CN114260307B - 管状藻及微生物菌剂的应用、去除环境重金属的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及藻类培养与环境污染领域，尤其涉及管状藻及微生物菌剂的应用、去除环境重金属的方法，本发明的管状藻(Fistulifera solaris)，保藏编号为CCTCC NO:M 20211113。本发明的管状藻可以在5℃～45℃、pH浓度为3～11、重金属离子的浓度为20～160ppm环境中生长，该藻株具有极强的重金属耐受性，可在含有高重金属含量的环境中生长。同时该藻株和该藻株制备的微生物菌剂可以高效去除水体和土壤中的重金属。

Description

管状藻及微生物菌剂的应用、去除环境重金属的方法

技术领域

本发明涉及藻类培养与环境污染领域，尤其涉及管状藻及微生物菌剂的应用、去除环境重金属的方法。

背景技术

重金属污染对生物体的具有严重的毒害。由于重金属的高毒性、不可生物降解性和在食物链和生物体中的积累性，会导致环境质量的恶化。因此，世界卫生组织(WHO)和美国环境保护署(USEPA)对向环境中排放的重金属的允许水平制定了严格的规定。在重金属污染中，铅(Pb2+)和铜(Cu2+)是主要的环境污染物，因为它们具有很高的毒性。除传统的物理化学方法外，研究人员已经尝试了多种去除重金属污染的技术，近年来生物方法的应用主要集中在利用微藻处理重金属污染问题上。浮游植物，如微藻，通过调节其物理化学和遗传结构以适应污染水体。硅藻是在海洋生态系统中最为丰富的生物群落之一。在重金属的去除、解毒和水生生态系统的恢复过程中起到重要的作用。因此，具有高重金属耐受力和去除能力的硅藻的筛选、分离和应用对生态系统平衡机理的阐释、重金属污染修复等具有重要的意义。

然而，由于重金属污染和全球温度的不断上升使得全球生态系统不断恶化。中国北方部分和南部大部地区，夏季温度有时可高达40℃±5℃，高温抑制了微藻的生长。同时随着工业化程度的不断提高，二氧化碳浓度的攀升导致海水pH值的降低，进一步增加了重金属的溶解度，并且影响了微藻的生长。

很多微藻虽然有一定的重金属离子吸附能力，但是很多微藻对于重金属的吸附能力有限，且随着环境的恶化，很多微藻的耐受力也不好，这极大限制了微藻在重金属吸附中的应用。因此，合适的微藻藻株的选择对其在相关领域中的应用至关重要。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了管状藻及微生物菌剂的应用、去除环境重金属的方法。该管状藻可以在5～45℃、pH浓度为3～11、重金属离子的浓度为20～160ppm环境中生长，该藻株具有极强的重金属耐受性。同时该藻株和该藻株制备的微生物菌剂可以高效去除水体和土壤中的重金属。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了管状藻(Fistulifera solaris)，该藻株的保藏编号为CCTCC NO:M20211113。

本发明还提供了微生物菌剂，包括该管状藻以及可接受的助剂。

本发明还提供了该管状藻和/或该微生物菌剂在重金属耐受和/或去除环境中重金属中的应用。

作为优选，该环境为水体和/或土壤。

作为优选，该重金属包括Pb、Cu、Ag、Cd和/或Cr中的一种或多种。

本发明还提供了去除环境重金属的方法，包括该管状藻和/或该微生物菌剂处理环境重金属的步骤。

作为优选，该步骤为：

S1：所述环境经预处理，得到样品；

S2：向所述样品中接种所述管状藻，得到培养物；

S3：取所述培养物分别置于光照处和无光照处培养。

作为优选，S2中样品中重金属离子的浓度为20～160ppm。

作为优选，S2中样品的pH浓度为3～11。

作为优选，S2中样品的培养温度为5～45℃。

本发明提供了管状藻及微生物菌剂的应用、去除环境重金属的方法，该管状藻(Fistulifera solaris)的保藏编号为CCTCC NO:M 20211113。

本发明的藻株可以在5℃～45℃、pH浓度为3～11、重金属离子的浓度为20～160ppm环境中生长，该藻株具有极强的重金属耐受性，可在含有高重金属含量的环境中生长。同时该藻株和该藻株制备的微生物菌剂可以高效去除水体和土壤中的重金属。

生物保藏说明

管状藻属MEM-A-406(Fistulifera solaris MEM-A-406)，保藏日期为2021年09月01日，保藏编号为CCTCC NO:M 20211113，保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为：中国.武汉.武汉大学。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示藻株Fistulifera solaris的18S rRNA基因的核苷酸序列；

图2示新分离得到的藻株Fistulifera solaris在显微镜下的细胞形态，放大倍数为100倍；

图3示藻株Fistulifera solaris的18S rRNA基因的PCR扩增产物；

泳道M是DL2000 Marker，泳道22是18SrRNA基因扩增产物；

其余泳道为其他样品的扩增结果；

图4示藻株Fistulifera solaris的18S rRNA基因序列的系统发育树；

图5示MEM-A-406在10ppm、20ppm和40ppm(a)铅(Pb)和(b)铜(Cu)下暴露的生长行为；

图6示MEM-A-406在80ppm、120ppm和160ppm(a)铅(Pb)和(b)铜(Cu)暴露下的生长行为；

图7示温度对MEM-A-406生长速率的影响；

图8示pH值对MEM-A-406生长速率的影响；

图9示MEM-A-406对不同温度、pH值和不同铅(Pb)浓度的耐受性。

具体实施方式

本发明公开了管状藻及微生物菌剂的应用、去除环境重金属的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的培养基的制备、藻株的分离鉴定以及耐受性验证中所用试剂均可由市场购得或相关科研单位获取。

实施例1 F/2藻类培养基的制备

(1)溶液I的配制

将35g/L的海盐溶于蒸馏水(dH₂O)后，经0.45μm孔径滤纸过滤得到滤液；

将滤液与1.21g/L的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(分子式为C4H₁₁NO₃)混合，调节pH值为7.6，121℃高压灭菌20min。

(2)溶液II的配制

将CuSO₄·5H₂O(终浓度为19.6g/L)、Na₂MoO₄·2H₂O(终浓度为12.6g/L)、ZnSO₄·7H₂O(终浓度为44g/L)、CoCl·6H₂O(终浓度为10.92g/L)、MnCl₂·4H₂O(终浓度为360g/L)混合，于121℃下加热灭菌20min。

(3)溶液III的配制

将5mL NaNO₃(终浓度为200g/L)、5mL NaH₂PO₄.H₂O(终浓度为13.3g/L)、1mL溶液II混合，于121℃加热灭菌15min后与溶液I混合，得到F/2藻类培养基。

实施例2藻株的分离鉴定

(1)采集土壤和水样

从中国海南省东方市铜矿场采集土壤和水样。

(2)预处理

将石头、鹅卵石和稻草移除，并清洗、过滤，得到样品，置于4℃待用。

(3)藻类的培养

取10mL样品与100mL F/2藻类培养基于250mL锥形瓶中混合，分别加入2mL PbNO₃和2mL CuSO₄·5H₂O，使铅(Pb²⁺)和铜(Cu²⁺)离子的终浓度为20ppm；

将锥形瓶置于25℃、100μmol m^-2s^-1光照下培养16h，之后将锥形瓶移入25℃、无光照条件下培养8h，得到培养物；

重金属离子溶液的配置：配置成1000ppm浓度的重金属离子母液。

(4)藻类的纯化

取80μL培养物接种于F/2藻类培养基培养，将藻类菌株通过反复扩散和划线法进行纯化。

(5)藻类的活化

将纯化后的藻类接种于F/2藻类液体培养基，震荡培养，每隔24h检测OD₇₅₀值，得到藻类培养物。

(6)PCR扩增18S rRNA基因

无菌环境下，取1mL藻类培养物，8000rpm离心5min，得到藻类细胞；无菌去离子水(dH2O)清洗细胞，去除残留盐分；提取藻类细胞DNA；以藻类细胞DNA为模板，优化，PCR扩增(PCR反应体系如表1所示；PCR反应程序如表2所示)18S rRNA基因。

表1 PCR反应体系

序号	原料	体积(μL)
			1	ddH<sub>2</sub>O	13.2
2	10×XBuffer	2
			3	dNTP(2.5mM each)	1.6
4	Forward Primer	1
			5	Reverse Primer	1
6	Template	1
			7	Easy-taq polymerase(2.5U/μL)	0.2

表2 PCR反应程序

(7)数据处理

经18s rRNA基因测序鉴定，该藻类属于管状属，命名为MEM-A-406。该管状藻(Fistulifera solaris)已于2021年9月1日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211113；基因序列表如图1所示；

该管状藻的细胞形态如图2所示，椭圆形、矩形和一些几何形状的棕色微藻，在正常生长条件下细胞的直径在5～14μm之间；

经RNA凝胶电泳鉴定，该管状藻的基因长度为916bp，RNA凝胶电泳图如图3所示；

经Mega-X软件分析该管状藻的系统发育，如图4所示；

实施例3藻株对低浓度重金属的耐受性

将实施例2分离的藻株接种在管式生物反应器(直径3.3cm、高度60cm)中，初始OD₇₅₀为0.3，分别在管式生物反应器中加入含有浓度为10ppm、20ppm、40ppm的Pb²⁺和Cu²⁺的F/2藻类培养基进行培养，在25℃，50μmol m^-2s^-1光照下培养16h，之后将锥形瓶移入25℃、无光照条件下培养8h，每2天测量一次OD₇₅₀，一共12天，结果表明在三种浓度的Pb²⁺和Cu²⁺培养基中藻株生长良好，如图5所示。

实施例4藻株对高浓度重金属的耐受性

根据实施例3的筛选结果，进一步在管式生物反应器中补充加入含有浓度为80ppm、120ppm、160ppm的Pb²⁺和Cu²⁺的F/2藻类培养基进行培养，培养条件同实施例3。检测OD₇₅₀，结果表明80ppm和120ppm的浓度对分离得到的藻株的生长没有显着影响，然而，在160ppm的浓度下，生长相对缓慢，但仍然能够生长，如图6所示。

实施例5藻株对不同温度、pH的耐受性

结果表明，MEM-A-406可在不同温度和pH水平下生长，如图7和图8和图9所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 海南大学

<120> 管状藻及微生物菌剂的应用、去除环境重金属的方法

<130> MP21026286

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 916

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

gtagtgacaa taaataagaa tgccgggcct ttgtaggtct ggcaattcga atgagaacaa 60

tttaaacccc ttatcgagta tcaattggag ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat 120

tccagctcca atagcgtata ttaaagttgt tgcagttaaa aagctcgtag ttggatttgt 180

ggtgtgtcct gtcgggccgt gggctttgcc cgtgtgcctg tacgggtctg ccttttatgg 240

gactgttggc tttgtggcat taggttgtcg cattgtcgat gcccatcttt tactgtgaaa 300

aaattagagt gttcaaagca ggcttatgcc gttgaatata ttagcatgga ataatgatat 360

aggaccttgg tactattttg ttggtttgcg cactaaggta atgattaata gggacagttg 420

ggggtatttg tattccattg tcagaggtga aattcttgga tttttggaag acaaactact 480

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tgattagata ccatcgtagt cttaaccata aactatgccg acaagggatt ggtggagttt 600

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tggtcgcaag gctgaaactt aaagaaattg acggaagggc accaccagga gtggagcctg 720

cggcttaatt tgactcaaca cgggaaaact taccaggtcc agacatagtg aggattgaca 780

gattgagagc tctttcttga ttctatgggt ggtggtgcat ggccgttctt agttggtgga 840

gtgatttgtc tggttaattc cgttaacgaa cgagacccct gcctgctaaa tagcccgcat 900

agtgcctgtc actgtg 916

Claims (10)

1.管状藻Fistulifera solaris，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO: M 20211113。

2.微生物菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的管状藻以及可接受的助剂。

3.如权利要求1所述的管状藻和/或如权利要求2所述的微生物菌剂在重金属耐受和/或去除环境中重金属中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述环境为水体和/或土壤。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述重金属包括：Pb、Cu、Ag、Cd和/或Cr中的一种或多种。

6.去除环境重金属的方法，其特征在于，包括取权利要求1所述的管状藻和/或如权利要求2所述的微生物菌剂处理环境中重金属的步骤。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：所述环境经预处理，得到样品；

S2：向所述样品中接种所述管状藻和/或所述微生物菌剂，得到培养物；

S3：取所述培养物分别置于光照处和无光照处培养。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，S2中所述样品中重金属离子的浓度为20~160ppm。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，S2中所述样品的pH浓度为3~11。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，S2中所述样品的培养温度为5~45℃。

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