KR20140033378A - 자일로오스를 대사시키는 유전자 조작된 미생물 - Google Patents

자일로오스를 대사시키는 유전자 조작된 미생물 Download PDF

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KR20140033378A
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솔라짐, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 고정 탄소원으로서 자일로오스를 이용하여 오일-함유 미생물을 배양하는 방법을 제공한다. 또한 미생물이 자일로오스를 오일로 전환시키는 것을 허용하는 고정 탄소원으로서 자일로오스를 대사시키기 위해 유전자 조작된 미생물을 제공한다. 본 명세서에서 제공된 공정의 특정한 잇점은 자일로오스를 이용한 미생물 발효 공정을 통하여 알코올보다는 오일의 생산을 포함한다.

Description

자일로오스를 대사시키는 유전자 조작된 미생물{GENETICALLY ENGINEERED MICROORGANISMS THAT METABOLIZE XYLOSE}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. 119(e) 하에 2011년 5월 6일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/483,550호, 및 2011년 6월 15일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/497,501호에 대한 우선권을 주장한다. 이들 각각의 출원은 이의 전문이 본 명세서에 참조로서 편입된다.
서열목록에 대한 참조
본 출원은 상세한 설명의 끝에서 나타낸 서열 목록을 포함한다.
정부 이익
본 발명은 캘리포니아 에너지 위원회 수혜 번호 제PIR-08-018호 하에 캘리포니아 주의 지원으로 만들어졌다. 에너지 위원회는 본 발명에 대하여 특정한 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 지질 또는 기타 유용한 바이오매스를 생산하기 위해 유성 미생물이 자일로오스를 대사시키는 것을 허용하기 위한 유성 미생물내 자일로오스 대사 경로의 발현, 그리고 바이오매스로부터 생산된 함유화학물질(oleochemical), 식품, 연료, 및 기타 산물과 관련된다.
발명의 배경
생명공학에서 중요하고 어려운 도전은 가치있는 물질, 가령 액체 연료, 화학물질, 식품, 및 기타 산물로 전환을 위한 셀룰로오스 물질내 탄소 포획의 막대한 잠재성을 촉발시킨다. 한 가지 특정한 도전은 미생물의 종속영양 배양을 위한 탄소원으로서, 탈중합된 헤미셀룰로오스에서 일반적으로 발견되는, 자일로오스를 이용하는 것과 관련된다. 효모를 이용한 에탄올의 생산에서 자일로오스를 이용하는 것에서 많은 연구가 이루어졌음에도 불구하고, 대부분의 효모 균주는 자일로오스를 이용할 수 없거나 또는 오직 매우 비효율적으로 자일로오스를 이용한다 (Jeffries, 2006, Curr. Op. Biotech. 17: 320-326; and Wang et al., 2004, Biotechnol. Lett. 26(11): 885-890을 참조).
특정한 유성 미생물 (가령 유성 효모 및 유성 미세조류)은 고정-탄소 에너지원을 더 높은 가치의 산물, 가령 트리글리세라이드, 지방산, 탄수화물, 및 단백질로 전환시킬 수 있다. 추가로, 미세조류 그들 자체는 식품원으로서 가치가 있을 수 있다. 예를 들어, 유성 미세조류의 특정 종은 유전자 조작되어 "맞춤 오일(tailored oil)"을 생산하였고, 이는 그들의 트리글리세라이드 내용물이 그들이 유래된 균주와 관련하여 지방산 쇄의 변경된 분포 및 포화를 나타낸다는 것을 의미한다. PCT 공개 번호 제2008/151149호, 제2009/126843호, 제2010/045358호, 제2010/063031호 및 제2010/063032호 그리고 PCT 출원 번호 제US11/038,463호 및 제US11/038,464호를 참고한다.
유성 미생물을 이용하여 의미있는 양으로 자일로오스를 지질 및 기타 산물로 전환하는 능력은 이 능력이 화석 연료의 의존성을 감소시키고 그리고 미생물 오일의 비용을 감소시킬 것이므로 주요 환경적 중요성이 될 것이다.
발명의 요약
하나의 측면에서, 본 발명은 식물(Plantae) 계의 미생물을 제공하며, 미생물은 활성 자일로오스 대사 경로 효소를 생산하도록 작동가능한 재조합 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에, 미생물은 자일로오스로 본질적으로 구성된 탄소원 상에서 배양될 때 세포 수를 증가시키거나 또는 지질을 생산할 수 있다. 몇몇 경우에, 미생물은 탄소원으로서 글루코오스를 이용하여 배양될 때 건조 세포 중량으로 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80% 트리글리세라이드를 축적할 수 있다. 몇몇 경우에, 미생물은 순수한 자일로오스 상에서 배양될 때 건조 세포 중량으로 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80% 트리글리세라이드를 축적할 수 있다. 몇몇 경우에, 미생물은 탄소원으로서 글루코오스 상에서 배양될 때 건조 세포 중량으로 적어도 50% 트리글리세라이드를 축적할 수 있고 그리고 순수한 자일로오스 상에서 배양될 때 건조 세포 중량으로 적어도 20% 트리글리세라이드를 축적할 수 있다. 몇몇 경우에, 미생물은 질소 제한 조건 하에 60% 글루코오스 및 40% 자일로오스인 탄소원 상에서 배양되고, 세포는 지질을 생산하며 여기서 탄소 원자는 동위원소 추적으로 측정된 바와 같이, 자일로오스의 탄소 원자로부터 적어도 5, l0, 20, 30, 40, 또는 50% 유래된다. 몇몇 경우에, 미생물은 21, 14 또는 7일 미만 또는 이와 동일한 날 내에 유일한 탄소원으로서 2.5% 자일로오스를 갖는 배양 배지에서 적어도 90%의 자일로오스를 소모할 수 있다.
몇몇 경우에, 재조합 핵산은 활성 자일로오스 운반체, 자일룰로스-5-포스페이트 운반체, 자일로오스 이성질화효소, 자일룰로키나아제, 자일리톨 탈수소효소, 또는 자일로오스 환원효소 중 하나 이상을 암호화하도록 작동가능하다. 몇몇 경우에, 재조합 핵산은 플라스티드(plastid)-표적 신호 서열과 작동가능하게 연결된 활성 자일룰로스-5-포스페이트 운반체를 암호화하며, 여기서 자일룰로스-5-포스페이트 운반체는 플라스티드 내로 자일룰로스-5-포스페이트를 운반하도록 작동가능하다. 몇몇 경우에, 재조합 핵산은 (a) 플라스티드 내로 자일룰로스-5-포스페이트의 이동을 야기하기 위하여, 플라스티드-표적 신호 서열을 가진 자일룰로스-5-포스페이트 운반체 단백질, (b) 자일룰로키나아제, 및 (c) 자일로오스 이성질화효소를 암호화하도록, 또는 자일리톨 탈수소효소 및 자일로오스 환원효소 둘 모두를 암호화하도록 작동가능하다.
몇몇 경우에, 미생물은 녹색식물(Viridiplantae) 아계에 속한다. 몇몇 경우에, 미생물은 클로로피태(Chlorophytae) 하계 또는 문, 테트라피티나(Tetraphytina) 아문, 트레복시오피세애(Trebouxiophyceae) 강, 또는 클로렐라레스 (Chlorellales) 목에 속한다. 몇몇 경우에, 미생물은 클로렐라(Chlorella) 또는 프로토테카(Prototheca) 속에 속한다. 몇몇 경우에, 미생물은 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis) 또는 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides) 종에 속한다.
몇몇 경우에, 미생물은 미생물에 의해 생산된 지질의 지방산 프로파일을 변경하도록 작동가능한 재조합 변형을 추가로 포함한다. 몇몇 경우에, 재조합 변형은 활성 아실-ACP 티오에스테라아제, 케토아실-ACP 생성효소 또는 지방산 불포화효소를 암호화하거나, 또는 아실-ACP 티오에스테라아제, 케토아실-ACP 생성효소 또는 지방산 불포화효소를 감소시키거나 또는 제거하도록 작동가능한 외인성 유전자를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 미생물 바이오매스 또는 바이오매스로부터 생성된 산물을 생산하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 방법은 자일로오스를 미생물 바이오매스로 전환시키기 위하여 자일로오스를 포함한 배양 배지에서, 상기 또는 본 명세서에서 논의되는 바와 같은, 재조합 미생물을 종속 영양으로 배양하는 단계를 포함한다. 몇몇 경우에, 미생물 바이오매스는 미생물 지질을 포함한다. 몇몇 경우에, 지질은 다음으로 구성된 그룹에서 선택된 산물을 만드는 데에 이용된다: 화학물질, 윤활제, 세제, 연료, 식품 오일, 및 화장료. 몇몇 경우에, 산물은 바이오디젤 또는 재생가능한 디젤에서 선택된 연료이다.
몇몇 경우에, 배양 배지는 50% 초과 자일로오스인 탄소원을 포함한다. 몇몇 경우에, 탄소원은 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 초과 자일로오스이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 또는 본 명세서에서 논의된 바와 같은, 임의의 미생물에 의해 생산된, 또는 상기 또는 본 명세서에서 논의된 바와 같은 임의의 방법에 의해 생산된 천연 오일을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 논의된 천연 오일로부터 생산된 함유화학물질, 식품 오일, 연료, 또는 기타 제품을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 탄소원으로서 자일로오스를 이용하는 재조합 유성 미생물을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 유성 미생물은 미세조류, 유성 효모, 유성 곰팡이 또는 유성 박테리아이다. 또 다른 구체예에서, 재조합 미생물은 세포가 탄소원으로서 자일로오스를 이용하거나, 또는 더욱 효과적으로 이용하는 것을 허용하는 하나 이상의 외인성 유전자를 포함한, 프로토테카(Prototheca) 속의 세포를 포함하지만, 이제 제한되지 않는, 미세조류 세포이다. 몇 가지 구체예에서, 세포는 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis), 프로토테카 크루가니(Prototheca kruegani), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora) 또는 프로토테카 조프피(Prototheca zopfii) 종의 균주이고, 그리고 다른 구체예에서, 세포는 서열 번호: 1-9중 하나 이상과 적어도 70, 75, 80, 85 또는 95% 뉴클레오티드 동일성을 가진 23S rRNA 서열을 갖는다. 외인성 유전자는 프로모터와 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 포함하고, 그리고 몇 가지 구체예에서, 프로모터는 프로토테카(Prototheca) 속의 종에 대해 내인성인 유전자로부터 기원한다. 추가적인 구체예에서, 암호화 서열은 산화환원효소 경로 단백질, 자일로오스 이성질화효소 경로 단백질, 자일로오스 전이체 단백질(translocator protein) 및 자일로오스 운반체 단백질로 구성된 그룹에서 선택된 단백질을 암호화한다.
여러 가지 구체예에서, 미세조류 세포는 세포가 탄소원으로서 자일로오스를 이용하거나, 또는 더욱 효과적으로 이용하는 것을 허용하는 하나 이상의 외인성 유전자를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 미세조류 세포는 다음을 포함하기 위해 조작된 것들을 포함한다: (i) 자일로오스 이성질화효소 경로 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자; 또는 (ii) 산화환원효소 경로 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자; 또는 (iii) 자일로오스 이성질화효소 경로 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자; (iv) 자일로오스 운반체 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자; 또는 (v) 자일로오스 전이체 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자; 또는 (i), (ii), (iii), (iv), 그리고 (v)의 조합. 구체예에서, 미생물 세포는 조작되어 자일로오스 운반체 단백질 및 자일로오스 이성질화효소 경로 단백질을 발현한다. 또 다른 구체예에서, 미생물 세포는 조작되어 자일로오스 운반체 단백질 및 산화환원효소 경로 단백질을 발현한다. 추가적인 구체예에서, 미생물 세포는 조작되어 자일로오스 운반체 단백질, 산화환원효소 경로 단백질 및 자일로오스 이성질화효소 단백질을 발현한다. 또 다른 구체예에서, 미생물 세포는 조작되어 자일로오스 운반체 단백질, 산화환원효소 경로 단백질, 및 자일로오스 전이체 단백질을 발현한다. 또 다른 구체예에서, 미생물 세포는 조작되어 자일로오스 운반체 단백질, 자일로오스 이성질화효소 경로 단백질, 및 자일로오스 전이체 단백질을 발현한다. 또 다른 구체예에서, 미생물 세포는 조작되어 자일로오스 운반체 단백질, 자일로오스 이성질화효소 경로 단백질, 자일로오스 이성질화효소 경로 단백질, 및 자일로오스 전이체 단백질을 발현한다.
본 발명의 몇 가지 구체예에서, 재조합 유성 미생물은 GPT-A-XPT (서열 번호: 45), GPT-F-XPT (서열 번호: 47) 또는 S106SAD-XPT (서열 번호: 49)에서 선택된 자일로오스 전이체 단백질을 암호화하는 제1 외인성 유전자, SUT1 (서열 번호: 37), GXS1 (서열 번호: 39), XLT1 (서열 번호: 43) 또는 공동 수송체 (서열 번호: 41)에서 선택된 자일로오스 운반체 단백질을 암호화하는 제2 외인성 유전자, XylA (서열 번호: 15) 또는 XYL3 (서열 번호: 51)에서 선택된 산화환원효소 경로 단백질을 암호화하는 제3 외인성 유전자, 및 XYL1 (서열 번호: 35), XYL2 (서열 번호: 50) 또는 XYL3 (서열 번호: 51)에서 선택된 자일로오스 이성질화효소 경로 단백질을 암호화하는 제4 외인성 유전자를 포함한다.
한 가지 구체예에서, 재조합 유성 미생물은 XylA, XYL3, SUT1, 및 GPT-F-XPT를 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 재조합 유성 미생물은 XylA, XYL2, XYL3, XLT1, 및 S106SAD-XPT를 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 재조합 유성 미생물은 XylA, XYL1, XYL3, XLT1, 및 S106SAD-XPT를 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 재조합 유성 미생물은 XylA, XYL1, XYL3, GXS1, 및 GPT-A-XPT를 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 재조합 유성 미생물은 XYL1, XYL2, XYL3, 공동 수송체, 및 GPT-F-XPT를 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 재조합 유성 미생물은 XYL1, XYL2, XYL3, GXS1, 및 GPT-F-XPT를 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 재조합 유성 미생물은 XYL2, XYL3, 공동 수송체, 및 S106SAD-XPT를 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 재조합 유성 미생물은 XYL2, XYL3, XLT1, 및 S106SAD-XPT를 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 재조합 유성 미생물은 XYL2, XYL3, GXS1, 및 GPT-A-XPT를 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다.
몇몇 경우에, 재조합 유성 미생물은 50% 초과 자일로오스인 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 증식되거나 또는 배양된다. 몇몇 경우에, 미생물은 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과 자일로오스인 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 증식되거나 또는 배양된다. 몇몇 경우에, 미생물은 유일한 탄소원으로서 자일로오스를 포함하는 배양 배지에서 증식되거나 또는 배양된다. 몇몇 경우에, 미생물은, 50% 초과 자일로오스인 탄소원을 포함한 배양배지, 또는 유일한 탄소원으로서 자일로오스를 포함한 배양 배지에서 증식되거나 또는 배양될 때, 유일한 탄소원으로서 글루코오스를 함유하고 하나 이상의 외인성 유전자가 결핍된 배양 배지에서 증식되거나 또는 배양된 비교가능한 미생물 세포에서 의해 생성된 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55% 또는 적어도 60%의 지질을 생산한다.
달리 명시되지 않는 한, 명시된 단백질을 암호화하는 외인성 유전자에 대한 상기 및 본 명세서 전반에 걸친 참조는 명시된 단백질을 암호화하도록 작동가능한 유전자를 나타낸다.
본 발명의 또 다른 구체예는 자일로오스의 존재에서 재조합 유성 미생물을 증식시키거나 또는 배양함으로써 생산된 미생물 지질 조성물이다. 한 가지 구체예에서, 본 명세서에서 논의된 재조합 유성 미생물은 자일로오스를 포함하는 셀룰로오스 물질의 존재에서 증식되고 및/또는 배양된다. 임의로, 셀룰로오스 물질은 글루코오스 및 수크로오스를 추가로 포함할 수 있다. 미생물 지질 조성물은 미생물 세포를 세포용해시키고 오일을 단리함으로써 생산된다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
핵산에 관하여 "활성"은 세포에서 기능성인 핵산을 나타낸다. 예를 들어, 미세조류에 항생제 내성을 부여하는 항생제 내성 유전자를 구동하기 위해 사용된 프로모터는 미세조류에서 활성이다.
"면적 퍼센트"는 실험 동안에 발생되는 크로마토그래피, 분광, 및 기타 피크의 면적 퍼센트의 측정을 나타낸다. 피크의 곡선 및 특정한 피크의 면적 퍼센트 하에 면적의 측정은 당업자에 의해 일반적으로 수행된다. 예를 들어, 샘플내 지방산 분자가 지방산 메틸 에스테르 (FAME)로 전환되는 FAME GC/FID 검출 방법에서, 분리 피크는 C14:1과 같은 임의의 다른 지방산과 비교하여 불포화성 (C14:0)을 갖지 않는 14개 탄소 원자의 지방산에 대해서 관찰된다. 각각의 부류의 FAME에 대한 면적 퍼센트는 혼합물내 이의 조성물 퍼센트와 직비례하고 샘플내 존재하는 모든 피크의 합계를 기준으로 계산된다 (즉, [특정 피크하의 면적/모든 측정된 피크의 총 면적] X 100). 본 발명의 오일 및 세포의 지질 프로파일을 언급하는 경우, "적어도 4% C8-C14"는 세포내 또는 추출된 글리세로지질 조성물 내의 총 지방산의 적어도 4% 가 탄소 원자 8, 10, 12 또는 14개를 포함하는 쇄 길이를 가짐을 의미한다.
"바이오디젤"은 디젤 엔진에서 연료로서 사용하기에 적합한 생물학적으로 생산된 지방산 알킬 에스테르이다.
"바이오매스"는 세포의 성장 및/또는 증식에 의해 생산된 물질이다. 바이오매스는 세포에 의해 분비되는 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 세포외 물질뿐만 아니라 세포 및/또는 세포내 내용물을 함유할 수 있다.
"생물반응기"는 임의로 현탁된 세포가 배양된 인클로저(enclosure) 또는 부분적 인클로저이다.
"셀룰로오스 물질"은 글루코오스 및 자일로오스 (가령, 헤미셀룰로오스로부터), 및 디사카라이드, 올리고사카라이드, 리그닌, 푸르푸랄 및 기타 화합물과 같은 임의의 추가의 화합물을 전형적으로 포함하는, 섬유성 물질의 분해 산물이다. 셀룰로오스 물질의 공급원의 비제한적인 예는 사탕수수 바가스, 사탕무 펄프, 옥수수 스토버, 목재 칩, 톱밥 및 지팽이풀을 포함한다.
"발현 벡터" 또는 "발현 작제물" 또는 "플라스미드" 또는 "재조합 DNA 작제물"은 숙주 세포에서 특정 핵산의 전사 및/또는 번역을 허용하는 일련의 특정 핵산 요소를 사용한 재조합 수단 또는 직접적인 화학적 합성에 의한 것을 포함하는, 사람 간섭을 통해 생성된 핵산을 나타낸다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 전형적으로, 상기 발현 벡터는 프로모터에 작동적으로 연결되어 전사된 핵산을 포함한다.
"외인성 유전자"는 세포 내로 도입된 ("형질전환된") RNA 및/또는 단백질의 발현을 위해 이들을 암호화하는 핵산이다. 형질전환된 세포는 추가의 외인성 유전자(들)가 도입될 수 있는 재조합 세포로서 언급될 수 있다. 외인성 유전자는 형질전환된 세포에 대해 상이한 종 (따라서 이종성) 또는 동일한 종 (따라서 동종성)의 기원일 수 있다. 따라서, 외인성 유전자는 유전자의 내인성 카피물에 비해 세포의 게놈내에서 상이한 위치를 차지하거나 상이한 제어 하에 있는 동종성 유전자를 포함한다. 외인성 유전자는 세포내에서 하나 이상의 카피물로 존재할 수 있다. 외인성 유전자는 게놈내로의 삽입물로서 또는 에피솜 분자로서 세포내 유지될 수 있다.
"외인성으로 제공된"은 세포 배양의 배양 배지에 공급된 분자를 나타낸다.
"지방산 프로파일"은 쇄 길이 및/또는 포화 패턴에 관하여 세포 또는 세포로부터 유래된 오일내 지방산의 분포를 의미할 것이다. 본 맥락에서, 포화 패턴은 세포의 여러 가지 지방산내 이중 결합의 위치의 분포의 더욱 상세 설명된 분석 또는 포화된 대 비포화된 산의 측정을 포함할 수 있다.
"고정 탄소원"은 본 명세서에서 배양된 미생물에 의해 사용될 수 있는 배양 배지내 고체 또는 액체 형태로 실온 및 압력에서 존재하는 탄소 함유 분자(들), 전형적으로 유기 분자이다.
"종송영양 배양(cultivation)" 및 이의 변이, 가령 "종송영양 배양(culture)" 및 "종속영양 발효는 고정 탄소원의 존재에서 성장 (세포 크기, 세포 함량, 및/또는 세포 활성도에서의 증가)의 의도적인 배양을 나타낸다. 전형적으로 종속영양 배양은 빛의 부재에서 수행된다. 하지만, 빛의 부재는 종송영양 배양에 대해 필수조건은 아니다. 빛의 부재에서 배양은 빛의 완전한 부재 또는 거의 완전한 부재에서 미생물 세포의 배양을 의미한다.
"지질 수율을 증가시킨다"는 예를 들어, 배양 리터당 세포의 건조 중량을 증가시키거나 지질로 구성된 세포의 퍼센트를 증가시키거나, 또는 단위 시간당 배양 용적 리터당 지질의 전체 양을 증가시킴에 의한 미생물 배양의 생산성의 증가를 나타낸다.
"작동가능한 연결로"는 두 개의 핵산 서열, 예를 들어, 조절 서열 (전형적으로 프로모터) 및 연결된 서열 (전형적으로 단백질을 암호화하는 서열, 또한 소위 암호화 서열)간의 기능적 연결이다. 프로모터는 이것이 유전자의 전사를 매개할 수 있다면 외인성 유전자와 작동가능하게 연결되어 있다.
"미세조류"는 엽록체 또는 플라스티드를 함유하고 임의로 광합성을 수행할 수 있는 진핵 미생물 유기체, 또는 광합성을 수행할 수 있는 원핵 미생물 유기체이다. 미세조류는 고정 탄소원으로부터 유일하게 생존할 수 있는 종속영양생물뿐만 아니라 에너지로서 고정 탄소원을 대사시킬 수 없는 절대 광합성독립영양생물을 포함한다. 미세조류는 두 개의 독특한 세포 유형의 단순한 다중세포 광합성 미생물인, 예를 들어, 볼복스(Volvox)와 같은 미생물뿐만 아니라 세포 분열 후 단시간에 자매세포로부터 분리되는 단일 세포 유기체, 예를 들어, 클라미도모나스(Chlamydomonas)를 포함한다. 미세조류는 클로렐라(Chlorella), 두날리엘라(Dunaliella), 및 프로토테카(Prototheca)와 같은 세포를 포함한다. 미세조류는 또한 아그메넬룸(Agmenellum), 아나바에나(Anabaena), 및 피로보트리스(Pyrobotrys)와 같은 세포-세포 접착을 나타내는 다른 미생물 광합성 유기체를 포함한다. 미세조류는 또한 특정 디노플라겔레이트 조류 종 및 프로토테카(Prototheca) 속의 종과 같은 광합성을 수행하는 능력을 상실한 절대 종속영양 미생물을 포함한다.
"미생물(microorganism)" 및 "미생물(microbe)"은 현미경적 단일 세포 유기체이다.
"천연 오일"은 유기체로부터 얻은 대부분의 트리글리세라이드 오일을 의미할 것이며, 여기서 오일은 트리글리세라이드의 지방산 프로파일을 실질적으로 변경하기 위한, 또 다른 천연 또는 합성 오일과의 혼합 또는 분획을 겪지 않았다. 여기서,　용어　"분획"은 유기체에 의해 생산된 프로파일에 관하여 이의 지방산 프로파일을 변화시키지만, 완성되는 방식으로 오일로부터 물질을 제거하는 것을 의미한다. 천연 오일은 유기체로부터 얻은 이러한 오일을 포함하며, 여기서 오일은 이의 트리글리세라이드 프로파일을 실질적으로 변화시키지 않는 정제, 표백 및/또는 정련을 포함한, 최소한의 가공을 겪었다. 천연 오일은 또한 "상호에스테르화된 천연 오일"이 될 수 있으며, 이는 천연 오일이 가공을 겪지 않았으며, 여기서 지방산이 그들의 아실 연결에서 재분포되고 유기체로부터 회복될 때와 같은 동일한 입체구조로 본질적으로 남아 있다는 것을 의미한다.
두 개의 단백질 또는 유전자와 관련하여 "천연적으로 동시-발현된"은 단백질 또는 이들의 유전자가 이들이 유래된 조직 또는 유기체에서 천연적으로 동시-발현됨을 의미하고, 상기 동시 발현 이유는 두 개의 단백질을 암호화하는 유전자가 공통된 조절 서열의 제어 하에 있기 때문이거나 이들이 동일한 자극에 응답하여 발현되기 때문이다.
"산화환원효소 경로"는 제한 없이, 자일로오스 환원효소 (자일로오스를 자일리톨로 전환시킴), 자일리톨 탈수소효소 (자일리톨을 자일룰로스로 전환시킴), 및 자일룰로키나아제 (자일룰로스를 자일룰로스 5-포스페이트로 전환시킴)를 포함한, 자일리톨 및 자일룰로스 중간체를 통하여 자일로오스를 자일룰로스 5-포스페이트로 전환시킬 수 있는 그들을 암호화하는 단백질 및/또는 유전자이다. 예시적인 산화환원효소 경로 유전자는 제한 없이, 피키아 스티피티스(Pichia stipitis)로부터의 XYL1, XYL2, 및 XYL3 유전자를 포함한다.
"프로모터"는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 조절 서열이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 프로모터는 전사 개시 부위 근처에 필수 핵산 서열, 예를 들어, 폴리머라아제 II형 프로모터의 경우에, TATA 요소를 포함한다. 프로모터는 또한 임의로 전사 개시 부위로부터 수천 염기쌍 정도로 멀리 위치할 수 있는 원거리 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함한다.
"재조합체"는 외인성 핵산의 도입 또는 고유 핵산의 변화로 인해 변형된 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터이다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 고유 (비-재조합체) 형태의 세포 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 비-재조합 세포에 의해 발현되는 유전자와는 상이하게 고유 유전자를 발현한다. "재조합 핵산"은 예를 들어, 폴리머라아제 및 엔도뉴클레아제를 사용하는 핵산의 조작에 의해 일반적으로 시험관내 형성된 고유 핵산이거나 통상적으로 천연적으로 존재하지 않는 형태로 존재한다. 재조합 핵산은 예를 들어, 두 개 이상의 핵산을 작동가능하게 연결시키도록 하여 생성될 수 있다. 따라서, 통상적으로 천연적으로 연결되어 있지 않은 DNA 분자를 연결함으로써 시험관내 형성된 단리된 핵산 또는 발현 벡터는 둘다 본 발명의 목적을 위한 재조합체인 것으로 고려된다. 일단 재조합 핵산이 제조되고 숙주 세포 또는 유기체로 도입되면, 이것은 숙주 세포의 생체내 세포 기구를 사용하여 복제할 수 있지만; 일단 재조합적으로 생성되면 이러한 핵산은 후속적으로 세포내에서 복제된다 하더라도 여전히 본 발명의 목적을 위한 재조합체인 것으로 고려된다. 유사하게, "재조합 단백질"은 즉, 재조합 핵산의 발현을 통해 재조합 기술을 사용하여 제조된 단백질이다.
"재생가능한 디젤"은 지질의 수소화 및 탈산소화를 통해 생성된 알칸 (예를 들어, C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 및 C18:0)의 혼합물이다.
"당화"는 바이오매스, 통상적으로 셀룰로오스 또는 리그노셀룰로오스 바이오매스를 글루코오스 및 자일로오스와 같은 단량체성 당으로 전환시키는 공정이다. "당화된" 또는 "탈중합된" 셀룰로오스 물질 또는 바이오매스는 당화를 통해 단량체 당으로 전환되는 셀룰로오스 물질 또는 바이오매스를 나타낸다.
"수크로오스 이용 유전자"는 발현되는 경우 에너지 (탄소)원으로서 수크로오스를 이용하는 세포의 능력을 도와주는 유전자이다. 수크로오스 이용 유전자에 의해 암호화된 단백질은 본 명세서에서 "수크로오스 이용 효소"로 언급되고 수크로오스 수송체, 수크로오스 전화효소, 및 글루코키나아제 및 프럭토키나아제와 같은 헥소키나아제를 포함한다.
"자일로오스 이성질화효소 경로"는 제한 없이, 자일로오스 이성질화효소 (자일로오스를 자일룰로스로 전환시킴), 및 자일로오스 이성질화효소 (자일룰로스를 자일룰로스 5-포스페이트로 전환시킴)를 포함한, 자일룰로스 중간체를 통하여 자일로오스를 자일룰로스 5-포스페이트로 전환시킬 수 있는 그들을 암호화하는 단백질 및/또는 유전자이다. 예시적인 자일로오스 이성질화효소 경로 유전자는 제한 없이, 피로마이세스 종(Piromyces sp.) 유전자 XylA 및 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) 유전자 XYL3을 포함한다.
"자일룰로스 5-포스페이트 전이체","자일룰로스 5-포스페이트 운반체" 또는 "플라스티드 펜토오스 포스페이트 전이체"는 플라스티드 막 단백질 및 자일룰로스 5-포스페이트를 운반하는 이러한 단백질을 암호화하는 유전자의 패밀리이다. 자일로오스 전이체의 비-제한적 예시는 아라비도프시스(Arabidopsis)로부터의 자일룰로스 5-포스페이트 전이체를 암호화하는 XPT 유전자이다.
"자일로오스 운반체"는 세포 배지에서 세포로 자일로오스를 운반하는 이러한 단백질을 암호화하는 단백질 및 유전자이고 제한 없이, 수동 운반체 및 활성 운반체 및 전이체를 포함한다. 수동 운반체는 에너지 소모 없이, 농도 기울기 (더 높은 농도의 면적에서 더 낮은 농도의 면적으로)를 낮추는 분자의 운반을 촉진하고, 제한 없이, 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) SUT1, SUT2, 및 SUT3 운반체 그리고 사카로미세스 세레비시애(S. cerevisiae) HXT 운반체를 포함한다. 활성 운반체는 농도 기울에 대항하여 (따라서 더 낮은 농도의 면적으로부터 더 높은 농도의 면적으로 운반) 분자를 운반하는 데에서 에너지를 소모한다. 활성 운반체는 제한 없이, 에너지원으로서 ATP를 이용하는 일차 활성 운반체, 즉, ATP-결합 카세트 (ABC) 운반체, 및 화학삼투 기울기로부터 에너지를 이용하는 이차 활성 운반체를 포함하고 그리고 제한 없이, 역수송체 및 공동 수송체, 즉, 칸디다 인터메디아(Candida intermedia)의 GXS1 단백질, 아라비도프시스(Arabidopsis)로부터의 H+-공동 수송체-유사 단백질 (가령 At5g59250n), 및 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei)로부터의 XLT1 단백질을 포함한다.
"자일로오스 이용 유전자"는 발현되는 경우, 탄소원 (가령, 에너지 및/또는 동화작용을 생성하기 위한)으로서 자일로오스를 이용하는 세포의 능력을 도와주는 유전자이다. 자일로오스 이용 유전자에 의해 암호화된 단백질은 본 명세서에서 "자일로오스 이용 유전자"로서 언급되고 자일로오스 운반체, 자일로오스 전이체, 산화환원효소 경로 단백질 및 자일로오스 이성질화효소 경로 단백질을 포함한다.
II. 일반적
본 발명의 예시적인 구체예는 자일로오스를 대사시키는 능력이 이전에는 결핍되었던 유기체 내로 자일로오스 이용 경로를 조작함으로써, 자일로오스를 고-가치 세포 바이오매스로 전환시키기 위해 세포 배양을 이용하는 장기간 도전을 극복한다. 여러 가지 측면에서, 본 개시는 유기체, 특히 식물(Plantae) 계의 미생물 (미생물로서 본 명세서에서 언급됨) 내로 활성 자일로오스 대사 경로를 조작하는 것에 대해 제공하는다. 이러한 유기체는 미세조류를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 개시는 유기체, 특히 플라스티드 및 유형 II 지방산 생물합성 경로 둘 모두를 가진 미생물 내로 활성 자일로오스 대사 경로를 조작하는 것에 대해 제공한다.
다른 것은 사카로마이세스(Saccharomyces)에서 자일로오스를 이용하여 에탄올 생성을 얻을 수 있음에도 불구하고, 이러한 유기체는 지질의 상업적 규모 생성으로는 유용하지 않다. 대조적으로, 유성 미생물, 가령 유성 효모 및 유성 미세조류는 대부부분 트리글리세라이드로서, 건조 세포 중량으로 20% 초과 지질을 축적할 수 있다. 유성 효모는 지질 생산에서 유용함에도 불구하고, 미세 조류는 세포에 의해 생산된 지질의 지방산 프로파일, 특히 트리글리세라이드를 제작하기 위한 유전적 조작의 이용을 촉진하는 유형 II 지방산 생물합성 경로를 갖는다. PCR 공개공보 WO2011/151149, WO2010/063032, 및 WO2011/15040을 참조한다. 지질을 생산하는 것 외에도, 본 명세서에서 설명된 유기체는 천연으로, 또는 추가적인 유전적 조작의 결과로서 생산되는 단백질, 비타민, 섬유, 및 기타 물질을 생산하는 데에 이용될 수 있다.
본 발명의 구체예에 따르면, 외인성 핵산은 세포의 플라스티드 내로 자일룰로스-5-포스페이트의 운반을 야기하도록 작동가능한 자일룰로스-5-포스페이트 운반체 (가령, 자일룰로스-5-포스페이트 전이체) 단백질을 생산하도록 작동가능한 플라스티드를 가진 세포 내로 도입된다. 특정한 구체예에서, 세포는 플라스티드 표적화 서열과 작동가능하게 연결된 자일룰로스-5-포스페이트 운반체를 암호화하는 외인성 DNA로 형질전환된다. 플라스티드 표적화 서열은 대사될 수 있는 플라스티드 내로, 그리고 잠재적으로 지방산 내로 자일룰로스-5-포스페이트를 더욱 효과적으로 운반하기 위하여 운반체 단백질을 플라스티드 막 (바람직하게는 안쪽 플라스티드 막)으로 유도할 수 있다. 예를 들어, 유기체는 자일룰로스-5-포스페이트를 대사하는 플라스티드내 내인성 펜토오스 대사 경로를 가질 수 있다. 하기 실시예에서 나타나는 바와 같이, 이것은 세포 성장 및/또는 지질 보호를 동반하는 자일로오스 이용을 부스팅(boosting)하는 효과적인 방법인 것으로 밝혀졌다.
임의로, 또는 추가로, 세포는 외부 환경으로부터 자일로오스를 흡수할 수 있고 그리고 자일로오스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환시킬 수 있다. 외인성 유전자는 이들 기능을 수행하기 위해 활성 단백질을 생산하는 것이 필요될 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예에서 설명된 바와 같이, 세포는 외부 배지로부터 세포 내로 자일로오스를 운반하기 위한 활성 자일로오스 운반체, 및 자일로오스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환시키기 위한 경로를 암호화하도록 작동가능한 DNA로 형질전환될 수 있다. 예를 들어, 자일로오스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환시키기 위한 경로는 자일로오스를 자일룰로스로 전환시키기 위한 경로와 자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트롤 전환시키기 위한 자일룰로키나아제의 조합이 될 수 있다. 자일로오스를 자일룰로스로 전환시키기 위한 경로는 자일로오스 이성질화효소 또는 자일로오스 환원효소 및 자일리톨 탈수소효소의 조합을 포함할 수 있다. 대안으로, 세포내로 자일로오스의 운반은 고유 단백질, 가령 헥소오스 운반 단백질의 활성도에 의존할 수 있다.
임의로, 상기 구체예 중 임의의 추가 정제에서, 세포는 형질전환되어 활성 자일리톨 탈수소효소를 발현할 수 있다. 이 변형은 자일리톨에 의해 자일로오스 이성질화효소의 저해를 감소시키거나 또는 제거하도록 기능할 수 있다.
여러 가지 유전자는 유기체의 염색체 내로 통합될 수 있거나, 또는 에피솜 형태가 될 수 있다. 바람직하게, 유전자는 안정하게 발현되고, 다수의 카피로 있을 수 있다. 여러 가지 구체예에서, 유전자는 조절가능 또는 항상성 프로모터의 통제 하에 있다. 형질전환 후, 안정성을 유지하기 위해 임의로, 세포는 선택가능한 마커로 형질전환될 수 있다.
세포는 종속영양 성장 조건 하에 증식 및/또는 지질 축적을 할 수 있다. 임의로, 세포는 절대 종속영양생물, 가령 미세조류 속인 프로토테카(Prototheca)일 수 있다. 세포는 예를 들어, 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis)일 수 있다. 하기 실시예에서, 프로토테카(Prototheca) 세포는 형질전환되어 활성 자일로오스 대사 경로를 발현한다. 하지만, 본 발명의 구체예는 많은 기타 종에도 적용가능하다는 점에 주목해야 한다. 바람직한 종은 식물(Plantae) 계, 녹색식물(Viridiplantae) 아계, 클로로피태(Chlorophytae) 하계 또는 문, 테트라피티나(Tetraphytina) 아문, 트레복시오피세애(Trebouxiophyceae) 강, 또는 클로렐라레스 (Chlorellales) 목에 포함된다. 특정 실시예는 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis) 또는 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides)를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 수득한 재조합 유기체는 탄소원으로서 글루코오스를 이용하여 배양될 때 건조 세포 중량으로 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80% 트리글리세라이드를 축적할 수 있다. 추가로, 유기체는 순수한 자일로오스 상에서 배양될 때 건조 세포 중량으로 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80% 트리글리세라이드를 축적할 수 있다. 예를 들면, 미생물은 탄소원으로서 글루코오스 상에서 배양될 때 건조 세포 중량으로 적어도 50% 트리글리세라이드를 축적할 수 있고 그리고 순수한 자일로오스 상에서 배양될 때 건조 세포 중량으로 적어도 20% 트리글리세라이드를 축적할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 재조합 유기체의 세포가 질소 제한 조건 하에 60% 글루코오스 및 40% 자일로오스인 탄소원 상에서 배양될 때, 세포는 지질을 생산하며, 여기서 탄소 원자는 동위원소 추적으로 측정된 바와 같이, 자일로오스의 탄소 원자로부터 적어도 5, l0, 20, 30, 40, 또는 50% 유래된다. 또 다른 구체예에서, 재조합 유기체의 세포는 35, 28, 21, 14 또는 7일 미만 또는 이와 동일한 날 내에 유일한 탄소원으로서 2.5% 자일로오스를 갖는 배양 배지에서 적어도 90%의 자일로오스를 소모할 수 있다.
자일로오스 대사 경로의 도입 외에도, 유기체는 미생물에 의해 생산된 지질의 지방산 프로파일을 변경하도록 작동가능한 유전자를 도입함으로써 유전자 조작될 수 있다. 결과로서, 자일로오스는 변경된 지방산 프로파일을 가진 아실글리세라이드로 전환될 수 있다. 예를 들어, 세포는 활성 아실-ACP 티오에스테라아제, 케토아실-ACP 생성효소 또는 지방산 불포화효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 유전자를 포함하는 재조합 변형을 가질 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 세포는 아실-ACP 티오에스테라아제, 케토아실-ACP 생성효소 또는 지방산 불포화효소를 감소시키거나 또는 제거하도록 작동가능한 재조합 변형을 가질 수 있다. 이러한 유전적 조작을 수행하기 위한 방법은 PCT 공개공보 WO2011/151149, WO2010/063032, 및 WO2011/15040에서 제공된다.
바람직한 구체예에서, 자일로오스 대사 세포는 자일로오스 함유 배지에서 배양된다. 결과로서, 바이오매스가 생성된다. 특정한 구체예에서, 자일로오스는 세포 바이오매스, 그리고 특정하게는 트리글리세라이드로 전환된다. 이것은 동위원소 추적에 의해; 가령 동위원소로 라벨링된 자일로오스를 이용하여 보여질 수 있다. 트리글리세라이드를 생산하기 위하여, 유성 미생물은 질소 제한 조건 하에, 가령 질소 제한 하에 배양될 수 있다. 수득한 천연 오일이 수거된다. 수거는 오일을 방출하기 위해 세포 용해를 포함할 수 있다. 이후 오일은 함유화학물질, 윤활제, 세제, 연료, 식품, 오일, 화장료, 또는 기타 제품을 생산하는 데에 이용될 수 있다. 예를 들어, 오일은 바이오디젤 (지방산 에스테르) 또는 재생가능한 디젤 (크랙킹(cracking)을 통해 오일로부터 생산된 연료)을 생산하는 데에 이용될 수 있다.
구체예에서, 방법은 50% 초과 자일로오스인 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 탄소원은 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 초과 자일로오스일 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 특정한 구체예는 외인성 유전자의 도입 및 발현에 기인한 플라스티드 및 작동가능 자일로오스 대사 경로를 가진 미생물을 포함한다. 유전자는 자일로오스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환시키는 데에 그리고 추가적인 대사를 위해 플라스티드 내로 자일룰로스-5-포스페이트를 운반하는 데에 활성이다. 미생물은 외부 환경에서 세포 내로 자일로오스를 운반하기 위해 임의로 자일로오스 운반체를 갖는다. 외인성 유전자의 발현의 결과로서, 세포는 순수한 자일로오스 상에 성장할 수 있고 바람직하게는 가령, 21, 14 또는 7일 또는 그 미만 내에 유일한 탄소원으로서 2.5% 자일로오스를 갖는 배양 배지에서 적어도 90% 자일로오스를 소모할 수 있다.
III. 배양
본 발명은 미세조류, 유성 효모, 유성 곰팡이, 및 유성 박테리아를 포함하지만 이에 제한되지 않는 유성 미생물의 배양과 일반적으로 관련된다. 몇 가지 구체예에서, 미세조류 균주, 특히 재조합 클로렐라(Chlorella) 및 프로토테카(Prototheca) 균주는 지질의 생성에 적합하다. 구독자의 편의를 위해, 본 섹션은 여러 서브섹션으로 세분된다. 서브섹션 1은 프로토테카(Prototheca) 종 및 균주를 설명하고 게놈 DNA 비교에 의해 새로운 프로토테카(Prototheca) 종 및 균주 및 관련 미세조류를 동정하는 방법을 설명한다. 서브섹션 2는 배양을 위해 유용한 생물반응기를 설명한다. 서브섹션 3은 배양을 위한 배지를 설명한다. 서브섹션 4는 본 발명의 예시적인 배양 방법에 따른 오일 생산을 설명한다.
1. 프로토테카( Prototheca ) 종 및 균주
프로토테카(Prototheca)는 고수준의 지질, 특히, 연료 생산에 적합한 지질을 생산할 수 있기 때문에 지질의 생산에 사용하기 위해 주목할만 한 미생물이다. 프로토테카(Prototheca)에 의해 생산된 지질은 다른 미세조류에 의해 생산되는 것 보다 단쇄 길이 및 고도의 포화를 갖는 탄화수소 쇄를 갖는다. 더욱이, 프로토테카(Prototheca) 지질은 일반적으로 색소 부재 (클로로필 및 특정 카로테노이드의 낮거나 검출가능하지 않은 수준)이고 임의의 경우에 다른 미세조류 기원의 지질 보다 색소를 훨씬 적게 포함한다. 더욱이, 본 발명에 의해 제공된 재조합 프로토테카(Prototheca) 세포는 탄소원으로서 자일로오스를 이용하는 이들의 증가된 능력에 기반한 다른 미생물로부터 지질을 생산하는 것과 비교하여 보다 큰 수율 및 효율로 저렴하게 지질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 상기 미세조류는 종속영양적으로 성장하고 유전자 조작될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 예시적인 프로토테카(Prototheca) 균주는 프로토테카 윅게르하미(Prototheca wickerhamii), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora) (UTEX 327을 포함), 프로토테카 포르토리센시스(Prototheca portoricensis), 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis) (UTEX 균주 1441, 1435를 포함), 및 프로토테카 조프피(Prototheca zopfii)를 포함한다. 프로토테카(Prototheca) 속의 종은 절대 종속영양생물이다.
본 발명에 사용하기 위한 프로토테카(Prototheca) 종은 게놈의 특정 표적 영역의 증폭으로 동정될 수 있다. 예를 들어, 특정 프로토테카(Prototheca) 종 또는 균주의 동정은 프라이머 및 게놈의 임의의 영역을 사용하는 방법, 예를 들어, Wu et al., Bot. Bull. Acad. Sin. (2001) 42: 115-121 Identification of Chlorella spp. isolates using ribosomal DNA sequences에서 설명된 방법을 사용하여 핵 및/또는 엽록체 DNA의 증폭 및 서열분석을 통해 성취될 수 있다. 리보솜 내부 전사된 스페이서 (ITSl 및 ITS2 rDNA), 23S rRNA, 18S rRNA, 및 기타 보존된 게놈 영역의 증폭 및 서열분석과 같은 계통발생적 분석에 대해 널리 확립된 방법은 당업자에 의해 사용되어 프로토테카(Prototheca)의 종뿐만 아니라 유사한 지질 프로파일 및 생산 능력을 갖는 다른 탄화수소 및 지질 생산 미생물 종을 동정할 수 있다. 조류의 동정 및 분류 방법에 대한 예는 또한 Genetics, 2005 Aug;170(4): 1601-10 및 RNA, 2005 Apr;11(4):361-4를 참조한다.
따라서, 게놈 DNA 비교를 사용하여 본 발명에 사용되는 미세조류의 적합한 종을 동정할 수 있다. 이에 제한되지 않는 23S rRNA를 암호화하는 DNA와 같은 보존된 게놈 DNA의 영역은 미세조류 종으로부터 증폭시키고 컨센서스 서열과 비교하여 본 발명에 사용되는 바람직한 미세조류와 분류학적으로 관련된 미세조류 종을 스크리닝할 수 있다. 프로토테카(Prototheca) 속 내의 종에 대한 상기 DNA 서열 비교의 예는 하기에 나타낸다. 게놈 DNA 비교는 또한 균주 수거에서 잘못 동정된 미생물 종을 동정하는 데에 유용할 수 있다. 흔히 균주 수집은 표현형 및 형태적 특성을 기본으로 미세조류 종을 동정한다. 이들 특성의 사용은 미세조류의 종 또는 속의 잘못된 분류를 유도할 수 있다. 게놈 DNA 비교를 사용하는 것이 이들의 계통발생 관계를 기준으로 미세조류 종을 분류하는데 보다 우수한 방법일 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 미세조류는 전형적으로 서열번호 1 내지 9에 목록된 서열 중 적어도 하나 이상과 적어도 99%, 적어도 95%, 적어도 90%, 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 23S rRNA에 대해 암호화하는 게놈 DNA 서열을 갖는다.
뉴클레오티드 퍼센트 또는 아미노산 동일성을 결정하기 위한 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 참조 서열로서 작용하고 이것과 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고 경우에 따라 세부서열의 좌표를 지정하고 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 이어서 서열 비교 알고리즘을 사용하여 지정된 프로그램 파라미터를 기준으로 표준 서열에 대한 시험 서열(들)의 서열 동일성 퍼센트를 계산한다.
비교용 서열의 최적의 정렬은 예를 들어, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘에 의해, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)의 컴퓨터에 의한 수행에 의해, 또는 육안 검사 (일반적으로 Ausubel et al., supra 참조)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 퍼센트 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 또 다른 예시적 알고리즘은 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)에서 설명된 BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information (웹 주소 www.ncbi.nlm.nih.gov)을 통해 입수할 수 있다. 상기 알고리즘은 먼저 탐색 서열에서 길이에 대한 단축어 W를 동정으로 높은 점수의 서열쌍 (HSP)을 동정함을 포함하고 이는 데이타베이스 서열중에 동일한 길이의 단어와 정렬되는 경우 몇몇 양성값의 역치 점수 T와 일치하거나 이를 충족한다. T는 이웃 단어 점수 역치로서 언급된다 (Altschul et al., supra.). 이들 초기 이웃 단어 히트는 이들을 함유하는 보다 긴 HSP를 발견하기 위한 검색을 개시하기 위한 근원으로서 작용한다. 이어서 단어 히트를 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양방향으로 확장시킨다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M (일치하는 잔기쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0임) 및 N (불일치 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 < 0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열에 대해, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각각의 방향에서의 단어 히트의 확장은 다음의 경우에 중지한다: 누적 정렬 점수가 이의 최대 성취 값으로부터 X 양으로 이탈하는 경우; 누적 점수가 하나 이상의 음성-스코어링 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하로 되는 경우; 또는 서열의 말단에 도달하는 경우. 핵산 또는 폴리펩타이드가 본 발명의 범위 내에 있는지의 여부를 동정하기 위해, BLAST 프로그램의 디폴트(default) 파라미터가 적합하다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열용)은 11의 단어 길이 (W), 10의 예상치 (E), M=5, N=-4, 및 양쪽 서열가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다. 아미노산 서열을 위해, BLASTP 프로그램은 3의 단어 길이 (W), 10의 예상치 (E), 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 디폴트로서 사용한다. TBLATN 프로그램 (뉴클레오티드 서열용 단백질 서열을 사용하는)은 3의 단어 길이 (W), 10의 예상값 (E), 및 BLOSUM 62 스코어링 매트릭스를 디폴트로서 사용한다 (Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)를 참조).
서열 동일성 퍼센트를 계산하는 것뿐만 아니라, BLAST 알고리즘은 또한 두 개의 서열 간의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다 (가령, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)을 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 한 가지의 유사성 측정은 최소 합계 가능성 (P(N))이고 이는 두 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 일치가 우연히 발생할 가능성을 지적한다. 예를 들어, 표준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에 있어서 최소의 합계 가능성이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 핵산은 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
본 발명에 사용하기 위한 미생물의 선별에 영향을 주는 다른 고려사항은 오일, 연료 및 함유화학물질의 생산에 적합한 지질 또는 탄화수소의 생성뿐만 아니라 다음을 포함한다: (1) 세포 중량 퍼센트로서 고지질 함량; (2) 성장의 용이함; (3) 유전자 조작의 용이함; 및 (4) 바이오매스 가공처리의 용이함. 특정한 구체예에서, 야생형 또는 유전자 조작된 미생물은 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 또는 적어도 70% 이상의 지질인 세포가 생성되도록 한다. 바람직한 유기체는 (빛의 부재 하에 당을 기초로) 종속영양적으로 성장한다.
2. 생물반응기
미생물은 유전자 조작을 수행하고 탄화수소 (예를 들어, 지질, 지방산, 알데하이드, 알코올 및 알칸)를 생성할 둘 모두의 목적을 위해 배양된다. 전자 유형의 배양은 소규모 및 처음에는 적어도 출발 미생물이 성장할 수 있는 조건 하에서 수행된다. 탄화수소 생산의 목적을 위한 배양은 생물반응기에서 통상적으로 대규모 (예를 들어, 10,000 L, 40,000 L, 100,000 L 또는 보다 대형의 생물반응기)로 수행된다. 프로토테카(Prototheca)는 전형적으로 생물반응기내 자일로오스를 함유한 액체 배지에서 본 발명의 방법으로 배양된다. 한 가지 구체예에서, 미세조류, 가령 프로토테카(Prototheca)는 유가식(fed-batch) 공정을 이용하여 생물반응기에서 배양된다. 전형적으로, 생물반응기는 빛이 입사되지 않도록 하고, 미생물은 고정 탄소원을 종속영양으로, 대사시키면서, 그리고 빛의 실질적인 부재에서 배양된다.
생물반응기 또는 발효기를 사용하여 다양한 단계의 세포의 생리학적 사이클을 통해 미세조류 세포를 배양한다. 생물반응기는 종속영양 성장 및 번식 방법에 사용하기 위해 많은 잇점을 제공한다. 식품에 사용하기 위한 바이오매스를 생산하기 위해 미세조류를 바람직하게 액체 중에서, 예를 들어, 하나의 예로서 현탁 배양으로 대량으로 발효시킨다. 강철 발효기와 같은 생물반응기는 매우 큰 배양 용적 (40,000 리터 이상의 용량을 갖는 생물반응기가 본 발명의 다양한 구체예에서 사용된다)을 수용할 수 있다. 생물반응기는 또한 전형적으로 온도, pH, 산소압 및 이산화탄소 수준과 같은 배양 조건의 제어를 허용한다. 예를 들어, 생물반응기는 전형적으로 예를 들어, 튜빙에 부착된 포트를 사용하여 산소 또는 질소와 같은 가스 성분이 액체 배양물을 통해 기포 주입될 수 있도록 하는 형태를 취할 수 있다. 배양 배지의 pH, 미량 요소의 종류 및 농도 및 기타 배지 성분과 같은 다른 배양 파라미터가 또한 생물반응기를 사용하여 보다 용이하게 조작될 수 있다.
생물반응기는 미세조류가 증식하고 수적으로 증가하는 전반적인 시간에 걸쳐 생물반응기를 통해 배양 배지가 유입되도록 하는 형태를 취할 수 있다. 몇 가지 구체예에서, 예를 들어, 배지는 접종 후 세포가 목적하는 밀도에 도달하기 전에 생물반응기로 주입될 수 있다. 다른 경우에, 생물반응기에는 배양 초기에 배양 배지가 충전되고 배양물이 접종된 후에는 더 이상의 배양 배지가 주입되지 않는다. 다른 말로, 미세조류 바이오매스는 미세조류가 증식하고 수적으로 증가하는 기간 동안 수성 배지에서 배양되지만 수성 배양 배지의 양이 그 기간에 걸쳐 생물반응기를 통해 유입되지 않는다. 따라서, 몇 가지 구체예에서, 수성 배양 배지는 접종 후 생물반응기를 통해 유입되지 않는다.
회전 블레이드 및 임펠러, 락킹 기구, 교반 막대, 가압 가스 주입용 수단과 같은 장치가 장착된 생물반응기를 사용하여 미세조류 배양물이 혼합되도록 할 수 있다. 혼합은 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 예를 들어, 몇 가지 구체예에서, 가스 주입 및 배지 주입의 난기류가 목적하는 수로 미세조류가 증가할때까지는 유지되지 않는다.
생물반응기 포트를 사용하여 가스, 고체, 반고체 및 액체를, 미세조류를 함유하는 생물반응기 챔버에 도입하거나 추출할 수 있다. 많은 생물반응기는 하나 이상의 포트 (예를 들어, 배지 주입을 위한 하나 및 샘플링을 위한 또 다른 하나)를 갖고 단지 하나의 물질이 포트를 출입할 필요는 없다. 예를 들어, 포트를 사용하여 배양 배지가 생물반응기로 유입될 수 있도록 하고 이후에 샘플링, 가스 주입, 가스 배출 또는 기타 목적을 위해 사용될 수 있다. 바람직하게, 샘플링 포트는 배양의 무균 특성을 손상시키지 않고 반복적으로 사용될 수 있다. 샘플링 포트는 샘플의 흐름이 중지되고 개시되거나 연속 샘플링의 수단을 제공하도록 하는 밸브 또는 기타 장치로 구성될 수 있다. 생물반응기는 전형적으로 배양의 접종을 허용하는 하나 이상의 포트를 갖고 이러한 포트는 또한 배지 또는 가스 주입과 같은 다른 목적을 위해 사용될 수 있다.
생물반응기 포트는 미세조류의 배양의 가스 함량이 조작되도록 할 수 있다. 설명하자면, 생물반응기 용적의 일부는 액체 보다는 가스일 수 있고 생물반응기의 가스 주입구는 가스를 생물반응기로 펌핑될 수 있도록 한다. 생물반응기 내로 이롭게 펌핑될 수 있는 가스는 공기, 공기/CO2 혼합물, 희가스 가령, 아르곤 및 기타 가스를 포함한다. 생물반응기는 전형적으로 사용자가 생물반응기로의 가스 주입 속도를 조절할 수 있도록 구성된다. 상기 언급된 바와 같이, 생물반응기로의 가스 주입 증가를 사용하여 배양물의 혼합을 증가시킬 수 있다.
증가된 가스 유입은 또한 배양물의 탁도에 영향을 미친다. 난기류는 수성 배양 배지의 수위 하부에 가스 주입 포트를 위치시켜 생물반응기로 주입되는 가스가 배양 표면으로 기포 주입되도록 함으로써 성취할 수 있다. 하나 이상의 가스 배출 포트는 가스가 배출되도록 하여 생물반응기내 압력 증강을 차단한다. 바람직하게, 가스 배출 포트는 생물반응기로 오염 미생물이 들어가는 것을 차단하는 '원-웨이' 밸브를 유도한다.
3. 배지
미생물 배양 배지는 전형적으로 고정 질소원, 고정 탄소원, 미량 요소, 임의로 pH 유지를 위한 완충제 및 포스페이트 (전형적으로 포스페이트 염으로서 제공됨)와 같은 성분들을 함유한다. 기타 성분은 특히 해양 미세조류를 위해 염화나트륨과 같은 염을 함유할 수 있다. 질소원은 예를 들어, 제한 없이 분자 질소, 니트레이트, 니트레이트 염, 암모니아 (순수 형태 또는 염 형태, 예를 들어, (NH4)2SO4 및 NH4OH), 단백질, 대두 음식물, 옥수수침지액, 및 효모 추출물을 포함하는 유기 및 무기 질소원을 함유한다. 미량 요소의 예는 아연, 붕소, 코발트, 구리, 망간, 및 몰리브덴을 포함하고 예를 들어, 이의 각각의 형태는 ZnCl2, H3BO3, CoCl2ㆍ6H2O, CuCl2ㆍ2H2O, MnCl2ㆍ4H2O 및 (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O이다.
고체 및 액체 성장 배지는 일반적으로 다양한 공급원으로부터 이용가능하고 광범위한 미생물 균주에 적합한 특정 배지를 제조하기 위한 지침은 예를 들어, 조류의 이의 배양물 수집을 위해, University of Texas at Austin, 1 University Station A6700, Austin, Texas, 78712-0183 (UTEX)에서 운영하는 온라인 사이트http://www.utex.org/에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 다양한 담수 및 염수 배지는 본 명세서에 참조로서 편입된 PCT 공개 번호 제2008/151149호에서 설명된 것들을 포함한다.
특정 예시에서, 프로테오스 배지 (Proteose Medium)는 무균 조건에 적합하고, 1L 용적의 배지 (pH ~ 6.8)는 1리터의 브리스톨(Bristol) 배지에 1g의 프로테오스 펩톤을 첨가하여 제조될 수 있다. 브리스톨 배지는 수용액 중에 2.94 mM NaNO3, 0.17 mM CaCl2ㆍ2H2O, 0.3 mM MgSO4ㆍ7H2O, 0.43 mM, 1.29 mM KH2PO4, 및 1.43 mM NaCl를 포함한다. 1.5% 한천 배지에 대해, 15g의 한천을 1L의 용액에 첨가될 수 있다. 상기 용액은 커버되고 오토클레이빙되고, 이어서 사용 전에 냉장 온도에 저장된다. 또 다른 예는 10g/L의 수소칼륨 프탈레이트 (KHP), 0.9g/L의 수산화나트륨, 0.1g/L의 황산마그네슘, 0.2g/L의 인산수소칼륨, 0.3g/L의 염화암모늄, 10g/L의 글루코오스, 0.001 g/L의 티아민 하이드로클로라이드, 20g/L 한천, 0.25g/L의 5-플루오로사이토신을 포함하고 pH 범위가 5.0 내지 5.2인 프로토테카(Prototheca) 단리 배지 (PIM)이다 (Pore, 1973, App. Microbiology, 26: 648-649를 참조). 본 발명의 방법을 사용하기에 적합한 다른 배지는 상기 확인된 URL에 문의하거나 미생물 배양물을 유지하는 다른 기관, 가령 SAG, CCAP, 또는 CCALA에 문의하여 용이하게 확인될 수 있다. SAG는 University of Gottingen (Gottingen, Germany) 에서의 조류 배양 수거물을 나타내고, CCAP는 Scottish Association for Marine Science (Scotland, United Kingdom)에 의해 관리되는 조류 및 원생동물의 배양 수거물을 나타내고, CCALA는 Institute of Botany (Trebon, Czech Republic)의 조류 연구소의 배양 수거물을 나타낸다. 추가로, 미국 특허 번호 제5,900,370호는 프로토테카(prototheca) 종의 종속영양 발효에 적합한 배지 제형 및 조건을 설명하고 있다.
오일 생산을 위해, 고정 탄소원의 선택이 중요한데 그 이유는 고정 탄소원의 비용이 경제적인 오일 생산을 위해 충분히 낮아야 하기 때문이다. 한 가지 구체예에서, 고정 탄소원은 자일로오스이다. 자일로오스는 헤미셀룰로오스의 성분으로서 발견되는 5-탄소 모노사카라이드이다. 헤미셀룰로오스는 모든 식물 물질의 약 30%를 포함하는, 대부분의 모든 식물 세포벽에서 발견되는 복합 폴리사카라이드이다. 자일로오스 외에도, 기타 탄소원, 예를 들어, 아세테이트, 플로리도사이드, 프럭토오스, 갈락토오스, 글루쿠론산, 글루코오스, 글리세롤, 락토오스, 만노오스, N-아세틸글루코사민, 람노오스, 수크로오스, 및/또는 자일로오스가 포함될 수 있고, 이들 화합물, 특히 자일로오스를 함유하는 공급원료의 선택은 본 발명의 방법의 중요한 측면이다.
본 발명의 방법에 따라 유용한 다른 적합한 공급원료는 예를 들어, 블랙 음료, 옥수수 전분, 탈중합된 셀룰로오스 물질, 유청, 당밀, 감자, 수수, 수크로오스, 사탕무, 사탕무 즙, 사탕수수, 사탕수수 즙, 굵은 줄기즙, 쌀 및 밀을 포함한다. 탄소원은 또한 수크로오스 또는 자일로오스와 탈중합된 사탕무 펄프, 탈중합된 셀룰로오스 물질의 혼합물과 같은 혼합물로서 제공될 수 있다. 하나 이상의 탄소원(들)은 하나 이상의 외인성으로 제공된 고정 탄소원(들)의 적어도 약 50 μM, 적어도 약 100 μM, 적어도 약 250 μM, 적어도 약 500 μM, 적어도 약 1 mM, 적어도 약 2.5 mM, 적어도 약 5 mM, 적어도 약 10 mM, 적어도 약 25 mM, 적어도 약 50 mM, 적어도 약 100 mM, 적어도 약 250 mM, 및 적어도 약 500 mM 의 농도로 제공될 수 있다. 몇몇 경우에, 하나 이상의 탄소원(들)은 적어도 약 100 g/L, 적어도 약 200 g/L, 적어도 약 300 g/L, 적어도 약 400 g/L, 적어도 약 500 g/L, 적어도 약 600 g/L, 적어도 약 700 g/L, 적어도 약 800 g/L또는 그 이상의 농도로, 유가식 발효를 위한 공급원료로서 공급될 수 있거나 또는 발효 배양 내로 고정 탄소원(들)이 외인성으로 제공될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 특히 유리한 탄소원은 자일로오스, 탈중합된 셀룰로오스 물질, 글리세롤, 글루코오스, 수크로오스 및 수수를 포함하고, 이들 각각은 하기에서 보다 상세히 논의된다.
본 발명에 따라, 미생물은 공급원료로서 탈중합된 셀룰로오스 바이오매스를 사용하여 배양될 수 있다. 셀룰로오스 바이오매스 (예를 들어, 옥수수 스토버와 같은, 스토버)는 저렴하고 용이하게 입수할 수 있다. 미세조류는 가공된 셀룰로오스 물질 상에서 성장할 수 있고, 그리고 본 발명의 미세조류는 특히 고효율의 탄소원으로서 자일로오스를 이용하는 것으로 지정된다. 셀룰로오스 물질은 일반적으로 약 40-60%의 셀룰로오스; 약 20-40%의 헤미셀룰로오스 및 10-30%의 리그닌을 포함한다.
적합한 셀룰로오스 물질은 농작물, 즉, 식물 일부, 일차 식품 또는 섬유 산물과 함께 야생에서 제거되지 않는 주로 줄기 및 잎뿐만 아니라 초본성 및 목재 에너지 작물로부터의 잔사를 포함한다. 이의 예는 농업 폐기물, 예를 들어, 사탕 수수 바가스, 쌀겨, 옥수수 섬유 (줄기, 잎, 껍질 및 코브), 밀짚, 쌀짚, 사탕무 펄프, 감귤 펄프, 감귤 과피; 산림 폐기물, 예를 들어, 경목재 및 연목재 간벌, 및 수목 작업으로부터의 경목재 및 연목재 잔사; 목재 폐기물, 예를 들어, 톱 가루 폐기물 (목재 칩, 톱밥) 및 펄프 가루 폐기물; 도시 폐기물, 예를 들어, 시의 고형 폐기물의 종이 분획물, 도시 목재 폐기물 및 도시 녹색 폐기물, 예를 들어, 시의 유리 클립핑; 및 목재 건축 폐기물을 포함한다. 추가의 셀룰로오스는 스위치그래스, 하이브리드 포플라 목재 및 미스칸투스, 섬유 케인(cane) 및 섬유 수수와 같은 전용 셀룰로오스 작물을 포한한다. 이러한 물질로부터 생성된 5-탄당은 자일로오스를 포함한다.
셀룰로오스 물질은 상기 물질내 함유된 당(들)을 미생물이 이용할 수 있도록 효율이 증가되도록 처리될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 리그노셀룰로오스 바이오매스는 셀룰로오스, 베타 1,4 연결된 글루코오스 (6-탄당)의 결정성 중합체, 헤미셀룰로오스, 자일로오스 (5-탄당)로 주로 구성된 보다 느슨하게 연합된 중합체 및 보다 드문 정도의 만노오스, 갈락토오스, 아라비노오스, 리그닌, 시나필 알코올 및 이의 유도체로 구성된 복합 방향족 중합체, 및 알파 1,4-연결된 폴리갈락투론산의 직쇄인 펙틴을 포함하는, 다양한 분획물로 구성된다. 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스의 중합체 구조때문에 이들내 당 (예를 들어, 단량체 글루코오스 및 자일로오스)은 많은 미생물에 의해 효율적으로 사용될 수 있는 (대사되는) 형태로 존재하지 않는다. 이러한 미생물을 위해 중합체를 구성하는 단량체 당을 생성하도록 셀룰로오스 바이오매스를 추가로 가공하면 셀룰로오스 물질이 공급원료 (탄소원)로서 효율적으로 확실히 사용되는 데에 매우 도움이 될 수 있다.
셀룰로오스 또는 셀룰로오스 바이오매스는, 바이오매스가 상승된 온도 및 압력에서 희석 황산 (또는 다른 산)으로 처리되는 "분해(explosion)"로 호칭되는 공정에 적용될 수 있다. 상기 공정 조건은 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 분획물의 글루코오스 및 자일로오스 단량체로 효소적 가수분해에 바이오매스가 효율적으로 적용될 수 있도록 한다. 수득한 단량체 당은 셀룰로오스 당으로 호칭된다. 셀룰로오스 당은 이어서 미생물에 의해 이용되어 다양한 대사물 (예를 들어, 지질)이 생성될 수 있도록 한다. 산 분해 단계는 헤미셀룰로오스 분획물이 구성 모노사카라이드로 부분 가수분해되도록 한다. 이들 당은 추가의 처리로 바이오매스로부터 완전히 유리될 수 있다. 몇 가지 구체예에서, 추가의 처리는 열수 처리이고 이는 분해된 물질을 고온수로 세척하여 염과 같은 오염물을 제거하도록 함을 포함한다. 상기 단계는 상기 공정에 사용되는 보다 희석된 당 농도로 인해 셀룰로오스 에탄올 발효를 위해 필요하지 않다. 다른 구체예에서, 추가의 처리는 추가의 산 처리이다. 또 다른 구체예에서, 추가의 처리는 분해된 물질의 효소적 가수분해이다. 이들 처리는 또한 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 처리 유형은 유리되는 당 (예를 들어, 5 탄당 대 6 탄당), 및 이들이 당해 공정에서 유리되는 단계의 유형에 영향을 미칠 수 있다. 결과로서, 이들이 5-탄당 또는 6-탄당이든 상관없이 상이한 당 스트림이 생성될 수 있다. 이들 집적된 5-탄당 또는 6-탄당 스트림은 따라서 상이한 탄소 이용 능력을 갖는 특이적 미생물에 지시될 수 있다. 본 발명의 방법의 특정한 구체예에서, 5-탄소 자일로오스 집적된 스트림이 바람직하다. 다른 구체예에서, 당화된, 5-탄당, 6-탄당, 또는 5-탄당/6-탄당의 조합을 함유한 상이한 당 스트림은 미생물 발효에서 이용하기 위해 결합되어 높은 세포 밀도 지질-생산 미생물 바이오매스를 생산할 수 있다.
지질 생산과 관련된 본 발명의 구체예는 에탄올 발효에서 성취되는 것 보다 높은 세포 밀도로 발효시킴을 포함할 수 있다. 종속영양성 셀룰로오스 오일 생산을 위한 배양물의 보다 높은 밀도 때문에, 고정 탄소원 (예를 들어, 셀룰로오스 유래된 당 스트림(들))은 바람직하게 농축된 형태로 존재한다. 예를 들어, 탈중합된 셀룰로오스 물질의 글루코오스 농도, 또는 자일로오스 농도, 또는 글루코오스 및 자일로오스 농도의 합은 배양 단계에 앞서 공급원료내 적어도 약 100 g/리터, 적어도 약 200 g/리터, 적어도 약 300 g/리터, 적어도 약 400 g/리터, 적어도 약 500 g/리터, 적어도 약 600 g/리터, 적어도 약 700 g/리터, 적어도 약 800 g/리터 또는 그 이상의 글루코오스 또는 자일로오스 또는 글루코오스 및 자일로오스의 조합일 수 있으며, 상기 배양 단계는 임의로 유가식 배양이고 여기서, 상기 물질은 세포가 성장하고 지질을 축적시킴으로써 시간 경과에 따라 세포에 공급된다. 이러한 당화 방법을 위한 여러 가지 방법 및 미세조류 발효에서 이용하기 위해 셀룰로오스물(cellulosics)을 가공하기 위한 방법은 미국 특허 출원 공개공보 20100151112에서 설명된다.
셀룰로오스 물질의 분해 공정 처리는 상당한 양의 황산, 열 및 압력을 사용하므로써 탄수화물의 부산물, 즉 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄을 유리시킨다. 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄은 자일로오스의 푸르푸랄 및 물로의 탈수를 통한 헤미셀룰로오스의 가수분해 동안에 생성된다. 자일로오스의 이러한 손실은 비-분해 공정이 이용되거나 또는 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄의 생성이 그들이 이용될 때 최소화되도록, 본 발명의 방법의 많은 구체예에서 바람직하지 않지만, 이들 부산물 (가령, 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄)은 생물반응기로 도입하기 전에 당화된 리그노셀룰로오스 물질로부터 제거될 수 있고, 그리고 분해 공정에 기인한 셀룰로오스 물질의 전도성은 미국 특허 공개공보 20100151112에서 설명된 방법에 의해 감소될 수 있다.
다른 구체예에서, 분해 공정 자체는 허용가능하지 않게 고수준으로 염의 생성을 피하도록 변화된다. 예를 들어, 셀룰로오스 바이오매스의 황산 (또는 다른 산) 분해에 대한 적합한 대용법은 기계적 펄핑으로 셀룰로오스 바이오매스가 효소적 가수분해 (당화)에 민감해지도록 하는 것이다. 또 다른 구체예에서, 고수준의 염에 내성인 미생물의 고유 균주 또는 고수준의 염에 내성을 갖는 유전자 조작된 균주가 사용된다. 셀룰로오스 당을 처리하여 본 발명을 위한 농축된 공급원료로서 이용하는 데에 적합한 비-제한 예시는 본 명세서에 참조로서 편입되는, 미국 특허 출원 공개공보 20100151538에서 설명된다. 한 가지 구체예에서, 당화된 리그노셀룰로오스 당은 처리되어 독소 (가령, 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄) 및 염 수준 둘 모두를 감소시켰고 이후 농축된 당 스트림 또는 고정 탄소원 공급원료에서 적어도 600 g/L 또는 그 이상의 농도까지 당 단량체를 농축시켰다. 다른 구체예에서, 이러한 농축 당화된 리그노셀룰로오스 당은 700 mM 미만 나트륨 등가물의 염 수준을 갖는다. 다른 구체예에서, 이러한 농축 당화된 리그노셀룰로오스 당은 100 mM 미만 나트륨 등가물, 200 mM 미만 나트륨 등가물, 300 mM 미만 나트륨 등가물, 400 mM 미만 나트륨 등가물, 500 mM 미만 나트륨 등가물, 600 mM 미만 나트륨 등가물, 700 mM 미만 나트륨 등가물, 또는 1000 mM 미만 나트륨 등가물의 염 수준을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 이러한 농축 당화된 리그노셀룰로오스 당 공급원료는 20,000 μS/cm 미만, 15,000 μS/cm 미만, 10,000 μS/cm 미만, 7,500 μS/cm 미만, 5,000 μS/cm 미만, 1000 μS/cm 미만, 500 μS/cm 미만, 300 μS/cm 미만, 또는 200 μS/cm 미만의 전도성을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 이러한 농축 당화된 리그노셀룰로오스 당 공급원료는 5 탄당 단량체, 또는 6 탄당 단량체, 또는 5 및 6 탄당 단량체의 조합에 대해 풍부해졌다.
본 발명의 방법의 또 다른 구체예에서, 탄소원은 바이오디젤 트랜스에스테르화로부터 산성화되고 비-산성화된 글리세롤 부산물과 같은 글리세롤을 포함한다. 한 가지 구체예에서, 탄소원은 글리세롤 및 자일로오스를 포함한다. 몇몇 경우에, 모든 글리세롤 및 자일로오스는 발효 초기에 미생물에게 제공된다. 몇몇 경우에, 글리세롤 및 자일로오스는 소정의 비율로 동시에 미생물에 제공된다. 몇몇 경우에, 글리세롤 및 자일로오스는 발효 과정 동안에 소정의 속도로 미생물에 공급된다.
몇몇 미세조류는 글리세롤의 존재 하에서, 또 다른 탄소원, 가령 글루코오스의 존재때보다 더 신속하게 세포 분열을 진행한다 (PCT 공개 번호 제2008/151149호를 참조). 글리세롤 및 자일로오스에 대하여 참인 경우에, 처음에 세포에게 글리세롤을 공급하여 세포 밀도를 신속하게 증가시킴에 이어서, 자일로오스를 공급하여 지질을 축적시키는 2단계 성장 공정은 지질이 생산되는 효율을 개선시킬 수 있다. 트랜스에스테르화 공정의 글리세롤 부산물의 사용은 생산 공정으로 도입되는 경우 상당한 경제적인 잇점을 제공한다. 글리세롤 및 글루코오스의 혼합물과 같은 다른 공급 방법이 제공된다. 이러한 혼합물의 공급은 또한 동일한 경제적 이득을 취득한다. 따라서, 본 발명은 글리세롤과 다양하게 조합된 자일로오스와 같은 대안적인 당을 미세조류에게 공급하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법의 여러 가지 구체예에서, 탄소원은 자일로오스를 함유하는 복합 공급원료, 가령 셀룰로오스물-유래 물질을 포함하는 자일로오스이다. 한 가지 구체예에서, 배양 배지는 적어도 하나의 자일로오스 이용 효소를 추가로 포함한다. 자일로오스를 함유하는 복합 공급원료의 사용은 탄화수소 및 기타 오일의 제조에 상당한 비용 절감을 제공할 수 있다.
4. 오일 생산
본 발명의 방법에 따른 오일 생산을 위해, 예를 들어, 빛이 배양물에 입사되지 않도록 하는 매우 대용량 (40,000 리터 이상)의 발효기를 사용하는 경우에서와 같이, 암실에서 (또는 빛의 실질적인 부재에서) 세포를 배양하는 것이 바람직할 수 있다. 절대 영양종속생물 종 가령 프로토테카(Prototheca) 종은 고정 탄소원을 함유하는 배지에서 빛의 부재 하에 오일 생산을 위해 성장되고 증식된다; 이러한 성장은 종속영양 성장으로서 공지되어 있다.
하나의 예로서, 지질-생산 미생물 세포의 접종물이 배지에 도입되고; 세포가 증식을 시작하기 전에 지체(lag) 기간 (지체 단계)이 있다. 지체 기간 후, 증식율은 일정하게 증가하고 로그 또는 대수증식기로 진입한다. 대수증식기에 이어서 질소와 같은 영양물의 감소 및 독성 물질의 증가 및 정족수 감지 기작으로 증식이 느려진다. 이와 같이 느려진 후, 증식은 멈추고 세포는 정체기 또는 일정한 성장 상태로 진입하고 이는 세포에 제공된 특정 환경에 의존한다. 지질 풍부 바이오매스를 수득하기 위해, 배양물은 전형적으로 질소 또는 또 다른 주요 영양물 (탄소 이외의 다른 영양물)이 고갈됨으로써 조기에 종결되어 세포가 과량으로 존재하는 탄소원을 지질로 전환하도록 강요되는 대수증식기 말기 후에 수거된다. 배양 조건 파라미터는 총 오일 생산, 생산된 지질 종의 조합 및/또는 특정 오일의 생성을 최적화하도록 조작될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 생물반응기 또는 발효기는 세포가 이들의 성장 사이클의 다양한 단계를 진행하도록 사용된다. 하나의 예로서, 지질-생산 세포의 접종물은 배지에 도입될 수 있고 이어서 세포가 성장을 시작하기 전에 지체 기간 (지체 기)이 도래한다. 지체 기간 후, 성장 속도는 일정하게 증가하고 로그기 또는 대수증식기로 진입한다. 대수증식기에 이어서 영양물의 감소 및/또는 독성 물질의 증가로 인해 성장이 느려진다. 느려진 후, 성장은 멈추고 당해 세포는 정체기 또는 일정 상태로 진입하고 이는 세포에 제공되는 특정 환경에 의존한다. 본 명세서에 명시된 세포에 의한 지질 생산은 영양물이 공급되거나 세포 분열의 부재 하에 계속적인 지질 생산을 허용하기에 여전히 가용한 정체기를 포함하는, 로그기 또는 이후 기간 동안에 일어날 수 있다.
바람직하게, 본 명세서에서 설명되고 당업계에 공지된 조건을 사용하여 성장한 미생물은 지질 중량으로 적어도 약 20%의 지질, 지질 중량으로 적어도 약 40%, 지질 중량으로 적어도 약 50%, 지질 중량으로 적어도 약 60%, 및 지질 중량으로 적어도 약 70%를 포함한다. 가공 조건은 특정 용도에 적합한 지질의 수율을 증가시키도록 및/또는 생산 비용을 절감시키도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 특정한 구체예에서, 미세조류는 예를 들어, 질소, 인 또는 황과 같은 하나 이상의 영양물의 제한 농도의 존재 하에 배양되고, 글루코오스와 같은 과량의 고정 탄소 에너지를 제공한다. 질소 제한은 질소가 과량으로 공급된 배양물에서의 미생물 지질 수율 이상으로 미생물 지질 수율을 증가시키는 경향이 있다. 특정한 구체예에서, 지질 수율의 증가는 질소 충만 조건 하에 더은 것보다 적어도 약: 10%, 50%, 100%, 200%, 또는 500% 초과이다. 상기 미생물은 전체 배양 기간 중 일부 동안 또는 전체 기간 동안 제한된 양의 영양물의 존재 하에 배양될 수 있다. 특정한 구체예에서, 총 배양 기간 동안 적어도 2회 영양물 농도는 제한 농도와 비제한 농도 사이에서 순환된다. 세포의 지질 함량은 과량의 탄소를 제공하지만 질소를 제한하거나 제공하지 않으면서 증가된 기간 동안 배양을 계속함으로써 증가될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 지질 수율은 지질 경로 효소 (예를 들어, 지방산 합성 효소)를 위한 하나 이상의 조인자(들)의 존재 하에 지질 생산 미생물 (예를 들어, 미세조류)를 배양함으로써 증가된다. 일반적으로, 조인자(들)의 농도는 조인자(들)의 부재 하에 미생물 지질 수율 보다 미생물 지질 (예를 들어, 지방산) 수율을 증가시키기에 충분하다. 특정한 구체예에서, 상기 조인자(들)는 배양물에 조인자(들)를 암호화하는 외인성 유전자를 함유하는 미생물 (예를 들어, 미세조류)을 포함시킴에 의해 배양물에 제공된다. 또는, 조인자(들)는 조인자의 합성에 관여하는 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 함유하는 미생물 (예를 들어, 미세조류)를 포함시킴에 의해 배양물에 제공될 수 있다. 특정한 구체예에서, 적합한 조인자는 예를 들어, 비오틴 또는 판토테네이트와 같은 지질 경로 효소에 의해 요구되는 임의의 비타민을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 조인자를 암호화하거나 이러한 조인자의 합성에 관여하는 유전자는 널리 공지되어 있고 상기 설명된 것들과 같은 기술 및 전략을 사용하여, 미생물 (예를 들어, 미세조류)에 도입될 수 있다.
본 명세서에서 설명된 생물반응기, 배양 조건 및 종속영양 성장 및 증식 방법의 특정 예는 임의의 적합한 방식으로 조합하여 미생물 성장 및 지질 및/또는 단백질 생산의 효율을 개선시킬 수 있다.
건조 중량으로 높은 퍼센트의 오일/지질 축적과 함께 미세조류 바이오매스는 당업계에 공지된 상이한 배양 방법을 사용하여 생산되었다 (PCT 공개 번호 제2008/151149호를 참조). 본 명세서에서 설명되고 본 발명에 따라 유용한 배양 방법에 의해 생성된 미세조류 바이오매스는 건조 중량으로 적어도 10%의 미세조류 오일을 포함한다. 몇 가지 구체예에서, 미생물 바이오매스는 건조 중량으로 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60% 미세조류 오일, 또는 적어도 70%의 미세조류 오일을 포함한다. 몇 가지 구체예에서, 미세조류 바이오매스는 건조 중량으로 10-90%의 미세조류 오일, 25-75%의 미세조류 오일, 40-75%의 미세조류 오일, 또는 50-70%의 미세조류 오일을 함유한다.
본 명세서에서 설명된 바이오매스의 미세조류 오일 또는 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기 위해 바이오매스로부터 추출된 오일은 하나 이상의 독특한 지방산 에스테르 측쇄를 갖는 글리세로지질을 포함할 수 있다. 글리세로지질은 다양한 길이 및 다양한 정도의 포화를 가질 수 있는 1개, 2개 또는 3개의 지방산 분자에 에스테르화된 글리세롤 분자로 구성된다. 지방산 분자 (및 미세조류 오일)의 길이 및 포화 특성은 하기 섹션 V에서 보다 상세하게 설명된 바와 같은 배양 조건을 통해 또는 지질 경로 가공을 통해 본 발명의 미세조류 오일내에서 지방산 분자의 성질 또는 비율을 변형시키기 위해 조작될 수 있다. 따라서, 조류 오일의 특이적 블렌드는 두 개 이상의 미세조류 종으로부터 바이오매스 또는 조류 오일을 함께 혼합함으로써 또는 대두, 평지씨, 카놀라, 팜, 팜 커넬, 코코넛, 옥수수, 폐기 식물, 차이니즈 탈로우, 올리브, 해바라기, 면화씨, 치킨 지방, 소 탈로우, 돼지 탈로우, 미세조류, 거대조류, 미생물, 쿠페아, 아마, 피넛, 쵸이스 백색 그리스, 라드, 카멜리나 사티바, 머스타드 씨, 캐슈 너트, 귀리, 루핀, 케나프, 금잔화, 헴프, 커피, 아마인 (아마), 헤이즐넛, 유포비아, 호박씨, 코리안더, 카멜리아, 참깨, 홍화, 쌀, 유동, 코코아, 코프라, 피움 파피, 피마자, 피칸, 호호바, 마카다미아, 브라질 너트, 아보카도, 석유 또는 상기 오일 중 임의의 증류 분획물과 같은 다른 공급원 기원의 오일과 본 발명의 조류 오일을 블렌딩함으로써 조류의 단일 종내에서 제조될 수 있다.
오일 조성물, 즉, 글리세로지질의 지방산 성분의 성질 및 비율은 또한 적어도 두 개의 독특한 종의 미세조류 기원의 바이오매스 또는 오일을 조합함으로써 조작될 수 있다. 몇 가지 구체예에서, 독특한 종의 미세조류 중 적어도 두 개는 상이한 글리세로지질 프로파일을 갖는다. 미세조류의 독특한 종은 바람직하게 종속영양 조건 하에 본 명세서에서 설명된 바와 같이 함께 배양되거나 별도로 배양되여 각각의 오일을 생성할 수 있다. 상이한 종의 미세조류는 세포의 글리세로지질내 상이한 퍼센트의 독특한 지방산 성분을 함유할 수 있다.
일반적으로, 야생형 프로토테카(Prototheca) 균주는 쇄 길이가 C8-C14인 지방산을 거의 갖지 않는다. 예를 들어, 프로토테타 모리포르미스(Prototheca moriformis) (UTEX 1435), 프로토테카 크루가니(Prototheca krugani) (UTEX 329), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora) (UTEX 1442) 및 프로토테카 조프피(Prototheca zopfii) (UTEX 1438)는 C8 지방산을 함유하지 않고 (또는 검출가능하지 않은 양) C10 지방산이 0 내지 0.01%이고 C12 지방산은 0.03 내지 2.1%이고 C14 지방산은 1.0 내지 1.7%이다.
미세조류 오일은 또한 미세조류에 의해 생산되거나 배양 배지로부터 미세조류 오일로 혼입된 다른 성분을 포함할 수 있다. 이들 다른 성분들은 미세조류를 배양하기 위해 사용되는 배양 조건, 미세조류 종, 바이오매스로부터 미세조류 오일을 회수하기 위해 사용되는 추출 방법 및 미세조류 오일 조성물에 영향을 줄 수 있는 다른 인자에 따라 다양한 양으로 존재할 수 있다. 상기 성분의 비-제한적인 예는 0.1-0.4 마이크로그램/ml로 존재하는 카로테노이드, 오일의 킬로그램당 0 내지 0.02 밀리그램으로 존재하는 클로로필, 오일의 100 그램당 0.4 내지 0.6 밀리그램으로 존재하는 감마 토코페롤, 및 오일의 그램당 0.2 내지 0.5 밀리그램으로 존재하는 총 토코트리에놀을 포함한다.
다른 성분은 제한 없이, 인지질, 토코페롤, 토코트리에놀, 카로테노이드 (가령, 알파-카로틴, 베타-카로틴, 리코펜 등), 크산토필 (가령, 루테인, 제악산틴, 알파-크립토산틴 및 베타-크립토산틴), 및 다양한 유기 또는 무기 화합물을 포함할 수 있다.
몇몇 경우에, 프로토테카(Prototheca) 종으로부터 추출된 오일은 0.02mg/kg 이하의 클로로필을 포함한다. 몇몇 경우에, 프로토테카(Prototheca) 종으로부터 추출된 오일은 총 0.4 mcg/ml 이하의 카로테노이드를 포함한다. 몇몇 경우에, 프로토테카(Prototheca) 오일은 오일의 100그램당 0.40 내지 0.60 밀리그램의 감마 토코페롤을 포함한다. 다른 경우에, 프로토테카(Prototheca) 오일은 오일의 그램당 총 0.2-0.5 밀리그램의 토코트리에놀을 포함한다.
IV. 유전자 조작 방법 및 재료
본 발명의 구체예는 재조합 유성 미생물, 미세조류, 및 유성 미세조류 가령 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis), 프로토테카 조프피(Prototheca zopfii), 프로토테카 크루가니(Prototheca krugani), 및 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora) 숙주 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 본 발명의 방법에서 유용한 세포 및 재조합 숙주 세포를 유전적으로 변형하기 위한 방법 및 재료를 제공한다. 이들 방법 및 재료의 설명은 구독자의 편의를 위해 서브섹션으로 나뉜다. 서브섹션 1에서, 형질전환 방법이 설명된다. 서브섹션 2에서, 상동 재조합 방법이 설명된다. 서브섹션 3에서, 발현 벡터 및 성분이 설명된다.
1. 형질전환 방법
세포는, 예를 들어, 유전자주입, 전기천공 (Maruyama et al. (2004), Biotechnology Techniques 8:821-826을 참조), 유리 비드 형질전환 및 탄화규소 휘스커 형질전환을 포함하는 임의의 적합한 기술에 의해 형질전환될 수 있다. 이용될 수 있는 또 다른 방법은 원형질세포를 형성하고 CaCl2 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 이용하여 재조합 DNA를 미세조류 세포에 도입하는 단계를 포함한다 (Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73을 참조하며, 본 문헌은 클로렐라 엘리프소이데아(Chorella ellipsoidea)의 형질전환을 위한 이 방법의 사용을 보고함). 미세조류의 동시-형질감염을 이용하여 두 개의 독특한 벡터 분자를 세포에 동시에 도입할 수 있다 (예를 들어 Protist 2004 Dec;155(4):381-93을 참조).
유전자 주입 방법 (예를 들어, Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6:299 302, 미국 특허 번호 제4,945,050호; 전기천공 (Fromm et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:5824 5828); 레이져 빔, 미세주입 또는 DNA를 미세조류로 도입할 수 있는 임의의 다른 방법의 이용은 프로토테카(Prototheca) 세포를 형질전환하는 데에 또한 이용될 수 있다.
2. 상동 재조합 방법
상동 재조합은 상동 영역을 정렬하고 교환하는 숙주 세포내 상보적 DNA 서열의 능력을 나타낸다. 표적화된 게놈 서열 ("주형")과 상동인 서열을 함유하는 유전자전이 DNA ("공여체")는 유기체에 도입되고 이어서 상응하는 게놈 상동 서열 부위에서 게놈으로 재조합을 진행한다. 대부분의 경우에, 이 공정의 기계론적 단계는 다음을 포함한다: (1) 상동 DNA 절편의 쌍형성; (2) 이중가닥 브레이크의 공여체 DNA 분자로의 도입; (3) 유리된 공여체 DNA 말단에 의한 주형 DNA 분자의 공격에 이어서 DNA의 합성; 및 (4) 이중-가닥 브레이크 복구 반응으로 최종 재조합 산물 생성.
숙주 유기체에서 상동 재조합을 수행하기 위한 능력은 분자 유전학적 수준에서 수행될 수 있는 것에 대한 많은 실제 연관성을 갖고 맞춤 오일을 생성할 수 있는 유성 미생물의 생성에 유용한 많은 실제 연관성을 갖는다. 이의 천연의 상동 재조합이란 정확한 유전자 표적화 반응이고; 따라서 동일한 표적화 서열로 생성된 대부분의 유전자 전이 계열은 근본적으로 표현형과 관련해서 동일하고 극소수의 형질전환 반응의 스크리닝을 필요로 한다. 상동 재조합은 또한 숙주 염색체로의 유전자 삽입 반응을 표적화하여 유전자 선별 부재 하에서도, 우수한 유전학적 안정성을 수득한다. 상이한 염색체 유전자좌는 심지어 이종성 프로모터/UTR로부터 유전자 발현에 영향을 줄 가능성이 있기 때문에, 상동 재조합은 유사하지 않은 게놈 환경 내에서 유전자좌를 탐색하고 유전자 발현에 대한 이들 환경의 영향을 평가하는 방법이 될 수 있다.
상동 재조합을 사용하는 특히 유용한 유전자 조작 응용은 고도로 특이적인 양상으로 이종성 유전자 발현을 구동시키는 프로모터/UTR과 같은 특이적 숙주 조절 요소를 선택하는 것이다. 예를 들어, 이종성 C12:0 특이적 FATB (티오에스테라아제) 유전자 카세트와 적합한 선택적 마커를 사용한 내인성 스테아로일 ACP 불포화효소 유전자의 정확한 절단은 C18:1의 지방산 수준을 급격히 감소시키고 동시에 C12:0 지방산의 수준을 증가시키는 것으로 예측할 수 있다. 특허 출원 공개공보 20100151112를 참조한다.
상동 재조합은 정확한 유전자 표적화 반응이기 때문에, 충분한 플랭킹 영역이 확인된 이상 정확하게 목적하는 유전자 또는 영역내 임의의 뉴클레오티드(들)를 변형시키는데 이용될 수 있다. 따라서, 상동 재조합은 RNA 및/또는 단백질의 유전자 발현에 영향을 주는 조절 서열을 변형시키기 위한 수단으로서 이용될 수 있다. 이것은 또한 기질 특이성, 친화성 및 Km과 같은 효소 활성을 변형시킴에 따라서 숙주 세포 대사의 목적하는 변화에 영향을 주고자 단백질 암호화 영역을 변형시키는데 이용될 수 있다. 상동 재조합은 유전자 표적화, 유전자 전환, 유전자 결실, 유전자 복제, 유전자 역위를 유도하고 프로모터, 인핸서 및 3'UTR과 같은 유전자 발현 조절 요소를 교환하여 고스트(gost) 게놈을 조작하기 위한 강력한 수단을 제공한다.
상동 재조합은 내인성 숙주 세포 게놈 내에 목적하는 유전자 또는 영역을 "표적"하기 위한 내인성 서열 조각을 함유하는 표적화 작제물을 사용하여 성취될 수 있다. 이러한 표적화 서열은 목적하는 유전자 또는 영역의 5'에 위치하거나 목적하는 유전자/영역의 3'에 위치하거나, 심지어 목적하는 유전자/영역을 플랭킹할 수 있다. 이러한 표적화 작제물은 추가의 벡터 골격과 함께 슈퍼코일된 플라스미드 DNA로서, 벡터 골격을 갖지 않는 PCR 산물로서 또는 선형화된 분자로서 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 몇몇 경우에, 이것은 먼저 제한 효소에 유전자전이 DNA (공여체 DNA)내의 상동성 서열을 노출시키는 것이 유리할 수 있다. 이 단계는 재조합 효율을 증가시킬 수 있고 목적하지 않은 반응의 발생을 감소시킬 수 있다. 재조합 효율을 증가시키는 다른 방법은 PCR을 사용하여 표적화된 게놈 서열에 상동인 선형 말단을 함유하는 형질전환 유전자전이 DNA를 생성시키는 단계를 포함한다.
3. 벡터 및 벡터 성분
본 발명에 따라 미생물은 형질전환시키기 위한 벡터는 본 명세서에서 설명된 바를 토대로 당업자에게 유사한 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 벡터는 전형적으로 하나 이상의 유전자를 함유하고, 여기서 각각의 유전자는 목적하는 산물 (유전자 산물)의 발현을 암호화하고 유전자 발현을 조절하거나 유전자 산물을 재조합 세포내 특정 위치에 표적화하는 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 구독자를 도와주기 위해, 본 서브섹션은 여러 서브섹션으로 나누어진다. 서브섹션 A는 프로토테카(Protoheca)와 같은 미세조류에서 특히 이용하기 위한 제어 서열뿐만 아니라 벡터 상에 전형적으로 함유된 제어 서열을 설명한다. 서브섹션 B는 프로토테카(Protoheca)와 같은 미세조류에서 특히 이용하기 위한 것을 사용하여 제조된 코돈 최적화 방법 및 유전자뿐만 아니라 벡터내 전형적으로 함유된 유전자를 설명한다.
A. 제어 서열
제어 서열은 암호화 서열의 발현을 조절하거나 유전자 산물을 세포 내부 또는 외부의 특정 위치로 지시하는 핵산이다. 발현을 조절하는 제어 서열은 예를 들어, 암호화 서열의 전사를 조절하는 프로모터 및 암호화 서열의 전사를 종결시키는 터미네이터(terminator)를 포함한다. 또 다른 제어 서열은 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 암호화 서열의 말단에 위치한 3' 비번역 서열이다. 유전자 산물을 특정 위치로 지시하는 제어 서열은 단백질이 세포 내부 또는 외부의 특정 위치에 부착되는 위치로 지시하는 신호 펩타이드를 암호화하는 것들을 포함한다.
따라서, 미세조류내 외인성 유전자의 발현을 위한 예시적인 벡터 디자인은 미세조류에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 목적하는 유전자 산물 (예를 들어, 선택가능한 마커, 지질 경로 변형 효소 또는 자일로오스 이용 효소)에 대한 암호화 서열을 함유한다. 대안으로, 벡터가 목적하는 암호화 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하지 않는 다면, 암호화 서열은 이것이 벡터 통합 부위에서 내인성 프로모터와 작동가능하게 연결되도록 세포를 형질전환시킬 수 있다.
많은 프로모터는 미세조류에서 활성이고 형질전환된 조류에 내인성이 아닌 프로모터 (즉, 다른 조류 기원의 프로모터, 고등 식물 기원의 프로모터 및 식물 바이러스 또는 조류 바이러스 기원의 프로모터)뿐만 아니라, 형질전환된 조류에 내인성인 프로모터를 포함한다. 미세조류에서 활성인 예시적인 외인성 및/또는 내인성 프로모터 (또한 미세조류에서 기능하는 항생제 내성 유전자)는 PCT 공개 번호 제2008/151149호 및 본 명세서에서 인용된 문헌에서 설명된다. 또한 미국 특허 출원 공개공보 20100151112를 참조한다.
외인성 유전자를 발현시키기 위해 이용되는 프로모터는 천연적으로 상기 유전자 또는 이종성 프로모터에 연결된 프로모터일 수 있다. 몇몇 프로모터는 하나 이상의 미세조류 종에서 활성이다. 다른 프로모터는 종 특이적이다. 예시적인 프로모터는 하기 실시예에서 사용된 클라미도모나스 레인하르드티(Chlamydomonas reinhardtii) 기원의 β-튜불린과 같은 프로모터 및 다수의 미세조류 종에서 활성인 것으로 밝혀진 콜리플라워 모자이크 바이러스(CMV) 및 클로렐라 바이러스와 같은 바이러스 프로모터를 포함한다 (예를 들어, Plant Cell Rep. 2005 Mar;23(10-11):727-35; J Microbiol. 2005 Aug;43(4):361-5; Mar Biotechnol (NY). 2002 Jan;4(l):63-73을 참조). 프로토테카(Prototheca)에서 외인성 유전자의 발현에 사용하기에 적합할 수 있는 또 다른 프로모터는 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 글루타메이트 탈수소효소 프로모터/5'UTR (서열번호: 10)이다. 임의로, 프로모터를 함유하는 상기 서열 중 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60개의 뉴클레오티드가 사용된다. 프로토테카(Prototheca) 외인성 유전자의 발현에 유용한 예시적인 프로모터는 본 명세서의 서열 목록에 열거되어 있고 예를 들어 클로렐라(Chlorella) HUP1 유전자 (서열번호: 11)의 프로모터 및 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea) 니트레이트 환원효소 프로모터 (서열번호: 12)가 있다. 클로렐라 바이러스 프로모터는 또한 프로토테카(Prototheca)에서 미국 특허 제6,395,965호의 서열번호: 1 내지 7과 같은 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있다. 프로토테카(Prototheca)에서 활성인 추가의 프로모터는 예를 들어 Biochem Biophys Res Commun. 1994 Oct 14;204(1):187-94; Plant Mol Biol. 1994 Oct;26(1):85-93; Virology. 2004 Aug 15;326(1):150-9; 및 Virology. 2004 Jan 5;318(1):214-23에서 찾을 수 있다.
프로모터는 일반적으로 항상성이거나 유도성인 것으로서 특성화될 수 있다. 항상성 프로모터는 일반적으로 동일한 수준에서 항상 (또는 세포 생활 사이클에서 특정 시점에서) 발현을 유도하기 위해 활성이거나 기능성이다. 역으로, 유도성 프로모터는 활성 (또는 불활성)이거나 단지 자극에 응답하여 상당히 상향-조절되거나 하향-조절된다. 상기 프로모터 유형 둘 모두는 본 명세서의 방법에 적용된다. 본 발명에서 유용한 유도성 프로모터는 외인성으로 제공된 소분자 (가령, 서열번호: 11에서와 같이, 글루코오스), 온도 (열 또는 냉), 배양 배지내 질소 부재 등과 같은 자극에 응답하여 작동하능하게 연결된 유전자의 전사를 매개하는 것들을 포함한다. 적합한 프로모터는 근본적으로 사일런트 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있거나 바람직하게는 낮은 수준으로 전사된 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 상당히 상향 조절한다.
종결 영역 제어 서열의 내포는 임의적이고 사용되는 경우, 선택은 종결 영역이 비교적 상호교환가능하므로 주로 편의를 위한 것이다. 종결 영역은 전사 개시 영역 (프로모터)에 특정된 것일 수 있거나 목적하는 DNA 서열에 특정된 것일 수 있거나, 또 다른 공급원으로부터 수득할 수 있다 (예를 들어, Chen and Orozco, Nucleic Acids Res. (1988) 16:8411을 참조).
본 발명은 또한 제어 서열 및 재조합 유전자 및 목적하는 유전자의 구분된 발현을 제공하는 것들을 함유하는 벡터를 제공한다. 표적화를 위한 기관은 엽록체, 플라스티드, 미토콘드리아, 및 소포체이다. 또한, 본 발명은 제어 서열 및 재조합 유전자, 및 세포 외부로의 단백질의 분비를 제공하는 것들을 함유하는 벡터를 제공한다.
프로토테카(Prototheca)의 핵 게놈에서 발현되는 단백질은 플라스티드 표적화 신호를 사용하여 플라스티드로 표적화될 수 있다. 클로렐라(Chlorella)에 내인성인 플라스티드 표적화 서열은 공지되어 있고 예를 들어, 플라스티드로 표적화되는 단백질을 암호화하는 클로렐라(Chlorella) 핵 게놈내 유전자들이 있고; 예를 들어, GenBank 승인 번호 AY646197 및 AF499684를 참조, 그리고 한 가지 구체예에서, 이러한 제어 서열은 단백질의 발현을 프로토테카(Prototheca) 플라스티드로 표적화하는 본 발명의 벡터 내에 사용된다.
숙주 세포내 올바른 구획으로 이종성 단백질을 표적화하는 조류 플라스티드 표적화 서열의 용도가 설명된다. 미국 특허 출원 공개공보 20100151112의 실시예 11 및 12를 참조한다. 한 가지 구체예에서, 이종성 단백질의 고유 플라스티드 표적화 서열은 이종성 단백질을 플라스티드/엽록체로 수송하는 데에 이용된다. 몇 가지 구체예에서, 고유 플라스티드 표적 서열은 플라스티드/엽록체 내로 재조합 또는 이종성 단백질의 수송을 증가시키기 위하여 이종성 플라스티드 표적화 서열로 대체된다. 몇 가지 구체예에서, 고유 플라스티드 표적 서열은 미세조류 단백질의 플라스티드 표적 서열로 대체된다. 서열은 BLAST이고 플라스티드/엽록체로 수송되는 공지된 단백질과의 상동성에 대해 분석된다. 이들 단백질을 암호화하는 cDNA를 클로닝하고 플라스티드 표적화 서열은 이들 cDNA로부터 단리되었다. 이러한 조류 플라스티드 표적화 서열은 세포내 유용한 발현 벡터 및 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 프로토테카(Prototheca)내에서 폴리펩타이드의 발현은 소포체로 표적화된다. 발현 벡터내 적절한 보유 또는 분류 신호의 내포는 단백질이 소포체 (ER)에 보유되고 골지체로 다운스트림되지 않도록 하는 것을 보장한다. 예를 들어, Wageningen UR- Plant Research International로부터의 IMPACT VECTOR 1.3 벡터는 널리 공지된 KDEL 보유 또는 분류 신호를 포함한다. 상기 벡터와 함께, ER 보유는 이것이 발현 수준을 5배 이상으로 개선시킴이 보고되었다는 점에서 실제 잇점을 갖는다. 이에 대한 주요 이유는 ER이 세포질내 존재하는 것 보다 발현된 단백질의 번역-후 분해에 관여하는 프로테아제가 보다 낮은 농도이고/이거나 상이하다는 점에 있는 것으로 나타난다. 녹색 미세조류에서 기능하는 ER 보유 신호가 공지된다. 예를 들어, Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Apr 26;102(17):6225-30을 참조한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드는 배양 배지내로 세포 외부로의 분비를 위해 표적화된다. 프로토테카(Prototheca)에서 본 발명에 방법에 따라 사용될 수 있는 클로렐라(Chlorella)에서 활성인 분비 신호에 대한 예는 Hawkins et al., Current Microbiology Vol. 38 (1999), pp. 335-341을 참조한다.
B. 유전자 및 코돈 최적화
전형적으로, 유전자는 프로모터, 암호화 서열 및 종결 제어 서열을 포함한다. 재조합 DNA 기술에 의해 어셈블리되는 경우, 유전자는 발현 카세트로 호칭될 수 있고 재조합 유전자를 숙주 세포로 도입하는데 사용되는 벡터로의 편리한 삽입을 위한 제한 부위에 의해 플랭킹될 수 있다. 발현 카세트는 상동 재조합에 의한 발현 카세트의 게놈으로의 안정적인 통합을 촉진시키는, 게놈 또는 다른 핵산 표적 기원의 DNA 서열에 의해 플랭킹될 수 있다. 대안으로, 벡터 및 이의 발현 카세트는 통합되지 않은 상태로 유지될 수 있고, 이 경우에, 벡터는 전형적으로, 이종성 벡터 DNA의 복제를 제공할 수 있는 복제 오리진을 포함한다.
벡터 상에 존재하는 통상의 유전자는 단백질을 암호화하는 유전자이고 이의 발현은 상기 단백질을 함유하는 재조합 세포가 상기 단백질을 발현하지 않는 세포로부터 구분될 수 있도록 한다. 이러한 유전자 및 이의 상응하는 유전자 산물은 선택가능한 마커로서 호칭된다. 선택가능한 마커는 프로토테카(Prototheca)를 형질전환시키기 위해 유용한 전이유전자 작제물에 사용될 수 있다. 적합한 선택가능한 마커의 예는 G418 내성 유전자, 니트레이트 환원효소 유전자 (Dawson et al. (1997), Current Microbiology 35:356-362를 참조), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자 (HPT; Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73을 참조), 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 및 플레오마이신 (Huang et al. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:197-205를 참조)에 대해 내성을 부여하는 ble 유전자를 포함한다. 항생제에 대한 미세조류의 민감성을 측정하는 방법은 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Mol Gen Genet. 1996 Oct 16;252(5):572-9를 참조한다.
본 발명의 목적을 위해, 본 발명의 구체예의 재조합 숙주 세포를 제조하기 위해 사용되는 발현 벡터는 상기 유전자들 중 하나가 선택가능한 마커인 경우, 적어도 2개 및 흔히 3개의 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자 조작된 프로토테카(Prototheca)는 선택가능한 마커 뿐만 아니라 하나 이상의 외인성 유전자, 예를 들어, 자일로오스 이용 유전자 또는 자일로오스 이용 유전자 및 아실 ACP-티오에스테라아제 유전자를 포함하는 본 발명의 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 하나 또는 둘 모두의 유전자는 지질 수율 및 지방산 에스테르로의 전환을 증진시키기 위해 이들 유전자들의 발현과 관련된 타이밍을 허용하는 유도성 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 두 개 이상의 외인성 유전자의 발현은 동일한 유도성 프로모터의 제어 하에 또는 상이한 유도성 (또는 항상성) 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 후자 상황에서, 제1 외인성 유전자의 발현은 제1 기간 동안 유도될 수 있고 (이 동안에 제2 외인성 유전자의 발현은 유도되거나 유도되지 않을 수 있다) 제2 외인성 유전자의 발현은 제2 기간 동안 유도될 수 있다 (이 동안에 제1 외인성 유전자의 발현은 유도되거나 유도되지 않을 수 있다).
다른 구체예에서, 두 개 이상의 외인성 유전자 (임의의 선택가능한 마커에 추가로)는 자일로오스 이용 유전자, 지방 아실-ACP 티오에스테라아제 및 케토-아실-ACP 생성효소, 스테로일-ACP 불포화효소, 지방산 불포화효소, 및 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소, 상기 수율의 조합 작용은 알코올 산물을 생성시킨다. 추가로 제한 없이, 자일로오스 이용 유전자뿐만 아니라, 알데하이드를 생성하기 위한 지방 아실-ACP 티오에스테라아제 및 지방 아실-CoA 환원효소를 포함하는 외인성 유전자의 다른 조합이 제공된다. 한 가지 구체예에서, 벡터는 자일로오스 이용 유전자뿐만 아니라, 알칸을 생성하기 위해 지방 아실-ACP 티오에스테라아제, 지방 아실-CoA 환원효소 및 지방 알데하이드 데카보닐라아제의 조합을 제공한다. 이들 구체예 각각에서, 하나 이상의 외인성 유전자는 유도성 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다.
두 개 이상의 외인성 유전자를 발현하는 다른 예시적인 벡터는 자일로오스 이용 효소 및 선택가능한 마커 둘 모두를 암호화하는 것들을 포함한다. 본 발명의 벡터로 형질전환된 재조합 프로토테카(Prototheca) 탄소원으로서 자일로오스를 사용하는 능력으로 조작되었으므로 낮은 제조 비용으로 지질을 생산한다. 상기 설명된 바와 같은 외인성 유전자의 삽입은, 보다 큰 탄소 유입이 지질 생산과 맞물리도록 지시되고 및/또는 무작위 돌연변이 유발을 통해 폴리사카라이드 생합성의 파괴와 조합될 수 있다. 개별적으로 및 조합적으로, 영양성 전환, 지질 생산을 변화시키기 위한 조작 및 외인성 효소를 이용한 처리는 미생물에 의해 생산되는 지질 조성물을 변형시킨다. 상기 변형은 미생물내에서 생산되는 지질의 양의 변화, 다른 지질과 비교하여 생산되는 하나 이상의 탄화수소 종의 양 및/또는 생산되는 지질 종의 유형의 변화일 수 있다. 예를 들어, 미세조류는 보다 높은 양 및/또는 퍼센트의 TAG를 생산하도록 조작될 수 있다.
재조합 단백질의 최적의 발현을 위해, 형질전환된 숙주 세포에 의해 우선적으로 사용되는 코돈으로 mRNA를 생산하는 암호화 서열을 사용하는 것이 이롭다. 따라서, 전이유전자의 적당한 발현은 전이유전자의 코돈 용법이 전이유전자가 발현되는 유기체의 특이적 코돈 편력에 부합되도록 하는 것이 요구될 수 있다. 상기 효과가 근거하는 정확한 기작은 많지만, 상기 필요성이 충족되는 경우 전이유전자 전령 RNA (mRNA)의 보다 효율적인 번역과 커플링되는, 세포내에서 합성되는 단백질과 가용하게 아미노아실화된 tRNA 풀의 적당한 균형을 포함한다. 전이유전장내 코돈 용법이 최적화되지 않은 경우, 가용한 tRNA 풀은 이종성 mRNA의 효율적인 번역을 허용하기에 충분하지 않고 리보솜 스톨링 및 종결 및 전이유전자 mRNA의 가능한 불안정성을 유도한다.
본 발명은 프로토테카(Prototheca)에서 재조합 단백질의 성공적인 발현을 위해 유용한 코돈-최적화된 핵산을 제공한다. 프로토테카(Prototheca) 종에서 코돈 용법은 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis)로부터 단리된 cDNA 서열을 연구함으로써 분석된다. 상기 분석은 24,000개 코돈에 대한 탐색이고 이의 결과는 하기의 표 1에 나타낸다.
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다른 구체예에서, 재조합 벡터내 유전자는 프로토테카(Prototheca) 균주 이외의 다른 미세조류 균주를 참조하여 코돈 최적화되었다. 예를 들어, 미세조류내 발현용 유전자를 재암호화하는 방법은 미국 특허 제7,135,290호에서 설명된다. 암호화 최적화를 위한 추가의 정보는 예를 들어, GenBank의 코돈 용법 데이타베이스에서 수득할 수 있다.
본 발명의 방법 및 재료가 외인성 유전자의 프로토테카(Prototheca)로의 도입을 허용하고, 자일로오스 이용 및 지질 경로 변형에 관한 유전자는 다음 섹션에서 논의되는 바와 같이, 관심 대상이다.
V. 자일로오스 이용
본 발명의 구체예는 또한 셀루로오스원에서 풍부한 자일로오스와 같은 펜토오스 당을 포함한 상이한 공급원료를 대사시키는 미생물의 능력을 변경하기 위해 변형된 재조합 유성 미생물을 제공한다. 이러한 재조합 유성 미생물은 플라스티드를 갖는 것들을 포람하고 유형 II 지방산 합성 경로는 식물(Plantae) 계, 미세조류, 유성 효모, 유성 박테리아 및 유성 곰팡이에 있다. 몇 가지 구체예에서, 재조합 유성 미생물은 미세조류이다. 다른 구체예에서, 재조합 유성 미생물은 프로토테카(Prototheca) 속의 미세조류이다. 한 가지 구체예에서, 재조합 유성 미생물은 유전자 조작되어 자일로오스 이용에 관여하는 하나 이상의 외인성 유전자를 포함한다. 자일로오스 이용에 관여하는 유전자는 하기 상세하게 설명된다. 본 발명의 하나 이상의 구체예에서 자일로오스 이용에 관여하는 유전자는 단독으로, 또는 이러한 유전자의 수 또는 조합(들)에 제한 없이, 자일로오스 이용에 관여하는 기타 유전자와 조합하여 이용될 수 있다는 점이 고려된다. 본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 자일로오스 이용에 관여하는 유전자는 이러한 유전자의 수 또는 조합(들)에 제한 없이, 기타 탄소원 또는 지질 생산의 이용을 수반하는 기타 외인성 유전자와 조합하여 이용될 수 있다는 점이 고려된다.
한 가지 구체예에서, 본 발명의 재조합 세포는 하나 이상의 외인성 자일로오스 이용 유전자를 추가로 함유한다. 자일로오스를 대사시키기 위해 진핵 유기체에 의해 이용되는 적어도 두 개의 상이한 경로가 있다. 이러한 한 가지 경로는 옥소-환원 (산화환원효소) 경로 또는 알도 케토 환원효소 경로이다. 이 경로의 첫 번째 단계에서, D-자일로오스는 자일로오스 환원효소에 의해 자일리톨로 환원된다. 이후 자일리톨은 자일리톨 탈수소효소에 의해 자일룰로스로 산화된다. 이후 자일룰로스는 자일룰로스 키나아제에 의해 자일룰로스-5-포스페이트로 전환되고 그 다음 펜토오스 포스페이트 경로를 통해 대사된다. 자일로오스를 대사시키는 데에 이용되는 또 다른 경로는 자일로오스 이성질화효소 경로이다. 자일로오스 이성질화효소 경로의 첫 번째 단계에서, 자일로오스는 자일로오스 이성질화효소에 의해 자일룰로스로 이소머화된다. 이후 자일룰로스는 자일룰로스 키나아제에 의해 자일룰로스-5-포스페이트로 전환된다. 이후 자일룰로스-5-포스페이트는 펜토오스 포스페이트 경로를 통해 대사된다.
몇몇 유기체에서, 하나 이상의 이들 경로가 존재하고 협력하여 이용된다. 몇몇 유기체에서, 옥소-환원 경로 및 자일로오스 이성질화효소 경로 둘 모두가 존재한다. 이러한 유기체에서, 자일리톨의 생산은 자일로오스 이성질화효소 활성도를 저해할 수 있다. 이러한 경우에서, 자일리톨 탈수소효소는 발현되어 이러한 저해를 완화시킨다.
자일로오스를 이용하지 않거나, 또는 효율적인 방식으로 자일로오스를 이용할 수 없는 유기체에서, 하나 또는 둘 모두의 상기 경로는 이들 유기체에서 존재할 수 없거나 또는 오직 부분적으로만 존재한다. 효과적으로 자일로오스를 활용하기 위해 유전자 조작된 이러한 유기체는 하나 또는 둘 모두의 이들 경로의 하나 또는 여러 가지 (또는 모든) 구성원의 도입을 포함할 수 있다. 운반체 단백질의 도입은 세포외 환경으로부터 세포 내로 자일로오스를 운반하는 데에 또는 더욱 효과적으로 자일로오스를 운반하는데 필수적일 수 있다. 자일로오스와 같은 펜토오스 당에 대해 특이성을 가진 운반체 단백질을 포함한, 운반체 단백질은 세포 막단백질 및 당 (가령 자일로오스)을 세포외 환경, 가령 배양 배지로부터 세포의 사이토졸 내로 운반하는 이러한 단백질을 암호화하는 유전자의 패밀리이다. 운반체는 활성 또는 수동일 수 있다. 수동 운반체는 에너지 소모 없이 농도 기울기 (더 높은 농도의 면적에서 더 낮은 농도의 면적으로)를 낮추는 분자(들)의 운반을 촉진한다. 몇 가지 구체예에서, 운반체는 펜토오스 당에 대한 특이성을 갖는 펜토오스 운반체이다. 다른 구체예에서, 운반체는 피키아 스티피티스(Pichia stipitis)로부터 유래딘 운반체이다. 또 다른 구체예에서, 운반체는 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) SUT1 (제한 없이, GenBank 수탁번호 XP_001387, 이는 본 명세서에 참조로서 편입됨) (서열 번호: 37), SUT2, 및/또는 SUT3 운반체로부터 또는 사카로미세스 세레비시애(S. cerevisiae) HXT 운반체로부터 유래된다. 활성 운반체는 주로 농도 기울기에 대항하여, 분자를 운반하는 데에서 에너지를 소모한다. 활성 운반체는 제한없이, 에너지원으로서 ATP를 이용하는 일차 활성 운반체, 즉, ATP-결합 카세트 (ABC) 운반체, 및 화학삼투 기울기로부터 에너지를 이용하는 이차 운반체를 포함하고 그리고 제한 없이, 역수송체 및 공동 수송체, 즉, 칸디다 인터메디아(Candida intermedia)의 GXS1 단백질 (서열 번호: 39) (제한 없이, GenBank 수탁번호 CAI44932.1, 이는 본 명세서에 참조로서 편입됨), 및 H+-공동 수송체-유사 단백질 (가령, 서열 번호: 41)을 포함한다. 몇 가지 구체예에서, 운반체는 아라비도프시스(Arabidopsis)로부터의 At5g59250n 유전자로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 운반체는 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei)로부터의 XLT1 단백질 (서열 번호: 43) 을 암호화하는 유전자로부터 유래된다.
추가적으로, 운반체 단백질 (가령, 자일룰로스-5-포스페이트 전이체)의 도입은 올바른 기질을 미생물의 올바른 하위구획 내로 분배하기 위하여 필수적이거나 또는 바람직할 수 있다. 펜토오스 당 대사는 주로 플라스티드에서 발생하는 펜토오스 포스페이트 경로를 통하여 발생하는 것으로 간주된다. 이러한 전이체는 플라스티드 막 단백질 및 사이토졸로부터 플라스티드로 이들 분자의 헥소오스, 트리오스, 또는 펜토오스 또는 포스페이트 버전을 운반하는 이러한 단백질을 암호화하는 유전자의 패밀리이다. 한 가지 구체예에서, 이러한 전이체는 헥소오스/헥소오스 포스페이트 또는 트리오스/트리오스 포스페이트 보다는 펜토오스 또는 펜토오스 포스페이트 분자에 대한 선호도를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 전이체는 자일룰로스 5-포스페이트 전이체 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 전이체는 아라비도프시스(Arabidopsis)의 XPT 유전자로부터 유래된다. 몇몇 경우에, 전이체는 자일로오스를 이용하도록 조작된 미생물에 내인성인 전이 펩티드를 포함하는 키메라 단백질이다. 예를 들어, 프로토테카(Prototheca)에 내인성인 전이 펩티드를 가진 키메라 전이체 (서열번호: 45, 47 및 49)는 몇 가지 구체예에서 유용하다.
몇 가지 구체예에서, 미생물 내로 도입된 이종 외인성 유전자는 옥소-환원 또는 알도 케토 환원효소 경로의 일부이다. 몇몇 경우에, 이종 외인성 유전자는 자일로오스 환원효소이다. 다른 경우에, 이종 외인성 유전자는 자일리톨 탈수소효소이다. 다른 구체예에서, 자일리톨 탈수소효소는 피키아 스티피티스(Pichia stipitis)로부터의 XYL2 유전자이다.
다른 구체예에서, 미생물 내로 도입된 이종 외인성 유전자는 자일로오스 이성질화효소 경로의 일부이다. 몇몇 경우에, 이종 외인성 유전자는 자일로오스 이성질화효소이다. 몇 가지 구체예에서, 자일로오스 이성질화효소는 피로마이세스 종(Piromyces sp.)으로부터의 XYLA 유전자에 의해 암호화된다. 다른 구체예에서, 이종 외인성 유전자는 자일룰로스 키나아제이다. 몇 가지 구체예에서, 자일룰로스 키나아제는 피키아 스티피티스(Pichia stipitis)로부터의 XYL3 유전자에 의해 암호화된다.
몇 가지 구체예에서, 이종 외인성 유전자는 전이체 단백질은 암호화한다. 다른 구체예에서, 이러한 전이체는 펜토오스 포스페이트 전이체이다. 또 다른 구체예에서, 펜토오스 포스페이트 전이체는 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 XPT 유전자에 의해 암호화된다. 또 다른 구체예에서, 유전자 조작된 미생물은 하나 이상의 전술한 외인성 이종 유전자를 포함한다. 다른 구체예에서, 유전자 조작된 미생물은 모든 전술한 외인성 이종 유전자를 포함한다.
하기 실시예 3은 영양종속 조건 하에 성장할 때 고정 탄소원으로서 자일로오스를 이용할 수 있는 유전자 조작된 미세조류 세포를 생성하기 위해 미세조류 내로 자일로오스 이성질화효소 경로 단백질, 옥소-환원 경로 효소, 및 자일로오스 전이체의 상이한 구성원의 성공적인 도입을 증명한다.
실시예 7은 프로토테카(Prototheca) 내로 자일로오스 운반체, 자일로오스 산화환원효소/이성질화효소 효소, 및 자일로오스 전이체의 다양한 조합의 도입을 증명한다. 실시예 8은 여러 가지 선택된 균주의 지질 생성 능력을 증명한다.
몇몇 구체예에서, 세포는 미국 특허 출원 공개공보 20100151112에서 설명 된 바와 같이, 하나 이상의 외인성 수크로오스 이용 유전자를 추가로 함유한다. 이러한 세포는 자일로오스와 수크로오스 둘 모두를 대사시킬 수 있다.
VI. 지질 경로 조작
자일로오스-함유 공급원료와 같은 공급원료를 사용하는 프로토테카(Prototheca)의 능력을 변형시키는 것에 추가로, 본 발명은 생산된 지질의 성질 및/또는 비율이 변화하도록 변형된 재조합 프로토테카(Prototheca)를 또한 제공한다. 경로는 추가로 또는 대안적으로, 지방산 경로에서 지질 및 중간체의 효소적 가공을 통해 생산된 다양한 지질 분자의 성질 및/또는 비율이 변화되도록 변형될 수 있다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 재조합 프로토테카(Prototheca) 세포는 이들의 비형질전환된 대응 세포에 비해, 단위 용적당 및/또는 단위 시간당 최적화된 지질 수율, 탄소 쇄 길이 (예를 들어, 재생가능한 디젤 생산 또는 지질 공급원료를 요구하는 산업적 화학 제품), 감소된 수의 이중 결합 또는 삼중 결합, 임의로 0개를 갖고 지질의 특정 종 또는 독특한 지질 집단의 수소:탄소 비율을 증가시킨다.
특정한 구체예에서, 지방산 합성으로의 대사를 제어하는 하나 이상의 주요 효소는 지질 생산을 개선시키기 위해 "상향-조절"되거나 "하향-조절"된다. 상향-조절은 예를 들어, 전사를 증가시키는 강한 프로모터 및/또는 인핸서 요소를 사용하여, 목적하는 효소를 암호화하는 유전자가 발현되는 발현 작제물로 세포를 형질전환시킴으로써 성취될 수 있다. 이러한 작제물은 선택가능한 마커를 함유하여 상기 형질전환체는 선택될 수 있고 이에 의해 작제물을 유지 및 증폭시키고 암호화된 효소의 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 상향-조절에 적합한 효소의 예는 미국 특허 공개공보 20100151112에서 설명된다.
유전자의 상향- 및/또는 하향-조절은 지방산 생합성 경로의 유전자의 발현을 제어하는 범용 조절제에 적용될 수 있다. 따라서, 지방산 합성의 하나 이상의 범용 조절제는 적당히 각각 다수의 지방산 합성 유전자의 발현을 억제하거나 증진시키고 궁극적으로 지질 생산을 증가시키도록 상향- 또는 하향-조절될 수 있다. 이의 예는 스테롤 조절 요소 결합 단백질 (SREBP), 예를 들어, SREBP-1a 및 SREBP-1c (예를 들어, Genbank 수탁번호 제NP_035610호 및 제Q9WTN3호를 참조)를 포함한다.
본 발명의 구체예는 또한 예를 들어, 지방 아실-ACP 티오에스테라아제, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소, 지방 아실-CoA 환원효소, 지방 알데하이드 데카보닐라아제, 지방 알데하이드 환원효소, 및 스쿠알렌 생성효소와 같은 지질 변형 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 유전자를 함유하도록 변형된 재조합 미세조류 세포를 제공한다 (미국 특허 출원 공개공보 20100151112를 참조).
따라서, 특정한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 아실-ACP 티오에스테라아제, 아실-CoA/알데하이드 환원효소, 지방 아실-CoA 환원효소, 지방 알데하이드 환원효소, 지방 알데하이드 데카보닐라아제, 또는 천연적으로 동시-발현되는 아실 담체 단백질로부터 선택되는 하나 이상의 외인성 유전자뿐만 아니라 자일로오스 이용 유전자를 발현하도록 유전자 조작된다. 적합한 발현 방법은 기타 방법 중에서 유도성 발현 및 구분된 발현을 포함하는 리파아제 유전자의 발현과 관련하여 상기 설명된다. 지방 아실-ACP 티오에스테라아제는 지질 합성 동안에 아실 담체 단백질 (ACP)로부터 지방산을 절단한다. 추가의 효소적 가공을 통해, 절단된 지방산은 이어서 조효소와 조합되어 아실-CoA 분자를 생성한다. 이러한 아실-CoA는 알코올을 생성하기 위한 지방 아실-CoA 알데하이드 환원효소에 대한 것뿐만 아니라 알데하이드를 생성하기 위한 지방 아실-CoA 환원효소의 효소 활성도에 대한 기질이다. 상기 식별된 지방 아실-CoA 환원효소의 작용에 의해 생산된 알데하이드는 알코올을 생성하기 위한 지방 알데하이드 환원효소, 또는 알칸 또는 알켄을 생성하기 위한 지방 알데하이드 환원효소에 의한 추가의 효소적 활성도에 대한 기질이다.
몇 가지 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 방법에 의해 생산되는 지방산, 글리세로지질, 또는 상응하는 1급 알코올, 알데하이드, 알칸 또는 알켄은 8, 10, 12, 또는 14개의 탄소 원자를 함유한다. 디젤, 바이오디젤, 재생가능한 디젤 또는 제트 연료의 생산을 위해 바람직한 지방산 또는 산업용을 위한 상응하는 1급 알코올, 알데하이드, 알칸 및 알켄은 8 내지 14개의 탄소 원자를 함유한다. 특정한 구체예에서, 다른 상응하는 탄화수소 분자뿐만 아니라 상기 지방산은 포화되거나 (어떠한 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합을 갖지 않음); 단일 불포화되거나 (단일 이중 결합); 다중 불포화되거나 (두 개 이상의 이중 결합); 선형 (환형이 아님)이거나 분지형이다. 연료 생산을 위해, 보다 큰 포화가 바람직하다.
상기 직접 설명된 효소는 특정 수의 탄소 원자를 함유하는 기질의 가수분해에 대해 우선적인 특이성을 갖는다. 예를 들어, 지방 아실-ACP 티오에스테라아제는 ACP로부터 12개의 탄소 원자를 갖는 지방산을 절단하는 것을 선호할 수 있다. 몇 가지 구체예에서, ACP 및 길이-특이적 티오에스테라아제는 이들이 조합체로서 특히 유용하게 하는 서로에 대한 친화성을 가질 수 있다 (예를 들어, 외인성 ACP 및 티오에스테라아제 유전자는 그들이 유래하는 특정 조직 또는 유기체에서 천연적으로 동시-발현될 수 있다). 따라서, 다양한 구체예에서, 본 발명의 구체예의 재조합 세포는 기질내 함유된 탄소 원자수 및 포화 패턴과 관련하여 효소적 활성도를 촉매하기 위한 특이성 (예를 들어, ACP로부터 지방산의 절단, 아실-CoA의 알데하이드 또는 알코올로의 환원, 또는 알데하이드의 알칸으로의 전환, 또는 KAS, SAD, 또는 FAD 유전자의 유전자 산물)을 갖는 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 함유할 수 있다. 외인성 티오에스테라아제를 발현하기 위한 다양한 벡터 및 방법에 대하여 미국 특허 출원 공개공보 20100151112를 참조한다. 따라서, 본 발명의 구체예에서, 유전적으로 변형된 세포는 자일로오스를 대사시키고 변경된 지방산 프로파일 (즉, 세포에 의해 생산된 지방산내 쇄 길이 및/또는 포화 패턴의 분포)을 생산한다.
따라서, 본 발명은 동일 종의 야생형 세포에 비해 변화된 수준에서 자일로오스 이용 효소 및 하나 이상의 지질 경로 효소를 발현하도록 유전자 조작된 세포 (및 특정한 구체예에서, 프로토테카(Prototheca) 세포)를 제공한다. 몇몇 경우에, 세포는 둘 모두의 세포가 동일한 조건 하에서 성장하는 경우 야생형 세포에 비해 보다 많은 세포를 생산한다. 몇몇 경우에, 세포는 야생형 세포 보다 높은 수준에서 지질 경로 효소를 발현하도록 유전자 조작되고 및/또는 선택되었다. 몇몇 경우에, 지질 경로 효소는 피루베이트 탈수소효소, 아세틸-CoA 카복실라아제, 아실 담체 단백질 및 글리세롤-3 포스페이트 아실트랜스퍼라아제로 구성된 그룹에서 선택된다. 몇몇 경우에, 세포는 야생형 세포 보다 낮은 수준에서 지질 경로 효소를 발현하도록 유전자 조작되고 및/또는 선택된다. 세포가 보다 낮은 수준에서 지질 경로 효소를 발현하는 적어도 한 가지 구체예에서, 지질 경로 효소는 시트레이트 생성효소를 포함한다.
몇 가지 구체예에서, 세포는 야생형 세포와 비교하여 변화된 수준에서 지방산 합성의 범용 조절제를 발현하도록 유전자 조작되고 및/또는 선택됨으로써 다수의 지방산 합성 유전자의 발현 수준은 야생형 세포와 비교하여 변화된다. 몇몇 경우에, 지질 경로 효소는 지방산을 변형시키는 효소를 포함한다. 몇몇 경우에, 지질 경로 효소는 스테아로일-ACP 불포화효소 및 글리세로지질 불포화효소로부터 선택된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 외인성 유전자를 함유하는 오일-생산 미생물에 관한 것이고 여기서, 외인성 유전자는 지방 아실-ACP 티오에스테라아제, 지방 아실-CoA 환원효소, 지방 알데하이드 환원효소, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소, 지방 알데하이드 데카보닐라아제 및 아실 담체 단백질로 구성된 그룹에서 선택된 단백질뿐만 아니라 자일로오스 이용 효소에서 선택된 단백질(들)을 암호화한다. 한 가지 구체예에서, 외인성 유전자는 자극에 응답하여 유도성이거나 억제성인 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 몇몇 경우에, 자극은 외부적으로 제공되는 작은 분자, 열, 냉 및 배양 배지에서 제한되거나 부재인 질소로 구성된 그룹에서 선택된다. 몇몇 경우에, 외인성 유전자는 세포 구획에서 발현된다. 몇 가지 구체예에서, 세포 구획은 엽록체, 플라스티드 및 미토콘드리아로 구성된 그룹에서 선택된다. 몇 가지 구체예에서 미생물은 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis), 프로토테카 크루가니(Prototheca krugani), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora) 또는 프로토테카 조프피(Prototheca zopfii)이다. 다양한 외인성 유전자 및 지질 경로 변형을 위한 유전자 조합은 미국 특허 출원 공개공보 20100151112에서 설명된다.
본 발명의 구체예는 또한 배양 배지에서 재조합 프로토테카(Prototheca) 세포의 집단을 배양하는 단계를 포함하는 알코올을 생산하는 방법을 제공하고, 여기서, 세포는 자일로오스 이용 효소를 암호화하는 제1 외인성 유전자; 지방 아실-ACP 티오에스테라아제를 암호화하는 제2 외인성 유전자; 및 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소를 암호화하는 제3 외인성 유전자를 함유하고, 그리고 세포는 아실 담체 단백질 (ACP)에 연결된 지방산을 합성하고, 지방 아실-ACP 티오에스테라아제는 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매하여 추가의 가공을 통해 지방 아실-CoA를 생산하고, 그리고 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소는 아실-CoA의 알코올로의 환원을 촉매한다.
본 발명의 구체예는 또한 프로토테카(Prototheca) 세포에서 알데하이드를 생산하는 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 방법은 배양 배지에서 프로토테카(Prototheca) 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 자일로오스 이용 효소를 암호화하는 제1 외인성 유전자; 지방 아실-ACP 티오에스테라아제를 암호화하는 제2 외인성 유전자; 및 지방 아실-CoA 환원효소를 암호화하는 제3 외인성 유전자를 함유하고, 그리고 세포는 아실 담체 단백질 (ACP)에 연결된 지방산을 합성하고, 지방 아실-ACP 티오에스테라아제는 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매하여 추가의 가공을 통해 지방 아실-CoA를 생산하고 지방 아실-CoA 환원효소는 아실-CoA의 알데하이드로의 환원을 촉매한다.
본 발명의 구체예는 또한 외인성 자일로오스 이용 유전자를 함유한 프로토테카(Prototheca) 세포에서 특정 탄소 쇄 길이를 갖는 지방산 분자를 생산하는 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 방법은 배양 배지에서 지질-생산 프로토테카(Prototheca) 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 미생물은 8, 10, 12 또는 14개 탄소 원자와 같은 특정 탄소 쇄 길이에 특이적이거나 우선적인 활성도를 갖는 외인성 자일로오스 이용 유전자 및 지방 아실-ACP 티오에스테라아제를 암호화하는 외인성 유전자를 함유하고, 미생물은 아실 담체 단백질 (ACP)에 연결된 지방산을 합성하고 티오에스테라아제는 지방산이 특정 탄소 쇄 길이로 합성되는 경우 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매한다.
상기 설명된 다양한 구체예에서, 세포는 지질 경로 효소를 암호화하는 적어도 하나의 외인성 유전자를 함유할 수 있다. 몇몇 경우에, 지질 경로 효소는 스테아로일-ACP 불포화효소, 글리세로지질 불포화효소, 피루베이트 탈수소효소, 아세틸-CoA 카복실라아제, 아실 담체 단백질, 및 글리세롤-3 포스페이트 아실트랜스퍼라아제로 구성된 그룹에서 선택된다. 다른 경우에, 세포는 지방 아실-ACP 티오에스테라아제, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소, 지방 아실-CoA 환원효소, 지방 알데하이드 환원효소, 지방 알데하이드 데카보닐라아제, 및/또는 아실 담체 단백질로 구성된 그룹에서 선택되는 지질 변형 효소를 함유한다.
VII. 연료 및 화학물질 또는 기타 산물의 생산
본 발명의 구체예의 방법에 따른 연료의 생산을 위해, 본 발명의 세포에 의해 생산된 지질은 수거되거나, 다르게는 임의의 편리한 수단에 의해 수집된다. 지질은 전체 세포 추출에 의해 단리될 수 있다. 세포를 우선 파쇄시키고 이어서 세포내 및 세포막/세포벽-연합 지질 및 세포외 탄화수소를 예를 들어, 상기 설명된 바와 같은 원심분리를 사용하여 세포 매스로부터 분리할 수 있다. 미생물 내에서 생성된 세포내 지질은 몇 가지 구체예에서 미생물의 세포를 용해시킨 후 추출된다. 일단 추출되면, 지질을 추가로 정련하여 오일, 연료 또는 함유화학물질을 생산한다.
배양을 완료 한 후, 미생물은 발효 브로쓰(broth)로부터 분리될 수 있다. 임의로, 상기 분리는 원심분리로 수행하여 농축된 페이스트(paste)를 생성한다. 이어서 바이오매스는 임의로 세척액 (예를 들어, 탈이온수(DI water))로 세척되어 발효 브로쓰 및 잔해를 제거할 수 있다. 임의로, 세척된 미생물 바이오매스는 또한 세포 분쇄 전에 건조 (오븐 건조, 동결 건조 등)시킬 수 있다. 대안으로, 세포는 발효가 완료된 경우 발효 브로쓰의 일부 또는 전부로부터 분리 없이 용해될 수 있다. 예를 들어, 세포는 세포가 용해된 경우 세포외 액체에 대한 세포의 비율이 1:1 v:v 미만이 될 수 있다.
액체를 함유하는 미생물은 용해되어 용해물을 생성할 수 있다. 본 명세서에서 상세 설명된 바와 같이, 미생물 용해시키는 단계 (또한 세포 용해로서 언급됨)는 열-유도된 용해, 염기의 첨가, 산의 첨가, 프로테아제와 같은 효소 및 폴리사카라이드 분해 효소의 사용, 초음파, 기계적 용해의 사용, 삼투압 쇼크의 사용, 용해성 바이러스에 의한 감염 및/또는 하나 이상의 용해성 유전자의 발현을 포함하는, 임의의 간편한 수단에 의해 성취될 수 있다. 용해가 수행되어 미생물에 의해 생성된 세포내 분자를 방출시킨다. 미생물을 용해시키기 위한 이들 방법 각각은 단일 방법으로 또는 동시에 또는 연속적으로 조합하여 이용될 수 있다. 세포 파쇄 정도는 현미경 분석에 의해 관찰될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 방법 중 하나 이상을 사용하여, 전형적으로 70% 초과의 세포 파괴가 관찰된다. 바람직하게, 세포 파괴는 80% 초과, 보다 바람직하게는 90% 초과 및 가장 바람직하게는 약 100%이다.
특정한 구체예에서, 미생물은 예를 들어, 추출 또는 추가의 가공을 위해 세포 지질 및/또는 탄화수소의 노출을 증가시키기 위해 성장 후 용해된다. 리파아제 발현 (예를 들어, 유도성 프로모터를 통한) 또는 세포 용해의 타이밍은 지질 및/또는 탄화수소의 수율을 최적화하기 위해 조정될 수 있다. 다수의 용해 기술은 아래에서 설명된다. 이들 기술은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 미생물을 용해시키는 단계는 미생물을 함유하는 세포 현탁액의 가열을 포함한다. 이 구체예에서, 미생물을 함유하는 발효 브로쓰 (또는 발효 브로쓰로부터 단리된 미생물 현탁액)는 미생물, 즉 미생물의 세포벽 및 막이 분해하거나 파괴될 때까지 가열된다. 전형적으로, 적용되는 온도는 적어도 5O℃이다. 보다 효율적인 세포 용해를 위해, 보다 고온, 예를 들어, 적어도 6O℃, 적어도 70℃, 적어도 80℃, 적어도 9O℃, 적어도 100℃, 적어도 11O℃, 적어도 12O℃, 적어도 13O℃ 또는 더 높은 온도가 이용된다. 가열 처리에 의한 세포 용해는 미생물을 비등시킴으로써 수행될 수 있다. 대안으로, 열 처리 (비등 없이)는 오토클레이브(autoclave)에서 수행될 수 있다. 열 처리된 용해물은 추가의 처리를 위해 냉각될 수 있다. 세포 파쇄는 또한 증기 처리, 즉 가압된 증기의 부가를 통해 수행될 수 있다. 세포 파쇄를 위한 미세조류의 증기 처리는 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,750,048호에서 설명된다. 몇 가지 구체예에서, 증기 처리는 발효기로 증기를 살포하고 브로쓰를 약 90분 미만, 바람직하게는 약 60분 미만, 및 보다 바람직하게는 약 30분 미만 동안 목적하는 온도에 유지시킴으로써 성취될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 미생물을 용해시키는 단계는 염기를, 미생물을 함유하는 세포 현탁액에 첨가하는 단계를 포함한다. 염기는 사용되는 미생물의 단백질성 화합물의 적어도 일부를 가수분해하기에 충분히 강해야만 한다. 단백질을 가용화시키기 위해 유용한 염기는 화학 기술 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 방법에 유용한 예시적인 염기는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘의 수산화물, 카보네이트 및 바이카보네이트 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 염기는 KOH이다. 세포 파쇄를 위한 미세조류의 염기 처리는 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,750,048호에서 설명된다.
본 발명의 또 구체예에서, 미생물을 용해시키는 단계는 산을, 미생물을 함유하는 세포 현탁액에 첨가하는 단계를 포함한다. 산 용해는 10-500 mN 또는 바람직하게 40-160 mN의 농도로 산을 사용하여 수행될 수 있다. 산 용해는 바람직하게 실온 이상 (예를 들어, 40 내지 160°, 및 바람직하게 50 내지 130°)에서 수행된다. 적당한 온도 (예를 들어, 실온 내지 100℃ 및 특히 실온 내지 65℃에 대해서, 산 처리는 통상적으로 초음파 처리 또는 다른 세포 파쇄 방법과 조합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 미생물을 용해시키는 단계는 효소를 이용함으로써 미생물을 용해시키는 단계를 포함한다. 미생물을 용해시키기 위해 바람직한 효소는 프로테아제 및 폴리사카라이드-분해 효소, 예를 들어, 헤미셀룰라제 (예를 들어, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger); Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #H2125), 펙티나아제(예를 들어, 리조푸스 종(Rhizopus sp.) 기원의 펙티나제; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #P2401), 만나웨이(Mannaway) 4.0 L (노보자임(Novozymes)), 셀룰라아제 (예를 들어, 트리코더마 비리드 기원의 셀룰로오스; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #C9422), 및 드리셀라아제 (예를 들어, 바시디오마이세테스 종(Basidiomycetes sp.) 기원의 드리셀라아제; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #D9515)이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 용해는 예를 들어, 임의로 클로렐라(Chlorella) 또는 클로렐라(Chlorella) 바이러스 기원의 폴리사카라이드-분해 효소와 같은 셀룰라아제 또는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제, 키모트립신, 프로테이나아제 K, Degradation of Polylactide by Commercial Proteases, Oda Yet al., Journal of Polymers and the Environment, Volume 8, Number 1, January 2000, pp. 29-32(4)에 기재된 프로테아제, 알칼라제 2.4 FG (노보자임), 및 플라보우르짐 100 L (노보자임)과 같은 프로테아제와 같은 효소를 사용하여 성취된다. 프로테아제 및 폴리사카라이드-분해 효소의 임의의 조합은 또한 이전의 프로테아제 및 폴리사카라이드-분해 효소의 임의의 조합을 포함하여 이용될 수 있다.
용해는 익스펠러 프레스(expeller press)를 이용하여 수행될 수 있다. 이 공정에서, 바이오매스는 고압에서 스크류형 장치를 통해 강제 주입하고 세포를 용해시키고 세포내 지질이 방출되고 세포내 단백질 및 섬유 (및 기타 성분)로부터 분리되도록 한다. PCT 특허 출원 번호 제US10/031108호를 참조하며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 편입된다.
몇몇 경우에서, 미생물을 용해시키는 단계는 초음파, 즉, 음파 처리(sonication)를 사용하여 수행된다. 따라서, 세포는 또한 고주파 음파로 용해될 수 있다. 음파는 전기적으로 생성될 수 있고 금속 팁을 통해 적당히 농축된 세포 현탁액으로 운반될 수 있다. 이 음파 처리 (또는 초음파 처리(ultrasonication))는 세포 현탁액 중 공극의 형성을 기준으로 세포 통합성을 붕괴시킨다.
몇몇 경우에, 미생물을 용해시키는 단계는 기계적 용해에 의해 수행된다. 세포는 기계적으로 용해되고 임의로 균질화되어 탄화수소 (예를 들어, 지질) 수집을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 압력 분쇄기가 사용되어 세포 함유 슬러리를 제한된 오리피스(orifice) 밸브를 통과하도록 펌핑시킬 수 있다. 고압 (최대 1500 바(bar) 까지)이 적용되고, 그 다음 출구 노출을 통해 즉시 확장된다. 세포 분쇄는 세 개의 상이한 기작에 의해 성취한다: 밸브상에 충돌, 오리피스내 액체 고전단, 및 방출시 급작스런 압력 강하로 세포 분해의 유도. 상기 방법은 세포내 분자를 방출시킨다. 대안으로, 볼 밀(ball mill)을 사용할 수 있다. 볼 밀에서, 세포는 비드와 같은 작은 연마 입자와 함께 현탁 상태로 진탕된다. 전단력 때문에 세포는 분해되고 비드 사이에서 분쇄되며 비드와 충돌한다. 상기 비드는 세포를 파쇄하여 세포 내용물을 방출시킨다. 세포는 예를 들어, 블렌딩의 사용과 함께 (예를 들어, 고속 또는 와링 블렌더(Waring blender)), 프레치 프레스(french press) 또는 심지어 약한 세포 벽의 경우에 세포 파쇄를 위한 원심분리의 사용과 같은 전단력에 의해 파쇄될 수 있다.
몇몇 경우에, 미생물을 용해시키는 단계는 삼투압 쇼크를 적용함으로써 수행된다.
몇몇 경우에, 미생물을 용해시키는 단계는 용해성 바이러스로 미생물을 감염시킴을 포함한다. 광범위한 바이러스는 본 발명에 사용하기에 적합한 미생물을 용해시키는 것으로 공지되어 있고 특정 미생물에 대한 특정 용해성 바이러스의 선택 및 용도는 당업계의 기술 범위 내에 있다. 예를 들어, 파라메시움 부르사리아 클로렐라 바이러스 (Paramecium bursaria chlorella virus) (PBCV-l)는 특정 단일, 세포 진핵 클로렐라-유사 녹색 조류내에서 복제하고 이를 용해시키는 대형의 20면체(icosahedral), 플라크-형성, 이중-가닥의 DNA 바이러스 그룹의 원형이다 (필코드나비리대(Phycodnaviridae) 패밀리, 클로로바이러스(Chlorovirus) 속). 따라서, 임의의 민감성 미세조류는 적합한 클로렐라(Chlorella) 바이러스로 배양물을 감염시킴에 의해 용해될 수 있다. 클로렐라(Chlorella) 바이러스로 클로렐라(Chlorella) 종을 감염시키는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, Adv. Virus Res. 2006;66:293-336; Virology, 1999 Apr 25;257(1):15-23; Virology, 2004 Jan 5;318(1):214-23; Nucleic Acids Symp. Ser. 2000;(44):161-2; J. Virol. 2006 Mar;80(5):2437-44; 및 Annu. Rev. Microbiol. 1999;53:447-94를 참조한다.
몇몇 경우에, 미생물을 용해시키는 단계는 자가용해를 포함한다. 이 구체예에서, 본 발명에 따른 미생물은 미생물을 용해시키는 용해성 단백질을 생성하도록 유전자 조작된다. 이 용해성 유전자는 유도성 프로모터를 사용하여 발현시켜 세포가 처음에 발효기내에서 목적하는 밀도로 성장한 후, 프로모터를 유도하여 용해성 유전자를 발현시키므로써 세포를 용해시킬 수 있다. 한 가지 구체예에서, 용해성 유전자는 폴리사카라이드-분해 효소를 암호화한다. 특정 다른 구체예에서, 용해성 유전자는 용해성 바이러스 기원의 유전자이다. 따라서, 예를 들어, 클로렐라(Chlorella) 바이러스 기원의 용해성 유전자는 조류 세포에서 발현시킬 수 있고 Virology 260, 308-315 (1999); FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45-53; Virology 263, 376-387 (1999); 및 Virology 230, 361-368 (1997)을 참조한다. 용해성 유전자의 발현은 바람직하게 유도성 프로모터, 예를 들어, 소분자, 광, 열과 같은 자극 및 다른 자극의 존재 하에 유도되는 미세조류에서 활성인 프로모터를 사용하여 수행된다.
상기 방법에 의해 생성된 세포 용해물로부터 지질을 분리하기 위한 다양한 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 지방 알데하이드, 지방 알코올 및 탄화수소 (예를 들어, 알칸)와 같은 지질 및 지질 유도체는 헥산과 같은 소수성 용매로 추출될 수 있다 (Frenz et al. 1989, Enzyme Microb. Technol., 11:717을 참조). 지질 및 지질 유도체는 또한 액화 (예를 들어, Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17:33-39 및 Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6(4):269-274를 참조); 오일 액화 (예를 들어, Minowa et al. 1995, Fuel 74(12):1735-1738을 참조); 및 초임계 CO2 추출 (예를 들어, Mendes et al. 2003, Inorganica Chimica Acta 356:328-334를 참조)을 사용하여 추출될 수 있다. 미아오(Miao) 및 우(Wu)는 클로렐라 프로토테오코이데스(Chlorella prototheocoides)의 배양으로부터 미세조류 지질 회수의 프로토콜을 기재하고 있고 여기서, 세포는 원심분리에 의해 수거되고 증류수로 세척되며 동결 건조에 의해 건조된다. 수득한 세포 분말은 모르타르에서 분쇄되고 이어서 n-헥산으로 추출된다. Miao and Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846.
따라서, 본 발명의 미생물에 의해 생성된 지질, 지질 유도체 및 탄화수소는 유기 용매로 추출하여 회수될 수 있다. 몇몇 경우에, 바람직한 유기 용매는 헥산이다. 전형적으로, 유기 용매는 용해 성분의 사전 분리 없이 용해물에 직접 첨가한다. 한 가지 구체예에서, 상기 설명된 하나 이상의 방법에 의해 생성된 용해물은 지질 및/또는 탄화수소 성분이 유기 용매와 용액을 형성하도록하기에 충분한 시간 동안 유기 용매와 접촉된다. 몇몇 경우에, 용액은 이어서 추가로 정련되어 특정 목적하는 지질 또는 탄화수소 성분이 회수된다. 헥산 추출 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 명세서에서 설명된 바와 같은 세포에 의해 생성된 지방 알데하이드, 지방 알코올 및 탄화수소 가령 알칸과 같은 지질 및 지질 유도체는 상기 설명된 바와 같이, 리파아제를 포함하는 하나 이상의 효소를 사용함으로써 변형될 수 있다. 탄화수소가 세포의 세포외 환경에 존재하는 경우, 하나 이상의 효소는, 효소가 탄화수소를 변형시키거나 탄화수소 전구체로부터 이의 합성을 완성하도록 하는 조건 하에서 상기 환경에 첨가될 수 있다. 대안으로, 탄화수소는 효소와 같은 하나 이상의 촉매의 첨가 전에 세포 물질로부터 부분적으로, 또는 완전하게 단리될 수 있다. 이러한 촉매는 외인성으로 첨가되고 이들의 활성은 세포 외부에서 또는 시험관내에서 발생한다.
따라서, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 생체내 세포에 의해 생성되거나 시험관내에서 효소적으로 변형된 지질 및 탄화수소는 임의로 통상적인 수단에 의해 추가로 가공될 수 있다. 가공은 탄화수소의 크기를 감소시키고, 따라서 이의 수소:탄소 비율을 증가시키기 위한 "크랙킹(cracking)"을 포함할 수 있다. 촉매 및 열 크랙킹 방법은 통상적으로 탄화수소 및 트리글리세라이드 오일 가공에 사용된다. 촉매 방법은 고체 산 촉매와 같은 촉매의 사용을 포함한다. 예를 들어, 촉매는 실리카-알루미나 또는 제올라이트일 수 있고 이로써 탄소-탄소 결합을 이종용해 또는 비대칭 분해시켜 카보양이온(carbocation) 및 수소화물 음이온을 수득할 수 있다. 이들 반응성 중간체를 이어서 또 다른 탄화수소와 함께 재배열하거나 수소화 전달을 진행시킨다. 이들 반응은 따라서 중간체를 재생성시켜 자가-증폭 쇄 기작을 유도할 수 있다. 또한 탄화수소는 여기서의 탄소-탄소 이중, 또는 삼중 결합의 수가 임의로 제로까지 감소하도록 가공될 수 있다. 또한 탄화수소는 가공되어 여기서의 환 또는 사이클릭 구조를 제거할 수 있다. 탄화수소는 또한 가공되어 수소:탄소 비율을 증가시킬 수 있다. 이것은 수소의 첨가 ("수소화") 및/또는 탄화수소의 보다 작은 탄화수소로의 "크랙킹"을 포함할 수 있다.
열 방법은 탄화수소 크기를 감소시키기 위한 상승된 온도 및 압력의 용도를 포함한다. 약 800℃의 상승된 온도 및 약 700kPa의 압력이 사용될 수 있다. 이들 조건은 때때로 수소-풍부 탄화수소 분자 (양성자 플럭스와는 구분되는 바와 같이)를 언급하는데 사용되는 용어, "가벼운" 탄화수소 분자를 생성하고, 또한 응축에 의해, 상대적으로 수소가 고갈된 보다 무거운 탄화수소 분자를 생성한다. 방법은 등방성 또는 대칭적 절단을 제공하고 상기 설명된 바와 같이 임의로 효소적으로 포화될 수 있는 알켄을 생성한다.
촉매 및 열 방법은 탄화수소 가공 및 오일 정련을 위한 식물에서의 표준 방법이다. 따라서, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 세포에 의해 생성된 탄화수소가 수거될 수 있고 통상적인 수단에 의해 가공되거나 정련될 수 있다. 미세조류 생산 탄화수소의 수소크랙킹에 대한 보고에 대해 Hillen et al. (Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIV: 193-205 (1982))을 참조한다. 대안적인 구체예에서, 상기 분획물은 또 다른 촉매, 가령 유기 화합물, 열, 및/또는 무기 화합물로 처리된다. 지질의 바이오디젤로의 가공을 위해, 트랜스에스테르화 공정이 본 명세서의 섹션 V에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법을 통해 생성되는 탄화수소는 다양한 산업 응용 분야에서 유용하다. 예를 들어, 거의 모든 유형의 세제 및 세정제에서 사용되는 음이온 계면활성제인 직쇄 알킬벤젠 설포네이트 (LAS)의 생산은 일반적으로 10 내지 14개의 탄소 원자 쇄를 포함하는 탄화수소를 이용한다. 예를 들어, 미국 특허 번호: 제6,946,430호; 제5,506,201호; 제6,692,730호; 제6,268,517호; 제6,020,509호; 제6,140,302호; 제5,080,848호; 및 제5,567,359호를 참조한다. LAS와 같은 계면활성제는 퍼스널 케어 조성물 및 세제, 가령, 미국 특허 번호 제5,942,479호; 제6,086,903호; 제5,833,999호; 제6,468,955호; 및 제6,407,044호에 기재된 것들의 제조에 사용될 수 있다.
관심이 고조되고 있는 것은 화석 연료로부터 유래된 출발 물질을 대체할 수 있는 재생가능한 생물학적 출발 물질이 가용하고 이의 사용이 바람직할 수 있기 때문에, 바이오디젤, 재생가능한 디젤 및 제트 연료와 같은 연료에서의 생물학적 기원의 탄화수소 성분의 용도에 대한 것이다. 생물학적 물질로부터 탄화수소 성분을 생산하기 위한 방법이 시급히 요구되고 있다. 본 발명은 바이오디젤, 재생가능한 디젤 및 제트 연료를 생산하기 위해 본 명세서에서 설명된 방법에 의해 생산된, 생물학적 재료로서의 지질을 사용하여, 바이오디젤, 재생가능한 디젤 및 제트 연료의 생산 방법을 제공하므로써 상기 필요성을 충족시킨다.
통상적인 디젤 연료는 파라핀 탄화수소가 풍부한 석유 증류물이다. 이들은 370° 내지 78O°F 정도로 넓은 비등 범위를 갖고 이는 디젤 엔진 승용차와 같은 압착 점화 엔진에서 연소용으로서 적합하다. The American Society of Testing and Materials (ASTM)는 세탄수, 혼탁점, 플래쉬 포인트, 점도, 아닐린 포인트, 황 함량, 물 함량, 재 함량, 구리 스트립 부식 및 탄소 잔기와 같은 허용 가능한 범위의 다른 연료 성질과 함께 비등 범위에 따라 디젤 등급을 확립한다. 기술적으로, 적당한 ASTM 세부항목을 충족하는 바이오매스 또는 기타로부터 유래된 임의의 탄화수소 증류 재료는 디젤 연료 (ASTM D975), 제트 연료 (ASTM D1655), 또는 이것이 지방산 메틸 에스테르인 경우 바이오디젤 (ASTM D6751)로서 정의될 수 있다.
추출 후, 본 명세서에서 설명된 미생물 바이오매스로부터 회수된 지질 및/또는 탄화수소 성분은 디젤 승용차 및 제트 엔진에 사용하기 위한 연료를 제조하기 위해 화학적 처리에 적용될 수 있다.
바이오디젤은 -금색에서 암갈색으로- 생산 공급원료에 따라 색상이 다양한 액체이다. 이것은 실제로 수불혼화성이고 고융점 및 저증기압을 갖는다. 바이오디젤은 디젤-엔진 승용차에 사용하기 위한 디젤-등가의 가공된 연료를 언급한다. 바이오디젤은 생분해성이고 비-독성이다. 통상적인 디젤 연료에 비해 바이오디젤의 추가의 이득은 보다 낮은 엔진 마모이다. 전형적으로, 바이오디젤은 C14-C18 알킬 에스테르를 포함한다. 다양한 가공은 본 명세서에서 설명된 바와 같이 생성되고 단리된 바이오매스 또는 지질을 디젤 연료로 전환시킨다. 바이오디젤을 생산하기 위한 바람직한 방법은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 지질의 트랜스에스테르화에 의한 것이다. 바이오디젤로서 사용하기 위한 바람직한 알킬 에스테르는 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르이다.
본 명세서에서 설명된 방법에 의해 생성된 바이오디젤은 대부분의 모던 디젤-엔진 승용차에서 임의의 농도로 단독으로 사용하거나 통상적인 디젤 연료와 블렌딩하여 사용될 수 있다. 통상적인 디젤 연료 (석유 디젤)와 블렌딩되는 경우, 바이오디젤은 약 0.1% 내지 약 99.9%로 존재할 수 있다. 많은 국가에서는 임의의 연료 혼합물에서 바이오디젤의 양을 지칭하기 위해 "B" 인자로서 공지된 시스템을 사용한다. 예를 들어, 20% 바이오디젤을 함유하는 연료는 B20으로 표시된다. 순수한 바이오디젤은 BlOO으로 언급된다.
바이오디젤은 또한 가정용 및 상업용 보일러에서 가열 연료로서 사용될 수 있다. 기존의 오일 보일러는 고무 구성품을 함유할 수 있고 바이오디젤상에서의 운행을 위해서는 전환을 필요로 할 수 있다. 전환 과정은 일반적으로 비교적 단순하고 바이오디젤이 강한 용매임으로 고무 구성품의 합성 구성품으로의 교환을 포함한다. 이의 강한 용해력 때문에, 바이오디젤의 연소는 보일러의 효율을 증가시킨다. 바이오디젤은 순수한 울트라-로우 황 디젤(ULSD) 연료의 윤활성을 증가시키기 위해 디젤 제형에 첨가제로서 사용될 수 있고, 이는 이것이 실제로 황을 내포하지 않기 때문에 유리하다. 바이오디젤은 석유디젤 보다 양호한 용매이고 이전에 석유디젤 상에서 운행된 자동차 연료 라인내 잔류 침적물을 분해시키는데 사용될 수 있다.
바이오디젤은 오일-풍부 바이오매스에 함유된 트리글리세라이드의 트랜스에스테르화에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 바이오디젤을 생산하기 위한 방법이 제공된다. 바람직한 구체예에서, 바이오디젤을 생산하는 방법은 (a) 본 명세서에서 설명된 방법을 사용하여 지질-함유 미생물을 배양하는 단계, (b) 지질-함유 미생물을 용해시켜 용해물을 생성시키는 단계, (c) 용해된 미생물로부터 지질을 단리하는 단계, 및 (d) 지질 조성물을 트랜스에스테르화하여 바이오디젤을 생성시키는 단계를 포함한다. 미생물의 성장 방법, 미생물을 용해시켜 용해물을 생성하는 방법, 유기 용매를 포함하는 배지에서 용해물을 처리하여 이종성 혼합물을 형성시키는 방법 및 처리된 용해물을 지질 조성물로 분리하는 방법이 설명되었고 또한 바이오디젤을 생산하는 방법에 사용될 수 있다.
바이오디젤의 지질 프로파일은 일반적으로 공급원료 오일의 지질 프로파일과 매우 유사하다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공된 다른 오일은 트랜스에스테르화시켜 바이오디젤을 생산할 수 있고 이때 지질 프로파일은 (a) 적어도 4%의 C8-C14; (b) 적어도 0.3%의 C8; (c) 적어도 2%의 ClO; (d) 적어도 2% 의 C12; 및 (3) 적어도 30%의 C8-C14를 포함한다.
지질 조성물은 트랜스에스테르화시켜 바이오디젤로서 유용한 장-쇄의 지방산 에스테르를 생산할 수 있다. 바람직한 트랜스에스테르화 반응은 하기에 명시되고 염기 촉매된 트렌스에스테르화 및 재조합 리파아제를 사용하는 트랜스에스테르화를 포함한다. 염기-촉매된 트랜스에스테르화 공정에서, 트리아실글리세라이드는 알칼린 촉매인, 전형적으로 수산화칼륨의 존재 하에 메탄올 또는 에탄올과 같은 알코올과 반응된다. 이 반응은 부산물로서 메틸 또는 에틸 에스테르 및 글리세린 (글리세롤)을 형성한다.
동물 및 식물 오일은 전형적으로 트리하이드릭 알코올인 글리세롤과 유리된 지방산의 에스테르인 트리글리세라이드로 구성된다. 트랜스에스테르화에서, 트리글리세라이드 (TAG)내 글리세롤은 메탄올 또는 에탄올과 같은 단-쇄 알코올로 대체된다. 전형적인 반응 계획은 다음과 같다:
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이 반응에서, 알코올은 염기로 탈양성자화되어 보다 강한 친핵성이 된다. 통상적으로, 에탄올 또는 메탄올은 매우 과량 (최대 50배까지)으로 사용된다. 정상적으로, 이 반응은 상당히 느리게 진행하거나 전혀 진행하지 않을 것이다. 산 또는 염기뿐만 아니라, 열을 사용하여 반응의 보다 신속한 진행을 도와줄 수 있다. 산 또는 염기는 트랜스에스테르화 반응에 의해 소모되지 않고, 따라서 이들은 반응물이 아니고 촉매이다. 거의 모든 바이오디젤은 이것이 단지 저온 및 저압을 요구하고 98% 초과의 전환 수율을 나타내므로 (단, 출발 오일은 수분 및 유리된 지방산이 낮아야 한다) 염기-촉매된 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
트랜스에스테르화는 상기 논의된 바돠 같이 염기 대신 리파아제와 같은 효소를 사용하여 또한 수행되었다. 리파아제-촉매된 트랜스에스테르화는 예를 들어, 실온 내지 80℃의 온도 및 1:1 초과, 바람직하게는 약 3:1인 TAG 대 저급 알코올의 몰비에서 수행될 수 있다. 트랜스에스테르화에 사용하기에 적합한 리파아제는 표 7에 기재된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 트랜스에스테르화를 위해 유용한 리파아제의 다른 예는 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,798,793호; 제4,940,845호; 제5,156,963호; 제5,342,768호; 제5,776,741호 및 WO89/01032에서 찾을 수 있다. 이러한 리파아제는 리조푸스 (Rhizopus), 아스퍼질러스(Aspergillus), 칸디다(Candida), 뮤코(Mucor), 슈도모나스(Pseudomonas), 리조뮤코(Rhizomucor), 칸디다, 및 휴미콜라(Humicola)에 의해 생성된 리파아제 및 췌장 리파아제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 트랜스에스테르화에서 이용에 적합한 리파아제는 미국 특허 출원 공개공보 20100151112의 표 7에서 설명된다.
바이오디젤로 적합한 지방산 에스테르의 제조를 위해 리파아제를 사용하는 문제는 리파아제 가격이 강염기 공정에 의해 사용되는 수산화나트륨 (NaOH)의 가격보다 훨씬 고가라는 것이다. 이 문제점은 재활용될 수 있는, 고정화된 리파아제를 사용하므로써 해결되었다. 그러나, 고정화된 리파아제의 활성도는 리파아제-기본 공정이 생산 단가의 측면에서 강염기 공정과 경쟁을 위해서는 최소의 사이클 동안 재활용된 후 유지되어야만 한다. 고정화된 리파아제는 트랜스에스테르화에 전형적으로 사용되는 저급 알코올에 의해 독성이 된다. 미국 특허 번호 제6,398,707호 (Wu et al.에게 2002년 6월 4일자로 허여됨)는 고정화된 리파아제의 활성도를 증진시키는 방법 및 감소된 활성도를 갖는 고정화된 리파아제를 재생시키는 방법을 설명하고 있다. 몇몇 적합한 방법은 일정 기간의 시간, 바람직하게는 0.5 내지 48시간 및 보다 바람직하게는 0.5 내지 1.5시간 동안 3개 이상의 탄소 원자수를 갖는 알코올에 고정화된 리파아제를 침지시키는 단계를 포함한다. 몇몇 적합한 방법은 또한 3개 이상의 탄소 원자수를 갖는 알코올과 불활성화된 고정화된 리파아제를 세척함에 이어서 식물성 오일에 0.5 내지 48시간 동안 불활성화된 고정화된 리파아제를 침지시키는 단계를 포함한다.
특정한 구체예에서, 재조합 리파아제는 리파아제가 작용하는 지질을 생산하는 동일한 미생물에서 발현된다. 적합한 재조합 리파아제는 상기 열거되고 및/또는 미국 특허 출원 공개공보 20100151112의 표 7에 열거된 GenBank 수탁번호를 갖는 것들, 또는 표 7에 열거된 리파아제 중 하나와 적어도 70% 이상 아미노산 동일성을 갖고 리파아제 활성도를 나타내는 폴리펩타이드를 포함한다. 추가의 구체예에서, 효소 활성도는 상기 설명된 서열 중 하나와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열내 존재하고 상기 서열 모두는 완전히 제시된 바와 같이 본 명세서에 참조로서 편입된다. 리파아제 및 선택가능한 마커를 암호화하는 DNA는 바람직하게 코돈-최적화된 cDNA이다. 미세조류에서 발현하기 위해 유전자를 재암호화하는 방법은 본 명세서 및 미국 특허 제7,135,290호에서 설명된다.
바이오디젤에 대한 통상의 국제 표준은 EN 14214이다. ASTM D6751은 미국 및 캐나다에서 참조되는 가장 공통된 바이오디젤 표준이다. 독일은 DIN EN 14214를 사용하고 UK는 BS EN 14214를 준수할 것으로 요구한다. 산물이 이들 표준에 부합하는지의 여부를 결정하기 위한 기본 산업적 시험은 전형적으로 가스 크로마토그래피, HPLC 등을 포함한다. 품질 표준을 충족하는 바이오디젤은 매우 비-독성이고 독성 등급 (LD50)은 50 mL/kg을 초과한다.
ASTM 표준을 충족하는 바이오디젤이 비-독성이어야만 하지만 결정화하고 및/또는 침전하고 용액으로부터 침강하는 경향이 있는 오염물이 있을 수 있다. 침강물 형성은 특히 바이오디젤이 보다 저온에서 사용되는 경우 문제이다. 침강 또는 침전은 연료 흐름을 감소시키고, 연료 라인을 막히게 하고 여과기를 막히게 하는 것 등과 같은 문제를 유발할 수 있다. 고품질의 산물을 만들기 위해 바이오디젤에서 이들 오염물 및 침강물을 제거하는 것과 관련된 공정들은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 공정의 예는 인지질 및 유리 지방산과 같은 오염물을 제거하기 위한 오일의 전처리 (예를 들어, 정련, 부식성 정련 및 실리카 흡착 여과) 및 냉각 여과를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 냉각 여과는 생성 후 바이오디젤에 존재하는 임의의 미립자 및 침강물을 제거하기 위해 특별히 개발된 공정이다. 이러한 공정은 바이오디젤을 냉각시키고 연료가 보다 저온에서 사용되는 경우 형성될 수 있는 임의의 침강물 또는 침전물을 여과 제거한다. 이러한 공정은 당업계에 널리 공지되어 있고 미국 특허 출원 공개 번호 제2007-0175091호에서 설명된다. 적합한 방법은 바이오디젤을 약 38℃ 미만의 온도로 냉각시켜 불순물 및 오염물이 바이오디젤 액체내 미립자로서 침전하도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 이어서 규조토 또는 다른 여과 재료가 냉각된 바이오디젤에 첨가되여 슬러리를 형성시킬 수 있고 이는 이어서 압력 리프(pressure leaf) 또는 다른 유형의 여과기를 통해 여과되어 미립자를 제거할 수 있다. 이어서 여과된 바이오디젤은 가연성 여과기에 통과되어 임의의 잔류 침강물 및 규조토를 제거하여, 최종 바이오디젤 산물을 생성할 수 있다.
미국 특허 출원 공개공보 20100151112의 실시예 14는 프로토테카 모리포르미스로(Prototheca moriformis)부터 트리글리세라이드를 사용하는 바이오디젤의 생산법을 설명한다. 실시예 14에서 생산된 바이오디젤의 ASTM D6751 Al 방법에 의한 냉각 담금 여과능(Cold Soak Filterability)은 300ml의 용적에 대해 120초였다. 이 시험은 16시간 동안 40°Ｆ로 냉각되고 실온으로 가온되도록 허용되고, 그리고 스테인레스 강철 지지체를 가진 0.7마이크론 유리 섬유 필터를 사용하여 진공 여과하는, 300ml의 B100의 여과를 포함한다. 본 발명의 오일은 120초 미만, 100초 미만, 및 90초 미만의 냉각 담금 시간과 함께 트랜스에스테르화되어 바이오디젤을 생성할 수 있다.
후속 공정은 또한 바이오디젤이 특히 냉온에서 사용되는 경우 이용될 수 있다. 이러한 공정은 동결방지처리(winterization) 및 분획화를 포함한다. 둘 모두의 공정은 혼탁점 (바이오디젤이 결정화하기 시작하는 온도)을 저하시킴으로써 연료의 냉각 흐름 및 동결방지 수행능을 개선시키도록 디자인된다. 바이오디젤의 동결방지처리에는 다수의 방법이 있다. 한 가지 방법은 바이오디젤을 석유 디젤과 블렌딩하는 것이다. 또 다른 방법은 바이오디젤의 혼탁점을 저하시킬 수 있는 첨가제를 사용하는 것이다. 또 다른 방법은 첨가제에서 혼합하고 포화물이 결정화하도록 허용하고 이어서 결정을 여과 제거함으로써 무분별하게 포화된 메틸 에스테르를 제거하는 것이다. 분획화는 선택적으로 메틸 에스테르를 개별 성분 또는 분획으로 분리하여 특정 메틸 에스테르가 제거 또는 포함되도록 할 수 있다. 분획화 방법은 우레아 분획화, 용매 분획화 및 열 증류를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 제공되는 또 다른 가치있는 연료는 C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 및 C18:0과 같은 알칸을 포함하여 바이오디젤과는 구분될 수 있는 재생가능한 디젤이다. 고품질의 재생가능한 디젤은 ASTM D975 표준에 부합한다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질은 공급원료로서 작용하여 재생가능한 디젤을 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 또 다른 측면에서, 재생가능한 디젤을 생산하는 방법이 제공된다. 재생가능한 디젤은 적어도 세 가지 공정에 의해 생산될 수 있다: 열수 가공 (수소 처리); 수소화처리; 및 간접적인 액화. 이들 공정으로 비-에스테르 증류물을 수득한다. 이들 공정 동안에, 본 명세서에서 설명된 바와 같이 생산되고 단리된 트리아실글리세라이드는 알칸으로 전환된다.
한 가지 구체예에서, 재생가능한 디젤을 생산하는 방법은 (a) 본 명세서에서 개시된 방법을 사용하여 지질-함유 미생물을 배양하고 (b) 미생물을 용해시켜 용해물을 생성하고, (c) 용해된 미생물로부터 지질을 단리하고 (d) 지질을 탈산화하고 수소화처리하여 알칸을 생성하므로써, 재생가능한 디젤이 생산되도록 하는 단계를 포함한다. 재생가능한 디젤을 제조하기에 적합한 지질은 헥산과 같은 유기 용매를 사용하거나, 미국 특허 제5,928,696호에서 설명된 것들과 같은 다른 방법을 통한 미생물 바이오매스로부터 추출을 통해 수득될 수 있다. 몇몇 적합한 방법은 기계적 프레싱 및 원심분리를 포함할 수 있다. PCT 특허 출원 US10/031108을 참조하고, 이는 본 명세서에 참조로서 편입된다.
몇몇 방법에서, 미생물 지질은 먼저 수소화처리와 연계하여 크랙킹되어 각각, 탄소쇄 길이를 감소시키고 이중 결합을 포화시킨다. 이후 물질을 또한 수소화처리와 연계하여, 이성체화한다. 이어서 나프타 분획을 증류를 통해 제거될 수 있고, 그 다음 추가 증류하여 디젤 연료에 요구되는 성분을 증발시키고 증류시키므로써 ASTM D975 표준에 충족하도록 하고 D975 표준을 충족시키기 위해 요구되는 것 보다 무거운 성분을 잔류시킨다. 트리글리세라이드 오일을 포함하는 화학적으로 변형된 오일의 수소 처리, 수소 크랙킹, 탈산소화 및 이성체화 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허 출원 제 EP1741768호 (A1); 제 EP1741767호 (A1); 제 EP1682466 호 (A1); 제EP1640437호 (A1); 제EP1681337호 (A1); 제EP1795576호 (A1); 및 미국 특허 제7,238,277호; 제6,630,066호; 제6,596,155호; 제6,977,322호; 제7,041,866호; 제6,217,746호; 제5,885,440호; 제6,881,873호를 참조한다.
재생가능한 디젤을 생산하기 위한 방법의 한 가지 구체예에서, 알칸을 생성하기 위한 지질을 처리하는 단계는 지질 조성물의 수소 처리에 의해 수행된다. 열수 가공에서, 전형적으로 바이오매스는 상승된 온도 및 압력의 물에서 반응되어 오일 및 잔류 고체를 형성시킨다. 전환 온도는 전형적으로 300° 내지 660°F 이고, 이때 압력은 주로 액체로서 물을 유지하게 충분한 100 내지 170 표준 대기압 (atm)이다. 반응 시간은 15 내지 30분 정도이다. 반응을 종결한 후 유기물은 물로부터 분리된다. 이로써 디젤에 적합한 증류물이 생성된다.
재생가능한 디젤을 만드는 몇 가지 구체예에서, 트리글리세라이드를 처리하는 첫 번째 단계는 이중 결합을 포화시키기 위한 수소 가공에 이어서 수소 및 촉매의 존재 하에 상승된 온도에서 탈산소화시키는 것이다. 몇몇 방법에서, 수소화 및 탈산소화는 동일한 반응에서 발생한다. 다른 방법에서, 탈산소화는 수소화 전에 발생한다. 이어서 이성체화는 임의로 또한 수소 및 촉매의 존재 하에서 수행된다. 나프타 성분은 바람직하게 증류를 통해 제거된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,475,160호 (트리글리세라이드의 수소화); 제5,091,116호 (탈산소화, 수소화 및 가스 제거); 제6,391,815호 (수소화); 및 제5,888,947호 (이성체화)를 참조한다.
트리글리세라이드의 수소화를 위한 한 가지 적합한 방법은 구리, 아연, 마그네슘 및 란탄염의 수용액 및 알칼리 금속 또는 바람직하게는, 탄산암모늄의 또 다른 용액을 제조하는 단계를 포함한다. 두 가지 용액은 약 20℃ 내지 약 85℃의 온도로 가열되고 침전 용기내 pH가 5.5 내지 7.5로 유지되어 촉매를 형성하도록 하는 비율로 침전 용기내로 함께 계량되어 부가될 수 있다. 추가의 물은 초기에 침전 용기 내에서 사용될 수 있거나 또는 염 용액 및 침전 용액과 동시에 첨가될 수 있다. 이어서 수득한 침전물을 약 300℃에서 세척되고 건조되고 하소되고 그리고 약 100℃ 내지 약 400℃의 온도 범위의 수소에서 활성화 될 수 있다. 이어서 하나 이상의 트리글리세라이드는 반응기내 상기-설명된 촉매의 존재에서 수소와 접촉되고 반응될 수 있다. 반응기는 트리클 상 반응기, 고정 상 가스-고체 반응기, 팩킹된 기포 칼럼 반응기, 연속 교반 탱크 반응기, 슬러리 상 반응기 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 반응기 유형일 수 있다. 공정은 배치식으로 또는 연속식으로 수행될 수 있다. 반응 온도는 전형적으로 약 170℃ 내지 약 250℃의 범위이고 반응 압력은 전형적으로 약 300 psig 내지 약 2000 psig 범위이다. 더욱이, 본 발명의 공정에서 수소 대 트리글리세라이드의 몰 비는 전형적으로 약 20:1 내지 약 700:1 범위이다. 공정은 전형적으로 중량 시간 공간 속도 (WHSV)에서 수행되고 이의 범위는 약 0.1hr-1 내지 약 5hr-1이다. 당업자는 반응을 위해 요구되는 시간은 사용되는 온도, 수소 대 트리글리세라이드의 몰비 및 수소 분압에 따라 다양함할 것이라는 점을 인지할 것이다. 이러한 수소화 공정에 의해 생성되는 산물은 지방 알코올, 글리세롤, 미량의 파라핀 및 미반응 트리글리세라이드를 포함한다. 이들 산물은 전형적으로 예를 들어, 증류, 추출, 여과, 결정화 등과 같은 통상적인 수단에 의해 분리된다.
석유 정련업자는 수소화처리을 사용하여 공급물을 수소로 처리함으로써 불순물을 제거한다. 수소화처리 전환 온도는 전형적으로 300° 내지 700°F이다. 압력은 전형적으로 40 내지 100atm이다. 반응 시간은 전형적으로 10 내지 60분 정도이다. 고체 촉매를 사용하여 특정 반응 속도를 증가시키고 특정 산물에 대한 선택성을 개선시키고, 그리고 수소 소모를 최적화한다.
오일의 탈산소화에 적합한 방법은 오일을 약 350°F 내지 약 55O°F 범위의 온도로 가열하고 연속적으로 가열된 오일을 적어도 약 5분 동안 적어도 약 대기압 이상의 압력 하에서 질소와 접촉시키는 단계를 포함한다.
이성체화에 적합한 방법은 알칼리 이성체화 및 당업계에 공지된 다른 오일 이성체화를 사용하는 단계를 포함한다.
수소 처리 및 수소 가공은 궁극적으로 트리글리세라이드 공급물의 중량 감소를 유도한다. 트리글리세라이드 분자는 수소 가공 조건 하에 네 개의 탄화수소 분자, 즉 프로판 분자 및 전형적으로 C8 내지 C18 범위의 세 개의 보다 무거운 탄화수소 분자로 감소된다.
따라서, 한 가지 구체예에서, 본 발명의 지질 조성물 상에서 수행되는 하나 이상의 화학 반응(들)의 산물은 ASTM D975 재생가능한 디젤을 포함하는 알칸 혼합물이다. 미생물에 의한 탄화수소의 생성은 Metzger et al. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66: 486-496 및 A Look Back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species Program: Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann and Paul Roessler (1998)에 의해 검토된다.
디젤 연료의 증류 성질은 T10-T90 (각각, 10% 및 90%의 용적이 증류되는 온도)의 관점에서 설명된다. 재생가능한 디젤은 미국 특허 출원 공개공보 20100151112의 실시예 14에서 설명된 바와 같은 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis) 트리글리세라이드 오일로부터 생성될 수 있다. 실시예 14에 생성된 물질의 T10-T90은 57.9℃였다. 본 명세서에 개시된 오일의 수소 처리, 이성체화, 및 다른 공유 변형 방법, 및 증류 및 본 명세서에 개시된 분획화 (예를 들어, 냉각 여과)의 방법이 이용되어, 본 명세서에 개시된 방법에 따라 생성된 트리글리세라이드를 사용하여 재생가능한 디젤 조성물을 생성할 수 있고 이때 다른 T10-T90 범위는 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 및 65℃이다.
미국 특허 출원 공개공보 20100151112의 실시예 14에서 생성된 물질의 T10은 242.1℃였다. 본 명세서에 개시된 오일의 수소 처리, 이성체화, 및 다른 공유 변형 방법 및 본 명세서에서 개시된 증류 및 분획화 (냉각 여과와 같은) 방법이 이용되어 재생가능한 디젤 조성물을 생성할 수 있고 이때 다른 T10 값은 예를 들어, 180 내지 295, 190 내지 270, 210 내지 250, 225 내지 245, 및 적어도 290 의 T10이다.
미국 특허 출원 공개공보 20100151112의 실시예 14에서 생성된 물질의 T90은 300℃였다. 본 명세서에 개시된 오일의 수소 처리, 이성체화, 및 다른 공유 변형 방법 및 본 명세서에 개시된 증류 및 분획화 (냉각 여과와 같은) 방법이 이용되어 재생가능한 디젤 조성물을 생성할 수 있고 이때 다른 T90 값은 예를 들어, 280 내지 380, 290 내지 360, 300 내지 350, 310 내지 340, 및 적어도 290의 T90이다.
미국 특허 출원 공개공보 20100151112의 실시예 14에서 생성된 물질의 FBP는 300℃였다. 본 명세서에 개시된 오일의 수소 처리, 이성체화, 및 다른 공유 변형 방법 및 본 명세서에 개시된 증류 및 분획화 (냉각 여과와 같은) 방법이 이용되어 재생가능한 디젤 조성물을 생성할 수 있고 이때 다른 FBP 값은 예를 들어, 290 내지 400, 300 내지 385, 310 내지 370, 315 내지 360, 및 적어도 300의 FBP이다.
본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공된 기타 오일은 수소화처리, 이성체화, 및 다른 공유 변형의 조합에 적용될 수 있고 (a) 적어도 4%의 C8-C14; (b) 적어도 0.3%의 C8; (c) 적어도 2%의 ClO; (d) 적어도 2%의 C12; 및 (3) 적어도 30%의 C8-C14를 포함하는 지질 프로파일을 갖는 오일을 포함한다.
통상적인 초-저 황 디젤은 2-단계 공정에 의해 임의의 형태의 바이오매스로부터 생성될 수 있다. 먼저, 바이오매스는 수소 및 일산화탄소가 풍부한 가스 혼합물인, 합성가스로 전환된다. 이어서, 합성가스는 촉매적으로 액체로 전환된다. 전형적으로, 액체의 생성은 피셔-트로프쉬(Fischer-Tropsch)(FT) 합성을 사용하여 성취된다. 이 기술은 석탄, 천연 가스, 및 중유에 적용한다. 따라서, 재생가능한 디젤을 생산하기 위한 방법의 여전히 또 다른 바람직한 구체예에서, 알칸을 생성하기 위한 액체 조성물을 처리하는 단계는 액체 조성물의 간접적인 액화에 의해 수행된다.
본 발명은 또한 제트 연료를 생산하는 방법을 제공한다. 제트 연료는 스트로 색상으로 투명하다. 가장 일반적인 연료는 국제 표준 세트의 세부 항목으로 제조되는 항공기 A-l로서 분류되는 무연/석유 오일-계 연료이다. 제트 연료는 다수의 상이한, 가능하게는 수천개 이상의 많은 상이한 탄화수소의 혼합물이다. 이들 크기의 범위 (분자량 또는 탄소수)는 산물에 대한 요건, 예를 들어, 동결점 또는 발연점에 의해 제한된다. 케로손형(Kerosone-type) 항공기 연료 (제트 A 및 제트 A-l을 포함함)는 약 8 내지 16개 탄소수의 탄소수 분포를 갖는다. 와이드-컷(wide-cut) 또는 나프타형(naphta-type) 항공기 연료 (제트 B를 포함함)는 전형적으로 약 5 내지 15개 탄소의 탄소수 분포를 갖는다.
둘 모두의 항공기 (제트 A 및 제트 B)는 다수의 첨가제를 함유할 수 있다. 유용한 첨가제는 항산화제, 대전방지제, 부식 억제제, 및 연료 시스템 아이싱 억제제 (FSII)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 항산화제는 검화(gumming)를 방지하고 일반적으로, 알킬화된 페놀, 예를 들어, AO-30, AO-31, 또는 AO-37을 기초로 한다. 대전방지제는 정전기를 소멸시켜 스파킹을 차단한다. 활성 성분으로서 디노닐나프틸설폰산 (DINNSA)을 갖는 Stadis 450이 하나의 예이다. 부식 억제제, 예를 들어, DCI-4A는 대중 및 군사 연료용으로 사용될 수 있고 DCI-6A는 군사 연료용으로 사용된다. FSII 제제는 예를 들어, Di-EGME를 포함한다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 제트 연료는 기존의 제트 연료와 조류 연료를 블렌딩함으로써 생산된다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질은 공급원료로서 작용하여 제트 연료를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 제트 연료를 생산하는 방법이 제공된다. 이와 함께 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질로부터 제트 연료를 생산하는 두 가지 방법으로서 유동 촉매 크랙킹(FCC); 및 수소탈산소화(HDO)가 제공된다.
유동 촉매 크랙킹(FCC)은 중질 분획물 기원의 올레핀, 특히 프로파일렌을 생산하기 위해 사용되는 하나의 방법이다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 지질은 올레핀으로 전환될 수 있다. 상기 방법은 FCC 영역을 통해 생산된 지질을 유동시키고 제트 연료로서 유용한 올레핀으로 구성된 산물 스트림을 수거하는 단계를 포함한다. 생산된 지질은 크랙킹 조건에서 크랙킹 촉매와 접촉되어 제트 연료로서 유용한 올레핀 및 탄화수소를 포함하는 산물 스트림을 제공한다.
한 가지 구체예에서, 제트 연료를 생산하는 방법은 (a) 프로토테카(Prototheca) 세포 및 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 자일로오스-함유 배지에서 지질-함유 미생물을 배양하고, (b) 지질-함유 미생물을 용해시켜 용해물을 생성하고, (c) 용해물로부터 지질을 단리하고, 그리고 (d) 지질 조성물을 처리함으로써 제트 연료가 생산되는 단계를 포함한다. 제트 연료를 생산하는 방법의 한 가지 구체예에서, 지질 조성물은 유체 촉매 크랙킹 영역을 통류할 수 있고 이는 한 가지 구체예에서, 지질 조성물을 크랙킹 조건에서 크랙킹 촉매와 접촉시켜 C2-C5 올레핀을 포함하는 산물을 제공하는 단계를 포함할 수 있다.
이 방법의 특정한 구체예에서, 지질 조성물에 존재할 수 있는 임의의 오염물을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 유체 촉매 크랙킹 영역을 통해 지질 조성물을 유동시키기 전에, 지질 조성물은 전처리된다. 전처리는 지질 조성물을 이온-교환 수지와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이온 교환 수지는 산성 이온 교환 수지, 예를 들어 Amberlyst™-15이고 지질 조성물이 통류, 상향 통류 또는 하향 통류하는 반응기내 상으로서 사용될 수 있다. 다른 전처리는 액체 조성물을 산, 예를 들어, 황산, 아세트산, 질산 또는 염산과 접촉시킴으로써 약산 세척을 포함할 수 있다. 접촉은 일반적으로 주위 온도 및 대기압에서 희석 산 용액으로 수행된다.
임의로 전처리된 지질 조성물은 탄화수소 성분이 올레핀으로 크랙킹되는 FCC 영역으로 유동한다. 촉매 크랙킹은 반응 영역내 지질 조성물을 미분된 미립자 물질로 구성된 촉매와 접촉시킴으로써 성취된다. 반응은 수소크랙킹과는 반대로 촉매 크랙킹이고 부가되는 수소의 부재 또는 수소의 소모에서 수행된다. 크랙킹 반응이 진행하므로써 상당한 양의 코크가 촉매 상에 침적된다. 촉매는 재생 영역에서 촉매 기원의 코크를 연소시킴으로써 고온에서 재생된다. 본 명세서에서, "코크 촉매"로서 언급되는 코크-함유 촉매는 반응 영역으로부터 재생될 재생 영역으로 연속으로 운반되고 재생 영역 기원의 필수적 코크-부재의 재생된 촉매에 의해 대체된다. 다양한 가스 스트림에 의한 촉매 입자의 유동화는 반응 영역과 재생 영역간에 촉매의 운반을 허용한다. 촉매의 유동화 스트림에서 본 명세서에서 설명된 지질 조성물의 탄화수소와 같은 탄화수소를 크랙킹하고, 반응 영역 및 재생 영역간에 촉매를 운반하고, 재생기내 코크를 연소시키는 방법은 FCC 방법 기술 분야의 당업자에게 널리 공지된다. C2-C5 올레핀을 생산하기 위해 지질 조성물을 크랙킹하는 데에 유용한 예시적인 FCC 적용 및 촉매는 미국 특허 번호 제6,538,169호 및 제7,288,685호에서 설명되고, 상기 문헌은 이의 전문이 본 명세서에 참조로서 편입된다.
적합한 FCC 촉매는 일반적으로 동일한 매트릭스에 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 적어도 두 가지 성분을 포함한다. 몇 가지 구체예에서, 둘 모두의 성분은 전체 반응 용기를 거쳐 순환될 수 있다. 제1 성분은 일반적으로 유동화된 촉매 크랙킹의 분야에 사용되는 임의의 널리 공지된 촉매를 포함하고, 예를 들어, 활성 무정형 점토형 촉매 및/또는 고활성의 결정 분자체가 있다. 분자체 촉매는 목적하는 산물에 대한 이의 매우 개선된 선택성때문에 무정형 촉매 보다 바람직할 수 있다. 몇 가지 바람직한 구체예에서, 제올라이트는 FCC 공정에서 분자체로서 사용될 수 있다. 바람직하게, 제1 촉매 성분은 실리카 또는 알루미나 및 카올린과 같은 불활성 충전제를 포함하는, 대형 공극 제올라이트, 예를 들어, Y형 제올라이트, 활성 알루미나 물질, 결합제 물질을 포함한다.
한 가지 구체예에서, 본 발명의 지질 조성물의 크랙킹은 FCC 영역의 상위 섹션 또는 리프트 섹션에서 발생한다. 지질 조성물은 노즐에 의해 상부로 도입되어 지질 조성물의 신속한 증발을 유도한다. 촉매와 접촉시키기 전에, 지질 조성물은 통상적으로 약 149℃ 내지 약 316℃ (300°F 내지 600°F)의 온도를 갖는다. 촉매는 블렌딩 용기로부터 상부로 유동하며 여기서 이것은 약 2초 이하의 시간 동안 지질 조성물과 접촉한다.
블렌딩된 촉매 및 반응된 지질 조성물 증기는 이어서 출구를 통해 상부로부터 배출되고 올레핀, 및 상당한 양의 코크로 덮어지고 일반적으로 "코크된 촉매"로 언급되는 촉매 입자의 수집물을 포함하는 크랙킹된 산물 증기로 분리된다. 목적하는 산물이 바람직하지 못한 다른 산물로 추가로 전환되는 것을 촉진시킬 수 있는, 지질 조성물과 촉매의 접촉 시간을 최소화하기 위한 일환으로, 스월 암 배열 장치(swirl arm arrangement)와 같은 임의의 배열된 분리기가 사용되어 산물 스트림으로부터 신속하게 코크된 촉매를 제거할 수 있다. 분리기, 예를 들어, 스월 암 분리기는 챔버의 하한부에 위치한 스트립핑 영역(stripping zone)과 함께 챔버의 상한부에 위치한다. 스월 암 배열 장치에 의해 분리된 촉매는 스트립핑 영역으로 적가된다. 가벼운 올레핀 및 몇몇 촉매를 포함하는 크랙킹된 탄화수소를 포함하는 크랙킹된 산물 증기는 사이클론과 소통하는 도관을 통해 챔버로부터 배출된다. 사이클론은 산물 증기로부터 잔류 촉매 입자를 제거하여 입자 농도를 매우 낮은 수준으로 감소시킨다. 이어서 산물 증기는 분리 용기의 상부로부터 배출된다. 사이클론에 의해 분리된 촉매는 분리 용기에 그리고 이후 스트립팅 영역으로 복귀된다. 스트립핑 영역은 증기와의 역류 접촉에 의해 촉매 표면으로터 흡착된 탄화수소를 제거한다.
낮은 탄화수소 분압은 가벼운 올레핀이 우선적으로 생성되도록 작용한다. 따라서, 상부압은 약 172 내지 241 kPa (25 내지 35 psia)로 설정되고 탄화수소 분압은 약 35 내지 172 kPa (5 내지 25 psia)이고, 바람직한 탄화수소 분압은 약 69 내지 138 kPa (10 내지 20 psia)이다. 탄화수소에 대한 상대적 낮은 분압은 희석제가 지질 조성물의 10 내지 55 중량% 및 바람직하게는 지질 조성물의 약 15 중량% 정도인 희석제로서 증기를 사용함으로써 성취된다. 다른 희석제, 예를 들어, 건조 가스를 사용하여 등가의 탄화수소 분압에 도달할 수 있도록 할 수 있다.
상부 출구에서 크랙킹된 증기의 온도는 약 510℃ 내지 621℃ (950°F 내지 1150°F)이다. 그러나, 566℃ (1050°F) 초과의 상부 출구 온도는 보다 건조의 가스 및 보다 많은 올레핀을 생성시킨다. 반면에, 566℃ (1050°F) 미만의 상부 출구 온도는 에틸렌 및 프로파일렌을 적게 생성시킨다. 따라서, 약 566℃ 내지 약 63O℃의 바람직한 온도에서, 약 138 kPa 내지 약 240 kPa (20 내지 35 psia)의 바람직한 압력에서 FCC 공정을 수행하는 것이 바람직하다. 공정의 또 다른 조건은 약 5 내지 약 20 및 바람직하게는 약 10 내지 약 15로 다양할 수 있는 지질 조성물에 대한 촉매 비율이다.
제트 연료를 생산하는 방법의 한 가지 구체예에서, 상기 지질 조성물은 FCC 반응기의 리프트 섹션으로 도입된다. 리프트 섹션에서 온도는 매우 고온이고 약 700℃ (1292°F) 내지 약 760℃ (1400°F)의 범위이고 지질 조성물에 대한 촉매의 비율은 약 100 내지 약 150이다. 이것은 지질 조성물의 리프트 섹션으로의 도입이 상당한 양의 프로파일렌 및 에틸렌을 생성시킬 것으로 예상된다.
본 명세서에서 설명된 바와 같이 생산된 지질 조성물 또는 지질을 사용하여 제트 연료를 생산시키는 방법의 또 다른 구체예에서, 지질 조성물 또는 지질의 구조는 수소탈산소화 (HDO)로서 언급되는 공정에 의해 파괴된다. HDO는 수소에 의한 산소의 제거를 의미하는데, 즉 산소는 물질의 구조를 파괴시키면서 제거된다. 올레핀 이중 결합을 수소화시키고 임의의 황 및 질소 화합물을 제거한다. 황 제거는 소위 수소탈황화 (HDS)로 불리운다. 원료 (지질 조성물 또는 지질)의 전처리 및 순도는 촉매의 작용 수명에 기여한다.
일반적으로 HDO/HDS 단계에서, 수소는 공급 스톡 (지질 조성물 또는 지질)과 혼합되고 이어서 상기 혼합물은 단일상 또는 두 개의 상 공급 스톡으로서 동시-유류물로서 촉매를 통해 통과된다. HDO/MDS 단계 후, 산물 분획은 분리되고 별도의 이성체화 반응기에 통과된다. 생물학적 출발 물질용 이성체화 반응기는 동시-유류 반응기로서 문헌 (FI 100 248)에서 설명된다.
탄화수소 공급물, 예를 들어, 본 명세서에서의 지질 조성물 또는 지질을 수소화시킴에 의한 연료의 생산 공정은 또한 지질 조성물 또는 지질을 동시-유류물로서 제1 수소화 영역을 통해 수소 가스와 함께 통과시킴으로써 수행될 수 있고 이후 탄화수소 유출물은, 수소 가스를 탄화수소 유출물과는 반대로 역류 유동물로서 제2 수소화 영역에 통과시킴으로써 제2 수소화 영역에서 추가로 수소화된다. 지질 조성물을 크랙킹하여 C2-C5 올레핀을 제조하는 데에 유용한 예시적인 HDO 적용 및 촉매는 전문이 본 명세서에 참조로서 편입되는 미국 특허 번호 제7,232,935호에서 설명된다.
전형적으로, 수소탈산소화 단계에서, 본 명세서에서의 지질 조성물 또는 지질과 같은 생물학적 성분의 구조는 산소, 질소, 인 및 황 화합물로 분해되고, 가스로서의 가벼운 탄화수소가 제거되며, 그리고 올레핀 결합은 수소화된다. 상기 공정의 두 번째 단계에서, 즉 소위 이성체화와 단계에서, 이성체화는 낮은 온도에서 탄화수소 쇄를 측쇄화하고 파라핀의 수행능을 개선시킴으로써 수행된다.
첫 번째 단계, 즉 크랙킹 공정의 HDO 단계에서, 수소 가스, 및 수소화되어야만 하는 본 명세서의 지질 조성물 또는 지질은 HDO 촉매 상 시스템에 동시 유류물로서 또는 역류물로서 통과되고 상기 촉매 상 시스템은 하나 이상의 촉매 상(들), 바람직하게는 1 내지 3개의 촉매 상을 포함한다. HDO 단계는 전형적으로 동시 유류 방식으로 작동된다. 두 개 이상의 촉매 상을 포함하는 HDO 촉매 상 시스템의 경우에, 상기 상 중 하나 이상은 역류물 원칙을 사용하여 작동될 수 있다. HDO 단계에서, 압력은 20 내지 150 바, 바람직하게는 50 내지 100 바로 다양하고 온도는 200 내지 500℃, 바람직하게는 300 내지 400℃로 다양하다. HDO 단계에서, 원소주기율표의 VII 족 및/또는 VIB족 금속을 함유하는 공지된 수소화 촉매가 사용될 수 있다. 바람직하게, 수소화 촉매는 지지된 Pd, Pt, Ni, NiMo 또는 CoMo 촉매이고, 지지체는 알루미나 및/또는 실리카이다. 전형적으로, NiMo/Al2O3 및 CoMo/Al2O3 촉매가 사용된다.
HDO 단계 전에, 본 명세서에서 지질 조성물 또는 지질은 임의로 보다 온화한 조건 하에 예비수소화로 처리되어 이중 결합의 부반응을 회피할 수 있다. 이러한 예비수소화는 50 내지 400℃의 온도 및 1 내지 200 바의 수소 압력, 바람직하게는 150 내지 250℃의 온도 및 10 내지 100 바의 수소 압력에서 수행된다. 촉매는 원소주기율표의 VIII족 및/또는 VIB족 기원의 금속을 함유할 수 있다. 바람직하게, 예비소화 촉매는 지지된 Pd, Pt, Ni, NiMo 또는 CoMo 촉매이고, 지지체는 알루미나 및/또는 실리카이다.
수소를 함유하는 HDO 단계 기원의 가스 기류를 냉각시킴에 이어서 일산화탄소, 이산화탄소, 질소, 인 및 황 화합물, 가벼운 가스 탄화수소 및 다른 불순물은 이로부터 제거된다. 압착시킨 후, 정제된 수소 또는 재활용된 수소는 제1 촉매 상으로 및/또는 촉매 상 사이로 복귀되어 인출된 기류를 구성하도록 한다. 물은 응축 액체로부터 제거된다. 상기 액체는 제1 촉매 상 또는 촉매 상 사이로 통과시킨다.
HDO 단계 후, 산물은 이성체화 단계에 적용된다. 이것은 탄화수소를 이성체화 촉매와 접촉시키기 전에 불순물을 가능한 완전히 제거되는 공정을 위해 필요하다. 이성체화 단계는 임의의 교반 단계를 포함하고, 이때 HDO 단계 기원의 반응 산물은 수증기 또는 가벼운 탄화수소, 질소 또는 수소와 같은 적합한 가스 증기를 스트립핑시킴으로써 정제될 수 있다. 임의의 스트립핑 단계는 이성체화 촉매의 상부 유닛에서 역류 방식, 여기서 가스 및 액체는 서로 접촉함,으로 수행되거나 역류 원칙을 사용하는 별도의 스트립핑 유닛에서 실제 이성체화 반응기 전에 수행한다.
스트립핑 단계 후, 수소 가스 및 본 명세서에서의 수소화된 지질 조성물 또는 지질, 및 n-파라핀 혼합물은 하나 이상의 촉매 상(들)을 포함하는 반응성 이성체화 유닛에 통과된다. 이성체화 단계의 촉매 상은 동시 유류 또는 역류 방식으로 작동할 수 있다.
역류 원리가 이성체화 단계에 적용되는 것이 상기 공정을 위해 중요하다. 이성화체 단계에서, 이것은 임의의 스트립핑 단계 또는 이성체화 반응 단계 중 하나 또는 둘 모두를 역류 방식으로 진행함으로써 수행한다. 이성체화 단계에서, 압력은 20 내지 150 바, 바람직하게는 20 내지 100 바로 다양하고, 온도는 200 내지 500℃, 바람직하게는 300 내지 400℃이다. 이성체화 단계에서, 당업계에 공지된 이성체화 촉매가 사용될 수 있다. 적합한 이성체화 촉매는 분자체 및/또는 VII족 금속 및/또는 담체를 함유한다. 바람직하게, 이성체화 촉매는 SAPO-11 또는 SAPO41 또는 ZSM-22 또는 ZSM-23 또는 페리어라이트(ferrierite) 및 Pt, Pd 또는 Ni 및 Al2O3 또는 SiO2를 함유한다. 전형적인 이성체화 촉매는 예를 들어, Pt/S APO-11/Al2O3, Pt/ZSM-22/Al2O3, Pt/ZSM-23/Al2O3 및 Pt/SAPO-11/SiO2이다. 이성체화 단계 및 HDO 단계는 동일한 압력 용기 또는 별도의 압력 용기에서 수행될 수 있다. 임의의 예비수소화는 별도의 압력 용기 또는 HDO 및 이성체화 단계와 동일한 압력 용기에서 수행될 수 있다.
따라서, 한 가지 구체예에서, 하나 이상의 화학적 반응 산물은 ASTM D1655 제트 연료를 포함하는 알칸 혼합물이다. 몇 가지 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부 항목을 준수하는 조성물은 10 ppm 미만의 황 함량을 갖는다. 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 205℃ 미만의 증기 곡선의 T10 값을 갖는다. 또 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 300℃ 미만의 최종 비점 (FBP)을 갖는다. 또 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 적어도 38℃의 인화점을 갖는다. 또 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 염료의 세부항목을 준수하는 조성물은 775K/M3 내지 840K/M3의 밀도를 갖는다. 또 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 -47℃ 아래의 동결점을 갖는다. 또 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 적어도 42.8 MJ/K의 총 연소열(Heat of Combustion)을 갖는다. 또 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 적어도 13.4 질량%의 수소 함량을 갖는다. 또 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 3mm 아래의 Hg인, 260℃에서의 정량적 중량 JFTOT에 의해 시험된 바와 같이, 열 안정성을 갖는다. 또 다른 구체예에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 7mg/dl 아래인 실제 검을 갖는다.
따라서, 본 발명은 미세조류 지질의 화학적 변형으로 다양한 산업적 및 다른 적용 분야에 유용한 산물을 수득하는 다양한 방법을 개시한다. 본 명세서에서 설명된 방법에 의해 생성된 오일을 변형시키는 방법의 예는 오일 가수분해, 오일의 수소화처리 및 오일의 에스테르화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 미세조류 오일의 변형은 기본 함유화학물질을 생산하고 이는 목적하는 기능을 위해 선택된 유도체 함유화학물질로 추가 변형될 수 있다. 연료 생산 공정과 관련하여 상기 설명된 것과 유사한 방식으로, 이들 화학적 변형은 또한 본 명세서에서 설명된 미생물 배양으로부터 생성된 오일 상에서 수행될 수 있다. 기본 함유화학물질의 예는 비누, 지방산, 지방산 메틸 에스테르 및 글리세롤을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 유도체 함유화학물질의 예는 지방 니트릴, 에스테르, 이량체 산, 쿠아트(quat), 계면활성제, 지방 알칸올아미드, 지방 알코올 설페이트, 수지, 유화제, 지방 알코올, 올레핀 및 고급 알칸을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 글리세로지질 기원의 지방산 성분의 가수분해는 다른 유용한 화학물질을 생산하도록 유도체화될 수 있는 유리된 지방산을 생성시킨다. 가수분해는 산 또는 염기일 수 있는 물 및 촉매의 존재 하에 수행한다. 유리된 지방산은 유도체화되어 하기에 보고된 바와 같은 다양한 산물을 수득할 수 있다: 미국 특허 번호 제5,304,664호 (고도로 황화된 지방산); 제7,262,158호 (세정 조성물); 제7,115,173호 (직물 연화 조성물); 제6,342,208호 (피부 처리용 에멀젼); 제7,264,886호 (방수 조성물); 제6,924,333호 (페인트 첨가제); 제6,596,768호 (지질 풍부 반추동물 공급원료); 및 제6,380,410호 (세제 및 세정제용 계면활성제).
본 발명의 한 가지 구체예에서 가수분해와 관련하여 트리글리세라이드 오일은 임의로 먼저 물 또는 수산화나트륨과 같은 액체 매질에서 가수분해되어 글리세롤 및 비누를 수득한다. 다양한 적합한 트리글리세라이드 가수분해 방법이 있고, 여기에는 비누화, 산 가수분해, 알칼린 가수분해, 효소 가수분해 (본 명세서에서 스프릿팅으로서 언급됨), 및 고온 압착수를 사용한 가수분해가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 트리글리세라이드 오일이 함유화학물질을 생성하기 위해 가수분해될 필요가 없고; 차라리, 오일이 다른 공지된 공정에 의해 목적하는 함유화학물질로 직접 전환될 수 있다는 점일 인지할 것이다. 예를 들어, 트리글리세라이드 오일은 에스테르화를 통해 메틸 에스테르 지방산으로 직접 전환될 수 있다.
몇 가지 구체예에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생성된 오일의 촉매 가수분해는 오일을 글리세롤 및 지방산으로 분리시킴으로써 발생한다. 상기 논의된 바와 같이, 지방산은 이어서 여러 다른 변형을 통해 수득된 유도체 함유화학물질로 추가로 가공될 수 있다. 예를 들어, 한 가지 구체예에서, 지방산은 아민화 반응하도록 진행시켜 지방 질소 화합물을 생산할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 지방산은 일염기성 및 이염기성 산을 생성하도록 오존용해에 적용될 수 있다.
다른 구체예에서, 가수분해는 본 명세서에서 생성된 오일의 분리를 통해 발생하여 함유화학물질을 생성할 수 있다. 본 발명의 몇몇 바람직한 구체예에서, 트리글리세라이드 오일은 다른 공정을 수행하기 전에 분리될 수 있다. 당업자는 많은 적합한 트리글리세라이드 분리 방법이 존재함을 인지할 것이고, 상기 방법은 효소 분리 및 압력 분리를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 효소적 오일 분리 방법은 물/오일 혼합물에 대해 작용하는 생촉매로서, 효소인 리파아제를 사용한다. 효소적 분리는 이어서 오일 또는 지방을 각각, 글리세롤 및 유리된 지방산으로 분리한다. 글리세롤은 물상으로 이동하는 반면, 유기상에는 유리된 지방산이 풍부해진다.
효소 분리 반응은 일반적으로 유기상 및 수성상 간의 경계상에서 일어나고 여기서 효소는 단지 경계상에 존재한다. 이어서 경계상과 만나는 트리글리세라이드는 분리 반응에 기여하거나 이에 관여한다. 반응이 진행됨에 따라, 유리된 지방산과는 대조적으로, 글리세라이드로 여전히 화학적으로 결합되어 있는 지방산의 작업 밀도 또는 농도는 경계상에서 감소하여 반응은 느려진다. 특정한 구체예에서, 효소 분리는 실온에서 일어날 수 있다. 당업자는 오일을 목적하는 지방산으로 분리시키는데 적합한 조건에 정통하고 있다.
예를 들어, 반응 속도는 상호 경계 표면을 증가시킴으로써 가속화될 수 있다. 일단 반응이 완료되면, 유리된 지방산은 이어서 효소로부터 유리된 유기상으로부터 분리되고 글리세라이드로 여전히 화학적으로 결합되어 있는 지방산을 함유하는 잔사는 역 공급되거나 재활용되고 새로운 오일 또는 지방과 혼합되어 분리방법에 적용된다. 이 방식으로, 이후 재활용된 글리세라이드는 추가의 효소적 분리 공정에 적용된다. 몇 가지 구체예에서, 유리된 지방산은 이러한 방식으로 부분적으로 분리된 오일 또는 지방으로부터 추출된다. 상기 방식으로, 화학적으로 결합된 지방산 (트리글리세라이드)이 분리 공정으로 복귀되거나 역 공급되는 경우, 효소 소모는 급격히 감소될 수 있다.
분리 정도는 측정된 산 값을, 소정의 오일 또는 지방에 대해 계산될 수 있는 이론적으로 가능한 산 값으로 나눈 비율로서 결정된다. 바람직하게, 산 값은 표준 일반 방법에 따른 적정을 사용하여 측정된다. 대안으로, 수성 글리세롤 상의 밀도는 분리 정도에 대한 척도로서 취할 수 있다.
한 가지 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 분리 공정은 또한 생성된 오일의 알칼리 정련 공정 기원의 소위 비누-스톡에 함유된 모노-, 디- 및 트리글리세라이드에 적합하다. 이 방식으로, 비누-스톡은 중성 오일의 사전 비누화 없이 지방산으로 정량적으로 전환될 수 있다. 이 목적을 위해, 비누에 화학적으로 결합된 지방산은 바람직하게는 분리 전에 산의 부가를 통해 방출된다. 특정한 구체예에서, 완충액은 분리 공정을 위한 물 및 효소에 추가로 사용된다.
한 가지 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 생성된 오일은 또한 가수분해 방법으로서 비누화에 적용될 수 있다. 동물성 및 식물성 오일은 트리하이드릭 알코올인 글리세롤과 지방산의 에스테르인 트리아실글리세롤 (TAG)로 이루어진다. 알칼린 가수분해 반응에서, TAG내 글리세롤이 제거되어 세 개의 카르복실산 음이온이 이탈되고 이는 나트륨 또는 칼륨과 같은 알칼리 금속 양이온과 연합하여 지방산 염을 생성할 수 있다. 이 기획에서, 카르복실산 성분들은 글리세롤 모이어티로부터 절단되고 하이드록실 기로 대체된다. 상기 반응에 사용되는 염기 (예를 들어, KOH)의 양은 목적하는 비누화 정도에 의해 측정된다. 예를 들어, 상기 목적이 본래 TAG 조성물에 존재하는 오일의 일부를 포함하는 산물을 제조하기 위한 것인 경우, 모든 TAG를 지방산 염으로 전환시키기에 불충한 양의 염기가 반응 혼합물로 도입된다. 통상적으로, 이 반응은 수용액에서 수행되어 서서히 진행되지만, 가열에 의해 촉진될 수 있다. 지방산 염의 침전은 수용성 알칼리 금속 할라이드 (예를 들어, NaCl 또는 KCl)와 같은 염을 반응 혼합물에 부가하여 촉진될 수 있다. 바람직하게, 염기는 알칼리 금속 수산화물, 가령 NaOH 또는 KOH이다. 대안으로, 예를 들어, 트리에탄올아민 및 아미노메틸프로판올을 포함하는 알칸올아민과 같은 다른 염기는 상기 반응 기획에서 사용될 수 있다. 몇몇 경우에, 이들 대안이 투명한 비누 산물을 제조하는데 바람직할 수 있다.
몇몇 방법에서, 화학적 변형의 첫 번째 단계는 수소 및 촉매의 존재 하에 상승된 온도에서 이중 결합을 포화시키기 위한 수소화처리에 이어서 탈산소화하는 것이다. 다른 방법에서, 수소화 및 탈산소화는 동일한 반응에서 일어날 수 있다. 여전히 다른 방법에서, 탈산소화는 수소화 전에 발생한다. 이어서 이성체화는 또한 수소 및 촉매의 존재 하에서 임의로 수행될 수 있다. 최종적으로, 가스 및 나프타 성분은 경우에 따라 제거될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,475,160호 (트리글리세라이드의 수소화); 제5,091,116호 (탈산소화, 수소화 및 가스 제거); 제6,391,815호 (수소화); 및 제5,888,947호 (이성체화)를 참조한다.
본 발명의 몇 가지 구체예에서, 트리글리세라이드 오일은 부분적으로 또는 완전히 탈산소화된다. 탈산소화 반응은 지방산, 지방 알코올, 폴리올, 케톤, 및 알데하이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 목적하는 산물을 형성한다. 일반적으로, 임의의 특정 이온에 제한되지 않고, 탈산소화 반응은, 지방산 또는 지방산 에스테르로부터 산소를 적어도 부분적으로 제거하여 추가의 공정에 의해 목적하는 화학물질로 용이하게 전환될 수 있는 지방 알코올과 같은 반응 산물을 생성시키는 반응으로서, 제한 없이 수소용해, 수소생성, 연속 수소화-수소용해, 연속 수소용해-수소화, 및 조합된 수소화-수소용해 반응을 포함하는 다양하고 상이한 반응 경로의 조합을 포함한다. 예를 들어, 한 가지 구체예에서, 지방 알코올은 FCC 반응을 통해 올레핀으로 또는 응축 반응을 통해 고급 알칸으로 전환될 수 있다.
하나의 이러한 화학적 변형은 글리세로지질 또는 유리 지방산의 지방산 성분에서 이중 결합으로 수소를 첨가하는 수소화이다. 수소화 공정으로 액체 오일은 특정 응용에 보다 적합할 수 있는 반-고체 또는 고체 지질로 전환될 수 있다.
본 명세서에서 설명된 방법에 의해 생성된 오일의 수소화는 하기에 보고된 바와 같이 본 명세서에서 제공된 방법 및/또는 재료 중 하나 이상과 연계하여 수행될 수 있다: 미국 특허 번호 제7,288,278호 (식품 첨가제 또는 의약); 제5,346,724호 (윤활 산물); 제5,475,160호 (지방 알코올); 제5,091,116호 (식용 오일); 제6,808,737호 (마가린 및 스프레드용 구조적 지방); 제5,298,637호 (감소된-칼로리 지방 대용물); 제6,391,815호 (수소화 촉매 및 황 흡착제); 제5,233,099호 및 제5,233,100호 (지방 알코올); 제4,584,139호 (수소화 촉매); 제6,057,375호 (소포제); 및 제7,118,773호 (식용 에멀젼 스프레드).
당업자는 오일을 수소화시키기 위해 다양한 공정이 이용될 수 있음을 인지할 것이다. 하나의 적합한 방법은 수소화 반응기에서 수소화된 산물을 형성하기 위해 충분한 조건 하에서 적합한 가스 및 촉매와 혼합된 수소, 또는 수소와 오일을 접촉시키는 단계를 포함한다. 수소화 촉매는 일반적으로 단독으로, 또는 W, Mo, Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, B, P, Bi, 및 이의 합금 또는 임의의 조합과 같은 촉진제와 함께 Cu, Re, Ni, Fe, Co, Ru, Pd, Rh, Pt, Os, Ir, 및 이의 합금 또는 임의의 조합을 포함할 수 있다. 다른 효과적인 수소화 촉매 물질은 지지된 니켈 또는 레늄으로 변형된 루테늄을 포함한다. 한 가지 구체예에서, 수소화 촉매는 또한 촉매의 목적하는 기능성에 따라, 지지체 중 임의의 하나를 포함한다. 수소화 촉매는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
몇 가지 구체예에서, 수소화 촉매는 지지된 VIII족 금속 촉매 및 금속 스폰지 물질 (예를 들어, 스폰지 니켈 촉매)을 포함한다. 라니 니켈은 본 발명에 사용하기에 적합한 활성화된 스폰지 니켈 촉매의 예를 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 수소화 반응은 니켈-레늄 촉매 또는 텅스텐-변형된 니켈 촉매를 포함하는 촉매를 사용하여 수행된다. 본 발명의 수소화 반응을 위해 적합한 촉매의 예는 탄소-지지된 니켈-레늄 촉매이다.
한 가지 구체예에서, 적합한 라니 니켈 촉매는 예를 들어, 약 25 중량%의 수산화나트륨을 함유하는 알칼리 수용액으로 대략 균등 중량의 니켈 및 알루미늄의 합금을 처리함으로써 제조될 수 있다. 알루미늄은 선택적으로 알칼리 수용액에 의해 용해되어 알루미늄이 최소량인 대부분 니켈을 포함하는 스폰지형 물질을 수득한다. 초기 합금은 약 1 내지 2 중량%가 형성된 스폰지 니켈 촉매에서 잔류하도록 하는 양으로 촉진제 금속 (즉, 몰리브덴 또는 크로뮴)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 수소화 촉매는 물에서 루테늄 (III) 니트로실니트레이트, 루테늄 (III) 클로라이드의 용액을 사용하여 적합한 지지체 물질을 침지시키기 위해 제조된다. 이어서 용액은 건조되고 수분 함량이 중량으로 약 1% 미만인 고체를 형성한다. 고체는 이어서 4시간 동안 회전볼 로내 300℃ (하소되지 않음) 또는 400℃ (하소됨)에서 수소 스트림내 대기압으로 감소될 수 있다. 촉매를 냉각시키고 질소로 촉매가 불활성이도록 한 후, 질소내 용적으로 5%의 산소는 2시간 동안 촉매 상에 통과된다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에 설명된 촉매는 촉매 지지체를 포함한다. 촉매 지지체는 촉매을 안정화시키고 지지한다. 사용되는 촉매 지지체의 유형은 선택된 촉매 및 반응 조건에 따라 다양하다. 본 발명에 적합한 지지체는 탄소, 실리카, 실리카-알루미나, 지르코니아, 티타니아, 세리아, 바나디아, 질화물, 질화붕소, 헤테로폴리산, 하이드록시애퍼타이트, 산화아연, 크로미아, 제올라이트, 탄소 나노튜브, 탄소 플러렌 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용되는 촉매는 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 방법은 초기 습윤화, 증발 침지, 화학적 증착, 세척-피복, 마그네트론 스퍼터링 기술 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
수소화 반응을 수행하기 위한 조건은 출발 물질 및 목적하는 산물의 유형에 따라 다양할 것이다. 본 개시의 이득과 함께 당업자는 적당한 반응 조건을 인지할 것이다. 일반적으로, 수소화 반응은 80℃ 내지 250℃, 및 바람직하게는 90℃ 내지 200℃, 그리고 가장 바람직하게는 100℃ 내지 150℃의 온도에서 수행된다. 몇 가지 구체예에서, 수소화 반응은 500 KPa 내지 14000 KPa의 압력에서 수행된다.
본 발명의 수소용해 반응에 사용되는 수소는 외부 소수, 재활용된 수소, 동일계 생성 수소, 및 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "외부 수소"는 바이오매스 반응 자체 기원이 아니고, 또 다른 공급원으로부터 시스템에 첨가되는 수소를 나타낸다.
본 발명의 몇 가지 구체예에서, 출발 트리글리세라이드 또는 지방산을, 목적하는 고급 탄화수소로 보다 용이하게 전환될 소분자로 전환시키는 것이 바람직할 수 있다. 이 전환을 위해 적합한 하나의 방법은 수소용해 반응을 통한 것이다. 다양한 방법이 오일의 수소용해를 수행하기 위해 공지된다. 하나의 적합한 방법은 소분자 또는 폴리올을 포함하는 반응 산물을 형성하기에 충분한 조건 하에서 수소용해 반응기내 적합한 가스 및 수소용해 촉매와 혼합된 수소, 또는 수소와 오일을 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "소분자 또는 폴리올"은 출발 오일보다 소수의 탄소 원자 또는 산소 원자를 포함할 수 있는, 소분자량을 갖는 임의의 분자를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 반응 산물은 폴리올 및 알코올을 포함하는 보다 작은 분자를 포함한다. 당업자는 수소용해 반응을 수행하기 위한 적당한 방법을 용이하게 선택할 수 있다.
몇 가지 구체예에서, 5 및/또는 6 탄당 또는 당 알코올은 수소용해 촉매를 사용하여 프로파일렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 및 글리세롤로 전환될 수 있다. 수소용해 촉매는 단독으로 또는 Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, Bi, B, O, 및 이의 합금 또는 임의의 조합과 같은 촉진제와 함께 Cr, Mo, W, Re, Mn, Cu, Cd, Fe, Co, Ni, Pt, Pd, Rh, Ru, Ir, Os, 및 이의 합금 또는 임의의 조합을 포함할 수 있다. 수소용해 촉매는 또한 전이 금속 (예를 들어, 크로뮴, 몰리브덴, 텅스텐, 레늄, 망간, 구리, 카드뮴) 또는 VIII족 금속 (예를 들어, 철, 코발트, 니켈, 백금, 팔라듐, 로듐, 루테늄, 이리듐 및 오스뮴)을 함유하는 탄소성 피로중합체 촉매를 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 수소용해 촉매는 알칼린 토금속 산화물과 배합되거나 촉매적 활성 지지체에 부착된 임의의 상기 금속을 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 수소용해 반응에서 설명된 촉매는 수소화 반응을 위해 상기 설명된 바와 같은 촉매 지지체를 포함할 수 있다.
수소용해 반응을 수행하기 위한 조건은 출발 물질 및 목적하는 산물의 유형에 따라 다양할 것이다. 당업자는 본 개시의 이득과 함께 반응을 수행하기 위해 사용하는 적당한 조건을 인지할 것이다. 일반적으로, 이들 수소용해 반응은 110℃ 내지 300℃, 및 바람직하게는 170℃ 내지 220℃, 그리고 가장 바람직하게는 200℃ 내지 225℃의 온도에서 수행된다. 몇 가지 구체예에서, 수소용해 반응은 염기성 조건, 바람직하게는 pH 8 내지 13, 및 보다 더 바람직하게는 pH 10 내지 12에서 수행된다. 몇 가지 구체예에서, 수소용해 반응은 60 KPa 내지 16500 KPa, 및 바람직하게는 1700 KPa 내지 14000 KPa의 범위, 그리고 보다 바람직하게는 4800 KPa 내지 11000 KPa의 압력에서 수행된다.
본 발명의 수소용해 반응에 사용되는 수소는 외부 수소, 재활용된 수소, 동일계 생성된 수소, 및 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
몇 가지 구체예에서, 상기 논의된 반응 산물은 응축 반응기에서 응축 반응을 통해 고급 탄화수소로 전환될 수 있다. 이러한 구체예에서, 반응 산물의 응축은 고급 탄화수소를 형성할 수 있는 촉매의 존재 하에 일어난다. 본 이론에 의해 제한되는 것 없이, 고급 탄화수소의 생산은 탄소-탄소 또는 탄소-산소 결합의 형성을 포함하는 단계적 부가 반응을 통해 진행하는 것으로 사료된다. 수득한 반응 산물은 하기에서 보다 상세하게 설명된 바와 같이, 이들 모이어티를 함유하는 임의의 수의 화합물을 포함한다.
특정한 구체예에서, 적합한 응축 촉매는 산 촉매, 염기 촉매 또는 산/염기 촉매를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "산/염기 촉매"는 산 및 염기 기능 둘 모두를 갖는 촉매를 나타낸다. 몇 가지 구체예에서, 응축 촉매는 제한없이, 제올라이트, 카바이드, 질화물, 지르코니아, 알루미나, 실리카, 알루미노실리케이트, 포스페이트, 산화티탄, 산화아연, 산화바나듐, 산화란탄, 산화이트륨, 산화스캔듐, 산화마그네슘, 산화세륨, 산화바륨, 산화칼슘, 수산화물, 헤테로폴리산, 무기산, 산 변형된 수지, 염기 변형된 수지 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 몇 가지 구체예에서, 응축 촉매는 또한 변형제를 포함할 수 있다. 적합한 변형제는 La, Y, Sc, P, B, Bi, Li, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 몇 가지 구체예에서, 응축 촉매는 또한 금속을 포함할 수 있다. 적합한 금속은 Cu, Ag, Au, Pt, Ni, Fe, Co, Ru, Zn, Cd, Ga, In, Rh, Pd, Ir, Re, Mn, Cr, Mo, W, Sn, Os, 합금 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
특정한 구체예에서, 응축 반응에서 설명된 촉매는 수소화 반응을 위해 상기 설명된 바와 같은 촉매 지지체를 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 응축 촉매는 자가-지지형이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "자가-지지형"은 촉매가 지지체로서 작용하기 위해 또 다른 물질을 필요로 하지 않음을 의미한다. 특정한 구체예에서, 응축 촉매는 촉매를 현탁시키기에 적합한 별도의 지지체와 연계하여 사용된다. 한 가지 구체예에서, 응축 촉매 지지체는 실리카이다.
응축 반응을 수행하는 조건은 출발 물질 및 목적하는 산물의 유형에 따라 다양할 것이다. 당업자는 본 개시의 이득과 함께 반응을 수행하는 적당한 조건을 인지할 것이다. 몇 가지 구체예에서, 응축 반응은 제안된 반응에 대한 열역학이 선호될 수 있는 온도에서 수행된다. 응축 반응을 위한 온도는 특정 출발 폴리올 또는 알코올에 따라 다양할 것이다. 몇 가지 구체예에서, 응축 반응을 위한 온도는 80℃ 내지 500℃, 및 바람직하게는 125℃ 내지 450℃, 그리고 가장 바람직하게는 125℃ 내지 250℃의 범위이다. 몇 가지 구체예에서, 응축 반응은 0 KPa 내지 9000 KPa 범위, 및 바람직하게는 0 KPa 내지 7000 KPa 범위, 그리고 보다 더 바람직하게는 0 KPa 내지 5000 KPa 범위의 압력에서 수행된다.
본 발명의 특정한 방법에 의해 형성되는 고급 알칸은 4 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 측쇄 또는 직쇄 알칸, 4 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 측쇄 또는 직쇄 알켄, 5 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 사이클로알칸, 5 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 사이클로알켄, 아릴, 융합된 아릴, 알코올, 및 케톤을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 알칸은 부탄, 펜탄, 펜텐, 2-메틸부탄, 헥산, 헥센, 2-메틸펜탄, 3-메틸펜탄, 2,2-디메틸부탄, 2,3-디메틸부탄, 헵탄, 헵텐, 옥탄, 옥텐, 2,2,4-트리메틸펜탄, 2,3-디메틸헥산, 2,3,4-트리메틸펜탄, 2,3-디메틸펜탄, 노난, 노넨, 데칸, 데센, 운데칸, 운데센, 도데칸, 도데센, 트리데칸, 트리데센, 테트라데칸, 테트라데센, 펜타데칸, 펜타데센, 노닐데칸, 노닐데센, 에이코산, 에이코센, 운데이코산, 운데이코센, 도에이코산, 도에이코센, 트리에이코산, 트리에이코센, 테트라에이코산, 테트라에이코센, 및 이들의 이성체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 산물 중 일부는 연료용으로 적합할 수 있다.
몇 가지 구체예에서, 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 비치환된다. 다른 구체예에서, 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 1-치환된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 다-치환된다. 치환된 사이클로알칸 및 사이클로알켄을 포함하는 구체예에서, 치환된 그룹은 제한없이, 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 측쇄 또는 직쇄 알킬, 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 측쇄 또는 직쇄 알킬렌, 페닐, 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 적합한 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 사이클로펜탄, 사이클로펜텐, 사이클로헥산, 사이클로헥센, 메틸-사이클로펜탄, 메틸-사이클로펜텐, 에틸-사이클로펜탄, 에틸-사이클로펜텐, 에틸-사이클로헥산, 에틸-사이클로헥센, 이들의 이성체 및 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
몇 가지 구체예에서, 형성된 아릴은 비치환된다. 또 다른 구체예에서, 형성된 아릴은 1-치환된다. 치환된 아릴을 포함하는 구체예에서, 치환된 그룹은 제한없이 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬, 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 측쇄 또는 직쇄 알킬렌, 페닐, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명을 위해 적합한 아릴은 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸 벤젠, 파라 자일렌, 메타 자일렌 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명의 특정한 방법에서 생성된 알코올은 4 내지 30개의 탄소 원자를 갖는다. 몇 가지 구체예에서, 알코올은 사이클릭이다. 다른 구체예에서, 알코올은 측쇄이다. 또 다른 구체예에서, 알코올은 직쇄이다. 본 발명의 적합한 알코올은 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, 운데칸올, 도데칸올, 트리데칸올, 테트라데칸올, 펜타데칸올, 헥사데칸올, 헵틸데칸올, 옥틸데칸올, 노닐데칸올, 에이코산올, 우네이코산올, 도에이코산올, 트리에이코산올, 테트라에이코산올, 및 이들의 이성체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 특정한 방법에서 생성된 케톤은 4 내지 30개의 탄소 원자를 갖는다. 한 가지 구체예에서, 케톤은 사이클릭이다. 또 다른 구체예에서, 케톤은 측쇄이다. 또 다른 구체예에서, 케톤은 직쇄이다. 본 발명을 위해 적합한 케톤은 부타논, 펜타논, 헥사논, 헵타논, 옥타논, 노나논, 데카논, 운데카논, 도데카논, 트리데카논, 테트라데카논, 펜타데카논, 헥사데카논, 헵틸데카논, 옥틸데카논, 노닐데카논, 에이코사논, 우네이코사논, 도에이코사논, 트리에이코사논, 테트라에이코사논, 및 이들의 이성체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 미세조류 오일 상에서 수행될 수 있는 또 다른 화학적 변형은 상호에스테르화이다. 천연적으로 생성된 글리세로지질은 지방산 성분의 균일한 분포를 갖지 않는다. 오일과 관련하여, 상호에스테르화는 상이한 글리세로지질의 두 개의 에스테르간의 아실 라디칼의 교환을 나타낸다. 상호에스테르화 공정은 글리세로지질의 혼합물의 지방산 성분이 재배열되어 분포 패턴을 변형시킬 수 있는 기작을 제공한다. 상호에스테르화는 널리-공지된 화학적 공정이고, 일반적으로 알칼리 금속 또는 알칼리 금속 알킬레이트 (예를 들어, 나트륨 메톡시드)와 같은 촉매의 존재 하에 일정 시간 (예를 들어, 30분)동안 오일의 혼합물을 가열 (약 200℃까지)함을 포함한다. 이 공정은 오일 혼합물의 지방산 성분의 분포 패턴을 무작위화는 데에 사용될 수 있거나, 목적하는 분포 패턴을 생성하도록 지시될 수 있다. 지질의 화학적 변형에 대한 이 방법은, 지질로서 건조 세포 중량의 퍼센트가 적어도 20%인 미생물 바이오매스와 같은, 본 명세서에 제공된 물질에 대해 수행될 수 있다.
지방산의 특정 분포 패턴이 요구되는 지시된 상호에스테르화는 존재할 수 있는 몇몇 TAG의 융점 아래의 온도에서 오일을 유지시킴으로써 수행될 수 있다. 이것은 이들 TAG의 선택적 결정화를 야기하고 이는 이들이 결정화함으로써 반응 혼합물로부터 이들을 효과적으로 제거한다. 공정은 예를 들어, 오일내 대부분의 지방산이 침전할 때까지 계속될 수 있다. 지시된 상호에스테르화 방법은 예를 들어, 장쇄 지방산의 단쇄 대응물로의 치환을 통해 보다 낮은 칼로리 함량을 갖는 산물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 지시된 상호에스테르화는 또한 원치않는 트랜스 이성체를 생성시킬 수 있는 수소화에 의지하는 것 없이 식품 첨가제 또는 제품 (예를 들어, 마가린)에서 요구되는 목적하는 융점 특성 및 구조적 특징을 제공할 수 있는 지방 혼합물을 갖는 산물을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 설명된 방법에 의해 생성된 오일의 상호에스테르화는 하기에 보고된 바와 같이, 방법 및/또는 재료 중 하나 이상과 연계하여, 또는 산물을 생성하기 위해 수행될 수 있다: 미국 특허 번호 제6,080,853호 (비분해성 지방 대용물); 제4,288,378호 (피넛 버터 안정화제); 제5,391,383호 (식용 스프레이 오일); 제6,022,577호 (식품에 대한 식용 지방); 제5,434,278호 (식품에 대한 식용 지방); 제5,268,192호 (저칼로리 너트 제품); 제5,258,197호 (감소된 칼로리의 식용 조성물); 제4,335,156호 (식용 지방 제품); 제7,288,278호 (식품 첨가제 또는 의약); 제7,115,760호 (분획 방법); 제6,808,737호 (구조적 지방); 제5,888,947호 (엔진 윤활제); 제5,686,131호 (식용 오일 혼합물); 및 제4,603,188호 (경화성 우레탄 조성물).
본 발명에 따른 한 가지 구체예에서, 이어서 상기 설명된 바와 같은 오일의 트랜스에스테르화는 미국 특허 번호 제6,465,642호에서 보고된 바와 같이, 트랜스에스테르화된 산물을 폴리올과 반응되어 폴리올 지방산 폴리에스테르를 생성한다. 이러한 에스테르화 및 분해 공정은 하기와 같은 단계를 포함할 수 있다: 저급 알킬 에스테르를 비누의 존재 하에 폴리올과 반응시키는 단계; 산물 혼합물로부터 잔여 비누를 제거하는 단계; 산물 혼합물을 물-세척 및 건조시켜 불순물을 제거하는 단계; 정련을 위해 산물 혼합물을 표백시키는 단계; 산물 혼합물내 폴리올 지방산 폴리에스테르로부터 미반응된 저급 알킬 에스테르의 적어도 일부를 분리하는 단계; 및 분리된 미반응된 저급 알킬 에스테르를 재활용하는 단계.
트랜스에스테르화는 또한 미국 특허 제6,278,006호에서 보고된 바와 같이, 단쇄 지방산 에스테를 갖는 미생물 바이오매스 상에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 트랜스에스테르화는 단쇄 지방산 에스테르를 적합한 촉매의 존재 하에 오일에 부가하고 혼합물을 가열시킴으로써 수행될 수 있다. 몇 가지 구체예에서, 오일은 중량으로 약 5% 내지 약 90%의 반응 혼합물을 포함한다. 몇 가지 구체예에서, 단쇄 지방산 에스테르는 중량으로 약 10% 내지 약 50%의 반응 혼합물일 수 있다. 촉매의 비-제한적인 예는 염기 촉매, 나트륨 메톡사이드, 황산 및 산성화된 점토와 같은 무기산, 메탄 설폰산, 벤젠설폰산, 및 톨루엔설폰산과 같은 유기산 및 Amberlyst 15와 같은 산성 수지를 포함하는 산 촉매를 포함한다. 나트륨 및 마그네슘과 같은 금속, 및 금속 수소화물은 또한 유용한 촉매이다.
또 다른 이러한 화학적 변형은 하이드록실화이고, 이는 물을 이중 결합으로 부가하여 하이드록실 모이어티의 포화 및 편입을 유도한다. 하이드록실화 공정은 글리세로지질의 하나 이상의 지방산을 하이드록시 지방산으로 전환시키기 위한 기작을 제공한다. 하이드록실화는 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,576,027호에서 보고된 방법을 통해 수행될 수 있다. 피마자유를 포함하는 하이드록실화된 지방산 및 이의 유도체는 식품 첨가제, 계면활성제, 안료 습윤제, 소포제, 방수 첨가제, 가소화제, 화장품 유화제 및/또는 탈취제를 포함하는 다수의 산업 응용 분야 및 전자, 약제, 페인트, 잉크, 접착제 및 윤활제에서 성분으로서 유용하다. 글리세라이드가 하이드록실화되는 방법의 한 가지 예는 다음과 같다: 지방은 바람직하게 헵탄과 배합하여 약 30 내지 50℃로 가열될 수 있고 30분 이상 동안 온도에 유지될 수 있으며; 이어서 아세트산이 혼합물에 첨가되고 그 다음 황산 수용액, 그 다음 과산화소수 수용액이 점진적 증가량으로 1시간 이상 동안 혼합물에 첨가될 수 있고; 수성 과산화수소 후에, 온도는 적어도 약 60℃까지 증가되고 6시간 이상 동안 교반될 수 있고; 교반 후, 혼합물이 침강하도록 허용되고 반응에 의해 형성된 저급 수성 층이 제거되면서 반응에 의해 형성된 상부 헵탄층은 약 60℃의 온도를 갖는 고온수로 세척될 수 있고; 이후 세척된 헵탄 층은 수산화칼륨 수용액을 사용하여 pH 약 5 내지 7로 중화되고 이어서 진공 증류에 의해 제거될 수 있고; 반응 산물은 이어서 100℃에서 진공 건조될 수 있고 건조된 산물은 진공 조건 하에 증기-탈취되고 규조토를 사용하여 약 50℃ 내지 60℃에서 여과될 수 있다.
본 명세서에서 설명된 방법에 의해 생성된 미생물 오일의 하이드록실화는 하기에 보고된 바와 같이, 방법 및/또는 재료 중 하나 이상과 연계하여, 또는 산물을 생성하기 위해 수행될 수 있다: 미국 특허 번호 제6,590,113호 (오일계 피복 및 잉크); 제4,049,724호 (하이드록실화 반응); 제6,113,971호 (올리브유 버터); 제4,992,189호 (윤활제 및 루브 첨가제); 제5,576,027호 (하이드록실화된 밀크); 및 제6,869,597호 (화장품).
하이드록실화된 글리세로지질은 에스톨리드로 전환될 수 있다. 에스톨리드는 글리세로지질로 구성되고 여기서, 하이드록실화된 지방산 성분은 또 다른 지방산 분자로 에스테르화되었다. 하이드록실화된 글리세로지질의 에스톨리드로의 전환은 글리세로지질 및 지방산의 혼합물을 가온시키고 혼합물을 Isbell et al., JAOCS 71(2):169-174 (1994)에서 설명된 바와 같이, 무기산과 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 에스톨리드는 제한없이 하기에 보고된 것들을 포함하는, 다양한 응용 분야에서 유용하다: 미국 특허 번호 제7,196,124호 (탄성 물질 및 바닥덮개); 제5,458,795호 (고온 응용을 위한 증점 오일); 제5,451,332호 (산업적 응용을 위한 유체); 제5,427,704호 (연료 첨가제); 및 제5,380,894호 (윤활제, 그리스, 기가소제, 및 인쇄 잉크).
미생물 오일 상에서 수행될 수 있는 다른 화학적 반응은 미국 특허 제6,051,539호에서 보고된 바와 같이, 트리아실글리세롤을 사이클로프로판화제와 반응시켜 유동성 및/또는 산화성 안정도를 증진시키는 것; 미국 특허 제6,770,104호에서 보고된 바와 같이, 트리아실글리세롤로부터 왁스를 제조하는 것; 및 "The effect of fatty acid composition on the acrylation kinetics of epoxidized triacylglycerols", Journal of the American Oil Chemists' Society, 79:1, 59-63, (2001) 및 Free Radical Biology and Medicine, 37:1, 104-114 (2004)에서 보고된 바와 같이, 트리아실글리세롤을 에폭시화시키는 것을 포함한다.
상기 설명된 바와 같은 연료 및 화학적 산물에 대한 오일-함유 미생물 바이오매스의 발생은 탈지된 바이오매스 밀(meal)을 야기한다. 탈지된 밀은 조류 오일을 제조하는데 있어서의 부산물이고 농장 동물, 예를 들어, 반추동물, 가금류, 돼지 및 양식물고기에 대한 동물 사료로서 유용하다. 수득한 밀은 오일 함량이 감소하였지만, 여전히 고급의 단백질, 탄수화물, 섬유, 재, 잔류 오일 및 동물 사료에 적당한 다른 영양물을 함유한다. 세포는 주로 오일 분리 공정에 의해 용해되기 때문에, 탈지된 밀은 상기 동물에 의해 쉽게 소화될 수 있다. 탈지된 밀은 임의로 동물 사료에서 곡물과 같은 다른 성분과 배합될 수 있다. 탈지된 밀은 분말성 점도를 갖기 때문에, 이것은 압출기 또는 확장기 또는 상업적으로 이용될 수 있는 다른 유형의 기계를 사용하여 펠렛으로 압착될 수 있다.
상기에서 상세하게 설명된 본 발명은 하기의 실시예에서 예시되지만, 이는 청구된 발명을 설명하기 위해 제공될 뿐, 이에 제한되지 않는다.
VIII. 실시예
실시예 1: 프로토테카( Prototheca )를 배양하기 위한 방법
프로토테카(Prototheca) 균주를 배양하여 건조 세포 중량으로 높은 퍼센트의 오일을 성취하였다. 동결보존된 세포를 실온에서 해동시키고 500ul의 세포를 4.5ml의 배지 (4.2 g/L K2HPO4, 3.1 g/L NaH2PO4, 0.24 g/L MgSO4·7H2O, 0.25 g/L 시트르산 일수화물, 0.025 g/L CaCl2 2H2O, 2g/L 효모 추출물) 플러스 2% 글루코오스에 첨가하고 6-웰 플레이트에서 진탕 (200rpm)과 함께 7일 동안 28℃에서 성장시켰다. 건조 세포 중량은 1ml의 배양물을 예비-칭량된 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에서 5분 동안 14,000 rpm에서 원심분리하여 결정하였다. 배양 상청액을 버리고 수득한 세포 펠렛을 1ml의 탈이온수로 세척하였다. 배양물을 다시 원심분리하고, 상청액을 버리고, 동결될 때까지 세포 펠렛을 -80℃에 위치시켰다. 이후 샘플을 24시간 동안 동결건조시키고 건조 세포 중량을 계산하였다.
배양물내 총 지질을 결정하기 위해, 3 ml의 배양물을 제거하고 제조업자의 프로토콜에 따라 Ankom 시스템 (Ankom Inc., Macedon, NY)을 사용하여 분석하였다. 샘플을 제조업자의 프로토콜에 따라 Amkom XTlO 추출기로 용매 추출에 적용하였다. 총 지질은 산 가수분해된 건조 샘플 및 용매 추출된, 건조 샘플 간의 질량 차이로서 결정하였다. 퍼센트 오일 건조 세포 중량 측정은 표 2에 나타난다.
Figure pct00003
미국 특허 출원 공개공보 20100151112의 표 22에 열거된 균주 기원의 미세조류 샘플을 유전자형으로 분류하였다. 게놈 DNA를 다음과 같이 조류 바이오매스로부터 단리하였다. 세포 (대략 200mg)를 14,000 x g에서 5분 동안 배양물로부터 원심분리하였다. 이후 세포를 멸균 증류수에서 재현탁시키고, 14,000 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버렸다. 직경이 ~2mm인 단일 유리 비드(bead)를 바이오매스에 첨가하고 튜브를 적어도 15분 동안 -80℃에 위치시켰다. 샘플을 제거하고 150 μl의 분쇄 완충액 (1% 사르코실(Sarkosyl), 0.25 M 수크로오스, 50 mM NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM 트리스-HCl, pH 8.0, RNase A 0.5 ug/ul)을 첨가하였다. 펠렛을 간단히 볼텍싱(vortexing)하여 재현탁시키고, 그 다음 40 μl의 5M NaCl를 첨가하였다. 샘플을 간략하게 볼텍싱하고, 그 다음 66 μl의 5% CTAB (세틸 트리메틸암모늄 브로마이드)를 첨가하고 최종적으로 간략하게 볼텍싱하였다. 다음에 샘플을 10분 동안 65℃에서 항온처리하고 이후 이들을 10분 동안 14,000 x g에서 원심분리하였다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 300 μl의 페놀: 클로로포름: 이소아밀 알코올 12:12:1로 한 번 추출하고, 그 다음 14,000 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 수득한 수성 상을 0.7 용적의 이소프로판올 (~190μl)을 함유하는 새로운 튜브로 옮기고, 뒤집어서 혼합하고 30분 동안 실온에서 또는 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. DNA를 10분 동안 14,000 x g에서 원심분리를 통해 회수하였다. 이후 수득한 펠렛을 70% 에탄올로 두 번 세척하고, 그 다음 100% 에탄올로 최종 세척하였다. 펠렛을 실온에서 20분 내지 30분 동안 공기 건조시키고, 그 다음 50 μl의 1OmM 트리스Cl, 1mM EDTA (pH 8.0)에서 재현탁시켰다.
상기 설명된 바와 같이 제조된 5 μl의 총 조류 DNA를 10mM 트리스, pH 8.0에서 1:50으로 희석시켰다. 최종 용적 20μl의 PCR 반응물을 다음과 같이 셋업(set up)하였다. 10 μl의 2 x iProof HF 마스터 믹스 (BIO-RAD)를 0.4 μl의 프라이머 SZ02613 (10mM 스톡 농도에서 5'-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3' (서열번호: 13))에 첨가하였다. 이 프라이머 서열은 GenBank 수탁번호 제L43357호에서 567번 내지 588번이고 고등 식물 및 조류 플라스티드 게놈에서 고도로 보존된다. 이어서 0.4 μl의 프라이머 SZ02615 (10mM 스톡 농도에서 5'-CAGTGAGCTATTACGCACTC-3' (서열번호: 14))를 첨가하였다. 이 프라이머 서열은 GenBank 수탁번호 제L43357호에서 1112번 내지 1093번 위치에 상보적이고 고등 식물 및 조류 플라스티드 게놈에서 고도로 보존된다. 다음에, 5 μl의 희석된 총 DNA 및 3.2 μl의 dH2O를 첨가하였다. PCR 반응을 다음과 같이 수행하였다: 35 사이클 동안 98℃, 45"; 98℃, 8"; 53℃, 12"; 72℃, 20"에, 그 다음 1분 동안 72℃에서 수행하고 25℃에 유지시킴. PCR 산물의 정제를 위해, 20 μl의 10 mM 트리스, pH 8.0를 각각의 반응물에 첨가하고, 그 다음 40 μl의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 12:12:1로 추출하고, 볼텍싱하고 그리고 5분 동안 14,000 x g에서 원심분리하였다. PCR 반응을 S-400 칼럼 (GE Healthcare)에 적용하고 3,000 x g에서 2분 동안 원심분리하였다. 정제된 PCR 산물을 이어서 PCR8/GW/TOPO 내로 TOPO 클로닝하고 양성 클론을 LB/Spec 플레이트를 위해 선택하였다.
정제된 플라스미드 DNA를 M13 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 양 방향에서 서열분석하였다. 전체적으로, 12개의 프로토테카(Prototheca) 균주를 서열분석된 이들의 23S rRNA DNA를 갖도록 선택하고 서열은 서열 목록에 열거한다. 균주 및 서열 목록 번호에 대한 요약은 하기에 포함된다. UTEX 1435 (서열번호: 5) 서열로부터 총 분기점에 대해 서열을 분석하였다. 두 개의 쌍 (UTEX 329/UTEX 1533 및 UTEX 329/UTEX 1440)이 가장 분기된 것으로서 나타났다. 둘 모두의 경우에, 쌍형성 정렬은 75.0% 쌍형성 서열 동일성을 나타내었다. UTEX 1435에 대한 서열 동일성 퍼센트는 또한 하기에 포함된다.
Figure pct00004
HPLC를 사용하여 상기-열거된 균주의 서브셋트 기원의 지질 샘플을 지질 프로파일에 대해 분석하였다. 결과는 하기 표 3에 나타난다.
Figure pct00005
실시예 2: 프로토테카( Prototheca )를 형질전환하기 위한 방법
A. 프로토테카( Prototheca )의 유전자주입(biolistic) 형질전환을 위한 일반적인 방법
Seashell Technology로부터의 S550d 골드 캐리어(gold carrier)를 제조업자의 프로토콜에 따라 제조하였다. 선형화된 플라스미드 (20 μg)를 50 μl의 결합 완충액과 60 μl (30 mg)의 S55Od 골드 캐리어와 혼합하고 1분 동안 얼음에서 항온처리하였다. 침전 완충액 (100 μl)을 첨가하고, 혼합물을 또 다른 1분 동안 얼음에서 항온처리하였다. 볼텍싱한 후, DNA-피복된 입자를 10초 동안 에펜도르프 5415C 소형원심분리기에서 10,000rpm으로 회전시켜 펠렛화하였다. 골드 펠렛을 500 μl의 냉 100% 에탄올로 한 번 세척하고, 소형원심분리기에서 간단히 회전시켜 펠렛화하고, 그리고 50 μl의 빙냉(ice-cold) 에탄올로 재현탁시켰다. 간략한 (1 내지 2초) 초음파 처리 후, 10 μl의 DNA-피복된 입자를 즉시 담체 막으로 이동시켰다.
프로토테카(Prototheca) 균주를 세포 밀도가 2 x 106 세포/ml가 될 때까지 회전 진탕기 상에서 프로테오스 배지 (2g/L 효모 추출물, 2.94mM NaNO3, 0.17mM CaC12·2H2O, 0.3mM MgSO4·7H2O, 0.4mM K2HPO4, 1.28mM KH2PO4, 0.43mM NaCl)에서 성장시켰다. 세포를 수거하고 멸균 증류수로 한 번 세척하고 50 μl의 배지에서 재현탁시켰다. 1 x 107 세포를 비-선택적 프로테오스 배지 플레이트의 세 번째 중앙에 도말하였다. 세포를 PDS-1000/He 유전자주입 입자 전달 시스템(Biolistic Particle Delivery system) (Bio-Rad)으로 충격을 가했다. 파열 디스크 (1100 및 1350 psi)를 사용하였고, 플레이트를 스크린/거대담체 어셈블리 9 및 12cm 아래에 위치시킨다. 세포가 12 내지 24시간 동안 25℃에서 회복되도록 하였다. 회복시, 세포를 고무 스패튤라(spatula)를 사용하여 플레이트로부터 긁어내고, 100 μl의 배지와 혼합하고 그리고 적당한 선별 항생제를 함유한 플레이트 상에 도말하였다. 25℃에서 항온처리 7 내지 10일 후에, 1100 및 1350 psi 파열 디스크로부터 및 9 및 12cm 거리로부터 플레이트 상에서 형질전환 세포를 나타내는 콜로니가 확인되었다. 콜로니를 집어내고 이차 선별용 선택 한천 플레이트 상에 스팟팅하였다.
실시예 3: 자일로오스를 대사시킬 수 있는 미세조류 균주의 발생
예를 들어, 코돈 최적화 및 염색체 재조합 부위를 포함하여, 프로토테카(Prototheca) 종에서 이종 외인성 유전자를 발현하는 방법 및 효과는 이전에 PCT 출원 번호 제PCT/US2009/66142호에서 설명되었으며, 상기 문헌은 이들 교시를 위해, 본 명세서세 참조로서 편입된다. 이 예시는 자일로오스의 대사 및 이동을 위한 외인성 유전자를 함유한 프로토테카 모리포르미스 (Prototheca moriformis) (UTEX 1435)로부터 유래된 형질전환 균주의 발생을 증명한다. 발생된 결과적 형질전환 프로토테카(Prototheca) 균주는 유일한 탄소원으로서 자일로오스를 함유한 배지 상에서 성장하는 능력을 가졌다. 상기 논의된 바와 같이, 자일로오스, 펜토오스가 셀룰로오스-유래 공급원료의 중요 성분이기 때문에, 자일로오스를 대사시킬 수 있는 능력은 중요하다. 자일로오스는 셀룰로오스와 함께, 대부분의 식물 물질의 주요 구조 성분을 형성하는 헤미셀룰로오스의 주요 당 단량체 성분이다.
예비 결과는 시간이 지남에 따라 액체 배지내 당 수준의 분석 측정에 의해 명시된 바와 같이, 프로토테카 모리포르미스 (Prototheca moriformis) (UTEX 1435)가 소량의 자일로오스를 자일리톨로 전환시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 배지에서 그리고 배지내 탄소원으로서 4% 자일로오스와 0.25% 글루코오스로 상기 실시예 1에서 설명된 바와 같은 조건에서 프로토테카 모리포르미스 (Prototheca moriformis) (UTEX 1435)를 배양하였다. 세포가 첨가되지 않은(no-cells-added) 음성 대조군 및 성장을 위한 양성 대조군 및 자일리톨 생산을 위한 음성 대조군에 대한 4% 글루코오스 조건이 또한 포함된다. 표 4는 음성 조절 조건에서는 자일리톨이 생산되지 않은 반면에, 프로토테카(Prototheca) 세포가 있는 자일로오스 함유 배지는 배양 5일 후 배양 상청액에서 검출가능한 양의 자일리톨을 생산하였다는 점을 보여준다. 글루코오스만 있는 조건에서 세포에 대해 강한 성장이 있었지만, 탐지될만한 수준의 자일리톨이 생산되지는 않았다.
Figure pct00006
이 결과는 자일로오스가 프로토테카 모리포르미스 (Prototheca moriformis)에서 내인성 알도-케토 환원효소 효소 활성도를 통해 자일리톨로 전환될 수 있다는 점을 명시할 수 있다. NAPDH-의존 산화환원효소의 패밀리에 속하는 효소는 플라즈마 막의 범위 내에 있고, 이러한 효소가 자일로오스의 자일리톨로의 전환에 관여한다면, 배양 배지내 자일로오스는 내인성 당 운반체를 통해 세포 내로 들어갈 것이다.
자일로오스를 대사시킬 수 있는 유기체에서, 자일로오스는 자일룰로스-5-포스페이트로 전환되고, 이는 펜토오스 포스페이트 경로를 통해 추가 대사된다. 프로토테카 모리포르미스 (Prototheca moriformis)는 이의 환경으로부터 자일로오스를 흡수할 수 있지만, 효율적으로 자일로오스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환시키는 능력은 결핍되어 있다. 상기 표 4에서 보여준 결과는 이것이 상기 사례일 수 있다는 것을 제시한다. 이 가설을 검사하기 위하여, 본 발명은 자일로오스를 자일룰로스로 먼저 전환시키기 위한 자일로오스 이성질화효소 그리고 자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환시키기 위한 자일룰로키나아제를 발현시키기 위한 방법 및 시약을 제공한다. 이러한 형질전환 미세조류 세포의 예시적인 설명은 프로토테카 모리포르미스 (Prototheca moriformis) (UTEX 1435)를 이용하여 하기 설명된다.
피로마이세스 종(Piromyces sp.)으로부터의 자일로오스 이성질화효소 (XylA) 유전자 및 피키아 스티피티스(Pichia stipitis)로부터의 자일룰로키나아제 (XYL3)유전자 및 사카로미세스 세레비시애(S. cerevisiae)로부터의 전화효소 유전자 (suc2, 선택가능한 마커)를 발현시키는 프로토테카 모리포르미스 (Prototheca moriformis)의 형질전환 수여자를 PCT 특허 공개 번호 제WO 2010/063031호 및 제WO 2010/063032호에서 이전에 설명된 방법론 및 형질전환을 이용하여 발생시켰다. 수크로오스 함유 배지 및 플레이트 상에서 양성 클론을 선택하였다. 피로마이세스 종(Piromyces sp.) XylA의 일차 아미노산 서열(Gen Bank 수탁번호 제CAB76571호, 이는 본 명세서에 참조로서 편입됨)은 서열번호: 15로서 열거된다. 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) XYL3의 일차 아미노산 서열 (Gen Bank 수탁번호 제CAA39066.1호, 이는 본 명세서에 참조로서 편입됨)은 서열번호: 51로서 열거된다. 피로마이세스 종(Piromyces sp.) XylA/ 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) XYL3 형질전환 카세트의 관련 부분은 하기 열거된다. 이 카세트는 게놈 통합을 위한 5' 및 3' 프로토테카 모리포르미스 (Prototheca moriformis) KE858 상동 재조합 표적화 서열을 함유하고 그리고 서열번호: 16 및 17로서 열거된다. 또한 (1) 클라미도모나스 레인하르드티 (C. reinhardtii) 베타-튜불린 프로모터 및 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) 니트레이트 환원효소 3' UTR (서열 번호: 18)의 조절 하에 사카로미세스 세레비시애(S. cerevisiae) suc2 수크로오스 전화효소 유전자; (2) 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides) EF1a 프로모터 및 3' UTR의 조절 하에 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) XYL3; 그리고 (3) 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides) 액틴 프로모터 및 EF1a 3' UTR의 조절 하에 피로마이세스 종(Piromyces sp.) XylA를 또한 함유한다. 수크로오스-함유 배지 및 플레이트 상에서 양성 클론을 선택하였고 웨스턴 블롯에서 XylA 또는 XYL3에 대항하여 발생된 토끼 다클론 항체를 이용하여 전이유전자의 발현을 확인하였다.
Figure pct00007
XylA/XYL3 수여자 균주가 발생되고 웨스턴 블롯을 이용하여 확인되면, 이후 균주를 두 개의 카세트 중 하나로 재형질전환시켰다. 첫 번째 카세트는 항생제 G418에 대한 내성을 주는 유전자 및 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis)와 동일한 전이체 패밀리에 속하는 이종상동성 유전자로부터의 전이 펩티드로 교체된 플라스티드 전이 펩티드를 가진 아라비도프시스 탈리아나(Arabidoposis thaliana)로부터의 추가 포스페이트/펜토오스 포스페이트 전이체 유전자 XPT를 가진 통합 형질전환 벡터였다. 일차 아미노산 서열 (교체된 전이 펩티드 서열번호: 25를 포함)은 서열 번호: 24에서 열거된다. 대안적인 플라스티드 전이 펩티드 서열 번호: 26도 또한 시도되었고 동일하게 성공적이었다. 두 번째 카세트는 항생제 G418에 대한 내성을 주는 유전자 및 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis)와 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) XYL2 유전자인, 자일리톨 탈수소효소와 동일한 전이체 패밀리에 속하는 이종상동성 유전자로부터의 전이 펩티드로 교체된 플라스티드 전이 펩티드를 가진 아라비도프시스 탈리아나(Arabidoposis thaliana)로부터의 추가 포스페이트/펜토오스 포스페이트 전이체 유전자 XPT를 함유한 에피솜 (비-통합) 형질전환 벡터였다. 효모 (가령, 피키아(Pichia))에서, XylA는 자일리톨에 의해 어느 정도까지 저해될 수 있다. 비-형질전환된 프로토테카(Prototheca) 세포를 가진 배양 상청액을 검사하는 상기 설명된 예비 실험은 자일로오스로부터 직접적으로 자일리톨을 발생시키는 내인성 환원효소 활성도를 나타내는, 배지내 탐지가능한, 낮은 수준의 자일리톨을 보여주었다. XYL2 자일리톨 탈수소효소를 함유한 이러한 두 번째 작제물은 XylA 상에서 이러한 자일리톨 저해를 완화시키기 위한 방법을 제공한다. 이들 두 가지 벡터 각각의 관련 부분은 하기 개별적인 카세트 성분와 함께, 각각 서열 번호: 32 및 서열 번호: 23으로서 열거된다. XPT 단독 통합 카세트는 5' 및 3' 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis) 6S 상동 재조합 표적화 서열 및 클라미도모나스 레인하르드티(C. reinhardtii) 베타-튜불린 프로모터 및 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) 니트레이트 환원효소 3' UTR의 조절 하에 네오마이신 내성 유전자 그리고 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides) 액틴 프로모터 및 EF1a 3'UTR의 조절 하에 교체된 전이 펩티드 서열 (상기 설명된 바와 같이)을 가진 아라비도프시스 탈리아나 (A. thaliana) XPT 유전자를 함유하였다. 에피솜 카세트는 클로렐라 소로키니아나(C. sorokiniana) Gdh 프로모터 및 클로렐라 불가리스 (C. vulgaris) 니트레이트 환원효소 3'UTR의 조절 하에 네오마이신 내성 유전자; 클로렐라 프로토테코이데스 (C. protothecoides) 액틴 프로모터 및 EF1a 3'UTR의 조절 하에 피키아 스티피티스 (Pichia stipitis) XYL2 유전자; 및 클라미도모나스 레인하르드티 (C. reinhardtii) 베타-튜불린 프로모터 및 클로렐라 프로토테코이데스 (C. protothecoides) EF1a 3'UTR의 조절 하에 아라비도프시스 탈리아나(A. thaliana) XPT 유전자를 함유하였다.
Figure pct00008
50 μg/ml G418을 첨가한 수크로오스-함유 배지/플레이트를 이용하여 둘 모두의 형질전환으로부터 양성 클론을 선택하였다.
더욱 상세한 특성분석을 위해 형질전환으로부터 많은 양성 클론 중에서, 형질전환 각각으로부터 하나씩, 두 가지 균주를 선택했다. 둘 모두의 균주를 유일한 탄소원으로서 2% 자일로오스를 함유한 고형 배지 플레이트 상에서 성장시켰다. 항온처리 3-4주 후, 이들 형질전환 균주에 대해서 성장을 측정하였고 둘 모두의 형질전환 균주에 대해서는 성장이 관찰되었지만, 오로지 XylA 및 XYL3 전이유전자를 함유한 부모 수여자 균주에서는 관찰되지 않았다. 액체 배양 환경을 이용하여 자일로오스 소모를 검사하기 위해 이들 결과를 확인하였다. 유일한 탄소원으로서 2% 자일로오스를 이용하여 형질전환 균주 (XylA, XYL3, XPT 및 XYL2; XylA XYL3 및 XPT) 및 부모 수여자 균주 (오직 XylA 및 XYL3) 둘 모두를 함유한 액체 배양을 셋업하였다. 성장 (OD750 판독으로 측정함) 및 자일로오스 소모 (배지에 남아있는 자일로오스의 양을 측정함)을 배양 동안 여러 시점에서 측정하였다. 부모 수여자 균주에서는 성장 또는 자일로오스 소모가 관찰되지 않았지만, 반면에 둘 모두의 형질전환 균주는 성장 및 자일로오스 소모를 보여주었다. 표 5는 성장 및 자일로오스 소모 결과를 요약한다.
Figure pct00009
실시예 4: 세포질 내로 자일로오스의 운반을 위한 운반체를 발현하는 조작된 미세조류 균주의 발생
네 개의 자일로오스-특이적 운반체 (SUT1, GXS1, 공동 수송체, 및 XLT1, 각각 서열 번호: 37, 39, 41 및 43)는 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis)내 전이유전자로서 발현되었으며, 여기서 상기 운반체 중 몇 가지는 자일로오스를 활발하게 운반하고 몇 가지는 세포 내로 자일로오스의 수동 분산을 허용한다. 자일로오스 운반체 각각에 대한 유전자를 코돈 최적화 (코돈-최적화된 암호화 영역은 각각 서열 번호: 36, 38, 40 및 42에서 보여줌)하여 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis)내 최대 발현을 허용하였고 그리고 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides) 액틴 프로모터 및 EF1a 3'UTR의 조절 하에 미세조류 세포의 게놈 내로 삽입시켰다. 네 가지 유전자 각각의 발현으로 확인하였고, 이와 같이　세포막으로의 그들의 삽입 및 국소화되었다는 점도 확인하였다. 세포막으로의 국소화 확인은 형광 단백질 인-프레임(in-frame)을 암호화하는 DNA 서열을 운반체 전이유전자 각각의 카르복실 말단에 융합시키는 것과 형광 현미경을 이용하여 작제물을 발현하는 세포를 관찰하는 것을 포함하였다.
운반체의 카르복실 말단에 융합된 형광 단백질를 이용한 네 가지 운반체 각각을 발현하는 세포의 현미경 사진은 운반체가 발현되고 세포막으로 국소화되었다는 점을 보여주었다.
실시예 5: 자일로오스의 자일룰로스-5-포스페이트로의 전환을 위한 효소를 발현하는 조작된 미세조류 균주의 발생
프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis)를 조작하여 자일로오스의 자일룰로스-5-포스페이트로의 생화학적 전환을 위한 두 가지 대안 경로에 상응하는 옥시도-환원효소 경로 효소 XYL1, XYL2, 또는 XYL3 (각각, 서열 번호: 34, 32, 및 20), 또는 이성질화효소 경로 효소 XylA 또는 XYL3 (각각, 서열 번호: 23 및 20)을 암호화하는 코돈-최적화된 유전자를 발현하도록 하였다. 두 가지 경로는 동일한 말단 효소 (XYL3)를 공유한다. 유전자 각각의 발현을 RNA 수준에서 확인하였다. 추가로, 각각의 유전자 산물에 대항하는 항체를 발생시켜 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 단백질 수준에서 발현을 추가 모니터링하는 것을 가능하게 하였다. 상응하는 삽입된 전이유전자를 함유하지만, 비형질전환된 부모 세포는 함유하지 않는 형질전환 균주로부터 만든 추출물에서 예상된 크기 밴드에 상응하는 단백질을 관찰하였다.
자일로오스의 자일룰로스-5-포스페이트로의 전환에 관여하는 효소의 발현이 프로토테카 모리포르미스(P. moriformis)에서 자일로오스를 대사시키는 능력을 초기에 부여하는 것으로 나타나지 않았지만, 전이유전자의 카피수가 증가함으로써 자일로오스 상에서 성장하는 능력이 부여되었다. 선택가능한 마커를 이용하여 이들 효소를 암호화하는 유전자의 카피수를 증가시켰다. 본래의 부모 세포는 세 개의 전이유전자 (suc2, XylA 및 XYL3) 모두에 대한 하나의 카피수를 갖고 자일로오스 상에서 성장하는 것으로 나타나지 않았지만, 선별 하에 성장 후, 특성화된 세 개의 독립적인 단리체는 3 내지 50배까지 세 개의 모든 전이유전자의 카피수를 증가시켰으며, 여기서 수크로오스 상에서 성장하는 능력이 자일로오스 대사를 암호화하는 유전자와 인접한 유전자 (suc2)에 의해 부여되었다. 증가된 카피수를 가진 단리체를 자일로오스 상에서의 성장에 대해 평가하였다. 카피수에서 가장 큰 증가 (~50배) 가 나타난 단리체 A는 자일로오스 상에서 성장하는 능력을 획득하였다. 본래의 부모 세포는 자일로오스 상에서 성장할 수 없었지만, 이와 같이 카피수에서 단지 적당한 증가 (~3-4배)를 나타낸 두 개의 단리체 (B 및 C)도 성장할 수 없었다. 단리체 A의 자일로오스 상에서 성장하는 능력은 전이유전자가 발현되었고, 이종성 유기체에서 그들의 효소 활성도를 유지시키고, 그리고 그 유기체 상에 자일로오스를 이용하는 능력을 부여할 수 있다는 점을 증명한다.
실시예 6: 펜토오스 포스페이트 대사 경로에 자일룰로스-5-포스페이트의 전달을 위한 전이체를 발현하는 조작된 미세조류 균주의 발생
프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis)를 조작하여 자일룰로스-5-포스페이트를 특이적으로 운반하는 세 가지 키메라 식물 전이체 중 하나를 발현하도록 하였다. 최종 세포 목적지/분획으로 자일룰로스-5-포스페이트를 내보내는 것을 개선시키기 위하여 식물 전이체 유전자 (아라비도프시스 탈리아나(Arabadopsis thaliana) XPT)에 의해 암호화된 전이 펩티드를 프로토테카 모리포르미스(P. moriformis) 또는 클로렐라 프로토테코이데스 (C. protothecoides)의 SAD 유전자에서 발견된 내인성 전이체에서 식별된 세 가지 전이 펩티드 중 하나로 교체함으로써 키메라 유전자를 생산하였다. 콘티그(contig) 어셈블리로부터 프로토테카 모리포르미스(P. moriformis)내 전이체 오솔로그의 부분적인 DNA 서열을 선택함으로써 그리고 선택된 서열을 증폭시킴으로써 프로토테카(Prototheca) 전이 펩티드를 식별하였다. 증폭으로부터 야기된 산물을 클로닝하고 서열화하였고, 그리고 신호 펩티드는 얻은 서열로부터 파생되었다. 키메라 유전자 산물을 플라스티드의 내막에 국소화하였다; 이것은 형광 단백질을 전이체 키메라의 카르복실 말단에 융합시킴으로써 그리고 형광 현미경을 이용하여 융합을 발현하는 세포를 검사함으로써 확인하였다. 형광 신호는 플라스티드 내막에서의 국소화와 일치하여, 세포내 세포기관-유사 구조 주변에 집중되어 있는 것을 나타냈다. 세 가지 키메라 전이체 GPT-A-XPT, GPT-F-XPT, 및 S106SAD-XPT는 각각, 서열 번호: 45, 47 및 49에서 나타난다.
실시예 7: 자일로오스 대사를 위한 유전자 조합을 발현하는 조작된 미세조류 균주의 발생
본 명세서의 실시예에서 증명된 바와 같이, 자일로오스 대사 효소를 암호화하는 개별적인 전이유전자를 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis) 내로 성공적으로 삽입하였다. 단일 세포내 이들의 다양한 전이유전자를 결합시키는 효과를 조사하기 위하여, 실시예 4-6에서 논의된 전이유전자의 특정한 조합 (표 6의 유전자형을 참고)을 함유한 프로토테카 모리포르미스(P. moriformis)를 제조하고 자일로오스 대사에 대해 스크리닝하였다.
독특한 유전자형 각각의 독립적인 형질전환체 10개를 클론으로(clonally) 정제하고 유일한 탄소원으로서 2.5 퍼센트 자일로오스를 함유한 고형 배지 상에서 성장에 대해 평가하였다. 유일한 탄소원으로서 자일로오스를 함유한 액체 배지에서 잠재적인 양성 클론을 추가로 검사하였다. 배양물의 시각적인 밀도를 측정함으로써 세포의 성장을 모니터링하였다. 실험 말기에, 자일로오스 함량에 대해 배양 상청액을 분석하였다. 표 6은 음성 대조군 (균주 A, B 및 C)와 비교하여 10개의 최고 균주 (균주 D 내지 M)의 최종 성장 및 자일로오스 소모를 보여준다. 균주 D 내지 M은 명확하게 자일로오스를 소모할 수 있는데, 이는 배양 배지내 모든 자일로오스가 실험 말기에는 사라졌기 때문이다. 대조적으로, 음성 대조군 균주 A, B 및 C가 있는 배양 배지에서는 시험 초반에 존재했던 동일한 양의 자일로오스가 실험 말기에도 여전히 검출되었다. 자일로오스의 소실은 세포 밀도의 증가를 수반하였고, 이는 자일로오스로부터의 탄소가 세포 성장을 지지하는 데에 이용되었다는 것을 명시한다. 대조적으로, 음성 대조군은 실험 과정에 걸쳐 세포 밀도가 증가되지 않았고, 실험 말기에, 배양 배지는 실험 초반에 배지에 있었던 것과 대략 동일한 양의 자일로오스를 함유하였으며, 이는 자일로오스가 모두 소모되지 않았거나, 또는 소모된 자일로오스의 양이 매우 적다는 것을 명시한다.
Figure pct00010
독특한 유전자형을 가진 다수의 균주는 유일한 탄소원으로서 자일로오스를 이용하는 바이오매스에서의 뚜렷한 증가를 보여주었다. 이들 결과는 세포 내로 자일로오스를 운반하고, 생화학적으로 자일로오스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환시키고, 그리고 내인성, 중앙 대사 경로로 자일룰로스-5-포스페이트를 전달하는 다수의 전이유전자 또는 전이유전자의 그룹의 형질전환을 통해 자일로오스 상에서 성장하도록 미세조류가 조작되었다는 것을 증명한다.
실시예 8: 자일로오스-대사 균주의 지질 생산 능력
유일한 탄소원으로서 자일로오스를 이용하여 성장할 때 오일을 생성하는 능력에 대해 실시예 7에서의 자일로오스-대사 균주 A-M을 평가하였다. 자일로오스 대사 균주를 음성 대조군 균주와 함께, 지질 생산성에 대해 분석하였다. 세포를 먼저 글루코오스를 함유한 배지에서 성장시켰고, 이후 유일한 탄소원으로서 글루코오스 또는 자일로오스 중 하나를 이용하여 지질 생산성 단계에 적용시켰다. 당이 배지에서 격감되었기 때문에, 소모를 멈출 때까지 상응하는 더 많은 당을 세포에 공급하였다. 이 시점에서, 실험을 종결하였고 지질 함량에 대해 세포를 분석하였다. 표 7은 지질 분석의 결과는 보여준다. 건조 세포 중량 퍼센트로 지질이 발현된 글루코오스 상에서의 균주 A의 수행에 대해 모든 균주를 표준화하였다. 배양물에 글루코오스가 공급되었을 때, 조작된 모든 균주는 부모, 비-조작된 대조군 균주와 유사하게 수행하였다. 자일로오스 (글루코오스내 균주 A에 의해 일반적으로 만들어진 6 내지 8 퍼센트의 양) 상에서 배양될 때 음성 대조군 균주 (A, B, C)는 적은 양의 지질을 생산하였다. 대조적으로, 10개의 모든 자일로오스 대사 균주는 자일로오스에서 배양될 때 상당한 양의 지질을 생산할 수 있었다. 최고의 균주, L은 글루코오스 상에서 성장할 때 균주 A에 의해 일반적으로 만들어진 지질의 양의 최대 60 퍼센트까지 축적하였다.
Figure pct00011
이들 결과는 삽입된 경로가 자일로오스로부터 탄소를 우회시킬 수 있고 지질을 생산하는 데에 이를 이용할 수 있다는 것을 보여준다.
본 발명은 이의 특정한 구체예와 연계하여 설명되었지만 이것은 추가의 변형이 있을 수 있는 것으로 이해되어야만 한다. 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따르고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되거나 통상적인 실시 범위내 있고 이전에 제시된 필수적 특징에 적용될 수 있는 바와 같이, 본 개시으로부터 비롯되는 것을 포함하는 본 발명의 임의의 변형, 용도 또는 적용을 포함하는 것으로 의도된다.
서열 목록
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
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SEQUENCE LISTING <110> SOLAZYME, INC. <120> GENETICALLY ENGINEERED MICROORGANISMS THAT METABOLIZE XYLOSE <130> 57518-418903 <140> PCT/US2012/036690 <141> 2012-05-04 <150> 61/497,501 <151> 2011-06-15 <150> 61/483,550 <151> 2011-05-06 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 541 <212> DNA <213> Prototheca kruegani <400> 1 tgttgaagaa tgagccggcg agttaaaaag agtggcatgg ttaaagaaaa tactctggag 60 ccatagcgaa agcaagttta gtaagcttag gtcattcttt ttagacccga aaccgagtga 120 tctacccatg atcagggtga agtgttagta aaataacatg gaggcccgaa ccgactaatg 180 ttgaaaaatt agcggatgaa ttgtgggtag gggcgaaaaa ccaatcgaac tcggagttag 240 ctggttctcc ccgaaatgcg tttaggcgca gcagtagcag tacaaataga ggggtaaagc 300 actgtttctt ttgtgggctt cgaaagttgt acctcaaagt ggcaaactct gaatactcta 360 tttagatatc tactagtgag accttggggg ataagctcct tggtcaaaag ggaaacagcc 420 cagatcacca gttaaggccc caaaatgaaa atgatagtga ctaaggatgt gggtatgtca 480 aaacctccag caggttagct tagaagcagc aatcctttca agagtgcgta atagctcact 540 g 541 <210> 2 <211> 573 <212> DNA <213> Prototheca wickerhamii <400> 2 tgttgaagaa tgagccggcg acttaaaata aatggcaggc taagagattt aataactcga 60 aacctaagcg aaagcaagtc ttaatagggc gtcaatttaa caaaacttta aataaattat 120 aaagtcattt attttagacc cgaacctgag tgatctaacc atggtcagga tgaaacttgg 180 gtgacaccaa gtggaagtcc gaaccgaccg atgttgaaaa atcggcggat gaactgtggt 240 tagtggtgaa ataccagtcg aactcagagc tagctggttc tccccgaaat gcgttgaggc 300 gcagcaatat atctcgtcta tctaggggta aagcactgtt tcggtgcggg ctatgaaaat 360 ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact agaaatgacg atatattagt gagactatgg 420 gggataagct ccatagtcga gagggaaaca gcccagacca ccagttaagg ccccaaaatg 480 ataatgaagt ggtaaaggag gtgaaaatgc aaatacaacc aggaggttgg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 3 <211> 541 <212> DNA <213> Prototheca stagnora <400> 3 tgttgaagaa tgagccggcg agttaaaaaa aatggcatgg ttaaagatat ttctctgaag 60 ccatagcgaa agcaagtttt acaagctata gtcatttttt ttagacccga aaccgagtga 120 tctacccatg atcagggtga agtgttggtc aaataacatg gaggcccgaa ccgactaatg 180 gtgaaaaatt agcggatgaa ttgtgggtag gggcgaaaaa ccaatcgaac tcggagttag 240 ctggttctcc ccgaaatgcg tttaggcgca gcagtagcaa cacaaataga ggggtaaagc 300 actgtttctt ttgtgggctt cgaaagttgt acctcaaagt ggcaaactct gaatactcta 360 tttagatatc tactagtgag accttggggg ataagctcct tggtcaaaag ggaaacagcc 420 cagatcacca gttaaggccc caaaatgaaa atgatagtga ctaaggacgt gagtatgtca 480 aaacctccag caggttagct tagaagcagc aatcctttca agagtgcgta atagctcact 540 g 541 <210> 4 <211> 541 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 4 tgttgaagaa tgagccggcg agttaaaaag agtggcatgg ttaaagataa ttctctggag 60 ccatagcgaa agcaagttta acaagctaaa gtcacccttt ttagacccga aaccgagtga 120 tctacccatg atcagggtga agtgttggta aaataacatg gaggcccgaa ccgactaatg 180 gtgaaaaatt agcggatgaa ttgtgggtag gggcgaaaaa ccaatcgaac tcggagttag 240 ctggttctcc ccgaaatgcg tttaggcgca gcagtagcaa cacaaataga ggggtaaagc 300 actgtttctt ttgtgggctt cgaaagttgt acctcaaagt ggcaaactct gaatactcta 360 tttagatatc tactagtgag accttggggg ataagctcct tggtcaaaag ggaaacagcc 420 cagatcacca gttaaggccc caaaatgaaa atgatagtga ctaaggatgt gggtatgtta 480 aaacctccag caggttagct tagaagcagc aatcctttca agagtgcgta atagctcact 540 g 541 <210> 5 <211> 573 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 5 tgttgaagaa tgagccggcg acttaaaata aatggcaggc taagagaatt aataactcga 60 aacctaagcg aaagcaagtc ttaatagggc gctaatttaa caaaacatta aataaaatct 120 aaagtcattt attttagacc cgaacctgag tgatctaacc atggtcagga tgaaacttgg 180 gtgacaccaa gtggaagtcc gaaccgaccg atgttgaaaa atcggcggat gaactgtggt 240 tagtggtgaa ataccagtcg aactcagagc tagctggttc tccccgaaat gcgttgaggc 300 gcagcaatat atctcgtcta tctaggggta aagcactgtt tcggtgcggg ctatgaaaat 360 ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact agaaatgacg atatattagt gagactatgg 420 gggataagct ccatagtcga gagggaaaca gcccagacca ccagttaagg ccccaaaatg 480 ataatgaagt ggtaaaggag gtgaaaatgc aaatacaacc aggaggttgg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 6 <211> 573 <212> DNA <213> Prototheca wickerhamii <400> 6 tgttgaagaa tgagccgtcg acttaaaata aatggcaggc taagagaatt aataactcga 60 aacctaagcg aaagcaagtc ttaatagggc gctaatttaa caaaacatta aataaaatct 120 aaagtcattt attttagacc cgaacctgag tgatctaacc atggtcagga tgaaacttgg 180 gtgacaccaa gtggaagtcc gaaccgaccg atgttgaaaa atcggcggat gaactgtggt 240 tagtggtgaa ataccagtcg aactcagagc tagctggttc tccccgaaat gcgttgaggc 300 gcagcaatat atctcgtcta tctaggggta aagcactgtt tcggtgcggg ctatgaaaat 360 ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact agaaatgacg atatattagt gagactatgg 420 gggataagct ccatagtcga gagggaaaca gcccagacca ccagttaagg ccccaaaatg 480 ataatgaagt ggtaaaggag gtgaaaatgc aaatacaacc aggaggttgg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 7 <211> 541 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 7 tgttgaagaa tgagccggcg agttaaaaag agtggcgtgg ttaaagaaaa ttctctggaa 60 ccatagcgaa agcaagttta acaagcttaa gtcacttttt ttagacccga aaccgagtga 120 tctacccatg atcagggtga agtgttggta aaataacatg gaggcccgaa ccgactaatg 180 gtgaaaaatt agcggatgaa ttgtgggtag gggcgaaaaa ccaatcgaac tcggagttag 240 ctggttctcc ccgaaatgcg tttaggcgca gcagtagcaa cacaaataga ggggtaaagc 300 actgtttctt ttgtgggctc cgaaagttgt acctcaaagt ggcaaactct gaatactcta 360 tttagatatc tactagtgag accttggggg ataagctcct tggtcgaaag ggaaacagcc 420 cagatcacca gttaaggccc caaaatgaaa atgatagtga ctaaggatgt gagtatgtca 480 aaacctccag caggttagct tagaagcagc aatcctttca agagtgcgta atagctcact 540 g 541 <210> 8 <211> 541 <212> DNA <213> Prototheca zopfii <400> 8 tgttgaagaa tgagccggcg agttaaaaag agtggcatgg ttaaagaaaa ttctctggag 60 ccatagcgaa agcaagttta acaagcttaa gtcacttttt ttagacccga aaccgagtga 120 tctacccatg atcagggtga agtgttggta aaataacatg gaggcccgaa ccgactaatg 180 gtgaaaaatt agcggatgaa ttgtgggtag gggcgaaaaa ccaatcgaac tcggagttag 240 ctggttctcc ccgaaatgcg tttaggcgca gcagtagcaa cacaaataga ggggtaaagc 300 actgtttctt tcgtgggctt cgaaagttgt acctcaaagt ggcaaactct gaatactcta 360 tttagatatc tactagtgag accttggggg ataagctcct tggtcaaaag ggaaacagcc 420 cagatcacca gttaaggccc caaaatgaaa atgatagtga ctaaggatgt gagtatgtca 480 aaacctccag caggttagct tagaagcagc aatcctttca agagtgcgta atagctcact 540 g 541 <210> 9 <211> 565 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ggtggcaaga gggcggcagc acttgctgga gctgccgcgg tgcctccagg 240 tggttcaatc gcggcagcca gagggatttc agatgatcgc gcgtacaggt tgagcagcag 300 tgtcagcaaa ggtagcagtt tgccagaatg atcggttcag ctgttaatca atgccagcaa 360 gagaaggggt caagtgcaaa cacgggcatg ccacagcacg ggcaccgggg agtggaatgg 420 caccaccaag tgtgtgcgag ccagcatcgc cgcctggctg tttcagctac aacggcagga 480 gtcatccaac gtaaccatga gctgatcaac actgcaatca tcgggcgggc gtgatgcaag 540 catgcctggc gaagacacat ggtgtgcgga tgctgccggc tgctgcctgc tgcgcacgcc 600 gttgagttgg cagcaggctc agccatgcac tggatggcag ctgggctgcc actgcaatgt 660 ggtggatagg atgcaagtgg agcgaatacc aaaccctctg gctgcttgct gggttgcatg 720 gcatcgcacc atcagcagga gcgcatgcga agggactggc cccatgcacg ccatgccaaa 780 ccggagcgca ccgagtgtcc acactgtcac caggcccgca agctttgcag aaccatgctc 840 atggacgcat gtagcgctga cgtcccttga cggcgctcct ctcgggtgtg ggaaacgcaa 900 tgcagcacag gcagcagagg cggcggcagc agagcggcgg cagcagcggc gggggccacc 960 cttcttgcgg ggtcgcgccc cagccagcgg tgatgcgctg atcccaaacg agttcacatt 1020 catttgcatg cctggagaag cgaggctggg gcctttgggc tggtgcagcc cgcaatggaa 1080 tgcgggaccg ccaggctagc agcaaaggcg cctcccctac tccgcatcga tgttccatag 1140 tgcattggac tgcatttggg tggggcggcc ggctgtttct ttcgtgttgc aaaacgcgcc 1200 agctcagcaa cctgtcccgt gggtcccccg tgccgatgaa atcgtgtgca cgccgatcag 1260 ctgattgccc ggctcgcgaa gtaggcgccc tcctttctgc tcgccctctc tccgtcccgc 1320 cactagtggc gcgcc 1335 <210> 11 <211> 1187 <212> DNA <213> Parachlorella kessleri <400> 11 gatcagacgg gcctgacctg cgagataatc aagtgctcgt aggcaaccaa ctcagcagct 60 gcttggtgtt gggtctgcag gatagtgttg cagggcccca aggacagcag gggaacttac 120 accttgtccc cgacccagtt ttatggagtg cattgcctca agagcctagc cggagcgcta 180 ggctacatac ttgccgcacc ggtatgaggg gatatagtac tcgcactgcg ctgtctagtg 240 agatgggcag tgctgcccat aaacaactgg ctgctcagcc atttgttggc ggaccattct 300 gggggggcca gcaatgcctg actttcgggt agggtgaaaa ctgaacaaag actaccaaaa 360 cagaatttct tcctccttgg aggtaagcgc aggccggccc gcctgcgccc acatggcgct 420 ccgaacacct ccatagctgt aagggcgcaa acatggccgg actgttgtca gcactctttc 480 atggccatac aaggtcatgt cgagattagt gctgagtaag acactatcac cccatgttcg 540 attgaagccg tgacttcatg ccaacctgcc cctgggcgta gcagacgtat gccatcatga 600 ccactagccg acatgcgctg tcttttgcca ccaaaacaac tggtacaccg ctcgaagtcg 660 tgccgcacac ctccgggagt gagtccggcg actcctcccc ggcgggccgc ggccctacct 720 gggtagggtc gccatacgcc cacgaccaaa cgacgcagga ggggattggg gtagggaatc 780 ccaaccagcc taaccaagac ggcacctata ataataggtg gggggactaa cagccctata 840 tcgcaagctt tgggtgccta tcttgagaag cacgagttgg agtggctgtg tacggtcgac 900 cctaaggtgg gtgtgccgca gcctgaaaca aagcgtctag cagctgcttc tataatgtgt 960 cagccgttgt gtttcagtta tattgtatgc tattgtttgt tcgtgctagg gtggcgcagg 1020 cccacctact gtggcgggcc attggttggt gcttgaattg cctcaccatc taaggtctga 1080 acgctcactc aaacgccttt gtacaactgc agaactttcc ttggcgctgc aactacagtg 1140 tgcaaaccag cacatagcac tcccttacat cacccagcag tacaaca 1187 <210> 12 <211> 1414 <212> DNA <213> Chlorella ellipsoidea <400> 12 cgctgcgcac cagggccgcc agctcgctga tgtcgctcca aatgcggtcc cccgattttt 60 tgttcttcat cttctccacc ttggtggcct tcttggccag ggccttcagc tgcatgcgca 120 cagaccgttg agctcctgat cagcatcctc aggaggccct ttgacaagca agcccctgtg 180 caagcccatt cacggggtac cagtggtgct gaggtagatg ggtttgaaaa ggattgctcg 240 gtcgattgct gctcatggaa ttggcatgtg catgcatgtt cacaatatgc caccaggctt 300 tggagcaaga gagcatgaat gccttcaggc aggttgaaag ttcctggggg tgaagaggca 360 gggccgagga ttggaggagg aaagcatcaa gtcgtcgctc atgctcatgt tttcagtcag 420 agtttgccaa gctcacagga gcagagacaa gactggctgc tcaggtgttg catcgtgtgt 480 gtggtggggg ggggggggtt aatacggtac gaaatgcact tggaattccc acctcatgcc 540 agcggaccca catgcttgaa ttcgaggcct gtggggtgag aaatgctcac tctgccctcg 600 ttgctgaggt acttcaggcc gctgagctca aagtcgatgc cctgctcgtc tatcagggcc 660 tgcacctctg ggctgaccgg ctcagcctcc ttcgcgggca tggagtaggc gccggcagcg 720 ttcatgtccg ggcccagggc agcggtggtg ccataaatgt cggtgatggt ggggaggggg 780 gccgtcgcca caccattgcc gttgctggct gacgcatgca catgtggcct ggctggcacc 840 ggcagcactg gtctccagcc agccagcaag tggctgttca ggaaagcggc catgttgttg 900 gtccctgcgc atgtaattcc ccagatcaaa ggagggaaca gcttggattt gatgtagtgc 960 ccaaccggac tgaatgtgcg atggcaggtc cctttgagtc tcccgaatta ctagcagggc 1020 actgtgacct aacgcagcat gccaaccgca aaaaaatgat tgacagaaaa tgaagcggtg 1080 tgtcaatatt tgctgtattt attcgtttta atcagcaacc aagttcgaaa cgcaactatc 1140 gtggtgatca agtgaacctc atcagactta cctcgttcgg caaggaaacg gaggcaccaa 1200 attccaattt gatattatcg cttgccaagc tagagctgat ctttgggaaa ccaactgcca 1260 gacagtggac tgtgatggag tgccccgagt ggtggagcct cttcgattcg gttagtcatt 1320 actaacgtga accctcagtg aagggaccat cagaccagaa agaccagatc tcctcctcga 1380 caccgagaga gtgttgcggc agtaggacga caag 1414 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 tgttgaagaa tgagccggcg ac 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 14 cagtgagcta ttacgcactc 20 <210> 15 <211> 437 <212> PRT <213> Piromyces sp. <400> 15 Met Ala Lys Glu Tyr Phe Pro Gln Ile Gln Lys Ile Lys Phe Glu Gly 1 5 10 15 Lys 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gagtagccaa agctttgtgc caatcagaaa gtcaacgcag 840 ctgcctgcct ggctcgcgta c 861 <210> 17 <211> 448 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 17 gtacccatca gcatccgggt gaatcttggc ctccaagata tggccaatcc tcacatccag 60 cttggcaaaa tcgactagac tgtctgcaag tgggaatgtg gagcacaagg ttgcttgtag 120 cgatcgacag actggtgggg tacattgaca ggtgggcagc gccgcatcca tcgtgcctga 180 cgcgagcgcc gccggttgct cgcccgtgcc tgccgtcaaa gagcggcaga gaaatcggga 240 accgaaaacg tcacattgcc tgatgttgtt acatgctgga ctagactttc ttggcgtggg 300 tctgctcctc gccaggtgcg cgacgcctcg gggctgggtg cgagggagcc gtgcggccac 360 gcatttgaca agacccaaag ctcgcatctc agacggtcaa ccgttcgtat tatacattca 420 acatatggta catacgcaaa aagcatgc 448 <210> 18 <211> 2335 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisae <400> 18 ctttcttgcg ctatgacact tccagcaaaa ggtagggcgg gctgcgagac ggcttcccgg 60 cgctgcatgc aacaccgatg atgcttcgac cccccgaagc tccttcgggg ctgcatgggc 120 gctccgatgc cgctccaggg cgagcgctgt ttaaatagcc aggcccccga ttgcaaagac 180 attatagcga gctaccaaag ccatattcaa acacctagat cactaccact tctacacagg 240 ccactcgagc ttgtgatcgc actccgctaa gggggcgcct cttcctcttc gtttcagtca 300 caacccgcaa acggcgcgcc atgctgctgc aggccttcct gttcctgctg gccggcttcg 360 ccgccaagat cagcgcctcc atgacgaacg agacgtccga ccgccccctg gtgcacttca 420 cccccaacaa gggctggatg aacgacccca acggcctgtg gtacgacgag aaggacgcca 480 agtggcacct gtacttccag tacaacccga acgacaccgt ctgggggacg cccttgttct 540 ggggccacgc cacgtccgac gacctgacca actgggagga ccagcccatc gccatcgccc 600 cgaagcgcaa cgactccggc gccttctccg gctccatggt ggtggactac aacaacacct 660 ccggcttctt caacgacacc atcgacccgc gccagcgctg cgtggccatc tggacctaca 720 acaccccgga gtccgaggag cagtacatct cctacagcct ggacggcggc tacaccttca 780 ccgagtacca gaagaacccc gtgctggccg ccaactccac ccagttccgc gacccgaagg 840 tcttctggta cgagccctcc cagaagtgga tcatgaccgc ggccaagtcc caggactaca 900 agatcgagat ctactcctcc gacgacctga agtcctggaa gctggagtcc gcgttcgcca 960 acgagggctt cctcggctac cagtacgagt gccccggcct gatcgaggtc cccaccgagc 1020 aggaccccag caagtcctac tgggtgatgt tcatctccat caaccccggc gccccggccg 1080 gcggctcctt caaccagtac ttcgtcggca gcttcaacgg cacccacttc gaggccttcg 1140 acaaccagtc ccgcgtggtg gacttcggca aggactacta cgccctgcag accttcttca 1200 acaccgaccc gacctacggg agcgccctgg gcatcgcgtg ggcctccaac tgggagtact 1260 ccgccttcgt gcccaccaac ccctggcgct cctccatgtc cctcgtgcgc aagttctccc 1320 tcaacaccga gtaccaggcc aacccggaga cggagctgat caacctgaag gccgagccga 1380 tcctgaacat cagcaacgcc ggcccctgga gccggttcgc caccaacacc acgttgacga 1440 aggccaacag ctacaacgtc gacctgtcca acagcaccgg caccctggag ttcgagctgg 1500 tgtacgccgt caacaccacc cagacgatct ccaagtccgt gttcgcggac ctctccctct 1560 ggttcaaggg cctggaggac cccgaggagt acctccgcat gggcttcgag gtgtccgcgt 1620 cctccttctt cctggaccgc gggaacagca aggtgaagtt cgtgaaggag aacccctact 1680 tcaccaaccg catgagcgtg aacaaccagc ccttcaagag cgagaacgac ctgtcctact 1740 acaaggtgta cggcttgctg gaccagaaca tcctggagct gtacttcaac gacggcgacg 1800 tcgtgtccac caacacctac ttcatgacca ccgggaacgc cctgggctcc gtgaacatga 1860 cgacgggggt ggacaacctg ttctacatcg acaagttcca ggtgcgcgag gtcaagtgat 1920 taattaactc gaggcagcag cagctcggat agtatcgaca cactctggac gctggtcgtg 1980 tgatggactg ttgccgccac acttgctgcc ttgacctgtg aatatccctg ccgcttttat 2040 caaacagcct cagtgtgttt gatcttgtgt gtacgcgctt ttgcgagttg ctagctgctt 2100 gtgctatttg cgaataccac ccccagcatc cccttccctc gtttcatatc gcttgcatcc 2160 caaccgcaac ttatctacgc tgtcctgcta tccctcagcg ctgctcctgc tcctgctcac 2220 tgcccctcgc acagccttgg tttgggctcc gcctgtattc tcctggtact gcaacctgta 2280 aaccagcact gcaatgctga tgcacgggaa gtagtgggat gggaacacaa atgga 2335 <210> 19 <211> 1176 <212> DNA <213> Chlorella protothecoides <400> 19 gagtttaggt ccagcgtccg tgggggggga cgggctggga gcttgggccg ggaagggcaa 60 gacgatgcag tccctctggg gagtcacagc cgactgtgtg tgttgcactg tgcggcccgc 120 agcactcaca cgcaaaatgc ctggccgaca ggcaggccct gtccagtgca acatccacgg 180 tccctctcat caggctcacc ttgctcattg acataacgga atgcgtaccg ctctttcaga 240 tctgtccatc cagagagggg agcaggctcc ccaccgacgc tgtcaaactt gcttcctgcc 300 caaccgaaaa cattattgtt tgaggggggg gggggggggg cagattgcat ggcgggatat 360 ctcgtgagga 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<400> 20 atgaccacca cccccttcga cgcccccgac aagctgttcc tgggcttcga cctgtccacc 60 cagcagctga agatcatcgt caccgacgag aacctggcgg ccctgaagac ctacaacgtg 120 gagttcgact cgatcaactc cagcgtgcag aagggcgtca tcgcgatcaa cgacgagatc 180 tccaagggcg ccatcatcag ccccgtctac atgtggctgg acgcgctgga ccacgtgttc 240 gaggacatga agaaggacgg cttccccttc aacaaggtcg tgggcatctc cggctcgtgc 300 cagcagcacg gcagcgtcta ctggtcccgc accgccgaga aggtgctgtc ggagctggac 360 gccgagtcgt ccctgagctc ccagatgcgc tcggccttca ccttcaagca cgcgcccaac 420 tggcaggacc acagcaccgg caaggagctg gaggagttcg agcgcgtgat cggcgcggac 480 gccctggcgg acatctcggg ctcccgcgcc cactaccgct tcaccggcct gcagatccgc 540 aagctgagca cccgcttcaa gcccgagaag tacaaccgca ccgcgcgcat ctccctggtg 600 tcgagcttcg tggcctcggt gctgctgggc cgcatcacca gcatcgagga ggccgacgcc 660 tgcggcatga acctgtacga catcgagaag cgcgagttca acgaggagct gctggccatc 720 gccgccggcg tgcaccccga gctggacggc gtggagcagg acggcgagat ctaccgcgcc 780 ggcatcaacg agctgaagcg caagctgggc cccgtgaagc ccatcaccta cgagtcggag 840 ggcgacatcg cctcctactt cgtgacccgc tacggcttca accccgactg caagatctac 900 tccttcacgg gcgacaacct ggccaccatc atctcgctgc ccctggcccc caacgacgcc 960 ctgatctcgc tgggcaccag caccaccgtc ctgatcatca ccaagaacta cgccccctcc 1020 tcgcagtacc acctgttcaa gcaccccacc atgcccgacc actacatggg catgatctgc 1080 tactgcaacg gcagcctggc ccgcgagaag gtccgcgacg aggtcaacga gaagttcaac 1140 gtcgaggaca agaagtcctg ggacaagttc aacgagatcc tggacaagtc gaccgacttc 1200 aacaacaagc tgggcatcta cttccccctg ggcgagatcg tgcccaacgc cgcggcccag 1260 atcaagcgca gcgtcctgaa ctccaagaac gagatcgtcg acgtggagct gggcgacaag 1320 aactggcagc ccgaggacga cgtctcgtcc atcgtggaga gccagaccct gagctgccgc 1380 ctgcgcaccg gccccatgct gtccaagtcc ggcgactcgt cggcgagctc ctccgcctcg 1440 ccccagcccg agggcgacgg caccgacctg cacaaggtct accaggacct ggtcaagaag 1500 ttcggcgacc tgtacaccga cggcaagaag cagaccttcg agagcctgac cgcccgcccc 1560 aaccgctgct actacgtcgg cggcgcgtcc aacaacggct cgatcatccg caagatgggc 1620 agcatcctgg cgcccgtcaa cggcaactac aaggtggaca tccccaacgc gtgcgccctg 1680 ggcggcgcct acaaggcctc ctggtcctac gagtgcgagg ccaagaagga gtggatcggc 1740 tacgaccagt acatcaaccg cctgttcgag gtgagcgacg agatgaactc gttcgaggtc 1800 aaggacaagt ggctggagta cgccaacggc gtcggcatgc tggccaagat ggagtcggag 1860 ctgaagcact ag 1872 <210> 21 <211> 160 <212> DNA <213> Chlorella protothecoides <400> 21 acggagcgtc gtgcgggagg gagtgtgccg agcggggagt cccggtctgt gcgaggcccg 60 gcagctgacg ctggcgagcc gtacgccccg agggtccccc tcccctgcac cctcttcccc 120 ttccctctga cggccgcgcc tgttcttgca tgttcagcga 160 <210> 22 <211> 1296 <212> DNA <213> Chlorella protothecoides <400> 22 gtttaggtcc agcgtccgtg gggggggcgt gagactcccc cctgaccttc gtatggcagg 60 gactcctact tgccaagtaa tcagttgaca atgccacttc aatgctcgtt gtggtacact 120 gacgcgggtc taacatactg ggaagcatga attgccgaca tggactcagt tggagacagt 180 aacagctctt tgtgttctat cttcaggaac acatttggca gcgcacccat acagtggcgc 240 acacgcagct gtacctgatg tggctctatt cccacatgtt tcaacttgat ccaaaagtca 300 ctcagactct cagcagctag acttgatcgc atctttggcc aagaagatgc ttgcgcaact 360 ctaggaatgg aacgagaaaa gagcctgctc tgatcggata tttccattct ctggatggga 420 ctgagatgat tctgaagaaa tgctgctcga cttatttgga agaacagcac ctgacgcatg 480 ctttgaggct gctgtggctg ggatgtgctg tatttgtcag cattgagcat ctacgggtag 540 atggccataa ccacgcgctg cctatcatgc ggtgggttgt gtagaaaacg tacaatggac 600 agaaatcaat cccattgcga gcctagcgtg cagccatgcg ctccctctgt agccccgctc 660 caagacaaag ccagccaatg ccagaaccca catagagagg gtatcttcct aatgacctcg 720 cccatcattt cctccaaatt aactataatg ccttgattgt ggagttggct ttggcttgca 780 gctgctcgcg ctggcacttt tgtaggcagc acagggtatg ccagcgccga actttgtgcc 840 cttgagcagg ccacaagggc acaagactac accatgcagc tggtatactt ggaactgata 900 ccattcttac caagcaaggc acagcacagc ctgcaccgac tcactttgct tgagcggggc 960 acagcgccgc gactgatcct gcgagctgtg gggagttccg actgttctgg acctcggtct 1020 ctgaaagatg tgtacgatgg gatcaagtca ttcaagtatg ctcttcacat gagcaatcgg 1080 gggagacacg gtggccctaa aggtgttcat ctgattcaag tgtagtgggg gggtgctgtt 1140 tgtcccgggg cgccccccgc tccccgaccc cggagaaggg ccccagagga ctcggccgcc 1200 cacagaggaa taaccgggcg tggctcggcc ctgcgcctcc ctctttcaat atttcacctg 1260 gtgttcagtg cacggacacg taaagaacta gataca 1296 <210> 23 <211> 1314 <212> DNA <213> Piromyces sp. <400> 23 atggccaagg agtacttccc ccagatccag aagatcaagt tcgagggcaa ggacagcaag 60 aacccgctgg cgttccacta ctacgacgcg gagaaggagg tcatgggcaa gaagatgaag 120 gactggctgc gcttcgcgat ggcctggtgg cacaccctgt gcgcggaggg cgcggaccag 180 ttcggcggcg gcaccaagtc gttcccgtgg aacgagggca ccgacgccat cgagatcgcc 240 aagcagaagg tcgacgcggg cttcgagatc atgcagaagc tgggcatccc ctactactgc 300 ttccacgacg tggacctggt gagcgagggc aactccatcg aggagtacga gtcgaacctg 360 aaggccgtgg tggcgtacct gaaggagaag cagaaggaga ccggcatcaa gctgctgtgg 420 tcgaccgcga acgtcttcgg ccacaagcgc tacatgaacg gcgccagcac caaccccgac 480 ttcgacgtgg tcgcgcgcgc catcgtccag atcaagaacg cgatcgacgc cggcatcgag 540 ctgggcgccg agaactacgt gttctggggc ggccgcgagg gctacatgtc cctgctgaac 600 acggaccaga agcgcgagaa ggagcacatg gcgaccatgc tgacgatggc ccgcgactac 660 gcccgctcga agggcttcaa gggcaccttc ctgatcgagc ccaagccgat ggagcccacc 720 aagcaccagt acgacgtcga caccgagacc gcgatcggct tcctgaaggc gcacaacctg 780 gacaaggact tcaaggtgaa catcgaggtg aaccacgcca ccctggcggg ccacaccttc 840 gagcacgagc tggcgtgcgc cgtggacgcc ggcatgctgg gcagcatcga cgcgaaccgc 900 ggcgactacc agaacggctg ggacaccgac cagttcccca tcgaccagta cgagctggtg 960 caggcctgga tggagatcat ccgcggcggc ggcttcgtca ccggcggcac gaacttcgac 1020 gccaagaccc gccgcaactc caccgacctg gaggacatca tcatcgcgca cgtctcgggc 1080 atggacgcca tggcccgcgc cctggagaac gccgcgaagc tgctgcagga gagcccctac 1140 accaagatga agaaggagcg ctacgcctcc ttcgactcgg gcatcggcaa ggacttcgag 1200 gacggcaagc tgaccctgga gcaggtctac gagtacggca agaagaacgg cgagcccaag 1260 cagacctccg gcaagcagga gctgtacgag gccatcgtgg cgatgtacca gtag 1314 <210> 24 <211> 398 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 24 Met Arg Val Glu Ile Trp Arg Thr Gly Ser Pro Tyr Ala Val Pro Glu 1 5 10 15 Gly Leu Tyr Trp Val Glu Ser Asp Leu Gly Ala Ala Thr His Arg Glu 20 25 30 Ser Glu Pro Ser Arg Gly Gly Thr Leu Leu Arg Gly Pro Ala Leu Thr 35 40 45 Pro Arg Pro Pro Ala Cys Ile Arg Asp 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ccctgaacga gctgcaggac gaggccgccc gcctgtcctg gctggccacc 540 accggcgtgc cctgcgccgc cgtgctggac gtggtgaccg aggccggccg cgactggctg 600 ctgctgggcg aggtgcccgg ccaggacctg ctgtcctccc acctggcccc cgccgagaag 660 gtgtccatca tggccgacgc catgcgccgc ctgcacaccc tggaccccgc cacctgcccc 720 ttcgaccacc aggccaagca ccgcatcgag cgcgcccgca cccgcatgga ggccggcctg 780 gtggaccagg acgacctgga cgaggagcac cagggcctgg cccccgccga gctgttcgcc 840 cgcctgaagg cccgcatgcc cgacggcgag gacctggtgg tgacccacgg cgacgcctgc 900 ctgcccaaca tcatggtgga gaacggccgc ttctccggct tcatcgactg cggccgcctg 960 ggcgtggccg accgctacca ggacatcgcc ctggccaccc gcgacatcgc cgaggagctg 1020 ggcggcgagt gggccgaccg ctgacaattg gcagcagcag ctcggatagt atcgacacac 1080 tctggacgct ggtcgtgtga tggactgttg ccgccacact tgctgccttg acctgtgaat 1140 atccctgccg cttttatcaa acagcctcag tgtgtttgat cttgtgtgta cgcgcttttg 1200 cgagttgcta gctgcttgtg ctatttgcga ataccacccc cagcatcccc ttccctcgtt 1260 tcatatcgct tgcatcccaa ccgcaactta tctacgctgt cctgctatcc ctcagcgctg 1320 ctcctgctcc tgctcactgc ccctcgcaca gccttggttt gggctccgcc tgtattctcc 1380 tggtactgca acctgtaaac cagcactgca atgctgatgc acgggaagta gtgggatggg 1440 aacacaaatg ga 1452 <210> 30 <211> 1197 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 30 atgagggtgg agatctggag aactgggtcg ccttatgccg tgccggaggg cttgtactgg 60 gttgagagtg atttgggtgc ggcgacgcac cgggagagcg agcccagccg aggcggtact 120 ttgctccgcg ggcccgccct cacgccccgc ccacccgcat gcatccgcga cctgcgcagg 180 gggcgcgccg ccgtgggctc ctccgactcg aaccccgacg agaagtccga cctgggcgag 240 gccgagaaga aggagaagaa ggccaagacc ctgcagctgg gcatcgtgtt cggcctgtgg 300 tacttccaga acatcgtctt caacatcttc aacaagaagg ccctgaacgt gttcccctac 360 ccctggctcc tggcctcctt ccagctgttc gccggctcca tctggatgct ggtgctgtgg 420 tcgttcaagc tgtacccctg ccccaagatc tcgaagccgt tcatcatcgc gctgctgggc 480 cccgccctgt tccacaccat cggccacatc tccgcctgcg tgtccttctc caaggtggcc 540 gtctcgttca cccacgtgat caagtccgcc gagcccgtgt tctccgtgat cttctcctcg 600 ctgctgggcg actcctaccc cctggccgtg tggctgtcca tcctgcccat cgtgatgggc 660 tgctccctgg ccgccgtgac cgaggtctcg ttcaacctgg gcggcctgtc cggcgccatg 720 atctccaacg tgggcttcgt gctgcgcaac atctactcca agcgctccct gcagtccttc 780 aaggagatcg acggcctcaa cctgtacggc tgcatctcca tcctgtccct gctgtacctg 840 ttccccgtgg ccatcttcgt ggagggctcc cactgggtgc ccggctacca caaggccatc 900 gcctccgtgg gcaccccctc caccttctac ttctgggtct ggctgtcggg cgtgttctac 960 cacctgtaca accagtcctc ctaccaggcc ctggacgaga tctcccccct gaccttctcg 1020 gtcggcaaca ccatgaagcg cgtggtggtg atcatctcca ccgtgctggt gttccgcaac 1080 cccgtgcgcc ccctgaacgc cctgggctcc gccatcgcca tctgcggcac cttcctgtac 1140 tcccaggcca ccgccaagaa gaagaagatc gaggtgggcg gcgacaagaa gaactga 1197 <210> 31 <211> 1333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 31 ggtacccgcc tgcaacgcaa gggcagccac agccgctccc acccgccgct gaaccgacac 60 gtgcttgggc gcctgccgcc tgcctgccgc atgcttgtgc tggtgaggct gggcagtgct 120 gccatgctga ttgaggcttg gttcatcggg tggaagctta tgtgtgtgct gggcttgcat 180 gccgggcaat gcgcatggtg gcaagagggc ggcagcactt gctggagctg ccgcggtgcc 240 tccaggtggt tcaatcgcgg cagccagagg gatttcagat gatcgcgcgt acaggttgag 300 cagcagtgtc agcaaaggta gcagtttgcc agaatgatcg gttcagctgt taatcaatgc 360 cagcaagaga aggggtcaag tgcaaacacg ggcatgccac agcacgggca ccggggagtg 420 gaatggcacc accaagtgtg tgcgagccag catcgccgcc tggctgtttc agctacaacg 480 gcaggagtca tccaacgtaa ccatgagctg atcaacactg caatcatcgg gcgggcgtga 540 tgcaagcatg cctggcgaag acacatggtg tgcggatgct gccggctgct gcctgctgcg 600 cacgccgttg agttggcagc aggctcagcc atgcactgga tggcagctgg gctgccactg 660 caatgtggtg gataggatgc aagtggagcg aataccaaac cctctggctg cttgctgggt 720 tgcatggcat cgcaccatca gcaggagcgc atgcgaaggg actggcccca tgcacgccat 780 gccaaaccgg agcgcaccga gtgtccacac tgtcaccagg cccgcaagct ttgcagaacc 840 atgctcatgg acgcatgtag cgctgacgtc ccttgacggc gctcctctcg ggtgtgggaa 900 acgcaatgca gcacaggcag cagaggcggc ggcagcagag cggcggcagc agcggcgggg 960 gccacccttc ttgcggggtc gcgccccagc cagcggtgat gcgctgatcc caaacgagtt 1020 cacattcatt tgcatgcctg gagaagcgag gctggggcct ttgggctggt gcagcccgca 1080 atggaatgcg ggaccgccag gctagcagca aaggcgcctc ccctactccg catcgatgtt 1140 ccatagtgca ttggactgca tttgggtggg gcggccggct gtttctttcg tgttgcaaaa 1200 cgcgccagct cagcaacctg tcccgtgggt cccccgtgcc gatgaaatcg tgtgcacgcc 1260 gatcagctga ttgcccggct cgcgaagtag gcgccctcct ttctgctcgc cctctctccg 1320 tcccgcctct aga 1333 <210> 32 <211> 1092 <212> DNA <213> Pichia stipitis <400> 32 atgaccgcca acccctccct ggtgctgaac aagatcgacg acatctcgtt cgagacctac 60 gacgcgccgg agatcagcga gcccaccgac gtcctggtgc aggtcaagaa gaccggcatc 120 tgcggctccg acatccactt ctacgcccac ggccgcatcg gcaacttcgt cctgaccaag 180 ccgatggtgc tgggccacga gtcggcgggc accgtggtcc aggtcggcaa gggcgtgacc 240 agcctgaagg tcggcgacaa cgtcgccatc gagcccggca tcccctcccg cttctcggac 300 gagtacaaga gcggccacta caacctgtgc ccgcacatgg cgttcgccgc gacccccaac 360 tccaaggagg gcgagcccaa cccgcccggc accctgtgca agtacttcaa gtcgcccgag 420 gacttcctgg tcaagctgcc cgaccacgtg agcctggagc tgggcgccct ggtcgagccg 480 ctgtccgtcg gcgtccacgc gtcgaagctg ggctccgtcg cgttcggcga ctacgtggcg 540 gtgttcggcg cgggccccgt gggcctgctg gcggccgcgg tggccaagac cttcggcgcg 600 aagggcgtca tcgtcgtgga catcttcgac aacaagctga agatggccaa ggacatcggc 660 gcggccaccc acaccttcaa ctcgaagacc ggcggctcgg aggagctgat caaggccttc 720 ggcggcaacg tcccgaacgt ggtgctggag tgcaccggcg ccgagccctg catcaagctg 780 ggcgtcgacg cgatcgcccc cggcggccgc ttcgtgcagg tgggcaacgc ggccggcccc 840 gtcagcttcc ccatcaccgt gttcgccatg aaggagctga ccctgttcgg ctccttccgc 900 tacggcttca acgactacaa gaccgccgtc ggcatcttcg acaccaacta ccagaacggc 960 cgcgagaacg cccccatcga cttcgagcag ctgatcaccc accgctacaa gttcaaggac 1020 gccatcgagg cctacgacct ggtccgcgcc ggcaagggcg ccgtgaagtg cctgatcgac 1080 ggccccgagt ag 1092 <210> 33 <211> 312 <212> DNA <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 33 ctttcttgcg ctatgacact tccagcaaaa ggtagggcgg gctgcgagac ggcttcccgg 60 cgctgcatgc aacaccgatg atgcttcgac cccccgaagc tccttcgggg ctgcatgggc 120 gctccgatgc cgctccaggg cgagcgctgt ttaaatagcc aggcccccga ttgcaaagac 180 attatagcga gctaccaaag ccatattcaa acacctagat cactaccact tctacacagg 240 ccactcgagc ttgtgatcgc actccgctaa gggggcgcct cttcctcttc gtttcagtca 300 caacccgcaa ac 312 <210> 34 <211> 957 <212> DNA <213> Pichia stipitis <400> 34 atgccctcca tcaagctgaa ctcgggctac gacatgccgg ccgtcggctt cggctgctgg 60 aaggtggacg tcgacacctg cagcgagcag atctaccgcg cgatcaagac cggctaccgc 120 ctgttcgacg gcgccgagga ctacgcgaac gagaagctgg tcggcgccgg cgtgaagaag 180 gccatcgacg agggcatcgt gaagcgcgag gacctgttcc tgacctccaa gctgtggaac 240 aactaccacc accccgacaa cgtggagaag gcgctgaacc gcaccctgtc ggacctccag 300 gtcgactacg tggacctctt cctgatccac ttcccggtga ccttcaagtt cgtgcccctg 360 gaggagaagt acccgcccgg cttctactgc ggcaagggcg acaacttcga ctacgaggac 420 gtcccgatcc tggagacctg gaaggccctg gagaagctgg tcaaggcggg caagatccgc 480 tccatcggcg tgagcaactt ccccggcgcc ctgctgctgg acctgctgcg cggcgcgacc 540 atcaagccgt ccgtcctgca ggtcgagcac cacccctacc tgcagcagcc ccgcctgatc 600 gagttcgccc agtcccgcgg catcgccgtg accgcgtaca gctccttcgg cccccagtcc 660 ttcgtggagc tgaaccaggg ccgcgccctg aacacctcgc ccctgttcga gaacgagacg 720 atcaaggcca tcgccgccaa gcacggcaag agccccgccc aggtcctgct gcgctggtcc 780 tcgcagcgcg gcatcgcgat catccccaag agcaacaccg tgccgcgcct gctggagaac 840 aaggacgtga actccttcga cctggacgag caggacttcg ccgacatcgc caagctggac 900 atcaacctgc gcttcaacga cccctgggac tgggacaaga tccccatctt cgtgtag 957 <210> 35 <211> 318 <212> PRT <213> Pichia stipitis <400> 35 Met Pro Ser Ile Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Asp Met Pro Ala Val Gly 1 5 10 15 Phe Gly Cys Trp Lys Val Asp Val Asp Thr Cys Ser Glu Gln Ile Tyr 20 25 30 Arg Ala Ile Lys Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Asp Gly Ala Glu Asp Tyr 35 40 45 Ala Asn Glu Lys Leu Val Gly Ala Gly Val Lys Lys Ala Ile Asp Glu 50 55 60 Gly Ile Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Leu Thr Ser Lys Leu Trp Asn 65 70 75 80 Asn Tyr His His Pro Asp Asn Val Glu Lys Ala Leu Asn Arg Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Leu Gln Val Asp Tyr Val Asp Leu Phe Leu Ile His Phe Pro 100 105 110 Val Thr Phe Lys Phe Val Pro Leu Glu Glu Lys Tyr Pro Pro Gly Phe 115 120 125 Tyr Cys Gly Lys Gly Asp Asn Phe Asp Tyr Glu Asp Val Pro Ile Leu 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agatcgacgt ggtgggcggc 780 tggcgctaca tgtacggctt cggcaccccc gtggcgctcc tgatgggcct gggcatgtgg 840 tccctgcccg cgtcgccccg ctggctgctg ctgcgcgcgg tgcagggcaa gggccagctg 900 caggagtaca aggagaaggc gatgctggcc ctgtccaagc tgcgcggccg cccccccggc 960 gacaagatct ccgagaagct ggtcgacgac gcctacctgt ccgtgaagac cgcctacgag 1020 gacgagaagt ccggcggcaa cttcctggag gtgttccagg gccccaacct gaaggccctg 1080 accatcggcg ggggcctggt cctgttccag cagatcaccg gccagccctc cgtgctgtac 1140 tacgccggct ccatcctgca gaccgccggc ttctcggcgg ccgccgacgc cacccgcgtg 1200 tccgtgatca tcggcgtgtt caagctgctg atgacctggg tcgcggtcgc caaggtggac 1260 gacctgggcc gccgccccct gctgatcggc ggcgtgtccg gcatcgcgct gtcgctgttc 1320 ctgctgtccg cctactacaa gttcctcggc ggcttccccc tggtggccgt gggcgccctg 1380 ctgctgtacg tgggctgcta ccagatctcc ttcggcccca tctcctggct gatggtgtcc 1440 gagatcttcc ccctccgcac ccgcggccgc ggcatctccc tggccgtgct gaccaacttc 1500 ggctccaacg ccatcgtgac cttcgccttc tcccccctga aggagttcct gggcgccgag 1560 aacctgttcc tcctgttcgg cggcatcgcc ctggtgtcgc tcctgttcgt 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Pro Ala Val Arg 115 120 125 Arg Leu His Leu Asp Ala Gly Ala Val Val Val Gln Ala Val Pro Leu 130 135 140 Pro Gln Asp Leu Glu Ala Val His His Arg Ala Ala Gly Pro Arg Pro 145 150 155 160 Val Pro His His Arg Pro His Leu Arg Leu Arg Val Leu Leu Gln Gly 165 170 175 Gly Arg Leu Val His Pro Arg Asp Gln Val Arg Arg Ala Arg Val Leu 180 185 190 Arg Asp Leu Leu Leu Ala Ala Gly Arg Leu Leu Pro Pro Gly Arg Val 195 200 205 Ala Val His Pro Ala His Arg Asp Gly Leu Leu Pro Gly Arg Arg Asp 210 215 220 Arg Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Pro Val Arg Arg His Asp Leu Gln 225 230 235 240 Arg Gly Leu Arg Ala Ala Gln His Leu Leu Gln Ala Leu Pro Ala Val 245 250 255 Leu Gln Gly Asp Arg Arg Pro Gln Pro Val Arg Leu His Leu His Pro 260 265 270 Val Pro Ala Val Pro Val Pro Arg Gly His Leu Arg Gly Gly Leu Pro 275 280 285 Leu Gly Ala Arg Leu Pro Gln Gly His Arg Leu Arg Gly His Pro Leu 290 295 300 His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Ala Val Gly Arg Val Leu Pro Pro Val 305 310 315 320 Gln Pro Val Leu Leu Pro Gly Pro Gly Arg Asp Leu Pro Pro Asp Leu 325 330 335 Leu Gly Arg Gln His His Glu Ala Arg Gly Gly Asp His Leu His Arg 340 345 350 Ala Gly Val Pro Gln Pro Arg Ala Pro Pro Glu Arg Pro Gly Leu Arg 355 360 365 His Arg His Leu Arg His Leu Pro Val Leu Pro Gly His Arg Gln Glu 370 375 380 Glu Glu Asp Arg Gly Gly Arg Arg Gln Glu Glu Leu 385 390 395 <210> 48 <211> 1114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 48 atggccaccg catccacttt ctcggcgttc aatgcccgct gcggcgacct gcgtcgctcg 60 gcgggctccg ggccccggcg cccagcgagg cccctccccg tgcgcggccg tgggctcctc 120 cgactcgaac cccgacgaga agtccgacct gggcgaggcc gagaagaagg agaagaaggc 180 caagaccctg cagctgggca tcgtgttcgg cctgtggtac ttccagaaca tcgtcttcaa 240 catcttcaac aagaaggccc tgaacgtgtt cccctacccc tggctcctgg cctccttcca 300 gctgttcgcc ggctccatct ggatgctggt gctgtggtcg ttcaagctgt acccctgccc 360 caagatctcg aagccgttca tcatcgcgct gctgggcccc gccctgttcc acaccatcgg 420 ccacatctcc gcctgcgtgt ccttctccaa ggtggccgtc tcgttcaccc acgtgatcaa 480 gtccgccgag cccgtgttct ccgtgatctt ctcctcgctg ctgggcgact cctaccccct 540 ggccgtgtgg ctgtccatcc tgcccatcgt gatgggctgc tccctggccg ccgtgaccga 600 ggtctcgttc aacctgggcg gcctgtccgg cgccatgatc tccaacgtgg gcttcgtgct 660 gcgcaacatc tactccaagc gctccctgca gtccttcaag gagatcgacg gcctcaacct 720 gtacggctgc atctccatcc tgtccctgct gtacctgttc cccgtggcca tcttcgtgga 780 gggctcccac tgggtgcccg gctaccacaa ggccatcgcc tccgtgggca ccccctccac 840 cttctacttc tgggtctggc tgtcgggcgt gttctaccac ctgtacaacc agtcctccta 900 ccaggccctg gacgagatct cccccctgac cttctcggtc ggcaacacca tgaagcgcgt 960 ggtggtgatc atctccaccg tgctggtgtt ccgcaacccc gtgcgccccc tgaacgccct 1020 gggctccgcc atcgccatct gcggcacctt cctgtactcc caggccaccg ccaagaagaa 1080 gaagatcgag gtgggcggcg acaagaagaa ctga 1114 <210> 49 <211> 371 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 49 Met Ala Thr Ala Ser Thr Phe Ser Ala Phe Asn Ala Arg Cys Gly Asp 1 5 10 15 Leu Arg Arg Ser Ala Gly Ser Gly Pro Arg Arg Pro Ala Arg Pro Leu 20 25 30 Pro Val Arg Gly Arg Gly Leu Leu Arg Leu Glu Pro Arg Arg Glu Val 35 40 45 Arg Pro Gly Arg Gly Arg Glu Glu Gly Glu Glu Gly Gln Asp Pro Ala 50 55 60 Ala Gly His Arg Val Arg Pro Val Val Leu Pro Glu His Arg Leu Gln 65 70 75 80 His Leu Gln Gln Glu Gly Pro Glu Arg Val Pro Leu Pro Leu Ala Pro 85 90 95 Gly Leu Leu Pro Ala Val Arg Arg Leu His Leu Asp Ala Gly Ala Val 100 105 110 Val Val Gln Ala Val Pro Leu Pro Gln Asp Leu Glu Ala Val His His 115 120 125 Arg Ala Ala Gly Pro Arg Pro Val Pro His His Arg Pro His Leu Arg 130 135 140 Leu Arg Val Leu Leu Gln Gly Gly Arg Leu Val His Pro Arg Asp Gln 145 150 155 160 Val Arg Arg Ala Arg Val Leu Arg Asp Leu Leu Leu Ala Ala Gly Arg 165 170 175 Leu Leu Pro Pro Gly Arg Val Ala Val His Pro Ala His Arg Asp Gly 180 185 190 Leu Leu Pro Gly Arg Arg Asp Arg Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Pro 195 200 205 Val Arg Arg His Asp Leu Gln Arg Gly Leu Arg Ala Ala Gln His Leu 210 215 220 Leu Gln Ala Leu Pro Ala Val Leu Gln Gly Asp Arg Arg Pro Gln Pro 225 230 235 240 Val Arg Leu His Leu His Pro Val Pro Ala Val Pro Val Pro Arg Gly 245 250 255 His Leu Arg Gly Gly Leu Pro Leu Gly Ala Arg Leu Pro Gln Gly His 260 265 270 Arg Leu Arg Gly His Pro Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Ala Val 275 280 285 Gly Arg Val Leu Pro Pro Val Gln Pro Val Leu Leu Pro Gly Pro Gly 290 295 300 Arg Asp Leu Pro Pro Asp Leu Leu Gly Arg Gln His His Glu Ala Arg 305 310 315 320 Gly Gly Asp His Leu His Arg Ala Gly Val Pro Gln Pro Arg Ala Pro 325 330 335 Pro Glu Arg Pro Gly Leu Arg His Arg His Leu Arg His Leu Pro Val 340 345 350 Leu Pro Gly His Arg Gln Glu Glu Glu Asp Arg Gly Gly Arg Arg Gln 355 360 365 Glu Glu Leu 370 <210> 50 <211> 363 <212> PRT <213> Pichia stipitis <400> 50 Met Thr Ala Asn Pro Ser Leu Val Leu Asn Lys Ile Asp Asp Ile Ser 1 5 10 15 Phe Glu Thr Tyr Asp Ala Pro Glu Ile Ser Glu Pro Thr Asp Val Leu 20 25 30 Val Gln Val Lys Lys Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Ile His Phe Tyr 35 40 45 Ala His Gly Arg Ile Gly Asn Phe Val Leu Thr Lys Pro Met Val Leu 50 55 60 Gly His Glu Ser Ala Gly Thr Val Val Gln Val Gly Lys Gly Val Thr 65 70 75 80 Ser Leu Lys Val Gly Asp Asn Val Ala Ile Glu Pro Gly Ile Pro Ser 85 90 95 Arg Phe Ser Asp Glu Tyr Lys Ser Gly His Tyr Asn Leu Cys Pro His 100 105 110 Met Ala Phe Ala Ala Thr Pro Asn Ser Lys Glu Gly Glu Pro Asn Pro 115 120 125 Pro Gly Thr Leu Cys Lys Tyr Phe Lys Ser Pro Glu Asp Phe Leu Val 130 135 140 Lys Leu Pro Asp His Val Ser Leu Glu Leu Gly Ala Leu Val Glu Pro 145 150 155 160 Leu Ser Val Gly Val His Ala Ser Lys Leu Gly Ser Val Ala Phe Gly 165 170 175 Asp Tyr Val Ala Val Phe Gly Ala Gly Pro Val Gly Leu Leu Ala Ala 180 185 190 Ala Val Ala Lys Thr Phe Gly Ala Lys Gly Val Ile Val Val Asp Ile 195 200 205 Phe Asp Asn Lys Leu Lys Met Ala Lys Asp Ile Gly Ala Ala Thr His 210 215 220 Thr Phe Asn Ser Lys Thr Gly Gly Ser Glu Glu Leu Ile Lys Ala Phe 225 230 235 240 Gly Gly Asn Val Pro Asn Val Val Leu Glu Cys Thr Gly Ala Glu Pro 245 250 255 Cys Ile Lys Leu Gly Val Asp Ala Ile Ala Pro Gly Gly Arg Phe Val 260 265 270 Gln Val Gly Asn Ala Ala Gly Pro Val Ser Phe Pro Ile Thr Val Phe 275 280 285 Ala Met Lys Glu Leu Thr Leu Phe Gly Ser Phe Arg Tyr Gly Phe Asn 290 295 300 Asp Tyr Lys Thr Ala Val Gly Ile Phe Asp Thr Asn Tyr Gln Asn Gly 305 310 315 320 Arg Glu Asn Ala Pro Ile Asp Phe Glu Gln Leu Ile Thr His Arg Tyr 325 330 335 Lys Phe Lys Asp Ala Ile Glu Ala Tyr Asp Leu Val Arg Ala Gly Lys 340 345 350 Gly Ala Val Lys Cys Leu Ile Asp Gly Pro Glu 355 360 <210> 51 <211> 623 <212> PRT <213> Pichia stipitis <400> 51 Met Thr Thr Thr Pro Phe Asp Ala Pro Asp Lys Leu Phe Leu Gly Phe 1 5 10 15 Asp Leu Ser Thr Gln Gln Leu Lys Ile Ile Val Thr Asp Glu Asn Leu 20 25 30 Ala Ala Leu Lys Thr Tyr Asn Val Glu Phe Asp Ser Ile Asn Ser Ser 35 40 45 Val Gln Lys Gly Val Ile Ala Ile Asn Asp Glu Ile Ser Lys Gly Ala 50 55 60 Ile Ile Ser Pro Val Tyr Met Trp Leu Asp Ala Leu Asp His Val Phe 65 70 75 80 Glu Asp Met Lys Lys Asp Gly Phe Pro Phe Asn Lys Val Val Gly Ile 85 90 95 Ser Gly Ser Cys Gln Gln His Gly Ser Val Tyr Trp Ser Arg Thr Ala 100 105 110 Glu Lys Val Leu Ser Glu Leu Asp Ala Glu Ser Ser Leu Ser Ser Gln 115 120 125 Met Arg Ser Ala Phe Thr Phe Lys His Ala Pro Asn Trp Gln Asp His 130 135 140 Ser Thr Gly Lys Glu Leu Glu Glu Phe Glu Arg Val Ile Gly Ala Asp 145 150 155 160 Ala Leu Ala Asp Ile Ser Gly Ser Arg Ala His Tyr Arg Phe Thr Gly 165 170 175 Leu Gln Ile Arg Lys Leu Ser Thr Arg Phe Lys Pro Glu Lys Tyr Asn 180 185 190 Arg Thr Ala Arg Ile Ser Leu Val Ser Ser Phe Val Ala Ser Val Leu 195 200 205 Leu Gly Arg Ile Thr Ser Ile Glu Glu Ala Asp Ala Cys Gly Met Asn 210 215 220 Leu Tyr Asp Ile Glu Lys Arg Glu Phe Asn Glu Glu Leu Leu Ala Ile 225 230 235 240 Ala Ala Gly Val His Pro Glu Leu Asp Gly Val Glu Gln Asp Gly Glu 245 250 255 Ile Tyr Arg Ala Gly Ile Asn Glu Leu Lys Arg Lys Leu Gly Pro Val 260 265 270 Lys Pro Ile Thr Tyr Glu Ser Glu Gly Asp Ile Ala Ser Tyr Phe Val 275 280 285 Thr Arg Tyr Gly Phe Asn Pro Asp Cys Lys Ile Tyr Ser Phe Thr Gly 290 295 300 Asp Asn Leu Ala Thr Ile Ile Ser Leu Pro Leu Ala Pro Asn Asp Ala 305 310 315 320 Leu Ile Ser Leu Gly Thr Ser Thr Thr Val Leu Ile Ile Thr Lys Asn 325 330 335 Tyr Ala Pro Ser Ser Gln Tyr His Leu Phe Lys His Pro Thr Met Pro 340 345 350 Asp His Tyr Met Gly Met Ile Cys Tyr Cys Asn Gly Ser Leu Ala Arg 355 360 365 Glu Lys Val Arg Asp Glu Val Asn Glu Lys Phe Asn Val Glu Asp Lys 370 375 380 Lys Ser Trp Asp Lys Phe Asn Glu Ile Leu Asp Lys Ser Thr Asp Phe 385 390 395 400 Asn Asn Lys Leu Gly Ile Tyr Phe Pro Leu Gly Glu Ile Val Pro Asn 405 410 415 Ala Ala Ala Gln Ile Lys Arg Ser Val Leu Asn Ser Lys Asn Glu Ile 420 425 430 Val Asp Val Glu Leu Gly Asp Lys Asn Trp Gln Pro Glu Asp Asp Val 435 440 445 Ser Ser Ile Val Glu Ser Gln Thr Leu Ser Cys Arg Leu Arg Thr Gly 450 455 460 Pro Met Leu Ser Lys Ser Gly Asp Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ser 465 470 475 480 Pro Gln Pro Glu Gly Asp Gly Thr Asp Leu His Lys Val Tyr Gln Asp 485 490 495 Leu Val Lys Lys Phe Gly Asp Leu Tyr Thr Asp Gly Lys Lys Gln Thr 500 505 510 Phe Glu Ser Leu Thr Ala Arg Pro Asn Arg Cys Tyr Tyr Val Gly Gly 515 520 525 Ala Ser Asn Asn Gly Ser Ile Ile Arg Lys Met Gly Ser Ile Leu Ala 530 535 540 Pro Val Asn Gly Asn Tyr Lys Val Asp Ile Pro Asn Ala Cys Ala Leu 545 550 555 560 Gly Gly Ala Tyr Lys Ala Ser Trp Ser Tyr Glu Cys Glu Ala Lys Lys 565 570 575 Glu Trp Ile Gly Tyr Asp Gln Tyr Ile Asn Arg Leu Phe Glu Val Ser 580 585 590 Asp Glu Met Asn Ser Phe Glu Val Lys Asp Lys Trp Leu Glu Tyr Ala 595 600 605 Asn Gly Val Gly Met Leu Ala Lys Met Glu Ser Glu Leu Lys His 610 615 620

Claims (90)

  1. 식물(Plantae) 계의 미생물에 있어서, 미생물은 활성 자일로오스 대사 경로 효소를 생산하도록 작동가능한 재조합 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 미생물은 자일로오스로 본질적으로 구성된 탄소원 상에서 배양될 때 세포수를 증가시키거나 또는 지질을 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는 미생물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미생물은 자일로오스를 트리글리세라이드로 전환시키는 것을 특징으로 하는 미생물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물은 탄소원으로서 글루코오스를 이용하여 배양될 때 건조 세포 중량(dry cell weight)으로 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80% 트리글리세라이드를 축적할 수 있는 것을 특징으로 하는 미생물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물은 순수한 자일로오스 상에서 배양될 때 건조 세포 중량으로 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80% 트리글리세라이드를 축적할 수 있는 것을 특징으로 하는 미생물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물은 탄소원으로서 글루코오스 상에서 배양될 때 건조 세포 중량으로 적어도 50% 트리글리세라이드를 축적할 수 있고 순수한 자일로오스 상에서 배양될 때 건조 세포 중량으로 적어도 20% 트리글리세라이드를 축적할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 질소 제한 조건 하에서 60% 글루코오스 및 40% 자일로오스인 탄소원 상에서 배양될 때, 세포는 지질을 생산하며, 여기서 탄소 원자는 동위원소 추적으로 측정된 바와 같이, 자일로오스의 탄소 원자로부터 적어도 5, l0, 20, 30, 40, 또는 50% 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물은 21, 14 또는 7일 미만 또는 이와 동일한 날 내에 유일한 탄소원으로서 2.5% 자일로오스를 가진 배양 배지에서 적어도 90%의 자일로오스를 소모할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 핵산은 활성 자일로오스 운반체, 자일룰로스-5-포스페이트 운반체, 자일로오스 이성질화효소, 자일룰로키나아제, 자일리톨 탈수소효소, 또는 자일로오스 환원효소 중 하나 이상을 암호화하도록 작동가능한 것을 특징으로 하는 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 재조합 핵산은 플라스티드(plastid)-표적 신호 서열과 작동가능한 연결된 활성 자일룰로스-5-포스페이트 운반체를 암호화하고 여기서 자일룰로스-5-포스페이트 운반체는 플라스티드 내로 자일룰로스-5-포스페이트를 운반하도록 작동가능한 것을 특징으로 하는 미생물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 핵산은 (a) 플라스티드 내로 자일룰로스-5-포스페이트의 운반을 야기하기 위하여, 플라스티드-표적 신호 서열을 가진 자일룰로스-5-포스페이트 운반체 단백질, (b) 자일룰로키나아제, 및 (c) 자일로오스 이성질화효소를 암호화하도록, 또는 자일리톨 탈수소효소 및 자일로오스 환원효소 둘 모두를 암호화하도록 작동가능한 것을 특징으로 하는 미생물.
  12. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물은 녹색식물(Viridiplantae) 아계에 속하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  13. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물은 클로로피태(Chlorophytae) 하계 또는 문, 테트라피티나(Tetraphytina) 아문, 트레복시오피세애(Trebouxiophyceae) 강, 또는 클로렐라레스 (Chlorellales) 목에 속하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  14. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물은 클로렐라(Chlorella) 또는 프로토테카(Prototheca) 속에 속하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  15. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물은 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis) 또는 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides) 종에 속하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  16. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물에 의해 생산된 지질의 지방산 프로파일을 변경하도록 작동가능한 재조합 변형을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  17. 제16항에 있어서, 재조합 변형은 활성 아실-ACP 티오에스테라아제, 케토아실-ACP 생성효소 또는 지방산 불포화효소를 암호화하거나, 또는 아실-ACP 티오에스테라아제, 케토아실-ACP 생성효소 또는 지방산 불포화효소를 감소시키거나 또는 제거하도록 작동가능한 외인성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  18. 미생물 바이오매스 또는 바이오매스로부터 생성된 산물을 생산하기 위한 방법에 있어서, 방법은 자일로오스를 미생물 바이오매스로 전환시키기 위하여 자일로오스를 포함하는 배양 배지에서 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 종속 영양으로 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 미생물 바이오매스는 미생물 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 지질은 화학물질, 윤활제, 세제, 연료, 식품 오일, 및 화장료로 구성된 그룹에서 선택된 산물을 만드는 데에 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 산물은 바이오디젤 또는 재생가능한 디젤에서 선택된 연료인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 배양배지는 50% 초과 자일로오스인 탄소원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 탄소원은 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 초과 자일로오스인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항 내지 제17항의 임의의 미생물 또는 제18항 내지 제23항의 임의의 방법에 의해 생산된 천연 오일.
  25. 제24항의 천연 오일로부터 생산된 함유화학물질(oleochemical), 식품 오일, 연료, 또는 기타 제품.
  26. 자일로오스 전이체 단백질(translocator protein)을 암호화하도록 작동가능한 외인성 유전자를 포함하는 재조합 유성 미생물.
  27. 제26항에 있어서, 미세조류, 유성 효모, 유성 곰팡이, 및 유성 박테리아로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  28. 제27항에 있어서, 미세조류인 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  29. 제28항에 있어서, 프로토테카(Prototheca) 속의 종인 것을 특징으로 하는 미세조류.
  30. 제29항에 있어서, 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis)인 것을 특징으로 하는 미세조류.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 유전자는 재조합 유성 미생물에서 발현을 위해 코돈-최적화된 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  32. 제26항에 있어서, 자일로오스 전이체의 고유 플라스티드 표적화 서열은 미세조류로부터의 플라스티드 표적화 서열로 교체된 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  33. 제26항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 자일로오스 전이체는 아라비도프시스(Arabidopsis) 속으로부터의 XPT 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  34. 하나 이상의 외인성 유전자를 포함하는 재조합 유성 미생물에 있어서, 하나 이상의 외인성 유전자는 산화환원효소 경로 단백질, 자일로오스 이성질화효소 경로 단백질, 또는 자일로오스 운반체 단백질 중 하나 이상을 암호화하도록 작동가능한 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  35. 제34항에 있어서, 미생물은 적어도 하나의 추가의 외인성 유전자를 추가로 포함하며, 여기서 상기 추가의 외인성 유전자는 수크로오스 전화효소, 지방 아실-ACP 티오에스테라아제, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소, 지방 아실-CoA 환원효소, 지방 알데하이드 환원효소, 지방 알데하이드 데카보닐라아제, 아실 담체 단백질, 불포화효소, 폴리사카라이드 분해 효소, 및 항생제에 대한 저항을 부여하는 단백질로 구성된 그룹에서 선택된 단백질을 암호화하도록 작동가능한 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 미생물은 미세조류, 유성 효모, 유성 곰팡이, 및 유성 박테리아로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  37. 제36항에 있어서, 미세조류인 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  38. 제37항에 있어서, 프로토테카(Prototheca) 속의 종인 것을 특징으로 하는 미세조류.
  39. 제38항에 있어서, 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis)인 것을 특징으로 하는 미세조류.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외인성 유전자는 자일로오스 환원효소, 자일리톨 탈수소효소, 및 자일룰로키나아제로 구성된 그룹에서 선택된 산화환원효소 경로 단백질을 암호화하도록 작동가능한 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  41. 제40항에 있어서, 하나 이상의 외인성 유전자는 자일룰로키나아제를 암호화하도록 작동가능한 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  42. 제41항에 있어서, 자일룰로키나아제는 피키아(Pichia) 속으로부터의 XYL3 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  43. 제40항에 있어서, 하나 이상의 외인성 유전자는 자일리톨 탈수소효소를 암호화하도록 작동가능한 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  44. 제43항에 있어서, 자일리톨 탈수소효소는 피키아(Pichia) 속으로부터의 XYL2 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  45. 제40항에 있어서, 하나 이상의 외인성 유전자는 자일로오스 환원효소를 암호화하도록 작동가능한 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  46. 제45항에 있어서, 자일로오스 환원효소는 피키아(Pichia) 속으로부터의 XYL1 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  47. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외인성 유전자는 자일로오스 이성질화효소 및 자일룰로키나아제로 구성된 그룹에서 선택된 자일로오스 이성질화효소 경로 단백질을 암호화하도록 작동가능한 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  48. 제47항에 있어서, 자일로오스 이성질화효소 경로 단백질은 자일로오스 이성질화효소인 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  49. 제48항에 있어서, 자일로오스 이성질화효소는 피키아(Piromyces) 속으로부터의 XYLA 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  50. 제47항에 있어서, 자일로오스 이성질화효소 경로 단백질은 자일룰로키나아제인 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  51. 제50항에 있어서, 자일룰로키나아제는 피키아(Pichia) 속으로부터의 XYL3 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  52. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외인성 유전자는 XYLA, XYL2, XYL3, 및 XPT로 구성된 그룹에서 선택된 단백질을 암호화하도록 작동가능한 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  53. 제52항에 있어서, 자일로오스 전이체의 고유 플라스티드 표적화 서열은 미세조류로부터의 플라스티드 표적화 서열로 교체된 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  54. 제53항에 있어서, 자일로오스 운반체는 아라비도프시스(Arabidopsis) 속으로부터의 XPT 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  55. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외인성 유전자는 자일로오스 운반체를 암호화하도록 작동가능한 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  56. 제55항에 있어서, 자일로오스 운반체는 트리코더마(Trichoderma) 속으로부터의 XLT1 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  57. 재조합 유성 미생물에 있어서, GPT-A-XPT (서열 번호: 45), GPT-F-XPT (서열 번호: 47) 또는 S106SAD-XPT (서열 번호: 49)에서 선택된 하나 이상의 자일로오스 전이체 단백질을 암호화하는 제1 외인성 유전자, SUT1 (서열 번호: 37), GXS1 (서열 번호: 39), XLT1 (서열 번호: 43) 또는 공동 수송체 (서열 번호: 41)에서 선택된 하나 이상의 자일로오스 운반체를 암호화하는 제2 외인성 유전자, XylA (서열 번호: 15) 또는 XYL3 (서열 번호: 51)에서 선택된 하나 이상의 산화환원효소 경로 단백질을 암호화하는 제3 외인성 유전자, 및 XYL1 (서열 번호: 35), XYL2 (서열 번호: 50) 또는 XYL3 (서열 번호: 51)에서 선택된 하나 이상의 자일로오스 이성질화효소 경로 단백질을 암호화하는 제4 외인성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  58. 제57항에 있어서, XylA, XYL3, SUT1, 및 GPT-F-XPT를 암호화하도록 작동가능한 외인성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  59. 제57항에 있어서, XylA, XYL2, XYL3, XLT1, 및 S106SAD-XPT를 암호화하도록 작동가능한 외인성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  60. 제57항에 있어서, XylA, XYL1, XYL3, XLT1, 및 S106SAD-XPT를 암호화하도록 작동가능한 외인성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  61. 제57항에 있어서, XylA, XYL1, XYL3, GXS1, 및 GPT-A-XPT를 암호화하도록 작동가능한 외인성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  62. 제57항에 있어서, XYL1, XYL2, XYL3, 공동 수송체, 및 GPT-F-XPT를 암호화하도록 작동가능한 외인성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  63. 제57항에 있어서, XYL1, XYL2, XYL3, GXS1, 및 GPT-F-XPT를 암호화하도록 작동가능한 외인성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  64. 제57항에 있어서, XYL2, XYL3, 공동 수송체, 및 S106SAD-XPT를 암호화하도록 작동가능한 외인성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  65. 제57항에 있어서, XYL2, XYL3, XLT1, 및 S106SAD-XPT를 암호화하도록 작동가능한 외인성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  66. 제57항에 있어서, XYL2, XYL3, GXS1, 및 GPT-A-XPT를 암호화하도록 작동가능한 외인성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  67. 제26항 내지 제 66항 중 어느 한 항에 있어서, 50% 초과 자일로오스인 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 성장하거나 또는 지질을 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  68. 제67항에 있어서, 미생물은 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 초과 자일로오스인 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 성장하거나 또는 지질을 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  69. 제68항에 있어서, 미생물은 유일한 탄소원으로서 자일로오스를 포함하는 배양 배지에서 성장하거나 또는 지질을 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  70. 제69항에 있어서, 유일한 탄소원으로서 글루코오스를 포함하고 하나 이상의 외인성 유전자가 결핍된 배양 배지에서 배양된 비교가능한 미생물 세포에 의해 생산된 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55% 또는 적어도 60%의 지질을 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 유성 미생물.
  71. 제26항 내지 제66항 중 어느 한 항의 미생물을 증식시키거나 또는 배양함으로써 생산된 미생물 지질 조성물에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 지질 조성물:
    (a) 자일로오스를 포함한 배양 배지에서 상기 미생물을 증식시키거나 또는 배양하는 단계; 및
    (b) 미생물을 세포용해시키고 미생물 지질 조성물을 단리하는 단계.
  72. 제71항에 있어서, 배양 배지는 글루코오스를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 지질 조성물.
  73. 제71항에 있어서, 배양 배지는 50% 초과 자일로오스인 탄소원을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 지질 조성물.
  74. 제73항에 있어서, 탄소원은 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 초과 자일로오스인 것을 특징으로 하는 미생물 지질 조성물.
  75. 제74항에 있어서, 배양 배지는 유일한 탄소원으로서 자일로오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 지질 조성물.
  76. 제26항 내지 제66항 중 어느 한 항의 미생물을 증식시키거나 또는 배양함으로써 생산된 미생물 지질 조성물에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 지질 조성물:
    (a) 배양 배지내 미생물을 제공하는 단계;
    (b) 배양 배지에 탈중합된 셀룰로오스 물질을 첨가하는 단계; 여기서 상기 셀루로오스 물질은 자일로오스를 포함함;
    (c) 미생물이 지질로서 적어도 약 20%의 이의 건조 중량을 축적할 때까지 미생물을 증식시키거나 또는 배양하는 단계; 및
    (d) 미생물을 세포용해시키고 미생물 지질 조성물을 단리하는 단계.
  77. 제76항에 있어서, 탈중합된 셀룰로오스 물질의 자일로오스 농도는 적어도 약 100 g/L인 것을 특징으로 하는 미생물 지질 조성물.
  78. 제77항에 있어서, 탈중합된 셀룰로오스 물질의 자일로오스 농도는 적어도 약 400 g/L인 것을 특징으로 하는 미생물 지질 조성물.
  79. 제77항에 있어서, 탈중합된 셀룰로오스 물질은 글루코오스를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 지질 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 탈중합된 셀룰로오스 물질의 글루코오스 농도는 적어도 약 100 g/L인 것을 특징으로 하는 미생물 지질 조성물.
  81. 제79항에 있어서, 탈중합된 셀룰로오스 물질의 글루코오스 농도는 적어도 약 400 g/L인 것을 특징으로 하는 미생물 지질 조성물.
  82. 제81항에 있어서, 탈중합된 셀룰로오스 물질의 자일로오스 및 글루코오스의 전체 농도는 적어도 약 100 g/L인 것을 특징으로 하는 미생물 지질 조성물.
  83. 제76항에 있어서, 탈중합된 셀룰로오스 물질의 자일로오스 및 글루코오스의 전체 농도는 적어도 약 400 g/L인 것을 특징으로 하는 미생물 지질 조성물.
  84. 제76항에 있어서, 탈중합된 셀룰로오스 물질의 자일로오스 및 글루코오스의 전체 농도는 적어도 약 600 g/L인 것을 특징으로 하는 미생물 지질 조성물.
  85. 제76항에 있어서, 탈중합된 셀룰로오스 물질의 자일로오스 및 글루코오스의 전체 농도는 적어도 약 800 g/L인 것을 특징으로 하는 미생물 지질 조성물.
  86. 제26항 내지 제66항 중 어느 한 항의 미생물을 증식시키거나 또는 배양하는 단계를 포함하는 미생물 지질 조성물을 생산하는 방법에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 자일로오스를 포함하는 배양 배지에서 상기 미생물을 증식시키거나 또는 배양하는 단계; 및
    (b) 미생물을 세포용해시키고 미생물 지질 조성물을 단리하는 단계.
  87. 제86항에 있어서, 배양 배지는 50% 초과 자일로오스인 탄소원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 탄소원은 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 초과 자일로오스인 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 배양 배지는 유일한 탄소원으로서 자일로오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 미생물은 유일한 탄소원으로서 글루코오스를 포함하고 하나 이상의 외인성 유전자가 결핍된 배양 배지에서 증식되거나 또는 배양된 비교가능한 미생물 세포에 의해 생산된 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55% 또는 적어도 60%의 지질을 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
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