KR101964965B1 - 재조합 유지성 미생물로부터 생산된 맞춤 오일 - Google Patents

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Abstract

오일, 연료, 함유 화학 제품 및 기타 다른 화합물을 재조합 미생물, 예를 들어 오일 함유 미생물 내에서 생산하기 위한 방법 및 조성물, 그리고 이와 같은 미생물을 저비용으로 배양하는 방법이 제공된다. 예를 들어 리파제, 수크로스 운반체, 수크로스 인버타제, 프럭토키나제, 다당류 분해 효소, 케토 아실-ACP 합성 효소, 지방 아실-ACP 티오에스테라제, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소, 지방 아실-CoA 환원 효소, 지방 알데하이드 환원 효소, 지방산 하이드록실라제, 불포화 효소, 지방 알데하이드 탈카보틸화 효소 및/또는 아실기 운반 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 함유하는 미세 조류 세포는, 교통 수단의 연료, 예를 들어 재생 디젤, 바이오디젤 및 재생 제트 연료, 그리고 함유 화학 제품, 예를 들어 기능성 유체, 계면 활성제, 비누 및 윤활제를 제조하는데 유용하다.

Description

재조합 유지성 미생물로부터 생산된 맞춤 오일{TAILORED OILS PRODUCED FROM RECOMBINANT OLEAGINOUS MICROORGANISMS}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. 119(e)에 따라서 2011년 2월 2일자로 출원된 미국 가출원 제61/438,969호, 2011년 4월 18일자로 출원된 미국 가출원 제61/476,691호, 2011년 5월 10일자로 출원된 미국 가출원 제61/484,458호, 및 2011년 10월 18일자로 출원된 미국 가출원 제61/548,616호의 이익을 주장한다. 이들 각각의 출원은 모든 목적을 위해 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다.
서열목록에 대한 참조
본 출원은 상세한 설명의 마지막에 나타낸 서열 목록을 포함한다.
기술분야
본 발명은 미생물로부터 만들어진 오일, 연료 및 함유 화학 제품의 제조에 관한 것이다. 특히, 본원은 오일 함유 미세 조류; 지질, 지방산 에스테르, 지방산, 알데하이드, 알코올 및 알칸을 포함하는 유용한 화합물의 제조를 위해 상기 미세 조류를 배양하는 방법; 및 상기 미세 조류를 유전적으로 변경시켜 제조 효율을 개선시키고 상기 미세 조류에 의해 생성된 오일의 유형과 조성을 변경시키는 방법 및 시약에 관한 것이다.
화석 연료는 썩은 식물 및 동물로부터 형성되어 수억년 이상 동안 지각에서 열 및 압력에 노출됨에 의해 원유, 석탄, 천연 가스 또는 중유로 전환된, 매장된 유기 물질의 연소성 지질학적 퇴적물에 대한 일반적인 용어이다. 화석 연료는 한정된 재생가능하지 않은 자원이다. 세계 경제의 에너지에 대한 수요 증가는 또한 탄화수소 비용에 대한 가중된 압력을 부여하였다. 에너지외에도 플라스틱 및 화학 물질 제조업체를 포함하는 많은 산업은 이들의 제조 공정을 위한 공급원료로서 탄화수소의 유용성에 크게 의존한다. 현재 공급 자원에 대한 비용 효율이 높은 대용물이 에너지 및 이들의 원료 비용에 대한 상승된 압력을 완화시키는데 일조할 수 있었다.
PCT 공개 제2008/151149호는 오일 제조용의 미세 조류를 배양하기 위한 방법 및 재료를 기술하고 있고 특히 미세 조류 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides)에 의해 생성된 오일로부터 디젤 연료의 제조를 예시하고 있다. 연료, 화학 물질, 식품 및 기타 다른 용도를 위한 개선된 오일 제조 방법, 특히 단쇄의 길이 및 더 높은 포화도를 갖고 안료를 포함하지 않는 오일을 보다 높은 수율 및 효율로 제조하는 방법이 여전히 요구되고 있다. 본 발명은 상기 필요성을 충족시킨다.
폴리우레탄은 카바메이트(우레탄) 결합을 포함하는 화합물이다. 통상적으로, 폴리우레탄은 유기 단위들로 이루어진 중합체이다. 이 중합체는 이소시아네이트부를 포함하는 제1 유기 단위(C(O)N-R1-NC(O)) 및 하이드록실기를 포함하는 제2 유기 단위(HO-R2-OH)의 반응에 의해 제조된다. 폴리우레탄은 화학식 -[C(O)NH-R1-NHC(O)-O-R2-O]m-(식 중, 아래 첨자 m은 중합체 중에 함유된 단량체의 수를 나타내는 수임)으로서 표시될 수 있다. R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있지만, 통상적으로는 상이하다. 폴리우레탄은 다수의 상이한 분야, 예를 들어 가요성 재료 및 경직성 재료에 사용된다. 폴리우레탄은 신발, 자동차, 비행기, 부싱(bushing), 개스킷, 접착제, 양탄자, 스판덱스 섬유 및 전자 제품의 하우징 등에 사용된다.
본 발명의 예시적인 구체예는 변경된 글리세로지질 프로필을 생산하는 유지성 세포와, 이 세포로부터 생산되는 생성물을 제공한다. 유지성 세포의 예로서는 제II형 지질 생합성 경로를 가지는 미생물 세포를 포함한다. 구체예는 또한 이 세포를 사용하여 얻을 수 있는 천연 오일을 특징으로 한다. 구체예는 단백질, 예를 들어 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자를 발현하는 재조합 세포를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 세포로부터 생성되는 지질 및 오일계 생성물, 예를 들어 연료, 예를 들어 바이오디젤, 재생 디젤 및 제트 연료, 식품용 오일 및 화학 물질을 제공한다.
제1 양태에서, 본 발명은 C8:0이 3% 이상인 지질 프로필을 가지는 미세 조류 세포를 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 지질 프로필은 C8:0이 12% 이상이다. 몇몇 구체예에서, 세포는 재조합 세포이다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 세포는 사슬 길이가 C8인 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수 분해 활성을 가지는 아실-ACP 티오에스테라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 외인성 유전자는 쿠페아 팔루스트리스(Cuphea palustris) 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 프로토테카(Prototheca) 세포이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 표 1에 제시된 미세 조류들로부터 선택되는 미세 조류 속 또는 종에 속하는 것이다.
제2 양태에서, 본 발명은 C10:0이 4% 이상인 지질 프로필을 가지는 미세 조류 세포를 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 지질 프로필은 C10:0이 18% 이상이다. 몇몇 경우에 있어서, 지질 프로필은 C10:0이 20% 이상이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류 세포의 지질 내용물은 C12:0을 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, C10:0 대 C12:0의 비율은 3:1 이상이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류 세포의 지질 내용물은 C14:0을 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, C10:0 대 C14:0의 비율은 10:1 이상이다. 몇몇 구체예에서, 세포는 재조합 세포이다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 세포는 사슬 길이가 C10인 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수 분해 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 외인성 유전자는 쿠페아 후커리아나(Cuphea hookeriana) 및 얼머스 아메리카나(Ulmus americana)로 이루어진 군으로부터 선택되는 종으로부터 유래하는 지방 아실-ACP 티오에스테라제 단백질을 암호화한다. 몇몇 구체예에서, 지방 아실-ACP 티오에스테라제 단백질은 쿠페아 후커리아나 및 얼머스 아메리카나로 이루어진 군으로부터 선택되는 종으로부터 유래한다. 몇몇 경우에 있어서, 지방 아실-ACP 티오에스테라제 유전자는 사슬 길이가 C10인 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수 분해 활성을 가지는 쿠페아 후커리아나 및 얼머스 아메리카나로부터 유래하는 지방 아실-ACP 티오에스테라제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 경우에 있어서, 세포는 프로토테카 세포이다. 몇몇 구체예에서, 세포는 표 1에 제시된 미세 조류들로부터 선택되는 미세 조류 속 또는 종에 속하는 것이다.
제3 양태에서, 본 발명은 C12:0이 13% 이상인 지질 프로필을 가지는 미세 조류 세포를 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 재조합 세포이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 세포는 사슬 길이가 C12인 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수 분해 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 지방 아실-ACP 티오에스테라제 단백질은 움벨루라리아 캘리포니카(Umbellularia californica) 및 신나모뮴 캠포라(Cinnamomum camphora)로 이루어진 군으로부터 선택되는 종으로부터 유래한다. 몇몇 경우에 있어서, 지방 아실-ACP 티오에스테라제 유전자는 사슬 길이가 C12인 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수 분해 활성을 가지는, 움벨루라리아 캘리포니카 및 신나모뮴 캠포라로부터 유래하는 지방 아실-ACP 티오에스테라제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 세포는 프로토테카 세포이다.
제4 양태에서, 본 발명은 C14:0이 10% 이상인 지질 프로필을 가지는 미세 조류 세포를 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 지질 프로필은 C14:0이 35% 이상이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류 세포의 지질 내용물은 C12:0을 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, C14:0 대 C12:0의 비율은 3:1 이상이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 재조합 세포이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 세포는 사슬 길이가 C14인 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수 분해 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 지방 아실-ACP 티오에스테라제 단백질은 신나모뮴 캠포라 및 얼머스 아메리카나로 이루어진 군으로부터 선택되는 종으로부터 유래한다. 몇몇 경우에 있어서, 지방 아실-ACP 티오에스테라제 유전자는 사슬 길이가 C14인 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수 분해 활성을 가지는 신나모뮴 캠포라 및 얼머스 아메리카나로부터 유래하는 지방 아실-ACP 티오에스테라제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 프로토테카 세포이다. 몇몇 구체예에서, 세포는 표 1에 제시된 미세 조류들로부터 선택되는 미세 조류 속 또는 종에 속하는 것이다.
제5 양태에서, 본 발명은 C16:0이 15% 이상인 지질 프로필을 가지는 미세 조류 세포를 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 지질 프로필은 C16:0이 39% 이상이다. 몇몇 경우에 있어서, 지질 프로필은 C16:0이 67% 이상이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 재조합 세포이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 세포는 사슬 길이가 C16인 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수 분해 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 지방 아실-ACP 티오에스테라제 단백질은 쿠페아 후커리아나 및 얼머스 아메리카나로부터 선택되는 종으로부터 유래한다. 몇몇 구체예에서, 재조합 세포는 사슬 길이가 C16인 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수 분해 활성을 가지는, 쿠페아 후커리아나 및 얼머스 아메리카나로 이루어진 군으로부터 선택되는 종으로부터 유래하는 지방 아실-ACP 티오에스테라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 프로토테카 세포이다. 몇몇 구체예에서, 미세 조류 세포는 내인성 불포화 효소 유전자를 추가로 포함하는데, 여기서 상기 내인성 불포화 효소 유전자는 돌연 변이되지 않은 불포화 효소보다 활성이 작거나 불활성인 불포화 효소를 암호화하도록 돌연 변이되었거나, 또는 상기 내인성 불포화 효소는 미세 조류 세포 게놈으로부터 결실되었다.
제6 양태에서, 본 발명은 지질 프로필이 포화 지방산 60% 이상인 미세 조류 세포를 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류 세포는 지질 프로필이 포화 지방산 85% 이상이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 재조합 세포이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 세포는 사슬 길이가 C10 내지 C16인 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수 분해 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 프로토테카 세포이다.
제7 양태에서, 본 발명은 C18:0이 19% 이상인 지질 프로필을 가지는 미세 조류 세포를 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 지질 프로필은 C18:0 27% 이상이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 재조합 세포이다, 몇몇 구체예에서, 재조합 세포는 사슬 길이가 C18인 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수 분해 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 지방 아실-ACP 티오에스테라제 단백질은 브라시카 나푸스(Brassica napus)로부터 선택되는 종으로부터 유래한다. 몇몇 구체예에서, 재조합 세포는 사슬 길이가 C16인 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수 분해 활성을 가지는 브라시카 나푸스로부터 유래하는 지방 아실-ACP 티오에스테라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다.
제8 양태에서, 본 발명은 쿠페아 후커리아나, 움벨루라리아 캘리포니카, 신나모뮴 캠포라, 쿠페아 팔루스트리스, 쿠페아 란세올라타(Cuphea lanceolata), 아이리스 게르마니카(Iris germanica), 미리스티카 프래그란스(Myristica fragrans), 가르시니아 망고스타나(Garcinia mangostana), 엘라에이스 기니엔시스(Elaeis guiniensis), 브라시카 나푸스, 리시누스 커뮤니스(Ricinus communis) 및 얼머스 아메리카나로 이루어진 군으로부터 유래하는 지방 아실-ACP 티오에스테라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함하는 미세 조류 세포를 제공한다.
제9 양태에서, 본 발명은 발현 구조물을 포함하는 미세 조류 세포를 제공하는데, 여기서 상기 발현 구조물은, 내인성 유전자가 돌연 변이되지 않은 유전자 생성물보다 활성이 작거나 불활성인 유전자 생성물을 암호화하도록 돌연 변이된 것, 내인성 유전자가 미세 조류 세포 게놈으로부터 결실된 것 및 RNA 유도 기작을 통한 것으로 이루어진 방법으로부터 선택된 내인성 유전자의 발현을 하향 조절한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 방법은 RNA 유도 기작, 예를 들어 RNAi, 안티센스 및/또는 dsRNA이다. 몇몇 경우에 있어서, 내인성 유전자는 불포화 효소 유전자이다. 몇몇 구체예에서, 불포화 효소 유전자는 델타 12 지방산 불포화 효소 유전자이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 프로토테카 세포이다.
제10 양태에서, 본 발명은 상기 양태들 중 임의의 것에 기술된 미세 조류 세포를 제공하는데, 여기서 상기 미세 조류 세포는 탄소원으로서 스타키오스, 라피노스 또는 멜리비오스를 사용하여 배양된다.
제11 양태에서, 본 발명은 지질 프로필이 C18:2 2% 이하인 미세 조류 세포를 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명은 지질 프로필이 C18:2 7% 이하인 미세 조류 세포를 제공한다.
제12 양태에서, 본 발명은 지질을 제조하는 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) 세포가 건조 중량으로 지질이 20% 이상일 때까지 상기 논의한 바와 같은 미세 조류 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 수용성 바이오매스 성분들로부터 지질을 분리하는 단계를 포함한다.
제13 양태에서, 본 발명은 지질을 제조하는 다른 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) 2개의 상이한 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 2개의 상이한 외인성 유전자를 함유하는 미세 조류 세포를 배양하는 단계, 및 (b) 수용성 바이오매스 성분들로부터 지질을 분리하는 단계를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 외인성 유전자들 중 하나 이상은 표 4에 제시된 티오에스테라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화한다.
제14 양태에서, 본 발명은 오일계 생성물을 제조하는 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) 세포가 건조 중량으로 지질이 10% 이상일 때까지 상기 논의한 바와 같은 미세 조류 세포를 배양하는 단계; (b) 미세 조류 세포로부터 지질을 분리하는 단계; (c) 지질을 대상으로, 비누화; 복분해; 산 가수 분해; 알칼리 가수 분해; 효소 가수 분해; 촉매 가수 분해; 고온 응축수 가수 분해; 촉매 가수 분해 반응(이 경우, 지질은 글리세롤과 지방산으로 분할됨); 지방 질소 화합물을 생성하는 아민화 반응; 1 염기산 및 2 염기산을 생성하는 오존 분해 반응; 효소 분할 및 가압 분할로 이루어진 군으로부터 선택되는 트리글리세라이드 분할 반응; 가수 분해 반응 이후의 축합 반응; 수소 가공 반응; 수소 가공 반응 및 탈산소화 반응 및/또는 수소 가공 반응 이전 또는 이와 동시에 진행되는 축합 반응; 가스 제거 반응; 수소화 분해 반응, 수소화, 연속적 수소화-수소화 분해 반응, 연속적 수소화 분해-수소화 반응 및 수소화-수소화 분해 복합 반응으로 이루어진 군으로부터 선택되는 탈산소화 반응; 탈산소화 반응 후 축합 반응; 에스테르화 반응; 에스테르 교환 반응; 에스테르 결합 전이 반응; 하이드록실화 반응; 및 하이드록실화 반응 후 축합 반응으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화학 반응을 진행시키는 단계; 그리고 (d) 임의로 기타 다른 성분들로부터 반응 생성물을 분리하여, 오일계 생성물을 제조하는 단계를 포함한다.
몇몇 경우에 있어서, 오일계 생성물은 비누 또는 연료 생성물로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 오일계 생성물은 바이오디젤, 재생 디젤 및 제트 연료로 이루어진 군으로부터 선택되는 연료 생성물이다. 몇몇 경우에 있어서, 연료 생성물은, (i) 총 카로티노이드 0.025mcg/g 내지 0.3mcg/g, 바람직하게는 0.05mcg/g 내지 0.244mcg/g; (ii) 라이코펜 0.005mcg/g 미만, 바람직하게는 0.003mcg/g 미만; (iii) 베타 카로틴 0.005mcg/g 미만, 바람직하게는 0.003mcg/g 미만; (iv) 엽록소 A 0.025mcg/g 내지 0.3mcg/g, 바람직하게는 0.045mcg/g 내지 0.268mcg/g; (v) 감마 토코페롤 35mcg/g 내지 175mcg/g, 바람직하게는 38.3mcg/g 내지 164mcg/g; (vi) 브라시카스테롤, 캄페스테롤, 스티그나스테롤 또는 베타-시토스테롤 0.25% 미만; (vii) 총 토코트리에놀 225mcg/g 내지 350mcg/g, 바람직하게는 249.6mcg/g 내지 325.3mcg/g; (viii) 루테인 0.0025mcg/g 내지 0.05mcg/g, 바람직하게는 0.003mcg/g 내지 0.039mcg/g; 또는 (ix) 토코페롤 50mcg/g 내지 300mcg/g, 바람직하게는 60.8mcg/g 내지 261.7mcg/g의 속성들 중 하나 이상의 속성을 가지는 바이오디젤이다. 몇몇 경우에 있어서, 연료 생성물은 T10 내지 T90이 20℃, 40℃ 또는 60℃ 이상인 재생 디젤이다. 몇몇 경우에 있어서, 연료 생성물은 HRJ-5 및/또는 ASTM 사양 D1655와 부합하는 제트 연료이다.
제15 양태에서, 본 발명은 (a) 지질 프로필이 C8:0 1% 내지 5% 이상, 바람직하게는 3% 이상, C10:0 2.5% 이상, 바람직하게는 4% 이상, C12:0 10% 이상, 바람직하게는 13% 이상, C14:0 10% 이상 및/또는 포화 지방산 60% 이상이고, (b) (i) 총 카로티노이드 0.025mcg/g 내지 0.3mcg/g, 바람직하게는 0.05mcg/g 내지 0.244mcg/g; (ii) 라이코펜 0.005mcg/g 미만, 바람직하게는 0.003mcg/g 미만; (iii) 베타 카로틴 0.005mcg/g 미만, 바람직하게는 0.003mcg/g 미만; (iv) 엽록소 A 0.025mcg/g 내지 0.3mcg/g, 바람직하게는 0.045mcg/g 내지 0.268mcg/g; (v) 감마 토코페롤 35mcg/g 내지 175mcg/g, 바람직하게는 38.3mcg/g 내지 164mcg/g; (vi) 브라시카스테롤, 캄페스테롤, 스티그나스테롤 또는 베타-시토스테롤 0.25% 미만; (vii) 총 토코트리에놀 225mcg/g 내지 350mcg/g, 바람직하게는 249.6mcg/g 내지 325.3mcg/g; (viii) 루테인 0.0025 mcg/g 내지 0.05mcg/g, 바람직하게는 0.003mcg/g 내지 0.039mcg/g; 또는 (ix) 토코페롤 50mcg/g 내지 300mcg/g, 바람직하게는 60.8mcg/g 내지 261.7mcg/g의 속성들 중 하나 이상을 포함하는 트리글리세라이드 오일을 제공한다.
제16 양태에서, 본 발명은 C8:C10 지방산 비율이 5:1 이상인 미세 조류로부터 분리된 트리글리세라이드 오일을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 트리글리세라이드 오일은 미세 조류 세포(예를 들어, 프로토테카 속에 속하는 미세 조류 세포)로부터 분리되는데, 여기서 상기 미세 조류 세포는 외인성 유전자를 포함한다. 관련 양태에서, 본 발명은 포화 지방산을 60% 이상 포함하는, 미세 조류로부터 분리되는 트리글리세라이드 오일을 제공한다.
다른 관련 양태에서, 본 발명은 C16:14 지방산 비율이 약 2:1인 지질 프로필을 가지는 미세 조류로부터 분리된 트리글리세라이드 오일을 제공한다. 다른 관련 양태에서, 본 발명은 미세 조류 세포에 의해 생산되는 트리글리세라이드 오일을 제공하는데, 여기서 상기 미세 조류 세포는 외인성 유전자를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 속에 속하는 것이다.
또 다른 관련 양태에서, 본 발명은 C12:14 지방산 비율이 약 3:1인 지질 프로필을 가지는 미세 조류로부터 분리된 트리글리세라이드 오일을 제공한다. 다른 관련 양태에서, 본 발명은 미세 조류 세포에 의해 생산되는 트리글리세라이드 오일을 제공하는데, 여기서 상기 미세 조류 세포는 외인성 유전자를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 속에 속하는 것이다.
제17 양태에서, 본 발명은 (a) C12 미만 지방산이 1% 미만; C14:0 지방산이 1% 내지 10%, 바람직하게는 2% 내지 7%; C16:0 지방산이 20% 내지 35%, 바람직하게는 23% 내지 30%; C18:0 지방산이 5% 내지 20%, 바람직하게는 7% 내지 15%; C18:1 지방산이 35% 내지 60%, 바람직하게는 40% 내지 55%; 그리고 C18:2 지방산이 1% 내지 20%, 바람직하게는 2% 내지 15%인 지질 프로필; 및 (b)(i) 총 카로티노이드 0.025mcg/g 내지 0.3mcg/g, 바람직하게는 0.05mcg/g 내지 0.244mcg/g; (ii) 라이코펜 0.005mcg/g 미만, 바람직하게는 0.003mcg/g 미만; (iii) 베타 카로틴 0.005mcg/g 미만, 바람직하게는 0.003mcg/g 미만; (iv) 엽록소 A 0.025mcg/g 내지 0.3mcg/g, 바람직하게는 0.045mcg/g 내지 0.268mcg/g; (v) 감마 토코페롤 35mcg/g 내지 175mcg/g, 바람직하게는 38.3mcg/g 내지 164mcg/g; (vi) 브라시카스테롤, 캄페스테롤, 스티그나스테롤 또는 베타-시토스테롤 0.25% 미만; (vii) 총 토코트리에놀 225mcg/g 내지 350mcg/g, 바람직하게는 249.6mcg/g 내지 325.3mcg/g; (viii) 루테인 0.0025mcg/g 내지 0.05mcg/g, 바람직하게는 0.003mcg/g 내지 0.039mcg/g; 또는 (ix) 토코페롤 50mcg/g 내지 300mcg/g, 바람직하게는 60.8mcg/g 내지 261.7mcg/g의 속성들 중 하나 이상을 가지는 트리글리세라이드 오일을 제공한다.
몇몇 경우에 있어서, 트리글리세라이드 오일은 하나 이상의 외인성 유전자를 포함하는 미생물로부터 분리된다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 외인성 유전자는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화한다. 몇몇 경우에 있어서, 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 사슬 길이가 C14인 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수 분해 활성을 가진다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 발현 구조물을 추가로 포함하는데, 여기서 상기 발현 구조물은, 내인성 유전자가 돌연 변이되지 않은 유전자 생성물보다 활성이 작거나 불활성인 유전자 생성물을 암호화하도록 돌연 변이된 것, 내인성 유전자가 미세 조류 세포 게놈으로부터 결실된 것 및 RNA 유도 기작을 통한 것으로 이루어진 방법으로부터 선택된 내인성 유전자의 발현을 하향 조절한다. 몇몇 구체예에서, 내인성 유전자는 불포화 효소를 암호화한다. 몇몇 경우에 있어서, 불포화 효소는 스테아로일-아실기 운반 단백질 불포화 효소(SAD) 또는 지방산 불포화 효소(FAD)이다.
제18 양태에서, 본 발명은 C12 미만 지방산이 1% 미만; C14:0 지방산이 2% 내지 7%; C16:0 지방산이 23% 내지 30%; C18:0 지방산이 7% 내지 15%; C18:1 지방산이 40% 내지 55%; 그리고 C18:2 지방산이 2% 내지 15%인 지질 프로필을 포함하는 트리글리세라이드 오일을 제조하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 트리글리세라이드 오일은 하나 이상의 외인성 유전자를 포함하는 미생물로부터 분리된다. 몇몇 경우에 있어서, 트리글리세라이드 오일은 C14:0이 3% 내지 5%; C16:0이 25% 내지 27%; C18:0이 10% 내지 15%; 그리고 C18:1이 40% 내지 45%인 지질 프로필을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 외인성 유전자는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화한다. 몇몇 경우에 있어서, 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 사슬 길이가 C14인 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수 분해 활성을 가진다.
제19 양태에서, 본 발명은 리시놀레산을 생산하는 미생물 세포를 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 미생물 세포는 미세 조류 세포이다. 몇몇 경우에 있어서, 미생물 세포와 미세 조류 세포는 지방산 하이드록실라제를 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 지방산 하이드록실라제는 올리에이트 12-하이드록실라제이다. 몇몇 경우에 있어서, 지방산 하이드록실라제는 리시누스 커뮤니스로부터 유래한다. 몇몇 경우에 있어서, 미생물 세포는 프로토테카 속, 예를 들어 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis)에 속하는 것이다.
제20 양태에서, 본 발명은 알파-갈락토시다제를 암호화하는 외인성 유전자를 포함하는 미세 조류 세포를 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류 세포는 알파-갈락토시다제를 암호화하는 외인성 유전자를 포함하는데, 여기서 상기 알파-갈락토시다제는 분비된다. 몇몇 구체예에서, 알파-갈락토시다제를 암호화하는 외인성 유전자는 사카로마이세스(Saccharomyces), 아스퍼질러스(Aspergillus) 및 시아몹시스(Cyamopsis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속으로부터 유래한다.
제21 양태에서, 본 발명은, (a) 종속 영양 조건에서 고정 탄소원의 존재 하에 미세 조류 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 상기 미세 조류 세포는 알파-갈락토시다제를 암호화하는 외인성 유전자를 포함하고, 상기 고정 탄소원은 라피노스, 스타키오스 및 멜리비오스로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계; (b) 지질이 아닌 성분들로부터 지질을 분리하여, 지질 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 지질 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류 세포는 프로토테카 속에 속하는 것이다.
제22 양태에서, 본 발명은 THIC 효소를 암호화하는 외인성 유전자를 포함하는 미세 조류 세포를 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, THIC 효소는 코코믹사(Coccomyxa), 아라비돕시스(Arabidopsis) 및 시네코시스티스(Synechocystis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속으로부터 유래한다.
다른 양태에서, 본 발명은 THIC 효소를 암호화하는 외인성 유전자를 발현하는 단계를 포함하는, 티아민의 부재 하에 미세 조류 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, THIC 효소는 코코믹사, 아라비돕시스 및 시네코시스티스로 이루어진 군으로부터 선택되는 속으로부터 유래한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 미세 조류 세포를 제공하는데, 여기서 상기 미세 조류 세포는 수크로스 인버타제, 알파-갈락토시다제 및 THIC 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 외인성 유전자를 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 미생물 세포로부터 분리된 하이드록실화 오일을 제공한다. 하나의 양태에서, 하이드록실화 오일은 미생물 세포로부터 분리되며, 여기서 상기 미생물 세포는 미세 조류 세포(예를 들어, 프로토테카 속에 속하는 미세 조류 세포)이다. 추가의 양태에서, 하이드록실화 오일은 프로토테카 모리포르미스 세포로부터 분리된다. 하나의 구체예에서, 하이드록실화 오일은 하이드록실화 트리글리세라이드이다. 하이드록실화 트리글리세라이드는 피마자유와 화학적으로 유사하거나 동일할 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 하이드록실화 지방산이다. 하이드록실화 지방산의 하나의 구체예는 리시놀레산이다.
또 다른 양태에서, 미생물의 하이드록실화 오일 또는 하이드록실화 지방산은 추가로 하이드록실화된다. 리시놀레산이 하이드록실화될 때, 2개의 하이드록실기를 함유하는 지방산이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태는 하이드록실화 오일 및/또는 하이드록실화 지방산과, 이소시아네이트부를 함유하는 화합물을 반응시켜 폴리우레탄을 형성함으로써 제조되는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 C18:2가 20% 이상인 지질 프로필을 가지는 미세 조류 세포를 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류 세포는 C18:2가 30% 이상인 지질 프로필을 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류 세포는 C18:2가 40% 이상인 지질 프로필을 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류 세포는 C18:2가 50% 이상인 지질 프로필을 가진다.
본 발명의 다른 양태는, (a) 배양 배지 중에서 미세 조류 세포를 배양하고, 당 농도를 모니터하는 단계; (b) 배양 배지의 당 농도가 약 1g/l 미만에 이를 때, 배양 배지에 제1 당 용액을 약 2시간 내지 약 24시간 동안 연속 공급율 약 2g/h/l 내지 약 10g/h/l 로 첨가하는 단계; (c) 배양 배지에 제2 당 용액을 첨가하여, 배양 배지의 당 농도를 약 15g/l 내지 약 20g/l로 유지하는 단계; 및 (d) 미세 조류 바이오매스로부터 지질을 분리하는 단계를 포함하는 지질 제조 방법을 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 제1 당 용액은 배양 배지에 공급율 약 4g 수크로스/h/l 내지 약 6g 수크로스/h/l로 첨가된다. 몇몇 경우에 있어서, 제1 당 용액은 배양 배지에 공급율 약 5.25g 수크로스/h/l로 첨가된다. 몇몇 경우에 있어서, 당은 수크로스 또는 글루코스이다.
본 발명의 다른 양태는 C18:3이 10% 이상인 지질 프로필을 가지는 미세 조류 세포를 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류 세포는 C18:3이 20% 이상인 지질 프로필을 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류 세포는 C18:3이 30% 이상인 지질 프로필을 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류 세포는 C18:3이 40% 이상인 지질 프로필을 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류 세포는 C18:3이 50% 이상인 지질 프로필을 가진다.
본 발명의 다른 양태는 리놀레산 또는 리놀렌산을 포함하는 트리글리세라이드를 생산하는 미생물을 제공하는데, 여기서 상기 미생물은 β-케토아실-ACP 합성 효소 II(KAS II) 효소를 암호화하는 재조합 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 미생물은 스테아로일 ACP 불포화 효소(SAD) 효소를 암호화하는 재조합 핵산을 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 미생물은 올리에이트 특이적 티오에스테라제 효소를 암호화하는 재조합 핵산을 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 미생물은 지방산 불포화 효소(FAD) 효소를 암호화하는 재조합 핵산을 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 미생물은 글리세로지질 불포화 효소를 암호화하는 재조합 핵산을 추가로 포함한다.
상기 논의한 조작 미생물에 있어서, KAS II 효소는 서열 번호 175, 서열 번호 176, 서열 번호 177, 서열 번호 178 및 서열 번호 179로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, SAD 효소는 서열 번호 172, 서열 번호 196, 서열 번호 197, 서열 번호 198, 서열 번호 199, 서열 번호 200 및 서열 번호 201로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 올리에이트 특이적 티오에스테라제 효소는 서열 번호 195, 서열 번호 202, 서열 번호 203, 서열 번호 204, 서열 번호 205 및 서열 번호 206으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, FAD 효소는 서열 번호 181, 서열 번호 182, 서열 번호 183, 서열 번호 184 및 서열 번호 185로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, FAD 효소는 서열 번호 207, 서열 번호 208, 서열 번호 209, 서열 번호 210, 서열 번호 211 및 서열 번호 212로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 Δ12 FAD 효소이다. 몇몇 경우에 있어서, FAD 효소는 서열 번호 213, 서열 번호 214, 서열 번호 215, 서열 번호 216, 서열 번호 217, 서열 번호 218, 서열 번호 219, 서열 번호 220 및 서열 번호 221로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 Δ15 FAD 효소이다. 몇몇 경우에 있어서, 글리세로지질 불포화 효소는 ω-6 지방산 불포화 효소, ω-3 지방산 불포화 효소 또는 ω-6 올리에이트 불포화 효소다.
상기 논의한 조작 미생물들 중 임의의 하나는 수크로스 이용 경로 효소를 암호화하는 재조합 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 수크로스 이용 경로 효소는 수크로스 인버타제이다.
상기 논의한 조작 미생물들 중 임의의 하나에 있어서, 미생물은 기타 다른 지방산에 비하여 리놀레산 또는 리놀렌산의 비율이 증가하도록 추가로 조작될 수 있다.
상기 논의한 조작 미생물들 중 임의의 하나에 있어서, 미생물은 C18 기질에 특이적이거나 이 기질을 선호하는 티오에스테라제를 과발현하도록 추가로 조작될 수 있다.
상기 논의한 조작 미생물들 중 임의의 하나에 있어서, 미생물은 C8 내지 C16 기질에 특이적이거나 이 기질을 선호하는 티오에스테라제의 발현이 감소하도록 추가로 조작될 수 있다.
상기 논의한 조작 미생물들 중 임의의 하나에 있어서, 미생물은 미세 조류 세포일 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류 세포는 프로토테카 속에 속하는 것이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 모리포르미스 세포이다.
본 발명의 다른 양태는 상기 논의한 조작 미생물들 중 임의의 하나에 의해 생산된 오일을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 재조합 핵산들 중 하나 이상을 미생물에 도입하여 리놀레산 또는 리놀렌산을 포함하는 트리글리세라이드를 생산하게 함으로써, 상기 논의한 조작 미생물들을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 트리아실글리세라이드를 포함하는 천연 오일 또는 천연 오일로부터 생성되는 생성물을 제조하는 방법을 제공하는데, 여기서 이 방법은 (i)(a) β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않거나(여기서, 세포는 임의로 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 유전자의 복사체 2개의 발현을 감소시키거나 이 복사체 2개를 발현하지 않도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함함); 또는 (b) 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자 생성물을 발현하거나; 또는 (c) β-케토아실-ACP 합성 효소 I 또는 β-케토아실-ACP 합성 효소 II를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 또는 이 효소를 발현하지 않고, 활성 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하거나; 또는 (d) 스테아로일 ACP 불포화 효소 또는 지방산 불포화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 또는 이 효소를 발현하지 않고, 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함하는 세포인, 재조합 미생물의 세포를 배양하는 단계; 그리고 (ii) 세포로부터 천연 오일을 회수하는 단계를 포함하고, 임의로는 식품, 연료 또는 화학 생성물을 생성하기 위하여 천연 오일을 가공하는 단계로서, 천연 오일은 재조합 핵산으로 인하여 변경된 지방산 프로필을 가지는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 경우에 있어서, 미생물은 제II형 지방산 생합성 경로를 통해 지방산을 합성한다. 몇몇 경우에 있어서, 미생물은 미세 조류이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 절대 종속 영양 생물이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 또는 클로렐라(Chlorella) 종이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 윅커해미(Prototheca wickerhamii), 프로토테카 스태그노라(Prototheca stagnora), 프로토테카 포르토리센시스(Prototheca portoricensis), 프로토테카 모리포르미스 또는 프로토테카 조프피(Prototheca zopfii)이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 클로렐라 케슬러리(Chlorella kessleri), 클로렐라 루테오비리디스(Chlorella luteoviridis), 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides) 또는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 활성 수크로스 인버타제를 발현하는 재조합 세포이다. 몇몇 경우에 있어서, 배양은 종속 영양 배양이다. 몇몇 경우에 있어서, 지방산 불포화 효소는 ω-6 지방산 불포화 효소, ω-3 지방산 불포화 효소 또는 ω-6 올리에이트 불포화 효소 또는 델타 12 지방산 불포화 효소 중 하나 이상이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 건조 세포 중량으로 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상 또는 50% 내지 90%의 트리글리세라이드를 포함하도록 배양된다. 몇몇 경우에 있어서, 오일은 발색 분자 500ppm, 50ppm 또는 5ppm 미만을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 핵산은 안정적으로 통합된다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 핵산은 미생물의 염색체 내에 안정적으로 통합된다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 하나 이상의 선택가능한 마커를 추가로 포함한다.
몇몇 경우에 있어서, 세포는 효소를 암호화하는 유전자 전사체를 표적화하는 안티센스, RNAi 또는 dsRNA의 발현을 통해 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소 또는 지방산 불포화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않는 것은, 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 하나 이상의 유전자로 하나 이상의 유전자를 분할(interrupt) 또는 치환하는 것을 원인으로 한다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 세포는 올리에이트 12-하이드록실라제를 암호화하는 외인성 유전자를 추가로 포함하여, 리시놀레산을 합성한다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 세포는 KASII 유전자에 의해 암호화되는 β-케토아실-ACP 합성 효소 II의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않도록 작동 가능하고, 또한 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이상의 C16 지방산을 가지는 것을 특징으로 하는 지방산 프로필을 나타내는 오일을 생산한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 C16:0이 50% 내지 75% 이상인 것을 특징으로 하는 지방산 프로필을 가지는 오일을 생산한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 C18:1이 20% 내지 40% 이상인 것을 추가의 특징으로 하는 지방산 프로필을 가지는 오일을 생산한다. 몇몇 경우에 있어서, 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자는 C8 내지 C16 지방 아실 사슬의 가수 분해 활성이 세포의 천연 아실-ACP 티오에스테라제보다 큰 활성 아실-ACP 티오에스테라제를 생산한다. 몇몇 경우에 있어서, 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자는 KASII 유전자를 분할한다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 세포는 β-케토아실-ACP 합성 효소 I을 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않도록 작동 가능한 핵산을 포함한다.
몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 재조합 핵산으로 인하여 평균 지방산 사슬 길이가 더 짧은 것을 특징으로 하는 지방산 프로필을 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 세포는 하나 이상의 FAD 유전자에 의해 암호화되는 지방산 불포화 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않도록 작동 가능하며, 활성 스테아로일 ACP 불포화 효소를 암호화하는 스테아로일-ACP 불포화 효소 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 핵산은 지방산 불포화 효소 유전자의 복사체 다수 개에 의해 암호화되는 지방산 불포화 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않도록 작동 가능하다. 몇몇 경우에 있어서, 스테아로일-ACP 불포화 효소 외인성 유전자는 지방산 불포화 효소 유전자의 암호화 영역 내 위치에 재조합된다. 몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 올레산이 증가한 지방산 프로필을 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 올레산은 지방산의 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 세포는 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 II를 암호화하는 β-케토아실-ACP 합성 효소 II 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 재조합 핵산으로 인하여 C18:1 지방산이 증가하였고, C16 지방산은 감소한 지방산 프로필을 특징으로 한다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 세포는 RNA 간섭에 의해 스테아로일-ACP 불포화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않도록 작동 가능한 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 C18:0 지방산이 증가한 것을 특징으로 하는 지방산 프로필을 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 C18:0이 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상인 지방산 프로필을 특징으로 한다. 몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 C18:0이 50% 내지 70% 이상인 지방산 프로필을 특징으로 한다. 몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 C18:1이 20% 내지 40% 이상인 지방산 프로필을 추가의 특징으로 한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소 또는 지방산 불포화 효소를 암호화하는 유전자의 복사체 2개의 발현을 감소시키거나 이 복사체 2개를 발현하지 않도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 핵산은 활성 ω-3 지방산 불포화 효소 및/또는 ω-6 올리에이트 불포화 효소를 암호화하는 지방산 불포화 효소 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능하다. 몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 리놀레산, 리놀렌산 또는 이것들 둘 다의 수준이 상승한 것을 특징으로 하는 지방산 프로필을 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 오일의 지방산 프로필은 리놀레산, 리놀렌산 또는 이것들 둘 다가 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상인 것을 특징으로 한다. 몇몇 경우에 있어서, 오일의 추가 가공으로서는 정제, 표백, 탈취, 복분해, 에스테르 결합 전이, 수소화, 가수 분해, 수소화, 탈산소화, 수소 크래킹, 이성체화, 하이드록실화, 에스테르 교환, 아미드화, 설폰화 및 가황 처리 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 오일은 식품용 오일, 지방산, 지방 알코올, 윤활제, 비누, 지방산 에스테르, 지방산 에톡실레이트, 지방 아민, 알킬 클로라이드, 지방 알코올 에톡실레이트, 지방 알코올 설페이트, 지방산 알카놀아미드, 설폰화된 오일, 가황 오일, 디젤 연료, 제트 연료, 가솔린, 연료 블렌드스톡(fuel blendstock), 연료 첨가제, 윤활제 첨가제 또는 코팅제를 형성하도록 가공된다.
본 발명의 다른 양태는 상기 논의한 방법에 의해 얻을 수 있는 천연 오일을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 상기 논의한 천연 오일로부터 제조된 생성물을 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 생성물은 식품용 오일, 지방산, 지방 알코올, 윤활제, 비누, 지방산 에스테르, 지방산 에톡실레이트, 지방 아민, 알킬 클로라이드, 지방 알코올 에톡실레이트, 지방 알코올 설페이트, 지방산 알카놀아미드, 설폰화 오일, 가황 오일, 디젤 연료, 제트 연료, 가솔린, 연료 블렌드스톡, 연료 첨가제, 화학 첨가제 또는 코팅제를 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 (a) β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않거나(여기서, 세포는 임의로 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 유전자의 복사체 2개의 발현을 감소시키거나 이 복사체 2개를 발현하지 않도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함함); 또는 (b) 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자 생성물을 발현하거나; 또는 (c) β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 또는 이것을 발현하지 않고, 활성 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하거나; 또는 (d) 스테아로일 ACP 불포화 효소 또는 지방산 불포화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않고, 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
몇몇 경우에 있어서, 미생물은 제II형 지방산 생합성 경로를 통해 지방산을 합성한다. 몇몇 경우에 있어서, 미생물은 미세 조류이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 절대 종속 영양 생물이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 또는 클로렐라 종이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 윅커해미, 프로토테카 스태그노라, 프로토테카 포르토리센시스, 프로토테카 모리포르미스 또는 프로토테카 조프피이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 클로렐라 케슬러리, 클로렐라 루테오비리디스, 클로렐라 프로토테코이데스 또는 클로렐라 불가리스이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 활성 수크로스 인버타제를 발현하는 재조합 세포이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 종속 영양 생장을 할 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 지방산 불포화 효소는 ω-6 지방산 불포화 효소, ω-3 지방산 불포화 효소 또는 ω-6 올리에이트 불포화 효소 또는 델타 12 지방산 불포화 효소 중 하나 이상이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 건조 세포 중량을 기준으로 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상 또는 50% 내지 90%의 트리글리세라이드를 포함하도록 배양될 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 핵산은 안정적으로 통합된다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 핵산은 미생물의 염색체 내에 안정적으로 통합된다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 하나 이상의 선택가능한 마커를 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 효소를 암호화하는 유전자 전사체를 표적화하는 안티센스, RNAi 또는 dsRNA의 발현을 통해 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소 또는 지방산 불포화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않는 것은, 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 하나 이상의 유전자로 하나 이상의 유전자를 분할 또는 치환하는 것을 원인으로 한다.
몇몇 경우에 있어서, 재조합 세포는 올리에이트 12-하이드록실라제를 암호화하는 외인성 유전자를 추가로 포함하여, 리시놀레산을 합성한다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 세포는 KASII 유전자에 의해 암호화되는 β-케토아실-ACP 합성 효소 II의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않도록 작동 가능하고, 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 C16 지방산이 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이상인 것을 특징으로 하는 지방산 프로필을 가지는 오일을 생산한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 C16:0이 50% 내지 75% 이상인 것을 특징으로 하는 지방산 프로필을 가지는 오일을 생산한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 C18:1이 20% 내지 40% 이상인 것을 추가의 특징으로 하는 지방산 프로필을 가지는 오일을 생산한다. 몇몇 경우에 있어서, 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자는 C8 내지 C16 지방 아실 사슬의 가수 분해 활성이 세포의 천연 아실-ACP 티오에스테라제보다 큰 활성 아실-ACP 티오에스테라제를 생산한다. 몇몇 경우에 있어서, 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자는 KASII 유전자를 분할한다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 세포는 β-케토아실-ACP 합성 효소 I을 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않도록 작동 가능한 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 재조합 핵산으로 인하여 평균 지방산 사슬 길이가 더 짧은 것을 특징으로 하는 지방산 프로필을 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 세포는 하나 이상의 FAD 유전자에 의해 암호화되는 지방산 불포화 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않도록 작동 가능하며, 활성 스테아로일 ACP 불포화 효소를 암호화하는 스테아로일-ACP 불포화 효소 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 핵산은 지방산 불포화 효소 유전자의 복사체 다수 개에 의해 암호화되는 지방산 불포화 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않도록 작동 가능하다. 몇몇 경우에 있어서, 스테아로일-ACP 불포화 효소 외인성 유전자는 지방산 불포화 효소 유전자의 암호화 영역 내 위치에 재조합된다.
몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 올레산이 증가한 지방산 프로필을 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 올레산은 지방산의 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 세포는 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 II를 암호화하는 β-케토아실-ACP 합성 효소 II 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 재조합 핵산으로 인하여 C18:1 지방산이 증가하였고, C16 지방산은 감소한 지방산 프로필을 특징으로 한다. 몇몇 경우에 있어서, 재조합 세포는 RNA 간섭에 의해 스테아로일 ACP 불포화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않도록 작동 가능한 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 C18:0 지방산이 증가한 것을 특징으로 하는 지방산 프로필을 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 C18:0이 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상인 지방산 프로필을 특징으로 한다. 몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 C18:0이 50% 내지 75% 이상인 지방산 프로필을 특징으로 한다. 몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 C18:1이 20% 내지 40% 이상인 지방산 프로필을 추가의 특징으로 한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소 또는 지방산 불포화 효소를 암호화하는 유전자의 복사체 2개의 발현을 감소시키거나 이 복사체 2개를 발현하지 않도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 핵산은 활성 ω-3 지방산 불포화 효소 및/또는 ω-6 올리에이트 불포화 효소를 암호화하는 지방산 불포화 효소 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능하다. 몇몇 경우에 있어서, 생산된 오일은 리놀레산, 리놀렌산 또는 이것들 둘 다의 수준이 상승한 것을 특징으로 하는 지방산 프로필을 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 오일의 지방산 프로필은 리놀레산, 리놀렌산 또는 이것들 둘 다가 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태는 전술한 세포로부터 생산된 오일 함유 생성물 또는 천연 오일을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 리시놀레산을 포함하는 트리아실글리세라이드를 포함하는 천연 오일, 또는 천연 오일로부터 생산되는 생성물을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 재조합 미생물의 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 이 세포는 활성 올리에이트 12-하이드록실라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하여 리시놀레산을 합성하도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함한다.
몇몇 경우에 있어서, 미생물은 제II형 지방산 생합성 경로를 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 미생물은 미세 조류이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 절대 종속 영양 생물이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 종이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 윅커해미, 프로토테카 스태그노라, 프로토테카 포르토리센시스, 프로토테카 모리포르미스 또는 프로토테카 조프피이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 클로렐라 케슬러리, 클로렐라 루테오비리디스, 클로렐라 프로토테코이데스 또는 클로렐라 불가리스이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 활성 수크로스 인버타제를 발현하는 재조합 세포이다. 몇몇 경우에 있어서, 배양은 종속 영양 배양이다. 몇몇 경우에 있어서, 활성 올리에이트 12-하이드록실라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 재조합 핵산을 가지지 않는 세포는 올레산을 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상 생산한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 올레산 생산을 증강하여 올리에이트 12-하이드록실라제에 대한 기질 수준을 상승시키도록 작동 가능한 재조합 핵산을 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 (a) 활성 스테아로일 ACP 불포화 효소를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하고, 지방산 불포화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않거나; 또는 (b) 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 I을 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하고, 활성 아실-ACP 티오에스테라제를 암호하하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 상기 논의한 방법들 중 임의의 것에 의하여 생산된 생성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 활성 올리에이트 12-하이드록실라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하여 리시놀레산을 합성하도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함하는 미생물 세포를 제공한다.
몇몇 경우에 있어서, 미생물은 제II형 지방산 생합성 경로를 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 미생물은 미세 조류이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 절대 종속 영양 생물이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 종이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 윅커해미, 프로토테카 스태그노라, 프로토테카 포르토리센시스, 프로토테카 모리포르미스 또는 프로토테카 조프피이다. 몇몇 경우에 있어서, 미세 조류는 클로렐라 케슬러리, 클로렐라 루테오비리디스, 클로렐라 프로토테코이데스 또는 클로렐라 불가리스이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 활성 수크로스 인버타제를 발현하는 재조합 세포이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 종속 영양 생장을 할 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 활성 올리에이트 12-하이드록실라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 재조합 핵산을 가지지 않는 세포는 올레산을 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상 생산한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 올레산 생산을 증강하여 올리에이트 12-하이드록실라제에 대한 기질의 수준을 상승시키도록 작동 가능한 재조합 핵산을 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 (a) 활성 스테아로일 ACP 불포화 효소를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하고, 지방산 불포화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않거나; 또는 (b) 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 I을 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하고, 활성 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 상기 논의한 오일을 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명의 이와 같은 양태와 다른 양태, 그리고 구체예는 첨부된 도면, 바로 다음에 기술된 도면의 간단한 설명, 이하 본 발명의 상세한 설명에 기술되어 있으며, 이하 실시예에 예시되어 있다. 상기 및 본원의 명세서 전반에 걸쳐 논의되어 있는 특징들 중 임의의 것 또는 모두는 본 발명의 다양한 구체예에서 조합될 수 있다.
도 1은 프로토테카 트리글리세라이드 오일로부터 생산된 재생 디젤의 크로마토그램을 나타낸다.
도 2는 리시놀레산 표준 및 야생형 대조군과 비교하여, 대표적인 양성 유전자 이식 클론의 GC 정체 시간을 나타낸다.
도 3은 실시예 18에 기술한 바와 같이 표적화 유전자가 파괴된 프로토테카 모리포르미스 FADc 대립 유전자 및 표적화 유전자가 파괴되지 않은 프로토테카 모리포르미스 FADc 대립 유전자의 PstI 제한 맵을 나타낸다.
도 4는 실시예 18에 기술된 서던 블럿의 결과들을 나타낸다.
본 발명의 예시적인 구체예는 변경된 글리세로지질 프로필을 생산하는 유지성 세포와, 이 세포로부터 생산되는 생성물을 특징으로 한다. 유지성 세포의 예로서는 제II형 지질 생합성 경로를 가지는 미생물 세포를 포함한다. 구체예는 단백질, 예를 들어 지방 아실-ACP 티오에스테라제, 지방산 불포화 효소, 케토-아실 합성 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 유전자를 발현하고, 임의로는 유사한 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 내인성 유전자가 녹다운된 재조합 세포를 포함한다. 결과적으로, 몇몇 구체예는 이전에는 결코 얻을 수 없었던 천연 오일을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 상기 세포로부터 지질 및 오일계 생성물, 예를 들어 연료, 예를 들어 바이오디젤, 재생 디젤 및 제트 연료, 식품용 오일 및 화학 물질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 구체예에 의하여 생산된 오일은 여러 분야들 중 교통 수단 연료, 함유 화학 제품 및/또는 식품과 화장품 산업에서 사용될 수 있다. 예를 들어 지질의 에스테르 결합 전이 반응으로 바이오디젤로서 유용한 장쇄 지방산 에스테르가 생성될 수 있다. 기타 다른 효소 및 화학 공정은 지방산, 알데하이드, 알코올, 알칸 및 알켄을 생성하도록 조작될 수 있다. 몇몇 분야에 있어서, 재생 디젤, 제트 연료 또는 기타 다른 탄화수소 화합물이 생산된다. 본 발명은 또한 지질 생산성과 수율을 증가시키고/증가시키거나, 본원에 기술된 조성물을 더욱 비용 효율적으로 생산하기 위하여 미세 조류를 배양하는 방법도 제공한다.
본 발명의 하나의 구체예는 트리글리세라이드를 포함하는 천연 오일을 생산하거나, 또는 천연 오일로부터 생산되는 생성물을 생산하는 방법을 제공한다. 천연 오일은 식물성 오일이 아니거나 종자로부터 유래하는 오일이 아닐 수 있다. 본 발명의 방법은 맞춤 오일, 즉 세포 내 재조합 핵산이 존재함으로 인하여 변경된 지방산 프로필을 가지는 오일을 생산하도록 재조합 미생물의 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 이후, 천연 오일은 추가로 가공되어, 식품, 연료 또는 화학 생성물로 생산될 수 있다. 세포 내 재조합 핵산은 (a) β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않거나(여기서, 세포는 임의로 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 유전자의 복사체 2개(즉 이배체 유기체의 대립 유전자 2개)의 발현을 감소시키거나 이 복사체 2개를 발현하지 않도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함함); 또는 (b) 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하거나; 또는 (c) β-케토아실-ACP 합성 효소 I 또는 β-케토아실-ACP 합성 효소 II를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않고, 활성 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하거나; 또는 (d) 스테아로일 ACP 불호화 효소 또는 지방산 불포화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않고, 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능하다.
하나 이상의 지방산 불포화 효소를 암호화하는 재조합 핵산이 세포 내에 존재할 경우, 핵산은 ω-6 지방산 불포화 효소, ω-3 지방산 불포화 효소 또는 ω-6 올리에이트 불포화 효소 또는 델타 12 지방산 불포화 효소 중 하나 이상을 암호화할 수 있다.
세포가 효소의 발현을 감소시키거나 효소를 발현하지 않도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함할 경우, 이와 같이 효소의 발현을 감소시키거나 효소를 발현하지 않도록 하는 것은, 효소를 암호화하는 유전자 전사체를 표적화하는 안티센스, RNAi 또는 dsRNA의 발현을 통해 이루어질 수 있거나, 또는 기타 다른 적당한 수단, 예를 들어 유도적 돌연 변이, 완전 결실 또는 부분 결실에 의해 이루어질 수 있다. 따라서, β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소 또는 지방산 불포화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소의 발현을 지지(alimentation)하는 것은, 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 하나 이상의 유전자로 하나 이상의 유전자를 분할 또는 치환하는 것을 원인으로 한다.
바람직하게, 재조합 핵산은 세포, 예를 들어 세포 염색체 또는 에피좀 내에 안정적으로 통합된다. 핵산이 안정적으로 통합된 세포의 선택은, 본원에 기술된 바와 같이 선택가능한 마커, 예를 들어 수크로스 인버타제, 항생제 저항성 유전자 또는 티아민 영양 요구성 보완을 이용하여 도움받을 수 있다.
바람직하게, 미생물은 제II형 지방산 생합성 경로를 통해 지방산을 합성하는 것일 수 있다. 예를 들어 미생물은 미세 조류일 수 있으나, 또는 보통 제I형 지방산 생합성 경로를 가지는 것으로서, 유전자 조작 기술을 이용하여 제II형 유전 기구가 도입된 미생물(예를 들어, 오일 생산 효모)일 수도 있다. 미생물은 종속 영양 생물일 수 있으며, 특정 구체예에서 절대 종속 영양 생물일 수 있다. 미세 조류가 사용되는 경우, 이 미세 조류는 프로토테카 또는 클로렐라 종일 수 있다. 예시적 종으로서는 프로토테카 윅커해미, 프로토테카 스태그노라, 프로토테카 포르토리센시스, 프로토테카 모리포르미스, 프로토테카 조프피, 클로렐라 케슬러리, 클로렐라 루테오비리디스, 클로렐라 프로토테코이데스 및 클로렐라 불가리스를 포함한다. 수크로스 공급원료, 예를 들어 사탕수수 즙과 기타 다른 본원에 기술된 것들을 사용할 수 있도록 하기 위해서, 재조합 세포는 수크로스 인버타제 유전자를 포함하여 활성 수크로스 인버타제를 발현하는 재조합 핵산을 포함할 수 있다. 수크로스 인버타제는 미생물에 의해 배지에 분비될 수 있다.
배양은, 예를 들어 고정 탄소원, 예를 들어 글루코스나 수크로스를 사용하는 생물 반응기 내에서 수행되는 종속 영양 배양일 수 있다. 배양은, 세포 중 트리글리세라이드가 건조 세포 중량으로 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 또는 50% 내지 90%가 될 때까지 지속될 수 있다. 이는 다음에 기술된 바와 같이 질소를 제한하면서 배양하는 것을 수반할 수 있다.
세포에 의해 생산된 오일은 세포로부터 추출될 수 있다. 하나의 구체예에서, 오일은 발색 분자 500ppm, 50ppm 또는 5ppm 미만을 포함한다. 임의로 오일은, 예를 들어 LC-MS에 의해 자체의 지방산 프로필에 대해 분석될 수 있다. 오일은 또한 실시예 19의 표 60 내지 표 63의 오일의 특성들 중 하나 이상을 가질 수도 있다.
특정 구체예에서, 재조합 세포는 KASII 유전자에 의해 암호화되는 β-케토아실-ACP 합성 효소 II의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않고, 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 핵산을 포함한다. 결과적으로, 세포는 C16 지방산이 40%, 50%, 60% 또는 70% 이상인 것(예를 들어, 팔미트산)을 특징으로 하는 지방산 프로필을 가지는 오일을 생산할 수 있다. 따라서, 오일은 길이가 더 단쇄 방향으로 옮겨진 지방산 분포를 가질 수 있다. 지방산 분포의 변화는 평균 지방산 길이의 감소 또는 기타 다른 분포와 관련된 통계학적 특징에 의해 특징지어질 수 있다. 예를 들어 평균 지방산 길이를 산정하기 위해서, 트리글리세라이드를 구성하는 각각의 검출 가능 지방산의 백분율은 지방산 내 탄소의 수로 곱하여 지고, 이 곱의 합은 100으로 나누어진다. 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자는 C8 내지 C16 지방 아실 사슬의 가수 분해 활성이 세포의 천연 아실-ACP-티오에스테라제보다 큰 활성 아실-ACP 티오에스테라제를 생산할 수 있다. 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자는 KASII 유전자를 분할할 수 있다. 이러한 방식으로, 아실-ACP 티오에스테라제의 삽입은 또한 β-케토아실-ACP 합성 효소 II의 발현을 하나의 단계로 억제할 수도 있다. 실시예 15 및 16을 참조한다.
다른 특정 구체예에서, 재조합 세포는 β-케토아실-ACP 합성 효소 I을 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않도록 작동 가능한 핵산을 포함한다. 결과적으로, 생산된 오일은 재조합 핵산이 결여된 비교 대상 세포보다 짧은 지방산 사슬 길이의 분포를 특징으로 하는 지방산 프로필을 가진다. 이와 같은 특징은 평균 지방산 사슬 길이가 감소한 것으로서 표현될 수 있다. 재조합 세포는 하나 이상의 FAD 유전자에 의해 암호화되는 지방산 불포화 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않으며, 활성 스테아로일 ACP 불포화 효소를 암호화하는 스테아로일-ACP 불포화 효소 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 핵산을 포함할 수 있다. 임의로, 핵산은 지방산 불포화 효소 유전자의 복사체(예를 들어, 대립 유전자) 다수 개에 의해 암호화되는 지방산 불포화 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않도록 작동 가능하다. 특정 구체예에서, 스테아로일-ACP 불포화 효소 외인성 유전자는 지방산 불포화 효소 유전자의 암호화 영역 내 위치에 재조합된다. 결과적으로, 생산된 오일은 핵산이 결여된 비교 대상 세포에 의해 생산된 오일에 비하여 올레산 수준이 상승할 수 있다. 올레산은 지방산 프로필에 있어서 지방산의 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상을 포함한다. 실시예 10을 참조한다.
다른 특정 구체예에서, 재조합 세포는 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 II를 암호화하는 β-케토아실-ACP 합성 효소 II 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 핵산을 포함한다. 결과적으로, 생산된 오일은 재조합 핵산으로 인하여 C18:1 지방산은 상승하고, C16 지방산은 감소하는 지방산 프로필을 특징으로 할 수 있다. KASII 유전자의 과발현으로 비 형질 전환 세포 내 C18 지방산의 백분율이 약 68%에서 약 84%까지 증가된 실시예 13을 참조한다. 관련 구체예에서, 증가율은 70% 이상, 75% 내지 85% 또는 70% 내지 90%이다.
다른 특정 구체예에서, 재조합 세포는 RNA 간섭에 의해 스테아로일 ACP 불포화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않도록 작동 가능한 핵산을 포함한다. 결과적으로, 생산된 오일은 C18:0 지방산이 증가한 것을 특징으로 하는 지방산 프로필을 가질 수 있다. C18:0 지방산은 프로필에 있어서 지방산의 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상일 수 있다. 실시예 12를 참조한다.
다른 특정 구체예에서, 세포는 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소 또는 지방산 불포화 효소를 암호화하는 유전자의 복사체 2개(예를 들어, 2개의 대립 유전자)의 발현을 감소시키거나 이 유전자의 복사체를 발현하지 않도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함한다. 내인성 KASI 대립 유전자가 프로토테카 내에서 녹아웃된 실시예 14를 참조한다. 결과적으로, 증가율은 내인성 KASI의 파괴로 인하여 총 C14 지방산 백분율이 약 35%에서 400%까지이고, C16 지방산 백분율이 약 30%에서 50%까지인 것으로 관찰되었다.
다른 특정 구체예에서, 세포는 활성 ω-3 지방산 불포화 효소 및/또는 ω-6 올리에이트 불포화 효소를 암호화하는 지방산 불포화 효소 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함한다. 결과적으로, 리놀레산, 리놀렌산 또는 이것들 둘 다의 수준의 상승은 상기 세포에 의해 생성되고, 세포 지질의 지방산 프로필을 통하여 확인될 수 있다. 예를 들어 세포는 리놀레산, 리놀렌산 또는 이것들 둘 다를 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 가질 수 있다. 예를 들어 재조합 Δ15 불포화 효소는 실시예 11에서와 같이 발현될 수 있다. 결과적으로, C18:3 지방산(즉 리놀렌산)은 약 2배 내지 17배, 또는 그 이상 증가할 수 있다.
다른 구체예에서, 재조합 미생물의 세포가 배양된다. 세포는 활성 올리에이트 12-하이드록실라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하여 리시놀레산을 합성하도록 작동하는 재조합 핵산을 포함한다. 이 유전자는 상기 언급한 구체예들 중 임의의 것에 존재할 수 있다. 실시예 7을 참조한다. 12-하이드록실라제에 바람직한 기질은 올레산이다, 따라서, 바람직한 구체예에서, 올레산 생산을 증가시키도록 작동하는 재조합 핵산을 세포 내에 포함시킴으로써 리시놀레산을 고수율로 얻을 수 있다. 제한하는 것은 아니지만, 세포는 활성 스테아로일 ACP 불포화 효소를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하고, 지방산 불포화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현을 감소시키거나 이 효소를 발현하지 않거나; 또는 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 I을 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하고, 활성 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함한다.
본 발명의 구체예들 중 임의의 것에 따르면, 오일은 정제, 표백, 탈취, 복분해, 에스테르 결합 전이, 수소화, 가수 분해, 탈산소화, 수소 크래킹, 이성체화, 하이드록실화, 에스테르 교환, 아미드화, 설폰화 및 가황 처리 중 하나 이상에 의해 추출 및 추가 가공될 수 있다. 오일은, 예를 들어 식품용 오일, 지방산, 지방 알코올, 윤활제, 비누, 지방산 에스테르, 지방산 에톡실레이트, 지방 아민, 알킬 클로라이드, 지방 알코올 에톡실레이트, 지방 알코올 설페이트, 지방산 알카놀아미드, 설폰화된 오일, 가황 오일, 디젤, 제트, 가솔린, 블렌드스톡, 첨가제, 윤활제 또는 페인트를 형성하도록 가공될 수 있다.
본원에 언급된 구체예들 중 임의의 것은 식품 또는 식품용 오일로서 유용할 수 있다. 전 유기체가 식품에 혼입될 수 있다. 유기체는 가공되지 않은 것, 일부가 용해된 것, 대부분이 용해된 것 또는 전체적으로 용해된 것일 수 있다. 식품 중 유지성 유기체를 제조 및 사용하는 방법은 WO2011/150411호, WO2010/12093호, WO2011/130578호 및 WO2011/130576호에 교시되어 있다. 대안적으로, 유기체로부터 추출된 오일 및 임의로 정제된 오일은 식품용 오일, 예를 들어 조리 식품, 예를 들어 스프레드, 소스, 당과 제품 및 냉동 당과 제품 중 식품용 오일 성분으로서 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 유지성 세포 또는 식품용 오일은 C18:0 50% 내지 70% 및 C18:1(예를 들어, 올리에이트) 20% 내지 40%를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 유지성 세포 또는 식품용 오일은 C16:0 50% 내지 70% 및 C18:1(예를 들어, 올리에이트) 20% 내지 40%를 포함한다.
본 발명의 상세한 설명은 독자의 편리를 위해 여러 섹션으로 나누어진다. 섹션 I은 본원에 사용되는 용어의 정의를 제공한다. 섹션 II는 본 발명의 방법에 유용한 배양 조건의 설명을 제공한다. 섹션 III은 유전자 조작 방법 및 재료의 설명을 제공한다. 섹션 IV는 수크로스를 이용가능할 수 있게 하는 유전자 조작의 설명을 제공한다. 섹션 V는 지질 생합성을 변형시키기 위한 유전자 조작의 설명을 제공한다. 섹션 VI은 연료 및 화학 물질을 제조하는 방법을 기술한다. 섹션 VII은 발명의 실시예 및 구체예를 개시한다. 본 발명의 상세한 설명에 이어서 발명의 다양한 양태 및 구체예를 예시하는 실시예가 제공된다.
I. 정의
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 하기의 용어는 달리 특정되지 않는다면 이들 본래의 의미를 갖는다.
“미세 조류에서 활성(active in microalgae)”은 미세 조류에서 기능성인 핵산을 말한다. 예를 들어, 유전자 이식 미세 조류에 항생제 내성을 부여하는 항생제 내성 유전자를 구동하기 위해 사용된 프로모터는 미세 조류에서 활성이다.
“면적 백분율”은 FAME GC/FID 검출 방법을 사용하여 관찰된 피크의 면적을 말하며, 상기 방법에서 샘플 내 모든 지방산은 검출 전에 지방산 메틸 에스테르(FAME)로 전환된다. 예를 들어, 분리 피크는 C14:1과 같은 임의의 기타 다른 지방산과 비교하여 불포화성(C14:0)을 갖지 않는 14개 탄소 원자의 지방산에 대해서 관찰된다. 각각의 부류의 FAME에 대한 피크 면적은 혼합물 내 이의 백분율 조성과 정비례하고 샘플 내 존재하는 모든 피크의 합계를 기준으로 계산된다(즉, [특정 피크하의 면적/모든 측정된 피크의 총 면적] X 100). 본 발명의 오일 및 세포의 지질 프로필을 말하는 경우, “4% 이상의 C8 내지 C14”는 세포 내 또는 추출된 글리세로지질 조성물 내의 총 지방산의 4% 이상이 탄소 원자 8개, 10개, 12개 또는 14개를 포함하는 사슬 길이를 가짐을 의미한다.
“무균성”은 기타 다른 생존 유기체에 의해 오염되지 않은 유기체의 배양물이다.
“바이오디젤”은 디젤 엔진에서 연료로서 사용하기에 적당한 생물학적으로 생산된 지방산 알킬 에스테르이다.
“바이오매스”는 세포의 생장 및/또는 번식에 의해 생산된 물질이다. 바이오매스는 세포에 의해 분비되는 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 세포외 물질뿐만 아니라 세포 및/또는 세포 내 내용물을 함유할 수 있다.
“생물 반응기”는 임의로 현탁된 세포가 배양된 인클로저(enclosure) 또는 부분적 인클로저이다.
“셀룰로스 물질”은 셀룰로스 및 임의로는 헤미셀룰로스를 포함하는 생물학적 물질이다. 이는 당, 예를 들어 글루코스 및 자일로스로 분해될 수 있으므로, 임의로는 부가의 화합물, 예를 들어 이당류, 올리고당, 리그닌, 푸르푸랄 및 기타 다른 화합물을 포함할 수 있다. 셀룰로스 물질의 공급원에 관한 비제한적 예로서는 사탕수수 바가스(sugar cane bagasses), 사탕무 펄프, 옥수수 대, 목재 칩, 톱밥 및 스위치그래스(switchgrass)를 포함한다.
“동시배양”, 및 이의 변형어구, 예를 들어 “공동 배양하다” 및 “공동 발효시키다”는 동일한 생물 반응기에 2가지 이상의 세포 유형을 배양함을 말한다. 2가지 이상의 세포 유형은 둘 다 미세 조류와 같은 미생물일 수 있거나 상이한 세포 유형과 함께 배양되는 미세 조류 세포일 수 있다.
본원에 사용된“발색된 분자” 또는 “발색 불순물”은 추출된 오일에 색을 부여하는 임의의 화합물을 말한다. “발색된 분자” 또는 “발색 불순물”은, 예를 들어 엽록소 a, 엽록소 b, 라이코펜, 토코페롤, 캄페스테롤, 토코트리에놀 및 카로티노이드, 예를 들어 베타 카로틴, 루테인, 제아잔틴, 아스타잔틴을 포함한다. 이와 같은 분자들은 바람직하게 미생물 바이오매스 또는 추출된 오일 중에 500ppm 이하, 250ppm 이하, 100ppm 이하, 75ppm 이하 또는 25ppm 이하의 농도로 존재한다. 다른 구체예에서, 미생물 바이오매스 또는 추출된 오일에 존재하는 엽록소의 양은 500㎎/㎏ 미만, 100㎎/㎏ 미만, 10㎎/㎏ 미만, 1㎎/㎏ 미만, 0.5㎎/㎏ 미만, 0.1㎎/㎏ 미만, 0.05㎎/㎏ 미만 또는 0.01㎎/㎏ 미만이다.
“배양된(cultivated)”, 및 이의 변형어, 예를 들어 “배양되는(cultured)” 및 “발효된”은 선택되고/선택되거나 제어된 조건의 사용에 의한 하나 이상의 세포의 생장의 의도적인 조성(세포 크기, 세포 함량 및/또는 세포 활성의 증가) 및/또는 번식(propagation)(세포 수의 증가)을 말한다. 생장 및 번식 둘 다의 조합은 “증식(proliferation)”이라고 일컬어진다. 선택되고/선택되거나 제어된 조건의 예는 생물 반응기에서 규정된 배지(pH, 이온 강도 및 탄소원과 같은 공지된 특성을 가짐), 특정 온도, 산소분압, 이산화탄소 수준 및 생장의 사용을 포함한다. “배양된”은 자연에서 또는 다르게는 사람 간섭이 없는 미생물의 생장 또는 번식을 말하지 않고, 예를 들어 궁극적으로 화석화되어 지질학적 미정제 오일을 생성하는 유기체의 자연적인 생장은 배양이 아니다.
“불포화 효소”는 지질 합성 경로에서 이중 결합(불포화)을 트리글리세라이드 분자의 지방산 사슬에 도입하는 역할을 담당하는 효소를 말한다. 그 예로서는 스테아로일-아실기 운반 단백질 불포화 효소(SAD) 및 지방산 불포화 효소(FAD)(지방 아실 불포화 효소라고도 알려짐)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
“발현 벡터” 또는 “발현 구조물” 또는 “플라스미드” 또는 “재조합 DNA 구조물”은 숙주 세포 내에 핵산을 도입하기 위한 비이클이다. 핵산은 특정 핵산의 전사 및/또는 번역을 허용하는 일련의 특정 핵산 요소를 사용하여 사람의 개입을 통하여, 예를 들어 재조합 수단 또는 직접 화학 합성법에 의해 생성된 것일 수 있다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편이나 기타 다른 적당한 비이클의 일부일 수 있다. 통상적으로, 발현 벡터는 프로모터에 작동 가능하도록 결합되어 전사될 핵산을 포함한다.
“외인성 유전자”는 (예를 들어, 형질 전환/형질 감염에 의해) 세포 내에 도입된 RNA 및/또는 단백질의 발현을 암호화하는 핵산으로서, 또한 “이식 유전자”라고도 칭하여진다. 외인성 유전자를 포함하는 세포는 부가의 외인성 유전자(들)가 도입될 수 있는 재조합 세포라고도 칭하여질 수 있다. 상기 외인성 유전자는 형질 전환될 세포에 대해 상이한 종(및 따라서 이종성) 또는 동일한 종(따라서 동종성)으로부터 유래한 것일 수 있다. 따라서, 외인성 유전자는 유전자의 내인성 복사체에 비해 세포의 게놈 내에서 상이한 위치를 차지하거나 상이한 제어 하에 있는 동종성 유전자를 포함할 수 있다. 외인성 유전자는 세포 내에서 하나 초과의 복사체에 존재할 수 있다. 외인성 유전자는 게놈(핵 또는 색소체) 내로의 삽입물로서 또는 에피좀 분자로서 세포 내에 유지될 수 있다.
“외인성으로 제공된”은 세포 배양의 배양 배지에 공급된 분자를 말한다.
본 발명의 내용에 따라서, “지방산”은 글리세로지질 중 유리 지방산, 지방산 염 또는 지방 아실부를 의미할 것이다.
“고정 탄소원”은 본원에서 배양된 미생물에 의해 사용될 수 있는 배양 배지 내 고체 또는 액체 형태로 주위 온도 및 압력에서 존재하는 탄소를 함유하는 분자(들), 통상적으로 유기 분자이다. 따라서, 이산화탄소는 고정된 탄소원이 아니다.
배양 조건과 관련된 “종속 영양성”은 실질적으로 빛이 존재하지 않는 조건 하에 고정된 탄소원을 이용하거나 대사하면서 배양하는 것이다.
“파쇄액”은 물리적으로 파괴된 바이오매스다.
“수소:탄소 비율”은 원자 대 원자를 기준으로 분자 내 수소 원자 대 탄소 원자의 비율이다. 상기 비율은 탄화수소 분자 내 탄소 원자 및 수소 원자의 수를 말하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 최고 비율의 탄화수소는 메탄 CH4(4:1)이다.
“유도성 프로모터”는 특정 자극에 응답하여 작동적으로 연결된 유전자의 전사를 매개하는 프로모터이다. 이와 같은 프로모터의 예는 pH 또는 질소 수준이 변하는 조건 하에서 유도되는 프로모터 서열일 수 있다.
“작동 가능한 연결”은 2개의 핵산 서열, 예를 들어 제어 서열(통상적으로 프로모터)과 연결된 서열(통상적으로 단백질을 암호화하는 서열, 또는 암호화 서열이라고 불림) 간의 기능적 연결이다. 프로모터는 이것이 유전자의 전사를 매개할 수 있다면 외인성 유전자와 작동가능하게 연결되어 있다.
“지질 변형 효소”는 지질의 공유 구조를 변경하거나, 아니면 세포 내 지방산 프로필을 변경시킬 수 있는 효소를 말한다. 지질 변형 효소의 예로서는 리파제, 지방 아실-ACP 티오에스테라제, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소, 지방 아실-CoA 환원 효소, 지방 알데하이드 환원 효소, 불포화 효소, 예를 들어 스테아로일 아실기 운반 단백질 불포화 효소(SAD) 및 지방 아실 불포화 효소(FAD), 및 지방 알데하이드 탈카보닐화 효소를 포함한다.
“지질 경로 효소”는 지질 대사, 즉 지질 합성, 변형 또는 분해에 역할을 하는 임의의 효소 및 운반 단백질뿐만 아니라 지질을 화학적으로 변형시키는 임의의 단백질이다.
“지질 프로필” 또는 “글리세로지질 프로필”은 사슬 길이 및/또는 포화 패턴의 관점에서, 세포 내 지방산의 분포 또는 세포로부터 유래하는 오일의 지방산의 분포를 말한다. 이와 같은 내용 중, 포화 패턴은 포화된 산 대 불포화된 산의 척도, 또는 세포의 다양한 지방산 내 이중 결합의 위치 분포를 더욱 자세히 분석한 결과를 포함할 수 있다.
“용해(lysis)”는 유기체의 일체성을 손상시키는 흔히, 기계적, 화학 물질, 바이러스 또는 삼투압 기작에 의해 적어도 일부의 세포 내 내용물을 방출하기에 충분한 생물학적 유기체의 세포질 막 및 임의로 세포 벽을 파괴하는 것이다.
“용해(lysing)”은 용해 공정이다.
“미세 조류”는 엽록체 또는 색소체를 함유하고 임의로 광합성을 수행할 수 있는 미생물 유기체, 또는 광합성을 수행할 수 있는 원핵 미생물 유기체이다. 미세 조류는 고정 탄소원으로부터 유일하게 생존할 수 있는 종속 영양 생물뿐만 아니라 에너지로서 고정 탄소원을 대사시킬 수 없는 절대 광합성 독립 영양 생물을 포함한다. 미세 조류는 2개의 독특한 세포 유형의 단순한 다중세포 광합성 미생물인, 예를 들어 볼복스(Volvox)와 같은 미생물뿐만 아니라 세포 분열 후 단시간에 자매 세포로부터 분리되는 단일 세포 유기체, 예를 들어 클라미도모나스(Chlamydomonas)를 포함한다. 미세 조류는 클로렐라, 두날리엘라(Dunaliella), 및 프로토테카와 같은 세포를 포함한다. 미세 조류는 또한 아그메넬룸(Agmenellum), 아나바에나(Anabaena), 및 피로보트리스(Pyrobotrys)와 같은 세포-세포 접착을 나타내는 기타 다른 미생물 광합성 유기체를 포함한다. 미세 조류는 또한 특정 디노플라겔레이트 조류 종 및 프로토테카 속의 종과 같은 광합성을 수행하는 능력을 상실한 절대 종속 영양 미생물을 포함한다.
지방산과 관련된 내용 중 본원에 사용된 “중간쇄”는 C10 내지 C16 지방산을 말한다. 지방산과 관련된 내용 중“단쇄”는 C6 내지 C10 지방산을 말하는 한편, “장쇄”은 C17 이상인 지방산을 말한다. 이와 같은 범위는 달리 지정되지 않는 한 정확히 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
“천연 오일”은 트리글리세라이드의 지방산 프로필이 실질적으로 변경되도록, 다른 천연 또는 합성 오일 또는 분획과 오일이 배합되지 않는 경우, 유기체로부터 얻어진 대부분의 트리글리세라이드 오일을 의미할 것이다. 본원에 있어서, “분별”은 오일 자체의 지방산 프로필을 유기체에 의해 생성되지만. 달성된 지방산 프로필과 비교하였을 때 변경하는 방식으로, 오일로부터 물질을 제거하는 것을 의미한다. 오일을 대상으로 하여 자체의 트리글리세라이드 프로필을 실질적으로 변화시키지 않는 최소의 가공, 예를 들어 정제, 표백 및/또는 고무 성질 제거가 행해진 경우, 천연 오일은 유기체로부터 얻어지는 오일을 포함한다. 천연 오일은 또한 “에스테르 교환 반응이 진행되지 않은 천연 오일”일 수 있는데, 이는 천연 오일이 자체의 아실 결합에 지방산이 재분포되어 글리세롤로 가공되는 공정이 진행되지 않게 되고, 본질적으로 유기체로부터 회수되었을 때와 동일한 배열로 유지되는 경우를 의미한다.
2개의 단백질 또는 유전자와 관련하여 “자연적으로 공동 발현된”은 단백질 또는 이들의 유전자가 이들이 유래된 조직 또는 유기체에서 자연적으로 공동 발현됨을 의미하며, 이는 예를 들어 2개의 단백질을 암호화하는 유전자가 공통된 조절 서열의 제어 하에 있기 때문이거나 이들이 동일한 자극에 응답하여 발현되기 때문이다.
“삽투압 쇼크”는 삼투압의 급작스런 감소 후 용액 내 세포의 파열이다. 삽투압 쇼크는 때때로 상기 세포의 세포 성분을 용액 내로 방출하도록 유도된다.
“다당류 분해 효소”는 임의의 다당류의 가수 분해 또는 당화를 촉매할 수 있는 임의의 효소이다. 예를 들어, 셀룰라제는 셀룰로스의 가수 분해를 촉매한다.
“다당류” 또는 “글리칸”은 글리코시드 결합에 의해 서로 함께 연결된 단당류로 구성된 탄수화물이다. 셀룰로스는 특정 식물 세포 벽을 구성하는 다당류다. 셀룰로스는 보다 큰 이당류 및 올리고당뿐만 아니라 자일로스 및 글루코스와 같은 단당류를 생성하도록 효소에 의해 해중합될 수 있다.
“프로모터”는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 서열이다. 본원에 사용된 바와 같이, 프로모터는 전사 개시 부위 근처에 필수 핵산 서열, 예를 들어 중합 효소 II형 프로모터의 경우에, TATA 요소를 포함한다. 프로모터는 또한 임의로 전사 개시 부위로부터 수천 염기쌍 정도로 멀리 위치할 수 있는 원거리 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함한다.
“재조합체”는 외인성 핵산의 도입 또는 고유 핵산의 변경으로 인해 변형된 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터이다. 따라서, 예를 들어 재조합 세포는 천연(비재조합체) 형태의 세포 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현할 수 있거나 비재조합 세포에 의해 발현되는 유전자와는 상이하게 천연 유전자를 발현할 수 있다. 재조합 세포는 유전자 생성물 또는 세포 내 활성 유전자 생성물의 수준을 감소시키는 억제 요소, 예를 들어 돌연 변이, 녹아웃, 안티센스, 간섭 RNA(RNAi) 또는 dsRNA를 암호화하는 재조합 핵산(이에 제한되는 것은 아님)을 포함할 수 있다. “재조합 핵산”은 예를 들어, 중합 효소, 리가아제, 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제를 사용하는 핵산의 조작에 의해 일반적으로 시험관내 형성된 본래의 핵산이거나, 다르게는 통상적으로 자연적으로 발견되지 않는 형태로 존재한다. 재조합 핵산은, 예를 들어 2개 이상의 핵산을 작동가능하게 연결시키도록 하여 생성될 수 있다. 따라서, 통상적으로 자연적으로 연결되어 있지 않은 DNA 분자를 연결함에 의해 시험관내 형성된 분리된 핵산 또는 발현 벡터는 둘 다 본 발명의 목적을 위한 재조합체인 것으로 고려된다. 일단 재조합 핵산이 제조되고 숙주 세포 또는 유기체로 도입되면, 이것은 숙주 세포의 생체내 세포 기구를 사용하여 복제할 수 있지만, 일단 재조합적으로 생성되면 당해 핵산은 후속적으로 세포 내에서 복제된다 하더라도 여전히 본 발명의 목적을 위한 재조합체인 것으로 고려된다. 유사하게, “재조합 단백질”은, 즉 재조합 핵산의 발현을 통해 재조합 기술을 사용하여 제조된 단백질이다.
“재생 디젤”은 지질의 수소화 및 탈산소화를 통해 천연 오일로부터 생성된 알칸(예를 들어, C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 및 C 18:0)의 혼합물이다.
“당화”는 바이오매스, 통상적으로 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스를 글루코스 및 자일로스와 같은 단량체성 당으로 전환시키는 공정이다. “당화된” 또는 “해중합된” 셀룰로스 물질 또는 바이오매스는 당화를 통해 단량체 당으로 전환되는 셀룰로스 물질 또는 바이오매스를 말한다.
“푸르푸랄 종”은 동일한 염기성 구조 특징을 보유한 2-푸란카복스알데하이드 또는 유도체이다.
본원의 구체예에 따르면(반드시 선행 기술에 관해 논의된 사항에 의하지는 않음) 재조합 균주를 형성하기 위한 균주의 형질 전환과 관련하였을 때, “안정적인” 또는 “안정적으로 통합된”은 균주의 세포가 10세대 이상 동안 재조합 핵산을 보유하고 있는 경우를 의미할 것이다. 예를 들어 재조합 균주가 선택압의 존재 하에서 배양을 가능하게 하는 선택가능한 마커를 가지는 경우, 재조합 핵산은 선택압의 부재시 10세대 배양된 후에도 유지된다.
“수크로스 이용 유전자”는 발현되는 경우 에너지원으로서 수크로스를 이용하는 세포의 능력을 도와주는 유전자이다. 수크로스 이용 유전자에 의해 암호화된 단백질은 본원에서 “수크로스 이용 효소”로 지칭되고 수크로스 수송체, 수크로스 인버타제, 및 글루코키나제 및 프럭토키나제와 같은 헥소키나제를 포함한다.
II . 배양
본 발명은 일반적으로 미생물, 특히 제II형 지방산 생합성 경로를 가지는 유지성 미생물, 예를 들어 트리글리세라이드를 생산하는 미세 조류의 배양에 관한 것이다. 하나의 구체예에서, 미생물은 절대 종속 영양 생물이다. 미생물은 예를 들어 본원에 개시된 유전자 조작 방법을 바탕으로 생산된 재조합 미생물일 수 있다. 독자들의 편의를 위하여, 본 섹션은 하위 섹션들로 세분화된다. 하위 섹션 1은 미생물의 종과 균주를 기술한다. 하위 섹션 2는 배양에 유용한 생물 반응기를 기술한다. 하위 섹션 3은 배양을 위한 배지를 기술한다. 하위 섹션 4는 본 발명의 예시적인 배양 방법에 따른 오일 생성을 기술한다.
1. 미생물 종 및 균주
비록 이하에 제시된 예시적인 구체예들이 다수의 미생물에 적용될 수 있지만, 프로토테카는 지질의 생산에 사용되는 바람직한 미생물이다. 중요한 점은, 예를 들어 프로토테카를 사용하는, 본원에 기술된 유전자 조작 방법은 기타 다른 미생물(예를 들어, 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 클로렐라 불가리스, 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea), 클로렐라 케슬러리, 두날리엘라 터티올렉타(Dunaliella tertiolecta), 볼복스 카르테리(Volvox carteri), 해마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis), 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체(Closterium peracerosum - strigosum - littorale complex), 두날리엘라 비리디스(Dunaliella viridis), 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina), 고니움 펙토랄레(Gonium pectorale), 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum), 카에토세로스(Chaetoceros), 실린드로테카 푸시포르미스(Cylindrotheca fusiformis), 암피디늄 종(Amphidinium sp.), 심비오디늄 마이크로아드리악티큠(Symbiodinium microadriacticum), 나노클로롭시스(Nannochloropsis), 시클로텔라 크립티카(Cyclotella cryptica), 나비큘라 사프로필라(Navicula saprophila) 또는 탈라시오시라 슈도나나(Thalassiosira pseudonana))에 적용 가능하다는 것이다.
절대 종속 영양 미세 조류, 예를 들어 프로토테카로부터 얻어진 지질 또는 오일은 일반적으로 색소 함량이 낮을 수 있으며(예를 들어, 엽록소 및 임의의 카로티노이드의 수준은 검출이 안 될 정도로 낮을 수 있으며, 예를 들어, 발색 분자, 발색 불순물 또는 엽록소와 카로티노이드 농도의 합이 500ppm, 50ppm 또는 5ppm 미만일 수 있으며), 임의의 경우에는 기타 다른 미세 조류로부터 유래하는 지질보다 색소를 훨씬 적게 함유한다. 더욱이, 본 발명에 의해 제공된 재조합 프로토테카 세포는 기타 다른 미생물로부터 지질을 생산하는 것과 비교하여 보다 큰 수율 및 효율로 저렴하게 지질을 생산하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 예시적인 프로토테카 균주가 포함된다. 추가로, 상기 미세 조류는 종속 영양적으로 생장하고 프로토테카 윅커해미, 프로토테카 스태그노라(UTEX 327을 포함함), 프로토테카 포르토리센시스, 프로토테카 모리포르미스(UTEX 균주 1441, 1435를 포함함), 및 프로토테카 조프피로서 유전자 조작될 수 있다. 프로토테카 속의 종은 절대 종속 영양 생물이다.
오일, 연료 및 함유 화학 제품을 생산하는데 적당한 지질 또는 탄화수소를 생산하는 것 이외에, 본 발명의 구체예에 사용될 미생물을 선택하는 것에 영향을 미치는 고려 사항으로서는, (1) 고 지질 함량(세포 중량 백분율); (2) 생장의 용이성; (3) 유전자 조작의 용이성; 및 (4) 바이오매스 가공의 용이성을 포함한다. 특정 구체예에서, 야생형 미생물 또는 유전자 조작된 미생물은 지질이 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상 또는 70% 이상 또는 그 이상인 세포를 생산한다. 기타 특정 구체예에서, 야생형 미생물 또는 유전자 조작된 미생물은 40% 내지 80% 또는 50% 내지 90%의 트리글리세라이드를 포함하는 세포를 생산한다. 바람직한 유기체는 종속 영양 조건 하에서(빛이 부재하고 당이 존재하는 조건 하에서) 생장한다.
본 발명을 실시하는데 사용될 수 있는 조류의 예로서는 이하 표 1에 나열된 조류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
조류의 예
아크난테스 오리엔탈리스(Achnanthes orientalis), 아그메넬룸, 암피프로라 히알린(Amphiprora hyaline), 암포라 코페이포르미스(Amphora coffeiformis), 암포라 코페이포르미스 리니아(Amphora coffeiformis linea), 암포라 코페이포르미스 펑타타(Amphora coffeiformis punctata), 암포라 코페이포르미스 타일로리(Amphora coffeiformis taylori), 암포라 코페이포르미스 테뉴이스(Amphora coffeiformis tenuis), 암포라 델리카티시마(Amphora delicatissima), 암포라 델리카티시마 카피타타(Amphora delicatissima capitata), 암포라 종(Amphora sp.), 아나바에나, 안키스트로데스무스(Ankistrodesmus), 안키스트로데스무스 팔카투스(Ankistrodesmus falcatus), 보에켈로비아 후글란디(Boekelovia hooglandii), 보로디넬라 종(Borodinella sp.), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 보트리오코커스 수데티쿠스(Botryococcus sudeticus), 카르테리아(Carteria), 카에토세로스 그라실리스(Chaetoceros gracilis), 카에토세로스 무엘러리(Chaetoceros muelleri), 카에토세로스 무엘러리 서브살섬(Chaetoceros muelleri subsalsum), 카에토세로스 종(Chaetoceros sp.), 클로렐라 아니트라타(Chlorella anitrata), 클로렐라 안타르크티카(Chlorella Antarctica), 클로렐라 아우레오비리디스(Chlorella aureoviridis), 클로렐라 칸디다(Chlorella candida), 클로렐라 캡슐라테(Chlorella capsulate), 클로렐라 데시카테(Chlorella desiccate), 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea), 클로렐라 에머소니(Chlorella emersonii), 클로렐라 푸스카(Chlorella fusca), 클로렐라 푸스카 변종 바큐올라타(Chlorella fusca var . vacuolata), 클로렐라 글루코트로파(Chlorella glucotropha), 클로렐라 인퓨시오늄(Chlorella infusionum), 클로렐라 인퓨시오늄 변종 악토필라(Chlorella infusionum var . actophila), 클로렐라 인퓨시오늄 변종 옥세노필라(Chlorella infusionum var . auxenophila), 클로렐라 케슬러리, 클로렐라 로보포라(Chlorella lobophora)(균주 SAG 37.88), 클로렐라 루테오비리디스, 클로렐라 루테오비리디스 변종 아우레오비리디스(Chlorella luteoviridis var . aureoviridis), 클로렐라 루테오비리디스 변종 루테센스(Chlorella luteoviridis var. lutescens), 클로렐라 미니아타(Chlorella miniata), 클로렐라 미뉴티시마(Chlorella minutissima), 클로렐라 뮤타빌리스(Chlorella mutabilis), 클로렐라 녹터나(Chlorella nocturna), 클로렐라 파르바(Chlorella parva), 클로렐라 포토필리아(Chlorella photophila), 클로렐라 프링스헤이미(Chlorella pringsheimii), 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides)(UTEX 균주 1806, 411, 264, 256, 255, 250, 249, 31, 29, 25, 및CCAP 균주 211/17 및 211/8d 중 임의의 것을 포함함), 클로렐라 프로토테코이데스 변종 아시디콜라(Chlorella protothecoides var . acidicola), 클로렐라 레귤라리스(Chlorella regularis), 클로렐라 레귤라리스 변종 미니마(Chlorella regularis var . minima), 클로렐라 레귤라리스 변종 움브리카타(Chlorella regularis var . umbricata), 클로렐라 레이시글리(Chlorella reisiglii), 클로렐라 사카로필라(Chlorella saccharophila), 클로렐라 사카로필라 변종 엘립소이데아(Chlorella saccharophila var . ellipsoidea), 클로렐라 살리나(Chlorella salina), 클로렐라 심플렉스(Chlorella simplex), 클로렐라 소로키니아나, 클로렐라 종(Chlorella sp.), 클로렐라 스파에리카(Chlorella sphaerica), 클로렐라 스티그마토포라(Chlorella stigmatophora), 클로렐라 바니엘리(Chlorella vanniellii), 클로렐라 불가리스, 클로렐라 불가리스, 클로렐라 불가리스 에프. 테르티아(Chlorella vulgaris f. tertia), 클로렐라 불가리스 변종 오토트로피카(Chlorella vulgaris var . autotrophica), 클로렐라 불가리스 변종 비리디스(Chlorella vulgaris var . viridis), 클로렐라 불가리스 변종 불가리스(Chlorella vulgaris var . vulgaris), 클로렐라 불가리스 변종 불가리스 에프. 테르티아(Chlorella vulgaris var . vulgaris f. tertia), 클로렐라 불가리스 변종 불가리스 에프. 비리디스(Chlorella vulgaris var . vulgaris f. viridis), 클로렐라 잔텔라(Chlorella xanthella), 클로렐라 조핀지엔시스(Chlorella zofingiensis), 클로렐라 트레복시오이데스(Chlorella trebouxioides), 클로렐라 불가리스, 클로로코쿰 인퓨시오늄(Chlorococcum infusionum), 클로로코쿰 종(Chlorococcum sp.), 클로로고늄(Chlorogonium), 크로오모나스 종(Chroomonas sp.), 크리소스파에라 종(Chrysosphaera sp.), 크리코스파에라 종(Cricosphaera sp.), 크립토모나스 종(Cryptomonas sp.), 시클로텔라 크립티카(Cyclotella cryptica), 시클로텔라 메네기니아나(Cyclotella meneghiniana), 시클로텔라 종(Cyclotella sp.), 두날리엘라 종(Dunaliella sp.), 두날리엘라 바르다윌(Dunaliella bardawil), 두날리엘라 비오큘라타(Dunaliella bioculata), 두날리엘라 그라뉼라테(Dunaliella granulate), 두날리엘라 마리타임(Dunaliella maritime), 두날리엘라 미뉴타(Dunaliella minuta), 두날리엘라 파르바(Dunaliella parva), 두날리엘라 페이르세이(Dunaliella peircei), 두날리엘라 프리몰렉타(Dunaliella primolecta), 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina), 두날리엘라 테리콜라(Dunaliella terricola), 두날리엘라 터티올렉타(Dunaliella tertiolecta), 두날리엘라 비리디스(Dunaliella viridis), 두날리엘라 터티올렉타, 에레모스파에라 비리디스(Eremosphaera viridis), 에레모스파에라 종(Eremosphaera sp.), 엘립소이돈 종(Ellipsoidon sp.), 유글레나(Euglena), 프란세이아 종(Franceia sp.), 프라길라리아 크로토넨시스(Fragilaria crotonensis), 프라길라리아 종(Fragilaria sp.), 글레오캡사 종(Gleocapsa sp.), 글로에오탐니온 종(Gloeothamnion sp.), 하이메노모나스 종(Hymenomonas sp.), 이소크리시스 에이에프에프. 갈바나(Isochrysis aff . galbana), 이소크리시스 갈바나(Isochrysis galbana), 레포신클리스(Lepocinclis), 마이크락티늄(Micractinium), 마이크락티늄(UTEX LB 2614), 모노라피듐 미뉴텀(Monoraphidium minutum), 모노라피듐 종(Monoraphidium sp.), 나노클로리스 종(Nannochloris sp.), 나노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina), 나노클로롭시스 종(Nannochloropsis sp.), 나비큘라 아셉타타(Navicula acceptata), 나비큘라 비스칸테라에(Navicula biskanterae), 나비큘라 슈도테넬로이데스(Navicula pseudotenelloides), 나비큘라 펠리큘로사(Navicula pelliculosa), 나비큘라 사프로필라(Navicula saprophila), 나비큘라 종(Navicula sp.), 네프로클로리스 종(Nephrochloris sp.), 네프로셀미스 종(Nephroselmis sp.), 니츠시아 커뮤니스(Nitschia communis), 니츠시아 알렉산드리나(Nitzschia alexandrina), 니츠시아 커뮤니스(Nitzschia communis), 니츠시아 디시파타(Nitzschia dissipata), 니츠시아 프러스튤럼(Nitzschia frustulum), 니츠시아 한츠시아나(Nitzschia hantzschiana), 니츠시아 인컨스피큐아(Nitzschia inconspicua), 니츠시아 인터미디아(Nitzschia intermedia), 니츠시아 마이크로세팔라(Nitzschia microcephala), 니츠시아 푸실라(Nitzschia pusilla), 니츠시아 푸실라 엘립티카(Nitzschia pusilla elliptica), 니츠시아 푸실라 모노엔시스(Nitzschia pusilla monoensis), 니츠시아 쿼드랭귤라(Nitzschia quadrangular), 니츠시아 종(Nitzschia sp.), 오크로모나스 종(Ochromonas sp.), 오오시스티스 파르바(Oocystis parva), 오오시스티스 푸실라(Oocystis pusilla), 오오시스티스 종(Oocystis sp.), 오실라토리아 림네티카(Oscillatoria limnetica), 오실라토리아 종(Oscillatoria sp.), 오실라토리아 수브레비스(Oscillatoria subbrevis), 파셰리아 악시도필라(Pascheria acidophila), 파블로바 종(Pavlova sp.), 파구스(Phagus), 포르미디움(Phormidium), 플라티모나스 종(Platymonas sp.), 플루로크리시스 카르테라에(Pleurochrysis carterae), 플루로크리시스 덴타테(Pleurochrysis dentate), 플루로크리시스 종(Pleurochrysis sp.), 프로토테카 윅커해미, 프로토테카 스태그노라, 프로토테카 포르토리센시스, 프로토테카 모리포르미스, 프로토테카 조프피, 피라미모나스 종(Pyramimonas sp.), 피로보트리스, 사르시노이드 크리소피트(Sarcinoid chrysophyte), 세네데스무스 아르마터스(Scenedesmus armatus), 스피로자이라(Spirogyra), 스피룰리나 플라텐시스(Spirulina platensis), 스티코코커스 종(Stichococcus sp.), 시네코코커스 종(Synechococcus sp.), 테트라에드론(Tetraedron), 테트라셀미스 종(Tetraselmis sp.), 테트라셀미스 수에시카(Tetraselmis suecica), 탈라시오시라 웨이스플로기(Thalassiosira weissflogii) 및 비리디엘라 프리데리시아나(Viridiella fridericiana)
2. 생물 반응기
미생물은 유전자 조작을 수행하고 탄화수소(예를 들어, 지질, 지방산, 알데하이드, 알코올 및 알칸)를 생성할 2가지 목적을 위해 배양한다. 전자 유형의 배양은 소규모 및 처음에는 적어도 출발 미생물이 생장할 수 있는 조건 하에서 수행한다. 탄화수소를 생산하기 위한 배양은 생물 반응기에서 통상적으로 대규모(예를 들어, 10,000L, 40,000L, 100,000L 또는 보다 대형의 생물 반응기)로 수행한다. 미세 조류, 예를 들어 프로토테카 종은 통상적으로 생물 반응기내 액체 배지 중에서 본 발명의 방법으로 배양한다. 통상적으로, 생물 반응기는 빛이 입사되지 않도록 한다.
생물 반응기 또는 발효기를 사용하여 다양한 단계의 세포의 생리학적 사이클을 통해 미세 조류 세포를 배양한다. 생물 반응기는 종속 영양 생장 및 번식 방법에 사용하기 위한 많은 이점을 제공한다. 바이오매스를 생산하기 위해 미세 조류를 바람직하게 액체 중에서, 예를 들어 현탁 배양으로 대량으로 발효시킨다. 강철 발효기와 같은 생물 반응기는 매우 큰 배양 용적(40,000리터 이상의 용량을 갖는 생물 반응기가 본 발명의 다양한 구체예에서 사용됨)을 수용할 수 있다. 생물 반응기는 또한 통상적으로 온도, pH, 산소분압 및 이산화탄소 수준과 같은 배양 조건의 제어를 허용한다. 예를 들어, 생물 반응기는 통상적으로, 예를 들어 관에 부착된 포트를 사용하여 산소 또는 질소와 같은 가스 성분이 액체 배양물을 통해 기포 주입될 수 있도록 하는 형태를 취할 수 있다. 배양 배지의 pH, 미량 요소의 종류 및 농도 및 기타 다른 배지 성분과 같은 기타 다른 배양 파라미터가 또한 생물 반응기를 사용하여 보다 용이하게 조작될 수 있다.
회전 블레이드 및 임펠러, 진동(rocking) 기구, 교반 막대, 가압 가스 주입용 수단과 같은 장치가 장착된 생물 반응기를 사용하여 배양물이 혼합되도록 할 수 있다. 혼합은 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 상기 세포의 수에 있어서 원하는 증가가 이루어질 때까지 가스 주입 및 배지 주입의 난류 체계는 미세 조류의 번식 동안에 유지되지 않는다.
생물 반응기 포트를 사용하여 가스, 고체, 반고체 및 액체를, 미세 조류를 함유하는 생물 반응기 챔버에 도입하거나 추출할 수 있다. 많은 생물 반응기는 하나 초과의 포트(예를 들어, 배지 주입을 위한 하나 및 샘플링을 위한 또 다른 하나)를 갖는 한편, 단지 하나의 물질이 포트를 출입할 필요는 없다. 예를 들어, 포트를 사용하여 배양 배지가 생물 반응기로 유입될 수 있도록 하고 이후에 샘플링, 가스 주입, 가스 배출 또는 기타 다른 목적을 위해 사용될 수 있다. 바람직하게, 샘플링 포트는 배양물의 무균 특성을 변경, 손상시키지 않고 반복적으로 사용될 수 있다. 샘플링 포트는 샘플의 흐름이 중지되고 개시되거나 연속 샘플링의 수단을 제공하도록 하는 밸브 또는 기타 다른 장치로 구성될 수 있다. 생물 반응기는 통상적으로 배양물의 접종을 가능하게 하는 하나 이상의 포트를 갖고 상기 포트는 또한 배지 또는 가스 주입과 같은 기타 다른 목적을 위해 사용될 수 있다.
생물 반응기 포트는 미세 조류의 배양물의 가스 함량이 조작되도록 할 수 있다. 설명하자면, 생물 반응기 용적의 일부는 액체보다는 가스일 수 있고, 생물 반응기의 가스 주입구는 가스가 생물 반응기로 펌핑될 수 있도록 한다. 생물 반응기 내로 이롭게 펌핑될 수 있는 가스는 공기, 산소, 공기/CO2 혼합물, 비활성 가스(예를 들어, 아르곤) 및 기타 다른 가스를 포함한다. 생물 반응기는 통상적으로 사용자가 생물 반응기로의 가스 주입 속도를 조절할 수 있도록 구성될 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 생물 반응기로의 가스 주입 증가를 사용하여 배양물의 혼합을 증가시킬 수 있다.
증가된 가스 유입은 또한 배양물의 탁도에 영향을 미친다. 난기류는 수성 배양 배지의 수위 하부에 가스 주입 포트를 위치시켜 생물 반응기로 주입되는 가스가 배양물 표면으로 기포 주입되도록 함으로써 성취할 수 있다. 하나 이상의 가스 배출 포트는 가스가 배출되도록 하여 생물 반응기 내 압력 증강을 차단한다. 바람직하게, 가스 배출 포트는 생물 반응기로 오염 미생물이 들어가는 것을 차단하는 “원-웨이” 밸브와 연결된다.
3. 배지
미생물 배양 배지는 통상적으로 고정 질소원, 고정 탄소원, 미량 요소, 임의로 pH 유지를 위한 완충제 및 포스페이트(통상적으로 포스페이트 염으로서 제공됨)와 같은 성분들을 함유한다. 기타 다른 성분은 특히 해양 미세 조류를 위해 염화나트륨과 같은 염을 포함할 수 있다. 질소원은, 예를 들어 제한 없이 분자 질소, 질산염(nitrate), 질산 염(nitrate salt), 암모니아(순수 형태 또는 염 형태, 예를 들어 (NH4)2SO4 및 NH4OH), 단백질, 대두 밀, 옥수수 침지액, 및 효모 추출물을 포함하는 유기 및 무기 질소원을 함유한다. 미량 요소의 예로서는 아연, 붕소, 코발트, 구리, 망간, 및 몰리브덴을 포함하고, 예를 들어 이의 각각의 형태는 ZnCl2, H3BO3, CoCl2ㆍ6H2O, CuCl2ㆍ2H2O, MnCl2ㆍ4H2O 및 (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O이다.
본 발명의 방법에 따라 유용한 미생물은 전세계적으로 다양한 장소 및 환경에서 발견된다. 기타 다른 종 및 이들의 궁극적인 진화적 분기점으로부터의 분리 결과로서, 최적의 생장 및 지질 및/또는 탄화수소 성분들의 최적의 생산을 위한 특정 생장 배지는 예측하기 어려울 수 있다. 몇몇 경우에, 특정 미생물 균주는 몇몇 억제 성분의 존재 또는 특정 미생물 균주에 의해 요구되는 일부 필수 영양 요구성 물질의 부재 때문에 특정 생장 배지 상에서 생장하지 않을 수 있다.
고체 및 액체 생장 배지는 일반적으로 다양한 공급원으로부터 이용 가능하며, 광범위하게 다양한 미생물 균주에 적합한 특정 배지를 제조하기 위한 지침은, 예를 들어 조류의 배양 수집물을 위하여 택사스 대학교 오스틴 캠퍼스(University of Texas at Austin; 1 University Station A6700, Austin, Texas, 78712-0183, (UTEX))에서 운영하는 온라인 사이트(http://www.utex.org/)에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 다양한 담수 및 염수 배지는 본원에 참조로서 포함된 문헌[PCT Pub. No. 2008/151149]에 기재된 것들을 포함한다.
특정 예에서, 프로테오스 배지(Proteose Medium)는 무균 배양에 적합하고, 1L 용적의 배지(pH 약 6.8)는 1리터의 Bristol 배지에 1g의 프로테오스 펩톤을 첨가하여 제조할 수 있다. Bristol 배지는 수용액 중에 2.94mM NaNO3, 0.17mM CaCl2ㆍ2H2O, 0.3mM MgSO4ㆍ7H2O, 0.43mM, 1.29mM KH2PO4, 및 1.43mM NaCl을 포함한다. 1.5% 한천 배지에 대해, 15g의 한천을 1L의 용액에 첨가할 수 있다. 상기 용액을 덮고 오토클레이브 처리하며, 이어서 사용 전에 냉장 온도에 저장한다. 또 다른 예는 프로토테카 분리 배지(PIM)이며, 이는 10g/L의 수소칼륨 프탈레이트(KHP), 0.9g/L의 수산화나트륨, 0.1g/L의 황산마그네슘, 0.2g/L의 인산수소칼륨, 0.3g/L의 염화암모늄, 10g/L의 글루코스, 0.001g/L의 티아민 염산염, 20g/L 한천, 0.25g/L의 5-플루오로사이토신을 pH 범위 5.0 내지 5.2로 포함한다(문헌[Pore, 1973, App. Microbiology, 26: 648-649] 참조). 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 기타 다른 배지는 상기의 URL에 문의하거나 미생물 배양물(예를 들어, SAG, CCAP, 또는 CCALA)을 유지하는 기타 다른 기관에 문의하여 용이하게 확인할 수 있다. SAG는 괴팅겐 대학교(University of
Figure 112013079886893-pct00001
;
Figure 112013079886893-pct00002
, Germany)에서의 조류의 배양 수집물을 말하고, CCAP는 스코틀랜드 해양과학협회(Scottish Association for Marine Science; Scotland, United Kingdom)에 의해 관리되는 조류 및 원생동물의 배양 수집물을 말하며, CCALA는 식물연구원(Institute of Botany;
Figure 112013079886893-pct00003
, Czech Republic)의 조류 연구소의 배양 수집물을 말한다. 추가로, 미국 특허 제5,900,370호는 프로토테카 종의 종속 영양 발효에 적합한 배지 제형 및 조건을 기술한다.
오일 생산을 위해, 고정 탄소원의 선택이 중요한데, 그 이유는 오일 생산을 경제적으로 하기 위해서는 고정 탄소원의 비용이 충분히 낮아야 하기 때문이다. 따라서, 적합한 탄소원은, 예를 들어 아세테이트, 플로리도사이드, 프럭토스, 갈락토스, 글루쿠론산, 글루코스, 글리세롤, 락토스, 만노스, N-아세틸글루코사민, 람노스, 수크로스, 및/또는 자일로스를 포함할 수 있고, 상기 화합물을 함유하는 공급원료의 선택이 본 발명의 구체예의 방법의 중요한 양태이다. 본 발명의 방법에 따라 유용한 적합한 공급원료는, 예를 들어 흑액, 옥수수 전분, 해중합된 셀룰로스 물질, 유청, 당밀, 감자, 수수, 수크로스, 사탕무, 사탕수수, 쌀 및 밀을 포함할 수 있다. 탄소원은 또한 수크로스와 해중합된 사탕무 펄프의 혼합물과 같은 혼합물로서 제공될 수 있다. 하나 이상의 탄소원(들)은 하나 이상의 외인성으로 제공된 고정 탄소원(들)의 약 50μM 이상, 약 100μM 이상, 약 500μM 이상, 약 5mM 이상, 약 50mM 이상, 및 약 500mM 이상의 농도로 제공될 수 있다. 발효를 위한 공급원료로서 고도로 농축된 탄소원이 바람직하다. 예를 들어 몇몇 구체예에서, 배양 단계 이전 공급원료 중 글루코스의 수준은 300g/L 이상, 400g/L 이상, 500g/L 이상 또는 600g/L 이상, 또는 그 이상의 글루코스 수준으로 유가식 배양(fed batch cultivation)에 첨가되는데, 여기서 고도로 농축된 고정 탄소원은 세포가 생장하고 지질을 축적함에 따라서 시간 경과에 따라 세포에 공급된다. 다른 구체예에서, 배양 이전 수크로스는 500g/L 이상, 600g/L 이상, 700g/L 이상, 800g/L 이상 또는 그 이상의 수크로스 수준으로 유가 배양에 첨가되는데, 여기서 고도로 농축된 고정 탄소원은 세포가 생장하고 지질을 축적함에 따라서 시간 경과에 따라 세포에 공급된다. 고도로 농축된 고정 탄소원, 예를 들어 수크로스의 비제한적인 예로서는 진한 감자 당즙, 사탕수수 즙, 사탕무 즙 및 당밀을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해 특히 관심이 있는 탄소원은 셀룰로스(해중합된 형태), 글리세롤, 수크로스 및 수수를 포함하고, 이들 각각은 하기에서 보다 상세히 논의된다.
본 발명에 따라, 미생물은 공급원료로서 해중합된 셀룰로스 바이오매스를 사용하여 배양할 수 있다. 셀룰로스 바이오매스(예를 들어, 여물, 예를 들어 옥수수 대)는 저렴하고 용이하게 입수할 수 있지만, 상기 공급원료는 효모 생장에 억제 작용을 하는 것으로 밝혀졌고, 효모는 셀룰로스 물질로부터 생성된 5탄당(예를 들어, 헤미셀룰로스 유래의 자일로스)을 사용할 수 없다. 대조적으로, 적어도 일부 미세 조류는 가공된 셀룰로스 물질 상에서 생장할 수 있다. 셀룰로스 물질은 일반적으로 약 40% 내지 60%의 셀룰로스, 약 20% 내지 40%의 헤미셀룰로스 및 10% 내지 30%의 리그닌을 포함한다.
셀룰로스 물질은 농작물, 즉, 식물 일부, 1차 식품 또는 섬유 생성물과 함께 야생에서 제거되지 않는 주로 줄기 및 잎뿐만 아니라 초본성 및 목재 에너지 작물로부터의 잔류물을 포함한다. 이의 예로서는 농업 폐기물, 예를 들어 사탕수수 바가스, 쌀겨, 옥수수 섬유(줄기, 잎, 껍질 및 속대를 포함함), 밀짚, 쌀짚, 사탕무 펄프, 감귤 펄프, 감귤 과피; 산림 폐기물, 예를 들어 경목재 및 연목재 간벌, 및 수목 작업으로부터의 경목재 및 연목재 잔류물; 목재 폐기물, 예를 들어 톱 가루 폐기물(목재 칩, 톱밥) 및 펄프 가루 폐기물; 도시 폐기물, 예를 들어 시의 고형 폐기물의 종이 분획물, 도시 목재 폐기물 및 도시 녹색 폐기물, 예를 들어 시의 깎아낸 풀; 및 목재 건축 폐기물을 포함한다. 추가의 셀룰로스는 스위치그래스, 잡종 포플러 목재 및 억제, 섬유 케인(cane) 및 섬유 수수와 같은 전용 셀룰로스 작물을 포한한다. 상기 물질로부터 생성된 5탄당은 자일로스를 포함한다.
셀룰로스 물질은 상기 물질내 함유된 당(들)을 미생물이 이용할 수 있는 효율이 증가되도록 처리될 수 있다. 본 발명의 구체예는 산 폭쇄(acid explosion) 후 셀룰로스 물질을 처리하여 물질이 미생물(예를 들어, 미세 조류 및 유지성 효모)의 종속 영양성 배양에 사용하기에 적합하도록 하는 방법을 제공한다. 상기 논의된 바와 같이, 리그노셀룰로스 바이오매스는 셀룰로스, 베타 1,4 연결된 글루코스(6탄당)의 결정성 중합체, 헤미셀룰로스, 자일로스(5탄당)로 주로 구성된 보다 느슨하게 회합된 중합체 및 보다 적은 정도의 만노스, 갈락토스, 아라비노스, 리그닌, 시나필 알코올 및 이의 유도체로 구성된 복합 방향족 중합체, 및 알파 1,4-연결된 폴리갈락투론산의 선형 사슬인 펙틴을 포함하는, 다양한 분획물로 구성된다. 셀룰로스 및 헤미셀룰로스의 중합체 구조 때문에 이들 내 당(예를 들어, 단량체 글루코스 및 자일로스)은 많은 미생물에 의해 효율적으로 사용(대사)될 수 있는 형태로 존재 하지 않는다. 상기 미생물을 위해 중합체를 구성하는 단량체 당을 생성하도록 셀룰로스 바이오매스를 추가로 가공하면 셀룰로스 물질이 공급원료(탄소원)로서 효율적으로 사용되는 것을 보장하는 데 매우 도움이 될 수 있다.
셀룰로스 또는 셀룰로스 바이오매스는, 바이오매스가 승온 및 승압에서 희석 황산(또는 기타 다른 산)으로 처리되는 “폭쇄(explosion)”로 호칭되는 공정을 거친다. 상기 공정은, 바이오매스가 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 분획물의 글루코스 및 자일로스 단량체로의 효소 가수 분해를 효율적으로 거칠 수 있도록 바이오매스에 영향을 미친다. 생성된 단량체 당은 셀룰로스 당으로 호칭된다. 셀룰로스 당은 이어서 미생물에 의해 이용되어 다양한 대사물(예를 들어, 지질)을 생성할 수 있다. 산 폭쇄 단계는 헤미셀룰로스 분획물이 구성 단당류로 부분 가수 분해되도록 한다. 이들 당은 추가의 처리로 바이오매스로부터 완전히 유리될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 추가의 처리는 열수 처리이고, 이는 폭쇄된 물질을 고온수로 세척하여 염과 같은 오염물을 제거하는 것을 포함한다. 이러한 단계는 상기 공정에 사용되는 보다 희석된 당 농도로 인해 셀룰로스 에탄올 발효에 대해서는 필요하지 않다. 다른 구체예에서, 추가의 처리는 추가의 산 처리이다. 또 다른 구체예에서, 추가의 처리는 폭쇄된 물질의 효소 가수 분해이다. 이들 처리는 또한 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 처리 유형은 유리되는 당의 유형(예를 들어, 5탄당 대 6탄당), 및 이들이 당해 공정에서 유리되는 단계에 영향을 미칠 수 있다. 결과로서, 이들이 주로 5탄당 또는 6탄당이든 상관없이 상이한 당 스트림이 형성될 수 있다. 따라서 이들 농축된 5탄당 또는 6탄당 스트림은 상이한 탄소 이용 능력을 갖는 특이적 미생물에 지시될 수 있다.
본 발명의 방법에서는 통상적으로 에탄올 발효에서 달성되는 것 보다 높은 세포 밀도로 발효가 이루어질 수 있다. 종속 영양성 셀룰로스 오일 생산을 위한 배양물의 보다 높은 밀도 때문에, 고정 탄소원(예를 들어, 셀룰로스 유래 당 스트림(들))은 바람직하게 농축된 형태로 존재한다. 해중합된 셀룰로스 물질의 글루코스 수준은 바람직하게 배양 단계 전에 300g/리터 이상, 400g/리터 이상, 500g/리터 이상 또는 600g/리터 이상이며, 상기 배양 단계는 임의로 유가식 배양이고, 여기서 상기 물질은 세포가 생장하고 지질을 축적함에 따라서 시간 경과에 따라 세포에 공급된다. 따라서, 리그노셀룰로스 오일의 생산 동안에 매우 높은 세포 밀도를 생성하고 유지하기 위해서, 탄소 공급원료(들)가 고농축된 형태로 종속 영양 배양물로 전달될 수 있다. 그러나, 유지성 미생물에 대한 기질이 아니고 유지성 미생물에 의해 대사되지 않는 공급 스트림에서 임의의 성분은 생물 반응기에 축적할 것이며, 이는 성분이 독성을 가지거나 원하는 최종 생성물의 생산을 억제하는 경우 문제점을 유발할 수 있다. 폭쇄 공정 및 후속적인 중화 공정 둘 다에서 셀룰로스 물질의 생성으로부터 유래된 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄 및 염과 같은 리그닌 및 리그닌 유래 부산물, 탄수화물 유래 부산물, 및 심지어 비대사된 펜토스/헥소스 당은 에탄올 발효에서 문제점을 제시할 수 있고, 이들 효과는 초기 공급원료에서 이들의 농도가 높은 공정에서 상당히 증폭된다. 본 발명에 기술된 리그노셀룰로스 오일의 대규모 생산에 사용될 수 있는 6탄당에 대한 300g/L 범위(또는 이보다 높은)의 당 농도를 성취하기 위해, 이들 독성 물질의 농도는 셀룰로스 바이오매스의 에탄올 발효물에 통상적으로 존재하는 농도보다 20배 높을 수 있다.
셀룰로스 물질의 폭쇄 공정 처리는 상당한 양의 황산, 열 및 압력을 사용함으로써 탄수화물의 부산물, 즉 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄을 유리시킨다. 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄은 자일로스의 푸르푸랄 및 물로의 탈수를 통한 헤미셀룰로스의 가수 분해 동안에 생성된다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, 이들 부산물(예를 들어, 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄)은 생물 반응기로 도입하기 전에 당화된 리그노셀룰로스 물질로부터 제거된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 탄수화물의 부산물의 제거 공정은 폭쇄된 셀룰로스 물질의 열수 처리이다. 추가로, 본 발명은 푸르푸랄 또는 하이드록시메틸 푸르푸랄과 같은 화합물에 내성일 수 있는 균주가 리그노셀룰로스 오일 생산에 사용되는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 또한 발효 배지에서 푸르푸랄에 내성일 수 있는 것뿐만 아니라 실제로 리그노셀룰로스 오일의 생산 동안에 당해 부산물을 대사시킬 수 있는 미생물 및 방법을 제공한다.
상기 폭쇄 공정은 또한 상당한 수준의 염을 생성한다. 예를 들어, 폭쇄를 위한 통상적인 조건은, 폭쇄된 셀룰로스 바이오매스가 10:1의 물:고체(건조 중량)의 비율로 재현탁되는 경우 5mS/cm 초과의 전도성을 초래할 수 있다. 본 발명의 임의의 구체예에서, 희석된 폭쇄된 바이오매스는 효소 당화를 거치고, 생성된 상청액은 생물 반응기에 사용하기 위해 25배까지 농축된다. 농축된 당 스트림(들)에서 염 수준(전도성에 의해 측정됨)은 허용가능하지 않게 높을 수 있다(1.5M까지의 Na+ 당량). 추가의 염은 또한 후속적인 효소 당화 공정을 위해 폭쇄된 물질의 중화시 생성된다. 본 발명의 구체예는 이들 염을 제거하기 위한 방법을 제공하여 생성된 농축된 셀룰로스 당 스트림(들)이 리그노셀룰로스 오일을 생산하기 위한 종속 영양 공정에 사용될 수 있도록 한다. 몇몇 구체예에서, 상기 염을 제거하는 방법은, 예를 들어 이에 제한되지 않지만 DOWEX Marathon MR3과 같은 수지를 사용한 탈이온화이다. 임의의 구체예에서 수지 단계를 사용하는 탈이온화는 당화 전에, 바이오매스의 당 농축 또는 pH 조정 및 열수 처리 전, 또는 이들의 임의의 조합 전에 일어나며, 다른 구체예에서 상기 단계는 이들 공정 중 하나 이상 후에 수행한다. 다른 구체예에서, 폭쇄 공정 자체는 허용가능하지 않게 높은 수준으로 염이 생성되는 것을 피하도록 변화시킨다. 예를 들어, 셀룰로스 바이오매스의 황산(또는 기타 다른 산) 폭쇄에 대한 대안법은 기계적 펄핑으로 셀룰로스 바이오매스가 효소 가수 분해(당화)에 민감해지도록 하는 것이다. 또 다른 구체예에서, 고수준의 염에 내성인 미생물의 본래의 균주 또는 고수준의 염에 내성을 갖는 유전자 조작된 균주가 사용된다.
유지성 미생물을 사용하는 종속 영양 리그노셀룰로스 오일 생산에 사용하기 위한 폭쇄된 셀룰로스 바이오매스를 제조하는 방법에 대한 바람직한 구체예는 하기에 기술한다. 제1 단계는 재현탁된 폭쇄된 셀룰로스 바이오매스의 pH를 5.0 내지 5.3의 범위로 조정하고 이어서 셀룰로스 바이오매스를 3회 세척하는 것을 포함한다. 이러한 세척 단계는 탈염 및 이온 교환 수지, 역삼투압, 열수 처리(전술한 바와 같음) 또는 단지 반복적인 탈이온수 중의 재현탁 및 원심분리의 사용을 포함하는 다양한 수단에 의해 성취될 수 있다. 이러한 세척 단계는 전도성이 100μS/cm 내지 300μS/cm인 셀룰로스 스트림을 초래하고 상당한 양의 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄을 제거시킨다. 이러한 세척 단계로부터 경사분리(decant)는 헤미셀룰로스 분획물로부터 유리된 5탄당을 농축시키는 단계를 배제할 수 있다. 제2 단계는 세척된 셀룰로스 바이오매스의 효소 당화를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 아셀레라제(Genencor)를 사용한다. 제3 단계는 상기 당화된 바이오매스의 원심분리 또는 경사분리 및 세정을 통한 당의 회수를 포함한다. 생성한 바이오매스(고체)는 연료로서 사용될 수 있거나 폐기물로 보내질 수 있는 에너지가 밀접한 리그닌 풍부 성분이다. 원심분리/경사분리 및 세정 공정에서 회수된 당 스트림을 수집한다. 제4 단계는 투과물의 회수와 함께 오염 고체를 제거하기 위한 마이크로여과를 포함한다. 제5 단계는 진공 증발기를 사용하여 성취될 수 있는 농축 단계를 포함한다. 이러한 단계는 P'2000(Sigma/Fluka)과 같은 소포제의 첨가를 임의로 포함할 수 있으며, 이는 생성된 당 공급원료의 단백질 함량으로 인해 때때로 필요하다.
본 발명의 방법의 다른 구체예에서, 탄소원은 글리세롤이며, 이는 바이오디젤 에스테르 결합 전이로부터 산성화 및 비산성화된 글리세롤 부산물을 포함한다. 하나의 구체예에서, 탄소원은 글리세롤 및 하나 이상의 기타 다른 탄소원을 포함한다. 몇몇 경우에, 글리세롤 및 하나 이상의 기타 다른 고정 탄소원 모두는 발효 초기에 미생물에 제공된다. 몇몇 경우에, 글리세롤 및 하나 이상의 기타 다른 고정 탄소원이 소정의 비율로 동시에 미생물에 제공된다. 몇몇 경우에, 글리세롤 및 하나 이상의 기타 다른 고정 탄소원은 발효 과정 동안에 소정의 속도로 미생물에 공급된다.
몇몇 미세 조류는 글루코스의 존재 하에서보다 글리세롤의 존재 하에서 보다 신속하게 세포 분열을 진행한다(PCT 공개 제2008/151149호 참조). 이들 경우에, 처음에 세포에 글리세롤을 공급하여 세포 밀도를 신속하게 증가시키고, 이어서 글루코스를 공급하여 지질을 축적시키는 2단계 생장 공정은 지질이 생산되는 효율을 개선시킬 수 있다. 에스테르 결합 전이 공정의 글리세롤 부산물의 사용은 생산 공정으로 도입되는 경우 상당한 경제적인 이점을 제공할 수 있다. 글리세롤 및 글루코스의 혼합물과 같은 기타 다른 공급 방법이 또한 제공된다. 상기 혼합물의 공급은 또한 동일한 경제적 이득을 취득한다. 추가로, 본 발명은 미세 조류에 글리세롤과의 다양한 조합으로 수크로스와 같은 대안적인 당을 공급하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법의 다른 구체예에서, 탄소원은 전화당이다. 전화당은 수크로스에 비하여 결정화되려는 성향이 약하므로, 저장 및 유가식 발효에 이점을 제공할 수 있으며, 미세 조류를 포함하는 미생물의 종속 영양 배양의 경우, 농축된 탄소원을 필요로 한다. 하나의 구체예에서, 탄소원은 전화당, 바람직하게는 농축된 형태의 전화당이며, 바람직하게는 배양 단계, 임의로는 유가식 배양 단계 이전에 800g/리터 이상, 900g/리터 이상, 1000g/리터 이상 또는 1100g/리터 이상으로 존재한다. 전화당, 바람직하게 농축된 형태의 전화당은 세포가 생장하고 지질을 축적함에 따라서 시간 경과에 따라 세포에 공급된다.
본 발명의 방법의 다른 구체예에서, 탄소원은 수크로스이며, 이는 사탕수수 가공 유래의 진한 감자 당즙과 같이 수크로스를 함유하는 복합 공급원료를 포함한다. 종속 영양 오일 생산용 배양물의 밀도가 더 높기 때문에, 고정된 탄소원(예를 들어, 수크로스, 글루코스 등)은 바람직하게 농축된 형태이며, 바람직하게는 배양 단계, 임의로는 세포가 생장하고 지질을 축적함에 따라서 시간 경과에 따라 물질이 세포에 공급되는 유가식 배양 단계 이전에 500g/리터 이상, 600g/리터 이상, 700g/리터 이상 또는 800g/리터 이상으로 존재한다. 몇몇 경우에 있어서, 탄소원은 진한 감자 당즙의 형태, 바람직하게는 농축된 형태의 수크로스이며, 바람직하게는 배양 단계, 임의로는 유가식 배양 단계 이전에 60% 이상의 고체 또는 약 770g/리터 당, 70% 이상의 고체 또는 약 925g/리터 당, 또는 80% 이상의 고체 또는 약 1125g/리터 당으로 존재한다. 농축된 진한 감자 당즙은 세포가 생장하고 지질을 축적함에 따라서 시간 경과에 따라 세포에 공급된다.
하나의 구체예에서, 배양 배지는 하나 이상의 수크로스 이용 효소를 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 수크로스 이용 효소는 수크로스 인버타제이다. 수크로스 인버타제 효소는 미생물 군집에 의해 발현되는 외인성 수크로스 인버타제 유전자에 의해 암호화되는 분비성 수크로스 인버타제 효소일 수 있다. 분비성 수크로스 인버타제는 미생물에 의해 배양 배지 중에 분비될 수 있으며, 그 결과 배지 중 수크로스는 미생물에 의해 사용될 글루코스와 프럭토스로 전환된다. 이하에 기술된 바와 같이, 수크로스 인버타제는 재조합될 수 있으며, 이에 의해 순수하거나 복합적인 수크로스 공급 원료를 생장 또는 오일 생산용 고정 탄소원으로서 사용할 수 있는 능력을 미생물에 부여할 수 있다. 몇몇 경우에 하기 섹션 IV에 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 미세 조류는 수크로스 수송체, 수크로스 인버타제, 헥소키나제, 글루코키나제 또는 프럭토키나제와 같은 수크로스 이용 효소를 발현하도록 유전자 조작하였다.
수크로스를 함유하는 복합 공급원료는 사탕수수 가공 유래의 폐기 당밀을 포함하며, 사탕수수 가공의 낮은 가치의 폐기물의 사용은 탄화수소 및 기타 다른 오일의 생성에 상당한 비용 절감을 제공할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 수크로스를 함유하는 다른 복합 공급원료는 수수 시럽 및 순수한 수수를 포함하는 수수이다. 수수 시럽은 달콤한 수수 줄기의 즙으로부터 생산된다. 이의 당 프로필은 주로 글루코스(덱스트로스), 프럭토스 및 수크로스로 이루어진다.
4. 오일 생산
본 발명의 방법에 따른 오일 생산을 위해, 예를 들어 빛이 배양물에 입사할 수 없도록 하는 매우 대용량(40,000리터 이상)의 발효기를 사용하는 경우에서와 같이 암실에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다. 종속 영양 종은, 고정 탄소원을 함유하는 배지에서 빛의 부재 하에 오일 생산을 위해 생장되고 번식되며, 상기 생장은 종속 영양 생장으로서 공지되어 있다.
하나의 예로서, 지질 생산 미세 조류 세포의 접종물을 배지에 도입하고, 세포가 번식을 시작하기 전에 지체(lag) 기간(지체 단계)이 있다. 지체 기간 후, 번식률은 일정하게 증가하고 대수기(log) 또는 지수기로 진입한다. 지수기에 이어서 차례로 질소와 같은 영양물의 감소, 및 독성 물질의 증가 및 쿼럼센싱(quorum sensing) 기작으로 번식이 느려진다. 상기와 같이 느려진 후, 번식은 멈추고 세포는 정지기 또는 일정한 생장 상태로 진입하며, 이는 세포에 제공된 특정 환경에 좌우된다. 지질 풍부 바이오매스를 수득하기 위해, 상기 배양물은 통상적으로 질소 또는 다른 주요 영양물(탄소 이외의 다른 영양물)이 고갈되게 함으로써 조기에 종결되어 세포가 과량으로 존재하는 탄소원을 지질로, 특히 트리글리세라이드로 전환하도록 하는 지수기의 말기 후에 잘 수거한다. 배양 조건 파라미터는 총 오일 생산, 생산된 지질 종의 조합 및/또는 특정 오일의 생산을 최적화하도록 조작될 수 있다.
본원에 개시된 세포에 의한 지질 생산은 영양물이 공급되거나 세포 분열의 부재 하에 계속적인 지질 생산을 가능하도록 하기에 여전히 이용가능한 정지기를 포함하는, 대수기 또는 이후 기간 동안에 일어날 수 있다.
바람직하게, 본원에 기술되고/기술되거나 당업계에 공지된 조건을 사용하여 생장한 미생물은 건조 세포 중량으로 약 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 또는 80% 내지 90% 이상의 트리글리세라이드를 포함한다. 가공 조건은 특정 용도에 적합한 지질의 수율을 증가시키고/증가시키거나 생산 비용을 절감시키도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 임의의 구체예에서, 고정 탄소 에너지, 예를 들어 글루코스를 과량으로 제공하면서, 미세 조류는 하나 이상의 영양분, 예를 들어 질소, 인 또는 황의 제한 농도의 존재 하에서 배양한다. 질소 제한은 질소가 과량으로 제공된 배양물에서의 미생물 지질 수율 이상으로 미생물 지질 수율(건조 세포 중량의 그램 당 생산된 지질의 양을 측정)을 증가시키는 경향이 있다. 특정 구체예에서, 지질 수율의 증가는 약 10%, 50%, 100%, 200%, 또는 500% 이상이다. 상기 미생물은 전체 배양 기간 중 일부 동안 또는 전체 기간 동안 제한된 양의 영양물의 존재 하에 배양할 수 있다. 특정 구체예에서, 영양물 농도는 총 배양 기간 동안 2회 이상 제한 농도와 비제한 농도 사이에서 순환한다. 세포의 지질 함량은 과량의 탄소를 제공하지만 질소를 제한하거나 제공하지 않으면서 증가된 기간 동안 배양을 계속함으로써 증가시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 지질 수율은 지질 경로 효소(예를 들어, 지방산 합성 효소의 조효소 또는 보결 분자단)를 위한 하나 이상의 조인자(들)의 존재 하에 지질 생산 미생물(예를 들어, 미세 조류)을 배양함으로써 증가된다. 일반적으로, 조인자(들)의 농도는 조인자(들)의 부재 하의 미생물 지질 수율 이상으로 미생물 지질(예를 들어, 지방산) 수율을 증가시키기에 충분하다. 특정 구체예에서, 상기 조인자(들)는 배양물에 조인자(들)를 암호화하는 외인성 유전자를 함유하는 미생물(예를 들어, 미세 조류)을 포함시킴으로써 배양물에 제공된다. 대안적으로, 조인자(들)는 조인자의 합성에 관여하는 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 함유하는 미생물(예를 들어, 미세 조류)를 포함시킴으로써 배양물에 제공될 수 있다. 임의의 구체예에서, 적합한 조인자는 예를 들어, 비오틴 또는 판토테네이트와 같은 지질 경로 효소에 의해 요구되는 임의의 비타민을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 조인자를 암호화하거나 상기 조인자의 합성에 관여하는 유전자는 널리 공지되어 있고 전술한 것들과 같은 기술 및 구조물을 사용하여 미생물(예를 들어, 미세 조류)에 도입될 수 있다.
본원에 기술된 생물 반응기, 배양 조건 및 종속 영양 생장 및 번식 방법의 특정 예를 임의의 적합한 방식으로 조합하여 미생물 생장 및 지질 및/또는 단백질 생산의 효율을 개선시킬 수 있다.
건조 중량으로 높은 백분율의 오일/지질이 축적된 미세 조류 바이오매스는 당업계에 공지된 상이한 배양 방법을 사용하여 생성되었다(PCT 공개 제2008/151149호 참조). 본원에 기술되고 본 발명에 따라 유용한 배양 방법에 의해 생성된 미세 조류 바이오매스는 건조 중량으로 10% 이상의 미세 조류 오일을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 미생물 바이오매스는 건조 중량을 기준으로 25%, 50%, 60%, 70% 이상, 또는 80% 이상의 미세 조류 오일을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 미세 조류 바이오매스는 건조 중량으로 10% 내지 90%의 미세 조류 오일, 25% 내지 75%의 미세 조류 오일, 40% 내지 75%의 미세 조류 오일, 75% 내지 85% 또는 50% 내지 70%의 미세 조류 오일을 함유한다.
본원에 기술된 바이오매스의 미세 조류 오일, 또는 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기 위한 바이오매스로부터 추출된 오일은 하나 이상의 별개의 지방산 에스테르 측쇄를 갖는 글리세로지질을 포함할 수 있다. 글리세로지질은 다양한 길이 및 다양한 포화도를 가질 수 있는 1개, 2개 또는 3개의 지방산 분자에 에스테르화된 글리세롤 분자로 구성된다. 지방산 분자(및 미세 조류 오일)의 길이 및 포화 특성은 하기 섹션 IV에서 보다 상세하게 기술된 바와 같은 배양 조건을 통해 또는 지질 경로 조작을 통해 본 발명의 구체예의 미세 조류 오일 중 지방산 분자의 특성 또는 비율을 변형시키기 위해 조작될 수 있다. 특성과 비율의 특정 변형은 미생물 트리글리세라이드의 지방산 분포 변화, 예를 들어 지방산의 사슬 길이 프로필, 포화 프로필 및 하이드록실화의 변화를 포함한다. 이와 같이 생산된 오일은 천연 오일을 포함할 수 있다. 대안적으로, 미생물 오일의 특이적 배합물은 2가지 이상의 미세 조류 종으로부터 바이오매스 또는 조류 오일을 함께 혼합함으로써, 또는 대두, 평지씨, 카놀라, 야자, 팜핵, 코코넛, 옥수수, 폐기 식물, 오구나무(Chinese tallow), 올리브, 해바라기, 면화씨, 닭 지방, 우지, 돈지(porcine tallow), 미세 조류, 거대 조류, 미생물, 쿠페아(Cuphea), 아마, 땅콩, 초이스 백색 그리스(choice white grease), 라드, 양구슬냉이(Camelina sativa), 겨자씨, 캐슈 너트, 귀리, 루핀, 양마, 금잔화, 대마, 커피, 아마인(아마), 헤이즐넛, 등대풀속, 호박씨, 고수, 동백나무, 참깨, 홍화, 벼, 유동, 코코아, 코프라, 양귀비, 아주까리씨, 피칸, 호호바, 마카다미아, 브라질 너트, 아보카도, 석유 또는 상기 오일 중 임의의 증류 분획물과 같은 기타 다른 공급원 유래의 오일과 본 발명의 조류 오일을 배합함으로써 조류의 단일 종 내에서 제조할 수 있다.
오일 조성물, 즉 글리세로지질의 지방산 성분의 특성 및 비율은 또한 미생물의 2가지 이상의 별개 종으로부터 유래한 바이오매스 또는 오일을 조합함으로써 조작할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 미세 조류의 2가지 이상의 별개 종은 상이한 글리세로지질 프로필을 갖는다. 미세 조류의 별개 종은 바람직하게 종속 영양 조건 하에 본원에 기술된 바와 같이 함께 배양하거나 별도로 배양하여 각각의 오일을 생성할 수 있다. 미세 조류의 상이한 종은 세포의 글리세로지질 내 상이한 백분율의 별개의 지방산 성분을 함유할 수 있다.
일반적으로, 프로토테카 균주는 사슬 길이가 C8 내지 C14인 지방산을 매우 적게 갖거나 또는 전혀 갖지 않는다. 예를 들어, 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435), 프로토테카 크루가니(Prototheca krugani)(UTEX 329), 프로토테카 스태그노라(UTEX 1442) 및 프로토테카 조프피(UTEX 1438)는 C8 지방산을 함유하지 않고(또는 검출가능하지 않은 양으로 함유함) C10 지방산을 0% 내지 0.01%, C12 지방산을 0.03% 내지 2.1%, C14 지방산을 1.0% 내지 1.7%를 함유한다.
몇몇 경우에 있어서, 사슬 길이가 C8 또는 C8 내지 10인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 이식 유전자 함유 미생물 균주는 사슬 길이가 C8인 지방산을 1.5% 이상, 3.0% 이상, 10% 이상, 12% 이상, 또는 그 이상 가진다. 다른 경우에 있어서, 사슬 길이가 C10인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 가지는 지방 아실 ACP 티오에스테라제를 암호화하는 이식 유전자 함유 미생물 균주는 사슬 길이가 C10인 지방산을 5.0% 이상, 10.0% 이상, 24% 이상, 29% 이상, 또는 그 이상 가진다. 다른 경우에 있어서, 사슬 길이가 C12인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 이식 유전자 함유 미생물 균주는 사슬 길이가 C12인 지방산을 5% 이상, 15% 이상, 34% 이상, 50% 이상, 또는 그 이상 가진다. 다른 경우에 있어서, 사슬 길이가 C14인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 이식 유전자 함유 미생물 균주는 사슬 길이가 C14인 지방산을 2.0% 이상, 7% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 30% 이상, 또는 43% 이상, 또는 그 이상 가진다. 다른 경우에 있어서, 사슬 길이가 C16인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 이식 유전자 함유 미생물 균주는 사슬 길이가 C16인 지방산을 30% 이상, 40% 이상, 66% 이상, 또는 그 이상 가진다. 또 다른 경우에 있어서, 사슬 길이가 C18인 지방 아실-ACP 기질, 특히 C18:0에 대한 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 이식 유전자 함유 미생물 균주는 C18:0 지방산 수준이 5% 이상, 10% 이상, 26% 이상, 40% 이상, 또는 그 이상이다. 이와 같은 예들 중 임의의 것에 있어서, 미생물은 미세 조류, 예를 들어 프로토테카일 수 있다.
비제한적인 예에 있어서, 사슬 길이가 C8인 지방 아실-ACP 기질에 대하여 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 이식 유전자 함유 미생물 균주는 사슬 길이가 C8인 지방산을 1% 내지 20%, 바람직하게는 1.8% 내지 13% 가진다. 다른 비제한적인 예에서, 사슬 길이가 C10인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 이식 유전자 함유 미생물 균주는 사슬 길이가 C10인 지방산을 1% 내지 40%, 바람직하게는 1.91% 내지 30% 가진다. 다른 비제한적인 예에서, 사슬 길이가 C12인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 이식 유전자 함유 미생물 균주는 사슬 길이가 C12인 지방산을 10% 내지 60%, 바람직하게는 13.55% 내지 55% 가진다. 기타 비제한적인 예에서, 사슬 길이가 C14인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 이식 유전자 함유 미생물 균주는 사슬 길이가 C14인 지방산을 1% 내지 50%, 바람직하게는 2.59% 내지 43.27% 가진다. 다른 비제한적인 예에서, 탄소 사슬 길이가 다양한 지방 아실-ACP 기질에 대한 특이성이 넓은 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 이식 유전자 함유 미생물 균주는 사슬 길이가 C16인 지방산을 70% 이하 가진다. 다른 경우에서, 사슬 길이가 C16인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 이식 유전자 함유 미생물 균주는 사슬 길이가 C16인 지방산을 75% 이하, 바람직하게는 67.42% 이하 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 사슬 길이가 C8 내지 C14인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 이식 유전자 함유 미생물 균주는 (C8 내지 C14) 지방산을 1% 내지 790%, 또는 약 2% 내지 80% 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 사슬 길이가 C12 내지 C14인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 이식 유전자 함유 미생물 균주는 C12 내지 C14 지방산을 50% 이상 또는 60% 이상 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 특정 사슬 길이의 원하는 지방산이 증가하게 되므로, 일정하면서 높은 선택압 하에 이식 유전자 함유 미생물 균주가 외인성 유전자를 보유하도록 유지시키는 것은 유리하다. 외인성 유전자 보유의 고수준은 또한 본원에 개시된 방법 및 상동성 재조합 벡터를 사용하여 세포의 핵내 염색체에 외인성 유전자를 삽입함으로써 성취될 수 있다. 핵내 염색체에 통합된 외인성 유전자를 함유하는 재조합 세포는 본 발명의 목적이다. 이와 같은 예들 중 임의의 것에 있어서, 미생물은 미세 조류, 예를 들어 프로토테카일 수 있다.
임의로, 미생물 오일은 또한 미세 조류에 의해 생산되거나, 배양 배지로부터 유래하는 미세 조류 오일에 통합되는 기타 다른 성분들을 포함할 수도 있다. 이러한 기타 다른 구성 성분들은 미세 조류를 배양하는데 사용되는 배양 조건, 미세 조류의 종, 바이오매스로부터 미세 조류 오일을 회수할 때 사용되는 추출 방법, 그리고 미세 조류 오일 조성에 영향을 미칠 수 있는 기타 다른 인자들에 따라서 다양한 양으로 존재할 수 있다. 이와 같은 성분들의 비제한적인 예로서는 카로티노이드(오일 중 0.025mcg/g 내지 0.3mcg/g, 바람직하게는 0.05mcg/g 내지 0.244mcg/g으로 존재), 엽록소 A(오일 중 0.025mcg/g 내지 0.3mcg/g, 바람직하게는 0.045mcg/g 내지 0.268mcg/g으로 존재); 총 엽록소(오일 중 0.03mcg/g 미만, 바람직하게는 0.025mcg/g 미만으로 존재); 감마 토코페롤(오일 중 35mcg/g 내지 175mcg/g, 바람직하게는 38.3mcg/g 내지 164mcg/g으로 존재); 총 토코페롤(오일 중 50mcg/g 내지 300mcg/g, 바람직하게는 60.8mcg/g 내지 261.7mcg/g으로 존재); 브라시카스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 또는 베타시토스테롤(0.5% 미만, 바람직하게는 0.25% 미만으로 존재); 총 토코트리에놀(오일 중 300mcg/g 미만으로 존재); 그리고 총 토코트리에놀(오일 중 225mcg/g 내지 350mcg/g, 바람직하게는 249.6mcg/g 내지 325.3mcg/g으로 존재)을 포함한다.
기타 다른 성분으로서는 인지질, 토코페롤, 토코트리에놀, 카로티노이드(예를 들어, 알파-카로틴, 베타-카로틴 및 라이코펜 등), 잔토필(예를 들어, 루테인, 제아잔틴, 알파-크립토잔틴 및 베타-크립토잔틴) 및 다양한 유기 또는 무기 화합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 몇몇 경우에 있어서, 프로토테카 종으로부터 추출된 오일은 오일 1g당 0.001마이크로그램 내지 0.05마이크로그램의 루테인, 바람직하게는 0.003마이크로그램 내지 0.039마이크로그램의 루테인, 오일 1g당 0.005마이크로그램 미만의 라이코펜, 바람직하게는 0.003마이크로그램 미만의 라이코펜; 오일 1g당 0.005마이크로그램 미만의 베타 카로틴, 바람직하게는 0.003마이크로그램 미만의 베타 카로틴을 포함한다.
III . 유전자 조작 방법 및 재료
본 발명은 프로토테카 세포를 유전자 변형시키기 위한 방법 및 재료 및 본 발명의 방법에 유용한 재조합 숙주 세포를 제공하고, 당해 숙주 세포는 재조합 프로토테카 모리포르미스, 프로토테카 조프피, 프로토테카 크루가니 및 프로토테카 스태그노라 숙주 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 방법 및 재료의 기재는 독자의 편의를 위해 하위 섹션으로 나눈다. 하위 섹션 1에서, 형질 전환 방법을 기술한다. 하위 섹션 2에서 상동성 재조합을 사용한 유전자 조작 방법을 기술한다. 하위 섹션 3에서 발현 벡터 및 성분을 기술한다.
1. 조작 방법 - 형질 전환
세포는, 예를 들어 유전자 총(biolistics), 전기천공(문헌[Maruyama et al. (2004), Biotechnology Techniques 8:821-826] 참조), 유리 비드 형질 전환 및 탄화규소 휘스커 형질 전환을 포함하는 임의의 적합한 기술에 의해 형질 전환될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 원형질체를 형성하고 CaCl2 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하여 재조합 DNA를 미세 조류 세포에 도입하는 것을 수반한다(문헌[Kim et al. (2002), Mar . Biotechnol. 4:63-73] 참조, 상기 문헌은 클로렐라 엘립소이데아의 형질 전환을 위한 상기 방법의 사용을 보고함). 미세 조류의 동시 형질전환을 사용하여 2가지의 별개 벡터 분자를 세포에 동시에 도입할 수 있다(예를 들어, 문헌[Protist 2004 Dec;155(4):381-93] 참조).
또한 유전자 총 방법(예를 들어, 문헌[Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6:299 302], 미국 특허 제4,945,050호 참조); 전기천공[문헌[Fromm et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:5824 5828]; 레이져 빔, 미세주입 또는 DNA를 미세 조류로 도입할 수 있는 임의의 기타 다른 방법을 프로토테카 세포의 형질 전환에 사용할 수 있다.
2. 조작 방법 - 상동성 재조합
상동성 재조합은 상동성 영역을 정렬하고 교환하는 상보적 DNA 서열의 능력이다. 표적화된 게놈 서열(“주형”)과 상동성인 서열을 함유하는 이식 유전자 DNA(“공여체”)는 유기체에 도입된 다음, 상응하는 게놈 상동성 서열 부위에서 게놈으로 재조합을 진행한다.
숙주 유기체에서 상동성 재조합을 수행하기 위한 능력은 분자 유전학적 수준에서 수행될 수 있는 것에 대한 많은 실제 연관성을 갖고 맞춤 오일을 생성할 수 있는 유지성 미생물의 생성에 유용하다. 이의 매우 자연적인 상동성 재조합이란 정확한 유전자 표적화 사건이고, 따라서 동일한 표적화 서열로 생성된 대부분의 이식 유전자 계열은 표현형의 관점에서 근본적으로 동일하고 극소수의 형질 전환 사건의 스크리닝을 필요로 한다. 상동성 재조합은 또한 숙주 염색체로의 유전자 삽입 사건을 표적화하여, 잠재적으로 심지어 유전자 선별 부재 하에서도 우수한 유전학적 안정성을 가져온다. 상이한 염색체 유전자좌는 심지어 이종성 프로모터/UTR로부터 유전자 발현에 영향을 줄 가능성이 있기 때문에, 상동성 재조합은 잘 모르는 게놈 환경 내에서 유전자좌를 탐색하고 유전자 발현에 대한 이들 환경의 영향을 평가하는 방법일 수 있다.
상동성 재조합을 사용하는 특히 유용한 유전자 조작 접근법은 고도로 특이적인 방식으로 이종성 유전자 발현을 구동시키는 프로모터/UTR과 같은 특이적 숙주 조절 요소를 선택하는 것이다. 예를 들어, 선택 마커를 암호화하는 이종 유전자로 불포화 효소 유전자/유전자 군을 제거 또는 녹아웃하는 것은 숙주 세포 내에서 생산된 포화 지방산의 전체 백분율을 증가시킬 것으로 예상될 수 있다. 실시예 6은 상동성 재조합 표적화 구조물과, (프로토테카 모리포르미스 내에서 발생되는) 이와 같은 불포화 효소 유전자 제거 또는 녹아웃의 작업 실시예를 기술한다. 내인성 유전자의 발현을 감소시키기 위한 다른 접근법으로서는 유전자 발현을 RNA 유도 하향 조절 또는 침묵을 이용하는 접근법, 예를 들어 RNAi 또는 안티센스 접근법, 그리고 dsRNA 접근법(이에 제한되는 것은 아님)이 있다. 안티센스, RNAi, dsRNA 접근법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, mRNA로서 발현될 때 헤어핀 RNA를 형성시킬 발현 구조물 또는 안티센스 배향으로 전사될 표적 유전자의 일부를 함유하는 발현 구조물의 도입을 포함한다. 3가지 접근법 모두는 표적 유전자의 발현의 감소를 가져올 것이다. 실시예 6은 또한 발현 구조물과, RNAi 및 안티센스 접근법에 의해 내인성 프로토테카 모리포르미스 델타 12 불포화 효소 유전자(FADc)를 하향 조절하는 작업 실시예를 기술한다.
상동성 재조합은 정확한 유전자 표적화 사건이기 때문에, 충분한 측접(flanking) 영역이 확인되었다면, 관심의 유전자 또는 영역 내 임의의 뉴클레오티드(들)를 정확히 변형시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 상동성 재조합은 RNA 및/또는 단백질의 유전자 발현에 영향을 주는 조절 서열을 변형시키기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 이것은 또한 기질 특이성, 친화성 및 Km과 같은 효소 활성을 변형시킴에 따라서 숙주 세포의 대사에서 원하는 변화에 영향을 주고자 단백질 암호화 영역을 변형시키는데 사용될 수 있다. 상동성 재조합은 숙주 게놈을 조작하여 유전자 표적화, 유전자 전환, 유전자 결실, 유전자 복제, 유전자 역위를 가져오고, 프로모터, 인핸서 및 3'UTR과 같은 유전자 발현 조절 요소를 교환하기 위한 강력한 수단을 제공한다.
상동성 재조합은 내인성 숙주 세포 게놈 내에 관심의 유전자 또는 영역을 “표적화”하기 위한 내인성 서열 조각을 함유하는 표적화 구조물을 사용하여 성취될 수 있다. 상기 표적화 서열은 관심의 유전자 또는 영역의 5'에 위치하거나 관심의 유전자/영역의 3'에 위치하거나 심지어 관심의 유전자/영역을 측접할 수 있다. 상기 표적화 구조물은 추가의 벡터 골격과 함께 고차코일화된 플라스미드 DNA로서, 벡터 골격을 갖지 않는 PCR 생성물로서 또는 선형화된 분자로서 숙주 세포로 형질 전환될 수 있다. 몇몇 경우에, 이것은 먼저 제한 효소에 이식 유전자 DNA(공여체 DNA)내의 상동성 서열을 노출시키는 것이 유리할 수 있다. 상기 단계는 재조합 효율을 증가시킬 수 있고 원하지 않는 사건의 발생을 감소시킬 수 있다. 재조합 효율을 증가시키는 기타 다른 방법은 PCR을 사용하여 표적화된 게놈 서열에 상동성인 선형 말단을 함유하는 형질 전환 이식 유전자 DNA를 생성시키는 것을 포함한다.
비제한적 예시를 위하여, 상동성 재조합에 유용한 공여 DNA 서열 영역은 프로토테카 모리포르미스 내 DNA의 KE858 영역을 포함한다. KE858은 단백질의 운반 RNA(tRNA) 군과 상동성을 공유하는 단백질의 암호화 영역의 일부를 포함하는, 1.3kb 크기의 게놈 단편이다. 서던 블럿은, KE858 서열이 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 게놈 내 단일 복사체로 존재한다는 것을 보여주었다. 이 영역과, 이 영역을 상동성 재조합 표적화에 이용하는 실시예는 PCT 출원 PCT/US2009/066142호에 기술되어 있다. 유용한 공여체 DNA의 다른 영역은 본원에서 “6S”라고 칭하여지는 게놈 서열(서열 번호 82 및 서열 번호 84의 공여체 서열)이다. 6S 서열은 6S rRNA 서열이 아니라는 것을 주목한다. 이 서열을 프로토테카 모리포르미스 내 상동성 재조합에 사용하는 것은 이하 실시예에 기술되어 있다.
3. 벡터 및 벡터 성분
본 발명에 따라 미생물을 형질 전환시키기 위한 벡터는 본원에 개시된 바를 고려하여 당업자에게 익숙한 공지된 기술에 의해 제조할 수 있다. 벡터는 통상적으로 하나 이상의 유전자를 함유하며, 여기서 각각의 유전자는 원하는 생성물(유전자 생성물)의 발현을 암호화하고 유전자 발현을 조절하거나 유전자 생성물을 재조합 세포 내 특정 위치에 표적화하는 하나 이상의 제어 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 독자를 돕기 위해, 본 하위 섹션은 여러 하위 섹션으로 나누어진다. 하위 섹션 A는 통상적으로 벡터 상에 함유된 제어 서열뿐만 아니라 본 발명에 의해 제공된 신규 제어 서열을 기술한다. 하위 섹션 B는 벡터 내에 통상적으로 함유된 유전자뿐만 아니라 신규 코돈의 최적화 방법 및 본 발명에 의해 제공된 것들을 사용하여 제조된 유전자를 기술한다.
A. 제어 서열
제어 서열은 암호화 서열의 발현을 조절하거나 유전자 생성물을 세포 내부 또는 외부의 특정 위치로 지시하는 핵산이다. 발현을 조절하는 제어 서열은, 예를 들어 암호화 서열의 전사를 조절하는 프로모터 및 암호화 서열의 전사를 종결시키는 종결자를 포함한다. 다른 제어 서열은 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 암호화 서열의 말단에 위치한 3' 비번역 서열이다. 유전자 생성물을 특정 위치로 지시하는 제어 서열은 단백질이 세포 내부 또는 외부의 특정 위치에 부착되는 위치로 지시하는 신호 펩티드를 암호화하는 것들을 포함한다.
따라서, 미세 조류 내 외인성 유전자의 발현을 위한 예시적인 벡터 설계는 미세 조류내에서 활성인 프로모터에 작동 가능하도록 결합된 원하는 유전자 생성물(예를 들어, 선택가능한 마커, 지질 경로 변형 효소 또는 수크로스 이용 효소)에 대한 암호화 서열을 함유한다. 대안적으로, 벡터가 관심의 암호화 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하지 않는 경우, 상기 암호화 서열은 이것이 벡터 통합 지점에서 내인성 프로모터와 작동가능하게 연결되도록 세포 내로 형질 전환될 수 있다. 형질 전환의 프로모터 부재 방법은 미세 조류에서 작동하는 것으로 입증되었다(예를 들어, 문헌[Plant Journal 14:4, (1998), pp.441-447] 참조).
많은 프로모터, 예를 들어 형질 전환된 조류에 내인성이 아닌 프로모터(즉, 다른 조류 유래의 프로모터, 고등 식물 유래의 프로모터 및 식물 바이러스 또는 조류 바이러스 유래의 프로모터)뿐만 아니라 형질 전환된 조류에 내인성인 프로모터는 미세 조류 내에서 활성이다. 미세 조류 내에서 활성인 예시적인 외인성 및/또는 내인성 프로모터(또한 미세 조류에서 기능하는 항생제 내성 유전자)는 PCT 공개 제2008/151149호 및 본원에 인용된 참조 문헌에 기술되어 있다.
외인성 유전자를 발현시키는데 사용되는 프로모터는 상기 유전자에 자연적으로 연결되는 프로모터일 수 있거나 이종성 프로모터일 수 있다. 몇몇 프로모터는 하나 초과의 미세 조류 종에서 활성이다. 기타 다른 프로모터는 종 특이적이다. 예시적인 프로모터로서는 하기 실시예에 사용된 클라미도모나스 레인하르드티(Chlamydomonas reinhardtii) 유래의 β-튜불린과 같은 프로모터, 및 다수의 미세 조류 종에서 활성인 것으로 밝혀진 콜리플라워 모자이크 바이러스(CMV) 및 클로렐라 바이러스와 같은 바이러스 프로모터를 포함한다(예를 들어, 문헌[Plant Cell Rep. 2005 Mar;23(10-11):727-35]; [J Microbiol. 2005 Aug;43(4):361-5]; [Mar Biotechnol (NY). 2002 Jan;4(l):63-73] 참조). 프로토테카에서 외인성 유전자의 발현에 사용하기에 적합한 다른 프로모터는 클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 탈수소화 효소 프로모터/5 'UTR이다. 임의로, 프로모터를 함유하는 상기 서열중 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 또는 60개 이상의 뉴클레오티드가 사용된다. 프로토테카에서 외인성 유전자의 발현에 유용한 예시적인 프로모터는 본 출원의 서열 목록에 열거되어 있으며, 예를 들어 클로렐라 HUP1 유전자의 프로모터(서열번호 1) 및 클로렐라 엘립소이데아 질산염 환원 효소 프로모터(서열번호 2)가 있다. 클로렐라 바이러스 프로모터는 또한 프로토테카에서 미국 특허 제6,395,965호의 서열번호 1 내지 서열번호 7과 같은 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있다. 프로토테카에서 활성인 추가의 프로모터는 예를 들어 문헌[Biochem Biophys Res Commun. 1994 Oct 14;204(l): 187-94]; [Plant Mol Biol. 1994 Oct;26(l):85-93]; [Virology. 2004 Aug 15;326(1): 150-9]; 및 [Virology. 2004 Jan 5;318(l):214-23]에서 찾을 수 있다. 기타 다른 유용한 프로모터는 이하 실시예에 상세히 기술되어 있다.
프로모터는 일반적으로 지속성(constitutive)이거나 유도성인 것으로서 특징지어질 수 있다. 지속성 프로모터는 일반적으로 동일한 수준에서 항상(또는 세포 수명 사이클의 특정 시점에서) 발현을 구동하는데 활성이거나 발현을 구동하도록 작용한다. 역으로, 유도성 프로모터는 활성이거나(또는 불활성화되거나) 단지 자극에 응답하여 상당히 상향 조절되거나 하향 조절된다. 상기 프로모터 유형 둘 다 본 발명의 방법에 적용된다. 본 발명에서 유용한 유도성 프로모터는 외인성으로 제공된 소분자(예를 들어, 서열번호 1에서와 같이 글루코스), 온도(열 또는 냉), 배양 배지 내 질소 부재 등과 같은 자극에 응답하여 작동 가능하도록 결합된 유전자의 전사를 매개하는 것들을 포함한다. 적합한 프로모터는 근본적으로 사일런트 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있거나 바람직하게 낮은 수준으로 전사된 작동 가능하도록 결합된 유전자의 전사를 상당히 상향 조절할 수 있다. 이하 실시예에는 프로토테카 세포 내에서 유용한 부가적인 유도성 프로모터를 기술한다.
종결 영역 제어 서열의 내포는 임의적이며, 상기 종결 영역은 비교적 상호교환가능하므로 사용되는 경우 상기 선택은 주로 편의를 위한 것이다. 상기 종결 영역은 전사 개시 영역(프로모터)에 고유한 것일 수 있거나, 관심의 DNA 서열에 고유한 것일 수 있거나, 다른 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chen 및 Orozco, Nucleic Acids Res. (1988) 16:8411]를 참조한다.
본 발명은 또한 제어 서열과 재조합 유전자, 그리고 관심의 유전자 생성물을 특정 세포 구획, 예를 들어 엽록체, 색소체, 미토콘드리아 또는 소포체로 보내는 것을 가능하게 하는 유전자를 함유하는 벡터를 제공한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 구체예는 제어 서열과 재조합 유전자, 그리고 세포 외부로 단백질의 분비를 가능하게 하는 유전자를 함유하는 벡터를 포함한다.
프로토테카 핵 게놈에서 발현되는 단백질은 색소체 표적화 신호를 사용하여 색소체로 표적화될 수 있다. 클로렐라에 내인성인 색소체 표적화 서열은, 예를 들어 색소체로 표적화되는 단백질을 암호화하는 클로렐라 핵 게놈 내 유전자들은 공지되어 있고, 이는 예를 들어 GenBank 수탁 번호 제AY646197호 및 제AF499684호를 참조하며, 하나의 구체예에서 이러한 제어 서열은 단백질의 발현을 프로토테카 색소체로 표적화하는 본 발명의 벡터 내에 사용된다.
하기 실시예는 숙주 세포 내 올바른 구획으로 이종성 단백질을 표적화하는 조류 색소체 표적화 서열의 용도를 기술한다. cDNA 라이브러리는 프로토테카 모리포르미스 및 클로렐라 프로토테코디에스(Chlorella protothecodies) 세포를 사용하여 제조되었으며 PCT 출원 PCT/US2009/066142호에 기술되어 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 프로토테카 내에서 폴리펩티드의 발현은 소포체로 표적화된다. 발현 벡터 내 적절한 보유 또는 분류 신호의 내포는 단백질이 소포체(ER)에 보유되고 골지체로 하류로 가지 않도록 하는 것을 보장한다. 예를 들어, IMPACTVECTOR 1.3 벡터(Wageningen UR- Plant Research International 제조)는 널리 공지된 KDEL 보유 또는 분류 신호를 포함한다. 상기 벡터와 함께, ER 보유는 이것이 발현 수준을 5배 이상으로 개선시킴이 보고되었다는 점에서 실제 이점을 갖는다. 이에 대한 주요 이유는 ER이 세포질 내 존재하는 것보다 발현된 단백질의 번역 후 분해에 관여하는 보다 낮은 농도이고/농도이거나 상이한 프로테아제를 함유하는 것으로 나타난다. 녹색 미세 조류에서 기능하는 ER 보유 신호는 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Apr 26;102(17):6225-30]을 참조한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 배양 배지 내로 세포 외부로의 분비를 위해 표적화된다. 프로토테카에서 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 클로렐라 중에서 활성인 분비 신호에 대한 예는 문헌[Hawkins et al., Current Microbiology Vol. 38 (1999), pp. 335-341]을 참조한다.
B. 유전자 및 코돈 최적화
통상적으로, 유전자는 프로모터, 암호화 서열 및 종결 제어 서열을 포함한다. 재조합 DNA 기술에 의해 조립되는 경우, 유전자는 발현 카세트로 호칭될 수 있고, 재조합 유전자를 숙주 세포로 도입하는데 사용되는 벡터로의 편리한 삽입을 위한 제한 부위에 측접할 수 있다. 상기 발현 카세트는 상동성 재조합에 의해 발현 카세트의 게놈으로의 안정적인 통합을 촉진시키는, 게놈 또는 기타 다른 핵산 표적 유래의 DNA 서열에 측접할 수 있다. 대안적으로, 상기 벡터 및 이의 발현 카세트는 통합되지 않은 상태(예를 들어, 에피좀)로 유지될 수 있고, 이 경우에 상기 벡터는 통상적으로, 이종성 벡터 DNA의 복제를 제공할 수 있는 복제 기점을 포함한다.
벡터상에 존재하는 통상의 유전자는 단백질을 암호화하는 유전자이고, 이의 발현은 상기 단백질을 함유하는 재조합 세포가 상기 단백질을 발현하지 않는 세포로부터 구분될 수 있도록 한다. 상기 유전자 및 이의 상응하는 유전자 생성물은 선택가능한 마커 또는 선택 마커로서 호칭된다. 임의의 광범위하게 다양한 선택가능한 마커는 프로토테카를 형질 전환시키는데 유용한 이식 유전자 구조물에 사용될 수 있다. 적합한 선택가능한 마커의 예로서는 G418 내성 유전자, 질산염 환원 효소 유전자(문헌[Dawson et al. (1997), Current Microbiology 35:356-362] 참조), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(HPT; 문헌[Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73] 참조), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 및 플레오마이신에 대해 내성을 부여하는 ble 유전자(문헌[Huang et al. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:197-205] 참조)를 포함한다. 항생제에 대한 미세 조류의 민감성을 측정하는 방법은 널리 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Mol Gen Genet. 1996 Oct 16;252(5):572-9]은 본원에 기술된 바와 같은 수크로스 인버타제 및 또한 본원에 기술된 바와 같은 티아민 영양 요구성 보완을 기술한다.
항생제를 바탕으로 하지 않는 기타 다른 선택가능한 마커도 또한 일반적으로 미세 조류(예를 들어, 프로토테카 종)를 형질 전환하는데 유용한 이식 유전자 구조물 내에 사용될 수 있다. 이전에는 미세 조류에 의해 이용될 수 없었던 임의의 탄소원을 이용하는 능력을 부여하는 유전자도 또한 선택가능한 마커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 프로토테카 모리포르미스 균주는 통상적으로 적어도 수크로스 상에서 잘 생장하지 못한다. 수크로스 인버타제 유전자를 함유하는 구조물의 사용으로 양성 형질 전환체가 탄소 기질인 수크로스 상에서 생장하는 능력을 부여할 수 있다. 기타 다른 선택가능한 마커와 함께 선택가능한 마커로서 수크로스를 활용하는 것에 관한 부연 설명은 이하 섹션 IV에 논의되어 있다.
본 발명의 목적을 위해, 본 발명의 재조합 숙주 세포를 제조하는데 사용되는 발현 벡터는 상기 유전자들 중 하나가 선택가능한 마커인 경우, 2개 이상, 흔히 3개의 유전자를 포함할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 유전자 조작된 프로토테카는 선택가능한 마커뿐만 아니라 하나 이상의 외인성 유전자, 예를 들어 수크로스 인버타제 유전자 또는 아실 ACP-티오에스테라제 유전자를 포함하는 본 발명의 벡터로 형질 전환될 수 있다. 하나 또는 2개의 유전자는 지질 수율 및 지방산 에스테르로의 전환을 증진시키기 위해 상기 유전자들의 발현의 상대 타이밍이 제어될 수 있게 하는 유도성 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 2개 이상의 외인성 유전자의 발현은 동일한 유도성 프로모터의 제어 하에 또는 상이한 유도성(또는 지속성) 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 후자 상황에서, 제1 외인성 유전자의 발현은 제1 기간 동안 유도될 수 있고(제1 기간 동안에 제2 외인성 유전자의 발현은 유도되거나 유도되지 않을 수 있음) 제2 외인성 유전자의 발현은 제2 기간 동안 유도될 수 있다(제2 기간 동안에 제1 외인성 유전자의 발현은 유도되거나 유도되지 않을 수 있음).
다른 구체예에서, (임의의 선택가능한 마커에 추가로) 2개 이상의 외인성 유전자는 지방 아실-ACP 티오에스테라제 및 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소이고, 상기 조합 작용은 알코올 생성물을 생성시킨다. 추가로 제한 없이 알데하이드를 생성하기 위한 지방 아실-ACP 티오에스테라제 및 지방 아실-CoA 환원 효소를 포함하는 외인성 유전자의 기타 다른 조합이 제공된다. 하나의 구체예에서, 벡터는 알칸을 생성하기 위한 지방 아실-ACP 티오에스테라제, 지방 아실-CoA 환원 효소 및 지방 알데하이드 탈카보닐화 효소의 조합을 제공한다. 이들 각각의 구체예에서, 외인성 유전자 중 하나 이상은 유도성 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다.
2개 이상의 외인성 유전자를 발현하는 본 발명의 기타 다른 예시적인 벡터는 수크로스 수송체 및 수크로스 인버타제 효소 둘 다를 암호화하는 것들 및 선택가능한 마커 및 분비된 수크로스 인버타제 둘 다를 암호화하는 것들을 포함한다. 벡터중 어느 하나의 유형으로 형질 전환된 재조합 프로토테카는 탄소원으로서 사탕수수(및 사탕수수 유래 당)를 사용하는 조작된 능력으로 인하여 보다 낮은 제조 비용으로 지질을 생산한다. 전술한 2개의 외인성 유전자의 삽입은, 유도적 돌연변이 유발 및/또는 무작위 돌연변이 유발을 통해 다당류 생합성의 파괴와 조합될 수 있으며, 이는 지질 생산으로 훨씬 더 많은 탄소가 유입되게 한다. 개별적으로 및 조합적으로, 영양성 전환, 지질 생산을 변화시키기 위한 조작 및 외인성 효소를 사용한 처리는 미생물에 의해 생산되는 지질의 조성을 변형시킨다. 상기 변형은 미생물 내에서 생산되는 지질의 양, 기타 다른 지질과 비교하여 생산되는 하나 이상의 탄화수소 종의 양, 및/또는 생산되는 지질 종의 유형의 변화일 수 있다. 예를 들어, 미세 조류는 보다 높은 양 및/또는 %의 TAG(트리아실글리세라이드)를 생산하도록 조작될 수 있다.
재조합 단백질의 최적의 발현을 위해, 형질 전환될 숙주 세포에 의해 우선적으로 사용되는 코돈을 가지는 mRNA를 생산하는 암호화 서열을 사용하는 것이 이롭다. 따라서, 이식 유전자의 적절한 발현은, 이식 유전자의 코돈 사용 빈도가 이식 유전자가 발현되는 유기체의 특이적 코돈 편향에 부합하는 것을 필요로 할 수 있다. 상기 효과의 기저를 이루는 정확한 기작은 많지만, 상기 필요성이 충족되는 경우 이식 유전자 전령 RNA(mRNA)의 보다 효율적인 번역과 커플링되는, 세포 내에서 합성되는 단백질과 이용가능하게 아미노아실화된 tRNA 풀의 적당한 균형을 포함한다. 이식 유전자 내 코돈 사용 빈도가 최적화되지 않은 경우, 이용가능한 tRNA 풀은 이식 유전자 mRNA의 가능한 불안정성 및 리보솜 멈춤(stalling) 종결을 초래하는 이종성 mRNA의 효율적인 번역을 가능하게 하기에 충분하지 않다.
본 발명은 프로토테카 내에서 재조합 단백질의 성공적인 발현을 위해 유용한 코돈 최적화된 핵산을 제공한다. 프로토테카 종에서 코돈 사용 빈도는 프로토테카 모리포르미스로부터 분리된 cDNA 서열을 연구함으로써 분석되었다. 상기 분석은 24,000개 코돈에 걸친 탐색을 나타내며, 이의 결과는 하기의 표 2에 나타내었다.
Figure 112013079886893-pct00004
다른 구체예에서, 재조합 벡터 내 유전자는 프로토테카 균주 이외의 다른 미세 조류 균주를 참조하여 코돈 최적화되었다. 예를 들어, 미세 조류 내 발현용 유전자를 재암호화하는 방법은 미국 특허 제7,135,290호에 기재되어 있다. 코돈 최적화를 위한 추가의 정보는, 예를 들어 GenBank의 코돈 사용 빈도 데이타베이스에서 입수할 수 있다.
코돈 최적화 유전자를 가지는 구체예와 관련하여, 최적화된 유전자는 바람직하게 10% 이상, 더욱 바람직하게는 20%, 40%, 60%, 80%, 100% 또는 200% 이상으로 최적화되는 유전자의 유전자 생성물의 발현을 증가시키도록 최적화된다.
본 발명의 방법 및 재료는 임의의 외인성 유전자의 프로토테카로의 도입을 허용하는 한편, 수크로스 이용 및 지질 경로 변형에 관한 유전자는 하기의 섹션에서 논의되는 바와 같이 특히 관심이 있는 것이다.
IV . 선택가능한 마커
1. 수크로스 이용
하나의 구체예에서, 본 발명의 재조합 세포는 하나 이상의 외인성 수크로스 이용 유전자를 추가로 함유한다. 다양한 구체예에서, 하나 이상의 유전자는 프럭토키나제, 글루코키나제, 헥소키나제, 수크로스 인버타제 및 수크로스 수송체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 수크로스 수송체 및 수크로스 인버타제의 발현은 프로토테카가 수크로스를 배양 배지로부터 세포에 수송하여 수크로스를 가수 분해시켜 글루코스 및 프럭토스를 생성하도록 한다. 임의로, 내인성 헥소키나제 활성이 프럭토스의 최대 인산화에 불충분한 경우에도 또한 프럭토키나제는 발현될 수 있다. 적합한 수크로스 수송체의 예로서는 Genbank 수탁 번호 제CAD91334호, 제CAB92307호, 및 제CAA53390호가 있다. 적합한 프럭토키나제의 예로서는 Genbank 수탁 번호 제P26984호, 제P26420호 및 제CAA43322호가 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 수크로스 인버타제를 분비하는 숙주 세포를 제공한다. 수크로스 인버타제의 분비는 수크로스를 세포 내로 수송할 수 있는 수송체의 발현에 대한 필요성을 제거한다. 이것은 분비된 인버타제가 수크로스 분자의 글루코스 분자 및 프럭토스 분자로의 전환을 촉매하기 때문이며, 이들 분자 둘 다는 본 발명에 의해 제공된 미생물에 의해 수송되고 이용될 수 있다. 예를 들어, 분비 신호(예를 들어, 서열번호 4(효모 유래), 서열번호 5(고등 식물 유래), 서열번호 6(진핵 공통 분비 신호) 및 서열번호 7(고등 식물 및 진핵 공통 서열 유래의 신호 서열의 조합체))와 함께 수크로스 인버타제(예를 들어, 서열번호 3)의 발현은 세포 외부에서 인버타제 활성을 생성시킨다. 본원에 개시된 유전자 조작 방법에 의해 가능해진 이러한 단백질의 발현은 이미 에너지원으로서 세포외 글루코스를 이용할 수 있는 세포가 세포외 에너지원으로 수크로스를 이용할 수 있게 한다.
수크로스 함유 배지에서 인버타제를 발현하는 프로토테카 종은 오일 생산을 위해 바람직한 미세 조류 종이다. 이러한 완전히 활성인 단백질의 발현 및 세포외 표적화는, 생성된 숙주 세포가 수크로스 상에서 생장할 수 있게 하는 반면에, 이 숙주 세포의 형질 전환되지 않은 대응 세포는 수크로스 상에서 생장할 수 없다. 그러므로, 본 발명의 구체예는 코돈 최적화 인버타제 유전자, 예를 들어 효모 인버타제 유전자(이에 제한되는 것은 아님)가 미세 조류 세포의 게놈에 통합되어 이 인버타제 유전자가 발현되는(이 유전자의 발현 여부는 인버타제 활성과 수크로스 가수 분해에 의해 평가됨) 재조합 미세 조류(예를 들어, 프로토테카) 세포를 제공한다. 인버타제 유전자는 재조합 세포 내 선택가능한 마커로서 유용하므로, 세포는 수크로스 상에서 생장할 수 있는 반면, 이 세포의 형질 전환되지 않은 대응 세포는 수크로스 상에서 생장할 수 없고, 조류 분자 유전학에 대하여 강력한 선택가능한 마커로서 인버타제를 사용하여 재조합 숙주 세포를 선택하는 방법에서도 유용하다.
프로토테카에서 수크로스 인버타제의 성공적인 발현은 또한, 이것이 이종성(재조합) 단백질이 조류 세포에서 발현되고 완전한 활성 및 기능적 형태로서 세포 외부로 및 배양 배지 내로 성공적으로 이동할 수 있음을 입증한다는 점에서 본 발명의 또 다른 양태를 설명한다. 따라서, 본 발명의 구체예는 미세 조류 내 광범위하고 다양한 집합체의 이종성 단백질을 발현하고 이들을 숙주 세포 외부로 분비시키기 위한 방법 및 시약을 제공한다. 상기 단백질은, 예를 들어 산업용 효소, 예를 들어 리파제, 프로테아제, 셀룰라제, 펙티나제, 아밀라제, 에스테라제, 산화 환원 효소, 트랜스퍼라제, 락타제, 이소머라제 및 인버타제, 및 치료학적 단백질, 예를 들어 생장 인자, 사이토킨, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 전장 항체, Fab, scFv(단일쇄 가변 단편), 카멜리드형 항체, 항체 단편, 항체-단편 융합체, 항체-수용체 융합체, 인슐린, 인터페론 및 인슐린형 생장 인자를 포함한다.
프로토테카 내 수크로스 인버타제의 성공적인 발현은 또한, 이것이 프로토테카 내 단백질의 분비를 지시하기 위한 조류 내 진균류 수송 펩티드의 사용을 위한 방법 및 시약을 제공하고 펩티드가 프로토테카 세포에서 수송 펩티드로서 기능할 수 있는지의 여부 및 펩티드가 기능하는 능력을 결정하기 위한 방법 및 시약을 제공한다는 점에서 본 발명의 다른 양태를 설명한다. 본 발명의 방법 및 시약은 단백질을 세포 외로 성공적으로 수송할 수 있는 기타 다른 수송 펩티드를 확인하기 위한 도구 및 플랫폼으로서 사용될 수 있고, 이때 효모 인버타제가 이들 방법에서 우수한 용도를 갖는다. 본 실시예에서 입증된 바와 같이, 내인성 효모 인버타제 수송 펩티드의 제거, 숙주 조류에 내인성이거나 기타 다른 공급원(진핵, 원핵 및 바이러스)으로부터 유래하는 기타 다른 수송 펩티드에 의한 이의 대체로 관심의 임의의 펩티드가 세포로부터 단백질의 방출을 유도하는 수송 펩티드로서 기능할 수 있는지의 여부를 확인할 수 있다.
적합한 수크로스 인버타제의 예로서는 Genbank 수탁 번호 제CAB95010호, 제NP_012104호 및 제CAA06839호에 의해 확인된 것들을 포함한다. 적합한 인버타제의 비제한적인 예는 하기 표 3에 열거되어 있다. 각각의 열거된 인버타제에 대한 아미노산 서열은 하기의 서열 목록에 포함된다. 몇몇 경우에, 본 발명의 방법 및 벡터에 사용하기에 적합한 외인성 수크로스 이용 유전자는 표 3로부터 선택되는 수크로스 인버타제와 적어도 40%, 50%, 60%, 75%, 또는 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 수크로스 인버타제를 암호화한다.
Figure 112013079886893-pct00005
프로토테카에 의한 배양 배지로의 인버타제의 분비는 세포가 이들이 순수 시약 등급의 글루코스 상에 생장하는 바와 같이 사탕수수 가공으로부터 비롯된 폐기 당밀 상에서 생장할 수 있게 하고, 사탕수수 가공의 이러한 낮은 가치의 폐기물의 사용은 지질 및 기타 다른 오일의 제조에서 상당한 비용 절감을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 (i) 수크로스 및 (ii) 수크로스 인버타제 효소를 포함하는 배양 배지 및 프로토테카 미생물 집단을 함유하는 미생물 배양물을 제공한다. 다양한 구체예에서 배양물 내 수크로스는 수수, 사탕무, 사탕수수, 당밀 또는 해중합된 셀룰로스 물질(이것은 임의로 리그닌을 함유할 수 있음)로부터 유래한다. 다른 양태에서, 본 발명의 방법 및 시약은 재조합 미세 조류 또는 기타 다른 미생물에 의해 사용될 수 있는 공급원료의 수 및 유형을 상당히 증가시킨다. 본원에 예시된 미생물은 이들이 수크로스를 이용할 수 있도록 변형되는 한편, 본 발명의 방법 및 시약이 적용되어 셀룰로스와 같은 공급원료가 셀룰라제, 펙티나제, 이소머라제 등을 분비하는 능력을 갖는 본 발명의 조작된 숙주 미생물에 의해 이용될 수 있도록 하고 효소 반응의 분해 생성물은 더 이상 단순히 내성이 아니고 숙주에 의해 탄소원으로 이용된다. 이에 관한 예는 이하, 및 올리고당 내 α-갈락토실 결합, 예를 들어 라피노스 및 스타키오스(이들 올리고당 2개는 농업 폐기물 스트림에서 발견됨) 내에 함유된 α-갈락토실 결합을 가수 분해하는 능력을 부여하는, 분비성 α-갈락토시다제를 발현하도록 조작된 미생물에 관한 실시예에 기술되어 있다.
2. 알파- 갈락토시다제 발현
전술한 바와 같이, 수크로스 인버타제의 발현으로 프로토테카 세포가 수크로스를 (이당류 수크로스 내 프럭토스 및 글루코스 분자 사이 α-결합을 가수 분해하는 효소를 통해) 탄소원으로서 더욱 효과적으로 이용하는 능력을 부여하는 한편, 올리고당 내 기타 다른 유형의 α-결합을 가수 분해하는 기타 다른 효소의 발현으로 프로토테카 세포가 기타 다른 탄소원을 이용하는 능력을 부여할 수 있다. 이러한 효소의 발현(그리고 결과로 얻어진, 프로토테카 및 기타 다른 미세 조류 세포는 일반적으로 이용할 수 없는 탄소원을 이용하는 능력)은, 이러한 탄소원 상에서 생장할 수 있는 양성 클론을 선택할 수 있게 함으로써, 이러한 유전자 이식 프로토테카 세포에 대한 선택가능한 마커로서 사용될 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 재조합 프로토테카 세포는 다당류 분해 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 유전자를 추가로 함유한다. 다양한 구체예에서, 다당류 분해 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자는 분비된 α-갈락토시다제를 암호화하는 유전자이다. 프로토테카 세포 내에서 외인성 분비 α-갈락토시다제의 발현으로, 이와 같이 형질 전환된 균주가 D-갈락토실 결합, 예를 들어 갈락토스 및 글루코스 단당류 단위 사이의 α-결합을 함유하는 당(탄소원) 상에서 생장할 수 있는 능력을 부여한다. 외인성 분비 α-갈락토시다제를 발현하는 프로토테카 균주는 이당류, 예를 들어 멜리비오스(α-D-갈락토스-글루코스로 구성된 이당류)를 이용할 수 있을 것이다.
당, 예를 들어 라피노스(α-결합된 갈락토스-글루코스-프럭토스로 이루어진 삼당류) 및 스타키오스(2개의 α-결합 D-갈락토스 단위와, 이어서 α-결합 글루코스 및 프럭토스를 포함하는 사당류)는 농업 폐기물 스트림, 예를 들어 사탕무 펄프(라피노스) 및 대두 밀(스타키오스) 내에 상당한 비율로 존재한다. 이와 같은 농업 잔류물은, 이 잔류물을 이용할 수 있는 미생물(예를 들어, 프로토테카)에 의해 오일로 전환하는데 사용되기 전 상당한 탄소원을 대표한다.
프로토테카 균주는 올리고당, 예를 들어 라피노스 및 스타키오스를 임의의 상당한 양으로 이용할 수 없거나 전혀 이용할 수 없다. 라피노스와 스타키오스의 경우, (전술한 바와 같이) 수크로스 인버타제를 발현하는 유전자 이식 균주는 수크로스의 α-갈락토실 유도체 내 프럭토스와 글루코스 간 α-결합을 가수 분해하는 능력을 가지지만, 상기 수크로스 인버타제는 이와 같은 당 내 잔여 α-결합은 절단하지 않을 것이며, 생성된 이당류는 이용될 수 없으므로, 올리고당의 나머지는 이용되지 않은 상태로 남게 된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 재조합 프로토테카 세포는 수크로스 인버타제를 암호화하는 외인성 유전자와 α-갈락토시다제를 암호화하는 외인성 유전자 둘 다를 포함한다. 따라서, 수크로스 인버타제와 α-갈락토시다제 둘 다를 발현하는 균주는 올리고당, 예를 들어 라피노스와 스타키오스를 완전히 가수 분해하여 구성 단량체들을 소모할 수 있을 것이다. 뿐만 아니라, α-갈락토시다제 암호화 유전자도 형질 전환에 있어서 선택가능한 마커로서 사용될 수 있다. 외인성 α-갈락토시다제 유전자를 함유하는 클론은 멜리비오스 상에서 생장하는 능력을 가질 것이다. 프로토테카 균주에 사용하기 적당한 α-갈락토시다제 유전자의 예로서는 사카로마이세스 칼베르젠시스로부터 유래하는 MEL1 유전자와 아스퍼질러스 나이저로부터 유래하는 AglC 유전자를 포함한다. 흥미로운 점은, 유전자가 프로토테카 균주 내 선호 코돈 사용 빈도에 따라서 최적화될지라도, 모든 α-갈락토시다제 유전자가 프로토테카 종 내에서 작용하는 것으로 관찰되지는 않는다는 점이다. 이하 실시예는 에스. 칼베르젠시스로부터 유래하는 코돈 최적화 MEL1 유전자와 에이. 나이저로부터 유래하는 AglC 유전자로 형질 전환되되, 고등 식물인 시아몹시스 테트라고노로바(Cyamopsis tetragonoloba)(구아 콩)로부터 유래하는 α-갈락토시다제 암호화 유전자로는 형질 전환되지 않을 때, 유전자 이식 프로토테카 세포가 멜리비오스 상에서 생장하는 능력을 입증한다.
3. 티아민 영양 요구성 보완
프로토테카 균주, 예를 들어 프로토테카 모리포르미스는 티아민 영양 요구성인 것으로 알려져 있는데(예를 들어, 문헌[Ciferri, O. (1956) Nature, v.178, pp. 1475-1476] 참조), 이는 상기 균주가 생장용 영양 배지 중에 티아민을 필요로 함을 의미한다. 티아민 영양 요구성은 돌연 변이, 또는 티아민 생합성 경로에 관여하는 효소들의 발현 부족의 결과일 수 있다. 이후, 티아민 생합성 경로에서 결여된 효소(들)를 발현하는 보완 유전자 이식 균주는 티아민이 첨가되지 않는 경우에도 생장할 수 있으므로, 영양 배지의 비용을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 생성된 미세 조류 바이오매스를 동물 먹이로서 사용함에 있어서 더욱 바람직하게 만들 수 있다. 티아민 생합성 경로 효소로 보완하는 것은 또한 유전자 이식된 유전자가 티아민을 함유하지 않는 평판/배지 상에서 생장할 수 있는 능력을 부여하므로, 선택가능한 마커로서 사용될 수도 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 재조합 프로토테카 세포는 티아민 생합성 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 유전자를 추가로 함유한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 재조합 프로토테카 세포는 조류, 식물 또는 시아노박테리아 공급원으로부터 유래하는 하이드록시메틸피리미딘 포스페이트 합성 효소를 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 하이드록시메틸피리미딘 포스페이트 합성 효소는 THIC 유전자에 의해 암호화된다. 또 다른 구체예에서, THIC 유전자는 코코믹사(Coccomyxa) C-169 THIC, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) THIC, 또는 시네코시스티스 종(Synechocystis sp .) PCC 6803 thiC이다. 이하 실시예는 티아민 원 영양성이 복구된 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435의 조작에 대해 상세히 기술한다.
V. 지질 경로 조작
수크로스 함유 공급원료와 같은 공급원료를 사용하는 미세 조류 또는 기타 다른 미생물의 능력을 변형시키는 것에 추가로, 본 발명은 또한 생산된 지질의 특성 및/또는 비율을 변화시키도록 변형된 재조합 미세 조류 또는 기타 다른 미생물을 제공한다. 상기 경로는 추가로 또는 대안적으로 지방산 경로에서 지질 및 중간체의 효소 가공을 통해 생성된 다양한 지질 분자의 특성 및/또는 비율을 변화시키도록 변형될 수 있다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 재조합 프로토테카 세포는 이들의 형질 전환되지 않은 대응 세포에 비해 단위 용적당 및/또는 단위 시간당 최적화된 지질 수율, 탄소 사슬 길이(예를 들어, 재생 디젤 생산 또는 지질 공급원료를 필요로 하는 산업적 화학 제품), (임의로 0까지) 감소 또는 증가된 수 및/또는 위치의 이중 결합, 지방산의 하이드록실화 및 지질의 특정 종 또는 독특한 지질 집단의 수소:탄소 비율의 증가를 가진다.
특정 구체예에서, 지방산 합성으로의 대사에서 분기점을 제어하는 하나 이상의 주요 효소는 지질 생산을 개선시키기 위해 상향 조절되거나 하향 조절되었다. 상향조절은, 예를 들어 전사를 증가시키는 강한 프로모터 및/또는 인핸서 요소를 사용하여, 관심의 효소를 암호화하는 유전자가 발현되는 발현 구조물로 세포를 형질 전환시킴으로써 성취될 수 있다. 상기 구조물은 선택가능한 마커를 포함하여 상기 형질 전환체는 선택될 수 있고 이에 의해 유전자 유지, 및 가능하게는 구조물의 증폭과 암호화된 효소의 발현 수준의 증가를 가져올 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 상향 조절을 위해 적합한 효소의 예는 피루베이트를 아세틸-CoA로 전환시키는 역할을 하는 피루베이트 탈수소화 효소 (예를 들어, 미세 조류 유래의 일부는 Genbank 수탁 번호 제NP_415392호; 제AAA53047호; 제QlXDMl호; 및 제CAF05587호를 포함함)를 포함한다. 피루베이트 탈수소화 효소의 상향조절은 아세틸-CoA의 생산을 증가시킬 수 있고, 이에 의해 지방산 합성을 증가시킬 수 있다. 아세틸-CoA 카복실라제는 지방산 합성에서 초기 단계를 촉매한다. 따라서, 상기 효소는 지방산의 생산을 증가시키기 위해 상향조절될 수 있다(예를 들어, 미세 조류 유래의 일부는 Genbank 수탁 번호 제BAA94752호; 제AAA75528호; 제AAA81471호; 제YP_537052호; 제YP_536879호; 제NP_045833호; 및 제BAA57908호를 포함함). 지방산 생산은 또한 지방산 합성 동안에 성장하는 아실 사슬을 운반하는 아실기 운반 단백질(ACP)의 상향 조절에 의해 증가될 수 있다(예를 들어, 미세 조류 유래의 일부는 Genbank 수탁 번호 제A0T0F8호; 제P51280호; 제NP_849041호; 제YP_874433호를 포함함). 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제는 지방산 합성의 속도 제한 단계를 촉매한다. 상기 효소의 상향 조절은 지방산 생산을 증가시킬 수 있다(예를 들어, 미세 조류 유래의 일부는 Genbank 수탁 번호 제AAA74319호; 제AAA33122호; 제AAA37647호; 제P44857호; 및 제ABO94442호를 포함함).
유전자의 상향 조절 및/또는 하향 조절은 지방산 생합성 경로의 유전자의 발현을 제어하는 범용 조절제에 적용될 수 있다. 따라서, 지방산 합성의 하나 이상의 범용 조절제는 적절히 각각 다수의 지방산 합성 유전자의 발현을 억제하거나 증진시키고 궁극적으로 지질 생산을 증가시키도록 상향 또는 하향 조절될 수 있다. 이의 예로서는 스테롤 조절 요소 결합 단백질(SREBP), 예를 들어 SREBP-1a 및 SREBP-1c(예를 들어, Genbank 수탁 번호 제NP_035610호 및 제Q9WTN3호를 참조)를 포함한다.
본 발명은 또한 지질 변형 효소, 예를 들어 지방 아실-ACP 티오에스테라제(표 4 참조), 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소(표 6 참조), 지방 아실-CoA 환원 효소(표 7 참조), 지방 알데하이드 탈카보닐화 효소(표 8 참조), 지방 알데하이드 환원 효소, 불포화 효소(예를 들어, 스테아로일-ACP 불포화 효소 및 지방 아실 불포화 효소 및 스쿠알렌 합성 효소(GenBank 수탁 번호 제AF205791호를 참조))를 암호화하는 하나 이상의 외인성 유전자를 함유하도록 변형된 재조합 프로토테카 세포를 제공한다. 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 통상적으로 지질을 직접 화학 변형시키지는 않지만, 본 발명의 구체예에 따른 조작으로 세포의 지방산 프로필을, 특히 사슬 길이 및 이중 결합 분포 측면에서 변화시킬 수 있다. 몇몇 구체예에서, 지방 아실-ACP 티오에스테라제와 자연적으로 공동 발현되는 아실기 운반 단백질을 암호화하는 유전자는 임의로 기타 다른 지질 변형 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자와 함께, 프로토테카 또는 기타 다른 미세 조류 세포 또는 미생물 세포로 형질 전환된다. 다른 구체예에서, ACP와 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 이것들이 특정 조직이나 유기체 내에서 자연적으로 공동 발현되든지 발현되지 않든지 상관없이, 본 발명의 방법 및 미생물에서 상기 ACP와 지방 아실-ACP 티오에스테라제가 함께 사용될 때 이점을 부여하는 서로에 대한 친화성을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 구체예는 상기 효소들의 자연적으로 공동 발현되는 쌍들뿐만 아니라, ACP로부터 길이 특이적 탄소 사슬의 절단을 촉진하기 위해 서로 상호 작용하기 위한 친화성을 공유하는 쌍들을 고려한다.
또 다른 구체예에서, 불포화 효소를 암호화하는 외인성 유전자는 지질 포화와 관련하여 변형을 제공하기 위해 기타 다른 지질 변형 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자와 함께 미세 조류 또는 기타 다른 미생물 세포로 형질 전환된다. 다른 구체예에서, 내인성 불포화 효소 유전자는 (예를 들어, 부가의 유전자 유래 복사체들을 도입함으로써) 미세 조류 세포 또는 기타 다른 미생물 세포 내에서 과발현된다. 스테아로일-ACP 불포화 효소(예를 들어, GenBank 수탁 번호 제AAF15308호; 제ABM45911호; 및 제 AAY86086호 참조)는, 예를 들어 스테아로일-ACP의 올레오일-ACP로의 전환을 촉매한다. 상기 유전자의 상향 조절은 세포에 의해 생산된 단일불포화 지방산의 비율을 증가시킬 수 있는 반면, 하향 조절은 단일 불포화 지방의 비율을 감소시킬 수 있다. 예시적 목적으로, 스테아로일-ACP 불포화 효소(SAD)는 C18:0 전구체로부터 C18:1 지방산을 합성하는데 관여한다. 불포화 효소의 다른 군으로서는 지방 아실 불포화 효소(FAD), 예를 들어 델타 12 지방산 불포화 효소(Δ12 FAD)가 있다. 이러한 불포화 효소는 또한 지질 포화도에 대한 변형을 제공한다. 예시적 목적으로, 델타 12 지방산 불포화 효소는 C18:1 전구체로부터 C18:2 지방산을 합성하는데 관여한다. 유사하게, ω-6 지방산 불포화 효소, ω-3 지방산 불포화 효소, 또는 ω-6-올리에이트 불포화 효소와 같은 하나 이상의 글리세로지질 불포화 효소의 발현은 포화 지방산에 대한 불포화 지방산의 비율을 변화시키기 위해 제어될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 불포화 효소는 불포화 효소가 특정 탄소 길이 기질 또는 특정 범위 내 탄소 길이를 갖는 기질 내에서 위치 특이적 변형을 만들 수 있도록 원하는 탄소 사슬 길이와 관련하여 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 만일 원하는 지방산 프로필이 단일 불포화 지방(예를 들어, C16:1 및/또는 C18:1)에 있어서 증가하면, SAD의 과발현 또는 이종 SAD의 발현은 (예를 들어, 돌연 변이, RNAi, 안티센스 또는 내인성 불포화 효소 유전자의 녹아웃 등을 통하여) 지방 아실 불포화 효소(FAD) 또는 다른 불포화 효소 유전자의 침묵 또는 불활성화와 결합될 수 있다.
다른 구체예에서, 미세 조류 세포 또는 기타 다른 미생물 세포는 돌연 변이된 내인성 불포화 효소 유전자를 가지도록 변형되었는데, 이 경우 상기 돌연 변이는 상기 유전자 또는 불포화 효소가 불활성이 되도록 만든다. 몇몇 경우에 있어서, 돌연 변이된 내인성 불포화 효소 유전자는 지방산 불포화 효소(FAD)이다. 다른 경우에 있어서, 돌연 변이된 내인성 불포화 효소 유전자는 스테아로일 아실기 운반 단백질 불포화 효소(SAD)이다. 이하 실시예 6은 프로토테카 내에서 스테아로일-ACP 불포화 효소 및 델타 12 지방산 불포화 효소의 표적화된 제거 또는 녹아웃을 기술한다. 실시예 6은 또한 내인성 불포화 효소 유전자의 발현을 감소시키는 RNAi 또는 안티센스 구조물의 사용을 기술한다.
몇몇 경우에 있어서, 원하는 지질 프로필을 생성하는 유전자 이식된 세포를 획득하기 위하여 유전자 조작 기술들 중 하나 이상을 함께 사용하는 것이 유리할 수 있다. 하나의 구체예에서, 미세 조류 세포 또는 기타 다른 미생물 세포는 돌연 변이된 내인성 불포화 효소 유전자와 하나 이상의 외인성 유전자를 포함한다. 비제한적인 실시예에서, 내인성 불포화 효소 유전자가 돌연 변이된 미세 조류 세포 또는 기타 다른 미생물 세포는 또한 외인성 지방 아실-ACP 티오에스테라제 유전자 및/또는 수크로스 인버타제 유전자를 발현할 수도 있다. 이하 실시예 6은 내인성 SAD가 표적화 제거 또는 녹아웃되었고, 신나모뮴 캠포라 C14 선호 티오에스테라제 및 수크로스 인버타제를 발현하는 유전자 이식 프로토테카 세포를 기술한다. 이와 같은 경우, 유전자 이식 프로토테카 세포는 우지에서 살펴볼 수 있는 지질 프로필과 매우 유사한 지질 프로필을 생성한다. 우지는 통상적으로 녹인 소 또는 양의 지방으로부터 유래하는 것으로서, 실온에서 고체이며, 식품, 화장품 및 화학 산업 분야에서 다양한 용도로 사용된다. 우지의 지방산 프로필은, C14:0 4%; C16:0 26%; C16:1 3%; C18:0 14%; C18:1 41%; C18:2 3%; 및 C18:3 1%이다. 이하 실시예 6에 나타낸 바와 같이, 내인성 SAD가 표적화 제거 또는 녹아웃되었고, 씨. 캠포라 C14 선호 티오에스테라제를 발현하는 유전자 이식 프로토테카 세포의 클론은 지질 프로필이, C12 및 이 보다 짧은 탄소 사슬 길이를 가지는 지방산 1% 미만; C14:0 2.74% 내지 6.13%; C16:0 23.07% 내지 25.69%; C18:0 7.02% 내지 11.08%; C18:1 42.03% 내지 51.21%; 및 C18:2 9.37% 내지 13.45%(면적 %로 표시함)이다. 몇몇 경우에 있어서, 유전자 이식 프로토테카 세포는 지질 프로필이, C14:0 3% 내지 5%; C16:0 25% 내지 27%; C18:0 10% 내지 15%; 및 C18:1 40% 내지 45%이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 미생물은 아실-ACP 티오에스테라제, 아실-CoA/알데하이드 환원 효소, 지방 아실-CoA 환원 효소, 지방 알데하이드 환원 효소, 지방 알데하이드 탈카보닐화 효소 또는 자연적으로 공동 발현되는 아실기 운반 단백질로부터 선택되는 하나 이상의 외인성 유전자를 발현하도록 유전자 조작된다. 적합한 발현 방법은 기타 다른 방법 중에서 유도성 발현 및 구분된 발현을 포함하는 리파제 유전자의 발현과 관련하여 상기 기술되어 있다. 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 지질 합성동안에 아실기 운반 단백질(ACP)로부터 지방산을 절단한다. 추가의 효소 가공을 통해, 절단된 지방산은 이어서 조효소와 조합되어 아실-CoA 분자를 생성한다. 이러한 아실-CoA는 알코올을 생성하기 위한 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소에 대한 것뿐만 아니라 알데하이드를 생성하기 위한 지방 아실-CoA 환원 효소의 효소 활성에 대한 기질이다. 상기 확인된 지방 아실-CoA 환원 효소의 작용에 의해 생산된 알데하이드는 알코올을 생성하기 위한 지방 알데하이드 환원 효소 또는 알칸 또는 알켄을 생성하기 위한 지방 알데하이드 탈카보닐화 효소에 의한 추가의 효소 활성에 대한 기질이다.
몇몇 구체예에서, 본원에 기술된 방법에 의해 생성되는 지방산, 글리세로지질, 또는 상응하는 1급 알코올, 알데하이드, 알칸 또는 알켄은 8개, 10개, 12개, 또는 14개의 탄소 원자를 함유한다. 산업적 적용을 위한 디젤, 바이오디젤, 재생 디젤 또는 제트 연료, 또는 상응하는 1급 알코올, 알데하이드, 알칸 및 알켄을 생산하기 위한 바람직한 지방산은 8개 내지 14개의 탄소 원자를 함유한다. 특정 구체예에서, 기타 다른 상응하는 탄화수소 분자뿐만 아니라 상기 지방산은 포화되거나(어떠한 탄소-탄소 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖지 않음); 단일 불포화되거나(단일 이중 결합); 다중 불포화되거나(2개 이상의 이중 결합); 선형(환형이 아님)이거나 분지형이다. 연료 생산을 위해 보다 큰 포화도가 바람직하다.
상기 직접 기술된 효소는 특정 수의 탄소 원자를 함유하는 기질의 가수 분해에 대해 우선적인 특이성을 갖는다. 예를 들어, 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 ACP로부터 12개의 탄소 원자를 갖는 지방산을 절단하는 것을 선호할 수 있다. 몇몇 구체예에서, ACP 및 길이 특이적 티오에스테라제는 이들이 조합체로서 특히 유용하게 하는 서로에 대해 친화성을 가질 수 있다(예를 들어, 외인성 ACP 및 티오에스테라제 유전자는 이들이 유래하는 특정 조직 또는 유기체에서 자연적으로 공동 발현될 수 있다). 따라서, 다양한 구체예에서, 본 발명의 재조합 프로토테카 세포는 기질 내 함유된 탄소 원자의 수와 관련하여 효소 활성(예를 들어, ACP로부터 지방산의 절단, 아실-CoA의 알데하이드 또는 알코올로의 환원, 또는 알데하이드의 알칸으로의 전환)을 촉매하기 위한 특이성을 갖는 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 함유할 수 있다. 다양한 구체예에서 효소 특이성은 8개 내지 34개의 탄소 원자, 바람직하게는 8개 내지 18개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 8개 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 기질에 대한 것일 수 있다. 바람직한 특이성은 더 많은 탄소 원자, 즉 18개 탄소 원자보다는 더 적은, 즉 12개 탄소 원자를 갖는 기질에 대한 것이다.
본 발명의 미생물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 기타 다른 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 표 4에 열거된 것들을 제한없이 포함한다.
지방 아실-ACP 티오에스테라제 및 GenBank 수탁 번호
움벨루라리아 캘리포니카 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #AAC49001)
신나모뮴 캠포라 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #Q39473)
움벨루라리아 캘리포니카 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #Q41635)
미리스티카 프래그란스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #AAB71729)
미리스티카 프래그란스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #AAB71730)
엘라에이스 기닌시스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #ABD83939)
엘라에이스 기닌시스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #AAD42220)
엘라에이스 기닌시스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank#AAD42220.2)
파퓰러스 토멘토사 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #ABC47311)
아라비돕시스 탈리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #NP_172327)
아라비돕시스 탈리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #CAA85387)
아라비돕시스 탈리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #CAA85388)
고시피움 히르서텀 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #Q9SQI3)
쿠페아 란세올라타 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #CAA54060)
쿠페아 후커리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #AAC72882)
쿠페아 칼로필라 아종 메소스테몬 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #ABB71581)
쿠페아 란세올라타 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #CAC19933)
엘라에이스 기닌시스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #AAL15645)
쿠페아 후커리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #Q39513)
쿠페아 후커리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank#Q39513.1)
고시피움 히르서텀 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #AAD01982)
비티스 비니페라 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #CAN81819)
가르시니아 망고스타나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #AAB51525)
가르시니아 망고스타나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank#AAB51525.1)
브라시카 준세아 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #ABI18986)
마듀카 론지폴리아 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #AAX51637)
브라시카 나푸스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #ABH11710)
브라시카 나푸스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank#CAA52070.1)
오리자 사티바(인디카 컬티바군) 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #EAY86877)
오리자 사티바(자포니카 컬티바군) 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #NP_001068400)
오리자 사티바(인디카 컬티바군) 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #EAY99617)
쿠페아 후커리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #AAC49269)
얼머스 아메리카나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #AAB71731)
쿠페아 란세올라타 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #CAB60830)
쿠페아 팔루스트리스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #AAC49180)
아이리스 게르마니카 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #AAG43858)
아이리스 게르마니카 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #AAG43858.1)
쿠페아 팔루스트리스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #AAC49179)
미리스티카 프래그란스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank# AAB71729)
미리스티카 프래그란스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank# AAB717291.1)
쿠페아 후커리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #U39834)
움벨루라리아 캘리포니카 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank # M94159)
신나모뮴 캠포라 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank #U31813)
리시누스 커뮤니스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank#ABS30422.1)
이하 실시예는 프로토테카 종 내에서 쿠페아 후커리아나, 움벨루라리아 캘리포니카, 신나모뮴 캠포라, 쿠페아 팔루스트리스, 쿠페아 란세올라타, 아이리스 게르마니카, 미리스티카 프래그란스, 가르시니아 망고스타나, 엘라에이스 기니엔시스, 브라시카 나푸스, 리시누스 커뮤니스 및 얼머스 아메리카나로부터 유래하는 이종 지방 아실-ACP 티오에스테라제의 성공적인 표적화 및 발현을 기술한다. 추가로, 지방산 프로필의 변경은 이러한 이종 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 발현하는 숙주 세포 내에서 확인되었다. 실시예들에서 나타낸 바와 같이, 프로토테카 내에서 이러한 이종 티오에스테라제의 발현은 몇몇 종자 곡물 오일을 배합하더라도 시판중인 종자 곡물로부터 현재는 얻을 수 없는, 진정 독특한 지방산 프로필을 가지는 오일/지질을 생산할 수 있는 유전자 이식 미세 조류를 생성한다. 표 5는 통상의 시판 종자 오일의 지방산 프로필을 나타낸다. 이하 시판 중인 종자 오일 데이터는 모두 문헌[US Pharmacopeias Food and Chemicals Codes, 7th Ed. 2010-2011]에서 수집되었다. 우지 데이터는 문헌[National Research Council: Fat Content and Composition of Animal Products (1976)]으로부터 수집한 것이다.
Figure 112013079886893-pct00006
예를 들어, 이러한 통상의 종자 오일 중 어느 것도 C8 또는 C10 지방산을 고량으로 함유하지 않으며, 코코넛 오일과 팜핵 오일은 가장 큰 공급원이지만, 이것들은 둘 다 (C8:C10 지방산) 비율이 약 1:1이다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 쿠페아 팔루스트리스 C:8 선호 티오에스테라제로 형질 전환된 프로토테카는 12% 초과인 C8 지방산 수준을 달성할 수 있었을 뿐만 아니라, C8:C10 지방산의 비율은 약 5:1이었다. 지방산 수준의 변화는, 다양한 상업적 용도로서 맞춤 지방산 프로필을 가지는 오일을 생산하는데 유용하다. 뿐만 아니라, 상이한 지방산 사슬 길이간 비율의 변화는 추가의 고비용 화학 공정(예를 들어, 에스테르화, 증류, 분별 및 재에스테르화)을 수행하지 않은 오일에서는 상업상 얻어질 수 없는 것이다. 다른 예로서, 팜 오일은 C16:0 지방산을 가장 높이(32% 내지 47%)함유하는 오일이지만, 팜 오일은 C14:0 지방산의 함량이 매우 낮다. 유.아메리카나 티오에스테라제를 함유하는 프로토테카는 C16:0 지방산 함유율이 약 33% 내지 38%, C14:0 지방산 함유율이 약 10% 내지 16%인 것으로 획득하였다(C16:0 대 C14:0 비율은 약 2:1). 16:0 지방산을 높은 비율로 포함하는 종자 오일은 일반적으로 14:0 지방산은 그다지 많이 함유하지 않으므로, 기존의 오일을 상업상 수준으로 배합하였을 때 이러한 지방산 프로필은 상업상 비실용적이었다.
이하 실시예는 또한 하나의 클론에서 2개 이상의 지방 아실-ACP 티오에스테라제의 성공적인 표적화 및 발현을 기술한다. 지방산 프로필 변화는 이러한은 클론에서 확인되었고, 2개의 티오에스테라제가 하나의 클론에서 공동 발현되었는지 여부에 의존적이었으며, 지방산 프로필은 상이한 방식으로 영향을 받았다. 예를 들어, 상기 표 5에 의하면, 코코넛 오일과 팜핵 오일 둘 다는 C12:C14 비율이 대략 3:1이다. 이하 실시예에 기술된 바와 같이, 2개의 이종 티오에스테라제 유전자를 함유하는 프로토테카 형질 전환체는 C12:C14 지방산 수준의 비율은 대략 5:1로 생성할 수 있었다. 이러한 종류의 C12:C14 지방산 비율은 (즉, 종자 오일을 배합할 때) 상업상 비실용적이었다.
유전자 이식 미세 조류에 의해 생산된 오일의 다른 신규 양태는 지방산의 포화도이다. 팜 오일은 현재 포화 오일의 가장 큰 공급원으로서 총 포화 오일 대 불포화 오일의 비율은 52% 내지 48%이다. 이하 실시예에 나타낸 바와 같이, 유.아메리카나 및 씨.캠포라로부터 유래하는 이종 티오에스테라제를 가지는 프로토테카는 그것이 생산하는 오일 중 포화 오일의 총 수준을 60% 초과로 획득하였다. 또한 이하 실시예에 나타낸 바와 같이, 유.아메리카나로부터 유래하는 이종 티오에스테라제를 가지는 프로토테카는 그것이 생산하는 오일 중 총 포화 오일 수준을 86% 초과로 획득하였다.
본 발명의 미생물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소는 제한없이 표 6에 열거된 것들을 포함한다.
Figure 112013079886893-pct00007
본 발명의 미생물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 지방 아실-CoA 환원 효소는 제한 없이 표 7에 기재된 것들을 포함한다.
Figure 112013079886893-pct00008
본 발명의 미생물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 지방 알데하이드 탈카보닐화 효소는 제한 없이 표 8에 열거된 것들을 포함한다.
Figure 112013079886893-pct00009
자연적으로 공동 발현된 지방 아실-ACP 티오에스테라제 및 아실기 운반 단백질의 조합은 본 발명의 미생물 및 방법과 사용하기에 적합하다.
탄화수소 또는 지질 변형 효소의 추가의 예는 미국 특허 제6,610,527호; 제6,451,576호; 제6,429,014호; 제6,342,380호; 제6,265,639호; 제6,194,185호; 제6,114,160호; 제6,083,731호; 제6,043,072호; 제5,994,114호; 제5,891,697호; 제5,871,988호; 제6,265,639호 중 어느 하나에 포함되거나 참조되거나, 함유되거나 참조된 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하고, 추가로 GenBank 수탁 번호 제AAO18435호; 제ZP_00513891호; 제Q38710호; 제AAK60613호; 제AAK60610호; 제AAK60611호; 제NP_113747호; 제CAB75874호; 제AAK60612호; 제AAF20201호; 제BAAl1024호; 제AF205791호; 및 제CAA03710호에 기술되어 있다.
지질 생합성 경로의 기타 다른 효소들 또한 본 발명의 미생물 및 방법과 함께 사용하기 적당하다. 예를 들어, 케토 아실-ACP 합성 효소(Kas)는 지질 생합성 경로에 있어서 상기 나열된 효소들 중 일부와 함께 작용한다. Kas 효소에는 상이한 군들이 있다: Kas I은 지속적으로 성장하는(ever-growing) 아실 ACP 사슬과 말로닐-ACP 간 연속 축합 단계에 참여한다. Kas II는 통상적으로 C16:0-ACP로부터 C18:0-ACP(예를 들어, 말로닐-ACP)에 이르게 하는 최종 축합 단계에 참여한다. 그러므로, C16 내지 C18:0 지방산(그리고 이의 불포화 유도체)을 주로 합성하는 고등 식물 및 일부 미세 조류 종/균주에 있어서, Kas II 효소는 FatA 유전자(아실-ACP 티오에스테라제)의 생성물과 상호 작용한다.
아실-ACP는 지방산 생합성 동안 성장중인 지방산 사슬을 ACP로부터 유리시키며, 대부분의 식물 종에 있어서 이는 C16:0에서 C18:0 단계로의 연장을 종결시키는 역할을 하는 FatA 유전자 군의 일원에 의해 수행된다. 길이가 더욱 단쇄의 지방산을 합성하는 종(예를 들어, 쿠페아, 엘라에이스, 미리스티카 또는 움벨루라리아)에서, FatB 유전자에 의해 암호화되는 아실-ACP 티오에스테라제의 상이한 군은 상기 종결 단계를 수행한다. Kas II 효소와 아실-ACP 티오에스테라제 간 상호 작용은 지방산 사슬 연장을 올바르게 종결하는데 중요하다. 결과적으로, 길이가 더욱 단쇄의 지질을 생합성할 수 있는 진화 FatB 유전자를 가지는 고등 식물 종(그리고 미세 조류 종)에 있어서, Kas IV 유전자라고 칭하는 Kas 유전자의 부가 군의 상응하는 공동 진화가 있었다. Kas IV 유전자는 길이가 4개 내지 14개 탄소인 특정한 크기 범위의 지방산의 사슬 길이 연장에 관여한다.
본 발명의 미생물 및 방법과 사용하기에 적합한 기타 다른 효소는 표 4, 표 6 내지 표 8에 열거된 단백질 중 하나와 70% 이상의 아미노산 동일성을 갖고 상응하는 원하는 효소 활성(예를 들어, 아실기 운반 단백질로부터 지방산의 절단, 아실-CoA의 알데하이드 또는 알코올로의 환원, 또는 알데하이드의 알칸으로의 전환)을 나타내는 것들을 포함한다. 추가의 구체예에서, 효소 활성은 전술된 서열 중 하나와 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 99% 이상의 동일성을 갖는 서열 중에 존재하고 이 모두는 완전히 제시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
발현되는 외인성 유전자의 원하는 조합을 선택함으로써, 이후에 수성 바이오매스로부터 추출될 수 있는, 미생물에 의해 생성되는 생성물을 조작할 수 있다. 예를 들어, 상기 미생물은 (i) 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자; 및, 임의로, (ii) 자연적으로 공동 발현된 아실기 운반 단백질 또는 다르게는 지방 아실-ACP 티오에스테라제(또는 역으로)에 대해 친화성을 갖는 아실기 운반 단백질; 및, 임의로, (iii) 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소 또는 지방 아실-CoA 환원 효소를 암호화하는 외인성 유전자; 및, 임의로, (iv) 지방 알데하이드 환원 효소 또는 지방 알데하이드 탈카보닐화 효소를 암호화하는 외인성 유전자 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 미생물은 또한 외인성 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소, β-케토아실-ACP 합성 효소 I(예를 들어, KASI 유전자에 의해 암호화됨), β-케토아실-ACP 합성 효소 II(예를 들어, KASII 유전자에 의해 암호화됨), 또는 올리에이트-12 하이드록실라제 중 하나 이상을 함유할 수도 있다. 본원에 기재된 배양 조건 하의 미생물은 ACP에 연결된 지방산을 합성하고, 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매하여 추가의 효소 가공을 통해 지방 아실-CoA 분자를 생산한다. 존재하는 경우, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소는 아실-CoA의 알코올로의 환원을 촉매한다. 유사하게, 존재하는 경우 지방 아실-CoA 환원 효소는 아실-CoA의 알데하이드로의 환원을 촉매한다. 지방 아실-CoA 환원 효소를 암호화하는 외인성 유전자가 존재 하고 알데하이드 생성물을 생산하기 위해 발현되는 상기 구체예에서, 제3 외인성 유전자에 의해 암호화된 지방 알데하이드 환원 효소는 알데하이드의 알코올로의 환원을 촉매한다. 유사하게, 지방 알데하이드 탈카보닐화 효소는 존재하는 경우 알데하이드의 알칸 또는 알켄으로의 전환을 촉매한다.
다른 구체예에서, 미생물은, (i) 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자; (ii) 임의로, 지방산 아실-ACP 티오에스테라제에 대한 친화성을 가지는 아실기 운반 단백질 또는 자연적으로 공동 발현된 아실기 운반 단백질; (iii) 돌연 변이된 내인성 불포화 효소 유전자(여기서, 상기 돌연 변이는 불포화 효소 유전자 또는 불포화 효소 단백질을 불활성이 되도록 만듦(예를 들어, 상기 불포화 효소 유전자 또는 단백질을 불포화 효소 녹아웃 요소 또는 불포화 효소 억제 요소, 예를 들어 표적화된 RNAi, 안티센스 또는 dsRNA 구조물로 만듦)); (iv) 내인성 스테아로일 아실기 운반 단백질 불포화 효소의 과발현 또는 이종 SAD의 발현; 및 (v) 상기 (i) 내지 (iv)의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
상기 효소, 예를 들어 지방 아실 ACP 티오에스테라제를 암호화하는 유전자는 클로렐라 프로토테코이데스와 같이 상당한 지질 생산을 나타내는 것으로 이미 공지된 세포로부터 수득될 수 있다. 지질 생산에 역할을 하는 것으로 이미 공지된 유전자, 예를 들어 이중 결합을 포화시키는 효소를 암호화하는 유전자는 개별적으로 수용 세포로 형질 전환될 수 있다. 그러나, 본 발명을 실시하기 위해 어느 유전자가 필요한지에 관해 우선적으로 추측할 필요는 없다. 미세 조류 내 지질 생산을 변형(개선)시킬 수 있는 유전자를 확인하는 방법은 PCT 공개 제2008/151149호에 기술되어 있다.
따라서, 본 발명은 동일 종의 야생형 세포에 비해 변화된 수준으로 지질 경로 효소를 발현하도록 유전자 조작된 프로토테카 세포를 제공한다. 몇몇 경우에, 상기 세포는 2개 세포가 동일한 조건 하에서 생장하는 경우 야생형 세포에 비해 더 많은 지질을 생산한다. 몇몇 경우에, 상기 세포는 야생형 세포보다 더 높은 수준 또는 더 낮은 수준으로 지질 경로 효소를 발현하도록 유전자 조작되고/조작되거나 선택되었다. 몇몇 경우에, 지질 경로 효소는 피루베이트 탈수소화 효소, 아세틸-CoA 카복실라제, 아실기 운반 단백질 및 글리세롤-3 포스페이트 아실트랜스퍼라제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 경우에, 상기 세포는 야생형 세포보다 더 낮은 수준으로 지질 경로 효소를 발현하도록 유전자 조작되고/조작되거나 선택되었다. 세포가 더 낮은 수준으로 지질 경로 효소를 발현하는 하나 이상의 구체예에서, 지질 경로 효소는 시트레이트 합성 효소를 포함한다.
몇몇 구체예에서, 상기 세포는 야생형 세포와 비교하여 변화된 수준으로 지방산 합성의 범용 조절제를 발현하도록 유전자 조작되고/조작되거나 선택됨으로써 다수의 지방산 합성 유전자의 발현 수준은 야생형 세포와 비교하여 변화된다. 몇몇 경우에, 지질 경로 효소는 지방산을 변형시키는 효소를 포함한다. 몇몇 경우에, 지질 경로 효소는 스테아로일-ACP 불포화 효소 및 글리세로지질 불포화 효소로부터 선택된다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 지질 경로 효소를 더 낮은 수준으로 발현하거나 특이적 지질 경로 효소를 전혀 발현하지 않도록 유전자 조작되고/조작되거나 선택되었다(즉, 지질 경로 효소가 녹아웃되어 외인성 유전자로 치환되거나, RNAi 또는 안티센스 방법을 이용하여 이 효소의 발현이 감소되었다). 다른 구체예에서, 지질 경로 효소는 불포화 효소 유전자, 예를 들어 스테아로일-ACP 불포화 효소 또는 지방산 불포화 효소(FAD) 유전자(이에 제한되는 것은 아님)의 이종 발현물이다. 실시예 6은 프로토테카 모리포르미스 유전적 배경에서 올레아 유로파에아로부터 이종 스테아로일-ACP의 발현을 기술한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 외인성 유전자를 함유하는 오일 생산 미생물에 관한 것으로서, 여기서 상기 외인성 유전자는 지방 아실-ACP 티오에스테라제, 지방 아실-CoA 환원 효소, 지방 알데하이드 환원 효소, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소, 지방 알데하이드 탈카보닐화 효소, 불포화 효소 및 아실기 운반 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질(들)을 암호화한다. 다른 구체예에서, 내인성 불포화 효소 유전자는 상기 외인성 유전자들 중 하나 이상을 함유하는 미생물 내에서 과발현된다. 하나의 구체예에서, 외인성 유전자는 자극에 응답하여 유도성이거나 억제성인 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 몇몇 경우에, 상기 자극은 외부적으로 제공되는 작은 분자, 열, 냉 및 배양 배지에서 제한되거나 부재인 질소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 경우에, 외인성 유전자는 세포 구획에서 발현된다. 몇몇 구체예에서, 세포 구획은 엽록체, 색소체 및 미토콘드리아로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서 미생물은 프로토테카 모리포르미스, 프로토테카 크루가니, 프로토테카 스태그노라 또는 프로토테카 조프피이다.
하나의 구체예에서, 외인성 유전자는 지방산 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화한다. 몇몇 경우에, 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스테라제는 아실기 운반 단백질(ACP)로부터 8개 내지 18개의 탄소 지방산의 절단을 촉매한다. 몇몇 경우에, 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스테라제는 ACP로부터 10개 내지 14개 탄소 지방산의 절단을 촉매한다. 하나의 구체예에서, 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스테라제는 ACP로부터 12개 탄소 지방산의 절단을 촉매한다.
하나의 구체예에서, 외인성 유전자는 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소를 암호화한다. 몇몇 경우에, 외인성 유전자에 의해 암호화된 환원 효소는 8개 내지 18개의 탄소 지방 아실-CoA의 상응하는 1급 알코올로의 환원을 촉매한다. 몇몇 경우에, 외인성 유전자에 의해 암호화된 환원 효소는 10개 내지 14개의 탄소 지방 아실-CoA의 상응하는 1급 알코올로의 환원을 촉매한다. 하나의 구체예에서, 외인성 유전자에 의해 암호화된 환원 효소는 12개 탄소의 지방 아실-CoA의 도데칸올로의 환원을 촉매한다.
본 발명은 또한 2개의 외인성 유전자를 함유하는 재조합 프로토테카 또는 기타 다른 세포를 제공하고, 여기서 제1 외인성 유전자는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하고 제2 외인성 유전자는 지방 아실-CoA 환원 효소, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소, 및 아실기 운반 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 암호화한다. 몇몇 경우에, 2개의 외인성 유전자는 각각 자극에 응답하여 유도성인 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있다. 몇몇 경우에, 각각의 프로모터는 배양 배지 내 제한된 질소 또는 질소 부재와 같은 동일한 자극에 응답하여 유도성이다. 배양 배지에서 질소의 제한 또는 완전한 부재는 프로토테카 종과 같은 몇몇 미생물에서 오일 생산을 자극하고, 높은 수준으로 오일 생산을 유도하기 위한 촉발제로서 사용될 수 있다. 본원에 개시된 유전자 조작 방법과 조합하여 사용되는 경우, 건조 세포 중량의 %로서 지질은 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상 및 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상 또는 75% 내지 90%와 같은 높은 수준으로 상승될 수 있고, 본원에 개시된 방법은 이러한 수준의 지질을 갖는 세포에 대해 제공하고, 여기서 지질은 C8 내지 C14 4% 이상, C8 0.3% 이상, ClO 2% 이상, C12 2% 이상, 및 C14 2% 이상이다. 몇몇 구체예에서, 상기 세포는 건조 세포 중량을 기준으로 지질이 25% 초과이고, C8 내지 C14 10% 이상, C8 내지 C14 20% 이상, C8 내지 C14 30% 이상, C8 내지 C14 10% 내지 30% 및 C8 내지 C14 20% 내지 30%인 지질을 함유한다.
본원에 개시된 신규 오일은 mid-사슬 지방산(예를 들어, 팜오일, 팜핵 오일 및 코코넛 오일)의 함량이 높은 기타 다른 자연적으로 존재하는 오일과 구분된다. 예를 들어, 카로티노이드와 같은 오염물 수준은 본 발명의 오일에서 보다 팜오일 및 팜핵 오일에서 훨씬 더 높다. 특히 팜오일 및 팜핵 오일은 본 발명의 오일에서 훨씬 더 높은 양으로 알파 및 베타 카로틴 및 라이코펜을 함유한다. 추가로, 20개 초과의 상이한 카로티노이드가 팜오일 및 팜핵 오일에서 발견된 반면 실시예는 본 발명의 오일이 매우 소량의 카로티노이드 종을 매우 낮은 수준으로 함유함을 입증한다. 추가로, 토코트리에놀과 같은 비타민 E 화합물의 수준은 본 발명의 오일에서 보다 팜오일, 팜핵 및 코코넛오일에서 훨씬 더 높다.
하나의 구체예에서, 제1 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스테라제는 ACP로부터 8개 내지 18개 탄소 지방산의 절단을 촉매한다. 몇몇 구체예에서, 제2 외인성 유전자는 8개 내지 18개 탄소 지방 아실-CoA의 상응하는 1급 알코올로의 환원을 촉매하는 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소를 암호화한다. 몇몇 경우에, 제1 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스테라제는 ACP로부터 10개 내지 14개 탄소 지방산의 절단을 촉매하고, 제2 외인성 유전자에 의해 암호화된 환원 효소는 10개 내지 14개 탄소 지방 아실-CoA의 상응하는 1급 알코올로의 환원을 촉매하며, 여기서 티오에스테라제 및 환원 효소는 동일한 탄소 사슬 길이에 작용한다. 하나의 구체예에서, 제1 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스테라제는 ACP로부터 12개 탄소 지방산의 절단을 촉매하고, 제2 외인성 유전자에 의해 암호화된 환원 효소는 12개 탄소 지방 아실-CoA의 도데칸올로의 환원을 촉매한다. 몇몇 구체예에서, 제2 외인성 유전자는 8개 내지 18개 탄소 지방 아실-CoA의 상응하는 알데하이드로의 환원을 촉매하는 지방 아실-CoA 환원 효소를 암호화한다. 몇몇 구체예에서, 제2 외인성 유전자는 자연적으로 지방 아실-ACP 티오에스테라제와 함께 공동 발현되는 아실기 운반 단백질을 암호화한다.
몇몇 구체예에서, 제2 외인성 유전자는 지방 아실-CoA 환원 효소를 암호화하고, 미생물은 지방 알데하이드 탈카보닐화 효소를 암호화하는 제3 외인성 유전자를 추가로 함유한다. 몇몇 경우에, 제1 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스테라제는 ACP로부터 8개 내지 18개 탄소 지방산의 절단을 촉매하고, 제2 외인성 유전자에 의해 암호화된 환원 효소는 8개 내지 18개 탄소 지방 아실-CoA의 상응하는 지방 알데하이드로의 환원을 촉매하며, 제3 외인성 유전자에 의해 암호화된 탈카보닐화 효소는 8개 내지 18개 탄소 지방 알데하이드의 상응하는 알칸으로의 전환을 촉매하고, 여기서 티오에스테라제, 환원 효소 및 탈카보닐화 효소는 동일한 탄소 사슬 길이에 작용한다.
몇몇 구체예에서, 제2 외인성 유전자는 아실기 운반 단백질을 암호화하고, 미생물은 지방 아실-CoA 환원 효소 및 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 제3 외인성 유전자를 추가로 함유한다. 몇몇 경우에, 제3 외인성 유전자는 지방 아실-CoA 환원 효소를 암호화하고, 미생물은 지방 알데하이드 탈카보닐화 효소를 암호화하는 제4 외인성 유전자를 추가로 함유한다.
본 발명은 또한 배양 배지에서 재조합 프로토테카 세포의 집단을 배양하는 것을 포함하는 알코올을 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 세포는 (i) 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 제1 외인성 유전자, 및 (ii) 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소를 암호화하는 제2 외인성 유전자를 함유하고, 상기 세포는 아실기 운반 단백질(ACP)에 연결된 지방산을 합성하며, 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매하여 추가의 가공을 통해 지방 아실-CoA를 생산하고, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소는 아실-CoA의 알코올로의 환원을 촉매한다.
본 발명은 또한 프로토테카 세포에서 지질 분자를 생산하는 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 상기 방법은 배양 배지에서 프로토테카 세포 집단을 배양하는 것을 포함하며, 상기 세포는 (i) 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 제1 외인성 유전자, 및 (ii) 지방 아실-CoA 환원 효소를 암호화하는 제2 외인성 유전자를 함유하고, 상기 미생물은 아실기 운반 단백질(ACP)에 연결된 지방산을 합성하며, 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매하여 추가의 가공을 통해 지방 아실-CoA를 생산하고, 지방 아실-CoA 환원 효소는 아실-CoA의 알데하이드로의 환원을 촉매한다.
본 발명은 또한 프로토테카 세포에서 특정된 탄소 사슬 길이를 갖는 지방산 분자를 생산하는 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 상기 방법은 배양 배지에서 지질 생산 프로토테카 세포 집단을 배양하는 것을 포함하며, 여기서 상기 미생물은 8개, 10개, 12개 또는 14개 탄소 원자와 같은 특정 탄소 사슬 길이에 특이적이거나 우선적인 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자를 함유하고, 상기 미생물은 아실기 운반 단백질(ACP)에 연결된 지방산을 합성하며, 상기 티오에스테라제는 지방산이 특정 탄소 사슬 길이로 합성되는 경우 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매한다.
전술한 다양한 구체예에서, 프로토테카 세포는 지질 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 유전자 또는 유전자 생성물의 발현을 억제하는 억제 요소, 예를 들어 RNA 간섭 요소를 함유할 수 있다. 몇몇 경우에, 지질 경로 효소는 스테아로일-ACP 불포화 효소, 글리세로지질 불포화 효소, 피루베이트 탈수소화 효소, 아세틸-CoA 카복실라제, 아실기 운반 단백질 및 글리세롤-3 포스페이트 아실트랜스퍼라제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 경우에, 프로토테카 세포는 지방 아실-ACP 티오에스테라제, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원 효소, 지방 아실-CoA 환원 효소, 지방 알데하이드 환원 효소, 지방 알데하이드 탈카보닐화 효소 및/또는 아실기 운반 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질 변형 효소를 함유한다.
본 발명은 또한 하이드록실화된 지방산을 생성하는 하이드록실라제를 암호화하는 이종 유전자를 함유하는 미생물 세포를 제공한다. 미생물 세포는 제II형 지방산 합성 경로를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미생물 세포는 미세 조류 세포일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 미세 조류 세포는 상기 표 1에 나열된 미세 조류 세포들로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 미세 조류 세포는 프로토테카 속에 속하는 것이다. 또 다른 구체예에서, 미세 조류 세포는 프로토테카 모리포르미스이다. 하이드록실라제는 하이드록실기(-OH)를 기질에 부가하는 효소이다. 지방산 하이드록실라제는 일부 고등 식물에서 발견되는 자연적으로 생성되는 효소이다. 고등 식물에서 발견되는 자연적으로 생성되는 하이드록실라제의 비제한적 예로서는 리시놀레산을 생산하는데 관여하는 리시누스 커뮤니스로부터 유래하는 올리에이트 12-하이드록실라제가 있다. 실시예 7은 프로토테카 세포 내에서 하이드록실라제의 이종 발현의 예, 특히 프로토테카 모리포르미스 세포 내에서 리시누스 커뮤니스 올리에이트 12-하이드록실라제의 발현을 기술한다.
VI . 연료 및 화학 물질 생산
본 발명의 방법에 따른 연료의 생산을 위해, 본 발명의 세포에 의해 생산된 지질을 임의의 편리한 수단에 의해 수거하거나, 다르게는 수집한다. 지질은 전체 세포 추출에 의해 분리될 수 있다. 상기 세포를 우선 파쇄시키고 이어서 세포 내 및 세포막/세포벽 결합 지질 및 세포외 탄화수소를, 예를 들어 전술된 바와 같은 원심분리를 사용하여 세포 덩어리로부터 분리할 수 있다. 미생물내에서 생성된 세포 내 지질은 몇몇 구체예에서 미생물의 세포를 용해시킨 후 추출된다. 일단 추출된 후, 지질을 추가로 정제하여 오일, 연료 또는 함유 화학 제품을 생성한다.
배양을 완료한 후, 미생물을 발효 브로스로부터 분리할 수 있다. 임의로, 상기 분리는 원심분리로 수행하여 농축된 페이스트를 생성한다. 원심분리는 미생물로부터 상당양의 세포 내 물을 제거하지 못하며, 건조 단계가 아니다. 그 다음, 상기 바이오매스는 임의로 세척액(예를 들어, 탈이온수)으로 세척하여 발효 브로스 및 잔해를 제거할 수 있다. 임의로, 세척된 미생물 바이오매스는 또한 세포 파쇄 전에 건조(오븐 건조, 동결 건조 등)될 수 있다. 대안적으로, 세포는 발효가 완료된 경우 발효 브로스의 일부 또는 전부로부터 분리 없이 용해될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 세포가 용해된 경우 세포외 액체에 대한 세포의 비율이 1:1(v:v) 미만일 수 있다.
지질을 함유하는 미생물은 용해시켜 용해물을 생성할 수 있다. 본원에 상세히 기술된 바와 같이, 미생물 용해시키는 단계(또한 세포 용해로서 언급됨)는 열 유도된 용해, 염기의 첨가, 산의 첨가, 프로테아제와 같은 효소 및 아밀라제와 같은 다당류 분해 효소의 사용, 초음파의 사용, 기계적 용해, 삼투압 충격의 사용, 용균성 바이러스에 의한 감염 및/또는 하나 이상의 용균성 유전자의 발현을 포함하는 임의의 간편한 수단에 의해 성취될 수 있다. 용해를 수행하여 미생물에 의해 생성된 세포 내 분자를 방출시킨다. 미생물을 용해시키기 위한 이들 방법 각각은 단일 방법으로 또는 동시에 또는 연속적으로 조합하여 사용할 수 있다. 세포 파쇄 정도는 현미경 분석에 의해 관찰할 수 있다. 본원에 기술된 방법중 하나 이상을 사용하여, 통상적으로 70% 초과의 세포 파괴가 관찰된다. 바람직하게, 세포 파괴는 80% 초과, 보다 바람직하게는 90% 초과 및 가장 바람직하게는 약 100%이다.
특정 구체예에서, 미생물은, 예를 들어 추출 또는 추가의 가공을 위해 세포 지질 및/또는 탄화수소의 노출을 증가시키기 위해 생장 후 용해시킨다. 리파제 발현(예를 들어, 유도성 프로모터를 통함) 및 세포 용해의 타이밍은 지질 및/또는 탄화수소의 수율을 최적화하기 위해 조정될 수 있다. 다수의 용해 기술은 하기에 기술되어 있다. 이들 기술은 개별적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 미생물을 용해시키는 단계는 미생물을 함유하는 세포 현탁액의 가열을 포함한다. 이러한 구체예에서, 미생물을 함유하는 발효 브로스(또는 발효 브로스로부터 분리된 미생물 현탁액)는 미생물, 즉 미생물의 세포벽 및 막이 분해하거나 파괴될 때까지 가열한다. 통상적으로, 적용되는 온도는 5O℃ 이상이다. 보다 효율적인 세포 용해를 위해, 보다 고온, 예를 들어 30℃ 이상, 6O℃ 이상, 70℃ 이상, 80℃ 이상, 9O℃ 이상, 100℃ 이상, 11O℃ 이상, 12O℃ 이상, 13O℃ 이상 또는 그 이상의 온도가 사용된다. 열 처리에 의한 세포 용해는 미생물을 비등시킴으로써 수행할 수 있다. 대안적으로, 열 처리(비등 없이)는 오토클레이브에서 수행할 수 있다. 열 처리된 용해물은 추가의 처리를 위해 냉각시킬 수 있다. 세포 파쇄는 또한 증기 처리, 즉 가압된 증기의 부가를 통해 수행할 수 있다. 세포 파쇄를 위한 미세 조류의 증기 처리는, 예를 들어 미국 특허 제6,750,048호에 기술되어 있다. 몇몇 구체예에서, 증기 처리는 발효기로 증기를 살포하고 브로스를 약 90분 미만, 바람직하게는 약 60분 미만, 보다 바람직하게는 약 30분 미만 동안 원하는 온도에서 유지시킴으로써 성취할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 미생물을 용해시키는 단계는 염기를, 미생물을 함유하는 세포 현탁액에 첨가하는 것을 포함한다. 상기 염기는 사용되는 미생물의 단백질성 화합물의 적어도 일부를 가수 분해하기에 충분히 강해야만 한다. 단백질을 가용화시키는데 유용한 염기는 화학 기술 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 방법에 유용한 예시적인 염기로서는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘의 수산화물, 탄산염 및 중탄산염, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 염기는 KOH이다. 세포 파쇄를 위한 미세 조류의 염기 처리는, 예를 들어 미국 특허 제6,750,048호에 기술되어 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 미생물을 용해시키는 단계는 산을, 미생물을 함유하는 세포 현탁액에 첨가하는 것을 포함한다. 산 용해는 10mN 내지 500mN 또는 바람직하게 40nM 내지 160nM의 농도로 산을 사용하여 수행할 수 있다. 산 용해는 바람직하게 실온 초과(예를 들어, 40℃ 내지 160℃, 및 바람직하게 50℃ 내지 130℃의 온도)에서 수행한다. 적당한 온도(예를 들어, 실온 내지 100℃ 및 특히 실온 내지 65℃)에 대해서, 산 처리는 초음파 처리 또는 기타 다른 세포 파쇄 방법과 유용하게 조합할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 미생물을 용해시키는 단계는 효소를 사용함으로써 미생물을 용해시키는 것을 포함한다. 미생물을 용해시키기 위해 바람직한 효소로서는 프로테아제 및 다당류 분해 효소, 예를 들어 헤미셀룰라제(예를 들어, 아스퍼질러스 나이저; Sigma Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재; #H2125), 펙티나제(예를 들어, 리조푸스 종 유래의 펙티나제; Sigma Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재; #P2401), 만나웨이(Mannaway) 4.0 L(Novozymes), 셀룰라제(예를 들어, 트리코더마 비리데 유래의 셀룰라제; Sigma Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재; #C9422), 및 드리셀라제(예를 들어, 바시디오마이세테스 종 유래의 드리셀라제; Sigma Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재; #D9515)가 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 용해는, 예를 들어 임의로 클로렐라 또는 클로렐라 바이러스 유래의 다당류 분해 효소와 같은 셀룰라제, 또는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제, 키모트립신, 프로테이나제 K, 문헌[Degradation of Polylactide by Commercial Proteases, Oda Yet al., Journal of Polymers and the Environment, Volume 8, Number 1, January 2000, pp. 29-32(4)]에 열거된 프로테아제, 알칼라제 2.4 FG(Novozymes), 및 플라보우르짐 100 L(Novozymes)과 같은 프로테아제와 같은 효소를 사용하여 성취한다. 또한 이전의 프로테아제 및 다당류 분해 효소의 임의의 조합을 비롯한 프로테아제 및 다당류 분해 효소의 임의의 조합을 사용할 수 있다.
다른 구체예에서, 용해는 익스펠러 프레스를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 공정에서, 바이오매스는 고압에서 스크류형 장치를 통해 강제 주입하고 세포를 용해시키며, 세포 내 지질이 방출되게 하고 세포 내에서 단백질 및 섬유(및 기타 다른 성분)로부터 분리되도록 한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 미생물을 용해시키는 단계는 초음파, 즉 초음파 처리를 사용하여 수행한다. 따라서, 세포는 또한 고주파음으로 용해시킬 수 있다. 상기 음은 전자적으로 생성될 수 있고 금속 팁을 통해 적절히 농축된 세포 현탁액으로 운반된다. 상기 초음파 처리(또는 초음파 처리(ultrasonication))는 세포 현탁액 중 공극의 형성을 기준으로 세포 완전성을 붕괴시킨다.
본 발명의 다른 구체예에서, 미생물을 용해시키는 단계는 기계적 용해에 의해 수행한다. 세포는 기계적으로 용해시키고, 임의로 균질화하여 탄화수소(예를 들어, 지질) 수집을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 압력 분쇄기를 사용하여 세포 함유 슬러리를 제한된 오리피스 밸브를 통과하도록 펌핑시킬 수 있다. 고압(1500바 이하)을 적용함에 이어서 출구 노즐을 통해 즉시 확장시킨다. 세포 파쇄는 밸브상에 충돌, 오리피스 내 액체 고전단, 및 방출시 급작스런 압력 강하로 세포 파열의 유도의 3가지 상이한 기작에 의해 성취한다. 상기 방법은 세포 내 분자를 방출시킨다. 대안적으로, 볼 밀을 사용할 수 있다. 볼 밀에서, 세포는 비드와 같은 작은 연마 입자와 함께 현탁 상태로 교반시킨다. 전단력 때문에 세포는 분해되고, 비드 사이에서 분쇄되며 비드와 충돌한다. 상기 비드는 세포를 파쇄하여 세포 내용물을 방출시킨다. 세포는, 예를 들어 블렌딩(예를 들어, 고속 또는 와링 블렌더(Waring blender)), 프렌치 프레스 또는 심지어 약한 세포 벽의 경우에 세포 파쇄를 위한 원심분리의 사용에 의하는 것과 같은 전단력에 의해 파쇄될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 미생물을 용해시키는 단계는 삼투압 충격을 적용함으로써 수행한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 미생물을 용해시키는 단계는 용균성 바이러스로 미생물을 감염시키는 것을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위해 적합한 미생물을 용해시키기 위한 광범위하게 다양한 바이러스가 공지되어 있고, 특정 미생물에 대한 특정 용균성 바이러스의 선택 및 용도는 당업계의 기술 수준 내에 있다. 예를 들어, 파라메시움 부르사리아 클로렐라 바이러스(paramecium bursaria chlorella virus; PBCV-l)는 특정 단일 세포 진핵 클로렐라형 녹색 조류 내에서 복제하고 이를 용해시키는 대형의 20면체 플라크 형성 이중가닥의 DNA 바이러스군의 프로토타입이다(피코드나비리대(Phycodnaviridae) 계열, 클로로바이러스(Chlorovirus) 속). 따라서, 임의의 민감성 미세 조류는 적합한 클로렐라 바이러스로 배양물을 감염시킴으로써 용해시킬 수 있다. 클로렐라 바이러스로 클로렐라 종을 감염시키는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Adv . Virus Res. 2006;66:293-336]; [Virology, 1999 Apr 25;257(1): 15-23]; [Virology, 2004 Jan 5;318(l):214-23]; [Nucleic Acids Symp . Ser. 2000;(44): 161-2]; [J. Virol. 2006 Mar;80(5):2437-44]; 및 [Annu . Rev . Microbiol. 1999;53:447-94]을 참조한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 미생물을 용해시키는 단계는 자가용해를 포함한다. 이러한 구체예에서, 본 발명에 따른 미생물은 미생물을 용해시킬 용균성 단백질을 생성하도록 유전자 조작된다. 이러한 용균성 유전자는 유도성 프로모터를 사용하여 발현시켜 세포가 처음에 발효기 내에서 바람직한 밀도로 생장한 후 프로모터를 유도하여 용균성 유전자를 발현시킴으로써 세포를 용해시킬 수 있게 할 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 용균성 유전자는 다당류 분해 효소를 암호화한다. 다른 특정 구체예에서, 상기 용균성 유전자는 용균성 바이러스 유래의 유전자이다. 따라서, 예를 들어 클로렐라 바이러스 유래의 용균성 유전자는 조류 세포에서 발현될 수 있고, 문헌[Virology 260, 308-315 (1999)]; [FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45-53]; [Virology 263, 376-387 (1999)]; 및 [Virology 230, 361-368 (1997)]을 참조한다. 용균성 유전자의 발현은 바람직하게 유도성 프로모터, 예를 들어 소분자, 광, 열의 존재와 같은 자극 및 기타 다른 자극에 의해 유도되는 미세 조류에서 활성인 프로모터를 사용하여 수행한다.
상기 방법에 의해 생성된 세포 용해물로부터 지질을 분리하기 위한 다양한 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 지방 알데하이드, 지방 알코올 및 탄화수소(예를 들어, 알칸)와 같은 지질 및 지질 유도체는 헥산과 같은 소수성 용매로 추출할 수 있다(문헌[Frenz et al. 1989, Enzyme Microb. Technol., 11:717] 참조). 지질 및 지질 유도체는 또한 액화(예를 들어, 문헌[Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17:33-39] 및 [Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6(4):269-274] 참조); 오일 액화(예를 들어, 문헌[Minowa et al. 1995, Fuel 74(12): 1735-1738] 참조); 및 초임계 CO2 추출(예를 들어, 문헌[Mendes et al. 2003, Inorganica Chimica Acta 356:328-334] 참조)을 사용하여 추출할 수 있다. Miao 및 Wu는 클로렐라 프로토테오코이데스의 배양으로부터 미세 조류 지질 회수의 프로토콜을 기술하며, 여기서 상기 세포는 원심분리에 의해 수거되고 증류수로 세척되며 동결 건조에 의해 건조된다. 생성된 세포 분말을 모르타르에서 분쇄하고 이어서 n-헥산으로 추출하였다(문헌[Miao 및 Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846]).
따라서, 본 발명의 미생물에 의해 생성된 지질, 지질 유도체 및 탄화수소는 유기 용매로 추출하여 회수할 수 있다. 몇몇 경우에, 바람직한 유기 용매는 헥산이다. 통상적으로, 유기 용매는 용해 성분의 사전 분리 없이 용해물에 직접 첨가한다. 하나의 구체예에서, 전술한 방법 중 하나 이상의 방법에 의해 생성된 용해물은 지질 및/또는 탄화수소 성분이 유기 용매와 용액을 형성하도록 하기에 충분한 시간 동안 유기 용매와 접촉시킨다. 몇몇 경우에, 상기 용액을 이어서 추가로 정제하여 특정의 원하는 지질 또는 탄화수소 성분을 회수할 수 있다. 헥산 추출 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본원에 기술된 세포에 의해 생성된 지방 알데하이드, 지방 알코올 및 탄화수소(예를 들어, 알칸)와 같은 지질 및 지질 유도체는 전술된 바와 같은 리파제를 포함하여 하나 이상의 효소를 사용함으로써 변형시킬 수 있다. 탄화수소가 세포의 세포외 환경에 존재하는 경우, 효소가 탄화수소를 변형시키거나 탄화수소 전구체로부터 이의 합성을 완성하도록 하는 조건 하에서 하나 이상의 효소를 상기 환경에 첨가할 수 있다. 대안적으로, 상기 탄화수소는 효소와 같은 하나 이상의 촉매의 첨가 전에 세포 물질로부터 부분적으로 또는 완전하게 분리될 수 있다. 상기 촉매는 외인성으로 첨가되고, 이들의 활성은 세포 외부에서 또는 시험관내에서 발생한다.
따라서, 본원에 기술된 바와 같이 생체 내에서 세포에 의해 생성되거나 시험관 내에서 효소로 변형된 지질 및 탄화수소는 임의로 통상적인 수단에 의해 추가로 가공될 수 있다. 상기 가공은 탄화수소 분자의 크기를 감소시키고 따라서 이의 수소:탄소 비율을 증가시키기 위한 “크래킹(cracking)”을 포함할 수 있다. 촉매 및 열 크래킹 방법은 통상적으로 탄화수소 및 트리글리세라이드 오일 가공에 사용한다. 촉매 방법은 고체 산 촉매와 같은 촉매의 사용을 포함한다. 촉매는 실리카-알루미나 또는 제올라이트일 수 있고, 이로써 탄소-탄소 결합을 이종 용해 또는 비대칭 분해시켜 카보양이온(carbocation) 및 수소화물 음이온을 생성할 수 있다. 이들 반응성 중간체를 이어서 다른 탄화수소와 함께 재배열하거나 수소화 전달을 진행시킨다. 따라서 상기 반응은 중간체를 재생성시켜 자가 증폭 사슬 기작을 유도할 수 있다. 또한 탄화수소는 여기서의 탄소-탄소 이중 결합 또는 삼중 결합의 수를 임의로 0까지 감소하도록 가공할 수 있다. 또한 탄화수소를 가공하여 여기서의 고리 또는 환형 구조를 제거할 수 있다. 탄화수소를 또한 가공하여 수소:탄소 비율을 증가시킬 수 있다. 이것은 수소의 첨가(“수소화”) 및/또는 탄화수소의 보다 작은 탄화수소로의 “크래킹”을 포함할 수 있다.
열 방법은 탄화수소 크기를 감소시키기 위한 상승된 온도 및 압력의 사용을 포함한다. 약 800℃의 승온 및 약 700kPa의 압력을 사용할 수 있다. 이들 조건은 때때로 수소 풍부 탄화수소 분자(양성자 플럭스와는 구분됨)를 언급하는데 사용되는 용어 “가벼운” 탄화수소 분자를 생성하는 한편, 또한 응축에 의해 상대적으로 수소가 고갈된 보다 무거운 탄화수소 분자를 생성한다. 상기 방법은 균형 분해 또는 대칭적 분해를 제공하고, 전술된 바와 같이 임의로 효소로 포화될 수 있는 알켄을 생성한다.
촉매 및 열 방법은 탄화수소 가공 및 정유를 위한 식물에서의 표준 방법이다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같은 세포에 의해 생성된 탄화수소가 수집될 수 있고, 통상적인 수단에 의해 가공되거나 정제될 수 있다. 미세 조류 생산 탄화수소의 수소크래킹에 대한 보고에 대해 문헌[Hillen et al. (Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIV: 193-205 (1982))]을 참조한다. 대안적인 구체예에서, 상기 분획물은 다른 촉매, 예를 들어 유기 화합물, 열 및/또는 무기 화합물로 처리한다. 지질의 바이오디젤로의 가공을 위해, 에스테르 결합 전이 공정이 본 섹션의 하기에 기술된 바와 같이 사용된다.
본 발명의 방법을 통해 생성되는 탄화수소는 다양한 산업 응용 분야에서 유용하다. 예를 들어, 거의 모든 유형의 세제 및 세정 제조물에서 사용되는 음이온 게면활성제인 선형 알킬벤젠 설포네이트(LAS)의 생산은 일반적으로 10개 내지 14개의 탄소 원자 사슬을 포함하는 탄화수소를 사용한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,946,430호; 제5,506,201호; 제6,692,730호; 제6,268,517호; 제6,020,509호; 제6,140,302호; 제5,080,848호; 및 제5,567,359호를 참조한다. LAS와 같은 계면활성제는 퍼스널 케어 조성물 및 세제(예를 들어, 미국 특허 제5,942,479호; 제6,086,903호; 제5,833,999호; 제6,468,955호; 및 제6,407,044호에 기술된 것들)의 제조에 사용할 수 있다.
화석 연료로부터 유래된 출발 물질을 대체할 수 있는 재생가능한 생물학적 출발 물질이 이용가능하고 이의 사용이 바람직할 수 있기 때문에, 바이오디젤, 재생 디젤 및 제트 연료와 같은 연료에서의 생물학적 유래의 탄화수소 성분의 사용에 대한 관심이 증대되고 있다. 생물학적 물질로부터 탄화수소 성분을 생산하기 위한 방법이 시급히 요구되고 있다. 본 발명은 바이오디젤, 재생 디젤 및 제트 연료를 제조하기 위해 생물학적 재료로서 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 지질을 사용하여, 바이오디젤, 재생 디젤 및 제트 연료를 생산하는 방법을 제공함으로써 상기 필요성을 충족시킨다.
통상적인 디젤 연료는 파라핀 탄화수소가 풍부한 석유 증류물이다. 이들은 370℉ 내지 78O℉ 정도로 넓은 비등 범위를 가지며, 이는 디젤 엔진 차량과 같은 압축 점화 엔진에서 연소용으로서 적합하다. 미국 재료 시험 협회(American Society of Testing and Materials; ASTM)는 세탄수, 혼탁점, 인화점, 점도, 아닐린 점, 황 함량, 물 함량, 재 함량, 동판 부식 및 잔류 탄소와 같은 허용 가능한 범위의 기타 다른 연료 특성과 함께 비등 범위에 따라 디젤 등급을 확립한다. 기술적으로, 적절한 ASTM 사양을 충족하는 바이오매스 또는 기타 다른 것으로부터 유래된 임의의 탄화수소 증류 재료는 디젤 연료(ASTM D975), 제트 연료(ASTM D1655), 또는 이것이 지방산 메틸 에스테르인 경우 바이오디젤(ASTM D6751)로서 정의될 수 있다.
추출 후, 본원에 기술된 미생물 바이오매스로부터 회수된 지질 및/또는 탄화수소 성분은 디젤 차량 및 제트 엔진에 사용하기 위한 연료를 제조하기 위해 화학 처리될 수 있다.
바이오디젤은 금색 내지 암갈색으로 생산 공급원료에 따라 색상이 다양한 액체이다. 이것은 실제로 수불혼화성이고, 고비등점 및 저증기압을 갖는다. 바이오디젤은 디젤-엔진 차량에 사용하기 위한 디젤 등가의 가공된 연료를 말한다. 바이오디젤은 생분해성이고 비독성이다. 통상적인 디젤 연료에 대한 바이오디젤의 추가의 이득은 보다 낮은 엔진 마모이다. 통상적으로, 바이오디젤은 C14 내지 C18 알킬 에스테르를 포함한다. 다양한 가공은 본원에 기술된 바와 같이 생성되고 분리된 바이오매스 또는 지질을 디젤 연료로 전환시킨다. 바이오디젤을 생산하기 위한 바람직한 방법은 본원에 기술된 바와 같이 지질의 에스테르 결합 전이에 의한 것이다. 바이오디젤로서 사용하기 위한 바람직한 알킬 에스테르는 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르이다.
본원에 기술된 방법에 의해 생성된 바이오디젤은 대부분의 현재 디젤-엔진 차량에서 임의의 농도로 단독으로 사용되거나 통상적인 디젤 연료와 배합하여 사용될 수 있다. 통상적인 디젤 연료(석유 디젤)와 배합되는 경우, 바이오디젤은 약 0.1% 내지 약 99.9%로 존재할 수 있다. 많은 국가에서는 임의의 연료 혼합물에서 바이오디젤의 양을 지칭하기 위해 “B” 인자로서 공지된 시스템을 사용한다. 예를 들어, 20%의 바이오디젤을 함유하는 연료는 B20으로 표시된다. 순수한 바이오디젤은 B1OO으로 언급된다.
바이오디젤은 또한 가정용 및 상업용 보일러에서 가열 연료로서 사용될 수 있다. 기존의 오일 보일러는 고무 부품을 함유할 수 있고 바이오디젤 상에서의 운행을 위해서는 전환을 필요로 할 수 있다. 전환 과정은 일반적으로 비교적 단순하고, 바이오디젤이 강한 용매이기 때문에 고무 부품의 합성 부품으로의 교환을 포함한다. 이의 강한 용해력 때문에, 바이오디젤의 연소는 보일러의 효율을 증가시킬 것이다. 바이오디젤은 순수한 초저황 디젤(ULSD) 연료의 윤활성을 증가시키기 위해 디젤 제형 중에 첨가제로서 사용될 수 있고, 이는 이것이 실제로 황을 내포하지 않기 때문에 유리하다. 바이오디젤은 석유디젤 보다 양호한 용매이고, 이전에 석유디젤 상에서 운행된 차량의 연료관 중에 잔류 침적물을 분해시키는데 사용될 수 있다.
바이오디젤은 오일 풍부 바이오매스 중에 함유된 트리글리세라이드의 에스테르 결합 전이에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양태에서, 바이오디젤을 생산하기 위한 방법이 제공된다. 바람직한 구체예에서, 바이오디젤을 생산하는 방법은 (a) 본원에 개시된 방법을 사용하여 지질 함유 미생물을 배양하는 단계, (b) 지질 함유 미생물을 용해시켜 용해물을 생성시키는 단계, (c) 용해된 미생물로부터 지질을 분리하는 단계, 및 (d) 지질 조성물을 에스테르 결합 전이하여 바이오디젤을 생성시키는 단계를 포함한다. 미생물의 생장 방법, 미생물을 용해시켜 용해물을 생성하는 방법, 유기 용매를 포함하는 배지에서 용해물을 처리하여 이종성 혼합물을 형성시키는 방법 및 처리된 용해물을 지질 조성물로 분리하는 방법은 상기 기술되었고 또한 바이오디젤을 생산하는 방법에 사용될 수 있다.
바이오디젤의 지질 프로필은 일반적으로 공급원료 오일의 지질 프로필과 고도로 유사하다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공된 기타 다른 오일은 에스테르 결합 전이시켜 바이오디젤을 생산할 수 있고, 이때 지질 프로필은 (a) C8 내지 C14 4% 이상; (b) C8 0.3% 이상; (c) ClO 2% 이상; (d) C12 2% 이상; 및 (e) C8 내지 C14 30% 이상을 포함한다.
지질 조성물은 에스테르 결합 전이되어 바이오디젤로서 유용한 장쇄의 지방산 에스테르를 생산할 수 있다. 바람직한 에스테르 결합 전이 반응은 하기에 개괄되어 있으며, 염기 촉매된 에스테르 결합 전이 및 재조합 리파제를 사용하는 에스테르 결합 전이를 포함한다. 염기 촉매된 에스테르 결합 전이 공정에서, 트리아실글리세라이드는 알칼리성인 촉매, 통상적으로 수산화칼륨의 존재 하에 메탄올 또는 에탄올과 같은 알코올과 반응시킨다. 상기 반응은 부산물로서 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르 및 글리세린(글리세롤)을 형성한다.
동물 및 식물 오일은 통상적으로 3가 알코올인 글리세롤과 유리된 지방산의 에스테르인 트리글리세라이드로 구성된다. 에스테르 결합 전이에서, 트리글리세라이드(TAG) 중의 글리세롤은 메탄올 또는 에탄올과 같은 단쇄 알코올로 대체된다. 통상적인 반응식은 다음과 같다.
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상기 반응에서, 알코올은 염기로 탈양성자화되어 보다 강한 친핵성이 되게 한다. 통상적으로, 에탄올 또는 메탄올은 매우 과량(50배 이하)으로 사용된다. 정상적으로 상기 반응은 상당히 느리게 진행하거나 전혀 진행하지 않을 것이다. 산 또는 염기뿐만 아니라 열을 사용하여 반응의 보다 신속한 진행을 도와줄 수 있다. 산 또는 염기는 에스테르 결합 전이 반응에 의해 소비되지 않으며, 따라서 이들은 반응물이 아니고 촉매이다. 거의 모든 바이오디젤은 이것이 단지 저온 및 저압을 필요로 하고 98% 초과의 전환 수율을 나타내므로(단, 출발 오일은 수분 및 유리된 지방산이 낮음) 염기 촉매된 기술을 사용하여 생산되었다.
에스테르 결합 전이는 또한 상기 개시된 바와 같이 염기 대신 리파제와 같은 효소를 사용하여 수행하였다. 리파제로 촉매된 에스테르 결합 전이는, 예를 들어 실온 내지 80℃의 온도 및 1:1 초과, 바람직하게는 약 3:1인 TAG 대 저급 알코올의 몰비에서 수행할 수 있다. 에스테르 결합 전이에 사용하기에 적합한 리파제는 표 9에 기재된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 에스테르 결합 전이에 유용한 리파제의 기타 다른 예는, 예를 들어 미국 특허 제4,798,793호; 제4,940,845호; 제5,156,963호; 제5,342,768호; 제5,776,741호 및 WO 89/01032호에서 찾을 수 있다. 상기 리파제로서는 리조푸스(Rhizopus), 아스퍼질러스(Aspergillus), 칸디다(Candida), 무코르(Mucor), 슈도모나스(Pseudomonas), 리조무코르(Rhizomucor), 칸디다 및 휴미콜라(Humicola) 미생물에 의해 생성된 리파제 및 췌장 리파제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
에스테르 결합 전이에 사용하기에 적합한 리파제
아스퍼질러스 나이저 리파제 ABG73614, 칸디다 안타크티카(Candida antarctica) 리파제 B (novozym-435) CAA83122, 칸디다 실린드라세아(Candida cylindracea) 리파제 AAR24090, 칸디다 리폴리티카(Candida lipolytica) 리파제(리파제 L; Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), 칸디다 루고사(Candida rugosa) 리파제(예를 들어, 리파제-OF; Meito Sangyo Co., Ltd.), 무코르 미에헤이(Mucor miehei) 리파제(Lipozyme IM 20), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 리파제 AAA25882, 리조푸스 자포니카스(Rhizopus japonicas) 리파제(리파제 A-10FG) Q7M4U7_1, 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 리파제 B34959, 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae) 리파제(리파제 F) AAF32408, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 리파제(SM Enzyme) ABI13521, 써모마이세스 라누기노사(Thermomyces lanuginosa) 리파제 CAB58509, 리파제 P(Nagase ChemteX Corporation), 및 리파제 QLM(Meito Sangyo Co., Ltd., Nagoya, Japan)
바이오디젤용으로 적합한 지방산 에스테르의 제조를 위해 리파제를 사용하는 것에 대한 문제점은 리파제 가격이 강염기 공정에 의해 사용되는 수산화나트륨(NaOH)의 가격보다 훨씬 고가라는 것이다. 상기 문제점은 재순환될 수 있는 고정화된 리파제를 사용함으로써 해결되었다. 그러나, 리파제 기반 공정이 생산 단가의 측면에서 강염기 공정과 경쟁을 하도록 하기 위해서는 최소의 주기 수 동안 재순환된 후 고정화된 리파제의 활성은 유지되어야만 한다. 고정화된 리파제는 에스테르 결합 전이에 통상적으로 사용되는 저급 알코올에 의해 독성이 된다. 미국 특허 제6,398,707호(Wu et al., 2002년 6월 4일자로 등록됨)는 고정화된 리파제의 활성을 증진시키는 방법 및 감소된 활성을 갖는 고정화된 리파제를 재생시키는 방법을 기술한다. 몇몇 적합한 방법은 일정 기간 동안, 바람직하게는 0.5시간 내지 48시간, 보다 바람직하게는 0.5시간 내지 1.5시간 동안 3개 이상의 탄소 원자수를 갖는 알코올 중에 고정화된 리파제를 침지시키는 것을 포함한다. 몇몇 적합한 방법은 또한 불활성화된 고정화된 리파제를 3개 이상의 탄소 원자수를 갖는 알코올로 세척함에 이어서 식물성 오일 중에 0.5시간 내지 48시간 동안 불활성화된 고정화된 리파제를 침지시키는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 재조합 리파제는 리파제가 작용하는 지질을 생산하는 동일한 미생물 내에서 발현된다. 적합한 재조합 리파제는 상기 표 9에 열거되고/열거되거나 표 9에 열거된 GenBank 수탁 번호를 갖는 것들, 또는 상기 표 9에 열거된 리파제 중 하나와 70% 이상의 아미노산 동일성을 갖고 리파제 활성을 나타내는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 구체예에서, 효소 활성은 전술된 서열 중 하나와 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 99% 이상 동일성을 갖는 서열 중에 존재하고 상기 서열 모두는 완전히 제시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 리파제 및 선택가능한 마커를 암호화하는 DNA는 바람직하게 코돈 최적화된 cDNA이다. 미세 조류 중에서 발현하기 위해 유전자를 재암호화하는 방법은 미국 특허 제7,135,290호에 기술되어 있다.
바이오디젤에 대한 통상의 국제 표준은 EN 14214이다. ASTM D6751은 미국 및 캐나다에서 참조되는 가장 일반적인 바이오디젤 표준이다. 독일은 DIN EN 14214를 사용하고, UK는 BS EN 14214을 준수할 것을 요구한다. 생성물이 이들 표준에 부합하는지의 여부를 결정하기 위한 기본 산업적 시험은 통상적으로 가스 크로마토그래피, HPLC 등을 포함한다. 품질 표준을 충족하는 바이오디젤은 매우 비독성이고, 독성 등급(LD50)은 50mL/kg을 초과한다.
ASTM 표준을 충족하는 바이오디젤이 비독성이어야만 하지만, 결정화하고/결정화하거나 침전하고 용액으로부터 침강물로서 나오는 경향이 있는 오염물이 있을 수 있다. 침강물 형성은 특히 바이오디젤이 보다 저온에서 사용되는 경우 문제가 된다. 침강 또는 침전은 연료 흐름을 감소시키고, 연료관을 막히게 하며, 필터를 막히게 하는 것 등과 같은 문제를 유발할 수 있다. 고품질의 생성물을 제조하기 위해 바이오디젤에서 상기 오염물 및 침강물을 제거하는 것을 다루는 공정들은 당업계에 널리 공지되어 있다. 상기 공정들의 예로서는 인지질 및 유리 지방산과 같은 오염물을 제거하기 위한 오일의 전처리(예를 들어, 고무 성질 제거(degumming), 가성 정제 및 실리카 흡착 여과) 및 냉여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 냉여과는 생성 후 바이오디젤에 존재하는 임의의 미립자 및 침강물을 제거하기 위해 특별히 개발된 공정이다. 상기 공정은 바이오디젤을 냉각시키고 연료가 보다 저온에서 사용되는 경우 형성될 수 있는 임의의 침강물 또는 침전물을 여과 제거한다. 상기 공정은 당업계에 널리 공지되어 있고 미국 특허 출원 공개 제2007-0175091호에 기술되어 있다. 적합한 방법은 바이오디젤을 약 38℃ 미만의 온도로 냉각시켜 불순물 및 오염물이 바이오디젤 액체 중에서 미립자로서 침전하도록 하는 것을 포함할 수 있다. 이어서 규조토 또는 기타 다른 여과 재료를 냉각된 바이오디젤에 첨가하여 슬러리를 형성시킬 수 있고, 이것은 이어서 압력 리프(pressure leaf) 또는 기타 다른 유형의 필터를 통해 여과하여 미립자를 제거할 수 있다. 이어서 여과된 바이오디젤은 연마(polish) 필터에 통과시켜 임의의 잔류 침강물 및 규조토를 제거하여 최종 바이오디젤 생성물을 생성할 수 있다.
실시예 9는 프로토테카 모리포르미스로부터 유래한 트리글리세라이드 오일을 사용하는 바이오디젤의 제조법을 기술한다. 실시예 9에서 생산된 바이오디젤의 ASTM D6751 A1 방법에 의한 콜드 소킹 여과능(Cold Soak Filterability)은 300ml의 용적에 대해 120초였다. 상기 시험은 16시간 동안 40℉로 냉각시키고 실온으로 가온되도록 하며, 스테인리스강 지지체를 가진 0.7마이크론 유리 섬유 필터를 사용하여 진공 여과하는, 300ml의 B100의 여과를 포함한다. 본 발명의 오일은 에스테르 결합 전이되어 120초 미만, 100초 미만 및 90초 미만의 콜드 소킹 시간을 가진 바이오디젤을 생성할 수 있다.
후속 공정은 또한 바이오디젤이 특히 냉온에서 사용될 경우 이용될 수 있다. 상기 공정은 윈터리제이션(winterization) 및 분별을 포함한다. 2개 공정은 혼탁점(바이오디젤이 결정화하기 시작하는 온도)을 저하시킴으로써 연료의 냉각 흐름 및 동결 방지 수행능을 개선시키도록 설계된다. 바이오디젤의 동결 방지 처리에는 다수의 접근법이 있다. 한가지 접근법은 바이오디젤을 석유 디젤과 배합하는 것이다. 다른 접근법은 바이오디젤의 혼탁점을 저하시킬 수 있는 첨가제를 사용하는 것이다. 다른 접근법은 첨가제 중에 혼합하고 포화물이 결정화하도록 하며, 이어서 결정을 여과 제거함으로써 무분별하게 포화된 메틸 에스테르를 제거하는 것이다. 분별은 선택적으로 메틸 에스테르를 개별 성분 또는 분획으로 분리하여 특정 메틸 에스테르가 제거 또는 포함될 수 있게 한다. 분별 방법은 우레아 분별, 용매 분별 및 열 증류를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 제공되는 다른 가치있는 연료는 C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 및 C18:0과 같은 알칸을 포함하여 바이오디젤과는 구분될 수 있는 재생 디젤이다. 고품질의 재생 디젤은 ASTM D975 표준에 부합한다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질은 공급원료로서 작용하여 재생 디젤을 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 재생 디젤을 생성하는 방법이 제공된다. 재생 디젤은 열수 가공(수소 처리); 수소화처리; 및 간접적인 액화의 3가지 이상의 공정에 의해 생성될 수 있다. 이들 공정으로 비에스테르 증류물을 생성한다. 이들 공정 동안에, 본원에 기술된 바와 같이 생성되고 분리된 트리아실글리세라이드는 알칸으로 전환된다.
하나의 구체예에서, 재생 디젤을 생성하는 방법은 (a) 본원에 개시된 방법을 사용하여 지질 함유 미생물을 배양하고 (b) 미생물을 용해시켜 용해물을 생성하며, (c) 용해된 미생물로부터 지질을 분리하고 (d) 지질을 탈산소화하고 수소화처리하여 알칸을 생성함으로써 재생 디젤이 생성되도록 하는 것을 포함한다. 재생 디젤을 제조하기에 적합한 지질은 헥산과 같은 유기 용매를 사용하거나 미국 특허 제5,928,696호에 기술된 것들과 같은 기타 다른 방법을 통해 미생물 바이오매스로부터 추출을 통해 수득할 수 있다. 몇몇 적합한 방법으로서는 기계적 프레싱 및 원심분리를 포함할 수 있다.
몇몇 방법에서, 미생물 지질은 먼저 수소화처리와 연계하여 크래킹하여 각각 탄소 사슬 길이를 감소시키고 이중 결합을 포화시킨다. 상기 물질을 또한 이어서 수소화처리와 연계하여 이성체화한다. 이어서 나프타 분획을 증류를 통해 제거하고 이어서 추가 증류하여 디젤 연료에 요구되는 성분을 증발시키고 증류시킴으로써 ASTM D975 표준에 충족하도록 하고 D975 표준을 충족시키기 위해 원하는 것보다 무거운 성분을 잔류시킨다. 트리글리세라이드 오일을 포함하는 오일을 화학적으로 변형시키는 수소 처리, 수소 크래킹, 탈산소화 및 이성체화 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허 출원 EP1741768(A1); EP1741767(A1); EP1682466(A1); EP1640437(A1); EP1681337(A1); EP1795576(A1); 및 미국 특허 제7,238,277호; 제6,630,066호; 제6,596,155호; 제6,977,322호; 제7,041,866호; 제6,217,746호; 제5,885,440호; 제6,881,873호를 참조한다.
재생 디젤을 생성하기 위한 방법의 하나의 구체예에서, 알칸을 생성하기 위한 지질의 처리는 지질 조성물의 수소 처리에 의해 수행한다. 열수 가공에서, 통상적으로 바이오매스는 승온 및 승압에서 물 중에서 반응시켜 오일 및 잔류 고체를 형성시킨다. 전환 온도는 통상적으로 300℉ 내지 660℉이고, 이때 압력은 주로 액체로서 물을 유지하기에 충분한 100 표준 대기압 내지 170 표준 대기압(atm)이다. 반응 시간은 대략 15분 내지 30분 정도이다. 반응을 종결한 후 유기물을 물로부터 분리한다. 이로써 디젤에 적합한 증류물이 생성된다.
재생 디젤을 제조하는 몇몇 방법에서, 트리글리세라이드를 처리하는 제1 단계는 이중 결합을 포화시키기 위한 수소 가공에 이어서, 수소 및 촉매의 존재 하에 승온에서 탈산소화시키는 것이다. 몇몇 방법에서, 수소화 및 탈산소화는 동일한 반응에서 발생한다. 기타 다른 방법에서, 탈산소화는 수소화 전에 일어난다. 이어서 이성체화는 임의로 또한 수소 및 촉매의 존재 하에서 수행한다. 나프타 성분은 바람직하게 증류를 통해 제거한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,475,160호 (트리글리세라이드의 수소화); 제5,091,116호(탈산소화, 수소화 및 가스 제거); 제6,391,815호(수소화); 및 제5,888,947호(이성체화)를 참조한다.
트리글리세라이드의 수소화를 위한 하나의 적합한 방법은 구리, 아연, 마그네슘 및 란탄염의 수용액 및 알칼리 금속 또는 바람직하게는 탄산암모늄의 다른 용액을 제조하는 것을 포함한다. 상기 2개의 용액을 약 20℃ 내지 약 85℃의 온도로 가열하고 침전 용기 내 pH가 5.5 내지 7.5로 유지되어 촉매를 형성하도록 하는 비율로 침전 용기 내로 함께 계량하여 부가할 수 있다. 추가의 물은 초기에 침전 용기 내에 사용할 수 있거나 염 용액 및 침전 용액과 동시에 첨가할 수 있다. 이어서 생성된 침전물을 약 300℃에서 완전히 세척하고 건조시키며 하소시키고 약 100℃ 내지 약 400℃의 온도 범위에서 수소 중에서 활성화시킬 수 있다. 이어서 하나 이상의 트리글리세라이드는 반응기 내 전술된 촉매의 존재 하에서 수소와 접촉시키고 반응시킬 수 있다. 상기 반응기는 살수층(trickle bed) 반응기, 고정 상 가스-고체 반응기, 충진된 기포 탑 반응기, 연속 교반 탱크 반응기, 슬러리 상 반응기 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 다른 적합한 반응기 유형일 수 있다. 상기 방법은 배치식으로 또는 연속식으로 수행할 수 있다. 반응 온도는 통상적으로 약 170℃ 내지 약 250℃의 범위인 한편, 반응 압력은 통상적으로 약 300psig 내지 약 2000psig 범위이다. 더욱이, 본 발명의 방법에서 수소 대 트리글리세라이드의 몰 비는 통상적으로 약 20:1 내지 약 700:1 범위이다. 상기 방법은 통상적으로 시간당 중량 공간 속도(WHSV)에서 수행하고 이의 범위는 약 0.1hr-1 내지 약 5hr-1이다. 당업자는 반응을 위해 요구되는 시간이 사용되는 온도, 수소 대 트리글리세라이드의 몰비, 및 수소 분압에 따라 다양할 것임을 인지할 것이다. 상기 수소화 공정에 의해 생성되는 생성물은 지방 알코올, 글리세롤, 미량의 파라핀 및 미반응 트리글리세라이드를 포함한다. 이들 생성물은 통상적으로, 예를 들어 증류, 추출, 여과, 결정화 등과 같은 통상적인 수단에 의해 분리한다.
석유 정유업자는 수소화처리를 사용하여 공급물을 수소로 처리함으로써 불순물을 제거한다. 수소화처리 전환 온도는 통상적으로 300℉ 내지 700℉이다. 압력은 통상적으로 40atm 내지 100atm이다. 반응 시간은 통상적으로 대략 10분 내지 60분 정도이다. 고체 촉매를 사용하여 특정 반응 속도를 증가시키고 특정 생성물에 대한 선택성을 개선시키며 수소 소비를 최적화한다.
오일의 탈산소화를 위해 적합한 방법은 오일을 약 350℉ 내지 약 55O℉ 범위의 온도로 가열하고 연속적으로 가열된 오일을 약 5분 이상 동안 적어도 약 대기압 내지 그 이상의 범위 압력 하에서 질소와 접촉시키는 것을 포함한다.
이성체화를 위해 적합한 방법은 알칼리 이성체화 및 당업계에 공지된 기타 다른 오일 이성체화를 사용하는 것을 포함한다.
수소 처리 및 수소 가공은 궁극적으로 트리글리세라이드 공급물의 분자량 감소를 유도한다. 상기 트리글리세라이드 분자는 수소 가공 조건 하에서 4개의 탄화수소 분자, 즉 프로판 분자 및 통상적으로 C8 내지 C18 범위인 3개의 보다 무거운 탄화수소 분자로 감소한다.
따라서, 하나의 구체예에서, 본 발명의 지질 조성물 상에서 수행되는 하나 이상의 화학 반응(들)의 생성물은 ASTM D975 재생 디젤을 포함하는 알칸 혼합물이다. 미생물에 의한 탄화수소의 생성은 문헌[Metzger et al. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66: 486-496] 및 [A Look Back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species Program: Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann 및 Paul Roessler (1998)]에 의해 검토되었다.
디젤 연료의 증류 특성은 T10-T90(각각 10% 및 90%의 용적이 증류되는 온도)의 관점에서 기술한다. 재생 디젤은 프로토테카 모리포르미스 트리글리세라이드 오일로부터 생성되었고 실시예 9에 기술된다. 실시예 9에 생성된 물질의 T10-T90은 57.9℃였다. 본원에 개시된 오일의 수소 처리, 이성체화 및 기타 다른 공유 변형 방법, 및 본원에 개시된 증류 및 분별(예를 들어, 냉여과) 방법을 사용하여, 본원에 개시된 방법에 따라 생성된 트리글리세라이드 오일을 사용하여 기타 다른 T10-T90 범위가 예를 들어 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 60℃ 및 65℃인 재생 디젤 조성물을 생성할 수 있다.
실시예 9에서 생성된 물질의 T10은 242.1℃이다. 본원에 개시된 오일의 수소 처리, 이성체화 및 기타 다른 공유 변형 방법, 및 본원에 개시된 증류 및 분별(예를 들어, 냉여과) 방법을 사용하여 기타 다른 T10 값, 예를 들어 T10이 180 내지 295, 190 내지 270, 210 내지 250, 225 내지 245, 및 290 이상의 T10인 재생 디젤 조성물을 생성할 수 있다.
실시예 9에서 생성된 물질의 T90은 300℃이다. 본원에 개시된 오일의 수소 처리, 이성체화 및 기타 다른 공유 변형 방법, 및 본원에 개시된 증류 및 분별(예를 들어, 냉여과) 방법을 사용하여 기타 다른 T90 값, 예를 들어 T90이 280 내지 380, 290 내지 360, 300 내지 350, 310 내지 340, 및 290 이상인 재생 디젤 조성물을 생성할 수 있다.
실시예 9에서 생성된 물질의 FBP는 300℃이다. 본원에 개시된 오일의 수소 처리, 이성체화 및 기타 다른 공유 변형 방법, 및 본원에 개시된 증류 및 분별(예를 들어, 냉여과) 방법을 사용하여 기타 다른 FBP 값, 예를 들어 FBP가 290 내지 400, 300 내지 385, 310 내지 370, 315 내지 360, 및 300 이상인 재생 디젤 조성물을 생성할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공된 기타 다른 오일은 수소처리, 이성체화 및 기타 다른 공유 변형의 조합을 거칠 수 있고, (a) C8 내지 C14 4% 이상; (b) C8 0.3% 이상; (c) ClO 2% 이상; (d) C12 2% 이상; 및 (e) C8 내지 C14 30% 이상을 포함하는 지질 프로필을 갖는 오일을 포함한다.
통상적인 초저황 디젤은 2단계 공정에 의해 임의의 형태의 바이오매스로부터 생성될 수 있다. 먼저, 바이오매스를 수소 및 일산화탄소가 풍부한 가스 혼합물인 합성가스로 전환시킨다. 이어서, 합성가스를 촉매적으로 액체로 전환시킨다. 통상적으로, 액체의 생성은 피셔-트로프슈(Fischer-Tropsch)(FT) 합성을 사용하여 성취한다. 상기 기술은 석탄, 천연 가스 및 중유에 적용한다. 따라서, 재생 디젤을 생성하기 위한 방법의 또 다른 바람직한 구체예에서, 알칸을 생성하기 위한 액체 조성물의 처리는 액체 조성물의 간접적인 액화에 의해 수행한다.
본 발명은 또한 제트 연료를 제조하는 방법을 제공한다. 제트 연료는 담황색 색상으로 투명하다. 가장 일반적인 연료는 국제 표준 세트의 사양으로 제조되는 항공기 A-1로서 분류되는 무연/파라핀 오일계 연료이다. 제트 연료는 다수의 상이한, 가능하게는 천 개 이상의 많은 상이한 탄화수소의 혼합물이다. 이들의 크기 범위(분자량 또는 탄소수)는 생성물에 대한 요건, 예를 들어 동결점 또는 발연점에 의해 제한된다. 등유형(Kerosene-type) 항공기 연료(제트 A 및 제트 A-1을 포함함)는 약 8개 내지 16개 탄소수의 탄소수 분포를 갖는다. 와이드-컷 또는 나프타형 항공기 연료(제트 B를 포함함)는 통상적으로 약 5개 내지 15개 탄소의 탄소수 분포를 갖는다.
2개의 항공기(제트 A 및 제트 B)는 다수의 첨가제를 함유할 수 있다. 유용한 첨가제로서는 항산화제, 대전방지제, 부식 억제제, 및 연료 시스템 아이싱 억제제(FSII)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항산화제는 검화(gumming)를 방지하고 일반적으로 알킬화된 페놀, 예를 들어 AO-30, AO-31, 또는 AO-37을 기초로 한다. 대전방지제는 정전기를 소멸시켜 스파킹을 차단한다. 활성 성분으로서 디노닐나프틸설폰산(DINNSA)을 갖는 Stadis 450이 하나의 예이다. 부식 억제제, 예를 들어 DCI-4A는 대중 및 군사 연료용으로 사용되고, DCI-6A는 군사 연료용으로 사용된다. FSII 제제는, 예를 들어 Di-EGME를 포함한다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 제트 연료는 기존의 제트 연료와 조류 연료를 배합함으로써 생성된다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질은 공급원료로서 작용하여 제트 연료를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양태에서, 제트 연료를 제조하는 방법이 제공된다. 이와 함께 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질로부터 제트 연료를 제조하는 2가지 방법으로서 유동 촉매 크래킹(FCC); 및 수소첨가탈산소화(HDO)가 제공된다.
유동 촉매 크래킹(FCC)은 중질 원유 분획물 유래의 올레핀, 특히 프로필렌을 제조하기 위해 사용되는 하나의 방법이다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질은 올레핀으로 전환시킬 수 있다. 상기 방법은 FCC 영역을 통해 생성된 지질을 유동시키고 제트 연료로서 유용한 올레핀으로 구성된 생성물 스트림을 수집함을 포함한다. 생성된 지질은 크래킹 조건에서 크래킹 촉매와 접촉시켜 제트 연료로서 유용한 올레핀 및 탄화수소를 포함하는 생성물 스트림을 제공한다.
하나의 구체예에서, 제트 연료를 제조하는 방법은 (a) 본원에 개시된 방법을 사용하여 지질 함유 미생물을 배양하는 단계, (b) 지질 함유 미생물을 용해시켜 용해물을 생성하는 단계, (c) 용해물로부터 지질을 분리하는 단계, 및 (d) 지질 조성물을 처리함으로써 제트 연료를 생성하는 단계를 포함한다. 제트 연료를 제조하는 방법의 하나의 구체예에서, 상기 지질 조성물은 유체 촉매 크래킹 영역을 통류할 수 있고 이는 하나의 구체예에서 지질 조성물을 크래킹 조건에서 크래킹 촉매와 접촉시켜 C2 내지 C5 올레핀을 포함하는 생성물 스트림을 제공함을 포함할 수 있다.
상기 방법의 특정 구체예에서, 지질 조성물에 존재할 수 있는 임의의 오염물을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 유체 촉매 크래킹 영역을 통해 지질 조성물을 유동시키기 전에, 지질 조성물을 전처리한다. 전처리는 지질 조성물을 이온 교환 수지와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이온 교환 수지는 산성 이온 교환 수지, 예를 들어 Amberlyst™-15이고, 지질 조성물이 통류(상향 통류 또는 하향 통류)하는 반응기 내 상으로서 사용될 수 있다. 기타 다른 전처리는 지질 조성물의 산, 예를 들어 황산, 아세트산, 질산 또는 염산과의 접촉에 의한 약산 세척을 포함할 수 있다. 접촉은 일반적으로 주위 온도 및 대기압에서 희석 산 용액으로 수행된다.
임의로 전처리된 지질 조성물은 탄화수소 성분이 올레핀으로 크래킹되는 FCC 영역으로 유동한다. 촉매 크래킹은 반응 영역중의 지질 조성물을 미분된 미립자 물질로 구성된 촉매와 접촉시킴으로써 성취된다. 상기 반응은 수소크래킹이 아닌 촉매 크래킹이고, 부가되는 수소의 부재 또는 수소의 소비 하에서 수행된다. 크래킹 반응이 진행함으로써 상당한 양의 코크가 촉매상에 침적된다. 상기 촉매는 재생 영역에서 촉매 유래의 코크를 연소시킴으로써 고온에서 재생된다. 본원에서, “코크 촉매”로서 언급되는 코크 함유 촉매는 반응 영역으로부터 재생될 재생 영역으로 연속으로 수송되고, 재생 영역 유래의 필수적 코크 부재의 재생된 촉매에 의해 대체된다. 다양한 가스 스트림에 의한 촉매 입자의 유동화는 반응 영역과 재생 영역간에 촉매의 수송을 허용한다. 촉매의 유동화 스트림에서 본원에 기술된 지질 조성물의 탄화수소와 같은 탄화수소를 크래킹하고, 반응 영역 및 재생 영역간에 촉매를 수송하고 재생기 내 코크를 연소시키는 방법은 FCC 방법 기술 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다. C2 내지 C5 올레핀을 제조하기 위해 지질 조성물을 크래킹하는데 유용한 예시적인 FCC 적용 및 촉매는 이의 전체가 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제6,538,169호 및 제7,288,685호에 기술되어 있다.
적합한 FCC 촉매는 일반적으로 동일한 매트릭스에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 2개 이상의 성분을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 2개의 성분 둘 다는 전체 반응 용기를 거쳐 순환할 수 있다. 제1 성분은 일반적으로 유동화된 촉매 크래킹의 분야에 사용되는 임의의 널리 공지된 촉매, 예를 들어 활성 무정형 점토형 촉매 및/또는 고활성의 결정 분자체를 포함한다. 분자체 촉매는 원하는 생성물에 대한 이의 매우 개선된 선택성 때문에 무정형 촉매보다 바람직할 수 있다. 몇몇 바람직한 구체예에서, 제올라이트는 FCC 공정에서 분자체로서 사용할 수 있다. 바람직하게, 제1 촉매 성분은 실리카 또는 알루미나 및 카올린과 같은 불활성 충전제를 포함하는, 대형 공극 제올라이트(예를 들어 Y형 제올라이트), 활성 알루미나 물질, 결합제 물질을 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 지질 조성물의 크래킹은 FCC 영역의 라이저(riser) 섹션 또는 대안적으로 리프트 섹션에서 발생한다. 상기 지질 조성물은 노즐에 의해 라이저로 도입되어 지질 조성물의 신속한 증발을 유도한다. 촉매와 접촉시키기 전에, 상기 지질 조성물은 통상적으로 약 149℃ 내지 약 316℃(300℉ 내지 600℉)의 온도를 가질 것이다. 상기 촉매는 블렌딩 용기로부터 라이저로 유동하여 여기서 촉매는 약 2초 이하의 시간 동안 지질 조성물과 접촉한다.
배합된 촉매 및 반응된 지질 조성물 증기는 이어서 출구를 통해 라이저의 최상부로부터 배출되고, 올레핀, 및 상당한 양의 코크로 덮여지고 일반적으로 “코크된 촉매”로 언급되는 촉매 입자의 수집물을 포함하는 크래킹된 생성물 증기 스트림으로 분리된다. 원하는 생성물이 바람직하지 못한 기타 다른 생성물로 추가로 전환되는 것을 촉진시킬 수 있는, 지질 조성물과 촉매의 접촉시간을 최소화하기 위해, 스월 암 배열 장치(swirl arm arrangement)와 같은 임의의 배열된 분리기를 사용하여 생성물 스트림으로부터 신속하게 코크된 촉매를 제거할 수 있다. 분리기, 예를 들어 스월 암 분리기는 챔버의 하한부에 위치한 스트립핑 영역(stripping zone)과 함께 챔버의 챔버의 상한부에 위치한다. 스월 암 배열 장치에 의해 분리된 촉매는 스트립핑 영역으로 떨어진다. 가벼운 올레핀 및 몇몇 촉매를 포함하는 크래킹된 탄화수소를 포함하는 크래킹된 생성물 증기 스트림은 사이클론과 소통하는 도관을 통해 챔버로부터 배출된다. 상기 사이클론은 생성물 증기 스트림으로부터 잔류 촉매 입자를 제거하여 입자 농도를 매우 낮은 수준으로 감소시킨다. 이어서 상기 생성물 증기는 분리 용기의 최상부로부터 배출된다. 사이클론에 의해 분리된 촉매는 분리 용기에 이어서 스트립팅 영역으로 복귀한다. 스트립핑 영역은 증기와의 향류 접촉에 의해 촉매 표면으로터 흡착된 탄화수소를 제거한다.
낮은 탄화수소 분압은 가벼운 올레핀이 우선적으로 생성되도록 작용한다. 따라서, 라이저 압력은 약 172kPa 내지 241kPa(25psia 내지 35psia)로 설정되며, 이 때 탄화수소 분압은 약 35kPa 내지 172kPa(5psia 내지 25psia)이고 바람직한 탄화수소 분압은 약 69kPa 내지 138kPa(10psia 내지 20psia)이다. 탄화수소에 대한 상대적으로 낮은 분압은 희석제가 지질 조성물의 10중량% 내지 55중량% 및 바람직하게는 지질 조성물의 약 15중량% 정도인 희석제로서 증기를 사용함으로써 성취된다. 기타 다른 희석제, 예를 들어 건조 가스를 사용하여 등가의 탄화수소 분압에 도달할 수 있다.
라이저 출구에서 크래킹된 스트림의 온도는 약 510℃ 내지 621℃ (950℉ 내지 1150℉)이다. 그러나, 566℃(1050℉) 초과의 라이저 출구 온도는 보다 많은 건조 가스 및 보다 많은 올레핀을 생성시킨다. 반면에, 566℃(1050℉) 미만의 라이저 출구 온도는 에틸렌 및 프로필렌을 적게 생성시킨다. 따라서, 약 566℃ 내지 약 63O℃의 바람직한 온도, 약 138kPa 내지 약 240kPa(20psia 내지 35psia)의 바람직한 압력에서 FCC 공정을 수행하는 것이 바람직하다. 상기 공정의 다른 조건은 약 5 내지 약 20 및 바람직하게는 약 10 내지 약 15로 다양할 수 있는 지질 조성물에 대한 촉매 비율이다.
제트 연료를 생성하는 방법의 하나의 구체예에서, 상기 지질 조성물은 FCC 반응기의 리프트 섹션으로 도입된다. 리프트 섹션에서 온도는 매우 고온이고 약 700℃(1292℉) 내지 약 760℃(1400℉)의 범위이며, 지질 조성물에 대한 촉매의 비율은 약 100 내지 약 150일 것이다. 이것은 지질 조성물의 리프트 섹션으로의 도입이 상당양의 프로필렌 및 에틸렌을 생성시킬 것으로 예상된다.
본원에 기술된 바와 같이 생성된 지질 조성물 또는 지질을 사용하여 제트 연료를 생성시키는 방법의 또 다른 구체예에서, 지질 조성물 또는 지질의 구조는 수소탈산소화(HDO)로서 언급되는 공정에 의해 파괴된다. HDO는 수소에 의한 산소의 제거를 의미하는데, 즉 산소는 물질의 구조를 파괴시키면서 제거된다. 올레핀 이중 결합을 수소화시키고 임의의 황 및 질소 화합물을 제거한다. 황 제거는 소위 수소탈황화(HDS)로 불린다. 원료(지질 조성물 또는 지질)의 전처리 및 순도는 촉매의 작용 수명에 기여한다.
일반적으로, HDO/HDS 단계에서, 수소는 공급 원료(지질 조성물 또는 지질)와 혼합하고 이어서 상기 혼합물을 단일상 또는 2개상 공급 원료로서 병류로서 촉매 상에 통과시킨다. HDO/HDS 단계 후, 생성물 분획을 분리하고 별도의 이성체화 반응기에 통과시킨다. 생물학적 출발 물질용 이성체화 반응기는 병류 반응기로서 문헌(FI 100 248)에 기술되어 있다.
탄화수소 공급물, 예를 들어 본원에서의 지질 조성물 또는 지질을 수소화시킴에 의한 연료의 제조 방법은 또한 지질 조성물 또는 지질을 병류로서 제1 수소화 영역을 통해 수소 가스와 함께 통과시킴으로써 수행될 수 있고, 이후 탄화수소 유출물은 수소 가스를 탄화수소 유출물에 대하여 향류로서 제2 수소화 영역에 통과시킴으로써 제2 수소화 영역에서 추가로 수소화시킨다. 지질 조성물을 크래킹하여 C2 내지 C5 올레핀을 제조하는데 유용한 예시적인 HDO 적용 및 촉매는 전체가 참조로 포함되어 있는 미국 특허 제7,232,935호에 기술되어 있다.
통상적으로, 수소탈산소화 단계에서, 본원에서의 지질 조성물 또는 지질과 같은 생물학적 성분의 구조는 산소, 질소, 인 및 황 화합물로 분해되고 가스로서의 가벼운 탄화수소는 제거되며, 올레핀 결합은 수소화된다. 상기 방법의 제2 단계에서, 즉 소위 이성체화 단계에서, 이성체화는 낮은 온도에서 탄화수소 사슬을 분지화하고 파라핀의 수행능을 개선시키기 위하여 수행된다.
제1 단계, 즉 크래킹 공정의 HDO 단계에서, 수소 가스, 및 수소화될 본원의 지질 조성물 또는 지질은 HDO 촉매 상 시스템에 병류로서 또는 향류로서 통과시키고, 상기 촉매 상 시스템은 하나 이상의 촉매 상(들), 바람직하게 1개 내지 3개의 촉매 상을 포함한다. HDO 단계는 통상적으로 병류 방식으로 작동한다. 2개 이상의 촉매 상을 포함하는 HDO 촉매 상 시스템의 경우에, 상기 상중 하나 이상은 향류 원리를 사용하여 작동할 수 있다. HDO 단계에서, 압력은 20바 내지 150바, 바람직하게는 50바 내지 100바로 다양하고, 온도는 200℃ 내지 500℃, 바람직하게는 300℃ 내지 400℃의 범위로 다양하다. HDO 단계에서, 원소주기율표의 VII 족 및/또는 VIB족 금속을 함유하는 공지된 수소화 촉매가 사용될 수 있다. 바람직하게, 수소화 촉매는 지지된 Pd, Pt, Ni, NiMo 또는 CoMo 촉매이고, 상기 지지체는 알루미나 및/또는 실리카이다. 통상적으로, NiMo/Al2O3 및 CoMo/Al2O3 촉매가 사용된다.
HDO 단계 전에, 본원에서 지질 조성물 또는 지질은 임의로 보다 온화한 조건 하에서 예비수소화로 처리하여 이중 결합의 부반응을 회피할 수 있다. 상기 예비수소화는 예비수소화 촉매의 존재 하에 50℃ 내지 400℃의 온도 및 1바 내지 200바의 수소 압력, 바람직하게는 150℃ 내지 250℃의 온도 및 10바 내지 100바의 수소 압력에서 수행한다. 상기 촉매는 원소주기율표의 VIII족 및/또는 VIB족 유래의 금속을 함유할 수 있다. 바람직하게, 예비수소화 촉매는 지지된 Pd, Pt, Ni, NiMo 또는 CoMo 촉매이고, 상기 지지체는 알루미나 및/또는 실리카이다.
수소를 함유하는 HDO 단계 유래의 가스 스트림을 냉각시킨 후, 일산화탄소, 이산화탄소, 질소, 인 및 황 화합물, 가벼운 가스 탄화수소 및 기타 다른 불순물을 이로부터 제거한다. 압축시킨 후 정제된 수소 또는 재순환된 수소를 제1 촉매 상으로 및/또는 촉매 상 사이로 복귀시켜 인출된 가스 스트림을 구성하도록 한다. 물은 응축 액체로부터 제거한다. 상기 액체는 제1 촉매 상 또는 촉매 상 사이로 통과시킨다.
HDO 단계 후, 생성물은 이성체화 단계를 거친다. 탄화수소를 이성체화 촉매와 접촉시키기 전에 불순물을 가능한한 완전히 제거하는 것이 공정을 위해 필요하다. 상기 이성체화 단계는 임의의 스트리핑 단계를 포함하고, 이때 HDO 단계 유래의 반응 생성물은 수증기 또는 가벼운 탄화수소, 질소 또는 수소와 같은 적합한 가스를 스트리핑시킴으로써 정제될 수 있다. 임의의 스트리핑 단계는 이성체화 촉매의 상부 유니트에서 향류 방식(여기서, 가스 및 액체는 서로 접촉함)으로 수행하거나, 향류 원리를 사용하는 별도의 스트리핑 유니트에서 실제 이성체화 반응기 전에 수행한다.
스트리핑 단계 후, 수소 가스 및 본원에서의 수소화된 지질 조성물 또는 지질, 및 임의로 n-파라핀 혼합물을 하나 또는 여러 가지의 촉매 상(들)을 포함하는 반응성 이성체화 유니트에 통과시킨다. 이성체화 단계의 촉매 상은 병류 또는 향류 방식으로 작동할 수 있다.
향류 원리가 이성체화 단계에 적용되는 것이 상기 공정을 위해 중요하다. 이성화체 단계에서, 이것은 임의의 스트리핑 단계 또는 이성체화 반응 단계 중 하나 또는 둘 다를 향류 방식으로 진행함에 의해 수행한다. 이성체화 단계에서, 압력은 20바 내지 150바, 바람직하게는 20바 내지 100바의 범위로 다양하고, 온도는 200℃ 내지 500℃, 바람직하게는 300℃ 내지 400℃이다. 이성체화 단계에서, 당업계에 공지된 이성체화 촉매가 사용될 수 있다. 적합한 이성체화 촉매는 분자체 및/또는 VII족 금속 및/또는 담체를 함유한다. 바람직하게, 이성체화 촉매는 SAPO-11 또는 SAPO41 또는 ZSM-22 또는 ZSM-23 또는 페리어라이트(ferrierite) 및 Pt, Pd 또는 Ni 및 Al2O3 또는 SiO2를 함유한다. 통상적인 이성체화 촉매는, 예를 들어 Pt/SAPO-11/Al2O3, Pt/ZSM-22/Al2O3, Pt/ZSM-23/Al2O3 및 Pt/SAPO-11/SiO2이다. 이성체화 단계 및 HDO 단계는 동일한 압력 용기 또는 별도의 압력 용기에서 수행할 수 있다. 임의의 예비수소화는 별도의 압력 용기 또는 HDO 및 이성체화 단계와 동일한 압력 용기에서 수행할 수 있다.
따라서, 하나의 구체예에서, 하나 이상의 화학 반응 생성물은 HRJ-5를 포함하는 알칸 혼합물이다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 화학적 반응 생성물은 ASTM D1655 제트 연료를 포함하는 알칸 혼합물이다. 몇몇 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 사양을 준수하는 조성물은 황 함량이 10ppm 미만이다. 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 사양을 준수하는 조성물은 205℃ 미만의 증류 곡선의 T10값을 갖는다. 또 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 사양을 준수하는 조성물은 300℃ 미만의 최종 비점(FBP)을 갖는다. 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 사양을 준수하는 조성물은 38℃ 이상의 인화점을 갖는다. 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 사양을 준수하는 조성물은 밀도가 775K/M3 내지 840K/M3이다. 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 사양을 준수하는 조성물은 동결점이 -47℃ 미만이다. 다른 구체예에서, ASTM 제트 연료의 사양을 준수하는 조성물은 순 연소열(Heat of Combustion)이 42.8MJ/K 이상이다. 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 사양을 준수하는 조성물은 수소 함량이 13.4질량% 이상이다. 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 사양을 준수하는 조성물은 Hg의 3mm 미만인, 260℃에서의 정량적 중량 JFTOT에 의하여 시험된 바와 같이, 열 안정성을 갖는다. 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 사양을 준수하는 조성물은 7mg/dl 미만인 실제 고무를 갖는다.
따라서, 본 발명은 미세 조류 지질의 화학적 변형으로 다양한 산업적 및 기타 다른 적용 분야에 유용한 생성물을 생성하는 다양한 방법을 개시한다. 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 오일을 변형시키는 방법의 예로서는 오일 가수 분해, 오일의 수소화처리 및 오일의 에스테르화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 미세 조류 지질의 기타 다른 화학 변형으로서는 에폭시화, 산화, 가수 분해, 황산화, 설폰화, 에톡시화, 프로폭시화, 아미드화 및 비누화를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 미세 조류 오일의 변형은 기본 함유 화학 제품을 생성하고 이는 추가로 원하는 기능을 위해 선택된 유도체 함유 화학 제품으로 변형시킬 수 있다. 연료 생성 공정과 관련하여 전술된 것과 유사한 방식으로, 이들 화학적 변형은 또한 본원에 기술된 미생물 배양물로부터 생성된 오일 상에서 수행할 수 있다. 염기성 함유 화학 제품의 예로서는 비누, 지방산, 지방 에스테르, 지방 알코올, 지방 질소 화합물, 지방산 메틸 에스테르 및 글리세롤을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 유도성 함유 화학 제품의 예로서는 지방 니트릴, 에스테르, 다이머산, 쿼트(quat), 계면 활성제, 지방 알카놀아미드, 지방 알코올 설페이트, 수지, 유화제, 지방 알코올, 올레핀, 시추 이수, 폴리올, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트, 고무, 양초, 화장품, 금속 비누, 비누, 알파-설폰화 메틸 에스테르, 지방 알코올 설페이트, 지방 알코올 에톡실레이트, 지방 알코올 에테르 설페이트, 이미다졸린, 계면 활성제, 세제, 에스테르, 쿼트, 오존 분해 생성물, 지방 아민, 지방 알카놀아미드, 에톡시설페이트, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드(예를 들어, 중간쇄 트리글리세라이드), 윤활제, 유압유, 그리스, 유전성 유체, 이형제, 금속 가공 유체, 열 전달 유체, 기타 다른 기능성 유체, 산업용 화학 물질(예를 들어, 클리너, 직물 가공 보조제, 가소제, 안정화제, 첨가제), 표면 코팅제, 페인트 및 래커, 전기 와이어 절연제 및 고급 알칸을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 글리세로지질 유래의 지방산 성분의 가수 분해는 기타 다른 유용한 화학 물질을 생성하도록 유도체화될 수 있는 유리 지방산을 생성시킨다. 가수 분해는 산 또는 염기일 수 있는 촉매 및 물의 존재 하에 일어난다. 유리된 지방산을 유도체화하여 미국 특허 제5,304,664호(고도로 황화된 지방산); 제7,262,158호(세정 조성물); 제7,115,173호(직물 연화 조성물); 제6,342,208호(피부 처리용 에멀젼); 제7,264,886호(방수 조성물); 제6,924,333호 (페인트 첨가제); 제6,596,768호(지질 풍부 반추동물 공급원료); 및 제6,380,410호(세제 및 세정제용 계면활성제)에 보고된 바와 같은 다양한 생성물을 수득할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서 가수 분해와 관련하여, 트리글리세라이드 오일은 임의로 먼저 물 또는 수산화나트륨과 같은 액체 매질 중에서 가수 분해하여 글리세롤 및 비누를 수득한다. 다양한 적합한 트리글리세라이드 가수 분해 방법이 있으며, 여기에는 비누화, 산 가수 분해, 알칼리성 가수 분해, 효소 가수 분해(본원에서 분리(splitting)로서 언급됨), 및 고온 압축수를 사용한 가수 분해가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 당업자는 트리글리세라이드 오일이 함유 화학 제품을 생성하기 위해 가수 분해될 필요가 없고, 오히려 상기 오일이 기타 다른 공지된 방법에 의해 원하는 함유 화학 제품으로 직접 전환될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 트리글리세라이드 오일은 에스테르화를 통해 메틸 에스테르 지방산으로 직접 전환될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 오일의 촉매 가수 분해는 오일을 글리세롤 및 지방산으로 분리시킴으로써 일어난다. 상기 논의된 바와 같이, 지방산은 이어서 여러 가지 기타 다른 변형을 통해 수득된 유도체 함유 화학 제품으로 추가로 가공될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 지방산은 아민화 반응을 거쳐서 지방 질소 화합물을 생성할 수 있다. 다른 구체예에서, 지방산은 일염기성 산 및 이염기성 산을 생성하도록 오존용해를 거칠 수 있다.
다른 구체예에서, 가수 분해는 본원에서 생성된 오일 분리를 통해 일어나서 함유 화학 제품을 생성할 수 있다. 본 발명의 몇몇 바람직한 구체예에서, 트리글리세라이드 오일은 기타 다른 공정을 수행하기 전에 분리될 수 있다. 당업자는 많은 적합한 트리글리세라이드 분리 방법, 예를 들어 효소 분리 및 압력 분리(이에 제한되지 않음)가 있음을 인식할 것이다.
일반적으로, 오일의 효소 분리 방법은 물/오일 혼합물에 대해 작용하는 생촉매로서 효소인 리파제를 사용한다. 효소 분리는 이어서 오일 또는 지방을 각각 글리세롤 및 유리 지방산으로 분리한다. 이어서 상기 글리세롤은 물상으로 이동하는 반면, 상기 유기상에는 유리 지방산이 풍부해진다.
효소 분리 반응은 일반적으로 유기 및 수성 상간의 상경계에서 일어나며, 여기서 효소는 단지 상경계에 존재한다. 이어서 상경계와 만나는 트리글리세라이드는 분리 반응에 기여하거나 이에 관여한다. 반응이 진행됨에 따라, 유리 지방산과는 대조적으로 글리세라이드로서 여전히 화학적으로 결합되어 있는 지방산의 작업 밀도 또는 농도는 상경계에서 감소하여 반응은 느려진다. 특정 구체예에서, 효소 분리는 실온에서 일어날 수 있다. 당업자는 오일을 원하는 지방산으로 분리시키는데 적합한 조건을 알 것이다.
예를 들어, 반응 속도는 계면 경계 표면을 증가시킴으로써 가속화될 수 있다. 일단 반응이 완료되면, 유리 지방산을 이어서 효소로부터 유리된 유기상으로부터 분리하고, 글리세라이드로서 여전히 화학적으로 결합되어 있는 지방산을 함유하는 잔류물은 역 공급되거나 재순환되고 새로운 오일 또는 지방과 혼합되어 분리를 거친다. 이어서 상기 방식으로, 재순환된 글리세라이드는 추가의 효소 분리를 거친다. 몇몇 구체예에서, 유리 지방산은 상기 방식으로 부분적으로 분리된 오일 또는 지방으로부터 추출된다. 상기 방식으로, 화학적으로 결합된 지방산(트리글리세라이드)이 분리 공정으로 복귀하거나 역 공급되는 경우, 효소 소비는 급격히 감소할 수 있다.
분리 정도는 측정된 산 값을, 소정의 오일 또는 지방에 대해 계산될 수 있는 이론적으로 가능한 산 값으로 나눈 비율로서 결정한다. 바람직하게, 산 값은 표준 일반 방법에 따른 적정을 사용하여 측정한다. 대안적으로, 수성 글리세롤 상의 밀도는 분리 정도에 대한 척도로서 취할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같은 분리 방법은 또한 생성된 오일의 알칼리 정제 공정 유래의 소위 비누-스톡에 함유된 모노글리세라이드, 디글리세라이드 및 트리글리세라이드에 적합하다. 상기 방식으로, 비누 스톡은 사전 비누화 없이 중성 오일의 지방산으로 정량적으로 전환될 수 있다. 상기 목적을 위해, 비누에 화학적으로 결합된 지방산을 바람직하게는 분리 전에 산의 부가를 통해 방출시킨다. 특정 구체예에서, 분리 공정을 위해 물 및 효소에 추가로 완충액이 사용된다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 생성된 오일은 또한 가수 분해 방법으로서 비누화를 거칠 수 있다. 동물성 및 식물성 오일은 통상적으로 3가 알코올인 글리세롤과 지방산의 에스테르인 트리아실글리세롤(TAG)로 이루어진다. 알칼리성 가수 분해 반응에서, TAG내 글리세롤이 제거되어 나트륨 또는 칼륨과 같은 알칼리 금속 양이온과 연합할 수 있는 3개의 카복실산 음이온을 남겨 두어 지방산 염을 생성한다. 상기 도식에서, 카복실산 성분들은 글리세롤부로부터 절단되고 하이드록실기로 대체된다. 상기 반응에 사용되는 염기(예를 들어, KOH)의 양은 원하는 비누화 정도에 의해 결정된다. 예를 들어, 상기 목적이 본래 TAG 조성물 중에 존재하는 오일의 일부를 포함하는 비누 생성물을 제조하기 위한 것인 경우, 모든 TAG를 지방산 염으로 전환시키기에 불충한 양의 염기가 반응 혼합물로 도입된다. 통상적으로, 상기 반응은 수용액 중에서 수행하여 서서히 진행시키지만 가열에 의해 촉진될 수 있다. 지방산 염의 침전은 수용성 알칼리 금속 할라이드(예를 들어, NaCl 또는 KCl)와 같은 염을 반응 혼합물에 부가하여 촉진될 수 있다. 바람직하게, 상기 염기는 알칼리 금속 수산화물(예를 들어, NaOH 또는 KOH)이다. 대안적으로, 예를 들어 트리에탄올아민 및 아미노메틸프로판올을 포함하는 알칸올아민과 같은 기타 다른 염기를 상기 반응 도식에 사용할 수 있다. 몇몇 경우에, 이들 대안이 투명한 비누 생성물을 제조하는데 바람직할 수 있다. 하나의 구체예에서, 비누화를 거친 지질 조성물은 본원에 기술된 바와 같이 제조된 우지 모의체(즉 우지와 유사한 지질 조성물), 또는 다른 트리글리세라이드 오일과 우지 모의체의 배합물이다.
몇몇 방법에서, 화학적 변형의 제1 단계는 수소 및 촉매의 존재 하에서 승온에서 이중 결합을 포화시키기 위한 수소화처리에 이어서 탈산소화일 수 있다. 다른 방법에서, 수소화 및 탈산소화는 동일한 반응 중에서 일어날 수 있다. 또 다른 방법에서, 탈산소화는 수소화전에 일어난다. 이어서 이성체화는 또한 수소 및 촉매의 존재 하에서 임의로 수행할 수 있다. 최종적으로, 가스 및 나프타 성분은 원한다면 제거할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,475,160호(트리글리세라이드의 수소화); 제5,091,116호(탈산소화, 수소화 및 가스 제거); 제6,391,815호(수소화); 및 제5,888,947호(이성체화)를 참조한다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 트리글리세라이드 오일은 부분적으로 또는 완전히 탈산소화된다. 탈산소화 반응은 지방산, 지방 알코올, 폴리올, 케톤 및 알데하이드(이에 제한되지 않음)를 포함하는 원하는 생성물을 형성시킨다. 일반적으로, 임의의 특정 이론에 구애되지 않고, 탈산소화 반응은 지방산 또는 지방산 에스테르로부터 산소를 적어도 부분적으로 제거하여 추가의 가공에 의해 원하는 화학 물질로 용이하게 전환될 수 있는 지방 알코올과 같은 반응 생성물을 생성시키는 반응으로서, 제한 없이 수소용해, 수소화, 연속 수소화-수소용해, 연속 수소용해-수소화 및 조합된 수소화-수소용해 반응을 포함하는 다양하고 상이한 반응 경로의 조합을 포함한다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 지방 알코올은 FCC 반응을 통해 올레핀으로 또는 응축 반응을 통해 고급 알칸으로 전환될 수 있다.
하나의 상기 화학적 변형은 글리세로지질 또는 유리 지방산의 지방산 성분에서 이중 결합으로 수소를 첨가하는 수소화이다. 수소화 과정으로 액체 오일을 특정 응용에 보다 적합할 수 있는 반고체 또는 고체 지방으로 전환하게 할 수 있다.
본원에 기술된 방법에 의해 생성된 오일의 수소화는 미국 특허 제7,288,278호(식품 첨가제 또는 의약); 제5,346,724호(윤활 생성물); 제5,475,160호(지방 알코올); 제5,091,116호(식용 오일); 제6,808,737호(마가린 및 스프레드용 구조적 지방); 제5,298,637호(감소된 칼로리 지방 대용물); 제6,391,815호(수소화 촉매 및 황 흡착제); 제5,233,099호 및 제5,233,100호(지방 알코올); 제4,584,139호(수소화 촉매); 제6,057,375호(소포제); 및 제7,118,773호(식용 에멀젼 스프레드)에 보고된 바와 같이 본원에 제공된 방법 및/또는 재료 중 하나 이상과 연계하여 수행할 수 있다.
당업자는 탄수화물을 수소화시키기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 하나의 적합한 방법은 수소화 반응기에서 수소화된 생성물을 형성하기 위해 충분한 조건 하에서 적합한 가스 및 촉매와 혼합된 수소, 또는 수소와 탄수화물을 접촉시키는 것을 포함한다. 수소화 촉매는 일반적으로 단독으로, 또는 W, Mo, Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, B, P, Bi, 및 이의 합금 또는 조합과 같은 프로모터와 함께 Cu, Re, Ni, Fe, Co, Ru, Pd, Rh, Pt, Os, Ir, 및 이의 합금 또는 조합을 포함할 수 있다. 기타 다른 효과적인 수소화 촉매 물질은 지지된 니켈 또는 레늄으로 변형된 루테늄을 포함한다. 하나의 구체예에서, 수소화 촉매는 또한 원하는 촉매의 기능성에 따라, 지지체 중 임의의 하나를 포함한다. 수소화 촉매는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 수소화 촉매는 지지된 VIII족 금속 촉매 및 금속 스폰지 물질(예를 들어, 스폰지 니켈 촉매)을 포함한다. 라니 니켈은 본 발명에 사용하기에 적합한 활성화된 스폰지 니켈 촉매의 예를 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 수소화 반응은 니켈-레늄 촉매 또는 텅스텐 변형 니켈 촉매를 포함하는 촉매를 사용하여 수행한다. 본 발명의 수소화 반응을 위해 적합한 촉매의 예로서는 탄소 지지된 니켈-레늄 촉매가 있다.
하나의 구체예에서, 적합한 라니 니켈 촉매는, 예를 들어 약 25중량%의 수산화나트륨을 함유하는 알칼리 수용액으로 대략 균등 중량의 니켈 및 알루미늄의 합금을 처리함으로써 제조할 수 있다. 상기 알루미늄은 선택적으로 알칼리 수용액에 의해 용해되어 알루미늄이 최소량인 대부분 니켈을 포함하는 스폰지형 물질을 생성한다. 초기 합금은 약 1중량% 내지 2중량%가 형성된 스폰지 니켈 촉매 중에 잔류하도록 하는 양으로 프로모터 금속(즉, 몰리브덴 또는 크롬)을 포함한다. 다른 구체예에서, 수소화 촉매는 물 중에서 루테늄(III) 니트로실질산염, 루테늄(III) 클로라이드의 용액을 사용하여 적합한 지지체 물질을 침지시키기 위해 제조한다. 이어서 상기 용액을 건조시켜 수분 함량이 약 1중량% 미만인 고체를 형성한다. 상기 고체는 이어서 4시간 동안 회전볼 로내 300℃(하소되지 않음) 또는 400℃(하소됨)에서 수소 스트림 중에 대기압에서 환원될 수 있다. 촉매를 냉각시키고 질소로 촉매가 불활성이도록 한 후, 질소 중에 5용적%의 산소를 2시간 동안 촉매 상에 통과시킨다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 촉매는 촉매 지지체를 포함한다. 상기 촉매 지지체는 촉매를 안정화시키고 지지한다. 사용되는 촉매 지지체의 유형은 선택된 촉매 및 반응 조건에 좌우된다. 본 발명에 적합한 지지체로서는 탄소, 실리카, 실리카-알루미나, 지르코니아, 티타니아, 세리아, 바나디아, 질화물, 질화붕소, 헤테로다중산, 하이드록시애퍼타이트, 산화아연, 크로미아, 제올라이트, 탄소 나노튜브, 탄소 풀러렌, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용되는 촉매는 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 방법은 초기 습윤화, 증발 침지, 화학적 증착, 세척-피복, 마그네트론 스퍼터링 기술 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
수소화 반응을 수행하기 위한 조건은 출발 물질 및 원하는 생성물의 유형에 따라 다양할 것이다. 본 개시 내용의 이득과 함께 당업자는 적절한 반응 조건을 인지할 것이다. 일반적으로, 수소화 반응은 80℃ 내지 250℃, 바람직하게는 90℃ 내지 200℃, 가장 바람직하게는 100℃ 내지 150℃의 온도에서 수행한다. 몇몇 구체예에서, 수소화 반응은 500KPa 내지 14000Kpa의 압력에서 수행한다.
본 발명의 수소용해 반응에 사용되는 수소는 외부 소수, 재순환된 수소, 동일계 생성 수소 및 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 “외부 수소”는 바이오매스 반응 자체 기원이 아니며, 오히려 다른 공급원으로부터 시스템에 첨가되는 수소를 언급한다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 출발 탄수화물을, 원하는 고급 탄화수소로 보다 용이하게 전환될 것인 소분자로 전환시키는 것이 바람직하다. 상기 전환을 위해 적합한 하나의 방법은 수소용해 반응을 통한 것이다. 탄수화물의 수소용해를 수행하기 위한 다양한 방법이 공지되어 있다. 하나의 적합한 방법은 소분자 또는 폴리올을 포함하는 반응 생성물을 형성하기에 충분한 조건 하에서 수소용해 반응기 내에서 적합한 가스 및 수소용해 촉매와 혼합된 수소, 또는 수소와 탄수화물을 접촉시키는 것을 포함한다. 본원에서, 용어 “소분자 또는 폴리올”은 출발 탄수화물보다 더 적은 양의 탄소 원자 또는 산소 원자를 포함할 수 있는, 소분자량을 갖는 임의의 분자를 포함한다. 하나의 구체예에서, 반응 생성물은 폴리올 및 알코올을 포함하는 보다 작은 분자를 포함한다. 당업자는 수소용해 반응을 수행하기 위한 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
몇몇 구체예에서, 5개 및/또는 6개 탄소 당 또는 당 알코올은 수소용해 촉매를 사용하여 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 및 글리세롤로 전환시킬 수 있다. 수소용해 촉매는 단독으로 또는 Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, Bi, B, O, 및 이의 합금 또는 임의의 조합과 같은 프로모터와 함께 Cr, Mo, W, Re, Mn, Cu, Cd, Fe, Co, Ni, Pt, Pd, Rh, Ru, Ir, Os, 및 이의 합금 또는 조합을 포함할 수 있다. 수소용해 촉매는 또한 전이 금속(예를 들어, 크롬, 몰리브덴, 텅스텐, 레늄, 망간, 구리, 카드뮴) 또는 VIII족 금속(예를 들어, 철, 코발트, 니켈, 백금, 팔라듐, 로듐, 루테늄, 이리듐 및 오스뮴)을 함유하는 탄소성 피로중합체 촉매를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 수소용해 촉매는 알칼리성 토금속 산화물과 조합되거나 촉매 활성 지지체에 부착된 임의의 상기 금속을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 수소용해 반응에 기술된 촉매는 수소화 반응을 위해 전술된 바와 같은 촉매 지지체를 포함할 수 있다.
수소용해 반응을 수행하기 위한 조건은 출발 물질 및 원하는 생성물의 유형에 따라 다양할 것이다. 당업자는 본 개시 내용의 이득과 함께 반응을 수행하기 위해 사용하는 적절한 조건을 인지할 것이다. 일반적으로, 이들 수소용해 반응은 110℃ 내지 300℃, 바람직하게는 170℃ 내지 220℃, 가장 바람직하게는 200℃ 내지 225℃의 온도에서 수행한다. 몇몇 구체예에서, 수소용해 반응은 염기성 조건 하, 바람직하게는 pH 8 내지 13, 훨씬 더 바람직하게는 pH 10 내지 12에서 수행한다. 몇몇 구체예에서, 수소용해 반응은 60KPa 내지 16500Kpa의 범위, 바람직하게는 1700KPa 내지 14000KPa의 범위, 훨씬 더 바람직하게는 4800KPa 내지 11000KPa의 압력에서 수행한다.
본 발명의 수소용해 반응에 사용되는 수소는 외부 수소, 재순환된 수소, 동일계 생성된 수소 및 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 상기 논의된 반응 생성물은 응축 반응기에서 응축 반응을 통해 고급 탄화수소로 전환시킬 수 있다. 상기 구체예에서, 반응 생성물의 응축은 고급 탄화수소를 형성할 수 있는 촉매의 존재 하에서 일어난다. 이론에 의해 제한되고자 하는 것은 아니지만, 고급 탄화수소의 생산은 탄소-탄소 또는 탄소-산소 결합의 형성을 포함하는 단계적 부가 반응을 통해 진행하는 것으로 여겨진다. 생성된 반응 생성물은 하기에서 보다 상세하게 기술된 바와 같이 상기 부를 함유하는 임의의 수의 화합물을 포함한다.
특정 구체예에서, 적합한 응축 촉매로서는 산 촉매, 염기 촉매 또는 산/염기 촉매를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 “산/염기 촉매”는 산 및 염기 기능 둘 다를 갖는 촉매를 나타낸다. 몇몇 구체예에서, 상기 응축 촉매는 제한없이, 제올라이트, 카바이드, 질화물, 지르코니아, 알루미나, 실리카, 알루미노실리케이트, 포스페이트, 산화티탄, 산화아연, 산화바나듐, 산화란탄, 산화이트륨, 산화스캔듐, 산화마그네슘, 산화세륨, 산화바륨, 산화칼슘, 수산화물, 헤테로다중산, 무기산, 산 변형된 수지, 염기 변형된 수지, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 응축 촉매는 또한 변형제를 포함할 수 있다. 적합한 변형제는 La, Y, Sc, P, B, Bi, Li, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 응축 촉매는 또한 금속을 포함할 수 있다. 적합한 금속은 Cu, Ag, Au, Pt, Ni, Fe, Co, Ru, Zn, Cd, Ga, In, Rh, Pd, Ir, Re, Mn, Cr, Mo, W, Sn, Os, 이들의 합금 및 임의의 조합을 포함한다.
특정 구체예에서, 응축 반응에 기술된 촉매는 수소화 반응을 위해 전술된 바와 같은 촉매 지지체를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 응축 촉매는 자가 지지형이다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 “자가 지지형”은 촉매가 지지체로서 작용하기 위해 다른 물질을 필요로 하지 않음을 의미한다. 다른 구체예에서, 상기 응축 촉매는 촉매를 현탁시키기에 적합한 별도의 지지체와 연계하여 사용된다. 하나의 구체예에서, 응축 촉매 지지체는 실리카이다.
응축 반응이 일어나는 조건은 출발 물질 및 원하는 생성물의 유형에 따라 다양할 것이다. 당업자는 본 개시 내용의 이득과 함께 반응을 수행하는데 사용하는 적절한 조건을 인지할 것이다. 몇몇 구체예에서, 응축 반응은 제안된 반응에 대한 열역학을 유리하게 하는 온도에서 수행한다. 응축 반응을 위한 온도는 특정 출발 폴리올 또는 알코올에 따라 다양할 것이다. 몇몇 구체예에서, 응축 반응을 위한 온도는 80℃ 내지 500℃, 바람직하게는 125℃ 내지 450℃, 가장 바람직하게는 125℃ 내지 250℃의 범위이다. 몇몇 구체예에서, 응축 반응은 0Kpa 내지 9000KPa 범위, 바람직하게는 0KPa 내지 7000KPa 범위, 훨씬 더 바람직하게는 0KPa 내지 5000KPa 범위의 압력에서 수행한다.
본 발명에 의해 형성되는 고급 알칸은 4개 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 직쇄 알칸, 4개 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 직쇄 알켄, 5개 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 사이클로알칸, 5개 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 사이클로알켄, 아릴, 융합된 아릴, 알코올 및 케톤을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 알칸은 부탄, 펜탄, 펜텐, 2-메틸부탄, 헥산, 헥센, 2-메틸펜탄, 3-메틸펜탄, 2,2-디메틸부탄, 2,3-디메틸부탄, 헵탄, 헵텐, 옥탄, 옥텐, 2,2,4-트리메틸펜탄, 2,3-디메틸헥산, 2,3,4-트리메틸펜탄, 2,3-디메틸펜탄, 노난, 노넨, 데칸, 데센, 운데칸, 운데센, 도데칸, 도데센, 트리데칸, 트리데센, 테트라데칸, 테트라데센, 펜타데칸, 펜타데센, 노닐데칸, 노닐데센, 에이코산, 에이코센, 운에이코산, 운에이코센, 도에이코산, 도에이코센, 트리에이코산, 트리에이코센, 테트라에이코산, 테트라에이코센 및 이들의 이성체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 생성물중 일부는 연료로서 사용하기에 적합할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 비치환된다. 다른 구체예에서, 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 1치환된다. 또 다른 구체예에서, 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 다치환된다. 치환된 사이클로알칸 및 사이클로알켄을 포함하는 구체예에서, 치환된 기는 제한없이, 1개 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 직쇄 알킬, 1개 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 직쇄 알킬렌, 페닐 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 적합한 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 사이클로펜탄, 사이클로펜텐, 사이클로헥산, 사이클로헥센, 메틸-사이클로펜탄, 메틸-사이클로펜텐, 에틸-사이클로펜탄, 에틸-사이클로펜텐, 에틸-사이클로헥산, 에틸-사이클로헥센, 이들의 이성체 및 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
몇몇 구체예에서, 형성된 아릴은 비치환된다. 다른 구체예에서, 형성된 아릴은 1치환된다. 치환된 아릴을 포함하는 구체예에서, 치환된 기는 제한없이 1개 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 직쇄 알킬, 1개 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 직쇄의 알킬렌, 페닐, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명에 적합한 아릴로서는 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸 벤젠, 파라크실렌, 메타크실렌 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명에서 생성된 알코올은 4개 내지 30개의 탄소 원자를 갖는다. 몇몇 구체예에서, 알코올은 환형이다. 다른 구체예에서, 알코올은 분지형다. 다른 구체예에서, 알코올은 직쇄이다. 본 발명에 적합한 알코올로서는 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, 운데칸올, 도데칸올, 트리데칸올, 테트라데칸올, 펜타데칸올, 헥사데칸올, 헵틸데칸올, 옥틸데칸올, 노닐데칸올, 에이코산올, 운에이코산올, 도에이코산올, 트리에이코산올, 테트라에이코산올 및 이들의 이성체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 생성된 케톤은 4개 내지 30개의 탄소 원자를 갖는다. 하나의 구체예에서, 케톤은 환형이다. 다른 구체예에서, 케톤은 분지형이다. 다른 구체예에서, 케톤은 직쇄이다. 본 발명에 적합한 케톤은 부탄온, 펜탄온, 헥산온, 헵탄온, 옥탄온, 노난온, 데칸온, 운데칸온, 도데칸온, 트리데칸온, 테트라데칸온, 펜타데칸온, 헥사데칸온, 헵틸데칸온, 옥틸데칸온, 노닐데칸온, 에이코산온, 운에이코산온, 도에이코산온, 트리에이코산온, 테트라에이코산온, 및 이들의 이성체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
다른 이러한 화학적 변형은 에스테르 교환이다. 자연적으로 생성된 글리세로지질은 지방산 성분의 균일한 분포를 갖지 않는다. 오일과 관련하여, 에스테르 교환은 상이한 글리세로지질의 2개의 에스테르간의 아실 라디칼의 교환을 언급한다. 에스테르 교환 공정은 글리세로지질의 혼합물의 지방산 성분이 재배열되어 분포 패턴을 변형시킬 수 있는 기작을 제공한다. 에스테르 교환은 널리 공지된 화학적 공정이고, 일반적으로 알칼리 금속 또는 알칼리 금속 알킬레이트(예를 들어, 나트륨 메톡사이드)와 같은 촉매의 존재 하에서 일정 시간(예를 들어, 30분) 동안 오일의 혼합물을 가열(약 200℃로)하는 것을 포함한다. 이러한 공정을 사용하여 오일 혼합물의 지방산 성분의 분포 패턴을 무작위화할 수 있거나, 원하는 분포 패턴을 생성하도록 지시될 수 있다. 지질의 화학 변형에 대한 상기 방법은, 지질로서 건조 세포 중량%가 20% 이상인 미생물 바이오매스와 같은 본원에 제공된 물질에 대해 수행할 수 있다.
지방산의 특정 분포 패턴이 요구되는 지시된 에스테르 교환은 일어날 수 있는 몇몇 TAG의 융점 미만의 온도에서 오일 혼합물을 유지시킴으로써 수행할 수 있다. 이것은 이들 TAG를 선택적으로 결정화하며, 이는 이들이 결정화함에 따라 반응 혼합물로부터 이들을 효과적으로 제거한다. 상기 방법은, 예를 들어 오일 중 대부분의 지방산이 침전할 때까지 계속할 수 있다. 지시된 에스테르 교환 방법은 예를 들어 장쇄 지방산의 단쇄 대응물로의 치환을 통해 보다 낮은 칼로리 함량을 갖는 생성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 지시된 에스테르 교환은 또한 원치않는 트랜스 이성체를 생성시킬 수 있는 수소화에 의지하는 것 없이 식품 부가물 또는 제품(예를 들어, 마가린)에서 요구되는 원하는 용융 특성 및 구조적 특징을 제공할 수 있는 지방 혼합물을 갖는 생성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 의해 생성된 오일의 에스테르 교환은 미국 특허 제6,080,853호(비분해성 지방 대용물); 제4,288,378호(땅콩 버터 안정화제); 제5,391,383호(식용 스프레이 오일); 제6,022,577호(식품 생성물에 대한 식용 지방); 제5,434,278호(식품 생성물에 대한 식용 지방);제 5,268,192호(저칼로리 너트 생성물); 제5,258,197호(감소된 칼로리의 식용 조성물); 제4,335,156호(식용 지방 생성물); 제7,288,278호(식품 부가물 또는 의약); 제7,115,760호(분별 방법); 제6,808,737호(구조적 지방); 제5,888,947호(엔진 윤활제); 제5,686,131호(식용 오일 혼합물); 및 제4,603,188호(경화성 우레탄 조성물)에 보고된 바와 같이 방법 및/또는 물질 중 하나 이상과 함께 또는 생성물을 생성하기 위해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 하나의 구체예에서, 상기된 바와 같은 오일의 에스테르 결합 전이에 이어서 미국 특허 제6,465,642호에 보고된 바와 같이 에스테르 결합 전이된 생성물을 폴리올과 반응시켜 폴리올 지방산 폴리에스테르를 생성시킨다. 상기 에스테르화 및 분리 공정은, 저급 알킬 에스테르를 비누의 존재 하에 폴리올과 반응시키는 단계; 생성물 혼합물로부터 잔여 비누를 제거하는 단계; 생성물 혼합물을 물 세척 및 건조시켜 불순물을 제거하는 단계; 정제를 위해 생성물 혼합물을 표백시키는 단계; 생성물 혼합물중에 폴리올 지방산 폴리에스테르로부터 미반응된 저급 알킬 에스테르의 적어도 일부를 분리하는 단계; 및 분리된 미반응된 저급 알킬 에스테르를 재순환하는 단계를 포함할 수 있다.
에스테르 결합 전이는 또한 미국 특허 제6,278,006호에 보고된 바와 같은 단쇄 지방산 에스테르를 갖는 미생물 바이오매스 상에서 수행할 수 있다. 일반적으로, 에스테르 결합 전이는 단쇄 지방산 에스테르를 적합한 촉매의 존재 하에서 오일에 부가하고 혼합물을 가열시킴으로써 수행할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 오일은 반응 혼합물의 약 5중량% 내지 약 90중량%를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 단쇄 지방산 에스테르는 반응 혼합물의 약 10중량% 내지 약 50중량%일 수 있다. 촉매의 비제한적인 예로서는 염기 촉매; 나트륨 메톡사이드; 산 촉매, 예를 들어 무기산(예를 들어, 황산 및 산성화된 점토), 유기산(예를 들어, 메탄 설폰산, 벤젠설폰산 및 톨루엔설폰산), 및 산성 수지(예를 들어, Amberlyst 15)를 포함한다. 나트륨 및 마그네슘과 같은 금속 및 금속 수소화물은 또한 유용한 촉매이다.
다른 당해 화학 변형은 하이드록실화이며, 이는 물을 이중 결합에 부가하여 하이드록실부의 포화 및 혼입을 가져온다. 상기 하이드록실화 공정은 글리세로지질의 하나 이상의 지방산 성분을 하이드록시 지방산으로 전환시키기 위한 기작을 제공한다. 하이드록실화는, 예를 들어 미국 특허 제5,576,027호에 보고된 방법을 통해 수행할 수 있다. 피마자유를 포함하는 하이드록실화된 지방산 및 이의 유도체는 식품 첨가제, 계면활성제, 안료 습윤제, 소포제, 방수 첨가제, 가소화제, 화장품 유화제 및/또는 탈취제를 포함하는 여러 가지의 산업 응용 분야, 및 전자기기, 약제, 페인트, 잉크, 접착제 및 윤활제에서의 성분으로서 유용하다. 글리세라이드의 하이드록실화를 수행할 수 있는 방법의 한가지 예는 다음과 같다: 지방은 바람직하게 헵탄과 조합하여 약 30℃ 내지 50℃로 가열하고 30분 이상 동안 온도에 유지시킬 수 있으며; 이어서 아세트산을 혼합물에 첨가하고 황산 수용액, 그 다음 과산화수소 수용액을 소량의 증분으로 1시간에 걸쳐서 혼합물에 첨가하며; 수성 과산화수소 후에 온도를 이어서 약 60℃ 이상으로 증가시키고 6시간 이상 동안 교반시킬 수 있으며; 교반 후 상기 혼합물이 침강할수 있게 하고 반응에 의해 형성된 저급 수성 층을 제거하는 한편, 반응에 의해 형성된 상부 헵탄층을 약 60℃의 온도를 갖는 고온수로 세척할 수 있고; 세척된 헵탄 층을 이어서 수산화칼륨 수용액을 사용하여 pH 약 5 내지 7로 중화시키고 이어서 진공 증류에 의해 제거할 수 있으며; 반응 생성물을 이어서 100℃에서 진공 건조시킬 수 있고 건조된 생성물을 진공 조건 하에 증기 탈취시키고 규조토를 사용하여 약 50℃ 내지 60℃에서 여과할 수 있다.
본원에 기술된 방법에 의해 생성된 미생물 오일의 하이드록실화는 미국 특허 제6,590,113호(오일계 피복제 및 잉크); 제4,049,724호(하이드록실화 공정); 제6,113,971호(올리브유 버터); 제4,992,189호(윤활제 및 루브 첨가제); 제5,576,027호(하이드록실화된 밀크); 및 제6,869,597호(화장품)에 보고된 바와 같이 방법 및/또는 물질 중 하나 이상과 함께 또는 생성물을 생성하기 위해 수행될 수 있다. 리시놀레산의 하이드록실화는 폴리올을 제공한다.
하이드록실화된 글리세로지질은 에스톨리드로 전환시킬 수 있다. 에스톨리드는 글리세로지질로 이루어지고, 여기서 하이드록실화된 지방산 성분은 다른 지방산 분자에 에스테르화시켰다. 하이드록실화된 글리세로지질의 에스톨리드로의 전환은 글리세로지질 및 지방산의 혼합물을 가온시키고 상기 혼합물을 문헌[Isbell et al., JAOCS 71(2): 169-174 (1994)]에 기술된 바와 같이 무기산과 접촉시킴으로써 수행할 수 있다. 에스톨리드는 미국 특허 제7,196,124호(탄성 물질 및 바닥덮개); 제5,458,795호(고온 응용을 위한 증점 오일); 제5,451,332호(산업적 응용을 위한 유체); 제5,427,704호(연료 첨가제); 및 제5,380,894호(윤활제, 그리스, 가소제 및 인쇄 잉크)(이에 제한되는 것은 아님)에 보고된 것들을 포함하는, 다양한 응용 분야에서 유용하다.
이와 같은 화학 변형의 다른 예로서는 올레핀 복분해가 있다. 올레핀 복분해에서, 촉매는 알켄(올레핀) 내에 있는 알킬리덴 탄소를 분리하며, 이와 같이 분리된 탄소들 각각과 상이한 알킬리덴 탄소들 간 쌍을 이룸으로써 새로운 알켄을 형성한다. 올레핀 복분해 반응은, 에틸렌을 사용한 분해(ethenolysis), 자가 복분해에 의한(알켄 결합을 통한) 지방산의 가교, 및 교차 복분해에 의하여 유도체화된 알켄과 함께 신규 작용기를 지방산에 통합시킴으로써, 알켄에 존재하는 불포화 지방산 알킬 사슬을 절두하는 것과 같은 공정 기작을 제공한다.
기타 다른 반응, 예를 들어 에스테르 결합 전이 및 수소화와 관련하여, 올레핀 복분해는 불포화 글리세로지질을 다양한 최종 생성물로 전환할 수 있다. 이러한 생성물은 왁스용 글리세로지질 올리고머; 윤활제용 단쇄 글리세로지질; 화학 물질 및 중합체용 동종이작용성 및 이종이작용성 알킬 사슬; 생물 연료용 단쇄 에스테르; 및 제트 연료용 단쇄 탄화수소를 포함한다. 올레핀 복분해는, 예를 들어 미국 특허 제7,119,216호, 미국 특허 공개 제2010/0160506호 및 미국 특허 공개 제2010/0145086호에 보고된 방법 및 촉매를 사용하여 트리아실글리세롤과 지방산 유도체 상에서 수행될 수 있다.
바이오오일(bio-oil)의 올레핀 복분해는 일반적으로 기타 다른 알켄의 존재 하(교차 복분해) 또는 부재 하(자가 복분해)에, 불활성 조건 하에서 Ru 촉매 용액을 약 10ppm 내지 250ppm의 로딩율로 불포화 지방산 에스테르에 첨가하는 것을 포함한다. 반응은 통상적으로 수 시간에서 수 일에 이르기까지 진행될 수 있으며, 궁극적으로는 알켄 생성물을 분배한다. 올레핀 복분해가 지방산 유도체 상에서 어떻게 수행될 수 있는지에 관한 일례는 다음과 같다: 톨루엔 중 제1 세대 그럽스 촉매(Grubbs Catalyst)(디클로로[2(1-메틸에톡시-α-O)페닐]메틸렌-α-C)(트리사이클로헥실-포스핀) 용액(촉매 로딩율 = 222ppm)은 탈기 및 무수 메틸 올리에이트가 담긴 용기에 첨가될 수 있다. 그 다음, 상기 용기는 약 60psig의 에틸렌 가스로 가압된 후, 약 30℃ 이하의 온도에서 3시간 동안 유지될 수 있는데, 이로써 대략 수율 50%의 메틸 9-데세노에이트가 생성될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 의해 생산된 오일의 올레핀 복분해는 특허 출원 PCT/US07/081427호(α-올레핀 지방산) 및 미국 특허 출원 제12/281,938호(바셀린), 제12/281,931호(페인트볼 건 캡슐), 제12/653,742호(가소제 및 윤활제), 제12/422,096호(이작용성 유기 화합물) 및 제11/795,052호(양초)에 보고된 바와 같은 방법 및/또는 물질 중 하나 이상과 함께 또는 생성물을 생성하기 위해 수행될 수 있다.
미생물 오일상에서 수행될 수 있는 기타 다른 화학적 반응은 미국 특허 제6,051,539호에 보고된 바와 같이 트리아실글리세롤과 사이클로프로판화제를 반응시켜 유동성 및/또는 산화 안정성을 증진시키는는 것; 미국 특허 제6,770,104호에 보고된 바와 같이 트리아실글리세롤로부터 왁스를 제조하는 것; 및 문헌[“The effect of fatty acid composition on the acrylation kinetics of epoxidized triacylglycerols”, Journal of the American Oil Chemists' Society, 79:1, 59-63, (2001)] 및 [Free Radical Biology and Medicine, 37:1, 104-114 (2004)]에 보고된 바와 같이 트리아실글리세롤을 에폭시화시키는 것을 포함한다.
전술된 바와 같이 연료 및 화학적 생성물에 대한 오일 함유 미생물 바이오매스의 생성은 탈지된 바이오매스 밀(meal)을 생성시킨다. 탈지된 밀은 조류 오일을 제조하는데 있어서의 부산물이고, 농장 동물, 예를 들어 반추동물, 가금류, 돼지 및 양식물고기에 대한 동물 사료로서 유용하다. 생성된 밀은 오일 함량이 감소하였지만 여전히 고품질의 단백질, 탄수화물, 섬유, 재, 잔류 오일 및 동물 사료에 적당한 기타 다른 영양물을 함유한다. 세포는 주로 오일 분리 공정에 의해 용해되기 때문에, 탈지된 밀은 상기 동물에 의해 쉽게 소화될 수 있다. 탈지된 밀은 임의로 동물 사료에서 곡물과 같은 기타 다른 성분과 배합될 수 있다. 탈지된 밀은 분말성 점도를 갖기 때문에, 이것은 압출기 또는 확장기 또는 시판되는 다른 유형의 기계를 사용하여 펠렛으로 압축될 수 있다.
피마자 오일은 아주까리로부터 분리되는, 자연적으로 생성되는 오일이다. 피마자 오일의 가수 분해로 리시놀레산이 생성된다. 아주까리는 다량의 리신을 함유하므로, 아주까리로부터의 피마자 오일의 생산은 어렵다. 리신은 화학 무기 금지 협약(Chemical Weapons Convention) 중 스케쥴 1 화합물로서 나열된 매우 위험한 독소이다. 그러므로, 아주까리로부터 피마자유를 생산할 때에는 세심한 주의를 기울여야 한다. 미세 조류 세포로부터 분리된 하이드록실화 오일은 본 발명의 하나의 구체예에 의해 제공된다. 이러한 방식으로, 리시놀레산이 생산될 수 있다. 하나의 구체예에서, 하이드록실화된 오일은 하이드록실화된 트리글리세라이드이다. 본 발명의 하이드록실화된 트리글리세라이드는 피마자 오일과 화학적으로 유사할 수 있다. 실시예 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 하이드록실화된 미생물 오일을 제공한다. 실시예 7의 오일의 GC/MS 분석 결과는, 본 발명자들이 리시놀레산(12-하이드록시-9-cis-옥타데센산)을 제조하였음을 나타낸다.
본 발명의 하나의 구체예에 따른 지방산은 하이드록실화된 지방산이다. 하이드록실화된 지방산의 하나의 구체예는 리시놀레산이다.
미생물의 하이드록실화 오일 또는 하이드록실화 지방산은 추가로 하이드록실화될 수 있다. 리시놀레산이 추가로 하이드록실화될 때, 2개의 하이드록실기를 함유하는 지방산, 폴리올이 제공된다.
본 발명은 폴리올(예를 들어, 하이드록실화된 오일 및/또는 하이드록실화된 지방산)과, 이소시아네이트부를 함유하는 화합물을 반응시킴으로써 제조된 조성물을 제공한다. 피마자 오일과 이소시아네이트를 사용하여 폴리우레탄이 생산되었다. 폴리우레탄은 오늘날 사용되는 제품에 두루 존재한다. 폴리우레탄은 자동차, 장난감, 운동 기구, 소비자용 전자 제품, 신발, 매트리스, 쿠션, 접착제, 건축 자재 등에서 발견된다. 현재, 피마자유로 제조된 폴리우레탄이 BASF, Itoh Oil 등으로부터 시판되고 있다. 하이드록실화된 대두 오일로 제조된 폴리우레탄은 Cargil, Dow, Bayer 등으로부터 시판되고 있다.
하나의 구체예에서, 미생물 세포에 의해 생산된 리시놀레산은, 당업계에 공지된 방법에 따라서, 함유 화학 제품, 예를 들어 리시놀레 에스테르, 리시놀레 아미드, 폴리우레탄, 폴리우레탄 폼 또는 폴리우레탄 부품으로 추가로 가공될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제6194475호, 제4266617호, 제6403664호 및 제4058492호, 그리고 미국 특허 출원 제20100227151호를 참조한다.
상기에서 상세하게 기술된 본 발명은 하기의 실시예에 예시되지만, 이는 청구된 발명을 설명하기 위해 제공될 뿐 이에 제한되지 않는다.
VII . 실시예
실시예 1: 프로토테카를 배양하는 방법
프로토테카 균주는 건조 세포 중량을 기준으로 높은 백분율의 오일을 성취하기 위해 배양하였다. 동결보존된 세포를 실온에서 해동시키고 500㎕의 세포를 4.5ml의 배지(4.2g/L K2HPO4, 3.1g/L NaH2PO4, 0.24g/L MgSO4·7H2O, 0.25g/L 시트르산 1수화물, 0.025g/L CaCl2 2H2O, 2g/L 효모 추출물) + 2% 글루코스에 첨가하고 6웰 평판에서 교반(200rpm)하면서 7일 동안 28℃에서 생장시켰다. 건조 세포 중량은 1ml의 배양물을 예비 칭량된 에펜도르프 튜브에서 5분 동안 14,000rpm에서 원심분리하여 측정하였다. 배양 상청액을 버리고 수득한 세포 펠렛을 1ml의 탈이온수로 세척하였다. 배양물을 다시 원심분리하고, 상청액을 버리며, 세포 펠렛을 동결될 때까지 -80℃에 두었다. 이어서 샘플을 24시간 동안 동결건조시키고 건조 세포 중량을 계산하였다. 배양물 중 총 지질을 측정하기 위해, 3ml의 배양물을 제거하고 제조업자의 프로토콜에 따라 Ankom 시스템(Ankom Inc., Macedon, NY)을 사용하여 분석하였다. 샘플은 제조업자의 프로토콜에 따라 Amkom XTlO 추출기로 용매 추출을 하였다. 총 지질은 산 가수 분해된 건조 샘플 및 용매 추출된 건조 샘플간의 질량 차이로서 측정하였다. 오일 건조 세포 중량의 백분율 측정은 표 10에 나타내어져 있다.
건조 세포 중량을 기준으로 한 오일 백분율
종 균주 % 오일
프로토테카 스태그노라 UTEX 327 13.14
프로토테카 모리포르미스 UTEX 1441 18.02
프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 27.17
프로토테카 속의 다수의 균주들로부터 얻은 미세 조류 샘플의 유전자형을 분석하였다. 게놈 DNA를 다음과 같이 조류 바이오매스로부터 분리하였다. 세포(대략 200mg)를 14,000 x g에서 5분 동안 액체 배양물로부터 원심분리하였다. 세포를 이어서 멸균 증류수에 재현탁시키며, 14,000 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버렸다. 직경이 약 2mm인 단일 유리 비드를 바이오매스에 첨가하고 튜브를 15분 이상 동안 -80℃에 두었다. 샘플을 제거하고 150μl의 분쇄 완충액(1% 사르코실(Sarkosyl), 0.25M 수크로스, 50mM NaCl, 20mM EDTA, 100mM Tris-HCl, pH 8.0, RNase A 0.5ug/ul)을 첨가하였다. 펠렛을 간단히 와류시켜 재현탁시키고, 이어서 40㎕의 5M NaCl을 첨가하였다. 샘플을 간단히 와류시키고, 이어서 66μl의 5% CTAB(세틸 트리메틸암모늄 브로마이드)를 첨가하며, 최종적으로 간단히 와류시켰다. 다음에 샘플을 10분 동안 65℃에서 항온처리하고, 이후 이들을 10분 동안 14,000 x g에서 원심분리하였다. 상기 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, 300μl의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 12:12:1로 1회 추출함에 이어서 14,000 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 생성된 수성 상을 0.7용적의 이소프로판올(약 190㎕)을 함유하는 새로운 튜브로 옮기고, 뒤집어서 혼합하며, 30분 동안 실온에서 또는 밤새 4℃에서 항온처리하였다. DNA를 10분 동안 14,000 x g에서 원심분리를 통해 회수하였다. 이어서 생성된 펠렛을 70% 에탄올로 2회 세척함에 이어서 100% 에탄올로 최종 세척하였다. 펠렛을 실온에서 20분 내지 30분 동안 공기 건조시킴에 이어서 50μl의 1OmM TrisCl, 1mM EDTA(pH 8.0) 중에 재현탁시켰다.
상기된 바와 같이 제조된 5μl의 총 조류 DNA를 10mM Tris(pH 8.0) 중에서 1:50으로 희석시켰다. 최종 용적 20㎕의 PCR 반응을 다음과 같이 준비하였다. 10μl의 2 x iProof HF 마스터 믹스(BIO-RAD)를 0.4μl의 프라이머 SZ02613 (10mM 스톡 농도에서 5'-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3'(서열번호 9))에 첨가하였다. 상기 프라이머 서열은 GenBank 수탁 번호 제L43357호에서 567번 내지 588번이고, 고등 식물 및 조류 색소체 게놈에서 고도로 보존되어 있다. 이어서 0.4μl의 프라이머 SZ02615(10mM 스톡 농도에서 5'-CAGTGAGCTATTACGCACTC-3'(서열번호 10))를 첨가하였다. 상기 프라이머 서열은 GenBank 수탁 번호 제L43357호에서 1112번 내지 1093번 위치에 상보적이고, 고등 식물 및 조류 색소체 게놈에서 고도로 보존되어 있다. 다음에, 5μl의 희석된 총 DNA 및 3.2μl의 dH2O를 첨가하였다. PCR 반응을, 35사이클 동안 98℃, 45초; 98℃, 8초; 53℃, 12초; 72℃, 20초에 이어서 1분 동안 72℃에서 수행하며, 25℃에 유지시켜 수행한다. PCR 생성물의 정제를 위해, 20μl의 10mM Tris(pH 8.0)를 각각의 반응에 첨가하고, 이어서 40μl의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 12:12:1로 추출하며, 와류시키고 5분 동안 14,000 x g에서 원심분리하였다. PCR 반응을 S-400 칼럼(GE Healthcare)에 적용하고 3,000 x g에서 2분 동안 원심분리하였다. 정제된 PCR 생성물을 이어서 PCR8/GW/TOPO로 TOPO 클로닝하고, 양성 클론을 LB/Spec 평판을 위해 선택하였다. 정제된 플라스미드 DNA를 M13 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 양 방향으로 서열분석하였다. 전체적으로, 12개의 프로토테카 균주는 서열분석된 이들의 23S rRNA DNA를 갖도록 선택하고, 상기 서열을 서열 목록 중에 열거하였다. 균주 및 서열 번호에 대한 요약은 하기에 포함된다. 상기 서열은 UTEX 1435(서열번호 15) 서열로부터 총 분기점에 대해 분석하였다. 2개의 쌍(UTEX 329/UTEX 1533 및 UTEX 329/UTEX 1440)이 가장 분기된 것으로서 나타났다. 양 경우에, 쌍형성 정렬은 75.0% 쌍형성 서열 동일성을 나타내었다. UTEX 1435에 대한 서열 동일성 백분율은 또한 하기에 포함된다.
Figure 112013079886893-pct00011
상기 열거된 균주의 서브세트 유래의 지질 샘플은 HPLC를 사용하여 지질 프로필에 대해 분석하였다. 결과는 하기 표 11에 나타내어져 있다. 대안적으로, 지질 프로필은 실시예 11에 개략적으로 기술된 방법을 이용하여 측정될 수 있다.
Figure 112013079886893-pct00012
(용매 추출을 통해 또는 익스펠러 프레스를 사용하여) 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435로부터 추출된 오일을 대상으로, 카로티노이드, 엽록소, 토코페롤, 기타 다른 스테롤 및 토코트리에놀에 대해 분석하였다. 그 결과는 하기 표 12에 요약되어 있다.
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)로부터 추출된 오일 중 카로티노이드, 엽록소, 토코페롤/스테롤 및 토코트리에놀 분석 결과
압착된 오일
(mcg/ml)		 용매 추출된 오일(mcg/ml)
cis-루테인 0.041 0.042
trans-루테인 0.140 0.112
trans-제아잔틴 0.045 0.039
cis-제아잔틴 0.007 0.013
t-알파-크립토잔틴 0.007 0.010
t-베타-크립토잔틴 0.009 0.010
t-알파-카로틴 0.003 0.001
c-알파-카로틴 검출되지 않음 검출되지 않음
t-베타-카로틴 0.010 0.009
9-cis-베타-카로틴 0.004 0.002
라이코펜 검출되지 않음 검출되지 않음
총 카로티노이드 0.267 0.238
엽록소 <0.01mg/kg <0.01mg/kg
토코페롤 및 스테롤
압착된 오일
(mg/100g)		 용매추출된 오일(mg/100g)
감마 토코페롤 0.49 0.49
캄페스테롤 6.09 6.05
스티그마스테롤 47.6 47.8
베타-시토스테롤 11.6 11.5
기타 다른 스테롤 445 446
토코트리에놀
프레스된 오일
(mg/g)		 용매추출된 오일(mg/g)
알파 토코트리에놀 0.26 0.26
베타 토코트리에놀 <0.01 <0.01
감마 토코트리에놀 0.10 0.10
델타 토코트리에놀 <0.01 <0.01
총 토코트리에놀 0.36 0.36
표준 식물성 오일 가공 방법을 이용하여, 프로토테카 모리포르미스(4개의 개별 분획)로부터 추출된 오일을 정제한 후 표백하였다. 간단히 말해서, 프로토테카 모리포르미스로부터 추출된 미정제 오일을 수평 디캔터 내에서 투명하게 만들었는데, 이때 오일로부터 고체가 분리되었다. 그 다음, 투명한 오일을 시트르산과 물이 담긴 탱크로 옮긴 후, 이를 약 24시간 동안 방치하여 침강시켰다. 24시간 경과 후, 탱크 내 혼합물은 2개의 별도 층들을 형성하였다. 아래 층은 물과 고무질로 이루어졌는데, 이후 이것들을 경사분리(decantation)에 의해 제거한 다음, 고무 성질이 제거된 오일을 표백 탱크로 옮겨 담았다. 그 다음, 오일을 일정량의 추가 시트르산과 함께 가열하였다. 이후, 표백 점토를 상기 표백 탱크 내에 첨가하였으며, 이 혼합물을 진공 하에서 추가로 가열하여 잔류하던 물을 전부 증발시켰다. 그 다음, 혼합물을 잎상 필터를 통해 펌핑하여 표백 점토를 제거하였다. 이후, 여과된 오일을 최종 5㎛ 연마 필터(polishing filter)에 통과시킨 다음, 이를 수집하여 사용시까지 보관하여 두었다. 그 다음, 정제 및 표백(RB) 오일을 카로티노이드, 엽록소, 스테롤, 토코트리에놀 및 토코페롤에 대해 분석하였다. 이와 같은 분석 결과는 하기 표 13에 요약되어 있다. “nd”는 검출되지 않았음을 의미하고, 검출 감도는 하기에 나열된 바와 같았다.
검출 감도
카로티노이드(mcg/g) nd = <0.003mcg/g
엽록소(mcg/g) nd = <0.03mcg/g
스테롤(%) nd = 0.25%
토코페롤(mcg/g); nd = 3mcg/g
Figure 112013079886893-pct00013
프로토테카 모리포르미스 오일의 동일한 4개 분획을 또한 미량 원소에 대해 분석하였으며, 그 결과는 하기 표 14에 요약되어 있다.
Figure 112013079886893-pct00014
실시예 2: 프로토테카의 일반적 유전자 총 형질 전환법
씨셸 골드 마이크로캐리어 550(Seashell Gold Microcarriers 550) 나노미터를 제조자 프로토콜에 따라서 제조하였다. 플라스미드(20㎍)를 결합 완충액 50㎕ 및 S550d 골드 캐리어 60㎕(30㎎)와 혼합하고 나서, 이 혼합물을 1분 동안 얼음 속에서 항온 처리하였다. 여기에 침전 완충액(100㎕)을 첨가하고, 이 혼합물을 얼음 속에서 1분 더 항온 처리하였다. 이를 와류시킨 다음, 에펜도르프 5415C 마이크로 원심 분리로 10초 동안 10,000rpm에서 회전시켜 DNA 코팅된 입자를 펠릿화하였다. 골드 펠릿을 냉각 100% 에탄올 500㎕로 1회 세정한 후, 마이크로 원심 분리로 간단히 회전시켜 펠릿화한 다음, 얼음 냉각된 에탄올 50㎕로 재현탁하였다. 간단히 초음파 처리한 후(1초 내지 2초), DNA 코팅된 입자들 10㎕를 즉시 캐리어 막으로 이동시켰다.
프로토테카 균주를 2% 글루코스 함유 프로테오스 배지(2g/L 효모 추출물, 2.94mM NaNO3, 0.17mM CaCl2ㆍ2H2O, 0.3mM MgSO4ㆍ7H2O, 0.4mM K2HPO4, 1.28mM KH2PO4, 0.43mM NaCl) 중에서, 세포 밀도가 2 x 106세포/㎖가 될 때까지 선회 진탕기에서 생육하였다. 세포를 회수한 후, 멸균 증류수로 1회 세정하고 나서, 배지 50㎕ 중에 재현탁하였다. 1 x 107 세포를 비선택성 프로테오스 배지 평판 중앙 3분의 1에 해당하는 부위에 도말하였다. 세포를 PDS-1000/He 유전자 총 입자 전달 시스템(Bio-Rad)으로 발사하였다. 파열 판(rupture disk)(1350psi)을 사용하였으며, 평판을 스크리닝/매크로캐리어 조립체 6㎝ 아래에 놓았다. 25℃에서 12시간 내지 24시간 동안 세포를 회수하였다. 회수시, 고무 주걱으로 세포를 평판으로부터 긁어내고 나서, 이를 배지 100㎕와 혼합한 다음, 적절하게 선택된 항생제를 함유하는 평판상에 도말하였다. 25℃에서 7일 내지 10일 동안 배양한 다음, 형질 전환된 세포를 나타내는 콜로니들을 평판 상에서 가시적으로 확인하였다. 콜로니들을 골라낸 다음 (항생제 또는 탄소원 함유) 선택 한천 평판 상에 점 찍었다(제2 선택 라운드용).
실시예 3: 프로토테카 내 다양한 티오에스테라제의 발현
프로토테카 종 내 이종 티오에스테라제 유전자를 발현하는 방법과 이에 따른 효과는, 본원에 참조로 포함되어 있는 PCT 출원 PCT/US2009/066142호에 이미 기술되어 있다. 고등 식물 종으로부터 유래하는 기타 다른 티오에스테라제 유전자/유전자 생성물의 효과를 더욱 자세히 관찰하였다. 이러한 티오에스테라제는 다음과 같은 고등 식물로부터 유래하는 티오에스테라제를 포함한다:
GenBank
종 수탁 번호 특이성 서열 번호
신나모뮴 캠포라 Q39473 C14 서열 번호 30 ~ 31
움벨루라리아 캘리포니카 Q41635 C10-C12 서열 번호 34 ~ 35
쿠페아 후커리아나 AAC49269 C8-C10 서열 번호 32 ~ 33
쿠페아 팔루스트리스 AAC49179 C8 서열 번호 36 ~ 37
쿠페아 란세올라타 CAB60830 C10 서열 번호 38 ~ 39
아이리스 게르마니카 AAG43858.1 C14 서열 번호 40 ~ 41
미리스티카 프래그란스 AAB717291.1 C14 서열 번호 42 ~ 43
쿠페아 팔루스트리스 AAC49180 C14 서열 번호 44 ~ 45
얼머스 아메리카나 AAB71731 광범위 서열 번호 46 ~ 47
미리스티카 프래그란스 AAB71729 광범위 서열 번호 145 ~ 146
가르시니아 망고스타나 AAB51525.1 C16 서열 번호 147 ~ 148
쿠페아 후커리아나 Q39513.1 C16 서열 번호 149 ~ 150
엘라에이스 기니엔시스 AAD42220.2 C16 서열 번호 151 ~ 152
브라시카 나푸스 CAA52070.1 C18 서열 번호 153 ~ 154
리시누스 커뮤니스 ABS30422.1 C18:1 서열 번호 155 ~ 156
모든 경우에서, 상기 티오에스테라제 구조물 각각은 유전자 총 입자 발사법을 사용하여 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)로 형질 전환되었다. 기타 다른 형질 전환법, 예를 들어 PCT 출원 PCT/US2009/066142호에 개시된 상동성 재조합법은 또한 관심의 유전자의 이종 발현에 적당할 것이다. 실시예 2에 기술된 방법을 사용하여 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)를 상기 티오에스테라제 구조물 각각으로 형질 전환하였다. 구조물 각각은 NeoR 유전자를 함유하였으며, 양성 클론 선택은 100㎍/㎖ G418을 사용하여 수행하였다. 모든 암호화 영역은 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435(표 2 참조) 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용(codon bias)을 반영하도록 최적화된 코돈이었다. 사용된 구조물에 대한 아미노산 서열과 cDNA 서열은 둘 다 서열 동일성 목록에 나열되어 있다. 달리 특정하지 않는 한, 고등 식물 티오에스테라제 각각에 대한 운반 펩티드(transit peptide)는 프로토테카 모리포르미스 델타 12 지방산 불포화 효소(서열 번호 48) 또는 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소(서열 번호 49)로부터 유래하는 조류 코돈 최적화 운반 펩티드로 대체되었다. 모든 티오에스테라제 구조물은 클라미도마나스 레인하르드티 베타-튜불린 프로모터/5'UTR에 의해 작동되었다. 선택된 양성 클론의 생장 및 지질 생산을 야생형(형질 전환되지 않은) 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)와 비교하였다. 야생형 및 선택된 양성 클론을 2% 글루코스 G418 평판 상에서 생육하였다. 선택된 양성 클론에 대한 각각의 구조물의 지질 프로필 분석 결과는 하기 표 15에 요약되어 있다(면적%로 표시).
Figure 112013079886893-pct00015
상기 결과들은 발현된 티오에스테라제 전부가 지방산 프로필에 어느 정도까지 영향을 주었음을 나타낸다. “총 포화물”행을 살펴보면, 포화도는 티오에스테라제, 예를 들어 유.캘리포니카, 씨.캠포라 및 가장 눈에 띄게는 유.아메리카나로부터 유래하는 티오에스테라제들 중 몇 개의 발현에 의해 깊은 영향을 받았다. 이러한 총 포화물의 백분율 변화는, 고등 식물로부터 유래하는 티오에스테라제의 이종 발현이 지질 사슬 길이에 확실하게 영향을 줄 수 있으며; 또한 미세 조류에 의해 생성되는 지질 프로필의 기타 다른 속성, 즉 지방산의 포화도에도 영향을 줄 수 있다는 점에서 예상하지 못했던 것이다.
씨.팔루스트리스 C8 티오에스테라제, 씨.후커리아나 티오에스테라제, 유.캘리포니카 및 씨.캠포라 티오에스테라제로 형질 전환된 선택 클론을, G418의 양에 변화를 주고(25㎎/L 내지 50㎎/L), 온도에도 변화를 주면서(22℃ 내지 25℃) 추가로 생육하였으며, 이러한 클론을 대상으로 지질 프로필을 측정하였다. 표 16은 각각의 티오에스테라제를 함유하는 대표적인 클론의 지질 프로필(면적%)을 요약한다. 유.아메리카나 티오에스테라제를 함유하는 제2 구조물을 구성하여, 전술한 유전자 총 발사법 이용하여 이를 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)로 형질 전환되었다. 제2 구조물을 상동성 재조합법을 통해 세포 내에 도입하였다. 프로토테카 종 내에서의 상동성 재조합법은 PCT 출원 PCT/US2009/66142호에 이미 기술되어 있다. 사용된 상동성 DNA는 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435로부터 유래하는 6S 게놈 DNA 서열로부터 유래한 것이었다(서열 번호 92 및 서열 번호 84에 제시된 공여체 서열). 선택 요인은 씨.레인하르드티 베타 튜불린 프로모터에 의해 작동되는, 에스.세레비지아에로부터 유래하는 코돈 최적화 suc2 유전자를 이용하여 수크로스 상에서 생장하는 능력이었다. 천연의 유.아메리카나 운반 펩티드는 클로렐라 프로토테코이데스(UTEX 250) 스테아로일 ACP 불포화 효소 운반 펩티드에 의해 대체되었다. 이 구조물의 cDNA는 서열 목록에 서열 번호 50으로서 나열되어 있다. 양성 클론의 선택은 2% 수크로스 평판 상에서 수행되었으며, 지질 프로필 측정을 위한 생성된 배양물도 또한 2% 수크로스 함유 배지 상에서 생육하였다. 상동적으로 재조합된 이종 유.아메리카나 티오에스테라제를 함유하는 프로토테카 모리포르미스 균주에 대한 대표적인 지질 프로필은 표 16에 요약되어 있다.
Figure 112013079886893-pct00016
전술한 클론을 사용하였을 때, 나타낸 이종 티오에스테라제 유전자를 함유하는 형질 전환체 모두는 지방산 프로필에 어느 정도까지 영향을 미쳤으며, 포화된 지방산의 총 백분율도 야생형(형질 전환되지 않은) 프로토테카 모리포르미스와 비교하였을 때 변하였다. 상동성 재조합법에 의해 도입된 유.아메리카나 티오에스테라제를 함유하는 프로토테카 모리포르미스는 총 포화물이 가장 많이 증가하였다.
뿐만 아니라, 외인성 씨.후커리아나, 씨.캠포라, 유.캘리포니카 또는 유.아메리카나 티오에스테라제를 함유하는 유전자 이식 클론은 신규 지질 프로필에 대해 평가하였다. 씨.후커리아나 티오에스테라제 함유 클론은 22℃에서 2% 글루코스, 25㎎/㎖ G418를 함유하는 배지 중에서 생육되었을 때, C8:0 5.10%; C10:0 18.28%; C12:0 0.41%; C14:0 1.76%; C16:0 16.31%; C18:0 1.40%; C18:1 40.49%; 및 C18:2 13.16%의 지질 프로필을 나타내었다. 씨.캠포라 티오에스테라제 함유 클론(또한 외인성 수크로스 인버타제도 함유함)은 25℃에서 2% 수크로스를 함유하는 배지 중에서 생육되었을 때, C10:0 0.04%; C12:0 6.01%; C14:0 35.98%; C16:0 19.42%; C18:0 1.48%; C18:1 25.44%; 및 C18:2 9.34%의 지질 프로필을 나타내었다. 유.캘리포니카 티오에스테라제 함유 클론은 22℃에서 2% 글루코스와 25㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖ G418을 함유하는 배지 중에서 생육되었을 때, C8:0 0%; C10:0 0.11%; C12:0 34.01%; C14:0 5.75%; C16:0 14.02%; C18:0 1.10%; C18:1 28.93%; 및 C18:2 13.01%의 지질 프로필을 나타내었다. 유.아메리카나 티오에스테라제 함유 클론은 28℃에서 2% 글루코스를 함유하는 배지 중에서 생육되었을 때, C10:0 1.54%; C12:0 0.43%; C14:0 7.56%; C16:0 39.45%; C18:0 2.49%; C18:1 38.49%; 및 C18:2 7.88%의 지질 프로필을 나타내었다.
고등 식물로부터 유래하는 부가의 티오에스테라제도 또한 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 유전적 배경에 도입하였으며, 코돈 최적화 cDNA 서열과 아미노산 서열은 전술한 서열 목록에 나열되어 있다. 이러한 부가의 티오에스테라제는 미리스티카 프래그란스 유래의 광범위한 특이성을 가지는 티오에스테라제(C14:0 내지 C18:0), 가르시니아 망고스타나 유래의 C16:0 선호 티오에스테라제, 쿠페아 후커리아나 유래의 C16:0 선호 티오에스테라제, 엘라에이스 기니엔시스 유래의 C16:0 선호 티오에스테라제, 브라시카 나푸스 유래의 C18:0 선호 티오에스테라제 및 리시누스 커뮤니스 유래의 C18:1 선호 티오에스테라제를 포함한다. 상기 이식 유전자/형질 전환체 각각으로부터 유래하는 생성 유전자 이식 클론과 발현 구조물에 대한 상세한 설명은 이하에 기술되어 있다.
미리스티카 프래그란스로부터 유래하며 광범위한 특이성을 가지는 티오에스테라제(C14:0 내지 C18:0)를, 전술한 방법을 사용하여 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 유전적 배경에 도입하였다. 2개의 상이한 발현 구조물들을 테스트하였으며, 이 구조물들은 각각 상이한 색소체 표적화 서열을 함유한다. 구조물 2개에 있어서, 에스.세레비지아에 수크로스 인버타제 유전자인 suc2는, 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 평판 상에서 생장하는 능력을 양성 형질 전환체에 부여하는 선택가능한 마커로서 사용되었다. 두 개의 발현 구조물, 즉 pSZ1318 및 pSZ1317은 6S 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 82) 및 3'(서열 번호 84) 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접)을 함유하였는데, 상기 재조합 표적화 서열은, 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역과 핵내 게놈으로의 통합 과정에 관여하였다. 이러한 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 159로서 나열되어 있다. pSZ1318은, 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터(서열 번호 89) 및 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는, 프로토테카 모리포르미스 델타 12 FAD 유래 운반 펩티드(서열 번호 48)에 의해 천연 운반 펩티드가 대체된 엠.프래그란스 티오에스테라제 암호화 영역을 함유하였다. 프로토테카 모리포르미스 델타 12 FAD 유래 운반 펩티드를 함유하는, 코돈 최적화 엠.프래그란스 티오에스테라제는 서열 번호 145로서 나열되어 있다. pSZ1317은, 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터(서열 번호 89) 및 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는, 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소 유래 운반 펩티드(서열 번호 49)에 의해 천연 운반 펩티드가 대체된 엠.프래그란스 암호화 영역을 함유하였다. 씨.프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소 유래 운반 펩티드를 함유하는, 코돈 최적화 엠.프래그란스 티오에스테라제는 서열 번호 158로서 나열되어 있다. 두개의 발현 구조물, 즉 pSZ1318 및 pSZ1317은 프로토테카 세포로 형질 전환되었으며, 선택은 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하였던 평판 상에서 수행되었다. 각각의 형질 전환 단계로부터 양성 클론을 선택하여, 이 클론은 지질 생산을 위한 질소 제한 조건 하에 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 배지 중에서 생육하였다. 선택된 양성 클론의 하위 세트의 지질 프로필을 전술한 직접 에스테르 결합 전이 방법을 사용하여 측정하였으며, 그 결과는 표 17에 요약되어 있다.
Figure 112013079886893-pct00017
미리스티카 프래그란스 티오에스테라제 이식 유전자를 함유하는 양성 클론은 지질 프로필에 변화가 나타났다. 그러나, 상기 요약된 결과들은 예상외의 결과를 나타내었으며, 고등 식물에서 미리스티카 프래그란스 티오에스테라제는 C16:0 지방 아실-ACP에 대해 상당한 활성을 나타낸 반면에(Voelker et al.,1997), 프로토테카 세포에서 미리스티카 프래그란스 티오에스테라제는 영향력의 크기가 차이가 났었으며(C14:0 > C18:0 > C16:0), 단지 C16:0만에 대해서는 영향이 미치는 범위가 더욱 넓었다.
가르시니아 망고스타나 유래 C16:0 선호 티오에스테라제를 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 유전적 배경에 도입하였으며, 이 경우 코돈 최적화 cDNA 서열과 아미노산 서열은 전술한 바와 같은 서열 목록 내에 나열되어 있다. 발현 구조물은 6S 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 82) 및 3'(서열 번호 84) 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접)을 포함하였는데, 이 재조합 표적화 서열은, 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역과 핵내 게놈으로의 통합 과정에 관여하였다. 이러한 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 159로서 나열되어 있으며, 선택 마커로서 작용하였다. 지.망고스타나 암호화 영역은 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 89) 및 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 두었다. 상기 지.망고스타나 천연 운반 펩티드는 또한 씨.프로토테코이데스 스테아로일 불포화 효소 유래 운반 펩티드(서열 번호 49)로 대체되었으며, 운반 펩티드로 대체된 상기 티오에스테라제의 cDNA 서열은 서열 번호 147로서 나열되어 있다. 전체 가르시니아 망고스타나 발현 카세트는 pSZ1452로 명명하였으며, 이 발현 카세트는 프로토테카 모리포르미스 유전적 배경으로 형질 전환되었다. 양성 클론을, 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 평판 상에서 스크리닝하였다. 양성 클론의 하위 세트를 선택하여, 지질 생산 조건 하에서 생육한 다음, 전술한 바와 같은 직접 에스테르 결합 전이 방법을 사용하여 지질 프로필을 측정하였다. 선택된 클론의 지질 프로필은 하기 표 18에 요약되어 있다.
Figure 112013079886893-pct00018
상기 결과는, 지.망고스타나 티오에스테라제 이식 유전자를 함유하는 형질 전환체가 C16:0 지방산 수준에 상당한 영향을 미쳤으며, 이보다는 그 정도가 약하지만, C14:0 지방산과 C18:0 지방산 수준에도 영향을 미쳤고, 아울러 야생형에 비해서 C18:1 지방산 수준은 극도로 감소하였음을 나타낸다.
쿠페아 후커리아나 유래 C16:0 선호 티오에스테라제를 프로토테카 모리포르미스 UTEX1435 유전적 배경에 도입하였다. 2개의 발현 구조물을 만들었는데, 이것들 중 하나는 천연 쿠페아 후커리아나 C16 선호 티오에스테라제 운반 펩티드 서열을 포함하였고(pSZ1417), 다른 하나는 천연 운반 펩티드 서열이 씨.프로토테코이데스 스테아로일-ACP 불포화 효소 유래 운반 펩티드(서열 번호 49)로 대체된 것이었다(pSZ1462). 천연 운반 펩티드를 함유하는 씨.후커리아나 티오에스테라제의 암호화 서열은 서열 번호 149로서 나열되어 있으며, 운반 펩티드가 대체된 씨.후커리아나 티오에스테라제의 암호화 서열은 서열 번호 160으로서 나열되어 있다. 상기 발현 구조물은 둘 다 6S 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 82) 및 3'(서열 번호 84) 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접)을 포함하였는데, 상기 재조합 표적화 서열은, 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역과 핵내 게놈으로의 통합 과정에 관여하였다. 이러한 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 159로서 나열되어 있으며, 선택 마커로서 작용하였다. 상기 2개의 구조물에서, 씨.후커리아나 암호화 영역은 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 89) 및 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 두었다. 상기 구조물은 둘 다 프로토테카 모리포르미스 유전적 배경으로 형질 전환되었으며, 양성 클론은 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 평판 상에서 스크리닝하였다. 양성 클론의 하위 세트를 선택하여 지질 생산 조건 하에서 생육하였으며, 지질 프로필은 전술한 직접 에스테르 결합 전이 방법을 사용하여 측정하였다. 선택된 클론의 지질 프로필은 하기 표 19에 요약되어 있다.
Figure 112013079886893-pct00019
상기 결과는, 쿠페아 후커리아나 C16:0 선호 티오에스테라제 구조물들 중 어느 하나를 함유하는 형질 전환체가 C16:0 지방산 수준에 상당한 영향을 미쳤으며, 이보다는 그 정도가 약하지만, C14:0 지방산 수준에도 영향을 미쳤고, 아울러 야생형에 비해서 C18:1 지방산 수준은 극도로 감소하였음을 나타낸다. 2개의 구조물 내 운반 펩티드의 차이는 pSZ1417 형질 전환체와 비교하였을 때, pSZ1462 형질 전환체 내 C16:0 지방산 수준이 증가하였음을 설명해줄 수 있다.
엘라에이스 기니엔시스(아프리카 기름 야자)로부터 유래하는 2개의 C16:0 선호 티오에스테라제(GenBank 수탁 번호 제AAD422220.2호(서열 번호 152) 및 제ABD83939호(서열 번호 162)인 아미노산 서열과 상응하며, 각각 이.기니엔시스 팔미토일-ACP 티오에스테라제 및 이.기니엔시스 팔미토일-ACP 티오에스테라제 PATE라 칭함)를, 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 유전적 배경에 도입하였다. 코돈 최적화 cDNA 서열과 아미노산 서열은 상기 지정한 바와 같은 서열 목록에 나열되어 있다. 상기 2개의 티오에스테라제는 아미노산 동일성을 상당한 수준으로 공유하지만(94% 초과), 이 테오에스테라제 각각의 아프리카 기름 야자수 내 역할은 여전히 규명되지 않았다. 이.기니엔시스 팔미토일-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 구조물은 pSZ1437로, 그리고 이.기니엔시스 팔미토일-ACP 티오에스테라제 PATE를 암호화하는 구조물은 pSZ1436으로 명명하였다. 상기 발현 구조물은 둘 다 6S 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 82) 및 3'(서열 번호 84) 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접)을 함유하였는데, 상기 재조합 표적화 서열은, 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역과 핵내 게놈으로의 통합 과정에 관여하였다. 이러한 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 159로서 나열되어 있으며, 선택 마커로서 작용하였다. 상기 2개의 구조물에서, 이.기니엔시스 티오에스테라제 암호화 영역은 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 89) 및 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 두었다. 상기 구조물은 둘 다 프로토테카 모리포르미스 유전적 배경으로 형질 전환되었으며, 양성 클론은 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 평판 상에서 스크리닝하였다. 양성 클론의 하위 세트를 선택한 후 지질 생산 조건 하에서 생육하였으며, 지질 프로필은 전술한 직접 에스테르 결합 전이 방법을 사용하여 측정하였다. 선택된 클론의 지질 프로필은 하기 표 20에 요약되어 있다.
Figure 112013079886893-pct00020
pSZ1437에 의해 암호화된 이.기니엔시스 C16:0 선호 티오에스테라제는 C16:0 지방산 수준에 상당한 영향을 미쳤으며, 이보다는 그 정도가 약하지만, C14:0 지방산 수준에도 영향을 미쳤고, 야생형에 비해서 C18:1 지방산 수준은 극도로 감소하였음을 나타낸다. 놀라운 점은, pSZ1436에 의해 암호화된 이.기니엔시스 C16:0 선호 티오에스테라제 PATE는, 이 pSZ1436에 의해 암호화된 티오에스테라제에 대한 아미노산 동일성이 상당한 수준이었음에도 불구하고, C16:0 또는 C14:0 지방산 수준에 대해 비교적 작은 활성을 나타냈다는 점이다.
브라시카 나푸스 유래 C18:0 선호 티오에스테라제를 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 유전적 배경에 도입하였으며, 코돈 최적화된 cDNA 서열 및 아미노산 서열은 상기 지정된 바와 같은 서열 목록 내에 나열되어 있다. 발현 구조물은 6S 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 82) 및 3'(서열 번호 84) 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접)을 함유하였는데, 이 재조합 표적화 서열은, 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역과 핵내 게놈으로의 통합 과정에 관여하였다. 이러한 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 159로서 나열되어 있으며, 선택 마커로서 작용하였다. 비.나푸스 암호화 영역은 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 89) 및 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 두었다. 전체 브라시카 나푸스 발현 카세트를 pSZ1358로 명명하였으며, 이는 프로토테카 모리포르미스 유전적 배경으로 형질 전환되었다. 양성 클론은 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 평판 상에서 스크리닝하였다. 양성 클론의 하위 세트를 선택한 후 지질 생산 조건 하에서 생육하였으며, 지질 프로필을 전술한 직접 에스테르 결합 전이 방법을 사용하여 측정하였다. 선택된 클론의 지질 프로필은 하기 표 21에 요약되어 있다.
Figure 112013079886893-pct00021
상기 결과는, 브라시카 나푸스 C18:0 선호 티오에스테라제 이식 유전자를 함유하는 형질 전환체가 C18:0 지방산 수준에 상당한 영향을 미쳤으며, 이보다는 그 정도가 약하지만, C16:0 지방산 수준에도 영향을 미쳤고, 아울러 야생형에 비해서 C18:1 지방산 수준은 극도로 감소하였음을 나타낸다.
리시누스 커뮤니스 유래 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 유전적 배경에 도입하였으며, 코돈 최적화 cDNA 서열 및 아미노산 서열은 상기 지정된 서열 목록에 나열되어 있다. 발현 구조물은 6S 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 82) 및 3'(서열 번호 84) 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접)을 포함하였는데, 상기 재조합 표적화 서열은, 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역과 핵내 게놈으로의 통합 과정에 관여하였다. 이러한 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 159로서 나열되어 있으며, 선택 마커로서 작용하였다. 알.커뮤니스 암호화 영역은 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 89) 및 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 두었다. 리시누스 커뮤니스 천연 운반 펩티드는 또한 씨.프로토테코이데스 스테아로일 불포화 효소 유래 운반 펩티드(서열 번호 49)로 대체되었으며, 운반 펩티드가 대체된 티오에스테라제의 cDNA 서열은 서열 번호 155로서 나열되어 있다. 전체 리시누스 커뮤니스 발현 카세트는 pSZ1375로 명명되었으며, 이는 프로토테카 모리포르미스 유전적 배경으로 형질 전환되었다. 양성 클론은 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 평판 상에서 스크리닝하였다. 양성 클론의 하위 세트를 선택한 후 지질 생산 조건 하에서 생육하였으며, 지질 프로필은 전술한 직접 에스테르 결합 전이 방법을 사용하여 측정하였다. 선택된 클론의 지질 프로필은 하기 표 22에 요약되어 있다.
Figure 112013079886893-pct00022
상기 결과는, 리시누스 커뮤니스 티오에스테라제 이식 유전자를 함유하는 형질 전환체가 C16:0 지방산 수준에 상당한 영향을 미쳤으며, 이보다는 그 정도가 약하지만, C18:0 지방산 수준에도 영향을 미쳤음을 나타낸다. 또한, 야생형의 수준에 비해서 C18:1 지방산 수준도 동반하여 증가하였다.
실시예 4: 다수의 외인성 이종 티오에스테라제 유전자를 사용하는 프로토테카의 형질 전환
전술한 방법을 사용하여 미세 조류 균주인 프로토테카 모리포르미스(UTEX1435)를 형질 전환하여 하나의 클론에서 다수의 티오에스테라제가 발현되도록 만들었다. 하나의 클론에서 다수의 티오에스테라제가 발현됨에 따라서, 미세 조류는, 임의의 단일 티오에스테라제만이 단독으로 발현될 때와 지방산 프로필이 완전히 상이한 오일을 생산하게 되었다(이전 실시예에서 입증됨). 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)는 처음에, 상동성 재조합법을 사용하여 신나모뮴 캠포라 티오에스테라제(C14 선호 티오에스테라제) 유전자와 함께 수크로스 인버타제 유전자, 그리고 에스.세레비지아에 유래 suc2 유전자(선택은 수크로스 상에서 생장하는 능력을 바탕으로 함)로 형질 전환되었다. 이와 같은 상동성 재조합 구조물에 사용된 DNA는 상기 섹션 III에 기술된 바와 같이 프로토테카 모리포르미스 게놈 DNA의 KE858 영역으로부터 유래한 것이다. 이 유전자 구조물의 관련 부분은 서열 목록 중 서열 번호 51로서 나열하였다. 수크로스 함유 평판 상에서 양성 클론을 스크리닝하였다. 그 다음, 양성 클론을 3개의 카세트들 중 하나로 다시 형질 전환하였는데, 이 경우, 카세트들은 각각 항생제 G418에 대한 내성과, (1) 쿠페아 후커리아나 유래 티오에스테라제 유전자(C8-10 선호), 서열 번호 52; (2) 움벨루라리아 캘리포니카 유래 티오에스테라제 유전자(C12 선호), 서열 번호 53; 또는 얼머스 아메리카나 유래 티오에스테라제(광범위; C10-C16 선호), 서열 번호 54의 부가의 티오에스테라제를 암호화하였다. 각각의 구조물의 관련 부분의 서열도 서열 목록에 포함된다. 티오에스테라제 유전자 둘 다를 발현하는 클론을 50㎍/㎖ G418과 수크로스를 함유하는 배지 상에서 스크리닝하였다. 양성 클론을 선택하고 나서, 이의 생장과 지질 프로필을 평가하였다. 표 23은 대표적인 양성 클론의 지질 프로필을 요약한 것이다(면적%로 표시).
Figure 112013079886893-pct00023
추가로, 씨.캠포라 및 유.캘리포니카 티오에스테라제를 함유하는 이중 티오에스테라제 클론을 22℃에서 50mg/L G418과 2% 수크로스를 함유하는 배지 중에서 생육하였다. 이와 같은 생육 조건 하에 있는 상기 균주로부터 얻어진 지방산 프로필은, C8:0(0); C10:0(0.10); C12:0(31.03); C14:0(7.47); C16:0(15.20); C18:0(0.90); C18:1(30.60); C18:2(12.44); 및 C18:3α(1.38)(총 포화물 = 54.7)이었다.
2개의 상동성 재조합 구조물(하나는 6S 영역을 표적화하며, 다른 하나는 KE858 영역을 표적화함)과 씨.캠포라 티오에스테라제를 함유하는 이중 티오에스테라제 클론을 제조하였다. 양성 클론으로서 대표적인 것의 지방산 프로필은, C8:0 0%; C10:0 0.06%; C12:0 5.91%; C14:0 43.27%; C16:0 19.63%; C18:0 0.87%; C18:1 13.96%; 및 C18:2 13.78%(총 포화물 = 69.74%)이었다. 이 클론의 C12 내지 C14 수준은 49% 이상이었는데, 이는 야생형 세포 내 C12 내지 C14 수준의 37배 이상에 해당하는 수준이었다.
상기 데이터는 다수의 티오에스테라제가 미세 조류 내에서 성공적으로 공동 발현될 수 있음을 보여준다. 다수의 티오에스테라제가 공동 발현되면, 지방산 프로필에 변화가 생겼는데, 즉, 지방산 프로필은 야생형 균주의 지방산 프로필과 상당히 상이할 뿐만 아니라, 개별적 티오에스테라제 중 임의의 하나를 발현시킴으로써 얻어지는 지방산 프로필과도 상이하였다. 중첩 사슬 길이가 특이적인 티오에스테라제를 다수 개 발현하면, 이와 같은 특이적 지방산을 누적 증가시킬 수 있었다.
프로토테카 모리포르미스 내에서 이종 티오에스테라제를 발현(어느 하나만을 단독으로 발현하거나 함께 발현)시키면, 숙주 균주의 지방산/지질 프로필을 변화시켰을 뿐만 아니라, 현재 다양한 종자 작물로부터 얻을 수 있는 오일과 비교하였을 때(표 5) 상기 프로필은 현재 이용되고 있는 기타 다른 시스템 내에서 발견되지 않는, 진정으로 유일한 오일의 프로필이었다. 유전자 이식된 균주는 형질 전환되지 않은 야생형 균주와 확연한 차이를 보였을 뿐만 아니라, 이들 유전자 이식 균주는 표 5에 보여준 시판 오일 중 임의의 것의 프로필과는 확연히 상이한 프로필을 나타냈다. 예를 들어, 코코넛 오일과 팜핵 오일의 C8 내지 C10 지방산 수준은 5.5% 내지 17%였다. 씨.팔루스트리스 C8 선호 티오에스테라제 또는 씨.후커리아나 C10 선호 티오에스테라제를 발현하는 유전자 이식 균주는 각각 C8 내지 C10 지방산을 3.66% 내지 8.65%의 범위 내에서 축적하였다. 이와 같은 C8 내지 C10 지방산 수준은 코코넛 오일과 팜핵 오일의 C8 내지 C10 지방산 수준과 비슷하였으나, 유전자 이식 조류 균주는 상당히 더 높은 수준의 C12:0 지방산이 결여되었으며, 이 균주는 또한 C16:0(유전자 이식체 중 23% 대 코코넛 또는 팜핵 오일 중 11% 내지 16%) 및/또는 C18:1(유전자 이식체 중 50% 내지 57% 대 코코넛 또는 팜핵 오일 중 8% 내지 19%) 수준이 매우 높았다.
쿠페아 라이티 ( Cuphea wrightii ) 티오에스테라제를 발현시켜 균주 UTEX1435 내 라우레이트 및 미리스테이트 풍부 오일 생산
쿠페아 라이티 종자는 C10:0 지방산 25% 이상 및 C12:0 지방산 65% 이상을 함유하는 오일을 축적하는 것으로 보였다. 2개의 FatB 티오에스테라제, CwFatB1(GenBank 수탁 번호 제U56103호) 및 CwFatB2(GenBank 수탁 번호 제U56104호)는 쿠페아 라이티(문헌[Leonard et al,, Plant Mol . Biol . 34(4):669-79 (1997)]에 기술됨)로부터 클로닝하여, 아라비돕시스 탈리아나 내에서 발현하였다(문헌[Leonard et al,, Plant J. 13(5):621-8 (1998)]에 기술됨). CwFatB1 및 CwFatB2를 발현하는 에이.탈리아나 유전자 이식 계열의 지방산 프로필에 있어서는, C12:0 지방산 종이 16% 내지 25% 증가되었음이 확인되었다(Leonard et al, 1998, 상동). 본 발명의 발명자들은, 균주 UTEX1435가 쿠페아 라이티 티오에스테라제, CwFatB1 및 CwFatB2을 발현시킴으로써 라우레이트 및 미리스테이트 풍부 오일을 생산하는 능력을 입증하였다. 본원에 기술된 실시예에서는, CwFatB1 및 CwFatB2를 발현하는 유전자 이식 균주를 전술된 형질 전환법을 사용하여 생산하였다.
CwFatB1 및 CwFatB2의 아미노산 서열을 이하에 보였다(예측 엽록체 표적화 서열에 밑줄을 그어 나타냄). 이와 같은 1차 아미노산 서열을 형질 전환 구조물에 삽입될 해당 유전자를 합성하는데 사용하였다. 2개의 유전자의 뉴클레오티드 서열을 균주 UTEX 1435(전술한 바와 같이 선호 코돈 사용 빈도 이용) 내에서 발현용으로서 최적화하였다.
CwFatB1(U56103):
Figure 112013079886893-pct00024
CwFatB2(U56104):
Figure 112013079886893-pct00025
씨. 라이티 티오에스테라제를 사용하는 UTEX1435 의 형질 전환: 본 실시예에서는, UTEX1435 균주를 씨.라이티 FatB1 및 FatB2 티오에스테라제를 발현하는 카세트가 도입된 수용체 균주로서 사용하였다. 형질 전환 구조물은 티오에스테라제와 함께, 수크로스 상에서 선택될 수 있도록 만드는 카세트(사카로마이세스 세레비지아에 suc2 유전자)를 함유하였다. 세포를, 전술한 바와 같이 유전자 총을 이용하여 형질 전환하였다. 세포를 2% 수크로스 함유 배지 상에서 직접 형질 전환하였다. 형질 전환 구조물을 제조하여, 티오에스테라제 발현이 씨.레인하르드티 B-튜불린 프로모터 또는 내인성 UTEX 1435 Amt3 프로모터에 의해 진행되도록 만들었다.
티오에스테라제 카세트의 부가 버전(천연 고등 식물 운반 펩티드가 조류 운반 펩티드에 의해 치환된 것)을 제조하였다. 이 구조물에 사용된 운반 펩티드는 다음과 같이 명명하였다: TP1은 UTEX250으로부터 유래하는 스테아로일 ACP 불포화 효소에 대한 운반 펩티드를 암호화하는 것이고, TP2는 UTEX1435로부터 유래하는 스테아로일 ACP 불포화 효소에 대한 운반 펩티드를 암호화하는 것이며, TP3은 UTEX1435로부터 유래된 델타 12 지방산 불포화 효소의 운반 펩티드를 암호화하는 것이고, 또한 TP4는 UTEX1435로부터 유래된 이소펜테닐 디포스페이트 합성 효소의 운반 펩티드를 암호화하는 것이다. 본 실시예에 사용된 구조물은 이하 표 24에 나열하였다.
Figure 112013079886893-pct00026
suc2 및 씨. 라이티 FatB1 티오에스테라제를 발현하는 형질 전환 DNA (Const.1): 형질 전환 구조물의 서열, 즉 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_CwFatB1_nr-6S(Const.1으로 명명)을 이하에 제시하였다. 관련 제한 위치는 굵은 글씨체의 소문자에 밑줄을 그어 표시하였으며, SapI , KpnI , AscI , MfeI , BamHI , EcoRI , SpeI , AscI, XhoI , SacI 및 SapI를 5'→3' 방향으로 각각 표시하였다. SapI 위치는 형질 전환 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정하는 것이었다. 구조물의 5' 및 3' 측접부에 존재하는 밑줄 친 서열은, 상동성 재조합을 통해 형질 전환 DNA를 표적 통합할 수 있는, UTEX1435 유래 게놈 DNA를 나타내는 것이다(6S 영역). 5'→3' 방향으로 진행되는 씨.레인하르드티 B-튜불린 프로모터(에스.세레비지아에 suc2 유전자(수크로스 가수 분해 활성을 암호화하므로, 균주가 수크로스 상에서 생육될 수 있도록 허용)를 발현시킴)는 소문자로 박스 안에 표시하였다. suc2 에 대한 개시 인자 ATG 및 종결 인자 TGA는 이탤릭체의 굵은 대문자로 표시하였으며, 암호화 영역은 소문자 이탤릭체로 표시하였다. 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR은 굵은 글씨체의 소문자로 표시하였으며, 이 뒤에는 스페이서 영역이 존재한다. 씨.라이티 TE(CwFatB1)를 발현시키는 씨.레인하르드티 B-튜불린 프로모터는 글씨에 박스를 쳐서 표시하였다. 티오에스테라제(CwFatB1)의 개시 인자 ATG 또는 종결 인자 TGA는 굵은 이탤릭체 대문자로 표시하였으며, 암호화 영역 나머지 부분은 소문자 이탤릭체로 표시하였다. 티오에스테라제의 예측 색소체 표적화 서열은 서열 내 개시 인자 ATG 및 AscI 위치 사이에 존재한다. 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR은 굵은 글시로 표시하였다.
Figure 112013079886893-pct00027
Figure 112013079886893-pct00028
Figure 112013079886893-pct00029
suc2 및 씨. 라이티 FatB2 티오에스테라제를 발현하는 형질 전환 DNA(Const.2): Const.1 유래 CwFatB1 유전자를 코돈 최적화 CwFatB2 유전자로 치환함으로써, SpeI 및 AscI 제한 위치(굵은 글씨체의 소문자에 밑줄 쳐 표시)를 이용하는 형질 전환 구조물, 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_CwFatB2_nr-6S(Const.2로 명명)을 제조하였다. 티오에스테라제(CwFatB2)의 개시 인자 ATG 및 종결 인자 TGA는 굵은 이탤릭체의 대문자로 표시하였으며, 암호화 영역의 나머지 부분은 소문자 이탤릭체로 표시하였다. 티오에스테라제의 예측 색소체 표적화 서열은 서열 내 개시 인자 ATG와 AscI 위치 사이에 존재한다.
Figure 112013079886893-pct00030
amt3 프로모터에 의해 작동되는, suc2 및 씨. 라이티 FatB1 및 FatB2 티오에스테라제를 발현하는 형질 전환 DNA ( Const .3 & 4): Const. 1 및 Const. 2 유래 티오에스테라제를 작동시키는 CrbTub 프로모터를, UTEX1435 유래 Amt3 프로모터(EcoRI 및 SpeI 제한 단편(이하 굵은 글씨체의 소문자에 밑줄 쳐 표시))로 치환하여, 형질 전환 구조물 6S-CrbTub_suc2_nr::Amt3_CwFatB1_nr-6S(Const.3로 명명), 그리고 6S-CrbTub_suc2_nr::Amt3_CwFatB2_nr-6S(Const.4로 명명)를 제조하였다. Amt3 프로모터 영역은 소문자에 박스를 쳐서 표시하였다.
Figure 112013079886893-pct00031
조류 운반 펩티드의 제어 하에 씨. 라이티 FatB1 티오에스테라제를 발현하는 형질 전환 DNA : Const.1 유래 CwFatB1의 천연 운반 펩티드를 이하에 SpeI 및 AscI 제한 단편(굵은 글씨체의 소문자에 밑줄 쳐서 표시)으로서 보인 상응 조류 운반 펩티드로 치환하여, 형질 전환 구조물 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP1-CwFatB1_nr-6S(Const.5로 명명); 구조물 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP2-CwFatB1_nr-6S(Const.6로 명명); 구조물 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP3-CwFatB1_nr-6S(Const.7로 명명) 및 구조물 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP4-CwFatB1_nr-6S(Const.8로 명명)을 제조하였다. 생성된 조류 운반 펩티드 서열은 이하 서열 내 개시 인자 ATG와 AscI 위치 사이에 존재한다.
Figure 112013079886893-pct00032
Figure 112013079886893-pct00033
조류 운반 펩티드의 제어 하에 씨. 라이티 FatB2 티오에스테라제를 발현하는 형질 전환 DNA : Const.2 유래 CwFatB2의 천연 운반 펩티드를, 상기 SpeI 및 AscI 제한 단편(굵은 글씨체의 소문자에 밑줄 쳐 표시)으로 보인 상응하는 조류 운반 펩티드로 치환하여, 형질 전환 구조물 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP1-CwFatB2_nr-6S(Const.9로 명명); 구조물 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP2-CwFatB2_nr-6S (Const.10로 명명); 구조물 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP3-CwFatB2_nr-6S(Const.11로 명명) 및 구조물 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_TP4-CwFatB2_nr-6S(Const.12로 명명)을 제조하였다. 조류 운반 펩티드 서열은 상기 서열 내 개시 인자 ATG와 AscI 위치 사이에 존재한다.
쿠페아 라이티 티오에스테라제를 발현하는 균주의 지방산 프로필: 전술한 구조물로 형질 전환된 균주를, 전술한 바와 같은 오일 생산 가능 조건 하에서 생육하였다. 야생형 UTEX 1435를 글루코스를 바탕으로 생육하였는데, 이때, UTEX 1435의 형질 전환을 통해 생산된 모든 유전자 이식 계열을 수크로스 상에서 생육하였다. 테스트된 각각의 구조물에 있어서, 4개의 형질 전환체를 지방산 프로필에 미치는 영향력에 대해 분석하였다. 유전자 이식 균주의 지방산 프로필을 이하 표 25 내지 표 28에 나타내었다.
CwFatB1 및 CwFatB2를 발현하는 에이.탈리아나의 유전자 이식 계열(표 25)은, C16:0 지방산 축적에 상당히 영향을 받았으며, 아울러 C14:0 및 C12:0 지방산의 축적에도 영향을 받았음이 확인되었다(Leonard et al, 1998, 상동).
표 26에서 볼 수 있는 바와 같이, 유전자 이식 UTEX 1435 계열(천연 고등 식물 운반 펩티드와 함께 CwFatB1(Const.1 & Const.3)을 발현)은, C14:0 지방산 축적에 1차적으로 영향을 받았으며, 이보다 그 정도는 덜하지만 C12:0 지방산 축적에도 영향을 받았다. 유전자 이식 UTEX1435 계열(천연 고등 식물 운반 펩티드와 함께 CwFatB2(Const.2 & Const.4)를 발현)은, C12:0 및 C14:0 지방산 축적에 상당히 영향을 받았으며, 이 경우, C12:0에 대한 영향력은 C14:0에 대한 영향력보다 컸음이 확인되었다. 2개의 프로모터, 즉 CrbTub(Const. 1 & Const.2) 및 Amt3(Const.3 & Const.4)를 비교함으로써, CwFatB1 및 CwFatB2를 발현하는 유전자 이식 계열은, Amt3 프로모터에 의해 작동될 때 C10:0, C12:0, C14:0 및 C16:0 지방산에 대해 상당히 큰 영향을 받았음이 입증되었다.
CwFatB1 티오에스테라제의 발현이 4개의 상이한 조류 엽록체 표적화 서열(Const. 5, 6, 7 및 8)에 의해 작동되는 유전자 이식 계열을 분석한 결과, 조류 운반 펩티드들 중 임의의 것은, 천연 고등 식물 운반 펩티드의 경우보다 티오에스테라제를 색소체에 더욱 효율적으로 표적화하는 것을 확인할 수 있었다(구조물 5 내지 8 내 C12:0 및 C14:0 수준(표 27)과, 구조물 1 내 C12:0 및 C14:0 수준(표 26)을 비교함). 이와 같은 유전자 이식 계열을 추가로 분석한 결과, 4개의 조류 운반 펩티드 TP2(UTEX1435 스테아로일 ACP 불포화 효소 엽록체 표적화 서열) 및 TP3(UTEX 1435 델타 12 지방산 불포화 효소 엽록체 표적화 서열)은, C12:0 및 C14:0 축적에 더욱 큰 영향을 미쳤음이 확인되었다. 이와 같은 2개의 운반 펩티드(TP1 & TP2)는 UTEX 1435 내 CwFatB1을 색소체에 더욱 효율적으로 표적화하는 것으로 보였다.
CwFatB2 티오에스테라제의 발현이 4개의 상이한 조류 엽록체 표적화 서열(Const. 9, 10, 11 및 12)에 의해 작동되는 유전자 이식 계열을 분석한 결과, 조류 운반 펩티드들 중 오로지 하나만이 천연 고등 식물 운반 펩티드(즉 TP-1)에 우수한 성능을 부여하였음이 입증되었다(C12:0 및 C14:0 지방산에 더욱 큰 영향을 미치는 것을 통해 알 수 있음(Const.9 및 Const.2 비교)).
씨.라이티 티오에스테라제가 UTEX 1435 내에서 발현될 때, 이 효소의 영향력은, 아라비돕시스 내에서 발현될 때와 상당히 상이하였다. CwFatB1 및 CwFatB2를 발현하는 에이.탈리아나의 유전자 이식 계열은, C16:0 지방산의 축적과 아울러 C14:0 및 C12:0 지방산의 축적에도 상당히 영향을 받았음을 나타내었다(표 25). 그러나, UTEX 1435 내에서 발현된 CwFatB1 및 CwFatB2의 C16:0 지방산에 대한 영향력 수준은 동일하지 않다. CwFatB1을 발현하는 모든 UTEX 1435 유전자 이식 계열과, CwFatB2를 발현하는 일부 UTEX 1435 유전자 이식 계열(Const. 10, 11, 12) 내 C12:C14 비율은, 이러한 티오에스테라제를 발현하는 에이.탈리아나 유전자 이식 계열 내 C12:C14 비율과 유사하였다(표 29). 그러나, UTEX 1435 유전자 이식 계열의 C14:C16 비율은, 에이.탈리아나 유전자 이식 계열의 C14:C16 비율과 비교하였을 때 상당히 작았다(표 29). Const.2, 4, 9를 사용하여 제조된 UTEX 1435 유전자 이식 계열 내 C12:C14 및 C14:C16 비율은, 동일한 티오에스테라제를 발현하는 에이.탈리아나 유전자 이식 계열 내 C12:C14 및 C14:C16 비율과는 상당히 상이하였다(표 29). 그러므로, UTEX 1435 내에서 CwFatB1 및 CwFatB2이 발현될 때의 오일 프로필은, 동일한 티오에스테라제를 발현하는 아라비돕시스의 유전자 이식 계열 내 오일 프로필과는 상당히 상이하였다. 또한, 이러한 UTEX 1435 유전자 이식 계열 내 오일 프로필은 야생형 UTEX 1435 내 오일 프로필과 확연히 상이하였다.
마지막으로, 본 실시예에 기술된 유전자 이식 계열에 의해 생산된 변형 오일들은 또한, (전술한 바와 같은) 움벨루라리아 캘리포니카 유래 C12:0 특이 티오에스테라제를 발현하는 유전자 이식 UTEX 1435 계열 내 생성되는 라우레이트 풍부 오일들과 상당히 상이하였다.
상기 사항들을 종합하여 보았을 때, 이와 같은 데이터들은, (1) UTEX 1435 내에서 쿠페아 라이티 티오에스테라제가 발현되면, 지방산 프로필에 상당한 영향을 미쳐 독특한 오일이 생산됨; (2) 균주 UTEX 1435 내에서 CwFatB1 티오에스테라제가 발현되면, 미리스테이트가 풍부한 오일이 생산됨; (3) UTEX 1435 내에서 CwFatB2 티오에스테라제가 발현되면, 라우레이트와 미리스테이트 둘 다가 풍부한 오일이 생산됨; (4) 조류 내에서 CwFatB1 및 FatB2가 발현되면, 생산된 중간 길이 사슬의 지방산의 절대 수준과 이 지방산의 상호간 상대 비율의 관점에서, 표준 고등 식물 시스템 내에서 나타나는 프로필과 분명히 구분되는 프로필을 나타냄과 같은 특성들을 나타내었다.
Figure 112013079886893-pct00034
Figure 112013079886893-pct00035
Figure 112013079886893-pct00036
Figure 112013079886893-pct00037
Figure 112013079886893-pct00038
실시예 5: 질소 의존 내인성 프로토테카 프로모터의 동정
A. 내인성 질소 의존 프로모터의 동정 및 특성 규명
cDNA 라이브러리는 표준 기술을 사용하여 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)로부터 생성하였다. 상기 프로토테카 모리포르미스를 질소 풍부 조건 하에서 48시간 동안 생육시켰다. 이어서 5%의 접종물(v/v)을 낮은 질소로 이동시키고 상기 세포를 7일 동안 24시간 마다 수거하였다. 배양 약 24시간 후, 배지 내 질소 공급은 완전히 고갈되었다. 수집된 샘플은 드라이아이스 및 이소프로판올을 사용하여 즉시 동결시켰다. 후속적으로 총 RNA는 동결된 세포 펠렛 샘플로부터 분리하고 각각의 샘플로부터 유래하는 부분은 RT-PCR 연구를 위해 보존하였다. 상기 샘플로부터 수거된 총 RNA의 나머지는 폴리A 선택을 거쳤다. 이어서 각각의 조건으로부터 동몰량의 폴리A 선택된 RNA를 모으고, 이를 사용하여 벡터 pcDNA 3.0(Invitrogen) 중에서 cDNA 라이브러리를 생성하였다. 대략적으로 1200개 클론을 생성된 모아진 cDNA 라이브러리로부터 무작위로 집어내고, 양쪽 가닥을 서열분석하였다. 대략적으로 68개의 상이한 cDNA는 이들 1200개의 서열로부터 선택하고, 이를 사용하여 실시간 RT-PCR 연구에 사용하기 위한 cDNA 특이적 프라이머를 설계하였다.
보존된 세포 펠렛 샘플로부터 분리된 RNA를 상기 생성된 cDNA 특이적 프라이머 세트를 사용한 실시간 RT-PCR 연구에서 기질로서 사용하였다. 상기 보존된 RNA를 cDNA로 전환시키고, 68개 유전자 특이적인 프라이머 세트 각각에 대한 RT-PCR의 기질로서 사용하였다. 역치 사이클 또는 CT 수를 사용하여 시간 전반에 걸쳐 수집된 각각의 RNA 샘플 내에서 68개 cDNA 각각에 대한 상대적인 전사체 풍부함을 나타내었다. 질소 풍부와 질소 고갈된 조건 간의 상당한 증가(3배 초과)를 나타내는 cDNA는 잠재적인 유전자로서 표시하고 이의 발현은 질소 고갈에 의해 상향조절된다. 명세서에서 논의된 바와 같이, 질소 고갈/제한은 유지성 미생물에서 지질 합성의 공지된 유도인자이다.
질소 고갈/제한 동안에 발현이 상향조절된 cDNA 유래의 추정 프로모터/5'UTR 서열을 확인하기 위해, 총 DNA를 질소 풍부 조건 하에서 생장한 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)로부터 분리하고, 이어서 454 서열분석 기술(Roche)을 사용하여 서열분석을 거쳤다. 상기 RT-PCR 결과에 의해 상향 조절된 바와 같은 표시된 cDNA는 454 게놈 서열분석 판독으로부터 비롯된 조립된 콘틱에 대한 BLAST를 사용하여 비교하였다. cDNA의 5' 말단은 특이적 콘틱으로 맵핑하고, 가능한 경우 500bp 초과의 5' 측접 DNA를 사용하여 추정적으로 프로모터/UTR을 확인하였다. 이어서 프로모터/5'UTR의 존재는 게놈 DNA의 PCR 증폭을 사용하여 확인하고 클로닝하였다. 개별 cDNA 5' 말단을 사용하여 3' 프라이머를 설계하고 454 콘틱 조립체의 5' 말단을 사용하여 5' 유전자 특이적 프라이머를 설계하였다.
제1 스크리닝으로서, 추정 프로모터 중 하나인 Aat2(암모늄 수송체, 서열번호 63)로부터 분리된 5'UTR/프로모터를 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소 운반 펩티드와 함께 신나모뮴 캠포라 C14 티오에스테라제 구조물로 클로닝하여, 씨. 소로키니아나 글루타메이트 탈수소화 효소 프로모터를 대체한다. 상기 구조물은 서열번호 81로서 열거되어 있다. 추정 프로모터를 시험하기 위해, 티오에스테라제 구조물을 프로토테카 모리포르미스 세포로 형질 전환시켜 전술된 방법을 사용하여 낮은/무 질소 조건 하에서 C14/C12 지방산 증가에 대해 스크리닝함으로써 실제 프로모터 활성을 확인하였다. cDNA/게놈 스크리닝으로부터 분리된 추정 질소 조정된 프로모터의 유사한 테스트는 동일한 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
cDNA/게놈 스크리닝으로부터 분리된 기타 다른 추정 질소 조절된 프로모터/5' UTR은 다음과 같다.
프로모터/ 5'UTR 서열 번호 증가 배수
FatB/A 프로모터/5'UTR 서열 번호 55 n/a
NRAMP 금속 운반체 프로모터/5'UTR 서열 번호 56 9.65
플랩 플라젤라 연관 단백질 프로모터/5'UTR 서열 번호 57 4.92
SulfRed 아황산염 환원 효소 프로모터/5'UTR서열 번호 58 10.91
SugT 당 운반체프로모터/5'UTR 서열 번호 59 17.35
Amt03-암모늄 운반체 03 프로모터/5'UTR 서열 번호 60 10.1
Amt02-암모늄 운반체 02 프로모터/5'UTR 서열 번호 61 10.76
Aat01-아미노산 운반체01 프로모터/5'UTR 서열 번호 62 6.21
Aat02-아미노산 운반체02 프로모터/5'UTR 서열 번호 63 6.5
Aat03-아미노산 운반체03 프로모터/5'UTR 서열 번호 64 7.87
Aat04-아미노산 운반체04 프로모터/5'UTR 서열 번호 65 10.95
Aat05-아미노산 운반체05 프로모터/5'UTR 서열 번호 66 6.71
증가 배수란, 질소 함량이 낮은 배지 중에서 24시간 동안 배양한 후 cDNA 존재량의 증가 배수를 말한다.
이와 같은 추정 프로모터/5'UTR의 잠재적 조절에 대하여 더욱 자세히 관찰하기 위해서, 서열들 중 8개를 선택하여 (1) FatB/A; (2) SulfRed 아황산염 환원 효소; (3) SugT 당 운반체; (4) Amt02-암모늄 운반체 02; (5) Aat01-아미노산 운반체 01; (6) Aat03-아미노산 운반체 03; (7) Aat04-아미노산 운반체 04; 및 (8) Aat05-아미노산 운반체 05에 대해 추가로 테스트하였다. 다양한 시점, 즉 T0(종자); 종자 접종 후 20시간; 32시간; 48시간; 62시간; 및 114시간의 시점에서 프로토테카 모리포르미스 세포로부터 분리된 RNA를 대상으로 일루미나(Illumina) 서열 결정 판독 결과를 이용하는 고 해상도 전사체 분석법을 수행하였다. T0(종자)의 배지에는 질소가 풍부하였으며, 20시간 경과시로부터 그 이후의 배지에는 질소가 약간 함유되었거나 질소를 아예 함유하지 않았다. 그 다음, 각 시점에서 분리된 RNA로부터 조립 생산된 전사체 콘틱(transcript contig)을, 미리 동정한 8개의 전사체 각각과 독립적으로 블라스팅(blasting)하였다. 그 결과는 하기 표 30에 요약되어 있다.
Figure 112013079886893-pct00039
상기 요약된 결과들로부터, 전사체들 중 몇몇은 시간이 경과함에 따라서 축적량이 증가하였음을 알 수 있었으나, 흥미롭게도 아황산염 환원 효소 mRNA는 시간이 경과함에 따라서 mRNA 축적량이 눈에 띄게 감소하였다.
이와 같은 8개의 추정 프로모터/5'UTR 영역들을 자체의 천연 운반 펩티드가 빠지고 클로렐라 프로토테코이데스(UTEX 250) 스테아로일 ACP 불포화 효소 유래 운반 펩티드로 치환된 씨.캠포라 티오에스테라제 암호화 영역의 상류에 클로닝하였다. 각각의 추정 프로모터/5'UTR 영역 구조물을, 6S 게놈 서열 유래 DNA를 사용하는 상동성 재조합을 통하여 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435에 도입하였다. 또한, 이 구조물 내에는 수크로스 함유 배지/평판 상 양성 클론 선택용 에스.세레비지아에 유래 suc2 수크로스 인버타제 유전자가 함유되어 있었다. Aat01에 대한 구조물의 관련 부위들에 대한 cDNA 서열은 서열 목록 중 서열 번호 67로서 나열하였다. 기타 다른 구조물에 있어서, 동일한 골격이 사용되었는데, 단지 추정 프로모터/5'UTR 서열만이 가변적이었다. 씨.레인하르드티 베타 튜불린 프로모터가 씨.캠포라 티오에스테라제 유전자 발현을 작동시키는데 사용된 부가의 제어 유전자 이식 균주를 생산하였다. 이 프로모터는 관심 유전자의 항상적 발현을 작동하는 것으로 보였으므로, 테스트된 다양한 추정 N-조절 프로모터/5'UTR에 의해 작동될 때 동일한 티오에스테라제 메시지 발현을 측정함에 있어서 유용한 제어 수단을 제공하였다.
일단 유전자 이식 클론이 생산되면, 3개의 독립적 실험을 수행하였다. 처음 2개의 실험에서는 배양액 상청액 중 정상 상태 티오에스테라제 mRNA 수준(RT-PCR로 측정), 지방산 프로필 및 암모니아 수준을 측정함으로써 8개의 추정 프로모터 모두의 잠재적 질소 조절 가능성을 평가하였다. 처음에 클론을 28℃에서 교반하면서(200rpm) 질소 풍부 종자 배지(1g/L 질산 암모늄 - 15mM 질소(암모니아), 4g/L 효모 추출물) 중에서 24시간 내지 48시간 동안 생육하였으며, 이때, 질소 저 함유 배지(0.2g/L 황산 암모늄 - 3mM 질소(암모니아), 0.2g/L 효모 추출물) 50㎖를 접종하는데에는 20OD 유닛(A750)을 적용하였다. 총 6일 동안 24시간 마다 세포의 샘플을 취하되, 저 질소 조건에 대해 스위칭(switching)하기 직전에 샘플을 수집하였다. 이후, 각각의 샘플로부터 취한 세포 일부를 총 RNA 추출(트리졸(Trizol) 시약 사용)에 사용하였다(제조자가 제안하는 방법에 따름). 암모니아 분석 결과, 저 질소 배지 중에서 24시간 경과하였을 때 상청액 중 암모니아 수준이 검출 한계(약 100μM) 이하로 강하되었음을 알 수 있었다.
실시간 RT-PCR에 있어서, 모든 RNA 수준을 각 시점에서 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 내에서 발현된 내부 제어 RNA의 수준에 대해 정규화하였다. 상기 내부 제어 RNA(cd189라 칭함)는 N-아세틸 오르니틴 아미노기 전이 효소를 암호화하는 ARG9 유전자의 생성물이다. 이 실험에 있어서 실시간 RT-PCR에 사용된 프라이머 세트는 다음과 같았다:
Figure 112013079886893-pct00040
각 시점에서 얻은 형질 전환체 각각의 지질 프로필도 구하여, 이를 RT-PCR 결과와 비교하였다. 암모니아 수준, RT-PCR 결과 및 C12 내지 C14 지방산 수준 변화를 바탕으로 하였을 때, 아미노산 운반체 01(Aat-01), 아미노산 운반체 04(Aat-04) 및 암모늄 운반체 02(Amt-02) 서열은 기능상 질소 조절 가능 프로모터/5'UTR을 함유하였다는 결론을 내릴 수 있었다.
RT-PCR 결과를 통하여 보았을 때, Aat-01은 정상 상태 씨.캠포라 티오에스테라제 mRNA 수준을, 대조군(씨.레인하르드티 베타 튜불린 프로모터)의 경우보다 4배 이하로 높게 만드는 기능이 있음이 입증되었다. mRNA 수준은 또한 질소 제한과, 눈에 띄는 C12 내지 C14 지방산 수준 증가와 상관되었다. 이와 같은 결과들은, Aat-01 프로모터 연관 5'UTR이 지질 생합성시 단백질 합성을, 대조군 씨.레인하르드티 프로모터의 경우보다 효율적으로 작동시킬 수 있다는 것을 입증하였다. Aat-01 프로모터와 같이, Aat-04 프로모터는, 씨.레인하르드티 제어 프로모터의 경우보다 mRNA를 5배 이하 정도로 많이 축적시킬 수 있었다. 그러나, Aat-04 프로모터 구조물은 C12 내지 C14 지방산 수준에 중간 정도로 영향을 미칠 수 있는 능력을 가지게 되었다. 이러한 데이터를 통하여, Aat-04 프로모터는 질소 고갈에 의해 명확히 조절 가능하지만, 프로모터 연관 UTR은 번역 인핸서로서의 기능이 떨어지는 경향이 있음이 입증되었다. 마지막으로, Amt-02 프로모터는, 대조군 프로모터의 경우보다 mRNA를 3배 이하로 많이 축적시킬 수 있다는 점에서 Aat-01 프로모터와 유사하였다. mRNA 수준은 또한 질소 제한, 눈에 띄는 C12 내지 C14 지방산 수준 증가와 상관되었다. 이러한 사실들을 종합하여 보면, 이와 같은 프로모터들 3개는 모두 질소에 의해 조절된다는 것이 입증되었다.
B. 암모늄 운반체 3( amt03 ) 프로모터 및 다양한 티오에스테라제 발현에 관한 추가 특성 규명
전술한 바와 같이, 부분 cDNA(암모늄 운반체 02 및 03(amt02 및 amt03)이라 칭함)를 동정하였다. 상기 2개의 부분 cDNA와 함께, 제3의 부분 cDNA(암모늄 운반체 01(amt01)이라 칭함)도 동정하였다. 부분 cDNA 및 추정 번역 아미노산 서열의 배열을 비교하였다. 그 결과들은, amt01은 상기 3개의 서열들과의 관련성이 더욱 낮았으며, amt02 및 amt03은 단지 하나의 아미노산만이 상이하다는 것을 보여주었다.
전술한 바와 같이, 처음에, 부분 cDNA 서열을 로쉬 454 게놈 DNA 조립체 및 일루미나 전사체 조립체에 대해 블라스팅함으로써 컴퓨터로 프로모터/5'UTR을 구성하였다. amt01, amt02 및 amt03을 암호화하는 cDNA와 상동성을 보이는 전사체 접합체를 동정하였으나, 전사체 접합체들은 상기 3개의 mRNA들에 의해 공유되는 서열을 함유하였으므로, 이 전사체 접합체 3개의 mRNA들간에는 차이가 없었다. 로쉬 454 게놈 DNA 조립체는 amt02 및 amt03 cDNA 서열에 대해 힛트(hit)를 부여하였으며, N-말단 단백질 서열을 함유하였다. PCR을 수행하여 5' 측접 영역을 클로닝하였다. 클론 amt02 및 amt03 프로모터/UTR을 입증하는데 사용된 PCR 프라이머는 다음과 같았다:
Amt03 정방향: 5'-GGAGGAATTCGGCCGACAGGACGCGCGTCA-3'(서열 번호 85)
Amt03 역방향: 5'-GGAGACTAGTGGCTGCGACCGGCCTGTG-3'(서열 번호 86)
Amt02 정방향: 5'-GGAGGAATTCTCACCAGCGGACAAAGCACCG-3'(서열 번호 87)
Amt02 역방향: 5'-GGAGACTAGTGGCTGCGACCGGCCTCTGG-3'(서열 번호 88)
상기 2개의 경우에 있어서, 5' 및 3' 프라이머는, 상기와 같은 프로모터/5'UTR 영역의 기능성을 입증하기 위해 발현 벡터에 예상 클로닝하는데 유용한 제한 위치들을 함유하였다.
이와 같이 컴퓨터와 PCR계 방법을 통하여 합체되어 클로닝된 DNA와, amt02(서열 번호 61) 및 amt03(서열 번호 60)을 암호화하는 원 cDNA 간에 쌍 정렬(pair wise alignment)을 수행하였다. 이 정렬의 결과를 통하여, 원 cDNA와, 클로닝된 게놈 서열들 간 상당한 차이가 확인되었는데, 이는 곧, 암모늄 운반체들은 다양한 유전자 군을 대표할 것이라는 것을 암시하는 것이다. 뿐만 아니라, amt03에 대한 병행법을 바탕으로 제조된 프로모터/5'UTR 클론은, 원 amt03 서열과 상이하였던 반면에, amt02 서열과는 동일하였다. amt03 프로모터/UTR 서열(서열 번호 89)의 특성을 규명하는 추가의 실험이 이하에 기술된 바와 같이 수행되었다.
추정 프로모터/UTR 서열을 클로닝하여, 4개의 상이한 티오에스테라제를 발현시킴으로써, 상기 동정된 amt03 프로모터//UTR 서열(서열 번호 89)을 테스트하였다. 발현 카세트는 게놈의 6S 위치에 상동성인 상류 및 하류 재조합 서열(각각 서열 번호 82 및 84)을 함유하였다. 카세트는 또한 수크로스 함유 배지에서 양성 클론들을 선택할 수 있도록 하는 에스.세레비지아에 SUC2 수크로스 인버타제 cDNA를 함유하였다. 수크로스 인버타제 발현은 씨.레인하르드티 베타 튜불린 프로모터에 의해 작동되었으며, 이는 또한 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR이 관여하였다. 그 다음, amt03 프로모터/UTR 서열은, 수크로스 인버타제 카세트 하류와, 다음과 같은 티오에스테라제 유전자 4개중 하나로부터 유래하는 인프레임 티오에스테라제 cDNA 서열 사이에 클로닝되었으며, 상기 amt03 프로모터/UTR 서열은 또한 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR을 함유하였다: (1) 씨.캠포라 유래 C14 티오에스테라제; (2) 유.캘리포니카 유래 C12 티오에스테라제; (3) 유.아메리카나 유래 C10 내지 C16 티오에스테라제; 또는 (4) 씨.후커리아나 유래 C10 티오에스테라제. C14 씨.캠포라 티오에스테라제, C12 유.캘리포니카 티오에스테라제, 그리고 C10 내지 C16 유.아메리카나는 모두, 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소로부터 유래하는 운반 펩티드를 함유하였다. C10 씨.후커리아나 티오에스테라제는 프로토테카 모리포르미스 델타 12 지방산 불포화 효소(FAD) 유래 운반 펩티드를 함유하였다. 모든 경우에서, 서열들은 프로토테카 모리포르미스 내 발현에 최적화된 코돈이었다. 상기 티오에스테라제 구조물들의 서열을 이하 서열 목록에 기술하였다:
amt03 프로모터/UTR::씨.캠포라 티오에스테라제 구조물 서열 번호 90
씨.캠포라 티오에스테라제 구조물 서열 번호 91
유.캘리포니카 티오에스테라제 구조물 서열 번호 92
유.아메리카나 티오에스테라제 구조물 서열 번호 93
씨.후커리아나 티오에스테라제 구조물 서열 번호 94
상기 실시예 2에 기술된 바와 같이, 야생형 프로토테카 모리포르미스 세포로의 유전자 총 형질 전환법을 통하여 유전자 이식 계열을 생산하였으며, 이를 수크로스 함유 평판/배지에서 선택하였다. 이후, 양성 계열을, 자체의 지방산 프로필이 변한 정도에 대해 스크리닝하였다. 그 다음, 4개의 계열들(이 계열들 중 하나는 전술한 4개의 구조물 각각으로 형질 전환하여 생산)을 대상으로 추가 분석을 수행하였다. 계열 76은 씨.캠포라 C14 티오에스테라제를 발현하였으며, 계열 37은 유.캘리포니카 C12 티오에스테라제를 발현하였고, 계열 60은 유.아메리카나 C10 내지 C16 티오에스테라제를 발현하였으며, 또한 계열 56은 씨.후커리아나 C10 티오에스테라제를 발현하였다. 각각의 계열을 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 배지 중에서 48시간 동안 생육하였으며, 14시간, 24시간, 36시간 및 48시간 경과시 세포 샘플(종자 배양액)을 취하여, 지방산 메틸 에스테르로의 직접 에스테르 결합 전이 반응을 통해 지방산 프로필을 측정하고 나서, GC-FID(전술한 바와 같음)로 분석하였으며, 또한 총 RNA를 분리하였다. 48시간 경과 시점이 거의 끝나갈 즈음, 이 세포들을 질소를 함유하지 않거나 낮은 수준으로 함유하는 배양액(이때, 이 배양액은 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하였으며, 또한 pH는 5.0(시트레이트 완충, 최종 농도 = 0.05M) 또는 7.0(HEPES 완충, 최종 농도 = 0.1M)으로 유지됨)에 접종하였다. (지질을 생산함에 있어서) 12시간, 24시간, 72시간 및 108시간 경과시 배양액 샘플을 취하여 지방산 프로파일링을 수행하였으며, 또한 총 RNA를 분리하였다. 상기 배양액의 암모니아 검정법을 통하여, 질소를 낮은 수준으로 함유하는 배지 중에서 24시간 배양하였을 때의 암모니아 수준은 검출 한계(약 100μM) 이하로 떨어졌음을 알 수 있었다.
상기와 같이 샘플을 수집한 각각의 시점에 취한 총 RNA를 대상으로 하여, 티오에스테라제의 mRNA 수준에 대한 실시간 RT-PCR 검정법을 수행하였으며, 이때 구하여진 모든 mRNA 수준은 내부 대조군 RNA(cd189)의 수준에 대해 정규화하였다. 실시간 PCR에 사용된 프라이머 세트를 이하 표 31에 나타내었다.
Figure 112013079886893-pct00041
종자 배양 단계의 각 시점에서의 지방산 프로필 결과들을 통하여, 티오에스테라제의 영향력이 매우 미약함을 알 수 있었다. 지질 생산 단계 개시시, 지방산 프로필은 상당히 영향을 받았는데, 이 경우 이 지방산 프로필은 pH 5.0인 배양액의 경우와 비교하였을 때 pH 7.0로 유지되는 배양액에서는 훨씬 극적으로 증가하였다. pH 7.0 및 5.0 표적 지방산 축적량 간 차이는 테스트된 각각의 티오에스테라제에 따라서 다양하였으나, 전체 효과는 동일하였으며, pH 5.0에서 생육된 세포들은 축적된 표적 지방산 수준이 상당히 낮았으나, 대조군 야생형 세포보다는 상기 축적된 표적 지방산 수준은 더욱 높았다.
티오에스테라제 각각에 대한 정상 상태 mRNA 수준에 대한 배양액 pH의 영향력은 명확하였던 것으로 보아, 이와 같이 매우 밀접하게 상관되어 있는 샘플들로부터 분리된 RNA의 분석 결과는, 지방산 프로필 데이터에 의존적일 것이다. 지방산 축적 데이터와 mRNA 데이터를 종합하였을 때, amt03 프로모터/UTR에 의해 작동되는 티오에스테라제 유전자 발현에 있어서 pH 조절은, 전사 수준 또는 mRNA 안정성중 하나, 또는 이것들 둘 다에 의해 조율되었음을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, 유.캘리포니카 mRNA의 정상 상태 수준은, 씨.후커리아나 mRNA의 정상 상태 수준과 비교하였을 때, 4로그만큼 낮았다. 이와 같은 관찰 결과는, 개별 mRNA 서열이 발현을 제어하는 역할을 할 수 있다는 가설과 일치하였다. 이러한 데이터는, 운반체의 amt03 군에 의해 프로토테카 모리포르미스 내에서의 암모늄 흡수가 pH와 직접적으로 상관되어 있음을 암시하는 것이다.
프로토테카 모리포르미스 세포를, 유.아메리카나 C10 내지 C16 티오에스테라제를 발현하는 amt03 프로모터/UTR 구조물로 형질 전환하여 생산된 계열들 12개를 대상으로 부가의 지방산 프로필 분석을 수행하였다. 전술한 계열 60은 다음과 같은 분석법의 일부였다. 이하 표 32는, 야생형 대조군과 함께 분석되었던 12개의 계열들 중 3개의 지질 프로필을 보여주는 것이다.
Figure 112013079886893-pct00042
상기 표에 나타낸 바와 같이, 총 포화물의 수준은 야생형과 비교하였을 때, 계열 40의 경우 야생형의 총 포화물 수준에 비하여 2.6배 이상 극적으로 증가하였다(분석된 12개의 계열들의 총 포화물 수준은 약 63% 내지 86%였음). 뿐만 아니라, 유.아메리카나 티오에스테라제가 상기와 같은 수준으로 발현될 때, 이 효소는 불포화물(특히 C18:1 및 C18:2) 수준을 극적으로 감소시켰는데(계열 40 및 44 참조), 이 경우, 계열 44에서 C18:1 수준은 야생형의 경우와 비교하였을 때 8배 이상 감소하였다. 뿐만 아니라, 유.아메리카나 티오에스테라제(amt03 프로모터에 의해 발현이 촉발됨)는 중간쇄 길이의 지방산 수준을 상당히 증가시켰다. 계열 44는, C10:0 내지 C14:0 수준이 56% 이상(야생형 균주에서 볼 수 있는 수준보다 약 42배 높음)이었으며, C8:0 내지 C14:0 수준은 57% 이상이었다. 유.아메리카나 티오에스테라제를 발현하는 Amt03 프로모터 구조물로 형질 전환된 부가의 균주들의 대표적인 지질 프로필은, C8:0 0.23%; C10:0 9.64%; C12:0 2.62%; C14:0 31.52%; C16:0 37.63%; C18:0 5.34%; C18:1 7.05%; 및 C18:2 5.03%(총 포화물 백분율 = 86.98%)이었다.
프로토테카 모리포르미스 세포를 구조물 amt03 프로모터/UTR(서열 번호 89)(씨.후커리아나 C10 티오에스테라제(서열 번호 94)를 발현시킴)로 형질 전환하여 부가 지질 프로필을 구하였다. 이 구조물을 발현하는 양성 클론을 선택하여 pH 7.0 조건 하에서 생육하였다. 양성 클론으로부터 얻은 대표적인 지질 프로필은, C8:0 9.87%; C10:0 23.97%; C12:0 0.46%; C14:0 1.24%; C16:0 10.24%; C18:0 2.45%; C18:1 42.81%; 및 C18:2 7.32%이었다. 이 클론의 C8 내지 C10 백분율은 33.84%였다.
이와 같은 데이터들을 종합하였을 때, 이 데이터들은, amt03 프로모터/UTR과 기타 다른 유사 프로모터는 조밀하게 조절되는 프로모터(잠재적으로 독성인 화합물을 발현하고, 유전자 발현을 엄격하게 수행해야 할 때 특히 유용할 수 있음)로서 사용될 수 있음을 암시하고 있다. 프로토테카 모리포르미스가 넓은 pH 범위(pH 5.0 이상 내지7.0)에서 생장할 수 있는 능력은, 이 유기체를 조절 요소, 예를 들어 amt03 프로모터/UTR과 함께 사용되기에 특히 유용하게 만든다. 뿐만 아니라, 상기 지질 프로필 데이터는, amt03 프로모터/UTR이 유전자를 발현하는 인상적인 능력을 입증해주는 것이다.
실시예 6: 미세 조류 프로토테카 모리포르미스 내 포화 지방산 수준의 변경
A. 유전자 녹아웃 접근법에 의한, 스테아로일 ACP 불포화 효소 및 델타 12 지방산 불포화 효소 발현의 감소
생물 정보학을 바탕으로 하는 접근법(cDNA 대상)을 사용하는 유전체학적 스크리닝의 일환으로서, 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 유래 게놈 DNA의 로쉬 454 서열 결정 및 일루미나 전사체, 지방산 불포화에 관여하는 유전자의 특정 군 2개를 동정하였다: 스테아로일 ACP 불포화 효소(SAD) 및 델타 12 지방산 불포화 효소(Δ12 FAD). 스테아로일 ACP 불포화 효소는 지질을 합성하는 경로, 예를 들어 C18:0 지방산으로부터 C18:1 지방산을 합성하는 경로에 관여하는 일원으로서, 이중 결합을 지방산 사슬에 도입하는 기능을 갖는다. 델타 12 지방산 불포화 효소는 또한 지질을 합성하는 경로, 예를 들어 C18:1 지방산으로부터 C18:2 지방산을 합성하는 경로에 관여하는 일원으로서, 이미 불포화된 지방산에 이중 결합을 도입하는 기능을 갖는다. 생물 정보학적 시도가 행해질 때 동정된 지방산 불포화 효소 유전자 군 2개를 바탕으로 하는 프로브를 사용하는 서던 블럿 분석은, 불포화 효소 유전자 각 군은 다수의 군 일원들로 이루어져 있을 것임을 말해주었다. 뿐만 아니라, 스테아로일 ACP 불포화 효소를 암호화하는 유전자들은 2개의 별도 군들에 속하였다. 이와 같은 결과를 토대로 하여, 3개의 유전자 중단 구조물을, 불포화 효소 각 군에 고도로 보존된 암호화 영역을 표적화함으로써, 잠재적으로 다수의 유전자 군 일원들을 중단하도록 설계하였다.
(1) 델타 12 지방산 불포화 효소(d12FAD) 군 일원의 암호화 서열의 고도로 보존된 부분들과 (2) SAD의 개별 군 2개 각각을 표적화하는 2개의 구조물(상기 구조물은 각각 상기 각 군으로부터 유래하는 암호화 서열의 보존된 영역을 함유함)을 사용하여 3개의 상동성 재조합 표적화 구조물을 설계하였다. 이와 같은 기법은, 통상적인 유전자 치환 기법보다 선택가능한 마커 유전자(에스.세레비지아에로부터 유래하는 suc2 수크로스 인버타제 카세트로서, 수크로스를 가수 분해하는 능력을 부여함)를 고도로 보존된 암호화 영역(다수의 군에 속하는 일원들을 표적화함)에 더욱 효율적으로 삽입할 것이며, 이 경우, 상동성 재조합은 표적화된 유전자에 측접하는 영역들을 표적화할 것이다.
전술한 방법들을 사용하여 유전자 총 형질 전환법에 의해 모든 구조물들을 세포에 도입하였는데 즉, 구조물을 선형화한 다음 세포에 발사하였다. 수크로스 함유 평판/배지에서 형질 전환체를 선택하였으며, 지질 프로필 변화는 전술한 방법을 사용하여 분석하였다. 3개의 표적화 구조물 각각으로부터 유래하는 관련 서열들을 이하에 나열하였다:
설 명 서열 번호
표적 구조물 유래 d12FAD의 암호화 영역 유래 5' 서열 서열 번호 72
표적 구조물 유래 d12FAD의 암호화 영역 유래 3' 서열 서열 번호 73
d12FAD 표적화 구조물cDNA 서열 서열 번호 74
SAD2A의 암호화 영역 유래 5' 서열 서열 번호 75
SAD2A의 암호화 영역 유래 3' 서열 서열 번호 76
SAD2A 표적화 구조물cDNA 서열 서열 번호 77
SAD2B의 암호화 영역 유래 5' 서열 서열 번호 78
SAD2B의 암호화 영역 유래 3' 서열 서열 번호 79
SAD2B 표적화 구조물 cDNA 서열 서열 번호 80
구조물 각각으로 형질 전환하여 얻은, 대표적인 양성 클론들을 골라낸 다음, 이 클론들에 대한 지질 프로필을 측정하여(면적%로 표시) 하기 표 33에 요약하였다.
Figure 112013079886893-pct00043
구조물 각각은 지방산의 원하는 군에 측정 가능한 정도의 영향을 미쳤으며, 3가지 경우 모두에 있어서, 특히 2개의 SAD가 녹아웃되었을 때 C18:0 수준은 눈에 띄게 증가하였다. SAD 녹아웃으로 인하여 생산된 클론들 다수 개를 추가로 비교한 결과, SDA2B 녹아웃 계열들은 C18:1 지방산 수준이, SAD2A 녹아웃 계열들에서 관찰되는 C18:1 지방산 수준보다 상당히 많이 감소되었음이 확인되었다.
부가의 Δ12 지방산 불포화 효소(FAD) 녹아웃은, 전술한 방법을 사용하였을 때 프로토테카 모리포르미스 배경에서 나타났다. Δ12FAD의 잠재적인 상동성을 확인하기 위해서 추정 FAD를 암호화하는 게놈 영역을 증폭시키기 위한, 다음과 같은 프라이머들을 사용하였다.
프라이머 1 5'-TCACTTCATGCCGGCGGTCC-3' 서열 번호 101
프라이머 2 5'- GCGCTCCTGCTTGGCTCGAA-3' 서열 번호 102
프로토테카 모리포르미스 게놈 DNA를, 상기 프라이머들을 사용하여 게놈 증폭 생성한 서열들은 매우 유사하였는데, 이는 프로토테카 내에 Δ12FAD의 유전자 또는 대립 유전자 다수 개가 존재함을 암시하는 것이었다.
이와 같은 결과를 바탕으로 하여, 1개 이상의 Δ12FAD 유전자를 불활성화하고자 하는 2개의 유전자 중단 구조물을 설계하였다. 이때 사용된 기법은, 통상의 유전자 치환 기법이 아니고, 수크로스 인버타제(에스.세레비지아에 유래 suc2) 카세트(선택가능한 마커로서 수크로스를 가수 분해하는 능력 부여)를 고도로 보존된 암호화 영역에 삽입하는 기법이었다. 제1 구조물(pSZ1124로 명명)은 에스.세레비지아에 suc2 유전자와 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR(에스.세레비지아에 suc2 카세트)을 발현하는, 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터 측접 5' 및 3'게놈표적화 서열을 함유하였다. 제2 구조물(pSZ1125로 명명)은 에스.세레비지아에 suc2 유전자와 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR을 발현하는, 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터 측접 5' 및 2' 게놈 표적화 서열들을 함유하였다. 이 구조물의 관련 서열을 서열 목록에 나열하였다.
pSZ1124 (FAD2B) 5' 게놈 표적화 서열 서열 번호 103
pSZ1124 (FAD2B) 3' 게놈 표적화 서열 서열 번호 104
에스.세레비지아에 suc2 카세트 서열 번호 105
pSZ1125 (FAD2C) 5' 게놈 표적화 서열 서열 번호 106
pSZ1125 (FAD2C) 3' 게놈 표적화 서열 서열 번호 107
pSZ1124 및 pSZ1125를 각각 프로토테카 모리포르미스 배경에 도입하고, 수크로스를 가수 분해하는 능력을 바탕으로 양성 클론을 선택하였다. 표 34는 pSZ1124 및 pSZ1125 표적화 벡터를 이용한 유전자 이식 계열 2개의 지질 프로필(면적%, 전술한 방법을 사용하여 구함)을 요약한 것이다.
Figure 112013079886893-pct00044
FAD2B(pSZ1124) 구조물을 함유하는 유전자 이식체는 지질 프로필(C18:2 수준)에 있어서 매우 이색적이면서 예상 외의 결과를 보였는데, 즉, 상기 C18:2 수준은 감소하되, 단지 약 1 면적%까지만 감소하는 것으로 예상되었다. 그러나, C18:1 지방산 수준은, 거의 배타적으로 C16:0 수준을 상당히 낮춰가면서 상당히 증가하였다. FAD2C(pSZ1125) 구조물을 함유하는 유전자 이식체는 또한 지질 프로필도 변화하였는데; C18:2의 수준은, C18:1 수준이 증가하였던 것과는 달리, 상당히 감소하였다.
소 우지 모의체
전술한 바와 같은 SAD2B 녹아웃 실험으로부터 생산된 하나의 양성 클론으로서, C14-선호 지방 아실-ACP 티오에스테라제 유전자를 추가로 도입하기 위한 배경으로 사용될 클론을 선택하였다. 씨.캠포라 C14 선호 티오에스테라제를 도입하는데 사용되는 구조물은, 6S 게놈 영역에 대한 표적화 서열(상동성 재조합을 통해 형질 전환 DNA를 표적 통합할 수 있음)을 함유하였으며, 발현 구조물은, neoR 유전자를 발현하는 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터와 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR, 그리고 이것들 다음에는 코돈 최적화 씨.캠포라 티오에스테라제를 발현하는 제2 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터와 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소 운반 펩티드(제2 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR 함유)를 함유하였다. 5'6S 게놈 공여 서열은 서열 번호 82에 나열하였고; 3'6S 게놈 공여 서열은 서열 번호 84에 나열하였으며; 씨.캠포라 티오에스테라제와 관련된 발현 구조물은 서열 번호 83에 나열하였다.
전술한 바와 같은 유전자 총 방법을 사용하여 형질 전환을 수행하였으며, 이때, 세포를 2% 수크로스 함유 평판 상에서 24시간 동안 회수하였다. 이 시간이 경과한 후, 세포를 재현탁하고 나서, 2% 수크로스와 50㎍/㎖ G418(선택용)을 함유하는 평판 상에 재도말하였다. 생산된 양성 클론들 중 9개의 클론들을 지질 생산 및 지질 프로필 분석용으로 선택하였다. 9개의 유전자 이식 클론(SAD2B KO를 함유하며, 씨.캠포라 C14 선호 티오에스테라제를 발현함)을 전술한 바와 같이 배양한 다음, 지질 프로필에 대해 분석하였다. 그 결과들은 하기 표 35에 요약되어 있다. 우지에 대한 지질 프로필도 이하 표 35에 제시하였다(National Research Council 1976: Fat Content and Composition of Animal Product).
Figure 112013079886893-pct00045
상기 표 35에서 살펴볼 수 있는 바와 같이, 유전자 이식 계열의 지질 프로필은 우지의 지질 프로필과 매우 유사하였다. 종합하여 보면, 상기 데이터는 특이적 유전자 이식 배경을, (이와 같은 경우에는 SAD2B 녹아웃) C14 선호 티오에스테라제(씨.캠포라 유래)와 통합하여, 우지의 지질 프로필과 유사한 지질 프로필을 나타내는 오일을 생산하는 유전자 이식 조류 균주를 생산하는 것의 이점을 입증하였다.
B. 프로토테카 세포 내 델타 12 불포화 효소 유전자( FADc )의 하향 조절에 대한 RNAi 접근법
RNAi에 의해 FADc 유전자(델타 12 불포화 효소 유전자) 발현을 하향 조절하는 벡터를 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 유전적 배경에 도입하였다. 사카로마이세스 세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 유전자를 선택가능한 마커(유일한 탄소원으로서 수크로스를 사용하여 생육할 수 있는 능력을 양성 클론에 부여)로서 사용하였다. 제1 유형의 구조물은, 자체의 제1 인트론에 대해 cis 배열로 결합된 FADc 암호화 영역의 제1 엑손의 일부와, 이것의 다음에 존재하는 제1 엑손의 역방향 반복 단위를 이용하였다. 이와 같은 유형의 구조물은 통상적으로 mRNA로서 발현될 때 이론상 헤어핀 RNA로 형성되었다. 상기 제1 유형의 구조물 2개를 제조하였는데, 이것들 중 하나는 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터(서열 번호 89)(pSZ1468로 명명)에 의해 작동되었으며, 제2 구조물은 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터(서열 번호 114)(pSZ1469로 명명)에 의해 작동되었다. 제2 유형의 구조물은, 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터(서열 번호 89)(pSZ1470으로 명명)에 의해 작동되거나, 또는 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터(서열 번호 114)(pSZ1471로 명명)에 의해 작동되는, 크기가 큰 FADc 엑손 2(안티센스 배향)를 이용하였다. 4개의 구조물 모두는, 6S 게놈 영역에 대해 상동성인 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 카세트(서열 번호 159) 및 5'(서열 번호 82) 및 3'(서열 번호 84) 재조합 표적화 서열(구조물에 측접)(핵내 게놈으로의 통합에 사용)을 가졌다. 각 구조물의 관련 부분들과 함께 각 RNAi 구조물의 FADc 부분들의 서열을 다음과 같이 서열 목록으로 나열하였다.
설 명 서열 번호
pSZ1468 FADc RNAi 헤어핀 카세트 서열 번호 163
pSZ1468 구조물의 관련 부분 서열 번호 164
pSZ1469 FADc RNAi 헤어핀 카세트 서열 번호 165
pSZ1469 구조물의 관련 부분 서열 번호 166
pSZ1470 FADc 엑손 2 RNAi 카세트 서열 번호 167
pSZ1470 구조물의 관련 부분 서열 번호 168
pSZ1471 FADc 엑손 2 RNAi 카세트 서열 번호 169
pSZ1471 구조물의 관련 부분 서열 번호 170
4개의 구조물 각각을 프로토테카 모리포르미스 배경에 도입하여 이를 형질 전환하고, 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 평판을 사용하여 양성 클론들을 스크리닝하였다. 각각의 형질 전환체로부터 양성 클론들을 골라낸 다음, 이것들의 하위 세트를 선택하여, pSZ1468, pSZ1469, pSZ1470 및 pSZ1471에 함유된 안티센스 카세트와 헤어핀 구조의 지방산 프로필에 대한 영향력을 분석하였다. 각각의 형질 전환체로부터 선택된 클론들을 지질 생산 조건 하에서 생육하였으며, 이때, 전술한 바와 같이 직접 에스테르 결합 전이 방법을 사용하여 지질 프로필을 분석하였다. 형질 전환체 각각의 대표적인 지질 프로필은 하기 표 36에 요약되어 있다. 야생형 1 및 2 세포들은, 음성 대조군으로서 형질 전환체들 각각과 별도로 생육되는 비형질 전환 프로토테카 모리포르미스 세포였다.
Figure 112013079886893-pct00046
상기 요약된 결과들을 통하여, 헤어핀 구조물인 pSZ1468 및 pSZ1469는 특이적 예상 표현형(즉, 야생형 1 및 야생형 2 각각과 비교하였을 때, C18:2 지방산 수준은 감소하였으며, C18:1 지방산 수준은 증가함)을 보였음을 알 수 있었다. 안티센스 구조물인 pSZ1470 및 pSZ1471은 C18:2 지방산 수준이 감소하지 않았으나, 그 대신, 야생형 1 및 야생형 2와 비교하였을 때 C18:2 지방산 수준은 약간 증가하였고, C16:0 지방산 수준은 약간 감소하였다.
C. 외인성 스테아로일 - ACP 불포화 효소의 발현
올레아 유로파에아 스테아로일-ACP 불포화 효소(GenBank 수탁 번호 제AAB67840.1호)를 프로토테카 모리포르미스 UTEX1435 유전적 배경에 도입하였다. 발현 구조물은 6S 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 82) 및 3'(서열 번호 84) 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접)을 함유하였는데, 이 재조합 표적화 사슬은 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역과 핵내 게놈으로의 통합에 사용되었다. 이와 같은 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트를 서열 번호 159로서 나열하였으며, 이를 선택 마커로 사용하였다. 올레아 유로파에아 스테아로일-ACP 불포화 효소 암호화 영역은 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 89) 및 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 두었으며, 천연 운반 펩티드는 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일-ACP 불포화 효소 운반 펩티드(서열 번호 49)로 치환되었다. 코돈 최적화된 cDNA 서열과 아미노산 서열(운반 펩티드가 치환됨)을 서열 목록 중 서열 번호 171 및 서열 번호 172로 각각 나열하였다. 전체 오.유로파에아 SAD 발현 카세트를 pSZ1377이라 명명하고, 이를 프로토테카 모리포르미스 유전적 배경에 도입하여 이 균주를 형질 전환하였다. 양성 클론을, 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 평판 상에서 스크리닝하였다. 양성 클론들의 하위 세트를 선택하여, 지질 생산 조건 하에서 생육하였으며, 이때, 지질 프로필은 전술한 바와 같은 직접 에스테르 결합 전이 방법을 통하여 분석하였다. 선택된 클론들의 지질 프로필은 하기 표 37에 요약되어 있다.
Figure 112013079886893-pct00047
상기 요약된 결과들은, 이종 불포화 효소(이 경우에는 올레아 유로파에아 유래 스테아로일-ACP 불포화 효소)를 도입하면 C18:1 지방산 수준은 증가할 수 있으며, 아울러 C18:0 및 C16:0 지방산 수준은 감소할 수 있음을 입증하는 것이다.
실시예 7: 하이드록실화된 지방산을 생산하기 위한 프로토테카 조작
리시누스 커뮤니스 올리에이트 12-하이드록실라제(Rc12hydro)(GenBank 수탁 번호 제AAC49010.1호)를 프로토테카 모리포르미스 UTEX1435 유전적 배경에 도입하였다. 발현 구조물은 6S 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 82) 및 3'(서열 번호 84) 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접)을 함유하였는데, 이 재조합 표적화 서열은 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역과 핵내 게놈으로의 통합에 사용되었다. 이와 같은 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트를 서열 번호 159에 나열하였으며, 이를 선택 마커로 사용하였다. 리시누스 커뮤니스 올리에이트 12-하이드록실라제 암호화 영역은 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 89) 및 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 두었다. 코돈 최적화 cDNA 서열 및 아미노산 서열을 각각 서열 목록 중 서열 번호 173 및 서열 번호 174에 나열하였다. 전체 Rc12hydro 발현 카세트는 pSZ1419로 명명하였으며, 이를 프로토테카 모리포르미스 유전적 배경에 도입하여 이 균주를 형질 전환하였다. 양성 클론을 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 평판 상에서 스크리닝하였다. 이와 같은 양성 클론 하위 세트를 선택하고 나서, 지질 생산 조건 하에 생육하여, 알.커뮤니스 올리에이트 12-하이드록실라제 생성물, 즉 리시놀레산에 대해 스크리닝하였다(GC/MS법 사용).
양성 Rc12hydro 유전자 이식체 내에서 생산되는 임의의 리시놀레산을 검출하는데 사용되는 GC/MS법은 다음과 같았다. 양성 클론 및 야생형 대조군 샘플을 건조한 다음, 이를 메탄올-톨루엔 중 4.5 H2SO4 2.2㎖(10:1(v/v)) 중에 현탁하였다. 이후, 이 혼합물을 70℃ 내지 75℃에서 3.5시간 동안 가열하였는데, 이때 중간 중간 초음파 처리 및 와류 처리를 해 주었다. 실온으로 냉각한 다음, 여기에 6% K2CO3(aq) 2㎖ 및 헵탄 2㎖를 첨가한 다음, 이 혼합물을 격렬하게 와류시킨 후, 층들을 원심 분리(900rpm, 2분)에 의해 급속하게 분리하였다. 상층을 분리하고 나서 농축하여 건조하였다(질소 기류 이용). 생성된 오일에 무수 피리딘 500㎕와 BSTFA/1% TMCS(서모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 500㎕를 첨가하였다. 생성된 용액을 70℃ 내지 75℃에서 1.5시간 동안 가열한 후, 농축하여 건조하였다(질소 기류 이용). 그 다음, 잔류물을 헵탄 2㎖ 중에 재현탁하고 나서, 다시 농축하였다. 샘플을 취하여 헵탄 2㎖중에 재현탁한 다음, 서모 트레이스 GC 울트라/DSQII 시스템(Thermo Trace GC Ultra/DSQII system) 상에서 GC/MS에 의해 분석하였다(EI 모드, 리시놀레산 메틸의 TMS 베이스 피크(m/z 187)의 선택적 이온 모니터링법 사용). 지방산 메틸 에스테르를 레스텍 Rxi-5Sil MS 컬럼(Restek Rxi-5Sil MS column)(0.25㎜ ID, 길이 30m 및 필름 두께 0.5㎛) 상에서 분리하였다(캐리어 가스로서 헬륨 사용, 유속 = 1㎖/분). 컬럼의 초기 온도는 4분 동안 130℃로 유지시켰으며, 이후 램프를 사용하여 4℃/분의 속도로 가열하여 최종 온도를 240℃로 만들었다. 샘플 중 리시놀레산의 존재 여부는, 전술한 바와 같이, 정체 시간과 전 스캔 질량 스펙트럼을, 처리된 리시놀레산의 진정한 샘플의 것과 비교함으로써 확인하였다. 도 2는 대표적인 양성 유전자 이식 클론의 GC 정체 시간을, 리시놀레산 표준과 야생형 대조군의 GC 정체 시간과 비교한 결과를 보여주는 것이다. 양성 유전자 이식 클론은 RT:33.22/33.23에서 유도성 피크(리시놀레산 표준에 있어서 유사한 피크와 상응함)를 나타냈는데, 이는 곧, 유전자 이식 클론과 양성 대조군 두가지에 유도성 리시놀레산이 존재한다는 것을 암시한다. 이 피크는 야생형 대조군 샘플에서는 전혀 나타나지 않았다.
실시예 8: 대안적 선택가능한 마커를 사용한 프로토테카 조작
A. 프로토테카 모리포르미스 내 분비 가능한 α- 갈락토시다제의 발현
프로토테카 종 내에서 이종 수크로스 인버타제 유전자를 발현하는 방법과 발현에 따른 효과에 대해서는 이미, 본원에 참조로 포함된 PCT 특허 출원 PCT/US2009/66142에 기술되어 있다. 본 실시예에서는 기타 다른 이종 다당류 분해 효소의 발현을 관찰하였다. MEL1 유전자(사카로마이세스 칼베르겐시스 유래; NCBI 수탁 번호 제P04824호의 서열에 상응하는 아미노산 서열), AglC 유전자(아스퍼질러스 나이저 유래; NCBI 수탁 번호 제Q9UUZ4호의 서열에 상응하는 아미노산 서열), 그리고 고등 식물인 시아몹시스 테트라고노로바(구아 콩) 유래 α-갈락토시다제(NCBI 수탁 번호 제P14749호의 서열에 상응하는 아미노산 서열)와 같은 α-갈락토시다제 암호화 외인성 유전자들 중 하나를 가지는 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435가 멜리비오스(α-D-gal-glu)를 바탕으로 생육할 수 있는 능력을 테스트하였다. 상기 수탁 번호들을 가지는 서열들과 이에 상응하는 아미노산 서열은 본원에 참조로 포함된 것이다. 모든 경우에 있어서, 프로토테카 모리포르미스 내 선호 코돈 사용 빈도에 따라서 유전자를 최적화하였다. 발현 카세트의 관련 부분들을 서열 목록 번호들과 함께 이하에 나열하였다. 모든 발현 카세트들은 안정적인 게놈 통합을 위한 5' 및 3'Clp 상동성 재조합 표적화 서열, 즉 클라미도모나스 레인하르드티 TUB2 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR을 사용하였다.
에스.칼베르겐시스 MEL1 아미노산 서열 서열 번호108
에스.칼베르겐시스 MEL1 아미노산 서열 신호 펩티드 서열 번호 109
에스.칼베르겐시스 MEL1 형질 전환 카세트 서열 번호 110
에스.칼베르겐시스 MEL1 서열(최적화된 코돈) 서열 번호 111
5' Clp 상동성 재조합 표적화 서열 서열 번호 112
3' Clp 상동성 재조합 표적화 서열 서열 번호 113
클라미도모나스 레인하르드티 TUB2 프로모터/5'UTR 서열 번호 114
클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR 서열 번호 115
에이.나이저 AlgC 아미노산 서열 서열 번호 116
에이.나이저 AlgC 아미노산 서열 신호 펩티드 서열 번호 117
에이.나이저 AlgC 서열(최적화된 코돈) 서열 번호 118
에이.나이저 AlgC 형질 전환 카세트 서열 번호 119
씨.테트라고노볼라 α-갈락토시다제 아미노산 서열 서열 번호 120
씨.테트라고노볼라 α-갈락토시다제 서열(최적화된 코돈)서열 번호 121
씨.테트라고노볼라 α-갈락토시다제 형질 전환 카세트 서열 번호 122
프로토테카 모리포르미스 세포를, 에스.칼베르겐시스 MEL1 , 에이.나이저 AlgC 또는 씨.테트라고노볼라 α-갈락토시다제 유전자를 함유하는 발현 카세트 3개 각각으로 형질 전환하였다(상기 실시예 2에 기술된 바와 같은, 유전자 총 형질 전환법 이용). 유일한 탄소원으로서 2% 멜리비오스를 함유하는 평판을 사용하여 양성 클론을 스크리닝하였다. 씨.테트라고노볼라 발현 카세트 형질 전환체를 함유하는 콜로니들은 평판 상에 출현하지 않았다. 양성 클론을, 에스.칼베르겐시스 MEL1 형질 전환체와 에이.나이저 AlgC 형질 전환체를 함유하는 평판으로부터 골라냈다. 형질 전환 DNA의 통합 여부는 씨.불가리스 3'UTR 및 3'Clp 상동성 재조합 표적화 서열의 일부를 표적화하는 프라이머를 사용하는 PCR을 통해 확인하였다.
5'프라이머 씨.불가리스 3'UTR:하류 Clp 서열(서열 번호 123)
ACTGCAATGCTGATGCACGGGA
3'프라이머 씨.불가리스 3'UTR:하류 Clp 서열(서열 번호 124)
TCCAGGTCCTTTTCGCACT
음성 대조군으로서, 형질 전환되지 않은 프로토테카 모리포르미스 세포 유래 게놈 DNA도 상기 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다. 야생형 세포로부터 유래하는 게놈 DNA로부터는 그 어떤 생성물도 증폭되지 않았다.
에스.칼베르겐시스 MEL1 형질 전환체와 에이.나이저 AlgC 형질 전환체 각각으로부터 유래하는 몇 개의 양성 클론들(PCR로 확인)을 대상으로, 지질 배지 중 유일한 탄소원으로서 멜리비오스 상에서 생육할 수 있는 능력에 대해 테스트하였다. 이와 같이 선택된 클론들을 상기 실시예 1에 기술된 기본 배지(유일한 탄소원으로서 멜리비오스 포함)와 조건 하에서 3일 동안 생육하였다. α-갈락토시다제 암호화 유전자들 중 어느 하나를 함유하는 클론들은 모두 이 시기 동안 튼튼하게 생육되었던 반면에, 사카로마이세스 세레비지아에 SUC2 수크로스 인버타제를 발현하는 프로토테카 모리포르미스와 형질 전환되지 않은 야생형 균주는 둘 다 멜리비오스 배지 상에서는 잘 자라지 못했다. 이러한 결과들은, α-갈락토시다제 암호화 유전자가 형질 전환에 있어서 선택가능한 마커로서 사용될 수 있음을 암시하는 것이다. 또한, 이 데이터들은 에스.칼베르겐시스 MEL1 (서열 번호 109) 또는 에이.나이저 AlgC (서열 번호 117) 내에 존재하는 천연 신호 펩티드가 단백질을 프로토테카 모리포르미스 세포 내 주변 세포질에 표적화하는데 유용함을 암시하는 것이다.
B. 프로토테카 내 THIC 유전자 상보체 티아민 영양 요구성
외인성 THIC 유전자의 발현을 이용하여 프로토테카 모리포르미스 세포 내 티아민 원 영양성을 관찰하였다. 식물과 조류 내 티아민 생합성은 통상적으로 색소체 내에서 수행되므로, 단백질 생산에 관여하는 대부분의 핵내 암호화 단백질은 색소체에 효율적으로 표적화되어야 할 것이다. 프로토테카 모리포르미스 세포의 DNA 서열 결정 및 전사체 서열 결정 결과, 티아민 생합성 효소를 암호화하는 유전자 모두(THIC 제외)는 게놈 내에 존재한다는 것이 규명되었다. 생화학적 수준으로 티아민 영양 요구성에 관여하는 병터를 나누기 위해서, (1) 2μM 티아민 하이드로클로라이드의 존재; (2) 티아민 부재; (3) 티아민은 존재하지 않되, 2μM 하이드록시에틸 티아졸(THZ)은 존재; (4) 티아민은 존재하지 않되, 2μM 2-메틸-4-아미노-5-(아미노메틸)피리미딘(PYR)은 존재; 그리고 (5) 티아민은 존재하지 않되, 2μM THZ 및 2μM PYR은 존재와 같은 5개의 상이한 조건 하에서의 프로토테카 모리포르미스 세포의 생장을 관찰하였다. 상기와 같은 5개의 상이한 조건 하에서 생육 실험을 수행한 결과들은, 프로토테카 모리포르미스 세포가 새로운 방식의 합성을 수행할 수 있지만, 만일 PYR 전구체가 제공되면 오로지 티아민 피로포스페이트(TPP)만을 생산할 수 있음을 암시한다. 이와 같은 결과는 프로토테카 모리포르미스의 티아민 영양 요구성은, (THIC 효소에 의해 촉매화되는 전환 과정인) 아미노이미다졸 리보뉴클레오티드로부터 하이드록시메틸피리미딘 포스페이트(HMP-P)로의 합성 과정을 진행시킬 수 없기 때문에 발생하는 것이라는 가설과 일치한다.
상기 실시예 2에 기술된 유전자 총 형질 전환법을 통하여, 선택 마커로서 코코믹사 C-169 THIC(JGI 단백질 ID 30481에 상응하는 아미노산 서열로서 본원에는 참조로 포함됨) 및 에스.세레비지아에 SUC2 수크로스 인버타제를 발현하는, 프로토테카 모리포르미스 세포를 형질 전환하였다. 상기 발현 구조물은 코코믹사 C-169 THIC 유래 천연 운반 펩티드 서열, 게놈 DNA의 6S 영역에 상동성인 상류 및 하류 재조합 표적화 서열, 씨.레인하르드티 TUB2 프로모터/5'UTR 영역(서열 번호 104) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR(서열 번호 115)을 함유하였다. 상기 에스.세레비지아에 SUC2 발현은 또한 씨.레인하르드티 TUB2 프로모터/5'UTR 영역(서열 번호 114)에 의해 작동되었으며, 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR(서열 번호 115)을 함유하였다. 유전자는 프로토테카 모리포르미스 내 선호 코돈 사용 빈도에 따라서 최적화하였다. 관련 발현 카세트 서열을 이하 서열 목록에 상세히 나열하였다:
코코믹사 C-169 THIC 아미노산 서열 서열 번호 125
코코믹사 C-169 THIC 아미노산 서열 천연 운반 펩티드 서열 번호 126
코코믹사 C-169 THIC 형질 전환 카세트 서열 번호 127
코코믹사 C-169 THIC 서열(최적화된 코돈) 서열 번호 128
에스.세레비지아에 SUC2 서열(최적화된 코돈) 서열 번호 129
5'6S 상동성 재조합 표적화 서열 서열 번호 82
3'6S 상동성 재조합 표적화 서열 서열 번호 84
양성 클론은, 티아민을 함유하지 않고 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 평판 상에서 선택되었다. 양성 클론은, 코코믹사 C-169 THIC 유전자 내에서 결합하는 5'프라이머와, 6S 위치 내 형질 전환 DNA의 하류에 어닐링되는 3'프라이머를 사용하는 PCR로써 확인되었다. PCR로 확인된 양성 클론은 또한, 서던 블럿 검정법을 사용하여 확인되기도 하였다.
야생형 프로토테카 모리포르미스 세포의 티아민 영양 요구성을 관찰하기 위하여는 우선, 내부 티아민 보존 세포를 고갈시켜야 했다. 티아민을 함유하지 않는 배지 중에서의 생장을 테스트하기 위해서 우선, 세포를 2μM 티아민을 함유하는 배지 중 고정 상에서 생육한 다음, 이 세포를 티아민 불포함 배지 중 750㎚에서의 광학 밀도(OD750)가 약 0.05가 되도록 희석하였다. 그 다음, 희석된 세포들을 티아민 불포함 배지 중 고정 상에서 다시 생육하였다(약 2일 내지 3일). 이와 같은 티아민 결핍 세포를, 티아민을 함유하지 않는 배지 중 생장 연구를 위해 배양액에 접종하였다. 야생형 세포를, 탄소원으로서 글루코스를 함유하는(또한 티아민을 함유하거나 함유하지 않는) 배지 중에서 생육한 다음, 천연 운반 펩티드 코코믹사 C-169 THIC 구조물을 포함하는 양성 클론을 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 배지 중에서 생육하였다. 생장은 750㎚에서의 흡광도를 모니터링함으로써 측정하였다. 생장 실험의 결과를 통하여, 티아민 불포함 배지 중 야생형 세포의 생장과 비교하였을 때 티아민 불포함 배지 중 이식 유전자를 발현하는 균주의 생장이 훨씬 컸음을 알 수 있었다. 그러나, 형질 전환체의 세포 생장 속도와 세포 밀도는 티아민 함유 배지 중 야생형 세포의 생장 속도와 세포 밀도에 못미쳤다. 또한, 티아민 불포함 배지 중 형질 전환체 클론의 생장량과, 통합된 코코믹사 효소의 복사체 수 간에는 강한 상관 관계가 있었다(즉, 티아민 불포함 배지 중 이식 유전자의 복사체 수는 더욱 많았으며, 이 배지 중에서 세포는 더욱 잘 생장하였다).
코코믹사 THIC, 아라비돕시스 탈리아나 THIC 유전자, 그리고 시네코시스티스 종 PCC 6803 thiC 유전자를 함유하는 발현 구조물을 사용하여 부가의 형질 전환체를 제조하였다. 코코믹사 및 에이.탈리아나 THIC 유전자의 경우, 천연 운반 펩티드 서열은 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일-ACP 불포화 효소(SAD) 유전자 유래 운반 펩티드 서열과 치환되었다. 시네코시스티스 종은 시아노박테리아이며, thiC 단백질은 천연 운반 펩티드 서열을 함유하지 않는다. 시네코시스티스 종 thiC 구조물에 있어서, 클로렐라 프로토테코이데스 SAD 유전자 유래 운반 펩티드 서열을 시네코시스티스 종 thiC의 N-말단에 융합하였다. 모든 경우에 있어서, 서열들은 프로토테카 모리포르미스 내 발현에 대해 최적화된 코돈이었다. 상기 구조물들 3개는 모두 게놈의 6S 영역에 상동성인 상류 및 하류 재조합 표적화 서열(서열 번호 82 및 84), 클로렐라 프로테코이데스 액틴 프로모터/5'UTR, 그리고 클로렐라 프로토테코이데스 EF1A 유전자 3'UTR을 함유하였다. 3개의 구조물은 모두 씨.레인하르드티 TUB2 프로모터/5'UTR(서열 번호 114)에 의해 작동되는 neoR 유전자를 함유하였으며, 또한 G418에 의해 선택되도록 하는 씨.불가리스 3'UTR(서열 번호 115)을 함유하였다. 에이.탈리아나 THIC의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 제NP_180524호에 해당하고, 시네코시스티스 종 thiC의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 제NP_442586호에 해당하며, 이들 서열은 둘 다 본원에 참조로 포함된 것이다. 관련된 발현 카세트 서열은 이하 서열 목록에 상세히 나열하였다:
씨.프로토테코이데스 운반 펩티드 함유 코코믹사 THIC 발현 구조물
서열 번호 130
씨.프로토테코이데스 운반 펩티드 함유 코코믹사 THIC 서열 번호 131
씨.프로토테코이데스 액틴 프로모터 /5'UTR 서열 번호 132
씨.프로토테코이데스 EF1A 3'UTR 서열 번호 133
에이.탈리아나 THIC 발현 구조물 서열 번호 134
씨.프로토테코이데스 운반 펩티드 함유 에이.탈리아나 THIC 서열 번호 135
천연 운반 펩티드 함유 에이.탈리아나 THIC 아미노산 서열 서열 번호136
시네코시스티스 종 thiC 발현 구조물 서열 번호 137
씨.프로토테코이데스 운반 펩티드 함유 시네코시스티스 종 thiC
서열 번호 138
시네코시스티스 종 thiC 아미노산 서열 서열 번호 139
neoR 유전자 서열 번호 140
양성 클론을, G418을 함유하는 평판 상에서 스크리닝하였으며, 각각의 형질 전환으로부터 유래하는 몇몇 클론들을 골라내어 PCR로 확인하였다. 코코믹사 C-169(씨.프로토테코이데스 운반 펩티드 함유), 에이.탈리아나 및 시네코시스티스 종 PCC 6803 THIC 유전자를 함유하는 형질 전환 DNA 구조물을 각각 게놈의 6S 위치에 통합한 결과는, 다음과 같은 프라이머들을 사용하는 PCR 분석법을 통하여 확인되었다.
5'THIC 코코믹사 확인 프라이머 서열(서열 번호 141)
ACGTCGCGACCCATGCTTCC
3'THIC 확인 프라이머 서열(서열 번호 142)
GGGTGATCGCCTACAAGA
5'THIC 에이.탈리아나 확인 프라이머 서열(서열 번호 143)
GCGTCATCGCCTACAAGA
5'thiC 시네코시스티스 종 확인 프라이머 서열(서열 번호 144)
CGATGCTGTGCTACGTGA
G418 함유 배지 중 상이한 구조물 각각의 형질 전환체로부터 선택 확인된 양성 클론을 사용하여, (전술한 바와 같이) 티아민 결핍 세포를 대상으로 하는 생장 실험을 수행하였다. 모든 형질 전환체는 티아민 불포함 배지 중에서 (다양한 견고성 정도로) 생육할 수 있었다. 티아민 불포함 배지 중 형질 전환체의 생장과 티아민 함유 배지 중 야생형 세포의 생장을 비교한 결과, 티아민 불포함 배지 중 생장을 지속할 수 있는 능력에 있어서, (1) 에이.탈리아나 형질 전환체; (2) 코코믹사 C-169(씨.프로토테코이데스 운반 펩티드 함유) 형질 전환체; 및 (3) 시네코시스티스 종 형질 전환체와 같은 순위가 매겨졌다. 이와 같은 결과들은, 에이.탈리아나 THIC 복사체 하나는 프로토테카 모리포르미스 세포 내 티아민 영양 요구성을 보완할 수 있었으며, 코코믹사 C-169(천연 운반 펩티드 서열 또는 씨.프로토테코이데스 유래 운반 펩티드 서열 중 어느 하나를 포함) 복사체 다수 개와 시네코시스티스 종 THIC 는 티아민 부재 하에 신속하게 생장할 수 있어야 함을 암시하는 것이다. 상이한 공급원으로부터 유래하는 상이한 THIC로 인한 결과가 다양하였으므로, 임의의 특정 THIC 유전자가 프로토테카 종 내에 존재하는 병터를 완전히 보완할 수 있는 능력은 예측 불가능하였다.
3개의 THIC 아미노산 서열의 정렬을 수행하였다. 시네코시스티스 종 유래 thiC와, 코코믹사 및 에이.탈리아나 유래 THIC 간 서열 보존 수준은 유의적이었던 반면에(아미노산 수준에서 41% 동일), 시아노박테리아 단백질에는 조류 및 식물 단백질에 잘 보존되어 있는, N-말단 존재 도메인이 존재하지 않았다. 도메인이 존재하지 않음에도 불구하고(그리고 이로 인하여 구조상에도 차이가 있을 수 있음에도 불구하고), 시네코시스티스 종 thiC 를 발현하는 구조물은 프로토테카 모리포르미스 세포 내 티아민 원 영양성을 최소한 부분적으로나마 복구할 수 있었다.
실시예 9: 연료 생산
A. 익스펠러 프레스 및 프레스 보조 장치를 사용한 미세 조류로부터 오일의 추출
DCW를 기준으로 38%의 오일을 함유하는 미세 조류 바이오매스는 드럼 건조기를 사용하여 건조시켜 수분 함량이 5% 내지 5.5%가 되게 하였다. 상기 바이오매스는 프렌치 L250 프레스에 공급하였다. 30.4kg(67lbs.)의 바이오매스를 프레스를 통해 공급하고 오일은 회수하지 않았다. 프레스 보조기로서 다양한 백분율의 스위치그래스와 조합된 동일한 건조된 미세 조류 바이오매스를 프레스를 통해 공급하였다. 건조된 미생물 바이오매스와 20% w/w의 스위치그래스의 조합으로 최상의 총 백분율의 오일을 회수하였다. 이어서 프레스된 케이크는 헥산 추출을 거치고 20% 스위치그래스 조건에 대한 최종 수율은 총 이용가능한 오일(중량으로 계산함)의 61.6%이었다. 상기 50% 이상의 오일 건조 세포 중량을 갖는 바이오매스는 오일을 유리시키기 위해 스위치그래스와 같은 프레싱 보조기의 사용을 필요로 하지 않는다. 익스펠러 프레스를 사용하여 미세 조류로부터 오일을 추출하는 기타 다른 방법은 본원에 참조로 포함되어 있는 PCT 특허 출원 PCT/US2010/31108호에 기술되어 있다.
B. 프로토테카 오일로부터 바이오디젤의 생성
전술된 방법에 따라 생성된 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 유래의 고무 성질이 제거된 오일을 에스테르 결합 전이를 거쳐서 지방산 메틸 에스테르를 생성하였다. 결과는 하기 표 38에 나타내어져 있다.
오일의 지질 프로필은 다음과 같다:
Figure 112013079886893-pct00048
Figure 112013079886893-pct00049
Figure 112013079886893-pct00050
바이오디젤의 지질 프로필은 원료공급 오일의 지질 프로필과 매우 유사하였다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공된 기타 다른 오일은 에스테르 결합 전이를 거쳐서 (a) C8 내지 C14 4% 이상; (b) C8 0.3% 이상; (c) ClO 2% 이상; (d) C12 2% 이상; 및 (e) C8 내지 C14 30% 이상을 포함하는 지질 프로필을 갖는 바이오디젤을 생성할 수 있다.
생성된 바이오디젤의 ASTM D6751 A1 방법에 의한 콜드 소킹 여과능은 300ml의 용적에 대해 120초였다. 이러한 시험은 16시간 동안 40℉로 냉각되고 실온으로 가온되도록 하며 스테인리스강 지지체와 함께 0.7마이크론 유리 섬유 필터를 사용하여 진공 여과하는 300ml의 B100의 여과를 포함한다. 본 발명의 오일은 에스테르 결합 전이하여 바이오디젤을 생성시킬 수 있으며, 이 때 콜드 소킹 시간은 120초 미만, 100초 미만 및 90초 미만이다.
C. 재생 디젤의 생산
전술된 방법에 따라 제조되고 본 실시예에서 바이오디젤을 제조하는데 사용되는 오일과 동일한 지질 프로필을 갖는, 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 유래의 고무 성질이 제거된 오일은 에스테르 결합 전이를 거쳐서 재생 디젤을 생성하였다.
상기 오일을 먼저 수소화처리하여 산소 및 글리세롤 골격을 제거하여 n-파라핀을 생성하였다. 상기 n-파라핀은 이어서 크래킹 및 이성체화를 거쳤다. 상기 물질의 크로마토그램은 도 1에 나타내어져 있다. 상기 물질은 이어서 냉 여과를 거쳐서 C18 물질의 약 5%를 제거하였다. 냉 여과 후, 총 용적의 물질을 인화점으로 컷팅하고, 인화점, ASTM D-86 증기 분포, 혼탁점 및 점도에 대해 평가하였다. 인화점은 63℃이었고, 점도는 2.86cSt(센티스토크)이었으며; 혼탁점은 4℃이었다. ASTM D86 증류가는 표 39에 나타내어져 있다.
Figure 112013079886893-pct00051
생성된 물질의 T10-T90은 57.9℃이었다. 본원에 개시된 오일의 수소화처리, 이성체화 및 기타 다른 공유적 변형 방법, 및 본원에 개시된 증류 및 분별(예를 들어, 냉여과) 방법을 사용하여, 본원에 개시된 방법에 따라 생성된 트리글리세라이드 오일을 사용하는 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 60℃ 및 65℃와 같은 기타 다른 T10-T90 범위를 갖는 재생 디젤 조성물 생성할 수 있다.
생성된 물질의 TlO은 242.1℃이었다. 본원에 개시된 오일의 수소화처리, 이성체화 및 기타 다른 공유적 변형 방법, 및 본원에 개시된 증류 및 분별(예를 들어, 냉여과) 방법을 사용하여, 180 내지 295, 190 내지 270, 210 내지 250, 225 내지 245, 및 290 이상의 T10과 같은 기타 다른 T10 값을 갖는 재생 디젤 조성물을 생성할 수 있다.
생성된 물질의 T9O은 300℃이었다. 본원에 개시된 오일의 수소화처리, 이성체화 및 기타 다른 공유적 변형 방법, 및 본원에 개시된 증류 및 분별(예를 들어, 냉여과) 방법을 사용하여, 280 내지 380, 290 내지 360, 300 내지 350, 310 내지 340, 및 290 이상의 T90과 같은 기타 다른 T90 값을 갖는 재생 디젤 조성물을 생성할 수 있다.
생성된 물질의 FBP는 300℃이었다. 본원에 기술된 오일의 수소화처리, 이성체화 및 기타 다른 공유적 변형 방법, 및 본원에 기술된 증류 및 분별(예를 들어, 냉여과) 방법을 사용하여, 290 내지 400, 300 내지 385, 310 내지 370, 315 내지 360, 및 300 이상의 FBP와 같은 기타 다른 FBP 값을 갖는 재생 디젤 조성물을 생성할 수 있다.
(a) C8 내지 C14 4% 이상; (b) C8 0.3% 이상; (c) ClO 2% 이상; (d) C12 2% 이상; 및 (e) C8 내지 C14 30% 이상을 포함하는 지질 프로필을 갖는 오일을 포함하는, 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공된 기타 다른 오일은 조합된 수소화처리, 이성체화 및 기타 다른 공유적 변형을 거칠 수 있다.
본 발명은 이의 특정 구체예와 관련하여 기술되었지만, 추가의 변형이 가능함이 이해될 것이다. 본원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따르고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되거나 통상적인 실시 범위 내에 있고 이전에 제시된 필수적 특징에 적용될 수 있는 바와 같이, 본 개시 내용을 벗어나는 것을 포함하는 본 발명의 임의의 변형, 용도 또는 적용을 포함하는 것으로 의도된다.
실시예 10: C18 :2 및 C18 :3 글리세로지질을 생산하기 위한 미생물 조작
조류 및 식물 내에서의 지질 합성은, 색소체 피루베이트 탈수소화 효소 복합체를 통해 글루코스 또는 기타 다른 탄소원을 아세틸 CoA로 전환하는 것으로 시작되었다. 그 다음, 중탄산염을 기질로서 사용하는 아세틸 CoA 카복실라제(ACCase)는 3-C 화합물, 말로닐 CoA를 생성하였다. 그 다음, b-케토아실-ACP(아실기 운반 단백질) 합성 효소 III(KAS III)은, 말로닐 CoA와 아세틸 CoA 간 제1 축합 반응을 촉진하여 4-C 화합물을 생성하였다. 연속적 2-C의 부가(C16:0를 이용함)는 KAS I에 의해 촉진되었다. 마지막으로, C18:0으로의 2-C 연장 과정은 KAS II에 의해 촉진되었다. 티오에스테라제(TE)는 아실-ACP의 연장을 종결시켰다. 가용성 효소, 스테아로일 ACP 불포화 효소(SAD)는 C18:0-ACP 기질에 대하여 활성을 가졌으며, 또한 D9 위치에 이중 결합을 형성하여 올리에이트-ACP를 생성하였다. 생성된 C18:1 지방산은 올리에이트 또는 광범위한 특이성을 가지는 TE 중 어느 하나의 작용으로 ACP로부터 유리되었다.
색소체 내 ACP로부터 일단 유리된 모든 지방산은 ER, 즉 지질(TAG) 생합성이 일어나는 곳으로 운반되었다. 포괄적으로 말하면, 고등 식물 내 ER에서 일어나는 지질 생합성 경로는 2개가 존재하는데, 이들 2개의 경로는 어느 정도 기질을 공유하는 것이 분명하다. 지방 아실 CoA 독립 경로는, 매우 선택적인 기질 특이성을 나타낼 수 있는 아실리소포스파티딜콜린 아실 트랜스퍼라제를 사용하는 포스파티딜 콜린(P-콜린) 부들 사이에 지방 아실 기들을 운반하며, 궁극적으로는 상기 지방 아실기들을 디아실글리세롤(DAG)로 운반하였다. 효소 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(DGAT)는 최종 운반 과정, 즉 아실 CoA 기질 유래 지방 아실 기를, DAG를 거쳐 마지막으로 트리아실 글리세롤로 운반하는 과정을 수행하였다. 다른 한편, 지방 아실 CoA 종속 경로는, 기질로서 지방 아실 CoA를 사용하여 지방 아실기를, 각각 글리세롤 포스페이트 아실트랜스퍼라제(GPAT), 리소포스파티딘산 아실트랜스퍼라제(LPAAT) 및 DGAT의 작용을 통하여, 글리세롤-3-포스페이트, 리소포스파티딘산(LPA) 및 DAG로 운반하였다.
C18:2 및 C18:3을 포함하는 TAG를 합성하도록 미생물을 조작하는데 유용한 효소로서는 b-케토아실-ACP 합성 효소 II(KAS II), 스테아로일 ACP 불포화 효소(SAD), 티오에스테라제, 예를 들어 올리에이트 특이적 티오에스테라제, 지방산 불포화 효소(FAD), 그리고 글리세로지질 불포화 효소, 예를 들어 ω-6 지방산 불포화 효소, ω-3 지방산 불포화 효소, 또는 ω-6 올리에이트 불포화 효소를 포함한다. 상이한 효소들은 미생물 내에서 단독으로, 또는 C18:2 또는 C18:3 지방산을 증가시키거나 TAG를 생산하면서 과발현될 수 있었다. KAS II 효소 활성의 발현이 증가함에 따라서, 팔미테이트(C16:0)로부터 스테아레이트(C18:0) 쪽으로, 그리고 그 이상의 프로필을 가지는 지방산으로 탄소가 축적되었다. 몇몇 후보 KAS II 효소의 아미노산 서열을 이하 표 40에 제시하였다. 개시된 KAS II 서열은 올레 지방산, 리놀레 지방산 또는 리놀렌 지방산의 수준을 특이적으로 상승시키는 고등 식물 종으로부터 유래하였다. 당업자는 KAS II에 대한 기타 다른 유전자, 예를 들어 자트로파 컬카스 유전자(GenBank 수탁 번호 제ABJ90469.2호), 글리신 맥스 유전자(GenBank 수탁 번호 제AAW88762.1호), 엘라에이스 올레이페라 유전자(GenBank 수탁 번호 제ACQ41833.1호), 아라비돕시스 탈리아나 유전자(GenBank 수탁 번호 제AAL91174호), 비티스 비니페라 유전자(GenBank 수탁 번호 제CBI27767호) 및 고시피움 히르서텀 유전자(GenBank 수탁 번호 제ADK23940.1호)(이에 제한되는 것은 아님)를 동정할 수 있을 것이다.
예시적 KAS II 효소
KAS II 효소 서열 번호
리시누스 커뮤니스 서열 번호 175
헬리안투스 아너스 서열 번호 176
브라시카 나푸스 서열 번호 177
글리신 맥스 서열 번호 178
피.모리포르미스 서열 번호 179
리놀레 지방산과 리놀렌 지방산의 수준을 높이기 위해, 증가된 수준의 스테아레이트를 올레산(C18:1)으로 전환시키는 것은, 하나 이상의 지질 경로 효소를 미생물 내에서 과발현시킴으로써 이루어질 수 있었다. 불포화물의 수준을 상승시킬 수 있는 활성을 가지는 부가 효소 2가지로서는 스테아로일 ACP 불포화 효소(SAD) 및 올리에이트 특이적 티오에스테라제가 있다. 이와 같은 효소들 중 하나 또는 둘 다의 작용을 통하여, 증가된 수준의 스테아레이트(C18:0)를 올레산으로 전환시키는 것은, 우선 리놀레 지방산과 리놀렌 지방산을 형성시킴으로써 이루어질 수 있었다.
올레산 수준을 상승시키기 위해 과발현하는데 유용한 예시적 SAD 효소의 아미노산 서열을 표 41에 제시하였다. 뿐만 아니라, 피.모리포르미스로부터 유래하는 내인성 SAD(서열 번호 180)는 또한 C18:1 수준을 증가시키는데 효율적이었다. 본원에 개시된, 올레 지방산, 리놀레 지방산 또는 리놀렌 지방산의 수준을 특이적으로 상승시키는 SAD 서열은, 고등 식물 종으로부터 유래하였다. 당업자는 SAD에 대한 기타 다른 유전자들을 동정할 수 있을 것이다.
예시적 SAD 효소
SAD 효소 서열 번호 GenBank ID 번호
리시누스 커뮤니스 서열 번호 196 ACG59946.1
헬리안투스 아너스 서열 번호 197 AAB65145.1
브라시카 준세아 서열 번호 198 AAD40245.1
글리신 맥스 서열 번호 199 ACJ39209.1
올레아 유로파에아 서열 번호 200 AAB67840.1
베르니시아 포르디 서열 번호 201 ADC32803.1
SAD 효소는 C18:0-ACP 기질에 대해 활성을 가졌으며, D9 위치에서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하여, 올리에이트-ACP를 생성하였다. 생성된 C18:1 지방산은, 올리에이트 또는 광범위한 특이성을 가지는 TE 중 어느 하나의 작용을 통하여 ACP로부터 유리되었다. 본 발명의 발명자들은, 본원의 실시예에서 올레아 유로파에아 스테아로일-ACP 불포화 효소(수탁 번호 제AAB67840.1호; 서열 번호 172) 또는 카르타머스 팅크토리우스 ACP 티오에스테라제(수탁 번호 제AAA33019.1호; 서열 번호 195)를 과발현시켰을 경우, C18:1 지방산의 축적량이 증가되었다는 것을 보여주었다. 올레 지방산을 증가시키는데 유용한, 예시적 올리에이트 티오에스테라제의 아미노산 서열을 표 42에 제시하였다. 당업자는 올리에이트 티오에스테라제에 대한 다른 유전자를 동정할 수 있을 것이다.
올레 지방산 생산을 증가시키기 위한 예시적 티오에스테라제
티오에스테라제 효소 서열 번호 GenBank ID 번호
헬리안투스 아너스 서열 번호 202 AAL79361.1
브라시카 라파 서열 번호 203 AAC49002.1
자트로파 컬카스 서열 번호 204 ABX82799.3
제아 메이스 서열 번호 205 ACG40089.1
제아 메이스 서열 번호 206 ACG42559.1
지방산 불포화 효소는 미생물 내에 리놀레 지방산과 리놀렌 지방산의 축적을 증가시키는데에 유용한 부가 효소이다. 특히, 2개의 효소 즉, FAD 2 및 FAD 3의 활성은 미생물 내 리놀레 지방산과 리놀렌 지방산의 축적을 증가시켰다. 예시적 FAD 2 및 FAD 3 효소의 아미노산 서열을 이하 표 43에 제시하였다.
예시적 FAD2 및 FAD3 효소
FAD 2 및 FAD 3 효소 서열 번호
리누스 유시타티시멈 12 불포화 효소 서열 번호 181
리누스 유시타티시멈 15 불포화 효소 서열 번호 182
리누스 유시타티시멈 15 불포화 효소 서열 번호 183
칼타머스 팅크토리우스 12 불포화 효소 서열 번호 184
헬리안투스 아너스 12 불포화 효소 서열 번호 185
표 43에 나열된 효소들 이외에, 예시적 Δ12 FAD 효소의 아미노산 서열을 표 44에 나열하였다. 미생물 내 과발현에 적당한 기타 다른 Δ12 FAD 효소는 표 45에 나열하였다. 예시적 Δ15 FAD 및 불포화 지방산과 TAG의 수준을 증가시키는데 유용한 기타 다른 효소를 표 46에 나열하였다. 부가의 글리세로지질 불포화 효소는 표 47에 나열하였다.
리놀레 지방산 생산을 증가시키기 위한 예시적 Δ12 FAD 효소
Δ12 FAD 효소 서열 번호 GenBank ID 번호
칼타머스 팅크토리우스 서열 번호 207 ADM48790.1
고시피움 히르서텀 서열 번호 208 CAA71199.1
글리신 맥스 서열 번호 209 BAD89862.1
제아 메이스 서열 번호 210 ABF50053.1
프로토테카 모리포르미스 대립유전자 1 서열 번호 211
프로토테카 모리포르미스 대립유전자 2 서열 번호 212
리놀레산 또는 리놀렌산을 증가시키기 위한, 미생물 내 과발현에 적당한 부가 Δ12 FAD 효소
Δ12 FAD 효소 GenBank 수탁 번호
베르노니아 갈라멘시스 AAF04094.1
베르노니아 갈라멘시스 AAF04093.1
라이티아 팅크토리아 ADK47520.1
올레아 유로파에아 AAW63041.1
베르니시아 포르디 AAN87573
아라비돕시스 탈리아나 AAA32782.1
카멜리나 사티바 ADU18247.1
카멜리나 사티바 ADU18248.1
카멜리나 사티바 ADU18249.1
칼타머스 팅크토리우스 ADK94440.1
글리신 맥스 BAD89862.1
글리신 맥스 DQ532371.1
고시피움 히르서텀 AAL37484.1
리넘 유시타티시멈 ACF49507.1
리넘 유시타티시멈 ACF49508.1
오에노테라 비에티스 ACB47482
사카로마이세스 세레비지아에 NP_011460.1
제아 메이스 ACG37433.1
브라시카 라파 CAD30827.1
리놀렌 지방산 생산을 증가시키기 위한 예시적 Δ15 FAD 효소
Δ15 FAD 효소 서열 번호 GenBank ID 번호
브라시카 라파 서열 번호 213 AAA32994.1
카멜리나 사티바 서열 번호 214
카멜리나 사티바 서열 번호 215
글리신 맥스 서열 번호 216 ACF19424.1
베르니시아 포르디 서열 번호 217 AAF12821.1
리시누스 커뮤니스 서열 번호 218 EEF36775.1
리넘 유시타티시멈 서열 번호 219 ADV92272.1
프로토테카 모리포르미스 대립유전자 1 서열 번호 220
프로토테카 모리포르미스 대립유전자 2 서열 번호 221
불포화 TAG의 수준 또는 리놀렌산을 증가시키기 위한 미생물 내 과발현에 적당한 글리세로지질 불포화 효소
글리세로지질 불포화 효소 GenBank 수탁 번호
글리신 맥스 ACD69577.1
글리신 맥스 컬티바 볼라니아 ACS15381.1
글리신 소자 P48621.1
아라비돕시스 탈리아나 NP_180559.1
리넘 그랜디플로럼 BAG70949.1
제아 메이스 BAA22440.1
올레아 유로파에아 ABG88130.2
자트로파 컬카스 ABX82798.1
베르니시아 포르디 CAB45155.1
베르니시아 포르디 AAD13527.1
본원에 개시된 아미노산 서열들은 본원에 개시된 방법을 사용하여 미생물 내에서 발현되었다. 암호화 서열은 미생물 내 발현에 최적화될 수 있었다. 예를 들어 피.모리포르미스 내 발현에 있어서 본원의 표 2에 개시된 선호 코돈 사용 빈도가 적용되었다.
실시예 11: 리놀렌 불포화 지방산 및 글리세로지질의 생산을 증가시키기 위한 미생물 조작
실시예 10에 기술된 바와 같이, Δ15 불포화 효소는 C18:2(리놀레) 지방산 또는 지방 아실 분자들의 15번 위치에 이중 결합을 형성하여, C18:3(리놀렌) 지방산 또는 지방 아실 분자가 생산되는 것을 촉진한다. 리놀렌 불포화 지방산이 풍부한 오일을 생산하는 임의의 고등 식물 종, 예를 들어 브라시카 나푸스(Bn), 카멜리나 사티바(Cs), 그리고 리넘 유시타티시멈은, 미생물 내에서 발현되어 지방산 프로필에 영향을 미칠 수 있는 Δ15 불포화 효소를 암호화하는 유전자 원이다. 본 실시예는, 형질 전환된 미생물의 지방산 프로필에 있어서 리놀렌산이 증가되도록 미생물을 조작하기 위해 Δ15 불포화 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것에 관하여 기술하고 있다.
프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435, 균주 A의, (고급 오일을 생산하도록) 전통적으로 돌연 변이된 파생 균주를 실시예 2에 상세히 기술된 유전자 총 형질 전환법에 따라서 표 49에 나열된 플라스미드 구조물 각각으로 개별 형질 전환하였다. 각각의 구조물은 6S 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 82) 및 3'(서열 번호 84) 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접함)을 함유하였으며, 여기서, 상기 재조합 표적화 서열은, 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역과 핵내 게놈으로의 통합에 사용되었다. 이와 같은 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 159로서 나열되었으며, 수크로스 인버타제 유전자는 선택 마커로서 사용되었다. 단백질 암호화 영역은 모두 표 2에 따라서 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 최적화된 코돈이었다. 브라시카 나푸스(Bn FAD3, GenBank 수탁 번호 제AAA32994호), 카멜리나 사티바 FAD-7 및 리넘 유시타티시멈(Lu FAD3A 및 Lu FAD3B, GenBank 수탁 번호 제ABA02172호 및 제ABA02173호) 유래 불포화 효소 유전자의 암호화 영역은 각각 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 89) 및 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 두었다. 플래그(FLAG)® 에피토프 서열은 재조합 불포화 효소 유전자 서열의 N-말단 세포질 루프 내에서 암호화되었다.
Figure 112013079886893-pct00052
구조물 pSZ2124, pSZ2125, pSZ2126 및 pSZ2127 각각은 균주 A에 개별적으로 도입되어 이 균주를 형질 전환하였다. 1차 형질 전환체를 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 한천 평판 상에서 선택하였다. 각각의 형질 전환체를 클론으로 정제하였으며, 이 클론을 (실시예 1에 개시된 조건과 유사한) 지질 생산에 적당한 조건 하에서 생육하였다(pH 7.0). 각각의 형질 전환체로부터 유래하는 무수 바이오매스로 지질 샘플을 제조하였다. 각각의 형질 전환체로부터 유래하는 무수 바이오매스 20㎎ 내지 40㎎을 MeOH 중 5% H2SO4 2㎖ 중에 재현탁하고 나서, 여기에 적당한 내부 표준(C19:0)을 적당량 함유하는 톨루엔 200ul을 첨가하였다. 혼합물을 간단히 초음파 처리하여 바이오매스를 분산한 다음, 이를 3.5시간 동안 70℃ 내지 75℃에서 가열하였다. 여기에 헵탄 2㎖를 첨가하여 지방산 메틸 에스테르를 추출한 후, 다시 6% K2CO3(aq) 2㎖를 첨가하여 산을 중화하였다. 상기 혼합물을 격렬하게 교반하고, 상층 일부를, 표준 FAME GC/FID법(지방산 메틸 에스테르 가스 크로마토그래피 불꽃 이온화 검출법)을 사용하는 가스 크로마토그래피 분석을 위해서, Na2SO4(무수)가 담긴 바이알에 옮겨 담았다. 표준 지방산 메틸 에스테르 가스 크로마토그래피 불꽃 이온화(FAME GC/FID) 검출법을 사용하여 지방산 프로필을 분석하였다. pSZ2124, pSZ2125, pSZ2126 및 pSZ2127으로 균주 A를 형질 전환하여 생성된 대표적인 클론 세트로부터 얻어진 지방산 프로필(총 지방산의 면적%로 표시)을 표 50에 나타내었다. 비교용으로서, 형질 전환되지 않은 균주 A 대조군 세포로부터 얻은 지질의 지방산 프로필을 표 50에 추가로 제시하였다.
Figure 112013079886893-pct00053
형질 전환되지 않은 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 A는 C18:3 지방산 1% 미만을 비롯한 지방산 프로필을 나타냈다. 이와는 반대로, 고등 식물 지방산 불포화 효소를 발현하는 균주 A의 지방산 프로필의 경우에는 C18:3 지방산 조성이 약 2배 내지 17배 증가하였음이 보였다. 리넘 유시타티시멈의 FAD3A 또는 FAD3B, 또는 브라시카 나푸스의 FAD3 유전자 생성물을 발현하는 조작 균주는 최대의 C18:3 증가 정도를 보였다(표 50). 18:3 대 총 C18 불포화물의 비율은, 형질 전환되지 않은 균주 내에서는 약 1%였으며, 형질 전환된 균주 내에서는 약 2% 내지 17%였다. 18:2 대 총 C18:0의 비율은, 형질 전환되지 않은 균주 내에서는 약 12% 내지 13%였으며, 형질 전환된 균주 내에서는 약 1% 내지 15%였다(FAD3A 형질 전환체 내 최저 수준). 이와 같은 데이터는, Δ15 불포화 효소 지방산 불포화 효소의 외부 발현이, 조작된 미생물의 지방산 프로필을 바꾸도록(특히 미생물 세포 내 18:3 지방산 농도가 증가되도록) 허용하는 폴리뉴클레오티드의 유용성과 효율을 입증하였다.
실시예 12: 헤어핀 RNA 접근법을 통해 스테아르산 및 스테아레이트의 생산을 증가시키기 위한 미생물 조작
스테아로일 ACP 불포화 효소(SAD)는 지질 합성 경로의 일부이다. 이 효소는 지방 아실 사슬에 이중 결합을 도입하는 역할을 한다. 예를 들어 SAD 효소는 C18:0 지방산(스테아르산)으로부터 C18:1 지방산이 합성되는 과정을 촉진한다. 실시예 6에 나타낸 바와 같이, 표적화 유전자 중단을 통해 프로토테카 모리포르미스의 SAD2 대립유전자를 중단시키면, 조작된 미생물의 지방산 프로필에 있어서 C18:0 지방산 수준이 측정 가능할 정도로 증가되었다. 본 실시예는, 형질 전환된 미생물의 지방산 프로필에 있어서 포화 C18:0 지방산이 증가하도록 미생물을 조작하기 위해, SAD2의 발현을 하향 조절하는 헤어핀 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것에 관하여 기술하고 있다.
표 51에 나열된 4개의 구조물 pSZ2139 내지 pSZ2142를, 프로토테카 모리포르미스 SAD2 유전자 생성물의 발현이 감소되도록 설계하였다. 각각의 구조물은 프로토테카 모리포르미스 SAD2 mRNA 전사체에 대해 표적화된 헤어핀 RNA를 암호화하는 상이한 핵산 서열(이 경우, 상기 헤어핀 구조의 줄기부 길이는 180 내지 240 염기쌍임), 6S 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 82) 및 3'(서열 번호 84) 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접함)을 함유하였는데, 이 재조합 표적화 서열은, 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역과 핵내 게놈으로의 통합에 사용되었다. 이와 같은 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 159로서 나열하였으며, 이는 선택 마커로서 사용되었다. 각 구조물의 SAD2 RNA 헤어핀을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 두었다.
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 A를 형질 전환하는데 사용되는
플라스미드 구조물
플라스미드 구조물 관련 서열 요소 서열 번호
SZ2139
헤어핀 A		 6S::Crβtub:ScSuc2:Cvnr:Crβtub:PmSAD2-hpA:Cvnr::6S 서열 번호 226
SZ2140 헤어핀 B 6S::Crβtub:ScSuc2:Cvnr:Crβtub:PmSAD2-hpB:Cvnr::6S 서열 번호 227
SZ2141 헤어핀 C 6S::Crβtub:ScSuc2:Cvnr:Crβtub:PmSAD2-hpC:Cvnr::6S 서열 번호 228
SZ2142 헤어핀 D 6S::Crβtub:ScSuc2:Cvnr:Crβtub:PmSAD2-hpD:Cvnr::6S 서열 번호 229
(고급 오일을 생산하도록) 전통적 방식으로 돌연 변이된 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 파생 균주, 균주 A에, 실시예 2에 상세히 기술된 유전자 총 형질 전환법에 따라서 표 51에 나열된 플라스미드 구조물들을 각각 도입하여 상기 균주를 형질 전환하였다. 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 한천 평판 상에서 1차 형질 전환체를 선택한 다음, 클론으로서 정제한 후, 표준 지질 생산 조건 하에서 생육하였다. 실시예 11에 기술된 바와 같은 직접 에스테르 결합 전이법을 이용하여 지방산 프로필을 측정하였다. 균주 A를 pSZ2139, pSZ2140, pSZ2141 및 pSZ2142로 형질 전환하여 생성된 대표적인 클론 세트로부터 얻어진 지방산 프로필(총 지방산의 면적%로 표시)을 이하 표 52에 제시하였다. 비교를 위해서, 형질 전환되지 않은 균주 A 대조군 세포로부터 얻은 지질의 지방산 프로필을 표 52에 추가로 제시하였다.
Figure 112013079886893-pct00054
상기 표 52에 제시된 데이터는, 숙주 유기체의 C18:0 및 C18:1 지방산 프로필에 SAD2 헤어핀 RNA 구조물 발현이 미치는 분명한 영향력을 보여주는 것이다. SAD2 헤어핀 RNA 구조물을 포함하는 균주 A 형질 전환체의 지방산 프로필은, 불포화 C18:1 지방산의 백분율은 감소하면서 포화 C18:0 지방산의 백분율은 증가하였음을 입증하는 것이다. 형질 전환되지 않은 균주의 지방산 프로필 중 C18:0는 약 3%였다. 형질 전환된 균주의 지방산 프로필은 C18:0 3% 이상 내지 거의 27%까지였다. C18:0 대 총 C18 불포화물의 비율은, 형질 전환되지 않은 균주 내에서는 약 4%였으며, 형질 전환된 균주 내에서는 약 5% 내지 69%였다. 이와 같은 데이터는, 프로토테카 모리포르미스 내 폴리뉴클레오티드 SAD RNA 헤어핀 구조물이 성공적으로 발현 및 사용된 결과, 조작된 숙주 미생물 내 포화 지방산 백분율이 바뀌었음(특히 미생물 세포 내 C18:0 지방산 농도는 증가되고 C18:1 지방산 농도는 감소하였음)을 입증하였다.
실시예 13: β- 케토아실 - ACP 합성 효소 II 유전자의 과발현을 통한 미세 조류의 지방산 프로필 변경
β-케토아실-ACP 합성 효소 II(KASII)는 지방산 생합성시 C16:0-ACP로부터 C18:0-ACP로의 2-탄소 연장을 촉진하였다. 플라스미드 구조물을 제조하여, KASII 유전자가 발현될 경우 숙주 세포의 지방산 프로필이 영향받을 수 있는지 여부를 평가하였다. 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 또는 고등 식물(글리신 맥스: GenBank 수탁 번호 제AAW88763호; 헬리안터스 아너스; GenBank 수탁 번호 제ABI18155호; 및 리시누스 커뮤니스: GenBank 수탁 번호 제AAA33872호)로부터 KASII 유전자 서열의 공급원을 선택하였다.
(고급 오일을 생산하도록) 전통적 방식으로 돌연 변이된 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 파생 균주, 균주 A에, 실시예 2의 방법에 따라서 표 53에 나열된 플라스미드 구조물들 중 하나를 각각 도입하여 이 균주를 형질 전환하였다. 각각의 구조물은 6S 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 82) 및 3'(서열 번호 84) 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접함)을 함유하였는데, 이 재조합 표적화 서열은, 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역과 핵내 게놈으로의 통합에 사용되었다. 이와 같은 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 29로서 나열하였으며, 이는 선택 마커로서 사용되었다. 각각의 구조물에 있어서, KASII 암호화 영역은 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 37) 및 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 두었다. 각각의 KASII 효소의 천연 운반 펩티드를 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일-ACP 불포화 효소 운반 펩티드(서열 번호 54)로 치환하였다. 모든 단백질 암호화 영역은 표 2에 따라서 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 최적화된 코돈이었다.
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 A 를 형질 전환하는데 사용되는
플라스미드 구조물
플라스미드
구조물		 KASII 효소의
공급원		 서열 요소 서열 번호
SZ1747 글리신 맥스 (Glm) 6S::β-tub:suc2:nr::Amt03:S106SAD:GlmKASII:nr::6S 서열 번호 230
SZ1750 헬리안터스 아너스
(Ha)		 6S::β-tub:suc2:nr::Amt03:S106SAD:HaKASII:nr::6S 서열 번호 231
SZ1754 리시누스
커뮤니스
( Rc ) 		6S::β-tub:suc2:nr::Amt03:S106SAD:RcKASII:nr::6S 서열 번호 232
SZ2041 프로토테카
모리포르미스
(Pm)		 6S::β-tub:suc2:nr::Amt03:S106SAD:PmKASII:nr::6S 서열 번호 233
구조물 6S::β-Tub:suc2:nr::Amt03:S106SAD :PmKASII:nr::6S 내 관련 제한 위치들은 굵은 글씨체의 소문자에 밑줄을 쳐서 표시하였으며, 각각 5'-3' BspQ 1, Kpn I, Xba I, Mfe I, BamH I, EcoR I, Spe I, Asc I, Cla I, Sac I, BspQ I에 해당하였다. BspQI 위치들은 형질 전환 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정하였다. 굵은 글씨체의 소문자 서열은 상동성 재조합을 통하여 6S 위치에서의 표적화 통합을 허용하는, 균주 A 유래 게놈 DNA를 나타낸다. 5'→3' 방향으로 진행되는, 효모 수크로스 인버타제 유전자(균주 A가 수크로스를 대사할 수 있는 능력을 부여함)의 발현을 작동하는 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터는 박스를 쳐서 표시하였다. 인버타제에 대한 개시 인자 ATG 및 종결 인자 TGA는 굵은 이탤릭체의 대문자로 표시한 반면에, 암호화 영역은 이탤릭체의 소문자로 표시하였다. 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR은 소문자에 밑줄을 쳐서 표시하였으며, 그 다음에 존재하는 피.모리포르미스의 내인성 amt03 프로모터는 이탤릭체에 박스를 쳐서 표시하였다. PmKASII의 개시 인자 ATG 및 종결 인자 TGA 코돈은 굵은 이탤릭체의 대문자로 표시하였으며, 유전자의 나머지 부분은 굵은 이탤릭체로 표시하였다. 클로렐라 프로토테코이데스 S106 스테아로일-ACP 불포화 효소 운반 펩티드는 개시 인자 ATG와 Asc I 위치 사이에 위치하였다. 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR은 또한 소문자에 밑줄을 쳐서 표시하였으며, 그 다음에 존재하는 균주 A 6S 게놈 영역은 굵은 소문자로 표시하였다. 구조물 6S::β-tub:suc2:nr::Amt03:S106SAD:PmKASII:nr::6S의 관련 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 234로서 서열 목록에 제공하였다. 클로렐라 프로토테코이데스 S106 스테아로일-ACP 불포화 효소 운반 펩티드를 포함하는 PmKASII의 코돈 최적화된 서열은 서열 목록 중 서열 번호 235로서 제공하였다. 서열 번호 236은 서열 번호 235의 단백질 번역물을 제공하였다.
Figure 112013079886893-pct00055
Figure 112013079886893-pct00056
Figure 112013079886893-pct00057
각각의 플라스미드 구조물을 균주 A에 도입하여 이 균주를 별도로 형질 전환하고 나서, 양성 클론을 유일한 탄소원으로서 수크로스를 포함하는 한천 평판 상에서 선택하였다. 상기 실시예들에서와 같이, 1차 형질 전환체는 클론으로서 정제하였으며, 또한 pH 7의 표준 지질 생산 조건 하에 생육하였고, 지질 샘플은 각각의 형질 전환체의 무수 바이오매스로 제조하였다. 지방산 프로필을 실시예 11에 기술된 직접 에스테르 결합 전이법을 사용하여 측정하였다. 균주 A를 형질 전환하여 생성된 대표적인 클론 세트에서 얻은 지방산 프로필(총 지방산의 면적%로 표시)과, 몇몇 양성 형질 전환체의 지방산 프로필(면적%로 표시)을 형질 전환되지 않은 균주 A 대조군의 지방산 프로필과 비교한 결과를, 이하 표 54에 제시된 각각의 플라스미드 구조물에 대해 요약하였다.
Figure 112013079886893-pct00058
pSZ2041을 사용하여, 표 2에 제시된 코돈 사용 빈도를 이용하여 추가로 코돈 최적화된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) KASII 유전자를 과발현하였을 때, C16:0 사슬 길이는 명확히 감소됨과 아울러 C18:1 지방산의 길이는 증가하는 것이 관찰되었다. β-튜불린 프로모터에 의해 작동되는 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) KASII 유전자를 발현하는 구조물로 형질 전환하였을 때에도 유사한 지방산 프로필 변화가 관찰되었다.
이와 같은 결과들은, 코돈 최적화된 프로토테카 지질 생합성 유전자가 외부 과발현될 때 유전자 조작된 미세 조류의 지방산 프로필이 변경될 수 있음을 보여주는 것이다. 특히 형질 전환되지 않은 세포 내에서의 KASII 유전자의 과발현은 C18 지방산의 백분율을 약 68%에서 약 84%로 증가시킬 수 있었다.
실시예 14: 조작된 프로토테카 내 중간 길이 사슬 지방산 수준의, KASI 대립 유전자의 표적화 녹아웃을 통한 변화
β-케토아실-ACP 합성 효소 I(KASI)은, 지방산 생합성시 C4:0, C6:0, C8:0, C10:0, C12:0 및 C14:0 지방 아실-ACP 분자의 2-탄소 연장을 촉진하였다. 본 실시예에서는, 녹아웃 플라스미드 구조물인 pSZ2014를 제조하여, KASI 유전자 위치가 표적 중단되었을 때 숙주 세포의 지방산 프로필에 미치는 영향을 평가하였다.
(고급 오일을 생산하도록) 전통적 방식으로 돌연 변이된 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 파생 균주, 균주 A에, 실시예 2에 기술된 유전자 총 형질 전환법에 따라서 pSZ2014 구조물을 도입하여 이 균주를 형질 전환하였다. pSZ2014는 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 인버타제 발현 카세트를 포함하였는데, 상기 발현 카세트는, 프로토테카 모리포르미스 게놈의 KASI 위치에 통합되는데 사용되는 구조물을 표적화하는 KASI 유전자 특이적 상동성 영역의 양 말단 중 어느 한쪽에 측접하였다. 이와 같은 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 159로서 나열하였으며, 또한 선택 마커로 사용되었다. 핵내 게놈 통합용 KASI 위치에 대한 표적화 영역과 관련된 서열을 이하에 보였으며, 또한 서열 번호 238과 서열 번호 239에 나열하였다. pSZ2014내 관련 제한 위치들(굵은 글씨체의 소문자에 밑줄을 쳐서 표시함)로서는 각각 5'→3' BspQ 1, Kpn I, AscI, Xho I, Sac I, BspQ I이 있으며, 이것들을 이하 서열에 보였다. BspQI 위치는 형질 전환 DNA의 5' 말단 및 3' 말단을 한정하였다. 굵은 글씨체의 소문자로 표시한 서열은, 상동성 재조합을 통해 KASI 위치에서의 표적화 통합을 허용하는, 균주 A 유래 게놈 DNA를 나타내는 것이다. 5'→3' 방향으로 진행될 때, 씨.레인하르드티 b-튜불린 프로모터(코돈 최적화 효모 수크로스 인버타제 유전자를 발현시킴)(균주 A에 수크로스를 대사할 수 있는 능력을 부여함)는 글자에 박스를 쳐서 표시하였다. suc2 인버타제에 대한 개시 인자 ATG 코돈과 종결 인자 TGA 코돈은 굵은 이탤릭체 대문자로 표시한 반면에, 암호화 영역은 이탤릭체 소문자로 표시하였다. 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR은 소문자에 밑줄을 쳐서 표시하였다. pSZ2014의 형질 전환 서열을 이하에 보였으며, 서열 번호 237로서 나열하였다.
Figure 112013079886893-pct00059
Figure 112013079886893-pct00060
플라스미드 구조물 pSZ2014를 균주 A에 도입하여 이 균주를 형질 전환하고 나서, 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 평판 상에서 선택하였다. 1차 형질 전환체를 클론으로서 정제한 다음, 이를 표준적인 지질 생산 조건 하에서 생육하였다. 각각의 형질 전환체로부터 얻은 무수 바이오매스로부터 지질 샘플을 제조하였다. 실시예 11에 기술된 직접 에스테르 결합 전이법을 사용하여 지방산 프로필을 측정하였다. 몇몇 양성 형질 전환체의 지방산 프로필(총 지방산의 면적%로 표시)을, 형질 전환되지 않은 균주 A 대조군의 지방산 프로필과 비교하였으며, 그 결과는 하기 표 55에 요약되어 있다.
Figure 112013079886893-pct00061
상기 표 55에 나타낸 바와 같이, KASI 대립 유전자의 표적화 중단에 의하여 형질 전환된 미생물의 지방산 프로필이 영향을 받았음을 알 수 있다. pSZ2014 형질 전환 벡터를 포함하는 균주 A의 지방산 프로필은, C18:1 지방산이 감소됨과 아울러, C14:0 및 C16:0 지방산의 조성이 증가하였음을 보여주었다. 모든 형질 전환체에서, C18:0 지방산은 감소하였다. 몇몇 형질 전환체에 있어서, KASI 대립 유전자가 중단되었을 경우에는, 형질 전환되지 않은 균주 A 유기체의 지방산 프로필에 비하여 C18:2 지방산의 백분율이 감소한 지방산 프로필을 추가로 얻을 수 있었다.
그러므로, 본 발명의 발명자들은 내인성 KASI를 중단함으로써 총 C14 지방산 백분율을 약 35%에서 400%로 증가시켰으며, C16 지방산의 백분율은 약 30%에서 약 50%로 증가시켰다.
상기 데이터는 숙주 미생물의 지방산 프로필을 변경함에 있어서 내인성 KASI 대립 유전자의 표적화 유전자 중단의 유용성을 입증하는 것이다.
실시예 15: 프로토테카 내 지방산 프로필을 변경시키기 위한 유전자 변형 접근법의 통합
본 실시예에서는, KASII 대립 유전자를 녹아웃시키고 아울러 중간쇄인 지방산의 가수 분해를 선호하는 외인성 티오에스테라제를 과발현하도록 만드는 유전자 변형법을 통합 수행하여, 미생물 내 숙주 유기체의 지방산 프로필이 미생물 내에서 변경되는 것을 입증하고 있다.
우선, (고급 오일을 생산하기 위하여) 전통적 방식에 따라서 돌연 변이된 프로토테카 모리포르미스 균주(UTEX 1435) 파생 균주, 즉 균주 C를, 실시예 2에 상세히 기술된 유전자 총 형질 전환법에 따라서 플라스미드 구조물 pSZ1283으로 형질 전환하였다. PCT 특허 출원 PCT/US2011/038463 및 PCT/US2011/038463에 이미 개시된 pSZ1283(서열 번호 256)은, 쿠페아 라이티 FATB2(CwTE2) 티오에스테라제의 암호화 서열, 6S 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 82) 및 3'(서열 번호 84) 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접함)을 함유하였으며, 이 재조합 표적화 서열은, 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역과 핵내 게놈으로의 통합에 사용되었다. 이와 같은 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 159로서 나열하였으며, 이는 선택 마커로서 사용되었다. CwTE2 암호화 서열은 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 89) 및 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR(서열 번호 32)의 제어 하에 두었다. CwTE2 및 suc2의 단백질 암호화 영역은 표 2에 따른 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 최적화된 코돈이었다.
pSZ1283을 균주 C에 도입하여 이 균주를 형질 전환하고 나서, 양성 클론을, 유일한 탄소원으로서 수크로스를 포함하는 한천 평판 상에서 선택하였다. 그 다음, 1차 형질 전환체를 클론으로서 정제한 다음, 단일 형질 전환체 즉, 균주 B를 추가 유전자 변형을 위해서 선택하였다. 이와 같이 유전자 조작된 균주를 플라스미드 구조물 pSZ2110(서열 번호 240)(KASII 대립 유전자 1 위치를 중단함)으로 형질 전환하였다. pSZ2110(KASII'5::CrbTub:NeoR:nr::KASII-3'으로 표시)는, G418에 대한 내성을 부여하고, 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터와 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR(여기서, 상기 발현 카세트는 프로토테카 모리포르미스 게놈의 KASII 위치에 통합할 때 사용되는 구조물을 표적화하는, KASII 유전자 특이적 상동성 영역 양쪽 말단 중 어느 한쪽에 측접)의 제어 하에 있는 네오마이신 내성(NeoR) 발현 카세트를 포함하였다. pSZ2110 구조물 내 관련 제한 위치로서는, 5'→3' 방향으로, BspQ 1, KpnI, XbaI, MfeI, BamHI, EcoRI, SpeI, XhoI , Sac I 및 BspQI이 있으며, 이것들은 굵은 글씨체의 소문자에 밑줄을 쳐서 표시하였다. BspQI 위치는 형질 전환 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 형질 전환 구조물의 5' 및 3' 말단에 존재하는 굵은 글씨체의 소문자로 표시된 서열은, 상동성 재조합을 통해 KASII 대립 유전자 1 위치로의 통합을 표적화하는 UTEX 1435 유래 게놈 DNA를 나타낸다. 씨.레인하르드티 β-튜불린은 소문자에 박스를 쳐서 표시하였다. NeoR 에 대한 개시 인자 ATG와 종결 인자 TGA는 이탤릭체의 대문자로 표시하였으며, 암호화 영역은 이탤릭체의 소문자로 표시하였다.
3'UTR은 소문자에 밑줄을 쳐서 표시하였다.
Figure 112013079886893-pct00062
균주 B를 pSZ2110으로 형질 전환하고 나서, 양성 클론을, G418을 함유하는 선택 한천 평판 상에서 선택하였다. 이후, 1차 형질 전환체를 클론으로서 정제한 다음, 표준 지질 생산 조건(pH 5.0 및 pH 7.0) 하에서 탄소원으로서 수크로스를 기반으로 생육하였다. 실시예 11에 기술된 바와 같이 각각의 형질 전환체로부터 얻어진 무수 바이오매스로부터 지질 샘플을 제조하였다. 5개의 양성 형질 전환체(T1-T5)의 지방산 프로필(총 지방산의 면적 %로 표시), 유일한 탄소원으로서 수크로스를 기반으로 생육된 균주 B(U1)의 프로필, 그리고 유일한 탄소원으로서 글루코스를 기반으로 생육된 비형질 전환 UTEX 1435(U1)의 프로필을 이하 표 56에 제시하였다.
Figure 112013079886893-pct00063
표 56에 보인 바와 같이, 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 B 내에서 CwTE2가 발현되었을 때의 영향으로 인하여, 형질 전환된 미생물의 지방산 프로필에는 눈에 띄는 변화가 일어났다. CwTE2를 발현하고, Amt03 프로모터에 의해 CwTE2가 발현되는 것이 촉진되도록 pH 7.0에서 배양된 균주 B의 지방산 프로필에서는, 형질 전환되지 않은 UTEX 1435의 지방산 프로필에 비하여, C10:0, C12:0 및 C14:0 지방산의 조성이 증가함과 아울러, C16:0 및 C18:1 지방산의 조성은 감소되었음이 확인되었다. 이후, C16:0 지방산에서 C18:0 지방산으로의 2-탄소 연장을 촉진하는 효소를 암호화하는 KASII 대립 유전자를 중단하도록 균주 B를 변형시킨 결과, 새로 조작된 균주가 pH 5.0에서 생육되었을 때 이 균주의 지질 프로필에 있어서 C16:0 지방산은 증가하였으며, 아울러 C18:1 지방산은 감소하였다. 배양 배지의 pH는 Amt03 프로모터의 활성에 최적이 아니므로, pH 5.0에서 형질 전환체가 증식하였음은 곧, 티오에스테라제가 지방산 프로필을 바구는데에 기여하는 것과는 별도로, KASII 대립 유전자 녹아웃이 일어났을 때의 영향력을 증명하는 것이다. pH 7.0에서 지질을 생산하여 CwTE2를 발현시키면, pSZ2011 형질 전환체는 UTEX 1435 균주의 지방산 프로필에 비하여, C10:0, C12:0 및 C14:0 지방산의 조성은 증가하고, 아울러 C16:0 및 C18:1 지방산 조성은 감소하는 지방산 프로필을 보였다. 몇몇 pSZ2011 형질 전환체가 pH 7.0에서 배양되었을 때 이 형질 전환체는, pH 7.0에서 배양된 부모 균주 B의 지방산 프로필에 비하여, C16:0 지방산은 증가하고, C18:1 지방산 조성은 더욱 감소한 지방산 프로필을 나타내었다.
이와 같은 데이터는, 숙주 유기체의 지방산 프로필에 영향을 미치도록 만드는 중복 유전자 변형의 유용성을 입증하는 것이다. 뿐만 아니라, 본 실시예는 숙주 미생물의 지방산 프로필을 바꾸는데 있어서 내인성 KASII 대립 유전자의 유전자 중단을 표적화하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 용도를 입증하는 것이다.
실시예 16: 프로토테카의 팔미트산 조성을 변경시키기 위한 유전자 변형 접근법의 통합
본 실시예는, KASII 대립 유전자를 녹아웃시키고, 이와 아울러 C14 및 C16 지방산의 가수 분해에 선호적인 특이성을 나타내는 외인성 티오에스테라제를 과발현하는 유전자 변형법들을 통합하면, 숙주 유기체의 지방산 프로필이 미생물 내에서 바뀐다는 사실을 입증하였다.
실시예 2에 상세히 기술된 바와 같은 유전자 총 형질 전환법에 따라서 플라스미드 구조물 pSZ2004를 사용하여, (고급 오일을 생산하도록) 전통적 방식으로 돌연 변이된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 A를 형질 전환하였다. pSZ2004(KASII_5'_btub-SUC2-nr_2X_Amt03-Ch16TE2-nr_KASII_3'으로 표시)는, 쿠페아 후커리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제의 암호화 서열(Ch16TE2, GenBank #Q39513), 5' 및 3' 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접)(핵내 게놈의 KASII 위치에 표적화 통합하는데 사용됨), 그리고 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역을 포함하였다. Ch16TE2는 C14 및 C16 지방산에 대해 선호적인 특이성을 보이는 티오에스테라제다. 이러한 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트를 서열 번호 159에 나열하였으며, 이를 또한 선택 마커로서 사용하였다. Ch16TE 암호화 서열은, 직렬로 반복되는 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 89)와, 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 두었다. Ch16TE의 단백질 암호화 영역 및 suc2는, 표 2에 따라서 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 최적화된 코돈이었다. pSZ2004는 서열 목록에 서열 번호 249로서 제시하였다.
pSZ2004로 형질 전환하고 나서, 1차 형질 전환체를, 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 평판 상에서 선택하였다. 각각의 형질 전환체를 클론으로서 정제하여, 표준 지질 생산 조건(pH 7.0, 실시예 1에 개시된 조건과 유사한 조건) 하에서 생육하였다. 실시예 11에 기술된 바와 같은 표준 지방산 메틸 에스테르 가스 크로마토그래피 불꽃 이온화(FAME GC/FID) 검출법을 사용하여 지방산 프로필을 분석하였다. 형질 전환 벡터 pSZ2004로 형질 전환하여 생산된 대표적인 클론으로부터 얻어진 지방산 프로필(총 지방산의 면적%로 표시)을 표 57에 보였다. 지질 생산 조건(유일한 탄소원으로서 글루코스 포함) 하에서 생육된, 형질 전환되지 않은 균주로부터 얻은 지질의 지방산 프로필을 표 57에 추가로 제시하였다.
Figure 112013079886893-pct00064
상기 표 57에 보인 바와 같이, KASII 대립 유전자를, 선택가능한 마커 및 C14/C16 선호 티오에스테라제를 발현하기 위한 발현 카세트로 표적 중단시키면, 형질 전환된 미생물의 지방산 프로필에 영향을 미쳤다. pSZ2004 형질 전환 벡터를 포함하는 균주는, C14:0 및 C16:0 지방산의 조성이 증가함과 아울러, C18:0 및 C18:1 지방산은 감소하는 지방산 프로필을 보였다. 형질 전환되지 않은 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주는, C16 지방산 약 27%와 C18:1 지방산 약 58%를 포함하는 지방산 프로필을 나타냈다. 이와는 대조적으로, 쿠페아 후커리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 발현시킬 수 있는 카세트와 선택가능한 마커에 의해 KASII 위치가 중단된 균주의 지방산 프로필은, C16 지방산 약 70%와 지방산 약 14%를 포함하였다. C16:0의 수준은 2.5배 이상 증가하였다. 이 데이터는, 외인성 유전자를 과발현하고, 내인성 유전자를 소모시키는 유전자 변형법들은 숙주 유기체 내 지방산 프로필을 변경하도록 통합될 수 있음을 보여주는 것이다.
비교를 위하여, 수크로스 인버타제 유전자를 발현시킬 수 있는 카세트에 의해 KASII 위치가 중단된 균주의 지방산 프로필은 C16 지방산이 약 35%이고 C18:1 지방산이 약 50%였다.
이와 같은 데이터는, 특히 티오에스테라제 효소를 외부적으로 발현시켜, 미생물 세포 내 C14 및 C16 지방산의 농도를 증가시키고, C18:0 및 C18:1 지방산을 감소시키는 것과 같이, 조작된 미생물의 지방산 프로필을 바꾸는 것을 허용하는 폴리뉴클레오티드로 KASII 대립 유전자를 표적화 중단함으로써, 지방산 프로필을 상기한 바와 같이 바꾸는데 있어서 상기 폴리뉴클레오티드의 유용성과 효율을 입증한다.
실시예 17: 리놀레 불포화 지방산 및 글리세로지질을 생산하기 위한 미생물 조작
임의의 Δ12 지방산 불포화 효소는 C18:1 지방산 또는 지방 아실 분자에 이중 결합을 형성하고, 이로써 C18:2(리놀레) 지방산 또는 지방 아실 분자를 생성하는 것을 촉진할 수 있었다. 리놀레 불포화 지방산이 풍부한 오일을 생산하는 임의의 식물 종, 예를 들어 고시피움 히르서텀, 칼타머스 팅크토리우스, 글리신 맥스, 헬리안터스 아너스 및 제아 메이스는, 미생물 내에서 발현되어 지방산 프로필에 영향을 미칠수 있는 Δ12 불포화 효소 암호화 유전자 공급원이다. 본 실시예는 형질 전환된 미생물의 지방산 프로필에 있어서 리놀레산이 증가한 미생물을 조작함에 있어서, Δ12 불포화 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 용도를 기술하였다.
(고급 오일을 생산하도록) 전통적 방식으로 돌연 변이된 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 파생 균주, 균주 A에, 실시예 2에 상세히 기술된 유전자 총 형질 전환법에 따라서 표 58에 나열된 플라스미드 구조물들 중 하나를 도입하여 이 균주를 형질 전환하였다. 각각의 구조물은 6S 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 82) 및 3'(서열 번호 84) 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접함)을 함유하였는데, 이 재조합 표적화 서열은, 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역과 핵내 게놈으로의 통합에 사용되었다. 이와 같은 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 159로서 나열하였으며, 이는 선택 마커로서 사용되었다. 모든 단백질 암호화 영역은, 표 2에 따라서 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 최적화된 코돈이었다. 고시피움 히르서텀 유래 불포화 효소 유전자(Gh , GenBank 수탁 번호 제CAA71199호), 칼타머스 팅크토리우스 유래 불포화 효소 유전자(Ct GenBank 수탁 번호 제ADM48789호), 글리신 맥스 유래 불포화 효소 유전자(Gm , GenBank 수탁 번호 제BAD89862호), 헬리안투스 아너스 유래 불포화 효소 유전자(Ha, GenBank 수탁 번호 제AAL68983호) 및 제아 메이스 유래 불포화 효소 유전자(Zm, GenBank 수탁 번호 제ABF50053호)의 암호화 영역들은 각각 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 89) 및 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 두었다.
Figure 112013079886893-pct00065
표 58에 나열된 구조물 각각을 개별적으로 균주 A에 도입하여 이 균주를 형질 전환하였다. 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 평판 상에서 1차 형질 전환체를 선택하였다. 각각의 형질 전환체를 클론으로서 정제하였으며, 이를 표준 지질 생산 조건(pH 7.0, 실시예 1에 기술된 조건과 유사한 조건) 하에서 생육하였다. 실시예 11에 기술된 바와 같은 표준 지방산 메틸 에스테르 가스 크로마토그래피 불꽃 이온화(FAME GC/FID) 검출법을 사용하여 지방산 프로필을 분석하였다. 표 58의 상응 균주 A 형질 전환을 통해 생산된 대표적인 클론 세트로부터 얻어진 지방산 프로필을 표 59에 보였다. 비교를 위하여, 형질 전환되지 않은 균주 A 대조군 세포로부터 얻은 지질의 지방산 프로필을 표 59에 추가로 제시하였다.
Figure 112013079886893-pct00066
형질 전환되지 않은 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주는 C18:2 지방산 8.5% 미만을 포함하는 지방산 프로필을 나타냈다. 표 59에 보인 바와 같이, 고등 식물 지방산 불포화 효소를 발현하는 균주 A의 지질 프로필에서는 C18:2 지방산이 증가하였다. 총 C18 불포화 지방산은 약 64%에서 약 67% 내지 72%로 증가하였다. 이와 유사하게, 총 C18 다중 불포화 지방산(C18:2 및 C18:3) 대 합하여진 총 C18 불포화 지방산(C18:1, C18:2 및 C18:3)의 비율은 14% 미만에서 19% 이상으로 증가하였다. 이와 같은 데이터는, 조작된 미생물의 지방산 프로필을 바꾸는데 있어서 Δ12 불포화 효소 지방산 불포화 효소의 외부 발현을 허용하는 폴리뉴클레오티드의 유용성과 효율을 입증하는 것이다.
실시예 18: 지방산 불포화 효소의 다수 대립 유전자 중단을 통한 조작 미생물의 지방산 수준의 변경
본 실시예는, 형질 전환된 미생물의 지방산 프로필이 변경되도록 미생물을 조작함에 있어서, 선택가능한 마커와, 외인성 SAD 효소를 암호화하는 서열을 포함하는 형질 전환 카세트로 프로토테카 모리포르미스의 FADc 위치를 중단할 때의 형질 전환 벡터의 용도를 기술하고 있다.
(고급 오일을 생산하기 위하여) 전통적 방식에 따라서 돌연 변이된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 파생 균주, 즉 균주 C를, 실시예 2에 상세히 기술된 유전자 총 형질 전환법에 따라서 형질 전환 구조물 pSZ1499(서열 번호 246)으로 형질 전환하였다. pSZ1499는 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 내 발현에 대해 코돈 최적화된 올레아 유로파에아 스테아로일-ACP 불포화 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하였다. 상기 pSZ1499 발현 구조물은 씨.레인하르드티 β -튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역과 핵내 게놈에의 통합에 사용되는, FADc 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 247) 및 3'(서열 번호 248) 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접함)을 함유하였다. 이와 같은 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 159로서 나열하였으며, 이는 선택 마커로서 사용되었다. 올레아 유로파에아 스테아로일-ACP 불포화 효소 암호화 영역은 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 89) 및 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 두었으며, 천연 운반 펩티드는 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일-ACP 불포화 효소 운반 펩티드(서열 번호 49)로 치환하였다. 전체 오.유로파에아 SAD 발현 카세트는 pSZ1499라고 명명하였으며, FADc5'_btub-Suc2-nr_amt03-S106SAD-OeSAD-nr-FADc3'로서 표시될 수 있다.
유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 평판 상에서 1차 형질 전환체를 선택하였다. 각각의 형질 전환체를 클론으로서 정제하여, 이를 표준 지질 생산 조건(pH 7.0, 실시예 1에 기술된 조건과 유사한 조건) 하에서 생육하였다. 실시예 11에 기술된 바와 같은 표준 지방산 메틸 에스테르 가스 크로마토그래피 불꽃 이온화(FAME GC/FID) 검출법을 사용하여 지방산 프로필을 분석하였다. 형질 전환 벡터로 형질 전환하여 생산된 대표적인 클론 세트로부터 얻어진 지방산 프로필을 표 60에 보였다. 유일한 탄소원으로서 글루코스를 포함하는 지질 생산 조건(pH 5.0) 하에서 생육된, 형질 전환되지 않은 균주 C로부터 얻은 지질의 지방산 프로필을 표 60에 추가로 제시하였다.
Figure 112013079886893-pct00067
표 60에 나타낸 바와 같이, 균주 C를 pSZ1499로 형질 전환하였을 경우, 형질 전환된 미생물의 지방산 프로필은 영향을 받았다. 형질 전환되지 않은 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 C의 지방산 프로필은, C18:1 지방산 60% 미만과, C18:2 지방산 7% 이상이었다. 이와는 대조적으로, pSZ1499 로 형질 전환된 균주 C는 지방산 프로필에 있어서 C18:1 지방산의 조성은 증가하였고, 이와 아울러 C18:0 및 C18:2 지방산의 조성은 감소하였다. pSZ1499로 형질 전환된 균주 C의 지방산 프로필에 있어서 C18:2 지방산은 확인되지 않았다. pSZ1499 형질 전환체 내 C18:2 지방산이 검출 가능할 정도로 확인되지 않음은 곧, 다수의 FADc 게놈 위치로의 통합에 사용되는 상동성 재조합 표적화 서열을 보유하는 pSZ1499로 형질 전환되었을 때에는 FAD 활성을 나타내지 않았다는 것을 암시하는 것이었다.
다수의 FADc 대립유전자들이 pSZ1499 형질 전환 벡터에 의해 중단되었음을 입증하기 위하여 서던 블럿 분석법을 수행하였다. 표준 분자 생물학적 방법을 사용하여 게놈 DNA를 균주 C와 pSZ1499 형질 전환체로부터 추출하였다. 각각의 샘플로부터 얻은 DNA를 제한 효소 PstI로 절단한 후 0.8% 아가로스 겔 상에서 이동시켰다. 이 겔로부터 얻은 DNA를 나일론+ 막(애머샴(Amersham)) 상에 옮긴 다음, 이 DNA를 FADc 2' 영역과 상응하는 P32-표지화 폴리뉴클레오티드 프로브와 혼성화하였다. 도 3은, pSZ1499 형질 전환 카세트, 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)의 서열 결정된 FADc 대립 유전자 2개, 그리고 크기를 예측할 수 있는 pSZ1499 형질 전환 벡터에 의해 중단된 대립 유전자들의 맵을 보여주는 것이다. FADc 대립 유전자 1은 PstI 제한 위치를 포함하였던 반면에, FADc 대립 유전자 2는 그렇지 않았다. SAD 카세트를 통합하면, PstI 제한 위치는 중단된 FADc 대립 유전자에 도입될 것이고, 그 결과, 어떤 대립 유전자가 중단되었는지 여부에 상관 없이 서던 블럿으로 약 6kb의 단편이 확인되었다. 도 4는 서던 블럿 분석 결과를 보여주는 것이다. 약 6kb에서의 혼성화 밴드는 형질 전환체 둘 다에서 확인되었다. 중단되지 않은 대립 유전자를 나타낼, 크기가 더 작은 혼성화 밴드는 확인되지 않았다. 이와 같은 결과들은 FADc 대립 유전자 둘 다는 pSZ1499에 의해 중단되었음을 보여주는 것이다.
FADc 지방산 불포화 효소의 대립 유전자 두 개를 SAD 발현 카세트로 소모시키면, 지방산 프로필에 있어서 C18:1이 약 74%였다. 종합해보면, 이러한 데이터는 조작된 미생물의 지방산 프로필을 바꾸는데 있어서, FAD 대립 유전자의 녹아웃과 스테아로일-ACP 불포화 효소의 외부 발현을 허용하는, 폴리뉴클레오티드의 유용성과 효율을 입증해주는 것이다.
실시예 19: 조작된 미생물로부터 생산된 가공 오일의 특징들
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)를 형질 전환 벡터 pSZ1500(서열 번호 250)으로 형질 전환하는 방법과 그 효율은 이미 PCT 특허 출원 PCT/US2011/038463 및 PCT/US2011/038463에 기술되어 있다.
(고급 오일을 생산하기 위하여) 전통적 방식에 따라서 돌연 변이된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 파생 균주, 즉 균주 C를, 실시예 2에 상세히 기술된 유전자 총 형질 전환법에 따라서 형질 전환 구조물 pSZ1500으로 형질 전환하였다. 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 한천 평판 상에서 1차 형질 전환체를 선택하고, 이를 클론으로 정제한 다음, 단일 조작된 계열인 균주 D를 분석용으로 선택하였다. 균주 D는 본원에 기술된 바와 같이 생육하였다. 그 다음, 표준적 방법을 사용하여, 제조된 바이오매스로부터의 오일 헥산 추출법을 수행하였는데, 이 경우, 생성된 트리글리세라이드 오일은 잔여 헥산이 존재하지 않는 것으로 확인되었다. 익스펠러 프레스를 사용하여 미세 조류로부터 오일을 추출하는 기타 다른 방법은 본원에 참조로 포함되어 있는 PCT 특허 출원 PCT/US2010/31108호에 기술되어 있다.
이후, 널리 공지된 식물성 오일 가공법을 사용하여 균주 D의 바이오매스로부터 추출된 오일을 정제, 표백 및 탈취하였다. 이와 같은 방법들을 통하여 오일 샘플(RBD469)을 제조하였는데, 이 샘플을 대상으로, 미국 유지 화학회, 미국 재료 시험 협회 및 국제 표준화 기구에 규정된 방법에 따라서 분석 테스트 프로토콜 다수 개를 수행하였다. 이러한 분석 결과들은 하기 표 60에 요약되어 있다.
[표 60]
Figure 112013079886893-pct00068
프로토테카 모리포르미스 균주 D RBD469 오일의 동일한 분획을 미량 원소 함량, 고체 지방 함량 및 로비본드 색상에 대해 분석하였다(AOCS 방법에 따름). 이와 같은 분석 결과들을 하기의 표 61, 표 62 및 표 63에 제시하였다.
Figure 112013079886893-pct00069
Figure 112013079886893-pct00070
Figure 112013079886893-pct00071
RBD469 오일을 대상으로 에스테르 결합 전이법을 수행하여 지방산 메틸 에스테르(FAME)를 생산하였다. 얻어진 RBD469의 지방산 메틸 에스테르 프로필을 표 64에 나타내었다.
Figure 112013079886893-pct00072
실시예 20: 지방산 프로필이 변경된 조작 미세 조류
전술한 바와 같이, 프로토테카 종 내 특이적 내인성 지질 경로 효소를 녹아웃 또는 녹다운하도록 이종 유전자를 통합시키면, 조작된 미생물의 지방산 프로필이 바뀔수 있었다. 본 실시예에서는 숙주 세포의 지질 프로필이, 내인성 지방 아실-ACP 티오에스테라제 유전자인 FATA1을 녹아웃 또는 녹다운함으로써 영향을 받을 수 있는지 여부에 대해 평가하기 위해 플라스미드 구조물을 제조하였다.
A. 내인성 프로토테카 모리포르미스 티오에스테라제 유전자를 녹아웃함으로써 지질 프로필 변경
(고급 오일을 생산하도록) 전통적 방식으로 돌연 변이된 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 파생 균주, 균주 A에, 실시예 2의 방법을 사용하여 표 65의 플라스미드 구조물들 중 하나를 도입하여 이 균주를 형질 전환하였다. 각각의 구조물은, 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 에스.세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역과 내인성 FATA1 유전자를 중단하는, 핵내 게놈으로의 통합에 사용되는 영역을 함유하였다. 이와 같은 에스.세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 159로서 나열하였으며, 이는 선택 마커로서 사용되었다. 모든 단백질 암호화 영역은, 표 2에 따라서 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 최적화된 코돈이었다. 핵내 게놈 통합에 사용되는 FATA1 유전자에 대한 표적화 영역과 관련된 서열들을 이하에 나타내었다.
설 명 서열 번호
FATA1 위치로의 통합에 사용되는 5' 서열 서열 번호 251
FATA1 위치로의 통합에 사용되는 3' 서열 서열 번호 252
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 A를 형질 전환하는데 사용된 플라스미드 구조물
플라스미드
구조물 		서열 요소
1 FATA1-CrbTub_yInv_nr-FATA1
2 FATA1-CrbTub_yInv_nr::amt03_CwTE2_nr-FATA1
구조물 FATA1-CrbTub_yInv_nr-FATA1(서열 번호 253) 내 관련 제한 위치들은 굵은 글씨체의 소문자에 밑줄을 쳐서 표시하였는데, 이 제한 위치들로서는 각각 5'→3' 방향의 BspQ 1, Kpn I, Asc I, Mfe I, Sac I, BspQ I이 있다. BspQI 위치는 형질 전환 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 굵은 글씨체의 소문자로 표시한 서열은, 상동성 재조합을 통하여 FATA1 위치에서 표적화 통합이 일어나는 것을 허용하는 균주 A 유래 게놈 DNA를 나타낸다. 5'→3' 방향으로 진행하였을 때, (균주 A에 수크로스를 대사하는 능력을 부여하는) 효모 수크로스 인버타제 유전자의 발현을 작동하는 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터는 글자에 박스를 쳐서 표시하였다. 인버타제에 대한 개시 인자 ATG와 종결 인자 TGA는 굵은 이탤릭체의 대문자로 표시하였으며, 암호화 영역은 이탤릭체 소문자로 표시하였다. 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR은 소문자에 밑줄을 쳐서 표시하였고, 그 다음에 존재하는 굵은 글씨체의 소문자는 균주 A의 FATA1 게놈 영역을 표시하는 것이었다.
Figure 112013079886893-pct00073
Figure 112013079886893-pct00074
쿠페아 라이티 ACP-티오에스테라제 2(CwTE2) 유전자(수탁 번호 제U56104호)를, 균주 A의 FATA1 위치에 도입하기 위하여, 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 89) 및 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있는 CwTE2 유전자의 단백질 암호화 영역을 발현하는 구조물을 제조하였다. 균주 A 내에서 발현된 구조물은 FATA1-CrbTub_yInv_nr::amt03_CwTE2_nr-FATA1(서열 번호 254)이라 표시하였다.
구조물 FATA1-CrbTub_yInv_nr::amt03_CwTE2_nr-FATA1 내 관련 제한 위치들은 굵은 글씨체의 소문자에 밑줄을 쳐서 표시하였으며, 이 제한 위치들로서는 각각 5'→3' 방향의 BspQ 1, Kpn I, Asc I, Mfe I, BamH I, EcoR I, Spe I, Asc I, Pac I, Sac I, BspQ I이 있다. BspQI 위치들은 형질 전환 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정하였다. 굵은 글씨체의 소문자로 표시한 서열은 상동성 재조합을 통하여 FATA1 위치에서의 표적화 통합을 허용하는 균주 A 유래 게놈 DNA를 나타낸다. 5'→3' 방향으로 진행하였을 때, (균주 A에 수크로스를 대사하는 능력을 부여하는) 효모 수크로스 인버타제 유전자의 발현을 작동하는 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터는 문자에 박스를 쳐서 표시하였다. 인버타제에 대한 개시 인자 ATG와 종결 인자 TGA는 굵은 이탤릭체의 대문자로 표시하였으며, 암호화 영역은 이탤릭체 소문자로 표시하였다. 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR은 소문자에 밑줄을 쳐서 표시하였고, 그 다음에 존재하는 프로토테카 모리포르미스의 내인성 Amt03 프로모터는 이탤릭체 문자에 박스를 쳐서 표시하였다. 씨.라이티 ACP-티오에스테라제의 개시 인자 ATG 및 종결 인자 TGA 코돈은 굵은 이탤릭체의 대문자로 표시하였으며, ACP-티오에스테라제 암호화 영역의 나머지 부분은 굵은 이탤릭체로 표시하였다. 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR은 또한 소문자에 밑줄을 쳐서 표시하였으며, 그 다음에 존재하는 균주 A FATA1 게놈 영역은 굵은 글씨체의 소문자로 표시하였다.
Figure 112013079886893-pct00075
Figure 112013079886893-pct00076
Figure 112013079886893-pct00077
Figure 112013079886893-pct00078
플라스미드 구조물 1 또는 2를 개별적으로 균주 A에 도입하여 이 균주를 형질 전환하고 나서, 유일한 탄소원으로서 수크로스를 포함하는 한천 평판 상에서 양성 클론들을 선택하였다. 상기 실시예들에서와 같이, 1차 형질 전환체를 클론으로서 정제한 다음, 표준적 지질 생산 조건(pH 7) 하에서 생육하고 나서, 각각의 형질 전환체 유래 무수 바이오매스로 지질 샘플들을 제조하였다. 실시예 11에 기술된 바와 같은 직접 에스테르 결합 전이법을 사용하여 지방산 프로필을 측정하였다. 구조물 1로 형질 전환하여 생성된 대표적인 클론 세트들로부터 얻어진 지방산 프로필(총 지방산의 면적%로 표시)을, 형질 전환되지 않은 균주 A 대조군의 지방산 프로필과 비교한 결과를 표 66에 제시하였다. 구조물 2로 형질 전환하여 생성된 대표적인 클론 세트들로부터 얻어진 지방산 프로필(총 지방산의 면적%로 표시)을, 형질 전환되지 않은 균주 A 대조군의 지방산 프로필과 비교한 결과를 표 67에 제시하였다.
Figure 112013079886893-pct00079
표 66에 제시된 결과들은, 숙주의 내인성 FATA1 대립 유전자가 소모될 경우, 조작된 미세 조류의 지방산 프로필이 바뀐다는 것을 보여주는 것이다. 선택가능한 마커를 내인성 FATA1 대립 유전자에 표적화하였을 때, 형질 전환된 미생물의 지방산 프로필에 상기 표적화가 미치는 영향력으로 인하여 C16:0 지방산은 명확히 감소하였으며, 이와 아울러 C18:1 지방산은 증가하였다.
Figure 112013079886893-pct00080
숙주 FATA1 대립 유전자에 선택가능한 마커만을 표적화하는 것과 아울러, 외인성 티오에스테라제와 함께 선택가능한 마커를 통합하였더니, 조작된 미세 조류의 지방산 프로필이 바뀌었다. 상기 표 67에 보인 바와 같이, FATA1 대립 유전자를 중단하는 외인성 티오에스테라제 유전자를 표적화한 결과, C16:0 지방산 생산이 명확히 감소하였다. FATA1 위치에서 CwTE2 티오에스테라제를 발현하면 또한, 분석된 형질 전환체 내에서 나타나는 외인성 티오에스테라제 활성의 수준에 의존적으로 중간쇄 지방산과 C18:1 지방산 생산에 영향을 미쳤다. 표적 통합 위치에서 증폭된 이식 유전자의 복사체 수와 티오에스테르 수준은 서로 조화가 매우 잘 되었다(이는 지방산 프로필에 대한 영향력이나 재조합 단백질 축적 여부(웨스턴 블럿팅에 의해 평가됨)에 의해 규명됨).
CwTE2 유전자를 증폭시킨 유전자 이식 계열에서는 C10:0 내지 C14:0 지방산이 눈에 띄게 증가하였고, 이와 아울러 C18:1 지방산은 감소하였다. 이와는 대조적으로, CwTE2를 약간 증폭시켰거나 아예 증폭시키지 않은 형질 전환체들은 외인성 티오에스테라제를 더욱 낮은 수준으로 발현하였으며, 그 결과, 중간쇄 지방산은 약간 증가하였고, C18:1 지방산의 증가에는 더욱 큰 영향을 미쳤다.
종합하여 보면, 상기 데이터는 숙주의 내인성 FATA1 대립 유전자가 표적 중단되면 조작된 미세 조류의 지질 프로필이 바뀐다는 것을 보여준다. 이 데이터는, FATA 대립 유전자를 표적 중단시켜, 조작된 미생물 세포의 지방산 프로필을 바꿀수 있는(특히 C16 지방산 농도를 감소시키고, C18:1 지방산 농도를 증가시킬 수 있는) 폴리뉴클레오티드의 유용성과 효율을 입증하였다. 상기 데이터는 또한, FATA 대립 유전자의 표적 중단을 허용함과 동시에, 조작된 미생물 세포의 지방산 프로필을 바꾸는(특히 C16 지방산의 농도를 감소시키는) 외인성 티오에스테라제를 발현하는, 폴리뉴클레오티드의 유용성과 효율도 입증하였다.
B. 내인성 프로토테카 모리포르미스 티오에스테라제 유전자의 녹다운에 의한 지질 프로필의 변화
RNAi에 의해 프로토테카 모리포르미스 FATA1 유전자 발현을 하향 조절하는 구조물을, 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 균주 A 유전적 배경에 도입하였다. 사카로마이세스 세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 유전자를, 유일한 탄소원으로서 수크로스를 바탕으로 생육할 수 있는 능력을 부여하는 선택가능한 마커로서 이용하였다. 구조물은 FatA1 암호화 영역의 제1 엑손 → 내인성 인트론 → 제1 엑손의 역방향 반복 단위를 이용하였다. 6S 게놈 영역에 대한 5' 및 3' 상동성 재조합 표적화 서열(구조물에 측접)(각각 서열 번호 82 및 84로 나열됨)을 헤어핀 구조물의 통합을 위해 핵내 게놈에 포함시켰다. 이 구조물을 6S::β-Tub:suc2:nr:: β-tub:hairpinFatA:nr::6S로 명명하였다.
6S::β-Tub:suc2:nr:: β-tub:hairpin FatA:nr::6S 내 관련 제한 위치들은 굵은 글씨체의 소문자에 밑줄을 쳐서 표시하였으며, 이 제한 위치로서는 각각 5'→3' 방향의 BspQ 1, Kpn I, Mfe I, BamH I, EcoR I, Spe I, Xho I, Sac I, BspQ I이 있다. BspQI 위치는 형질 전환 DNA의 5' 말단 및 3' 말단을 한정한다. 굵은 글씨체의 소문자로 표시한 서열은 상동성 재조합을 통하여 6S 위치에서의 표적 통합을 허용하는 균주 A 유래 게놈 DNA를 나타낸다. 5'→3' 방향으로 진행되는, 효모 수크로스 인버타제 유전자(균주 A가 수크로스를 대사할 수 있는 능력 부여)의 발현을 작동하는 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터는 글자에 박스를 쳐서 표시하였다. 인버타제에 대한 개시 인자 ATG 및 종결 인자 TGA는 굵은 이탤릭체의 대문자로 표시하였으며, 암호화 영역은 이탤릭체의 소문자로 표시하였다. 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR은 소문자에 밑줄을 쳐서 표시하였으며, 그 다음에 존재하는 제2 씨.레인하르드티 β-튜불린 프로모터(헤어핀 FatA1의 발현을 작동함)는 이탤릭체에 박스를 쳐서 표시하였다. FatA1의 개시 인자 ATG 코돈은 굵은 이탤릭체의 대문자로 표시하였으며, FatA1 암호화 영역의 제1 엑손의 나머지 부분은 대문자로 표시하였다. FatA 유전자의 인트론은 대문자에 밑줄을 쳐서 표시하였으며, 굵은 이탤릭체 대문자에 밑줄을 쳐서 표시한 링커 영역은 FatA1 인트론/역행 제1 엑손 접합부에 삽입하여, 이 벡터 내에서의 RNA 스플라이싱을 보조하도록 만들었다. FatA1의 역행 제1 엑손은 대문자로 표시하였다. 씨.불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR도 역시 소문자에 밑줄을 쳐서 표시하였으며, 그 다음에 존재하는 균주 A의 6S 게놈 영역은 굵은 글씨체의 소문자로 표시하였다. 이 RNAi 구조물의 FATA 부분들의 서열은 서열 번호 255로서 나열하였다.
Figure 112013079886893-pct00081
Figure 112013079886893-pct00082
Figure 112013079886893-pct00083
6S::β-Tub:suc2:nr:: β-tub:hairpin FatA:nr::6S를 발현하였을 경우, 헤어핀 RNA가 형성되어 표적 FatA 유전자 생성물이 침묵되었다. 구조물 6S::β-Tub:suc2:nr:: β-tub:hairpin FatA:nr::6S를 균주 A에 도입하여 이 균주를 형질 전환하고 나서, 유일한 탄소원으로서 수크로스를 포함하는 한천 평판 상에서 양성 클론들을 선택하였다. 1차 형질 전환체를 클론으로서 정제한 다음, 표준적 지질 생산 조건(pH 5.0) 하에서 생육하고 나서, 각각의 형질 전환체 유래 무수 바이오매스로 지질 샘플들을 제조하였다. 실시예 11에 기술된 바와 같은 직접 에스테르 결합 전이법을 사용하여 지방산 프로필을 측정하였다. 형질 전환하여 생성된 대표적인 클론 세트들로부터 얻어진 지방산 프로필(총 지방산의 면적%로 표시)을, 형질 전환되지 않은 균주 A 대조군의 지방산 프로필과 비교한 결과를 표 68에 제시하였다.
Figure 112013079886893-pct00084
표 68에 제시된 데이터는, FATA 헤어핀 RNA 구조물의 발현이 숙주 유기체의 C16 및 C18:1 지방산 프로필에 미치는 명확한 영향력을 보여주는 것이다. FATA 헤어핀 RNA 구조물을 포함하는 균주 A 형질 전환체의 지방산 프로필은, C18:1 지방산 백분율이 증가하였음과 아울러, C16 지방산은 감소하였음이 확인되었다. 이러한 데이터는, 조작된 숙주 미생물의 지방산 프로필을 바꾸는데 있어서(특히 미생물 세포 내 C18:1 지방산 농도를 증가시키고, C16 지방산의 농도를 감소시키는데 있어서) 프로토테카 모리포르미스 내 폴리뉴클레오티드 FATA RNA 헤어핀 구조물의 성공적인 발현과 용도를 입증하는 것이다.
실시예 21: 클로렐라 소로키니아나의 조작
본 발명에 의하여, 본원에 기술된 바와 같이 Dawson(도슨) et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형함으로써 클로렐라 소로키니아나 내에서 재조합 유전자를 발현시킬 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Dawson et al ., Current Microbiology Vol. 35 (1997) pp. 356-362]에는 플라스미드 DNA로 클로렐라 소로키니아나를 핵내에서 안정적으로 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 도슨은 미세 입자 투사법(microprojectile bombardment)과 같은 형질 전환법을 사용하여, 전 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 유전자(NR, GenBank 수탁 번호 제U39931호)를 암호화하는 플라스미드 pSV72-NRg를 돌연 변이 클로렐라 소로키니아나(NR 돌연 변이체)에 도입하였다. 상기 NR 돌연 변이체는 질소원으로서 질산염을 사용하지 않으면 생육할 수 없었다. 질산염 환원 효소는 질산염이 아질산염으로 전환되는 것을 촉진한다. 형질 전환하기 전, 클로렐라 소로키니아나 NR 돌연 변이체는 유일한 질소원으로서 질산염(NO3 -)을 포함하는 배양 배지상에서 마이크로콜로니 단계 이상으로는 생육하지 못하였다. NR 돌연 변이체 클로렐라 소로키니아나 내 클로렐라 불가리스 NR 유전자 생성물의 발현은 질산염 대사 결핍을 복구하는 선택가능한 마커로서 사용되었다. pSV72-NRg 플라스미드로 형질 전환하여, 클로렐라 불가리스 NR 유전자 생성물을 안정적으로 발현하는 NR 돌연 변이 클로렐라 소로키니아나(유일한 탄소원으로서 질산염을 포함하는 한천 평판 상에서 마이크로콜로니 단계 이상으로 생육할 수 있었음)를 제조하였다. 안정적인 형질 전환체의 DNA 평가는 서던 블럿 분석법에 의해 수행되었으며, 안정적인 형질 전환체의 RNA 평가는 RNase 보호법(RNase protection)에 의해 수행되었다. 형질 전환된 클로렐라 소로키니아나(NR 돌연 변이체)의 선택과 유지는, 0.2g/L MgSO4, 0.67g/L KH2PO4, 3.5g/L K2HPO4, 1.0g/L Na3C6H5O7·H2O 및 16.0g/L 한천, 적당한 질소원(예를 들어, NO3 -), 미세 영양소 및 탄소원을 포함하는 한천 평판(pH 7.4) 상에서 수행되었다. 도슨은 또한 클로렐라 소로키니아나 및 클로렐라 소로키니아나 NR 돌연 변이체의 액체 배양 배지 중 번식에 대해서도 개시하였다. 도슨은 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 유전자의 3' UTR/종결 인자와 프로모터, 그리고 플라스미드 pSV72-NRg는 클로렐라 소로키니아나 NR 돌연 변이체 중 이종 유전자를 발현하는데 적당하였다고 개시하였다. 도슨은 또한 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 유전자 생성물의 발현은 클로렐라 소로키니아나 NR 돌연 변이체 내에서 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서는, 선택가능한 마커로서 사용될 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소(CvNR) 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pSV72-NRg를 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 제조하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택된 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 여기서, 각각의 단백질 암호화 서열은 표 69에 따른 클로렐라 소로키니아나의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 클로렐라 소로키니아나 내 발현에 대하여 최적화된 코돈이었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각 단백질 암호화 서열 상류의 CvNR 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었고, 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에서 CvNR 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 추가로는 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는 클로렐라 소로키니아나 게놈에 대한 상동성 영역을 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 클로렐라 소로키니아나는, 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 미세 입자 투사법 또는 기타 다른 공지된 방법을 통해 형질 전환 벡터를 사용하여 안정적으로 형질 전환되었다. CvNR 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 클로렐라 소로키니아나 NR 돌연 변이 균주의 질소 동화 결핍을 복구하고, 형질 전환 벡터를 안정적으로 발현하는 클로렐라 소로키니아나 NR 돌연 변이체를 선택하는 선택가능한 마커로서 사용될 수 있었다. 클로렐라 소로키니아나 지질 생산에 적당한 생육 배지는 0.5g/L KH2PO4, 0.5g/L K2HPO4, 0.25g/L MgSO4-7H2O와, 보충 미량 영양소, 그리고 적당한 질소원과 탄소원을 포함하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다(Patterson, Lipids Vol.5:7 (1970), pp.597-600). 클로렐라 소로키니아나 지질의 지방산 프로필은 본원에 기술된 분석 방법과 표준적 지질 추출법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 22 내지 실시예 44: 도입 및 표
이하 실시예 22 내지 실시예 44는 본 발명에 따라서 다양한 미생물을 조작하는 것에 관해 기술하고 있다. 미생물의 지방산 프로필을 변경하기 위하여, 미생물을 유전자 변형할 수 있었는데, 이때, 내인성 또는 외인성 지질 생합성 경로 효소는 발현 또는 과발현되었거나, 발현이 약화되었다. 미생물 지질 자체의 지방산 프로필을 지방산 불포화 정도에 대해서 바꾸고, 지방산 사슬 길이를 감소 또는 증가시키기 위하여 미생물을 유전자 조작하는 단계는, 형질 전환 벡터(예를 들어, 플라스미드)의 설계 및 구성, 하나 이상의 벡터를 사용하는 미생물의 형질 전환, 형질 전환된 미생물(형질 전환체)의 선택, 형질 전환된 미생물의 생육, 그리고 조작된 미생물에 의해 생산된 지질의 지방산 프로필 분석을 포함한다.
숙주 유기체의 지방산 프로필을 바꾸는 이식 유전자는 다수의 진핵 미생물 내에서 발현될 수 있었다. 진핵 미생물, 예를 들어 클라미도모나스 레인하르드티,　클로렐라 엘립소이데아,　클로렐라 사카로필라, 클로렐라 불가리스,　클로렐라 케슬러리,　클로렐라 소로키니아나,　해마토코커스 플루비알리스,　고니움 펙토랄레, 볼복스 칼테리,　두날리엘라 터티올렉타, 두날리엘라 비리디스, 두날리엘라 살리나, 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체, 나노클로롭시스 종, 탈라시오시라 슈도나나, 파에오닥틸룸 트리코르누툼, 나비큘라 사프로필라, 실린드로테카 후시포르미스, 시클로텔라 크립티카, 심비오디늄 마이크로아드리악티큠, 암피디늄 종, 카에토세로스 종, 모르티에렐라 알피나,　그리고 야로위아 리폴리티카 내에서 이식 유전자를 발현하는 예는 과학 문헌에서 살펴볼 수 있다. 이와 같은 발현 기술들은 본 발명에 교시된 기술들 즉, 지방산 프로필에 변화가 있는 조작 미생물을 생산하기 위한 기술들과 통합될 수 있었다.
숙주 유기체의 지방산 프로필에 변화를 일으키는 이식 유전자는 또한 다수의 원핵 미생물 내에서 발현될 수도 있었다. 유지성 미생물, 예를 들어 로도코커스 오파쿠스 내에서 이식 유전자를 발현하는 것에 관한 예도 문헌에서 살펴볼 수 있다. 이와 같은 발현 기술들은 본 발명에 교시되어 있는 기술들 즉, 지방산 프로필에 변화가 있는 조작 미생물을 생산하기 위한 기술들과 통합될 수 있었다.
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지질 생합성 경로 단백질들
3-케토아실 ACP 합성 효소

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지방 아실-ACP 티오에스테라제

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불포화 효소

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올리에이트 12-하이드록실라제 효소

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피사리아 린데이메리 돌연 변이 이작용성 올리에이트 12-하이드록실라제:불포화 효소(GenBank 수탁 번호 제ACF17571.1호), 피사리아 린데이메리 이작용성 올리에이트 12-하이드록실라제:불포화 효소(GenBank 수탁 번호 제ACQ42234.1호), 피사리아 린데이메리 이작용성 올리에이트 12-하이드록실라제:불포화 효소(GenBank 수탁 번호 제AAC32755.1호), 아라비돕시스 라이라타 아종 라이라타(GenBank 수탁 번호 제XP_002884883.1호)
실시예 22: 클로렐라 불가리스의 조작
본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현을, 본원에 기술된 바와 같이 Chow(초우) 및 Tung(퉁) et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형하여 클로렐라 불가리스 내에서 수행할 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Chow 및 Tung et al ., Plant Cell Reports, Volume 18 (1999), pp. 778-780]에는 클로렐라 불가리스를 플라스미드 DNA로 핵내에서 안정적으로 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 초우 및 퉁은, 전기 천공법과 같은 형질 전환법을 사용하여 플라스미드 pIG121-Hm(GenBank 수탁 번호 제AB489142호)을 클로렐라 불가리스에 도입하였다. pIG121-Hm의 뉴클레오티드 서열은, 베타-글루큐로니다제(GUS) 단백질 암호화 서열 상류의 CaMV 35S 프로모터에 작동 가능하도록 결합되었으며, 또한 GUS 단백질 암호화 서열 하류의 노팔린 합성 효소(nos) 유전자의 3'UTR/종결 인자에도 작동 가능하도록 결합된, GUS 리포터 유전자 생성물을 암호화하는 서열을 포함하였다. 플라스미드 pIG121-Hm 서열은 하이그로마이신 B 항생제 내성 카세트를 추가로 포함하였다. 이 하이그로마이신 B 항생제 내성 카세트는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hpt, GenBank 수탁 번호 제BAH24259호) 유전자 생성물을 암호화하는 서열에 작동 가능하도록 결합된 CaMV 35S 프로모터를 포함하였다. 형질 전환하기 전, 클로렐라 불가리스는 50ug/㎖ 하이그로마이신 B를 포함하는 배양 배지 중에서 번식될 수 없었다. pIG121-Hm 플라스미드로 형질 전환을 수행한 결과, 50ug/㎖ 하이그로마이신 B를 포함하는 배양 배지중에서 번식한 클로렐라 불가리스 형질 전환체를 제조하였다. 클로렐라 불가리스 내 hpt 유전자 생성물의 발현은, 50ug/㎖의 하이그로마이신 B의 존재 하에 형질 전환된 클로렐라 불가리스의 번식을 가능하게 만들었는데, 이로써 클로렐라 불가리스 내에서 사용될 선택가능한 마커로서 하이그로마이신 B 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. GUS 리포터 유전자의 검출 가능한 활성은, CaMV 35S 프로모터 및 nos 3'UTR이 클로렐라 불가리스 내 이종 유전자 발현을 가능하게 만드는데 적당함을 암시하였다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법으로 평가하였다. 형질 전환된 클로렐라 불가리스의 선택과 유지는 YA 배지(한천 및 4g/L 효모 추출물)를 포함하는 한천 평판 상에서 수행하였다. 액체 배양 배지 중 클로렐라 불가리스의 번식은 초우 및 퉁에 의해 기술된 바와 같이 수행되었다. YA 배지 이외의 배지 중에서 클로렐라 불가리스의 번식에 대해서는 이미 개시된 바 있다(예를 들어, 문헌[Chader et al., Revue des Energies Renouvelabes, Volume 14 (2011), pp. 21-26] 및 [Illman et al., Enzyme and Microbial Technology, Vol. 27 (2000), pp. 631-635] 참조). 초우 및 퉁은, 플라스미드 pIG121-Hm, CaMV 35S 프로모터 및 아그로박테리움 튜미파시엔스 노팔린 합성 효소 유전자 3'UTR/종결 인자가 클로렐라 불가리스 내 이종 유전자 발현을 가능하게 만드는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 초우 및 퉁은, 하이그로마이신 B 내성 카세트는 클로렐라 불가리스 내 선택가능한 마커로서 사용되기 적당하였다고 개시하였다. 부가의 플라스미드, 프로모터, 3'UTR/종결 인자, 그리고 클로렐라 불가리스 내 이종 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당한 선택가능한 마커에 대해서는 문헌[Chader et al., Revue des Energies Renouvelabes, Volume 14 (2011), pp. 21-26]에 기술되어 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로 사용되는 하이그로마이신 B 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pIG121-Hm을 구성하고 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 제조하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 이 경우, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 의한 클로렐라 불가리스의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 클로렐라 불가리스 내에서의 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 회적화된 유전자 서열은 각각 단백질 암호화 서열 상류의 CaMV 35S 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었으며, 또한 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에 있는 아그로박테리움 튜미파시엔스 노팔린 합성 효소 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 추가로는 클로렐라 불가리스 게놈에 상동성인 영역(형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합용)을 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 전기 천공법 또는 기타 다른 공지된 방법을 통하여 클로렐라 불가리스는 형질 전환 벡터로 안정적으로 형질 전환될 수 있었다. 하이그로마이신 B 내성 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 하이그로마이신을 포함하는 한천 배지 상에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 클로렐라 불가리스를 선택하기 위한 마커로서 사용될 수 있었다. 클로렐라 불가리스 지질 생산에 적당한 생장 배지는 미량 금속이 보충되어 있으며, 임의로는 1.5g/L NaNO3도 함유하는 BG11 배지(0.04g/L KH2PO4, 0.075g/L CaCl2, 0.036g/L 시트르산, 0.006g/L 구연산 철 암모늄, 1㎎/L EDTA 및 0.02g/L Na2CO3)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 지질 생산용으로서 클로렐라 불가리스를 배양하는데 적당한 부가 배지는, 예를 들어 와타나베 배지(1.5g/L KNO3, 1.25g/L KH2PO4, 1.25　g l-1 MgSO4·7H2O, 20　mg　l-1 FeSO4·7H2O와 미량 영양소, 그리고 저 질소 배지(203㎎/L (NH4)2HPO4, 2.236g/L KCl, 2.465g/L MgSO4, 1.361g/L KH2PO4 및 10㎎/L FeSO4 포함))를 포함한다(Illman et al., Enzyme and Microbial Technology, Vol. 27 (2000), pp. 631-635). 클로렐라 불가리스 지질의 지방산 프로필은 본원에 기술된 바와 같은 표준적인 지질 추출 및 분석 방법을 통하여 평가할 수 있었다.
실시예 23: 클로렐라 엘립소이데아의 조작
본 발명에 따라서, 재조합 유전자의 발현은 본원에 기술된 바와 같이 Chen(첸) et al.에 의하여 교시된 방법과 벡터를 변형하여 클로렐라 엘립소이데아 내에서 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Chen et al., Current Genetics, Vol. 39:5 (2001), pp. 365-370]에는 클로렐라 엘립소이데아를 플라스미드 DNA로 안정적으로 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 첸은 전기 천공법과 같은 형질 전환법을 사용하여 플라스미드 pBinUWNP-1을 클로렐라 엘립소이데아에 도입하였다. pBinUWNP-1의 뉴클레오티드 서열은 호중구 펩티드-1(NP-1) 단백질 암호화 영역 상류의 제아 메이스 유비쿼틴(ubi1) 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합되어 있으며, 또한 NP-1 단백질 암호화 영역 하류의 노팔린 합성 효소(nos) 유전자의 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합된, NP-1 토끼 유전자 생성물 암호화 서열을 포함하였다. 플라스미드 pBinUWNP-1의 서열은 또한 G418 항생제 내성 카세트를 추가로 포함하였다. 이 G418 항생제 내성 카세트는 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제(aph 3') 유전자 생성물을 암호화하는 서열을 포함하
였다. aph 3' 유전자 생성물은 항생제 G418에 대한 내성을 부여하였다. 형질 전환하기 전, 클로렐라 엘립소이데아는 30ug/㎖ G418을 포함하는 배양 배지 중에서 번식할 수 없었다. pBinUWNP-1 플라스미드로 형질 전환하여, 30ug/㎖ G418을 포함하는 선택 배양 배지 중에서 번식한 클로렐라 엘립소이데아 형질 전환체를 제조하였다. 클로렐라 엘립소이데아 내에서 aph 3' 유전자 생성물을 발현하면, 30ug/㎖ G418 존재 하에 형질 전환된 클로렐라 엘립소이데아가 번식할 수 있었으므로, 클로렐라 엘립소이데아 내에서 사용될 G418 항생제 내성 카세트의 선택가능한 마커로서의 유용성이 확립되었다. NP-1 유전자 생성물의 검출 가능한 활성은, ubi1 프로모터와 nos 3'UTR이 클로렐라 엘립소이데아 내에서의 이종 유전자 발현을 가능하게 만드는데 적당하다는 것을 나타낸다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법에 의해 평가하였다. 형질 전환된 클로렐라 엘립소이데아의 선택 및 유지는 납(Knop) 배지(0.2g/L K2HPO4, 0.2g/L MgSO4 ·7H2O, 0.12g/L KCl 및 10㎎/L FeCl3(pH 6.0 내지 8.0)를 포함하고, 0.1% 효모 추출물과 0.2% 글루코스가 보충됨)로서, 15ug/㎖ G418(액체 배양액용) 또는 30ug/㎖ G418(1.8% 한천을 포함하는 고체 배양액용)을 포함하는 배지에서 수행되었다. 납 배지 이외의 배지 중에서 클로렐라 엘립소이데아를 번식시키는 것에 대해서는 개시된 바 있다(문헌[Cho et al ., Fisheries Science, Vol. 73:5 (2007), pp. 1050-1056], [Jarvis 및 Brown, Current Genetics, Vol. 19 (1991), pp.317-321] 및 [Kim et al ., Marine Biotechnology, Vol. 4 (2002), pp.63-73] 참조). 부가의 플라스미드, 프로모터, 3'UTR/종결 인자 및 클로렐라 엘립소이데아 내에서 이종 유전자를 발현하는데 적당한 선택가능한 마커에 대해서도 개시된 바 있다(문헌[Jarvis 및 Brown 및 Kim et al ., Marine Biotechnology, Vol. 4 (2002), pp.63-73] 참조). 첸은, 플라스미드 pBinUWNP-1, ubi1 프로모터, 그리고 아그로박테리움 튜미파시엔스 노팔린 합성 효소 유전자 3'UTR/종결 인자가 클로렐라 엘립소이데아 내에서 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 첸은, pBinUWNP-1 상에서 암호화된 G418 내성 카세트가 클로렐라 엘립소이데아 내에서 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, aph 3' 유전자 생성물을 암호화하고, G418에 대한 내성을 부여하며, 선택가능한 마커로서 사용되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pBinUWNP-1을 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 생산하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택된 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 여기서, 각각의 단백질 암호화 서열은 표 69에 의한 클로렐라 엘립소이데아의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 클로렐라 엘립소이데아 내에서의 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 회적화된 유전자 서열은 각각 단백질 암호화 서열 상류의 제아 메이스 ubi1 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있으며, 또한 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에 있는 아그로박테리움 튜미파시엔스 노팔린 합성 효소 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 추가로 클로렐라 엘립소이데아 게놈에 상동성인 영역(형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합용)을 포함하였다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 전기 천공법 또는 기타 다른 공지된 방법을 통하여 클로렐라 엘립소이데아는 형질 전환 벡터로 안정적으로 형질 전환되었다. aph3' 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 G418을 포함하는 납 한천 배지 상에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 클로렐라 엘립소이데아를 선택하기 위한 마커로서 사용될 수 있었다. 클로렐라 엘립소이데아 지질 생산에 적당한 생장 배지는 납 배지와, 자비스(Jarvis) 및 브라운(Brown) 및 Kim et al.에 의해 개시된 배양 배지들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 클로렐라 엘립소이데아 지질의 지방산 프로필은 표준적인 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 24: 클로렐라 케슬러리의 조작
본 발명에 따라서, 재조합 유전자의 발현은 본원에 기술된 El-Sheekh(엘-쉬크) et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형하여 클로렐라 케슬러리 내에서 이루어졌다. 간단히 말해서, 문헌[El-Sheekh et al ., Biologia Plantarium, Vol. 42:2 (1999), pp. 209-216]에는, 플라스미드 DNA로 클로렐라 케슬러리를 안정적으로 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 엘-쉬크는 미세 입자 투사법과 같은 형질 전환법을 사용하여 플라스미드 pBI121(GenBank 수탁 번호 제AF485783호)를 클로렐라 케슬러리에 도입하였다. 플라스미드 pBI121은 카나마이신/네오마이신 항생제 내성 카세트를 포함하였다. 이 카나마이신/네오마이신 항생제 내성 카세트는, 아그로박테리움 튜미파시엔스 노팔린 합성 효소(nos) 유전자 프로모터, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(nptII) 유전자 생성물을 암호화하는 서열(GenBank 수탁 번호 제AAL92039호)(카나마이신 및 G418에 대한 내성 부여용), 그리고 아그로박테리움 튜미파시엔스 노팔린 합성 효소(nos) 유전자의 3'UTR/종결 인자를 포함하였다. pBI121은, CaMV 35S 프로모터에 작동 가능하도록 결합되고, 또한 nos 유전자의 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합된 베타-글루쿠로니다제(GUS) 리포터 유전자 생성물을 암호화하는 서열을 추가로 포함하였다. 형질 전환하기 전, 클로렐라 케슬러리는 15ug/L 카나마이신을 포함하는 배양 배지 중에서 번식할 수 없었다. 상기 균주를 pBI121 플라스미드로 형질 전환하여, 15㎎/L 카나마이신을 포함하는 선택 배양 배지중에서 번식한 클로렐라 케슬러리 형질 전환체를 제조하였다. 클로렐라 캐슬러리 내 nptII 유전자 생성물의 발현은, 이 균주가 15㎎/L 카나마이신의 존재 하에서 번식할 수 있도록 만들 수 있으므로, 카나마이신/네오마이신 항생제 내성 카세트의 클로렐라 케슬러리 내에서 사용될 선택가능한 마커로서의 유용성이 확립되었다. GUS 유전자 생성물의 검출 가능한 활성은, CaMV 35S 프로모터와 nos 3'UTR이 클로렐라 케슬러리 내에서 이종 유전자 발현을 가능하도록 만드는데 적당하다는 것을 암시하였다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법으로 평가하였다. 엘-쉬크에 의해 개시된 바와 같이, 형질 전환된 클로렐라 케슬러리의 선택과 유지는, YEG 배지(1% 효모 추출물, 1% 글루코스) 및 15㎎/L 카나마이신을 포함하는 반고체 한천 평판 상에서 수행되었다. 엘-쉬크는 또한 YEG 액체 배양 배지 중 클로렐라 케슬러리의 번식에 대해 개시하였다. 지질 생산을 위해 클로렐라 케슬러리를 배양하는데 적당한 부가의 배지는 문헌[Sato et al., BBA Molecular and Cell Biology of Lipids, Vol. 1633 (2003), pp. 27-34]에 개시되어 있다. 엘-쉬크는, 플라스미드 pBI121, CaMV 프로모터, 그리고 노팔린 합성 효소 유전자 3'UTR/종결 인자가 클로렐라 케슬러리 내에서 이종 유전자 발현을 가능하게 만드는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 엘-쉬크는, pBI121 상에 암호화된 카나마이신/네오마이신 내성 카세트가 클로렐라 케슬러리 내에서 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로서 사용할 카나마이신/네오마이신 내성 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pBI121을 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 제조하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택된 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 여기서, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 의하여 클로렐라 케슬러리의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 클로렐라 케슬러리 내에서의 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각, 단백질 암호화 상류의 CaMV 35S 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있으며, 또한 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에서 아그로박테리움 튜미파시엔스 노팔린 합성 효소 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 추가로는 형질 전환 벡터로의 표적화 게놈 통합용인, 클로렐라 케슬러리 게놈에 상동성인 영역을 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 형질 전환 벡터로 클로렐라 케슬러리를 안정적으로 형질 전환하는 것은, 널리 알려진 형질 전환 기술, 예를 들어 미세 입자 투사법 또는 기타 다른 공지된 방법들을 통하여 이루어졌다. nptII 유전자 생성물의 활성은, 카나마이신이나 네오마이신을 포함하는 YEG 한천 배지(이에 제한되는 것은 아님) 상에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 클로렐라 케슬러리를 선택하기 위한 마커로서 사용될 수 있었다. 클로렐라 케슬러리 지질 생산에 적당한 생장 배지는 YEG 배지와, Sato et al.에 의해 개시된 배양 배지를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 클로렐라 케슬러리 지질의 지방산 프로필은 본원에 기술된 분석 방법과 표준적인 지질 추출법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 25: 두날리엘라 터티올렉타의 조작
본 발명에 따라서, 두날리엘라 터티올렉타 내 재조합 유전자의 발현은 본원에 기술된 바와 같이, Walker(워커) et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형함으로써 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Walker et al ., Journal of Applied Phycology, Vol. 17 (2005), pp. 363-368]에는 두날리엘라 터티올렉타를 플라스미드 DNA로 안정적으로 핵내 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 워커는 전기 천공법과 같은 형질 전환법을 사용하여 플라스미드 pDbleFLAG1.2를 두날리엘라 터티올렉타에 도입하였다. pDbleFLAG1.2는, 스트렙토알로테이쿠스 힌두스타너스(Streptoalloteichus hindustanus) 블레오마이신 결합 단백질(ble)을 암호화하는 서열을 포함하는 블레오마이신 항생제 내성 카세트(항생제 플레오마이신에 대한 내성 부여)를 암호화하는 서열로서, 두날리엘라 터티올렉타 리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제/옥시게나제 소형 서브유닛 유전자(rbcS1, GenBank 수탁 번호 제AY530155호)의 3'UTR과 프로모터에 작동 가능하도록 결합된 서열을 포함하였다. 형질 전환하기 전, 두날리엘라 터티올렉타는 1㎎/L 플레오마이신을 포함하는 배양 배지 내에서 번식할 수 없었다. 이 균주를 pDbleFLAG1.2 플라스미드를 사용하여 형질 전환하여, 1㎎/L 플레오마이신을 포함하는 선택 배양 배지 내에서 번식한 두날리엘라 터티올렉타 형질 전환체를 제조하였다. ble 유전자 생성물의 두날리엘라 터티올렉타 내 발현은, 1㎎/L 플레오마이신의 존재 하에서 번식을 가능하게 만들었으며, 이로써 두날리엘라 터티올렉타 내에서 사용될 선택가능한 마커로서 블레오마이신 항생제 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법으로 평가하였다. 워커에 의해 개시된 바와 같이, 형질 전환된 두날리엘라 터티올렉타의 선택 및 유지는, 4.5g/L NaCl 및 1㎎/L 페오마이신을 추가로 포함하는 두날리엘라 배지(DM, 문헌[Provasoli et al., Archiv fur Mikrobiologie, Vol. 25 (1957), pp. 392-428]에 개시된 바와 같음) 중에서 이루어졌다. 지질을 생산하기 위하여 두날리엘라 터티올렉타를 배양하는데 적당한 부가의 배지는 문헌[Takagi et al ., Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 101:3 (2006), pp. 223-226] 및 [Massart 및 Hanston, Proceedings Venice 2010, Third International Symposium on Energy from Biomass and Waste]에 기술되어 있다. 워커는, 플라스미드 pDbleFLAG1.2, 두날리엘라 터티올렉타 리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제/옥시게나제 소형 서브유닛 유전자의 3'UTR 및 프로모터가, 두날리엘라 터티올렉타 내 이종 발현을 가능하게 하는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 워커는 pDbleFLAG1.2 상에 암호화된 블레오마이신 내성 카세트가 두날리엘라 터티올렉타 내 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서는, 선택가능한 마커로서 사용되는 ble 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pDbleFLAG1.2를 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 제조하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택된 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 여기서, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 의하여 두날리엘라 터티올렉타의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 두날리엘라 터티올렉타 내에서의 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각, 단백질 암호화 서열 상류의 rbcS1 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있으며, 또한 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에 있는 rbcS1 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용될 두날리엘라 터티올렉타 게놈에 대한 상동성 영역을 추가로 포함할 수도 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 두날리엘라 터티올렉타를 형질 전환 벡터로 안정적으로 형질 전환하는 것은, 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 전기 천공법 또는 기타 다른 공지된 방법들을 사용하여 이루어질 수 있었다. ble 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 페오마이신을 포함하는 DM 배지에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 두날리엘라 터티올렉타를 선택하기 위한 마커로서 사용될 수 있었다. 두날리엘라 터티올렉타 지질 생산에 적당한 생장 배지로서는 DM 배지와, Takagi et al. 및 Massart 및 Hanston에 의해 개시된 배양 배지를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 두날리엘라 터티올렉타 지질의 지방산 프로필은 표준적인 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법들을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 26: 볼복스 카르테리의 조작
본 발명에 따라서 볼복스 카르테리 내 재조합 유전자의 발현은 본원에 기술된 바와 같이, Hallman(홀맨) 및 Rappel(라펠) et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형함으로써 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Hallman 및 Rappel et al ., The Plant Journal, Volume 17 (1999), pp. 99-109]에는 볼복스 카르테리를 플라스미드 DNA로 안정적으로 핵내 형질 전환하는 것을 기술한다. 홀맨과 라펠은 미세 입자 투사법과 같은 형질 전환법을 사용하여 pzeoE 플라스미드를 볼복스 카르테리에 도입하였다. pzeoE 플라스미드는, 스트렙토알로테이쿠스 힌두스타너스 블레오마이신 결합 단백질(ble)을 암호화하는 서열을 포함하는 블레오마이신 항생제 내성 카세트(항생제 제오신에 대한 내성 부여)를 암호화하는 서열로서, 볼복스 카르테리 베타-튜불린 유전자(GenBank 수탁 번호 제L24547호)의 3'UTR과 프로모터에 작동 가능하도록 결합된 서열을 포함하였다. 형질 전환하기 전, 볼복스 카르테리는 1.5ug/mL 제오신을 포함하는 배양 배지 내에서 번식할 수 없었다. 이 균주를 pzeoE 플라스미드를 사용하여 형질 전환하여, 20ug/mL 이상의 제오신을 포함하는 선택 배양 배지 내에서 번식된 볼복스 카르테리 형질 전환체를 제조하였다. ble 유전자 생성물의 볼복스 카르테리 내 발현은, 20ug/mL 제오신의 존재 하에서 번식을 가능하게 만들었으며, 이로써 볼복스 카르테리 내에서 사용될 선택가능한 마커로서 블레오마이신 항생제 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법으로 평가하였다. 홀맨과 라펠에 의해 개시된 바와 같이, 형질 전환된 볼복스 카르테리의 선택 및 유지는, 1㎎/L 페오마이신을 포함하는 볼복스 배지(VM, 문헌[Provasoli 및 Pintner, The Ecology of Algae, Special Publication No. 2 (1959)], [Tyron, C.A. 및 Hartman, R.T., eds., Pittsburgh: Univeristy of Pittsburgh, pp. 88-96]에 개시된 바와 같음) 중에서 이루어졌다. 지질을 생산하기 위하여 볼복스 카르테리를 배양하는데 적당한 배지는 문헌[Starr in Starr R,C,. Dev Biol Suppl., Vol. 4 (1970), pp.59-100]에 기술되어 있다. 홀맨과 라펠은 플라스미드 pzeoE, 볼복스 카르테리 베타-튜불린 유전자의 3'UTR 및 프로모터가, 볼복스 카르테리 내 이종 발현을 가능하게 하는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 홀맨과 라펠은 pzeoE 상에 암호화된 블레오마이신 내성 카세트가 볼복스 카르테리 내 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다. 부가의 플라스미드, 프로모터, 3'UTR/종결 인자, 그리고 볼복스 카르테리 내 이종 유전자 발현을 가능하게 하고, 볼복스 카르테리 내 선택 마커로서 사용되기 적당한 선택가능한 마커에 대해서도 개시된 바 있다(예를 들어, 문헌[Hallamann 및 Sumper, Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 91 (1994), pp 11562-11566] 및 [Hallman 및 Wodniok, Plant Cell Reports, Volume 25 (2006), pp. 582-581]을 참조한다).
본 발명의 하나의 구체예에서는, 선택가능한 마커로서 사용되는 ble 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pzeoE를 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 제조하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택된 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 여기서, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 의하여 볼복스 카르테리의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 볼복스 카르테리 내에서의 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각, 단백질 암호화 서열 상류의 볼복스 카르테리 베타-튜불린 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있으며, 또한 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에 있는 볼복스 카르테리 베타-튜불린 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용될 볼복스 카르테리 게놈에 대한 상동성 영역을 추가로 포함할 수도 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 당업자는 볼복스 카르테리 게놈 내 서열에 존재하는 이와 같은 상동성 영역을 동정할 수 있다(문헌[Prochnik et al., Science, Vol. 329:5988 (2010), pp223-226] 참조). 볼복스 카르테리를 형질 전환 벡터로 안정적으로 형질 전환하는 것은, 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 미세 입자 투사법 또는 기타 다른 공지된 방법들을 사용하여 이루어졌다. ble 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 제오신을 포함하는 VM 배지 상에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 볼복스 카르테리를 선택하기 위한 마커로서 사용될 수 있었다. 볼복스 카르테리 지질 생산에 적당한 생장 배지로서는 VM 배지와, 스타(Starr)에 의해 개시된 배양 배지를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 볼복스 카르테리 지질의 지방산 프로필은 표준적인 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법들을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 27: 해마토코커스 플루비알리스의 조작
본 발명에 따라서 해마토코커스 플루비알리스 내 재조합 유전자의 발현은 본원에 기술된 바와 같이, Steinbrenner(슈타인브레너) 및 Sandmann(샌드만) et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형함으로써 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Steinbrenner 및 Sandmann et al ., Applied and Environmental Microbiology, Vol. 72:12 (2006), pp.7477-7484]에는 해마토코커스 플루비알리스를 플라스미드 DNA로 안정적으로 핵내 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 슈타인브레너는 미세 입자 투사법과 같은 형질 전환법을 사용하여 pPlat-pds-L504R을 해마토코커스 플루비알리스에 도입하였다. pPlat-pds-L504R 플라스미드는, 해마토코커스 플루비알리스 피토엔 불포화 효소 유전자(Pds, GenBank 수탁 번호 제AY781170호)의 3'UTR, 단백질 암호화 서열 및 프로모터를 포함하는 노르플루라존 내성 카세트를 포함하였으며, 여기서, Pds의 단백질 암호화 서열은 504번 위치가 변형되어(즉 루신이 아르기닌으로 바뀌어), 제초제 노르플루라존에 대한 내성을 부여하는 유전자 생성물(Pds-L504)을 암호화하였다. pPlat-pds-L504R로 형질 전환하기 전, 해마토코커스 플루비알리스는 5uM 노르플루라존을 포함하는 배지 상에서 번식할 수 없었다. pPlat-pds-L504R 플라스미드로 형질 전환하여, 5uM 노르플루라존을 포함하는 선택 배양 배지중에서 번식한 헤마토코커스 플루비알리스 형질 전환체를 제조하였다. 해마토코커스 플루비알리스 내 Pds-L504R 유전자 생성물의 발현은, 5uM 노르플루라존의 존재 하에서 번식이 가능하도록 만들었는데, 이로써 해마토코커스 플루비알리스 내에서 사용되는 선택가능한 마커로서 노르플루라존 제초제 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법으로 평가하였다. 슈타인브레너에 의해 개시된 바와 같이, 형질 전환된 해마토코커스 플루비알리스의 선택 및 유지는, 2.42g/L 트리스-아세테이트 및 5mM 노르플루라존이 보충된 OHA 배지(OHM(0.41g/L KNO3, 0.03g/L Na2HPO4, 0.246g/L MgSO4·7H2O, 0.11g/L CaCl2·2H2O, 2.62mg/L Fe( III )citrate x H2O, 0.011㎎/L CoCl2·6H2O, 0.012㎎/L CuSO4·5H2O, 0.075㎎/L Cr2O3, 0.98㎎/L MnCl2·4H2O, 0.12㎎/L Na2MoO4 x 2H20, 0.005㎎/L SeO2 및 25㎎/L 바이오틴, 17.5㎎/L 티아민, 그리고 15㎎/L 비타민 B12))를 포함하는 한천 평판 상에서 이루어졌다. 액체 배양액 중 해마토코커스 플루비알리스의 번식은 슈타인브레너 및 샌드만에 의해 기저 배지(문헌[Kobayashi et al ., Applied and Environmental Microbiology, Vol. 59 (1993), pp.867-873]에 기술되어 있는 기저 배지)를 사용하여 이루어졌다. 슈타인브레너와 샌드만은, pPlat-pds-L504R 플라스미드, 해마토코커스 플루비알리스 파이토엔 불포화 효소 유전자의 3'UTR과 프로모터는 해마토코커스 플루비알리스 내 이종 발현을 가능하게 하는데 적당하였다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 슈타인브레너와 샌드만은, pPlat-pds-L504R상에서 암호화되는 노르플루라존 내성 카세트는 해마토코커스 플루비알리스 내 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다. 부가의 플라스미드, 프로모터, 3'UTR/종결 인자, 그리고 해마토코커스 플루비알리스 내에서 이종 유전자를 발현하는데 적당한 선택가능한 마커에 대해서는 문헌[Kathiresan et al., Journal of Phycology, Vol. 45 (2009), pp 642-649]에 개시되어 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로서 사용되는 Pds-L504R　유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pPlat-pds-L504R을 구성하고, 이 벡터가 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 제조하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하는데, 이 경우, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 의하여 해마토코커스 플루비알리스의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 해마토코커스 플루비알리스 내에서의 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각, 단백질 암호화 서열 상류의 해마토코커스 플루비알리스 pds 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있으며, 또한 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에 있는 해마토코커스 플루비알리스 pds 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용될 해마토코커스 플루비알리스 게놈에 대한 상동성 영역을 추가로 포함할 수도 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 해마토코커스 플루비알리스를 형질 전환 벡터로 안정적으로 형질 전환하는 것은, 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 미세 입자 투사법 또는 기타 다른 공지된 방법들을 사용하여 이루어졌다. Pds-L504R 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 노르플루라존을 포함하는 OHA 배지에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 해마토코커스 플루비알리스에 대하여 선택하기 위한 마커로서 사용될 수 있었다. 해마토코커스 플루비알리스 지질 생산에 적당한 생장 배지는 기저 배지 및 문헌[Kobayashi et al., Kathiresan et al, and Gong and Chen, Journal of Applied Phycology, Vol. 9:5 (1997), pp. 437-444]에 기술된 배양 배지를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 해마토코커스 플루비알리스 지질의 지방산 프로필은 표준적인 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 28: 클로스테리움 페라세로섬 - 스트리고섬 - 리토랄레 복합체의 조작
본 발명에 따라서 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체 내 재조합 유전자 발현은 본원에 기술된 바와 같은 Abe(아베) et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형하여 이루어질 수 있었다. 간단히 말하면, 문헌[Abe et al., Plant Cell Physiology, Vol. 52:9 (2011), pp. 1676-1685]에는, 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체를 플라스미드 DNA로 안정적으로 핵내 형질 전환하는 것에 관하여 개시되어 있다. 아베는 미세 입자 투사법과 같은 형질 전환법을 사용하여 플라스미드 pSA106을 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체에 도입하였다. 플라스미드 pSA106은, 스트렙토알로테이쿠스 힌두스타너스 블레오마이신 결합 단백질 유전자(ble, GenBank 수탁 번호 제CAA37050호)를 암호화하는 서열을 포함하는 블레오마이신 내성 카세트로서, 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체 엽록소 a/b 결합 단백질 유전자(CAB, GenBank 수탁 번호 제AB363403호)의 3'UTR과 프로모터에 작동 가능하도록 결합된 카세트를 포함하였다. Psa106으로 형질 전환하기 전, 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체는 3ug/mL 플레오마이신을 포함하는 배지에서 번식할 수 없었다. pSA106을 사용하여 형질 전환하여, 3ug/mL 플레오마이신을 포함하는 선택 배양 배지 내에서 번식한 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체 형질 전환체를 제조하였다. ble 유전자 생성물의 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체 내 발현은, 3ug/mL 플레오마이신의 존재 하에서 번식을 가능하게 만들었는데, 이로써 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체 내에서 사용될 선택가능한 마커로서 블레오마이신 항생제 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법으로 평가하였다. 아베에 의해 개시된 바에 의하면, 형질 전환된 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체의 선택 및 유지는 우선, C 배지(0.1g/L KNO3, 0.015g/L Ca(NO3)2·4H2O, 0.05g/L 글리세로포스페이트 -Na2, 0.04g/L MgSO4·7H2O, 0.5g/L 트리스(하이드록실메틸) 아미노메탄, 미량 무기물, 바이오틴, 비타민 B1 및 B12)를 포함하는 탑 한천에서 수행되었으며, 이후에는 이 복합체를 분리하여, C 배지를 포함하고 플레오마이신이 보충된 한천 평판으로 옮겼다고 개시하였다. 아베에 의해 개시된 바에 의하면, 액체 배양액 중 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체의 번식은 C 배지 중에서 수행되었다. 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체의 번식에 적당한 부가의 액체 배양 배지에 대해서는 문헌[Sekimoto et al ., DNA Research, 10:4 (2003), pp. 147-153]에 기술되어 있다. 아베는, 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체 CAB 유전자의 3'UTR, 프로모터 및 pSA106 플라스미드는 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체 내에서 이종 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당하였다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 아베는 pSA106 상에 암호화된 블레오마이신 내성 카세트가 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체 내에서 선택가능한 마커로서 사용되기 적당하였다고 개시하였다. 부가의 플라스미드, 프로모터, 3'UTR/종결 인자, 그리고 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체 내에서 이종 유전자 발현을 가능하게 만드는데 적당한 선택가능한 마커에 대해서는 문헌[Abe et al ., Plant Cell Physiology, Vol. 49 (2008), pp. 625-632]에 개시된 바 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로서 사용되는 ble 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pSA106을 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 제조하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하는데, 이 경우, 각각의 단백질 암호화 서열은 표 69에 의하여 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 이 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체 내 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각 단백질 암호화 서열 상류의 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체 CAB 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있으며, 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에 있는 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체 CAB 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체 게놈에 상동성인 영역들을 추가로 포함할 수 있었다. 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하도록 상동성 영역들을 선택할 수 있었다. 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체는, 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 미세 입자 투사법 또는 기타 다른 공지된 방법을 통하여 형질 전환 벡터로 안정적으로 형질 전환되었다. Ble 유전자 생성물의 활성은, 플레오마이신을 포함하는 C 배지(이에 제한되는 것은 아님) 상에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체를 선택하는 마커로서 사용될 수 있었다. 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체 지질 생산에 적당한 생장 배지는 C 배지 및 Abe et al . 및 Sekimoto et al .에 의해 개시된 바와 같은 배양 배지를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 클로스테리움 페라세로섬-스트리고섬-리토랄레 복합체 지질의 지방산 프로필은 본원에 기술된 분석 방법과 표준적인 지질 추출법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 29: 두날리엘라 비리디스의 조작
본 발명에 의한 두날리엘라 비리디스 내에서의 재조합 유전자의 발현은 본원에 기술된 바와 같이 Sun(선) et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형함으로써 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Sun et al., Gene, Vol. 377 (2006), pp.140-149]에는 두날리엘라 비리디스를 플라스미드 DNA로 안정적으로 형질 전환하는 것에 관하여 개시되어 있다. 선은 전기 천공법과 같은 형질 전환법을 사용하여 전 두날리엘라 비리디스 질산염 환원 효소 유전자를 암호화하는 플라스미드 pDVNR을 돌연 변이 두날리엘라 비리디스(두날리엘라 비리디스 NR-돌연 변이체)에 도입하였다. 상기 NR-돌연 변이체는 질소원으로서 질산염을 사용하지 않았을 때에는 생장할 수 없었다. 질산염 환원 효소는 질산염이 아질산염으로 전환되는 것을 촉진한다. 형질 전환하기 전, 두날리엘라 비리디스 NR 돌연 변이체는 유일한 질소원으로서 질산염(NO3 -)을 포함하는 배양 배지 중에서 번식할 수 없었다. NR 돌연 변이 두날리엘라 비리디스 내 두날리엘라 비리디스 NR 유전자 생성물의 발현은 질산염 대사 결핍을 복구하는 선택가능한 마커로서 사용되었다. pDVNR 플라스미드로 형질 전환하여, 유일한 탄소원으로서 질산염을 포함하는 한천 평판 상에서 생장할 수 있는 두날리엘라 비리디스 NR 유전자 생성물을 안정적으로 발현하는 NR-돌연 변이 두날리엘라 비리디스를 제조하였다. 안정적인 형질 전환체의 DNA는 서던 블럿 분석법에 의해 평가하였다. 형질 전환된 두날리엘라 비리디스(NR 돌연 변이체)의 선택과 유지는 5mM KNO3를 포함하는 한천 평판 상에서 수행되었다. 선은 또한 액체 배양 배지 내에서 두날리엘라 비리디스 NR 돌연 변이체와 두날리엘라 비리디스를 번식시키는 것에 관하여 개시하였다. 두날리엘라 비리디스의 번식에 적당한 부가의 배지에 대해서는 문헌[Gordillo et al., Journal of Applied Phycology, Vol. 10:2 (1998), pp. 135-144] 및 [Moulton 및 Burford, Hydrobiologia, Vols. 204-205:1 (1990), pp. 401-408]에 개시되어 있다. 선은, 두날리엘라 비리디스 질산염 환원 효소 유전자의 3' UTR/종결 인자, 프로모터 및 플라스미드 pDVNR은 두날리엘라 비리디스 NR-돌연 변이체 내에서 이종 발현을 가능하게 하는데 적당하였다고 개시하였다. 선은 또한 두날리엘라 비리디스 질산염 환원 효소 유전자 생성물의 발현은 두날리엘라 비리디스 NR 돌연 변이체 내 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로서 사용되는 두날리엘라 비리디스 질산염 환원 효소(DvNR) 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pDVNR을 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 제조하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 이 경우, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 따라서, 두날리엘라 비리디스의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 두날리엘라 비리디스 내 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각 단백질 암호화 서열 상류의 DvNR 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었으며, 또한 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에 있는 DvNR 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합용인 두날리엘라 비리디스 게놈에 대해 상동성인 영역을 추가로 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 두날리엘라 비리디스 NR 돌연 변이체를 형질 전환 벡터로 안정적으로 형질 전환하는 것은, 전기 천공법과 같은 널리 공지된 형질 전환 기술 또는 기타 다른 공지된 방법을 통해 이루어졌다. DvNR 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 두날리엘라 비리디스 NR 돌연 변이 균주의 질소 동화 결핍을 복구하고, 형질 전환 벡터를 안정적으로 발현하는 두날리엘라 비리디스 NR-돌연 변이체를 선택하는 선택가능한 마커로서 사용될 수 있었다. 두날리엘라 비리디스 지질 생산에 적당한 생장 배지는 Sun et al., Moulton 및 Burford, 그리고 Gordillo et al.에 의해 개시된 것들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 두날리엘라 비리디스 지질의 지방산 프로필은 표준적인 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법들을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 30: 두날리엘라 살리나의 조작
본 발명에 의하여 두날리엘라 살리나 내에서 재조합 유전자를 발현하는 것은 본원에 기술된 바와 같이 Geng(겡) et al.에 의해 교시된 방법 및 벡터를 변형하여 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Geng et al ., Journal of Applied Phycology, Vol. 15 (2003), pp. 451-456]에는 두날리엘라 살리나를 플라스미드 DNA로 안정적으로 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 겡은 전기 천공법과 같은 형질 전환법을 사용하여 pUWHBsAg-CAT 플라스미드를 두날리엘라 살리나에 도입하였다. pUWHBsAg-CAT은, HBsAG 단백질 암호화 영역 상류의 제아 메이스 ubi1 프로모터에 작동 가능하도록 결합되고, HBsAG 단백질 암호화 영역 하류의 아그로박테리움 튜미파시엔스 노팔린 합성 효소 유전자(nos)의 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합된 B형 간염 표면 항원을 암호화하는 서열을 포함하는, B형 간염 표면 항원(HBsAG) 발현 카세트를 포함하였다. pUWHBsAg-CAT는 또한, 유인원 바이러스 40 프로모터 및 인핸서와 작동 가능하도록 결합된, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자 생성물(항생제 클로람페니콜에 대한 내성 부여)을 암호화하는 서열을 포함하는 클로람페니콜 내성 카세트를 추가로 포함하였다. pUWHBsAg-CAT으로 형질 전환하기 전, 두날리엘라 살리나는 60㎎/L 클로람페니콜을 포함하는 배지 상에서 번식할 수 없었다. pUWHBsAg-CAT 플라스미드로 형질 전환하여, 60㎎/L 클로람페니콜을 포함하는 선택 배양 배지 중에서 번식한 두날리엘라 살리나의 형질 전환체를 제조하였다. 두날리엘라 살리나 내 CAT 유전자 생성물의 발현을 통하여, 60㎎/L 클로람페니콜의 존재 하에서 상기 균주는 번식할 수 있었는데, 이로써 두날리엘라 살리나 내에서 클로람페니콜 내성 카세트의 선택가능한 마커로서의 유용성이 확립되었다. HBsAg 유전자 생성물의 검출 가능한 활성은, ubi1 프로모터와 nos 3'UTR/종결 인자가 두날리엘라 살리나 내 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당하다는 것을 암시하였다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법에 의해 평가하였다. 겡은, 형질 전환된 두날리엘라 살리나의 선택 및 유지는 존슨 배지(Johnson? medium)(J1, 문헌[Borowitzka 및 Borowitzka (eds), Micro-algal Biotechnology. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 460-461]에 개시됨)와 60㎎/L 클로람페니콜을 포함하는 한천 평판 상에서 수행되었다고 개시하였다. 두날리엘라 살리나의 액체 중 번식은 겡에 의하여 J1 배지(60㎎/L 클로람페니콜 함유) 중에서 수행되었다. J1 배지 이외의 배지 중에서의 두날리엘라 살리나의 번식에 대해서는 문헌[Feng et al ., Mol . Bio . Reports, Vol. 36 (2009), pp.1433-1439] 및 [Borowitzka et al., Hydrobiologia, Vols. 116-117:1 (1984), pp. 115-121]에 개시되어 있다. 두날리엘라 살리나 내에서 이종 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당한 부가의 플라스미드, 프로모터 3'UTR/종결 인자, 그리고 선택가능한 마커는 Feng et al.에 의해 개시된 바 있다. 겡은 플라스미드 pUWHBsAg-CAT, ubi1 프로모터 및 아그로박테리움 튜미파시엔스 노팔린 합성 효소 유전자 3'UTR/종결 인자는 두날리엘라 살리나 내에서 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 겡은 pUWHBsAg-CAT 상에 암호화되는 CAT 내성 카세트는 두날리엘라 살리나 내 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로서 사용되는 CAT 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pUWHBsAg-CAT을 구성되고, 이것이 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 제조하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 여기서, 각각의 단백질 암호화 서열은 표 69에 따라서 두날리엘라 살리나의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 두날리엘라 살리나 내 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각, 단백질 암호화 서열 상류의 ubi1 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있으며, 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에서 아그로박테리움 튜미파시엔스 노팔린 합성 효소 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는, 두날리엘라 살리나 게놈에 상동성인 영역을 추가로 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 전기 천공법 또는 기타 다른 공지된 방법들을 사용하여 형질 전환 벡터로 두날리엘라 살리나를 안정적으로 형질 전환하였다. CAT 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 클로람페니콜을 포함하는 J1 배지 중에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 두날리엘라 살리나를 선택하는 선택가능한 마커로서 사용될 수 있었다. 두날리엘라 살리나 지질 생산에 적당한 생장 배지는 J1 배지와 Feng et al.와 Borowitzka et al.에 의해 개시된 배양 배지들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 두날리엘라 살리나 지질의 지방산 프로필은 표준적인 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 31: 고니움 펙토랄의 조작
본 발명에 따라서 고니움 펙토랄 내에서 재조합 유전자를 발현하는 것은, 본원에 기술된 바와 같이 Lerche(레르헤) 및 Hollman et al.에 의해 교시된 바와 같은 방법과 벡터를 변형하여 수행될 수 있다. 간단히 말해서, 문헌[Lerche 및 Hallman et al ., BMC Biotechnology, Volume 9:64, 2009]에는 고니움 펙토랄레를 플라스미드 DNA로 안정적으로 핵내 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 레르헤는 미세 입자 투사법과 같은 형질 전환법을 사용하여 플라스미드 pPmr3을 고니움 펙토랄레에 도입하였다. 플라스미드 pPmr3는 스트렙토마이세스 리모서스의 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제(aphVIII) 유전자 생성물을 암호화하는 서열(GenBank 수탁 번호 제AAB03856호)(항생제 파로모마이신에 대한 내성 부여)을 포함하며, aphVIII 단백질 암호화 영역 상류의 볼복스 카르테리 hsp70A-rbcS3 하이브리드 프로모터에 작동 가능하도록 결합되고, aphVIII 단백질 암호화 영역 하류의 볼복스 카르테리 rbcS3 유전자의 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합된 파로모마이신 내성 카세트를 포함하였다. pPmr3으로 형질 전환하기 전, 고니움 펙토랄레는 0.06ug/㎖ 파로모마이신을 포함하는 배지에서 번식할 수 없었다. pPmr3으로 형질 전환하여, 0.75ug/㎖ 이상의 파로모마이신을 포함하는 선택 배양 배지 중에서 번식될 수 있었던 고니움 펙토랄레의 형질 전환체를 제조하였다. 고니움 펙토랄레 내 aphVIII 유전자 생성물이 발현됨으로 인하여 0.75ug/㎖ 이상의 파로모마이신의 존재 하에서 번식될 수 있었는데, 이로써 파로모마이신 항생제 내성 카세트의 고니움 펙토랄레 내에서 사용되는 선택가능한 마커로서의 유용성이 확립되었다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법으로 평가하였다. 레르헤 및 홀맨은, 형질 전환된 고니움 펙토랄레의 선택 및 유지는, 1.0ug/㎖ 파로모마이신을 함유하는 액체 자보르스키 배지(Jaworski? medium)(20㎎/L Ca(NO3)2·4H2O, 12.4㎎/L KH2PO4, 50㎎/L MgSO4·7H2O, 15.9㎎/L NaHCO3, 2.25㎎/L EDTA-FeNa, 2.25㎎/L EDTA Na2, 2.48g/L H3BO3, 1.39g/L MnCl2.4H2O, 1㎎/L (NH4)6MO7O24.4H2O, 0.04㎎/L 비타민 B12, 0.04㎎/L 티아민-HCl, 0.04㎎/L 바이오틴, 80㎎/L NaNO3, 36㎎/L Na4HPO4.12H2O) 중에서 수행되었다고 개시하였다. 고니움 펙토랄레 내에서 이종 유전자 발현을 가능하게 만드는데 적당한 부가의 플라스미드, 프로모터, 3'UTR/종결 인자 및 선택가능한 마커는 레르헤 및 홀맨에 의해 추가로 기술되었다. 레르헤 및 홀맨은, 플라스미드 pPmr3, 볼복스 카르테리 hsp70A-rbcS3 하이브리드 프로모터, 그리고 볼복스 카르테리 rbcS3 유전자의 3'UTR/종결 인자는 고니움 펙토랄레 내 외인성 유전자 발현을 가능하게 만드는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라 레르헤 및 홀맨은, 파로모마이신 내성 카세트 암호화 pPmr3은 고니움 펙토랄레 내 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로서 사용되는 aphVIII 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pPmr3을 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 제조하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 여기서, 각각의 단백질 암호화 서열은 표 69에 의하여 고니움 펙토랄레의 핵내 유전자에 고유한 고돈 편향 사용을 반영하도록 고니움 펙토랄레 내 발현에 대해서 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각 단백질 암호화 서열 상류의 볼복스 카르테리 hsp70A-rbcS3 하이브리드 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었으며, 또한 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에서 볼복스 카르테리 rbcS3 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는 고니움 펙토랄레 게놈에 상동성인 영역을 추가로 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 미세 입자 투사법 또는 기타 다른 공지된 방법을 통하여 형질 전환 벡터로 고니움 펙토랄레를 안정적으로 형질 전환할 수 있었다. aphVIII 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 파로모마이신을 포함하는 자보르스키 배지 중에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 고니움 펙토랄레를 선택하는 선택가능한 마커로서 사용될 수 있었다. 고니움 펙토랄레 지질 생산에 적당한 생장 배지는 자보르스키 배지와 문헌[Stein, American Journal of Botany, Vol. 45:9 (1958), pp. 664-672]에 개시된 배지를 포함하였다. 고니움 펙토랄레 지질의 지방산 프로필은 표준적인 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법들을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 32: 파에오닥틸룸 트리코르누툼의 조작
본 발명에 따라서, 재조합 유전자의 발현은 본원에 개시된 바와 같이 Apt(앱트) et al.에 의해 교시된 방법 및 벡터를 변형함으로써 파에오닥틸룸 트리코르누툼 내에서 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Apt et al ., Molecular and General Genetics, Vol. 252 (1996), pp. 572-579]에는 파에오닥틸룸 트리코르누툼을 벡터 DNA로 안정적으로 핵내 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 앱트는 미세 입자 투사법과 같은 형질 전환 기술을 사용하여 파에오닥틸룸 트리코르누툼에 플라스미드 pfcpA를 도입하였다. 플라스미드 pfcpA는 항생제 플레오마이신과 제오신에 대한 내성을 나타내는, 스트렙토알로테이쿠스 힌두스타너스 블레오마이신 결합 단백질(ble)을 암호화하는 서열을 포함하고, ble 단백질 암호화 영역 상류의 파에오닥틸룸 트리코르누툼 후코잔틴 엽록소 a 결합 단백질 유전자(fcpA)의 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었으며, 또한 ble 단백질 암호화 영역의 하류 또는 3' 영역에서 파에오닥틸룸 트리코르누툼 fcpA 유전자의 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있는 블레오마이신 내성 카세트를 포함하였다. pfcpA로 형질 전환하기 전에, 파에오닥틸룸 트리코르누툼은 50ug/㎖ 제오신을 포함하는 배지에서 번식할 수 없었다. pfcpA로 형질 전환하여, 50ug/㎖ 제오신을 포함하는 선택 배양 배지에서 번식할 수 있는 파에오닥틸룸 트리코르누툼의 형질 전환체를 제조하였다. 파에오닥틸룸 트리코르누툼 내 ble 유전자 생성물이 발현됨으로써, 50ug/㎖ 제오신의 존재 하에서 번식할 수 있었으며, 이로써 파에오닥틸룸 트리코르누툼 내에서 사용되는 선택가능한 마커로서 블레오마이신 항생제 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법에 의해 평가되었다. 앱트는, 형질 전환된 파에오닥틸룸 트리코르누툼의 선택 및 유지는 LDM 배지(문허 [Starr and Zeikus, Journal of Phycology, Vol. 29, Supplement, (1993)]에 개시됨)와 50㎎/L 제오신을 함유하는 한천 평판상에서 수행되었다고 개시하였다. 앱트는, 50㎎/L 제오신을 함유하는 LDM 배지 중 파에오닥틸룸 트리코르누툼 형질 전환체의 액체 중 번식에 대해 개시하였다. LDM 배지 이외의 배지 중에서 파에오닥틸룸 트리코르누툼을 번식시키는 것에 대해서는 문헌[Zaslavskaia et al., Science, Vol. 292 (2001), pp. 2073-2075], 및 [Radokovits et al., Metabolic Engineering, Vol. 13 (2011), pp. 89-95]에 기술되어 있다. 파에오닥틸룸 트리코르누툼 내에서의 이종 유전자 발현을 가능하게 만드는데 적당한 부가 플라스미드, 프로모터, 3'UTR/종결 인자 및 선택가능한 마커에 대해서는 Apt et al., Zaslavskaia et al. 및 Radokovits et al.에 의해 개시된 바 있다. 앱트는, 플라스미드 pfcpA와, 파에오닥틸룸 트리코르누툼 fcpA 프로모터, 그리고 3'UTR/종결 인자는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 내에서 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 앱트는, pfcpA상에서 암호화되는 블레오마이신 내성 카세트는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 내 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로서 사용되는 ble 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pfcpA를 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 생산하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 여기서, 단백질 암호화 서열은 각각 표 69에 따라서 파에오닥틸룸 트리코르누툼의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록, 파에오닥틸룸 트리코르누툼 내 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화된 유전자 서열은 각각 단백질 암호화 서열 상류의 파에오닥틸룸 트리코르누툼 fcpA 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었으며, 또한 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에서 파에오닥틸룸 트리코르누툼 fcpA 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 게놈에 상동성인 영역을 추가로 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 당업자는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 게놈의 서열 내에 존재하는 이와 같은 상동성 영역들을 동정할 수 있다(문헌[Bowler et al., Nature, Vol. 456 (2008), pp. 239-244]에 개시된 바 참조). 파에오닥틸룸 트리코르누툼을 형질 전환 벡터로 안정적으로 형질 전환하는 것은 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 미세 입자 투사법 또는 기타 다른 공지된 방법을 통하여 이루어질 수 있었다. ble 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 파로모마이신을 포함하는 LDM 배지 중에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 파에오닥틸룸 트리코르누툼을 선택하는 마커로서 사용될 수 있었다. 파에오닥틸룸 트리코르누툼 지질 생산에 적당한 생장 배지는 Radokovits et al.에 의해 개시된 f/2 배지를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 파에오닥틸룸 트리코르누툼 지질의 지방산 프로필은 표준적인 지질 추출법과 본원에 개시된 분석 방법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 33: 카에토세로스 종의 조작
본 발명에 따라서, 카에토세로스 종 내 재조합 유전자의 발현은 본원에 기술된 Yamaguchi(야마구치) et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형하여 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Yamaguchi et al ., Phycological Research, Vol. 59:2 (2011), pp.113-119]에는 카에토세로스 종을 플라스미드 DNA로 핵내 안정적으로 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 야마구치는 미세 입자 투사법과 같은 형질 전환법을 사용하여 플라스미드 pTpfcp/nat를 카에토세로스 종에 도입하였다. pTpfcp/nat는, nat 단백질 암호화 영역 상류의 탈라시오시라 슈도나나 후코잔틴 엽록소 a/c 결합 단백질 유전자(fcp) 프로모터에 작동 가능하도록 결합되고, 또한 3' 영역(nat 단백질 암호화 서열의 하류)에서 탈라시오시라 슈도나나 fcp 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합된, 누르세오트리신 아세틸트랜스퍼라제(nat) 유전자 생성물을 암호화하는 서열(GenBank 수탁 번호 제AAC60439호)을 포함하는 누르세오트리신 내성 카세트를 포함하였다. nat 유전자 생성물은 항생제 누르세오트리신에 대한 내성을 부여한다. pTpfcp/nat으로 형질 전환하기 전, 카에토세로스 종은 500ug/㎖ 누르세오트리신을 포함하는 배지 상에서 번식될 수 없었다. pTpfcp/nat으로 형질 전환하여, 500ug/㎖ 누르세오트리신을 포함하는 선택 배양 배지에서 번식한 카에토세로스 종의 형질 전환체를 제조하였다. 카에토세로스 종 내에서 nat 유전자 생성물이 발현되면, 500ug/㎖ 누르세오트리신의 존재 하에 번식될 수 있었는데, 이로써 카에토세로스 종 내에서 사용되는 선택가능한 마커로서의 누르세오트리신 항생제 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법으로 평가하였다. 야마구치는, 형질 전환된 카에토세로스 종의 선택과 유지는 f/2 배지(문헌[Guilard, R.R., Culture of Phytoplankton for feeding marine invertebrates, In Culture of Marine Invertebrate Animals, Smith and Chanley (eds) 1975, Plenum Press, New York, pp. 26-60]에 개시됨)와 500ug/㎖ 누르세오트리신을 포함하는 한천 평판 상에서 수행되었다고 개시하였다. 야마구치에 의해 수행된 카에토세로스 종 형질 전환체의 액체 중 번식은 500ug/㎖ 누르세오트리신을 함유하는 f/2 배지 중에서 수행되었다. 부가의 배양 배지 중 카에토세로스 종의 번식에 대해서는, 예를 들어 문헌[Napolitano et al., Journal of the World Aquaculture Society, Vol. 21:2 (1990), pp. 122-130], 및 [Volkman et al., Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, Vol. 128:3 (1989), pp. 219-240]에 개시되어 있다. 카에토세로스 종 내 이종 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당한 부가의 플라스미드, 프로모터, 3'UTR/종결 인자, 그리고 선택가능한 마커는 Yamaguchi et al.에 의한 동일한 문헌에 개시되었다. 야마구치는 플라스미드 pTpfcp/nat, 탈라시오시라 슈도나나 fcp 프로모터, 그리고 3'UTR/종결 인자가, 카에토세로스 종 내 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 야마구치는, pTpfcp/nat 상에서 암호화되는 누르세오트리신 내성 카세트가 카에토세로스 종 내 선택가능한 마커로서 사용되기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로서 사용되는 nat 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pTpfcp/nat를 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 생산하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 이 경우, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 따라서 카에토세로스 컴프레섬의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록, 밀접하게 관련된 카에토세로스 컴프레섬 내 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각 단백질 암호화 서열 상류의 탈라시오시라 슈도나나 fcp 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었으며, 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에서 탈라시오시라 슈도나나 fcp 유전자 3'UTR/종결 인자와 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는, 카에토세로스 종 게놈에 대한 상동성 영역을 추가로 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 카에토세로스 종을 형질 전환 벡터로 안정적으로 형질 전환하는 것은 널리 공지된 형질 전환법, 예를 들어 미세 입자 투사법 또는 기타 다른 공지된 방법을 통하여 이루어졌다. nat 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 누르세오트리신을 포함하는 f/2 한천 배지 중에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 카에토세로스 종을 선택하는 선택가능한 마커로서 사용될 수 있었다. 카에토세로스 종 지질 생산에 적당한 생산 배지는 f/2 배지와 Napolitano et al. 및 Volkman et al.에 의해 개시된 배양 배지를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 카에토세로스 종 지질의 지방산 프로필은 표준적인 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 34: 실린드로테카 후지포르미스의 조작
본 발명에 따라서 재조합 유전자를 실린드로테카 후지포르미스 내에서 발현하는 것은, 본원에 기술된 Poulsen(풀센) 및 Kroger(크로거) et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형함으로써 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Poulsen 및 Kroger et al., FEBS Journal, Vol. 272 (2005), pp.3413-3423]에는 실린드로테카 후지포르미스를 플라스미드 DNA로 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 풀센과 크로거는 미세 입자 투사법과 같은 형질 전환법을 사용하여 pCF-ble 플라스미드를 실린드로테카 후지포르미스에 도입하였다. 플라스미드 pCF-ble은, 항생제 제오신 및 플레오마이신에 대한 내성을 부여하는, 스트렙토알로테이쿠스 힌두스타너스 블레오마이신 결합 단백질(ble)을 암호화하는 서열을 포함하고, ble 단백질 암호화 영역 상류의 실린드로테카 후지포르미스 후코잔틴 엽록소 a/c 결합 단백질 유전자(fcpA, GenBank 수탁 번호 제AY125580호) 프로모터에 작동 가능하도록 결합되었고, 3' 영역(ble 단백질 암호화 영역의 하류)에서 실린드로테카 후지포르미스 fcpA 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합된, 블레오마이신 내성 카세트를 포함하였다. pCF-ble로 형질 전환하기 전, 실린드로테카 후지포르미스는 1㎎/㎖ 제오신을 포함하는 배지 상에서 번식할 수 없었다. pCF-ble로 형질 전환하여, 1㎎/㎖ 제오신을 포함하는 선택 배양 배지 중에서 번식한 실린드로테카 후지포르미스 형질 전환체를 제조하였다. 실린드로테카 후지포르미스 내 ble 유전자 생성물의 발현으로 인하여 1㎎/㎖ 제오신의 존재 하에서 번식될 수 있었는데, 이로써 실린드로테카 후지포르미스 내에서 사용되는 선택가능한 마커로서의 블레오마이신 항생제 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. 풀센 및 크로거는, 형질 전환된 실린드로테카 후지포르미스의 선택 및 유지는 1㎎/㎖ 제오신과 인공 해양수 배지를 포함하는 한천 평판 상에서 수행되었다고 개시하였다. 풀센 및 크로거는, 1㎎/㎖ 제오신을 포함하는 인공 해양수 배지 중 실린드로테카 후지포르미스 형질 전환체의 액체 중 번식에 대해 개시하였다. 부가의 배양 배지 중 실린드로테카 후지포르미스의 번식에 대해서는, 예를 들어 문헌[Liang et al., Journal of Applied Phycology, Vol. 17:1 (2005), pp. 61-65], 및 [Orcutt 및 Patterson, Lipids, Vol. 9:12 (1974), pp. 1000-1003]에 기술되어 있다. 카에토세로스 종 내 이종 유전자 발현을 가능하게 만드는 부가 플라스미드, 프로모터 및 3'UTR/종결 인자는 풀센 및 크로거에 의한 동일 문헌에 개시되었다. 플센 및 크로거는, 플라스미드 pCF-ble, 실린드로테카 후지포르미스 fcp 프로모터 및 3'UTR/종결 인자는 실린드로테카 후지포르미스 내 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 풀센 및 크로거는, pCF-ble 상에 암호화된 블레오마이신 내성 카세트는 실린드로테카 후지포르미스 내 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로서 사용되는 ble 유전자 생성물 암호화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pCF-ble를 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 생산하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택된 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 여기서, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 따른 실린드로테카 후지포르미스의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 실린드로테카 후지포르미스 내 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화된 유전자 서열은 각각, 단백질 암호화 서열 상류의 실린드로테카 후지포르미스 fcp 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었고, 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에서 실린드로테카 후지포르미스 fcp 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는 실린드로테카 후지포르미스 게놈에 상동성인 영역을 추가로 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 형질 전환 벡터를 사용하는 실린드로테카 후지포르미스의 안정적인 형질 전환은 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 미세 입자 투사법 또는 기타 다른 공지된 방법을 통하여 이루어졌다. Ble 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 제오신을 포함하는 인공 해양수 한천 배지 중 형질 전환 벡터로 형질 전환된 실린드로테카 후지포르미스를 선택하는 선택가능한 마커로서 사용될 수 있었다. 실린드로테카 후지포르미스 지질 생산에 적당한 생장 배지는 Liang et al. 및 Orcutt 및 Patterson에 의해 개시된 배지와 인공 해양수를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 실린드로테카 후지포르미스 지질의 지방산 프로필은 표준적인 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 35: 암피디니움 종의 조작
본 발명에 따라서 암피디니움 종 내 재조합 유전자의 발현은 본원에 기술된 ten Lohuis(텐 로휘스) 및 Miller et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형하여 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[ten Lohuis 및 Miller et al ., The Plant Journal, Vol. 13:3 (1998), pp. 427-435]에는, 플라스미드 DNA로 암피디니움 종을 안정적으로 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 텐 로휘스는 탄화 규소 위스커의 존재 하에서 교반과 같은 형질 전환 기술을 사용하여 플라스미드 pMT NPT/GUS를 암피디니움 종에 도입하였다. pMT NPT/GUS는, nptII 단백질 암호화 영역 상류의 5' 또는 아그로박테리움 튜미파시엔스 노팔린 합성 효소(nos) 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합되었고, 3' 영역(nptII 단백질 암호화 영역의 하류)에서 nos 유전자의 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합된, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(nptII) 유전자 생성물을 암호화하는 서열(GenBank 수탁 번호 제AAL92039호)을 포함하는, 네오마이신 내성 카세트를 포함하였다. nptII 유전자 생성물은 항생제 G418에 대한 내성을 부여하였다. pMT NPT/GUS 플라스미드는 CaMV 35S 프로모터에 작동 가능하도록 결합되었으며, 또한 CaMV 35S 3'UTR/종결 인자에도 작동 가능하도록 결합된 베타-글루쿠로니다제(GUS) 리포터 유전자 생성물을 암호화하는 서열을 추가로 포함하였다. pMT NPT/GUS로 형질 전환하기 전, 암피디니움 종은 3㎎/㎖ G418을 포함하는 배지에서 번식할 수 없었다. pMT NPT/GUS로 형질 전환하여, 3㎎/㎖ G418을 포함하는 선택 배양 배지 중에서 번식한 암피디니움 종의 형질 전환체를 제조하였다. nptII 유전자 생성물의 암피디니움 종 내 발현을 통하여, 3㎎/㎖ G418의 존재 하에 번식이 가능하게 되었는데, 이로써 암피디니움 종 내에서 사용되는 선택가능한 마커로서의 네오마이신 항생제 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. GUS 리포터 유전자의 검출 가능한 활성은, CaMV 35S 프로모터 및 3'UTR은 암피디니움 종 내 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당하다는 것을 암시하는 것이다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법에 의해 평가하였다. 텐 로휘스와 밀러는, F/2 풍부 용액(시그마(Sigma)에 의해 공급) 및 3㎎/㎖ G418이 보충된 해양수 포함 배지 중 암피디니움 종 형질 전환체의 액체 중 번식과, F/2 풍부 용액 및 3㎎/㎖ G418이 보충된 해양수 포함 한천 배지에서의 암피디니움 종 형질 전환체의 선택 및 유지에 대해 개시하였다. 부가의 배양 배지 중 암피디니움 종의 번식은, 예를 들어 문헌[Mansour et al., Journal of Applied Phycology, Vol. 17:4 (2005) pp. 287-v300]에 개시되어 있다. 암피디니움 종 내에서 이종 유전자 발현을 가능하게 하는 부가의 프로모터, 3'UTR/종결 인자 및 선택가능한 마커를 포함하는 부가의 플라스미드는 텐 로휘스 및 밀러에 의한 동일 문헌에 개시되어 있다. 텐 로휘스 및 밀러는, 플라스미드 pMT NPT/GUS, 프로모터 그리고 nos 및 CaMV 35S 유전자의 3'UTR/종결 인자가 암피디니움 종 내 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 텐 로휘스 및 밀러는 pMT NPT/GUS 상에서 암호화된 네오마이신 내성 카세트가 암피디니움 종 내 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로 사용되는 nptII 유전자 생성물 암호화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pMT NPT/GUS를 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 생산하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 이 경우, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 따라서 상기 균주와 밀접한 관련이 있는 종인 암피디니움 카르테라에의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록, 암피디니움 종 내 발현에 대해서 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각, 단백질 암호화 서열 상류의 아그로박테리움 튜미파시엔스 노팔린 합성 효소(nos) 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었으며, 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에서 nos 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는 암피디니움 종 게놈에 상동성인 영역들을 추가로 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자들의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 형질 전환 벡터를 사용하는 암피디니움 종의 안정적인 형질 전환은 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 규소 섬유 매개 미세 주입법 또는 기타 다른 공지된 방법을 통하여 이루어질 수 있었다. nptII 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 G418을 포함하는 해양수 한천 배지 중 형질 전환 벡터로 형질 전환된 암피디니움 종을 선택하는 선택가능한 마커로서 사용될 수 있었다. 암피디니움 종 지질 생산에 적당한 생장 배지는 Mansour et al. 및 텐 로휘스 및 밀러에 의해 개시된 배지와 인공 해양수를 포함하였으나, 이에 제한되는 것은 아니었다. 암피디니움 종 지질의 지방산 프로필은 표준적인 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법들을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 36: 심비오디늄 마이크로아드리악티큠의 조작
본 발명에 따라서 심비오디늄 마이크로아드리악티큠 내 재조합 유전자의 발현은 본원에 기술된 바와 같이 ten Lohuis 및 Miller et al.에 의해 교시되는 방법과 벡터를 변형함으로써 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[ten Lohuis 및 Miller et al ., The Plant Journal, Vol. 13:3 (1998), pp. 427-435]에는, 플라스미드 DNA로 심비오디늄 마이크로아드리악티큠을 안정적으로 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 텐 로휘스는, 규소 섬유 매개 미세 주입법과 같은 형질 전환 기술을 사용하여 플라스미드 pMT NPT/GUS를 심비오디늄 마이크로아드리악티큠에 도입하였다. pMT NPT/GUS는, nptII 단백질 암호화 영역의 5'또는 상류의 아그로박테리움 튜미파시엔스 노팔린 합성 효소(nos) 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합되었고, 3' 영역 nptII 단백질 암호화 영역의 하류)에서 nos 유전자의 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합된, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(nptII) 유전자 생성물을 암호화하는 서열(GenBank 수탁 번호 제AAL92039호)을 포함하는 네오마이신 내성 카세트를 포함하였다. nptII 유전자 생성물은 항생제 G418에 대한 내성을 부여하였다. pMT NPT/GUS 플라스미드는 CaMV 35S 프로모터에 작동 가능하도록 결합되었고, 추가로 CaMV 35S 3'UTR/종결 인자에도 작동 가능하도록 결합된, 베타-글루쿠로니다제(GUS) 리포터 유전자 생성물을 암호화하는 서열을 추가로 포함하였다. pMT NPT/GUS로 형질 전환하기 전, 심비오디늄 마이크로아드리악티큠은 3㎎/㎖ G418을 포함하는 배지에서 번식할 수 없었다. pMT NPT/GUS로 형질 전환하여, 3㎎/㎖ G418을 포함하는 선택 배양 배지 내 번식한 심비오디늄 마이크로아드리악티큠 형질 전환체를 제조하였다. nptII 유전자 생성물의 심비오디늄 마이크로아드리악티큠 내 발현으로 인하여, 3㎎/㎖ G418의 존재 하에 번식될 수 있었으며, 이로써, 심비오디늄 마이크로아드리악티큠 내 사용되는 선택가능한 마커로서의 네오마이신 항생제 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. GUS 리포터 유전자의 검출 가능한 활성은, CaMV 35S 프로모터 및 3'UTR은 심비오디늄 마이크로아드리악티큠 내 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당하다는 것을 암시하였다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법에 의해 평가되었다. 텐 로휘스 및 밀러는, F/2 풍부 용액(공급자 시그마에 의해 제공) 및 3㎎/㎖ G418이 보충된, 해양수 포함 배지 중 심비오디늄 마이크로아드리악티큠 형질 전환체의 액체 중 번식과, F/2 풍부 용액 및 3㎎/㎖ G418이 보충된, 해양수 포함 한천 배지에서의 심비오디늄 마이크로아드리악티큠 형질 전환체의 선택과 유지에 대해 개시하였다. 부가의 배양 배지 중 심비오디늄 마이크로아드리악티큠의 번식에 대해서는, 예를 들어 문헌[Iglesias-Prieto et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 89:21 (1992) pp. 10302-10305]에 개시되어 있다. 심비오디늄 마이크로아드리악티큠 내 이종 유전자 발현을 가능하게 하는 부가의 프로모터, 3'UTR/종결 인자 및 선택가능한 마커를 포함하는 부가의 플라스미드에 대해서는 텐 로휘스 및 밀러에 의한 동일한 문헌에 개시되어 있다. 텐 로휘스와 밀러는, 플라스미드 pMT NPT/GUS와, nos의 3'UTR/종결 인자 및 프로모터, 그리고 CaMV 35S 유전자는 심비오디늄 마이크로아드리악티큠 내 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데에 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 텐 로휘스 및 밀러는, pMT NPT/GUS상에 암호화된 네오마이신 내성 카세트가 심비오디늄 마이크로아드리악티큠 내 선택가능한 마커로서 사용하기에 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로 사용되는 nptII 유전자 생성물 암호화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pMT NPT/GUS를 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 생산하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 이 경우, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 따라서 심비오디늄 마이크로아드리악티큠의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록, 심비오디늄 마이크로아드리악티큠 내 발현에 대해서 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각, 단백질 암호화 서열 상류의 아그로박테리움 튜미파시엔스 노팔린 합성 효소(nos) 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었으며, 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에서 nos 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는 심비오디늄 마이크로아드리악티큠 게놈에 상동성인 영역을 추가로 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자들의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 형질 전환 벡터를 사용하는 심비오디늄 마이크로아드리악티큠의 안정적인 형질 전환은 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 규소 섬유 매개 미세 주입법 또는 기타 다른 공지된 방법을 통하여 이루어졌다. nptII 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 G418을 포함하는 해양수 한천 배지 중 형질 전환 벡터로 형질 전환된 심비오디늄 마이크로아드리악티큠을 선택하는 선택가능한 마커로서 사용될 수 있었다. 심비오디늄 마이크로아드리악티큠 지질 생산에 적당한 생장 배지는 Iglesias-Prieto et al. 및 텐 로휘스 및 밀러에 의해 개시된 배지와 인공 해양수를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 심비오디늄 마이크로아드리악티큠 지질의 지방산 프로필은 표준적인 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법들을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 37: 나노클로롭시스 종의 조작
본 발명에 따라서 재조합 유전자의 나노클로롭시스 종 W2J3B 내 발현은 본원에 기술된 바와 같이 Kilian(킬리안) et al.에 의해 교시된 방법 및 벡터를 변형하여 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Kilian et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 108:52 (2011) pp.21265-21269]에는, 형질 전환 구조물을 사용하여 나노클로롭시스를 핵내 안정적으로 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 킬리안은 전기 천공법과 같은 형질 전환법을 사용하여 형질 전환 구조물 C2를 나노클로롭시스 종 W2J3B에 도입하였다. 상기 C2 형질 전환 구조물은, 스트렙토알로테이쿠스 힌두스타너스 블레오마이신 결합 단백질(ble)에 대한 암호화 서열(항생제 플레오마이신과 제오신에 대한 내성 부여)을 포함하고, ble 단백질 암호화 영역 상류의 나노클로롭시스 종 W2J3B 비올라잔틴/엽록소 a 결합 단백질 유전자 VCP2의 프로모터에 작동 가능하도록 결합되어 있으며, ble 단백질 암호화 영역 하류의 나노클로롭시스 종 W2J3B 비올라잔틴/엽록소 a 결합 유전자 VCP1의 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합된, 블레오마이신 내성 카세트를 포함하였다. C2로 형질 전환하기 전, 나노클로롭시스 종 W2J3B는 2ug/㎖ 제오신을 포함하는 배지에서 번식할 수 없었다. C2로 형질 전환하여, 2ug/㎖ 제오신을 포함하는 선택 배양 배지 중 번식된 나노클로롭시스 종 W2J3B의 형질 전환체를 제조하였다. 나노클로롭시스 종 W2J3B 내 ble 유전자 생성물의 발현을 통하여, 2ug/㎖ 제오신의 존재 하에서 번식이 가능하게 되었는데, 이로써 나노클로롭시스에서 사용되는 선택가능한 마커로서의 블레오마이신 항생제 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 PCR에 의해 평가되었다. 킬리안은, 미량 금속, 비타민 및 포스페이트 용액을 5배 많은 수준으로 포함하고 2ug/㎖ 제오신을 추가로 함유하는 F/2 배지(문헌[Guilard and Ryther, Canadian Journal of Microbiology, Vol. 8 (1962), pp. 229-239]에 개시됨) 내에서 나노클로롭시스 종 W2J3B 형질 전환체의 액체 중 번식에 대해 개시하였다. 킬리안은 또한, 2㎎/㎖ 제오신과 인공 해양수를 포함하는 한천 F/2 배지에서의 나노클로롭시스 종 W2J3B 형질 전환체의 선택과 유지에 대해서도 개시하였다. 부가 배양 배지 중 나노클로롭시스의 번식에 대해서는, 예를 들어 문헌[Chiu et al., Bioresour Technol ., Vol . 100:2 (2009), pp . 833-838] 및 [Pal et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 90:4 (2011), pp. 1429-1441]에 기술되었다. 나노클로롭시스 종 W2J3B 내에서 이종 유전자 발현을 가능하게 하는 부가 프로모터 및 3'UTR/종결 인자와, 형질 전환체의 선택에 사용되는 선택가능한 마커를 포함하는 부가의 형질 전환 구조물은 킬리안에 의한 동일 문헌에 기술되어 있다. 킬리안은, 형질 전환 구조물 C2, 나노클로롭시스 종 W2J3B 비올라잔틴/엽록소 a 결합 단백질 유전자 VCP2의 프로모터, 그리고 나노클로롭시스 종 W2J3B 비올라잔틴/엽록소 a 결합 단백질 유전자 VCP1의 3'UTR/종결 인자는 나노클로롭시스 종 W2J3B 내 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 킬리안은, C2 상에서 암호화되는 블레오마이신 내성 카세트가 나노클로롭시스 종 W2J3B 내 선택가능한 마커로 사용하기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로 사용되는 ble 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질 전환 구조물 C2를 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 생산하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 따라서 나노클로롭시스 종의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 나노클로롭시스 종 W2J3B 내에서의 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각, 단백질 암호화 서열 상류의 나노클로롭시스 종 W2J3B VCP2 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었으며, 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에서 나노클로롭시스 종 W2J3B VCP1 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은, 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는 나노클로롭시스 종 W2J3B 게놈에 상동성인 영역을 추가로 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 형질 전환 벡터로 나노클로롭시스 종 W2J3B를 안정적으로 형질 전환하는 것은, 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 전기 천공법 또는 기타 다른 공지된 방법을 통하여 이루어졌다. ble 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 제오신을 포함하는 F/2 배지 중에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 나노클로롭시스 종 W2J3B를 선택하는 선택가능한 마커로서 사용될 수 있었다. 나노클로롭시스 종 W2J3B 지질 생산에 적당한 생장 배지는 F/2 배지와 Chiu et al.과 Pal et al.에 의해 개시된 배지를 포함하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 나노클로롭시스 종 W2J3B 지질의 지방산 프로필은 표준적 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 38: 시클로텔라 크립티카의 조작
본 발명에 따라서 재조합 유전자의 발현은 본원에 개시된 바와 같이 Dunahay(듀나헤이) et al.에 의해 교시된 방법 및 벡터를 변형함으로써 시클로텔라 크립티카 내에서 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Dunahay et al ., Journal of Phycology, Vol. 31 (1995), pp. 1004-1012]에는 시클로텔라 크립티카를 플라스미드 DNA로 안정적으로 형질 전환하는 것이 개시되어 있다. 듀나헤이는 미세 입자 투사법과 같은 형질 전환법을 사용하여 플라스미드 pACCNPT5.1를 시클로텔라 크립티카에 도입하였다. 플라스미드 pACCNPT5.1은, nptII 암호화 영역 상류의 시클로텔라 크립티카 아세틸-CoA 카복실라제(ACCase) 유전자(GenBank 수탁 번호 제L20784호)의 프로모터에 작동 가능하도록 결합되어 있으며, 또한 3' 영역(nptII 암호화 영역의 하류)에서 시클로텔라 크립티카 ACCase 유전자의 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합되어 있는, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(nptII) 유전자 생성물의 암호화 서열을 포함하는, 네오마이신 내성 카세트를 포함하였다. nptII 유전자 생성물은 항생제 G418에 대한 내성을 부여하였다. pACCNPT5.1로 형질 전환하기 전, 시클로텔라 크립티카는 100ug/㎖ G418을 포함하는 50% 인공 해양수 배지에서 번식할 수 없었다. pACCNPT5.1로 형질 전환하여, 100ug/㎖ G418을 포함하는 50% 인공 해양수 선택 배지에서 번식된 시클로텔라 크립티카 형질 전환체를 제조하였다. 시클로텔라 크립티카 내 nptII 유전자 생성물의 발현으로 인하여 이 균주는 100ug/㎖ G418의 존재 하에서 번식할 수 있었는데, 이로써 시클로텔라 크립티카에서 사용되는 선택가능한 마커로서의 네오마이신 항생제 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법에 의해 평가하였다. 듀나헤이는, 1.07mM 규산화 나트륨과 100ug/㎖ G418이 보충된 인공 해양수 배지(ASW, 문헌[Brown, L., Phycologia, Vol. 21 (1982), pp. 408-410]에 개시됨) 내 시클로텔라 크립티카의 액체 중 번식에 대해 개시하였다. 듀나헤이는 또한, 100ug/㎖ G418을 함유하는 ASW 배지를 포함하는 한천 평판 상에서의 시클로텔라 크립티카 형질 전환체의 선택 및 유지에 대해서도 개시하였다. 부가의 배양 배지 중에서의 시클로텔라 크립티카의 번식에 대해서는, 예를 들어 문헌[Sriharan et al ., Applied Biochemistry and Biotechnology , Vol. 28-29:1 (1991), pp . 317-326] 및 [Pahl et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 109:3 (2010), pp. 235-239]에 기술되어 있다. 듀나헤이는, 플라스미드 pACCNPT5.1과 시클로텔라 크립티카 아세틸-CoA 카복실라제(ACCase) 유전자의 프로모터는 시클로텔라 크립티카 내에서 외인성 유전자의 발현을 가능하게 하는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 듀나헤이는, pACCNPT5.1상에서 암호화된 네오마이신 내성 카세트가 시클로텔라 크립티카 내 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, nptII 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(선택가능한 마커로서 사용)을 포함하는 벡터 pACCNPT5.1을 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 생산하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 이때, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 의한 시클로텔라 크립티카의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록, 시클로텔라 크립티카 내에서의 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화된 유전자 서열은 각각 단백질 암호화 서열 상류의 시클로텔라 크립티카 ACCase 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었으며, 또한 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에서 시클로텔라 크립티카 ACCase 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는 시클로텔라 크립티카 게놈에 상동성인 영역을 추가로 포함할 수도 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 시클로텔라 크립티카를 형질 전환 벡터로 안정적으로 형질 전환하는 것은, 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 미세 입자 투사법 또는 기타 다른 공지된 방법을 통하여 이루어졌다. nptII 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 G418을 포함하는 한천 ASW 배지 중에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 시클로텔라 크립티카를 선택하는 마커로서 사용될 수 있었다. 시클로텔라 크립티카 지질 생산에 적당한 생장 배지는 ASW 배지와, Sriharan et al.(1991)와 Pahl et al.에 의해 개시된 배지를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 시클로텔라 크립티카 지질의 지방산 프로필은 표준적인 지질 추출법과 본원에 개시된 분석 방법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 39: 나비큘라 사프로필라의 조작
본 발명에 따라서 나비큘라 사프로필라 내에서 재조합 유전자를 발현하는 것은, 본원에 기술된 Dunahay et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형함으로써 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Dunahay et al ., Journal of Phycology, Vol. 31 (1995), pp. 1004-1012]에는, 플라스미드 DNA를 사용하여 나비큘라 사프로필라를 안정적으로 형질 전환하는 것이 개시되어 있다. 더나헤이는 미세 입자 투사법과 같은 형질 전환법을 사용하여 플라스미드 pACCNPT5.1를 나비큘라 사프로필라에 도입하였다. 플라스미드 pACCNPT5.1는, nptII 암호화 영역 상류의 시클로텔라 크립티카 아세틸-CoA 카복실라제(ACCase) 유전자(GenBank 수탁 번호 제L20784호)의 프로모터에 작동 가능하게 연결되었으며, 3' 영역(nptII 암호화 영역의 하류)에서 시클로텔라 크립티카 ACCase 유전자의 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합된, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(nptII) 유전자 생성물의 암호화 서열을 포함하는 네오마이신 내성 카세트를 포함하였다. nptII 유전자 생성물은 항생제 G418에 대한 내성을 부여하였다. pACCNPT5.1로 형질 전환하기 전, 나비큘라 사프로필라는 100ug/㎖ G418을 포함하는 인공 해양수 배지에서는 번식할 수 없었다. pACCNPT5.1로 형질 전환한 후에는, 100ug/㎖ G418을 포함하는 인공 해양수 선택 배지중에서 번식한 나비큘라 사프로필라 형질 전환체를 제조하였다. 나비큘라 사프로필라 내 nptII 유전자 생성물의 발현으로 인하여, G418의 존재 하에서 상기 균주는 번식할 수 있었는데, 이로써 네오마이신 항생제 내성 카세트의 나비큘라 사프로필라 내에서 사용되는 선택가능한 마커로서의 유용성이 확립되었다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법에 의해 평가하였다. 더나헤이는, 1.07mM 규산화나트륨과 100ug/㎖ G418이 보충된 인공 해양수 배지(ASW, 문헌[Brown, L., Phycologia, Vol. 21 (1982), pp. 408-410]에 기술됨) 중 나비큘라 사프로필라의 액체 중 번식에 대해 개시하였다. 더나헤이는 또한, 100ug/㎖ G418와 함께 ASW 배지를 포함하는 한천 평판에서의 나비큘라 사프로필라 형질 전환체의 선택 및 유지에 대해 개시하였다. 부가의 배양 배지 중에서의 나비큘라 사프로필라의 번식에 대해서는, 예를 들어 문헌[Tadros 및 Johansen, Journal of Phycology, Vol. 24:4 (1988), pp. 445-452] 및 [Sriharan et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 20-21:1 (1989), pp . 281-291]에 기술된 바 있다. 더나헤이는, 플라스미드 pACCNPT5.1과 시클로텔라 크립티카 아세틸-CoA 카복실라제(ACCase) 유전자의 프로모터는 나비큘라 사프로필라 내에서 외인성 유전자를 발현시킬 수 있는데에 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 더나헤이는, pACCNPT5.1상에서 암호화된 네오마이신 내성 카세트는 나비큘라 사프로필라 내 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로서 사용되는, nptII 유전자 생성물 암호화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pACCNPT5.1를 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 생산하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 이 경우, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 따라서, 나비큘라 사프로필라와 밀접하게 관련된 나비큘라 펠리큘로사의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록 나비큘라 사프로필라 내 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각, 단백질 암호화 서열 상류의 시클로텔라 크립티카 ACCase 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었으며, 또한 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에서 시클로텔라 크립티카 ACCase 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 또한 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는 나비큘라 사프로필라 게놈에 상동성인 영역을 추가로 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택될 수 있었다. 나비큘라 사프로필라를 형질 전환 벡터로 안정적으로 형질 전환하는 것은, 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 미세 입자 투사법 또는 기타 다른 공지된 방법을 통하여 이루어졌다. nptII 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 G418을 포함하는 한천 ASW 배지에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 나비큘라 사프로필라를 선택하는 선택가능한 마커로서 사용될 수 있었다. 나비큘라 사프로필라 지질 생산에 적당한 생장 배지로서는 ASW 배지 및 Sriharan et al.(1989) 및 태드로스(Tadros) 및 요한슨(Johansen)에 의해 개시된 배지를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 나비큘라 사프로필라 지질의 지방산 프로필은 표준적 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 40: 탈라시오시라 슈도나나의 조작
본 발명에 따라서, 재조합 유전자의 탈라시오시라 슈도나나 내 발현은 본원에 기술된 바와 같이 Poulsen(풀센) et al.에 의해 교시된 방법 및 벡터를 변형하여 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Poulsen et al., Journal of Phycology, Vol. 42 (2006), pp. 1059-1065]에는, 플라스미드 DNA를 사용하여 탈라시오시라 슈도나나를 안정적으로 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 풀센은 미세 입자 투사법과 같은 형질 전환법을 사용하여 플라스미드 pTpfcp/nat를 탈라시오시라 슈도나나에 도입하였다. pTpfcp/nat는, nat 단백질 암호화 영역 상류의 탈라시오시라 슈도나나 후코잔틴 엽록소 a/c 결합 단백질 유전자(fcp) 프로모터에 작동 가능하도록 결합되고, 또한 3' 영역(nat 단백질 암호화 서열의 하류)에서 탈라시오시라 슈도나나 fcp 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합된, 누르세오트리신 아세틸트랜스퍼라제(nat) 유전자 생성물을 암호화하는 서열(GenBank 수탁 번호 제AAC60439호)을 포함하는, 누르세오트리신 내성 카세트를 포함하였다. nat 유전자 생성물은 항생제 누르세오트리신에 대한 내성을 부여하였다. pTpfcp/nat로 형질 전환하기 전, 탈라시오시라 슈도나나는 10ug/㎖ 누르세오트리신을 포함하는 배지에서 번식할 수 없었다. pTpfcp/nat로 형질 전환하여, 100ug/㎖ 누르세오트리신을 포함하는 선택 배양 배지에서 번식한 탈라시오시라 슈도나나 형질 전환체를 제조하였다. 탈라시오시라 슈도나나 내에서 nat 유전자 생성물이 발현됨으로 인하여, 100ug/㎖ 누르세오트리신의 존재하에 상기 균주는 번식할 수 있었는데, 이로써 탈라시오시라 슈도나나에서 사용되는 선택가능한 마커로서의 누르세오트리신 항생제 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법에 의해 평가하였다. 풀센은, 형질 전환된 탈라시오시라 슈도나나의 선택 및 유지는 100ug/㎖ 누르세오트리신 함유 개질 ESAW 배지(문헌[Harrison et al., Journal of Phycology, Vol. 16 (1980), pp. 28-35]에 기술됨)를 포함하는 액체 배양액 중에서 수행되었다고 개시하였다. 부가의 배양 배지 중 탈라시오시라 슈도나나의 번식에 대해서는, 예를 들어 문헌[Volkman et al., Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, Vol. 128:3 (1989), pp. 219-240]에 기술된 바 있다. 탈라시오시라 슈도나나 내에서 사용하기 적당한 부가의 선택가능한 마커를 포함하는 부가의 플라스미드에 대해서는 풀센에 의한 동일한 문헌에 기술되어 있다. 풀센은, 플라스미드 pTpfcp/nat, 그리고 탈라시오시라 슈도나나 fcp 프로모터 및 3'UTR/종결 인자는 탈라시오시라 슈도나나 내에서 외인성 유전자의 발현을 가능하게 하는데 적당하였다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 풀센은, pTpfcp/nat 상에서 암호화된 누르세오트리신 내성 카세트는 탈라시오시라 슈도나나 내에서 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로서 사용되는, nat 유전자 생성물 암호화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pTpfcp/nat를 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 생산하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 이 경우, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 따라서 탈라시오시라 슈도나나의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록, 탈라시오시라 슈도나나 내 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각, 단백질 암호화 서상류의 탈라시오시라 슈도나나 fcp 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었으며, 또한 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에서 탈라시오시라 슈도나나 fcp 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는 탈라시오시라 슈도나나 게놈에 대해 상동성인 영역을 추가로 포함할 수도 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 당업자는, 탈라시오시라 슈도나나 게놈의 서열 내에서 이와 같은 상동성 영역을 동정할 수 있었다(문헌[Armbrust et al., Science, Vol. 306: 5693 (2004): pp. 79-86] 참조). 탈라시오시라 슈도나나를 형질 전환 벡터로 안정적으로 형질 전환하는 것은, 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 미세 입자 투사법 또는 기타 다른 공지된 방법을 통하여 이루어졌다. nat 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 누르세오트리신을 포함하는 ESAW 한천 배지 내에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 탈라시오시라 슈도나나를 선택하는 마커로서 사용될 수 있었다. 탈라시오시라 슈도나나 지질 생산에 적당한 생장 배지로서는 ESAW 배지와 Volkman et al. 및 Harrison et al.에 의해 개시된 배양 배지를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 탈라시오시라 슈도나나 지질의 지방산 프로필은 표준적 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 41: 클라미도모나스 레인하르드티의 조작
본 발명에 따라서, 클라미도모나스 레인하르드티 내에서 재조합 유전자의 발현은 본원에 기술된 바와 같이 Cerutti(세루티) et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형하여 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Cerutti et al ., Genetics , Vol. 145:1 (1997), pp. 97-110]에는, 형질 전환 벡터로 클라미도모나스 레인하르드티를 핵내 안정적으로 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 세루티는 미세 입자 투사법과 같은 형질 전환법을 사용하여 형질 전환 구조물 P[1030]을 클라미도모나스 레인하르드티에 도입하였다. 구조물 P[1030]는, 아미노글루코시드 3'-아데닐트랜스퍼라제(aadA) 단백질 암호화 영역 상류의 클라미도모나스 레인하르드티 리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제/옥시게나제 소형 서브유닛 유전자(RbcS2, GenBank 수탁 번호 제X04472호) 프로모터에 작동 가능하도록 결합되고, 3' 영역(aadA 단백질 암호화 서열의 하류)에서 클라미도모나스 레인하르드티 RbcS2 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합된, aadA 유전자 생성물 암호화 서열을 포함하는, 스펙티노마이신 내성 카세트를 포함하였다. aadA 유전자 생성물은, 항생제 스펙티노마이신에 대한 내성을 부여하였다. P[1030]로 형질 전환하기 전, 클라미도모나스 레인하르드티는 90ug/㎖ 스펙티노마이신을 포함하는 배지에서는 번식할 수 없었다. P[1030]로 형질 전환하여, 90ug/㎖ 스펙티노마이신을 포함하는 선택 배양 배지에서 번식한 클라미도모나스 레인하르드티 형질 전환체가 제조되었는데, 이로써 클라미도모나스 레인하르드티 내에서 사용되는 선택가능한 마커로서의 스펙티노마이신 항생제 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿 분석법에 의해 평가되었다. 세루티는, 형질 전환된 클라미도모나스 레인하르드티의 선택 및 유지는 90ug/㎖ 스펙티노마이신을 함유하고 트리스-아세테이트-포스페이트 배지(TAP, 문헌[Harris, The Chlamydomonas Sourcebook, Academic Press, San Diego, 1989]에 개시됨)를 포함하는 한천 평판 상에서 수행되었다고 개시하였다. 세루티는 또한, 클라미도모나스 레인하르드티의 TAP 액체 배양액(90ug/㎖ 스펙티노마이신 함유) 중 번식에 대해서도 개시하였다. 대안적 배양 배지 중 클라미도모나스 레인하르드티의 번식에 대해서는, 예를 들어 문헌[Dent et al ., African Journal of Microbiology Research, Vol. 5:3 (2011), pp. 260-270] 및 [Yantao et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 107:2 (2010), pp. 258-268]에 개시되어 있다. 클라미도모나스 레인하르드티에 사용하기 적당한 부가의 선택가능한 마커와 다수의 조절 서열(예를 들어, 클라미도모나스 레인하르드티 내 이종 유전자 발현을 촉진하는데 적당한 3'UTR 및 프로모터)을 포함하는 부가의 구조물은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌[Radakovits et al ., Eurkaryotic Cell, Vol. 9:4 (2010), pp. 486-501]에 기술되어 있다. 세루티는, 형질 전환 벡터 P[1030]과 클라미도모나스 레인하르드티 프로모터 및 3'UTR/종결 인자는 클라미도모나스 레인하르드티 내 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 세루티는, P[1030] 상에 암호화되는 스펙티노마이신 내성 카세트가 클라미도모나스 레인하르드티 내에서 선택가능한 마커로서 사용되기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로서 사용되는 aadA 유전자 생성물 암호화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 P[1030]를 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 생산하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 이 경우, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 따라서 클라미도모나스 레인하르드티의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록, 클라미도모나스 레인하르드티 내 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각, 단백질 암호화 서열 상류의 클라미도모나스 레인하르드티 RbcS2 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었으며, 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에서 클라미도모나스 레인하르드티 RbcS2 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는, 클라미도모나스 레인하르드티 게놈에 상동성인 영역을 추가로 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 당업자는, 클라미도모나스 레인하르드티 게놈의 서열 내에서 이와 같은 상동성 영역을 동정할 수 있다(문헌[Merchant et al., Science, Vol. 318:5848 (2007), pp. 245-250] 참조). 클라미도모나스 레인하르드티를 형질 전환 벡터로 안정적으로 형질 전환하는 것은, 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 미세 입자 투사법 또는 기타 다른 공지된 방법들을 통하여 이루어졌다. aadA 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 스펙티노마이신을 포함하는 TAP 한천 배지에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 클라미도모나스 레인하르드티를 선택하는 마커로서 사용될 수 있었다. 클라미도모나스 레인하르드티 지질 생산에 적당한 생장 배지는 ESAW 배지와, Yantao et al. 및 Dent et al.에 의해 개시된 배양 배지를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 클라미도모나스 레인하르드티 지질의 지방산 프로필은 표준적 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 42: 야로위아 리폴리티카의 조작
본 발명에 따라서 재조합 유전자의 발현은 본원에 기술된 바와 같이 Fickers(픽커스) et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형하여 야로위아 리폴리티카 내에서 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Fickers et al ., Journal of Microbiological Methods, Vol. 55 (2003), pp. 727-737]에는, 플라스미드 DNA로 야로위아 리폴리티카를 안정적으로 핵내 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 픽커스는 아세트산 리튬 형질 전환법을 사용하여 플라스미드 JMP123을 야로위아 리폴리티카에 도입하였다. 플라스미드 JMP123은, hph 단백질 암호화 영역 상류의 야로위아 리폴리티카 LIP2 유전자 프로모터(GenBank 수탁 번호 제AJ012632호)에 작동 가능하도록 결합되고, 또한 hph 단백질 암호화 영역 하류의 야로위아 리폴리티카 LIP2 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합된, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자 생성물(hph)을 암호화하는 서열을 포함하는 하이그로마이신 B 내성 카세트를 포함하였다. JMP123으로 형질 전환하기 전, 야로위아 리폴리티카는 100ug/㎖ 하이그로마이신을 포함하는 배지에서 번식할 수 없었다. JMP123으로 형질 전환하여, 100ug/㎖ 하이그로마이신을 포함하는 배지에서 번식할 수 있었던, 형질 전환된 야로위아 리폴리티카가 생산되었는데, 이로써, 야로위아 리폴리티카 내에서 사용되는 선택가능한 마커로서의 하이그로마이신 B 항생제 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. 야로위아 리폴리티카 LIP2 유전자의 3'UTR/종결 인자와 프로모터의 JMP123상에 제공된 뉴클레오티드 서열은, LIP2 위치로 hph 암호화 서열이 상동성 재조합되는데 사용되는 공여 서열로서 사용되었다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿에 의해 평가되었다. 픽커스는, 형질 전환된 야로위아 리폴리티카의 선택 및 유지는 100ug/㎖ 하이그로마이신을 함유하는 표준 YPD 배지(효모 추출 펩톤 덱스트로스)를 포함하는 한천 평판에서 수행되었다. 형질 전환된 야로위아 리폴리티카의 액체 배양은, 하이그로마이신을 함유하는 YPD 배지 중에서 수행되었다. 야로위아 리폴리티카를 배양하는데 사용되는 기타 다른 배지와 기술에 대해서는 개시되었으며, 야로위아 리폴리티카 내에서 사용되는 선택가능한 마커, 3'UTR, 프로모터 및 기타 다른 다수의 플라스미드도, 예를 들어 문헌[Pignede et al., Applied and Environmental Biology, Vol. 66:8 (2000), pp. 3283-3289], [Chuang et al., New Biotechnology, Vol. 27:4 (2010), pp. 277-282], 및 [Barth 및 Gaillardin, (1996), In: K,W. (Ed.), Nonconventional Yeasts in Biotecnology. Sprinter-Verlag, Berlin-Heidelber, pp. 313-388]에 개시되었다. 픽커스는, 형질 전환 벡터 JMP123 및 야로위아 리폴리티카 LIP2 유전자 프로모터, 그리고 3'UTR/종결 인자는 야로위아 리폴리티카 내에서 이종 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 픽커스는, JMP123상에서 암호화되는 하이그로마이신 내성 카세트가 야로위아 리폴리티카 내 선택가능한 마커로서 사용되기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로서 사용되는 hph 유전자 생성물 암호화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 JMP123을 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 생산하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 이 경우, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 따라서 야로위아 리폴리티카의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록, 야로위아 리폴리티카 내 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각, 단백질 암호화 서열 상류의 야로위아 리폴리티카 LIP2 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었으며, 단백질 암호화 서열의 하류 또는 3' 영역에서 야로위아 리폴리티카 LIP2 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는, 야로위아 리폴리티카 게놈에 상동성인 영역을 추가로 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 당업자는, 야로위아 리폴리티카 게놈의 서열 내에서 이와 같은 상동성 영역을 동정할 수 있다(문헌[Dujun et al ., Nature, Vol. 430 (2004), pp. 35-44] 참조). 야로위아 리폴리티카를 형질 전환 벡터로 안정적으로 형질 전환하는 것은, 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 아세트산 리튬 형질 전환법 또는 기타 다른 공지된 방법들을 통하여 이루어졌다. hph 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 하이그로마이신을 포함하는 YPD 배지에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 야로위아 리폴리티카를 선택하는 마커로서 사용될 수 있었다. 야로위아 리폴리티카 지질 생산에 적당한 생장 배지는 YPD 배지와, Chuang et al.에 의해 개시된 배양 배지를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 야로위아 리폴리티카 지질의 지방산 프로필은 표준적 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 43: 모르티에렐라 알파인의 조작
본 발명에 따라서, 재조합 유전자의 모르티에렐라 알파인 내 발현은 본원에 기술된 바와 같이 Mackenzie(맥켄지) et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형하여 이루어질 수 있었다. 간단히 말해서, 문헌[Mackenzie et al., Applied and Environmental Microbiology, Vol. 66 (2000), pp. 4655-4661]에는, 플라스미드 DNA로 모르티에렐라 알피나를 안정적으로 핵내에서 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 맥켄지는 원형질체 형질 전환법을 사용하여 플라스미드 pD4를 모르티에렐라 알피나에 도입하였다. 플라스미드 pD4는, hpt 단백질 암호화 영역 상류의 모르티에렐라 알피나 히스톤 H4.1 유전자 프로모터(GenBank 수탁 번호 제AJ249812호)에 작동 가능하도록 결합되고, hpt 단백질 암호화 영역 하류의 아스퍼질러스 니듈란스 N-(5'-포스포리보실)안트라닐레이트 이소머라제(trpC) 유전자 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합된, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자 생성물(hpt) 암호화 서열을 포함하는 하이그로마이신 B 내성 카세트를 포함하였다. pD4로 형질 전환하기 전, 모르티에렐라 알피나는 300ug/㎖ 하이그로마이신을 포함하는 배지에서 번식할 수 없었다. pD4로 형질 전환하였을 때, 300ug/㎖ 하이그로마이신을 포함하는 배지에서 번식된, 형질 전환된 모르티에렐라 알피나가 생산되었는데, 이로써, 모르티에렐라 알피나 내에서 사용되는 선택가능한 마커로서의 하이그로마이신 B 항생제 내성 카세트의 유용성이 확립되었다. 안정적인 형질 전환체의 게놈 DNA는 서던 블럿에 의해 평가되었다. 맥켄지는, 형질 전환된 모르티에렐라 알피나의 선택 및 유지는 하이그로마이신을 포함하는 PDA(감자 덱스트로스 한천) 배지에서 이루어졌다고 개시하였다. 형질 전환된 모르티에렐라 알피나의 액체 배양(맥켄지에 의함)은 PDA 배지 중 또는 S2GYE 배지(5% 글루코스, 0.5% 효모 추출물, 0.18% NH4SO4, 0.02% MgSO4-7H2O, 0.0001% FeCl3- 6H2O, 0.1% 미량 원소, 10mM K2HPO4-NaH2PO4 포함)(하이그로마이신 함유) 중에서 수행되었다. 모르티에렐라 알피나를 배양하는데 사용되는 기타 다른 배지와 기술, 그리고 모르티에렐라 알피나에서 사용되는 선택가능한 마커, 3'UTR, 프로모터 및 기타 다른 플라스미드에 대해서는, 예를 들어 문헌[Ando et al., Applied and Environmental Biology, Vol. 75:17 (2009) pp. 5529-35] 및 [Lu et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 164:7 (2001), pp. 979-90]에 개시되어 있다. 맥켄지는, 형질 전환 벡터 pD4와 모르티에렐라 알피나 하스톤 H4.1 프로모터, 그리고 에이.니듈란스 trpC 유전자 3'UTR/종결 인자는 모르티에렐라 알피나 내에서의 이종 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 맥켄지는, pD4상에서 암호화된 하이그로마이신 내성 카세트는 모르티에렐라 알피나 내에서 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로서 사용되는 hpt 유전자 생성물 암호화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pD4를 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형히여, 형질 전환 벡터를 생산하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 이 경우, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 따라서 모르티에렐라 알피나의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록, 모르티에렐라 알피나 내 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각, 단백질 암호화 서열 상류의 모르티에렐라 알피나 히스톤 H4.1 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었으며, 단백질 암호화 영역의 하류 또는 3' 영역에서 에이.니듈란스 trpC 3'UTR/종결 인자에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는, 모르티에렐라 알피나 게놈에 상동성인 영역을 추가로 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택될 수 있었다. 당업자는, 모르티에렐라 알파인 게놈의 서열 내에서 이와 같은 상동성 영역을 동정할 수 있다(문헌[Wang et al., PLOS One, Vol. 6:12 (2011)] 참조). 모르티에렐라 알피나를 형질 전환 벡터로 안정적으로 형질 전환하는 것은, 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 원형질체 형질 전환법 또는 기타 다른 공지된 방법들을 통하여 이루어졌다. hpt 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 하이그로마이신을 포함하는 PDA 배지에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 모르티에렐라 알피나를 선택하는 마커로서 사용될 수 있었다. 모르티에렐라 알피나 지질 생산에 적당한 생장 배지는 S2GYE 배지와, Lu et al. 및 Ando et al.에 의해 개시된 배양 배지를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 모르티에렐라 알피나 지질의 지방산 프로필은 표준적 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법을 통하여 평가될 수 있었다.
실시예 44: 로도코커스 오파쿠스 PD630 의 조작
본 발명에 따라서 재조합 유전자의 로도코커스 오파쿠스 PD630 내 발현은 본원에 기술된 바와 같이 Kalscheuer(칼슈어) et al.에 의해 교시된 방법과 벡터를 변형하여 이루어질 수 있었다. 간단히 말하면, 문헌[Kalscheuer et al ., Applied and Environmental Microbiology, Vol. 52 (1999), pp. 508-515]에는, 로도코커스 오파쿠스를 플라스미드 DNA로 안정적으로 형질 전환하는 것에 대해 개시되어 있다. 칼슈어는 전기 천공법과 같은 형질 전환법을 사용하여 플라스미드 pNC9501을 로도코커스 오파쿠스 PD630에 도입하였다. 플라스미드 pNC9501은, 유전자의 프로모터와 3' 종결 인자 서열을 포함하는, 스트렙토마이세스 아주레우스 23S rRNA A1067 메틸트랜스퍼라제 유전자의 전 뉴클레오티드 서열을 포함하는 티오스트렙톤 내성(thior) 카세트를 포함하였다. pNC9501으로 형질 전환하기 전, 로도코커스 오파쿠스는 1mg/㎖ 티오스트렙톤을 포함하는 배지에서 번식할 수 없었다. 로도코커스 오파쿠스 PD630을 pNC9501로 형질 전환하여, 1mg/㎖ 티오스트렙톤을 포함하는 배양 배지에서 번식된 형질 전환체가 생산되었는데, 이로써, 로도코커스 오파쿠스 PD630 내 선택가능한 마커로서의 티오스트렙톤 내성 카세트의 용도가 확립되었다. 칼슈어에 의해 개시된 제2 플라스미드 pAK68은, 내성 thior 카세트와, 랄스토니아 유트로파 베타-케토티올라제 유전자(phaB) 서열, 아세토아세틸-CoA 환원 효소 유전자(phaA) 서열 및 폴리 3-하이드록시알칸산 합성 효소 유전자(phaC) 서열(폴리하이드록시알카노에이트 생합성용; lacZ 프로모터에 의해 작동됨)을 포함하였다. 폴리하이드록시알카노에이트 생합성 경로가 결핍된 로도코커스 오파쿠스 PD630 균주를 pAK68로 형질 전환하여, 형질 전환된 로도코커스 오파쿠스 PD630(형질 전환되지 않은 균주보다 많은 양의 폴리하이드록시알카노에이트를 생산)을 생산하였다. 도입된 랄스토니아 유트로파 phaB, phaA 및 phaC 효소의 검출 가능한 활성은, pAK68 플라스미드상에서 암호화되는 조절 요소가 로도코커스 오파쿠스 PD630 내 이종 유전자 발현에 적당하였음을 암시하였다. 칼슈어는, 형질 전환된 로도코커스 오파쿠스 PD630의 선택 및 유지는, 표준적 루리아 브로스(Luria Broth)(LB) 배지, 영양 브로스(NB), 또는 티오스트렙톤을 포함하는 무기염 배지(MSM) 상에서 이루어졌다고 개시하였다. 로도코커스 오파쿠스 PD630를 배양하는데 사용되는 기타 다른 배지와 기술에 대해서는, 예를 들어 문헌[Kurosawa et al., Journal of Biotechnology, Vol. 147:3-4 (2010), pp. 212-218] 및 [Alverez et al., Applied Microbial and Biotechnology, Vol. 54:2 (2000), pp.218-223]에 개시되어 있다. 칼슈어는, 형질 전환 벡터 pNC9501 및 pAK68, 스트렙토마이세스 아주레우스 23S rRNA A1067 메틸트랜스퍼라제 유전자의 프로모터 및 lacZ 유전자가 로도코커스 오파쿠스 PD630 내 이종 유전자 발현을 가능하게 하는데 적당하다고 개시하였다. 뿐만 아니라, 칼슈어는, pNC9501 및 pAK68상에서 암호화되는 thior 카세트가 로도코커스 오파쿠스 PD630 내 선택가능한 마커로서 사용하기 적당하였다고 개시하였다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 선택가능한 마커로서 사용되는 thior 유전자 생성물 암호화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pNC9501을 구성하고, 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 변형하여, 형질 전환 벡터를 생산하였다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 70으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하였는데, 이 경우, 각각의 단백질 암호화 서열은, 표 69에 따라서 로도코커스 오파쿠스의 핵내 유전자에 고유한 코돈 편향 사용을 반영하도록, 로도코커스 오파쿠스 PD630 내 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 표 70의 지질 생합성 경로 단백질 각각에 있어서, 코돈 최적화 유전자 서열은 각각, 단백질 암호화 서열 상류의 lacZ 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 결합될 수 있었다. 형질 전환 구조물은 형질 전환 벡터의 표적화 게놈 통합에 사용되는, 로도코커스 오파쿠스 PD630 게놈에 상동성인 영역을 추가로 포함할 수 있었다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 위치를 중단하는 것으로 선택할 수 있었다. 당업자는, 로도코커스 오파쿠스 PD630 게놈의 서열 내에서 이와 같은 상동성 영역을 동정할 수 있다(문헌[Holder et al ., PLOS Genetics, Vol. 7:9 (2011)] 참조). 로도코커스 오파쿠스 PD630을 형질 전환 벡터로 형질 전환하는 것은, 널리 공지된 형질 전환 기술, 예를 들어 전기 천공법 또는 기타 다른 공지된 방법들을 통하여 이루어졌다. 스트렙토마이세스 아주레우스 23S rRNA A1067 메틸트랜스퍼라제 유전자 생성물의 활성은, 예를 들어 티오스트렙톤을 포함하는 LB 배지에서 형질 전환 벡터로 형질 전환된 로도코커스 오파쿠스 PD630을 선택하는 마커로서 사용될 수 있었다. 로도코커스 오파쿠스 PD630 지질 생산에 적당한 생장 배지는 Kurosawa et al. 및 Albarez et al.에 의해 개시된 배양 배지를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 로도코커스 오파쿠스 PD630 지질의 지방산 프로필은 표준적 지질 추출법과 본원에 기술된 분석 방법을 통하여 평가될 수 있었다.
본원에 인용된 모든 참고 문헌, 예를 들어 특허, 특허 출원 및 공보, 예를 들어 GenBank 수탁 번호는, 사전에 구체적으로 인용되었든 아니든, 본원에 그 자체로서 참조로 포함되어 있는 것이다. 본원에 인용된 공보는, 본 발명과 연관되어 사용될 수 있는 시약, 방법 및 개념을 기술 및 개시하고자 하는 목적으로 인용되었다. 본원에 개시된 것들 중 그 어떤 것도, 본원에 인용된 참고 문헌들이 본원에 기술된 본 발명과 관련하여 선행 기술에 해당함을 인정하는 것으로서 해석되지 않는다. 특히 다음과 같은 특허 출원은 모든 목적을 위하여 그 자체로서 본원에 참조로 포함되었다: PCT 특허 출원 PCT/US2008/065563(2008년 6월 2일 출원; 발명의 명칭“Production of Oil in Microorganisms”), PCT 특허 출원 PCT/US2010/31108(2010년 4월 14일 출원; 발명의 명칭“Methods of Microbial Oil Extraction and Separation”), 그리고 PCT 특허 출원 PCT/US2009/066142(2009년 11월 30일 출원; 발명의 명칭 “Production of Tailored Oils in Heterotrophic Microorganisms”).
서열 목록
서열 번호 1
클로렐라로부터의 HUP 프로모터 (GenBank 수탁 번호 X55349의 서브시퀀스)
Figure 112013079886893-pct00095
서열 번호 2
AY307383으로부터의 클로렐라 엘립소이데아 질산염 환원 효소 프로모터
Figure 112013079886893-pct00096
Figure 112013079886893-pct00097
서열 번호 3
효모 수크로스 인버타제
Figure 112013079886893-pct00098
서열 번호 4
효모 분비 신호
Figure 112013079886893-pct00099
서열 번호 5
고등 식물 분비 신호
Figure 112013079886893-pct00100
서열 번호 6
콘센서스 진핵 분비 신호
Figure 112013079886893-pct00101
서열 번호 7
조합 고등 식물/진핵 분비 신호
Figure 112013079886893-pct00102
서열 번호 8
에스.세레비지아에 수크로스 인버타제 NP_012104
Figure 112013079886893-pct00103
Figure 112013079886893-pct00104
서열 번호 9
Figure 112013079886893-pct00105
서열 번호 10
Figure 112013079886893-pct00106
서열 번호 11
UTEX 329 프로토테카 크로에가니
Figure 112013079886893-pct00107
서열 번호 12
UTEX 1440 프로토테카 윅커해미
Figure 112013079886893-pct00108
서열 번호 13
UTEX 1442 프로토테카 스태그노라
Figure 112013079886893-pct00109
서열 번호 14
UTEX 288 프로토테카 모리포르미스
Figure 112013079886893-pct00110
Figure 112013079886893-pct00111
서열 번호 15
UTEX 1439, UTEX 1441, UTEX 1435, UTEX 1437 프로토테카 모리포르미스
Figure 112013079886893-pct00112
서열 번호 16
UTEX 1533 프로토테카 윅커해미
Figure 112013079886893-pct00113
서열 번호 17
UTEX 1434 프로토테카 모리포르미스
Figure 112013079886893-pct00114
Figure 112013079886893-pct00115
서열 번호 18
UTEX 1438 프로토테카 조프피이
Figure 112013079886893-pct00116
서열 번호 19
UTEX 1436 프로토테카 모리포르미스
Figure 112013079886893-pct00117
서열 번호 20
치코리움 인티부스 인버타제: Genbank 수탁 번호 Y11124
Figure 112013079886893-pct00118
서열 번호 21
스키조사카로마이세스 폼베 인버타제: Genbank 수탁 번호 AB011433
Figure 112013079886893-pct00119
서열 번호 22
피카 아노말라 베타-프럭토푸라노시다제 (인버타제): Genank 수탁 번호 X80640
Figure 112013079886893-pct00120
서열 번호 23
데바리오마이세스 옥시덴탈리스 인버타제: Genank 수탁 번호 X17604
Figure 112013079886893-pct00121
서열 번호 24
오리자 사티바 인버타제: Genank 수탁 번호 AF019113
Figure 112013079886893-pct00122
Figure 112013079886893-pct00123
서열 번호 25
알리움 케파 인버타제: Genank 수탁 번호 AJ006067
Figure 112013079886893-pct00124
서열 번호 26
베타 불가리스 아종 불가리스 인버타제: Genank 수탁 번호 AJ278531
Figure 112013079886893-pct00125
서열 번호 27
비피도박테리움 브레베 UCC2003 베타-프럭토푸라노시다제 (인버타제): Genank 수탁 번호 AAT28190
Figure 112013079886893-pct00126
서열 번호 28
사카로마이세스 세레비지아에 인버타제: Genank 수탁 번호 NP_012104
Figure 112013079886893-pct00127
서열 번호 29
지모모나스 모빌리스 인버타제 A: Genank 수탁 번호 AY171597
Figure 112013079886893-pct00128
서열 번호 30
프로토테카 모리포르미스 델타 12 지방산 불포화 효소 운반 펩티드를 지니 는 신나모뮴 캠포라 FATB1 (Genbank Q39473) 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00129
서열 번호 31
프로토테카 모리포르미스 델타 12 지방산 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 신나모뮴 캠포라 FATB1 cDNA의 관련 코돈 최적화 발현 구조물
Figure 112013079886893-pct00130
Figure 112013079886893-pct00131
Figure 112013079886893-pct00132
서열 번호 32
프로토테카 모리포르미스 델타 12 지방산 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 쿠페아 후커리아나 FATB2 (Genbank AAC49269) 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00133
서열 번호 33
프로토테카 모리포르미스 델타 12 지방산 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 쿠페아 후커리아나 FATB2 cDNA의 관련 코돈 최적화 발현 구조물
Figure 112013079886893-pct00134
Figure 112013079886893-pct00135
Figure 112013079886893-pct00136
서열 번호 34
프로토테카 모리포르미스 델타 12 지방산 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 움벨루라리아 캘리포니카 FATB1 (Genbank Q41635) 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00137
서열 번호 35
프로토테카 모리포르미스 델타 12 지방산 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 움벨루라리아 캘리포니카 FATB1 cDNA의 관련 코돈 최적화 발현 구조물
Figure 112013079886893-pct00138
Figure 112013079886893-pct00139
서열 번호 36
프로토테카 모리포르미스 델타 12 지방산 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 쿠페아 팔루스트리스 C8 선호 티오에스테라제 (Genbank AAC49179) 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00140
서열 번호 37
프로토테카 모리포르미스 델타 12 지방산 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 쿠페아 팔루스트리스 C8 선호 티오에스테라제 cDNA의 관련 코돈 최적화 발현 구조물
Figure 112013079886893-pct00141
Figure 112013079886893-pct00142
서열 번호 38
프로토테카 모리포르미스 델타 12 지방산 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 쿠페아 란세올라타 C10 선호 티오에스테라제 (Genbank CAB60830) 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00143
Figure 112013079886893-pct00144
서열 번호 39
프로토테카 모리포르미스 델타 12 지방산 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 쿠페아 란세올라타 C10 선호 티오에스테라제의 관련 코돈 최적화 코딩 영역
Figure 112013079886893-pct00145
서열 번호 40
클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소 엽록체 운반 펩티드를 지니는 아이리스 게르마니카 C14 선호 티오에스테라제 (Genbank AAG43858.1) 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00146
서열 번호 41
클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 아이리스 게르마니카 C14 선호 티오에스테라제의 관련 코돈 최적화 코딩 영역
Figure 112013079886893-pct00147
서열 번호 42
프로토테카 모리포르미스 델타 12 지방산 불포화 효소 엽록체 운반 펩티드를 지니는 미리스티카 프래그란스 지방산 티오에스테라제 (Genbank AAB717291.1) 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00148
서열 번호 43
프로토테카 모리포르미스 델타 12 지방산 불포화 효소 엽록체 운반 펩티드를 지니는 미리스티카 프래그란스 지방산 티오에스테라제의 관련 코돈 최적화 코딩 영역
Figure 112013079886893-pct00149
Figure 112013079886893-pct00150
서열 번호 44
클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 쿠페아 팔루스트리스 C14 선호 티오에스테라제 (Genbank AAC49180) 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00151
서열 번호 45
클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 쿠페아 팔루스트리스 C14 선호 티오에스테라제의 관련 코돈 최적화 코딩 영역
Figure 112013079886893-pct00152
Figure 112013079886893-pct00153
서열 번호 46
클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 얼머스 아메리카나 광범위 특이성 티오에스테라제 (Genbank AAB71731) 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00154
서열 번호 47
클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 얼머스 아메리카나 광범위 특이성 티오에스테라제의 관련 코돈 최적화 코딩 영역
Figure 112013079886893-pct00155
서열 번호 48
코돈 최적화 프로토테카 모리포르미스 (UTEX 1435) 델타 12 지방산 불포화 효소 운반 펩티드 cDNA 서열
Figure 112013079886893-pct00156
서열 번호 49
코돈 최적화 클로렐라 프로토테코이데스 (UTEX 250) 스테아로일 ACP 불포화 효소 운반 펩티드 cDNA 서열
Figure 112013079886893-pct00157
서열 번호 50
얼머스 아메리카나 광범위 특이성 티오에스테라제의 코돈 최적화 코딩 영역의 적절한 상동 재조합 발현 구조물
Figure 112013079886893-pct00158
Figure 112013079886893-pct00159
Figure 112013079886893-pct00160
서열 번호 51
신나모뮴 캠포라 C14 선호 티오에스테라제의 코돈 최적화 코딩 영역의 적절한 상동 재조합 발현 구조물
Figure 112013079886893-pct00161
Figure 112013079886893-pct00162
Figure 112013079886893-pct00163
서열 번호 52
클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 쿠페아 후커리아나 C10 선호 티오에스테라제의 코돈 최적화 코딩 영역에 대한 관련 발현 구조물
Figure 112013079886893-pct00164
Figure 112013079886893-pct00165
Figure 112013079886893-pct00166
서열 번호 53
클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 움벨루라리아 캘리포니카 C12 선호 티오에스테라제의 코돈 최적화 코딩 영역에 대한 관련 발현 구조물
Figure 112013079886893-pct00167
Figure 112013079886893-pct00168
Figure 112013079886893-pct00169
서열 번호 54
클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 얼머스 아메리카나 광범위 특이성 티오에스테라제의 코돈 최적화 코딩 영역에 대한 관련 발현 구조물
Figure 112013079886893-pct00170
Figure 112013079886893-pct00171
Figure 112013079886893-pct00172
서열 번호 55
프로토테카 모리포르미스 FatB/A 프로모터/5'UTR
Figure 112013079886893-pct00173
서열 번호 56
프로토테카 모리포르미스 NRAMP 금속 운반체 프로모터/5'UTR
Figure 112013079886893-pct00174
서열 번호 57
프로토테카 모리포르미스 FLAP 편모-관련 단백질 프로모터/5'UTR
Figure 112013079886893-pct00175
서열 번호 58
프로토테카 모리포르미스 SulfRed Sulfite 환원 효소 프로모터/5'UTR
Figure 112013079886893-pct00176
서열 번호 59
프로토테카 모리포르미스 SugT 당 운반체 프로모터/5'UTR
Figure 112013079886893-pct00177
Figure 112013079886893-pct00178
서열 번호 60
프로토테카 모리포르미스 Amt03-암모늄 운반체 프로모터/5'UTR
Figure 112013079886893-pct00179
서열 번호 61
프로토테카 모리포르미스 Amt02-암모늄 운반체 프로모터/5'UTR
Figure 112013079886893-pct00180
Figure 112013079886893-pct00181
서열 번호 62
프로토테카 모리포르미스 Aat01-아미노산 운반체 프로모터/5'UTR
Figure 112013079886893-pct00182
서열 번호 63
프로토테카 모리포르미스 Aat02-아미노산 운반체 프로모터/5'UTR
Figure 112013079886893-pct00183
Figure 112013079886893-pct00184
서열 번호 64
프로토테카 모리포르미스 Aat03-아미노산 운반체 프로모터/5'UTR
Figure 112013079886893-pct00185
서열 번호 65
프로토테카 모리포르미스 Aat04-아미노산 운반체 프로모터/5'UTR
Figure 112013079886893-pct00186
Figure 112013079886893-pct00187
서열 번호 66
프로토테카 모리포르미스 Aat05-아미노산 운반체 프로모터/5'UTR
Figure 112013079886893-pct00188
서열 번호 67
프로토테카 모리포르미스 Aat01의 추정 프로모터/5'UTR을 시험하기 위한 리포터 구조물의 관련 부분
Figure 112013079886893-pct00189
Figure 112013079886893-pct00190
Figure 112013079886893-pct00191
Figure 112013079886893-pct00192
서열 번호 68
씨. 캠포라 티오에스테라제 정방향 프라이머
Figure 112013079886893-pct00193
서열 번호 69
씨. 캠포라 티오에스테라제 역방향 프라이머
Figure 112013079886893-pct00194
서열 번호 70
cd189 정방향 프라이머
Figure 112013079886893-pct00195
서열 번호 71
cd189 역방향 프라이머
Figure 112013079886893-pct00196
서열 번호 72
프로토테카 모리포르미스 델타 12 FAD 녹아웃 상동 재조합 표적화 구조물의 5' 공여체 DNA 서열
Figure 112013079886893-pct00197
Figure 112013079886893-pct00198
서열 번호 73
프로토테카 모리포르미스 델타 12 FAD 녹아웃 상동 재조합 표적화 구조물의 3' 공여체 DNA 서열
Figure 112013079886893-pct00199
서열 번호 74
프로토테카 모리포르미스 델타 12 FAD 녹아웃 상동 재조합 표적화 구조물
Figure 112013079886893-pct00200
Figure 112013079886893-pct00201
Figure 112013079886893-pct00202
서열 번호 75
프로토테카 모리포르미스 SAD2A 녹아웃 상동 재조합 표적화 구조물의 5' 공여체 DNA 서열
Figure 112013079886893-pct00203
서열 번호 76
프로토테카 모리포르미스 SAD2A 녹아웃 상동 재조합 표적화 구조물의 3' 공여체 DNA 서열
Figure 112013079886893-pct00204
Figure 112013079886893-pct00205
서열 번호 77
프로토테카 모리포르미스 SAD2A 녹아웃 상동 재조합 표적화 구조물
Figure 112013079886893-pct00206
Figure 112013079886893-pct00207
서열 번호 78
프로토테카 모리포르미스 SAD2B 녹아웃 상동 재조합 표적화 구조물의 5' 공여체 DNA 서열
Figure 112013079886893-pct00208
Figure 112013079886893-pct00209
서열 번호 79
프로토테카 모리포르미스 SAD2B 녹아웃 상동 재조합 표적화 구조물의 3' 공여체 DNA 서열
Figure 112013079886893-pct00210
서열 번호 80
프로토테카 모리포르미스 SAD2B 녹아웃 상동 재조합 표적화 구조물
Figure 112013079886893-pct00211
Figure 112013079886893-pct00212
서열 번호 81
피. 모리포르미스 Aat02 프로모터/5'UTR::씨. 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화 효소 PTS::신나모뮴 캠포라 C14 티오에스테라제::씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR
Figure 112013079886893-pct00213
Figure 112013079886893-pct00214
서열 번호 82
5' 6S 영역 게놈 공여체 서열
Figure 112013079886893-pct00215
서열 번호 83
신나모뮴 캠포라 티오에스테라제에 대한 관련 발현 구조물
(βtub::neo::nitred::βtub::씨. 캠포라 TE::nitred)
Figure 112013079886893-pct00216
Figure 112013079886893-pct00217
서열 번호 84
3' 6S 영역 게놈 공여체 서열
Figure 112013079886893-pct00218
Figure 112013079886893-pct00219
서열 번호 85
Amt03 정방향 프라이머
Figure 112013079886893-pct00220
서열 번호 86
Amt03 역방향 프라이머
Figure 112013079886893-pct00221
서열 번호 87
Amt02 정방향 프라이머
Figure 112013079886893-pct00222
서열 번호 88
Amt02 역방향 프라이머
Figure 112013079886893-pct00223
서열 번호 89
Amt03 프로모터/UTR 서열
Figure 112013079886893-pct00224
Figure 112013079886893-pct00225
서열 번호 90
amt 프로모터/UTR의 관련 서열::씨. 캠포라 티오에스테라제 발현 구조물
Figure 112013079886893-pct00226
Figure 112013079886893-pct00227
Figure 112013079886893-pct00228
서열 번호 91
코돈-최적화 씨. 캠포라 티오에스테라제 서열
Figure 112013079886893-pct00229
Figure 112013079886893-pct00230
서열 번호 92
코돈-최적화 유. 캘리포니카 티오에스테라제 서열
Figure 112013079886893-pct00231
서열 번호 93
코돈-최적화 유. 아메리카나 티오에스테라제 서열
Figure 112013079886893-pct00232
Figure 112013079886893-pct00233
서열 번호 94
코돈-최적화 씨. 후커리아나 티오에스테라제 서열
Figure 112013079886893-pct00234
서열 번호 95
유. 캘리포니카 티오에스테라제 정방향 프라이머
Figure 112013079886893-pct00235
서열 번호 96
유. 캘리포니카 티오에스테라제 역방향 프라이머
Figure 112013079886893-pct00236
서열 번호 97
유. 아메리카나 티오에스테라제 정방향 프라이머
Figure 112013079886893-pct00237
서열 번호 98
유. 아메리카나 티오에스테라제 역방향 프라이머
Figure 112013079886893-pct00238
서열 번호 99
씨. 후커리아나 티오에스테라제 정방향 프라이머
Figure 112013079886893-pct00239
서열 번호 100
씨. 후커리아나 티오에스테라제 역방향 프라이머
Figure 112013079886893-pct00240
서열 번호 101
FAD 프라이머 1
Figure 112013079886893-pct00241
서열 번호 102
FAD 프라이머 2
Figure 112013079886893-pct00242
서열 번호 103
pSZ1124 (FAD2B) 5' 게놈 표적화 서열
Figure 112013079886893-pct00243
서열 번호 104
pSZ1124 (FAD2B) 3' 게놈 표적화 서열
Figure 112013079886893-pct00244
Figure 112013079886893-pct00245
서열 번호 105
씨. 세레비지아에 suc2 카세트
Figure 112013079886893-pct00246
Figure 112013079886893-pct00247
서열 번호 106
pSZ1125 (FAD2C) 5' 게놈 표적화 서열
Figure 112013079886893-pct00248
서열 번호 107
pSZ1125 (FAD2C) 3' 게놈 표적화 서열
Figure 112013079886893-pct00249
서열 번호 108
에스. 칼베르겐시스 MEL1 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00250
Figure 112013079886893-pct00251
서열 번호 109
에스. 칼베르겐시스 MEL1 천연 신호 펩티드 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00252
서열 번호 110
에스. 칼베르겐시스 MEL1 발현 카세트의 관련 서열
Figure 112013079886893-pct00253
Figure 112013079886893-pct00254
서열 번호 111
코돈-최적화 에스. 칼베르겐시스 MEL1 서열
Figure 112013079886893-pct00255
Figure 112013079886893-pct00256
서열 번호 112
5' Clp 상동 재조합 표적화 서열
Figure 112013079886893-pct00257
서열 번호 113
3' Clp 상동 재조합 표적화 서열
Figure 112013079886893-pct00258
서열 번호 114
클라미도모나스 레인하르드티 TUB2 프로모터/5'UTR
Figure 112013079886893-pct00259
서열 번호 115
클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR
Figure 112013079886893-pct00260
Figure 112013079886893-pct00261
서열 번호 116
에이. 나이저 AlgC 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00262
서열 번호 117
에이. 나이저 AlgC 천연 신호 펩티드 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00263
서열 번호 118
코돈-최적화 에이. 나이저 AlgC 코딩 서열
Figure 112013079886893-pct00264
Figure 112013079886893-pct00265
서열 번호 119
에이. 나이저 AlgC 발현 카세트의 관련 서열
Figure 112013079886893-pct00266
Figure 112013079886893-pct00267
Figure 112013079886893-pct00268
서열 번호 120
씨. 테트라고노볼라 α-갈락토시다제 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00269
서열 번호 121
코돈 최적화 씨. 테트라고노볼라 α-갈락토시다제 서열
Figure 112013079886893-pct00270
서열 번호 122
씨. 테트라고노볼라 α-갈락토시다제 발현 카세트의 관련 서열
Figure 112013079886893-pct00271
Figure 112013079886893-pct00272
Figure 112013079886893-pct00273
서열 번호 123
5' 프라이머 씨. 불가리스 3'UTR:하류 Clp 서열
Figure 112013079886893-pct00274
서열 번호 124
3' 프라이머 씨. 불가리스 3'UTR:하류 Clp 서열
Figure 112013079886893-pct00275
서열 번호 125
코코믹사 C-169 THIC 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00276
서열 번호 126
코코믹사 C-169 THIC 천연 운반 펩티드 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00277
서열 번호 127
코코믹사 C-169 THIC 발현 카세트의 관련 서열
Figure 112013079886893-pct00278
Figure 112013079886893-pct00279
Figure 112013079886893-pct00280
Figure 112013079886893-pct00281
서열 번호 128
코돈-최적화 코코믹사 C-169 THIC 서열
Figure 112013079886893-pct00282
서열 번호 129
코돈-최적화 에스. 세레비지아에 suc2 서열
Figure 112013079886893-pct00283
서열 번호 130
씨. 프로토테코이데스 운반 펩티드를 지니는 코코믹사 C-169 THIC 발현 구조물의 관련 서열
Figure 112013079886893-pct00284
Figure 112013079886893-pct00285
Figure 112013079886893-pct00286
서열 번호 131
씨. 프로토테코이데스 운반 펩티드를 지니는 코돈-최적화 코코믹사 C-169 THIC 서열
Figure 112013079886893-pct00287
서열 번호 132
클로렐라 프로토테코이데스 액틴 프로모터/5'UTR
Figure 112013079886893-pct00288
서열 번호 133
클로렐라 프로토테코이데스 EF1A 3'UTR
Figure 112013079886893-pct00289
서열 번호 134
에이. 탈리아나 THIC 발현 카세트의 관련 서열
Figure 112013079886893-pct00290
Figure 112013079886893-pct00291
Figure 112013079886893-pct00292
서열 번호 135
씨. 프로토테코이데스 운반 펩티드를 지니는 코돈-최적화 에이.탈리아나 THIC
Figure 112013079886893-pct00293
서열 번호 136
에이.탈리아나 아미노산 서열 (천연 운반 펩티드 서열을 지님)
Figure 112013079886893-pct00294
Figure 112013079886893-pct00295
서열 번호 137
시네코시스티스 종 thiC 발현 카세트의 관련 서열
Figure 112013079886893-pct00296
Figure 112013079886893-pct00297
Figure 112013079886893-pct00298
서열 번호 138
씨. 프로토테코이데스 운반 펩티드를 지니는 코돈-최적화 시네코시스티스 종 thiC 서열
Figure 112013079886893-pct00299
Figure 112013079886893-pct00300
서열 번호 139
시네코시스티스 종 thiC 아미노산 서열 (천연 운반 펩티드 서열을 지님)
Figure 112013079886893-pct00301
서열 번호 140
코돈-최적화 neoR 유전자
Figure 112013079886893-pct00302
서열 번호 141
5'THIC 코코믹사 C-169 확인 프라이머
Figure 112013079886893-pct00303
서열 번호 142
3'THIC 확인 프라이머
Figure 112013079886893-pct00304
서열 번호 143
5'THIC 에이. 탈리아나 확인 프라이머
Figure 112013079886893-pct00305
서열 번호 144
5'thiC 시네코시스티스 종 확인 프라이머
Figure 112013079886893-pct00306
서열 번호 145
pSZ1318로부터의 미리스티카 프래그란스 광범위-기반 C14:0-C18:0 티오에스테라제의 코돈-최적화 코딩 영역
Figure 112013079886893-pct00307
서열 번호 146
미리스티카 프래그란스 광범위-기반 C14:0-C18:0 티오에스테라제의 아미노산 서열 (수탁 번호 AAB71729)
Figure 112013079886893-pct00308
서열 번호 147
pSZ1452로부터의 가르시니아 망고스타나 C16:0-선호 티오에스테라제의 코돈-최적화 코딩 영역
Figure 112013079886893-pct00309
Figure 112013079886893-pct00310
서열 번호 148
가르시니아 망고스타나 C16:0-선호 티오에스테라제의 아미노산 서열 (수탁 번호 AAB51525.1)
Figure 112013079886893-pct00311
서열 번호 149
pSZ1417로부터의 쿠페아 후커리아나 C16:0-선호 티오에스테라제의 코돈-최적화 코딩 영역
Figure 112013079886893-pct00312
Figure 112013079886893-pct00313
서열 번호 150
쿠페아 후커리아나 C16:0-선호 티오에스테라제의 아미노산 서열 (수탁 번호 Q39513.1)
Figure 112013079886893-pct00314
서열 번호 151
pSZ1437로부터의 엘라에이스 기니엔시스 C16:0-선호 티오에스테라제의 코돈-최적화 코딩 영역
Figure 112013079886893-pct00315
Figure 112013079886893-pct00316
서열 번호 152
엘라에이스 기니엔시스 C16:0-선호 티오에스테라제의 아미노산 서열 (수탁 번호 AAD42220.2)
Figure 112013079886893-pct00317
서열 번호 153
pSZ1358로부터의 브라시카 나푸스 C18:0-선호 티오에스테라제의 코돈-최적화 코딩 영역
Figure 112013079886893-pct00318
서열 번호 154
브라시카 나푸스 C18:0-선호 티오에스테라제의 아미노산 서열 (수탁 번호 CAA52070.1)
Figure 112013079886893-pct00319
서열 번호 155
pSZ1375로부터의 클로렐라 프로토테코이데스 UTEX 250 스테아로일-ACP 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 리시누스 커뮤니스 ACP-티오에스테라제의 코돈-최적화 코딩 서열
Figure 112013079886893-pct00320
서열 번호 156
리시누스 커뮤니스 ACP-티오에스테라제의 아미노산 서열 (수탁 번호 ABS30422.1)
Figure 112013079886893-pct00321
서열 번호 157
pSZ1317로부터의 클로렐라 프로토테코이데스 UTEX 250 스테아로일-ACP 운반 펩티드를 지니는 미리스티카 프래그란스 광범위-기반 티오에스테라제의 코돈-최적화 코딩 영역
Figure 112013079886893-pct00322
서열 번호 158
클로렐라 프로토테코이데스 UTEX 250 스테아로일-ACP 운반 펩티드 서열을 지니는 미리스티카 프래그란스 광범위-기반 티오에스테라제의 아미노산 서열
Figure 112013079886893-pct00323
서열 번호 159
씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR을 지니는 에스. 세레비지아에 suc2 유전자의 코돈-최적화 발현 카세트의 뉴클레오티드 서열
Figure 112013079886893-pct00324
Figure 112013079886893-pct00325
서열 번호 160
pSZ1462로부터의 클로렐라 프로토테코이데스 UTEX 250 스테아로일-ACP 불포화 효소 운반 펩티드를 지니는 쿠페아 후커리아나 C16:선호 티오에스테라제의 코돈-최적화 코딩 영역
Figure 112013079886893-pct00326
Figure 112013079886893-pct00327
서열 번호 161
pSZ1436으로부터의 엘라에이스 기니엔시스 C16:0-선호 티오에스테라제 PATE의 코돈-최적화 코딩 영역
Figure 112013079886893-pct00328
서열 번호 162
엘라에이스 기니엔시스 C16:0-선호 티오에스테라제 PATE의 아미노산 서열 (GenBank 수탁 번호 ABD83939)
Figure 112013079886893-pct00329
Figure 112013079886893-pct00330
서열 번호 163
pSZ1468로부터의 RNAi 발현 카세트의 FADc 부분
Figure 112013079886893-pct00331
서열 번호 164
pSZ1468로부터의 FADc RNAi 발현 카세트의 관련 부분
Figure 112013079886893-pct00332
Figure 112013079886893-pct00333
Figure 112013079886893-pct00334
서열 번호 165
pSZ1469로부터의 RNAi 발현 카세트의 FADc 부분
Figure 112013079886893-pct00335
Figure 112013079886893-pct00336
서열 번호 166
pSZ1469로부터의 FADc RNAi 발현 카세트의 관련 부분
Figure 112013079886893-pct00337
Figure 112013079886893-pct00338
Figure 112013079886893-pct00339
서열 번호 167
pSZ1470으로부터의 RNAi 발현 카세트의 FADc 부분
Figure 112013079886893-pct00340
서열 번호 168
pSZ1470으로부터의 FADc RNAi 발현 카세트의 관련 부분
Figure 112013079886893-pct00341
Figure 112013079886893-pct00342
Figure 112013079886893-pct00343
Figure 112013079886893-pct00344
서열 번호 169
pSZ1471로부터의 RNAi 발현 카세트의 FADc 부분
Figure 112013079886893-pct00345
서열 번호 170
pSZ1471로부터의 FADc RNAi 발현 카세트의 관련 부분
Figure 112013079886893-pct00346
Figure 112013079886893-pct00347
Figure 112013079886893-pct00348
Figure 112013079886893-pct00349
서열 번호 171
pSZ1377로부터의 클로렐라 프로토테코이데스 UTEX 250 스테아로일-ACP 운반 펩티드를 지니는 올레아 유로파에아 스테아로일-ACP 불포화 효소의 코돈-최적화 코딩 영역
Figure 112013079886893-pct00350
서열 번호 172
올레아 유로파에아 스테아로일-ACP 불포화 효소의 아미노산 서열 (수탁 번호 AAB67840.1)
Figure 112013079886893-pct00351
서열 번호 173
pSZ1419로부터의 리시누스 커뮤니스 올리에이트 12-하이드록실라제의 코돈-최적화 코딩 서열
Figure 112013079886893-pct00352
Figure 112013079886893-pct00353
서열 번호 174
리시누스 커뮤니스 올리에이트 12-하이드록실라제의 아미노산 서열 (수탁 번호 AAC49010.1)
Figure 112013079886893-pct00354
서열 번호 175
리시누스 커뮤니스
Figure 112013079886893-pct00355
서열 번호 176
헬리안터스 아너스
Figure 112013079886893-pct00356
Figure 112013079886893-pct00357
서열 번호 177
브라시카 나푸스
Figure 112013079886893-pct00358
서열 번호 178
GenBank 수탁 번호 ABR01158.1, ABI18155.1, AAF61739.1 및 AAW88763.1을 각각 지니는 글리신 맥스
Figure 112013079886893-pct00359
서열 번호 179
피. 모리포르미스
Figure 112013079886893-pct00360
서열 번호 180
피. 모리포르미스 스테아로일 ACP 불포화 효소
Figure 112013079886893-pct00361
서열 번호 181
리누스 유시타티시멈 12 불포화 효소
Figure 112013079886893-pct00362
서열 번호 182
리누스 유시타티시멈 15 불포화 효소
Figure 112013079886893-pct00363
서열 번호 183
리누스 유시타티시멈 15 불포화 효소
Figure 112013079886893-pct00364
서열 번호 184
칼타머스 팅크토리우스 12 불포화 효소
Figure 112013079886893-pct00365
서열 번호 185
GenBank 수탁 번호 ABB05230.1, ABA02173.1, ABA02172.1, ADM48789.1 및 AAL68983.1을 각각 지니는 헬리안투스 아너스 12 불포화 효소
Figure 112013079886893-pct00366
Figure 112013079886893-pct00367
서열 번호 186
쿠페아 라이티 FatB1 티오에스테라제: GenBank 수탁 번호 U56103
Figure 112013079886893-pct00368
서열 번호 187
쿠페아 라이티 FatB2 티오에스테라제: GenBank 수탁 번호 U56104
Figure 112013079886893-pct00369
서열 번호 188
형질 전환 구조물, 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_CwFatB1_nr-6S, Const.1으로 명명됨
Figure 112013079886893-pct00370
Figure 112013079886893-pct00371
Figure 112013079886893-pct00372
서열 번호 189
형질 전환 구조물, 6S-CrbTub_suc2_nr::CrbTub_CwFatB2_nr-6S, Const.2로 명명됨
Figure 112013079886893-pct00373
서열 번호 190
형질 전환 구조물 6S-CrbTub_suc2_nr::Amt3_CwFatB1_nr-6S (Const.3으로 명명됨) 및 6S-CrbTub_suc2_nr::Amt3_CwFatB2_nr-6S (Const.4로 명명됨)
Figure 112013079886893-pct00374
서열 번호 191
TP1 (UTEX 250 스테아로일 ACP 불포화 효소 운반 펩티드 서열)
Figure 112013079886893-pct00375
서열 번호 192
TP2 (UTEX 1435 스테아로일 ACP 불포화 효소 운반 펩티드 서열)
Figure 112013079886893-pct00376
서열 번호 193
TP3 (UTEX 1435 델타 12 지방산 불포화 효소 운반 펩티드 서열)
Figure 112013079886893-pct00377
서열 번호 194
TP4 (UTEX 1435 이소펜테닐 디포스페이트 합성 효소 운반 펩티드 서열)
Figure 112013079886893-pct00378
서열 번호 195
카르타머스 팅크토리우스 올레오일-아실 담체 단백질 티오에스테라제; GenBank 수탁 번호 AAA33019.1
Figure 112013079886893-pct00379
서열 번호 196
리시누스 커뮤니스 스테아로일-아실 담체 단백질 불포화 효소, GenBank 수탁 번호 AACG59946.1
Figure 112013079886893-pct00380
서열 번호 197
헬리안투스 아너스 스테아로일-ACP 불포화 효소, GenBank 수탁 번호 AAB65145.1
Figure 112013079886893-pct00381
Figure 112013079886893-pct00382
서열 번호 198
브라시카 준세아 색소체 델타-9-스테아로일-아실 담체 단백질 불포화 효소, GenBank 수탁 번호 AAD40245.1
Figure 112013079886893-pct00383
서열 번호 199
글리신 맥스 스테아로일-ACP 불포화 효소, GenBank 수탁 번호 ACJ39209.1
Figure 112013079886893-pct00384
서열 번호 200
올레아 유로파에아 스테아로일-ACP 불포화 효소, GenBank 수탁 번호 AAB67840.1
Figure 112013079886893-pct00385
서열 번호 201
베르니시아 포르디 스테아로일-아실-담체 단백질 불포화 효소, GenBank 수탁 번호 ADC32803.1
Figure 112013079886893-pct00386
서열 번호 202
헬리안투스 아너스 아실-ACP 티오에스테라제 FATA1, GenBank 수탁 번호 AAL79361.1
Figure 112013079886893-pct00387
서열 번호 203
브라시카 라파 FATA1, GenBank 수탁 번호 AAC49002.1
Figure 112013079886893-pct00388
서열 번호 204
자트로파 컬카스 아실-ACP 티오에스테라제, GenBank 수탁 번호 ABX82799.3
Figure 112013079886893-pct00389
서열 번호 205
제아 메이스 올레오일-아실 담체 단백질 티오에스테라제, GenBank 수탁 번호 ACG40089.1
Figure 112013079886893-pct00390
서열 번호 206
제아 메이스 올레오일-아실 담체 단백질 티오에스테라제, GenBank 수탁 번호 ACG42559.1
Figure 112013079886893-pct00391
Figure 112013079886893-pct00392
서열 번호 207
칼타머스 팅크토리우스 델타 12 지방산 CtFAD2-3, GenBank 수탁 번호 ADM48790.1
Figure 112013079886893-pct00393
서열 번호 208
고시피움 히르서텀 오메가-6 불포화 효소, GenBank 수탁 번호 CAA71199.1
Figure 112013079886893-pct00394
서열 번호 209
글리신 맥스 마이크로좀 불포화 효소 GmFAD2-2a, GenBank 수탁 번호 BAD89862.1
Figure 112013079886893-pct00395
서열 번호 210
제아 메이스 지방산 불포화 효소 FAD2, GenBank 수탁 번호 ABF50053.1
Figure 112013079886893-pct00396
서열 번호 211
프로토테카 모리포르미스 d12 불포화 효소 대립유전자 1 CHP - check with Riyaz
Figure 112013079886893-pct00397
서열 번호 212
프로토테카 모리포르미스 델타 12 불포화 효소 대립유전자 2
Figure 112013079886893-pct00398
서열 번호 213
브라시카 나파 리놀레산 불포화 효소 FAD3, GenBank 수탁 번호 AAA32994.1
Figure 112013079886893-pct00399
서열 번호 214
카멜리나 사티바 오메가-3 FAD7-2
Figure 112013079886893-pct00400
서열 번호 215
카멜리나 사티바 오메가-3 FAD7-1
Figure 112013079886893-pct00401
Figure 112013079886893-pct00402
서열 번호 216
글리신 맥스 엽록체 오메가 3 지방산 불포화 효소 아이소형 2, GenBank 수탁 번호 ACF19424.1
Figure 112013079886893-pct00403
서열 번호 217
베르니시아 포르디 오메가-3 지방산 불포화 효소, GenBank 수탁 번호 AAF12821.1
Figure 112013079886893-pct00404
서열 번호 218
리시누스 커뮤니스 오메가-3 지방산 불포화 효소, 소포체, 추정, GenBank 수탁 번호 EEF36775.1
Figure 112013079886893-pct00405
서열 번호 219
리넘 유시타티시멈 지방산 불포화 효소 3C, GenBank 수탁 번호 ADV92272.1
Figure 112013079886893-pct00406
서열 번호 220
프로토테카 모리포르미스 FAD-A 리놀리에이트 불포화 효소
Figure 112013079886893-pct00407
서열 번호 221
프로토테카 모리포르미스 FAD-D 오메가 3 불포화 효소
Figure 112013079886893-pct00408
서열 번호 222
Bn FAD3-3xFLAG에 대한 pSZ2124 형질 전환 서열의 부분, 피. 모리포르미스에서의 발현을 위해 코돈-최적화됨
Figure 112013079886893-pct00409
Figure 112013079886893-pct00410
Figure 112013079886893-pct00411
서열 번호 223
pSZ2125의 부분, 피. 모리포르미스에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 카멜리나 사티바 FAD-7-3XFLAG의 코딩 서열
Figure 112013079886893-pct00412
서열 번호 224
pSZ2126의 부분, 피. 모리포르미스에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 리넘 유시타티시멈 FAD3A-3XFLAG의 코딩 서열
Figure 112013079886893-pct00413
Figure 112013079886893-pct00414
서열 번호 225
pSZ2127의 부분, 피. 모리포르미스에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 리넘 유시타티시멈 FAD3B-3XFLAG의 코딩 서열
Figure 112013079886893-pct00415
서열 번호 226
pSZ2139의 부분, 프로토테카 모리포르미스 SAD2-헤어핀 A
Figure 112013079886893-pct00416
Figure 112013079886893-pct00417
서열 번호 227
pSZ2140의 부분, 프로토테카 모리포르미스 SAD2-헤어핀 B
Figure 112013079886893-pct00418
Figure 112013079886893-pct00419
서열 번호 228
pSZ2141의 부분, 프로토테카 모리포르미스 SAD2-헤어핀 C
Figure 112013079886893-pct00420
서열 번호 229
pSZ2142의 부분, 프로토테카 모리포르미스 SAD2-헤어핀 D
Figure 112013079886893-pct00421
서열 번호 230
코돈-최적화 글리신 맥스 KASII을 포함하는 pSZ1747의 부분
Figure 112013079886893-pct00422
Figure 112013079886893-pct00423
서열 번호 231
코돈-최적화 헬리안터스 아너스 KASII을 포함하는 pSZ1750의 관련 부분
Figure 112013079886893-pct00424
서열 번호 232
코돈-최적화 리시누스 커뮤니스 KASII을 포함하는 pSZ1754의 부분
Figure 112013079886893-pct00425
서열 번호 233
코돈-최적화 프로토테카 모리포르미스 KASII을 포함하는 pSZ2041 형질 전환 벡터의 관련 부분
Figure 112013079886893-pct00426
Figure 112013079886893-pct00427
Figure 112013079886893-pct00428
Figure 112013079886893-pct00429
서열 번호 234
Figure 112013079886893-pct00430
Figure 112013079886893-pct00431
서열 번호 235
Figure 112013079886893-pct00432
서열 번호 236
Figure 112013079886893-pct00433
서열 번호 237
형질 전환 구조물 pSZ2014의 관련 서열
Figure 112013079886893-pct00434
Figure 112013079886893-pct00435
서열 번호 238
Figure 112013079886893-pct00436
서열 번호 239
Figure 112013079886893-pct00437
서열 번호 240
pSZ2110, KASII'5::CrbTub:NeoR:nr::KASII-3'의 관련 서열
Figure 112013079886893-pct00438
Figure 112013079886893-pct00439
서열 번호 241
CtFad2-2의 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pSZ2150의 부분
Figure 112013079886893-pct00440
Figure 112013079886893-pct00441
서열 번호 242
GlmFad2-2의 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pSZ2151의 부분
Figure 112013079886893-pct00442
서열 번호 243
HaFad2의 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pSZ2152의 부분
Figure 112013079886893-pct00443
서열 번호 244
ZmFad2의 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pSZ2153의 부분
Figure 112013079886893-pct00444
Figure 112013079886893-pct00445
서열 번호 245
플라스미드 pSZ2172에 함유된 형질 전환 DNA의 뉴클레오티드 서열
Figure 112013079886893-pct00446
Figure 112013079886893-pct00447
서열 번호 246
pSZ1499
Figure 112013079886893-pct00448
Figure 112013079886893-pct00449
Figure 112013079886893-pct00450
Figure 112013079886893-pct00451
서열 번호 247
Figure 112013079886893-pct00452
서열 번호 248
Figure 112013079886893-pct00453
서열 번호 249
pSZ2004
Figure 112013079886893-pct00454
Figure 112013079886893-pct00455
Figure 112013079886893-pct00456
Figure 112013079886893-pct00457
서열 번호 250
pSZ1500
Figure 112013079886893-pct00458
Figure 112013079886893-pct00459
Figure 112013079886893-pct00460
서열 번호 251
프로토테카 모리포르미스 FATA1 녹아웃 상동 재조합 표적화 구조물의 5' 공여체 DNA 서열
Figure 112013079886893-pct00461
서열 번호 252
프로토테카 모리포르미스 FATA1 녹아웃 상동 재조합 표적화 구조물의 3' 공여체 DNA 서열
Figure 112013079886893-pct00462
서열 번호 253
Figure 112013079886893-pct00463
Figure 112013079886893-pct00464
서열 번호 254
Figure 112013079886893-pct00465
Figure 112013079886893-pct00466
Figure 112013079886893-pct00467
서열 번호 255
RNAi 발현 카세트의 FATA 부분
Figure 112013079886893-pct00468
서열 번호 256
pSZ1283
Figure 112013079886893-pct00469
Figure 112013079886893-pct00470
Figure 112013079886893-pct00471
SEQUENCE LISTING <110> SOLAZYME, INC. <120> Tailored Oils Produced from Recombinant Oleaginous Microorganisms <130> 057518-415312 (068PCT) <140> PCT/US12/023696 <141> 2012-02-02 <150> US 61/438,969 <151> 2011-02-02 <150> US 61/476,691 <151> 2011-04-18 <150> US 61/484,458 <151> 2011-05-10 <150> US 61/548,616 <151> 2011-10-18 <160> 256 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1187 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chlorella species <400> 1 gatcagacgg gcctgacctg cgagataatc aagtgctcgt aggcaaccaa ctcagcagct 60 gcttggtgtt gggtctgcag gatagtgttg cagggcccca aggacagcag gggaacttac 120 accttgtccc cgacccagtt ttatggagtg cattgcctca agagcctagc cggagcgcta 180 ggctacatac ttgccgcacc ggtatgaggg gatatagtac tcgcactgcg ctgtctagtg 240 agatgggcag tgctgcccat aaacaactgg ctgctcagcc atttgttggc ggaccattct 300 gggggggcca gcaatgcctg actttcgggt agggtgaaaa ctgaacaaag actaccaaaa 360 cagaatttct tcctccttgg aggtaagcgc aggccggccc gcctgcgccc acatggcgct 420 ccgaacacct ccatagctgt aagggcgcaa acatggccgg actgttgtca gcactctttc 480 atggccatac aaggtcatgt cgagattagt gctgagtaag acactatcac cccatgttcg 540 attgaagccg tgacttcatg ccaacctgcc cctgggcgta gcagacgtat gccatcatga 600 ccactagccg acatgcgctg tcttttgcca ccaaaacaac tggtacaccg ctcgaagtcg 660 tgccgcacac ctccgggagt gagtccggcg actcctcccc ggcgggccgc ggccctacct 720 gggtagggtc gccatacgcc cacgaccaaa cgacgcagga ggggattggg gtagggaatc 780 ccaaccagcc taaccaagac ggcacctata ataataggtg gggggactaa cagccctata 840 tcgcaagctt tgggtgccta tcttgagaag cacgagttgg agtggctgtg tacggtcgac 900 cctaaggtgg gtgtgccgca gcctgaaaca aagcgtctag cagctgcttc tataatgtgt 960 cagccgttgt gtttcagtta tattgtatgc tattgtttgt tcgtgctagg gtggcgcagg 1020 cccacctact gtggcgggcc attggttggt gcttgaattg cctcaccatc taaggtctga 1080 acgctcactc aaacgccttt gtacaactgc agaactttcc ttggcgctgc aactacagtg 1140 tgcaaaccag cacatagcac tcccttacat cacccagcag tacaaca 1187 <210> 2 <211> 1414 <212> DNA <213> Chlorella ellipsoidea <400> 2 cgctgcgcac cagggccgcc agctcgctga tgtcgctcca aatgcggtcc cccgattttt 60 tgttcttcat cttctccacc ttggtggcct 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gcttggattt gatgtagtgc 960 ccaaccggac tgaatgtgcg atggcaggtc cctttgagtc tcccgaatta ctagcagggc 1020 actgtgacct aacgcagcat gccaaccgca aaaaaatgat tgacagaaaa tgaagcggtg 1080 tgtcaatatt tgctgtattt attcgtttta atcagcaacc aagttcgaaa cgcaactatc 1140 gtggtgatca agtgaacctc atcagactta cctcgttcgg caaggaaacg gaggcaccaa 1200 attccaattt gatattatcg cttgccaagc tagagctgat ctttgggaaa ccaactgcca 1260 gacagtggac tgtgatggag tgccccgagt ggtggagcct cttcgattcg gttagtcatt 1320 actaacgtga accctcagtg aagggaccat cagaccagaa agaccagatc tcctcctcga 1380 caccgagaga gtgttgcggc agtaggacga caag 1414 <210> 3 <211> 512 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Yeast sequence <400> 3 Met Thr Asn Glu Thr Ser Asp Arg Pro Leu Val His Phe Thr Pro Asn 1 5 10 15 Lys Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Trp Tyr Asp Glu Lys Asp 20 25 30 Ala Lys Trp His Leu Tyr Phe Gln Tyr Asn Pro Asn Asp Thr Val Trp 35 40 45 Gly Thr Pro Leu Phe Trp Gly His Ala Thr Ser Asp Asp Leu Thr Asn 50 55 60 Trp Glu Asp Gln Pro Ile Ala Ile Ala Pro Lys Arg Asn Asp Ser Gly 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gggacgccat 1020 tgttttgggg ccacgccacg tccgacgacc tgaccaattg ggaggaccaa ccaatagcta 1080 tcgctccgaa gaggaacgac tccggagcat tctcgggttc catggtggtt gactacaaca 1140 atacttccgg ctttttcaac gataccattg acccgagaca acgctgcgtg gccatatgga 1200 cttacaacac accggagtcc gaggagcagt acatctcgta tagcctggac ggtggataca 1260 cttttacaga gtatcagaag aaccctgtgc ttgctgcaaa ttcgactcag ttccgagatc 1320 cgaaggtctt ttggtacgag ccctcgcaga agtggatcat gacagcggca aagtcacagg 1380 actacaagat cgaaatttac tcgtctgacg accttaaatc ctggaagctc gaatccgcgt 1440 tcgcaaacga gggctttctc ggctaccaat acgaatgccc aggcctgata gaggtcccaa 1500 cagagcaaga tcccagcaag tcctactggg tgatgtttat ttccattaat ccaggagcac 1560 cggcaggagg ttcttttaat cagtacttcg tcggaagctt taacggaact catttcgagg 1620 catttgataa ccaatcaaga gtagttgatt ttggaaagga ctactatgcc ctgcagactt 1680 tcttcaatac tgacccgacc tatgggagcg ctcttggcat tgcgtgggct tctaactggg 1740 agtattccgc attcgttcct acaaaccctt ggaggtcctc catgtcgctc gtgaggaaat 1800 tctctctcaa cactgagtac caggccaacc cggaaaccga actcataaac ctgaaagccg 1860 aaccgatcct gaacattagc aacgctggcc cctggagccg gtttgcaacc aacaccacgt 1920 tgacgaaagc caacagctac aacgtcgatc tttcgaatag caccggtaca cttgaatttg 1980 aactggtgta tgccgtcaat accacccaaa cgatctcgaa gtcggtgttc gcggacctct 2040 ccctctggtt taaaggcctg gaagaccccg aggagtacct cagaatgggt ttcgaggttt 2100 ctgcgtcctc cttcttcctt gatcgcggga acagcaaagt aaaatttgtt aaggagaacc 2160 catattttac caacaggatg agcgttaaca accaaccatt caagagcgaa aacgacctgt 2220 cgtactacaa agtgtatggt ttgcttgatc aaaatatcct ggaactctac ttcaacgatg 2280 gtgatgtcgt gtccaccaac acatacttca tgacaaccgg gaacgcactg ggctccgtga 2340 acatgacgac gggtgtggat aacctgttct acatcgacaa attccaggtg agggaagtca 2400 agtgagatct gtcgatcgac aagctcgagt ttctccataa taatgtgtga gtagttccca 2460 gataagggaa ttagggttcc tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct 2520 tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca 2580 aaatccagta ctaaaatcca gatcccccga attaa 2615 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 9 tgttgaagaa tgagccggcg ac 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aaagtcattt attttagacc cgaacctgag tgatctaacc atggtcagga tgaaacttgg 180 gtgacaccaa gtggaagtcc gaaccgaccg atgttgaaaa atcggcggat gaactgtggt 240 tagtggtgaa ataccagtcg aactcagagc tagctggttc tccccgaaat gcgttgaggc 300 gcagcaatat atctcgtcta tctaggggta aagcactgtt tcggtgcggg ctatgaaaat 360 ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact agaaatgacg atatattagt gagactatgg 420 gggataagct ccatagtcga gagggaaaca gcccagacca ccagttaagg ccccaaaatg 480 ataatgaagt ggtaaaggag gtgaaaatgc aaatacaacc aggaggttgg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 13 <211> 541 <212> DNA <213> Prototheca stagnora <400> 13 tgttgaagaa tgagccggcg agttaaaaaa aatggcatgg ttaaagatat ttctctgaag 60 ccatagcgaa agcaagtttt acaagctata gtcatttttt ttagacccga aaccgagtga 120 tctacccatg atcagggtga agtgttggtc aaataacatg gaggcccgaa ccgactaatg 180 gtgaaaaatt agcggatgaa ttgtgggtag gggcgaaaaa ccaatcgaac tcggagttag 240 ctggttctcc ccgaaatgcg tttaggcgca gcagtagcaa cacaaataga ggggtaaagc 300 actgtttctt ttgtgggctt cgaaagttgt acctcaaagt ggcaaactct gaatactcta 360 tttagatatc tactagtgag accttggggg ataagctcct tggtcaaaag ggaaacagcc 420 cagatcacca gttaaggccc caaaatgaaa atgatagtga ctaaggacgt gagtatgtca 480 aaacctccag caggttagct tagaagcagc aatcctttca agagtgcgta atagctcact 540 g 541 <210> 14 <211> 541 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 14 tgttgaagaa tgagccggcg agttaaaaag agtggcatgg ttaaagataa ttctctggag 60 ccatagcgaa agcaagttta acaagctaaa gtcacccttt ttagacccga aaccgagtga 120 tctacccatg atcagggtga agtgttggta aaataacatg gaggcccgaa ccgactaatg 180 gtgaaaaatt agcggatgaa ttgtgggtag gggcgaaaaa ccaatcgaac tcggagttag 240 ctggttctcc ccgaaatgcg tttaggcgca gcagtagcaa cacaaataga ggggtaaagc 300 actgtttctt ttgtgggctt cgaaagttgt acctcaaagt ggcaaactct gaatactcta 360 tttagatatc tactagtgag accttggggg ataagctcct tggtcaaaag ggaaacagcc 420 cagatcacca gttaaggccc caaaatgaaa atgatagtga ctaaggatgt gggtatgtta 480 aaacctccag caggttagct tagaagcagc aatcctttca agagtgcgta atagctcact 540 g 541 <210> 15 <211> 573 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 15 tgttgaagaa tgagccggcg acttaaaata aatggcaggc taagagaatt aataactcga 60 aacctaagcg aaagcaagtc ttaatagggc gctaatttaa caaaacatta aataaaatct 120 aaagtcattt attttagacc cgaacctgag tgatctaacc atggtcagga tgaaacttgg 180 gtgacaccaa gtggaagtcc gaaccgaccg atgttgaaaa atcggcggat gaactgtggt 240 tagtggtgaa ataccagtcg aactcagagc tagctggttc tccccgaaat gcgttgaggc 300 gcagcaatat atctcgtcta tctaggggta aagcactgtt tcggtgcggg ctatgaaaat 360 ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact agaaatgacg atatattagt gagactatgg 420 gggataagct ccatagtcga gagggaaaca gcccagacca ccagttaagg ccccaaaatg 480 ataatgaagt ggtaaaggag gtgaaaatgc aaatacaacc aggaggttgg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 16 <211> 573 <212> DNA <213> Prototheca wickerhamii <400> 16 tgttgaagaa tgagccgtcg acttaaaata aatggcaggc taagagaatt aataactcga 60 aacctaagcg aaagcaagtc ttaatagggc gctaatttaa caaaacatta aataaaatct 120 aaagtcattt attttagacc cgaacctgag tgatctaacc atggtcagga tgaaacttgg 180 gtgacaccaa gtggaagtcc gaaccgaccg atgttgaaaa atcggcggat gaactgtggt 240 tagtggtgaa ataccagtcg aactcagagc tagctggttc tccccgaaat gcgttgaggc 300 gcagcaatat atctcgtcta tctaggggta aagcactgtt tcggtgcggg ctatgaaaat 360 ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact agaaatgacg atatattagt gagactatgg 420 gggataagct ccatagtcga gagggaaaca gcccagacca ccagttaagg ccccaaaatg 480 ataatgaagt ggtaaaggag gtgaaaatgc aaatacaacc aggaggttgg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 17 <211> 541 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 17 tgttgaagaa tgagccggcg agttaaaaag agtggcgtgg ttaaagaaaa ttctctggaa 60 ccatagcgaa agcaagttta acaagcttaa gtcacttttt ttagacccga aaccgagtga 120 tctacccatg atcagggtga agtgttggta aaataacatg gaggcccgaa ccgactaatg 180 gtgaaaaatt agcggatgaa ttgtgggtag gggcgaaaaa ccaatcgaac tcggagttag 240 ctggttctcc ccgaaatgcg tttaggcgca gcagtagcaa cacaaataga ggggtaaagc 300 actgtttctt ttgtgggctc cgaaagttgt acctcaaagt ggcaaactct gaatactcta 360 tttagatatc tactagtgag accttggggg ataagctcct tggtcgaaag ggaaacagcc 420 cagatcacca gttaaggccc caaaatgaaa atgatagtga ctaaggatgt gagtatgtca 480 aaacctccag caggttagct tagaagcagc aatcctttca agagtgcgta atagctcact 540 g 541 <210> 18 <211> 541 <212> DNA <213> Prototheca zopfii <400> 18 tgttgaagaa tgagccggcg agttaaaaag agtggcatgg ttaaagaaaa ttctctggag 60 ccatagcgaa agcaagttta acaagcttaa gtcacttttt ttagacccga aaccgagtga 120 tctacccatg atcagggtga agtgttggta aaataacatg gaggcccgaa ccgactaatg 180 gtgaaaaatt agcggatgaa ttgtgggtag gggcgaaaaa ccaatcgaac tcggagttag 240 ctggttctcc ccgaaatgcg tttaggcgca gcagtagcaa cacaaataga ggggtaaagc 300 actgtttctt tcgtgggctt cgaaagttgt acctcaaagt ggcaaactct gaatactcta 360 tttagatatc tactagtgag accttggggg ataagctcct tggtcaaaag ggaaacagcc 420 cagatcacca gttaaggccc caaaatgaaa atgatagtga ctaaggatgt gagtatgtca 480 aaacctccag caggttagct tagaagcagc aatcctttca agagtgcgta atagctcact 540 g 541 <210> 19 <211> 565 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 19 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa ggtggcatgg ttaaggaaat attccgaagc 60 cgtagcaaaa gcgagtctga atagggcgat aaaatatatt aatatttaga atctagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaagctt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaga acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cgatgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaatacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565 <210> 20 <211> 550 <212> PRT <213> Chicorium intybus <400> 20 Met Ser Asn Ser Ser Asn Ala Ser Glu Ser Leu Phe Pro Ala Thr Ser 1 5 10 15 Glu Gln Pro Tyr Arg Thr Ala Phe His Phe Gln Pro Pro Gln Asn Trp 20 25 30 Met Asn Asp Pro Asn Gly Pro Met Cys Tyr Asn Gly Val Tyr His Leu 35 40 45 Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Phe Gly Pro Leu Trp Asn Leu Arg Met Tyr 50 55 60 Trp Ala His Ser Val Ser His Asp Leu Ile Asn Trp Ile His Leu Asp 65 70 75 80 Leu Ala Phe Ala Pro Thr Glu Pro 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cerevisae <400> 28 Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ile Ser Ala Ser Met Thr Asn Glu Thr Ser Asp Arg Pro Leu Val His 20 25 30 Phe Thr Pro Asn Lys Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Trp Tyr 35 40 45 Asp Glu Lys Asp Ala Lys Trp His Leu Tyr Phe Gln Tyr Asn Pro Asn 50 55 60 Asp Thr Val Trp Gly Thr Pro Leu Phe Trp Gly His Ala Thr Ser Asp 65 70 75 80 Asp Leu Thr Asn Trp Glu Asp Gln Pro Ile Ala Ile Ala Pro Lys Arg 85 90 95 Asn Asp Ser Gly Ala Phe Ser Gly Ser Met Val Val Asp Tyr Asn Asn 100 105 110 Thr Ser Gly Phe Phe Asn Asp Thr Ile Asp Pro Arg Gln Arg Cys Val 115 120 125 Ala Ile Trp Thr Tyr Asn Thr Pro Glu Ser Glu Glu Gln Tyr Ile Ser 130 135 140 Tyr Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Gln Lys Asn Pro 145 150 155 160 Val Leu Ala Ala Asn Ser Thr Gln Phe Arg Asp Pro Lys Val Phe Trp 165 170 175 Tyr Glu Pro Ser Gln Lys Trp Ile Met Thr Ala Ala Lys Ser Gln Asp 180 185 190 Tyr Lys Ile Glu Ile Tyr Ser Ser Asp Asp Leu Lys Ser Trp Lys Leu 195 200 205 Glu 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cgtcgctcgg cgggctccgg gccccggcgc ccagcgaggc 2160 ccctccccgt gcgcgggcgc gcccccgact ggtccatgct gttcgccgtg atcaccacca 2220 tcttctccgc cgccgagaag cagtggacca acctggagtg gaagcccaag cccaaccccc 2280 cccagctgct ggacgaccac ttcggccccc acggcctggt gttccgccgc accttcgcca 2340 tccgcagcta cgaggtgggc cccgaccgct ccaccagcat cgtggccgtg atgaaccacc 2400 tgcaggaggc cgccctgaac cacgccaagt ccgtgggcat cctgggcgac ggcttcggca 2460 ccaccctgga gatgtccaag cgcgacctga tctgggtggt gaagcgcacc cacgtggccg 2520 tggagcgcta ccccgcctgg ggcgacaccg tggaggtgga gtgctgggtg ggcgcctccg 2580 gcaacaacgg ccgccgccac gacttcctgg tgcgcgactg caagaccggc gagatcctga 2640 cccgctgcac ctccctgagc gtgatgatga acacccgcac ccgccgcctg agcaagatcc 2700 ccgaggaggt gcgcggcgag atcggccccg ccttcatcga caacgtggcc gtgaaggacg 2760 aggagatcaa gaagccccag aagctgaacg actccaccgc cgactacatc cagggcggcc 2820 tgaccccccg ctggaacgac ctggacatca accagcacgt gaacaacatc aagtacgtgg 2880 actggatcct ggagaccgtg cccgacagca tcttcgagag ccaccacatc tcctccttca 2940 ccatcgagta ccgccgcgag 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<211> 1182 <212> DNA <213> Cuphea hookeriana <400> 94 actagtatgg ctatcaagac gaacaggcag cctgtggaga agcctccgtt cacgatcggg 60 acgctgcgca aggccatccc cgcgcactgt ttcgagcgct cggcgcttcg tgggcgcgcc 120 cagctgcccg actggagccg cctgctgacc gccatcacca ccgtgttcgt gaagtccaag 180 cgccccgaca tgcacgaccg caagtccaag cgccccgaca tgctggtgga cagcttcggc 240 ctggagtcca ccgtgcagga cggcctggtg ttccgccagt ccttctccat ccgctcctac 300 gagatcggca ccgaccgcac cgccagcatc gagaccctga tgaaccacct gcaggagacc 360 tccctgaacc actgcaagag caccggcatc ctgctggacg gcttcggccg caccctggag 420 atgtgcaagc gcgacctgat ctgggtggtg attaagatgc agatcaaggt gaaccgctac 480 cccgcctggg gcgacaccgt ggagatcaac acccgcttca gccgcctggg caagatcggc 540 atgggccgcg actggctgat ctccgactgc aacaccggcg agatcctggt gcgcgccacc 600 agcgcctacg ccatgatgaa ccagaagacc cgccgcctgt ccaagctgcc ctacgaggtg 660 caccaggaga tcgtgcccct gttcgtggac agccccgtga tcgaggactc cgacctgaag 720 gtgcacaagt tcaaggtgaa gaccggcgac agcatccaga agggcctgac ccccggctgg 780 aacgacctgg acgtgaacca gcacgtgtcc aacgtgaagt acatcggctg gatcctggag 840 agcatgccca ccgaggtgct ggagacccag gagctgtgct ccctggccct ggagtaccgc 900 cgcgagtgcg gccgcgactc cgtgctggag agcgtgaccg ccatggaccc cagcaaggtg 960 ggcgtgcgct cccagtacca gcacctgctg cgcctggagg acggcaccgc catcgtgaac 1020 ggcgccaccg agtggcgccc caagaacgcc ggcgccaacg gcgccatctc caccggcaag 1080 accagcaacg gcaactccgt gtccatggac tacaaggacc acgacggcga ctacaaggac 1140 cacgacatcg actacaagga cgacgacgac aagtgactcg ag 1182 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Umbellularia californica <400> 95 ctgggcgacg gcttcggcac 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Umbellularia californica <400> 96 aagtcgcggc gcatgccgtt 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Ulmus americana <400> 97 cccagctgct cacctgcacc 20 <210> 98 <211> 26 <212> DNA <213> Ulmus americana <400> 98 cacccaaggc caacggcagc gccgtg 26 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Cuphea hookeriana <400> 99 taccccgcct ggggcgacac 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Cuphea hookeriana <400> 100 agcttggaca ggcggcgggt 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 101 tcacttcatg ccggcggtcc 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 102 gcgctcctgc ttggctcgaa 20 <210> 103 <211> 733 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 103 gctcttcgag acgtggtctg aatcctccag gcgggtttcc ccgagaaaga aagggtgccg 60 atttcaaagc agagccatgt gccgggccct gtggcctgtg ttggcgccta tgtagtcacc 120 ccccctcacc caattgtcgc cagtttgcgc aatccataaa ctcaaaactg cagcttctga 180 gctgcgctgt tcaagaacac ctctggggtt tgctcacccg cgaggtcgac gcccagcatg 240 gctatcaaga cgaacaggca gcctgtggag aagcctccgt tcacgatcgg gacgctgcgc 300 aaggccatcc ccgcgcactg tttcgagcgc tcggcgcttc gtagcagcat gtacctggcc 360 tttgacatcg cggtcatgtc cctgctctac gtcgcgtcga cgtacatcga ccctgcgccg 420 gtgcctacgt gggtcaagta tggcgtcatg tggccgctct actggttctt ccaggtgtgt 480 gtgagggttg tggttgcccg tatcgaggtc ctggtggcgc gcatggggga gaaggcgcct 540 gtcccgctga cccccccggc taccctcccg gcaccttcca gggcgccttc ggcacgggtg 600 tctgggtgtg cgcgcacgag tgcggccacc aggccttttc ctccagccag gccatcaacg 660 acggcgtggg cctggtgttc cacagcctgc tgctggtgcc ctactactcc tggaagcact 720 cgcaccgggt acc 733 <210> 104 <211> 739 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 104 ccgccaccac tccaacacgg ggtgcctgga caaggacgag gtgtttgtgc cgccgcaccg 60 cgcagtggcg cacgagggcc tggagtggga ggagtggctg cccatccgca tgggcaaggt 120 gctggtcacc ctgaccctgg gctggccgct gtacctcatg ttcaacgtcg cctcgcggcc 180 gtacccgcgc ttcgccaacc actttgaccc gtggtcgccc atcttcagca agcgcgagcg 240 catcgaggtg gtcatctccg acctggcgct ggtggcggtg ctcagcgggc tcagcgtgct 300 gggccgcacc atgggctggg cctggctggt caagacctac gtggtgccct acctgatcgt 360 gaacatgtgg ctcgtgctca tcacgctgct ccagcacacg cacccggcgc tgccgcacta 420 cttcgagaag gactgggact ggctgcgcgg cgccatggcc accgtggacc gctccatggg 480 cccgcccttc atggacaaca tcctgcacca catctccgac acccacgtgc tgcaccacct 540 cttcagcacc atcccgcact accacgccga ggaggcctcc gccgccatca ggcccatcct 600 gggcaagtac taccagtccg acagccgctg ggtcggccgc gccctgtggg aggactggcg 660 cgactgccgc tacgtcgtcc cggacgcgcc cgaggacgac tccgcgctct ggttccacaa 720 gtgagtgagt gagaagagc 739 <210> 105 <211> 2327 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 105 ctttcttgcg ctatgacact tccagcaaaa ggtagggcgg gctgcgagac ggcttcccgg 60 cgctgcatgc aacaccgatg atgcttcgac cccccgaagc tccttcgggg ctgcatgggc 120 gctccgatgc cgctccaggg cgagcgctgt ttaaatagcc aggcccccga ttgcaaagac 180 attatagcga gctaccaaag ccatattcaa acacctagat cactaccact tctacacagg 240 ccactcgagc ttgtgatcgc actccgctaa gggggcgcct cttcctcttc gtttcagtca 300 caacccgcaa acggcgcgcc atgctgctgc aggccttcct gttcctgctg gccggcttcg 360 ccgccaagat cagcgcctcc atgacgaacg agacgtccga ccgccccctg gtgcacttca 420 cccccaacaa gggctggatg aacgacccca acggcctgtg gtacgacgag aaggacgcca 480 agtggcacct gtacttccag tacaacccga acgacaccgt ctgggggacg cccttgttct 540 ggggccacgc cacgtccgac gacctgacca actgggagga ccagcccatc gccatcgccc 600 cgaagcgcaa cgactccggc gccttctccg gctccatggt ggtggactac aacaacacct 660 ccggcttctt caacgacacc atcgacccgc gccagcgctg cgtggccatc tggacctaca 720 acaccccgga gtccgaggag cagtacatct cctacagcct ggacggcggc tacaccttca 780 ccgagtacca gaagaacccc gtgctggccg ccaactccac ccagttccgc gacccgaagg 840 tcttctggta cgagccctcc cagaagtgga tcatgaccgc ggccaagtcc caggactaca 900 agatcgagat ctactcctcc gacgacctga agtcctggaa gctggagtcc gcgttcgcca 960 acgagggctt cctcggctac cagtacgagt gccccggcct gatcgaggtc cccaccgagc 1020 aggaccccag caagtcctac tgggtgatgt tcatctccat caaccccggc gccccggccg 1080 gcggctcctt caaccagtac ttcgtcggca gcttcaacgg cacccacttc gaggccttcg 1140 acaaccagtc ccgcgtggtg gacttcggca aggactacta cgccctgcag accttcttca 1200 acaccgaccc gacctacggg agcgccctgg gcatcgcgtg ggcctccaac tgggagtact 1260 ccgccttcgt gcccaccaac ccctggcgct cctccatgtc cctcgtgcgc aagttctccc 1320 tcaacaccga gtaccaggcc aacccggaga cggagctgat caacctgaag gccgagccga 1380 tcctgaacat cagcaacgcc ggcccctgga gccggttcgc caccaacacc acgttgacga 1440 aggccaacag ctacaacgtc gacctgtcca acagcaccgg caccctggag ttcgagctgg 1500 tgtacgccgt caacaccacc cagacgatct ccaagtccgt gttcgcggac ctctccctct 1560 ggttcaaggg cctggaggac cccgaggagt acctccgcat gggcttcgag gtgtccgcgt 1620 cctccttctt cctggaccgc gggaacagca aggtgaagtt cgtgaaggag aacccctact 1680 tcaccaaccg catgagcgtg aacaaccagc ccttcaagag cgagaacgac ctgtcctact 1740 acaaggtgta cggcttgctg gaccagaaca tcctggagct gtacttcaac gacggcgacg 1800 tcgtgtccac caacacctac ttcatgacca ccgggaacgc cctgggctcc gtgaacatga 1860 cgacgggggt ggacaacctg ttctacatcg acaagttcca ggtgcgcgag gtcaagtgac 1920 aattggcagc agcagctcgg atagtatcga cacactctgg acgctggtcg tgtgatggac 1980 tgttgccgcc acacttgctg ccttgacctg tgaatatccc tgccgctttt atcaaacagc 2040 ctcagtgtgt ttgatcttgt gtgtacgcgc ttttgcgagt tgctagctgc ttgtgctatt 2100 tgcgaatacc acccccagca tccccttccc tcgtttcata tcgcttgcat cccaaccgca 2160 acttatctac gctgtcctgc tatccctcag cgctgctcct gctcctgctc actgcccctc 2220 gcacagcctt ggtttgggct ccgcctgtat tctcctggta ctgcaacctg taaaccagca 2280 ctgcaatgct gatgcacggg aagtagtggg atgggaacac aaatgga 2327 <210> 106 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 106 gctcttcgag gggctggtct gaatccttca ggcgggtgtt acccgagaaa gaaagggtgc 60 cgatttcaaa gcagacccat gtgccgggcc ctgtggcctg tgttggcgcc tatgtagtca 120 ccccccctca cccaattgtc gccagtttgc gcactccata aactcaaaac agcagcttct 180 gagctgcgct gttcaagaac acctctgggg tttgctcacc cgcgaggtcg acgcccagca 240 tggctatcaa gacgaacagg cagcctgtgg agaagcctcc gttcacgatc gggacgctgc 300 gcaaggccat ccccgcgcac tgtttcgagc gctcggcgct tcgtagcagc atgtacctgg 360 cctttgacat cgcggtcatg tccctgctct acgtcgcgtc gacgtacatc gaccctgcac 420 cggtgcctac gtgggtcaag tacggcatca tgtggccgct ctactggttc ttccaggtgt 480 gtttgagggt tttggttgcc cgtattgagg tcctggtggc gcgcatggag gagaaggcgc 540 ctgtcccgct gacccccccg gctaccctcc cggcaccttc cagggcgcct tcggcacggg 600 tgtctgggtg tgcgcgcacg agtgcggcca ccaggccttt tcctccagcc aggccatcaa 660 cgacggcgtg ggcctggtgt tccacagcct gctgctggtg ccctactact cctggaagca 720 ctcgcaccgg gtacc 735 <210> 107 <211> 739 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 107 ccgccaccac tccaacacgg ggtgcctgga caaggacgag gtgtttgtgc cgccgcaccg 60 cgcagtggcg cacgagggcc tggagtggga ggagtggctg cccatccgca tgggcaaggt 120 gctggtcacc ctgaccctgg gctggccgct gtacctcatg ttcaacgtcg cctcgcggcc 180 gtacccgcgc ttcgccaacc actttgaccc gtggtcgccc atcttcagca agcgcgagcg 240 catcgaggtg gtcatctccg acctggcgct ggtggcggtg ctcagcgggc tcagcgtgct 300 gggccgcacc atgggctggg cctggctggt caagacctac gtggtgccct acctgatcgt 360 gaacatgtgg ctcgtgctca tcacgctgct ccagcacacg cacccggcgc tgccgcacta 420 cttcgagaag gactgggact ggctgcgcgg cgccatggcc accgtggacc gctccatggg 480 cccgcccttc atggacaaca tcctgcacca catctccgac acccacgtgc tgcaccacct 540 cttcagcacc atcccgcact accacgccga ggaggcctcc gccgccatca ggcccatcct 600 gggcaagtac taccagtccg acagccgctg ggtcggccgc gccctgtggg aggactggcg 660 cgactgccgc tacgtcgtcc cggacgcgcc cgaggacgac tccgcgctct ggttccacaa 720 gtgagtgagt gagaagagc 739 <210> 108 <211> 471 <212> PRT <213> Saccharomyces carlbergensis <400> 108 Met Phe Ala Phe Tyr Phe Leu Thr Ala Cys Ile Ser Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 Phe Gly Val Ser Pro Ser Tyr Asn Gly Leu Gly Leu Thr Pro Gln Met 20 25 30 Gly Trp Asp Asn Trp Asn Thr Phe Ala Cys Asp Val Ser Glu Gln Leu 35 40 45 Leu Leu Asp Thr Ala Asp Arg Ile Ser Asp Leu Gly Leu Lys Asp Met 50 55 60 Gly Tyr Lys Tyr Ile Ile Leu Asp Asp Cys Trp Ser Ser Gly Arg Asp 65 70 75 80 Ser Asp Gly Phe Leu Val Ala Asp Glu Gln Lys Phe Pro Asn Gly Met 85 90 95 Gly His Val Ala Asp His Leu His Asn Asn Ser Phe Leu Phe Gly Met 100 105 110 Tyr Ser Ser Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Ala Gly Tyr Pro Gly Ser Leu 115 120 125 Gly Arg Glu Glu Glu Asp Ala Gln Phe Phe Ala Asn Asn Arg Val Asp 130 135 140 Tyr Leu Lys Tyr Asp Asn Cys Tyr Asn Lys Gly Gln Phe Gly Thr Pro 145 150 155 160 Glu Ile Ser Tyr His Arg Tyr Lys Ala Met Ser Asp Ala Leu Asn Lys 165 170 175 Thr Gly Arg Pro Ile Phe Tyr Ser Leu Cys Asn Trp Gly Gln Asp Leu 180 185 190 Thr Phe Tyr Trp Gly Ser Gly Ile Ala Asn Ser Trp Arg Met Ser Gly 195 200 205 Asp Val Thr Ala Glu Phe Thr Arg Pro Asp Ser Arg Cys Pro Cys Asp 210 215 220 Gly Asp Glu Tyr Asp 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Arg Leu Phe Gly Gln Lys Ile Gly Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Asn Ala Ile Leu Asn Thr Thr Val Pro Ala His Gly Ile Ala Phe 450 455 460 Tyr Arg Leu Arg Pro Ser Ser 465 470 <210> 109 <211> 18 <212> PRT <213> Saccharomyces carlbergensis <400> 109 Met Phe Ala Phe Tyr Phe Leu Thr Ala Cys Ile Ser Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 Phe Gly <210> 110 <211> 3183 <212> DNA <213> Saccharomyces carlbergensis <400> 110 gcggccgcgt ggacgagggc tacaaccccg cctacggcgc gcgcccgctg cgccgcgcca 60 tcatgcgcct gctggaggac gcgctggccg agcgcatgct cgccggcgac gtcaaggagg 120 gcgactcggt catcatggac gtcgatggcg atggcgccat cagcgtcctc aacggagacc 180 gcacccacac caccaccatc gactcctccc cggcgggcat ctcgtagacg cgagagggag 240 ggagggagga ttttcagagg gagatgagac gaggactggg ccgggggcct tggggcgctg 300 ctggagcgtg gtgagagcgc ggcggacgtg ccttttcttc ttccgtgcgc gcgctcttgg 360 ccattgatcc ccgattcgcg cccgcatccc cccactgccc ccatcatctt gcctgttgtc 420 gtggcactga cataaacccc ctgcgctgcg ctgctccgct actattgata taggtctcac 480 gcgccaatct tttttgctcc gggtaaccgt ctggacgcca 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agacgggccg 1380 ccccatcttc tactccctgt gcaactgggg ccaggacctg accttctact ggggctccgg 1440 catcgcgaac tcctggcgca tgtccggcga cgtcacggcg gagttcacgc gccccgactc 1500 ccgctgcccc tgcgacggcg acgagtacga ctgcaagtac gccggcttcc actgctccat 1560 catgaacatc ctgaacaagg ccgcccccat gggccagaac gcgggcgtcg gcggctggaa 1620 cgacctggac aacctggagg tcggcgtcgg caacctgacg gacgacgagg agaaggcgca 1680 cttctccatg tgggccatgg tgaagtcccc cctgatcatc ggcgcgaacg tgaacaacct 1740 gaaggcctcc tcctactcca tctactccca ggcgtccgtc atcgccatca accaggactc 1800 caacggcatc cccgccacgc gcgtctggcg ctactacgtg tccgacacgg acgagtacgg 1860 ccagggcgag atccagatgt ggtccggccc cctggacaac ggcgaccagg tcgtggcgct 1920 gctgaacggc ggctccgtgt cccgccccat gaacacgacc ctggaggaga tcttcttcga 1980 ctccaacctg ggctccaaga agctgacctc cacctgggac atctacgacc tgtgggcgaa 2040 ccgcgtcgac aactccacgg cgtccgccat cctgggccgc aacaagaccg ccaccggcat 2100 cctgtacaac gccaccgagc agtcctacaa ggacggcctg tccaagaacg acacccgcct 2160 gttcggccag aagatcggct ccctgtcccc caacgcgatc ctgaacacga 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cgactcccgc 660 tgcccctgcg acggcgacga gtacgactgc aagtacgccg gcttccactg ctccatcatg 720 aacatcctga acaaggccgc ccccatgggc cagaacgcgg gcgtcggcgg ctggaacgac 780 ctggacaacc tggaggtcgg cgtcggcaac ctgacggacg acgaggagaa ggcgcacttc 840 tccatgtggg ccatggtgaa gtcccccctg atcatcggcg cgaacgtgaa caacctgaag 900 gcctcctcct actccatcta ctcccaggcg tccgtcatcg ccatcaacca ggactccaac 960 ggcatccccg ccacgcgcgt ctggcgctac tacgtgtccg acacggacga gtacggccag 1020 ggcgagatcc agatgtggtc cggccccctg gacaacggcg accaggtcgt ggcgctgctg 1080 aacggcggct ccgtgtcccg ccccatgaac acgaccctgg aggagatctt cttcgactcc 1140 aacctgggct ccaagaagct gacctccacc tgggacatct acgacctgtg ggcgaaccgc 1200 gtcgacaact ccacggcgtc cgccatcctg ggccgcaaca agaccgccac cggcatcctg 1260 tacaacgcca ccgagcagtc ctacaaggac ggcctgtcca agaacgacac ccgcctgttc 1320 ggccagaaga tcggctccct gtcccccaac gcgatcctga acacgaccgt ccccgcccac 1380 ggcatcgcgt tctaccgcct gcgcccctcc tcctga 1416 <210> 112 <211> 526 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 112 gcggccgcgt ggacgagggc tacaaccccg cctacggcgc gcgcccgctg cgccgcgcca 60 tcatgcgcct gctggaggac gcgctggccg agcgcatgct cgccggcgac gtcaaggagg 120 gcgactcggt catcatggac gtcgatggcg atggcgccat cagcgtcctc aacggagacc 180 gcacccacac caccaccatc gactcctccc cggcgggcat ctcgtagacg cgagagggag 240 ggagggagga ttttcagagg gagatgagac gaggactggg ccgggggcct tggggcgctg 300 ctggagcgtg gtgagagcgc ggcggacgtg ccttttcttc ttccgtgcgc gcgctcttgg 360 ccattgatcc ccgattcgcg cccgcatccc cccactgccc ccatcatctt gcctgttgtc 420 gtggcactga cataaacccc ctgcgctgcg ctgctccgct actattgata taggtctcac 480 gcgccaatct tttttgctcc gggtaaccgt ctggacgcca gaattc 526 <210> 113 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 113 gagctcagaa tagtatcggg tgatgcgaag tcagaaccag gcagggcctg tcgcctgagg 60 tggcaacgat gggaagcaat caatctgggt acagtcgtcc gcacgatccc gtgatctccc 120 ccaccgacac ctatccccgc ccatcccggc ccaccctttc agtcccctca gcatgcattg 180 tgcaccgcga caaagcatgt ctgctcgtgc actggttcag gccacggcgc accgagtcct 240 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aacgagaacg tcgtccgcga gacggcggac 240 gccatggtgt ccaccggcct ggccgccctg ggctaccagt acatcaacct ggacgactgc 300 tgggcggagc tgaaccgcga ctccgagggc aacatggtgc ccaacgccgc cgcgttcccc 360 tccggcatca aggcgctggc ggactacgtc cactccaagg gcctgaagct gggcgtctac 420 tccgacgcgg gcaaccagac ctgctccaag cgcatgcccg gctccctggg ccacgaggag 480 caggacgcga agacgttcgc ctcctggggc gtcgactacc tgaagtacga caactgcgag 540 aacctgggca tctccgtgaa ggagcgctac ccccccatgg gcaaggcgct gctgtcctcc 600 ggccgcccca tcttcttctc catgtgcgag tggggctggg aggaccccca gatctgggcc 660 aagtccatcg gcaactcctg gcgcaccacc ggcgacatcg aggacaactg gaactccatg 720 acctccatcg ccgactccaa cgacaagtgg gcctcctacg ccggccccgg cggctggaac 780 gaccccgaca tgctggaggt cggcaacggc ggcatgacga cggaggagta ccgctcccac 840 ttctccatct gggccctggc caaggcgccc ctgctggtgg gctgcgacat ccgcgcgatg 900 gacgacacga cgcacgagct gatctccaac gccgaggtga tcgcggtgaa ccaggacaag 960 ctgggcgtgc agggcaagaa ggtcaagtcc acgaacgacc tggaggtctg ggccggcccc 1020 ctgtccgaca acaaggtggc ggtgatcctg tggaaccgct 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tinctorius <400> 195 Met Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala Met Tyr 1 5 10 15 Asn Ala Ser Ala Lys Asp Thr Thr Phe Ala Leu Thr His Ser Arg Ser 20 25 30 Ile Gly Ser Val Ser Ile Arg Arg Arg Tyr Asn Val Phe Leu Cys Asn 35 40 45 Ser Ser Ser Ser Ser Arg Lys Val Ser Pro Leu Leu Ala Val Ala Thr 50 55 60 Gly Glu Gln Pro Ser Gly Val Ala Ser Leu Arg Glu Ala Asp Lys Glu 65 70 75 80 Lys Ser Leu Gly Asn Arg Leu Arg Leu Gly Ser Leu Thr Glu Asp Gly 85 90 95 Leu Ser Tyr Lys Glu Lys Phe Val Ile Arg Cys Tyr Glu Val Gly Ile 100 105 110 Asn Lys Thr Ala Thr Ile Glu Thr Ile Ala Asn Leu Leu Gln Glu Val 115 120 125 Gly Gly Asn His Ala Gln Gly Val Gly Phe Ser Thr Asp Gly Phe Ala 130 135 140 Thr Thr Thr Thr Met Arg Lys Leu His Leu Ile Trp Val Thr Ala Arg 145 150 155 160 Met His Ile Glu Ile Tyr Arg Tyr Pro Ala Trp Ser Asp Val Ile Glu 165 170 175 Ile Glu Thr Trp Val Gln Gly Glu Gly Lys Val Gly Thr Arg Arg Asp 180 185 190 Trp Ile Leu Lys Asp Tyr Ala Asn Gly Glu Val Ile Gly Arg Ala Thr 195 200 205 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construct <400> 244 actagtatgg gcgccggcgg ccgcatgacc gagaaggagc gcgagaagca ggagcagctg 60 gcccgcgcca ccggcggcgc cgccatgcag cgctcccccg tggagaagcc ccccttcacc 120 ctgggccagg ggcgcgccat caagaaggcc atcccccccc actgcttcga gcgctccgtg 180 ctgaagtcct tctcctacgt ggtgcacgac ctggtgatcg ccgccgccct gctgtacttc 240 gccctggcca tcatccccgc cctgccctcc cccctgggct acgccgcctg gcccctgtac 300 tggatcgccc agggctgcgt gtgcaccggc gtgtgggtga tcgcccacga gtgcggccac 360 cacgccttct ccgactactc cctgctggac gacgtggtgg gcctggtgct gcactcctcc 420 ctgatggtgc cctacttctc ctggaagtac tcccaccgcc gccaccactc caacaccggc 480 tccctggagc gcgacgaggt gttcgtgccc aagaagaagg aggccctgcc ctggtacacc 540 ccctacgtgt acaacaaccc cgtgggccgc ctggcccaca tcgtggtgca gctgaccctg 600 ggctggcccc tgtacctggc caccaacgcc tccggccgcc cctacccccg cttcgcctgc 660 cacttcgacc cctacggccc catctacaac gaccgcgagc gcgcccagat cttcgtgtcc 720 gacgccggcg tggccgccgt ggccttcggc ctgtacaagc tggccgccgc cttcggcgtg 780 tggtgggtgg tgcgcgtgta cgccgtgccc ctgctgatcg tgaacgcctg gctggtgctg 840 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ggccggcggc gcggacgcgg ccatcatccc 10260 ctcgggcatc ggcggcttca tcgcgtgcaa ggcgctgagc aagcgcaacg acgagcccga 10320 gcgcgcgagc cggccctggg acgccgaccg cgacggcttc gtcatgggcg agggcgccgg 10380 cgtgctggtg ctggaggagc tggagcacgc caagcgccgc ggcgcgacca ttttggctga 10440 attagttggc ggcgcggcca cctcggacgc gcaccacatg accgagcccg acccgcaggg 10500 ccgcggcgtg cgcctctgcc tcgagcgcgc gctcgagcgc gcgcgcctcg cgcccgagcg 10560 cgtcggctac gtcaacgcgc acggcaccag cacgcccgcg ggcgacgtgg ccgagtaccg 10620 cgccatccgc gccgtcatcc cgcaggactc actacgcatc aactccacaa agtccatgat 10680 cgggcacctg ctcggcggcg ccggcgcggt cgaggccgtg gccgccatcc aggccctgcg 10740 caccggctgg ctccacccca acttgaacct cgagaacccc gcgcctggcg tcgaccccgt 10800 cgtgctcgtg gggaagagcc tctagatctt aaaatgaagt gaagttccta tactttctag 10860 agaataggaa cttctatagt gagtcgaata agggcgacac aaaatttatt ctaaatgcat 10920 aataaatact gataacatct tatagtttgt attatatttt gtattatcgt tgacatgtat 10980 aattttgata tcaaaaactg attttccctt tattattttc gagatttatt ttcttaattc 11040 tctttaacaa actagaaata 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gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 8880 gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 8940 tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 9000 aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 9060 gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 9120 aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 9180 ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 9240 tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 9300 tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 9360 ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 9420 tatcgc 9426

Claims (114)

  1. 트리아실글리세라이드를 포함하는 천연 오일 또는 상기 천연 오일로부터 생성된 생성물의 제조 방법으로서, 상기 방법은,
    프로토테카 (Prototheca) 또는 클로렐라 (Chlorella) 속의 재조합 미세 조류의 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 β-케토아실-ACP 합성 효소 I 또는 β-케토아실-ACP 합성 효소 II를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 활성을 감소시키거나 제거하도록 작동가능한 재조합 핵산을 포함하며, 여기서 임의로 세포는 외인성 아실-ACP 티오에스테라제를 발현하도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함하는 단계; 및
    세포로부터 천연 오일을 회수하는 단계를 포함하고, 임의로 식품, 연료 또는 화학 생성물을 생성하기 위하여 천연 오일을 추가로 가공하는 단계를 포함하며, 천연 오일은 재조합 핵산으로 인하여 변형된 지방산 프로필을 갖는 방법.
  2. 제1항에 있어서, β-케토아실-ACP 합성 효소 I 또는 β-케토아실-ACP 합성 효소 II를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현의 감소 또는 제거는 β-케토아실-ACP 합성 효소 I 또는 β-케토아실-ACP 합성 효소 II를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 하나 이상의 유전자로의 치환, 또는 중단에 의한 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 세포는 올리에이트 12-하이드록실라제를 암호화하는 외인성 유전자를 추가로 포함하여, 리시놀레산을 합성하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 세포는 KASI 유전자에 의해 암호화되는 β-케토아실-ACP 합성 효소 I 또는 KASII 유전자에 의해 암호화되는 β-케토아실-ACP 합성 효소 II의 발현을 감소시키거나 제거하도록, 그리고 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 핵산을 포함하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 세포는 하나 이상의 지방산 불포화 효소 (FAD) 유전자에 의해 암호화되는 FAD의 발현을 감소시키거나 제거하도록, 그리고 활성 스테아로일 ACP 불포화 효소를 암호화하는 스테아로일-ACP 불포화 효소 외인성 유전자의 생성물을 발현하도록 작동 가능한 핵산을 포함하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 속으로부터 선택되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 윅커해미, 프로토테카 스태그노라, 프로토테카 포르토리센시스, 프로토테카 모리포르미스 또는 프로토테카 조프피로부터 선택되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 모리포르미스인 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미세 조류는 클로렐라 속으로부터 선택되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 미세 조류는 클로렐라 케슬러리, 클로렐라 루테오비리디스, 클로렐라 프로토테코이데스 또는 클로렐라 불가리스로부터 선택되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 미세 조류는 클로렐라 프로토테코이데스인 방법.
  12. 프로토테카 또는 클로렐라 속의 재조합 미세 조류 세포로서, 상기 세포는 β-케토아실-ACP 합성 효소 I 또는 β-케토아실-ACP 합성 효소 II를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 활성을 감소시키거나 제거하도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함하고, 여기서 임의로 세포는 외인성 아실-ACP 티오에스테라제를 발현하도록 작동 가능한 재조합 핵산을 포함하고, 상기 세포는 비재조합 미세 조류 세포의 지방산 프로필과 비교했을 때 재조합 핵산으로 인하여 변형된 지방산 프로필을 갖는 세포.
  13. 제12항에 있어서, β-케토아실-ACP 합성 효소 I 또는 β-케토아실-ACP 합성 효소 II를 암호화하는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는 효소의 발현의 감소 또는 제거는 β-케토아실-ACP 합성 효소 I 또는 β-케토아실-ACP 합성 효소 II를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 활성 β-케토아실-ACP 합성 효소 I, β-케토아실-ACP 합성 효소 II, 스테아로일 ACP 불포화 효소, 지방산 불포화 효소 또는 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 하나 이상의 유전자로의 치환, 또는 중단에 의한 것인 세포.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 속으로부터 선택되는 세포.
  15. 제14항에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 윅커해미, 프로토테카 스태그노라, 프로토테카 포르토리센시스, 프로토테카 모리포르미스 또는 프로토테카 조프피로부터 선택되는 세포.
  16. 제15항에 있어서, 미세 조류는 프로토테카 모리포르미스인 세포.
  17. 제12항에 있어서, 미세 조류는 클로렐라 속으로부터 선택되는 세포.
  18. 제12항에 있어서, 미세 조류는 클로렐라 케슬러리, 클로렐라 루테오비리디스, 클로렐라 프로토테코이데스 또는 클로렐라 불가리스로부터 선택되는 세포.
  19. 제18항에 있어서, 미세 조류는 클로렐라 프로토테코이데스인 세포.
  20. 제12항 또는 제13항의 세포로부터 생산된 오일 함유 생성물 또는 천연 오일.
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