ES2898678T3 - Composiciones alimentarias que comprenden aceites a medida - Google Patents

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Aravind Somanchi
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George Rudenko
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Abstract

Proceso para producir un aceite de triglicéridos que tiene un perfil de ácidos grasos inferior al 7 % de C18: 2 a partir de un microbio, donde el proceso comprende: (i) cultivar una célula de microalgas oleaginosas recombinante, del género Prototheca, que comprende genes exógenos en un medio de cultivo hasta que al menos el 10 % del peso seco de la célula sea aceite de triglicéridos; y (ii) aislar el aceite de la célula, en el que una desaturasa de ácido graso delta 12 endógena de la célula de microalgas oleaginosas se ha inactivado o mutado para tener menos actividad enzimática.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones alimentarias que comprenden aceites a medida
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere a un proceso para producir un aceite de triglicéridos. La divulgación se refiere a microalgas oleaginosas, métodos de cultivo de las mismas para la producción de biomasa y compuestos útiles, incluyendo lípidos, ésteres de ácidos grasos, ácidos grasos, aldehídos, alcoholes y alcanos, y métodos y reactivos para alterarlos genéticamente para mejorar la eficiencia de la producción y alterar el tipo y composición de los aceites producidos por ellos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] A medida que la población humana continúa aumentando, existe una necesidad creciente de fuentes de alimentos adicionales, en particular fuentes de alimentos que sean baratas de producir pero nutritivas. Además, la dependencia actual de la carne como alimento básico de muchas dietas, al menos en los países más desarrollados, contribuye significativamente a la liberación de gases de efecto invernadero, y existe la necesidad de producir nuevos alimentos que sean igualmente sabrosos y nutritivos pero menos dañinos para el medio ambiente. Sigue existiendo la necesidad de métodos para producir productos alimenticios a partir de microorganismos, incluidas las algas, de forma económica y eficaz, a gran escala, en particular productos alimenticios que sean sabrosos y nutritivos. La presente invención satisface estas y otras necesidades.
RESUMEN
[0003] La presente divulgación describe células microbianas oleaginosas, preferiblemente células de microalgas, que tienen distintos perfiles lipídicos, y células recombinantes que expresan genes exógenos que codifican proteínas tales como las acil-ACP tioesterasas grasas. La presente divulgación también describe métodos para fabricar lípidos y productos a base de aceite, incluyendo combustibles tales como biodiésel, diésel renovable y combustible para aviones, a partir de dichas células.
[0004] La presente invención proporciona un proceso para producir un aceite de triglicéridos tal como se define en la reivindicación 1. Las características preferidas del proceso se definen en las reivindicaciones dependientes.
[0005] La presente divulgación describe una célula microbiana oleaginosa, preferiblemente una célula de microalgas, que comprende un aceite de triglicéridos, en el que el perfil de ácidos grasos del aceite de triglicéridos es inferior al 7 % de C18: 2. La célula microbiana oleaginosa comprende un gen exógeno y una desaturasa endógena de la célula microbiana oleaginosa que ha sido inactivada o mutada para tener menos actividad enzimática.
[0006] La desaturasa endógena es la desaturasa de ácido graso delta 12. El gen exógeno puede ser un gen de sacarosa invertasa.
[0007] La célula microbiana oleaginosa es una célula del género Prototheca. En algunos casos, la célula microbiana oleaginosa es una célula del género Prototheca moriformis. US 2009/0061493 describe el cultivo de cepas de Prototheca.
[0008] Como se señaló anteriormente, la presente invención proporciona un método para producir una composición oleaginosa de aceite de triglicéridos microbianos que tiene un perfil de ácidos grasos inferior al 7 % de C18: 2, en el que el método comprende las etapas de: (a) cultivar una población de células microbianas oleaginosas en un medio de cultivo hasta que al menos el 10 % del peso de las células secas de las células microbianas oleaginosas sea aceite de triglicéridos; y (b) aislar la composición de aceite de triglicéridos de las células microbianas oleaginosas. La composición de aceite de triglicéridos se produce mediante el cultivo de una población de células microbianas oleaginosas recombinantes como se ha descrito anteriormente.
[0009] El aceite de triglicéridos producido por el proceso de la invención puede usarse para producir un jabón, un combustible, un fluido dieléctrico, un fluido hidráulico, un plastificante, un lubricante, un fluido caloportador o un fluido para trabajar metales. El combustible puede ser: a) biodiésel; (b) diésel renovable; o (c) combustible para aviones.
[0010] El biodiésel puede tener uno o más de los siguientes atributos: (i) menos de 0.3 mcg/g de carotenoides totales; (ii) menos de 0.005 mcg/g de licopeno; (iii) menos de 0.005 mcg/g de betacaroteno; (iv) menos de 0.3 mcg/g de clorofila A; (v) menos de 175 mcg/g de gamma tocoferol; (vi) menos del 0.25 % de brassicasterol, campesterol, estigmasterol o beta-sitosterol; (vii) menos de 350 mcg/g de tocotrienoles totales; (viii) menos de 0.05 mcg/g de luteína; o (ix) menos de 275 mcg/g de tocoferoles.
[0011] El diésel renovable puede tener una T10-T90 de al menos 20 °C, 40 °C o 60 °C.
[0012] El combustible para aviones puede cumplir con las especificaciones HRJ-5 y/o ASTM D1655.
[0013] Todos los procesos descritos en este documento se pueden realizar de acuerdo con la GMP o normativas equivalentes. En los Estados Unidos, las normativas GMP para la fabricación, envasado o almacenamiento de alimentos para humanos están codificadas en el 21 CFR 110. Las condiciones de GMP en los Estados Unidos, y condiciones equivalentes en otras jurisdicciones, son válidas para determinar si un alimento está adulterado (el alimento ha sido fabricado en condiciones tales que no es apto para el consumo) o se ha preparado, envasado o mantenido en condiciones insalubres, condiciones tales que pueda haberse contaminado o haberse vuelto perjudicial para la salud. Las condiciones de GMP pueden incluir la adherencia a las normativas que gobiernan: el control de enfermedades; la limpieza y la formación del personal; el mantenimiento y la operación sanitaria de edificios e instalaciones; la provisión de instalaciones y alojamientos sanitarios adecuados; el diseño, la construcción, el mantenimiento y la limpieza de equipos y utensilios; la provisión de procedimientos de control de calidad apropiados para asegurar que se tomen todas las precauciones razonables al recibir, inspeccionar, transportar, segregar, preparar, fabricar, envasar y almacenar productos alimenticios de acuerdo con los principios de saneamiento adecuados para evitar la contaminación de cualquier fuente; y el almacenamiento y el transporte de alimentos acabados en condiciones que protejan los alimentos contra la contaminación física, química o microbiana indeseable, así como contra el deterioro de los alimentos y el recipiente.
[0014] La célula de microalgas puede derivar de un alga que es un mutante de color con pigmentación de color reducida en comparación con la cepa de la que se derivó. Los mutantes con pigmentación de color reducida se preparan típicamente usando técnicas estándar de mutagénesis. Hay muchos laboratorios de pago por servicio que generarán mutantes con pigmentación de color reducida. En algunas realizaciones, la célula de microalgas se cultiva heterótroficamente y opcionalmente en ausencia de luz.
[0015] La presente divulgación también describe un proceso que implica extraer el lípido (triglicérido) de la biomasa para formar un aceite.
[0016] La presente divulgación describe además alimentos que incorporan un aceite microbiano recombinante.
[0017] Estos y otros aspectos y realizaciones de la invención se describen con referencia al dibujo adjunto, cuya breve descripción se presenta a continuación, y en la descripción detallada de la invención que viene después y se ejemplifican en los ejemplos más adelante.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0018] La figura 1 muestra un cromatograma de diésel renovable producido a partir de aceite de triglicéridos de Prototheca.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0019] La presente invención surge del descubrimiento de que las Prototheca y ciertos microorganismos relacionados tienen propiedades inesperadamente beneficiosas para la producción de aceites, combustibles y otras composiciones de hidrocarburos o lípidos de forma económica y en grandes cantidades, así como del descubrimiento de métodos y reactivos para alterar genéticamente estos microorganismos para mejorar estas propiedades. Los aceites producidos por estos microorganismos se pueden utilizar en las industrias de combustibles de transporte, oleoquímica y/o alimentaria y cosmética, entre otras aplicaciones. La transesterificación de lípidos produce ésteres de ácidos grasos de cadena larga útiles como biodiésel. Se pueden adaptar otros procesos enzimáticos y químicos para producir ácidos grasos, aldehídos, alcoholes, alcanos y alquenos. En algunas aplicaciones, se producen diésel renovable, combustible para aviones u otros compuestos de hidrocarburos. La presente divulgación también describe métodos de cultivo de microalgas para aumentar la productividad y aumentar el rendimiento lipídico y/o para una producción más rentable de las composiciones descritas en el presente documento.
[0020] Esta descripción detallada se divide en secciones para comodidad del lector. La sección I proporciona definiciones de los términos utilizados en este documento. La sección II proporciona una descripción de las condiciones de cultivo útiles. La sección III proporciona una descripción de los métodos y materiales de ingeniería genética. La sección IV proporciona una descripción de la ingeniería genética de microorganismos (por ejemplo, Prototheca) para permitir la utilización de sacarosa. La sección V proporciona una descripción de la ingeniería genética de microorganismos (por ejemplo, Prototheca) para modificar la biosíntesis de lípidos. La sección VI describe métodos para fabricar combustibles y productos químicos. La sección VII da a conocer ejemplos que ilustran los diversos aspectos y realizaciones de la invención.
I. DEFINICIONES
[0021] A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el significado comúnmente entendido por una persona experta en la técnica a la que pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan a un experto una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed.
1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5a Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Tal como se usan en el presente documento, los siguientes términos tienen los significados que se les atribuyen a menos que se especifique lo contrario.
[0022] "Activo en microalgas" se refiere a un ácido nucleico que es funcional en microalgas. Por ejemplo, un promotor que se ha utilizado para impulsar un gen de resistencia a los antibióticos para impartir resistencia a los antibióticos a una microalga transgénica es activo en microalgas.
[0023] La "proteína portadora de acilo" o "ACP" es una proteína que se une a una cadena de acilo en crecimiento durante la síntesis de ácidos grasos como un éster de tiol en el tiol distal de la fracción 4'-fosfopanteteína y comprende un componente del complejo de ácido graso sintasa.
[0024] La "molécula de acil-CoA" o "acil-CoA" es una molécula que comprende un resto acilo unido covalentemente a la coenzima A a través de un enlace tioéster en el tiol distal de la fracción 4'-fosfopanteteína de la coenzima A.
[0025] El "porcentaje de área" se refiere al área de picos observados usando los métodos de detección FAME GC/FID en los que cada ácido graso de la muestra se convierte en un éster metílico de ácido graso (FAME) antes de la detección. Por ejemplo, se observa un pico separado para un ácido graso de 14 átomos de carbono sin insaturación (C14: 0) en comparación con cualquier otro ácido graso como C14: 1. El área del pico para cada clase de FAME es directamente proporcional a su porcentaje de composición en la mezcla y se calcula basándose la suma de todos los picos presentes en la muestra (es decir, [área bajo el pico específico/área total de todos los picos medidos] X 100) . Cuando se hace referencia a los perfiles lipídicos de los aceites y las células, "al menos un 4 % de C8-C14" significa que al menos el 4 % del total de ácidos grasos en la célula o en la composición de glicerolípidos extraída tienen una longitud de cadena que incluye 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono.
[0026] El "biodiésel" es un éster de alquilo de ácido graso producido biológicamente, adecuado para su uso como combustible en un motor diésel.
[0027] La "biomasa" es material producido por crecimiento y/o propagación de células. La biomasa puede contener células y/o contenido intracelular así como material extracelular e incluye, entre otra cosas, compuestos secretados por una célula.
[0028] El "material celulósico" es el producto de la digestión de la celulosa, que incluye glucosa y xilosa, y opcionalmente compuestos adicionales tales como disacáridos, oligosacáridos, lignina, furfurales y otros compuestos. Los ejemplos no limitantes de fuentes de material celulósico incluyen bagazos de caña de azúcar, pulpa de remolacha azucarera, rastrojo de maíz, astillas de madera, serrín y pasto varilla.
[0029] La "citólisis" es la lisis de células en un ambiente hipotónico. La citólisis es causada por ósmosis excesiva o movimiento de agua hacia el interior de una célula (hiperhidratación). La célula no puede soportar la presión osmótica del agua en el interior y explota.
[0030] "Vector de expresión" o "constructo de expresión" o "plásmido" o "constructo de ADN recombinante" se refieren a un ácido nucleico que se ha generado mediante intervención humana, incluso por medios recombinantes o síntesis química directa, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción y/o traducción de un ácido nucleico particular en una célula huésped. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, un virus o un fragmento de un ácido nucleico. Normalmente, el vector de expresión incluye un ácido nucleico para transcribir operativamente enlazado a un promotor.
[0031] Un "gen exógeno" es un ácido nucleico que codifica la expresión de un ARN y/o proteína que se ha introducido ("transformado") en una célula. Una célula transformada puede denominarse célula recombinante, en la que pueden introducirse genes exógenos adicionales. El gen exógeno puede ser de una especie diferente (y por tanto heterólogo) o de la misma especie (y por tanto homólogo), en relación con la célula que se está transformando. Por tanto, un gen exógeno puede incluir un gen homólogo que ocupa una ubicación diferente en el genoma de la célula o está bajo un control diferente, en relación con la copia endógena del gen. Un gen exógeno puede estar presente en más de una copia de la célula. Un gen exógeno puede mantenerse en una célula como una inserción en el genoma o como una molécula episomal.
[0032] "Proporcionado de forma exógena" se refiere a una molécula proporcionada al medio de cultivo de un cultivo celular.
[0033] "Grasa" se refiere a un lípido o mezcla de lípidos que generalmente es sólido a temperaturas y presiones ambiente normales. La "grasa" incluye, entre otras, manteca de cerdo y mantequilla.
[0034] La "acil-ACP tioesterasa grasa" es una enzima que cataliza la escisión de un ácido graso de una proteína portadora de acilo (ACP) durante la síntesis de lípidos.
[0035] La "acil-CoA/aldehído reductasa grasa" es una enzima que cataliza la reducción de una molécula de acil-CoA a un alcohol primario.
[0036] La "acil-CoA reductasa grasa" es una enzima que cataliza la reducción de una molécula de acil-CoA a un aldehído.
[0037] La "aldehído descarbonilasa grasa" es una enzima que cataliza la conversión de un aldehído graso en un alcano.
[0038] La "aldehído reductasa grasa" es una enzima que cataliza la reducción de un aldehído a un alcohol primario.
[0039] Una "fuente de carbono fijo" es una molécula o moléculas que contienen carbono, típicamente una molécula orgánica, que está presente a temperatura y presión ambiente en forma sólida o líquida en un medio de cultivo que puede ser utilizado por un microorganismo cultivado en el mismo.
[0040] "Alimento", "composición alimenticia", "producto alimenticio" y "comestible" se refieren a cualquier composición prevista o pensada para ser ingerida por humanos como fuente de nutrición y/o calorías. Las composiciones alimenticias se componen principalmente de carbohidratos, grasas, agua y/o proteínas y constituyen sustancialmente la totalidad de la ingesta calórica diaria de una persona. Una "composición alimenticia" puede tener un peso mínimo que sea al menos diez veces el peso de una tableta o cápsula típica (los rangos de peso de tableta/cápsula típicos son menores o iguales a 100 mg hasta 1500 mg). Una "composición alimenticia" no está encapsulada ni en forma de tableta.
[0041] "Aumentar el rendimiento lipídico" se refiere a un aumento en la productividad de un cultivo microbiano, por ejemplo, aumentando el peso seco de células por litro de cultivo, aumentando el porcentaje de células que constituyen lípidos o aumentando la cantidad total de lípidos por litro de volumen de cultivo por unidad de tiempo.
[0042] "Promotor inducible" es un promotor que media la transcripción de un gen operativamente enlazado en respuesta a un estímulo particular. Ejemplos de dichos promotores pueden ser secuencias promotoras que se inducen en condiciones de cambios de pH o de niveles de nitrógeno.
[0043] "En enlace operable" es un enlace funcional entre dos secuencias de ácido nucleico, como una secuencia de control (típicamente un promotor) y la secuencia enlazada (típicamente una secuencia que codifica una proteína, también llamada secuencia codificante). Un promotor está en enlace operable con un gen exógeno si puede mediar en la transcripción del gen.
[0044] La "concentración limitante de un nutriente" es una concentración de un compuesto en un cultivo que limita la propagación de un organismo cultivado. Una "concentración no limitante de un nutriente" es una concentración que ayuda a la propagación máxima durante un periodo de cultivo dado. Por tanto, el número de células producidas durante un periodo de cultivo dado es menor en presencia de una concentración limitante de un nutriente que cuando el nutriente no es limitante. Se dice que un nutriente está "en exceso" en un cultivo cuando el nutriente está presente en una concentración mayor que la que ayuda a la propagación máxima.
[0045] La "lipasa" es una enzima soluble en agua que cataliza la hidrólisis de enlaces éster en sustratos lipídicos insolubles en agua. Las lipasas catalizan la hidrólisis de lípidos en gliceroles y ácidos grasos.
[0046] "Enzima modificadora de lípidos" se refiere a una enzima que altera la estructura covalente de un lípido. Los ejemplos de enzimas modificadoras de lípidos incluyen una lipasa, una acil-ACP tioesterasa grasa, una acil-CoA/aldehído reductasa grasa, una acil-CoA reductasa grasa, una aldehído reductasa grasa, una desaturasa, incluyendo una proteína portadora de estearoil acil desaturasa (SAD) y una acil desaturasa grasa (FAD) y una aldehído descarbonilasa grasa.
[0047] La "enzima de la ruta lipídica" es cualquier enzima que desempeña un papel en el metabolismo de los lípidos, es decir, la síntesis, modificación o degradación de lípidos, y cualquier proteína que modifique químicamente los lípidos, así como las proteínas portadoras.
[0048] Los "lípidos" son una clase de moléculas solubles en disolventes no polares (como éter y cloroformo) y son relativamente o completamente insolubles en agua. Las moléculas de lípidos tienen estas propiedades porque consisten principalmente en largas colas de hidrocarburos que son de naturaleza hidrófoba. Los ejemplos de lípidos incluyen ácidos grasos (saturados e insaturados); glicéridos o glicerolípidos (tales como monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos o grasas neutras y fosfoglicéridos o glicerofosfolípidos); no glicéridos (esfingolípidos, lípidos de esterol, que incluyen colesterol y hormonas esteroides, lípidos de prenol, que incluyen terpenoides, alcoholes grasos, ceras y policétidos); y derivados de lípidos complejos (lípidos enlazados a azúcares o glicolípidos y lípidos enlazados a proteínas). Las "grasas" son un subgrupo de lípidos llamados "triacilglicéridos".
[0049] Un "lisado" es una solución que contiene el contenido de las células lisadas.
[0050] La "lisis" es la rotura de la membrana plasmática y, opcionalmente, la pared celular de un organismo biológico suficiente para liberar al menos algo de contenido intracelular, a menudo mediante mecanismos mecánicos, virales u osmóticos que ponen en peligro su integridad.
[0051] "Lisar" es romper la membrana celular y, opcionalmente, la pared celular de un organismo biológico o una célula lo suficiente para liberar al menos algo de contenido intracelular.
[0052] Una "microalga" es un organismo microbiano eucariota que contiene un cloroplasto o plastidio y, opcionalmente, que es capaz de realizar la fotosíntesis, o un organismo microbiano procariota capaz de realizar la fotosíntesis. Las microalgas incluyen fotoautótrofos obligados, que no pueden metabolizar una fuente de carbono fijo como energía, así como heterótrofos, que pueden vivir únicamente de una fuente de carbono fijo. Las microalgas incluyen organismos unicelulares que se separan de las células hermanas poco después de la división celular, como las Chlamydomonas, así como microbios como, por ejemplo, el Volvox, que es un microbio fotosintético multicelular simple de dos tipos de células distintos. Las microalgas incluyen células como Chlorella, Dunaliella, y Prototheca. Las microalgas también incluyen otros organismos fotosintéticos microbianos que presentan adhesión célula-célula, como Agmenellum, Anabaena, y Pyrobotrys. Las microalgas también incluyen microorganismos heterótrofos obligados que han perdido la capacidad de realizar la fotosíntesis, como ciertas especies de algas dinoflageladas y especies del género Prototheca.
[0053] "Micronizada" significa biomasa que se ha homogeneizado a alta presión (o un proceso equivalente) de modo que al menos el 50 % del tamaño de partícula no supere los 10 |_im en su dimensión más larga. Normalmente, al menos del 50 % al 90 % o más de tales partículas tienen menos de 5 |_im en su dimensión más larga. En cualquier caso, el tamaño medio de partícula de la biomasa micronizada es menor que el de la célula de microalgas recombinantes intactas.
[0054] "Coexpresado naturalmente" con referencia a dos proteínas o genes significa que las proteínas o sus genes se coexpresan naturalmente en un tejido u organismo del que se derivan, p. ej., porque los genes que codifican las dos proteínas están bajo el control de una secuencia reguladora común o porque se expresan en respuesta al mismo estímulo.
[0055] "Aceite" se refiere a cualquier triacilglicérido producido por organismos, incluyendo microalgas, otras plantas y/o animales. "Aceite", a diferencia de "grasa", se refiere, a menos que se indique lo contrario, a lípidos generalmente líquidos a temperaturas y presiones ambiente normales. Por ejemplo, "aceite" incluye aceites vegetales o de semillas derivados de plantas que incluyen, entre otros, un aceite derivado de soja, colza, canola, palma, palmiste, coco, maíz, oliva, girasol, semilla de algodón, cuphea, cacahuete, camelina sativa, semilla de mostaza, anacardo, avena, lupino, kenaf, caléndula, cáñamo, café, linaza, avellana, euforbia, semilla de calabaza, cilantro, camelia, sésamo, cártamo, arroz, árbol de aceite de tung, cacao, copra, adormidera, ricino, nuez, jojoba, jatropha, macadamia, nueces de Brasil y aguacate, así como combinaciones de los mismos.
[0056] El "choque osmótico" es la ruptura de células en una solución después de una reducción repentina de la presión osmótica. A veces se induce el choque osmótico para liberar componentes celulares de tales células a una solución.
[0057] Una "enzima degradante de polisacáridos" es cualquier enzima capaz de catalizar la hidrólisis o la sacarificación de cualquier polisacárido. Por ejemplo, las celulasas catalizan la hidrólisis de la celulosa.
[0058] Los "polisacáridos" o "glicanos" son carbohidratos formados por monosacáridos unidos por enlaces glicosídicos. La celulosa es un polisacárido que forma ciertas paredes celulares de las plantas. La celulosa se puede despolimerizar mediante enzimas para producir monosacáridos, como xilosa y glucosa, así como disacáridos y oligosacáridos más grandes.
[0059] "Recombinante" es una célula, ácido nucleico, proteína o vector que se ha modificado debido a la introducción de un ácido nucleico exógeno o la alteración de un ácido nucleico nativo. Por tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos de manera diferente a como una célula no recombinante expresa los genes. Un "ácido nucleico recombinante" es un ácido nucleico originalmente formado in vitro, en general mediante la manipulación de ácido nucleico, p. ej., usando polimerasas y endonucleasas, o que en caso contrario está en una forma que normalmente no se encuentra en la naturaleza. Pueden producirse ácidos nucleicos recombinantes, por ejemplo, para colocar dos o más ácidos nucleicos en un enlace operable. Por tanto, un ácido nucleico aislado o un vector de expresión formado in vitro mediante la ligadura de moléculas de ADN que normalmente no están unidas en la naturaleza, se consideran ambos recombinantes para los propósitos de esta invención. Una vez que un ácido nucleico recombinante se produce y se introduce en una célula u organismo huésped, puede replicarse utilizando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped; sin embargo, dichos ácidos nucleicos, una vez producidos de forma recombinante, aunque se repliquen posteriormente de manera intracelular, se siguen considerando recombinantes para los propósitos de esta invención. De manera similar, una "proteína recombinante" es una proteína elaborada usando técnicas recombinantes, es decir, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante.
[0060] "Aceite microbiano recombinante", "aceite de microalgas recombinante" y "aceite de algas" se refieren a cualquiera de los componentes lipídicos producidos por células recombinantes microbianas o de microalgas o células de algas, respectivamente, incluyendo los triacilgliceroles.
[0061] El "diésel renovable" es una mezcla de alcanos (tales como C10: 0, C12: 0, C14: 0, C16: 0 y C18: 0) producida por hidrogenación y desoxigenación de lípidos.
[0062] La "sacarificación" es un proceso de conversión de biomasa, normalmente biomasa celulósica o lignocelulósica, en azúcares monoméricos, como glucosa y xilosa. El material celulósico o biomasa "sacarificado" o "despolimerizado" se refiere al material celulósico o biomasa que se ha convertido en azúcares monoméricos mediante sacarificación.
[0063] El término "similar", cuando se usa en el contexto de una comparación con un aceite de origen natural, sin más calificación, significa que el aceite que se compara con el aceite natural contiene un /- 15 % o /- 10 % de los dos triglicéridos principales del aceite natural. Por ejemplo, la manteca de karité (el aceite de B. Parkii) contiene un 41.2-56.8 % de C18: 0 y un 34.0-46.9 % de C18: 1 como los dos componentes de triglicéridos más comunes (ver tabla 5). Un aceite "similar" que esté dentro del /- 10 % contendría del 37 % al 62 % de C18: 0 y del 31 % al 52 % de C18: 1 como los dos componentes de triglicéridos más comunes. Cuando se utiliza en este contexto, el término "similar" incluye un /- 9 %, un /- 8 %, un /- 7 %, un /- 6 %, un /- 5 %, un /- 4 %, un /-3 %, un /- 2 % o un /- 1 %, y además puede representar una comparación con los tres o cuatro triglicéridos principales del aceite de origen natural, o dos de los tres triglicéridos principales, o tres de los cuatro triglicéridos principales.
[0064] La "sonicación" es un proceso de alteración de materiales biológicos, como una célula, mediante el uso de energía de ondas sonoras.
[0065] Los "rastrojos" son los tallos secos y las hojas de un cultivo que quedan después de cosechar un grano.
[0066] El "gen de utilización de sacarosa" es un gen que, cuando se expresa, ayuda a la capacidad de una célula para utilizar sacarosa como fuente de energía. Las proteínas codificadas por un gen de utilización de sacarosa se denominan en el presente documento "enzimas de utilización de sacarosa" e incluyen transportadores de sacarosa, sacarosa invertasas y hexoquinasas tales como glucoquinasas y fructoquinasas.
[0067] "Adecuado para el consumo humano" significa que los seres humanos pueden consumir una composición como ingesta dietética sin efectos nocivos para la salud y que puede proporcionar una ingesta calórica significativa debido a la absorción de material digerido en el tracto gastrointestinal.
II. Cultivo
[0068] En la actualidad se describe generalmente el cultivo de microorganismos (p. ej., microalgas, levadura oleaginosa, hongos y bacterias), particularmente cepas de microalgas recombinantes, incluyendo cepas de Prototheca, para la producción de lípidos. Para comodidad del lector, esta sección se subdivide en subsecciones. La subsección 1 describe especies y cepas de Prototheca y cómo identificar nuevas especies y cepas de Prototheca y microalgas relacionadas por comparación de ADN genómico, así como otros microorganismos. La subsección 2 describe biorreactores útiles para el cultivo. La subsección 3 describe los medios de cultivo. La subsección 4 describe la producción de aceite de acuerdo con métodos de cultivo ilustrativos. Estas descripciones también son aplicables de manera más general a otros microorganismos.
1. Especies y cepas de Prototheca y otros microorganismos
[0069] Prototheca es un microorganismo notable para su uso en la producción de lípidos, porque puede producir altos niveles de lípidos, particularmente lípidos adecuados para la producción de combustible. El lípido producido por Prototheca tiene cadenas de hidrocarburos de menor longitud de cadena y mayor grado de saturación que la producida por otras microalgas. Es más, los lípidos de Prototheca generalmente no contienen pigmentos (niveles bajos o indetectables de clorofila y ciertos carotenoides) y, en cualquier caso, contienen mucho menos pigmento que los lípidos de otras microalgas. Además, las células de Prototheca recombinantes proporcionadas por la invención se pueden utilizar para producir lípidos con mayor rendimiento y eficacia, y con un coste reducido, en relación con la producción de lípidos a partir de otros microorganismos. Las cepas ilustrativas de Prototheca para su uso en los métodos de la invención incluyen además, esta microalga crece heterótroficamente y se puede manipular genéticamente como las Prototheca wickerhamii, Prototheca stagnora (incluyendo UTEX 327), Prototheca portoricensis, Prototheca moriformis (incluyendo las cepas UTEX 1441, 1435) y Prototheca zopfii. Las especies del género Prototheca son heterótrofos obligados.
[0070] Las especies de Prototheca para su uso en la invención se puede identificar mediante la amplificación de ciertas regiones diana del genoma. Por ejemplo, la identificación de una especie o cepa de Prototheca específica se puede lograr mediante la amplificación y la secuenciación de ADN nuclear y/o de cloroplasto usando cebadores y metodología usando cualquier región del genoma, por ejemplo usando los métodos descritos en Wu et al., Bot. Bull. Acad. Sin. (2001) 42: 115-121 Identificación de los aislados de Chlorella spp. que utilizan secuencias de ADN ribosómico. Los expertos en la técnica pueden utilizar métodos bien establecidos de análisis filogenético, como la amplificación y secuenciación del espaciador transcrito interno ribosómico (ADNr ITS1 e ITS2), ARNr 23S, ARNr 18S y otras regiones genómicas conservadas para identificar especies no solo de Prototheca, sino de otros organismos productores de hidrocarburos y lípidos con perfiles lipídicos y capacidad de producción similares. Para obtener ejemplos de métodos de identificación y clasificación de algas, consulte también, por ejemplo Genetics, agosto de 2005; 170 (4): 1601-10 y RNA, abril de 2005; 11 (4): 361-4.
[0071] Por tanto, la comparación de ADN genómico se puede utilizar para identificar especies adecuadas de microalgas que se utilizarán en la presente invención. Las regiones de ADN genómico conservado, como por ejemplo, entre otros, el ADN que codifica el ARNr 23S, pueden amplificarse a partir de especies de microalgas y compararse con secuencias de consenso para seleccionar especies de microalgas que están relacionadas taxonómicamente con las microalgas preferidas utilizadas en la presente invención. A continuación, se muestran ejemplos de dicha comparación de secuencias de ADN para especies dentro del género Prototheca. La comparación del ADN genómico también puede ser útil para identificar especies de microalgas que se han identificado erróneamente en una colección de cepas. A menudo, una colección de cepas identificará especies de microalgas basándose en características fenotípicas y morfológicas. El uso de estas características puede llevar a una categorización errónea de la especie o el género de una microalga. El uso de la comparación de ADN genómico puede ser un método mejor para clasificar las especies de microalgas en función de su relación filogenética.
[0072] Las microalgas para su uso en la presente invención normalmente tienen secuencias de ADN genómico que codifican el ARNr 23S que tienen al menos un 99 %, al menos un 95 %, al menos un 90 % o al menos un 85 % de identidad de nucleótidos con al menos una de las secuencias enumeradas en la SEQ ID. N.°: 11-19.
[0073] Para la comparación de secuencias con el fin de determinar el porcentaje de identidad de nucleótidos o aminoácidos, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designados.
[0074] Se puede realizar una alineación óptima de secuencias para comparación, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Apl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE. UU. 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección visual (ver generalmente Ausubel et al., supra).
[0075] Otro ejemplo de algoritmo adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El software para realizar los análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (en la dirección web www.ncbi.nlm.nih.gov). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen una puntuación umbral T con valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se conoce como el umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul et al., supra.). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que las contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se pueda aumentar la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre> 0) y N (puntuación de penalización por residuos no coincidentes; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulada cae en una cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada baja a cero o por debajo de cero debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Para identificar si un ácido nucleico o polipéptido está dentro del alcance de la invención, los parámetros predeterminados de los programas BLAST son adecuados. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62. El programa TBLATN (que utiliza la secuencia de proteínas para la secuencia de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y una matriz de puntuación BLOSUM 62, (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89: 10915 (1989)).
[0076] Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, p. ej., Karlin y Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE. UU. 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P (N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se produciría por casualidad una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menos de 0.1, más preferiblemente menos de 0.01 y lo más preferible menos de 0.001.
[0077] Otras consideraciones que afectan a la selección de microorganismos para su uso en la invención incluyen, además de la producción de lípidos o hidrocarburos adecuados para la producción de aceites, combustibles y oleoquímicos: (1) alto contenido de lípidos como porcentaje del peso celular; (2) facilidad de crecimiento; (3) facilidad de ingeniería genética; y (4) facilidad de procesamiento de biomasa. En realizaciones particulares, el microorganismo de tipo salvaje o modificado genéticamente produce células que son lípidos al menos en un 40 %, al menos en un 45 %, al menos en un 50 %, al menos en un 55 %, al menos en un 60 %, al menos en un 65 % o al menos en un 70 % o más. Los organismos preferidos crecen heterotróficamente (sobre azúcares en ausencia de luz).
[0078] Los ejemplos de algas que se pueden usar para practicar la presente invención incluyen, entre otras, Prototheca wickerhamii, Prototheca stagnora, Prototheca portoricensis, Prototheca moriformis y Prototheca zopfii.
2. Biorreactor
[0079] Los microorganismos se cultivan tanto para realizar manipulaciones genéticas como para la producción de hidrocarburos (por ejemplo, lípidos, ácidos grasos, aldehídos, alcoholes y alcanos). El primer tipo de cultivo se realiza a pequeña escala y, al menos inicialmente, en condiciones en las que puede crecer el microorganismo de partida. El cultivo con fines de producción de hidrocarburos generalmente se realiza a gran escala (p. ej., biorreactores de 10000 l, 40000 l, 100000 l o más grandes) en un biorreactor. Las especies de Prototheca se cultivan típicamente en los métodos de la invención en medios líquidos dentro de un biorreactor. Normalmente, el biorreactor no permite la entrada de luz.
[0080] El biorreactor o fermentador se utiliza para cultivar células de microalgas oleaginosas a través de las diversas fases de su ciclo fisiológico. Los biorreactores ofrecen muchas ventajas para su uso en métodos de crecimiento y propagación heterótrofos. Los biorreactores, tales como los fermentadores de acero, pueden acomodar volúmenes de cultivo muy grandes (se utilizan biorreactores de 40000 litros y de mayor capacidad en diversas realizaciones de la invención). Los biorreactores también permiten típicamente el control de las condiciones de cultivo, como la temperatura, el pH, la tensión de oxígeno y los niveles de dióxido de carbono. Por ejemplo, los biorreactores se pueden configurar típicamente, por ejemplo, utilizando puertos unidos a los tubos para permitir que los componentes gaseosos, como oxígeno o nitrógeno, se burbujeen a través de un cultivo líquido. Otros parámetros de cultivo, como el pH del medio de cultivo, la identidad y concentración de oligoelementos y otros constituyentes del medio también pueden manipularse más fácilmente utilizando un biorreactor.
[0081] Los biorreactores pueden configurarse para hacer fluir los medios de cultivo a través del biorreactor a lo largo del periodo de tiempo durante el cual las microalgas se reproducen y aumentan en número. En algunas realizaciones, por ejemplo, se pueden infundir medios en el biorreactor después de la inoculación pero antes de que las células alcancen la densidad deseada. En otros casos, un biorreactor se llena con medio de cultivo al comienzo de un cultivo y no se infunde más medio de cultivo después de inocular el cultivo. En otras palabras, la biomasa de microalgas se cultiva en un medio acuoso a lo largo de un periodo de tiempo durante el cual las microalgas se reproducen y aumentan en número; sin embargo, no fluyen cantidades de medio de cultivo acuoso a través del biorreactor durante todo el periodo de tiempo. Por tanto, en algunas realizaciones, el medio de cultivo acuoso no fluye a través del biorreactor después de la inoculación.
[0082] Los biorreactores equipados con dispositivos tales como palas e impulsores giratorios, mecanismos de balanceo, barras de agitación, medios para la infusión de gas presurizado se pueden utilizar para someter a mezcla los cultivos de microalgas. La mezcla puede ser continua o intermitente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, no se mantiene un régimen de flujo turbulento de entrada de gas y entrada de medios para la reproducción de microalgas hasta que se haya logrado un aumento deseado en el número de dichas microalgas.
[0083] Los puertos del biorreactor se pueden utilizar para introducir o extraer gases, sólidos, semisólidos y líquidos de la cámara del biorreactor que contiene las microalgas. Si bien muchos biorreactores tienen más de un puerto (por ejemplo, uno para la entrada de medios y otro para el muestreo), no es necesario que solo una sustancia entre o salga de un puerto. Por ejemplo, un puerto puede usarse para hacer fluir el medio de cultivo hacia el biorreactor y luego usarse para muestreo, entrada de gas, salida de gas u otros propósitos. Preferiblemente, un puerto de muestreo puede usarse repetidamente sin alterar la naturaleza axénica del cultivo. Un puerto de muestreo se puede configurar con una válvula u otro dispositivo que permita detener e iniciar el flujo de muestra o proporcionar un medio de muestreo continuo. Los biorreactores suelen tener al menos un puerto que permite la inoculación de un cultivo y dicho puerto también se puede utilizar para otros fines, como la entrada de medios o gas.
[0084] Los puertos de los biorreactores permiten manipular el contenido de gas del cultivo de microalgas. A modo de ilustración, parte del volumen de un biorreactor puede ser gas en lugar de líquido y las entradas de gas del biorreactor permiten el bombeo de gases al biorreactor. Los gases que se pueden bombear beneficiosamente a un biorreactor incluyen aire, mezclas de aire/CO2, gases nobles, como argón, y otros gases. Los biorreactores suelen estar equipados para permitir al usuario controlar la velocidad de entrada de un gas en el biorreactor. Como se señaló anteriormente, se puede usar el aumento del flujo de gas en un biorreactor para aumentar el mezclado del cultivo.
[0085] El aumento del flujo de gas también afecta a la turbidez del cultivo. La turbulencia se puede lograr colocando un puerto de entrada de gas por debajo del nivel del medio de cultivo acuoso para que el gas que entre al biorreactor burbujee en la superficie del cultivo. Uno o más puertos de salida de gas permiten que el gas escape, evitando así la acumulación de presión en el biorreactor. Preferiblemente, un puerto de salida de gas conduce a una válvula "unidireccional" que evita que los microorganismos contaminantes entren en el biorreactor.
3. Medios
[0086] Los medios de cultivo de microalgas normalmente contienen componentes tales como una fuente de nitrógeno fijo, una fuente de carbono fijo, oligoelementos, opcionalmente un tampón para el mantenimiento del pH y fosfato (normalmente proporcionado como una sal de fosfato). Otros componentes pueden incluir sales tales como cloruro sódico, particularmente para microalgas de agua de mar. Las fuentes de nitrógeno incluyen fuentes de nitrógeno orgánico e inorgánico que incluyen, por ejemplo, entre otras, nitrógeno molecular, nitrato, sales de nitrato, amoniaco (puro o en forma de sal, como (NH^SO4 y NH4OH), proteína, harina de soja, licor de maíz y extracto de levadura. Los ejemplos de oligoelementos incluyen zinc, boro, cobalto, cobre, manganeso y molibdeno, por ejemplo, en las formas respectivas de ZnCl2, H3BO3, CoCb6H2O, CuCb2H2O, MnCb4H2O y (NH4)6Mo/O244H2O.
[0087] Los microorganismos útiles de acuerdo con los métodos de la presente invención se encuentran en varios lugares y entornos en todo el mundo. Como consecuencia de su aislamiento de otras especies y su divergencia evolutiva resultante, el medio de crecimiento particular para el crecimiento óptimo y la generación de constituyentes de lípidos y/o hidrocarburos puede ser difícil de predecir. En algunos casos, es posible que ciertas cepas de microorganismos no puedan crecer en un medio de crecimiento particular debido a la presencia de algún componente inhibidor o la ausencia de algún requisito nutricional esencial requerido por la cepa particular de microorganismo.
[0088] Los medios de crecimiento sólidos y líquidos están generalmente disponibles en una amplia variedad de fuentes y las instrucciones para la preparación de medios particulares adecuados para una amplia variedad de cepas de microorganismos se pueden encontrar, por ejemplo, en línea en http: //www.utex.org/, un sitio mantenido por la Universidad de Texas en Austin, 1 University Station A6700, Austin, Texas, 78712-0183, para su colección de cultivo de algas (UTEX). Por ejemplo, varios medios de agua dulce y agua salada incluyen los descritos en la pub. de PCT n.° 2008/15ll49.
[0089] En un ejemplo particular, el medio de proteosa es adecuado para cultivos axénicos y se puede preparar un volumen de 1 l del medio (pH ~ 6.8) mediante la adición de 1 g de proteosa peptona a 1 litro de medio de Bristol. El medio de Bristol comprende NaNO32.94 mM, CaCb2H2O 0.17 mM, MgSO47H2O 0.3 mM, KH2PO4 0.43 mM, 1.29 mM y NaCl 1.43 mM en una solución acuosa. Para un medio de agar al 1.5 %, se pueden añadir 15 g de agar a 1 l de la solución. La solución se cubre, se esteriliza en autoclave y luego se almacena a temperatura refrigerada antes de su uso. Otro ejemplo es el medio de aislamiento de Prototheca (PIM), que comprende 10 g/l de hidrógeno ftalato de potasio (KHP), 0.9 g/l de hidróxido de sodio, 0.1 g/l de sulfato de magnesio, 0.2 g/l de hidrogenofosfato de potasio, 0.3 g/l de cloruro de amonio, 10 g/l de glucosa 0.001 g/l de clorhidrato de tiamina, 20 g/l de agar, 0.25 g/l de 5-fluorocitosina, a un pH en el rango de 5.0 a 5.2 (ver Pore, 1973, App. Microbiology, 26: 648-649). Otros medios adecuados para usar con los métodos de la invención pueden identificarse fácilmente consultando la URL identificada anteriormente o consultando a otras organizaciones que mantienen cultivos de microorganismos, tales como la SAG, la CCAP o la CCALA. La SAG se refiere a la colección de cultivos de algas de la Universidad de Gottingen (Gottingen, Alemania), la CCAP se refiere a la colección de cultivos de algas y protozoos gestionada por la Asociación Escocesa de Ciencias Marinas (Escocia, Reino Unido) y la CCALA se refiere a la colección de cultivos de laboratorio de algas en el Instituto de Botánica (Treboñ, República Checa). Adicionalmente, la patente EE. UU. n.° 5.900.370 describe formulaciones de medios y condiciones adecuadas para la fermentación heterotrófica de la especie Prototheca.
[0090] Para la producción de petróleo, la selección de una fuente de carbono fijo es importante ya que el coste de la fuente de carbono fijo debe ser lo suficientemente bajo como para que la producción de petróleo sea rentable. Así pues, aunque las fuentes de carbono adecuadas incluyen, por ejemplo, acetato, floridosida, fructosa, galactosa, ácido glucurónico, glucosa, glicerol, lactosa, manosa, N-acetilglucosamina, ramnosa, sacarosa y/o xilosa, la selección de materias primas que contienen esos compuestos es una aspecto importante de los métodos de la invención. Las materias primas adecuadas útiles de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, por ejemplo, licor negro, almidón de maíz, material celulósico despolimerizado, suero de leche, melaza, patata, sorgo, sacarosa, remolacha azucarera, caña de azúcar, arroz y trigo. Las fuentes de carbono también se pueden proporcionar como una mezcla, por ejemplo, una mezcla de sacarosa y pulpa de remolacha azucarera despolimerizada. La fuente o fuentes de carbono se pueden suministrar con una concentración de al menos 50 pM, al menos 100 pM, al menos 500 pM, al menos 5 mM, al menos 50 mM y al menos 500 mM, de una o varias fuentes de carbono fijo proporcionadas exógenamente. Las fuentes de carbono de particular interés para los propósitos de la presente invención incluyen celulosa (en forma despolimerizada), glicerol, sacarosa y sorgo, cada uno de los cuales se discute con más detalle a continuación.
[0091] De acuerdo con la presente invención, los microorganismos pueden cultivarse usando biomasa celulósica despolimerizada como materia prima. La biomasa celulósica (por ejemplo, rastrojo como el rastrojo de maíz) es barata y fácilmente asequible. Las microalgas pueden crecer en material celulósico procesado. Los materiales celulósicos generalmente incluyen entre un 40 y un 60 % de celulosa; 20-40 % de hemicelulosa; y 10-30 % de lignina.
[0092] Los materiales celulósicos adecuados incluyen residuos de cultivos energéticos herbáceos y leñosos, así como cultivos agrícolas, es decir, partes de plantas, principalmente tallos y hojas, que no se eliminan de los campos con el producto alimenticio primario o de fibra. Los ejemplos incluyen desechos agrícolas como bagazo de caña de azúcar, cáscaras de arroz, fibra de maíz (incluidos tallos, hojas, cáscaras y mazorcas), paja de trigo, paja de arroz, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de cítricos, cáscaras de cítricos; desechos forestales, como madera dura y blanda, y residuos de madera dura y blanda de las operaciones madereras; desechos de madera, tales como desechos de aserraderos (astillas de madera, serrín) y desechos de plantas de celulosa; desechos urbanos como fracciones de papel de desechos sólidos urbanos, desechos de madera urbana y desechos verdes urbanos como recortes de césped municipal; y desechos de construcción de madera. Los productos celulósicos adicionales incluyen cultivos celulósicos dedicados como el pasto varilla, el miscanto de madera de álamo híbrido, la fibra de caña y la fibra de sorgo. Los azúcares de cinco carbonos que se producen a partir de dichos materiales incluyen la xilosa.
[0093] Los materiales celulósicos se tratan para aumentar la eficiencia con la que el microbio puede utilizar los azúcares contenidos en los materiales. La divulgación describe métodos para el tratamiento de materiales celulósicos después de una explosión de ácido, de modo que los materiales sean adecuados para su uso en un cultivo heterotrófico de microalgas. Como se ha discutido anteriormente, la biomasa lignocelulósica se compone de varias fracciones que incluyen celulosa, un polímero cristalino de glucosa beta 1,4 enlazada (un azúcar de seis carbonos), hemicelulosa, un polímero más débilmente asociado compuesto predominantemente por xilosa (un azúcar de cinco carbonos) y en menor medida mañosa, galactosa, arabinosa, lignina, un polímero aromático complejo compuesto por alcohol sinapílico y sus derivados, y pectinas, que son cadenas lineales de un ácido poligalacturónico alfa 1,4 enlazado. Debido a la estructura polimérica de la celulosa y la hemicelulosa, los azúcares (por ejemplo, glucosa monomérica y xilosa) que hay en ellas no están en una forma que pueda ser utilizada (metabolizada) eficientemente por muchos microbios. Para tales microbios, el procesamiento adicional de la biomasa celulósica para generar los azúcares monoméricos que componen los polímeros puede ser muy útil para garantizar que los materiales celulósicos se utilicen eficientemente como materia prima (fuente de carbono).
[0094] La celulosa o la biomasa celulósica se somete a un proceso, denominado "explosión", en el que la biomasa se trata con ácido sulfúrico (u otro ácido) diluido a temperatura y presión elevadas. Este proceso acondiciona la biomasa de modo que pueda someterse eficazmente a hidrólisis enzimática de las fracciones celulósica y hemicelulósica en monómeros de glucosa y xilosa. Los azúcares monoméricos resultantes se denominan azúcares celulósicos. Los microorganismos pueden utilizar posteriormente azúcares celulósicos para producir una variedad de metabolitos (por ejemplo, lípidos). La etapa de explosión de ácido da como resultado una hidrólisis parcial de la fracción de hemicelulosa a monosacáridos constituyentes. Estos azúcares pueden liberarse completamente de la biomasa con un tratamiento adicional. En algunas realizaciones, el tratamiento adicional es un tratamiento hidrotérmico que incluye el lavado del material explotado con agua caliente, lo que elimina contaminantes como las sales. Esta etapa no es necesaria para las fermentaciones de etanol celulósico debido a las concentraciones de azúcar más diluidas utilizadas en tales procesos. En otras realizaciones, el tratamiento adicional es un tratamiento adicional con ácido. En otras, el tratamiento adicional es la hidrólisis enzimática del material explosionado. Estos tratamientos también se pueden utilizar en cualquier combinación. El tipo de tratamiento puede afectar al tipo de azúcares liberados (por ejemplo, cinco azúcares de carbono frente a seis azúcares de carbono) y a la etapa en la que se liberan en el proceso. Como consecuencia, se pueden crear diferentes corrientes de azúcares, tanto predominantemente de cinco como de seis carbonos. Por tanto, estas corrientes enriquecidas de cinco o seis carbonos pueden dirigirse a microorganismos específicos con diferentes capacidades de utilización del carbono.
[0095] Los métodos de la presente invención implican típicamente la fermentación a densidades celulares más altas que las que se logran en la fermentación con etanol. Debido a las densidades más altas de los cultivos para la producción de aceite celulósico heterotrófico, la fuente de carbono fijo (por ejemplo, la(s) corriente(s) de azúcar derivada de celulosa) está preferiblemente en forma concentrada. El nivel de glucosa del material celulósico despolimerizado es preferiblemente al menos 300 g/litro, al menos 400 g/litro, al menos 500 g/litro o al menos 600 g/litro antes de la etapa de cultivo, que opcionalmente es un cultivo por lote alimentado en el que el material se suministra a las células a lo largo del tiempo a medida que las células crecen y acumulan lípidos. Las corrientes de azúcar celulósico no se utilizan en este rango de concentración o cerca de él en la producción de etanol celulósico. Por tanto, para generar y mantener densidades celulares muy elevadas durante la producción de aceite lignocelulósico, las materias primas de carbono deben suministrarse a los cultivos heterótrofos en una forma altamente concentrada. Sin embargo, cualquier componente de la corriente de alimentación que no sea un sustrato para el microorganismo oleaginoso y que no sea metabolizado por él se acumulará en el biorreactor, lo que puede provocar problemas si el componente es tóxico o inhibe la generación del producto final deseado. Si bien la lignina y los subproductos derivados de la lignina, los subproductos derivados de los carbohidratos como los furfurales y los hidroximetil furfurales y las sales derivadas de la generación de los materiales celulósicos (tanto en el proceso de explosión como en el posterior proceso de neutralización), e incluso los azúcares no metabolizados de pentosa/hexosa pueden presentar problemas en las fermentaciones etanólicas, estos efectos se amplifican significativamente en un proceso en el que su concentración en la materia prima inicial es alta. Para lograr concentraciones de azúcar en el rango de 300 g/l (o más) para azúcares de seis carbonos que pueden usarse en la producción a gran escala del aceite lignocelulósico descrito en la presente invención, la concentración de estos materiales tóxicos puede ser 20 veces mayor que las concentraciones típicamente presentes en fermentaciones etanólicas de biomasa celulósica.
[0096] El tratamiento del proceso de explosión del material celulósico utiliza cantidades significativas de ácido sulfúrico, calor y presión, liberando así subproductos de carbohidratos, a saber, furfurales e hidroximetil furfurales. Los furfurales y los hidroximetil furfurales se producen durante la hidrólisis de la hemicelulosa mediante la deshidratación de la xilosa en furfural y agua. En algunas realizaciones, estos subproductos (por ejemplo, furfurales e hidroximetil furfurales) se retiran del material lignocelulósico sacarificado antes de su introducción en el biorreactor. En ciertas realizaciones, el proceso para eliminar los subproductos de carbohidratos es un tratamiento hidrotérmico de los materiales celulósicos explosionados. Además, la presente invención proporciona métodos en los que se utilizan cepas capaces de tolerar compuestos tales como furfurales o hidroximetil furfurales para la producción de aceite lignocelulósico. En otra realización, la presente invención también proporciona métodos y microorganismos que no solo son capaces de tolerar furfurales en el medio de fermentación, sino que, de hecho, son capaces de metabolizar estos subproductos durante la producción de aceite lignocelulósico.
[0097] El proceso de explosión también genera niveles importantes de sales. Por ejemplo, las condiciones típicas de explosión pueden dar lugar a conductividades superiores a 5 mS/cm cuando la biomasa celulósica explosionada se resuspende en una proporción de agua:sólidos de 10: 1 (peso seco). La biomasa explosionada diluida puede someterse a sacarificación enzimática y el sobrenadante resultante se concentra hasta 25 veces para su uso en el biorreactor. El nivel de sal (medido mediante la conductividad) en las corrientes de azúcar concentrado puede ser inaceptablemente alto (equivalentes de hasta 1.5 M de Na+). También se generan sales adicionales tras la neutralización de los materiales explosionados para el posterior proceso de sacarificación enzimática. Se proporcionan métodos para eliminar estas sales de modo que la corriente o corrientes de azúcar celulósico concentrado resultante se puedan usar en procesos heterotróficos para producir aceite lignocelulósico. En algunas realizaciones, el método para eliminar estas sales es la desionización con resinas, tales como, entre otras, DOWEX Marathon MR3. En determinadas realizaciones, la etapa de desionización con resina se produce antes de la concentración de azúcar o el ajuste del pH y el tratamiento hidrotérmico de la biomasa antes de la sacarificación, o cualquier combinación de lo anterior; en otras realizaciones, la etapa se realiza después de uno o más de estos procesos. En otras realizaciones, el proceso de explosión en sí se cambia para evitar la generación de sales a niveles inaceptablemente altos. Por ejemplo, una alternativa adecuada a la explosión del ácido sulfúrico (u otro ácido) de la biomasa celulósica es el despulpado mecánico para hacer que la biomasa celulósica sea receptiva a la hidrólisis enzimática (sacarificación). En otras realizaciones, se usan cepas nativas de microorganismos resistentes a altos niveles de sales o cepas manipuladas genéticamente con resistencia a altos niveles de sales.
[0098] Una realización preferida para el proceso de preparación de biomasa celulósica explosionada para su uso en la producción de aceite lignocelulósico heterotrófico usando microbios oleaginosos. Una primera etapa comprende el ajuste del pH de la biomasa celulósica explosionada resuspendida en el intervalo de 5.0-5.3 seguido de tres lavados de la biomasa celulósica. Esta etapa de lavado se puede realizar mediante una variedad de medios que incluyen el uso de resinas de desalinización e intercambio iónico, ósmosis inversa, tratamiento hidrotérmica (como se ha descrito anteriormente) o simplemente resuspensión y centrifugación repetidas en agua desionizada. Esta etapa de lavado da como resultado una corriente celulósica cuya conductividad está entre 100-300 pS/cm y la eliminación de cantidades significativas de furfurales e hidroximetil furfurales. Los decantados de esta etapa de lavado se pueden guardar para concentrar los azúcares de cinco carbonos liberados de la fracción de hemicelulosa. Una segunda etapa comprende la sacarificación enzimática de la biomasa celulósica lavada. En una realización preferida, se usa Accellerase (Genencor). Una tercera etapa comprende la recuperación de azúcares mediante centrifugación o decantación y aclarado de la biomasa sacarificada. La biomasa resultante (sólidos) es un componente rico en lignina y denso en energía que puede usarse como combustible o enviarse a la basura. Se recoge la corriente de azúcar recuperada en el proceso de centrifugación/decantación y enjuague. Una cuarta etapa comprende la microfiltración para eliminar los sólidos contaminantes con la recuperación del permeato. Una quinta etapa comprende un paso de concentración que se puede lograr usando un evaporador de vacío. Esta etapa puede incluir opcionalmente la adición de agentes antiespumantes como P'2000 (Sigma/Fluka), que a veces es necesaria debido al contenido de proteínas de la materia prima de azúcar resultante.
[0099] En otra realización de los métodos de la invención, la fuente de carbono es glicerol, incluyendo el subproducto de glicerol acidulado y no acidulado de la transesterificación del biodiesel. En una realización, la fuente de carbono incluye glicerol y al menos otra fuente de carbono. En algunos casos, todo el glicerol y las otras fuentes de carbono fijo se suministran al microorganismo al comienzo de la fermentación. En algunos casos, el glicerol y las otras fuentes de carbono fijo se suministran al microorganismo simultáneamente en una proporción predeterminada. En algunos casos, el glicerol y las otras fuentes de carbono fijo se suministran a los microbios a una velocidad predeterminada durante el transcurso de la fermentación.
[0100] Algunas microalgas se dividen más rápidamente en presencia de glicerol que en presencia de glucosa (ver Pub. de PCT n.° 2008/151149). En estos casos, los procesos de crecimiento en dos etapas en los que las células se alimentan primero con glicerol para aumentar rápidamente la densidad celular y luego se alimentan con glucosa para acumular lípidos pueden mejorar la eficiencia con la que se producen los lípidos. El uso del subproducto de glicerol del proceso de transesterificación proporciona importantes ventajas económicas cuando se vuelve a introducir en el proceso de producción. También se proporcionan otros métodos de alimentación, como mezclas de glicerol y glucosa. La alimentación con estas mezclas también genera los mismos beneficios económicos. Además, la divulgación describe métodos para alimentar a microalgas con azúcares alternativos como sacarosa en varias combinaciones con glicerol.
[0101] En otra realización de los métodos de la invención, la fuente de carbono es azúcar invertido. El azúcar invertido se produce al dividir la sacarosa en sus componentes monosacáridos, fructosa y glucosa. La producción de azúcar invertido se puede lograr mediante varios métodos que se conocen en la técnica. Uno de estos métodos consiste en calentar una solución acuosa de sacarosa. A menudo, se emplean catalizadores para acelerar la conversión de sacarosa en azúcar invertido. Estos catalizadores pueden ser biológicos, por ejemplo, se pueden añadir enzimas tales como invertasas y sacarasas a la sacarosa para acelerar la reacción de hidrólisis para producir azúcar invertido. El ácido es un ejemplo de catalizador no biológico que, cuando se combina con calor, puede acelerar la reacción de hidrólisis. Una vez que se fabrica el azúcar invertido, es menos propenso a la cristalización en comparación con la sacarosa y, por lo tanto, proporciona ventajas para el almacenamiento y en la fermentación por lote alimentado, que en el caso del cultivo heterotrófico de microbios, incluyendo las microalgas, existe la necesidad de una fuente de carbono concentrado. En una realización, la fuente de carbono es azúcar invertido, preferiblemente en forma concentrada, preferiblemente de al menos 800 g/litro, al menos 900 g/litro, al menos 1000 g/litro o al menos 1100 g/litro antes de la etapa de cultivo, que es opcionalmente un cultivo por lote alimentado. El azúcar invertido, preferiblemente en forma concentrada, se suministra a las células a lo largo del tiempo a medida que las células crecen y acumulan lípidos.
[0102] En otra realización de los métodos de la invención, la fuente de carbono es sacarosa, que incluye una materia prima compleja que contiene sacarosa, por ejemplo, jugo de caña espeso procedente del procesamiento de la caña de azúcar. Debido a las densidades más altas de los cultivos para la producción de aceite heterotrófica, la fuente de carbono fijo (por ejemplo, sacarosa, glucosa, etc.) está preferiblemente en forma concentrada, preferiblemente de al menos 500 g/litro, al menos 600 g/litro, al menos 700 g/litro o al menos 800 g/litro de la fuente de carbono fijo antes de la etapa de cultivo, que es opcionalmente un cultivo por lote alimentado en el que el material se suministra a las células a lo largo del tiempo a medida que las células crecen y acumulan lípidos. En algunos casos, la fuente de carbono es sacarosa en forma de jugo de caña espeso, preferiblemente en forma concentrada, preferiblemente al menos con un 60 % de sólidos o aproximadamente 770 g/litro de azúcar, al menos con un 70 % de sólidos o aproximadamente 925 g/litro de azúcar o al menos con un 80 % de sólidos o aproximadamente 1125 g/litro de azúcar antes de la etapa de cultivo, que es opcionalmente un cultivo por lote alimentado. El jugo de caña espeso concentrado se suministra a las células con el tiempo a medida que las células crecen y acumulan lípidos.
[0103] En una realización, el medio de cultivo incluye además al menos una enzima de utilización de sacarosa. En algunos casos, el medio de cultivo incluye sacarosa invertasa. En una realización, la enzima sacarosa invertasa es una enzima sacarosa invertasa secretable codificada por un gen de sacarosa invertasa exógeno expresado por la población de microorganismos. Por tanto, en algunos casos, como se describe con más detalle en la sección IV, más adelante, la microalga ha sido modificada genéticamente para expresar una enzima de utilización de sacarosa, por ejemplo, un transportador de sacarosa, una sacarosa invertasa, una hexoquinasa, una glucoquinasa o una fructoquinasa.
[0104] Las materias primas complejas que contienen sacarosa incluyen las melazas de desecho del procesamiento de la caña de azúcar; el uso de este producto de desecho de bajo valor del procesamiento de la caña de azúcar puede proporcionar importantes ahorros de costes en la producción de hidrocarburos y otros aceites. Otra materia prima compleja con contenido de sacarosa que es útil en los métodos de la invención es el sorgo, incluyendo el jarabe de sorgo y el sorgo puro. El jarabe de sorgo se produce a partir del jugo de la caña de sorgo dulce. Su perfil glucémico se compone principalmente de glucosa (dextrosa), fructosa y sacarosa.
4. Producción de aceite
[0105] Para la producción de aceite de acuerdo con los métodos de la invención, es preferible cultivar las células en la oscuridad como es el caso, por ejemplo, cuando se utilizan fermentadores extremadamente grandes (40 000 litros y más grandes) que no permiten que la luz incida sobre el cultivo. Las especies de Prototheca se cultivan y propagan para la producción de aceite en un medio que contiene una fuente de carbono fijo y en ausencia de luz; dicho crecimiento se conoce como crecimiento heterótrofo.
[0106] Como ejemplo, se introduce en el medio un inóculo de células de microalgas oleaginosas productoras de lípidos; hay un periodo de retraso (fase de retraso) antes de que las células comiencen a propagarse. Después del periodo de retraso, la tasa de propagación aumenta de manera constante y entra en la fase logarítmica o exponencial. A la fase exponencial le sigue a su vez una deceleración de la propagación debido a la disminución de nutrientes como el nitrógeno, el aumento de sustancias tóxicas y los mecanismos de detección de quórum. Después de esta deceleración, la propagación se detiene y las células entran en una fase estacionaria o en un estado de crecimiento estable, dependiendo del entorno particular proporcionado a las células. Para obtener biomasa rica en lípidos, el cultivo generalmente se cosecha mucho después del final de la fase exponencial, que puede finalizarse temprano al permitir que el nitrógeno u otro nutriente clave (que no sea el carbono) se agote, lo que obliga a las células a convertir las fuentes de carbono presente en exceso, en lípidos. Los parámetros de las condiciones de cultivo se pueden manipular para optimizar la producción total de aceite, la combinación de especies de lípidos producidas y/o la producción de un aceite específico.
[0107] Tal como se ha comentado anteriormente, se usa un biorreactor o fermentador para permitir que las células experimenten las diversas fases de su ciclo de crecimiento. Como ejemplo, se puede introducir un inóculo de células productoras de lípidos en un medio seguido de un periodo de retraso (fase de retraso) antes de que las células comiencen a crecer. Después del periodo de retraso, la tasa de crecimiento aumenta de manera constante y entra en la fase logarítmica o exponencial. A la fase exponencial le sigue a su vez una deceleración del crecimiento debido a la disminución de nutrientes y/o al aumento de sustancias tóxicas. Después de esta deceleración, el crecimiento se detiene y las células entran en una fase estacionaria o en un estado estable, dependiendo del entorno particular proporcionado a las células. La producción de lípidos por las células descritas en el presente documento puede ocurrir durante la fase logarítmica o posteriormente, incluyendo la fase estacionaria en la que se suministran o aún están disponibles los nutrientes, para permitir la continuación de la producción de lípidos en ausencia de división celular.
[0108] Preferiblemente, los microorganismos cultivados usando las condiciones descritas en el presente documento y conocidas en la técnica comprenden al menos un 20 % en peso de lípidos, preferiblemente al menos un 40 % en peso, más preferiblemente al menos un 50 % en peso y lo más preferible al menos un 60 % en peso. Las condiciones del proceso se pueden ajustar para aumentar el rendimiento de lípidos adecuados para un uso particular y/o para reducir el coste de producción. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se cultiva una microalga en presencia de una concentración limitante de uno o más nutrientes como, por ejemplo, nitrógeno, fósforo o azufre, mientras se proporciona un exceso de energía de carbono fijo como la glucosa. La limitación de nitrógeno tiende a aumentar la producción de lípidos microbianos sobre la producción de lípidos microbianos en un cultivo en el que se proporciona nitrógeno en exceso. En realizaciones particulares, el aumento en el rendimiento lipídico es al menos: un 10 %, un 50 %, un 100 %, un 200 % o un 500 %. El microbio se puede cultivar en presencia de una cantidad limitante de un nutriente durante una parte del periodo de cultivo total o durante todo el periodo. En realizaciones particulares, la concentración de nutrientes se somete a ciclos entre una concentración limitante y una concentración no limitante al menos dos veces durante el periodo de cultivo total. El contenido de lípidos de las células puede aumentarse continuando el cultivo durante periodos de tiempo más prolongados mientras se proporciona un exceso de carbono pero con contenido de nitrógeno limitado o nulo.
[0109] En otra realización, el rendimiento lipídico aumenta cultivando una microalga productora de lípidos en presencia de uno o varios cofactores para una enzima de la ruta lipídica (por ejemplo, una enzima sintética de ácidos grasos). Generalmente, la concentración de los cofactores es suficiente para aumentar el rendimiento de los lípidos microbianos (por ejemplo, ácidos grasos) sobre el rendimiento de los lípidos microbianos en ausencia de los cofactores. En una realización particular, los cofactores se suministran al cultivo incluyendo en el cultivo una microalga que contiene un gen exógeno que codifica los cofactores. Alternativamente, se pueden proporcionar cofactores a un cultivo mediante la inclusión de una microalga que contiene un gen exógeno que codifica una proteína que participa en la síntesis del cofactor. En determinadas realizaciones, los cofactores adecuados incluyen cualquier vitamina requerida por una enzima de la ruta lipídica como, por ejemplo, biotina o pantotenato. Los genes que codifican cofactores adecuados para su uso en la invención o que participan en la síntesis de dichos cofactores son bien conocidos y pueden introducirse en microalgas, usando constructos y técnicas como los descritas anteriormente.
[0110] Los ejemplos específicos de biorreactores, condiciones de cultivo y métodos de crecimiento y propagación heterótrofos descritos en el presente documento pueden combinarse de cualquier manera adecuada para mejorar las eficiencias del crecimiento microbiano y la producción de lípidos y/o proteínas.
[0111] Se ha generado biomasa de microalgas con un alto porcentaje de acumulación de aceite/lípidos por peso seco utilizando diferentes métodos de cultivo, los cuales son conocidos en la técnica (ver Pub. de PCT n.° 2008/151149). La biomasa de microalgas generada por los métodos de cultivo descritos en este documento y útil de acuerdo con la presente invención comprende al menos un 10 % de aceite de microalgas en peso seco. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas comprende al menos un 25 %, al menos un 50 %, al menos un 55 % o al menos un 60 % de aceite de microalgas en peso seco. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas contiene del 10 al 90 % de aceite de microalgas, del 25 al 75 % de aceite de microalgas, del 40 al 75 % de aceite de microalgas o del 50 al 70 % de aceite de microalgas en peso seco.
[0112] El aceite de microalgas de la biomasa descrita en el presente documento, o extraído de la biomasa para su uso en los métodos y composiciones descritos en el presente documento, puede comprender glicerolípidos con una o más cadenas laterales de ésteres de ácidos grasos distintas. Los glicerolípidos se componen de una molécula de glicerol esterificada en una, dos o tres moléculas de ácido graso, que pueden tener diferentes longitudes y diferentes grados de saturación. Las características de longitud y saturación de las moléculas de ácidos grasos (y los aceites de microalgas) pueden manipularse para modificar las propiedades o proporciones de las moléculas de ácidos grasos en los aceites de microalgas mediante condiciones de cultivo o mediante ingeniería de la ruta lipídica, como se describe con más detalle en la sección IV más adelante. Por lo tanto, se pueden preparar mezclas específicas de aceite de algas dentro de una única especie de alga mezclando la biomasa o el aceite de algas de dos o más especies de microalgas o mezclando aceite de algas con aceites de otras fuentes como soja, colza, canola, palma, palmiste, coco, maíz, residuos vegetales, sebo chino, oliva, girasol, semilla de algodón, grasa de pollo, sebo de res, sebo porcino, microalgas, macroalgas, microbios, cuphea, lino, cacahuete, grasa blanca de calidad, manteca de cerdo, camelina sativa , semilla de mostaza, anacardo, avena, lupino, kenaf, caléndula, cáñamo, café, linaza (lino), avellana, euforbia, semilla de calabaza, cilantro, camelia, sésamo, cártamo, arroz, árbol de tung, cacao, copra, amapola pium, ricino, nuez, jojoba, macadamia, nueces de Brasil, aguacate, petróleo o una fracción destilada de cualquiera de los aceites anteriores.
[0113] La composición del aceite, es decir, las propiedades y proporciones de los componentes de ácidos grasos de los glicerolípidos también pueden manipularse combinando biomasa o aceite de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunas realizaciones, al menos dos de las distintas especies de microalgas tienen diferentes perfiles de glicerolípidos. Las distintas especies de microalgas se pueden cultivar juntas o por separado tal como se describe en el presente documento, preferiblemente en condiciones heterótrofas, para generar los correspondientes aceites. Diferentes especies de microalgas pueden contener diferentes porcentajes de distintos componentes de ácidos grasos en los glicerolípidos de la célula.
[0114] Generalmente, las cepas de Prototheca tienen muy pocos o ningún ácido graso con la longitud de cadena C8-C14. Por ejemplo, Prototheca moriformis (UTEX 1435), Prototheca krugani (UTEX 329), Prototheca stagnora (UTEX 1442) y Prototheca zopfii (UTEX 1438) no contienen (o contienen cantidades indetectables de) ácidos grasos C8, contienen entre 0-0.01 % de ácidos grasos C10, entre 0.03-2.1 % de ácidos grasos C12 y entre 1.0­ 1.7 % de ácidos grasos C14.
[0115] En algunos casos, las cepas de Prototheca que contienen un transgén que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa que tiene actividad hacia el sustrato de acil-ACP graso de longitudes de cadena C8 o C8-10 tienen al menos un 1 %, al menos un 1.5 %, al menos un 2 %, al menos un 3 %, al menos un 4 %, al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 12 % o al menos un 15 % o más de ácidos grasos de longitud de cadena C8. En otros casos, las cepas de Prototheca que contienen un transgén que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa que tiene actividad frente al sustrato de acil-ACP graso de longitudes de cadena C10 tienen al menos un 1 %, al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 24 % o al menos un 25 % o más de ácidos grasos de longitud de cadena C10. En otros casos, las cepas de Prototheca que contienen un transgén que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa que tiene actividad hacia el sustrato de acil-ACP graso de longitud de cadena C12 tienen al menos un 1 %, al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 % al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 34 %, al menos un 35 % o al menos un 40 % o más de ácidos grasos de longitud de cadena C12. En otros casos, las cepas de Prototheca que contienen un transgén que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa que tiene actividad hacia el sustrato de acil-ACP graso de longitud de cadena C14 tienen al menos un 1 %, al menos un 2 %, al menos un 3 %, al menos un 4 %, al menos un 5 %, al menos un 6 %, al menos un 7 % al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 30 %, al menos un 43 % o al menos un 45 % o más de ácidos grasos de longitud de cadena C14.
[0116] En ejemplos no limitantes, las cepas de Prototheca que contienen un transgén que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa que tiene actividad hacia el sustrato de acil-ACP graso de longitud de cadena C8 tienen entre un 1 %-25 %, o entre un 1 %-15 %, preferiblemente un 1.8-12.29 % de ácidos grasos de longitud de cadena C8. En otros ejemplos no limitantes, las cepas de Prototheca que contienen un transgén que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa que tiene actividad hacia el sustrato de acil-ACP graso de longitud de cadena C10 tienen entre un 1 %-50 %, o entre un 1 %-25 %, preferiblemente un 1.91-23.97 % de ácidos grasos de longitud de cadena C10. En otros ejemplos no limitantes, las cepas de Prototheca que contienen un transgén que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa que tiene actividad hacia el sustrato de acil-ACP graso de longitud de cadena C12 tienen entre un 5 %-50 %, o entre un 10 %-40 %, preferiblemente un 13.55-34.01 % de ácidos grasos de longitud de cadena C12. En otros ejemplos no limitantes, las cepas de Prototheca que contienen un transgén que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa que tiene actividad hacia el sustrato de acil-ACP graso de longitud de cadena C14 tienen entre un 1 %-60 %, o entre un 2 %-45 %, preferiblemente un 2.59-43.27 % de ácidos grasos de longitud de cadena C14. En otros ejemplos no limitantes, las cepas de Prototheca que contienen un transgén que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa que tiene una amplia especificidad hacia sustratos de acil-ACP graso de longitud de cadena de carbono variable tienen hasta un 30 %, hasta un 35 % o preferiblemente hasta un 39.45 % de ácidos grasos con una longitud de cadena C16. En algunos casos, las cepas de Prototheca que contienen un transgén que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa que tiene actividad hacia el sustrato de acil-ACP graso de longitudes de cadena entre C8 y C14 tienen entre un 1 %-75 %, o entre un 2 %-60 %, preferiblemente un 2.69­ 57.98 % de ácidos grasos de cadena media (C8-C14). En algunos casos, las cepas de Prototheca que contienen un transgén que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa que tiene actividad hacia sustratos de acil-ACP graso de longitudes de cadena entre C12 y C14 tienen al menos un 30 %, al menos un 40 % o al menos un 49 % de ácidos grasos C12-C14. En algunos casos, mantener las cepas de Prototheca transgénicas sometidas a una presión selectiva alta y constante para retener genes exógenos es beneficioso debido al aumento del ácido graso deseado de una longitud de cadena específica. También se pueden lograr altos niveles de retención de genes exógenos insertándolos en los cromosomas nucleares de las células usando vectores de recombinación homólogos y métodos descritos en el presente documento. Las células recombinantes que contienen genes exógenos pueden integrarse en cromosomas nucleares.
[0117] El aceite de microalgas también puede incluir otros constituyentes producidos por la microalga o incorporados al aceite de microalgas a partir del medio de cultivo. Estos otros constituyentes pueden estar presentes en cantidades variables dependiendo de las condiciones de cultivo utilizadas para cultivar las microalgas, las especies de microalgas, el método de extracción utilizado para recuperar el aceite de microalgas de la biomasa y otros factores que pueden afectar la composición del aceite de microalgas. Los ejemplos no limitantes de tales constituyentes incluyen carotenoides, presentes de 0.01-0.5 mcg/g, 0.025-0.3 mcg/g, preferiblemente de 0.05 a 0.244 microgramos/gramo de aceite; clorofila A presente de 0.01-0.5 mcg/g, 0.025-0.3 mcg/g, preferiblemente de 0.045 a 0.268 microgramos/gramo de aceite; clorofila total de menos de 0.1 mcg/g, menos de 0.05 mcg/g, preferiblemente menos de 0.025 microgramos/gramo de aceite; gamma tocoferol presente de 1-300 mcg/g, 35-175 mcg/g, preferiblemente 38.3-164 microgramos/gramo de aceite; tocoferoles totales presentes de 10-500 mcg/g, 50-300 mcg/g, preferiblemente de 60.8 a 261.7 microgramos/gramo de aceite; menos del 1 %, menos del 0.5 %, preferiblemente menos del 0.25 % de brasicasterol, campesterol, estigmasterol o betasitosterol; tocotrienoles totales de menos de 400 mcg/g, preferiblemente menos de 300 microgramos/gramo de aceite; o tocotrienoles totales presentes de 100-500 mcg/g, 225-350 mcg/g, preferiblemente de 249.6 a 325.3 microgramos/gramo de aceite.
[0118] Los otros constituyentes pueden incluir, entre otros, fosfolípidos, tocoferoles, tocotrienoles, carotenoides (por ejemplo, alfacaroteno, betacaroteno, licopeno, etc.), xantofilas (por ejemplo, luteína, zeaxantina, alfacriptoxantina y beta-critoxantina) y varios compuestos orgánicos o inorgánicos. En algunos casos, el aceite extraído de la especie Prototheca comprende entre 0.001-0.01 mcg/g, 0.0025-0.05 mcg/g, preferiblemente de 0.003 a 0.039 microgramos de luteína/gramo de aceite, menos de 0.01 mcg/g, menos de 0.005 mcg/g, preferiblemente menos de 0.003 microgramos de licopeno/gramo de aceite; y menos de 0.01 mcg/g, menos de 0. 005 mcg/g, preferiblemente menos de 0.003 microgramos de betacaroteno/gramo de aceite.
[0119] En algunas realizaciones, se describe una célula microbiana oleaginosa que comprende un aceite de triglicéridos, en la que el perfil de ácidos grasos del aceite de triglicéridos es menos del 7 %, menos del 5 %, menos del 3 %, menos del 1 % o el 0 % de C18: 2.
[0120] En algunas realizaciones, se describe una composición oleaginosa de aceite de triglicéridos microbianos, en la que el perfil de ácidos grasos del aceite de triglicéridos es menos del 7 %, menos del 5 %, menos del 3 %, menos del 1 % o el 0 % de C18: 2.
[0121] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición oleaginosa de aceite de triglicéridos microbianos que tiene un perfil de ácidos grasos de menos del 7 %, menos del 5 %, menos del 3 %, menos del 1 % o el 0 % de C18: 2, en el que el método comprende las etapas de: (a) cultivar una población de células microbianas oleaginosas en un medio de cultivo hasta que al menos el 10 % del peso de las células secas de las células microbianas oleaginosas sea aceite de triglicéridos; y (b) aislar la composición de aceite de triglicéridos de las células microbianas oleaginosas.
III. MÉTODOS Y MATERIALES DE INGENIERÍA GENÉTICA
[0122] La presente divulgación describe métodos y materiales para modificar genéticamente microorganismos, que incluyen células de Prototheca y células huésped recombinantes, útiles en los métodos de la presente invención, que incluyen, entre otras, células huésped recombinantes de Prototheca moriformis, Prototheca zopfii, Prototheca krugani y Prototheca stagnora. La descripción de estos métodos y materiales se divide en subsecciones para conveniencia del lector. En la subsección 1, se describen los métodos de transformación. En la subsección 2, se describen los métodos de ingeniería genética que utilizan recombinación homóloga. En la subsección 3, se describen los vectores y componentes de expresión.
[0123] En ciertas realizaciones, es deseable modificar genéticamente un microorganismo para mejorar la producción de lípidos, modificar las propiedades o proporciones de los componentes generados por el microorganismo o para mejorar o proporcionar de novo características de crecimiento en una variedad de materias primas.
[0124] Se pueden generar promotores, ADNc y 3'UTR, así como otros elementos de los vectores, mediante técnicas de clonación utilizando fragmentos aislados de fuentes nativas (ver por ejemplo Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. (3a edición, 2001, Cold Spring Harbor Press; y la patente EE. UU.
4.683.202). Alternativamente, los elementos se pueden generar sintéticamente usando métodos conocidos (ver, por ejemplo, Gene, 16 de octubre de 1995; 164 (1): 49-53).
1. Métodos de ingeniería - Transformación
[0125] Las células se pueden transformar mediante cualquier técnica adecuada incluyendo, p. ej., biolística, electroporación (ver Maruyama et al. (2004), Biotechnology Techniques 8: 821-826), transformación de perlas de vidrio y transformación de filamentos de carburo de silicio. Otro método que puede usarse consiste en formar protoplastos y usar CaCl2 y polietilenglicol (PEG) para introducir ADN recombinante en células de microalgas (ver Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4: 63-73, que describe el uso de este método para la transformación de Chlorella elipsoidea). La cotransformación de microalgas se puede utilizar para introducir dos moléculas vector distintas en una célula simultáneamente (ver por ejemplo Protist, diciembre de 2004; 155 (4): 381-93).
[0126] Se pueden usar también métodos biolísticos (ver, por ejemplo, Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6:299 302, patente EE. UU. n.° 4.945.050); electroporación (Fromm et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (EE. UU.) (1985) 82:5824 5828); uso de un rayo láser, microinyección o cualquier otro método capaz de introducir ADN en una microalga para la transformación de una célula de Prototheca.
[0127] Puede emplearse cualquier técnica conveniente para introducir un transgén en un microorganismo. Dawson et al. (1997) (supra) describieron el uso de bombardeo con microproyectiles para introducir el gen de la nitrato reductasa (NR) de Chlorella vulgaris en mutantes de Chlorella sorokiniana con deficiencia de NR, dando como resultado transformantes estables. En resumen, se recubrieron perlas de tungsteno de 0.4 micrómetros con plásmido; 3 X 107 células de C. sorokiniana se esparcieron en el tercio central de una placa de agar no selectivo y se bombardearon con el sistema PDS-1000/He Biolistic Particle Delivery® (Bio-Rad).
[0128] Un método preferido para introducir un transgén en un microorganismo es el método descrito por Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4: 63-73. Kim describe la transformación de protoplastos de Chlorella elipsoidea mediante el uso de CaCl2 y polietilenglicol (PEG). En particular, los protoplastos se prepararon cultivando células de C. elipsoidea a una densidad de 1-2 X 108/ml. Las células se recuperaron y se lavaron mediante centrifugación durante 5 minutos a 1600 g y se resuspendieron en 5 ml de tampón fosfato (pH 6.0) que contenía sorbitol 0.6 M, manitol 0.6 M, celulosa al 4 % (peso/volumen) (Calbiochem), macerasa al 2 % (peso/volumen) (Calbiochem) y 50 unidades de pectinasa (Sigma). La suspensión celular se incubó a 25 °C durante 16 horas a oscuras con agitación suave. Los protoplastos resultantes se recuperaron mediante centrifugación a 400 g durante 5 minutos. El sedimento se resuspendió suavemente en 5 ml de medio f/2 que contenía sorbitol 0.6 M y manitol 0.6 M y se centrifugó a 400 g durante 5 minutos. Este sedimento se resuspendió en 1 ml de solución de sorbitol/manitol 0.6 M que contenía CaC^50 mM. Luego, se añadieron 5 mg de ADN transgénico, junto con 25 pg de ADN de timo de ternera (Sigma), a 107-108 protoplastos en 0.4 ml. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 200 pl de PNC (40 % polietilenglicol 4000, NaCl 0.8 M, CaCl250 Mm) y se mezclaron suavemente durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, se añadieron 0.6 ml de medio f/2 suplementado con solución de sorbitol/manitol 0.6 M, extracto de levadura al 1 % y glucosa al 1 % y las células transformadas se incubaron a 25 °C durante 12 horas a oscuras para la regeneración de la pared celular. Un método similar fue utilizado por Huang et al. (2007) (supra) para introducir un transgén que codifica mercurio reductasa en Chlorella sp. DT.
[0129] También se ha empleado la electroporación para transformar microorganismos, como la Chlorella. Según lo descrito por Maruyama et al. (2004), Biotechnology Techniques 8: 821-826, esta técnica se utilizó para introducir un transgén en protoplastos de Chlorella saccharophila c-211-1 a preparada a partir de las células en la fase estacionaria. La expresión transitoria del plásmido introducido se observó bajo una intensidad de campo de entre 600 y 900 V/cm, y una duración de pulso de alrededor de 400 ms, donde se determinó una alta permeabilidad de la membrana al FITC-dextrano de 70 kDa.
[0130] Se pueden encontrar ejemplos de expresión de transgenes en microorganismos en la literatura (ver por ejemplo Current Microbiology Vol. 35 (1997), págs. 356-362; Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. julio de 2000; 16 (4): 443-6; Current Microbiology Vol. 38 (1999), págs. 335-341; Appl Microbiol Biotechnol (2006) 72: 197-205; Marine Biotechnology 4, 63-73, 2002; Current Genetics 39: 5, 365-370 (2001); Plant Cell Reports 18: 9, 778-780, (1999); Biologia Plantarium 42 (2): 209-216, (1999); Plant Pathol. J 21 (1): 13-20, (2005)). Consulte también los ejemplos en el presente documento.
[0131] Los vectores para la transformación de microorganismos según la presente invención pueden prepararse mediante técnicas conocidas familiares para los expertos en la técnica. La secuencia de nucleótidos del constructo utilizado para la transformación de múltiples especies de Chlorella corresponde a la SEQ ID N.°: 8. En una realización, un diseño de vector de ejemplo para la expresión de un gen de lipasa en una microalga contiene un gen que codifica una lipasa en enlace operable con un promotor activo en microalgas. Alternativamente, si el vector no contiene un promotor en enlace operable con el gen de interés, el gen puede transformarse en las células de manera que se vuelva operativamente enlazado a un promotor endógeno en el punto de integración del vector. Se ha demostrado que el método de transformación sin promotor funciona en microalgas (ver por ejemplo Plant Journal 14: 4, (1998), págs. 441-447). El vector también puede contener un segundo gen que codifica una proteína que, por ejemplo, imparte resistencia a un antibiótico o herbicida, es decir, un marcador seleccionable. Opcionalmente, uno o ambos genes van seguidos de una secuencia no traducida 3' que contiene una señal de poliadenilación. Los casetes de expresión que codifican los dos genes pueden unirse físicamente en el vector o en vectores separados. También se puede utilizar la cotransformación de microalgas, en la que se utilizan simultáneamente distintas moléculas vector para transformar células (ver por ejemplo Protist, diciembre de 2004; 155 (4): 381-93). Las células transformadas pueden seleccionarse opcionalmente basándose en la capacidad de crecer en presencia del antibiótico u otro marcador seleccionable en condiciones en las que las células que carecen del casete de resistencia no crecerían.
2. Métodos de ingeniería - Recombinación homologa
[0132] La recombinación homóloga es la capacidad de las secuencias de ADN complementarias para alinear e intercambiar regiones de homología. El ADN transgénico ("donante") que contiene secuencias homólogas a las secuencias genómicas a las que apunta ("plantilla") se introduce en el organismo y luego se somete a recombinación dentro del genoma en el sitio de las correspondientes secuencias homólogas genómicas. Los pasos mecánicos de este proceso, en la mayoría de los casos, incluyen: (1) emparejamiento de segmentos de ADN homólogos; (2) introducción de roturas bicatenarias en la molécula de a Dn donante; (3) invasión de la molécula de ADN plantilla por los extremos del ADN del donante libre seguida de la síntesis de ADN; y (4) resolución de eventos de reparación de rotura de doble hebra que dan como resultado productos de recombinación finales.
[0133] La capacidad de llevar a cabo una recombinación homóloga en un organismo huésped tiene muchas implicaciones prácticas para lo que puede llevarse a cabo a nivel genético molecular y es útil en la generación de un microbio oleaginoso que puede producir aceites personalizados. Por su propia naturaleza, la recombinación homóloga es un evento de reconstrucción génica preciso, por lo que la mayoría de las líneas transgénicas generadas con la misma secuencia de direccionamiento serán esencialmente idénticas en términos de fenotipo, lo que requiere el cribado de muchos menos sucesos de transformación. La recombinación homóloga también apunta a los eventos de inserción de genes en el cromosoma del huésped, lo que da como resultado una excelente estabilidad genética, incluso en ausencia de selección genética. Debido a que diferentes loci cromosómicos afectarán probablemente a la expresión génica, incluso a partir de promotores/UTR heterólogos, la recombinación homóloga puede ser un método para consultar loci en un entorno genómico desconocido y para evaluar el impacto de estos entornos en la expresión génica.
[0134] Una aplicación de ingeniería genética particularmente útil que utiliza la recombinación homóloga es la cooptación de elementos reguladores huésped específicos, tales como promotores/UTR, para impulsar la expresión génica heteróloga de una manera muy específica. Por ejemplo, podría esperarse que la ablación o inactivación de genes/familias de genes de desaturasa con un gen heterólogo que codifica un marcador selectivo aumente el porcentaje global de ácidos grasos saturados producidos en la célula huésped. El ejemplo 11 describe los constructos de direccionamiento de recombinación homóloga y un ejemplo práctico de dichas ablaciones o inactivaciones de genes de desaturasa generadas en Prototheca moriformis.
[0135] Debido a que la recombinación homóloga es un evento de reconstrucción génica preciso, puede usarse para modificar con precisión cualquier nucleótido o nucleótidos dentro de un gen o una región de interés, siempre que se hayan identificado suficientes regiones flanqueantes. Por lo tanto, la recombinación homóloga puede usarse como un medio para modificar secuencias reguladoras que afectan a la expresión génica de ARN y/o las proteínas. También se puede utilizar para modificar regiones codificantes de proteínas en un esfuerzo por modificar las actividades enzimáticas tales como la especificidad, las afinidades y la Km del sustrato y causar así el cambio deseado en el metabolismo de la célula huésped. La recombinación homóloga proporciona un potente medio para manipular el genoma huésped, lo que da como resultado la selección de genes, la conversión de genes, la deleción de genes, la duplicación de genes, la inversión de genes y el intercambio de elementos reguladores de la expresión de genes como los promotores, los potenciadores y los 3'UTR.
[0136] La recombinación homóloga se puede lograr usando constructos de direccionamiento que contienen fragmentos de secuencias endógenas para "apuntar" al gen o región de interés dentro del genoma de la célula huésped endógena. Dichas secuencias de direccionamiento pueden estar ubicadas en el extremo 5' del gen o región de interés, en el extremo 3' del gen/región de interés o incluso flanquear el gen/región de interés. Dichos constructos de direccionamiento se pueden transformar en la célula huésped como un ADN plasmídico superenrollado con un esqueleto de vector adicional, un producto de PCR sin esqueleto de vector o como una molécula linealizada. En algunos casos, puede ser beneficioso exponer primero las secuencias homólogas dentro del ADN transgénico (ADN donante) con una enzima de restricción. Este paso puede aumentar la eficiencia de la recombinación y disminuir la aparición de eventos no deseados. Otros métodos para aumentar la eficacia de la recombinación incluyen el uso de PCR para generar ADN transgénico transformante que contiene extremos lineales homólogos a las secuencias genómicas a las que se apunta.
[0137] Con fines de ilustración no limitante, las regiones de las secuencias de ADN del donante útiles para la recombinación homóloga incluyen la región de ADN KE858 en Prototheca moriformis. KE858 es un fragmento genómico de 1.3 kb que abarca parte de la región codificante de una proteína que comparte homología con la familia de proteínas del ARN de transferencia (ARNt). Las transferencias de Southern han demostrado que la secuencia de KE858 está presente en una sola copia en el genoma de Prototheca moriformis (UTEX 1435). Esta región y los ejemplos de uso de esta región para el direccionamiento de recombinación homóloga se han descrito en la solicitud PCT n.° PCT/US2009/66142. Otra región del ADN del donante que es útil son las porciones de la secuencia genómica del ARNr 6S. El uso de esta secuencia en recombinación homóloga en Prototheca moriformis se describe a continuación en los ejemplos.
3. Vectores y componentes vectoriales
[0138] Los vectores para la transformación de microorganismos pueden prepararse mediante técnicas conocidas y familiares para los expertos en la técnica en vista de la divulgación en el presente documento. Un vector normalmente contiene uno o más genes, en los que cada gen codifica la expresión de un producto deseado (el producto génico) y está operativamente enlazado a una o más secuencias de control que regulan la expresión génica o dirigen el producto génico a una ubicación particular en la célula recombinante. Para ayudar al lector, esta subsección se divide en subsecciones. La subsección A describe secuencias de control típicamente contenidas en vectores, así como nuevas secuencias de control. La subsección B describe genes típicamente contenidos en vectores así como nuevos métodos de optimización de codones y genes que se preparan usando dichos métodos proporcionados por la invención.
A. Secuencias de control
[0139] Las secuencias de control son ácidos nucleicos que regulan la expresión de una secuencia codificante o dirigen un producto génico a una ubicación particular dentro o fuera de una célula. Las secuencias de control que regulan la expresión incluyen, por ejemplo, promotores que regulan la transcripción de una secuencia codificante y terminadores que terminan la transcripción de una secuencia codificante. Otra secuencia de control es una secuencia no traducida 3' ubicada al final de una secuencia codificante que codifica una señal de poliadenilación. Las secuencias de control que dirigen productos génicos a ubicaciones particulares incluyen aquellas que codifican péptidos señal, que dirigen la proteína a la que están unidos a una ubicación particular dentro o fuera de la célula.
[0140] Por lo tanto, un diseño de vector de ejemplo para la expresión de un gen exógeno en una microalga contiene una secuencia codificante para un producto génico deseado (por ejemplo, un marcador seleccionable, una enzima de modificación de la ruta lipídica o una enzima de utilización de sacarosa) en enlace operable con un promotor activo en microalgas. Alternativamente, si el vector no contiene un promotor en enlace operable con la secuencia codificante de interés, la secuencia codificante puede transformarse en las células de manera que se vuelva operativamente enlazada a un promotor endógeno en el punto de integración del vector. Se ha demostrado que el método de transformación sin promotor funciona en microalgas (ver por ejemplo Plant Journal 14: 4, (1998), págs. 441-447).
[0141] Muchos promotores son activos en microalgas, incluyendo los promotores endógenos al alga que se está transformando, así como los promotores que no son endógenos al alga que se está transformando (es decir, promotores de otras algas, promotores de plantas superiores y promotores de virus de plantas o virus de algas ). Los promotores exógenos y/o endógenos ilustrativos que son activos en microalgas (así como los genes de resistencia a antibióticos funcionales en microalgas) se describen en la Pub. de PCT n.° 2008/151149 y las referencias allí citadas.
[0142] El promotor usado para expresar un gen exógeno puede ser el promotor naturalmente enlazado a ese gen o puede ser un gen heterólogo. Algunos promotores están activos en más de una especie de microalgas. Otros promotores son específicos de la especie. Los promotores ilustrativos incluyen promotores tales como p-tubulina de Chlamydomonas reinhardtii, utilizados en los ejemplos siguientes, y promotores virales, como el virus del mosaico de la coliflor (CMV) y el virus de la chlorella, que se ha demostrado que son activos en múltiples especies de microalgas (ver por ejemplo Plant Cell Rep. marzo de 2005; 23 (10-11): 727-35; J Microbiol. agosto de 2005; 43 (4): 361-5; Mar Biotechnol (NY). enero de 2002; 4 (1): 63-73). Otro promotor adecuado para su uso en la expresión de genes exógenos en Prototheca es el promotor de glutamato deshidrogenasa/5'UTR de Chlorella sorokiniana. Opcionalmente, se utilizan al menos 10, 20, 30, 40, 50 o 60 nucleótidos o más de estas secuencias que contienen un promotor. En la lista de secuencias de esta solicitud se enumeran promotores ilustrativos útiles para la expresión de genes exógenos en Prototheca, por ejemplo, el promotor del gen HUP1 de Chlorella (SEQ ID N.°: 1) y el promotor de nitrato reductasa de Chlorella elipsoidea (SEQ ID N.°: 2). Los promotores del virus de la Chlorella también se pueden utilizar para expresar genes en Prototheca, tales como las SEQ ID N.°: 1-7 de la patente EE. UU. 6.395.965. Se pueden encontrar promotores adicionales activos en Prototheca, por ejemplo, en Biochem Biophys Res Commun. 14 de octubre de 1994; 204 (1): 187-94; Plant Mol Biol. octubre de 1994; 26 (1): 85-93; Virology. 15 de agosto de 2004; 326 (1): 150-9; y Virology. 5 de enero de 2004; 318 (1): 214-23. Otros promotores útiles se describen en detalle en los ejemplos siguientes.
[0143] Generalmente, un promotor puede caracterizarse como constitutivo o inducible. Los promotores constitutivos están generalmente activos o funcionan para impulsar la expresión en todo momento (o en ciertos momentos del ciclo de vida celular) al mismo nivel. Por el contrario, los promotores inducibles están activos (o se vuelven inactivos) o aumentan o disminuyen significativamente solo en respuesta a un estímulo. Ambos tipos de promotores encuentran aplicación en los métodos descritos en este documento. Los promotores inducibles útiles incluyen aquellos que median la transcripción de un gen operativamente enlazado en respuesta a un estímulo, tal como una molécula pequeña proporcionada exógenamente (por ejemplo, glucosa, como en la SEQ ID N.°: 1), la temperatura (calor o frío), la falta de nitrógeno en medios de cultivo, etc. Los promotores adecuados pueden activar la transcripción de un gen esencialmente silencioso o aumentar, preferiblemente de manera sustancial, la transcripción de un gen operativamente enlazado que se transcribe a un nivel bajo. Los ejemplos siguientes describen promotores inducibles adicionales útiles en las células de Prototheca.
[0144] La inclusión de la secuencia de control de la región de terminación es opcional y, si se emplea, la elección es principalmente por conveniencia, ya que la región de terminación es relativamente intercambiable. La región de terminación puede ser nativa de la región de inicio de la transcripción (el promotor), puede ser nativa de la secuencia de a Dn de interés o puede obtenerse de otra fuente. Ver, por ejemplo, Chen y Orozco, Nucleic Acids Res. (1988) 16:8411.
[0145] La presente divulgación también describe secuencias de control y genes recombinantes y vectores que los contienen y que proporcionan la expresión compartimentada de un gen de interés. Los orgánulos para el direccionamiento son cloroplastos, plástidos, mitocondrias y retículo endoplásmico. Además, también se describen secuencias de control y genes recombinantes y vectores que las contienen y que proporcionan la secreción de una proteína fuera de la célula.
[0146] Las proteínas expresadas en el genoma nuclear de la Prototheca se pueden dirigir al plástido utilizando señales de direccionamiento de plástidos. Las secuencias de direccionamiento de plástidos endógenas a la Chlorella son conocidas, por ejemplo, los genes en el genoma nuclear de la Chlorella que codifican proteínas dirigidas al plástido; ver, por ejemplo, los números de acceso de GenBank AY646197 y AF499684 y, en una realización, dichas secuencias de control se utilizan en los vectores descritos en el presente documento para dirigir la expresión de una proteína a un plástido de Prototheca.
[0147] Los ejemplos siguientes describen el uso de secuencias de direccionamiento de plástidos de algas para dirigir proteínas heterólogas al compartimento correcto en la célula huésped. Las bibliotecas de ADNc se hicieron utilizando células de Prototheca moriformis y Chlorella Protothecoides y se describen en la solicitud PCT n.° PCT/US2009/066142.
[0148] En otra realización, la expresión de un polipéptido en Prototheca está dirigida al retículo endoplásmico. La inclusión de una señal apropiada de retención o clasificación en un vector de expresión garantiza que las proteínas se retengan en el retículo endoplásmico (RE) y no vayan corriente abajo hacia el Golgi. Por ejemplo, el vector IMPACTVECTOR1.3, de Wageningen UR-Plant Research International, incluye la bien conocida señal de retención o clasificación KDEL. Con este vector, la retención del ER tiene una ventaja práctica porque se ha sabido que mejora los niveles de expresión 5 veces o más. La razón principal de esto parece ser que el RE contiene concentraciones más bajas y/o diferentes proteasas responsables de la degradación postraduccional de las proteínas expresadas que las que están presentes en el citoplasma. Se conocen señales de retención del ER funcionales en microalgas verdes. Por ejemplo, ver Proc Natl Acad Sci USA. 26 de abril de 2005; 102 (17): 6225­ 30.
[0149] En otra realización, se dirige un polipéptido para su secreción fuera de la célula al medio de cultivo. Ver Hawkins et al., Current Microbiology Vol. 38 (1999), págs. 335-341 para obtener ejemplos de señales de secreción activas en Chlorella que se puede utilizar en Prototheca.
[0150] Muchos promotores son activos en microalgas, incluyendo los promotores endógenos al alga que se está transformando, así como los promotores que no son endógenos al alga que se está transformando (es decir, promotores de otras algas, promotores de plantas superiores y promotores de virus de plantas o virus de algas ). Los promotores exógenos y/o endógenos que son activos en microalgas y los genes de resistencia a antibióticos funcionales en microalgas se describen, por ejemplo, en Curr Microbiol. diciembre de 1997; 35 (6): 356-62 (Chlorella vulgaris); Mar Biotechnol (NY). enero de 2002; 4 (1): 63-73 (Chlorella elipsoidea); Mol Gen Genet. 16 de octubre de 1996; 252 (5): 572-9 (Phaeodactylum tricornutum); Plant Mol Biol. abril de 1996; 31 (1): 1-12 (Volvox carteri); Proc Natl Acad Sci u Sa .22 de noviembre de 1994; 91 (24): 11562-6 (Volvox carteri); Falciatore A, Casotti R, Leblanc C, Abrescia C, Bowler C, PMID: 10383998, mayo de 1999; 1 (3): 239-251 (Laboratorio de Biología Vegetal Molecular, Stazione Zoologica, Villa Comunale, 1-80121 Nápoles, Italia) (Phaeodactylum tricornutum y Thalassiosira weissflogii); Plant Physiol. mayo de 2002; 129 (1): 7-12. (Porphyridium sp.); Proc Natl Acad Sci uSa . 21 de enero de 2003; 100 (2): 438-42. (Chlamydomonas reinhardtii); Proc Natl Acad Sci USA. febrero de 1990; 87 (3): 1228-32. (Chlamydomonas reinhardtii); Nucleic Acids Res. 25 de junio de 1992; 20 (12): 2959-65; Mar Biotechnol (NY). enero de 2002; 4 (1): 63-73 (Chlorella); Biochem Mol Biol Int. agosto de 1995; 36 (5): 1025-35 (Chlamydomonas reinhardtii); J Microbiol. agosto de 2005; 43 (4): 361-5 (Dunaliella); Yi Chuan Xue Bao. abril de 2005; 32 (4): 424-33 (Dunaliella); Mar Biotechnol (NY). mayo de 1999; 1 (3): 239-251. (Thalassiosira y Phaedactylum); Koksharova, Appl Microbiol Biotechnol 2002 febrero; 58 (2): 123-37 (varias especies); Mol Genet Genomics. febrero de 2004; 271 (1): 50-9 (Thermosynechococcus elongates); J. Bacteriol. (2000), 182, 211-215; FEMS Microbiol Lett. 25 de abril de 2003; 221 (2): 155-9; Plant Physiol. junio de 1994; 105 (2): 635-41; Plant Mol Biol. diciembre de 1995; 29 (5): 897-907 (Synechococcus PCC 7942); Mar Pollut Bull. 2002; 45 (1-12): 163-7 (Anabaena PCC 7120); Proc Natl Acad Sci USA. marzo de 1984; 81 (5): 1561-5 (Anabaena (varias cepas)); Proc Natl Acad Sci USA. 27 de marzo de 2001; 98 (7): 4243-8 (Synechocystis); Wirth, Mol Gen Genet marzo de 1989; 216 (1): 175-7 (varias especies); Mol Microbiol, junio de 2002; 44 (6): 1517-31 y Plasmid, septiembre de 1993; 30 (2): 90-105 (Diplosifón de Fremyella); Hall et al. (1993) Gene 124: 75-81 (Chlamydomonas reinhardtii); Gruber et al. (1991). Current Micro. 22: 15-20; Jarvis et al. (1991) Current Genet.
19: 317-322 (Chlorella); para promotores adicionales ver también la tabla 1 de la patente e E. UU. 6.027.900).
[0151] El promotor usado para expresar un gen exógeno puede ser el promotor naturalmente enlazado a ese gen o puede ser un gen heterólogo. Algunos promotores están activos en más de una especie de microalgas. Otros promotores son específicos de la especie. Los promotores preferidos incluyen promotores como RBCS2 de Chlamydomonas reinhardtii y promotores virales, como el virus del mosaico de la coliflor (CMV) y el virus de la chlorella, que han demostrado estar activos en múltiples especies de microalgas (ver por ejemplo Plant Cell Rep. marzo de 2005; 23 (10-11): 727-35; J Microbiol. agosto de 2005; 43 (4): 361-5; Mar Biotechnol (NY). enero de 2002; 4 (1): 63-73). En otras realizaciones, puede usarse el promotor de malato deshidrogenasa de Botryococcus, por ejemplo, un ácido nucleico que comprende cualquier parte de la SEQ ID N.°: 150, o el promotor RBCS2 de Chlamydomonas reinhardtii (SEQ ID N.°: 151). Opcionalmente, se utilizan al menos 10, 20, 30, 40, 50 o 60 nucleótidos o más de estas secuencias que contienen un promotor. Los promotores preferidos endógenos a las especies del género Chlorella son las SEQ ID N.°: 1 y SEQ ID N.°: 2.
[0152] En la lista de secuencias de esta solicitud se enumeran promotores preferidos útiles para la expresión de genes exógenos en Chlorella, por ejemplo, el promotor del gen HUP1 de Chlorella (SEQ ID N.°: 1) y el promotor de nitrato reductasa de Chlorella elipsoidea (SEQ ID N.°: 2). Los promotores del virus de la Chlorella también se pueden utilizar para expresar genes en Chlorella, tales como las SEQ ID N.°: 1-7 de la patente EE. UU.
6.395.965. Se pueden encontrar promotores adicionales activos en Chlorella, por ejemplo, en Biochem Biophys Res Commun. 14 de octubre de 1994; 204 (1): 187-94; Plant Mol Biol. octubre de 1994; 26 (1): 85-93; Virology.
15 de agosto de 2004; 326 (1): 150-9; y Virology. 5 de enero de 2004; 318 (1): 214-23.
B. Optimización de genes y codones
[0153] Normalmente, un gen incluye un promotor, una secuencia codificante y secuencias de control de terminación. Cuando se ensambla mediante tecnología de ADN recombinante, un gen puede denominarse casete de expresión y puede estar flanqueado por sitios de restricción para una inserción conveniente en un vector que se usa para introducir el gen recombinante en una célula huésped. El casete de expresión puede estar flanqueado por secuencias de ADN del genoma u otra diana de ácidos nucleicos para facilitar la integración estable del casete de expresión en el genoma mediante recombinación homóloga. Alternativamente, el vector y su casete de expresión pueden permanecer sin integrar, en cuyo caso el vector incluye típicamente un origen de replicación, capaz de proporcionar la replicación del ADN del vector heterólogo.
[0154] Un gen común presente en un vector es un gen que codifica una proteína, cuya expresión permite diferenciar la célula recombinante que contiene la proteína de las células que no expresan la proteína. Dicho gen, y su producto génico correspondiente, se denomina marcador seleccionable. Cualquier marcador seleccionable entre una amplia variedad de géneros puede emplearse en un constructo transgénico útil para transformar Prototheca. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de resistencia G418, el gen de nitrato reductasa (ver Dawson et al. (1997), Current Microbiology 35: 356-362), el gen de la higromicina fosfotransferasa (HPT; ver Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4: 63-73), el gen de la neomicina fosfotransferasa, el gen ble, que confiere resistencia a la fleomicina (Huang et al. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol. 72: 197-205) y la aminoglucósido-3'-O-fosfotransferasa (SEQ ID N.°: 194), que confiere resistencia a la kanamicina. Los métodos para determinar la sensibilidad de las microalgas a los antibióticos son bien conocidos. Por ejemplo, Mol Gen Genet. 16 de octubre de 1996; 252 (5): 572-9.
[0155] También se pueden emplear otros marcadores seleccionables que no están basados en antibióticos en un constructo transgénico útil para transformar microalgas en general, que incluyen la especie Prototheca. Los genes que confieren la capacidad de utilizar ciertas fuentes de carbono que anteriormente no podían ser utilizadas por las microalgas también pueden usarse como un marcador seleccionable. A modo de ilustración, las cepas de Prototheca moriformis normalmente crecen escasamente, si es que lo hacen, con sacarosa. El uso de un constructo que contiene un gen de sacarosa invertasa puede conferir la capacidad de los transformantes positivos para crecer en sacarosa como sustrato de carbono. Los detalles adicionales sobre el uso de la sacarosa como marcador seleccionable junto con otros marcadores seleccionables se analizan en la sección IV más adelante.
[0156] El vector de expresión usado para preparar una célula huésped recombinante puede incluir al menos dos, y a menudo tres, genes, si uno de los genes es un marcador seleccionable. Por ejemplo, se puede hacer una Prototheca genéticamente modificada mediante transformación con vectores que comprenden, además de un marcador seleccionable, uno o más genes exógenos, tales como, por ejemplo, el gen de sacarosa invertasa o el gen de acil ACP-tioesterasa. Uno o ambos genes pueden expresarse usando un promotor inducible, lo que permite controlar el tiempo relativo de expresión de estos genes para mejorar el rendimiento lipídico y la conversión en ésteres de ácidos grasos. La expresión de los genes exógenos puede estar bajo el control del mismo promotor inducible o bajo el control de diferentes promotores inducibles (o constitutivos). En esta última situación, se puede inducir la expresión de un primer gen exógeno durante un primer periodo de tiempo (durante el cual se puede inducir o no la expresión de un segundo gen exógeno) y se puede inducir la expresión de un segundo gen exógeno durante un segundo periodo de tiempo (durante el cual se puede inducir o no la expresión de un primer gen exógeno).
[0157] En otras realizaciones, los genes exógenos (además de cualquier marcador seleccionable) son: una acil-ACP tioesterasa grasa y una acil-CoA/aldehído reductasa grasa, cuya acción combinada produce un producto alcohólico. Se proporcionan además otras combinaciones de genes exógenos, que incluyen, entre otros, una acil-ACP tioesterasa grasa y una acil-CoA reductasa grasa para generar aldehídos. En una realización, el vector proporciona la combinación de una acil-ACP tioesterasa grasa, una acil-CoA reductasa grasa y una aldehído descarbonilasa grasa para generar alcanos. En cada una de estas realizaciones, uno o más de los genes exógenos pueden expresarse usando un promotor inducible.
[0158] Otros vectores ilustrativos que expresan dos o más genes exógenos incluyen los que codifican tanto un transportador de sacarosa como una enzima sacarosa invertasa y los que codifican tanto un marcador seleccionable como una sacarosa invertasa secretada. La Prototheca recombinante transformada con cualquiera de los tipos de vector produce lípidos a un coste de fabricación más bajo debido a la capacidad diseñada para utilizar la caña de azúcar (y azúcares derivados de la caña de azúcar) como fuente de carbono. La inserción de los dos genes exógenos descritos anteriormente puede combinarse con la interrupción de la biosíntesis de polisacáridos mediante mutagénesis dirigida y/o aleatoria, que dirige un flujo de carbono cada vez mayor hacia la producción de lípidos. Individualmente y en combinación, la conversión trófica, la ingeniería para alterar la producción de lípidos y el tratamiento con enzimas exógenas alteran la composición de lípidos producida por un microorganismo. La alteración puede ser un cambio en la cantidad de lípidos producida, la cantidad de una o más especies de hidrocarburos producida en relación con otros lípidos y/o los tipos de especies de lípidos producidos en el microorganismo. Por ejemplo, las microalgas pueden modificarse para producir una mayor cantidad y/o porcentaje de TAG.
[0159] Para una expresión óptima de una proteína recombinante, es beneficioso emplear secuencias codificantes que produzcan ARNm con codones utilizados preferentemente por la célula huésped que se va a transformar. Por tanto, la expresión adecuada de los transgenes puede requerir que el uso del codón del transgén coincida con el sesgo del codón específico del organismo en el que se expresa el transgén. Los mecanismos precisos responsables de este efecto son muchos, pero incluyen el equilibrio adecuado de los grupos de ARNt aminoacilados disponibles con proteínas que se sintetizan en la célula, combinada con una traducción más eficiente del ARN mensajero transgénico (ARNm) cuando se satisface esta necesidad. Cuando no se optimiza el uso de codones en el transgén, los grupos de ARNt disponibles no son suficientes para permitir la traducción eficaz del ARNm heterólogo, lo que da como resultado un estancamiento y terminación ribosomales y una posible inestabilidad del ARNm transgénico.
[0160] Ácidos nucleicos optimizados por codón útiles para la expresión exitosa de proteínas recombinantes en Prototheca se describen en el presente documento. El uso de codones en la especie Prototheca se analizó mediante el estudio de secuencias de ADNc aisladas a partir de Prototheca moriformis. Este análisis representa la interrogación sobre 24000 codones y dio como resultado la tabla 2 a continuación.
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C. Expresión inducible
[0161] También se describe el uso de un promotor inducible para expresar un gen de interés. En particular, el uso de un promotor inducible para expresar un gen de lipasa permite la producción de la lipasa después del crecimiento del microorganismo cuando se han ajustado las condiciones, si es necesario, para mejorar la transesterificación, por ejemplo, después de la disrupción celular, la reducción del contenido de agua de la mezcla de reacción y/o la adición de suficiente de alcohol para impulsar la conversión de TAG en ésteres de ácidos grasos.
[0162] Los promotores inducibles útiles incluyen aquellos que median la transcripción de un gen operativamente enlazado en respuesta a un estímulo, tal como una molécula pequeña proporcionada exógenamente (por ejemplo, glucosa, como en la SEQ ID N.°: 1), la temperatura (calor o frío), la luz, etc. Los promotores adecuados pueden activar la transcripción de un gen esencialmente silencioso o aumentar, preferiblemente de manera sustancial, la transcripción de un gen operativamente enlazado que se transcribe a un nivel bajo. En este último caso, el nivel de transcripción de la lipasa preferiblemente no interfiere significativamente con el crecimiento del microorganismo en el que se expresa.
D. Expresión de dos o más genes exógenos
[0163] Además, un microorganismo modificado genéticamente, por ejemplo, una microalga, puede comprender y expresar dos o más genes exógenos, como, por ejemplo, una lipasa y un gen lítico, p. ej., uno que codifica una enzima que degrada polisacáridos. Uno o ambos genes pueden expresarse usando un promotor inducible, lo que permite controlar el tiempo relativo de expresión de estos genes para mejorar el rendimiento lipídico y la conversión en ésteres de ácidos grasos. La expresión de los genes exógenos puede estar bajo el control del mismo promotor inducible o bajo el control de un promotor inducible diferente. En esta última situación, se puede inducir la expresión de un primer gen exógeno durante un primer periodo de tiempo (durante el cual se puede inducir o no la expresión de un segundo gen exógeno) y se puede inducir la expresión de un segundo gen exógeno durante un segundo periodo de tiempo (durante el cual se puede inducir o no la expresión de un primer gen exógeno). En el presente documento se proporcionan vectores y métodos para la modificación de microbios productores de lípidos con el fin de metabolizar sacarosa, que es un rasgo ventajoso porque permite que las células modificadas conviertan materias primas de caña de azúcar en lípidos.
[0164] También se proporcionan en el presente documento cepas de microalgas modificadas genéticamente que expresan dos o más genes exógenos, tales como, por ejemplo, una acil-ACP tioesterasa grasa y una acil-CoA/aldehído reductasa grasa, cuya acción combinada produce un producto alcohólico. Se proporcionan además otras combinaciones de genes exógenos, que incluyen, entre otros, una acil-ACP tioesterasa grasa y una acil-CoA reductasa grasa para generar aldehídos. Además, esta solicitud prevé la combinación de una acil-ACP tioesterasa grasa, una acil-CoA reductasa grasa y una aldehído descarbonilasa grasa para generar alcanos. Uno o varios de los genes exógenos se pueden expresar usando un promotor inducible.
[0165] Los ejemplos de modificaciones adecuadas adicionales incluyen cepas de microalgas modificadas genéticamente para expresar dos o más genes exógenos, uno que codifica un transportador de una fuente de carbono fijo (como sacarosa) y un segundo que codifica una enzima sacarosa invertasa. Los organismos fermentables resultantes producen hidrocarburos a un coste de fabricación inferior al que se puede obtener mediante métodos previamente conocidos de producción de hidrocarburos biológicos. La inserción de los dos genes exógenos descritos anteriormente puede combinarse con la interrupción de la biosíntesis de polisacáridos mediante mutagénesis dirigida y/o aleatoria, que dirige un flujo de carbono cada vez mayor hacia la producción de hidrocarburos. Individualmente y en combinación, la conversión trófica, la ingeniería para alterar la producción de hidrocarburos y el tratamiento con enzimas exógenas alteran la composición de hidrocarburos producida por un microorganismo. La alteración puede ser un cambio en la cantidad de hidrocarburos producida, la cantidad de una o más especies de hidrocarburos producida en relación con otros hidrocarburos y/o los tipos de especies de hidrocarburos producidos en el microorganismo. Por ejemplo, las microalgas pueden modificarse para producir una mayor cantidad y/o porcentaje de TAG.
E. Expresión compartimentada
[0166] La presente descripción también da a conocer la expresión compartimentada de un gen de interés. En particular, puede ser beneficioso en realizaciones particulares, dirigir la expresión de la lipasa a uno o más compartimentos celulares, donde se aísla de la mayoría de los lípidos celulares hasta el inicio de la reacción de transesterificación. Los orgánulos preferidos para el direccionamiento son cloroplastos, mitocondrias y retículo endoplásmico.
(1) Expresión en cloroplastos
[0167] En una realización, la expresión de un polipéptido en un microorganismo se dirige a los cloroplastos. Se conocen y pueden emplearse métodos para dirigir la expresión de un gen heterólogo al cloroplasto. Los métodos para dirigir productos de genes foráneos a los cloroplastos se describen en Shrier et al., EMBO J. (1985) 4:2532. Ver también Tomai et al. Gen. Biol. Chem. (1988) 263:15104 15109 y Pat. EE. UU. n.° 4.940.835 para el uso de péptidos de tránsito en la translocación de productos génicos nucleares en el cloroplasto. Los métodos para dirigir el transporte de proteínas al cloroplasto también se revisan en Kenauf TIBTECH (1987) 5:40 47. Son conocidas las secuencias de direccionamiento de cloroplasto endógenas a la Chlorella, por ejemplo, los genes en el genoma nuclear de la Chlorella que codifica proteínas dirigidas al cloroplasto; ver, por ejemplo, los números de acceso de GenBank AY646197 y AF499684.
[0168] Wageningen UR-Plant Research International comercializa un vector IMPACTVECTOR1.4, que utiliza la señal de secreción de la proteína de subunidad pequeña de Crisantemo morifolium para liberar una proteína heteróloga en el entorno (citoplásmico) del estroma del cloroplasto, atravesando un sistema de doble membrana. La proteína se fusiona con los primeros 11 aminoácidos de la proteína rubisco madura para permitir el procesamiento adecuado del péptido señal (Wong et al., Plant Molecular Biology 20: 81-93 (1992)). El péptido señal contiene un intrón natural del gen RbcS.
[0169] En otro enfoque, el genoma del cloroplasto se modifica genéticamente para expresar la proteína heteróloga. Transformación estable de cloroplastos de Chlamydomonas reinhardtii (un alga verde) utilizando el bombardeo de células receptoras con microproyectiles de tungsteno de alta velocidad recubiertos con ADN foráneo. Ver, por ejemplo, Boynton et al., Science (1988) 240: 1534 1538; Blowers et al. Plant Cell (1989) 1:123 132 y Debuchy et al., Em BO J. (1989) 8: 28032809. La técnica de transformación, utilizando microproyectiles de tungsteno, ha sido descrita por Klein et al., Nature (Londres) (1987) 7:70 73. Se conocen otros métodos de transformación de cloroplastos tanto para plantas como para microalgas. Ver, por ejemplo, las patentes EE. UU.
5.693.507; 6.680.426; y Plant Physiol. mayo de 2002; 129 (1): 7-12; y Plant Biotechnol J. mayo de 2007; 5 (3): 402-12.
[0170] Tal como se describe en la patente n.° 6.320.101 (expedida el 20 de noviembre de 2001 para Kaplan et al.), las células pueden tratarse químicamente para reducir el número de cloroplastos por célula a aproximadamente uno. Luego, el ácido nucleico heterólogo puede introducirse en las células mediante bombardeo de partículas con el objetivo de introducir al menos una molécula de ácido nucleico heterólogo en los cloroplastos. El ácido nucleico heterólogo se selecciona de modo que sea integrable en el genoma del cloroplasto mediante recombinación homóloga que se efectúa fácilmente mediante enzimas inherentes al cloroplasto. Para ello, el ácido nucleico heterólogo incluye, además de un gen de interés, al menos una secuencia de ácido nucleico que se deriva del genoma del cloroplasto. Además, el ácido nucleico heterólogo incluye típicamente un marcador seleccionable. Más detalles relacionados con esta técnica se encuentran en las patentes EE.UU. n.° 4.945.050 y 5.693.507. Por tanto, puede producirse un polipéptido mediante el sistema de expresión de proteínas del cloroplasto.
[0171] La patente n.° 7.135.620 (expedida el 14 de noviembre de 2006 para Daniell et al.) describe vectores de expresión de cloroplastos y métodos relacionados. Los casetes de expresión son constructos de ADN que incluyen una secuencia codificante y secuencias de control apropiadas para proporcionar la expresión adecuada de la secuencia codificante en el cloroplasto. Los casetes de expresión típicos incluyen los siguientes componentes: la región 5' no traducida de un gen de microorganismos o un gen de cloroplastos, por ejemplo, el psbA, que proporcionará la transcripción y la traducción de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés en el cloroplasto; una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés; y una región de terminación traduccional y transcripcional, por ejemplo, una región de repetición invertida 3' de un gen de cloroplastos que puede estabilizar el ARN de los genes introducidos, mejorando así la expresión de los genes foráneos. El casete puede incluir opcionalmente un gen de resistencia a antibióticos.
[0172] Normalmente, el casete de expresión está flanqueado por sitios de restricción convenientes para la inserción en un genoma apropiado. El casete de expresión puede estar flanqueado por secuencias de ADN del ADN del cloroplasto para facilitar la integración estable del casete de expresión en el genoma del cloroplasto, particularmente mediante recombinación homóloga. Alternativamente, el casete de expresión puede permanecer sin integrar, en cuyo caso el casete de expresión incluye típicamente un origen de replicación del cloroplasto, que es capaz de proporcionar la replicación del ADN heterólogo en el cloroplasto.
[0173] El casete de expresión generalmente incluye una región promotora de un gen capaz de expresarse en el cloroplasto. La región promotora puede incluir promotores que se pueden obtener a partir de genes de cloroplasto, tales como el gen psbA de la espinaca o el guisante, o la región promotora rbcL y atpB de los promotores de maíz y ARNr. Se describen ejemplos de promotores en Hanley-Bowdoin y Chua, TIBS (1987) 12:67 70; Mullet et al., Plant Molec Biol. (1985) 4: 39 54; Hanley-Bowdoin (1986) tesis doctoral, Universidad Rockefeller; Krebbers et al., Nucleic Acids Res. (1982) 10: 49855002; Zurawaki et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9:3251 3270; y Zurawski et al., Proc. Natl Acad Sci. EE: UU. (1982) 79: 7699 7703. Pueden identificarse otros promotores y evaluarse la fuerza relativa de los promotores identificados colocando un promotor de interés 5' respecto a un gen marcador sin promotor y observando su eficacia en relación con la transcripción obtenida, por ejemplo, del promotor del gen psbA, un promotor de cloroplasto relativamente fuerte. La eficacia de la expresión del gen heterólogo puede mejorarse adicionalmente mediante cualquier técnica entre una variedad de ellas. Estas incluyen el uso de múltiples promotores insertados en tándem 5' en el gen heterólogo, por ejemplo, un promotor doble psbA, la adición de secuencias potenciadoras y similares.
[0174] Cuando se desee garantizar la expresión inducible del gen heterólogo, se puede incluir un promotor inducible y/o una región no traducida 5' que contenga secuencias que garantizan la regulación a nivel de transcripción y/o traducción (en el extremo 3'). en el casete de expresión. Por ejemplo, la región no traducida 5' puede ser de un gen en el que la expresión es regulable mediante la luz. De manera similar, podrían usarse regiones de repetición invertidas 3' para estabilizar el ARN de genes heterólogos. Los genes inducibles pueden identificarse mediante una expresión mejorada en respuesta a un estímulo particular de interés y una expresión baja o ausente en ausencia del estímulo. Por ejemplo, se puede identificar un gen inducible por luz cuando se produce una expresión potenciada durante la irradiación con luz, mientras que cuando hay poca o ninguna luz, se produce una expresión sustancialmente reducida o no se produce expresión. Se conocen promotores regulados por luz de microalgas verdes (ver por ejemplo Mol Genet Genomics. diciembre de 2005; 274 (6): 625­ 36).
[0175] La región de terminación que se emplea será principalmente una de conveniencia, ya que la región de terminación parece ser relativamente intercambiable entre cloroplastos y bacterias. La región de terminación puede ser nativa de la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa de la secuencia de ADN de interés o puede obtenerse de otra fuente. Ver, por ejemplo, Chen y Orozco, Nucleic Acids Res. (1988) 16:8411.
[0176] Los casetes de expresión se pueden transformar en una célula vegetal de interés mediante varios métodos. Estos métodos incluyen, por ejemplo, métodos biolísticos (ver, por ejemplo, Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6:299302, patente EE. UU. n.° 4.945.050; electroporación Fromm et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (EE. UU.) (1985) 82:58245828); uso de un rayo láser, microinyección o cualquier otro método capaz de introducir ADN en un cloroplasto.
[0177] En las patentes EE. UU. n.° 7.081.567 (expedida el 25 de julio de 2006 para Xue et al.); 6.680.426 (expedida el 20, de enero de 2004 para Daniell et al.); y 5.693.507 (expedida el 2 de diciembre de 1997 para Daniell et al.).
(2) Expresión en mitocondrias
[0178] En otra realización, la expresión de un polipéptido en un microorganismo se dirige a las mitocondrias. Se han descrito métodos para dirigir productos de genes foráneos a las mitocondrias (Boutry et al. Nature (Londres) (1987) 328:340 342) incluso en microalgas verdes (ver por ejemplo Mol Gen Genet. enero de 1993; 236 (2-3): 235-44).
[0179] Por ejemplo, un vector de expresión que codifica una señal de secreción adecuada puede dirigir una proteína heteróloga a la mitocondria. El vector IMPACTVECTOR1.5, de Wageningen UR-Plant Research International, utiliza la señal de secreción de la levadura CoxIV, que se ha demostrado que libera proteínas en la matriz mitocondrial. La proteína se fusiona con los primeros 4 aminoácidos de la proteína CoxIV de levadura para permitir el procesamiento adecuado del péptido señal (Kohler et al. Plant J 11: 613-621 (1997)). Se conocen otras secuencias de direccionamiento mitocondrial, incluyendo las funcionales en microalgas verdes. Por ejemplo, ver FEBS Lett. 29 de enero de 1990; 260 (2): 165-8; y J Biol Chem. 22 de febrero de 2002; 277 (8): 6051-8.
[0180] Proteínas expresadas en el genoma nuclear de Chlorella pueden dirigirse a las mitocondrias utilizando señales de direccionamiento mitocondrial. Consulte las secciones anteriores en el presente documento para obtener detalles sobre la selección y la transformación de proteínas mitocondriales.
(3) Expresión en retículo endoplásmico
[0181] En otra realización, la expresión de un polipéptido en un microorganismo se dirige al retículo endoplásmico. La inclusión de una señal apropiada de retención o clasificación en un vector de expresión garantiza que las proteínas se retengan en el retículo endoplásmico (RE) y no vayan corriente abajo hacia el Golgi. Por ejemplo, el vector IMPACTVECTOR1.3, de Wageningen UR-Plant Research International, incluye la bien conocida señal de retención o clasificación KDEL. Con este vector, la retención del ER tiene una ventaja práctica porque se ha sabido que mejora los niveles de expresión 5 veces o más. La razón principal de esto parece ser que el RE contiene concentraciones más bajas y/o diferentes proteasas responsables de la degradación postraduccional de las proteínas expresadas que las que están presentes en el citoplasma. Se conocen señales de retención del ER funcionales en microalgas verdes. Por ejemplo, ver Proc Natl Acad Sci USA. 26 de abril de 2005; 102 (17): 6225-30.
[0182] Si bien los métodos y materiales descritos en este documento permiten la introducción de cualquier gen exógeno en un microorganismo, por ejemplo Prototheca, los genes relacionados con la utilización de sacarosa y la modificación de la ruta lipídica son de especial interés, tal como se comenta en las siguientes secciones.
IV. MARCADORES SELECCIONABLES
1. Utilización de sacarosa
[0183] En una realización, una célula recombinante de Prototheca contiene además uno o más genes exógenos de utilización de sacarosa. En diversas realizaciones, los genes codifican una o más proteínas seleccionadas del grupo que consta de una fructoquinasa, una glucoquinasa, una hexoquinasa, una sacarosa invertasa y un transportador de sacarosa. Por ejemplo, la expresión de un transportador de sacarosa y una sacarosa invertasa permite a las Prototheca transportar sacarosa a la célula desde el medio de cultivo e hidrolizar la sacarosa para producir glucosa y fructosa. Opcionalmente, también se puede expresar una fructoquinasa en casos en los que la actividad de hexoquinasa endógena es insuficiente para la fosforilación máxima de fructosa. Los números de acceso de Genbank CAD91334, CAB92307 y CAA53390 son ejemplos de transportadores de sacarosa adecuados. Los números de acceso de Genbank P26984, P26420 y CAA43322 son ejemplos de fructoquinasas adecuadas.
[0184] En una realización, se proporciona una célula huésped de Prototheca que secreta sacarosa invertasa. La secreción de sacarosa invertasa obvia la necesidad de expresión de un transportador que pueda transportar sacarosa al interior de la célula. Esto se debe a que una invertasa secretada cataliza la conversión de una molécula de sacarosa en una molécula de glucosa y una molécula de fructosa, las cuales pueden ser transportadas y utilizadas por los microbios descritos en el presente documento. Por ejemplo, la expresión de una sacarosa invertasa (como la SEQ ID N.°: 3) con una señal de secreción (como la de la SEQ ID N.°: 4 (de levadura), la SEQ ID N.°: 5 (de plantas superiores), la SEQ ID N.°: 6 (la señal de secreción de consenso eucariota) y la SEQ ID N.°: 7 (la combinación de la secuencia señal de plantas superiores y la de consenso eucariota) genera actividad invertasa fuera de la célula. La expresión de dicha proteína, según lo habilitado por la metodología de ingeniería genética descrita en el presente documento, permite que las células que ya son capaces de utilizar glucosa extracelular como fuente de energía utilicen sacarosa como fuente de energía extracelular.
[0185] Las especies de Prototheca que expresan una invertasa en medios que contienen sacarosa son especies de microalgas preferidas para la producción de aceite. La expresión y el direccionamiento extracelular de esta proteína completamente activa permite que las células huésped resultantes crezcan en sacarosa, mientras que sus contrapartidas sin transformar no pueden. Por lo tanto, la divulgación describe células recombinantes de Prototheca con un gen de invertasa con codones optimizados, que incluyen, entre otros, el gen de la invertasa de levadura, integrado en su genoma de manera que el gen de la invertasa se expresa según la evaluación mediante la actividad de la invertasa y la hidrólisis de sacarosa. La presente divulgación también describe genes de invertasa útiles como marcadores seleccionables en células recombinantes de Prototheca, ya que tales células pueden crecer en sacarosa, mientras que sus contrapartidas sin transformar no pueden; y métodos para seleccionar las células huésped recombinantes usando una invertasa como un potente marcador seleccionable para la genética molecular de las algas.
[0186] La expresión exitosa de una sacarosa invertasa en Prototheca también ilustra otro aspecto de la presente descripción en cuanto a que demuestra que las proteínas heterólogas (recombinantes) pueden expresarse en la célula de algas y transitar con éxito fuera de la célula y hacia el medio de cultivo con una forma completamente activa y funcional. Por tanto, la presente divulgación describe métodos y reactivos para expresar una amplia y diversa gama de proteínas heterólogas en microalgas y secretarlas fuera de la célula huésped. Dichas proteínas incluyen, por ejemplo, enzimas industriales tales como, por ejemplo, lipasas, proteasas, celulasas, pectinasas, amilasas (por ejemplo, SEQ ID N.°: 190-191), esterasas, oxidorreductasas, transferasas, lactasas, isomerasas e invertasas, así como proteínas terapéuticas como, por ejemplo, factores de crecimiento, citocinas, anticuerpos de longitud completa que comprenden dos cadenas ligeras y dos pesadas, Fabs, scFv (fragmento variable de cadena simple), anticuerpos de tipo camélido, fragmentos de anticuerpos, fusiones de fragmentos de anticuerpos, fusiones de anticuerpo-receptor, insulina, interferones y factores de crecimiento similares a la insulina.
[0187] La expresión exitosa de una sacarosa invertasa en Prototheca también ilustra otro aspecto en cuanto a que proporciona métodos y reactivos para el uso de péptidos de tránsito de hongos en algas para dirigir la secreción de proteínas en Prototheca; y métodos y reactivos para determinar si un péptido puede funcionar, y su capacidad para funcionar como un péptido de tránsito en células de Prototheca. Los métodos y reactivos se pueden utilizar como herramienta y plataforma para identificar otros péptidos de tránsito que pueden transportar con éxito proteínas fuera de una célula, y que la invertasa de levadura tiene una gran utilidad en estos métodos. Como se demuestra en este ejemplo, la eliminación del péptido endógeno de tránsito de invertasa de levadura y su reemplazo por otros péptidos de tránsito, tanto endógenos a las algas hospedadoras como de otras fuentes (eucariotas, procariotas y virales), puede identificar si algún péptido de interés puede funcionar como un péptido de tránsito para guiar la salida de proteínas de la célula.
[0188] Los ejemplos de sacarosa invertasas adecuadas incluyen las identificadas por los números de acceso de Genbank CAB95010, NP_012104 y CAA06839. Los ejemplos no limitantes de invertasas adecuadas se enumeran a continuación en la tabla 3. Las secuencias de aminoácidos para cada invertasa enumerada se incluyen en el listado de secuencias más adelante. En algunos casos, el gen de utilización de sacarosa exógeno adecuado para su uso en los métodos y vectores descritos en el presente documento codifica una sacarosa invertasa que tiene al menos un 40, 50, 60, 75 o 90 % o más de identidad de aminoácidos con una sacarosa invertasa seleccionada de la tabla 3.
Tabla 3. Sacarosa invertasas.
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[0189] La secreción de una invertasa al medio de cultivo por Prototheca permite que las células crezcan tanto en la melaza residual del procesamiento de la caña de azúcar como en la glucosa pura de grado reactivo; el uso de este producto de desecho de bajo valor del procesamiento de la caña de azúcar puede proporcionar importantes ahorros de costes en la producción de lípidos y otros aceites. Por tanto, se describe un cultivo microbiano que contiene una población de microorganismos de Prototheca y un medio de cultivo que comprende (i) sacarosa y (ii) una enzima sacarosa invertasa. En diversas realizaciones, la sacarosa en el cultivo proviene del sorgo, la remolacha azucarera, la caña de azúcar, la melaza o el material celulósico despolimerizado (que opcionalmente puede contener lignina). En otro aspecto, los métodos y reactivos aumentan significativamente el número y tipo de materias primas que pueden ser utilizadas por Prototheca recombinante. Si bien los microbios ejemplificados aquí están alterados de modo que puedan utilizar sacarosa, los métodos y reactivos se pueden aplicar de modo que las materias primas tales como las celulósicas sean utilizables por un microbio huésped diseñado con la capacidad de secretar celulasas, pectinasas, isomerasas o similares, de modo que los productos de degradación de las reacciones enzimáticas ya no sean simplemente tolerados, sino que el huésped los utilice como fuente de carbono. Un ejemplo de esto se describe más adelante y en los ejemplos de microbios diseñados para expresar una a-galactosidasa secretable, que confiere la capacidad de hidrolizar enlaces a-galactosilo en oligosacáridos tales como los contenidos en la rafinosa y la estaquiosa, que son dos oligosacáridos que se encuentran en corrientes de desechos agrícolas .
2. Expresión de la alfa-galactosidasa
[0190] Si bien la expresión de una sacarosa invertasa, tal como se ha descrito anteriormente, confiere la capacidad a las células de Prototheca de utilizar de manera más eficiente la sacarosa como fuente de carbono (a través de la enzima que hidroliza el enlace a entre las moléculas de fructosa y glucosa en el disacárido sacarosa), la expresión de otras enzimas que hidrolizan otros tipos de enlaces a en oligosacáridos puede conferir la capacidad a las células de Prototheca de utilizar otras fuentes de carbono. La expresión de estas enzimas (y la capacidad resultante de utilizar fuentes de carbono que las células de Prototheca y de otras microalgas normalmente no podrían) se puede utilizar como un marcador seleccionable para estas células de Prototheca transgénicas permitiendo la selección de clones positivos que pueden crecer en estas fuentes de carbono.
[0191] En una realización, la célula de Prototheca recombinante contiene además uno o varios genes exógenos que codifican enzimas que degradan polisacáridos. En varias realizaciones, el gen o genes que codifican una enzima que degrada polisacáridos son genes que codifican una a-galactosidasa secretada. La expresión de una a-galactosidasa exógena secretada en una célula de Prototheca confiere la capacidad a tales cepas transformadas de crecer en azúcares (fuentes de carbono) que contienen enlaces D-galactosilo, tales como los enlaces a entre unidades de galactosa y glucosa monosacárido. Las cepas de Prototheca que expresan una agalactosidasa exógena secretada podrán utilizar disacáridos tales como melibiosa (disacárido compuesto de a-D-galactosa-glucosa).
[0192] Los azúcares como la rafinosa (un trisacárido compuesto de galactosa-glucosa-fructosa a enlazadas) y la estaquiosa (un tetrasacárido compuesto por dos unidades de D-galactosa a enlazadas, seguidas de glucosa y fructosa a enlazadas) están presentes en proporciones significativas en las corrientes de desechos agrícolas como la pulpa de remolacha (rafinosa) y la harina de soja (estaquiosa). Dichos residuos agrícolas representan una importante fuente de carbono sin explotar para la conversión en aceite por parte microbios (incluyendo Prototheca) capaces de utilizarlos.
[0193] Las cepas de Prototheca no pueden utilizar oligosacáridos tales como rafinosa y estaquiosa en cantidades significativas o en ninguna cantidad. En el caso de la rafinosa y la estaquiosa, aunque las cepas transgénicas que expresan una sacarosa invertasa (como se ha descrito anteriormente) tienen la capacidad de hidrolizar el enlace a entre la fructosa y la glucosa en los derivados a-galactosilo de la sacarosa, el resto del oligosacárido permanece sin utilizar, ya que la sacarosa invertasa no escindirá los enlaces a restantes en tales azúcares y los disacáridos resultantes no son utilizables. En otra forma de realización, la célula recombinante de Prototheca comprende tanto un gen exógeno que codifica una sacarosa invertasa como un gen exógeno que codifica una agalactosidasa. Por tanto, las cepas que expresan tanto una sacarosa invertasa como una a-galactosidasa serán capaces de hidrolizar completamente oligosacáridos tales como la rafinosa y la estaquiosa, permitiendo el consumo de los monómeros componentes. Además, los genes que codifican la a-galactosidasa pueden usarse como un marcador seleccionable para la transformación. Los clones que contienen el gen de la a-galactosidasa exógena tendrán la capacidad de crecer en melibiosa. Los ejemplos de genes de a-galactosidasa adecuados para su uso en las cepas de Prototheca incluyen el gen MEL1 de Saccharomyces carlsbergensis y el gen AglC de Aspergillus niger. Curiosamente, no todos los genes de la a-galactosidasa son funcionales en la especie Prototheca, incluso si los genes se optimizan de acuerdo con el uso preferido de codones en cepas de Prototheca. Los ejemplos más adelante demuestran la capacidad de las células transgénicas de Prototheca para crecer en melibiosa cuando se transforman con el gen MEL1 con codones optimizados de S. carlsbergensis y el gen AglC de A. niger, pero no con un gen que codifica la a-galactosidasa de la planta superior, Cyamopsis tetragonobola (semilla de guar).
3. Complementación con auxotrofia de tiamina
[0194] Las cepas de Prototheca que incluyen Prototheca moriformis son conocidas por ser auxotróficas de tiamina (ver, por ejemplo, Ciferri, O. (1956) Nature, v.178, págs. 1475-1476), lo que significa que estas cepas requieren tiamina en el medio nutritivo para su crecimiento. La auxotrofia de tiamina puede ser el resultado de mutaciones o la falta de expresión de enzimas en la ruta biosintética de la tiamina. Las cepas transgénicas complementadas que expresan las enzimas que faltan en la ruta biosintética de la tiamina se pueden cultivar sin tiamina añadida, reduciendo así el coste de los medios nutritivos y haciendo que la biomasa de microalgas resultante sea más deseable desde una perspectiva de nutrición animal. La complementación con una enzima de la ruta biosintética de tiamina también se puede utilizar como marcador seleccionable ya que el gen transgénico confiere la capacidad de crecer en placas/medios que no contienen tiamina.
[0195] En una realización, la célula de Prototheca recombinante contiene además uno o varios genes exógenos que codifican la enzima de la ruta biosintética de la tiamina. En otra realización, la célula recombinante de Prototheca comprende un gen exógeno que codifica hidroximetilpirimidina fosfato sintasas (por ejemplo, la SEQ ID N.°: 192) de fuentes de algas, plantas o cianobacterias. En otras realizaciones, la hidroximetilpirimidina fosfato sintasa está codificada por un gen THIC. En otras realizaciones, el gen THIC es el THIC de Coccomyxa C-169 , THIC de Arabidopsis thaliana, el THIC de Synechocystis sp. PCC 6803 , o el THIC de Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium str. (SEQ ID N.°: 193). Los ejemplos siguientes detallan la ingeniería de Prototheca moriformis UTEx 1435 con prototrofia de tiamina restaurada.
4. Otros marcadores seleccionables
[0196] Se puede emplear cualquier marcador seleccionable entre una amplia variedad en un constructo transgénico útil para transformar microorganismos, tales como Chlorella. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de la nitrato reductasa, el gen de la higromicina fosfotransferasa (HPT), el gen de la neomicina fosfotransferasa y el gen ble, que confiere resistencia a la fleomicina. Los métodos para determinar la sensibilidad de las microalgas a los antibióticos son bien conocidos. Por ejemplo, Mol Gen Genet. 16 de octubre de 1996; 252 (5): 572-9.
[0197] Más específicamente, Dawson et al. (1997), Current Microbiology 35: 356-362, describió el uso del gen de la nitrato reductasa (NR) de Chlorella vulgaris como marcador seleccionable para los mutantes con deficiencia de NR de Chlorella sorokiniana. Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4: 63-73, describieron el uso del gen HPT como marcador seleccionable para transformar Chlorella elipsoidea. Huang et al. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol.
72: 197-205, informaron sobre el uso de Sh ble como marcador seleccionable para Chlorella sp. DT.
V. INGENIERÍA DE LA RUTA LIPÍDICA
[0198] Además de alterar la capacidad de las microalgas, como la Prototheca, para utilizar materias primas, por ejemplo, materias primas que contienen sacarosa, la presente divulgación también describe microorganismos recombinantes (por ejemplo, Prototheca) modificados para alterar las propiedades y/o proporciones de los lípidos producidos. Pueden realizarse modificaciones adicionales a la ruta o como alternativa a ella para alterar las propiedades y/o proporciones de diversas moléculas de lípidos producidas mediante el procesamiento enzimático de lípidos e intermediarios en la ruta de los ácidos grasos. En varias realizaciones, los microorganismos recombinantes (por ejemplo, las células de Prototheca) tienen, en relación con sus contrapartidas sin transformar, un rendimiento lipídico optimizado por unidad de volumen y/o por unidad de tiempo, longitud de la cadena de carbono (por ejemplo, para la producción de diésel renovable o para aplicaciones de productos químicos industriales que requieren materia prima lipídica), un número reducido, opcionalmente a cero, de enlaces dobles o triples y un aumento de la proporción hidrógeno:carbono de una especie particular de lípido o de una población de lípidos distintos. Además, los microorganismos que producen los hidrocarburos deseables pueden diseñarse para producir dichos componentes en mayores cantidades o con mayor especificidad.
[0199] En el caso de las microalgas, algunas células de tipo salvaje ya tienen buenas características de crecimiento pero no producen los tipos o cantidades de lípidos deseados. Los ejemplos incluyen, entre otros, Pyrobotrys, Phormidium, Agmenellum, Cartería, Lepocinclis, Pyrobotrys, Nitzschia, Lepocinclis, Anabaena, Euglena, Spirogyra, Chlorococcum, Tetraedron, Oscillatoria, Phagus, y Clorogonio, que tienen la característica de crecimiento deseable de crecer en aguas de alcantarillado o aguas residuales. Las células de Prototheca se pueden diseñar para tener características mejoradas de producción de lípidos. Las características deseadas incluyen la optimización del rendimiento lipídico por unidad de volumen y/o por unidad de tiempo, la longitud de la cadena de carbono (por ejemplo, para la producción de biodiésel o para aplicaciones industriales que requieran materia prima de hidrocarburos), la reducción del número de enlaces dobles o triples, opcionalmente a cero, la retirada o eliminación anillos y estructuras cíclicas y el aumento de la proporción relación hidrógeno:carbono de una especie particular de lípido o de una población de lípidos distintos. Además, las microalgas que producen los hidrocarburos apropiados también pueden diseñarse para obtener producciones aún más deseables de hidrocarburos. Los ejemplos de tales microalgas incluyen el género Prototheca.
[0200] En realizaciones particulares, una o varias enzimas clave que controlan los puntos de ramificación en el metabolismo de la síntesis de ácidos grasos se han incrementado o se han disminuido para mejorar la producción de lípidos. El incremento se puede lograr, por ejemplo, transformando células con constructos de expresión en los que se expresa un gen que codifica la enzima de interés, p. ej., utilizando un promotor fuerte y/o elementos potenciadores que aumentan la transcripción. Tales constructos pueden incluir un marcador seleccionable de manera que los transformantes puedan someterse a selección, lo que puede dar como resultado la amplificación del constructo y un aumento en el nivel de expresión de la enzima codificada. Los ejemplos de enzimas adecuadas para incrementar incluyen la piruvato deshidrogenasa, que desempeña un papel en la conversión de piruvato en acetil-CoA (los ejemplos, algunos entre las microalgas, incluyen los números de acceso de Genbank NP_415392; AAA53047; Q1XDM1; y CAF05587). El incremento de la piruvato deshidrogenasa puede aumentar la producción de acetil-CoA y, por lo tanto, aumentar la síntesis de ácidos grasos. La acetil-CoA carboxilasa cataliza el paso inicial en la síntesis de ácidos grasos. En consecuencia, esta enzima puede incrementarse para aumentar la producción de ácidos grasos (los ejemplos, algunos entre las microalgas, incluyen los números de acceso de Genbank BAA94752; AAA75528; a Aa 81471; YP_537052; YP_536879; NP_045833; y BAA57908). La producción de ácidos grasos también se puede aumentar mediante el incremento de la proteína transportadora de acilo (ACP), que transporta las cadenas de acilo en crecimiento durante la síntesis de ácidos grasos (los ejemplos, algunos entre las microalgas, incluyen los números de acceso de Genbank A0T0F8; P51280; NP_849041; YP_874433). La glicerol-3-fosfato aciltransferasa cataliza el paso limitante de la síntesis de ácidos grasos. El incremento de esta enzima puede aumentar la producción de ácidos grasos (los ejemplos, algunos entre las microalgas, incluyen los números de acceso de Genbank AAA74319; AAA33122; AAA37647; P44857; y ABO94442).
[0201] El incremento y/o la disminución de genes se puede aplicar a reguladores globales que controlan la expresión de los genes de las rutas biosintéticas de los ácidos grasos. Por consiguiente, uno o más reguladores globales de la síntesis de ácidos grasos pueden incrementarse o disminuirse, según sea apropiado, para inhibir o mejorar, respectivamente, la expresión de una variedad de genes sintéticos de ácidos grasos y, en última instancia, para aumentar la producción de lípidos. Los ejemplos incluyen proteínas de unión a elementos reguladores de esteroles (SREB-Ps), como SREBP-1a y SREBP-1c (para ver ejemplos, consulte los números de acceso de Genbank NP_035610 y Q9WTN3).
[0202] La presente divulgación también describe microorganismos recombinantes (por ejemplo, células de Prototheca ) que han sido modificados para contener uno o más genes exógenos que codifican enzimas de modificación de lípidos tales como, por ejemplo, acil-ACP tioesterasas grasas (por ejemplo, C. callophylla (SEQ ID N.°: 145 y SeQ ID N.°: 146; ver también tabla 4), acil-CoA/aldehído reductasas grasas (ver tabla 6), acil-CoA reductasas grasas (ver tabla 7), aldehído descarbonilasa grasa (ver tabla 8), aldehído reductasas grasas, desaturasas (como estearoil-ACP desaturasas (por ejemplo, SAD de R. communis optimizada por codón, SEQ ID N.°: 147 y SEQ ID N.°: 148) y acil desaturasas grasas y escualeno sintasas (véase el número de acceso de GenBank AF205791). En algunas realizaciones, los genes que codifican una acil-ACP tioesterasa grasa y una proteína portadora de acilo coexpresada de manera natural se transforman en una célula de Prototheca, opcionalmente con uno o varios genes que codifican otras enzimas de modificación de lípidos. En otras realizaciones, la ACP y la acil-ACP tioesterasa grasa pueden tener una afinidad entre sí que confiere una ventaja cuando las dos se usan juntas en los microbios y métodos descritos en el presente documento, independientemente de si se coexpresan o no de forma natural en un tejido u organismo particular. Por tanto, se contempla que tanto los pares coexpresados de manera natural de estas enzimas como los que comparten una afinidad por interactuar entre sí facilitan la escisión de una cadena de carbono de longitud específica de la ACP.
[0203] En otras realizaciones, un gen exógeno que codifica una desaturasa se transforma en el microorganismo (por ejemplo, una célula de Prototheca) junto con uno o varios genes que codifican otras enzimas de modificación de lípidos para proporcionar modificaciones con respecto a la saturación de lípidos. En otras realizaciones, un gen de desaturasa endógena se sobreexpresa (por ejemplo, mediante la introducción de copias adicionales del gen) en el microorganismo (por ejemplo, una célula de Prototheca). La estearoil-ACP desaturasa (ver, por ejemplo, los números de acceso de GenBank AAF15308; ABM45911; y AAY86086), por ejemplo, cataliza la conversión de estearoil-ACP en oleoil-ACP. El incremento de este gen puede aumentar la proporción de ácidos grasos monoinsaturados producidos por una célula; mientras que la disminución puede reducir la proporción de monoinsaturados. Con fines ilustrativos, las estearoil-ACP desaturasas (SAD) son responsables de la síntesis de ácidos grasos C18: 1 a partir de precursores C18: 0. Otra familia de desaturasas son las acil desaturasas grasas (FAD), incluyendo las desaturasas de ácidos grasos delta 12 (A12 FAD). Estas desaturasas también proporcionan modificaciones con respecto a la saturación de lípidos. Con fines ilustrativos, las desaturasas de ácidos grasos delta 12 son responsables de la síntesis de ácidos grasos C18: 2 a partir de precursores C18: 1. De manera similar, la expresión de una o más glicerolípido desaturasas puede controlarse para alterar la proporción de ácidos grasos insaturados con respecto a saturados tales como ácido graso w-6 desaturasa, ácido graso w-3 desaturasa o w-6-oleato desaturasa. En algunas realizaciones, la desaturasa se puede seleccionar con referencia a una longitud de cadena de carbono deseada, de modo que la desaturasa sea capaz de realizar modificaciones específicas de ubicación dentro de un sustrato de longitud de carbono especificado, o sustratos que tengan una longitud de carbono dentro de un intervalo especificado. En otra realización, si el perfil de ácidos grasos deseado es un aumento de monoinsaturados (tales como C16: 1 y/o C18: 1), la sobreexpresión de una SAD o la expresión de una SAD heteróloga puede acoplarse con el silenciamiento o la inactivación (por ejemplo, mediante mutación, ARNi, inactivación de un gen de desaturasa endógena, etc.) de una acil desaturasa grasa (FAD).
[0204] En otras realizaciones, el microorganismo (por ejemplo, la célula de Prototheca) se ha modificado para tener un gen de desaturasa endógena mutado, en el que la mutación hace que el gen o la enzima desaturasa estén inactivos. En algunos casos, el gen de la desaturasa endógena mutada es una desaturasa de ácido graso (FAD). En otros casos, el gen de la desaturasa endógena mutada es una proteína transportadora de la estearoil acil desaturasa (SAD). El ejemplo 11 más adelante describe la ablación o la inactivación dirigidas de las estearoil-ACP desaturasas y las delta 12 desaturasas de ácidos grasos.
[0205] En algunos casos, puede ser ventajoso emparejar una o más de las técnicas de ingeniería genética para lograr una célula transgénica que produzca el perfil de lípidos deseado. En una realización, un microorganismo (por ejemplo, una célula de Prototheca) comprende un gen de desaturasa endógena mutado y uno o más genes exógenos. En los ejemplos no limitantes, una célula de Prototheca con un gen de desaturasa endógena mutado también puede expresar un gen de acil-ACP tioesterasa grasa exógeno y/o un gen de sacarosa invertasa. El ejemplo 11 más adelante describe una célula transgénica de Prototheca que contiene una ablación o una inactivación dirigidas de una SAD endógena y también expresa una tioesterasa y una sacarosa invertasa con preferencia por C14 de Cinnamomum camphora. En este caso, la célula transgénica de Prototheca produce un perfil de lípidos que se aproxima mucho al perfil de lípidos que se encuentra en el sebo. El sebo se obtiene típicamente de la grasa extraída de carne de res o de cordero, es sólido a temperatura ambiente y se utiliza en una variedad de aplicaciones en las industrias alimentaria, cosmética y química. El perfil de ácidos grasos del sebo es: 4 % de C14: 0; 26 % de C16: 0; 3 % de C16: 1; 14 % de C18: 0; 41 % de C18: 1; 3 % de C18: 2; y 1 % de C18: 3. Como se muestra en el ejemplo 11 más adelante, los clones de células transgénicas de Prototheca con una ablación o una inactivación dirigidas de una SAD endógena y que expresan una tioesterasa de C. camphora con preferencia por C14 tienen perfiles de lípidos de menos del 1 % de C12 y ácidos grasos de cadena de carbono más corta; del 2.74 % al 6.13 % de C14: 0; del 23.07 % al 25.69 % de C16: 0; del 7.02 % al 11.08 % de C18: 0; del 42.03 % al 51.21 % de C18: 1; y del 9.37 % al 13.45 % de C18: 2 (expresado en porcentaje de área). En algunos casos, las células transgénicas Prototheca tienen perfiles de lípidos de: 3-5 % de C14: 0; 25-27 % de C16: 0; 10-15 % de C18: 0; y 40-45 % de C18: 1.
[0206] Por tanto, en realizaciones particulares, los microbios se modifican genéticamente para expresar uno o más genes exógenos seleccionados entre una acil-ACP tioesterasa, una acil-CoA/aldehído reductasa, una acil-CoA reductasa grasa, una aldehído reductasa grasa, una aldehído descarbonilasa grasa o una proteína portadora de acilo coexpresada de forma natural. Los métodos de expresión adecuados se han descrito anteriormente con respecto a la expresión de un gen de lipasa, incluyendo, entre otros métodos, la expresión inducible y la expresión compartimentada. Una acil-ACP tioesterasa grasa escinde un ácido graso de una proteína portadora de acilo (ACP) durante la síntesis de lípidos. A través de un procesamiento enzimático adicional, el ácido graso escindido se combina con una coenzima para producir una molécula de acil-CoA. Esta acil-CoA es el sustrato para la actividad enzimática de una acil-CoA reductasa grasa para producir un aldehído, así como para una acil-CoA/aldehído reductasa grasa para producir un alcohol. El aldehido producido por la acción de la acil-CoA reductasa grasa identificada anteriormente es el sustrato para la actividad enzimática adicional por parte de una aldehído reductasa grasa para producir un alcohol, o de una aldehído descarbonilasa grasa para producir un alcano o un alqueno.
[0207] En algunas realizaciones, los ácidos grasos, los glicerolípidos o los correspondientes alcoholes primarios, aldehídos, alcanos o alquenos, generados por los métodos descritos en el presente documento, contienen 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono. Los ácidos grasos preferidos para la producción de diésel, biodiésel, diésel renovable o combustible de aviación o los correspondientes alcoholes primarios, aldehídos, alcanos y alquenos para aplicaciones industriales contienen de 8 a 14 átomos de carbono. En determinadas realizaciones, los ácidos grasos anteriores, así como las otras moléculas de hidrocarburos correspondientes, son saturados (sin dobles o triples enlaces carbono-carbono); monoinsaturados (enlace doble simple); poliinsaturados (dos o más dobles enlaces); son lineales (no cíclicos) o ramificados. Para la producción de combustible, se prefiere una mayor saturación.
[0208] Las enzimas antes descritas tienen una especificidad preferencial para la hidrólisis de un sustrato que contiene un número específico de átomos de carbono. Por ejemplo, una acil-ACP tioesterasa grasa puede tener preferencia por escindir un ácido graso que tiene 12 átomos de carbono de la ACP. En algunas realizaciones, la ACP y la tioesterasa de longitud específica pueden tener una afinidad entre sí que las hace particularmente útiles como combinación (por ejemplo, los genes de ACP y tioesterasa exógenos pueden coexpresarse naturalmente en un tejido u organismo particular del cual se obtienen). Por lo tanto, en diversas realizaciones, una Prototheca recombinante puede contener un gen exógeno que codifica una proteína con especificidad para catalizar una actividad enzimática (por ejemplo, la escisión de un ácido graso de una ACP, la reducción de un acil-CoA en un aldehído o un alcohol o la conversión de un aldehído en un alcano) con respecto al número de átomos de carbono contenidos en el sustrato. La especificidad enzimática puede, en diversas realizaciones, ser para un sustrato que tiene de 8 a 34 átomos de carbono, preferiblemente de 8 a 18 átomos de carbono y más preferiblemente de 8 a 14 átomos de carbono. Una especificidad preferida para un sustrato es tener menos átomos de carbono, es decir, 12, en lugar de más, es decir, 18.
[0209] Otras acil-ACP tioesterasas grasas adecuadas para su uso con los microbios y los métodos descritos en el presente documento incluyen, entre otras, las enumeradas en la tabla 4.
Tabla 4. Acil-ACP tioesterasas rasas números de acceso a GenBank.
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[0210] Los ejemplos siguientes describen el éxito del direccionamiento y la expresión de acil-ACP tioesterasas grasas heterólogas de Cuphea hookeriana, Umbellularia californica, Cinnamomum camphora, Cuphea palustris, Cuphea lanceolata, Iris germanica, Myristica fragrans y Ulmus americana en especies de Prototheca. Además, se confirmaron alteraciones en los perfiles de ácidos grasos en las células huésped que expresan estas acil-ACP tioesterasas grasas heterólogas. Estos resultados fueron bastante inesperados dada la falta de identidad de secuencia entre las tioesterasas de algas y plantas superiores en general y entre la acil-ACP tioesterasa grasa de Prototheca moriformis y las acil-ACP tioesterasas grasas heterólogas enumeradas anteriormente. Tal como se muestra en los ejemplos, la expresión de estas tioesterasas heterólogas en Prototheca genera una microalga transgénica capaz de producir aceite/lípidos con perfiles de ácidos grasos verdaderamente únicos que actualmente no están disponibles en cultivos de semillas comerciales, incluso mediante la mezcla de varios aceites de cultivos de semillas. La tabla 5 muestra los perfiles de ácidos grasos de los aceites de semillas comerciales comunes. Todos los datos de aceites de semillas comerciales siguientes se compilaron a partir de los Códigos de productos químicos y alimentarios de las farmacopeas de EE. UU., 7a ed. 2010-2011. Los datos de sebo son del National Research Council: Fat Content and Composition of Animal Products (1976).
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[0211] Por ejemplo, ninguno de estos aceites de semillas comunes contiene altas cantidades de ácidos grasos C8 o C10, siendo el aceite de coco y el aceite de palmiste las fuentes más importantes, pero ambos en una proporción de 1: 1 (ácidos grasos C8: C10). Como se muestra en los ejemplos, la Prototheca transformada con tioesterasa de Cuphea palustris que prefiere C: 8 fue capaz de alcanzar no solo un nivel de ácidos grasos C8 de más del 12 %, sino que también, la proporción de ácidos grasos C8: C10 fue de aproximadamente 5: 1. Los cambios en los niveles de ácidos grasos son útiles para producir aceites que contienen un perfil de ácidos grasos adaptado para una variedad de aplicaciones comerciales. Además, los cambios en las proporciones entre diferentes longitudes de cadenas de ácidos grasos es algo que no ha estado disponible comercialmente en aceites que no han pasado por otros procesos químicos costosos (como esterificación, destilación, fraccionamiento y reesterificación). Como ejemplo adicional, el aceite de palma es el aceite que contiene más ácidos grasos C16: 0 (32-47 %), pero el aceite de palma tiene muy pocos ácidos grasos C14: 0. La Prototheca que contiene la tioesterasa de U. americana alcanzó un 33-38 % de ácidos grasos C16: 0 y un 10-16 % de ácidos grasos C14: 0 (una proporción 2: 1 de C16: 0 a C14: 0). Este perfil de ácidos grasos es inalcanzable mediante la mezcla de aceites existentes a nivel comercial porque los aceites de semillas que tienen un alto contenido de ácidos grasos 16: 0 generalmente no contienen muchos ácidos grasos 14: 0.
[0212] Los ejemplos siguientes también describen, por primera vez, el direccionamiento y la expresión con éxito de al menos dos acil-ACP tioesterasas grasas en un clon. Las alteraciones en los perfiles de ácidos grasos se confirmaron en estos clones y, dependiendo de qué dos tioesterasas se coexpresaran en un clon, los perfiles de ácidos grasos se vieron afectados de diferentes formas. Como ejemplo, de la tabla 5 anterior, tanto el aceite de coco como el aceite de palmiste tienen proporciones C12: C14 de aproximadamente 3: 1. Tal como se describe en los ejemplos siguientes, un transformante de Prototheca que contiene dos genes de tioesterasa heterólogos fue capaz de producir niveles de ácidos grasos C12: C14 en una proporción de aproximadamente 5: 1. Este tipo de proporción de ácidos grasos C12: C14 ha sido, hasta ahora, inalcanzable a niveles comerciales (es decir, mediante la mezcla de aceites de semillas).
[0213] Otro aspecto novedoso de los aceites producidos por microalgas transgénicas es el grado de saturación de los ácidos grasos. El aceite de palma es actualmente la mayor fuente de aceite saturado, con una relación total de saturados respecto a insaturados del 52 % al 48 %. Tal como se muestra en los ejemplos siguientes, la Prototheca con tioesterasas heterólogas de U. americana y C. camphora logró niveles totales de saturados superiores al 60 % en el aceite que producía. También se muestra en los ejemplos siguientes, que la Prototheca con tioesterasa heteróloga de U. americana logró un nivel de saturados totales superior al 86 % en el aceite que producía.
[0214] Las acil-CoA/aldehído reductasas grasas adecuadas para su uso con los microbios y los métodos descritos en el presente documento incluyen, entre otras, las enumeradas en la tabla 6.
Tabla 6. Acil-CoA/aldehído reductasas rasas enumeradas or números de acceso a GenBank.
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[0215] Las acil-CoA reductasas grasas adecuadas para su uso con los microbios y los métodos descritos en el presente documento incluyen, entre otras, las enumeradas en la tabla 7.
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[0216] Las aldehído descarbonilasas grasas adecuadas para su uso con los microbios y los métodos descritos en el presente documento incluyen, entre otras, las enumeradas en la tabla 8.
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[0217] Las combinaciones de acil-ACP tioesterasas grasas y proteínas portadoras de acilo coexpresadas de forma natural son adecuadas para su uso con los microbios y los métodos descritos en el presente documento.
[0218] Los ejemplos adicionales de enzimas de modificación de hidrocarburos o lípidos incluyen secuencias de aminoácidos contenidas, referenciadas o codificadas por secuencias de ácidos nucleicos contenidas o referenciadas en cualquiera de las siguientes patentes EE. UU.: 6.610.527; 6.451.576; 6.429.014; 6.342.380;
6.265.639; 6.194.185; 6.114.160; 6.083.731; 6.043.072; 5.994.114; 5.891.697; 5.871.988; 6.265.639, y se describen adicionalmente en los números de acceso de GenBank: AAO18435; ZP_00513891;Q38710;
AAK60613; AAK60610; AAK60611; NP_113747; CAB75874; AAK60612; AAF20201; BAA11024; AF205791;y CAA03710.
[0219] Otras enzimas en las rutas biosintéticas de lípidos también son adecuadas para su uso con microbios y métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, las enzimas ceto acil-ACP sintasa (Kas) funcionan junto con algunas de las enzimas enumeradas anteriormente en la ruta biosintética de lípidos. Hay diferentes clases de enzimas Kas: Kas I participa en pasos sucesivos de condensación entre las cadenas de acil ACP en constante crecimiento y malonil-ACP. Kas II típicamente participa en el paso de condensación final que va desde C16: 0-ACP a C18: 0-ACP incorporando malonil-ACP. Como tal, en plantas superiores y algunas especies/cepas de microalgas que sintetizan predominantemente los ácidos grasos C16-C18: 0 (y sus derivados insaturados), las enzimas Kas 11 interactúan con productos de genes FatA (acil-ACP tioesterasas).
[0220] Las acil-ACP tioesterasas son los terminadores de la biosíntesis de ácidos grasos de plantas superiores (y de algunas especies de microalgas) y, en la mayoría de las especies de plantas, esto es llevado a cabo por miembros de la familia de genes FatA, cuya función es terminar la elongación en la etapa C16: 0 a C18: 0. En especies que sintetizan ácidos grasos de cadena más corta (como Cuphea, Elaeis, Myristica o Umbellularia), un grupo diferente de acil-ACP tioesterasas codificadas por genes FatB llevan a cabo este paso de terminación (ver por ejemplo, la región codificante optimizada por codón de Cocos nucífera FatB3-B, SEQ ID N.°: 189). La interacción entre las enzimas Kas II y las acil-ACP tioesterasas es importante para la terminación correcta del alargamiento de la cadena de ácidos grasos. Como consecuencia, en las especies de plantas superiores (y las especies de microalgas) que han desarrollado genes FatB capaces de biosíntesis de lípidos de cadena más corta, ha habido una coevolución correspondiente de una clase adicional de genes Kas, denominados genes Kas IV. Los genes Kas IV son responsables del alargamiento de la longitud de la cadena de un rango de tamaño específico de ácidos grasos, de 4-14 carbonos de longitud.
[0221] Otras enzimas adecuadas para usar con los microbios y los métodos descritos en el presente documento incluyen aquellas que tienen al menos un 70 % de identidad de aminoácidos con una de las proteínas enumeradas en las tablas 4 y 6-8 y que presentan la correspondiente actividad enzimática deseada (por ejemplo, escisión de un ácido graso de una proteína portadora de acilo, reducción de un acil-CoA en un aldehído o un alcohol o conversión de un aldehído en un alcano). En realizaciones adicionales, la actividad enzimática está presente en una secuencia que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % de identidad con una de las secuencias descritas anteriormente.
[0222] Al seleccionar la combinación deseada de genes exógenos que se van a expresar, se puede adaptar el producto generado por el microbio, que luego se puede extraer de la biomasa acuosa. Por ejemplo, el microbio puede contener: (i) un gen exógeno que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa; y, opcionalmente, (ii) una proteína portadora de acilo coexpresada de forma natural o una proteína portadora de acilo que de otro modo tenga afinidad por la acil-ACP tioesterasa grasa (o viceversa); y, opcionalmente, (iii) un gen exógeno que codifica una acil-CoA/aldehído reductasa grasa o una acil-CoA reductasa grasa; y, opcionalmente, (iv) un gen exógeno que codifica una aldehído reductasa grasa o una aldehído descarbonilasa grasa. El microbio, en las condiciones de cultivo descritas en el presente documento, sintetiza un ácido graso unido a una ACP y la acil-ACP tioesterasa grasa cataliza la escisión del ácido graso de la ACP para producir, mediante un procesamiento enzimático adicional, una molécula de acil-CoA grasa. Cuando está presente, la acil-CoA/aldehído reductasa grasa cataliza la reducción de la acil-CoA a un alcohol. De manera similar, la acil-CoA reductasa grasa, cuando está presente, cataliza la reducción de la acil-CoA a un aldehído. En aquellas realizaciones en las que está presente un gen exógeno que codifica una acil-CoA reductasa grasa y se expresa para producir un producto aldehído, una aldehído reductasa grasa, codificada por el tercer gen exógeno, cataliza la reducción del aldehído a un alcohol. De manera similar, una aldehído descarbonilasa grasa cataliza la conversión del aldehído en un alcano o un alqueno, cuando está presente.
[0223] En otra realización, el microbio puede contener: (i) un gen exógeno que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa; (ii) opcionalmente, una proteína portadora de acilo coexpresada de forma natural o una proteína portadora de acilo con afinidad por la acil-ACP tioesterasa de ácido graso; (iii) un gen de desaturasa endógeno mutado, en el que la mutación vuelve inactivo el gen de desaturasa o la proteína de desaturasa, como una inactivación de desaturasa; (iv) la sobreexpresión de una proteína transportadora de estearoil acil desaturasa endógena o la expresión de una SAD heteróloga; y (v) cualquier combinación de los anteriores.
[0224] Los genes que codifican dichas enzimas, como las acil ACP tioesterasas grasas, pueden obtenerse de células conocidas por presentar una producción significativa de lípidos como Chlorella protothecoides. Los genes que ya se sabe que tienen un papel en la producción de lípidos, p. ej., un gen que codifica una enzima que satura dobles enlaces, pueden transformarse individualmente en células receptoras. Sin embargo, para practicar la invención, no es necesario realizar suposiciones a priori sobre qué genes se requieren. Los métodos para identificar genes que pueden alterar (mejorar) la producción de lípidos en microalgas se describen en la Pub. de PCT n.° 2008/151149.
[0225] Por tanto, la presente divulgación describe un microorganismo (por ejemplo, una célula de Prototheca) que ha sido modificada genéticamente para expresar una enzima de la ruta lipídica a un nivel alterado en comparación con una célula de tipo salvaje de la misma especie. En algunos casos, la célula produce más lípidos en comparación con la célula de tipo salvaje cuando ambas células se cultivan en las mismas condiciones. En algunos casos, la célula ha sido modificada por ingeniería genética y/o seleccionada para expresar una enzima de la ruta lipídica a un nivel más alto que la célula de tipo salvaje. En algunos casos, la enzima de la ruta lipídica se selecciona del grupo que consiste en piruvato deshidrogenasa, acetil-CoA carboxilasa, proteína transportadora de acilo y glicerol-3-fosfato aciltransferasa. En algunos casos, la célula ha sido modificada por ingeniería genética y/o seleccionada para expresar una enzima de la ruta lipídica a un nivel más bajo que la célula de tipo salvaje. En al menos una realización en la que la célula expresa la enzima de la ruta lipídica a un nivel más bajo, la enzima de la ruta lipídica comprende citrato sintasa.
[0226] En algunas realizaciones, la célula se ha modificado genéticamente y/o seleccionado para expresar un regulador global de la síntesis de ácidos grasos a un nivel alterado en comparación con la célula de tipo salvaje, donde los niveles de expresión de una variedad de genes sintéticos de ácidos grasos se alteran en comparación con la célula de tipo salvaje. En algunos casos, la enzima de la ruta lipídica comprende una enzima que modifica un ácido graso. En algunos casos, la enzima de la ruta lipídica se selecciona entre una estearoil-ACP desaturasa y una glicerolípido desaturasa. En algunos casos, la célula se ha modificado genéticamente y/o seleccionado para expresar un nivel más bajo de una enzima de la ruta lipídica, o para no expresar una enzima de la ruta lipídica específica en absoluto (es decir, donde una enzima de la ruta lipídica se ha inactivado o reemplazado por un gen exógeno).
[0227] Algunas microalgas producen cantidades importantes de metabolitos no lipídicos como, por ejemplo, polisacáridos. Debido a que la biosíntesis de polisacáridos puede usar una proporción significativa de la energía metabólica total disponible para las células, la mutagénesis de las células productoras de lípidos seguida de la detección de la producción de polisacáridos reducida o eliminada genera nuevas cepas que son capaces de producir mayores rendimientos lipídicos.
[0228] En otras realizaciones, la presente divulgación describe un microbio productor de aceite que contiene uno o más genes exógenos, donde los genes exógenos codifican proteínas seleccionadas del grupo que consiste en una acil-ACP tioesterasa grasa, una acil-CoA reductasa grasa, una aldehído reductasa grasa, una acil-CoA/aldehído reductasa grasa, una aldehído descarbonilasa grasa, una desaturasa y una proteína portadora de acilo. En otra realización, un gen de desaturasa endógena se sobreexpresa en un microbio que contiene uno o varios de los genes exógenos anteriores. En una realización, el gen exógeno está en enlace operable con un promotor inducible o reprimible en respuesta a un estímulo. En algunos casos, el estímulo se selecciona del grupo que consiste en una molécula pequeña proporcionada exógenamente, calor, frío y nitrógeno limitado o nulo en el medio de cultivo. En algunos casos, el gen exógeno se expresa en un compartimento celular. En algunas realizaciones, el compartimento celular se selecciona del grupo que consiste en un cloroplasto, un plástido y una mitocondria. En algunas realizaciones, el microbio es Prototheca moriformis, Prototheca krugani, Prototheca stagnora o Prototheca zopfii.
[0229] En una realización, el gen exógeno codifica una acil-ACP tioesterasa de ácido graso. En algunos casos, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 8 a 18 carbonos de una proteína portadora de acilo (ACP). En algunos casos, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 10 a 14 carbonos de una ACP. En una realización, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 12 carbonos de una ACP.
[0230] En una realización, el gen exógeno codifica una acil-CoA/aldehído reductasa grasa. En algunos casos, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de una acil-CoA grasa de 8 a 18 carbonos a un alcohol primario correspondiente. En algunos casos, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de una acil-CoA grasa de 10 a 14 carbonos a un alcohol primario correspondiente. En una realización, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de una acil-CoA grasa de 12 carbonos a dodecanol.
[0231] También se describe una célula recombinante de Prototheca que contiene dos genes exógenos, en la que un primer gen exógeno codifica una acil-ACP tioesterasa grasa y un segundo gen exógeno codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en una acil-CoA reductasa grasa, una acil-CoA/aldehído reductasa grasa y una proteína transportadora de acilo. En algunos casos, los dos genes exógenos están cada uno en enlace operable con un promotor, que es inducible en respuesta a un estímulo. En algunos casos, cada promotor es inducible en respuesta a un estímulo idéntico, como la limitación o la falta de nitrógeno en el medio de cultivo. La limitación o falta total de nitrógeno en los medios de cultivo estimula la producción de aceite en algunos microorganismos como los de la especie Prototheca, y se puede utilizar como desencadenante para inducir la producción de aceite a niveles altos. Cuando se usa en combinación con los métodos de ingeniería genética descritos en el presente documento, el lípido como porcentaje del peso seco de la célula se puede llevar a niveles altos, tales como de al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 % y al menos el 75 %; los métodos descritos en el presente documento garantizan células con estos niveles de lípidos, en los que el lípido es al menos un 1 %-5 %, preferiblemente al menos un 4 %, de C8-C14, al menos un 0.25 %-1 %, preferiblemente al menos un 0.3 %, de C8, al menos un 1 %-5 %, preferiblemente al menos un 2 %, de C10, al menos un 1 %-5 %, preferiblemente al menos un 2 %, de C12 y al menos un 1 %-5 %, preferiblemente al menos un 2 %, de C14. En algunas realizaciones, las células tienen más del 10 %, más del 15 %, más del 20 % o más del 25 % de lípidos en peso seco de las células y contienen lípidos que son al menos un 5 %, al menos un 10 % o al menos un 15 % de C8-C14, al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 % o al menos un 30 % de C8-C14, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 % o al menos un 40 % de C8-C14, un 5 %-40 %, preferiblemente un 10-30 % de C8-C14 y un 10 %-40 %, preferiblemente un 20-30 % de C8-C14.
[0232] Los nuevos aceites descritos en el presente documento son distintos de otros aceites naturales que tienen un alto contenido de ácidos grasos de cadena media, tales como aceite de palma, aceite de palmiste y aceite de coco. Por ejemplo, los niveles de contaminantes tales como carotenoides son mucho más altos en el aceite de palma y el aceite de palmiste que en los aceites de la invención. Los aceites de palma y de palmiste contienen en particular alfa y betacarotenos y licopeno en cantidades mucho mayores que los aceites de la invención. Además, se encuentran más de 20 carotenoides diferentes en el aceite de palma y de palmiste, mientras que los ejemplos demuestran que los aceites descritos en este documento contienen muy pocas especies de carotenoides y niveles muy bajos. Además, los niveles de compuestos de vitamina E tales como tocotrienoles son mucho más altos en la palma, el palmiste y el aceite de coco que en los aceites descritos en este documento.
[0233] En una realización, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 8 a 18 carbonos de una ACP. En algunas realizaciones, el segundo gen exógeno codifica una acil-CoA/aldehído reductasa grasa que cataliza la reducción de una acil-CoA grasa de 8 a 18 carbonos a un alcohol primario correspondiente. En algunos casos, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 10 a 14 carbonos de una ACP, y la reductasa codificada por el segundo gen exógeno cataliza la reducción de una acil-CoA grasa de 10 a 14 carbonos al correspondiente alcohol primario, donde la tioesterasa y la reductasa actúan sobre la misma longitud de cadena de carbono. En una realización, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 12 carbonos de una ACP, y la reductasa codificada por el segundo gen exógeno cataliza la reducción de una acil-CoA grasa de 12 carbonos a dodecanol. En algunas realizaciones, el segundo gen exógeno codifica una acil-CoA reductasa grasa que cataliza la reducción de una acil-CoA grasa de 8 a 18 carbonos a un aldehído correspondiente. En algunas realizaciones, el segundo gen exógeno codifica una proteína portadora de acilo que se coexpresa naturalmente con la acil-ACP tioesterasa grasa.
[0234] En algunas realizaciones, el segundo gen exógeno codifica una acil-CoA reductasa grasa, y el microbio contiene además un tercer gen exógeno que codifica una aldehído descarbonilasa grasa. En algunos casos, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 8 a 18 carbonos de una ACP, la reductasa codificada por el segundo gen exógeno cataliza la reducción de una acil-CoA grasa de 8 a 18 carbonos a un aldehído graso correspondiente, y la descarbonilasa codificada por el tercer gen exógeno cataliza la conversión de un aldehído graso de 8 a 18 carbonos en un alcano correspondiente, donde la tioesterasa, la reductasa y la descarbonilasa actúan sobre la misma longitud de cadena de carbono.
[0235] En algunas realizaciones, el segundo gen exógeno codifica una proteína transportadora de acilo, y el microbio contiene además un tercer gen exógeno que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en una acil-CoA reductasa grasa y una acil-CoA/aldehído reductasa grasa. En algunos casos, el tercer gen exógeno codifica una acil-CoA reductasa grasa, y el microbio contiene además un cuarto gen exógeno que codifica una aldehído descarbonilasa grasa.
[0236] La presente descripción también describe métodos para producir un alcohol que comprenden cultivar una población de microorganismos recombinantes (por ejemplo, células de Prototheca) en un medio de cultivo, donde las células contienen (i) un primer gen exógeno que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa y (ii) un segundo gen exógeno que codifica una acil-CoA/aldehído reductasa grasa y las células sintetizan un ácido graso enlazado a una proteína portadora de acilo (ACP), la acil-ACP tioesterasa grasa cataliza la escisión del ácido graso de la ACP para producir, a través de un procesamiento adicional, una acil-CoA grasa, y la acil-CoA/aldehído reductasa grasa cataliza la reducción de la acil-CoA a un alcohol.
[0237] La presente divulgación también describe métodos para producir una molécula lipídica en un microorganismo (por ejemplo, una célula de Prototheca). En una realización, el método comprende cultivar una población de células de Prototheca en un medio de cultivo, donde las células contienen (i) un primer gen exógeno que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa y (ii) un segundo gen exógeno que codifica una acil-CoA reductasa grasa y donde los microbios sintetizan un ácido graso enlazado a una proteína portadora de acilo (ACP), la tioesterasa de acil-ACP grasa cataliza la escisión del ácido graso de la ACP para producir, a través de un procesamiento adicional, una acil-CoA grasa, y la acil-CoA reductasa grasa cataliza la reducción de la acil-CoA a un aldehído.
[0238] La presente divulgación también describe métodos para producir una molécula de ácido graso que tiene una longitud de cadena de carbono específica en un microorganismo (por ejemplo, una célula de Prototheca). En una realización, el método comprende cultivar una población de células de Prototheca productoras de lípidos en un medio de cultivo, donde los microbios contienen un gen exógeno que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa que tiene una actividad específica o preferencial para una cierta longitud de cadena de carbono, por ejemplo 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono, y donde los microbios sintetizan un ácido graso enlazado a una proteína portadora de acilo (ACP) y la tioesterasa cataliza la escisión del ácido graso de la ACP cuando el ácido graso se ha sintetizado hasta la longitud específica de la cadena de carbono.
[0239] En las diversas realizaciones descritas anteriormente, el microorganismo (por ejemplo, una célula de Prototheca ) puede contener al menos un gen exógeno que codifica una enzima de la ruta lipídica. En algunos casos, la enzima de la ruta lipídica se selecciona del grupo que consiste en una estearoil-ACP desaturasa, una glicerolípido desaturasa, una piruvato deshidrogenasa, una acetil-CoA carboxilasa, una proteína portadora de acilo y una glicerol-3-fosfato aciltransferasa. En otros casos, el microorganismo (por ejemplo, una célula de Prototheca) contiene una enzima de modificación de lípidos seleccionada del grupo que consiste en una acil-ACP tioesterasa grasa, una acil-CoA/aldehído reductasa grasa, una acil-CoA reductasa grasa, una aldehído reductasa grasa, una aldehído descarbonilasa grasa y/o una proteína transportadora.
[0240] En los ejemplos se presentan varios casetes o constructos de transformación ejemplares utilizados para expresar una variedad de enzimas de la ruta lipídica y enzimas de modificación de lípidos comentadas en el presente documento. Otros constructos útiles, sin limitación, se enumeran en la tabla 37 a continuación.
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VI. PRODUCCIÓN DE COMBUSTIBLES Y SUSTANCIAS QUÍMICAS
[0241] Para la producción de combustible, los lípidos producidos por las células tal como se describe en el presente documento se cosechan o se recolectan por cualquier medio conveniente. Los lípidos se pueden aislar mediante extracción de células completas. Las células se rompen primero y luego los lípidos intracelulares y asociados a la membrana celular/pared celular, así como los hidrocarburos extracelulares, pueden separarse de la masa celular, por ejemplo, mediante el uso de centrifugación tal como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, los lípidos intracelulares producidos en microorganismos se extraen después de lisar las células del microorganismo. Una vez extraídos, los lípidos se refinan aún más para producir aceites, combustibles o productos oleoquímicos.
[0242] Una vez finalizado el cultivo, los microorganismos se pueden separar del caldo de fermentación. Opcionalmente, la separación se efectúa por centrifugación para generar una pasta concentrada. La centrifugación no elimina cantidades significativas de agua intracelular de los microorganismos y no constituye un paso de secado. La biomasa se puede lavar opcionalmente con una solución de lavado (por ejemplo, agua desionizada) para eliminar el caldo de fermentación y los residuos. Opcionalmente, la biomasa microbiana lavada también se puede secar (secar al horno, liofilizar, etc.) antes de la disrupción celular. Alternativamente, las células se pueden lisar sin separación parcial o total a partir del caldo de fermentación cuando la fermentación se completa. Por ejemplo, las células pueden estar en una proporción de menos de 1: 1 v:v de células con respecto al líquido extracelular cuando las células se lisan.
[0243] Los microorganismos que contienen un lípido se pueden lisar para producir un lisado. Tal como se detalla en el presente documento, la etapa de lisado de un microorganismo (también denominada lisis celular) se puede lograr por cualquier medio conveniente, incluyendo la lisis inducida por calor, la adición de una base, la adición de un ácido, el uso de enzimas como las proteasas y enzimas de degradación de polisacáridos como las amilasas, el uso de ultrasonidos, la lisis mecánica, el uso del choque osmótico, la infección con un virus lítico y/o la expresión de uno o más genes líticos. La lisis se realiza para liberar moléculas intracelulares producidas por el microorganismo. Cada uno de estos métodos para lisar un microorganismo se puede utilizar como método único o en combinación simultánea o secuencial. La extensión de la alteración celular se puede observar mediante análisis microscópico. Utilizando uno o varios de los métodos descritos en el presente documento, se observa típicamente más de un 70 % de rotura celular. Preferiblemente, la rotura celular es superior al 80 %, más preferiblemente superior al 90 % y lo más preferido el 100 %.
[0244] En realizaciones particulares, el microorganismo se lisa después del crecimiento, por ejemplo para aumentar la exposición de lípidos y/o hidrocarburos celulares para la extracción o el procesamiento adicional. La temporización de la expresión de la lipasa (por ejemplo, a través de un promotor inducible) o la lisis celular se puede ajustar para optimizar el rendimiento de lípidos y/o hidrocarburos. A continuación se describen varias técnicas de lisis. Estas técnicas se pueden utilizar individualmente o en combinación.
[0245] En una realización, la etapa de lisado de un microorganismo comprende calentar una suspensión celular que contiene el microorganismo. En esta realización, el caldo de fermentación que contiene los microorganismos (o una suspensión de microorganismos aislada a partir del caldo de fermentación) se calienta hasta que los microorganismos, es decir, las paredes y las membranas celulares de los microorganismos, se degradan o se rompen. Normalmente, las temperaturas aplicadas son de al menos 50 °C. Para una lisis celular más eficiente se usan temperaturas más altas, por ejemplo, al menos 30 °C, al menos 60 °C, al menos 70 °C, al menos 80 °C, al menos 90 °C, al menos 100 °C, al menos 110 °C, al menos 120 °C, al menos 130 °C o más. La lisis de células mediante tratamiento térmico se puede realizar hirviendo el microorganismo. Alternativamente, el tratamiento térmico (sin hervir) se puede realizar en un autoclave. El lisado tratado térmicamente se puede enfriar para un tratamiento adicional. La rotura celular también se puede realizar mediante tratamiento con vapor, es decir, mediante la adición de vapor a presión. El tratamiento de microalgas con vapor para la disrupción celular se describe, por ejemplo, en la patente EE. UU. n.° 6.750.048. En algunas realizaciones, el tratamiento con vapor se puede lograr rociando vapor en el fermentador y manteniendo el caldo a la temperatura deseada durante menos de 90 minutos, preferiblemente menos de 60 minutos y más preferiblemente menos de 30 minutos.
[0246] En otra realización, la etapa de lisado de un microorganismo comprende añadir una base a una suspensión celular que contiene el microorganismo. La base debe ser lo suficientemente fuerte como para hidrolizar al menos una porción de los compuestos proteicos de los microorganismos utilizados. Las bases útiles para solubilizar proteínas se conocen en la técnica química. Lo ejemplos de bases útiles en los métodos descritos en el presente documento incluyen, entre otros, hidróxidos, carbonatos y bicarbonatos de litio, sodio, potasio, calcio y mezclas de los mismos. Una base preferida es el KOH. El tratamiento de microalgas con una base para la disrupción celular se describe, por ejemplo, en la patente EE. UU. n.° 6.750.048.
[0247] En otra realización, la etapa de lisado de un microorganismo comprende añadir un ácido a una suspensión celular que contiene el microorganismo. La lisis ácida se puede efectuar usando un ácido a una concentración de 10-500 mN o preferiblemente 40-160 nM. La lisis ácida se realiza preferiblemente por encima de la temperatura ambiente, por ejemplo, a 40-160 °C y preferiblemente a una temperatura de 50-130 °C. Para temperaturas moderadas, por ejemplo, de temperatura ambiente a 100 °C y particularmente de temperatura ambiente a 65 °C, el tratamiento ácido se puede combinar de manera útil con la sonicación u otros métodos de disrupción celular.
[0248] En otra realización, la etapa de lisado de un microorganismo comprende lisar el microorganismo usando una enzima. Las enzimas preferidas para lisar un microorganismo son las proteasas y las enzimas que degradan polisacáridos tales como la hemicelulasa (por ejemplo, hemicelulasa de Aspergillus niger, Sigma Aldrich, St. Louis, MO; # H2125), la pectinasa (por ejemplo, pectinasa de Rhizopus sp.; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; # P2401), Mannaway 4.0 L (Novozymes), la celulasa (por ejemplo, celulosa de Trichoderma viride; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; # C9422) y driselasa (por ejemplo, driselasa de Basidiomycetes sp.; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; # D9515).
[0249] En otras realizaciones, la lisis se logra usando una enzima como, por ejemplo, una celulasa, por ejemplo, una enzima degradante de polisacáridos, opcionalmente de Chlorella o un virus de Chlorella o una proteasa, como la proteasa de Streptomyces griseus, quimotripsina, proteinasa K, proteasas enumeradas en Degradation of Polylactide by Commercial Proteases, Oda Yet al., Journal of Polymers and the Environment, volumen 8, número 1, enero de 2000, págs.), Alcalase 2.4 FG (Novozymes) y Flavourzyme 100 L (Novozymes). También se puede usar cualquier combinación de una proteasa y una enzima degradante de polisacáridos, incluyendo cualquier combinación de las proteasas y enzimas degradantes de polisacáridos precedentes.
[0250] En otra realización, la lisis se puede realizar usando una prensa de expulsión. En este proceso, se obliga a la biomasa a pasar a través de un dispositivo tipo tornillo a alta presión, lisando las células y haciendo que el lípido intracelular se libere y se separe de la proteína y la fibra (y otros componentes) en la célula.
[0251] En otra realización, la etapa de lisado de un microorganismo se realiza usando ultrasonidos, es decir, sonicación. Por tanto, las células también pueden lisarse con sonido de alta frecuencia. El sonido puede producirse electrónicamente y transportarse a través de una punta metálica hasta una suspensión celular adecuadamente concentrada. Esta sonicación (o ultrasonicación) altera la integridad celular basándose en la creación de cavidades en la suspensión celular.
[0252] En otra realización, la etapa de lisado de un microorganismo se realiza mediante lisis mecánica. Las células se pueden lisar mecánicamente y, opcionalmente, homogeneizar para facilitar la recolección de hidrocarburos (por ejemplo, lípidos). Por ejemplo, se puede usar un disruptor de presión para bombear una suspensión de células a través de una válvula de orificio restringido. Se aplica alta presión (hasta 1500 bar), seguida de una expansión instantánea a través de una boquilla de salida. La disrupción de la célula se logra mediante tres mecanismos diferentes: impacto en la válvula, cizalladura elevada del líquido en el orificio y caída repentina de la presión al descargar, lo que provoca la explosión de la célula. El método libera moléculas intracelulares. Alternativamente, se puede utilizar un molino de bolas. En un molino de bolas, las células se agitan en suspensión con pequeñas partículas abrasivas, como, por ejemplo, perlas. Las células se rompen debido a las fuerzas de cizalladura, el triturado entre las perlas y las colisiones con las perlas. Las perlas rompen las células para liberar contenido celular. Las células también pueden romperse por fuerzas de cizalladura, como ocurre con el uso de mezclas (por ejemplo, con un mezclador de alta velocidad o Waring), la prensa francesa o incluso la centrifugación en caso de paredes celulares débiles, para romper las células.
[0253] En otra realización, la etapa de lisado de un microorganismo se aplicando un choque osmótico.
[0254] En otra realización, la etapa de lisado de un microorganismo comprende la infección del microorganismo con un virus lítico. Se sabe que una amplia variedad de virus lisan microorganismos adecuados y la selección y uso de un virus lítico particular para un microorganismo particular está dentro del nivel de experiencia en la técnica. Por ejemplo, el virus de chlorella paramecium bursaria (PBCV-1) es el prototipo de un grupo (familia Phycodnaviridae, género Clorovirus) de virus de ADN bicatenario grandes, icosaédricos, formadores de placas, que se replican y lisan en determinadas algas verdes unicelulares, eucariotas, parecidas a la chlorella. Por consiguiente, cualquier microalga susceptible se puede lisar infectando el cultivo con un virus de Chlorella adecuado. Los métodos para infectar las especies de Chlorella con un virus de chlorella son conocidos. Ver por ejemplo Adv. Virus Res. 2006; 66: 293-336; Virology, 25 de abril de 1999; 257 (1): 15-23; Virology, lunes, 5 de enero de 2004; 318 (1): 214-23; Nucleic Acids Symp. Ser. 2000; (44): 161-2; J. Virol. marzo de 2006; 80 (5): 2437-44; y Annu. Rev. Microbiol. 1999; 53: 447-94.
[0255] En otra realización, la etapa de lisado de un microorganismo comprende la autólisis. En esta realización, un microorganismo se modifica mediante ingeniería genética para producir una proteína lítica que lisará el microorganismo. Este gen lítico puede expresarse usando un promotor inducible de modo que las células puedan cultivarse primero hasta una densidad deseable en un fermentador, y, a continuación, inducir el promotor de modo que exprese el gen lítico para lisar las células. En una realización, el gen lítico codifica una enzima degradante de polisacáridos. En otras determinadas realizaciones, el gen lítico es un gen de un virus lítico. Así, por ejemplo, un gen lítico de un virus de Chlorella se puede expresar en una célula de algas; ver Virology 260, 308-315 (1999); FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45-53; Virology 263, 376-387 (1999); y Virology 230, 361­ 368 (1997). La expresión de genes líticos se realiza preferiblemente usando un promotor inducible, por ejemplo, un promotor activo en microalgas que es inducido por un estímulo como la presencia de una molécula pequeña, la luz, el calor y otros estímulos.
[0256] Están disponibles varios métodos para separar lípidos a partir de lisados celulares producidos por los métodos anteriores. Por ejemplo, los lípidos y derivados de lípidos como los aldehídos grasos, los alcoholes grasos y los hidrocarburos tales como los alcanos se pueden extraer con un disolvente hidrófobo como el hexano (ver Frenz et al. 1989, Enzyme Microb. Technol., 11:717). Los lípidos y derivados de lípidos también se pueden extraer mediante licuefacción (ver, por ejemplo, Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17: 33-39 e Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6 (4): 269-274); licuefacción de aceite (ver, por ejemplo, Minowa et al.
1995, Fuel 74 (12): 1735-1738); y extracción de CO2 supercrítico (ver, por ejemplo, Mendes et al. 2003, Inorganica Chimica Acta 356: 328-334). Miao y Wu describen un protocolo de recuperación de lípidos de microalgas de un cultivo de Chlorella Protothecoides en el que las células se cosecharon por centrifugación, se lavaron con agua destilada y se secaron por liofilización. El polvo celular resultante se pulverizó en un mortero y luego se extrajo con n-hexano. Miao and Wu, Biosource Technology (2006) 97: 841-846.
[0257] Por tanto, los lípidos, derivados de lípidos e hidrocarburos generados por los microorganismos descritos en el presente documento pueden recuperarse mediante extracción con un disolvente orgánico. En algunos casos, el disolvente orgánico preferido es el hexano. Normalmente, el disolvente orgánico se añade directamente al lisado sin separación previa de los componentes del lisado. En una realización, el lisado generado por uno o más de los métodos descritos anteriormente se pone en contacto con un disolvente orgánico durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los componentes lipídicos y/o hidrocarbonados formen una solución con el disolvente orgánico. En algunos casos, la solución se puede refinar aún más para recuperar componentes lipídicos o hidrocarbonados específicos deseados. Los métodos de extracción con hexano son bien conocidos en la técnica.
[0258] Los lípidos y derivados de lípidos tales como aldehídos grasos, alcoholes grasos e hidrocarburos tales como alcanos producidos por células tal como se describe en el presente documento pueden modificarse mediante el uso de una o más enzimas, incluyendo una lipasa, tal como se ha descrito anteriormente. Cuando los hidrocarburos se encuentran en el entorno extracelular de las células, se pueden añadir una o más enzimas a ese entorno en condiciones en las que la enzima modifica el hidrocarburo o completa su síntesis a partir de un precursor de hidrocarburo. Alternativamente, los hidrocarburos pueden aislarse parcial o completamente a partir del material celular antes de la adición de uno o más catalizadores tales como, por ejemplo, las enzimas. Dichos catalizadores se añaden exógenamente y su actividad se produce fuera de la célula o in vitro.
[0259] Por lo tanto, los lípidos e hidrocarburos producidos por las células in vivo o modificados enzimáticamente in vitro, tal como se describe en el presente documento, opcionalmente pueden procesarse además por medios convencionales. El procesamiento puede incluir el "craqueo" para reducir el tamaño y así aumentar la proporción hidrógeno:carbono de las moléculas de hidrocarburo. Los métodos de craqueo catalítico y térmico se utilizan habitualmente en el procesamiento de aceites de hidrocarburos y triglicéridos. Los métodos catalíticos implican el uso de un catalizador, por ejemplo, un catalizador ácido sólido. El catalizador puede ser sílice-alúmina o una zeolita, lo que da como resultado la rotura heterolítica o asimétrica de un enlace carbono-carbono para dar lugar a un carbocatión y un anión hidruro. Estos reactivos intermedios se someten después a reordenación o transferencia de hidruro con otro hidrocarburo. Por tanto, las reacciones pueden regenerar los intermedios para dar como resultado un mecanismo de cadena de autopropagante. Los hidrocarburos también pueden procesarse para reducir, opcionalmente a cero, el número de enlaces dobles o triples carbono-carbono que estos contengan. Los hidrocarburos también se pueden procesar para retirar o eliminar un anillo o una estructura cíclica que estos contengan. Los hidrocarburos también se pueden procesar para aumentar la proporción hidrógeno:carbono. Esto puede incluir la adición de hidrógeno ("hidrogenación") y/o el "craqueo" de hidrocarburos en hidrocarburos más pequeños.
[0260] Los métodos térmicos implican el uso de temperatura y presión elevadas para reducir el tamaño de los hidrocarburos. Puede usarse una temperatura de aproximadamente 800 °C y una presión de aproximadamente 700 kPa elevadas. Estas condiciones generan "luz", un término que a veces se usa para referirse a moléculas de hidrocarburos ricas en hidrógeno (a diferencia del flujo de fotones), mientras que también generan, por condensación, moléculas de hidrocarburos más pesadas que están relativamente desprovistas de hidrógeno. La metodología proporciona una rotura homolítica o simétrica y produce alquenos, que pueden estar de manera opcional saturados enzimáticamente tal como se ha descrito anteriormente.
[0261] Los métodos catalíticos y térmicos son la norma en las plantas de procesamiento de hidrocarburos y refinado del petróleo. Por tanto, los hidrocarburos producidos por las células tal como se describe en el presente documento pueden recolectarse y procesarse o refinarse por medios convencionales. Ver Hillen et al. (Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIV: 193-205 (1982)) para obtener un informe sobre el hidrocraqueo de hidrocarburos producidos por microalgas. En realizaciones alternativas, la fracción se trata con otro catalizador, por ejemplo, un compuesto orgánico, calor y/o un compuesto inorgánico. Para el procesamiento de lípidos en biodiésel, se utiliza un proceso de transesterificación según se describe más adelante en esta sección.
[0262] Los hidrocarburos producidos mediante los métodos descritos en este documento son útiles en una variedad de aplicaciones industriales. Por ejemplo, la producción de alquilbencenosulfonato lineal (LAS), un surfactante aniónico utilizado en casi todos los tipos de detergentes y preparaciones de limpieza, utiliza hidrocarburos que generalmente comprenden una cadena de 10-14 átomos de carbono. Ver, por ejemplo, las patentes EE. UU. n.°: 6.946.430; 5.506.201; 6.692.730; 6.268.517; 6.020.509; 6.140.302; 5.080.848; y 5.567.359. Los surfactantes, como el LAS, se pueden utilizar en la fabricación de composiciones y detergentes para el cuidado personal, como los descritos en las patentes EE. UU. n.°: 5.942.479; 6.086.903; 5.833.999; 6.468.955; y 6.407.044.
[0263] El interés creciente se dirige al uso de componentes de hidrocarburos de origen biológico en combustibles, tales como biodiésel, diésel renovable y combustible de aviación, ya que se encuentran disponibles materiales de partida biológicos renovables que pueden reemplazar a los derivados de combustibles fósiles, y su uso es deseable. Existe una necesidad urgente de métodos para producir componentes de hidrocarburos a partir de materiales biológicos. La presente descripción satisface esta necesidad proporcionando métodos para la producción de biodiésel, diésel renovable y combustible para aviones utilizando los lípidos generados por los métodos descritos en el presente documento como material biológico para producir biodiésel, diésel renovable y combustible para aviones.
[0264] Los combustibles diésel tradicionales son destilados de petróleo ricos en hidrocarburos parafínicos. Tienen rangos de ebullición con una amplitud de 188 a 416 °C (370 ° a 780 °F), adecuados para la combustión en un motor de encendido por compresión, por ejemplo, un vehículo con motor diésel. La Sociedad Estadounidense de Pruebas y Materiales (ASTM) establece el grado de diésel de acuerdo con el rango de ebullición, junto con los rangos permitidos de otras propiedades del combustible, como el número de cetano, el punto de enturbiamiento, el punto de inflamación, la viscosidad, el punto de anilina, el contenido de azufre, el contenido de agua, el contenido de cenizas, la corrosión de las tiras de cobre y los residuos de carbono. Técnicamente, cualquier material destilado de hidrocarburos derivado de la biomasa o que cumpla con la especificación ASTM apropiada puede definirse como combustible diésel (ASTM D975), combustible para aviones (ASTM D1655) o como biodiésel si es un éster metílico de ácido graso (ASTM D6751).
[0265] Después de la extracción, los componentes de lípidos y/o hidrocarburos recuperados de la biomasa microbiana descrita en el presente documento pueden someterse a un tratamiento químico para fabricar un combustible para su uso en vehículos diésel y motores a reacción.
[0266] El biodiésel es un líquido que varía en color, entre dorado y marrón oscuro, según la materia prima de producción. Es prácticamente inmiscible con agua, tiene un alto punto de ebullición y baja presión de vapor. El biodiésel se refiere a un combustible procesado equivalente al diésel para su uso en vehículos con motor diésel. El biodiésel es biodegradable y no tóxico. Un beneficio adicional del biodiesel sobre el combustible diésel convencional es un menor desgaste del motor. Normalmente, el biodiésel comprende ésteres de alquilo C14-C18. Varios procesos convierten la biomasa o un lípido producido y aislado como se describe en el presente documento en combustibles diésel. Un método preferido para producir biodiésel es la transesterificación de un lípido como se describe en el presente documento. Un éster de alquilo preferido para usar como biodiésel es un éster metílico o éster etílico.
[0267] El biodiésel producido por un método descrito en este documento puede usarse solo o mezclado con combustible diésel convencional a cualquier concentración en la mayoría de los vehículos con motor diésel modernos. Cuando se mezcla con combustible diésel convencional (diésel de petróleo), el biodiésel puede estar presente en un porcentaje de entre un 0.1 % y un 99.9 %. Gran parte del mundo utiliza un sistema conocido como factor "B" para indicar la cantidad de biodiésel en cualquier mezcla de combustible. Por ejemplo, el combustible que contiene un 20 % de biodiésel está etiquetado como B20. El biodiésel puro se denomina B100.
[0268] El biodiésel también se puede utilizar como combustible de calefacción en calderas domésticas y comerciales. Las calderas de aceite existentes pueden contener piezas de caucho y pueden requerir conversión para funcionar con biodiésel. El proceso de conversión suele ser relativamente simple e implica el intercambio de piezas de caucho por piezas sintéticas debido a que el biodiésel es un disolvente fuerte. Debido a su fuerte poder disolvente, la quema de biodiésel aumentará la eficiencia de las calderas. El biodiésel se puede utilizar como aditivo en formulaciones de diésel para aumentar la lubricidad del combustible diésel ultrabajo en azufre (ULSD) puro, lo cual es beneficioso porque prácticamente no tiene contenido de azufre. El biodiésel es un mejor disolvente que el petrodiésel y se puede usar para descomponer los depósitos de residuos en las líneas de combustible de los vehículos que previamente han funcionado con petrodiésel.
[0269] El biodiésel se puede producir mediante la transesterificación de los triglicéridos contenidos en la biomasa rica en aceite. Por tanto, en otro aspecto se describe un método para producir biodiésel. En una realización preferida, el método para producir biodiésel comprende las etapas de (a) cultivar un microorganismo que contiene lípidos usando los métodos descritos en el presente documento (b) lisar un microorganismo que contiene lípidos para producir un lisado, (c) aislar lípidos del microorganismo lisado y (d) transesterificar la composición lipídica, por lo cual se produce biodiésel. Los métodos para el cultivar un microorganismo, lisar un microorganismo para producir un lisado, tratar el lisado en un medio que comprende un disolvente orgánico para formar una mezcla heterogénea y separar el lisado tratado en una composición lipídica se han descrito anteriormente y también se pueden utilizar en el método de producción de biodiésel.
[0270] El perfil de lípidos del biodiésel suele ser muy similar al perfil de lípidos del aceite de materia prima. Otros aceites proporcionados por los métodos y composiciones de la invención pueden someterse a transesterificación para producir biodiésel con perfiles lipídicos que incluyen (a) al menos un 1 %-5 %, preferiblemente al menos un 4 % de C8-C14; (b) al menos un 0.25 %-1 %, preferiblemente al menos un 0.3 % de C8; (c) al menos un 1 %-5 %, preferiblemente al menos un 2 % de C10; (d) al menos un 1 %-5 %, preferiblemente al menos un 2 % de C12; y (3) al menos un 20 %-40 %, preferiblemente al menos un 30 % de C8-C14.
[0271] Las composiciones lipídicas se pueden someter a transesterificación para producir ésteres de ácidos grasos de cadena larga útiles como biodiésel. Las reacciones de transesterificación preferidas se describen a continuación e incluyen la transesterificación catalizada por una base y la transesterificación usando lipasas recombinantes. En un proceso de transesterificación catalizado por una base, los triacilglicéridos se hacen reaccionar con un alcohol, por ejemplo, metanol o etanol, en presencia de un catalizador alcalino, típicamente hidróxido de potasio. Esta reacción forma ésteres metílicos o etílicos y glicerina (glicerol) como subproducto.
[0272] Los aceites animales y vegetales están hechos típicamente de triglicéridos que son ésteres de ácidos grasos libres con el alcohol trihídrico, glicerol. En la transesterificación, el glicerol en un triacilglicérido (TAG) se reemplaza con un alcohol de cadena corta como metanol o etanol. Un esquema de reacción típico es el siguiente:
cat. base
----------------------------------------------
Figure imgf000045_0001
3BOIH R, CQOEt R2CQ0Et R3COOEt C3H5(OH)3
Triglicérido Ésteres etílicos de ácidos grasos Glicerol [0273] En esta reacción, el alcohol se desprotona con una base para convertirlo en un nucleófilo más fuerte. Comúnmente, el etanol o el metanol se utilizan en cantidad excesivamente grande (hasta 50 veces superior). Normalmente, esta reacción tendrá un desarrollo excesivamente lento o nulo. Se puede usar calor, así como un ácido o una base para ayudar a que la reacción se desarrolle más rápidamente. El ácido o la base no son consumidos por la reacción de transesterificación, por lo que no son reactivos sino catalizadores. Casi todo el biodiésel se ha producido utilizando la técnica de catalización mediante una base, ya que solo requiere bajas temperaturas y presiones y produce un rendimiento de conversión superior al 98 % (siempre que el aceite de partida tenga poca humedad y ácidos grasos libres).
[0274] También se ha llevado a cabo la transesterificación, tal como se ha comentado anteriormente, usando una enzima, por ejemplo, una lipasa, en lugar de una base. La transesterificación catalizada por lipasa se puede llevar a cabo, por ejemplo, a una temperatura entre la temperatura ambiente y 80 °C y una relación molar del TAG con respecto al alcohol inferior por encima de 1: 1, preferiblemente alrededor de 3: 1. Las lipasas adecuadas para su uso en la transesterificación incluyen, entre otras, las enumeradas en la tabla 9. Otros ejemplos de lipasas útiles para la transesterificación se encuentran en, p. ej., las patentes EE. UU. n.04.798.793; 4.940.845; 5.156.963; 5.342.768; 5.776.741 y WO89/01032. Dichas lipasas incluyen, entre otras, las lipasas producidas por microorganismos de Rhizopus, Aspergillus, Candida, Mucor, Pseudomonas, Rhizomucor, Candida y Humicola y la lipasa del páncreas.
T l . Li r n l r n rifi i n.
Figure imgf000046_0001
(Nagase ChemteX Corporation) y lipasa QLM (Meito Sangyo Co., Ltd., Nagoya, Japón)
[0275] Un desafío al usar una lipasa para la producción de ésteres de ácidos grasos adecuados para biodiésel es que el precio de la lipasa es mucho más alto que el precio del hidróxido de sodio (NaOH) usado por el proceso de base fuerte. Este desafío se ha abordado mediante el uso de una lipasa inmovilizada, que se puede reciclar. Sin embargo, la actividad de la lipasa inmovilizada debe mantenerse después de reciclarse durante un número mínimo de ciclos para permitir que un proceso basado en lipasas compita con el proceso de base fuerte en términos de coste de producción. Las lipasas inmovilizadas están sujetas a envenenamiento por los alcoholes inferiores que se usan típicamente en la transesterificación. La patente EE. UU. n.° 6.398.707 (expedida el 4 de junio de 2002 para Wu et al.) describe métodos para mejorar la actividad de las lipasas inmovilizadas y regenerar las lipasas inmovilizadas que tienen una actividad reducida. Algunos métodos adecuados incluyen sumergir una lipasa inmovilizada en un alcohol que tiene un número de átomos de carbono no menor de 3 durante un periodo de tiempo, preferiblemente de 0.5 a 48 horas, y más preferiblemente de 0.5 a 1.5 horas. Algunos métodos adecuados también incluyen lavar una lipasa inmovilizada desactivada con un alcohol que tiene un número de átomos de carbono no menor de 3 y luego sumergir la lipasa inmovilizada desactivada en un aceite vegetal durante 0.5-48 horas.
[0276] En realizaciones particulares, una lipasa recombinante se expresa en los mismos microorganismos que producen el lípido sobre el que actúa la lipasa. Las lipasas recombinantes adecuadas incluyen las enumeradas anteriormente en la tabla 9 y/o que tienen los números de acceso de GenBank enumerados anteriormente en la tabla 9 o un polipéptido que tiene al menos un 70 % de identidad de aminoácidos con una de las lipasas enumeradas anteriormente en la tabla 9 y que presenta actividad de lipasa. En realizaciones adicionales, la actividad enzimática está presente en una secuencia que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % de identidad con una de las secuencias descritas anteriormente. El ADN que codifica la lipasa y el marcador seleccionable es preferiblemente ADNc con codones optimizados. Los métodos de recodificación de genes para la expresión en microalgas se describen en la patente EE. UU. 7.135.290.
[0277] La norma internacional común para biodiésel es EN 14214. ASTM D6751 es la norma de biodiesel más común referenciada en los Estados Unidos y Canadá. Alemania usa la DIN EN 14214 y el Reino Unido requiere el cumplimiento de la BS EN 14214. Las pruebas industriales básicas para determinar si los productos cumplen con estas normas incluyen típicamente cromatografía de gases, HPLC y otras. El biodiésel que cumple con los estándares de calidad es no tóxico, con una clasificación de toxicidad (LD50) de más de 50 ml/kg.
[0278] Aunque el biodiésel que cumple con las normas ASTM tiene que ser no tóxico, puede haber contaminantes que tienden a cristalizar y/o precipitar y caer de la solución en forma de sedimento. La formación de sedimentos es un problema especialmente cuando se usa biodiésel a temperaturas más bajas. Los sedimentos o precipitados pueden causar problemas como la disminución del flujo de combustible, la obstrucción de las líneas de combustible, la obstrucción de los filtros, etc. Son bien conocidos en la técnica los procesos que gestionan específicamente la eliminación de estos contaminantes y sedimentos en biodiésel para producir un producto de una calidad superior. Los ejemplos de dichos procesos incluyen, entre otros, el pretratamiento del aceite para eliminar contaminantes tales como fosfolípidos y ácidos grasos libres (por ejemplo, desgomado, refinado cáustico y filtración con adsorbente de sílice) y la filtración en frío. La filtración en frío es un proceso que se desarrolló específicamente para eliminar las partículas y sedimentos que están presentes en el biodiésel después de la producción. Este proceso enfría el biodiésel y filtra los sedimentos o precipitados que podrían formarse cuando el combustible se usa a una temperatura más baja. Dicho proceso es bien conocido en la técnica y se describe en la publicación de solicitud de patente EE. UU. n.° 2007-b0175091. Los métodos adecuados pueden incluir enfriar el biodiésel a una temperatura inferior a 38 °C para que las impurezas y contaminantes se precipiten como partículas en el líquido del biodiésel. Luego, se puede agregar tierra de diatomeas u otro material de filtrado al biodiésel enfriado para formar una suspensión, que luego se puede filtrar a través de una hoja de presión u otro tipo de filtro para eliminar las partículas. El biodiésel filtrado se puede hacer pasar a través de un filtro de pulido para eliminar los sedimentos restantes y la tierra de diatomeas, a fin de producir el producto de biodiésel final.
[0279] El ejemplo 13 describe la producción de biodiésel utilizando aceite de triglicéridos de Prototheca moriformis. La filtrabilidad de impregnado en frío por el método ASTM D6751 A1 del biodiésel producido en el ejemplo 13 fue de 120 segundos para un volumen de 300 ml. Esta prueba implica la filtración de 300 ml de B100, se enfría a 4.4 °C (40 °F) durante 16 horas, se deja calentar hasta la temperatura ambiente y se filtra al vacío utilizando un filtro de fibra de vidrio de 0.7 micras con soporte de acero inoxidable. Los aceites tal como se describen en el presente documento se pueden transesterificar para generar biodiésel con un tiempo de impregnado en frío de menos de 120 segundos, menos de 100 segundos y menos de 90 segundos.
[0280] También se pueden utilizar procesos posteriores si el biodiésel se va a utilizar en temperaturas particularmente frías. Dichos procesos incluyen la preparación para el invierno y el fraccionamiento. Ambos procesos están diseñados para mejorar el flujo en frío y el rendimiento invernal del combustible al reducir el punto de enturbiamiento (la temperatura a la que el biodiésel comienza a cristalizar). Hay varios enfoques para preparar el biodiésel para el invierno. Un enfoque consiste en mezclar el biodiésel con diésel de petróleo. Otro enfoque consiste en utilizar aditivos que puedan reducir el punto de enturbiamiento del biodiésel. Otro enfoque es eliminar los ésteres metílicos saturados de forma indiscriminada mezclando aditivos y permitiendo la cristalización de los saturados y luego filtrando los cristales. El fraccionamiento separa selectivamente los ésteres metílicos en componentes o fracciones individuales, lo que permite la eliminación o inclusión de ésteres metílicos específicos. Los métodos de fraccionamiento incluyen el fraccionamiento con urea, el fraccionamiento con disolventes y la destilación térmica.
[0281] Otro combustible valioso proporcionado por los métodos descritos en el presente documento es el diésel renovable que comprende alcanos, tales como C10: 0, C12: 0, C14: 0, C16: 0 y C18: 0, y por lo tanto es distinguible del biodiésel. El diésel renovable de alta calidad cumple con la norma ASTM D975. Los lípidos producidos por los métodos descritos en este documento pueden servir como materia prima para producir diésel renovable. De este modo, en otro aspecto, se proporciona un método para producir diésel renovable. El diésel renovable se puede producir mediante al menos tres procesos: procesamiento hidrotermal (hidrotratamiento); hidroprocesamiento; y licuefacción indirecta. Estos procesos producen destilados sin ésteres. Durante estos procesos, los triacilglicéridos producidos y aislados tal como se describe en el presente documento se convierten en alcanos.
[0282] En una realización, el método para producir diésel renovable comprende (a) cultivar un microorganismo que contiene lípidos usando los métodos descritos en este documento (b) lisar el microorganismo para producir un lisado, (c) aislar el lípido del microorganismo lisado y (d) desoxigenar y hidrotratar el lípido para producir un alcano, mediante el cual se produce diésel renovable. Los lípidos adecuados para la fabricación de diésel renovable se pueden obtener mediante extracción de biomasa microbiana utilizando un disolvente orgánico como el hexano, o mediante otros métodos, como los descritos en la patente EE. UU 5.928.696. Algunos métodos adecuados pueden incluir el prensado mecánico y el centrifugado.
[0283] En algunos métodos, el lípido microbiano primero se rompe en conjunción con el hidrotratamiento para reducir la longitud de la cadena de carbono y saturar los dobles enlaces, respectivamente. A continuación, el material se isomeriza, también en conjunción con el hidrotratamiento. Luego, la fracción nafta se puede eliminar mediante destilación, seguida de una destilación adicional para vaporizar y destilar los componentes deseados en el combustible diésel para cumplir con la norma ASTM D975, dejando componentes que son más pesados de lo deseado para cumplir con la norma D975. Los métodos de hidrotratamiento, hidrocraqueo, desoxigenación e isomerización de aceites de modificación química, incluyendo los aceites de triglicéridos, son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, solicitudes de patente europea EP1741768 (A1); EP1741767 (A1); EP1682466 (A1); EP1640437 (A1); EP1681337 (A1); EP1795576 (A1); y las patentes EE. UU. 7.238.277; 6.630.066; 6.596.155; 6.977.322; 7.041.866; 6.217.746; 5.885.440; 6.881.873.
[0284] En una realización del método para producir diésel renovable, el tratamiento del lípido para producir un alcano se realiza mediante hidrotratamiento de la composición lipídica. En el procesamiento hidrotermal, típicamente, la biomasa se hace reaccionar en agua a una temperatura y presión elevadas para formar aceites y sólidos residuales. Las temperaturas de conversión son típicamente de 149 ° a 316 °C (300 ° a 660 °F), con una presión suficiente para mantener el agua principalmente como un líquido, de 100 a 170 atmósferas (atm) estándar. Los tiempos de reacción son del orden de 15 a 30 minutos. Una vez completada la reacción, los orgánicos se separan del agua. De ese modo se produce un destilado adecuado para el diésel.
[0285] En algunos métodos de fabricación de diésel renovable, el primer paso del tratamiento de un triglicérido es el hidroprocesamiento para saturar los dobles enlaces, seguido de la desoxigenación a temperatura elevada en presencia de hidrógeno y un catalizador. En algunos métodos, la hidrogenación y la desoxigenación ocurren en la misma reacción. En otros métodos, la desoxigenación ocurre antes de la hidrogenación. A continuación, se realiza opcionalmente la isomerización, también en presencia de hidrógeno y un catalizador. Los componentes de nafta se eliminan preferiblemente mediante destilación. Para obtener ejemplos, consulte las patentes EE. UU.
5.475.160 (hidrogenación de triglicéridos); 5.091.116 (desoxigenación, hidrogenación y eliminación de gases); 6.391.815 (hidrogenación); y 5.888.947 (isomerización).
[0286] Un método adecuado para la hidrogenación de triglicéridos incluye preparar una solución acuosa de sales de cobre, zinc, magnesio y lantano y otra solución de metal alcalino o preferiblemente, carbonato de amonio. Las dos soluciones se pueden calentar a una temperatura de 20 °C a 85 °C y dosificar juntas en un recipiente de precipitación a velocidades tales que el pH en el recipiente de precipitación se mantenga entre 5.5 y 7.5 para formar un catalizador. Puede usarse agua adicional inicialmente en el recipiente de precipitación o añadirse simultáneamente con la solución salina y la solución de precipitación. El precipitado resultante se puede lavar a fondo, secar, calcinar a aproximadamente 300 °C y activar en hidrógeno a temperaturas que varían entre 100 °C y 400 °C. A continuación, se pueden poner en contacto y hacer reaccionar uno o varios triglicéridos con hidrógeno en presencia del catalizador descrito anteriormente en un reactor. El reactor puede ser un reactor de lecho percolador, un reactor de gas-sólido de lecho fijo, un reactor de columna de burbujeo empaquetado, un reactor de tanque con agitación continua, un reactor de fase de suspensión o cualquier otro tipo de reactor adecuado conocido en la técnica. El proceso puede llevarse a cabo por lotes o de forma continua. Las temperaturas de reacción están típicamente en el rango de 170 °C a 250 °C mientras que las presiones de reacción están típicamente en el rango de 300 psig a 2000 psig. Además, la relación molar del hidrógeno con respecto al triglicérido en el proceso está típicamente en el rango de 20: 1 a 700: 1. El proceso se lleva a cabo típicamente a una velocidad espacial horaria en peso (WHSV) en el rango de 0.1 h-1 a 5 h-1. Un experto en la técnica reconocerá que el periodo de tiempo requerido para la reacción variará según la temperatura utilizada, la relación molar del hidrógeno con respecto al triglicérido y la presión parcial del hidrógeno. Los productos generados por tales procesos de hidrogenación incluyen alcoholes grasos, glicerol, trazas de parafinas y triglicéridos sin reaccionar. Estos productos se separan típicamente por medios convencionales tales como, por ejemplo, destilación, extracción, filtración, cristalización y similares.
[0287] Las refinerías de petróleo utilizan el hidroprocesamiento para eliminar las impurezas tratando el hidrógeno entrante. Las temperaturas de conversión del hidroprocesamiento son típicamente de 149 ° a 371 °C (300 ° a 700 °F). Las presiones son típicamente de 40 a 100 atm. Los tiempos de reacción son típicamente del orden de 10 a 60 minutos. Los catalizadores sólidos se emplean para aumentar ciertas velocidades de reacción, mejorar la selectividad para ciertos productos y optimizar el consumo de hidrógeno.
[0288] Los métodos adecuados para la desoxigenación de un aceite incluyen calentar un aceite a una temperatura en el rango de 177 ° a 288 °C (350 °F a 550 °F) y poner en contacto continuamente el aceite calentado con nitrógeno bajo al menos una presión que varía de aproximadamente la presión atmosférica a presiones superiores durante al menos 5 minutos.
[0289] Los métodos adecuados para la isomerización incluyen el uso de isomerización alcalina y otra isomerización de aceite conocida en la técnica.
[0290] El hidrotratamiento y el hidroprocesamiento conducen finalmente a una reducción del peso molecular del triglicérido entrante. La molécula de triglicérido se reduce a cuatro moléculas de hidrocarburo en condiciones de hidroprocesamiento: una molécula de propano y tres moléculas de hidrocarburo más pesadas, típicamente en el rango de C8 a C18.
[0291] Por tanto, en una realización, el producto de una o varias reacciones químicas realizadas en las composiciones lipídicas descritas en el presente documento es una mezcla de alcanos que comprende el diésel renovable ASTM D975. La producción de hidrocarburos por parte microorganismos ha sido revisada por Metzger et al. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66: 486-496 y A Look Back at the U.S.Department of Energy’ s Aquatic Species Program : Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann y Paul Roessler (1998).
[0292] Las propiedades de destilación de un combustible diésel se describen en términos de T10-T90 (temperatura al 10 % y al 90 %, respectivamente, de volumen destilado). El diésel renovable se produjo a partir del aceite de triglicéridos de Prototheca moriformis y se describe en el ejemplo 13. La T10-T90 del material producido en el ejemplo 13 era 57.9 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos en el presente documento, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos en el presente documento, pueden emplearse para generar composiciones diésel renovables con otros rangos T10-T90, por ejemplo, de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 y 65 °C usando aceites de triglicéridos producidos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento.
[0293] La T10 del material producido en el ejemplo 13 fue 242.1 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos en el presente documento, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos en el presente documento, pueden emplearse para generar composiciones diésel renovables con otros valores de T10, por ejemplo, una T10 entre 180 y 295 , entre 190 y 270, entre 210 y 250, entre 225 y 245 y al menos 290.
[0294] La T10 del material producido en el ejemplo 13 fue 300 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos en el presente documento, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos en el presente documento, pueden emplearse para generar composiciones diésel renovables con otros valores de T90, por ejemplo, una T90 entre 280 y 380, entre 290 y 360, entre 300 y 350, entre 310 y 340 y al menos 290.
[0295] El FBP del material producido en el ejemplo 13 fue 300 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos en el presente documento, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos en el presente documento, pueden emplearse para generar composiciones diésel renovables con otros valores del FBP, por ejemplo, un FBP entre 290 y 400, entre 300 y 385, entre 310 y 370, entre 315 y 360 y al menos 300.
[0296] Otros aceites proporcionados por los métodos y composiciones descritos en este documento pueden someterse a combinaciones de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes que incluyen aceites con perfiles lipídicos que incluyen (a) al menos un 1 %-5 %, preferiblemente al menos un 4 % de C8-C14; (b) al menos un de 0.25 %-1 %, preferiblemente al menos un 0.3 % de C8; (c) al menos 1 %-5 %, preferiblemente al menos un 2 % de C10; (d) al menos un 1 %-5 %, preferiblemente al menos un 2 % de C12; y (3) al menos un 20 %-40 %, preferiblemente al menos un 30 % de C8-C14.
[0297] Se puede producir un diésel tradicional ultrabajo en azufre a partir de cualquier forma de biomasa mediante un proceso de dos pasos. Primero, la biomasa se convierte en gas de síntesis, una mezcla gaseosa rica en hidrógeno y monóxido de carbono. Luego, el gas de síntesis se convierte catalíticamente en líquidos. Normalmente, la producción de líquidos se logra mediante la síntesis Fischer-Tropsch (FT). Esta tecnología se aplica al carbón, el gas natural y los petróleos pesados. Por tanto, en otra realización preferida del método para producir diésel renovable, el tratamiento de la composición lipídica para producir un alcano se realiza mediante licuefacción indirecta de la composición lipídica.
[0298] También se describen métodos para producir combustible para aviones. El combustible para aviones es de color claro a pajizo. El combustible más común es un combustible sin plomo/con base de aceite de parafina clasificado como Avión A-1, que se produce según un conjunto de especificaciones estandarizadas internacionalmente. El combustible para aviones es una mezcla de una gran cantidad de hidrocarburos diferentes, posiblemente hasta mil o más. El rango de sus tamaños (pesos moleculares o número de carbonos) está restringido por los requisitos del producto, por ejemplo, el punto de congelación o el punto de humo. El combustible para aviones de tipo queroseno (incluyendo Jet A y Jet A-1) tiene una distribución del número de carbonos entre 8 y 16 carbonos. El combustible para aviones de alta volatilidad o tipo nafta (incluyendo el Jet B) generalmente tiene una distribución del número de carbonos de entre 5 y 15 carbonos.
[0299] Ambos aviones (Jet A y Jet B) pueden contener varios aditivos. Los aditivos útiles incluyen, entre otros, antioxidantes, agentes antiestáticos, inhibidores de corrosión y agentes inhibidores de la formación de hielo en el sistema de combustible (FSII). Los antioxidantes evitan el engomado y, por lo general, se basan en fenoles alquilados, por ejemplo, AO-30, AO-31 o AO-37. Los agentes antiestáticos disipan la electricidad estática y evitan las chispas. El Stadis 450, con ácido dinonilnaftilsulfónico (DINNSA) como ingrediente activo, es un ejemplo. Inhibidores de la corrosión, p. ej., el DCI-4A se utiliza para combustibles civiles y militares y el DCI-6A se utiliza para combustibles militares. Los agentes FSII incluyen, por ejemplo, Di-EGME.
[0300] En una realización, se produce un combustible para aviones mezclando combustibles de algas con combustible para aviones existente. Los lípidos producidos por los métodos de la presente invención pueden servir como materia prima para producir combustible para aviones. Por tanto, en otro aspecto, se proporciona un método para producir combustible para aviones. A continuación se proporcionan dos métodos para producir combustible para aviones a partir de los lípidos producidos por los métodos descritos en el presente documento: craqueo catalítico fluido (FCC); e hidrodesoxigenación (HDO).
[0301] El craqueo catalítico fluido (FCC) es un método que se utiliza para producir olefinas, especialmente propileno, a partir de fracciones pesadas de crudo. Los lípidos producidos por el método descrito en el presente documento se pueden convertir en olefinas. El proceso implica hacer fluir los lípidos producidos a través de una zona de FCC y recolectar una corriente de producto compuesta de olefinas, que es útil como combustible para aviones. Los lípidos producidos se ponen en contacto con un catalizador de craqueo en condiciones de craqueo para proporcionar una corriente de producto que comprende olefinas e hidrocarburos útiles como combustible para aviones.
[0302] En una realización, el método para producir combustible para aviones comprende (a) cultivar un microorganismo que contiene lípidos usando los métodos descritos en el presente documento, (b) lisar el microorganismo que contiene lípidos para producir un lisado, (c) aislar los lípidos del lisado y (d) tratar la composición de lípidos, de lo cual se produce combustible para aviones. En una realización del método para producir un combustible para aviones, la composición lipídica se puede hacer fluir a través de una zona fluida de craqueo catalítico que, en una realización, puede comprender poner en contacto la composición lipídica con un catalizador de craqueo en condiciones de craqueo para proporcionar una corriente de producto que comprende olefinas de C2-C5.
[0303] En ciertas realizaciones de este método, puede ser deseable eliminar cualquier contaminante que pueda estar presente en la composición lipídica. Por tanto, antes de hacer fluir la composición de lípidos a través de una zona fluida de craqueo catalítico, se trata previamente la composición de lípidos. El pretratamiento puede implicar poner en contacto la composición lipídica con una resina de intercambio iónico. La resina de intercambio iónico es una resina de intercambio iónico ácida, como Amberlyst™-15 y se puede usar como lecho en un reactor a través del cual fluye la composición de lípidos, ya sea corriente arriba o corriente abajo. Otros pretratamientos pueden incluir lavados ácidos suaves poniendo en contacto la composición lipídica con un ácido, como ácido sulfúrico, acético, nítrico o clorhídrico. El contacto se realiza con una solución ácida diluida generalmente a temperatura ambiente y presión atmosférica.
[0304] La composición de lípidos, opcionalmente pretratada, se hace fluir a una zona de FCC donde los componentes hidrocarbonados se craquean en olefinas. El craqueo catalítico se logra poniendo en contacto la composición lipídica en una zona de reacción con un catalizador compuesto de material particulado finamente dividido. La reacción es un craqueo catalítico, en contraposición al hidrocraqueo, y se lleva a cabo en ausencia de hidrógeno añadido o consumo de hidrógeno. A medida que avanza la reacción de craqueo, se depositan cantidades sustanciales de coque sobre el catalizador. El catalizador se regenera a altas temperaturas quemando coque del catalizador en una zona de regeneración. El catalizador que contiene coque, denominado en el presente documento "catalizador coquificado", se transporta de manera continuada desde la zona de reacción a la zona de regeneración para ser regenerado y reemplazado por un catalizador regenerado esencialmente libre de coque desde la zona de regeneración. La fluidización de las partículas de catalizador por diversas corrientes gaseosas permite el transporte de catalizador entre la zona de reacción y la zona de regeneración. Los métodos para craquear hidrocarburos, tales como los de la composición lipídica descrita en el presente documento, en una corriente fluidizada de catalizador, para transportar el catalizador entre las zonas de reacción y regeneración y para quemar coque en el regenerador son bien conocidos por los expertos en la técnica de los procesos FCC. Ejemplos de aplicaciones de FCC y catalizadores útiles para romper la composición de lípidos para producir olefinas C2-C5 se describen en las patentes EE. UU. n.° 6.538.169, 7.288.685.
[0305] Los catalizadores de FCC adecuados generalmente comprenden al menos dos componentes que pueden estar o no en la misma matriz. En algunas realizaciones, ambos componentes pueden circular por todo el recipiente de reacción. El primer componente generalmente incluye cualquiera de los catalizadores bien conocidos que se usan en la técnica del craqueo catalítico fluido, por ejemplo, un catalizador activo de tipo arcilla amorfa y/o un tamiz molecular cristalino de alta actividad. Los catalizadores de tamiz molecular pueden preferirse a los catalizadores amorfos debido a su selectividad muy mejorada para los productos deseados. En algunas realizaciones preferidas, se pueden usar zeolitas como tamiz molecular en los procesos de FCC. Preferiblemente, el primer componente catalizador comprende una zeolita de poros grandes, por ejemplo, una zeolita de tipo Y, un material de alúmina activa, un material aglutinante, que comprende sílice o alúmina y una carga inerte como el caolín.
[0306] En una realización, el craqueo de la composición lipídica descrita en el presente documento tiene lugar en la sección de subida o en la sección de elevación de la zona de FCC. La composición de lípidos se introduce en el tubo ascendente mediante una boquilla, lo que da como resultado la vaporización rápida de la composición de lípidos. Antes de entrar en contacto con el catalizador, la composición de lípidos normalmente tendrá una temperatura de 149 °C a 316 °C (de 300 °F a 600 °F). El catalizador se hace fluir desde un recipiente de mezcla hasta el tubo ascendente donde entra en contacto con la composición de lípidos durante un tiempo de 2 segundos o menos.
[0307] El catalizador mezclado y los vapores de la composición de lípidos reaccionados se descargan luego desde la parte superior del tubo ascendente a través de una salida y se separan en una corriente de vapor del producto craqueado que incluye olefinas y una colección de partículas de catalizador cubiertas con cantidades sustanciales de coque y generalmente denominadas "catalizador coquificado". En un esfuerzo por minimizar el tiempo de contacto de la composición de lípidos y el catalizador, que puede promover una mayor conversión de los productos deseados en otros productos indeseables, se puede usar cualquier disposición de separadores, por ejemplo, una disposición de brazo giratorio, para eliminar rápidamente el catalizador coquizado de la corriente de producto. . El separador, p. ej., un separador de brazo giratorio está ubicado en la parte superior de una cámara con una zona de extracción situada en la parte inferior de la cámara. El catalizador separado por la disposición del brazo giratorio cae a la zona de extracción. La corriente de vapor del producto craqueado que comprende hidrocarburos craqueados que incluyen olefinas ligeras y algo de catalizador sale de la cámara a través de un conducto que se comunica con ciclones. Los ciclones eliminan las partículas de catalizador restantes de la corriente de vapor del producto para reducir las concentraciones de partículas a niveles muy bajos. La corriente de vapor del producto sale luego por la parte superior del recipiente de separación. El catalizador separado por los ciclones se devuelve al recipiente de separación y luego a la zona de decapado. La zona de extracción elimina los hidrocarburos adsorbidos de la superficie del catalizador mediante el contacto a contracorriente con el vapor.
[0308] La baja presión parcial de hidrocarburos actúa para favorecer la producción de olefinas ligeras. En consecuencia, la presión del tubo ascendente se establece en 172 a 241 kPa (25 a 35 psia) con una presión parcial de hidrocarburos de 35 a 172 kPa (5 a 25 psia), con una presión parcial de hidrocarburos preferida de 69 a 138 kPa (10 a 20 psia). Esta presión parcial relativamente baja para el hidrocarburo se logra usando vapor como diluyente en la medida en que el diluyente sea del 10 al 55 % en peso de la composición de lípidos y preferiblemente aproximadamente del 15 % en peso de la composición de lípidos. Se pueden usar otros diluyentes, como gas seco, para alcanzar presiones parciales de hidrocarburos equivalentes.
[0309] La temperatura de la corriente craqueada en la salida del tubo ascendente será de 510 °C a 621 °C (de 950 °F a 1150 °F). Sin embargo, las temperaturas de salida del tubo ascendente superiores a 566 °C (1050 °F) producen más gas seco y más olefinas. Mientras que las temperaturas de salida del tubo ascendente por debajo de 566 °C (1050 °F) producen menos etileno y propileno. Por consiguiente, se prefiere ejecutar el proceso de FCC a una temperatura preferida de 566 °C a 630 °C, presión preferida de 138 kPa a 240 kPa (20 a 35 psia). Otra condición para el proceso es la proporción de composición de catalizador con respecto a lípido que puede variar de 5 a 20 y preferiblemente de 10 a 15.
[0310] En una realización del método para producir un combustible para aviones, la composición lipídica se introduce en la sección de elevación de un reactor FCC. La temperatura en la sección de elevación será muy alta y variará de 700 °C (1292 °F) a 760 °C (1400 °F) con una proporción de composición de catalizador con respecto a lípido de 100 a 150. Se prevé que la introducción de la composición de lípidos en la sección de elevación producirá cantidades considerables de propileno y etileno.
[0311] En otra realización del método para producir un combustible para aviones usando la composición lipídica o los lípidos producidos como se describe en el presente documento, la estructura de la composición lipídica o los lípidos se rompe mediante un proceso denominado hidrodesoxigenación (HDO). HDO significa la eliminación de oxígeno mediante hidrógeno, es decir, el oxígeno se elimina mientras se rompe la estructura del material. Los dobles enlaces olefínicos se hidrogenan y se eliminan los compuestos de azufre y nitrógeno. La eliminación de azufre se llama hidrodesulfuración (HDS). El pretratamiento y la pureza de las materias primas (la composición lipídica o los lípidos) contribuyen a la vida útil del catalizador.
[0312] Generalmente, en la etapa HDO/HDS, el hidrógeno se mezcla con la materia prima (la composición lipídica o los lípidos) y luego la mezcla se hace pasar a través de un lecho de catalizador como un flujo en paralelo, ya sea como materia prima monofásica o bifásica. . Después de la etapa de HDO/MDS, la fracción de producto se separa y se pasa a un reactor de isomerización separado. Un reactor de isomerización para material de partida biológico se describe en la literatura (FI 100248) como un reactor en paralelo.
[0313] El proceso para producir un combustible hidrogenando hidrocarburos entrantes, p. ej., la composición de lípidos o los lípidos en el presente documento, también se puede realizar pasando la composición de lípidos o los lípidos como un flujo en paralelo con hidrógeno gaseoso a través de una primera zona de hidrogenación y, a continuación, el efluente de hidrocarburo se hidrogena adicionalmente en una segunda zona de hidrogenación pasando hidrógeno gaseoso a la segunda zona de hidrogenación como un flujo de contracorriente con respecto al efluente de hidrocarburo. Ejemplos de aplicaciones de HDO y catalizadores útiles para romper la composición de lípidos para producir olefinas C2-C5 se describen en la patente EE. UU. n.° 7.232.935.
[0314] Normalmente, en la etapa de hidrodesoxigenación, se descompone la estructura del componente biológico, por ejemplo, la composición lipídica o los lípidos del presente documento, se eliminan los compuestos de oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre y los hidrocarburos ligeros como gas, y se hidrogenan los enlaces olefínicos. En la segunda etapa del proceso, es decir, en el llamado paso de isomerización, se lleva a cabo la isomerización para ramificar la cadena de hidrocarburos y mejorar el rendimiento de la parafina a bajas temperaturas.
[0315] En la primera etapa, es decir, la etapa de HDO, del proceso de craqueo, el hidrógeno gaseoso y la composición lipídica o los lípidos de la presente invención que se van a hidrogenar se pasan a un sistema de lecho de catalizador de HDO ya sea como flujos en paralelo o en contracorriente, donde dicho sistema de lecho de catalizador comprende uno o varios lechos de catalizador, preferiblemente 1-3 lechos de catalizador. La etapa HDO se opera típicamente en paralelo. En el caso de un sistema de lecho de catalizador HDO que comprende dos o más lechos de catalizador, uno o varios de los lechos pueden funcionar usando el principio de flujo en contracorriente. En la etapa de HDO, la presión varía entre 20 y 150 bar, preferiblemente entre 50 y 100 bar, y la temperatura varía entre 200 y 500 °C, preferiblemente en el rango de 300-400 °C. En la etapa de HDO, pueden usarse catalizadores de hidrogenación conocidos que contienen metales del grupo VII y/o VIB del sistema periódico. Preferiblemente, los catalizadores de hidrogenación son catalizadores de Pd, Pt, Ni, NiMo o CoMo con soporte, siendo el soporte alúmina y/o sílice. Normalmente, se utilizan los catalizadores NiMo/A^Oa y CoMo/Al2O3.
[0316] Antes de la etapa de HDO, la composición lipídica o los lípidos del presente documento pueden tratarse opcionalmente mediante prehidrogenación en condiciones más suaves evitando así reacciones secundarias de los dobles enlaces. Dicha prehidrogenación se lleva a cabo en presencia de un catalizador de prehidrogenación a temperaturas de 50-400 °C y a presiones de hidrógeno de 1-200 bar, preferiblemente a una temperatura entre 150 y 250 °C y a una presión de hidrógeno entre 10 y 100 bar. . El catalizador puede contener metales del grupo VIII y/o VIB del sistema periódico. Preferiblemente, el catalizador de prehidrogenación es un catalizador de Pd, Pt, Ni, NiMo o CoMo con soporte, siendo el soporte alúmina y/o sílice.
[0317] Se enfría una corriente gaseosa de la etapa de HDO que contiene hidrógeno y luego se eliminan de ella monóxido de carbono, dióxido de carbono, nitrógeno, compuestos de fósforo y azufre, hidrocarburos ligeros gaseosos y otras impurezas. Después de la compresión, el hidrógeno purificado o reciclado se devuelve al primer lecho de catalizador y/o entre los lechos de catalizador para compensar la corriente de gas extraída. El agua se elimina del líquido condensado. El líquido se hace pasar al primer lecho de catalizador o entre los lechos de catalizador.
[0318] Después de la etapa de HDO, el producto se somete a una etapa de isomerización. Es importante para el proceso que las impurezas se eliminen lo más completamente posible antes de que los hidrocarburos entren en contacto con el catalizador de isomerización. La etapa de isomerización comprende una etapa de extracción opcional, en la que el producto de reacción de la etapa de HDO puede purificarse mediante extracción de nitrógeno o hidrógeno con vapor de agua o un gas adecuado, por ejemplo, un hidrocarburo ligero. La etapa de extracción opcional se lleva a cabo en contracorriente en una unidad aguas arriba del catalizador de isomerización, en la que el gas y el líquido se ponen en contacto entre sí, o antes del reactor de isomerización real en una unidad de extracción separada utilizando el principio de contracorriente.
[0319] Después de la etapa de separación, el hidrógeno gaseoso y la composición de lípidos hidrogenados o los lípidos del presente documento, y opcionalmente una mezcla de n-parafina, se pasan a una unidad de isomerización reactiva que comprende uno o varios lechos de catalizador. Los lechos de catalizador de la etapa de isomerización pueden funcionar en paralelo o en contracorriente.
[0320] Es importante para el proceso que se aplique el principio de flujo en contracorriente en la etapa de isomerización. En la etapa de isomerización, esto se realiza llevando a cabo, o bien la etapa de extracción opcional, o bien la etapa de reacción de isomerización o ambas en contracorriente. En la etapa de isomerización, la presión varía en el rango de 20-150 bar, preferiblemente en el rango de 20-100 bar, con la temperatura entre 200 y 500 °C, preferiblemente entre 300 y 400 °C. En la etapa de isomerización, se pueden usar catalizadores de isomerización conocidos en la técnica. Los catalizadores de isomerización adecuados contienen un tamiz molecular y/o un metal del grupo VII y/o un portador. Preferiblemente, el catalizador de isomerización contiene SAPO-11 o SAPO41 o ZSM-22 o ZSM-23 o ferrierita y Pt, Pd o Ni y A^O3 o SiO2. Los catalizadores de isomerización típicos son, por ejemplo, Pt/SAPO-11/Al2O3, Pt/ZSM-22/Al2O3, Pt/ZSM-23/Al2O3 y Pt/SAPO-11/SiO2. La etapa de isomerización y la etapa de HDO se pueden llevar a cabo en el mismo recipiente a presión o en recipientes a presión separados. La prehidrogenación opcional se puede llevar a cabo en un recipiente a presión separado o en el mismo recipiente a presión que el HDO y las etapas de isomerización.
[0321] Por tanto, en una realización, el producto de una o varias reacciones químicas es una mezcla de alcanos que comprende HRJ-5. En otra realización, el producto de una o varias reacciones químicas es una mezcla de alcanos que comprende combustible para aviones ASTM D1655. En algunas realizaciones, la composición que se ajusta a la especificación de combustible para aviones ASTM 1655 tiene un contenido de azufre inferior a 10 ppm. En otras realizaciones, la composición que se ajusta a la especificación de combustible para aviones ASTM 1655 tiene un valor T10 de la curva de destilación de menos de 205 °C..En otra realización, la composición que se ajusta a la especificación de combustible para aviones ASTM 1655 tiene un punto final de ebullición (FBP) de menos de 300 °C. En otra realización, la composición que se ajusta a la especificación de combustible para aviones ASTM 1655 tiene un punto de inflamación de al menos 38 °C. En otra realización, la composición que se ajusta a la especificación de combustible para aviones ASTM 1655 tiene una densidad entre 775K/M3 y 840K/M3. En otra realización más, la composición que se ajusta a la especificación de combustible para aviones ASTM 1655 tiene un punto de congelación que está por debajo de -47 °C. En otra realización, la composición que se ajusta a la especificación de combustible para aviones ASTM 1655 tiene un calor de combustión neto de al menos 42.8 MJ/K. En otra realización, la composición que se ajusta a la especificación de combustible para aviones ASTM 1655 tiene un contenido de hidrógeno que es al menos del 13.4 % en masa. En otra realización, la composición que se ajusta a la especificación de combustible para aviones ASTM 1655 tiene una estabilidad térmica, según se ha comprobado mediante JFTOT gravimétrico cuantitativo a 260 °C, que está por debajo de 3 mmHg. En otra realización, la composición que se ajusta a la especificación de combustible para aviones ASTM 1655 tiene una goma existente por debajo de 7 mg/dl.
[0322] Por tanto, la presente divulgación describe una variedad de métodos en los que se emprende la modificación química de lípidos de microalgas para producir productos útiles en una variedad de aplicaciones industriales y de otro tipo. Los ejemplos de procesos para modificar aceite producido por los métodos descritos en el presente documento incluyen, entre otros, la hidrólisis del aceite, el hidroprocesamiento del aceite y la esterificación del aceite. Otras modificaciones químicas de lípidos de microalgas incluyen, entre otras, epoxidación, oxidación, hidrólisis, sulfatación, sulfonación, etoxilación, propoxilación, amidación y saponificación. La modificación del aceite de microalgas produce oleoquímicos básicos que pueden modificarse aún más para dar oleoquímicos derivados seleccionados para una función deseada. De una manera similar a la descrita anteriormente en referencia a los procesos de producción de combustible, estas modificaciones químicas también se pueden realizar en aceites generados a partir de los cultivos microbianos descritos en el presente documento. Los ejemplos de oleoquímicos básicos incluyen, entre otros, jabones, ácidos grasos, ésteres grasos, alcoholes grasos, compuestos de nitrógeno graso, ésteres metílicos de ácidos grasos y glicerol. Ejemplos de derivados oleoquímicos incluyen, entre otros, nitrilos grasos, ésteres, ácidos diméricos, quats, surfactantes, alcanolamidas grasas, sulfatos de alcoholes grasos, resinas, emulsionantes, alcoholes grasos, olefinas, lodos de perforación, polioles, poliuretanos, poliacrilatos, caucho, velas, cosméticos, jabones metálicos, jabones, ésteres metílicos alfa-sulfonados, sulfatos de alcoholes grasos, alcoholes grasos etoxilados, éter sulfatos de alcoholes grasos, imidazolinas, surfactantes, detergentes, ésteres, quats, productos de ozonólisis, aminas grasas, alcanolamidas grasas, etoxisulfatos, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos (incluyendo los triglicéridos de cadena media), lubricantes, fluidos hidráulicos, grasas, fluidos dieléctricos, agentes de desmoldeo, fluidos para el trabajo de metales, fluidos de transferencia de calor, otros fluidos funcionales, productos químicos industriales (por ejemplo, limpiadores, coadyuvantes de procesamiento textil, plastificantes, estabilizadores, aditivos), revestimientos superficiales, pinturas y lacas, aislamiento de cableado eléctrico y alcanos superiores.
[0323] La hidrólisis de los constituyentes de ácidos grasos a partir de los glicerolípidos producidos por los métodos descritos en el presente documento produce ácidos grasos libres que pueden derivatizarse para producir otros productos químicos útiles. La hidrólisis se produce en presencia de agua y un catalizador que puede ser un ácido o una base. Los ácidos grasos libres liberados pueden derivatizarse para producir una variedad de productos, tal como se explica en las siguientes patentes EE. UU. n.° 5.304.664 (ácidos grasos altamente sulfatados); 7.262.158 (composiciones de limpieza); 7.115.173 (composiciones suavizantes de telas); 6.342.208 (emulsiones para el tratamiento de la piel); 7.264.886 (composiciones repelentes de agua); 6.924.333 (aditivos para pinturas); 6.596.768 (pienso para rumiantes enriquecido con lípidos); y 6.380.410 (surfactantes para detergentes y limpiadores).
[0324] Con respecto a la hidrólisis, en una realización, opcionalmente, primero se hidroliza un aceite de triglicéridos en un medio líquido como el agua o el hidróxido de sodio para obtener glicerol y jabones. Existen varios métodos adecuados de hidrólisis de triglicéridos, que incluyen, entre otros, saponificación, hidrólisis ácida, hidrólisis alcalina, hidrólisis enzimática (llamada división en el presente documento) e hidrólisis con agua caliente comprimida. Un experto en la técnica reconocerá que no es necesario hidrolizar un aceite de triglicéridos para producir un oleoquímico; más bien, el aceite se puede convertir directamente en el oleoquímico deseado mediante otro proceso conocido. Por ejemplo, el aceite de triglicéridos se puede convertir directamente en un éster metílico de ácidos grasos mediante esterificación.
[0325] En algunas realizaciones, la hidrólisis catalítica del aceite producido por los métodos descritos en el presente documento se produce mediante la división del aceite en glicerol y ácidos grasos. Como se ha discutido anteriormente, los ácidos grasos pueden luego procesarse adicionalmente a través de otras diversas modificaciones para obtener derivados oleoquímicos. Por ejemplo, en una realización, los ácidos grasos pueden sufrir una reacción de aminación para producir compuestos grasos de nitrógeno. En otra realización, los ácidos grasos pueden sufrir ozonólisis para producir ácidos mono y dibásicos.
[0326] En otras realizaciones, la hidrólisis puede ocurrir mediante la división de los aceites producidos en el presente documento para crear oleoquímicos. En algunas realizaciones preferidas, un aceite de triglicéridos puede dividirse antes de que se realicen otros procesos. Un experto en la técnica reconocerá que existen muchos métodos adecuados de división de triglicéridos que incluyen, entre otros, la división enzimática y la división por presión.
[0327] Generalmente, los métodos de división enzimática de aceite utilizan enzimas, lipasas, como biocatalizadores que actúan sobre una mezcla de agua/aceite. La división enzimática luego divide el aceite o la grasa, respectivamente, en glicerol y ácidos grasos libres. El glicerol puede luego migrar a la fase acuosa, mientras que la fase orgánica se enriquece con ácidos grasos libres.
[0328] Las reacciones de división enzimática generalmente tienen lugar en el límite de fase entre la fase orgánica y acuosa, donde la enzima está presente solo en el límite de fase. Los triglicéridos que respetan el límite de fase contribuyen o participan en la reacción de división. A medida que avanza la reacción, la densidad de ocupación o concentración de ácidos grasos todavía unidos químicamente como glicéridos, en comparación con los ácidos grasos libres, disminuye en el límite de fase de modo que la reacción se ralentiza. En ciertas realizaciones, la división enzimática puede ocurrir a temperatura ambiente. Un experto en la materia conocerá las condiciones adecuadas para dividir el aceite en los ácidos grasos deseados.
[0329] A modo de ejemplo, la velocidad de reacción se puede acelerar aumentando la superficie límite de interfaz. Una vez que se completa la reacción, los ácidos grasos libres se separan de la fase orgánica libre de enzimas y el residuo que todavía contiene ácidos grasos químicamente unidos como glicéridos se realimenta o recicla y se mezcla con aceite o grasa nuevos para someterlo a división. De esta manera, los glicéridos reciclados se someten luego a un proceso de división enzimática adicional. En algunas realizaciones, los ácidos grasos libres se extraen de un aceite o grasa parcialmente dividido de esta manera. De ese modo, si los ácidos grasos químicamente unidos (triglicéridos) se devuelven o realimentan al proceso de división, el consumo de enzimas puede reducirse drásticamente.
[0330] El grado de división se determina como la relación del índice de acidez medido dividido por el índice de acidez teóricamente posible que se puede calcular para un aceite o grasa dado. Preferiblemente, el índice de acidez se mide mediante valoración según métodos habituales estándar. Alternativamente, la densidad de la fase acuosa de glicerol se puede tomar como una medida del grado de división.
[0331] En una realización, el proceso de división tal como se describe en el presente documento también es adecuado para dividir los mono, di y triglicéridos contenidos en la denominada pasta de neutralización procedente de los procesos de refinado alcalino de los aceites producidos. De esta manera, la pasta de neutralización se puede convertir cuantitativamente sin saponificación previa de los aceites neutros en ácidos grasos. Para ello, los ácidos grasos que se unen químicamente en los jabones se liberan, preferiblemente antes de la división, mediante la adición de ácido. En ciertas realizaciones, se usa una solución tampón además del agua y la enzima para el proceso de división.
[0332] En una realización, los aceites producidos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento también pueden someterse a saponificación como método de hidrólisis. Los aceites animales y vegetales están hechos típicamente de triacilgliceroles (TAG), que son ésteres de ácidos grasos con alcohol trihídrico, glicerol. En una reacción de hidrólisis alcalina, el glicerol de un TAG se elimina, dejando tres aniones de ácido carboxílico que pueden asociarse con cationes de metales alcalinos como el sodio o el potasio para producir sales de ácidos grasos. En este esquema, los constituyentes de ácido carboxílico se escinden de la fracción de glicerol y se reemplazan con grupos hidroxilo. La cantidad de base (por ejemplo, KOH) que se usa en la reacción está determinada por el grado de saponificación deseado. Si el objetivo es, por ejemplo, producir un producto de jabón que comprenda algunos de los aceites originalmente presentes en la composición de TAG, se introduce en la mezcla de reacción una cantidad de base insuficiente para convertir todos los TAG en sales de ácidos grasos. Normalmente, esta reacción se realiza en una solución acuosa y avanza lentamente, pero puede acelerarse añadiendo calor. La precipitación de las sales de ácidos grasos se puede facilitar añadiendo sales, tales como haluros de metales alcalinos solubles en agua (por ejemplo, NaCl o KCl), a la mezcla de reacción. Preferiblemente, la base es un hidróxido de metal alcalino, como el NaOH o el KOH. Alternativamente, se pueden usar en el esquema de reacción otras bases, tales como las alcanolaminas, que incluyen, por ejemplo, trietanolamina y aminometilpropanol. En algunos casos, se pueden preferir estas alternativas para producir un producto jabonoso transparente. En una realización, la composición lipídica sometida a saponificación es un mimético de sebo (es decir, una composición lipídica similar a la del sebo) producida como se describe en el presente documento o una mezcla de un mimético de sebo con otro aceite de triglicéridos.
[0333] En algunos métodos, el primer paso de la modificación química puede ser el hidroprocesamiento para saturar los dobles enlaces, seguido de la desoxigenación a temperatura elevada en presencia de hidrógeno y un catalizador. En otros métodos, la hidrogenación y desoxigenación pueden ocurrir en la misma reacción. En otros métodos, la desoxigenación ocurre antes de la hidrogenación. La isomerización puede entonces realizarse opcionalmente, también en presencia de hidrógeno y un catalizador. Finalmente, los gases y los componentes de nafta se pueden eliminar si se desea. Por ejemplo, ver las patentes EE. UU. 5.475.160 (hidrogenación de triglicéridos); 5.091.116 (desoxigenación, hidrogenación y eliminación de gases); 6.391.815 (hidrogenación); y 5.888.947 (isomerización).
[0334] En algunas realizaciones, los aceites de triglicéridos están parcial o completamente desoxigenados. Las reacciones de desoxigenación forman los productos deseados, que incluyen, entre otros, ácidos grasos, alcoholes grasos, polioles, cetonas y aldehídos. En general, sin estar limitado por ninguna teoría en particular, las reacciones de desoxigenación implican una combinación de varias rutas de reacción diferentes, que incluyen, entre otras: reacciones de hidrogenólisis, hidrogenación, hidrogenación-hidrogenólisis consecutiva, hidrogenólisis-hidrogenación consecutiva e hidrogenólisis-hidrogenólisis combinada, que dan como resultado al menos la eliminación parcial del oxígeno del ácido graso o éster de ácido graso para generar productos de reacción, tales como los alcoholes grasos, que pueden convertirse fácilmente en los productos químicos deseados mediante un procesamiento adicional. Por ejemplo, en una realización, un alcohol graso se puede convertir en olefinas mediante la reacción de FCC o en alcanos superiores mediante una reacción de condensación.
[0335] Una de estas modificaciones químicas es la hidrogenación, que es la adición de hidrógeno a los dobles enlaces en los constituyentes de ácidos grasos de los glicerolípidos o de los ácidos grasos libres. El proceso de hidrogenación permite la transformación de aceites líquidos en grasas semisólidas o sólidas, que pueden ser más adecuadas para aplicaciones específicas.
[0336] La hidrogenación del aceite producido por los métodos descritos en el presente documento se puede realizar conjuntamente con uno o varios de los métodos y/o materiales proporcionados en el presente documento, tal como se explica en las siguientes patentes EE. UU. n.° 7.288.278 (aditivos alimentarios o medicamentos); 5.346.724 (productos de lubricación); 5.475.160 (alcoholes grasos); 5.091.116 (aceites comestibles); 6.808.737 (grasas estructurales para margarina y untables); 5.298.637 (sucedáneos de grasas bajas en calorías); 6.391.815 (catalizador de hidrogenación y adsorbente de azufre); 5.233.099 y 5.233.100 (alcoholes grasos); 4.584.139 (catalizadores de hidrogenación); 6.057.375 (agentes supresores de espuma); y 7.118.773 (emulsiones comestibles para untar).
[0337] Un experto en la técnica reconocerá que se pueden usar varios procesos para hidrogenar carbohidratos. Un método adecuado incluye poner en contacto el carbohidrato con hidrógeno o hidrógeno mezclado con un gas adecuado y un catalizador en condiciones suficientes en un reactor de hidrogenación para formar un producto hidrogenado. El catalizador de hidrogenación generalmente puede incluir Cu, Re, Ni, Fe, Co, Ru, Pd, Rh, Pt, Os, Ir y aleaciones o cualquier combinación de los mismos, ya sea solo o con promotores tales como W, Mo, Au, Ag, Cr , Zn, Mn, Sn, B, P, Bi y aleaciones o cualquier combinación de los mismos. Otros materiales catalizadores de hidrogenación eficaces incluyen níquel con soporte o rutenio modificado con renio. En una realización, el catalizador de hidrogenación también incluye cualquiera de los soportes, dependiendo de la funcionalidad deseada del catalizador. Los catalizadores de hidrogenación pueden prepararse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica.
[0338] En algunas realizaciones, el catalizador de hidrogenación incluye un catalizador de metal del grupo VIII con soporte y un material de esponja metálica (por ejemplo, un catalizador de esponja de níquel). El níquel Raney proporciona un ejemplo de un catalizador de esponja de níquel activado adecuado para su uso en esta invención. En otra realización, la reacción de hidrogenación de la invención se realiza usando un catalizador que comprende un catalizador de níquel-renio o un catalizador de níquel modificado con tungsteno. Un ejemplo de un catalizador adecuado para la reacción de hidrogenación de la invención es un catalizador de níquel-renio con soporte de carbono.
[0339] En una realización, se puede preparar un catalizador de níquel Raney adecuado tratando una aleación de cantidades aproximadamente iguales en peso de níquel y aluminio con una solución alcalina acuosa, por ejemplo, que contenga aproximadamente un 25 % en peso de hidróxido de sodio. La solución acuosa alcalina disuelve selectivamente el aluminio dando como resultado un material en forma de esponja que comprende principalmente níquel con cantidades menores de aluminio. La aleación inicial incluye metales promotores (es decir, molibdeno o cromo) en una cantidad tal que quede del 1 al 2 % en peso en el catalizador de esponja de níquel que se ha formado. En otra realización, el catalizador de hidrogenación se prepara usando una solución de nitrosilnitrato de rutenio (III), cloruro de rutenio (III) en agua para impregnar un material de soporte adecuado. A continuación, la solución se seca para formar un sólido con un contenido de agua inferior al 1 % en peso. A continuación, el sólido se puede reducir a presión atmosférica en una corriente de hidrógeno a 300 °C (sin calcinar) o 400 °C (calcinada) en un horno de bolas rotatorio durante 4 horas. Después de enfriar y volver inerte el catalizador con nitrógeno, se pasa un 5 % en volumen de oxígeno en nitrógeno al catalizador durante 2 horas.
[0340] En determinadas realizaciones, el catalizador descrito incluye un soporte de catalizador. El soporte del catalizador estabiliza y soporta el catalizador. El tipo de soporte de catalizador utilizado depende del catalizador elegido y de las condiciones de la reacción. Los soportes adecuados para la invención incluyen, entre otros, carbono, sílice, sílice-alúmina, zirconia, titania, ceria, vanadia, nitruro, nitruro de boro, heteropoliácidos, hidroxiapatita, óxido de zinc, cromia, zeolitas, nanotubos de carbono, fullereno de carbono y cualquier combinación de los mismos.
[0341] Los catalizadores usados en esta invención se pueden preparar usando métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos adecuados pueden incluir, entre otros, humectación incipiente, impregnación por evaporación, deposición de vapor químico, recubrimiento por lavado, técnicas de pulverización catódica con magnetrón y similares.
[0342] Las condiciones para llevar a cabo la reacción de hidrogenación variarán según el tipo de material de partida y los productos deseados. Un experto en la técnica, con el beneficio de esta descripción, reconocerá las condiciones de reacción apropiadas. En general, la reacción de hidrogenación se lleva a cabo a temperaturas de 80 °C a 250 °C, y preferiblemente de 90 °C a 200 °C, y lo más preferible de 100 °C a 150 °C. En algunas realizaciones, la reacción de hidrogenación se lleva a cabo a presiones de 500 KPa a 14000 KPa.
[0343] El hidrógeno usado en la reacción de hidrogenólisis de la presente invención puede incluir hidrógeno externo, hidrógeno reciclado, hidrógeno generado in situ y cualquier combinación de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, el término "hidrógeno externo" se refiere al hidrógeno que no se origina en la reacción de la biomasa en sí, sino que se agrega al sistema desde otra fuente.
[0344] En algunas realizaciones de la invención, es deseable convertir el carbohidrato de partida en una molécula más pequeña que se convertirá más fácilmente en los hidrocarburos superiores deseados. Un método adecuado para esta conversión es mediante una reacción de hidrogenólisis. Se conocen varios procesos para realizar la hidrogenólisis de carbohidratos. Un método adecuado incluye poner en contacto un carbohidrato con contenido de hidrógeno o hidrógeno mezclado con un gas adecuado y un catalizador de hidrogenólisis en un reactor de hidrogenólisis en condiciones suficientes para formar un producto de reacción que comprende moléculas o polioles más pequeños. Tal como se usa en el presente documento, el término "moléculas o polioles más pequeños" incluye cualquier molécula que tenga un peso molecular más pequeño, lo cual puede incluir un número menor de átomos de carbono o átomos de oxígeno que el carbohidrato de partida. En una realización, los productos de reacción incluyen moléculas más pequeñas que incluyen polioles y alcoholes. Los expertos en la técnica podrían elegir el método apropiado mediante el cual llevar a cabo la reacción de hidrogenólisis.
[0345] En algunas realizaciones, un azúcar o alcohol de azúcar de 5 y/o 6 carbonos se puede convertir en propilenglicol, etilenglicol y glicerol usando un catalizador de hidrogenólisis. El catalizador de hidrogenólisis puede incluir Cr, Mo, W, Re, Mn, Cu, Cd, Fe, Co, Ni, Pt, Pd, Rh, Ru, Ir, Os y aleaciones o cualquier combinación de los mismos, ya sea solo o con promotores tales como Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, Bi, B, O y aleaciones o cualquier combinación de los mismos. El catalizador de hidrogenólisis también puede incluir un catalizador piropolimérico carbonado que contiene metales de transición (por ejemplo, cromo, molibdeno, tungsteno, renio, manganeso, cobre, cadmio) o metales del grupo VIII (por ejemplo, hierro, cobalto, níquel, platino, paladio, rodio, rutenio , iridio y osmio). En determinadas realizaciones, el catalizador de hidrogenólisis puede incluir cualquiera de los metales anteriores combinado con un óxido de metal alcalinotérreo o adherido a un soporte catalíticamente activo. En ciertas realizaciones, el catalizador descrito en la reacción de hidrogenólisis puede incluir un soporte de catalizador como se ha descrito anteriormente para la reacción de hidrogenación.
[0346] Las condiciones para llevar a cabo la reacción de hidrogenólisis variarán según el tipo de material de partida y los productos deseados. Un experto en la técnica, con el beneficio de esta descripción, reconocerá las condiciones apropiadas de uso para llevar a cabo la reacción. En general, la reacción de hidrogenólisis se lleva a cabo a temperaturas de 110 °C a 300 °C, y preferiblemente de 170 °C a 220 °C, y lo más preferible de 200 °C a 225 °C. En algunas realizaciones, la reacción de hidrogenólisis se lleva a cabo en condiciones básicas, preferiblemente a un pH de 8 a 13, e incluso más preferiblemente a un pH de 10 a 12. En algunas realizaciones, la reacción de hidrogenólisis se lleva a cabo a presiones en un intervalo entre 60 KPa y 16 500 KPa, y preferiblemente en un intervalo entre 1700 KPa y 14000 KPa, e incluso más preferiblemente entre 4800 KPa y 11 000 KPa.
[0347] El hidrógeno usado en la reacción de hidrogenólisis de la presente invención puede incluir hidrógeno externo, hidrógeno reciclado, hidrógeno generado in situ y cualquier combinación de los mismos.
[0348] En algunas realizaciones, los productos de reacción discutidos anteriormente se pueden convertir en hidrocarburos superiores mediante una reacción de condensación en un reactor de condensación. En dichas realizaciones, la condensación de los productos de reacción se produce en presencia de un catalizador capaz de formar hidrocarburos superiores. Aunque sin pretender quedar limitado por la teoría, se cree que la producción de hidrocarburos superiores avanza a través de una reacción de adición escalonada que incluye la formación de un enlace carbono-carbono o carbono-oxígeno. Los productos de reacción resultantes incluyen cualquier número de compuestos que contienen estas fracciones, tal como se describe con más detalle más adelante.
[0349] En determinadas realizaciones, los catalizadores de condensación adecuados incluyen un catalizador ácido, un catalizador base o un catalizador ácido/base. Tal como se usa en el presente documento, el término "catalizador ácido/base" se refiere a un catalizador que tiene una funcionalidad tanto de ácido como de base. En algunas realizaciones, el catalizador de condensación puede incluir, entre otros, zeolitas, carburos, nitruros, zirconia, alúmina, sílice, aluminosilicatos, fosfatos, óxidos de titanio, óxidos de zinc, óxidos de vanadio, óxidos de lantano, óxidos de itrio, óxidos de escandio, óxidos de magnesio, óxidos de cerio, óxidos de bario, óxidos de calcio, hidróxidos, heteropoliácidos, ácidos inorgánicos, resinas modificadas con ácido, resinas modificadas con base y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el catalizador de condensación también puede incluir un modificador. Los modificadores adecuados incluyen La, Y, Sc, P, B, Bi, Li, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el catalizador de condensación también puede incluir un metal. Los metales adecuados incluyen Cu, Ag, Au, Pt, Ni, Fe, Co, Ru, Zn, Cd, Ga, In, Rh, Pd, Ir, Re, Mn, Cr, Mo, W, Sn, Os, aleaciones y cualquier combinación de los mismos.
[0350] En ciertas realizaciones, el catalizador descrito en la reacción de condensación puede incluir un soporte de catalizador como se ha descrito anteriormente para la reacción de hidrogenación. En determinadas realizaciones, el catalizador de condensación es autoportante. Tal como se usa en el presente documento, el término "autoportante" significa que el catalizador no necesita otro material para servir como soporte. En otras realizaciones, el catalizador de condensación se usa en conjunción con un soporte separado adecuado para suspender el catalizador. En una realización, el soporte del catalizador de condensación es sílice.
[0351] Las condiciones en las que se produce la reacción de condensación variarán según el tipo de material de partida y los productos deseados. Un experto en la técnica, con el beneficio de esta descripción, reconocerá las condiciones apropiadas de uso para llevar a cabo la reacción. En algunas realizaciones, la reacción de condensación se lleva a cabo a una temperatura a la que la termodinámica para la reacción propuesta es favorable. La temperatura para la reacción de condensación variará dependiendo del poliol o alcohol de partida específico. En algunas realizaciones, la temperatura para la reacción de condensación está en un intervalo de 80 °C a 500 °C, preferiblemente de 125 °C a 450 °C y lo más preferible de 125 °C a 250 °C. En algunas realizaciones, la reacción de condensación se lleva a cabo a presiones en un intervalo entre 0 KPa y 9000 KPa, preferiblemente en un intervalo entre 0 KPa y 7000 KPa y más preferiblemente entre 0 KPa y 5000 KPa.
[0352] Los alcanos superiores formados por los métodos descritos en el presente documento incluyen, entre otros, alcanos de cadena lineal o ramificada que tienen de 4 a 30 átomos de carbono, alquenos de cadena lineal o ramificada que tienen de 4 a 30 átomos de carbono, cicloalcanos que tienen de 5 a 30 átomos de carbono, cicloalquenos que tienen de 5 a 30 átomos de carbono, arilos, arilos fusionados, alcoholes y cetonas. Los alcanos adecuados incluyen, entre otros, butano, pentano, penteno, 2-metilbutano, hexano, hexeno, 2-metilpentano, 3-metilpentano, 2,2-dimetilbutano, 2,3-dimetilbutano, heptano, hepteno, octano , octeno, 2,2,4-trimetilpentano, 2,3-dimetilhexano, 2,3,4-trimetilpentano, 2,3-dimetilpentano, nonano, noneno, decano, deceno, undecano, undeceno, dodecano, dodeceno, tridecano, trideceno, tetradecano, tetradeceno, pentadecano, pentadeceno, nonildecano, nonildeceno, eicosano, eicoseno, uneicosano, uneicoseno, doeicosano, doeicoseno, trieicosano, trieicoseno, tetraeicosano, tetraeicoseno e isómeros de los mismos. Algunos de estos productos pueden ser adecuados para su uso como combustibles.
[0353] En algunas realizaciones, los cicloalcanos y los cicloalquenos son no sustituidos. En otras realizaciones, los cicloalcanos y cicloalquenos son monosustituidos. En otras realizaciones, los cicloalcanos y cicloalquenos son multisustituidos. En las realizaciones que comprenden los cicloalcanos y cicloalquenos sustituidos, el grupo sustituido incluye, entre otros, un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 12 átomos de carbono, un alquileno de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 12 átomos de carbono, un fenilo y cualquier combinación de los mismos. Los cicloalcanos y cicloalquenos adecuados incluyen, entre otros, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexeno, metilciclopentano, metilciclopenteno, etilciclopentano, etilciclopenteno, etilciclohexano, etilciclohexeno y cualquier combinación de los mismos.
[0354] En algunas realizaciones, los arilos formados son no sustituidos. En otra realización, los arilos formados son monosustituidos. En las realizaciones que comprenden los arilos sustituidos, el grupo sustituido incluye, entre otros, un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 12 átomos de carbono, un alquileno de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 12 átomos de carbono, un fenilo y cualquier combinación de los mismos. Los arilos adecuados incluyen, entre otros, benceno, tolueno, xileno, etilbenceno, paraxileno, metaxileno y cualquier combinación de los mismos.
[0355] Los alcoholes producidos en la invención tienen de 4 a 30 átomos de carbono. En algunas realizaciones, los alcoholes son cíclicos. En otras realizaciones, los alcoholes son ramificados. En otra realización, los alcoholes son de cadena lineal. Los alcoholes adecuados incluyen, entre otros, butanol, pentanol, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, decanol, undecanol, dodecanol, tridecanol, tetradecanol, pentadecanol, hexadecanol, heptildecanol, octildecanol, nonildecanol, eicosanol, uneicosanol, doeicosanol, trieicosanol, tetraeicosanol e isómeros de los mismos.
[0356] Las cetonas producidas por los métodos descritos en este documento tienen de 4 a 30 átomos de carbono. En una realización, las cetonas son cíclicas. En otra realización, las cetonas son ramificadas. En otra realización, las cetonas son de cadena lineal. Las cetonas adecuadas para la invención incluyen, entre otras, butanona, pentanona, hexanona, heptanona, octanona, nonanona, decanona, undecanona, dodecanona, tridecanona, tetradecanona, pentadecanona, hexadecanona, heptildecanona, octildecanona, nonildecanona, eicosanona, uneicosanona, doeicosanona, trieicosanona, tetraeicosanona e isómeros de las mismas.
[0357] Otra modificación química de este tipo es la interesterificación. Los glicerolípidos producidos de manera natural no tienen una distribución uniforme de constituyentes de ácidos grasos. En el contexto de los aceites, la interesterificación se refiere al intercambio de radicales acilo entre dos ésteres de diferentes glicerolípidos. El proceso de interesterificación proporciona un mecanismo mediante el cual los constituyentes de ácidos grasos de una mezcla de glicerolípidos se pueden reorganizar para modificar el patrón de distribución. La interesterificación es un proceso químico bien conocido, y generalmente comprende calentar (a aproximadamente 200 °C) una mezcla de aceites durante un periodo (por ejemplo, 30 minutos) en presencia de un catalizador, por ejemplo, un metal alcalino o un alquilato de metal alcalino (por ejemplo, metóxido de sodio). Este proceso puede usarse para aleatorizar el patrón de distribución de los constituyentes de ácidos grasos de una mezcla de aceite, o puede dirigirse para producir un patrón de distribución deseado. Este método de modificación química de lípidos se puede realizar en materiales proporcionados en este documento, tales como biomasa microbiana con un porcentaje de peso de células secas como lípidos de al menos el 20 %.
[0358] La interesterificación dirigida, en la que se busca un patrón de distribución específico de ácidos grasos, se puede realizar manteniendo la mezcla de aceite a una temperatura por debajo del punto de fusión de algunos TAG que podría producirse. Esto da como resultado la cristalización selectiva de estos TAG, lo cual los elimina eficazmente de la mezcla de reacción a medida que cristalizan. El proceso puede continuar hasta que la mayoría de los ácidos grasos del aceite hayan precipitado, por ejemplo. Se puede utilizar un proceso de interesterificación dirigida, por ejemplo, para generar un producto con un contenido calórico más bajo mediante la sustitución de ácidos grasos de cadena más larga por homólogos de cadena más corta. La interesterificación dirigida también se puede utilizar para generar un producto con una mezcla de grasas que puede proporcionar las características de fusión deseadas y las características estructurales buscadas en los aditivos o productos alimentarios (por ejemplo, la margarina) sin recurrir a la hidrogenación, que puede producir isómeros trans no deseados.
[0359] La interesterificación de los aceites producidos por los métodos descritos en el presente documento se puede realizar conjuntamente con uno o varios de los métodos y/o materiales, o para generar productos, como se explica en las siguientes patentes EE. UU. n.° 6.080.853 (sucedáneos de grasas no digeribles); 4.288.378 (estabilizador de mantequilla de cacahuete); 5.391.383 (aceite comestible en aerosol); 6.022.577 (grasas comestibles para productos alimentarios); 5.434.278 (grasas comestibles para productos alimentarios); 5.268.192 (productos de frutos secos bajos en calorías); 5.258.197 (composiciones comestibles bajas en calorías); 4.335.156 (producto graso comestible); 7.288.278 (aditivos alimentarios o medicamentos); 7.115.760 (proceso de fraccionamiento); 6.808.737 (grasas estructurales); 5.888.947 (lubricantes de motor); 5.686.131 (mezclas de aceites comestibles); y 4.603.188 (composiciones de uretano curables).
[0360] En una realización, la transesterificación del aceite, tal como se ha descrito anteriormente, es seguida por la reacción del producto transesterificado con poliol, como se explica en la patente EE. UU. n.° 6.465.642, para producir poliésteres de ácidos grasos y poliol. Dicho proceso de esterificación y separación puede comprender las etapas siguientes: hacer reaccionar un éster de alquilo inferior con poliol en presencia de jabón; eliminar el jabón residual de la mezcla de productos; lavar con agua y secar la mezcla de productos para eliminar las impurezas; blanquear la mezcla de productos para su refinamiento; separar al menos una porción del éster de alquilo inferior sin reaccionar del poliéster de ácido graso de poliol en la mezcla de productos; y reciclar el éster de alquilo inferior sin reaccionar separado.
[0361] La transesterificación también se puede realizar en la biomasa microbiana con ésteres de ácidos grasos de cadena corta, como se explica en la patente EE. UU. 6.278.006. En general, la transesterificación se puede realizar añadiendo un éster de ácido graso de cadena corta a un aceite en presencia de un catalizador adecuado y calentando la mezcla. En algunas realizaciones, el aceite comprende del 5 % al 90 % de la mezcla de reacción en peso. En algunas realizaciones, los ésteres de ácidos grasos de cadena corta pueden ser del 10 % al 50 % en peso de la mezcla de reacción. Los ejemplos no limitantes de catalizadores incluyen catalizadores base, metóxido de sodio, catalizadores ácidos que incluyen ácidos inorgánicos como el ácido sulfúrico y arcillas acidificadas, ácidos orgánicos como el ácido metanosulfónico, el ácido bencenosulfónico y el ácido toluenosulfónico y resinas ácidas como Amberlyst 15. Metales tales como sodio y magnesio, y los hidruros metálicos también son catalizadores útiles.
[0362] Otra modificación química de este tipo es la hidroxilación, que implica la adición de agua a un doble enlace que da como resultado la saturación y la incorporación de un resto hidroxilo. El proceso de hidroxilación proporciona un mecanismo para convertir uno o varios constituyentes de ácido graso de un glicerolípido en un hidroxiácido graso. La hidroxilación se puede realizar, por ejemplo, mediante el método descrito en la patente EE. UU. n.° 5.576.027. Los ácidos grasos hidroxilados, incluyendo el aceite de ricino y sus derivados, son útiles como componentes en varias aplicaciones industriales, incluyendo aditivos alimentarios, surfactantes, agentes humectantes de pigmentos, agentes antiespumantes, aditivos impermeables, agentes plastificantes, emulsionantes cosméticos y/o agentes desodorantes, así como en electrónica, farmacéutica, pinturas, tintas, adhesivos y lubricantes. Un ejemplo de cómo se puede realizar la hidroxilación de un glicérido es el siguiente: la grasa puede calentarse, preferiblemente a 30-50 °C combinada con heptano y mantenerse a la temperatura durante treinta minutos o más; a continuación, puede añadirse ácido acético a la mezcla seguido de una solución acuosa de ácido sulfúrico seguida de una solución acuosa de peróxido de hidrógeno que se añade en pequeños incrementos a la mezcla durante una hora; después del peróxido de hidrógeno acuoso, la temperatura puede entonces aumentarse hasta al menos 60 °C y agitarse durante al menos seis horas; después de la agitación, se deja asentar la mezcla y se puede eliminar una capa acuosa inferior formada por la reacción, mientras que la capa superior de heptano formada por la reacción se puede lavar con agua caliente a una temperatura de aproximadamente 60 °C; la capa de heptano lavada se puede neutralizar luego con una solución acuosa de hidróxido de potasio a un pH de 5 a 7 y luego eliminar por destilación al vacío; el producto de reacción se puede secar luego al vacío a 100 °C y el producto seco se puede desodorizar con vapor en condiciones de vacío y filtrar a una temperatura de 50 ° a 60 °C usando tierra de diatomeas.
[0363] La hidroxilación de los aceites microbianos por los métodos descritos en el presente documento se puede realizar conjuntamente con uno o varios de los métodos y/o materiales, o para generar productos, como se explica en las siguientes patentes EE. UU. n.° 6.590.113 (recubrimientos y tintas con base oleosa); 4.049.724 (proceso de hidroxilación); 6.113.971 (mantequilla de aceite de oliva); 4.992.189 (lubricantes y aditivos lubricantes); 5.576.027 (leche hidroxilada); y 6.869.597 (productos cosméticos).
[0364] Los glicerolípidos hidroxilados se pueden convertir en estólidos. Los estólidos consisten en un glicerolípido en el que un constituyente de ácido graso hidroxilado se ha esterificado en otra molécula de ácido graso. La conversión de glicerolípidos hidroxilados en estólidos se puede llevar a cabo calentando una mezcla de glicerolípidos y ácidos grasos y poniendo en contacto la mezcla con un ácido mineral, como se describe en Isbell et al., JAOCS 71 (2): 169-174 (1994). Los estólidos son útiles en una variedad de aplicaciones, incluyendo, entre otras, las que se explican en las siguientes patentes EE. UU. n.° 7.196.124 (materiales elastoméricos y recubrimientos para suelos); 5.458.795 (aceites espesados para aplicaciones de alta temperatura); 5.451.332 (fluidos para aplicaciones industriales); 5.427.704 (aditivos para combustibles); y 5.380.894 (lubricantes, grasas, plastificantes y tintas de impresión).
[0365] Otra modificación química de este tipo es la metátesis de olefinas. En la metátesis de olefinas, un catalizador corta los carbonos de alquilideno en un alqueno (olefina) y forma nuevos alquenos emparejando cada uno de ellos con diferentes carbonos de alquilidina. La reacción de metátesis de olefinas proporciona un mecanismo para procesos tales como truncar las cadenas de alquilo de ácidos grasos insaturados en los alquenos mediante etenólisis, reticular ácidos grasos a través de enlaces de alqueno por autometátesis e incorporar nuevos grupos funcionales en ácidos grasos por metátesis cruzada con alquenos derivatizados. .
[0366] Junto con otras reacciones, como la transesterificación y la hidrogenación, la metátesis de olefinas puede transformar glicerolípidos insaturados en diversos productos finales. Estos productos incluyen oligómeros de glicerolípidos para ceras; glicerolípidos de cadena corta para lubricantes; cadenas de alquilo homo y heterobifuncionales para productos químicos y polímeros; ésteres de cadena corta para biocombustible; e hidrocarburos de cadena corta para combustible de aviación. La metátesis de olefinas se puede realizar en triacilgliceroles y derivados de ácidos grasos, por ejemplo, utilizando los catalizadores y métodos descritos en la patente EE. UU. n.° 7.119.216, la pub. de patente EE. UU. n.° 2010/0160506 y la pub. de patente EE. UU. n.° 2010/0145086.
[0367] La metátesis de olefinas de bioaceites generalmente comprende añadir una solución de catalizador de Ru con una carga de 10 a 250 ppm en condiciones inertes a ésteres de ácidos grasos insaturados en presencia (metátesis cruzada) o ausencia (autometátesis) de otros alquenos. Típicamente, se deja que las reacciones transcurran durante un periodo que va de horas a días y finalmente generan una distribución de productos de alqueno. Un ejemplo de cómo se puede realizar la metátesis de olefinas en un derivado de ácido graso es el siguiente: Una solución del catalizador de Grubbs de primera generación (dicloro [2 (1-metiletoxi-a-O) fenil] metilen-a-C] (triciclohexil-fosfina) en tolueno a una carga de catalizador de 222 ppm puede añadirse a un recipiente que contiene oleato de metilo desgasificado y seco. Luego, el recipiente puede presurizarse con aproximadamente 60 psig de gas etileno y mantenerse a 30 °C o menos durante 3 horas, por lo que se puede producir aproximadamente un 50 % de rendimiento de 9-decenoato de metilo.
[0368] La metátesis de olefinas de aceites producidos por los métodos descritos en el presente documento se puede realizar conjuntamente con uno o varios de los métodos y/o materiales, o para generar productos, como se explica en la siguiente solicitud de patente PCT/US07/081427 (ácidos grasos a-olefinas) y las solicitudes de patente EE. UU. n.° 12/281.938 (cremas de petróleo), 12/281.931 (cápsulas de pistola de paintball), 12/653.742 (plastificantes y lubricantes), 12/422.096 (compuestos orgánicos bifuncionales) y 11/795.052 (cera de vela).
[0369] Otras reacciones químicas que se pueden realizar en aceites microbianos incluyen la reacción de triacilgliceroles con un agente ciclopropanante para mejorar la fluidez y/o la estabilidad oxidativa, como se explica en la patente EE. UU. 6.051.539; la fabricación de ceras a partir de triacilgliceroles, como se explica en la patente 6.770.104; y la epoxidación de triacilgliceroles, como se explica en "The effect of fatty acid composition on the acrylation kinetics of epoxidized triacylglycerols", Journal of the American Oil Chemists' Society, 79: 1, 59-63, (2001) y Free Radical Biology and Medicine, 37: 1, 104-114 (2004).
[0370] La invención, que se ha descrito en detalle anteriormente, se ejemplifica en los siguientes ejemplos, que se ofrecen para ilustrar, pero no limitar, la invención reivindicada.
VII. MÉTODOS PARA LA PREPARACIÓN DE BIOMASA DE MICROALGAS RECOMBINANTES
[0371] La presente descripción describe una biomasa microbiana recombinante, preferiblemente de algas, adecuada para el consumo humano rica en nutrientes, incluyendo constituyentes de lípidos y/o proteínas, métodos para combinar dichos nutrientes con ingredientes, incluyendo ingredientes comestibles y otros ingredientes, y las composiciones alimenticias que los contienen. Aunque gran parte de la siguiente discusión está dirigida a la biomasa de algas o al aceite de algas, la intención es que se aplique igualmente a la biomasa microbiana o al aceite microbiano en general. La invención surgió en parte de los descubrimientos de que la biomasa de algas recombinantes se puede preparar con un alto contenido de aceite y/o con excelente funcionalidad, y la biomasa resultante se puede incorporar a productos alimenticios en los que el contenido de aceite y/o proteína de la biomasa puede sustituir total o parcialmente para aceites y/o grasas y/o proteínas presentes en productos alimenticios convencionales. El aceite de algas, que puede comprender predominantemente aceite monoinsaturado, proporciona beneficios para la salud en comparación con las grasas saturadas, hidrogenadas (grasas trans) y poliinsaturadas que se encuentran a menudo en los productos alimenticios convencionales. El aceite de algas también se puede utilizar como un aceite de cocina estable, saludable y sin grasas trans. El resto de la biomasa de algas puede encapsular el aceite al menos hasta que se cocine un producto alimenticio, aumentando así la vida útil del aceite. En los productos crudos, en los que las células permanecen intactas, la biomasa, junto con los antioxidantes naturales que se encuentran en el aceite, también protege el aceite de la oxidación, que de lo contrario crearía olores, sabores y texturas desagradables. La biomasa también proporciona varios micronutrientes beneficiosos además del aceite y/o las proteínas, por ejemplo, fibras dietéticas derivadas de algas (carbohidratos solubles e insolubles), fosfolípidos, glicoproteínas, fitoesteroles, tocoferoles, tocotrienoles y selenio.
1. Microalgas para el uso en los métodos de la invención
[0372] Se puede usar una variedad de especies de microalgas que producen aceites y/o lípidos y/o proteínas adecuados de acuerdo con los métodos de la presente invención, aunque se prefieren las microalgas que producen naturalmente altos niveles de aceites y/o lípidos y/o proteínas adecuados. . Las consideraciones que afectan a la selección de microalgas para su uso en la invención incluyen, además de la producción de aceites, lípidos o proteínas adecuados para la producción de productos alimenticios: (1) un alto contenido de lípidos (o proteínas) como porcentaje del peso celular; (2) facilidad de crecimiento; (3) facilidad de propagación; (4) facilidad de procesamiento de biomasa; (5) perfil de glicerolípidos; y (6) ausencia de toxinas de algas (el ejemplo 5 más adelante demuestra que la biomasa de microalgas recombinantes seca y los aceites o lípidos extraídos de la biomasa carecen de toxinas de algas).
[0373] En algunas realizaciones, la pared celular de las microalgas debe romperse durante el procesamiento de alimentos (por ejemplo, al cocinar) para liberar los componentes activos o para la digestión y, en estas realizaciones, se prefieren cepas de microalgas con paredes celulares susceptibles de digestión en el tracto gastrointestinal de un animal, p. ej., un humano u otros monogástricos, especialmente si la biomasa de algas se va a utilizar en productos alimenticios crudos. La digestibilidad generalmente disminuye para las cepas de microalgas recombinantes que tienen un alto contenido de celulosa/hemicelulosa en las paredes celulares. La digestibilidad se puede evaluar usando un ensayo de digestibilidad de pepsina estándar.
4. Aceite de algas
[0374] En un aspecto, la presente invención está dirigida a un método para preparar aceite de algas mediante la recolección de aceite de algas a partir de una biomasa de algas que comprende al menos un 15 % de aceite en peso seco en condiciones de GMP, en el que el aceite de algas es superior al 50 % de lípido 18:1. En algunos casos, la biomasa de algas comprende una mezcla de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunos casos, al menos dos de las distintas especies de microalgas se han cultivado por separado. En al menos una realización, al menos dos de las distintas especies de microalgas tienen diferentes perfiles de glicerolípidos. En algunos casos, la biomasa de algas se deriva de algas cultivadas heterotróficamente. En algunos casos, todas las especies distintas de microalgas contienen al menos un 15 % de aceite en peso seco.
[0375] La presente divulgación también describe un método para preparar una composición alimenticia que comprende combinar aceite de algas obtenido a partir de células de algas que contienen al menos un 10 % o al menos un 15 % de aceite en peso seco con uno o varios de otros ingredientes comestibles para formar la composición alimenticia. En algunos casos, el método comprende además preparar el aceite de algas en condiciones de GMP.
[0376] El aceite de algas se puede separar de la biomasa lisada para usarlo en un producto alimenticio (entre otras aplicaciones). La biomasa de algas que queda después de la extracción del aceite se denomina harina deslipidada. La harina deslipidada contiene menos aceite por peso seco o volumen que las microalgas contenidas antes de la extracción. Normalmente, se extrae del 50 al 90 % del aceite de modo que la harina deslipidada contenga, por ejemplo, del 10 al 50 % del contenido de aceite de la biomasa antes de la extracción. Sin embargo, la biomasa todavía tiene un alto valor nutritivo en contenido de proteínas y otros constituyentes comentados anteriormente. Por tanto, la harina deslipidada se puede utilizar en piensos para animales o en aplicaciones alimentarias para humanos.
[0377] En algunas realizaciones, el aceite de algas tiene al menos un 50 % p/p de ácido oleico y contiene menos de un 5 % de DHA. En algunas realizaciones, el aceite de algas tiene al menos un 50 % p/p de ácido oleico y contiene menos de un 0.5 % de DHA. En algunas realizaciones, el aceite de algas es ácido oleico al menos en un 50 % p/p y contiene menos de un 5 % de glicerolípidos que contienen una longitud de cadena de carbono mayor de 18. En algunos casos, las células de algas de las que se obtiene el aceite de algas comprenden una mezcla de células de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunos casos, al menos dos de las distintas especies de microalgas se han cultivado por separado. En al menos una realización, al menos dos de las distintas especies de microalgas tienen diferentes perfiles de glicerolípidos. En algunos casos, las células de las algas se cultivan en condiciones heterótrofas. En algunos casos, todas las especies distintas de microalgas contienen al menos un 10 % o al menos un 15 % de aceite en peso seco.
[0378] La presente divulgación también describe aceite de algas que contiene al menos un 50 % de aceite monoinsaturado y que contiene menos de un 1 % de DHA preparado en condiciones de GMP. En algunos casos, el aceite monoinsaturado es un lípido 18: 1. En algunos casos, el aceite de algas se envasa en una cápsula para administrar una dosis unitaria de aceite. En algunos casos, el aceite de algas se obtiene de una mezcla de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunos casos, al menos dos de las distintas especies de microalgas se han cultivado por separado. En al menos una realización, al menos dos de las distintas especies de microalgas tienen diferentes perfiles de glicerolípidos. En algunos casos, el aceite de algas se obtiene de células de algas cultivadas en condiciones heterótrofas.
[0379] La presente divulgación también describe un aceite que comprende más de un 60 % de 18: 1 y al menos 0.20 mg/g de tocotrienol.
[0380] La presente divulgación también describe una composición de éster de alquilo de ácido graso que comprende más de un 60 % de éster 18: 1 y al menos 0.20 mg/g de tocotrienol.
[0381] El aceite de algas se prepara a partir de biomasa de microalgas recombinantes lavadas y concentradas mediante extracción. Las células de la biomasa se lisan antes de la extracción. Opcionalmente, la biomasa microbiana también se puede secar (secar al horno, liofilizar, etc.) antes de la lisis (disrupción celular). Alternativamente, las células se pueden lisar sin separación parcial o total a partir del caldo de fermentación cuando la fermentación se completa. Por ejemplo, las células pueden estar en una proporción de menos de 1: 1 v:v de células con respecto al líquido extracelular cuando las células se lisan.
[0382] Las microalgas que contienen lípidos se pueden lisar para producir un lisado. Tal como se detalla en el presente documento, la etapa de lisado de un microorganismo (también denominada lisis celular) se puede lograr por cualquier medio conveniente, incluyendo la lisis inducida por calor, la adición de una base, la adición de un ácido, el uso de enzimas como las proteasas y enzimas de degradación de polisacáridos como las amilasas, el uso de ultrasonidos, la lisis mecánica basada en presión y lisis usando choque osmótico. Cada uno de estos métodos para lisar un microorganismo se puede utilizar como método único o en combinación simultánea o secuencial. La extensión de la alteración celular se puede observar mediante análisis microscópico. Utilizando uno o más de los métodos anteriores, se observa típicamente más de un 70 % de rotura celular. Preferiblemente, la rotura celular es superior al 80 %, más preferiblemente superior al 90 % y lo más preferido alrededor del 100 %.
[0383] Los lípidos y aceites generados por las microalgas se pueden recuperar mediante extracción. En algunos casos, la extracción se puede realizar usando un disolvente orgánico o un aceite o se puede realizar usando un procedimiento de extracción sin disolvente.
[0384] Para la extracción del aceite de microalgas recombinantes con un disolvente orgánico, el disolvente orgánico preferido es el hexano. Normalmente, el disolvente orgánico se añade directamente al lisado sin separación previa de los componentes del lisado. En una realización, el lisado generado por uno o más de los métodos descritos anteriormente se pone en contacto con un disolvente orgánico durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los componentes lipídicos formen una solución con el disolvente orgánico. En algunos casos, la solución se puede refinar aún más para recuperar componentes lipídicos específicos deseados. A continuación, la mezcla se puede filtrar y el hexano se puede eliminar mediante, por ejemplo, rotoevaporación. Los métodos de extracción con hexano son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Frenz et al., Enzyme Microb. Technol., 11: 717 (1989)..
[0385] En algunos casos, los aceites de microalgas recombinantes se pueden extraer mediante licuefacción (ver, por ejemplo, Sawayama et al., Biomass and Bioenergy 17: 33-39 (1999) e Inoue et al., Biomass Bioenergy 6 (4): 269-274 (1993)); licuefacción del aceite (ver, por ejemplo, Minowa et al., Fuel 74 (12): 1735-1738 (1995)); o extracción de CO2 supercrítico (ver, por ejemplo, Mendes et al., Inorganica Chimica Acta 356: 328-334 (2003)).
[0386] La extracción de aceite incluye la adición de un aceite directamente a un lisado sin separación previa de los componentes del lisado. Después de la adición del aceite, el lisado se separa por sí solo o como resultado de la centrifugación o técnicas similares en diferentes capas. Las capas pueden incluir en orden de densidad decreciente: un sedimento de sólidos pesados, una fase acuosa, una fase de emulsión y una fase oleosa. La fase de emulsión es una emulsión de lípidos y fase acuosa. Dependiendo del porcentaje de aceite añadido con respecto al lisado (p/p o v/v), la fuerza de centrifugación, si la hay, el volumen del medio acuoso y otros factores, pueden estar presentes una o las dos fases de emulsión y oleosa. La incubación o el tratamiento del lisado celular o la fase de emulsión con el aceite se realiza durante un tiempo suficiente para permitir que el lípido producido por el microorganismo se solubilice en el aceite para formar una mezcla heterogénea.
[0387] En varias realizaciones, el aceite usado en el proceso de extracción se selecciona del grupo que consiste en aceite de soja, colza, canola, palma, palmiste, coco, maíz, aceite de residuo vegetal, sebo chino, oliva, girasol, semilla de algodón, grasa de pollo, sebo vacuno, sebo porcino, microalgas, macroalgas, Cuphea, lino, cacahuete, grasa blanca de calidad (manteca de cerdo), Camelina sativa semilla de mostaza, anacardo, avena, lupino, kenaf, caléndula, cáñamo, café, linaza, avellana, euforbia, semilla de calabaza, cilantro, camelia, sésamo, cártamo, arroz, aceite de árbol de tung, cacao, copra, amapola pium, semillas de ricino, nuez , jojoba, jatropha, macadamia, nueces de Brasil y aguacate. La cantidad de aceite añadido al lisado es típicamente superior al 5 % (medido en v/v y/o p/p) del lisado con el que se combina el aceite. Por tanto, un v/v o p/p preferido del aceite es superior al 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 50 %, 70 %, 90 % o al menos 95 % del lisado celular.
[0388] Los lípidos también se pueden extraer de un lisado mediante un procedimiento de extracción en ausencia de disolvente sin usar sustancialmente o en absoluto los disolventes o aceites orgánicos mediante el enfriamiento del lisado. También se puede usar la sonicación, particularmente si la temperatura está entre la temperatura ambiente y 65 °C. Dicho lisado por centrifugación o sedimentación se puede separar en capas, una de las cuales es una capa acuosa:lípida. Otras capas pueden incluir un sedimento sólido, una capa acuosa y una capa lipídica. El lípido se puede extraer de la capa de emulsión congelando, descongelando o enfriando de otro modo la emulsión. En dichos métodos, no es necesario añadir ningún disolvente o aceite orgánico. Si se añade algún disolvente o aceite, puede estar por debajo del 5 % v/v o p/p del lisado.
[0389] Esta divulgación también describe una composición alimenticia que comprende al menos un 0.1 % p/p de aceite de triglicéridos de algas aislado a partir de células de algas recombinantes cultivadas en condiciones heterotróficas y uno o varios de otros ingredientes. Las células de algas recombinantes se pueden cultivar opcionalmente a oscuras. En algunas realizaciones, el perfil de triglicéridos del aceite de triglicerol de algas es similar al perfil de triglicéridos de un aceite de origen natural. En la tabla 5 se proporcionan algunos de los aceites de origen natural. En una realización, los triglicéridos de algas son similares a la manteca de cacao, el aceite de coco, el aceite de palma, el sebo de ternera o la manteca de cerdo. En al menos una realización, al menos el 50 % en peso del aceite es aceite de glicerolípido monoinsaturado. En algunos casos, al menos el 50 %, 60 %, 70 % 80 % o 90 % en peso del aceite es un lípido C18: 1.
[0390] Aunque en general cualquiera de estas fuentes de aceite de algas se puede utilizar en cualquier producto alimenticio, la fuente preferida depende en parte de si el aceite está presente principalmente con fines nutricionales o calóricos en lugar de por la textura, la apariencia o el sabor de los alimentos, o alternativamente si el aceite en combinación con otros ingredientes alimenticios tiene la finalidad de aportar el sabor, la textura o la apariencia deseados al alimento además de la mejora de su perfil nutricional o calórico o en lugar de esta.
VII. EJEMPLOS
EJEMPLO 1: Métodos de cultivo de Prototheca
[0391] Se cultivaron cepas de Prototheca para lograr un alto porcentaje de aceite en peso de células secas. Las células criopreservadas se descongelaron a temperatura ambiente y se añadieron 500 |_il de células a 4.5 ml de medio (4.2 g/l de K2HPO4, 3.1 g/l de NaH2PO4, 0.24 g/l de MgSO47H2O, 0.25 g/l de ácido cítrico monohidrato, 0.025 g/l de CaCb2H2O, 2 g/l de extracto de levadura) más glucosa al 2 % y se cultivaron durante 7 días a 28 °C con agitación (200 rpm) en una placa de 6 pocillos. Los pesos de las células secas se determinaron centrifugando 1 ml de cultivo a 14 000 rpm durante 5 min en un tubo Eppendorf previamente pesado. El sobrenadante del cultivo se desechó y el sedimento celular resultante se lavó con 1 ml de agua desionizada. El cultivo se centrifugó de nuevo, se desechó el sobrenadante y los sedimentos celulares se colocaron a -80 °C hasta que se congelaron. A continuación, las muestras se liofilizaron durante 24 horas y se calcularon los pesos de las células secas. Para la determinación de los lípidos totales en los cultivos, se extrajeron 3 ml de cultivo y se sometieron a un análisis usando un sistema Ankom (Ankom Inc., Macedon, NY) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las muestras se sometieron a una extracción con disolvente con un extractor Ankom XT10 de acuerdo con el protocolo del fabricante. El lípido total se determinó como la diferencia de masa entre las muestras secas hidrolizadas con ácido y las muestras secas extraídas con disolvente. En la tabla 10 se muestran las mediciones de porcentaje de aceite en peso de la célula seca.
Tabla 10. Porcentaje de i n l l l
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[0392] Se genotiparon muestras de microalgas de múltiples cepas del género Prototheca. El ADN genómico se aisló de la biomasa de algas de la siguiente manera. Se centrifugaron las células (aproximadamente 200 mg) de cultivos líquidos durante 5 minutos a 14000 x g. A continuación, las células se resuspendieron en agua destilada estéril, se centrifugaron durante 5 minutos a 14000 x g y el sobrenadante se desechó. Se añadió una sola perla de vidrio de aproximadamente 2 mm de diámetro a la biomasa y se colocaron los tubos a -80 °C durante al menos 15 minutos. Se retiraron las muestras y se añadieron 150 pl de tampón de molienda (Sarkosyl al 1 %, sacarosa 0.25 M, NaCl 50 mM, EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8.0, RNasa A 0.5 pg/pl). Los sedimentos se resuspendieron agitando brevemente en remolino, añadiendo después 40 pl de NaCl 5M. Las muestras se agitaron brevemente en remolino, luego se añadieron 66 pl de CTAB al 5 % (bromuro de cetiltrimetilamonio) y se realizó una breve agitación final. A continuación, las muestras se incubaron a 65 °C durante 10 minutos, después de lo cual se centrifugaron a 14000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se extrajo una vez con 300 pl de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 12: 12: 1, luego se centrifugó durante 5 minutos a 14000 x g. La fase acuosa resultante se transfirió a un tubo nuevo que contenía 0.7 vol de isopropanol (~ 190 pl), se mezcló por inversión y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos o durante la noche a 4 °C. El ADN se recuperó mediante centrifugación a 14 000 x g durante 10 minutos. El sedimento resultante se lavó entonces dos veces con etanol al 70 %, y después se hizo un lavado final con etanol al 100 %. Los sedimentos se secaron al aire durante 20-30 minutos a temperatura ambiente y luego se resuspendieron en 50 pl de TrisCl 10 mM y EDTA 1 mM (pH 8.0).
[0393] Cinco pl de ADN de algas completo, preparado como se ha descrito anteriormente, se diluyeron 1:50 en Tris 10 mM, pH 8.0. Las reacciones de PCR, con volumen final de 20 pl, se prepararon de la siguiente manera. Se añadieron diez pl de 2 x iProof HF master mix (BIO-RAD) a 0.4 pl de cebador SZ02613 (5'-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3' (SEQ ID N.°: 9) a una concentración de stock de 10 mM). Esta secuencia de cebador va desde la posición 567-588 en el n.° de acceso de Gen Bank L43357 y está altamente conservada en genomas de plantas superiores y de plástidos de algas. A esto le siguió la adición de 0.4 pl de cebador SZ02615 (5'-CAGTGAGCtAt TACg Ca CTC-3' (SEQ ID N.°: 10) a una concentración de stock de 10 mM). Esta secuencia de cebador es complementaria a la posición 1112-1093 en el n.° de acceso de Gen Bank L43357 y está altamente conservada en genomas de plantas superiores y de plástidos de algas. A continuación, se agregaron 5 pl de ADN total diluido y 3.2 pl de dH2O. Las reacciones de PCR se ejecutaron como sigue: 98 °C, 45"; 98 °C, 8"; 53 °C, 12"; 72 °C, 20" durante 35 ciclos seguidos de 72 °C durante 1 min y manteniéndolo a 25 °C. Para la purificación de los productos de PCR, se añadieron 20 pl de Tris 10 mM, pH 8.0, a cada reacción, seguidos de extracción con 40 pl de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 12:12:1, agitando en remolino y centrifugando a 14000 x g durante 5 minutos. . Las reacciones de PCR se aplicaron a columnas S-400 (GE Healthcare) y se centrifugaron durante 2 minutos a 3000 x g. Los productos de PCR purificados se clonaron posteriormente con TOPO en PCR8/GW/TOPO y se seleccionaron los clones positivos en placas LB/espec. El ADN plasmídico purificado se secuenció en ambas direcciones utilizando cebadores directos e inversos M13. En total, se seleccionaron doce cepas de Prototheca para tener su ADN del ARNr 23S secuenciado y las secuencias se enumeran en el listado de secuencias. A continuación se incluye un resumen de las cepas y los números del listado de secuencias. Las secuencias se analizaron para determinar la divergencia general de la secuencia de UTEX 1435 (SEQ ID N.°: 15). Surgieron dos pares (UTEX 329/UTEX 1533 y UTEX 329/UTEX 1440) como los más divergentes. En ambos casos, la alineación por pares dio como resultado una identidad de secuencia por pares del 75.0 %. El porcentaje de identidad de secuencia con UTEX 1435 también se incluye a continuación:
Especie Cepa % nt identidad SEQ ID N.° Prototheca kruegani UTEX 329 75.2 SEQ ID N.°: 11 Prototheca wickerhamii UTEX 1440 99 SEQ ID N.°: 12 Prototheca stagnora UTEX 1442 75.7 SEQ ID N.°: 13 Prototheca moriformis UTEX 288 75.4 SEQ ID N.°: 14 Prototheca moriformis UTEX 1439; 1441; 1435; 1437 100 SEQ ID N.°: 15 Prototheca wickerhamii UTEX 1533 99.8 SEQ ID N.°: 16 Prototheca moriformis UTEX 1434 75.9 SEQ ID N.°: 17 Prototheca zopfii UTEX 1438 75.7 SEQ ID N.°: 18 Prototheca moriformis UTEX 1436 88.9 SEQ ID N.°: 19
[0394] Las muestras de lípidos de un subconjunto de las cepas enumeradas anteriormente se analizaron para determinar el perfil lipídico usando HPLC. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 11.
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[0395] Aceite extraído de Prototheca moriformis UTEX 1435 (se analizó mediante extracción con disolvente o usando una prensa de expulsión para carotenoides, clorofila, tocoferoles, otros esteroles y tocotrienoles). Los resultados se resumen a continuación en la tabla 12.
Tabla 12. Análisis de carotenoides, clorofila, tocoferol/esteroles y tocotrienol en el aceite extraído de Prototheca moriformis UTEX 1435.
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[0396] El aceite extraído de Prototheca moriformis, de cuatro lotes separados, se refinó y blanqueó utilizando métodos estándar de procesamiento de aceite vegetal. Brevemente, el aceite crudo extraído de Prototheca moriformis se clarificó en un decantador horizontal, donde se separaron los sólidos del aceite. A continuación, el aceite clarificado se transfirió a un tanque con ácido cítrico y agua y se dejó reposar durante aproximadamente 24 horas. Después de 24 horas, la mezcla en el tanque formó 2 capas separadas. La capa inferior estaba compuesta de agua y gomas que luego se eliminaron por decantación antes de transferir el aceite desgomado a un tanque de blanqueo. A continuación, se calentó el aceite junto con otra dosis de ácido cítrico. A continuación, se añadió arcilla blanqueadora al tanque de blanqueo y la mezcla se siguió calentando al vacío para evaporar el agua que estuviera presente. A continuación, la mezcla se bombeó a través de un filtro de hojas para eliminar la arcilla blanqueadora. El aceite filtrado se hizo pasar luego a través de un filtro de pulido final de 5 |_im y luego se recolectó para su almacenamiento hasta su uso. A continuación, se analizó el aceite refinado y blanqueado (RB) en busca de carotenoides, clorofila, esteroles, tocotrienoles y tocoferoles. Los resultados de estos análisis se resumen en la tabla 13 a continuación. "Nd" denota no detectado y la sensibilidad de detección se enumera a continuación:
Sensibilidad de detección
[0397] Carotenoides (mcg/g) nd = <0.003 mcg/g
Clorofila (mcg/g) nd = <0.03 mcg/g
Esteroles (%) nd = 0.25 % tocoferoles (mcg/g); nd = 3 mcg/g
Tabla 13. Análisis de carotenoides, clorofila, esteroles, tocotrienoles y tocoferol de aceites refinados y blan ueados de Prototheca moriformis.
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[0398] También se analizaron los mismos cuatro lotes de aceite de Prototheca moriformis en busca de oligoelementos y los resultados se resumen a continuación en la tabla 14.
Tabla 14. Análisis elemental de aceite refinado blan ueado de Prototheca moriformis.
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EJEMPLO 2: Métodos generales para la transformación biolística de Prototheca
[0399] Se prepararon microportadores Seashell Gold de 550 nanómetros de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se mezclaron plásmidos (20 jg ) con 50 j l de tampón de unión y 60 j l (30 mg) de portadores de oro S550d y se incubó en hielo durante 1 min. Se añadió tampón de precipitación (100 jl) y la mezcla se incubó en hielo durante 1 min más. Después de agitar en remolino, las partículas recubiertas de ADN se sedimentaron mediante centrifugación a 10 000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf 5415C durante 10 segundos. El sedimento de oro se lavó una vez con 500 j l de etanol al 100 % frío, se sedimentó mediante un breve giro en la microcentrífuga y se resuspendió con 50 j l de etanol helado. Después de una breve sonicación (1-2 segundos), se transfirieron inmediatamente 10 j l de partículas recubiertas de ADN a la membrana portadora.
[0400] Las cepas de Prototheca se cultivaron en un medio de proteosa (2 g/l de extracto de levadura, NaNO3 2.94 mM, CaCl2 • 2H2O 0.17 mM, MgSO4 • 7H2O 0.3 mM, K2HPO4 0.4 mM, KH2PO4 1.28 mM, NaCl 0.43 mM) con glucosa al 2 % en un agitador giratorio hasta alcanza una densidad celular de 2x106células/ml. Las células se cosecharon, se lavaron una vez con agua destilada estéril y se resuspendieron en 50 j l de medio. 1 x 107 las células se extendieron en el tercio central de una placa de medio de proteosa no selectiva. Las células se bombardearon con el sistema biolístico de liberación de partículas PDS-1000/He (Bio-Rad). Se utilizaron discos de ruptura (1350 psi) y las placas se colocaron 6 cm por debajo del conjunto de tamiz/macroportador. Se dejó que las células se recuperaran a 25 °C durante 12-24 h. Tras la recuperación, las células se rasparon de las placas con una espátula de goma, se mezclaron con 100 j l de medio y se extendieron sobre placas que contenían la selección de antibióticos apropiada. Después de 7-10 días de incubación a 25 °C, las colonias que representaban células transformadas se hicieron visibles en las placas. Las colonias se recogieron y se colocaron en placas de agar selectivas (antibiótico o fuente de carbono) para una segunda ronda de selección.
EJEMPLO 3: Transformación de Chlorella
Construcción de vectores
[0401] Un fragmento BamHI-SaclI que contenía el promotor de CMV, un ADNc de resistencia a la higromicina y una Ut R 3' del CMV (SEQ ID N.°: 152, una subsecuencia del vector pCAMBIA1380, Cambia, Canberra, Australia) se clonó en los sitios BamHI y SacII de pBluescript y se denomina en el presente documento pHyg.
Transformación biolística de Chlorella
[0402] Los portadores de oro S550d de Seashell Technology se prepararon de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se mezcló el plásmido pHyg linealizado (20 jg ) con 50 j l de tampón de unión y 60 j l (30 mg) de vehículos de oro S550d y se incubó en hielo durante 1 min. Se añadió tampón de precipitación (100 jl) y la mezcla se incubó en hielo durante 1 min más. Después de agitar en remolino, las partículas recubiertas de ADN se sedimentaron mediante centrifugación a 10 000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf 5415C durante 10 segundos. El sedimento de oro se lavó una vez con 500 j l de etanol al 100 % frío, se sedimentó mediante un breve giro en la microcentrífuga y se resuspendió con 50 j l de etanol helado. Después de una breve sonicación (1-2 segundos), se transfirieron inmediatamente 10 j l de partículas recubiertas de ADN a la membrana portadora.
[0403] Se hizo crecer un cultivo de Chlorella protothecoides (University of Texas Culture Collection 250) en un medio de proteosa (extracto de levadura 2 g/l, NaNO3 2.94 mM, CaCl2 0.17 mM • 2H2O, MgSO4 0.3 mM • 7H2O, K2HPO40.4 mM, KH2PO4 1.28 mM, NaCl 0.43 mM) en un agitador giratorio bajo luz continua a 75 jmol fotones m-2 s-1 hasta que alcanzó una densidad celular de 2x106células/ml. Las células se cosecharon, se lavaron una vez con agua destilada estéril y se resuspendieron en 50 j l de medio. 1 x 107 las células se extendieron en el tercio central de una placa de medio de proteosa no selectiva. Las células se bombardearon con el sistema biolístico de liberación de partículas PDS-1000/He (Bio-Rad). Se utilizaron discos de ruptura (1100 y 1350 psi) y las placas se colocaron 9 y 12 cm por debajo del conjunto de tamiz/macroportador. Se dejó que las células se recuperaran a 25 °C durante 12-24 h. Tras la recuperación, las células se rasparon de las placas con una espátula de goma, se mezclaron con 100 j l de medio y se extendieron sobre placas que contenían higromicina (200 jg/ml). Después de 7-10 días de incubación a 25 °C, las colonias que representaban células transformadas se hicieron visibles en las placas a partir de los discos de ruptura de 1100 y 1350 psi y de distancias de 9 y 12 cm. Las colonias se recogieron y se colocaron en placas de agar selectivas para una segunda ronda de selección.
Transformación de Chlorella por electroporación
[0404] El cultivo de Chlorella protothecoides se hizo crecer en un medio de proteosa en un agitador giratorio bajo luz continua a 75 jmol fotones m-2 s-1 hasta alcanzar una densidad celular de 2x106células/ml. Las células se cosecharon, se lavaron una vez con agua destilada estéril y se resuspendieron en un tampón de tris-fosfato (Tris-HCl 20 mM, pH 7.0; fosfato de potasio 1 mM) que contenía sacarosa 50 mM a una densidad de 4x108células/ml. Aproximadamente 250 j l de la suspensión celular (1x108células) se colocaron en una cubeta de electroporación desechable de 4 mm de gap. A la suspensión celular se le añadieron 5 jg de ADN del plásmido pHyg linealizado y 200 jg de ADN portador (ADN de esperma de salmón cortado). La cubeta de electroporación se incubó luego en un baño de agua a 16 °C durante 10 minutos. A continuación, se aplicó un pulso eléctrico (1100 V/cm) a la cubeta con una capacidad de 25 jF (no se utilizó ninguna resistencia de derivación para la electroporación) usando un aparato de electroporación Gene Pulser II (Bio-Rad Labs, Hercules, CA). A continuación, la cubeta se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos, tras lo cual la suspensión celular se transfirió a 50 ml de medio de proteosa y se agitó en un agitador giratorio durante 2 días. Después de la recuperación, las células se cosecharon mediante centrifugación a baja velocidad, se resuspendieron en un medio de proteosa y se colocaron a baja densidad en placas suplementadas con 200 jg/ml de higromicina. Las placas se incubaron bajo luz continua a 75 jmol fotones m-2 s-1. Los transformantes aparecieron como colonias en 1-2 semanas. Las colonias se recogieron y se colocaron en placas de agar selectivas para una segunda ronda de selección.
Genotipado
[0405] Un subconjunto de colonias que sobrevivió a una segunda ronda de selección se cultivó en un volumen pequeño y se cosechó. Se resuspendieron sedimentos de aproximadamente 5-10 j l de volumen en 50 j l de NaEDTA 10 mM mediante agitación en remolino y luego se incubaron a 100 °C durante 10. Los tubos se agitaron en remolino brevemente y se sonicaron durante 10 segundos, luego se centrifugaron a 12 000 x g durante 1 minuto. Se utilizaron 2 j l de sobrenadante como plantilla en una reacción de PCR de 50 jl. Los cebadores utilizados para el genotipado fueron la SEQ ID N.°: 153 y SEQ ID N.°: 154. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 95 °C 5 min x 1 ciclo; 95 °C 30 s - 58 °C 30 s - 72 °C 1 min 30 s x 35 ciclos; 72 °C 10 min x 1 ciclo. El fragmento esperado de 992 pb se encontró en 6 de las 10 colonias del método biolístico y en una sola colonia de electroporación. Una banda inespecífica de menor tamaño estaba presente en todos los carriles. Para confirmar la identidad del fragmento amplificado de 992 pb, se escindieron del gel y se secuenciaron individualmente dos bandas biolísticas y la banda de electroporación. La secuencia de las tres bandas correspondía al fragmento esperado de 992 pb. (Escalera de ADN: Bionexus® All Purpose Hi-Lo® DNA ladder n.° de catálogo BN2050). EJEMPLO 4: Promotores y genes derivados de algas para su uso en microalgas
A. Secuencias promotoras y 5'UTR de Chlorella protothecoides
[0406] Se generó una genoteca de ADNc a partir de cultivos mixotróficos de Chlorella protothecoides (UTEX 250) utilizando técnicas estándar. Basándose en las secuencias de ADNc, se diseñaron cebadores en ciertos genes de mantenimiento conocidos, para "caminar" en dirección hacia 5' de las regiones codificantes utilizando el kit DNA Walking de Seegene (Rockville, MD). Las secuencias aisladas incluyen un promotor/UTR de actina (SEQ ID N.°: 155) y un factor de elongación-la (EF1a) (SEQ ID N.°: 156), los cuales contienen intrones (mostrados en minúsculas) y exones (mayúsculas en cursiva ) y el sitio de inicio previsto (en negrita) y dos elementos del promotor de beta-tubulina/UTR: Isoforma A (SEQ ID N.°: 157) e Isoforma B (SEQ ID N.°: 158).
B Enzimas de la biosíntesis de lípidos y secuencias dirigidas a los plástidos de C. protothecoides
[0407] De la genoteca de ADNc descrita anteriormente, tres ADNc que codifican proteínas funcionales en el metabolismo de lípidos en Chlorella protothecoides (UTEX 250) se clonaron usando los mismos métodos descritos anteriormente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para una acil-ACP-desaturasa (SEQ ID N.°: 159 y 160) y dos geranil difosfato sintasas (SEQ ID N.°: 161-164) se incluyen en el listado de secuencias más adelante. Además, también se clonaron tres ADNc con secuencias señal putativas dirigidas al plástido. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (SEQ ID N.°: 165 y 166), una proteína compleja de desprendimiento de oxígeno OEE33 (SEQ ID N.°: 167 y 168) y una proteasa Clp (SEQ ID N.°: 169 y 170) se incluyen en el listado de secuencias más adelante. La secuencia putativa dirigida al plástido se ha subrayado tanto en la secuencia de nucleótidos como en la de aminoácidos. Las secuencias dirigidas a plástidos pueden usarse para dirigir los productos de transgenes a los plástidos de microbios, tales como las enzimas de modificación de lípidos.
EJEMPLO 5: Ingeniería genética de Chlorella protothecoides para expresar una sacarosa invertasa exógena [0408] Cepas y medios: Chlorella protothecoides (UTEX 250) se obtuvo de la colección de cultivos de algas de la Universidad de Texas (Austin, TX, EE. UU.). Los cultivos madre se mantuvieron en un medio de proteosa modificado. El medio de proteosa modificado consta de 0.25 g de NaNO3, 0.09 g de K2HPO4, 0.175 g de KH2PO4, 0.025 g de CaC^ 2H2O, 0.075 g de MgSO4- 7H2O y 2 g de extracto de levadura por litro (g/l).
[0409] Construcción de plásmidos: Para expresar la forma secretada de invertasa en Chlorella protothecoides, un gen SUC2 de Saccharomyces cerevisiae se colocó bajo el control de tres promotores diferentes: el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CMV), el promotor del virus de Chlorella (NC-1A) y el promotor HUP1 de Chlorella. Se sintetizó un gen de levadura SUC2 para adaptarse al uso de codones optimizado para C. protothecoides e incluye una secuencia señal requerida para dirigir la secreción extracelular de invertasa. Cada constructo se construyó en pBluescript KS , y los sitios EcoRI/AscI, AscI/XhoI y XhoI/BamHI se introdujeron en cada promotor, gen de invertasa y 3'UTR del CMV, respectivamente, mediante amplificación por PCR utilizando cebadores específicos. Los productos de PCR purificados se clonaron secuencialmente.
[0410] Transformación de Chlorella protothecoides: Un cultivo de Chlorella protothecoides se hizo crecer en un medio de proteosa modificado en un agitador giratorio bajo luz continua a 75 pmol fotones m-2 s-1 hasta alcanzar una densidad celular de 6x106células/ml.
[0411] Para la transformación biolística, se prepararon portadores de oro S550d de Seashell Technology de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se mezcló un constructo linealizado (20 pg) mediante BsaI con 50 pl de tampón de unión y 60 pl (3 mg) de portadores de oro S550d y se incubó en hielo durante 1 min. Se añadió tampón de precipitación (100 pl) y la mezcla se incubó en hielo durante 1 min más. Después de agitar suavemente en remolino, las partículas recubiertas de ADN se sedimentaron mediante centrifugación a 10000 rpm en una microesfera Eppendorf durante 10 segundos. El sedimento de oro se lavó una vez con 500 pl de etanol al 100 % frío, se sedimentó mediante un breve giro en la microcentrífuga y se resuspendió con 50 pl de etanol helado. Después de una breve sonicación (1-2 segundos), se transfirieron inmediatamente 10 pl de partículas recubiertas de ADN a la membrana portadora. Las células se cosecharon, se lavaron una vez con agua destilada estéril, se resuspendieron en 50 pl de medio (1 x 107 células) y se extendieron en el tercio central de una placa Proteous no selectiva. Las células se bombardearon con el sistema biolístico de liberación de partículas PDS-1000/He (Bio-Rad). Se utilizaron discos de ruptura (1100 y 1350 psi) y las placas se colocaron 9­ 12 cm por debajo del conjunto de tamiz/macroportador. Se dejó que las células se recuperaran a 25 °C durante 12-24 horas. Tras la recuperación, las células se rasparon de las placas con una espátula de goma, se mezclaron con 100 pl de medio y se extendieron sobre placas de proteosa modificadas con sacarosa al 1 %. Después de 7-10 días de incubación a 25 °C a oscuras, las colonias que representaban células transformadas se hicieron visibles en las placas.
[0412] Para la transformación con electroporación, las células se cosecharon, se lavaron una vez con agua destilada estéril y se resuspendieron en un tampón de tris-fosfato (Tris-HCl 20 mM, pH 7.0; fosfato de potasio 1 mM) que contenía sacarosa 50 mM a una densidad de 4x108células/ml. Aproximadamente 250 pl de la suspensión celular (1x108células) se colocaron en una cubeta de electroporación desechable de 4 mm de gap. A la suspensión celular se le añadieron 5 pg de ADN del plásmido linealizado y 200 pg de ADN portador (ADN de esperma de salmón cortado). La cubeta de electroporación se incubó luego en un baño de agua helada a 16 °C durante 10 min. A continuación, se aplicó un pulso eléctrico (1100 V/cm) a la cubeta con una capacidad de 25 pF (no se utilizó ninguna resistencia de derivación para la electroporación) usando un aparato de electroporación Gene Pulser II (Bio-Rad Labs, Hercules, CA). A continuación, la cubeta se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos, tras lo cual la suspensión celular se transfirió a 50 ml de medio de proteosa modificado y se agitó en un agitador giratorio durante 2 días. Después de la recuperación, las células se cosecharon a baja velocidad (4000 rpm), se resuspendieron en un medio de proteosa modificado y se sembraron en placas a baja densidad sobre placas de proteosa modificadas con sacarosa al 1 %. Después de 7-10 días de incubación a 25 °C a oscuras, las colonias que representaban células transformadas se hicieron visibles en las placas.
[0413] Cribado de transformantes y genotipado: Las colonias se recogieron de las placas de proteosa modificadas cultivadas a oscuras con sacarosa al 1 % y aproximadamente la misma cantidad de células se transfirió a placas de 24 pocillos que contenían 1 ml de medio líquido de proteosa modificado con sacarosa al 1 %. Los cultivos se mantuvieron a oscuras y se agitaron mediante un agitador orbital de Labnet (Berkshire, Reino Unido) a 430 rpm durante 5 días.
[0414] Para verificar la presencia del gen invertasa introducido en transformantes de Chlorella, el ADN de cada transformante se aisló y amplificó con un conjunto de cebadores específicos de genes (constructo CMV: cebador directo (CAACCACGTCTTCAAAGCAA) (SEQ ID N.°: 153)/cebador inverso (TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA) (SEQ ID N.°: 171), constructos CV: cebador directo (TTGTCGGAATGTCATATCAA) (SEQ ID N.°: 172)/cebador inverso (TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA) (SEQ ID N.°: 171) y constructo HUP1: cebador directo (AACGCCTTTGTACAACTGCA) (SEQ ID N.°: 173)/cebador inverso (TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA) (SEQ ID N. °: 171)). Para el aislamiento rápido del ADN, se resuspendió un volumen de células (aproximadamente de 5 a 10 pl de tamaño) en 50 pl de Na-EDTA 10 mM. La suspensión celular se incubó a 100 °C durante 10 min y se sonicó durante 10 s. Después de centrifugar a 12000 g durante 1 min, se utilizaron 3 pl de sobrenadante para la reacción de PCR. La amplificación por PCR se realizó en el termociclador de ADN (Perkin-Elmer GeneAmp 9600). La mezcla de reacción (50 pl) contenía 3 pl de ADN extraído, 100 pmol de cada uno de los cebadores respectivos descritos anteriormente, dNTP 200 pM, 0.5 unidades de Taq ADN polimerasa (NEB) y tampón de Taq ADN polimerasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La desnaturalización del ADN se llevó a cabo a 95 °C durante 5 minutos durante el primer ciclo y luego durante 30 segundos. Las reacciones de hibridación y extensión del cebador se llevaron a cabo a 58 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 min, respectivamente. A continuación, los productos de la PCR se visualizaron en geles de agarosa al 1 % teñidos con bromuro de etidio.
[0415] Crecimiento en cultivo líquido: Después de cinco días de crecimiento a oscuras, los transformantes con genotipo positivo mostraron un crecimiento en un medio líquido de proteosa mínimo sacarosa al 1 % a oscuras, mientras que las células de tipo salvaje no mostraron crecimiento en el mismo medio a oscuras.
EJEMPLO 6: Transformación de cepas de algas con una invertasa secretada derivada de S. cerevisiae
[0416] Invertasa secretada: Un gen que codifica una sacarosa invertasa secretada (número de acceso de Gen Bank NP_012104 a partir de Saccharomyces cerevisiae) se sintetizó de novo como un fragmento Asc I-Xho de 1599 pb que posteriormente se subclonó en un derivado de pUC19 que poseía el promotor 35s del virus del mosaico de la coliflor y la 3'UTR como casetes EcoR I/Asc I y Xho/Sac I, respectivamente .
[0417] Crecimiento de las células de algas: Los medios utilizados en estos experimentos fueron medios base líquidos (2 g/l de extracto de levadura, NaNO32.94 mM, CaCb* 2H2O 0.17 mM, MgSO4* 7H2O 0.3 mM, K2HPO4 O. 4 mM, KH2PO41.28 mM, NaCl 0.43 mM) y medios base sólidos (+ agarosa al 1.5 %) que contienen carbono fijo en forma de sacarosa o glucosa (según se designe) a una concentración final del 1 %. Las cepas utilizadas en este experimento no crecieron a oscuras sobre un medio base en ausencia de una fuente adicional de carbono fijo. Las especies se sembraron en placas y se cultivaron a oscuras a 28 °C. Se recogieron las colonias individuales y se usaron para inocular 500 ml de medio base líquido que contenía glucosa al 1 % y se dejaron crecer a oscuras hasta la fase logarítmica media, midiendo los recuentos de células cada día. Previamente se había examinado el crecimiento de cada una de las siguientes cepas en sacarosa a oscuras como única fuente de carbono y no mostraron crecimiento, por lo que se eligieron para la transformación con una invertasa secretada: (1) Chlorella protothecoides (UTEX 31); (2) Chlorella minutissima (UTEX 2341); y (3) Chlorella emersonii (CCAP 211/15).
[0418] Transformación de las células de algas mediante bombardeo de partículas: Se centrifugó suficiente cultivo para dar aproximadamente 1-5 x 108 células totales. El sedimento resultante se lavó con medio base sin añadir una fuente de carbono fijo. Las células se centrifugaron nuevamente y el sedimento se resuspendió en un volumen de medio base suficiente para dar de 5 x 107 a 2 x 108 células/ml. A continuación, se sembraron 250­ 1000 |_il de células en un medio base sólido suplementado con sacarosa al 1 % y se dejaron secar sobre la placa en una campana estéril. El ADN plasmídico se precipitó sobre partículas de oro de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Seashell Technology, La Jolla, CA). Las transformaciones se llevaron a cabo usando un sistema de liberación de partículas BioRad PDS He-1000 usando discos de ruptura de 1350 psi con el conjunto de macroportador colocado a 9 cm del soporte del disco de ruptura. Después de las transformaciones, las placas se incubaron a oscuras a 28 °C. Todas las cepas generaron múltiples colonias transformantes. Las placas de control transformadas sin insertos de invertasa, pero, por lo demás, preparadas de manera idéntica, no contenían colonias.
[0419] Análisis de los transformantes de Chlorella protothecoides: El ADN genómico se extrajo de las células de Chlorella protothecoides de tipo salvaje y de las colonias transformantes de la siguiente manera: Las células se resuspendieron en 100 |_il de tampón de extracción (Tris Cl 87.5 mM, pH 8.0, NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8.0, SDS al 0.25 %) y se incubaron a 60 °C, mezclando ocasionalmente mediante inversión, durante 30 minutos. Para la PCR, las muestras se diluyeron 1: 100 en Tris Cl 20 mM, pH 8.0.
[0420] El genotipado se realizó en ADN genómico extraído de las TS, los transformantes y el ADN plasmídico. Las muestras se genotiparon para el gen marcador. Los cebadores 2383 (5' CT GACCCGACCT ATGGGAGCGCTCTTGGC 3') (SEQ ID N.°: 174) y 2279 (5' CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3') (SEQ ID N.°: 175) se usaron en esta PCR de genotipado. El perfil de PCR utilizado fue el siguiente: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 60 °C 30 s, 72 °C 3 minutos; 72 °C 5 min. Se amplificó una banda de idéntico tamaño a partir de los controles positivos (plásmido) y de dos transformantes de Chlorella protothecoides (UTEX 31).
[0421] Análisis de los transformantes de Chlorella minutissima y Chlorella emersonii: el ADN genómico se extrajo de Chlorella de TS y los transformantes de la siguiente manera: las células se resuspendieron en 100 |_il de tampón de extracción (Tris Cl 87.5 mM, pH 8.0, NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8.0, SDS al 0.25 %) y se incubaron a 60 °C, mezclando ocasionalmente mediante inversión, durante 30 minutos. Para la PCR, las muestras se diluyeron 1: 100 en Tris Cl 20 mM, pH 8.0. El genotipado se realizó en ADN genómico extraído de las TS, los transformantes y el ADN plasmídico. Las muestras se genotiparon para el gen marcador. Los cebadores 2336 (5' GTGGCCATATGGACTTACAA 3') (SEQ ID N.°: 176) y 2279 (5' CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3') (SEQ ID N.°: 175) se designaron como conjunto cebador 2 (1215 pb del producto esperado), mientras que los cebadores 2465 (5 ' CAAGGGCTGGAT GAAT GACCCCAATGGACT GTGGT ACGACG 3 ') (SEQ ID N.°: 177) y 2470 (5' CACCCGTCGTCATGTTCACGGAGCCCAGTGCG 3') (SEQ ID N.°: 178) se designaron como conjunto cebador 4 (1442 pb del producto esperado). El perfil de PCR utilizado fue el siguiente: desnaturalización a 94 °C durante 2 min; 29 ciclos a 94 °C 30 s, 60 °C 30 s, 72 °C 1 minuto, 30 s; 72 °C 5 min. Se usó un control de plásmido que contenía la invertasa secretada como control de PCR.
[0422] La secuencia del constructo de invertasa corresponde a la SEQ ID N.°: 8.
EJEMPLO 7: Recombinación homóloga en la especie Prototheca
[0423] La recombinación homóloga de transgenes tiene varias ventajas. Primero, la introducción de transgenes sin recombinación homóloga puede ser impredecible porque no hay control sobre el número de copias del plásmido que se introduce en la célula. Además, la introducción de transgenes sin recombinación homóloga puede ser inestable porque el plásmido puede permanecer episómico y se pierde en las divisiones celulares posteriores. Otra ventaja de la recombinación homóloga es la capacidad de "inactivar" los genes diana, introducir etiquetas de epítopos, cambiar los promotores de genes endógenos y otros modos alterar los genes diana (por ejemplo, la introducción de mutaciones puntuales).
[0424] Se construyeron dos vectores usando una región específica de Prototheca moriformis (UTEX 1435), denominada KE858. KE858 es un fragmento genómico de 1.3 kb que abarca parte de la región codificante de una proteína que comparte homología con la familia de proteínas del ARN de transferencia (ARNt). Las transferencias de Southern han demostrado que la secuencia de KE858 está presente en una sola copia en el genoma de Prototheca moriformis (UTEX 1435). El primer tipo de vector que se construyó, denominado SZ725 (SEQ ID N.°: 179), consistía en el fragmento KE858 completo de 1.3 kb clonado en un esqueleto del vector pUC19 que también contiene el gen de la invertasa de levadura optimizada (suc2). El fragmento KE858 contiene un sitio SnaB1 único que no se encuentra en ningún otro lugar del constructo de direccionamiento. El segundo tipo de vector que se construyó, denominado SZ726 (SEQ ID N.°: 180), consistía en la secuencia KE858 que había sido interrumpida por la inserción del gen de la invertasa de levadura (suc2) en el sitio SnaB1 dentro de la secuencia genómica de KE858. El fragmento de ADN completo que contiene las secuencias de KE858 que flanquean el gen de la invertasa de levadura puede escindirse del esqueleto del vector mediante digestión con EcoRI, que corta en cualquier extremo de la región KE858.
[0425] Ambos vectores se utilizaron para dirigir la recombinación homóloga del gen de la invertasa de levadura (suc2) en la región KE858 correspondiente del genoma de Prototheca moriformis (UTEX 1435) . Los extremos lineales del ADN homólogos a la región genómica que estaba siendo el objetivo de la recombinación homóloga se expusieron digiriendo el constructo del vector SZ725 con SnaB1 y el constructo del vector SZ726 con EcoRI. Los constructos del vector digeridos se introdujeron luego en los cultivos de Prototheca moriformis utilizando los métodos descritos anteriormente. Los transformantes de cada constructo de vector se seleccionaron luego usando placas de sacarosa. Se analizaron diez transformantes independientes, clonalmente puros de cada transformación de vector para la recombinación exitosa del gen de la invertasa de levadura en la ubicación genómica deseada (usando transferencias Southern) y para la estabilidad del transgén.
[0426] El análisis de transferencia Southern de los transformantes SZ725 mostró que 4 de los 10 transformantes seleccionados para el análisis contenían las bandas recombinantes previstas, lo que indicaba que se había producido un solo evento de cruce entre las secuencias de KE858 en el vector y las secuencias de KE858 en el genoma. Por el contrario, los diez transformantes SZ726 contenían las bandas recombinantes previstas, lo que indicaba que se habían producido eventos de doble cruce entre el fragmento EcoRI de pSZ726 que porta la secuencia KE858 que flanquea el transgén de levadura invertasa y la región KE858 correspondiente del genoma.
[0427] La expresión de sacarosa invertasa y la estabilidad del transgén se evaluaron cultivando los transformantes durante más de 15 generaciones en ausencia de selección. Se seleccionaron los cuatro transformantes SZ725 y los diez transformantes SZ276 que dieron positivo para el transgén por transferencia Southern y se cultivaron en serie 48 colonias individuales de cada uno de los transformantes: primero sin selección en medios con contenido glucosa y luego con selección en medios con contenido de sacarosa como única fuente de carbono. Los diez transformantes SZ276 (100 %) conservaron su capacidad para crecer en sacarosa después de 15 generaciones, mientras que aproximadamente el 97 % de los transformantes SZ725 retuvieron su capacidad para crecer en sacarosa después de 15 generaciones. Los transgenes introducidos por un evento de doble cruce (vector SZ726) tienen una estabilidad extremadamente alta a lo largo de las duplicaciones de generación. Por el contrario, los transgenes introducidos mediante un solo evento cruzado (vector SZ725) pueden dar lugar a cierta inestabilidad a lo largo de las duplicaciones de generación, ya que si se introdujeron copias en tándem de los transgenes, las regiones homólogas repetidas que flanquean los transgenes pueden recombinarse y escindir el ADN transgénico ubicado entre ellos. .
[0428] Estos experimentos demuestran el uso exitoso de la recombinación homóloga para generar transformantes de Prototheca que contienen un gen de sacarosa invertasa heterólogo que está integrado de forma estable en los cromosomas nucleares del organismo. El éxito de la recombinación homóloga permite otras alteraciones genómicas en Prototheca, incluyendo deleciones de genes, mutaciones puntuales y etiquetado de epítopos de un producto génico deseado. Estos experimentos también demuestran el primer sistema documentado para la recombinación homóloga en el genoma nuclear de una microalga eucariota.
Uso de la recombinación homóloga para inactivar un gen endógeno de Prototheca moriformis:
[0429] En un cribado de ADNc/genómico de Prototheca moriformis, como el descrito anteriormente en el ejemplo 4, se identificó un ADNc de estearoil ACP desaturasa (SAPD) endógeno. Las enzimas estearoil ACP desaturasa son parte de la ruta de síntesis de lípidos y sirven para introducir dobles enlaces en las cadenas de acilo graso. En algunos casos, puede resultar beneficioso eliminar o reducir la expresión de las enzimas de la ruta lipídica para alterar un perfil de ácidos grasos. Se creó un constructo de recombinación homóloga para evaluar si la expresión de una enzima estearoil ACP desaturasa endógena se puede reducir (o inactivar) y si se puede observar una reducción correspondiente en los ácidos grasos insaturados en el perfil lipídico de la célula huésped. Se identificó y se clonó una secuencia codificante de aproximadamente 1.5 kb de un gen de estearoil ACP desaturasa de Prototheca moriformis (UTEX 1435) (SEQ ID N.°: 181). El constructo de recombinación homólogo se construyó utilizando 0.5 kb de la secuencia codificante de SAPD en el extremo 5' (sitio de dirección 5'), seguido del promotor de la p-tubulina de Chlamydomonas reinhardtii que impulsaba un gen suc2 de la sacarosa invertasa de levadura optimizada por codón con la 3'UTR de Chlorella vulgaris. El resto (~1kb) de la secuencia codificante de la SAPD de Prototheca moriformis se insertó entonces después de la 3'UTR de C. vulgaris para formar el sitio diana 3'. La secuencia para este casete de recombinación homóloga se enumera en la SEQ ID N.°: 182. Como se ha mostrado antes, la tasa de éxito para la integración del casete de recombinación homóloga en el genoma nuclear se puede aumentar linealizando el casete antes de transformar las microalgas, dejando los extremos expuestos. . El casete de recombinación homóloga dirigido a una enzima SAPD endógena en Prototheca moriformis se linealiza y luego se transforma en la célula huésped (Prototheca moriformis, UTEX 1435). Una integración exitosa eliminará la región codificante de la enzima SAPD endógena del genoma del huésped a través de un evento de recombinación recíproca doble, mientras que la expresión del gen suc2 recién insertado será regulada por el promotor de p-tubulina de C.reinhardtii . Los clones resultantes se pueden cribar usando placas/medios que contienen sacarosa como única fuente de carbono. Los clones que contienen una integración exitosa del casete de recombinación homóloga tendrán la capacidad de crecer en sacarosa como única fuente de carbono y los cambios en la saturación general de los ácidos grasos en el perfil lipídico servirán como factor de confirmación secundario. Además, los ensayos de transferencia Southern que utilizan una sonda específica para el gen suc2 de la sacarosa invertasa de levadura y la RT-PCR también pueden confirmar la presencia y la expresión del gen de invertasa en clones positivos. Como alternativa, se puede usar el mismo constructo sin el promotor de p-tubulina para escindir la región codificante de la enzima SAPD endógena. En este caso, el gen suc2 recién insertado de la sacarosa invertasa de levadura estará regulado por el promotor de SAPD endógeno/5'UTR.
EJEMPLO 8: Expresión de varias tioesterasas en Prototheca
[0430] Los métodos y los efectos de la expresión de un gen de tioesterasa heterólogo en la especie Prototheca se han descrito previamente en la solicitud PCT n.° PCT/US2009/66142. Se investigó más a fondo el efecto de otros genes de tioesterasa/productos génicos de especies de plantas superiores. Estas tioesterasas incluyen tioesterasas de las siguientes plantas superiores:
Especie N°. de acceso a GenBank Especificidad SEQ ID N.°:
Cinnamomum camphora Q39473 C14 SEQ ID N.°: 30-31 Umbellularia californica Q41635 C10-C12 SEQ ID N.°: 34-35 Cuphea hookeriana AAC49269 C8-C10 SEQ ID N.°: 32-33 Cuphea palustris AAC49179 C8 SEQ ID N.°: 36-37 Cuphea lanceolata CAB60830 C10 SEQ ID N.°: 38-39
Iris germanica AAG43858.1 C14 SEQ ID N.°: 40-41 Myristica fragrans AAB717291.1 C14 SEQ ID N.°: 42-43 Cuphea palustris AAC49180 C14 SEQ ID N.°: 44-45 Ulmus americana AAB71731 amplia SEQ ID N.°: 46-47
[0431] En todos los casos, cada uno de los constructos de tioesterasa anteriores se transformó en Prototheca moriformis (UTEX 1435) utilizando bombardeo de partículas biolísticas. Otros métodos de transformación que incluyen la recombinación homóloga tal como se describe en la solicitud PCT n.° PCT/US2009/66142, también serían adecuados para la expresión heteróloga de los genes de interés. Se realizó la transformación de Prototheca moriformis (UTEX 1435) con cada una de las construcciones de tioesterasa anteriores usando los métodos descritos en el ejemplo 2. Cada uno de los constructos contenía un gen NeoR y la selección de clones positivos se llevó a cabo usando 100 pg/ml de G418. Todas las regiones codificantes se optimizaron por codón para reflejar el sesgo de codones inherente en los genes nucleares de Prototheca moriformis UTEX 1435 (ver tabla 2). Tanto las secuencias de aminoácidos como las secuencias de ADNc para el constructo utilizado se enumeran en la lista de identidades de secuencia. El péptido de tránsito para cada una de las tioesterasas de plantas superiores se reemplazó con un péptido de tránsito de algas con codones optimizados de la desaturasa de ácido graso delta 12 de Prototheca moriformis (SEQ ID N.°: 48)) o de la estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides (SEQ ID N.°: 49). Todos los constructos de tioesterasa fueron impulsados por el promotor de beta-tubulina/5'UTR de Chlamydomonas reinhardtii. El crecimiento y la producción de lípidos de clones positivos seleccionados se compararon con el tipo salvaje (sin transformar) de Prototheca moriformis (UTEX 1435). Los clones de tipo salvaje y positivos seleccionados se cultivaron en placas de glucosa G418 al 2 %. El análisis de los perfiles lipídicos en clones positivos seleccionados para cada constructo se resume a continuación (expresado en % de área) en la tabla 15.
Tabla 15. Perfiles lipídicos de Prothoteca moriformis que expresan varias tioesterasas heterólogas
Tioesterasa
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[0432] Los resultados muestran que todas las tioesterasas expresaron perfiles de ácidos grasos afectados hasta cierto nivel. En cuanto a la fila "saturados totales", el grado de saturación se vio profundamente afectado por la expresión de varias de las tioesterasas, incluyendo las de U. califomica, C. camphora, y más notablemente, U. americana. Estos cambios en el porcentaje de saturados totales fueron inesperados en el sentido de que la expresión heteróloga de tioesterasas de plantas superiores aparentemente puede afectar más que simplemente las longitudes de las cadenas lipídicas; también pueden afectar otros atributos de los perfiles lipídicos producidos por las microalgas, a saber, el grado de saturación de los ácidos grasos.
[0433] Se cultivaron adicionalmente clones seleccionados transformados con tioesterasa C8 de C. palustris, tioesterasa de C. hookeriana, tioesterasa de U. californica y de C. camphora en cantidades variables de G418 (de 25 mg/l a 50 mg/l) y a temperaturas variables (de 22 °C a 25 °C) y se determinó el perfil lipídico para estos clones. La tabla 16 resume el perfil lipídico (en % de área) de los clones representativos que contienen cada tioesterasa. Un segundo constructo que contenía la tioesterasa de U. americana se construyó y se transformó en Prototheca moriformis (UTEX 1435) utilizando los métodos biolísticos descritos anteriormente. Este segundo constructo se introdujo en la célula mediante recombinación homóloga. Los métodos de recombinación homóloga en la especie Prototheca se han descrito previamente en la solicitud PCT n.° PCT/US2009/66142. El ADN homólogo que se utilizó fue el de la secuencia de ADN genómico del ARNr 6S de Prototheca moriformis UTEX 1435. El agente de selección fue la capacidad de crecer en sacarosa, utilizando un gen suc2 con codones optimizados de S. cerevisiae impulsado por el promotor de beta tubulina de C. reinhardtii. El péptido de tránsito nativo de U. americana fue reemplazado por el péptido de tránsito de estearoil ACP desaturasa de Chlorella Protothecoides (UTEX 250) . El ADNc de este constructo se enumera en el listado de secuencias como la SEQ ID N.°: 50. La selección de clones positivos se realizó en placas de sacarosa al 2 % y los cultivos resultantes para la determinación del perfil lipídico también se cultivaron en un medio que contenía sacarosa al 2 %. Un perfil lipídico representativo para esta cepa de Prototheca moriformis que contiene una tioesterasa heteróloga recombinada homólogamente de U. americana se resume en la tabla 16.
Tabla 1 . P rfil li í i Pr h m rif rmi ni n n n i r h r l .
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[0434] Al igual que con los clones descritos anteriormente, todos los transformantes que contienen un gen de tioesterasa heterólogo mostraron perfiles de ácidos grasos afectados hasta cierto nivel, y el porcentaje total de ácidos grasos saturados también se modificó, en comparación con el tipo salvaje (sin transformar) de Prototheca moriformis. Los Prototheca moriformis que contenían la tioesterasa de U. americana introducida mediante recombinación homóloga tuvieron el mayor aumento en saturados totales.
[0435] Además, los clones transgénicos que contienen la tioesterasa exógena de C. hookeriana, C. camphora, U. californica o U. americana se evaluaron en busca de nuevos perfiles lipídicos. El clon con contenido de tioesterasa de C. hookeriana logró el siguiente perfil lipídico cuando se cultivó en glucosa al 2 %, 25 mg/ml de G418 a 22 °C: 5.10 % de C8: 0; 18.28 % de C18: 0; 0.41 % de C12: 0; 1.76 % de C14: 0; 16.31 % de C16: 0; 1.40 % de C18: 0; 40.49 % de C18: 1; y 13.16 % de C18: 2. El clon con contenido de tioesterasa de C. camphora (que también contiene una sacarosa invertasa exógena) logró el siguiente perfil lipídico cuando se cultivó en sacarosa al 2 % a 25 °C: 0.04 % de C18: 0; 6.01 % de C12: 0; 35.98 % de C14: 0; 19.42 de C16: 0; 1.48 % de C18: 0; 25.44 % de C18: 1; y 9.34 % de C18: 2. El clon con contenido de tioesterasa de U. californica logró el siguiente perfil lipídico cuando se cultivó en glucosa al 2 %, 25-100 mg/ml de G418 a 22 °C: 0 % de C8: 0; 0.11 % de C18: 0; 34.01 % de C12: 0; 5.75 % de C14: 0; 14.02 % de C16: 0; 1.10 % de C18: 0; 28.93 % de C18: 1; y 13.01 % de C18: 2. El clon con contenido de tioesterasa de U. americana logró el siguiente perfil lipídico cuando se cultivó en glucosa al 2 % a 28 °C: 1.54 % de C18: 0; 0.43 % de C12: 0; 7.56 % de C14: 0; 39.45 % de C16: 0; 2.49 % de C18: 0; 38.49 % de C18: 1; y 7.88 % de C18: 2.
EJEMPLO 9: Transformación de Prototheca con múltiples genes de tioesterasa heterólogos exógenos
[0436] La cepa de microalgas de Prototheca moriformis (UTEX 1435) se transformó usando los métodos descritos anteriormente para expresar múltiples tioesterasas en un solo clon. La expresión de múltiples tioesterasas en un solo clon permite que las microalgas produzcan aceites con perfiles de ácidos grasos completamente diferentes de los elaborados cuando una tioesterasa individual se expresa sola (como se ha demostrado en los ejemplos precedentes). La Prototheca moriformis (UTEX 1435) se transformó por primera vez con la tioesterasa de Cinnamomum camphora (una tioesterasa con preferencia por C14) junto con un gen de sacarosa invertasa, el suc2 de S. cerevisiae (la selección fue la capacidad de crecer en sacarosa) usando recombinación homóloga. El ADN utilizado para este constructo de recombinación homóloga es el de la región KE858 del ADN genómico de Prototheca moriformis tal como se ha descrito en la sección III anteriormente. La parte relevante de este constructo se enumera en el listado de secuencias como la SEQ ID N.°: 51. Los clones positivos se cribaron en placas que contenían sacarosa. A continuación, se volvió a transformar un clon positivo con uno de los tres casetes, cada uno de los cuales codificaba la resistencia al antibiótico G418, así como una tioesterasa adicional: (1) el gen de la tioesterasa de Cuphea hookeriana (con preferencia por C8-10), SEQ ID N.°: 52; (2) el gen de la tioesterasa de Umbellularia californica (con preferencia por C12), SEQ ID N.°: 53; o la tioesterasa de Ulmus americana (amplia; con preferencia por C10-C16), SEQ ID N.°: 54. La secuencia de la porción relevante de cada construcción está incluida en el listado de secuencias. Los clones que expresan ambos genes de tioesterasa se seleccionaron en un medio que contenía sacarosa con 50 pg/ml de G418. Se seleccionaron y cultivaron los clones positivos y se ensayó el perfil lipídico. La tabla 17 resume el perfil lipídico de los clones positivos representativos (expresados en % de área).
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[0437] Además, un clon de doble tioesterasa con tioesterasas de C. camphora y U. californica se cultivó en un medio que contenía sacarosa al 2 % con 50 mg/l de G418 a 22 °C. El perfil de ácidos grasos obtenido de esta cepa en estas condiciones de crecimiento fue: C8: 0 (0); C10: 0 (0.10); C12: 0 (31.03); C14: 0 (7.47); C16: 0 (15.20); C18: 0 (0.90); C18: 1 (30.60); C18: 2 (12.44); y C18: 3a (1.38), con saturados totales de 54.7.
[0438] Se produjeron clones de doble tioesterasa con dos constructos de recombinación homóloga (uno dirigido a la región 6S y el otro dirigido a la región KE858) que contenían la tioesterasa de C. camphora. Un clon representativo positivo tenía un perfil de ácidos grasos de: 0 % de C8: 0; 0.06 % de C18: 0; 5.91 % de C12: 0; 43.27 % de C14: 0; 19.63 % de C16: 0; 0.87 % de C18: 0; 13.96 % de C18: 1; y 13.78 % de C18: 2, con saturados totales de 69.74 %. Este clon tenía un nivel de C12-C14 por encima del 49 %, que es más de 37 veces el nivel de C12-C14 en las células de tipo salvaje.
[0439] Los datos anteriores muestran que se pueden coexpresar múltiples tioesterasas con éxito en microalgas. La coexpresión de múltiples tioesterasas da como resultado perfiles de ácidos grasos alterados que difieren significativamente no solo de la cepa de tipo salvaje, sino también del perfil de ácidos grasos obtenido por la expresión de cualquiera de las tioesterasas individuales. La expresión de múltiples tioesterasas con especificidad de longitud de cadena superpuesta puede dar lugar a aumentos acumulativos en esos ácidos grasos específicos.
[0440] La expresión de las tioesterasas heterólogas (solas o en combinación) en Prototheca moriformis no solo altera los perfiles de ácidos grasos/lípidos en la cepa huésped, sino que, en comparación con los aceites actualmente disponibles de una variedad de cultivos de semillas (tabla 5), estos perfiles son de aceites verdaderamente únicos que no se encuentran en ningún otro sistema actualmente disponible. Las cepas transgénicas no solo muestran diferencias significativas con respecto a la cepa de tipo salvaje no transformada, sino que tienen perfiles notablemente diferentes de cualquiera de los aceites comerciales que se muestran en la tabla 5. Como ejemplo, tanto el aceite de coco como el de palmiste tienen niveles de ácidos grasos C8-C10 que oscilan entre el 5.5 y el 17 %. La cepa transgénica que expresa la tioesterasa de C. palustris con preferencia por C8 o la tioesterasa de C. hookeriana con preferencia por C10 se acumula entre un 3.66 y 8.65 %, respectivamente. Estos niveles de ácidos grasos C8-C10 son similares a los del aceite de coco y de palmiste, sin embargo, las cepas de algas transgénicas carecen de los ácidos grasos C12: 0 significativamente superiores y tienen C16: 0 (un 23 % en transgénicos frente a un 11-16 % en aceite de coco o palmiste, respectivamente) y/o 18: 1 (50-57 % en transgénicos frente a un 8-19 % en aceite de coco o palmiste, respectivamente) extremadamente altos.
EJEMPLO 10: Identificación de los promotores endógenos dependientes del nitrógeno de Prototheca
A. Identificación y caracterización de los promotores endógenos dependientes del nitrógeno.
[0441] Se generó una genoteca de ADNc a partir de Prototheca moriformis (UTEX 1435) utilizando técnicas estándar. Las células de Prototheca moriformis se cultivaron durante 48 horas en condiciones repletas de nitrógeno. Luego, se transfirió un inóculo al 5 % (v/v) a bajo contenido de nitrógeno y las células se cosecharon cada 24 horas durante siete días. Después de aproximadamente 24 horas en cultivo, el suministro de nitrógeno en el medio se agotó por completo. Las muestras cosechadas se congelaron inmediatamente usando hielo seco e isopropanol. Posteriormente, se aisló el ARN total de las muestras de sedimento celular congeladas y una porción de cada muestra se mantuvo en reserva para estudios de RT-PCR. El resto del ARN total extraído de las muestras se sometió a selección de poliA. A continuación, se combinaron cantidades equimolares de ARN seleccionado con poliA de cada condición y se utilizaron para generar una genoteca de ADNc en el vector pcDNA 3.0 (Invitrogen). Aproximadamente 1200 clones se seleccionaron aleatoriamente de la genoteca de ADNc combinada resultante y se sometieron a secuenciación en ambas cadenas. Se seleccionaron aproximadamente 68 ADNc diferentes de entre estas 1200 secuencias y se usaron para diseñar cebadores específicos de ADNc para su uso en estudios de RT-PCR en tiempo real.
[0442] El ARN aislado de las muestras de sedimento celular que se mantuvieron en reserva se usó como sustrato en los estudios de RT-PCR en tiempo real usando los conjuntos de cebadores específicos de ADNc generados anteriormente. Este ARN reservado se convirtió en ADNc y se usó como sustrato para RT-PCR para cada uno de los 68 conjuntos de cebadores específicos de genes. Se utilizaron el ciclo umbral o los números Ct para indicar la abundancia relativa de transcripciones para cada uno de los 68 ADNc dentro de cada muestra de ARN recogida a lo largo del tiempo. Los ADNc que mostraban un aumento significativo (de más del triple) entre las condiciones de abundancia de nitrógeno y las condiciones de agotamiento de nitrógeno se marcaron como genes potenciales cuya expresión aumentó por el agotamiento del nitrógeno. Tal como se ha comentado en la especificación, el agotamiento/limitación del nitrógeno es un inductor conocido de lipogénesis en microorganismos oleaginosos.
[0443] Con el fin de identificar los promotores putativos/secuencias 5'UTR de los ADNc cuya expresión aumentó durante el agotamiento/limitación de nitrógeno, se aisló el ADN total a partir de Prototheca moriformis (UTEX 1435) cultivados en condiciones de abundancia de nitrógeno y luego se sometieron a secuenciación usando tecnología de secuenciación 454 (Roche). Los ADNc marcados como en aumento por los resultados de RT-PCR anteriores se compararon usando BLAST con los cóntigos ensamblados que surgen de las lecturas de secuenciación genómica 454. Los extremos 5 'de los ADNc se mapearon para cóntigos específicos y, cuando fue posible, se usaron más de 500 pb de ADN flanqueante en 5' para identificar putativamente los promotores/UTR. La presencia de promotores/5'UTR se confirmó posteriormente y se clonó mediante amplificación por PCR de ADN genómico. Se usaron extremos 5' de ADNc individuales para diseñar cebadores 3' y se usó el extremo 5' de los ensamblajes de cóntigos 454 para diseñar cebadores 5' específicos de genes.
[0444] Como primer cribado, uno de los promotores putativos, el 5'UTR/promotor aislado de Aat2 (transportador de amonio, SEQ ID N.°: 63), se clonó en el constructo de tioesterasa C14 de Cinnamomum camphora con el péptido de tránsito de estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides, que reemplaza al promotor de glutamato deshidrogenasa de C.sorokinana. Este constructo se enumera como SEQ ID N.°: 81. Para ensayar el promotor putativo, el constructo de tioesterasa se transforma en células de Prototheca moriformis para confirmar la actividad promotora real mediante la búsqueda por cribado de un aumento de ácidos grasos C14/C12 en condiciones de nitrógeno bajo o nulo, utilizando los métodos descritos anteriormente. Se pueden realizar pruebas similares de los promotores putativos regulados por nitrógeno aislados a partir del cribado de ADNc/genómico usando los mismos métodos.
[0445] Otros 5'UTR/promotores putativos regulados por nitrógeno que se aislaron a partir del cribado de ADNc/genómico fueron:
Promotor/5'UTR SEQ ID N.° Veces aumentado Promotor FatB/A/5'UTR SEQ ID N.°: 55 n/A
Promotor transportador de metales NRAMP/5'UTR SEQ ID N.°: 56 9.65
Promotor proteico asociado a flap flagelar/5'UTR SEQ ID N.°: 57 4.92
Promotor de sulfito reductasa SulfRed/5'UTR SEQ ID N.°: 58 10.91 Promotor transportador de azúcar SugT/5'UTR SEQ ID N.°: 59 17.35 Promotor del transportador de amonio 03 Amt03/5'UTR SEQ ID N.°: 60 10.1
Promotor del transportador de amonio 02 Amt02/5'UTR SEQ ID N.°: 61 10.76 Promotor del transportador de aminoácidos 01 Aat01/5'UTR SEQ ID N.°: 62 6.21
Promotor del transportador de aminoácidos 02 Aat02/5'UTR SEQ ID N.°: 63 6.5
Promotor del transportador de aminoácidos 03 Aat03/5'UTR SEQ ID N.°: 64 7.87
Promotor del transportador de aminoácidos 04 Aat04/5'UTR SEQ ID N.°: 65 10.95 Promotor del transportador de aminoácidos 05 Aat05/5'UTR SEQ ID N.°: 66 6.71
[0446] Las veces de aumento se refiere al aumento de abundancia de ADNc después de 24 horas de cultivo en un medio con bajo contenido de nitrógeno.
[0447] Para obtener más información sobre la regulación potencial de estos promotores putativos/5'UTR, se seleccionaron ocho de las secuencias para pruebas adicionales: (1) FatB/A; (2) sulfito reductasa SulfRed; (3) Transportador de azúcar SugT; (4) transportador de amonio 02 amt02; (5) transportador de aminoácidos 01 Aat01; (6) transportador de aminoácidos 03 Aat03; (7) transportador de aminoácidos 04 Aat04; y (8) transportador de aminoácidos 05 Aat05. Se llevaron a cabo análisis de transcriptoma de mayor resolución utilizando lecturas de secuenciación de Illumina en ARN aislado a partir de células de Prototheca moriformis en varios puntos temporales: T0 (semilla); 20 horas; 32 horas; 48 horas; 62 horas; y 114 horas después de la inoculación de la semilla. El medio en T0 (semilla) tenía abundante nitrógeno, mientras que en los puntos temporales de 20 horas y más, el medio contenía poco o nada de nitrógeno. Los cóntigos de transcritos ensamblados generados a partir de ARN aislado de cada uno de los puntos temporales se compararon luego de forma independiente con cada uno de los ocho transcritos previamente identificados. Los resultados se resumen en la tabla 18 a continuación.
Tabla 18. Perfiles de expresión del transcriptoma para ocho promotores putativos/5'UTR.
ADNc TS T20 T32 T48 T62 T114 aa trans_01 absoluto 98 96 321 745 927 1300 relativo 1 0.98 3.28 7.61 9.47 13.28 aa trans_03 absoluto 7 21 51 137 102 109 relativo 1 2.95 7.2 19.42 14.47 15.45 aa trans_04 absoluto 1 6 25 90 131 160 relativo 1 5.16 21.29 74.97 109.35 133.31 aa trans_05 absoluto 109 88 123 210 214 273 relativo 1 0.81 1.13 1.93 1.97 2.51 ammon trans_02 absoluto 683 173 402 991 1413 1397 relativo 1 0.25 0.59 1.45 2.07 2.04 fatA/B-1_ADNc absoluto 13 36 654 617 544 749 relativo 1 2.8 51.57 48.65 42.9 59.1 sug trans_01 absoluto 25 25 106 261 266 251 relativo 1 1 4.22 10.4 10.63 10 sulfito reductasa_01 absoluto 634 238 138 145 163 155 relativo 1 0.38 0.22 0.22 0.26 0.24
[0448] A partir de los resultados resumidos anteriormente, varios de los transcritos muestran una acumulación aumentada a lo largo del tiempo, aunque, curiosamente, el ARNm de la sulfito reductasa muestra una disminución clara en la acumulación de ARNm a lo largo del tiempo.
[0449] Estas ocho regiones promotoras putativas/5'UTR se clonaron aguas arriba de la región codificante de la tioesterasa de C. camphora con su péptido de tránsito nativo extraído y sustituido con el péptido de tránsito de la estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides (UTEX 250). Cada constructo de la región del promotor putativo/5'UTR se introdujo en Prototheca moriformis UTEX 1435 mediante recombinación homóloga utilizando ADN de la secuencia genómica del ARNr 6S. También contenido dentro del constructo hay un gen suc2 de sacarosa invertasa de S. cerevisiae para la selección de clones positivos en medios/placas que contienen sacarosa. La secuencia de ADNc para las porciones relevantes del constructo para Aat01 se enumera en el listado de secuencias como SEQ ID N.°: 67. Para los otros constructos, se usó el mismo esqueleto, la única variable fue la secuencia promotora putativa/5'UTR. Se generó una cepa transgénica de control adicional en la que el promotor de beta tubulina de C. reinhardtii se utilizó para impulsar la expresión del gen de la tioesterasa de C. camphora. Se ha demostrado que este promotor impulsa la expresión constitutiva del gen de interés y, por lo tanto, proporciona un control útil contra el cual medir la expresión del mismo mensaje de tioesterasa cuando es impulsado por los diversos promotores/5'UTR putativos regulados por N probados.
[0450] Una vez que se generaron los clones transgénicos, se llevaron a cabo tres experimentos separados. Los dos primeros experimentos evalúan la regulabilidad potencial por nitrógeno de los ocho supuestos promotores midiendo los niveles de ARNm de tioesterasa en estado estacionario a través de RT-PCR, los perfiles de ácidos grasos y los niveles de amoniaco en los sobrenadantes de cultivo. Los clones se cultivaron inicialmente a 28 °C con agitación (200 rpm) en un medio de siembra rico en nitrógeno (1 g/l de nitrato de amonio - 15 mM de nitrógeno como amoniaco, 4 g/l de extracto de levadura) durante 24 a 48 horas, momento en el que se utilizaron 20 unidades de DO (A750) para inocular 50 ml de medio con bajo contenido de nitrógeno (0.2 g/l de sulfato de amonio, 3 mM de nitrógeno como amoniaco, 0.2 g/l de extracto de levadura). Se tomaron muestras de las células cada 24 horas durante 6 días y también se recogió una muestra justo antes de cambiar a condiciones bajas en nitrógeno. A continuación, se utilizó una parte de las células de cada muestra para la extracción de ARN total utilizando el reactivo Trizol (de acuerdo con los métodos sugeridos por el fabricante). Los ensayos de amoniaco revelaron que los niveles de amoniaco en los sobrenadantes cayeron por debajo de los límites de detección (~100 |j M) después de 24 horas en un medio con bajo contenido de nitrógeno.
[0451] Para la RT-PCR en tiempo real, todos los niveles de ARN se normalizaron a los niveles de un ARN de control interno expresado en Prototheca moriformis (UTEX 1435) para cada punto temporal. El ARN de control interno, denominado cd189, es un producto del gen ARG9 que codifica la N-acetilornitina aminotransferasa. Los conjuntos de cebadores utilizados para la RT-PCR en tiempo real en estos experimentos fueron:
Gen específico para Secuencia de cebador 5'-3' SEQ ID N.°:
TE de C. camphora directo TACCCCGCCTGGGGCGACAC SEQ ID N.°: 68
TE de C. camphora inverso CTTGCTCAGGCGGCGGGTGC SEQ ID N.°: 69
cd189 directo CCGGATCTCGGCCAGGGCTA SEQ ID N.°: 70
cd189 inverso TCGATGTCGTGCACCGTCGC SEQ ID N.°: 71
[0452] También se generaron perfiles lipídicos de cada uno de los transformantes de cada punto temporal y se compararon con los resultados de RT-PCR. Con base en los niveles de amoniaco, los resultados de la RT-PCR y los cambios en los niveles de ácidos grasos C12-C14, se concluyó que las secuencias del transportador de aminoácidos 01 (Aat-01), el transportador de aminoácidos 04 (Aat-04) y el transportador de amonio 02 (Amt-02) contienen un promotor funcional regulable por nitrógeno/5'UTR.
[0453] A partir de los resultados de la RT-PCR, Aat-01 demostró la capacidad de impulsar los niveles de ARNm de la tioesterasa de C. camphora en estado estable hasta cuatro veces por encima del control (promotor de beta tubulina de C. reinhardtii). Los niveles de ARNm también se correlacionaron con la limitación de nitrógeno y un marcado aumento en los niveles de ácidos grasos C12-C14. Estos resultados demuestran que el 5'UTR asociado con el promotor Aat-01 es probablemente más eficiente para impulsar la síntesis de proteínas bajo biosíntesis de lípidos que el promotor de C. reinhardtii de control. Al igual que el promotor Aat-01, el promotor Aat-04 fue capaz de impulsar la acumulación de ARNm hasta cinco veces por encima de la del promotor de control de C. reinhardtii. Sin embargo, la construcción del promotor Aat-04 solo produjo una capacidad modesta para afectar los niveles de ácidos grasos C12-C14. Estos datos demuestran que el promotor Aat-04 es claramente regulable mediante el agotamiento de nitrógeno, pero la UTR asociada con el promotor probablemente no funcione bien como potenciador de la traducción. Finalmente, el promotor Amt-02 fue similar al promotor Aat-01, en el sentido de que fue capaz de impulsar la acumulación de ARNm hasta tres veces por encima de la del promotor de control. Los niveles de ARNm también se correlacionaron con la limitación de nitrógeno y un marcado aumento en los niveles de ácidos grasos C12-C14. Tomados en conjunto, se demostró que estos tres promotores estaban regulados por nitrógeno.
B. Caracterización adicional del promotor del transportador de amonio 3 (amt03) y la expresión de varias tioesterasas.
[0454] Tal como se ha descrito anteriormente, se identificaron los ADNc parciales denominados transportadores de amonio 02 y 03 (amt02 y amt03). Junto con estos dos ADNc parciales, también se identificó un tercer ADNc parcial denominado transportador de amonio 01 (amt01). Se comparó la alineación del ADNc parcial y las secuencias de aminoácidos putativas traducidas. Los resultados muestran que el amt01 es el que tiene una relación más distante de las tres secuencias, mientras que el amt02 y el amt03 difieren en un solo aminoácido.
[0455] Los promotores/5'UTR se generaron inicialmente in silico bombardeando las secuencias de ADNc parciales contra conjuntos de ADN genómico de Roche 454 y conjuntos de transcriptoma de Illumina tal como se ha descrito anteriormente. Se identificaron los cóntigos de transcritos que mostraban identidad con el ADNc que codifica amt01, amt02 y amt03, sin embargo, los cóntigos de transcritos no pudieron diferenciar entre los tres ARNm ya que los cóntigos contenían secuencias compartidas por los tres. Los ensamblajes de ADN genómico de Roche 454 dieron aciertos en las secuencias de ADNc de amt02 y amt03 y contenían secuencias de proteínas N-terminales. Se llevó a cabo una PCR para clonar las regiones flanqueantes 5'. Los cebadores de PCR utilizados para validar el clon amt02 y el promotor amt03/UTR fueron:
Amt03 directo: 5-GGAGGAATTCGGCCGACAGGACGCGCGTCA-3' (SEQ ID N.°: 85)
Amt03 inverso: 5-GGAGACTAGTGGCTGCGACCGGCCTGTG-3' (SEQ ID N.°: 86)
Amt02 directo: 5'-GGAGGAATTCTCACCAGCGGACAAAGCACCG-3' (SEQ ID N.°: 87)
Amt03 inverso: 5-GGAGACT AGTGGCTGCGACCGGCCT CTGG-3' (SEQ ID N.°: 88)
En ambos casos, los cebadores 5' y 3' contenían sitios de restricción útiles para la clonación anticipada en vectores de expresión para validar la funcionalidad de estas regiones promotoras/5'UTR.
[0456] Se realizaron alineaciones por pares entre los ADN clonados a través de este método combinado in silico y basado en PCR y el ADNc original que codifica el amt02 (SEQ ID N.°: 61) y amt03 (SEQ ID N.°: 60). Los resultados de estas alineaciones mostraron diferencias significativas entre los ADNc originales y las secuencias genómicas clonadas, lo que indica que los transportadores de amonio probablemente representan una familia de genes diversa. Además, el clon promotor/5'UTR basado en el método combinado para el amt03 era diferente de la secuencia amt03 original, mientras que las secuencias amt02 eran idénticas. Se llevaron a cabo y se describen más adelante experimentos adicionales para caracterizar la secuencia promotora amt03/UTR (SEQ ID N.°: 89).
[0457] La secuencia promotora amt03/UTR identificada anteriormente (SEQ ID N.°: 89) se ensayó clonando esta secuencia promotora/UTR putativa para impulsar la expresión de cuatro tioesterasas diferentes. El casete de expresión contenía secuencias de recombinación homólogas aguas arriba y aguas abajo del locus 6S del genoma (SEQ ID N.°: 82 y 84, respectivamente). El casete también contiene un ADNc de sacarosa invertasa SUC2 de S. cerevisiae para permitir la selección de clones positivos en un medio que contiene sacarosa. La expresión de sacarosa invertasa fue impulsada por el promotor de beta tubulina de C. reinhardtii y también contenía una nitrato reductasa 3'UTR de C. vulgaris. La secuencia promotora amt03/UTR se clonó aguas abajo del casete de sacarosa invertasa seguida de la secuencia de ADNc de tioesterasa en el marco de uno de los cuatro genes de tioesterasa: (1) tioesterasa C14 de C. camphora; (2) tioesterasa C12 de U. californica; (3) tioesterasa C10-C16 de U. americana; o (4) tioesterasa C10 de C. hookeriana y también contenía una nitrato reductasa 3'UTR de C. vulgaris. La tioesterasa C14 de C. camphora, la tioesterasa C12 de U. californica y el C10-C16 de U. americana contenían el péptido de tránsito de una estearoil ACP desaturasa Chlorella protothecoides. La tioesterasa C10 de C. hookeriana contenía el péptido de tránsito de una desaturasa de ácido graso (FAD) delta 12 de Prototheca moriformis. En todos los casos, las secuencias se optimizaron por codón para la expresión en Prototheca moriformis. Las secuencias de los constructos de tioesterasa precedentes se describen en el listado de secuencias:
promotor amt03/UTR: constructo de tioesterasa de C. camphora SEQ ID N.°: 90
constructo de tioesterasa de C. camphora SEQ ID N.°: 91
constructo de tioesterasa de U. californica SEQ ID N.°: 92
constructo de tioesterasa de U. americana SEQ ID N.°: 93
constructo de tioesterasa de C. hookeriana SEQ ID N.°: 94
[0458] Las líneas transgénicas se generaron mediante métodos de transformación biolística tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 2 en las células de Prototheca moriformis de tipo salvaje y la selección se llevó a cabo en placas/medio que contenían sacarosa. A continuación, se cribaron las líneas positivas para determinar el grado en que se alteraron sus perfiles de ácidos grasos. Luego se sometieron a análisis adicionales cuatro líneas, una resultante de la transformación con cada uno de los cuatro constructos descritos anteriormente. La línea 76 expresó la tioesterasa C14 de C. camphora, la línea 37 expresó la tioesterasa C12 de U. californica, la línea 60 expresó la tioesterasa C10-C16 de U. americana y la línea 56 expresó la tioesterasa C10 de C. hookeriana. Cada línea se cultivó durante 48 horas en un medio que contenía sacarosa como única fuente de carbono y se extrajeron muestras de células a las 14, 24, 36 y 48 horas (cultivo de semillas) para la determinación del perfil de ácidos grasos mediante transesterificación directa a ésteres metílicos de ácidos grasos y análisis posterior por GC-FID (descrito anteriormente) y para el aislamiento del ARN total. Después de 48 horas, estas células se utilizaron para inocular cultivos con niveles bajos o nulos de nitrógeno (que contenían sacarosa como única fuente de carbono) mantenidos a pH 5.0 (tamponado con citrato, concentración final 0.05 M) o pH 7.0 (tamponado con HEPES, concentración final 0.1 M). Las muestras de cultivo se extrajeron a las 12, 24, 72 y 108 horas (producción de lípidos) para la determinación del perfil de ácidos grasos y el aislamiento del ARN total. Los ensayos de amoniaco de estos cultivos revelaron que los niveles de amoniaco había caído por debajo de los límites de detección (aprox. 100 pM) después de 24 horas en un medio con bajo contenido de nitrógeno.
[0459] Se realizaron los ensayos de RT-PCR en tiempo real sobre los niveles de ARNm de las tioesterasas en el ARN total de cada uno de los puntos temporales recopilados anteriormente y todos los niveles de ARNm se normalizaron a los niveles de un ARN de control interno (cd189). Los conjuntos de cebadores utilizados en la PCR en tiempo real se muestran en la tabla 19 a continuación:
Tabla 19. Conjuntos de cebadores para PCR en tiempo real.
Gen específico para Secuencia de cebador 5'-3' SEQ ID N.°:
TE de C. camphora directo TACCCCGCCTGGGGCGACAC SEQ ID N.°: 68 TE de C. camphora inverso CTTGCTCAGGCGGCGGGTGC SEQ ID N.°: 69 TE de U. cali fornica directo CTGGGCGACGGCTTCGGCAC SEQ ID N.°: 95 TE de U. californica inverso AAGTCGCGGCGCATGCCGTT SEQ ID N.°: 96 TE de U. americana directo CCCAGCTGCTCACCTGCACC SEQ ID N.°: 97 TE de U. americana inverso CACCCAAGGCCAACGGCAGCGCCGTG SEQ ID N.°: 98 TE de C. hookeriana directo TACCCCGCCTGGGGCGACAC SEQ ID N.°: 99 TE de C. hookeriana inverso AGCTTGGACAGGCGGCGGGT SEQ ID N.°: 100 cd189 inverso TCGATGTCGTGCACCGTCGC SEQ ID N.°: 71 cd189 directo CCGGATCTCGGCCAGGGCTA SEQ ID N.°: 70
[0460] Los resultados de los perfiles de ácidos grasos en cada uno de los puntos de tiempo en la fase de cultivo de semillas mostraron muy poco efecto de las tioesterasas. Con el comienzo de la fase de producción de lípidos, los perfiles de ácidos grasos se vieron afectados significativamente, con incrementos que son mucho más drásticos para los cultivos mantenidos a pH 7.0 en comparación con los cultivos a pH 5.0. Si bien la magnitud de la diferencia entre la acumulación de ácidos grasos objetivo de pH 7.0 y 5.0 varió con cada tioesterasa ensayada, el efecto general fue el mismo: que las células cultivadas a pH 5.0 mostraron niveles significativamente más bajos de los ácidos grasos objetivo acumulados, pero más que en comparación con el control de las células de tipo salvaje.
[0461] El análisis del ARN aislado de estas mismas muestras se correlacionó muy bien con los datos del perfil de ácidos grasos, ya que hubo un claro impacto del pH del cultivo en los niveles de ARNm en estado estacionario para cada una de las tioesterasas. Tomando conjuntamente los datos de acumulación de ácidos grasos y los datos de ARNm, la regulación del pH de la expresión del gen de tioesterasa impulsada por el promotor amt03/UTR estaba claramente mediada a nivel de transcripción, estabilidad de ARNm o ambos. Además, se observó que los niveles en estado estacionario del ARNm de U. californica eran cuatro logaritmos más bajos en comparación con los niveles en estado estacionario del ARNm de C. hookeriana. Esta observación es consistente con la hipótesis de que las secuencias de ARNm individuales pueden desempeñar un papel en el control de la expresión. Estos datos implican que la absorción de amonio en Prototheca moriformis por parte de la familia de transportadores amt03 está vinculada directamente al pH.
[0462] Se realizó un análisis adicional del perfil de ácidos grasos en doce líneas generadas a partir de la transformación de células de Prototheca moriformis con el constructo promotor amt03/UTR que impulsa la expresión de la tioesterasa de U. americana C10-C16. La línea 60, descrita anteriormente, fue parte del siguiente análisis. La tabla 20 a continuación muestra los perfiles lipídicos de tres de las doce líneas que se analizaron junto con el control de tipo salvaje.
Tabla 20. Perfiles de ácidos grasos de transformantes que contienen la TE de U. americana impulsados por el promotor amt03/UTR.
Figure imgf000081_0001
[0463] Tal como se muestra en la tabla anterior, los niveles de saturados totales aumentaron espectacularmente sobre los de tipo salvaje con más de 2.6 veces en el caso de la línea 40 en comparación con el tipo salvaje (los saturados totales de las doce líneas analizadas variaron del 63 % a más del 86 %) . Además, la tioesterasa de U. americana, cuando se expresa en estos niveles, reduce drásticamente el nivel de insaturados, especialmente C18: 1 y C18: 2 (ver líneas 40 y 44), donde en la línea 44, los niveles de C18: 1 se reducen en más de 8 veces en comparación con el tipo salvaje. También la tioesterasa de U. americana (impulsada por el promotor amt03) aumenta en gran medida los niveles de ácidos grasos de cadena media. La línea 44 muestra los niveles C10: 0-C14: 0 por encima de un 56 %, aproximadamente 42 veces más altos a los niveles observados en la cepa de tipo salvaje y los niveles C8: 0-C14: 0 por encima de un 57 %. Las cepas adicionales transformadas con un constructo del promotor Amt03 que impulsa la expresión de la tioesterasa de U. americana tenían un perfil lipídico representativo de: 0.23 % de C8: 0; 9.64 % de C18: 0; 2.62 % de C12: 0; 31.52 % de C14: 0; 37.63 % de C16: 0; 5.34 % de C18: 0; 7.05 % de C18: 1; y 5.03 % de C18: 2, con un porcentaje de saturados totales del 86.98 %.
[0464] Perfiles lipídicos adicionales generados a partir de la transformación de células de Prototheca moriformis con el constructo del promotor amt03/UTR (SEQ ID N.°: 89) que impulsa la expresión de la tioesterasa C10 de C. hookeriana (SEQ ID N.°: 94). Los clones positivos que expresan este constructo se seleccionaron y se cultivaron en condiciones de pH 7.0. El perfil lipídico representativo de un clon positivo fue: 9.87 % de C8: 0; 23.97 % de C18: 0; 0.46 % de C12: 0; 1.24 % de C14: 0; 10.24 % de C16: 0; 2.45 % de C18: 0; 42.81 % de C18: 1; y 7.32 % de C18: 2. Este clon tenía un porcentaje de C8-C10 del 33.84.
[0465] Tomados en conjunto, los datos sugieren que el promotor amt03/UTR, y otros promotores similares, pueden usarse como un promotor estrictamente regulado, que puede ser particularmente útil para expresar un compuesto potencialmente tóxico y se requiere una aplicación estricta de la expresión génica. La habilidad de Prototheca moriformis de crecer bajo una amplia gama (al menos pH 5.0 a 7.0) de regímenes de pH hace que este organismo sea particularmente útil en combinación con elementos reguladores tales como el promotor amt03/UTR. Además, los datos del perfil lipídico anteriores demuestran la impresionante capacidad del promotor amt03/UTR para impulsar la expresión génica.
EJEMPLO 11: Alteración de los niveles de ácidos grasos saturados en la microalga de Prototheca moriformis
[0466] Como parte de un cribado genómico que utiliza un enfoque basado en bioinformática basado en el ADNc, el transcriptoma de Illumina y la secuenciación Roche 454 del ADN genómico de Prototheca moriformis (UTEX 1435), se identificaron dos grupos específicos de genes implicados en la desaturación de los ácidos grasos: las estearoil ACP desaturasas (SAD) y las desaturasas de ácidos grasos delta 12 (A12 FAD). Las enzimas estearoil ACP desaturasa son parte de la ruta de síntesis de lípidos y sirven para introducir dobles enlaces en las cadenas de acilo graso, por ejemplo, la síntesis de ácidos grasos C18: 1 a partir de ácidos grasos C18: 0. Las desaturasas de ácidos grasos delta 12 también forman parte de la ruta de síntesis de lípidos y funcionan para introducir dobles enlaces en ácidos grasos ya insaturados, por ejemplo, la síntesis de ácidos grasos C18: 2 a partir de ácidos grasos C18: 1. El análisis de transferencia Southern utilizando sondas basadas en las dos clases de genes de desaturasa de ácidos grasos identificados durante los esfuerzos bioinformáticos indicó que cada clase de genes de desaturasa probablemente estaba compuesta por varios miembros de la familia. Además, los genes que codifican las estearoil ACP desaturasas se dividieron en dos familias distintas. Sobre la base de estos resultados, se diseñaron tres constructos de disrupción de genes para alterar potencialmente a varios miembros de la familia de genes al dirigirse a regiones codificantes más conservadas dentro de cada familia de enzimas desaturasa.
[0467] Se diseñaron tres constructos de direccionamiento de recombinación homóloga utilizando: (1) porciones altamente conservadas de la secuencia codificante de los miembros de la familia de la desaturasa de ácidos grasos delta 12 (d12FAD) y (2) dos constructos dirigidos a cada una de las dos familias distintas de SAD, cada una con regiones conservadas de las secuencias codificantes de cada familia. Esta estrategia incorporaría un gen marcador seleccionable (el casete de sacarosa invertasa suc2 de S. cerevisiae que confiere la capacidad de hidrolizar sacarosa) en estas regiones codificantes altamente conservadas (dirigidas a múltiples miembros de la familia) en lugar de una estrategia clásica de reemplazo de genes donde la recombinación homóloga se dirigiría a regiones flanqueantes del gen diana.
[0468] Todas los constructos se introdujeron en las células mediante transformación biolística usando los métodos descritos anteriormente y los constructos se linealizaron antes de inyectarse en las células. Los transformantes se seleccionaron en placas/medios que contenían sacarosa y se ensayaron los cambios en el perfil de lípidos usando el método descrito anteriormente. Las secuencias relevantes de cada uno de los tres constructos de direccionamiento se enumeran a continuación.
Descripción SEQ ID N.°:
Secuencia 5' de la región codificante de la d12FAD del constructo de direccionamiento SEQ ID N.°: 72
Secuencia 3' de la región codificante de la d12FAD del constructo de direccionamiento SEQ ID N.°: 73 Secuencia de ADNc del constructo de direccionamiento de d12FAD SEQ ID N.°: 74 Secuencia 5' de la región codificante de SAD2A SEQ ID N.°: 75 Secuencia 3' de la región codificante de SAD2A SEQ ID N.°: 76 Secuencia de ADNc del constructo de direccionamiento de SAD2A SEQ ID N.°: 77 Secuencia 5' de la región codificante de SAD2B SEQ ID N.°: 78 Secuencia 3' de la región codificante de SAD2B SEQ ID N.°: 79 Secuencia de ADNc del constructo de direccionamiento de SAD2B SEQ ID N.°: 80
[0469] Se seleccionaron clones positivos representativos de las transformaciones con cada uno de los constructos y los perfiles lipídicos para estos clones (expresados en % de área) se determinaron y se resumieron en la tabla 21 a continuación.
Tabla 21. Perfiles lipídicos para knockouts de desaturasa.
Ácido graso d12FAD KO SAD2A KO SAD2B KO ts UTEX 1435
C8:0 0 0 0 0
C10:0 0.01 0.01 0.01 0.01
C12:0 0.03 0.03 0.03 0.03
C14:0 1.08 0.985 0.795 1.46
C16:0 24.42 25.335 23.66 29.87
C18:0 6.85 12.89 19.555 3.345
C18:1 58.35 47.865 43.115 54.09
C18:2 7.33 10.27 9.83 9.1
C18: 3 alfa 0.83 0.86 1 0.89
C20:0 0.48 0.86 1.175 0.325
[0470] Cada uno de los constructos tuvo un efecto medible en la clase deseada de ácido graso y en los tres casos los niveles de C18: 0 aumentaron notablemente, particularmente con los dos knockouts de SAD. La comparación adicional de múltiples clones de los knockouts de SAD indicó que las líneas de knockout de SAD2B tenían reducciones significativamente mayores en los ácidos grasos C18: 1 que los niveles de ácidos grasos C18: 1 observados con las líneas de knockout de SAD2A.
[0471] Se generaron knockouts adicionales de desaturasa de ácidos grasos A12 (FAD) en un antecedente de Prototheca moriformis utilizando los métodos descritos anteriormente. Para identificar posibles homólogos de A12FAD, se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar una región genómica que codifica una FAD putativa:
Cebador 15'-TCACTTCATGCCGGCGGTCC-3' SEQ ID N.°: 101 Cebador 25'- GCGCT CCTGCTTGGCT CGAA-3' SEQ ID N.°: 102
Las secuencias resultantes de la amplificación genómica del ADN genómico de Prototheca moriformis mediante el uso de los cebadores anteriores fueron muy similares, pero indicaron que existen múltiples genes o alelos de A12FAD en Prototheca.
[0472] Sobre la base de este resultado, se diseñaron dos constructos de disrupción de genes que buscaban inactivar uno o varios genes A12FAD. La estrategia sería incorporar una casete de sacarosa invertasa (suc2 de S. cerevisiae), lo que le conferiría la capacidad de hidrolizar sacarosa como marcador seleccionable, en regiones codificantes altamente conservadas en lugar de utilizar una estrategia clásica de reemplazo de genes. El primer constructo, denominado pSZ1124, contenía secuencias de direccionamiento genómico 5' y 3' que flanqueaban un promotor de p-tubulina de C. reinhardtii que impulsa la expresión del gen suc2 de S. cerevisiae y una nitrato reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris (casete suc2 de S. cerevisiae ). El segundo constructo, denominado pSZ1125, contenía secuencias de direccionamiento genómico 5' y 3' que flanqueaban un promotor de p-tubulina de C. reinhardtii que impulsa la expresión del gen suc2 de S. cerevisiae y una nitrato reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris. Las secuencias relevantes de los constructos se enumeran en el listado de secuencias: pSZ1124 (FAD2B) secuencia de direccionamiento genómico 5' SEQ ID N.°: 103 pSZ1124 (FAD2B) secuencia de direccionamiento genómico 3' SEQ ID N.°: 104 casete suc2 de S. cerevisiae SEQ ID N.°: 105 pSZ1125 (FAD2C) secuencia de direccionamiento genómico 5' SEQ ID N.°: 106 pSZ1125 (FAD2C) secuencia de direccionamiento genómico 3' SEQ ID N.°: 107
[0473] pSZ1124 y pSZ1125 se introdujeron cada uno en un antecedente de Prototheca moriformis y los clones positivos se seleccionaron basándose en la capacidad de hidrolizar sacarosa. La tabla 22 resume los perfiles de lípidos (en % de área, generados usando los métodos descritos anteriormente) obtenidos en dos líneas transgénicas en las que se utilizaron los vectores de dirección pSZ1124 y pSZ1125.
Figure imgf000084_0001
[0474] El transgénico que contiene el constructo FAD2B (pSZ1124) dio un resultado muy interesante e inesperado en el perfil lipídico, en cuanto a que los niveles de C18: 2, que se esperaría que disminuyeran, solo disminuyeron en aproximadamente un % de área. Sin embargo, los niveles de ácidos grasos C18: 1 aumentaron significativamente, casi exclusivamente a expensas de los niveles C16: 0, que disminuyeron significativamente. El transgénico que contenía el constructo FAD2C (pSZ1125) también dio un cambio en el perfil lipídico: los niveles de C18: 2 se reducen significativamente junto con un aumento correspondiente en los niveles de C18: 1.
Mimético de sebo de ternera
[0475] Se seleccionó un clon positivo generado a partir del experimento de inactivación de SAD2B anterior tal como se ha descrito anteriormente para usarlo como antecedente para la introducción adicional de un gen de tioesterasa de acil ACP grasa con preferencia por C14. El constructo que introduce la tioesterasa de C. camphora con preferencia por C14 contenía una secuencia dirigida a la región genómica del ARNr 6S (lo que permite la integración dirigida del ADN transformante mediante recombinación homóloga) y el constructo de expresión contenía el promotor de p-tubulina de C. reinhardtii que impulsa la expresión del gen neoR con la nitrato reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris, seguido de un segundo promotor de p-tubulina de C. reinhardtii que impulsa la expresión de una tioesterasa de C. camphora optimizada por codón con un péptido de tránsito de estearoil ACP desaturasa de Protothecoides de Chlorella con una segunda nitrato reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris. La secuencia del donante genómico de ARNr 5' 6S se enumera en la SEQ ID N.°: 82; la secuencia del donante genómico de ARNr 3' 6S se enumera en la SEQ ID N.°: 84; y el constructo de expresión relevante para la tioesterasa de C. camphora se enumera en la SEQ ID N.°: 83.
[0476] La transformación se llevó a cabo usando métodos biolísticos tal como se ha descrito anteriormente y se dejó que las células se recuperaran durante 24 horas en placas que contenían sacarosa al 2 %. Después de este tiempo, las células se resuspendieron y se volvieron a sembrar en placas que contenían sacarosa al 2 % y 50 |jg/ml de G418 para la selección. Se seleccionaron nueve clones entre los clones positivos generados para la producción de lípidos y el perfil lipídico. Los nueve clones transgénicos (con SAD2B KO y que expresan la tioesterasa con preferencia por C14 de C. camphora) se cultivaron tal como se ha descrito anteriormente y se analizaron para determinar el perfil lipídico. Los resultados se resumen a continuación en la tabla 23. El perfil lipídico para el sebo también se incluye en la tabla 23 a continuación (National Research Council 1976: Fat Content and Composition of Animal Products).
Tabla 23. Perfil lipídico de clones transformados con tioesterasa.
C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20 Clon 1 TE de C. camphora SAD2BKO 0.01 0.33 6.13 24.24 0.19 11.08 42.03 13.45 0.98 0.73 Clon 2 TE de C. camphora SAD2BKO 0.01 0.16 3.42 23.80 0.40 9.40 50.62 10.2 0.62 0.70 Clon 3 TE de C. camphora SAD2BKO 0.01 0.20 4.21 25.69 0.40 7.79 50.51 9.37 0.66 0.63 Clon 4 TE de C. camphora SAD2BKO 0.01 0.21 4.29 23.57 0.31 9.44 50.07 10.07 0.70 0.70 Clon 5 TE de C. camphora SAD2BKO 0.01 0.18 3.87 24.42 0.32 9.24 49.75 10.17 0.71 0.71 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C16: C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20
Clon 6 TE de C. camphora SAD2BKO 0.01 0.28 5.34 23.78 0.33 9.12 49.12 10.00 0.68 0.70
SAD2BKO de C. camphora 0.01 0.15 3.09 23.07 0.32 10.08 51.21 10.00 0.66 0.74 Clon 7 de TE
Clon 8 TE de C. camphora SAD2BKO 0.01 0.29 5.33 24.62 0.37 7.02 49.67 10.74 0.69 0.70
Clon 9 TE de C. camphora SAD2BKO 0.01 0.12 2.74 25.13 0.30 10.17 50.18 9.42 0.71 0.71 ts UTEX 1435 0.01 0.02 0.96 23.06 0.79 3.14 61.82 9.06 0.46 0.27
SAD2BKO 0.01 0.03 0.80 23.66 0.13 19.56 43.12 9.83 1.00 1.18
Sebo 0.00 0.00 4.00 26.00 3.00 14.00 41.00 3.00 1.00 0.00
[0477] Como puede verse en la tabla 23, los perfiles lipídicos de las líneas transgénicas son bastante similares al perfil lipídico del sebo. Tomados colectivamente, los datos demuestran la utilidad de combinar antecedentes transgénicos específicos, en este caso un knockout de SAD2B con una tioesterasa con preferencia por C14 (de C. camphora), para generar una cepa de algas transgénicas productoras de aceite similar al perfil lipídico del sebo.
Constructo utilizado para reducir la expresión de la B-cetoacil sintasa II (KASII) mediante un enfogue de inactivación dirigida
[0478] Se introdujo un vector que regulaba negativamente la expresión del gen KASII mediante un enfoque de inactivación dirigida en un derivado mutagenizado clásico del UTEX 1435, el S1331. El gen de la invertasa de Saccharomyces cerevisiae se utilizó como marcador seleccionable, lo que le confería la capacidad de crecer en sacarosa. El casete de expresión de la invertasa bajo el control del promotor de B-tubulina de C. reinhardtii se insertó en el medio de la región genómica KASII de 315 pb de longitud para permitir la integración dirigida (pSZ1503).
[0479] Los sitios de restricción relevantes en pSZ1503 se indican en minúsculas, en negrita y subrayados y son 5'-3' BspQ 1, Kpn I, AscI, Xho I, Sac I, BspQ I, respectivamente. Los sitios BspQI delimitan los extremos 5' y 3' del ADN transformante. Las secuencias en negrita y minúscula representan el ADN genómico del S1331 que permite la integración dirigida en el locus KASII mediante recombinación homóloga. Continuando en la dirección de 5' a 3', el promotor de la B-tubulina de C. reinhardtii que impulsa la expresión del gen de la sacarosa invertasa de levadura (que confiere la capacidad de S1331 para metabolizar la sacarosa) se indica mediante el texto un recuadro. El iniciador ATG y el terminador TGA para invertasa se indican en mayúsculas, negrita y cursiva, mientras que la región codificante se indica en minúsculas y cursiva. La nitrato reductasa 3 'UTR de Chlorella vulgaris se indica mediante texto subrayado en minúsculas.
[0480] Secuencia de nucleótidos del ADN transformante contenido en pSZ1503_ [KASII_btub-y.inv-nr_KASII]: gctcttcccgcaccggctggctccaccccaacttgaacctcgagaaccccgcgcctggcgtcgaccccgtcgtgctcgtggggc ggagcgcgccgaagacctggacgtcgtcctctccaactcctttggctttggcgggcacaattcgtgcgtcggtacc ctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgcttcg
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gaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgc
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ccggcttcgccgccaagatcagcgcctccatgacgaacgagacgtccgaccgccccctggtgcacttcacccccaacaagggct ggatgaacgaccccaacggcctgtggtacgacgagaaggacgccaagtggcacctgtacttccagtacaacccgaacgacac cgtctgggggacgcccttgttctggggccacgccacgtccgacgacctgaccaactgggaggaccagcccatcgccatcgcccc gaagcgcaacgactccggcgccttctccggctccatggtggtggactacaacaacacctccggcttcttcaacgacaccatcgac ccgcgccagcgctgcgtggccatctggacctacaacaccccggagtccgaggagcagtacatctcctacagcctggacggcgg ctacaccttcaccgagtaccagaagaaccccgtgctggccgccaactccacccagttccgcgacccgaaggtcttctggtacgag ccctcccagaagtggatcatgaccgcggccaagtcccaggactacaagatcgagatctactcctccgacgacctgaagtcctgg aagctggagtccgcgttcgccaacgagggcttcctcggctaccagtacgagtgccccggcctgatcgaggtccccaccgagcag gaccccagcaagtcctactgggtgatgttcatctccatcaaccccggcgccccggccggcggctccttcaaccagtacttcgtcgg cagcttcaacggcacccacttcgaggccttcgacaaccagtcccgcgtggtggacttcggcaaggactactacgccctgcagacc ttcttcaacaccgacccgacctacgggagcgccctgggcatcgcgtgggcctccaactgggagtactccgccttcgtgcccacca acccctggcgctcctccatgtccctcgtgcgcaagttctccctcaacaccgagtaccaggccaacccggagacggagctgatcaa cctgaaggccgagccgatcctgaacatcagcaacgccggcccctggagccggttcgccaccaacaccacgttgacgaaggcc aacagctacaacgtcgacctgtccaacagcaccggcaccctggagttcgagctggtgtacgccgtcaacaccacccagacgatc tccaagtccgtgttcgcggacctctccctctggttcaagggcctggaggaccccgaggagtacctccgcatgggcttcgaggtgtc cgcgtcctccttcttcctggaccgcgggaacagcaaggtgaagttcgtgaaggagaacccctacttcaccaaccgcatgagcgtg aacaaccagcccttcaagagcgagaacgacctgtcctactacaaggtgtacggcttgctggaccagaacatcctggagctgtact tcaacgacggcgacgtcgtgtccaccaacacctacttcatgaccaccgggaacgccctgggctccgtgaacatgacgacgggg stssacaacctsttctacatceacaasttccasstscscsasetcaas TGAcaattggcagcagcagctcggatagtatcgac acactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcct cagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgttt catatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagc cttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatggga acacaaatggaggatcgtagagctcatcttccgaaagtacgacgagtgagcgagctgattctctttgagcggggtcgggtggttc ggggagagtgcgcggaaaggcgcagagacgtgcggccggccgtgtccctccgtcttcccctggttggtgctatagtaacctgc ctgtgtcgcgtgcgcgtcgggaagagc (SEO ID NO: 149).
[0481] Los ADNc del alelo 1 y el alelo 2 de KAS II se identifican en las SEQ ID N.°: 279 y 280, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de los alelos 1 y 2 se identifican en las SEQ ID N.°: 281 y 282, respectivamente.
[0482] Para determinar el impacto de la inactivación de KASII en la composición de lípidos, el ADN del vector pSZ1503 se transformó en S1331 para generar un fenotipo de inactivación de KASII dirigido. Los clones individuales iniciales se aislaron y se cultivaron en condiciones estándar de producción de lípidos a pH 5.0. Los perfiles resultantes del clon más representativo y las células de tipo salvaje se muestran a continuación en la tabla 31.
Tabla 31. Perfiles de ácidos grasos en S1331 y una línea transgénica derivada transformada con ADN de pSZ1503.
ID de muestra C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18: 3 a
1331-5 0.01 0.03 0.96 24.28 0.64 3.94 62.69 6.21 0.49
D698-2 0.01 0.01 0.83 38.36 1.38 2.21 48.31 7.60 0.55
EJEMPLO 12: Diseño de Prototheca con marcadores seleccionables alternativos
A. Expresión de una a-galactosidasa secretable en Prototheca moriformis
[0483] Los métodos y los efectos de la expresión de un gen de sacarosa invertasa heterólogo en la especie Prototheca se han descrito previamente en la solicitud PCT n.° PCT/US2009/66142. En este ejemplo se examinó la expresión de otras enzimas degradantes de polisacáridos heterólogas. La capacidad de crecer en melibiosa (a-D-gal-glu) de Prototheca moriformis UTEX 1435 se ensayó con uno de los siguientes genes exógenos que codifican una a-galactosidasa: el gen MEL1 de Saccharomyces carlsbergensis (secuencia de aminoácidos correspondiente al número de acceso de NCBI P04824 (SeQ ID N.°: 108)), el gen AglC de Aspergillus niger (secuencia de aminoácidos correspondiente al número de acceso de NCBI Q9UUZ4 (SEQ ID N.°: 116)) y la agalactosidasa de la planta superior de Cyamopsis tetragonobola (semilla de guar) (secuencia de aminoácidos correspondiente al número de acceso de NCBl P14749 (SEQ ID N.°: 120). En todos los casos, los genes se optimizaron de acuerdo con el uso de codones preferido en Prototheca moriformis. Las partes relevantes del casete de expresión se enumeran a continuación junto con los números del listado de secuencias. Todos los casetes de expresión utilizaron las secuencias de direccionamiento de recombinación homólogas de Clp 5' y 3' para la integración genómica estable, el promotor/5'UTR TUB2 de Chlamydomonas reinhardtii y la nitrato reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris.
Secuencia de aminoácidos de MEL1 de S. carlsbergensis SEQ ID N.°: 108
Péptido señal de la secuencia de aminoácidos de MEL1 de S. carlsbergensis SEQ ID N.°: 109
Casete de transformación de MEL1 de S. carlsbergensis SEQ ID N.°: 110
Secuencia (optimizada por codón) de MEL1 de S. carlsbergensis SEQ ID N.°: 111
Secuencia de direccionamiento de recombinación homóloga clp 5' SEQ ID N.°: 112
Secuencia de direccionamiento de recombinación homóloga clp 3' SEQ ID N.°: 113 Promotor/5'UTR TUB2 de Chlamydomonas reinhardtii SEQ ID N.°: 114
Nitrato reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris SEQ ID N.°: 115
Secuencia de aminoácidos de AlgC de A. niger SEQ ID N.°: 116
Péptido señal de la secuencia de aminoácidos de AlgC de A. niger SEQ ID N.°: 117
Secuencia (optimizada por codón) de AlgC de A. niger SEQ ID N.°: 118
Casete de transformación de AlgC de A. niger SEQ ID N.°: 119
Secuencia de aminoácidos de la a-galactosidasa de C. tetragonobola SEQ ID N.°: 120
Secuencia de a-galactosidasa (optimizada por codón) de C. tetragonobola SEQ ID N.°: 121
Casete de transformación de a-galactosidasa de C. tetragonobola SEQ ID N.°: 122
[0484] Las células de Prototheca moriformis se transformaron con cada uno de los tres casetes de expresión que contenían MEL1 de S. carlsbergensis, AlgC de A. niger, o el gen de la a-galactosidasa de C. tetragonobola usando los métodos de transformación biolística como se ha descrito en el ejemplo 2 anteriormente. Los clones positivos se cribaron usando placas que contenían melibiosa al 2 % como única fuente de carbono. No aparecieron colonias en las placas para los transformantes del casete de expresión de C. tetragonobola. Los clones positivos se recogieron de las placas que contenían los transformantes de MEL1 de S. carlsbergensis y los transformantes de AlgC de A. niger. La integración del ADN transformante se confirmó mediante PCR con cebadores dirigidos a una parte de la 3'UTR de C. vulgaris y la secuencia de direccionamiento de recombinación homóloga de 3' Clp.
cebador 5' C. vulgaris 3'UTR: secuencia de Clp en dirección hacia 3' (SEQ ID N.°: 123) ACTGCAATGCTGATGCACGGGA
cebador 3' C. vulgaris 3'UTR: secuencia de Clp en dirección hacia 3' (SEQ ID N.°: 124) TCCAGGTCCTTTTCGCACT
[0485] Como control negativo, el ADN genómico de las células de Prototheca moriformis no transformadas también se amplificó con el conjunto de cebadores. No se amplificaron productos a partir del ADN genómico de las células de tipo salvaje.
[0486] Se ensayó la capacidad de varios clones positivos de cada uno de los transformantes MEL1 de S. carlsbergensis y los transformantes AlgC de A. niger (según lo confirmado por PCR) para crecer en melibiosa como única fuente de carbono en un medio líquido. Estos clones seleccionados se cultivaron durante 3 días en las condiciones y el medio base descritos en el ejemplo 1 anteriormente con melibiosa como única fuente de carbono. Todos los clones que contienen genes que codifican la a-galactosidasa crecieron de manera robusta durante este tiempo, mientras que tanto la cepa de tipo salvaje sin transformar como la Prototheca moriformis que expresa una sacarosa invertasa SUC2 de Saccharomyces cerevisiae tuvieron un crecimiento escaso en el medio de melibiosa. Estos resultados sugieren que los genes que codifican la a-galactosidasa pueden usarse como un marcador seleccionable para la transformación. Además, estos datos indican que los péptidos señal nativos presentes en MEL1 de S. carlsbergensis (SEQ ID N.°: 109) o AlgC de A. niger (SEQ ID N.°: 117) son útiles para dirigir proteínas al periplasma en las células de Prototheca moriformis.
B. Los genes THIC complementan la auxotrofia de la tiamina en Prototheca
[0487] La prototrofia de la tiamina en las células de Prototheca moriformis se examinó utilizando la expresión de genes exógenos THIC. La biosíntesis de tiamina en plantas y algas se lleva a cabo típicamente en el plástido, por lo tanto, la mayoría de las proteínas codificadas por el núcleo que participan en su producción deberán dirigirse de manera eficiente al plástido. La secuenciación del ADN y la secuenciación del transcriptoma de las células de Prototheca moriformis revelaron que todos los genes que codifican las enzimas biosintéticas de tiamina estaban presentes en el genoma, con la excepción del THIC. Para diseccionar la lesión responsable de la auxotrofia de la tiamina a nivel bioquímico, el crecimiento de las células de Prototheca moriformis se examinó bajo cinco regímenes diferentes: (1) en presencia de clorhidrato de tiamina 2 j M; (2) sin tiamina; (3) sin tiamina, pero con hidroxietiltiazol (THZ) 2 j M; (4) sin tiamina, pero con 2-metil-4-amino-5-(aminometil)pirimidina (PYR) 2 j M; y (5) sin tiamina, pero con THZ 2 j M y PYR 2 j M. Los resultados de los experimentos de crecimiento en estas 5 condiciones diferentes indicaron que las células de Prototheca moriformis son capaces de síntesis de novo, pero solo pueden producir pirofosfato de tiamina (TPP) si se proporciona el precursor PYR. Este resultado es consistente con la hipótesis de que la auxotrofia de tiamina de Prototheca moriformis se debe a la incapacidad para sintetizar fosfato de hidroximetilpirimidina (HMP-P) a partir del ribonucleótido de aminoimidazol, que es el catalizador de conversión por la enzima THIC.
[0488] Las células de Prototheca moriformis se transformaron usando los métodos de transformación biolística descritos anteriormente en el ejemplo 2, expresando el THIC de Coccomyxa C-169 (secuencia de aminoácidos correspondiente a la proteína JGI ID 30481) y una sacarosa invertasa SUC2 de S. cerevisiae como marcador selectivo. Este constructo de expresión contenía la secuencia del péptido de tránsito nativo THIC de Coccomyxa C-169, las secuencias de direccionamiento de recombinación homólogas en dirección hacia 5' y en dirección hacia 3' a la región 6S del ADN genómico, una región promotora/5'UTR TUB2 de C. reinhardtii (SEQ ID N.°: 104) y una nitrato reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris (SEQ ID N.°: 115). La expresión del SUC2 de S. cerevisiae también fue impulsada por una región promotora/5'UTR TUB2 de C. reinhardtii (SEQ ID N.°: 114) y contenía una nitrato reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris (SEQ ID N.°: 115). Los genes se optimizaron de acuerdo con el uso de codones preferido en Prototheca moriformis. Las secuencias de casetes de expresión relevantes se enumeran en el listado de secuencias y se detallan a continuación:
Secuencia de aminoácidos del THIC de Coccomyxa C-169 SEQ ID N.°: 125 Péptido de tránsito nativo de la secuencia de aminoácidos del THIC de Coccomyxa C- SEQ ID N.°: 126 169
Casete de transformación del THIC de Coccomyxa C-169 SEQ ID N.°: 127 Secuencia (optimizada por codón) del THIC de Coccomyxa C-169 SEQ ID N.°: 128 Secuencia (optimizada por codón) de SUC2 de S. cerevisiae SEQ ID N.°: 129 Secuencia de direccionamiento de recombinación homóloga 5' 6S SEQ ID N.°: 82 Secuencia de direccionamiento de recombinación homóloga 3' 6S SEQ ID N.°: 84
La selección de clones positivos se realizó en placas sin tiamina y que contenían sacarosa como única fuente de carbono. Los clones positivos se confirmaron mediante PCR con un cebador 5' que se une dentro del gen THIC de Coccomyxa C-169 y un cebador 3' que se hibrida en dirección hacia 3' del ADN transformante en el locus 6S. Los clones positivos confirmados por PCR también se confirmaron usando ensayos de transferencia Southern.
[0489] Para observar la auxotrofia de la tiamina de las células de Prototheca moriformis de tipo salvaje, primero fue necesario agotar las células de las reservas internas de tiamina. Para probar el crecimiento en un medio sin tiamina, las células se cultivaron primero hasta la fase estacionaria en un medio que contenía tiamina 2 j M y luego las células se diluyeron hasta una densidad óptica a 750 nm (DO750) de aproximadamente 0.05 en un medio sin tiamina. A continuación, las células diluidas se cultivaron una vez más hasta la fase estacionaria en un medio sin tiamina (2-3 días). Estas células con la tiamina agotada se utilizaron para inocular cultivos para estudios de crecimiento en medio sin tiamina. Las células de tipo salvaje se cultivaron en un medio con glucosa como fuente de carbono (con o sin tiamina) y clones positivos con el péptido de tránsito nativo. Los constructos del THIC de Coccomyxa C-169 THIC se cultivaron en un medio con sacarosa como única fuente de carbono. El crecimiento se midió controlando la absorbancia a 750 nm. Los resultados de los experimentos de crecimiento mostraron un crecimiento sustancialmente mayor en un medio sin tiamina de cepas que expresan el transgén en comparación con las células de tipo salvaje en el medio sin tiamina. Sin embargo, los transformantes no lograron la tasa de crecimiento y las densidades celulares de las células de tipo salvaje en medios con contenido de tiamina. También hubo una fuerte correlación entre la cantidad de crecimiento en los clones transformantes en el medio sin tiamina y el número de copias de la enzima integrada de Coccomyxa (es decir, cuantas más copias del transgén, mejor será el crecimiento de las células en un medio sin tiamina).
[0490] Se generaron transformantes adicionales usando constructos de expresión que contenían el THIC de Coccomyxa, el gen THIC de Arabidopsis thaliana y el gen thiC de Synechocystis sp. PCC 6803. En el caso del el gen THIC de Coccomyxa y de A. thaliana, la secuencia del péptido de tránsito nativo se reemplazó con la secuencia del péptido de tránsito de un gen de la estearoil-ACP desaturasa (SAD) de Chlorella protothecoides. Synechocystis sp. es una cianobacteria y la proteína thiC no contiene una secuencia de péptido de tránsito nativo. En el constructo del thiC de Synechocystis sp, la secuencia del péptido de tránsito de un gen SAD de Chlorella protothecoides se fusionó con el N-terminal del thiC de Synechocystis sp.. En todos los casos, las secuencias se optimizaron por codón para la expresión en Prototheca moriformis. Los tres constructos anteriores contenían una secuencia de direccionamiento de recombinación homóloga en dirección hacia 5' y en dirección hacia 3' a la región 6S del genoma (SEQ ID N.°: 82 y 84), un promotor de actina/5'UTR de Chlorella protothecoides y un gen EF1A de Chlorella protothecoides 3'UTR. Los tres constructos contenían un gen neoR impulsado por el promotor/5'UTR TUB2 de C. reinhardtii (SEQ ID N.°: 114) y contenían el 3'UTR de C. vulgaris (SEQ ID N.°: 115), lo que confiere la selección por parte de G418. La secuencia de aminoácidos del THIC de A. thaliana correspondía al número de acceso NP_180524 del NCBI y la secuencia de aminoácidos del thiC de Synechocystis sp. correspondía al número de acceso NP_442586 del NCBI. Las secuencias de casetes de expresión relevantes se enumeran en el listado de secuencias y se detallan a continuación:
Constructo de expresión del THIC de Coccomyxa con C. protothecoides péptido de tránsito SEQ ID N 130 THIC de Coccomyxa con péptido de tránsito de C. protothecoides SEQ ID N 131 Promotor de actina/5 'UTR de C. protothecoides SEQ ID N 132 EF1A 3'UTR de C. protothecoides SEQ ID N 133 Constructo de expresión del THIC de A. thaliana SEQ ID N 134 THIC de A. thaliana con péptido de tránsito de C. protothecoides SEQ ID N 135 Secuencia de aminoácidos del THIC de A. thaliana con péptido de tránsito nativo SEQ ID N 136 Constructo de expresión del thiC de Synechocystis sp SEQ ID N 137 thiC de Synechocystis sp. con péptido de tránsito de C. protothecoides SEQ ID N 138 Secuencia de aminoácidos del thiC de Synechocystis sp. SEQ ID N 139 gen neoR SEQ ID N 140
[0491] Los clones positivos se cribaron en placas que contenían G418 y se seleccionaron varios clones de cada transformación para su verificación mediante PCR. La integración de los constructos de ADN transformante que contienen el Coccomyxa C-169 (con péptido de tránsito de C. protothecoides) y los genes THIC de A. thaliana y Synechocystis sp. PCC 6803, respectivamente en el locus 6S del genoma se confirmó mediante análisis de PCR con los siguientes cebadores:
Secuencia del cebador de confirmación 5' THIC de Coccomyxa (SEQ ID N.°: 141) ACGTCGCGACCCATGCTTCC
Secuencia del cebador de confirmación 3' THIC (SEQ ID N.°: 142) GGGTGATCGCCTACAAGA Secuencia del cebador de confirmación 5' THIC de A. thaliana (SEQ ID N.°: 143) GCGTCATCGCCTACAAGA
Secuencia del cebador de confirmación 5' thiC de Synechocystis sp. (SEQ ID N.°: 144) CGATGCTGTGCTACGTGA
[0492] Se realizaron experimentos de crecimiento en células con la tiamina agotada (como se ha descrito anteriormente) usando clones positivos confirmados seleccionados de transformantes de cada uno de los diferentes constructos en un medio que contenía G418. Todos los transformantes pudieron crecer (con diversos grados de robustez) en un medio sin tiamina. La comparación del crecimiento de los transformantes en el medio sin tiamina con las células de tipo salvaje en un medio que contiene tiamina mostró la siguiente clasificación con respecto a su capacidad para ayudar al crecimiento en el medio sin tiamina: (1) transformantes de A. thaliana; (2) transformantes de Coccomyxa C-169 (con péptido de tránsito de C. protothecoides); y (3) transformantes de Synechocystis sp.. Estos resultados sugieren que, si bien una sola copia del THIC de A. thaliana fue capaz de complementar la auxotrofia de la tiamina en las células de Prototheca moriformis, se necesitaron múltiples copias de Coccomyxa C-169 (con la secuencia de péptido de tránsito nativo o una secuencia de péptido de tránsito de C. protothecoides) y del THIC de Synechocystis sp. para permitir un crecimiento rápido en ausencia de tiamina. Dada la variabilidad en los resultados de los diferentes THIC de las diferentes fuentes, la capacidad de cualquier gen THIC para complementar completamente la lesión presente en la especie Prototheca no es predecible.
[0493] Se realizó un alineamiento de las tres secuencias de aminoácidos del THIC. Si bien existe una conservación de secuencia significativa entre el thiC de Synechocystis sp. en comparación con los THIC de Coccomyxa y A. thaliana (41 % de identidad a nivel de los aminoácidos), a la proteína cianobacteriana le falta un dominio en el N-terminal que esté bien conservado en las proteínas de algas y plantas. A pesar del dominio ausente (lo que presumiblemente da como resultado diferencias estructurales), el constructo que expresa el thiC de Synechocystis sp. fue capaz de restaurar al menos parcialmente la tiamina prototrófica en las células de Prototheca moriformis.
EJEMPLO 13: Producción de combustible
A. Extracción de aceite de microalgas utilizando una prensa de expulsión y un auxiliar de prensado
[0494] La biomasa de microalgas que contenía un 38 % de aceite en peso seco de la célula se secó usando un secador de tambor dando como resultado un contenido de humedad resultante del 5-5.5 %. La biomasa se suministró a una prensa francesa L250. Se suministraron 30.4 kg (671bs.) de biomasa a través de la prensa y no se recuperó aceite. La misma biomasa microbiana seca combinada con un porcentaje variable de pasto varilla como auxiliar de prensado se suministró a través de la prensa. La combinación de biomasa microbiana seca y un 20 % p/p de pasto varilla produjo el mejor porcentaje general de recuperación de aceite. A continuación, los pasteles prensados se sometieron a extracción con hexano y el rendimiento final para la condición de pasto varilla al 20 % fue del 61.6 % del aceite total disponible (calculado en peso). La biomasa con más del 50 % en peso de células secas de aceite no requirió el uso de un auxiliar de prensado como el pasto varilla para liberar aceite. Otros métodos de extracción de aceite de microalgas utilizando una prensa de expulsión se describen en la solicitud PCT n.° PCT/US2010/31108.
B. Producción de biodiésel a partir de aceite de Prototheca
[0495] El aceite desgomado de Prototheca moriformis UTEX 1435, producido según los métodos descritos anteriormente, se sometió a transesterificación para producir ésteres metílicos de ácidos grasos. Los resultados se muestran en la tabla 24 a continuación.
[0496] El perfil lipídico del aceite fue:
C10: 00.02
C12: 00.06
C14: 01.81
C14.10.07
C16: 024.53
C16: 11.22
C18: 02.34
C18: 159.21
C18: 28.91
C18: 30.28
C20: 00.23
C20: 10.10
C20: 10.08
C21: 00.02
C22: 00.06
C24: 00.10
Tabla 24. Perfil de biodiésel del aceite de tri licéridos de Prototheca moriformis.
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Figure imgf000091_0001
Figure imgf000092_0001
[0497] El perfil de lípidos del biodiésel fue muy similar al perfil de lípidos del aceite de materia prima. Otros aceites proporcionados por los métodos y composiciones de la invención pueden someterse a transesterificación para producir biodiésel con perfiles lipídicos que incluyen (a) al menos un 4 % de C8-C14; (b) al menos un 0.3 % de c 8; (c) al menos un 2 % de C10; (d) al menos un 2 % de C12; y (3) al menos un 30 % de C8-C14.
[0498] La filtrabilidad de impregnado en frío por el método ASTM D6751 A1 del biodiésel producido fue de 120 segundos para un volumen de 300 ml. Esta prueba implica la filtración de 300 ml de B100, se enfría a 4.4 °C (40 °F) durante 16 horas, se deja calentar hasta la temperatura ambiente y se filtra al vacío utilizando un filtro de fibra de vidrio de 0.7 micras con soporte de acero inoxidable. Los aceites descritos en el presente documento se pueden transesterificar para generar biodiésel con un tiempo de impregnado en frío de menos de 120 segundos, menos de 100 segundos y menos de 90 segundos.
C. Producción de diésel renovable
[0499] El aceite desgomado de Prototheca moriformis UTEX 1435, producido de acuerdo con los métodos descritos anteriormente y que tiene el mismo perfil lipídico que el aceite usado para hacer biodiésel en este ejemplo anterior, se sometió a transesterificación para producir diésel renovable.
[0500] El aceite se hidrotrató primero para eliminar el oxígeno y el esqueleto de glicerol, produciendo n-parafinas. A continuación, las n-parafinas se sometieron a craqueo e isomerización. En la figura 1 se muestra un cromatograma del material. A continuación, el material se sometió a filtración en frío, lo cual eliminó aproximadamente el 5 % del material de C18. Después de la filtración en frío, el material en volumen total se redujo hasta el punto de inflamación y se evaluaron el punto de inflamación, la distribución de destilación ASTM D-86, el punto de enturbiamiento y la viscosidad. El punto de inflamación fue de 63 °C; la viscosidad fue de 2.86 cSt (centistokes); el punto de enturbiamiento fue de 4 °C. Los valores de destilación ASTM D86 se muestran en la tabla 25:
Tabla 25. Valores de destilación ASTM D86.
Lecturas en °C:
Volumen Temperatura
IBP 173
5 217.4
10 242.1
15 255.8
20 265.6
30 277.3
40 283.5
50 286.6
60 289.4
70 290.9
80 294.3
90 300
95 307.7
FBP 331.5
[0501] La T10-T90 del material producido fue de 57.9 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos en el presente documento, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos en el presente documento, pueden emplearse para generar composiciones diésel renovables con otros rangos T10-T90, por ejemplo, de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 y 65 °C usando aceites de triglicéridos producidos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento.
[0502] La T10 del material producido fue de 242.1 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos en el presente documento, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos en el presente documento, pueden emplearse para generar composiciones diésel renovables con otros valores de T10, por ejemplo, una T l0 entre 180 y 295 , entre 190 y 270, entre 210 y 250, entre 225 y 245 y al menos 290.
[0503] La T90 del material producido fue de 300 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos en el presente documento, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos en el presente documento, pueden emplearse para generar composiciones diésel renovables con otros valores de T90, por ejemplo, una T90 entre 280 y 380 , entre 290 y 360, entre 300 y 350, entre 310 y 340 y al menos 290.
[0504] El FBP del material producido fue de 300 °C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes de los aceites descritos en el presente documento, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) descritos en el presente documento, pueden emplearse para generar composiciones diésel renovables con otros valores del FBP, por ejemplo, un FBP entre 290 y 400, entre 300 y 385, entre 310 y 370, entre 315 y 360 y al menos 300.
[0505] Otros aceites proporcionados por los métodos y composiciones descritos en el presente documento pueden someterse a combinaciones de hidrotratamiento, isomerización y otras modificaciones covalentes incluyendo aceites con perfiles lipídicos que incluyen (a) al menos un 4 % de C8-C14; (b) al menos un 0.3 % de C8; (c) al menos un 2 % de C10; (d) al menos un 2 % de C12; y (3) al menos un 30 % de C8-C14.
EJEMPLO 14: Producción de aceites personalizados
[0506] Usando los métodos y materiales descritos en el presente documento, se produjeron varios aceites personalizados. La tabla 32 muestra la cepa, el gen y los números de acceso al genbank de los genes que confieren el fenotipo y los diversos perfiles de ácidos grasos producidos por la cepa indicada. Ambas cepas A y B son cepas de Prototheca moriformis (UTEX 1435), y fueron sometidas a mutagenización clásica por un laboratorio de pago por servicio para mejorar el rendimiento del aceite. A continuación, las cepas A y B se modificaron mediante ingeniería genética tal como se describe en el presente documento con los constructos de ADN apropiados para expresar los genes deseados. Las cepas también se diseñaron para inactivar desaturasas endógenas, según se indica. Las secuencias de nucleótidos de las tioesterasas se optimizaron por codón para su expresión y uso en Prototheca.
[0507] El perfil de ácidos grasos de Prototheca de tipo salvaje sin modificaciones genéticas se muestra en la primera línea de la tabla 32. Como puede verse, el perfil de ácidos grasos se ha alterado drásticamente de diferentes formas en las diferentes cepas. Por ejemplo, el porcentaje de C8: 0 producido por las células de P. moriformis sin modificaciones genéticas es del 0 %. Sin embargo, las células de P. moriformis diseñadas genéticamente para expresar una tioesterasa de C. hookeriana aumentaron la producción de C8: 0 de un 0 % a un 13.2 % del total de triglicéridos. En otro ejemplo, la cantidad total combinada de C8: 0 y C10: 0 en las cepas modificadas genéticamente fue aproximadamente un 39 % del total de ácidos grasos. Por el contrario, la cantidad combinada total de C8: 0 y C10: 0 en las células de tipo salvaje es del 0.01 %. En otro ejemplo, la cantidad total de ácidos grasos saturados se incrementó del 32 % al 90 % mediante la expresión de una tioesterasa de U. americana en las células en las que se interrumpió la expresión del SAD2b endógeno. Esto constituye un aumento de casi el 300 %.
[0508] Los diversos perfiles de ácidos grasos que se describen a continuación son útiles en una miríada de aplicaciones en las que los aceites de triglicéridos están presentes. Por ejemplo, los niveles altos de ácidos grasos saturados de menor longitud de cadena de carbono que comprenden triglicéridos (C12: 0, C14: 0, C16: 0) son particularmente útiles en la producción de combustible renovable para aviones. Para la producción de biodiésel, son deseables cantidades elevadas de C18: 1. Para la producción de jabón en barra, es deseable controlar y lograr el equilibrio adecuado entre los niveles de saturación y los ácidos grasos de cadena más corta. Como ejemplo, son deseables cantidades elevadas de C12: 0 para las propiedades espumantes, al mismo tiempo que las longitudes de cadena más largas proporcionan más estructura, mientras que los triglicéridos que contienen linoleico y linolénico son menos deseables ya que contribuyen a la inestabilidad oxidativa. Para los jabones líquidos, son deseables altas cantidades de C12: 0 y C14: 0. Además, tanto para la producción de jabón en barra como para la producción de jabón líquido, son deseables cantidades bajas de C6: 0, C8: 0 y C10: 0 ya que estos triglicéridos de cadena inferior son irritantes para la piel.
Tabla 32. Genes y números de acceso que confieren fenotipos de varios perfiles de triglicéridos.
Figure imgf000094_0001
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Aceite de palmiste
[0509] Produjimos un mimético de aceite de palmiste microbiano que era similar al aceite de palmiste (PKO). Para producir el mimético del aceite de palmiste, se construyó un plásmido, se usó para transformar la cepa A y se llevó a cabo la producción de aceite. El constructo pSZ1413 (SEq ID N.°: 231), comprendía la interrupción del gen FATB2 de Cuphea wrightii con codones optimizados (SEQ ID N.°: 284) (número de acceso de GenBank U56106) y del gen SAD2B (estearoil ACP desaturasa).
[0510] Como se muestra en la tabla 33 a continuación, el mimético del aceite de palmiste era similar al aceite de palmiste. Los porcentajes de los tres ácidos grasos más abundantes del mimético de PKO (C12: 0, C14: 0 y C18: 1) eran idénticos a los del aceite de palmiste o estaban dentro de una diferencia del 10 % con respecto a ellos.
Tabla 33. Perfil de triglicéridos del mimético del aceite de palmiste.
C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 E. guineensis (palmiste) 3.0-5.0 2.5-6.0 40-52 14.0-18.0 7.0-10.0 1.0-3.0 11.0-19.0 0.5-4.0
pSZ1413 8.33 37.45 18.22 13.52 1.25 15.29 4.95
Aceite de palma
[0511] Produjimos un mimético de aceite de palma microbiano que era similar al aceite de palma. Se construyeron varios plásmidos diferentes, se transformaron individualmente en la cepa A y se llevó a cabo la producción de aceite. El constructo pSZ1503 (SEQ ID N.°: 283) se diseñó para interrumpir un gen KASII endógeno. El constructo pSZ1439 (SEQ ID N.°: 237), comprendía un gen de TE de Elaeis guineensis con codones optimizados (SeQ ID N.°: 205) (número de acceso de GenBank AAD42220.2). El constructo pSZ1420 (SEQ ID N.°: 225), comprendía un gen de TE de Cuphea hookeriana con codones optimizados (SEQ ID N.°: 201) (número de acceso de GenBank Q39513). El constructo pSZ1119 (SEQ ID N.°: 227), comprendía un gen KAS IV de Cuphea hookeriana con codones optimizados (SEQ ID N.°: 186) (número de acceso de GenBank AF060519) así como un gen FATB2 de Cuphea wrightii (SEQ ID N.°: 184) (número de acceso de GenBank U56104).
[0512] Como se muestra en la tabla 34 a continuación, el mimético del aceite de palma era similar al aceite de palma. Los porcentajes de los tres ácidos grasos más abundantes del mimético del aceite de palma (C16: 0, C18: 1 y C18: 2) eran idénticos a los del aceite de palma o estaban dentro de una diferencia del 10 % con respecto a ellos.
Tabla 34. Perfil de triglicéridos del mimético del aceite de palma.
C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2
E. guineensis (palma) 0 0 0.5-5.9 32.0-47.0 2.0-8.0 34-44 7.2-12.0
pSZ1503 0.01 0.01 0.83 38.36 2.21 48.31 7.60
pSZ1439 0.01 0.04 1.88 43.50 3.32 39.95 9.16 pSZ1420 0.02 0.04 2.44 48.04 2.76 35.62 8.91
pSZ1119 1.77 0.40 7.85 35.45 2.47 42.85 8.15
Manteca de cacao

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Proceso para producir un aceite de triglicéridos que tiene un perfil de ácidos grasos inferior al 7 % de C18: 2 a partir de un microbio, donde el proceso comprende:
(i) cultivar una célula de microalgas oleaginosas recombinante, del género Prototheca, que comprende genes exógenos en un medio de cultivo hasta que al menos el 10 % del peso seco de la célula sea aceite de triglicéridos; y
(ii) aislar el aceite de la célula,
en el que una desaturasa de ácido graso delta 12 endógena de la célula de microalgas oleaginosas se ha inactivado o mutado para tener menos actividad enzimática.
2. El proceso según la reivindicación 1, en el que el gen de desaturasa de ácido graso delta 12 endógeno se ha inactivado mediante la interrupción del gen endógeno.
3. El proceso según cualquier reivindicación precedente, en el que una estearoil ACP desaturasa endógena también se ha inactivado o mutado para tener menos actividad enzimática.
4. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que un gen exógeno es un gen de sacarosa invertasa.
5. El proceso según cualquier reivindicación anterior, en el que un gen exógeno codifica una KAS I exógena o una KAS IV.
6. El proceso según cualquier reivindicación anterior, en el que un gen exógeno codifica una acil-ACP tioesterasa exógena FatB.
7. El proceso según la reivindicación 6, en el que el gen exógeno que codifica la tioesterasa viene de una planta del género Cuphea, Elaeis, Myristica o Umbellularia.
8. El proceso según cualquier reivindicación anterior, en el que un gen exógeno codifica una acil-ACP tioesterasa exógena FatA.
9. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el aceite aislado se refina y se blanquea adicionalmente.
10. El proceso según cualquier reivindicación anterior, que comprende además combinar el aceite aislado con un ingrediente comestible.
11. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además someter el aceite a al menos una reacción química seleccionada del grupo que consta de: saponificación; metátesis; hidrólisis ácida; hidrólisis alcalina; hidrólisis enzimática; hidrólisis catalítica; hidrólisis de agua comprimida en caliente; una reacción de hidrólisis catalítica en la que el aceite se divide en glicerol y ácidos grasos; una reacción de aminación para producir compuestos nitrogenados grasos; una reacción de ozonólisis para producir ácidos mono y dibásicos; una reacción de división de triglicéridos seleccionada del grupo que consta de división enzimática y división por presión; una reacción de condensación que sigue a una reacción de hidrólisis; una reacción de hidroprocesamiento; una reacción de hidroprocesamiento y una reacción de desoxigenación o una reacción de condensación anterior o simultánea a la reacción de hidroprocesamiento; una reacción de eliminación de gas; una reacción de desoxigenación seleccionada del grupo que consta de una reacción de hidrogenólisis, hidrogenación, una reacción de hidrogenación-hidrogenólisis consecutiva, una reacción de hidrogenólisishidrogenación consecutiva y una reacción de hidrogenación-hidrogenólisis combinada; una reacción de condensación que sigue a una reacción de desoxigenación; una reacción de esterificación; una reacción de interesterificación; una reacción de transesterificación; una reacción de hidroxilación; y una reacción de condensación que sigue a una reacción de hidroxilación.
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