ES2749850T3

ES2749850T3 - Nuevas composiciones alimenticias a base de algas

Info

Publication number: ES2749850T3
Application number: ES10765119T
Authority: ES
Inventors: Geoffrey Brooks; Scott Franklin; Jeff Avila; Stephen M Decker; Enrique Baliu; Walter Rakitsky; John Piechocki; Dana Zdanis; Lesile M Norris
Original assignee: Corbion Biotech Inc
Current assignee: Corbion Biotech Inc
Priority date: 2009-04-14
Filing date: 2010-04-14
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2030-04-14
Also published as: EP2418959A4; EP2418959A1; KR101899933B1; WO2010120923A1; EP3622828A1; CA2758479C; JP2016198117A; CN102946738A; EP3622828B1; BRPI1013431B1; CA2758479A1; CN102946738B; AU2010236491A1; BRPI1013431A2; HK1182595A1; KR20170096218A; KR20110138407A; AU2010236491B2; JP2014138620A; KR101769121B1

Abstract

Una composición de harina libre de gluten que comprende una harina de microalgas y al menos una otra harina libre de gluten excepto la harina de microalgas, en donde la harina de microalgas comprende un homogeneizado de la biomasa de microalgas que contiene células lisadas predominantemente o completamente en forma de un polvo y contiene al menos 16% en aceite de triglicérido de peso en seco, en donde la al menos una otra harina libre de gluten se selecciona del grupo que consiste en harina de amaranto, harina de raíz flecha, harina de trigo sarraceno, harina de arroz, harina de garbanzo, harina de maíz, harina de mijo, harina de patata, harina de almidón de patata, harina de quinoa, harina de sorgo, harina de soja, harina de habas, harina de leguminosa, tapioca (yuca) harina, harina de teff, harina de alcachofa, harina de almendra, harina de bellota, harina de coco, harina de castañas, harina de maíz y harina de taro; el contenido de clorofila de la biomasa de microalgas es inferior a 200 ppm; y la biomasa de microalgas se deriva de Chlorella protothecoides.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevas composiciones alimenticias a base de algas

REFERENCIA A UN LISTADO DE SECUENCIAS

[0001] Esta aplicación incluye una lista de secuencias en un archivo de texto titulado 026172-0o4150PC_Sequence_Listing, creado el 14 de abril de 2010 y que contiene 22803 bytes.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La invención reside en los campos de la microbiología, la preparación de alimentos, y la nutrición humana y animal.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] A medida que la población humana sigue aumentando, hay una creciente necesidad de fuentes de alimentación adicionales, en particular las fuentes de alimentos que son baratos de producir, pero nutritivos. Por otra parte, la actual dependencia de la carne como el alimento básico de muchas dietas, por lo menos en los países más desarrollados, contribuye significativamente a la emisión de gases de efecto invernadero, y hay una necesidad de nuevos productos alimenticios que son igualmente sabrosos y nutritivos sin embargo, menos perjudiciales para el medio ambiente para producir.

[0004] Requiriendo solamente "el agua y la luz del sol" para crecer, algas durante mucho tiempo han sido consideradas como una fuente potencial de alimento. Mientras que ciertos tipos de algas, algas marinas, principalmente, en efecto, proporcionan importantes alimentos para el consumo humano, la promesa de algas como alimento no se ha realizado. polvos de algas hechos con algas fotosintéticamente crecidas en estanques al aire libre o fotobiorreactores están disponibles comercialmente, pero tienen un color verde profundo (de la clorofila) y un sabor fuerte y desagradable. Cuando se formula en productos alimenticios o suplementos nutricionales, estos polvos de algas imparten un color verde poco atractivo visualmente al producto alimenticio o suplemento nutricional y tienen un sabor a pescado o algas desagradable.

[0005] Hay varias especies de algas que se utilizan en los productos alimenticios, hoy en día la mayoría que son las macroalgas como algas marinas, algas púrpura (Porphyra, utilizado en nori), dulse (Palmaria palmate) y lechuga de mar (Ulva lactuca). Las microalgas, tales como Spirulina (Arthrospira platensis) se cultivan comercialmente en estanques abiertos (fotosintéticamente) para su uso como un suplemento nutricional o incorporado en pequeñas cantidades en batidos o bebidas de jugo (generalmente menos de 0,5% p/p). Otras microalgas, incluyendo algunas especies de Chlorella son muy populares en los países asiáticos como un suplemento nutricional.

[0006] Además de estos productos, aceite de algas con alto contenido de ácido docosahexanoico (DHA) se usa como un ingrediente en las fórmulas infantiles. DHA es un aceite altamente poliinsaturado. DHA tiene propiedades anti inflamatorias y es un suplemento bien conocido, así como un aditivo utilizado en la preparación de productos alimenticios. Sin embargo, el DHA no es adecuado para los alimentos cocinados porque se oxida con el tratamiento térmico. Además, el DHA es inestable cuando se expone al oxígeno, incluso a temperatura ambiente en presencia de antioxidantes. La oxidación del DHA resulta en un sabor a pescado y aroma desagradable.

[0007] Sigue habiendo una necesidad de métodos para producir barata y eficientemente productos alimenticios a partir de algas, a gran escala, en particular de productos alimenticios que son sabrosos y nutritivos. La presente invención satisface estas y otras necesidades.

[0008] US5547699 describe una amplia variedad de productos alimenticios que comprenden una cuajada de soja a partir de cuerpos secos de algas, agua, agente de coagulación y harina de soja.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0009] La presente invención proporciona una composición de harina sin gluten tal como se define en la reivindicación 1 y un producto alimenticio libre de gluten como se define en la reivindicación 14. Las características preferidas del producto de harina y los alimentos se definen en las reivindicaciones dependientes. Las microalgas utilizadas en la invención están libres de toxinas de algas y contienen niveles variables de aceite de triglicérido principalmente monoinsaturado. Harinas descritas en este documento se formulan como polvos que fluyen libres mezclables, ingredientes alimentarios mixtos, estabilizados por oxidación, homogeneizados y micronizados, y combinaciones de las mismas. Harinas descritas en este documento también forman auto estabilización de emulsiones en las suspensiones con viscosidades manejables. También se describen métodos innovadores de la formulación de harinas y su incorporación en composiciones alimenticias. La invención también comprende harinas con proteínas significativas digeribles y contenido único de fibra dietética y de agua asociada de unión, texturización, y los atributos de entrega de aceite saludables. También se describen métodos novedosos de aceite y sustitución de la grasa usando harinas de la invención. Harinas de la invención pueden ser fabricadas a partir de materias primas de fermentación heterotróficas comestibles y no comestibles, incluidos almidón de maíz, caña de azúcar, glicerol, y celulosa despolimerizada.

[0010] La presente invención incluye composiciones alimenticias acabadas libres de gluten que contienen microalgas, así como ingredientes alimentarios que contienen microalgas para la fabricación a gran escala de alimentos libres de gluten. Alimentos e ingredientes de la invención, mientras que la eliminación del gluten, también han aumentado los beneficios de salud a través de la reducción o eliminación de aceites y grasas menos saludables a través de la sustitución de aceites de algas monoinsaturadas, principalmente. Las composiciones alimenticias novedosas también poseen propiedades sensoriales más deseables y vida útil que los alimentos libres de gluten previamente existentes. Alimentos e ingredientes descritos en este documento, que no contienen gluten, también contienen niveles altos de fibra en la dieta, el colesterol reducido o eliminado, y contenido de aceite más saludable que los alimentos libres de gluten existentes. También se describen métodos de reducción de las alergias alimenticias y síntomas de enfermedades tales como celiaca-bebedero para hacer frente al aumento de las tasas de sensibilidad al gluten que contienen productos. También se describen métodos de formulación y fabricación de alimentos e ingredientes sin gluten que contienen microalgas para la formulación de tales alimentos.

[0011] La presente invención proporciona un producto alimenticio libre de gluten formado por combinación de biomasa de microalgas que comprende al menos 16% de aceite de triglicérido en peso seco y al menos una otra harina libre de gluten. El producto de harina sin gluten o grano sin gluten comprende al menos uno de los siguientes: harina de amaranto, harina de flecha de la raíz, harina de trigo sarraceno, harina de arroz, harina de garbanzo, harina de maíz, harina de mijo, harina de patata, harina de almidón de patata, harina de quinoa, harina de sorgo, harina de soja, harina de habas, harina de leguminosa, harina de tapioca (yuca), harina de teff, harina de alcachofa, harina de almendra, harina de bellota, harina de coco, harina de castañas, harina de maíz y harina de taro.

[0012] El producto alimenticio se forma con la biomasa de microalgas en la forma de una harina de microalgas, que es un homogeneizado de la biomasa de microalgas que contiene células lisadas predominantemente o completamente en forma de polvo. El contenido de clorofila de la biomasa de microalgas es menor que 200 ppm y la biomasa de microalgas se deriva de Chlorella protothecoides. En algunos casos, la biomasa de microalgas es predominantemente células lisadas. En algunos casos, la harina de microalgas tiene un tamaño medio de partícula de entre 1 y 100 |im. En una realización, el aceite de triglicéridos es menor que 2% 14: 0, 13-16% 16: 0, 1-4% 18: 0, 64-70% 18: 1, 10-16% 18: 2, 0,5- 2,5% 18: 3, y menos de 2% de aceite de una longitud de cadena de carbono de 20 o más. En algunos casos, la biomasa de microalgas tiene entre 25-40% de carbohidratos en peso seco. En algunos casos, el componente de hidratos de carbono de la biomasa es de entre fibra dietética 25-35% y el azúcar libre de 2% a 8% incluyendo sacarosa en peso seco. En una realización, la composición de monosacáridos del componente de fibra dietética de la biomasa es 0,1-4% de arabinosa, 5-15% de manosa, 15-35% de galactosa y 50-70% de glucosa. En algunos casos, la biomasa de microalgas tiene entre 20-115 pg/g del total de carotenoides, incluyendo 20-70|ig/g luteína. En una realización, el contenido de clorofila de la biomasa de microalgas es menos de 2 ppm. En algunos casos, la biomasa tiene 1-8 mg/100 g de tocoferoles totales, incluyendo 2-6 mg/100 tocoferol alfa. En algunos casos, la biomasa tiene 0,05-0,30 mg/g tocotrienoles totales, incluyendo 0,10-0,25 mg/g tocotrienol alfa. En algunos casos, el aceite de triglicérido es el ácido de menos de 5% docosahexanoico (DHA) (22: 6) en peso seco.

[0013] En algunas realizaciones, la harina carece de aceite visible. En algunos casos, la harina de microalgas comprende además un agente de flujo. En algunos casos, la harina de microalgas comprende además un antioxidante.

[0014] En algunos casos, la biomasa de microalgas se deriva de una microalga que es un mutante de color con una reducción de la pigmentación de color en comparación con la cepa de la que se derivó. En algunos casos, la biomasa de microalgas se deriva de la cultivo de microalgas heterótroficamente. En algunos casos, la biomasa de microalgas se deriva a partir de algas cultivadas y procesadas bajo condiciones de buenas prácticas de fabricación (GMP).

[0015] En algunos casos, el producto alimenticio es un producto horneado, pan, cereales, galletas o pasta. En algunas realizaciones, el producto horneado se selecciona del grupo que consiste de brownies, pasteles y productos de tipo tortas, y cookies. En algunos casos, se añade un conservante compatible con los alimentos a la biomasa de microalgas. En algunos casos, el producto alimenticio está libre de aceite o grasa al margen de aceite de algas aportado por la biomasa de microalgas. En algunos casos, el producto alimenticio está libre de las yemas de huevo. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas tiene aproximadamente 0,5% a 1,2% p/p fosfolípidos de algas. En algunos casos, los fosfolípidos comprenden una combinación de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, y fosfatidilinositol. En una realización, el producto alimenticio es un producto sin cocer. En una realización, el producto alimenticio es un producto cocido.

[0016] La presente invención proporciona una composición de harina libre de gluten que comprende una harina de microalgas y al menos una otra harina libre de gluten excepto la harina de microalgas, en donde la harina de microalgas comprende un homogeneizado de la biomasa de microalgas que contiene células lisadas predominantemente o completamente en forma de un polvo y contiene al menos 16% en peso de aceite triglicérido seco. Al menos otra harina libre de gluten se selecciona del grupo que consiste en harina de amaranto, harina de raíz flecha, harina de trigo sarraceno, harina de arroz, harina de garbanzo, harina de maíz, harina de mijo, harina de patata, harina de almidón de patata, harina de quinoa, harina de sorgo, harina de soja, harina de habas, harina de leguminosa, harina de tapioca (yuca), harina de teff, harina de alcachofa, harina de almendra, harina de bellota, harina de coco, harina de castañas, harina de maíz y harina de taro. El contenido de clorofilo de la biomasa de microalgas es menos de 200 ppm y la biomasa de microalgas se deriva de Chlorella protothecoides. En algunas realizaciones, el tamaño medio de partículas de biomasa en la harina de microalgas es de entre 1 y 100|im. En algunos casos, la harina de microalgas tiene un contenido de humedad de 10% o menos, o 5% o menos en peso. En algunos casos, la biomasa de microalgas tiene entre 45% y 70% en peso de aceite triglicérido seco. En una realización, el 60-75% del aceite es un 18: 1 lípido en una forma glicerolípido. En una realización, el aceite es menos de 2% 14: 0, 13-16% 16: 0, 1-4% 18: 0, 64-70% 18: 1, 10-16% 18: 2, 0,5-2,5 % 18: 3 y menos de 2% de aceite de una longitud de cadena de carbono de 20 o más.

[0017] En algunos casos, la composición de harina libre de gluten comprende biomasa de microalgas que es de entre 25% a 40% de carbohidratos en peso seco. En algunas realizaciones, el componente de hidratos de carbono de la biomasa de microalgas es entre fibra dietética 25-35% y 2% a 8% de azúcar libre incluyendo sacarosa, en peso seco. En una realización, la composición de monosacáridos del componente de fibra dietética de la biomasa es 0,1-4% de arabinosa, 5-15% de manosa, 15-35% de galactosa y 50-70% de glucosa. En algunos casos, la biomasa de microalgas tiene entre 20-115|ig/g del total de carotenoides, incluyendo 20-70|ig/g de luteína. En una realización, el contenido de clorofila de la biomasa de microalgas es menos de 2 ppm. En algunos casos, la biomasa de microalgas tiene 1-8 mg/100 g de tocoferoles totales, incluyendo 2-6 mg/100 g de tocoferol alfa. En algunos casos, la biomasa de microalgas tiene 0,05-0,30 mg/g de tocotrienoles totales, incluyendo 0,10-0,25 mg/g de tocotrienol alfa.

[0018] En algunas realizaciones, la harina de microalgas se carece de aceite visible. En algunos casos, la harina libre de gluten más comprende además un agente de flujo. En algunos casos, la harina libre de gluten comprende además un antioxidante.

[0019] En algunos casos, la biomasa de microalgas se deriva de un alga que es un mutante de color con una reducción de la pigmentación de color en comparación con la cepa de la que se derivó. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas se deriva de algas heterotróficamente cultivadas. En algunos casos, la biomasa de microalgas se deriva a partir de algas cultivadas y se procesa en condiciones de buenas prácticas de fabricación (GMP).

[0020] También se describe un método para reducir los síntomas de la intolerancia al gluten que comprende (a) la sustitución de un producto alimenticio que contiene gluten en la dieta de un sujeto que tiene intolerancia al gluten con un producto alimenticio del mismo tipo producido por la combinación de la biomasa de microalgas que comprende al menos 16% de aceite de triglicéridos por masa seca y al menos otro ingrediente alimenticio libre de gluten, en el que el producto alimenticio del mismo tipo está libre de gluten, y (b) proporcionar el producto alimenticio del mismo tipo a un sujeto con la intolerancia al gluten, con lo cual al menos un síntoma de la intolerancia al gluten se reduce en el sujeto.

[0021] Se da a conocer además un método de fabricación de un producto alimenticio libre de gluten que comprende combinar la biomasa de microalgas que comprende aceite de triglicéridos de peso en seco de al menos 16% con al menos otro ingrediente libre de gluten comestible para hacer el producto alimenticio. En algunos casos, la biomasa de microalgas tiene entre 45% y 70% de aceite en peso seco. En algunos casos, 60%-75% del aceite es un 18: 1 lípido en una forma glicerolípido. En una realización, el aceite de triglicéridos es menor que 2% 14: 0, 13-16% 16: 0, 1-4% 18: 0, 64-70% 18: 1, 10-16% 18: 2, 0,5- 2,5% 18: 3 y menos de 2% de aceite de una longitud de cadena de carbono de 20 o más.

[0022] En algunos casos, la biomasa de microalgas se deriva de no más de una sola cepa de microalgas. La biomasa de microalgas se deriva de un alga que es Chlorella protothecoides. En algunos casos, la biomasa de microalgas se deriva de algas heterotróficamente cultivadas. En algunos casos, la biomasa de microalgas se deriva a partir de algas cultivadas y procesadas bajo condiciones de buenas prácticas de fabricación (GMP).

[0023] Estos y otros aspectos y realizaciones de la invención se describen en los dibujos adjuntos, una breve descripción de los cuales sigue inmediatamente, y en la descripción detallada de la invención más adelante, y se ejemplifican en los ejemplos siguientes. Cualquiera o todas las características que se describen anteriormente y en toda la aplicación se pueden combinar en diversas realizaciones de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0024]

La Figura 1 muestra el perfil lipídico de cepas seleccionadas de microalgas como porcentaje del contenido total de lípidos. La especie/cepa correspondiente a cada número de cepa se muestra en la Tabla 1 del Ejemplo 1.

La Figura 2 muestra el perfil de aminoácidos de biomasa Chlorella protothecoides en comparación con el perfil de aminoácidos de la proteína de huevo entero.

La Figura 3 muestra las puntuaciones sensoriales de huevo entero líquido con y sin harina de algas en una mesa de vapor durante 60 minutos. La apariencia, textura y sensación en la boca de los huevos se evaluaron cada 10 minutos.

La Figura 4 muestra la harina de algas (aproximadamente 50% de lípidos en peso seco) en una dispersión de agua con microscopía de luz. Las flechas apuntan a las partículas de tamaño medio, individuales de algas de harina, mientras que el punto de puntas de flecha más grande para algas partículas de harina que se han aglomerado o agrupado después de que se forma la dispersión.

Las Figuras 5A-C muestran la distribución del tamaño de partículas de harina de algas acuosas resuspendidas inmediatamente después de: (5A) mezclado suave; (5B) homogeneizado bajo una presión de 300 bar; y (5C) homogeneizado bajo 1.000 bar de presión.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0025] Esta descripción detallada de la invención se divide en secciones y subsecciones para la conveniencia del lector. Sección I proporciona definiciones para diversos términos utilizados en el presente documento. Sección II, en partes A-E, se describen métodos para la preparación de biomasa de microalgas, incluyendo organismos (A) adecuados, métodos de generación de una cepa de microalgas carece de o ha reducido significativamente la pigmentación (B) condiciones de cultivo (C), condiciones de concentración (d), y composición química de la biomasa producida de acuerdo con la invención (E). Sección III, en partes A-D, se describen métodos para el procesamiento de la biomasa de microalgas en escama de algas (A), polvo de algas (B), harina de algas (C); y aceite de algas (D) de la invención. Sección IV describe diversos alimentos de la invención y métodos de combinar la biomasa de microalgas con otros ingredientes alimenticios.

[0026] Todos los procesos descritos en este documento se pueden realizar de acuerdo con GMP o regulaciones equivalentes. En Estados Unidos, las regulaciones GMP para la fabricación, embalaje, o sujeción de la alimentación humana están codificadas en 21 CFR 110. Estas disposiciones, así como disposiciones complementarias a las que se hace referencia en el mismo, se incorporan aquí como referencia en su totalidad a todos los efectos. Condiciones GMP en los Estados Unidos y condiciones equivalentes en otras jurisdicciones, se aplican en la determinación de si un alimento está adulterado (la comida ha sido fabricada en condiciones tales que no es apto para alimentos) o ha sido preparado, empacado o mantenido en condiciones insalubres tal que puede haberse contaminado o de otro modo puede haber sido perjudicial para la salud. Condiciones GMP pueden incluir adhesión a las normativas que rigen: control de la enfermedad; la limpieza y la formación del personal; mantenimiento y operación sanitaria de los edificios e instalaciones; provisión de instalaciones y alojamientos sanitarios adecuados; diseño, construcción, mantenimiento y limpieza de los equipos y utensilios; provisión de procedimientos de control de calidad apropiados para asegurar que todas las precauciones razonables se toman en recepción, inspección, el transporte, la segregación, la preparación, fabricación, envasado, y el almacenamiento de productos alimenticios de acuerdo con principios de saneamiento adecuados para prevenir la contaminación de cualquier fuente; y el almacenamiento y el transporte de alimento terminado en condiciones que protejan a los alimentos contra contaminación microbiana física, química, o indeseable, así como contra el deterioro de los alimentos y el recipiente.

I. DEFINICIONES

[0027] Salvo que se defina lo contrario a continuación, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Definiciones generales de muchos de los términos usados en este documento pueden encontrarse en Singleton et al, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5a Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991).

[0028] "Porcentaje de área" se refiere al área de los picos observados usando métodos de detección de FAME GC/FID en donde cada ácido graso en la muestra se convierte en un éster metílico de ácido graso (FAME) antes de la detección. Por ejemplo, se observa un pico separado para un ácido graso de 14 átomos de carbono sin insaturación (C14: 0) en comparación con cualquier otro ácido graso tal como C14: 1. El área del pico para cada clase de FAME es directamente proporcional a su composición por ciento en la mezcla y se calcula basándose en la suma de todos los picos presentes en la muestra (es decir, [área bajo el pico específico/área total de todos los picos medidos] X 100). Cuando se hace referencia a los perfiles de lípidos de los aceites y las células de la invención, "por lo menos 4% C8-C14" significa que al menos 4% de los ácidos grasos totales en la célula o en la composición glicerolípido extraído tiene una longitud de cadena que incluye 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono.

[0029] "Axénico" significa un cultivo de un organismo que no está contaminado por otros organismos vivos.

[0030] "Producto cocido" significa un alimento, típicamente encontrado en una panadería, que se prepara mediante el uso de un horno y generalmente contiene un agente de fermentación. Los productos horneados incluyen, pero no se limitan a brownies, galletas, pasteles, tartas y pasteles.

[0031] "Bioreactor" y "fermentador" significan un recinto o cerramiento parcial, tal como un tanque de fermentación o recipiente, en el que se cultivan típicamente las células en suspensión.

[0032] "Pan" significa un alimento que contiene harina, el líquido, y por lo general un agente de fermentación. Panes se preparan normalmente por cocción en un horno, aunque otros métodos de cocción también son aceptables. El agente fermentador puede ser de naturaliza química u orgánica/biológica. Típicamente, el agente de fermentación orgánica es la levadura. En el caso en que el agente de fermentación es de naturaleza química (tales como la levadura en polvo y/o bicarbonato de sodio), estos productos alimenticios se conocen como "panes rápidos". Galletas y otros productos de tipo galleta son ejemplos de panes que no contienen un agente de fermentación.

[0033] "Material celulósico" significa los productos de la digestión de la celulosa, en particular la glucosa y la xilosa. Digestión de la celulosa produce típicamente compuestos adicionales, tales como disacáridos, oligosacáridos, lignina, furfurales y otros compuestos. Fuentes de material celulósico incluyen, por ejemplo y sin limitación, bagazo de caña de azúcar, pulpa de remolacha azucarera, rastrojo de maíz, virutas de madera, serrín, y switchgrass.

[0034] "Co-cultivo" y variantes del mismo tal como "co-cultivar" y "co-fermentar" significa que dos o más tipos de células están presentes en el mismo biorreactor en condiciones de cultivo. Los dos o más tipos de células son, para los propósitos de la presente invención, típicamente ambos microorganismos, típicamente ambas microalgas, pero puede en algunos casos incluir un tipo de célula no de tipo microalgas. Las condiciones de cultivo adecuadas para el co-cultivo incluyen, en algunos casos, los que estimulan el crecimiento y/o propagación de los dos o más tipos de células, y, en otros casos, las que facilitan el crecimiento y/o proliferación de sólo una, o sólo un subconjunto, de las dos o más células, mientras que se mantiene el crecimiento celular para el resto.

[0035] "Cofactor" significa una molécula, que no sea el sustrato, requerido para una enzima para llevar a cabo su actividad enzimática.

[0036] "Producto alimenticio convencional" significa una composición destinada para el consumo, p.ej., por un ser humano, que carece de la biomasa de algas o de otros componentes de algas e incluye ingredientes normalmente asociados con el producto alimenticio, en particular un aceite vegetal, grasa animal, y/o huevo(s), junto con otros ingredientes comestibles. Productos alimenticios convencionales incluyen los productos alimenticios que se venden en tiendas y restaurantes y las realizados en el hogar. Productos alimenticios convencionales a menudo se hacen siguiendo las recetas convencionales que especifican la inclusión de un aceite o grasa de una fuente no de algas y/o de huevo(s) junto con otro(s) ingrediente(s) comestible(s).

[0037] "Producto cocido" significa un alimento que ha sido calentado, p.ej., en un horno, por un período de tiempo.

[0038] "Aderezo de ensalada cremosa" significa un aderezo de ensalada que es una dispersión estable con alta viscosidad y una velocidad de vertido lenta. Generalmente, aderezos de ensalada cremosos son opacos.

[0039] "Cultivar", "cultivo", y "fermento", y variantes de los mismos, significan el fomento intencional de crecimiento y/o propagación de una o más células, típicamente microalgas, mediante el uso de condiciones de cultivo. Condiciones aptas excluyen el crecimiento y/o propagación de microorganismos en la naturaleza (sin intervención humana directa).

[0040] "Citólisis" significa la lisis de las células en un entorno hipotónico. Citolisis resulta de osmosis, o el movimiento de agua, en el interior de una célula a un estado de hiperhidratación, de manera que la célula no puede soportar la presión osmótica del agua dentro, y así explota.

[0041] "Fibra dietética" significa carbohidratos no de almidón se encuentran en plantas y otros organismos que contienen paredes celulares, incluyendo microalgas. La fibra dietética puede ser soluble (disuelta en agua) o insoluble (no es capaz de ser disuelta en agua). La fibra soluble e insoluble constituye la fibra dietética total.

[0042] "Comida sin lípidos" significa la biomasa de algas que se ha sometido a un proceso de extracción de aceite y así contiene menos aceite, con relación a la biomasa antes de la extracción de aceite. Las células en la comida sin lípidos predominantemente se lisan. Comida sin lípidos incluye la biomasa de algas que ha sido extraido por disolvente (hexano).

[0043] "Proteína cruda digestible" es la porción de proteína que está disponible o se puede convertir en nitrógeno libre (aminoácidos) después de digerir con las enzimas gástricas. En la medición in vitro de la proteína cruda digestible se lleva a cabo mediante el uso de enzimas gástricas tales como la pepsina y la digestión de una muestra y midiendo el aminoácido libre después de la digestión. En la medición in vivo de proteína cruda digestible se lleva a cabo mediante la medición de los niveles de proteína en una muestra de alimento/alimentación y la alimentación de la muestra a un animal y midiendo la cantidad de nitrógeno recogida en las heces del animal.

[0044] "Peso en seco" y "peso celular seco" significan peso determinado en la relativa ausencia de agua. Por ejemplo, la referencia a la biomasa de microalgas como que comprende un porcentaje especificado de un componente particular en peso seco significa que el porcentaje se calcula basándose en el peso de la biomasa después de que sustancialmente toda el agua se ha eliminado.

[0045] "Ingrediente comestible" significa cualquier sustancia o composición que es apta para ser comida. "Ingredientes comestibles" incluyen, sin limitación, granos, frutas, verduras, proteínas, hierbas, especias, carbohidratos y grasas.

[0046] "Proporcionado exógenamente" significa una molécula proporcionada a una célula (incluyendo proporcionada a los medios de una célula en cultivo).

[0047] "Grasa" significa un lípido o mezcla de lípidos que es generalmente sólido a temperaturas ambiente normales y presiones. "Grasa" incluye, sin limitación, manteca de cerdo y mantequilla.

[0048] "Fibra" significa carbohidratos no de almidón en forma de polisacárido. La fibra puede ser soluble en agua o insoluble en agua. Muchas microalgas producen fibra soluble e insoluble, típicamente residen en la pared celular.

[0049] "Producto alimenticio acabado" y "ingrediente alimentario terminado" significa una composición alimenticia que está listo para el embalaje, el uso o consumo. Por ejemplo, un "producto alimentario terminado" puede haber sido cocido o los ingredientes que comprenden el "producto alimentario terminado" puede haber sido mezclado o integrado de otro modo entre sí. Un "ingrediente del producto final" se usa típicamente en combinación con otros ingredientes para formar un producto alimenticio.

[0050] "Fuente de carbono fijo" significa molécula(s) que contiene(n) carbono, típicamente moléculas orgánicas, que están presentes a temperatura ambiente y presión en forma sólida o líquida.

[0051] "Los alimentos", "composición de los alimentos", y "producto alimenticio" significa cualquier composición destinada a ser o se espera a ser ingerida por los seres humanos como fuente de nutrición y/o calorías. Las composiciones alimenticias están compuestas principalmente de hidratos de carbono, grasas, agua y/o proteínas y constituyen sustancialmente la totalidad de la ingesta calórica diaria de una persona. Una "composición de alimentos" puede tener un mínimo de peso que es al menos diez veces el peso de un comprimido o cápsula (rangos típicos de la tableta/peso de la cápsula son de menos de o igual a 100 mg hasta 1.500 mg) típico. Una "composición de alimentos" no está encapsulada o en forma de tabletas.

[0052] "Perfil glicerolípido" significa la distribución de diferentes longitudes de cadena de carbono y los niveles de saturación de glicerolípidos en una muestra particular de biomasa o aceite. Por ejemplo, una muestra podría tener un perfil glicerolípido en el que aproximadamente 60% del glicerolípido es C18: 1,20% es C18: 0, 15% es C16: 0 y 5% es C14: 0. Cuando se hace referencia una longitud de carbono genéricamente, como "C: 18", dicha referencia puede incluir cualquier cantidad de saturación; por ejemplo, la biomasa de microalgas que contiene 20% (en peso/masa) de lípidos como C: 18 puede incluir C18: 0, C18: 1, C18: 2, y similares, en cantidades iguales o distintas, la suma de los que constituyen 20% de la biomasa. La referencia a porcentajes de un cierto tipo de saturación, como "al menos 50% monoinsaturado en una forma glicerolípido 18: 1" significa que las cadenas laterales alifáticas de los glicerolípidos son al menos 50% 18: 1, pero no significa necesariamente que al menos 50% de los triglicéridos son trioleína (tres cadenas 18: 1 unidas a un único esqueleto de glicerol); un perfil de este tipo puede incluir glicerolípidos con una mezcla de 18: 1 y otras cadenas laterales, provistas al menos el 50% de las cadenas laterales totales son 18: 1.

[0053] "Buenas prácticas de fabricación" y "GMP" significan esas condiciones establecidas por las normas previstas en la norma 21 CFR 110 (para la alimentación humana) y 111 (para los suplementos dietéticos), o esquemas de regulación comparables establecidos en lugares fuera de los Estados Unidos. Las regulaciones estadounidenses son promulgadas por la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos bajo la autoridad de la Federal Food, Drug, and Cosmetic Act y para regular los fabricantes, procesadores y envasadores de productos alimenticios y suplementos dietéticos para el consumo humano.

[0054] "Crecimiento" significa un aumento en el tamaño celular, contenido celular total, y/o masa celular o en peso de una célula individual, incluido el aumento de peso de la célula debido a la conversión de una fuente de carbono fijado en el aceite intracelular.

[0055] "Homogeneizado" significa biomasa que se ha visto alterada físicamente. La homogeneización es un proceso mecánico de fluido que implica la subdivisión de partículas en tamaños uniformes más pequeños y más, formando una dispersión que puede ser sometida a un procesamiento adicional. La homogeneización se utiliza en el tratamiento de varios alimentos y productos lácteos para mejorar la estabilidad, vida útil, la digestión y el gusto.

[0056] "Producción de lípidos aumentada" significa un aumento en la productividad de lípidos/aceite de un cultivo microbiano que se puede lograr, por ejemplo, aumentando el peso seco de células por litro de cultivo, aumentando el porcentaje de células que contienen lípidos, y/o aumentando la cantidad total de lípido por litro de volumen de cultivo por unidad de tiempo.

[0057] "In situ" significa "en el lugar" o "en su posición original". Por ejemplo, un cultivo puede contener un primer tipo celular de microalgas secretoras de un catalizador y un segundo tipo de célula microorganismo que secreta un sustrato, en donde el primer y segundo tipos de células producen los componentes necesarios para una reacción química particular, que se produzca in situ en el co-cultivo sin requerir una separación adicional o el procesamiento de los materiales.

[0058] "Lípido" significa cualquiera de una clase de moléculas que son solubles en disolventes no polares (tales como éter y hexano) y relativamente o completamente insoluble en agua. Moléculas de lípidos tienen estas propiedades, ya que se componen en gran parte de colas hidrocarbonadas largas que son de naturaleza hidrófoba. Ejemplos de lípidos incluyen ácidos grasos (saturados e insaturados); glicéridos o glicerolípidos (tales como monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos o grasas neutras, y fosfoglicéridos o glicerofosfolípidos); y no glicéridos (esfingolípidos, tocoferoles, tocotrienoles, lípidos de esterol incluyendo el colesterol y las hormonas esteroides, lípidos de prenol incluyendo terpenoides, alcoholes grasos, ceras, y policétidos).

[0059] "Lisado" significa una solución que contiene el contenido de las células lisadas.

[0060] "Lisis" se refiere a la rotura de la membrana plasmática y, opcionalmente, la pared celular de un microorganismo suficiente para liberar al menos algún contenido intracelular, que a menudo se logra mediante mecanismos mecánicos o osmóticos que comprometen su integridad.

[0061] "Lisis" se refiere a la interrupción de la membrana celular y, opcionalmente, la pared celular de un organismo biológico o celular suficiente para liberar al menos algún contenido intracelular.

[0062] "Microalgas" significa un organismo microbiano eucaritótico que contiene un cloroplasto, y que puede o no ser capaz de realizar la fotosíntesis. Las microalgas incluyen obligar fotoautótrofos, que no pueden metabolizar una fuente de carbono fijo en forma de energía, así como los heterótrofos, que pueden vivir exclusivamente fuera de una fuente de carbono fijo, incluyendo heterótrofos obligados, que no pueden realizar la fotosíntesis. Las microalgas incluyen organismos unicelulares que se separan de las células hermanas poco después de la división celular, tales como Chlamydomonas, así como microbios tales como, por ejemplo, Volvox, que es un simple microbio fotosintético multicelular de dos tipos de células distintas. "Microalgas" también incluyen células, tales como Chlorella, Parachlorella y Dunaliella.

[0063] "Biomasa de microalgas", "biomasa de algas," y "biomasa" significan un material producido por el crecimiento y/o propagación de células de microalgas. La biomasa puede contener células y/o contenidos intracelulares, así como material extracelular. Material extracelular incluye, pero no se limita a, compuestos secretados por una célula.

[0064] "Aceite de microalgas" y "aceite de algas" significan cualquiera de los componentes lipídicos producidos por las células de microalgas, incluyendo los triacilgliceroles.

[0065] "Micronizado" significa biomasa que ha sido homogeneizada a alta presión (o un proceso equivalente) de manera que al menos el 50% del tamaño de partícula (tamaño medio de partícula) no es más que 10^m en su dimensión o diámetro de una esfera de volumen equivalente más larga. Típicamente, al menos 50% a 90% o más de tales partículas son de menos de 5|imen su dimensión o diámetro de una esfera de volumen equivalente más larga. En cualquier caso, el tamaño medio de partícula de la biomasa micronizada es más pequeña que la célula de microalgas intacta. Los tamaños de partícula se hace referencia son los resultantes de la homogeneización y se miden preferiblemente tan pronto como sea práctico después de haberse producido la homogeneización y antes del secado para evitar posibles distorsiones causadas por la aglutinación de partículas de como puede ocurrir en el curso de secado. Algunas de las técnicas de medición de tamaño de partícula, tales como difracción de láser, detecta el tamaño de partículas aglomeradas en lugar de partículas individuales y pueden mostrar un tamaño de partícula aparente mayor (por ejemplo, el tamaño medio de partícula de 1-100|im) después del secado. Debido a que las partículas son típicamente de forma aproximadamente esférica, el diámetro de una esfera de volumen equivalente y la dimensión más larga de una partícula es aproximadamente el misma.

[0066] "Microorganismo" y "microbio" significa cualquier organismo unicelular microscópico.

[0067] "Suplemento nutricional" significa una composición destinada a complementar la dieta, proporcionando nutrientes específicos en lugar de calorías a granel. Un suplemento nutritivo puede contener uno cualquiera o más de los siguientes ingredientes: una vitamina, un mineral, una hierba, un aminoácido, un ácido graso esencial, y otras sustancias. Los suplementos alimenticios son típicamente comprimidos o cápsulas. Un suplemento nutricional de comprimidos únicos o cápsulas se ingiere normalmente a un nivel no superior a 15 gramos por día. Los suplementos alimenticios pueden presentarse en bolsitas listas para su mezcla, que pueden mezclarse con composiciones de alimentos, como el yogur o un "batido", como complemento a la dieta, y por lo general se ingieren a un nivel de no más de 25 gramos por día.

[0068] "Aceite" significa cualquier triacilglicérido (o aceite de triglicéridos), producido por organismos, incluyendo microalgas, otras plantas, y/o animales. "Aceite", como se distingue de "grasa", se refiere, a menos que se indique lo contrario, a los lípidos que son generalmente líquidos a temperaturas ambiente normales y presiones. Por ejemplo, "aceite" incluye aceites vegetales o semillas derivados de plantas, incluyendo, sin limitación, un aceite derivado de la soja, de colza, canola, palma, almendra de palma, coco, maíz, oliva, girasol, semilla de algodón, cuphea, cacahuete, camelina sativa, semilla de mostaza, nuez de anacardo, avena, lupino, kenaf, la caléndula, el cáñamo, el café, semillas de lino, avellanas, Euphorbia, semilla de calabaza, cilantro, camelia, sésamo, cártamo, arroz, aceite de árbol de tung, cacao, copra, amapola pium, semillas de ricino, pacana, de jojoba, jatropha, macadamia, nueces de Brasil, y el aguacate.

[0069] "Choque osmótico" significa la ruptura de las células en una solución después de una reducción repentina en la presión osmótica y puede ser utilizado para inducir la liberación de componentes celulares de las células en una solución.

[0070] "Pasteurización" significa un proceso de calentamiento que está destinada a frenar el crecimiento microbiano en productos alimenticios. Típicamente la pasteurización se realiza a una temperatura elevada (pero por debajo de ebullición) durante un corto periodo de tiempo. Como se describe aquí, la pasteurización no sólo puede reducir el número de microbios no deseados en productos alimenticios, pero también puede inactivar determinadas enzimas presentes en el producto alimenticio.

[0071] "Polisacárido" y "glicano" significa cualquier carbohidrato hecho de monosacáridos unidos entre sí por enlaces glicosídicos. La celulosa es un ejemplo de un polisacárido que forma ciertas paredes celulares vegetales.

[0072] "Puerto" significa una abertura en un biorreactor que permite entrada o salida de materiales tales como gases, líquidos, y las células; un puerto está normalmente conectado a un tubo.

[0073] "Predominantemente encapsulado" significa que más de 50% y típicamente más de 75% a 90% de un componente de referencia, p.ej., aceite de algas, es secuestrado en un recipiente de referencia, que puede incluir, p.ej., una célula de microalgas.

[0074] "Células predominantemente intactas" y "biomasa predominantemente intacta" significa una población de células que comprenden más de 50, y, a menudo más de 75, 90, y 98% de células intactas. "Intacto", en este contexto, significa que la continuidad física de la membrana celular y/o de la pared celular que encierra los componentes intracelulares de la célula no se ha interrumpido en cualquier forma que pueda liberar los componentes intracelulares de la célula en una medida que excede la permeabilidad de la membrana celular en cultivo.

[0075] "Predominantemente lisado" significa una población de células en las que más del 50%, y típicamente más de 75 a 90%, de las células han sido alterados de tal manera que los componentes intracelulares de la célula ya no son completamente encerrados dentro de la membrana celular.

[0076] "Proliferación" significa una combinación de tanto el crecimiento como la propagación.

[0077] "Propagación" significa un aumento en el número de células a través de la mitosis o la otra división celular.

[0078] "Análisis proximal" significa análisis de productos para la grasa, nitrógeno/proteína, fibra cruda (celulosa y lignina como componentes principales), humedad y cenizas. Carbohidrato soluble (fibra dietética total y azúcares libres) puede calcularse restando el total de los valores conocidos de la análisis aproximado de 100 (carbohidratos por diferencia).

[0079] "Sonicación" significa la interrupción de materiales biológicos, tales como una célula, por la energía de la onda de sonido.

[0080] "Especies de furfural" significa 2-furancarboxaldehído y derivados de los mismos que retienen las mismas características estructurales básicas.

[0081] "Rastrojo" significa los tallos y hojas secas de un cultivo que queda después de un grano ha sido cosechado a partir de ese cultivo.

[0082] "Adecuados para el consumo humano" significa una composición que puede ser consumida por seres humanos como la ingesta alimentaria sin efectos nocivos para la salud y puede proporcionar la ingesta calórica significativa debido a la absorción de material digeridos en el tracto gastrointestinal.

[0083] "Producto sin cocer" significa una composición que no ha sido sometida a calentamiento, pero puede incluir uno o más componentes previamente sometidos a calentamiento.

[0084] "V/V" o "v/v", en referencia a proporciones en volumen, significa la relación del volumen de una sustancia en una composición para el volumen de la composición. Por ejemplo, la referencia a una composición que comprende 5% de aceite de v/v de microalgas significa que 5% del volumen de la composición se compone de aceite de microalgas (p.ej., dicha composición tiene un volumen de 100 mm3 contendría 5 mm3 de aceite de microalgas), y el resto del volumen de la composición (p.ej., 95 mm3en el ejemplo) se compone de otros ingredientes.

[0085] "P/P" o "p/p", en referencia a proporciones en peso, significa la relación del peso de una sustancia en una composición para el peso de la composición. Por ejemplo, la referencia a una composición que comprende 5% p/p de biomasa de microalgas significa que 5% del peso de la composición se compone de biomasa de microalgas (p.ej., dicha composición tiene un peso de 100 mg contendría 5 mg de biomasa de microalgas) y el resto del peso de la composición (p.ej., 95 mg en el ejemplo) se compone de otros ingredientes.

II. MÉTODOS PARA PREPARAR BIOMASA MICROALGAL

[0086] La presente solicitud da a conocer la biomasa de algas adecuada para el consumo humano, que es rico en nutrientes, incluyendo lípidos y/o proteínas constituyentes, los métodos de la combinación de los mismos con ingredientes comestibles y composiciones alimentarias que contienen los mismos. La divulgación surgió en parte a partir de los descubrimientos de que biomasa de algas se puede preparar con un alto contenido de aceite y/o con una funcionalidad excelente, y la biomasa resultante incorporada en productos alimenticios en los que el contenido de aceite y/o proteína de la biomasa puede sustituir en su totalidad o en parte de los aceites y/o grasas y/o proteínas presentes en los productos alimenticios convencionales. Aceite de algas, que puede comprender predominantemente aceite monosaturado, proporciona beneficios para la salud en comparación con (grasas trans) hidrogenadas y grasas poliinsaturadas saturadas que se encuentran a menudo en productos alimenticios convencionales. Aceite de algas también se puede utilizar como aceite de cocina estable sano y libre de grasas trans. El resto de la biomasa de algas puede encapsular el aceite al menos hasta que se cocina un producto alimenticio, lo que aumenta la vida útil del aceite. En los productos crudos, en los cuales las células permanecen intactas, la biomasa, junto con antioxidantes naturales que se encuentran en el aceite, que también protege el aceite de la oxidación, que de otro modo crean malos olores, sabores y texturas. La biomasa también proporciona varios micro-nutrientes beneficiosos además del aceite y/o proteína, tales como fibras de algas derivadas de la dieta (tanto los hidratos de carbono solubles como insolubles), fosfolípidos, glicoproteína, fitoesteroles, tocoferoles, tocotrienoles, y selenio, lo que aumenta la vida útil del aceite. En los productos crudos, en los cuales las células permanecen intactas, la biomasa, junto con antioxidantes naturales que se encuentran en el aceite, que también protege el aceite de la oxidación, que de otro modo crea malos olores, sabores y texturas. La biomasa también proporciona varios micro-nutrientes beneficiosos además del aceite y/o proteína, tales como fibras de algas derivadas de la dieta (tanto los hidratos de carbono solubles e insolubles), fosfolípidos, glicoproteína, fitoesteroles, tocoferoles, tocotrienoles, y selenio, lo que aumenta la vida útil del aceite. En los productos crudos, en los cuales las células permanecen intactas, la biomasa, junto con antioxidantes naturales que se encuentran en el aceite, que también protege el aceite de la oxidación, que de otro modo crea malos olores, sabores y texturas. La biomasa también proporciona varios micro-nutrientes beneficiosos además del aceite y/o proteína, tales como fibras de algas derivadas de la dieta (tanto los hidratos de carbono solubles como insolubles), fosfolípidos, glicoproteína, fitoesteroles, tocoferoles, tocotrienoles, y selenio.

[0087] Esta sección revisa primero los tipos de microalgas adecuados para su uso en los métodos de revelado en el presente documento (parte A), métodos de generación de una cepa de microalgas carece de o ha reducido significativamente la pigmentación (parte B), entonces las condiciones de cultivo (parte C) que se utilizan para propagar la biomasa, a continuación, las etapas de concentración que se utilizan para preparar la biomasa para su posterior procesamiento (parte D), y concluye con una descripción de la composición química de la biomasa preparada de acuerdo con los métodos (parte E).

A. Microalgas para uso en los métodos

[0088] Una especie de variedades de microalgas que producen aceites adecuados y/o lípidos y/o proteínas se pueden utilizar de acuerdo con los métodos descritos en este documento, aunque microalgas que producen de forma natural altos niveles de aceites adecuados y/o lípidos y/o proteínas son los preferidos. Consideraciones que afectan a la selección de microalgas incluyen, además de la producción de aceites adecuados, lípidos, o proteína para la producción de productos alimenticios: (1) alto contenido en lípidos (o proteínas) como un porcentaje del peso de la célula; (2) facilidad de crecimiento; (3) facilidad de propagación; (4) facilidad de procesamiento de la biomasa; (5) el perfil glicerolípido; y (6) la ausencia de toxinas de algas (Ejemplo 5 a continuación demuestra biomasa seca de microalgas y aceites o lípidos extraídos de la biomasa carece de toxinas de algas).

[0089] En algunas realizaciones, la pared celular de las microalgas debe ser interrumpida durante el procesamiento de alimentos (p.ej., cocción) para liberar los componentes activos o para la digestión, y, en estas realizaciones, las cepas de microalgas con paredes celulares susceptibles a la digestión en el tracto gastrointestinal de un animal, p.ej., un humano u otro monogástricos, se prefieren, especialmente si la biomasa de algas es para ser utilizada en los productos alimenticios no cocidos. Digestibilidad se disminuye generalmente para las cepas de microalgas que tienen un alto contenido de celulosa/hemicelulosa en las paredes celulares. La digestibilidad se puede evaluar usando un ensayo de digestibilidad de pepsina estándar.

[0090] En realizaciones particulares, las microalgas comprenden células que son al menos 10% o más de aceite en peso seco. En otras realizaciones, las microalgas contienen al menos 25-35% o más de aceite en peso seco. Generalmente, en estas realizaciones, cuánto más aceite esté contenido en el microalgas, más nutritiva será la biomasa, por lo que las microalgas que se pueden cultivar para contener al menos 40%, al menos 50%, 75%, o más de aceite en peso seco son especialmente preferidos. Microalgas preferidas para uso en los métodos pueden crecer heterotróficamente (en azúcares en ausencia de luz) o son heterótrofos obligados. No todos los tipos de lípidos son deseables para su uso en alimentos y/o nutracéuticos, ya que pueden tener un sabor desagradable o un olor desagradable, así como exhibir una pobre estabilidad o proporcionar una mala sensación en la boca, y estas consideraciones también influyen la selección de microalgas para uso en los métodos.

[0091] Las microalgas del género Chlorella son generalmente útiles en los métodos. Chlorella es un género de algas verdes unicelulares, que pertenece a la phylum Chlorophyta. Las células Chlorella son generalmente de forma esférica, aproximadamente 2 a 10 |im de diámetro, y carecen de flagelos. Algunas especies de Chlorella son naturalmente heterótrofas. En realizaciones preferidas, las microalgas usadas en los métodos son Chlorella protothecoides, Chlorella ellipsoidea, Chlorella minutissima, Chlorella zofinienesi, Chlorella luteoviridis, Chlorella kessleri, Chlorella sorokiniana, Chlorella fusca var. vacuolata Chlorella sp., Chlorella cf. minutissima o Chlorella emersonii. Chlorella, particularmente Chlorella protothecoides, es un microorganismo preferido para uso en los procedimientos debido a su alta composición de lípidos. Especies particularmente preferidas de Chlorella protothecoides para su uso en los procedimientos incluyen los ejemplificados en los ejemplos siguientes.

[0092] Otras especies de Chlorella adecuadas para su uso en los métodos incluyen las especies seleccionadas de entre el grupo que consiste en anitrata, la Antártida, aureoviridis, cándida, encapsulado, desecado, ellipsoidea (incluyendo la cepa 211/42 CCAP), emersonii, fusca (incluyendo var. vacuolata), glucotropha, infusionum (incluyendo var. actophila y var. auxenophila), kessleri (incluyendo cualquiera de cepas UTEX 397,2229,398), lobophora (incluyendo la cepa SAG 37.88), luteoviridis (incluyendo la cepa SAG 2203 y var. aureoviridis y lutescens), miniata, cf. minutissima, minutissima (Incluyendo cepa UTEX 2341), mutabilis, nocturna, ovalis, parva, photophila, pringsheimii, protothecoides (incluyendo cualquiera de las cepas UTEX 1806, 411, 264, 256, 255, 250, 249, 31, 29, 25 o CCAP 211/8D, o CCAP 211/17 y var. acidicola), regularis (incluyendo var. mínimos, y umbricata), reisiglii (incluyendo la cepa CCP 11/8), saccharophila (incluyendo la cepa 211/31 Cc AP, 211/32 CCAP y var. ellipsoidea), salina, a una cara, sorokiniana (incluyendo la cepa SAG 211.40B), sp. (incluyendo cepa UTEX 2068 y CCAP 211/92), sphaerica, stigmatophora, trebouxioides, vanniellii, vulgar (incluyendo cepas CCAP 211/11K, CCAP 211/80 y F. Tertia y var. autotrophica, viridis, vulgaris, vulgaris f tertia, vulgaris fvirid is), xanthella, y zofingiensis.

[0093] Especies de Chlorella (y especies de otros géneros de microalgas) se pueden identificar por comparación de determinadas regiones de destino de su genoma con esas mismas regiones de especies identificadas en el presente documento; especies preferidas son las que presentan identidad o al menos un nivel muy alto de homología con las especies identificadas en el presente documento. Por ejemplo, la identificación de una especie específica Chlorella o cepa se pueden lograr a través de la amplificación y secuenciación de ADN nuclear y/o cloroplasto utilizando cebadores y metodología utilizando regiones apropiadas del genoma, por ejemplo utilizando los métodos descritos en Wu et al., Bot. Bull. Acad. Sin. 42: 115-121 (2001), Identificación de aislados de Chlorella spp. usando secuencias de ADN ribosomal. métodos bien establecidos de análisis filogenético, tales como la amplificación y secuenciación de espaciador transcrito interno ribosomal (ITS1 e ITS2 de ADNr), 23S ARN, 18S ARNr, y otras regiones genómicas conservadas pueden ser utilizadas por los expertos en la técnica de identificar especies de no sólo Chlorella, sino otras microalgas de producción de aceite y lípidos adecuadas para uso en los métodos descritos en este documento. Para ejemplos de métodos de identificación y clasificación de las algas, ver Genetics, 170 (4): 1601-1610 (2005) y RNA, 11 (4): 361-4 (2005).

[0094] Por lo tanto, la comparación de ADN genómico se puede utilizar para identificar las especies adecuadas de microalgas para ser usadas en la presente invención. Regiones de ADN genómico conservadas, tales como y no limitadas a ADN que codifica para 23S ARNr, se pueden amplificar a partir de especies de microalgas que pueden ser, por ejemplo, taxonómicamente relacionadas con la microalga preferida usada en los presentes métodos y en comparación con las regiones correspondientes de las especies preferidas. Las especies que presentan un alto nivel de similitud se seleccionan entonces para su uso en estos métodos. Los ejemplos ilustrativos de tal ADN de comparación de secuencias entre las especies dentro del género Chlorella se presentan a continuación. En algunos casos, las microalgas que se prefieren tienen secuencias de ADN genómico que codifican para 23S ARNr que tienen identidad de nucleótidos al menos el 65% a al menos una de las secuencias enumeradas en la SEQ ID NOs: 1-23 y 26-27. En otros casos, las microalgas que se prefieren tienen secuencias de ADN genómico que codifican para 23S ARNr que tienen al menos 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de nucleótidos de al menos una o más de las secuencias enumeradas en la SEQ ID NOs: 1-23 y 26-27. Genotipado de una composición alimenticia y/o de la biomasa de algas antes de que se combina con otros ingredientes para formular una composición de alimentos es también un método fiable para determinar si la biomasa de algas es de más de una sola cepa de microalgas.

[0095] Para la comparación de secuencias para determinar el porcentaje de nucleótidos o de identidad de aminoácidos, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, a la que las secuencias de prueba se comparan. En la aplicación de un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, las coordenadas de subsecuencia se designan, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces la identidad de secuencia por ciento para la secuencia de prueba(s) con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designados. La alineación óptima de secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, p.ej., por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nacional. Acad. Sci. EE.UU. 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección visual (véase en general, Ausubel et al., supra). Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (en la dirección web www.ncbi.nlm.nih.gov).

[0096] Además de Chlorella, otros géneros de microalgas también se pueden utilizar en los métodos descritos en el presente documento. En realizaciones preferidas, la microalga es una especie seleccionada del grupo que consiste de Parachlorella kessleri, Parachlorella beijerinckii, Neochloris oleabundans, Bracteacoccus, incluso B. grandis, B. cinnabarinas, y B. aerius, Bracteococcus sp. o Scenedesmus rebescens. Otros ejemplos no limitativos de especies de microalgas incluyen aquellas especies del grupo de especies y géneros que consiste en Achnanthes orientalis; Agmenellum; Amphiprora hyaline; Amphora, incluyendo A. coffeiformis incluyendo A.c. linea, A.c. punctata, A.c. taylori, A . c. tenuis, A.c. delicatissima, A.c. delicatissima capitata; Anabaena; Ankistrodesmus, incluyendo A. falcatus; Boekelovia hooglandii; Borodinella; Botryococcus braunii, incluyendo B. sudeticus; Bracteoccocus, incluyendo B. aerius, B.grandis, B.cinnabarinas, B.minor, and B.medionucleatus; Carteria; Chaetoceros, incluyendo C. gracilis, C. muelleri, y C. muelleri subsalsum; Chlorococcum, incluyendo C. infusionum; Chlorogonium; Chroomonas; Chrysosphaera; Cricosphaera; Crypthecodinium cohnii; Cryptomonas; Cyclotella, incluyendo C. cryptica y C. meneghiniana; Dunaliella, incluyendo D. bardawil, D. bioculata, D. granulate, D. maritime, D. minuta, D. parva, D. peircei, D. primolecta, D. salina, D. terrícola, D. tertiolecta, and D. viridis; Eremosphaera, incluyendo E. viridis; Ellipsoidon; Euglena; Franceia; Fragilaria, incluyendo F. crotonensis; Gleocapsa; Gloeothamnion; Hymenomonas; Isochrysis, incluyendo 1. aff. galbana y 1. galbana; Lepocinclis; Micractinium (incluyendo UTEX LB 2614); Monoraphidium, incluyendo M. minutum; Monoraphidium; Nannochloris; Nannochloropsis, incluyendo N. salina; Navicula, incluyendo N. acceptata, N. biskanterae, N. pseudotenelloides, N. pelliculosa, y N. saprophila; Neochloris oleabundans; Nephrochloris; Nephroselmis; Nitschia communis; Nitzschia, incluyendo N. alexandrina, N. communis, N. dissipata, N. frustulum, N. hantzschiana, N. inconspicua, N. intermedia, N. microcephala, N. pusilla, N. pusilla elliptica, N. pusilla monoensis, and N. quadrangular; Ochromonas; Oocystis, incluyendo O. parva y O. pusilla; Oscillatoria, incluyendo O. limnetica and O. subbrevis; Parachlorella, incluyendo P. beijerincki (incluyendo la cepa SAG 2046) y P. kessleri (incluyendo cualquiera de las cepas SAG 11,80, 14,82, 21.11H9); Pascheria, incluyendo P. acidophila; Pavlova; del phagus; Phormidium; Platymonas; Pleurochrysis, incluyendo P. carterae y PAGS. dentado; prototecas, incluyendo P. stagnora (incluyendo UTEX 327), P. portoricensis,y PAGS. moriformis (incluyendo cepas UTEX 1441,1435, 1436, 1437, 1439); Pseudochlorella aquatica; Pyramimonas; Pyrobotrys; Rhodococcus opacus; Sarcinoid chrysophyte; Scenedesmus, incluyendo S. armatus y S. rubescens; Schizochytrium; spirogyra; Spirulina platensis; Stichococcus; Synechococcus; Tetraedron; Tetraselmis, incluyendo T. suecica; Thalassiosira weissflogii; y Viridiella Fridericiana.

[0097] En algunas realizaciones, las composiciones de alimentos e ingredientes alimentarios como la harina de algas se deriva a partir de algas que tiene al menos 90% o 95% 23S ARNr de identidad de secuencia genómica a una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27.

B. Métodos de generación de una cepa de microalgas que carece de pigmentación o tiene pigmentación significativamente reducida

[0098] Las microalgas, tales como Chlorella, pueden ser capaces de crecimiento fotosintético o heterótrofo. Cuando se cultivan en condiciones heterotróficas, donde la fuente de carbono es una fuente de carbono fijo y en ausencia de luz, las microalgas de color normalmente verde tienen un color amarillo, que carecen de pigmentación o tiene pigmentación significativamente reducida en la pigmentación verde. Las microalgas de la reducción (o falta de) la pigmentación verde pueden ser ventajosas como un ingrediente alimentario. Una ventaja de microalgas de la reducción (o que falta de) en la pigmentación verde es que las microalgas tienen un sabor clorofila reducido. Otra de las ventajas de las microalgas de la reducción (o falta de) la pigmentación verde es que como ingrediente alimentario, la adición de la microalga a los productos alimenticios no va a impartir un color verde que puede ser poco atractivo para el consumidor. La pigmentación verde reducida de microalgas cultivadas bajo condiciones heterotróficas es transitoria. Cuando se cambia de nuevo a crecimiento fototrófico, microalgas capaces tanto del crecimiento fototrófico como heterótrofo recuperarán la pigmentación verde. Además, incluso con la reducción de pigmentos verdes, las microalgas heterotróficamente cultivadas es un color amarillo y esto puede ser inadecuado para algunas aplicaciones de alimentos en el que el consumidor espera que el color del producto alimenticio sea blanco o de color claro. Por lo tanto, es ventajoso generar una cepa de microalgas que es capaz de crecimiento heterótrofo (por lo que se reduce o carece de pigmentación verde) y también se reduce en la pigmentación amarilla (de modo que es un color neutro para aplicaciones en alimentos).

[0099] Un método para la generación de tales cepas de microalgas carece de o ha reducido significativamente la pigmentación a través de mutagénesis y luego el cribado para el fenotipo deseado. Se conocen y practican varios métodos de mutagénesis en la técnica. Por ejemplo, Urano et al, (Urano et al, J Bioscience Bioengineering (2000) v.

90 (5): pp 567-569). Describe mutantes de color amarillo y blanco de Chlorella ellipsoidea generados utilizando irradiación UV. Kamiya (Kamiya, Plant Cell Physiol (1989) v. 30 (4): 513 a 521) describe una cepa incolora de Chlorella vulgaris, 11h (M125).

[0100] Además de la mutagénesis mediante irradiación UV, mutagénesis química se puede emplear también con el fin de generar las microalgas con reducida (o falta de) pigmentación. Mutágenos químicos tales como metanosulfonato de etilo (EMS) o N-metilo-N'nitro-N-nitroguanidina (NTG) se han demostrado para ser mutágenos químicos eficaces en una variedad de microbios, incluyendo levaduras, hongos, micobacterias y microalgas. Mutagénesis también puede llevarse a cabo en varias rondas, donde las microalgas se exponen al mutágeno (ya sea UV o química o ambas) y luego son examinados para el fenotipo de pigmentación reducida deseada. Las colonias con el fenotipo deseado son entonces sembradas en placas y reaisladas para asegurar que la mutación sea estable de una generación a la siguiente y que la colonia es pura y no de una población mixta.

[0101] En un ejemplo particular, Chlorella protothecoides se utilizó para generar cepas que carecen de o tienen pigmentación reducida usando una combinación de UV y mutagénesis química. Chlorella protothecoides fue expuesto a una ronda de mutagénesis química con NTG y las colonias se rastrearon para los mutantes de color. Las colonias que no presentan mutaciones de color se sometieron a una ronda de la irradiación UV y de nuevo se examinan para mutantes de color. En una realización, una cepa Chlorella protothecoides carente de pigmentación se aisló y es Chlorella protothecoides 33-55, depositada el 13 de octubre de 2009 en la American Type Culture Collection en 10801 University Boulevard, Manassas, Va 20110-2209, de acuerdo con el Tratado de Budapest, con una denominación de depósito de patente de PTA-10397. En otra realización, una cepa Chlorella protothecoides con pigmentación reducida se aisló y es Chlorella protothecoides 25-32, depositada el 13 de octubre de 2009 en la American Type Culture Collection en 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, de acuerdo con el Tratado de Budapest, con una denominación de depósito de patente de PTA-10396.

C. Condiciones de medios y cultivo para microalgas

[0102] Las microalgas se cultivan en medios líquidos para propagar la biomasa. En los métodos, especies de microalgas se hacen crecer en un medio que contiene un carbono fijo y/o fuente de nitrógeno fijado en la ausencia de luz. Tal crecimiento se conoce como crecimiento heterótrofo. Para algunas especies de microalgas, por ejemplo, el crecimiento heterótrofo para largos períodos de tiempo tal como de 10 a 15 o más días en acumulación de resultados de condiciones de nitrógeno limitado de alto contenido de lípidos en las células.

[0103] Medios de cultivo de microalgas contienen típicamente componentes, tales como una fuente de carbono fijo (discutido más adelante), una fuente de nitrógeno fijo (tales como proteína, harina de soja, extracto de levadura, licor de maíz fermentado, amoníaco (puro o en forma de sal), nitrato, o sal de nitrato), los elementos (por ejemplo, zinc, boro, cobalto, cobre, manganeso y molibdeno en, p.ej., las respectivas formas de ZnCl2, H3BO3, CoCl2-6H2O, CuCl2-2H2O, MnCl2-4H2O y (NH4)6Mo7O244H2O), opcionalmente un tampón para el mantenimiento del pH, y fosfato (una fuente de fósforo; otras sales de fosfato pueden ser utilizadas). Otros componentes incluyen sales tales como cloruro sódico, en particular para microalgas de agua de mar.

[0104] En un ejemplo particular, un medio adecuado para el cultivo Chlorella protothecoides comprende Proteosa Medium. Este medio es adecuado para cultivos axénicos, y un volumen de 1 litro del medio (pH~6.8) se puede preparar mediante la adición de 1 g de peptona proteosa a 1 litro de medio Bristol. El medio Bristol comprende de NaNO32,94 mM, CaCl20,17 mM 2H2O, MgSO40,3 mM 7H2O, 0,43 mM, KH2PO41,29 mM, y NaCl 1,43 mM en una solución acuosa. Por medio de agar al 1,5%, 15 g de agar se puede añadir a 1 L de la solución. La solución se cubre y se somete a autoclave, y después se almacena a una temperatura refrigerada antes de su uso. Otros métodos para el crecimiento y la propagación de Chlorella protothecoides a niveles altos del petróleo como un porcentaje de peso seco se han descrito (véase por ejemplo Miao y Wu, J. Biotechnology, 2004, 11: 85-93 y Miao y Wu, Technology Biosource (2006) 97: 841-846 (que demuestran métodos de fermentación para la obtención del peso celular seco de aceite al 55%)). Algas de alto aceite típicamente pueden ser generadas por el aumento de la longitud de una fermentación mientras que proporcionan un exceso de fuente de carbono bajo limitación de nitrógeno.

[0105] Medios de cultivo sólidos y líquidos están generalmente disponibles de una amplia variedad de fuentes, y las instrucciones para la preparación de medios determinados que son adecuados para una amplia variedad de cepas de microorganismos se pueden encontrar, por ejemplo, en línea en http://www.utex.org/, un sitio mantenido por la Universidad de Texas en Austin para su colección de cultivos de algas (UTEX). Por ejemplo, varios medios de agua dulce incluyen 1/2, 1/3, 1/5, 1X, 2/3, 2X medio diatomea CHEV; 1: 1 DYIII/PEA Gr ; medio diatomea Ag; medio Allen; medio BG11-1; medio bold 1NV y 3N; medio Botryococcus; medio Bristol; Medio de Chu; Medio CR1, CR1-S, y CR1 Diatomea; Medio Cyanidium; Medio Cyanophycean; Medio Desmid; Medio DYIII; Medio Euglena; Medio HEPES; Medio J; Medio Malta; Medio MES; Medio modificado bold 3N; Medio modificado COMBO; Medio N/20; Medio Ochromonas; Medio P49; Medio Polytomella; Medio Proteosa; Medios de algas de nieve; Medio de extracto de suelo; agua del suelo: Medio BAR, GR-, GR-/NH4, GR , GR /NH4, PEA, turba, y VT; Medio Spirulina; Medio Tap; Medio Trebouxia; Medio Volvocacean; Medio Volvocacean-3N; Medio Volvox; Medio Volvox-Dextrosa; Medio Waris; y Medio Waris extracto de suelo. Varios Medios de agua salada incluyen: 1%, 5%, y 1X medio f/2; 1/2, 1X, y de 2X Medio Erdschreiber; 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1X, 5/3, y 2X Medio de suelo agua de mar; 1/4 ERD; 2/3 medio enriquecido de agua de mar; 20% Allen 80% ERD; Medio artificial agua de mar; BG11-1 0,36% de Medio NaCl; BG11-1 1% de Medio NaCl; 1NV bold: Erdshreiber (1: 1) y (4: 1); Medio Bristol-NaCI; Medio Dasycladales de agua de mar; 1/2 y 1X medio enriquecido de agua de mar, incluyendo ES/10, ES/2, y ES/4; F/2 NH4; Medio LDM; 1X y 2X CHEV modificado; 2 X CHEV modificado suelo; Medio modificado artificial de agua de mar; Medio Porphridium; y Medio SS diatom.

[0106] Otros medios adecuados pueden ser fácilmente identificados mediante la consulta de la URL identificada anteriormente, o mediante la consulta de otras organizaciones que mantienen cultivos de microorganismos, tales como SAG, CCAP, o CCALA. SAG se refiere a la colección de cultivos de algas en la Universidad de Gottingen (Gottingen, Alemania), CCAP se refiere a la colección de cultivos de algas y protozoos gestionados por la Asociación Escocesa de Ciencias Marinas (Escocia, Reino Unido), y CCALA se refiere a la colección de cultivos de algas de laboratorio en el Instituto de Botánica (Trebon, República Checa).

[0107] Microorganismos útiles de acuerdo con los métodos se encuentran en varios lugares y entornos en todo el mundo. Como consecuencia de su aislamiento de otras especies y su divergencia evolutiva resultante, el medio de crecimiento particular para un crecimiento óptimo y la generación de aceite y/o lípidos y/o proteína de una especie en particular de microbio puede ser difícil o imposible de predecir, pero aquellos de habilidad en la técnica pueden encontrar fácilmente los medios apropiados por pruebas de rutina a la vista de la presente descripción. En algunos casos, ciertas cepas de microorganismos pueden ser incapaces de crecer en un medio de crecimiento particular debido a la presencia de algún componente inhibidor o la ausencia de algún requisito nutricional esencial requerido por la cepa particular de microorganismo.

[0108] La fuente de carbono fijo es un componente clave del medio. Fuentes fijas de carbono adecuado incluyen, por ejemplo, glucosa, fructosa, sacarosa, galactosa, xilosa, manosa, ramnosa, arabinosa, N-acetilglucosamina, glicerol, floridósido, ácido glucurónico, y/o acetato. Otras fuentes de carbono para el cultivo de microalgas incluyen mezclas, tales como mezclas de glicerol y glucosa, mezclas de glucosa y xilosa, mezclas de fructosa y glucosa, y mezclas de sacarosa y pulpa de remolacha azucarera despolimerizada. Otras fuentes de carbono adecuado para su uso en el cultivo de microalgas incluyen, licor negro, almidón de maíz, despolimerizados material celulósico (derivado de, por ejemplo, rastrojo de maíz, pulpa de remolacha azucarera, y switchgrass, por ejemplo), lactosa, suero de leche, melaza, patata, arroz, sorgo, sacarosa, remolacha azucarera, caña de azúcar, y trigo. La una o más fuente(s) de carbono pueden ser suministrada(s) a una concentración de al menos 50 |im, al menos aproximadamente 100 |im, al menos aproximadamente 500|im, al menos aproximadamente 5 mM, al menos aproximadamente 50 mM, y al menos aproximadamente 500 mM.

[0109] Por lo tanto, en diversas realizaciones, la fuente de energía de carbono fijo utilizado en el medio de crecimiento comprende glicerina y/o 5 y/o 6-azúcares de carbono, tales como glucosa, fructosa, y/o xilosa, que se puede derivar a partir de sacarosa y/o material celulósico, incluyendo material celulósico despolimerizado. Varias especies de Chlorella y múltiples cepas dentro de una especie pueden ser cultivadas en presencia de sacarosa, material celulósico despolimerizado, y glicerol, como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. Nos 20090035842, 20090011480, 20090148918, respectivamente, y ver también, Publicación de la Solicitud de Patente PCT N° 2008/151.149, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia.

[0110] Por lo tanto, los microorganismos se cultivan a partir de biomasa celulósica despolimerizada como materia prima. A diferencia de otras materias primas, tales como almidón de maíz o sacarosa de la caña de azúcar o remolacha azucarera, biomasa celulósica (despolimerizada o no) no es adecuada para el consumo humano y, potencialmente, podrían estar disponibles a bajo coste, que la hace especialmente ventajosa. Las microalgas pueden proliferar en material celulósico despolimerizado. Los materiales celulósicos incluyen generalmente de celulosa a peso seco de 40-60%; hemicelulosa en peso seco de 20-40%; y lignina en peso seco de 10-30%. Materiales celulósicos adecuados incluyen residuos de plantas herbáceas y cultivos energéticos leñosos, así como los cultivos agrícolas, es decir, las partes de la planta, principalmente tallos y hojas, no eliminados de los campos con el producto alimenticio o de fibra primaria. Los ejemplos incluyen los residuos agrícolas tales como bagazo de caña de azúcar, cáscaras de arroz, fibra de maíz (incluyendo tallos, hojas, cáscaras, y mazorcas), paja de trigo, paja de arroz, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de cítricos, cáscaras de cítricos; residuos forestales como desechos de madera dura y blanda, y residuos de madera dura y de madera blanda de las operaciones de madera; residuos de madera, tales como residuos de las fábricas de sierra (virutas de madera, serrín) y residuos de planta de celulosa; residuos urbanos tales como fracciones de papel de residuos sólidos municipales, residuos de madera urbanos y residuos verdes urbanos tales como recortes de hierba municipales; y residuos de la construcción en madera. Celulósicos adicionales incluyen cultivos celulósicos dedicados tales como pasto varilla, madera de álamo híbrido, y miscanthus, caña de fibra, y sorgo de fibra. Azúcares de cinco carbonos que son producidos a partir de tales materiales incluyen xilosa. Ejemplo 20 describe Chlorella protothecoides que se cultiva exitosamente bajo condiciones heterotróficas usando azúcares derivados de celulósicos de rastrojo de maíz y pulpa de remolacha de azúcar.

[0111] Algunos microbios son capaces de procesar el material celulósico y directamente utilizar materiales celulósicos como una fuente de carbono. Sin embargo, material celulósico típicamente necesita ser tratado para aumentar el área superficial accesible o para la celulosa que se rompe primero hacia abajo como una preparación para la utilización microbiana como fuente de carbono. Formas de preparación o pretratamiento de material celulósico para la digestión de la enzima son bien conocidos en la técnica. Los métodos se dividen en dos categorías principales: (1) se rompe el material celulósico en partículas más pequeñas con el fin de aumentar el área superficial accesible; y (2) tratar químicamente el material celulósico para crear un sustrato utilizable para la digestión enzimática.

[0112] Los métodos para aumentar el área de superficie accesible incluyen explosión de vapor, lo que implica el uso de vapor de agua a altas temperaturas para romper materiales celulósicos. Debido al requisito de alta temperatura de este proceso, algunos de los azúcares en el material celulósico puede perderse, reduciendo de este modo la fuente de carbono disponible para la digestión de la enzima (véase, por ejemplo, Chahal, D.S. et al., Proceedings of the 2nd World Congress of Chemical Engineering; (1981) y Kaar et al., Biomass and Bioenergy (1998) 14(3): 277-87). Explosión de amoníaco permite la explosión de material celulósico a una temperatura más baja, pero es más costoso de realizar, y el amoníaco podría interferir con los procesos de digestión enzimática posteriores (véase, por ejemplo, Dale, BE et al, Biotechnology and Bioengineering (1982);. 12: 31-43).

[0113] Los métodos para tratar químicamente el material celulósico para crear sustratos utilizables para la digestión de la enzima también son conocidos en la técnica. Patente de Estados Unidos N° 7.413.882 describe el uso de microbios genéticamente modificados que secretan betaglucosidasa en el caldo de fermentación y el tratamiento de material celulósico con el caldo de fermentación para mejorar la hidrólisis de material celulósico en glucosa. Material celulósico también puede tratarse con ácidos fuertes y bases para facilitar la digestión enzimática subsiguiente. Patente de Estados Unidos N° 3.617.431 describe el uso de la digestión alcalina para descomponer materiales celulósicos.

[0114] Chlorella puede proliferar en medios que contienen combinaciones de xilosa y glucosa, tales como material celulósico despolimerizado, y sorprendentemente, algunas especies incluso exhiben mayores niveles de productividad cuando se cultivan en una combinación de glucosa y xilosa que cuando se cultivan en glucosa o xilosa solo. Por lo tanto, ciertas microalgas pueden utilizar una materia prima de otro modo no comestible, tal como un material celulósico (o un material celulósico pre-tratado) o glicerol, como fuente de carbono y producir aceites comestibles. Esto permite la conversión de celulosa no comestible y glicerol, que normalmente no son parte de la cadena alimentaria humana (en contraposición a la glucosa de maíz y sacarosa de la caña de azúcar y remolacha azucarera) en alta nutrición, aceites comestibles, que pueden proporcionar nutrientes y calorías como parte de la dieta humana diaria.

[0115] Las microalgas co-cultivadas con un organismo que expresa una invertasa sacarosa secretable o cultivadas en medios que contienen una invertasa de sacarosa o expresan un gen de la invertasa de sacarosa exógena (donde la invertasa es secretada o el organismo también expresa un transportador de sacarosa) pueden proliferar en melaza de desecho de azúcar de caña u otras fuentes de sacarosa. El uso de tales residuos de bajo valor que contienen sacarosa puede proporcionar ahorros de costes significativos en la producción de aceites comestibles. Por lo tanto, los métodos de cultivo de microalgas en un material de alimentación de sacarosa y la formulación de composiciones de alimentos y suplementos nutricionales, como se describe en este documento, proporcionan un medio para convertir sacarosa de baja nutrición en aceites de alta nutrición (ácido oleico, DHA, ARA, etc.) y la biomasa que contiene dichos aceites.

[0116] Como se detalla en las publicaciones de patente mencionadas anteriormente, múltiples especies distintas Chlorella y cepas proliferan muy bien en no sólo glicerol purificado de grado reactivo, sino también en subproductos de glicerol acidulados y no acidulados y de transesterificación de biodiesel. Sorprendentemente, algunas cepas de Chlorella se someten a la división celular más rápida en presencia de glicerol que en presencia de glucosa. Los procesos de crecimiento de dos etapas, en donde las células se alimentan primero de glicerol para aumentar la densidad celular rápidamente y luego se alimentan de glucosa para acumular lípidos, pueden mejorar la eficiencia con la que se producen lípidos.

[0117] Otro método para aumentar los lípidos como un porcentaje del peso celular seco implica el uso de etilo como materia prima para las microalgas. Acetato alimenta directamente en el punto de metabolismo que inicia la síntesis de ácidos grasos (es decir, acetil-CoA); proporcionando de este modo acetato en el cultivo puede aumentar la producción de ácido graso. Generalmente, el microbio que se cultiva en presencia de una cantidad suficiente de acetato para aumentar lípido microbiano y/o rendimiento de ácido graso, en concreto, en relación con el rendimiento en ausencia de acetato. Alimentación de acetato es un componente útil de los métodos proporcionados en este documento para la generación de biomasa de microalgas que tiene un alto porcentaje de peso de células secas como lípido.

[0118] En otra realización, producción de lípidos se incrementa mediante el cultivo de microalgas productoras de lípidos en presencia de uno o más cofactor(es) para una enzima de la ruta de los lípidos (p.ej., un ácido graso de la enzima sintética). Generalmente, la concentración de cofactor(es) es suficiente para aumentar lípido microbiano (p.ej., ácido graso) de rendimiento sobre producción de lípidos microbianos en ausencia del (de los) cofactor(s). En realizaciones particulares, el (los) cofactor(es) se proporciona(n) al cultivo mediante la inclusión en el cultivo un microbio que secretan el (los) cofactor(es) o mediante la adición del (de los) cofactor(es) al medio de cultivo. Alternativamente, las microalgas pueden ser modificadas para expresar un gen exógeno que codifica una proteína que participa en la síntesis del cofactor. En ciertas realizaciones, cofactores adecuados incluyen cualquier vitamina requerida por una enzima de la ruta de los lípidos, tales como, por ejemplo, biotina o pantotenato.

[0119] Alta biomasa de lípidos a partir de microalgas es un material ventajoso para su inclusión en productos alimenticios en comparación con la biomasa bajo de lípidos, ya que permite la adición de menos biomasa de microalgas para incorporar la misma cantidad de lípido en una composición alimentaria. Esto es ventajoso, porque los aceites saludables de microalgas de altos lípidos pueden añadirse a los alimentos sin alterar otros atributos tales como la textura y el sabor en comparación con baja biomasa lipídica. La biomasa rica en lípidos proporcionada por estos métodos tiene típicamente al menos 25% de lípidos en peso celular seco. Las condiciones del proceso se pueden ajustar para aumentar el peso porcentaje de células que es de lípidos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, una microalga se cultiva en presencia de una concentración limitante de uno o más nutrientes, tal como, por ejemplo, nitrógeno, fósforo o azufre, mientras que proporciona un exceso de una fuente de carbono fijo, tal como glucosa. limitación de nitrógeno tiende a aumentar el rendimiento de lípidos microbianos sobre producción de lípidos microbianos en un cultivo en el que se proporciona nitrógeno en exceso. En realizaciones particulares, el aumento de la producción de lípidos es al menos aproximadamente 10%, 50%, 100%, 200% o 500%. El microbio puede ser cultivado en presencia de una cantidad limitante de un nutriente para una parte del periodo de cultivo, total o para todo el período. En algunas realizaciones, la concentración de nutrientes se cicla entre una concentración limitante y una concentración no limitante al menos dos veces durante el periodo de cultivo total.

[0120] En un estado de crecimiento constante, las células acumulan aceite pero no se someten a la división celular. En una realización, el estado de crecimiento se mantiene mediante la continuación para proporcionar todos los componentes del medio de crecimiento original a las células con la excepción de una fuente de nitrógeno fijo. El cultivo de células de microalgas por la alimentación de todos los nutrientes proporcionados originalmente a las células excepto una fuente de nitrógeno fijo, tales como a través de la alimentación de las células durante un período prolongado de tiempo, da como resultado un mayor porcentaje de lípidos por peso de células secas.

[0121] En otras realizaciones, la biomasa alta en lípidos se genera por la alimentación de una fuente de carbono fijado a las células después de que todo el nitrógeno fijo ha sido consumido durante largos períodos de tiempo, tales como al menos una o dos semanas. En algunas realizaciones, se dejó que las células acumularan aceite en presencia de una fuente de carbono fijo y en ausencia de una fuente de nitrógeno fijo durante más de 20 días. Microalgas cultivadas usando las condiciones descritas en el presente documento o de otra manera conocidas en la técnica puede comprender al menos aproximadamente 20% de lípidos en peso seco, y a menudo comprenden 35%, 45%, 55%, 65%, e incluso 75% o más de lípidos en peso seco. Porcentaje de peso de células secas como lípido en la producción de lípidos microbianos se puede mejorar mediante la celebración de células en un estado de crecimiento heterótrofo en el que consumen carbono y acumulan aceite pero no se someten a la división celular.

[0122] Biomasa de alta proteína a partir de algas es otro material ventajoso para su inclusión en productos alimenticios. Los métodos también pueden proporcionar biomasa que tiene al menos 30% de su peso de células secas como proteína. Las condiciones de crecimiento se pueden ajustar para aumentar el peso porcentaje de células que es la proteína. En una realización preferida, una microalga se cultiva en un ambiente rico en nitrógeno y un exceso de energía de carbono fijo tal como la glucosa o cualquiera de las otras fuentes de carbono descritas anteriormente. Condiciones en las que el nitrógeno está en exceso tiende a aumentar el rendimiento de proteína microbiana sobre la producción de proteína microbiana en un cultivo en el que no se proporciona nitrógeno en exceso. Para la producción máxima de proteínas, el microbio se cultiva preferiblemente en presencia de un exceso de nitrógeno durante el periodo de cultivo total.

[0123] Fuentes de nitrógeno orgánico se han utilizado en los cultivos microbianos desde principios de los años 1900. El uso de fuentes de nitrógeno orgánico, tales como licor de maíz fermentado se popularizó con la producción de penicilina de molde. Los investigadores encontraron que la inclusión de licor de maíz en el medio de cultivo aumentó el crecimiento del microorganismo y resultó en un aumento del rendimiento en los productos (tales como penicilina). Un análisis de licor de maíz fermentado determinó que era una rica fuente de nitrógeno y también vitaminas tales como las vitaminas del complejo B, ácido pantoténico de riboflavina, niacina, inositol y nutrientes minerales tales como calcio, hierro, magnesio, fósforo y potasio (Ligget y Koffler Bacteriological Reviews (1948); 12 (4): 297-311). Fuentes de nitrógeno orgánico, tales como licor de maíz fermentado, se han utilizado en medios de fermentación para las levaduras, bacterias, hongos y otros microorganismos. Los ejemplos no limitantes de fuentes de nitrógeno orgánico son extracto de levadura, peptona, licor de maíz fermentado y polvo escarpado de maíz. Ejemplos de fuentes de nitrógeno inorgánico preferidas incluyen, por ejemplo no limitativo, y sin limitación, (NH4)2SO4 y NH4OH. En una realización, el medio de cultivo contiene fuentes de nitrógeno solamente inorgánicas. En otra realización, el medio de cultivo contiene sólo fuentes de nitrógeno orgánico. En aún otra realización, el medio de cultivo contiene una mezcla de fuentes de nitrógeno orgánicas e inorgánicas.

[0124] En los métodos, un biorreactor o fermentador se utiliza para cultivar células de microalgas a través de las diversas fases de su ciclo fisiológico. Como un ejemplo, un inóculo de células de microalgas productoras de lípidos se introduce en el medio; hay un período de latencia (fase de latencia) antes de que las células comienzan a propagarse. Tras el período de retraso, los aumentos de las tasas de propagación de manera constante y entra en la fase de registro, o exponencial. La fase exponencial a su vez está seguida por una desaceleración de la propagación debido a la disminución de nutrientes tales como nitrógeno, aumentos en sustancias tóxicas, y los mecanismos de detección de quórum. Después de esta desaceleración, la propagación se detiene, y las células entran en una fase estacionaria o estado de crecimiento constante, dependiendo del ambiente particular proporcionado a las células. Para la obtención de biomasa rica en proteínas, el cultivo se cosecha típicamente durante o poco después del final de la fase exponencial. Para la obtención de biomasa de lípidos ricos, el cultivo se cosecha típicamente bien después del final de la fase exponencial, que puede ser terminado antes permitiendo que el nitrógeno u otro nutriente clave (distinto de carbono) se agote, obligando a las células para que conviertan las fuentes de carbono, presentes en exceso, a los lípidos. Los parámetros de condiciones de cultivo se pueden manipular para optimizar la producción total de petróleo, la combinación de especies de lípidos producida, y/o producción de un aceite específico.

[0125] Biorreactores ofrecen muchas ventajas para su uso en los métodos de propagación de crecimiento y heterótrofos. Como se apreciará, las disposiciones adoptadas para hacer la luz disponible para las células en los métodos de crecimiento fotosintético son innecesarias cuando se utiliza una fuente de carbono fijado en los métodos de crecimiento y propagación heterotróficos descritos en este documento. Para producir biomasa para uso en alimentos, las microalgas se fermentan preferiblemente en grandes cantidades en el líquido, tales como en cultivos en suspensión como un ejemplo. Biorreactores tales como fermentadores de acero (5.000 litros, 10.000 litros, 40.000 litros, y más altos se utilizan en diversas formas de realización) pueden acomodar volúmenes de cultivo muy grandes. Biorreactores también permiten típicamente el control de las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, tensión de oxígeno, y los niveles de dióxido de carbono. Por ejemplo, biorreactores son típicamente configurables, por ejemplo, utilizando puertos unidos a la tubería para permitir que componentes gaseosos, tal como oxígeno o nitrógeno, se barbujeen a través del cultivo líquido.

[0126] Biorreactores pueden configurarse para fluir medios de cultivo a través del biorreactor durante todo el período de tiempo durante el cual las microalgas se reproducen y aumentan en número. En algunas realizaciones, por ejemplo, medios pueden ser infundidos en el biorreactor después de la inoculación, pero antes de que las células alcanzan una densidad deseada. En otros casos, un biorreactor se llena con medio de cultivo en el comienzo de un cultivo, y no más medio de cultivo se infunde después de inocularse el cultivo. En otras palabras, la biomasa de microalgas se cultiva en un medio acuoso durante un periodo de tiempo durante el cual reproducen microalgas y aumentan en número; sin embargo, las cantidades de medio de cultivo acuoso no se hacen fluir a través del biorreactor durante todo el período de tiempo. Así, en algunas realizaciones, medio de cultivo acuoso no se hace fluir a través del biorreactor después de la inoculación.

[0127] Biorreactores equipados con dispositivos tales como láminas de giro e impulsores, los mecanismos de balancín, barras de agitación, medios para la infusión de gas a presión pueden ser utilizados para someter los cultivo de microalgas al mezclado. El mezclado puede ser continuo e intermitente. Por ejemplo, en algunas formas de realización, un régimen de flujo turbulento de entrada de gas y la entrada de los medios no se mantiene para la reproducción de microalgas hasta que se ha logrado un aumento deseado de número de dichas microalgas.

[0128] Como se ha mencionado brevemente más arriba, biorreactores a menudo están equipados con varios puertos que, por ejemplo, permiten que el contenido de gas del cultivo de microalgas a ser manipulado. Para ilustrar, una parte del volumen de un biorreactor puede ser gas en lugar de líquido, y las entradas de gas del biorreactor para permitir el bombeo de los gases en el biorreactor. Gases que pueden ser beneficiosamente bombeados a un biorreactor incluyen aire, mezclas de aire/CO2, gases nobles, tales como argón y otros gases. Biorreactores están típicamente equipados para que el usuario pueda controlar la velocidad de entrada de un gas en el biorreactor. Como se señaló anteriormente, el aumento de flujo de gas en un biorreactor se puede utilizar para aumentar la mezcla del cultivo.

[0129] El aumento del flujo de gas afecta la turbidez del cultivo. La turbulencia se puede conseguir mediante la colocación de un puerto de entrada de gas por debajo del nivel de los medios de cultivo acuosos de modo que el gas que entra en el biorreactor de burbujas a la superficie del cultivo. Uno o más puertos de salida de gas permiten que pueda escapar gas, evitando así la acumulación de presión en el biorreactor. Preferiblemente, un orificio de salida de gas conduce a una válvula "unidireccional" que evita que los microorganismos contaminantes entren en el biorreactor.

[0130] Los ejemplos específicos de biorreactores, condiciones de cultivo, y métodos de crecimiento y propagación heterotróficos descritos en este documento se pueden combinar de cualquier manera adecuada para mejorar las eficiencias de crecimiento microbiano y de los lípidos y/o la producción de proteínas.

D. Concentración de microalgas después de la fermentación

[0131] Cultivos de microalgas generados de acuerdo con los métodos descritos anteriormente producen biomasa de microalgas en medios de fermentación. Para preparar la biomasa para su uso como una composición alimentaria, la biomasa se concentra, o cosecha, del medio de fermentación. En el punto de la recolección de la biomasa de microalgas del medio de fermentación, la biomasa comprende predominantemente células intactas en suspensión en un medio de cultivo acuoso. Para concentrar la biomasa, se realiza una etapa de deshidratación. La deshidratación o concentración se refiere a la separación de la biomasa del caldo de fermentación u otro medio líquido y por lo tanto es la separación sólido-líquido. Por lo tanto, durante la deshidratación, el medio de cultivo se elimina de la biomasa (por ejemplo, mediante el drenaje del caldo de fermentación a través de un filtro que retiene la biomasa), o la biomasa se elimina de otra forma de medio de cultivo. Procesos comunes para la deshidratación incluyen centrifugación, filtración, y el uso de presión mecánica. Estos procesos pueden ser utilizados individualmente o en cualquier combinación.

[0132] La centrifugación implica el uso de la fuerza centrífuga para separar mezclas. Durante la centrifugación, los componentes más densos de la mezcla migran fuera del eje de la centrífuga, mientras que los componentes menos densos de la mezcla migran hacia el eje. Al aumentar la fuerza de la gravedad efectiva (es decir, aumentando la velocidad de centrifugación), un material más denso, tal como sólidos, separados de material menos denso, tales como líquidos, y así se separan de acuerdo con la densidad. La centrifugación de la biomasa y el caldo u otra solución acuosa forma una pasta concentrada que comprende las células de microalgas. La centrifugación no elimina cantidades significativas de agua intracelular. De hecho, después de la centrifugación, todavía puede haber una cantidad sustancial de superficie o humedad libre en la biomasa (p.ej., más de 70%), por lo que la centrifugación no es considerada como una etapa de secado.

[0133] La filtración también puede ser utilizada para la deshidratación. Un ejemplo de filtración que es adecuado es la filtración de flujo tangencial (TFF), también conocida como filtración de flujo cruzado. Filtración de flujo tangencial es una técnica de separación que utiliza sistemas de membrana y el flujo de fuerza a los sólidos separados de los líquidos. Para un método de filtración adecuado ilustrativo, ver Geresh, Carb. Polym. 50; 183-189 (2002), que describe el uso de un filtro de fibra hueca MaxCell A/G Technologies 0.45uM. También véase, por ejemplo, los dispositivos Millipore Pellicon®, usados con 100 kD, 300kD, 1.000 kD (número de catálogo P2C01MC01), 0,1um (número de catálogo P2VVPPV01), 0,22uM (número de catálogo P2GVPPV01), y las membranas 0,45uM (número de catálogo P2HVMPV01). El retenido preferiblemente no pasa a través del filtro a un nivel significativo, y el producto en el retenido preferiblemente no se adhiere al material de filtro. TFF también se puede realizar utilizando sistemas de filtración de fibra hueca. Filtros con un tamaño de poro de al menos aproximadamente 0,1 micrómetros, por ejemplo aproximadamente 0,12, 0,14, 0,16, 0,18, 0,2, 0,22, 0,45, o al menos aproximadamente 0,65 micrómetros, son adecuados.

[0134] La deshidratación puede efectuarse también con presión mecánica aplicada directamente a la biomasa para separar el caldo de fermentación líquido de la biomasa microbiana suficiente para deshidratar la biomasa, pero no para provocar la lisis predominante de células. La presión mecánica para eliminar el agua de la biomasa microbiana puede ser aplicada usando, por ejemplo, una prensa de filtro de banda. Una prensa de filtro de banda es un dispositivo de deshidratación que se aplica una presión mecánica a una suspensión (p.ej., biomasa microbiana tomada directamente del fermentador o biorreactor) que se pasa entre las dos cintas en tensión a través de una serpentina de la disminución de rollos de diámetro. La prensa de filtro de banda en realidad se puede dividir en tres zonas: la zona de gravedad, donde el libre drenaje de agua/líquido se drena por gravedad a través de una cinta porosa; una zona de cuña, donde los sólidos se preparan para la aplicación de presión; y una zona de presión, donde se aplica presión ajustable a los sólidos drenados por gravedad.

[0135] Después de la concentración, la biomasa de microalgas puede ser procesada, como se describe más adelante, para producir torta empaquetada por vacío, copos de algas, homogeneizado de algas, polvo de algas, harina de algas, o aceite de algas.

E. Composición química de biomasa de microalgas

[0136] La biomasa de microalgas generada por los métodos de cultivo descritos en el presente documento comprende aceite de microalgas y/o proteínas, así como otros constituyentes generados por los microorganismos o incorporados por los microorganismos del medio de cultivo durante la fermentación.

[0137] La biomasa de microalgas con un alto porcentaje de acumulación de aceite/lípido en peso seco ha sido generada usando diferentes métodos de cultivo, incluyendo métodos conocidos en la técnica. Biomasa de microalgas con un mayor porcentaje de aceite acumulado/lípido es útil. Cultivos de Chlorella vulgaris con hasta 56,6% de lípidos por peso de células secas (DCW) en cultivos estacionarios cultivados bajo condiciones autótrofos utilizando altas concentraciones de hierro (Fe) han sido descritos (Li et al, Bioresource Technology 99 (11): 4717-22 (2008).Nannochloropsis sp. y cultivos Chaetoceros calcitrans con 60% de lípidos por DCW y 39,8% de lípidos por DCW, respectivamente, se cultivaron en un fotobiorreactor en condiciones de inanición de nitrógeno también se han descrito (Rodolfi et al., Biotechnology & Bioengineering (2008)). Cultivos Parietochloris inciso se han descrito con aproximadamente 30% de lípidos por DCW cuando se cultivan fototrópicamente y bajo condiciones de bajo nitrógeno (Solovchenko et al, Journal of Applied Phycology. 20: 245-251 (2008).Chlorella protothecoides puede producir hasta 55% de lípidos por DCW cuando se cultivan en ciertas condiciones heterotróficas con escasez de nitrógeno (Miao y Wu, Bioresource Technology 97: 841-846 (2006)). Otras especies de Chlorella, entre ellas Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana y Chlorella minutissima se han descrito por haber acumulado aceite de hasta 63% en DCW cuando se cultivan en biorreactores de tanque agitado en condiciones de medios de bajo nitrógeno (Illman et al, Enzyme and Microbial Technology 27: 631-635 (2000). Un porcentaje todavía más alto de lípidos por DCW se ha informado, incluyendo 70% de lípidos en cultivos de Dumaliella tertiolecta cultivados en un aumento de las condiciones de NaCl (Takagi et al, Journal of Bioscience and Bioengineering 101 (3): 223-226 (2006)) y 75% de lípidos en cultivos de Botryococcus braunii (Banerjee et al, Critical Reviews in Biotechnology 22 (3): 245-279 (2002)).

[0138] Crecimiento heterotrófico resulta en el contenido relativamente bajo de clorofila (en comparación con los sistemas fototróficos tales como estanques abiertos o sistemas de fotobiorreactor cerrados). Contenido de clorofila reducido generalmente mejora las propiedades organolépticas de microalgas y por lo tanto permite que una mayor biomasa de algas (o aceite preparado de la misma) se incorpore en un producto alimenticio. El contenido de clorofila reducido encontrado en microalgas heterotróficamente cultivadas (por ejemplo, Chlorella) reduce también el color verde en la biomasa en comparación con microalgas cultivadas fototróficamente. Por lo tanto, el contenido de clorofila reducido evita una coloración verde a menudo no deseada asociada con los productos alimenticios que contienen microalgas fototróficamente cultivadas y permite la incorporación o un aumento de la incorporación de la biomasa de algas en un producto alimenticio. En al menos una realización, el producto alimenticio contiene microalgas heterotróficamente cultivadas de contenido de clorofila reducido en comparación con microalgas fototróficamente cultivadas. En algunas realizaciones, el contenido de clorofila de la harina de microalgas es menor que 5 ppm, menos de 2 ppm, o menos de 1 ppm.

[0139] Biomasa de microalgas rica en aceite generada por los métodos de cultivo descritos en el presente documento comprende al menos 10% de aceite de microalgas por DCW. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas comprende al menos 15%, 25-35%, 30-50%, 50-55%, 50-65%, 54-62%, 56-60%, al menos 75% o al menos 90% de aceite de microalgas por DCW.

[0140] El aceite de microalgas de la biomasa descrito en este documento (o extraido de la biomasa) puede comprender glicerolípidos con una o más distintas cadenas laterales éster de ácido graso. Glicerolípidos se componen de una molécula de glicerol esterificada a una, dos, o tres moléculas de ácidos grasos, que puede ser de diferentes longitudes y tienen diversos grados de saturación. Mezclas específicas de aceite de algas se pueden preparar ya sea dentro de una sola especie de algas, o mediante la mezcla de la biomasa (o de algas aceite) a partir de dos o más especies de microalgas.

[0141] Por lo tanto, la composición de aceite, es decir, las propiedades y las proporciones de los constituyentes de ácidos grasos de los glicerolípidos, también pueden ser manipuladas mediante la combinación de la biomasa (o aceite) a partir de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunas realizaciones, al menos dos de las distintas especies de microalgas tienen diferentes perfiles de glicerolípido. Las distintas especies de microalgas pueden cultivarse conjuntamente o por separado como se describe en el presente documento, preferiblemente en condiciones heterotróficas, para generar los respectivos aceites. Las diferentes especies de microalgas pueden contener diferentes porcentajes de los constituyentes de ácidos grasos distintos en glicerolípidos de la célula.

[0142] En algunas realizaciones, el aceite de microalgas se compone principalmente de aceite monoinsaturado tal como 18: 1 de aceite (oleico), particularmente en forma de triglicéridos. En algunos casos, el aceite de algas es de al menos 20% de aceite monoinsaturado en peso. En diversas realizaciones, el aceite de algas es de al menos 25%, 50%, 75% o más aceite monoinsaturado tal como 18: 1 en peso o en volumen. En algunas realizaciones, el aceite monoinsaturado es 18: 1, 16: 1, 14: 1 o 12: 1. En algunos casos, el aceite de algas es 60-75%, 64-70%, o 65-69% 18: 1 de aceite. En algunas realizaciones, el aceite de microalgas comprende al menos 10%, 20%, 25%, o 50% o ácido oleico más esterificado o ácido alfa-linolénico esterificado en peso o por volumen (en particular en forma de triglicéridos). En al menos una realización, el aceite de algas comprende menos de 10%, menos de 5%, menos del 3%, menos de 2%, o menos de 1% en peso o en volumen, o está sustancialmente libre de, ácido esterificado docosahexanoico (DHA (22: 6)) (en particular en forma de triglicéridos). Para ejemplos de producción de microalgas de alto contenido de DHA, tales como en Crypthecodinium cohnii, véase la Patente de Estados Unidos Nos 7.252.979, 6.812.009 y 6.372.460. En algunas realizaciones, el perfil de lípidos del aceite extraído o aceite en la harina de microalgas es inferior al 2% 14: 0; 13-16% 16: 0; 1-4% 18: 0; 64-70% 18: 1; 10-16% 18: 2; 0,5-2,5% 18: 3; y menos de 2% de aceite de una longitud de cadena de carbono de 20 o más.

[0143] Biomasa de microalgas de alto contenido de proteínas se ha generado utilizando diferentes métodos de cultivo. biomasa de microalgas con un mayor porcentaje de contenido de proteína es útil. Por ejemplo, se ha informado del contenido de proteína de varias especies de microalgas (ver Tabla 1 de Becker, los avances en biotecnología (2007) 25: 207-210). El control de la tasa de renovación en un cultivo fotoautotrófico semi-continuo de Tetraselmis suecica se ha informado que afecta el contenido de proteína por célula, siendo el más alto de aproximadamente 22,8% de proteína (Fabregas, et al, Marine Biotechnology (2001) 3: 256-263).

[0144] Biomasa de microalgas generada por métodos de cultivo descritos en el presente documento relativo a alta proteína comprende típicamente proteína al menos 30% en peso de células secas. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas comprende al menos 40%, 50%, 75% o más de proteína por peso de células secas. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas comprende de proteína 30-75% en peso de células secas o de la proteína de 40-60% en peso de células secas. En algunas realizaciones, la proteína en la biomasa de microalgas comprende al menos proteína cruda digestible al 40%. En otras realizaciones, la proteína en la biomasa de microalgas comprende al menos 50%, 60%, 70%, 80%, o al menos 90% de proteína cruda digestible. En algunas realizaciones, la proteína en la biomasa de microalgas comprende de proteína cruda digestible al 40-90%, de proteína cruda digestible al 50-80%, o de proteína cruda digestible al 60-75%.

[0145] Biomasa de microalgas (y aceite extraído de la misma), también puede incluir otros constituyentes producidos por las microalgas, o incorporados en la biomasa del medio de cultivo. Estos otros constituyentes pueden estar presentes en cantidades variables en función de las condiciones de cultivo utilizadas y las especies de microalgas (y, si procede, el método de extracción utilizado para recuperar el aceite de microalgas de la biomasa). En general, el contenido de clorofila en la biomasa de microalgas alta en proteínas es mayor que el contenido de clorofila en la biomasa de microalgas de alto contenido de lípidos. En algunas realizaciones, el contenido de clorofila en la biomasa de microalgas es de menos de 200 ppm o menos de 100 ppm. Los otros constituyentes pueden incluir, sin limitación, fosfolípidos (p.ej., lecitina de algas), hidratos de carbono, fibra soluble e insoluble, glicoproteínas, fitoesteroles (p.ej., ^{P -}sitosterol, campesterol, estigmasterol, ergosterol, y brasicasterol), tocoferoles, tocotrienoles, carotenoides (p.ej., ^a caroteno, ^{p -}caroteno y licopeno), xantofilas (p.ej., luteína, zeaxantina, ⁽criptoxantina, y ^{a -}criptoxantina), proteínas, polisacáridos (p.ej., arabinosa, manosa, galactosa, galactosa 6-metil y glucosa) y diversos compuestos orgánicos o inorgánicos (p.ej., selenio).

[0146] En algunos casos, la biomasa comprende al menos 10 ppm de selenio. En algunos casos, la biomasa comprende al menos 25% p/p polisacárido de algas. En algunos casos, la biomasa comprende al menos 15% p/p glicoproteína de algas. En algunos casos, la biomasa o aceite derivado de la biomasa comprende entre 0-200, 0-115, o 50-115 mcg/g carotenoides totales, y en realizaciones específicas 20-70 o 50-60 mcg/g del contenido de carotenoides totales es luteína. En algunos casos, la biomasa comprende al menos 0,5% de fosfolípidos de algas. En algunos casos, la biomasa o aceite derivado de la biomasa de algas contiene al menos 0,10, 0,02-0,5, o 0,05-0,3 mg/g tocotrienoles totales, y en realizaciones específicas 0,05-0,25 mg/g es tocotrienol alfa. En algunos casos, la biomasa o aceite derivado de la biomasa de algas contiene entre 0,125 mg/g a 0,35 mg/g tocotrienoles totales. En algunos casos, el aceite derivado de la biomasa de algas contiene al menos 5,0, 1-8, 2-6 o 3-5 mg/100 g de tocoferoles totales y en realizaciones específicas 2-6 mg/100 g es tocoferol alfa. En algunos casos, el aceite derivado de la biomasa de algas contiene entre 5,0 mg/100 g de tocoferoles 10 mg/100 g.

[0147] En algunos casos la composición de otros componentes de la biomasa de microalgas es diferente para biomasa de alto contenido de proteínas en comparación con la biomasa alta en lípidos. En realizaciones específicas, la biomasa de alta proteína contiene entre 0,18 a 0,79 mg/100 g de tocoferoles totales y en realizaciones específicas, la biomasa de alta proteína contiene alrededor de 0,01-0,03 mg/g tocotrienoles. En algunos casos, la biomasa alta en proteínas también contiene entre 1-3g/100 g esteroles totales, y en realizaciones específicas, 1.299-2.46g/100g esteroles totales. Las descripciones detalladas de composición de tocotrienoles y tocoferoles en Chlorella protothecoides se incluye en los Ejemplos a continuación.

[0148] En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas comprende 20-45% de hidratos de carbono en peso seco. En otras formas de realización, la biomasa comprende 25-40% o 30-35% de hidratos de carbono en peso seco. Hidratos de carbono pueden ser de fibra dietética, así como azúcares libres, tales como sacarosa y glucosa. En algunas realizaciones, el azúcar en la biomasa microialgal es 1-10%, 2-8% o 3-6% en peso seco. En ciertas realizaciones, el componente de azúcar libre comprende sacarosa.

[0149] En algunos casos, la biomasa de microalgas comprende fibra soluble de al menos 10%. En otras realizaciones, la biomasa de microalgas comprende fibra soluble de al menos 20% a 25%. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas comprende al menos 30% de fibra insoluble. En otras realizaciones, la biomasa de microalgas comprende al menos 50% a la fibra insoluble al menos 70%. Fibra dietética total es la suma de fibra soluble y fibra insoluble. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas comprende al menos 40% de fibra dietética total. En otras realizaciones, la biomasa de microalgas comprende al menos 50%, 55%, 60%, 75%, 80%, 90%, a 95% de la fibra dietética total.

[0150] En una realización, el contenido de monosacáridos de la fibra total (carbohidrato total menos azúcares libres) es 0,1-3% de arabinosa; 5-15% de manosa; 15-35% de galactosa; y 50-70% de glucosa. En otras realizaciones, el contenido de monosacáridos de la fibra total es de aproximadamente 1-1,5% de arabinosa; aproximadamente 10-12% de manosa; aproximadamente 22-28% de galactosa; y 55-65% de glucosa.

III. PROCESAMIENTO DE BIOMASA MICROALGAL EN INGREDIENTES DE ALIMENTO TERMINADO

[0151] La biomasa de microalgas concentrada producida de acuerdo con los métodos descritos anteriormente es en sí mismo un ingrediente alimenticio acabado y puede ser utilizado en los productos alimenticios sin más, o sólo con una mínima modificación. Por ejemplo, la torta puede ser congelada o envasada al vacío. Alternativamente, la biomasa puede secarse mediante liofilización, un proceso de "liofilización", en el que la biomasa se congela en una cámara de liofilización a la que se aplica un vacío. La aplicación de un vacío a la cámara de liofilización resulta en la sublimación (secado primario) y la desorción (secado secundario) del agua de la biomasa. Sin embargo, se proporciona una variedad de ingredientes alimentarios terminados derivados de microalgas con propiedades mejoradas resultantes de métodos de procesamiento que se pueden aplicar a la biomasa de microalgas concentrada.

[0152] El secado de la biomasa de microalgas, ya sea predominantemente intacto o en forma de homogeneizado, es ventajoso para facilitar un procesamiento adicional o para el uso de la biomasa en los métodos y composiciones descritas en el presente documento. El secado se refiere a la eliminación de la humedad/agua libre o de la superficie de la biomasa predominantemente intacta o la extracción de agua de superficie de una suspensión de homogeneizado (p.ej., por micronización de biomasa). Diferentes texturas y sabores pueden conferirse a los productos alimenticios en función de si la biomasa de algas se seca, y si es así, el método de secado. El secado de la biomasa generada a partir de las microalgas cultivadas descritas en este documento elimina el agua que puede ser un componente indeseable de productos alimenticios terminados o ingredientes alimentarios. En algunos casos, el secado de la biomasa puede facilitar un proceso de extracción de aceite de microalgas más eficiente.

[0153] En una realización, la biomasa de microalgas concentrada es secada en tambor a una forma de escamas para producir escamas de algas, tal como se describe en la parte A de esta sección. En otra realización, la biomasa micralgal concentrada es secada por pulverización o flash (es decir, sometida a un proceso de secado neumático) para formar un polvo que contiene predominantemente células intactas para producir polvo de algas, tal como se describe en la parte B de esta sección. En otra realización, la biomasa microalgal concentrada se microniza (se homogeneiza) para formar un homogeneizado de células predominantemente lisadas que luego se seca por pulverización o instantáneamente para producir harina de algas, tal como se describe en la parte C de esta sección. En otra realización, el aceite se extrae de la biomasa de microalgas concentrada para formar aceite de algas, tal como se describe en la parte D de esta sección.

[0154] En algunas realizaciones, la harina, escamas o polvo es 15% o menos, 10% o menos, 5% o menos, 2-6%, o 3-5% de humedad en peso después del secado.

A. Escamas de algas

[0155] Escamas de algas se preparan a partir de biomasa de microalgas concentrada que se aplica como una película a la superficie de un tambor calentado que rueda. Los sólidos secados se rasparon con un cuchillo o cuchilla, lo que resulta en pequeñas escamas. Patente de Estados Unidos N° 6.607.900 describe el secado de la biomasa de microalgas usando un secador de tambor sin una etapa de centrifugación anterior (concentración), y un proceso de este tipo puede ser utilizado.

[0156] Debido a que la biomasa puede ser expuesta a altas temperaturas durante el proceso de secado, puede ser ventajoso añadir un antioxidante a la biomasa antes del secado. La adición de un antioxidante no sólo protegerá la biomasa durante el secado, sino también extender la vida útil de la biomasa de microalgas secas cuando se almacena. En una realización preferida, se añade un antioxidante a la biomasa de microalgas antes de su procesamiento posterior tal como secado o de homogeneización. Los antioxidantes que son adecuados para su uso se discuten en detalle a continuación.

[0157] Además, si hay tiempo significativo entre la producción de la biomasa de microalgas deshidratada y posteriores etapas de procesamiento, puede ser ventajoso pasteurizar la biomasa antes del secado. Los ácidos grasos libres a partir de lipasas se pueden formar si hay tiempo significativo entre la producción y el secado de la biomasa. La pasteurización de la biomasa inactiva estas lipasas y previene la formación de un sabor "a jabón" en el producto de biomasa seca resultante. Por lo tanto, en una realización, se proporciona la biomasa de microalgas pasteurizada. En otra realización, la biomasa de microalgas pasteurizada es una escama de algas.

B. Polvo de algas

[0158] Polvo de algas (o polvo de microalgas) se prepara a partir de biomasa de microalgas concentrada utilizando un secador neumático o de pulverización (véase por ejemplo la patente US N° 6.372.460). En un secador por pulverización, el material en una suspensión líquida se pulveriza en una dispersión de gotas finas en una corriente de aire calentado. El material arrastrado se seca rápidamente y forma un polvo seco. En algunos casos, un secador de combustión pulsante también se puede utilizar para conseguir una textura de polvo en el material secado final. En otros casos, una combinación de secado por pulverización seguido por el uso de un secador de lecho fluido se utiliza para conseguir las condiciones óptimas para la biomasa microbiana seca (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.255.505). Como alternativa, secadores neumáticos también se pueden utilizar en la producción de polvo de algas. Secadores neumáticos extraen o arrastran el material que ha de ser secado en una corriente de aire caliente. Mientras que el material es arrastrado en el aire caliente, la humedad se elimina rápidamente. El material secado se separa entonces de la humedad del aire y luego se recircula el aire húmedo para un secado adicional.

C. Harina de algas

[0159] Harina de algas se prepara a partir de biomasa de microalgas concentrada que ha sido sometida a lisis mecánica y homogeneizada y el spray homogeneizado o secado en flash en forma de polvo (o secado utilizando otro sistema de secado neumático). La producción de harina de algas requiere que se lisen las células para liberar su aceite y que la pared celular y componentes intracelulares sean micronizados o al menos reducidos en tamaño de partícula. El tamaño medio de partículas medidas inmediatamente después de homogeneización o tan pronto sea práctico después de eso es preferiblemente no más de 10, no más de 25, o no más de 100|im. En algunas realizaciones, el tamaño medio de partícula es 1-10, 1-15, 10-100 o 1-40|im. En algunas realizaciones, el tamaño medio de partícula es mayor que 10|im y hasta 100 |im. En algunas realizaciones, el tamaño medio de partícula es 0,1 a 100|im.

[0160] Como se señaló en la discusión de la micronización, y en particular si se mide por una técnica, tal como difracción de láser, que mide grumos en lugar de partículas individuales, el tamaño medio de las partículas se miden preferiblemente inmediatamente después de que ha ocurrido la homogeneización o tan pronto como sea práctico después de esto (por ejemplo, dentro de 2 semanas) para evitar o minimizar posibles distorsiones de la medición del tamaño de partícula debido a la formación de grumos. En la práctica, las emulsiones resultantes de la homogeneización normalmente se pueden almacenar al menos dos semanas en un refrigerador sin cambio material en tamaño de partícula. Algunas técnicas para la medición de tamaño de partículas, tales como difracción de láser, medir el tamaño de grupos de partículas en lugar de partículas individuales. Los grupos de partículas medidos tienen un tamaño medio más grande que las partículas individuales (por ejemplo, 1-100 micras). Microscopía de luz de la harina de microalgas dispersa en agua muestra ambas partículas y racimos de partículas (véase la Figura 4) individuales. En la dispersión de la harina de algas en agua con mezcla suficiente (por ejemplo, con una batidora de mano), pero sin repetir la homogeneización original, los grumos se pueden romper y difracción de láser puedn de nuevo generalmente detectar un tamaño medio de partícula de no más de 10|im. Software para el análisis de tamaño automático de las partículas de micrografías electrónicas está disponible comercialmente y también se puede utilizar para la medición de tamaño de partícula. Aquí, como en otras partes, tamaño medio de partícula se puede referir a cualquier medida reconocida en la técnica de un promedio, tales como la media, media geométrica, la mediana o el modo. El tamaño de partícula se puede medir por cualquier medida reconocida en la técnica incluyendo la dimensión más larga de una partícula o el diámetro de una partícula de volumen equivalente. Como las partículas son típicamente de forma aproximadamente esférica, estas mediciones pueden ser esencialmente las mismas.

[0161] Después de la homogeneización, el aceite resultante, agua y partículas micronizadas se emulsionan de manera que el aceite no se separa de la dispersión antes del secado. Por ejemplo, un disruptor de presión se puede utilizar para bombear una suspensión que contiene células a través de una válvula de orificio restringido para lisar las células. se aplica alta presión (hasta 1500 bar), seguido de una expansión instantánea a través de una boquilla de salida. La disrupción celular se realiza por tres mecanismos diferentes: pinzamiento en la válvula, de alto cizallamiento líquido en el orificio, y la caída de presión repentina después de la descarga, provocando una explosión de la célula. El método libera moléculas intracelulares. Un homogeneizador Niro (Niro Soavi GEA) (o cualquier otro homogeneizador de alta presión) se puede utilizar para procesar las células a las partículas predominantemente de 0,2 a 5 micras de longitud.

[0162] Alternativamente, un molino de bolas se puede utilizar. En un molino de bolas, las células se agitan en suspensión con pequeñas partículas abrasivas, tales como perlas. Las células se rompen debido a fuerzas de cizallamiento, trituración entre perlas, y las colisiones con los granos. Las perlas rompen las células para liberar el contenido celular. En una realización, la biomasa de algas se interrumpe y se forma en una emulsión estable usando un molino de bolas Dyno-mill ECM Ultra (CB Mills). Las células también se pueden romper mediante fuerzas de cizallamiento, tales como con el uso de la mezcla (tal como con una alta velocidad o mezclador Waring como ejemplos), la prensa francesa, o incluso de la centrifugación en el caso de las paredes celulares débiles, para romper las células. Un molino de bolas adecuado, incluyendo detalles de tamaño de la bola y la cuchilla se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.330.913.

[0163] El producto inmediato de la homogeneización es una suspensión de partículas de menor tamaño que las células originales que se suspende en en aceite y agua. Las partículas representan restos celulares. El aceite y el agua son liberados por las células. Agua adicional puede ser aportada por medios acuosos que contienen las células antes de la homogeneización. Las partículas son preferiblemente en la forma de un homogeneizado micronizado. Si se deja en reposo, algunas de las partículas más pequeñas pueden unirse. Sin embargo, una dispersión uniforme de partículas pequeñas puede ser preservada por siembra con un estabilizador microcristalino, tal como celulosa microcristalina.

[0164] Para formar la harina de algas, la suspensión es por pulverización o se seca instantáneamente, eliminando agua y dejando un material de tipo polvo seco que contiene los restos celulares y el aceite. Aunque el contenido de aceite de la harina (es decir: células rotas como un material de tipo polvo) puede ser al menos 10, 25 o 50% en peso del polvo seco, el polvo puede tener un tacto seco en lugar graso y la apariencia (p.ej., carente de aceite visible) y también puede fluir libremente cuando se agitan. Varios agentes de flujo (incluyendo productos de sílice derivados, tales como sílice precipitada, sílice pirógena, silicato de calcio y silicatos de sodio y aluminio) también se pueden añadir. La aplicación de estos materiales a polvos altos en grasas, higroscópicos o pegajosos evita el apelmazamiento de secado posterior y en el paquete, promueve el flujo libre de polvos secos y se puede reducir la adherencia, acumulación y oxidación de materiales en las superficies de la secadora. Todos están aprobados para uso alimentario en los niveles máximos designados por la FDA. Después del secado, el contenido de agua o de humedad del polvo es típicamente menor que 10%, 5%, 3% o 1% en peso. Otros secadores, tales como secadores neumáticos o secador de combustión de impulsos también se pueden utilizar para producir harina de algas.

[0165] El contenido de aceite de la harina de algas puede variar dependiendo del por ciento de aceite de la biomasa de algas. Harina de algas puede ser producida a partir de biomasa de algas de contenido de aceite variable. En ciertas realizaciones, la harina de algas se produce a partir de la biomasa de algas del mismo contenido de aceite. En otras realizaciones, la harina de algas se produce a partir de biomasa de algas de diferente contenido de aceite. En el último caso, la biomasa de algas de la variación de contenido de aceite se puede combinar y luego realizarse la etapa de homogeneización. En otras realizaciones, la harina de algas de la variación de contenido de aceite se produce primero y luego se mezcla en diversas proporciones con el fin de lograr un producto de harina de algas que contiene el contenido de aceite deseado final. En una realización adicional, la biomasa de algas de diferentes perfiles de lípidos se puede combinar y luego homogeneizar para producir harina de algas.

[0166] La harina de algas es útil para una amplia gama de preparaciones alimenticias. Debido al contenido de aceite, contenido de fibra y las partículas micronizadas, la harina de algas es un ingrediente alimentario multifuncional. Harina de algas puede ser utilizada en productos horneados, panes rápidos, productos de masa de levadura, productos de huevo, aderezos, salsas, bebidas nutricionales, leche, pasta de algas y productos libres de gluten. Productos libres de gluten de la invención se pueden hacer usando harina de algas y otro producto libre de gluten, tal como harina de amaranto, harina de flecha de la raíz, harina de trigo sarraceno, harina de arroz, harina de garbanzo, harina de maíz, harina de mijo, harina de patata, almidón de patata harina, harina de quinoa, harina de sorgo, harina de soja, harina de habas, harina de leguminosa, harina de tapioca (yuca), harina de teff, harina de alcachofa, harina de almendra, harina de bellota, harina de coco, harina de castañas, harina de maíz y harina de taro. Harina de algas, en combinación con otros ingredientes libres de gluten es útil en la fabricación de productos alimenticios libres de gluten, tales como productos horneados (pasteles, galletas, brownies y productos de tortas similares (por ejemplo, muffins)), panes, cereales, galletas y pastas. Detalles adicionales de la formulación de estos productos alimenticios y más con harina de algas se describen en los Ejemplos a continuación.

[0167] Harina de algas se puede utilizar en productos horneados en lugar de fuentes de grasa convencionales (p.ej., aceite, mantequilla o margarina) y huevos. productos horneados y productos libres de gluten tienen un contenido de humedad superior y una estructura que es indistinguible de productos de panadería convencionales hechos con mantequilla y huevos. Debido al contenido de humedad superior, estos productos horneados tienen una vida útil más larga y conservan su textura original más tiempo que los productos horneados convencionales que se producen sin harina de algas.

[0168] La actividad de agua (Aw) de un alimento puede ser un indicador de la retención de la vida útil en un producto alimenticio preparado. La actividad de agua (que va desde 0 a 1) es una medida de lo eficiente que puede ser el agua presente en un producto alimenticio cuando participa en una reacción química o física. La actividad de agua de algunos alimentos comunes que representan el espectro de la Aw son: fruta fresca/carne/leche (1,0 a 0,95); queso (0,95-0,90); margarina (0,9-0,85); nueces (0.75-0.65); miel (0,65-0,60); carnes saladas (0.85-0.80); mermelada (0,8-7,5); pasta (0,5); galletas (0,3); y legumbres secas/galletas saladas (0,2). La mayoría de las bacterias no crecen a actividades de agua por debajo de 0,91. Por debajo de 0,80, la mayoría de los mohos no pueden ser cultivados y por debajo de 0,60 ningún crecimiento microbiológico es posible. Mediante la medición de la actividad de agua, es posible predecir las posibles fuentes de deterioro.

[0169] Harina de algas también puede actuar como un extensor de la grasa y es utilizada en batidos, salsas, o aderezos. La composición de la harina de algas es única en su capacidad de transmitir cualidades organolépticas y sensación en la boca comparables a un producto alimenticio con un mayor contenido de grasa. Esto también demuestra la capacidad de la harina de algas para actuar como modificador de textura. Los aderezos, salsas y bebidas hechas con harina de algas tienen una reología y la opacidad que está cerca de las recetas más altas de grasa convencionales aunque estos productos alimenticios contienen aproximadamente la mitad de los niveles de grasa/aceite. Harina de algas es también un emulsionante superior y es adecuada en uso en la preparación de alimentos que requieren espesor, opacidad y viscosidad, como por ejemplo, salsas, aderezos y sopas. Además, el perfil de lípidos que se encuentra en la harina de algas no contiene grasas trans y tiene un mayor nivel de grasas saludables, insaturadas en comparación con mantequilla o margarina (u otras grasas animales). Por lo tanto, los productos elaborados con harina de algas pueden tener un menor contenido de grasa (grasas saludables) sin sacrificar la sensación en la boca y las cualidades organolépticas del mismo producto alimenticio que se hace usando una receta convencional que utiliza una fuente de grasa convencional. Un panel tactil evaluó un producto alimenticio hecho con harina de algas que tenía el mismo contenido de grasa como un control de bajo contenido de grasa. Un control no graso y el control con toda la grasa también se ensayó. La Figura 6 demuestra cualidades de extensión de grasa de la harina de algas. El producto de harina de algas se rastreó de manera similar al control con toda su grasa, especialmente en las categorías sensoriales de espesor, recubrimiento bucal y cómo se mezcla con la saliva.

[0170] Harina de algas también se puede añadir a los huevos en polvo o líquidos, que típicamente se sirven en un entorno de servicio de alimentos. La combinación de un producto de huevo en polvo y harina de algas es en sí mismo un polvo, que se puede combinar con un líquido comestible u otro ingrediente comestible, típicamente seguido de la cocción para formar un producto alimenticio. En algunas realizaciones, la harina de algas se puede combinar con un producto líquido que entonces será rociado en seco para formar un ingrediente en polvo de alimentos (por ejemplo, huevos en polvo, mezcla de salsa en polvo, mezcla de sopa en polvo, etc). En tales casos, es ventajoso combinar la harina de algas después de la homogeneización, pero antes del secado de modo que es una suspensión o dispersión, con el producto líquido y, a continuación secar por pulverización la combinación, formando el ingrediente alimenticio en polvo. Este proceso de co-secado aumentará la homogeneidad del ingrediente alimentario en polvo, en comparación con la mezcla de las formas secas de los dos componentes juntos. La adición de harina de algas mejora la apariencia, textura y sensación en la boca de los huevos en polvo y líquido y también se extiende una mejor apariencia, textura y sensación en la boca con el tiempo, incluso cuando los huevos preparados se llevan a cabo en una mesa de vapor. Las formulaciones específicas y los resultados del panel sensorial se describen a continuación en los Ejemplos.

[0171] Harina de algas se puede usar para formular productos alimenticios reconstituidos mediante la combinación de harina con uno o más ingredientes y comestibles líquidos, como el agua. El producto alimenticio reconstituido puede ser una bebida, aderezo (tales como aderezos para ensaladas), salsa (tales como una salsa de queso), o un intermedio tal como una masa que luego puede ser horneada. En algunas formas de realización, el producto alimenticio reconstituido se somete después a fuerzas de cizallamiento, tales como la interrupción de presión o de homogeneización. Esto tiene el efecto de reducir el tamaño de partícula de la harina de algas en el producto acabado, porque el alto contenido de aceite de la harina puede causar aglomeración durante el proceso de reconstitución. Un tamaño de partícula de harina de algas preferido en un producto alimenticio reconstituido es un promedio de 1 a 15 micrómetros.

D. Aceite de algas

[0172] En un aspecto, se describe un método de preparación de aceite de algas por el aceite de la recolección de alga de una biomasa de algas que comprende aceite de al menos 15% en peso seco bajo condiciones GMP, en donde el aceite de algas es mayor que 50% 18: 1 de lípidos. En algunos casos, la biomasa de algas comprende una mezcla de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunos casos, al menos dos de las distintas especies de microalgas han sido cultivadas por separado. En al menos una realización, al menos dos de las distintas especies de microalgas tienen diferentes perfiles de glicerolípido. En algunos casos, la biomasa de algas se deriva a partir de algas cultivadas heterotróficamente. En algunos casos, todas las al menos dos especies distintas de microalgas contienen aceite de al menos 15% en peso seco.

[0173] En un aspecto, se describe un método de fabricación de una composición alimentaria que comprende la combinación de aceite de algas obtenida de células de algas que contienen al menos 10%, o al menos 15% de aceite en peso seco con uno o más de otros ingredientes comestibles para formar la composición de alimentos. En algunos casos, el método comprende además la preparación del aceite de algas bajo condiciones GMP.

[0174] Aceite de algas se puede separar de la biomasa lisada para el uso en productos alimenticios (entre otras aplicaciones). La biomasa de algas que queda después de la extracción de aceite se denomina alimento sin lípidos. Alimento sin lípidos contiene menos aceite en peso seco o volumen que la microalga contenida antes de la extracción. Típicamente 50-90% de aceite se extrae de modo que el alimento sin lípidos contiene, por ejemplo, 10-50% del contenido de aceite de la biomasa antes de la extracción. Sin embargo, la biomasa todavía tiene un alto valor nutriente en el contenido de proteína y otros constituyentes discutidos anteriormente. Por lo tanto, el alimento sin lípidos puede ser utilizado en la alimentación animal o en aplicaciones de alimentos humanos.

[0175] En algunas realizaciones del método, el aceite de algas es de al menos 50% p/p de ácido oleico y contiene menos de 5% de DHA. En algunas realizaciones del método, el aceite de algas es de al menos 50% p/p de ácido oleico y contiene menos de 0,5% de DHA. En algunas realizaciones del método, el aceite de algas es de al menos 50% p/p de ácido oleico y contiene menos de 5% glicerolípido que contiene una longitud de cadena de carbono mayor que 18. En algunos casos, las células de algas de las que se obtiene el aceite de algas comprenden una mezcla de células a partir de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunos casos, al menos dos de las distintas especies de microalgas han sido cultivadas por separado. En al menos una realización, al menos dos de las distintas especies de microalgas tienen diferentes perfiles de glicerolípido. En algunos casos, las células de algas se cultivan en condiciones heterotróficas. En algunos casos, todas las al menos dos especies de microalgas contienen al menos 10%, o al menos 15% de aceite por peso seco.

[0176] En un aspecto, se da a conocer aceite de algas que contiene al menos 50% de aceite monoinsaturado y que contiene menos de 1% de DHA preparado bajo condiciones GMP. En algunos casos, el aceite monoinsaturado es 18: 1 de lípidos. En algunos casos, el aceite de algas se envasa en una cápsula para la entrega de una dosis unitaria de aceite. En algunos casos, el aceite de algas se deriva de una mezcla de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunos casos, al menos dos de las distintas especies de microalgas han sido cultivadas por separado. En al menos una realización, al menos dos de las distintas especies de microalgas tienen diferentes perfiles de glicerolípido. En algunos casos, el aceite de algas se deriva de células de algas cultivadas en condiciones heterotróficas. En algunas realizaciones, el aceite de algas contiene los mismos componentes como se discutió en la sección anterior titulada “Composición química de biomasa de microalgas”.

[0177] En un aspecto, se da a conocer aceite que comprende más del 60% 18: 1, y al menos 0,20mg/g de tocotrienol.

[0178] En un aspecto, se da a conocer una composición de éster alquílico de ácido graso que comprende más de 60% 18: 1 de éster (preferiblemente como triglicérido), y al menos 0,20mg/g de tocotrienol.

[0179] Aceite de algas se prepara a partir de biomasa de microalgas concentrada, lavada por extracción. Las células de la biomasa se lisan antes de la extracción. Opcionalmente, la biomasa microbiana puede también ser secada (secada al horno, liofilizada, etc.) antes de la lisis (rotura de las células). Alternativamente, las células pueden lisarse sin separación de algunos o todos del caldo de fermentación cuando la fermentación es completa. Por ejemplo, las células pueden estar en una relación de menos de 1: 1 v: v células a líquido extracelular cuando se lisan las células.

[0180] Lípidos que contienen microalgas pueden lisarse para producir un lisado. Como se detalla en el presente documento, la etapa de lisis de un microorganismo (también denominada lisis celular) se puede lograr por cualquier medio conveniente, incluyendo la lisis inducida por el calor, la adición de una base, la adición de un ácido, utilizando enzimas tales como proteasas y enzimas de degradación de polisacáridos tales como amilasas, usando ultrasonido, lisis basada en la presión mecánica, y lisis utilizando choque osmótico. Cada uno de estos métodos para la lisis de un microorganismo se puede utilizar como un único método o en combinación simultánea o secuencialmente. La extensión de la rotura celular se puede observar por análisis microscópico. Mediante el uso de uno o más de los métodos anteriores, por lo general se observa más de 70% de rotura celular. Preferiblemente, la rotura de células es más de 80%, más preferiblemente más de 90% y lo más preferido aproximadamente el 100%.

[0181] Los lípidos y aceites generados por las microalgas se pueden recuperar por extracción. En algunos casos, la extracción puede realizarse usando un disolvente orgánico o un aceite, o se puede realizar utilizando un procedimiento sin disolvente-extracción.

[0182] Para la extracción de disolvente orgánico del aceite de microalgas, el disolvente orgánico preferido es hexano. Típicamente, se añade directamente el disolvente orgánico al lisado sin separación previa de los componentes del lisado. En una realización, el lisado generado por uno o más de los métodos descritos anteriormente se pone en contacto con un disolvente orgánico durante un período de tiempo suficiente para permitir que los componentes de lípidos formen una solución con el disolvente orgánico. En algunos casos, la solución puede ser entonces refinada de nuevo para recuperar los componentes lipídicos deseados específicos. La mezcla se puede filtrar y el hexano se elimina mediante, por ejemplo, evaporación rotatoria. Métodos de extracción con hexano son bien conocidos en la técnica. Ver, p.ej., Frenz et al., Enzyme Microb. Technol., 11: 717 (1989).

[0183] Miao y Wu describen un protocolo de la recuperación de los lípidos de microalgas de un cultivo de Chlorella protothecoides en el que las células se recogieron por centrifugación, se lavaron con agua destilada y se secaron por liofilización. El polvo de células resultante se pulverizó en un mortero y después se extrajo con n-hexano. Miao y Wu, Biosource Technology 97: 841-846 (2006).

[0184] En algunos casos, los aceites de microalgas se pueden extraer utilizando licuefacción (ver por ejemplo Sawayama et al, Biomass and Bioenergy. 17: 33-39 (1999) y Inoue et al, Biomass Bioenergy 6 (4): 269-274 (1993)); licuación de aceite (véase, por ejemplo, Minowa et al, Fuel 74 (12): 1735-1738 (1995)); o extracción supercrítica de CO2 (véase, por ejemplo Mendes et al, Inorganica Chimica Acta 356: 328-334 (2003)). Un ejemplo de aceite extraído por extracción supercrítica de CO2 se describe a continuación. Aceite de algas extraído a través de extracción supercrítica de CO2 contiene todos los esteroles y carotenoides a partir de la biomasa de algas y naturalmente no contiene fosfolípidos como una función del proceso de extracción. El residual de los procesos comprende esencialmente la biomasa de algas deslipidada desprovist de aceite, pero todavía conserva la proteína e hidratos de carbono de la biomasa de pre-extracción de algas. Así, la biomasa de algas sin lípidos residual es materia prima adecuada para la producción de concentrado/aislado de proteína de algas y también como una fuente de fibra dietética.

[0185] La extracción de aceite incluye la adición de un aceite directamente a un lisado sin separación previa de los componentes del lisado. Después de la adición del aceite, el lisado separa ya sea por su propia voluntad o como resultado de la centrifugación o similar en diferentes capas. Las capas pueden incluir en orden decreciente de densidad: un gránulo de sólidos pesados, una fase acuosa, una fase de emulsión y una fase de aceite. La fase de emulsión es una emulsión de lípidos y fase acuosa. Dependiendo del porcentaje de aceite añadido con respecto al lisado (p/p o v/v), la fuerza de centrifugación en su caso, volumen de medios acuosos y otros factores, una o ambas de las fases de emulsión y de aceite pueden estar presentes.

[0186] En diversas realizaciones, el aceite usado en el proceso de extracción se selecciona entre el grupo que consiste en aceite de soja, colza, canola, palma, almendra de palma, coco, maíz, residuos de aceite vegetal, sebo chino, semillas de oliva, de girasol, de algodón, grasa de pollo, sebo de vaca, sebo de cerdo, microalgas, macroalgas, Cuphea, lino, cacahuete, grasa blanca (manteca de cerdo), Camelina sativa semilla de mostaza, anarcado, avena, lupino, kenaf, caléndula, cáñamo, café, semillas de lino, avellanas, Euphorbia, semilla de calabaza, cilantro, camelia, sésamo, cártamo, arroz, aceite de árbol de tung, cacao, copra, amapola pium, semillas de ricino, pacana, de jojoba, jatropha, macadamia, nueces de Brasil, y el aguacate. La cantidad de aceite añadido al lisado es típicamente mayor que 5% (medido por v/v y/o p/p) del lisado con el que se está combinando el aceite. Por lo tanto, un v/v preferido o p/p del aceite es mayor que 5%, 10%, 20%, 25%, 50%, 70%, 90%, o al menos el 95% del lisado celular.

[0187] Los lípidos también pueden ser extraídos de un lisado a través de un procedimiento de extracción sin disolvente y sin sustancial o cualquier uso de disolventes o aceites orgánicos enfriando el lisado. La sonicación también se puede utilizar, en particular si la temperatura es entre la temperatura ambiente y 65°C. Tal lisado en centrifugación o sedimentación se puede separar en capas, una de las cuales es una solución acuosa: capa lipídica. Otras capas pueden incluir una pastilla sólida, una capa acuosa y una capa lipídica. Lípido puede ser extraído de la capa de emulsión por congelación descongelación o por otro modo el enfriamiento de la emulsión. En tales métodos, no es necesario añadir ningún disolvente orgánico o aceite. Si se añade cualquier disolvente o aceite, que puede estar por debajo de 5% v/v o p/p del lisado.

IV. COMBINACIÓN DE BIOMASA DE MICROALGAS O MATERIALES DERIVADOS DE LOS MISMOS CON OTROS INGREDIENTES ALIMENTARIOS

[0188] En un aspecto, se proporciona una composición alimenticia que comprende al menos 0,1% p/p de biomasa de algas y uno o más ingredientes comestibles, en donde la biomasa de algas comprende aceite de al menos 10% en peso seco, opcionalmente en donde al menos el 90% de la aceite es glicerolípido. En algunas realizaciones, la biomasa de algas contiene al menos 25%, 40%, 50% o 60% de aceite en peso seco. En algunos casos, la biomasa de algas contiene 10-90%, 25-75%, 40-75% o 50-70% de aceite en peso seco, opcionalmente en donde al menos el 90% del aceite es glicerolípido. En al menos una realización, al menos 50% en peso del aceite es aceite glicerolípido monoinsaturado. En algunos casos, al menos 50% en peso del aceite es un lípido 18: 1 en forma de glicerolípido. En algunos casos, menos de 5% en peso del aceite es el ácido docosahexanoico (DHA) (22: 6). En al menos una realización, menos de 1% en peso del aceite es DHA. Se prefiere un contenido de lípidos de las algas con bajos niveles de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) para asegurar la estabilidad química de la biomasa. En realizaciones preferidas, la biomasa de algas se cultiva en condiciones heterotróficas y ha reducido la pigmentación verde. En otras realizaciones, la microalga es un mutante de color que carece de o se reduce en la pigmentación.

[0189] En otro aspecto, se proporciona una composición de alimentos que comprende al menos 0,1% p/p de biomasa de algas y uno o más ingredientes comestibles, en donde la biomasa de algas comprende proteína de al menos 30% en peso seco, proteína de al menos 40% en peso seco, al menos 45% de proteína en peso seco, al menos 50% de proteína en peso seco, al menos 55% de proteína en peso seco, al menos 60% de proteína en peso seco o al menos 75% de proteína en peso seco. En algunos casos, la biomasa de algas contiene 30-75% o 40-60% de proteína en peso seco. En algunas realizaciones, al menos el 40% de la proteína cruda es digerible, por lo menos 50% de la proteína cruda es digerible, por lo menos 60% de la proteína cruda es digerible, por lo menos 70% de la proteína cruda es digerible, por lo menos 80% de la proteína cruda es digerible, o al menos 90% de la proteína cruda es digerible. En algunos casos, la biomasa de algas se cultiva bajo condiciones heterotróficas. En al menos una realización, la biomasa de algas se cultiva en condiciones de nitrógeno repleta. En otras realizaciones, la microalga es un mutante de color que carece de o se reduce en la pigmentación.

[0190] En algunos casos, la biomasa de algas comprende células predominantemente intactas. En algunas realizaciones, la composición alimenticia comprende aceite que es predominantemente o completamente encapsulado dentro de las células de la biomasa. En algunos casos, la composición alimenticia comprende células de microalgas predominantemente intactas. En algunos casos, el aceite de algas se encapsula predominantemente en las células de la biomasa. En otros casos, la biomasa comprende predominantemente células lisadas (p.ej., un homogeneizado). Como se discutió anteriormente, un homogeneizado tal se puede proporcionar como una suspensión, en escamas, polvo o harina.

[0191] En algunas realizaciones de la composición de los alimentos, la biomasa de algas comprende además al menos 10 ppm de selenio. En algunos casos, la biomasa comprende además al menos 15% p/p polisacárido de algas. En algunos casos, la biomasa comprende además al menos un 5% p/p glicoproteína de algas. En algunos casos, la biomasa comprende entre 0 y 115 mcg/g carotenoides totales. En algunos casos, la biomasa comprende al menos 0,5% p/p fosfolípidos de algas. En todos los casos, como se acaba de señalar, estos componentes son verdaderos componentes celulares y no extracelulares.

[0192] En algunos casos, la biomasa de algas de la composición alimenticia contiene componentes que tienen propiedades antioxidantes. Las fuertes propiedades antioxidantes se pueden atribuir a las múltiples antioxidantes presentes en la biomasa de algas, que incluyen, pero no se limitan a los carotenoides, minerales esenciales tales como cinc, cobre, magnesio, calcio y manganeso. La biomasa de algas también se ha demostrado que contienen otros antioxidantes, tales como los tocotrienoles y tocoferoles. Estos miembros de la familia de la vitamina E son antioxidantes importantes y tienen otros beneficios para la salud, tales como efectos de protección contra lesiones inducidas por los infartos, reversión de la obstrucción arterial, inhibición del crecimiento de células de cáncer de mama y de próstata, la reducción de los niveles de colesterol, diabetes un riesgo reducido de tipo II y los efectos protectores contra el daño glaucomatoso.

[0193] En algunos casos, las composiciones de alimentos contienen aceite de algas que comprende al menos 5 mg/100 g, tocoferol total de al menos 7 mg/100 g, o al menos 8 mg/100 g. En algunos casos, las composiciones de alimentos contienen aceite de algas que comprende al menos 0,15 mg/g, al menos 0,20mg/g o al menos 0,25 mg/g tocotrienol total.

[0194] En formas de realización particulares de las composiciones y/o métodos descritos anteriormente, las microalgas pueden producir carotenoides. En algunas realizaciones, los carotenoides producidos por las microalgas pueden co extraerse con los lípidos o aceite producidos por las microalgas (es decir, el aceite o lípido contendrán los carotenoides). En algunas realizaciones, los carotenoides producidos por las microalgas son xantofilas. En algunas realizaciones, los carotenoides producidos por las microalgas son carotenos. En algunas realizaciones, los carotenoides producidos por las microalgas son una mezcla de carotenos y xantofilas. En diversas realizaciones, los carotenoides producidos por las microalgas comprenden al menos un carotenoide seleccionado de entre el grupo constituido por astaxantina, luteína, zeaxantina, alfa-caroteno, caroteno trans-beta, caroteno cis-beta, el licopeno y cualquier combinación de los mismos. Un ejemplo no limitante de un perfil de carotenoides de aceite de Chlorella protothecoidesse se incluye a continuación en los Ejemplos.

[0195] En algunas realizaciones de la composición de los alimentos, la biomasa de algas se deriva a partir de algas cultivadas y se secó bajo condiciones de buenas prácticas de fabricación (GMP). En algunos casos, la biomasa de algas se combina con uno o más de otros ingredientes comestibles, incluyendo, sin limitación, grano, fruta, verdura, proteínas, lípidos, hierba y/o ingredientes de especias. En algunos casos, la composición alimenticia es un aderezo para ensaladas, productos de huevo, horneado, pan, barra, pasta, salsa, sopa de bebida, refresco, postre helado, o mantequilla. En realizaciones particulares, la composición alimenticia no es una píldora o polvo. En algunos casos, la composición alimenticia pesa al menos 50 g, o al menos 100 g.

[0196] La biomasa puede ser combinada con uno o más de otros ingredientes comestibles para hacer un producto alimenticio. La biomasa puede ser de una fuente única de algas (p.ej., cepa) o la biomasa de algas de múltiples fuentes (p.ej., diferentes cepas). La biomasa también puede ser de una sola especie de algas, pero con diferente perfil de la composición. Por ejemplo, un fabricante puede mezclar microalgas que sean de alto contenido de aceite con microalgas que sean de alto contenido de proteína para el contenido de aceite y proteína exacta que se desea en el producto alimenticio acabado. La combinación puede ser realizada por un fabricante de alimentos para hacer un producto terminado para la venta al por menor o el uso de servicios de alimentos. Alternativamente, un fabricante puede vender la biomasa de algas como producto, y un consumidor puede incorporar la biomasa de algas en un producto alimenticio, por ejemplo, mediante la modificación de una receta convencional. En cualquier caso, la biomasa de algas se suele utilizar para sustituir la totalidad o parte del aceite, grasa, huevos, o similares, utilizados en muchos productos alimenticios convencionales.

[0197] En un aspecto, se proporciona una composición alimenticia que comprende al menos 0,1% p/p de biomasa de algas y uno o más ingredientes comestibles, en el que la biomasa de algas se formula mediante el mezclado completo de la biomasa de algas que contiene proteína de al menos 40% en peso seco con la biomasa de algas que contiene 40% de lípidos en peso seco para obtener una mezcla de una proteína por ciento deseada y de lípidos en peso seco. En algunas realizaciones, la biomasa es de la misma cepa de algas. Alternativamente, la biomasa de algas que contiene al menos 40% de lípidos en peso seco que contiene menos de 1% de su lípido como DHA se mezcla con la biomasa de algas que contiene al menos 20% de lípidos en peso seco que contiene al menos 5% de su lípido como DHA para obtener una mezcla de biomasa seca que contiene en el agregado de al menos 10% de lípidos y 1% de DHA en peso seco.

[0198] En un aspecto, se proporciona un método de preparación de la biomasa de algas mediante secado de un cultivo de algas para proporcionar biomasa de algas que comprende aceite de al menos 15% en peso seco bajo condiciones GMP, en donde el aceite de algas es mayor que 50% de lípidos monoinsaturados.

[0199] En un aspecto, se proporciona la biomasa de algas que contiene aceite de al menos 15% en peso seco fabricado bajo condiciones GMP, en donde el aceite de algas es mayor que 50% 18: 1 de lípidos. En un aspecto, se proporciona la biomasa de algas que contiene aceite de al menos 40% en peso seco fabricado bajo condiciones GMP. En un aspecto, se proporciona la biomasa de algas que contiene aceite de al menos 55% en peso seco fabricado bajo condiciones GMP. En algunos casos, la biomasa de algas se empaqueta como un comprimido para la administración de una dosis unitaria de la biomasa. En algunos casos, la biomasa de algas se empaqueta con o de lo contrario lleva una etiqueta que proporciona instrucciones para la combinación de la biomasa de algas con otros ingredientes comestibles.

[0200] En un aspecto, se proporcionan métodos de combinar la biomasa de microalgas y/o materiales derivados de los mismos, como se describe anteriormente, con al menos otro ingrediente alimenticio acabado, como se describe a continuación, para formar una composición de alimento o producto alimenticio. En diversas realizaciones, la composición alimenticia formada por los métodos comprende un producto de huevo (en polvo o líquido), un producto de pasta, un producto de tocador, un producto de mayonesa, un producto de torta, un producto de pan, una barra de energía, un producto de leche, un producto de jugo, o un batido. En algunos casos, la composición alimenticia no es una píldora o polvo. En diversas realizaciones, la composición alimenticia pesa al menos 10 g, al menos 25 g, al menos 50 g, al menos 100 g, al menos 250 g, o al menos 500 g o más. En algunas realizaciones, la composición alimenticia formada por la combinación de la biomasa y/o producto de microalgas derivado de la misma es un producto sin cocer. En otros casos, la composición alimenticia es un producto cocinado.

[0201] En otros casos, la composición alimenticia es un producto cocinado. En algunos casos, la composición alimenticia contiene aceite de menos de 25% o la grasa mediante la exclusión de peso de aceite aportado por la biomasa de algas. Grasa, en forma de triglicéridos saturados (etiquetas o grasas trans), se hace cuando la hidrogenación de aceites vegetales, como se practica al hacer diferenciales tales como margarinas. La grasa contenida en la biomasa de algas no tiene grasas trans presentes. En algunos casos, la composición alimenticia contiene aceite de menos de 10% o la grasa mediante la exclusión de peso de aceite aportado por la biomasa. En al menos una realización, la composición alimenticia es libre de aceite o grasa con exclusión del aceite aportado por la biomasa. En algunos casos, la composición alimenticia está exenta de hidrocarburos que no sean aportados por la biomasa. En algunos casos, la composición alimenticia está exenta de huevo o productos de huevo.

[0202] En un aspecto, se proporciona un método de fabricación de una composición alimenticia en la que la grasa o aceite en un producto alimenticio convencional es completamente o parcialmente sustituido con biomasa de algas que contiene al menos 10% en peso de aceite. En una realización, el método comprende determinar una cantidad de la biomasa de algas para la sustitución usando la proporción de aceite de algas en la biomasa y la cantidad de aceite o grasa en el producto alimenticio convencional, y la combinación de la biomasa de algas con al menos otro ingrediente comestible y menos de la cantidad de aceite o grasa contenida en el producto alimenticio convencional para formar una composición alimenticia. En algunos casos, la cantidad de la biomasa de algas en combinación con el al menos otro ingrediente es 1-4 veces la masa o el volumen de aceite y/o grasa en el producto alimenticio convencional.

[0203] En algunas realizaciones, el método descrito anteriormente incluye además proporcionar una receta para un producto alimenticio convencional que contiene el por lo menos otro ingrediente comestible combinado con un aceite o grasa, y la combinación de 1-4 veces la masa o volumen de la biomasa de algas con el por lo menos otro ingrediente comestible como la masa o el volumen de grasa o aceite en el producto alimenticio convencional. En algunos casos, el método incluye además la preparación de la biomasa de algas bajo condiciones GMP.

[0204] En algunos casos, la composición alimenticia formada por la combinación de la biomasa y/o producto de microalgas derivado de la misma comprende al menos 0,1%, al menos 0,5%, al menos 1%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 25%, o al menos 50% p/p o v/v de biomasa de microalgas o aceite de microalgas. En algunas realizaciones, las composiciones alimenticias formadas como se describe en el presente documento comprenden al menos 2%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 25%, al menos 50%, al menos 75%, al menos 90%, o al menos 95% p/p de biomasa de microalgas o producto derivado de la misma. En algunos casos, la composición alimenticia comprende 5-50%, 10-40%, o 15-35% de la biomasa de algas o producto derivado de la misma en peso o en volumen.

[0205] Como se describió anteriormente, la biomasa de microalgas puede ser sustituida por otros componentes que de otro modo serían convencionalmente incluidos en un producto alimenticio. En algunas realizaciones, la composición alimenticia contiene menos de 50%, menos de 40%, o menos de 30% de aceite o grasa en peso excepto el aceite de microalgas contribuido por la biomasa o a partir de fuentes de microalgas. En algunos casos, la composición alimenticia contiene menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10%, o menos de 5% de aceite o grasa en peso excepto el aceite de microalgas contribuido por la biomasa o a partir de fuentes de microalgas. En al menos una realización, la composición alimenticia es libre de aceite o grasa con exclusión del aceite de microalgas contribuido por la biomasa o a partir de fuentes de microalgas. En algunos casos, la composición alimenticia está exenta de huevos, mantequilla, u otras grasas/aceites o al menos otro ingrediente que normalmente se incluye en un producto alimenticio convencional comparable. Algunos productos alimenticios están libres de productos lácteos (por ejemplo, mantequilla, crema y/o queso).

[0206] La cantidad de biomasa de algas usada para preparar una composición alimenticia depende de la cantidad de aceite no algal, grasas, huevos, o similar, para ser reemplazados en un producto alimenticio convencional y el porcentaje de aceite en la biomasa de algas. Por lo tanto, en al menos una realización, los métodos incluyen la determinación de una cantidad de la biomasa de algas para combinar con al menos otro ingrediente comestible a partir de una proporción de aceite en la biomasa y una proporción de aceite y/o grasa que se combinan normalmente con el al menos otro ingrediente comestible en un producto alimenticio convencional. Por ejemplo, si la biomasa de algas es 50% p/p de aceite de microalgas, y la sustitución completa del aceite o la grasa en una receta convencional se desea, a continuación, la lata de aceite, por ejemplo, se sustituye en una proporción de 2: 1. La relación se puede medir en masa, pero a efectos prácticos, a menudo es más fácil medir el volumen utilizando una taza de medición o una cuchara, y la sustitución puede ser en volumen. En un caso general, el volumen o la masa de aceite o grasa a ser reemplazados, se sustituye por volumen o masa de la biomasa de algas, donde X es el porcentaje de aceite de microalgas en la biomasa (100/100-X). En general, el aceite y grasas para ser sustituidos en las recetas convencionales pueden ser reemplazados en total por la biomasa de algas, aunque la sustitución total no es necesario y cualquier proporción deseada de aceite y/o grasas puede ser retenida y el resto sustituido de acuerdo con los gustos y necesidades nutricionales. Debido a que la biomasa de algas contiene proteínas y fosfolípidos, que funcionan como emulsionantes, los artículos tales como huevos pueden ser sustituidos en su totalidad o en parte, con la biomasa de algas. Si un huevo se sustituye en total con biomasa, a veces es deseable o necesario aumentar las propiedades emulsionantes en la composición alimenticia con un agente adicional emulsionante y/o añadir agua adicional u otro(s) líquido(s) para compensar la pérdida de estos componentes que de otra manera serían proporcionados por el huevo. Debido a que un huevo no es toda grasa, la cantidad de biomasa utilizada para reemplazar un huevo puede ser inferior a la utilizada para reemplazar el aceite o grasa pura. Un huevo promedio pesa alrededor de 58 g y comprende aproximadamente el 11,2% de grasa. Por lo tanto, sobre 13 g de biomasa de algas que comprende 50% de aceite de microalgas en peso se puede utilizar para reemplazar la porción de grasa total de un huevo en total. La sustitución de la totalidad o parte de los huevos en un producto alimenticio tiene el beneficio adicional de reducir el colesterol. Un huevo promedio pesa alrededor de 58 g y comprende aproximadamente el 11,2% de grasa. Por lo tanto, sobre 13 g de biomasa de algas que comprende 50% de aceite de microalgas en peso se puede utilizar para reemplazar la porción de grasa total de un huevo en total. La sustitución de la totalidad o parte de los huevos en un producto alimenticio tiene el beneficio adicional de reducir el colesterol. Un huevo promedio pesa alrededor de 58 g y comprende aproximadamente el 11,2% de grasa. Por lo tanto, sobre 13 g de biomasa de algas que comprende 50% de aceite de microalgas en peso se puede utilizar para reemplazar la porción de grasa total de un huevo en total. La sustitución de la totalidad o parte de los huevos en un producto alimenticio tiene el beneficio adicional de reducir el colesterol.

[0207] Por simplicidad, las proporciones de sustitución se pueden proporcionar también en términos de masa o volumen de aceite, grasa y/o huevos reemplazados con la masa o el volumen de biomasa. En algunos métodos, la masa o volumen de aceite, grasa y/o los huevos en una receta convencional se sustituye con 5-150%, 25-100% o 25-75% de la masa o volumen de aceite, grasa y/o huevos. La tasa de reemplazo depende de factores tales como el producto alimenticio, perfil nutricional deseado del producto alimenticio, la textura y el aspecto general del producto alimenticio, y el contenido de aceite de la biomasa.

[0208] En los alimentos cocinados, la determinación de los porcentajes (es decir, peso o volumen) se pueden hacer antes o después de la cocción. El porcentaje de la biomasa de algas puede aumentar durante el proceso de cocción debido a la pérdida de líquidos. Debido a que algunas células biomasa de algas pueden lisar en el curso del proceso de cocción, puede ser difícil medir el contenido de biomasa de algas directamente en un producto cocido. Sin embargo, el contenido se puede determinar indirectamente a partir de la masa o el volumen de biomasa que entró en el producto crudo como un porcentaje del peso o volumen del producto acabado (en una base de biomasa de sólidos secos), así como por métodos de análisis de componentes que son exclusivos de la biomasa de algas tales como secuencias genómicas o compuestos que se entregan únicamente por la biomasa de algas, tales como ciertos carotenoides.

[0209] En algunos casos, puede ser deseable combinar la biomasa de algas con el al menos otro ingrediente comestible en una cantidad que exceda la cantidad proporcional de aceite, grasa, huevos, o similar, que está presente en un producto alimenticio convencional. Por ejemplo, se puede reemplazar la masa o volumen de aceite y/o grasa en un producto alimenticio convencional con 1, 2, 3, 4, o más veces esa cantidad de biomasa de algas. Algunas realizaciones incluyen proporcionar una receta para un producto alimenticio convencional que contiene el por lo menos otro ingrediente comestible combinado con un aceite o grasa, y la combinación de 1-4 veces la masa o el volumen de la biomasa de algas con el otro al menos un ingrediente comestible como la masa o el volumen de grasa o aceite en el producto alimenticio convencional.

[0210] La biomasa de algas (predominantemente intacta o homogeneizada o micronizada) y/o aceite de algas se combinan con al menos otro ingrediente comestible para formar un producto alimenticio. En algunos productos alimenticios, la biomasa de algas y/o aceite de algas se combina con 1-20, 2-10, o 4-8 otros ingredientes comestibles. Los ingredientes comestibles pueden ser seleccionados entre todos los grupos de alimentos, incluyendo, sin limitación, frutas, verduras, legumbres, carnes, pescado, cereales (p.ej., trigo, arroz, avena, harina de maíz, cebada), hierbas, especias, agua, caldo de verduras, zumos, vino y vinagre. En algunas composiciones de alimentos, por lo menos 2, 3, 4, o 5 grupos de alimentos están representados, así como la biomasa de algas o aceite de algas.

[0211] Aceites, grasas, huevos y similares también se pueden combinar en composiciones de alimentos, pero, como se ha discutido anteriormente, están por lo general presentes en cantidades reducidas (p.ej., menos de 50%, 25%, o 10% de la masa o volumen de aceite, la grasa o los huevos en comparación con productos alimenticios convencionales. Algunos de estos productos alimenticios son libres de aceite distinto del previsto por la biomasa de algas y/o aceite de algas. Algunos productos alimenticios son libres de aceite distinto del previsto por la biomasa de algas. Algunos productos alimenticios están libres de grasas distintas de las proporcionadas por la biomasa de algas o aceite de algas. Algunos productos alimenticios están libres de grasas distintas de las proporcionadas por la biomasa de algas. Algunos productos alimenticios son libres tanto de aceites como grasas distintas a las previstas por la biomasa de algas o aceite de algas. Algunos productos alimenticios son libres tanto de aceites como grasas distintas a las previstas por la biomasa de algas. Algunos productos alimenticios están libres de huevos.

[0212] En algunos casos, la biomasa de algas usada en la fabricación de la composición alimenticia comprende una mezcla de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunos casos, al menos dos de las distintas especies de microalgas han sido cultivadas por separado. En al menos una realización, al menos dos de las distintas especies de microalgas tienen diferentes perfiles de glicerolípido. En algunos casos, el método descrito anteriormente comprende además algas de cultivo bajo condiciones heterotróficas y la preparación de la biomasa de las algas. En algunos casos, todos las al menos dos especies distintas de microalgas contienen al menos 10%, o aceite de al menos 15% en peso seco. En algunos casos, una composición alimenticia contiene una mezcla de dos preparaciones distintas de la biomasa de la misma especie, en donde una de las preparaciones contiene aceite de al menos 30% en peso seco y la segunda contiene aceite de menos 15% en peso seco. En algunos casos, una composición alimenticia contiene una mezcla de dos preparaciones distintas de la biomasa de la misma especie, en donde una de las preparaciones contiene aceite de al menos 50% en peso seco y la segunda contiene aceite de menos de 15% en peso seco, y además en donde la especie es Chlorella protothecoides.

[0213] Así como el uso de la biomasa de algas en forma de aceite, grasa o reemplazo de huevo en alimentos por lo demás convencionales, la biomasa de algas se puede utilizar como un suplemento en alimentos que normalmente no contienen aceite, como un batido. La combinación de aceite con los productos que son principalmente hidratos de carbono puede tener beneficios asociados con el aceite, y de la combinación de aceite y de hidratos de carbono mediante la reducción del índice glucémico de los hidratos de carbono. El suministro de aceite encapsulado en la biomasa es ventajoso en la protección del aceite de la oxidación y también puede mejorar el sabor y la textura del batido.

[0214] El aceite extraído de la biomasa de algas se puede utilizar de la misma manera como la propia biomasa, es decir, como un reemplazo para el aceite, grasa, huevos, o similares en las recetas convencionales. El aceite puede ser usado para reemplazar el aceite y/o grasa convencional en alrededor de un 1: 1 peso/peso o volumen/base de volumen. El aceite puede ser usado para reemplazar los huevos por sustitución de aproximadamente 1 cucharadita de aceite de algas por huevo opcionalmente en combinación con agua adicional y/o un emulsionante (un huevo promedio 58g es de aproximadamente 11,2% de grasa, aceite de algas tiene una densidad de aproximadamente 0,915 g/ml, y una cucharadita tiene un volumen de aproximadamente 5 ml = 1,2 cucharaditas de aceite de algas/huevo). El aceite también puede ser incorporado en aliños, salsas, sopas, margarinas, cremas, mantecas y similares. El aceite es particularmente útil para productos alimenticios en los que hace falta combinación del aceite con otros ingredientes alimenticios para dar un sabor deseado, textura y/o apariencia. El contenido de aceite por peso o volumen en los productos alimenticios puede ser al menos 5, 10, 25, 40 o 50%.

[0215] En al menos una realización, el aceite extraído de la biomasa de algas también puede ser utilizado como un aceite de cocina por los fabricantes de alimentos, restaurantes y/o consumidores. En tales casos, aceite de algas puede sustituir a los aceites de cocina convencionales, tales como aceite de cártamo, aceite de canola, aceite de oliva, aceite de semilla de uva, aceite de maíz, aceite de girasol, aceite de coco, aceite de palma, o cualquier otro aceite de cocina usado convencionalmente. El aceite obtenido a partir de la biomasa de algas como con otros tipos de aceite se puede someter a un mayor refinamiento para aumentar su idoneidad para cocinar (p.ej., aumento de punto de humo). El aceite puede ser neutralizado con sosa cáustica para eliminar los ácidos grasos libres. Los ácidos grasos libres forman un jabón extraíble. El color del aceite se puede eliminar por blanqueo con productos químicos tales como negro de carbón y de la tierra de blanqueo. La tierra de blanqueo y los productos químicos se pueden separar del aceite por filtración. El petróleo también puede ser desodorizado por tratamiento con vapor de agua.

[0216] Biomasa predominantemente intacta, la biomasa homogeneizada o micronizada (como una suspensión, escama, polvo o harina) y aceite de algas purificado se puede combinar con otros ingredientes de alimentos para formar productos alimenticios. Todos son una fuente de aceite con un perfil nutricional favorable (relativamente alto contenido de grasas monoinsaturadas). Biomasa predominantemente intacta, homogeneizada, y micronizada también suministraa proteínas de alta calidad (composición de aminoácidos equilibrada), hidratos de carbono, fibra y otros nutrientes como se ha discutido anteriormente. Los alimentos que incorporen cualquiera de estos productos se pueden hacer en forma vegano o vegetariano. Otra ventaja en el uso de biomasa de microalgas (ya sea predominantemente intacta o homogeneizada (o micronizada) o ambos) como fuente de proteína es que es una fuente de proteína vegana/vegetariana que no es de una fuente de alergeno importante, como la soja, huevos o productos lácteos.

[0217] Otros ingredientes comestibles con los que la biomasa de algas y/o aceite de algas se pueden combinar incluyen, sin limitación, los cereales, frutas, verduras, proteínas, carnes, hierbas, especias, hidratos de carbono y grasas. Los otros ingredientes comestibles con los que se combina la biomasa de algas y/o aceite de algas para formar composiciones de alimentos dependen del producto alimenticio a ser producido y el sabor deseado, la textura y otras propiedades del producto alimenticio.

[0218] Aunque en general cualquiera de estas fuentes de aceite de algas se puede utilizar en cualquier producto alimenticio, la fuente preferida depende en parte de si el aceite está presente principalmente con fines nutricionales o calóricos en lugar de para la textura, apariencia o sabor de los alimentos, o alternativamente si el aceite en combinación con otros ingredientes alimentarios pretende aportar un sabor deseado, la textura o el aspecto de los alimentos, así como o en lugar de la mejora de su perfil nutricional o de calorías.

[0219] Los productos alimenticios pueden ser cocinados mediante procedimientos convencionales según se desee. Dependiendo de la duración y de la temperatura, el proceso de cocción puede romper algunas paredes celulares, liberando el aceite de tal manera que se combinan con otros ingredientes en la mezcla. Sin embargo, al menos algunas células de algas a menudo sobreviven a la cocción intactas. Alternativamente, los productos alimenticios se pueden utilizar sin cocinar. En este caso, la pared de algas permanece intacta, protegiendo el aceite de la oxidación.

[0220] La biomasa de algas, si se proporciona en una forma con células predominantemente intactas, o como un polvo homogeneizado, difiere de aceite, grasa o huevos en que se puede proporcionar como un ingrediente seco, lo que facilita la mezcla con otros ingredientes secos, tales como harina. En una realización, la biomasa de algas se proporciona como un homogeneizado seco que contiene entre 25 y 40% de aceite en peso seco. Un homogeneizado de biomasa también se puede proporcionar como suspensión. Después de la mezcla de ingredientes secos (y suspensión de homogeneizado de la biomasa, si se usa), se pueden añadir líquidos tales como agua. En algunos productos alimenticios, la cantidad de líquido requerida es algo mayor que en un producto alimenticio convencional, debido al componente no aceite de la biomasa y/o porque el agua no está siendo suministrada por otros ingredientes, tales como huevos. Sin embargo, la cantidad de agua puede determinarse fácilmente como en la cocción convencional.

[0221] En un aspecto, se proporciona una composición de ingredientes de alimentos que comprende al menos 0,5% p/p de biomasa de algas que contiene al menos 10% de aceite de algas en peso seco y al menos otro ingrediente comestible, en donde el ingrediente alimentario se puede convertir en un producto alimenticio reconstituido mediante la adición de un líquido a la composición de ingredientes de alimentos. En una realización, el líquido es agua.

[0222] Biomasa de alto aceite de homogeneizado o micronizado es particularmente ventajoso en líquido, y/o productos emulsionados alimentarios (agua en aceite y emulsiones aceite en agua), tales como salsas, sopas, bebidas, aderezos para ensaladas, mantequillas, cremas para untar y similares, en donde el aceite contribuido por la biomasa forma una emulsión con otros líquidos. Los productos que se benefician de una mejor reología, tales como aliños, salsas y pastas para untar se describen a continuación en los Ejemplos. Mediante el uso de la biomasa homogeneizada, una emulsión con textura deseada (p.ej., sensación en la boca), el sabor y la apariencia (p.ej., opacidad) puede formar con un contenido de aceite inferior (por peso o volumen de producto en general) que es el caso con los productos convencionales que emplean los aceites convencionales, por lo tanto se pueden usar como un extensor de grasa. Tal es útil para productos bajos en calorías (es decir, dieta). Aceite de algas purificado también es ventajoso para tales productos líquidos y/o emulsionados. La biomasa de alto contenido de aceite tanto homogeneizada como micronizada y aceite de algas purificado se combinan bien con otros ingredientes comestibles en productos horneados logrando similar o mejor sabor, apariencia y textura a los productos por lo demás similares hechos con aceites convencionales, grasas y/o huevos, pero con un mejor perfil nutricional (p.ej., mayor contenido de aceite monosaturado, y/o el contenido más alto o calidad de la proteína, y/o un mayor contenido de fibra y/o otros nutrientes).

[0223] Biomasa predominantemente intacta es particularmente útil en situaciones en las que se desea cambiar o aumentar el perfil nutricional de un alimento (p.ej., mayor contenido de aceite, diferente contenido de aceite (p.ej., aceite más monoinsaturado), mayor contenido de proteínas, un mayor contenido de calorías, mayor contenido de otros nutrientes). Tales alimentos pueden ser útiles por ejemplo, para los atletas o pacientes que sufren de trastornos de emaciación. Predominantemente biomasa intacta se puede utilizar como un agente de carga. Agentes de carga se pueden utilizar, por ejemplo, para aumentar la cantidad de un alimento más caro (p.ej., ayudante de carne y similares) o en los alimentos simulados o de imitación, como sustitutos de la carne vegetariana. Alimentos simulados o de imitación difieren de los alimentos naturales en que el sabor y el volumen son generalmente realizados por diferentes fuentes. Por ejemplo, sabores de los alimentos naturales, tales como carne, se pueden impartir en un agente de carga que sostiene el sabor. Predominantemente biomasa intacta se puede utilizar como un agente de carga en tales alimentos. Predominantemente biomasa intacta también es particularmente útil en alimentos secos, como la pasta, ya que tiene buenas propiedades de retención de agua, y por lo tanto puede facilitar la rehidratación de tales alimentos. Predominantemente biomasa intacta también es útil como un conservante, por ejemplo, en productos horneados. La biomasa predominantemente intacto puede mejorar la retención de agua y por lo tanto su vida útil.

[0224] Biomasa de algas perturbada o micronizadaa también puede ser útil como un agente aglutinante, agente de carga o para cambiar o aumentar el perfil nutricional de un producto alimenticio. La biomasa de algas perturbada se puede combinar con otra fuente de proteína tal como carne, proteína de soja, proteína de suero, proteína de trigo, proteína de soja, proteína de arroz, proteína de guisante, proteína de leche, etc., donde las funciones de la biomasa de algas como una unión y/o aumento de agente de volumen. La biomasa de algas que ha sido alterada o micronizada también puede mejorar la retención de agua y por lo tanto su vida útil. El aumento de la retención de humedad es especialmente deseable en los productos libres de gluten, tales como productos horneados sin gluten. Una descripción detallada de la formulación de una galleta libre de gluten usando la biomasa de algas interrumpida y el posterior estudio de vida útil se describe en los Ejemplos a continuación.

[0225] En algunos casos, la biomasa de algas se puede utilizar en las preparaciones de huevo. En algunas realizaciones, la biomasa de algas (p.ej., harina de algas) que se añade a una preparación de huevo en polvo seco convencional para crear huevos revueltos que son más cremosos, tienen más humedad y una textura mejor que huevos en polvo secos preparados sin la biomasa de algas. En otras formas de realización, se añade la biomasa de algas para huevos líquidos enteros con el fin de mejorar la textura global y la humedad de los huevos que se preparan y después se mantuvo sobre una mesa de vapor. Los ejemplos específicos de las preparaciones anteriores se describen en los Ejemplos a continuación.

[0226] La biomasa de algas (predominantemente intacta y/o homogeneizada o micronizada) y/o aceite de algas se pueden incorporar en prácticamente cualquier composición de alimentos. Algunos ejemplos incluyen productos horneados, tales como pasteles, brownies, torta amarilla, pan incluyendo brioche, galletas, incluyendo galletas de azúcar, y pasteles. Otros ejemplos incluyen productos a menudo proporcionados en forma seca, tales como pastas o aderezo en polvo, cremas secas, carnes conmutadas y sustitutos de la carne. La incorporación de biomasa predominantemente intacta en tales productos como un agente de unión y/o aumento de volumen puede mejorar la hidratación y aumentar el rendimiento debido a la capacidad de unión de agua de la biomasa predominantemente intacta. Alimentos re-hidratados, tales como huevos revueltos hechos de huevos en polvo secos, pueden también haber mejorado la textura y el perfil nutricional. Otros ejemplos incluyen productos alimenticios líquidos, tales como salsas, sopas, aderezos (listos para comer), natas, bebidas lácteas, jugos, batidos, natas. Otros productos alimenticios líquidos incluyen las bebidas nutricionales que sirven como reemplazo de una comida o leche de algas. Otros productos alimenticias incluyen mantequillas o quesos y similares, incluyendo manteca, margarina/pastas para untar, mantequillas de nueces y productos de queso, tales como salsa para nachos. Otros productos alimenticios incluyen barras energéticas, confitería de chocolate-reemplazo de lecitina, barras de reemplazo de alimentos, productos de tipo barra de granola. Otro tipo de producto alimenticio es bateadores y recubrimientos. Al proporcionar una capa de aceite que rodea a un alimento, predominantemente biomasa intacta o un homogeneizado repelen que el aceite adicional a partir de un medio de cocción penetre una comida. Por lo tanto, la comida puede retener los beneficios de alto contenido de aceite monoinsaturado de recubrimiento sin recoger aceites menos deseables (p.ej., grasas trans, grasas saturadas, y por los productos a partir del aceite de cocción). El revestimiento de la biomasa también puede proporcionar una textura deseable (p.ej., crujiente) de la comida y un sabor más limpio debido a la menor absorción de aceite de cocina y sus derivados.

[0227] En los alimentos no cocinados, la mayoría de las células de algas en la biomasa permanecen intactas. Esto tiene la ventaja de proteger el aceite de alga de oxidación, que confiere una larga vida útil y reduce al mínimo la interacción adversa con otros ingredientes. Dependiendo de la naturaleza de los productos alimenticios, la protección conferida por las células puede reducir o evitar la necesidad de refrigeración, envasado al vacío o similar. Retención de células intactas también evita el contacto directo entre el aceite y la boca de un consumidor, que reduce la sensación oleosa o grasa que puede ser indeseable. En los productos alimenticios en los que el aceite se utiliza más como suplemento nutricional, como puede ser una ventaja en la mejora de las propiedades organolépticas del producto. Por lo tanto, la biomasa predominantemente intacta es adecuada para uso en tales productos. Sin embargo, en los productos crudos, tales como un aderezo para ensaladas, p.ej., como una emulsión con una solución acuosa tal como el vinagre), se prefiere el uso de aceite de algas purificado o biomasa micronizada. En los alimentos cocinados, algunas células de algas de la biomasa original intacta se pueden lisar pero otras células de algas pueden permanecer intactas. La relación de células lisadas a intactas depende de la temperatura y la duración del proceso de cocción. En los alimentos cocinados en donde se desea la dispersión de aceite en una manera uniforme con otros ingredientes para el sabor, la textura y/o apariencia (p.ej., productos horneados), se prefiere el uso de la biomasa micronizada o aceite de algas purificado. En los alimentos cocidos, en los que se utiliza la biomasa de algas para suministrar aceite y/o proteínas y otros nutrientes, principalmente por su valor nutricional o de calorías en lugar de textura.

[0228] La biomasa de algas también puede ser útil en el aumento del índice de saciedad de un producto alimenticio (p.ej., una bebida de reemplazo de comidas o smoothie) en relación con un producto convencional de otro modo similar hecho sin la biomasa de algas. El índice de saciedad es una medida del grado en que el mismo número de calorías de alimentos diferentes a satisfacer el apetito. Un índice de este tipo puede ser medido por la alimentación de un alimento que se está probando y midiendo apetito para otros alimentos a un intervalo fijo a partir de entonces. Cuanto menos apetito para otros alimentos a partir de entonces, mayor será el índice de saciedad. Los valores de índice de saciedad se pueden expresar en una escala en la que se asigna el pan blanco un valor de 100. Los alimentos con un índice de saciedad mayor son útiles para hacer dieta. Aunque no depende de una comprensión de mecanismo, se cree que la biomasa de algas aumenta el índice de la saciedad de un alimento mediante el aumento de la proteína y/o contenido de fibra de los alimentos para una cantidad dada de calorías.

[0229] La biomasa de algas (predominantemente intactas y homogeneizadas o micronizadas) y/o aceite de algas también puede ser fabricado en los suplementos nutricionales o dietéticos. Por ejemplo, aceite de algas se puede encapsular en cápsulas de digeribles en una manera similar al aceite de pescado. Tales cápsulas pueden envasarse en una botella y tomarse sobre una base diaria (p.ej., 1-4 cápsulas o comprimidos por día). Una cápsula puede contener una dosis unitaria de la biomasa de algas o aceite de algas. Del mismo modo, la biomasa puede ser comprimida opcionalmente con farmacéutica u otros excipientes en comprimidos. Los comprimidos se pueden envasar, por ejemplo, en un paquete de botella o blister, y tomarse diariamente a una dosis de, p.ej., 1-4 comprimidos por día. En algunos casos, la tableta u otra formulación de dosificación comprende una dosis unitaria de la biomasa o aceite de algas. Fabricación de cápsulas y tabletas de productos y otros suplementos se realiza preferiblemente bajo condiciones GMP apropiadas para suplementos nutricionales como se ha codificado en 21 CFR 111, o las normas comparables establecidas por jurisdicciones extranjeras. La biomasa de algas se puede mezclar con otros polvos y se presentará en sobres como un material listo para mezclar (p.ej., con agua, jugo, leche u otros líquidos). La biomasa de algas también puede ser mezclada en productos tales como yogures.

[0230] Aunque la biomasa de algas y/o aceite de algas se pueden incorporar en los suplementos nutricionales, los productos alimenticios funcionales discutidos anteriormente tienen distinciones de suplementos nutricionales típicos, que son en forma de píldoras, cápsulas, o polvos. El tamaño de la porción de tales productos alimenticios es típicamente mucho más grande que un suplemento nutricional, tanto en términos de peso y en términos de calorías proporcionadas. Por ejemplo, los productos alimenticios a menudo tienen un peso de más de 100 g y/o el suministro de al menos 100 calorías cuando se envasan o consumen de una vez. Típicamente productos alimenticios contienen al menos un ingrediente que es ya sea una proteína, un carbohidrato o un líquido y, a menudo contienen dos o tres de tales otros ingredientes. La proteína o hidrato de carbono en un producto alimenticio a menudo suministra al menos 30%, 50%, o 60% de las calorías del producto alimenticio.

[0231] Como se comentó anteriormente, la biomasa de algas puede ser hecha por un fabricante y vendida a un consumidor, tales como un restaurante o individual, para su uso en un entorno comercial o en el hogar. Tal biomasa de algas se fabrica preferiblemente y se envasa en condiciones de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) de los productos alimenticios. La biomasa de algas en forma predominantemente intacta o en forma de homogeneizado o micronizado en forma de polvo a menudo se envasa en seco en un recipiente hermético, tal como una bolsa sellada. Biomasa homogeneizada o micronizada en forma de suspensión puede ser convenientemente empaquetada en una tina entre otros recipientes. Opcionalmente, la biomasa de algas se puede envasar al vacío para mejorar la vida útil. No se requiere refrigeración de la biomasa de algas envasadas. La biomasa de algas empaquetada puede contener instrucciones de uso, incluyendo instrucciones para la cantidad de la biomasa de algas utilizada para reemplazar una cantidad dada de aceite, grasa o huevos en una receta convencional, como se discutió anteriormente. Para simplicidad, las direcciones pueden afirmar que el aceite o grasa son para ser sustituidos en una proporción de 2: 1 por masa o volumen de la biomasa, y los huevos en una proporción de biomasa 11g o 1 cucharadita de aceite de algas por huevo. Como se discutió anteriormente, otras relaciones son posibles, por ejemplo, utilizando una proporción de masa 10-175% o el volumen de biomasa a la masa o el volumen de aceite y/o grasa y/o los huevos en una receta convencional. Al abrir un envase sellado, las instrucciones pueden dirigir al usuario a mantener la biomasa de algas en un recipiente hermético, tales como las ampliamente disponibles comercialmente (p.ej., Glad), opcionalmente con refrigeración.

[0232] La biomasa de algas (predominantemente intactas o en polvo homogeneizado o micronizado) también puede envasarse en una forma combinada con otros ingredientes secos (p.ej., azúcar, harina, frutos secos, aromas) y las raciones estaban bien embaladas para asegurar la uniformidad en el producto final. La mezcla entonces se puede convertir en un producto alimenticio por una compañía de consumo o servicio de alimentos simplemente mediante la adición de un líquido, tal como agua o leche, y opcionalmente la mezcla, y/o cocinar sin añadir aceites o grasas. En algunos casos, se añade el líquido para reconstituir una composición de la biomasa de algas secadas. Cocinar opcionalmente se puede realizar utilizando un horno de microondas, horno de convección, horno convencional, o en una estufa. Tales mezclas se pueden utilizar para la fabricación de pasteles, panes, panqueques, gofres, bebidas, salsas y similares. Estas mezclas tienen ventajas de conveniencia para el consumidor, así como una larga vida útil sin necesidad de refrigeración.

[0233] Aceite de algas para uso como ingrediente alimenticio es igualmente preferiblemente fabricado y empaquetado en condiciones GMP para un alimento. El aceite de algas se envasa típicamente en una botella u otro recipiente de una manera similar a los aceites convencionalmente usados. El recipiente puede incluir una etiqueta pegada con instrucciones para usar el aceite en sustitución de aceites, grasas o huevos convencionales en los productos alimenticios, y, como un aceite de cocina. Cuando envasado en un recipiente sellado, el aceite tiene una larga vida de almacenamiento (al menos un año) sin deterioro sustancial. Después de la apertura, aceite de algas compuesto principalmente de aceites monoinsaturados no es muy sensible a la oxidación. Sin embargo, las partes no utilizadas del aceite se pueden mantener más tiempo y con menos oxidación si se mantiene frío y/o de la luz solar directa (p.ej., dentro de un espacio cerrado, tal como un armario). Las instrucciones incluidas con el aceite pueden contener dicha información de almacenamiento preferida.

[0234] Opcionalmente, la biomasa de algas y/o el aceite de algas pueden contener un conservante aprobado para alimentos/antioxidante para maximizar la vida útil, incluyendo, pero no limitado a, los carotenoides (p.ej., astaxantina, luteína, zeaxantina, alfa-caroteno, beta-caroteno y licopeno), fosfolípidos (p.ej., N-acilfosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol y lisofosfatidilcolina), tocoferoles (p.ej., tocoferol alfa, tocoferol beta, tocoferol gamma y tocoferol delta), tocotrienoles (p.ej., tocotrienol alfa, tocotrienol beta, tocotrienol gamma y tocotrienol delta), hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, polifenoles, ácido rosmarínico, galato de propilo, ácido ascórbico, ascorbato de sodio, ácido sórbico, ácido benzoico, parabenos de metilo, ácido levulínico, ácido anísico, ácido acético, ácido cítrico, y bioflavonoides.

[0235] La descripción de incorporación de biomasa predominantemente intacta, homogeneizado, o biomasa micronizada (en suspensión, en escamas, polvo o harina) o aceite de algas en los alimentos para la nutrición humana es en general aplicable también a los productos alimenticios para animales no humanos.

[0236] La biomasa imparte aceite de alta calidad o proteínas o ambos, en tales alimentos. El contenido de aceite de algas es preferiblemente al menos 10 o 20% en peso como es el contenido de proteína de algas. La obtención de al menos una parte del aceite de algas y/o proteína a partir de biomasa predominantemente intacta a veces es ventajosa para alimentos para animales de alto rendimiento, tales como perros deportivos o caballos. Predominantemente biomasa intacta es también útil como conservante. La biomasa de algas o aceite se combina con otros ingredientes que típicamente se encuentran en los alimentos de origen animal (p.ej., una carne, sabor de la carne, ácido graso, verdura, fruta, almidón, vitaminas, minerales, antioxidantes, probióticos) y cualquier combinación de los mismos. Tales alimentos también son adecuados para animales de compañía, particularmente los que tienen un estilo de vida activo. Se recomienda la inclusión de la taurina para alimentos para gatos. Al igual que con los alimentos animales convencionales, la comida puede ser proporcionada en partículas de tamaño de un bocado apropiadas para el animal previsto.

[0237] Comida sin lípidos es útil como materia prima para la producción de un concentrado y/o aislado de proteína de algas, especialmente comida sin lípidos de alta biomasa de algas que contiene proteína. El concentrado y/o aislado de proteínas de algas se pueden producir usando procedimientos estándar utilizados para producir concentrado/aislado de proteína de soja. Un concentrado de proteína de algas se preparó mediante la eliminación de azúcares solubles a partir de la biomasa de algas sin lípidos o comida. Los componentes restantes serían principalmente proteínas y polisacáridos insolubles. Al eliminar los azúcares solubles de la comida sin lípidos, el contenido de proteína se aumenta, creando así un concentrado de proteína de algas. Un concentrado de proteína de algas contendría proteína al menos 45% en peso seco. Preferiblemente, un concentrado de proteína de algas contendría al menos 50%-75% de proteína en peso seco. Aislado de proteína de algas también se puede preparar utilizando los procesos estándar que se utilizan para producir proteína de soja aislada. Este proceso por lo general implica una etapa de temperatura y la extracción de pH básico con NaOH. Después de la etapa de extracción, los líquidos y los sólidos se separan y las proteínas se precipitan fuera de la fracción líquida usando HCl. La fracción sólida se puede volver a extraer y las fracciones líquidas resultantes pueden ser agrupadas antes de la precipitación con HCl. La proteína se neutraliza y se seca por pulverización para producir un aislado de proteína. Un aislado de proteína de algas típicamente contendría al menos 90% de proteína en peso seco.

[0238] Comida sin lípidos es útil como alimento para animales para animales de granja, p.ej., rumiantes, aves de corral, cerdos y acuicultura. Comida sin lípidos es un subproducto de la preparación de aceite de algas purificado ya sea para alimentos o para otros fines. La harina resultante aunque de reducido contenido de aceite todavía contiene proteínas de alta calidad, carbohidratos, fibras, cenizas y otros nutrientes apropiados para un alimento para animales. Debido a que las células se lisan predominantemente, harina sin lípidos es fácilmente digerible por dichos animales. Comida sin lípidos opcionalmente se puede combinar con otros ingredientes, tales como grano, en un alimento para animales. Debido a que la comida sin lípidos tiene una consistencia de polvo, puede ser presionado en gránulos utilizando una extrusora o expansores, que son comercialmente disponibles.

[0239] Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar, la invención reivindicada.

V. EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Cultivo de microalgas para lograr un alto contenido de aceite

[0240] Cepas de microalgas se cultivaron en matraces de agitación con el objetivo de alcanzar más del 20% de aceite por peso de células secas. Los medios de matraz utilizados fueron los siguientes: K2HPO4: 4,2 g/l, NaH2PO4: 3,1 g/L, MgSO4-7H2O: 0,24 g/L, ácido cítrico monohidrato: 0,25 g/L, CaCl22H2O: 0,025 g/L, extracto de levadura: 2 g/L, y 2% de glucosa. Células crioconservadas se descongelaron a temperatura ambiente y 500 ul de células se añadieron a 4,5 ml de medio y se hicieron crecer durante 7 días a 28°C con agitación (200 rpm) en una placa de 6 pocillos. Los pesos de células secas se determinaron centrifugando 1 ml de cultivo a 14.000 rpm durante 5 min en un tubo previamente pesado Eppendorf. El sobrenadante del cultivo se desechó y el sedimento celular resultante se lavó con 1 ml de agua desionizada. El cultivo se centrifugó de nuevo, se desechó el sobrenadante, y los sedimentos celulares se coloca a -80°C hasta la congelación. Las muestras fueron luego liofilizadas durante 24 horas y fueron calculados los pesos de células secas. Para la determinación de lípido total en cultivos, se retiraron 3 ml de cultivo y se sometieron a análisis utilizando un sistema Ankom (Ankom Inc., Macedon, NY) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las muestras se sometieron a extracción con disolvente con un extractor Amkom XT10 de acuerdo con el protocolo del fabricante. El lípido total se determinó como la diferencia en masa entre muestras secas de ácido hidrolizado y muestras secas con el disolvente extraido. Mediciones de peso celular seco por ciento de aceite se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Porcentaje de aceite por peso de células secas

[0241] Cepas adicionales de Chlorella protothecoides también se hicieron crecer usando las condiciones descritas anteriormente y se determinó el perfil de lípidos para cada uno de estas cepas Chlorella protothecoides usando los procedimientos de cromatografía de gas estándar (GC/FID) descritos brevemente en el Ejemplo 2. Un resumen del perfil lipídico se incluye a continuación. Los valores se expresan como porcentaje de área de los lípidos totales. Los números de colección con UTEX son cepas de algas de las algas Colección UTEX en la Universidad de Texas, Austin (1 Universidad Station A6700, Austin, Texas 78712-0183). Los números de colecciones con CCAP son cepas de algas de la colección de cultivos de algas y protozoos (SAMS Research Services, Ltd. Scottish Marine Institute, OBAN, Argull PA37 1QA, Escocia, Reino Unido). El número de colección con SAG son cepas de algas de la colección de cultivos de algas en la Universidad de Gotinga (Nikolausberger Weg 18, 37073 Gotinga, Alemania).

N° de C12:0 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 colección

UTEX 25 0,0 0,6 8,7 0,3 2,4 72,1 14,2 1,2 0,2 0,2

UTEX 249 0,0 0,0 9,7 0,0 2,3 72,4 13,7 1,9 0,0 0,0

UTEX 250 0,0 0,6 10,2 0,0 3,7 69,7 14,1 1,4 0,3 0,0

UTEX 256 0,0 0,9 10,1 0,3 5,6 64,4 17,4 1,3 0,0 0,0

UTEX 264 0,0 0,0 13,3 0,0 5,7 68,3 12,7 0,0 0,0 0,0

UTEX 411 0,0 0,5 9,6 0,2 2,8 71,3 13,5 1,5 0,2 0,2

CCAP 211/17 0,0 0,8 10,5 0,4 3,3 68,4 15,0 1,6 0,0 0,0

CCAP 221/8d 0,0 0,8 11,5 0,1 3,0 70,3 12,9 1,2 0,2 0,0 SAG 221 10d 0,0 1,4 17,9 0,1 2,4 55,3 20,2 2,7 0,0 0,0

[0242] Estos datos muestran que, aunque todas las cepas anteriores son Chlorella protothecoides, hay diferencias en el perfil lipídico entre algunas de las cepas.

EJEMPLO 2

[0243] Tres procesos de fermentación se realizaron con tres formulaciones de medios diferentes con el objetivo de generar la biomasa de algas con alto contenido de aceite. La primera formulación (Medios 1) se basó en medio descrito en Wu et al. (1994 Science in China, vol 37, N° 3, pp 326-335) y consistió en por litro: KH2PO4, 0,7 g; K2HPO4, 0,3 g; MgSO47H2O, 0,3 g; FeSO47H2O, 3 mg; clorhidrato de tiamina, 10|ig; glucosa, 20 g; glicina, 0,1 g; H3BO3, 2,9 mg; MnCl2-4H2O, 1,8 mg; ZnSO47H2O, 220|ig; CuSO45H2O, 80|ig; y NaMoO4-2H2O, 22,9mg. El segundo medio (Medios 2) se derivó de los medios del matraz descritos en el Ejemplo 1 y consistía en por litro: K2HPO4, 4,2 g; NaH2PO4, 3,1 g; MgSO4-7H2O, 0,24 g; ácido cítrico monohidrato, 0,25 g; calcio dihidrato de cloruro, 25 mg; glucosa, 20 g; extracto de levadura, 2 g. El tercer medio (Medios 3) era un híbrido y consistía por litro: K2HPO4, 4,2 g; NaH2PO4, 3,1 g; MgSO47H2O, 0,24 g; ácido cítrico monohidrato, 0,25 g; calcio dihidrato de cloruro, 25 mg; glucosa, 20 g; extracto de levadura, 2 g; H3BO3, 2,9 mg; MnCl2-4H2O, 1,8 mg; ZnSO47H2O, 220|ig; CuSO4-5H2O, 80|ig; y NaMoO4-2H2O, 22,9mg. Las tres formulaciones de medios se prepararon y la autoclave se esterilizó en recipientes de fermentador a escala de laboratorio durante 30 minutos a 121°C. Glucosa estéril se añadió a cada recipiente tras enfriamiento después de la esterilización en autoclave.

[0244] El inóculo para cada fermentador era Chlorella protothecoides (UTEX 250), preparado en dos etapas del matraz utilizando las condiciones del medio y la temperatura del fermentador inoculado. Cada fermentador se inoculó con 10% (v/v) de cultivo semilogarítmico. Los tres fermentadores a escala de laboratorio se llevaron a cabo a 28°C durante la duración del experimento. El crecimiento celular de microalgas en Medios 1 también se evaluó a una temperatura de 23°C. Para todas las evaluaciones del fermentador, el pH se mantuvo a 6,6 hasta 6,8, agitaciones a 500 rpm, y el flujo de aire a 1 vvm. Cultivos de fermentación se cultivaron durante 11 días. La acumulación de biomasa se midió mediante densidad óptica a 750 nm de peso de células y seco.

[0245] La concentración de lípidos/aceite se determinó usando transesterificación directa con métodos de cromatografía de gas estándar. Brevemente, las muestras de caldo de fermentación con la biomasa se transfirieron a papel secante y se transfirieron a tubos de centrífuga y se secaron en un horno de vacío a 65-70°C durante 1 hora. Cuando las muestras se secaron, 2 ml de 5% H2SO4 en metanol se añadió a los tubos. Los tubos se calentaron a continuación en un bloque de calor a 65-70°C durante 3,5 horas, mientras que se agitó con vórtex y se sonicó intermitente. Después, se añadió 2 ml de heptano y los tubos se agitaron vigorosamente. 2 ml de 6% K2CO3 se añadió y los tubos se agitaron vigorosamente para mezclar y después se centrifugaron a 800 rpm durante 2 minutos. A continuación, el sobrenadante se transfirió a viales de GC que contenían agente de secado Na2SO4y corrió usando métodos de cromatografía de gas estándar. Por ciento de aceite/lípido se basa en una base de peso celular seco. Los pesos de células secas para las células cultivadas usando: Medios 1, a 23°C fueron de 9,4 g/L; Medios 1 a 28°C fueron de 1,0 g/L, Medios 2 a 28°C fueron de 21,2 g/L; y Medios 3 a 28°C fueron de 21,5 g/L. La concentración de lípido/aceite para las células cultivadas usando: Medios 1, a 23°C fueron de 3 g/L; Medios 1 a 28°C fueron de 0,4 g/L; Medios 2 a 28°C fueron de 18 g/L; y Medios 3 a 28°C fueron de 19 g/L. El aceite ciento basado en el peso celular seco por células cultivadas usando: Medios 1 a 23°C fueron de 32%; Medios 1 a 28°C fueron de 40%; Medios 2 a 28°C fueron de 85%; y Medios 3 a 28°C fueron de 88%. Los perfiles de lípidos (en área %, después de la normalización para el estándar interno) para la biomasa de algas generada usando las tres formulaciones de medios diferentes a 28°C se resumen a continuación en la Tabla 2.

Tabla 2. Perfiles de lípidos para Chlorella protothecoides cultivado bajo diferentes condiciones de medios.

EJEMPLO 3

Preparación de biomasa para productos alimenticios

[0246] La biomasa de microalgas se genera mediante el cultivo de microalgas como se describe en uno cualquiera de los Ejemplos 1-2. La biomasa de microalgas se recoge del fermentador, frasco, o de otro biorreactor.

[0247] Siguen procedimientos de GMP. Cualquier persona que, mediante un reconocimiento médico o la observación de supervisión, está demostrada que tiene, o parece tener, una enfermedad, lesión abierta, incluyendo forúnculos, llagas, o heridas infectadas, o cualquier otra fuente anormal de contaminación microbiana por la cual existe una razonable posibilidad de alimentos, superficies de contacto con alimentos, o de envasado de alimentos materiales se contaminan, ha de excluirse de las operaciones que se pueden esperar para dar lugar a tal contaminación hasta que se corrija la condición. El personal es instruido para informar de las condiciones de salud a sus supervisores. Todas las personas que trabajan en contacto directo con la biomasa de microalgas, las superficies de biomasa de contacto, y los materiales biomasspackaging se ajustan a las prácticas de higiene durante el servicio en la medida necesaria para proteger contra la contaminación de la biomasa de microalgas. Los métodos para mantener la limpieza incluyen, pero no se limitan a: (1) El uso de las prendas exteriores adecuadas para la operación de una manera que protege contra la contaminación de la biomasa, las superficies de contacto de biomasa, o materiales de embalaje de biomasa. (2) El mantenimiento de la higiene personal adecuada. (3) Lavar las manos a fondo (y desinfectantes si es necesario para proteger contra la contaminación con microorganismos indeseables) en una instalación de lavado de manos adecuada antes de empezar a trabajar, después de cada ausencia de la estación de trabajo, y en cualquier otro momento cuando las manos se hayan ensuciado o contaminado. (4) Extracción de todas las joyas sin garantía y otros objetos que puedan caer en la biomasa, equipo o contenedores, y la eliminación de la joyería de mano que no puede ser esterilizado adecuadamente durante periodos en los que la biomasa se manipula con la mano. Si tal joyería de mano no se puede quitar, puede cubrirse por material que puede ser mantenido en una condición intacta, limpia, y sanitaria y que protege eficazmente contra la contaminación por estos objetos de la biomasa, las superficies de biomasa de contacto, o materiales de embalaje de biomasa. (5) El mantenimiento de los guantes, si se utilizan en el manejo de la biomasa, en una condición intacta, limpia e higiénica. Los guantes deben ser de un material impermeable. (6) El uso, en su caso, de una manera eficaz, redes para el cabello, bandas para la cabeza, los casquillos, las cubiertas de la barba, o otras restricciones de pelo efectivas. (7) El almacenamiento de la ropa u otros objetos personales en áreas distintas de la biomasa, donde se exponen o cuando se lavan los equipos o utensilios. (8) El confinamiento de las siguientes zonas distintas de donde la biomasa puede estar expuesta o donde se lavan el equipo o los utensilios: comer biomasa, masticar goma, beber refrescos, o usar tabaco. (9) tomar cualesquiera otras precauciones necesarias para proteger contra la contaminación de la biomasa, las superficies de biomasa de contacto, o materiales de biomasaenvasado con microorganismos o sustancias extrañas, incluyendo, pero no limitado a, la transpiración, el cabello, cosméticos, tabaco, productos químicos, y medicinas aplicadas a la piel. La biomasa de microalgas opcionalmente puede someterse a un procedimiento de rotura de las células para generar un lisado y/o opcionalmente se seca para formar una composición de biomasa de microalgas.

EJEMPLO 4

Cultivo de Chlorella protothecoides para generar escamas de algas de alto aceite

[0248] Biomasa de Chlorella protothecoides (UTEX 250) fue producida usando tanques de fermentación 5.000L utilizando procesos descritos en los Ejemplos 2 y 3. La concentración de glucosa (jarabe de maíz) se controló a lo largo de la ejecución. Cuando la concentración de glucosa era baja, se añadió más glucosa al tanque de fermentación. Después de que se consumió todo el nitrógeno, las células comenzaron la acumulación de lípidos. Se tomaron muestras de la biomasa a través del funcionamiento para controlar los niveles de lípidos y la ejecución se detuvo cuando la biomasa alcanza el contenido de lípidos deseado (más del 40% de lípidos en peso celular seco). En este caso, la biomasa fue cosechada cuando alcanzó aproximadamente 50% de lípidos en peso celular seco.

[0249] Para procesar la biomasa de microalgas en algas en escamas, la biomasa de Chlorella protothecoides cosechada se separó del medio de cultivo usando centrifugación y se secó en un secador de tambor utilizando métodos estándar a aproximadamente 150-170°C. La biomasa Chlorella protothecoides secada en tambor resultante con aproximadamente 50% de lípidos por peso de células secas (alta en lípidos) se empaquetó y se almacenó para su uso como escamas de algas.

EJEMPLO 5

Ausencia de toxinas de algas en biomasa de Chlorella protothecoides seca

[0250] Una muestra de Chlorella protothecoides (UTEX 250) de la biomasa se cultivó y preparó utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 4. La biomasa seca se analizó mediante un análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC-MS/MS) de la presencia de contaminación de las algas y las toxinas de cianobacterias. Los análisis cubrieron todos los grupos de toxinas de algas y cianobacterias publicadas en la literatura y se mencionan en las regulaciones internacionales de los alimentos. Los resultados muestran que la muestra de biomasa no contenía niveles detectables de ninguna de las toxinas de algas o cianobacterias que se probaron. Los resultados se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3. Los resultados analíticos LC-MS/MS para toxinas de algas y cianobacterias.

EJEMPLO 6

Contenido de fibra en biomasa de Chlorella protothecoides

[0251] El análisis proximal se realizó en muestras de la biomasa secada Chlorella protothecoides (UTEX 250) cultivada y se preparó utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 4 y el Ejemplo 17 de acuerdo con los Official Methods of ACOC International (AOAC Method 991.43). La hidrólisis ácida para el contenido total de grasa (lípido/aceite) se realizó en ambas muestras y el contenido de grasa de la biomasa de algas alta en lípidos fue de aproximadamente 50% y para la biomasa de algas de alta proteína fue de aproximadamente 15%. El contenido de fibra cruda fue del 2% para biomasa de algas de alto contenido de lípidos y de alta proteína. La humedad (determinada gravimétricamente) fue 5% para biomasa de algas de alto contenido de lípidos y de alta proteína. El contenido de cenizas, determinado por la quema y el análisis de la ceniza inorgánica crisol, fue del 2% para la alta biomasa de algas de lípidos y 4% para la biomasa alta en proteínas. La proteína cruda, determinada por la cantidad de nitrógeno liberada de la combustión de cada biomasa, fue del 5% para la alta biomasa de lípidos y 50% de la biomasa alta en proteínas. El contenido de carbohidratos se calculó por diferencia, tomando los valores anteriormente conocidos para la grasa, fibra cruda, humedad, cenizas y proteína cruda y restando ese total de 100. El contenido de carbohidratos calculado para la biomasa alta en lípidos fue de 36% y el contenido de hidratos de carbono para la biomasa de alta proteína como 24%.

[0252] Un análisis más detallado del contenido de hidratos de carbono tanto de la biomasa de algas mostró aproximadamente 4-8% (p/p) azúcares libres (predominantemente sacarosa) en las muestras. Varios lotes de alta biomasa de algas que contiene lípidos se ensayaron para determinar azúcares libres (ensayos para la fructosa, glucosa, maltosa sacarosa y lactosa) y la cantidad de sacarosa variaron de 2,83%-para 5,77%; maltosa desde no detectada a 0,6%; y glucosa desde no detectada a 0,6%. Los otros azúcares, a saber, fructosa, maltosa y lactosa, no se habían detectado en cualquiera de los lotes ensayados. Varios lotes de alta biomasa de algas que contienen proteína también se ensayaron para azúcares libres y sólo sacarosa se detectó en cualquiera de los lotes en un rango de 6,93% a 7,95%.

[0253] El análisis del contenido total de fibra dietética (dentro de la fracción de hidratos de carbono de la biomasa de algas) de ambas biomasas de algas se realizó utilizando métodos de acuerdo con Official Methods of ACOC International (AOAC Method 991.43). La biomasa de alto contenido de lípidos contenía fibra soluble al 19,58% y la fibra insoluble 9,86%, para un total de fibra dietética 29,44%. La biomasa de alta proteína contenía fibra soluble 10,31% y la fibra insoluble 4,28%, para un total de fibra dietética de 14,59%.

Análisis de monosacáridos de la biomasa de algas

[0254] Una muestra de biomasa secada Chlorella protothecoides (UTEX 250) con aproximadamente 50% de lípidos en peso de células seco, cultivada y preparada utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 4 se analizó para composición de monosacáridos (glicosilo) usando cromatografía de gases combinada/espectrometría de masas (GC/MS) de los derivados de per-O-trimetilsililo (TMS) de los glucósidos metílicos de monosacáridos producidos a partir de la muestra por ácido de metanolisis. Brevemente, los glicósidos de metilo se prepararon primero desde la muestra secada de Chlorella protothecoides por metanolisis en HCl 1M en metanol a 80°C durante 18-22°C, seguido de re-N-acetilación con piridina y anhídrido acético en metanol (para la detección de amino azúcares). Las muestras fueron luego per-O-trimetilsililadas por tratamiento con Tri-Sil (Pierce) a 80°C durante 30 minutos. Estos procedimientos fueron descritos anteriormente en Merkle y Poppe (1994) Methods Enzymol. 230: 1-15 y York et al. (1985) Methods Enzymol. 118: 3-40. Análisis de GC/MS de los glicósidos de metilo TMS se realizó en un Gc HP 6890 en interfaz con una 5975b MSD, usando una columna capilar de sílice fundida All Tech EC-1 (30 m x 0,25 mm ID). Los monosacáridos se identificaron por sus tiempos de retención en comparación con los estándares, y el carácter de hidratos de carbono de estos fueron autenticados por sus espectros de masas. La composición de monosacáridos (glicosilo) de Chlorella protothecoides fue: 1,2% en moles de arabinosa, 11,9% en moles de manosa, 25,2% en moles de galactosa y 61,7% en moles de glucosa. Estos resultados se expresan como porcentaje en moles de hidrato de carbono total.

EJEMPLO 7

Perfil de aminoácidos de la biomasa de algas

[0255] Una muestra de biomasa secada de Chlorella protothecoides (250 UTEX) con aproximadamente 50% de lípidos en peso de células seco, que se cultivó y se preparó utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 4 se analizó por contenido de aminoácidos de acuerdo con Official Methods of AOAC International (análisis de triptófano: método AOAC 988.15; análisis de metionina y cistina: método AOAC 985,28 y los otros aminoácidos: método AOAC 994.12). El perfil de aminoácidos de la biomasa de algas se seca (expresada en porcentaje de proteína total) se comparó con el perfil de aminoácidos de huevo entero secado (perfil de la hoja de especificaciones para huevo entero, Protein Factory Inc., Nueva Jersey), y los resultados demuestran que las dos fuentes tienen valores nutricionales de proteínas comparables. Los resultados del perfil de aminoácidos relativo (a la proteína total) de una muestra de Chlorella protothecoides muestran la biomasa que contiene metionina (2,25%), cisteína (1,69%), lisina (4,87%), fenilalanina (4,31%), leucina (8,43%), isoleucina (3,93%), treonina (5,62%), valina (6,37%), histidina (2,06%), arginina (6,74%), glicina ( 5,99%), ácido aspártico (9.55%), serina (6,18%), ácido glutámico (12,73%), praliné (4,49%) hidroxiprolina (1,69%), alanina (10,11%), tirosina (1,87%), y triptófano ( 1,12%). La comparación de la biomasa de algas y perfiles de aminoácidos de huevo entero se muestra en la Figura 2.

EJEMPLO 8

Composición de carotenoide, fosfolípido, tocotrienol y tocoferol de Biomasa de Chlorella protothecoides UTEX 250

[0256] Una muestra de la biomasa de algas producida utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 4 se analizó para contenido de tocotrienol y tocoferol mediante HPLC de fase normal, AOCS Method Ce 8-89. La fracción que contiene tocotrienol y tocofero de la biomasa se extrajo usando hexano u otro disolvente no polar. Los resultados de composición completa de tocotrienol y tocoferol se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4. Contenido de tocotrienol y tocoferol en la biomasa de algas.

[0257] La fracción que contiene carotenoides de la biomasa fue aislada y analizada por carotenoides fpr utilizando métodos de HPLC. La fracción que contiene carotenoide se preparó mezclando la biomasa de algas liofilizada (producida utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 3) con carburo de silicio en un mortero de aluminio y molido cuatro veces durante 1 minuto cada vez, con un mortero y una mano de mortero. A continuación, la biomasa molida y la mezcla de silicio se enjuagó con tetrahidrofurano (THF) y se recogió el sobrenadante. La extracción de la biomasa se repitió hasta que el sobrenadante fue incoloro, y el sobrenadante THF de todas las extracciones se reunieron y se analizó el contenido de carotenoide usando métodos de HPLC estándar. El contenido de carotenoides de la biomasa de algas que se secó utilizando un secador de tambor también se analizó usando los métodos descritos anteriormente.

[0258] El contenido de carotenoides de la biomasa de algas congelada en seco fue: luteína total (66,9-68,9mcg/g: con cis-luteína que van desde 12,4-12,7mcg/g y trans-luteína que van desde 54,5-56,2mcg/g); trans-zeaxantina (31,427-33,451mcg/g); cis-zeaxantina (1,201-1,315mcg/g); t-alfa criptoxantina (3,092-3,773mcg/g); t-beta criptoxantina (1,061-1,354mcg/g); caroteno 15-cisbeta (0,625-,0675mcg/g); caroteno 13-cis-beta (,0269-,0376mcg/g); caroteno t-alfa (0,269-,0376mcg/g); caroteno calpha (0,043-,010mcg/g); t-beta caroteno (0,664-0,741mcg/g); y caroteno 9-cis-beta (0,241-0,263mcg/g). Los carotenoides totales informados variaron de 105,819mcg/g a 110,815mcg/g.

[0259] El contenido de carotenoides de la biomasa de algas secada por tambor fue significativamente menor: luteína total (0,709mcg/g: siendo trans-luteína 0,091mcg/g y siendo cis-luteína 0,618mcg/g); trans-zeaxantina (0,252mcg/g); cis-zeaxantina (0,037mcg/g); alfa-criptoxantina (0,010mcg/g); beta-criptoxantina (0,010mcg/g) y t-beta-caroteno (0,008mcg/g). Los carotenoides totales informados eran 1,03mcg/g. Estos datos sugieren que el método utilizado para el secado de la biomasa de algas puede afectar significativamente el contenido de carotenoides.

[0260] El análisis de fosfolípidos se realizó también en la biomasa de algas. El fosfolípido que contiene fracción se extrajo utilizando el método de Folch de extracción (cloroformo, metanol y la mezcla de agua) y la muestra de aceite se analizó utilizando el método oficial AOCS Ja 7b-91, la determinación por HPLC de lecitinas hidrolizadas (International Lecithin and Phopholipid Society 1999), y análisis HPLC de fosfolípidos con métodos de detección de luz scatting (International Lecithin and Phospholipid Society 1995) para el contenido de fosfolípidos. Los fosfolípidos totales por ciento p/p fue 1,18%. El perfil de fosfolípido de aceite de algas era fosfatidilcolina (62,7%), fosfatidiletanolamina (24,5%), lisofosfatidilcolina (1,7%) y fosfatidilinositol (11%). También se realizó un análisis similar utilizando la extracción con hexano de la fracción que contiene fosfolípidos de la biomasa de algas. Los fosfolípidos totales por ciento p/p fue del 0,5%. El perfil de fosfolípido era fosfatidiletanolamina (44%), fosfatidilcolina (42%) y fosfatidilinositol (14%).

EJEMPLO 9

Productos alimenticios que contienen escamas de algas (alto contenido de aceite)

Barra de salud cardio/metabólica

[0261] Los ingredientes de la barra de salud cardio/metabólica consistieron de avena rápida (30,725%), arroz crujiente (9,855%), azúcar granular fino (sacarosa) (14,590%), azúcar marrón claro (6,080%), sal (0,550%), el aceite de canola (10,940%), jarabe de maíz 42 DE (7,700%), miel (3,650%), agua (7,700%), lecitina (0,180%), bicarbonato de sodio (0,180%), biomasa de algas secada (Chlorella protothecoides UTEX 250, 48% de lípidos) (1,540%), esterol vegetal corowise (1,060%), la inulina (fibra soluble) (4,280%), y psilio (fibra insoluble) (0,970%).

[0262] Instrucciones: (1) Precalentar el horno a 325 grados Fahrenheit con convección. (2) Pesar los primeros 5 ingredientes en un recipiente. (3) Mezclar el agua, lecitina y bicarbonato de sodio en un mezclador Hobart. (4) Mezclar la miel, jarabe de maíz y aceite de canola; calor en el microondas durante 30-40 segundos. Mano de la mezcla con una espátula y verter la mezcla en el mezclador Hobart. (5) Añadir sabor de la comida estándar deseada. (6) Añadir los nutracéuticos secos (la biomasa de algas, esterol vegetal, fibra) en el mezclador Hobart. (7) Añadir los ingredientes secos restantes. (8) Formar y hornear a 325 grados Farenheit durante 20-25 minutos con convección.

Toma diaria cardio (un alimento líquido que contiene la biomasa de algas de alto aceite intacta)

[0263] Los ingredientes de la toma cardio de sabor a naranja consistían en agua destilada (869,858 g), benzoato de sodio (0,100 g), polvo de ticaloide 5415 (1,000 g), azúcar de jugo de caña evaporado (88,500 g), biomasa de algas secada (aceite de más del 40%) (16,930 g), fibersol - 2 ADM (47,000 g), esterol de plantas corowise ES-200 (18,300 g), ácido cítrico granular (1,312 g), extracto de naranja (WONF, sabor 884,0062U) (1,000 g). Los ingredientes se combinaron y mezclaron hasta que estuvieran lisos.

Batido para el control de peso (un alimento líquido que contiene la biomasa de algas de alto aceite intacta)

[0264] Los ingredientes del batido a base de fruta consistían en agua destilada (815,365g), estabilizador (4,5 g), concentrado de zumo de manzana (58g), zumo de naranja concentrado (46,376g), concentrado de zumo de limón (1,913g), concentrado de puré de mango ( 42,5 g), puré de plátano (40,656g), concentrado de zumo de maracuyá (8,4 g), ácido ascórbico (0,320 g), escamas de algas (46,41g), extracto de sabor a naranja (1 g), aroma de piña (0,4 g) y sabor mango (0,16 g). Los ingredientes se combinaron y mezclaron hasta que estuvieran lisos.

Tabletas de cardio/metabólicas (biomasa intacta de algas de alto aceite encapsulada/en forma de comprimido)

[0265] Los ingredientes de la tableta de la salud metabólica (1,25-1,75 g tamaño) consistían en biomasas de microalgas secadas de Chlorella protothecoides (UTEX 250, más del 40% de lípidos de peso celular seco) (1000 mg/comprimido), caroteno betateno beta (beta caroteno 20% a partir de Dunaliella) (15 mg/comprimido), la vitamina C como ácido ascórbico (100 mg/comprimido), y bioperina (piper nigrem potenciador de biodisponibilidad) (2,5 mg/comprimido).

Patatas fritas de algas

[0266] Los ingredientes de las patatas fritas de algas consistían en harina blanca sin blanquear (1 taza), harina de patata (1/2 taza), biomasa de algas (más del 40% de lípidos de peso celular seco) (3 cucharadas), sal (3/4 cucharadita, ajustar al gusto), harina de cebada (2 cucharadas), agua (1/3 -1 taza), y los condimentos (p.ej., comino, curry, salsa ranchera) (al gusto).

[0267] Procedimiento de preparación: Los ingredientes secos se mezclaron y se añadió 1/3 taza de agua a los ingredientes secos. Se añadió agua adicional (hasta 1 taza total) para formar la masa. La masa se amasa en un producto uniforme y luego se dejó en reposo durante 30 minutos a temperatura ambiente. La masa se cortó y se conformó en virutas finas y se horneó a 275°F durante 20-30 minutos, o hasta que estuvieran crujientes.

Galletas de pasas de algas

[0268] Los ingredientes de las galletas de pasas de algas consistieron de mantequilla o margarina (1/2 taza, receta de alimentos convencionales exige 3/4 taza), escamas de cebada o avena (1 3/4 taza), nuez moscada (1/4 de cucharadita), agua o leche (2-3 cucharadas), azúcar marrón (1 taza), sal (1/2 cucharadita), polvo de hornear (1/2 de cucharadita), vainilla (1 cucharadita), canela (1 cucharadita), pasas (opcionalmente remojadas previamente en brandy o jugo de naranja) (3/4 taza), y la biomasa de algas secada (aceite de más del 30%) (1/3 taza). Esta receta hace alrededor de 2 docenas de galletas.

[0269] La receta de los alimentos convencionales pide 2 huevos y % taza de mantequilla o margarina. Con el uso de la biomasa de algas secas, % taza de mantequilla o margarina y los huevos se eliminan por sustitución con biomasa de algas que contiene aceite.

[0270] Procedimiento de preparación: Batir la mantequilla y el azúcar. Batir hasta que esté muy suave y esponjosa. Agregue la vainilla. Combine la harina y hojuelas de cebada y algas. Combinar la mezcla de mantequilla con la mezcla de harina de copos. Añadir las pasas. Añadir a cucharaditas, y aplanar ligeramente. Hornear unos 9-10 minutos a 375 grados F.

Pasta de cebada de algas

[0271] Los ingredientes de la pasta de cebada con algas consistían en harina de cebada (3/4 taza), se secó la biomasa de algas con al menos 20% de lípidos en peso seco de células (2 cucharadas), huevo grande (1), y sal (1/2 cucharadita).

[0272] Procedimiento de preparación: Colocar la harina en un tazón y agregar algas y sal. Mezcle. Agregue el huevo en el medio (hacer un pozo), y remover poco a poco la harina. Si difícil de agitar, añadir 1 cucharada de agua, salpicando a su alrededor. Cuando toda la harina se ha incorporado, comenzar a amasar la masa para que sea más uniforme. Esto debe hacerse durante 5-8 minutos. Cuando la masa es uniforme, dividirla en dos bolas pequeñas, y frotar aceite de oliva en el exterior. Tapar y dejar reposar unos 30 minutos. Aplanar la masa, a continuación, rodar con un rodillo hasta un espesor de alrededor de un octavo de pulgada, para la pasta de tipo fettucine. Cortar la pasta en tiras finas. Deje caer en agua hirviendo con sal. Cocinar unos 8-10 minutos. La pasta se puede servir con una pequeña cantidad de queso parmesano rallado por encima, y un poco de pimienta molida.

Pasta

[0273] Este ejemplo compara las pastas hechas por una receta convencional y una biomasa alta en lípidos de células enteras (Chlorella protothecoides (cepa UTEX 250) con 48% de lípidos en peso celular seco) para sustituir el huevo en la receta convencional.

Tabla 5. Receta para el control de la pasta tradicional.

Componente Medidas de Peso (g) Porcentaje % grasa. Peso recetas húmedo

Huevo entero 1 55,67 24,97% 1,87%

(batido) A cdta. 3,74 1,68% 0,00%

Sal, Mesa 1 taza 133,18 59,74% 0,00%

Harina, todo uso 1-2 cdta. 30,35 13,61% 0,00%

Agua

Rendimiento: 3 222,94 100,00% 1,87%

Tabla 6. Receta para biomasa de algas de célula entera reemplazando el huevo entero.

Componente Medidas de Peso (g) Porcentaje % grasa. Peso húmedo recetas

Biomasa de célula entera 7,55 3,16% 1,52%

Sal, Mesa A cdta. 3,61 1,51% 0,00%

Harina, todo uso 1 taza 146,28 61,25% 0,00%

Agua 81,37 34,07% 0,00%

Rendimiento: 3 238,81 100,00% 1,52%

[0274] En cada caso el procedimiento de cocción fue:

1. En un cuenco de cocina usando gancho de la pasta, combine la harina y la sal.

2. Batir ligeramente el huevo. En una baja velocidad (velocidad n° 2), añadir el huevo ligeramente batido hasta que se forme una masa firme.

3. Si es necesario, agregar 1-2 cucharadas de agua.

4. Mezclar durante 3-4 minutos, añadir un poco más de harina si la masa es demasiado pegajosa.

5. Dividir la masa en porciones laminables. Permitir que la masa repose durante 1 hora antes de la lámina.

6. Uso de una laminadora de pasta, lámina de masa a espesor deseado.

7. Cortar la pasta en tiras.

8. Colocar una olla de agua en la estufa a hervir.

9. Cocinar la pasta y mezclar con el aceite/mantequilla para evitar que se pegue. Servir con la salsa.

[0275] La pasta de biomasa celular tenía la textura y apariencia similar a la receta convencional. Ningún sabor prominente de algas era evidente. La biomasa de algas de células enteras mejoró el rendimiento en la pasta seca, muy probablemente debido a una función de unión al agua. Estas observaciones son consistentes con la idea de que toda la biomasa de algas celular puede actuar como un buen agente de aumento de volumen en alimentos secos o procesados.

Leche de algas

[0276] Leche de algas contiene alrededor de 8% de sólidos, que se compone de 4% de lípidos saludables del corazón, 2,5% de las proteínas ricas en aminoácidos esenciales, 1,5% de carbohidratos y 0,5% de fibra, y está fortificada con vitaminas A y D. Leche de algas es extremadamente sana; es vegetariana, y se puede utilizar como un sustituto de la leche de soja y leche de vaca. A diferencia de la leche de vaca, es muy baja en grasas saturadas, y a diferencia de la leche de soja, la grasa es principalmente mono-insaturada (más del 50% de C18: 1). La leche de algas tiene un sabor suave; no "frijol" como en la leche de soja. Sabores pueden añadirse, tales como fresa o frambuesa.

[0277] Los ingredientes de la leche de algas consistieron en células de algas secas enteras que contienen aproximadamente 40% de lípidos (8%), vitamina D (200 unidades), vitamina A (200 unidades), goma de xantano (0,2%), y agua (al 100%). El agua se calentó y luego la goma de xantano se dispersó. Las células de algas secas enteras se dispersan a continuación en la solución de goma de xantano caliente y se añadieron vitaminas. Después, la solución se homogeneizó usando un homogeneizador de alta presión y se pasteuriza. Una formulación adicional se incluye a continuación usando harina de algas.

EJEMPLO 10

Producción de homogeneizado de algas (alto contenido de lípidos)

[0278] Chlorella protothecoides que contiene alto contenido de lípidos cultivado utilizando los métodos y condiciones descritas en el Ejemplo 4 se procesó en un homogeneizado de algas alto de lípidos. Para procesar la biomasa de microalgas en un homogeneizado de algas, la biomasa Chlorella protothecoides recogida se procesa en primer lugar en forma de escamas de algas (véase el Ejemplo 4). Las escamas de algas secas se rehidrataron luego en agua desionizada a la concentración de sólidos de aproximadamente 40%. A continuación, la suspensión de escamas de algas resultante se microniza utilizando un homogeneizador de alta presión (GEA modelo NS1001) que opera a un nivel de presión de 1000 a 1200 bar hasta que el tamaño medio de partícula de la biomasa fue de menos de 10|im. El homogeneizado de algas resultante se envasa y se almacena hasta su uso.

EJEMPLO 11

Productos alimenticios funcionales: escamas de algas de alto contenido de lípidos y homogeneizado de algas utilizado en los alimentos como una sustitución de la grasa

[0279] Los siguientes ejemplos describen el uso de escamas de algas altas en lípidos (por encima de 40% en peso) o homogeneizado de algas como un reemplazo en recetas convencionales y de bajo contenido de grasa. Escamas de algas de alto contenido de lípidos. Las escamas de algas de alto contenido de lípidos se prepararon usando los métodos descritos en el ejemplo se preparó 4. altos de lípidos de las algas homogeneizado usando los métodos descritos en el Ejemplo 8.

Brownies de chocolate

[0280] Este ejemplo compara brownies de chocolate hechas usando una receta convencional, una receta bajo control de la grasa y con escamas de algas de contenido de lípidos (Chlorella protothecoides (cepa UTEX 250) con 48% de lípidos en peso celular seco) con sustitución de parte de la grasa en la receta convencional.

Tabla 7. Receta para el control de brownie de chocolate convencional

Componente Medidas de Peso (g) Porcentaje % Grasa. Peso húmedo recetas

Mantequilla 1 palo, 1/41b 114,00 19,05% 15,24%

Polvo de cacao 1/4 taza 48,00 8,02% 0,80%

Huevos enteros 3 156,00 26,07% 1,96%

Azucar, granulada 1 taza 140,92 23,55% 0,00%

Harina, todo uso 1 taza 130,40 21,79% 0,00%

Polvo para hornear 1 cdta. 3,97 0,66% 0,00%

Extracto de vainilla 1 cdta. 5,07 0,85% 0,00%

Rendimiento: 1 cacerola 598,36 100,00% 18,00%

Tabla 8. Receta para el control de baja grasa

Componente Medidas de Peso (g) Porcentaje % Grasa. Peso húmedo recetas

Mantequilla 0,00 0,00% 0,00%

Polvo de cacao 1/4 taza 48,00 10,25% 1,03%

Agua 139,80 29,86% 0,00%

Huevos enteros 0,00 0,00 0,00% 0,00%

Azucar, granulada 1 taza 140,92 30,10% 0,00%

Harina, todo uso 1 taza 130,40 27,85% 0,00%

Polvo para hornear 1 cdta. 3,97 0,85% 0,00%

Extracto de vainilla 1 cdta. 5,07 1,08% 0,00%

Rendimiento: 1 cacerola 468,16 100,00% 1,03%

Tabla 9. Receta para brownies de biomasa de algas con sustitución de mantequilla y huevos.

Componente Medidas de recetas Peso (g) Porcentaje % Grasa. Peso húmedo

Biomasa de células enteras 73,00g 12,59% 6,5%

Polvo de cacao 1/4 taza 24,00 4,14%

Agua 3 148,00 25,52%

Azucar, granulada 1 taza 183,00 31,55%

Harina, todo uso 1 taza 133,00 22,93%

Polvo para hornear 1 cdta. 4,00 0,69%

Pacanas, cortadas 1 taza 0,00 0,00%

Extracto de vainilla 1 cdta. 15,00 2,59%

Rendimiento: 1 cacerola 580,00 100,00% 6,5%

[0281] En cada caso, el procedimiento de cocción fue:

1. Precalentar el horno a 177°C (350°F). Añadir grasa y harina al molde para hornear de 8x8.

2. En una olla pequeña, derrita la mantequilla con cacao en polvo. Deje enfriar.

3. En un bol de cocina con la conexión de la paleta, bata los huevos hasta que estén espumosas. Añadir poco a poco el azúcar.

4. Agregar mezcla de mantequilla caliente/polvo de cacao a temperatura ambiente/sl.

5. Mezclar la harina y polvo para hornear. Añadir la mezcla 1/2 lentamente a la masa.

6. Añadir las nueces a la porción de la harina restante. Agregar la mezcla a la masa. Mezclar a baja (velocidad n° 2) hasta que esté bien mezclada. Agregar el extracto de vainilla y mezclar.

7. Repartir la mezcla en el molde. Hornear durante 20-25 minutos.

8. Enfriar los brownies y aplicar hielo si se desea.

[0282] Los brownies de control de bajo contenido de grasa (con la mantequilla y los huevos omitidos) no tienen la misma estructura de la miga en comparación con los brownies hechos con las escamas de algas o los brownies convencionales. Los brownies de escamas de algas tenían una buena estructura de la miga, visible, pero eran un poco más denso y más gomoso que los bizcochos de chocolate con toda su grasa. En general, los brownies hechos con las escamas de algas tenían una reducción del 64% en el contenido de grasa en comparación con los brownies convencionales.

Torta amarilla

[0283] Este ejemplo compara la torta amarilla hecha por una receta convencional, una receta baja en grasas, homogeneizado de algas alto en lípidos (HL-AH) para sustituir a los huevos y mantequilla en la receta convencional, y las escamas de algas de lípidos elevados para sustituir a los huevos en la receta convencional. Tanto el homogeneizado de algas como las escamas de algas eran de Chlorella protothecoides (Cepa UTEX 250) con 48% de lípidos en peso celular seco.

Tabla 10. convencional receta de la torta amarilla.

Componente Medidas de recetas Peso (g) Porcentaje % Grasa. Peso húmedo Mantequilla 1 taza 222,20 11,38% 9,11%

Azucar, granulada 2 A taza 476,16 24,40% 0,00%

Huevos, enteros 3 148,26 7,60% 0,57%

Extracto de vainilla 1 A cdta. 6,50 0,33% 0,00%

Suero de leche. 1% MF 2 A tazas 575,00 29,46% 0,29%

Harina, todo uso 3 % tazas 502,96 25,77% 0,00%

Polvo para hornear 2 A cdta. 8,35 0,43% 0,00% Bicarbonato de sodio 2 A cdta. 12,44 0,64% 0,00% Rendimiento: 2 cacerolas 1951,87 100,00% 9,97%

Tabla 11. Receta para el control negativo de baja grasa.

Componente Medidas de recetas Peso (g) Porcentaje % Grasa. Peso húmedo Mantequilla 0,00 0,00 0,00% 0,00%

Azucar, granulada 2 A tazas 475,00 30,36% 0,00%

Huevos, enteros 0,00 0,00 0,00% 0,00%

Extracto de vainilla 1 A cdta. 6,50 0,42% 0,00%

Suero de leche. 1% MF 2 A tazas 575,00 36,75% 0,37%

Harina, todo uso 3 % tazas 487,69 31,17% 0,00%

Polvo para hornear 2 A cdta. 8,52 0,54% 0,00% Bicarbonato de sodio 2 A cdta. 11,90 0,76% 0,00% Rendimiento: 2 cacerolas 1564,61 100,00% 0,37%

Tabla 12. Receta para la biomasa de algas de alto contenido de lípidos micronizada como sustituto para huevo y mantequilla.

Componente Medidas de recetas Peso (g) Porcentaje % Grasa. Peso húmedo Mantequilla 0,00 00,00 0,00 0,00%

Azucar, granulada 2 A tazas 457,00 22,98%

HL-AH micronizado 100,00 5,03% 2,41%

Agua (como de huevo, 308,47 15,51%

mantequilla) adicional

Extracto de vainilla 1 A cdta. 20,00 1,01%

Suero de leche 2 A tazas 575,00 28,92%

Harina, todo uso 3 % tazas 505,00 25,40%

Polvo para hornear 2 A cdta. 9,80 0,49%

Bicarbonato de sodio 2 A cdta. 13,30 0,67%

Rendimiento: 2 cacerolas 1988,57 100,00% 2,41%

Tabla 13. Receta para escamas de algas de alto contenido de lípidos como sustituto de huevo.

Componente Medidas de recetas Peso (g) Porcentaje % Grasa. Peso húmedo Mantequilla 1 Taza 227,00 11,69% 9,35%

Azucar, granulada 2 A tazas 457,00 23,53%

Escamas de algas 22,50 1,16% 0,56%

Agua (como de huevo) 112,50 5,79%

Extracto de vainilla 1 A cdta. 20,00 1,03%

Suero de leche 2 A tazas 575,00 29,61%

Harina, todo uso 3 505,00 26,00%

Polvo para hornear 2 A cdta. 9,80 0,50%

Bicarbonato de sodio 2 A cdta. 13,30 0,68%

Rendimiento: 2 cacerolas 1942,10 100,00% 9,91%

[0284] En cada caso el procedimiento de cocción fue:

1. Precalentar el horno a 177°C (350°F). La grasa y la harina de dos 9x13 en cacerolas.

2. Tamizar la harina, el polvo para hornear y bicarbonato de sodio. Dejar de lado.

3. En un bol de cocina, mezclar crema de mantequilla y el azúcar hasta que esté la mezcla suave. Batir los huevos en 1 a la vez.

4. Agregar el extracto de vainilla.

5. Añadir la mezcla de harina alternando con suero de leche a la masa. Mezclar hasta que se incorporen.

6. Verter la mezcla en los moldes preparados.

7. Hornear las tortas durante 35-40 minutos, o hasta que un palillo salga limpio.

8. Enfriar.

[0285] La torta amarilla hecha con las escamas de algas de alto contenido de lípidos (como un sustitutivo de huevo) era muy densa, con casi ninguna estructura de la miga. Sin embargo, la torta amarilla hecha con escamas de algas de alto contenido de lípidos estaba húmeda en comparación con el control negativo bajo en grasa, que era muy denso y seco. La torta hecha con homogeneizado de algas de alto contenido de lípidos (HL-AH) (en sustitución de toda la mantequilla y los huevos en la torta con toda la grasa) era muy húmeda y mantecosa en la textura y tenía muy buena estructura de la miga que era similar a la torta de receta convencional. En cata, la torta hecha con HL-AH carecía de un sabor a mantequilla que estaba presente en la torta convencional. En general, la HL-AH era un buen sustituto de la mantequilla y los huevos en una receta de la torta amarilla convencional. La torta con la HL-AH contenía aproximadamente 75% menos de grasa que la torta amarilla convencional, sino que se produce una torta con una buena estructura de la miga, la textura y la humedad.

Galletas

[0286] Este ejemplo compara galletas hechas por una receta convencional, escamas de algas de alto contenido en lípidos para sustituir a los huevos y acortamiento en la receta convencional, y homogeneizado de algas de alto contenido de lípidos (HL-AH) para sustituir a los huevos y el acortamiento en la receta convencional. Tanto las escamas de algas como la biomasa de homogeneizado de algas eran Chlorella protothecoides (Cepa UTEX 250) con 48% de lípidos en peso celular seco.

Tabla 14. Receta convencional para galletas.

Componente Medidas de recetas Peso (g) Porcentaje % Grasa. Peso húmedo

Harina, todo uso 2 tazas 277,73 44,59% 0,00%

Polvo para hornear 4 cdta. 20,28 3,26% 0,00%

Azucar, granulado 3 cdta. 12,61 2,02% 0,00%

Sal, Mesa A cdta. 3,40 0,55% 0,00% Acortamiento (Crisco) 'A taza 82,04 13,17% 13,17%

Huevo, Entero 1 53,15 8,53% 0,64%

Leche. 2% 2/3 taza 173,68 27,88% 0,56% Rendimiento: 12 622,89 100,00% 14,37%

Tabla 15. Receta para escamas de algas de alto contenido de lípidos para sustituir huevo y acortamiento.

Componente Medidas de recetas Peso (g) Porcentaje % Grasa. Peso húmedo

Harina, todo uso 2 tazas 275,00 46,08%

Polvo para hornear 4 cdta. 17,20 2,88%

Azucar, granulado 3 cdta. 11,28 1,89%

Sal, Mesa A cdta. 3,30 0,55%

Escamas de algas 50.00 8,38% 4,02%

Agua 56.00 9,38%

Leche. 2% 2/3 taza 184,00 30,83% 0,62% Rendimiento: 12 596,78 100,00% 4,64%

Tabla 16. Receta de galletas utilizando homogeneizado de algas de alto contenido de lípidos (HL-AH).

Componente Medidas de recetas Peso (g) Porcentaje % Grasa. Peso húmedo

Harina, todo uso 2 tazas 137,50 46,08%

Polvo para hornear 4 cdta. 8,60 2,88%

Azucar, granulado 3 cdta. 5,65 1,89%

Sal, Mesa A cdta. 1,65 0,55%

HL-AH 25.00 8,38% 4,02%

Agua 28.00 9,38%

Leche. 2% 2/3 taza 92,00 30,83% 0,62% Rendimiento: 12 298,40 100,00% 4,64%

[0287] En cada caso el procedimiento de cocción fue:

1. Precalentar el horno a 222°C (450°F).

2. En un recipiente auxiliar de cocina, combine la harina, la levadura en polvo, el azúcar y la sal.

3. Añadir el acortamiento en la mezcla hasta que se forme migas gruesas. (Velocidad n° 2).

4. Batir el huevo con la leche. Añadir los ingredientes húmedos a los secos y mezclarlos hasta que se humedezcan los ingredientes secos.

5. Mezclar hasta que forme una masa (velocidad n° 2 durante 15 segundos).

6. Extender a 3/4" de espesor (o la hoja si se desea). Cortar con un cortador de galletas enharinado de 2 1/2".

7. Colocar en una bandeja para horno ligeramente engrasada. Hornear durante 8-10 minutos, o hasta que estén dorados.

8. Sirva caliente.

[0288] La muestra hecha con HL-AH apareció similar al control de la grasa total en la textura y la apariencia. En general, las galletas HL-AH fueron más cercanas a las galletas de recetas convencionales, produciendo una galleta con 65% menos de grasa, pero todavía conservan la textura y el aumento de una galleta de receta convencional.

Aderezo cremoso

[0289] Este ejemplo compara la mayonesa/aderezo utilizando una receta convencional con control de 40% de grasa, una receta baja en grasa con control de la grasa 20%, y una receta con homogeneizado de algas de alto contenido de lípidos (HL-AH) (con ~20% de grasa en peso) a partir de Chlorella protothecoides (Cepa UTEX 250) con 48% de lípidos en peso celular seco.

Tabla 17. Receta para 40% de control de grasa.

Componente Medidas de recetas Peso (g) Porcentaje % Grasa. Peso húmedo

Aceite, canola 200,00 40,00% 40,00%

Yema líquida 15,00 3,00% 3,00%

Vinagre, destilado, 60 granos 200,00 40,00% 0,00%

Sal, Mesa 0,00 0,00% 0,00%

Agua 85,00 17,00% 0,00% Rendimiento: 12 500,00 100,00% 43,00%

Tabla 18. Receta para 20% de control de grasa.

Componente Medidas de recetas Peso (g) Porcentaje % Grasa. Peso húmedo

Aceite, canola 100,00 20,00% 20,00%

Yema líquida 14,78 2,96% 2,96%

Vinagre, destilado, 60 granos 200,00 40,00% 0,00%

Sal, Mesa 0,00 0,00% 0,00%

Agua 185,22 37,04% 0,00% Rendimiento: 12 500,00 100,00% 22,96%

Tabla 19 Receta para aderezo cremoso HL-AH.

Componente Medidas de recetas Peso (g) Porcentaje % Grasa. Peso húmedo

HL-AH 200.00 40.00% 19,0

Agua 180.00 36.00%

Vinagre (5% de ácido) 120.00 24.00%

Sal. Mesa 0.00 0.00%

500,00 100,00% 19,0%

[0290] En cada caso el procedimiento de cocción fue:

1. El uso de un procesador de alimentos, combinar la yema de huevo, ácido, agua y sal.

2. Hacer fluir lentamente en aceite, hasta que se forme una emulsión apretada.

3. Si la emulsión es demasiado apretada, añadir un poco de agua adicional.

4. Raspe los lados y realizar cizallamiento de nuevo durante 10 segundos para incorporar cualesquiera gotitas de aceite.

[0291] El aderezo de control de grasa 20% (hecho con aceite de canola) no tenía ninguna viscosidad y no formaba una emulsión. La superficie era espumosa y gotitas de aceite formaron después de dejar el aderezo en reposo. La preparación hecha con HL-AH tenía un sabor de biomasa de algas, buena opacidad y viscosidad, y una sensación bucal cremosa. En general, la HL-AH imparte una mejor opacidad y viscosidad al aderezo, en comparación con los aderezos de grasa tanto al 20% y al 40%. El HL-AH funcionó como un gran emulsionante y produjo un aderezo que tenía las propiedades de un aderezo de grasa al 40% con la sensación en la boca a la mitad del contenido de grasa. Se obtuvieron resultados similares con el HL-AH micronizado (a un contenido de grasa al 19%) en una receta de la salsa holandesa (control de receta convencional estaba en grasa al 80%). La salsa holandesa producida con la HL-AH fue sabor suave y rica, con una sensación en la boca cremosa y buena viscosidad. El color de la salsa era un poco más oscuro que el color amarillo de control con toda la grasa. En general, la salsa holandesa con e1HL-AH micronizado produjo un producto que era comparable al control con toda la grasa con 75% menos de grasa.

Modelo de bebida de chocolate

[0292] Este ejemplo compara una bebida de chocolate nutricional modelo hecha con una receta convencional, con homogeneizado de algas de alto contenido en lípidos (HL-AH) para sustituir a la leche y el aceite en la receta convencional, y uno con la biomasa de escamas de algas de alto contenido en lípidos para sustituir a la leche y el aceite en la receta convencional. Tanto la biomasa de escamas de algas como la HL-HA fueron de Chlorella protothecoides (cepa UTEX 250) con 48% de lípidos en peso celular seco.

Tabla 20. Receta para el control de bebida de chocolate convencional.

Componente Peso (g) 1000,00g Porcentaje % Grasa

Agua 278,60 g 835,81 g 83,581%

Lecha seca no grasa 17,88 g 53,64 g 5,364%

Polvo de cacao alcalizado 11,38 g 34,14 g 3,414% 0,376%

Aislado de proteína de soja 8,12 g 24,36 g 2,436%

Maltodextrina 5,00 g 15,00 g 1,500%

Sabor, Choc 1,62 g 4,86 g 0,486%

Lecitina 1,14 g 1 g 0,1%

Mezcla de goma 0,81 g 2,43 g 0,243%

Fosfato de disodio 0,32 g 0,96 g 0,096%

Sucralosa 0,13 g 0,39 g 0,039%

Aceite de canola 8,33 g 24,99 g 2,499% 2,499%

333,3g 1000,00g 100,000% 2,875%

Tabla 21. Receta para la bebida de chocolate utilizando HL-AH para reemplazar leche y aceite.

Componente Peso (g) 1000,00g Porcentaje % Grasa

Agua 278,60 g 857,23 g 85,723%

HL-AH 17,88 g 55,02g 5,502% 2,641%

Polvo de cacao alcalizado 11,38 g 35,02 g 3,502% 0,385%

Aislado de proteína de soja 8,12 g 24,98 g 2,498%

Maltodextrina 5,00 g 15,38 g 1,538%

Sabor, Choc 1,62 g 4,98 g 0,498%

Mezcla de goma 0,81 g 2,49 g 0,249%

Fosfato de disodio 0,32 g 0,98 g 0,098%

Sucralosa 0,13 g 0,40 g 0,040%

325,00g 1000,00g 100,000% 3,026%

Tabla 22. Receta para la bebida de chocolate utilizando biomasa de escamas de algas para reemplazar leche y aceite.

Componente Peso (g) 1000,00g Porcentaje % Grasa

Agua 278,60 g 857,23 g 85,723%

Escamas de algas (48% lípidos) 17,88 g 55,02g 5,502% 2,641%

Polvo de cacao alcalizado 11,38 g 35,02 g 3,502% 0,385%

Aislado de proteína de soja 8,12 g 24,98 g 2,498%

Maltodextrina 5,00 g 15,38 g 1,538%

Sabor, Choc 1,62 g 4,98 g 0,498%

Mezcla de goma 0,81 g 2,49 g 0,249%

Fosfato de disodio 0,32 g 0,98 g 0,098%

Sucralosa 0,13 g 0,40 g 0,040%

325,00g 1000,00g 100,000% 3,026%

[0293] En cada caso, el procedimiento de cocción fue:

1) Mezclar ingredientes secos.

2) Añadir húmedos (excepto sabor) a la olla.

3) Añadir y batir los ingredientes secos.

4) Cizallamiento con mezcladora de barra durante 1 minuto.

5) Calentar en la parte superior estufa a 93°C (200°F).

6) Homogeneizar 172/34 bar (2500/500 psi).

7) Enfriar a <4°C (40°F) y refrigerar.

[0294] La bebida de chocolate que contiene el HL-AH tenía un aspecto más grueso, más rica que la bebida de chocolate que contiene las escamas de algas, y estaba más cerca en apariencia a la bebida de chocolate convencional.

En general, la muestra HL-AH micronizado se parecía más a la de control de bebida de chocolate convencional, impartir una buena viscosidad y con un poco más opacidad que el control de bebida de chocolate convencional.

EJEMPLO 12

Producción de algas en polvo (alto contenido de lípidos)

[0295] Chlorella protothecoides que contiene alto contenido de lípidos cultivado utilizando los métodos de fermentación y las condiciones descritas en el Ejemplo 4 se procesó en un polvo de algas de alto contenido de lípidos. Para procesar la biomasa de microalgas en polvo de algas, biomasa de Chlorella protothecoides cosechada se separó del medio de cultivo y después se concentró usando centrifugación y se secó usando un secador de pulverización de acuerdo con métodos estándar. El polvo de algas resultante (células de algas enteras que se han secado en forma de polvo de pulverización) se empaquetó y se almacenó hasta su uso.

EJEMPLO 13

Producción de harina de algas (alto contenido de lípidos)

[0296] Chlorella protothecoides que contiene alto contenido de lípidos cultivado utilizando los métodos de fermentación y las condiciones descritas en el Ejemplo 4 se procesó en una harina de algas de alto contenido de lípidos. Para procesar la biomasa de microalgas en harina de algas, la biomasa de Chlorella protothecoides cosechada se separó del medio de cultivo utilizando la centrifugación. La biomasa concentrada resultante, que contiene más de 40% de humedad, fue micronizada usando un homogeneizador de alta presión ((GEA modelo NS1001) que opera a un nivel de presión de 1000 a 1200 bar hasta que el tamaño medio de partícula de la biomasa fue de menos de 10|im. El homogeneizado de algas se secó entonces por aspersión utilizando métodos estándar. La harina de algas resultante (célula de alga micronizada que se han secado en forma de polvo de pulverización) se empaquetó y se almacenó hasta su uso.

[0297] Una muestra de harina de elevada de lípidos se analizó para el tamaño de partícula. Una harina de algas en dispersión acuosa fue creada y el tamaño de partícula de harina de algas se determinó usando difracción láser en una máquina Malvern Mastersizer 2000 usando un accesorio Hydro 2000S. Una dispersión de control fue creada por mezcla suave y otras dispersiones fueron creadas usando 100 bar, 300 bar, 600 bar y 1000 bar de presión. Los resultados mostraron que el tamaño medio de partícula de la harina de algas es más pequeño en la condición con presión más alta (3,039|im en la condición de mezcla suave y 2,484|im en la condición 1,000 bar). La distribución de los tamaños de partícula se movió en las condiciones de presión más alta, con una disminución en partículas de mayor tamaño (por encima de 10|im) y un aumento en partículas más pequeñas (menos de 1 |im). Gráficos de distribución de la condición de mezclado suave (Figura 5A), la condición 300 bar (Figura 5B), y la condición 1000 bar (Figura 5C) se muestran en la Figura 5. La Figura 4 muestra una imagen de la harina de algas en dispersión acuosa con microscopía de luz inmediatamente después de la homogeneización. Las flechas apuntan a las partículas de harina de algas individuales (menos de 10|im) y las cabezas de flecha apuntan a partículas de harina de algas aglomeradas o agrupadas (más de 10|im).

EJEMPLO 14

Harina de algas (alto aceite) que contiene productos alimenticios

[0298] Los siguientes ejemplos describen el uso de harina de algas de alto contenido de lípidos (por lo menos 20% en peso, típicamente 25-60% de lípidos en peso) como un reemplazo de grasa en las recetas convencionales. Ejemplos adicionales también demuestran funcionalidad única de la harina de algas en un aumento de la retención de humedad y una textura mejorada cuando se utiliza en alimentos preparados tales como huevos revueltos en polvo. La harina de algas de alto contenido de lípidos utiliza los ejemplos siguientes preparados utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 13.

Brownies de chocolate

[0299] En un esfuerzo por evaluar diferencias funcionales y de perfil de degustación utilizando la harina de algas de alto contenido de lípidos, brownies de chocolate hechos con una receta convencional se comparó con los brownies hechos con harina de algas y un bizcocho de chocolate bajo en grasa convencional. Harina de algas de alto contenido de lípidos (aproximadamente 53% de lípidos por peso seco) se utilizó en lugar de mantequilla y huevos.

Tabla 23. Receta de brownie convencional.

Componente Peso (g) 650,00g Porcentaje % Grasa

Mantequilla, no salada 170,00 135,75 20,88 16,71

Polvo de cacao 50,00 39,93 6,14 0,61

Huevos enteros 200,00 159,71 24,57 1,84

Azucar, granulado 250,00 199,63 30,71 0,00

Harina, todo uso 130,00 103,81 15,97 0,00

Polvo para hornear 4,00 3,19 0,49 0,00

Sal 3,00 2,40 0,37 0,00

Extracto de vainilla 7,00 5,59 0,86 0,00

814,00g 650,00g 100,00% 19,16%

Tabla 24. Receta de brownie de grasa reducida.

Componente Peso (g) 650,00g Porcentaje % Grasa

Mantequilla, no salada 60,00 57,44 8,84 7,07

Polvo de cacao 50,00 47,86 7,36 0,74

Huevos enteros 100,00 95,73 14,73 1,10

Azucar, granulado 225,00 215,39 33,14 0,00

Agua 50,00 47,86 7,36 0,00

Jarabe de maíz 50,00 47,86 7,36 0,00

Harina, todo uso 130,00 124,45 19,15 0,00

Polvo para hornear 4,00 3,83 0,59 0,00

Sal 3,00 2,87 0,44 0,00

Extracto de vainilla 7,00 6,70 1,03 0,00

679,00g 650,00g 100,00% 8,91%

Tabla 25. Receta de brownie de harina de algas.

Componente Peso (g) 650,00g Porcentaje % Grasa

Harina de algas 195,00 206,72 34,45 7,30

Polvo de cacao 48,00 50,88 8,48 0,85

Agua 41,00 43,46 7,24 0,00

Azucar, granulado 140,92 149,39 24,90 0,00

Harina, todo uso 130,40 138,24 23,04 0,00

Polvo para hornear 4,00 4,24 0,71 0,00

Sal 1,67 1,77 0,30 0,00

Extracto de vainilla 5,00 5,30 0,88 0,00

565,99 600,00 100,00% 8,15%

[0300] En cada caso, el procedimiento de cocción fue:

1. Precalentar el horno a 177°C (350°F). Añadir grasa y harina a una olla 8"x 8".

3. Batir los huevos junto con la vainilla hasta que estén ligeramente espumosos. Añadir poco a poco el azúcar y el resto de los ingredientes húmedos.

4. Añadir la mezcla de mantequilla/cacao a la mezcla de huevo. Combinar el resto de los ingredientes secos y añadirlos lentamente a la mezcla húmeda hasta el mezclado.

5. Extender la mezcla en el molde y hornear durante 20-25 minutos, o hasta que cuaje.

[0301] Para los brownies con harina de algas, los ingredientes secos se combinaron y después se añadió la harina de algas a los ingredientes secos. A continuación, los ingredientes húmedos (agua y vainilla) se mezclaron lentamente en los ingredientes secos. Distribuir la masa en el molde y hornear durante 27-28 minutos.

[0302] La receta de grasa reducida convencional produjo un brownie que tenía una textura seca y era más parecido a un pastel de una textura de brownie. Los brownies hechos con harina de algas (que tenía el porcentaje de grasa similar al de los brownies de la receta de grasa reducida, aproximadamente el 8% de grasa) eran muy húmedos y tenían una textura brownie, pero tenían una estructura de la miga más frágil en comparación con la receta brownie convencional (aproximadamente 19% grasa). Cuando se comparan con los brownies hechos con escamas de algas que se describieron en el Ejemplo 11, los brownies hechos con harina de algas no eran tan densos, tenían una estructura de la miga más blanda. En general, la harina de algas era un sustituto eficaz para la mantequilla y los huevos en una buena receta al horno, y produjo un producto similar en textura, sabor y apariencia al producto de receta convencional. La harina de algas exhíbe funcionalidad única (p.ej., estructura de la miga más fina, no es tan pegajosa, y la textura de luz) que no se ve con el uso de escamas de algas.

Pastel de chocolate de tamaño individual sin gluten

[0303] Un pastel de chocolate sin harina libre de gluten se preparó usando harina de algas (harina de algas 8% en agua para hacer una suspensión) en lugar de yemas de huevo y mantequilla. Se utilizaron los siguientes ingredientes, con la cantidad en paréntesis: azúcar granulado (130 gramos); chocolate semi dulce (150 gramos); agua (20 gramos); 8% masa de harina de algas (100 gramos); sal (2,45 gramos); polvo de hornear (4,5 gramos); extracto de vainilla (4 gramos); y claras de huevo (91,5 gramos). El chocolate se combinó con el agua y se fundió lentamente sobre agua apenas cocida a fuego lento. Después, la suspensión de algas se dejó en la mezcla de chocolate a temperatura ambiente. Después se añadió el azúcar (reserva de 5 gramos de azúcar para las claras de huevo) y vainilla a la mezcla de chocolate y luego se añadieron el polvo de hornear y la sal (reserva de 0,15 gramos de sal para las claras de huevo). Las claras de huevo fueron batidas a velocidad media hasta que estén espumosas y luego se añadió la sal reservada. Las claras de huevo fueron batidas hasta que se formaron picos blandos y luego se añadió el azúcar reservado. Las claras de huevo fueron batidas hasta que se formaron picos rígidos. Las claras de huevo fueron entonces plegadas en la mezcla de chocolate hasta estar completamente mezcladas. La pasta se vertió luego en moldes de tamaño individuales y se horneó a 191°C (375°F) durante 14-15 minutos (girada en 8 minutos). Este pastel de chocolate sin harina libre de gluten tenía la textura y la apariencia de un pastel de chocolate sin harina convencional hecha con mantequilla y yemas de huevo. La harina de algas era un reemplazo exitoso para la mantequilla y las yemas de huevo en esta formulación para un pastel de chocolate sin harina libre de gluten.

Mayonesa

[0304] Con el fin de evaluar las capacidades emulsionantes de harina de algas, mayonesa hace con harina de algas que se ha reconstituido en agua (40% en p/v) y se homogeneizó a baja presión (100-200 bar) para producir una suspensión se comparó con mayonesa hecha con una receta convencional y una mayonesa de grasa reducida. La suspensión de harina de algas se hizo con harina de algas de alto contenido de lípido que tiene aproximadamente 53% de lípidos en peso seco y reemplazó por completo el aceite y las yemas de huevo en las recetas convencionales.

Tabla 26. Receta de mayonesa convencional.

Componente Peso (g) 1000,00g Porcentaje % Grasa

Aceite, soja 344,00 573,33 57,33 57,33

Yema líquida 60,00 100,00 10,00 2,65

Vinagre, destilado 47,50 79,17 7,92 0,00

Azucar, granulado 12,00 20,00 2,00 0,00

Sal 11,00 18,33 1,83 0,00

Concentrado de jugo de limón 1,25 2,08 0,21 0,00

Goma de xantano 1,20 2,00 0,20 0,00

Polvo de ajo 0,50 0,83 0,08 0,00

Polvo de cebolla 0,75 1,25 0,13 0,00

Agua 121,80 203,00 20,30 0,00

600,00 1000,00 100,00% 59,98%

Tabla 27. Receta de mayonesa convencional de grasa reducida.

Componente Peso (g) 1000,00g Porcentaje % Grasa

Aceite, soja 152,00 253,33 25,33 25,33

Yema líquida 15,00 25,00 2,50 0,66

Vinagre, destilado 47,50 79,07 7,91 0,00

111

Almidón de comida instantánea 15,00 24,97 2,50 0,00

Azucar, granulado 15,50 25,80 2,58 0,00

Sal 11,00 18,31 1,83 0,00

Concentrado de jugo de limón 1,25 2,08 0,21 0,00

Ácido fosfórico 5,70 9,49 0,95 0,00

Goma de xantano 1,80 3,00 0,30 0,00

Polvo de ajo 0,50 0,83 0,08 0,00

Polvo de cebolla 0,75 1,25 0,13 0,00

Agua 333,00 555,00 55,50 0,00

600,00 1000,00 100,00% 26,00%

Tabla 28. Receta de mayonesa hecha con suspensión de harina de algas.

Componente Peso (g) 1000,00g Porcentaje % Grasa

Harina de algas, suspensión 344.00 499.38 49.94 26.47

Yema líquida 0.00 0.00 0.00 0.00

Vinagre, destilado 47.50 79.07 7.91 0.00

Almidón de comida instantánea 15.00 24.97 2.50 0.00

Azucar, granulado 15.50 25.80 2.58 0.00

Sal 11.00 18.31 1.83 0.00

Concentrado de jugo de limón 1.25 2.08 0.21 0.00

Ácido fosfórico 5.70 9.49 0.95 0.00

Goma de xantano 1.80 3.00 0.30 0.00

Polvo de ajo 1.50 2.50 0.25 0.00

Polvo de cebolla 1.50 2.50 0.25 0.00

Agua 200.00 332.92 33.29 0.00

600,75 1000,00 100,00% 26,47%

[0305] En cada caso, el procedimiento fue:

1. Mediante el uso de un procesador de alimentos, combine los ácidos, el agua y los ingredientes secos.

2. Añadir las yemas de huevo y lentamente hacer fluir en aceite o suspensión de harina de algas. Una emulsión apretada debe formar. Si la emulsión es demasiado apretada, añadir agua adicional hasta que la emulsión alcanza la consistencia deseada.

3. Raspar los lados y realizar cizallamiento de nuevo durante 10 segundos para incorporar cualquier gota de aceite/suspensión.

[0306] La mayonesa hecha con la suspensión de harina de algas tenía la viscosidad de entre la mayonesa convencional y de grasa reducida. La sensación en la boca de la mayonesa de suspensión de harina de algas era comparable a la de la mayonesa convencional (pero contiene menos de 50% de la grasa total). Se necesitaba almidón alimenticio instantáneo tanto en la mayonesa de grasa reducida y la mayonesa de suspensión de harina de algas a fin de unir más agua y hacer el producto más "para untar". En general, el uso de la suspensión de harina de algas para reemplazar todas las fuentes de grasa (p.ej., aceite y yemas de huevo) en una receta de mayonesa convencional produjo una mayonesa con buena viscosidad y una sensación en la boca que era indistinguible de la mayonesa convencional. La suspensión de harina de algas funcionaba como un emulsionante eficaz, reemplazando con éxito la funcionalidad de las yemas de huevo de aceite encontradas en la mayonesa convencional.

[0307] En una aplicación adicional, la suspensión de harina de algas de alto contenido de lípidos se utiliza para hacer una salsa/aderezo de mostaza de miel de grasa reducida. Miel, mostaza, vinagre blanco, sabor de zumo de limón y la sal de mar se añadió a la mayonesa preparada (modificada ligeramente para conseguir la consistencia apropiada de una salsa/aderezo) descrita anteriormente. Todos los ingredientes se combinan y se mezclan en un procesador de alimentos hasta que sea homogéneos y suaves. El producto final contenía aproximadamente 14% de harina de algas en peso, y tenía aproximadamente 8% de grasa total. La salsa/aderezo de mostaza de miel que contiene harina de algas tenía una sensación bucal cremosa comparable a una salsa de mostaza de miel convencional (con toda la grasa).

Aderezo para ensaladas de miso

[0308] Con el fin de evaluar la harina de algas en una aplicación de aderezo de ensalada cremoso, aderezo de ensalada de miso se preparó usando una receta convencional y una receta que contenía harina de algas alta en lípidos reconstituida como una suspensión (40% de sólidos), producida usando los métodos como se describe en la formulación precedente de mayonesa.

Tabla 29. Receta para el aderezo de ensalada de miso convencional.

Componente Peso(g) Porcentaje (en peso)

Fase de aceite:

Aceite de canola 294,00 98,00

Aceite de sésamo 6,00 2,00

300,0 100%

Fase acuosa:

Vinagre, vino de arroz 143,50 20,50

Pasta de miso, roja 166,25 23,70

Azucar, granulado 78,75 11,250

Polvo de ajo 3,5 0,50

Harina de mostaza 5,25 0,75

Polvo de jengibre 5,25 0,75

Goma de xantano 1,50 0,214

Sorbato de potasio 0,88 0,125

Disodio de calcio EDTA 0,18 0,025

Agua 294,95 42,136

700,00 100,00%

Tabla 30. Receta para el aderezo de ensalada de miso con suspensión de harina de algas.

Componente Peso(g) Porcentaje (en peso)

Fase de aceite:

Aceite de canola 94,00 94,00

Aceite de sésamo 6,00 6,00

100% 100%

Fase acuosa:

Harina de algas, suspensión 125,00 13,889

Vinagre, vino de arroz 80,00 8,889

Vinagre, destilado 60,00 6,667

Pasta de miso, roja 225,00 25,00

Azucar, granulado 85,00 9,444

Polvo de ajo 3,5 0,389

Harina de mostaza 5,25 0,583

Polvo de jengibre 5,25 0,583

Goma de xantano 2,70 0,300

Sorbato de potasio 0,88 0,097

Disodio de calcio EDTA 0,18 0,019

Dióxido de titanio 4,20 0,467

Agua 300,00 33,344

900,00 100,00%

[0309] En cada caso, los ingredientes secos se mezclaron juntos a un lado. El agua, vinagre y ácido se mezclaron juntos y se apartaron. La pasta de miso se midió por separado. Para la receta convencional, los aceites se combinaron entre sí y se dejaban de lado. Para la receta de algas que contiene harina, la suspensión de harina de algas, aceite, y dióxido de titanio se pesó por separado y se combinó. Después, la mezcla de agua/vinagre se mezcló con un mezclador de cizallamiento alto. Después de mezclar, se añadieron los ingredientes secos en la mezcla de agua/vinagre. La mezcla de aceites se transmite lentamente mientras que el agua/vinagre y los ingredientes secos se mezclaban con un mezclador de cizallamiento alto. Se calentó el aderezo luego a 88°C (190°F) durante 2 minutos y luego el aderezo se ejecuta a través de un molino coloidal en el ajuste más apretado.

[0310] Tanto las recetas convencionales como las que contienen la harina de algas produjo un aderezo de ensalada cremoso grueso y opaco. Visualmente, los dos aderezos fueron comparables en color y textura. El aderezo de ensalada de miso hecho con la receta convencional contenía aproximadamente 30% de grasa, mientras que el aderezo de ensalada de miso hecho con la suspensión de harina de algas contenía aproximadamente 12,65% de grasa. En general, el aderezo de miso hecho con la suspensión de harina de algas contenía menos de la mitad de la grasa del aderezo de miso hecho con la receta convencional, preservando al mismo tiempo la sensación en la boca cremosa y la opacidad.

Masa de pizza/grisines

[0311] La capacidad de la harina de algas para funcionar en una aplicación de masa de levadura se ensayó usando una receta de masa de pizza/grisines convencional y una receta de masa de pizza/grisines que contiene 5% o 10% en peso de harina de algas. La masa de pizza/grisines que contienen harina de algas se hizo con suspensión de harina de algas de alto contenido de lípidos (40% de sólidos), producida usando los métodos como se describe en la formulación precedente de mayonesa.

[0312] En cada caso, 7,3 gramos de levadura se combinó con 9,3 gramos de harina para todo uso y se mezclaron con 58 gramos de agua caliente. La mezcla de levadura se dejó asentar a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos. En las muestras que contienen suspensión de harina de algas, la suspensión se mezcló con 167 gramos de agua y se combinó con 217 gramos de harina para todo uso y 4,9 gramos de sal en un mezclador. En la receta convencional, el agua se combinó con la harina y la sal en el mezclador. Después de ser combinado, se añadió la mezcla de levadura a la masa y se añadió 90 gramos adicionales de harina para todo uso. A continuación, la masa se amasó a mano, añadiendo harina adicional, según sea necesario si la masa era demasiado húmeda. La masa se cubrió y se dejó reposar durante 1 hora en un lugar cálido. Después de permitir que se eleve, la masa se repartió y, o bien se extendió como masa de pizza o se formó en grisines. A continuación, la masa se coció en un horno de 232°C (450°F) durante 8-12 minutos o hasta que estuviera hecha.

[0313] La receta de masa de pizza convencional y grisines era dura con una corteza tradicional. La masa de pizza que contiene 5% de suspensión de harina de algas tenía una textura de tipo galleta y era más crujiete que la masa de pizza de la receta convencional. La masa de pizza que contiene suspensión de harina de algas al 10% era más crujiente que la masa de pizza que contiene suspensión de harina de algas al 5%. En los grisines hechos con masa de harina de algas, los grisines de algas al 5% tenían un centro húmedo y masticable cuando se comparan con los grisines de recetas convencionales. Los grisines que contienen suspensión de harina de algas al 10% fueron aún más húmedos que los grisines de algas al 5%. El tiempo de cocción se incrementó con los dos grisines que contienen harina de algas. Una vez más, solo había un sabor de algas mínimo en los grisines que contenían suspensión de harina de algas, lo cual no interfería con el sabor general. En general, la suspensión de harina de algas aumenta el carácter crujiente de la masa de pizza y se la dio una textura más como una galleta, y el aumento de la humedad de los grisines en comparación con los grisines de recetas convencionales. En otra aplicación, la masa de harina de algas de alto contenido de lípidos (40% de sólidos) se utilizó en una receta de tortilla de maíz y se comparó con tortillas de maíz hechas de una receta convencional. Similarmente a los resultados de masa de pizza, las tortillas de maíz que contienen suspensión de harina de algas eran de una textura más similar a una galleta y más crujiente que las tortillas de recetas convencionales.

Brioche

[0314] Un brioche con harina de algas en lugar de las yemas de huevo y la mantequilla se preparó usando los siguientes ingredientes con las cantidades entre paréntesis: agua caliente, aprox. 110°F (54,77 gramos); levadura de rápido aumento (3,5 gramos); leche entera escaldada (58,47 gramos); harina de algas (45,5 gramos); azúcar granulado (10 gramos); harina (237 gramos); harina de gluten vital (15 gramos); sal (3,5 gramos); y claras de huevo (42 gramos). La levadura se roció sobre el agua tibia y se dejó reposar durante 5 minutos. La leche escaldada se añadió a la solución de levadura cuando la temperatura de la leche alcanzó 110-115°F y se mezcla para combinar. Se añadió el azúcar y se mezcló para disolver. Después se añadió la harina de algas y se mezcló hasta que se mezclaron a fondo. Los ingredientes secos restantes se combinaron y se añadió la mezcla de levadura/leche a los ingredientes secos restantes. Las claras de huevo se añadieron entonces inmediatamente a la mezcla y se mezclaron usando un procesador de alimentos (10 veces, pulsando la masa 1-2 cada vez). A continuación, la masa se pulsó cinco veces más durante 3-5 segundos, añadiendo más agua si es necesario. La masa acabada era suave y ligeramente pegajosa. La masa se cubre con un paño y se deja reposar en un lugar cálido durante una hora y se había duplicado en tamaño cerca de 2-3 veces su tamaño original. A continuación, la masa se pulsó de nuevo con el procesador de alimentos 2 3 veces durante 1-2 segundos, para desinflar y se dejó reposar hasta que se había duplicado en tamaño de nuevo. A continuación, la masa se volvió a cabo sobre una superficie y se aplana para eliminar el aire. A continuación, la masa se extendió en un rectángulo y se enrolló y los bordes se sellaron. A continuación, la masa se colocó en un molde y se dejó subir de nuevo hasta que fue el doble de tamaño y luego se colocó en un horno pre-calentado a 204°C (400°F) y se horneó durante aproximadamente 35 minutos. El brioche tenía la apariencia y la textura de un brioche convencional y representó una formulación exitosa de una receta brioche con harina de algas y sin mantequilla o yemas de huevo.

Pan sin gluten

[0315] La capacidad de la harina de algas para funcionar en una condición de masa de levadura libre de gluten se ensayó mediante la preparación de un pan sin gluten que contiene harina de algas. Estando libre de gluten y no un trigo, harina de algas es adecuada para su incorporación en la dieta de las personas con gluten y/o alergias al trigo/intolerancia. Los siguientes ingredientes con las cantidades en paréntesis: mezcla de harina libre de gluten de todo uso (3 tazas) que consiste en: 2 tazas de harina de sorgo, 2 tazas de harina de arroz de arroz marrón, 1,5 tazas almidón de patata, 0,5 taza de harina de arroz blanco, 0,5 taza de harina de arroz dulce, 0,5 taza de harina de tapioca, 0,5 taza de harina de amaranto y 0,5 taza de harina de quinoa; (1/3 taza) de leche en polvo; goma guar (2 cucharaditas); goma de xantano (1 % cucharaditas); gelatina sin sabor o polvo de agar (1 A cucharaditas); azúcar (3 cucharaditas); sal (1 cucharadita); sustituto de huevo (1 A cucharaditas); la levadura de Baker (1 paquete o 2 A cucharilla); huevos enteros (2); mantequilla (5 cucharadas, cortada en trozos pequeños); agua o soda (1 A tazas); miel (1 cucharada); y el vinagre de sidra de manzana (1 cucharadita). Un molde de pan era ligeramente engrasado y espolvoreado con harina de arroz dulce. Los ingredientes secos se deseaban en un recipiente de mezcla hasta que se mezcle a fondo. Los huevos, la mantequilla, el vinagre y la miel se mezclaron en un recipiente grande y luego se añadió 1 taza de agua o agua mineral con gas a la mezcla de huevo. Los ingredientes secos mezclados se combinaron lentamente con la mezcla de huevo. Se añadió lentamente el agua restante y después se añadió el resto de los ingredientes secos y se mezclaron hasta que la masa era de la consistencia de una masa de pastel de espesor. Esta pasta se mezcló a continuación a alta velocidad durante aproximadamente 5 minutos. Entonces el bateador se virtió en el molde de pan y se cubrió y se dejó crecer en un lugar cálido durante 1 hora. A continuación, la masa se coció durante 55-60 minutos en un horno precalentado a 191°C (375°F), subiendo el papel de aluminio después de 15 minutos para evitar el exceso de oscurecimiento de la corteza. A continuación, el pan fue retirado inmediatamente del horno y se enfrió completamente sobre una rejilla antes de cortar. El pan sin gluten tenía el aspecto y la textura de una barra de pan convencional. Esto demuestra el uso exitoso de la harina de algas en una aplicación de masa de levadura libre de gluten.

Galleta de pepitas de chocolate horneada

[0316] La capacidad de la harina de algas para funcionar en una aplicación de la galleta se ensayó usando una receta convencional de galleta de pepitas de chocolate horneada, una receta de galleta de pepitas de chocolate horneada de grasa reducida hecha con suspensión de harina de algas de alto contenido de lípidos (producida utilizando los mismos métodos como se describe en la formulación de mayonesa anterior). La suspensión de harina de algas también sustituye la totalidad de la mantequilla y los huevos, tanto en las recetas de galletas convencionales como de grasa reducida.

Tabla 31. Receta convencional para galleta de pepitas de chocolate horneada

Componente Peso (g) Porcentaje % Grasa Harina, todo uso 2 tazas 284,00 24,88 0,00 Bicarbonato A cdta. 2,50 0,22 0,00 Polvo para hornear % cdta. 1,23 0,11 0,00

Sal A cdta. 3,35 0,29 0,00 Azucar marrón ligero 1 taza 239,00 20,94 0,00 Mantequilla no salada, blanda 1 A barritas 170,25 14,92 11,93 Jarabe de maíz % taza 82,00 7,18 0,00 Huevo, entero 2 100,00 8,76 0,66 Extracto de vainilla 1 cdta. 4,00 0,35 0,00 Pepitas de chocolate semi-dulces 1 A tazas 255,00 22,34 6,37

1141,33 100,00% 18,96%

Tabla 32. Receta convencional para galleta de pepitas de chocolate horneada

Componente Peso (g) Porcentaje % Grasa Harina, todo uso 2 A tazas 355,00 33,58 0,00 Bicarbonato A cdta. 2,50 0,24 0,00 Polvo para hornear % cdta. 1,23 0,12 0,00

Sal A cdta. 3,35 0,32 0,00 Azucar marrón ligero 1 taza 239,00 22,61 0,00 Mantequilla no salada, blanda A barritas 40,00 3,78 3,03 Jarabe de maíz % taza 82,00 7,76 0,00 Huevo, entero 1 50,00 4,73 0,35 Huevo, blanco 1 25,00 2,37 0,00 Extracto de vainilla 1 cdta. 4,00 0,38 0,00 Pepitas de chocolate semi-dulces 1 A tazas 255,00 24,12 6,88

1057,08 100,00% 10,26% Tabla 33. Receta para galletas de pepitas de chocolate horneadas con suspensión de harina de algas.

Componente Peso (g) Porcentaje % Grasa Harina, todo uso 2 A tazas 355,00 31,08 0,00 Bicarbonato 'A cdta. 2,50 0,22 0,00 Polvo para hornear % cdta. 1,23 0,11 0,00

Sal A cdta. 3,35 0,29 0,00 Azucar marrón ligero 1 taza 239,00 20,93 0,00 Suspensión de harina de algas 200,00 17,51 3,71 Jarabe de maíz % taza 82,00 7,18 0,00 Extracto de vainilla 1 cdta. 4,00 0,35 0,00 Pepitas de chocolate semi-dulces 1 A tazas 255,00 22,33 6,36

1142,08 100,00% 10,08%

[0317] En cada caso, el procedimiento fue:

1. Precalentar el horno a 177°C (350°F). En un bol, mezclar la harina, el bicarbonato de sodio, el polvo de hornear y la sal. Dejar de lado.

2. Crema de mantequilla/suspensión de harina de algas con el azúcar y el jarabe de maíz hasta que esté suave. Batir el huevo (si lo hay) y la vainilla.

3. Añadir poco a poco los ingredientes secos y mezclar hasta que apenas forma una masa. Doblar las pepitas de chocolate.

4. Tomar cucharadas de masa; caer en bandeja de horno o enrollar en bolas y colocar en bandeja de horno.

5. Hornear durante 16-18 minutos o hasta ser marrón dorado, gire bandeja de horno a mitad de camino de la cocción.

[0318] La galleta de receta convencional tuvo buena difusión durante el horneado y era suave y esponjosa al salir del horno. En la galleta de grasa reducida, la masa no se extendió en el primer lote, así que en lotes posteriores, la masa se aplana antes de la cocción. La galleta de grasa reducida era suave fuera del horno, y se afirmó en una galleta densa al enfriar. La galleta de grasa reducida también se tenía sabor de jarabe de maíz pronunciado. La galleta de harina de algas tenía similar extensión durante la cocción como la galleta receta convencional y la textura era mejor que la galleta de grasa reducida. Después de tres días a temperatura ambiente, la galleta de harina de algas era más húmeda que la galleta de la receta convencional y la galleta de grasa reducida. En general, la suspensión de biomasa de algas era eficaz como un sustituto de la mantequilla y los huevos en una aplicación de galleta. Funcionalmente, la suspensión de la biomasa de algas extiende la vida útil de la galleta, en que la galleta retiene más humedad después de tres días en la temperatura ambiente.

Estudio de vida útil de galletas libres de gluten de avena y pasas

[0319] Con los resultados de conservación prolongada, de los experimentos de galleta de pepitas de chocolate anteriores, una galleta de avena y pasas libre de gluten se hizo utilizando harina de algas alta en lípidos (aproximadamente 53% de lípidos en peso seco), producida usando los métodos descritos en el Ejemplo 13. Las galletas se hornearon y después se mantuvieron a temperatura ambiente durante siete días. Se realizaron pruebas sensoriales iniciales y actividad de agua en las galletas inmediatamente después de la cocción y enfriamiento. Se realizaron pruebas sensoriales adicionales y ensayos de actividad de agua en el día 1,3 y 7. En cada día de la prueba, una galleta se cortó en pedazos pequeños y las pasas y la avena se distribuyeron uniformemente en la muestra. Al menos dos muestras por galleta se ensayaron en el ensayo de actividad de agua para asegurar la exactitud de la medición. Las pruebas de actividad de agua (Aw) se realizaron de acuerdo con los protocolos del fabricante utilizando un instrumentos de Aqua Lab, Model Series 3 TE (Decagon Devices, Inc.). En resumen, la actividad de agua mide la presión de vapor de agua que cuantifica el agua disponible, no unida químicamente en un producto; cuanto mayor sea el valor Aw, más húmedo será el producto. En esta aplicación de galleta, el valor de Aw mayor se correlaciona con una mayor vida útil. Un nivel de Aw de 0,65 era el objetivo deseado.

Tabla 34. Receta para galletas de pasas y avena libres de gluten hechas con suspensión de harina de algas

Componente Peso (g) 1000,00g Porcentaje Harina libre de gluten 225,00 174,69 17,47

Harina de arroz marrón 25,00 19,41 1,94

Bicarbonato 4,00 3,11 0,31

Polvo para hornear 2,00 1,55 0,16

Sal 3,50 2,72 0,27

Canela molida 1,30 1,01 0,10

Nuez moscada molida 1,20 0,93 0,09

Goma de xantano 2,50 1,94 0,19

Agua, filtrada 215,00 166,93 16,69

Harina de algas 110,00 85,40 8,54

Azucar marrón ligero 270,00 209,63 20,96

Azucar granulado 45,00 34,94 3,49

Extracto de vainilla 8,50 6,60 0,66

Pasas 125,00 97,05 9,70

Copos de avena 250,00 194,10 19,41

600,75 1000,00 100,00%

600,75 1000,00% 100,00%

[0320] El procedimiento fue:

1. Precalentar el horno a 191° (375°F).

2. Mezclar los ingredientes secos con la excepción de avena y harina de algas. Avena de hidratos en % de agua. Hidratar la harina de algas en % de agua y mezclar bien usando un mezclador de mano. Permitir que la avena y harina de algas se hidraten durante 10 minutos.

3. Añadir la harina de algas hidratada a los ingredientes secos y mezclar bien. Agregar la vainilla y mezclar bien hasta que se mezcle y esté suave.

4. Añadir la avena y las pasas y mezclar hasta que esté la mezcla homogénea.

5. Repartir las galletas en una bandeja de horno y presionar ligeramente cada una.

6. Cocinar las galletas en el horno durante 20 minutos, girando la bandeja de horno a mitad de camino del horneado.

[0321] Los resultados de los ensayos de actividad sensoriales y de agua se resumen a continuación en la Tabla 5. Las muestras para la prueba sensorial se evaluaron en una escala de 10 puntos: 1-2 = inaceptable; 3-4 = pobre; 5-6 = regular; 7-8 = bueno; y 9-10 = excelente. En general, las galletas preparadas con harina de algas retienen un buen nivel de humedad cuando se mantienen a temperatura ambiente durante siete días, con poco deterioro de sabor y textura.

Tabla 35. Puntajes sensoriales y resultados de actividad de agua para galletas de pasas y avena a temperatura ambiente.

Huevos revueltos (de huevos en polvo)

[0322] La capacidad de la harina de algas para retener la humedad y ofrecer una mejora textural fue probada en una aplicación de huevos en polvo reconstituida. Huevos en polvo se prepararon usando una receta convencional, y con niveles variables (5%, 10% y 20%) de harina de algas alta en lípidos como un reemplazo para el porcentaje correspondiente (p/p) de los huevos en polvo. La harina de algas usada en las formulaciones siguientes se preparó utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 13 y contenía aproximadamente 53% de lípidos en peso seco.

Tabla 36. Receta convencional para huevos revueltos de huevos en polvo.

Componente Peso(g) 200,00g Porcentaje % Grasa Huevos en polvo, enteros 25,00 49,83 24,91 9,77

Sal 0,25 0,50 0,25 0,00

Pimienta negra, molida 0,10 0,20 0,10 0,00

Agua 75,00 149,48 74,74 0,00

100,35 200,00 100,00% 9,77%

Tabla 37. Receta para huevos revueltos de huevos en polvo con harina de algas al 5%.

Componente Peso(g) 200,00g Porcentaje % Grasa

Huevos en polvo, enteros 23,75 47,33 23,67 9,28

Harina de algas 1,25 2,49 1,25 0,66

Sal 0,25 0,50 0,25 0,00

Pimienta negra, molida 0,10 0,20 0,10 0,00

Agua 75,00 149,48 74,74 0,00

100,35 200,00 100,00% 9,94%

Tabla 38. Receta para huevos revueltos de huevos en polvo con harina de algas al 10%.

Componente Peso(g) 200,00g Porcentaje % Grasa

Huevos en polvo, enteros 22,50 44,84 22,42 8,79

Harina de algas 2,50 4,98 2,49 1,32

Sal 0,25 0,50 0,25 0,00

Pimienta negra, molida 0,10 0,20 0,10 0,00

Agua 75,00 149,48 74,74 0,00

100,35 200,00 100,00% 10,11%

Tabla 39. Receta para huevos revueltos de huevos en polvo con harina de algas al 20%.

Componente Peso(g) 200,00g Porcentaje % Grasa

Huevos en polvo, enteros 20,00 39,86 19,93 7,81

Harina de algas 5,00 9,97 4,98 2,64

Sal 0,25 0,50 0,25 0,00

Pimienta negra, molida 0,10 0,20 0,10 0,00

Agua 75,00 149,48 74,74 0,00

100,35 200,00 100,00% 10,45%

[0323] En todos los casos, los huevos se prepararon como sigue:

1. Mezclar la harina de algas (si la hay) con huevos en polvo. Mezclar los huevos con agua. Batir hasta que esté suave. Si es necesario, utilice la batidora de mano para esquilar en cualquier grumos.

2. En una sartén precalentada, antiadherente, vierta la mezcla de huevo.

3. Cocine la mezcla de huevo hasta que cuaje y sazone como se desee.

[0324] Todas las preparaciones fueron similares en color y no hubo diferencias de color notables entre los huevos de recetas convencionales y los huevos que contienen harina de algas. Los huevos de recetas convencionales estaban secos, excesivamente aireados y esponjosos en la textura y le faltaba una sensación bucal cremosa. Los huevos preparados con biomasa de algas 5% eran más húmedos y eran más firmes en textura que los huevos de recetas convencionales. La sensación en la boca era más cremos que los huevos de recetas convencionales. Los huevos preparados con harina de algas al 10% eran aún más húmedos que los huevos de recetas convencionales y tenía la textura y sensación en la boca de huevos revueltos preparados a partir de huevos frescos. Los huevos preparados con harina de algas al 20% eran demasiado húmedos y tenían la textura de huevos poco cocidos. En general, la inclusión de harina de algas mejoró la sensación en la boca, textura y humedad de huevos en polvo preparados en comparación con huevos en polvo preparados convencionales. En el 5% y el 10%, la harina de algas funcionó bien en la aplicación de huevo sin aumentar significativamente el contenido de grasa. Al 20%, la harina de algas imparte demasiada humedad, haciendo inaceptable la textura de los huevos en polvo preparados.

Prueba de sujeción de huevos en polvo

[0325] Debido a que la harina de algas era capaz de aumentar la humedad significativa y mejorar la textura de huevo en polvo, se realizó el siguiente ensayo de conservación con el fin de evaluar cuál sería el rendimiento de los huevos cocidos cuando se mantiene en una mesa de vapor. Huevos revueltos hechos con una receta convencional usando huevos en polvo, harina de algas al 5% y harina de algas al 10% (todos hechos usando métodos descritos anteriormente) se hidrataron 10-15 minutos antes de ser cocinados sobre la estufa. Después de la cocción, las muestras se transfirieron inmediatamente a una mesa de vapor, donde se sujetaron cubiertas durante 30 minutos a una temperatura entre 71-93°C (160-200°F). Cada 10 minutos, se hicieron muestras frescas con las que comparar las muestras conservadas. Las muestras se evaluaron en una escala de 10 puntos: 1-2 = inaceptable; 3-4 = pobre; 5-6 = regular; 7-8 = bueno; y 9-10 = excelente. Los resultados de la prueba se resumen a continuación en la Tabla 40.

Tabla 40. Resultados sensoriales de la prueba de retención de huevos en polvo.

Egg Beaters®

[0326] La capacidad de la harina de algas para mejorar la textura y la sensación en la boca de claras de huevo revueltas fue probada usando Egg Beaters®. 100 gramos de Egg Beaters® fueron revueltos usando una pequeña sartén antiadherente durante aproximadamente 1-2 minutos hasta que se fijaron los huevos. Se utilizaron sin mantequilla o condimentos. Una muestra con sustitución 10% p/p de alta masa de harina de algas de lípidos (preparada usando métodos descritos anteriormente en la solicitud de mayonesa con harina de algas que contiene aproximadamente 53% de lípidos en peso seco). Los Egg Beaters® con la harina de algas se preparó de una manera idéntica a la del control.

[0327] La muestra de control tenía una consistencia más acuosa y se disuelve en la boca más como el agua, con relativamente poca o ninguna textura. La muestra que contiene suspensión de harina de algas al 10% cocinada más como huevos revueltos más como hechos con huevos frescos. La muestra que contiene suspensión de harina de algas al 10% cocinada más como huevos revueltos hechos con huevos frescos. La muestra de suspensión de harina de algas al 10% tenía una textura más de huevos revueltos y tenía una sensación en la boca llena, similar a la de los huevos revueltos hechos con huevos frescos. En general, la adición de la suspensión de harina de algas tuvo mucho éxito en la mejora de la textura y la sensación en la boca de claras de huevo revueltas, por lo que las claras de huevo tenían un sabor más como huevos revueltos hechos con huevos enteros frescos.

Huevos enteros líquidos

[0328] La capacidad de la harina de algas para mejorar la textura y la humedad de huevos revueltos usando huevos enteros líquidos estaba fue probada en un estudio de sujeción y utilizando un panel sensorial. Huevos enteros líquidos se preparan de acuerdo con las instrucciones del fabricante como un control y se comparan con los huevos enteros líquidos preparados con masa de harina de algas al 10% (harina de algas al 2,5% con agua al 7,5%). Huevos tanto de control como 10% de huevos de harina de algas fueron cocinados como huevos revueltos y se mantienen en una mesa de vapor durante 60 minutos en total. Se tomaron muestras de cada producto de huevos revueltos y se ensayaron en un panel sensorial cada 10 minutos. El panel sensorial juzgó el aspecto general, el nivel de humedad, textura y sensación en la boca del producto de huevos revueltos en una escala de 1 a 9, siendo 1 inaceptable, siendo 3 moderadamente inaceptable, siendo 5 justo, siendo 7 aceptable y siendo 9 excelente.

[0329] En general, la adición de masa de harina de algas al 10% (2,5% de sólidos de harina de algas) mejoró la textura, el nivel de humedad, y sensación en boca de los huevos preparados. Después de 60 minutos en la mesa de vapor, el producto de huevo revuelto con suspensión de harina de algas 10% era todavía aceptable (5 en la escala sensorial) en comparación con el control de huevos revueltos, que estaba en el intervalo inaceptable a moderadamente inaceptable (2,7 en la escala sensorial). Los resultados de todos los puntos de tiempo se resumen en la Figura 3.

Tortitas con huevos en polvo.

[0330] Mezclas para tortitas/gofres que se encuentran en tiendas al por menor contienen los huevos enteros en polvo como ingrediente. Como se ha demostrado anteriormente en la formulación de huevos en polvo, la adición de harina de algas alta en lípidos mejoró la textura y sensación en la boca del producto de huevo preparado. Fue probada la capacidad de la harina de algas alta en lípidos para mejorar la textura y sensación en la boca de tortitas hechas con mezclas para tortitas premezcladas.

Tabla 41. Receta para las tortitas de control.

Componente_______________ Peso(g)____________________Porcentaje

Huevos enteros en polvo 10,1 4,6

Sólidos no grasos de leche 10,9 5

Harina de trigo de todo uso 65,5 29,8

Aceite de canola 7,3 3,3

Levadura en polvo 3,6 1,6

Sal 0,9 0,41

Azúcar 1,8 0,82

Agua 120 54,5

Total 220,1

Tabla 42. Receta para tortitas que contienen harina de algas de alto contenido de lípidos.

Componente Peso(g) Porcentaje

Huevos enteros en polvo 5,05 2,3

Harina de algas 5,05 2,3

Sólidos no grasos de leche 10,9 5

Harina de trigo de todo uso 65,5 29,8

Aceite de canola 7,3 3,3

Levadura en polvo 3,6 1,6

Sal 0,9 0,41

Azúcar 1,8 0,82

Agua 120 54,5

Total 220,1

[0331] En ambos casos, se utilizó el agua para rehidratar los huevos en polvo, harina de algas, y sólidos no grasos de leche. A continuación se añadieron los ingredientes restantes y se batieron hasta que la pasta fuera suave. La pasta se vertió en una sartén antiadherente sin engrasar caliente en porciones de tamaño de tortitas. Las tortitas estaban cocinadas hasta que las burbujas en la parte superior se explotaron y luego se volcaron y se cocinaron hasta que estuvieran hechas.

[0332] Ambos bateadores fueron similares en apariencia y ambas tortitas tuvieron aproximadamente la misma cantidad de tiempo para cocinar. Las tortitas de harina de algas que contienen eran más ligeras, más cremosas y esponjosas en la textura y eran menos gomosas de las tortitas de control. En general, la sustitución de 50% en peso de los huevos enteros en polvo con harina de algas produjo una tortita texturalmente mejor con una mejor sensación en la boca.

Leche de algas/postre congelado

[0333] Una formulación adicional para la leche de algas se produce utilizando harina de alto contenido de lípidos de las algas. La leche de algas contenía los siguientes ingredientes (en peso): 88,4% de agua, 6,0% de harina de algas, 3,0% de concentrado de proteína de suero de leche, 1,7% de azúcar, 0,6% de extracto de vainilla, 0,2% de sal y 0,1% de estabilizantes. Los ingredientes se combinaron y se homogeneizaron en baja presión usando un homogeneizador de mano. La leche de algas resultante se enfrió antes de servir. La sensación en boca es comparable a la de la leche entera y tenía una buena opacidad. La harina de algas utilizada contenía aproximadamente 50% de lípidos, por lo que la leche de algas resultante contenía aproximadamente 3% de grasa. Cuando se compara con sabor a vainilla leche de soja (seda), la leche de algas tenía una sensación en la boca y la opacidad comparable y le faltaba el sabor a haba de leche de soja.

[0334] A continuación, la leche de algas se combinó con el azúcar adicional y el extracto de vainilla y se mezcla hasta homogeneidad en un mezclador durante 2-4 minutos. La mezcla se colocó en un fabricante de helados preenfriado (Cuisinart) durante 1-2 horas hasta que se alcanzó la consistencia deseada. Un helado de receta convencional hecho con 325 gramos de mitad y mitad, 220 gramos de 2% de leche y 1 yema de huevo se preparó como una comparación. El helado de receta convencional tenía la consistencia comparable a la de helado servido suave, y era un helado de degustación rico, de textura suave. Aunque el helado hecho con leche de algas carecía de la cremosidad general y sensación en la boca del helado de receta convencional, la consistencia y sensación en boca es comparable a un rico helado de leche de degustación. En general, el uso de la leche de algas en una aplicación de postre congelado fue un éxito: la leche de algas de postre congelado producida era una alternativa de grasa inferior a un helado convencional.

Bebida de algas naranja

[0335] Una bebida de algas con sabor a naranja se preparó usando los siguientes ingredientes con las cantidades en paréntesis: agua destilada (879,51 gramos); azúcar granulado (30 gramos); sal (1,9 gramos); harina de algas (50 gramos); carragenina (0,14 gramos); FMC Viscarin 359 Estabilizador (0,75 gramos); extracto de vainilla (6 gramos); proteína de suero (Eggstend) (30 gramos); y sabor a naranja (1,7 gramos). Los ingredientes se combinaron y se homogeneizaron con un homogeneizador de lote para 1 pase a 300 bar. La bebida de algas de color naranja fue enfriada y luego se sirvió. La bebida tenía un sabor similar a un dreamcicle y era muy suave y tenía una sensación en la boca cremosa, similar a la leche entera a pesar de que sólo contenía 2,5% de grasa por peso húmedo.

Ponche de huevo sin huevo

[0336] Un ponche de huevo sin huevo se preparó usando los siguientes ingredientes con las cantidades en paréntesis: agua destilada (842,5 gramos); azúcar granulado (50 gramos); sal (2,3 gramos); harina de algas (50 gramos); carragenina (0,2 gramos); FMC Viscarin 359 Estabilizador (1,0 gramos); extracto de vainilla (3 gramos); proteína de suero (Eggstend) (50 gramos); y nuez moscada (1 gramo). Los ingredientes se combinaron y se homogeneizaron con un homogeneizador de lote para 1 pase a 300 bar. El ponche de huevo fue enfriado y luego se sirvió frío. El ponche de huevo tenía la apariencia y sensación en la boca de un ponche de huevo convencional, pero el contenido de grasa (2,5% de grasa por peso húmedo) se ha reducido de manera significativa debido a la falta de las yemas de huevo y la crema de leche en la receta.

Salsa de queso

[0337] Una salsa de queso se preparó usando los siguientes ingredientes con el porcentaje de peso total en paréntesis: 40% suspensión de harina de algas (65,9%); goma de xantano (0,22%); almidón de flujo puro (0,81%); agua (26,6%); azúcar (0,25%); sal (0,54%); ácido acético al 50% (0,5%); queso en polvo modificado por enzima (5%). Los ingredientes se mezclaron juntos hasta estar lisos. Esto fue una demostración exitosa de la utilización de harina de algas en una aplicación de salsa de queso salado.

Yogures de algas

[0338] Un yogur se preparó usando los siguientes ingredientes con el porcentaje de peso total (500 gramos) en paréntesis: harina de algas (1,25%); leche desnatada (50%); azúcar (1%); sal (0,1%); agua desionizada (47,15%) y cultivo iniciador (0,5%). El cultivo iniciador utilizado fue Euro Cuisine Yogurt Starter Culture que contiene leche desnatada en polvo, sacarosa, ácido ascórbico, bacterias lácticas (L. bulcaricus, S. thermophilus y L. acidophilus). Todos los ingredientes excepto el cultivo iniciador se combinaron y se calentaron a 185°F durante 5-10 minutos después se enfrió a 105-110°F usando un baño de hielo. A continuación se añadió el cultivo iniciador a la mezcla de yogur se enfrió y se incubó en un fabricante de yogur de uso en el hogar de Waring Pro YM 350 durante aproximadamente 8 horas. El yogur era degustación agria, lo que indica que el proceso de fermentación mediante el cultivo iniciador en vivo fue un éxito. La consistencia del yogur era suave y un poco más gruesa que una bebida de yogur.

[0339] Se realizaron experimentos adicionales en yogur sin saborizante no graso y la incorporación de harina de algas para determinar las contribuciones a la sensación en la boca del yogur sin grasa. Cinco por ciento (en peso) de harina de algas se mezcló en un yogur sin saborizante no graso (Pavel) hasta que esté suave y bien incorporado. El yogur se re-enfría y luego se sirve. El yogur sin grasa que contiene harina de algas 5%, que ahora contiene aproximadamente 2,5% de grasa) tenía la sensación en la boca que era tan rica y cremosa como un control de yogur sin saborizante de grasa completa (Pavel), que tiene un contenido de grasa de 3,5%.

EJEMPLO 15

Aceite de algas

Extracción de disolvente de aceite a partir de biomasa

[0340] Aceite de algas se extrae de la biomasa de microalgas preparada como se describe en los Ejemplos 1-4 por secado de la biomasa usando métodos descritos en este documento, lo que altera la biomasa usando métodos descritos en este documento, y poner en contacto la biomasa interrumpida con un disolvente orgánico, por ejemplo, hexano, durante un período de tiempo suficiente para permitir que el aceite forme una solución con el hexano. La solución se filtró entonces y el hexano se eliminó por evaporación rotatoria para recuperar el aceite extraído.

Extracción sin disolventes de aceite a partir de biomasa

[0341] Aceite de algas se extrae de la biomasa de microalgas preparada como se describe en los Ejemplos 1-4, secando la biomasa, y perturbando físicamente la biomasa en una prensa de semillas oleaginosas, en donde el aceite de algas se libera a partir de la biomasa. El aceite, así separado de la biomasa perturbada, se recupera a continuación. Extracción con fluidos supercríticos de aceite de biomasa de algas

[0342] Aceite de microalgas se extrajo de Chlorella protothecoides (UTEX 250) crecido como se describe en los Ejemplos 1-4 utilizando extracción con fluidos supercríticos (SFE). Una muestra de la biomasa de microalgas (25,88 gramos) se cargó en un recipiente de extracción y gas de CO2 (a una presión seleccionada y las condiciones de temperatura) se hicieron pasar a través del recipiente durante un período de tiempo hasta que la masa total deseada de gas ha pasado a través del recipiente. A continuación, la corriente de alta presión de gas y el material extraído se hizo pasar a través de una válvula de reducción de presión en un colector que contiene los extraíbles (aceite de alga). Después de que la cantidad deseada de gas haya fluido a través del recipiente de extracción, se retiró el colector. El material restante en el recipiente (o residual) se recogió después de la extracción. 15,68 gramos de aceite de algas se extrajo y el residuo pesó 10,2 gramos. El residual comprendía biomasa de algas sin lípidos y tenía un aspect blanco, polvoriento.

[0343] El aceite de algas producido usando SFE se analizó para antioxidantes (12,7 ppm terc-butilhidroquinona (TBHQ)), clorofila (1 ppm), ácidos grasos libres (1,34%), humedad Karl Fischer (0,05), monoglicéridos (0,04%), diglicéridos (2,52%), fosfolípidos (ninguno-debajo de los niveles de detección), tocoferoles y esteroles y tocotrienoles utilizando métodos de HPLc estándar y los métodos descritos en el Ejemplo 8. El aceite de algas contenía los siguientes tocoferoles y esteroles: tocoferol delta (0,13 mg/100 g); gamma tocoferol (0,20 mg/g), alfa tocoferol (5,58 mg/100 mg); ergosterol (164 mg/100 g); campesterol (6,97 mg/100 g), estigmasterol (6,97 mg/100 g); p-sitosterol (5,98 mg/100 g); y 176 mg/100 g de otros esteroles. El aceite de algas también contenía 0,24 mg/g de alfa tocotrienol. Diversidad de las cadenas lipídicas en especies de algas

[0344] Muestras de lípidos de un subconjunto de cepas cultivadas en el Ejemplo 1 fueron analizadas para el perfil de lípidos usando HPLC. Los resultados se muestran en la Figura 1.

EJEMPLO 16

Productos nutracéuticos y alimenticios que contienen aceite de algas

Cápsulas de aceite de algas (aceite encapsulado que ha sido extraído de algas (a) a través de la extracción con disolvente o (b) a través de la extracción de no disolvente)

[0345] Sistema de protección completa - aceite de algas que proporciona tocotrienoles, tocoferoles, carotenoides, Omega 3s y esteroles de origen natural. Ofrece una alternativa no animal a base de plantas al uso de aceite de pescado.

Tabla 43. Ingredientes de la composición nutracéutica ejemplar.

Aceite de algas (aceite que ha sido extraído de las algas, ya sea a través de extracción con disolvente o por medio de extracción no disolvente)

[0346]

Tabla 44. Ingredientes de la composición nutracéutica ejemplar.

Brownies y pasteles de vainilla que contienen aceite de algas

[0347] El aceite extraído de Chlorella protothecoides (UTEX 250) cultivado utilizando los métodos de fermentación descritos en el Ejemplo 4 se utilizó en aplicaciones de productos horneados. Torta amarilla (Moist Deluxe, Duncan Hines) y brownies (Chocolate Chunk, Pillsbury) se produjeron usando 1/3 taza de aceite extraído de Chlorella protothecoides según las instrucciones sugeridas por el fabricante. Los resultados tanto de la torta amarilla como brownies fueron indistinguibles de torta amarilla y brownies producidos usando el aceite vegetal y la misma mezcla de caja.

EJEMPLO 17

Producción de biomasa de algas de alto contenido de proteína

Cultivo heterotrófico de microalgas con alto valor proteico

[0348] Chlorella protothecoides heterótrofo producido de manera (UTEX 250) se cultivó en condiciones ricas en nitrógeno suministrado por uno o más de los siguientes: extracto de levadura (fuente de nitrógeno orgánico), NH4OH y (NH4)2SO4, que complementa el medio descrito en los Ejemplos 2-4. Aparte de los medios de cultivo, las condiciones de fermentación fueron idénticas a las condiciones descritas en el Ejemplo 2. La biomasa de algas de alta proteína se recogieron después de aproximadamente 3-5 días de crecimiento exponencial, cuando alcanzó la densidad de cultivo deseada. Cualquiera de los métodos de transformación descritos anteriormente (escamas de algas en el Ejemplo 4, homogeneizado de algas en el Ejemplo 10, el polvo de algas en el Ejemplo 12 y la harina de algas en el Ejemplo 13) se puede aplicar a la biomasa de algas de alta proteína.

Análisis proximal de la biomasa de microalgas

[0349] La biomasa alta en proteínas se procesó en forma de escamas de algas utilizando métodos descritos en el Ejemplo 4. Tanto biomasa seca, alta en lípidos (Ejemplo 4) como alta en proteínas, se analizaron para la humedad, grasa, fibra, ceniza, proteína cruda y digestibilidad de la proteína usando métodos de acuerdo con Official Methods of ACOC International. Los resultados se resumen en la Tabla 45 a continuación.

Tabla 45. Análisis proximal de microalgas con alto contenido de proteínas.

[0350] Hidratos de carbono totales se calcularon por diferencia: 100% menos los porcentajes conocidos de análisis inmediato. Hidratos de carbono totales en peso de la biomasa alta en lípidos fue de aproximadamente 36% y de hidratos de carbono totales en peso de la biomasa de alta proteína fue de aproximadamente 24%.

[0351] La fibra en bruto anterior representa la cantidad de celulosa y lignina (entre otros componentes) en las muestras de biomasa. Ambas biomasas se sometieron a mediciones de fibra soluble e insoluble (juntas es el total de fibra dietética), que es parte del componente de hidrato de carbono de la biomasa, usando métodos de acuerdo con Official Methods of ACo C International. (método AOAC 991,43). Para la alta biomasa de lípidos, la fibra soluble fue 19,58% y la fibra insoluble fue 9,86% (fibra dietética total de 29,44%). Para la biomasa rica en proteínas, la fibra soluble fue 10,31% y la fibra insoluble fue 4,28% (fibra dietética total de 14,59%.

[0352] Dos muestras (muestra A y muestra B) de la biomasa de alto contenido de proteínas que eran dos lotes de la biomasa cultivada como se ha descrito anteriormente también se analizaron para la clorofila, esteroles, tocoferoles y tocotrienoles usando los métodos descritos en el Ejemplo 8. Los resultados para la muestra A fueron: clorofila (93,1 ppm); esteroles totales (1,299 g/100 g) que incluyen: colesterol (1,05 mg/100 g); brasicasterol (301 mg/100 g); ergosterol (699 mg/100 g); campesterol (13,8 mg/100 g); estigmasterol (15,7 mg/100 g); y p-sitosterol (3,72 mg/100 g); otros esteroles (265 mg/100 g); tocoferol alfa (0,18 mg/g); y tocotrienol alfa (0,03 mg/g). Los resultados para la muestra B fueron: clorofila (152 ppm); esteroles totales (2,460 g/100 g) que incluyen: colesterol (1,01 mg/100 g); brasicasterol (549 mg/100 g); ergosterol (1,39 g/100 g); campesterol (22,6 mg/100 g); estigmasterol (26,1 mg/100 g); p-sitosterol (2,52 mg/100 g); y otros esteroles (466 mg/100 g); tocoferoles totales (0,79 mg/g) que incluyen: tocoferol alfa (0,35 mg/g), tocoferol gamma (0,35 mg/g) y tocoferol delta (0,09 mg/g); y tocotrienol alfa (0,01 mg/g).

Digestibilidad de las proteínas en la biomasa de algas

[0353] Varios lotes de alto contenido en proteínas y la biomasa alta en lípidos (producidos utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 4) y la biomasa rica en proteínas se analizaron para la digestibilidad utilizando un ensayo de digestibilidad in vitro (0,2% del ensayo de digestibilidad de pepsina, N° de Método AOAC 971,09). Para la alta biomasa de lípidos, el porcentaje total de proteína cruda varió de 5,4% a 10,3%, con porcentaje total de proteína digerible que varía de 46,4% a 58,6%. Para la biomasa alta en proteínas, la proteína bruta por ciento varió de 40,8% a 53,3%, con el porcentaje total de proteína digerible que varía de 71,6% a 85,3%. El mismo ensayo de digestibilidad también se realizó en bioalimento extraído por hexano (biomasa de algas de alto contenido de lípidos después de extracción de hexanos del aceite de algas). El porcentaje total de proteína en bruto fue de aproximadamente 11-12% para todos los lotes ensayados, con porcentaje total de proteína digerible que varía de 76,72% a 80.

[0354] Cuando se compara con la harina de soja en grano que tiene una proteína bruta porcentual de aproximadamente el 40,9% y proteína digestible total de 95,35%, la biomasa de algas de alto valor proteico tenía un porcentaje total de proteína digestible que era un poco menos de la harina de soja en grano. Los ensayos adicionales se realizaron en la biomasa de algas de alta proteína que había sido procesada de manera que las células de algas se lisaron predominantemente. Estos ensayos resultaron en un porcentaje total de proteína digerible que era comparable al de la harina de soja en grano (aproximadamente 95% de proteína digerible total). En general, el porcentaje total de proteína bruta y el porcentaje total de los niveles de proteína digerible de la biomasa alta en proteínas son comparables al de la harina de soja en grano.

[0355] Los resultados del ensayo de digestibilidad de la bioalimento extraído de hexanos indicaron que el bioalimento puede ser un aditivo viable para la alimentación animal. El bioalimento tenía tanto la proteína residual como el aceite y tenía un porcentaje total de nivel de proteína digerible de aproximadamente 80%.

EJEMPLO 18

Productos alimenticios con biomasa de algas de alto valor proteico

Composiciones de alimentos utilizando la biomasa de algas de alto valor proteico (escamas de algas y homogeneizado de algas)

[0356] La biomasa de algas de alta proteína utilizada en las recetas a continuación fue producida con los métodos descritos en el Ejemplo 17 anterior. La biomasa de algas utilizada en las recetas a continuación fue tomada de Chlorella protothecoides UTEX 250, que contenía proteína de aproximadamente 51% en peso y se denomina a continuación la biomasa de algas de alto contenido de proteínas y designada ya sea en forma de escamas de algas o homogeneizado de algas.

Hamburguesas vegetarianas

[0357] Este ejemplo compara las hamburguesas de hamburguesa vegetariana hechas por una receta convencional, con la biomasa de algas alta en proteínas, ya sea de escamas de algas o homogeneizado de algas (AH), en sustitución de fuentes de proteínas vegetarianas (proteína texturizada de soja (TSP), gluten de trigo y/o aislar la proteína de soja (SPI)).

Tabla 46. Receta convencional de hamburguesa vegetariana.

Componente Peso (g) % % Fibra % Proteína % Grasa Agua 62,0 2,0 0 0 0

TSP (Arcon T U272) 11,0 1,0 7,59 7,59 0,22

TSP (Arcon T U218) 10,0 0,0 6,90 6,90 0,20

Aceite de canola 4,0 0 0 0 4,0

SPI 5,5 5 4,95 4,95 0,22

Gluten de trigo 3,0 0 2,46 2,46 0,03

Sabor a hamburguesa veg. nat. 2,0 0 0 0 0

Sensirome ultra vegetal 1,0 0 0 0 0

Metilcelulosa 1,0 0 0 0 0

Sal 0,5 5 0 0 0

Total 100 gramos 00 21,90 21,90 4,67

Tabla 47. Receta para una hamburguesa vegetariana con escamas de algas de alto contenido en proteínas reemplazando el aislado de proteína de soja (SPI), metilcelulosa, y gluten de trigo.

Componente Peso (g) % % Fibra % Proteína % Grasa Agua 54,28 58,82 0 0 0

TSP (Arcon T U272) 11,0 11,92 2,26 8,22 0,24

TSP (Arcon T U218) 10,0 10,84 2,06 7,48 0,22

Aceite de canola 4,0 4,33 0 0 4,33

SPI 0 0 0 0 0

Escamas de algas altas en proteína 9,5 10,29 4,12 5,18 0,51

Gluten de trigo 0 0 0 0 0

Sabor a hamburguesa veg. nat. 2,0 2,17 0 0 0

Sensirome ultra vegetal 1,0 1,08 0 0 0

Metilcelulosa 0 0 0 0 0

Sal 0,5 0,54 0 0 0

Total 92,28 100 8,44 20,88 5,30

Tabla 48. Receta para una hamburguesa vegetariana con escamas de algas de alto contenido en proteínas reemplazando el concentrado de proteína de soja texturizado (TSP), y aislado de proteína de soja.

Componente Peso (g) % % Fibra % Proteína % Grasa Agua 57,5 49,57 0 0 0

TSP (Arcon T U272) 0 0 0 0 0

TSP (Arcon T U218) 0 0 0 0 0

Aceite de canola 4,0 3,45 0 0 3,45

SPI 0 0 0 0 0

Escamas de algas altas en proteína 47,0 40,52 16,21 20,38 2,03

Gluten de trigo 3,0 2,59 0 2,12 0,03

Sabor a hamburguesa veg. nat. 2,0 1,72 0 0 0

Sensirome ultra vegetal 1,0 0,86 0 0 0

Metilcelulosa 1,0 0,86 0,08 0 0

Sal 0,50 0,43 0 0 0

Total 116,0 100 16,29 22,50 5,50 Tabla 49. Receta para una hamburguesa vegetariana hecha con homogeneizado de algas (AH) de alto contenido en proteínas reemplazando el aislado de proteína de soja (SPI), metilcelulosa, y gluten de trigo.

Componente Peso (g) % % Fibra % Proteína % Grasa Agua 62,0 62,0 0 0 0

TSP (Arcon T U272) 11,0 11,0 2,09 7,59 0,22 TSP (Arcon T U218) 10,0 10,0 1,90 6,90 0,20 Aceite de canola 4,0 4,0 0 0 4,0

SPI 0 0 0 0 0

Escamas de algas altas en proteína 9,5 9,5 3,80 4,78 0,48 Gluten de trigo 0 0 0 0 0 Sabor a hamburguesa veg. nat. 2,0 2,0 0 0 0 Sensirome ultra vegetal 1,0 1, 0 0 0 Metilcelulosa 0 0 0 0 0

Sal 0,5 0,5 0 0 0 Total 100 100 7,79 19,27 4,90

Tabla 50. Receta para una hamburguesa vegetariana hecha con homogeneizado de algas de alto contenido en proteínas reemplazando el concentrado de proteína de soja texturizado (TSP), metilcelulosa, y gluten de trigo.

Componente Peso (g) % % Fibra % Proteína % Grasa Agua 52,570 47,33 0 0 0

TSP (Arcon T U272) 0 0 0 0 0

TSP (Arcon T U218) 0 0 0 0 0 Aceite de canola 4,0 3,60 0 0 3,60 Aislado de proteína de soja 0 0 0 0 0 Escamas de algas altas en proteína 47,0 42,32 16,93 21,28 2,12 Gluten de trigo 3,0 2,7 0 2,12 0,03 Sabor a hamburguesa veg. nat. 2,0 1,8 0 0 0 Sensirome ultra vegetal 1,0 0,90 0 0 0 Metilcelulosa 1,0 0,90 0,08 0 0

Sal 0,50 0,43 0 0 0 Total 111,07 100 17,01 23,50 5,74

[0358] En cada caso el procedimiento de cocción fue:

1. Pesar juntas las dos proteínas de soja texturadas (si aplicable).

2. En un recipiente mezclador, añadir primera porción de agua (2,5-3 veces el peso de TSP y mezclar durante 10 minutos.

3. Pesar concentrado de proteína de soja, metilcelulosa, gluten de trigo, y la biomasa de algas y mezcla seca juntas.

4. Añadir los ingredientes secos en el mezclador. Añadir el agua restante y mezclar durante 5-10 minutos.

5. Pesar sal y sabores. Pesar aceite. Añadir a la mezcladora y mezclar durante 5 minutos.

6. Formar hamburguesas utilizando el molde (65-75g por hamburguesa), tapar y congelar.

[0359] En las muestras donde la biomasa de algas (escamas de algas y homogeneizado de algas) sustituyó TSP, las hamburguesas eran muy pegajosas y tenían relativamente ninguna estructura cuando se cocinaban. La adición de otros aglutinantes tales como avena, salvado de avena y harina de arroz integral produjo una hamburguesa que, cuando se cocinaba, era firme en textura. Recetas donde escamas de algas reemplazaron el aislado de proteína de soja produjeron una hamburguesa que era más suave, más blanda y con menos textura que el control. Las hamburguesas que contenían homogeneizado de algas que reemplazaron aislado de proteína de soja tenían una firmeza y textura que eran comparables al control. En general, la hamburguesa de hamburguesa vegetariana con homogeneizado de algas sustituyeron aislado de proteína de soja fue la más exitosa de las recetas ensayadas y produjo una hamburguesa que era comparable a la de la hamburguesa de control vegetariano, pero con casi dos veces más fibra dietética.

Barra de proteina

[0360] El siguiente ejemplo compara una barra de proteína convencional, con la biomasa de algas alta en proteínas, ya sea escamas de algas o homogeneizado de algas (AH), en sustitución de las fuentes convencionales de proteína (proteína de soja (SPI) y concentrado de proteína de leche (MPC)).

Tabla 51. Receta convencional de barra de proteína.

Componente Peso (g) % % Fibra % Proteína % Grasa Jarabe de maíz 63/43 53,0 53,7 0 0 0 Harina de arroz marrón 8,3 8,41 3,15 0 0 Aislado de proteína de soja 9,35 9,47 0 8,24 0 Conc. de proteína de soja 9,35 9,47 0 7,67 0,14 Polvo de cacao, alcalizado 8,0 8,11 2,59 1,824 0,89 Lecha seca sin grasa 7,0 7,09 0 2,483 0 Sabor a chocolate 0,5 0,51 0 0 0 Sabor a vainilla 0,4 0,41 0 0 0 Glicerina (99,5% USP) 2,3 2,33 0 0 0 Mezcla de vitaminas 0,49 0,5 0 0 0 Total 98,69 100 5,75 20,22 1,03

Tabla 52. Receta para barra de proteína hechas con escamas de algas de alto contenido de proteína reemplazando SPI y MPC.

Componente Peso (g) % % Fibra % Proteína % Grasa Jarabe de maíz 63/43 49,7 52,21 0 0 0 Escamas de algas altas en proteína 34,0 35,72 14,29 17,97 1,79 Polvo de cacao, alcalizado 8,0 8,40 2,69 1,89 0,92 Sabor a chocolate 0,47 0,49 0 0 0 Sabor a vainilla 0,375 0,39 0 0 0 Glicerina (99,5% USP) 2,16 2,27 0 0 0 Mezcla de vitaminas 0,49 0,51 0 0 0 Total 95,20 100 16,98 19,86 2,71

Tabla 53. Receta para barras de proteína hechas con homogeneizado de algas de alto contenido de proteína (AH) con sustitución de SPI y MPC.

Componente Peso (g) % % Fibra % Proteína % Grasa Jarabe de maíz 63/43 48,0 51,4 0 0 0 Escamas de algas altas en proteína 34,0 36,41 14,56 18,31 1,82 Polvo de cacao, alcalizado 8,0 8,57 2,741 1,928 0,942 Sabor a chocolate 0,47 0,48 0 0 0 Sabor a vainilla 0,36 0,39 0 0 0 Glicerina (99,5% USP) 2,080 2,23 0 0 0 Mezcla de vitaminas 0,49 0,52 0 0 0 Total 93,38 100 17,31 20,24 2,76

[0361] En cada caso el procedimiento de cocción era:

1. Mezclar todos los ingredientes del jarabe.

2. Calentar en estufa a 88°C (190°F) y el agujero durante 10 minutos con la tapa puesta. Revuelva de vez en cuando.

3. Mantenga el calor durante 10 minutos. Enfriar a aproximadamente 60°C (140°F).

4. Combinar con los ingredientes secos.

5. Porción en losas y dejar reposar durante la noche.

6. Cortar en barras, recubrir con recubrimiento compuesto como se desee y empaquetar.

[0362] En general, la barra de proteína hecha con el homogeneizado de algas de alto valor proteico mostró ligeramente mejor unión en comparación con la barra de proteína hecha con las escamas de algas. Además, la barra de proteína hecha con el homogeneizado de algas requiere la menor cantidad de jarabe de maíz para unir los ingredientes. La barra de proteína hecha con homogeneizado de algas de alto contenido de proteína fue la composición más exitosa en comparación con la barra de proteína convencional: por cantidad comparable de proteínas y grasas, contenía alrededor de 3 veces más fibra dietética.

Bebida nutricional de chocolate (sustituto de comida)

[0363] El siguiente ejemplo compara una bebida nutricional con sabor de chocolate convencional, con bebidas de chocolate nutricionales hechas ya sea con escamas de algas de alto contenido de proteínas o homogeneizado de algas (AH) de alto contenido de proteínas, en sustitución de las fuentes convencionales de proteínas (aislado de proteína de soja (SPI) y concentrado de proteína de leche (MPC)).

Componente Peso % Azucar % % Proteína % Grasa (g) Fibra

Agua (filtrada) 908,0 72,99 0 0 0 0 Azucar (granulado) 95,0 7,637 7,64 0 0 0 Jarabe de maíz 70,0 5,627 1,24 0 0 0 Maltodextrina 60,0 4,823 0 0 0 0 Aislado de proteína de leche 44,0 3,53 0 0 2,86 0 Aceite de canola 29,0 2,33 0 0 0 2,33 Polvo de cacao 15,0 1,206 0 0,39 0,27 0,13 Aislado de proteína de soja 11,5 0,924 0 0 0,8 0,04 Fosfato de disodio 2,0 0,161 0 0 0 0 Lecitina 1,7 0,137 0 0 0 0 Mezcla de estabilizador 2,0 0,161 0 0 0 0 Sabor a vainilla 2,0 0,161 0 0 0 0 Sabor a chocolate 2,0 0,161 0 0 0 0 Mezcla de vitaminas 1,8 0,145 0 0 0 0 Total 1244 100 8,88 0,39 3,93 2,5

Tabla 55. Receta de la bebida nutricional de chocolate hecha con escamas de algas con sustitución de SPI, maltodextrina y aislado de proteína de leche.

Componente Peso % Azucar % % Proteína % Grasa (g) Fibra

Agua (filtrada) 910,0 74,959 0 0 0 0 Azucar (granulado) 92,5 7,619 7,62 0 0 0 Jarabe de maíz 70,0 5,766 1,27 0 0 0 Escamas de algas altas en proteína 87,0 7,166 0 2,87 3,6 0 Aceite de canola 28,0 2,306 0 0 0 2,31 Polvo de cacao 15,0 1,236 0 0,4 0,28 0,14 Fosfato de disodio 2,0 0,165 0 0 0 0 Lecitina 1,7 0,14 0 0 0 0 Mezcla de estabilizador 2,0 0,165 0 0 0 0 Sabor a vainilla 2,0 0,165 0 0 0 0 Sabor a chocolate 2,0 0,165 0 0 0 0 Mezcla de vitaminas 1,8 0,148 0 0 0 0 Total 1214 100 8,89 3,27 3,88 2,45

Tabla 56. Receta para bebida nutricional de chocolate hecha con homogeneizado de algas (AH) de alto contenido proteínas en sustitución de SPI, maltodextrina y aislado de proteína de leche.

Componente Peso % Azucar % % Proteína % Grasa (g) Fibra

Agua (filtrada) 910.0 74.959 0 0 0 0 Azucar (granulado) 92.5 7.619 7.62 0 0 0 Jarabe de maíz 70.0 5.766 1.27 0 0 0 Escamas de algas altas en proteína 87.0 7.166 0 2,87 3,6 0 Aceite de canola 28.0 2.306 0 0 0 2,31 Polvo de cacao 15.0 1.236 0 0,4 0,28 0,14 Fosfato de disodio 2.0 0.165 0 0 0 0 Lecitina 1.7 0.14 0 0 0 0 Mezcla de estabilizador 2.0 0.165 0 0 0 0 Sabor a vainilla 2.0 0.165 0 0 0 0 Sabor a chocolate 2.0 0.165 0 0 0 0 Mezcla de vitaminas 1.8 0.148 0 0 0 0 Total 1214 100 8.89 3,27 3,88 2,45

[0364] El homogeneizado de algas de alto contenido de proteína produjo una bebida nutricional que era más gruesa en el cuerpo en comparación con la bebida de receta convencional. Las escamas de algas de alto contenido de proteína produjeron una bebida nutricional que era menos consistente que la bebida de control. En general, la bebida que contiene homogeneizado de algas de alto contenido en proteínas fue más exitosa en esta solicitud, produciendo una bebida nutricional de espesor con gran opacidad. La bebida nutricional hecha con homogeneizado de algas era comparable a la bebida convencional en los niveles de azúcar, grasa y proteína, mientras que contenía casi diez veces más fibra.

EJEMPLO 19

Genotipado para identificar otras cepas de microalgas adecuadas para uso como alimento

Genotipado de algas

[0365] El ADN genómico se aisló a partir de la biomasa de algas del siguiente modo. Las células (aproximadamente 200 mg) se centrifugaron a partir de cultivos líquidos 5 minutos a 14.000 x g. Las células se resuspendieron luego en agua destilada estéril, se centrifugaron 5 minutos a 14.000 x g y el sobrenadante se desechó. Un grano de cristal único de ~2 mm de diámetro se añadió a la biomasa y los tubos se colocaron a -80°C durante al menos 15 minutos. Las muestras se retiraron y se añadió 150 pl de tampón de molido (1% de Sarkosyl, sacarosa 0,25 M, NaCl 50 mM, EDTA 20 mM, Tris-HCl100 mM, pH 8,0 RNasa A 0,5 ug/ul) se añadió. Los sedimentos se resucitación agitando con vórtex brevemente, seguido de la adición de 40 ul de NaCl 5M. Las muestras se agitaron con vórtex brevemente, seguido de la adición de 66 pl de 5% de CTAB (bromuro de cetil trimetilamonio) y un vórtice breve final. Las muestras se incubaron a 65°C durante 10 minutos después de lo cual se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se extrajo una vez con 300 plde fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 12: 12: 1, seguido de centrifugación durante 5 minutos a 14.000 x g. La fase acuosa resultante se transfirió a un tubo fresco que contenía 0,7 vol de isopropanol (~190 pl), se mezcló por inversión y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos o durante la noche a 4°C. El a Dn se recuperó mediante centrifugación a 14.000 x g durante 10 minutos. Después, el sedimento resultante se lavó dos veces con 70% de etanol, seguido de un lavado final con 100% de etanol. Los sedimentos se secaron al aire durante 20-30 minutos a temperatura ambiente seguido por resuspensión en 50 pl de TrisCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0).

[0366] Cinco pl de ADN de algas totales, preparado como se ha descrito anteriormente, se diluyó 1:50 en Tris 10 mM, pH 8,0. Las reacciones de PCR, un volumen final de 20pl, se establecieron del siguiente modo. Diez pl de 2 x mezcla maestra iProof HF (BIO-RAD) se añadió a cebador 0,4 pl SZ02613 (5'-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3' (SEQ ID NO: 24) en 10 mM de concentración de reserva). Esta secuencia del cebador se extiende desde la posición 567 a 588 en Gen Bank n° L43357 y está altamente conservada en las plantas superiores y los genomas de plástidos de algas. Esto fue seguido por la adición de 0,4 pl de cebador SZ02615 (5'-CAg Tg AGCTATTACGCACTC-3' (SEQ ID NO: 25) en 10 mM de la concentración de reserva). Esta secuencia de cebador es complementaria a la posición 1112 a 1093 en la adhesión Gen Bank n° L43357 y está altamente conservada en las plantas superiores y los genomas de plástidos de algas. A continuación, se añadieron 5 pl de ADN total diluido y 3,2 pl dH2O. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo de la siguiente manera: 98°C, 45"; 98°C, 8"; 53°C, 12”; 72°C, 20" durante 35 ciclos seguido de 72°C durante 1 min y mantenimiento a 25°C. Para la purificación de productos de PCR, 20 pl de Tris 10 mM, pH 8,0, se añadió a cada reacción, seguido de extracción con 40 pl de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 12: 12: 1, agitación con vórtex y centrifugación a 14.000 x g durante 5 minutos. Las reacciones de PCR se aplicaron a S-400 columnas (GE Healthcare) y se centrifugaron durante 2 minutos a 3000 x g. Los productos de PCR purificados se clonaron TOPO posteriormente en PCR8/GW/TOPO y los clones positivos fueron seleccionados para placas de LB/Spec. ADN plásmido purificado se secuenció en ambas direcciones usando cebadores M13 directo e inverso. Los alineamientos de secuencia y los árboles sin raíces se generaron usando el software de análisis de ADN Geneious. Secuencias de cepas 1-23 (designadas en el Ejemplo 1, Tabla 1) se muestran como SEQ ID NOs: 1-23 en la lista de secuencias adjunta.

Análisis del ADN genómico de 23S ARNr de 9 cepas de Chlorella protothecoides

[0367] El ADN genómico a partir de 8 cepas de Chlorella protothecoides (UTEX 25, UTEX 249, UTEX 250, UTEX 256, UTEX 264, UTEX 411, SAG 211 10d, CCAP 211/17, y CCAP 211/8d) se aisló y se realizó un análisis genómico de ADN de 23S ARNr de acuerdo con los métodos descritos arriba. Todas las cepas de Chlorella protothecoides probadas eran idénticas en secuencia a excepción de UTEX 25. Las secuencias para todas las ocho cepas son enumeradas como SEQ ID NOs: 26 y 27 en la lista de secuencias adjunta.

Análisis de genotipificación de muestras Chlorella compradas comercialmente

[0368] Tres muestras Chlorella compradas comercialmente, Chlorella regularis (nuevo capítulo, 390 mg/cápsula de gel), Whole Foods Broken Cell Wall Chlorella (Whole Foods, 500 mg/comprimido prensado) y NutriBiotic CGF Chlorella (NutriBiotic, 500 mg/comprimido prensado), se genotiparon utilizando los métodos descritos anteriormente. Aproximadamente 200 mg de cada muestra Chlorella adquirida comercialmente se resuspendieron y agua destilada estéril para el aislamiento de ADN genómico.

[0369] Los productos de PCR resultantes se aislaron y se clonaron en vectores y se secuenciaron usando cebadores M13 directo e inverso. Las secuencias se compararon con secuencias conocidas utilizando una búsqueda BLAST.

[0370] Comparación de las secuencias de ADN 23S ARNr reveló que dos de las tres muestras de Chlorella compradas comercialmente tenían secuencias de ADN que emparejan Lyngbya aestuarii presentes (Whole Foods Broken Wall Chlorella y NutriBiotic CGF). Lyngbya aestuarii es una cianobacteria de especie marina. Estos resultados muestran que Chlorella disponible comercialmente contienen otras especies de microorganismos contaminantes, incluyendo organismos de géneros tales como Lyngbya que son conocidos por producir toxinas (ver por ejemplo Teneva et al, Environmental Toxicology, 18 (1) 1, pp 9-20 (2003); Matthew et al, J Nat Prod, 71 (6): pp. 1113-6 (2008); y Carmichael et al, Appl Environ Microbiol, 63 (8): pp 3104 a 3110 (1997).

Ejemplo 20

Mutantes de color de biomasa de microalgas adecuada para uso como alimento

Mutagénesis química para generar mutantes de color

[0371] Chlorella protothecoides (UTEX 250) se cultivó de acuerdo con los métodos y las condiciones descritas en el Ejemplo 1. Mutagénesis química se realizó en la cepa de algas utilizando N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG). El cultivo de algas se sometió al mutágeno (NTG) y luego se seleccionó a través de rondas de reaislamiento en placas de agar de glucosa 2,0%. Las colonias se rastrearon para los mutantes de color. Chlorella protothecoides (de tipo salvaje) parece ser un color dorado cuando se cultivan heterotróficamente. El cribado produce una cepa que apareció de color blanco en la placa de agar. Este mutante de color fue nombrado 33-55 (depositado el 13 de octubre de 2009, en conformidad con el Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection en 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 con una Denominación de Depósito de Patente de PTA-10397). Otra colonia también se aisló y se pasó por tres rondas de reaislamiento para confirmar que esta mutación era estable. Este mutante parecía ser de color amarillo claro en la placa de agar y fue nombrado 25-32 (depositado el 13 de octubre de 2009, en conformidad con el Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo en 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 hasta 2209 con una Designación de Depósito de Patente de PTA-10396).

Perfil lipídico de Chlorella protothecoides 33-55

[0372] Chlorella protothecoides 33-55 y Chlorella protothecoides parental (UTEX 250) se cultivaron de acuerdo con los métodos y las condiciones descritas en el Ejemplo 1. El porcentaje de lípidos (por peso de células secas) se determinó para ambas cepas: Chlorella protothecoides 33-55 fue en 68% de lípidos y la cepa parental fue en 62% de lípidos. Los perfiles de lípidos se determinaron para ambas cepas y fueron los siguientes (expresados como % de área): Chlorella protothecoides 33-55, C14: 0 (0,81); C16: 0 (10,35); C16: 1 (0,20); C18: 0 (4,09); C18: 1 (72,16); C18: 2 (10,60); C18: 3 (0,10); y otros (1,69); para la cepa parental, C14: 0 (0,77); C16: 0 (9,67); C16: 1 (0,22); C18: 0 (4,73); C18: 1 (71,45); C18: 2 (10,99); C18: 3 (0,14); y otros (2,05).

EJEMPLO 21

La materia prima celulósica para el cultivo de microalgas de biomasa adecuado para su uso como alimento

[0373] Con el fin de evaluar si Chlorella protothecoides (UTEX 250) fue capaz de utilizar una fuente de carbono no alimentaria, materiales celulósicos (rastrojo de maíz en despiece ordenado) se preparó para su uso como fuente de carbono para el cultivo heterotrófico de Chlorella protothecoides que es adecuado para uso en cualquiera de las aplicaciones de alimentos descritas anteriormente en los Ejemplos precedentes.

[0374] Material de rastrojo de maíz en húmedo, en despiece ordenado fue preparado por el National Renewable Energy Laboratory (Golden, CO) por la cocción de rastrojo de maíz en una solución de ácido sulfúrico 1,4% y deshidratar la suspensión resultante. Mediante el uso de un analizador de humedad Mettler Toledo, se determinó que los sólidos secos en el rastrojo de maíz húmedo eran 24%. Una muestra húmeda de 100 g se volvió a suspender en agua desionizada hasta un volumen final de 420 ml y el pH se ajustó a 4,8 usando NaOH 10 N. se añadió Celluclast™ (Novozymes) (una celulasa) a una concentración final de 4% y la suspensión resultante se incubó con agitación a 50°C durante 72 horas. El pH de este material se ajustó a 7,5 con NaOH (cambio de volumen despreciable), esterilizado por filtración a través de un filtro de 0,22um y se almacenó a -20°C. Una muestra estaba reservada para la determinación de la concentración de glucosa utilizando un kit basado en hexoquinasa de Sigma, tal como se describe a continuación.

[0375] Las concentraciones de glucosa se determinaron usando Reactivo de Ensayo de Glucosa Sigma n° G3293. Las muestras, tratadas como se describe anteriormente, se diluyeron 400 veces y 40 |il se añadió a la reacción. Se determinó la preparación celulósica de rastrojo de maíz que contiene aproximadamente 23 g/L de glucosa.

[0376] Después del tratamiento enzimático y la sacarificación de la celulosa en glucosa, xilosa y otros azúcares de monosacáridos, el material preparado anteriormente se evaluó como un material de alimentación para el crecimiento de Chlorella protothecoides (UTEX 250) usando el medio descrito en el Ejemplo 1. Concentraciones variables de azúcares celulósicos mezclados con glucosa pura se pusieron a prueba (0, 12,5, 25, 50 y 100% de azúcares celulósicos). Las células se incubaron en la oscuridad en las concentraciones variables de azúcares celulósicos a 28°C con agitación (300 rpm). El crecimiento se evaluó por medición de la absorbancia a 750 nm en un espectrofotómetro UV. Cultivos de Chlorella protothecoides crecieron en el material de rastrojo de maíz preparado con Celluclast, incluyendo las condiciones de medios en las 100% de azúcar fermentable se derivó celulósicamente. Experimentos similares también se realizaron con pulpa de remolacha azucarera tratada con Accelerasa como la materia prima celulósica. Al igual que los resultados obtenidos con el material de rastrojo de maíz, todos los cultivos de Chlorella protothecoides fueron capaces de utilizar el azúcar celulósico derivado como fuente de carbono.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0377]

<110> SOLAZYME, INC. BROOKS, GEOFFREY FRANKLIN, SCOTT AVILA, JEFF DECKER, STEPHEN M. BALIU, ENRIQUE RAKITSKY, WALTER PIECHOCKI, JOHN ZDANIS, DANA NORRIS, LESLIE M.

<120> COMPOSICIONES ALIMENTICIAS DE MICROALGAS NOVELAS

<130> 026172-004150PC

<150> US 12/684,894

<151> 2010-01-08

<150> US 12/684,893

<151> 2010-01-08

<150> US 12/684,892

<151> 2010-01-08

<150> US 12/684,891

<151> 2010-01-08

<150> US 12/684,889

<151> 2010-01-08

<150> US 12/684,888

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<170> Patentin version 3.5

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<212> ADN

<213> ChloreMa protothecoides

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tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cggtgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaacacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565

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<213> Chlorella protothecoides

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tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa cgtggcaagg ttaaggaaac gtatccggag 60 ccgaagcgaa agcaagtctg aacagggcga ttaagtcatt ttttctagac ccgaacccgg 120 gtgatctaac catgaccagg atgaagcttg ggtgacacca agtgaaggtc cgaaccgacc 180 gatgttgaaa aatcggcgga tgagttgtgg ttagcggtga aataccagtc gaactcggag 240 ctagctggtt ctccccgaaa tgcgttgagg cgcagcggtt cataaggctg tctaggggta 300 aagcactgtt tcggtgcggg ctgcgaaagc ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact 360 agatatgcta tttatgggcc agtgagacgg tgggggataa gcttcatcgt cgagagggaa 420 acagcccaga tcactagcta aggccccaaa atgatcgtta agtgacaaag gaggtgagaa 480 tgcagaaaca accaggaggt ttgcttagaa gcagccaccc tttaaagagt gcgtaatagc 540 tcactg 546 <210> 3

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tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cggtgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaacacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565 <210> 4

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<213> Chlorella kessleri

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tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc bu cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cggtgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaacacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565 <210> 5

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<213> Chlorella kessleri

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tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaga agtggcttgg ttaaggataa ctatccggag 60 ccagagcgaa agcaagtctg aatagggcgc ttaaaggtca ctttttctag acccgaaccc 120 gggtgatcta accatgacca ggatgaagct tgggtaacac cacgtgaagg tccgaaccga 180 ccgatgttga aaaatcggcg gatgagttgt ggttagcggt gaaataccaa tcgaactcgg 240 agctagctgg ttctccccga aatgcgttga ggcgcagcgg tttatgaggc tgtctagggg 300 taaagcactg tttcggtgcg ggctgcgaaa gcggtaccaa atcgtggcaa actctgaata 360

ctagatatgc tattcatgag ccagtgagac ggtgggggat aagcttcatc gtcaagaggg 420 aaacagccca gatcaccagc taaggcccca aaatggtcgt taagtggcaa aggaggtgag 480 aatgctgaaa caaccaggag gtttgcttag aagcagccac cctttaaaga gtgcgtaata 540 gctcactg 548

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<213> Chlorella kessleri

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tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaga agtggcttgg ttaaggataa ctatccggag 60 ccagagcgaa agcaagtctg aatagggcgc ttaaaggtca ctttttctag acccgaaccc 120 gggtgatcta accatgacca ggatgaagct tgggtaacac cacgtgaagg tccgaaccga 180 ccgatgttga aaaatcggcg gatgagttgt ggttagcggt gaaataccaa tcgaactcgg 240 agctagctgg ttctccccga aatgcgttga ggcgcagcgg tttatgaggc tgtctagggg 300 taaagcactg tttcggtgcg ggctgcgaaa gcggtaccaa atcgtggcaa actctgaata 360 ctagatatgc tattcatgag ccagtgagac ggtgggggat aagcttcatc gtcaagaggg 420 aaacagccca gatcaccagc taaggcccca aaatggtcgt taagtggcaa aggaggtgag 480 aatgctgaaa caaccaggag gtttgcttag aagcagccac cctttaaaga gtgcgtaata 540 gctcactg 548 <210>7

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<213> Parachlorella kessleri

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tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaga agtggcttgg ttaaggataa ctatccggag 60 ccagagcgaa agcaagtctg aatagggcgc ttaaaggtca ctttttctag acccgaaccc 120 gggtgatcta accatgacca ggatgaagct tgggtaacac cacgtgaagg tccgaaccga 180 ccgatgttga aaaatcggcg gatgagttgt ggttagcggt gaaataccaa tcgaactcgg 240 agctagctgg ttctccccga aatgcgttga ggcgcagcgg tttatgaggc tgtctagggg 300 taaagcactg tttcggtgcg ggctgcgaaa gcggtaccaa atcgtggcaa actctgaata 360 ctagatatgc tattcatgag ccagtgagac ggtgggggat aagcttcatc gtcaagaggg 420 aaacagccca gatcaccagc taaggcccca aaatggtcgt taagtggcaa aggaggtgag 480 aatgctgaaa caaccaggag gtttgcttag aagcagccac cctttaaaga gtgcgtaata 540 gctcactg 548

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<213> Parachlorella kessleri

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tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaga agtggcttgg ttaaggataa ctatccggag 60 ccagagcgaa agcaagtctg aatagggcgc ttaaaggtca ctttttctag acccgaaccc 120 gggtgatcta accatgacca ggatgaagct tgggtaacac cacgtgaagg tccgaaccga 180 ccgatgttga aaaatcggcg gatgagttgt ggttagcggt gaaataccaa tcgaactcgg 240 agctagctgg ttctccccga aatgcgttga ggcgcagcgg tttatgaggc tgtctagggg 300 taaagcactg tttcggtgcg ggctgcgaaa gcggtaccaa atcgtggcaa actctgaata 360 ctagatatgc tattcatgag ccagtgagac ggtgggggat aagcttcatc gtcaagaggg 420 aaacagccca gatcaccagc taaggcccca aaatggtcgt taagtggcaa aggaggtgag 480 aatgctgaaa caaccaggag gtttgcttag aagcagccac cctttaaaga gtgcgtaata 540 gctcactg 548 <210>9

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<213> Parachlorella kessleri

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tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaaagtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgatcaaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaaccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaaaaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggttctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300

ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565

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<213> Prototheca stagnora

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tgttgaagaa tgagccggcg agttaaaaaa aatggcatgg ttaaagatat ttctctgaag 60 ccatagcgaa agcaagtttt acaagctata gtcatttttt ttagacccga aaccgagtga 120

tctacccatg atcagggtga agtgttggtc aaataacatg gaggcccgaa ccgactaatg 180 gtgaaaaatt agcggatgaa ttgtgggtag gggcgaaaaa ccaatcgaac tcggagttag 240 ctggttctcc ccgaaatgcg tttaggcgca gcagtagcaa cacaaataga ggggtaaagc 300 actgtttctt ttgtgggctt cgaaagttgt acctcaaagt ggcaaactct gaatactcta 360 tttagatatc tactagtgag accttggggg ataagctcct tggtcaaaag ggaaacagcc 420 cagatcacca gttaaggccc caaaatgaaa atgatagtga ctaaggacgt gagtatgtca 480 aaacctccag caggttagct tagaagcagc aatcctttca agagtgcgta atagctcact 540 g 541 <210> 11

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<213> Prototheca moriformis

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tgttgaagaa tgagccggcg acttaaaata aatggcaggc taagagaatt aataactcga 60 aacctaagcg aaagcaagtc ttaatagggc gctaatttaa caaaacatta aataaaatct 120 aaagtcattt attttagacc cgaacctgag tgatctaacc atggtcagga tgaaacttgg 180 gtgacaccaa gtggaagtcc gaaccgaccg atgttgaaaa atcggcggat gaactgtggt 240 tagtggtgaa ataccagtcg aactcagagc tagctggttc tccccgaaat gcgttgaggc 300 gcagcaatat atctcgtcta tctaggggta aagcactgtt tcggtgcggg ctatgaaaat 360 ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact agaaatgacg atatattagt gagactatgg 420 gggataagct ccatagtcga gagggaaaca gcccagacca ccagttaagg ccccaaaatg 480 ataatgaagt ggtaaaggag gtgaaaatgc aaatacaacc aggaggttgg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573

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<211> 573

<212> ADN

<213> Prototheca moriformis

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tgttgaagaa tgagccggcg acttaaaata aatggcaggc taagagaatt aataactcga 60 aacctaagcg aaagcaagtc ttaatagggc gctaatttaa caaaacatta aataaaatct 120 aaagtcattt attttagacc cgaacctgag tgatctaacc atggtcagga tgaaacttgg 180 gtgacaccaa gtggaagtcc gaaccgaccg atgttgaaaa atcggcggat gaactgtggt 240 tagtggtgaa ataccagtcg aactcagagc tagctggttc tccccgaaat gcgttgaggc 300 gcagcaatat atctcgtcta tctaggggta aagcactgtt tcggtgcggg ctatgaaaat 360

ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact agaaatgacg atatattagt gagactatgg 420 gggataagct ccatagtcga gagggaaaca gcccagacca ccagttaagg ccccaaaatg 480 ataatgaagt ggtaaaggag gtgaaaatgc aaatacaacc aggaggttgg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573

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<213> Chlorella minutissima

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tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cggtgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaacacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565

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<213> ChloreMa sp.

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<212> ADN

<213> Chlorella sp.

<400> 15

tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa cgtggcaagg ttaaggacat gtatccggag 60 ccgaagcgaa agcaagtctg aatagggcgc ctaagtcatt ttttctagac ccgaacccgg 120 gtgatctaac catgaccagg atgaagcttg ggtgacacca agtgaaggtc cgaaccgacc 180 gatgttgaaa aatcggcgga tgagttgtgg ttagcggtga aataccagtc gaactcggag 240 ctagctggtt ctccccgaaa tgcgttgagg cgcagcggtt cataaggctg tctaggggta 300 aagcactgtt tcggtgcggg ctgcgaaagc ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact 360 agatatgcta tttatgagcc agtgagacgg tgggggataa gcttcatcgt cgagagggaa 420 acagcccaga tcactagcta aggcccctaa atgatcgtta agtgacaaag gaggtgagaa 480 tgcagaaaca accaggaggt ttgcttagaa gcagccaccc tttaaagagt gcgtaatagc 540 tcactg 546

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<213> ChloreMa sorokiniana

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tgttgaagaa tgagccggcg acttatagga agtggcaggg ttaaggaaga atctccggag 60 cccaagcgaa agcgagtctg aaaagggcga tttggtcact tcttatggac ccgaacctgg 120 atgatctaat catggccaag ttgaagcatg ggtaacacta tgtcgaggac tgaacccacc 180 gatgttgaaa aatcggggga tgagctgtga ttagcggtga aattccaatc gaattcagag 240 ctagctggat ctccccgaaa tgcgttgagg cgcagcggcg acgatgtcct gtctaagggt 300 agagcgactg tttcggtgcg ggctgcgaaa gcggtaccaa gtcgtggcaa actccgaata 360 ttaggcaaag gattccgtga gccagtgaga ctgtggggga taagcttcat agtcaagagg 420 gaaacagccc agaccatcag ctaaggcccc taaatggctg ctaagtggaa aaggatgtga 480 gaatgctgaa acaaccagga ggttcgctta gaagcagcta ttccttgaaa gagtgcgtaa 540 tagctcactg 550

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<212> ADN

<213> Parachlorella beijerinkii

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tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaga agtggcttgg ttaaggataa ctatccggag 60 ccagagcgaa agcaagtctg aatagggcgc ttaaaggtca ctttttctag acccgaaccc 120 gggtgatcta accatgacca ggatgaagct tgggtaacac cacgtgaagg tccgaaccga 180 ccgatgttga aaaatcggcg gatgagttgt ggttagcggt gaaataccaa tcgaactcgg 240 agctagctgg ttctccccga aatgcgttga ggcgcagcgg tttatgaggc tgtctagggg 300 taaagcactg tttcggtgcg ggctgcgaaa gcggtaccaa atcgtggcaa actctgaata 360 ctagatatgc tattcatgag ccagtgagac ggtgggggat aagcttcatc gtcaagaggg 420 aaacagccca gatcaccagc taaggcccca aaatggtcgt taagtggcaa aggaggtgag 480 aatgctgaaa caaccaggag gtttgcttag aagcagccac cctttaaaga gtgcgtaata 540 gctcactg 548

<210> 18

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<212> ADN

<213> Chlorella luteoviridis

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tgttgaagaa tgagccggcg acttataggg ggtggcgtgg ttaaggaagt aatccgaagc 60 caaagcgaaa gcaagttttc aatagagcga ttttgtcacc ccttatggac ccgaacccgg 120 gtgatctaac cttgaccagg atgaagcttg ggtaacacca agtgaaggtc cgaactcatc 180 gatcttgaaa aatcgtggga tgagttgggg ttagttggtt aaatgctaat cgaactcgga 240 gctagctggt tctccccgaa atgtgttgag gcgcagcgat taacgaaata ttttgtacgg 300 tttaggggta aagcactgtt tcggtgcggg ctgcgaaagc ggtaccaaat cgtggcaaac 360 tctgaatact aagcctgtat accgttagtc agtgagagta taggggataa gctctatact 420 caagagggaa acagcccaga tcaccagcta aggccccaaa atgacagcta agtggcaaag 480 gaggtgaaag tgcagaaaca accaggaggt tcgcttagaa gcagcaaccc tttaaagagt 540 gcgtaatagc tcactg 556 <210> 19

<211> 548

<212> ADN

<213> Chlorella vulgaris

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ctagatatgc tattcatgag ccagtgagac ggtgggggat aagcttcatc gtcaagaggg 420 aaacagccca gatcaccagc taaggcccca aaatggtcgt taagtggcaa aggaggtgag 480 aatgctgaaa caaccaggag gtttgcttag aagcagccac cctttaaaga gtgcgtaata 540 gctcactg 548 <210> 20

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<212> ADN

<213> Chlorella reisiglii

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tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagto tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cggtgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaacacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565 <210> 21

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<212> ADN

<213> Chlorella ellipsoidea

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tgttgaagaa tgagccggcg acttataggg ggtggcttgg ttaaggacta caatccgaag 60 cccaagcgaa agcaagtttg aagtgtacac acattgtgtg tctagagcga ttttgtcact 120 ccttatggac ccgaacccgg gtgatctatt catggccagg atgaagcttg ggtaacacca 180 agtgaaggtc cgaactcatc gatgttgaaa aatcgtggga tgagttgtga ataggggtga 240 aatgccaatc gaactcggag ctagctggtt ctccccgaaa tgtgttgagg cgcagcgatt 300 cacgatctaa agtacggttt aggggtaaag cactgtttcg gtgcgggctg ttaacgcggt 360 acoaaatcgt ggcaaactaa gaatactaaa cttgtatgcc gtgaatcagt gagactaaga 420 gggataagct tcttagtcaa gagggaaaca gcccagatca ccagctaagg ccccaaaatg 480 acagctaagt ggcaaaggag gtgagagtgc agaaacaacc aggaggtttg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573

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<212> ADN

<213> ChloreMa saccharophila

<400> 22

tgttgaagaa tgagccggcg acttataggg ggtggcttgg ttaaggacta caatccgaag 60 cccaagcgaa agcaagtttg aagtgtacac acgttgtgtg tctagagcga ttttgtcact 120 ccttatggac ccgaacccgg gtgatctatt catggccagg atgaagcttg ggtaacacca 180 agtgaaggtc cgaactcatc gatgttgaaa aatcgtggga tgagttgtga ataggggtga 240 aatgccaatc gaactcggag ctagctggtt ctccccgaaa tgtgttgagg cgcagcgatt 300 cacgatctaa agtacggttt aggggtaaag cactgtttcg gtgcgggctg ttaacgcggt 360 accaaatcgt ggcaaactaa gaatactaaa cttgtatgcc gtgaatcagt gagactaaga 420 gggataagct tcttagtcaa gagggaaaca gcccagatca ccagctaagg ccccaaaatg 480 acagctaagt ggcaaaggag gtgagagtgc agaaacaacc aggaggtttg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 23

<211> 573

<212> ADN

<213> Chlorella saccharophila

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tgttgaagaa tgagccggcg acttataggg ggtggcttgg ttaaggacta caatccgaag 60 cccaagcgaa agcaagtttg aagtgtacac acattgtgtg tctagagcga ttttgtcact 120 ccttatggac ccgaacccgg gtgatctatt catggccagg atgaagcttg ggtaacacca 180 agtgaaggtc cgaactcatc gatgttgaaa aatcgtggga tgagttgtga ataggggtga 240 aatgccaatc gaactcggag ctagctggtt ctccccgaaa tgtgttgagg cgcagcgatt 300 cacgatctaa agtacggttt aggggtaaag cactgtttcg gtgcgggctg ttaacgcggt 360 accaaatcgt ggcaaactaa gaatactaaa cttgtatgcc gtgaatcagt gagactaaga 420 gggataagct tcttagtcaa gagggaaaca gcccagatca ccagctaagg ccccaaaatg 480 acagctaagt ggcaaaggag gtgagagtgc agaaacaacc aggaggtttg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 24

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

<400> 24

tgttgaagaa tgagccggcg ac 22

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<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador sintético

<400> 25

cagtgagcta ttacgcactc 20

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<211> 546

<212> ADN

<213> Chlorella protothecoides

<400> 26

tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa cgtggcaagg ttaaggaaac gtatccggag 60 ccgaagcgaa agcaagtctg aacagggcga ttaagtcatt ttttctagac ccgaacccgg 120 gtgatctaac catgaccagg atgaagcttg ggtgacacca agtgaaggtc cgaaccgacc 180 gatgttgaaa aatcggcgga tgagttgtgg ttagcggtga aataccagtc gaactcggag 240 ctagctggtt ctccccgaaa tgcgttgagg cgcagcggtt cataaggctg tctaggggta 300 aagcactgtt tcggtgcggg ctgcgaaagc ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact 360 agatatgcta tttatgggcc agtgagacgg tgggggataa gcttcatcgt cgagagggaa 420 acagcccaga tcactagcta aggccccaaa atgatcgtta agtgacaaag gaggtgagaa 480 tgcagaaaca accaggaggt ttgcttagaa gcagccaccc tttaaagagt gcgtaatagc 540 tcactg 546 <210> 27

<211> 565

<212> ADN

<213> Chlorella protothecoides

<400> 27

tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cggtgtagta gtgagactgt gggggataag 420

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de harina libre de gluten que comprende una harina de microalgas y al menos una otra harina libre de gluten excepto la harina de microalgas, en donde la harina de microalgas comprende un homogeneizado de la biomasa de microalgas que contiene células lisadas predominantemente o completamente en forma de un polvo y contiene al menos 16% en aceite de triglicérido de peso en seco, en donde

la al menos una otra harina libre de gluten se selecciona del grupo que consiste en harina de amaranto, harina de raíz flecha, harina de trigo sarraceno, harina de arroz, harina de garbanzo, harina de maíz, harina de mijo, harina de patata, harina de almidón de patata, harina de quinoa, harina de sorgo, harina de soja, harina de habas, harina de leguminosa, tapioca (yuca) harina, harina de teff, harina de alcachofa, harina de almendra, harina de bellota, harina de coco, harina de castañas, harina de maíz y harina de taro;

el contenido de clorofila de la biomasa de microalgas es inferior a 200 ppm; y

la biomasa de microalgas se deriva de Chlorella protothecoides.

2. La harina de la reivindicación 1, en donde el tamaño medio de partículas de biomasa en la harina de algas micro está entre 1 y 100 |im.

3. La harina de la reivindicación 1, en donde la harina de microalgas tiene un contenido de humedad de 10% o menos, 0 5% o menos en peso.

4. La harina de la reivindicación 1, en donde la biomasa de microalgas tiene entre 45% y 70% en peso de aceite triglicérido seco.

5. La harina de la reivindicación 1, en donde 60-75% del aceite es un 18: 1 lípido en una forma de glicerolípido.

6. La harina de la reivindicación 1, en donde el aceite es menor que 2% 14: 0, 13-16% 16: 0, 1-4% 18: 0, 64-70% 18: 1, 10-16% 18: 2, 0,5-2,5% 18: 3 y menos de 2% de aceite de una longitud de cadena de carbono de 20 o más.

7. La harina de la reivindicación 1, que comprende la biomasa de microalgas que es de entre 25% a 40% de carbohidratos en peso seco.

8. La harina de la reivindicación 7, en donde el componente hidrato de carbono de la biomasa de microalgas es entre fibra dietética 25-35% y 2% a 8% de azúcar libre incluyendo sacarosa, en peso seco.

9. La harina de la reivindicación 8, en donde la composición de monosacáridos del componente de fibra dietética de la biomasa es 0,1-4% de arabinosa, 5-15% manosa, 15-35% de galactosa y 50-70% de glucosa.

10. La harina de la reivindicación 1, en donde la biomasa de microalgas tiene entre 20-115 |ig/g del total de carotenoides, incluyendo 20-70|ig/g luteína.

11. La harina de la reivindicación 1, en donde la biomasa de microalgas tiene 1-8 mg/100 g de tocoferoles totales, incluyendo 2-6 mg/100 g de tocoferol alfa.

12. La harina de la reivindicación 1, en donde la biomasa de microalgas tiene 0,05-0,30 mg/g de tocotrienoles totales, incluyendo 0,10-0,25 mg/g de tocotrienol alfa.

13. La harina de la reivindicación 1, que comprende además un antioxidante.

14. Un producto alimenticio libre de gluten formado por combinación de biomasa de microalgas que comprende al menos 16% de aceite de triglicérido en peso seco y al menos una otra harina libre de gluten, en donde:

la harina libre de gluten comprende al menos una de las siguientes: harina de amaranto, flecha harina de raíz, harina de trigo sarraceno, harina de arroz, harina de garbanzo, harina de maíz, harina de mijo, harina de patata, harina de almidón de patata, harina de quinoa, harina de sorgo, harina de soja, harina de habas, harina de leguminosa, tapioca (yuca) harina, harina teff, harina de alcachofa, harina de almendra, harina de bellota, harina de coco, harina de castañas, harina de maíz y harina de taro; la biomasa de microalgas en la forma de una harina de microalgas, que es un homogeneizado de la biomasa de microalgas que contiene células lisadas predominantemente o completamente en forma de polvo; el contenido de clorofila de la biomasa de microalgas es inferior a 200 ppm; y

la biomasa de microalgas se deriva de Chlorella protothecoides.

15. El producto de la reivindicación 14, en donde la harina de microalgas tiene un tamaño medio de partícula de entre 1 y 100 |im.

16. El producto de la reivindicación 14, en donde el aceite de triglicéridos es menor que 2% 14: 0, 13-16% 16: 0, 1-4% 18: 0, 64-70% 18: 1, 10-16% 18: 2, 0,5-2,5% 18: 3 y menos de 2% de aceite de una longitud de cadena de carbono de 20 o más.

17. El producto de la reivindicación 14, en donde la biomasa de microalgas tiene entre 25-40% de carbohidratos en peso seco.

18. El producto de la reivindicación 14, en donde el componente hidrato de carbono de la biomasa es de entre fibra dietética 25-35% y el azúcar libre de 2% a 8% incluyendo sacarosa en peso seco.

19. El producto de la reivindicación 18, en donde la composición de monosacáridos del componente de fibra dietética de la biomasa es 0,1-4% de arabinosa, 5-15% manosa, 15-35% de galactosa y 50-70% de glucosa.

20. El producto de la reivindicación 14, en donde la biomasa de microalgas tiene entre 20-115 |ig/g de carotenoides totales, incluyendo 20-70 |ig/g luteína.

21. El producto de la reivindicación 14, en donde la biomasa tiene 1-8 mg/100 g de tocoferoles totales, incluyendo 2 6 mg/100 de tocoferol alfa.

22. El producto de la reivindicación 14, en donde la biomasa tiene 0,05-0,30 mg/g tocotrienoles totales, incluyendo 0,10-0,25 mg/g tocotrienol alfa.

23. El producto de la reivindicación 14, en donde el aceite de triglicérido es de menos de 5% de ácido docosahexanoico (DHA) (22: 6) en peso seco.

24. El producto de la reivindicación 14, que es un producto horneado, pan, cereales, galleta o pasta.