JP2009536830A - 新規Chlorella種およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2006年5月12日に出願された米国仮特許出願第60/800077号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第60/800077号は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
本発明は、藻類、藻類選択法、および、種々の製品の製造のために藻類を使用する方法に関する。
大気中のCO2およびその他の温室効果ガス(メタン、クロロフルオロカーボンなど)による地球規模の温暖化、および、栄養素(例えば、窒素およびリン酸塩)およびその他の汚染物質による広範な水質汚染は、特に大きな環境不安とされる。汚染防止およびコントロールのために、多くの従来の技術および方法の利用が可能であるが、これらの方法は、通常、きわめて高価で、高度のエネルギー消費を伴う。これらのシステムから生成される大量の汚泥および/または廃液は、処理が難しく、さらに二次汚染を引き起こす危険性を抱える。石油、天然ガス、石炭、および核エネルギーは、今日使用されるエネルギーの主要供給源であるが、その維持は不可能である。エネルギー消費が増すにつれ、これら再生不能の化石燃料の天然埋蔵量は急激に縮小する。例えば、現在の消費率で行くと、現在特定されている石油埋蔵量は約50年以下しか続かない。化石燃料の生産および消費はまた、地域的、および地球規模の大気および水質汚染の主要原因でもある。
第1局面において、本発明は、単離Chlorella種組成物であって、その単離Chlorella種ゲノムが、配列番号1(ITS−1249bp)、配列番号2(rbcL−1393bp)、配列番号3(ITS1−ITSの502−739)、配列番号4(ITS2−ITSの899−1137)、配列番号5(ITS−827bp)、および配列番号6(rbcL−1160bp)、またはその相補体から成る群から選ばれる、一つ以上の核酸配列を含む、組成物を提供する。
(a)増殖培地;および、
(b)本発明の第3局面の単離Chlorella種
を含む培養物を提供する。
(a)光バイオリアクター;および、
(b)本発明の第2局面の実質的に純粋な培養物
を含むシステムを提供する。
第1局面において、本発明は、単離Chlorella種組成物であって、その単離Chlorella種ゲノムが、配列番号1(ITS−1249bp)、配列番号2(rbcL−1393bp)、配列番号3(ITS1−ITSの502−739)、配列番号4(ITS2−ITSの899−1137)、配列番号5(ITS−827bp)、および配列番号6(rbcL−1160bp)、またはその相補体から成る群から選ばれる、一つ以上の核酸配列を含む、組成物を提供する。下記により詳細に論じるように、これらの核酸配列はそれぞれ、本発明の新規Chlorella種のマーカーとして有用であり、このChlorellaを他のChlorella株と区別する。
(a)光バイオリアクター;および、
(b)本発明の第2局面の、実質的に純粋な培養物
を含むシステムを提供する。
生物および増殖条件:
開始の藻類培養物は、フェニックス都市圏の水環境から得、BG−11増殖培地において25℃で維持した(Rippka,1979)。
藻類細胞集団の密度は、毎日、マイクロプレート分光光度計(SPECTRA max 340PC)によって測定し、660nm波長における光学的密度として記録した。藻類マスの乾燥重量は、あらかじめ重量測定したWhatman GF/Cフィルターによる10〜20mlの培養物のろ過によって定量した。藻類を登載するフィルターは、105℃で一晩乾燥し、デシケータで室温に冷却し、重量測定した。
高温メタノール抽出法を用いた(Azov(1982))。濃度は、Talling係数を用いて計算した。
上式において、DO665=665nm波長において測定した光学的密度、DO750=750nm波長において測定した光学的密度、V=メタノールの全体体積(ml)、および、U=藻類縣濁液の体積(ml)である。
脂質抽出手順は、Bigogno et al.(2002)にしたがって改変した。Chlorella細胞バイオマス(100mg凍結乾燥)を、小型のガラスバイアルに加え、Teflonねじ込みキャップで密封し、1時間磁力攪拌しながら40℃に温めることによって、10%DMSO含有メタノールで抽出した。この混合物を、3,500rpmで10分遠心した。得られた上清を、別の清潔なバイアルに移動し、ペレットを、ヘキサンおよびエーテル(1:1,v/v)の混合物で30分再抽出した。この抽出手順を、ペレット中に残留するクロロフィルの量が無視できるほどになるまで数回繰り返した。ジエチルエーテル、ヘキサン、および水を、合わせた上清に、1:1:1:1(v/v/v/v)比となるように加えた。この混合物を、手で振とうし、次いで、3,500rpmで5分遠心した。上部相を収集した。下部の水相は、ジエチルエーテル:ヘキサン(1:1,v/v)の混合液で2度再抽出した。これらの有機相を合わせ、窒素ガスを、残留する油状抽出物の重量が一定となるまで、バブリングすることによって油状抽出物中の溶媒を完全に除去した。
脂肪酸は、メタノール液中の硫酸による直接的メチル基移転の後(Christie,2003)、ガスクロマトグラフィー(GC)によって分析した。この脂肪酸メタノールエステル(FAME)を、0.8%BHT含有ヘキサンで抽出し、HP7673インジェクター、および、HP−INNOWAX(商標)毛細管カラム(HP19091N−133、30m×0.25mm×0.25μm)を備えたHP−6890ガスクロマトグラフィー(Hewlett−Packard)によって分析した。2μLのサンプルを、非分割性(split−less)注入方式で注入した。入力および検出器温度は、それぞれ、250℃および270℃に維持し、オーブン温度は、170℃から220℃まで1℃/分で上昇するようにプログラムした。キャリヤーガスとして高純度の窒素ガスを用いた。FAMEは、その保持時間を、真性標準(Sigma)と比較することによって特定し、そのピーク面積を、内部標準(C17:0)のものと比較することによって定量した。
酪農場廃水は、Mesa、Arizonaの酪農場(北緯N33.35030、西経W111.65837)において、飼養区画送管廃棄物および地表水から成る、浅い廃水池から収集した。廃水複合サンプルを、浅い廃水池の土手にそった、少なくとも3ヶ所の接近地点から収集した。廃水は、プラスチック容器(5ガロン以上)に納めて4℃で保存した。
この藻類を増殖するために、300ml容量のガラスカラム(68cm長、内径2.3cm)であって、通気を行うためにカラムの中心より下にガラス毛細管を設置したカラムを用いた。カラムの最頂部は、カラム間の汚染を防止するため、ゆるい結合性のアルミニウムフォイルで囲まれたゴム製ストッパーで覆った。別様に指示しない限り、実験を通じて、25℃の培養温度、170μmolm−2s−1の光強度、および、1%CO2の圧縮空気をガラスカラムに与えた。
CO2処理実験のために、1%CO2添加空気、または15%CO2添加空気でバブルさせたBG−11増殖培地において、藻類細胞を増殖した。
50mlの細胞培養物を収集し、遠心し(3000rpm×5分)、次いで、ホモジェナイズし、液体窒素において粉末とした。ゲノムDNAを抽出し、NucleoSpin Plant Kit(MACHEREY−NAGEL Inc.)によって精製した。リボソームDNA内部転写スペーサ(ITS)(配列番号1)、および、Rubisco遺伝子の大型サブユニット(rbcL)(配列番号2)を、Chlorella種名特定のための分子マーカーとして用いた。PCR反応は、12.5μlのGoTaq Green Master Mix(Promega)、200ngの鋳型DNA、および0.5μMのプライマー(表参照)およびH2Oを、25μlの最終容量の中に含んでいた。領域ITS増幅のためのPCRサイクルは、下記の通りであった:94℃、5分が1サイクル、94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で1分30秒が35サイクル、72℃、10分が1サイクル。rbcL増幅のためのPCRサイクルは、下記の通りであった:94℃、5分が1サイクル、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分30秒が35サイクル、72℃、10分が1サイクル。PCR産物は、1.5%アガロース上で調べた。2μlのPCR産物を、pCR(登録商標)4−TOPOベクター(Invitrogen)にクローンした。PureLink Quick Plasmid Miniprepキット(Invitrogen)を用いて、陽性クローンから配列決定用プラスミドを抽出した。配列決定のためにプライマーM13RおよびM13Fを用いた。
DNA配列を、Clustal W 1.83と整列させ、Seaviewによる手動で確認した。系統樹は、Mega3に登載される隣接接合(NJ)アルゴリスムによって再構築した。系統樹を再構築するための置換率を計算するために、Kimuraの2−パラメータモデルを用いた。
Chlorella種の単離および形態学的記述
開始藻類培養物は、Tempe市(アリゾナ)の公共水源池から収集し、藻類単離株は、標準的寒天プレート法によって水サンプルから単離した。次に、個々の緑色コロニーを、10mlのBG−11増殖培地を含む、ねじ込みキャップ付き試験管に移した。培養物を、20〜40μmolフォトンm−2s−1の光強度の下に20〜25℃に維持した。培養物は、毎週、顕微鏡観察および分光光度計測によってその成長を調べた。急速な成長および生殖を示す、単一藻類株(我々の培養条件(例えば、BG−11増殖培地、25℃、170μmolm−2s−1の光強度、および1〜2%CO2による通気)下において、1日当たり1から3倍増加を示す全ての単離株)に対し、脂肪酸含量分析を行った。高い脂肪酸含量を処理する藻類株のみを選び、その後、高CO2濃度、温度範囲、および/または各種廃水に対する耐性に関して選別を行った。この選択プロセスから得られた藻類株の一つが、形態学的特徴に基づいてChlorella種と特定され、その後の分析に使用された。
本発明の選択法によって得られたChlorella種は、高いCO2濃度(すなわち、15%CO2以上)でも、一般に藻類培養物に適用される1%CO2で見られるものと同じ成長率で成長する能力を有する(図1)。このCO2レベルは、化石燃料発電所から吐き出される煙道ガスに通常見られるものと等価である。15%CO2において増殖されるChlorella種培養物のバイオマスの生産性は、420±50mgl−1d−1であり、これは、1%CO2において増殖される培養物から得られる350±40mgl−1d−1と近似するか、やや高かった(図2)。
細胞の脂質(脂肪酸)含量、または脂質生産に対し、CO2の作用はほとんど無かった。本明細書で用いる「含量」とは、ある一時点における、細胞の脂質含量を指し;脂質の「生産率」または脂質の「生産性」または「収率」とは、時間(日)当たり、培養物単位容量またはリアクター照明面積当たりに生産される、Chlorella種の脂質の量を指す。Chlorella種培養物が、前記培養条件下において、1%または15%CO2を補給されるガラスカラムバイオリアクター中に維持される場合、細胞の脂質含量は、乾燥重量の40.5+4%であった(図3a)。同様に、Chlorella種培養物は、いずれのレベルのCO2を補給されても、体積当たり脂質の生産は、約150±12mgl−1d−1であった(図3b)。
Chlorella種は、様々な供給源からの廃水、例えば、栄養素汚染地下水、農業排水、および動物飼養作業場廃水の中でも繁殖する能力を有する。培養物に対し添加性栄養薬品はまったく加えなかった。これは、酪農場廃水は、藻類成長および生殖に必要な栄養素を含むことを示唆する。図4は、種々の濃度の酪農廃水(すなわち、25%、50%、75%、および100%廃水)に維持したChlorella種の成長を示す。Chlorella種細胞は、100%酪農廃水に接種されると、最初の6日間ほとんど成長は起こらなかった。その後、Chlorella種細胞は、急速に成長を開始し、さらに5日の培養後、4.2±0.3gl−1の最大細胞密度に達した。酪農廃水を、100%から75%、次いで50%に希釈すると、Chlorella種培養物の遅延相は次第に短縮した。しかしながら、廃水をさらに25%に希釈すると、最大細胞密度の低下がもたらされた。しかしながら、BG−11増殖培地と比較すると、酪農廃水は、僅かな成長低下しかもたらさなかった。各種希釈度の内、50%廃水で、体積当たりもっとも高いバイオマス生産性が得られた。50%よりも低い廃水濃度も、高い廃水濃度も、いずれもバイオマス収率の低下をもたらした(図5)。
酪農廃水の濃度は、成長ばかりでなく、細胞の脂質含量にも影響を及ぼした。最高脂質含量は、25%廃水において増殖した培養物において測定された。廃水濃度が、50%および75%に増加するにつれて、細胞の脂質含量は徐々に減少した(図6)。体積あたりのバイオマス生産性において観察された傾向同様、50%廃水が、油について最高の生産性を維持したが、それよりも高い(例えば、75%DWW)、または低い(例えば、25%DWW)希釈率では、脂質生産は低下した(図7)。
表2は、BG−11増殖培地において増殖したChlorella種の脂肪酸組成を示す。C16およびC18が、細胞中の総脂質の96%を超える割合を構成する主要脂肪酸である。
1249−bp ITSセグメントを、Chlorella種から増幅した(配列番号1)。これは、18S rDNA(1−501)の3’末端(配列番号11)、ITS1(502−739)(配列番号3)、5.8S rDNA(740−898)(配列番号12)、ITS2(899−1137)(配列番号4)、および28S rDNAの5’末端(1138−1249)(配列番号13)から成る。National Center for Biotechnology Information(NCBI)データベースにおいて、BLAST検索によって同一ヌクレオチド配列は見出せなかった。22種の藻類門分類群が、ITS領域の827塩基対(配列番号5)に基づいて推定された。図9に示すように、Chlorella種は、他の8種のクロレラ株と共に単系統群に配置された。この系統樹において、Chlorella種は、Chlorella vulgaris CBS15−2075の姉妹種であり、80%の配列同一性を有していた。NCBIにおけるBLAST配列検索に基づき、Chlorella種において、系統的にもっとも近縁の種によるITS1共有の最大同一性は71%であり、ITS2の最大同一性は85%である(図11の配列整列を参照)。したがって、この新規単離クロレラ株に対する近縁種は、この急速に進化するDNA領域において識別することが可能である。
Claims (16)
- 単離Chlorella種組成物であって、前記単離Chlorella種のゲノムが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、および配列番号6、またはその相補体から成る群から選ばれる一つ以上の核酸配列を含む、組成物。
- 前記単離Chlorella種ゲノムが、配列番号3の核酸配列を含む、請求項1に記載の、単離Chlorella種組成物。
- 前記単離Chlorella種ゲノムが、配列番号4の核酸配列を含む、請求項1に記載の、単離Chlorella種組成物。
- 前記単離Chlorella種ゲノムが、配列番号5の核酸配列を含む、請求項1に記載の、単離Chlorella種組成物。
- 前記単離Chlorella種ゲノムが、配列番号1の核酸配列を含む、請求項1に記載の、単離Chlorella種組成物。
- 実質的に純粋な培養物であって:
(a)増殖培地;および、
(b)請求項1〜5のいずれか1項の単離Chlorella種組成物
を含む培養物。 - 藻類培養システムであって:
(a)光バイオリアクター;および、
(b)請求項6の実質的に純粋な培養物
を含むシステム。 - Chlorella種を培養することを含む、脂質単離のための方法であって、前記Chlorella種のゲノムが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、および配列番号6、またはその相補体から成る群から選ばれる一つ以上の核酸配列を含み、前記培養が、前記Chlorella種の増殖、および前記Chlorella種からの脂質の抽出に好適な条件下で行われる、方法。
- Chlorella種を培養することを含む、廃水から栄養素を除去するための方法であって、前記Chlorella種のゲノムが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、および配列番号6、またはその相補体から成る群から選ばれる一つ以上の核酸配列を含み、前記培養が、前記Chlorella種の増殖に好適な条件下で行われ、かつ、前記培養が、前記廃水中の栄養素が前記Chlorella種によって除去される条件下で、少なくとも5%の廃水を含む培養培地中で行われる、方法。
- Chlorella種を培養することを含む、廃ガスから栄養素を除去するための方法であって、前記Chlorella種のゲノムが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、および配列番号6、またはその相補体から成る群から選ばれる一つ以上の核酸配列を含み、前記培養が、前記Chlorella種の増殖に好適な条件下で行われ、かつ、前記培養が、廃ガス中の栄養素が前記Chlorella種によって除去される条件下で、前記廃ガスを含む培養培地中で行われる、方法。
- 前記培養Chlorella種から藻類タンパクおよび/またはバイオマス成分を収集することをさらに含む、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
- Chlorella種を培養することを含む、バイオマスを生産するための方法であって、前記Chlorella種のゲノムが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、および配列番号6、またはその相補体から成る群から選ばれる一つ以上の核酸配列を含み、前記培養が、前記Chlorella種の増殖、および前記培養Chlorella種からの藻類タンパクおよび/またはバイオマス成分の収集に好適な条件下で行われる、方法。
- 前記Chlorella種ゲノムが、配列番号3の核酸配列を含む、請求項8〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Chlorella種ゲノムが、配列番号4の核酸配列を含む、請求項8〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Chlorella種ゲノムが、配列番号5の核酸配列を含む、請求項8〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Chlorella種ゲノムが、配列番号1の核酸配列を含む、請求項8〜12のいずれか1項に記載の方法。
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