具体实施方式
实施例1脂肪酶基因的克隆
以假单胞菌DNA为模板,采用引物1加入EcoRI酶切位点:GGATCCatgggtgtgtatgactacaaga,与引物2加入SpeI酶切位点:ACTAGTtcaggcgatcacgattccatcagc;进行了PCR扩增。其中基因的PCR反应条件为:94℃5min,94℃45s,54.6℃40s,72℃103s,循环30次,70℃10min,4℃永恒。
通过胶回收系统回收条带1854bp左右,通过测序,其序列如SEQ ID NO:1所示。在NCBI中通过blast比对,发现其就是脂肪酶的一种。
按照变本领域常规基因突变方式,将所述的基因分别在A 83T,G 101Q,E 112S,L124V,T 143G,A 165S,N 249S,L 261K,L 268Q,H 291S,M 322T,A 343M,G 385Q,G 401S,K423v,T 505S,Q 522P,G 529N,I 542E,A 561Q,G 569S,Q 570P,A583S或V 591L进行点突变,具体的实施方式采用重叠PCR的方式获得了突变后的目的基因。
实施例2转基因酵母细胞的制备
将实施例1得到的编码序列以及相应的突变序列以及pScIKP载体分别用限制性内切酶EcoRI和SpeI双酶切,纯化双酶切后的产物,将两者用T4 DNA连接酶连接过夜,平板转化,鉴定重组子,通过PCR鉴定获得了57个阳性的重组子。其中,通过质粒提取,并鉴定,成功获得了重组质粒pScIKP-Pslip。同时类似的也分别获得了重组质粒pScIKP-Pslip-A 83T,pScIKP-Pslip-G 101Q,pScIKP-Pslip-E 112S,pScIKP-Pslip-L 124V,pScIKP-Pslip-T143G,pScIKP-Pslip-A 165S,pScIKP-Pslip-N 249S,pScIKP-Pslip-L 261K,pScIKP-Pslip-L 268Q,pScIKP-Pslip-H 291S,pScIKP-Pslip-M 322T,pScIKP-Pslip-A 343M,pScIKP-Pslip-G 385Q,pScIKP-Pslip-G 401S,pScIKP-Pslip-K 423v,pScIKP-Pslip-T505S,pScIKP-Pslip-Q 522P,pScIKP-Pslip-G 529N,pScIKP-Pslip-I 542E,pScIKP-Pslip-A 561Q,pScIKP-Pslip-G 569S,pScIKP-Pslip-Q 570P,pScIKP-Pslip-A583S和pScIKP-Pslip-V 591L。
在酿酒酵母进行电转化之前,对汉逊德巴利酵母汉逊变种CGMCC 2.1831、菱型伊萨酵母CGMCC 2.1592进行抗性筛选标记G418的敏感性测定,发现CGMCC 2.1831和CGMCC2.1592在浓度为175μg/ml的YH平板上酵母已经被抑制而不能生长,因而在筛选转化子的时候可以用超过175μg/ml的G418的浓度来筛选。
将上述得到的基因表达重组质粒pScIKP-Pslip用限制性内切酶ApaI线性化后,用电穿孔转化法转入所述的二个酵母中,在G418的浓度为175μg/ml的YPD琼脂平板上培养4d后,挑取能够正常生长的菌落即为转有上述重组质粒的转化子。以基因特异性的引物1和引物2进行菌落PCR,均能成功扩增出大小为1854bp左右的的基因片段,验证了基因确实已经转入并整合入二个酵母基因组中。
使用上述相似的方法,将pScIKP-Pslip-A83T,pScIKP-Pslip-G101Q,pScIKP-Pslip-E112S,pScIKP-Pslip-L124V,pScIKP-Pslip-T143G,pScIKP-Pslip-A 165S,pScIKP-Pslip-N 249S,pScIKP-Pslip-L 261K,pScIKP-Pslip-L 268Q,pScIKP-Pslip-H 291S,pScIKP-Pslip-M322T,pScIKP-Pslip-A343M,pScIKP-Pslip-G385Q,pScIKP-Pslip-G 401S,pScIKP-Pslip-K 423v,pScIKP-Pslip-T 505S,pScIKP-Pslip-Q 522P,pScIKP-Pslip-G529N,pScIKP-Pslip-I 542E,pScIKP-Pslip-A561Q,pScIKP-Pslip-G569S,pScIKP-Pslip-Q570P,pScIKP-Pslip-A583S和pScIKP-Pslip-V591L载体也都分别导入汉逊德巴利酵母汉逊变种CGMCC 2.1831和菱型伊萨酵母CGMCC 2.1592中,并通过PCR验证了导入成功。
实施例3菌剂的制备
将木糖氧化碱菌反硝化亚种CGMCC 1.768、解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.1177、汉逊德巴利酵母汉逊变种CGMCC 2.1831、菱型伊萨酵母CGMCC 2.1592、嗜角蛋白粉落霉CGMCC3.3544、巴氏诺卡菌CGMCC 4.1128,各菌按照最适培养基扩大培养后,菌液混合的体积比为10:5:10:1:5:10制备得到相应的菌剂。其中各菌混合前的浓度为2*108个/ml。
导入了脂肪酶基因或其变体汉逊德巴利酵母汉逊变种CGMCC 2.1831和菱型伊萨酵母CGMCC 2.1592分别替换上述原始的没有导入脂肪酶基因的汉逊德巴利酵母汉逊变种CGMCC 2.1831、菱型伊萨酵母CGMCC 2.1592对应的制备成为相应的菌剂。菌剂命名为:Pslip菌剂,A83T菌剂,G101Q菌剂,E112S菌剂,L124V菌剂,T143G菌剂,A165S菌剂,N249S菌剂,L261K菌剂,L268Q菌剂,H291S菌剂,M322T菌剂,A343M菌剂,G385Q菌剂,G401S菌剂,K423v菌剂,T505S菌剂,Q522P菌剂,G529N菌剂,I542E菌剂,A561Q菌剂,G569S菌剂,Q570P菌剂,A583S菌剂或V 591L菌剂。
实施例4菌剂垃圾处理效果验证
将来自某垃圾处理厂的垃圾经过粗分,去掉一些固体和不能分解的部分,分选出竹木类、废电池、塑料、玻璃、打火机、金属、织物等进行回收,将砖瓦石块等无机材料用于新型建材的制造。将剩余的有机质混合物破碎搅拌混匀,在混合过程中加入混合菌种,将混合菌种按照体积比1:50用水稀释,将稀释好的混合菌种按照垃圾重量的0.5%(V/W)加入,通风供氧发酵5天,温度控制在45℃,将生物处理所产生的渗滤水经发酵罐底管道进入污水处理系统,产生的废气经过发酵罐上部的管道进入废气处理系统;将发酵后的产物作为有机肥进行后续的利用。所述的混合菌种为各个菌种经扩大培养后,按如下体积比混合:木糖氧化碱菌反硝化亚种CGMCC 1.768、解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.1177、汉逊德巴利酵母汉逊变种CGMCC 2.1831、菱型伊萨酵母CGMCC 2.1592、嗜角蛋白粉落霉CGMCC3.3544、巴氏诺卡菌CGMCC 4.1128,各菌扩大培养后,菌液混合的体积比为10∶10∶20∶30∶15∶20,各菌液在混合前的细胞浓度为2*108个/ml。混合后的菌剂浓度为也基本相同。通过处理后,垃圾的重量减重率(垃圾减重率-(分选后的垃圾重量-发酵好的垃圾重量)/分选后的垃圾重量X100%)为40.21%。
同时检测处理后的垃圾样品中的脂肪含量以及蛋白质含量。脂肪含量测定方法:参照GB/T5009.6-2003方法中索氏抽提法,利用SZC-C脂肪测定仪乙醚作为提取剂,测定处理后的垃圾中脂肪含量。粗蛋白含量测定方法:参照GB/T6432-94方法用KDY-9820型凯氏定氮仪,测定处理后垃圾中粗蛋白含量。通过测定,二者的含量分别为6.32%,2.1%。处理后的垃圾在味觉上仍然呈现酸败气味。
将汉逊德巴利酵母汉逊变种CGMCC 2.1831、菱型伊萨酵母CGMCC 2.1592分别导入了脂肪酶基因后的转基因的汉逊德巴利酵母汉逊变种CGMCC 2.1831、菱型伊萨酵母CGMCC2.1592制备得到的菌剂按照上述相似的方法,也分别测定相应的数据,结果如下:
实施例5有机肥效果验证
将实施例4发酵之后得到的发酵产物,经过干燥粉碎后,以每m2玉米苗田施加10kg发酵后的有机肥的比例,分别施加本发明制备得到的有机肥,施加之后,不施加其它肥料,行距株距相同,从发芽开始,培养100d,测定1m2内植株的生物量,具体数据如下:
从以上结果可以看出,本发明制备的到的有机肥,其油脂类物质能够更好的被消化为小分子的物质从而被植物利用,提高了植物的利用效率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 窦欣童
<120> 一种城市垃圾处理方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1854
<212> DNA
<213> Pseudomonas saccharophila
<400> 1
atgggtgtgt atgactacaa gaacttcggc acagccgatt ccaaagcgtt attcaccgac 60
gctatggcga tcacgctgta ttcctatcac aacctcgaca atggctttgc caccggctac 120
cagcacaacg gcttcggcct gggcttgccg gcgactttgg ttaccgcgct gctgggcggc 180
accgactctc aaggcgtgat ccccggcatt ccctggaacc ccgattcgga aaaagccgcc 240
ctggaggccg tgcaaaaagc cggctggacg cccatcacgg cctcgcaact gggttatgac 300
ggcaaggtcg acgctcgcgg aacgttcttc ggcgagaagg ccgggtacac cagcgcgcag 360
gtcgaaatcc tcggcaagta cgatgctcaa ggccatctca gcgaaatcgg catcgccttt 420
cgcggcacca gcggcccgcg ggaaatcttg atcggcgatt ccatcggcga cgtgatcaac 480
gatctgctgg cggcgctagg tcccaaggat tatgcgaaaa actatgtggg tgaagccttc 540
ggcaatctgc tcggcgacgt catggcgttt gcccaggcca atggcctgtc gggaaaaaac 600
gtgctggtca gcggccacag cctcggcggg ctggcggtca acagcctggc ggacttgagc 660
gcggagaagt ggtccgggtt ctaccaggat tccaactaca tcgcctacgc gtccccgacc 720
cagagcagca ccgacaaagt gctcaatgtc ggctatgaaa acgacccggt ttttcgggct 780
ctcgacggtt catccttcaa cctttcgtcg gtgggtgtgc acgatgccgc caaggcctcg 840
gcgaccgata acatcgtcag cttcaacgat cactacgcct cgaccgcatg gaatgtgctg 900
ccgttctcca tcctcaacat cccgacctgg atctcgcact tgccgaccgc ctatggcgac 960
ggcatgaacc gggtgatcga atcgaagttc tacgacctca ccagcaagga ctcgacgatc 1020
gtcgtcgcca atctctcgga cccggcacgc gccaatacct gggttcagga cctcaatcgc 1080
aacgccgaaa cccacaaggg cagtaccttc atcatcggca gcgacggcaa cgacctgatt 1140
cagggtggca agggtaacga ctacctggag gggcgtgacg gtaacgacac cttccgtgac 1200
ggcggcggct acaacatcgt attgggtggc aagggcagca acgtgctgga cttgcagcag 1260
tcggtgaaaa atttcaactt tgccaacgat ggcgccggca ccctctatgt tcgtgacgcc 1320
aatggcggta tcagcatcac ccgagacatc ggcagtattg tcaccaagga accggggttc 1380
ttgtgggggc tgttcaagga tgatgtgacg cacagtgtga cggccaatgg acttgccgtc 1440
ggcaacaacc tgacgtcata cgcgtcatcg gtgaagggcg gcacgggggc cgatacgctc 1500
aaggcgcata cgacgggcga ttggttgttc ggtctggacg gcaacgatca tttgatcggc 1560
ggccagggca acgatgtgtt tgtgggcggg gcggggaatg acctgatgga atcggggggc 1620
gggattgata cgttcctgtt cagcggtgcg tttggtcagg accgggtggt ggggtatcag 1680
gcaaacgaca agctggtatt cctcggggtt cagggggtcg cgccgaatga tgactatcgg 1740
gctcatgcca cgacggtggg gcaggatacg gtgctgacgt ttggcgggga ttcggtgacg 1800
ttggttgggg tggcgctcaa tagcctcagt gctgatggaa tcgtgatcgc ctga 1854
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Pseudomonas saccharophila
<400> 2
ggatccatgg gtgtgtatga ctacaaga 28
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Pseudomonas saccharophila
<400> 3
actagttcag gcgatcacga ttccatcagc 30
<210> 4
<211> 617
<212> PRT
<213> Pseudomonas saccharophila
<400> 4
Met Gly Val Tyr Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Thr Ala Asp Ser Lys Ala
1 5 10 15
Leu Phe Thr Asp Ala Met Ala Ile Thr Leu Tyr Ser Tyr His Asn Leu
20 25 30
Asp Asn Gly Phe Ala Thr Gly Tyr Gln His Asn Gly Phe Gly Leu Gly
35 40 45
Leu Pro Ala Thr Leu Val Thr Ala Leu Leu Gly Gly Thr Asp Ser Gln
50 55 60
Gly Val Ile Pro Gly Ile Pro Trp Asn Pro Asp Ser Glu Lys Ala Ala
65 70 75 80
Leu Glu Ala Val Gln Lys Ala Gly Trp Thr Pro Ile Thr Ala Ser Gln
85 90 95
Leu Gly Tyr Asp Gly Lys Val Asp Ala Arg Gly Thr Phe Phe Gly Glu
100 105 110
Lys Ala Gly Tyr Thr Ser Ala Gln Val Glu Ile Leu Gly Lys Tyr Asp
115 120 125
Ala Gln Gly His Leu Ser Glu Ile Gly Ile Ala Phe Arg Gly Thr Ser
130 135 140
Gly Pro Arg Glu Ile Leu Ile Gly Asp Ser Ile Gly Asp Val Ile Asn
145 150 155 160
Asp Leu Leu Ala Ala Leu Gly Pro Lys Asp Tyr Ala Lys Asn Tyr Val
165 170 175
Gly Glu Ala Phe Gly Asn Leu Leu Gly Asp Val Met Ala Phe Ala Gln
180 185 190
Ala Asn Gly Leu Ser Gly Lys Asn Val Leu Val Ser Gly His Ser Leu
195 200 205
Gly Gly Leu Ala Val Asn Ser Leu Ala Asp Leu Ser Ala Glu Lys Trp
210 215 220
Ser Gly Phe Tyr Gln Asp Ser Asn Tyr Ile Ala Tyr Ala Ser Pro Thr
225 230 235 240
Gln Ser Ser Thr Asp Lys Val Leu Asn Val Gly Tyr Glu Asn Asp Pro
245 250 255
Val Phe Arg Ala Leu Asp Gly Ser Ser Phe Asn Leu Ser Ser Val Gly
260 265 270
Val His Asp Ala Ala Lys Ala Ser Ala Thr Asp Asn Ile Val Ser Phe
275 280 285
Asn Asp His Tyr Ala Ser Thr Ala Trp Asn Val Leu Pro Phe Ser Ile
290 295 300
Leu Asn Ile Pro Thr Trp Ile Ser His Leu Pro Thr Ala Tyr Gly Asp
305 310 315 320
Gly Met Asn Arg Val Ile Glu Ser Lys Phe Tyr Asp Leu Thr Ser Lys
325 330 335
Asp Ser Thr Ile Val Val Ala Asn Leu Ser Asp Pro Ala Arg Ala Asn
340 345 350
Thr Trp Val Gln Asp Leu Asn Arg Asn Ala Glu Thr His Lys Gly Ser
355 360 365
Thr Phe Ile Ile Gly Ser Asp Gly Asn Asp Leu Ile Gln Gly Gly Lys
370 375 380
Gly Asn Asp Tyr Leu Glu Gly Arg Asp Gly Asn Asp Thr Phe Arg Asp
385 390 395 400
Gly Gly Gly Tyr Asn Ile Val Leu Gly Gly Lys Gly Ser Asn Val Leu
405 410 415
Asp Leu Gln Gln Ser Val Lys Asn Phe Asn Phe Ala Asn Asp Gly Ala
420 425 430
Gly Thr Leu Tyr Val Arg Asp Ala Asn Gly Gly Ile Ser Ile Thr Arg
435 440 445
Asp Ile Gly Ser Ile Val Thr Lys Glu Pro Gly Phe Leu Trp Gly Leu
450 455 460
Phe Lys Asp Asp Val Thr His Ser Val Thr Ala Asn Gly Leu Ala Val
465 470 475 480
Gly Asn Asn Leu Thr Ser Tyr Ala Ser Ser Val Lys Gly Gly Thr Gly
485 490 495
Ala Asp Thr Leu Lys Ala His Thr Thr Gly Asp Trp Leu Phe Gly Leu
500 505 510
Asp Gly Asn Asp His Leu Ile Gly Gly Gln Gly Asn Asp Val Phe Val
515 520 525
Gly Gly Ala Gly Asn Asp Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Ile Asp Thr
530 535 540
Phe Leu Phe Ser Gly Ala Phe Gly Gln Asp Arg Val Val Gly Tyr Gln
545 550 555 560
Ala Asn Asp Lys Leu Val Phe Leu Gly Val Gln Gly Val Ala Pro Asn
565 570 575
Asp Asp Tyr Arg Ala His Ala Thr Thr Val Gly Gln Asp Thr Val Leu
580 585 590
Thr Phe Gly Gly Asp Ser Val Thr Leu Val Gly Val Ala Leu Asn Ser
595 600 605
Leu Ser Ala Asp Gly Ile Val Ile Ala
610 615