, ácido glucurônico e/ou acetato. Outras fontes de carbono para a cultura de microalgas, de acordo com a presente invenção incluem misturas, tais como misturas de glicose e glicerol, misturas de glicose e xilose, misturas de frutose e glicose, e as misturas de sacarose e de polpa de beterraba de açúcar despolimerizado. Outras fontes de carbono adequadas para uso na cultura de microalgas incluem licor negro, amido de milho, material celulósico despolimerizado (derivado de, por exemplo, palha de milho, polpa de beterraba de açúcar, e grama de ponta, por exemplo), lactose, soro de leite, melaço, batata, arroz, sorgo, sacarose, beterraba de açúcar, cana-de-açúcar e trigo. A uma ou mais fonte(s) de carbono pode ser fornecida a uma concentração de pelo menos cerca de 50 μ M, pelo menos cerca de 100 μ M, pelo menos cerca de 500 μ M, pelo menos cerca de 5 mM, pelo menos cerca de 50 mM, e pelo menos cerca de 500 mM.
Assim, em várias modalidades, a fonte de energia de carbono fixo utilizada no meio de crescimento compreende de glicerol e/ou açúcares de 5- e/ou 6- carbonos, tais como a glicose, frutose, e/ou xilose, que podem ser derivadas de sacarose e/ou de material celulósico, incluindo material celulósico despolimerizado. Múltiplas espécies de Chlorella e múltiplas cepas dentro de uma espécie podem ser crescidas na presença de sacarose, material celulósico despolimerizado, e glicerol, como descrito na Publicação de Pedido de Patente US 20090035842, 20090011480, 20090148918, respectivamente, e ver também, o publicação de Pedido de Patente PCT 2008/151149, cada um dos quais sendo aqui incorporado por referência.
Assim, em uma modalidade da presente invenção, os microrganismos são cultivados utilizando biomassa celulósica despolimerizada como carga de alimentação. Ao contrário de outras cargas de alimentação, tais como amido de milho ou sacarose da cana de açúcar ou beterraba de açúcar, a biomassa celulósica (despolimerizada ou de outra forma), não é adequada para o consumo humano e pode potencialmente estar disponível a um custo baixo, o que faz com que seja especialmente vantajoso para os fins da invenção. As microalgas podem se proliferar no material celulósico despolimerizado. Os materiais celulósicos incluem geralmente celulose de 40-60% em peso seco; hemicelulose de 20-40% em peso seco, e lignina de 10-30% em peso seco. Materiais celulósicos adequados incluem resíduos de culturas energéticas lenhosas e herbáceas, bem como de culturas agrícolas, ou seja, as partes de plantas, principalmente dos caules e folhas, não são removidas a partir dos campos com o alimento primário ou produto de fibra. Os exemplos incluem os resíduos agrícolas como o bagaço de cana, casca de arroz, fibra de milho (incluindo talos, folhas, cascas e espigas), palha de trigo, palha de arroz, polpa de beterraba de açúcar, polpa cítrica, cascas de frutas cítricas; resíduos florestais como desbastes de madeira dura e de madeira macia, e resíduos de madeira dura e de madeira macia de operações de madeira; resíduos de madeira, como resíduos de serração (lascas de madeira, serragem) e resíduos da pasta de papel; resíduos urbanos, tais como frações de papel de resíduos sólidos urbanos, resíduos de madeira urbana e resíduos verdes urbanos, como recortes de grama municipal; resíduos de construção de madeira. Celulósicos adicionais incluem culturas celulósicas dedicadas como a grama de ponta, madeira de choupo híbrido, madeira e miscanthus, fibra de cana, e fibra de sorgo. Os açúcares de cinco carbonos que são produzidos a partir de tais materiais incluem xilose. Chlorella protothecoides, por exemplo, pode ser cultivada com sucesso em condições heterotróficas utilizando açúcares celulósicos de palha de milho e polpa de beterraba de açúcar.
Alguns microrganismos são capazes de processar o material celulósico e diretamente utilizam materiais celulósicos como uma fonte de carbono. No entanto, o material celulósico, em geral, precisa ser tratado para aumentar a área de superfície acessível ou para a celulose ser primeiramente dividida como uma preparação para uso microbiano como fonte de carbono. As formas de preparar ou pré-tratar o material celulósico para a digestão enzimática são bem conhecidos na técnica. Os métodos são divididos em duas categorias principais: (1) quebra do material celulósico em partículas menores, a fim de aumentar a área de superfície acessível, e (2) tratamento químico do material celulósico para criar um substrato utilizável para a digestão enzimática.
Os métodos para aumentar a área de superfície acessível incluem explosão de vapor, o que envolve o uso de vapor a alta temperatura para separar os materiais celulósicos. Devido à exigência de alta temperatura do processo, alguns dos açúcares do material celulósico podem ser perdidos, reduzindo assim a fonte de carbono disponível para a digestão enzimática (ver por exemplo, Chahal, D.S. et al., Proceedings of the 2 World Congress of Chemical Engineering; (1981) e Kaar et al., Biomass and Bioenergy (1998) 14(3): 277-87). A explosão de amoníaco permite uma explosão de material celulósico com uma temperatura inferior, mas é mais dispendioso de realizar, e a amônia pode interferir com os processos subsequentes de digestão enzimática (ver, por exemplo, Dale, B.E. et al., Biotechnology and Bioengineering (1982); 12: 31-43).. Outra técnica de explosão envolve o uso de explosão de dióxido de carbono supercrítico de, a fim de quebrar o material celulósico em fragmentos menores (ver, por exemplo, Zheng et al., Biotechnology Letters (1995); 17(8): 845-850).
Os métodos para tratar quimicamente o material celulósico para criar substratos utilizáveis para a digestão enzimática são também conhecidos na técnica. A Patente US 7.413.882 descreve o uso de microrganismos geneticamente modificados que secretam betaglucosidase no caldo de fermentação e tratamento do material celulósico para o caldo de fermentação para intensificar a hidrólise de material celulósico, em glicose. O material celulósico também pode ser tratado com ácidos e bases fortes para ajudar a digestão enzimática subsequente. A Patente US 3.617.431 descreve o uso de digestão alcalina, para decompor materiais celulósicos.
A Chlorella pode se proliferar em meio contendo combinações de xilose e glicose, como material celulósico despolimerizado e, surpreendentemente, algumas espécies ainda exibem níveis mais elevados de produtividade quando cultivadas em uma combinação de glicose e xilose que, quando cultivadas em glicose ou xilose individualmente. Assim, determinadas microalgas podem tanto utilizar uma carga de alimentação não comestível de outra forma, tal como material celulósico, (ou um material celulósico prétratado) ou glicerol como fonte de carbono e produzir óleos comestíveis. Isto permite a conversão da celulose e glicerol não comestíveis, que não são normalmente parte da cadeia alimentar humana (em oposição a glicose de milho e sacarose de cana-de-açúcar e beterraba de açúcar) em óleos comestíveis altamente nutritivos, que podem fornecer nutrientes e calorias, como parte da dieta humana diária. Assim, a invenção fornece métodos para transformar carga de alimentação não comestível em óleos de elevada nutrição, produtos alimentícios comestíveis, e composições alimentícias.
As microalgas cocultivadas com um organismo que expressa uma invertase sacarose secretável ou cultivadas em meio contendo uma invertase sacarose ou expressando um gene exógeno de invertase sacarose (onde a invertase ou é secretada ou o organismo também expressa um transportador de sacarose) podem se proliferar em resíduos de melaço de cana-de-açúcar ou de outras fontes de sacarose. O uso de um desses produtos de resíduos contendo sacarose de valor baixo pode fornecer economias de custo significativas na produção de óleos comestíveis. Assim, os métodos de cultivo de microalgas em uma carga de alimentação de sacarose e formulação de composições alimentícias e suplementos nutricionais como aqui descritos, fornece um meio para converter a sacarose de baixa nutrição em óleos de nutrição elevada (ácido oleico, DHA, ARA, etc) e biomassa contendo tais óleos.
Como detalhado nas publicações de patentes acima referidas, várias espécies e cepas distintas de Chlorella se proliferam muito bem não só em glicerol de grau reagente purificado, mas também em subprodutos de glicerol acidulados e não acidulados de transesterificação de biodiesel. Surpreendentemente, algumas cepas Chlorella sofrem divisão celular mais rápido na presença de glicerol do que na presença de glicose. Processos de duas fases de crescimento, em que as células são primeiramente alimentadas com glicerol para aumentar a densidade de células e, em seguida, rapidamente alimentadas com glicose para acumular lipídios, pode melhorar a eficiência com a qual os lipídios são produzidos.
Outro método para aumentar os lipídios, como uma porcentagem do peso seco da célula envolve o uso de acetato como carga de alimentação para as microalgas. O acetato alimenta diretamente no ponto do metabolismo que inicia a síntese de ácidos graxos (isto é, acetil-CoA); fornecendo-se assim o acetato na cultura pode-se aumentar a produção de ácido graxo. Geralmente, o micróbio é cultivado na presença de uma quantidade suficiente de acetato para aumentar o rendimento de ácido graxo e/ou lipídio microbiano, mais especificamente, em relação ao rendimento na ausência de acetato. A alimentação com acetato é um componente útil dos métodos aqui fornecidos para a geração de biomassa de microalgas que tenha uma elevada porcentagem de peso seco de células como lipídios.
Em outra modalidade, o rendimento de lipídios é aumentado por cultura de uma microalga produtora de lipídio na presença de um ou mais cofatores para uma enzima via lipídios (por exemplo, uma enzima de síntese de ácidos graxos). Geralmente, a concentração de cofatores é suficiente para aumentar o rendimento de lipídios microbianos (por exemplo, ácido graxo) sobre o rendimento de lipídios microbianos na ausência de cofatores. Em modalidades particulares, o(s) cofator(es) é(são) fomecido(s) à cultura, incluindo a cultura de um microrganismo que secretar o(s) cofator(es) ou por adição de cofator(es) ao meio de cultura. Altemativamente, as microalgas podem ser manipuladas para expressar um gene exógeno que codifica uma proteína que participa na síntese do cofator. Em certas modalidades, cofatores apropriados incluem qualquer vitamina exigida por uma enzima via lipídios, tais como, por exemplo, biotina ou pantotenato.
A biomassa rica em lipídios a partir de microalgas é um material vantajoso para inclusão em produtos alimentícios de biomassa em comparação com a biomassa pobre em lipídios, uma vez que permite a adição de menos biomassa de microalgas para incorporar a mesma quantidade de lipídio em uma composição alimentícia. Isto é vantajoso, pois os óleos saudáveis de microalgas ricas em lipídios podem ser adicionados a produtos alimentícios, sem alterar outros atributos, tais como a textura e sabor em comparação com a biomassa pobre em lipídios. A biomassa rica em lipídios fornecida pelos métodos da presente invenção tem tipicamente pelo menos 25% de lipídios por peso seco de células. As condições de processo podem ser ajustadas para aumentar o peso percentual de células que é de lipídio. Por exemplo, em certas modalidades, uma microalga é cultivada na presença de uma concentração limite de um ou mais nutrientes, tais como, por exemplo, nitrogênio, fósforo ou enxofre, ao fornecer um excesso de uma fonte de carbono fixo, tal como a glicose. A limitação de nitrogênio tende a aumentar a produção de lipídios microbianos sobre rendimento de lipídios microbianos em uma cultura na qual o nitrogênio é fornecido em excesso. Em modalidades particulares, o aumento do rendimento de lipídio é de pelo menos cerca de 10%, 50%, 100%, 200%, ou 500%. O micróbio pode ser cultivado na presença de uma quantidade limitante de um nutriente para uma porção do período de cultura total, ou para a totalidade do período. Em algumas modalidades, a concentração de nutrientes é ciclada entre uma concentração limitativa e uma concentração não limitativa em pelo menos duas vezes durante o período de cultura total.
Em um estado de crescimento constante, as células acumulam óleo, mas não sofrem divisão celular. Em uma modalidade da invenção, o estado de crescimento é mantido, continuando a fornecer todos os componentes dos meios de crescimento originais para as células com a exceção de uma fonte de nitrogênio fixo. O cultivo de células de microalgas, alimentando todos os nutrientes originalmente fornecidos para as células, exceto uma fonte de nitrogênio fixo, como por exemplo, através da alimentação das células por um período prolongado de tempo, resulta em uma porcentagem mais elevada de lipídios por peso seco de células.
Em outras modalidades, a biomassa rica em lipídios é gerada pela alimentação de uma fonte de carbono fixo para as células depois de todo o nitrogênio fixo ter sido consumido por períodos de tempo prolongados, tais como, pelo menos uma ou duas semanas. Em algumas modalidades, as células são permitidas acumular óleo na presença de uma fonte de carbono fixo, e na ausência de uma fonte de nitrogênio fixo por mais de 20 dias. As microalgas crescidas utilizando as condições aqui descritas ou, de outro modo, conhecidas na técnica podem compreender pelo menos cerca de lipídios a 20% em peso seco e, frequentemente, compreendem 35%, 45%, 55%, 65%, e mesmo 75% ou mais por peso seco de lipídios. A porcentagem de peso seco de células de lipídios na produção de lipídios microbianos pode, portanto, ser melhorada, mantendo as células em um estado de crescimento heterotrófico em que consomem carbono e acumulam-se o óleo, mas não sofrem divisão celular.
A biomassa rica em proteína a partir de algas é outro material vantajoso para inclusão em produtos alimentícios. Os métodos da invenção também podem fornecer biomassa que tem pelo menos 30% do seu peso seco de células como proteínas. Condições de crescimento podem ser ajustadas para aumentar o peso percentual de células que é de proteína. Em uma modalidade preferida, uma microalga é cultivada em um ambiente rico em nitrogênio e um excesso de energia de carbono fixo, tal como glicose ou qualquer uma das outras fontes de carbono acima referidas. As condições em que o nitrogênio está em excesso tendem a aumentar o rendimento da proteína microbiana durante o rendimento de proteína microbiana em uma cultura em que o nitrogênio não é fornecido em excesso. Para a produção de proteína máxima, o micróbio é preferencialmente cultivado na presença de excesso de nitrogênio durante o período de cultura total. Fontes de nitrogênio adequadas para as microalgas podem ser provenientes de fontes de nitrogênio orgânico e/ou fontes de nitrogênio inorgânico. O teor de lipídios da biomassa rica em proteínas é menos de 30%, menos de 20% ou menos de 10% em peso de lipídios.
As fontes de nitrogênio orgânico têm sido utilizadas em culturas microbianas desde 1900. O uso de fontes de nitrogênio orgânico, tal como licor de milhocina foi popularizado com a produção de penicilina a partir do mofo. Os pesquisadores verificaram que a inclusão de licor de milhocina no meio de cultura aumentou o crescimento do microrganismo e resultou em um maior rendimento de produtos (tais como penicilina). Uma análise de licor de milhocina determinou que se tratava de uma fonte rica de nitrogênio e também vitaminas como as vitaminas do complexo B, ácido pantotênico riboflavina, niacina, inositol e minerais nutrientes, como cálcio, ferro, magnésio, fósforo e potássio (Ligget and Koffler, Bacteriological Reviews (1948); 12(4): 297-311). As fontes de nitrogênio orgânico, tal como licor de milhocina, têm sido utilizadas em meios de fermentação por leveduras, bactérias, fungos e outros microrganismos. Exemplos não limitantes de fontes orgânicas de nitrogênio são extrato de levedura, peptona, licor de milhocina e pó de milhocina. Exemplos não limitativos preferidos de fontes de nitrogênio inorgânico incluem, por exemplo, e sem limitação, (NH4)2SO4 e NH4OH. Em uma modalidade, os meios de cultura para a realização da invenção contêm apenas fontes de nitrogênio inorgânico. Em outra modalidade, os meios de cultura para a realização da invenção contêm apenas fontes de nitrogênio orgânico. Em ainda outra modalidade, os meios de cultura para a realização da invenção contêm uma mistura de fontes de nitrogênio orgânico e inorgânico.
Nos métodos da presente invenção, um biorreator ou fermentador é usado para cultura de células de microalgas, através das diversas fases do seu ciclo fisiológico. Como um exemplo, um inóculo de células de microalgas produtoras de lipídio é introduzido no meio, há um período de retardo (fase de retardo), antes das células começarem a se propagar. Após o período de retardo, a taxa de propagação aumenta de forma constante e entra na fase de log, ou exponencial. A fase exponencial é, por sua vez, seguida de uma redução da propagação devido à diminuição em nutrientes como o nitrogênio, aumentos de substâncias tóxicas, e mecanismos de detecção de quórum. Depois desta diminuição, a propagação para, e as células entram em uma fase estacionária ou em um estado de crescimento constante, dependendo do ambiente particular fornecido às células. Para a obtenção de biomassa rica em proteína, a cultura é geralmente colhida durante ou logo após o final depois da fase exponencial. Para a obtenção de biomassa rica lipídios, a cultura é colhida geralmente bem depois do final da fase exponencial, a qual pode ser terminada cedo permitindo que o nitrogênio ou outro nutriente chave (diferente de carbono) se esgote, forçando as células a converter as fontes de carbono, presentes em excesso, para lipídio. Os parâmetros de condições de cultura podem ser manipulados para otimizar a produção total de óleo, a combinação de espécies de lipídios produzidas, e/ou a produção de um óleo específico.
Os biorreatores oferecem muitas vantagens para o uso em crescimento heterotrófico e métodos de propagação. Como será apreciado, as providências tomadas para tomar a luz disponível para as células em métodos de crescimento fotossintético são desnecessárias quando se utiliza uma fonte de carbono fixo no crescimento heterotrófico e os métodos de propagação aqui descritos. Para a produção de biomassa para uso em alimentos, as microalgas são preferencialmente fermentadas em grandes quantidades no líquido, tal como em culturas em suspensão, como um exemplo. Os biorreatores, como fermentadores de aço (5000 litros, 10.000 litros, 40.000 litros, e superiores são utilizados em várias modalidades da invenção) podem acomodar volumes de cultura muito grandes. Os biorreatores também * permitem tipicamente o controle das condições de cultura, tais como temperatura, pH, tensão de oxigênio, e os níveis de dióxido de carbono. Por exemplo, biorreatores são tipicamente configurados, por exemplo, usando as 5 portas fixas à tubulação, para permitir que os componentes gasosos, tais como oxigênio ou nitrogênio, borbulhem através de uma cultura líquida.
Os biorreatores podem ser configurados para fluir os meios de cultura através do biorreator durante todo o período de tempo durante o qual a microalga se reproduz e aumenta em número. Em algumas modalidades, por 10 exemplo, os meios podem ser infundidos no biorreator após a inoculação das células, mas antes de chegar a uma densidade desejada. Em outros casos, um biorreator é preenchido com meio de cultura, no início de uma cultura, e mais nenhum meio de cultura é infundido após a cultura ser inoculada. Em outras palavras, a biomassa de microalgas é cultivada em um meio aquoso por um 15 período de tempo durante o qual as microalgas se reproduzem e aumentam em número, no entanto, as quantidades de meio de cultura aquoso não são fluidas através do biorreator durante todo o período de tempo. Assim, em algumas modalidades, o meio de cultura aquoso não é fluido através do biorreator após a inoculação.
Os biorreatores equipados com dispositivos, tais como lâminas e rotores giratórios, mecanismos de balanço, barras de agitação, meios para a infusão de gás pressurizado podem ser utilizados para submeter às culturas de microalgas à mistura. A mistura pode ser contínua ou intermitente. Por exemplo, em algumas modalidades, um regime de fluxo turbulento de entrada 25 de gás e de entrada de meios não é mantido durante a reprodução de microalgas até um aumento desejado no número de referidas microalgas ter sido alcançado.
Como brevemente mencionado acima, os biorreatores são muitas vezes equipados com várias portas que, por exemplo, permitem que o conteúdo de gás da cultura de microalgas seja manipulado. Para ilustrar, parte do volume de um biorreator pode ser gás, em vez de líquido, e as entradas de gás do biorreator permitem o bombeamento de gases para o biorreator. Os gases que podem ser beneficamente bombeados para um biorreator de ar, incluem misturas ar/CO2, gases nobres, tais como de argônio, e outros gases. Os biorreatores são tipicamente equipados para permitir ao usuário o controle da velocidade de entrada de um gás para o biorreator. Como notado acima, o aumento de fluxo de gás para um biorreator pode ser usado para aumentar a mistura da cultura.
O aumento de fluxo de gás atinge a turvação da cultura também. A turbulência pode ser conseguida através da colocação de uma porta de entrada de gás abaixo do nível do meio de cultura aquoso, de modo que o gás que entra no biorreator borbulhe para a superfície da cultura. Uma ou mais portas de saída de gás permitem que o gás escape, evitando, assim, a acumulação de pressão no biorreator. Preferencialmente, um orifício de saída do gás leva a uma válvula de “uma via” que evita que os micróbios contaminantes entrem no biorreator.
Os exemplos específicos de biorreatores, condições de cultura e crescimento heterotrófico e métodos de propagação aqui descritos podem ser combinados de qualquer forma adequada para melhorar a eficiência do crescimento microbiano e lipídico e/ou a produção de proteína.
D. Concentração de Microalgas Após fermentação
As culturas de microalgas geradas de acordo com os métodos descritos acima produzem biomassa de microalgas nos meios de fermentação. Para preparar a biomassa para uso como uma composição alimentícia, a biomassa é concentrada, ou colhida, a partir do meio de fermentação. No ponto de colheita da biomassa de microalgas a partir do meio de fermentação, a biomassa compreende predominantemente células intactas em suspensão em um meio de cultura aquoso. Para concentrar a biomassa, uma etapa de desidratação é realizada. A desidratação ou concentração refere-se à separação da biomassa do caldo de fermentação ou de outro meio líquido e, assim, é a separação de sólido-líquido. Assim, durante a remoção de água, o meio de cultura é removido da biomassa (por exemplo, drenando o caldo de fermentação através de um filtro que retém a biomassa), ou a biomassa é, de outra forma, removida do meio de cultura. Processos comuns para a remoção de água incluem centrifugação, filtração, e o uso de pressão mecânica. Estes processos podem ser usados individualmente ou em qualquer combinação.
A centrifugação envolve o uso da força centrífuga para separar misturas. Durante a centrifugação, os componentes mais densos do mistura migram para longe do eixo de centrifugação, enquanto que os componentes menos densos da mistura migram na direção do eixo. Ao aumentar a força gravitacional eficaz (isto é, através do aumento da velocidade de centrifugação), o material mais denso, tal como sólidos, é separado do material menos denso, tal como líquidos, e assim separado de acordo com a densidade. A centrifugação da biomassa e caldo ou outra solução aquosa forma a uma pasta concentrada compreendendo as células de microalgas. A centrifugação não remove as quantidades significativas de água intracelular. De fato, depois da centrifugação, pode ainda haver uma quantidade substancial de superfície ou umidade livre na biomassa (por exemplo, para cima de 70%), de modo que a centrifugação não é considerada como sendo uma etapa de secagem.
A filtração pode também ser utilizada para a remoção de água. Um exemplo de filtração que é adequado para a presente invenção é o de filtração de fluxo tangencial (TFF), também conhecido como filtração de fluxo cruzado. A filtração de fluxo tangencial é uma técnica de separação que utiliza sistemas de membrana e força de fluxo para separar os sólidos dos líquidos. Para um método de filtração adequado ilustrativo, ver Geresh, Carb. Polym. 50; 183-189 (2002), que descreve o uso de um filtro de fibra oca de
0,45uM MaxCell A/G Technologies. Ver também, por exemplo, dispositivos de Millipore Pellicon®, usados com lOOkD, 300 kD, 1000 kD (número de catálogo P2C01MC01), membranas de 0,1 um (número de catálogo P2WPPV01), 0,22uM (número de catálogo P2GVPPV01), e 0,45uM (número de catálogo P2IJVMPV01). O retentado preferencialmente não passa através do filtro a um nível significativo, e o produto no retentado preferencialmente não adere ao material do filtro. TFF pode também ser realizada utilizando sistemas de filtração de fibras ocas. Os filtros com um tamanho de poro de pelo menos cerca de 0,1 micrômetro, por exemplo, cerca de 0,12, 0,14, 0,16, 0,18, 0,2, 0,22, 0,45, ou pelo menos cerca de 0,65 micrômetro, são adequados. Tamanhos de poros preferidos de TFF permitem que solutos e detritos no interior do caldo de fermentação fluam, mas não as células microbianas.
A remoção de água pode também ser efetuada com uma pressão mecânica aplicada diretamente para a biomassa para separar o caldo de fermentação líquido a partir da biomassa microbiana suficiente para desidratar a biomassa, mas não para provocar a lise de células predominante. A pressão mecânica para desidratar biomassa microbiana pode ser aplicada usando, por exemplo, uma correia de filtro prensa. Uma correia de filtro de prensa é um dispositivo de remoção de água que aplica uma pressão mecânica a uma pasta (por exemplo, biomassa microbiana tomada diretamente a partir do fermentador, ou biorreator) que passa entre as duas correias tensionadas por meio de uma serpentina com cilindros de diâmetro decrescente. A correia de prensa de filtro, na verdade, pode ser dividida em três zonas: a zona de gravidade, em que a água/líquido de drenagem livre é drenada por gravidade através de uma correia porosa, uma zona de cunha, em que os sólidos são preparados por aplicação de pressão, e uma zona de pressão, quando pressão ajustável é aplicada aos sólidos drenados por gravidade.
Após a concentração, a biomassa de microalgas pode ser processada, tal como descrito aqui a seguir, para a produção de bolo empacotado em alto vácuo, flocos de algas, homogeneizado de algas, algas em pó, farinha de algas, ou óleo de algas.
E. Composição Química de Biomassa de Microalgas
A biomassa de microalgas gerada pelos métodos de cultura aqui descritos compreende óleo de microalgas e/ou proteína, assim como outros constituintes gerados pelos microrganismos ou incorporados pelos microrganismos a partir do meio de cultura durante a fermentação.
A biomassa de microalgas, com uma porcentagem elevada de acumulação de óleo/lipídio em peso seco foi gerada usando os diferentes métodos de cultura, incluindo os métodos conhecidos na técnica. A biomassa de microalgas, com uma porcentagem mais elevada do óleo/lipídio acumulado é útil de acordo com a presente invenção. Culturas de Chlorella vulgaris com até 56,6% de lipídios em peso seco de células (DCW) em culturas cultivadas em condições autotróficas estacionárias que utilizam concentrações elevadas de ferro (Fe), foram descritas (Li et al., Bioresource Technology 99 (11):4717-22 (2008). Culturas de Nanochloropsis sp. e Chaetoceros calcitrans com 60% de lipídio em DCW e 39,8% de lipídio por DCW, respectivamente, crescidas em uma fotobiorreator em condições de jejum de nitrogênio também foram descritas (Rodolfi et al. Biotechnology & Bioengineering (2008)). Culturas de Parietochloris incise com aproximadamente 30% de lipídios por DCW quando crescidas fototropicamente em condições de baixo nitrogênio foram descritas (Solovchenko et al., Journal of Applied Phycology 20:245-251 (2008). Chlorella protothecoides pode produzir até 55% de lipídios por DCW, quando crescida em certas condições heterotróficas com privação de nitrogênio (Miao and Wu, Bioresource Technology 97:841-846 (2006)) Outras espécies de Chlorella, incluindo Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana e Chlorella minutissima foram descritas como tendo acumulado até 63 % de óleo de DCW quando crescidas em biorreatores de tanque agitado em condições de meio de baixo nitrogênio (Ulman et al., Enzyme and Technology Microbial 27:631-635 (2000). O percentual lipídico ainda maior por DCW foi relatado, incluindo 70% de lipídio, em culturas de Dumaliella tertiolecta cultivadas em condições de aumento de NaCl (Takagi et al., Journal ofBioscience and Bioengineering 101(3): 223-226 (2006)) e 75% de lipídios em culturas de Botryococcus braunii (Banerjee et al.. Criticai Reviews in Biotechnology 22(3): 245-279 (2002)).
O crescimento heterotrófico resulta no teor de clorofila relativamente baixo (em comparação com os sistemas fototróficos tais como lagoas abertas ou sistemas de fotobiorreatores fechados). Teor de clorofila reduzido geralmente melhora as propriedades organolépticas de microalgas e, portanto, permite que mais biomassa de algas (ou óleo preparado da mesma) seja incorporada num produto alimentício. O teor de clorofila reduzido encontrado em microalgas crescidas heterotroficamente (por exemplo, Chlorella) também reduz a cor verde na biomassa, em comparação com microalgas crescidas fototroficamente. Assim, o teor de clorofila reduzido evita uma coloração verde frequentemente indesejada associado com produtos alimentícios contendo microalgas cultivadas fototroficamente e permite a incorporação ou uma incorporação aumentada de biomassa de algas em um produto alimentício. Em pelo menos uma modalidade, o produto alimentício contém microalgas crescidas heterotroficamente do teor de clorofila reduzido em comparação com microalgas crescidas fototroficamente. Em algumas modalidades o teor de clorofila de farinha de microalgas ou biomassa de algas é menos de 500 ppm, menos de 400 ppm, menos de 300 ppm, menos de 200 ppm, menos de 100 ppm, menos de 50 ppm, menos de 10 ppm, menos de 2 ppm ou menos de 1 ppm.
A biomassa de microalgas e farinha de algas ricas em óleo geradas pelos métodos de cultura aqui descritos é útil de acordo com a presente invenção compreendendo pelo menos 10% de óleo de microalgas por DCW. Em algumas modalidades, a biomassa microalgas ou farinha de algas compreende pelo menos 15%, 25-35%, 30-50%, 50-55%, 50-65%, 54-62%, 56-60%, pelo menos 75% ou, pelo menos 90% de óleo de microalgas por DCW.
O óleo de microalgas da biomassa aqui descrita (ou extraído a partir da biomassa ou a farinha de algas) pode compreender glicerolipídios com um ou mais ésteres de ácidos graxos de diferentes cadeias laterais. Glicerolipídios são constituídos por uma molécula de glicerol esterificada para uma, dois, ou três moléculas de ácido graxo, que podem ser de diferentes comprimentos e ter diferentes graus de saturação. Misturas específicas de óleo de algas podem ser preparadas, quer dentro de uma única espécie de algas, ou por mistura em conjunto com a biomassa (ou óleo de algas) a partir de duas ou mais espécies de microalgas.
Assim, a composição do óleo, isto é, as propriedades e as proporções dos constituintes de ácidos graxos dos glicerolipídios, também podem ser manipuladas através da combinação de biomassa (ou óleo) a partir de pelo menos duas espécies distintas de microalgas. Em algumas modalidades, pelo menos duas das espécies distintas de microalgas têm diferentes perfis de glicerolipídio. As espécies distintas de microalgas podem ser cultivadas em conjunto ou separadamente, como descrito na presente invenção, preferencialmente em condições heterotróficas, para gerar os respectivos óleos. Diferentes espécies de microalgas podem conter diferentes porcentagens de constituintes de ácidos graxos distintos em glicerolipídios da célula.
Em algumas modalidades, o óleo de microalgas é constituído principalmente por óleo monoinsaturado tal como óleo de 18:1 (oleico), particularmente na forma de triglicerídeo. Em alguns casos, o óleo de algas é, pelo menos 20% em peso de óleo monoinsaturado. Em várias modalidades, o óleo de algas tem pelo menos 25%, 50%, 75% ou mais de óleo monoinsaturado, tal como 18:1 por peso ou por volume. Em algumas modalidades, o óleo monoinsaturado éde 18:1, 16:1, 14:1 ou 12:1. Em alguns casos, o óleo de algas é de 60-75%, 64-70%, 65-69% ou 18:1 de óleo. Em algumas modalidades, o óleo de microalgas compreende pelo menos 10%, 20%, 25%, ou 50% ou mais de ácido oleico cstcrificado ou de ácido alfa linolênico esterificado em peso por volume (em particular na forma de triglicerídeo). Em pelo menos uma modalidade, o óleo de algas compreende menos de 10%, menos de 5%, menos de 3%, menos de 2%, ou menos do que 1% em peso ou em volume, ou é substancialmente livre de ácido docosahexanóico esterificado (DHA (22:6)) (em particular na forma de triglicerídeo). Para exemplos de produção de microalgas contendo DHA elevado, tais como em Crypthecodinium cohnii, ver Patente US nos. 7.252.979, 6.812.009 e 6.372.460. Em algumas modalidades, o perfil lipídico de óleo extraído do óleo ou de farinha de microalgas ou biomassa de algas é menos de 2% 14:0; 13-16% 16:0; 1-4% 18:0; 64-70% 18:1; 10-16% 18:2; 18:3 0,5-2,5%, e menos de 2% de óleo de um comprimento de cadeia de carbono de 20 ou mais.
A biomassa de microalgas (e o óleo extraído dela), pode também incluir outros constituintes produzidos pelas microalgas, ou incorporados na biomassa a partir do meio de cultura. Estes outros componentes podem estar presentes em quantidades variáveis, dependendo das condições de cultura utilizadas e das espécies de microalgas (e, se for o caso, do método de extração usado para recuperar o óleo a partir da biomassa de microalgas). Em geral, o teor de clorofila na biomassa de microalgas rica em proteínas é maior do que o teor de clorofila na biomassa de microalgas rica em lipídios. Em algumas modalidades, o teor de clorofila na biomassa de microalgas é menos de 200 ppm ou menos de 100 ppm. Os outros componentes podem incluir, sem limitação, fosfolipídios (por exemplo, lecitina de algas), carboidratos, fibra solúvel e insolúvel, glicoproteínas, fitosteróis (por exemplo, β-sitosterol, campesterol, estigmasterol, ergosterol, e brassicasterol), tocoferóis, tocotrienóis, carotenoides (por exemplo, acaroteno, β-caroteno e licopeno), xantofilas (por exemplo, luteína, zeaxantina, α-criptoxantina e β-criptoxantina), proteínas, polissacarídeos (por exemplo, arabinose, manose, galactose, 6-metil galactose e glicose) e vários compostos orgânicos ou inorgânicos (por exemplo, selênio).
Em alguns casos, a farinha de biomassa ou de algas compreende pelo menos 10 ppm de selênio. Em alguns casos, a farinha de biomassa ou de algas compreende pelo menos 25% p/p de polissacarídeo de algas. Em alguns casos, a farinha de biomassa ou de algas compreende pelo menos 15% p/p da glicoproteína de algas. Em alguns casos, a biomassa, farinha de algas ou óleo derivado da biomassa compreende entre 0-200, 0-115 ou 50-115 mcg de carotenoide total por grama de biomassa de algas ou farinha de algas, e em modalidades específicas 20-70 ou 50 -60 mcg do teor de carotenoide total é luteína. Em alguns casos, a farinha de biomassa ou de algas compreende pelo menos 0,5% de fosfolipídios de algas ou a partir de cerca de 0,25% a cerca de 1,5% de fosfolipídios totais por grama de farinha de algas ou biomassa de algas. Em alguns casos, a biomassa, farinha de algas ou óleo derivado da biomassa das algas contém, pelo menos 0,10, 0,02-0,5, ou 0,05-0,3 mg/g de tocotrienóis totais e em modalidades específicas 0,05-0,25 mg/g é alfa tocotrienol. Em alguns casos, a biomassa, farinha de algas ou óleo derivado da biomassa de algas contém entre 0,125 mg/g a 0,35 mg/g no total tocotrienóis. Em alguns casos, a farinha de algas ou o óleo derivado da biomassa das algas contém, pelo menos 5,0, 1-8, 2-6 ou 3-5 mg/100g de tocoferóis totais e em modalidades específicas 2-6 mg/100g é alfa-tocoferol. Em alguns casos, a farinha de algas ou o óleo derivado da biomassa de algas contém entre 5,0mg/100g 10mg/100g de tocoferóis.
Em alguns casos, a composição de outros componentes da biomassa de microalgas é diferente para a biomassa rica em proteínas em comparação com a biomassa rica em lipídios. Em modalidades específicas, a biomassa rica em proteínas, a farinha de algas ou o óleo contém entre 0,180,79 mg/100g de tocoferol total e em modalidades específicas, a biomassa rica em proteínas, a farinha de algas ou o óleo contém cerca de 0,01-0,03 mg/g de tocotrienóis. Em alguns casos, o elevado teor de proteínas da farinha de algas ou da biomassa de óleo também contém entre l-3g/100g de esteróis totais, e em modalidades específicas, 1,299-2,46g/100g de esteróis totais. Descrições detalhadas de tocotrienóis e tocoferóis na composição de Chlorella protothecoides estão incluídas nos Exemplos a seguir.
Em algumas modalidades, a biomassa de microalgas ou farinha de algas compreende 20-45% de carboidratos em peso seco. Em outras modalidades, a biomassa ou a farinha de algas compreende 25-40% ou 30-35% de carboidratos em peso seco. O carboidrato pode ser de fibra dietética, bem como de açúcares livres, tais como sacarose e glicose. Em algumas modalidades o açúcar livre na biomassa de microalgas é de 1-10%,
2-8%, ou 3-6% em peso seco. Em certas modalidades o componente livre de açúcar compreende sacarose.
Em alguns casos, a biomassa de microalgas ou farinha de algas compreende pelo menos 5% de fibra solúvel. Em outras modalidades, a biomassa de microalgas ou farinha de algas compreende pelo menos 10% de fibra solúvel ou pelo menos 20% a 35% de fibra solúvel. Em algumas modalidades, a biomassa de microalgas ou farinha de algas compreende pelo menos 5% de fibra insolúvel. Em outras modalidades, a biomassa de microalgas ou farinha de algas compreende pelo menos 5%, pelo menos 10%, ou, pelo menos 10% a 25%, ou, pelo menos 25% a 50% de fibra insolúvel. A fibra dietética total é a soma das fibras solúvel e fibra insolúvel. Em algumas modalidades, a biomassa de microalgas ou farinha de algas compreende pelo menos 20% de fibra dietética total. Em outras modalidades, a biomassa de microalgas ou farinha de algas compreende pelo menos 25%, 50%, 55%, 60%, 75% de fibra dietética total.
Em uma modalidade os teores de monossacarídeo da fibra total (carboidrato total menos açúcares livres) é de 1-20% de arabinose, 5-50% de manose; 15-80% de galactose e 10-70% de glicose. Em outras modalidades, o teor de monossacarídeo de fibra total é de cerca de 1-2% de arabinose, de cerca de 10-15% de manose; cerca de 20-30% de galactose e 55-65% de glicose
III. PROCESSAMENTO DE BIOMASSA DE MICROALGAS EM FARINHA DE ALGAS E INGREDIENTES ALIMENTÍCIOS ACABADOS
A biomassa de microalgas concentrada produzida de acordo com os métodos da presente invenção é por si só um ingrediente alimentício acabado e pode ser utilizada em gêneros alimentícios, sem modificação adicional, ou com apenas um mínimo de modificação. Por exemplo, o bolo pode ser embalado a vácuo ou congelado. Altemativamente, a biomassa pode ser seca através de liofilização, um processo de “liofilizado” no qual a biomassa é congelada em uma câmara de secagem por congelamento para que o vácuo seja aplicado. A aplicação de um vácuo para a câmara de secagem por congelamento resulta da sublimação (secagem primária) e dessorção (secagem secundária) da água a partir da biomassa. No entanto, a presente invenção fornece uma variedade de ingredientes alimentícios acabados derivados de microalgas com propriedades aprimoradas que resultam de métodos de processamento da invenção que podem ser aplicados à biomassa de microalgas concentrada. A Farinha de algas compreende as células de algas crescidas, cultivadas ou propagadas como aqui descrito ou, em condições bem conhecidas dos versados na técnica, e processadas em farinha de algas, como aqui divulgado.
A secagem da biomassa de microalgas, ou predominantemente na forma intacta ou de homogeneizado, é vantajosa a fim de facilitar o processamento adicional ou para o uso da biomassa nos métodos e composições aqui descritos. A secagem refere-se à remoção de umidade/água livre ou da superfície da biomassa predominantemente intata ou a remoção de água de superfície a partir de uma pasta de biomassa (por exemplo, por micronização) homogeneizada. Diferentes texturas e sabores podem ser conferidos aos produtos alimentícios, dependendo de se a biomassa de algas é seca e, em caso afirmativo, do método de secagem. A secagem da biomassa gerada a partir de microalgas cultivadas aqui descritas remove a água que pode ser um componente indesejável dos produtos alimentícios acabados ou de ingredientes alimentícios. Em alguns casos, a secagem da biomassa pode facilitar um processo de extração óleo de microalgas mais eficiente.
Em uma modalidade, a biomassa de microalgas concentrada é primeiramente rompida e, em seguida, seca por pulverização ou por flash (isto é, sujeita a um processo de secagem pneumática), para formar um pó contendo predominantemente células lisadas para produzir a farinha de algas. Em outra modalidade, substancialmente todo o óleo contido na farinha de algas é extraído, deixando a farinha de algas desengordurada a qual é predominantemente constituída por carboidratos (incluindo sob a forma de fibras dietéticas), proteínas e óleo residual ou lipídios.
Em algumas modalidades, a biomassa de microalgas, ou farinha de algas tem 15% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, 2-6%, ou
3-5% de umidade em peso após a secagem.
A. Farinha de Algas
A farinha de algas da invenção é preparada a partir de biomassa de microalgas concentrada que foi mecanicamente homogeneizada e lisada e seca por pulverização ou flash do homogeneizado em forma de pó (ou seca usando outro sistema de secagem pneumático). A produção de farinha de algas requer que as células sejam lisadas para liberar o seu óleo, e que os componentes da parede celular e intracelulares sejam micronizados ou, pelo menos reduzidos em tamanho de partícula. O tamanho médio das partículas medido imediatamente após a homogeneização, ou tão logo depois de ser praticada é, preferencialmente não mais do que 10, não mais do que 25, ou não mais do que 100 pm. Em algumas modalidades, o tamanho médio das partículas é 1-10, 1-15, 10-100, ou 1-40 μπι. Em algumas modalidades, o tamanho médio das partículas é maior que 10 pm e até 100 pm. Em algumas modalidades, o tamanho médio das partículas é 0,1-100 pm.
O tamanho médio de uma célula de Chlorella protothecoides é cerca de 5 a 15 pm. Na preparação da farinha de algas, como aqui divulgado, o tamanho médio das partículas é menos de 10 pm, como ensinado no Exemplo 8, a variação das condições de homogeneização resultou em diferentes tamanhos de partícula. O especialista na técnica reconhecerá que as condições de homogeneização podem ser variadas para produzir diferentes tamanhos de partícula.
As células individuais, incluindo a biomassa (partículas de biomassa de algas) ou os aglomerados de partículas de farinha de algas em graus variados. Em uma modalidade, os aglomerados de partículas de farinha de algas ou aglomerados de partículas de biomassa de algas têm tamanhos de partícula de menos de cerca de 1.000 pm, menos de 750 pm, com menos de 500 pm, com menos de 250 pm, ou menos do que 100 pm.
Como observado na discussão de micronização e, em particular, se medido por uma técnica, tal como difração a laser, a qual mede aglomerados em vez de partículas individuais, o tamanho médio das partículas, preferencialmente, medido imediatamente após a homogeneização ter ocorrido ou logo que possível depois (por exemplo, dentro de 2 semanas), para evitar ou minimizar as distorções potenciais de medição do tamanho das partículas, devido à aglomeração. Na prática, as emulsões resultantes de homogeneização geralmente podem ser armazenadas, pelo menos duas semanas em um frigorífico sem alteração significativa no tamanho das partículas. Algumas técnicas para a medição de tamanho de partícula, como difração a laser, medem o tamanho dos aglomerados de partículas, em vez de partículas individuais. Os aglomerados de partículas medidos possuem um tamanho médio maior do que as partículas individuais (por exemplo, 1-100 microns). A microscopia de luz de farinha de microalgas dispersa em água mostra ambas as partículas individuais e aglomerados de partículas. Em dispersão de farinha de algas em água com mistura suficiente (por exemplo, com um misturador manual), mas sem repetir a homogeneização original, os aglomerados podem ser quebrados e a difração a laser pode detectar novamente geralmente um tamanho médio de partícula de não mais do que 10 pm. O software para análise de tamanho de partículas a partir eletromicrografias automatizadas está disponível comercialmente e pode também ser utilizada para a medição de tamanho de partícula. Aqui, como em outra parte, o tamanho médio de partícula pode se referir a qualquer medida reconhecida na técnica de uma média, como média aritmética, média geométrica, mediana ou moda. O tamanho das partículas pode ser medido por qualquer medida reconhecida na técnica, incluindo a maior dimensão de uma partícula ou o diâmetro de uma partícula de volume equivalente. Devido às partículas serem tipicamente aproximadamente esféricas, estas medições podem ser essencialmente as mesmas.
Após a homogeneização, o óleo, água e partículas micronizadas resultantes são emulsionados tal modo que o óleo não é separado da dispersão antes da secagem. Por exemplo, um rompedor de pressão pode ser usado para bombear uma pasta de células contendo pasta através de uma válvula de orifício restrito para lisar as células. A alta pressão (até 1500 bar) é aplicada, seguida de uma expansão instantânea através de um bocal de saída. A ruptura das células é realizada por três mecanismos diferentes: impacto sobre a válvula, cisalhamento elevado de líquido no orifício, e a queda de pressão repentina de descarga, causando uma explosão da célula. O método libera moléculas intracelulares. Um homogeneizador Niro (Niro Soavi GEA) (ou qualquer outro homogeneizador de alta pressão) pode ser usado para processar as células de partículas predominantemente de 0,2 a 5 microns de comprimento. O processamento de biomassa de algas, sob pressão elevada (cerca de 1000 bar) normalmente lisa mais de 90% das células e reduz o tamanho de partícula para menos de 5 microns.
Altemativamente, um moinho de esferas pode ser usado. Em um moinho de esferas, as células são agitadas em suspensão com pequenas partículas abrasivas, tais como esferas. As células quebram por causa das forças de cisalhamento, moagem entre esferas, e colisões com as esferas. As esferas rompem as células para liberar o conteúdo celular. Em uma modalidade, a biomassa de algas é rompida e formada em uma emulsão estável usando um moinho de esferas Dyno-mill ECM Ultra (CB Mills). As células podem também ser rompidas por forças de cisalhamento, tais como com o uso de mistura (por exemplo, com uma alta velocidade ou um misturador de Waring como exemplos), a prensa francesa, ou mesmo a centrifugação no caso de as paredes celulares fracas, para romper as células. Um moinho de esferas adequado, incluindo detalhes de tamanho de bola e lâmina é descrito na Patente US 5.330.913.
O produto imediato de homogeneização é uma pasta de partículas de tamanho menor do que as células originais que estão em suspensão no óleo e na água. As partículas representam os restos celulares. O óleo e água são liberados pelas células. Água adicional pode contribuir com o meio aquoso contendo as células antes da homogeneização. As partículas estão, preferencialmente, na forma de um homogeneizado micronizado. Se deixadas em repouso, algumas das partículas de menores dimensões podem coalescer. No entanto, mesmo uma dispersão de pequenas partículas pode ser preservada por semeadura com um estabilizador microcristalino, tal como a celulose microcristalina.
Para formar a farinha de algas, a pasta é seca por pulverização ou flash, removendo a água e deixando um material tipo pó seco que contém detritos celulares e óleo. Embora o teor de óleo de farinha (ou seja: células rompidas como um material tipo pó) possa ser de pelo menos 10, 25 ou 50% por peso de pó seco, o pó pode ter uma sensação e aparência de seco em vez de gorduroso (por exemplo, sem óleo visível) e também pode fluir livremente quando agitado. Vários agentes de fluxo (incluindo vários produtos derivados de silica, tais como a silica precipitada, silica fumada, silicato de cálcio, silicatos de alumínio e sódio) podem também ser adicionados. A aplicação destes materiais para pós higroscópicos ou pegajosos com alto teor de gordura impede a secagem pós endurecimento e na embalagem, promove o fluxo livre dos pó secos e pode reduzir a aderência, acúmulo e oxidação de materiais em superfícies secas. Todos são aprovados para uso em alimentos em níveis máximos designados pelo FDA. Após a secagem, o teor de água ou de umidade do pó é geralmente inferior a 10%, 5%, 3% ou 1% em peso. Outros secadores, tais como secadores pneumáticos ou secadores de combustão de pulso também podem ser usados para produzir a farinha de algas.
O teor de óleo de farinha de algas pode variar, dependendo do percentual de óleo da biomassa de algas. A farinha de algas pode ser produzida a partir de biomassa de algas de diferentes teores de óleo. Em certas modalidades, a farinha de algas é produzida a partir de biomassa de algas do mesmo teor de óleo. Em outras modalidades, a farinha de algas é produzida a partir de biomassa de algas de diferente teor de óleo. Neste último caso, a biomassa de algas de teor de óleo variável pode ser combinada e, em seguida, a etapa de homogeneização é realizada. Em outras modalidades, a farinha de algas de teor de óleo variável é produzida primeiro e, em seguida, misturada em várias proporções para conseguir um produto de farinha de algas que contém o teor de óleo final desejado. Em uma modalidade adicional, a biomassa de algas de diferentes perfis lipídicos pode ser combinada em conjunto e, em seguida, homogeneizada para produzir a farinha de algas. Em uma outra modalidade, a farinha de algas de diferentes perfis lipídicos é produzida primeiro e, em seguida, misturada em proporções diferentes para conseguir um produto de farinha de algas que contém o perfil lipídico final desejado.
A farinha de algas ou biomassa de algas da invenção é útil para uma ampla faixa de preparações alimentícias. Por causa do teor de óleo, teor de fibras e partículas micronizadas, a farinha de algas ou biomassa de algas é um ingrediente alimentício multifuncional.
B. Farinha de Algas Desengordurada
Em alguns casos, a farinha de algas (ou qualquer biomassa de microalgas rompida) pode ser submetida a um processo de extração de óleo para produzir uma farinha de algas ou biomassa de algas desengordurada. Óleos de microalgas podem ser extraídos usando liquefação (ver, por exemplo, Sawayama et al., Biomass and Bioenergy 17:33-39 (1999) and Inoue et al., Biomass Bioenergy 6(4):269-274 (1993)); Liquefação de óleo (ver, por exemplo, Minowa et al., Fuel 74(12):1735-1738 (1995)); ou extração de CO2 supercrítico (ver por exemplo Mendes et al., Inorgânica Chimica Acta 356:328-334 (2003)). As Farinhas de algas desengorduradas que têm tido substancialmente todo o óleo extraído utilizando a extração por CO2 supercrítico que geralmente irá conter fosfolipídios como uma função do processo de extração. Outros métodos de extração de óleo, incluindo o uso de um solvente polar e não polar não só irá extrair substancialmente todo o óleo a partir da farinha de microalgas, mas também irá extrair os fosfolipídios. A farinha desengordurada de algas ainda mantém a proteína e carboidratos da farinha de algas pré-extraída. Os carboidratos contidos na farinha de algas desengordurada incluem carboidratos sob a forma de fibra dietética (tanto a fibra solúvel quanto insolúvel).
A farinha desengordurada de algas ou a biomassa de algas, com ou sem fosfolipídios, é útil como um ingrediente funcional. A farinha desengordurada de algas ou biomassa de algas contendo fosfolipídios tem uma elevada capacidade emulsificante. A farinha de algas desengordurada ou biomassa de algas, com e sem os fosfolipídios possui uma grande capacidade de retenção de água e, portanto, é útil para uma variedade de aplicações em alimentos. A farinha de algas ou biomassa de algas desengordurada pode ser uma boa fonte de fibra alimentar, uma vez que contém carboidratos sob a forma de fibra solúvel e insolúvel.
IV. COMBINAÇÃO DE BIOMASSA DE MICROALGAS OU MATERIAIS DERIVADOS DA MESMA COM OUTROS INGREDIENTES ALIMENTÍCIOS
Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a uma composição alimentícia compreendendo pelo menos 0,1% p/p da biomassa das algas e um ou mais outros ingredientes, incluindo um ou mais ingredientes alimentícios, em que a biomassa de algas compreende óleo de pelo menos 10% em peso seco, em que, opcionalmente, pelo menos 90% do óleo é glicerolipídio. Em algumas modalidades, a biomassa de algas contém pelo menos 25%, 40%, 50% ou 60% de óleo em peso seco. Em alguns casos, a biomassa de algas contém 10-90%, 25-75%, 40-75% ou 50-70% de óleo, em peso seco, opcionalmente, em que pelo menos 90% do óleo é glicerolipídio. Em pelo menos uma modalidade, pelo menos 50% em peso do óleo é o óleo de glicerolipídio monoinsaturado. Em alguns casos, pelo menos 50% em peso do óleo é um lipídio na forma glicerolipídio 18:1. Em alguns casos, menos de 5% em peso do óleo é o ácido docosa-hexanóico (D11A) (22:6). Em pelo menos uma modalidade, menos de 1% em peso do óleo é DHA. Um teor de lipídios de algas com os baixos níveis de ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) é preferido para garantir a estabilidade química da biomassa. Em modalidades preferidas, a biomassa de algas é cultivada em condições heterotróficas e reduzido pigmento verde. Em outras modalidades, as microalgas são um mutante que sem pigmentação ou tem pigmentação reduzida. Em outra modalidade, a composição alimentícia compreende pelo menos 0,1% p/p de algas biomassa e um ou mais outros ingredientes alimentícios e, opcionalmente, um ou mais outros ingredientes.
Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a uma composição alimentícia compreendendo pelo menos 0,1% p/p da biomassa das algas e um ou mais outros ingredientes, incluindo um ou mais ingredientes alimentícios, em que a biomassa de algas compreende pelo menos 30% de proteína em peso seco, de pelo menos 40% de proteína em peso seco, de pelo menos 45% de proteína em peso seco, de pelo menos 50% de proteína em peso seco, de pelo menos 55% de proteína em peso seco, de pelo menos 60% de proteína em peso seco, ou menos pelo menos 75% de proteína em peso seco. Em alguns casos, a biomassa de algas contém 30-75% ou 40-60% de proteína em peso seco. Em algumas modalidades, pelo menos 40% da proteína bruta é digerível, pelo menos 50% da proteína bruta é digerível, pelo menos 60% da proteína bruta é digerível, pelo menos 70% da proteína bruta é digerível, pelo menos 80% da proteína bruta é digerível, ou pelo menos 90% da proteína bruta é digerível. Em alguns casos, a biomassa de algas é cultivada em condições heterotróficas. Em pelo menos uma modalidade, a biomassa de algas é crescida em condições repletas de nitrogênio. Em outras modalidades, a microalga é um mutante de cor sem pigmentação ou com pigmentação reduzida. Em outra modalidade, a composição alimentícia compreende pelo menos 0,1% p/p de biomassa de algas e um ou mais outros ingredientes alimentícios e, opcionalmente, um ou mais outros ingredientes.
Em alguns casos, a biomassa de algas compreende predominantemente células intactas. Em algumas modalidades, a composição alimentícia compreende óleo que é predominantemente ou completamente encapsulado no interior das células da biomassa. Em alguns casos, a composição alimentícia compreende predominantemente células de microalgas intactas. Em alguns casos, o óleo de algas é predominantemente encapsulado em células da biomassa. Em outros casos, a biomassa compreende predominantemente células lisadas (por exemplo, um homogeneizado). Como discutido acima, tal homogeneizado pode ser fornecido como uma pasta, flocos, pó ou farinha.
Em algumas modalidades da composição alimentícia, a biomassa de algas compreende ainda pelo menos 10 ppm de selênio. Em alguns casos, a biomassa compreende ainda pelo menos 15% p/p de polissacarídeo de algas. Em alguns casos, a biomassa compreende ainda pelo menos 5% p/p de glicoproteína de algas. Em alguns casos, a biomassa compreende entre 0 e 115 mcg de carotenoides totais por grama de biomassa. Em alguns casos, a biomassa compreende pelo menos 0,5% p/p de fosfolipídios de algas. Em todos os casos, como já observado, estes componentes são verdadeiros componentes celulares e não extracelulares.
Em alguns casos, a biomassa de algas da composição alimentícia contém componentes que têm qualidades antioxidantes. As qualidades antioxidantes fortes podem ser atribuídas aos múltiplos antioxidantes presentes na biomassa de algas, as quais incluem, mas não estão limitados aos carotenoides, minerais essenciais, tais como zinco, cobre, magnésio, cálcio e manganês. A biomassa de algas também tem demonstrado conter outros antioxidantes, tais como tocoferóis e tocotrienóis. Estes membros da família da vitamina E são antioxidantes importantes e têm outros benefícios para a saúde, tais como um efeito protetor contra lesões induzidas por derrame, reversão de bloqueio arterial, inibição de crescimento de mama e células de câncer da próstata, redução dos níveis de colesterol, um risco reduzido de diabetes tipo II e efeitos de proteção contra danos glaucomatosos. As fontes naturais de tocotrienóis e tocoferóis podem ser encontradas em óleos produzidos a partir de óleo de palma, girassol, soja, milho e oliva, no entanto as composições aqui fornecidas têm níveis significativamente maiores de tocotrienóis do que os materiais até agora conhecidos.
Em alguns casos, as composições alimentícias da presente invenção contêm óleo de algas compreendendo pelo menos 5mg/100g, pelo menos 7mg/100g ou pelo menos 8mg/100g de tocoferol total. Em alguns casos, as composições alimentícias da presente invenção contêm óleo de algas compreendendo pelo menos 0,15 mg/g, pelo menos 0,20mg/g ou pelo menos 0,25 mg/g de tocotrienol total.
Em modalidades específicas das composições e/ou métodos acima descritos, as microalgas podem produzir carotenoides. Em algumas modalidades, os carotenoides produzidos por microalgas podem ser coextraídos com os lipídios ou óleo produzidos por microalgas (isto é, o óleo ou o lipídio irá conter os carotenoides). Em algumas modalidades, os carotenoides produzidos por microalgas são xantofilas. Em algumas modalidades, os carotenoides produzidos por microalgas são carotenos. Em algumas modalidades, os carotenoides produzidos por microalgas são uma mistura de carotenos e xantofilas. Em várias modalidades, os carotenoides produzidos por microalgas compreendem pelo menos um carotenoide selecionado a partir do grupo consistindo em astaxantina, luteína, zeaxantina, alfa-caroteno, trans-beta-caroteno, cis-beta-caroteno, licopeno, e qualquer combinação destes. Um exemplo não limitativo de um perfil de carotenoides de óleo a partir de Chlorella protothecoid.es é incluído abaixo nos Exemplos.
Em algumas modalidades da composição alimentícia, a biomassa de algas é derivada de algas cultivadas e secas em condições de boas práticas de fabricação (GMP). Em alguns casos, a biomassa de algas é combinada com um ou mais outros ingredientes comestíveis, incluindo, sem limitação, ingredientes de grãos, frutos, vegetais, proteínas, lipídios, erva e/ou especiarias. Em alguns casos, a composição alimentícia é uma salada, ovo, produto cozido, pão, café, massas, molho, bebida de sopa, refrigerante, sobremesa congelada, manteiga ou creme. Em modalidades particulares, a composição alimentícia não é um comprimido ou pó. Em alguns casos, a composição alimentícia de acordo com a presente invenção pesa pelo menos 50 g, ou, pelo menos 100 g.
A biomassa pode ser combinada com um ou mais outros ingredientes alimentícios para fazer um produto alimentício. A biomassa pode ser a partir de uma única fonte de algas (por exemplo, cepa), ou biomassa de algas a partir de várias fontes (por exemplo, as diferentes cepas). A biomassa também pode ser a partir de uma única espécie de algas, mas com o perfil de composição diferente. Por exemplo, um fabricante pode misturar microalgas que é rica em teor de óleo com microalgas, que é rica em teor de proteínas para o exato teor de óleo e proteína que é desejado no produto alimentício acabado. A combinação pode ser realizada por um fabricante de alimentos para fazer um produto acabado para venda a varejo ou para uso em serviço de alimentos. Em alternativa, o fabricante pode vender a biomassa de algas como um produto, e o consumidor pode incorporar a biomassa de algas em um produto alimentício, por exemplo, através da modificação de uma receita convencional. Em ambos os casos, a biomassa de algas é normalmente usada para substituir a totalidade ou parte do óleo, a gordura, os ovos, ou semelhantes utilizados em muitos produtos alimentícios convencionais.
Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a uma composição alimentícia que compreende pelo menos 0,1% p/p da biomassa de algas e um ou mais outros ingredientes comestíveis, em que a biomassa de algas é formulada misturando a biomassa de algas que contém pelo menos 40% de proteína em peso seco, com biomassa de algas que contém 40% em peso seco de lipídio, para obter uma mistura de um percentual desejado de mistura de proteína e lipídios em peso seco. Em algumas modalidades, a biomassa é da mesma cepa de algas. Em alternativa a biomassa de algas que contém pelo menos 40% em peso seco de lipídios contendo menos de 1% do seu lipídio como o DHA é misturada com a biomassa de algas contendo pelo menos 20% de lipídios, em peso seco, contendo pelo menos 5% do seu lipídio como a DHA para obter uma mistura de biomassa seca que contém no agregado pelo menos 10% de lipídios e 1% de DHA em peso seco.
Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de preparação de biomassa de algas por secagem de uma cultura de algas para fornecer biomassa de algas compreendendo pelo menos 15% de óleo em peso seco em condições de GMP, em que o óleo de algas tem mais do que 50 % de lipídio monoinsaturado.
Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a biomassa de algas que contêm pelo menos 15% de óleo em peso seco fabricado em condições de GMP, em que o óleo de algas tem mais do que 50% de lipídios 18:1. Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a biomassa de algas que contêm pelo menos 40% de óleo em peso seco fabricada em condições de GMP. Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a biomassa de algas que contêm pelo menos 55% de óleo em peso seco fabricada em condições de GMP. Em alguns casos, a biomassa de algas é embalada como um comprimido para distribuição de uma dose unitária de biomassa. Em alguns casos, a biomassa de algas é embalada com, ou de outro modo, tem uma etiqueta fornecendo instruções para combinar a biomassa de algas com outros ingredientes comestíveis.
Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a métodos para a combinação de biomassa de microalgas e/ou materiais derivados das mesmas, tal como descrito acima, com pelo menos outro ingrediente alimentício acabado, como descrito abaixo, para formar uma composição alimentícia ou gênero alimentícios. Em várias modalidades, a composição alimentícia formada pelos métodos da presente invenção compreende um produto de ovo (em pó ou líquido), um produto de massa, um produto de molho, um produto de maionese, um produto de bolo, um produto de pão, uma barra energética, um produto de leite, um produto de suco, um creme, ou um cremoso. Em alguns casos, a composição alimentícia não é um comprimido ou pó. Em várias modalidades, a composição alimentícia pesa pelo menos 10 g, pelo menos 25 g, pelo menos 50 g, pelo menos 100 g, pelo menos 250 g, ou pelo menos 500 g ou mais. Em algumas modalidades, a composição alimentícia formada pela combinação de biomassa de microalgas e/ou produto derivado da mesma é um produto não cozido. Em outros casos, a composição alimentícia é um produto cozido.
Em outros casos, a composição alimentícia é um produto cozido. Em alguns casos, a composição alimentícia contém menos de 25% de óleo ou gordura por peso excluindo óleo de contribuição da biomassa de algas. A gordura, sob a forma de triglicerídeos saturados (TAG ou gorduras trans) é feita quando da hidrogenação de óleos vegetais, tal como é praticada na ao preparar cremes tais como margarina. A gordura contida na biomassa de algas não tem gorduras trans presentes. Em alguns casos, a composição alimentícia contém menos de 10% de gordura ou óleo por peso excluindo a contribuição de óleo da biomassa. Em pelo menos uma modalidade, a composição alimentícia é livre de óleo ou gordura excluindo o óleo contribuído pela biomassa. Em alguns casos, a composição alimentícia é livre de óleo com exceção do óleo contribuído pela biomassa. Em alguns casos, a composição alimentícia é livre de produtos de ovo ou ovo.
Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de fabricação de uma composição alimentícia em que a gordura ou óleo em um produto alimentício convencional é total ou parcialmente substituído com biomassa de algas contendo pelo menos 10% em peso de óleo. Em uma modalidade, o método compreende a determinação de uma quantidade de biomassa de algas para a substituição utilizando a razão de óleo de algas na biomassa e a quantidade de óleo ou gordura no produto alimentício convencional, e combinando a biomassa de algas com pelo menos outro ingrediente comestível e menos do que a quantidade de óleo ou de gordura contida no produto alimentício convencional para formar uma composição alimentícia. Em alguns casos, a quantidade de biomassa de algas combinada com pelo menos outro ingrediente, é 1-4 vezes a massa ou volume de óleo e/ou gordura no produto alimentício convencional.
Em algumas modalidades, o método descrito acima inclui ainda fornecer uma receita para um produto alimentício convencional contendo o pelo menos um outro ingrediente comestível combinado com um óleo ou gordura, e combinando 1-4 vezes a massa ou volume de biomassa de algas com o pelo menos um outro ingrediente comestível como a massa ou volume de óleo ou gordura no produto alimentício convencional. Em alguns casos, o método inclui ainda a preparação de biomassa de algas em condições de GMP.
Em alguns casos, a composição alimentícia formada pela combinação de biomassa de microalgas e/ou produto derivado da mesma compreende pelo menos 0,1%, pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, em pelo menos 25%, ou pelo menos 50% da biomassa p/p ou v/v de microalgas ou óleo de microalgas. Em algumas modalidades, as composições alimentícias formadas como aqui descritas compreendem pelo menos 2%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95 % p/p de biomassa de microalgas ou um produto derivado da mesma. Em alguns casos, a composição alimentícia compreende 5-50%, 10-40% ou 15-35% de biomassa de microalgas produtos derivado da mesma, por peso ou por volume.
Tal como descrito acima, a biomassa de microalgas pode ser substituída por outros componentes que de outro modo seriam convencionalmente incluídos em um produto alimentício. Em algumas modalidades, a composição alimentícia contém menos de 50%, menos de 40%, ou menos de 30% de óleo ou de gordura em peso, excluindo o óleo de microalgas contribuído pela biomassa ou a partir de fontes de microalgas. Em alguns casos, a composição alimentícia contém menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10%, ou menos de 5% em peso de óleo ou gordura excluindo o óleo de microalgas contribuído pela biomassa ou a partir de fontes de microalgas. Em pelo menos uma modalidade, a composição alimentícia é livre de óleo ou gordura excluindo o óleo de microalgas contribuído pela biomassa ou a partir de fontes de microalgas. Em alguns casos, a composição alimentícia é livre de ovos, manteiga, ou outros óleos e/ou gorduras ou pelo menos um outro ingrediente que normalmente deve ser incluído em um produto alimentício convencional comparável. Alguns alimentos são livres de produtos de laticínio (por exemplo, manteiga, creme e/ou queijo).
A quantidade de biomassa de algas usada para preparar uma composição alimentícia depende da quantidade de óleo de não algas, da gordura, ovos, ou semelhantes, a ser substituída em um produto alimentício convencional e da porcentagem de óleo na biomassa de algas. Assim, em pelo menos uma modalidade, os métodos da invenção incluem a determinação de uma quantidade de biomassa de algas para combinar com pelo menos um outro ingrediente comestível a partir de uma razão de óleo na biomassa e uma razão de óleo e/ou gordura que é normalmente combinada com o pelo menos um outro ingrediente comestível em um produto alimentício convencional. Por exemplo, se a biomassa de algas tem de 50% p/p de óleo de microalgas, e a substituição completa do óleo ou da gordura na receita convencional é desejada, então o óleo pode ser substituído, por exemplo, na razão de 2:1. A razão pode ser medida em massa, mas para fins práticos, é geralmente mais fácil de medir o volume usando um copo ou colher de medição, e a substituição pode ser feita por volume. Em um caso geral, o volume ou massa de gordura ou óleo a ser substituído é substituído por (100/100-X) de volume ou massa de biomassa de algas, em que X é a porcentagem de óleo na biomassa de microalgas. Em geral, os óleos e gorduras a serem substituídos em receitas convencionais podem ser substituídos por um total de biomassa de algas, embora a substituição total não seja necessária e qualquer razão desejada de óleo e/ou gordura pode ser mantida e os restantes substituídos de acordo com os gostos e necessidades nutricionais. Devido a biomassa de algas conter proteínas e fosfolipídios, as quais funcionam como emulsionantes, itens, tais como os ovos podem ser substituídos, no todo ou em parte, com biomassa de algas. Se um ovo é substituído, no total, com a biomassa ou a farinha de algas, por vezes é desejável ou necessário aumentar os agentes emulsionantes na composição alimentícia com um agente(s) emulsionante adicional e/ou adicionar água adicional ou outro(s) líquido para compensar a perda destes componentes que, de outra forma, seriam fornecidos pelo ovo. Em algumas modalidades, pode ser necessário adicionar agentes emulsionantes adicionais. Altemativamente, dependendo da composição alimentícia, pode não ser necessário adicionar agentes emulsionantes adicionais.
Para simplificar, as razões de substituição também podem ser fornecidas em termos de massa ou volume de óleo, gordura e/ou de ovos substituído com massa ou volume de biomassa ou farinha de algas. Em alguns métodos, a massa ou volume de óleo, gordura e/ou de ovos de uma receita convencional é substituída com 5-150%, 25-100% ou 25-75% da massa ou volume de óleo, gordura e/ou ovos. A razão de substituição depende de fatores tais como o produto alimentício, perfil nutricional do produto alimentício desejado, textura e aparência geral do produto alimentício, e o teor de óleo da biomassa ou da farinha de algas.
Em alimentos cozidos, a determinação das porcentagens (ou seja, peso ou volume) pode ser feita antes ou depois da cozimento. A porcentagem de biomassa de algas ou farinha de algas pode aumentar durante o processo de cozimento, devido à perda de líquidos. Uma vez que algumas células de biomassa de algas podem lisar no decurso do processo de cozimento, pode ser difícil medir o teor de biomassa de algas diretamente no produto cozido. No entanto, o conteúdo pode ser determinado indiretamente a partir da massa ou volume de biomassa, que foi para o produto bruto como uma porcentagem do peso ou volume do produto acabado (com base em sólidos secos da biomassa), bem como por métodos de análise de componentes que são únicos para a biomassa de algas, tais como sequências genômicas ou de compostos que são fornecidos unicamente pela biomassa de algas, tais como certos carotenoides.
Em alguns casos, pode ser desejável combinar a biomassa de algas ou de farinha de algas com o pelo menos outro ingrediente comestível em uma quantidade que excede a quantidade proporcional de óleo, gordura, ovos, ou semelhantes, que está presente em um produto alimentício convencional. Por exemplo, pode-se substituir a massa ou volume de óleo e/ou gordura de um produto alimentício convencional com 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4 ou mais vezes a quantidade de biomassa de algas ou farinha de algas. Algumas modalidades dos métodos da presente invenção incluem o fornecimento de uma receita para um produto alimentício convencional contendo o pelo menos um outro ingrediente comestível combinado com um óleo ou gordura, e combinando 0,25-4 vezes a massa ou volume de biomassa de algas ou farinha de algas com o pelo menos um outro ingrediente comestível como a massa ou volume de óleo ou gordura no produto alimentício convencional.
A biomassa de algas ou farinha de algas (predominantemente intactas ou homogeneizadas ou micronizadas) e/ou óleo de algas são combinados com pelo menos um outro ingrediente comestível, para formar um produto alimentício. Em alguns produtos alimentícios, a biomassa de algas e/ou óleo de algas é combinado com 1-20, 2-10, ou 4-8, outros ingredientes comestíveis. Os ingredientes alimentícios podem ser selecionados a partir de todos os principais grupos de alimentos, incluindo, sem limitação, frutos, vegetais, legumes, carne, peixe, grãos (por exemplo, trigo, arroz, aveia, farinha de milho, cevada), ervas, especiarias, água, caldo de vegetais, suco, vinho e vinagre. Em algumas composições alimentícias, pelo menos 2, 3, 4, ou 5 grupos de alimentos estão representados bem como a biomassa de algas ou óleo de algas.
Os óleos, gorduras, ovos e semelhantes também podem ser combinados em composições alimentícias, mas, como já foi discutido acima, estão geralmente presentes em quantidades reduzidas (por exemplo, menos de 50%, 25%, ou 10% da massa ou volume da gordura, óleo ou ovos) em comparação com os produtos alimentícios tradicionais. Alguns produtos alimentícios da presente invenção são livres de óleo diferentes dos fornecidos pela biomassa de algas e/ou óleo de algas. Alguns produtos alimentícios são livres de óleo diferentes dos fornecidos pela biomassa de algas. Alguns alimentos são livres de gorduras diferentes das fornecidas pela biomassa de algas ou óleo de algas. Alguns alimentos são livres de gorduras diferentes das fornecidas pela biomassa de algas. Alguns alimentos são livres de óleo e gorduras diferentes dos fornecidos pela biomassa de algas ou óleo de algas. Alguns produtos alimentícios são livres de óleos e gorduras diferentes dos fornecidos pela biomassa de algas. Alguns produtos alimentícios são livres de ovos. Em algumas modalidades, os óleos produzidos por microalgas podem ser adaptados por condições de cultura ou seleção de cepa para incluir níveis ou um componente(s) de ácido graxo específico.
Em alguns casos, a biomassa de algas ou farinha de algas usada para fazer a composição alimentícia compreende uma mistura de pelo menos duas espécies distintas de microalgas. Em alguns casos, pelo menos duas das espécies distintas de microalgas foram cultivadas separadamente.
Em pelo menos uma modalidade, pelo menos duas das espécies distintas de microalgas têm diferentes perfis de glicerolipídio. Em alguns casos, o método descrito acima compreende ainda a cultura de algas em condições heterotróficas e preparação da biomassa a partir de algas. Em alguns casos, 5 todas de pelo menos duas espécies distintas de microalgas contêm pelo menos 10% ou pelo menos 15% de óleo em peso seco. Em alguns casos, uma composição alimentícia contém uma mistura de duas preparações diferentes de biomassa da mesma espécie, na qual uma das preparações contém pelo menos 30% de óleo em peso seco e a segunda contém menos de 15% de óleo 10 em peso seco. Em alguns casos, uma composição alimentícia contém uma mistura de duas preparações distintas de biomassa da mesma espécie, em que uma das preparações contém pelo menos 50% de óleo em peso seco e a segunda contém menos de 15% de óleo em peso seco, e ainda em que a espécie é Chlorella protothecoides.
Além do uso de biomassa de algas ou farinha de algas como um substituto de óleo, gordura, ou ovos em outra forma de alimentos convencionais, a biomassa de algas ou farinha de algas pode ser usada como um suplemento em alimentos que normalmente não contêm óleo, tal como uma vitamina. A combinação de óleo com produtos que são principalmente 20 carboidratos pode ter benefícios associados com o óleo, e a partir da combinação de óleo e de carboidratos, reduzindo o índice glicêmico do carboidrato. O fornecimento de óleo encapsulado em biomassa é vantajoso na proteção do óleo da oxidação e também pode melhorar o sabor e textura do cremoso.
O óleo extraído de biomassa de algas ou farinha de algas pode ser usado da mesma maneira como a biomassa em si, isto é, como um substituto para o óleo, a gordura, os ovos, ou semelhantes, em receitas convencionais. O óleo pode ser utilizado para substituir o óleo e/ou gordura convencional a cerca de 1:1 em base de peso/peso ou volume/volume. O óleo pode ser utilizado para substituir os ovos por substituição de cerca de 1 colher de chá de óleo de algas por ovo opcionalmente em combinação com água adicional e/ou um agente emulsionante (uma média de ovo de 58g é de cerca de 11,2% de gordura, óleo de algas tem uma densidade de cerca de 0,915 5 g/ml, e uma colher de chá tem um volume de cerca de 5 ml = 1,2 colheres de chá de óleo de algas/ovo). O óleo também pode ser incorporado em coberturas, molhos, sopas, margarinas, cremes, gorduras vegetais e semelhantes. O óleo é particularmente útil para produtos alimentícios em que a combinação do óleo com outros ingredientes alimentícios é necessária 10 para se obter um sabor, textura e/ou aparência desejados. O teor de óleo, em peso ou volume de produtos alimentícios pode ser de pelo menos 5, 10, 25, 40 ou 50%.
Em pelo menos uma modalidade, o óleo extraído de biomassa de algas ou farinha de algas pode também ser utilizado como um óleo de 15 cozinha por fabricantes de alimentos, restaurantes e/ou consumidores. Em tais casos, o óleo de algas pode substituir os óleos de cozinha convencionais, tais como o óleo de cártamo, óleo de canola, óleo de oliva, óleo de semente de uva, óleo de milho, óleo de girassol, óleo de coco, óleo de palma, óleo de cozinha ou qualquer outro convencionalmente usado. O óleo obtido a partir de 20 biomassa de algas ou farinha de algas, como com outros tipos de óleo, pode ser submetido a um refinamento adicional para aumentar a sua aptidão para a { cozimento (por exemplo, aumento do ponto de fumo). O óleo pode ser
Í . neutralizado com soda cáustica para remover ácidos graxos livres. Os ácidos graxos livres formam um estoque de sabão removível. A cor do óleo pode ser 25 removida por branqueamento com produtos químicos, tais como negro de carbono e terra de branqueamento. A terra de branqueamento e os produtos químicos podem ser separados do óleo por filtração. Oleo também pode ser desodorizado por tratamento com vapor.
Predominantemente a biomassa intacta, a biomassa homogeneizada ou micronizada (como uma pasta, flocos, pó ou farinha) e óleo de algas purificado podem ser combinados com outros ingredientes alimentícios para formar produtos alimentícios. Todos são uma fonte de óleo com um perfil nutricional favorável (teor de monoinsaturado relativamente 5 elevado). A biomassa predominantemente intacta, homogeneizada e micronizada também fornece proteína de alta qualidade (composição de aminoácidos equilibrada), carboidratos, fibras e outros nutrientes, como discutido acima. Alimentos incorporando qualquer um desses produtos podem ser feitos em forma vegetariana ou vegetal. Uma outra vantagem no uso de 10 biomassa de microalgas ou farinha de algas (ou predominantemente intacta ou homogeneizada (ou micronizada), ou ambos), como uma fonte de proteína é que é uma fonte de proteína vegetariana/vegetal que não é de uma fonte de alérgeno principal, tal como soja, ovos ou lacticínios.
Outros ingredientes alimentícios com os quais a biomassa de 15 algas ou farinha de algas e/ou óleo de algas podem ser combinados, de acordo com a presente invenção, incluem, sem limitação, grãos, frutos, vegetais, proteínas, carnes, ervas, especiarias, carboidratos e gorduras. Os outros componentes comestíveis com que a biomassa de algas ou farinha de algas e/ou óleo de algas são combinados para formar as composições alimentícias 20 dependem do produto alimentício a ser produzido e do sabor, textura e outras propriedades do produto alimentício desejado.
Apesar de, em geral, qualquer uma destas fontes de óleo de * algas poder ser utilizada em qualquer produto alimentício, a fonte preferida depende, em parte, se o óleo está presente, principalmente para fins 25 nutricionais ou calóricos em vez da aparência, textura ou sabor do alimento, ou altemativamente, se o óleo em combinação com outros ingredientes alimentícios destina-se a contribuir para um sabor, textura ou aparência da comida desejada, assim como, ou em vez de, melhorar o seu perfil nutricional ou calórico.
Os produtos alimentícios podem ser cozidos por processos convencionais, conforme desejado. Dependendo do comprimento e da temperatura, o processo de cozimento pode quebrar algumas paredes celulares, liberando o óleo de tal modo que se combina com outros componentes da mistura. No entanto, pelo menos algumas células de algas, muitas vezes sobrevivem à cozimento intacta. Em alternativa, os produtos alimentícios podem ser utilizados sem cozimento. Neste caso, a parede de algas permanece intacta, protegendo o óleo da oxidação.
A biomassa de algas ou farinha de algas, se fornecida na forma 10 de células predominantemente intactas, ou como um pó homogeneizado, difere de óleo, gordura ou ovos na medida em que pode ser fornecida como um ingrediente seco, facilitando a mistura com outros ingredientes secos, tal como a farinha. Em uma modalidade, a biomassa de algas ou farinha de algas é fornecida como um homogeneizado seco que contém entre 25 e 40% de óleo em peso seco. Um homogeneizado de biomassa também pode ser fornecido como pasta. Após a mistura dos ingredientes secos (e pasta de homogeneizado de biomassa, se utilizada), os líquidos como a água podem ser adicionados. Em alguns produtos alimentícios, a quantidade de líquido necessária é um tanto maior do que em um produto alimentício convencional por causa do componente de não óleo da biomassa e/ou porque a água não está sendo fornecida por outros ingredientes, tais como ovos. No entanto, a quantidade de água pode ser prontamente determinada como no cozimento ' convencional.
Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a uma composição de ingrediente alimentício compreendendo pelo menos 0,5% p/p de biomassa de algas ou farinha de algas que contêm pelo menos 10% de óleo de algas em peso seco, e pelo menos um outro ingrediente comestível, em que o ingrediente alimentício pode ser convertido em um produto alimentício reconstituído através da adição de um líquido para a composição de ingredientes alimentícios. Em uma modalidade, o líquido é água.
A biomassa rica em óleo homogeneizada ou micronizada é particularmente vantajosa no estado líquido, e/ou de produtos alimentícios emulsionados (emulsões de água em óleo e óleo em água), tais como 5 coberturas, sopas, bebidas, molhos para saladas, manteigas, cremes e semelhantes em que o óleo contribuído pela biomassa forma uma emulsão com outros líquidos. Produtos que se beneficiam da reologia melhorada, tal como corbeturas, molhos e cremes são descritos a seguir nos Exemplos. O uso de biomassa em uma emulsão homogeneizada com textura desejada (por 10 exemplo, a sensação da boca), sabor e aparência (por exemplo, a opacidade) pode formar um teor de óleo mais baixo (por peso ou por volume do produto em global) que é o caso com os produtos convencionais que empregam óleos convencionais, portanto, pode ser usada como um extensor de gordura. Isso é útil para produtos de baixo teor calórico (por exemplo, de dieta). O óleo de 15 algas purificado é também vantajoso para produtos líquidos e/ou emulsionados. A biomassa rica em óleo homogeneizada ou micronizada e óleo de algas purificado combinam bem com outros ingredientes comestíveis em produtos cozidos atingindo o sabor, aparência e textura semelhante ou melhor de produtos de outro modo semelhantes feitos com óleos, gorduras 20 e/ou ovos convencionais, mas com o perfil nutricional melhorado (por exemplo, maior teor de óleo monoinsaturado, e/ou maior teor ou qualidade da proteína, e/ou maior de fibras e/ou outros nutrientes).
Predominantemente a biomassa intacta é particularmente útil em situações em que é desejado mudar ou melhorar o perfil nutricional de um 25 alimento (por exemplo, maior teor de óleo, diferente teor de óleo (por exemplo, óleo mais monoinsaturado), maior teor de proteína, maior teor de calorias, maior teor de outros nutrientes). Tais alimentos podem ser úteis, por exemplo, por atletas ou pacientes que sofrem de distúrbios de desperdício. A biomassa predominantemente intacta pode ser usada como um agente de volume. Os agentes de volume podem ser utilizados, por exemplo, para aumentar a quantidade de um alimento mais caro (por exemplo, auxiliar de carne e semelhantes) ou em alimentos simulados ou de imitação, tais como substitutos de carnes vegetarianas. Alimentos simulados ou de imitação 5 diferem dos alimentos naturais pelo fato de que o sabor e o volume são geralmente fornecidos por fontes diferentes. Por exemplo, os sabores de alimentos naturais, tais como a carne, podem ser conferidos em um agente de volume que mantém o sabor. A biomassa predominantemente intacta pode ser usada como um agente de volume em tais alimentos. Predominantemente a 10 biomassa intacta também é particularmente útil em alimentos secos, tais como massas, pois tem boas propriedades de ligação de água, e pode, assim, facilitar a reidratação de tais alimentos. A biomassa predominantemente intacta é também útil como um agente de conservação, por exemplo, em produtos assados. A biomassa predominantemente intacta pode melhorar a 15 retenção de água e, portanto, a vida de prateleira.
A biomassa de algas ou farinha de algas rompida ou micronizada pode também ser útil como um agente de ligação, agente de volume ou para mudar ou aumentar o perfil nutricional de um produto alimentício. O rompimento de biomassa de algas ou farinha de algas pode ser 20 combinado com outra fonte de proteínas tais como a carne, proteína de soja, proteína de soro de leite, proteína de trigo, proteína de feijão, proteína de arroz, proteína de ervilha, proteína de leite, etc., em que a biomassa de algas ou farinha de algas como funções um agente de ligação e/ou de volume. A biomassa de algas ou farinha de algas que tenha sido rompida ou micronizada 25 pode também melhorar a retenção de água e, portanto, a vida de prateleira. A retenção de umidade aumentada é especialmente desejável em produtos sem glúten, tais como assados sem glúten. Uma descrição detalhada da formulação de um biscoito sem glúten usando biomassa de algas ou farinha de algas rompida e estudo da vida de prateleira subsequente é descrito nos Exemplos a seguir.
Em alguns casos, a biomassa de algas ou farinha de algas pode ser utilizada em preparações de ovo. Em algumas modalidades, a biomassa de algas ou farinha de algas (por exemplo, farinha de algas) adicionada a uma 5 preparação de ovo em pó seco convencional para formar ovos mexidos que são mais cremosos tem mais umidade e uma textura melhor do que a de ovos em pó seco preparada sem a biomassa de algas ou farinha de algas. Em outras modalidades, a biomassa de algas ou farinha de algas é adicionada a ovos líquidos inteiros, a fim de melhorar a textura e a umidade global de ovos que 10 são preparados e, em seguida, mantidos sobre uma mesa de vapor. Os exemplos específicos de preparações anteriores são descritos nos Exemplos abaixo.
A biomassa de algas ou farinha de algas (predominantemente intacta e/ou homogeneizada, ou micronizada) e/ou óleo de algas pode ser 15 incorporado em praticamente composição qualquer alimento. Alguns exemplos incluem produtos de assados, como bolos, brownies, bolo amarelo, pão, incluindo brioche, biscoitos incluindo biscoitos de açúcar, bolachas e tortas. Outros exemplos incluem produtos muitas vezes fornecidos na forma seca, como massas ou cobertos com pó, cremes secos, carnes trituradas e 20 substitutos de came. A incorporação de biomassa predominantemente intacta em tais produtos como um agente de ligação e/ou espessante pode melhorar a hidratação e aumentar o rendimento devido à capacidade de ligação de água da biomassa predominantemente intacta. Os alimentos reidratados, tais como ovos mexidos feitos de ovo em pó, também podem ter um perfil nutricional e 25 textura melhorada. Outros exemplos incluem produtos alimentícios líquidos, como molhos, sopas, coberturas (prontos para comer), cremes, bebidas de laticínios, sucos, cremosos, cremes. Outros produtos alimentícios líquidos incluem refrigerantes nutricionais que servem como um substituto de refeição ou leite de algas. Outros produtos alimentícios incluem manteigas ou queijos e semelhantes, incluída gordura vegetal, margarina/ manteiga, manteigas de noz e produtos de queijo, como molho nacho. Outros produtos alimentícios incluem barras energéticas, substituição de chocolate confecções-lecitina, barras de substituição de refeições, produtos de barra tipo granola. Outro tipo de produto alimentício é de massa de farinha e ovos e revestimentos. Ao fornecer uma camada de óleo em tomo de um alimento, a biomassa predominantemente intacta ou homogeneizado impede que um óleo adicional do meio de cozimento penetre um alimento. Assim, o alimento pode manter os benefícios de elevado teor de óleo monoinsaturado de revestimento, sem 10 ter de óleos menos desejáveis (por exemplo, as gorduras trans, gorduras saturadas e subprodutos a partir de óleo de cozinha). O revestimento da biomassa também pode fornecer uma textura desejável (por exemplo, crocante) para o alimento e um sabor mais limpo devido a uma menor absorção de óleo e de seus derivados.
Em alimentos não cozidos, a maioria das células de algas na biomassa permanece intacta. Isto tem a vantagem de proteger o óleo de algas da oxidação, o que confere uma longa vida de prateleira e minimiza a interação adversa com outros ingredientes. Dependendo da natureza dos produtos alimentícios, a proteção conferida pelas células pode reduzir ou 20 evitar a necessidade de refrigeração da embalagem a vácuo, ou semelhantes.
Células de retenção intactas também impedem o contato direto entre o óleo e a boca de um consumidor, o que reduz a sensação oleosa ou gordurosa, que pode ser indesejável. Nos produtos alimentícios em que o óleo é mais utilizado como suplemento nutricional, essa pode ser uma vantagem na 25 melhoria das propriedades organolépticas do produto. Deste modo, a biomassa predominantemente intacta é adequada para uso em tais produtos. No entanto, nos produtos não cozidos, tal como uma cobertura para salada, na qual o óleo transmite uma sensação oral desejada (por exemplo, uma emulsão com uma solução aquosa, tais como o vinagre), o uso de óleo de algas purificado ou biomassa micronizada é preferido. Em alimentos cozidos, algumas células de algas de biomassa intacta original podem ser lisadas, mas outras células de algas podem permanecer intacta. A razão de lisados de células intactas depende da temperatura e da duração do processo de 5 cozimento. Em alimentos cozidos em que a dispersão de óleo de um modo uniforme com outros ingredientes é desejável para a textura, sabor e/ou aparência (por exemplo, produtos de assado), o uso de biomassa micronizada ou óleo de algas purificado é preferido. Em alimentos cozidos, a biomassa de algas ou farinha de algas é usada para fornecer o óleo e/ou a proteína e outros 10 nutrientes, principalmente pelo seu valor nutritivo ou calórico em vez da textura.
A biomassa de algas ou farinha de algas pode ser também útil para aumentar o índice de saciedade de um produto alimentício (por exemplo, um cremoso ou bebida de substituição refeição) em relação a um produto 15 semelhante convencional, de outra forma, feito sem a biomassa de algas ou farinha de algas. O índice de saciedade é uma medida do grau em que o mesmo número de calorias de alimentos diferentes satisfaz o apetite. Esse índice pode ser medido pela alimentação de um alimento a ser testado e medição do apetite para outros alimentos em um intervalo fixo em seguida.
Quanto menos apetite para outros alimentos em seguida, maior o índice de saciedade. Os valores de índice de saciedade podem ser expressos em uma escala em que o pão branco é atribuído com um valor de 100. Os alimentos com maior índice de saciedade são úteis para fazer dieta. Apesar de não ser dependente de um entendimento do mecanismo, acredita-se que a biomassa 25 de algas ou farinha de algas aumenta o índice de saciedade de um alimento através do aumento do teor de proteína e/ou de fibras de alimentos para uma dada quantidade de calorias.
A biomassa de algas ou farinha de algas (predominantemente intacta e homogeneizada ou micronizada) e/ou óleo de algas pode também ser fabricada em suplementos nutricionais ou dietéticos. Por exemplo, o óleo de algas pode ser encapsulado em cápsulas de digestão de um modo similar ao óleo de peixe. Tais cápsulas podem ser embaladas em um frasco e tomadas em uma base diária (por exemplo, 1-4 cápsulas ou comprimidos por dia). A 5 cápsula pode conter uma dose unitária de biomassa de algas ou farinha de algas ou óleo de algas. Da mesma forma, a biomassa pode ser, opcionalmente, compactada com os excipientes farmacêuticos ou outros para formar comprimidos. Os comprimidos podem ser embalados, por exemplo, em uma embalagem blister ou frasco, e levados a uma dose diária de, por exemplo, 1-4 10 comprimidos por dia. Em alguns casos, a formulação de dosagem de comprimido ou outro compreende uma dose unitária de biomassa ou óleo de algas. A fabricação de produtos de cápsulas e comprimidos e outros suplementos é realizada preferencialmente em condições de GMP adequadas para suplementos nutricionais como codificado em 21 C.F.R. 111, ou 15 estabelecido em regulamentos comparáveis por jurisdições estrangeiras. A biomassa de algas ou farinha de algas pode ser misturada com outros pós e ser apresentada em sachês como um material pronto para mistura (por exemplo, com a água, suco, leite ou outros líquidos). A biomassa de algas ou farinha de algas pode também ser misturada em produtos, tais como iogurtes.
Embora a biomassa de algas ou farinha de algas e/ou óleo de algas possa ser incorporada em suplementos nutricionais, produtos alimentícios funcionais discutidos acima têm distinções de suplementos nutricionais típicas, as quais são na forma de comprimidos, cápsulas ou pós. O tamanho da dose de produtos alimentícios tais é tipicamente muito maior 25 do que um suplemento nutricional, tanto em termos de peso quanto em termos de calorias fornecidas. Por exemplo, os produtos alimentícios têm, frequentemente, um peso de mais de 100 g e/ou o fornecimento de pelo menos 100 calorias quando embalado ou consumido de uma só vez. Tipicamente os produtos alimentícios contêm pelo menos um ingrediente que é ou uma proteína, um carboidrato ou um líquido e muitas vezes contêm dois ou três desses outros ingredientes. A proteína ou carboidrato em um produto alimentício geralmente fornece pelo menos 30%, 50%, ou 60% das calorias do produto alimentício.
Como discutido acima, a biomassa de algas ou farinha de algas pode ser feita por um fabricante e vendida a um consumidor, tal como um restaurante ou individual, para uso num ambiente comercial, ou em casa. A biomassa de algas ou farinha de algas é preferencialmente fabricada e embalada em condições de Boas Práticas de Fabricação (GMP) para produtos alimentícios. A biomassa de algas ou farinha de algas em forma intacta ou predominantemente homogeneizada ou forma micronizada como um pó seco é muitas vezes embalada em um recipiente hermeticamente fechado, tal como i um saco selado. A biomassa homogeneizada ou micronizada em forma de pasta pode ser convenientemente embalada em um tonel entre outros recipientes. Opcionalmente, a biomassa de algas ou farinha de algas pode ser embalada sob vácuo, para aumentar a vida de prateleira. A refrigeração de biomassa de algas ou farinha de algas empacotada não é necessária. A biomassa de algas ou farinha de algas embalada pode conter instruções de uso, incluindo instruções para a quantidade de biomassa de algas ou farinha de algas para uso na substituição de uma determinada quantidade de óleo, gordura ou ovos em uma receita convencional, como discutido acima. Para simplificar, as direções podem afirmar que o óleo ou gordura devem ser ’ substituídos em uma razão de 2:1 em massa ou volume de biomassa, e ovos em uma razão de 1 Ig de biomassa ou 1 colher de chá de óleo de algas por ovo. Como discutido acima, são possíveis outras razões, por exemplo, usando uma razão de 10-175% de massa ou volume de biomassa para massa ou volume de óleo e/ou gordura e/ou ovos de uma receita convencional. Após a abertura de uma embalagem fechada, as instruções podem orientar o usuário a manter a biomassa de algas ou farinha de algas em um recipiente hermeticamente fechado, tal como aqueles amplamente disponíveis comercialmente (por exemplo, Glad), opcionalmente com refrigeração.
A biomassa de algas ou farinha de algas (em pó predominantemente intacta ou homogeneizada ou micronizada) pode também 5 ser embalada de uma forma combinada com outros ingredientes secos (por exemplo, açúcar, farinha, frutos secos, aromatizantes), e embalada separadas para assegurar uniformidade no produto acabado. A mistura pode então ser convertida em um produto alimentício, por um consumidor ou companhia de serviço de alimentos, simplesmente pela adição de um líquido, tal como água 10 ou leite e, opcionalmente, misturando e/ou cozinhando, sem adição de óleos ou gorduras. Em alguns casos, o líquido é adicionado para reconstituir uma composição de biomassa de algas ou farinha de algas seca. O cozimento pode, opcionalmente, ser realizado utilizando um forno de micro-ondas, forno de convecção, forno convencional, ou um fogão. Tais misturas podem ser usadas 15 para fazer bolos, pães, panquecas, waffles, bebidas, molhos e semelhantes.
Essas misturas têm vantagens de conveniência para o consumidor, bem como longa vida de prateleira sem refrigeração. Tais misturas são tipicamente embaladas em um recipiente fechado que carrega instruções para a adição de líquido para converter a mistura em um produto alimentício.
O óleo de algas para uso como ingrediente alimentício é igualmente preferencialmente, fabricado e embalado em condições GMP por um alimento. O óleo de algas é normalmente embalado em uma garrafa ou outro recipiente de uma forma semelhante para os óleos convencionalmente usados. O recipiente pode incluir uma etiqueta afixada com instruções para 25 uso do óleo em substituição de óleos, gorduras ou ovos convencionais em produtos alimentícios e, como um óleo de cozinha. Quando embalada em um recipiente fechado, o óleo tem uma longa vida de prateleira (pelo menos um ano), sem deterioração substancial. Após a abertura, o óleo de algas composto principalmente de óleos monoinsaturados não é extremamente sensível à oxidação. No entanto, as porções não utilizadas do óleo podem ser mantidas por mais tempo e com menos de oxidação se forem mantidas frias e/ou fora da luz solar direta (por exemplo, dentro de um espaço fechado, tal como um armário). As instruções incluídas com o óleo podem conter tais informações 5 de armazenamento preferidas.
Opcionalmente, a biomassa de algas ou farinha de algas e/ou o óleo de algas pode conter um conservante/antioxidante alimentar aprovado para maximizar a vida de prateleira, incluindo, mas não se limitando a, (por exemplo, carotenoides, astaxantina, luteína, zeaxantina, alfa-caroteno, beta10 caroteno e licopeno), fosfolipídios (por exemplo, N-acilfosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol fosfatidilcolina, e lisofosfatidilcolino), tocoferóis (por exemplo, alfa-tocoferol, beta-tocoferol, gama-tocoferol e tocoferol delta), tocotrienóis (por exemplo, alfa tocotrienol, beta tocotrienol, gama tocotrienol e delta tocotrienol), hidroxitolueno 15 butilado, hidroxianisol butilado, polifenóis, ácido rosmarínico, gaiato de propila, ácido ascórbico, ascorbato de sódio, ácido sórbico, ácido benzóico, metilparabeno, ácido levulínico, ácido anísico, ácido acético, ácido cítrico e bioflavonóides.
A descrição da incorporação de biomassa predominantemente 20 intacta, homogeneizada, ou biomassa micronizada (pasta, flocos, pó ou farinha) ou óleo de algas em alimento para a alimentação humana, em geral, é também aplicável a produtos alimentícios para animais não humanos.
A biomassa confere proteínas ou óleo de alta qualidade ou ambos em tais alimentos. O teor de óleo de algas é preferencialmente pelo 25 menos 10 ou 20% em peso assim como o teor de proteína das algas. A obtenção de pelo menos algum óleo de algas e/ou proteína intacta a partir de biomassa, predominantemente, por vezes, é vantajosa para alimentos para animais de alto desempenho, tais como cães ou cavalos de desporto. A biomassa predominantemente intacta é também útil como um agente de conservação. A biomassa de algas ou farinha de algas ou óleo é combinada com outros ingredientes normalmente encontrados em alimentos de origem animal (por exemplo, uma carne, sabor de carne, ácidos graxos, vegetais, frutas, amido, vitaminas, minerais, antioxidantes, probióticos) e suas combinações. Tais alimentos são também adequados para os animais domésticos, particularmente aqueles tendo um estilo de vida ativo. A inclusão da taurina é recomendada para alimentos de gato. Tal como acontece com os alimentos animais convencionais, o alimento pode ser fornecido em partículas de tamanho de mordida adequado para o animal pretendido.
A refeição deslipidada é útil como carga de alimentação para a produção de um concentrado e/ou isolado de proteínas de algas, em especial farinha deslipidada a partir de biomassa de algas ou farinha de algas contendo alto teor de proteína. O concentrado e/ou isolado de proteínas de algas pode ser produzido usando processos padrões usados para produzir concentrado/isolado de proteína de soja. Um concentrado de proteína de algas seria preparado através da remoção de açúcares solúveis a partir de biomassa de algas ou farinha de algas ou refeição deslipidada. Os componentes restantes seriam, sobretudo, proteínas e polissacarídeos insolúveis. Através da remoção dos açúcares solúveis da refeição deslipidada, o teor de proteína é aumentado, criando assim um concentrado de proteína de algas. Um concentrado de proteína de algas que iria conter pelo menos 45% de proteína em peso seco. Preferencialmente, um concentrado de proteína de algas que iria conter pelo menos 50% -75% de proteína em peso seco. O isolado de proteína de algas também pode ser preparado utilizando processos padronizados utilizados para a produção de proteína de soja isolada. Este processo geralmente envolve uma etapa de extração de pH básico e temperatura usando NaOH. Após a etapa de extração, os líquidos e sólidos são separados e as proteínas são precipitadas fora da fração líquida com HC1. A fração de sólidos pode ser re-extraída e as frações líquidas resultantes podem ser combinadas antes da precipitação cõm ácido clorídrico. A proteína é então neutralizada e seca por pulverização para produzir um isolado de proteína. Um isolado de proteína de algas ar normalmente contém pelo menos 90% em peso seco de proteína.
A refeição delipidada é útil como ração animal para animais de criação, por exemplo, ruminantes, aves, suínos, e de aquicultura. A refeição deslipidada é um subproduto da preparação purificada de óleo de algas, quer para a alimentação ou para outros fins. A refeição resultante, apesar de ter reduzido teor de óleo contém ainda as proteínas, carboidratos, fibras, cinzas e 10 outros nutrientes de alta qualidade apropriados para uma ração para animais.
Uma vez que as células são lisadas, predominantemente, a refeição deslipidada é facilmente digerível por esses animais. A refeição deslipidada pode, opcionalmente, ser combinada com outros ingredientes, tais como grãos, em uma ração para animais. Devido a refeição deslipidada ter uma 15 consistência pulverulenta, a mesma pode ser pressionada em pelotas utilizando uma extrusora ou expansores que estão disponíveis comercialmente.
A. Alimentos Aerados
O alimento aerado é um termo que normalmente se aplica a 20 sobremesas, mas também pode se aplicar aos alimentos que não são sobremesas formulados com os mesmos princípios. Sobremesas aeradas referem-se a sobremesas como musse, sorvete, coberturas batidas, sorbets, etc.. Alimentos aerados são compostos de duas fases: uma fase contínua e uma fase descontínua. A fase descontínua é o ar, que é mantida como células 25 de ar ou bolhas de ar no artigo alimentar. A fase contínua pode ser constituída por água, água com sólidos dissolvidos (como o leite), sólidos coloidais, proteínas, etc.. Como os alimentos aerados são compostos de uma fase descontínua de ar, a capacidade de reter o ar em células de ar no interior dos alimentos é crítica para a formulação com sucesso de um alimento aerado.
Emulsionantes ajudam a formar as células de ar para a fase descontínua e estabilizantes podem ajudar a manter as células de ar intactas no interior do alimento. Um efeito surpreendente e inesperado da adição de biomassa de algas ou farinha de algas (especialmente farinha de microalgas ricas em lipídios) na preparação de um alimento aerado é a capacidade de retenção de ar da biomassa. A biomassa de algas ou farinha de algas, especialmente a farinha de microalgas rica em lipídios tem excelente capacidade de retenção e de estabilização do ar. A farinha de microalgas ou biomassa de algas da invenção também tem uma grande capacidade de emulsificação e, por conseguinte, é adequada para uso em produtos alimentícios aerados.
Os produtos de assados, como bolos, gorduras incluindo os lipídios contribuídos pela farinha de algas ou biomassa de microalgas rica em lipídios desempenham vários papéis cruciais: (1) as gorduras são parcialmente responsáveis pela textura leve e aerada, mantendo ou estabilizando bolhas de ar minúsculas que se formam a partir do agente de fermentação no bolo (o mesmo pode ser verdade em pães); (2) gorduras criam a textura de “derreter na boca” e outras propriedades organolépticas, revestindo as proteínas de farinha e proibindo a formação de glúten, (3) as gorduras sólidas (com elevado grau de saturação) normalmente têm uma maior capacidade de retenção de ar ou de estabilização do que as gorduras líquidas, o que resulta em uma textura mais leve, e (4) emulsionantes (tais como mono e diglicerídeos) ajudam na distribuição da gordura na massa, o que resulta em uma melhor distribuição das bolhas de ar na massa, levando a uma textura leve e aerada do bolo ou assados. Embora a farinha de algas ou biomassa de algas rica em gordura contenha mono- e diglicerídeos, a mesma não contém gorduras saturadas (ao contrário de gorduras sólidas, tais como manteiga/banha). Assim, é inesperado que a farinha de algas ou biomassa de algas rica em lipídios tenha tão grande capacidade de manutenção/estabilização do ar e produza a mesma textura aerada/com luz de produtos de assados quando se utiliza apenas a farinha de algas ou biomassa de algas para substituir a manteiga e/ou gemas de ovo.
Outro exemplo de um alimento aerado é sorvete (ou sorbets e gelados, etc). O sorvete pode ser definido como uma espuma parcialmente congelada, geralmente com um teor de 20% de ar ou maiores (fase descontínua). A fase contínua contém sólidos dissolvidos e coloidais, ou seja, açúcares, proteínas, estabilizantes, e uma fase graxa em uma forma emulsionada. Sob um microscópio eletrônico, a estrutura do gelado parece ser composta por células de ar que são revestidas por glóbulos de gordura, entre os cristais de gelo que formam a fase contínua. As capacidades emulsionante e o teor de lipídios na farinha de algas ou biomassa de algas a toma adequada para uso na formulação de um gelado. Outros exemplos não limitantes de alimentos aerados incluem musse (tanto salgados quanto doces), glacê/creme batido e merengue. O aeramento é também responsável pela leveza que é encontrada em alguns bolos (por exemplo, bolo alimentício de claras), biscoitos, pães ou molhos.
B. Carnes Reformadas e Trituradas
As cames trituradas são, essencialmente, um sistema de duas fases constituído por uma dispersão de um sólido e um líquido, onde o sólido é imiscível. O líquido é uma solução aquosa de sais e, ao mesmo tempo, é um meio no qual as proteínas insolúveis (e outros componentes) das fibras do músculo, gordura e tecido conjuntivo da carne (os sólidos) são dispersas e formam uma matriz. Embora este sistema de duas fases não seja tecnicamente uma emulsão que tenha componentes e aspectos estruturais de uma “emulsão” de carne. O estado estável desta emulsão de carne é responsável pela integridade das cames trituradas e reformadas. A fase sólida de cames trituradas é constituída por cames processadas (contendo fibras musculares, de tecido conjuntivo e gordura, entre outros componentes) que tenham sido picados ou moídos até obter uma consistência encontrada em cames forçadas.
A fase sólida é incorporada, em seguida, com a fase líquida para formar uma emulsão de carne. Exemplos comuns de carnes trituradas incluem as salsichas, mortadelas, linguiça, rodelas de carne (por exemplo, rodelas de hambúrgueres) e carnes enlatadas.
As carnes reformadas referem-se à carne que foi mecanicamente separadá e depois reformada em formatos. Devido a came ser “reformada”, o produto de came pode ter um artefato com a aparência de um corte, uma fatia ou porção da came que tenha sido rompida, que é formada por “queda” de carne picada, com ou sem a adição de came finamente triturada, por de que as proteínas solúveis da came picada se ligam os pequenos pedaços em conjunto. A separação mecânica da carne pode incluir corte, moagem ou outras formas de processamento de carne em pedaços menores, diminuindo assim as fibras musculares. Uma vez que as fibras de carne originais foram quebradas, a formação de uma emulsão de carne parcial (semelhante a carnes trituradas) é necessária para manter o produto de carne reformada em conjunto. Os exemplos não limitantes de produtos de carnes reformadas são nuggets de frango, cortes gelados embalados (por exemplo, presunto, peru, etc.) e tiras de peixe.
A biomassa de algas ou farinha de algas da invenção pode ser adicionada como um ingrediente em carnes trituradas e reformadas. A biomassa de algas ou farinha de algas pode ter um efeito multifuncional em produtos de carne. Um aspecto é o de que a biomassa de algas ou farinha de algas pode agir como um agente de volume ou produto de enchimento. Outro aspecto é que os lipídios, carboidratos e proteínas a partir da biomassa de algas ou farinha de algas agem como um ligante para os outros componentes na carne triturada/reformada. Outra vantagem que é bastante surpreendente e inesperada, é que a biomassa de algas ou farinha de algas (em particular farinha de algas rico em lipídios) pode melhorar a textura e sabor de carne triturada e/ou de produtos de came reformadas, especialmente se o produto de came é feito com carnes contendo baixo teor de gordura. O bife moído (4% de gordura) e peru moído (3% de gordura) com baixo teor de gordura têm uma textura seca e mastigável resistente e podem ter um sabor de carne “atípico” semelhante a fígado. A adição de farinha de algas ou biomassa de algas rica em lipídios pode resultar na melhoria tanto da textura quanto do sabor de cames trituradas e/ou reformadas feitas com tais cames com baixo teor de gordura. Em tais casos, o produto de came de baixo teor de gordura terá uma textura que é mais úmida e mais macia e um sabor que é mais rico e mais parecido com came do que sem a adição de farinha de algas ou biomassa de algas rica em lipídios, dando ao produto de carne uma textura de baixa gordura que é semelhante à de um bife moído (20% gordura) ou peru moído (15% de gordura) com alto teor de gordura. A adição da biomassa de algas ou farinha de algas em cames trituradas e/ou reformadas pode criar um produto de carne mais saudável (baixo teor em gordura), apesar de terem a textura e sabor de um produto de came com alto teor de gordura.
C. Miméticos de Laticínios
A farinha de algas ou biomassa de algas pode ser utilizada como um substituto de laticínio ou mimético laticínio (exemplos incluem o uso de farinha de algas em vez da manteiga). A farinha de algas ou biomassa de algas pode também ser usada como um extensor, quando misturada com o queijo modificado por enzimas (em aroma de queijo ou molhos de queijo). Adicionalmente, a farinha de algas ou biomassa de algas pode também ser usada para fazer bebidas, tais como leite de algas. A farinha de algas ou biomassa de algas pode também aumentar a cremosidade de um produto alimentício (alimentos em que os produtos de laticínio são adicionados para dar à comida uma textura cremosa), tais como macarrão e queijo, leite de soja, leite de arroz, leite de amêndoa, iogurte, sorvetes, creme batido, etc.
A farinha de algas ou biomassa de algas deslipidada pode também ser usada como um mimético de laticínios. A farinha de algas ou
100 biomassa de algas desengordurada ou deslipidada não contém quantidades substanciais de óleo após a extração. Dependendo do método de processamento, a farinha de algas ou biomassa de algas desengordurada pode incluir fosfolipídios que são um componente da biomassa de algas ou farinha de algas. A farinha de algas desengordurada ou biomassa de algas é não de laticínios e também é potencialmente muito baixo em teor em gordura (em comparação com os óleos hidrogenados contenda gordura trans utilizada atualmente para preparar cremes de não de laticínios). Quando adicionada ao café, a farinha de algas ou biomassa de algas desengordurada pode reduzir a amargura no café e dar uma sensação na boca de cremoso (plenitude). O produto é adequado como um creme ou para uso em mochas, chocolates quentes, frappé, e outras bebidas à base de café.
Os exemplos seguintes são apresentados para ilustrar, mas não limitar, a invenção reivindicada.
V. EXEMPLOS
EXEMPLO 1
Cultivo de Microalgas para Atingir Alto teor de Oleo
Cepas de microalgas foram cultivadas em frascos com agitação com um objetivo de atingir mais de 20% de óleo por peso seco de células. Os meios do frasco utilizados foram como segue: K2HPO4: 4,2 g/L, NaH2PO4: 3,1 g/L, MgSO4-7H2O: 0.24g/L, ácido cítrico mono-hidratado: 0,25 g/L, CaCL, 2H2O: 0,025 g/L, extrato de levedura: 2 g/L, e 2% de glicose. As células criopreservadas foram descongeladas à temperatura ambiente e 500 ul de células foram adicionados a 4,5 ml de Meio e cultivadas durante 7 dias a 28°C com agitação (200 rpm) em uma placa de 6 poços. Pesos de células secas foram determinados por centrifugação de 1 ml de cultura a 14,000 rpm durante 5 min em um tubo de Eppendorf pré-pesado. O sobrenadante da cultura foi rejeitado e a pelota de células resultante foi lavado com 1 ml de água deionizada. A cultura foi novamente centrifugada, o sobrenadante
101 descartado e as pelotas de células colocados a -80°C até serem congelados. As amostras foram, em seguida, liofilizadas durante 24 horas e os pesos de células secas foram calculados. Para a determinação do total de lipídios em culturas de 3 ml de cultura foram removidas e submetidas a análise usando um sistema Ankom (Ankom Inc., Macedon, NY) de acordo com o protocolo do fabricante. As amostras foram submetidas à extração com solvente em um extrator XT 10 Amkom de acordo com o protocolo do fabricante. O lipídio total foi determinado como a diferença em massa entre amostras secas hidrolisadas com ácido e amostras secas extraídas com solvente. As medições percentuais de peso seco de células de óleo são mostradas na Tabela 1.
Tabela 1. Percentual de Óleo por peso seco de células
Espécies Cepa % de óleo Cepa#
Chlorella protothecoides UTEX 250 34,24 1
Chlorella protothecoides UTEX 25 40.00 2
Chlorella protothecoides CCAP211/8D 47,56 3
Chlorella kessleri UTEX 397 39,42 4
Chlorella kessleri UTEX 2229 54.07 5
Chlorella kessleri UTEX 398 41,67 6
ParaChlorella kessleri SAG 11,80 37,78 7
ParaChlorella kessleri SAG 14,82 50,70 8
ParaChlorella kessleri SAG 21,11 H9 37,92 9
Prototheca stagnora UTEX 327 13,14 10
Prototheca moriformis UTEX 1441 18.02 11
Prototheca moriformis UTEX 1435 27,17 12
Chlorella minutissima UTEX 2341 31,39 13
Chlorella sp. UTEX 2068 45,32 14
Chlorella sp. CCAP 211/92 46,51 15
Chlorella sorokiniana SAG211.40B 46,67 16
ParaChlorella beijerinkii SAG 2046 30,98 17
Chlorella luteoviridis SAG 2203 37,88 18
Chlorella vulgaris CCAP211/11K 35,85 19
Chlorella reisiglii CCAP 11/8 31,17 20
Chlorella ellipsoidea CCAP 211/42 32,93 21
Chlorella saccharophila CCAP 211/31 34,84 22
Chlorella saccharophila CCAP 211/32 30,51 23
As cepas adicionais de Chlorella protothecoides também foram crescidas utilizando as condições descritas acima, bem como o perfil de lipídio foi determinado para cada uma destas cepas Chlorella protothecoides 15 utilizando a procedimentos padrões de cromatografia gasosa (GC/FID). Um resumo do perfil lipídico está incluído abaixo. Os valores são expressos como porcentagem de área de lipídios totais. Os números da coleção com UTEX são cepas de algas da Coleção de Algas de UTEX da Universidade de Texas,
102
Austin (1 University Station A67Ó0, Austin, Texas 78712-0183). Os números de coleções com CCAP são variedades de algas da Coleção Cultura de algas e protozoários (SAMS Research Services, Ltd. Scottish Marine Institute, OBAN, Argull PA37 1QA, Scotland, United Kingdom). O número de coleção 5 com o SAG são cepas de algas da Coleção de Cultura de Algas na
Universidade Goettingen (Nikolausberger Weg 18, 37073 Gottingen, Alemanha)
Coleção Número C12:0 Cl 4:0 C16:0 C16:l Cl 8:0 C18:l C18:2 C18:3 C20:0 C20:l
UTEX 25 0,0 0,6 8,7 0,3 2,4 72,1 14,2 1,2 0,2 0,2
UTEX 249 0,0 0,0 9,7 0,0 2,3 72,4 13,7 1,9 0,0 0,0
UTEX 250 0,0 0,6 10,2 0,0 3,7 69,7 14,1 1,4 0,3 0,0
UTEX 256 0,0 0,9 10,1 0,3 5,6 64,4 17,4 1,3 0,0 0,0
UTEX 264 0,0 0,0 13,3 0,0 5,7 68,3 12,7 0,0 0,0 0,0
UTEX 411 0,0 0,5 9,6 0,2 2,8 71,3 13,5 1,5 0,2 0,2
CCAP 211/17 0,0 0,8 10,5 0,4 3,3 68,4 15,0 1,6 0,0 0,0
CCAP 221/8d 0,0 0,8 11,5 o,l 3,0 70,3 12,9 1,2 0,2 0,0
SAG 221 lOd 0,0 E4 17,9 0,1 2,4 55,3 20,2 2,7 0,0 0,0
Estes dados indicam que. , embora todas as cepas acima sejam
Chlorella protothecoides, existem diferenças i no perfil de lipídios entre
algumas das cepas.
EXEMPLO 2
Três processos de fermentação foram realizados com três diferentes formulações de meios com o objetivo de gerar biomassa de algas com alto teor de óleo. A primeira formulação (meio 1) baseou-se no Meio 15 descrito em Wu et al. (1994 Science in China, vol. 37, No. 3, pp. 326-335) e consistia em por litro: KH2PO4, 0,7 g; K2HPO4, 0,3 g; MgSO4-7H2O, 0,3 g; FeSO4-7H2O, 3 mg; cloridrato de tiamina, 10 pg; glicose, 20 g; glicina, 0,1 g; H3BO3, 2,9 mg; MnCl2-4H2O, l,8mg; ZnSO4-7H2O, 220pg; CuSO4-5H2O, 80pg e NaMoO4-2H2O, 22,9mg. O segundo meio (Meio 2) foi obtido a partir 20 dos meios de frascos descritos no Exemplo 1 e consistia em, por litro: K2HPO4, 4,2g, NaH2PO4, 3,1 g; MgSO4-7H2O, 0,24 g; mono-hidrato de ácido cítrico, 0,25 g; cloreto de cálcio desidratado, 25mg; glicose, 20 g; extrato de levedura, 2g. O terceiro meio (Meio 3) era um híbrido e consistia em, por litro: K2EtPO4, 4,2g, NaH2PO4, 3,1 g; MgSO4-7H2O, 0,24 g; mono-hidrato de 25 ácido cítrico, 0,25 g; cloreto de cálcio desidratado, 25 mg; glicose, 20 g;
103 extrato de levedura, 2g; H3BO3, 2,9 mg; M11CI2-4H2O, 1,8 mg; Z11SO4-7H2O, 220pg; CuSO4-5H2O, 80pg e NaMoO4-2H2O, 22,9mg. Todas as três formulações de meios foram preparadas e esterilizadas em autoclave, em vasos de fermentador de escala de laboratório durante 30 minutos a 121 °C. Glicose estéril foi adicionada a cada vaso após esterilização a frio em autoclave.
O inóculo para cada fermentador foi Chlorella protothecoides (UTEX 250), preparada em dois estágios com frascos usando as condições de temperatura e o meio do fermentador inoculado. Cada fermentador foi inoculado com 10% (v/v) de cultura de mid-log. Os três fermentadores de escala de laboratório foram mantidos a 28°C durante a duração da experiência. O crescimento de células de microalgas no Media 1 também foi avaliado a uma temperatura de 23°C. Para todas as avaliações do fermentador, o pH foi mantido a 6,6-6,8, agitações em 500rpm e fluxo de ar a 1 wm. Culturas de fermentação foram cultivadas durante 11 dias. Acumulação de biomassa foi medida por densidade óptica a 750 nm e o peso de células secas.
A concentração de lipídio/óleo foi determinada utilizando transesterificação direta com métodos de cromatografia de gás padrão. Resumidamente, as amostras de caldo de fermentação com biomassa foram transferidas para papel absorvente e transferidas para tubos de centrífuga e secos em uma estufa de vácuo a 65-70°C durante 1 hora. Quando as amostras foram secas, 2 ml de H2SO4 a 5% em metanol foi adicionado aos tubos. Os tubos foram aquecidos em seguida em um bloco de aquecimento a 65-70°C durante 3,5 horas, enquanto são submetidos a vórtice e sonicados intermitentemente. 2 ml de heptano foram então adicionados e os tubos foram agitados vigorosamente. 2 ml de K2CO3 6% foram adicionados e tubos foram agitados vigorosamente para mistura e, em seguida, centrifugados a 800 rpm durante 2 minutos. O sobrenadante foi, então, transferido para frascos de GC contendo agente de secagem Na2SO4 e foi executado através de métodos
104 padrões de cromatografia de gás. O percentual de lipídio/óleo foi baseado em base de peso seco de células. Os pesos secos de células para células cultivadas usando meios: 1 a 23°C foi de 9,4 g/L; Meio 1 a 28°C foi de 1,0 g/L, Meio 2 a 28°C foi de 21,2 g/L, e Meio 3 a 28°C foi de 21,5 g/L. A concentração de 5 lipídio/óleo para células cultivadas usando: Meio 1 a 23°C foi de 3 g/L; Meio 1 a 28°C foi de 0,4 g/L; Meio 2 a 28°C foi de 18 g/L, e Meio 3 a 28°C foi de 19 g/L. O percentual de óleo com base no peso seco de células por células cultivadas usando: Meio 1 a 23°C foi de 32%; Meio 1 a 28°C foi de 40%; Meio 2 a 28°C foi de 85%, e Meio 3 a 28°C foi de 88%. Os perfis de lipídios 10 (% em área, após a normalização para o padrão interno) para a biomassa de algas gerada usando as três formulações de meios diferentes, a 2 8 °C «te encontram-se resumidos na Tabela 2 abaixo.
Tabela 2. Perfil lipídico para Chlorella protothecoides cultivada em diferentes meios.
Meio 1 28°C (em % de Área) Meio2 28°C (em % de Área) Meio 3 28°C (em % de Área)
C14:0 1,40 0,85 0,72
C16:0 8,71 7,75 7,43
C16:l — 0,18 0,17
C17:0 — 0,16 0,15
C17:l — 0,15 0,15
C18:0 3,77 3,66 4,25
C18:l 73,39 72,72 73,83
C18:2 11,23 12,82 11,41
C18:3 alfa 1,50 0,90 1,02
C20:0 — 0,33 0,37
C20:l — 0,10 0,39
C20:l — 0,25 —
C22:0 — 0,13 0,11
EXEMPLO 3
Preparação.......de Biomassa.....para......Prqdutqg.....Alimentares
A biomassa de microalgas foi gerada por cultivo de microalgas, tal como descrito em qualquer uma dos Exemplos 1-2. A biomassa de microalgas foi colhida a partir do fermentador, frasco ou outro biorreator.
Os procedimentos de GMP foram seguidos. Qualquer pessoa que, através de exame médico ou observação de supervisão, mostre ter, ou
105 pareça ter, uma doença, lesão aberta, incluindo furúnculo, machucado, ou feridas infectada, ou qualquer outra fonte de contaminação microbiana anormal pela qual há uma razoável possibilidade de alimentos ou superfícies de contato com alimentos ou materiais de embalagem alimentares se tomarem 5 contaminados deve ser excluída de quaisquer operações que possam ser esperadas de causar contaminação, até que a condição seja corrigida. As pessoas são instruídas a relatar problemas de saúde aos seus supervisores. Todas as pessoas que trabalham em contato direto com a biomassa de microalgas, superfícies de contato com biomassa, e materiais de embalagem 10 de biomassa em conformidade com as práticas de higiene durante o serviço na medida necessária para proteger contra a contaminação da biomassa de microalgas. Os métodos para a manutenção de limpeza incluem, mas não estão limitados a: (1) uso de roupas exteriores adequadas para o funcionamento de uma maneira que protege contra a contaminação de 15 biomassa, superfícies de contacto com biomassa ou materiais de embalagem de biomassa. (2) Manter a higiene pessoal adequada. (3) Para lavar as mãos cuidadosamente (e esterilizando se necessário, para proteger contra a contaminação por microrganismos indesejáveis) em instalações de lavagem das mãos adequadas antes de iniciar o trabalho, depois de cada ausência da 20 estação de trabalho, e em qualquer outra ocasião em que as mãos podem ter ficado sujas ou contaminadas. (4) Retirar todas as joias não seguras e outros objetos que possam cair em equipamentos de biomassa, ou recipientes e remoção de joias da mão que não podem ser adequadamente higienizadas durante os períodos em que a biomassa é manipulada por mão. Se joia de mão 25 não pode ser removida, pode ser coberta por material que pode ser mantido em uma condição intacta, limpa e higiênica e que protege eficazmente contra a contaminação por esses objetos da biomassa, superfícies de contacto com biomassa, ou materiais de embalagem de biomassa. (5) manutenção de luvas, se elas são utilizadas no tratamento de biomassa, em um estado intacto, limpo
106 e higiênico. As luvas devem ser de um material impermeável. (6) Vestir, se for o caso, de uma forma eficaz, redes de cabelo, bandanas, bonés, capas de barba, cabelo ou outras restrições eficazes. (7) roupas de armazenamento ou outros pertences pessoais em áreas diferentes de onde a biomassa é exposta ou onde equipamentos ou utensílios são lavados. (8) Limitar o seguimento para outras áreas onde a biomassa é exposta ou onde equipamentos ou utensílios são lavados: biomassa de comer, gomas de mascar, bebidas, ou uso de tabaco.
(9) Tomar quaisquer outras precauções necessárias para proteger contra a contaminação da biomassa, superfícies de contato com biomassa, ou materiais de embalagem de biomassa com microrganismos ou substâncias estranhas incluindo, mas não limitado a, suor, cabelo, cosméticos, tabaco, produtos químicos e medicamentos aplicada à pele. A biomassa de microalgas pode, opcionalmente, ser submetida a um processo de ruptura celular para gerar um lisado e/ou, opcionalmente, seca para formar uma composição de biomassa de microalgas.
EXEMPLO 4
Ausência de Toxinas de Algas em Biomassa de Chlorella protothecoides seca Uma amostra de biomassa de Chlorella protothecoides (UTEX 250) foi cultivada e preparada utilizando os métodos descritos no Exemplo 1. A biomassa seca foi analisada por meio de análise de cromatografia líquida-espectrometria de massa/cspectrometria de massa (LCMS/MS) para detectar a presença de contaminação de toxinas de algas e cianobactérias. As análises cobriram todos os grupos de toxinas de algas e cianobactérias publicados na literatura e mencionados nos regulamentos internacionais de alimentos. Os resultados mostram que a amostra de biomassa não continha quaisquer níveis detectáveis de qualquer uma das toxinas de algas ou cianobactérias que foram testadas. Os resultados estão resumidos na Tabela 3.
107
Tabela 3. Resultados analíticos de LC-MS/MS para as toxinas de algas e cianobactérias.
Categoria de Toxina Toxina Resultado Limite de detecção (LC/MS)
Toxinas de Envenenamento do marisco amnésico (ASP) Ácido domóico Não detectável 1 pg/g
Toxinas de Envenenamento do marisco diarreico (DSP) Ácido ocadaico e Dinofisistoxinas Não detectável 0,1 pg/g
Pectenotoxicinas Não detectável 0,1 pg/g
Yessotoxicinas Não detectável 0,1 Pg/g
Azaspiracidas Não detectável θ,ι pg/g
Gimnodiminas Não detectável o,l pg/g
Toxinas de Envenenamento do marisco Paralítico (PSP) T Saxitoxina Não detectável (HPLC/FD) 0,3 pg/g
Neosaxitoxina Não detectável (HPLC/FD) 0,3 pg/g
Decarbamoilsaxitoxina Não detectável (HPLC/FD)) 0,3 pg/g
Goniautoxicinas Não detectável (HPLC/FD) 0,3 pg/g
Toxinas de Envenenamento do marisco Neurotóxico (NSP) Brevetoxicinas Não detectável 0,1 pg/g
Toxinas Cianobacterianas Microsistinas MC-RR, MC-LR, MC-YR, MCLA, MC-LW e MC-LF Não detectável 0,1 pg/g
Nodularina Não detectável 0,1 pg/g
Anatoxina-a Não detectável 0,5 pg/g
Cilindrospermopsins Não detectável 0,2 pg/g
Beta-Metilamino-LAlanina Não detectável 2,5 pg/g
EXEMPLO 5
Teor de fibra dietética de biomassa de Chlorella protothecoides
A análise proximal foi realizada em amostras de biomassa de
Chlorella protothecoides secas (UTEX 250) crescidas e preparadas utilizando os métodos descritos no Exemplo 1, de acordo com Métodos Oficiais de ACOC International (Método AO AC 991,43). A hidrólise ácida para o teor de gordura total (lipídio/óleo) foi realizada em ambas as amostras e o teor de 10 gordura para a biomassa de algas rica em lipídios foi de aproximadamente 50% e para a biomassa de algas rica em proteínas foi de aproximadamente 15%. O teor de fibra bruta foi de 2% tanto para a biomassa de algas rica em lipídios quanto rica em proteínas. A umidade (determinada por gravimetria) foi de 5%, tanto para a biomassa de algas rica em lipídios quanto rica em 15 proteínas. O teor de cinzas determinado pela queima de cadinho e análise da cinza inorgânica foi de 2% para a biomassa de algas rica em lipídios e de 4% para a biomassa rica em proteínas. A proteína bruta, determinada pela quantidade de nitrogênio liberado pela combustão de biomassa de cada, foi de
108
5% para a biomassa rica em lipideos e 50% para a biomassa rica em proteínas. O teor de carboidratos foi calculado pela diferença, tendo os valores acima conhecidos para gordura, fibra bruta, umidade, cinzas e proteína bruta e subtraindo esse total de 100. O teor de carboidratos calculado para a biomassa rica em lipídios foi de 36% e o teor de carboidratos para a biomassa rica em proteínas como 24%.
Uma posterior análise do teor de carboidratos para ambas as biomasssa de algas mostrou aproximadamente 4-8% (p/p) de açúcares livres (predominantemente sacarose) nas amostras. Lotes múltiplos de biomassa de algas contendo alto teor de lipídio foram testados para os açúcares livres (ensaios de frutose, glicose, sacarose, maltose e lactose) e a quantidade de sacarose variou de 2,83% para 5,77%; a maltose variou de não detectável para 0,6% e glicose variou de não detectável para 0,6%. Os outros açúcares, a saber, frutose, maltose e lactose não foram detectados em nenhum dos lotes ensaiados. Lotes múltiplos de biomassa contendo proteína de alta algal também foram testados para teor de açúcares livres e apenas sacarose foi detectada em algum dos lotes na faixa de 6,93% a 7,95%.
A análise do teor de fibra dietética total (dentro da fração de carboidratos da biomassa das algas) de ambas as biomassas de algas foi realizada utilizando métodos de acordo corn os Métodos Oficiais de ACOC International (Método AO AC 991,43). A biomassa lipídica elevada continha 19,58% de fibra solúvel e 9,86% de fibra insolúvel, para um total de fibra dietética de 29,44%. A biomassa da proteína continha 10,31% de fibra solúvel e 4,28% de fibra insolúvel para um total de fibra dietética de 14,59%.
Análise de monossacarídeo da biomassa de algas
Uma amostra de biomassa de Chlorella protothecoides seca (UTEX 250) com cerca de 50% de lipídios por peso seco de células, crescidas e preparada utilizando os métodos descritos no Exemplo 4 foi analisada para composição monossacarídeo (glicosil) utilizando cromatografia de
109 gás/espectrometria de massa combinada (GC/MS) de derivados de per-Otrimetilsilil (TMS) de glicósidos de metil monossacarídeos produzidos a partir da amostra por metanólise ácida. Resumidamente, os glicosídeos de metila foram primeiro preparados a partir da amostra de Chlorella protothecoides seca por metanólise em HC1 1M em metanol a 80°C para 18-22°C, seguida de re-N-acetilação com anidrido acético e piridina em metanol (para a detecção de osaminas). As amostras foram, em seguida, per-O-trimetilsililado por tratamento com Tri-Sil (Pierce) a 80°C durante 30 minutos. Estes procedimentos foram previamente descritos em Merkle e Poppe (1994) Methods Enzymol. 230:1-15 e York et al. (1985) Methods Enzymol. 118:3-40. A análise de GC/MS dos glicosídeos metílicos de TMS foi efetuada em um HP 6890 GC em interface com um MSD 5975b, utilizando uma coluna capilar de silica fundida All Tech EC-1 (30m x 0,25 mm ID). Os monossacarídeos foram identificados pelos seus tempos de retenção em comparação com os padrões, e os caracteres destes carboidratos foram autenticados pelo seu espectro de massa. A composição de monossacarídeo (glicosil) de Chlorella protothecoides foi: 1,2 % molar de arabinose, 11,9% molar de manose, galactose 25,2% molar e 61,7 % molar de glicose. Estes resultados são expressos em porcentagem molar de carboidrato total.
EXEMPLO 6
Perfil de aminoácidos da biomassa das algas
Uma amostra de biomassa de Chlorella protothecoides seca (UTEX 250) com cerca de 50% lipídios por peso seco de célula, crescida e preparada utilizando os métodos descritos no Exemplo 1 foi analisada quanto ao teor de aminoácidos de acordo com o Métodos Oficiais de AOAC International (análise de triptofano: método AOAC 988,15; análise de metionina e cistina: método AOAC 985,28 e os outros aminoácidos: método AOAC 994,12). O perfil de aminoácidos a partir da biomassa seca das algas (expresso em porcentagem de proteína total) foi comparado com o perfil de
110 aminoácidos do ovo inteiro seco (perfil de folha de características do produto para o ovo inteiro, Protein Fatory Inc., Nove Jérsei), e os resultados mostram que as duas fontes de proteínas têm valores nutricionais comparáveis. Os resultados do perfil de aminoácidos em relação a uma amostra de Chlorella protothecoides mostram que a biomassa contém metionina (2,25%), cisteína (1,69%), lisina (4,87%), fenilalanina (4,31%), leucina (8,43%), a isoleucina (3,93 %), treonina (5,62%), valina (6,37%), histidina (2,06%), arginina (6,74%), glicina (5,99%), ácido aspártico (9,55%), serina (6,18%), ácido glutâmico (12,73 %), prolina (4,49%), hidroxiprolina (1,69%), alanina (10,11%), tirosina (1,87%), e triptofano (1,12%).
EXEMPLO 7
Composições de Carotenoides, Fosfolipídeos Tocotrienol, e Tocoferol de Biomassa de Chlorella protothecoides UTEX 250, farinha de algas de Chlorella protothecoides, mutante de cor Chlorella protothecoides (cepa BM1320) e óleo extraído de mutante de cor Chlorella protothecoides (cepa BM1320)
Uma amostra de biomassa de algas produzidas utilizando os métodos descritos no Exemplo 4 foi analisada quanto ao teor de tocoferol e tocotrienol usando HPLC de fase normal, Método AOCS Ce 8-89. A fração contendo tocotrienol e tocoferol parte da biomassa foi extraída utilizando-se hexano ou outro solvente não polar. A composição de tocotrienol e tocoferol completa resultante está resumida na Tabela 4.
Tabela 4. Teor de tocotrienol e tocoferol na biomassa de algas.
Composição de tocotrienol e tocoferol de Chlorella protothecoides UTEX 250
Tocoferóis
Alfa tocoferol 6,29 mg/100g
Delta tocoferol 0,47mg/100g
Gama tocoferol 0,54mg/100g
focoferóis Totais 7,3 mg/100«
Tocotrienois
Alfa tocotrienol 0,13 mg/g
Beta tocotrienol 0
Gamma tocotrienol 0,09 mg/g
Delta tocotrienol 0
Total tocotrienois 0,22 mg/g
A fração contendo carotenoides da biomassa foi isolada e
Ill analisada por carotenoides usando métodos de HPLC. A fração contendo carotenoides foi preparada por mistura de biomassa de algas liofilizada (produzido usando métodos descritos no Exemplo 3) com carboneto de silício em um almofariz de alumínio e moída quatro vezes durante 1 minuto de cada 5 vez, com um almofariz e um pilão. A biomassa moída e mistura de silício foi então lavada com tetra-hidrofurano (THF) e o sobrenadante foi recolhido. A extração da biomassa foi repetida até que o sobrenadante ficasse incolor e os sobrenadantes de THF a partir de todas as extrações foram agrupados e analisados quanto ao teor de carotenoides utilizando métodos de HPLC 10 padrão. O teor de carotenoides de biomassa de algas que foi seca utilizando um secador de tambor foi também analisado utilizando os métodos descritos acima.
O teor de carotenoides de biomassa de algas liofilizadas foi: luteína total (66,9-68,9mcg/g: com cis-luteina variando de 12,4 -12,7mcg/g e 15 trans-luteina variando de 54,5-56,2mcg/g); trans-zeaxantina (31,42733,45 lmcg/g); cis-zeaxantina (l,201-l,315mcg/g), t-alfa-criptoxantina (3,092-3,773mcg/g), t-beta criptoxantina (l,061-l,354mcg/g), 15 -cis-betacaroteno (0,625-,0675mcg/g); caroteno 13-cis-beta (,0269-0,0376 mcg/g); talfa-caroteno (0,269-,0376mcg/g), c-alfa-caroteno (0,043- 0,010 mcg/g), t20 beta-caroteno (0,664-0,741mcg/g); caroteno e 9-cis-beta-(0,241-0,263mcg/g).
Os carotenoides totais reportados variaram de 105,819mcg/g para 110,815mcg/g.
O teor de carotenoides da biomassa de algas seca em tambor foi significativamente mais baixo: luteína total (0,709mcg/g: com trans25 luteína sendo 0,091 mcg/g e cis-luteína sendo 0,618mcg/g); trans-zeaxantina (0,252 mcg/g); cis-zeaxantina (0,037mcg/g); alfa-criptoxantina (0,010mcg/g); beta-criptoxantina (0,010mcg/g) e t-beta-caroteno (0,008mcg/g). Os carotenoides totais relatados foram l,03mcg/g. Estes dados sugerem que o método utilizado para a secagem da biomassa das algas pode afetar
112 significativamente o teor de carotenoides.
A análise de fosfolipídios foi também realizada na biomassa de algas. A fração contendo fosfolipídio foi extraída utilizando o método de extração de Folch (mistura de clorofórmio, metanol e água) e a amostra de óleo foi analisada usando o método AOCS Oficial Ja 7b-91, determinação por HPLC de lecitinas hidrolisadas (International Society Phopholipid and Lecithin 1999), e análise de HPLC de fosfolipídios com métodos de detecção por varredura com luz (Internacional Lecithin and Phospholipid Society 1995) para teor fosfolipídios. Os fosfolipídios totais em porcentagem p/p foi de 1,18%. O perfil de fosfolipídio de óleo de algas foi fosfatidilcolina (62,7%), fosfatidiletanolamina (24,5%), lisofosfatidilcolina (1,7%) e fosfatidilinositol (11%). Análise semelhante, utilizando a extração de hexano da fração contendo fosfolipídio da biomassa de algas foi também realizada. Os fosfolipídios totais em porcentagem p/p foram de 0,5%. O perfil de fosfolipídio foi fosfatidiletanolamina (44%), fosfatidilcolina (42%) e fosfatidilinositol (14%).
Uma amostra de farinha de algas de Chlorella protothecoides foi testada quanto ao seu teor de fosfolipídio, como discutido acima. O teor de fosfolipídio total desta amostra foi determinado como sendo de 0,8% p/p. O teor de fosfolipídios individuais em base de %p/p foi o seguinte: <0,01% Nacilfosfatidiletanolamina, <0,01% de ácido fosfatídico; 0,25% de fosfatidiletanolamina, 0,48% de fosfatidilcolina, 0,07% fosfatidilinositol e <0,01% de lisofosfatidilcolina.
Uma amostra de farinha de algas feita a partir de um mutante de cor Chlorella protothecoides, cepa BM320, foi testado para o seu teor de fosfolipídio, como discutido acima. O conteúdo total de fosfolipídio desta amostra foi determinado como sendo de 0,62% p/p. O teor de fosfolipídios individuais em base de %p/p foi o seguinte: <0,01% Nacilfosfatidiletanolamina, <0,01% de ácido fosfatídico; 0,21% de
113 fosfatidiletanolamina, 0,36% de fosfatidilcolina, 0,05% de fosfatidilinositol e <0,01% lisofosfatidilcolina.
Um óleo extraído a partir de um mutante de cor de Chlorella protothecoides, cepa BM320, foi analisado para vários componentes. O óleo foi extraído por extração com solvente (acetona e CO2 líquido). O óleo não foi refinado, branqueado ou desodorizado. O óleo composto, em porcentagem, p/p, 0,19% de monoglicerídeos e 5,77% de diglicerídeos. O óleo compreendia 3,24 mg de alfa-tocoferol por 100 g de óleo e 0,95 mg de gama-tocoferol por 100 g de óleo. O óleo continha 191 mg de ergosterol por 100 g de óleo, 5,70 mg de campesterol por 100 g de óleo, 10,3 mg do estigmasterol, por 100 g de óleo, 5,71 mg β-sitosterol por 100 g de óleo, e 204 mg de outros esteróis por 100 g de óleo. Os tocotrienóis totais deste óleo foi de 0,25 mg por 100 g de óleo (0,22 mg de alfa tocotrienol, <0,01 mg beta tocotrienol e 0,03 mg delta tocotrienol).
EXEMPLO 8
Produção de farinha de algas (Alto teor lipídico)
Chlorella protothecoides contendo alto teor lipídico cultivado utilizando os métodos de fermentação e as condições descritas no exemplo 1 foi transformada em uma farinha de algas com alto teor lipídico. Para processar a biomassa de microalgas em farinha de algas, a biomassa de Chlorella protothecoides colhida foi separada do meio de cultura usando centrifugação. A biomassa resultante concentrada, contendo mais de 40% de umidade, foi micronizada utilizando um homogeneizador de alta pressão ((GEA modelo NS1001) operando a uma pressão de 1000 a 1200 Bar até que o tamanho médio das partículas da biomassa fosse de menos do que 10 pm. As algas homogeneizadas foram então secas por pulverização utilizando os métodos padrão. A farinha de algas resultante (célula de algas micronizada que tenha sido seca por pulverização em uma forma de pó) foi embalada e armazenada até a sua utilização.
114
Uma amostra de farinha com alto teor lipídico foi analisada quanto ao tamanho das partículas. Uma farinha de algas em dispersão aquosa foi criada e o tamanho das partículas da farinha de algas foi determinado utilizando difração de laser em uma máquina Malvern® Mastersizer 2000 utilizando uma ligação Hydro 2000S. Uma dispersão de controle foi criada por suaves dispersões da mistura e outras foram criadas utilizando 100 bar, 300 bar, 600 bar e 1000 bar de pressão. Os resultados mostraram que o tamanho médio das partículas da farinha de algas é menor na condição com uma pressão mais elevada (3,039pm na condição de mistura suave e 2,484pm na condição de 1000 bar). A distribuição dos tamanhos das partículas foi deslocada nas condições de alta pressão, com uma redução do tamanho das partículas maiores (acima de 10 pm) e um aumento de partículas menores (menos de 1 pm).
EXEMPLO 9
Composições Alimentícias Utilizando Farinha de Algas com Alto Teor Lipídico (rica em lipídios)
As seguintes formulações alimentícias com alto teor lipídico compreendem farinha de algas produzida utilizando os métodos descritos no exemplo 8, e contendo cerca de 50% de lipídios.
Leite de Algas/Sobremesa Congelada
A formulação de leite de algas foi produzida a partir de farinha de algas com alto teor lipídico. O leite de algas continha os seguintes ingredientes (em peso): 88,4% de água, 6,0% de farinha de algas, concentrado de proteína de soro de leite 3,0%, 1,7% de açúcar, 0,6% de extrato de baunilha, 0,2% de sal e 0,1% estabilizadores. Os ingredientes foram combinados e homogeneizados em baixa pressão, utilizando um homogeneizador manual. O leite de algas resultante foi esfriado antes de servir. O sabor era comparável ao do leite integral e tinha boa opacidade. A farinha de algas utilizada continha cerca de 50% de lipídios, de modo que o β115 leite de algas resultante continha cerca de 3% de gordura. Quando comparado com o leite de soja com sabor de baunilha (seda), o leite de algas tinha um sabor e opacidade comparável e não tinha o sabor de feijão cru do leite de soja.
O leite de algas foi então combinado com açúcar adicional e o extrato de baunilha e misturou-se até ficar homogêneo em um misturador durante 2 a 4 minutos. A mistura foi colocada em uma máquina de creme prérefrigerada com gelo (Cuisinart) durante 1 a 2 horas até que a consistência desejada fosse atingida. O sorvete de receita convencional feito com 325 gramas de meio a meio, 220 gramas de 2% de leite e uma gema de ovo foi preparada como uma comparação. O sorvete de receita convencional tinha a consistência comparável à do sorvete servido mole, e tinha um rico sabor, sorvete de textura fina. Embora o sorvete feito à base de leite de algas faltasse a cremosidade e o sabor total do sorvete de receita convencional, a consistência e o sabor eram comparáveis a um rico sabor de leite gelado. No geral, a utilização de leite de algas em um pedido de sobremesa congelada foi bem sucedida: o leite de algas de sobremesa gelada produzido foi uma alternativa de gordura inferior a um sorvete convencional.
Bolo Inglês de Farinha de algas
O Bolo Inglês foi produzido com farinha de algas com elevado teor lipídico, como um exemplo de uma formulação bem cozida para demonstrar a capacidade da farinha de algas ou da biomassa de algas “para manter ou estabilizar as bolhas de ar (aeramento), em um produto de assado. A formulação para o Bolo Inglês de farinha de algas: extrato de baunilha (6,0 g), açúcar em pó (122,0 g); ovos inteiros (122,0 g), água (16,0 g); farinha de trigo (122 g), sal (1,5 g); goma xantana (Keltrol F) (0,2 g); fermento em pó (4 g), farinha de algas de com alto teor lipídico (45 g). Os ovos foram batidos até engrossar, ficar pálido e cremoso e em seguida, o açúcar foi adicionado e incorporado também. O extrato de baunilha foi então adicionado e misturado,
116 seguido pela farinha de algas, que foi dobrada na mistura de açúcar/ovo. Os ingredientes secos foram então bem misturados e adicionados à mistura de açúcar/ovo, altemativamente, com a água. A massa foi depois dobrada até ficar bem incorporada. A massa foi então derramada em latas de muffin revestidas com papel e cozida a 325° F durante 8 a 9 minutos. A panela foi então girada e cozida durante máis 8 a 10 minutos. /
Os bolos tinham uma textura leve e arejada, com uma estrutura de miolo bem desenvolvida, idêntica ao Bolo Inglês utilizando manteiga. Este Bolo Inglês com 10% (p/p) de farinha de algas com alto teor lipídico, em vez de manteiga demonstrou a capacidade da farinha de algas ou da biomassa de algas “para manter ou estabilizar a aeração em um produto de assado”. Macarrão e queijo
Macarrão e queijo foram produzidos com a finalidade de examinar a capacidade de farinha de algas ou biomassa de algas e farinha de algas desengordurada (produzido através da extração de CO2 de farinha de algas com alto teor lipídico) para aumentar o sabor de queijo e cremosidade de um produto de leite (queijo modificado por enzima (EMC) e manteiga/leite). A formulação para macarrão e queijo foi (expressa em peso % do produto final): pó de queijo EMC (6,35%), água (21,27%), sal (0,21%), farinha de algas com alto teor lipídico (3,81%); farinha de algas desengordurada (0,32%); massa de macarrão cozida (67,95%), e 50% de ácido acético (0,10%). Os ingredientes secos (exceto para a massa) foram combinados e adicionou-se água aos ingredientes secos. A mistura de queijo foi depois combinada com o macarrão.
O macarrão e o queijo produzidos com farinha de algas com alto teor lipídico e farinha de algas desengordurada tinha um gosto similar aos produtos de macarrão e queijo feitos de pó de EMC (macarrão e queijo encaixotados). A farinha de algas com alto teor lipídico/farinha de algas desengordurada contendo macarrão e queijo tinha uma textura cremosa e
117 sabor similar ao macarrão e ao queijo preparado de acordo com a direção de embalagem (com leite e manteiga). Este exemplo é uma demonstração com êxito de como uma farinha de algas com alto teor lipídico ou a biomassa das algas e farinha de algas desengordurada podem transmitir um sabor de queijo aumentado, cremoso, como um substituto para manteiga e leite. O teor de gordura total da farinha de algas contendo macarrão e queijo foi inferior a 2%. Leite de soja com farinha de algas com alto teor lipídico
A capacidade para aumentar a sensação cremosa na boca e riqueza de leite de soja foi testada com as seguintes formulações: leite de soja, contendo 0,5%, 1% ou 2% de farinha de algas com alto teor lipídico (como uma percentagem do peso do produto final). Um controle negativo foi também testado com o leite de soja, sem adição de farinha de algas. A farinha de algas foi misturada com o leite de soja, usando um misturador manual até ser totalmente incorporada. Em todos os casos em que a farinha de algas foi adicionada, o leite de soja teve uma textura tipo leite de mais “gordura total”, mais rica. Além disso, os leites de soja contendo farinha de algas (mesmo na concentração mais baixa) têm um menor gosto “feijão”.
Hambúrgueres de carne com baixo teor de gordura
Os efeitos de farinha de algas ou de biomassa de algas com alto teor lipídico em hambúrgueres de carne moída foi testada nas seguintes formulações: a carne moída com 96% livre de gordura contendo 0, 0,5%, 1% ou 2% de farinha de algas de com alto teor lipídico (como uma percentagem do peso do produto final). A carne moída com 80% livre de gordura foi utilizada como um controle positivo. A carne moída foi misturada com a farinha de algas até ficar bem misturada e foi, então, moldada em hambúrgueres. Nenhum ingrediente adicional foi adicionado. Os hambúrgueres foram então cozidos em uma frigideira quente até que ficassem totalmente cozidos. O hambúrguer de controle negativo de 94% livre de gordura foi seco e teve um sabor à caça/fígado. O hambúrguer de controle
118 positivo com 80% livre de gordura tinha uma textura úmida e macia e o sabor à caça/fígado foi menos pronunciado. Os hambúrgueres feitos com carne moída com 96% livre de gordura com 0,5%, 1% e 2% de farinha de algas com alto teor lipídico tinha uma textura mais úmida e macia do que o hambúrguer de controle negativo. 2% de hambúrguer de farinha de algas com alto teor lipídico foram texturalmente similares ao de controle positivo e tinha o mesmo sabor reduzido de sabor de caça/fígado.
Hambúrgueres de carne moída de peru com 0, 0,5%, de farinha de algas com alto teor lipídico de 1% ou 2% (como uma percentagem do peso do produto final) incorporados em peru moído livre de gordura foram também testados. Como controle positivo, um hambúrguer de peru feito de peru moído com 93% livre de gordura foi também feito. O peru moído foi misturado com a farinha de algas até ficar bem misturado e, em seguida, foi moldado em hambúrgueres. Os hambúrgueres foram então cozidos em uma frigideira quente até que ficassem totalmente cozidos. O hambúrguer de peru com 97% livre de gordura ficou seco, encorpado e mastigável. O hambúrguer de peru de controle positivo com 93% livre de gordura ficou mais suculento e tinha um gosto de peru assado. Os hambúrgueres contendo 0,5%, 1% e 2% de farinha de algas com alto teor lipídico tinha uma textura mais úmida e suculenta do que o hambúrguer de controle negativo. Além disso, os 2% de hambúrguer de farinha de algas com alto teor lipídico tinha um sabor de peru assado similar ao do controle positivo.
EXEMPLO 10
Genotipagem para a Identificação de Outras Cepas de Microalgas Adequadas para Uso como Alimento
Genotipagem de Algas
O DNA genômico ficou isolado a partir da biomassa de algas como se segue. As células (aproximadamente 200 mg) foram centrifugadas a partir de culturas líquidas de 5 minutos a 14.000 x g. As células foram então
119 colocadas em ressuspensão em água destilada estéril, centrifugadas por 5 minutos a 14.000 x g e o sobrenadante foi descartado. Uma esfera de vidro simples de ~ 2 mm de diâmetro foi adicionada à biomassa e os tubos foram colocados a -80°C durante pelo menos 15 minutos. As amostras foram removidas e 150 μΐ de tampão de moagem (1% de Sarkosyl, sacarose a 0,25 M, NaCl a 50 mM, EDTA a 20 mM, Tris-HCl a 100 mM, pH 8,0, 0,5 pg/μΐ de RNase A) foram adicionados. As pelotas foram colocados em ressuspensão por agitação em vórtex brevemente, seguido pela adição de 40 μ 1 de NaCl a 5M. As amostras foram agitadas em vortex brevemente, seguido pela adição de 66 μΐ de 5% de CTAB (brometo de cetil-trimetilamônio) e um vórtice definitivo breve. As amostras foram em seguida incubadas a 65°C durante 10 minutos, após o que foram centrifugadas a 14.000 x g durante 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e extraído uma vez com 300 μΐ de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico 12:12:1, seguido por centrifugação durante 5 minutos a 14.000 x g. A fase aquosa resultante foi transferida para um novo tubo contendo 0,7 vol de isopropanol (~ 190 μΐ), misturada por inversão e incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos ou durante a noite a 4°C. O DNA foi recuperado através de centrifugação a 14.000 xg durante 10 minutos. A pelota resultante foi então lavada duas vezes com etanol a 70%, seguido de uma lavagem final com 100% de etanol. As pelotas foram secas ao ar durante 20 a 30 minutos à temperatura ambiente, seguido por ressuspensão em 50 μΐ de TrisCl a 10 mM, EDTA a 1 mM (pH 8,0).
Cinco μΐ do DNA de algas total, preparados tal como descrito acima, foram diluídos a 1:50 em Tris a 10 mM, pH 8,0. As reações de PCR, volume final de 20 μΐ, foram estabelecidas como se segue. Dez μΐ de misturador mestre 2 x iProof HF (BIO-RAD), foram adicionados a 0,4 μΐ de iniciador SZ02613 (5'-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3' (SEQ ID NO: 24) em uma concentração de estoque de 10 mM). Esta sequência do iniciador é executada a partir da posição 567-588 em adesão Banco de Gene n° L43357
120 e é altamente conservada em plantas superiores e genomas de plastídios de algas. Isto foi seguido pela adição de 0,4 μΐ de iniciador SZ02615 (5CAGTGAGCTATTACGCACTC-3 '(SEQ ID NO: 25) com uma concentração de estoque de 10 mM). Esta sequência do iniciador é complementar para posicionar 1112-1093 em adesão Banco de Gene n° L43357 e é altamente conservada em plantas superiores e genomas de plastídios de algas. Em seguida, 5 μΐ do DNA total diluído e 3,2 pL de dILO foram adicionados. As reações de PCR foram realizadas como se segue: 98°C, 45, 98°C, 8, 53°C, 12, 72°C, durante 20, seguido por 35 ciclos de 72°C durante 1 minuto e mantendo a 25°C. Para a purificação dos produtos de PCR, 20 μΐ de Tris a 10 mM, pH 8,0, foram adicionados a cada reação, seguido por extração com 40 μΐ de fenol: clorofórmio:álcool isoamílico 12:12:1, em vórtex e centrifugação a 14.000 x g durante 5 minutos. As reações de PCR foram aplicadas em colunas de S-400 (GE Healthcare) e centrifugadas durante 2 minutos a 3.000 x g. Os produtos de PCR purificados foram subsequentemente clonados em TOPO PCR8/GW/TOPO e clones positivos selecionados para placas de LB/Especificação. O DNA plasmídico purificado foi sequenciado em ambas as direções utilizando os iniciadores Ml3 para frente e inverso. Os alinhamentos de sequência e as árvores enraizadas foram gerados usando o software de análise de DNA Geneious. As sequências de cepas de 1 a 23 (apresentadas no exemplo 1) são apresentadas como SEQ ID NOs: 1 a 23 na Listagem de Sequências em anexo, respectivamente (ou seja, a cepa 1 corresponde a SEQ ID NO:1, a cepa 2 corresponde a SEQ ID NO:2, e assim por diante).
A análise do DNA genômico de rRNA 23S a partir de 9 cepas de Chlorella protothecoides
O DNA genômico a partir de 8 cepas de Chlorella protothecoides (UTEX 25, UTEX 249, UTEX 250, UTEX 256, UTEX 264, UTEX 411, SAG 211 lOd, CCAP 211/17, e CCAP 21 l/8d), foram isolados e
121 a análise do DNA genômico de rRNA 23 S foi realizada de acordo com os métodos descritos acima. Todas as cepas de Chlorella protothecoides testadas ficaram idênticas na sequência exceto para UTEX 25. As sequências para todas as oito cepas são listadas como SEQ ID NOs: 26 e 27 na Listagem de Sequências em anexo.
Análise de Genotipagem das Amostras de Chlorella Comercialmente Adquiridas
Três amostras de chlorella comercialmente adquiridas, Chlorella Regularis (New Chapter, 390mg/gelcap), Whole Foods Broken Wall Chlorella (Whole Food, comprimido prensado de 500mg) e Chlorella de Nutribiotic CGF (Nutribiotic, comprimido prensado de 500mg), foram genotipadas utilizando os métodos descritos no presente documento. Aproximadamente 200 mg de cada uma das amostras de Chlorella comercialmente adquiridas foram colocados em ressuspensão e água destilada estéril para o isolamento de DNA genômico.
Os produtos de PCR resultantes foram isolados e clonados em vetores Ml3 e sequenciados utilizando os iniciadores para frente e inverso. As sequências foram comparadas com as sequências conhecidas usando uma pesquisa BLAST.
A comparação de sequências de DNA rRNA 23 s revelou que duas das três amostras de Chlorella comercialmente adquiridas teve sequências de DNA correspondendo a Lyngbya aestuarii presente (Whole Foods Broken Wall Chlorella e Nutribiotic CGF). Lyngbya aestuarii é um fuzileiro-espécies cynobacteria. Estes resultados mostram que alguma de Chlorella disponível comercialmente contém outras espécies de microrganismos contaminantes, incluindo os organismos de gêneros, tal como Lyngbya, que são conhecidos para a produção de toxinas (vide, por exemplo, Teneva et. al., Environmental Toxicology, 18(1)1, pp. 9 - 20 (2003); Matthew et al., J Nat Prod., 71(6):pp. 1113-6 (2008); and Carmichael et al.,
122
Appl Environ Microbiol, 63(8): pp. 3104-3110 (1997).
EXEMPLO 11
Mutantes de cor de biomassa de microalgas adequados para uso como alimento
Mutagênese química para gerar Mutantes de Cor
Chlorella protothecoides (UTEX 250) foi cultivada de acordo com os métodos e condições descritos no exemplo 1. A mutagênese química foi realizada na cepa de algas, utilizando N-metil-bf-nitro-N-nitroguanidina (NTG). A cultura de algas foi submetida ao agente mutagênico (NTG) e, em seguida, selecionada através de ciclos de reisolamento em placas de ágar de 2,0% de glicose. As colônias foram rastreadas para os mutantes de cor. Chlorella protothecoides (tipo selvagem) parece ser de uma cor dourada, quando cultivada heterotopicamente. A tela produziu uma cepa que apareceu na cor branca na placa de ágar. Este mutante de cor foi nomeado 33-55 (depositado em 13 de Outubro, 2009 de acordo com o Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection em 10801 University Boulevard, Manassas, VA20110-2209 com uma Designação de Depósito de Patente de PTA-10397). Outra colônia também foi isolada e passou por três rodadas de reisolamento para confirmar que esta mutação era estável. Este mutante pareceu estar na cor amarelo clara na placa de ágar e foi nomeado 25-32 (depositado em 13 de Outubro, 2009 de acordo com o Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection em 10801 University Boulevard, Manassas, VA20110-2209 com uma Designação de Depósito de Patente de PTA-10396).
Perfil lipidico de Chlorella protothecoides 33-55
Chlorella protothecoides 33-55 e Chlorella protothecoides parental (UTEX 250) foram cultivadas de acordo com os métodos e condições descritos no exemplo 1. O por cento de lipídio (em peso de células secas) foi determinado para ambas as cepas: Chlorella protothecoides 33-55 foi a 68%
123 de lipídios e de uma cepa parental de lipídio foi de 62%. Os perfis lipídicos foram determinados para ambas as cepas e foram os seguintes (expressos como % de área): Chlorella protothecoid.es 33-55, C14:0 (0,81); C16:0 (10,35); C16:l (0,20); C18:0 (4,09); Cl8:1 (72,16); C18:2 (10,60); C18:3 (0,10), e outros (1,69), para a cepa parental, C14:0 (0,77); C16:0 (9,67); C16:l (0,22); C18:0 (4,73); Cl 8:1 (71,45); Cl8:2 (10,99); C18:3 (0,14), e outros (2,05).
EXEMPLO 12
Carga de alimentação Celulósica para a Cultivação de Biomassa de Microalgas adequada para uso como alimento
Com a finalidade de avaliar se Chlorella protothecoides (UTEX 250) foi capaz de utilizar uma fonte de carbono não alimentar, materiais celulósicos (palha de milho ampliada) foram preparados para serem usados como uma fonte de carbono para o cultivo de Chlorella protothecoides heterotrófica que é adequada para utilizar em qualquer uma das aplicações nos alimentos acima descritos nos exemplos precedentes.
Material de palha de milho ampliada, úmida foi preparado por National Renewable Energy Laboratory (Golden, CO) por cozimento da palha de milho em uma solução de 1,4% de ácido sulfúrico e removendo água da suspensão resultante. Utilizando um analisador de umidade Mettler Toledo, os sólidos secos na palha de milho úmida foram determinados como sendo 24%. Uma amostra úmida de 100 g foi colocada em ressuspensão em água deionizada até um volume final de 420 ml e o pH foi ajustado para 4,8 utilizando NaOH a 10N. Celluclast® (Novozymes) (uma celulase) foi adicionada a uma concentração final de 4% e a pasta fluida resultante incubada com agitação a 50°C durante 72 horas. O pH deste material foi então ajustado para 7,5 com NaOH (mudança de volume desprezável), esterilizado por filtração através de um filtro de 0,22 pm e armazenado a -20°C. A amostra foi reservada para determinação da concentração de glicose
124 utilizando um kit baseado em hexoquinase de Sigma, como descrito abaixo.
As concentrações de glicose foram determinadas utilizando um Reagente de Ensaio de Glicose Sigma #G3293. As amostras tratadas, como descrito acima, foram diluídas 400 vezes e 40 gL foram adicionados à reação. A preparação de palha de milho celulósica foi determinada contendo cerca de 23 g/L de glicose.
Após o tratamento enzimático e de sacarificação da celulose a glicose, xilose, e outros açúcares de monossacarídeos, o material preparado acima foi avaliado como uma carga de alimentação para o crescimento de Chlorella protothecoides (UTEX 250) usando o meio descrito no exemplo 1. As concentrações variáveis de açúcares celulósicos misturados com glicose pura foram testadas (0, 12,5, 25, 50 e 100% de açúcares celulósicos). As células foram incubadas no escuro nas concentrações variáveis de açúcares celulósicos a 28°C com agitação (300 rpm). O crescimento foi avaliado pela medida da absorbância a 750 nm em um espectrofotômetro de UV. As culturas de Chlorella protothecoides cresceram no material de palha de milho preparado com Celluclast, incluindo condições de meio em que as condições de 100% de açúcar fermentável foram derivadas de celulósico. Experimentos similares foram também realizados utilizando polpa de beterraba de açúcar, tratada com Accellerase como a carga de alimentação celulósica. Tal como os resultados obtidos com o material de palha de milho, todas as culturas de Chlorella protothecoides foram capazes de utilizar o açúcar derivado de celulósico como fonte de carbono.
EXEMPLO 13
Farinha de Algas Melhora o Paladar e Realça a Textura de Composições Alimentícias
Biscoitos Amanteigados
Biscoitos amanteigados contendo farinha de algas, compreendendo aproximadamente 20% de gordura total, foram preparados
125 usando a seguinte receita. Biscoitos amanteigados não contendo nenhuma farinha de algas, compreendendo aproximadamente 20% de gordura total, também foram preparados usando a seguinte receita (controle). Os biscoitos feitos com farinha de algas foram determinados pelo painel para serem mais 5 amanteigados e mais ricos em sabor do que os biscoitos feitos sem farinha de algas.
Biscoito Amanteigado Fonte Biscoito de Controle Biscoito com farinha algas
Componente Porcentagem em peso Porcentagem em peso
Farinha, para todos os propósitos Geral 42,11% 41,50%
Bicarbonate de Sódio De varejo 0,50% 0,50%
Fermento em pó De varejo 0,65% 0,65%
Sal De varejo 0,51%- 0,51%
Leite em pó sem gordura 1,00% 1,00%
Clara de ovo, seco 1,00% 1,00%
Amido Alimentício Modificado Baka 2,00% 2,00%
Açúcar de confeiteiro Snack 23,20% 22,81%
Farinha de Algas 0,00% 3,00%
Água 4,00% 4,00%
Extrato de baunilha: McCormick lx 1,53% 1,53%
Manteiga 23,50% 21,50%
TOTAL 100,00% 100,00%
Gordura a partir de Manteiga 19,98% 18,28%
Gordura a partir de Farinha de Algas 0,00% 1,65%
Gordura Total 19,98% 19,93%
Água from Manteiga 3,53% 3,23%
Água 4,00% 4,00%
Total Água 9,06% 8,76%
Os biscoitos foram cozidos em um forno convencional a 325°F (168°C) por 7 minutos.
Sorvete de chocolate
O sorvete de chocolate contendo farinha de algas, compreendendo aproximadamente 10% de gordura total, foi preparado usando a seguinte receita. Sorvete de chocolate não contendo nenhuma farinha de algas, compreendendo aproximadamente 10% de gordura total, também foi preparado usando a seguinte receita (controle). O sorvete de 15 chocolate feito com farinha de algas foi determinado por um painel a ser mais rico, mais suave e mais cremoso do que o sorvete feito sem farinha de algas. O sorvete feito com farinha de algas foi percebido pelo painel com teor de gordura mais elevado. Foram adicionadas pequenas quantidades de ingredientes adicionais como mostrado abaixo.
126
Sorvete de Chocolate com Farinha de Algas
Componente Fonte Porcentagem em peso % de Gordura Total
Leitelho 52,90%
Açúcar Granulado C&H 18,00%
Farinha de algas 2,00% 1,10%
Fabricação de Creme, 40% de gordura 40% Fat 20,50% 8,2%
11% de Cacau Gerken’s Russet Plus 2,50% 0,28%
Xarope de Milho, 36DE 36DE quantidade mínima
Leite em pó sem gordura calor elevado,
#33225 2,00%
Chocolate sem açúcar 1,50% 0,75%
GELSTAR®, IC 3548 (estabilizante) FMC / 0,600%
flavorizantes quantidade mínima
Total 100,00% 10,33%
Direções
1. Todos os ingredientes foram misturados na ordem a seguir. Uma faca de massa foi usada para misturar o açúcar, estabilizante e farinha de algas. Em seguida, cacau foi adicionado e a mistura foi reservada.
2. Xarope de milho, leitelho e sólidos de leite misturados juntos e agitados na mistura seca (1) acima. O creme foi adicionado por último.
3. A mistura foi aquecida a 180°F em uma tigela com uma tampa em um forno de micro-ondas de vidro. A cada dois minutos, a temperatura foi verificada e a mistura foi agitada. Uma vez que a mistura atingiu 180° F, o forno de micro-ondas foi desligado. Altemativamente, a mistura pode ser aquecida em banho-maria até que a temperatura atinja 150°F
4. Em seguida, a mistura foi homogeneizada em 18030 bar 15 usando o Homogenizador GEA NiroSoavi Panda.
5. A mistura foi então refrigerada geralmente durante a noite, os flavorizantes foram adicionados e a máquina de sorvete foi ativada.
Sorvete de Chocolate sem Farinha de Algas
| Componente | | Porcentagem em peso | % de Gordura Total |
Leitelho 51,40%
Açúcar granulado C&H 18,00%
Farinha de algas 0,00% 0,00%
Fabricação de creme, 40% de gordura 40% de Gordura 23,00% 9,2%
11% de Cacau Gerken’s Russet Plus 2,50% 0,28%
Xarope de Milho, 36DE 36DE quantidade mínima
NFDM, calor elevado, #33225 3,00%
Chocolate sem açúcar 1,50% 0,75%
GELSTAR® IC 3548 (estabilizante) FMC 0,600%
flavorizante quantidade mínima
Total 100,00% 10,23%
127
Direções
O sorvete foi feito como acima, sem a adição de farinha de algas.
Maionese
A maionese contendo farinha de algas foi preparada usando a seguinte receita. A maionese não contendo nenhuma farinha de algas também foi preparada usando a seguinte receita (controle). A maionese feita com farinha de algas foi determinada por um painel tendo uma textura cremosa e similar a uma maionese amplamente disponível não contendo nenhuma 10 farinha de algas. O derretimento, o sabor e o corpo de maionese contendo farinha de algas dissiparam uniformemente e durou mais tempo do que a maionese sem farinha de algas.
Maionese (73% de Gordura) com Farinha de Algas
| Componente | % em Peso de Ingrediente Úmido | % de Gordura Total
Água 5,44%
Farinha de algas 3,00% 1,65%
Açúcar granulado 0,250%
Gemas de ovos frescas 9,50% 2,52%
Mostarda, seca 0,550%
Sal 1,490%
Vinagre, 5% de ácido acético 5,7400%
Oleo de canola 69,200% 69,20%
Suco limão, textura simples 4,830%
Total 100,00% 73,37%
Direções:
1. A farinha de algas foi misturada com água para formar uma dispersão e reservar.
2. Os ingredientes secos restantes foram misturados (açúcar, sal, mostarda seca) e reservados.
3. Em uma tigela separada, a primeira gema de ovo foi batida e misturada com os ingredientes secos da etapa 2 acima.
4. A dispersão de farinha de algas da etapa 1 foi adicionada à mistura da etapa 3.
5. O vinagre e 50% de suco de limão combinados em uma tigela separada e foram levados à mistura da etapa 4.
128
6. A mistura da etapa 5 foi misturada e o óleo foi adicionado lentamente, algumas gotas de cada vez até a mistura engrossar.
7. Uma vez que se formou a emulsão, foi adicionado o óleo restante (aproximadamente 50%) e a emulsão misturada ainda mais. Em seguida, o suco de limão remanescente foi adicionado e a emulsão foi misturada ainda mais. Opcionalmente, uma pequena porção de água quente pode ser adicionada se a emulsão estiver muito grossa.
8. A maionese foi refrigerada durante a noite.
Maionese de Controle (75% de gordura) sem Farinha de Algas
| Componente | Porcentagem em peso de Ingrediente Úmido | % de Gordura Total
Água 5,44%
Farinha de algas 0,00% 0,00%
Açúcar granulado 0,250%
Gemas de ovo, frescas 9,50% 2,52%
Mostarda seca 0,550%
Sal 1,490%
Vinagre, 5% de ácido acético 5,7400%
Óleo de canola 72,200% 72,20%
Suco de limão, textura simples 4,830%
Total 100,00% 74,72%
Direções
A maionese foi feita como descrito acima, mas sem a adição de farinha de algas.
Molho de Salada
O molho de salada, contendo farinha de algas foi preparado 15 usando a seguinte receita. Para um molho de varejo, foi adicionado 1% ou 3% de farinha de algas. O molho de varejo que não continha farinha de algas foi o molho de controle. A salada feita com farinha de algas foi determinada por um painel para ser rico, cremoso e melhorar os sabores de molho de salada feito sem nenhuma farinha de algas. A salada contendo farinha de algas foi 20 considerada ter um teor de gordura mais elevado do que o molho para salada feito sem farinha de algas.
% Peso, em gramas % Peso, em gramas
Molho de varejo 97,5 97,5 Molho de varejo 92,5 92,5
40% de Farinha de Algas 1 2,5 40% Pasta de Farinha de Algas 3 7,5
Total 100 100
129
EXEMPLO 14
Interação com Proteínas do leite
As proteínas contidas no leite são caseína e soro de leite. A farinha de algas ou a biomassa de algas interage com leite e proteínas do leite para fornecer melhor paladar a determinados alimentos.
A utilização de farinha de algas em combinação com o soro de leite melhorou o paladar da bebida de algas do exemplo 9. A bebida mencionada no exemplo 9 foi modificada conforme descrito abaixo. A adição de soro de leite à bebida de. algas melhorou o paladar da bebida. Outras proteínas tal como a proteína com elevado teor de Golden Chlorella (comercialmente disponível) também foram mostradas melhorar o paladar. Em contraste, a adição de proteína de soja, proteína de ervilha, não melhorou o paladar da bebida das algas.
De forma similar, a interação da farinha de algas ou da biomassa de algas com leite fornece melhor paladar às composições alimentícias de alimentos compreendendo leite, por exemplo, sopas à base de creme, café e cremes de chá, bebidas baseadas em produto de leite, iogurtes, sorvete, leite gelado, limonada, sorvete e similares.
Bebida de Leite de Algas
Componente Porcentagem em peso de Ingrediente Úmido
Água engarrafada ou da torneira 89,381
Açúcar Granulado 1,7
sal 0,23
farinha de algas 5
Tie 71 OH Carragenina (estabilizante) 0,014
Estabilizante FMC Viscarin 359 (estabilizante) 0,075
Extrato de baunilha: McCormick lx 0,6
Eggstend 300 (proteína do soro de leite) 3
Total 100
Direções
A água foi adicionada a um recipiente e os ingredientes restantes foram adicionados à água na ordem listada enquanto mistura. O líquido foi homogeneizado em um homogeneizador de batelada em 300 a 400 bar para uma passagem. O líquido homogeneizado foi transferido para recipientes apropriados e refrigerado.
130
EXEMPLO 15
Extensão da Vida de Prateleira de Composições Alimentícias Contendo
Farinha de Algas
Biscoitos Açucarados
Biscoitos açucarados contendo farinha de algas foram preparados usando a seguinte receita. Biscoitos açucarados contendo nenhuma farinha de algas foram também preparados usando a seguinte receita. A formulação de biscoito açucarado com 3% de farinha de algas foi ajustada através da remoção da gema de ovo e reduzindo a manteiga da 10 formulação de biscoito convencional para fornecer um biscoito que a Gordura Total seja a mesma em ambas as formulações. Os biscoitos foram armazenados por um período de tempo em embalagens de folha e avaliados por um painel sensorial, depois de três dias e depois de três meses. Os biscoitos que não continham farinha de algas ficaram estáveis e aderentes, 15 depois de três dias e não eram aceitáveis em três meses. Os biscoitos que continham farinha de algas permaneceram frescos em três dias e três meses e eram aceitáveis nos dois períodos de tempo.
Biscoito Açucarado
Fonte Biscoito sem farinha de algas Biscoito com 3% de farinha de algas
| Componente | Porcento | Porcento |
Farinha, para todos os
propósitos General Mills 36,09% 35,00%
Bicarbonate de Sódio De varejo 0,30% 0,30%
Fermento em pó De varejo 0.70% 0,70%
Sal De varejo 0,00% 0,00%
Ovos inteiros 6,52% 0,00%
Clara de ovo 0,00% 0,50%
Açúcar de confeiteiro C&H 37,00% 35,00%
Farinha de Algas 0,00% 3,00%
Água 0,00% 7,00%
Extrato de baunilha, IX: McCormick 0,75% 0,75%
Manteiga sem sal 19,00% 17,75%
TOTAL 100,36% 100,00%
Gordura dos ovos 0,73% 0,00%
Gordura a partir de
Manteiga 16,15% 15,09%
Gordura a partir da
Farinha de Algas 1,65%
Gordura Total 16,88% 16,74%
Água 0 0
Água de ovos 4,89% 0,00%
Água da manteiga 2,85% 2,66%
Extrato de baunilha 0,75% 0,75%
Total Água 0,00% 7,00%
Total 8,49% 10,41%
131
Direções
1. Os ingredientes secos, farinha, sal bicarbonate de sódio e fermento em pó foram misturados e reservados.
2. A gordura foi transformada em creme adicionando 5 lentamente farinha de algas e o açúcar na batedeira Kitchen Aid com o acessório da pá.
3. Com a batedeira em velocidade lenta (1 ou 2), água e extrato de baunilha foram lentamente adicionados. Uma vez que a água e o extrato de baunilha foram adicionados, a velocidade da mistura foi aumentada para médio e mixada por dois minutos.
4. Em seguida os ovos foram adicionados e a mistura foi misturada em velocidade média por dois minutos.
5. Os ingredientes secos misturados da etapa 1 foram adicionados lentamente à mistura da etapa 4, inicialmente a uma velocidade de mistura lenta, em seguida, aumentando para 6 a 8 por cerca de 2 a 3 minutos para formar uma massa.
6. Uma folha de cozimento foi pulverizada com óleo e a massa da etapa 6 foi enrolada para fora a uma espessura de 8 mm e cozida a 350°F por 7 a 9 minutos.
Bolachas
As bolachas contendo farinha de algas foram preparadas por American Baking Institute utilizando a seguinte receita. Bolachas não contendo farinha de algas foram também preparadas utilizando a seguinte receita. Na preparação de biscoitos contendo farinha de algas, gordura e 25 farinha de algas os níveis de utilização foram ajustados para proporcionar um biscoito com cerca de 33% ou cerca de 50% de redução na gordura adicionada, em comparação com as formulações de controle de gordura total não contendo farinha de algas. Os procedimentos de mistura foram testados para avaliar o impacto das características da massa de pão. Retardar a adição
132 da farinha de algas à massa durante o processo de mistura resultou em uma redução na quantidade total da água adicionada à massa de pão. O procedimento foi modificado para adicionar todos os ingredientes exceto a farinha de algas à bacia de mistura e misturou-se com uma velocidade durante dois minutos para misturar os ingredientes. A velocidade de mistura foi em seguida alterada para acelerar dois e misturada durante quatro minutos. Em seguida, a farinha de algas foi adicionada e misturada durante mais de oito minutos.
A textura da bolacha contendo farinha de algas ficou similar à da bolacha não contendo farinha de algas, de gordura total. Um painel descreveu a bolacha formulada com a farinha de algas como sendo crocante e foi preferido o sabor e textura sobre a bolacha formulada sem a farinha de algas.
As bolachas foram armazenadas durante um período de tempo em embalagens de alumínio e avaliadas por um painel depois de 30 dias e depois de quatro meses. As bolachas não contendo farinha de algas ficaram mofados e aderente após 30 dias e não foi aceitável em quatro meses. As bolachas contendo farinha de algas após quatro meses de armazenamento mantiveram-se crocantes e aceitáveis.
Bolachas
Bolachas com Farinha de Algas
Bolachas sem Farinha de Algas (50% de redução de gordura)
| Ingrediente | Porcentagem em peso | Porcentagem em peso |
Massa de farinha 65,34% 65,06%
Sal 0,65% 0,65%
Bicarbonate de Sódio 0,49% 0,49%
Gordura 7,84% 1,04%
Farinha de Algas 0,00% 5,21%
Açúcar granulado 5,23% 5,23%
Leite em pó sem gordura 0,98% 0.98%
Malte não diastásico 0,33% 0,33%
Bicarbonate de amônio 0,65% 0,65%
Levedura fresca 0,16% 0,16%
Sulfito de Sódio 0,03% 0,03%
Água 18,30% 20,17%
TOTAL 100,00% 100,00%
Direções
Todos os ingredientes exceto a farinha de algas foram misturados
133 em um misturador de chão Hobart com uma pá por dois minutos na primeira velocidade para formar uma massa. A velocidade do misturador foi aumentada para a segunda velocidade e mixada por quatro minutos. A farinha de algas, em seguida, foi adicionada à massa então misturada por mais 8 minutos na segunda 5 velocidade. A massa foi assada ao fomo em uma banda de malha na zona 1 (amortecedores/p 450° superior 430° inferior fechado/fechado), zona 2 (amortecedores/p 425° superior 400° inferior aberto/aberto) ou zona 3 (amortecedores/p 415° superior 375° inferior aberto/aberto) até dourar. As bolachas tinham um teor de umidade de cerca de 3%.
EXEMPLO 16
O produto de manteiga em tablete com farinha de algas e uma margarina em tablete com farinha de algas foram preparados de acordo com as receitas abaixo. A manteiga em tablete foi feita batendo a farinha de algas com manteiga na batedeira em alta velocidade e subsequente água foi 15 lentamente adicionada à mistura de manteiga farinha de algas, enquanto misturava em alta velocidade. A margarina em tablete foi feita batendo a farinha de algas com o óleo de Palma em um misturador em alta velocidade. Em seguida, o sal foi dissolvido em água para preparar a água salgada. Por conseguinte, a água salgada foi lentamente adicionada à mistura de óleo de 20 Palma com farinha de algas enquanto misturava em alta velocidade. A textura e o sabor da farinha de algas que contêm o tablete era similar aos da manteiga e margarina em tabletes de gordura total sem farinha de algas.
Manteiga em tablete e Margarina em tablete
Manteiga em tablete_____________ | Componente | Porcentagem em peso
Farinha de Algas 20%
Água 30%
Manteiga, com sal 50%
TOTAL 100%
Margarina em tablete
| Componente | Porcentagem em peso |
Oleo Vegetal 17,25%
Sal 0,86%
Farinha de Algas 8,60%
Agua 51,73%
Óleo de Palma 21,56%
TOTAL 100,00%
134
EXEMPLO 17
Combinação de óleo de algas e farinha de algas desengordurada
Na formulação de biscoito como mostrado abaixo, em vez de usar farinha de algas, uma quantidade equivalente de farinha de algas 5 desengordurada e óleo de algas foram usados para fazer os biscoitos. Os biscoitos feitos com farinha de algas desengordurada e óleo de algas foram comparados aos biscoitos feitos com farinha de algas. Um painel avaliou os biscoitos. Os biscoitos feitos com farinha de algas foram anotados como tendo melhor, sabor doce, tinha uma textura mais mastigável e foi considerado ter mais um sabor mais forte, sabor mais amanteigado. Além disso, a cor dos biscoitos feitos com farinha de algas desengordurada e óleo de algas tinha uma cor diferente do que a dos biscoitos feitos com farinha de algas. Em alimentos não homogeneizados, o uso de farinha de algas desengordurada e óleo de algas produziu um produto inferior quando comparado ao uso de 15 farinha de algas.
Biscoitos Açucarados de Algas: Sem Ovos e Sem Manteiga (aproximadamente 3,5% de Gordura Total)
Porcentagem em peso do
Componente Ingrediente Gramas
Mistura Seca 1: Farinha, para todos os propósitos 38 155,6
Bicarbonato de Sódio 0,3 1,19
Fermento em pó 0,7 2,88
sal 0,5 2,2
Mistura Seca 2: Farinha de algas 7 28,8
Ingredientes Úmidos Açúcar Granulado 34 140,5
água 17 70,7
Extrato de baunilha: McCormick, lx 1,5 6,5
eggstend 1 4
TOTAL 100 412,37
Direções
1. A mistura de farinha, sal, bicarbonato de sódio, fermento em 20 pó e eggstend foram misturados e reservados.
2. O açúcar e a farinha de algas foram misturados em um misturador auxiliar de cozinha com um acessório de espátula por 5 minutos.
3. Com a batedeira em velocidade lenta (1 a 2) água foi lentamente adicionada à mistura da etapa 2 acima.
135
4. Com a batedeira em velocidade lenta (1 a 2) o extrato de baunilha foi lentamente adicionado à mistura da etapa 3 acima para formar uma massa.
5. A massa foi refrigerada por 1 hora. Altemativamente, a massa pode ser refrigerada por longos períodos, incluindo até 2 a 4 dias ou ser congelada para uso posterior.
6. A folha de biscoito foi pulverizada com óleo.
7. A massa foi manuseada e enrolada em discos e colocada em uma folha de biscoito. Cada biscoito pesava cerca de 15 gramas.
8. Os biscoitos foram cozidos por cerca de 6 minutos a 9 minutos a 325F. Os biscoitos cozidos por cerca de 6 minutos, renderam um biscoito macio em textura. Os biscoitos cozidos já ficaram crocantes e mais escuros.
Na formulação de bebidas de algas do exemplo 9, em vez de usar farinha de algas, uma quantidade equivalente de farinha de algas desengorduraria e óleo de algas foi utilizada para fazer a bebida homogeneizada. Um painel determinou que a bebida feita com farinha de algas desengorduraria e óleo de algas ficou equivalente à bebida feita com farinha de algas.
EXEMPLO 18
Combinação de óleo de não algas e fibra de não algas
Os biscoitos e uma bebida, tal como descrito no exemplo 17, foram preparados usando óleo de canola e fibra de aveia. Para ambas as bebidas e biscoitos, a combinação de óleo de canola e fibra de aveia não reproduziu os resultados de bebidas e biscoitos feitos com farinha de algas. O uso de óleo de canola e fibra de aveia produziu bebidas e biscoitos inferiores.
O Pedido PCT7US2009/060692, depositado em 14 de Outubro, de 2009, intitulado “Food Compositions of Microalgal Biomass,” O Pedido PCT/US10/31088, depositado em 14 de Abril, de 2010, intitulado “Novel
136
Microalgal Food Compositions,” e Pedido Provisório US 61/324.285, depositado em 14 de Abril, de 2010, intitulado “Oleaginous Yeast Food Compositions” são, cada um, incorporados neste documento por referência em sua totalidade para todos os propósitos.
Todas as referências citadas neste documento, incluindo Patentes, Pedidos de Patentes, e Publicações, são incorporadas por referência por este meio em sua totalidade, se anteriormente incorporadas especifícamente ou não. As publicações aqui mencionadas são citadas com a finalidade de descrever e divulgar os reagentes, as metodologias e os conceitos que podem ser utilizados em conexão com a presente invenção. Nada neste documento é para ser interpretado como uma admissão de que estas referências são o estado da técnica em relação às invenções descritas neste documento.
Embora a presente invenção tenha sido descrita em conexão com as modalidades específicas da mesma, será entendido que é capaz de modificações adicionais. Este pedido destina-se a cobrir quaisquer variações, utilizações ou adaptações da seguinte invenção, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais saídas a partir da divulgação do presente como vêm dentro da prática habitual ou conhecidas na técnica a que pertence a invenção e como podem ser aplicadas às características essenciais estabelecidas anteriormente neste documento.
Entende-se que os exemplos e as modalidades descritas neste documento são apenas para fins ilustrativos, e que diversas modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas por pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e do alcance deste pedido e do escopo das reivindicações em anexo.

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composição alimentícia, caracterizada pelo fato de que compreende:
    (a) farinha de algas produzidas heterotroficamente compreendendo menos do que 500 ppm de clorofila e mais do que cerca de 20% em peso seco de óleo de triglicerídeo, em que menos do que 5% em peso do óleo é ácido docosahexanóico (DHA);
    (b) pelo menos um ingrediente adicional; e (c) gás;
    em que a composição alimentícia compreende uma fase contínua, uma fase gasosa descontínua, e em que a porcentagem do volume do alimento contribuída pelo gás está entre cerca de 1% e cerca de 50%, ou entre 10% e cerca de 60%.
  2. 2. Composição alimentícia de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a farinha de algas é obtida a partir de uma espécie do gênero Chlorella.
  3. 3. Composição alimentícia de acordo com a reivindicação 1 ou revindicação 2, caracterizada pelo fato de que a composição alimentícia é um alimento aerado, opcionalmente, em que a farinha de alga melhora a capacidade de retenção de ar no alimento.
  4. 4. Composição alimentícia de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o alimento é congelado.
  5. 5. Composição alimentícia de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a composição alimentícia é um sorvete, sorbet ou gelato, tendo um teor de 20% ou mais de ar.
  6. 6. Composição alimentícia de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a farinha de alga é obtida de Chlorella protothecoides.
  7. 7. Composição alimentícia de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a farinha de alga é de uma alga que é um mutante de cor com pigmentação de cor reduzida em comparação à cepa da qual ela derivou, e/ou em que a farinha de alga não possui pigmentação verde e é reduzida em pigmentação amarela, opcionalmente, em que a farinha de alga é amarela ou branca em cor.
  8. 8. Composição alimentícia de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a composição é selecionada do grupo consistindo em sorvete, gelato, sorbet, musse, flan, creme de ovos, suspiro, patê, produto assado, musse, coberturas de laticínio batido, sorvete de iogurte, recheios batidos e molho.
  9. 9. Método para produzir um alimento aerado, caracterizado pelo fato de compreender misturar:
    (a) farinha de alga produzida heterotroficamente compreendendo menos do que 500 ppm de clorofila e mais do que cerca de 20% em peso seco de óleo de triglicerídeo, em que menos do que 5% em peso do óleo é ácido docosahexanóico (DHA), opcionalmente, de uma espécie do gênero Chlorella, e, opcionalmente, de Chlorella protothecoides', (b) água; e (c) pelo menos um ingrediente adicional, para preparar a dispersão, em que a farinha de alga compreende 0,5 a 10% p/p da dispersão; e incorporar gás na dispersão para formar bolhas de fase gasosa descontínua estáveis, em que a composição alimentícia compreende uma fase contínua, uma fase gasosa descontínua, e o percentual do volume do alimento contribuído pelo gás é entre cerca de 1% e cerca de 60%.
  10. 10. Produto de carne, caracterizado pelo fato de que compreende uma matriz de:
    (a) came moída ou picada; e (b) pelo menos cerca de 0,5% p/p de farinha de algas produzidas heterotroficamente compreendendo menos do que 500 ppm de clorofila e pelo menos 20% em peso seco de óleo de triglicerídeo, em que menos do que 5% em peso do óleo é ácido docosahexanóico (DHA); em que a carne e a farinha de algas estão dispersas por toda a matriz, opcionalmente, em que a farinha de alga é obtida de uma espécie do gênero Chlorella, por exemplo, Chlorella protothecoid.es, ainda, opcionalmente, em que a farinha de alga é de uma alga que é um mutante de cor com pigmentação de cor reduzida em comparação à cepa da qual ela derivou, e/ou em que a farinha de alga não possui pigmentação verde e é reduzida em pigmentação amarela, opcionalmente, em que a farinha de alga é amarela ou branca em cor.
  11. 11. Composição alimentícia láctea, caracterizada pelo fato de que compreende:
    (a) pelo menos um ingrediente lácteo; e (b) farinha de algas produzidas heterotroficamente compreendendo menos do que 500 ppm de clorofila e pelo menos 20% em peso seco de óleo de triglicerídeo, em que menos do que 5% em peso do óleo é ácido docosahexanóico (DHA);
    em que entre cerca de 0,1% a cerca de 100% da gordura no alimento é fornecida pela farinha de alga, opcionalmente, em que a farinha de alga é obtida de uma espécie do gênero Chlorella, por exemplo, Chlorella protothecoides, opcionalmente, em que a farinha de alga é de uma alga que é um mutante de cor com pigmentação de cor reduzida em comparação à cepa da qual ela derivou, e/ou em que a farinha de alga não possui pigmentação verde e é reduzida em pigmentação amarela, opcionalmente, em que a farinha de alga é amarela ou branca em cor.
  12. 12. Método para melhorar a textura na boca de uma composição alimentícia, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    (a) fornecer uma composição alimentícia, opcionalmente compreendendo leite, soja, caseína ou soro; e (b) adicionar uma quantidade especificada de farinha de algas produzidas heterotroficamente compreendendo menos do que 500 ppm de clorofila e mais do que cerca de 20% em peso seco de óleo de triglicerídeo a composição alimentícia, em que menos do que 5% em peso do óleo é ácido docosahexanóico (DHA), opcionalmente, em que a farinha de alga é obtida de uma espécie do gênero Chlorella, por exemplo, Chlorella protothecoides, ainda, opcionalmente, em que a farinha de alga é de uma alga que é um mutante de cor com pigmentação de cor reduzida em comparação à cepa da qual ela derivou, e/ou em que a farinha de alga não possui pigmentação verde e é reduzida em pigmentação amarela, opcionalmente, em que a farinha de alga é amarela ou branca em cor.
  13. 13. Método para melhorar a vida de prateleira de uma composição alimentícia, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    (a) fornecer uma composição alimentícia; e (b) adicionar uma quantidade especificada de farinha de algas produzidas heterotroficamente compreendendo menos do que 500 ppm de clorofila e mais do que cerca de 20% em peso seco de óleo de triglicerídeo a composição alimentícia, em que menos do que 5% em peso do óleo é ácido docosahexanóico (DHA), opcionalmente, em que a farinha de alga é obtida de uma espécie do gênero Chlorella, por exemplo, Chlorella protothecoides, ainda, opcionalmente, em que a farinha de alga é de uma alga que é um mutante de cor com pigmentação de cor reduzida em comparação à cepa da qual ela derivou, e/ou em que a farinha de alga não possui pigmentação verde e é reduzida em pigmentação amarela, opcionalmente, em que a farinha de alga é amarela ou branca em cor.
  14. 14. Composição alimentícia não-láctea, caracterizada pelo fato de que compreende:
    (a) pelo menos um ingrediente não-lácteo opcionalmente selecionado do grupo que consiste em soja, amêndoa, cânhamo, arroz e aveia; e (b) farinha de algas produzidas heterotroficamente compreendendo menos do que 500 ppm de clorofila e pelo menos 20% em peso seco de óleo de triglicerídeo, em que menos do que 5% em peso do óleo é ácido docosahexanóico (DHA);
    em que entre cerca de 0,1% e cerca de 100% da gordura no alimento é fornecida pela farinha de algas, e opcionalmente, em que a composição alimentícia é selecionada do grupo consistindo em margarina, leite de soja, leite de amêndoa, leite de cânhamo, leite de arroz, sobremesa congelada não láctea, creme não lácteo, queijo não lácteo e iogurte não lácteo, opcionalmente em que a farinha de alga é obtida de uma espécie do gênero Chlorella, por exemplo, Chlorella protothecoides, ainda, opcionalmente, em que a farinha de alga é de uma alga que é um mutante de cor com pigmentação de cor reduzida em comparação à cepa da qual ela derivou, e/ou em que a farinha de alga não possui pigmentação verde e é reduzida em pigmentação amarela, opcionalmente, em que a farinha de alga é amarela ou branca em cor.
  15. 15. Farinha de algas produzidas heterotroficamente, caracterizada pelo fato de compreender partículas de farinha de algas, em que, opcionalmente, as partículas são aglomeradas, a dita farinha de alga compreendendo menos do que 500 ppm de clorofila e mais do que cerca de
    10% de óleo de triglicerídeo em peso seco, em que menos do que 5% em peso do óleo é ácido docosahexanóico (DHA), em que a dita farinha de algas compreende ainda compostos selecionados a partir do grupo consistindo em de cerca de 0 gg a cerca de 115
    5 gg de carotenoides totais por grama de farinha de algas, de cerca de 1 mg a cerca de 8 mg de tocoferóis por 100g de farinha de alga, de cerca de 0,05 mg a cerca de 0,30 mg de tocotrienois por grama de farinha de alga e de cerca de 0,1 mg a cerca de 10 mg de fosfolipídeos por grama de farinha de alga, opcionalmente em que a farinha de alga é obtida de uma
    10 espécie do gênero Chlorella, por exemplo, Chlorella protothecoides ainda, opcionalmente, em que a farinha de alga é de uma alga que é um mutante de cor com pigmentação de cor reduzida em comparação à cepa da qual ela derivou, e/ou em que a farinha de alga não possui pigmentação verde e é reduzida em pigmentação amarela, opcionalmente, em 15 que a farinha de alga é amarela ou branca em cor.
BR112012026241A 2010-04-14 2011-04-14 composição alimentícia, método para preparar um alimento aerado, produto de carne, métodos para melhorar a textura na boca e a vida de prateleira de uma composição alimentícia, e, farinha de algas BR112012026241A2 (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32429410P 2010-04-14 2010-04-14
PCT/US2011/032588 WO2011130578A2 (en) 2010-04-14 2011-04-14 Lipid-rich microalgal flour food compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112012026241A2 true BR112012026241A2 (pt) 2019-12-24

Family

ID=44788390

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112012026241A BR112012026241A2 (pt) 2010-04-14 2011-04-14 composição alimentícia, método para preparar um alimento aerado, produto de carne, métodos para melhorar a textura na boca e a vida de prateleira de uma composição alimentícia, e, farinha de algas

Country Status (9)

Country Link
US (3) US20110256282A1 (pt)
EP (1) EP2557937B1 (pt)
JP (2) JP5865894B2 (pt)
KR (2) KR101849367B1 (pt)
BR (1) BR112012026241A2 (pt)
CA (1) CA2796395C (pt)
ES (1) ES2784774T3 (pt)
MX (1) MX347228B (pt)
WO (1) WO2011130578A2 (pt)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8802422B2 (en) 2007-06-01 2014-08-12 Solazyme, Inc. Renewable diesel and jet fuel from microbial sources
US20100297331A1 (en) * 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Reduced Fat Foods Containing High-Lipid Microalgae with Improved Sensory Properties
US20100303957A1 (en) * 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. Edible Oil and Processes for Its Production from Microalgae
CN104770424A (zh) * 2008-10-14 2015-07-15 索拉兹米公司 微藻生物质的食品组合物
US20100303990A1 (en) * 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. High Protein and High Fiber Algal Food Materials
US20100297325A1 (en) * 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Egg Products Containing Microalgae
US20100297295A1 (en) * 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Microalgae-Based Beverages
US20100303961A1 (en) * 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. Methods of Inducing Satiety
JP5859311B2 (ja) 2008-11-28 2016-02-10 ソラザイム, インコーポレイテッドSolazyme Inc 組み換え従属栄養微生物における、用途に応じた油の生産
CA3039432A1 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Corbion Biotech, Inc. Tailored oils produced from recombinant heterotrophic microorganisms
CA3024641A1 (en) 2010-11-03 2012-05-10 Corbion Biotech, Inc. Microbial oils with lowered pour points, dielectric fluids produced therefrom, and related methods
CA2825691C (en) 2011-02-02 2020-08-25 Solazyme, Inc. Tailored oils produced from recombinant oleaginous microorganisms
GB201104761D0 (en) * 2011-03-21 2011-05-04 Univ United Arab Emirates Biodiesel production
WO2012154626A1 (en) 2011-05-06 2012-11-15 Solazyme, Inc. Genetically engineered microorganisms that metabolize xylose
CN109007229A (zh) * 2011-10-21 2018-12-18 索拉兹米罗凯特营养品有限责任公司 抗结晶冷冻食物产品
US9719114B2 (en) 2012-04-18 2017-08-01 Terravia Holdings, Inc. Tailored oils
ES2744868T3 (es) 2012-04-18 2020-02-26 Corbion Biotech Inc Aceites hechos a medida
WO2013166374A2 (en) * 2012-05-04 2013-11-07 Norris Leslie Flavor, odor, and/or colorant compositions with oleaginous microorganisms and related methods
EP2724625A1 (en) * 2012-10-26 2014-04-30 Roquette Freres Microalgal flour granules and process for preparation thereof
US10098371B2 (en) * 2013-01-28 2018-10-16 Solazyme Roquette Nutritionals, LLC Microalgal flour
CA2901469A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Axiom Foods, Inc. Rice protein supplements
US9820504B2 (en) 2013-03-08 2017-11-21 Axiom Foods, Inc. Rice protein supplement and methods of use thereof
EP2777400A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-17 Roquette Freres Microalgal flour granules and process for preparation thereof
WO2014154787A2 (fr) 2013-03-29 2014-10-02 Roquette Freres Procédé d'enrichissement en protéines de la biomasse de microalgues
WO2014176515A2 (en) 2013-04-26 2014-10-30 Solazyme, Inc. Low polyunsaturated fatty acid oils and uses thereof
FR3007837B1 (fr) 2013-06-26 2015-07-17 Roquette Freres Compositions de farine de microalgues de qualite sensorielle optimisee
FR3008001B1 (fr) 2013-07-04 2017-05-05 Roquette Freres Procede optimise de rupture des parois de chlorelles par broyage mecanique
FR3008581B1 (fr) 2013-07-19 2016-11-04 Roquette Freres Farine de microalgues riches en lipides et procede de preparation
JP2016524922A (ja) 2013-07-25 2016-08-22 ロケット フレールＲｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓ タンパク質富化微細藻類バイオマスの生産効率、官能特性、及び経時的安定性を最適化する方法
FR3009619B1 (fr) 2013-08-07 2017-12-29 Roquette Freres Compositions de biomasse de microalgues riches en proteines de qualite sensorielle optimisee
EP3036316B1 (fr) * 2013-08-23 2020-09-30 Corbion Biotech, Inc. Procede de production industrielle de farine de biomasse de microalgues riches en lipides sans "off-notes" par controle de la disponibilite en oxygene
EP3052636A2 (en) 2013-10-04 2016-08-10 Solazyme, Inc. Tailored oils
US20160256380A1 (en) * 2013-10-10 2016-09-08 Beagle Bioproducts, Inc. Use of naturally-occurring blooms containing toxic cyanobacteria
JP2016533180A (ja) * 2013-10-18 2016-10-27 ロケット フレールＲｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓ 微細藻類バイオマスのテクスチャー方法
FR3013186B1 (fr) * 2013-11-19 2019-07-19 Roquette Freres Nouveaux snacks non allergenes contenant des proteines vegetales
KR20160088864A (ko) 2013-11-29 2016-07-26 로께뜨프레르 단백질이 풍부한 미세조류 바이오매스 미분 과립 및 이의 제조 방법
CN103636808B (zh) * 2013-12-20 2016-05-18 云南农业大学 一种即食火夹乳饼产品的制作方法
WO2015149026A1 (en) 2014-03-28 2015-10-01 Solazyme, Inc. Lauric ester compositions
CN104041730A (zh) * 2014-06-19 2014-09-17 覃良 一种黑色食品配料
WO2016007862A2 (en) 2014-07-10 2016-01-14 Solazyme, Inc. Novel ketoacyl acp synthase genes and uses thereof
US11077158B2 (en) 2014-07-17 2021-08-03 Cornell University Omega-3 fatty acid enrichment of poultry products with defatted microalgae animal feed
MX2017000668A (es) * 2014-07-17 2017-10-20 Bakery Supplies Europe Holding B V Uso de particulas de grasa en la preparacion de los productos farinaceos.
CN106661082A (zh) 2014-07-18 2017-05-10 罗盖特公司 用于从微藻生物质提取可溶性蛋白的方法
US11122817B2 (en) 2014-07-25 2021-09-21 Smallfood Inc. Protein rich food ingredient from biomass and methods of production
US11213048B2 (en) 2014-07-25 2022-01-04 Smallfood, Inc. Protein rich food ingredient from biomass and methods of preparation
FR3030191B1 (fr) * 2014-12-18 2018-03-23 Corbion Biotech, Inc. Composition pour produit frit allege en matiere grasse et procede de fabrication
AU2016255437B2 (en) 2015-04-28 2020-10-08 Mars, Incorporated Process of preparing a sterilized wet pet food product
FR3036404B1 (fr) * 2015-05-19 2019-06-07 Corbion Biotech, Inc. Procede fermentaire de decoloration de la biomasse de chlorella protothecoides
CA2992860A1 (en) * 2015-07-24 2017-02-02 Synthetic Genomics, Inc. A protein rich food ingredient from biomass and methods of production
MX2018009521A (es) 2016-02-08 2018-12-11 Corbion Biotech Inc Procedimiento de enriquecimiento con proteinas de una biomasa de microalgas.
JPWO2017169713A1 (ja) * 2016-03-29 2019-01-10 富士フイルム株式会社 微細藻類の培養方法、及び藻類バイオマスの製造方法
US11419350B2 (en) 2016-07-01 2022-08-23 Corbion Biotech, Inc. Feed ingredients comprising lysed microbial cells
IT201600128070A1 (it) * 2016-12-19 2018-06-19 Alghea Biomarine S R L Miscela per prodotti alimentari arricchiti con acidi grassi insaturi
GB201622360D0 (en) 2016-12-29 2017-02-15 Mars Inc Pet food product
GB2558673B (en) * 2017-01-17 2019-05-01 Nueber Food Ltd Baked food product
CA3043521A1 (en) * 2017-02-08 2018-08-16 Nestec S.A. Creamers compositions
GB201702881D0 (en) * 2017-02-23 2017-04-12 Seaweed & Co Ltd Improved method for milling seaweed
EP3381301A1 (en) 2017-03-30 2018-10-03 Golden Chlorella SA Methods of preparation of food products comprising microalgae & products thereof
EP3634155A4 (en) 2017-05-12 2021-02-17 Axiom Foods Inc. RICE PRODUCTS AND SYSTEMS AND PROCESSES FOR THEIR PRODUCTION
MX2020006748A (es) 2017-12-26 2020-11-09 Locus Ip Co Llc Composiciones de conservacion de alimentos organicos.
FR3076438B1 (fr) * 2018-01-11 2021-09-17 Odontella Preparation de microalgues marines agglomerees et utilisations comme produit alimentaire
US20210401801A1 (en) * 2018-11-06 2021-12-30 Abl Co.,Ltd Method for long-term storage of chlorophyll-containing extract
KR102162832B1 (ko) * 2018-12-12 2020-10-07 국립해양생물자원관 헤테로클로렐라 루테오비리디스 mm0014 균주 및 그 용도
CN109601903A (zh) * 2018-12-19 2019-04-12 福建农林大学 一种海苔及保持海苔脆度的制备方法
EP3955750A4 (en) * 2019-04-16 2023-01-11 Locus IP Company, LLC MICROBE-BASED EMULSIFYING FOOD ADDITIVES
CN110115345A (zh) * 2019-05-10 2019-08-13 成都大学 一种营养肉粉及其制备方法
CN114286625A (zh) * 2019-06-28 2022-04-05 诺贝尔根公司 裸藻的蛋白质提取及后续加工的方法
US11638731B2 (en) 2019-11-20 2023-05-02 Nooter/Eriksen, Inc. Medical compositions with Omega-3 containing excipients
EP4072300B1 (en) * 2019-12-13 2023-08-02 Unilever IP Holdings B.V. Dressing composition comprising microalgal protein
CN112042880A (zh) * 2020-08-14 2020-12-08 河海大学 一种紫菜小球藻牛肉丸的制作方法
KR102636793B1 (ko) * 2020-08-28 2024-02-15 대상 주식회사 클로로필을 함유하지 않는 클로렐라를 사용한 생면의 제조방법
US11298387B1 (en) 2020-11-20 2022-04-12 Nooter/Eriksen, Inc. Omega-3 containing compositions
US11730782B2 (en) 2020-11-20 2023-08-22 Nooter/Eriksen, Inc Processes for producing omega-3 containing compositions from algae and related extractions
WO2023043945A2 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Checkerspot, Inc. High oleic oil compositions and uses thereof
WO2023091669A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Checkerspot, Inc. Recycled polyurethane formulations
WO2023102069A1 (en) 2021-12-01 2023-06-08 Checkerspot, Inc. Polyols, polyurethane dispersions, and uses thereof
WO2023131656A1 (en) * 2022-01-05 2023-07-13 Biotrino Aps Chlorella vulgaris strain with reduced chlorophyll content
SE2250075A1 (en) * 2022-01-28 2023-07-29 Mycorena Ab Fungi-based fat tissue
WO2023198694A1 (fr) 2022-04-11 2023-10-19 Algama Microalgues texturées fermentées
WO2024092022A1 (en) * 2022-10-25 2024-05-02 Cella Farms Inc. Carrier and filler food compositions with high protein and low lipid content
WO2024105258A1 (en) * 2022-11-18 2024-05-23 Alver World Sa Methods of preparation of a food or a feed product or ingredient from non-refined microalgae & uses thereof

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2967700A (en) * 1955-03-01 1961-01-10 Morris B Kallison Whipping and aerating apparatus
FR1510761A (fr) 1966-03-03 1968-01-19 Mo Och Domsjoe Ab Procédé pour l'accroissement du rendement de la préparation de pâtes à papier par voie alcaline
US4324067A (en) * 1980-02-04 1982-04-13 The University Of Arizona Foundation Algal cell harvesting
JPS60221037A (ja) * 1984-04-16 1985-11-05 Toshiyuki Oota アイスケ−キ
US6977167B2 (en) * 1988-09-07 2005-12-20 Martek Biosciences Corporation Mixtures of omega-3 and omega-6 highly unsaturated fatty acids from euryhaline microorganisms
US5244921A (en) * 1990-03-21 1993-09-14 Martek Corporation Eicosapentaenoic acids and methods for their production
JP3143636B2 (ja) 1991-09-11 2001-03-07 株式会社サン・クロレラ 細胞破裂によるクロレラ細胞壁の破砕方法
JPH0712466A (ja) * 1993-06-25 1995-01-17 Nippon Steel Corp 電気炉内への非消耗型ランスによる酸素または酸素含有ガスの吹込み方法
JPH0912466A (ja) * 1995-06-26 1997-01-14 Yakult Honsha Co Ltd 脂質の吸収阻害・排出促進剤および高脂肪食品
AU748220C (en) 1997-08-01 2003-02-27 Martek Biosciences Corporation DHA-containing nutritional compositions and methods for their production
CN103834699A (zh) 2003-10-02 2014-06-04 Dsmip资产公司 使用改进量的氯和钾在微藻类中产生高水平的dha
ES2810026T3 (es) 2004-03-25 2021-03-08 Novozymes Inc Métodos para la degradación o la conversión de polisacáridos de la pared celular vegetal
US8685679B2 (en) * 2004-11-04 2014-04-01 E I Du Pont De Nemours And Company Acyltransferase regulation to increase the percent of polyunsaturated fatty acids in total lipids and oils of oleaginous organisms
US20090274736A1 (en) * 2006-01-19 2009-11-05 Solazyme Inc. Nutraceutical Compositions From Microalgae And Related Methods of Production And Administration
CN101522043A (zh) * 2006-09-28 2009-09-02 珀法克特美食家有限公司 基于藻类生物粗料的增味剂及其使用和制备方法
US8802422B2 (en) * 2007-06-01 2014-08-12 Solazyme, Inc. Renewable diesel and jet fuel from microbial sources
WO2009058799A1 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 Wake Forest University School Of Medicine Compositions and methods for prevention and treatment of mammalian diseases
CN104770424A (zh) * 2008-10-14 2015-07-15 索拉兹米公司 微藻生物质的食品组合物
US20100303957A1 (en) * 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. Edible Oil and Processes for Its Production from Microalgae
ES2749850T3 (es) * 2009-04-14 2020-03-24 Corbion Biotech Inc Nuevas composiciones alimenticias a base de algas

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180039763A (ko) 2018-04-18
KR101914694B1 (ko) 2018-11-02
MX347228B (es) 2017-04-19
JP5865894B2 (ja) 2016-02-17
JP2013523188A (ja) 2013-06-17
CA2796395A1 (en) 2011-10-20
JP2016041082A (ja) 2016-03-31
ES2784774T3 (es) 2020-09-30
EP2557937B1 (en) 2020-01-22
US20110256282A1 (en) 2011-10-20
US20170119005A1 (en) 2017-05-04
KR20130055597A (ko) 2013-05-28
US20200015490A1 (en) 2020-01-16
WO2011130578A2 (en) 2011-10-20
MX2012011827A (es) 2013-02-07
WO2011130578A3 (en) 2012-11-08
CA2796395C (en) 2019-01-15
EP2557937A4 (en) 2016-02-17
EP2557937A2 (en) 2013-02-20
KR101849367B1 (ko) 2018-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210244064A1 (en) Novel microalgal food compositions
US20190254292A1 (en) Gluten-free foods containing microalgae
US20190254291A1 (en) Microalgal flour
CA2796395C (en) Lipid-rich microalgal flour food compositions
US20180139994A1 (en) Microalgal food compositions
CA2758479C (en) Novel microalgal food compositions
US20100303961A1 (en) Methods of Inducing Satiety
US20100303990A1 (en) High Protein and High Fiber Algal Food Materials
US20100297295A1 (en) Microalgae-Based Beverages
US20100303957A1 (en) Edible Oil and Processes for Its Production from Microalgae
US20100297296A1 (en) Healthier Baked Goods Containing Microalgae
US20120128851A1 (en) Novel microalgal food compositions
US20100297292A1 (en) Reduced Pigmentation Microalgae Strains and Products Therefrom
US20100297331A1 (en) Reduced Fat Foods Containing High-Lipid Microalgae with Improved Sensory Properties
US20100239712A1 (en) Food Compositions of Microalgal Biomass
US20100297325A1 (en) Egg Products Containing Microalgae
AU2015261580B2 (en) Food compositions of microalgal biomass
AU2015271929A1 (en) Novel microalgal food compositions

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: CORBION BIOTECH., INC. (US)

B11B Dismissal acc. art. 36, par 1 of ipl - no reply within 90 days to fullfil the necessary requirements
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]