JP2017104132A - 組み換え従属栄養性微生物から産生された用途に応じた油 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】組換え微生物内で油、燃料、油脂化学品、及び他の化合物を産生する方法及び組成物が提供されており、油を生み出す微生物、及びかかる微生物を低コストで栽培する方法を含む。例えば、リパーゼ、ショ糖トランスポーター、ショ糖インベルターゼ、フルクトキナーゼ、多糖分解酵素、ケトアシル−ACP合成酵素、脂肪族アシル−ACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシル−CoA/アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル−CoA還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素、及び/又はアシルキャリアータンパク質をコードする外来遺伝子を含む微細藻類細胞は、再生可能なディーゼル、バイオディーゼル及び再生可能なジェット燃料のような輸送燃料、並びに機能液、界面活性剤、石鹸及び潤滑剤のような油脂化学品を製造するのに有用である。
【選択図】図1
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づき、2010年5月28日に出願した米国仮出願第61/349,774号、2010年8月18日に出願した米国仮出願第61/374,992号、2010年11月16日に出願した米国仮出願第61/414,393号、2010年12月29日に出願した米国仮出願第61/428,192号の利益を請求する。これらの出願は、それぞれ、あらゆる目的のために内容全体が参照により組み込まれる。
本明細書は、添付した1〜195ページに示されるように、配列表を含んでいる。
特許文献1は、油産生のための微細藻類培養の方法および物質を記載しており、特に、微細藻類Chlorella protothecoidesにより産生される油由来のディーゼル燃料の産生を例示するものである。微細藻類での油産生を改善する方法、特に、長鎖がより短く、飽和度がより高く、色素がなく、収量および効率性のより優れた油を産生する方法に対する必要性が依然として存在する。本発明はこの必要性を満たすものである。
(項目1)
トリグリセリド油を含む油産生微生物細胞であって、前記トリグリセリド油の前記脂肪酸プロフィールが、少なくとも約1%のC8:0、少なくとも約1%のC10:0、少なくとも約1%のC12:0、少なくとも約2%のC14:0、少なくとも約30%のC16:0、少なくとも約5%のC18:0、少なくとも約60%のC18:1、約7%未満のC18:2及び少なくとも約35%の飽和脂肪酸からなる群から選択される、油産生微生物細胞。
(項目2)
前記油産生微生物細胞が外来遺伝子を含み、任意に、前記油産生微生物細胞の内在性デサチュラーゼが不活性化であるか、又はより弱い酵素活性を有するように変異した、項目1に記載の油産生微生物細胞。
(項目3)
前記トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールが、天然に存在する油のトリグリセリドプロフィールに類似している、項目2に記載の油産生微生物細胞。
(項目4)
前記天然に存在する油が、カカオバター、ココナツ油、パーム油、パーム核油、シアバター牛脂及びラードからなる群から選択される、項目3に記載の油産生微生物細胞。
(項目5)
前記トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールが、C8:0とC10:0の総合計量が少なくとも約10%であること、C10:0とC12:及びC14:0の総合計量が少なくとも約50%であること、C16:0とC18:0とC18:1の総合計量が少なくとも約60%であること、C18:0とC18:1とC18:2の総合計量が少なくとも約60%であること、C14:0とC16:0とC18:0とC18:1の総合計量が少なくとも約60%であり、及びC18:1とC18:2の総合計量が約30%未満であることからなる群から選択されるプロフィールを含む、項目2に記載の油産生微生物細胞。
(項目6)
前記トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールが、C8:0とC10:0の比は少なくとも約5:1、C10:0とC12:0の比は少なくとも約6:1、C12:0とC14:0の比は少なくとも約5:1、C14:0とC12:0の比は少なくとも約7:1、及びC14:0とC16:0の比は少なくとも約1:2からなる群から選択される脂肪酸比を含む、項目1に記載の油産生微生物細胞。
(項目7)
前記内在性デサチュラーゼが、ステアロイルACPデサチュラーゼおよびデルタ12脂肪酸デサチュラーゼからなる群から選択される、項目2に記載の油産生微生物細胞。
(項目8)
前記外来遺伝子が、アシル−ACPチオエステラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される、項目7に記載の油産生微生物細胞。
(項目9)
前記外来遺伝子が、Umbellularia californicaの脂肪族−ACPチオエステラーゼ(GenBank寄託番号AAC49001); Cinnamomum camphora の脂肪族−ACPチオエステラーゼ(GenBank寄託番号Q39473);Umbellularia californicaの脂肪族アシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank寄託番号Q41635);Myristica fragransの脂肪族アシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank寄託番号AAB71729);Myristica fragransの脂肪族アシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank寄託番号AAB71730);Elaeis guineensisの脂肪族アシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank寄託番号ABD83939);Elaeis guineensisの脂肪族アシル−ACP チオエステラーゼ(GenBank寄託番号AAD42220);Populus tomentosaの脂肪族アシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank寄託番号ABC47311);Arabidopsis thaliana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号NP_172327);Arabidopsis thaliana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAA85387);Arabidopsis thaliana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAA85388); Gossypium hirsutum 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号Q9SQI3);Cuphea lanceolata 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAA54060);Cuphea hookeriana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAC72882);Cuphea calophylla subsp. mesostemon 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABB71581);Cuphea lanceolata 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAC19933);Elaeis guineensis 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAL15645);Cuphea hookeriana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号Q39513);Gossypium hirsutum 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank 寄託番号AAD01982);Vitis vinifera 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank 寄託番号CAN81819);Garcinia mangostana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB51525);Brassica juncea 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABI18986);Madhuca longifolia 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAX51637);Brassica napus 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABH11710);Oryza sativa(インディカ品種群) 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号EAY86877);Oryza sativa(ジャポニカ品種群) 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号NP_001068400);Oryza sativa(インディカ品種群) 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号EAY99617);Cuphea hookeriana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAC49269);Ulmus Americana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB71731);Cuphea lanceolata 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAB60830);Cuphea palustris 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAC49180);Iris germanica 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAG43858);Iris germanica 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAG43858.1);Cuphea palustris 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAC49179);Myristicafragrans 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB71729);Myristica fragrans 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB717291.1);Cuphea hookeriana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号U39834);Umbelluaria californica 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号M94159);Cinnamomum camphora 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号U31813);Cuphea wrightiiの脂肪族アシル−ACOPチオエステラーゼ(GenBank寄託番号U56103);及びRicinus communis 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABS30422)からなる群から選択されるアシルACPチオエステラーゼをコードする、項目8に記載の油産生微生物細胞。
(項目10)
前記油産生微生物細胞が、スクロースインベルターゼをコードする遺伝子を更に含む、項目2に記載の油産生微生物細胞。
(項目11)
前記油産生微生物細胞が、Achnanthes orientalis、Agmenellum、Amphiprora hyaline、Amphora coffeiformis、Amphora coffeiformis linea、Amphora coffeiformis punctata、Amphora coffeiformis taylori、Amphora coffeiformis tenuis、Amphora delicatissima、Amphora delicatissima capitata、Amphora sp.、Anabaena、Ankistrodesmus、Ankistrodesmus falcatus、Boekelovia hooglandii、Borodinella sp.、Botryococcus braunii、Botryococcus sudeticus、Carteria、Chaetoceros gracilis、Chaetoceros muelleri、Chaetoceros muelleri subsalsum、Chaetoceros sp.、Chlorella anitrata、Chlorella Antarctica、Chlorella aureoviridis、Chlorella candida、Chlorella capsulate、Chlorella desiccate、Chlorella ellipsoidea、Chlorella emersonii、Chlorella fusca、Chlorella fusca var. vacuolata、Chlorella glucotropha、Chlorella infusionum、Chlorella infusionum var. actophila、Chlorella infusionum var. auxenophila、Chlorella kessleri、Chlorella lobophora(strain SAG37.88)、Chlorella luteoviridis、Chlorella luteoviridis var. aureoviridis、Chlorella luteoviridis var. lutescens、Chlorella miniata、Chlorella minutissima、Chlorella mutabilis、Chlorella nocturna、Chlorella parva、Chlorella photophila、Chlorella pringsheimii、Chlorella protothecoides(任意のUTEX株1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25、並びにCCAP株211/17及び211/8dを含む)、Chlorella protothecoides var. acidicola、Chlorella regularis、Chlorella regularis var. minima、Chlorella regularis var. umbricata、Chlorella reisiglii、Chlorella saccharophila、Chlorella saccharophila var. ellipsoidea、Chlorella salina、Chlorella simplex、Chlorella sorokiniana、Chlorella sp.、Chlorella sphaerica、Chlorella stigmatophora、Chlorella vanniellii、Chlorella vulgaris、Chlorella vulgaris、Chlorella vulgaris f. tertia、Chlorella vulgaris var. autotrophica、Chlorella vulgaris var. viridis、Chlorella vulgaris var. vulgaris、Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia、Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis、Chlorella xanthella、Chlorella zofingiensis、Chlorella trebouxioides、Chlorella vulgaris、Chlorococcum infusionum、Chlorococcum sp.、Chlorogonium、Chroomonas sp.、Chrysosphaera sp.、Cricosphaera sp.、Cryptomonas sp.、Cyclotella cryptica、Cyclotella meneghiniana、Cyclotella sp.、Dunaliella sp.、Dunaliella bardawil、Dunaliella bioculata、Dunaliella granulate、Dunaliella maritime、Dunaliella minuta、Dunaliella parva、Dunaliella peircei、Dunaliella primolecta、Dunaliella salina、Dunaliella terricola、Dunaliella tertiolecta、Dunaliella viridis、Dunaliella tertiolecta、Eremosphaera viridis、Eremosphaera sp.、Ellipsoidon sp.、Euglena、Franceia sp.、Fragilaria crotonensis、Fragilaria sp.、Gleocapsa sp.、Gloeothamnion sp.、Hymenomonas sp.、Isochrysis aff. galbana、Isochrysis galbana、Lepocinclis、Micractinium、Micractinium(UTEX LB2614)、Monoraphidium minutum、Monoraphidium sp.、Nannochloris sp.、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis sp.、Navicula acceptata、Navicula biskanterae、Navicula pseudotenelloides、Navicula pelliculosa、Navicula saprophila、Navicula sp.、Nephrochloris sp.、Nephroselmis sp.、Nitschia communis、Nitzschia alexandrina、Nitzschia communis、Nitzschia dissipata、Nitzschia frustulum、Nitzschia hantzschiana、Nitzschia inconspicua、Nitzschia intermedia、Nitzschia microcephala、Nitzschia pusilla、Nitzschia pusilla elliptica、Nitzschia pusilla monoensis、Nitzschia quadrangular、Nitzschia sp.、Ochromonas sp.、Oocystis parva、Oocystis pusilla、Oocystis sp.、Oscillatoria limnetica、Oscillatoria sp.、Oscillatoria subbrevis、Pascheria acidophila、Pavlova sp.、Phagus、Phormidium、Platymonas sp.、Pleurochrysis carterae、Pleurochrysis dentate、Pleurochrysis sp.、Prototheca wickerhamii、Prototheca stagnora、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis、Prototheca zopfii、Pyramimonas sp.、Pyrobotrys、Sarcinoid chrysophyte、Scenedesmus armatus、Spirogyra、Spirulina platensis、Stichococcus sp.、Synechococcus sp.、Tetraedron、Tetraselmis sp.、Tetraselmis suecica、Thalassiosira weissflogii、及びViridiella fridericianaから選択される微細藻類遺伝子又は種の細胞である、項目2に記載の油産生微生物細胞。
(項目12)
前記油産生微生物細胞が、Prototheca属の種の細胞である、項目11に記載の油産生微生物細胞。
(項目13)
前記油産生微生物細胞が、Prototheca moriformis属の細胞である、項目12に記載の油産生微生物細胞。
(項目14)
前記油産生微生物細胞が、油産生酵母細胞である、項目2に記載の油産生微生物細胞。
(項目15)
前記油産生微生物細胞が、油産生細菌細胞である、項目2に記載の油産生微生物細胞。
(項目16)
前記天然に存在する油が、カカオバターであり、前記外来遺伝子が、Carthamus tinctorusチオエステラーゼ遺伝子を含む、項目4に記載の油産生微生物細胞。
(項目17)
前記の天然に存在する油が、ココナツ油である、項目4に記載の油産生微生物細胞。
(項目18)
前記の天然に存在する油が、パーム油であり、前記外来遺伝子が、Elaeis guiniensisのチオエステラーゼ遺伝子、Cuphea hookerianaのチオエステラーゼ遺伝子、Cuphea hookerianaのKAS IV遺伝子とCuphea wrightiiのFATB2遺伝子との組み合わせ、又は内在性KAS II遺伝子を破壊するように設計された構築物を含む、項目4に記載の油産生微生物細胞。
(項目19)
前記天然に存在する油が、パーム核油であり、前記外来遺伝子が、Cuphea wrightiiのFATB2遺伝子と、内在するSAD2B遺伝子を破壊するように設計された構築物との組み合わせを含む、項目4に記載の油産生微生物細胞。
(項目20)
前記天然に存在する油が、シアバターである、項目4に記載の油産生微生物細胞。
(項目21)
前記天然に存在する油が、牛脂である、項目4に記載の油産生微生物細胞。
(項目22)
前記天然に存在する油がラードであり、前記外来遺伝子が、U.californicaのチオエステラーゼ遺伝子と、内在するSAD2B遺伝子を破壊するよう設計された構築物との組み合わせ、Garcinia mangostanaのチオエステラーゼ遺伝子と、内在するSAD2B遺伝子を破壊するように設計された構築物との組み合わせ、Brassica napusのチオエステラーゼ遺伝子、又はCuphea hookerianaのチオエステラーゼ遺伝子を含む、項目4に記載の油産生微生物細胞。
(項目23)
トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールが、少なくとも約1%のC8:0、少なくとも約1%のC10:0、少なくとも約1%のC12:0、少なくとも約2%のC14:0、少なくとも約30%のC16:0、少なくとも約5%のC18:0、少なくとも約60%のC18:1、約7%未満のC18:2及び少なくとも約35%の飽和脂肪酸からなる群から選択される、油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目24)
培養培地中の組み換え油産生微生物細胞の個体群を培養することにより産生し、前記油産生微生物細胞が外来遺伝子を含み、任意に、前記油産生微生物細胞の内在性デサチュラーゼが、不活性化もしくはより低い酵素活性を有するよう変異した、項目23に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目25)
前記トリグリセリド油の前記脂肪酸プロフィールが、天然に存在する油のトリグリセリド油プロフィールに類似する、項目24に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目26)
前記の天然に存在する油が、カカオバター、ココナツ油、パーム油、パーム核油、シアバター牛脂及びラードからなる群から選択される、項目25に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目27)
前記トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールが、C10:0とC12:0とC14:0の総合計量が少なくとも約50%であり、C16:0とC18:0とC18:1の総合計量が少なくとも約60%であり、C18:0、C18:1及びC18:2の総合計量が約60%であり、C14:0とC16:0とC18:0とC18:1の総合計量が少なくとも約60%であり、及びC8:0とC10:0の総合計量が約50%未満であるプロフィールを含む、項目24に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目28)
前記トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールが、C8:0とC10:0の比は少なくとも約5:1、C10:0とC12:0の比は少なくとも約6:1、C12:0とC14:0の比は少なくとも約5:1、C14:0とC12:0の比は少なくとも約7:1、C14:0とC16:0の比は少なくとも約1:2からなる群から選択される脂肪酸比を含む、項目24に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目29)
培養培地で組み換え油産生微生物細胞の個体群を培養することにより産生され、前記内在性デサチュラーゼが、ステアロイルACPデサチュラーゼおよびデルタ12脂肪酸デサチュラーゼからなる群から選択される、項目24に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目30)
培養培地で組み換え油産生微生物細胞の個体群を培養することにより産生され、培養培地で組み換え油産生微生物細胞の個体群を培養することにより産生され、前記油産生微生物細胞が、アシルACPチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を含む、項目29に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目31)
培養培地で組み換え油産生微生物細胞の個体群を培養することにより産生され、前記油産生微生物細胞が、Umbellularia californica 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAC49001);Cinnamomum camphora 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号Q39473);Umbellularia californicaの 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号Q41635);Myristica fragrans 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB71729);Myristica fragrans 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB71730);Elaeis guineensis 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABD83939);Elaeis guineensis 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAD42220);Populus tomentosa 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABC47311);Arabidopsis thaliana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号NP_172327);Arabidopsis thaliana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAA85387);Arabidopsis thaliana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAA85388);Gossypium hirsutum 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号Q9SQI3);Cuphea lanceolata 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAA54060);Cuphea hookeriana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAC72882);Cuphea calophylla subsp. mesostemon 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABB71581);Cuphea lanceolata 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAC19933);Elaeis guineensis 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAL15645);Cuphea hookeriana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号Q39513);Gossypium hirsutum 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAD01982);Vitis vinifera 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAN81819);Garcinia mangostana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB51525);Brassica juncea 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABI18986);Madhuca longifolia脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAX51637);Brassica napus 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABH11710);Oryza sativa(インディカ品種群) 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号EAY86877);Oryza sativa(ジャポニカ品種群) 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号NP_001068400);Oryza sativa(インディカ品種群) 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号EAY99617);Cuphea hookeriana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAC49269);Ulmus Americana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB71731);Cuphea lanceolata 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAB60830);Cuphea palustris 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAC49180);Iris germanica 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAG43858);Iris germanica 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAG43858.1);Cuphea palustris 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAC49179);Myristica fragrans 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB71729);Myristica fragrans脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB717291.1);Cuphea hookeriana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号U39834);Umbelluaria californica 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号M94159);Cinnamomum camphora 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号U31813);Cuphea wrightiiの脂肪族アシル−ACOPチオエステラーゼ(GenBank寄託番号U56103);及びRicinus communis 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABS30422)からなる群から選択されるアシル−ACPチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を含む、項目30に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目32)
培養培地で組み換え油産生微生物細胞の個体群を培養することにより産生され、前記油産生微生物細胞が、スクロースインベルターゼをコードする遺伝子を更に含む、項目31に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目33)
培養培地で組み換え油産生微生物細胞の個体群を培養することにより産生され、前記油産生微生物細胞が、Achnanthes orientalis、Agmenellum、Amphiprora hyaline、Amphora coffeiformis、Amphora coffeiformis linea、Amphora coffeiformis punctata、Amphora coffeiformis taylori、Amphora coffeiformis tenuis、Amphora delicatissima、Amphora delicatissima capitata、Amphora sp.、Anabaena、Ankistrodesmus、Ankistrodesmus falcatus、Boekelovia hooglandii、Borodinella sp.、Botryococcus braunii、Botryococcus sudeticus、Carteria、Chaetoceros gracilis、Chaetoceros muelleri、Chaetoceros muelleri subsalsum、Chaetoceros sp.、Chlorella anitrata、Chlorella Antarctica、Chlorella aureoviridis、Chlorella candida、Chlorella capsulate、Chlorella desiccate、Chlorella ellipsoidea、Chlorella emersonii、Chlorella fusca、Chlorella fusca var. vacuolata、Chlorella glucotropha、Chlorella infusionum、Chlorella infusionum var. actophila、Chlorella infusionum var. auxenophila、Chlorella kessleri、Chlorella lobophora(SAG株37.88)、Chlorella luteoviridis、Chlorella luteoviridis var. aureoviridis、Chlorella luteoviridis var. lutescens、Chlorella miniata、Chlorella minutissima、Chlorella mutabilis、Chlorella nocturna、Chlorella parva、Chlorella photophila、Chlorella pringsheimii、Chlorella protothecoides(任意のUTEX株1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25、並びにCCAP株211/17及び211/8dを含む)、Chlorella protothecoides var. acidicola、Chlorella regularis、Chlorella regularis var. minima、Chlorella regularis var. umbricata、Chlorella reisiglii、Chlorella saccharophila、Chlorella saccharophila var. ellipsoidea、Chlorella salina、Chlorella simplex、Chlorella sorokiniana、Chlorella sp.、Chlorella sphaerica、Chlorella stigmatophora、Chlorella vanniellii、Chlorella vulgaris、Chlorella vulgaris、Chlorella vulgaris f. tertia、Chlorella vulgaris var. autotrophica、Chlorella vulgaris var. viridis、Chlorella vulgaris var. vulgaris、Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia、Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis、Chlorella xanthella、Chlorella zofingiensis、Chlorella trebouxioides、Chlorella vulgaris、Chlorococcum infusionum、Chlorococcum sp.、Chlorogonium、Chroomonas sp.、Chrysosphaera sp.、Cricosphaera sp.、Cryptomonas sp.、Cyclotella cryptica、Cyclotella meneghiniana、Cyclotella sp.、Dunaliella sp.、Dunaliella bardawil、Dunaliella bioculata、Dunaliella granulate、Dunaliella maritime、Dunaliella minuta、Dunaliella parva、Dunaliella peircei、Dunaliella primolecta、Dunaliella salina、Dunaliella terricola、Dunaliella tertiolecta、Dunaliella viridis、Dunaliella tertiolecta、Eremosphaera viridis、Eremosphaera sp.、Ellipsoidon sp.、Euglena、Franceia sp.、Fragilaria crotonensis、Fragilaria sp.、Gleocapsa sp.、Gloeothamnion sp.、Hymenomonas sp.、Isochrysis aff. galbana、Isochrysis galbana、Lepocinclis、Micractinium、Micractinium(UTEX LB2614)、 Monoraphidium minutum、Monoraphidium sp.、Nannochloris sp.、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis sp.、Navicula acceptata、Navicula biskanterae、Navicula pseudotenelloides、Navicula pelliculosa、Navicula saprophila、Navicula sp.、Nephrochloris sp.、Nephroselmis sp.、Nitschia communis、Nitzschia alexandrina、Nitzschia communis、Nitzschia dissipata、Nitzschia frustulum、Nitzschia hantzschiana、Nitzschia inconspicua、Nitzschia intermedia、Nitzschia microcephala、Nitzschia pusilla、Nitzschia pusilla elliptica、Nitzschia pusilla monoensis、Nitzschia quadrangular、Nitzschia sp.、Ochromonas sp.、Oocystis parva、Oocystis pusilla、Oocystis sp.、Oscillatoria limnetica、Oscillatoria sp.、Oscillatoria subbrevis、Pascheria acidophila、Pavlova sp.、Phagus、Phormidium、Platymonas sp.、Pleurochrysis carterae、Pleurochrysis dentate、Pleurochrysis sp.、Prototheca wickerhamii、Prototheca stagnora、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis、Prototheca zopfii、Pyramimonas sp.、Pyrobotrys、Sarcinoid chrysophyte、Scenedesmus armatus、Spirogyra、Spirulina platensis、Stichococcus sp.、Synechococcus sp.、Tetraedron、Tetraselmis sp.、Tetraselmis suecica、Thalassiosira weissflogii、及びViridiella fridericianaから選択される微細藻類遺伝子又は種の細胞である、項目32に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目34)
培養培地で組み換え油産生微生物細胞の個体群を培養することにより産生され、前記油産生微生物細胞がPrototheca属の細胞である、項目24に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目35)
培養培地で組み換え油産生微生物細胞の個体群を培養することにより産生され、前記油産生微生物細胞がPrototheca moriformis属の細胞である、項目34に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目36)
前記油産生微生物細胞が油産生酵母細胞である、項目24に記載の油産生微生物トリグリセリド油。
(項目37)
前記油産生微生物細胞が産生細菌細胞である、項目24に記載の油産生微生物トリグリセリド油。
(項目38)
前記天然に存在する油がココナツ油である、項目26に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目39)
前記天然に存在する油がパーム油であり、前記外来遺伝子が、前記外来遺伝子が、Elaeis guiniensisのチオエステラーゼ遺伝子、Cuphea hookerianaのチオエステラーゼ遺伝子、Cuphea hookerianaのKAS IV遺伝子とCuphea wrightiiのFATB2遺伝子との組み合わせ、又は内在性KAS II遺伝子を破壊するように設計された構築物を含む、項目26に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目40)
前記の天然に存在する油がパーム核油であり、前記外来遺伝子が、Cuphea wrightiiのFATB2遺伝子と、内在するSAD2B遺伝子を破壊するように設計された構築物との組み合わせを含む、項目26に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目41)
前記の天然に存在する油がシアバターである、項目26に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目42)
前記の天然に存在する油が牛脂である、項目26に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目43)
前記の天然に存在する油がラードであり、前記外来遺伝子が、U.californicaのチオエステラーゼ遺伝子と、内在するSAD2B遺伝子を破壊するよう設計された構築物との組み合わせ、Garcinia mangostanaのチオエステラーゼ遺伝子と、内在するSAD2B遺伝子を破壊するように設計された構築物との組み合わせ、Brassica napusのチオエステラーゼ遺伝子、又はCuphea hookerianaのチオエステラーゼ遺伝子を含む、項目26に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目44)
トリグリセリド油組成物が、
i.0.3mcg/g未満の総カロテノイド;
ii.0.005mcg/g未満のリコピン;
iii.0.005mcg/g未満のβ−カロテン;
iv.0.3mcg/g未満のクロロフィルA;
v.175mcg/g未満のγトコフェロール;
vi.0.25%未満のブラシカステロール、カンペステロール、スチグナステロール、またはβ−シトステロール;
vii.350mcg/g未満の総トコトリエノール;
viii.0.05mcg/g未満のルテイン;又はix.275mcg/g未満のトコフェロール;
からなる群から選択される性質を更に含む、項目23に記載の油産生微生物トリグリセリド油組成物。
(項目45)
油産生微生物トリグリセリド油組成物の製造法であって、前記トリグリセリド油組成物が、少なくとも約1%のC8:0、少なくとも約1%のC10:0、少なくとも約1%のC12:0、少なくとも約2%のC14:0、少なくとも約30%のC16:0、少なくとも約5%のC18:0、少なくとも約60%のC18:1、約7%未満のC18:2及び少なくとも約35%の飽和脂肪酸からなる群から選択される脂肪酸プロフィールを有し、本方法が、
a. 乾燥細胞重量で前記油産生微生物細胞の少なくとも10%がトリグリセリド油でとなるまで培養培地で組み換え油産生微生物細胞の個体群を培養し;及び
b.前記トリグリセリド油組成物を前記油産生微生物細胞から分離する
工程を含む製造法。
(項目46)
前記油産生微生物細胞が外来遺伝子を含み、任意に、前記油産生微生物細胞の内在性デサチュラーゼが不活性化又はより低い酵素活性に変異した、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記トリグリセリド油の脂肪酸プロフィールが、天然に存在する油のトリグリセリド油プロフィールに類似している、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記の天然に存在する油が、カカオバター、ココナツ油、パーム油、パーム核油、シアバター、牛脂及びラードからなる群から選択される、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記トリグリセリド油の前記脂肪酸プロフィールが、プロフィールを含み、
C10:0とC12:0とC14:0の総合計量が少なくとも約50%であり、C16:0とC18:0とC18:1の総合計量が少なくとも約60%であり、
C18:0とC18:1及びC18:2の総合計量が少なくとも約60%であり、C14:0とC16:0とC18:0及びC18:1の総合計量が少なくとも約60%であり、C8:0とC10:0の総合計量が約50%未満である、項目46に記載の方法。
(項目50)
前記トリグリセリド油の前記脂肪酸プロフィールが、C8:0とC10:0の比は少なくとも約5:1、C10:0とC12:0の比は少なくとも約6:1、C12:0とC14:0の比は少なくとも約5:1、C14:0とC12:0の比は少なくとも約7:1、C14:0とC16:0の比は少なくとも約1:2からなる群から選択される脂肪酸比を含む、項目45に記載の方法。
(項目51)
前記内在性デサチュラーゼが、ステアロイルACPデサチュラーゼ及びデルタ12脂肪酸デサチュラーゼからなる群から選択される、項目46に記載の方法。
(項目52)
前記外来遺伝子は、アシル−ACPチオエステラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される、項目46に記載の方法。
(項目53)
前記外来遺伝子が、Umbellularia californica 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAC49001);Cinnamomum camphora 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号Q39473);Umbellularia californica 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号Q41635);Myristica fragrans 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB71729);Myristica fragrans 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB71730);Elaeis guineensis 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABD83939);Elaeis guineensis 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAD42220);Populus tomentosa 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABC47311);Arabidopsis thaliana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号NP_172327);Arabidopsis thaliana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAA85387);Arabidopsis thaliana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAA85388);Gossypium hirsutum 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号Q9SQI3);Cuphea lanceolata 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAA54060);Cuphea hookeriana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAC72882);Cuphea calophylla subsp. mesostemon 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABB71581);Cuphea lanceolata 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAC19933);Elaeis guineensis 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAL15645);Cuphea hookeriana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号Q39513);Gossypium hirsutum 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAD01982);Vitis vinifera 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAN81819);Garcinia mangostana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB51525);Brassica juncea 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABI18986);Madhuca longifolia 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAX51637);Brassica napus 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABH11710);Oryza sativa(インディカ品種群) 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号EAY86877);Oryza sativa(ジャポニカ品種群) 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号NP_001068400);Oryza sativa(インディカ品種群) 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号EAY99617);Cuphea hookeriana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAC49269);Ulmus Americana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB71731);Cuphea lanceolata 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号CAB60830);Cuphea palustris 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAC49180);Iris germanica 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAG43858);Iris germanica 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAG43858.1);Cuphea palustris 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAC49179);Myristica fragrans 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB71729);Myristica fragrans 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号AAB717291.1);Cuphea hookeriana 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号U39834);Umbelluaria californica 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号M94159);Cinnamomum camphora 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号U31813);Cuphea wrightiiの脂肪族アシル−ACOPチオエステラーゼ(GenBank寄託番号U56103);及びRicinus communis 脂肪アシル−ACP チオエステラーゼ (GenBank寄託番号ABS30422)からなる群から選択されるアシルACPチオエステラーゼをコードする、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記油産生微生物細胞が、スクロースインベルターゼをコードする遺伝子を更に含む、項目46に記載の方法。
(項目55)
前記油産生微生物細胞が、Achnanthes orientalis、Agmenellum、Amphiprora hyaline、Amphora coffeiformis、Amphora coffeiformis linea、Amphora coffeiformis punctata、Amphora coffeiformis taylori、Amphora coffeiformis tenuis、Amphora delicatissima、Amphora delicatissima capitata、Amphora sp.、Anabaena、Ankistrodesmus、Ankistrodesmus falcatus、Boekelovia hooglandii、Borodinella sp.、Botryococcus braunii、Botryococcus sudeticus、Carteria、Chaetoceros gracilis、Chaetoceros muelleri、Chaetoceros muelleri subsalsum、Chaetoceros sp.、Chlorella anitrata、Chlorella Antarctica、Chlorella aureoviridis、Chlorella candida、Chlorella capsulate、Chlorella desiccate、Chlorella ellipsoidea、Chlorella emersonii、Chlorella fusca、Chlorella fusca var. vacuolata、Chlorella glucotropha、Chlorella infusionum、Chlorella infusionum var. actophila、Chlorella infusionum var. auxenophila、Chlorella kessleri、Chlorella lobophora(SAG株37.88)、Chlorella luteoviridis、Chlorella luteoviridis var. aureoviridis、Chlorella luteoviridis var. lutescens、Chlorella miniata、Chlorella minutissima、Chlorella mutabilis、Chlorella nocturna、Chlorella parva、Chlorella photophila、Chlorella pringsheimii、Chlorella protothecoides(任意のUTEX株1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25、並びにCCAP株211/17及び211/8dを含む)、Chlorella protothecoides and var. acidicola、Chlorella regularis、Chlorella regularis var. minima、Chlorella regularis var. umbricata、Chlorella reisiglii、Chlorella saccharophila、Chlorella saccharophila var. ellipsoidea、Chlorella salina、Chlorella simplex、Chlorella sorokiniana、Chlorella sp.、Chlorella sphaerica、Chlorella stigmatophora、Chlorella vanniellii、Chlorella vulgaris、Chlorella vulgaris、Chlorella vulgaris f. tertia、Chlorella vulgaris var. autotrophica、Chlorella vulgaris var. viridis、Chlorella vulgaris var. vulgaris、Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia、Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis、Chlorella xanthella、Chlorella zofingiensis、Chlorella trebouxioides、Chlorella vulgaris、Chlorococcum infusionum、Chlorococcum sp.、Chlorogonium、Chroomonas sp.、Chrysosphaera sp.、Cricosphaera sp.、Cryptomonas sp.、Cyclotella cryptica、Cyclotella meneghiniana、Cyclotella sp.、Dunaliella sp.、Dunaliella bardawil、Dunaliella bioculata、Dunaliella granulate、Dunaliella maritime、Dunaliella minuta、Dunaliella parva、Dunaliella peircei、Dunaliella primolecta、Dunaliella salina、Dunaliella terricola、Dunaliella tertiolecta、Dunaliella viridis、Dunaliella tertiolecta、Eremosphaera viridis、Eremosphaera sp.、Ellipsoidon sp.、Euglena、Franceia sp.、Fragilaria crotonensis、Fragilaria sp.、Gleocapsa sp.、Gloeothamnion sp.、Hymenomonas sp.、Isochrysis aff. galbana、Isochrysis galbana、Lepocinclis、Micractinium、Micractinium (UTEX LB2614)、Monoraphidium minutum、Monoraphidium sp.、Nannochloris sp.、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis sp.、Navicula acceptata、Navicula biskanterae、Navicula pseudotenelloides、Navicula pelliculosa、Navicula saprophila、Navicula sp.、Nephrochloris sp.、Nephroselmis sp.、Nitschia communis、Nitzschia alexandrina、Nitzschia communis、Nitzschia dissipata、Nitzschia frustulum、Nitzschia hantzschiana、Nitzschia inconspicua、Nitzschia intermedia、Nitzschia microcephala、Nitzschia pusilla、Nitzschia pusilla elliptica、Nitzschia pusilla monoensis、Nitzschia quadrangular、Nitzschia sp.、Ochromonas sp.、Oocystis parva、Oocystis pusilla、Oocystis sp.、Oscillatoria limnetica、Oscillatoria sp.、Oscillatoria subbrevis、Pascheria acidophila、Pavlova sp.、Phagus、Phormidium、Platymonas sp.、Pleurochrysis carterae、Pleurochrysis dentate、Pleurochrysis sp.、Prototheca wickerhamii、Prototheca stagnora、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis、Prototheca zopfii、Pyramimonas sp.、Pyrobotrys、Sarcinoid chrysophyte、Scenedesmus armatus、Spirogyra、Spirulina platensis、Stichococcus sp.、Synechococcus sp.、Tetraedron、Tetraselmis sp.、Tetraselmis suecica、Thalassiosira weissflogii、及びViridiella fridericianaから選択される微細藻類の遺伝子もしくは種の細胞である、項目46に記載の方法。
(項目56)
前記油産生微生物細胞がPrototheca属の細胞である、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記油産生微生物細胞が、Prototheca moriformis属の細胞である、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記天然に存在する油が、ココナツ油である、項目48に記載の方法。
(項目59)
前記の天然に存在する油がパーム油であり、前記外来遺伝子が、前記外来遺伝子が、Elaeis guiniensisのチオエステラーゼ遺伝子、Cuphea hookerianaのチオエステラーゼ遺伝子、Cuphea hookerianaのKAS IV遺伝子とCuphea wrightiiのFATB2遺伝子との組み合わせ、又は内在性KAS II遺伝子を破壊するように設計された構築物を含む、項目48に記載の方法。
(項目60)
前記の天然に存在する油がパーム核油であり、前記外来遺伝子が、Cuphea wrightiiのFATB2遺伝子と、内在するSAD2B遺伝子を破壊するように設計された構築物との組み合わせを含む、項目48に記載の方法。
(項目61)
前記の天然に存在する油がシアバターである、項目48に記載の方法。
(項目62)
前記の天然に存在する油が牛脂である、項目48に記載の方法。
(項目63)
前記の天然に存在する油がラードであり、前記外来遺伝子が、U.californicaのチオエステラーゼ遺伝子と、内在するSAD2B遺伝子を破壊するよう設計された構築物との組み合わせ、Garcinia mangostanaのチオエステラーゼ遺伝子と、内在するSAD2B遺伝子を破壊するように設計された構築物との組み合わせ、Brassica napusのチオエステラーゼ遺伝子、又はCuphea hookerianaのチオエステラーゼ遺伝子を含む、項目48に記載の方法。
(項目64)
油を基本とする産物を作成する方法であって、本方法には
a.項目21に記載の前記油産生微生物トリグリセリド油組成物に対し、鹸化;メタセシス;酸加水分解;アルカリ加水分解;酵素加水分解;触媒的加水分解;加圧熱水による加水分解;脂質がグリセロールと脂肪酸に分解される触媒的加水分解反応;脂肪族窒素化合物が生成されるアミノ化反応;一塩基性及び二塩基性酸が生成されるオゾン分解反応;酵素分解及び加圧分解からなる群から選択されるトリグリセリド分解反応;加水分解反応の後の縮合反応;水素化処理反応;水素化処理反応と脱酸素反応、又は水素化処理反応の前若しくは水素化処理反応と同時の縮合反応;ガス除去反応;水素化分解反応、水素化、水素化−水素化分解の連続反応、水素化分解−水素化の連続反応及び水素化−水素化分解反応の組み合わせからなる群から選択される脱酸素反応;脱酸素反応の後の縮合反応;エステル化反応;インターエステル化反応;トランスエステル化反応;ヒドロキシル化反応;及びヒドロキシル化反応の後の縮合反応;からなる群から選択される少なくとも1つの化学反応を施すこと;及び
b.他の組成物から前記反応物を分離すること
が工程として含まれる、製造方法。
(項目65)
前記の油を基本とする産物が、石鹸、燃料、電解液、作動油、可塑剤、潤滑剤、伝熱流体、及び金属作動流体からなる群から選択される、項目64に記載の方法。
(項目66)
前記の油を基本とする産物が、
a.バイオディーゼル
b.再生可能ディーゼル、及び
c.ジェット燃料
からなる群から選択される燃料製品である、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記の燃料製品が、
以下の1つ又はそれ以上の性質、すなわち、
i.総カロテノイドが、0.3mcg/g未満;
ii.リコピンが0.005mcg/g未満;
iii.β−カロテンが、0.005mcg/g未満;
iv.クロロフィルAが、0.3mcg/g未満;
v.γトコフェロールが、175mcg/g未満;
vi.ブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロール、またはβ−シトステロールが、0.25%未満;
vii.トコトリエノールが、350mcg/g未満;
viii.ルテインが、0.05mcg/g未満;若しくは
ix.トコフェロールが、275mcg/g未満;
のうち1つ又はそれ以上の性質を有するバイオディーゼルである、項目66に記載の方法。
(項目68)
前記燃料製品が、少なくとも、20℃、40℃、又は60℃のT10からT90を有する再生可能ディーゼルである、項目66に記載の方法。
(項目69)
前記燃料製品が、HRJ−5及び/又はASTM規格D1655を満たすジェット燃料である、項目66に記載の方法。
本発明は、異なる脂質プロフィールを有する油産生微生物細胞、好ましくは微細藻類細胞を提供し、脂肪族アシル−ACPチオエステラーゼのようなタンパク質をコードする外来遺伝子を発現する組み換え細胞を含む。また本発明は、このような細胞からバイオディーゼル、再生可能なディーゼル及びジェット燃料のような燃料を含めた脂質及び油脂系製品を製造する方法も提供する。
本発明は、Prototheca及び特定の関連する微生物が、油、燃料、他の炭化水素又は脂質組成物を経済的に大量に産生するという予測できない有利な性質を有しているという発見と、これらの性質を改良するために、上述の微生物を遺伝的に変えるための方法及び試薬の発見とから生じたものである。これらの微生物によって産生される油は、他の用途の中でも、輸送燃料、油脂化学、並びに/又は食品及び香粧品産業で使用することができる。脂質のトランスエステル化によって、バイオディーゼルに有用な長鎖脂肪酸エステルが得られる。他の酵素プロセス及び化学プロセスを、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、アルカン、アルケンを生成するように調節することができる。いくつかの用途では、再生可能なディーゼル、ジェット燃料、又は他の炭化水素化合物を生成する。また、本発明は、生産性を高め、脂質収量を増やし、及び/又は、本明細書に記載される組成物を高い費用効率で生成するために、微細藻類を育てる方法を提供する。
他の意味であると定義されていない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び化学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解している意味を有する。以下の参考文献は、本発明で用いられる多くの用語に関する一般的な定義に関する知識を与えるものである。Singleton et al.、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版、1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker編集、1988);The Glossary of Genetics、第5版、R.Rieger et al.(編集)、Springer Verlag(1991);Hale & Marham、The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。本明細書で使用される場合、他の意味であると明記されていない限り、以下の用語は、それらに属する以下の意味を有する。
本発明は、一般的には、脂質を生成させるために、微生物(例えば、微細藻類、油産生酵母、真菌及び細菌)、特にPrototheca株を含めた組み換え微細藻類株を育てることに関する。読者が読みやすいように、この章をいくつかの節に分けている。第1節は、Prototheca種及びPrototheca株と、新しいProtothecaの種及び株、関連する微細藻類、並びに他の微生物をゲノムDNA比較によって同定するやり方について記載している。第2節は、育てるのに有用なバイオリアクターについて記載している。第3節は、育てるための培地について記載している。第4節は、本発明の例示的な育てる方法に従って油を生成することについて記載している。これらの記載は、さらに一般的に他の微生物にも適用される。
Protothecaは、高濃度の脂質を産生することができ、特に、燃料生成に適した脂質を産生することができるため、脂質の生成に使用するのに卓越した微生物である。Protothecaによって産生される脂質は、他の微細藻類によって産生される脂質よりも鎖長が短く、飽和度が高い炭化水素鎖を含んでいる。さらに、Protothecaの脂質は、一般的に、色素を含まず(クロロフィル及び特定のカロチノイドの濃度が検出不可能なほど低く)、いかなる状況でも、他の微細藻類から得られる脂質よりもかなり色素の含有量が低い。さらに、本発明によって与えられる組み換えPrototheca細胞を用い、他の微生物から脂質を産生する場合と比較して、低コストで、高収率及び高効率で脂質を生成させることができる。本発明の方法で用いる具体的なPrototheca株としては、が挙げられる。それに加え、この微細藻類は、従属栄養性で成長し、Prototheca wickerhamii、Prototheca stagnora(UTEX 327を含む)、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis(UTEX株1441、1435を含む)、Prototheca zopfiiとして遺伝子操作することができる。Prototheca属の種は、偏性従属栄養生物である。
微生物を、遺伝子操作を行うという目的で、及び炭化水素(例えば、脂質、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、アルカン)を生成するという目的で培養する。前者の種類の培養では、小スケールで実施し、最初は、少なくとも、原料微生物が成長可能な条件下で実施する。炭化水素を生成させるための培養は、通常は、バイオリアクター中、大スケールで実施する(例えば、10,000リットル、40,000リットル、100,000リットル、又はそれより大きなバイオリアクター)。Prototheca種を含めた微細藻類を、典型的には、バイオリアクター内の液体培地にて、本発明の方法で培養する。典型的には、バイオリアクターには光を入れない。
微細藻類の培地は、典型的には、固定窒素源、固定炭素源、微量元素、場合により、pHを維持するためのバッファー、ホスフェート(典型的には、リン酸塩として与えられる)のような成分を含有する。他の成分は、特に、海水微細藻類の場合には、塩化ナトリウムのような塩を含んでいてもよい。窒素源としては、有機窒素源及び無機窒素源が挙げられ、例えば、限定されないが、分子状窒素、硝酸エステル、硝酸塩、アンモニア(純水なもの、又は塩形態、例えば、(NH4)2SO4及びNH4OH)、タンパク質、大豆ミール、コーンスティープリカー、酵母抽出物が挙げられる。微量元素の例としては、例えば、それぞれZnCl2、H3BO3、CoCl2・6H2O、CuCl2・2H2O、MnCl2・4H2O、(NH4)6Mo7O24・4H2Oのような形態の亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン、モリブデンが挙げられる。
本発明の方法に従って油を生成する場合、例えば、光が培養物にあたらないような、きわめて大きな(40,000リットル以上の)発酵槽の場合のように、細胞を暗い場所で培養することが好ましい。Prototheca種は、固定炭素源を含有する培地内で、光が存在しない状態で、油を生成するように成長し、増殖する。このような成長は、従属栄養性の成長として知られている。
本発明は、本発明の方法で有用なPrototheca細胞、及び限定されないが、組み換えPrototheca moriformis、Prototheca zopfii、Prototheca krugani、Prototheca stagnora宿主細胞を含む組み換え宿主細胞を含めた微生物を遺伝的に改変する方法及び材料を提供する。読者が読みやすいように、これらの方法及び材料の記載をいくつかの節に分けている。第1節では、形質転換方法について記載している。第2節では、相同組み換えを用いた遺伝子操作方法について記載している。第3節では、発現ベクター及び成分について記載している。
細胞を、例えば、微粒子銃、エレクトロポレーション(Maruyama et al.(2004)、Biotechnology Techniques 8:821−826)、ガラスビーズによる形質転換、及び炭化ケイ素ウィスカーによる形質転換のような任意の適切な技術によって形質転換することができる。使用可能な別の方法は、プロトプラストを作成し、CaCl2及びポリエチレングリコール(PEG)を用い、組み換えDNAを微細藻類細胞に導入することを含む(Kim et al.(2002)、Mar.Biotechnol.4:63−73、この論文は、Chorella ellipsoideaを形質転換するために、この方法を用いることを報告している)。微細藻類の共形質転換を利用し、2種類の別個のベクター分子を細胞に同時に導入することができる(例えば、Protist 2004 Dec;155(4):381−93)。
相同組み換えは、相補的DNA配列を整列させ、相同領域の置き換えを可能にすることである。標的となるゲノム配列(「テンプレート」)と同種の配列を含むトランスジェニックDNA(「ドナー」)を有機体に導入し、次いで、対応するゲノム同種配列の部位にあるゲノムで組み換えが起こる。このプロセスの機構的な工程は、ほとんどの場合、(1)同種DNAセグメントを対にすることと;(2)ドナーDNA分子内に二本鎖開裂部分を導入することと;(3)自由になったドナーDNA末端が、テンプレートDNA分子に侵入した後、DNA合成が起こることと;(4)二本鎖開裂部分の修復事象が起こり、最終的な組み換え産物が得られることとを含む。
本発明に従う微生物を形質転換するためのベクターは、本明細書の開示を考慮して、当業者には有名な既知の技術によって調製することができる。ベクターは、典型的には、1つ以上の遺伝子を含有しており、それぞれの遺伝子は、望ましい生成物(遺伝子産物)を発現するようにコードしており、この遺伝子発現を制御し、組み換え細胞内の特定の位置に向かうように遺伝子産物を標的化するような1つ以上の制御配列に動作可能に連結している。読者の助けとなるように、この節をいくつかの副節に分けている。A副節は、制御配列、典型的には、ベクター上に含まれている制御配列、及び本発明によって提供される新規制御配列について記載している。B副節は、遺伝子、典型的には、ベクターに含まれる遺伝子、及び新規コドン最適化方法、及び本発明によって提供される方法によって調製される遺伝子について記載している。
制御配列は、コード配列の発現を制御するか、又は遺伝子産物を、細胞内又は細胞外の特定の位置に向かわせる核酸である。発現を制御する制御配列としては、例えば、コード配列の転写を制御するプロモーター、コード配列の転写を止めるターミネーターが挙げられる。別の制御配列は、コード配列の末端に位置する3’非翻訳配列であり、ポリアデニル化シグナルをコードする。遺伝子産物を特定の位置に向かわせる制御配列としては、シグナルペプチドをコードする配列が挙げられ、この配列は、細胞内又は細胞外の特定の位置に、この配列が結合したタンパク質を向かわせる。
典型的には、遺伝子は、プロモーターと、コード配列と、停止制御配列とを含む。組み換えDNA技術によって組み立てられる場合、遺伝子は、発現カセットと呼ばれることもあり、組み換え遺伝子を宿主細胞に導入するために使用されるベクターに簡便に挿入するために、制限配列に隣接していてもよい。発現カセットは、ゲノム由来のDNA配列、又は相同組み換えにいよって発現カセットをゲノムに安定に組み込みやすくすることを標的とした他の核酸に隣接していてもよい。又は、ベクター及びその発現カセットは、組み込まれないままであってもよく、この場合には、ベクターは、典型的には、異種ベクターDNAを複製するために与えることができるような、複製起源を含んでいてもよい。
また本発明は、目的の遺伝子を発現させる誘発性プロモーターの使用も提供する。具体的には、必要に応じて、例えば細胞の破壊、反応混合物の水含有量の減少、及び/又はTAGから脂肪酸エステルへの変換を促進するための十分なアルコールの添加の後のエステル転移反応を増強するように条件が調節されていれば、リパーゼ遺伝子を発現させる誘発性プロモーターの使用により、微生物の成長後にリパーゼの産生が可能となる。
さらに、遺伝子操作された微細藻類のような微生物は、例えば一方が多糖分解酵素をコードする、例えばリパーゼ遺伝子と溶解遺伝子のような2種以上の外来遺伝子を含み、発現し得る。誘発性プロモーターを用いて一方又は両方の遺伝子を発現させてもよく、これにより、これらの遺伝子が発現する相対的なタイミングを制御して、脂質収量及び脂肪酸エステルへの変換を高めることができる。2種以上の外来遺伝子の発現は、同じ誘発性プロモーターの制御下にあっても、異なる誘発性プロモーターの制御下にあってもよい。後者の場合、第1の外来遺伝子の発現が第1の期間に誘発され(この間、第2の外来遺伝子の発現は誘発されても、されなくてもよい)、第2の外来遺伝子の発現が第2の期間に誘発され得る(この間、第1の外来遺伝子の発現は誘発されても、されなくてもよい)。ショ糖を代謝するように脂質産生微生物を操作するためのベクター及び方法が本明細書に提供されるが、このような形質は、操作された細胞がサトウキビ原材料を脂質に変換することを可能にするため、有利な形質である。
また本発明は、目的遺伝子の区画化された発現も提供する。具体的には、特定の実施形態では、リパーゼの発現を1つ以上の細胞内区画に標的化することが有利であり、この場合、リパーゼがエステル転移反応の開始まで大部分の細胞内脂質から隔離されている。標的とするのに好ましい細胞小器官は、葉緑体、ミトコンドリア及び小胞体である。
本発明の一実施形態では、微生物内でのポリペプチド発現は、葉緑体を標的とする。異種遺伝子を葉緑体に対して標的化する方法は既知であり、これを本発明で使用することができる。外来遺伝子産物を葉緑体内に標的化する方法は、Shrier et al.、EMBO J.(1985)4:25 32に記載されている。また、核遺伝子産物を葉緑体内に移動させるためのトランジットペプチドの使用に関して、Tomai et al.、Gen.Biol.Chem.(1988)263:15104 15109及び米国特許第4,940,835号も参照されたい。タンパク質の輸送を葉緑体に方向付ける方法もKenauf TIBTECH(1987)5:40 47で概説されている。Chlorellaに内在する葉緑体標的配列、例えば、葉緑体を標的とするタンパク質をコードする、Chlorella核ゲノム内の遺伝子などが知られており、例えば、GenBank寄託番号AY646197及びAF499684を参照されたい。
本発明の別の実施形態では、微生物内でのポリペプチドの発現は、ミトコンドリアを標的とする。外来遺伝子産物をミトコンドリア内に標的化する方法(Boutry et al.、Nature(London)(1987)328:340 342)が記載されており、緑色微細藻類における方法がこれに含まれる(例えば、Mol Gen Genet.1993 Jan;236(2−3):235−44を参照)。
本発明の別の実施形態では、微生物内でのポリペプチド発現は、小胞体を標的とする。発現ベクター内に適切な保持シグナル又は選別シグナルを含むことにより、タンパク質が確実に小胞体(ER)に保持され、下流のゴルジ体には行かない。例えば、Wageningen UR−Plant Research InternationalのIMPACTベクター1.3ベクターは、よく知られているKDEL保持シグナル又は選別シグナルを含んでいる。このベクターを用いてERに保持すれば、これが発現レベルを5倍以上向上させることが報告されていることから、実用上の利点がある。この現象の主な理由は、ERが、発現タンパク質の翻訳後の分解に関与するプロテアーゼを細胞質に存在するプロテアーゼよりも低い濃度で含んでいるか、及び/又は、細胞質に存在するプロテアーゼとは異なるプロテアーゼを含んでいるからだと思われる。緑色微細藻類内で機能するER保持シグナルが知られている。例えば、Proc Natl Acad Sci USA.2005 Apr 26;102(17):6225−30を参照。
(1.ショ糖の利用)
実施形態では、本発明の組み換えPrototheca細胞は、1つ以上の外来のショ糖利用遺伝子をさらに含む。種々の実施形態では、1つ以上の遺伝子は、フルクトキナーゼ、グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、ショ糖インベルターゼ、ショ糖トランスポーターからなる群から選択される1つ以上のタンパク質をコードする。例えば、ショ糖トランスポーター及びショ糖インベルターゼの発現によって、Protothecaは、ショ糖を培地から細胞に移動させ、ショ糖を加水分解し、グルコース及びフルクトースを得ることができる。場合により、フルクトキナーゼは、内在するヘキソキナーゼ活性が、フルクトースの最大リン酸化には不十分であるような状況でも同様に発現することができる。適切なショ糖トランスポーター典枝は、Genbank寄託番号CAD91334、CAB92307、CAA53390である。適切なフルクトキナーゼの例は、寄託番号P26984、P26420、CAA43322である。
上記のように、ショ糖インベルターゼの発現により、炭素源としてショ糖をより効率的に利用する(二糖類であるショ糖のフルクトース分子とグルコース分子の間のα結合を加水分解する酵素を介した)能力がPrototheca細胞に付与されるのに対し、オリゴ糖の他の種類のα結合を加水分解する他の酵素の発現により、他の炭素源を利用する能力がPrototheca細胞に付与され得る。これらの炭素源で成長することができる陽性クローンの選択を可能にすることによって、これらの酵素の発現(及び結果として得られる、Protothecaなどの微細藻類細胞が本来利用することができなかった炭素源を利用する能力)を、上記のトランスジェニックPrototheca細胞の選択マーカーとして用いることができる。
Protothca moriformisを含めたPrototheca株は、チアミン栄養要求性であることが知られており(例えば、Ciferri,O.(1956)Nature,v.178,pp.1475−1476を参照)、このことは、これらの株が成長するためには栄養培地中にチアミンを必要とするということを意味する。チアミン栄養要求性は、チアミン生合成経路の酵素の変異又は発現欠如の結果であり得る。そこで、チアミン生合成経路で欠けている酵素(1つ又は複数)を発現する補完されたトランスジェニック株はチアミンを添加しなくても成長することができるため、栄養培地のコストが低減されるだけでなく、得られる微細藻類バイオマスは動物栄養の観点からもより望ましいものとなる。またトランスジェニック遺伝子が、チアミンを含有しないプレート/培地で成長する能力を付与することから、チアミン生合成経路酵素による補完を選択マーカーとして用いてもよい。
多種多様な選択マーカーのいずれも、Chlorellaのような微生物の形質転換に有用なトランス遺伝子構築物に用いることができる。適当な選択マーカーの例としては、硝酸還元酵素遺伝子、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(HPT)、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、及びフレオマイシン耐性を付与するble遺伝子が挙げられる。微細藻類の抗生物質に対する感度を決める方法はよく知られている。例えば、Mol Gen Genet.1996 Oct 16;252(5):572−9。
ショ糖を含有する原材料のような原材料をProtothecaのような微生物(例えば、油産生酵母、真菌または細菌)が利用する能力を変えることに加え、本発明は、産生する脂質の性質及び/又は割合を変えるように改変された組み換え微生物(例えば、Prototheca)も提供する。上述の経路は、さらに、又は上述のことに変えて、脂質の酵素処理によって産生する種々の脂質分子及び脂肪酸経路の中間体の性質及び/又は割合を変えるように改変されてもよい。種々の実施形態では、本発明の組み換え微生物(例えば、Prototheca細胞)は、形質転換されていない対応する細胞と比較して、単位容積あたり及び/又は単位時間あたりの脂質収量が最適化されており、炭素鎖長(例えば、再生可能なディーゼルを生成するための、又は、脂質原材料を必要とする産業的な化学用途のための)を有しており、二重結合又は三重結合の数が減っており、場合によりゼロになっており、特定の脂質種又は個々の脂質の集合について、水素:炭素比が大きくなっている。さらに、このような高品質の又は特異性の高い成分を生成するように、所望の炭化水素を生成する微生物を操作してもよい。
本発明の方法に従って燃料を生成する場合、本発明の細胞が産生する細胞を収穫するか、又は任意の従来の方法によって、それ以外の方法で集める。全細胞の抽出によって脂質を単離することができる。まず、細胞を破壊し、次いで、例えば、上述のような遠心分離を用いることによって、細胞内の脂質及び細胞膜/細胞壁に関連する脂質、及び細胞外の炭化水素を細胞塊から分けることができる。微生物中で生成する細胞内脂質を、ある実施形態では、微生物の細胞を溶解させた後に抽出する。抽出したら、脂質をさらに精製し、油、燃料又は油脂化学品を作り出す。
(実施例1:Protothecaを培養する方法)
細胞乾燥重量で高い割合の油を得るようにPrototheca株を育てた。凍結保存した細胞を室温で解凍し、細胞500μlを、2%グルコースを含む培地4.5ml(4.2g/L K2HPO4、3.1g/L NaH2PO4、0.24g/L MgSO4・7H2O、0.25g/L クエン酸一水和物、0.025g/L CaCl2 2H2O、2g/L 酵母抽出物)に入れ、6ウェルプレートで攪拌しつつ(200rpm)、28℃で7日間成長させた。細胞乾燥重量は、あらかじめ秤量しておいたエッペンドルフ管中、培養物1mlを14,000rpmで5分間遠心分離することによって決定した。培養物の上澄みを棄て、得られた細胞ペレットを脱イオン水1mlで洗浄した。培養物を再び遠心分離処理し、上澄みを棄て、細胞ペレットを凍結するまで−80℃に置いた。次いで、サンプルを24時間凍結乾燥し、細胞乾燥重量を算出した。培養物中の総脂質を決定するために、培養物3mlを取り出し、Ankomシステム(Ankom Inc.、マセドン、ニューヨーク)を用い、製造業者のプロトコルに従って分析した。サンプルを、Amkom XT10抽出機を用い、製造業者のプロトコルに従って、溶媒抽出した。酸によって加水分解して乾燥させたサンプルと、溶媒抽出して乾燥させたサンプルとの質量差として、総脂質を決定した。細胞乾燥重量での油の割合を測定した値を表10に示す。
検出感度
カロチノイド(mcg/g)nd=<0.003mcg/g
クロロフィル(mcg/g)nd=<0.03mcg/g
ステロール(%)nd=0.25%
トコフェロール(mcg/g);nd=3mcg/g
Seashell Gold Microcarriers 550ナノメートルを、製造業者のプロトコルに従って調製した。プラスミド(20μg)を、結合バッファー50μl及びS550d金担体60μl(30mg)と混合し、氷中、1分間インキュベートした。沈殿バッファー(100μl)を加え、この混合物を氷中でさらに1分間インキュベートした。ボルテックスした後、DNAでコーティングされた粒子を、5415C微量遠心器で10,000rpmで10秒間回転させることによって、ペレット状にした。この金ペレットを冷たい100%エタノール500μlで洗浄し、微量遠心器で軽く攪拌することによってペレット状にし、氷冷したエタノール50μlで再び懸濁させた。軽く(1〜2秒)超音波処理した後、10μlのDNAコーティングされた粒子を、すぐにキャリア膜に移した。
(ベクター構築)
CMVプロモーターと、ヒグロマイシン耐性cDNAと、CMV3’UTRとを含むBamHI−SacIIフラグメント(配列番号152、pCAMBIA1380ベクターの部分配列、Cambia、キャンベラ、オーストラリア)を、pBluescriptのBamHI及びSacIIサイト中にクローン化し、これを本明細書ではpHygと呼ぶ。
Seashell Technology製のS550d金担体を、製造業者のプロトコルに従って調製した。線状pHygプラスミド(20μg)を、結合バッファー50μl及びS550d金担体60μl(30mg)と混合し、氷中、1分間インキュベートした。沈殿バッファー(100μl)を加え、混合物を氷中でさらに1分間インキュベートした。ボルテックスした後、DNAでコーティングされた粒子を、エッペンドルフ5415C微量遠心器で10,000rpmで10秒間回転させることにより、ペレット状にした。この金ペレットを冷たい100%エタノール500μlで1回洗浄し、微量遠心器で短時間回転させてペレット状にし、氷冷したエタノール50μlで再び懸濁させた。短時間(1〜2秒)の超音波処理を行った後、10μlのDNAコーティングされた粒子を、すぐにキャリア膜に移した。
Chlorella protothecoides培養物を、プロテオース培地中、75μmol光子m−2秒−1の連続光下、旋回シェーカー上で、細胞密度が2×106細胞/mlになるまで成長させた。細胞を回収し、滅菌蒸留水で1回洗浄し、4×108細胞/mlの密度になるように、50mMのショ糖を含有するtris−リン酸バッファー(20mM Tris−HCl、pH7.0;1mMリン酸カリウム)に再び懸濁させた。約250μlの細胞懸濁物(1×108個の細胞)を、4mmギャップの使い捨てエレクトロポレーションキュベットに入れた。この細胞懸濁物に、線状pHygプラスミドDNA5μg及び担体DNA(剪断サケ精子DNA)200μgを加えた。次いで、エレクトロポレーションキュベットを水浴中、16℃で10分間インキュベートした。次いで、Gene Pulser II(Bio−Rad Labs、Hercules、CA)エレクトロポレーション装置を用いて、キュベットに25μFのキャパシタンスで電気パルス(1100V/cm)をかけた(エレクトロポレーション分路抵抗器は使用しなかった)。次いで、キュベットを室温で5分間インキュベートした後、細胞懸濁物を50mlのプロテオース培地に移し、施回シェーカー上で2日間、振とうさせた。回復後、低速の遠心分離により細胞を回収し、プロテオース培地に再び懸濁させ、ヒグロマイシン200μg/mlを添加したプレートに低密度で播種した。プレートを75μmol光子m−2秒−1の連続光下でインキュベートした。1〜2週間で形質転換体がコロニーとして現れた。コロニーを取り出し、2回目の選択のために選択的な寒天プレートにスポットした。
2回目の選択を生き延びたコロニーの一部を小量で培養し、回収した。約5〜10μLの容積のペレットを、ボルテックスして50μLの10mM NaEDTAに再び懸濁させてから、100℃で10インキュベートした。次いで、チューブを軽くボルテックスし、10秒間の超音波処理を行った後、12,000×gで1分間遠心分離した。上澄み2μLを50μLのPCR反応で鋳型として使用した。遺伝子型同定に使用したプライマーは、配列番号153及び配列番号154であった。PCR条件は以下の通りであった:95℃で5分間×1サイクル;95℃で30秒間−58℃で30秒間−72℃で1分間30秒×35サイクル;72℃で10分間×1サイクル。予想された992bpフラグメントは、微粒子銃コロニー及び単一のエレクトロポレーションコロニー由来の10コロニーのうち6コロニーで見られた。大きさの小さい、非特異的なバンドがすべてのレーンで見られた。増幅された992bpフラグメントの同一性を確認するために、微粒子銃のバンド2つとエレクトロポレーションのバンドをゲルから切り出し、それぞれを配列決定した。3つのバンドすべての配列が、予想された992bpフラグメントと一致していた。(DNAラダー:Bionexus(登録商標)All Purpose Hi−LoR DNAラダー、カタログ番号BN2050)。
(A.Chlorella protothecoidesに由来する5’UTR及びプロモーターの配列)
混合栄養的に成長するChlorella protothecoides(UTEX 250)から、標準的な技術を用いてcDNAライブラリーを作成した。cDNA配列に基づいて、Seegene’s DNA Walkingキット(ロックビル、MD)を用い、コード領域の上流を「ウォーキングする」ために、特定の既知のハウスキーピング遺伝子においてプライマーを設計した。単離された配列は、アクチン(配列番号155)と、伸長因子−1a(EF1a)(配列番号156)プロモーター/UTRとを含み、これらは、両方とも、イントロン(小文字で示されているもの)と、エクソン(大文字のイタリックで示されている)と、予測開始部位(太字)と、2個のβ−チューブリンプロモーター/UTRエレメント:アイソフォームA(配列番号157)及びアイソフォームB(配列番号158)とを含む。
上述のcDNAライブラリーから、Chlorella protothecoides(UTEX 250)において、脂質代謝に機能するタンパク質をコードする3種類のcDNAを、上述の方法と同じ方法を用いてクローン化した。アシルACPデサチュラーゼ(配列番号159及び160)及び2種類のゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼ(配列番号161〜164)のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、以下の配列表に含まれている。さらに、プラスチドを標的とする推定シグナル配列を有する3種類のcDNAもクローン化した。グリセルアルデヒド−3−ホスフェート脱水素酵素(配列番号165及び166)、酸素発生複合体タンパク質OEE33(配列番号167及び168)、Clpプロテアーゼ(配列番号169及び170)のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、以下の配列表に含まれている。ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列において、推定プラスチド標的配列には、下線を引いている。トランス遺伝子の産物が、細菌のプラスチド、例えば、脂質改変酵素を標的とするように仕向けるために、プラスチド標的配列を用いることができる。
(株及び培地):テキサス大学のCulture Collection of Alga(オースチン、テキサス、米国)からChlorella protothecoides(UTEX 250)を入手した。保存培養株を改変プロテオース培地で維持した。改変プロテオース培地は、1リットルあたり(g/L)、NaNO30.25g、K2HPO40.09g、KH2PO40.175g、CaCl2・2H2O0.025g、MgSO4・7H2O0.075及び酵母抽出物2gからなる。
SUC2遺伝子を3つの異なるプロモーター:カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(CMV)、クロレラウイルスプロモーター(NC−1A)及びクロレラHUP1プロモーターの制御下に置いた。C.protothecoidesに対して最適化されたコドンの使用を調節するために酵母SUC2遺伝子を合成したが、これは、インベルターゼの細胞外分泌を指令するのに必要なシグナル配列を含む。各構築物をpBluescript KS+中で構築し、特異的プライマーを用いたPCR増幅により、EcoRI/AscI、AscI/XhoI及びXhoI/BamHIサイトを、それぞれのプロモーター、インベルターゼ遺伝子及びCMV 3’UTRに個別に導入した。精製したPCR産物を順次、クローン化した。
(分泌型インベルターゼ):分泌型ショ糖インベルターゼをコードする遺伝子(Saccharomyces cerevisiae由来のGen Bank寄託番号NP_012104)を1599bpのAsc I−Xhoフラグメントとしてde−novo合成し、次いで、EcoRI/AscI及びXho/SacIカセットとして、それぞれカリフラワーモザイクウイルス35sプロモーター及び3’UTRを有するpUC19誘導体中にこれをサブクローン化した。
トランス遺伝子の相同組み換えは、いくつかの利点を有する。第1に、相同組み換えではないトランス遺伝子の導入は、細胞に導入されるプラスミドの複製数が制御されないので、予測不可能となり得る。また、相同組み換えではないトランス遺伝子の導入は、プラスミドがエピソームを保有し得、次の細胞分裂のときに失われるので、不安定となり得る。相同組み換えの別の利点は、遺伝子標的を「ノックアウト」し、エピトープタグを導入し、内在する遺伝子のプロモーターを切り替え、遺伝子標的をそれ以外の方法で変える(例えば、点変異の導入)ことができることである。
上の実施例4に記載さているようなPrototheca moriformis cDNA/ゲノムのスクリーニングでは、内在するステアロイルACPデサチュラーゼ(SAPD)cDNAが同定された。ステアロイルACPデサチュラーゼ酵素は、脂質合成経路の一部であり、脂肪酸アシル鎖に二重結合を導入する機能がある。ある場合では、脂肪酸プロフィールを変えるために、脂質経路に関連する酵素の発現をノックアウトするか、又は減らすことが有益な場合がある。内在するステアロイルACPデサチュラーゼ酵素の発現を減らす(又はノックアウトする)ことができるかどうか、そして、不飽和脂肪酸の対応する減少が、宿主細胞の脂質プロフィールでみられるかどうかを評価するために、相同組み換え構築物を作成した。Prototheca moriformis(UTEX 1435)に由来するステアロイルACPデサチュラーゼ遺伝子の約1.5kbのコード配列を同定し、クローン化した(配列番号181)。0.5kbのSAPDコード配列を5’末端(5’標的部位)で用い、次いでChlorella vulgaris 3’UTRを有するChlamydomonas reinhardtii コドンが最適化された酵母ショ糖インベルターゼsuc2遺伝子を駆動するβ−チューブリンプロモーターを用いて相同組み換え構築物を構築した。次いで、Prototheca moriformis SAPDコード配列の残り(約1kb)を、C.vulgaris 3’UTRの後に挿入し、3’標的部位を作った。この相同組み換えカセットの配列を配列番号182に列挙している。上に示されるように、微細藻類を形質転換する前にカセットを線状にし、露出されている末端を残すことによって、相同組み換えカセットを核ゲノムに組み込むのがうまくいく率が増す。Prototheca moriformisに内在するSAPD酵素を標的とする相同組み換えカセットを線状にし、次いで、宿主細胞(Prototheca moriformis、UTEX 1435)内で形質転換した。うまく組み込むと、二箇所の相互組み換えが起こることによって、宿主ゲノムから、内在するSAPD酵素のコード領域が失われ、一方、新しく挿入されたsuc2遺伝子の発現は、C.reinhardtii β−チューブリンプロモーターによって制御されるであろう。唯一の炭素源としてショ糖を含むプレート/培地を用い、得られたクローンをスクリーニングすることができる。相同組み換えカセットがうまく組み込まれたクローンは、唯一の炭素源としてショ糖を用いて成長する能力を有しており、脂質プロフィールにおける脂肪酸の最終的な飽和度が変わることは、二次的な確認因子として役立つであろう。さらに、酵母ショ糖インベルターゼsuc2遺伝子に特異的なプローブを用いたサザンブロットアッセイ、及びRT−PCRによって、陽性クローンにおけるインベルターゼ遺伝子の存在及び発現を確認することができる。代替法として、β−チューブリンプロモーターを含まない同じ構築物を用い、内在するSAPD酵素コード領域を切断することができる。この場合、新しく挿入された酵母ショ糖インベルターゼsuc2遺伝子は、内在するSAPDプロモーター/5’UTRによって制御されるであろう。
Prototheca種における異種チオエステラーゼ遺伝子発現の方法及び効果は、参照により組み込まれる、国際出願PCT/US2009/66142号に既に記載されている。高等植物種由来の他のチオエステラーゼ遺伝子/遺伝子産物の効果をさらに調べた。これらのチオエステラーゼには、以下の高等植物のチオエステラーゼが含まれる。
微細藻類株Prototheca moriformis(UTEX 1435)を、上で開示されている方法を用いて形質転換し、単一クローン内で複数のチオエステラーゼを発現させた。単一クローン内での複数のチオエステラーゼの発現により、微細藻類は、いずれかの単一のチオエステラーゼが単独で発現されたときに産生されるもの(上記の実施例で示されている)とは全く異なる脂肪酸プロフィールの油を産生することが可能となる。最初に、Prototheca moriformis(UTEX 1435)を、相同組み換えを用いて、S.cerevisiae(ショ糖で成長する能力により選択)由来のショ糖インベルターゼ遺伝子であるsuc2とともにCinnamomum camphoraチオエステラーゼ(C14選択性のチオエステラーゼ)で形質転換する。この相同組み換え構築物に使用したDNAは、上の第3節に記載されているように、Prototheca moriformisゲノムDNAのKE858領域に由来するものである。この構築物の関連する部分は、配列番号51として配列表に記載されている。ショ糖含有プレートで陽性クローンをスクリーニングした。次いで、それぞれが抗生物質G418に対する耐性、及び追加のチオエステラーゼ:(1)Cuphea hookeriana(C8−10選択性)由来のチオエステラーゼ遺伝子、配列番号52;(2)Umbellularia californica(C12選択性)由来のチオエステラーゼ遺伝子、配列番号53;又はUlmus americana(広範;C10〜C16選択性)由来のチオエステラーゼ、配列番号54をコードする3つのカセットのうちの1つを用いて、陽性クローンを再び形質転換した。各構築物の関連する部分の配列が配列表に記載されている。両方のチオエステラーゼ遺伝子を発現するクローンを、50μg/mlのG418を含むショ糖含有培地でスクリーニングした。陽性クローンを選択し、成長及び脂質プロフィールをアッセイした。代表的な陽性クローンの脂質プロフィールを表17にまとめる(面積%として表す)。
(A.外来窒素依存性プロモーターの同定及び特徴づけ)
Prototheca moriformis(UTEX 1435)から、標準的な技術を用いてcDNAライブラリーを作成した。Prototheca moriformis細胞を、窒素が枯渇した条件下で48時間成長させた。次いで、5%の播種物質(v/v)を低窒素環境に移し、細胞を24時間ごとに7日間採集した。培養して約24時間後、培地への窒素の供給を完全に絶った。集めたサンプルを、ドライアイス及びイソプロパノールですぐに凍結させた。次いで、凍結した細胞ペレットサンプルから全RNAを単離し、各サンプルの一部をRT−PCR試験のために残しておいた。サンプルから採集した全RNAの残りに、polyA選択を行った。それぞれの条件から、等モル量のpolyAで選択したRNAを保存しておき、ベクターpcDNA3.0(Invitrogen)でcDNAを作成するために使用した。このようにして得られた保存しておいたcDNAライブラリーから、ほぼ1200種類のクローンを無作為に取り出し、両方の鎖について塩基配列を決定した。これらの1200個の配列の中から、ほぼ68種類の異なるcDNAを選択し、リアルタイムRT−PCR試験で使用するためのcDNA特異的なプライマーを設計するのに使用した。
上記のように、アンモニウムトランスポーター02及び03(amt02及びamt03)と呼ばれる部分的cDNAが同定された。これら2つの部分的cDNAsとともに、アンモニウムトランスポーター01(amt01)と呼ばれる第3の部分的cDNAも同定された。部分的cDNAと推定翻訳アミノ酸配列のアラインメントを比較した。結果は、amt01が3つの配列の中では遠縁であるのに対し、amt02とamt03はアミノ酸1個しか違わないことを示している。
Amt03 順方向:5’−GGAGGAATTCGGCCGACAGGACGCGCGTCA−3’(配列番号85)
Amt03 逆方向:5’−GGAGACTAGTGGCTGCGACCGGCCTGTG−3’(配列番号86)
Amt02 順方向:5’−GGAGGAATTCTCACCAGCGGACAAAGCACCG−3’(配列番号87)
Amt02 逆方向:5’−GGAGACTAGTGGCTGCGACCGGCCTCTGG−3’(配列番号88)。
どちらの場合も、5’及び3’プライマーは、これらのプロモーター/5’UTR領域の機能性を確認するための発現ベクター中への予測されるクローン化に有用な制限部位を含んでいた。
Prototheca moriformis(UTEX 1435)由来ゲノムDNAのcDNA、Illumiaトランスクリプトーム及びRoche 454の配列決定によるバイオインフォマティクスに基づくアプローチを用いたゲノムスクリーニングの一部として、脂肪酸飽和に関与する2つの特定の遺伝子群であるステアロイルACPデサチュラーゼ(SAD)及びデルタ12脂肪酸デサチュラーゼ(Δ12FAD)が同定された。ステアロイルACPデサチュラーゼ酵素は、脂質合成経路の一部であり、例えば、C18:0脂肪酸からのC18:1脂肪酸の合成のように、脂肪族アシル鎖に二重結合を導入するよう機能する。またデルタ12脂肪酸デサチュラーゼも脂質合成経路の一部であり、例えば、C18:1脂肪酸からのC18:2脂肪酸の合成のように、既に不飽和である脂肪酸に二重結合を導入するよう機能する。バイオインフォマティクスに取り組む間に同定された2種類の脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子に基づくプローブを用いたサザンブロット分析により、それぞれの種類のデサチュラーゼ遺伝子が複数のファミリーメンバーで構成される可能性があることが示された。さらに、ステアロイルACPデサチュラーゼをコードする遺伝子は、2つの異なるファミリーに分類される。これらの結果に基づき、デサチュラーゼ酵素の各ファミリー内で高度に保存されたコード領域を標的とすることにより複数の遺伝子ファミリーメンバーを破壊する可能性のある、3つの遺伝子破壊構築物を設計した。
プライマー1 5’−TCACTTCATGCCGGCGGTCC−3’ 配列番号101
プライマー2 5’−GCGCTCCTGCTTGGCTCGAA−3’ 配列番号102。
上記プライマーを用いてPrototheca moriformisゲノムDNAのゲノム増幅から得られた配列は非常に類似していたが、Δ12FADの複数の遺伝子又は対立遺伝子がProtothecaに存在することを示していた。
上記のSAD2Bノックアウト実験から作製された陽性クローンを1つ選択して、C14選択性の脂肪族アシルACPチオエステラーゼ遺伝子をさらに導入するためのバックグラウンドとして使用した。C.camphoraのC14選択性のチオエステラーゼを導入する構築物は、6Sゲノム領域に対する標的化配列を含み(相同組み換えによる形質転換DNAの標的組み込みを可能にする)、またこの発現構築物は、neoR遺伝子の発現を駆動するC.reinhardtii β−チューブリンプロモーターとChlorella vulgaris硝酸還元酵素3’UTR、次いで、Chlorella protothecoidesステアロイルACPデサチュラーゼトランジットペプチドを有するコドン最適化C.camphoraチオエステラーゼの発現を駆動する、第2のC.reinhardtii β−チューブリンプロモーターと、Chlorella vulgaris硝酸還元酵素3’UTRとを含んでいた。5’6S領域ゲノムドナー配列は配列番号82として記載され;3’6S領域ゲノムドナー配列は配列番号84として記載され;C.camphoraチオエステラーゼの関連する発現構築物は配列番号83として記載されている。
Content and Composition of Animal Product)。
標的化されたノックアウトアプローチによりKASII遺伝子発現を下方調節するベクターを、古典的変異誘発したUTEX 1435誘導体であるS1331に導入した。選択マーカーとしてSaccharomyces cerevisiaeインベルターゼ遺伝子を用いて、ショ糖で成長する能力を付与した。C.reinhardtii β−チューブリンプロモーターの制御下にあるインベルターゼ発現カセットを長さ315bpのKASIIゲノム領域の中央に挿入して、標的組み込みを可能にした(pSZ1503)。
(A.Prototheca moriformisにおける分泌型α−ガラクトシダーゼの発現)
Prototheca speciesにおける異種ショ糖インベルターゼ遺伝子発現の方法及び効果は、参照により組み込まれる国際出願PCT/US2009/66142号に既に記載されている。本実施例では、他の異種多糖分解酵素の発現を調べた。α−ガラクトシダーゼをコードする以下の外来遺伝子のうちの1つを有するPrototheca moriformis UTEX 1435がメリビオース(α−D−gal−glu)で増殖する能力を試験した:Saccharomyces carlbergensis由来のMEL1遺伝子(NCBI寄託番号P04824に対応するアミノ酸配列(配列番号108))、Aspergillus niger由来のAglC遺伝子(NCBI寄託番号Q9UUZ4に対応するアミノ酸配列(配列番号116))、及び高等植物Cyamopsis tetragobobola(グァー豆)由来のα−ガラクトシダーゼ(NCBI寄託番号P14749に対応するアミノ酸配列(配列番号120)。上記寄託番号及び対応するアミノ酸配列は参照により組み込まれる。すべての場合において、Prototheca moriformis内での好ましいコドンの使用に従って遺伝子が最適化されていた。発現カセットの関連する部分を、配列番号とともに下に記載する。すべての発現カセットに、安定なゲノム組み込みのための5’及び3’Clp相同組み換え標的化配列、Chlamydomonas reinhardtii TUB2プロモーター/5’UTR、及びChlorella vulgaris硝酸還元酵素3’UTRを用いた。
5’プライマー C.vulgaris 3’UTR:下流Clp配列(配列番号123)
ACTGCAATGCTGATGCACGGGA
3’プライマー C.vulgaris 3’UTR:下流Clp配列(配列番号124)
TCCAGGTCCTTTTCGCACT
Prototheca moriformis細胞のチアミン原栄養性を、外来のTHIC遺伝子の発現を用いて調べた。植物及び藻類におけるチアミン生合成は、典型的には、プラスチドで行われるのため、その産生に関与する核コートタンパク質の大部分が、プラスチドに対して効率的に標的化される必要がある。Prototheca moriformis細胞のDNA配列決定及びトランスクリプトーム配列決定により、THICを除く、チアミン生合成酵素をコードする遺伝子がすべて、ゲノム中に存在するということが明らかとなった。チアミン栄養要求性の原因となる損傷を生化学的レベルで詳細に分析するために、次のような5つの異なる状況下でのPrototheca moriformis細胞の成長を調べた:(1)2μMチアミン塩酸塩の存在下;(2)チアミンなし;(3)チアミンなし、2μMヒドロキシエチルチアゾール(THZ)あり;(4)チアミンなし、2μM 2−メチル−4−アミノ−5−(アミノメチル)ピリミジン(PYR)あり;及び(5)チアミンなし、2μM THZ及び2μM PYRあり。これら5つの異なる条件下での成長実験の結果は、PYR前駆体を与えた場合、Prototheca moriformis細胞はde novo合成を行うことができるが、チアミンピロリン酸塩(TPP)しか産生できないということを示していた。この結果は、Prototheca moriformisのチアミン栄養要求性が、THIC酵素により触媒される変換である、アミノイミダゾールリボヌクレオチドからヒドロキシメチルピリミジンリン酸塩(HMP−P)の合成を行うことができないことに起因するという仮説と一致する。
5’THIC Coccomyxa確認用プライマー配列(配列番号141)
ACGTCGCGACCCATGCTTCC
3’THIC確認用プライマー配列(配列番号142)
GGGTGATCGCCTACAAGA
5’THIC A.thaliana確認用プライマー配列(配列番号143)
GCGTCATCGCCTACAAGA
5’thiC Synechocystis sp.確認用プライマー配列(配列番号144)
CGATGCTGTGCTACGTGA。
(A.連続圧搾機及び圧縮助剤を用いた、微細藻類に由来する油を抽出)
ドラム乾燥機を用い、DCWで38%の油を含む微細藻類バイオマスを乾燥させ、得られた含水量は5〜5.5%であった。バイオマスをFrench L250プレスに供給した。バイオマス30.4kg(67lbs.)をプレスに供給したが、油は回収されなかった。同じ乾燥させた微生物バイオマスに、種々の割合のスイッチグラスを圧縮助剤として組み合わせ、プレスに供給した。乾燥微生物バイオマス及び20%w/wスイッチグラスを組み合わせることによって、最終的には最も良好な油回収率が得られた。次いで、圧縮したケーキをヘキサンで抽出し、スイッチグラスが20%の条件で、最終収率は、61.6%の利用可能な油(重量によって算出)の総量であった。細胞乾燥重量の50%を超える油を有するバイオマスは、油を放出させるために、スイッチグラスのような圧縮助剤を使う必要はなかった。連続圧搾機を用いて微細藻類から油を抽出する他の方法は、国際出願PCT/US2010/31108号に記載されており、参照により組み込まれる。
上に記載した方法に従って生成した、Prototheca moriformis UTEX 1435から得た脱ガム油に、トランスエステル化を行い、脂肪酸メチルエステルを得た。結果を下の表24に示す。
C10:0 0.02
C12:0 0.06
C14:0 1.81
C14.1 0.07
C16:0 24.53
C16:1 1.22
C18:0 2.34
C18:1 59.21
C18:2 8.91
C18:3 0.28
C20:0 0.23
C20:1 0.10
C20:1 0.08
C21:0 0.02
C22:0 0.06
C24:0 0.10
上に記載の方法に従って生成した、Prototheca moriformis UTEX 1435に由来する脱ガム油は、上の本実施例でバイオディーゼルを製造するために使用した油と同じ脂質プロフィールを有しており、この油をトランスエステル化し、再生可能なディーゼルを生成した。
本明細書に開示される方法及び材料を用いて、用途の応じた様々な油を生成した。株、示される株により生じる表現型及び様々な脂肪酸プロフィールを付与する遺伝子、並びにその遺伝子のGenBank寄託番号を表32に示す。株A及びBはともにPrototheca moriformis(UTEX 1435)株であり、両者とも個別支払い方式の研究所で古典的な変異誘発を行い、油の産生量を向上させたものである。次いで、株A及びBを、所望の遺伝子を発現するように、本明細書に記載の通りに適当なDNA構築物で遺伝子操作した。また、記載の通りに株を操作して、内在性デサチュラーゼを不活性化した。チオエステラーゼのヌクレオチド配列を、Protothecaでの発現及び使用に対してコドンを最適化した。
本発明者らは、パーム核油(PKO)に類似した微生物パーム核油模倣物を生成した。パーム核油模倣物を生成するために、プラスミドを構築し、これを株Aの形質転換に使用して、油の生成を行った。構築物pSZ1413(配列番号231)は、コドンが最適化されたCuphea wrightii FATB2遺伝子(配列番号284)(Gen bank寄託番号U56106)及びSAD2B(ステアロイルACPデサチュラーゼ)遺伝子破壊を含んでいた。
本発明者らは、パーム油に類似した微生物パーム油模倣物を生成した。いくつかの異なるプラスミドを構築して株A中に個々に形質転換し、油の生成を行った。構築物pSZ1503(配列番号283)は、内在するKASII遺伝子を破壊するようにを設計された。構築物pSZ1439(配列番号237)は、コドンが最適化されたElaeis guiniensis TE遺伝子(配列番号205)(Gen bank寄託番号AAD42220.2)を含んでいた。構築物pSZ1420(配列番号225)は、コドンが最適化されたCuphea hookeriana TE遺伝子(配列番号201)(Gen Bank寄託番号Q39513)を含んでいた。構築物pSZ1119(配列番号227)は、コドンが最適化されたCuphea hookeriana KASIV遺伝子(配列番号186)(Gen Bank寄託番号AF060519)及びCuphea wrightii FATB2遺伝子(配列番号184)(Gen Bank寄託番号U56104)を含んでいた。
本発明者らは、カカオバターに類似した微生物カカオバター模倣物を生成した。構築物pSZ1451を構築して株A内で形質転換し、油の生成を行った。構築物pSZ1451(配列番号239)は、コドンが最適化されたCarthamus tinctorus TE遺伝子(配列番号187)(Gen Bank寄託番号AAA33019.1)を含んでいた。
本発明者らは、ラードに類似した微生物ラード模倣物を生成した。いくつかの異なるプラスミドを構築して株A中に個々に形質転換し、油の生成を行った。構築物pSZ1493(配列番号241)は、内在するSAD 2B遺伝子を破壊すると同時に、コドンが最適化されたUmbellularia californica TE遺伝子(配列番号285)(Gen Bank寄託番号M94159)を発現するように設計された。構築物pSZ1452(配列番号240)は、内在するSAD2B遺伝子を破壊し、コドンが最適化されたGarcinia mangostana TE遺伝子(配列番号196)(Gen Bank寄託番号AAB51525.1)を発現するように設計された。構築物pSZ1449(配列番号238)は、コドンが最適化されたBrassica napus TE遺伝子(配列番号195)(Gen Bank寄託番号CAA52070.1)を発現するように設計された。構築物pSZ1458のポリヌクレオチド配列は、Cuphea hookerianaチオエステラーゼ(Gen Bank寄託番号U39834)をコードする、コドンが最適化されたポリヌクレオチド配列が、Brassica napus TE遺伝子(配列番号195)(Gen Bank寄託番号CAA52070.1)をコードするポリヌクレオチド配列に置き換わっている以外は、pSZ1449と同じであった。
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- 明細書に記載された発明。
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