MX2013008651A

MX2013008651A - Aceites adaptados producidos a partir de microorganismos oleaginosos recombinantes.

Info

Publication number: MX2013008651A
Application number: MX2013008651A
Authority: MX
Inventors: Scott Franklin; Janice Wee; George Rudenko; Walt Rakitsky; Xinhua Zhao; Aravind Somanchin; Jeffrey Moseley; Riyaz Bhat
Original assignee: Solazyme Inc
Priority date: 2011-02-02
Filing date: 2012-02-02
Publication date: 2013-09-02
Also published as: US8633012B2; KR20190036571A; US20190100780A1; JP6071904B2; MX351063B; EP2670855A1; KR20140114274A; EP2670855A4; WO2012106560A9; SG192594A1; US20130034887A1; US8852885B2; CA2825691A1; AU2016247159B2; KR102117225B1; CN110066836A; US10100341B2; JP6513058B2; EP3643774A1; WO2012106560A1

Abstract

Se proporcionan métodos y composiciones para producir aceite, combustibles, productos oleoquímicos y otros compuestos en microorganismos recombinantes, incluidos microorganismos que contienen aceites, y métodos de bajo costo para el cultivo de tales microorganismos. Las células de microalgas que contienen genes exógenos que codifican, por ejemplo, una lipasa, un transportador de sacarosa, una sacarosa-invertasa, una fructocinasa, una enzima que degrada polisacáridos, una enzima cetoacil-ACP-sintasa, una acil graso-ACP-tioesterasa, una acil graso-CoA/aldehído-reductasa, una acil graso-CoA-reducatasa, una aldehído graso-reductasa, una hidroxilasa de ácidos grasos, una enzima desaturasa, una descarbonilasa de aldehídos grasos y/o una proteína portadora de acilo son útiles en la fabricación de combustibles para el transporte tales como diésel renovable, biodiésel y combustible para aviones renovable, así como también productos oleoquímicos tales como fluidos funcionales, surfactantes, jabones y lubricantes.

Description

ACEITES ADAPTADOS PRODUCIDOS A PARTIR DE MICROORGANISMOS OLEAGINOSOS RECOMBINANTES REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio, conforme a 35 U.S.C. 119(e), de la Solicitud de Patente Provisional de EE . UU. N.° 61/438.969, presentada el 2 de febrero de 2011, la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. . ° ' 61/476.691, presentada el 18 de abril de 2011, la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. N.° 61/484.458, presentada el 10 de mayo de 2011 y la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. N.° 61/548.616 presentada el 18 de octubre de 2011. Cada una de estas solicitudes se incorpora a la presente en su totalidad por referencia a todos los efectos.

REFERENCIA A LA LISTA DE SECUENCIAS Esta solicitud incluye una lista de secuencias que se muestra al final de la descripción detallada.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la producción de aceites, combustibles y productos oleoquimicos obtenidos a partir de microorganismos. En particular, la descripción se refiere a microalgas que contienen aceites, a métodos para cultivarlas con el fin de producir compuestos útiles, incluidos lipidos, ésteres de ácidos grasos, ácidos grasos, aldehidos, alcoholes y alcanos, y a métodos y reactivos para alterarlas genéticamente con el fin de mejorar la eficacia de producción y alterar el tipo y la composición de los aceites producidos por estas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN "Combustible fósil" es una expresión general para referirse a yacimientos geológicos de materiales orgánicos combustibles enterrados, formados a partir de animales y plantas en estado de descomposición que se han convertido en petróleo bruto, carbón, gas natural o aceites densos por exposición a calor y presión en la corteza terrestre durante cientos de millones de años. Los combustibles fósiles son una fuente no renovable finita. La mayor demanda energética por parte de la economía global también ha impuesto una presión cada vez mayor sobre el costo de los hidrocarburos. Además de la energía, muchas industrias, incluidos los fabricantes de plásticos y productos químicos, dependen en gran medida de la disponibilidad de hidrocarburos como materia prima para sus procesos de fabricación. Las alternativas rentables a las fuentes de suministro actuales podrían ayudar a mitigar la presión creciente sobre los costos de energía y estas materias primas.

La Pub. de PCT N.° 2008/151149 describe métodos y materiales para cultivar microalgas con el fin de producir aceite y particularmente ilustra la producción de combustible diésel a partir de aceite producido por las microalgas Chlorella protothecoides . Se siguen necesitando métodos mejorados para producir aceite para combustible, productos químicos, alimentos y otros usos, particularmente métodos que produzcan aceites con una longitud de cadena más corta y un mayor grado de saturación y sin pigmentos, con un rendimiento y una eficacia mayores. La presente invención satisface esta necesidad .

Un poliuretano es un compuesto que comprende un conector de tipo carbamato (uretano) . Habitualmente, un poliuretano es un polímero de unidades orgánicas. El polímero se prepara mediante la reacción de una primera unidad orgánica que comprende un resto isocianato (C (O) -Ri-NC (O) ) y una segunda unidad orgánica que comprende un grupo hidroxilo (HO-R2-OH) . Un poliuretano se puede representar como - [C (O) H-Ri-NHC (O) -0-R2~0]m-, donde el subíndice m es un número que representa el número de monómeros contenidos en el polímero. Ri y R2 pueden ser iguales o diferentes, pero suelen ser diferentes. Los poliuretanos se utilizan en muchas aplicaciones diferentes, que incluyen los materiales tanto rígidos como flexibles. Los poliuretanos se utilizan en zapatos, automóviles, aviones, cojinetes, juntas, adhesivos, alfombras, fibras de elastano, carcasas para aparatos electrónicos y similares.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Las realizaciones ilustrativas de la presente invención proporcionan células oleaginosas que producen perfiles de glicerolipidos alterados y productos producidos a partir de las células. Los ejemplos de células oleaginosas incluyen células microbianas que presentan una vía de biosíntesis de lípidos de tipo II. Las realizaciones también proporcionan aceites naturales, los cuales se pueden obtener utilizando las células. Las realizaciones incluyen células recombinantes que expresan genes exógenos que codifican proteínas tales como acil graso-ACP-tioesterasas . La presente invención también proporciona métodos para preparar lípidos y productos basados en aceites, incluidos los combustibles tales como el biodiésel, diésel renovable y combustible para aviones, aceites alimenticios y productos químicos a partir de dichas células .

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una célula de microalga que tiene un perfil lipídico de al menos un 3% de C8 : 0. En algunos casos, el perfil lipídico es de al menos un 12% de C8:0. En algunas realizaciones, la célula es una célula recombinante . En algunos casos, la célula recombinante comprende un gen exógeno que codifica una proteina de tipo acil-ACP-tioesterasa que tiene actividad hidrolítica frente a sustratos de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C8. En algunas realizaciones, el gen exógeno codifica una acil-ACP-tioesterasa de Cuphea palustris En algunos casos, la célula es una célula de Prototheca. En algunos casos, la célula es de un género o especie de microalgas que se selecciona entre las microalgas identificadas en la Tabla 1.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una célula de microalga que tiene un perfil lipidico de al menos un 4% de C10:0. En algunos casos, el perfil lipidico es de al menos un 18% de C10:0. En algunos casos, el perfil lipidico es de al menos un 20% de C10:0. En algunos casos, el contenido lipidico de la célula de microalga comprende además C12:0. En algunos casos, la proporción de C10:0 frente a C12:0 es de al menos 3:1. En algunos casos, el contenido lipidico de la célula de microalga comprende además C14:0. En algunos casos, la proporción de C10:0 frente a C14:0 es de al menos 10:1. En algunas realizaciones, la célula es una célula recombinante. En algunos casos, la célula recombinante comprende un gen exógeno que codifica una proteina de tipo acil graso-ACP-tioesterasa que tiene actividad hidrolitica frente a sustratos de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de CIO. En algunas realizaciones, el gen exógeno codifica una proteina de tipo acil graso-ACP-tioesterasa de una especie seleccionada del grupo constituido por Cuphea hookeriana y Ulmus americana . En algunas realizaciones, la proteina de tipo acil graso-ACP-tioesterasa es de una especie seleccionada del grupo constituido por Cuphea hookeriana y Ulmus americana. En algunos casos, el gen de la acil graso-ACP-tioesterasa se selecciona del grupo constituido por un gen de acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana y Ulmus americana que tiene actividad hidrolitica frente a sustratos de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de CIO.

En algunos casos, la célula es una célula de Prototheca. En algunas realizaciones, la célula es de un género o especie de microalgas que se selecciona entre las microalgas identificadas en la Tabla 1.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una célula de microalga que tiene un perfil lipidico de al menos un 13% de C12:0. En algunos casos, la célula es una célula recombinante . En algunas realizaciones, la célula recombinante comprende un gen exógeno que codifica una proteina de tipo acil graso-ACP-tioesterasa que tiene actividad hidrolitica frente a sustratos de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C12. En algunas realizaciones, la proteina de tipo acil graso-ACP-tioesterasa es de una especie seleccionada del grupo constituido por Umbellularia californica y Cinnamomum camphora . En algunos casos, el gen de la acil graso-ACP-tioesterasa se selecciona del grupo constituido por un gen de acil graso-ACP-tioesterasa de Umbellularia californica y Cinnamomum camphora que tiene actividad hidrolitica frente a sustratos de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C12. En algunas realizaciones, la célula es una célula de Prototheca .

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una célula de microalga que tiene un perfil lipidico de al menos un 10% de C14:0. En algunos casos, el perfil lipidico es de al menos un 35% de C14:0. En algunos casos, el contenido lipidico de la célula de microalga comprende además C12:0. En algunos casos, la proporción de C14:0 frente a C12:0 es de al menos 3:1. En algunos casos, la célula es una célula recombinante . En algunas realizaciones, la célula recombinante comprende un gen exógeno que codifica una proteina de tipo acil graso-ACP-tioesterasa que tiene actividad hidrolitica frente a sustratos de tipo acil graso- ACP con una longitud de cadena de C14. En algunas realizaciones, la proteina de tipo acil graso-ACP-tioesterasa es de una especie seleccionada del grupo constituido por Cinnamo um camphora y Ulmus americana. En algunos casos, el gen de la acil graso-ACP-tioesterasa se selecciona del grupo constituido por un gen de acil graso-ACP-tioesterasa de Cinnamomum camphora y Ulmus americana que tiene actividad hidrolitica frente a sustratos de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C14. En algunos casos, la célula es una célula de Prototheca . En algunas realizaciones, la célula es de un género o especie de microalgas que se selecciona entre las microalgas identificadas en la Tabla 1.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una célula de microalga que tiene un perfil lipidico de al menos un 15% de C16:0. En algunos casos, el perfil lipidico es de al menos un 39% de C16:0. En algunos casos, el perfil lipidico es de al menos un 67% de C16:0. En algunos casos, la célula es una célula recombinante . En algunas realizaciones, la célula recombinante comprende un gen exógeno que codifica una proteina de tipo acil graso-ACP-tioesterasa que tiene actividad hidrolitica frente a sustratos de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C16. En algunas realizaciones, la proteina de tipo acil graso-ACP-tioesterasa es de una especie seleccionada entre Cuphea hookeriana y Ulmus americana. En algunas realizaciones, la célula recombinante comprende un gen exógeno que codifica una proteina de tipo acil graso-ACP-tioesterasa de una especie seleccionada del grupo' constituido por Cuphea hookeriana y Ulmus americana que tiene actividad hidrolitica frente a sustratos de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C16. En algunos casos, la célula es una célula de Prototheca . En algunas realizaciones, la célula de microalga comprende además un gen de desaturasa endógena, donde el gen de desaturasa endógena ha sido mutado para que codifique una desaturasa que es inactiva o menos activa que la desaturasa no mutada, o donde dicha desaturasa endógena ha sido borrada del genoma celular de la microalga.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una célula de microalga que tiene un perfil lipidico de al menos un 60% de ácidos grasos saturados. En algunos casos, la célula de microalga tiene un perfil lipidico de al menos un 85% de ácidos grasos saturados. En algunos casos, la célula es una célula recombinante. En algunas realizaciones, la célula recombinante comprende un gen exógeno que codifica una proteina de tipo acil graso-ACP-tioesterasa que tiene actividad hidrolitica frente a sustratos de tipo acil graso- ACP con longitudes de cadena de C10-C16. En algunos casos, la célula es una célula de Prototheca .

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona una célula de microalga que tiene un perfil lipídico de al menos un 19% de C18:0. En algunos casos, el perfil lipidico es de al menos un 27% de C18:0. En algunos casos, la célula es una célula recombinante . En algunas realizaciones, la célula recombinante comprende un gen exógeno que codifica una proteina de tipo acil graso-ACP-tioesterasa que tiene actividad hidrolitica frente a sustratos de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C18. En algunas realizaciones, la proteina de tipo acil graso-ACP-tioesterasa es de una especie seleccionada a partir de Brassica napus . En algunas realizaciones, la célula recombinante comprende un gen exógeno que codifica una proteina de tipo acil graso-ACP-tioesterasa de Brassica napus que tiene actividad hidrolitica frente a sustratos de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C16.

En un octavo aspecto, la presente invención proporciona una célula de microalga que comprende un gen exógeno que codifica una proteina de tipo acil graso-ACP-tioesterasa del grupo constituido por Cuphea hookeriana , Umbellularia californica , Cinnamomun camphora, Cuphea palustris , Cuphea lanceolata, Iris germánica, Myristica fragrans, Garcinia mangostana , Elaeis guiniensis , Brassica napus, Ricinus communis y Ulmus americana .

En un noveno aspecto, la presente invención proporciona una célula de microalga que comprende un constructo de expresión, donde el constructo de expresión reduce la expresión de un gen endógeno seleccionado entre los métodos constituidos por: el gen endógeno ha sido mutado para que codifique un producto génico que es inactivo o menos activo que el producto génico no mutado, el gen endógeno ha sido borrado del genoma celular de la . microalga, y mediante un mecanismo inducido por ARN. En algunos casos, el método es un mecanismo inducido por ARN, tal como ARNi, antisentido y/o ARNbc. En algunos casos, el gen endógeno es un gen de desaturasa. En algunas realizaciones, el gen de desaturasa es un gen de desaturasa de ácidos grasos delta 12. En algunos casos, la célula es una célula de Prototheca.

En un décimo aspecto, la presente invención proporciona una célula de microalga según se ha descrito en cualquiera de los aspectos anteriores, donde la célula de microalga se cultiva utilizando estaquiosa, rafinosa o melibiosa como fuente de carbono.

En un decimoprimer aspecto, la presente invención proporciona una célula de microalga que tiene un perfil lipidico que no es superior a un 2% de 18:2. En algunos casos, la presente invención proporciona una célula de microalga que tiene un perfil lipidico que no es superior a un 7% de 18:2.

En un decimosegundo aspecto, la presente invención proporciona un método para obtener un lipido. En una realización, el método comprende (a) cultivar una célula de microalga según se ha descrito previamente hasta que la célula tenga un contenido lipidico de al menos un 20% en peso seco; y (b) separar el lipido de los componentes hidrosolubles de la biomasa.

En un decimotercer aspecto, la presente invención proporciona otro método para obtener un lipido. En una realización, el método comprende (a) cultivar una célula de microalga que contiene dos genes exógenos diferentes que codifican dos acil-ACP-tioesterasas diferentes, y (b) separar el lipido de los componentes hidrosolubles de la biomasa. En algunos casos, al menos uno de los genes exógenos codifica una acil graso-ACP-tioesterasa seleccionada del grupo constituido por las tioesterasas identificadas en la Tabla 4.

En un decimocuarto aspecto,. la presente invención proporciona un método para obtener un producto basado en aceite. En una realización, el método comprende (a) cultivar una célula de microalga según se ha discutido previamente hasta que la célula tenga un contenido lipidico de al menos un 10% en peso seco; (b) separar el lipido de la célula de microalga; (c) someter el lipido a al menos una reacción química seleccionada del grupo constituido por: saponificación; metátesis; hidrólisis ácida; hidrólisis alcalina; hidrólisis enzimática; hidrólisis catalítica; hidrólisis con agua comprimida caliente; una reacción de hidrólisis catalítica en la que el lipido se escinde en glicerol y ácidos grasos; una reacción de aminación para producir compuestos nitrogenados grasos; una reacción de ozonólisis para producir ácidos mono- y dibásicos; una reacción de escisión de triglicéridos seleccionada del grupo constituido por escisión enzimática y escisión a presión; una reacción de condensación posterior a una reacción de hidrólisis; una reacción de hidroprocesamiento ; una reacción de hidroprocesamiento y una reacción de desoxigenación y/o una reacción de condensación previa o simultánea a la reacción de hidroporcesamiento; una reacción de eliminación de gas; una reacción de desoxigenación seleccionada del grupo constituido por una reacción de hidrogenólisis, hidrogenación, una reacción de hidrogenación-hidrogenólisis consecutiva, una reacción de hidrogenolisis-hidrogenación consecutiva, y una reacción de hidrogenación-hidrogenólisis combinada; una reacción de condensación tras una reacción de desoxigenación; una reacción de esterificación; una reacción de interesterificación; una reacción de transesterificación; una reacción de hidroxilación; y una reacción de condensación tras una reacción de hidroxilación; y (d) opcionalmente aislar un producto de la reacción de los demás componentes, con lo que se produce un producto basado en aceite.

En algunos casos, el producto basado en aceite se selecciona entre jabón o un producto combustible. En algunas realizaciones, el producto basado en aceite es un producto combustible seleccionado del grupo constituido por biodiésel, diésel renovable y combustible para aviones. En algunos casos, el producto combustible es biodiésel con uno o más de los siguientes atributos: (i) 0.025-0.3 mcg/g, preferentemente 0.05-0.244 mcg/g, de carotenoides totales; (ii) menos de 0.005 mcg/g, preferentemente menos de 0.003 mcg/g, de licopeno; (iii) menos de 0.005 mcg/g, preferentemente menos de 0.003 mcg/g, de beta-caroteno; (iv) 0.025-0.3 mcg/g, preferentemente 0.045-0.268 mcg/g, de clorofila A; (v) 35-175 mcg/g, preferentemente 38.3-164 mcg/g, de gamma-tocoferol ; (vi) menos de un 0.25% de brasicasterol, campesterol, estignasterol o beta-sitosterol ; (vii) 225-350 mcg/g, preferentemente 249.6-325.3 mcg/g, de tocotrienoles totales; (viii) 0.0025-0.05 mcg/g, preferentemente 0.003-0.039 mcg/g, de luteina; o (ix) 50-300 mcg/g, preferentemente 60.8-261.7 mcg/g, de tocoferóles. En algunos casos, el producto combustible es diésel renovable que tiene una T10-T90 de al menos 20 °C, 40 °C o 60 °C. En algunos casos, el producto combustible es combustible para aviones que cumple con los requisitos de HRJ-5 y/o D1655 de ASTM.

En un decimoquinto aspecto, la presente invención proporciona un aceite de triglicéridos que comprende (a) un perfil lipidico de al menos un 1-5%, preferentemente al menos un 3%, de C8:0, al menos un 2.5%, preferentemente al menos un 4%, de C10:0, al menos un 10%, preferentemente al menos un 13%, de C12:0, al menos un 10% de C14:0, y/o al menos un 60% de ácidos grasos saturados, y (b) uno o más de los siguientes atributos: (i) 0.025-0.3 mcg/g, preferentemente 0.05-0.244 mcg/g, de carotenoides totales; (ii) menos de 0.005 mcg/g, preferentemente menos de 0.003 mcg/g, de licopeno; (iii) menos de 0.005 mcg/g, preferentemente menos de 0.003 mcg/g, de beta-caroteno; (iv) 0.025-0.3 mcg/g, preferentemente 0.045-0.268 mcg/g, de clorofila A; (v) 35-175 mcg/g, preferentemente 38.3-164 mcg/g, de gamma-tocoferol ; (vi) menos de un 0.25% de brasicasterol , campesterol, estignasterol o beta-sitosterol; (vii) 225-350 mcg/g, preferentemente 249.6-325.3 mcg/g, de tocotrienoles totales; (viii) 0.0025-0.05 mcg/g, preferentemente 0.003-0.039 mcg/g, de luteina; o (ix) 50-300 mcg/g, preferentemente 60.8-261.7 mcg/g, de tocoferóles.

En un decimosexto aspecto, la presente invención proporciona un aceite de triglicéridos aislado a partir de microalgas que tiene una proporción de ácidos grasos C8:C10 de al menos 5:1. En algunas realizaciones, el aceite de triglicéridos se aisla a partir de una célula de microalga (p. ej . , del género Prototheca) , donde la célula de microalga comprende un gen exógeno. En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona un aceite de triglicéridos aislado a partir de microalgas con al menos un 60% de ácidos grasos saturados.

En otro aspecto relacionado, la presente invención proporciona un aceite de triglicéridos aislado a partir de microalgas que tiene un perfil lipidico con una proporción de ácidos grasos C16:C14 de aproximadamente 2:1. En otro aspecto relacionado, la presente invención proporciona un aceite de triglicéridos producido por una célula de microalga, donde la célula de microalga comprende un gen exógeno. En algunos casos, la microalga es del género Prototheca .

En otro aspecto relacionado, la presente invención proporciona un aceite de triglicéridos aislado a partir de microalgas que tiene un perfil lipidico con una proporción de ácidos grasos C12:C14 de aproximadamente 3:1. En otro aspecto relacionado, la presente invención proporciona un aceite de triglicéridos producido por una célula de microalga, donde la célula de microalga comprende un gen exógeno. En algunos casos, la microalga es del género Prototheca.

En un decimoséptimo aspecto, la presente invención proporciona un aceite de triglicéridos que comprende (a) un perfil lipidico con menos de un 1% de ácidos grasos < C12; entre un 1%-10%, preferentemente un 2%-7%, de C14:0; entre un 20%-35%, preferentemente un 23%-30%, de C16:0; entre un 5%-20%, preferentemente un 7%-15%, de C18:0; entre un 35%-60%, preferentemente un 40%-55%, de C18:l; y entre un l%-20%, preferentemente un 2%-15%, de C18:2; y (b) uno o más de los siguientes atributos: (i) 0.025-0.3 mcg/g, preferentemente 0.05-0.244 mcg/g, de carotenoides totales; (ii) menos de 0.005 mcg/g, preferentemente menos de 0.003 mcg/g, de licopeno; (iii) menos de 0.005 mcg/g, preferentemente menos de 0.003 mcg/g, de beta-caroteno; (iv) 0.025-0.3 mcg/g, preferentemente 0.045-0.268 mcg/g, de clorofila A; (v) 35-175 mcg/g, preferentemente 38.3-164 mcg/g, de gamma-tocoferol ; (vi) menos de un 0.25% de brasicasterol, campesterol, estignasterol o beta-sitosterol; (vii) 225-350 mcg/g, preferentemente 249.6-325.3 mcg/g, de tocotrienoles totales/ (viii) 0.0025-0.05 mcg/g, preferentemente 0.003-0.039 mcg/g, de luteina; o (ix) 50-300 mcg/g, preferentemente 60.8-261.7 mcg/g, de tocoferoles.

En algunos casos, el aceite de triglicéridos se aisla a partir de un microbio que comprende uno o más genes exógenos.

En algunas realizaciones, dichos genes exógenos codifican una acil graso-ACP-tioesterasa . En algunos casos, la acil graso-ACP-tioesterasa tiene una actividad hidrolítica frente a sustratos de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C14. En algunas realizaciones, el microbio comprende además un constructo de expresión, donde el constructo de expresión reduce la expresión de un gen endógeno seleccionado entre los métodos constituidos por: el gen endógeno ha sido mutado para que codifique un producto génico que es inactivo o menos activo que el producto génico no mutado, el gen endógeno ha sido borrado del genoma celular de la microalga, y mediante un mecanismo inducido por ARN . En algunas realizaciones, el gen endógeno codifica una desaturasa. En algunos casos, la desaturasa es una estearoil-proteina portadora de acilo-desaturasa (SAD) o una desaturasa de ácidos grasos (FAD) .

En un deciraooctavo aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un aceite de triglicéridos que comprende un perfil lipidico con menos de un 1% de ácidos grasos < C12; entre un 2%-7% de C14:0; entre un 23%-30% de C16:0; entre un 7%-15% de C18:0; entre un 40-55% de C18:l; y entre un 2-15% de C18:2, donde el aceite de triglicéridos se aisla a partir de un microbio que comprende uno o más genes exógenos. En algunos casos, el aceite de triglicéridos comprende un perfil lipidico de un 3-5% de C14:0; un 25-27% de C16:0; un 10-15% de C18:0; y un 40-45% de C18:l. En algunas realizaciones, dichos genes exógenos codifican una acil graso-ACP-tioesterasa. En algunos casos, la acil graso-ACP-tioesterasa tiene una actividad hidrolitica frente a sustratos de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C14.

En un decimonoveno aspecto, la presente invención proporciona una célula microbiana que produce ácido ricinoleico. En algunos casos, la célula microbiana es una célula de microalga. En algunos casos, la célula microbiana y la célula de microalga comprenden un gen exógeno que codifica una hidroxilasa de ácidos grasos. En algunas realizaciones, la hidroxilasa de ácidos grasos es una hidroxilasa de oleatos 12. En algunos casos, la hidroxilasa de ácidos grasos es de Ricinus communis. En algunos casos, la célula microbiana es del género Prototheca tal como, por ejemplo, Prototheca morifcrmis.

En un vigésimo aspecto, la presente invención proporciona una célula de microalga que comprende un gen exógeno que codifica una alfa-galactosidasa . En algunos casos, la célula de microalga comprende un gen exógeno que codifica una alfa-galactosidasa, donde la alfa-galactosidasa es secretada. En algunas realizaciones, el gen exógeno que codifica una alfa-galactosidasa es de un género seleccionado del grupo constituido por Saccharomyces , Aspergillus y Cyamopsis .

En un vigesimoprimer aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una composición lipidica que comprende los pasos de: (a) cultivar una célula de microalga en condiciones heterotróficas en presencia de una fuente fija de carbono, donde la célula de microalga comprende un gen exógeno que codifica una alfa-galactosidasa y la fuente fija de carbono se selecciona del grupo constituido por rafinosa, estaquxosa y melibiosa; (b) separar el lipido de los componentes no lipidíeos; con lo que se produce una composición lipídica. En algunos casos, la célula de microalga es del género Prototheca .

En un vigesimosegundo aspecto, la presente invención proporciona una célula de microalga que comprende un gen exógeno que codifica una enzima THIC. En algunos casos, la enzima THIC es de un género seleccionado del grupo constituido por Coccomyxa, Arabidopsis y Synechocystis .

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para cultivar una célula de microalga en ausencia de tiamina que comprende expresar un gen exógeno que codifica una enzima THIC. En algunos casos, la enzima THIC es de un género seleccionado del grupo constituido por Coccomyxa, Arabidopsis y Synechocystis .

En otros aspectos, la presente invención proporciona una célula de microalga según se describe en la presente, donde dicha célula de microalga comprende además otro gen exógeno seleccionado del grupo constituido por una sacarosa-invertasa, una alfa-galactosidasa y una enzima THIC.

Otro aspecto de esta invención proporciona un aceite hidroxilado aislado de una célula microbiana. En un aspecto, el aceite hidroxilado se aisla de una célula microbiana, donde la célula microbiana es una célula de microalga (p. ej . , del género Prototheca) . En un aspecto adicional, el aceite hidroxilado se aisla de una célula de Prototheca moriformis. En una realización, el aceite hidroxilado es un triglicérido hidroxilado. El .triglicérido hidroxilado puede ser químicamente similar o idéntico al aceite de ricino.

Un aspecto adicional de la invención es un ácido graso hidroxilado. Una realización del ácido graso hidroxilado es ácido ricinoleico.

En otro aspecto más, el ácido graso hidroxilado o el aceite hidroxilado microbiano está hidroxilado adicionalmente . Cuando el ácido ricinoleico está hidroxilado, se proporciona un ácido graso que contiene dos grupos hidroxilo.

Otro aspecto más de la invención proporciona una composición preparada haciendo reaccionar un aceite hidroxilado y/o un ácido graso hidroxilado con un compuesto que contiene un resto isocianato para formar un poliuretano.

Otro aspecto de la invención proporciona una célula de microalga que tiene un perfil lipídico de al menos un 20% de C18:2. En algunos casos, la célula de microalga tiene un perfil lipídico de al menos un 30% de C18:2. En algunos casos, la célula de microalga tiene un perfil lipídico de al menos un 40% de C18:2. En algunos casos, la célula de microalga tiene un perfil lipídico de al menos un 50% de C18:2.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para obtener un lipido, que comprende: (a) cultivar una célula de microalga en un medio de cultivo y monitorizar la concentración de azúcar; (b) cuando la concentración de azúcar del medio de cultivo llegue a menos de aproximadamente 1 gramo por litro, añadir una primera solución de azúcar al medio de cultivo a una velocidad continua de entre aproximadamente 2 gramos por hora por litro a aproximadamente 10 gramos por hora por litro durante de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas; (c) añadir una segunda solución de azúcar al medio de cultivo para mantener la concentración de azúcar del medio de cultivo entre aproximadamente 15 y aproximadamente 20 gramos por litro; y (d) aislar el lipido de la biomasa de microalgas. En algunos casos, la primera solución de azúcar se añade al medio de cultivo a una velocidad de aproximadamente 4 gramos de sacarosa por hora por litro a aproximadamente 6 gramos de sacarosa por hora por litro. En algunos casos, la primera solución de azúcar se añade al medio de cultivo a una velocidad de aproximadamente 5.25 gramos de sacarosa por hora por litro. En algunos casos, el azúcar es sacarosa o glucosa.

Otro aspecto de la invención proporciona una célula de microalga que tiene un perfil lipidico de al menos un 10% de C18:3. En algunos casos, la célula de microalga tiene un perfil lipidico de al menos un 20% de C18:3. En algunos casos, la célula de microalga tiene un perfil lipidico de al menos un 30% de C18:3. En algunos casos, la célula de microalga tiene un perfil lipidico de al menos un 40% de C18:3. En algunos casos, la célula de microalga tiene un perfil lipidico de al menos un 50% de C18.:3.

Otro aspecto de la invención proporciona un microorganismo que produce un triglicérido que comprende ácido linoleico o ácido linolénico, donde el microorganismo comprende un ácido nucleico recombinante que codifica una enzima de tipo ß-cetoacil-ACP-sintasa II (KAS II). En algunos casos, el microorganismo comprende además un ácido nucleico recombinante que codifica una enzima de tipo estearoil-ACP-desaturasa (SAD) . En algunos casos, el microorganismo comprende además un ácido nucleico recombinante que codifica una enzima de tipo tioesterasa. especifica para oleato. En algunos casos, el microorganismo comprende además un ácido nucleico recombinante que codifica una enzima de tipo desaturasa de ácidos grasos (FAD). En algunos casos, el microorganismo comprende además un ácido nucleico recombinante que codifica una desaturasa de glicerolipidos .

En los microorganismos modificados genéticamente discutidos previamente, la enzima KAS II puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178 y SEQ ID NO: 179. En algunos casos, la enzima SAD puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200 y SEQ ID NO: 201. En algunos casos, la enzima de tipo tioesterasa especifica para oleato puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205 y SEQ ID NO: 206. En algunos casos, la enzima FAD puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184 y SEQ ID NO: 185. En algunos casos, la enzima FAD es una enzima FAD ?12 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211 y SEQ ID NO: 212. En algunos casos, la enzima FAD es una enzima FAD ?15 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220 y SEQ ID NO: 221. En algunos casos, la desaturasa de glicerolípidos es una desaturasa de ácidos grasos ?-6, una desaturasa de ácidos grasos ?-3 o una desaturasa de oleatos ?-6.

Cualquiera de los microorganismos modificados genéticamente discutidos previamente pueden comprender además un ácido nucleico recombinante que codifica una enzima de la via de utilización de la sacarosa. En algunos casos, la enzima de la via de utilización de la sacarosa es una sacarosa-invertasa .

En cualquiera de los microorganismos modificados genéticamente discutidos previamente, el microorganismo se puede modificar adicionalmente para que aumente la proporción de ácido linoleico o ácido linolénico respecto a otros ácidos grasos .

En cualquiera de los microorganismos modificados genéticamente discutidos previamente, el microorganismo se puede modificar adicionalmente para que sobreexprese una tioesterasa especifica para, o con preferencia por, sustratos C18.

En cualquiera de los microorganismos modificados genéticamente discutidos previamente, el microorganismo se puede modificar adicionalmente para que reduzca la expresión de una tioesterasa específica para, o con preferencia por, un sustrato C8-C16.

En cualquiera de los microorganismos modificados genéticamente discutidos previamente, el microorganismo puede ser una célula de microalga. En algunos casos, la célula de microalga es del género Prototheca . En algunos casos, la célula de microalga es una célula de Prototheca moriformis.

Otro aspecto de la invención proporciona un aceite producido por cualquiera de los microorganismos modificados gené icamente discutidos previamente.

Otro aspecto de la invención proporciona métodos para producir los microorganismos modificados genéticamente discutidos previamente mediante la introducción en los microorganismos de uno o más de los ácidos nucleicos recombinantes para producir triglicéridos que comprendan ácido linoleico o ácido linolénico.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para producir un aceite natural que comprende triacilglicéridos , o un producto producido a partir del aceite natural, comprendiendo el método (i) cultivar una célula de un microorganismo recombinante, comprendiendo la célula ácidos nucleicos recombinantes operables para (a) reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa, y donde opcionalmente la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para reducir o eliminar la expresión de dos copias de un gen que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa ~I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa; o (b) expresar un producto de un gen exógeno que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos, grasos o acil-ACP-tioesterasa activa; o (c) reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I o ß-cetoacil-ACP-sintasa II, y expresar un producto de un gen exógeno que codifica una estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa activa; o (d) reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una estearoil-ACP-desaturasa o desaturasa de ácidos grasos, y expresar un producto de un gen exógeno que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II o acil-ACP-tioesterasa activa; y (ii) recuperar el aceite natural de la célula, y opcionalmente procesar adicionalraente el aceite natural para producir un producto alimenticio, combustible o un producto químico, donde el aceite natural tiene un perfil alterado de ácidos grasos debido a los ácidos nucleicos recombinantes .

En algunos casos, el microorganismo sintetiza ácidos grasos a través de una vía de biosíntesis de ácidos grasos de tipo II. En algunos casos, el microorganismo es una microalga En algunos casos, la microalga es un heterotrofo obligado. En algunos casos, la microalga es una especie de Prototheca o Chlorella. En algunos casos, la microalga es Prototheca wickerhamli , Prototheca stagnora, Prototheca portoricensis , Prototheca moriformis o Prototheca zopfii. En algunos casos, la microalga es Chlorella kessleri , Chlorella luteoviridis , Chlorella protothecoid.es o Chlorella vulgaris . En algunos casos, la célula es una célula recombinante que expresa una sacarosa-invertasa activa. En algunos casos, el cultivo es heterotrófico . En algunos casos, la desaturasa de ácidos grasos es una o más de las siguientes: una desaturasa de ácidos grasos ?-6, una desaturasa de ácidos grasos ?-3, una desaturasa de oleatos ?-6 o una desaturasa de ácidos grasos delta 12. En algunos casos, la célula se cultiva para que comprenda entre al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70% o un 50 y un 90% de triglicérido en peso celular seco. En algunos casos, el aceite comprende menos de 500, 50 o 5 ppm de moléculas con color. En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se integran de forma estable. En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se integran de forma estable en el cromosoma del microorganismo. En algunos casos, la célula comprende además al menos un marcador seleccionable .

En algunos casos, la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para reducir o eliminar la expresión de una enzima mediante la expresión de ARN antisentido, ARNi o ARNbc que actúa sobre la transcripción de un gen que codifica la enzima. En algunos casos, la reducción o eliminación de la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II-, estearoil-ACP-desaturasa o desaturasa de ácidos grasos es debida a la interrupción o el reemplazo de dichos genes por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa activa. En algunos casos, la célula recombinante comprende además un gen exógeno que codifica una hidroxilasa de oleatos 12, para sintetizar ácido ricinoleico. En algunos casos, la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una ß-cetoacil-ACP-sintasa II codificada por un gen KASII, y para expresar un producto de un gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa . En algunos casos, la célula produce un aceite con un perfil de ácidos grasos caracterizado por tener al menos un 40, 50, 60, 70 u 80% de ácidos grasos C16. En algunos casos, la célula produce un aceite con un perfil de ácidos grasos caracterizado por tener al menos un 50-75% de C16:0. En algunos casos, la célula produce un aceite con un perfil de ácidos grasos caracterizado además por tener al menos un 20-40% de C18:l. En algunos casos, el gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa produce una acil-ACP-tioesterasa activa que tiene una mayor actividad en cuanto a la hidrólisis de cadenas de' acilo graso C8-C16 que una acil-ACP-tioesterasa nativa de la célula. En algunos casos, el gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa interrumpe el gen KASII. En algunos casos, la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I.

En algunos casos, el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por una longitud de cadena media más corta de los ácidos grasos como resultado de los ácidos nucleicos recombinantes . En algunos casos, la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una desaturasa de ácidos grasos codificada por al menos un gen FAD y expresar un producto de un gen exógeno de estearoil-ACP-desaturasa que codifica una estearoil-ACP-desaturasa activa. En algunos casos, los ácidos nucleicos son operables para reducir o eliminar la expresión de una desaturasa de ácidos grasos codificada por múltiples copias de un gen de la desaturasa de ácidos grasos. En algunos casos, el gen exógeno de la estearoil-ACP-desaturasa se recombina en un locus dentro de la región codificante del gen de la desaturasa de ácidos grasos. En algunos casos, el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos con un contenido elevado de ácido oleico. En algunos casos, el ácido oleico comprende al menos un 50, 60, 70, 80 o 90% de los ácidos grasos. En algunos casos, la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para expresar un producto de un gen exógeno de ß-cetoacil-ACP-sintasa II que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa II activa. En algunos casos, el aceite producido está caracterizado por un perfil de ácidos grasos con un contenido elevado de ácidos grasos C18:l y un contenido reducido de ácidos grasos C16 como resultado de los ácidos nucleicos recombinantes. En algunos casos, la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una estearoil-ACP-desaturasa por interferencia de ARN. En algunos casos, el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por un aumento de los ácidos grasos C18:0. En algunos casos, el aceite producido está caracterizado por un perfil de ácidos grasos que tiene al menos un 50, 60, 70, 80 o 90% de C18:0. En algunos casos, el aceite producido está caracterizado por un perfil de ácidos grasos que tiene al menos un 50-75% de C18:0. En algunos casos, el aceite producido está caracterizado además por un perfil de ácidos grasos que tiene al menos un 20-40% de C18:l. En algunos casos, la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para reducir o eliminar la expresión de dos copias de un gen que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa o desaturasa de ácidos grasos. En algunos casos, los ácidos nucleicos son operables para expresar un producto de un gen exógeno de desaturasa de ácidos grasos que codifica una desaturasa de ácidos grasos ?-3 y/o una desaturasa de oleatos ?-6 activa. En algunos casos, el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por un nivel elevado de ácido linoleico, ácido linolénico o ambos. En algunos casos, el perfil de ácidos grasos del aceite se caracteriza por tener al menos un 10, 20, 30, 40 o 50% de ácido linoleico, ácido linolénico o ambos. En algunos casos, el procesamiento adicional del aceite comprende uno o más de los siguientes: refinación, decoloración, desodorización, metátesis, transesterificación, hidrogenación, hidrólisis, hidrogenación, desoxigenación, hidrocraqueo, isomerización, hidroxilación, interesterificación, amidación, sulfonación y sulfuración. En algunos casos, el aceite se procesa para crear un aceite alimenticio, ácidos grasos, un alcohol graso, un lubricante, un jabón, un éster de un ácido graso, un ácido graso etoxilado, una amina grasa, un cloruro de alquilo, un alcohol graso etoxilado, un sulfato de alcohol graso, una alcanolamida de un ácido graso, un aceite sulfonado, un aceite sulfurado, combustible diésel, combustible para aviones, gasolina, un componente de mezcla para combustibles, un aditivo para combustibles, un aditivo para lubricantes, o un recubrimiento.

Otro aspecto de la invención proporciona un aceite natural que se puede obtener mediante los métodos discutidos previamente .

Otro aspecto de la invención proporciona un producto hecho de un aceite natural discutido previamente. En algunos casos, el producto comprende un aceite alimenticio, ácidos grasos, un alcohol graso, un lubricante, un jabón, un éster de un ácido graso, un ácido graso etoxilado, una amina grasa, un cloruro de alquilo, un alcohol graso etoxilado, un sulfato de alcohol graso, una alcanolamida de un ácido graso, un aceite sulfonado, un aceite sulfurado, combustible diésel, combustible para aviones, gasolina, un componente de mezcla para combustibles, un aditivo para combustibles, un aditivo químico o un recubrimiento.

Otro aspecto de la invención proporciona una célula recombinante que comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para (a) reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa, y donde opcionalmente la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para reducir o eliminar la expresión de dos copias de un gen que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa; o (b) expresar un producto de un gen exógeno que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa activa; o (c) reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I o ß-cetoacil-ACP-sintasa II, y expresar un producto de un gen exógeno que codifica una estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa activa; o (d) reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una estearoil-ACP-desaturasa o desaturasa de ácidos grasos, y expresar un producto de un gen exógeno que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II o acil-ACP-tioesterasa activa.

En algunos casos, el microorganismo sintetiza ácidos grasos a través de una vía de biosintesis de ácidos grasos de tipo II. En algunos casos, el microorganismo es una microalga En algunos casos, la microalga es un heterótrofo obligado. En algunos casos, la microalga es una especie de Prototheca o Chlorella. En algunos casos, la microalga es Prototheca wickerhamii , Prototheca stagnora , Prototheca portoricensis , Prototheca moriformis o Prototheca zopfii. En algunos casos, la microalga es Chlorella kessleri , Chlorella luteoviridis , Chlorella protothecoides o Chlorella vulgaris . En algunos casos, la célula es una célula recombinante que expresa una sacarosa-invertasa activa. En algunos casos, la célula es capaz de crecer heterotróficamente . En algunos casos, la desaturasa de ácidos grasos es una o más de las siguientes: una desaturasa de ácidos grasos co-6, una desaturasa de ácidos grasos ?-3, una desaturasa de oleatos ?-6 o una desaturasa de ácidos grasos delta 12. En algunos casos, la célula se puede cultivar de manera que comprenda entre al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70% o un 50 y un 90% de triglicérido en peso celular seco. En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se integran de forma estable. En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se integran de forma estable en el cromosoma del microorganismo. En algunos casos, la célula comprende además al menos un marcador seleccionable . En algunos casos, la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para reducir o eliminar la expresión de una enzima mediante la expresión de ARN antisentido, ARNi o ARNbc. que actúa ¦ sobre la transcripción de un gen que codifica la enzima. En algunos casos, la reducción o eliminación de la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa o desaturasa de ácidos grasos es debida a la interrupción o el reemplazo de dichos genes por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa activa.

En algunos casos, la célula recombinante comprende además un gen exógeno que codifica una hidroxilasa de oleatos 12, para sintetizar ácido ricinoleico. En algunos casos, la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una ß-cetoacil-ACP-sintasa II codificada por un gen KASII, y para expresar un producto de un gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa. En algunos casos, la célula produce un aceite con un perfil de ácidos grasos caracterizado por tener al menos un 40, 50, 60, 70 u 80% de ácidos grasos C16. En algunos casos, la célula produce un aceite con un perfil de ácidos grasos caracterizado por tener al menos un 50-75% de C16:0. En algunos casos, la célula produce un aceite con un perfil de ácidos grasos caracterizado además por tener al menos un 20-40% de C18:l. En algunos casos, el gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa produce una acil-ACP-tioesterasa activa que tiene una mayor actividad en cuanto a la hidrólisis de cadenas de acilo graso C8-C16 que una acil-ACP-tioesterasa nativa de la célula. En algunos casos, el gen exógeno que' codifica una acil-ACP-tioesterasa interrumpe el gen KASII. En algunos casos, la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I. En algunos casos, el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por una longitud de cadena media más corta de los ácidos grasos como resultado de los ácidos nucleicos recombinantes . En algunos casos, la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una desaturasa de ácidos grasos codificada por al menos un gen FAD y expresar, un producto de un gen exógeno de estearoil-ACP-desaturasa que codifica una estearoil-ACP-desaturasa activa. En algunos casos, los ácidos nucleicos son operables para reducir o eliminar la expresión de una desaturasa de ácidos grasos codificada por múltiples copias de un gen de la desaturasa de ácidos grasos. En algunos casos, el gen exógeno de la estearoil-ACP-desaturasa se recombina en un locus dentro de la región codificante del gen de la desaturasa de ácidos grasos.

En algunos casos, el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos con un contenido elevado de ácido oleico. En algunos casos, el ácido oleico comprende al menos un 50, 60, 70, 80 o 90% de los ácidos grasos. En algunos casos, la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para expresar un producto de un gen exógeno de ß-cetoacil-ACP-sintasa II que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa II activa. En algunos casos, el aceite producido está caracterizado por un perfil de ácidos grasos con un contenido elevado de ácidos grasos C18:l y un contenido reducido de ácidos grasos C16 como resultado de los ácidos nucleicos recombinantes . En algunos casos, la célula recombinante' comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una estearoil-ACP-desaturasa por interferencia de ARN. En algunos casos, el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por un aumento de los ácidos grasos C18:0. En algunos casos, el aceite producido está caracterizado por un perfil de ácidos grasos que tiene al menos un 50, 60, 70, 80 o 90% de C18:0. En algunos casos, el aceite producido está caracterizado por un perfil de ácidos grasos que tiene al menos un 50-75% de C18:0. En algunos casos, el aceite producido está caracterizado además por un perfil de ácidos grasos que tiene al menos un 20-40% de C18:l. En algunos casos, la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para reducir o eliminar la expresión de dos copias de un gen que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa o desaturasa de ácidos grasos. En algunos casos, los ácidos nucleicos son operables para expresar un producto de un gen exógeno de desaturasa de ácidos grasos que codifica una desaturasa de ácidos grasos ?-3 y/o una desaturasa de oleatos ?-6 activa. En algunos casos, el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por un nivel elevado de ácido linoleico, ácido linolénico o ambos. En algunos casos, el perfil de ácidos grasos del aceite¦ se caracteriza por tener al menos un 10, 20, 30, 40 o 50% de ácido linoleico, ácido linolénico o ambos.

Otro aspecto de la invención proporciona un producto que contiene aceite o aceite natural producido a- partir de las células descritas previamente.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para producir un aceite natural que comprende triacilglicéridos que comprenden ácido ricinoleico, o un producto producido a partir del aceite natural, comprendiendo el método cultivar una célula de un microorganismo recombinante, comprendiendo la célula ácidos nucleicos recombinantes operables para expresar un producto de un gen exógeno que codifica una hidroxilasa de oleatos 12 activos, con el fin de sintetizar el ácido ricinoleico.

En algunos casos, el microorganismo dispone de una vía de biosintesis de ácidos grasos de tipo II. En algunos casos, el microorganismo es una microalga. En algunos casos, la microalga es un heterótrofo obligado. En algunos casos, la microalga es una especie de Prototheca. En algunos casos, la microalga es Prototheca wickerhamii , Prototheca stagnora , Prototheca portoricensis , Prototheca moriformis o Prototheca zopfii. En algunos casos', la microalga es Chlorella kessleri , Chlorella luteovirldls , Chlorella protothecoides o Chlorella vulgaris . En algunos casos, la célula es una célula recombinante que expresa una sacarosa-invertasa activa. En algunos casos, el cultivo es heterotrófico . En algunos casos, la célula produce al menos un 40, 50,- 60, 70, 80 o 90% de ácido oleico sin los ácidos nucleicos recombinantes operables para expresar un producto de un gen exógeno que codifica una hidroxilasa de oleatos 12 activa. En algunos casos, la célula comprende además ácidos nucleicos recombinantes operables para mejorar la producción de ácido oleico con el fin de elevar los niveles del sustrato para la hidroxilasa de oleatos 12. En algunos casos, la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para (a) expresar un producto de un gen exógeno que codifica una estearoil-ACP-desaturasa activa y reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una desaturasa de ácidos grasos; o (b) expresar un producto de un gen exógeno que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I activa y expresar un producto de un gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa activa.

Otro aspecto de la invención proporciona un aceite producido de acuerdo con cualquiera de los métodos discutidos previamente .

Otro aspecto de la invención proporciona una célula de un microorganismo que comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para expresar un producto de un- gen exógeno que codifica una hidroxilasa de oleatos 12 activa, con el fin de sintetizar ácido ricinoleico.

En algunos casos, el microorganismo dispone de una via de biosintesis de ácidos grasos de tipo II. En algunos casos, el microorganismo es una microalga. En algunos casos, la microalga es un heterótrofo obligado. En algunos casos, la microalga es una especie de Prototheca . En algunos casos, la microalga es Prototheca wickerhamii , Prototheca stagnora , Prototheca portoricensis, Prototheca moriformis o Prototheca zopfii. En algunos casos, la microalga es Chlorella kessleri , Chlorella luteoviridis , Chlorella protothecoides o Chlorella vulgaris . En algunos casos, la célula es una célula recombinante que expresa una sacarosa-invertasa activa. En algunos casos, la célula es capaz de crecer heterotróficamente . En algunos casos, la célula produce al menos un 40, 50, 60, 70, 80 o 90% de ácido oleico sin los ácidos nucleicos recombinantes operables para expresar un producto de un gen exógeno que codifica una hidroxilasa de oleatos 12 activa. En algunos casos, la célula comprende además ácidos nucleicos recombinantes operables para mejorar la producción de ácido oleico con el fin de elevar los niveles del sustrato para la hidroxilasa de oleatos 12. En algunos casos, la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para (a) expresar un producto de un gen exógeno que codifica una estearoil-ACP-desaturasa activa y reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una desaturasa de ácidos grasos; o (b) expresar un producto de un gen exógeno que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I activa y expresar un producto de un gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa activa.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un producto alimenticio que comprende un aceite según se ha descrito previamente.

Estos y otros aspectos y realizaciones.de la invención se describen en los dibujos adjuntos, de los cuales se presenta a continuación una breve descripción, y en la descripción detallada de la invención posterior, y se ejemplifican en los ejemplos posteriormente. Todas o cualquiera de las características discutidas previamente y a lo largo de la solicitud se pueden combinar en varias realizaciones de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra un cromatograma de diésel renovable producido a partir de aceite de triglicéridos de Prototheca.

La Figura 2 muestra los tiempos de retención de GC para un clon transgénico positivo representativo en comparación con el ácido ricinoleico estándar y un control de origen natural .

La Figura 3 muestra mapas de restricción de PstI para alelos de FAD de Prototheca moriformis con y sin una interrupción génica dirigida, según se describe en el Ejemplo 18.

La Figura 4 muestra los resultados de la inmunotransferencia de Southern que se describe en el Ejemplo 18.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Las realizaciones ilustrativas de la presente invención proporcionan células oleaginosas que producen perfiles de glicerolipidos alterados y productos producidos a partir de las células. Los ejemplos de células oleaginosas incluyen células microbianas que presentan una via de biosintesis de lipidos de tipo II. Las realizaciones incluyen células recombinantes que expresan uno o más genes exógenos que codifican proteínas, tales como acil graso-ACP-tioesterasas, desaturasas de ácidos grasos, ceto-acil-sintasas, y que tienen opcionalmente una o más supresiones de genes endógenos que codifican proteínas con actividades similares. Como resultado, algunas realizaciones proporcionan aceites naturales que no se podían obtener previamente. La presente invención también proporciona métodos para preparar lipidos y productos basados en aceites, incluidos los combustibles tales como el biodiésel, diésel renovable y combustible para aviones, aceites alimenticios y productos químicos a partir de dichas células.

Los aceites producidos de acuerdo con las realizaciones de la presente invención se pueden utilizar en el combustible para transporte, productos oleoquimicos y/o la industria alimentaria y cosmética, entre otras aplicaciones. Por ejemplo, la transesterificción de lipidos puede proporcionar ésteres de ácidos grasos de cadena larga útiles como diodiésel. Otros procesos enzimáticos y químicos se pueden adaptar para obtener ácidos grasos, aldehidos, alcoholes, alcanos y alquenos. En algunas aplicaciones, se produce diésel renovable, combustible para aviones u otros compuestos hidrocarbonados . La presente invención también proporciona métodos para cultivar microalgas con el fin de obtener mayor productividad y mayor rendimiento lipídico, y/o una producción más rentable de las composiciones descritas en la presente .

Una realización de la invención proporciona un método para producir un aceite natural que comprende triacilglicéridos, o para producir un producto producido a partir del aceite natural. El aceite natural puede ser un aceite no vegetal o no seminal. El método comprende cultivar una célula de un microorganismo recombinante para producir un aceite adaptado, es decir, un aceite con un perfil alterado de ácidos grasos debido a la presencia de los ácidos nucleicos recombinantes en la célula. A continuación, el aceite natural se puede procesar adicionalmente para producir un producto alimenticio, combustible o un producto químico. Los ácidos nucleicos recombinantes en la célula son operables para (a) reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa. Opcionalmente, la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para reducir o eliminar la expresión de dos copias de un gen (p. ej . , dos alelos en un organismo diploide) que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa; o (b) expresar un producto de un gen exógeno que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa activa; o (c) reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I o ß-cetoacil-ACP-sintasa II, y expresar un producto de un gen exógeno que codifica una estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa activa; o (d) reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una estearoil-ACP-desaturasa o desaturasa de ácidos grasos, y expresar un producto de un gen exógeno que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II o acil-ACP-tioesterasa activa.

Cuando hay un ácido nucleico recombinante que codifica una o más desaturasas de ácidos grasos presente en la célula, el ácido nucleico puede codificar una o más de las siguientes una desaturasa de ácidos grasos ?-6, una desaturasa de ácidos grasos ?-3, una desaturasa de oleatos ?-6 o una desaturasa de ácidos grasos delta 12.

Cuando la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para reducir o eliminar la expresión de una enzima, esto puede ocurrir mediante la expresión de ARN antisentido, ARNi o ARNbc que actúa sobre la transcripción de un gen que codifica la enzima, o mediante otro medio adecuado, que incluye una mutación directa, deleción completa o deleción parcial. De este modo, la reducción o alimentación de la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa o desaturasa de ácidos grasos puede ser debida a la interrupción o el reemplazo de dichos genes por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacíl-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa activa.

Preferentemente, los ácidos nucleicos recombinantes se integran de forma estable en la célula, p. ej . , en el cromosoma de la célula o un episoma. La selección de las células con ácidos nucleicos integrados de forma estable se puede facilitar utilizando un marcador seleccionable tal como sacarosa-invertasa, un gen de resistencia a antibióticos o complementación para la auxotrofia de tiamina, según se describe en la presente.

Preferentemente, el microorganismo puede ser uno que sintetice ácidos grasos a través de una via de biosintesis de ácidos grasos de tipo II. Por ejemplo, el microorganismo puede ser una microalga, pero también puede ser un microorganismo que posea normalmente una vía biosintética de ácidos grasos de tipo I (p. ej . , una levadura que produzca aceite) y en el que se haya introducido la maquinaria genética de tipo dos utilizando técnicas de ingeniería genética. El microorganismo puede ser un heterótrofo y, en una realización específica, un heterótrofo obligado. Cuando se utiliza una microalga, dicha microalga puede ser una especie de Prototheca o Chlorella. Las especies ilustrativas incluyen Prototheca wickerhamii , Prototheca ¦ stagnora , Prototheca portoricensis , Prototheca moriformis, Prototheca zopfii, Chlorella kessleri , Chlorella luteoviridis , Chlorella protothecoides y Chlorella vulgaris . Para poder utilizar materias primas de sacarosa, tales como jugo de caña de azúcar y otras que se describen en la presente, la célula recombinante puede incluir ácidos nucleicos recombinantes que incluyan un gen de sacarosa-invertasa para que exprese una sacarosa-invertasa activa. La sacarosa-invertasa puede ser secretada por el microorganismo en el medio.

El cultivo puede ser heterotrófico , p. e . , que se lleva a cabo en un biorreactor utilizando una fuente fija de carbono tal como glucosa o sacarosa. El cultivo se puede continuar hasta que la célula alcance al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70% o de un 50 a un 90% de triglicérido en peso celular seco. Esto puede implicar que el cultivo se lleve a cabo utilizando nitrógeno limitante, según se describe posteriormente.

El aciete producido por la célula se puede extraer de la célula. En una realización, el aceite comprende menos de 500, 50 o 5 ppm de moléculas con color. Opcionalmente, el aceite se analiza para determinar su perfil de ácidos grasos, p. ej . , mediante LC-MS. El aceite también puede tener una o más de las propiedades del aceite de las tablas 60-63 del Ejemplo 19.

En una realización especifica, la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una ß-cetoacil-ACP-sintasa II codificada por un gen KASII, y para expresar un producto de un gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa . Como resultado, la célula puede producir un aceite con un perfil de ácidos grasos caracterizado por tener al menos un 40, 50, 60 o 70% de ácidos grasos C16 (p. ej . , ácido palmitico) . Por lo tanto, el aceite puede tener una distribución de ácidos grasos desplazada hacia longitudes de cadena más cortas. El desplazamiento de la distribución de ácidos grasos se puede caracterizar por una longitud media reducida de los ácidos grasos u otra caracterización estadística de la distribución. Por ejemplo, para calcular la longitud media de los ácidos grasos, el porcentaje de cada ácido graso detectable que constituye los triglicéridos se multiplica por el número de carbonos en el ácido graso y la suma de los productos se divide por 100. El gen exógeno que codifica la acil-ACP-tioesterasa puede producir una acil-ACP-tioesterasa activa con una mayor actividad en cuanto a la hidrólisis de cadenas de acilo graso C8-C16 que una acil-ACP-tioesterasa nativa de la célula. El gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa puede interrumpir el gen KASII. De este modo, la inserción de la acil-ACP-tioesterasa también puede eliminar la expresión de la ß-cetoacil-ACP-sintasa II en un paso. Remítase a los Ejemplos 15 y 16.

En otra realización específica, la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I. Como resultado, el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por una distribución de longitudes de cadena de los ácidos grasos más corta que la de una célula comparable que carezca de los ácidos nucleicos recombinantes . Esto se puede expresar como una longitud de cadena media reducida de los ácidos grasos. La célula recombinante puede incluir ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una desaturasa de ácidos grasos codificada por al menos un gen FAD y para expresar un producto de un gen exógeno de estearoil-ACP-desaturasa que codifica una estearoil-ACP-desaturasa activa. Opcionalmente, los ácidos nucleicos son operables para reducir o eliminar la expresión de una desaturasa de ácidos grasos codificada por múltiples copias (p. ej . , alelos) de un gen de la desaturasa de ácidos grasos. En una realización especifica, el gen exógeno de la estearoil-ACP-desaturasa se recombina en un locus dentro de la región codificante del gen de la desaturasa de ácidos grasos. Como resultado, el aceite producido puede tener un nivel elevado de ácido oleico en comparación con el producido por una célula comparable que carezca de los ácidos nucleicos. El ácido oleico comprende al menos un 50, 60, 70, 80 o 90% de los ácidos grasos en el perfil de ácidos grasos. Remítase al Ejemplo 10.

En otra realización específica, la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para expresar un producto de un gen exógeno de ß-cetoacil-ACP-sintasa II que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa II activa. Como resultado, el aceite producido puede estar caracterizado por un perfil de ácidos grasos con un contenido elevado de ácidos grasos 18:1 y un contenido reducido de ácidos grasos C16 como resultado de los ácidos nucleicos recombinantes . Remítase al Ejemplo 13, en el que la sobreexpresión de un gen KASII aumentó el porcentaje de. ácidos grasos C18 desde aproximadamente un 68% en las células no transformadas hasta aproximadamente un 84%. En realizaciones relacionadas, el aumento es superior a un 70%, desde un 75-85% o desde un 70- En otra realización especifica, la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una estearoil-ACP-desaturasa por interferencia de ARN. Como resultado, el aceite producido puede tener un perfil de ácidos grasos caracterizado por un aumento de los ácidos grasos 18:0. Los ácidos grasos 18:0 puede ser al menos un 50, 60, 70, 80 o 90% de los ácidos grasos en el perfil. Remítase al Ejemplo 12.

En otra realización específica, la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para reducir o eliminar la expresión de dos copias de un gen (p. e . , dos alelos) que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa o desaturasa de ácidos grasos. Remítase al Ejemplo 14, en el que se suprimió un alelo de KASI endógeno en Prototheca . Como resultado, se observó un aumento del porcentaje de ácidos grasos C14 totales desde aproximadamente un 35% hasta un 400%, y del porcentaje de ácidos grasos C16 desde un 30 hasta un 50% debido a la interrupción de un KASI endógeno.

En otra realización específica, la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para expresar un producto de un gen exógeno de desaturasa de ácidos grasos que codifica una desaturasa de ácidos grasos ?-3 y/o una desaturasa de oleatos ?-6 activa. Como resultado, la célula puede producir niveles elevados de ácido linoleico, ácido linolénico o ambos, y estos pueden ser detectados en el perfil de ácidos grasos de los lipidos celulares. Por ejemplo, la célula puede tener al menos un 10, 20, 30, 40 o 50% de ácido linoleico, ácido linolénico o ambos. Por ejemplo, una enzima desaturasa ?15 recombinante se puede expresar como en el Ejemplo 11. Como resultado, el contenido de ácidos grasos C18:3 (es decir, ácido linolénico) puede aumentar de aproximadamente 2 a 17 veces o más .

En otra realización, se cultiva una célula de un microorganismo recombinante. La célula incluye ácidos nucleicos recombinantes que operan para expresar un producto de un gen exógeno que codifica una hidroxilasa de oleatos 12 activa, con el fin de sintetizar ácido ricinoleico. Este gen puede estar presente en cualquiera de las realizaciones mencionadas previamente. Remítase al Ejemplo 7. Un sustrato preferido para la hidroxilasa 12 es el ácido oleico. De este modo, en una realización preferida, se puede obtener un mayor rendimiento de ácido ricinoleico mediante la inclusión en la célula de ácidos nucleicos recombinantes que operan para aumentar la producción de ácido oleico. Sin carácter limitante, la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para expresar un producto de un gen exógeno que codifica una estearoil-ACP-desaturasa activa y reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una desaturasa de ácidos grasos; o expresar un producto de un gen exógeno que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I activa y expresar un producto de un gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa activa.

De acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la invención, el aceite se puede extraer y procesar adicionalmente mediante uno o más de los siguientes procesos: refinación, decoloración, desodorización, metátesis, transesterificación, hidrogenación, hidrólisis, hidrogenación, desoxigenación, hidrocraqueo, isomerización, hidroxilación, interesterificación, amidación, sulfonación y sulfuración. El aceite se puede procesar, por ejemplo, para crear un aceite alimenticio, ácidos grasos, un alcohol graso, un lubricante, un jabón, un éster de un ácido graso, un ácido graso etoxilado, una amina grasa, un cloruro de alquilo, un alcohol graso etoxilado, un sulfato de alcohol graso, una alcanolamida de un ácido graso, un aceite sulfonado, un aceite sulfurado, diésel, gasolina para aviones, un componente de mezcla o un aditivo, un lubricante o una pintura .

Cualquiera de las realizaciones mencionadas en la presente puede ser útil como un producto alimenticio o un aceite alimenticio. El organismo entero se puede incorporar a un producto alimenticio. El organismo puede estar intacto, parcialmente lisado, mayoritariamente lisado o completamente lisado. En WO2011/150411, WO2010/12093, O2011130578 y WO2011/130576 se describen métodos para preparar y utilizar organismos oleaginosos en productos alimenticios. Como alternativa, el aceite extraído y opcionalmente purificado del organismo se puede utilizar como aceite alimenticio, incluido como un ingrediente de aceite alimenticio en productos alimenticios preparados tales como productos para untar, salsas, confecciones y confecciones congeladas. En una realización especifica, las células oleaginosas o el aceite alimenticio comprenden un 50-70% de C18:0 y un 20-40% de 18:1 (p. e . , oleato) . En otra realización especifica, las células oleaginosas o el aceite alimenticio comprenden un 50-70% de C16:0 y un 20-40% de 18:1 (p. ej . , oleato).

Esta descripción detallada de la invención se divide en secciones para mayor comodidad del lector. La Sección I proporciona definiciones de los términos utilizados en la presente. La Sección II proporciona una descripción de condiciones de cultivo útiles en los métodos de la invención. La Sección III proporciona una descripción de materiales y métodos de ingeniería genética. La Sección IV proporciona una descripción de ingeniería genética para permitir el uso de sacarosa. La Sección V proporciona una descripción de ingeniería genética para modificar la biosintesis de lípidos. La Sección VI describe métodos para obtener combustibles y productos químicos. La Sección VII describe ejemplos y realizaciones de la invención. La descripción detallada de la invención va seguida de ejemplos que ilustran los diferentes aspectos y realizaciones de la invención, i . DEFINICIONES A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el significado que habitualmente sobreentiende un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención. Los siguientes términos, según se utilizan en la presente, tienen los significados que se les atribuyen a menos que se especifique de otra manera.

La expresión "activo en microalgas" se refiere a un ácido nucleico que es funcional en microalgas. Por ejemplo, un promotor que se ha utilizado para hacer que un gen de resistencia a antibióticos confiera resistencia a antibióticos a una microalga transgénica es activo en microalgas .

La expresión "porcentaje de área" se refiere al área de los picos observados, utilizando métodos de detección por FA E GC/FID en los que cada ácido graso en la muestra se convierte en un éster metílico de ácido graso (FAME) antes de la detección. Por ejemplo, se observa un pico separado para un ácido graso de 14 átomos de carbono sin insaturación (C14:0) en comparación con cualquier otro ácido graso tal como C14:l. El área del pico para cada clase de FAME es directamente proporcional a su composición porcentual en la mezcla y se calcula en función de la suma de todos los picos presentes en la muestra (es decir, [área bajo un pico especifico/área total de todos los picos medidos] X 100). Cuando se hace referencia a perfiles lipidíeos de aceites y células de la invención, la expresión "al menos un 4% de C8-C14" quiere decir que al menos un 4% de los ácidos grasos totales en la célula o en la composición glicerolípidica extraída tiene una longitud de cadena que incluye 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono .

El término "axénico" se refiere a un cultivo de un organismo que no está contaminado por otros organismos vivos.

El término "biodiésel" se refiere a un éster alquilico de ácidos grasos producido biológicamente adecuado para emplear como combustible en un motor diésel.

El término "biomasa" se refiere al material producido por el crecimiento y/o la propagación de células. La biomasa puede contener células y/o componentes intracelulares, asi como también material extracelular, que incluye, sin carácter limitante, los compuestos secretados por una célula.

El término "biorreactor" se refiere a un lugar cerrado o parcialmente cerrado en el que se cultivan las células, opcionalmente en suspensión.

La expresión "material celulósico" se refiere a un material biológico que comprende celulosa y opcionalmente hemicelulosa . En este sentido, se puede digerir para obtener azúcares tales como glucosa y xilosa, y opcionalmente puede comprender compuestos adicionales tales como disacáridos, oligosacáridos, lignina, furfurales y otros compuestos. Los ejemplos no limitantes de fuentes de material celulósico incluyen bagazos de la caña de azúcar, pulpa de la remolacha azucarera, forraje del maíz, virutas de madera, aserrín y pasto varilla.

La expresión "cocultivo" y sus variantes, tales como "cocultivar" y "cofermentar" , se refieren a cultivar dos o más tipos de células en el mismo biorreactor. Los dos o más tipos de células pueden ser microorganismos, tales como microalgas, o pueden ser una célula de microalga cultivada con un tipo de célula diferente.

La expresión "moléculas con color" o "impurezas que generan color", tal como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier compuesto que confiere un color al aceite extraído. Las "moléculas con color" o "impurezas que confieren color" incluyen, por ejemplo, clorofila a, clorofila ' b, licopenos, tocoferoles, campesteroles, tocotrienoles y carotenoides tales como beta-caroteno, luteínas, zeaxantina y astaxantina. Estas moléculas están presentes preferentemente en la biomasa microbiana o el aceite extraído con una concentración que no es superior a 500 ppm, no superior a 250 ppm, no superior a 100 ppm, no superior a 75 ppm o no superior a 25 ppm. En otras realizaciones, la cantidad de clorofila presente en la biomasa microbiana o el aceite extraído es inferior a 500 mg/kg, inferior a 100 mg/kg, inferior a 10 mg/kg, inferior a 1 mg/kg, inferior a 0.5 mg/kg, inferior a 0.1 mg/kg, inferior a 0.05 mg/kg o inferior a 0.01 mg/kg.

El término "cultivado" y sus variantes, tales como "fermentado", se refieren a la fomentación intencionada del crecimiento (aumentos del tamaño celular, contenido celular y/o actividad celular) y/o la propagación (aumentos de los números de células) de una o más células mediante el uso de condiciones seleccionadas y/o controladas. La combinación de crecimiento y propagación se denomina "proliferación". Los ejemplos de condiciones seleccionadas ylo controladas incluyen el uso de un medio definido (con características conocidas tales como pH, fuerza iónica y fuente de carbono) , temperatura específica, tensión de oxígeno, niveles de dióxido de carbono y crecimeinto en un biorreactor. El término "cultivado" no se refiere al crecimiento o la propagación de microorganismos en la naturaleza o sin intervención humana, por ejemplo, el crecimiento natural de un organismo que acaba por convertirse en un fósil para producir petróleo bruto geológico no es un cultivo.

El término "desaturasa" se refiere a una enzima en la vía de síntesis de lípidos responsable de la introducción de dobles enlaces ( insaturaciones ) en las cadenas de ácidos grasos de las moléculas de triglicéridos . Los ejemplos incluyen, sin carácter limitante, una estearoil-proteína portadora de acilo-desaturasa (SAD) y una desaturasa de ácidos grasos (FAD) , también conocida como desaturasa de acilos grasos.

La expresión "vector de expresión" o "constructo de expresión" o "plásmido" o "constructo de ADN recombinante" se refiere a un vehículo para introducir un ácido nucleico en una célula huésped. El ácido nucleico puede ser uno que se haya generado por intervención humana, que incluye mediante métodos recombinantes o síntesis química directa, con una serie de elementos de ácidos nucleicos especificados que permitan la transcripción y/o traducción de un ácido nucleico particular. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus o un fragmento de ácido nucleico, u otro vehículo adecuado. Habitualmente, el vector de expresión incluye un ácido nucleico que se ha de transcribir unido operablemente a un promotor.

La expresión "gen exógeno" se refiere a un ácido nucleico que codifica la expresión de un ARN y/o una proteína que se ha introducido en una célula (p. ej . , por transformación/transfección) y también se denomina "transgén" Una célula que comprende un gen exógeno se puede denominar célula recombinante, en la cual se pueden introducir uno o más genes exógenos adicionales. El gen exógeno puede ser de una especie diferente (y, por lo tanto, heterólogo) o de la misma especie (y, por lo tanto, homólogo) respecto a la célula que se está transformando. De este modo, un gen exógeno puede incluir un gen homólogo que ocupa una posición diferente en el genoma de la célula o que está bajo un control diferente, respecto a la copia endógena del gen. Un gen exógeno puede estar presente en más de una copia en la célula. Un gen exógeno se puede mantener en una célula como una inserción en el genoma (nuclear o del plástido) o como una molécula episomal.

La expresión "proporcionado/a de forma exógeno" se refiere a una molécula proporcionada al medio de cultivo de un cultivo celular.

Dependiendo del contexto, la expresión "ácidos grasos" se referirá a ácidos grasos libres, sales de ácidos grasos o restos de acilos grasos en un glicerolipido .

La expresión "fuente fija de carbono" se refiere a una o más moléculas que contienen carbono, habitualmente una molécula orgánica, que están presentes a temperatura y presión ambiente en forma sólida o liquida en un medio de cultivo que puede ser utilizado por un microorganismo cultivado en él. Por consiguiente, el dióxido de carbono no es una fuente fija de carbono.

El término "heterotrófico" , cuando pertenece a condiciones de cultivo, se refiere a cultivar en ausencia sustancial de luz, a la vez que se utiliza o metaboliza una fuente fija de carbono.

El término "homogeneizado" se refiere a biomasa que ha sido alterada físicamente.

La expresión "proporción de hidrógeno : carbono" se refiere a la proporción de átomos de hidrógeno frente a átomos de carbono en una molécula, basada átomo por átomo. La proporción se puede utilizar para referirse al número de átomos de carbono e hidrógeno en una molécula hidrocarbonada. Por ejemplo, el hidrocarburo con la mayor proporción es el metano CH4 (4:1) .

La expresión "promotor inducible" se refiere a un promotor que media la transcripción de un gen unido operablemente como respuesta a un estímulo particular. Algunos ejemplos de estos promotores pueden ser secuencias de promotores que son inducidas en condiciones de cambio del pH o de. los niveles de nitrógeno.

La expresión "en unión operable" se refiere a una unión funcional entre dos secuencias de ácidos nucleicos, tales como una secuencia de control (habitualmente un promotor) y la secuencia unida (habitualmente una secuencia que codifica una proteína, también denominada secuencia codificante) . Un promotor está en unión operable con un gen exógeno si puede mediar la transcripción del gen.

La expresión "enzima para la modificación de lipidos" se refiere a una enzima que altera la estructura covalente de un lipido o que puede provocar un perfil alterado de ácidos grasos en una célula. Los ejemplos de enzimas para la modificación de lipidos incluyen una lipasa, una acil graso-ACP-tioesterasa, una acil graso-coA/aldehído-reductasa, una acil graso-CoA reductasa, una reductasa de aldehidos grasos, una desaturasa, incluida una estearoil-proteina portadora de acilo-desaturasa (SAD) y una desaturasa de acilos grasos (FAD) , y una descarbonilasa de aldehidos grasos.

La expresión "enzima de la vía lipidica" se refiere a cualquier enzima que desempeña una función en el metabolismo de lipidos, es decir, ya sea en la síntesis, la modificación o la degradación de lipidos, y cualesquiera proteínas que modifican lipidos químicamente, así como también proteínas portadoras .

La expresión "perfil lipídico" o "perfil glicerolipídico" se refiere a la distribución de ácidos grasos en una célula o aceite derivado de una célula en cuanto a la longitud de cadena y/o el patrón de saturación. En este contexto, el patrón de saturación puede comprender una medida del ácido saturado frente al insaturado o un análisis más detallado de la distribución de las posiciones de los dobles enlaces en los diferentes ácidos grasos de una célula.

El término "lisis" se refiere a la rotura de la membrana plasmática y opcionalmente la pared celular de un organismo biológico suficiente para liberar al menos parte del contenido intracelular, a menudo mediante mecanismos mecánicos, químicos, víricos u osmóticos que comprometen su integridad .

El término "lisar" se refiere al proceso de lisis.

El término "microalgas" se refiere a un organismo microbiano que contiene un cloroplasto o plástido y que opcionalmente es capaz de realizar la fotosíntesis, o a un organismo microbiano procariótico capaz de realizar la fotosíntesis. Las microalgas incluyen fotoautótrofos obligados, que no pueden metabolizar una fuente fija de carbono como energía, así como también heterótrofos, los cuales pueden vivir únicamente a costa de una fuente fija de carbono. Las microalgas incluyen organismos unicelulares que se separan de células hermanas poco después de la división celular, tales como Chlamydomonas, así como también microbios tales como, por ejemplo, Volvox, que es un microbio fotosintético multicelular simple de dos tipos diferentes de células. Las microalgas incluyen células tales como Chlorella, Dunaliella y Prototheca. Las microalgas también incluyen otros organismos fotosintéticos microbianos que exhiben adhesión de célula-célula tales como Agmenellum , Anabaena y Pyrobotrys . Las microalgas también incluyen microorganismos heterotróficos obligados que han perdido la capacidad de realizar la fotosíntesis, tales como ciertas especies de algas dinoflageladas y especies del género Prototheca.

La expresión "de cadena media", tal como se utiliza en la presente en el contexto de ácidos grasos, se refiere a un ácido graso C10-C16. La expresión "de cadena corta", en este contexto, se refiere a ácidos grasos C6-C10, mientras que "de cadena larga" se refiere a ácidos grasos C17 o más largos. Estos límites no pretenden estar definidos exactamente, a menos que se indique de otra manera.

Un "aceite natural" se referirá a un aceite predominantemente de triglicéridos obtenido a partir de un organismo, donde el aceite no se ha sometido a ninguna mezcla con otro aceite natural o sintético, ni fraccionamiento para alterar sustancialmente el perfil de ácidos grasos del triglicérido . En la presente, el término "fraccionamiento" se refiere a eliminar material del aceite en un modo que modifique su perfil de ácidos grasos con relación al perfil producido por el organismo, como sea que se lleve a cabo. Un aceite natural engloba un aceite de este tipo obtenido a partir de un organismo, donde el aceite se ha sometido a un procesamiento mínimo, que incluye refinación, decoloración y/o desgomado, que no modifica sustancialmente su perfil de triglicéridos . Un aceite natural también puede ser un "aceite natural no interesterificado" , lo cual significa que el aceite natural no se ha sometido a ningún proceso en el que los ácidos grasos se hayan redistribuido en sus uniones de acilo con el glicerol y permanecen esencialmente en la misma configuración que cuando se obtuvieron del organismo.

La expresión "coexpresado/a de forma natural", con referencia a dos proteínas o genes, se refiere a que las proteínas o sus genes se coexpresan de forma natural en un tejido u organismo a partir del cual derivan, p. ej . , porque los genes que codifican las dos proteínas están controlados por una secuencia reguladora común o porque se expresan como respuesta al mismo estímulo.

La expresión "choque osmótico" se refiere a la ruptura de las células en una solución tras una reducción repentina de la presión osmótica. En algunas ocasiones se induce el choque osmótico para liberar los componentes celulares de dichas células a la solución.

La expresión "enzima que degrada polisacáridos" se refiere a cualquier enzima capaz de catalizar la hidrólisis o sacarificación de cualquier polisacárido . Por ejemplo, las celulasas catalizan la hidrólisis de la celulosa.

Los "polisacáridos" o "glicanos" son carbohidratos constituidos por monosacáridos unidos entre si por enlaces glicosidicos . La celulosa es un polisacárido que forma parte de ciertas paredes celulares de plantas. La celulosa puede ser despolimerizada por enzimas para obtener monosacáridos tales como xilosa y glucosa, asi como también disacáridos más grandes y oligosacáridos .

El término "promotor" se refiere a una secuencia de control de un ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Un promotor, tal como se utiliza en la presente, incluye las secuencias necesarias de ácido nucleico cerca del sitio de inicio de la transcripción tales como, en el caso de un promotor de tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor también incluye opcionalmente elementos represores o potenciadores distales, que se pueden situar incluso varios miles de pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción.

El término "recombinante" se refiere a una célula, ácido nucleico, proteína o vector que ha sido modificado debido a la introducción de un ácido nucleico exógeno o la alteración de un ácido nucleico nativo. De este modo, p. ej . , las células recombinantes pueden expresar genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresar genes nativos de forma diferente a la que esos genes son expresados por una célula no recombinante. Las células recombinantes pueden incluir, sin carácter limitante, ácidos nucleicos recombinantes que . codifican un producto génico o elementos de supresión, tales como mutaciones, supresiones, ARN antisentido, ARN interferente (ARNi) o ARNbc, que reducen los niveles de producto génico activo en una célula. Un "ácido nucleico recombinante" es un ácido nucleico formado originariamente in vitro, en general, mediante la manipulación de un ácido nucleico, p. ej . , utilizando polimerasas, ligasas, exonucleasas y endonucleasas, o si no está en una forma que no se encuentra normalmente en la naturaleza. Los ácidos nucleicos recombinantes se pueden producir, por ejemplo, para colocar dos, o más ácidos nucleicos en unión operable. De este modo, un ácido nucleico aislado o un vector de expresión formado in vitro ligando moléculas de ADN que normalmente no están unidas en la naturaleza serán ambos considerados recombinantes a los efectos de esta invención. Una vez se ha obtenido un ácido nucleico recombinante y se ha introducido en una célula u organismo huésped, este se puede replicar utilizando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped; sin embargo, estos ácidos nucleicos, una vez producidos de forma recombinante, aunque se repliquen posteriormente de forma intracelular, se seguirán considerando recombinantes a los efectos de esta invención. De forma similar, una "proteína recombinante" es una proteína obtenida utilizando técnicas recombinantes, es decir, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante.

La expresión "diésel renovable" se refiere a una mezcla de alcanos (tal como C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 y C18:0) producidos a partir de un aceite natural, p. ej . , mediante la hidrogenación y desoxigenación de lipidos.

El término "sacarificación" se refiere a un proceso de conversión de biomasa, normalmente biomasa celulósica o lignocelulósica, en azúcares monoméricos tales como glucosa y xilosa. La biomasa o material celulósico "sacarificado" o "despolimerizado" se refiere a la biomasa o material celulósico que se ha convertido en azúcares monoméricos mediante sacarificación.

La expresión "especies de furfural" se refiere a 2-furancarboxaldehído o a un derivado que conserva las mismas características estructurales básicas.

Cuando hace referencia a la transformación de una cepa para crear una cepa recombinante de acuerdo con las realizaciones de la presente (y no necesariamente con discusiones de la técnica anterior) , la expresión "estable" o "integrado de forma estable" significará que los ácidos nucleicos recombinantes son retenidos por las células de la cepa durante al menos 10 generaciones. Por ejemplo, cuando una cepa recombinante tiene un marcador seleccionable que hace posible el cultivo en presencia de una presión de selección, los ácidos nucleicos recombinantes se retendrán después de 10 generaciones de cultivo en ausencia de la presión de selección.

La expresión "gen de utilización de la sacarosa" se refiere a un gen que, cuando se expresa, aumenta la capacidad de una célula de utilizar sacarosa como fuente de energía. Las proteínas codificadas por un gen de utilización de la sacarosa se denominan en la presente "enzimas de utilización de la sacarosa" e incluyen transportadores de la sacarosa, sacarosa-invertasas y hexocinasas tales como glucocinasas y fructocinasas .

II . Cultivo La presente invención se refiere en general al cultivo de microorganismos y particularmente microorganismos oleaginosos que tienen una vía de biosínteisis de ácidos grasos de tipo II, tales como las microalgas, para producir triglicéridos . En una realización, los microorganismos son heterótrofos obligados. Los microorganismos pueden ser microorganismos recombinantes basados, por ejemplo, en los métodos de ingenieria genética que se describen posteriormente. Para mayor comodidad del lector, esta sección se subdivide en subsecciones . La subsección 1 describe especies y cepas de microorganismos. La subsección 2 describe biorreactores útiles para el cultivo. La subsección 3 describe medios de cultivo. La subsección 4 describe la producción de aceite de acuerdo con métodos de cultivo ilustrativos de la invención. 1. Especies y cepas de microorganismos Aunque las realizaciones ilustrativas que se presentan posteriormente se pueden aplicar a numerosos microorganismos, Prototheca es un microorganismo preferido para emplear en la producción de lipidos. Cabe destacar que los métodos de ingenieria genética descritos en la presente con Prototheca como ejemplo se pueden aplicar a otros microorganismos (p. ej . , Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris, Chlorella ellipsoideá , Chlorella kessleri , Dunaliella tertiolecta , Volvox carteri, Haematococcus pluvialis , complejo de Closterium peracerosum-strigosum-littorale, Dunaliella viridis , Dunaliella salina, Gonium pectorale, Phaeodactylum tricornutum, Chaetoceros, Cylindrotheca fusiformis, Amphidinium sp. , Symbiodinium microadriacticum , Nannochloropsis, Cyclotella cryptica , Navícula saprophila o Thalassiosira pseudonana) .

El lípido o aceite obtenido a partir de una microalga heterotrófica obligada, tal como Prototheca , puede tener en general un contenido bajo de pigmento (p. e . , niveles de bajos a indetectables de clorofila y ciertos carotenoides , por ejemplo, inferiores a 500, 50 o 5 ppm de moléculas con color, impurezas que generan color o la suma de las concentraciones de clorofila y carotenoides) y, en cualquier caso, contiene mucho menos pigmento que el lípido de otras microalgas. Además, las células de Prototheca recombinantes proporcionadas por la invención se pueden utilizar para producir lípido con mayor rendimiento y eficacia y con un costo reducido, con relación a la producción de lípido a partir de otros microorganismos. Las cepas de Prototheca ilustrativas para emplear en los métodos de la invención incluyen . Además, estas microalgas crecen de forma heterotrófica y se pueden modificar genéticamente como Prototheca wickerhamii, Prototheca stagnora (que incluye UTEX 321 ) , Prototheca portoricensis, Prototheca moriformis (que incluye las cepas UTEX 1441, 1435,) y Prototheca zopfii. Las especies del género Prototheca son heterótrofos obligados.

Las consideraciones que afectan a la selección de los microorganismos para su uso en las realizaciones de la invención incluyen, además de la producción de lipidos' o hidrocarburos adecuados para la producción de aceites, combustibles y productos oleoquimicos : (1) contenido elevado de lipidos como porcentaje de peso celular; (2) crecimiento fácil; (3) modificación genética fácil; y (4) procesamiento de la biomasa fácil. En realizaciones particulares, el microorganismo de origen natural o modificado genéticamente proporciona células con un contenido lipidico de al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65% o al menos un 70% o más. En otras realizaciones particulares, el microorganismo de origen natural o modificado genéticamente proporciona células que comprenden entre un 40 y un 80% o entre un 50 y un 90% de triglicéridos . Los organismos preferidos crecen de forma heterotrófica (con azúcares en ausencia de luz) .

Los ejemplos de algas que se pueden utilizar para llevar a la práctica la presente invención incluyen, sin carácter limitante, las siguientes algas que se enumeran en la Tabla 1 Tabla 1. Ejemplos de algas.

Achnanthes orientalis , Agmenellum, Amphiprora hyaline, Amphora coffeiformis, Amphora coffeifor is linea, Amphora coffeiformis punctata , Amphora coffeiformis taylori , Amphora coffeiformis tenuis, Amphora delicatissima , Amphora delicatissima capitata, Amphora sp . ,· Anabaena , Ankistrodesmus , Ankistrodesmus falcatus , Boekelovia hooglandii, Borodinella sp., Botryococcus braunii , Botryococcus sudeticus , Cartería , Chaetoceros gracilis, Chaetoceros muelleri , Chaetoceros muelleri subsalsu , Chaetoceros sp., Chlorella anitrata, Chlorella Antárctica , Chlorella aureoviridis, Chlorella candida, Chlorella capsúlate, Chlorella desiccate, Chlorella ellipsoidea , Chlorella emersonii , Chlorella fusca, Chlorella fusca var. vacuolata , Chlorella glucotropha, Chlorella infusionum, Chlorella infusionum var. actophila , Chlorella infusionum var. auxenophila , Chlorella kessleri , Chlorella lobophora (cepa SAG 37.88,) , Chlorella luteoviridis , Chlorella luteoviridis var. aureoviridis, Chlorella luteoviridis var. lutescens, Chlorella miniata , Chlorella minutissima , Chlorella mutabilis , Chlorella nocturna , Chlorella parva, Chlorella photophila , Chlorella pringsheimii , Chlorella protothecoides (incluidas cualquiera de las cepas UTEX 1806, 411, 264, 256, 255, 250, 249, 31, 29, 25, y las cepas CCAP 211/17 y 211/8d) , Chlorella protothecoides var. acidicola , Chlorella regularis , Chlorella regularis var. mínima, Chlorella regularis var. umbricata, Chlorella reisiglii, Chlorella saccharophila , Chlorella saccharophila var. ellipsoidea , Chlorella salina, Chlorella simplex, Chlorella sorokiniana, Chlorella sp., Chlorella sphaerica , Chlorella stigmatophora , Chlorella vanniellii, Chlorella vulgaris, Chlorella vulgaris , Chlorella vulgaris f. tertia, Chlorella vulgaris var. autotrophica , Chlorella vulgaris var. viridis , Chlorella vulgaris var. vulgaris , Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia, Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis, Chlorella xanthella , Chlorella zofingiensis , Chlorella trebouxioides , Chlorella vulgaris, Chlorococcum infusionum, Chlorococcum sp., Chlorogonium, Chroomonas sp., Chrysosphaera sp . , Cricosphaera sp. , Cryptomonas sp. , Cyclotella cryptica , Cyclotella meneghiniana , Cyclotella sp., Dunaliella sp., Dunaliella bardawil, Dunaliella bioculata, Dunaliella granúlate, Dunaliella maritime, Dunaliella minuta, Dunaliella parva, Dunaliella peircei , Dunaliella primolecta , Dunaliella salina, Dunaliella terrícola , Dunaliella tertiolecta , Dunaliella viridis, Dunaliella tertiolecta , Eremosphaera viridis, Eremosphaera sp . , Elllpsoldon sp . , Euglena , Franceia sp., Fragilaria crotonensis, Fragilaria sp., Gleocapsa sp., Gloeothamnion. sp. , Hymenomonas sp., Isochrysis aff. galbana, Isochrysis galbana, Lepocinclis, Micractinium, Micractinium (UTEX LB 2614) , Monoraphidium minutum, Monoraphidium sp. , Nannochloris sp. , Nannochloropsis salina, Nannochloropsís sp., Navícula acceptata , Navícula bískanterae, Navícula pseudotenelloides , Navícula pelliculosa, Navícula saprophila, Navícula sp., Nephrochlorís sp., Nephroselmis sp. , Nitschia communis, Nitzschia alexandrina , Nitzschia communis, Nitzschia dissipata , Nitzschia frustulum, Nitzschia hantzschiana , Nitzschia inconspicua , Nitzschia intermedia , Nitzschia microcephala , Nitzschia pusilla , Nitzschia pusilla eiliptica , Nitzschia pusilla monoensis , Nitzschia quadrangular, Nitzschia sp., Ochromonas sp., Oocystis parva, Oocystis pusilla, Oocystis sp., Oscillatoria limnetica, Oscillatoria sp. , Oscillatoria subbrevis, Pascheria acidophila, Pavlova sp . , Phagus, Phormidium, Platymonas sp., Pleurochrysis carterae, Pleurochrysis dentate, Pleurochrysis sp., Prototheca wickerhamii , Prototheca stagnora , Prototheca portoricensis , Prototheca moriformis, Prototheca zopfii, Pyramimonas sp., Pyrobotrys , Sarcinoid chrysophyte, Scenedesmus armatus, Spirogyra , Spirulina platensis, Stichococcus sp., Synechococcus sp. , Tetraedroh, Tetraselmis sp. , Tetraselmis suecica, Thalassiosira weissflogii y Viridiella fridericiana . 2. Biorreactor Los microorganismos se cultivan tanto con el fin de realizar manipulaciones genéticas como para la producción de hidrocarburos (p. ej . , lipidos, ácidos grasos, aldehidos, alcoholes y alcanos) . El primer tipo de cultivo se realiza a pequeña escala y al menos inicialmente en condiciones en las que el microorganismo de partida pueda crecer. El cultivo cuyo fin es la producción de hidrocarburos se realiza normalmente a gran escala (p. ej . , en biorreactores de 10 000 L, 40 000 L, 100 000 L o más grandes) en un biorreactor. Las microalgas, incluidas las especies de Prototheca , se suelen cultivar en los métodos de la invención en medio liquido dentro de un biorreactor.. Habitualmente, el biorreactor no permite que entre la luz.

El biorreactor o termentador se utiliza para cultivar las células de microalgas a través de las diferentes fases de su ciclo fisiológico. Los biorreactores ofrecen muchas ventajas para su uso en los métodos de propagación y crecimiento heterotrófico . Para producir biomasa, las microalgas se fermentan preferentemente en grandes cantidades en un liquido, tal como en cultivos en suspensión. Los biorreactores, tales como los fermentadores de acero, pueden dar cabida a volúmenes de cultivo muy grandes (en varias realizaciones de la invención se utilizan biorreactores de 40 000 litros y de mayor capacidad) . Los biorreactores normalmente también permiten controlar las condiciones de cultivo tales como la temperatura, el pH, la tensión de oxigeno y los niveles de dióxido de carbono. Por ejemplo, habitualmente los biorreactores se pueden configurar, por ejemplo, utilizando puertos conectados a tubos, para permitir que los componentes gaseosos, como oxigeno o nitrógeno, sean burbujeados en un cultivo liquido. Otros parámetros de cultivo, tales como el pH del medio de cultivo, la identidad y la concentración de elementos traza y otros constituyentes del medio, también se pueden manipular más fácilmente utilizando un biorreactor.

Para someter los cultivos a un proceso de mezcla, se pueden utilizar biorreactores dotados de dispositivos tales como aspas giratorias e impulsores, mecanismos de oscilación, barras de agitación y medios para la infusión de gas a presión. La mezcla puede ser continua o intermitente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, no se mantiene un régimen de flujo turbulento de entrada de gas ni entrada de medios durante la reproducción de las células, hasta que se haya conseguido un aumento deseado en el número de dichas células.

Los puertos del biorreactor se pueden utilizar para introducir o extraer gases, sólidos, semisólidos y líquidos en la cámara del biorreactor que contiene las microalgas. Aunque muchos biorreactores tienen más de un puerto (por ejemplo, uno para la entrada de medios y otro para el muestreo) , no es necesario que solamente una sustancia entre o salga de un puerto. Por ejemplo, un puerto se puede utilizar para hacer fluir medios de cultivo al interior del biorreactor y posteriormente se puede utilizar para el muestreo, la entrada de gas, la salida de gas u otros fines. Preferentemente, un puerto de muestreo se puede utilizar repetidamente sin alterar ni comprometer la naturaleza axénica del cultivo. Un puerto de muestreo se puede configurar con una válvula u otro dispositivo que permita detener y reanudar el flujo de muestra o para proporcionar un modo de muestreo continuo. Los biorreactores normalmente tienen al menos un puerto que permite la inoculación de un cultivo y dicho puerto también se puede utilizar con otros fines tales como la entrada de gas o medios.

Los puertos de los biorreactores permiten manipular el contenido de gas del cultivo de microalgas . A modo ilustrativo, parte del volumen de un biorreactor puede ser gas en lugar de liquido y las entradas de gas del biorreactor pueden permitir el bombeo de gases al interior del biorreactor. Los gases que se pueden bombear de forma beneficiosa al interior de un biorreactor incluyen aire, oxigeno, mezclas de aire/C02, gases nobles tales como argón, y otros gases. Los biorreactores pueden estar equipados para que el usuario pueda controlar la velocidad de entrada de un gas en el biorreactor. Como se indicó anteriormente, el aumento del flujo de gas en un biorreactor se puede usar para aumentar la mezcla del cultivo.

El aumento del flujo de gas afecta también a la turbidez del cultivo. Se puede producir turbulencia colocando un puerto de entrada de gas por debajo del nivel de los medios de cultivo acuosos para que de este modo la entrada de gas en el biorreactor produzca burbujas en la superficie del cultivo Uno o más puertos de salida de gas permiten que el gas se escape, de este modo se evita que la presión aumente en el biorreactor. Preferentemente, un puerto de salida de gas lleva a una válvula "unidireccional" que evita la entrada de microorganismos contaminantes en el biorreactor. 3. Medios Los medios de cultivo microbianos normalmente contienen componentes tales como una fuente de nitrógeno fijo, una fuente de carbono fijo, elementos traza, opcionalmente un tampón regulador del pH y fosfato (normalmente proporcionado como una sal de fosfato) . Otros componentes pueden incluir sales tales como cloruro de sodio, en particular para las microalgas de agua de mar. Las fuentes de nitrógeno incluyen fuentes de nitrógeno orgánicas e inorgánicas, entre ellas, por ejemplo, sin carácter limitante, nitrógeno molecular, nitrato, sales de nitrato, amoniaco (puro o en forma salina, tal como (NH4)2S04 y NH4OH) , proteina, harina de soya, licor de maceración del maíz y extracto de levadura. Los ejemplos de elementos traza incluyen zinc, boro, cobalto, cobre, manganeso y molibdeno en, por ejemplo, las formas respectivas de ZnCl2, H3BO3, CoCl2-6H20, CuCl2 -2H20, MnCl2 ·4?20 y (NH4) 6 o7024 ·4?20.

Los microorganismos útiles de acuerdo con los métodos de la presente invención se encuentran en diversos lugares y entornos en todo el mundo. Como consecuencia de su aislamiento de otras especies y su divergencia evolutiva resultante, puede ser difícil predecir el medio de cultivo particular para el cultivo y la generación óptimos de constituyentes lipidíeos y/o hidrocarbonados . En algunos casos, puede que no sea posible cultivar ciertas cepas efe microorganismos en un medio de cultivo particular debido a la presencia de algún componente inhibitorio o a la ausencia de algún nutriente esencial requerido por la cepa particular del microorganismo .

Normalmente los medios de cultivo sólidos y líquidos se pueden adquirir de una amplia variedad de fuentes, y las instrucciones para la preparación de medios particulares que son adecuados para una amplia variedad de cepas de microorganismos se pueden encontrar en Internet, por ejemplo, en http://www.utex.org/, un sitio mantenido por la Universidad de Texas en Austin, 1 University Station A6700, Austin, Texas, 78712-0183, para su colección de cultivos de algas (UTEX) . Por ejemplo, diversos medios de agua dulce y agua salada incluyen los descritos en la Publicación de PCT N.° 2008/151149, incorporada a la presente por referencia.

En un ejemplo particular, el medio Proteosa es adecuado para cultivos axénicos, y se puede preparar un volumen de 1 L del medio (pH ~ 6.8) mediante la adición de 1 g de proteosa peptona a 1 L de medio Bristol. El medio Bristol comprende NaN03 2.94 mM, CaCl2 -2H20 0.17 mM, MgS04 ·7?20 0.3 mM, 0.43 m , KH2P04 1.29 mM y NaCl 1.43 mM en una solución acuosa. Para medio agar al 1.5%, se pueden añadir 15 g de agar a 1 L de solución. La solución se cubre y esteriliza en autoclave, y se conserva después a una temperatura refrigerada antes de usarla. Otro ejemplo es el medio de aislamiento de Prototheca (PIM, por sus siglas en inglés), que comprende 10 g/L de hidrogenoftalato de potasio (KHP) , 0.9 g/L de hidróxido sódico, 0.1 g/L de sulfato de magnesio, 0.2 g/L de hidrogenofosfato de potasio, 0.3 g/L de cloruro de amonio, 10 g/L de glucosa, 0.001 g/L de clorhidrato de tiamina, 20 g/L de agar, 0.25 g/L de 5-fluorocitosina, a un pH comprendido en el rango de 5.0 a 5.2 (remítase a Pore, 1973, App. Microbiology, 26: 648-649) . Otros medios adecuados para utilizar con los métodos de la invención se pueden identificar fácilmente consultando la URL identificada anteriormente o consultando otras organizaciones que mantienen cultivos de microorganismos, tales como SAG, CCAP o CCALA. SAG se refiere a la colección de cultivos de algas en la Universidad de Góttingen (Gottingen, Alemania) , CCAP se refiere a la colección de cultivos de algas y protozoos gestionada por la Asociación Escocesa de Ciencias Marinas (Escocia, Reino Unido) y CCALA se refiere a la colección de cultivos del laboratorio de algas en el Instituto de Botánica (Tfeboñ, República Checa). Además, la patente de EE. UU. N.° 5.900.370 describe formulaciones de medios y condiciones adecuadas para la fermentación heterotrófica de especies de Prototheca.

Para la producción de aceite, la selección de una fuente de carbono fijo es importante, ya que el costo de la fuente de carbono fijo debe ser lo suficientemente bajo como para que la producción de aceite sea económica. De este modo, aunque las fuentes de carbono fijo pueden incluir, por ejemplo, acetato, floridosida, fructosa, galactosa, ácido glucurónico, glucosa, glicerol, lactosa, mañosa, N- acetilglucosamina, ramnosa, sacarosa y/o xilosa, la selección de materias primas que contengan estos compuestos es un aspecto importante de los métodos de las realizaciones de la invención. Las materias primas adecuadas útiles de acuerdo con los métodos de la invención pueden incluir, por ejemplo, licor negro, almidón de maiz, material celulósico despolimerizado, suero lácteo, melazas, papa, sorgo, sacarosa, remolacha azucarera, caña de azúcar, arroz y trigo. Las fuentes de carbono también se pueden proporcionar como una mezcla, tal como una mezcla de sacarosa y pulpa de remolacha azucarera despolimerizada . La fuente o las fuentes de carbono se pueden suministrar con una concentración de al menos aproximadamente 50 µ?, al menos aproximadamente 100 µ?, al menos aproximadamente 500 µ , al menos aproximadamente 5 mM, al menos aproximadamente 50 mM y al menos aproximadamente 500 mM de una o más fuentes de carbono fijo proporcionadas de forma exógena . Se prefieren las fuentes de carbono muy concentradas como materia prima para la fermentación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se añaden niveles de glucosa de al menos 300 g/L, al menos 400 g/L, al menos 500 g/L o al menos 600 g/L o superiores en la materia prima, antes del paso de cultivo, al cultivo de lote alimentado, en el que la fuente de carbono fijo muy concentrada se añade a las células con el tiempo mientras las células crecen y acumulan lípido. En otras realizaciones, se añaden niveles de sacarosa de al menos 500 g/L, al menos 600 g/L, al menos 700 g/L o al menos 800 g/L o superiores, antes del paso de cultivo, al cultivo de lote alimentado, en el que la fuente de carbono fijo muy concentrada se añade a las células con el tiempo mientras las células crecen y acumulan lipido. Los ejemplos no limitantes de fuentes de carbono fijo muy concentradas, tales como sacarosa, incluyen jugo de caña espeso, jugo de caña de azúcar, jugo de remolacha azucarera y melazas . Las fuentes de carbono de particular interés a efectos de la presente invención incluyen celulosa (en una forma despolimerizada) , glicerol, sacarosa y sorgo, cada uno de los cuales se describe más detalladamente a continuación.

De acuerdo con la presente invención, los microorganismos se pueden cultivar utilizando biomasa celulósica despolimerizada como materia prima. La biomasa celulósica (p. ej . , forraje tal como forraje de maíz) es barata y fácil de conseguir; sin embargo, se ha descubierto que tales materias primas inhiben el crecimiento de levaduras y las levaduras no pueden utilizar los azúcares de cinco carbonos producidos a partir de materiales celulósicos (p. ej . , xilosa a partir de hemicelulosa) . Por el contrario, al menos algunas microalgas pueden crecer en material celulósico procesado. Los materiales celulósicos generalmente incluyen aproximadamente un 40-60% de celulosa; aproximadamente un 20-40% de hemicelulosa; y un 10-30% de lignina.

Los materiales celulósicos incluyen residuos de cultivos energéticos herbáceos y leñosos, asi como también cultivos agrícolas, es decir, las partes de la planta, principalmente tallos y hojas, que no se eliminaron de los campos con el alimento principal o el producto fibroso. Los ejemplos incluyen desperdicios agrícolas tales como el bagazo de la caña de azúcar, cáscaras de arroz, fibra de maíz (incluidos los tallos, hojas, cascarillas y mazorcas), paja de trigo, paja de arroz, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de cítricos, pieles de cítricos; desperdicios forestales tales como diluyentes de madera dura y blanda, y residuos de madera dura y blanda de operaciones madereras; desperdicios de madera tales como desperdicios de aserraderos (virutas de madera, aserrín) y desperdicios del molino de pulpa; desperdicios urbanos tales como fracciones de papel de los desperdicios sólidos municipales, desperdicios urbanos de madera y desperdicios urbanos verdes tales como segados de hierba municipales; y. desperdicios de la construcción con madera. Los materiales celulósicos adicionales incluyen cultivos celulósicos dedicados tales como el pasto varilla, madera híbrida de álamo y Miscanthus, caña fibrosa y sorgo fibroso. Los azúcares de cinco carbonos que se producen a partir de este tipo de materiales incluyen la xilosa.

Los materiales celulósicos se pueden tratar para incrementar la eficacia con la que los microbios pueden utilizar el azúcar o los azúcares contenidos en los materiales. Las realizaciones de la invención proporcionan métodos para el tratamiento de materiales celulósicos después de la explosión ácida de modo que los materiales sean adecuados para utilizarlos en un cultivo heterotrófico de microbios (p. ej . , microalgas y levaduras oleaginosas). Tal como se indicó anteriormente, la biomasa lignocelulósica está compuesta por varias fracciones, que incluyen celulosa, un polímero cristalino de glucosa con enlaces beta-1,4 (un azúcar de seis carbonos), hemicelulosa, un polímero asociado más ligeramente compuesto principalmente por xilosa (un azúcar de cinco carbonos) y en menor medida por mañosa, galactosa, arabinosa, lignina, un polímero aromático complejo compuesto por alcohol sinapílico y sus derivados, y pectinas, que son cadenas lineales de un ácido poligalacturónico con enlaces alfa-1,4. Debido a la estructura polimérica de la celulosa y la hemicelulosa, los azúcares (p. ej . , xilosa y glucosa monomérica) contenidos en estas no se encuentran en una forma que muchos microbios puedan utilizar (metabolizar ) de forma eficaz. Para tales microbios, puede ser muy útil procesar adicionalmente la biomasa celulósica para generar los azúcares monoméricos que constituyen los polímeros con el fin de garantizar que los materiales celulósicos se utilizan de forma eficaz como materia prima (fuente de carbono) .

La celulosa o la biomasa celulósica se somete a un proceso, denominado "explosión", en el que la biomasa se trata con ácido sulfúrico diluido ( u otro ácido) a una temperatura y presión elevadas. Este proceso acondiciona la biomasa de modo que se pueda someter de forma eficaz a la hidrólisis enzimática de las fracciones celulósicas y hemicelulósicas para obtener monómeros de glucosa y xilosa. Los azúcares monoméricos resultantes se denominan azúcares celulósicos. Los azúcares celulósicos pueden ser utilizados posteriormente por microorganismos para producir varios metabolitos (p. ej . , lípido) . El paso de la explosión ácida da como resultado una hidrólisis parcial de la fracción hemicelulósica para, obtener los monosacáridos constituyentes. Estos azúcares se pueden liberar completamente de la biomasa con un tratamiento posterior. En algunas realizaciones, el tratamiento posterior es un tratamiento hidrotérmico que incluye lavar el material sometido a explosión con agua caliente, la cual elimina contaminantes tales como sales. Este paso no es necesario para fermentaciones de etanol celulósico debido a las concentraciones de azúcares más diluidas utilizadas en tales procesos. En otras realizaciones, el tratamiento posterior es un tratamiento ácido adicional. En otras realizaciones más, el tratamiento posterior es la hidrólisis enzimática del material sometido a explosión. Estos tratamientos también se pueden utilizar en cualquier combinación. El tipo de tratamiento puede afectar al tipo de azúcares liberados (p. e . , azúcares de cinco carbonos frente a azúcares de seis carbonos) y a la etapa en la que se liberen en el proceso. Como consecuencia de esto, se pueden crear corrientes diferentes de azúcares, ya sean principalmente de cinco carbonos o de seis carbonos. Estas corrientes enriquecidas de cinco carbonos o de seis carbonos se pueden dirigir, por lo tanto, a microorganismos específicos con diferentes capacidades de utilización de carbono .

Los métodos de la presente invención pueden implicar la fermentación hasta densidades celulares superiores a las que se consiguen normalmente en la fermentación etanólica. Debido a las densidades más elevadas de los cultivos para la producción de aceite celulósico heterotrófico, la fuente de carbono fijo (p. ej . , la corriente o las corrientes de azúcares derivados de materiales celulósicos) se encuentra preferentemente en una forma concentrada. El nivel de glucosa del material celulósico despolimerizado es preferentemente de al menos 300 g/L, al menos 400 g/L, al menos 500 g/L o al menos 600 g/1 antes del paso de cultivo, que es opcionalmente un cultivo de lote alimentado en el que el material se añade a las células con el tiempo mientras las células crecen y acumulan lipido. Por lo tanto, para generar y mantener las densidades celulares sumamente elevadas durante la producción de aceite lignocelulósico, la materia o materias primas de carbono se deben suministrar a los cultivos heterotróficos en una forma muy concentrada. Sin embargo, cualquier componente en la corriente de alimentación que no sea un sustrato para el microorganismo oleaginoso y que no sea metabolizado por este se acumulará en el biorreactor, lo cual puede dar lugar a problemas si el componente es tóxico o inhibe la producción del producto final deseado. Aunque los subproductos de tipo lignina y derivados de la lignina, los subproductos derivados de carbohidratos, tales como furfurales e hidroximetilfurfurales, y las sales derivadas de la generación de los materiales celulósicos (tanto en el proceso de explosión como en el proceso de neutralización posterior) e incluso azúcares de pentosa/hexosa no metabolizados pueden plantear problemas en las fermentaciones etanólicas, estos efectos se amplifican significativamente en un proceso en el que su concentración en la materia prima inicial sea elevada. Para conseguir concentraciones de azúcares en el rango de 300 g/L (o superiores) para azúcares de seis carbonos que se puedan utilizar en la producción a gran escala de aceite lignocelulósico que se describe en la presente invención, la concentración de estos materiales tóxicos puede ser 20 veces superior a las concentraciones que suelen estar presentes en las fermentaciones etanólicas de biomasa celulósica.

El tratamiento del proceso de explosión del material celulósico utiliza cantidades significativas de ácido sulfúrico, calor y presión, de este modo se liberan subproductos de carbohidratos, a saber furfurales e hidroximetilfurfurales . Los furfurales e hidroximetilfurfurales se producen durante la hidrólisis de hemicelulosa por deshidratación de xilosa para obtener furfural y agua. En algunas realizaciones de la presente invención, estos subproductos (p. ej . , furfurales e hidroximetilfurfurales) se eliminan del material lignocelulósico sacarificado antes de introducirlo en el biorreactor. En ciertas realizaciones de la presente invención, el proceso para la eliminación de los subproductos de carbohidratos es un tratamiento hidrotérmico de los materiales celulósicos sometidos a explosión. Además, la presente invención proporciona métodos en los que se utilizan cepas que pueden tolerar compuestos tales como furfurales o hidroximetilfurfurales para la producción de aceite lignocelulósico. En otra realización, la presente invención también proporciona métodos y microorganismos que no solamente pueden tolerar furfurales en los medios de fermentación, sino que de hecho pueden metabolizar estos subproductos durante la producción de aceite lignocelulósico.

El proceso de explosión también genera niveles significativos de sales. Por ejemplo, las condiciones típicas para la explosión pueden dar como resultado conductividades en exceso de 5 mS/cm cuando la biomasa celulósica sometida a explosión se resuspende en una proporción 10:1 de agua: sólidos (peso seco). En ciertas realizaciones de la presente invención, la biomasa sometida a explosión diluida se somete a sacarificación enzimática, y el sobrenadante resultante se concentra con un factor de 25 para utilizarlo en el biorreactor. El nivel salino (según se mide por conductividad) en la corriente o las corrientes de azúcares concentrados puede que sea inaceptablemente elevado (de hasta 1.5 M equivalentes de Na+) . Se generan a su vez sales adicionales durante la neutralización -de los materiales sometidos a explosión para el proceso de sacarificación enzimática posterior. Las realizaciones de la presente invención proporcionan métodos para eliminar estas sales de modo que la corriente o las corrientes de azúcares celulósicos concentrados resultantes se puedan utilizar en procesos heterotróficos para producir aceite lignocelulósico . En algunas realizaciones, el método de eliminación de estas sales consiste en la desionización con resinas tales como, sin carácter limitante, DOWEX Marathón MR3. En ciertas realizaciones, el paso de desionización con resinas se lleva a cabo antes de ajustar el pH o la concentración de los azúcares y el tratamiento hidrotérmico de la biomasa antes de la sacarificación, o cualquier combinación de lo anterior; en otras realizaciones, el paso tiene lugar después de uno o más de estos procesos. En otras realizaciones, el proceso de explosión en si se modifica para evitar de este modo que se generen sales hasta niveles inaceptablemente elevados. Por ejemplo, una alternativa a la explosión con ácido sulfúrico (u otro ácido) de la biomasa celulósica es la pulpación mecánica para que la biomasa celulósica se vuelva receptiva a la hidrólisis enzimática (sacarificación) . En otras realizaciones más, se utilizan cepas nativas de microorganismos resistentes a niveles elevados de sales o cepas modificadas genéticamente con resistencia a niveles elevados de sales.

A continuación se expone una realización preferida para el proceso de preparación de biomasa celulósica sometida a explosión para utilizar en la producción de aceite lignocelulósico heterotrófico utilizando microbios oleaginosos. Un primer paso comprende ajustar el pH de la biomasa celulósica sometida a explosión resuspendida al rango de 5.0-5.3 y a continuación lavar la biomasa celulósica tres veces. Este paso de lavado se puede llevar a cabo de varias formas, que incluyen el uso de resinas de intercambio iónico y desalinizantes, osmosis inversa, tratamiento hidrotérmico (como el descrito anteriormente) o simplemente la resuspensión y centrifugación repetidas en agua desionizada. Este paso de lavado da como resultado una corriente celulósica cuya conductividad está comprendida entre 100 y 300 S/cm y la eliminación de cantidades significativas de furfurales e hidroximetilfurfurales . El liquido decantado en este paso de lavado se puede guardar para concentrar azúcares de cinco carbonos liberados de la fracción hemicelulósica . Un segundo paso comprende la sacarificación enzimática de la biomasa celulósica lavada. En una realización preferida, se utiliza Acelerasa (Genencor) . Un tercer paso comprende la recuperación de azúcares mediante centrifugación o decantación y el enjuague de la biomasa sacarificada. La biomasa (sólidos) resultante es un componente energético denso con un alto contenido de lignina que se puede utilizar como combustible o se puede enviar a desechos. Se recoge la corriente de azúcares recuperados en el proceso de centrifugación/decantación y enjuague. Un cuarto paso comprende la microfiltración para eliminar sólidos contaminantes con recuperación del permeado. Un quinto paso comprende un paso de concentración que se puede llevar a cabo utilizando un evaporador de vacio. Este paso puede incluir opcionalmente la adición de agentes antiespumantes, tales como P'2000 ( Sigma/Fluka ) , que en ocasiones es necesaria debido al contenido proteico de la materia prima de azúcar resultante .

En otra realización de los métodos de la invención, la fuente de carbono es glicerol, incluido el subproducto de glicerol acidulado y . no acidulado procedente de la transesterificación de biodiésel. En una realización, la fuente de carbono incluye glicerol y al menos otra fuente de carbono diferente. En algunos casos, todo el glicerol y la fuente o las fuentes de carbono fijo diferentes se proporcionan al microorganismo al principio de la fermentación. En algunos casos, el glicerol y la fuente o las fuentes de carbono fijo diferentes se proporcionan al microorganismo simultáneamente con una proporción predeterminada. En algunos casos, el glicerol y la fuente o las fuentes de carbono fijo diferentes se proporcionan a los microbios con una tasa predeterminada durante el curso de la fermentación .

Algunas microalgas experimentan la división celular más rápido en presencia de glicerol que en presencia de glucosa (remítase a la Publicación de PCT N.° 2008/151149) . En estos casos, los procesos de crecimiento de dos etapas, en los que las células se alimentan primero de glicerol, para aumentar la densidad celular rápidamente, y se alimentan de glucosa después para acumular lípidos, pueden mejorar la eficacia con la que se producen los lípidos. El uso del subproducto de glicerol del proceso de transesterificación puede proporcionar ventajas económicas significativas cuando se recicla en el proceso de producción. Además se proporcionan otros métodos de alimentación, tales como mezclas de glicerol y glucosa. El uso de tales mezclas como alimentación también proporciona los mismos beneficios económicos. Además, la invención proporciona métodos de alimentación de microalgas con azúcares alternativos tales como sacarosa en diferentes combinaciones con glicerol.

En otra realización de los métodos de la invención, la fuente' de carbono es azúcar invertido. El azúcar invertido tiene una menor tendencia a cristalizar en comparación con la sacarosa y, por lo tanto, puede proporcionar ventajas para el almacenamiento y en la fermentación de lote alimentado, en la que, en el caso del cultivo heterotrófico de microbios, incluidas las microalgas, se necesita una fuente de carbono concentrada. En una realización, la fuente de carbono es azúcar invertido, preferentemente en una forma concentrada, preferentemente al menos 800 g/L, al menos 900 g/L, al menos 1000 g/L o al menos 1100 g/L antes del paso de cultivo, que es opcionalmente · un cultivo de lote alimentado. El azúcar invertido, preferentemente en una forma concentrada, se añade a las células con el tiempo mientras las células crecen y acumulan lipido.

En otra realización de los métodos de la invención, la fuente de carbono es sacarosa, incluida una materia prima compleja que contiene sacarosa, tal como el jugo de caña espeso obtenido tras procesar la caña de azúcar. Debido a las elevadas densidades de los cultivos para la producción de aceite heterotrófico, la fuente de carbono fijo (p. ej . , sacarosa, glucosa, etc.) está preferentemente en una forma concentrada, preferentemente al menos 500 g/L, al menos 600 g/L, al menos 700 g/L o al menos 800 g/L de la fuente de carbono fijo antes del paso de cultivo, que es opcionalmente un cultivo de lote alimentado en el que el material se añade a las células con el tiempo mientras las células crecen y acumulan lipidos. En algunos casos, la fuente de carbono es sacarosa en forma de jugo de caña espeso, preferentemente en una forma concentrada, preferentemente al menos un 60% de sólidos o aproximadamente 770 g/L de azúcar, al menos un 70% de sólidos o aproximadamente 925 g/L de azúcar, o al menos un 80% de sólidos o aproximadamente 1125 g/L de azúcar antes del paso de cultivo, que es opcionalmente un cultivo de lote alimentado. El jugo de caña espeso concentrado se añade a las células con el tiempo mientras las células crecen y acumulan lipido .

En una realización, el medio de cultivo incluye además al menos una enzima de utilización de sacarosa. En algunos casos, la enzima de utilización de la sacarosa es una sacarosa-invertasa . La enzima sacarosa-invertasa puede ser una enzima sacarosa-invertasa secretable codificada por un gen de sacarosa-invertasa exógeno expresado por la población de microorganismos. La sacarosa-invertasa secretable puede ser secretada por los microorganismos en el medio de cultivo para convertir la sacarosa del medio en glucosa y fructosa que pueda utilizar el microorganismo. Como se describe posteriormente, la sacarosa-invertasa puede ser recombinante, de este modo confiere a un microorganismo la capacidad de utilizar materias primas de sacarosa puras o complejas como fuente de carbono fijo para el crecimiento o la producción de aceite. En algunos casos, como se describe más detalladamente en la Sección IV, más adelante, las microalgas han sido modificadas genéticamente para expresar una enzima de utilización de sacarosa, tal como un transportador de sacarosa, una sacarosa-invertasa, una hexocinasa, una glucocinasa o una frutocinasa.

Las materias primas complejas que contienen sacarosa incluyen melazas de desecho obtenidas durante el procesamiento de la caña de azúcar; el uso de este producto de desecho de escaso valor obtenido durante el procesamiento de la caña de azúcar puede proporcionar un ahorro de costos importante en la producción de hidrocarburos y otros aceites. Otra materia prima compleja que contiene sacarosa y que es útil en los métodos de la invención es el sorgo, incluidos el jarabe de sorgo y el sorgo puro. El jarabe de sorgo se produce a partir del jugo de caña de sorgo dulce. Su perfil de azúcares está constituido principalmente por glucosa (dextrosa) , fructosa y sacarosa. 4. Producción de aceite Para la producción de aceite de acuerdo con los métodos descritos de la invención, es preferible cultivar las células en la oscuridad, como en el caso, por ejemplo, en el que se utilizan termentadores de capacidad sumamente elevada (superior o igual a 40 000 litros), los cuales no permiten que la luz llegue al cultivo. Las especies heterotróficas se cultivan y propagan para producir aceite en un medio que contenga una fuente de carbono fijo y en ausencia de luz; dicho cultivo se conoce como cultivo heterotrófico .

A modo de ejemplo, se introduce un inoculo de células de microalgas que producen lipido en el medio; hay un periodo de latencia (fase de latencia) antes de que las células comiencen a propagarse. Tras el periodo de latencia, la velocidad de propagación aumenta constantemente y entra en la fase logarítmica o exponencial. La fase exponencial va seguida a su vez de una ralentización de la propagación debido a la disminución de nutrientes, tales como nitrógeno, el aumento de sustancias tóxicas y los mecanismos de detección de cuórum. Después de esta ralentización, la propagación se detiene y las células entran en una fase estacionaria o estado de crecimiento constante, en función del entorno particular que se proporcione a las células. Para obtener la biomasa con un contenido lipidico elevado, el cultivo se cosecha normalmente mucho después del final de la fase exponencial, la cual puede finalizar temprano si se permite que el nitrógeno u otro nutriente fundamental (que no sea carbono) se agote, lo cual obliga a las células a convertir las fuentes de carbono, presentes en exceso, en lipido y, en particular, en triglicérido . Los parámetros de las condiciones de cultivo se pueden manipular para optimizar la producción total de aceite, la combinación de especies de lipidos producidas y/o la producción de un aceite especifico.

La producción de lipido por parte de las células que se describe en la presente puede tener lugar durante la fase logarítmica o posteriormente, incluida la fase estacionaria en la cual se suministran nutrientes o estos siguen estando disponibles para permitir que continúe la producción de lipido en ausencia de división celular.

Preferentemente, los microorganismos cultivados utilizando las condiciones descritas en la presente y/o conocidas en la técnica comprenden al menos aproximadamente un 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70% u 80-90% en peso celular seco de triglicérido. Las condiciones del proceso se pueden ajustar para incrementar el rendimiento lipidico de modo que sea adecuado para un uso particular y/o para reducir los costos de producción. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se cultiva una microalga en presencia de una concentración limitante de uno o más nutrientes, tales como, por ejemplo, nitrógeno, fósforo o azufre, y a la vez se proporciona un exceso de una fuente energética de carbono fijo tal como glucosa. La limitación de nitrógeno tiende a aumentar el rendimiento lipidico microbiano (una medida de la cantidad de lipido producido por gramo de peso celular seco) en comparación con el rendimiento lipidico microbiano en un cultivo en el que se proporciona nitrógeno en exceso. En realizaciones particulares, el aumento del rendimiento lipidico es de al menos aproximadamente: un , 10%, un 50%, un 100%, un 200% o un 500%. El microbio se puede cultivar en presencia de una cantidad limitante de un nutriente durante parte del periodo de cultivo total o durante el periodo completo. En realizaciones particulares, la concentración de nutrientes se alterna entre una concentración limitante y una concentración no limitante al menos dos veces durante el periodo de cultivo total. El contenido lipidico de las células se puede incrementar continuando el cultivo durante periodos de tiempo mayores mientras se proporciona un exceso de carbono, pero limitando el nitrógeno o en ausencia de este.

En otra realización, el rendimiento lipidico se incrementa cultivando un microbio que produce lipido (p. e . , una microalga) en presencia de uno o más cofactores para una enzima de la vía lipidica (p. ej . , una coenzima o un grupo prostético de una enzima sintética de ácidos grasos) . Generalmente, la concentración del cofactor o de los cofactores es suficiente para que el rendimiento del lipido microbiano (p. ej . , ácido graso) sea superior al. rendimiento del lipido microbiano en ausencia del cofactor o los cofactores. En una realización particular, el cofactor o los cofactores se proporcionan al cultivo mediante la inclusión en el cultivo de un microbio (p. ej . , microalga) que contiene un gen exógeno que codifica el cofactor o los cofactores. Como alternativa, el cofactor o los cofactores se pueden proporcionar al cultivo mediante la inclusión de un microbio (p. ej . , microalga) que contiene un gen exógeno que codifica una proteina que participa en la síntesis del cofactor. En ciertas realizaciones, los cofactores adecuados incluyen cualquier vitamina requerida por una enzima de la vía lipidica, tal como, por ejemplo: biotina o pantotenato. Los genes que codifican cofactores adecuados para utilizar en la invención o que participan en la síntesis de tales cofactores son muy conocidos y se pueden introducir en microbios (p. ej . , microalgas) utilizando constructos y técnicas como los que se describen anteriormente.

Los ejemplos específicos de biorreactores, condiciones de cultivo, y métodos de propagación y crecimiento heterotrófico descritos en la presente se pueden combinar de cualquier manera que sea adecuada para mejorar los rendimientos del crecimiento microbiano y la producción de lipido y/o proteina.

La biomasa de microalgas con un porcentaje alto de acumulación de aceite/lípido en peso seco se ha generado utilizando diferentes métodos de cultivo, los cuales son conocidos en la técnica (remítase a la Publicación de PCT N.° 2008/151149) . La biomasa de microalgas generada mediante los métodos de cultivo descritos en la presente y útil de acuerdo con la presente invención comprende al menos un 10% de aceite microalgáceo en peso seco. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas comprende al meno's un 25%, 50%, 60%, 70% o al menos un 80% de aceite microalgáceo en peso seco. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas contiene entre un 10 y un 90% de aceite microalgáceo, entre un 25 y un 75% de aceite microalgáceo, entre un 40 y un 75% de aceite microalgáceo, entre un 75 y un 85% o entre un 50 y un 70% de aceite microalgáceo en peso seco.

El aceite microalgáceo de la biomasa descrita en la presente o extraído de la biomasa para utilizar en los métodos y las composiciones de la presente invención puede comprender glicerolípidos con una o más cadenas laterales de éster de ácido graso diferentes. Los glicerolípidos están compuestos por una molécula de glicerol esterificada a una, dos o tres moléculas de ácidos grasos, que pueden tener longitudes variables y grados de saturación variables. Las características referentes a la saturación y a la longitud de las moléculas de ácidos grasos (y los aceites microalgáceos ) se pueden manipular para modificar las propiedades o las proporciones de las moléculas de ácidos grasos en los aceites microalgáceos de las realizaciones de . la presente invención modificando las condiciones de cultivo o la vía lipídica, tal como se describe más detalladamente en la Sección IV, más adelante. Las modificaciones particulares de las propiedades y las proporciones incluyen la alteración de la distribución de ácidos grasos de los triglicéridos microbianos, por ejemplo, cambios en el perfil de longitudes de cadena, perfil de saturación e hidroxilación de los ácidos grasos. Los aceites producidos de este modo pueden comprender un aceite natural. Como alternativa, se pueden preparar mezclas específicas de aceite microbiano ya sea dentro de una única especie de algas, mezclando la biomasa o aceite algáceo de dos o más especies de microalgas, o mezclando aceite algáceo de la invención con aceites procedentes de otras fuentes tales como la soya, colza, cañóla, palma, palmiste, coco, maíz, hortalizas de desecho, árbol del sebo, oliva, girasol, semilla del algodón, grasa de pollo, sebo bovino, sebo porcino, microalgas, macroalgas, microbios, Cuphea, lino, cacahuate, grasa blanca de calidad, manteca, Camellina sativa, semilla de mostaza, nuez de la India, avena, lupino, kenaf, caléndula, cáñamo, café, linaza (lino) , avellana, Euphorbia , pepita de calabaza, cilantro, camelia, ajonjolí, cártamo, arroz, tung, cacao, copra, adormidera, semillas de ricino, pacana, jojoba, nuez de macadamia, nuez de Brasil, aguacate, petróleo o una fracción destilada de cualquiera de los aceites precedentes.

La composición del aceite, es decir, las propiedades y proporciones de los constituyentes correspondientes a los ácidos grasos de los glicerolípidos , también se pueden manipular combinando biomasa o aceite de al menos dos especies distintas de microorganismos. En algunas realizaciones, al menos dos de las especies distintas de microalgas tienen diferentes perfiles glicerolipidicos . Las especies distintas de microalgas se pueden cultivar juntas o por separado, tal como se describe en la presente, preferentemente en condiciones heterotróficas , para generar los aceites respectivos. Las diferentes especies de microalgas pueden contener diferentes porcentajes de distintos constituyentes correspondientes a los ácidos grasos en los glicerolípidos de la célula.

En general, las cepas de Prototheca no contienen ácidos grasos con una longitud de cadena de C8-C14 o presentan un contenido muy bajo de estos. Por ejemplo, Prototheca moriformis (UTEX 1435) , Prototheca krugani (UTEX 329) , Prototheca stagnora (UTEX 1442) y Prototheca zopfii (UTEX 1438) no contienen ácidos grasos C8 (o contienen cantidades no detectables de estos), contienen entre un 0 y un 0.01% de ácidos grasos CIO, entre un 0.03 y un 2.1% de ácidos grasos C12 y entre un 1.0 y un 1.7% de ácidos grasos C14.

En algunos casos, las cepas microbianas gue contienen un transgén que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa con actividad frente a un sustrato de tipo acil graso-ACP con longitudes de cadena de C8 o C8-10 contienen al menos un 1.5%, al menos un 3.0%, al menos un 10%, al menos un 12% o más ácidos grasos con una longitud de cadena de C8. En otros casos, las cepas microbianas que contienen un transgén que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa con actividad frente a un sustrato de tipo acil graso-ACP con longitudes de cadena de CIO contienen al menos un 5.0%, al menos un 10.0%, al menos un 24%, al menos un 29% o más ácidos grasos con una longitud de cadena de CIO. En otros casos, las cepas microbianas que contienen un transgén que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa con actividad frente a un sustrato de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C12 contienen al menos, un 5%, al menos un 15%, al menos un 34%, al menos un 50% o más ácidos grasos con una longitud de cadena de C12. En otros casos, las cepas microbianas que contienen un transgén que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa con actividad frente a un sustrato de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C14 contienen al menos un 2.0%, al menos un 7%, al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 30%, al menos un 43% o más ácidos grasos con una longitud de cadena de C14. En otros casos, las cepas microbianas que contienen un transgén que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa con actividad frente a un sustrato de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C16 contienen al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 66% o más ácidos grasos con una longitud de cadena de C16. En otros casos más, las cepas microbianas que contienen un transgén que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa con actividad frente a un sustrato de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C18 y específicamente para C18:0 contienen unos niveles de ácidos grasos C18 : 0 de al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 26%, al menos un 40% o superiores. En cualquiera de estos ejemplos, el microbio puede ser una microalga tal como Prototheca .

En ejemplos no limitantes, una cepa microbiana que contiene un transgén que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa con actividad frente a un sustrato de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C8 contiene entre un 1 y un 20%, preferentemente entre un 1.8 y un 13% de ácidos grasos con una longitud de cadena de C8. En otros ejemplos no limitantes, una cepa microbiana que contiene un transgén que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa. con actividad frente a un sustrato de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de CIO contiene entre un 1 y un 40%, preferentemente entre un 1.91 y un 30% de ácidos grasos con una longitud de cadena de CIO. En otros ejemplos no limitantes, las cepas microbianas que contienen un transgén que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa con actividad frente a un sustrato de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C12 contienen entre un 10 y un 60%, preferentemente entre un 13.55 y un 55% de ácidos grasos con una longitud de cadena de C12. En otros ejemplos no limitantes, las cepas microbianas que contienen un transgén que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa con actividad frente a un sustrato de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C14 contienen entre un 1 y un 50%, preferentemente entre un 2.59 y un 43.27% de ácidos grasos con una longitud de cadena de C14. En otros ejemplos no limitantes, las cepas microbianas que contienen un transgén que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa con una gran especificidad frente a sustratos de tipo acil graso-ACP con longitudes de cadena carbonada variables contienen hasta un 70% de ácidos grasos con una longitud de cadena de C16. En otros casos, las cepas microbianas que contienen un transgén que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa con actividad frente a un sustrato de tipo acil graso-ACP con una longitud de cadena de C16 contienen hasta un 75%, preferentemente hasta un 67.42% de ácidos grasos con una longitud de cadena de C16. En algunos casos, las cepas microbianas que contienen un transgén que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa con actividad frente a un sustrato de tipo acil graso-ACP con longitudes de cadena comprendidas entre C8 y C14 contienen entre un 1 y un 790% o entre un 2 y un 80% de ácidos grasos (C8-C14). En algunos casos, las cepas microbianas que contienen un transgén que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa con actividad frente a un sustrato de tipo acil graso-ACP con longitudes de cadena comprendidas entre C12 y C14 contienen al menos un 50% o un 60% de ácidos grasos C12-C14. En algunos casos, mantener las cepas microbianas transgénicas bajo una presión selectiva elevada y constante para retener los genes exógenos resulta beneficioso debido al aumento del ácido graso deseado con una longitud de cadena especifica. También se pueden obtener unos niveles elevados de retención del gen exógeno insertando genes exógenos en los cromosomas nucleares de las células utilizando vectores de recombinación homologa y métodos que se describen en la presente. Las células recombinantes que contienen genes exógenos integrados en cromosomas nucleares constituyen un objeto de la invención. En cualquiera de estos ejemplos, el microbio puede ser una microalga tal como Prototheca .

Opcionalmente, el aceite de microalgas también puede incluir otros constituyentes producidos por las microalgas o incorporados en el aceite de microalgas a partir del medio de cultivo. Estos otros constituyentes pueden estar presentes en diferentes cantidades dependiendo de las condiciones de cultivo utilizadas para cultivar las microalgas, las especies de microalgas, el método de extracción utilizado para recuperar el aceite de microalgas a partir de la biomasa y otros factores que puedan afectar a la composición del aceite de microalgas. Los ejemplos no limitantes de estos constituyentes incluyen carotenoides , presentes en una cantidad de 0.025 a 0.3 mcg/g, preferentemente de 0.05 a 0.244 microgramos/gramo de aceite; clorofila A, presente en una cantidad de 0.025 a 0.3 mcg/g, preferentemente de 0.045 a 0.268 microgramos/gramo de aceite; clorofila total, presente en una cantidad inferior a 0.03 mcg/g, preferentemente inferior a 0.025 microgramos/gramo de aceite; gamma-tocoferol, presente en una cantidad de 35 a 175 mcg/g, preferentemente de 38.3 a 164 microgramos/gramo de aceite; tocoferoles totales, presentes en una cantidad de 50 a 300 mcg/g, preferentemente de 60.8 a 261.7 microgramos/gramo de aceite; una cantidad inferior a un 0.5%, preferentemente inferior a un 0.25% de brasicasterol, campesterol, estigmasterol o betasitosterol; tocotrienoles totales, presentes en una cantidad inferior a 300 microgramos/gramo de aceite; y tocotrienoles totales, presentes en una cantidad de 225 a 350 mcg/g, preferentemente de 249.6 a 325.3 microgramos/gramo de aceite .

Los otros constituyentes pueden incluir, sin carácter limitante, fosfolipidos, tocoferoles, tocotrienoles , carotenoides (p. ej . , alfa-caroteno, beta-caroteno, licopeno, etc.), xantófilas (p. ej . , luteina, zeaxantina, alfa-criptoxantina y beta-criptoxantina) y varios compuestos orgánicos o inorgánicos. En algunos casos, el aceite extraído de especies de Prototheca comprende entre 0.001 y 0.05, preferentemente entre 0.003 y 0.039 microgramos de luteína/gramo de aceite, menos de 0.005, preferentemente menos de 0.003 microgramos de licopeno/gramo de aceite; y menos de 0.005, preferentemente menos de 0.003 microgramos de beta-caroteno/gramo de aceite.

III. MÉTODOS Y MATERIALES PARA LA MOFICIACION GENÉTICA La presente invención proporciona métodos y materiales para modificar genéticamente células de Prototheca y células huésped recombinantes útiles en los métodos de la presente invención, que incluyen, sin carácter limitante, células huésped de Prototheca moriformis, Prototheca zopfii, Prototheca krugani y Prototheca stagnora recombinantes. La descripción de estos métodos y materiales se divide en subsecciones para mayor comodidad del lector. En la subsección 1, se describen métodos de transformación. En la subsección 2, se describen métodos de modificación por ingeniería genética que emplean recombinación homologa. En la subsección 3, se describen componentes y vectores de expresión . 1. Métodos de modificación - transformación Las células se pueden transformar medíante cualquier técnica adecuada, que incluye, p. ej . , biolística, electroporación (remítase a Maruyama et al. (2004), Biotechnology Techniques 8:821-826), transformación con microesferas de vidrio y transformación con whiskers de carburo de silicio. Otro método que se puede utilizar implica la formación de protoplastos y el uso de CaCl2 y polietilenglicol (PEG) para introducir ADN recombinante en células de microalgas (remítase a Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol . 4:63-73, que describe el uso de este método para la transformación de Chorella ellipsoidea) . La cotransformación de microalgas se puede utilizar para introducir dos moléculas vectoriales distintas en una célula simultáneamente (remítase, por ejemplo, a Protist, diciembre de 2004; 155(4) : 381-93) .

También se pueden utilizar métodos biolisticos (remítase, por ejemplo, a Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6:299 302, la Patente de EE. UU. N.° 4.945.050); electroporación (Fromm et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:5824 5828); el uso de un haz de láser, microinyección o cualquier otro método capaz de introducir ADN en una microalga, para transformar una célula de Prototheca . 2. Métodos de modificación - recombinación homologa La recombinación homologa es la capacidad de secuencias de ADN complementarias para alinearse e intercambiar regiones de homología. El ADN transgénico ("donante") que contiene secuencias homologas a las secuencias genómicas diana ("molde") se introduce en el organismo y posteriormente se somete a recombinación en el genoma en el sitio de las secuencias homologas genómicas correspondientes.

La capacidad para realizar una recombinación homologa en un organismo huésped tiene muchas implicaciones prácticas sobre lo que se puede llevar a cabo a nivel genético molecular y es útil en la generación de un microbio oleaginoso que pueda producir aceites diseñados. Por su propia naturaleza, la recombinación homologa es un evento preciso de modificación dirigida a genes; por lo tanto, la mayoría de las líneas transgénicas generadas con la misma secuencia de modificación dirigida serán esencialmente idénticas en cuanto al fenotipo, lo cual reduce el número de eventos de transformación . que se deben evaluar. La recombinación homologa también dirige eventos de inserción génica en el cromosoma huésped, lo cual puede dar como resultado una estabilidad genética excelente, incluso en ausencia de selección genética. Debido a que locus cromosómicos diferentes podrán afectar probablemente a la expresión génica, incluso de promotores/UTR heterólogos, la recombinación homologa puede ser un método de búsqueda de locus en un entorno genómico poco familiar y de evaluación del impacto de estos entornos sobre la expresión génica.

Una estrategia de modificación genética particularmente útil que emplea recombinación homologa incorpora elementos reguladores huésped específicos tales como promotores/UTR para dirigir la expresión génica heteróloga de un modo sumamente específico. Por ejemplo, cabría esperar que la ablación o desactivación de genes de desaturasa/familias génicas con un gen heterólogo que codifica un marcador selectivo incrementara el porcentaje global de ácidos grasos saturados producidos en la célula huésped. El Ejemplo 6 describe los constructos de modificación dirigida por recombinación homologa y un ejemplo práctico de tales ablaciones o desactivaciones de genes de desaturasa generadas en Prototheca moriformis. Otra estrategia para reducir la expresión de un gen endógeno consiste en emplear la reducción o el silenciamiento inducido por ARN de la expresión génica que incluye, sin carácter limitante, una estrategia de ARNi o antisentido, asi como también una estrategia de ARNbc. Las estrategias de ARNbc, ARNi y antisentido son muy conocidas en la técnica e incluyen la introducción de un constructo de expresión que, cuando se exprese como ARNm, conduciría a la formación de un ARN horquillado o un constructo de expresión que contendría una porción del gen diana que se transcribiría en la orientación antisentido. Estas tres estrategias darían como resultado la reducción de la expresión del gen diana. El Ejemplo 6 también describe constructos de expresión y un ejemplo práctico de la reducción de la expresión de un gen de desaturasa delta 12 de Prototheca moriformis endógeno (FADc) mediante una estrategia de ARNi y antisentido.

Debido a que la recombinación homologa es un evento preciso de modificación dirigida a genes, se puede utilizar para modificar de forma precisa cualquier nucleótido o nucleótidos en un gen o región de interés, siempre que se hayan identificado suficientes regiones flanqueantes. Por lo tanto, la recombinación homologa se puede utilizar como una forma de modificación de secuencias reguladoras que afectan a la expresión génica de ARN y/o proteínas. También se puede emplear para modificar regiones que codifican proteínas en un intento de modificar actividades enzimáticas tales como la km, las afinidades y la especificidad del sustrato, de este modo se consigue el cambio deseado en el metabolismo de la célula huésped. La recombinación homologa proporciona un medio potente para manipular el genoma huésped que da como resultado la modificación dirigida a genes, conversión génica, deleción génica, duplicación génica, inversión génica y el intercambio de elementos reguladores de la expresión génica tales como promotores, potenciadores y 3'UTR.

La recombinación homologa se puede conseguir utilizando constructos de modificación dirigida que contienen trozos de secuencias endógenas cuya "diana" es el gen o región de interés en el genoma de la célula huésped endógena. Tales secuencias de modificación dirigida pueden estar situadas en 5' respecto al gen o la región de interés, 3' respecto al gen/región de interés o incluso flanquear el gen/región de interés. Tales constructos de modificación dirigida se pueden transformar en la célula huésped ya sea como un ADN plasmídico superhelicoidal con una estructura principal vectorial adicional, un producto de PCR sin estructura principal vectorial o como una molécula linealizada. En algunos casos, puede ser conveniente exponer primero las secuencias homologas del ADN transgénico (ADN donante) a una enzima de restricción. Este paso puede incrementar la eficacia de la recombinación y reducir la aparición de eventos no deseados. Otros métodos para incrementar la eficacia de la recombinación incluyen utilizar PCR para generar ADN transgénico transformante que contenga extremos lineales homólogos a las secuencias genómicas diana.

A efectos ilustrativos no limitantes, las regiones de secuencias de ADN donante que son útiles para la recombinación homologa incluyen la región KE858 de ADN en Prototheca moriformis. KE858 es un fragmento genómico de 1.3 kb que engloba parte de la región codificante de una proteina que comparte homología con la familia de proteínas de ARN transferente (ARNt) . Los ensayos de inmunotransferencia de Southern han demostrado que la secuencia de KE858 está presente en una única copia en el genoma de Prototheca moriformis (UTEX 1435) . Esta región y los ejemplos de uso de esta región para la modificación dirigida por recombinación homologa se han descrito en la Solicitud de PCT N.° PCT/US2009/066142. Otra región de ADN donante que es útil es la secuencia genómica denominada en la presente "6S" (secuencias donantes en SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84) . Cabe destacar que la secuencia 6S no es la secuencia de ARNr 6S.

El uso de esta secuencia en recombinación homologa en Prototheca morifomis se describe a continuación en los Ej emplos . 3. Vectores y componentes vectoriales Los vectores para la transformación de microorganismos de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante técnicas con las que estarán familiarizados los expertos en la técnica teniendo en cuenta la descripción de la presente. Un vector contiene normalmente uno o más genes, donde cada gen codifica la expresión de un producto deseado (el producto génico) y está unido operablemente a una o más secuencias de control que regulan la expresión génica o dirigen el producto génico a una posición particular en la célula recombinante . Para mayor comodidad del lector, esta subsección está dividida en subsecciones . La subsección A describe secuencias de control contenidas normalmente en vectores, asi como también secuencias de control novedosas proporcionadas por la presente invención. La subsección B describe genes contenidos normalmente en vectores, asi como también métodos de optimización de codones novedosos y genes preparados utilizándolos proporcionados por la invención.

A. Secuencias de control Las secuencias de control son ácidos nucleicos que regulan la expresión de una secuencia codificante o dirigen un producto géhico a una posición particular en el interior o exterior de una célula. Las secuencias de control que regulan la expresión incluyen, por ejemplo, promotores que regulan la transcripción de una secuencia codificante y terminadorés que detienen la transcripción de una secuencia codificante. Otra secuencia de control es una secuencia 3' no traducida situada en el extremo de una secuencia codificante que codifica una señal de poliadenilación . Las secuencias de control que dirigen productos génicos a posiciones particulares incluyen aquellas que codifican péptidos señal, que dirigen la proteina a la que están unidos a una posición particular en el interior o exterior de la célula.

Por lo tanto, un diseño de un vector ilustrativo para la expresión de un gen exógeno en una microalga contiene una secuencia que codifica un producto génico deseado (por ejemplo, un marcador seleccionábale, una enzima de modificación de la vía lipidica o una enzima de utilización de sacarosa) en unión operable con un promotor activo en la microalga. Como alternativa, si el vector no contiene un promotor en unión operable con la secuencia codificante de interés, la secuencia codificante se podrá transformar en las células de modo que se una operablemente a un promotor endógeno en el punto de integración del vector. Se ha demostrado que el método de transformación sin promotor funciona en microalgas (remítase, por ejemplo, a Plant Journal 14:4, (1998), págs. 441-447).

Muchos promotores son activos en microalgas, incluidos promotores que son endógenos a las algas que se están transformando, así como también promotores que no son endógenos a las algas que se están transformando (es decir, promotores de otras algas, promotores de plantas superiores y promotores de ciertos virus vegetales o virus algáceos) . En la publicación de PCT N.° 2008/151149 y las referencias citadas en dicho documento se describen promotores endógenos y/o exógenos ilustrativos que son activos en microalgas (así como también genes de resistencia a antibióticos funcionales en microalgas) .

El promotor utilizado para expresar un gen exógeno puede ser el promotor unido de forma natural a ese gen o puede ser un promotor heterologo. Algunos promotores son activos en más de una especie de microalgas. Otros promotores son específicos para una especie. Los promotores ilustrativos incluyen promotores tales como ß-tubulina de Chlamydomonas reinhardtii , utilizada más adelante en los Ejemplos, y promotores víricos, tales como los del virus del mosaico de la coliflor (VMC) y el virus de Chlorella , que se ha demostrado que son activos en múltiples especies de microalgas (remítase, por ejemplo, a Plant Cell Rep. marzo de 2005;23 (10-11) :727-35; J Microbiol. agosto de 2005; 43 (4 ): 361-5; Mar Biotechnol (NY) . enero de 2002 ; 4 ( 1 ): 63-73) . Otro promotor que es adecuado para ' utilizar con el fin de expresar genes exógenos en Prototheca es el promotor/5 ' UTR de la glutamato-deshidrogenasa de Chlorella sorokiniana.

Opcionalmente , se utilizan al menos 10,. 20, 30, 40, 50 O 60 nucleótidos o más de estas secuencias que contienen un promotor. En la lista de secuencias de esta solicitud se enumeran los promotores ilustrativos útiles para la expresión de genes exógenos en Prototheca , tales como el promotor del gen HUPl de Chlorella (SEQ ID NO:l) y el promotor de la nitrato-reductasa de Chlorella ellipsoidea (SEQ ID NO:2). Los promotores del virus de Chlorella también se pueden utilizar para expresar genes en Prototheca tales como las SEQ ID NO: 1-7 de la Patente de EE. UU. 6.395.965. Se pueden encontrar otros promotores activos en Prototheca, por ejemplo, en Biochem Biophys Res Commun. 14 de octubre de 1994 ; 204 ( 1 ): 187-94; Plant Mol Biol. octubre de 1994 ; 26 ( 1 ): 85-93 ; Virology. 15 de agosto de 2004; 326 (1) : 150-9; ^ y Virology. 5 de enero de 2004 ; 318 (1 ): 214-23. En los Ejemplos más adelante se describen detalladamente otros promotores útiles.

Un promotor se puede caracterizar generalmente como constitutivo o inducible. Los promotores constitutivos son generalmente activos o funcionan para dirigir la expresión en todo momento (o en ciertos momentos durante el ciclo de la vida celular) al mismo nivel. Los promotores inducibles, por el contrario, son activos (o se desactivan) , o se inducen o reprimen de forma significativa únicamente en respuesta a estímulos. Ambos tipos de promotores encuentran aplicación en los métodos de la invención. Los promotores inducibles útiles en la invención incluyen aquellos que median la transcripción de un gen unido operablemente en respuesta a un estimulo, tal como una molécula de peso molecular bajo proporcionada exógenamente (p. ej . , glucosa, como en la SEQ ID NO:l), temperatura (calor o frió) , carencia de nitrógeno en medios de cultivo, etc. Los promotores adecuados pueden activar la transcripción de un gen esencialmente silencioso o incrementar, preferentemente de forma sustancial, la transcripción de un gen unido operablemente que se transcribe en un nivel bajo. Los Ejemplos a continuación describen otros promotores inducibles que son útiles en células de Prototheca La inclusión de una secuencia de control correspondiente a la región de terminación es opcional y, si se emplea, entonces la elección será principalmente una de conveniencia, ya que la región de terminación es relativamente intercambiable. La región de terminación puede ser nativa de la región de inicio de la transcripción (el promotor) , puede ser nativa de la secuencia de ADN de interés o se puede obtener de otra fuente. Remítase, por ejemplo, a Chen y Orozco, Nucleic Acids Res. (1988) 16:8411.

La presente invención también proporciona secuencias de control y genes recombinantes, y vectores que los contienen que proporcionan el direccionamiento de un producto génico de interés hacia un compartimento celular particular tal como cloroplastos, plástidos, mitocondrias o el retículo endoplasmático . Además, las realizaciones de la presente invención incluyen secuencias de control y genes recombinantes, y vectores que los contienen que proporcionan la secreción de una proteína fuera de la célula.

Las proteínas que se expresan en el genoma nuclear de Prototheca se pueden dirigir al plástido utilizando señales de direccionamiento plastídico. Se conocen secuencias de direccionamiento plastídico endógenas de Chlorella, tales como genes en el genoma nuclear de Chlorella que codifican proteínas que se dirigen al plástido; remítase, por ejemplo, a los números de acceso a GenBank AY646197 y AF499684, y, en una realización, tales secuencias de control se utilizan en los vectores de la presente invención para dirigir la expresión de una proteína a un plástido de Prototheca.

Los Ejemplos describen más adelante el uso de secuencias de direccionamiento plastídico de algas para dirigir proteínas heterólogas al compartimento correcto en la célula huésped. Se prepararon genotecas de ADNc utilizando células de Prototheca moriformis y Chlorella protothecodies, y se describen en la solicitud de PCT N.° PCT/US2009/066142.

En otra realización de la presente invención, la expresión de un polipéptido en Prototheca se dirige al retículo endoplasmático . La inclusión de una señal de selección o retención adecuada en ' un vector de expresión garantiza que las proteínas se retengan en el retículo endoplasmático (RE) y no se pasen posteriormente al aparato de Gblgi. Por ejemplo, el vector IMPACTVECT0R1.3, de Wageningen UR- Plant Research International, incluye la señal de selección o retención muy conocida KDEL. Con este vector, la retención en el RE tiene la ventaja práctica de que se ha descrito que mejora los niveles de expresión aumentándolos cinco veces o más. Parece ser que la principal razón por la que esto ocurre es que el RE contiene concentraciones menores y/o diferentes proteasas responsables de la degradación tras la traducción de proteínas expresadas que están presentes en el citoplasma. Las señales de retención en el RE funcionales en microalgas verdes son conocidas. Por ejemplo, remítase a Proc Nati Acad Sci U S A. 26 de abril de 2005 ; 102 ( 17 ) : 6225-30.

En otra realización de la presente invención, un polipéptido se dirige para que se secrete fuera de la célula en los medios de cultivo. Remítase a Hawkins et al., Current Microbiology Vol. 38 (1999), págs . 335-341 para consultar ejemplos de señales de secreción activas en Chlorella que se pueden utilizar, de acuerdo con los métodos de la invención, en Prototheca .

B. Optimización de codones y genes Normalmente, un gen incluye un promotor, una secuencia codificante y secuencias de control de terminación. Cuando se prepara mediante tecnología de ADN recombinante, un gen se puede denominar cásete de expresión y puede estar flanqueado por sitios de restricción . para ser insertado de forma conveniente en un vector que se utiliza para introducir el gen recombinante en una célula huésped. El cásete de expresión puede estar flanqueado por secuencias de ADN del genoma u otro ácido nucleico diana para facilitar la integración estable del cásete de expresión en el genoma mediante recombinación homologa. Como alternativa, el vector y su cásete de expresión pueden permanecer no integrados (p. ej . , un episoma) , en cuyo caso el vector normalmente incluye un origen de replicación, que es capaz de proporcionar la replicación del ADN del vector heterólogo.

Un gen común presente en un vector es un gen que codifica una proteína, cuya expresión permite que la célula recombinante que contiene la proteína se diferencie de células que no expresan la proteína. Dicho gen, y su producto génico correspondiente, se denomina marcador¦ seleccionable o marcador de selección. Se puede utilizar cualquiera de los muchos marcadores seleccionables diferentes en un constructo transgénico útil para transformar Prototheca. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de resistencia G418, el gen de nitrato-reductasa (remítase a Dawsbn et al. (1997), Current Microbiology 35:356-362), el gen de higromicina-fosfotransferasa (HPT; remítase a im et al. (2002), Mar. Biotechnol . 4:63-73), el gen de neomicina-fosfotransferasa y el gen ble, que confiere resistencia a la fleomicina (Huang et al. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:197-205). Los métodos para determinar la sensibilidad de microalgas a antibióticos son muy conocidos. Por ejemplo, remítase a Mol Gen Genet. 16 de octubre de 1996; 252 (5) : 572-9, sacarosa-invertasa, según se describe en la presente, y complementacion para la auxotrofia de tiamina, según también se describe en la presente.

También se pueden emplear otros marcadores seleccionables que no están basados en antibióticos en un constructo transgénico útil para transformar microalgas en general, incluidas las especies de Prototheca . También se pueden utilizar como marcadores seleccionables genes que confieren la capacidad de utilización de ciertas fuentes de carbono que previamente no podían ser utilizadas por las microalgas. A modo ilustrativo, las cepas de Prototheca moriformis normalmente crecen poco o nada en sacarosa. Utilizando un constructo que contenga un gen de sacarosa-invertasa se puede conferir la capacidad a transformantes positivos de crecer en sacarosa como sustrato de carbono. En la Sección IV más adelante, se comentan más detalles sobre el empleo de la utilización de sacarosa como marcador seleccionable junto con otros marcadores seleccionables.

A efectos de la presente invención, el vector de expresión utilizado para preparar una célula huésped recombinante de la invención incluirá al menos dos y a menudo tres genes, si uno de los genes es un marcador seleccionable.

Por ejemplo, una Prototheca modificada genéticamente de la invención se puede preparar mediante la transformación con vectores de la invención que comprenden, además de un marcador seleccionable, uno o más genes exógenos, tales como, por ejemplo, un gen de sacarosa-invertasa o un gen de acil-ACP-tioesterasa . Uno o ambos genes se pueden expresar utilizando un promotor inducible, que permite controlar el momento relativo en el que se expresen estos genes para incrementar el rendimiento lipidico y la conversión en ásteres de ácidos grasos. La expresión de los dos o más genes exógenos puede estar controlada por el mismo promotor inducible o controlada por promotores inducibles (o constitutivos) diferentes. En la última situación, la expresión de un primer gen exógeno se puede inducir durante un primer periodo de tiempo (durante el cual se puede inducir o no la expresión de un segundo gen exógeno) y la expresión de un segundo gen exógeno se puede inducir durante un segundo periodo de tiempo (durante el cual se puede inducir o no la expresión de un primer gen exógeno) .

En otras realizaciones, los dos o más genes exógenos (además de cualquier marcador seleccionable) son: una acil graso-ACP-tioesterasa y una acil graso-CoA/aldehido-reductasa, cuya acción combinada proporciona un producto alcohólico. Se proporcionan además otras combinaciones de genes exógenos que incluyen, sin carácter limitante, una acil graso-ACP-tioesterasa y una acil graso-CoA-reductasa para generar aldehidos. En una realización, el vector proporciona la combinación de una acil graso-ACP-tioesterasa, una acil graso-CoA-reductasa y una aldehido graso-descarbonilasa para generar alcanos. En cada una de estas realizaciones, se pueden expresar uno o más genes exógenos utilizando un promotor inducible.

Otros vectores ilustrativos de la invención que expresan dos o más genes exógenos incluyen aquellos que codifican tanto un transportador de sacarosa como una enzima sacarosa-invertasa y aquellos que codifican tanto un marcador seleccionable como una sacarosa-invertasa secretada. La Prototheca recombinante transformada con cualquiera de los tipos de vectores produce lipidos con costos de fabricación menores debido a la capacidad modificada de utilización de la caña de azúcar (y azúcares derivados de la caña de azúcar) como fuente de carbono. La inserción de los dos genes exógenos descritos anteriormente se puede combinar con la alteración de la biosintesis de polisacáridos mediante mutagénesis dirigida y/o aleatoria, que dirige un flujo de carbono incluso mayor a la producción de lipido. De modo individual y combinados, la conversión trófica, la modificación para alterar la producción de lipido y el tratamiento con enzimas exógenas alteran la composición lipidica producida por un microorganismo. La alteración puede ser un cambio en la cantidad de lipidos producidos, la cantidad de una o más especies hidrocarbonadas producidas con relación a otros lipidos y/o los tipos de especies lipidicas producidas en el microorganismo. Por ejemplo, las microalgas se pueden modificar para que produzcan una cantidad y/o un porcentaje mayor de TAG (triacilglicéridos) .

Para la expresión óptima de una proteina recom inante , es beneficioso emplear secuencias codificantes que produzcan ARNm con codones utilizados preferentemente por la célula huésped que se haya de transformar. Por lo tanto, la expresión adecuada de transgenes puede requerir que el uso de codones del transgén coincida con la preferencia codónica especifica del organismo en el que el transgén se esté expresando. Los mecanismos precisos en los que se basa este efecto son muchos pero incluyen el balance adecuado de agrupaciones de ARNt aminoacilado disponibles con las proteínas que se están sintetizando en la célula, acoplado con una traducción más eficaz del ARN mensajero transgénico (ARNm) cuando se satisface esta necesidad. Cuando el uso de codones en el transgén no está optimizado, las agrupaciones de ARNt disponibles no son suficientes para permitir una traducción eficaz del ARNm heterólogo, lo cual produce la detención y terminación ribosómicas y la posible inestabilidad del ARNm transgénico.

La presente invención proporciona ácidos nucleicos con codones optimizados útiles para la expresión satisfactoria de proteínas recombinantes en Prototheca . El uso de codones en especies de Prototheca se analizó estudiando secuencias de ADNc aisladas de Prototheca moriformis. Este análisis representa la interrogación sobre 24 000 codones y dio como resultado la siguiente Tabla 2.

Tabla 2. Uso preferido de codones en cepas de Prototheca.

Ala GCG 345 (0.36) Asn AAT 8 (0.04) GCA 66 (0.07) AAC 201 (0.96) GCT 101 (0.11) GCC 442 (0.46) Pro CCG 161 (0.29) CCA 49 (0.09) Cys TGT 12 (0.10) CCT 71 (0.13) TGC 105 (0. 0) CCC 267 (0.49) Asp GAT 43 (0.12) Gln CAG 226 (0.82) GAC 316 (0.88) CAA 48 (0.18) Glu GAG 377 (0.96) Arg AGG 33 (0.06) GAA 14 (0.04) AGA 14 (0.02) CGG 102 (0.18) Phe TT 89 (0.29) CGA 49 (0.08) TTC 216 (0.71) CGT 51 (0.09) CGC 331 (0.57) Gly GGG 92 (0.12) GGA 56 (0.07) Ser AGT 16 (0.03) GGT 76 (0.10) AGC 123 (0.22) GGC 559 (0.71) TCG 152 (0.28) TCA 31 (0.06) His CAT 42 (0.21) CT 55 (0.10) CAC 154 (0.79) TCC 173 (0.31) Ile ATA 4 (0.01) Thr ACG 184 (0.38) ATT 30 (0.08) ACA 24 (0.05) ATC 338 (0.91) ACT 21 (0.05) ACC 249 (0.52) Lys AAG 284 (0.98) AAA 7 (0.02) Val GTG 308 (0.50) GTA 9 (0.01) Leu TTG 26 (0.04) GTT 35 (0.06) TTA 3 (0.00) GTC 262 (0.43) CTG 447 (0.61) CTA 20 (0.03) Trp TGG 107 (1.00) CTT 45 (0.06) CTC 190 (0.26) Tyr TAT 10 (0.05) TAC 180 (0.95) Met ATG 191 (1.00) Parada TGA/TAG/TAA En otras realizaciones, el gen en el vector recombinante ha sido sometido a optimización de codones con referencia a una cepa de microalga que no sea una cepa de Prototheca. Por ejemplo, en la Patente de EE. UU. 7.135.290 se describen métodos de recodificación de genes para la expresión en microalgas. Se dispone de información adicional sobre la optimización de codones, p. ej . , en la base de datos de uso de codones de GenBank.

En cuanto a las realizaciones con genes de condones optimizados, los genes . optimizados se optimizan preferentemente para incrementar la expresión del producto génico del gen que se está optimizando al menos un 10% y, más preferentemente, al menos un 20, 40, 60, 80, 100 o 200%.

Aunque los métodos y materiales de la invención permiten la introducción de cualquier gen exógeno en Prototheca, los genes relacionados con la utilización de sacarosa y la modificación de la via lipidica son de particular interés, según se expone en las siguientes secciones.

IV. MARCADORES SELECCIONABLES 1. Utilización de sacarosa En una realización, la célula recombinante de la invención contiene además uno o más genes de utilización de sacarosa exógenos. En varias realizaciones, el gen o genes codifican una o más proteínas seleccionadas del grupo constituido por una fructocinasa, una glucocinasa, una hexocinasa, una sacarosa-invertasa y un transportador de sacarosa. Por ejemplo, la expresión de un transportador de sacarosa y una sacarosa-invertasa permite a Prototheca transportar sacarosa al interior de la célula desde los medios de cultivo e hidrolizar sacarosa para proporcionar glucosa y fructosa. Opcionalmente, se puede expresar además una fructocinasa en casos en los que la actividad hexocinasa endógena es insuficiente para que la fosforilización de fructosa sea máxima. Algunos ejemplos de transportadores de sacarosa adecuados son los números de acceso a GenBank CAD91334, CAB92307 y CAA53390. Algunos ejemplos de fructocinasas adecuadas son los números de acceso a GenBank P26984, P26420 y CAA43322.

En una realización, la presente invención proporciona una célula huésped que secreta una sacarosa-invertasa . La secreción de una sacarosa-invertasa obvia la necesidad de expresar un transportador que pueda transportar sacarosa a la célula. Esto se debe a que una invertasa secretada cataliza la conversión de una molécula de sacarosa . en una molécula de glucosa y una molécula de fructosa, las cuales pueden ser ambas transportadas y utilizadas por los microbios proporcionados en la invención. Por ejemplo, la expresión de una sacarosa-invertasa (tal como SEQ ID NO: 3) con una señal de secreción (tal como la de la SEQ ID NO: 4 (de levadura) , SEQ ID NO: 5 (de plantas superiores), SEQ ID NO: 6 (señal de secreción de consenso eucariota) y SEQ ID NO: 7 (combinación de la secuencia señal de plantas superiores y de consenso eucariota) genera actividad invertasa fuera de la célula. La expresión de esta proteina, tal como permite la metodología de modificación genética descrita en la presente, permite a las células que ya son capaces de utilizar glucosa extracelular como fuente de energía utilizar sacarosa como fuente de energía extracelular.

Una especie de Prototheca que exprese una invertasa en medios que contienen sacarosa será una especie de microalgas preferida para la producción de aceite. La expresión y el direccionamiento extracelular de esta proteína completamente activa permite a las células huésped resultantes crecer en sacarosa, mientras que sus homologas no transformadas no pueden. Por lo tanto, las realizaciones de la presente invención proporcionan células de microalgas (incluida Prototheca) recombinantes con un gen de invertasa con codones optimizados, incluido, sin carácter limitante, el gen de invertasa de levadura, integrado en su genoma de modo que el gen de invertasa se expresa tal y como se evalúa por la actividad de invertasa y la hidrólisis de sacarosa. Los genes de invertasa son útiles como marcadores seleccionables en las células recombinantes , tales como células que pueden crecer en sacarosa, mientras que sus homólogos no transformados no pueden; y los métodos para seleccionar células huésped recombinantes que emplean una invertasa como marcador seleccionable son muy valiosos para la genética molecular de algas .

La expresión exitosa de una sacarosa-invertasa en Prototheca también ilustra otro · aspecto de la presente invención, ya que demuestra que se pueden expresar proteínas (recombinantes ) heterólogas en la célula algácea, y transportarlas con éxito . fuera de la célula y al medio de cultivo en una forma completamente activa y funcional. Por lo tanto, las realizaciones de la presente invención proporcionan métodos y reactivos para expresar una amplia y diversa gama de proteínas heterólogas en microalgas y secretarlas fuera de la célula huésped. Tales proteínas incluyen,, por ejemplo, enzimas industriales tales como, por ejemplo, lipasas, proteasas, celulasas, pectinasas, amilasas, esterasas, oxidoreductasas , transferasas , lactasas, isomerasas e invertasas, así como también proteínas terapéuticas tales como, por ejemplo, factores de crecimiento, citocinas, anticuerpos de longitud completa que comprenden dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, Fab, scFv (fragmento variable de cadena única) , anticuerpos de camélidos, fragmentos de anticuerpos, fusiones de fragmentos de anticuerpos, fusiones de receptores de anticuerpos, insulina, interferones y factores de crecimiento insulínicos.

La expresión exitosa de una sacarosa-invertasa en Prototheca también ilustra otro aspecto de la presente invención, ya que proporciona métodos y reactivos para el uso de péptidos de tránsito fúngicos en algas para dirigir la secreción de proteínas en Prototheca ; y métodos y reactivos para determinar si un péptido puede actuar, así como su capacidad para actuar, como un péptido de tránsito en células de Prototheca . Los métodos y reactivos de la invención se pueden utilizar como una herramienta y plataforma para identificar otros péptidos de tránsito que puedan transportar con éxito las proteínas fuera de una célula, y la invertasa de levadura tiene una gran utilidad en estos métodos. Según se demuestra en este ejemplo, la eliminación del péptido de tránsito endógeno de la invertasa de levadura y su sustitución por otros péptidos de tránsito, ya sean endógenos a la alga huésped o de otras fuentes (eucariota, procariota y vírica) , permiten identificar si cualquier péptido de interés podría actuar como un péptido de tránsito a la hora de guiar la salida de la proteina fuera de la célula.

Algunos ejemplos de sacarosa-invertasas adecuadas incluyen las identificadas con los números de acceso a GenBank CAB95010, NP_012104 y CAA06839. En la Tabla 3 a continuación se enumeran ejemplos no limitantes de invertasas adecuadas. Las secuencias de aminoácidos para cada invertasa enumerada se incluyen en la Lista de Secuencias posteriormente. En algunos casos, el gen de utilización de sacarosa exógeno adecuado para utilizar en los métodos y vectores de la invención codifica una sacarosa-invertasa con una identidad aminoacidica de al menos un 40, 50, 60, 75 o 90% o superior respecto a una sacarosa-invertasa seleccionada de la Tabla 3.

Tabla 3. Sacarosa-invertasas .

NO:25 Invertasa Beta AJ278531 SEQ ID vulgaris NO:26 subsp. Vulgaris beta- Bifidobacterium AAT28190 SEQ ID fructofuranosidasa breve UCC2003 NO:27 (invertasa) Invertasa Saccharomyces NP_012104 SEQ ID cerevisiae NO: 8 (nucleótidos) SEQ ID NO:28 (aminoácidos) Invertasa A Zymomonas AA038865 SEQ ID mobilis NO:29 La secreción de una invertasa al medio de cultivo por parte de Prototheca permite a las células crecer del mismo modo en melazas de desecho obtenidas durante el procesamiento de la caña de azúcar que en glucosa de calidad de reactivo puro; el uso de este producto de desecho de escaso valor obtenido durante el procesamiento de la caña de azúcar puede proporcionar un ahorro significativo de costos en la producción de lípidos y otros aceites. Por lo tanto, la presente invención proporciona un cultivo microbiano que contiene una población de microorganismos de Prototheca y un medio de cultivo que . comprende (i) sacarosa y (ii) una enzima sacarosa-invertasa . En varias realizaciones, la sacarosa del cultivo proviene de sorgo, remolacha azucarera, caña de azúcar, melazas o material celulósico despolimerizado (que puede contener opcionalmente lignina) . En otro aspecto, los métodos y reactivos de la invención aumentan significativamente el número y tipo de materias primas que pueden ser utilizadas por las microalgas recombinantes u otros microbios. Aunque los microbios e emplificados en la presente se alteran de modo que puedan utilizar sacarosa, los métodos y reactivos de la invención se pueden aplicar de modo que las materias primas, tales como materiales celulósicos, puedan ser utilizadas por un microbio huésped modificado de la invención con la capacidad de secretar celulasas, pectinasas, isomerasas o similares, de tal forma que los productos de ruptura de las reacciones enzimáticas ya no sean tan solo tolerados sino que sean utilizados como fuente de carbono por el huésped. Un ejemplo de esto se describe a continuación y en los Ejemplos de microbios modificados para que expresen una a-galactosidasa secretable, lo cual les confiere la capacidad de hidrolizar enlaces de tipo -galactosilo en oligosacáridos tales como los contenidos en rafinosa y estaquiosa, que son dos oligosacáridos presentes en corrientes de desechos agrícolas. 2. Expresión de alfa-galactosidasa Aunque la expresión de una sacarosa-invertasa, según se ha descrito previamente, confiere la capacidad a células de Prototheca para utilizar sacarosa de forma más eficaz como fuente de carbono (mediante la hidrólisis enzimática del enlace o¡ entre las moléculas de fructosa y glucosa en el disacárido sacarosa), la expresión de otras enzimas que hidrolizan otros tipos de enlaces en oligosacáridos puede conferir la capacidad a células de Prototheca para utilizar otras fuentes de carbono. La expresión de estas enzimas (y la capacidad resultante para utilizar fuentes de carbono que Prototheca y otras células de microalgas no podrían utilizar de forma ordinaria) se puede utilizar como marcador seleccionable para estas células transgénicas de Prototheca permitiendo la selección de clones positivos que son capaces de crecer en estas fuentes de carbono.

En una realización, la célula recombinante de Prototheca de la invención contiene además uno o más genes exógenos que codifican enzimas que degradan polisacáridos . En varias realizaciones, el gen o los genes que codifican una enzima que degrada polisacáridos es un gen que codifica una OÍ-galactosidasa secretada. La expresión de una a-galactosidasa secretada exógena en una célula de Prototheca confiere la capacidad a estas cepas transformadas de crecer en azúcares (fuentes de carbono) que contengan enlaces de tipo D-galactosidasa tales como enlaces OÍ entre las unidades de monosacáridos galactosa y glucosa. Las cepas de Prototheca que expresan una a-galactosidasa secretada exógena serán capaces de utilizar disacáridos tales como melibiosa (disacárido compuesto por -D-galactosa-glucosa ) .

Los azúcares tales como rafinosa (un trisacárido compuesto por galactosa-glucosa-fructosa con enlaces a) y estaquiosa (un tetrasacárido compuesto por dos unidades de D-galactosa con enlaces a seguidas de glucosa y fructosa con enlaces a) se encuentran presentes en proporciones significativas en corrientes de desechos agrícolas tales como pulpa de remolacha (rafinosa) y harina de soya (estaquiosa) . Tales residuos agrícolas representan una fuente de carbono sin explotar significativa para la conversión en aceite por parte de microbios (incluida Prototheca) capaces de utilizarlos .

Las cepas de Prototheca son incapaces de utilizar oligosacáridos tales como rafinosa y estaquiosa en cualquier cantidad significativa o en absoluto. En el caso de rafinosa y estaquiosa, aunque las cepas transgénicas que expresan una sacarosa-invertasa (como se ha descrito anteriormente) tienen la capacidad de hidrolizar el enlace a entre la fructosa y la glucosa en los derivados de tipo -galactosilo de la sacarosa, el resto de los oligosacáridos permanecerá, sin embargo, inutilizado, ya que la sacarosa-invertasa no escindirá los enlaces a remanentes en estos azúcares y los disacáridos resultantes no se podrán utilizar. En otra realización, la célula de Prototheca recombinante de la invención comprende tanto un gen exógeno que codifica una sacarosa-invertasa como un gen exógeno que codifica una -galactosidasa . De este modo, las cepas que expresan tanto una sacarosa-invertasa como una a-galactosidasa serán capaces de hidrolizar completamente oligosacáridos tales como rafinosa y estaquiosa, lo cual hará posible el consumo de los monómeros que los componen. Además, los genes que codifican a-galactosidasa se pueden utilizar como un marcador seleccionable para la transformación. Los clones que contengan el gen exógeno de -galactosidasa tendrán la capacidad de crecer en melibiosa. Los ejemplos de genes de a-galactosidasa adecuados para su uso en cepas de Prototheca incluyen el gen MELl de Saccharomyces carlbergensís y el gen AglC de Aspergilus niger. Cabe destacar que se ha descubierto que no todos los genes de o¡-galactosidasa son funcionales en especies de- Prototheca , incluso cuando los genes se han optimizado de acuerdo con el uso preferido de codones en cepas de Prototheca . Los Ejemplos más adelante demuestran la capacidad de las células transgénicas de Prototheca para crecer en melibiosa cuando se han transformado con el gen MELl de codones optimizados de S. carlbergensís y el gen- AglC de A. niger, pero no con un gen que codifica -galactosidasa de la planta superior Cyamopsis tetragonobola (frijol guar) . 3. Complementación para la auxotrofia de tiamina Existe constancia de que las cepas de Prototheca , incluida Prototheca moriformis, presentan auxotrofia de tiamina (remítase, por ejemplo, a Ciferri, 0. (1956) Nature, vol. 178, págs . 1475-1476), lo cual significa que estas cepas requieren tiamina en los medios de nutrientes para su crecimiento. La auxotrofia de tiamina puede ser el resultado de mutaciones o falta de expresión de enzimas en la vía biosintética de la tiamina. Las cepas transgénicas complementadas que expresan la enzima o las enzimas que faltan en la vía biosintética de la tiamina pueden crecer posteriormente sin tiamina añadida, de este modo se reduce el costo de los medios de nutrientes y a la vez la biomasa de microalgas resultante se vuelve más adecuada para ser utilizada como pienso para . animales . La complementación con una enzima de la vía biosintética de la tiamina también se puede utilizar como un marcador seleccionable, ya que el gen transgénico confiere la capacidad de crecer en placas/medios que no contengan tiamina.

En una realización, la célula de Prototheca recombinante de la invención contiene además uno o más genes exógenos que codifican una enzima de la via biosintética de la tiamina. En otra realización, la célula de Prototheca recombinante de la invención comprende un gen exógeno que codifica hidroximetilpirimidin-fosfato-sintasas de fuentes algáceas, vegetales o cianobacterianas . En otras realizaciones, la hidroximetilpirimidin-fosfato-sintasa está codificada por un gen THIC. En otras realizaciones más, el gen THIC es THIC de Coccomyxa C-169, THIC de Arabidopsis thaliana o thiC de Synechocystis sp. PCC 6803. Los Ejemplos más adelante describen detalladamente la modificación de Prototheca moriformis UTEX 1435 con prototrofia de timania restaurada.

V. MODIFICACION DE LA VIA LIPIDICA Además de modificar la capacidad de las microalgas u otros microbios para utilizar materias primas tales como materias primas que contienen sacarosa, la presente invención también proporciona microalgas recombinantes u otros microbios que han sido modificados para alterar las propiedades y/o proporciones de los lipidos producidos. La via además, o como alternativa, se puede modificar para alterar las propiedades y/o proporciones de vari'as moléculas de lipidos producidas mediante el procesamiento enzimático de lipidos e intermedios en la via de ácidos grasos. En varias realizaciones, las células de Prototheca recombinantes de la invención presentan, en comparación con sus homologas no transformadas, un rendimiento lipidico optimizado por unidad de volumen y/o por unidad de tiempo, una longitud de la cadena carbonada optimizada (p. ej . , para la producción de diésel renovable o para aplicaciones de productos químicos industriales que requieren materia prima lipídica) , una posición y/o un número mayor o menor de dobles enlaces, opcionalmente hasta cero, hidroxilación de ácidos grasos y una mayor proporción de hidrógeno : carbono de una especie particular de lípido o de una población de lipidos diferentes.

En realizaciones particulares, la expresión de una o más enzimas fundamentales que controlan los puntos de ramificación en el metabolismo de síntesis de ácidos grasos se ha incrementado o reducido para mejorar la producción de lípido. El incremento de la expresión se puede conseguir, por ejemplo, transformando células con constructos de expresión en los que se expresa un gen que codifica la enzima de interés, p. ej . , utilizando un promotor fuerte y/o elementos potenciadores que incrementan la transcripción. Estos constructos pueden incluir un marcador selecciónatele de modo que los transformantes se puedan someter a selección, lo cual puede dar como resultado el mantenimiento del gen, y posiblemente amplificación del constructo y para obtener un incremento en el nivel de expresión de la enzima codificada. Los ejemplos de enzimas adecuadas para el incremento de la expresión de acuerdo con los métodos de la invención incluyen la piruvato-deshidrogenasa, que desempeña una función en la conversión de piruvato en acetil-CoA (los ejemplos, algunos de microalgas, incluyen los números de acceso a GenBank NP_415392; AAA53047; Q1XDM1 y CAF05587) . El incremento de la expresión de la piruvato-deshidrogenasa puede aumentar la producción de acetil-CoA y de este modo incrementar la síntesis de ácidos grasos. La acetil-CoA-carboxilasa cataliza el paso inicial de la síntesis de ácidos grasos. Por consiguiente, se puede incrementar la expresión de esta enzima para aumentar la producción de ácidos grasos (los ejemplos, de algunas microalgas, incluyen los números de acceso, a GenBank BAA94752; AAA75528; AAA81471; YP_537052; YP_536879; NP_045833 y ?7??57908) . La producción de ácidos grasos también se puede aumentar incrementando la expresión de la proteína portadora de acilo (ACP) , que porta las cadenas de acilo en fase de crecimiento durante la síntesis de ácidos grasos (los ejemplos, algunos de microalgas, incluyen los números de acceso a GenBank A0T0F8; P51280; NP_849041; YP_874433) . La glicerol-3-fosfato-aciltransferasa cataliza el paso limitante de la velocidad de la síntesis de ácidos grasos. El incremento de la expresión de esta enzima puede hacer que la producción de ácidos grasos aumente (los ejemplos, algunos de microalgas, incluyen los números de acceso a GenBank AAA74319; AAA33122; AAA37647; P4485.7; y AB094442) .

El aumento y la reducción de la expresión de genes se puede aplicar a reguladores globales que controlan la expresión de los genes de las vías biosintéticas de ácidos grasos. Por consiguiente, se pueden incrementar o reducir la expresión de uno o más , reguladores globales de la síntesis de ácidos grasos, según proceda, para inhibir o aumentar, respectivamente, la expresión de una pluralidad de genes sintéticos de ácidos grasos y, en última instancia, para incrementar la producción de. lipidos. Los ejemplos incluyen proteínas de unión a elementos reguladores de esterol (SREBP) , tales como SREBP-la y SREBP-lc (por ejemplo, consulte los números de acceso a GenBank NP_035610 y Q9WTN3) .

La presente invención también proporciona células de Prototheca recombinantes que han sido modificadas para que contengan uno o más genes exógenos que codifican enzimas de modificación de lipidos tales como, por ejemplo, acil graso-ACP-tioesterasas (remítase a la Tabla 4), acil graso-CoA/aldehído-reductasas (remítase a la Tabla 6) , acil graso-CoA-reductasas (remítase a la Tabla 7), aldehido graso-decarbonilasa (remítase a la Tabla 8), aldehido graso-reductasas, desaturasas (tales como estearoil-ACP-desaturasas y acil graso-desaturasas ) y escualeno-sintasas (consulte el número de acceso a GenBank AF205791) . Aunque las acil graso-ACP-tioesterasas normalmente no modifican químicamente de forma directa los lipidos, su manipulación de acuerdo con las realizaciones de la invención puede alterar el perfil de ácidos grasos de una célula, especialmente en cuanto a la distribución de dobles enlaces y longitudes de cadena. En algunas realizaciones, los genes que codifican una acil graso-ACP-tioesterasa y una proteína portadora de acilo coexpresada de forma natural se transforman en. una célula de Prototheca o de otra microalga o de otro microbio, opcionalmente con uno o más genes que codifican otras enzimas de modificación de lipidos.- En otras realizaciones, la ACP y la acil graso-ACP-tioesterasa pueden presentar afinidad la una por la otra, lo cual supone una ventaja cuando se utilizan las dos juntas en los microbios y los métodos de la presente invención, independientemente de si se coexpresan o no de forma natural en un tejido u organismo particular. Por lo tanto, las realizaciones de la presente invención contemplan tanto pares coexpresados de forma natural de estas enzimas como también aquellas que comparten afinidad por interaccionar entre sí para facilitar la escisión de una cadena carbonada de una longitud específica de la ACP.

En otras realizaciones más, un gen exógeno que codifica una desaturasa se transforma en la célula de microalga o de otro microbio junto con uno o más genes que codifican otras enzimas de modificación de lipidos para proporcionar modificaciones con respecto a la saturación de los lipidos. En otras realizaciones, se sobreexpresa un gen de desaturasa endógeno (p. ej . , mediante la introducción de copias adicionales del gen) en una célula de microalga o de otro microbio. La estearoil-ACP-desaturasa (consulte, p. ej . , los números de acceso a GenBank AAF15308; ABM45911 y AAY86086) , por ejemplo, cataliza la conversión de estearoil-ACP en oleoil-ACP. El incremento de la expresión de este gen puede aumentar la proporción de ácidos grasos monosaturados producidos por una célula; mientras que la reducción de su expresión puede disminuir la proporción de monoinsaturados. A efectos ilustrativos, las estearoil-ACP-desaturasas (SAD) son responsables de la síntesis de ácidos grasos C18:l a partir de precursores C18:0. Otra familia de desaturasas son las acil graso-desaturasas (FAD), incluidas las desaturasas de ácidos grasos delta 12 (?12 FAD) . Estas desaturasas también proporcionan modificaciones con respecto a la saturación de los lípidos. A efectos ilustrativos, las desaturasas de ácidos grasos delta 12 son responsables de la síntesis de ácidos grasos C18:2 a partir de precursores C18 : 1. De forma análoga, se puede controlar la expresión de una o más desaturasas de glicerolípidos para alterar la proporción de ácidos grasos insaturados respecto a saturados, tales como una desaturasa de ácidos grasos ?-6, desaturasa de ácidos grasos ?-3 o desaturasa de ácidos grasos ?-6. En algunas realizaciones, la desaturasa se puede seleccionar con referencia a una longitud de la cadena carbonada deseada, de modo que la desaturasa sea capaz de realizar modificaciones en sitios específicos dentro- de un sustrato con una longitud de carbonos específica o sustratos con una longitud de carbonos comprendida dentro de un rango específico. En otra realización, si el perfil de ácidos grasos deseado es un incremento de monoinsaturados (tales como C16:l y/o C18:l), la sobreexpresión de una SAD o la expresión de una SAD heteróloga se puede acoplar con el silenciamiento o inactivación (p. ej . , mediante mutación, ARNi, antisentido o desactivación de un gen de desaturasa endógeno, etc.) de una acil graso-desaturasa (FAD) u otro gen de desaturasa.

En otras realizaciones,, la célula de microalga o de otro microbio se ha modificado para que contenga un gen de desaturasa endógeno mutado, donde la mutación desactiva el gen o la enzima desaturasa. En algunos casos, el gen de desaturasa endógeno mutado es una desaturasa de ácidos grasos (FAD). En otros casos, el gen de desaturasa endógeno mutado es una estearoil-proteína portadora de acilo-desaturasa (SAD) El Ejemplo 6 más adelante describe la desactivación o ablación dirigida de estearoil-ACP-desaturasas y desaturasas de ácidos grasos delta 12 en Prototheca . El Ejemplo 6 también describe el uso de ARNi o constructos antisentido para reducir la expresión de un gen de desaturasa endógeno.

En algunos casos, puede resultar beneficioso agrupar una o más de las técnicas de modificación genética con el fin de obtener una célula transgénica que produzca el perfil lipidico deseado. En una realización, una célula de microalga o de otro microbio comprende un gen de desaturasa endógeno mutado y uno o más genes exógenos . En los ejemplos no limitantes, una célula de microalga o de otro microbio con un gen de desaturasa endógeno mutado también puede expresar un gen de acil graso-ACP-tioesterasa exógeno y/o un gen de sacarosa-invertasa . El Ejemplo 6 más adelante describe una célula de Prototheca transgénica que contiene una desactivación o ablación dirigida de una SAD endógena y también expresa una sacarosa-invertasa y una tioesterasa con preferencia por C14 de Cinnamomum camphora. En este caso, la célula de Prototheca transgénica produce un perfil lipidico muy parecido al perfil lipidico presente en el sebo. El sebo normalmente se obtiene a partir de carne de vaca reciclada o grasa de cordero, es sólido a temperatura ambiente y se utiliza en varias aplicaciones en la industria alimentaria, de cosméticos y de productos químicos. El perfil de ácidos grasos del sebo es: un 4% de C14:0; un 26% de C16:0; un 3% de C16:l-; un 14% de C18:0; un 41% de C18:l; un 3% de C18:2 y un 1% de C18:3. Según se muestra en el Ejemplo 6 más adelante, los clones de células transgénicas de Prototheca con una desactivación o ablación dirigida de una SAD endógena y que expresan una tioesterasa con preferencia por C14 de C. camphora presentan perfiles lipidíeos de: menos de un 1% de C12 y ácidos grasos con una longitud menor de la cadena carbonada; de un 2.74% a un 6.13% de C14:0; de un 23.07% a un 25.69% de C16:0; de un 7.02% a un 11.08% de C18:0; de un 42.03% a un 51.21% de C18:l y de un 9.37% a un 13.45% de C18:2 (expresado como un porcentaje del área) . En algunos casos, las células transgénicas de Prototheca presentan perfiles lipidíeos de: un 3-5% de C14:0; un 25-27% de C16:0; un 10-15% de C18:0 y un 40-45% de C18:l.

En realizaciones particulares, los microbios de la presente invención están modificados genéticamente para que expresen uno o más genes exógenos seleccionados entre una acil-ACP-tioesterasa, una acil-CoA/aldehído-reductasa, üna acil graso-CoA-reductasa, una aldehido graso-reductasa, una aldehido graso-descarbonilasa o una proteína portadora de acilo coexpresada de forma natural. Previamente se han descrito métodos de expresión adecuados respecto a la expresión de un gen de lipasa, incluidos, entre otros métodos, la expresión inducible y la expresión compartimentada . Una acil graso-ACP-tioesterasa escinde un ácido graso de una protéina portadora de acilo (ACP) durante la síntesis de lípidos. Mediante procesamiento enzimático adicional, el ácido graso escindido se combina a continuación con una coenzima para obtener una molécula de acil-CoA. Esta acil-CoA es el sustrato de la actividad enzimática de una acil graso-CoA-reductasa para obtener un aldehido, así como también para una acil graso-CoA/aldehído-reductasa para obtener un alcohol. El aldehido producido por acción de la acil graso-CoA-reductasa identificada anteriormente es el sustrato de la actividad enzimática adicional ya sea por una aldehido graso-reductasa para obtener un alcohol o una aldehido graso-descarbonilasa para obtener un alcano o alqueno.

En algunas realizaciones, los ácidos grasos, glicerolípidos o los alcoholes primarios, aldehidos, alcanos o alquenos correspondientes generados por los métodos descritos en la presente contienen 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono. Los ácidos grasos preferidos para la producción de diésel, biodiésel, diésel renovable o combustible para aviones, o los alcoholes primarios, aldehidos, alcanos y alquenos correspondientes para aplicaciones industriales contienen de 8 a 14 átomos de carbono. En ciertas realizaciones, los ácidos grasos anteriores, asi como también las otras moléculas hidrocarbonadas correspondientes, están saturados (sin dobles ni triples enlaces carbono-carbono); son monoinsaturados (un -único doble enlace) ; poliinsaturados (dos o más dobles enlaces; son lineales (no cíclicos) o ramificados. Para la producción de combustible, se prefiere una mayor saturación.

Las enzimas que se acaban de describir tienen una especificidad preferencial por la hidrólisis de un sustrato que contenga un número específico de átomos de carbono. Por ejemplo, una acil graso-ACP-tioesterasa puede tener preferencia por escindir un ácido graso con 12 átomos de carbono de la ACP. En algunas realizaciones, la ACP y la tioesterasa de longitud específica pueden tener afinidad una por la otra, lo que hace que sean particularmente útiles combinadas (p. ej . , los genes exógenos de tioesterasa y ACP se pueden coexpresar de forma natural en un tejido u organismo particular del que se derivan) . Por lo tanto, en varias realizaciones, la célula de¦> Prototheca recombinante de la invención puede contener un gen exógeno que codifica una proteína con especificidad para la catálisis de una actividad enzimática (p. ej . , escisión de un ácido graso de una ACP, reducción de una acil-CoA para obtener un aldehido o un alcohol, o conversión de un aldehido en un alcano) con respecto al número de átomos de carbono contenidos en el sustrato. La especificidad enzimática puede ser, en varias realizaciones, respecto a un sustrato que contenga de 8 a 34 átomos de carbono, preferentemente de 8 a 18 átomos de carbono y, más preferentemente, de 8 a 14 átomos de carbono. Una especificidad preferida es respecto a un sustrato que contenga menos, es decir, 12, en lugar de más, es decir, 18, átomos de carbono.

Otras acil graso-ACP-tioesterasas adecuadas para utilizar con los microbios y métodos de la invención incluyen, sin carácter limitante, las enumeradas en la Tabla 4.

Tabla . Acil graso-ACP-tioesterasas y números de acceso a GenBank.

Acil graso-ACP-tioesterasa de Umbellularia californica (# de GenBank AAC49001) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cinnamomu camphora (# de GenBank Q39473) Acil graso-ACP-tioesterasa de Umbellularia californica (# de GenBank Q41635) Acil graso-ACP-tioesterasa de Myristica fragrans (# de GenBank ???71729) Acil graso-ACP-tioesterasa de Myristica fragrans (# de GenBank AAB71730) Acil graso-ACP-tioesterasa de Elaeis guineensis (# de GenBank ABD83939) Acil graso-ACP-tioesterasa de Elaeis guineensis (# de GenBank AAD42220) Acil graso-ACP-tioesterasa de Elaeis guineensis (# de GenBank AAD42220.2) Acil graso-ACP-tioesterasa de Populus tomentosa (# de GenBank ABC47311) Acil graso-ACP-tioesterasa de Arabidopsis thaliana (# de GenBank NP_172327) Acil graso-ACP-tioesterasa de Arabidopsis thaliana (# de GenBank CAA85387) Acil graso-ACP-tioesterasa de Arabidopsis thaliana (# de GenBank CAA85388) Acil graso-ACP-tioesterasa de Gossypiu hirsutum (# de GenBank Q9SQI3) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea lanceolata (# de GenBank CAA54060) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana (# de GenBank AAC72882) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea calophylla subsp . mesostemon (# de GenBank ABB7158 1) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea lanceolata (# de GenBank CAC19933) Acil graso-ACP-tioesterasa de Elaeis guineensis (# de GenBank AAL15645) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana (# de GenBank Q39513) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana (# de GenBank Q39513.1) Acil graso-ACP-tioesterasa de Gossypium hirsutum (# de GenBank AAD01982) Acil graso-ACP-tioesterasa de Vitis vínifera (# de GenBank CAN81819) Acil graso-ACP-tioesterasa de Garcinia mangostana (# de GenBank AAB51525) Acil . graso-ACP-tioesterasa de Garcinia mangostana (# de GenBank AAB51525.1) Acil graso-ACP-tioesterasa de Brassica júncea (# de GenBank ABI18986) Acil graso-ACP-tioesterasa de Madhuca longifolia (# de GenBank AAX51637) Acil graso-ACP-tioesterasa de Brassica napus (# de GenBank ABH11710) Acil¦ graso-ACP-tioesterasa de Brassica napus (# de GenBank CAA52070.1) Acil graso-ACP-tioesterasa de Oryza sativa (grupo-cultivar indica) (# de GenBank EAY86877) Acil graso-ACP-tioesterasa de Oryza sativa (grupo-cultivar japónica) (# de GenBank NP_001068400 ) Acil graso-ACP-tioesterasa de Oryza sativa (grupo-cultivar indica) (# de GenBank EAY99617) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana (# de GenBank AAC49269)' Acil graso-ACP-tioesterasa de Ulmus Americana (# de GenBank AAB71731) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea lanceolata (# de GenBank CAB60830) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea palustris (# de GenBank AAC49180) Acil graso-ACP-tioesterasa de Iris germánica (# de GenBank AAG43858) Acil graso-ACP-tioesterasa de Iris germánica (# de GenBank AAG43858.1) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea palustris (# de GenBank AAC49179) Acil graso-ACP-tioesterasa de Myristica fragrans (# de GenBank AAB71729) Acil graso-ACP-tioesterasa de Myristica fragrans (# de GenBank AAB717291.1) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana (# de GenBank U39834) Acil graso-ACP-tioesterasa de Umbelluaria californica (# de GenBank M94159) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cinnamomum camphora (# de GenBank U31813) Acil graso-ACP-tioesterasa de Ricinus communis (# de GenBank ABS30422.1) Los Ejemplos más adelante describen la modificación dirigida y la expresión con éxito de acil graso-ACP-tioesterasas heterólogas de Cuphea hookeriana , Umbellularia californica , Cinnamomun camphora , Cuphea palustris , Cuphea lanceolata , Iris germánica , Myristica fragrans , Garcinia mangostana , Elaeis guiniensis, Brassica napus, Ricinus communis y Ulmus americana en especies de Prototheca. Además, se confirmaron las alteraciones en los perfiles de ácidos grasos de las células huésped que expresan estas acil graso-ACP-tioesterasas heterologas. Como se muestra en los Ejemplos, la expresión de estas tioesterasas heterologas en Prototheca genera una microalga transgénica que es capaz de producir aceite/lipidos con unos perfiles de ácidos grasos realmente únicos que actualmente no se pueden obtener a partir de cultivos de semillas comerciales, incluso mezclando varios aceites de cultivos seminales. La Tabla 5 muestra los perfiles de ácidos grasos de aceites seminales comerciales comunes . Todos los datos de aceites seminales comerciales que se muestran a continuación se recopilaron de los Códigos de las Farmacopeas de Productos Químicos y Alimentos de EE. UU . , 7.a Ed. 2010-2011. Los datos sobre el sebo proceden de National Research Council: Fat Content and Composition of Animal Products (1976) .

Tabla 5. Perfiles lipidíeos de aceites seminales comerciales .

A modo de ejemplo, ninguno de estos aceites seminales comunes contienen cantidades elevadas de ácidos grasos C8 o CIO, siendo el aceite de coco y el aceite de palmiste las fuentes principales pero sin llegar a una proporción de aproximadamente 1:1 (de ácidos grasos C8:C10). Según se muestra en los Ejemplos, la Prototheca transformada con tioesterasa con preferencia por C:8 de Cuphea palustris fue capaz de proporcionar, no solo unos niveles de ácidos grasos C8 superiores a un 12%, sino que la proporción de ácidos grasos C8:C10 fue de aproximadamente 5:1. Los cambios en los niveles de ácidos grasos son útiles para producir aceites que contengan un perfil de ácidos grasos diseñado para varias aplicaciones comerciales. Además, los cambios de las proporciones entre diferentes longitudes de cadena de los ácidos grasos es algo gue no existía a nivel comercial en aceites que no se hubieran sometido a procesos químicos adicionales costosos (tales como esterificación, destilación, fraccionamiento y reesterificación) . A modo de ejemplo adicional, el aceite de palma es el aceite que contiene un nivel más elevado de ácidos grasos C16:0 (32-47%), pero el aceite de palma tiene un nivel muy bajo de ácidos grasos C14:0. La Prototheca que contenía tioesterasa de U. americana presentó aproximadamente un 33-38% de ácidos grasos C16:0 y aproximadamente un 10-16% de ácidos grasos C14:0 (una proporción de aproximadamente 2:1 de C16:0 respecto a C14:0) . Este perfil de ácidos grasos no se ha podido obtener en la práctica comercialmente mezclando aceites existentes con un nivel comercial, porque los aceites seminales que tienen un contenido elevado de ácidos grasos 16:0 normalmente no contienen muchos ácidos grasos 14:0.

Los Ejemplos más adelante también describen la modificación dirigida y la expresión exitosas de al menos dos acil graso-ACP-tioesterasas en un clon. Se confirmaron las alteraciones en los perfiles de ácidos grasos de estos clones y, dependiendo de cuales fueran las dos tioesterasas coexpresadas en un clon, los perfiles de ácidos grasos se vieron afectados de formas diferentes. A modo de ejemplo, a partir de la Tabla 5 anterior, se puede observar que tanto el aceite de coco como el aceite de palmiste presentan proporciones C12:C14 de aproximadamente 3:1. Según se describe en los Ejemplos más adelante, un transformante de Prototheca que contenia dos genes de tioesterasa heterólogos fue capaz de producir niveles de ácidos grasos C12:C14 con una proporción de aproximadamente 5:1. Este tipo de proporción de ácidos grasos C12:C14 no se ha podido obtener en la práctica comercialmente (es decir, mediante la mezcla de aceites seminales) .

Otro aspecto novedoso de los aceites producidos por microalgas transgénicas es el grado de saturación de los ácidos grasos. Actualmente, el aceite de palma es la fuente principal de aceite saturado, con una proporción total de componentes saturados frente á insaturados de un 52% frente a un 48%. Según se muestra en los Ejemplos más adelante, Prototheca con tioesterasas heterólogas de U. americana y C. camphora presentó niveles totales de componentes saturados superiores a un 60% en el aceite que produjo. Según también se muestra en los Ejemplos más adelante, Prototheca con tioesterasas heterólogas de U. americana presentó un nivel total de componentes saturados superior a un 86% en el aceite que produjo.

Las acil graso-CoA/aldehido-reductasas adecuadas para utilizar con los microbios y métodos de la invención incluyen, sin carácter limitante, las enumeradas en la Tabla 6.

Tabla 6. Acil graso-CoA/aldehido-reductasas enumeradas en los números de acceso a GenBank.

AAC45217, YP_047869, BAB85476, YP_001086217 , YP_580344, YP_001280274, YP_264583, YP_436109, YP_959769, ZP_01736962, ZP_01900335, ZP_01892096, ZP_01103974, ZP_01915077, YP_924106, YP_130411, ZP_01222731, YP_550815, YP_983712, YP_001019688 , YP_524762, YP_856798, ZP_01115500, YP_001141848, NP_336047, NP_216059, YP_882409, YP_706156, YP_001136150, YP_952365, ZP_01221833, YP_130076, NP_567936, AAR88762, ABK28586, NP_197634, CAD30694, NP_001063962 , BAD46254, NP_001030809, EAZ10132, EAZ43639, EAZ07989, NP_001062488, CAB88537, NP_001052541, CAH66597, CAE02214, CAH66590, CAB88538, EAZ39844, AAZ06658, CAA68190, CAA52019 y BAC84377 Las acil graso-CoA-reductasas adecuadas para utilizar con los microbios y métodos de la invención incluyen, sin carácter limitante, las enumeradas en la Tabla 7.

Tabla 7. Acil graso-CoA-reductasas enumeradas en los números de acceso a GenBank.

NP_187805, AB014927, NP_001049083, CAN83375, NP_191229, EAZ42242, EAZ06453, CAD30696, BAD31814, NP_190040, AAD38039, CAD30692, CAN81280, NP_197642, NP_190041, AAL15288 y NP_190042 Las aldehido graso-descarbonilasas adecuadas para utilizar con los microbios y métodos de la invención incluyen, sin carácter limitante, las enumeradas en la Tabla 8.

Tabla 8. Aldehido graso-descarbonilasas enumeradas en los números de acceso a GenBank.

NP_850932, ABN07985, CAN60676, AAC23640, CAA65199, AAC24373, CAE03390, ABD28319, NP_181306, EAZ31322, CAN63491, EAY94825, EAY86731, CAL55686, XP 001420263, EAZ23849, NP_200588, NP 001063227, CAN83072, AAR90847 y AAR97643 Las combinaciones de proteínas portadoras de acilo y acil graso-ACP-tioesterasas con expresadas de forma natural son adecuadas para utilizar con los microbios y métodos de la invención .

Otros ejemplos de enzimas para la modificación de lipidos o hidrocarburos incluyen las secuencias de aminoácidos contenidas en, referenciadas en o codificadas por las secuencias de ácido nucleico contenidas o referenciadas en cualquiera de las siguientes patentes de EE. UU . : 6.610.527; 6.451.576; 6.429.014; 6.342.380; 6.265.639; 6.194.185; 6.114.160; 6.083.731; 6.043.072; 5.994.114; 5.891.697; 5.871.988; 6.265.639 y que se describen adicionalmente en los números de acceso a GenBank: AA018435; ZP_00513891; Q38710; AAK60613; AAK60610; AAK60611; NP_113747; CAB75874; AAK60612; AAF20201; BAA11024; AF205791 y CAA03710.

Otras enzimas de las vias biosintéticas lipidicas también son adecuadas para utilizar con los microbios y métodos de la invención. Por ejemplo, las enzimas cetoacil-ACP-sintasas (Kas) actúan conjuntamente con algunas de las enzimas enumeradas anteriormente en la vía biosintética lipidica. Existen diferentes clases de enzimas Kas: Kas I participa en pasos de condensación sucesivos entre las cadenas de acil-ACP en fase de crecimiento y malonil-ACP. Kas II normalmente participa en el paso de condensación final que va desde C16:0-ACP hasta C18:0-ACP que incorpora malonil-ACP. En este sentido, en plantas superiores y algunas especies/cepas de microalgas que sintetizan principalmente ácidos grasos C16-C18:0 (y sus derivados insaturados ) , las enzimas Kas II interaccionan con los productos de los genes FatA (acil-ACP tioesterasas ) .

Las acil-ACP liberan cadenas de ácidos grasos en fase de crecimiento a partir de ACP durante la biosintesis de ácidos grasos y, en la mayoría de las especies vegetales, esto es realizado por miembros de la familia de genes FatA, cuya función es detener la elongación en la etapa de C16:0 a C18:0 En especies que sintetizan ácidos grasos de cadena más corta (tales como Cuphea, Elaeis, Myristica o Umbellularia) , un grupo diferente de acil-ACP-tioesterasas codificadas por genes FatB lleva a cabo este paso de terminación. La interacción entre enzimas Kas II y acil-ACP-tioesterasas es importante para la terminación correcta de la elongación de las cadenas de ácidos grasos. Como consecuencia, en especies de plantas superiores (y especies de microalgas) que han desarrollado genes FatB capaces de realizar la biosintesis de lípidos de cadena más corta, se ha producido una coevolución correspondiente de una clase adicional de genes Kas, denominada genes Kas IV. Los genes Kas IV son responsables de la elongación de la longitud de la cadena de un rango de ácidos grasos de tamaño específico, con una longitud de 4-14 carbonos .

Otras enzimas adecuadas para utilizar con los microbios y métodos de la invención incluyen las que tienen al menos un 70% de identidad aminoacidica respecto a una de las proteínas enumeradas en las Tablas 4, 6-8, y que exhiben la actividad enzimática deseada correspondiente (p. ej . , escisión de un ácido graso a partir de una proteína portadora de acilo, reducción de una acil-CoA a un aldehido o un alcohol, o conversión de un aldehido en un alcano) . En realizaciones adicionales, la actividad enzimática está presente en una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o al menos aproximadamente un 99% de identidad respecto a una de las secuencias descritas anteriormente, todas las cuales se incorporan a la presente por referencia como si se hubieran expuesto completamente.

Seleccionando la combinación deseada de genes exógenos que se han de expresar, se puede modificar el producto generado por el microbio, el cual se puede extraer posteriormente de la biomasa acuosa. Por ejemplo, el microbio puede contener uno o más de los siguientes componentes: (i) un gen exógeno que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa; y, opcionalmente, (ii) una . proteína portadora de acilo coexpresada de forma natural o una proteina portadora de acilo con afinidad por la acil graso-ACP-tioesterasa (o a la inversa) ; y, opcionalmente, (iii) un gen exógeno que codifica una acil graso-CoA/aldehido-reductasa o una acil graso-6A-reductasa; y, opcionalmente, (iv) un gen exógeno que codifica una aldehido graso-reductasa o una aldehido graso-descarbonilasa . El microbio también puede contener uno o más de los siguientes componentes: una estearoil-ACP-desaturasa exógena, una desaturasa de ácidos grasos, una ß-cetoacil-ACP-sintasa I (p. ej . , codificada por un gen KASI) , una ß-cetoacil-ACP-sintasa II (p. ej . , codificada por un gen KASII) o una oleato-12-hidroxilasa . El microbio, en las condiciones de cultivo descritas en la presente, sintetiza un ácido graso unido a una ACP y la acil graso-ACP-tioesterasa cataliza la escisión del ácido¦ graso a partir de la ACP para obtener, mediante procesamiento enzimático adicional, una molécula de acil graso-CoA. Cuando está presente, la acil graso-CoA/aldehído-reductasa cataliza la reducción de la acil-CoA para obtener un alcohol. De forma análoga, la acil graso-CoA-reductasa, cuando está presente, cataliza la reducción de la acil-CoA para obtener un aldehido. En aquellas realizaciones en las que hay presente un gen exógeno que codifica una acil graso-CoA-reductasa y se expresa para obtener un producto que es un aldehido, una aldehido graso-reductasa, codificada por el tercer gen exógeno, catalizará la reducción del aldehido para obtener un alcohol. De forma análoga, una aldehido graso-descarbonilasa cataliza la conversión del aldehido en un alcano o un alqueno, cuando esté presente.

En otra realización, el microbio puede contener: (i) un gen exógeno que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa; (ii) opcionalmente, una proteina portadora de acilo coexpresada de forma natural o una proteina portadora de acilo con afinidad por la acil (ácido graso) -ACP-tioesterasa; (iii) un gen de desaturasa endógeno mutado, donde la mutación desactiva el gen de desaturasa o la proteina desaturasa, tal como una desactivación de desaturasa o un elemento supresor de desaturasa tal como un constructo de ARNi, antisentido o ARNbc dirigido; (iv) la sobreexpresión de una estearoil-proteina portadora de acilo-desaturasa endógena o la expresión de una SAD heteróloga; y (v) cualquier combinación de lo anterior.

Los genes que codifican estas enzimas, tales como acil graso-ACP-tioesterasas , se pueden obtener a partir de células de las que ya hay constancia de que exhiben una producción de lipidos significativa tales como Chlorella protothecoides . Los genes de los que hay constancia de que desempeñan una función en la producción de lipidos, p. ej . , un gen que codifica una enzima que satura dobles enlaces, se pueden transformar de forma individual en células receptoras. Sin embargo, para llevar a la práctica la invención no es necesario realizar suposiciones a priori sobre qué genes son necesarios. Los métodos para identificar genes que pueden alterar (mejorar) la producción de lipidos en microalgas se describen en la Publicación de PCT N.° 2008/151149.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una célula de Prototheca que ha sido modificada genéticamente para que exprese una enzima de la via lipidica con un nivel alterado en comparación con una célula natural de la misma especie. En algunos casos, la célula produce más lipido en comparación con la célula natural cuando ambas células se cultivan en las mismas condiciones. En algunos casos, la célula ha¦ sido modificada genéticamente y/o seleccionada para que exprese una enzima de la via lipidica en un nivel superior o un nivel inferior al de la célula natural. En algunos casos, la enzima de la via lipidica se selecciona del grupo constituido por piruvato-deshidrogenasa, acetil-CoA-carboxilasa, proteina portadora de acilo y glicerol-3-fosfato-aciltransferasa . En algunos casos, la célula ha sido modificada genéticamente y/o seleccionada para que exprese una enzima de la vía lipídica en un nivel inferior al de la célula natural. En al menos una realización en la que la célula expresa la enzima de la vía lipídica en un nivel inferior, la enzima de la vía lipídica comprende citrato-sintasa .

En algunas realizaciones, la célula ha sido modificada genéticamente y/o seleccionada para que exprese un regulador global de la síntesis de ácidos grasos con un nivel alterado en comparación con la célula natural, de modo que los niveles de expresión de una pluralidad de genes sintéticos de ácidos grasos se alteran en comparación con la célula natural. En algunos casos, la enzima de la vía lipídica comprende una enzima que modifica un ácido graso. En algunos casos, la enzima de la vía lipídica se selecciona entre una estearoil-ACP-desaturasa y una glicerolípido-desaturasa . En algunos casos, la célula ha sido modificada genéticamente y/o seleccionada para que exprese un nivel inferior de una enzima de la vía lipídica o para que no exprese en absoluto una enzima de la vía lipídica específica (es decir, donde una enzima de la vía lipídica ha sido desactivada, reemplazada por un gen exógeno o se ha reducido su expresión utilizando métodos antisentido o ARNi) . En otra realización, la enzima de la vía lipídica es la expresión heteróloga de un gen de desaturasa, incluida, sin carácter limitante, una estearoil-ACP-desaturasa o una desaturasa de ácidos grasos (FAD) . El Ejemplo 6 describe la expresión de una estearoil-ACP heteróloga de Olea europaea en un entorno genético de Prototheca moriformis.

En otras realizaciones, la presente invención se refiere a un microbio que produce aceite el cual contiene uno o más genes exógenos, donde los genes exógenos codifican una o más proteínas seleccionadas del grupo constituido por una acil graso-ACP-tioesterasa, una acil graso-CoA-reductasa, una aldehido graso-reductasa, una acil graso-CoA/aldehído-reductasa, una aldehido graso-descarbonilasa, una desaturasa y una proteína portadora de acilo. En otra realización, un gen de desaturasa endógeno se sobreexpresa en un microbio que contiene uno o más de los genes exógenos anteriores. En una realización, el gen exógeno está en unión operable con un promotor, que se puede inducir o reprimir en respuesta a un estímulo. En algunos casos, el estímulo se selecciona del grupo constituido por una molécula de peso molecular bajo proporcionada de forma exógena, calor, frío y una cantidad limitada de nitrógeno o ausencia de este en los medios de cultivo. En algunos casos, el gen exógeno se expresa en un compartimento celular. En algunas realizaciones, el compartimento celular se selecciona del grupo constituido por un cloroplasto, un plástido y una mitocondria. En algunas realizaciones, el microbio es Prototheca moriformis, Prototheca krugani, Prototheca stagnora o Prototheca zopfií.

En una realización, el gen exógenp codifica una acil (ácido graso) -ACP-tioesterasa . En algunos casos, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 8-18 carbonos de una proteina portadora de acilo (ACP) . En algunos casos, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 10-14 carbonos de una ACP. En una realización, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 12 carbonos de una ACP.

En una realización, el gen exógeno codifica una acil graso-CoA/aldehído-reductasa . En algunos casos, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de una acil graso-CoA de 8-18 carbonos para obtener el alcohol primario correspondiente. En algunos casos, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de una acil graso-CoA de 10-14 carbonos para obtener el alcohol primario correspondiente. En una realización, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de una acil graso-CoA de 12 carbonos para obtener dodecanol .

La presente invención también proporciona una célula de Prototheca recombinante u otra célula que contiene dos genes exógenos, donde un primer gen exógeno codifica una acil graso-ACP-tioesterasa y un segundo 'gen exógeno codifica una proteina seleccionada del grupo constituido por una acil graso-CoA-reductasa, una acil graso-CoA/aldehido-reductasa y una proteina portadora de acilo. En algunos casos, los dos genes exógenos están cada uno en unión operable con un promotor, que se puede inducir en respuesta a un estimulo. En algunos casos, cada promotor se puede inducir en respuesta a un estimulo idéntico, tal como una cantidad limitada de nitrógeno o ausencia de este en los medios de cultivo. La limitación o la ausencia total de nitrógeno én los medios de cultivo estimula la producción de aceite en algunos microorganismos, tales como las especies de Prototheca, y se puede utilizar como desencadenante para inducir la producción de aceite hasta niveles altos. Cuando se utiliza combinado con los métodos de modificación genética descritos en la presente, el lipido, expresado como un porcentaje del peso celular seco, puede llegar a alcanzar niveles elevados tales como al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85% o entre un 75 y un 90%; los métodos descritos en la presente proporcionan células con estos niveles de lipido, donde el lipido representa al menos un 4% de C8-C14, al menos un 0.3% de C8, al menos un 2% de CIO, al menos un 2% de C12 y al menos un 2% de C14. En algunas realizaciones, las células contienen más de un 25% de lipido en peso celular seco y este lipido que contienen está constituido por al menos un 10% de C8-C14, al menos un 20% de C8-C14, al menos un 30% de C8-C14, un 10-30% de C8-C14 y un 20-30% de C8-C14.

Los aceites novedosos descritos en la presente se diferencian de otros aceites de origen natural en que presentan un contenido elevado de ácidos grasos de cadena media, tales como aceite de palma, aceite de palmiste y aceite de coco. Por ejemplo, los niveles de contaminantes tales como carotenoides son mucho más elevados en el aceite de palma y aceite de palmiste que en los aceites de la invención. Los aceites de palma y palmiste en particular contienen cantidades mucho mayores de alfa- y beta-carotenos y licopeno que los aceites de la invención. Además, en el aceite de palma y palmiste se encuentran más de 20 carotenoides diferentes, mientras que los Ejemplos demuestran que los aceites de la invención contienen muchas menos especies de carotenoides y con niveles muy bajos. Además, los niveles de compuestos de tipo vitamina E, tales como tocotrienoles, son mucho más elevados en el aceite de palma, palmiste y coco que en los aceites de la invención.

En una realización, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 8-18 carbonos de una ACP. En algunas realizaciones, el segundo gen exógeno codifica una acil graso-CoA/aldehido-reductasa que cataliza la reducción de una acil graso-CoA de 8-18 carbonos para obtener el alcohol primario correspondiente. En algunos casos, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 10-14 carbonos de una ACP y la reductasa codificada por el segundo gen exógeno cataliza la reducción de una acil graso-CoA de 10-14 carbonos para obtener el alcohol primario correspondiente, donde la tioesterasa y la reductasa actúan sobre la misma longitud de cadena carbonada. En una realización, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 12 carbonos de una ACP y la reductasa codificada¦ por el segundo gen exógeno cataliza la reducción de una acil graso-CoA de 12 carbonos para obtener dodecanol. En algunas realizaciones, el segundo gen exógeno codifica una acil graso-CoA-reductasa que cataliza la reducción de una acil graso-CoA de 8-18 carbonos para obtener el aldehido correspondiente. En algunas realizaciones, el segundo gen exogeno codifica una proteina portadora de acilo que se coexpresa de forma natural con la acil graso-ACP-tioesterasa .

En algunas realizaciones, el segundo gen exógeno codifica una acil graso-CoA-reductasa y el microbio contiene además un tercer gen exógeno que codifica una aldehido graso-descarbonilasa . En algunos casos, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 8-18 carbonos de una ACP, la reductasa codificada por el segundo gen exógeno cataliza la reducción de una acil graso-CoA de 8-18 carbonos para obtener el aldehido graso correspondiente, y la descarbonilasa codificada por el tercer gen exógeno cataliza la conversión de un aldehido graso de 8-18 carbonos en el alcano correspondiente, donde la tioesterasa, la reductasa y la descarbonilasa actúan sobre la misma longitud de cadena carbonada.

En algunas realizaciones, el segundo gen exógeno codifica una proteina portadora de acilo y el microbio contiene además un tercer gen exógeno que codifica una proteína seleccionada del grupo constituido por una acil graso-CoA-reductasa y una acil graso-CoA/aldehído-reductasa . En algunos casos, el tercer gen exógeno codifica una acil graso-CoA-reductasa y el microbio contiene además un cuarto gen exógeno que codifica una aldehido graso-descarbonilasa .

La presente invención también proporciona métodos para producir un alcohol que comprenden cultivar una población de células de Prototheca recombinantes en un medio de cultivo, donde las células contienen (i) un primer gen exógeno que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa, y (ii) un segundo gen exógeno que codifica una acil graso-CoA/aldehido-reductasa, y las células sintetizan un ácido graso unido a una proteina portadora de acilo (ACP) , la acil graso-ACP-tioesterasa cataliza la escisión del ácido graso de la ACP para obtener, mediante procesamiento adicional, una acil graso-CoA, y la acil graso-CoA/aldehido-reductasa cataliza la reducción de la acil-CoA para obtener un alcohol.

La presente invención también proporciona métodos para producir una molécula lipidica en una célula de Prototheca . En una realización, el método comprende cultivar una población de células de Prototheca en un medio de cultivo, donde las células contienen (i) un primer gen exógeno que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa, y (ii) un segundo gen exógeno que codifica una acil graso-CoA-reductasa, y donde los microbios sintetizan un ácido graso unido a una proteína portadora de acilo (ACP) , la acil graso-ACP- tioesterasa cataliza la escisión del ácido graso de la ACP para obtener, mediante procesamiento adicional, una acil graso-CoA, y la acil graso-CoA-reductasa cataliza la reducción de la acil-CoA para obtener un aldehido.

La presente invención también proporciona métodos para producir una molécula de ácido graso con una longitud determinada de la cadena carbonada en una célula de Prototheca . En una realización, el método comprende cultivar una población de células de Prototheca productoras de lípidos en un medio de cultivo, donde los microbios contienen un gen exógeno que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa con una actividad específica o preferencial por una cierta longitud de la cadena carbonada, tal como 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono, y donde los microbios sintetizan un ácido graso unido a una proteína portadora de acilo (ACP) y la tioesterasa cataliza la escisión del ácido graso . de la ACP cuando el ácido graso ha sido sintetizado con la longitud específica de la cadena carbonada.

En las diferentes realizaciones descritas anteriormente, la célula de Prototheca puede contener al menos un gen exógeno que codifique una enzima de la vía lipídica o un elemento supresor tal como un elemento de interferencia por ARN que suprime la expresión del producto génico. En algunos casos, la enzima de la vía lipídica se selecciona del grupo constituido por una estearoil-ACP-desaturasa, una glicerolipido-desaturasa, una piruvato-deshidrogenasa, una acetil-CoA-carboxilasa, una proteína portadora de acilo y una glicerol-3-fosfato-aciltransferasa.. En otros casos, la célula de Prototheca contiene una enzima de modificación de lípidos seleccionada del grupo constituido por una acil graso-ACP-tioesterasa, una acil graso-CoA/aldehído-reductasa, una acil graso-CoA-reductasa, una aldehido graso-reductasa, una aldehido graso-descarbonilasa y/o una proteína portadora de acilo .

La presente invención también proporciona una célula microbiana que contiene un gen heterólogo que codifica una hidroxilasa que genera un ácido graso hidroxilado. La célula microbiana puede comprender una vía de síntesis de ácidos grasos de tipo II. Por ejemplo, la célula microbiana puede ser una célula de microalga. En algunas realizaciones, la célula de microalga se selecciona entre las células de microalgas enumeradas en la Tabla 1 anterior. En otras realizaciones, la célula de microalga es del género Prototheca. En otras realizaciones más, la célula de microalga es Prototheca moriformis. Las hidroxilasas son enzimas que añaden un grupo hidroxilo (-0H) a un sustrato.

Las hidroxilasas de ácidos grasos son enzimas de origen natural que se encuentran en algunas plantas superiores. Un ejemplo no limitante de una hidroxilasa de origen natural que se encuentra en una planta superior es la oleato-12-hidroxilasa de Ricinus communis, que es la responsable de la producción de ácido ricinoleico. El Ejemplo 7 describe un ejemplo de la expresión heteróloga de una hidroxilasa en células de Prototheca , concretamente, la expresión de oleato-12-hidroxilasa de Ricinus communis en células de Prototheca moriformis.

VI . PRODUCCIÓN DE COMBUSTIBLES Y PRODUCTOS QUÍMICOS Para producir combustible de acuerdo con los métodos de la invención, los lipidos producidos por las células de la invención se recolectan o recogen mediante cualquier medio adecuado. Los lipidos se pueden aislar mediante la extracción de células enteras. En primer lugar se rompen las células y después se pueden separar los lipidos asociados con la pared celular/membrana celular e intracelular, asi como también los hidrocarburos extracelulares, de la masa celular, por ejemplo, mediante el uso de centrifugación según se ha descrito anteriormente. Los lipidos intracelulares producidos en los microorganismos, en algunas realizaciones, se extraen después del proceso de lisis de las células del microorganismo. Una vez extraídos, los lípidos se refinan adicionalmente para producir aceites, combustibles o productos oleoquímicos .

Una vez finalizado el cultivo, los microorganismos se pueden separar del caldo de fermentación. Opcionalmente, la separación se efectúa mediante centrifugación para generar una pasta concentrada. La centrifugación no elimina las cantidades significativas de agua intracelular de los microorganismos y no es un paso de secado. A continuación, la biomasa se puede lavar opcionalmente con una solución de lavado (p. ej . , agua DI) para eliminar el caldo de fermentación y los desechos. Opcionalmente, la biomasa microbiana lavada también se podría secar (secar en un horno, liofilizar, etc.) antes de la ruptura celular. Por otra parte, las células se pueden lisar sin separarlas de parte o todo el caldo de fermentación cuando la fermentación haya finalizado. Por ejemplo, las células pueden estar en una proporción inferior a 1:1 (v:v) de células respecto al líquido extracelular cuando las células se lisan.

Los microorganismos que contienen un lípido se pueden lisar para producir un lisado. Tal como se indica en la presente, el paso de lisis de un microorganismo (denominado también lisis celular) se puede conseguir mediante cualquier método conveniente, incluidas la lisis termoinducida, adición de una base, adición de un ácido, utilizando enzimas tales como proteasas y enzimas de degradación de polisacáridos tales como amilasas, utilizando ultrasonidos, lisis mecánica, utilizando choque osmótico, infección con un virus Utico y/o expresión de uno o más genes Uticos. La lisis se lleva a cabo para liberar las moléculas intracelulares que han sido producidas por el microorganismo. Cada uno de estos métodos para la lisis de un microorganismo se puede usar como método único o en combinación simultánea o secuencial. El alcance de la ruptura celular se puede observar por análisis microscópico. Utilizando uno o más de los métodos descritos en la presente, normalmente se observa más de un 70% de ruptura celular. Preferentemente, la ruptura celular es superior a un 80%, más preferentemente superior a un 90% y aún más preferentemente aproximadamente un 100%.

En realizaciones particulares, el microorganismo se lisa después del cultivo, por ejemplo, con el fin de incrementar la exposición del lípido y/o hidrocarburo celular para la extracción o procesamiento posterior. El momento de la expresión de la lipasa (p. ej . , a través de un promotor inducible) o lisis celular se puede ajusfar para optimizar el rendimiento de lipidos y/o hidrocarburos. A continuación se describen una serie de técnicas de lisis. Estas técnicas se pueden usar individualmente o en cualquier combinación.

En una realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo comprende calentar una suspensión celular que contiene el microorganismo. En esta realización, el caldo de fermentación que contiene los microorganismos (o una suspensión de microorganismos aislada del caldo de fermentación) se calienta hasta que los microorganismos, es decir, las paredes y membranas celulares de los microorganismos, se degradan o rompen. Normalmente, las temperaturas aplicadas son de al menos 50 °C . Se utilizan temperaturas superiores, tales como de al menos 30 °C, al menos 60 °C, al menos 70 °C, al menos 80 °C, al menos 90 °C, al menos 100 °C, al menos 110 °C, al menos 120 °C, al menos 130 °C o superiores, para una lisis celular más eficaz. La lisis celular por tratamiento térmico se puede realizar hirviendo el microorganismo. Como alternativa, el tratamiento térmico (sin hervir) se puede realizar en un autoclave. El lisado termotratado se puede enfriar para el tratamiento posterior. La ruptura celular también se puede realizar mediante un tratamiento con vapor, es decir, mediante la adición de vapor presurizado. Por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N.° 6.750.048 se describe el tratamiento con vapor de microalgas para la ruptura celular. En algunas realizaciones, el tratamiento con vapor se puede conseguir inyectando vapor en el fermentador y manteniendo el caldo a una temperatura deseada durante menos de aproximadamente 90 minutos, preferentemente menos de aproximadamente 60 minutos y más preferentemente menos de aproximadamente 30 minutos.

En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo comprende añadir una base a una suspensión celular que contiene el microorganismo. La base debe ser suficientemente fuerte para hidrolizar al menos una porción de los compuestos proteicos de los microorganismos utilizados. Las bases que son útiles para solubilizar proteínas se conocen en la técnica de la química. Las bases ilustrativas que son útiles en los métodos de la presente invención incluyen, sin carácter limitante, hidróxidos, carbonatos y bicarbonatos de litio, sodio, potasio, calcio y mezclas de estos. Una base preferida es KOH. El tratamiento con base de microalgas para la ruptura celular se describe, por ejemplo, en la Patente de EE . UU. N.° 6.750.048.

En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo comprende añadir un ácido a una suspensión celular que contiene el microorganismo. La lisis ácida se puede conseguir utilizando un ácido con una concentración de 10-500 mN o preferentemente 40-160 nM. La lisis ácida se realiza preferentemente a una temperatura superior a la temperatura ambiente (p. ej . , a 40-160 °C y preferentemente a una temperatura de 50-130 °C) . Para temperaturas moderadas (p. ej . , de temperatura ambiente a 100 °C y particularmente de temperatura ambiente a 65 °C) , el tratamiento ácido se puede combinar de forma útil con sonicación u otros métodos de ruptura celular.

En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo comprende lisar el microorganismo utilizando una enzima. Las enzimas preferidas para lisar un microorganismo son proteasas y enzimas que degradan polisacáridos tales como hemicelulasa (p. ej . , hemicelulasa de Aspergillus niger; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #H2125) , pectinasa (p. ej . , pectinasa de Rhizopus sp. ; Sigma Aldrich, St . Louis, MO; #P2401), Mannaway 4.0 L (Novozymes) , celulasa (p. ej . , celulasa de Trichoderma viride; Sigma Aldrich, St . Louis, MO; #C9422) y driselasa (p. ej . , driselasa de Basidiomycetes sp.; Sigma Aldrich, St . Louis, MO; #D9515) .

En otras realizaciones de la presente invención, la lisis se consigue utilizando una enzima tal como, por ejemplo, una celulasa tal como una enzima que degrada polisacáridos, opcionalmente de Chlorella o un virus de Chlorella , o una proteasa tal como una proteasa de Streptomyces griseus, quimotripsina, proteinasa K, proteasas enumeradas en "Degradation of Polylactide by Commercial Proteases", Oda Y et al., Journal of Polymers and the Environment, Volumen 8, Número 1, enero de 2000, págs . 29-32(4), Alcalase 2.4 FG (Novozymes) y Flavourzyme 100 L (Novozymes) . También se puede utilizar cualquier combinación de una proteasa y una enzima que degrada polisacáridos , incluida cualquier combinación de las proteasas y enzimas que degradan polisacáridos precedentes .

En otra realización, la lisis se puede realizar utilizando una prensa de tornillo. En este proceso, la biomasa se introduce a través de un dispositivo de tipo tornillo a una presión elevada, Usando las células y haciendo que el lipido intracelular se libere y se separe de la proteina y fibra (y el resto de los componentes) de la célula.

En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo se realiza utilizando ultrasonidos, es decir, sonicación. Por lo tanto, las células también se pueden lisar con sonidos de alta frecuencia. Los sonidos se pueden producir electrónicamente y transportar a través de un ápice metálico hasta una suspensión celular concentrada de forma apropiada. Esta sonicación (o ultrasonicación) desestabiliza la integridad celular debido a la creación de cavidades en la suspensión celular.

En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo se realiza mediante lisis mecánica Las células se pueden lisar mecánicamente y opcionalmente homogeneizar para facilitar la separación de los hidrocarburos (p. ej . , lipido) . Por ejemplo, se puede emplear un desestabilizador de la presión para bombear una suspensión que contiene las células a través de una válvula con un orificio restringido. Se aplica alta presión (de hasta 1500 bares) , seguida por una expansión instantánea a través de una boquilla de salida. La ruptura celular se consigue mediante tres mecanismos diferentes: el impacto sobre la válvula, la alta tensión de cizalla del liquido en el orificio y la reducción repentina de la presión durante la descarga, lo cual hace que la célula reviente. El método libera moléculas intracelulares . Como alternativa, se puede usar un molino de bolas. En un molino de bolas, las células se agitan en suspensión con partículas abrasivas pequeñas tales como microesferas . Las células se rompen debido a fuerzas de cizalla, molienda entre las microesferas y colisiones con las microesferas . Las microesferas rompen las células para que se libere el contenido celular. Las células también se pueden romper por acción de fuerzas de cizalla, por ejemplo, empleando un mezclador (tal como, por ejemplo, una licuadora Waring o de alta velocidad) , una prensa francesa o incluso con centrifugación, cuando las paredes celulares sean débiles, para romper las células.

En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo se realiza aplicando un choque osmótico .

En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo comprende infectar el microorganismo con un virus Utico. Se conocen una amplia gama de virus que lisan microorganismos adecuados para utilizar en la presente invención, y la selección y el uso de un virus Utico particular para un microorganismo particular entra dentro de las competencias de la técnica. Por ejemplo, el virus de paramecium bursaria chlorella (PBCV-1) es el prototipo de un grupo (familia Phycodnaviridae, género Chlorovirus) de virus con ADN bicatenario, formadores de placas, icosahédricos y grandes que lisan y se replican en ciertas algas verdes similares a Chlorella eucariotas e unicelulares. Por consiguiente, cualquier microalga sensible se puede lisar infectando el cultivo con un virus de Chlorella adecuado. Se conocen métodos para infectar especies de Chlorella con un virus de Chlorella . Remítase, por ejemplo, a Adv. Virus Res. 2006;66:293-336; Virology, 25 de abril de 1999;257 (1) : 15-23; Virology, 5 de enero de 2004 ; 318 ( 1) : 214-23 ; Nucleic Acids Symp. Ser. 2000 ; ( 4 ) : 161-2 ; J. Virol. marzo de 2006; 80 (5) :2437-44; y Annu. Rev. Microbiol . 1999; 53:447-94.

En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo comprende la autólisis. En esta realización, un microorganismo de acuerdo con la invención se modifica genéticamente para que produzca una proteína lítica que sará el microorganismo. Este gen Utico se puede expresar utilizando un promotor inducible, de modo que las células se pueden cultivar primero hasta una densidad deseada en un termentador y a continuación se induce el promotor para que exprese el gen lítico que lisará las células. En una realización, el gen lítico codifica una enzima que degrada polisacáridos . En ciertas realizaciones diferentes, el gen lítico es un gen que proviene de un virus lítico. Así pues, por ejemplo, un gen lítico de un virus de Chlorella se puede expresar en una célula algácea; remítase a Virology 260, SOS-SIS (1999); FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45-53; Virology 263, 376-387 (1999); y Virology 230, 361-368 (1997). La expresión de genes líticos se realiza preferentemente utilizando un promotor inducible, tal como, un promotor activo en microalgas, el cual se induce mediante un estimulo tal como la presencia de una molécula de peso molecular bajo, luz calor y otros estímulos.

Se dispone de varios métodos para separar lipidos de lisados celulares producidos mediante los métodos anteriores. Por ejemplo, se pueden extraer lipidos y derivados de lipidos tales como aldehidos grasos, alcoholes grasos e hidrocarburos tales como alcanos, con un disolvente hidrófobo tal como hexano (remítase a Frenz et al. 1989, Enzyme Microb. Technol. 11:717) . También se pueden extraer lipidos y derivados de lipidos utilizando licuación (remítase, por ejemplo, a Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17:33-39 e Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6 (4 ) : 269-274 ) ; licuación de aceite (remítase, por ejemplo, a Minowa et al. 1995, Fuel 7 (12) : 1735-1738) ; y extracción de C02 supercrítico (remítase por ejemplo, a Mendes et al. 2003, Inorgánica Chimica Acta 356:328-334). Miao y Wu describen un protocolo para la recuperación de lipidos microalgáceos a partir de un cultivo de Chlorella prototheocoid.es, en el que las células se recolectaron por centrifugación, se lavaron con agua destilada y se secaron mediante liofilización . El polvo celular resultante se pulverizó en un mortero y después se extrajo con n-hexano. Miao y Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846.

Por lo tanto, los lipidos, derivados de lipidos e hidrocarburos generados por los microorganismos de la presente invención se pueden recuperar extrayendo con un disolvente orgánico. En algunos casos, el disolvente orgánico preferido es hexano. Normalmente, el disolvente orgánico se añade directamente al lisado sin separar previamente los componentes del lisado. En una realización, el lisado generado mediante uno o más de los métodos descritos anteriormente se pone en contacto con un disolvente orgánico durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los componentes lipidíeos y/o hidrocarbonados formen una solución con el disolvente orgánico. En algunos casos, la solución se puede refinar posteriormente de forma adicional para recuperar componentes lipidíeos o hidrocarbonados deseados específicos. Los métodos de extracción con hexano son muy conocidos en la técnica.

Los lipidos y derivados de lipidos, tales como aldehidos grasos, alcoholes grasos e hidrocarburos, tales como alcanos, producidos por las células tal como se describe en la presente se pueden modificar utilizando una o más enzimas, incluida una lipasa, tal como se ha descrito previamente.

Cuando los hidrocarburos están en el entorno extracelular de las células, la enzima o las enzimas se pueden añadir al entorno en condiciones en las que la enzima modifique el hidrocarburo o complete su síntesis a partir de un precursor del hidrocarburo. Como alternativa, los hidrocarburos se pueden aislar parcial o completamente del material celular antes de añadir uno o más catalizadores tales como enzimas. Estos catalizadores se añaden exógenamente y su actividad se ejerce en el exterior de la célula o in vitro.

Así pues, los lípidos e hidrocarburos producidos por las células in vivo o modificados enzimáticamente in vitro, tal como se describe en la presente, se pueden procesar opcionalmente de forma adicional mediante métodos convencionales. El procesamiento puede incluir el "craqueo" para reducir el tamaño e incrementar de este modo la proporción de hidrógeno: carbono de las moléculas hidrocarbonadas . Los métodos de craqueo catalítico y térmico se utilizan habitualmente en el procesamiento de aceites triglicéridos e hidrocarbonados . Los métodos catalíticos implican el uso. de un catalizador, tal como un catalizador ácido sólido. El catalizador puede ser sílice-alúmina o una zeolita, que produce la ruptura asimétrica o heterolítica de un enlace carbono-carbono para dar como resultado un carbocatión y un anión hidruro. Estos intermedios reactivos experimentan posteriormente una transposición o una. transferencia de hidruro con otro hidrocarburo. Las reacciones pueden regenerar de este modo los intermedios para dar como resultado un mecanismo en cadena autopropagante . Los hidrocarburos también se pueden procesar para reducir, opcionalmente hasta cero, el número de dobles o triples enlaces carbono-carbono que estos contengan. Los hidrocarburos también se pueden procesar para eliminar o escindir un anillo o estructura cíclica que estos contengan. Los hidrocarburos también se pueden procesar para incrementar la proporción de hidrógeno : carbono . Esto puede incluir la adición de hidrógeno ("hidrogenación") y/o el "craqueo" de hidrocarburos para obtener hidrocarburos más pequeños.

Los métodos térmicos implican el uso de temperatura y presión elevadas para reducir el tamaño de los hidrocarburos. Se puede utilizar una temperatura elevada de aproximadamente 800 °C y una presión elevada de aproximadamente 700kPa. Estas condiciones generan "moléculas ligeras", un término que se utiliza en ocasiones para referirse a moléculas hidrocarbonadas ricas en hidrógeno (a diferencia del flujo de fotones) , a la vez que también se generan moléculas hidrocarbonadas más pesadas mediante condensación, las cuales no tienen prácticamente hidrógeno. La metodología proporciona una rotura simétrica u homolitica y produce alquenos, los cuales se pueden saturar enzimáticamente de forma opcional según se ha descrito anteriormente.

Los métodos catalíticos y térmicos son estándar en plantas para el procesamiento de hidrocarburos y el refinado de aceites. De este modo, los hidrocarburos producidos por las células según se describe en la presente se pueden recolectar y procesar o retinar mediante métodos convencionales. Remítase a Hillen et al. (Biotechnology and Bloenglneerlng, Vol . XXIV: 193-205 (1982)) para consultar un informe sobre el hidrocraqueo de hidrocarburos producidos por microalgas. En realizaciones alternativas, la fracción se trata con otro catalizador tal como un compuesto orgánico, calor y/o un compuesto inorgánico. A la hora de procesar los lípidos para obtener biodiésel, se utiliza un proceso de transesterificación según se describe más adelante en esta sección .

Los hidrocarburos producidos mediante los métodos de la presente invención son útiles en varias aplicaciones industriales. Por ejemplo, la producción de sulfonato de alquilbenceno lineal (LAS, por sus siglas en inglés) , un surfactante aniónico utilizado en casi todos los tipos de detergentes y preparados de limpieza, utiliza hidrocarburos que generalmente comprenden una cadena de 10-14 átomos de carbono. Remítase, por ejemplo, a las Patentes de EE. UU. N.os: 6.946.430; 5.506.201; 6.692.730; 6.268.517; 6.020.509; 6.140.302; 5.080.848 y 5.567.359. Los surfactantes, tales como LAS, se pueden utilizar en la elaboración de composiciones para el cuidado personal y detergentes, tales como los que se describen en las Patentes de EE. UU. N.os: 5.942.479; 6.086.903; 5.833.999; 6.468.955 y 6.407.044.

Cada vez despierta más interés el uso de componentes hidrocarbonados de origen biológico en combustibles, tales como biodiésel, diésel renovable y combustible para aviones, ya que los materiales de partida biológicos renovables que podrían reemplazar a los materiales de partida derivados de combustibles fósiles están disponibles y su uso es deseable. Se necesita urgentemente desarrollar métodos para producir componentes hidrocarbonados a partir de materiales biológicos. La presente invención satisface esta necesidad proporcionando métodos para producir biodiésel, diésel renovable y combustible para aviones que utilizan los lípidos generados mediante los métodos descritos en la presente como material biológico para producir biodiésel, diésel renovable combustible para aviones.

Los combustibles diésel tradicionales son destilados de petróleo ricos en hidrocarburos parafinicos. Estos presentan rangos de ebullición muy amplios comprendidos entre 370 0 y 780 °F, los cuales son adecuados para la combustión en un motor de ignición por compresión, por ejemplo, en un vehículo con motor diésel. La Sociedad Americana para Ensayos y Materiales (ASTM, por sus siglas en inglés) establece el grado del diésel de acuerdo con el rango de ebullición, junto con los rangos permisibles de otras propiedades del combustible, tales como Indice de cetano, punto de enturbiamiento, punto de inflamación, viscosidad, punto de anilina, contenido de azufre, contenido de agua, contenido de cenizas, corrosión en lámina de cobre y residuo carbonoso. Técnicamente, cualquier material destilado hidrocarbonado derivado de biomasa o que cumpla la especificación de AS-TM adecuada se podrá definir como combustible diésel (ASTM D975) , combustible para aviones (ASTM D1655) o como biodiésel si es un éster metílico de un ácido graso (ASTM D6751) .

Después de la extracción, los componentes lipidíeos y/o hidrocarbonados recuperados a partir de la biomasa microbiana que se describe en la presente se pueden someter a un tratamiento químico para producir un combustible que se utilice en vehículos diésel y motores de aviones.

El biodiésel es un líquido cuyo color varía entre dorado y café oscuro dependiendo de la materia prima utilizada en la producción. Es prácticamente inmiscible en agua, tiene un punto de ebullición elevado y una presión de vapor baja. El término "biodiésel" se refiere a un combustible procesado equivalente al diésel para utilizar en vehículos con motor diésel. El biodiésel es biodegradable y atóxico. Un beneficio adicional del biodiésel respecto al combustible diésel convencional es que supone un menor desgaste del motor. Normalmente, el biodiésel comprende ésteres de alquilo C14-C18. Existen varios procesos que convierten la biomasa o un lípido producido y aislado según se describe en la presente en combustibles diésel. Un método preferido para producir biodiésel consiste en la transesterificación de un lípido según se describe en la presente. Un éster alquílico preferido para utilizar como biodiésel es un éster metílico o éster etílico.

El biodiésel producido mediante el método descrito en la presente se puede utilizar solo o combinado con combustible diésel convencional con cualquier concentración en la mayoría de vehículos modernos con motor diésel. Cuando se combina con combustible diésel convencional (diésel de petróleo) , el biodiésel puede estar presente con una concentración de aproximadamente un 0.1% a aproximadamente un 99.9%. En la mayoria del mundo de utiliza un sistema conocido como el factor "B" para indicar la cantidad de biodiésel en cualquier mezcla de combustibles. Por ejemplo, un combustible que contenga un 20% de biodiésel se denomina B20. El biodiésel puro se denomina B100.

El biodiésel también se puede utilizar como un combustible calefactor en calderas domésticas y comerciales. Las calderas de aceite existentes pueden contener partes de goma y pueden requerir un proceso de conversión para poderlas utilizar con biodiésel. Normalmente, el proceso de conversión es relativamente simple e implica el intercambio de las partes de goma por partes sintéticas, ya que el biodiésel es un disolvente potente. Debido a su acción como disolvente potente, la combustión del biodiésel incrementará la eficacia de las calderas. El biodiésel se puede utilizar como un aditivo en formulaciones de diésel para aumentar la lubricidad del combustible diésel puro con un bajo contenido de azufre (ULSD, por sus siglas en inglés) , el cual presenta ventajas debido a que prácticamente no contiene azufre. El biodiésel es un disolvente mejor que el petrodiésel y se puede utilizar para romper depósitos de residuos en las lineas de combustible de vehículos en los que se ha utilizado previamente petrodiésel.

El biodiésel se puede producir mediante la 'transesterificación de los triglicéridos contenidos en biomasa .rica en aceite. De este modo, en otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir biodiésel. En una realización preferida, el método para¦ producir biodiésel comprende los pasos de (a) cultivar un microorganismo que contiene lípidos utilizando los métodos descritos en la presente, (b) lisar un microorganismo que contiene lipidos para producir un lisado, (c) aislar el lípido del microorganismo lisado y (d) transesterificar la composición lipídica, con lo cual se produce el biodiésel. Los métodos para cultivar un microorganismo, lisar un microorganismo para producir un lisado, tratar el lisado en un medio que comprenda un disolvente orgánico para formar una mezcla heterogénea y separar el lisado tratado para obtener una composición lipídica se han descrito anteriormente y también se pueden utilizar en el método para producir biodiésel .

El perfil lipídico del biodiésel normalmente es muy similar al perfil lipídico del aceite utilizado como materia prima. Otros aceites proporcionados por los métodos y las composiciones de la invención se pueden someter a transesterificación para obtener biodiésel con perfiles lipidíeos que incluyen (a) al menos un 4% de C8-C14; (b) al menos un 0.3% de C8; (c) al menos un 2% de CIO; (d) al menos un 2% de C12; y (3) al menos un 30% de C8-C14.

Las composiciones lipídicas se pueden someter a transesterificación para obtener ésteres de ácidos grasos de cadena larga útiles como biodiésel. Las reacciones de transesterificación preferidas se indican a continuación e incluyen la transesterificación catalizada con base y la transesterificación que utiliza lipasas recombinantes . En un proceso de transesterificación catalizada con base, los triacilglicéridos se hacen reaccionar con un alcohol, tal como metanol o etanol, en presencia de un catalizador alcalino, normalmente hidróxido de potasio. Esta reacción forma ésteres metílicos o etílicos y glicerina (glicerol) como un producto secundario.

Los aceites de origen animal y vegetal están constituidos normalmente por triglicéridos , los cuales son ésteres de ácidos grasos libres con el' alcohol trihídrico glicerol. En la transesterificación, el glicerol de un triacilglicérido (TAG) se reemplaza por un alcohol de cadena corta tal como metanol o etanol . Un esquema de reacción habitual es como el que se indica a continuación: , C00Et + R2C00Et + R3C00Et + C3H5(OH)3 Esteres etílicos de ácidos grasos Glicerol Triglicérido En esta reacción, el alcohol se desprotona con una base para convertirlo en un nucleófilo más fuerte. Habitualmente, el etanol o metanol se utiliza en gran exceso (de hasta 50 veces) . Normalmente, esta reacción o bien tendrá lugar de forma excesivamente lenta o bien no tendrá lugar en absoluto. Se puede utilizar calentamiento, asi como también un ácido o una base, para propiciar que la reacción proceda más rápidamente. El ácido o la base no se consumen en la reacción de transesterificación, por lo tanto, no son reactivos sino catalizadores. La mayoría del biodiésel se ha producido utilizando la técnica de catálisis básica, ya que solo requiere temperaturas y presiones bajas y produce un rendimiento de conversión superior a un 98% (siempre que el aceite de partida tenga un contenido bajo de humedad y ácidos grasos libres) .

La transesterificación también se ha llevado a cabo, según se ha descrito anteriormente, utilizando una enzima, tal como una lipasa, en lugar de una base. La transesterificación catalizada con lipasas se puede llevar a cabo, por ejemplo, a una temperatura comprendida entre temperatura ambiente y 80° C, y con una relación molar del TAG frente al alcohol inferior que sea superior a 1:1, preferentemente de aproximadamente 3:1. Las lipasas adecuadas para utilizar en la transesterificación incluyen, sin carácter limitante, las enumeradas en la Tabla 9. Otros ejemplos de lipasas útiles para la transesterificación se describen, p. ej . , en las Patentes de EE. UU. N.os 4.798.793; 4.940.845; 5.156.963; 5.342.768; 5.776.741 y WO89/01032. Estas lipasas incluyen, sin carácter limitante, las lipasas producidas por microorganismos de Rhízopus, Aspergillus, Candida, Mucor, Pseudomonas, Rhizomucor, Candida y Humicola y lipasas pancreáticas.

Tabla 9. Lipasas adecuadas para utilizar en la transesterificación . lipasa ABG73614 de Aspergillus niger, lipasa B (novozym-435) CAA83122 de Candida antárctica, lipasa AAR24090 de Candida cylíndracea , lipasa de Candida lípolytica (Lipasa L; Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), lipasa de Candida rugosa (p. ej . , Lipasa-OF; eito Sangyo Co., Ltd.), lipasa de Mucor miehei (Lipozyme I 20), lipasa AAA25882 de Pseudomonas fluorescens, lipasa Q7M4U7_1 de Rhizopus japónicas (Lilipasa A-10FG) , lipasa B34959 de Rhizomucor miehei, lipasa AAF32408 (Lipasa F) de Rhizopus oryzae, lipasa ABI13521 de Serratia marcescens (S Enzyme) , lipasa CAB58509 de Thermomyces lanuginosa, Lipasa P (Nagase ChemteX Corporation) y Lipasa QLM (Meito Sangyo Co., Ltd., Nagoya, Japón) Un reto que plantea la utilización de una lipasa para la producción de ésteres de ácidos grasos adecuados para biodiésel es que el precio de la lipasa es mucho más elevado que el precio del hidróxido sódico (NaOH) utilizado en el proceso de base fuerte. Este reto se ha resuelto utilizando una lipasa inmovilizada, la cual se puede reciclar. Sin embargo, la actividad de la lipasa inmovilizada debe mantenerse después de reciclarla durante un número mínimo de ciclos. para gue el proceso basado en lipasas pueda competir con el proceso de base fuerte en cuanto al costo de producción. Las lipasas inmovilizadas se ven sometidas al envenenamiento por parte de los alcoholes inferiores utilizados habitualmente en la transesterificación . La Patente de EE. UU. N.° 6.398.707 (concedida el 4 de junio de 2002 a Wu et al.) describe métodos para mejorar la actividad de lipasas inmovilizadas y para regenerar lipasas inmovilizadas que tienen una actividad reducida. Algunos métodos adecuados incluyen sumergir una lipasa inmovilizada en un alcohol con un número de átomos de carbono que no sea inferior a tres durante un periodo de tiempo, preferentemente de 0.5-48 horas y, más preferentemente, de 0.5-1.5 horas. Algunos métodos adecuados también incluyen lavar una lipasa inmovilizada desactivada con un alcohol que tenga un número de átomos de carbono que no sea inferior a tres y a continuación sumergir la lipasa inmovilizada desactivada en un aceite vegetal durante 0.5-48 horas.

En realizaciones particulares, se expresa una lipasa recombinante en los mismos microorganismos que producen el lipido sobre el cual actúa la lipasa. Las lipasas recombinantes adecuadas incluyen las enumeradas anteriormente en la Tabla 9 y/o que tienen los números de acceso a GenBank enumerados anteriormente en la Tabla 9, o un polipéptido con al menos un 70% de identidad aminoacidica con una de las lipasas enumeradas anteriormente en la Tabla 9 y que presenta actividad lipasa. En realizaciones adicionales, la actividad enzimática está presente en una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o al menos aproximadamente un 99% de identidad respecto a una de las secuencias descritas anteriormente, todas las cuales se incorporan a la presente por referencia como si se hubieran expuesto completamente. El ADN que codifica la lipasa y el marcador seleccionable es preferentemente un ADNc con codones optimizados. En la Patente de EE. UU. 7.135.290 se describen métodos de recodificación de genes para la expresión en microalgas.

El estándar internacional común para el biodiésel es EN 14214. ASTM D6751 es el estándar de biodiésel más común al que se hace referencia en los Estados Unidos y Canadá. Alemania utiliza DIN EN 14214 y el Reino Unido requiere el cumplimiento de BS EN 14214. Los ensayos industriales básicos para determinar si los productos cumplen con estos estándares normalmente incluyen cromatografía de gases, HPLC y otros. El biodiésel que cumple los estándares de calidad es muy atóxico, con una evaluación de la toxicidad (DL50) superior a 50 mL/kg.

Aunque el biodiésel que cumple los estándares de ASTM debe ser atóxico, puede haber contaminantes con tendencia a cristalizar y/o precipitar y salir de la solución como sedimentos. La formación de sedimentos supone un problema especialmente cuando el biodiésel se utiliza a temperaturas bajas. El sedimento o los precipitados pueden provocar problemas tales como la reducción del flujo del combustible, la obstrucción de las lineas de combustible, la obstrucción de los filtros, etc. En la técnica se dispone de procesos específicos para la eliminación de estos contaminantes y sedimentos del biodiésel con el fin de producir un producto de mayor calidad. Los ejemplos de tales procesos incluyen, sin carácter limitante, el pretratamiento del aceite para eliminar contaminantes tales como fosfolípidos y ácidos grasos libres (p. ej . , desgomación, refinación cáustica y filtración por adsorción sobre sílice) y filtración en frío. La filtración en frío es un proceso que se desarrolló específicamente para eliminar cualesquiera materiales particulados y sedimentos presentes en el biodiésel después de su producción. Este proceso enfría el biodiésel y separa por filtración cualesquiera sedimentos o precipitados que se pueden formar cuando se utiliza el combustible a una temperatura más baja. Un proceso de este tipo es muy conocido en la técnica y se describe en la Solicitud de Patente de EE. UU. con N.° de Publicación 2007-0175091. Los métodos adecuados pueden incluir enfriar el biodiésel hasta una temperatura inferior a aproximadamente 38 °C, de manera que las impurezas y contaminantes precipiten como materiales particulados en el biodiésel liquido. A continuación, se puede añadir tierra de diatomeas u otro material filtrante al biodiésel enfriado para formar una suspensión, que posteriormente se puede filtrar a través de un filtro de hojas a presión u otro tipo de filtro para eliminar los materiales particulados. A continuación, el biodiésel filtrado se puede hacer pasar por un filtro de pulido para eliminar cualesquiera sedimentos y tierras de diatomeas remanentes y producir de este modo el producto de biodiésel final .

El Ejemplo 9 describe la producción de biodiésel utilizando aceite de triglicéridos de Prototheca moriformis. La filtrabilidad con empapamiento en frió,, según el método Al de ASTM D6751, del biodiésel producido en el Ejemplo 9 fue de 120 segundos para un volumen de 300 mL. Este ensayo implica la filtración de 300 mL de B100, que se ha enfriado hasta 40 °F durante 16 horas, se ha dejado calentar hasta temperatura ambiente y se ha filtrado al vacio utilizando un filtro de fibra de vidrio de 0.7 mieras con soporte de acero inoxidable. Los aceites de la invención se pueden transesterificar para generar biodiésel con un tiempo de empapamiento en frió inferior a 120 segundos, inferior a 100 segundos e inferior a 90 segundos.

También se pueden utilizar procesos posteriores si el biodiésel se utilizará en temperaturas particularmente frías. Estos procesos incluyen la winterización y el fraccionamiento Ambos procesos están diseñados para mejorar el flujo en frío y el rendimiento en invierno del combustible mediante la reducción del punto de enturbiamiento (la temperatura a la cual el biodiésel empieza a cristalizar) . Existen varias estrategias para winterizar el biodiésel. Una estrategia consiste en mezclar el biodiésel con diésel de petróleo. Otra estrategia consiste en utilizar aditivos que puedan reducir el punto de enturbiamiento del biodiésel. Otra estrategia consiste en eliminar los ésteres metílicos saturados de forma indiscriminada añadiendo los aditivos a la mezcla, dejando que cristalicen los componentes saturados y a continuación separando los cristales por filtración. El fraccionamiento separa selectivamente los ésteres metílicos en sus componentes o fracciones individuales para poder eliminar o incluir ésteres metílicos específicos. Los métodos de fraccionamiento incluyen el fraccionamiento con urea, fraccionamiento con disolventes y destilación térmica.

Otro combustible valioso proporcionado por los métodos de la presente invención es el diésel renovable, el cual comprende alcanos tales como C10:0, C12:0, C14:0 C16:0 y C18:0 y, por lo tanto, se distingue del biodiésel. El diésel renovable de alta calidad cumple el estándar de ASTM D975. Los lipidos producidos mediante los métodos de la presente invención pueden actuar como materia prima para producir diésel renovable. De este modo, en otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir diésel renovable. El diésel renovable se puede producir mediante al menos tres procesos: procesamiento hidro érmico (hidrotratamiento) , hidroprocesamiento y licuación indirecta. Estos procesos proporcionan destilados que no son esteres. Durante estos procesos, los triacilgligéridos producidos y aislados como se describe en la presente se convierten en alcanos .

En una realización, el método para producir diésel renovable comprende (a) cultivar un microorganismo que contiene lipidos utilizando los métodos descritos en la presente, (b) lisar el microorganismo para producir un lisado, (c) aislar el lipido del microorganismo lisado y (d) desoxigenar e hidrotratar el lipido para producir un alcano, con lo cual se produce el diésel renovable. Los lipidos adecuados para fabricar diésel renovable se pueden obtener por extracción a partir de la biomasa microbiana utilizando un disolvente orgánico tal como hexano o mediante otros métodos, tales como los que se describen en la Patente de EE. UU. 5.928.696. Algunos métodos adecuados pueden incluir prensado mecánico y centrifugación.

En algunos métodos, el lípido microbiano se somete primero a craqueo junto con hidrotratamiento para reducir la longitud de la cadena carbonada y saturar los dobles enlaces, respectivamente. A continuación, el material se isomeriza, también junto con hidrotratamiento. A con inuación, la fracción de naftas se puede eliminar mediante destilación, seguida por una destilación adicional para vaporizar y destilar los componentes deseados del combustible diésel para cumplir el estándar de ASTM D975, a la vez que se conservan los componentes que son más pesados de lo deseado para cumplir el estándar D975. Los métodos de hidrotratamiento, hidrocraqueo, desoxigenación e isomerización de aceites modificados químicamente, incluidos los aceites de triglicéridos, son muy conocidos en la técnica. Remítase, por ejemplo, a las Solicitudes de Patente Europea EP1741768 (Al); EP1741767 (Al); EP1682466 (Al); EP1640437 (Al); EP1681337 (Al); EP1795576 (Al); y a las Patentes de EE. UU. 7.238.277; 6.630.066; 6.596.155; 6.977.322; 7.041.866; 6.217.746; 5.885.440; 6.881.873.

En una realización del método para producir diesel renovable, el tratamiento del lipido para producir un alcano se lleva a cabo mediante el hidrotratamiento de la composición lipidica. Normalmente, en el procesamiento hidrotérmico, se hace reaccionar la biomasa en agua a una temperatura y presión elevadas para formar aceites y sólidos residuales. Normalmente, las temperaturas de conversión son de 300 ° a 660 °F, con una presión suficiente para mantener el agua principalmente como un liquido, de 100 a 170 atmósferas estándar (atm) . Los tiempos de reacción son del orden de 15 a 30 minutos. Después de que finalice la reacción, los componentes orgánicos se separan del agua. De este modo, se produce un destilado adecuado para utilizar como diésel.

En algunos métodos para obtener diésel renovable, el primer paso de tratamiento de un triglicérido consiste en el hidroprocesamiento para saturar los dobles enlaces, seguido de la desoxigenación a temperatura elevada en presencia de hidrógeno y un catalizador. En algunos métodos, la hidrogenación y la desoxigenación tienen lugar en la misma reacción. En otros métodos, la desoxigenación tiene lugar antes de la hidrogenación. A continuación, se realiza opcionalmente una isomerización, también en presencia de hidrógeno y un catalizador. Preferentemente, los componentes de naftas se eliminan por destilación. Para consultar algunos ejemplos, remítase a las Patentes de EE. UU. 5.475.160 (hidrogenación de triglicéridos) ; 5.091.116 (desoxigenación, hidrogenación y eliminación de gases); 6.391.815 (hidrogenación) y 5.888.947 (isomerización).

Un método adecuado para la hidrogenación de triglicéridos incluye preparar una solución acuosa de sales de cobre, zinc, magnesio y lantano y otra solución de un metal alcalino o, preferentemente, carbonato de amonio. Las dos soluciones se pueden calentar hasta una temperatura comprendida entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 85 °C y se pueden dosificar conjuntamente en un envase para precipitación con unas tasas tales que el pH en el recipiente para precipitación se mantenga entre 5.5 y 7.5 con el fin de formar un catalizador. Se puede utilizar agua adicional ya sea inicialmente en el envase para precipitación o añadiéndola concurrentemente con la solución salina y la solución de precipitación. A continuación, el precipitado resultante se puede lavar completamente, secar, calcinar a aproximadamente 300 °C y activar con hidrógeno a temperaturas comprendidas entre aproximadamente 100 °C y aproximadamente 400 °C. A continuación, uno o más triglicéridos se pueden poner en contacto con hidrógeno y hacerlos reaccionar con este en presencia del catalizador descrito anteriormente en un reactor. El reactor puede ser un reactor por aspersión, un reactor de gas-sólido con lecho fijo, un reactor de tipo columna de burbujeo empaquetada, un reactor en tanque agitado de forma continua, un reactor en fase de suspensión o cualquier otro tipo de reactor adecuado conocido en la técnica. El proceso se puede llevar a cabo de forma continua o discontinua. Las temperaturas de reacción están comprendidas normalmente en el rango de aproximadamente 170 °C a aproximadamente 250 °C, mientras que las presiones de reacción están comprendidas normalmente en el rango de aproximadamente 300 psig a aproximadamente 2000 psig. Además, la relación molar de hidrógeno respecto a triglicérido en el proceso de la presente invención está comprendida normalmente en el rango de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 700:1. El proceso se lleva a cabo normalmente con una velocidad espacial horaria másica (WHSV, por sus siglas en inglés) comprendida en el rango de aproximadamente 0.1 h-1 a aproximadamente 5 h_1. Un experto en la técnica se dará cuenta de que el periodo de tiempo necesario para la reacción variará de acuerdo con la temperatura utilizada, la relación molar de hidrógeno respecto al triglicérido y la presión parcial de hidrógeno. Los productos producidos mediante los procesos de hidrogenación de este tipo incluyen alcoholes grasos, glicerol, trazas de parafinas y triglicéridos que no hayan reaccionado. Normalmente, estos productos se separan utilizando métodos convencionales tales como, por ejemplo, destilación, extracción, filtración, cristalización y similares .

Las refinerías petrolíferas utilizan un hidroprocesamiento para eliminar las impurezas, tratando las corrientes de alimentación con hidrógeno. Las temperaturas de conversión del hidroprocesamiento están comprendidas normalmente entre 300 ° y 700 °F. Las presiones están comprendidas normalmente entre 40 y 100 atm. Los tiempos de reacción son normalmente del orden de 10 a 60 minutos. Se utilizan catalizadores sólidos para aumentar ciertas velocidades de reacción, mejorar la selectividad por ciertos productos y optimizar el consumo de hidrógeno.

Los métodos adecuados para la desoxigenación de un aceite incluyen calentar el aceite hasta una temperatura comprendida en el rango de aproximadamente 350 °F a aproximadamente 550 °F y poner en contacto de forma continua el aceite calentado con nitrógeno a al menos una presión comprendida entre aproximadamente presión atmosférica y una presión superior a esta durante al menos aproximadamente 5 minutos .

Los métodos adecuados para la isomerización incluyen la isomerización alcalina y otros tipos de isomerización de aceites conocidos en la técnica.

El hidrotratamiento e hidroprocesamiento producen en última instancia una reducción del peso molecular de la corriente de alimentación de triglicéridos . En las condiciones de hidroprocesamiento, la molécula de triglicérido se reduce para obtener cuatro moléculas hidrocarbonadas: una molécula de propano y tres moléculas hidrocarbonadas más pesadas, normalmente en el rango de C8 a C18.

De este modo, en una realización, el producto de una o más reacciones químicas llevadas a cabo en composiciones de lípidos de la invención es una mezcla de alcanos que comprende diésel renovable de acuerdo con ASTM D975. La producción de hidrocarburos por parte de microorganismos se describe en el articulo de revisión de Metzger et al. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66: 486-496 y en A Look Back at the U.S. Department of Energy' s Aquatic Species Program: Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann y Paul Roessler (1998) .

Las propiedades de destilación de un combustible diésel se describen haciendo referencia a los términos T10-T90 (temperatura para un 10% y un 90%, respectivamente, de volumen destilado) . Se produjo combustible renovable a partir de aceite de triglicéridos de Prototheca moriformis y se describe en el Ejemplo 9. La T10-T90 del material producido en el Ejemplo 9 fue de 57.9 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otros tipos de modificación covalente de los aceites descritos en la presente, asi como también los métodos de destilación y fraccionamiento (tales como la filtración en frió) que se describen en la presente, se pueden emplear para generar composiciones de diésel renovable con otros rangos de T10-T90, tales como 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 y 65 °C, utilizando los aceites de triglicéridos producidos de acuerdo con los métodos descritos en la presente.

La TIO del material producido en el Ejemplo 9 fue de 242.1 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otros tipos de modificación covalente de los aceites descritos en la presente, asi como también los métodos de destilación y fraccionamiento (tales como la filtración en frío) que se describen en la presente, se pueden emplear para generar composiciones de diésel renovable con otros valores de TIO, tales como una TIO comprendida entre 180 y 295, entre 190 y 270, entre 210 y 250, entre 225 y 245, y de al menos 290.

La T90 del material producido en el Ejemplo 9 fue de 300 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otros tipos de modificación covalente de los aceites descritos en la presente, así como también los métodos de destilación y fraccionamiento (tales como la filtración en frió) que se describen en la presente, se pueden emplear para generar composiciones de diésel renovable con otros valores de T90, tales como una T90 comprendida entre 280 y 380, entre 290 y 360, entre 300 y 350, entre 310 y 340, y de al menos 290.

El PEF del material producido en el Ejemplo 9 fue de 300 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otros tipos de modificación covalente de los aceites descritos en la presente, así como también los métodos de destilación y fraccionamiento (tales como la filtración en frío) que se describen en la presente, se pueden emplear para generar composiciones de diésel renovable con otros valores de PEF, tales como un PEF comprendido entre 290 y 400, entre 300 y 385, entre 310 y 370, entre 315 y 360, y de al menos 300.

Otros aceites proporcionados por los métodos y las composiciones de la invención se pueden someter a combinaciones de hidrotratamiento, isomerización y otros tipos de modificación covalente, incluidos los aceites con perfiles lipidíeos que incluyen (a) al menos un 4% de C8-C14; (b) al menos un 0.3% de C8; (c) al menos un 2% de CIO; (d) al menos un 2% de C12; y (3) al menos un 30% de C8-C14.

Un diésel con un contenido ultrabajo de azufre tradicional se puede producir a partir de cualquier forma de biomasa mediante un proceso de dos pasos. En primer lugar, la biomasa se convierte en un gas de síntesis, que consiste en una mezcla gaseosa rica en hidrógeno y monóxido de carbono. A continuación, el gas de síntesis se convierte catalíticamente en líquidos. Normalmente, la producción de los líquidos se lleva a cabo utilizando la síntesis de Fischer-Tropsch (FT) . Esta tecnología se aplica a carbón, gas natural y aceites pesados. De este modo, en otra realización preferida más del método para producir diésel renovable, el tratamiento de la composición lipídica para producir un alcano se lleva a cabo mediante la licuación indirecta de la composición lipídica.

La presente invención también proporciona métodos para producir combustible para aviones. El combustible para aviones tiene un color que varia entre transparente y pajizo. El combustible más habitual és un combustible basado en aceite de parafina/sin plomo que se clasifica como Jet A-l, el cual se produce de acuerdo con un conjunto de especificaciones estandarizadas a nivel internacional. El combustible para aviones es una mezcla de un gran número de hidrocarburos diferentes, posiblemente incluso un millar o más. El rango de sus tamaños (pesos moleculares o números de carbonos) se ve restringido por los requisitos del producto, por ejemplo, el punto de congelación o el punto de humeo. El combustible para aviones de tipo queroseno (incluidos el Jet A y Jet A-l) presenta una distribución de los números de carbonos entre aproximadamente 8 y 16 números de carbonos. El combustible para aviones de tipo nafta o de corte amplio (incluido el Jet B) presenta normalmente una distribución de los números de carbonos entre aproximadamente 5 y 15 carbonos Ambos combustibles para aviones (Jet A y Jet B) pueden contener una serie de aditivos. Los aditivos útiles incluyen, sin carácter limitante, antioxidantes, agentes antiestáticos, inhibidores de la corrosión y agentes inhibidores de la formación de hielo en el sistema de combustible (FSII, por sus siglas en inglés) . Los antioxidantes evitan el espesamiento y normalmente se basan en fenoles alquilados, por ejemplo, AO-30, AO-31 o AO-37. Los agentes antiestáticos disipan la electricidad estática y evitan la formación de chispas. Un ejemplo es Stadis 450 con ácido dinonilnaftilsulfónico (DINNSA) como principio activo. En cuanto a los inhibidores de la . corrosión, p. ej . , DCI-4A se utiliza para combustibles de uso militar y civil, y DCI-6A se utiliza para combustibles de uso militar. Los agentes FSII incluyen, p. ej . , Di-EGME.

En una realización de la invención, se produce combustible para aviones mezclando combustibles de algas con un combustible para aviones existente. Los lipidos producidos mediante los métodos de la presente invención pueden actuar como materia prima para producir combustible para aviones. De este modo, en otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir combustible para aviones. En la presente se proporcionan dos métodos para producir combustible para aviones a partir de los lipidos producidos mediante los métodos de la presente invención: craqueo catalítico de fluidos (CCF) e hidrodesoxigenación (HDO) .

El craqueo catalítico de fluidos (CCF) es uno de los métodos utilizados para producir olefinas, especialmente propileno a partir de fracciones pesadas de crudo. Los lipidos producidos mediante el método de la presente invención se pueden convertir en olefinas. El proceso implica hacer fluir los lipidos producidos a través de una zona de CCF y recolectar una corriente de producto que comprende las olefinas, la cual es útil como combustible para aviones. Los lipidos producidos se ponen en contacto con un catalizador de craqueo en condiciones de craqueo para proporcionar una corriente de producto que comprende olefinas e hidrocarburos, la cual es útil como combustible para aviones.

En una realización, el método para producir combustible para aviones comprende (a) cultivar un microorganismo que contiene lipidos utilizando los métodos descritos en la presente, (b) lisar el microorganismo que contienen lipidos para producir un lisado, (c) aislar el lipido del lisado y (d) tratar la composición lipidica, con lo cual se produce el combustible para aviones. En una realización del método para producir un combustible para aviones, la composición lipidica se puede hacer fluir a través de una zona de craqueo catalítico de fluidos, lo cual, en una realización, puede comprender poner en contacto la composición lipidica con un catalizador de craqueo en condiciones de craqueo para proporcionar una corriente de prodycto que comprende olefinas C2-C5.

En ciertas realizaciones de este método, puede resultar deseable eliminar cualesquiera contaminantes que puedan estar presentes en la composición lipidica. De este modo, antes de hacer fluir la composición lipidica a través de una zona de craqueo catalítico de fluidos, la composición lipidica se trata previamente. El pretratamiento puede implicar poner en contacto la composición lipidica con una resina de intercambio iónico. La resina de intercambio iónico es una resina de intercambio iónico ácida, tal como Amberlyst™-15 , y se puede utilizar como un lecho en un reactor a través del cual se hace fluir la composición lipidica, ya sea hacia arriba o hacia abajo. Otros pretratamientos pueden incluir lavados con un ácido suave poniendo en contacto la composición lipidica con un ácido tal como ácido sulfúrico, acético, nítrico o clorhídrico. La puesta en contacto se realiza con una solución ácida diluida, normalmente a temperatura ambiente y presión atmosférica.

La composición lipidica, opcionalmente sometida a pretratamiento, se hace fluir a través de una zona de CCF, en la cual los componentes hidrocarbonados se someten a craqueo para obtener olefinas. El craqueo catalítico se lleva a cabo poniendo en contacto la composición lipidica en una zona de reacción con un catalizador compuesto por un material particulado finamente dividido. La reacción consiste en un craqueo catalítico, a diferencia del hidrocraqueo, y se lleva a cabo en ausencia de hidrógeno añadido o sin consumo de hidrógeno. A medida que la reacción de craqueo procede, se depositan cantidades sustanciales de coque sobre el catalizador. El catalizador se regenera a temperaturas elevadas quemando el coque del catalizador en una zona de regeneración. El catalizador que contiene coque, denominado en la presente "catalizador con coque", se transporta continuamente desde la zona de reacción hasta la zona de regeneración para regenerarlo y reemplazarlo por catalizador regenerado esencialmente exento de coque que proviene de la zona de regeneración. La fluidización de las partículas de catalizador por parte de varias corrientes gaseosas hace posible el transporte del catalizador entre la zona de reacción y la zona de regeneración. Los métodos para el craqueo de hidrocarburos, tales como los de la composición lipidica descrita en la presente, en una corriente fluidizada de catalizador, el transporte del catalizador entre la zona de reacción y la zona de regeneración, y la combustión del coque en el regenerador son muy conocidos por los expertos en la técnica de los procesos de CCF. Los ejemplos de catalizadores y aplicaciones de CCF útiles para el craqueo de la composición lipidica para producir definas C2-C5 se describen en las Patentes de EE. UU. N.os 6.538.169 y 7.288.685, las cuales se incorporan en su totalidad por referencia.

Los catalizadores de CCF adecuados generalmente comprenden al menos dos componentes que pueden estar o no en la misma matriz. En algunas realizaciones, ambos componentes se pueden hacer circular a través de todo el recipiente de reacción. El primer componente generalmente incluye cualquiera de los catalizadores conocidos que se utilizan en la técnica de craqueo catalítico fluidizado, tal como un catalizador amorfo activo de tipo arcilla y/o un tamiz molecular cristalino de alta actividad. Se suelen preferir los catalizadores de tipo tamiz molecular frente a los catalizadores amorfos debido a que presentan una selectividad mucho mejor para obtener los productos deseados. En algunas realizaciones preferidas, se pueden utilizar zeolitas como tamices moleculares en los procesos de CCF. Preferentemente, el primer componente del catalizador comprende una zeolita de poros grandes, tal como una zeolita de tipo Y, un material de alúmina activo, un material aglutinante, que comprende sílice o alúmina y un relleno inerte tal como caolín.

En una realización, el craqueo de la composición lipidica de la presente invención tiene lugar en la sección ascendente o, como alternativa, la sección de subida, de la zona de CCF. La composición lipidica se introduce en el conductor ascendente mediante una boquilla, lo cual da como resultado la vaporización rápida de la composición lipidica. Antes de entrar en contacto con el catalizador, la composición lipidica normalmente tendrá una temperatura comprendida entre aproximadamente 149 °C y aproximadamente 316 °C (entre 300 °F y 600 °F) . El catalizador se hace fluir desde el recipiente de mezcla hasta el conductor ascendente, donde entra en contacto con la composición lipidica durante un tiempo de aproximadamente 2 segundos o un tiempo inferior.

A continuación, los vapores mezclados de la composición lipidica que ha reaccionado y del catalizador se retiran de la parte ' superior del conductor ascendente a través de una salida y se separan para obtener una corriente de vapor de producto craqueado que contiene olefinas y una colección de partículas de catalizador cubiertas con cantidades sustanciales de coque y denominadas generalmente "catalizador con coque". Para intentar minimizar el tiempo de contacto de la composición lipidica y el catalizador, el cual puede fomentar la conversión adicional de los productos deseados en otros productos no deseados, se puede utilizar cualquier disposición de separadores, tal como una disposición de brazo en espiral, para eliminar rápidamente el catalizador con coque de la corriente de producto. El separador, p. ej . , un separador de brazo en espiral, se coloca en la porción superior de una cámara con una zona de extracción situada en la porción inferior de la cámara. El catalizador separado por el dispositivo de brazo en espiral desciende por goteo a la zona de extracción. La corriente de vapor de producto craqueado que comprende hidrocarburos craqueados, incluidas olefinas ligeras y parte del catalizador, sale de la cámara mediante un conducto que está comunicado con ciclones. Los ciclones eliminan las partículas de catalizador remanentes de la corriente de vapor de producto para reducir las concentraciones de partículas hasta niveles muy bajos. A continuación, la corriente de vapor de producto sale de la parte superior del recipiente de separación. El catalizador separado en los ciclones se devuelve al recipiente de separación y después a la zona extracción. La zona de extracción elimina los hidrocarburos adsorbidos de la superficie del catalizador mediante el contacto con vapor a contracorriente .

Se opera con una presión parcial baja de hidrocarburos para favorecer la producción de olefinas ligeras. Por consiguiente, la presión del conductor ascendente se fija entre aproximadamente 172 y 241 kPa (entre 25 y 35 psia) , con una presión parcial de hidrocarburos comprendida entre aproximadamente 35 y 172 kPa (entre 5 y 25 psia) , estando comprendida la presión parcial de hidrocarburos preferida entre 69 y 138 kPa (entre 10 y 20 psia) . Esta presión parcial relativamente baja para los hidrocarburos se consigue utilizando vapor como diluyente hasta el punto de que el diluyente esté constituido por un 10-55% p de composición lipidica y, preferentemente, aproximadamente un 15% p de composición lipidica. Se pueden utilizar otros diluyentes, tales como gas anhidro, para obtener presiones parciales de hidrocarburos equivalentes.

La temperatura de la corriente craqueada en la salida del conductor ascendente estará comprendida entre aproximadamente 510 °C y 621 °C (entre 950 °F y 1150 °F) . Sin embargo, unas temperaturas en la salida del conductor ascendente superiores a 566 °C (1050 °F) proporcionan más gas anhidro y más olefinas. En cambio, unas temperaturas en la salida del conductor ascendente inferiores a 566 °C (1050 °F) proporcionan menos etileno y propileno. Por consiguiente, se prefiere llevar a cabo el proceso de CCF a una temperatura preferida comprendida entre aproximadamente 566 °C y aproximadamente 630 °C, y una presión preferida comprendida entre . aproximadamente 138 kPa y aproximadamente 240 kPa (entre 20 y 35 psia) . Otra condición para el proceso es la proporción de catalizador frente a composición lipidica, la cual puede estar comprendida entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 y, preferentemente, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15.

En una realización del método para producir un combustible para aviones, la composición lipidica se introduce en la sección de subida de un reactor de CCF. La temperatura en la sección de subida será muy elevada y estará comprendida entre aproximadamente 700 °C (1292 °F) y aproximadamente 760 °C (1400 °F) , con una proporción de catalizador frente a composición lipidica comprendida entre aproximadamente 100 y aproximadamente 150. Cabe anticipar que la introducción de la composición lipidica en la sección de subida producirá cantidades considerables de propileno y etileno.

En otra realización del método para producir un combustible para aviones utilizando la composición lipidica o los lipidos producidos según se describe en la presente, la estructura de la composición lipidica o los lipidos se rompe mediante un proceso denominado hidrodesoxigenación (HDO) . La HDO se refiere a la eliminación de oxigeno utilizando hidrógeno, es decir, se elimina oxigeno a la vez que se rompe la estructura del material. Se hidrogenan dobles enlaces olefinicos y se elimina cualquier compuesto que contenga nitrógeno y azufre. La eliminación de azufre se denomina hidrodesulfuración (HDS) . El pretratamiento y la pureza de los materiales de partida (composición lipidica o lipidos) afectan a la vida útil del catalizador.

Generalmente, en el paso de HDO/HDS, se mezcla hidrógeno con el patrón de alimentación (composición lipidica o lipidos) y a continuación se hace pasar la mezcla a través de un lecho de catalizador como un flujo en equicorriente, ya sea como un patrón de alimentación de una única fase o de dos fases. Después del paso de HDO/MDS, la fracción del producto se separa y se transfiere a un reactor de isomerización diferente. En la bibliografía (FI 100 248), se describe un reactor de isomerización para material de partida biológico como un reactor en equicorriente.

El proceso para producir un combustible mediante la hidrogenacion de una corriente de alimentación de hidrocarburos, p. ej . , la composición lipidica o los lipidos de la presente, también se puede llevar a cabo haciendo pasar la composición lipidica o los · lipidos como un flujo en equicorriente con hidrógeno gaseoso a través de una primera zona de hidrogenacion y, posteriormente, el efluente de hidrocarburos se hidrogena de forma adicional en una segunda zona de hidrogenacion haciendo pasar hidrógeno gaseoso por la segunda zona de hidrogenacion como un flujo a contracorriente respecto al efluente de hidrocarburos. Los ejemplos de catalizadores y aplicaciones de HDO útiles para el craqueo de la composición lipidica para producir olefinas C2-C5 se describen en la Patente de EE. UU. N.° 7.232.935, la cual se incorpora en su totalidad por referencia.

Normalmente, en el paso de hidrodesoxigenación, se descompone la estructura del componente biológico, tal como la composición lipidica o los lipidos de la presente, se eliminan los compuestos que contienen oxigeno, nitrógeno, fósforo y azufre, asi como hidrocarburos ligeros en forma de gas, y se hidrogenan los enlaces olefinicos. En el segundo paso del proceso, es decir, en el denominado paso de isomerización, la isomerización se lleva a cabo para ramificar la cadena hidrocarbonada y mejorar el rendimiento de la parafina a temperaturas bajas.

En el primer paso, es decir, el paso de HDO, del proceso de craqueo se hacen pasar hidrógeno gaseoso y la composición lipidica o los lipidos de la presente que se han de hidrogenar a través de un sistema de tipo lecho de catalizador de HDO, ya sea en un flujo equicorriente o contracorriente, comprendiendo dicho sistema de tipo lecho de catalizador uno o más lechos de catalizador, preferentemente 1-3 lechos de catalizador. El paso de HDO se lleva a cabo normalmente en un modo equicorriente. En el caso de un sistema de tipo lecho de catalizador de HDO que comprenda dos o más lechos de catalizador, uno o más de los lechos se pueden operar utilizando el principio de flujo contracorriente. En el · paso de HDO, la presión está comprendida entre 20 y 150 bar, preferentemente entre 50 y 100 bar, y la temperatura está comprendida entre 200 y 500 °C, preferentemente en el rango de 300-400 °C. En el paso de HDO, se pueden utilizar catalizadores de hidrogenación conocidos que contienen metales del Grupo VII y/o VIB del Sistema Periódico. Preferentemente, los catalizadores de hidrogenación son catalizadores de Pd, Pt, Ni, NiMo o CoMo soportados, siendo el soporte sílice y/o alúmina. Normalmente, se utilizan catalizadores de NiMo/Al203 y CoMo/Al203.

Antes del paso de HDO, la composición lipídica o los lípidos de la presente se pueden tratar opcionalmente mediante un proceso de prehidrogenación en condiciones más suaves para evitar de este modo reacciones secundarias de los dobles enlaces. Esta prehidrogenación se lleva a cabo en presencia de un catalizador de prehidrogenación a temperaturas de 50-400 °C y a presiones de hidrógeno de 1-200 bar, preferentemente a una temperatura comprendida entre 150 y 250 °C y a una presión de hidrógeno comprendida entre 10 y 100 bar. El catalizador puede contener metales del Grupo VIII y/o VIB del Sistema Periódico. Preferentemente, el catalizador de prehidrogenación es un catalizador de Pd, Pt, Ni, NiMo o CoMo soportado, siendo el soporte sílice y/o alúmina .

La corriente gaseosa del paso de HDO que contiene hidrógeno se enfría y a continuación se elimina el monóxido de carbono, dióxido de carbono, los compuestos que contienen nitrógeno, fósforo y azufre, los hidrocarburos ligeros gaseosos y otras impurezas de dicha corriente. Tras un paso de compresión, el hidrógeno purificado o hidrógeno reciclado se devuelve al primer lecho de catalizador y/o entre los lechos de catalizador para compensar la corriente gaseosa retirada. Se retira el agua del liquido condensado. El liquido se traspasa al primer lecho de catalizador o entre los lechos de catalizador.

Después del paso de HDO, el producto se somete a un paso de isomerización . Resulta esencial para el proceso que las impurezas se eliminen tanto como sea posible antes de poner en contacto los hidrocarburos con el catalizador de isomerización. El paso de isomerización comprende un paso de extracción opcional, en el que el producto de reacción del paso de HDO se puede purificar por extracción con vapor de agua o un gas adecuado tal como un hidrocarburo ligero, nitrógeno o hidrógeno. El paso de extracción opcional se lleva a cabo en un modo a contracorriente en una unidad situada antes del catalizador de isomerización, donde el gas y el liquido se ponen en contacto entre si, o antes del reactor de isomerización en si en una unidad de extracción separada utilizando el principió de contracorriente.

Después del paso de extracción, el hidrógeno gaseoso y la composición lipidica o los lipidos hidrogenados de la presente, y opcionalmente una mezcla de n-parafina, se hacen pasar a través de una unidad de isomerización reactiva que comprende uno o varios lechos de catalizador. Los lechos de catalizador del paso de isomerización pueden operar de modo equicorriente o contracorriente.

Es importante para el proceso que en el paso de isomerización se aplique el principio de flujo a contracorriente. En el paso de isomerización, esto se consigue llevando a cabo el paso de extracción opcional o el paso de reacción de isomerización o ambos en un modo a contracorriente. En el paso de isomerización, la presión está comprendida en el rango de 20-150 bar, preferentemente en el rango de 20-100 bar, estando comprendida la temperatura entre 200 y 500 °C, preferentemente entre 300 y 400 °C En el paso de isomerización, se pueden utilizar los catalizadores de isomerización conocidos en la técnica. Los catalizadores de isomerización adecuados contienen tamices moleculares y/o un metal del Grupo VII y/o un portador. Preferentemente, el catalizador de isomerización contiene SAPO-11 o SAP041 o ZSM-22 o ZSM-23 o ferrierita y Pt, Pd o Ni y A1203 o Si02. Algunos catalizadores de isomerización habituales son, por ejemplo, Pt/SAPO-ll/Al203, Pt/ZSM-22/Al203, Pt/ZSM-23/Al203 y Pt/SAPO-ll/Si02. El paso de isomerización y el paso de HDO se pueden llevar a cabo en el mismo recipiente a presión o en recipientes a presión diferentes. La prehidrogenación opcional se puede llevar a cabo en un recipiente a presión diferente o en el mismo recipiente a presión que los pasos de isomerización y HDO.

De este modo, en una realización, el producto de una o más reacciones químicas es una mezcla de alcanos que comprende HRJ-5. En otra realización, el producto de la reacción química o las reacciones químicas es una mezcla de alcanos que comprende combustible para aviones de acuerdo con ASTM D1655. En algunas realizaciones, la composición de acuerdo con la especificación de ASTM 1655 para combustible de aviones tiene un contenido de azufre inferior a 10 ppm. En otras realizaciones, la composición de acuerdo con la especificación de ASTM 1655 para combustible de aviones tiene un valor TIO de la curva de destilación inferior a 205 °C. En otra realización, la composición de acuerdo con la especificación de ASTM 1655 para combustible de aviones tiene un punto de ebullición final (PEF) inferior a 300 °C. En otra realización, la composición de acuerdo con la especificación de ASTM 1655 para combustible de aviones tiene un punto de inflamación de al menos 38 °C. En otra realización, la composición de acuerdo con la especificación de ASTM 1655 para combustible de aviones tiene una densidad comprendida entre 775K/M3 y 840K/M3. En otra realización más, la composición de acuerdo con la especificación de ASTM 1655 para combustible de aviones tiene un punto de congelación inferior a -47 °C. En otra realización, la composición de acuerdo con la especificación de ASTM 1655 para combustible de aviones presenta un calor de combustión neto de al menos 42.8 MJ/K. En otra realización, la composición de acuerdo con la especificación de ASTM 1655 para combustible de aviones tiene un contenido de hidrógeno de al menos un 13.4% en masa. En otra realización, la composición de acuerdo con la especificación de ASTM 1655 para combustible de aviones tiene una estabilidad térmica, evaluada según un análisis gravimétrico cuantitativo JFTOT a 260 °C, inferior a 3 rara de Hg. En otra realización, la composición de acuerdo con la especificación de ASTM 1655 para combustible de aviones contiene una sustancia gomosa existente con una concentración inferior a 7 mg/dl.

De este modo, la presente invención describe varios métodos en los cuales se lleva a cabo una modificación química de un lípido de microalgas para obtener productos útiles en varias aplicaciones industriales y de otro tipo. Los ejemplos de procesos para modificar aceite producido mediante los métodos descritos en la presente incluyen, sin carácter limitante, la hidrólisis del aceite, el hidroprocesamiento del aceite y la esterificación del aceite.

Otras modificaciones químicas del lipido de microalgas incluyen, sin carácter limitante, epoxidación, oxidación, hidrólisis, sulfataciones, sulfonación, etoxilación, propoxilación, amidación y saponificación. La modificación del aceite de microalgas produce compuestos oleoquímicos básicos que se pueden modificar posteriormente para obtener compuestos oleoquímicos derivados seleccionados para una función deseada. De una forma similar a la descrita anteriormente con respecto a los procesos de producción de combustible, estas modificaciones químicas también se pueden llevar a cabo en los aceites generados a partir de los cultivos microbianos descritos en la presente. Los ejemplos de compuestos oleoquímicos básicos incluyen, sin carácter limitante, jabones, ácidos grasos, ésteres grasos, alcoholes grasos, compuestos grasos que contienen nitrógeno, ésteres metílicos de ácidos grasos y glicerol. Los ejemplos de compuestos oleoquímicos derivados incluyen, sin carácter limitante, nitrilos grasos, ésteres, ácidos que son dímeros, cationes de tipo amonio cuaternario, tensioactivos , alcanolaminas grasas, sulfatos de alcoholes grasos, resinas, emulsionantes, alcoholes grasos, olefinas, lodos de perforación, polioles, poliuretanos, poliacrilatos, caucho, velas, productos cosméticos, jabones metálicos, jabones, ésteres metílicos sulfonados en la posición alfa, sulfatos de alcoholes grasos, alcoholes grasos etoxilados, sulfatos de éteres de alcoholes grasos, imidazolinas , tensioactivos , detergentes, ésteres, cationes de tipo amonio cuaternario, productos de ozonólisis, aminas grasas, alcanolamidas grasas, etoxisulfatos, monoglicéridos , diglicéridos, triglicéridos (incluidos los triglicéridos de cadena media) , lubricantes, fluidos hidráulicos, grasas, fluidos dieléctricos, agentes para eliminar el moho, fluidos de metalistería, fluidos para la transferencia de calor, otros fluidos funcionales, productos químicos para la industria (p. ej . , productos de limpieza, adyuvantes para procesos textiles, plastifiantes , estabilizantes, aditivos), recubrimientos de superficies, pinturas y lacas, aislantes para cables eléctricos y alcanos superiores .

La hidrólisis de los constituyentes de tipo ácido graso de los glicerolípidos producidos mediante los métodos de la invención proporciona ácidos grasos libres que se pueden derivatizar para producir otros productos químicos útiles. La hidrólisis tiene lugar en presencia de agua y un catalizador, el cual puede ser un ácido o una base. Los ácidos grasos libres liberados se pueden derivatizar para obtener varios productos según se describe en los siguientes documentos: las Patentes de EE. UU . N.os 5.304.664 (ácidos grasos muy sulfatados); 7.262.158 (composiciones de productos de limpieza); 7.115.173 (composiciones de suavizantes para la ropa); 6.342.208 (emulsiones para el tratamiento de la piel); 7.264.886 (composiciones que repelen el agua); 6.924.333 (aditivos para pinturas); 6.596.768 (piensos para rumiantes ricos en lípidos) y 6.380.410 (tensioactivos para detergentes y productos de limpieza) .

Con respecto a la hidrólisis, en una realización de la invención, un aceite de triglicéridos se hidroliza opcionalmente en primer lugar en un medio liquido, tal como agua o hidróxido de sodio, para obtener glicerol y jabones. Existen varios métodos adecuados para la hidrólisis de triglicéridos, que incluyen, sin carácter limitante, saponificación, hidrólisis ácida, hidrólisis alcalina, hidrólisis enzimática (denominada en la presente división) e hidrólisis utilizando agua comprimida caliente. Un experto en la técnica se dará cuenta de que no es necesario hidrolizar un aceite de triglicéridos para producir un producto oleoquimico; en su lugar, el aceite se puede convertir directamente en el producto oleoquimico deseado mediante otros procesos conocidos. Por ejemplo, el aceite de triglicéridos se puede convertir directamente en un ácido graso de éster metílico mediante esterificación .

En algunas realizaciones, la hidrólisis catalítica del aceite producido mediante los métodos descritos en la presente tiene lugar mediante la división del aceite en glicerol y ácidos grasos. Según se ha descrito anteriormente, los ácidos grasos se pueden procesar posteriormente de manera adicional mediante varias modificaciones diferentes para obtener productos oleoquímicos derivados. Por ejemplo, en una realización, los ácidos grasos se pueden someter a una reacción de aminación para producir compuestos nitrogenados grasos. En otra realización, los ácidos grasos se pueden someter a ozonólisis para producir ácidos mono- y dibásicos.

En otras realizaciones, la hidrólisis puede tener lugar mediante la división de los aceites producidos en la presente para crear productos oleoquímicos. En algunas realizaciones preferidas de la invención, se puede dividir un aceite de triglicéridos antes de llevar a cabo otros procesos. Un experto en la técnica se dará cuenta de que existen muchos métodos de división de triglicéridos adecuados, que incluyen, sin carácter limitante, la división enzimática y la división a presión.

En general, los métodos enzimáticos de división de aceites utilizan enzimas, lipasas, como biocatalizadores que actúan en una mezcla de agua/aceite. A continuación, la división enzimática divide el aceite o la grasa, respectivamente, en glicerol y ácidos grasos libres. A continuación, el glicerol puede migrar a la fase acuosa, mientras que la fase orgánica se enriquece con los ácidos grasos libres.

Las reacciones de división enzimática generalmente tienen lugar en la inferíase entre la fase acuosa y la orgánica, donde la enzima está presente solamente en la inferíase. Los triglicéridos que se encuentran en la inferíase contribuyen o participan posteriormente en la-reacción de división. A medida que la reacción procede, la densidad de ocupación o concentración de ácidos grasos todavía unidos químicamente como glicéridos se reduce en la inferíase, en comparación con los ácidos grasos libres, de manera que la reacción se ralentiza. En ciertas realizaciones, la división enzimática puede tener lugar ' a temperatura ambiente. Un experto en la técnica conocerá las condiciones adecuadas para la división del aceite en los ácidos grasos deseados.

A modo de ejemplo, la velocidad de la reacción se puede acelerar aumentando la superficie de la interfase. Una vez que se ha completado la reacción, los ácidos grasos se separan a continuación de la fase orgánica exenta de enzima, y el residuo que todavía contiene los ácidos grasos unidos químicamente como glicéridos se puede utilizar como fuente de alimentación o se recicla y se mezcla con grasa o aceite fresco para someterlo a división. De este modo, los glicéridos reciclados se someten a continuación a un proceso de división enzimática adicional. En algunas realizaciones, los ácidos grasos libres se extraen a partir de un aceite o grasa parcialmente dividido de este modo. De este modo, si los ácidos grasos unidos químicamente (triglicéridos ) se vuelven a incorporar o se utilizan como fuente de alimentación en el proceso de división, el consumo de la enzima se puede reducir de forma drástica.

El grado de división se determina como la proporción del índice de acidez medido dividido por el índice de acidez teóricamente posible, el cual se puede calcular para una grasa o aceite dado. Preferentemente, el índice de acidez se mide mediante una valoración de acuerdo con los métodos comunes estándar. Como alternativa, la densidad de la fase acuosa que contiene el glicerol se puede considerar como una medida del grado de división.

En una realización, el proceso de división según se describe en la presente también resulta adecuado para la división de mono-, di- y triglicéridos que están contenidos en el denominado caldo de jabón del proceso de refinación alcalina de los aceites producidos. De este modo, un caldo de jabón se puede convertir de forma cuantitativa sin saponificación previa de los aceites naturales en los ácidos grasos. A este efecto, los ácidos grasos que están unidos químicamen e en los jabones se liberan, preferentemente antes de la división, mediante la adición de ácido. En ciertas realizaciones, se utiliza una solución tampón, además de agua y la enzima, para el proceso de división.

En una realización, los aceites producidos de acuerdo con los métodos de la invención también se pueden someter a una saponificación como método de hidrólisis. Los aceites de origen animal y vegetal están constituidos normalmente por triacilgliceroles (TAG) , los cuales son ésteres de ácidos grasos con el alcohol trihidrico glicerol. En una reacción de hidrólisis alcalina, se elimina el glicerol de un TAG, dejando tres aniones de ácidos carboxilicos , los cuales se pueden asociar con cationes de metales alcalinos, tales como sodio o potasio, para producir sales de ácidos grasos. En este esquema, los constituyentes de tipo ácido carboxilico se escinden del resto de glicerol y se reemplazan por grupos hidroxilo. La cantidad de base (p. ej . , KOH) que se utiliza en la reacción se determina en función del grado de saponificación deseado. Si el objetivo es, por ejemplo, producir un producto de jabón que comprenda algunos de los aceites presentes originariamente en la composición de TAG, se introducirá en la mezcla de reacción una cantidad de base insuficiente para convertir todos los TAG en sales de ácidos grasos. Normalmente, esta reacción se lleva a cabo en una solución acuosa y procede de forma lenta, pero se puede acelerar calentando. La precipitación de las sales de ácidos grasos se puede fomentar añadiendo sales tales como haluros de metales alcalinos hidrosolubles (p. ej . , NaCl o KC1) a la mezcla de reacción. Preferentemente, la base es un hidróxido de un metal alcalino tal como NaOH o KOH. Como alternativa, en el esquema de reacción se pueden utilizar otras bases tales como alcanolaminas , que incluyen, por ejemplo, trietanolamina y aminometilpropanol . En algunos casos, se pueden preferir estas alternativas para producir un producto de jabón transparente. En una realización, la composición lipidica sometida a saponificación es un mimético de sebo (es decir, una composición lipidica similar al del sebo) producido según se describe en la presente, o una mezcla de un mimético de sebo con otro aceite de triglicéridos .

En algunos métodos, el primer paso de la modificación química puede ser el hidroprocesamiento para saturar los dobles enlaces, seguido de la desoxigenación a temperatura elevada en presencia de hidrógeno y un catalizador. En otros métodos, la hidrogenacion y la desoxigenación tienen lugar en la misma reacción. En otros métodos más, la desoxigenación tiene lugar antes de la hidrogenacion. A continuación, se puede realizar opcionalmente una isomerización, también en presencia de hidrógeno y un catalizador. Finalmente, se pueden eliminar los gases y los componentes de nafta, si se desea. Por ejemplo, remítase a las Patentes de EE. UU . 5.475.160 (hidrogenacion de, triglicéridos); 5.091.116 (desoxigenación, hidrogenacion y eliminación de gases) ; 6.391.815 (hidrogenacion) y 5.888.947 (isomerización).

En algunas realizaciones de la invención, los aceites de triglicéridos están parcial o completamente desoxigenados. Las reacciones de desoxigenación forman productos deseados, que incluyen, sin carácter limitante, ácidos grasos, alcoholes grasos, polioles, cetonas y aldehidos. En general, sin limitarse a ninguna teoría particular, las reacciones de desoxigenación implican una combinación de varias vías de reacción diferentes, que incluyen, sin carácter limitante: hidrogenólisis , hidrogenación, hidrogenación-hidrogenólisis consecutivas, hidrogenólisis-hidrogenación consecutivas y reacciones de hidrogenación-hidrogenólisis combinadas, que dan como resultado la eliminación al menos parcial del oxígeno del ácido graso o éster de ácido graso para producir los productos de reacción, tales como alcoholes grasos, que se pueden convertir fácilmente en los productos químicos deseados mediante un procesamiento adicional. Por ejemplo, en una realización, un alcohol graso se puede convertir en olefinas mediante una reacción de CCF o en alcanos superiores mediante una reacción de condensación.

Una modificación química de este tipo es la hidrogenación, que consiste en la adición de hidrógeno a los dobles enlaces de los constituyentes de tipo ácido graso de los glicerolípidos o de los ácidos grasos libres. El proceso de hidrogenación permite la transformación de aceites líquidos en grasas sólidas o semisólidas, que pueden ser más adecuadas para aplicaciones específicas.

La hidrogenación del aceite producido mediante los métodos descritos en la presente se puede llevar a cabo junto con uno o más de los métodos y/o materiales que se proporcionan en la presente, según se describe en los siguientes documentos: Patentes de EE. UU. N.os 7.288.278 (aditivos alimentarios o medicamentos); 5.346.724 (productos para lubricación); 5.475.160 (alcoholes grasos); 5.091.116 (aceites comestibles); 6.808.737 (grasas estructurales para margarinas y productos de untar); 5.298.637 (sustitutos de grasas bajos en calorías); 6.391.815 (catalizador de hidrogenación y adsorbente de azufre); 5.233.099 y 5.233.100 (alcoholes grasos); 4.584.139 (catalizadores de hidrogenación); 6.057.375 (agentes supresores de espumas); y 7.118.773 (productos para untar que son emulsiones comestibles) .

Un experto en la técnica se dará cuenta de que se pueden utilizar varios procesos para hidrogenar carbohidratos. Un método adecuado incluye poner en contacto el carbohidrato con hidrógeno o hidrógeno mezclado- con un gas adecuado y un catalizador en condiciones adecuadas en un reactor de hidrogenación para formar un producto hidrogenado. Generalmente, el catalizador de hidrogenación puede incluir Cu, Re, Ni, Fe, Co, Ru, Pd, Rh, Pt, Os, Ir y aleaciones o cualquier combinación de estos, ya sea solos o con promotores tales como , Mo, Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, B, P, Bi y aleaciones o cualquier combinación de estos. Otros materiales que son catalizadores de hidrogenación eficaces incluyen rutenio modificado con renio o níquel soportado. En una realización, el catalizador de hidrogenación también incluye cualquiera de los soportes, dependiendo de la funcionalidad deseada del catalizador. Los catalizadores de hidrogenación se pueden preparar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica.

En algunas realizaciones, el catalizador de hidrogenación incluye un catalizador que es un metal del Grupo VIII soportado y un material esponjoso metálico (p. ej . , un catalizador de níquel esponjoso) . El niquel Raney proporciona un ejemplo de un catalizador de níquel esponjoso activado adecuado para utilizar en esta invención. En otra realización, la reacción de hidrogenación en la invención se lleva a cabo utilizando un catalizador que comprende un catalizador de níquel-renio o un catalizador de wolframio-níquel modificado. Un ejemplo de un catalizador adecuado para la reacción de hidrogenación de la invención es un catalizador de níquel-renio soportado en carbón.

En una realización, se puede preparar un catalizador de níquel Raney adecuado tratando una aleación de cantidades aproximadamente iguales en peso de níquel y aluminio con una solución alcalina acuosa, p. ej . , que contenga aproximadamente un 25% en peso de hidróxido de sodio. El aluminio se disuelve selectivamente en la solución alcalina acuosa, lo cual da como resultado un material en forma de esponja que comprende principalmente níquel con cantidades minoritarias de aluminio. La aleación inicial incluye metales promotores (es decir, molibdeno o cromo) en una cantidad tal que aproximadamente de un 1 a un 2% en peso permanezca en el catalizador de níquel esponjoso formado. En otra realización, el catalizador de hidrogenación se prepara utilizando una solución de nitrosilnitrato de rutenio (III) , cloruro de rutenio (III) en agua para impregnar un material de soporte adecuado. A continuación, la solución se seca para formar un sólido que tenga un contenido acuoso inferior a aproximadamente 1% en peso. A continuación, el sólido se puede reducir a presión atmosférica con una corriente de hidrógeno a 300 °C (sin calcinarlo) o 400 °C (calcinado) en un horno de bolas rotatorias durante 4 horas. Después de enfriar el catalizador y volverlo inerte con nitrógeno, se hace pasar un 5% en volumen de oxígeno en nitrógeno sobre el catalizador durante 2 horas.

En ciertas realizaciones, el catalizador descrito incluye un soporte para el catalizador. El soporte para el catalizador estabiliza y soporta el catalizador. El tipo de soporte para catalizador utilizado depende del catalizador seleccionado y las condiciones de reacción. Los soportes adecuados para la invención incluyen, sin carácter limitante, carbón, sílice, sílice-alúmina, zirconia, óxido de titanio, óxido de cerio, óxido de vanadio, nitruro, nitruro de boro, heteropoliácidos, hidroxiapatita, óxido de zinc, óxido de cromo, zeolitas, nanotubos de carbono, fulereno de carbono y cualquier combinación de estos.

Los catalizadores utilizados en esta invención se pueden preparar utilizando métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos adecuados pueden incluir, sin carácter limitante, humectación incipiente, impregnación evaporativa, deposición química de vapor, recubrimiento-lavado, técnicas de pulverización catódica con magnetrón y similares .

Las condiciones para llevar a cabo la reacción de hidrogenación variarán en función del tipo de material de partida y los productos deseados. Un experto en la técnica, teniendo en cuenta esta memoria descriptiva, podrá determinar las condiciones de reacción adecuadas. En general, la reacción de hidrogenación se lleva a cabo a temperaturas comprendidas entre 80 °C y 250 °C, preferentemente entre 90 °C y 200 °C y, de la forma más preferida, entre 100 °C y 150 °C. En algunas realizaciones, la reacción de hidrogenación se lleva a cabo a presiones comprendidas entre 500 KPa y 14000 KPa.

El hidrógeno utilizado en la reacción de hidrogenólisis de la presente invención puede incluir hidrógeno externo, hidrógeno reciclado, hidrógeno generado in situ y cualquier combinación de estos. La expresión "hidrógeno externo", tal como se utiliza en la presente, se refiere a hidrógeno que no se genera a partir de la reacción de la biomasa en si, sino que en su lugar se añade al sistema a partir de otra fuente.

En algunas realizaciones de la invención, resulta deseable convertir el carbohidrato de partida en una molécula más pequeña que se convertirá más fácilmente en los hidrocarburos superiores deseados. Un método adecuado para esta conversión se lleva a cabo a través de una reacción de hidrogenólisis. Se conocen varios procesos para llevar a cabo la hidrogenólisis de carbohidratos. Un método adecuado incluye poner en contacto un carbohidrato con hidrógeno o hidrógeno mezclado con un gas adecuado y un catalizador de hidrogenólisis en un reactor de hidrogenólisis en condiciones adecuadas para formar un producto de reacción que comprenda moléculas más pequeñas o polioles. En la presente, la expresión "moléculas más pequeñas o polioles" incluye cualquier molécula que tenga un peso molecular más bajo, que puede incluir un número menor de átomos de carbono o átomos de oxigeno que el carbohidrato de partida. En una realización, los productos de reacción incluyen moléculas más pequeñas que incluyen polioles y alcoholes. Un experto en la técnica podrá seleccionar el método adecuado para llevar a cabo la reacción de hidrogenólisis .

En algunas realizaciones, un azúcar o alcohol de azúcar de 5 y/o 6 carbonos se puede convertir en propilenglicol, etilenglicol y glicerol utilizando un catalizador de hidrogenólisis. El catalizador de hidrogenólisis puede incluir Cr, Mo, W, Re, Mn, Cu, Cd, Fe, Co, Ni, Pt, Pd, Rh, Ru, Ir, Os y aleaciones o cualquier combinación de estos, ya sea solos o con promotores tales como Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, Bi, B, O y aleaciones o cualquier combinación de estos. El catalizador de hidrogenólisis también puede incluir un catalizador piropolimérico carbonáceo que contenga metales de transición (p. ej . , cromo, molibdeno, wolframio, renio, manganeso, cobre, cadmio) o metales del Grupo VIII (p. ej . , hierro, cobalto, niquel, platino, paladio, rodio, rutenio, iridio y osmio) . En ciertas realizaciones, el catalizador de hidrogenólisis puede incluir cualquiera de los metales anteriores combinado con un óxido de un metal alcalinotérreo o adherido a un soporte- catalíticamente activo. En ciertas realizaciones, el catalizador descrito en la reacción de hidrogenólisis puede incluir un soporte para el catalizador según se ha descrito anteriormente para la reacción de hidrogenación.

Las condiciones para llevar a cabo la reacción de hidrogenólisis variarán en función del tipo de material de partida y los productos deseados. Teniendo en cuenta esta memoria descriptiva, un experto en la técnica podrá determinar las condiciones adecuadas que se deben utilizar para llevar a cabo la reacción. En general, la reacción de hidrogenólisis se lleva a cabo a temperaturas comprendidas entre 110 °C y 300 °C, preferentemente entre 170 °C y 220 °C y, de la forma más preferida, entre 200 °C y 225 °C. En algunas realizaciones, la reacción de hidrogenólisis se lleva a cabo en condiciones básicas, preferentemente a un pH comprendido entre 8 y 13 y, aún más preferentemente, a un pH comprendido entre 10 y 12. En algunas realizaciones, la reacción de hidrogenólisis se lleva a cabo a presiones comprendidas en el rango de 60 KPa a 16500 KPa, preferentemente en el rango de 1700 KPa a 14000 KPa y, aún más preferentemente, de 4800 KPa a 11000 KPa.

El hidrógeno utilizado en la reacción de hidrogenólisis de la presente invención puede incluir hidrógeno externo, hidrógeno reciclado, hidrógeno generado in situ y cualquier combinación de estos.

En algunas realizaciones, los productos de reacción mencionados anteriormente se pueden convertir en hidrocarburos superiores mediante una reacción de condensación en un reactor de condensación. En estas realizaciones, la condensación de los productos de reacción tiene lugar en presencia de un catalizador capaz de formar hidrocarburos superiores. Sin pretender vincularse a ninguna teoría, se cree que la producción de hidrocarburos superiores tiene lugar mediante una reacción de adición por pasos, que incluye la formación de enlaces carbono-carbono o carbono-oxígeno. Los productos de reacción resultantes incluyen una serie de compuestos que contienen estos restos, según se describe más detalladamente a continuación.

En ciertas realizaciones, los catalizadores de condensación adecuados incluyen un catalizador ácido, un catalizador básico o un catalizador ácido/básico. La expresión ."catalizador ácido/básico", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un catalizador que tiene una funcionalidad ácida y una funcionalidad básica. En algunas realizaciones, el catalizador de condensación puede incluir, sin carácter limitante, zeolitas, carburos, nitruros, zirconia, alúmina, sílice, aluminosilicatos, fosfatos, óxidos de titanio, óxidos de zinc, óxidos de vanadio, óxidos de lantano, óxidos de itrio, óxidos de escandio, óxidos de magnesio, óxidos de cerio, óxidos de bario, óxidos de calcio, hidróxidos, heteropoliácidos , ácidos inorgánicos, resinas modificadas con ácido, resinas modificadas con base y cualquier combinación de estos. En algunas realizaciones, el catalizador de condensación también puede incluir un modificador. Los modificadores adecuados incluyen La, Y, Se, P, B, Bi, Li, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba y cualquier combinación de estos. En algunas realizaciones, el catalizador de condensación también puede incluir un metal. Los metales adecuados incluyen Cu, Ag, Au, Pt, Ni, Fe, Co, Ru, Zn, Cd, Ga, In, Rh, Pd, Ir, Re, Mn, Cr, Mo, W, Sn, Os, aleaciones y cualquier combinación de estos.

En ciertas realizaciones, el catalizador descrito en la reacción de condensación puede incluir un soporte para el catalizador según se ha descrito anteriormente para la reacción de hidrogenación . En ciertas realizaciones, el catalizador de condensación está soportado sobre sí mismo. La expresión "soportado sobre sí mismo", tal como se utiliza en la presente, se refiere a que el catalizador no necesita ningún otro material que actúe como soporte. En otras realizaciones, el catalizador de condensación se utiliza junto con un soporte separado adecuado para suspender el catalizador. En una realización, el soporte del catalizador de condensación es sílice.

Las condiciones en las que tiene lugar la reacción de condensación variarán en función del tipo de material de partida y los productos deseados. Teniendo en cuenta esta memoria descriptiva, un ' experto en la técnica podrá determinar las condiciones adecuadas que se deben utilizar para llevar a cabo la reacción. En algunas realizaciones, la reacción de condensación se lleva a cabo a una temperatura en la que la termodinámica para la reacción propuesta sea favorable. La temperatura para la reacción de condensación variará dependiendo del alcohol o poliol de partida específico. En algunas realizaciones, la temperatura de la reacción de condensación está comprendida en el rango de 80 °C a 500 °C, preferentemente de 125 °C a 450 °C y, de la forma más preferida, de 125 °C a 250 °C. En algunas realizaciones, la reacción de condensación se lleva a cabo a presiones comprendidas en el rango de 0 KPa a 9000 KPa, preferentemente en el rango de 0 KPa a 7000 KPa y, aún más preferentemente, de 0 KPa a 5000 KPa.

Los aléanos superiores formados en la invención incluyen, sin carácter limitante, alcanos de cadena lineal o ramificada que contienen de 4 a 30 átomos de carbono, alquenos de cadena lineal o ramificada que contienen de 4 a 30 átomos de carbono, cicloalcanos que contienen de 5 a 30 átomos de carbono, cicloalquenos que contienen de 5 a 30 átomos de carbono, arilos, arilos condensados, alcoholes y cetonas. Los alcanos adecuados incluyen, sin carácter limitante, butano, pentano, penteno, 2-metilbutano, hexano, hcxcno, 2-metilpentano, 3-metilpentano, 2 , 2 , -dimetilbutano, 2 , 3-dimetilbutano, heptano, hepteno, octano, octeno, 2, 2, 4-trimetilpentano, 2,3-dimetilhexano, 2, 3, 4-trimetilpentano, 2 , 3-dimetilpentano, nonano, noneno, decano, deceno, undecano, undeceno, dodecano, dodeceno, tridecano, trideceno, tetradecano, tetradeceno, pentadecano, pentadeceno, nonildecano, nonildeceno, eicosano, eicoseno, uneicosano, uneicoseno, doeicosano, doeicoseno, trieicosano, trieicoseno, tetraeicosano, tetraeicoseno e isómeros de estos. Algunos de estos productos pueden ser adecuados para utilizar como combustibles.

En algunas realizaciones, los cicloalcanos y los cicloalquenos no están sustituidos. En otras realizaciones, los cicloalcanos y los cicloalquenos están monosustituidos . En otras realizaciones más, los cicloalcanos y los cicloalquenos están multisustituidos . En las realizaciones que comprenden los cicloalcanos y cicloalquenos sustituidos, el grupo sustituido incluye, sin carácter limitante, un alquilo de cadena lineal o ramificada que contiene de 1 a 12 átomos de carbono, un alquileno de cadena lineal o ramificada que contiene de 1 a 12 átomos de carbono, un fenilo y cualquier combinación de estos. Los cicloalcanos y cicloalquenos adecuados incluyen, sin carácter limitante, ciclopentano, ciclopenteno , ciclohexano, ciclohexeno, metilciclopentano, metilciclopenteno, etilciclopentano, etilciclopenteno, etilciclohexano, etilciclohexeno, isómeros y cualquier combinación de estos.

En algunas realizaciones, los arilos formados no están sustituidos. En otra realización, los arilos formados están monosustituidos. En las realizaciones que comprenden los arilos sustituidos, el grupo sustituido incluye, sin carácter limitante, un alquilo de cadena lineal o ramificada que contiene de 1 a 12 átomos de carbono, un alquileno de cadena lineal o ramificada que contiene de 1 a 12 átomos de carbono, un fenilo y cualquier combinación de estos. Los arilos adecuados para la invención incluyen, sin carácter limitante, benceno, tolueno, xileno, etilbenceno, para-xileno, meta-xileno y cualquier combinación de estos.

Los alcoholes producidos en la invención contienen de 4 a 30 átomos de carbono. En algunas realizaciones, los alcoholes son cíclicos. En otras realizaciones, los alcoholes están ramificados. En otra realización, los alcoholes son de cadena lineal. Los alcoholes adecuados para la invención incluyen, sin carácter limitante, butanol, pentanol, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, decanol, undecanol, dodecanol, tridecanol, tetradecanol, pentadecanol , hexadecanol, heptildecanol , octildecanol , nonildecanol , eicosanol, uneicosanol, doeicosanol, trieicosanol , tetraeicosanol e isómeros de estos.

Las cetonas producidas en la invención contienen de 4 a 30 átomos de carbono. En una realización, las cetonas son cíclicas. En otra realización, las cetonas están ramificadas. En otra realización, las cetonas son de cadena lineal. Las cetonas adecuadas para la invención incluyen, sin carácter limitante, butanona, pentanona, hexanona, heptanona, octanona, nonanona, decanona, undecanona, dodecanona, tridecanona, tetradecanona, pentadecanona, hexadecanona, heptildecanona, octildecanona, nonildecanona, eicosanona, uneicosanona, doeicosanona, trieicosanona, tetraeicosanona e isómeros de estas .

Otra modificación química de este tipo es la interesterificación . Los glicerolípidos producidos de forma natural no tienen una distribución uniforme de los constituyentes de tipo ácido graso. En el contexto de los aceites, la interesterificación se refiere al intercambio de radicales acilo entre dos ésteres de glicerolípidos diferentes. El proceso de interesterificación proporciona un mecanismo mediante el cual los constituyentes de tipo ácido graso de una mezcla de glicerolípidos se pueden reorganizar para modificar el patrón de distribución. La interesterificación es un proceso químico muy conocido y generalmente comprende calentar (hasta aproximadamente 200 °C) una mezcla de aceites durante un periodo de tiempo (p. ej . , 30 minutos) en presencia de un catalizador tal como un metal alcalino o un alquilato de un metal alcalino (p. e . , metóxido de sodio) . Este proceso se puede utilizar para aleatorizar el patrón de distribución de los constituyentes de tipo ácido graso de una mezcla de aceites o se puede dirigir a la producción de un patrón de distribución deseado. Este método de modificación química de lípidos se puede llevar a cabo con los materiales proporcionados en la presente tales como la biomasa microbiana con un porcentaje de peso celular seco en forma de lípido de al menos un 20%.

La interesterificación dirigida, en la cual se busca un patrón de distribución especifico de los ácidos grasos, se puede llevar a cabo manteniendo la mezcla de aceites a una temperatura inferior al punto de fusión de algunos TAG que pueda haber presentes. Esto provoca la cristalización selectiva de estos TAG, la cual los elimina de forma eficaz de la mezcla de reacción a medida que cristalizan. Se puede continuar el proceso hasta que la mayoría de los ácidos grasos del aceite hayan precipitado, por ejemplo. Un proceso de interesterificación dirigida se puede emplear, por ejemplo, para producir un producto con un menor contenido calórico mediante la sustitución de ácidos grasos de cadena más larga con homólogos de cadena más corta. La interesterificación dirigida también se puede utilizar para producir un producto con una mezcla de grasas que pueda proporcionar las características de fusión y propiedades estructurales deseadas que se buscan en los productos o aditivos alimentarios (p. ej . , margarina) sin tener que recurrir a la hidrogenación, la cual puede producir isómeros trans no deseados .

La interesterificación de los aceites producidos mediante los métodos descritos en la presente se puede llevar a cabo junto con uno o más de los métodos y/o materiales, o para producir productos, que se describen en los siguientes documentos: Patentes de EE. UU. N.os 6.080.853 (sustitutos de grasas no digeribles); 4.288.378 (estabilizante para ,1a mantequilla de cacahuate); 5.391.383 (aceite en aerosol comestible); 6.022.577 (grasas comestibles para productos alimentarios); 5.434.278 (grasas comestibles para productos alimentarios); 5.268.192 (productos de frutos secos con un contenido calórico bajo); 5.258.197 (composiciones comestibles bajas en calorías); 4.335.156 (productos grasos comestibles); 7.288.278 (aditivos alimentarios o medicamentos); 7.115.760 (proceso de fraccionamiento); 6.808.737 (grasas estructurales); 5.888.947 (lubricantes para motores); 5.686.131 (mezclas de aceites comestibles); y 4.603.188 (composiciones de un etano curables).

En una realización de acuerdo con la invención, la transesterificación del aceite, según se ha descrito anteriormente, va seguida de la reacción del producto transesterificado con poliol, según se describe en la Patente de EE. UU. N.° 6.465.642, para producir poliésteres de ácidos grasos y polioles. Esta esterificación y este proceso de separación pueden comprender los pasos que se indican a continuación: hacer reaccionar un éster de alquilo inferior con un poliol en presencia de un jabón; eliminar el jabón residual de la mezcla de producto; lavar con agua y secar la mezcla de producto para eliminar las impurezas; blanquear la mezcla de producto para refinarla; separar al menos una porción del éster de alquilo inferior que no haya reaccionado del poliéster de ácido graso y poliol en la mezcla de producto; y reciclar el éster de alquilo inferior que no haya reaccionado separado.

La transesterificación también se puede llevar a cabo en biomasa microbiana con ésteres de ácidos grasos de cadena corta, según se describe en la Patente de EE. UU . 6.278.006. En general, la transesterificación se puede llevar a cabo añadiendo un éster de ácido graso de cadena corta a un aceite en presencia de un catalizador adecuado y calentando la mezcla. En algunas realizaciones, el aceite comprende de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 90% de la mezcla de reacción en peso. En algunas realizaciones, los ésteres de ácidos grasos de cadena corta pueden constituir de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 50% de la mezcla de reacción en peso. Los ejemplos no limitantes de catalizadores incluyen catalizadores básicos, metóxido de sodio, catalizadores ácidos, incluidos los ácidos inorgánicos tales como ácido sulfúrico y arcillas acidificadas, ácidos orgánicos tales como ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico y ácido toluenosulfónico, y resinas ácidas tales como Amberlyst 15. Los metales, tales como sodio y magnesio, y los hidruros de metales también son catalizadores útiles .

Otra modificación química de este tipo es la hidroxilación, que implica la adición de agua a un doble enlace, lo cual da como resultado la saturación y la incorporación de un resto hidroxilo. El proceso de hidroxilación proporciona un mecanismo para convertir uno o más constituyentes de tipo ácido graso de un glicerolipido en un hidróxiácido graso. La hidroxilación se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el método descrito en la Patente de EE. UU. N.° 5.576.027. Los ácidos grasos hidroxilados , incluido el aceite de ricino y sus derivados, son útiles como componentes en varias aplicaciones industriales, que incluyen aditivos alimentarios, tensioactivos , agentes humectantes que son pigmentos, agentes desespumantes, aditivos impermeabilizantes, agentes plastificantes , agentes desodorantes y/o emulsionantes cosméticos, así como también productos electrónicos, farmacéuticos, pinturas, tintas, adhesivos y lubricantes. A continuación se presenta un ejemplo de cómo se puede llevar a cabo la hidroxilación de un glicérido: la grasa se puede calentar, preferentemente hasta aproximadamente 30-50 °C, combinada con heptano y se puede mantener a esta temperatura durante treinta minutos o más; a continuación, se puede añadir ácido acético a la mezcla, después una solución acuosa de ácido sulfúrico y a continuación una solución acuosa de peróxido de hidrógeno, la cual se añade en porciones pequeñas a la mezcla durante una hora; después de la adición del peróxido de hidrógeno acuoso, la temperatura se puede incrementar a continuación hasta al menos aproximadamente 60 °C y se agita durante al menos seis horas; después de agitar, se deja reposar la mezcla y la fase acuosa inferior formada en la reacción se puede eliminar, mientras que la fase superior de heptano formada en la reacción se puede lavar con agua caliente que tenga una temperatura de aproximadamente 60 °C; la capa de heptano lavada se puede neutralizar a continuación con una solución acuosa de hidróxido de potasio hasta obtener un pH de aproximadamente 5-7 y . a continuación se elimina mediante destilación al vacio; a continuación, el producto de reacción se puede secar al vacio a 100 °C y el producto seco se desodoriza al vapor en condiciones de vacio y se filtra a una temperatura de aproximadamente 50 °C a 60 °C utilizando tierra de diatomeas.

La hidroxilación de los aceites microbianos producidos mediante los métodos descritos en la presente se puede llevar a cabo junto con uno o más de los métodos y/o materiales, o para producir productos, que se describen en los siguientes documentos: Patentes de EE . UU. N.os 6.590.113 (tinta y recubrimientos basados en aceites); 4.049.724 (proceso de hidroxilación); 6.113.971 (mantequilla de aceite de oliva); 4.992.189 (lubricantes y aditivos para lubricantes); 5.576.027 (leche hidroxilada) ; y 6.869.597 (productos cosméticos). La hidroxilación del ácido ricinoleico proporciona un poliol.

Los glicerolipidos hidroxilados se pueden convertir en estólidos. Los estólidos están constituidos por un glicerolipido en el que un constituyente de tipo ácido graso hidroxilado se ha esterificado con otra molécula de ácido graso. La conversión de glicerolipidos hidroxilados en estólidos se puede llevar a cabo calentando una mezcla de glicerolipidos y ácidos grasos y poniendo en contacto la mezcla con un ácido mineral, según se describe en Isbell et al., JAOCS 71 (2) : 169-174 (1994). Los estólidos son útiles en varias aplicaciones, que incluyen, sin carácter limitante, las que se describen en los siguientes documentos: Patentes de EE . UU. N.os 7.196.124 (materiales elastómeros y recubrimientos para suelos); 5.458.795 (aceites espesados para aplicaciones a alta temperatura); 5.451.332 (fluidos para aplicaciones industriales); 5.427.704 (aditivos para combustibles); y 5.380.894 (lubricantes, grasas, plastificantes y tintas para impresoras) .

Otra modificación química de este tipo es la metátesis de olefinas. En la metátesis de olefinas, un catalizador separa los carbonos de tipo alquilideno en un alqueno (olefina) y forma alquenos nuevos apareando cada uno de ellos con diferentes carbonos de tipo alquilideno. La reacción de metátesis de olefinas proporciona un mecanismo para procesos tales como el truncamiento de cadenas alquílicas de ácidos grasos insaturados en los alquenos mediante etenolisis, la reticulación de ácidos grasos a través de conectores de tipo alqueno por autometátesis y la incorporación de nuevos grupos funcionales en los ácidos grasos mediante metátesis cruzada con alquenos derivatizados .

Junto con otras reacciones, tales como la transesterificación y la hidrogenación, la metátesis de olefinas permite transformar glicerolípidos insaturados en varios productos finales. Estos productos incluyen oligómeros de glicerolipidos para ceras, glicerolípidos de cadena corta para lubricantes, cadenas de alquilo homo- y heterobifuncionales para productos químicos y polímeros, ésteres de cadena corta para biocombustible e hidrocarburos de cadena corta para combustible de aviones. La metátesis de olefinas se puede llevar a cabo con derivados de ácidos grasos y triacilgliceroles , por ejemplo, utilizando los catalizadores y métodos que se describen en la Patente de EE. UU. N.° 7.119.216, la Patente de EE . UU . con N.° de Pub. 2010/0160506 y la Patente de EE. UU. con N.° de Pub. 2010/0145086.

La metátesis de olefinas de bioaceites generalmente comprende añadir una solución de catalizador de Ru con una concentración de aproximadamente 10 a 250 ppm en condiciones inertes a ésteres de ácidos grasos insaturados en presencia (metátesis cruzada) o ausencia (autometátesis ) de otros alquenos. Normalmente, las reacciones se dejan evolucionar desde unas horas hasta varios días y en última instancia proporcionan una distribución de productos alquénicos. A continuación se presenta un ejemplo de cómo se puede llevar a cabo una metátesis de olefinas con un derivado de tipo ácido graso: se puede añadir una solución del catalizador de Grubbs de primera generación {dicloro [2 ( 1-metiletoxi-a- O) fenil] metilen-oí-C] (triciclohexilfosfina) en tolueno con una concentración del catalizador de 222 ppm a un recipiente que contenga oleato de metilo anhidro y desgasificado. A continuación, se puede presurizar el recipiente con aproximadamente 60 psig de etileno gaseoso y mantenerlo a una temperatura inferior o igual a aproximadamente 30 °C durante 3 horas, de este modo se puede producir 9-decenoato de metilo con un rendimiento de aproximadamente un 50%.

La metátesis de olefinas de los aceites producidos mediante los métodos descritos en la presente se puede llevar a cabo junto con uno o más de los métodos y/o materiales, o para producir productos, que se describen en los siguientes documentos: la Solicitud de Patente PCT/US07/081427 (ácidos grasos con olefinas en la posición a) y las Solicitudes de Patente de EE. UU. N.03 12/281.938 (vaselinas), 12/281.931 (cápsulas para pistolas de aire comprimido de pintura) , 12/653.742 (plastificantes y lubricantes), 12/422.096 (compuestos orgánicos bifuncionales ) y 11/795.052 (cera para velas) .

Otras reacciones químicas que se pueden llevar a cabo con aceites microbianos incluyen la reacción de triacilgliceroles con un agente ciclopropanador para mejorar la fluidez y/o la estabilidad frente a la oxidación, según se describe en la Patente de EE. ÜU . 6.051.539; la producción de ceras a partir de triacilgliceroles, según se describe en la Patente de EE. UU. 6.770.104; y la epoxidación de triacilgliceroles, según se describe en "The effect of fatty acid composition on the acrylation kinetics of epoxidized triacylglycerols" , Journal of the American Oil Chemists ' Society, 79:1, 59-63, (2001) y Free Radical Biology and Medicine, 37:1, 104-114 (2004).

La generación de biomasa microbiana que contiene aceite para productos químicos y combustibles según se ha descrito anteriormente da como resultado la producción de harina de biomasa deslipidada. La harina deslipidada es un producto secundario de la preparación de aceite de algas y es útil como pienso para animales tales como animales de granja, p. ej . , rumiantes, aves de corral, cerdos y animales de acuicultura. La harina resultante, aunque presenta un contenido de aceite reducido, sigue conteniendo proteínas de alta calidad, carbohidratos, fibra, cenizas, aceite residual y otros nutrientes adecuados para un pienso para animales. Ya que las células están predominantemente lisadas debido al proceso de separación del aceite, la harina deslipidada es fácilmente digerible por animales de este tipo. La harina deslipidada se puede combinar opcionalmente con otros ingredientes, tales como grano, en un pienso para animales. Debido a que la harina deslipidada tiene una consistencia en polvo, se puede prensar para obtener pellets utilizando un extrusor o expansor u otro tipo de máquina, que se puede adquirir de proveedores comerciales.

El aceite de ricino es un aceite de origen natural que se aisla a partir de las semillas de ricino. La hidrólisis del aceite de ricino proporciona ácido ricinoleico. La producción de aceite de ricino a partir de semillas de ricino es dificultosa porque las semillas de ricino contienen elevadas cantidades de ricina. La ricina es una toxina extremadamente peligrosa, clasificada como un compuesto de tipo 1 en la Convención de Armas Químicas. Por consiguiente, se deben tomar muchas precauciones en la producción de aceite de ricino a partir de semillas de ricino. En una realización de la invención, se proporciona un aceite hidroxilado aislado a partir de una célula de microalga. De este modo, se puede producir ácido ricinoleico. En una realización, el aceite hidroxilado es un triglicérido hidroxilado. El triglicérido hidroxilado de la presente invención puede ser químicamente similar al aceite de ricino. Según se muestra en el Ejemplo 7, la invención proporciona un aceite microbiano hidroxilado. Cuando el aceite del Ejemplo 7 se analizó por GC/MS, se demostró que los inventores habían producido ácido ricinoleico (ácido 12-hidroxi-9-cis-octadecenoico) .

Un ácido graso de acuerdo con una realización de la invención es un ácido graso hidroxilado. Una realización del ácido graso hidroxilado es ácido ricinoleico.

El aceite hidroxilado microbiano o ácido graso hidroxilado se puede hidroxilar de forma adicional. Cuando el ácido ricinoleico se hidroxila de forma adicional, se proporciona un ácido graso que contiene dos grupos hidroxilo, un poliol.

La invención proporciona una composición preparada haciendo reaccionar un poliol (p. ej . , aceite hidroxilado y/o un ácido graso hidroxilado) con un compuesto que contenga un resto isocianato. Se han producido poliuretanos utilizando aceite de ricino y un isocianato. Los poliuretanos se encuentran en muchos de los productos que utilizamos hoy en día. Se pueden encontrar poliuretanos en automóviles, juguetes, equipos de atletismo, aparatos electrónicos, zapatos, colchones, cojines, adhesivos, materiales de construcción y similares. Actualmente, los poliuretanos hechos de aceite de ricino se pueden adquirir de proveedores comerciales tales como BASF, Itoh Oil y otros. Los poliuretanos hechos de aceite de soya hidroxilado se pueden adquirir de proveedores comerciales tales como Cargill, Dow, Bayer y otros.

En una realización, el ácido ricinoleico producido por las células microbianas se puede procesar de forma adicional para obtener un producto oleoquimico, que incluye un éster ricinoleico, una amida ricinoleica, poliuretano, espuma de poliuretano o una pieza de poliuretano, de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Remítase, por ejemplo, a las Patentes de EE. UU. N.os 6194475, 4266617, 6403664 y 4058492 y a la Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 20100227151.

Habiéndose descrito con detalle anteriormente, la invención se ejemplifica en los siguientes ejemplos, que se presentan para ilustrar, pero no limitar, la invención reivindicada .

VII. EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Métodos para cultivar Prototheca Se cultivaron cepas de Prototheca para obtener un porcentaje elevado de aceite en peso seco celular. Las células conservadas criológicamente se descongelaron a temperatura ambiente y se añadieron 500 de células a 4.5 mL de medio (4.2 g/L de K2HP04, 3.1 g/L de NaH2P04, 0.24 g/L de MgS04 ·7?20, 0.25 g/L de ácido cítrico monohidratado, 0.025 g/L de CaCl2 ·2?20, 2g/L de extracto de levadura) junto con un 2% de glucosa y se cultivaron durante 7 días a 28 °C con agitación (200 rpm) en una placa de 6 pocilios. Los pesos secos celulares se determinaron por centrifugación de 1 mL de cultivo a 14 000 rpm durante 5 minutos en un tubo Eppendorf pesado previamente. El sobrenadante de cultivo se descartó y el pellet celular resultante se lavó con 1 mL de agua desionizada. El cultivo se centrifugó de nuevo, el sobrenadante se descartó y los pellets celulares se mantuvieron a -80 °C hasta que se congelaron. A continuación, las muestras se liofilizaron durante 24 horas y se calcularon los pesos secos celulares. Para la de erminación del contenido lipídico total en los cultivos, se extrajeron 3 mL del cultivo y se analizaron utilizando un sistema de Ankom (Ankom Inc., Macedón, NY) , de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las muestras se sometieron a extracción con disolvente en un extractor Amkom XT10 de acuerdo con el protocolo del fabricante. El contenido lipídico total se determinó como la diferencia másica entre las muestras secas hidrolizadas con ácido y las muestras secas extraídas con disolvente. Las mediciones del porcentaje de aceite en peso seco celular se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10. Porcentaje de aceite en peso seco celular Se determinó el genotipo de muestras de microalgas para múltiples cepas del género Prototheca . Se aisló ADN genómico de la biomasa algácea como se indica a continuación. Las células (aproximadamente 200 mg) de los cultivos líquidos se centrifugaron 5 minutos a 14 000 x g. A continuación, las células se volvieron a suspender en agua destilada estéril, se centrifugaron 5 minutos a 14 000 x g y se desechó el sobrenadante. Se añadió una única microesfera de cristal con un diámetro de - 2 ni a la biomasa y los tubos se trataron a -80 °C durante al menos 15 minutos. Se retiraron las muestras y se añadieron 150 pL de tampón de trituración (1% de Sarkosil, sacarosa 0.25 M, NaCl 50 mM, EDTA 20 m , Tris-HCl 100 mM, pH de 8.0, 0.5 ug/pL de ARNasa A). Se volvieron a suspender los pellets agitando brevemente con un vórtex y a continuación se añadieron 40 \i de NaCl 5 M. Las muestras se agitaron brevemente con un vórtex, a continuación se añadieron 66 pL de CTAB al 5% (bromuro de cetiltrimetilamonio) y se agitó brevemente por última vez con un vórtex.

Posteriormente, las muestras se incubaron a 65 °C durante 10 minutos y después se centrifugaron a 14 000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se extrajo una vez con 300 L de fenol : cloroformo : alcohol isoamilico 12:12:1, a continuación se centrifugó durante 5 minutos a 14 000 x g. La fase acuosa resultante se transfirió a un tubo nuevo que contenia 0.7 volúmenes de isopropanol (~ 190 µ??) , se mezcló por inversión y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos o durante toda la noche a 4 °C. El ADN se obtuvo por centrifugación a 14 000 x g durante 10 minutos. A continuación, el pellet resultante se lavó dos veces con etanol al 70% y después se realizó un lavado final con etanol al 100%. Los pellets se secaron al aire durante 20-30 minutos a temperatura ambiente, y después se volvieron a suspender en 50 L de TrisCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH de 8.0) .

Se diluyeron cinco \iL de ADN total de algas, preparado como se ha descrito anteriormente, con un factor de 1:50 en Tris 10 mM, pH de 8.0. Las reacciones de PCR, con un volumen final de 20 iL, se llevaron a cabo como se indica a continuación. Se añadieron diez \iL de mezcla patrón 2 x iProof HF (Bio-Rad) a 0.4 uL del cebador SZ02613 (5'-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3 ' (SEQ ID NO: 9) con una concentración estándar de 10 mM) . Esta secuencia de cebador comprende desde la posición 567 a 588 en el número de acceso a GenBank L43357 y está altamente conservada en genomas plastidicos de algas y plantas superiores. A continuación, se añadieron 0.4 i del cebador SZ02615 (5' -CAGTGAGCTATTACGCACTC-3' (SEQ ID NO: 10) con una concentración estándar de 10 mM) . Esta secuencia de cebador es complementaria con la posición 1112-1093 en el número de acceso a GenBank L43357 y está altamente conservada en genomas plastidicos de algas y plantas superiores. A continuación, se añadieron 5 µL de ADN total diluido y 3.2 µL de dH20. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo como se indica a continuación: 98 °C, 45''; 98 °C, 8''; 53 °C, 12''/ 72 °C, 20' ' durante 35 ciclos seguidos de 72 °C durante 1 minuto y manteniéndose a 25 °C. Para la purificación de los productos de PCR, se añadieron 20 de Tris 10 mM, pH de 8.0, a cada reacción, a continuación se extrajo con 40 µL de fenol : cloroformo : alcohol isoamilico 12:12:1, se agitó con vórtex y se centrifugó a 14 000 x g durante 5 minutos. Las reacciones de PCR se trataron en columnas S-400 (GE Healthcare) y se centrifugaron durante 2 minutos a 3000 x g. Posteriormente, Jos productos purificados de PCR se sometieron a clonación TOPO en PCR8 /GW/TOPO y se seleccionaron los clones positivos para placas de LB/Spec. El ADN del plásmido purificado se secuenció en ambas direcciones utilizando cebadores 13 directos e inversos. En total, se seleccionaron doce cepas de Prototheca para secuenciar el ADN de ARNr 23S y las secuencias se enumeran en la Lista de secuencias. A continuación se incluye un resumen de las cepas y los números de la Lista de secuencias.' Se analizaron las secuencias para determinar la divergencia total respecto a la secuencia de UTEX 1435 (SEQ ID NO: 15). Se detectaron dos pares (UTEX 329/UTEX 1533 y UTEX 329/UTEX 1440) como las más divergentes. En ambos casos, el alineamiento de pares de bases dio como resultado un 75.0% de identidad secuencial de pares de bases. ? continuación, también se incluye el porcentaje de identidad secuencial respecto a UTEX 1435: Las muestras lipidicas de un subconjunto de las cepas enumeradas anteriormente se analizaron para determinar el perfil lipídico mediante HPLC. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 11. Como alternativa, los perfiles lipidíeos se pueden determinar utilizando el procedimiento que se indica en el Ejemplo 11.

Tabla 11. Diversidad de las cadenas lipídicas en especies de Prototheca El aceite extraído de UTEX 1435 de Prototheca moriformis (mediante extracción con disolvente o utilizando una prensa de tornillo) se analizó para determinar el contenido de carotenoides , clorofila, tocoferoles, otros esteróles y tocotrienoles . Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 12.

Tabla 12. Análisis ' de carotenoides, clorofila, tocoferol/esteroles y tocotrienol en aceite extraído de Prototheca moriformis (UTEX 1435) .

El aceite extraído de Prototheca moriformis, de cuatro lotes diferentes, se refino y decoloró utilizando métodos de procesamiento de aceites vegetales estándares. Resumiendo, el aceite crudo extraído de Prototheca moriformis se clarificó en un decantador horizontal, donde se separaron los sólidos del aceite. A continuación, el aceite clarificado se transfirió a un tanque con ácido cítrico y agua, y se dejó que reposara durante aproximadamente 24 horas. Después de 24 horas, la mezcla del tanque formó dos fases diferentes. La fase inferior estaba compuesta por agua y productos gomosos, que posteriormente se eliminaron por decantación antes de transferir el aceite desgomado a un tanque de decoloración. A continuación, el aceite se calentó junto con otra dosis de ácido cítrico. Después se añadió arcilla decolorante al tanque de decoloración y la mezcla se calentó adicionalmente al vacío para evaporar cualquier resto de agua que estuviera presente. A continuación, la mezcla se bombeó a través de un filtro de hojas para eliminar la arcilla decolorante. Después el aceite filtrado se hizo pasar a través de un filtro pulidor' final de .5 µp? y a continuación se recolectó para almacenarlo hasta su uso. Después el aceite refinado y decolorado (RB) se analizó para determinar el contenido de carotenoides , clorofila, esteróles, tocotrienoles y tocoferóles. Los resultados de estos análisis se resumen en la Tabla 13 a continuación. "Nd" significa no detectado y la sensibilidad de la detección se éspecifica a continuación: Sensibilidad de la detección Carotenoides (mcg/g) ; nd = < 0.003 mcg/g Clorofila (mcg/g); nd = < 0.03 mcg/g Esteróles (%); nd = 0.25% Tocoferoles (mcg/g) ; nd = 3 mcg/g Tabla 13. Análisis de carotenoides , clorofila, esteróles, tocotrienoles y tocoferol de aceite refinado y decolorado de Prototheca moriformis.

Los mismos cuatro lotes de aceite de Prototheca moriformis también se analizaron para determinar los elementos traza y los resultados se resumen a continuación en la Tabla 14.

Tabla 14. Análisis elemental de aceite refinado y decolorado de Prototheca moriformis .

EJEMPLO 2 : Métodos generales para la transformación biolistica de Prototheca Se prepararon microportadores de oro de Seashell de 550 nanómetros de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se mezcló plásmido (20 µg) con 50 de tampón aglutinante y 60 \i (30 mg) de portadores de oro S550d y se incubó en hielo durante 1 min. Se añadió tampón de precipitación (100 µ?,) y la mezcla se incubó en hielo, durante 1 min más. Después de agitar con vórtex, se formaron pellets de las partículas recubiertas con ADN centrifugándolas a 10 000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf 5415C durante 10 segundos. El pellet de oro se lavó una vez con 500 de etanol al 100% frío, se formaron pellets por centrifugación breve en la microcentrífuga y se volvieron a suspender con 50 µ?. de etanol enfriado con hielo. Después de una breve sonicación (1-2 s) , se transfirieron inmediatamente 10 µ?? de partículas recubiertas con ADN a la membrana portadora.

Se cultivaron cepas de Prototheca en medio Proteosa (2 g/L de extracto de levadura, NaN03 2.94 mM, CaCl2'2H20 0.17 mM, MgS04»7H20 0.3 mM, K2HP04 0.4 mM, KH2P04 1.28 mM, NaCl 0.43 mM) con un 2% de glucosa en un agitador giratorio hasta que se obtuvo una densidad . celular de 2 x 106 células/mL. Las células se recolectaron, se lavaron una vez con agua destilada estéril y se volvieron a suspender en 50 µ?,. de medio. Se esparcieron 1 x 107 células en el tercer centro de una placa de medio Proteosa no selectivo. Las células se bombardearon con el sistema biolístico de suministro de partículas PDS-1000/He (Bio-Rad) . Se utilizaron discos de ruptura (1350 psi) y las placas se colocaron 6 cm por debajo del montaje de macroportador/pantalla . Se dejó que las células se recuperasen a 25 °C durante 12-24 h. Tras la recuperación, se rasparon las células de las placas con una espátula de goma, se mezclaron con 100 µL de medio y se esparcieron en placas que contenían la selección adecuada de antibióticos. Después de 7-10 días de incubación a 25 °C, se pudieron observar colonias que representaban células transformadas en las placas. Las colonias se seleccionaron y se colocaron en placas selectivas de agar (con fuente de antibiótico o de carbón) para una segunda ronda de selección.

EJEMPLO 3 : Expresión de varias tioesterasas en Prototheca Los métodos para expresar un gen heterólogo de tioesterasa en especies de Prototheca y sus efectos se han descrito previamente en la Solicitud de PCT N.° PCT/US2009/066142, que se incorpora a la presente por referencia. Se ha investigado adicionalmente el efecto de otros productos génicos/genes de tioesterasa de especies de plantas superiores. Estas tioesterasas incluyen las tioesterasas de las siguientes plantas superiores: En todos los casos, cada uno de los constructos de tioesterasa anteriores se transformó en Prototheca moriformis (UTEX 1435) empleando bombardeo biolistico de partículas. Otros métodos de transformación, incluida la recombinación homologa según se describe en la Solicitud de PCT N.° PCT/US2009/066142 , también serían adecuados para la expresión heteróloga de genes de interés. La transformación de Prototheca moriformis (UTEX 1435) con cada uno de los constructos de tioesterasa anteriores se llevó a cabo utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 2. Cada uno de los constructos contenía un gen NeoR y la selección de los clones positivos se llevó a cabo utilizando 100 µg/mL de G418.

Todas las regiones codificantes tenían los codones optimizados para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Prototheca moriformis UTEX 1435 (remítase a la Tabla 2) . En la lista de identidad de las secuencias se enumeran tanto las secuencias de aminoácidos como las secuencias de ADNc para el constructo utilizado. A menos que se especifique de otro modo, el péptido de tránsito para cada una de las tioesterasas de plantas superiores se reemplazó con un péptido de tránsito con codones optimizados de algas de una desaturasa de ácidos grasos delta-12 de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 48) o de una estearoil-ACP-desaturasa de Chlorella protothecoides (SEQ ID NO: 49). Todos los constructos de tioesterasa fueron dirigidos por el promotor de beta-tubulina/5' UTR de Chlamydomanas reinhardtii. El crecimiento y la producción de lípidos de los clones positivos seleccionados se compararon con los de Prototheca moriformis (UTEX 1435) de origen natural (sin transformar) . Los clones positivos seleccionados y de origen natural se cultivaron en placas G418 con un 2% de glucosa. El análisis de los perfiles lipidíeos de los clones positivos seleccionados para cada constructo se resume a continuación (expresado en % de área) en la Tabla 15.

Tabla 15. Perfiles lipidíeos de Prototheca moriformis que expresan varias tioesterasas heterologas.

Los resultados indican que todas las tioesterasas expresadas ejercieron un efecto sobre los perfiles de ácidos grasos en cierto grado. En la fila de "Productos saturados totales" se observa que el grado de saturación se vio significativamente afectado por la expresión de varias tioesterasas, incluidas las de U. californica , C. camphora y, de forma más notable, U. americana. Estos cambios en el porcentaje de productos saturados totales fue inesperado, en el sentido de que la expresión heterologa de tioesterasas de plantas superiores aparentemente puede ejercer un efecto no solo en las longitudes de cadena de los lipidos, sino que también puede ejercer un efecto sobre otros atributos de los perfiles lipidíeos producidos por las microalgas, a saber, el grado de saturación de los ácidos grasos.

Se cultivaron adicionalmente clones seleccionados transformados con tioesterasa C8 de C. palustris, tioesterasa de C. hookeriana, tioesterasa de U. californica y C. camphora con varias cantidades de G418 (de 25 mg/L a 50 mg/L) y a diferentes temperaturas (de 22 °C a 25 °C) y se determinó el perfil lipídico para estos clones. La Tabla 16 resume el perfil lipídico (en % de área) de clones representativos que contienen cada tioesterasa. Se construyó un segundo constructo que contenía tioesterasa de U. americana y se transformó en Prototheca moriformis (UTEX 1435) utilizando los métodos biolisticos descritos anteriormente. Este segundo constructo se introdujo en la célula mediante recombinación homologa. Los métodos de recombinación homologa en especies de Prototheca se han descrito previamente en la Solicitud de PCT N.° PCT/US2009/66142. El ADN homólogo utilizado fue el de la secuencia de ADN genómico 6S de Prototheca moriformis UTEX 1435 (secuencias donantes mostradas en SEQ, ID 92 y SEQ ID 84). El agente de selección fue la capacidad para crecer en sacarosa, utilizando un gen suc2 con codones optimizados de S. cereveisiae dirigido por el promotor de beta-tubulina de C. reinhardtii . El péptido de tránsito nativo de U. americana se reemplazó por el péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de Chlorella protothecoides (UTEX 250) . El ADNc de este constructo se enumera en la Lista de secuencias como SEQ ID NO: 50. La selección de los clones positivos se llevó a cabo en placas con un 2% de sacarosa y los cultivos resultantes para la determinación del perfil lipidico también se cultivaron en un medio que contenia un 2% de sacarosa. En la Tabla 16 se resume un perfil lipidico representativo para esta cepa de Prototheca moriformis que contiene una tioesterasa de U. americana heteróloga recombinada de forma homogénea.

Tabla 16. Perfiles lipidíeos de cepas, de Prototheca moriformis que contienen genes heterologos de tioesterasas.

Del mismo modo que para los clones descritos anteriormente, todos los transformantes que contenían un gen heterólogo de tioesterasa presentaron perfiles de ácidos grasos modificados en cierto grado, y el porcentaje total de ácidos grasos saturados también se vio modificado, en comparación con Prototheca moriformís de origen natural {sin transformar) . Prototheca moriformís que contenia la tioesterasa de U. americana introducida por recombinación homologa presentó el mayor incremento de productos saturados totales .

Además, los clones transgénicos que contenían la tioesterasa exógena de C. hookeriana , C. camphora , U. cali-fornica o U. americana fueron evaluados para determinar los perfiles lipidíeos novedosos. El clon que contenía la tioesterasa de C. hookeriana presentó el siguiente perfil lipidico cuando se cultivó en un 2% de glucosa y 25 mg/mL de G418 a 22 °C: un 5.10% de C8:0; un 18.28% de C10:0; un 0.41% de C12:0; un 1.76% de C14:0; un 16.31% de C16:0; un 1.40% de C18:0; un 40.49% de C18:l; y un 13.16% de C18:2. El clon que contenía la tioesterasa de C. camphora (que contenía también una sacarosa-invertasa exógena) presentó el siguiente perfil lipidico cuando se cultivó en un 2% de sacarosa a 25 °C: un 0.04% de C10:0; un 6.01% de C12:0; un 35.98% de C14:0; un 19.42% de C16:0; un 1.48% de C18:0; un 25.44% de C18:l; y un 9.34% de C18:2. El clon que contenía la tioesterasa de U. calfornica presentó el siguiente perfil lipidico cuando se cultivó en un 2% de glucosa y 25-100 mg/mL de G418 a 22 °C: un 0% de C8:0; un 0.11% de C10:0; un 34.01% de C12:0; un 5.75% de C14:0; un 14.02% de C16:0; un 1.10% de C18:0; un 28.93% de C18:l; y un 13.01% de C18:2. El clon que contenía la tioesterasa de U. americana presentó el siguiente perfil lipídico cuando se cultivó en un 2% de glucosa a 28 °C: un 1.54% de C10:0; un 0.43% de C12:0; un 7.56% de C14:0; un 39.45% de C16:0; un 2.49% de C18:0; un 38.49% de C18:l; y un 7.88% de C18:2.

También se introdujeron otras tioesterasas de plantas superiores en un entorno genético de Prototheca moriformis UTEX 1435, y las secuencias de ADNc con codones optimizados y las secuencias de aminoácidos se enumeran en la Lista de secuencias según se ha especificado anteriormente. Estas tioesterasas adicionales incluyen una tioesterasa de especificidad amplia (C14 : 0-C18 : 0 ) de Myristica fragrans, una tioesterasa con preferencia por C16:0 de Garcinia mangostana, una tioesterasa con preferencia por C16:0 de Cuphea hookeriana, una tioesterasa con preferencia por C16:0 de Elaeis guiniensis, una tioesterasa con preferencia por C18:0 de Brassica napus y una tioesterasa con preferencia por C18 : 1 de Ricinus communis . A continuación se describen los datos sobre los constructos de expresión y los clones transgénicos resultantes de cada uno de los transgenes/transformaciones anteriores .

Se introdujo una tioesterasa de especificidad amplia (C14 : 0-C18 : 0 ) de Myristica fragrans en un entorno genético de Prototheca moriformis UTEX 1435 utilizando los métodos descritos anteriormente. Se evaluaron dos constructos de expresión diferentes, cada uno de los cuales contenia una secuencia de direccionamiento plastidico diferente. En ambos constructos, se utilizó un gen de sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae como marcador seleccionable, el cual confería a los transformantes positivos la capacidad de crecer en placas con sacarosa como única fuente de carbono. Ambos constructos de expresión, pSZ1318 y pSZ1317, contenían secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' (SEQ ID NO: 82) y 3' (SEQ ID NO: 84) (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica 6S para su integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae bajo el control del promotor de p-tubulina/5' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris . Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159. pSZ1318 contenía la región codificante de la tioesterasa de M. fragrans con el péptido de tránsito nativo reemplazado con el péptido de tránsito de delta 12-FAD de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 48) bajo el control del promotor Amt03 de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) y la nitrato-reductasa 3'UTR de C. vulgaris. La tioesterasa de M. fragrans con codones optimizados y con el péptido de tránsito de delta 12-FAD de Prototheca moriformis se enumera como SEQ ID NO: 145. pSZ1317 contenia la región codificante de M. fragrans con el péptido de tránsito nativo reemplazado con el péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de Chlorella protothecoides (SEQ ID NO: 49) bajo el control del promotor Amt03 de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) y la nitrato-reductasa 3'UTR de C. vulgaris . La tioesterasa de M. fragrans con codones optimizados y con el péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de C. protothecoides se enumera como SEQ ID NO: 158. Ambos constructos de expresión, pSZ1318 y pSZ1317, se transformaron en células de Prototheca y la selección se llevó a cabo en placas en las que la única fuente de carbono era la sacarosa. Se seleccionaron los clones positivos de cada transformación y se cultivaron en medio con sacarosa como única fuente de carbono en condiciones de nitrógeno limitado para la producción de lipidos. Se determinaron los perfiles lipidicos de un subconjunto de los clones positivos seleccionados utilizando los métodos de transesterificación directa descritos anteriormente y se resumen en la Tabla 17.

Tabla 17. Perfiles lipidíeos de células de Prototheca transgénicas con tioesterasas de especificidad amplia de Myristica fragrans .

Los clones positivos que contenían un transgén de ioesterasa de Myristica fragrans presentaron perfiles ipídicos alterados. Sin embargo, los resultados resumidos reviamente mostraron un resultado inesperado: en plantas superiores, la tioesterasa de Myristica fragrans presenta una actividad significativa sobre acil graso-ACP C16:0 (Voelker et al., 1997), mientras que, en células de Prototheca, parece ser que la tioesterasa de Myristica fragrans presenta un impacto gradual C14 : 0>C18 : 0>C16 : 0 y tiene una base más amplia que tan solo C16:0.

Se introdujo la tioesterasa con preferencia por C16:0 de Garcinia mangostana en un entorno genético de Prototheca moriformis UTEX 1435, y las secuencias de ADNc con codones optimizados y las secuencias de aminoácidos se enumeran en la Lista de secuencias según se ha especificado anteriormente. El constructo de expresión contenia secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' (SEQ ID NO: 82) y 3' (SEQ ID NO: 84) (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica 6S para su integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae bajo el control del promotor de ß-tubulina/5' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris . Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159 y actuó como un marcador de selección. La región codificante de G. mangostana estaba bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) y la nitrato-reductasa 3'UTR de C. vulgaris. El péptido de tránsito nativo de G. mangostana también se reemplazó con el péptido de tránsito de la estearoil-desaturasa de C.protothecoides (SEQ ID NO: 49) y la secuencia del ADNc de la tioesterasa con el péptido de tránsito reemplazado se enumera como SEQ ID NO: 147. El cásete de expresión entero de Garcinia mangostana se denominó pSZl452 y se transformó en un entorno genético de Prototheca moriformis. Los clones positivos se evaluaron en placas con sacarosa como única fuente de carbono. Se seleccionó un subconjunto de los clones positivos, se cultivaron en condiciones de producción de lipidos y se determinaron los perfiles lipidíeos utilizando métodos de transesterificación directa según se ha descrito anteriormente. Los perfiles lipidíeos de los clones seleccionados se resumen en la Tabla 18 a continuación.

Tabla 18. Perfiles lipidíeos de células de Prototheca transgénicas con tioesterasas que tienen preferencia por C16:0 de Garcinia .mangostana .

Los resultados muestran que los transformantes con el transgén de tioesterasa de G. mangostana presentan unos niveles de ácidos grasos C16:0 significativamente alterados y unos niveles de ácidos grasos C14:0 y C18:0 alterados en menor grado, junto con una reducción pronunciada de los niveles de ácidos grasos C18:l en comparación con el de origen natural.

Se introdujo una tioesterasa con preferencia por C16:0 de Cuphea hookeriana en un entorno genético de Prototheca moriformis UTEX 1435. Se crearon dos constructos de expresión, uno con la secuencia del péptido de tránsito nativo de la tioesterasa con preferencia por C16 de Cuphea hookeriana , denominado pSZ1417, y un segundo en el que la secuencia del péptido de tránsito nativo se reemplazó con el péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de C. protothecoides (SEQ ID NO: 49), denominado pSZl462. La secuencia codificante de la tioesterasa de C. hookeriana con el péptido de tránsito nativo se enumera como SEQ ID NO: 149 y la secuencia codificante de la tioesterasa de C. hookeriana con el péptido de tránsito reemplazado se enumera como SEQ ID NO: 160. Ambos constructos de expresión contenían secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' (SEQ ID NO: 82) y 3' (SEQ ID NO: 84) (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica 6S para su integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae bajo el control del promotor de ß-tubulina/5' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris . Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159 y actuó como un marcador de selección. En ambos constructos, la región codificante de C. hookeriana estaba bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) y la nitrato-reductasa 3' UTR de C. vulgaris. Ambos constructos se transformaron en un entorno genético de Prototheca moriformis y los clones positivos se evaluaron utilizando placas con sacarosa como única fuente de carbono. Se seleccionó un subconjunto de los clones positivos, se cultivaron en condiciones de producción, de lípidos y se determinaron los perfiles lipidióos utilizando métodos de transesterificación directa según se ha descrito anteriormente. Los perfiles lipidíeos de los clones seleccionados se resumen en la Tabla 19 a continuación.

Tabla 19. Perfiles lipidíeos de células de Prototheca transgénicas con tioesterasas que tienen preferencia por C16:0 de Cuphea hookeriana.

Los resultados muestran que los transformantes con cualquiera de los constructos de tioesterasa con preferencia por C16:0 de Cuphea hookeriana presentan unos niveles de ácidos grasos C16:0 significativamente alterados y unos niveles de ácidos grasos C14:0 alterados en menor grado, junto con una reducción pronunciada de los niveles de ácidos grasos C18:l en comparación con el de origen natural. La diferencia en los péptidos de tránsito de los dos constructos puede justificar el aumento de los niveles de ácidos grasos C16:0 en los transformantes pSZ1462 en comparación con los transformantes pSZ1417.

Dos tioesterasas con preferencia por C16:0 de Elaeis guiniensis (palma aceitera africana) que corresponden a la secuencia de aminoácidos de los N.os de acceso a GenBank AAD422220.2 (SEQ ID NO: 152) y ABD83939 (SEQ ID NO: 162), denominadas palmitioil-ACP-tioesterasa de E. guiniensis y palmitoil-ACP-tioesterasa PATE de E. guiniensis, respectivamente, se introdujeron en un entorno genético de Prototheca moriformis UTEX 1435. Las secuencias de ADNc con codones optimizados y las secuencias de aminoácidos se enumeran en la Lista de secuencias según se ha especificado anteriormente. Las dos tioesterasas comparten un nivel significativo de identidad aminoacidica (superior a un 94%), pero todavía no se han establecido sus funciones respectivas en la palma aceitera africana. El constructo que codificaba la palmitoil-ACP-tioesterasa de E. guiniensis se denominó pSZ1437 y el constructo que codificaba la palmitoil-ACP-tioesterasa PATE de E. guiniensis se denominó pSZ1436. Ambos constructos de expresión contenían secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' (SEQ ID NO: 82) y 3' (SEQ ID NO: 84) (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica 6S para su integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevlsiae bajo el control del promotor de p-tubulina/5' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris . Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159 y actuó como un marcador de selección. En ambos constructos, la región codificante de la tioesterasa de E. guiniensis estaba bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) y la nitrato-reductasa 3' UTR de C. vulgaris. Ambos constructos se transformaron en un entorno genético de Prototheca moriformis y los clones positivos se evaluaron utilizando placas con sacarosa como única fuente de carbono. Se seleccionó un subconjunto de los clones positivos, se cultivaron en condiciones de producción de lípidos y se determinaron los perfiles lipidíeos utilizando métodos de transesterificación directa según se ha descrito anteriormente. Los perfiles lipidíeos de los clones seleccionados se resumen en la Tabla 20 a continuación.

Tabla 20. Perfiles lipidíeos de células de Prototheca transgénicas con tioesterasas que tienen preferencia por C16:0 de Elaeis guiniensis.

La tioesterasa con preferencia por C16:0 de E. guinlensis codificada por pSZ 1437 ejerció un efecto significativo sobre los niveles de ácidos grasos C16:0 y, en menor grado, sobre los niveles de ácidos grasos C14:0, y redujo de forma pronunciada los niveles de ácidos grasos C18:l en comparación con la de origen natural. Sorprendentemente, la tioesterasa con preferencia por C16:0 PATE de E. guiniensis codificada por pSZ1436, a pesar del nivel significativo de identidad aminoacidica con la tioesterasa codificada por pSZ1436, presentó una actividad relativamente baja con relación a los niveles de ácidos grasos C16:0 o C14:0.

Se introdujo la tioesterasa con preferencia por C18:0 de Brassica napus en un entorno genético' de Prototheca moriformis UTEX 1435, y las secuencias de ADNc con codones optimizados y las secuencias de aminoácidos se enumeran en la Lista de secuencias según se ha especificado anteriormente. El constructo de expresión contenia secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' (SEQ ID NO: 82) y 3' (SEQ ID NO: 84) (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica 6S para su integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae bajo el control del promotor de -tubulina/5' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgarls . Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159 y actuó como un marcador de selección. La región codificante de B. napus estaba bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) y la nitrato-reductasa 3' UTR de C. vulgaris. El cásete de expresión entero de Brassica napus se denominó pSZ1358 y se transformó en un entorno genético de Prototheca moriformis . Los clones positivos se evaluaron en placas con sacarosa como única fuente de carbono. Se seleccionó un subconjunto de los clones positivos, se cultivaron en condiciones de producción de lipidos y se determinaron los perfiles lipidíeos utilizando métodos de transesterificación directa según se ha descrito anteriormente. Los perfiles lipidíeos de los clones seleccionados se resumen en la Tabla 21 a continuación.

Tabla 21. Perfiles lipidíeos de células de Prototheca transgénicas con tioesterasas que tienen preferencia por C18:0 de Brassica napus.

Los resultados muestran que los transformantes con el transgén de tioesterasa que tiene preferencia por C18:0 de Brassica napus presentan unos niveles de ácidos grasos C18:0 significativamente alterados y unos niveles de ácidos grasos C16:0 alterados en menor grado, junto con una reducción pronunciada de los niveles de ácidos grasos C18:l en comparación con el de origen natural.

Se introdujo la acil graso-ACP-ti.oesterasa de Ricinus communis en un entorno genético de Prototheca moriformis UTEX 1435, y las secuencias de ADNc con codones optimizados y las secuencias de aminoácidos se enumeran en la Lista de secuencias según se ha especificado anteriormente. El constructo de expresión contenia secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' (SEQ ID NO: 82) y 3' (SEQ ID NO: 84) (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica 6S para su integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae bajo el control del promotor de p-tubulina/5' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris. Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159 y actuó como un marcador de selección. La región codificante de R. communis estaba bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) y la nitrato-reductasa 3' UTR de C. vulgaris. El péptido de tránsito nativo de Ricinus communis también se reemplazó con el péptido de tránsito de la estearoil-desaturasa de C.protothecoides (SEQ ID NO: 49) y la secuencia del ADNc de la tioesterasa con el péptido de tránsito reemplazado se enumera como SEQ ID NO: 155. El cásete de expresión entero de Ricinus communis se denominó pSZ1375 y se transformó en un entorno genético de Prototheca moriformis . Los clones positivos se evaluaron en placas con sacarosa como única fuente de carbono. Se seleccionó un subconjunto de los clones positivos, se cultivaron en condiciones de producción de lipidos y se determinaron los perfiles lipidíeos utilizando métodos de transesterificación directa según se ha descrito anteriormente. Los perfiles lipidíeos de los clones seleccionados se resumen en la Tabla 22 a continuación.

Tabla 22. Perfiles lipidíeos de células de Prototheca transgénicas con ACP-tioesterasas de Ricinus communis .

Los resultados indican que los transformantes con el transgén de tioesterasa de Ricinus communis presentan niveles alterados de ácidos grasos C16:0 y niveles alterados en menor grado de ácidos grasos Cl-8 : 0. Además, se observó un aumento concomitante del nivel de ácidos grasos C18:l en comparación con el nivel natural.

EJEMPLO 4 : Transformación de Prototheca con múltiples genes exógenos heterologos de tioesterasa Se transformó una cepa de microalgas de Prototheca moriformis (UTEX 1435) utilizando los métodos descritos anteriormente para que expresara múltiples tioesterasas en un único clon. La expresión de múltiples tioesterasas en un único clon permite que las microalgas produzcan aceites con perfiles de ácidos grasos completamente diferentes a los elaborados cuando cualquier tioesterasa única se expresa sola (según se ha demostrado en los ejemplos precedentes) . En primer lugar, se transformó Prototheca moriformis (UTEX 1435) con la tioesterasa de Cinnamomum camphora (una tioesterasa con preferencia por C14) junto con un gen de sacarosa-invertasa, suc2 de S. cerevisiae (la selección fue la capacidad para crecer en sacarosa), utilizando recombinación homologa. El ADN utilizado para este constructo de recombinación homologa procede de la región KE858 del ADN genómico de Prototheca moriformis, según se ha descrito en la Sección III previamente. La porción relevante de este constructo se enumera en la Lista de secuencias como SEQ ID NO: 51. Los clones positivos se evaluaron en placas que contenían sacarosa. A continuación, un clon positivo se volvió a transformar con uno de entre tres casetes, cada uno de los cuales codificaba resistencia al antibiótico G418, asi como también una tioesterasa adicional: (1) gen de tioesterasa de Cuphea hookeriana (con preferencia por C8-10) , SEQ ID NO: 52; (2) gen de tioesterasa de Umbellularia californica (con preferencia por C12) , SEQ ID NO: 53; o tioesterasa de Ulmus americana (amplia; con preferencia por C10-C16) , SEQ ID NO: 54. En la Lista de secuencias se incluye la secuencia de la porción relevante de cada constructo. Los clones que expresaban ambos genes de tioesterasa se evaluaron en medio que contenia sacarosa con 50 pg/mL de G418. Se seleccionaron los clones positivos, se cultivaron y se determinó su perfil lipídico. La Tabla 23 resume el perfil lipidico de clones positivos representativos (expresado en % de área) Tabla 23. Perfiles lipidíeos de Prototheca moriformis transformada con múltiples tioesterasas.

Además, un clon de tioesterasas doble con tioesterasas de C. camphora y U. californica se cultivó en un medio que contenia un 2% de sacarosa con 50 mg/L de G418 a 22 °C. El perfil de ácidos grasos obtenido de esta cepa en estas condiciones de cultivo fue el siguiente: C8 : 0 (0); C10:0 (0.10); C12:0 (31.03); C14 : 0 (7.47); C16:0 (15.20); C18:0 (0.90); C18:l (30.60); C18:2 (12.44); y C18:3a (1.38), con un total de productos saturados de 54.7.

Se produjeron clones de tioesterasas dobles con dos constructos de recombinación homólogos (uno que tenia como diana la región 6S y otro que tenia como diana la región KE858) que contenían la tioesterasa de C. camphora. Un clon representativo positivo tenía el siguiente perfil de ácidos grasos: un 0% de C8:0; un 0.06% de C10:0; un 5.91% de C12:0; un 43.27% de C14:0; un 19.63% de C16:0; un 0.87% de C18:0; un 13.96% de C18:l; y un 13.78% de C18:2, con un total de productos saturados de un 69.74%. Este clon presentó un nivel de C12-C14 superior a un 49%, que es 37 veces mayor que el nivel de C12-C14 en células naturales.

Los datos anteriores indican que se pueden expresar conjuntamente con éxito múltiples tioesterasas en microalgas. La expresión conjunta de múltiples tioesterasas da como resultado perfiles de ácidos grasos alterados que difieren significativamente no solo de la cepa de origen natural, sino también del perfil de ácidos grasos obtenido mediante la expresión de cualquiera de las tioesterasas individuales. La expresión de múltiples tioesterasas con una especificidad por longitudes de cadena coincidentes puede dar como resultado aumentos acumulados de esos ácidos grasos específicos.

La expresión de tioesterasas heterologas (ya sean solas o combinadas) en Prototheca moriformis no solo altera los perfiles de ácidos grasos/lípidos en la cepa huésped, sino que, cuando se compara con los aceites actualmente disponibles a partir de varios cultivos de semillas (Tabla 5), estos perfiles pertenecen a unos aceites realmente únicos que no se encuentran en ningún otro sistema disponible actualmente. Las cepas transgénicas no solo presentan diferencias significativas respecto a la cepa natural no transformada, sino que además presentan unos perfiles considerablemente diferentes a los de cualquiera de los aceites comerciales que se muestran en la Tabla 5. A modo de ejemplo, tanto el aceite de coco como el de palmiste presentan niveles de ácidos, grasos C8-C10 comprendidos entre un 5.5 y un 17%. La cepa transgénica que · expresa la tioesterasa con preferencia por C8 de C. palustrís o la tioesterasa con preferencia por CIO de C. hookeriana acumula una cantidad comprendida entre un 3.66 y un 8.65%, respectivamente. Estos niveles de ácidos grasos C8-C10 son similares a los del aceite de coco y palmiste, sin embargo, las cepas de algas transgénicas carecen de los niveles significativamente superiores de ácidos grasos C12:0 y presentan niveles extremadamente elevados de C16:0 (un 23% en las cepas transgénicas frente a un 11-16% en el aceite de coco o palmiste, respectivamente) y/o 18:1 (un 50-57% en las cepas transgénicas frente a un 8-19% en el aceite de coco o palmiste, respectivamente) .

Generación de aceites ricos en laura.to y miristato en la cepa UTEX1435 mediante la expresión de tioesterasas de Cuphea wrightii: Se ha observado que semillas de Cuphea wrightii acumulan aceite que contiene un 25% de C10:0 y más de un 65% de ácidos grasos C12:0. Se han clonado dos tioesterasas FatB, CwFatBl (N.° de acceso a GenBank U56103) y CwFatB2 (N.° de acceso a GenBank U56104), de Cuphea wrightii (según se describe en Leonard et al., Plant Mol. Biol. 34 (4): 669-79 (1997)) y se han expresado en Arabidopsis thaliana (según se describe en Leonard et al., Plant J. 13(5): 621-8 (1998)). Los perfiles de ácidos grasos de las lineas transgénicas de A. thaliana que expresan CwFatBl y CwFatB2 presentan un incremento de las especies de ácidos grasos C12:0 de hasta un 16%-25% (Leonard et al . , 1998, mencionado previamente). En la presente se demuestra que es posible generar aceites ricos en laurato y miristato mediante la expresión de las tioesterasas de Cuphea wrightii, CwFatBl y CwFatB2, en la cepa UTEX1435. En el ejemplo que se describe en la presente, las cepas transgénicas que expresan CwFatBl y CwFatB2 se generaron utilizando la metodología de transformación descrita previamente .

Las secuencias de aminoácidos de CwFatBl y CwFatB2 se muestran a continuación, con las secuencias de direccionamiento al cloroplasto previstas subrayadas. Estas secuencias de aminoácidos primarias se utilizaron para sintetizar los genes correspondientes para los constructos de transformación. Las secuencias de nucleótidos de los dos genes se optimizaron para la expresión en la cepa UTEX 1435 empleando su uso preferido de codones, según se ha descrito previamente .

CwFatBl (U56103) : MVAAAASSAFFSVPTPGTSPKPGKFGNWPSSLSVPFKPDNGGFVKANASAHPKANGSAVNL KSGSLETPPRSFINQLPDLSMLLSKITTVFGAAEKQWKRPGMLVEPFGVDRIFQDGVFFRQ SFSIRSYEIGVDRTASIETLMNIFQETSLNHCKSIGLLNDGFGRTPE CKRDLI WTKIQ VEVNRYPT GDTIEVNTWVSESGKNGMGRDWLISDCRTGEILIRATSVWAMMNQNTRRLSK FPYEVRQEIAPHFVDSAPVIEDDRKLHKLDVKTGDSIRDGLTPR NDLDVNQHVNNVKYIG WILKSVPIEVFETQELCGVTLEYRRECGRDSVLESVTT DPAKEGDRCVYQHLLRLEDGAD ITIGRTEWRPKNAGANGAISSGKTSNGNSVS (SEQ ID NO: 186) CwFatB2 (U56104) : MVVAAAASSAFFPVPAPRPTPKPGKFGNWPSSLSQPFKPKSNPNGRFQVKANVSPHPKANG SAVSLKSGSLNTLEDPPSSPPPRTFLNQLPDWSRLRTAITTVFVAAEKQFTRLDRKSKRPD MLVDWFGSETIVQDGLVFRERFSIRSYEIGADRTASIETLMNHLQDTSLNHCKSVGLLNDG FGRTPEMCTRDLIWVLTK QIVVNRYPT GDTVEINS FSQSGKIGMGRE LISDCNTGEI LVRATSAWAMMNQKTRRFSKLPCEVRQEIAPHFVDAPPVIEDNDRKLHKFDVKTGDSICKG LTPGWNDFDVNQHVSNVKYIGWILESMPTEVLETQELCSLTLEYRRECGRESVVESVTSMN PSKVGDRSQYQHLLRLEDGADIMKGRTEWRPKNAGTNRAIST (SEQ ID NO : 187) Transformación de UTEX1435 con tioesterasas de C. wrightii: En este ejemplo, se utilizó la cepa UTEX 1435 como cepa receptora en la cual se introdujeron casetes que expresaban las tioesterasas FatBl y FatB2 de C. wrightii. Los constructos de transformación contenían un cásete que permitía la selección en sacarosa (el gen suc2 de Saccharomyces cerevesiae) junto con las tioesterasas. Las células se transformaron según se describió previamente utilizando métodos biolísticos. Las células se transformaron directamente en medio que contenía un 2% de sacarosa. Los constructos de transformación se prepararon de modo que la expresión de las tioesterasas estuviera dirigida por el promotor de b-tubulina de C. reinhardtii o por el promotor endógeno Amt3 de UTEX 1435.

Se prepararon versiones adicionales de los casetes de tioesterasas en las que los péptidos de tránsito nativos de plantas superiores se reemplazaron por péptidos de tránsito de algas. Los péptidos de tránsito empleados en estos constructos se designan como se indica a continuación: TP1 codifica un péptido de tránsito para la estearoil-ACP-desaturasa derivada de UTEX250; TP2 codifica un péptido de tránsito para la estearoil-ACP-desaturasa derivada de UTEX 1435; TP3 codifica un péptido de tránsito de la desaturasa de ácidos grasos delta 12 derivada de UTEX 1435; y TP4 codifica un péptido de tránsito de la isopentenil-difosfato-sintasa derivada de UTEX 1435. Los constructos utilizados en este ejemplo se enumeran en la Tabla 24 a continuación.

Tabla 24. Constructos de TE.

ADN transformante que expresa s\xc2 y Xa tioesterasa FatBl de C. wrightii (Const. 1) : La secuencia del constructo transformante, 6S-CrbTub_suc2_nr : : CrbTub_CwFatBl_nr-6S, denominado Const. 1, se muestra a continuación. Los sitios de restricción relevantes se indican en minúscula, negrita y subrayados y son 5' -3' SapI, Kpnl, AscI, Mfel, BamHI, EcoRI, Spel, AscI, Xhol, SacI y SapI, respectivamente. Los sitios SapI delimitan los extremos 5' y 3' del ADN transformante. Las secuencias subrayadas en los extremos 5' y 3' del constructo representan ADN genómico de UTEX1435 que permite la integración dirigida del ADN transformante mediante recombinación homologa (región ,6S) . Siguiendo en la dirección de 5' a 3', el promotor de b-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión del gen suc2 de S. cerevísiae (que codifica actividad para hidrolizar sacarosa, lo cual permite que la cepa pueda crecer en sacarosa) se indica en minúscula y con un recuadro. El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA para suc2 se indican en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que la región codificante se indica en minúscula y cursiva. La nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris se indica en minúscula y con un recuadro, seguida de una región espadadora. El promotor de b-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión de C. wrightii TE (CwFatBl) se indica con un recuadro. El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA de la tioesterasa (CwFatBl) se indican en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que el resto de la región codificante se indica en minúscula y cursiva. La secuencia de direccionamiento plastidico prevista de la tioesterasa se encuentra entre el codón de iniciación ATG y el sitio AscI de la secuencia. La nitrato-reductasa 3' UTR de C. vulgaris se indica en negrita.

Constructo 1: gctcttcgccgccgccactcctgctcgagcgcgcccgcgcgtgcgccgccagcgccttggc cttttcgccgcgctcgtgcgcgtcgctgatqtccatcaccaggtccatgaggtctgccttg cgccggctgagccactgcttcgtccgggcggccaagaggagcatgagggaggactcctggt ccagggtcctgacgtggtcgcggctctgggagcgggccagcatcatctggctctgccgcac cgaggccgcctccaactggtcctccagcagccgcagtcgccgccgaccctggcagaggaag acaggtgaggggggtatgaattgtacagaacaaccacgagccttgtctaggcagaatccct accagtcatggctttacctggatgacggcctgcgaacagctgtccagcgaccctcgctgcc gccgcttctcccgcacgcttctttccagcaccgtgatggcgcgagccagcgccgcacgctg gcgctgcgcttcgccgatctgaggacagtcggggaactctgatcagtctaaacccccttgc gcgttagtgttgccatcctttgcagaccggtgagagccgacttgttgtgcgccacccccca caccacctcctcccagaccaattctgtcacctttttggcgaaggcatcggcctcggcctgc agagaggacagcagtgcccagccgctgggggttggcggatgcacgctcaggtacc|ctttct tgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgca| tgcaacaccgatgatgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgaq gccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgcaaagacattatagcgl 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ccgacctgagcatgctgctgagcaagatcaccaccgtgttcggcgccgccgagaagcagtg gaagcgccccggca tgctggtggagcccttcggcgtggaccgcatcttccaggacggcgtg ttct tccgccagagettcagca tcegeagetacgaga tcggcgtggaccgcaccgccagca tcgagaccctga tgaacatcttccaggagaccagcctgaaccactgcaagagcatcggcct gctgaacgacggcttcggccgcacccccgaga tgtgcaagcgcgacctga tctgggtggtg accaagatccaggtggaggtgaaccgctaccccacctggggcgacaccatcgaggtgaaca cctgggtgagcgagagcggcaagaacggcatgggccgcgactggctgatcagcgactgccg caccggcgagatcctgatccgcgccaccagcgtgtgggccatgatgaaccagaacacccgc cgcctgagcaagttcccctacgaggtgcgccaggagatcgccccccacttcgtggacagcg cccccgtgatcgaggacgaccgcaagctgcacaagctggacgtgaagaccggcgacagcat ccgcgacggcctgaccccccgctggaacgacctggacgtgaaccagcacgtgaacaacgtg aagtacatcggctggattctgaagtccgtgcccatcgaggtgttcgagacccaggagctgt gcggcgtgaccctggagtaccgccgcgagtgcggccgcgacagcgtgctggagagcgtgac cacea tggaccccgccaaggagggcgaccgctgcgtgtaccagcacctgctgcgcctggag gacggcgccgacatcaccatcggccgcaccgagtggcgccccaagaacgccggcgccaacg gcgcca tcagcagcggcaagaccagcaacggcaacagcgtgagcTGAttaattaactcgag goagcagcagctcggatagtatcgaoacactctggaogotggtogtgtgatggactgttgc cgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtg tgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgegagttgctagctgcttgtgctatttgcgaata ccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatcta cgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagcctt ggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctg a gcacgggaagtagtgggatgggaacacaa tggaaagcttgagctcttgttttccagaa ggagttgctccttgagcctttcattctcagcctcgataacctccaaagccgctctaattgt ggagggggttcgaatttaaaagcttggaatgttggttcgtgcgtctggaacaagcccagac ttgttgctcactgggaaaaggaccatcagctccaaaaaacttgccgctcaaaccgcgtacc tctgctttcgcgcaatctgccctgttgaaatcgccaccacattcatattgtgacgcttgag cagtctgtaattgcctcagaatgtggaatcatctgccccctgtgcgagcccatgccaggca tgtcgcgggcgaggacacccgccactcgtacagcagaccattatgctacctcacaatagtt cataacagtgaccatatttctcgaagctccccaacgagcacctccatgctctgagtggcca ccccccggccctggtgcttgcggagggcaggtcaaccggcatggggctaccgaaatccccg accggatcccaccacccccqcgatggqaagaatctctccccgggatgtgggcccaccacca gcacaacctgctggcccaggcgagcgtcaaaccataccacacaaatatccttqgcatcqgc cctgaattccttctgccgctctgctacccggtgcttctgtccgaagcaggggttgctaggg atcgctccgagtccgcaaacccttgtcgcgtggcggggcttgttcgagcttgaagagc (SEQ ID NO: 188) ADN transformante que expresa suc2 y la tioesterasa Fa B2 de C. wrighfcii (Const. 2) : El constructo transformante, 6S-CrbTub_suc2_nr : : CrbTub_CwFatB2_nr- 6S , denominado Const. 2, se generó reemplazando el gen CwFatBl del Const. 1 con el gen CwFatB2 de codones optimizados utilizando los sitios de restricción Spel y AscI, que se indican en minúscula, negrita y subrayados. El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA de la tioesterasa (CwFatB2) se indican en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que el resto de la región codificante se indica en minúscula y cursiva. La secuencia de direccionamiento plastádico prevista de la tioesterasa se encuentra entre el codón de iniciación ATG y el sitio AscI de la secuencia.

Constructo 2 (parcial) : actagtATGgtggtggccgccgccgccagcagcqccttcttccccqtqcccqccccccqcc ccacccccaagcccggcaagttcggcaactggcccagcagcctgagccagcccttcaagcc caagagcaaccccaacggccgcttccaggtgaaggccaacgtgagcccccacqggcgcgcc cccaaggccaacggcagcgccgtgagcctgaagtccggcagcctgaacaccctggaggacc cccccagcagcccccccccccgcaccttcctgaaccagctgcccgactggagccgcctgcg caccgccatcaccaccgtgttcgtggccgccgagaagcagttcacccgcctggaccgcaag agcaagcgccccgaca tgctggtggactggttcggcagcgagaccatcgtgcaggacggcc tggtgttccgcgagcgcttcagca tccgcagctacgaga tcggcgccgaccgcaccgccag catcgagaccctga tgaaccacctgcaggacaccagcctgaaccactgcaagagcgtgggc ctgctgaacgacggcttcggccgcacccccgagatgtgcacccgcgacctgatctgggtgc tga ccaaga tgcagatcgtggtgaaccgctaccccacctggggcgaca ccgtggagatcaa cagetggttcagccagagcggcaagatcggca tgggccgcgagtggctgateagcgactgc aacaccggcgagatcctggtgcgcgccaccagcgcctgggcca tgatgaaccagaagaccc gccgcttcagcaagctgccctgcgaggtgcgccaggagatcgccccccacttcgtggacgc cccccccgtgatcgaggacaacgaccgcaagctgcacaagttcgacgtgaagaccggcgac agcatctgcaagggcctgacccccggctggaacgacttcgacgtgaaccagcacgtgagca acgtgaagtacatcggctggattctggagagcatgcccaccgaggtgctggagacccagga gctgtgcagcctgaccctggagtaccgccgcgagtgcggccgcgagagcgtggtggagagc gtgaccagca tgaaccccagcaaggtgggcgaccgcagccagtaccagcacctgctgcgcc tggaggacggcgccgaca tcatgaagggccgcaccgagtggcgccccaagaacgccggcac caaccgcgccatcagcaccTGAttaattaactcqa.q (SEQ ID NO: 189) ADN transformante que expresa suc2 y las tioesterasas FatBl y FatB2 de C.wxíghtii dirigidas por el promotor amt3 (Const. 3 y 4) : Los constructos transformantes 6S-CrbTub_suc2_nr : : Amt3_CwFatBl_nr-6S, denominado Const. 3, y 6S-CrbTub_suc2_nr : :Amt3_CwFatB2_nr-6S, denominado Const. 4, se generaron . reemplazando el promotor CrbTub, que dirige las tioesterasas, del Const. 1 y Const. 2, con el promotor Amt3 derivado de UTEX1435 como un fragmento de restricción EcoRI y Spel, que se indica a continuación en minúscula, negrita y subrayado. La región del promotor Amt3 se indica en minúscula y con un recuadro.

Constructos 3 y 4 (parciales) : gaattqggcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggq gctgcatgcaacaccgatgatgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcg |tccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgcaaagacatt| atagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccaq |tcgagcttgtgatcgcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcggccga| ¡caggacgcgcgtcaaaggtgctggtcgtgtatgccctggccggcaggtcgttgctgctgct ¡ggttagtgattccgcaaccctgattttggcgtcttattttggcgtggcaaacgctggcgcq cgcgagccgggccggcggcgatgcggtgccccacggctgccggaatccaagggaggcaaga| gcgcccgggtcagttgaagggctttacgcgcaaggtacagccgctcctgcaaggctgcgtg| gtggaattggacgtgcaggtcctgctgaagttcctccaccgcctcaccagcggacaaagca ccggtgtatcaggtccgtgtcatccactctaaagagctcgactacgacctactgatggccq |tagattcttcatcaaaaacgcctgagacacttgcccaggattgaaactccctgaagggacc| |accaggggccctgagttgttccttccccccgtggcgagctgccagccaggctgtacctgtg| |atcgaggctggcgggaaaataggcttcgtgtgctcaggtcatgggaggtgcaggacagctc| jatgaaacgccaacaatcgcacaattcatgtcaagctaatcagctatttcctcttcacgagq [tgtaattgtcccaaaattctggtctaccgggggtgatccttcgtgtacgggcccttccctq ¡aaccctaggtatgcgcgcatgcggtcgccgcgcaactcgcgcgagggccgagggtttggga| cgggccgtcccgaaatgcagttgcacccggatgcgtggcaccttttttgcgataatttatgl caatggactgctctgcaaaattctggctctgtcgccaaccctaggatcagcggcgtaggatj ttcgtaatcattcgtcctgatggggagctaccgactaccctaatatcagcccgactgcctgl acgccagcgtccacttttgtgcacacattccattcgtgcccaagacatttcattgtggtgq Igaagcg ccccagttacgctcacctgtttcccgacctccttactgttctgtcgacagagcg] Iggcccacaggccggtcgcagcclactagt ( SEQ ID NO: 190) ADN transformante que expresa la tioesterasa FatBl de C.wrightii bajo el control de péptidos de tránsito algáceos : Los constructos transformantes 6S-CrbTub_suc2_nr : : CrbTub_TPl-CwFatBl_nr-6S, denominado Const. 5; el constructo 6S-CrbTub_suc2_nr : :CrbTub_TP2-CwFatBl_nr-6S, denominado Const. 6 el constructo 6S-CrbTub_suc2_nr : : CrbTub_TP3-CwFatBl_nr-6S, denominado Const. 7 y el constructo 6S- CrbTub_suc2_nr : :CrbTub_TP4-CwFatBl_nr-6S, denominado Const. 8, se generaron reemplazando el péptido de tránsito nativo de CwFatBl del Const. 1 con los correspondientes péptidos de tránsito algáceos gue se muestran a continuación como fragmentos de restricción Spel y AscI, los cuales se indican en minúscula, negrita y subrayados. Las secuencias de los péptidos de tránsito algáceos resultantes se encuentran entre el codón de iniciación ATG y el sitio AscI de las siguientes secuencias .

Constructos 5-12 (parciales) : TP1 (Secuencia del péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de UTEX250) actagtATGgccaccgca tccactttctcggcgttcaatgcccgctgcggcgacctgcgtc gctcggcgggctccgggccccggcgcccagcgaggcccctccccgtgcgcgggcgcgcc (SEQ ID NO: 191) TP2 (Secuencia del péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de UTEX1435) actagtATGgc1tccgcggca tteacea tgtcggcgt ccccgcgatgactggcagggccc ctggggcacgtcgctccggacggccagtcgccacccgcctgaggqggcgcgcc_{SEQ ID NO: 192) TP3 (Secuencia del péptido de tránsito de la desaturasa de ácidos grasos delta 12 de UTEX1435) actagtATGgctatcaagacgaacaggcagcctgtggagaagcctccgttcacgatcggga cgctgcgcaaggccatccccgcgcactgtttcgagcgctcggcgcttcgtq23£3£2£c (SEQ ID NO: 193) TP4 (Secuencia del péptido de tránsito de la sopentenil-difosfato-sintasa de UTEX1435) actagtATGacgttcggggtcgccctcccggcca tgggccgcggtgtctcccttccccggc ceagggtcgcggtgcgcgcccagtcggcgagtcaggt tttggagagcqggcgcgcc ( SEQ ID NO: 194) ADN transformante que expresa la tioesterasa FatB2 de C.wr±ght±± ba o el control de péptidos de tránsito algáceos : Los constructos transformantes 6S-CrbTub_suc2_nr : : CrbTub_TPl-CwFatB2_nr-6S, denominado Const. 9; el constructo 6S-CrbTub_suc2_nr : :CrbTub_TP2-CwFatB2_nr-6S, denominado Const. 10; el constructo 6S-CrbTub_suc2_nr : : CrbTub_TP3-CwFatB2_nr-6S , denominado Const. 11 y el constructo 6S- CrbTub_suc2_nr : :CrbTub_TP4-CwFatB2_nr-6S, denominado Const. 12, se generaron reemplazando el péptido de tránsito nativo de CwFatB2 del Const. 2 con los correspondientes péptidos de tránsito algáceos que se han mostrado previamente como fragmentos de restricción Spel y AscI, los cuales se indican en minúscula, negrita y subrayados. La secuencia de los péptidos de tránsito algáceos se encuentra entre el codón de iniciación ATG y el sitio AscI de las secuencias anteriores.

Perfiles de ácidos grasos resultantes de las cepas que expresan tioesterasas de Cuphea wrLght x: Las cepas transformadas con los constructos descritos anteriormente se cultivaron en unas condiciones que permitieran la producción de aceite, según se ha descrito previamente. La cepa UTEX 1435 de origen natural se cultivó en glucosa, mientras que todas las lineas transgénicas generadas mediante la transformación de UTEX 1435 se cultivaron en sacarosa. Para cada constructo evaluado, se analizaron cuatro transformantes para determinar el efecto sobre los perfiles de ácidos grasos. Los perfiles de ácidos grasos para las cepas transgénicas se muestran en las Tablas 25-28 más adelante.

Las lineas transgénicas de A. thaliana que expresan CwFatBl y CwFatB2 (Tabla 25) muestran un efecto significativo sobre la acumulación de ácidos grasos C16:0 junto con la acumulación de ácidos grasos C14:0 y C12:0 (de Leonard et al., 1998, mencionado anteriormente).

Según se puede observar en la Tabla 26, las lineas de UTEX 1435 transgénicas que expresan CwFatBl (Const. 1 y Const. 3) con el péptido de tránsito nativo de plantas superiores muestran un efecto principalmente sobre la acumulación de ácidos grasos C14:0 y, en menor grado, sobre la acumulación de ácidos grasos C12:0. Las líneas de UTEX1435 transgénicas que expresan CwFatB2 (Const. 2 y Const. 4) con el péptido de tránsito nativo de plantas superiores muestran un efecto significativo sobre la acumulación de ácidos grasos C12:0 y C14:0, siendo mayor el efecto sobre C12:0 que sobre C14:0. Una comparación entre los dos promotores, CrbTub (Const. 1 y Const. 2) y Amt3 (Const. 3 y Const. 4), demuestra que las líneas transgénicas que expresan CwFatBl y CwFatB2 presentan efectos significativamente mayores sobre los ácidos grasos C10:0, C12:0, C14:0 y C16:0 cuando se dirigen con el promotor Amt3.

El análisis de líneas transgénicas en las que la expresión de la tioesterasa CwFatBl está dirigida por las cuatro secuencias diferentes de direccionamiento al cloroplasto de algas (Const. 5, 6, 7 y 8) indica que cualquiera de los péptidos de tránsito algáceos dirige la tioesterasa hacia el plástido de forma más eficaz que el péptido de tránsito nativo de plantas superiores (compare los niveles de C12:0 y C14:0 en los constructos 5-8, Tabla 27, con los del constructo 1, Tabla 26) . Un análisis más exhaustivo de estas líneas transgénicas revela que, de los cuatro péptidos de tránsito algáceos, TP2 (secuencia de direccionamiento al cloroplasto de la estearoil-ACP-desaturasa de UTEX1435) y TP3 (secuencia de direccionamiento al cloroplasto de la desaturasa de ácidos grasos delta 12 de UTEX 1435) ejercen un mayor efecto sobre la acumulación de C12 : 0 y C14:0. Parece ser que estos dos péptidos de tránsito (TP1 y TP2) son mejores a la hora de dirigir CwFatBl hacia el plástido en UTEX 1435.

El análisis de lineas transgénicas en las que la expresión de la tioesterasa CwFatB2 está dirigida por las cuatro secuencias diferentes de direccionamiento al cloroplasto de algas (Const. 9, 10, 11 y 12) demuestra que solo uno de los péptidos de tránsito algáceo presenta un rendimiento superior al del péptido de tránsito nativo de plantas superiores, a saber TP-1, según se puede observar a partir del mayor efecto ejercido sobre los ácidos grasos C12:0 y C14:0 (compare el Const. 9 con el Const. 2).

El efecto de estas tioesterasas de C. wrightii es significativamente diferente cuando se expresan en UTEX 1435 que cuando se expresan en Arabidopsis . Las lineas transgénicas de A. thaliana que expresan CwFatBl y CwFatB2 (Tabla 25) muestran un efecto significativo sobre la acumulación de ácidos grasos C16:0 junto con la acumulación de ácidos grasos C14:0 y C12:0. Sin embargo, CwFatBl y CwFatB2 expresadas en UTEX 1435 no muestran el mismo nivel de efecto sobre ácidos grasos C16:0. Las proporciones de C12:C14 en todas las lineas transgénicas de UTEX 1435, que expresan CwFatBl y algunas que expresan CwFatB2 (Const. 10, 11, 12), son similares a las de las lineas transgénicas de A. thaliana que expresan esta tioesterasa (Tabla 29) . Sin embargo, las lineas transgénicas de UTEX 1435 presentan una proporción de C14:C16 significativamente menor en comparación con las lineas transgénicas de A. thaliana (Tabla 29) . Las proporciones de C12:C14 y C14:C16 en las lineas transgénicas de UTEX 1435 generadas con los Const. 2, 4 y 9 son significativamente diferentes a las de las lineas transgénicas de A. thaliana que expresan la misma tioesterasa (Tabla 29) . Por lo tanto, la expresión de CwFatBl y CwFatB2 en UTEX 1435 generó un perfil de aceites significativamente diferente al generado en las lineas transgénicas de Arabidopsis que expresan las mismas tioesterasas . El perfil de aceites en estas lineas transgénicas de UTEX 1435 también es notablemente diferente al de UTEX 1435 de origen natural.

Finalmente, los aceites modificados producidos por las líneas transgénicas descritas en este ejemplo también son significativamente diferentes a los aceites ricos en laurato generados en las líneas transgéncias de UTEX 1435 que expresan una tioesterasa especifica para C12:0 de Umbellularia californica (que se han descrito previamente) .

Al considerarlos de forma conjunta, estos datos indican que: (1) la expresión de tioesterasas de Cuphea wrightii en UTEX 1435 ejerce un efecto significativo sobre los perfiles de ácidos grasos y genera aceites únicos; (2) la expresión de la tioesterasa CwFatBl en la cepa UTEX 1435 da como resultado la generación de un aceite rico en miristato; (3) la expresión de la tioesterasa CwFatB2 en UTEX 1435 da como resultado la generación de un aceite rico tanto en laurato como en miristato; y (4) la expresión de CwFatBl y FatB2 en algas genera perfiles bastante diferentes a los generados en un sistema modelo de plantas superiores, tanto en cuanto a los niveles absolutos de ácidos grasos de cadena media producidos como en cuanto a sus proporciones relativas de unos respecto a otros.

Tabla 25. Perfiles de ácidos grasos (expresados como % de área) en UTEX1435, A.thaliana de origen natural (Ath) y lineas transgénicas de A.thaliana que expresan las tioesterasas CwFatBl (CwFatBl-Ath) y CwFatB2 (CwFatB2-Ath) .

Tabla 26. Perfiles de ácidos grasos (expresados como % de área) en lineas transgenicas de UTEX1435 gue expresan el Const. 1, Const. 2, Const. 3 y Const. 4.

Tabla 27. Perfiles de ácidos grasos (expresados como área) en lineas transgénicas de UTEX1435 gue expresan st. 5, Const. 6, Const. 7 y Const. 8.

Tabla 28. Perfiles de ácidos grasos (expresados como % de área) en lineas transgénicas de UTEX1435 que expresan el Const. 9, Const. 10, Const. 11 y Const. 12.

Tabla 29. Proporciones de C12:C14 y C14:C16 en lineas transgénicas de UTEX1435 que expresan CwFatBl (Const. 1, 3 , 5, 6, 7, 8) y CwFatB2 (Const. 2, 4, 9, 10, 11, 12) junto con lineas transgénicas de A. thaliana que expresan CwFatBl (CwFatBl-Ath) y CwFatB2 (CwFatB2-Ath) .

EJEMPLO 5 : Identificación de promotores endógenos de Prototheca dependientes de nitrógeno A. Identificación y caracterización de promotores endógenos dependientes de nitrógeno Se generó una genoteca de ADNc de Prototheca oriformis (UTEX 1435) utilizando técnicas estándar. Las células de Prototheca moriformis se cultivaron durante 48 horas en condiciones de saturación de nitrógeno. A continuación, se transfirió un inoculo de un 5% (v/v) a condiciones de poco nitrógeno y se recogieron las células cada 24 horas durante siete días. Después de aproximadamente 24 horas de cultivo, se suprimió completamente el suministro de nitrógeno en el medio. Las muestras recogidas se congelaron inmediatamente utilizando hielo seco e isopropanol. Posteriormente, se aisló el ARN total de las muestras de pellets celulares congelados y se conservó una porción de cada muestra en reserva para estudios de RT-PCR. El resto del ARN total recolectado de las muestras se sometió a una selección de poliA. A continuación, se agruparon cantidades equimolares de ARN seleccionado por poliA de cada condición y se utilizaron para generar una genoteca de ADNc en el vector pcDNA 3.0 ( Invitrogen) . Se seleccionaron de forma aleatoria aproximadamente 1200 clones de la genoteca resultante de ADNc agrupados y se sometieron a una secuenciación de ambas hebras. Se seleccionaron aproximadamente 68 ADNc diferentes de entre estas 1200 secuencias y se utilizaron para diseñar cebadores específicos para ADNc con el fin de utilizarlos en estudios de RT-PCR a tiempo real.

El ARN aislado de las muestras de pellets celulares que se mantuvieron en reserva se utilizó como sustrato en los estudios de RT-PCR a tiempo real, utilizando los grupos de cebadores específicos para ADNc generados previamente. Este ARN en reserva se convirtió en ADNc y se utilizó como sustrato para RT-PCR para cada uno de los 68 grupos de cebadores específicos para genes. Se emplearon números CT o ciclo umbral para indicar la abundancia relativa del transcrito para cada uno de los 68 ADNc en cada muestra de ARN recolectada durante el transcurso del tiempo. Los ADNc que mostraron un incremento significativo (más del triple) entre las condiciones de saturación de nitrógeno y supresión de nitrógeno se marcaron como genes potenciales cuya expresión aumentó debido a la supresión de nitrógeno. Según se ha mencionado en la memoria descriptiva, la supresión/limitación de nitrógeno es un inductor conocido de la lipogénesis en microorganismos oleaginosos.

Con el fin de identificar posibles secuencias de promotores/5' UTR a partir de los ADNc cuya expresión aumentó durante la limitación/supresión de nitrógeno, se aisló el ADN total de Prototheca moriformis (UTEX 1435) que se había cultivado en condiciones de saturación de nitrógeno y a continuación se sometió a secuenciación utilizando la tecnología de secuenciación 454 (Roche) . Los ADNc marcados por que su expresión había aumentado mediante los resultados de RT-PCR anteriores se compararon utilizando BLAST frente a cóntigos acoplados procedentes de las lecturas de secuenciación genómica 454. Los extremos 5' de los ADNc se mapearon frente a cóntigos específicos y, cuando fue posible, se emplearon más de 500 bp de ADN flanqueante 5' para identificar posibles promotores/UTR. Posteriormente, se confirmó la presencia de promotores/5' UTR y se clonaron utilizando amplificación por PCR de ADN genómico. Los extremos 5' de ADNc individuales se utilizaron para diseñar cebadores 3' y los extremos 5' de los 454 acoplamientos de cóntigos se utilizaron para diseñar cebadores específicos para genes 5' .

En un primer cribado, uno de los posibles promotores, el promotor/5' UTR aislado de Aat2 (transportador de amonio, SEQ ID NO: 63), se clonó en el constructo de tioesterasa C14 de Cinnamomum camphora con el péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de Chlorella protothecoid.es, reemplazando el promotor de glutamato-deshidrogenasa de C. sorokinana . Este constructo se enumera como SEQ ID NO: 81. Para evaluar el posible promotor, el constructo de tioesterasa se transforma en células de Prototheca moriformis para confirmar la actividad real del promotor analizando el aumento de ácidos grasos C14/C12 en condiciones de poco/ningún nitrógeno, utilizando los métodos descritos anteriormente. Se puede realizar una evaluación similar de los posibles promotores regulados con nitrógeno aislados del cribado genómico/ADNc utilizando los mismos métodos.

Otros posibles promotores/5 ' UTR regulados con nitrógeno que se aislaron del cribado genómico/ADNc fueron los siguientes : Promotor/5' UTR SEQ ID NO. Factor de incremento Promotor FatB/A /5'UTR SEQ ID NO: 55 n/a Promotor transportador de SEQ ID NO: 56 9.65 metales NRAMP/5' UTR Promotor proteico asociado SEQ ID NO: 57 4.92 a flagelos Flap/5'UTR Promotor sulfito-reductasa SEQ ID NO: 58 10.91 SulfRed/5' UTR Promotor transportador de SEQ ID NO: 59 17.35 azúcares SugT/5'UTR Promotor transportador de SEQ ID NO: 60 10.1 amonio 03 Amt03/5'UTR Promotor transportador de SEQ ID NO: 61 10.76 amonio 02 Amt02/5'UTR Promotor transportador de SEQ ID NO: 62 6.21 aminoácidos 01 Aat01/5'UTR Promotor transportador de SEQ ID NO: 63 6.5 aminoácidos 02 Aat02/5'UTR Promotor transportador de SEQ ID NO: 64 7.87 aminoácidos 03 Aat03/5'UTR Promotor transportador de SEQ ID NO: 65 10.95 aminoácidos 04 Aat04/5'UTR Promotor transportador de SEQ ID NO: 66 6.71 aminoácidos 05 Aat05/5'UTR El factor de incremento se refiere al factor de incremento de la abundancia de ADNc después de 24 horas de cultivo en un medio con poco nitrógeno.

Para obtener más información sobre la regulación potencial de estos posibles promotores/5' UTR, se seleccionaron ocho de las secuencias para realizar más estudios: (1) FatB/A; (2) sulfito-reductasa SulfRed; (3) transportador de azúcares SugT; (4) transportador de amonio 02 Amt02; (5) transportador de aminoácidos 01 AatOl; (6) transportador de aminoácidos 03 Aat03; (7) transportador de aminoácidos 04 Aat04; y (8) transportador de aminoácidos 05 Aat05. Se realizaron análisis de los transcriptomas de alta resolución utilizando lecturas de secuenciaciones de Illumina para el ARN aislado de células de Prototheca moriformis en varios puntos de evaluación: T0 (siembra) , 20 horas, 32 horas, 48 horas, 62 horas y 114 horas tras la inoculación de la siembra. El medio en TO (siembra) estaba saturado de nitrógeno, mientras que en los puntos de evaluación de 20 horas y posteriores, el medio contenia poco o nada de nitrógeno. Los cóntigos de transcritos acoplados generados a partir del ARN aislado de cada uno de los puntos de evaluación se procesaron con BLAST independientemente con cada uno de los ocho transcritos identificados previamente. Los resultados se resumen en la Tabla 30 a continuación.

Tabla 30. Perfiles de expresión de los transcriptomas para ocho posibles promotores/5' UTR.

En los resultados resumidos anteriormente, varios de los transcritos muestran una mayor acumulación con el tiempo, aunque cabe notar que el ARNm de la sulfito-reductasa presenta una reducción notable de la acumulación de ARNm con el tiempo.

Estas ocho posibles regiones de promotor/5' UTR se clonaron antes de la región codificante de la tioesterasa de C. camphora eliminando su péptido de tránsito nativo y sustituyéndolo con el péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de Chlorella protothecoides (UTEX 250) . Cada constructo de la posible región de promotor/5' UTR se introdujo en Prototheca moriformis UTEX 1435 mediante recombinación homologa utilizando el ADN de la secuencia genómica 6S. El constructo también contenia un gen de sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae para la selección de clones positivos en placas/medios que contenían sacarosa. La secuencia de ADNc para las porciones relevantes del constructo para AatOl se enumera en la Lista de secuencias como SEQ ID NO: 67. Para los demás constructos, se utilizó la misma estructura, siendo la única variable la secuencia del posible promotor/5' UTR. Se generó una cepa transgénica de control adicional, en la cual se utilizó el promotor de beta-tubulina de C. reinhardtii para dirigir la expresión del gen de tioesterasa de C. camphora. Se ha demostrado que este promotor dirige la expresión constitutiva del gen de interés y, por lo tanto, proporciona un control útil frente al cual se puede medir la expresión del mismo mensaje de tioesterasa cuando es dirigido por los diferentes promotores/5' UTR regulados con N posibles evaluados.

Una vez que se generaron los clones transgénicos , se llevaron a cabo tres experimentos diferentes. Los dos primeros experimentos evalúan la capacidad potencial de regulación con nitrógeno de los ocho promotores posibles mediante la medición de los niveles de ARNm de la tioesterasa en estado de equilibrio mediante RT-PCR, los perfiles de ácidos grasos y los niveles de amoniaco en los sobrenadantes de los . cultivos. Los clones se cultivaron inicialmente a 28 °C con agitación (200 rpm) en medio de siembra rico en nitrógeno (1 g/L de nitrato de amonio—nitrógeno 15 mM en forma de amoniaco, 4g/L de extracto de levadura) durante 24-48 horas; en este punto, se utilizaron 20 unidades de DO (A750) para inocular 50 mL de medio con poco nitrógeno (0.2 g/L de sulfato de amonio—nitrógeno 3mM en forma de amoniaco, 0.2 g/L de extracto de levadura) . Se tomaron muestras de las células cada 24 horas durante 6 días y también se tomó una muestra justo antes de cambiar a las condiciones de poco nitrógeno. A continuación, se utilizó una porción de las células de cada muestra para realizar la extracción de ARN total utilizando el reactivo Trizol (de acuerdo con los métodos sugeridos por el fabricante) . Los ensayos de amoniaco pusieron de manifiesto que los niveles de amoniaco en los sobrenadantes se redujeron por debajo de los limites de detección (~ 100 µ?) después de 24 horas en un medio con poco nitrógeno.

Para RT-PCR a tiempo real, todos los niveles de ARN se normalizaron respecto a los niveles de un ARN de control interno, expresado . en Prototheca moriformis (UTEX 1435) para cada punto de evaluación. El ARN de control interno, denominado cdl89, es un producto del gen ARG9 que codifica la iV-acetilornitina-aminotransferasa . Los grupos de cebadores ilizados para la RT-PCR a tiempo real en estos experimentos eron los siguientes: Gen especifico Secuencia 5' -3' del SEQ ID NO: para cebador directo de TE de TACCCCGCCTGGGGCGACAC SEQ ID NO: 68 C. camphora inverso de TE de CTTGCTCAGGCGGCGGGTGC SEQ ID NO: 69 C. camphora directo de cdl89 CCGGATCTCGGCCAGGGCTA SEQ ID NO: 70 inverso de cdl89 TCGATGTCGTGCACCGTCGC SEQ ID NO: 71 También se generaron perfiles lipidíeos de cada uno de los transformantes para cada punto de evaluación y se compararon con los resultados de RT-PCR. Teniendo en cuenta los niveles de amoniaco, los resultados de RT-PCR y los cambios en los niveles de ácidos grasos C12-C14, se concluyó que las secuencias del transportador de aminoácidos 01 (Aat-01), del transportador de aminoácidos 04 (Aat-04) y del transportador de amonio 02 (Amt-02) contienen un promotor/5' UTR funcional que se puede regular con nitrógeno.

A partir de los resultados de RT-PCR, se demostró que Aat-01 tiene la capacidad de dirigir los niveles de ARNm de la tioesterasa de C. camphora en estado de equilibrio hasta un nivel cuatro veces superior al del control (promotor de beta-tubulina de C. reinhardtii) . Los niveles de ARNm también se correlacionaron con la limitación de nitrógeno y un incremento marcado de los niveles de ácidos grasos C12-C14. Estos resultados demuestran que la región 5'UTR asociada con el promotor Aat-01 es probablemente más eficaz a la hora de dirigir la síntesis de proteínas bajo la biosíntesis de lípidos que el promotor de control de C. reinhardtii . Del mismo modo que el promotor Aat-01, el promotor Aat-04 fue capaz de aumentar la acumulación de ARNm hasta cinco veces por encima de la del promotor de control de C. reinhardtii. Sin embargo, el constructo del promotor Aat-04 solo fue capaz de ejercer un efecto moderado sobre los niveles de ácidos grasos C12-C14. Estos datos demuestran claramente que el promotor Aat-04 se puede regular con la reducción de nitrógeno, pero que la región UTR asociada con el promotor probablemente ejerce una función insatisfactoria como potenciador de la traducción. Finalmente, el promotor Amt-02 fue similar al promotor Aat-01, ya que fue capaz de aumentar la acumulación de ARNm hasta tres veces por encima de la del promotor de control. Los niveles de ARNm también se correlacionaron con la limitación de nitrógeno y un incremento marcado de los niveles de ácidos grasos C12-C14. Se demostró que estos tres promotores, considerados conjuntamente, se regulaban con nitrógeno.

B. Caracterización adicional del promotor transportador de amonio 3 (amt03) y expresión de varias tioesterasas Según se ha descrito anteriormente, se identificaron ADNc parciales denominados transportadores de amonio 02 y 03 (amt02 y amt03) . Junto con estos dos ADNc parciales, también se identificó un tercer ADNc parcial denominado transportador de amonio 01 (amtOl) . Se comparó la alineación de los ADNc parciales y las posibles secuencias de aminoácidos traducidas. Los resultados muestran que amtOl presenta un parecido menor con las tres secuencias, mientras que amt02 y amt03 difieren solamente en un único aminoácido.

Los promotores/5' UTR se generaron inicialmente in silico mediante el procesamiento con BLAST de las secuencias de ADNc parcial frente a los acoplamientos de ADN genómico 454 de Roche y los acoplamientos de transcriptomas de Illumina, según se ha descrito anteriormente. Se identificaron los cóntigos de los transcritos que mostraban cierta identidad respecto al ADNc que codificaba amtOl, amt02 y amt03, sin embargo, los cóntigos de los transcritos no pudieron diferenciar entre los tres ARNm, ya que los cóntigos contenían secuencias compartidas por los tres. Los acoplamientos de ADN genómico 454 de Roche dieron resultados positivos con las secuencias de ADNc de amt02 y amt03, y contenían secuencias proteicas N-terminales . Se realizó una PCR para clonar las regiones flanqueantes 5' . Los cebadores de PCR utilizados para validar el clon del promotor amt02 y amt03/UTR fueron los siguientes: Amt03 directo: 5' -GGAGGAATTCGGCCGACAGGACGCGCGTCA-3' (SEQ ID NO: 85) Amt03 inverso: 5' -GGAGACTAGTGGCTGCGACCGGCCTGTG-3' (SEQ ID NO: 86) Amt02 directo: 5 ' -GGAGGAATTCTCACCAGCGGACAAAGCACCG-3 ' (SEQ ID NO: 87) Amt02 inverso: 5 ' -GGAGACTAGTGGCTGCGACCGGCCTCTGG-3 ' (SEQ ID NO: 88) En ambos casos, los cebadores 5' y 3' contenían sitios de restricción útiles para la clonación anticipada en vectores de expresión con el fin de validar la funcionalidad de estas regiones de promotor/5' UTR.

Se realizaron alineaciones por pares entre los ADN clonados mediante este método combinado in silico y basado en PCR y el ADNc original que codifica amt02 (SEQ ID NO: 61) y amt03 (SEQ ID NO: 60) . Los resultados de estas alineaciones mostraron diferencias significativas entre los ADNc originales y las secuencias genómicas clonadas, lo cual indica que los transportadores de amonio probablemente representan una familia de genes diversos. Además, el clon de promotor/5' UTR basado en el método combinado para amt03 fue diferente a la secuencia de amt03 original, mientras que las secuencias de amt02 fueron idénticas. Se realizaron experimentos adicionales para caracterizar la secuencia del promotor amt03/UTR (SEQ ID NO: 89) , los cuales se describen a continuación .

La secuencia del promotor amt03/UTR identificada anteriormente (SEQ ID NO: 89) se evaluó clonando esta posible secuencia de promotor/UTR para que dirigiera la expresión de cuatro tioesterasas diferentes. El cásete de expresión contenia secuencias de recombinación homologa situadas antes y después del sitio 6S del genoma (SEQ ID NO: 82 y 84, respectivamente) . El cásete también contenia un ADNc de sacarosa-invertasa SUC2 de S. cerevisiae para hacer posible la selección de clones positivos en medio que contenga sacarosa. La expresión de la sacarosa-invertasa estaba dirigida por el promotor de beta-tubulina de C. reinhardtii y también contenia una nitrato-reductasa 3' UTR de C. vulgaris. A continuación, la secuencia del promotor amt03/UTR se clonó en una posición posterior del cásete de sacarosa-invertasa, seguida de la secuencia de ADNc de tioesterasa en fase de uno de los cuatro genes de tioesterasa: (1) tioesterasa C14 de C. camphora; (2) tioesterasa C12 de U. californica; (3) tioesterasa C10-C16 de U. americana ; o (4) tioesterasa CIO de C. hookeriana y también contenia una nitrato-reductasa 3'UTR de C. vulgaris . La tioesterasa C14 de C. camphora, la tioesterasa C12 de U. californica y la C10-C16 de U. americana contenían, todas ellas, el péptido de tránsito de una estearoil-ACP-desaturasa de Chlorella protothecoides. La tioesterasa CIO de C. hookeriana contenia el péptido de tránsito de una desaturasa de ácidos grasos delta 12 (FAD) de Prototheca moriformis. En todos los casos, las secuencias tenían los codones optimizados para la expresión en Prototheca moriformis . Las secuencias de los constructos de tioesterasa anteriores se describen en la Lista de secuencias promotor amt03/UTR: constructo de SEQ ID NO: 90 tioesterasa de C. camphora constructo de tioesterasa de C. camphora SEQ ID NO: 91 constructo de tioesterasa de C. SEQ ID NO: 92 californica constructo de tioesterasa de U. SEQ ID NO: 93 americana constructo de tioesterasa de C. SEQ ID NO: 94 hookeriana Las lineas transgénicas se generaron mediante métodos de transformación biolistica según se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2 en células de Prototheca moriformis de origen natural y la selección se llevó a cabo en medio/placas que contenían sacarosa. A continuación, se analizaron las líneas positivas para determinar en qué grado se hablan alterado los perfiles de ácidos grasos. A continuación, cuatro líneas, cada una resultante de la transformación de cada uno de los cuatro constructos descritos anteriormente, se sometieron a un análisis adicional. La línea 76 expresó la tioesterasa C14 de C. camphora, la línea 37 expresó la tioesterasa C12 de U. californica, la línea 60 expresó la tioesterasa C10-C16 de U. americana y la línea 56 expresó la tioesterasa CIO de C. hookeriana. Cada línea se cultivó durante 48 horas en medio que contenía sacarosa como única fuente de carbono y se tomaron muestras de células a las 14, 24, 36 y 48 horas (cultivo de siembra) para determinar el perfil de ácidos grasos mediante la transesterificación directa en los ésteres metílicos de los ácidos grasos y el análisis posterior mediante GC-FID (descrito anteriormente) y para el aislamiento del ARN total. Al transcurrir las 48 horas, estas células se utilizaron para inocular cultivos con niveles bajos de nitrógeno o sin nitrógeno (que contenían sacarosa como única fuente de carbono) que se mantuvieron a un pH de 5.0 (con tampón de citrato, concentración final de 0.05 M) o un pH de 7.0 (con tampón de HEPES, concentración final de 0.1 M) . Se tomaron muestras de los cultivos a las 12, 24, 72 y 108 horas (producción de lípidos) para determinar el perfil de ácidos grasos y para aislar el ARN total. Los ensayos de amoniaco de estos cultivos pusieron de manifiesto que los niveles de amoniaco se redujeron por debajo de los límites de detección (aprox. 100 µ?) después de 24 horas en un medio con poco nitrógeno.

Los ensayos de RT-PCR a tiempo real sobre los niveles de ARNm de las tioesterasas se realizaron con el ARN total de cada uno de los puntos de evaluación recolectados anteriormente y todos los niveles de ARNm se normalizaron respecto a los niveles de un ARN de control interno (cdl89) . Los grupos de cebadores utilizados en la PCR a tiempo real se muestran en la Tabla 31 a continuación: Tabla 31. Grupos de cebadores para la PCR a tiempo Los resultados de los perfiles de ácidos grasos en cada uno de los puntos de evaluación en la fase de cultivo de siembra mostraron un efecto muy pequeño por parte de las tioesterasas . En el inicio de la fase de producción de lipidos, los perfiles de ácidos grasos se vieron significativamente afectados, con unos incrementos mucho más dramáticos para los cultivos que se mantuvieron a un pH de 7.0, en comparación con los cultivos a un pH de 5.0. Aunque la magnitud de la diferencia en la acumulación de ácidos grasos diana entre un pH de 7.0 y de 5.0 varió con cada tioesterasa evaluada, el efecto global fue el mismo: las células cultivadas a un pH de 5.0 mostraron unos niveles significativamente inferiores de los ácidos grasos diana acumulados, pero superiores en comparación con las células de control de origen natural.

El análisis de los ARN aislados de las mismas muestras se correlacionó muy bien con los datos de los perfiles de ácidos grasos, en el sentido de que se observó un claro efecto del pH del cultivo sobre los niveles de ARNm en estado de equilibrio para cada una de las tioesterasas. Considerando los datos de acumulación de ácidos grasos y los datos de ARNm conjuntamente, la regulación del pH de la expresión del gen de tioesterasa dirigida por el promotor amt03/UTR estuvo claramente controlada a nivel de transcripción, estabilidad de ARNm o ambas. Además, se observó que los niveles en estado de equilibrio del ARNm de U. californica eran cuatro unidades logarítmicas inferiores en comparación con los niveles en estado de equilibrio del ARNm de C. hookeriana. Esta observación es coherente con la hipótesis de que las secuencias de ARNm individuales pueden desempeñar una función en el control de la expresión. Estos datos implican que la captación de amoniaco en Prototheca moriformis por la familia de transportadores amt03 está relacionada directamente con el pH.

Se realizaron análisis adicionales del perfil de ácidos grasos en doce líneas generadas a partir de la transformación de células de Prototheca moriformis con el constructo de promotor amt03/UTR que dirige la expresión de la tioesterasa C10-C16 de U. americana . La línea 60, descrita anteriormente, formó parte del siguiente análisis. La Tabla 32 a continuación muestra los perfiles lipidíeos de tres de las doce líneas que se analizaron junto con el control de origen natural .

Tabla 32. Perfiles de ácidos grasos de transformantes que contienen TE de U. americana dirigido por el promotor amt03/UTR.

Según se muestra en la tabla anterior, los niveles de productos saturados totales se incrementaron dramáticamente en comparación con los de origen natural, con un factor de 2.6 en el caso de la línea 40 en comparación con el de origen natural (los productos saturados totales de las doce líneas analizadas variaron desde aproximadamente un 63% hasta por encima de un 86%) . Además, cuando la tioesterasa de U. americana se expresa a estos niveles, reduce dramáticamente el nivel de productos insaturados, especialmente C18:l y C18:2 (remítase a las líneas 40 y 44), donde en la línea 44, los niveles de C18:l se reducen más de 8 veces en comparación con los de origen natural. Además, la tioesterasa de U. americana (dirigida por el promotor amt03) aumenta notablemente los niveles de ácidos grasos de cadena media. La linea 44 muestra unos niveles de C10:0-C14:0 superiores a un 56%, aproximadamente 42 veces superiores a los niveles observados en la cepa de origen natural, y unos niveles de C8:0-C14:0 superiores a un 57%. Otras cepas transformadas con un constructo del promotor Amt03 que dirige la expresión de la tioesterasa de U. americana presentaron un perfil lipidico representativo de: un 0.23% de C8:0; un 9.64% de C10:0; un 2.62% de C12:0; un 31.52% de C14:0; un 37.63% de C16:0; un 5.34% de C18:0; un 7.05% de C18:l; y un 5.03% de C18:2, con un porcentaje total de productos saturados de un 86.98%.

Se generaron otros perfiles lipidíeos a partir de la transformación de células de Prototheca moriformis con el constructo del promotor amt03/UTR (SEQ ID NO: 89) que dirigía la expresión de la tioesterasa CIO de C. hookeriana (SEQ ID NO: 94). Se seleccionaron los clones positivos que expresaban este constructo y se cultivaron en unas condiciones de pH 7.0. El perfil representativo de un clon positivo fue el siguiente: un 9.87% de C8:0; un 23.97% de C10:0; un 0.46% de C12:0; un 1.24% de C14:0; un 10.24% de C16:0; un 2.45% de C18:0 un 42.81% de C18:l; y un 7.32% de C18:2. Este clon presentó un porcentaje de C8-C10 de un 33.84.

Al considerarlos conjuntamente, estos datos sugieren que el promotor amt03/UTR y otros promotores como este se pueden utilizar como un promotor estrictamente regulado, el cual puede ser particularmente útil para expresar un compuesto potencialmente tóxico y requiere un refuerzo estricto de la expresión génica. La capacidad de Prototheca moriformis para crecer en un amplio rango (de al menos pH 5.0 a 7.0) de regímenes de pH hace que este organismo sea particularmente útil combinado con elementos reguladores tales como el promotor amt03/UTR. Además, los datos de perfiles lipidíeos anteriores demuestran la increíble capacidad del promotor amt03/UTR para dirigir la expresión génica.

EJEMPLO 6 : Alteración de los niveles de ácidos grasos saturados en las microalgas Prototheca moriformis A. Reducción de la expresión de la estearoil-ACP-desaturasa y la desaturasa de ácidos grasos delta 12 mediante una estrategia de desactivación génica Como parte de un análisis genómico utilizando una estrategia bioinformática basada en ADNc, el transcriptoma de Illumia y la secuenciación 454 de Roche del ADN genómico de Prototheca moriformis (UTEX 1435) , se identificaron dos grupos específicos de genes implicados en la desaturación de ácidos grasos: estearoil-ACP-desaturasas (SAD) y desaturasas de ácidos grasos delta 12 (?12 FAD) . Las enzimas estearoil-ACP-desaturasas son parte de la vía de síntesis de lípidos y actúan introduciendo dobles enlaces en las cadenas de los acilos grasos, por ejemplo, la síntesis de ácidos grasos C18:l a partir de ácidos grasos C18:0. Las desaturasas de ácidos grasos delta 12 también son parte de la vía de síntesis de lípidos y actúan introduciendo dobles enlaces en los ácidos grasos ya insaturados, por ejemplo, la síntesis de ácidos grasos C18:2 a partir de ácidos grasos C18:l. Los análisis de inmunotransferencia de Southern utilizando sondas basadas en las dos clases de genes de desaturasas de ácidos grasos identificadas durante los estudios bioinformáticos indicaron que cada clase de genes de desaturasas comprendía probablemente múltiples miembros de la familia. Además, los genes que codificaban estearoil-ACP-desaturasas pertenecían a dos familias distintas. Basándose en estos resultados, se diseñaron tres constructos de interrupción génica para interrumpir potencialmente múltiples miembros de la familia de genes mediante la modificación dirigida de regiones codificantes más altamente conservadas en cada familia de enzimas desaturasas.

Se diseñaron tres constructos de modificación dirigida por recombinación homologa utilizando: (1) porciones altamente conservadas de la secuencia codificante de los miembros de la familia de desaturasas de ácidos grasos delta 12 (dl2FAD) y (2) dos constructos que tenían como diana cada una de las dos familias diferentes de SAD, cada uno de ellos con regiones conservadas de las secuencias codificantes de cada familia. Esta estrategia incorporaría un gen marcador seleccionable (el cásete de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae que confiere la capacidad para hidrolizar sacarosa) en estas regiones codificantes altamente conservadas (que tienen múltiples miembros de la familia como diana), en lugar de una estrategia clásica de reemplazo de genes en la que la recombinación homologa tendría como diana regiones flanqueantes del gen diana.

Todos los constructos se introdujeron en las células mediante una transformación biolística utilizando los métodos descritos anteriormente y los constructos se linealizaron antes de ser bombardeados en las células. Los transformantes se seleccionaron en medios/placas que contenían sacarosa y los cambios en el perfil lipídico se analizaron utilizando el método descrito anteriormente. A continuación se enumeran las secuencias relevantes de cada uno de los tres constructos de modificación dirigida.

Descripción SEQ ID NO: Secuencia 5' de la región codificante de SEQ ID NO: 72 dl2FAD del constructo de modificación dirigida Secuencia 3' de la región codificante de SEQ ID NO: 73 dl2FAD del constructo de modificación dirigida Secuencia de ADNc del constructo de SEQ ID NO: 74 modificación dirigida de dl2FAD Secuencia 5' de la región codificante de SEQ ID NO: 75 SAD2A Secuencia 3' de la región codificante de SEQ ID NO: 76 SAD2A Secuencia de ADNc del constructo de SEQ ID NO: 77 modificación dirigida de SAD2A Secuencia 5' de la región codificante de SEQ ID NO: 78 SAD2B Secuencia 3' de la región codificante de SEQ ID NO: 79 SAD2B Secuencia de ADNc del constructo de SEQ ID NO: 80 modificación dirigida de SAD2B Se seleccionaron los clones positivos representativos de las transformaciones con cada uno de los constructos y se determinaron los perfiles lipidíeos para estos clones (expresados en % de área) , los cuales se resumen en la Tabla 33 a continuación.

Tabla 33. Perfiles lipidíeos para las desactivaciones de desaturasas .

Cada uno de los constructos presentó un efecto considerable sobre la clase deseada de ácido graso y en los tres casos los niveles de C18:0 aumentaron de forma significativa, particularmente con las desactivaciones de las dos SAD. Una comparación adicional de múltiples clones de las desactivaciones de SAD indicó que las lineas de desactivación de SAD2B presentaban unas reducciones significativamente mayores de los niveles de ácidos grasos C18:l que de los ácidos grasos C18:l observados con las lineas de desactivación de SAD2A.

Se generaron desactivaciones adicionales de desaturasas de ácidos grasos ?12 (FAD) en un entorno de Prototheca morlformis utilizando los métodos descritos anteriormente. Para identificar homólogos potenciales de A12FAD, se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar una región genómica codificante de un posible FAD: Cebador 1: 5' -TCACTTCATGCCGGCGGTCC-3' SEQ ID NO: 101 Cebador 2: 5'- GCGCTCCTGCTTGGCTCGAA-3 ' SEQ ID NO: 102 Las secuencias resultantes de la amplificación genómica del ADN genómico de Prototheca moriformis utilizando los cebadores anteriores fueron muy similares, pero indicaron que existen múltiples genes o alelos de A12FADs en Prototheca.

Basándose en este resultado, se diseñaron dos constructos de interrupción génica para intentar desactivar uno o más genes de A12FAD. La estrategia incorporaría un cásete de sacarosa-invertasa (suc2 de S. cerevisiae) , de este modo se conferiría la capacidad para hidrolizar sacarosa como un marcador seleccionable en regiones codificantes altamente conservadas en lugar de utilizar una estrategia clásica de reemplazamiento de genes. El primer constructo, denominado pSZ1124, contenía secuencias de modificación dirigida genómica 5' y 3' flanqueando un promotor de ß-tubulina de C. reinh.ard.tll que dirige la expresión del gen suc2 de S. cerevisiae y una nitrato-reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris (cásete suc2 de S. cerevisiae) . El segundo constructo, denominado pSZ1125, contenía secuencias de modificación dirigida genómica 5' y 3' flanqueando un promotor de ß-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión del gen suc2 de S. cerevisiae y una nitrato-reductasa 3'UTR de Chlorella vuígaris . Las secuencias relevantes de los constructos se enumeran en la Lista de secuencias : Secuencia de modificación dirigida SEQ ID NO: 103 genómica 5' (FAD2B) de pSZ1124 Secuencia de modificación dirigida SEQ ID NO: 104 genómica 3' (FAD2B) de pSZ1124 Cásete de suc2 de S. cerevisiae SEQ ID NO: 105 Secuencia de modificación dirigida SEQ ID NO: 106 genómica 5' (FAD2C) de pSZ1125 Secuencia de modificación dirigida SEQ ID NO: 107 genómica 3' (FAD2C) de pSZ1125 pSZ1124 y pSZ1125 se introdujeron, cada uno de ellos, en un entorno de Prototheca moriformis y se seleccionaron los clones positivos basándose en la capacidad para hidrolizar sacarosa. La Tabla 34 resume los perfiles lipidíeos (en % de área, que se generó utilizando los métodos descritos anteriormente) obtenidos en dos líneas transgénicas en las que se utilizaron los vectores de modificación dirigida pSZ1124 y pSZ1125.

Tabla 34. Perfiles lipidíeos para las desactivaciones de A12-FAD Las líneas transgénicas que contenían el constructo de FAD2B (pSZ1124) presentaron un resultado inesperado y muy interesante en el perfil lipídico, ya que los niveles de C18:2, que cabría esperar que se hubieran reducido, solo disminuyeron aproximadamente un 1% de área. Sin embargo, los niveles de ácidos grasos C18:l aumentaron significativamente, casi exclusivamente a costa de los niveles de C16:0, que se redujeron significativamente. Las líneas transgénicas que contenían el constructo de FAD2C (pSZ1125) también presentaron un cambio en el perfil lipídico: los niveles de C18:2 se redujeron significativamente, junto con un aumento correspondiente de los niveles de C18:l.

Mimético de sebo bovino Se seleccionó un clon positivo generado a partir del experimento de desactivación de SAD2B anterior según se ha descrito previamente para utilizarlo como base para la introducción adicional de un gen de acil graso-ACP-tioesterasa con preferencia por C14. El constructo para introducir la tioesterasa con preferencia por C14 de C. camphora contenía la secuencia de modificación dirigida para la región genómica 6S (que permite la integración dirigida del ADN transformante mediante recombinación homologa) y el constructo de expresión contenía el promotor de ß-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión del gen neoR con la nitrato-reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris, y a continuación un segundo promotor de ß-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión de una tioesterasa de C. camphora de codones optimizados con un péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de Chlorella protothecoides con una segunda nitrato-reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris. La secuencia donante genómica 6S 5' se enumera en la SEQ ID NO: 82; la secuencia donante genómica 6S 3' se enumera en la SEQ ID NO: 84/ y el constructo de expresión relevante para la tioesterasa de C. camphora se enumera en la SEQ ID NO: 83.

La transformación se llevó a cabo utilizando métodos biolísticos según se ha descrito anteriormente y se permitió que las células se recuperaran durante 24 horas en placas que contenían un 2% de sacarosa. Una vez transcurrido este tiempo, las células se volvieron a suspender y se volvieron a colocar en placas que contenían un 2% de sacarosa y 50 g/ml de G418 para la selección. Se seleccionaron nueve clones de entre los clones positivos generados para la producción de lípidos y el perfil lipídico. Los nueve clones transgénicos (con la desactivación de SAD2B y que expresan la tioesterasa con preferencia por C14 de C. camphora) se cultivaron según se ha descrito anteriormente y se analizaron para determinar el perfil lipídico. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 35. El perfil lipídico para el sebo también se incluye en la Tabla 35 a continuación (Consejo Nacional de Investigación 1976: Fat Content and Composition of Animal Products) .

Tabla 35. Perfil lipídico de clones transformados con tioesterasas .

Según se puede observar en la Tabla 35, los perfiles lipidicos de las lineas transgénicas son bastante similares al perfil lipidico del sebo. Al considerarlos de forma colectiva, los datos demuestran la utilidad de combinar entornos transgénicos específicos, en este caso, una desactivación de SAD2B, con una tioesterasa con preferencia por C14 (de C. camphora) , para generar una cepa algácea transgénica que produzca un aceite similar al perfil lipidico del sebo.

B. Estrategia de ARNi para reducir la expresión del gen de desaturasa delta 12 (FADc) en células de Prototheca Se introdujeron vectores que reducen la expresión génica de FADc (gen de desaturasa delta 12) mediante ARNi en un entorno genético de Prototheca moriformis UTEX 1435. El gen de la sacarosa-invertasa suc2 de Saccharomyces cerevisiae se utilizó como marcador seleccionábale, que confiere capacidad para crecer en sacarosa como única fuente de carbono, para obtener clones positivos. El primer tipo de constructos utilizó una porción del primer exón de la región codificante de FADc unida en cis a su primer intrón, seguida de una unidad de repetición del primer exón en orientación inversa. Este tipo de constructos teóricamente provoca la formación de un ARN horquillado cuando se expresa como ARNm. Se crearon dos constructos de este primer tipo, uno dirigido por el promotor Amt03 de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) , denominado pSZl468, y un segundo constructo dirigido por el promotor de ß-tubulina de Chlamydomomas reinhardtii (SEQ ID NO: 114), denominado pSZ 1469. Un segundo tipo de constructos utilizó el exón 2 grande de FADc en orientación antisentido dirigido por el promotor Amt03 de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) , denominado pSZl470, o dirigido por el promotor de ß-tubulina de Chlamydomomas reinhardtii (SEQ ID NO: 114), denominado pSZ 1471. Los cuatro constructos contenían un cásete de sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 159) y una secuencia de modificación dirigida por recombinación homologa 5' (SEQ ID NO: 82) y 3' (SEQ ID NO: 84) (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica 6S para la integración en el genoma nuclear. Las secuencias de las porciones de FADc de cada constructo de ARNi, junto con las porciones relevantes de cada constructo, se enumeran en la Lista de secuencias como se indica a continuación: Descripción SEQ ID NO: Cásete de ARNi horquillado para FADc SEQ ID NO: 163 pSZ1468 Porciones relevantes del constructo SEQ ID NO: 164 pSZ1468 Cásete de ARNi horquillado para FADc SEQ ID NO: 165 pSZ1469 Porciones relevantes del constructo SEQ ID NO: 166 pSZ1469 Cásete de ARNi para el exón 2 de FADc SEQ ID NO: 167 pSZ1470 Porciones relevantes del constructo SEQ ID NO: 168 PSZ1470 Cásete de ARNi para el exón 2 de FADc SEQ ID NO: 169 pSZ1471 Porciones relevantes del constructo SEQ ID NO: 170 pSZ1471 Cada uno de los cuatro constructos se transformó en un entorno de Prototheca moriformis y los clones positivos se evaluaron utilizando placas con sacarosa como única fuente de carbono. Se seleccionaron los clones positivos de cada transformación y se seleccionó un subconjunto para determinar el efecto de los casetes de tipo antisentido y horquillado contenidos en pSZ1468, pSZ1469, pSZ1470 y pSZ1471 sobre los perfiles de ácidos grasos. Los clones seleccionados de cada transformación se cultivaron en condiciones de producción de lipidos y se determinaron los perfiles lipidíeos utilizando métodos de transesterificación directa según se ha descrito anteriormente. Los perfiles lipidíeos representativos de cada una de las transformaciones se resumen a continuación en la Tabla 36. Las células de origen natural 1 y 2 eran células de Prototheca moriformis no transformadas que se analizaron con cada uno de los transformantes como control negativo.

Tabla 36. Perfiles lipidíeos de células de Prototheca moriformis que contenían constructos de ARNi para reducir la expresión del gen de desaturasa delta 12 (FADc) .

Los resultados resumidos anteriormente indican que los constructos de horquilla, pSZ1468 y pSZ1469, presentaron los fenotipos esperados específicos, a saber, una reducción de los niveles de ácidos grasos C18:2 y un aumento de los niveles de ácidos grasos C18:l, en comparación con los de origen natural 1 y origen natural 2, respectivamente. Los constructos antisentido, pSZ1470 y pSZ1471, no dieron como resultado ninguna reducción de los niveles de ácidos grasos C18:2, pero en su lugar presentaron un ligero aumento en comparación con los de origen natural 1 y origen natural 2, respectivamente, y una ligera reducción de los niveles de ácidos grasos C16:0.

C. Expresión de una estearoil-ACP-desaturasa exógena Se introdujo estearoil-ACP-desaturasa de Olea europaea (N.° de acceso a GenBank AAB67840.1) en un entorno genético de Prototheca moriformis UTEX1435. El constructo de expresión contenia secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' (SEQ ID NO: 82) y 3' (SEQ ID NO: 84) 84) (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica 6S para su integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae bajo el control del promotor de p-tubulina/5' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris . Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159 y actuó como un marcador de selección. La región codificante de la estearoil-ACP-desaturasa de Olea europaea estaba bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) y la nitrato-reductasa 3' UTR de C. vulgaris, y el péptido de tránsito nativo se reemplazó con el péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de Chlorella protothecoid.es (SEQ ID NO: 49) . Las secuencias de ADNc con codones optimizados y las secuencias de aminoácidos (con el péptido de tránsito reemplazado) se enumeran en la Lista de secuencias como SEQ ID NO: 171 y SEQ ID NO: 172, respectivamente. El cásete de expresión entero de SAD de 0. europaea se denominó pSZ1377 y se transformó en un entorno genético de Prototheca moriformis Los clones positivos se evaluaron en placas con sacarosa como única fuente de carbono. Se seleccionó un subconjunto de los clones positivos, se cultivaron en condiciones de producción de lipidos y se determinaron los perfiles lipidíeos utilizando métodos de transesterificación directa según se ha descrito anteriormente, Los perfiles lipidíeos de los clones seleccionados se resumen en la Tabla 37 a continuación, Tabla 37. Perfil lipidíeos de células de Prototheca moriformis transgénicas con estearoil-ACP-desaturasa de Olea europaea .

Los resultados resumidos anteriormente demuestran que la introducción de una desaturasa heteróloga, en este caso una estearoil-ACP-desaturasa de Olea europaea , puede dar como resultado unos niveles más elevados de ácidos grasos C18 : 1 y una reducción concomitante de los niveles de ácidos grasos C18:0 y C16:0.

EJEMPLO 7 : Modificación de Prototheca. para producir ácidos grasos hidroxilados Se introdujo oleato 12-hidroxilasa de Ricinus communis (Rcl2hidro) (N.° de acceso a GenBank AAC49010.1) en un entorno genético de Prototheca moriformis UTEX1435. El constructo de expresión contenia secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' (SEQ ID NO: 82) y 3' (SEQ ID NO: 84) 84) (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica 6S para su integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae bajo el control del promotor de ß-tubulina/5' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris. Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159 y actuó como un marcador de selección. La región codificante de la oleato 12-hidroxilasa de Ricinus communis estaba bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) y la nitrato-reductasa 3' UTR de C. vulgaris. Las secuencias de ADNc con codones optimizados y las secuencias de aminoácidos se enumeran en la Lista de secuencias como SEQ ID NO: 173 y SEQ ID NO: 174, respectivamente. El cásete de expresión entero de Rcl2hidro se denominó pSZ1419 y se transformó en un entorno genético de Prototheca moriformis . Los clones positivos se evaluaron en placas con sacarosa como única fuente de carbono. Se seleccionó un subconjunto de los clones positivos, se cultivaron en condiciones para la producción de lipidos y se analizaron para determinar el producto de la oleato 12-hidroxilasa de R. communis, a saber, el ácido ricinoleico, utilizando un método de GC/MS.

El método de GC/MS utilizado para detectar el ácido ricinoleico producido en las lineas transgénicas positivas de Rcl2hidro se llevó a cabo como se indica a continuación. Las muestras de clones positivos y un control de origen natural se secaron y a continuación se suspendieron en 2.2 mL de H2SC 4.5 en metanol-tolueno, 10:1 (v/v) . A continuación, la mezcla se calentó a 70-75°C durante 3.5 horas con sonicación intermitente y agitación con vórtex. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, se añadieron 2 mL de K2CO3 al 6% (ac) y 2 mL de heptano, a continuación la mezcla se agitó con vórtex enérgicamente y la separación de las fases se aceleró por centrifugación a 900 rpm durante 2 minutos.. La fase superior se retiró y se concentró a sequedad con una corriente de nitrógeno. Al aceite resultante, se añadieron 500 µL de piridina anhidra y 500 íL de BSTFA/1% de TMCS (Thermo Scientific) . La solución resultante se calentó a 70-75 °C durante 1.5 horas y a continuación se concentró a sequedad con una corriente de nitrógeno. A continuación, el residuo se volvió a suspender en 2 mL de heptano y se volvió a concentrar. Las muestras se volvieron a suspender en 2 mL de heptano y se analizaron por GC/MS en un sistema Thermo Trace GC Ultra/DSQII en modo de El, utilizando una monitorización de iones selectiva del pico de referencia de TMS o del ricinoleato de metilo (m/z 187) . Los ásteres metílicos de los ácidos grasos se separaron en una columna Restek Rxi-5Sil MS (0.25 mm de DI, 30 m de longitud, 0.5 µp? de grosor de la película) utilizando helio como gas portador con un flujo de 1 mL/min. La temperatura inicial de la columna se mantuvo a 130 °C durante 4 minutos y a continuación se aplicó una rampa de 4 °C/min hasta una temperatura final de 240 °C. La presencia de ácido ricinoleico en las muestras se confirmó comparando el tiempo de retención y los espectros de masas de barrido completo con los de una muestra auténtica de ácido ricinoleico tratada como se ha descrito anteriormente. La Figura 2 muestra el tiempo de retención de GC para un clon transgénico positivo representativo en comparación con el ácido ricinoleico estándar y un control de origen natural. El clon transgénico positivo presentó un pico derivable en un tR: 33.22/33.23, que se corresponde con un pico similar en el estándar de ácido ricinoleico, lo cual indica la presencia de ácido ricinoleico derivable tanto en el clon transgénico como en el control positivo. Este pico no apareció en absoluto en la muestra de control de origen natural.

EJEMPLO 8 : Modificación de Prototheca con marcadores seleccionábales alternativos A. Expresión de una -galactosidasa secretable en Prototheca morlformis Los métodos para expresar un gen heterologo de sacarosa-invertasa en especies de Prototheca y sus efectos se han descrito previamente en la Solicitud de PCT N.° PCT/US2009/66142, que se incorpora a la presente por referencia. En este ejemplo se ha examinado la expresión de otras enzimas heterólogas que degradan polisacáridos . Se evaluó la capacidad de crecer en melibiosa ( -D-gal-glu ) de Prototheca moriformis UTEX 1435 con uno de los siguientes genes exógenos que codifican una a-galactosidasa : el gen MEL1 de Saccharomyces carlbergensis (secuencia de aminoácidos que corresponde al número de acceso a NCBI P04824) , el gen AglC de Aspergillus niger (secuencia de aminoácidos que corresponde al número de acceso a NCBI Q9UUZ4) y la <¾-galactosidasa de la planta superior Cyamopsis tetragobobola (frijol guar) (secuencia de aminoácidos que corresponde al número de acceso a NCBI P14749) . Los números de acceso anteriores y las secuencias de aminoácidos correspondientes se incorporan a la presente por referencia. En todos los casos, los genes se optimizaron de acuerdo con el uso de codones preferido en Prototheca moriformis. Las porciones relevantes del cásete de expresión se enumeran a continuación, junto con los números de la Lista de secuencias. Todos los casetes de expresión utilizaron las secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa Clp 5' y 3' para la integración genómica estable, el promotor TUB2/5' OTR de Chlamydomonas reinhardtii y la nitrato-reductasa 3'UTR de Chlorella.

Secuencia de aminoácidos de MEL1 de S. SEQ ID NO: 108 carlbergensis Péptido señal de la secuencia de SEQ ID NO: 109 aminoácidos de MEL1 de S. carlbergensis Cásete de transformación de MEL1 de SEQ ID NO: 110 S. carlbergensis Secuencia de MEL1 de S. carlbergensis (con SEQ ID NO: 111 codones optimizados) Secuencia de modificación dirigida por SEQ ID NO: 112 recombinación homologa Clp 5' Secuencia de modificación dirigida por SEQ ID NO: 113 recombinación homologa Clp 3' Promotor TUB2/5'UTR de Chlamydomonas SEQ ID NO: 114 reinhardtii Nitrato-reductasa 3'UTR de Chlorella SEQ ID NO: 115 vulgaris Secuencia de aminoácidos de AlgC de A. SEQ ID NO: 116 niger Péptido señal de la secuencia de SEQ ID NO: 117 aminoácidos de AlgC de A. niger Secuencia de AlgC de A. niger (con codones SEQ ID NO: 118 optimizados ) Cásete de transformación de AlgC de A. SEQ ID NO: 119 niger Secuencia de aminoácidos de a-galactosidasa SEQ ID NO: 120 de C. tetragonobola Secuencia de a-galactosidasa de C. SEQ ID NO: 121 tetragonobola (con codones optimizados) Cásete de transformación de a-galactosidasa SEQ ID NO: 122 de C. tetragonobola Las células de Prototheca moriformis se transformaron con cada uno de los tres casetes de expresión que contenían el gen MEL1 de S. carlbergensis, AlgC de A. niger o a-galactosidasa de C. tetragonobola utilizando los métodos de transformación biolistica según se ha descrito en el Ejemplo 2 previamente. Los clones positivos se evaluaron utilizando placas que contenían un 2% de melibiosa como única fuente de carbono. No aparecieron colonias en las placas para los transformantes del cásete de expresión de C. tetragonobola . Los clones positivos se seleccionaron de las placas que contenían transformantes de MEL1 de S. carlbergensis y transformantes de AlgC de A. niger. La integración del ADN transformante se confirmó utilizando PCR con cebadores que tenían como diana una porción de la región 3'UTR de C. vulgaris y la secuencia de modificación dirigida por recombinación homologa Clp 3' . 3'UTR de C. vulgaris del cebador 5': secuencia Clp posterior (SEQ ID NO: 123) ACTGCAATGCTGATGCACGGGA 3'UTR de C. ulgaris del cebador 3': secuencia Clp posterior (SEQ ID NO: 124) TCCAGGTCCTTTTCGCACT Como control negativo, el ADN genómico de células de Prototheca moriformis no transformadas también se amplificó con el conjunto de cebadores. No se amplificaron productos del ADN genómico procedente de las células de origen natural.

Se evaluaron varios clones positivos de cada uno de los transformantes de MEL1 de S. carlbergensis y los transformantes de AlgC de A. niger (según se confirmó por PCR) para determinar su capacidad para crecer en melibiosa como única fuente de carbono en medios líquidos. Estos clones seleccionados se cultivaron durante 3 días en las condiciones y el medio base que se han descrito en el Ejemplo 1 anteriormente con melibiosa como única fuente de carbono. Todos los clones que contenían cualquiera de los genes que codifican a-galactosidasa crecieron enérgicamente durante este tiempo, mientras que la cepa de origen natural no transformada y Prototheca moriformis que expresaba una sacarosa-invertasa de SUC2 de Saccharomyces cerevisiae crecieron ambas de forma insatisfactoria en los medios de melibiosa. Estos resultados sugieren que los genes que codifican a-galactosidasa se pueden utilizar como un marcador seleccionable para la transformación. Además, estos datos indican que los péptidos señal nativos presentes en MEL1 de S. carlbergensis (SEQ ID NO: 109) o AlgC de A. niger (SEQ ID NO: 117) son útiles para dirigir proteínas hacia el periplasma en células de Prototheca moriformis.

B. Los genes THIC complementan la auxotrofia de tiamina en Prototheca Se examinó la prototrofia de tiamina en células de Prototheca moriformis utilizando la expresión de genes THIC exógenos. La biosíntesis de tiamina en plantas y algas se lleva a cabo normalmente en el plástido, por lo tanto, la mayor parte de proteínas nucleares codificadas implicadas en su producción se deberán dirigir eficazmente hacia el plástido. La secuenciación de ADN y la secuenciación del transcriptoma de células de Prototheca moriformis puso de manifiesto que todos los genes que codifican las enzimas que biosintetizan tiamina estaban presentes en el genoma, con la excepción de THIC. Para determinar la lesión responsable de la auxotrofia de tiamina a nivel bioquímico, se examinó el crecimiento de células de Prototheca moriformis en cinco regímenes diferentes: (1) en presencia de clorhidrato de tiamina 2 µ?; (2) sin tiamina; (3) sin tiamina, pero con hidroxietiltiazol (THZ) 2 µ?; (4) sin tiamina, pero con 2-metil-4-amino-5- (aminometil) pirimidina (PYR) 2 µ ; y (5) sin tiamina, pero con THZ 2 µ y PYR 2µ?. Los resultados de los experimentos de crecimiento en estas 5 condiciones diferentes indicaron que las células de Prototheca moriformis son capaces de una síntesis de novo, pero solo pueden producir pirofosfato de tiamina (TPP) si se proporciona el precursor PYR. Este resultado es coherente con la hipótesis de que la auxotrofia de tiamina de Prototheca moriformis es debida a la incapacidad de sintetizar fosfato de hidroximetilpirimidina (HMP-P) a partir del ribonucleótido aminoimidazólico, que es la conversión catalizada por la enzima THIC.

Las células de Prototheca moriformis se transformaron utilizando los métodos de transformación biolística descritos anteriormente en el Ejemplo 2, para que expresaran THIC de Coccomyxa C-169 (secuencia de aminoácidos que corresponde a la proteína de JGI con ID 30481, que se incorpora a la presente por referencia) y una sacarosa-invertasa SUC2 de S. cerevisiae como marcador seleccionable . Este constructo de expresión contenía la secuencia del péptido de tránsito nativo de THIC de Coccomyxa C-169, secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa antes y después de la región 6S del ADN genómico, un promotor TC7B2/región 5'UTR de C. reinhardtii (SEQ ID NO: 104) y una nitrato-reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris (SEQ ID NO: 115) . La expresión de SUC2 de S. cerevisiae también fue dirigida por un promotor rt/B2/región 5'UTR de C. reinhardtii (SEQ ID NO: 114) y contenía una nitrato-reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris (SEQ ID NO: 115) . Los genes se optimizaron de acuerdo con el uso de codones preferido en Prototheca moriformis . Las secuencias de los casetes de expresión relevantes se enumeran en la Lista de secuencias y se detallan a continuación: Secuencia de aminoácidos de THIC de SEQ ID NO: 125 Coccomyxa C-169 Péptido de tránsito nativo de la SEQ ID NO: 126 secuencia de aminoácidos de THIC de Coccomyxa C-169 Cásete de transformación de THIC de SEQ ID NO: 127 Coccomyxa C-169 Secuencia de THIC de Coccomyxa C- SEQ ID NO: 128 169 (con codones optimizados) Secuencia de SUC2 de S. cerevisiae SEQ ID NO: 129 (con codones optimizados) Secuencia de modificación dirigida SEQ ID NO: 82 por recombinación homologa 6S 5' Secuencia de modificación dirigida SEQ ID NO: 84 por recombinación homologa 6S 3' La selección de los clones positivos se llevó a cabo en placas sin tiamina y que contenían sacarosa como única fuente de carbono. Los clones positivos se confirmaron utilizando PCR con un cebador 5' que se une al gen THIC de Coccomyxa C-169 y un cebador 3' que se híbrida en una posición posterior del ADN transformante en el locus 6S. Los clones positivos confirmados por PCR también se confirmaron utilizando ensayos de inmunotransferencia de Southern.

Para observar la auxotrofia de tiamina de las células de Prototheca moriformis de origen natural, fue necesario en primer lugar suprimir las reservas internas de tiamina de las células. Para evaluar el crecimiento en un medio sin tiamina, las células se cultivaron en primer lugar hasta la fase estacionaria en un medio que contenia tiamina 2 µ y a continuación las células se diluyeron hasta obtener una densidad óptica a 750 nm (DO750) de aproximadamente 0.05 en medio sin tiamina. A continuación, las células diluidas se cultivaron una vez más hasta la fase estacionaria en un medio sin tiamina (aproximadamente 2—3 días) . Estas células sin tiamina se utilizaron para inocular cultivos para estudios de crecimiento en medio sin tiamina. Las células de origen natural se cultivaron en medio con glucosa como fuente de carbono (con o sin tiamina) y los clones positivos con el constructo del péptido de tránsito nativo de THIC de Coccomyxa C-169 se cultivaron en medio con sacarosa como única fuente de carbono. El crecimiento se midió monitorizando la absorbancia a 750 nm. Los resultados de los experimentos de crecimiento mostraron un crecimiento sustancialmente mayor en medio exento de tiamina de las cepas que expresan el transgén en comparación con las células de origen natural en medio exento de tiamina. Sin embargo, los transformantes no consiguieron obtener la tasa de crecimiento ni las densidades celulares de las células de origen natural en medios que contenían tiamina. También se observó una fuerte correlación entre la cantidad de crecimiento en los clones de los transformantes en medio exento de tiamina y el número de copias de la enzima de Coccomyxa integrada (es decir, cuanto mayor fue el número de copias del transgén, mejor fue el crecimiento de las células en medio exento de tiamina) .

Se generaron transformantes adicionales utilizando constructos de expresión que contenían el gen THIC de Coccomyxa , el gen THIC de Arabidopsis thaliana y el gen thiC de Synechocystis sp. PCC 6803. En el caso del gen THIC de Coccomyxa y A. thaliana , la secuencia del péptido de tránsito nativo se reemplazó con la secuencia del péptido de tránsito de un gen de estearoil-ACP-desaturasa (SAD) de Chlorella protothecoides. Synechocystis sp. es una cianobacteria y la proteína thiC no contiene ninguna secuencia de péptido de tránsito nativo. En el constructo de thiC de Synechocystis sp., la secuencia del péptido de tránsito de un gen de SAD de Chlorella protothecoides se fusionó con el extremo N-terminal de thiC de Synechocystis sp. En todos los casos, las secuencias tenían los codones optimizados para la expresión en Prototheca moriformis. Los tres constructos anteriores contenían secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa situadas antes y después de la región 6S del genoma (SEQ ID NO: 82 y 84), un promotor de actina/5' UTR de Chlorella protothecoides y un gen EF1A 3'UTR de Chlorella protothecoides . Los tres constructos contenían un gen neoR dirigido por el promotor TUB2/5' OTR de C. reinhardtii (SEQ ID NO: 114) y contenían 3'UTR de C. vulgaris (SEQ ID NO: 115) , que confería la selección por parte de G418 La secuencia de aminoácidos de THIC de A. thaliana corresponde al número de acceso a NCBI NP 180524 y la secuencia de aminoácidos de thiC de Synechocystis sp. corresponde al número de acceso a NCBI NP_442586; ambas secuencias se incorporan a la presente por referencia. Las secuencias de los casetes de expresión relevantes se enumeran en la Lista de secuencias y se detallan a continuación: Constructo de expresión de THIC de Coccomyxa con el péptido de tránsito de C. protothecoides SEQ ID NO: 130 THIC de Coccomyxa con el péptido de SEQ ID NO: 131 tránsito de C. protothecoides Promotor de actina/5' UTR de C. SEQ ID NO: 132 protothecoides EF1A 3'UTR de C. protothecoides SEQ ID NO: 133 Constructo de expresión de THIC de A. SEQ ID NO: 134 thaliana THIC de A. thaliana con el péptido de SEQ ID NO: 135 tránsito de C. protothecoides Secuencia de aminoácidos de THIC de A. SEQ ID NO: 136 thaliana con el péptido de tránsito nativo Constructo de expresión de thiC de SEQ ID NO: 137 Synechocystis sp. thiC de Synechocystis sp. con el SEQ ID NO: 138 péptido de . tránsito de C. protothecoides Secuencia de aminoácidos de thiC de SEQ ID NO: 139 Synechocystis sp. gen neoR SEQ ID NO: 140 Los clones positivos se evaluaron en placas que contenían G418 y se seleccionaron varios clones de cada transformación para la verificación por PCR. La integración de los constructos de ADN transformante que contenían los genes THIC de Coccomyxa C-169 (con el péptido de tránsito de C. protothecoides), A. thaliana y Synechocystis sp. PCC 6803, respectivamente, en el locus 6S del genoma se confirmó utilizando análisis de PCR con los siguientes cebadores: Secuencia del cebador de confirmación 5' para THIC de Coccomyxa (SEQ ID NO: 141) ACGTCGCGACCCATGCTTCC Secuencia del cebador de confirmación 3' para THIC (SEQ ID NO: 142) GGGTGATCGCCTACAAGA Secuencia del cebador de confirmación 5' para THIC de A. thaliana (SEQ ID NO: 143) GCGTCATCGCCTACAAGA Secuencia del cebador de confirmación 5' para THIC de Synechocystis sp. (SEQ ID NO: 144) CGATGCTGTGCTACGTGA Los experimentos de crecimiento en células sin tiamina (según se han descrito anteriormente) se llevaron a cabo utilizando los clones positivos confirmados seleccionados de los transformantes de cada uno de los diferentes constructos en medio que contenia G418. Todos los transformantes fueron capaces de crecer (con diferentes grados de robustez) en medio exento de tiamina. La comparación del crecimiento de los transformantes en medio exento de tiamina con las células de origen natural en medio que contenia tiamina presentó la siguiente clasificación respecto a su capacidad para sostener el crecimiento en medio exento de tiamina: (1) transformantes de A. thaliana ; (2) transformantes de Coccomyxa C-169 (con el péptido de tránsito de C. protothecoides) ; y (3) transformantes de Synechocystis sp. Los resultados sugieren que, aunque una única copia de THIC de A. thaliana fue capaz de complementar la auxotrofia de tiamina en células de Prototheca moriformis, fueron necesarias múltiples copias de THIC de Coccomyxa C-169 (con la secuencia del péptido de tránsito nativo o una secuencia del péptido de tránsito de C. protothecoides) y Synechocystis sp . para obtener un crecimiento rápido en ausencia de tiamina. Debido a la variabilidad de los resultados de los diferentes THIC de diferentes fuentes, la capacidad de cualquier gen THIC particular para complementar totalmente la lesión presente en especies de Prototheca no es predecible.

Se realizó una alineación de las tres secuencias de aminoácidos de THIC. Aunque existe una conservación, de la secuencia significativa en thiC de Synechocystis sp. en comparación con los THIC de Coccomyxa y A. thaliana (un 41% de identidad a nivel de aminoácidos) , la proteina cianobacteriana carece de un dominio en el extremo N-terminal que está bien conservado en las proteínas de plantas y algas.

Además del dominio ausente (que probablemente dé como resultado diferencias estructurales) , el constructo que expresa thiC de Synechocystis sp. fue capaz de restaurar, al menos parcialmente, la prototrofia de tiamina en células de Prototheca moriformis.

EJEMPLO 9 : Producción de combustible A. Extracción de aceite a partir de microalgas utilizando una prensa de tornillo y un adyuvante de prensado Se secó biomasa de microalgas que contenia un 38% de aceite en PSC utilizando una secadora de tambor, lo cual dio como resultado un contenido de humedad resultante de un 5— 5.5%. La biomasa se introdujo en una prensa francesa L250. Se introdujeron 30.4 kg (67 Ib) de biomasa en la prensa y no se obtuvo nada de aceite. Se introdujo en la prensa la misma biomasa microbiana seca combinada con varios porcentajes de pasto varilla como adyuvante de prensado. La combinación de biomasa microbiana seca y un 20% p/p de pasto varilla proporcionó el mejor porcentaje global de recuperación de aceite. A continuación, la masa prensada se sometió a una extracción con hexano y el rendimiento final para el uso de un 20% de pasto varilla fue de un 61.6% del aceite disponible total (calculado en peso) . La biomasa con más de un 50% de aceite en peso seco celular no requirió el uso de un adyuvante de prensado, tal como el pasto varilla, para liberar el aceite. Otros métodos para extraer aceite de microalgas utilizando una prensa de tornillo se describen en la Solicitud de PCT N.° PCT/US2010/31108 , la cual se incorpora a la presente por referencia.

B. Producción de biodiésel a partir de aceite de Prototheca El aceite desgomado de Prototheca moriformis UTEX 1435, producido de acuerdo con los métodos descritos anteriormente, se sometió a transesterificación para producir ésteres metílicos de los ácidos grasos . Los resultados se muestran en la Tabla 38 a continuación.

El perfil lipidico del aceite fue el siguiente: CIO: 0 0.02 C12 : 0 0.06 C14 : 0 1.81 C14. 1 0.07 C16: 0 24.53 C16: 1 1.22 C18: 0 2.34 C18 : 1 59.21 C18: 2 8.91 C18: 3 0.28 C20:0 0.23 C20:l 0.10 C20:l 0.08 C21:0 0.02 C22:0 0.06 C24:0 0.10 Tabla 38. Perfil del biodiésel obtenido a partir de aceite de triglicéridos de Prototheca moriformis .

El perfil lipídico del biodiésel fue muy similar al perfil lipídico del aceite utilizado como materia prima. Otros aceites proporcionados por los métodos y las composiciones de la invención se pueden someter a transesterificación para obtener biodiésel con perfiles lipidíeos que incluyen (a) al menos un 4% de C8-C14; (b) al menos un 0.3% de C8; (c) al menos un 2% de CIO; (d) al menos un 2% de C12; y (3) al menos un 30% de C8-C14.

La filtrabilidad con empapamiento en frío, según el método Al de ASTM D6751, del biodiésel producido fue de 120 segundos para un volumen de 300 mL. Este ensayo implica la filtración de 300 mL de B100, que se ha enfriado hasta 40 °F durante 16 horas, se ha dejado calentar hasta temperatura ambiente y se ha filtrado al vacio utilizando un filtro de fibra de vidrio de 0.7 mieras con soporte de acero inoxidable Los aceites de la invención se pueden transesterificar para generar biodiésel con un tiempo de empapamiento en frió inferior a 120 segundos, inferior a 100 segundos e inferior a 90 segundos.

C . Producción de diésel renovable El aceite desgomado de Prototheca moriformis UTEX 1435, producido de acuerdo con los métodos descritos anteriormente y que tiene el mismo perfil lipidico que el aceite utilizado para obtener biodiésel en este ejemplo, anteriormente, se sometió a transesterificación para producir diésel renovable.

En primer lugar, el aceite se sometió a un hidrotratamiento para eliminar oxígeno y el esqueleto de glicerol, con lo cual se obtuvieron n-parafinas. A continuación, las n-parafinas se sometieron a craqueo e isomerización . En la Figura 1 se muestra un cromatograma del material. A continuación, el material se sometió a una filtración en frió, la cual eliminó aproximadamente un 5% del material C18. Tras la filtración en frío, el volumen total del material se redujo hasta el punto de inflamación y se evaluó para determinar el punto de inflamación, la distribución de destilación según ASTM D-86, el punto de enturbiamiento y la viscosidad. El punto de inflamación fue de 63 °C; la viscosidad fue de 2.86 cSt (centistokes) ; el punto de enturbiamiento fue de 4 °C. Los valores de destilación según ASTM D86 se muestran en la Tabla 39: Tabla 39. Valores de destilación según ASTM D86.

Lecturas en °C: Volumen Temperatura PEI 173 5 217.4 10 242.1 15 255.8 20 265.6 30 277.3 40 283.5 50 286.6 60 289.4 70 290.9 80 294.3 90 300 95 307.7 PEF 331.5 La T10-T90 del material producido fue de 57.9 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otros tipos de modificación covalente de los aceites descritos en la presente, así como también los métodos de destilación y fraccionamiento (tales como la filtración en frío) que se describen en la presente, se pueden emplear para generar composiciones de diésel renovable con otros rangos de T10-T90, tales como 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 y 65 °C, utilizando los aceites de triglicéridos producidos de acuerdo con los métodos descritos en la presente.

La TIO del material producido fue de 242.1 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otros tipos de modificación covalente de los aceites descritos en la presente, así como también los métodos de destilación y fraccionamiento (tales como la filtración en frío) que se describen en la presente, se pueden emplear para generar composiciones de diésel renovable con otros valores de TIO, átales como una TIO comprendida entre 180 y 295, entre 190 y 270, entre 210 y 250, entre 225 y 245, y de al menos 290.

La T90 del material producido fue de 300 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otros tipos de modificación covalente de los aceites descritos en la presente, así como también los métodos de destilación y fraccionamiento (tales como la filtración en frió) que se describen en la presente, se pueden emplear para qenerar composiciones de diésel renovable con otros valores de T90, tales como una T90 comprendida entre 280 y 380, entre 290 y 360, entre 300 y 350, entre 310 y 340, y de al menos 290.

El PEF del material producido fue de 300 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otros tipos de modificación covalente de los aceites descritos en la presente, así como también los métodos de destilación y fraccionamiento (tales como la filtración en frío) que se describen en la presente, se pueden emplear para generar composiciones de diésel renovable con otros valores de PEF, tales como un PEF comprendido entre 290 y 400, entre 300 y 385, entre 310 y 370, entre 315 y 360, y de al menos 300.

Aunque esta invención se haya descrito haciendo referencia a realizaciones específicas de esta, se sobreentenderá que se pueden realizar modificaciones adicionales. Se pretende que esta solicitud contemple cualesquiera variaciones, usos o adaptaciones de la invención que sigan, en general, los principios de la invención y que incluyan aquellas desviaciones de la presente memoria descriptiva contempladas por la práctica conocida o habitual en la técnica a la que pertenece la invención y tal y como se puedan aplicar a las características esenciales expuestas anteriormente en la presente.

EJEMPLO 10: Modificación de microorganismos para producir glicerolipidos C18:2 y C18 : 3 La síntesis de lípidos en algas y plantas empieza con la conversión de glucosa u otras fuentes de carbono en acetil-CoA mediante el complejo plastídico de la piruvato-deshidrogenasa . A continuación, la acetil-CoA-carboxilasa (ACCasa) , utilizando bicarbonato como sustrato, genera el compuesto de 3-C malonil-CoA. ]l^-cetoacil-ACP (proteina portadora de acilo) -sintasa III (KAS III) cataliza a continuación la primera reacción de condensación entre malonil-CoA y acetil-CoA para producir un compuesto de 4-C. Las adiciones de 2-C sucesivas a través de C16:0 son catalizadas por KAS I. La extensión de 2-C final hasta C18:0 es catalizada por KAS II. Las tioesterasas (TE) detienen la elongación de acil-ACP. La enzima soluble estearoil-ACP-desaturasa (SAD) presenta actividad frente a sustratos C18:0-ACP y forma el doble enlace en la posición ?9, con lo cual se obtiene oleato-ACP. El ácido graso C18:l resultante se libera de la ACP mediante la acción de una TE de especificidad amplia o con especificidad por oleatos.

Todos los ácidos grasos, una vez liberados de la ACP en el plástido, se transportan al RE, donde tiene lugar la biosintesis de lipidos (TAG) . En términos generales, existen dos vias para la biosintesis de lipidos en el RE de plantas superiores, sin embargo, no hay lugar a dudas de que las dos vias comparten sustratos en cierto grado. La via independiente de acil graso-CoA transfiere grupos acilo graso entre restos de fosfatidilcolina (P-colina) utilizando acilisofosfatidilcolina-aciltransferasas que pueden presentar unas especificidades muy selectivas por los sustratos, transfiriéndolos en última instancia a diacilglicerol (DAG) . La enzima diacilglicerol-aciltransferasa (DGAT) lleva a cabo la transferencia final de grupos acilo graso desde un sustrato de tipo acil-CoA hasta DAG, con lo cual se obtiene el triacilglicerol final. Por otro lado, la via dependiente de acil graso-CoA transfiere grupos acilo graso utilizando acil graso-CoA como sustratos en glicerol-3-fosfato, ácido lisofosfatídico (LPA) y DAG mediante las acciones de glicerol-fosfato-aciltransferasa (GPAT) , ácido lisofosfatidico-aciltransferasa (LPAAT) y DGAT, respectivamente .

Las enzimas útiles a la hora de modificar microorganismos para que sinteticen TAG que comprendan C18:2 y C18:3 incluyen ß-cetoacil-ACP-sintasas II (KAS II), estearoil-ACP-desaturasas (SAD), tioesterasas , incluidas las tioesterasas especificas para oleatos, desaturasas de ácidos grasos (FAD) y desaturasas de glicerolipidos tales como desaturasas de ácidos grasos ?-6, desaturasas de ácidos grasos ?-3 o desaturasas de oleatos ?-6. Estas diferentes enzimas se pueden sobreexpresar en microorganismos ya sea solas o combinadas para aumentar los ácidos grasos C18:2 o C18:3 o la producción de TAG. El aumento de la expresión de la actividad de una enzima KAS II fuerza la acumulación de carbono desde el palmitato (C16:0) hacia el estearato (C18:0) y más allá. En la Tabla 40 a continuación se muestran las secuencias de aminoácidos de varias enzimas KAS II candidatas Las secuencias de KAS II descritas pertenecen a especies de plantas superiores que producen específicamente niveles elevados de los ácidos grasos siguientes: oleico, linoleico o linolénico. Un experto será capaz de identificar otros genes para KAS IT, que incluyen, sin carácter limitante, Jatropha curcas (N.° de acceso a GenBank ABJ90469.2), Glycine max (N.° de acceso a GenBank AAW88762.1), Elaeis oleífera (N.° de acceso a GenBank ACQ41833.1), Arabidopsis thaliana (N.° de acceso a GenBank AAL91174), Vitis vinifera (N.° de acceso a GenBank CBI27767) y Gossypium hirsutum (N.° de acceso a GenBank ADK23940.1) .

Tabla 40. Ejemplos de enzimas KAS II.

La conversión de niveles más elevados de estearatos en ácido oleico (C18:l) para producir niveles elevados de los ácidos grasos linoleico y linolénico se consigue mediante la sobreexpresión microbiana de una o más enzimas de la via lipidica. Dos actividades enzimáticas adicionales que tienen utilidad a la hora de elevar los niveles de productos insaturados son las estearoil-ACP-desaturasas (SAD) y las tioesterasas especificas para oleatos. La conversión de niveles más elevados de estearatos (C18:0) en ácido oleico mediante la acción de una de estas enzimas o ambas se consigue en primer lugar por la formación de los ácidos grasos linoleico y linolénico.

En la Tabla 41 se hace referencia a las secuencias de aminoácidos de enzimas SAD ilustrativas útiles para la sobreexpresión con el fin de obtener niveles elevados de ácido oleico. Además, la SAD endógena de P. moriformis (SEQ ID NO: 180) también resulta eficaz a la hora de aumentar los niveles de C18:l. Las secuencias de SAD descritas pertenecen a especies de plantas superiores que producen específicamente niveles elevados de los ácidos grasos siguientes: oleico, linoleico o linolénico. Un experto será capaz de identificar otros genes para SAD.

Tabla 41. Ejemplos de enzimas SAD.

Las enzimas SAD presentan actividad frente a sustratos C18:0-ACP y forman el doble enlace carbono-carbono en la posición ?9, con lo cual se obtiene oleato-ACP. El ácido graso C18:l resultante se libera de la ACP mediante la acción de una TE de especificidad amplia o con especificidad por oleatos. En los ejemplos de la presente se ha demostrado que la sobreexpresión de la estearoil-ACP-desaturasa de Olea europaea (N.° de acceso: AAB67840.1; SEQ ID NO: 172) o la ACP-tioesterasa de Carthamus tinctorius (N.° de acceso: AAA33019.1; SEQ ID NO: 195) da como resultado una mayor acumulación de ácidos grasos C18:l. En la Tabla 42 se hace referencia a las secuencias de aminoácidos de tioesterasas de oleatos ilustrativas útiles para incrementar los ácidos grasos oleicos. Un experto será capaz de identificar otros genes para tioesterasas de oleatos.

Tabla 42. Ejemplos de tioesterasas para una mayor producción de ácidos grasos oleicos.

Las desaturasas de ácidos grasos son otras enzimas que tienen utilidad a la hora de aumentar la acumulación de los ácidos grasos linoleico y linolénico en microbios. En particular, dos actividades enzimáticas, FAD 2 y FAD 3, proporcionan una mayor acumulación de los ácidos grasos linoleico y linolénico en microbios. En la Tabla 43 a continuación se muestran las secuencias de aminoácidos de enzimas FAD 2 y FAD 3 ilustra ivas.

Tabla 43. Ejemplos de enzimas FAD 2 y FAD 3.

Además de las enzimas enumeradas en la Tabla 43, las secuencias de aminoácidos de enzimas FAD ?12 ilustrativas se enumeran en la Tabla 44. En la Tabla 45 se hace referencia a otras enzimas FAD ?12 adecuadas para la sobreexpresión en microorganismos. En la Tabla 46 se enumeran las secuencias de aminoácidos de FAD ?15 ilustrativas y otras enzimas útiles para incrementar el nivel de ácidos grasos insaturados y TAG. En la Tabla 47 se proporcionan enzimas desaturasas de glicerolipidos adicionales.

Tabla 44. Ejemplos de enzimas FAD ?12 para incrementar la producción del ácido graso linoleico.

Tabla 45. Enzimas FAD ?12 adicionales adecuadas para la sobreexpresión en microorganismos con el fin de incrementar el ácido linoleico o ácido linolénico.

Enzimas FAD ?12 N.° de acceso a GenBank Vernonia galamensis AAF0409 .1 Vernonia galamensis AAF04093.1 Wrightia tinctoria ADK47520.1 Olea europaea AAW63041.1 Vernicia fordii AAN87573 Arabidopsis thallana AAA32782.1 Camelina sativa ADU18247.1 Camelina sativa ADU18248.1 Camelina sativa ADU18249.1 Carthamus tinctorius ADK94440.1 Glycine max BAD89862.1 Glycine max DQ532371.1 Gossypium hirsutum AAL37484.1 Linum usitatissimum ACF49507.1 Linum usitatissimum ACF49508.1 Oenothera biennis ACB47482 Saccharomyces cerevisiae NP 011460.1 Zea mays ACG37433 Brassica rapa CAD30827 Tabla 46. Ejemplos de enzimas FAD ?15 para incrementar producción del ácido graso linolénico.

Tabla 47. Desaturasas de glicerolípidos adecuadas para la sobreexpresión en microorganismos con el fin de incrementar el ácido linolénico o incrementar los niveles de TAG insaturados.

Las secuencias de aminoácidos descritas en la presente se expresan en microbios utilizando los métodos descritos en la presente. Las secuencias codificantes se pueden optimizar para la expresión en el microorganismo. Por ejemplo, para la expresión en P. moriformis, se emplea el uso de codones preferido según se ha descrito en la Tabla 2 de la presente.

EJEMPLO 11 : Modificación de microorganismos para incrementar la producción de ácidos grasos insaturados linolénicos y glicerolipidos Según se ha descrito en el Ejemplo 10, las enzimas desaturasas ?15 catalizan la formación de un doble enlace en la posición 15 de moléculas de acilo graso o ácidos grasos C18:2 (linoleico) , de este modo se generan moléculas de acilo graso o ácidos grasos C18:3 (linolénico) . Ciertas especies de plantas superiores, que incluyen Brassica napus (Bn) , Camelina sativa (Cs) y Linum usitatissimum, las cuales producen aceites ricos en ácidos grasos insaturados linolénicos, son fuentes de genes que codifican desaturasas ?15 que se pueden expresar en microorganismos para alterar los perfiles de ácidos grasos. Este ejemplo describe el uso de polinucleótidos que codifican enzimas desaturasas ?15 para modificar microorganismos, donde el perfil de ácidos grasos del microorganismo transformado se ha enriquecido en ácido linolénico .

Un derivado mutado de forma clásica (para una mayor producción de aceite) de Protheca moriformis UTEX 1435, cepa A, se transformó de forma individual con cada uno de los constructos plasmidicos enumerados en la Tabla 49 de acuerdo con los métodos de transformación biolistica descritos en el Ejemplo 2. Cada constructo contenia secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' (SEQ ID NO: 82) y 3' (SEQ ID NO: 84) 84) (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica 6S para su integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae bajo el control del promotor de -tubulina/5' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' ÜTR de Chlorella vulgaris . Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159 y el gen de sacarosa-invertasa actuó como marcador para la selección. Todas las regiones codificantes de proteínas tenían los codones optimizados para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Prototheca moriformis UTEX 1435, de acuerdo con la Tabla 2. Las regiones codificantes de los genes de desaturasas de Brassica napus {Bn FAD3, N.° de acceso a GenBank AAA32994), Camelina sativa FAD-7 y Linum usitatissimum (Lu FAD3A y Lu FAD3B, N.os de acceso a GenBank ABA02172 y ABA02173) estaban bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) y la nitrato-reductasa 3'UTR de C. vulgaris . La secuencia del epítopo FLAG® se codificó en el bucle citoplasmático N-terminal de las secuencias de los genes de desaturasas recombinantes .

Tabla 49. Constructos plasmidicos utilizados para transformar la cepa A de Protheca moriformis (UTEX 1435) .

Constructo Elementos relevantes de la SEQ ID NO: plasmidico secuencia pSZ2124 6S: : C^tub : ScSuc2 : Cvnr : : PmAmt SEQ ID NO: 222 03: 3xFlag-BnFad3:Cvnr: : 6S pSZ2125 6S: :Cr tub:ScSuc2 : Cvnr: : PmAmt SEQ ID NO: 223 03:3xFlag-CsFad7-l:Cvnr: : 6S pSZ2126 6S: :Cr tub:ScSuc2 : Cvnr: : PmAmt SEQ ID NO: 224 03: 3xFlag-LuFad3A:Cvnr: : 6S pSZ2127 6S :: Cr tub: ScSuc2 : Cvnr :: PmAmt SEQ ID NO: 225 03: 3xFlag-LuFad3B:Cvnr: : 6S Cada uno de los constructos pSZ2124, pSZ2125, pSZ2126 y pSZ2127 se transformó individualmente en la cepa A. Los transformantes primarios se seleccionaron en placas de agar que contenían sacarosa como única fuente de carbono. Los transformantes individuales se purificaron por clones y se cultivaron a un pH de 7.0 en condiciones adecuadas para la producción de lípidos, similares a las descritas en el Ejemplo 1. Las muestras de lípidos se prepararon a partir de la biomasa seca de cada transformante. Se volvieron a suspender 20-40 mg de la biomasa seca de cada uno de ellos en 2 mL de H2S04 al 5% en MeOH y se añadieron 200 µ? de tolueno que contenia una cantidad adecuada de un patrón interno adecuado (C19:0). La mezcla se sonicó brevemente para dispersar la biomasa y a continuación se calentó a 70-75 °C durante 3.5 horas. Se añadieron 2 mL de heptano para extraer los ásteres metílicos de los ácidos grasos y a continuación se añadieron 2 mL de K2CO3 (ac) al 6% para neutralizar el ácido. La mezcla se agitó enérgicamente y se transfirió una porción de la fase superior a un vial que contenía Na2SC>4 (anhidro) para el análisis por cromatografía de gases utilizando métodos estándar de FAME GC/FID (cromatografía de gases para ésteres metílicos de ácidos grasos con detección de ionización a la llama) . Los perfiles de ácidos grasos se analizaron utilizando métodos estándar de detección por cromatografía de gases de ésteres metílicos de ácidos grasos con ionización a la llama (FAME GC/FID) . Los perfiles de ácidos grasos resultantes (expresados como % de área de los ácidos grasos totales) de un grupo de clones representativos obtenidos a partir de transformaciones de la cepa A de pSZ2124, pSZ2125, pSZ2126 y pSZ2127 se muestran en la Tabla 50. Para poder comparar, los perfiles de ácidos grasos de los lípidos obtenidos a partir de células de control de la cepa A no transformada se presentan de forma adicional en la Tabla 50.

Tabla 50. Perfiles de ácidos grasos insaturados C18:l, C18:2 y C18:3 de células de Prototheca moriformis modificadas para que expresen enzimas desaturasas exógenas de plantas superiores .

La cepa A de Prototheca moriformis (UTEX 1435) no transformada presenta un perfil de ácidos grasos que comprende menos de un 1% de ácidos grasos C18:3. Por el contrario, los perfiles de ácidos grasos de la cepa A que expresaba enzimas desaturasas de ácidos grasos de plantas superiores presentó una composición más elevada de ácidos grasos C18:3, con un incremento de un factor comprendido entre 2 y 17. Las cepas modificadas que expresaban FAD3A o FAD3B de Linum usitatissimum o el producto génico FAD3 de Brassica napus presentaron el incremento de nivel más elevado para C18:3 (Tabla 50). La proporción de 18:3 frente a productos insaturados C18 totales fue de aproximadamente un 1% en las cepas no transformadas y estuvo comprendida entre aproximadamente un 2% y un 17% en las cepas transformadas. La proporción de 18:2 frente a productos C18:0 totales fue de aproximadamente un 12-13% en las cepas no transformadas y estuvo comprendida entre aproximadamente un 1% y un 15% en las cepas transformadas, con los niveles más bajos en el transformante FAD3A. Estos datos demuestran la utilidad y eficacia de polinucleótidos que permiten la expresión exógena de enzimas desaturasas de ácidos grasos ?15 a la hora de alterar el perfil de ácidos grasos de microorganismos modificados y, en particular, a la hora de incrementar la concentración de ácidos grasos 18:3 en células microbianas.

EJEMPLO 12: Modificación de microorganismos para incrementar la producción de ácido esteárico y estearato mediante una estrategia de ARN horquillado Las enzimas estearoil-ACP-desaturasas (SAD) forman parte de la vía de síntesis de lipidos. Actúan introduciendo dobles enlaces en las cadenas de acilo graso. Por ejemplo, las enzimas SAD catalizan la síntesis de ácidos grasos C18:l a partir de ácidos grasos C18:0 (ácido esteárico). Según se ha mostrado en el Ejemplo 6, la interrupción de los alelos de SAD2 de Prototheca moriformís mediante interrupción génica dirigida dio como resultado incrementos medibles de los niveles de ácidos grasos C18:0 en los perfiles de ácidos grasos del microorganismo modificado. Este ejemplo describe el uso de polinucleótidos que codifican ARN horquillados que reducen la expresión de SAD2 para modificar microorganismos, donde el perfil de ácidos grasos del microorganismo transformado se ha enriquecido en ácidos grasos saturados C18:0.

Se diseñaron cuatro constructos, pSZ2139-pSZ2142 , enumerados en la Tabla 51, para atenuar la expresión del producto génico SAD2 de Prototheca moriformis. Cada constructo contenía una secuencia de ácido nucleico diferente que codificaba un ARN horquillado dirigido al transcripto de ARNm de SAD2 de Prototheca moriformis, con una longitud del tallo de un tamaño comprendido entre 180 y 240 pares de bases, así como también secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' (SEQ ID NO: 82) y 3' (SEQ ID NO: 84) 84) (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica 6S para su integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae bajo el control del promotor de -tubulina/5' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris . Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159 y actuó como un marcador de selección. La secuencia polinucleotídica que codificaba el ARN horquillado de SAD2 de cada constructo estaba bajo el control del promotor de ß-tubulina/5' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de C. vulgaris.

Tabla 51. Constructos plasmídicos utilizados transformar la cepa A de Protheca moriforráis (UTEX 1435) Constructo Elementos relevantes de la SEQ ID NO: plasmidico secuencia Horquilla A 6S: :C^tub:ScSuc2: Cvnr :Cr tu SEQ ID NO: 226 de SZ2139 b : PmSAD2-hpA : Cvnr : : 6S Horquilla B 6S: :Cr tub:ScSuc2: Cvnr :Cr tu SEQ ID NO: 227 de SZ2140 b : PmSAD2-hpB : Cvnr : : 6S Horquilla C 6S : : Cr tub: ScSuc2 : Cvnr :Crptu SEQ ID NO: 228 de SZ2141 : PmSAD2-hpC : Cvn : : 6S Horquilla D 6S: :Cr tub:ScSuc2: Cvnr :Crptu SEQ ID NO: 229 de SZ2142 : PmSAD2-hpD : Cvnr : : 6S Un derivado mutado de forma clásica (para una mayor producción de aceite) de Protheca moriformis UTEX 1435, cepa A, se transformó de forma individual con los constructos plasmidicos enumerados en la Tabla 51 de acuerdo con los métodos de transformación biolistica descritos en el Ejemplo 2. Los transformantes primarios se seleccionaron en placas de agar que contenían sacarosa como única fuente de carbono, se purificaron por clones y se cultivaron en condiciones estándar de producción de lípidos. Se determinaron los perfiles de ácidos grasos utilizando métodos de transesterificación directa según se ha descrito en el Ejemplo 11. Los perfiles de ácidos grasos resultantes (expresados como % de área de los ácidos grasos totales) de un grupo de clones representativos obtenidos a partir de transformaciones de la cepa A con pSZ2139, pSZ2140, pSZ2141 y pSZ2142 se muestran en la Tabla 52 a continuación. Para poder comparar, los perfiles de ácidos grasos de los lípidos obtenidos a partir de células de control de la cepa A no transformada se presentan de forma adicional en la Tabla 52.

Tabla 52. Perfiles de ácidos grasos C18:0, C18 : 1 y C18:2 de células de Prototheca moriformis modificadas para que expresen constructos de ARN horquillado que tienen como diana productos génicos/genes de estearoil-ACP-desaturasa.

Los datos presentados en la Tabla 52 muestran un claro efecto de la expresión de constructos de ARN horquillado de SAD2 sobre el perfil de ácidos grasos C18:0 y C18:1 del organismo huésped. Los perfiles de ácidos' grasos de los transformantes de la cepa A que comprendían constructos de ARN horquillado de SAD2 presentaron un incremento del porcentaje de ácidos grasos saturados C18:0 con una disminución concomitante de ácidos grasos insaturados C18:l. Los perfiles de ácidos grasos de la cepa no transformada comprenden aproximadamente un 3% de C18:0. Los perfiles de ácidos grasos de las cepas transformadas comprenden desde más de un 3% hasta casi un 27% de C18:0. La proporción de C18:0 frente a productos insaturados C18 totales fue de aproximadamente un 4 % en las cepas no transformadas y estuvo comprendida entre aproximadamente un 5% y un 69% en las cepas transformadas. Estos datos ilustran la expresión y el uso con éxito de constructos polinucleotidicos de ARN horquillado de SAD en Prototheca moriformis para alterar el porcentaje de ácidos grasos saturados en los microbios huésped modificados y, en particular, para incrementar la concentración de ácidos grasos C18:0 y reducir los ácidos grasos C18:l en células microbianas .

EJEMPLO 13 : Alteración de perfiles de ácidos grasos de microalgas mediante la sobreexpreslón de genes de ß-cetoacll-ACP-sintasa II.

La ß-cetoacil-ACP-sintasa II (KASII) cataliza la extensión de 2 carbonos de C16:0-ACP a C18:0-ACP durante la biosintesis de ácidos grasos. Se crearon constructos plasmidicos para evaluar si el perfil de ácidos grasos de una célula huésped podría verse afectado como resultado de la expresión de un gen KASII. Las fuentes de las secuencias de los genes KASII se seleccionaron de Protheca moriformis UTEX 1435 o de plantas superiores {Glycine max N.° de acceso a GenBank AAW88763, Helianthus annus N.° de acceso a GenBank ABI18155 y Ricinus communis N.° de acceso a GenBank AAA33872) Un derivado mutado de forma clásica (para una mayor producción de aceite) de Protheca moriformis UTEX 1435, cepa A, se transformó de forma individual con uno de los siguientes constructos plasmidicos de la Tabla 53 utilizando los métodos del Ejemplo 2. Cada constructo comprendía secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' (SEQ ID NO: 82) y 3' (SEQ ID NO: 84) 84) (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica 6S para su integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae bajo el control del promotor de -tubulina/5' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris . Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 29 y actuó como un marcador de selección. Para cada constructo, la región codificante de KASII estaba bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 37) y la nitrato-reductasa 3'UTR de C. vulgaris. El péptido de tránsito nativo de cada enzima KASII se reemplazó con el péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de Chlorella protothecoides (SEQ ID NO: 54). Todas las regiones codificantes de proteínas tenían los codones optimizados para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Prototheca moriformis UTEX 1435, de acuerdo con la Tabla 2.

Tabla 53. Constructos plasmídicos utilizados para transformar la cepa A de Protheca moriformis (UTEX 1435) .

Constructo Fuente de Elementos SEQ ID. NO: plasmídico la enzima de la secuencia KASII SZ1747 Glycine 6S: : ß- SEQ ID NO: max (Glm) tub: suc2 : nr : :Amt03 : SI 230 06SAD:GlmKASII:nr: : 6S SZ1750 Helianthus 6S:: - SEQ ID NO: annuus tub: suc2 :nr : :Amt03: SI 231 (Ha) 06SAD:HaKASII:nr: : 6S SZ1754 Ricinus 6S: : ß- SEQ ID NO: communis tub: suc2 :nr: :Amt03: SI 232 (Re) 06SAD:RcKASII:nr: : 6S SZ2041 Protheca 6S: : ß- SEQ ID NO: moriformis tub: suc2 : nr : :Amt03:Sl 233 (P ) 06SAD:PmKASII:nr: : 6S Los sitios de restricción relevantes en el constructo 6S : : ß-Tub: suc2 : nr : : Amt03 : S106SAD: PmKASII :nr : : 6S se indican en minúscula, negrita y subrayados y son 5' -3' BspQ 1, Kpn I, Xba I, Mfe I, BamH I, EcoR I, Spe I, Ase I, Cía I, Sac I, BspQ I, respectivamente. Los sitios BspQI delimitan los extremos 5' y 3' del ADN transformante. Las secuencias en negrita y minúscula representan ADN genómico de la cepa A que permite la integración dirigida en el locus 6S mediante recombinación homologa. Siguiendo en la dirección de 5' a 3' , el promotor de ß-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión del gen de sacarosa-invertasa de la levadura (que confiere la capacidad a la cepa A para metabolizar sacarosa) se indica con un recuadro. El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA para la invertasa se indican en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que la región codificante se indica en minúscula y cursiva. La nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris se indica con texto en minúscula y subrayado, y viene seguida por un promotor amt03 endógeno de P. moriformis, que se indica con texto en cursiva y encuadrado. El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA de PmKASII se indican en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que el resto del gen se indica en neqrita y cursiva. El péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de Chlorella protothecoides S106 está situado entre el codón de iniciación ATG y el sitio Ase I. La nitrato-reductasa 3' UTR de C. vulgaris se indica de nuevo con texto en minúscula y subrayado y viene seguida por la región genómica 6S de la cepa A, que se indica con texto en negrita y minúscula. La secuencia de nucleótidos relevantes del constructo 63::ß-tub : suc2 : nr: :Amt03 : S106SAD: PmKASII : nr :: 6S se proporciona en la Lista de secuencias como SEQ ID. NO: 234. La secuencia con codones optimizados de PmKASII que comprende un péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de Chlorella protothecoides S106 se proporciona en la Lista de secuencias como SEQ ID. NO: 235. La SEQ ID NO: 236 proporciona la traducción de la proteina de SEQ ID NO. 235. g^tc tcgccgccgccactcctgctcgagcgcgcccgcgcgtgcgccgccagcgccttggc cttttcgccgcgctcgtgcgcgtcgctgatgtccatcaccaggtccatgaggtctgccttg cgccggctgagccactgcttcgtccgggcggccaagaggagcatgagggaggactcc ggt ccagggtccfcgacgtggtcgcggctctgggagcgggccagcatcatctggcfcctgccgcac cgaggccgcctccaactggtcctccagcagccgcagtcgccgccgaccctggcagaggaag acaggtgaggggggtatgaattgtacagaacaaccacgagccttgtctaggcagaatccct accagtcatggctttacctggatgacggcctgcgaacagctgtccagcgaccctcgctgcc gccgcttctcccgcacgcttctttccagcaccgtgatggcgcgagccagcgccgcacgctg gcgctgcgcttcgccgatctgaggacagtcggggaactctgatcagtctaaacccccttgc gcgttagtgttgccatcctttgcagaccggtgagagccgacttgttgtgcgccacccccca caccacctcctcccagaccaattctgtcacctttttggcgaaggcatcggcctcggcctgc agagaggacagcagtgcccagccgctgggggttggcggatgcacgctcag_g_t. tgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgca |tgcaacaccgatgatgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgat| Igccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgcaaagacattatagcgl agctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagq ttgtgatcgcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaa| [cjtctagaatatcaATGctgctgcaggccttcctgttcctqctqgccggcttcgccgccaag atcagcgcctccatgacgaacgagacgtccgaccgccccctggtgcacttcacccccaaca agggctggatgaacgaccccaacggcctgtggtacgacgagaaggacgccaagtggcacct gtacttccagtacaacccgaacgacaccgtctgggggacgcccttgttctggggccacgcc acgtccgacgacctgaccaactgggaggaccagcccatcgccatcgccccgaagcgcaacg actccggcgccttctccggctcca tggtggtggactacaacaacacctccggcttcttcaa cgacaccatcgacccgcgccagcgctgcgtggccatctggacctacaacaccccggagtcc gaggagcagtacatctcctacagcctggacggcggctacaccttcaccgagtaccagaaga accccgtgctggccgccaactccacccagttccgcgacccgaaggtcttctggtacgagcc ctcccagaagtggatcatgaccgcggccaagtcccaggactacaagatcgagatctactcc tccgacgacctgaagtcctggaagctggagtccgcgttcgccaacgagggcttcctcggct accagtacgagtgccccggcctgatcgaggtccccaccgagcaggaccccagcaagtccta ctgggtgatgttcatctcca tcaaccccggcgccccggccggcggctccttcaaccagtac ttcgtcggcagcttcaacggcacccacttcgaggccttcgacaaccagtcccgcgtggtgg acttcggcaaggactactacgccctgcagaccttcttcaacaccgacccgacctacgggag cgccctgggcatcgcgtgggcctccaactgggagtactccgccttcgtgcccaccaacccc tggcgctcctccatgtccctcgtgcgcaagttctccctcaacaccgagtaccaggccaacc cggagacggagctgatcaacctgaaggccgagccgatcctgaacatcagcaacgccggccc ctggagccggt tcgccaceaacaccacgttgacgaaggccaaca gctacaacgtcgac tg tccaacagcaccggcaccctggagttcgagctggtgtacgccgtcaacaccacccagacga tctccaagtccgtgttcgcggacctctccctctggttcaagggcctggaggaccccgagga gtacctccgcatgggcttcgaggtgtccgcgtcctccttcttcctggaccgcgggaacagc aaggtgaagttcgtgaaggagaacccctacttcaccaaccgca tgagcgtgaacaaccagc ccttcaagagcgagaacgacctgtcctactacaaggtgtacggcttgctggaccagaacat cctggagctgtacttcaacgacggcgacgtcgtgtccaccaacacctacttca tgaccacc gggaacgccctgggctccgtgaaca tgacgacgggggtggacaacctgttctacatcgaca agttccaggtgcgcgaggtcaagrGAcaattggcagcagcagctcggatagtatcgacaca ctctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaat atccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgc gagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttc atatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctc ctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggt actgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacac aaatggaggatcccgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcctctg tcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtc cattagcgaagcgtccggttcacacacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgat cqgtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatcgaattqggccgaca cgcgtcaaaggtgctggtcgtgtatgccctggccggcaggtcgttgctgctgctggttagt] gattccgcaaccctgattttggcgtcttattttggcgtggcaaacgctggcgcccgcgagq cgggccggcggcgatgcggtgccccacggctgccggaatccaagggaggcaagagcgcccg ggtcagttgaagggctttacgcgcaaggtacagccgctcctgcaaggctgcgtggtggaat\ tggacgtgcaggtcctgctgaagttcctccaccgcctcaceagcggacaaagcaccggtgt ttcatcaaaaacgcctgagacacttgcccaggattgaaactccctgaagggaccaccaggg\ gccctgagttgttccttccccccgtggcgagctgccagccaggctgtacctgtgatcgagg ctggcgggaaaa taggcttcgtgtgctcaggtcatgggaggtgcaggacagctcatgaaaq gccaacaatcgcacaattca tgtcaagctaatcagctatttcctcttcacgagctgtaatt gtcccaaaattctggtctaccgggggtgatccttcgtgtacgggcccttccctcaacccta\ ggta tgcgcgca tgcggtcgccgcgcaactcgcgcgagggccgagggtttgggacgggccg tcccgaaatgcagttgcacccggatgcgtggcaccttttttgcga taatttatgcaa tgga\ ctgctctgcaaaattctggctctgtcgccaaccctaggatcagcggcgtaggatttcgtaa\ tcattcgtcctgatggggagctaccgactaccctaatatcagcccgactgcctgacgccag\ cgtccacttttgtgcacacattccattcgtgcccaagacatttcattgtggtgcgaagcgt ccccagttacgctcacctgtttcccgacctccttactgttctgtcgacagagcgggcccaq aggccggtcgcagcqactaqtATGgccaccgcatccactttctcggcgttcaatgcccgct gcggcgacctgcgtcgctcggcgggctccgggccccggcgcccagcgaggcccctccccgt gcgcgqqcqcgccgccgccgccgccgacgccaaccccgcccgccccgagcgccgcgtggtg at.caccggccagggcgtggt.gacct.ccctgggccagaccatcgagcagtt.ctact.cct.ccc tgctggagggcgtgtccggcatctcccagatccagaagttcgacaccaccggctacaccac caccatcgccggcgagatcaagtccctgcagctggacccctacgtgcccaagcgctgggcc aagcgcgtggacgacgtgatcaagtacgtgtacatcgccggcaagcaggccctggagtccg ccggcctgcccatcgaggccgccggcctggccggcgccggcctggaccccgccctgtgcgg cgtgctgatcggcaccgccatggccggcatgacctccttcgccgccggcgtggaggccctg acccgcggcggcgtgcgcaagatgaaccccttctgcatccccttctccatctccaacatgg gcggcgccatgctggccatggacatcggcttcatgggccccaactactccatctccaccgc ctgcgccaccggcaactactgcatcctgggcgccgccgaccacatccgccgcggcgacgcc aacgtgatgctggccggcggcgccgacgccgccatcatcccctccggcatcggcgg tca tcgcctgcaaggccctgtccaagcgcaacgacgagcccgagcgcgcctcccgcccctggga cgccgaccgcgacggcttcgtgatgggcgagggcgccggcgtgctggtgctggaggagctg gagcacgccaagcgccgcggcgccaccatcctggccgagctggtgggcggcgccgccacct ccgacgcccaccacatgaccgagcccgacccccagggccgcggcgtgcgcctgtgcctgga gcgcgccctggagcgcgcccgcctggcccccgagcgcgtgggctacgtgaacgcccacggc acctccacccccgccggcgacgtggccgagtaccgcgccatccgcgccgtgatcccccagg actccctgcgcatcaactccaccaagtccatgatcggccacctgctgggcggcgccggcgc cgtggaggccgtggccgccatccaggccctgcgcaccggctggctgcaccccaacctgaac ctggagaaccccgcccccggcgtggaccccgtggtgctggtgggcccccgcaaggagcgcg ccgaggacctggacgtggtgctgtccaactccttcggcttcggcggccacaactcctgcgt gatcttccgcaagtacgacgagatggactacaaggaccacgacggcgactacaaggaccac gacatcgactacaaggacgacgacgacaagTGAatcgataqatctcttaaqqcaqcaqcaq ctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacactt gctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatct tgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccag catccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctg ctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggct ccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacggga agtagtgggatgggaacacaaatggaaagcttaattaagagctcttgttttccagaaggag ttgctccttgagcctttcattctcagcctcgataacctccaaagccgctctaattgtggag ggggttcgaatttaaaagcttggaatgttggttcgtgcgtctggaacaagcccagacttgt tgctcactgggaaaaggaccatcagctccaaaaaacttgccgctcaaaccgcgtacctctg ctttcgcgcaatctgccctgttgaaatcgccaccacattcatattgtgacgcttgagcagt ctgtaattgcctcagaatgtggaatcatctgccccctgtgcgagcccatgccaggcatgtc gcgggcgaggacacccgccactcgtacagcagaccattatgctacctcacaatagttcata acagtgaccatatttctcgaagctccccaacgagcacctccatgctctgagtggccacccc ccggccctggtgcttgcggagggcaggtcaaccggcatggggctaccgaaatccccgaccg gatcccaccacccccgcgatgggaagaatctctccccgggatgtgggcccaccaccagcac aacctgctggcccaggcgagcgtcaaaccataccacacaaatatccttggcatcggccctg aattccttctgccgctctgctacccggtgcttctgtccgaagcaggggttgctagggatcg ctccgagtccgcaaacccttgtcgcgtggcggggcttgttcgagcttgaagagc Tras la transformación individual de cada constructo plasmidico en la cepa A, se seleccionaron los clones positivos en placas de agar que comprendían sacarosa como única fuente de carbono. Como en los ejemplos anteriores, los transformantes primarios se purificaron por clones y se cultivaron en condiciones estándar para la producción de lípidos a un pH de 7 y se prepararon muestras lipídicas a partir de la biomasa seca de cada transformante. Se determinaron los perfiles de ácidos grasos utilizando métodos de transesterificación directa según se ha descrito en el Ejemplo 11. Los perfiles de ácidos grasos resultantes (expresados como % de área de los ácidos grasos totales) de un grupo de clones representativos procedentes de las transformaciones de los perfiles de ácidos grasos de la cepa A (expresados como % de área) de varios transformantes positivos en comparación con los de los controles de la cepa A no transformados se resumen, para cada constructo plasmidico, en la Tabla 54 a continuación.

Tabla 54. Perfiles de ácidos grasos de células de Prototheca moriformis modificadas para sobreexpresar genes KAS II.

Se observó una clara disminución de las longitudes de cadena C16:0 con un incremento concomitante de los ácidos grasos de longitud C18:l al sobreexpresar el gen KAS II de Prototheca moriformis (UTEX 1435) con codones optimizados adicionalmente utilizando la frecuencia de codones indicada en la Tabla 2 empleando pSZ2041. Se observaron cambios de los perfiles de ácidos grasos similares con la transformación de constructos gue expresaban el gen KAS II de Prototheca moriformis (UTEX 1435) dirigido por un promotor de ß-tubulina Estos resultados muestran que la sobreexpresión exógena de un gen de la biosintesis de lipidos de Prototheca con codones optimizados puede alterar el perfil de ácidos grasos de microalgas modificadas genéticamente. En particular, la sobreexpresión de un gen KASII puede incrementar el porcentaje de ácidos grasos C18 desde aproximadamente un 68% en las células no transformadas hasta aproximadamente un 84%.

EJEMPLO 14 : Alteración de los niveles de ácidos grasos de cadena media en Prototheca modificada mediante la desactivación dirigida de un alelo de KASI La ß-cetoacil-ACP-sintasa I (KASI) cataliza extensiones de 2 carbonos de moléculas de (acil graso C4:0, C6:0, C8:0, C10:0, C12:0 y C14:0)-ACP durante la biosintesis de ácidos grasos. En este ejemplo, se creó un constructo plasmidico de desactivación, pSZ2014, para evaluar el efecto sobre el perfil de ácidos grasos de una célula huésped de la interrupción dirigida de un locus genético de KASI.

Un derivado mutado de forma clásica (para una mayor producción de aceite) de Protheca moriformis UTEX 1435, cepa A, se transformó con el constructo pSZ2014 utilizando los métodos de transformación biolistica descritos en el Ejemplo 2. pSZ2014 comprendía el cásete de expresión de la invertasa suc2 de S. cerevisiae bajo el control del promotor de ß-tubulina de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris, flanqueados en ambos lados por regiones de homología específicas para el gen KASI para dirigir el constructo con el fin de integrarlo en el locus KASI del genoma de Prototheca morifiormis. Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159 y actuó como un marcador de selección. Las secuencias relevantes para las regiones de direccionamiento hacia el locus KASI para la integración en el genoma nuclear se muestran a continuación y se enumeran en la SEQ ID NO: 238 y SEQ ID NO: 239. Los sitios de restricción relevantes en pSZ2014, indicados en minúscula, negrita y subrayados, son 5' -3' BspQ 1, Kpn I, Ascl, Xho I, Sac I, BspQ I, respectivamente, los cuales se muestran en la secuencia a continuación. Los sitios BspQI delimitan los extremos 5' y 3' del ADN transformante. Las secuencias en negrita y minúscula representan ADN genómico de la cepa A que permite la integración dirigida en el locus KASI mediante recombinación homologa. Siguiendo en la dirección de 5' a 3' , el promotor de ß-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión del gen de sacarosa-invertasa de la levadura con codones optimizados (que confiere la capacidad a la cepa A para metabolizar sacarosa) se indica con un recuadro. El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA para la invertasa de suc2 se indican en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que la región codificante se indica en minúscula y cursiva. La nitrato-reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris se indica con texto en minúscula y subrayado. La secuencia transformante de pSZ2014 se indica a continuación y se enumera como SEQ ID NO: 237. gctcttcgctcaccgcgtgaattgctgtcccaaacgtaagcatcatcgtggctcggtcacg cgatcctggatccggggatcctagaccgctggtggagagcgctgccgtcggattggtggca agtaagattgcgcaggttggcgaagggagagaccaaaaccggaggctggaagcgggcacaa catcgtattattgcgtatagtagagcagtggcagtcgcatttcgaggtccgcaacggatct cgcaagctcgctacgctcacagtaggagaaaggggaccactgcccctgccagaatggtcgc gaccctctccctcgccggccccgcctgcaacacgcagtgcgtatccggcaagcgggctgtc gccttcaaccgcccccatgttggcgtccgggctcgatcaggtgcgctgaggggggtttggt gtgoccgcgcotctgggcccgtgtcggccgtgcggacgtggggocctgggcagtggatoag cagggtttgcgtgcaaatgcctataccggcgattgaatagcgatgaacgggatacggttgc gctcactccatgcccatgcgaccccgtttctgtccgccagccgtggtcgcccgggctgcga agcgggaccccacccagcgcattgtgatcaccggaatgggcgtggggtacqc111cttgcgj ctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgca| ¡acaccgatgatgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgl [ctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgcaaagacattatagcgagct [accaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgt |gatcgcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaac|ggc gcqccATGctgctgcaggccttcctgttcctgctggccgqcttcqccqccaaqatcaqcqc ctcca tgacgaacgagacgtccgaccgccccctggtgcacttcacccccaacaagggctgg atgaacgaccccaacggcctgtggtacgacgagaaggacgccaagtggcacctgtacttcc agtacaacccgaacgacaccgtctgggggacgcccttgttctggggccacgccacgtccga cgacctgaccaactgggaggaccagcccatcgcca tcgccccgaagcgcaacgactccggc gccttctccggctccatggtggtggactacaacaacacctccggcttcttcaacgacacca tcgacccgcgccagcgctgcgtggccatctggacctacaacaccccggagtccgaggagca gtacatctcctacagcctggacggcggctacaccttcaccgagtaccagaagaaccccgtg ctggccgccaactccacccagttccgcgacccgaaggtcttctggtacgagccctcccaga agtggatca tgaccgcggccaagtcccaggactacaagatcgagatctactcctccgacga cctgaagtcctggaagctggagtccgcgttcgccaacgagggcttcctcggctaccagtac gagtgccccggcctgatcgaggtccccaccgagcaggaccccagcaagtcctactgggtga tgttcatctccatcaaccccggcgccccggccggcggctccttcaaccagtacttcgtcgg cagcttcaacggcacccacttcga gccttcgacaacca tcccgcgtggtggacttcggc aaggactactacgccctgcagaccttcttcaacaccgacccgacctacgggagcgccctgg gcatcgcgtgggcctccaactgggagtactccgccttcgtgcccaccaacccctggcgctc ctccatgtccctcgtgcgcaagttctccctcaacaccgagtaccaggccaacccggagacg gagctgatcaacctgaaggccgagccgatcctgaacatcagcaacgccggcccctggagcc ggttcgccaccaacaccacgttgacgaaggccaacagctacaacgtcgacctgtccaacag caccggcaccctggagttcgagctggtgtacgccgtcaacaccacccagacgatctccaag tccgtgttcgcggacctctccctctggttcaagggcctggaggaccccgaggagtacctcc gca tgggcttcgaggtgtccgcgtcctccttcttcctggaccgcgggaacagcaaggtgaa gttcgtgaaggagaacccctacttcaccaaccgcatgagcgtgaacaaccagcccttcaag agcgagaacgacctgtcctactacaaggtgtacggcttgctggaccagaacatcctggagc tgtacttcaacgacggcgacgtcgtgtccaccaacacctacttcatgaccaccgggaacgc cctgggctccgtgaacatgacgacgggggtggacaacctgttctacatcgacaagttccag gtgcgcgaggtcaagTGAcaattggcagcagcagctcggatagtatcgacacactctggac gctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgc cgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttqcgagttgct agctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgct tgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcct gctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaac ctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggag qatcqtagagctccacctgcatccgcctggcgctcgaggacgccggcgtctcgcccgacga ggtcaactacgtcaacgcgcacgccacctccaccctggtgggcgacaaggccgaggtgcgc gcggtcaagtcggtctttggcgacatgaagggcatcaagatgaacgccaccaagtccatga tcgggcactgcctgggcgccgccggcggcatggaggccgtcgccacgctcatggccatccg caccggctgggtgcaccccaccatcaaccacgacaaccccatcgccgaggtcgacggcctg gacgtcgtcgccaacgccaaggcccagcacaaaatcaacgtcgccatctccaactccttcg gcttcggcgggcacaactccgtcgtcgcctttgcgcccttccgcgagtaggcggagcgagc gcgcttggctgaggagggaggcggggtgcgagccctttggctgcgcgcgatactctcceeg cacgagcagactccacgcgcctgaatctacttgtcaacgagcaaccgtgtgttttgtccgt ggccattcttattatttctccgactgtggccgtactotgtttggctgtgcaagcaccgaag age Tras la transformación del constructo plasmidico pSZ2014 en la cepa A, se seleccionaron los clones positivos en placas con sacarosa como única fuente de carbono. Los transformantes primarios se purificaron por clones y se cultivaron en condiciones estándar para la producción de lipidos. Las muestras de lípidos se prepararon a partir de la biomasa seca de cada transformante. Se determinaron los perfiles de ácidos grasos utilizando métodos de transesterificación directa según se ha descrito en el Ejemplo 11. Los perfiles de ácidos grasos (expresados como % de área de los ácidos grasos totales) de varios transformantes positivos, comparados con los de los controles de la cepa A no transformados, se resumen en la Tabla 55 a continuación.

Tabla 55. Perfiles de ácidos grasos de células de Prototheca moriformis modificadas que comprenden un marcador seleccionable para interrumpir un alelo de KASI endógeno.

Según se muestra en la Tabla 55 anterior, la interrupción dirigida de un alelo de KASI ejerció un efecto sobre los perfiles de ácidos grasos de microorganismos transformados. Los perfiles de ácidos grasos de la cepa A que comprendía el vector de transformación pSZ2014 presentaron una mayor composición de ácidos grasos C14:0 y C16:0 con una reducción concomitante de ácidos grasos C18:l. En todos los transformantes, se redujeron los ácidos grasos C18:0. En algunas transformaciones, la interrupción del alelo de KASI proporcionó además un perfil de ácidos grasos que comprendía porcentajes menores de ácidos grasos C18:2 respecto al perfil de ácidos grasos del organismo de la cepa A no transformado.

Por lo tanto, se ha incrementado el porcentaje de ácidos grasos C14 totales desde aproximadamente un 35% hasta un 400%, y el porcentaje de ácidos grasos C16 desde un 30 hasta un 50% mediante la interrupción de un KASI endógeno.

Estos datos demuestran la utilidad de la interrupción génica dirigida de un alelo de KASI endógeno para alterar el perfil de ácidos grasos de un microbio huésped.

EJEMPLO 15: Combinación de estrategias de modificación genética para alterar los perfiles de ácidos grasos en Prototheca En este ejemplo, se muestra la combinación de modificaciones genéticas para desactivar un alelo de KASII y sobreexpresar de forma concomitante una tioesterasa exógena que presenta una preferencia por la hidrólisis de ácidos grasos de cadena media, en un microorganismo para alterar el perfil de ácidos grasos del organismo huésped.

Una cepa mutada de forma clásica (para una mayor producción de aceite) de Prototheca moriformis (UTEX 1435) , cepa C, se transformó inicialmente con el constructo plasmidico pSZ1283 de acuerdo con los métodos de transformación biolistica descritos en el Ejemplo 2. pSZ1283 (SEQ ID NO: 258), descrito previamente en las Solicitudes de PCT N.os PCT/US2011/038463 y PCT/US2011/038463, comprende la secuencia codificante de la tioesterasa (CwTE2) de FATB2 de Cuphea wrightii, secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' (SEQ ID NO: 82) y 3' (SEQ ID NO: 84) 84) (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica 6S para su integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae bajo el control del promotor de ß-tubulina/S ' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris . Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159 y actuó como un marcador de selección. La secuencia codificante de CwTE2 estaba bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) y la nitrato-reductasa 3' UTR de C. vulgaris (SEQ ID NO: 32). Las regiones codificantes de proteínas de CwTE2 y suc2 tenían los codones optimizados para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Prototheca moriformis UTEX 1435, de acuerdo con la Tabla 2.

Tras la transformación de pSZ1283 en la cepa C, se seleccionaron los clones positivos en placas de agar con sacarosa como única fuente de carbono. A continuación, los transformantes primarios se purificaron por clones y se seleccionó un único transformante, cepa B, para una modificación genética adicional. Esta cepa modificada genéticamente se transformó con un constructo plasmídico, pSZ2110 (SEQ ID NO: 240), para interrumpir el locus del alelo 1 de KASII. pSZ2110, que se denota como KASII x5 : : CrbTub:NeoR:nr : : KASII- '3, comprendía un cásete de expresión de resistencia a neomicina (NeoR) , que confiere resistencia a G418, bajo el control del promotor de ß-tubulina de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris, flanqueado en cada lado por regiones de homología especificas del gen KASII para dirigir el constructo con el fin de que se integre en el locus KASII del genoma de Prototheca morifiormis. Los sitios de restricción relevantes en el constructo pSZ2110 de 5' a 3' son BspQ 1, Kpnl, Xbal, Mfel, BamHI, EcoRI , Spel , Xhol, Sac I y BspQI , los cuales se indican en un formato en minúscula, negrita y subrayado. Los sitios BspQI delimitan los extremos 5' y 3' del ADN transformante. Las secuencias en negrita y minúscula en los extremos 5' y 3' del constructo transformante representan el ADN genómico de UTEX 1435 que dirige la integración en el locus del alelo 1 de KASII mediante recombinación homologa. La ß-tubulina de C. reinhardtii se indica en minúscula y con un recuadro. El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA para NeoR se indican en mayúscula y cursiva, mientras que la región codificante se indica en minúscula y cursiva.

La 3' UTR se indica con el texto en minúscula y subrayado . gctcttcgctggcctgttgccggacgatccgtgtcgtcgagactgcattttgttttgggtg tggggctggggtactggatggcttgagggcatgactttttctgatggagaagattgcaatg agatcatttgggtcgtctatttgtttgctgtgcaagagggtttactggtatctggcaccag cttttggcccgtgcccgtttgatggacgcgtgacaggcaggcgtcctggaaagcacagaca ccgtacgtacgaccttgacctcccccccttctccacacggcaggtgcgaggctgcccacgg cgtcgaggcgggcggtgcgccgggcatggtcccgcatcgcgcgcgcggcggccgcggccga cgcaaaccccgcccgccctgagcgccgcgtggtcatcacgggccagggcgtggtgaccagc ctgggccagacgatcgagcagttttacagcagcctgctggagggcgtgagcggcatctcgc agatacagaagttcgacaccacgggctacacgacgacgatcgcgggcgagatcaagtcgct gcagctggacccgtacgtgcccaagcgctgggcgaagcgcgtggacgacgtgataaagtac gtctaca cgcgggcaagcaggcgctggagagcgccggcctgccgatcgaggcggcggggc tggcgggcgcggggctggacccggcgctgtgcggcgtgctcatcggcaccgccatggcggg catgacgtctttcgcggcgggcgtggaggcgctgacgcgcggtacqc11tcttgcgctatg| |acacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggGttcccggcgctgcatgcaacacc| gatgatgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctcca| |gggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgcaaagacattatagcgagctaccaa| agccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatcgl cactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaaqtctagaat atcaATGatcgagcaggacggcctccacgccggctcccccgccgcctgggtggagcgcctg ttcggctacgactgggcccagcagaccatcggctgctccgacgccgccgtgttccgcctgt ccgcccagggccgccccgtgctgttcgtgaagaccgacctgtccggcgccctgaacgagct gcaggacgaggccgcccgcctgtcctggctggccaccaccggcgtgccctgcgccgccgtg ctggacgtggtgaccgaggccggccgcgactggctgctgctgggcgaggtgcccggccagg acctgctgtcctcccacctggcccccgccgagaaggtgtccatcatggccgacgccatgcg ccgcctgcacaccctggaccccgccacctgccccttcgaccaccaggccaagcaccgcatc gagcgcgcccgcacccgca tggaggccggcctggtggaccaggacgacctggacgaggagc accagggcctggcccccgccgagctgttcgcccgcctgaaggcccgca tgcccgacggcga ggacctggtggtgacccacggcgacgcctgcctgcccaacatcatggtggagaacggccgc ttctccggcttcatcgactgcggccgcctgggcgtggccgaccgctaccaggacatcgccc tggccacccgcgacatcgccgaggagctgggcggcgagtgggccgaccgcttcctggtgct gtacggcatcgccgcccccgactcccagcgcatcgccttctaccgcctgctggacgagttc ttcrGAcaattggcagcagcagctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtg atqgactqttgccqccacacttqctgccttgacctqtgaatatccctqccqcttttatcaa acagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgc tatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaacc gcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccc tcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagc actgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaggatccactagtt ctagagcggccgccaccgcggtgg_ag_ctcggcggcgtgcgcaagatgaacccc111tgcat ccccttc ccatctccaacatgggcggcgcgatgctggcgatggacatcggcttcatgggc cccaactactccatctccacggcctgcgcgacgggcaactactgcatcctgggcgcggcgg accacafcccggcgcggcgacgcaaacgfcgatgctggccggcggcgcggacgcggccafccat cccctcgggcatcggcggcttcatcgcgtgcaaggcgctgagcaagcgcaacgacgagccc gagcgcgcgagccggccctgggacgccgaccgcgacggcttcgtcatgggcgagggcgccg gcgtgctggtgctggaggagctggagcacgccaagcgccgcggcgcgaccattttggctga attagttggcggcgcggccacctcggacgcgcaccacatgacegagcccgacccgcagggc cgcggcgtgcgcctctgcctcgagcgcgcgctcgagcgcgcgcgcctcgcgcccgagcgcg tcggctacgtcaacgcgcacggcaccagcacgcccgcgggcgacgtggccgagtaccgcgc catccgcgccgtcatcccgcaggactcactacgcatcaactccacaaagtccatgatcggg cacctgctcggcggcgccggcgcggtcgaggccgtggccgccatccaggccctgcgcaccg gctggctccaccccaacttgaacctcgagaaccccgcgcctggcgtcgaccccgtcgtgct cgtgggctcttcc Tras la transformación de la cepa B con pSZ2110, los clones positivos se seleccionaron en placas de agar selectivas que contenían G418. A continuación, los transformantes primarios se purificaron por clones y se cultivaron en sacarosa como única fuente de carbono en condiciones estándar para la producción de lipidos a un pH de 5.0 y a un pH de 7.0. Las muestras de lipidos se prepararon a partir de la biomasa seca de cada transformante según se ha descrito en el Ejemplo 11. En la Tabla 56 a continuación se presentan los perfiles de ácidos grasos (expresados como % de área de los ácidos grasos totales) de 5 transformantes positivos (T1-T5) , los perfiles de la cepa B cultivada en sacarosa como única fuente de carbono (Ul) y los perfiles de UTEX 1435 no transformada (Ul) cultivada en glucosa como única fuente de carbono.

Tabla 56. Perfiles de ácidos grasos de Prototheca moriformis (UTEX 1435) modificada de forma múltiple para suprimir un producto génico ASII endógeno y para expresar una tioesterasa de Cuphea wrightii .

Cepa * No evaluado Según se muestra en la Tabla 56, el efecto de la expresión de CVTE2 en la cepa B de Prototheca moriformis (UTEX 1435) consiste en un cambio pronunciado de los perfiles de ácidos grasos de los microorganismos transformados. Los perfiles de ácidos grasos de la cepa B que expresaba CwTE2 y que se cultivó a un pH de 7.0, para fomentar la expresión de CwTE2 del promotor Amt03, presentaron una mayor composición de ácidos grasos C10:0, C12 : 0 y C14:0 con una reducción concomitante en la composición de ácidos grasos C16:0 y C18:l respecto al perfil de ácidos grasos de UTEX 1435 no transformada. La modificación posterior de la cepa B para interrumpir un alelo de KASII, que codifica una enzima que cataliza la extensión de 2 carbonos desde ácidos grasos C16:0 hasta C18:0, dio como resultado un incremento de los ácidos grasos C16:0 con una reducción concomitante de los ácidos grasos C18:l presentes en el perfil lipidico de la cepa modificada de nuevo cuando se cultivó a un pH de 5.0. La propagación de los transformantes a un pH de 5.0 ilustra el efecto de la desactivación del alelo de KASII, además de la contribución de la tioesterasa, sobre los perfiles de ácidos grasos alterados, ya que el pH de este medio de cultivo no es óptimo para la actividad del promotor Amt03. Tras la producción de lipidos a un pH de 7.0, con lo cual se expresa CVTE2, los transformantes de pSZ2011 presentaron un perfil de ácidos grasos con una mayor composición de ácidos grasos C10:0, C12:0 y C14:0 y con una reducción concomitante en la composición de ácidos grasos C16:0 y C18:l respecto al perfil de la cepa UTEX 1435. Algunos transformantes de pSZ2011, cuando se cultivaron a un pH de 7.0, presentaron un perfil de ácidos grasos enriquecido en ácidos grasos C16:0 con una reducción aún mayor en la composición de ácidos grasos C18:l respecto al perfil de ácidos grasos de su cepa B original cultivada a un pH de 7.0.

Estos datos demuestran la utilidad de las modificaciones genéticas múltiples a la hora de ejercer un efecto sobre el perfil de ácidos grasos de un organismo huésped. Además, este ejemplo ilustra el uso de polinucleótidos recombinantes para la interrupción génica dirigida de un alelo de KASII endógeno con el fin de alterar el perfil de ácidos grasos de un microbio huésped.

EJEMPLO 16: Combinación de estrategias de modificación genética para alterar la composición de ácido palm tico de Prototheca En este ejemplo, se muestra la combinación de modificaciones genéticas para desactivar un alelo de KASII y sobreexpresar de forma concomitante una tioesterasa exógena que presenta especificidad preferencial por la hidrólisis de ácidos grasos C14 y C16, en un microorganismo para alterar el perfil de ácidos grasos del organismo huésped.

Una cepa mutada de forma clásica . (para una mayor producción de aceite) de Prototheca moriformis (UTEX 1435) , cepa A, se transformó con el constructo plasmidico pSZ2004 de acuerdo con los métodos de transformación biolistica descritos en el Ejemplo 2. pSZ2004, que se denota como KASII_5'_btub-SUC2-nr_2X_Amt03-Chl6TE2-nr_KASII_3 ' , comprendía la secuencia codificante de la acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana (Chl6TE2, GenBank #Q39513), secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' y 3' (que flaqueaban el constructo) para la integración dirigida en el locus KASII del genoma nuclear, y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae bajo el control del promotor de p-tubulina/5' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris . Chl6TE2 es una tioesterasa que presenta especificidad preferencial por ácidos grasos C14 y C16. Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159 y actuó como un marcador de selección. La secuencia codificante de Chl6TE estaba bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89), repetidos en tándem, y la nitrato-reductasa 3'UTR de C. vulgaris . Las regiones codificantes de proteínas de Chl6TE y suc2 tenían los codones optimizados para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Prototheca moriformis UTEX 1435, de acuerdo con la Tabla 2. pSZ2004 se presenta en la Lista de secuencias como SEQ ID NO: 250.

Tras la transformación con pSZ2004, los transformantes primarios se seleccionaron en placas que contenían sacarosa como única fuente de carbono. Los transformantes individuales se purificaron por clones y se cultivaron en condiciones estándar para la producción de lipidos a un pH de 7.0, similares a las condiciones descritas en el Ejemplo 1. Los perfiles de ácidos grasos se analizaron utilizando métodos estándar de detección por cromatografía de gases de ésteres metílicos de ácidos grasos con ionización a la llama (FAME GC/FID) , según se ha descrito en el Ejemplo 11. En la Tabla 57 se muestra el perfil de ácidos grasos resultante (expresado como % de área de los ácidos grasos totales) de un clon representativo obtenido a partir de transformaciones del vector de transformación pSZ2004. En la Tabla 57 se presenta adicionalmente el perfil de ácidos grasos de los lipidos obtenidos a partir de la cepa no transformada cultivada en condiciones para la producción de lipidos que comprenden glucosa como única fuente de carbono.

Tabla 57. Perfiles de ácidos grasos de Prototheca moriformis (UTEX 1435) modificada de forma múltiple para suprimir un producto génico KASII endógeno y para expresar una tioesterasa de Cuphea hookeriana .

Según se muestra en la Tabla 57 anterior, la interrupción dirigida de un alelo de KASII con un cásete de expresión para la expresión de un marcador seleccionable y una tioesterasa con preferencia por C14/C16 ejerció un efecto sobre el perfil de ácidos grasos del microorganismo transformado. El perfil de ácidos grasos de la cepa que comprendía el vector de transformación pSZ2004 presentó una mayor composición de ácidos grasos C14:0 y C16:0 con una reducción concomitante de ácidos grasos C18:0 y C18:l. La cepa de Prototheca moriformis (UTEX 1435) no transformada presentó un perfil de ácidos grasos que comprendía aproximadamente un 27% de ácidos grasos C16 y aproximadamente un 58% de ácidos grasos C18:l. Por el contrario, los perfiles de ácidos grasos de la cepa interrumpida en el locus KASII por un cásete que permitía la expresión de una acilo graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana y un marcador seleccionable comprendían aproximadamente un 70% de ácidos grasos C16 y aproximadamente un 14% de ácidos grasos. El nivel de C16:0 se incrementó en un factor superior a 2.5. Estos datos muestran que las modificaciones genéticas que consisten en la sobreexpresión de un gen exógeno y la supresión de un gen endógeno se pueden combinar para alterar los perfiles de ácidos grasos en organismos huésped.

A modo comparativo, los perfiles de ácidos grasos de una cepa interrumpida en el locus KASII por un cásete que permitía la expresión de un gen de sacarosa-invertasa proporcionaron una cepa con aproximadamente un 35% de ácidos grasos C16 y aproximadamente un 50% de ácidos grasos C18:l.

Estos datos demuestran la utilidad y eficacia de polínucleótidos que permiten la expresión exógena de una enzima tioesterasa para alterar el perfil de ácidos grasos de microorganismos modificados, en particular para incrementar la concentración- de ácidos grasos C14 y C16 y, de forma concomitante, mediante la interrupción dirigida de un alelo de KASII con dichos polinucleótidos , se consigue la reducción de ácidos grasos C18:0 y C18 : 1 en células microbianas.

EJEMPLO 17 : Modificación de microorganismos para producir ácidos grasos insaturados linoleicos y glicerolipidos Ciertas enzimas desaturasas de ácidos grasos ?12 pueden catalizar la formación de un doble enlace en moléculas de acilo graso o ácidos grasos C18:l, de este modo se generan moléculas de acilo graso o ácidos grasos C18:2 (linoleico) . Ciertas especies de plantas, que incluyen Gossypium hirsutum, Carthamus ticntorius, Glycine max, Helíanthus annus y Zea mays, las cuales producen aceites ricos en ácidos grasos insaturados linoleicos, son fuentes de genes que codifican desaturasas ?12 que se pueden expresar en microorganismos para alterar los perfiles de ácidos grasos. Este ejemplo describe el uso de polinucleótidos que codifican enzimas desaturasas ?12 para modificar microorganismos, donde el perfil de ácidos grasos del microorganismo transformado se ha enriquecido en ácido linoleico.

Un derivado mutado de forma clásica (para una mayor producción de aceite) de Protheca moriformis UTEX 1435, cepa A, se transformó con uno de los siguientes constructos plasmídicos enumerados en la Tabla 58 de acuerdo con los métodos de transformación biolistica descritos en el Ejemplo 2. Cada constructo contenía secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' (SEQ ID NO: 82) y 3' (SEQ ID NO: 84) 84) (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica 6S para su integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cersvlsiae bajo el control del promotor de ß-tubulina/5' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris . Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159 y actuó como un marcador de selección. Todas las regiones codificantes de proteínas tenían los codones optimizados para reflejar los codones preferenciales inherentes en Prototheca moriformis UTEX 1435, de acuerdo con la Tabla 2. Las regiones codificantes de genes de desaturasas de Gossypium hirsutum (Gh, N.° de acceso a GenBank CAA71199) , Carthamus ticntorius (Ct, N.° de acceso a GenBank ADM48789) , Glycine max {Gm, N.° de acceso a GenBank BAD89862), Helianthus annus (Ha, N.° de acceso a GenBank AAL68983) y Zea mays (Zm, N.° de acceso a GenBank ABF50053) estaban, cada una de ellas, bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) y la nitrato-reductasa 3'UTR de C. vulgaris.

Tabla 58. Constructos plasmidicos utilizados para transformar la cepa A de Protheca moriformis (UTEX 1435) .

Cada uno de los constructos enumerados en la Tabla 58 se transformó individualmente en la cepa A. Los transformantes primarios se seleccionaron en placas que contenían sacarosa como única fuente de carbono. Los transformantes individuales se purificaron por clones y se cultivaron en condiciones estándar para la producción de lipidos a un pH de 7.0, similares a las condiciones descritas en el Ejemplo 1. Los perfiles de ácidos grasos se analizaron utilizando los métodos estándar de detección por cromatografía de gases de ásteres metílicos de ácidos grasos con ionización a la llama (FAME GC/FID) que se han descrito en el Ejemplo 11. En la Tabla 59 se muestran los perfiles de ácidos grasos resultantes de un grupo de clones representativos obtenidos a partir de las transformaciones correspondientes de la cepa A de la Tabla 58. Para poder comparar, los perfiles de ácidos grasos de los lipidos obtenidos a partir de células de control de la cepa A no transformada se presentan de forma adicional en la Tabla 59.

Tabla 59. Perfiles de ácidos grasos C18:l, C18:2 y C18:3 de células de Prototheca moriformis modificadas para que expresen enzimas desaturasas FAD exógenas.

La cepa de Prototheca moriformis (UTEX 1435) no transformada presenta un perfil de ácidos grasos que comprende menos de un 8.5% de ácidos grasos C18:2. Según se muestra en la Tabla 59, los perfiles lipidíeos de la cepa A, que expresa enzimas de desaturasas de ácidos grasos de plantas superiores, presentaron más ácidos grasos C18:2. Los ácidos grasos insaturados C18 aumentaron desde aproximadamente un 64% hasta aproximadamente un 67-72%. De forma similar, la proporción de ácidos grasos poliinsaturados C18 totales (C18:2 y C18:3) frente a los ácidos grasos insaturados C18 combinados totales (C18:l, C18:2 y C18:3) aumentó desde menos de un 14% hasta más de un 19%. Estos datos demuestran la utilidad y eficacia de polinucleótidos que permiten la expresión exógena de enzimas desaturasas de ácidos grasos ?12 a la hora de alterar el perfil de ácidos grasos de microorganismos modificados.

EJEMPLO 18 : Alteración de los niveles de ácidos grasos de microbios modificados mediante la interrupción alélica múltiple de una desaturasa de ácidos grasos Este ejemplo describe el uso de un vector de transformación para interrumpir los locus FADc de Prototheca moriformis con un cásete de transformación que comprende un marcador seleccionable y una secuencia que codifica una enzima SAD exógena para modificar microorganismos, donde se altera el perfil de ácidos grasos del microorganismo transformado .

Un derivado mutado de forma clásica (para una mayor producción de aceite) de Protheca moriformis (UTEX 1435) , cepa C, se transformó con el constructo de transformación pSZ1499 (SEQ ID NO: 246) de acuerdo con los métodos de transformación biolistica descritos en el Ejemplo 2. pSZ1499 comprendía una secuencia de nucleótidos del gen de la estearoil-ACP-desaturasa de Olea europaea , con los codones optimizados para la expresión en Protheca moriformis UTEX 1435. El constructo de expresión pSZ1499 contenía secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' (SEQ ID NO: 247) y 3' ( SEQ ID NO: 84) 248) (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica FADc para su integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae bajo el control del promotor de ß-tubulina/S ' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris . Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159 y actuó como un marcador de selección. La región codificante de la estearoil-ACP-desaturasa de Olea europaea estaba bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) y la nitrato-reductasa 3' UTR de C. vulgaris, y el péptido de tránsito nativo se reemplazó con el péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de Chl'orella protothecoides (SEQ ID NO: 49) . El cásete de expresión entero de SAD de O. europaea se denominó pSZ1499 y se puede denotar como FADc5 '_btub-Suc2-nr_amt03-S106SAD-0eSAD-nr-FADc3 ' .

Los transformantes primarios se seleccionaron en placas que contenían sacarosa como única fuente de carbono. Los transformantes individuales se purificaron por clones y se cultivaron en condiciones estándar para la producción de lípidos a un pH de 7.0, similares a las condiciones descritas en el Ejemplo 1. Los perfiles de ácidos grasos se analizaron utilizando métodos estándar de detección por cromatografía de gases de ésteres metílicos de ácidos grasos con ionización a la llama (FAME GC/FID) , según se ha descrito en el Ejemplo 11 En la Tabla 60 se muestran los perfiles de ácidos grasos resultantes de un grupo de clones representativos obtenidos a partir de las transformaciones del vector de transformación. En la Tabla 60 se presentan adicionalmente los perfiles de ácidos grasos de los lípidos obtenidos a partir de la cepa C no transformada cultivada en condiciones para la producción de lípidos que comprenden glucosa como única fuente de carbono (pH 5.0).

Tabla 60. Perfiles de ácidos grasos de Prototheca moriformis (UTEX 1435) modificada de forma múltiple para desactivar alelos de FADc endógenos y para expresar una estearoil-ACP-desaturasa de 0. europaea.

Según se muestra en la Tabla 60, la transformación de la cepa C con pSZ1499 ejerce un efecto sobre los perfiles de ácidos grasos de los microbios transformados. La cepa C de Prototheca moríformis (UTEX 1435) no transformada presentó un perfil de ácidos grasos que comprendía menos de un 60% de ácidos grasos C18:l y más de un 7% de ácidos grasos C18:2.

Por el contrario, la cepa C transformada con pSZ1499 presentó perfiles de ácidos grasos con una mayor composición de ácidos grasos C18:l y una reducción concomitante de ácidos grasos C18:0 y C18:2. En los perfiles de ácidos grasos de la cepa C transformada con pSZ1499 no se detectaron ácidos grasos C18:2. La ausencia de ácidos grasos C18:2 detectables en los transformantes de pSZ1499 indicó que la transformación con pSZ1499, que contenia secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa para la integración en múltiples locus genómicos de FADc, había eliminado la actividad de FAD.

Se realizaron análisis de inmunotransferencia de Southern para verificar que múltiples alelos de FADc habían sido interrumpidos por el vector de transformación pSZ1499. Se extrajo ADN genómico de la cepa C y de los transformantes de pSZ1499 utilizando métodos estándar de biología molecular. El ADN de cada muestra se analizó en geles de agarosa al 0.8% tras la digestión con la enzima de restricción PstI. El ADN de este gel se transfirió a una membrana de Nailon+ (Amersham) , que se híbrido a continuación con una sonda polinucleotídica marcada con P32 que correspondía a una región 3' de FADc. La Figura 3 muestra mapas del cásete de transformación de pSZ1499, los dos alelos de FADc secuenciados de Prototheca moriformis (UTEX 1435) y los tamaños previstos de los alelos interrumpidos por el vector de transformación pSZ1499. El alelo 1 de FADc comprende un sitio de restricción PstI, mientras que el alelo 2 de FADc no. La integración del cásete de SAD introduciría un sitio de restricción PstI en el alelo de FADc interrumpido, que daría como resultado un fragmento de ~6kb determinado por Southern, independientemente del alelo que se hubiera interrumpido. La Figura 4 muestra los resultados del análisis de inmunotransferencia de Southern. En ambos transformantes se detecta una banda de hibridación a ~6kb. No se detectaron bandas de hibridación más pequeñas, las cuales indicarían la presencia de alelos no alterados. Estos resultados indican que ambos alelos de FADc fueron interrumpidos por pSZ1499.

La supresión de ambos alelos de la desaturasa de ácidos grasos FADc con un cásete de expresión de SAD da como resultado perfiles de ácidos grasos que comprenden aproximadamente un 74% de C18:l. Al considerarlos conjuntamente, estos datos demuestran la utilidad y eficacia de polinucleótidos que permiten la desactivación de alelos de FAD y la expresión exógena concomitante de enzimas estearoil-ACP-desaturasas para alterar el perfil de ácidos grasos de organismos modificados.

EJEMPLO 19: Características del aceite procesado producido a partir de microorganismos modificados Los métodos para transformar Prototheca moriformís (UTEX 1435) con el vector de transformación pSZ1500 (SEQ ID NO: 251) y sus efectos se han descrito previamente en las Solicitudes de PCT N.os PCT/US2011/038463 y PCT/US2011/038463.

Un derivado mutado de forma clásica (para una mayor producción de aceite) de Protheca moriformís UTEX 1435, cepa C, se transformó con el constructo de transformación pSZ1500 de acuerdo con los métodos de transformación biolística descritos en el Ejemplo 2. Los ransformantes primarios se seleccionaron en placas de agar que contenían sacarosa como única fuente de carbono, se purificaron por clones y se seleccionó una única línea modificada, cepa D, para análisis. La cepa D se cultivó según se ha descrito en la presente. A continuación, se realizó una extracción con hexano del aceite a partir de la biomasa generada utilizando métodos estándar y se determinó que el aceite de triglicéridos resultante estaba exento de hexano residual. Otros métodos para extraer aceite de microalgas utilizando una prensa de tornillo se describen en la Solicitud de PCT N.° PCT/US2010/31108 y se incorporan a la presente por referencia.

A continuación, el aceite extraído a partir de la biomasa de la cepa D se refino, blanqueó y desodorizó utilizando métodos de procesamiento de aceites vegetales de uso común. Estos procedimientos generaron una muestra de aceite, RBD469, que se sometió a una serie de protocolos analíticos de evaluación de acuerdo con los métodos definidos por la Sociedad Americana de Químicos de Aceites, la Sociedad Americana para Ensayos y Materiales y la Organización Internacional de Normalización. Los resultados de estos análisis se resumen a continuación en la Tabla 60.

Tabla 60. Resultados analíticos para la muestra de aceite RBD469.

AOCS Ce 9a-48 Punto de humeo 232 °C AOCS Cd 12b- índice de estabilidad 31.6 horas 92 oxidativa Rancimat (110 °C) AOCS Ca 6a-40 Materia no saponificada 2.28 a o El mismo lote de RBD469 de la cepa D de Prototheca moriformis se analizó para determinar el contenido de elementos traza, el contenido de grasa sólida y el color Lovibond de acuerdo con los métodos de la AOCS (por sus siglas en inglés) . Los resultados de estos análisis se presentan a continuación en la Tabla 61, Tabla 62 y Tabla 63.

Tabla 61. Análisis elemental por ICP del aceite RBD469.

Tabla 62. Contenido de grasa sólida del aceite RBD469 Tabla 63. Color Lovibond del aceite RBD469 El aceite RBD469 se sometió a transesterificación para producir ésteres metílicos de los ácidos grasos (FAME, por sus siglas en inglés) . El perfil resultante de ésteres metílicos de los ácidos grasos de RBD469 se muestra en la Tabla 64: Tabla 64. Perfil de esteres metílicos de los ácidos grasos del aceite RBD469 FAME totales identificados 99.13 EJEMPLO 20: Microalgas modificadas con perfiles de ácidos grasos alterados Según se ha descrito anteriormente, la integración de genes heterólogos para desactivar o reducir la expresión de enzimas de la vía lipidica endógenas especificas en especies de Prototheca puede alterar los perfiles de ácidos grasos del microbio modificado. En este ejemplo, se crearon constructos plasmidicos para evaluar si el perfil lipidico de una célula huésped podría verse afectado como resultado de una desactivación o reducción de la expresión de un gen endógeno de acilo graso-ACP-tioesterasa, FATA1.

A. Alteración de los perfiles lipidióos mediante la desactivación de un gen endógeno de tioesterasa de Prototheca moriformis Un derivado mutado de forma clásica (para una mayor producción de aceite) de Protheca moriformis UTEX 1435, cepa A, se transformó con uno de los siguientes constructos plasmidicos de la Tabla 65 utilizando los métodos del Ejemplo 2. Cada constructo contenia una región para la integración en el genoma nuclear con el fin de interrumpir el gen endógeno FATA1 y una región codificante de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae bajo el control del promotor de ß-tubulina/5' UTR de C. reinhardtii y la nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris . Este cásete de expresión de suc2 de S. cerevisiae se enumera como SEQ ID NO: 159 y actuó como un marcador de selección. Todas las regiones codificantes de proteínas tenian los codones optimizados para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Prototheca moriformis UTEX 1435, de acuerdo con la Tabla 2. A continuación se muestran las secuencias relevantes para las regiones de modificación dirigida para el gen FATA1 que se utilizaron para la integración en el genoma nuclear.

Descripción SEQ ID NO: Secuencia 5' para la integración en el SEQ ID NO: 253 locus FATA1 Secuencia 3' para la integración en el SEQ ID NO: 254 locus FATA1 Tabla 65. Constructos plasmídicos utilizados para transformar la cepa A de Protheca moriformis (UTEX 1435) .

Constructo Elementos de la secuencia plasmidico 1 FATAl-CrbTub_yInv_nr-FATAl 2 FATAl-CrbTub_yInv_nr: : amt03_C TE2_nr-FATAl Los sitios de restricción relevantes en el constructo FATAl-CrbTub_yInv_nr-FATAl (SEQ ID NO: 255) se indican en minúscula, negrita y subrayados y son 5' -3' BspQ 1, Kpn I, Ase I, Mfe I, Sac I, BspQ I, respectivamente. Los sitios BspQI delimitan los extremos 5' y 3' del ADN transformante. Las secuencias en negrita y minúscula representan ADN genómico de la cepa A que permite la integración dirigida en el locus FATA1 mediante recombinación homologa. Siguiendo en la dirección de 5' a 3' , el promotor de ß-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión del gen de sacarosa-invertasa de la levadura (que confiere la capacidad a la cepa A para metabolizar sacarosa) se indica con un recuadro. El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA para la invertasa se indican en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que la región codificante se indica en minúscula y cursiva. La nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgarís se indica con texto en minúscula y subrayado y viene seguida por la región genómica FATA1 de la cepa A, que se indica con texto en negrita y minúscula: gctcttcggagtcactgtgccactgagttcgactggtagctgaatggagtcgctgctccac taaacgaattgtcagcaccgccagccggccgaggacccgagtcatagcgagggtagtagcg cgccatggcaccgaccagcctgcttgccagtactggcgtctcttccgcttctctgtggtcc tctgcgcgctccagcgcgtgcgcttfctccggtggatcatgcggtccgtggcgcaccgcagc ggccgctgcccatgcagcgccgctgcttccgaacagtggcggtcagggccgcacccgcggt agccgtccgtccggaacccgcccaagagttttgggagcagcttgagccctgcaagatggcg gaggacaagcgcatcttcctggaggagcaccggtgcgtggaggtccggggctgaccggccg tcgcattcaacgtaatcaatcgcatgatgatcagaggacacgaagtcttggtggcggtggc cagaaacactgtccattgcaagggcatagggatgcgttccttcacctctcatttctcattt ctgaatccctccctgctcactctttctcctcctccttcccgttcacgcagcattcggggta cc|ctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccg| jgcgctgcatgcaacaccgatgatgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggq |gctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgcaaagaca| |ttatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggcc| |actcgagcttgtgatcgcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaa| qggcgcgccArGctqctqcaqqccttcctqttcctqctqqccqqcttcqccqc caagatcagcgcctccatgacgaacgagacgtccgaccgccccctggtgcacttcaccccc aacaagggctggatgaacgaccccaacggcctgtggtacgacgagaaggacgccaagtggc acctgtacttccagtacaacccgaacgacaccgtctgggggacgcccttgttctggggcca cgccacgtccgacgacctgaccaactgggaggaccagcccatcgccatcgccccgaagcgc aacgactccggcgccttctccggctcca tggtggtggactacaacaacacctccggcttct tcaacgacaccatcgacccgcgccagcgctgcgtggccatctggacctacaacaccccgga gtccgaggagcagtacatctcctacagcctggacggcggctacaccttcaccgagtaccag aagaaccccgtgctggccgccaactccacccagttccgcgacccgaaggtcttctggtacg agccctcccagaagtggatcatgaccgcggccaagtcccaggactacaagatcgagatcta ctcctccgacgacctgaagtcctggaagctggagtccgcgttcgccaacgagggcttcctc ggctaccagtacgagtgccccggcctgatcgaggtccccaccgagcaggaccccagcaagt cctactgggtga tgttcatctccatcaaccccggcgccccggccggcggctccttcaacca gtacttcgtcggcagcttcaacggcacccacttcgaggccttcga caaccagtcccgcgtg gtggacttcggcaaggactactacgccctgcagaccttcttcaacaccgacccgacctacg ggagcgccctgggcatcgcgtgggcctccaactgggagtactccgccttcgtgcccaccaa cccctggcgctcctcca tgtccctcgtgcgcaagttctccctcaacaccgagtaccaggcc aacccggagacggagctgatcaacctgaaggccgagccgatcctgaacatcagcaacgccg gcccctggagccggttcgccaccaacaccacgttgacgaaggccaacagctacaacgtcga cctgtccaacagcaccggcaccctggagttcgagctggtgtacgccgtcaacaccacccag acgatctccaagtccgtgttcgcggacctctccctctggttcaagggcctggaggaccccg aggagtacctccgcatgggcttcgaggtgtccgcgtcctccttcttcctggaccgcgggaa cagcaaggtgaagttcgtgaaggagaacccctacttcaccaaccgca tgagcgtgaacaac cagcccttcaagagcgagaacgacctgtcctactacaaggtgtacggcttgctggaccaga acatcctggagctgtacttcaacgacggcgacgtcgtgtccaccaacacctacttcatgac caccgggaacgccctgggctccgtgaacatgacgacgggggtggacaacctgttctacatc gacaagttccaggtgcgcgaggtcaagTGAca.a.t.qqcaqcaqcaqctcqqataqtatcqa cacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgt gaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgctt ttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcg tttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgct gctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcc tggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatggga acacaaatggaggatcgtagagctcactagtatcgatttcqaagacagggtggttggctgg atggggaaacgctggtcgcgggattcgatcctgctgcttatatcctccctggaagcacacc cacgactctgaagaagaaaacgtgcacacacacaacccaaccggccgaatatttgcttcct tatcccgggtccaagagagactgcgatgcccccctcaatcagcatcctcctccctgccgct tcaatcttccctgcttgcctgcgcccgcggtgcgccgtctgcccgcccagtcagtcactcc tgcacaggccccttgtgcgcagtgctcctgtaccctttaccgctccttccattctgcgagg ccecctattgaatgtattogttgcotgtgtggcoaagcgggctgctgggcgcgeogecgtc gggcagtgctcggcgactttggcggaagccgattgttcttctgtaagccacgcgcttgctg ctttgggaagagaagggggggggtactgaatggatgaggaggagaaggaggggtattggta ttatctgagttgggtgaagagc Para introducir el gen de la ACP-tioesterasa 2 de Cuphea wrightii (CwTE2) (N.° de acceso: U56104) en el locus FATA1 de la cepa A, se generó un constructo para expresar la región codificante de proteínas del gen CwTE2 bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 89) y la nitrato-reductasa 3'UTR de C. vulgaris. El constructo que se ha expresado en la cepa A se puede denotar como FATA1-CrbTub_yInv_nr: :amt03 CwTE2 nr-FATAl (SEQ ID NO: 256).

Los sitios de restricción relevantes en el constructo FATAl-CrbTub_yInv_nr : : amt03_CwTE2_nr-FATAl se indican en minúscula, negrita y subrayados y son 5' -3' BspQ 1, Kpn I, Ase I, Mfe I, BamH I, EcoR I, Spe I, Ase I, Pac I, Sac I, BspQ I, respectivamente. Los sitios BspQI delimitan los extremos 5' y 3' del ADN transformante. Las secuencias en negrita y minúscula representan ADN genómico de la cepa A que permite la integración dirigida en el locus FATA1 mediante recombinación homologa. Siguiendo en la dirección de 5' a 3' , el promotor de ß-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión del gen de sacarosa-invertasa de la levadura (que confiere la capacidad a la cepa A para metabolizar sacarosa) se indica con un recuadro. El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA para la invertasa se indican en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que la región codificante se indica en minúscula y cursiva. La nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris se indica con texto en minúscula y subrayado, y viene seguida por un promotor Amt03 endógeno de Prototheca moriformis, que se indica con texto en cursiva encuadrado. El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA de la ACP-tioesterasa de C. wrightii se indican en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que el resto de la región codificante de la ACP-tioesterasa se Índica en negrita y cursiva. La nitrato-reductasa 3' UTR de C vulgaris se indica de nuevo con texto en minúscula y subrayado y viene seguida por la región genómica FATA1 de la cepa A, que se indica con texto en negrita y minúscula: g_ctct cggagtcactgtgccactgagttcgactggtagctgaatggagtcgctgctccac taaacgaattgtcagcaccgccagccggccgaggacccgagtcatagcgagggtagtagcg cgccatggcaccgaccagcctgcttgccagtactggcgtctcttccgcttctctgtggtcc tctgcgcgctccagcgcgtgcgcttttccggtgga ca gcggtccgtggcgcaccgcagc ggccgctgcccatgcagcgccgctgcttccgaacagtggcggtcagggccgcacccgcggt agccgtccgtccggaacccgcccaagagttttgggagcagcttgagccctgcaagatggcg gaggacaagcgcatcttcctggaggagcaccggtgcgtggaggtccggggctgaccggccg tcgcattcaacgtaatcaatcgcatgatgatcagaggacacgaagtcttggtggcggtggc cagaaacactgtccattgcaagggcatagggatgcgttccttcacctctcatttctcattt ctgaatccctccctgctcactctttctcctcctccttcccgttcacgcagcattcggg_g_ta cqctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccgl gcgctgcatgcaacaccgatgatgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggc gctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgcaaagaca| |ttatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggcc actcgagcttgtgatcgcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaa| adqqcqcqccATGctqctqcagqccttcctqttcctqctqqccqqcttcqccqc caaga tcagcgcctccatgacgaacgagacgtccgaccgccccctggtgcacttcaccccc aacaagggctgga tgaacgaccccaacggcctgtggtacgacgagaaggacgccaagtggc acctgtacttccagtacaacccgaacgacaccgtctgggggacgcccttgttctggggcca cgccacgtccgacgacctgaceaactgggaggaccagcccatcgcca tcgccccgaagcgc aacgactccggcgccttctccggctccatggtggtggactacaacaacacctccggcttct tcaacgacaccatcgacccgcgccagcgctgcgtggccatctggacctacaacaccccgga gtccgaggagcagtacatctcctacagcctggacggcggctacaccttcaccgagtaccag aagaaccccgtgctggccgccaactccacccagttccgcgacccgaaggtcttctggtacg agccctcccagaagtggatcatgaccgcggccaagtcccaggactacaagatcgagatcta ctcctccgacgacctgaagtcctggaagctggagtccgcgttcgccaacgagggcttcctc ggctaccagtacgagtgccccggcctgatcgaggtccccaccgagcaggaccccagcaagt cctactgggtga tgttca tctccatcaaccccggcgccccggccggcggctccttcaacca gtacttcgtcggcagcttcaacggcacccacttcgaggccttcgacaaccagtcccgcgtg gtggacttcggcaaggactactacgccctgcagaccttcttcaacaccgacccgacctacg ggagcgccctgggcatcgcgtgggcctccaactgggagtactccgccttcgtgcccaccaa cccctggcgctcctccatgtccctcgtgcgcaagttctccctcaacaccgagtaccaggcc aacccggagacggagctgatcaacctgaaggccgagccgatcctgaacatcagcaacgccg gcccctggagccggttcgccaccaacaccacgttgacgaaggccaacagctacaacgtcga cctgtccaacagcaccggcaccctggagttcgagctggtgtacgccgtcaacaccacccag acgatctccaagtccgtgttcgcggacctctccctctggttcaagggcctggaggaccccg aggagtacctccgca tgggcttcgaggtgtccgcgtcctccttcttcctggaccgcgggaa cagcaaggtgaagttcgtgaaggagaacccctacttcaccaaccgcatgagcgtgaacaac cagcccttcaagagcgagaacgacctgtcctactacaaggtgtacggcttgctggaccaga acatcctggagctgtacttcaacgacggcgacgtcgtgtccaccaacacctacttcatgac caccgggaacgccctgggctccgtgaaca tgacgacgggggtggacaacctgttctacate gacaagttccaggtgcgcgaggtcaagTGAcaattggcagcagcagctcggatagtatcqa cacactctggacgctqqtcqtqtqatggactqttqccqccacacttgctgccttqacctgt gaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgctt ttgcga ttqctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcg tttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgct gctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcc tggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatggga acacaaatggaggatcccgcgtctcgaacagagcgcgcagagqaacgctgaaqqtctcgcc tctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttctt cgtccattagcgaagcgtccggttcacacacgtgccacgttggcgagg ggcaggtgacaa tgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctagggatatcgaattqggccgacag\ gacgcgcgtcaaaggtgctggtcgtgtatgccctggccggcaggtcgttgctgctgctggt] tagtgattccgcaaccctgattttggcgtcttattttggcgtggcaaacgctggcgcccgq gagccgggccggcggcgatgcggtgccccacggctgccggaatccaagggaggcaagagcg\ cccgggtcagttgaagggctttacgcgcaaggtacagccgctcctgcaaggctgcgtggtg gaattggacgtgcaggtcctgctgaagttcctccaccgcctcaccagcggacaaagcaccg\ gtgtatcaggtccgtgtcatccactctaaagagctcgactacgacctactgatggccctag\ \attcttcatcaaaaacgcctgagacacttgcccaggattgaaactccctgaagggaccacq ¡aggggccctgagttgttccttccccccgtggcgagctgccagccaggctgtacctgtgatq gaggctggcgggaaaataggc11cgtgtgctcaggtca tgggaggtgcaggacagetcatgj aaacgccaacaatcgcacaattcatgtcaagctaatcagctatttcctcttcacgagctgt] aattgtcccaaaattctggtctaccgggggtgatccttcgtgtacgggcccttccctcaaq cctaggtatgcgcgca tgcggtcgccgcgcaactcgcgcgagggccgagggtttgggacgg gccgtcccgaaatgcagttgcacccggatgcgtggcaccttttttgcgataatttatgcaa\ tggactgctctgcaaaattctggctctgtcgccaaccctaggatcagcggcgtaggatttq gtaatcattcgtcctgatggggagctaccgactaccctaatatcagcccgactgcctgacq ccagcgtccacttttgtgcacacattccattcgtgcccaagacatttcattgtggtgcgaa] gcgtccccagttacgctcacctgtttcccgacctccttactgttctgtcgacagagcgggq ccacaggccggtcgcagcqactagtatggtggtggccgccgccgccagcagcgccttcttc cccgtgcccgccccccgccccacccccaagcccggcaa.gttcggca.actggcccagca.gcc tgagccagcccttcaagcccaagagcaaccccaacggccgcttccaggtgaaggccaacgt gagcccccacgqqcqcqcccccaaggccaacggcagcgccgtgagcctgaagtccggcagc ctgaacaccctggaggacccccccagcagcccccccccccgcaccttcctgaaccagctgc ccgactggagccgcctgcgcaccgccatcaccaccgtgttcgtggccgccgagaagcagtt cacccgcctggaccgcaagagcaagcgccccgacatgctggtggactggttcggcagcgag accatcgtgcaggacggcctggtgttccgcgagcgcttcagcatccgcagctacgagatcg gcgccgaccgcaccgccagcatcgagaccctgatgaaccacctgcaggacaccagcctgaa ccactgcaagagcgtgggcctgctgaacgacggcttcggccgcacccccgagatgtgcacc cgcgacctgatctgggtgctgaccaagatgcagatcgtggtgaaccgctaccccacctggg gcgacaccgtggagatcaacagctggttcagccagagcggcaagatcggcatgggccgcga gtggctgatcagcgactgcaacaccggcgagatcctggtgcgcgccaccagcgcctgggcc atgatgaaccagaagacccgccgcttcagcaagctgccctgcgaggtgcgccaggagatcg ccccccacttcgtggacgccccccccgtgatcgaggacaacgaccgcaagctgcacaagtt cgacgtgaagaccggcgacagcatctgcaagggcctgacccccggctggaacgacttcgac gtgaaccagcacgtgagcaacgtgaagtacatcggctggattctggagagcatgcccaccg aggtgctggagacccaggagctgtgcagcctgaccctggagtaccgccgcgagtgcggccg cgagagcgtggtggagagcgtgaccagcatgaaccccagcaaggtgggcgaccgcagccag taccagcacctgctgcgcctggaggacggcgccgacatcatgaagggccgcaccgagtggc gccccaagaacgccggcaccaaccgcgccatcagcaccTGAttaattaactcqaqqcaqca gcagctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccac acttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttg atcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccaccc ccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgt cctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttg ggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcac gggaagtagtgggatgggaacacaaatggaaagcttgagctcttgttttccagaaggagtt gctccttgagcctttcattctcagcctcgataacctccaaagccgctctaattgtggaggg ggttcgaagacagggtggttggctggatggggaaacgctggtcgcgggattegatcctget gcttatatcctccctggaagcacacccacgactctgaagaagaaaacgtgcacacacacaa cccaaccggccgaatatttgcttccttatcccgggtccaagagagactgcgatgcccccct caatcagcatcctcctccctgccgcttcaatcttccctgcttgcctgcgcccgcggtgcgc cgtctgcccgcccagtcagtcactcctgcacaggcccettgtgcgcagtgctcctgtaccc tttaccgctccttccattctgcgaggccccctattgaatgtattcgttgcctgtgtggcca agcgggctgctgggcgcgccgccgtcgggcagtgctcggcgactttggcggaagccgattg ttcttctgtaagccacgcgcttgctgctttgggaagagaagggggggggtactgaatggat gaggaggagaaggaggggtattggtattatetgagttgggtgaagagc Tras la transformación individual del constructo plasmídico 1 o 2 en la cepa A, se seleccionaron los clones positivos en placas de agar que comprendían sacarosa como única fuente de carbono. Como en los ejemplos anteriores, los transformantes individuales se purificaron por clones y se cultivaron en condiciones estándar para la producción de lípidos a un pH de 7 y se prepararon muestras lipídicas a partir de la biomasa seca de cada transformante. Se determinaron los perfiles de ácidos grasos utilizando métodos de transesterificación directa según se ha descrito en el Ejemplo 11. En la Tabla 66 se presentan los perfiles de ácidos grasos resultantes (expresados como % de área de los ácidos grasos totales) de un grupo de clones representativos obtenidos a partir de transformaciones con el constructo 1 comparados con los de los controles de la cepa A no transformados. En la Tabla 67 se presentan los perfiles de ácidos grasos resultantes (expresados como % de área de los ácidos grasos totales) de un grupo de clones representativos obtenidos a partir de transformaciones con el constructo 2 comparados con los de los controles de la cepa A no transformados .

Tabla 66. Perfiles de ácidos grasos de células Prototheca moriformis que comprenden un marca seleccionable para interrumpir un alelo de FATAl endógeno.

Transformación % de % de % de de % de C14:0 C16:0 C18:0 C18:l C18:2 Los resultados presentados en la Tabla 66 muestran que la supreción del alelo de FATAl endógeno del huésped altera el perfil de ácidos grasos de las microalgas modificadas. El efecto de dirigir un marcador seleccionable al alelo de FATAl endógeno sobre el perfil de ácidos grasos del microbio transformado consiste en una clara disminución de los ácidos grasos C16:0 con un incremento concomitante de los ácidos grasos C18 : 1.

Tabla 67. Perfiles de ácidos grasos de células de Prototheca moriformis que contenían un marcador seleccionable y una tioesterasa exógena para interrumpir un alelo de FATA1 endógeno .

Trans- Fuente % de % de % de % de % de % de % de formantede C10:0C12:0 C14 : 0 C16 : 0 C18 : 0 C18:l C18:2 carbono Cepa ANatural Glucosa 0.01 0.04 1.38 28.83 3.00 56.05 8.21 Natural Glucosa 0.01 0.04 1.50 29.38 3.00 55.29 8.23 Natural Glucosa/ 0.01 0.05 1.48 28.58 3.20 57.14 7.27 Fructosa Natural Glucosa/ 0.01 0.04 1.54 29.05 3.23 56.47 7.32 Fructosa > 2 1 Glucosa/ 4.29 19.98 9.17 20.68 3.47 34.38 6.37 copias Fructosa 2 Glucosa/ 3.11 16.17 9.91 15.97 1.57 45.72 5.81 Fructosa 3 Sacarosa 4.84 24.22 11.5619.48 2.67 29.56 6.02 4 Sacarosa 3.24 16.67 10.3916.34 1.43 44.41 6.00 1-2 1 Glucosa/ 0.18 1.64 1.85 14.43 2.12 70.30 7.63 copias Fructosa 2 Glucosa/0.18 1.56 1.74 13.56 2.25 71.04 7.72 Fructosa 3 Sacarosa 0.19 1.69 1.89 13.79 3.15 69.97 7.68 4 Sacarosa 0.15 1.26 1.49 13.44 2.73 71.46 7.77 En concordancia con el direccionamiento de un marcador seleccionable solo al alelo de FATA1 del huésped, la integración de un marcador seleccionable concomitante con una tioesterasa exógena provoca la alteración del perfil de ácidos grasos de las microalgas modificadas. Según se muestra en la Tabla 67 anterior, el direccionamiento de un gen exógeno de tioesterasa para interrumpir el alelo de FATA1 produce una clara disminución de la producción de ácidos grasos C16:0. La expresión de la tioesterasa CwTE2 en el locus FATA1 también afecta a los ácidos grasos de cadena media y a la producción de ácidos grasos C18:l en una medida que depende del nivel de actividad de la tioesterasa exógena presente en los transformantes analizados. Existe una buena concordancia entre el número de copias del transgén amplificado en el sitio de integración diana y los niveles de tioesterasa, tal como indica el efecto sobre los perfiles de ácidos grasos o la acumulación de proteínas recombinantes que se evalúa mediante inmunotransferencia de Western.

Las líneas transgénicas en las que el gen CwTE2 ha sido sometido a amplificación muestran un aumento marcado de los ácidos grasos C10:0-C14:0 y una reducción concurrente de los ácidos grasos C18:l. Por el contrario, aquellos transformantes en los que CwTE2 no fue ampliado o fue ampliado poco concuerdan con una expresión inferior de la tioesterasa exógena, lo cual produce un ligero incremento de los ácidos grasos de cadena media y un efecto mucho mayor sobre el incremento de ácidos grasos C18:l.

Al considerarlos de forma conjunta, estos datos muestran que la interrupción dirigida del alelo de FATA1 endógeno del huésped altera el perfil lipídico de las microalgas modificadas. Estos datos demuestran la utilidad y eficacia de polinucleotidos que permiten la interrupción dirigida de un alelo de FATA para alterar el perfil de ácidos grasos de células microbianas modificadas, en particular para reducir la concentración de ácidos grasos C16 e incrementar la concentración de ácidos grasos C18:l. Además, estos datos demuestran la utilidad y eficacia de polinucleotidos que permiten la interrupción dirigida de un alelo de FATA a la vez que expresan de forma concomitante una tioesterasa exógena para alterar el perfil de ácidos grasos de células microbianas modificadas, en particular para reducir la concentración de ácidos grasos C16.

B. Alteración de los perfiles lipidicos mediante la reducción de la expresión de un gen endógeno de tioesterasa de Prototheca moriformis Se introdujo un constructo para reducir la expresión del gen FATA1 de Prototheca moriformis mediante ARNi en un entorno genético de la cepa A de Prototheca moriformis UTEX 1435. El gen de la sacarosa-invertasa suc2 de Saccharomyces cerevisiae se utilizó como marcador seleccionable, que confiere capacidad para crecer en sacarosa como única fuente de carbono. El constructo empleó el primer exón de la región codificante de FatAl, seguido del intrón endógeno y una unidad de repetición del primer exón en la orientación inversa. Las secuencias de modificación dirigida por recombinación homologa 5' y 3' (que flanqueaban el constructo) respecto a la región genómica 6S, enumeradas como SEQ ID NO: 82 y 84 respectivamente, se incluyeron para la integración del constructo horquillado en el genoma nuclear. Este constructo se denomina 6S : : ß-Tub : suc2 : nr : : ß-tub : hairpinFatA: nr : : 6S .

Los sitios de restricción relevantes en 63::ß-Tub : suc2 : nr : : ß-tub : hairpin FatA:nr::6S se indican en minúscula, negrita y subrayados y son 5' -3' BspQ 1, Kpn I, Mfe I, BamH I, EcoR I, Spe I, Xho I, Sac I, BspQ I, respectivamente. Los sitios BspQI delimitan los extremos 5' y 3' del ADN transformante. Las secuencias en negrita y minúscula representan ADN genómico de la cepa A que permite la integración dirigida en el locus 6S mediante recombinación homologa. Siguiendo en la dirección de 5' a 3' , el promotor de ß-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión del gen de sacarosa-invertasa de la levadura (que confiere la capacidad a la cepa A para metabolizar sacarosa) se indica con un recuadro. El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA para la invertasa se indican en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que la región codificante se indica en minúscula y cursiva. La nitrato-reductasa 3' UTR de Chlorella vulgaris se indica con texto en minúscula y subrayado, y viene seguida por el segundo promotor de ß-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión de FatAl horquillado, el cual se indica con texto en cursiva encuadrado. El codón de iniciación ATG de FatAl se indica en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que el resto del primer exón de la región codificante de FatAl se indica en mayúscula. El intrón del gen FatA se indica en mayúscula y subrayado, y se creó una región conectora, mostrada en mayúscula, negrita, cursiva y subrayada, en el punto de unión del intrón/primer exón inverso de FatAl para facilitar el corte y empalme del ARN en estos vectores. El primer exón inverso de FatAl se indica en mayúscula. La nitrato-reductasa 3' UTR de C. vulgaris se indica de nuevo con texto en minúscula y subrayado y viene seguida por la región genómica 6S de la cepa A, gue se indica con texto en negrita y minúscula. La secuencia de las porciones de FATA de este constructo de ARNi se enumeran como SEQ ID NO: 257. gctcttcgccgccgccactcctgctcgagcgcgcccgcgcgtgcgccgccagcgccttggc cttttcgccgcgctcgtgcgcgtcgctgatgtccatcaccaggtccatgaggtctgccttg cgccggctgagccactgcttcgtccgggcggccaagaggagcatgagggaggactcctggt ccagggtcctgacgtggtcgcggctctgggagcgggccagca catc ggctctgccgcac cgaggccgcctccaactggtcctccagcagccgcagtcgccgccgaccctggcagaggaag acaggtgaggggggtatgaattgtacagaacaaccacgagccttgtctaggcagaatccct accagtcatggctttacctggatgacggcctgcgaacagctgtccagcgaccctcgctgcc gccgcttctcccgcacgcttctttccagcaccgtgatggcgcgagccagcgccgcacgctg gcgctgcgcttcgccgatctgaggacagtcggggaactctgatcagtctaaacccccttgc gcgttagtgttgccatcctttgcagaccggtgagagccgacttgttgtgcgccacccccca caccacctcctcccagaccaattctgtcacctttttggcgaaggcatcggcctcggcctgc agagaggacagcagtgcccagccgctgggggttggcggatgcacgctcaggti |tgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgca| |tgcaacaccgatgatgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgat| gccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgcaaagacattatagcg agctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagc ttgtgatcgcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaa |c|tctagaatatcaATGctgctgcaggccttcctgttcctgctggccggcttcgccgccaag atcagcgcctccatgacgaacgagacgtccgaccgccccctggtgcacttcacccccaaca agggctggatgaacgaccccaacggcctgtggtacgacgagaaggacgccaagtggcacct gtacttccagtacaacccgaacgacaccgtctgggggacgcccttgttctggggccacgcc acgtccgacgacctgaccaactgggaggaccagcccatcgccatcgccccgaagcgcaacg actccggcgccttctccggctcca tggtggtggactacaacaacacctccggcttcttcaa cgacaccatcgacccgcgccagcgctgcgtggcca tctggacctacaacaccccggagtcc gaggagcagtacatctcctacagcctggacggcggctacaccttcaccgagtaccagaaga accccgtgctggccgccaactccacccagttccgcgacccgaaggtcttctggtacgagcc ctcccagaagtggatca tgaccgcggccaagtcccaggactacaagatcgagatctactcc tccgacgacctgaagtcctggaagctggagtccgcgttcgccaacgagggcttcctcggct accagtacgagtgccccggcctgatcgaggtccccaccgagcaggaccccagcaagtccta ctgggtga tgttcatctcca tcaaccccggcgccccggccggcggctccttcaaccagtac ttcgtcggcagcttcaacggcacccacttcgaggccttcgacaaccagtcccgcgtggtgg acttcggcaaggactactacgccctgcagaccttcttcaacaccgacccgacctacgggag cgccctgggcatcgcgtgggcctccaactgggagtactccgccttcgtgcccaccaacccc tggcgctcctccatgtccctcgtgcgcaagttctccctcaacaccgagtaccaggccaacc cggagacggagctga tcaacctgaaggccgagccgatcctgaaca tea caacgccggccc ctggagccggttcgccaccaacaccacgttgacgaaggccaacagctacaacgtcgacctg tceaacagcaccggcaccctggagttcgagctggtgtacgccgtcaacaceaeccagacga tctccaagtccgtgttcgcggacctctccctctggttcaagggcctggaggaccccgagga gtacctccgcatgggcttcgaggtgtccgcgtcctccttcttcctggaccgcgggaacagc aaggtgaagttcgtgaaggagaacccctacttcaccaaccgcatgagcgtgaacaaccagc ccttcaagagcgagaacgacctgtcctactacaaggtgtacggcttgctggaccagaacat cetggagctgtacttcaacgacggcgacgtcgtgtccaccaacacetacttcatgaccacc gggaacgccctgggctccgtgaacatgacgacgggggtggacaacctgttctacatcgaca agttccaggtgcgcgaggtcaagT(¾caattggcagcagcagctcggatagtatcgacaca ctctggacqctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaat atccct ccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgc gagttgctagetgettgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttcectcgtttc atatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctc ctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggt actgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgqqaagtagtgggatgggaacac aaatggaggatcccgcgtctcqaacaqaqcqcqcaqaqqaacqctqaaqqtctcqcctctq tcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtc cattagcgaagcgtccggttcacacacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgat cqgtggagctgatggtcgaaacgttcacaqcctaqqqatatcgaattc|cttt ttgcgcta¡ tgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaaca\ ccgatgatgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctq cagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgcaaagacattatagcgagctacc aaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtga t\ cgcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaaqactcqt.

ATGGCACCGACCAGCCTGCTTGCCAGTACTGGCGTCTCTTCCGCTTCTCTGTGGTCCTCTG CGCGCTCCAGCGCGTGCGCTTTTCCGGTGGATCATGCGGTCCGTGGCGCACCGCAGCGGCC GCTGCCCATGCAGCGCCGCTGCTTCCGAACAGTGGCGGTCAGGGCCGCACCCGCGGTAGCC GTCCGTCCGGAACCCGCCCAAGAGTTTTGGGAGCAGCTTGAGCCCTGCAAGATGGCGGAGG ACAAGCGCATCTTCCTGGAGGAGCACCGGTGCGTGGAGGTCCGGGGCTGACCGGCCGTCGC ATTCAACGTAATCAATCGCATGATGATCAGAGGACACGAAGTCTTGGTGGCGGTGGCCAGA AACACTGTCCATTGCAAGGGCATAGGGATGCGTTCCTTCACCTCTCATTTCTCATTTCTGA ATCCCTCCCTGCTCACTCTTTCTCCTCCTCCTTCCCGTTCACGCAG arrCGGGGCaACgA GGTGGGCCOGTGCTCCTCCAGGAAGATGCGCTTGTCCTCCGCCATCTTGCAGGGCTCAAGC TGCTCCCAAAACTCTTGGGCGGGTTCCGGACGGACGGCTACCGCGGGTGCGGCCCTGACCG CCACTGTTCGGAAGCAGCGGCGCTGCATGGGCAGCGGCCGCTGCGGTGCGCCACGGACCGC ATGATCCACCGGAAAAGCGCACGCGCTGGAGCGCGCAGAGGACCACAGAGAAGCGGAAGAG ACGCCAGTACTGGCAAGCAGGCTGGTCGGTGCCATatcgataqatctcttaaqqcaqcagc agctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccqccacac ttgctgccttgacctgtqaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgat cttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctqcttqtqctatttgcgaataccaccccc agcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacqctqtcc tgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttggg ctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgg gaagtagtgggatgggaacacaaatggaaagcttaattaag_ag_ctcttgttttccagaagg agttgctccttgagcctttcattctcagcctcgataacctccaaagccgctctaattgtgg agggggttcgaatttaaaagcttggaatgttggttcgtgcgtctggaacaagcccagactt gttgctcactgggaaaaggaccatcagctccaaaaaacttgccgctcaaaccgcgtacctc tgctttcgcgcaatctgccctgttgaaatcgccaccacattcatattgtgacgcttgagca gtctgtaattgcctcagaatgtggaatcatctgccccctgtgcgagcccatgccaggcatg tcgcgggcgaggacacccgccactcgtacagcagaccattatgctacctcacaatagttca taacagtgaccatatttctcgaagctccccaacgagcacctccatgctctgagtggccacc ccccggccctggtgcttgcggagggcaggtcaaccggcatggggctaccgaaatccccgac cggatcccaccacccccgcgatgggaagaatctctccccgggatgtgggcccaccaccagc acaacctgctggcccaggcgagcgtcaaaccataccacacaaatatccttggcatcggccc tgaattccttctgccgctctgctacccggtgcttctgtccgaagcaggggttgctagggat cgctccgagtccgcaaacccttgtcgcgtggcggggcttgttcgagcttg_aag_ag_c La expresión de 6S : : ß-Tub : suc2 : nr : : ß-tub : hairpin FatA:nr::6S conduce a la formación de un ARN horquillado para silenciar los productos génicos FatA diana. Tras la transformación del constructo 6S : : ß-Tub : suc2 : nr : : ß-tub:hairpin FatA:nr::6S en la cepa A, se seleccionaron los clones positivos en placas de agar que comprendían sacarosa como única fuente de carbono. Los transformantes primarios se purificaron por clones y se cultivaron en condiciones estándar para la producción de lípidos a un pH de 5.0 y se prepararon muestras lipídicas a partir de la biomasa seca de cada transformante. Se determinaron los perfiles de ácidos grasos utilizando métodos de transesterificación directa según se ha descrito en el Ejemplo 11. En la Tabla 68 se presentan los perfiles de ácidos grasos resultantes (expresados como % de área de los ácidos grasos totales) de un grupo de clones representativos obtenidos a partir de las transformaciones comparados con los de un control de la cepa A no transformado.

Tabla 68. Perfiles de ácidos grasos de células de Prototheca moriformis que contenían un constructo de ARN horquillado para reducir la expresión de FATA.

Transformante % de % de % de % de % de % de % de % de C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C16:l C18:0 C18:l C18:2 No transformada 0.01 0.03 1.23 25.68 0.96 2.83 60.54 7.52 Transformante 10.01 0.03 0.71 15.10 1.05 1.67 72.08 8.27 Transformante 20.01 0.03 0.81 15.66 1.16 1.56 70.03 9.61 Transformante 30.01 0.03 1.09 22.67 1.05 2.12 63.18 8.66 Transformante 40.01 0.04 1.14 23.31 1.01 2.23 62.83 8.26 Los datos presentados en la Tabla 68 muestran un claro efecto de la expresión de un constructo de ARN horquillado de FATA sobre el perfil de ácidos grasos C16 y C18:l del organismo huésped. Los perfiles de ácidos grasos de los transformantes de la cepa A que comprendían el constructo de ARN horquillado de FATA presentaron un incremento del porcentaje de ácidos grasos C18:l con una disminución concomitante de ácidos grasos C16. Estos datos ilustran la expresión y el uso con éxito de un constructo polinucleotidico de ARN horquillado de FATA en Prototheca moriformis para alterar el perfil de ácidos grasos de microbios huésped modificados y, en particular, para incrementar la concentración de ácidos grasos C18:l y reducir los ácidos grasos C16 en células microbianas.

EJEMPLO 21: Modificación de Chlorella sorokinian La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Chlorella sorokinian se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Dawson et al según se expone en la presente. Resumiendo, Dawson et al., Current Microbiology, Vol. 35 (1997) págs. 356-362, han descrito la transformación nuclear estable de Chlorella sorokiniana con ADN plasmidico. Utilizando el método de transformación de bombardeo con microproyectiles , Dawson introdujo el plásmido pSV72-NRg, que codifica el gen entero de la nitrato-reductasa de Chlorella vulgaris (NR, N.° de acceso a GenBank U39931), en Chlorella sorokiniana mutante (mutantes NR) . Los mutantes NR son incapaces de crecer sin el uso de nitrato como fuente de nitrógeno. La nitrato-reductasa cataliza la conversión de nitrato en nitrito. Antes de la transformación, los mutantes NR de Chlorella sorokiniana eran incapaces de crecer más allá del estadio de microcolonia en un medio de cultivo que comprendiera nitrato (?03~) como única fuente de nitrógeno. La expresión del producto génico NR de Chlorella vulgaris en un mutante NR de Chlorella sorokiniana se utilizó como marcador selecciónatele para resolver la deficiencia metabólica de nitrato. Tras la transformación con el plásmido pSV72-NRg, se obtuvieron mutantes NR de Chlorella sorokiniana que expresaban de forma estable el producto génico NR de Chlorella vulgaris y que eran capaces de crecer más allá del estadio de microcolonia en placas de agar que comprendían nitrato como única fuente de carbono. La evaluación del ADN de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern y la evaluación del ARN de los transformantes estables se realizó mediante la protección de ARNasa. La selección y el mantenimiento de Chlorella sorokiniana transformada (mutante NR) se realizó en placas de agar (pH 7.4) que comprendían 0.2 g/L de gS04, 0.67 g/L de KH2PO4, 3.5 g/L de K2HP04, 1.0 g/L de Na3C6H507 -H20 y 16.0 g/L de agar, una fuente adecuada de nitrógeno (p. ej . , N03") , micronutrientes y una fuente de carbono. Dawson también describió la propagación de Chlorella sorokiniana y mutantes NR de Chlorella sorokiniana en un medio de cultivo liquido. Dawson describió que el plásmido pSV72-NRg y el promotor y 3' UTR/terminador del gen de la nitrato-reductasa de Chlorella vulgaris eran adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en mutantes NR de Chlorella sorokiniana . Dawson también describió que la expresión del producto génico de la nitrato-reductasa de Chlorella vulgaris era adecuada para utilizar como marcador seleccionable en los mutantes NR de Chlorella sorokiniana .

En una realización de la presente invención, se construye el vector pSV72-NRg, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico de la nitrato-reductasa de Chlorella vulgaris (CVNR) para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la via de biosintesis de lipidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la via de biosintesis de lipidos codifica una o más proteínas de la via de biosintesis de lipidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Chlorella sorokiniana para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Chlorella sorokiniana de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosintesis de lípidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor CvNR antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a 3'UTR de CVNR/terminador en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Chlorella sorokiniana para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosintesis de lípidos endógenos. La transformación estable de Chlorella sorokiniana con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen el bombardeo con microproyectiles u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico CvNR se puede utilizar como marcador seleccionable para resolver la deficiencia de la asimilación de nitrógeno por parte de cepas mutantes NR de Chlorella sorokiniana y para seleccionar los mutantes NR de Chlorella sorokiniana que expresen de forma estable el vector de transformación. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lípidos por parte de Chlorella sorokiniana incluyen, sin carácter limitante, 0.5 g/L de KH2P04, 0.5 g/L de K2HP04, 0.25 g/L de gS04-7H20, con micronutrientes complementarios y las fuentes de carbono y nitrógeno adecuadas (Patterson, Lipids Vol .5 : 7 (1970), págs . 597-600). La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lípidos de Chlorella sorokiniana se puede determinar mediante la extracción de lípidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLOS 22-4 : Introducción y tablas Los Ejemplos 22-44 a continuación describen la modificación de varios microorganismos de acuerdo con la presente invención. Para alterar el perfil de ácidos grasos de un microorganismo, los microorganismos se pueden modificar genéticamente de manera que las enzimas de la vía de biosíntesis de lípidos exógenas o endógenas se expresen, sobreexpresan o atenúen. Los pasos para modificar genéticamente un microbio con el fin de alterar su perfil de ácidos grasos, por ejemplo, para alterar el grado de insaturación de los ácidos grasos y para reducir o incrementar la longitud de cadena de los ácidos grasos, comprenden el diseño y la construcción de un vector de transformación (p. ej . , un plásmido) , la transformación del microbio con uno o más vectores, la selección de los microbios transformados (transformantes), el crecimiento del microbio transformado y el análisis del perfil de ácidos grasos de los lipidos producidos por el microbio modificado.

Los transgenes que alteran los perfiles de ácidos grasos de los organismos huésped se pueden expresar en numerosos microbios eucariotas. En la bibliografía científica se pueden encontrar ejemplos de expresión de transgenes en microbios eucariotas, que incluyen Chlamydomonas reinhardtii , Chlorella ellipsoidea, Chlorella saccarophila , Chlorella vulgaris, Chlorella kessleri, Chlorella sorokiniana, Haematococcus pluvlalls, Gonium pectorale, Volvox cartera, Dunaliella tertiolecta, Dunaliella viridis, Dunaliella salina, complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale, Nannochloropsis sp., Thalassiosira pseudonana, Phaeodactylum tricornutum, Navícula saprophila, Cylindrotheca fusiformis, Cyclotella cryptica , Symbiodinium microadriacticum , Amphidinium sp. , Chaetoceros sp. , Mortierella alpina y Yarrowia lipolytica. Estas técnicas de expresión se pueden combinar con el contenido de la presente invención para producir microorganismos modificados con perfiles de ácidos grasos alterados .

Los transgenes que alteran los perfiles de ácidos grasos de los organismos huésped también se pueden expresar en numerosos microbios procariotas. En la bibliografía se pueden encontrar ejemplos de expresión de transgenes en microbios oleaginosos, que incluyen Rhodococcus opacus. Estas técnicas de expresión se pueden combinar con el contenido de la presente invención para producir microorganismos modificados con perfiles de ácidos grasos alterados.

Tablas 69A-D. Lista de preferencias de codo Tabla 70. Proteínas de la vía de biosíntesis de lípidos. 3-Cetoacil-ACP-sintasa 3-Cetoacil-ACP-sintasa de Cuphea hookeriana (N.° de acceso a GenBank AAC68861.1), beta-cetoacil-ACP-sintasa II de Cuphea wrightii (N.° de acceso a GenBank AAB37271.1), beta-cetoacil-ACP-sintasa IV de Cuphea lanceolata (N.° de acceso a GenBank CAC59946.1), beta-cetoacil-ACP-sintasa II de Cuphea wrightii (N.° de acceso a GenBank AAB37270.1), cetoacil-ACP-sintasa de Ricinus communis (N.° de acceso a GenBank XP_002516228 ) , cetoacil-ACP-sintasa de Gossypium hirsutum (N.° de acceso a GenBank ADK23940.1), 3-cetoacil-ACP-sintasa II-A del plástido de Glycine max (N.° de acceso a GenBank AAW88763.1), beta-cetoacil-ACP-sintasa II de Elaeis guineensis (N.° de acceso a GenBank AAF26738.2), 3-cetoacil-ACP-sintasa I del plástido de Helianthus annuus (N.° de acceso a GenBank ABM53471.1), 3-cetoacil-ACP-sintasa I de Glycine max (N.° de acceso a GenBank NP_001238610.1) , 3-cetoacil-ACP-sintasa II del plástido de Helianthus annuus (N.° de acceso a GenBank ABI18155.1), beta-cetoacil-ACP-sintetasa 2 de Brassica napus (N.° de acceso a GenBank AAF61139.1), beta-cetoacil-ACP-sintasa II de Perilla frutescens (N.° de acceso a GenBank AAC04692.1), beta-cetoacil-ACP-sintasa II de Helianthus annus (N.° de acceso a GenBank ABI18155 , beta-cetoacil-ACP-sintasa II de Ricinus communis (N.° de acceso a GenBank AAA33872) , beta-cetoacil-proteina portadora de acilo-sintasa de Haematococcus pluvialis (N.° de acceso a GenBank HM560033.1), cetoacil-ACP-sintasa I de Jatropha curcasbeta (N.° de acceso a GenBank ABJ90468.1), beta-cetoacil-ACP-sintasa I de Populus trichocarpa (N.° de acceso a GenBank XP_002303661.1 ) , beta-cetoacil-ACP-sintetasa I de Coríandrum sativum (N.° de acceso a GenBank AAK58535.1), 3-oxoacil- [proteina portadora de acilo] -sintasa I de Arabidopsis thaliana (N.° de acceso a GenBank NP_001190479.1 ) , 3-oxoacil- [proteina portadora de acilo] -sintasa I de Vitis vinifera (N.° de acceso a GenBank XP_002272874.2) Acil graso-ACP-tioesterasas Acil graso-ACP-tioesterasa de Umbellularia californica (N.° de acceso a GenBank AAC49001), acil graso-ACP-tioesterasa de Cinnamomum camphora (N.° de acceso a GenBank Q39473) , acil graso-ACP-tioesterasa de Umbellularia californica (N.° de acceso a GenBank Q41635), acil graso-ACP-tioesterasa de Myristica fragrans (N.° de acceso a GenBank AAB71729) , acil graso-ACP-tioesterasa de Myristica fragrans (N.° de acceso a GenBank AAB71730), acil graso-ACP-tioesterasa de Elaeis guineensis (N.° de acceso a GenBank ABD83939) , acil graso-ACP-tioesterasa de Elaeis guineensis (N.° de acceso a GenBank AAD42220), acil graso-ACP-tioesterasa de Populus tomentosa (N.° de acceso a GenBank ABC47311), acil graso-ACP-tioesterasa de Arabidopsis thaliana (N.° de acceso a GenBank NP_172327), acil graso-ACP-tioesterasa de Arabidopsis thaliana (N.° de acceso a GenBank CAA85387), acil graso-ACP-tioesterasa de Arabidopsis thaliana (N.° de acceso a GenBank CAA85388), acil graso-ACP-tioesterasa de Gossypium hirsutum (N.° de acceso a GenBank Q9SQI3), acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea lanceolata (N.° de acceso a GenBank CAA54060), acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana (N.° de acceso a GenBank AAC72882), acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea calophylla subsp. mesostemon (N.° de acceso a GenBank ABB71581), acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea lanceolata (N.° de acceso a GenBank CAC19933), acil graso-ACP-tioesterasa de Elaeis guineensis (N.° de acceso a GenBank AAL15645), acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana (N.° de acceso a GenBank Q39513) , acil graso-ACP-tioesterasa de Gossypium hirsutum (N.° de acceso a GenBank AAD01982), acil graso-ACP-tioesterasa de Vitis vinifera (N.° de acceso a GenBank CAN81819) , acil graso-ACP-tioesterasa de Garcinia mangostana (N.° de acceso a GenBank ???51525) , acil graso-ACP-tioesterasa de Brassica júncea (N.° de acceso a GenBank ABI18986) , acil graso-ACP-tioesterasa de Madhuca longifolia (N.° de acceso a GenBank AAX51637), acil graso-ACP-tioesterasa de Brassica napus (N.° de acceso a GenBank ABH11710), acil graso-ACP-tioesterasa de Brassica napus (N.° de acceso a GenBank CAA52070.1), acil graso-ACP-tioesterasa de Oryza sativa (grupo de cultivar indica) (N.° de acceso a GenBank EAY86877) , acil graso-ACP-tioesterasa de Oryza sativa (grupo de cultivar japónica) (N.° de acceso a GenBank NP_001068400) , acil graso-ACP-tioesterasa de Oryza sativa (grupo de cultivar indica) (N.° de acceso a GenBank EAY99617), acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana (N.° de acceso a GenBank AAC49269) , acil graso-ACP-tioesterasa de Ulmus Americana (N.° de acceso a GenBank AAB71731) , acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea lanceolata (N.° de acceso a GenBank CAB60830), acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea palustris (N.° de acceso a GenBank AAC49180) , acil graso-ACP-tioesterasa de Jris germánica (N.° de acceso a GenBank AAG43858, acil graso-ACP-tioesterasa de Iris germánica (N.° de acceso a GenBank AAG43858.1), acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea palustris (N.° de acceso a GenBank AAC49179) , acil graso-ACP-tioesterasa de Myristica fragrans (N.° de acceso a GenBank AAB71729) , acil graso-ACP-tioesterasa de Myristica fragrans (N.° de acceso a GenBank AAB717291.1) , acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana (N.° de acceso a GenBank U39834), acil graso-ACP-tioesterasa de Umbelluaria californica (N.° de acceso a GenBank M94159) , acil graso-ACP-tioesterasa de Cinnamomum camphora (N.° de acceso a GenBank U31813) , acil graso-ACP-tioesterasa de Ricinus communis (N.° de acceso a GenBank ABS30422.1), acil-ACP-tioesterasa de Helianthus annuus (N.° de acceso a GenBank AAL79361.1), acil-ACP-tioesterasa de Jatropha curcas (N.° de acceso a GenBank ABX82799.3), oleoil-proteina portadora de acilo-tioesterasa de Zea mays (N.° de acceso a GenBank ACG40089.1), acil graso-ACP-tioesterasa de Haematococcus pluvialis (N.° de acceso a GenBank HM560034.1) Enzimas desaturasas Desaturasa de ácidos grasos 3C de Linum usitatissimum, (N.° de acceso a GenBank ADV92272.1), desaturasa de ácidos grasos omega 3 de Ricinus communis del retículo endoplasmático, putativa (N.° de acceso a GenBank EEF36775.1), desaturasa de ácidos grasos omega 3 de Vernicia fordii (N.° de acceso a GenBank AAF12821), isoforma 2 de la desaturasa de ácidos grasos omega 3 del cloroplasto de Glycine max (N.° de acceso a GenBank ACF19424.1), desaturasa omega 3 FAD-D de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 221), linoleato-desaturasa de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 220), desaturasa delta 12 de Carthamus tinctorius, (N.° de acceso a GenBank ADM48790.1), desaturasa omega 6 Gossypium hirsutum, (N.° de acceso a GenBank CAA71199.1), desaturasa microsomal de Glycine max (N.° de acceso a GenBank BAD89862.1), desaturasa de ácidos grasos de Zea mays (N.° de acceso a GenBank ABF50053.1), ácido linoleico-desaturasa de Brassica napa (N.° de acceso a GenBank AAA32994.1) , desaturasa omega 3 de Camelina sativa (SEQ ID NO: 214), alelo 2 de la desaturasa delta 12 de Prototheca moriformis (SEQ ID NO: 212), FAD7-1 omega 3 de Camelina sativa (SEQ ID NO: 215) , estearoil-ACP-desaturasa de Helianthus annuus, (N.° de acceso a GenBank AAB65145.1), estearoil-ACP-desaturasa de Ricinus communis (N.° de acceso a GenBank AACG59946.1 ) , delta-9-estearoil-ACP-desaturasa plastídica de Brassica júncea (N.° de acceso a GenBank AAD40245.1), estearoil-ACP-desaturasa de Glycine max (N.° de acceso a GenBank ACJ39209.1), estearoil-ACP-desaturasa de Olea europaea (N.° de acceso a GenBank AAB67840.1), estearoil-proteina portadora de acilo-desaturasa de Vernicia fordii (N.° de acceso a GenBank ADC32803.1), desaturasa de ácidos grasos delta 12 de Descurainia sophia (N.° de acceso a GenBank ABS86964.2), desaturasa de ácido oleico delta 12 de Euphorbia lagascae (N.° de acceso a GenBank AAS57577.1), desaturasa de ácidos grasos delta 12 de Chlorella vulgaris (N.° de acceso a GenBank ACF98528), desaturasa de ácidos grasos omega 3 de Chlorella vulgaris (N.° de acceso a GenBank BAB78717), desaturasa de ácidos grasos omega 3 de Haematococcus pluvialis (N.° de acceso a GenBank HM560035.1) , estearoil-ACP-desaturasa de Haematococcus pluvialis (N.° de acceso a GenBank EF586860.1), estearoil-ACP-desaturasa de Haematococcus pluvialis (N.° de acceso a GenBank EF523479.1) Enzimas oleato 12-hidroxilasa Oleato 12-hidroxilasa de Ricinus communis (N.° de acceso a GenBank AAC49010.1), oleato 12-hidroxilasa de Physaria lindheimeri (N.° de acceso a GenBank ABQ01458.1), oleato 12-hidroxilasa bifuncional mutante de Physaria lindheimeri (N.° de acceso a GenBank ACF17571.1), oleato 12-hidroxilasa : desaturasa bifuncional de Physaria lindheimeri (N.° de acceso a GenBank ACQ42234.1), oleato 12- hidroxilasa : desaturasa bifuncional de Physaria lindheimeri (N.° de acceso a GenBank AAC32755.1), Arabidopsis lyrata subsp. Lyrata (N.° de acceso a GenBank XP_002884883.1) EJEMPLO 22 : Modificación de Chlorella vulgarIs La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Chlorella vulgaris se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Chow y Tung et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Chow y Tung et al., Plant Cell Reports, Volumen 18 (1999), págs. 778-780, han descrito la transformación nuclear estable de Chlorella vulgaris con ADN plasmidico. Utilizando el método de transformación de electroporación, Chow y Tung introdujeron el plásmido pIG121-Hm (N.° de acceso a GenBank AB489142) en Chlorella vulgaris . La secuencia de nucleótidos de pIG121-Hm comprendía una secuencia que codificaba un producto génico marcador de beta-glucuronidasa (GUS) unido operablemente a un promotor 35S de CaMV antes de la secuencia codificante de proteínas de GUS y unido operablemente además a la región 3' UTR/terminador del gen de la nopalina-sintasa (nos) situado después de la secuencia codificante de proteínas de GUS. La secuencia del plásmido pIG121-Hm comprendía además un cásete de resistencia al antibiótico higromicina B. El cásete de resistencia al antibiótico higromicina B comprendía un promotor 35S de CaMV unido operablemente a una secuencia que codificaba el producto génico de la higromicina-fosfotransferasa (hpt, N.° de acceso a GenBank BAH24259) . Antes de la transformación, Chlorella vulgaris era incapaz de propagarse en un medio de cultivo que comprendiera 50 g/ml de higromicina B. Después de la transformación con el plásmido pIG121-Hm, se obtuvieron transformantes de Chlorella vulgaris que se propagaron en un medio de cultivo que comprendía 50 g/ml de hirgromicina B. La expresión del producto génico hpt en Chlorella vulgaris permitió la propagación de Chlorella vulgaris transformada en presencia de 50 µg/mL de hirgromicina B, de este modo se estableció la utilidad de un cásete de resistencia a higromicina B como marcador seleccionable para su uso en Chlorella vulgaris . La actividad detectable del gen marcador GUS indicó que el promotor 35S de CaMV y nos 3'UTR eran adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en Chlorella vulgaris . La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. La selección y el mantenimiento de Chlorella vulgaris transformada se realizó en placas de agar que comprendían medio YA (agar y 4 g/L de extracto de levadura) . La propagación de Chlorella vulgaris en medio de cultivo líquido se llevó a cabo según describen Chow y Tung. La propagación de Chlorella vulgaris en medios que no sean el medio YA ha sido descrita (por ejemplo, remítase a Chader et al., Revue des Energies Renouvelabes, Volumen 14 (2011), págs . 21-26 e IIlman et al., Enzyme and Microbial Technology, Vol . 27 (2000), págs. 631-635). Chow y Tung han descrito que el plásmido pIG121-Hm, el promotor 35S de CaMV y la región 3' UTR/terminador del gen de la nopalina-sintasa de Agrobacterium turnefaciens son adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en Chlorella vulgaris . Además, Chow y Tung han descrito que el cásete de resistencia a higromicina B era adecuado para el uso como marcador seleccionable en Chlorella vulgaris. En Chader et al., Revue des Energies Renouvelabes, Volumen 14 (2011), págs. 21-26 se han descrito otros plásmidos, promotores, regiones 3' UTR/terminadores y marcadores seleccionables adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en Chlorella vulgaris .

En una realización de la presente invención, se construye pIG121-Hm, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico de la higromician B para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lípidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la via de biosíntesis de lípidos codifica una o más proteínas de la vía de biosíntesis de lípidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Chlorella vulgaris para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Chlorella vulgaris de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosíntesis de lípidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor 35S de CaMV antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a la región 3' UTR/terminador del gen de la nopalina-sintasa de Agrobacterium turnefaciens en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Chlorella vulgaris para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosíntesis de lípidos endógenos. La transformación estable de Chlorella vulgaris con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen la electroporación u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico de resistencia a higromicina B se puede utilizar como marcador para seleccionar Chlorella vulgaris transformada con el vector de transformación en medio agar que comprenda higromicina, pero no se limita a este medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lipidos por parte de Chlorella vulgaris incluyen, sin carácter limitante, el medio BG11 (0.04 g/L de KH2P04, 0.075 g/L de CaCl2, 0.036 g/L de ácido cítrico, 0.006 g/L de citrato férrico de amonio, 1 mg/L de EDTA y 0.02 g/L de Na2C03) complementado con metales traza y opcionalmente 1.5 g/L de NaNC>3. Otros medios adecuados para cultivar Chlorella vulgaris para la producción de lipidos incluyen, por ejemplo, el medio atanabe (que comprende 1.5 g/L de KN03, 1.25 g/L de KH2P0 , 1.25 g L"1 de MgS04 -7H20, 20 mg L"1 de FeS04 -7H20 con micronutrientes y un medio con un contenido bajo de nitrógeno (que comprende 203 mg/L de (NH4)2HP04, 2.236 g/L de KC1, 2.465 g/L de MgS04, 1.361 g/L de KH2P04 y 10 mg/L de FeS04) según describen Illman et al., Enzyme and Microbial Technology, Vol . 27 (2000), págs 631-635. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Chlorella vulgaris se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 23: Modificación de Chlorella ellipsoidea La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Chlorella ellipsoidea se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Chen et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Chen et al., Current Genetics, Vol. 39:5 (2001), págs. 365-370, han descrito la transformación estable de Chlorella ellipsoidea con ADN plasmidico. Utilizando el método de transformación de electroporación, Chen introdujo el plásmido pBinUQNP-l en Chlorella ellipsoidea. La secuencia de nucleótidos de pBinUQNP-l comprendía una secuencia que codificaba el producto génico de conejo del péptido neutrófilo 1 (NP-1) unida operablemente a un promotor del gen de la ubiquitina (ubil) de Zea mays antes de la región codificante de proteínas de NP-1 y unida operablemente a la región 3' UTR/terminador del gen de la nopalina-sintasa (nos) después de la región codificante de proteínas de NP-1. La secuencia del plásmido pBinUQNP-l comprendía además un cásete de resistencia al antibiótico G418. Este cásete de resistencia al antibiótico G418 comprendía una secuencia que codifica el producto génico de aminoglicósido-3' -fosfotransferasa {aph 3'). El producto génico aph 3' confiere resistencia al antibiótico G418. Antes de la transformación, Chlorella ellipsoidea era incapaz de propagarse en un medio de cultivo que comprendiera 30 g/mL de G418. Después de la transformación con el plásmido pBinUQNP-l, se obtuvieron transformantes de Chlorella ellipsoidea que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía 30 µg/mL de G418. La expresión del producto génico aph 3' en Chlorella ellipsoidea permitió la propagación de Chlorella ellipsoidea transformada en presencia de 30 pg/mL de G418, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al antibiótico G418 como marcador seleccionable para su uso en Chlorella ellipsoidea . La actividad detectable del producto génico NP-1 indicó que el promotor ubil y nos 3'UTR eran adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en Chlorella ellipsoidea . La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. La selección y el mantenimiento de Chlorella ellipsoidea transformada se realizó en medio Knop (que comprendía 0.2 g/L de K2HP04, 0.2 g/L de MgS04 -7H20, 0.12 g/L de KC1 y 10 mg/L de FeCl3, pH 6.0-8.0 complementado con un 0.1% de extracto de levadura y un 0.2% de glucosa) con 15 µg/mL de G418 (para cultivos líquidos) o con 30 µg/mL de G418 (para cultivos sólidos que comprendían un 1.8% de agar) . La propagación de Chlorella ellipsoidea en medios que no sean el medio Knop ha sido descrita (remítase a Cho et al., Fisheries Science, Vol. 73:5 (2007), págs . 1050-1056, Jarvis y Brown, Current Genetics, Vol. 19 (1991), págs. 317-321 y Kim et al., Marine Biotechnology, Vol. 4 (2002), págs. 63-73). Se han descrito otros plásmidos, promotores, regiones 3' UTR/terminadores y marcadores seleccionables adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en Chlorella ellipsoidea (remítase a Jarvis y Brown y Kim et al., Marine Biotechnology, Vol. 4 (2002), págs.63-73). Chen ha descrito que el plásmido pBinUQNP-l, el promotor ubil y la región 3 ' UTR/terminador del gen de la nopalina-sintasa de Agrobacterium turnefaciens son adecuados para permitir la expresión génica exógena en Chlorella ellipsoidea. Además, Chen ha descrito que el cásete de resistencia a G418 codificado en pBinUQNP-l era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Chlorella ellipsoidea.

En una realización de la presente invención, se construye el vector ?????O??-l, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico aph 3' , que confiere resistencia a G418, para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lípidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la vía de biosintesis de lípidos codifica una o más proteínas de la vía de biosintesis de lípidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Chlorella ellipsoidea para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Chlorella ellipsoidea de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosintesis de lípidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor ubil de Zea mays antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a la región 3' UTR/terminador del gen de la nopalina-sintasa de Agrobacterium turnefaciens en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Chlorella ellipsoidea para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosintesis de lípidos endógenos. La transformación estable de Chlorella ellipsoidea con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen la electroporación u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico aph 3' se puede utilizar como marcador para seleccionar Chlorella ellipsoidea transformada con el vector de transformación en medio de agar Knop que comprenda G 18, pero no se limita a este medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lipidos por parte de Chlorella ellipsoidea incluyen, sin carácter limitante, el medio Knop y los medios de cultivo descritos por Jarvis y Brown y Kim et al. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Chlorella ellipsoidea se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 24: Modificación de Chlorella kessleri La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Chlorella kessleri se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por El-Sheekh et al. según se expone en la presente. Resumiendo, El-Sheekh et al., Biología Plantarium, Vol . 42:2 (1999), págs. 209-216, han descrito la transformación estable de Chlorella kessleri con ADN plasmídico. Utilizando el método de transformación de bombardeo con microproyectiles, El-Sheekh introdujo el plásmido pBI121 (N.° de acceso a GenBank AF485783) en Chlorella kessleri. El plásmido pBI121 comprendía un cásete de resistencia a los antibióticos kanamicina/neomicina . Este cásete de resistencia a los antibióticos kanamicina/neomicina comprendía el promotor del gen de la nopalina-sintasa {nos) de Agrobacterium turnefaciens , una secuencia que codificaba el producto génico de neomicina-fosfotransferasa II (nptil) (N.° de acceso a GenBank AAL92039) para la resistencia a kanamicina y G418, y la región 3' UTR/terminador del gen de la nopalina-sintasa [nos) de Agrobacterium turnefaciens . pBI121 comprendía además una secuencia que codificaba un producto génico marcador de beta-glucuronidasa (GUS) unida operablemente a un promotor 35S de CaMV y unida operablemente a una región 3' UTR/terminador del gen nos. Antes de la transformación, Chlorella kessleri era incapaz de propagarse en un medio de cultivo que comprendiera 15 g/mL de kanamicina. Tras la transformación con el plásmido pBI121, se obtuvieron transformantes de Chlorella kessleri que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía 15 mg/L de kanamicina. La expresión del producto génico nptil en Chlorella kessleri permitió la propagación en presencia de 15 mg/L de kanamicina, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia a los antibióticos kanamicina/neomicina como marcador seleccionable para su uso en Chlorella kessleri. La actividad detectable del producto génico GUS indicó que el promotor 35S de CaMV y nos 3'UTR eran adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en Chlorella kessleri. La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. Según describe El-Sheekh, la selección y el mantenimiento de Chlorella kessleri transformada se llevó a cabo en placas de agar semisólido que comprendían medio YEG (un 1% de extracto de levadura, un 1% de glucosa) y 15 mg/L de kanamicina. El-Sheekh también describió la propagación de Chlorella kessleri en medio de cultivo YEG líquido. Otros medios adecuados para cultivar Chlorella kessleri para la producción de lípidos se describen en Sato et al., BBA Molecular and Cell Biology of Lipids, Vol. 1633 (2003), págs . 27-34. El-Sheekh ha descrito que el plásmido pBI121, el promotor de CaMV y la región 3 ' UTR/terminador del gen de la nopalina-sintasa son adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en Chlorella kessleri. Además, El-Sheekh ha descrito que el cásete de resistencia a kanamicina/neomicina codificado en pBI121 era adecuado para el uso como marcador seleccionable en Chlorella kessleri .

En una realización de la presente invención, se construye el vector pBI121, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico de resistencia a kanamicina/neomicina para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosintesis de lipidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la via de biosintesis de lipidos codifica una o más proteínas de la vía de biosintesis de lipidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Chlorella kessleri para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Chlorella kessleri de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteina de la vía de biosintesis de lipidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor 35S de CaMV antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a la región 3 ' UTR/terminador del gen de la nopalina-sintasa de Agrobacterium turnefaciens en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Chlorella kessleri para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosintesis de lípidos endógenos. La transformación estable de Chlorella kessleri con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen el bombardeo con microproyectiles u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico nptll se puede utilizar como marcador para seleccionar Chlorella kessleri transformada con el vector de transformación en medio de agar YEG que comprenda kanamicina o neomicina, pero no se limita a este medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lípidos por parte de Chlorella kessleri incluyen, sin carácter limitante, el medio YEG y los medios de cultivo descritos por Sato et al. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lípidos de Chlorella kessleri se puede determinar mediante la extracción de lípidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 25: Modificación de Dunallella. tertxolecta La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Dunaliella tertxolecta se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por alker et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Walker et al., Journal of Applied Phycology, Vol. 17 (2005), págs . 363-368, han descrito la transformación nuclear estable de Dunaliella tertiolecta con ADN plasmídico. Utilizando el método de transformación de electroporacion, Walker introdujo el plásmido pDbleFLAG1.2 en Dunaliella tertiolecta. pDbleFLAG1.2 comprendía una secuencia que codificaba un cásete de resistencia al antibiótico bleomicina, que comprendía la secuencia que codificaba la proteína de unión a bleomicina (ble) de Streptoalloteichus hindustanus, para la resistencia al antibiótico fleomicina, unida operablemente al promotor y la región 3' UTR del gen de subunidad pequeña de la ribulosa-1 , 5-bisfosfato-carboxilasa/oxigenasa de Dunaliella tertiolecta. (rhcSl, N.° de acceso a GenBank AY530155). Antes de la transformación, Dunaliella tertiolecta era incapaz de propagarse en un medio de cultivo que comprendiera 1 mg/L de fleomicina. Tras la transformación con el plásmido pDbleFLAGl .2 , se obtuvieron transformantes de Dunaliella tertiolecta que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía 1 mg/L de fleomicina. La expresión del producto génico ble en Dunaliella tertiolecta permitió la propagación en presencia de 1 mg/L de fleomicina, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al antibiótico bleomicina como marcador seleccionable para su uso en Dunaliella tertiolecta . La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. Según describe Walker, la selección y el mantenimiento de Dunaliella tertiolecta transformada se llevó a cabo en el medio Dunaliella (DM, según describen Provasoli et al., Archiv fur Mikrobiologie, Vol. 25 (1957), págs . 392-428) que comprendía además 4.5 g/L de NaCl y 1 mg/L de feomicina. Otros medios adecuados para cultivar Dunaliella tertiolecta para la producción de lípidos se describen en Takagi et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 101:3 (2006), págs. 223-226 y en Massart y Hanston, Proceedings Venice 2010, Third International Symposium on Energy from Biomass and Waste. Walker describió que el plásmido pDbleFLAG1.2 y el promotor y la región 3' UTR del gen de subunidad pequeña de la ribulosa-1 , 5-bisfosfato-carboxilasa/oxigenasa de Dunaliella tertiolecta eran adecuados para permitir la expresión heteróloga en Dunaliella tertiolecta. Además, Walker ha descrito que el cásete de resistencia a bleomicina codificado en pDbleFLAG1.2 era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Dunaliella tertiolecta.

En una realización de la presente invención, se construye el vector pDbleFLAGl .2 , que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico ble para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lípidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lípidos codifica una o más proteínas de la vía de biosíntesis de lípidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Dunaliella tertiolecta para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Dunaliella tertiolecta de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosíntesis de lípidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor rbcSl antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a 3'UTR de rj cSl/terminador en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Dunaliella tertiolecta para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosíntesis de lípidos endógenos. La transformación estable de Dunaliella tertiolecta con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen la electroporación u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico ble se puede utilizar como marcador para seleccionar Dunaliella tertiolecta transformada con el vector de transformación en medio DM que comprenda feomicina, pero no se limita a este medio. El medio de crecimiento adecuado para la producción de lipidos por parte de Dunaliella tertiolecta incluye, sin carácter limitante, el medio DM y los medios de cultivo descritos por Takagi et al. y Massart y Hanston. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Dunaliella tertiolecta se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 26: Modificación de Volvox carteri La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Volvox carteri se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Hallman y Rappel et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Hallman y Rappel et al., The Plant Journal, Volumen 17 (1999), págs . 99-109, han descrito la transformación nuclear estable de Volvox carteri con ADN plasmídico. Utilizando el método de transformación de bombardeo con microproyectiles , Hallman y Rappel introdujeron el plásmido pzeoE en Volvox carteri. El plásmido pzeoE comprendía una secuencia que codificaba un cásete de resistencia al antibiótico bleomicina, que comprendía una secuencia que codificaba la proteína de unión a bleomicina de Streptoalloteichus hindustanus {ble) , para la resistencia al antibiótico zeocina, unida operablemente al promotor y la región 3' UTR del gen de beta-tubulina de Volvox carteri (N.° de acceso a GenBank L24547). Antes de la transformación, Volvox carteri era incapaz de propagarse en un medio de cultivo que comprendiera 1.5 pg/mL de zeocina. Tras la transformación con el plásmido pzeoE, se obtuvieron transformantes de Volvox carteri que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía más de 20 µg/ml de zeocina. La expresión del producto génico ble en Volvox carteri permitió la propagación en presencia de 20 pg/ml de zeocina, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al antibiótico bleomicina como marcador seleccionable para su uso en Volvox carteri. La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. Según describen Hallman y Rappel, la selección y el mantenimiento de Volvox carteri transformada se llevó a cabo en medio Volvox (VM, según describen Provasoli y Pintner, The Ecology of Algae, Publicación especial N.° 2 (1959), Tyron, C.A. y Hartman, R.T., eds., Pittsburgh: Universidad de Pittsburgh, págs. 88-96) con 1 mg/L de feomicina. Los medios adecuados para cultivar Volvox carteri para la producción de lipidos también han sido descritos por Starr en Starr R,C,. Dev Biol Suppl., Vol. 4 (1970), págs. 59-100). Hallman y Rappel han descrito que el plásmido pzeoE y el promotor y la región 3' UTR del gen de beta-tubulina de Volvox carteri son adecuados para permitir la expresión heteróloga en Volvox carteri. Además, Hallman y Rappel han descrito que el cásete de resistencia a bleomicina codificado en pzeoE era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Volvox carteri. Se han descrito otros plásmidos, promotores, regiones 3' UTR/terminadores y marcadores seleccionables adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en Volvox carteri y adecuados para su uso como marcadores seleccionables en Volvox carteri (por ejemplo, remítase a Hallamann y Sumper, Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 91 (1994), págs. 11562-11566 y Hallman y odniok, Plant Cell Reports, Volumen 25 (2006), págs. 582-581).

En una realización de la presente invención, se construye el vector pzeoE, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico ble para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lípidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lípidos codifica una o más proteínas de la vía de biosíntesis de lípidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Volvox cárteri para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Volvox carteri de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosíntesis de lípidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor de beta-tubulina de Volvox carteri antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a 3'UTR de beta-tubulina/terminador de Volvox carteri en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Volvox carteri para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosíntesis de lípidos endógenos. Un experto en la técnica puede identificar tales regiones de homología en la secuencia del genoma de Volvox carteri (se menciona en la publicación de Prochnik et al., Science, Vol. 329:5988 (2010), págs. 223-226). La transformación estable de Volvox carteri con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen el bombardeo con microproyectiles u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico ble se puede utilizar como marcador para seleccionar Volvox carteri transformada con el vector de transformación en medio VM que comprenda zeocina, pero no se limita a este medio. El medio de crecimiento adecuado para la producción de lipidos por parte de Volvox carteri incluye, sin carácter limitante, el medio VM y los medios de cultivo descritos por Starr. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Volvox carteri se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 27 : Modificación de Haematococcus pluvialis La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Haematococcus pluvialis se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Steinbrenner y Sandmann et al. según se expone en la presente Resumiendo, Steinbrenner y Sandmann et al., Applied and Environmental Microbiology, Vol. 72:12 (2006), págs .7477-7484, han descrito la transformación nuclear estable de Haematococcus pluvialis con ADN plasmidico. Utilizando el método de transformación dé bombardeo con microproyectiles , Steinbrenner introdujo el plásmido pPlat-pds-L504R en Haematococcus pluvialis . El plásmido pPlat-pds-L504R comprendía un cásete de resistencia a norflurazón, el cual comprendía el promotor, la secuencia codificante de proteínas y la región 3'UTR del gen de fitoeno-desaturasa de Haematococcus pluvialis (Pds, N.° de acceso a GenBank AY781170) , donde la secuencia codificante de proteínas de Pds estaba modificada en la posición 504 (cambiando de este modo una leucina por una arginina) para codificar un producto génico (Pds-L504R) que confiera resistencia al herbicida norflurazón. Antes de la transformación con pPlat-pds-L504R, Haematococcus pluvialis era incapaz de propagarse en un medio que comprendiera 5 µ? de norflurazón. Tras la transformación con el plásmido pPlat-pds-L504R, se obtuvieron transformantes de Haematococcus pluvialis que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía 5 µ? de norflurazón. La expresión del producto génico Pds-L504R en Haematococcus pluvialis permitió la propagación en presencia de 5 µ de norflurazón, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al herbicida norflurazón como marcador seleccionable para su uso en Haematococcus pluvialis . La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. Según describió Steinbrenner, la selección y el mantenimiento de Haematococcus pluvialis transformada se llevó a cabo en placas de agar que comprendían medio OHA (OHM (0.41 g/L de KN03, 0.03 g/L de Na2HP04, 0.246 g/L de MgS04 ·7?20, 0.11 g/L de CaCl2 ·2?20, 2.62 mg/L de citrato de Fe(in) x H20, 0.011 mg/L de CoCl2-6H20, 0.012 mg/L de CuS0 ·5?20, 0.075 mg/L de Cr203, 0.98 mg/L de MnCl2-4H20, 0.12 mg/L de Na2Mo04 x 2H20, 0.005 mg/L de Se02 y 25 mg/L de biotina, 17.5 mg/L de tiamina y 15 mg/L de vitamina B12) complementado con 2.42 g/L de Tris-acetato y norflurazón 5 mM. La propagación de Haematococcus pluvialis en medio de cultivo líquido se llevó a cabo según Steinbrenner y Sandmann utilizando medio basal (medio basal según describen Kobayashi et al., Applied and Environmental Microbiology, Vol . 59 (1993), págs . 867-873). Steinbrenner y Sandmann han descrito que el plásmido pPlat-pds-L504R y el promotor y la región 3' UTR del gen de fitoeno-desaturasa de Haematococcus pluvialis son adecuados para permitir la expresión heteróloga en Haematococcus pluvialis . Además, Steinbrenner y Sandmann han descrito que el cásete de resistencia a norflurazón codificado en pPlat-pds-L504R era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Haematococcus pluvíalis . Se han descrito otros plásmidos, promotores, regiones 3' UTR/terminadores y marcadores seleccionables adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en Haematococcus pluvíalis (remítase a Kathiresan et al., Journal of Phycology, Vol . 45 (2009), págs . 642-649).

En una realización de la presente invención, se construye el vector pPlat-pds-L504R, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico Pds-L504R para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosintesis de lípidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la vía de biosintesis de lípidos codifica una o más proteínas de la vía de biosintesis de lípidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Haematococcus pluvíalis para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Haematococcus pluvíalis de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosintesis de lípidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor del gen pds de Haematococcus pluvialis antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a la región 3'UTR del gen pds/terminador de Haematococcus pluvialis en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Haematococcus pluvialis para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosintesis de lipidos endógenos. La transformación estable de Haematococcus pluvialis con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen el bombardeo con microproyectiles u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico Pds-L504R se puede utilizar como marcador para seleccionar Haematococcus pluvialis transformada con el vector de transformación en medio OHA que comprenda norflurazón, pero no se limita a este medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lipidos por parte de Haematococcus pluvialis incluyen, sin carácter limitante, el medio basal y los medios de cultivo descritos por Kobayashi et al., Kathiresan et al., y Gong y Chen, Journal of Applied Phycology, Vol. 9:5 (1997), págs. 437-444. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Haematococcus pluvialis se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 28: Modificación del complejo Closterium peracerosvim-strigosum-11ttorale La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en el complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Abe et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Abe et al., Plant Cell Physiology, Vol. 52:9 (2011), págs. 1676-1685, han descrito la transformación nuclear estable del complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale con ADN plasmídico. Utilizando los métodos de transformación de bombardeo con microproyectiles, Abe introdujo el plásmido pSA106 en el complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale . El plásmido pSA106 comprendía un cásete de resistencia a bleomicina, el cual comprendía una secuencia que codificaba el gen de la proteína de unión a bleomicina de Streptoalloteichus hindustanus (ble, N.° de acceso a GenBank CAA37050) unida operablemente al promotor y la región 3' UTR del gen de la proteína de unión a clorofila a/b del complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale (CAB,N.° de acceso a GenBank AB363403) . Antes de la transformación con pSA106, el complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale era incapaz de propagarse en un medio que comprendiera 3 µg/ml de fleomicina. Tras la transformación con pSA106, se obtuvieron transformantes del complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía 3 pg/ml de fleomicina. La expresión del producto génico ble en el complejo Closterium peracerosum-strigosum—littorale permitió la propagación en presencia de 3 yg/ml de fleomicina, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al antibiótico bleomicina como marcador seleccionable para su uso en el complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale. La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. Según describe Abe, la selección y el mantenimiento del complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale transformado se llevaron a cabo en primer lugar en agar blando con medio C (0.1 g/L de KN03, 0.015 g/L de Ca (N03) 2 -4H20, 0.05 g/L de glicerofosfato-Na2, 0.04 g/L de MgS04 -7H20, 0.5 g/L de Tris (hidroxilmetil) aminometano, minerales traza, biotina, vitaminas Ei y B12) y a continuación se aisló en placas de agar que comprendían medio C complementado con fleomicina. Según describe Abe, la propagación del complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale en cultivo líquido se llevó a cabo en medio C. Se describen otros medios de cultivo líquidos adecuados para la propagación del complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale en Sekimoto et al., DNA Research, 10:4 (2003), págs . 147-153. Abe describió que el plásmido pSA106 y el promotor y la región 3' UTR del gen CAB del complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale eran adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en el complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale. Además, Abe describió que el cásete de resistencia a bleomicina codificado en pSA106 era adecuado para su uso como marcador seleccionable en el complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale. Se han descrito otros plásmidos, promotores, regiones 3 ' UTR/terminadores y marcadores seleccionables adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en el complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale (remítase a Abe et al., Plant Cell Physíology, Vol. 49 (2008), págs. 625-632).

En una realización de la presente invención, se construye el vector pSA106, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico ble para su uso como marcador seleccionadle, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosintesis de lipidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la vía de biosintesis de lipidos codifica una o más proteinas de la via de biosintesis de lipidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteinas codones optimizados para la expresión en el complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares del complejo Closterium peracerosum—strigosum—littorale de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteina de la via de biosintesis de lipidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor del gen CAB del complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale antes de la secuencia codificante de proteinas y se puede unir de forma operable a 3'UTR del gen CAB/terminador del complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteinas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma del complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosíntesis de lípidos endógenos. La transformación estable del complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen el bombardeo con microproyectiles u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico ble se puede utilizar como marcador para seleccionar el complejo Closterium peracerosum-strigosum-llttorale transformado con el vector de transformación en medio C que comprenda fleomicina, pero no se limita a este medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lípidos por parte del complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale incluyen, sin carácter limitante, el medio C y los medios de cultivo descritos por Abe et al. y Sekimoto et al. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lípidos del complejo Closterium peracerosum-strigosum-littorale se puede determinar mediante la extracción de lípidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 29: Modificación de Dunaliella. viridis La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Dunaliella viridis se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Sun et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Sun et al., Gene, Vol. 377 (2006), págs . 140-149, han descrito la transformación estable de Dunaliella viridis con ADN plasmidico. Utilizando el método de transformación de electroporación, Sun introdujo el plásmido pDVNR, que codifica el gen entero de la nitrato-reductasa de Dunaliella viridis , en Dunaliella viridis mutante (mutantes NR de Dunaliella viridis) . Los mutantes NR son incapaces de crecer sin el uso de nitrato como fuente de nitrógeno. La nitrato-reductasa cataliza la conversión de nitrato en nitrito. Antes de la transformación, los mutantes NR de Dunaliella viridis eran incapaces de propagarse en un medio de cultivo que comprendiera nitrato ( 03~) como única fuente de nitrógeno. La expresión del producto génico NR de Dunaliella viridis en un mutante NR de Dunaliella viridis se utilizó como marcador seleccionable para resolver la deficiencia metabólica de nitrato. Tras la transformación con el plásmido pDVNR, se obtuvieron mutantes NR de Dunaliella viridis que expresaban de forma estable el producto génico NR de Dunaliella viridis y que eran capaces de crecer en placas de agar que comprendían nitrato como única fuente de carbono. La evaluación del ADN de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. La selección y el mantenimiento de Dunaliella viridis (mutante NR) transformada se realizó en placas de agar que comprendían KNO3 5 mM. Sun también describió la propagación de Dunaliella viridis y mutantes NR de Dunaliella viridis en un medio de cultivo líquido. Se describen otros medios adecuados para la propagación de Dunaliella viridis en Gordillo et al., Journal of Applied Phycology, Vol. 10:2 (1998), págs. 135-144 y en Moulton y Burford, Hydrobiologia , Vols. 204-205:1 (1990), págs. 401-408. Sun describió que el plásmido pDVNR y el promotor y la región 3' UTR/terminador del gen de la nitrato-reductasa de Dunaliella viridis eran adecuados para permitir la expresión heterologa en mutantes NR de Dunaliella viridis. Sun también describió que la expresión del producto génico de la nitrato-reductasa de Dunaliella viridis era adecuada para utilizar como marcador seleccionable en los mutantes NR de Dunaliella viridis.

En una realización de la presente invención, se construye el vector pDVNR, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico de la nitrato- reductasa de Dunaliella viridis (DvNR) para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosintesis de lipidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la vía de biosintesis de lipidos codifica una o más proteínas de la vía de biosintesis de lipidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Dunaliella viridis para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Dunaliella viridis de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosintesis de lipidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor DvNR antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a 3'UTR de DvNR /terminador en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Dunaliella viridis para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosintesis de lipidos endógenos.

La transformación estable de los mutantes NR de Dunaliella viridis con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen la electroporación u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico DvNR se puede utilizar como marcador seleccionable para resolver la deficiencia de la asimilación de nitrógeno por parte de cepas mutantes NR de Dunaliella viridis y para seleccionar los mutantes NR de Dunaliella viridis que expresen de forma estable el vector de transformación. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lipidos por parte de Dunaliella viridis incluyen, sin carácter limitante, los descritos por Sun et al., Moulton y Burford, y Gordillo et al. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Dunaliella viridis se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente .

EJEMPLO 30 : Modificación de Dunaliella salina La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Dunaliella salina se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Geng et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Geng et al., Journal of Applied Phycology, Vol. 15 (2003), págs. 451-456, han descrito la transformación estable de Dunaliella salina con ADN plasmidico . Utilizando el método de transformación de electroporación, Geng introdujo el plásmido pUQHBsAg-CAT en Dunaliella salina. pUQHBsAg-CAT comprendía un cásete de expresión del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAG) , el cual comprendía una secuencia que codificaba el antígeno de superficie de la hepatitis B unida operablemente al promotor ubil de Zea mays antes de la región codificante de proteínas de HBsAG y unida operablemente a la región the 3' UTR/terminador del gen de la nopalina-sintasa de Agroha cterl um turnefaclens {nos) después de la región codificante de proteínas de HBsAG. pUQHBsAg-CAT comprendía además un cásete de resistencia a cloranfenicol, el cual comprendía una secuencia que codificaba el producto génico de cloranfenicol-acetiltransíerasa (CAT) , que confiere resistencia al antibiótico cloranfenicol, unida operablemetne al potenciador y promotor del virus del simio 40. Antes de la transformación con pUQHBsAg-CAT, Dunaliella salina era incapaz de propagarse en medio que comprendiera 60 mg/L de cloranfenicol . Tras la transformación con el plásmido pUQHBsAg-CAT, se obtuvieron transformantes de Dunaliella salina que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía 60 mg/L de cloranfenicol . La expresión del producto génico CAT en Dunaliella salina permitió la propagación en presencia de 60 mg/L de cloranfenicol, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia a cloranfenicol como marcador seleccionadle para su uso en Dunaliella salina. La actividad detectable del producto génico HBsAg indicó que el promotor ubil y 3'UTR de nos/terminador eran adecuados para permitir la expresión génica en Dunaliella salina. La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. Geng describió que la selección y el mantenimiento de Dunaliella salina transformada se realizaron en placas de agar que comprendían medio de Johnson (Jl, descrito en Borowitzka y Borowitzka (eds) , Micro-algal Biotechnology. Cambridge University Press, Cambridge, págs . 460-461) con 60 mg/L de cloranfenicol. Geng llevó a cabo la propagación líquida de Dunaliella salina en medio Jl con 60 mg/L de cloranfenicol. Se ha descrito la propagación de Dunaliella salina en otros medios que no sean el medio Jl (remítase a Feng et al., Mol. Bio. Reports, Vol. 36 (2009), págs. 1433-1439 y Borowitzka et al., Hydrobiologia, Vols. 116-117:1 (1984), págs. 115-121). Feng et al. han descrito otros plásmidos, promotores, regiones 3' UTR/terminadores y marcadores seleccionables adecuados para permitir la expresión génica exógena en Dunaliella salina. Geng ha descrito que el plásmido pUQHBsAg-CAT, el promotor ubil y la región 3 ' UTR/terminador del gen de la nopalina-sintasa de Agrobacterium turnefaciens son adecuados para permitir la expresión génica exógena en Dunaliella salina. Además, Geng ha descrito que el cásete de resistencia CAT codificado en pUQHBsAg-CAT era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Dunaliella salina.

En una realización de la presente invención, se construye el vector pUQHBsAg-CAT, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico CAT para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la via de biosintesis de lipidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la via de biosintesis de lipidos codifica una o más proteínas de la vía de biosintesis de lipidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Dunaliella salina para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Dunaliella salina de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosintesis de lipidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor ubil antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a la región 3' UTR/terminador del gen de la nopalina-sintasa de Agrobacterium turnefaciens en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Dunaliella salina para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosintesis de lipidos endógenos. La transformación estable de Dunaliella salina con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen la electroporación u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico CAT se puede utilizar como marcador seleccionable para seleccionar Dunaliella salina transformada con el vector de transformación en medio Jl que comprenda cloranfenicol, pero no se limita a este medio. El medio de crecimiento adecuado para la producción de lipidos por parte de Dunaliella salina incluye, sin carácter limitante, el medio Jl y los medios de cultivo descritos por Feng et al. y Borowitzka et al. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Dunaliella salina se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 31: Modificación de Gonivaa. pectoral La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Gonium pectoral se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Lerche y Hallman et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Lerche y Hallman et al., BMC Biotechnology, Volumen 9:64, 2009, han descrito la transformación nuclear estable de Gonium pectorale con ADN plasmidico. Utilizando el método de transformación de bombardeo con microproyectiles , Lerche introdujo el plásmido pPmr3 en Gonium pectorale. El plásmido pPmr3 comprendía un cásete de resistencia a paromomicina, el cual comprendía una secuencia que codificaba el producto génico de aminoglicósido-3' -fosfotransferasa (aphVIII) (N.° de acceso a GenBank ???03856) de Streptomyces rimosus para la resistencia al antibiótico paromomicina, unida operablemente al promotor híbrido hsp70A-rbcS3 de Volvox carteri antes de la región codificante de proteínas de aphVIII y unida operablemente a la región 3' UTR/terminador del gen rbcS3 de Volvox carteri después de la región codificante de proteínas de aphVIII. Antes de la transformación con pPmr3, Gonium pectorale era incapaz de propagarse en un medio que comprendiera 0.06 pg/ml de paromomicina . Tras la transformación con pPmr3, se obtuvieron transformantes de Gonium pectorale que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía 0.75 g/ml y concentraciones superiores de paromomicina. La expresión del producto génico aphVIII en Gonium pectorale permitió la propagación en presencia de 0.75 pg/ml y concentraciones superiores de paromomicina, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al antibiótico paromomicina como marcador seleccionable para su uso en Gonium pectoral . La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. Lerche y Hallman han descrito que la selección y el mantenimiento de Gonium pectorale transformada se realizó en medio líquido de Jaworski (20 mg/L de Ca (N03) 2 ·4?20, 12.4 mg/L de KH2P04, 50 mg/L de MgS04 ·7?20, 15.9 mg/L de NaHC03, 2.25 mg/L de EDTA-FeNa, 2.25 mg/L de EDTA Na2, 2.48 g/L de H3B03, 1.39 g/L de MnCl2.4H20, 1 mg/L de (NH4) 6M07024.4H20, 0.04 mg/L de vitamina B12, 0.04 mg/L de Tiamina-HCl, 0.04 mg/L de biotina, 80 mg/L de NaN03, 36 mg/L de Na4HP04.12H20) con 1.0 g/ml de paromomicina. Lerche y Hallman han descrito adicionalmente otros plásmidos, promotores, regiones 3' UTR/terminadores y marcadores selecciónateles adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en Gonium pectorale . Lerche y Hallman han descrito que el plásmido pPmr3, el promotor híbrido hsp70A-rbcS3 de Volvox carteri y la región 3' UTR/terminador del gen rbcS3 de Volvox carteri son adecuados para permitir la expresión génica exógena en Gonium pectorale Además, Lerche y Hallman han descrito que el' cásete de resistencia a paromomicina codificado en pPmr3 era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Gonium pectorale .

En una realización de la presente invención, se construye el vector pPmr3, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico aphVIII para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lipidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lipidos codifica una o más proteínas de la vía de biosíntesis de lipidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Gonium pectorale para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Gonium pectorale de acuerdo con las Tablas 69A-D Para cada proteína de la vía de biosíntesis de lipidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor híbrido hsp70A-rbcS3 de Volvox carteri antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a la región 3 ' UTR/terminador del gen rbcS3 de Volvox carteri en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Gonium pectorale para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosíntesis de lípidos endógenos. La transformación estable de Gonium pectorale con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen el bombardeo con microproyectiles u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico aphVIII se puede utilizar como marcador seleccionable para seleccionar Gonium pectorale transformada con el vector de transformación en medio de Jaworski que comprenda paromomicina, pero no se limita a este medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lípidos por parte de Gonium pectorale incluyen el medio de Jawaorski y los medios descritos en Stein, American Journal of Botany, Vol. 45:9 (1958), págs. 664-672. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Gonium pectorale se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 32 : Modificación de Phaeodactylvim trlcornutum La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Phaeodactylum tricornutum se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Apt et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Apt et al., Molecular and General Genetics, Vol. 252 (1996), págs. 572-579, han descrito la transformación nuclear estable de Phaeodactylum tricornutum con ADN vectorial. Utilizando la técnica de transformación de bombardeo con microproyectiles , Apt introdujo el plásmido pfcpA en Phaeodactylum tricornutum. El plásmido pfcpA comprendía un cásete de resistencia a bleomicina, el cual comprendía una secuencia que codificaba la proteína de unión a bleomicina (ble) de Streptoalloteichus hindustanus para la resistencia a los antibióticos fleomicina y zeocina, unida operablemente al promotor del gen de la proteína de unión a clorofila a fucoxantina (fcpA) de Phaeodactylum tricornutum antes de la región codificante de proteínas de ble y unida operablemente a la región 3' UTR/terminador del gen fcpA de Phaeodactylum tricornutum en la región 3' o después de la región codificante de proteínas de ble. Antes de la transformación con pfcpA, Phaeodactylum tricornutum era incapaz de propagarse en un medio que comprendiera 50 g/ml de zeocina. Tras la transformación con pfcpA, se obtuvieron transformantes de Phaeodactylum tricornutum que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía 50 pg/ml de zeocina. La expresión del producto génico ble en Phaeodactylum tricornutum permitió la propagación en presencia de 50 g/ml de zeocina, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al antibiótico bleomicina como marcador seleccionable para su uso en Phaeodactylum tricornutum. La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. Apt ha descrito que la selección y el mantenimiento de Phaeodactylum tricornutum transformada se realizó en placas de agar que comprendían medio LDM (según se describe en Starr y Zeikus, Journal of Phycology, Vol. 29, Suplemento, (1993) ) con 50 mg/L de zeocina. Apt ha descrito la propagación líquida de transformantes de Phaeodactylum tricornutum en medio LDM con 50 mg/L de zeocina. Se ha descrito la propagación de Phaeodactylum tricornutum en un medio que no sea el medio LDM (en Zaslavskaia et al., Science, Vol. 292 (2001), págs . 2073-2075, y en Radokovits et al., Metabolic Engineering, Vol . 13 (2011), págs. 89-95). Otros plásmidos, promotores, regiones 3' UTR/terminadores y marcadores seleccionables adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en Phaeodactylum tricornutum han sido descritos en el mismo informe por Apt et al., por Zaslavskaia et al. y por Radokovits et al. Apt ha descrito que el plásmido pfcpA y el promotor y la región 3' UTR/terminador de fcpA de Phaeodactylum tricornutum eran adecuados para permitir la expresión génica exógena en Phaeodactylum tricornutum. Además, Apt ha descrito que el cásete de resistencia a bleomicina codificado en pfcpA era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Phaeodactylum tricornutum.

En una realización de la presente invención, se construye el vector pfcpA, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico ble para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosintesis de lipidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la via de biosintesis de lipidos codifica una o más proteínas de la vía de biosintesis de lipidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Phaeodactylum tricornutum para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Phaeodactylum tricornutum de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosíntesis de lípidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor del gen fcpA de Phaeodactylum tricornutum antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a la región 3' UTR/terminador del gen fcpA de Phaeodactylum tricornutum en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Phaeodactylum tricornutum para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosíntesis de lípidos endógenos. Un experto en la técnica puede identificar tales regiones de homología en la secuencia del genoma de Phaeodactylum tricornutum (se menciona en la publicación de Bowler et al., Nature, Vol . 456 (2008), págs. 239-244). La transformación estable de Phaeodactylum tricornutum con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen el bombardeo con microproyectiles u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico ble se puede utilizar como marcador para seleccionar Phaeodactylum tricornutum transformada con el vector de transformación en medio LDM que comprenda paramomicina, pero no se limita a este medio. El medio de crecimiento estable para la producción de lipidos por parte de Phaeodactylum tricornutum incluye, sin carácter limitante, el medio f/2 según describe Radokovits et al. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Phaeodactylum tricornutum se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 33: Modificación de Chaetoceros sp.

La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Chaetoceros sp. se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Yamaguchi et al. según se expone en la presente. Brevemente, Yamaguchi et al., Phycological Research, Vol . 59:2 (2011), págs . 113-119, han descrito la transformación nuclear estable de Chaetoceros sp. con ADN plasmidico. Utilizando el método de transformación de bombardeo con microproyectiles, Yamaguchi introdujo el plásmido pTpfcp/nat en Chaetoceros sp. pTpfcp/nat comprendía un cásete de resistencia a nourseotricina, el cual comprendía una secuencia que codificaba el producto génico de nourseotricina-acetiltransferasa {nat) (N.° de acceso a GenBank AAC60439) unida operablemente al promotor del gen de la proteína de unión a clorofila a/c fúcoxantina (fcp) de Thalassiosira pseudonana antes de la región codificante de proteínas de nat y unida operablemente a la región 3' UTR/terminador del gen fcp de Thalassiosira pseudonana en la región 3' (después de la secuencia codificante de proteínas de nat) . El producto génico nat confiere resistencia al antibiótico nourseo ricina Antes de la transformación con pTpfcp/nat, Chaetoceros sp. era incapaz de propagarse en un medio que comprendiera 500 µ?/p?? de nourseotricina. Tras la transformación con pTpfcp/nat, se obtuvieron transformantes de Chaetoceros sp. que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía 500 g/ml de nourseotricina. La expresión del producto génico nat en Chaetoceros sp. permitió la propagación en presencia de 500 9 ?t?1 de nourseotricina, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al antibiótico nourseotricina como marcador seleccionable para su uso en Chaetoceros sp. La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se llevó a cabo mediante análisis de Southern. Yamaguchi describió que la selección y el mantenimiento de Chaetoceros sp. transformada se llevó a cabo en placas de agar que comprendían medio f/2 (según se describe en Guilard, R.R., Culture of Phytoplankton for feeding marine invertebrates , In Culture of Marine Invertebrate Animáis, Smith y Chanley (eds) 1975, Plenum Press, Nueva York, págs. 26-60) con 500 µg/ml de nourseotricina . La propagación líquida de los transformantes de Chaetoceros sp., según realizó Yamaguchi, se llevó a cabo en medio f/2 con 500 mg/L de nourseotricina. Se ha descrito la propagación de Chaetoceros sp. en otros medios de cultivo (por ejemplo, en Napolitano et al., Journal of the World Aquaculture Society, Vol. 21:2 (1990), págs. 122-130, y en Volkman et al., Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, Vol. 128:3 (1989), págs. 219-240). En el mismo informe, Yamaguchi et al. han descrito otros plásmidos, promotores, regiones 3 ' UTR/terminadores y marcadores seleccionables útiles para permitir la expresión génica heteróloga en Chaetoceros sp. Yamaguchi ha descrito que el plásmido pTpfcp/nat y el promotor y la región 3' UTR/terminador de fcp de Thalassiosira pseudonana son adecuados para permitir la expresión génica exógena en Chaetoceros sp. Además, Yamaguchi ha descrito que el cásete de resistencia a nourseotricina codificado en pTpfcp/nat era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Chaetoceros sp.

En una realización de la presente invención, se construye el vector pTpfcp/nat, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico nat para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lípidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lípidos codifica una o más proteínas de la vía de biosíntesis de lípidos seleccionadas, a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en la especie estrechamente relacionada Chaetoceros co pressum para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Chaetoceros compressum de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteina de la vía de biosíntesis de lípidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor del gen fcp de Thalassiosira pseudonana antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a la región 3' UTR/terminador del gen fcp de Thalassiosira pseudonana en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Chaetoceros sp. para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosíntesis de lípidos endógenos. La transformación estable de Chaetoceros sp. con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen el bombardeo con microproyectiles u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico nat se puede utilizar como marcador seleccionable para seleccionar Chaetoceros sp. transformada con el vector de transformación en medio de agar f/2 que comprenda nourseotricina, pero no se limita a este medio. El medio de crecimiento adecuado para la producción de lípidos por parte de Chaetoceros sp. incluye, sin carácter limitante, el medio f/2 y los medios de cultivo descritos por Napolitano et al. y Volkman et al. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lípidos de Chaetoceros sp. se puede determinar mediante la extracción de lípidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 34 : Modificación de Cylindrotheca fusiformís La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Cylindrotheca fusiformís se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Poulsen y Kroger et al. según se expone en la presente. Brevemente, Poulsen y Kroger et al., FEBS Journal, Vol. 272 (2005), págs . 3413-3423, han descrito la transformación de Cylindrotheca fusiformís con ADN plasmídico. Utilizando el método de transformación de bombardeo con microproyectiles , Poulsen y Kroger introdujeron el plásmido pCF-ble en Cylindrotheca fusiformís. El plásmido pCF-ble comprendía un cásete de resistencia a bleomicina, el cual comprendía una secuencia gue codificaba la proteína de unión a bleomicina {ble) de Streptoalloteichus hindustanus, para la resistencia a los antibióticos zeocina y fleomicina, unida operablemente al promotor del gen de la proteína de unión a clorofila a/c fucozantina de Cylindrotheca fusiformís (fcpA, N.° de acceso a GenBank AY125580) antes de la región codificante de proteínas de ble y unida operablemente a la región 3' UTR/terminador del gen fcpA de Cylindrotheca fusiformís en la región 3' (después de la región codificante de proteínas de ble) . Antes de la transformación con pCF-ble, Cylindrotheca fusiformís era incapaz de propagarse en un medio que comprendiera 1 mg/ml de zeocina. Tras la transformación con pCF-ble, se obtuvieron transformantes de Cylindrotheca fusiformis que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía 1 mg/ml de zeocina. La expresión del producto génico ble en Cylindrotheca fusiformis permitió la propagación en presencia de 1 mg/ml de zeocina, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al antibiótico bleomicina como marcador seleccionable para su uso en Cylindrotheca fusiformis . Poulsen y Kroger describieron que la selección y el mantenimiento de Cylindrotheca fusi ormis transformada se realizó en placas de agar que comprendían medio de agua marina artificial con 1 mg/ml de zeocina. Poulsen y Kroger describieron la propagación líquida de transformantes de Cylindrotheca fusiformis en medio de agua marina artificial con 1 mg/ml de zeocina. Se ha descrito la propagación de Cylindrotheca fusiformis en otros medios de cultivo (por ejemplo, en Liang et al., Journal of Applied Phycology, Vol . 17:1 (2005), págs . 61-65, y en Orcutt y Patterson, Lipids, Vol. 9:12 (1974), págs. 1000-1003). En el mismo informe de Pulsen y Kroger se describen otros plásmidos, promotores y regiones 3 ' UTR/terminadores para permitir la expresión génica heteróloga en Chaetoceros sp. Poulsen y Kroger han descrito que el plásmido pCF-ble y el promotor y la región 3' UTR/terminador de fcp de Cylindrotheca fusiformis eran adecuados para permitir la expresión génica exógena en Cylindrotheca fusiformis . Además, Poulsen y Kroger han descrito que el cásete de resistencia a bleomicina codificado en pCF-ble era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Cylindrotheca fusiformis .

En una realización de la presente invención, se construye el vector pCF-ble, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico ble para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosintesis de lipidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la via de biosintesis de lipidos codifica una o más proteínas de la via de biosintesis de lipidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Cylindrotheca fusiformis para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Cylindrotheca fusiformis de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosintesis de lipidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor del gen fcp de Cylindrotheca fusiformis antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a la región 3' UTR/terminador del gen fcp de Cylindrotheca fusiformis en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Cylindrotheca fusiformis para la integración genómica dirigida del vector de transformación Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosintesis de lipidos endógenos. La transformación estable de Cylindrotheca fusiformis con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen el bombardeo con microproyectiles u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico ble se puede utilizar como marcador seleccionable para seleccionar Cylindrotheca fusiformis transformada con el vector de transformación en medio agar de agua marina artificial que comprenda zeocina, pero no se limita a este medio. Los medios de cultivo adecuados para la producción de lipidos por parte de Cylindrotheca fusiformis incluyen, sin carácter limitante, el agua marina artificial y los medios descritos por Liang et al. y Orcutt y Patterson.

La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Cylindrotheca fusiformis se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 35 : Modificación de Amphidinium sp .

La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Amphidinium sp. se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por ten Lohuis y Miller et al. según se expone en la presente. Resumiendo, ten Lohuis y Miller et al., The Plant Journal, Vol . 13:3 (1998), págs . 427-435, han descrito la transformación estable de Amphidinium sp. con ADN plasmídico. Utilizando la técnica de transformación de agitación en presencia de fibras de carburo de silicio, ten Lohuis introdujo el plásmido pMT NPT/GÜS en Amphidinium sp . pMT NPT/GUS comprendía un cásete de resistencia a neomicina, el cual comprendía una secuencia que codificada el producto génico de la neomicina-fosfotransferasa II {nptll) (N.° de acceso a GenBank AAL92039) unida operablemente al promotor del gen de la nopalina-sintasa {nos) de Agrobacterium tumefaciens antes o 5' de la región codificante de proteínas de nptll y operablemente unida a la región 3' UTR/terminador del gen nos en la región 3' (después de la región codificante de proteínas de nptll) .

El producto génico nptil confiere resistencia al antibiótico G418. El plásmido pMT NPT/GUS comprendía además una secuencia que codificaba el producto génico marcador de beta-glucuronidasa (GUS) unida operablemente al promotor 35S de CaMV y unida operablemente además a la región 3' UTR/terminador de 35S de CaMV. Antes de la transformación con pMT NPT/GUS, Amphidinium sp. era incapaz de propagarse en un medio que comprendiera 3 mg/ml de G 18. Tras la transformación con pMT NPT/GUS, se obtuvieron transformantes de Amphidinium sp. que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía 3 mg/ml de G418. La expresión del producto génico nptil en Amphidinium sp. permitió la propagación en presencia de 3 mg/ml de G418, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al antibiótico neomicina como marcador seleccionable para su uso en Amphidinium sp. La actividad detectable del gen marcador GUS indicó que el promotor y la región 3'UTR de 35S de CaMV eran adecuados para permitir la expresión génica en Amphidinium sp. La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. Ten Lohuis y Miller describieron la propagación líquida de los transformantes de Amphidinium sp . en un medio que comprendía agua marina complementada con una solución de enriquecimiento F/2 (proporcionada por el proveedor Sigma) y 3 mg/ml de G418, asi como también la selección y el mantenimiento de los transformantes de Amphidinium sp. en medio de agar que comprendía agua marina complementada con una solución de enriquecimiento F/2 y 3 mg/ml de G418. Se ha descrito la propagación de Amphidinium sp. en otros medios de cultivo (por ejemplo, en ansour et al., Journal of Applied Phycology, Vol . 17:4 (2005) págs. 287-v300). En el mismo informe de ten Lohuis y Miller se ha descrito un plásmido adicional, que comprende otros promotores, regiones 3 ' UTR/terminadores y un marcador seleccionable para permitir la expresión génica heteróloga en Amphidinium sp. Ten Lohuis y Miller han descrito que el plásmido pMT NPT/GUS y el promotor y la región 3' UTR/terminador de los genes nos y 35S de CaMV son adecuados para permitir la expresión génica exógena en Amphidinium sp. Además, ten Lohuis y Miller han descrito que el cásete de resistencia a neomicina codificado en pMT NPT/GUS era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Amphidinium sp.

En una realización de la presente invención, se construye el vector pMT NPT/GUS, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico nptil para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lípidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lípidos codifica una o más proteínas de la vía de biosíntesis de lípidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Amphidinium sp. para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de la especie estrechamente relacionada Amphidinium carterae de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la via de biosíntesis de lípidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor del gen de la nopalina-sintasa (nos) de Agrojbacterium turnefaciens antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a la región 3' UTR/terminador de nos en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Amphidinium sp. para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosíntesis de lípidos endógenos.

La transformación estable de Amphidinium sp. con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen la microinyección mediada con fibras de silicio u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico nptll se puede utilizar como marcador seleccionable para seleccionar Amphidinium sp. transformada con el vector de transformación en medio agar de agua marina que comprenda G418, pero no se limita este medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lipidos por parte de Amphidinium sp. incluyen, sin carácter limitante, el agua marina artificial y los medios descritos por Mansour et al. y ten Lohuis y Miller. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Amphidinium sp. se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente .

EJEMPLO 36: Modificación de Symbiodinium microadríactícum La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Symbiodinium microadriacticum se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por ten Lohuis y Miller et al. según se expone en la presente. Resumiendo, ten Lohuis y Miller et al., The Plant Journal, Vol. 13:3 (1998), págs. 427-435, han descrito la transformación estable de Symbiodinium microadriacticum con ADN plasmidico. Utilizando la técnica de transformación de microinyección mediada con fibra de silicio, ten Lohuis introdujo el plásmido pMT NPT/GUS en Symbiodinium microadriacticum. pMT NPT/GUS comprendía un cásete de resistencia a neomicina, el cuál comprendía una secuencia que codificada el producto génico de la neomicina-fosfotransferasa II (nptll) (N.° de acceso a GenBank AAL92039) unida operablemente al promotor del gen de la nopalina-sintasa (nos) de Agrobacterium turnefaciens antes o 5' de la región codificante de proteínas de nptll y unida operablemente a la región 3' UTR/terminador del gen nos en la región 3' (después de la región codificante de proteínas de nptll) . El producto génico nptll confiere resistencia al antibiótico G418. El plásmido pMT NPT/GUS comprendía además una secuencia que codificaba el producto génico marcador de beta-glucuronidasa (GUS) unida operablemente al promotor 35S de CaMV y unida operablemente además a la región 3' UTR/terminador de 35S de CaMV. Antes de la transformación con pMT NPT/GUS, Symbiodinium microadriacticum era incapaz de propagarse en un medio que comprendiera 3 mg/ml de G418. Tras la transformación con pMT NPT/GUS, se obtuvieron transformantes de Symbiodinium microadriacticum que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía 3 mg/ml de G418. La expresión del producto génico nptll en Symbiodinium microadriacticum permitió la propagación en presencia de 3 mg/ml de G418, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al antibiótico neomicina como marcador seleccionable para su uso en Symbiodinium microadriacticum. La actividad detectable del gen marcador GUS indicó que el promotor y la región 3'UTR de 35S de CaMV eran adecuados para permitir la expresión génica en Symbiodinium microadriacticum . La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. Ten Lohuis y iller describieron la propagación líquida de los transformantes de Symbiodinium microadriacticum en un medio que comprendía agua marina complementada con una solución de enriquecimiento F/2 (proporcionada por el proveedor Sigma) y 3 mg/ml de G418, así como también la selección y el mantenimiento de los transformantes de Symbiodinium microadriacticum en medio de agar que comprendía agua marina complementada con una solución de enriquecimiento F/2 y 3 mg/ml de G 18. Se ha descrito la propagación de Symbiodinium microadriacticum en otros medios de cultivo (por ejemplo, en Iglesias-Prieto et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 89:21 (1992) págs . 10302-10305). En el mismo informe de ten Lohuis y Miller se ha descrito un plásmido adicional, que comprende otros promotores, regiones 3' UTR/terminadores y un marcador seleccionable para permitir la expresión génica heteróloga en Symbiodinium microadriacticum. Ten Lohuis y Miller han descrito que el plásmido pMT NPT/GUS y el promotor y la región 3' UTR/terminador de los genes nos y 35S de CaMV son adecuados para permitir la expresión génica exógena en Symbiodinium microadriacticum. Además, ten Lohuis y Miller han descrito que el cásete de resistencia a neomicina codificado en pMT NPT/GUS era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Symbiodinium microadriacticum .

En una realización de la presente invención, se construye el vector pMT NPT/GUS, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico nptil para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosintesis de lípidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la vía de biosintesis de lípidos codifica una o más proteínas de la vía de biosintesis de lípidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Symbiodinium microadriacticum para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Symbiodinium microadriacticum de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteina de la vía de biosíntesis de lipidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor del gen de la nopalina-sintasa (nos) de Agrobacterium tumefaciens antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a la región 3' UTR/terminador de nos en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Symbiodinium microadriacticum para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosíntesis de lipidos endógenos. La transformación estable de Symbiodinium microadriacticum con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen la microinyección mediada con fibras de silicio u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico nptll se puede utilizar como marcador seleccionable para seleccionar Symbiodinium microadriacticum transformada con el vector de transformación en medio agar de agua marina que comprenda G 18, pero no se limita este medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lipidos por parte de Symbiodinium microadriacticum incluyen, sin carácter limitante, el agua marina artificial y los medios descritos por Iglesias-Prieto et al. y ten Lohuis y Miller. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Symbiodinium microadriacticum se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 37: Modificación de Nannochloropsis sp.

La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Nannochloropsis sp. W2J3B se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Kilian et al. según se expone en la presente. Brevemente, Kilian et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 108:52 (2011) págs .21265-21269, han descrito la transformación nuclear estable de Nannochloropsis con un constructo de transformación. Utilizando el método de transformación de electroporación, Kilian introdujo el constructo de transformación C2 en Nannochloropsis sp. W2J3B. El constructo de transformación C2 comprendía un cásete de resistencia a bleomicina, el cual comprendía la secuencia codificante para la proteina de unión a bleomicina (ble) de Streptoalloteichus hindustanus, para la resistencia a los antibióticos fleomicina y zeocina, unida operablemente al promotor del gen de la proteina de unión a clorofila a/violaxantina VCP2 de Nannochloropsis sp. W2J3B antes de la región codificante de proteínas de ble y unida operablemente a la región 3' UTR/terminador del gen de unión a clorofila a/violaxantina VCP1 de Nannochloropsis sp. W2J3B después de la región codificante de proteínas de ble. Antes de la transformación con C2, Nannochloropsis sp . 2J3B era incapaz de propagarse en un medio que comprendiera 2 g/ml de zeocina. Tras la transformación con C2, se obtuvieron transformantes de Nannochloropsis sp. W2J3B que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía 2 µg/ml de zeocina. La expresión del producto génico ble en Nannochloropsis sp. W2J3B permitió la propagación en presencia de 2 pg/ml de zeocina, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al antibiótico bleomicina como marcador seleccionable para su uso en Nannochloropsis . La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante PCR. Kilian ha descrito la propagación líquida de transformantes de Nannochloropsis sp. 2J3B en medio F/2 (que se describe en Guilard y Ryther, Canadian Journal of Mícrobiology, Vol . 8 (1962), págs . 229-239) que comprendía niveles cinco veces superiores de metales traza, vitaminas y solución de fosfato, y que comprendía además 2 pg/ml de zeocina. Kilian también ha descrito la selección y el mantenimiento de transformantes de Nannochloropsis sp. 2J3B en medio agar F/2 que comprendía agua marina artificial y 2 mg/ml de zeocina. Se ha descrito la propagación de Nannochloropsis en otros medios de cultivo (por ejemplo, en Chiu et al., Bioresour Technol., Vol. 100:2 (2009), págs. 833-838 y en Pal et al., Applied Microhlology and Biotechnology, Vol. 90:4 (2011), págs. 1429-1441). En el mismo informe de Kilian se describen otros constructos de transformación, que comprenden otros promotores y regiones 3 ' UTR/terminadores para permitir la expresión génica heteróloga en Nannochloropsis sp. W2J3B y marcadores seleccionables para la selección de los transformantes. Kilian ha descrito que el constructo de transformación C2 y el promotor del gen de la proteína de unión a clorofila a/violaxantina VCP2 de Nannochloropsis sp. W2J3B y la región 3' UTR/terminador del gen de la proteína de unión a clorofila a/violaxantina VCP1 de Nannochloropsis sp. 2J3B son adecuados para permitir la expresión génica exógena en Nannochloropsis sp. W2J3B. Además, Kilian ha descrito que el cásete de resistencia a bleomicina codificado en C2 era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Nannochloropsis sp. W2J3B.

En una realización de la presente invención, se construye el constructo de transformación C2, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico ble para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosintesis de lipidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la vía de biosintesis de lipidos codifica una o más proteínas de la vía de biosintesis de lipidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Nannochloropsis sp. W2J3B para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Nannochloropsis sp. de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteina de la via de biosintesis de lipidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor del gen VCP2 de Nannochloropsis sp. 2J3B antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a la región 3' UTR/terminador del gen VCPl de Nannochloropsis sp. 2J3B en la región 3' o después de la región codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Nannochloropsis sp. W2J3B para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosintesis de lipidos endógenos. La transformación estable de Nannochloropsis sp. W2J3B con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de ransformación de uso común, que incluyen la electroporación u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico ble se puede utilizar como marcador seleccionable para seleccionar Nannochloropsis sp. W2J3B transformada con el vector de transformación en medio F/2 que comprenda zeocina, pero no se limita este medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lipidos por parte de Nannochloropsis sp. W2J3B incluyen, sin carácter limitante, el medio F/2 y los medios descritos por Chiu et al. y Pal et al. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Nannochloropsis sp. 2J3B se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 38 : Modificación de Cyclotella cryptica La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Cyclotella cryptica se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Dunahay et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Dunahay et al., Journal of Phycology, Vol. 31 (1995), págs . 1004-1012, han descrito la transformación estable de Cyclotella cryptica con ADN plasmidico. Utilizando el método de transformación de bombardeo con microproyectiles , Dunahay introdujo el plásmido pACCNPT5.1 en Cyclotella cryptica. El plásmido pACCNPT5.1 comprendía un cásete de resistencia a neomicina, el cual comprendía la secuencia codificante del producto génico de la neomicina-fosfotransferasa II {nptll) unida operablemente al promotor del gen de la acetil-CoA-carboxilasa (ACCasa) de Cyclotella cryptica (N.° de acceso a GenBank L20784) antes de la región codificante de nptll y unida operablemente a la región 3' UTR/terminador del gen de ACCasa de Cyclotella cryptica en la región 3' (después de la región codificante de nptll) . El producto génico nptll confiere resistencia al antibiótico G418. Antes de la transformación con pACCNPT5.1, Cyclotella cryptica era incapaz de propagarse en un medio de agua marina artificial al 50% que comprendiera 100 g/ml de G418. Tras la transformación con pACCNPT5.1, se obtuvieron transformantes de Cyclotella cryptica que se propagaron en un medio selectivo de agua marina artificial al 50% que comprendía 100 µq/ l de G418. La expresión del producto génico nptll en Cyclotella cryptica permitió la propagación en presencia de 100 pg/ml de G418, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al antibiótico neomicina como marcador seleccionable para su uso en Cyclotella cryptica . La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. Dunahay ha descrito la propagación líquida de Cyclotella cryptica en un medio de agua marina artificial (ASW, según se describe en Brown, L., Phycologia, Vol. 21 (1982), págs. 408-410) complementado con silicato de sodio 1.07 mM y con 100 µg/ml de G418. Dunahay también ha descrito la selección y el mantenimiento de transformantes de Cyclotella cryptica en placas de agar que comprendían medio ASW con 100 µg/ml de G418. Se ha descrito la propagación de Cyclotella cryptica en otros medios de cultivo (por ejemplo, en Sriharan et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 28-29:1 (1991), págs. 317-326 y Pahl et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 109:3 (2010), págs. 235-239). Dunahay ha descrito que el plásmido pACCNPT5.1 y el promotor del gen de la acetil-CoA-carboxilasa (ACCasa) de Cyclotella cryptica son adecuados para permitir la expresión génica exógena en Cyclotella cryptica. Además, Dunahay ha descrito que el cásete de resistencia a neomicina codificado en pACCNPT5.1 era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Cyclotella cryptica .

En una realización de la presente invención, se construye el vector pACCNPT5.1, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico nptil para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lipidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la via de biosintesis de lipidos codifica una o más proteínas de la vía de biosíntesis de lipidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Cyclotella cryptica para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Cyclotella cryptica de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosíntesis de lipidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor ACCasa de Cyclotella cryptica antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a 3'UTR de ACCasa/terminador de Cyclotella cryptíca en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Cyclotella cryptíca para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosíntesis de lípidos endógenos. La transformación estable de Cyclotella cryptíca con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen el bombardeo con microproyectiles u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico nptll se puede utilizar como marcador para seleccionar Cyclotella cryptíca transformada con el vector de transformación en medio agar ASW que comprenda G418, pero no se limita a ese medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lípidos por parte de Cyclotella cryptíca incluyen, sin carácter limitante, el medio ASW y los medios descritos por Sriharan et al., 1991 y Pahl et al. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lípidos de Cyclotella cryptíca se puede determinar mediante la extracción de lípidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 39: Modificación de Navícula saprophila La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Navícula saprophila se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Dunahay et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Dunahay et al., Journal of Phycology, Vol. 31 (1995), págs. 1004-1012, han descrito la transformación estable de Navícula saprophila con ADN plasmidico. Utilizando el método de transformación de bombardeo con microproyectiles , Dunahay introdujo el plásmido pACCNPT5.1 en Navícula saprophila. El plásmido pACCNPT5.1 comprendía un cásete de resistencia a neomicina, el cual comprendía la secuencia codificante del producto génico de la neomicina-fosfotransferasa II {nptll) unida operablemente al promotor del gen de la acetil-CoA-carboxilasa (ACCasa) de Cyclotella cryptica (N.° de acceso a GenBank L20784) antes de la región codificante de nptll y unida operablemente a la región 3' UTR/terminador del gen de ACCasa de Cyclotella cryptica en la región 3' (después de la región codificante de nptll) . El producto génico nptll confiere resistencia al antibiótico G418. Antes de la transformación con pACCNPT5.1, Navícula saprophila era incapaz de propagarse en un medio de agua marina artificial que comprendiera 100 µg/ml de G418. Tras la transformación con pACCNPT5.1, se obtuvieron transformantes de Navícula saprophila que se propagaron en un medio selectivo de agua marina artificial que comprendía 100' g/ml de G418. La expresión del producto génico nptll en Navícula saprophila permitió la propagación en presencia de G418, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al antibiótico neomicina como marcador seleccionable para su uso en Navícula saprophila . La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. Dunahay ha descrito la propagación líquida de Navícula saprophila en un medio de agua marina artificial (ASW, según se describe en Brown, L., Phycologia, Vol. 21 (1982), págs . 408-410) complementado con silicato de sodio 1.07 mM y con 100 µg/ml de G418. Dunahay también ha descrito la selección y el mantenimiento de transformantes de Navícula saprophila en placas de agar que comprendían medio ASW con 100 g/ml de G418. Se ha descrito la propagación de Navícula saprophila en otros medios de cultivo (por ejemplo, en Tadros y Johansen, Journal of Phycology, Vol. 24:4 (1988), págs. 445-452 y Sriharan et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 20-21:1 (1989), págs. 281-291). Dunahay ha descrito que el plásmido pACCNPT5.1 y el promotor del gen de la acetil-CoA-carboxilasa (ACCasa) de Cyclotella cryptica son adecuados para permitir la expresión génica exógena en Navícula saprophila. Además, Dunahay ha descrito que el cásete de resistencia a neomicina codificado en pACCNPT5.1 era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Navícula saprophila.

En una realización de la presente invención, se construye el vector pACCNPT5.1, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico nptil para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosintesis de lipidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la vía de biosintesis de lipidos codifica una o más proteínas de la vía de biosintesis de lipidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Navícula saprophila para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Navícula pelliculosa, que está estrechamente relacionada, de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosintesis de lipidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor del gen de ACCasa de Cyclotella cryptíca antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a 3'UTR de ACCasa/terminador de Cyclotella cryptica en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Navícula saprophila para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosíntesis de lípidos endógenos. La transformación estable de Navícula saprophila con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen el bombardeo con microproyectiles u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico nptll se puede utilizar como marcador seleccionable para seleccionar Navícula saprophila transformada con el vector de transformación en medio agar ASW que comprenda G418, pero no se limita a ese medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lípidos por parte de Navícula saprophila incluyen, sin carácter limitante, el medio ASW y los medios descritos por Sriharan et al. 1989 y Tadros y Johansen. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lípidos de Navícula saprophila se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 40: Modificación de Thalassiosira pseudonana La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Thalassiosira pseudonana se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Poulsen et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Poulsen et al., Journal of Phycology, Vol. 42 (2006), págs . 1059-1065, han descrito la transformación estable de Thalassiosira pseudonana con ADN plasmídico. Utilizando el método de transformación de bombardeo con microproyectiles , Poulsen introdujo el plásmido pTpfcp/nat en Thalassiosira pseudonana. pTpfcp/nat comprendía un cásete de resistencia a nourseotricina, el cual comprendía una secuencia que codificaba el producto génico de nourseotricina-acetiltransferasa (nat) (N.° de acceso a GenBank AAC60439) unida operablemente al promotor del gen de la proteína de unión a clorofila a/c fucoxantina (fcp) de Thalassiosira pseudonana antes de la región codificante de proteínas de nat y unida operablemente a la región 3' UTR/terminador del gen fcp de Thalassiosira pseudonana en la región 3' (después de la secuencia codificante de proteínas de nat) . El producto génico nat confiere resistencia al antibiótico nourseotricina.

Antes de la transformación con pTpfcp/nat, Thalassiosira pseudonana era incapaz de propagarse en un medio que comprendiera 10 pg/ml de nourseotricina. Tras la transformación con pTpfcp/nat, se obtuvieron transformantes de Thalassiosira pseudonana que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía 100 µq/ml de nourseotricina. La expresión del producto génico nat en Thalassiosira pseudonana permitió la propagación en presencia de 100 g/ml de nourseotricina, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al antibiótico nourseotricina como marcador selcccionable para su uso en Thalassiosira pseudonana. La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. Poulsen ha descrito que la selección y el mantenimiento de Thalassiosira pseudonana transformada se realizaron en un cultivo líquido que comprendía medio ESA modificado (según se expone en Harrison et al., Journal of Phycology, Vol. 16 (1980), págs. 28-35) con 100 g/ml de nourseotricina. Se ha descrito la propagación de Thalassiosira pseudonana en otros medios de cultivo (por ejemplo, en Volkman et al., Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, Vol. 128:3 (1989), págs. 219-240). En el mismo informe de Poulsen, se ha descrito un plásmido adicional que comprende marcadores selecciónateles adicionales para su uso en Thalassiosira pseudonana . Poulsen ha descrito que el plásmido pTpfcp/nat y el promotor y la región 3' UTR/terminador de fcp de Thalassiosira pseudonana son adecuados para permitir la expresión génica exógena en Thalassiosira pseudonana. Además, Poulsen ha descrito que el cásete de resistencia a nourseotricina codificado en pTpfcp/nat era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Thalassiosira pseudonana .

En una realización de la presente invención, se construye el vector pTpfcp/nat, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico nat para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la via de biosintesis de lipidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la via de biosintesis de lipidos codifica una o más proteínas de la via de biosintesis de lipidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Thalassiosira pseudonana para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Thalassiosira pseudonana de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosintesis de lipidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor del gen fcp de Thalassiosíra pseudonana antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a la región 3' UTR/terminador del gen fcp de Thalassiosíra pseudonana en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Thalassiosíra pseudonana para la integración genómica dirigida del vector de transformación Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosíntesis de lipidos endógenos. Un experto en la técnica puede identificar tales regiones de homología en la secuencia del genoma de Thalassiosíra pseudonana (se menciona en la publicación de Armbrust et al., Science, Vol. 306: 5693 (2004): págs . 79-86). La transformación estable de Thalassiosíra pseudonana con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen el bombardeo con microproyectiles u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico nat se puede utilizar como marcador para seleccionar Thalassiosíra pseudonana transformada con el vector de transformación en medio de agar ESAW que comprenda nourseotricina, pero no se limita a este medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lipidos por parte de Thalassiosira pseudonana incluyen, sin carácter limitante, el medio ESAW y los medios de cultivo descritos por Volkman et al. y Harrison et al. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Thalassiosira pseudonana se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 41 : Modificación de Chlamydomonas reinhardtii La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Chlamydomonas reinhardtii se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Cerutti et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Cerutti et al., Genetics, Vol. 145:1 (1997), págs . 97-110, han descrito la transformación nuclear estable de Chlamydomonas reinhardtii con un vector de transformación. Utilizando el método de transformación de bombardeo con microproyectiles, Cerutti introdujo el constructo de transformación P

[1030] en Chlamydomonas reinhardtii. El constructo P

[1030] comprendía un cásete de resistencia a espectinomicina, el cual comprendía una secuencia que codificaba el producto génico de aminoglucósido-3' ' - adeniltransferasa {aadA) unida operablemente al promotor del gen de subunidad pequeña de la ribulosa-1 , 5-bisfosfato-carboxilasa/oxigenasa de Chlamydomonas reinhardtii (RbcS2, N.° de acceso a GenBank X04472) antes de la región codificante de proteínas de aadA y unida operablemente a la región 3' UTR/ terminador del gen RbcS2 de Chlamydomonas reinhardtii en la región 3' (después de la secuencia codificante de proteínas de aadA) . El producto génico aadA confiere resistencia al antibiótico espectinomicina. Antes de la transformación con P

[1030], Chlamydomonas reinhardtii era incapaz de propagarse en un medio que comprendiera 90 g/ml de espectinomicina. Tras la transformación con P

[1030], se obtuvieron transformantes de Chlamydomonas reinhardtii que se propagaron en un medio de cultivo selectivo que comprendía 90 µg/ml de espectinomicina, de este modo se estableció la utilidad del cásete de resistencia al antibiótico espectinomicina como marcador seleccionable para su uso en Chlamydomonas reinhardtii . La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante análisis de Southern. Cerutti ha descrito que la selección y el mantenimiento de Chlamydomonas reinhardtii transformada se realizó en placas de agar que comprendían medio de tris-acetato-fosfato (TAP, según se describe en Harris, The Chlamydomonas Sourcebook, Academic Press, San Diego, 1989) con 90 g/ml de espectinomicina. Además, Cerutti ha descrito la propagación de Chlamydomonas reinhardtii en un cultivo liquido de TAP con 90 µg/ l de espectinomicina. Se ha descrito la propagación de Chlamydomonas reinhardtii en medios de cultivo alternativos (por ejemplo, en Dent et al., African Journal of Microbiology Research, Vol. 5:3 (2011), págs. 260-270 y Yantao et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 107:2 (2010), págs. 258-268). En la técnica se conocen y se han descrito otros constructos, que comprenden marcadores selecciónateles adicionales adecuados para su uso en Chlamydomonas reinhardtii, asi como numerosas secuencias reguladoras, incluidos los promotores y las regiones 3' UTR adecuados para fomentar la expresión génica heteróloga en Chlamydomonas reinhardtii (para consultar un articulo de revisión, remítase a Radakovits et al., Eurkaryotic Cell, Vol. 9:4 (2010), págs. 486-501). Cerutti ha descrito que el vector de transformación P

[1030] y el promotor y la región 3' UTR/terminador de Chlamydomonas reinhardtii son adecuados para permitir la expresión génica exógena en Chlamydomonas reinhardtii. Además, Cerutti ha descrito que el cásete de resistencia a espectinomicina codificado en P

[1030] era adecuado como marcador selecciónatele en Chlamydomonas reinhardtii.

En una realización de la presente invención, se construye el vector P

[1030], que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico aadA para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la via de biosíntesis de lípidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la via de biosíntesis de lípidos codifica una o más proteínas de la vía de biosíntesis de lípidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Chlamydomonas reinhardtii para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Chlamydomonas reinhardtii de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosíntesis de lípidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor de RbcS2 de Chlamydomonas reinhardtii antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a 3' UTR/terminador de RbcS2 de Chlamydomonas reinhardtii en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Chlamydomonas reinhardtii para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos del gen de la vía de biosíntesis de lípidos endógenos. Un experto en la técnica puede identificar tales regiones de homología en la secuencia del genoma de Chlamydomonas reinhardtii (se menciona en la publicación de Merchant et al., Science, Vol. 318:5848 (2007), págs. 245-250). La transformación estable de Chlamydomonas reinhardtii con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen el bombardeo con microproyectiles u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico aadA se puede utilizar como marcador para seleccionar Chlamydomonas reinhardtii transformada con el vector de transformación en medio de agar TAP que comprenda espectinomicina, pero no se limita a este medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lípidos por parte de Chlamydomonas reinhardtii incluyen, sin carácter limitante, el medio ESAW y los medios de cultivo descritos por Yantao et al. y Dent et al. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lípidos de Chlamydomonas reinhardtii se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 42 : Modificación de Yarrotria lipolytica La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Yarrowia lipolytica se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Fickers et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Fickers et al., Journal of Microbiological Methods, Vol. 55 (2003), págs 727-737, han descrito la transformación nuclear estable de Yarrowia lipolytica con ADN plasmidico. Utilizando un método de transformación con acetato de litio, Fickers introdujo el plásmido JMP123 en Yarrowia lipolytica. El plásmido JMP123 comprendía un cásete de resistencia a higromicina B, el cual comprendía una secuencia que codificaba el producto génico de la higromicina B-fosfotransferasa (hph) , unida operablemente al promotor del gen LIP2 de Yarrowia lipolytica (N.° de acceso a GenBank AJ012632) antes de la región codificante de proteínas de hph y unida operablemente a la región 3' UTR/terminador del gen LIP2 de Yarrowia lipolytica después de la región codificante de proteínas de hph. Antes de la transformación con JMP123, Yarrowia lipolytica era incapaz de propagarse en un medio que comprendiera 100 g/ml de higromicina. Tras la transformación con JMP123, se obtuvo Yarrowia lipolytica transformada que fue capaz de propagarse en medio que comprendía 100 pg/ml de higromicina, de este modo se estableció el cásete de resistencia a higromicina B como un marcador seleccionable para su uso en Yarrowia lipolytica. La secuencia de nucleótidos proporcionada en J P123 del promotor y la región 3' UTR/terminador del gen LIP2 de Yarrowia lipolytica sirvió como secuencia donadora para la recombinación homologa de la secuencia codificante de hph en el locus de LIP2. La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante Southern. Fickers ha descrito que la selección y el mantenimiento de Yarrowia lipolytica transformada se realizaron en placas de agar que comprendían medio YPD estándar (dextrosa y peptona de extracto de levadura) con 100 µ?/p?? de higromicina. El cultivo líquido de Yarrowia lipolytica transformada se realizó en medio YPD con higromicina. Se han descrito otros medios y técnicas utilizados para cultivar Yarrowia lipolytica , y se han descrito numerosos plásmidos, promotores, regiones 3' UTR y marcadores selecciónateles diferentes para su uso en Yarrowia lipolytica (por ejemplo, remítase a Pignede et al., Applied and Environmental Biology, Vol. 66:8 (2000), págs. 3283-3289, Chuang et al., New Biotechnology, Vol. 27:4 (2010), págs. 277-282, y Barth y Gaillardin, (1996), en: K,W. (Ed. ) , Nonconventional Yeasts in Biotecnology. Sprinter-Verlag, Berlin-Heidelber , págs . 313-388). Fickers ha descrito que el vector de transformación JMP123 y el promotor y la región 3' UTR/terminador del gen LIP2 de Yarrowia lipolytica son adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en Yarrowia lipolytica . Además, Fickers ha descrito que el cásete de resistencia a higromicina codificado en JMP123 era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Yarrowia lipolytica .

En una realización de la presente invención, se construye el vector JMP123, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico hph para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la via de biosintesis de lipidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la via de biosintesis de lipidos codifica una o más proteínas de la vía de biosintesis de lipidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Yarrowia lipolytica para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Yarrowia lipolytica de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosintesis de lipidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor del gen LIP2 de Yarrowia lipolytica antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a la región 3' UTR/terminador del gen LIP2 de Yarrowia lipolytica en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Yarrowia lipolytica para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosíntesis de lípidos endógenos. Un experto en la técnica puede identificar tales regiones de homología en la secuencia del genoma de Yarrowia lipolytica (se menciona en la publicación de Dujun et al., Nature, Vol. 430 (2004), págs . 35-44). La transformación estable de Yarrowia lipolytica con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen la transformación con acetato de litio u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico hph se puede utilizar como marcador para seleccionar Yarrowia lipolytica transformada con el vector de transformación en medio YDP que comprenda higromicina, pero no se limita a este medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lipidos por parte de Yarrowia lipolytica incluyen, sin carácter limitante, el medio YPD y los medios de cultivo descritos por Chuang et al. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Yarrowia lipolytica se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 43 : Modificación de Mortierella alpine La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Mortierel la alpine se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Mackenzie et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Mackenzie et al., Applied and Envíronmental Microbiology, Vol. 66 (2000), págs. 4655-4661, han descrito la transformación nuclear estable de Mortierella alpina con ADN plasmídico. Utilizando un método de transformación con protoplastos , MacKenzie introdujo el plásmido pD4 en Mortierella alpina. El plásmido pD4 comprendía un cásete de resistencia a higromicina B, el cual comprendía una secuencia que codificaba el producto génico de la higromicina B-fosfotransferasa {hpt) , unida operablemente al promotor del gen de la histona H .1 de Mortierella alpina (N.° de acceso a GenBank AJ249812,) antes de la región codificante de proteínas de hpt y unida operablemente a la región 3' UTR/terminador del gen de la N- (5' -foforibosil) antranilato-isomerasa (trpC) de Aspergillus nidulans después de la región codificante de proteínas de hpt Antes de la transformación con pD4, Mortierella alpina era incapaz de propagarse en un medio que comprendiera 300 pg/ml de higromicina. Tras la transformación con pD4, se obtuvo Mortierella alpina transformada que se propagó en medio que comprendía 300 g/ml de higromicina, de este modo se estableció el cásete de resistencia a higromicina B como un marcador seleccionable para su uso en Mortierella alpina. La evaluación del ADN genómico de los transformantes estables se realizó mediante Southern. ackenzie ha descrito que la selección y el mantenimiento de Mortierella alpina transformada se realizaron en medio PDA (agar-dextrosa de papa) que comprendía higromicina. El cultivo líquido de Mortierella alpina transformada por Mackenzie se realizó en medio PDA o en medio S2GYE (que comprendía un 5% de glucosa, un 0.5% de extracto de levadura, un 0.18% de NH4S04, un 0.02% de MgS04-7H20, un 0.0001% de FeCl3- 6H20, un 0.1% de elementos traza, K2HP04- aH2P04 10 mM) con higromicina. Se han descrito otros medios y técnicas utilizados para cultivar Mortierella alpina, y se han descrito otros plásmidos, promotores, regiones 3' UTR y marcadores selecciónateles para su uso en Mortierella alpina (por ejemplo, remítase a Ando et al., Applied and Environmental Biology, Vol. 75:17 (2009) págs . 5529-35 y Lu et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 164:7 (2001), págs. 979-90). Mackenzie ha descrito que el vector de transformación pD4, el promotor de la histona H4.1 de Mortierella alpina y la región 3' UTR/terminador del gen trpC de A. nidulans son adecuados para permitir la expresión génica heteróloga en Mortierella alpina. Además, Mackenzie ha descrito que el cásete de resistencia a higromicina codificado en pD4 era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Mortierella alpina.

En una realización de la presente invención, se construye el vector pD4, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico hpt para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lípidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lípidos codifica una o más proteínas de la vía de biosíntesis de lípidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Mortierella alpina para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Mortierella alpina de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosíntesis de lípidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor del gen de la histona H4.1 de Mortierella alpina antes de la secuencia codificante de proteínas y se puede unir de forma operable a 3' UTR/terminador de trpC de A. nidulans en la región 3' o después de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Mortierella alpina para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosíntesis de lípidos endógenos. Un experto en la técnica puede identificar tales regiones de homología en la secuencia del genoma de Mortierella alpina (se menciona en la publicación de Wang et al., PLOS One, Vol. 6:12 (2011)). La transformación estable de Mortierella alpina con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen la transformación con protoplastos u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico hpt se puede utilizar como marcador para seleccionar Mortierella alpina transformada con el vector de transformación en medio PDA que comprenda higrorr.icina, pero no se limita a este medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lipidos por parte de Mortierella alpina incluyen, sin carácter limitante, el medio S2GYE y los medios de cultivo descritos por Lu et al. y Ando et al. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Mortierella alpina se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

EJEMPLO 44 : Modificación ele RhocLococcvLS opacus PD630 La expresión de genes recombinantes de acuerdo con la presente invención en Rhodococcus opacus PD630 se puede conseguir modificando los métodos y vectores descritos por Kalscheuer et al. según se expone en la presente. Resumiendo, Kalscheuer et al., Applied and Environmental Microbiology, Vol. 52 (1999), págs . 508-515, han descrito la transformación estable de Rhodococcus opacus con ADN plasmídico. Utilizando el método de transformación de electroporación, Kalscheuer introdujo el plásmido pNC9501 en Rhodococcus opacus PD630. El plásmido pNC9501 comprendía un cásete de resistencia a tiostreptona (tior) , el cual comprendía la secuencia entera de nucleótidos del gen de la metiltransferasa A1067 del ARNr 23S de Streptomyces azureus, incluida la secuencia del terminador 3' y del promotor del gen. Antes de la transformación con pNC9501, Rhodococcus opacus era incapaz de propagarse en un medio que comprendiera 1 mg/ml de tiostreptona . Tras la transformación de Rhodococcus opacus PD630 con pNC9501, se obtuvieron transformantes que se propagaron en un medio de cultivo que comprendía 1 mg/ml de tiostreptona, de este modo se estableció el uso del cásete de resistencia a tiostreptona como marcador seleccionable en Rhodococcus opacus PD630. Un segundo plásmido descrito por Kalscheuer, pAK68, comprendía el cásete de resistencia a tior, así como también las secuencias génicas de los genes de beta-cetotiolasa (phaB) , acetoacetil-CoA-reductasa (phaA) y ácido poli3-hidroxialcanoico-sintasa (phaC) de Ralstonia eutropha para la biosíntesis de polihidroxialcanoato, dirigida por el promotor lacZ . Tras la transformación con pAK68 de una cepa de Rhodococcus opacus PD630 deficiente en la biosíntesis de polihidroxialcanoato, se obtuvo Rhodococcus opacus PD630 que producía cantidades mayores de polihidroxialcanoatos que la cepa no transformada. La actividad detectable de las enzimas phaB, phaA y phaC de Ralstonia eutropha introducidas indicó que los elementos reguladores codificados en el plásmido pAK68 eran adecuados para la expresión génica heteróloga en Rhodococcus opacus PD630. Kalscheuer ha descrito que la selección y el mantenimiento de Rhodococcus opacus PD630 transformada se realizaron con un medio que contenia caldo de Luria (LB) , caldo de nutrientes (NB) o un medio de sales minerales (MSM) estándar que comprendía tiostreptona . Se han descrito otros medios y técnicas utilizados para cultivar Rhodococcus opacus PD630 (por ejemplo, remítase a Kurosawa et al., Journal of Biotechnology, Vol. 147:3-4 (2010), págs. 212-218 y Alvarez et al., Applied Microbial and Biotechnology, Vol. 54:2 (2000), págs. 218-223). Kalscheuer ha descrito que los vectores de transformación pNC9501 y pAK68, y los promotores del gen lacZ y el gen de metiltransferasa A1067 del ARNr 23S de Streptomyces azureus eran adecuados para permitir la expresión génica heterologa en Rhodococcus opacus PD630. Además, Kalscheuer ha descrito que el cásete de tior codificado en pNC9501 y pAK68 era adecuado para su uso como marcador seleccionable en Rhodococcus opacus PD630.

En una realización de la presente invención, se construye el vector pNC9501, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico tior para su uso como marcador seleccionable, y se modifica para que comprenda además una secuencia del cásete de expresión de la vía de biosíntesis de lípidos, de este modo se crea un vector de transformación. El cásete de expresión de la vía de biosintesis de lípidos codifica una o más proteínas de la vía de biosintesis de lípidos seleccionadas a partir de la Tabla 70, teniendo cada secuencia codificante de proteínas codones optimizados para la expresión en Rhodococcus opacus PD630 para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Rhodococcus opacus de acuerdo con las Tablas 69A-D. Para cada proteína de la vía de biosintesis de lípidos de la Tabla 70, la secuencia génica con codones optimizados se puede unir de forma operable individualmente al promotor del gen lacZ antes de la secuencia codificante de proteínas. El constructo de transformación puede comprender adicionalmente regiones de homología respecto al genoma de Rhodococcus opacus PD630 para la integración genómica dirigida del vector de transformación. Las regiones de homología se pueden seleccionar para que interrumpan uno o más sitios genómicos de los genes de la vía de biosintesis de lípidos endógenos. Un experto en la técnica puede identificar tales regiones de homología en la secuencia del genoma de Rhodococcus opacus PD630 (se menciona en la publicación de Holder et al., PLOS Genetics, Vol . 7:9 (2011)). La transformación de Rhodococcus opacus PD630 con el vector de transformación se consigue empleando técnicas de transformación de uso común, que incluyen la electroporacion u otros métodos conocidos. La actividad del producto génico de la metiltransferasa A1067 del ARNr 23S de Strepto yces azureus se puede utilizar como marcador para seleccionar Rhodococcus opacus PD630 transformada con el vector de transformación en medio LB que comprenda tiostreptona, pero no se limita a este medio. Los medios de crecimiento adecuados para la producción de lipidos por parte de Rhodococcus opacus PD630 incluyen, sin carácter limitante, los medios de cultivo descritos por Kurosawa et al. y Alvarez et al. La evaluación de los perfiles de ácidos grasos de los lipidos de Rhodococcus opacus PD630 se puede determinar mediante la extracción de lipidos y los métodos analíticos estándar que se describen en la presente.

Todas las referencias citadas en la presente, incluidas las patentes, solicitudes de patentes y publicaciones, incluidos los números de acceso a Genbank, se incorporan en su totalidad a la presente por referencia, tanto si se han incorporado previamente de forma específica como si no. Las publicaciones mencionadas en la presente se citan con el propósito de describir y presentar los reactivos, metodologías y conceptos que se pueden emplear en relación con la presente invención. En la presente no se debe interpretar nada como una admisión de que estas referencias tratan sobre la técnica anterior en lo que respecta a las invenciones descritas en la presente. En particular, las siguientes solicitudes de patente se incorporan a la presente por referencia en su totalidad a todos los efectos: la Solicitud de PCT N.° PCT/US2008/065563, presentada el 2 de junio de 2008 y titulada "Producción de aceite en microorganismos", la Solicitud de PCT N.° PCT/US2010/31108 , presentada el 14 de abril de 2010 y titulada "Métodos para la extracción y separación de aceite microbiano", y la Solicitud de PCT N.° PCT/US2009/066142, presentada el 30 de noviembre de 2009 y titulada "Producción de aceites diseñados en microorganismos heterotróficos" .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES : Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para producir un aceite natural que comprende triacilglicéridos , o un producto producido a partir del aceite natural, comprendiendo el método: cultivar una célula de un microorganismo recombinante, comprendiendo la célula ácidos nucleicos recombinantes operables para (a) reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa, y donde opcxonalmente la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para reducir o eliminar la expresión de dos copias de un gen que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa; o (b) expresar un producto de un gen exógeno que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa activa; o (c) reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I o ß-cetoacil-ACP-sintasa II, y expresar un producto de un gen exógeno que codifica una estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa activa; o (d) reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una estearoil- ACP-desaturasa o desaturasa de ácidos grasos, y expresar un producto de un gen exógeno que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II o acil-ACP-tioesterasa activa; y recuperar el aceite natural de la célula, y opcionalmente procesar adicionalmente el aceite natural para producir un producto alimenticio, combustible o un producto químico, donde el aceite natural tiene un perfil alterado de ácidos grasos debido a los ácidos nucleicos recombinantes .

2. El método de la reivindicación 1, donde el microorganismo sintetiza ácidos grasos a través de una via de biosintesis de ácidos grasos de tipo II.

3. El método de la reivindicación 2, donde el microorganismo es una microalga.

4. El método de la reivindicación 3, donde la microalga es un heterotrofo obligado.

5. El método de la reivindicación 2, donde la microalga es una especie de Prototheca o Chlorella.

6. El método de la reivindicación 5, donde la microalga es Prototheca wickerhamii , Prototheca stagnora , Prototheca portoricensis , Prototheca moriformis o Prototheca zopfii.

7. El método de la reivindicación 2, donde la microalga es Chlorella kessleri , Chlorella luteovíridis , Chlorella protothecoides o Chlorella vulgaris .

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la célula es una célula recombinante que expresa una sacarosa-invertasa activa.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el cultivo es heterotrófico .

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde la desaturasa de ácidos grasos es una o más de las siguientes: una desaturasa de ácidos grasos ?-6, una desaturasa de ácidos grasos ?-3, una desaturasa de oleatos ?-6 o una desaturasa de ácidos grasos delta 12.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la célula se cultiva para que comprenda al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70% o de un 50 a un 90% de triglicérido en peso celular seco.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el aceite comprende menos de 500, 50 o 5 ppm de moléculas con color.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde los ácidos nucleicos recombinantes se integran de forma estable.

14. El método de la reivindicación 13, donde los ácidos nucleicos recombinantes se integran de forma estable en el cromosoma del microorganismo.

15. El método de la reivindicación 14, que comprende además al menos un marcador seleccionable .

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para reducir o eliminar la expresión de una enzima mediante la expresión de ARN antisentido, ARNi o ARNbc que actúa sobre la transcripción de un gen que codifica la enzima.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, donde la reducción o eliminación de la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa o desaturasa de ácidos grasos es debida a la interrupción o el reemplazo de dichos genes por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa activa.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, donde la célula recombinante comprende además un gen exógeno que codifica una hidroxilasa de oleatos 12, para sintetizar ácido ricinoleico.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, donde la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una ß-cetoacil-ACP-sintasa II codificada por un gen KASII, y para expresar un producto de un gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa .

20. El método de la reivindicación 19, donde la célula produce un aceite con un perfil de ácidos grasos caracterizado por tener al menos un 40, 50, 60, 70 u 80% de ácidos grasos C16.

21. El método de la reivindicación 20, donde la célula produce un aceite con un perfil de ácidos grasos caracterizado por tener al menos un 50-75% de C16:0.

22. El método de la reivindicación 20 o 21, donde la célula produce un aceite con un perfil de ácidos grasos caracterizado por tener al menos un 20-40% de C18:l.

23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19-22, donde el gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa produce una acil-ACP-tioesterasa activa que tiene una mayor actividad en cuanto a la hidrólisis de cadenas de acilo graso C8-C16 que una acil-ACP- ioesterasa nativa de la célula .

24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19-23, donde el gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa interrumpe el gen KASII.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, donde la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I.

26. El método de la reivindicación 25, donde el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por una longitud de cadena media más corta de los ácidos grasos como resultado de los ácidos nucleicos recombinantes .

27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, donde la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una desaturasa de ácidos grasos codificada por al menos un gen FAD y expresar un producto de un gen exógeno de estearoil-ACP-desaturasa que codifica una estearoil-ACP-desaturasa activa .

28. El método de la reivindicación 27, donde los ácidos nucleicos son operables para reducir o eliminar la expresión de una desaturasa de ácidos grasos codificada por múltiples copias de un gen de la desaturasa de ácidos grasos.

29. El método de la reivindicación 27 o 28, donde el gen exógeno de la estearoil-ACP-desaturasa se recombina en un locus dentro de la región codificante del gen de la desaturasa de ácidos grasos.

30. El método de cualquiera de las reivindicaciones 27-29, donde el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos con un contenido elevado de ácido oleico.

31. El método de la reivindicación 30, donde el ácido oleico comprende al menos un 50, 60, 70, 80 o 90% de los ácidos grasos.

32. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, donde la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para expresar un producto de un gen exógeno de ß-cetoacil-ACP-sintasa II que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa II activa.

33. El método de la reivindicación 32, donde el aceite producido está caracterizado por un perfil de ácidos grasos con un contenido elevado de ácidos grasos C18:l y un contenido reducido de ácidos grasos C16 como resultado de los ácidos nucleicos recombinantes . Un método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, donde la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una estearoil-ACP-desaturasa por interferencia de ARN.

34. El método de acuerdo con la reivindicación 33, donde el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por un aumento de los ácidos grasos C18:0.

35. El método de la reivindicación 34, donde el aceite producido está caracterizado por un perfil de ácidos grasos que tiene al menos un 50, 60, 70, 80 o 90% de C18:0.

36. El método de la reivindicación 35, donde el aceite producido está caracterizado por un perfil de ácidos grasos que tiene al menos un 50-75% de C18:0.

37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34- 36, donde el aceite producido está caracterizado además por un perfil de ácidos grasos que tiene al menos un 20-40% de C18:l.

38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, donde la célula comprende ' ácidos nucleicos recombinantes operables para reducir o eliminar la expresión de dos copias de un gen que codifica una ß—cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa o desaturasa de ácidos grasos.

39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, operable para expresar un producto de un gen exógeno de desaturasa de ácidos grasos que codifica una desaturasa de ácidos grasos ?-3 y/o una desaturasa de oleatos ?-6 activa.

40. El método de la reivindicación 39, donde el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por un nivel elevado de ácido linoleico, ácido linolénico o ambos.

41. El método de la reivindicación 35, donde el perfil de ácidos grasos del aceite se caracteriza por tener al menos un 10, 20, 30, 40 o 50% de ácido linoleico, ácido linolénico o ambos.

42. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-41, donde el procesamiento adicional del aceite comprende uno o más de los siguientes: refinación, decoloración, desodorización, metátesis, transesterificación, hidrogenación, hidrólisis, hidrogenación, desoxigenación, hidrocraqueo, isomerización, hidroxilación, interesterificación, amidación, sulfonación y sulfuración.

43. El método de cualquiera de 1-42, donde el aceite se procesa para crear un aceite alimen icio, ácidos grasos, un alcohol graso, un lubricante, un jabón, un éster de un ácido graso, un ácido graso etoxilado, una amina grasa, un cloruro de alquilo, un alcohol graso etoxilado, un sulfato de alcohol graso, una alcanolamida de un ácido graso, un aceite sulfonado, un aceite sulfurado, combustible diésel, combustible para aviones, gasolina, un componente de mezcla para combustibles, un aditivo para combustibles, un aditivo para lubricantes, o un recubrimiento.

44. Un aceite natural que se puede obtener mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-43.

45. Un producto hecho del aceite natural de la reivindicación 44.

46. El producto de la reivindicación 45, que comprende un aceite alimenticio, ácidos grasos, un alcohol graso, un lubricante, un jabón, un éster de un ácido graso, un ácido graso etoxilado, una amina grasa, un cloruro de alquilo, un alcohol graso etoxilado, un sulfato de alcohol graso, una alcanolamida de un ácido graso, un aceite sulfonado, un aceite sulfurado, combustible diésel, combustible para aviones, gasolina, un componente de mezcla para combustibles, un aditivo para combustibles, un aditivo químico o un recubrimiento.

47. Una célula recombinante que comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para (a) reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa, y donde opcxonalmente la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para reducir o eliminar la expresión de dos copias de un gen que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa ; o (b) expresar un producto de un gen exógeno que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa activa; o (c) reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I o ß-cetoacil-ACP-sintasa II, y expresar un producto de un gen exógeno que codifica una estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa activa; o (d) reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una estearoil-ACP-desaturasa o desaturasa de ácidos grasos, y expresar un producto de un gen exógeno que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II o acil-ACP-tioesterasa activa.

48. La célula de la reivindicación 46, donde el microorganismo sintetiza ácidos grasos a través de una vía de biosintesis de ácidos grasos de tipo II.

49. La célula de la reivindicación 48, donde el microorganismo es una microalga.

50. La célula de la reivindicación 49, donde la microalga es un heterótrofo obligado.

51. La célula de la reivindicación 50, donde la microalga es una especie de Prototheca o Chlorella.

52. La célula de la reivindicación 51, donde la microalga es Prototheca wickerhamii , Prototheca stagnora , Prototheca portoricensis , Prototheca moriformis o Prototheca zopfii .

53. La célula de la reivindicación 51, donde la microalga es Chlorella kessleri, Chlorella luteoviridis, Chlorella protothecoides o Chlorella vulgaris .

54. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 46-53, donde la célula es una célula recombinante que expresa una sacarosa-invertasa activa.

55. La célula que cualquiera de las reivindicaciones 46-54, donde la célula es capaz de crecer heterotroficamente .

56. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 46-55, donde la desaturasa de ácidos grasos es una o más de las siguientes: una desaturasa de ácidos grasos ?-6, una desaturasa de ácidos grasos ?-3, una desaturasa de oleatos ?-6 o una desaturasa de ácidos grasos delta 12.

57. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 46-56, donde la célula se puede cultivar para que comprenda entre al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70% o un 50 y un 90% de triglicérido en peso celular seco.

58. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 46-57, donde los ácidos nucleicos recombinantes se integran de forma estable.

59. La célula de la reivindicación 58, donde los ácidos nucleicos recombinantes se integran de forma estable en el cromosoma del microorganismo.

60. La célula de la reivindicación 59, que comprende además al menos un marcador seleccionable .

61. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 46-60, donde la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para reducir o eliminar la expresión de una enzima mediante la expresión de ARN antisentido, ARNi o ARNbc que actúa sobre la transcripción de un gen que codifica la enzima.

62. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 46-61, donde la reducción o eliminación de la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa o desaturasa de ácidos grasos es debida a la interrupción o el reemplazo de dichos genes por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa, desaturasa de ácidos grasos o acil-ACP-tioesterasa activa.

63. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 46-62, donde la célula recombinante comprende además un gen exógeno que codifica una hidroxilasa de oleatos 12, para sintetizar ácido ricinoleico.

64. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 46-62, donde la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una ß-cetoacil-ACP-sintasa II codificada por un gen KASII, y para expresar un producto de un gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa .

65. La célula de la reivindicación 64, donde la célula produce un aceite con un perfil de ácidos grasos caracterizado por tener al menos un 40, 50, 60, 70 u 80% de ácidos grasos C16.

66. La célula de la reivindicación 65, donde la célula produce un aceite con un perfil de ácidos grasos caracterizado por tener al menos un 50-75% de C16:0.

67. La célula de la reivindicación 66, donde la célula produce un aceite con un perfil de ácidos grasos caracterizado además por tener al menos un 20-40% de C18:l.

68. La célula de la reivindicación 64 o 65, donde el gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa produce una acil-ACP-tioesterasa activa que tiene una mayor actividad en cuanto a la hidrólisis de cadenas de acilo graso C8-C16 que una acil-ACP-tioesterasa nativa de la célula.

69. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 64-66, donde el gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa interrumpe el gen KASII.

70. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 46-62, donde la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una ß-cetoacil-ACP-sintasa I.

71. La célula de la reivindicación 70, donde el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por una longitud de cadena media más corta de los ácidos grasos como resultado de los ácidos nucleicos recombinantes .

72. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 46-62, donde la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una desaturasa de ácidos grasos codificada por al menos un gen FAD y expresar un producto de un gen exógeno de estearoil-ACP-desaturasa que codifica una estearoil-ACP-desaturasa activa.

73. La célula de la reivindicación 72, donde los ácidos nucleicos son operables para reducir o eliminar la expresión de una desaturasa de ácidos grasos codificada por múltiples copias de un gen de la desaturasa de ácidos grasos.

74. La célula de la reivindicación 72 o 73, donde el gen exógeno de la estearoil-ACP-desaturasa se recombina en un locus dentro de la región codificante del gen de la desaturasa de ácidos grasos.

75. La célula de cualguiera de las reivindicaciones 72-74, donde el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos con un contenido elevado de ácido oleico.

76. La célula de la reivindicación 75, donde el ácido oleico comprende al menos un 50, 60, 70, 80 o 90% de los ácidos grasos.

77. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 46-62, donde la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para expresar un producto de un gen exógeno de ß-cetoacil-ACP-sintasa II que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa II activa.

78. La célula de la reivindicación 77, donde el aceite producido está caracterizado por un perfil de ácidos grasos con un contenido elevado de ácidos grasos C18:l y un contenido reducido de ácidos grasos C16 como resultado de los ácidos nucleicos recombinantes .

79. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 46-62, donde la célula recombinante comprende ácidos nucleicos operables para reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una estearoil-ACP-desaturasa por interferencia de ARN.

80. La célula de acuerdo con la reivindicación 79, donde el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por un aumento de los ácidos grasos C18:0.

81. La célula de la reivindicación 80, donde el aceite producido está caracterizado por un perfil de ácidos grasos que tiene al menos un 50, 60, 70, 80 o 90% de C18:0.

82. La célula de la reivindicación 80, donde el aceite producido está caracterizado por un perfil de ácidos grasos que tiene al menos un 50-75% de C18:0.

83. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 79-82, donde el aceite producido está caracterizado además por un perfil de ácidos grasos que tiene al menos un 20-40% de C18:l.

84. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 46-62, donde la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para reducir o eliminar la expresión de dos copias de un gen que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I, ß-cetoacil-ACP-sintasa II, estearoil-ACP-desaturasa o desaturasa de ácidos grasos.

85. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 46-62, operable para expresar un producto de un gen exógeno de desaturasa de ácidos grasos que codifica una desaturasa de ácidos grasos ?-3 y/o una desaturasa de oleatos ?-6 activa.

86. La célula de la reivindicación 85, donde el aceite producido tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por un nivel elevado de ácido linoleico, ácido linolénico o ambos.

87. La célula de la reivindicación 86, donde el perfil de ácidos grasos del aceite se caracteriza por tener al menos un 10, 20, 30, 40 o 50% de ácido linoleico, ácido linolénico o ambos.

88. Un aceite natural o un producto que contiene un aceite natural producido a partir de la célula de cualquiera de las reivindicaciones 46-87.

89. Un método para producir un aceite natural que comprende triacilglicéridos que comprende ácido ricinoleico, o un producto producido a partir del aceite natural, comprendiendo el método: cultivar una célula de un microorganismo recombinante, comprendiendo la célula ácidos nucleicos recombinantes operables para expresar un producto de un gen exógeno que codifica una hidroxilasa de oleatos 12 activa, con el fin de sintetizar ácido ricinoleico.

90. El método de la reivindicación 48, donde el microorganismo presenta una vía de biosintesis de ácidos grasos de tipo II.

91. El método de la reivindicación 90, donde el microorganismo es una microalga.

92. El método de la reivindicación 91, donde la microalga es un heterotrofo obligado.

93. El método de la reivindicación 92, donde la microalga es una especie de Prototheca .

94. El método de la reivindicación 93, donde la microalga es Prototheca wickerhamii , Prototheca stagnora , Prototheca portoricensís , Prototheca moriformis o Prototheca zopfii .

95. El método de la reivindicación 91, donde la microalga es Chlorella kessleri , Chlorella luteoviridis , Chlorella protothecoides o Chlorella vulgaris .

96. El método de cualquiera de las reivindicaciones 46-95, donde la célula es una célula recombinante que expresa una sacarosa-invertasa activa.

97. El método de cualquiera de las reivindicaciones 46-96, donde el cultivo es heterotrófico .

98. El método de cualquiera de las reivindicaciones 46-98, donde la célula produce al menos un 40, 50, 60, 70, 80 o 90% de ácido oleico sin los ácidos nucleicos recombinantes operables para expresar un producto de un gen exógeno que codifica una hidroxilasa de oleatos 12 activa.

99. El método de cualquiera de las reivindicaciones 89-98 98, que comprende además ácidos nucleicos recombinantes operables para mejorar la producción de ácido oleico con el fin de elevar los niveles del sustrato para la hidroxilasa de oleatos 12.

100. El método de la reivindicación 99, donde la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para (a) expresar un producto de un gen exógeno que codifica una estearoil-ACP-desaturasa activa y reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una desaturasa de ácidos grasos; o (b) expresar un producto de un gen exógeno que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I activa y expresar un producto de un gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa activa.

101. Un producto producido de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 89-100.

102. Una célula de un microorganismo que comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para expresar un producto de un gen exógeno que codifica una hidroxilasa de oleatos 12 activa, con el fin de sintetizar ácido ricinoleico .

103. La célula de la reivindicación 102, donde el microorganismo presenta una vía de biosintesis de ácidos grasos de tipo II.

104. La célula de la reivindicación 103, donde el microorganismo es una microalga.

105. La célula de la reivindicación 104, donde la microalga es un heterótrofo obligado.

106. La célula de la reivindicación 105, donde la microalga es una especie de Prototheca .

107. La célula de la reivindicación 106, donde la microalga es Prototheca wickerhamii , Prototheca stagnora , Prototheca portoricensis , Prototheca moriformis o Prototheca zopfii.

108. La célula de la reivindicación 104, donde la microalga es Chlorella kessleri , Chlorella luteoviridis , Chlorella protothecoides o Chlorella vulgaris .

109. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 102-108, donde la célula es una célula recombinante que expresa una sacarosa-invertasa activa.

110. La célula que cualquiera de las reivindicaciones 102 a 109, donde la célula es capaz de crecer heterotróficamente .

111. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 102 a 109, donde la célula produce al menos un 40, 50, 60, 70, 80 o 90% de ácido oleico sin los ácidos nucleicos recombinantes operables para expresar un producto de un gen exógeno que codifica una hidroxilasa de oleatos 12 activa.

112. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 102-111, que comprende además ácidos nucleicos recombinantes operables para mejorar la producción de ácido oleico con el fin de elevar los niveles del sustrato para la hidroxilasa de

113. La célula de la reivindicación 112, donde la célula comprende ácidos nucleicos recombinantes operables para (a) expresar un producto de un gen exógeno que codifica una estearoil-ACP-desaturasa activa y reducir o eliminar la expresión de una enzima codificada por uno o más genes que codifican una desaturasa de ácidos grasos; o (b) expresar un producto de un gen exógeno que codifica una ß-cetoacil-ACP-sintasa I activa y expresar un producto de un gen exógeno que codifica una acil-ACP-tioesterasa activa.

114. Un producto alimenticio que comprende un aceite de la reivindicación 44.