BRPI0709946A2

BRPI0709946A2 - composições e métodos para produzir produtos e resìduos de fermentação

Info

Publication number: BRPI0709946A2
Application number: BRPI0709946-0A
Authority: BR
Inventors: Peter R David
Original assignee: Ambrozea Inc
Priority date: 2006-04-13
Filing date: 2007-04-05
Publication date: 2011-08-02
Also published as: WO2007121100A2; WO2007121100A3; DOP2007000075A; EP2018174A4; EP2018174A2; AU2007238228A1; US20090291469A1; AR060447A1; GB2439310A; PE20081193A1; TW200815596A; GB0706778D0; UY30286A1; US20110269185A1; CA2648934A1

Abstract

<B>COMPOSIçOES E MéTODOS PARA PRODUZIR PRODUTOS E RESìDUOS DE FERMENTAçãO <D>A presente invenção refere-se a composições e métodos planejados para aumentar o valor da produção de uma reação de fermentação que produz um primeiro produto, pretendido para comercialização, tal como etanol, e um resíduo de fermentação usado, por exemplo, como ração animal. Os métodos envolvem usar microorganismos no processo de fermentação, os quais foram modificados para produzir um resíduo que tem um valor maior que um resíduo produzido no processo por um microorganismo não-modificado. Em particular, a presente invenção contempla usar microorganismos em um processo de fermentação, os quais foram modificados para aumentar a produção de um nutriente, tal como um aminoácido essencial, reduzindo desse modo a necessidade suplementar o nutriente na dieta do animal. A presente invenção fornece também um resíduo de fermentação modificado de valor comercial mais elevado. Também são fornecidas na presente invenção rações animais completas suplementos nutricionais que compreendem os resíduos de fermentação em questão. Ainda é fornecido pela presente invenção um método de executar a fermentação, um microorganismo fermentativo modificado e um veículo genético para modificar tal microorganismo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÕES E MÉTODOS PARA PRODUZIR PRODUTOS E RESÍDUOS DEFERMENTAÇÃO".

REFERÊNCIA CRUZADA

Esse pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N°60/744.833 depositado em 13 de abril de 2006, Pedido Provisório U.S. N°60/797.431 depositado em 3 de maio de 2006, Pedido Provisório U.S. N°60/863.556 depositado em 30 de outubro de 2006, Pedido Não-ProvisórioU.S. N° 11/383.748 depositado em 16 de maio de 2006 e Pedido de PatenteNão-Provisório N° 11/383.750 depositado em 16 de maio de 2006, todos osquais estão incorporados aqui por referência em sua totalidade.Antecedente da Invenção

A presente invenção refere-se à indústria que usa microorga-nismos em processos comerciais para produzir quantidades comerciais devários compostos orgânicos e inorgânicos úteis diferentes. Esses incluemprodutos químicos e farmacêuticos industriais. Exemplos de produtos quími-cos industriais produzidos por microorganismos incluem solventes, ácidos(e acetatos) e gases. Solventes produzidos industrialmente incluem alcoóis(por exemplo, etanol e butanol), cetonas (por exemplo, acetona) e alcanos.Ácidos produzidos industrialmente incluem, por exemplo, ácido acético (vi-nagre), ácido pirúvico e ácido lático. Gases industrialmente produzidos inclu-em, por exemplo, amônia, metano e hidrogênio. Cientistas agora estão u-sando biotecnologia para produzir microorganismos que incluem vias enzi-máticas para produzir químicos úteis não produzidos normalmente pelo mi-croorganismo. (Veja, por exemplo, Martin et ai., "Engineering a mevalonatepathway in Escherichia coli for production of terpenoids," Nature Biotechno-logy, 2003, 21:796.) Engenheiros também usam tais processos para produzirenzimas comercialmente valiosas, por exemplo, renina. Na indústria farma-cêutica, micróbios produzem antibióticos e proteínas recombinantes. Nessesprocessos, os microorganismos são cultivados e os produtos químicos úteissão coletados (por exemplo, isolados ou removidos) da cultura.

A indústria de etanol combustível está crescendo em ritmo ace-lerado. Vários incentivos federais e estaduais, tais como programas de com-bustíveis de queima limpa, promoveram um crescimento exponencial demais de cinco vezes durante as duas últimas décadas. Em 2004, os altospreços do petróleo, um cultivo excessivo de milho e uma capacidade de pro-cessamento limitada criaram novas oportunidades de mercado e resultaramem uma produção recorde de mais de 3,4 bilhões de galões de etanol com-bustível. Atualmente, o etanol representa o terceiro maior mercado para omilho dos EUA. Nesse ritmo, a produção de etanol combustível está se colo-cando como parte essencial do desenvolvimento econômico rural e da me-Ihoria ambiental.

O etanol pode ser feito através da fermentação e destilação deamido encontrado em cultivos tais como milho, sorgo, batata, cana de açú-car, assim como em espigas de milho. O etanol geralmente é produzido tan-to em fábricas de trituração seca quanto em moinhos de trituração úmida. Ossubprodutos primários gerados a partir dos moinhos de trituração úmida ou"refinarias de milho" incluem xarope de milho com alto conteúdo de frutose,óleo de milho, alimento com glúten e farelo de glúten. Os subprodutos doprocesso de trituração seca incluem grãos do destiladores e dióxido de car-bono. Apesar de ambos os tipos de fábrica terem custos operacionais simila-res, as fábricas de trituração seca são geralmente menores e requerem uminvestimento inicial menor, tornando seus custos de capital duas a quatrovezes menores por galão. Os tipos de trituração seca de produção de etanolprocessam a porção de amido do milho, que é cerca de 60% da semente.Todos os nutrientes remanescentes - proteína, gordura, minerais e vitami-nas - são concentrados em grãos de destilador que é um alimento valiosopara animais de criação. Um alqueire de milho pesando aproximadamente25,4 kg (56 libras) pode produzir aproximadamente 10,59 L (2,8 galões) deetanol e 8,16 kg (18 libras) de grão de destilador.

Grãos de destilador podem fornecer uma ração alimentícia dealta qualidade para gado leiteiro, gado de corte, suínos, aves domésticas,cães e aqüicultura. A ração é uma substituição econômica parcial para mi-lho, farelo de soja e fosfato de dicálcico em rações para animais de criação eaves domésticas. Grão de destilador continua a ser um ingrediente alimentí-cio excelente, econômico para uso em dietas de ruminantes. Foi esperadoque a produção de DDGS (grãos secos de destilador com material solúvel)dobrasse de 3,5 milhões de toneladas métricas em 2002 para mais de 7 mi-lhões de toneladas métricas em 2006. A venda de grão de destilador é umaparte importante da rentabilidade e crescimento da indústria do etanol. Se asvendas de grão de destilador seco ficar atrás do aumento da produção deetanol, a indústria de etanol atual poderia ser significativamente afetada. Ummercado efetivo de grão de destilador como ração animal indubitavelmentecontribuirá para a eficiência e rentabilidade global de uma fábrica de etanol.

Esquemas de produção de etanol atuais por fermentação estãolonge de serem otimizados. Apesar dos esforços direcionados para melhorara produção de etanol, pouca pesquisa tem tido foco no aumento do valor doproduto dos resíduos de fermentação incluindo grão de destilador que con-tribuem para uma porção significativa do mercado de ração animal.

Assim, permanece uma necessidade considerável por composi-ções e métodos que sejam planejados para aumentar o valor do produto deuma fábrica de fermentação. Um esquema de fermentação ideal manteria aalta produção de etanol e, ao mesmo tempo, fornecer resíduos de fermenta-ção de alto valor comercial. A presente invenção satisfaz essa necessidadee também fornece vantagens relacionadas.

Sumário da Invenção

Essa invenção fornece microorganismos modificados e proces-sos para o uso desses microorganismos que, quando fermentados, forne-cem um produto comercial e um resíduo de fermentação que têm valor co-mercial maior do que um resíduo de fermentação produzido na reação defermentação por um microorganismo que não tenha sido modificado. Emuma modalidade, o valor comercial aumentado resulta dos aumentos de nu-trientes no resíduo, tornando-o mais desejável como ração animal.

Em um aspecto, essa invenção fornece um método que compre-ende: (a) misturar um material que contém carbono com uma cultura quecompreende microorganismos geneticamente modificados que, em um pro-cesso de fermentação, produzem um primeiro produto e um resíduo de fer-mentação que compreende um nutriente, em que o conteúdo do nutriente noresíduo de fermentação é maior do que aquele de microorganismos corres-pondentes não-modificados quando usados no processo de fermentação; (b)fermentar a cultura sob condições adequadas para a produção comercial doprimeiro produto e sob condições adequadas para a produção do nutriente;(c) separar o primeiro produto da cultura; e (d) produzir o resíduo de fermen-tação como descrito.

Em uma modalidade, os microorganismos compreendem umvetor de expressão recombinante que compreende uma seqüência de nu-cleotídeos exógena que codifica um polipeptídeo e uma seqüência regulató-ria que controla a expressão do polipeptídeo exógeno, em que a expressãodo polipeptídeo exógeno resulta em conteúdo nutricional aumentado do re-síduo de fermentação comparado com aquele do microorganismo não-modificado. Em outra modalidade, o nutriente produzido pelos microorga-nismos é selecionado do grupo que consiste em uma gordura, um ácido gra-xo, um lipídio, uma vitamina, um aminoácido essencial, um peptídeo, umaproteína, um carboidrato, um esterol, uma enzima e um mineral-traço. Emuma modalidade adicional, o nutriente produzido pelos microorganismos éselecionado do grupo de aminoácidos essenciais que consiste em lisina, me-tionina, fenilalanina, treonina, isoleucina, triptofano, valina, leucina, arginina,taurina e histidina.

Em outra modalidade, a expressão da seqüência exógena estásob o controle de uma seqüência regulatória selecionada do grupo que con-siste em uma seqüência regulatória de um gene de choque térmico, em umaseqüência regulatória de um gene de toxicidade e uma seqüência regulatóriade um gene de formação de esporo. Em outra modalidade, a expressão daseqüência exógena é induzida quando a reação de fermentação tiver atingi-do pelo menos cerca de 50% do término. Em outra modalidade ainda, a ex-pressão da seqüência de nucleotídeos exógena depende da concentraçãode glicose.

Em uma modalidade, a modificação genética modifica pelo me-nos um dos genes estruturais na via sintética do nutriente. Em outra modali-dade, a modificação genética modifica um controle regulatório da via sintéti-ca do nutriente.

Em outra modalidade, a via sintética é para um aminoácido es-sencial selecionado do grupo que consiste em lisina, metionina, fenilalanina,treonina, isoleucina, triptofano, valina, leucina, arginina, taurina e histidina.Em uma modalidade adicional, a modificação genética modifica os proces-sos de transporte do nutriente para fora ou para dentro do microorganismo.

Em uma modalidade, o nutriente é um aminoácido essencial se-lecionado do grupo que consiste em lisina, metionina, fenilalanina, treonina,isoleucina, triptofano, valina, leucina, arginina, taurina e histidina. Em outramodalidade, o nutriente é uma vitamina. Em outra modalidade, a vitamina éselecionada do grupo que consiste em vitamina A, vitamina B1, vitamina B2,vitamina B3, vitamina B5, vitamina B6, vitamina B7, vitamina B9, vitaminaB12, vitamina C, vitamina D1-D4, um tocoferol, e vitamina K. Em uma moda-lidade adicional, o nutriente é um lipídio.

Em uma modalidade, o primeiro produto é um álcool. Em outramodalidade, o álcool é etanol. Em uma modalidade adicional, o álcool é se-lecionado do grupo que consiste em metanol, propanol e butanol. Em umamodalidade adicional, o álcool é separado por destilação. Outra modalidadeainda compreende misturar o álcool com outro combustível.

Em uma modalidade, o primeiro produto é selecionado entre umsolvente ou um gás. Em outra modalidade, o primeiro produto é um compos-to farmacêutico.

Em outra modalidade, o material que contém carbono é selecio-nado do grupo que consiste em celulose, lascas de madeira, vegetais, bio-massa, excretas, resíduos animais, aveia, trigo, milho, cevada, cará, painço,arroz, centeio, sorgo, batata, beterraba, cará, mandioca, frutas, sucos defruta, e cana-de-açúcar.

Em outra modalidade, o resíduo de fermentação compreendegrãos secos de destilador, solúveis secos de destilador ou grãos secos dedestilador com solúveis. Uma modalidade adicional compreende ainda incor-porar o resíduo de fermentação em ração animal. Em outra modalidade, onutriente é produzido quando a fermentação está substancialmente completa.

Em uma modalidade, o microorganismo é levedura. Em outramodalidade, a levedura é um Saccharomyces. Em outra modalidade ainda,os microorganismos compreendem levedura, a fonte de carbono compreen-de amido de milho ou sacarose, o primeiro produto compreende etanol e onutriente é selecionado entre lisina, metionina, triptofano e treonina.

Em outra modalidade ainda, o microorganismo compreendeClostridium. Em outra modalidade, o produto é butanol ou acetona. Em umamodalidade adicional, os microorganismos compreendem Clostridium, a fon-te de carbono compreende amido de milho ou sacarose, o primeiro produtocompreende etanol e o nutriente é selecionado entre lisina, metionina, tripto-fano e treonina. Em uma modalidade adicional, o microorganismo é selecio-nado do grupo que consiste em Zymomonas sp., E. coli, Corynebacterium,Brevibacterium e Bacillus ssp. Uma modalidade adicional compreende co-mercializar o primeiro produto e o resíduo de fermentação.

Em outro aspecto, essa invenção fornece um método de fermen-tação compreendendo: (a) misturar um material que contém carbono comuma cultura que compreende microorganismos geneticamente modificadosque, durante a fermentação, produzem um primeiro produto e um resíduo defermentação, em que o valor do resíduo de fermentação é maior do que a-quele de um resíduo de fermentação produzido por fermentar um microorga-nismo correspondente não-modificado; (b) fermentar a cultura sob condiçõesadequadas para a produção do primeiro produto e para a produção do resí-duo de fermentação que tem o maior valor; (c) separar o primeiro produto dacultura; e (d) coletar o resíduo de fermentação.

Em uma modalidade, o resíduo de fermentação compreendeuma quantidade aumentada de um produto industrial ou farmacêutico. Emoutra modalidade, o resíduo de fermentação exibe uma propriedade físicamelhorada. Em uma modalidade adicional, o resíduo de fermentação exibeuma propriedade física melhorada selecionada dentre aderência aumentadaou densidade aumentada.Em outro aspecto, essa invenção fornece um microorganismogeneticamente modificado que, em um processo de fermentação, produz umprimeiro produto para comercialização e um resíduo de fermentação quecompreende um nutriente, em que o conteúdo do nutriente no resíduo defermentação é maior do que aquele de um microorganismo correspondentenão-modificado quando usado na reação de fermentação.

Em uma modalidade, o microorganismo geneticamente modifi-cado compreende um vetor de expressão recombinante que compreendeuma seqüência de nucleotídeos exógena que codifica um polipeptídeo euma seqüência regulatória que controla a expressão do polipeptídeo exóge-no, em que a expressão do polipeptídeo exógeno resulta em conteúdo nutri-cional aumentado do resíduo de fermentação comparado com aquele domicroorganismo não-modificado.

Em outra modalidade, o nutriente é selecionado do grupo queconsiste em uma gordura, um ácido graxo, um lipídio, uma vitamina, um a-minoácido essencial, um peptídeo, uma proteína, um carboidrato, um este-rol, uma enzima e um mineral-traço. Em uma modalidade adicional, o nutri-ente é um aminoácido essencial para pelo menos um animal doméstico e opolipeptídeo exógeno compreende o aminoácido essencial. Em uma modali-dade adicional, o aminoácido essencial é selecionado do grupo que consisteem lisina, metionina, fenilalanina, treonina, isoleucina, triptofano, valina, Ieu-cina, arginina, taurina e histidina.

Em uma modalidade, a expressão da seqüência exógena estásob o controle de uma seqüência regulatória selecionada do grupo que con-siste em uma seqüência regulatória de gene de choque térmico, uma se-qüência regulatória de gene de toxicidade e uma seqüência regulatória degene de formação de esporo. Em outra modalidade, a modificação genéticamodifica pelo menos um dos genes estruturais na via de síntese do nutrien-te. Em outra modalidade, a modificação genética modifica um controle regu-latório da via de síntese do nutriente. Em uma modalidade adicional, a via desíntese é para um aminoácido essencial para um animal doméstico.

Em uma modalidade, a modificação genética modifica um con-trole regulatório da via de síntese do nutriente. Em outra modalidade, a mo-dificação genética modifica um gene estrutural que regula a síntese de umpeptídeo que contém pelo menos um aminoácido essencial para um animaldoméstico. Em uma modalidade adicional, a modificação genética modificaos processos de transporte de nutriente para fora ou para dentro do microor-ganismo.

Em outra modalidade, a expressão de uma seqüência exógena éinduzida quando a reação de fermentação atingiu pelo menos cerca de 50%do total. Em outra modalidade, pelo menos 50% do total é evidenciado peladiminuição no conteúdo de glicose para menos do que cerca de 50% do con-teúdo de glicose inicial presente em uma mistura de reação de fermentaçãoantes do início da reação de fermentação. Em uma modalidade adicional, aexpressão da seqüência de nucleotídeos exógena depende da concentraçãode glicose.

Em uma modalidade, o nutriente é um aminoácido essencial pa-ra pelo menos um animal doméstico. Em outra modalidade, o aminoácidoessencial é selecionado do grupo que consiste em lisina, metionina, fenilala-nina, treonina, isoleucina, triptofano, valina, leucina, arginina, taurina e histi-dina. Em uma modalidade adicional, o nutriente é uma vitamina. Em outramodalidade, a vitamina é selecionada do grupo que consiste em vitamina A,vitamina B1, vitamina B2, vitamina B3, vitamina B5, vitamina B6, vitaminaB7, vitamina B9, vitamina B12, vitamina C, vitamina D1-D4, um tocoferol, evitamina K.

Em uma modalidade, o produto comercial é um álcool. Em outramodalidade, o álcool é etanol. Em uma modalidade adicional, o produto co-mercial é selecionado entre um solvente ou um gás. Em outra modalidade, oproduto comercial é um composto farmacêutico. Em outra modalidade, onutriente é um lipídio. Em uma modalidade adicional, o álcool é selecionadodo grupo que consiste em metanol, propanol e butanol.

Em uma modalidade, o microorganismo é levedura. Em outramodalidade, a levedura é Saccharomyces. Em uma modalidade adicional, omicroorganismo é Clostridium. Em uma modalidade adicional, o microorga-nismo é selecionado do grupo que consiste em Zymomonas sp., E. coli,Corynebacterium, Brevibacterium e Bacillus ssp.

Em outro aspecto, esta invenção fornece uma cultura defermentação que compreende: (a) um microorganismo geneticamentemodificado que, em uma reação de fermentação, produz um primeiroproduto para comercialização e um resíduo de fermentação que compreendeum nutriente, em que o conteúdo do nutriente no resíduo de fermentação émaior do que aquele de um microorganismo correspondente não-modificadoquando usado na reação de fermentação e (b) um meio de fermentação quecompreende uma fonte do carbono para a produção do nutriente, em que acultura produz o produto.

Em uma modalidade, o nutriente é selecionado do grupo queconsiste em uma gordura, um ácido graxo, um lipídio, uma vitamina, umaminoácido essencial, um peptídeo, uma proteína, um carboidrato, umesterol, uma enzima, e um mineral-traço. Em outra modalidade, a fonte docarbono é selecionada de celulose, de lascas de madeira, vegetais,biomassa, excretas, resíduos animais, aveia, trigo, milho, da cevada, milho,painço, arroz, centeio, sorgo, batata, beterraba, cará, mandioca, frutas,sucos de fruta, e cana-de-açúcar.

Em outra modalidade, o primeiro produto é um álcool. Em umamodalidade adicional, o álcool é etanol. Em uma modalidade adicional, oálcool é selecionado do grupo que consiste em metanol, propanol, e butanol.

Em uma modalidade, o primeiro produto é um compostofarmacêutico. Em outra modalidade, o primeiro produto é selecionado de umsolvente ou um gás.

Em outra modalidade, o microorganismo é levedura. Em outramodalidade, a levedura é Saccharomyces. Em uma modalidade adicional, omicroorganismo é Clostridium. Em uma modalidade adicional, omicroorganismo é selecionado do grupo que consiste em Zymomonas sp., E.coli, Corynebacterium, Brevibacterium e Bacillus ssp.

Em uma modalidade, o volume é de pelo menos 100 litros. Emoutra modalidade, os microorganismos compreendem levedura, a fonte decarbono compreende amido de milho ou sacarose, o primeiro produtocompreende etanol e o nutriente é selecionado de lisina, metionina,triptofano e treonina. Em uma modalidade adicional, os microorganismoscompreendem Clostridium, a fonte de carbono compreende amido de milhoou sacarose, o primeiro produto compreende etanol e o nutriente éselecionado dentre lisina, metionina, triptofano e treonina.

Em outro aspecto, esta invenção compreende um vetor deexpressão que compreende uma seqüência exógena que codifica umpolipeptídeo que compreende pelo menos um aminoácido essencial para umanimal domesticado, em que a expressão da seqüência exógena é induzidaquando uma reação de fermentação que produz um álcool ou um alcanotiver atingido pelo menos cerca de 50% do término.

Em uma modalidade, a seqüência exógena está sob o controlede uma seqüência regulatória selecionada do grupo que consiste em umoperon do supressor de glicose, seqüência regulatória de um gene dechoque térmico, seqüência regulatória de um gene de toxicidade, seqüênciaregulatória de um gene de formação de esporo. Em outra modalidade, pelomenos cerca de 5% dos resíduos de aminoácido contidos no polipeptídeosão aminoácidos essenciais para um animal domesticado.

Em outro aspecto, esta invenção fornece um resíduo defermentação de um processo de fermentação comercial de ummicroorganismo geneticamente modificado, o dito resíduo de fermentaçãotendo uma quantidade maior de um nutriente em comparação a um resíduode fermentação de um processo de fermentação comercial de ummicroorganismo não-modificado geneticamente.

Em uma modalidade, o resíduo de fermentação compreendegrãos secos de destilador. Em outra modalidade, o resíduo de fermentaçãocompreende solúveis secos de destilador. Em uma modalidade adicional, oresíduo de fermentação compreende grãos secos de destilador comsolúveis.

Em uma modalidade, o resíduo de fermentação compreende omicroorganismo geneticamente modificado. Em outra modalidade, onutriente é selecionado do grupo que consiste em uma gordura, um ácidograxo, um lipídio, uma vitamina, um aminoácido essencial, um peptídeo, umaproteína, um carboidrato, um esterol, uma enzima, e um mineral-traço. Emuma modalidade adicional, o processo de fermentação produz um produtoquímico industrial para isolamento.

(12) Em uma modalidade, o nutriente é um aminoácidoessencial selecionado do grupo que consiste em lisina, metionina, treonina,isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, e arginina. Em outramodalidade, o aminoácido essencial está contido em um polipeptídeoheterólogo produzido por um microorganismo usado no processo defermentação. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo heterólogocontém pelo menos cerca de 5% de aminoácidos essenciais como resíduosde aminoácido. Em uma modalidade adicional, o aminoácido essencial estápresente em uma quantidade que excede cerca de 3% do resíduo defermentação em peso seco.

(13) Em outra modalidade, o resíduo de fermentação ésuplementado com um flavorizante. Em outra modalidade, o resíduo defermentação é embalado com instruções para uso como ração animal. Emuma modalidade adicional, a ração animal completa compreende pelomenos cerca de 15% do resíduo de fermentação em peso.

(14) Em uma modalidade, ração animal completa compreendeum resíduo de fermentação que resulta de um processo de fermentaçãocomercial de um microorganismo geneticamente modificado, o dito resíduo defermentação tendo uma quantidade maior de um nutriente em comparação aum resíduo de fermentação de um processo de fermentação comercial de ummicroorganismo não-modificado geneticamente. Em outra modalidade, aração animal completa compreende o microorganismo geneticamentemodificado. Em uma modalidade adicional, a ração animal completacompreende um sabor evidente para um animal de interesse. Em umamodalidade adicional, o nutriente é selecionado do grupo de aminoácidosessenciais que consiste em lisina, metionina, treonina, isoleucina, metionina,fenilalanina, triptofano, e arginina. Em outra modalidade, o aminoácidoessencial está contido em um polipeptídeo heterólogo produzido por ummicroorganismo usado na reação de fermentação.

Em outro aspecto, esta invenção fornece método comercial quecompreende (a) fermentar uma cultura que contém microorganismosgeneticamente modificados e uma fonte de carbono para produzir umprimeiro produto, separar o primeiro produto da cultura e coletar um resíduode fermentação, em que o resíduo de fermentação tem um valor comercialmais elevado do que um resíduo de fermentação produzido por fermentarum microorganismo correspondente não-modificado; e (b) comercializar ouvender o primeiro produto e o resíduo da fermentação.

Em uma modalidade, o resíduo de fermentação tem umaquantidade aumentada de um nutriente comparado com um resíduo defermentação produzido por cultivar um microorganismo correspondente não-modificado na reação de fermentação. Em outra modalidade, o nutriente éselecionado do grupo que consiste em uma gordura, um ácido graxo, umlipídio, uma vitamina, um aminoácido essencial, um peptídeo, uma proteína,um carboidrato, um esterol, uma enzima, e um mineral-traço.

Em outra modalidade, o resíduo de fermentação tempropriedades físicas melhoradas. Em uma modalidade adicional, o resíduode fermentação tem uma quantidade aumentada de um composto industrialou farmacêutico. Em uma modalidade adicional, o microorganismo élevedura. Em uma modalidade adicional, o microorganismo é Clostridium.

Em outra modalidade, a fonte de carbono compreende amido demilho ou sacarose. Em uma modalidade adicional, o primeiro produto é umálcool selecionado do grupo que consiste em etanol, metanol, propanol, ebutanol. Em outra modalidade, o primeiro produto é um biocombustível e ométodo compreende adicionalmente misturar o biocombustível com outrocombustível para a comercialização.

Em uma modalidade, o nutriente é selecionado do grupo queconsiste em uma gordura, um ácido graxo, um lipídio, uma vitamina, umaminoácido essencial, um peptídeo, uma proteína, um carboidrato, umesterol, uma enzima, e um mineral-traço. Em outra modalidade, o resíduo defermentação compreende grãos secos de destilador, solúveis secos dedestilador ou grãos secos de destilador com solúveis. Outra modalidadecompreende misturar o resíduo de fermentação com outros nutrientes paraproduzir uma ração completa para um animal domesticado. Em outrosaspectos, esta invenção fornece um processo que compreende combinar umresíduo de fermentação com um nutriente e uma composição quecompreende um resíduo de fermentação suplementado com um nutrienteexógeno.

A presente invenção também tem como modalidades variaçõese todas as combinações da composição e métodos descritos aqui.Incorporação por Referência

Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nestaespecificação estão incorporados aqui por referência da mesma proporçãoque se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especifica-mente e individualmente incorporado por referência.

Breve Descrição dos Desenhos

As ilustrações incluídas dentro desta especificação descrevemmuitas das vantagens e características da invenção. Deve ser compreendidoque numerais e caracteres semelhantes observados dentro das ilustrações aqui contidas podem designar características iguais ou semelhantes da in-venção. As ilustrações e características descritas aqui não estão necessari-amente desenhadas em escala.

A figura 1 é um fluxograma que descreve processo de produçãode etanol exemplar que resulta na formação de etanol, dióxido de carbono e resíduos de fermentação tais como grão de destilador com solúveis ou sóli-dos (DDGS).

A figura 2 é uma representação esquemática de um veículo ge-nético exemplar útil para modificar um microorganismo usado reação defermentação em questão.

A figura 3A é um diagrama do vetor pKS1-ST:G06205 usado pa-ra a expressão das proteínas ricas em Iisina em Saccharomyces cerivisiae.

A figura 3B é um diagrama do vetor pKS2-ST:G06205 usado pa-ra a expressão e secreção das proteínas ricas em Iisina dentro de Saccha-romyces cerivisiae.

A figura 4A é a seqüência da proteína expressa por pKS1-ST:G06205, uma endopeptidase rica em lisina, específica de Flavobaeteri-um meningosepticum.

A figura 4B é a seqüência da proteína expressa por pKS2-ST:G06205, uma endopeptidase rica em lisina, específica de Flavobacteri-um meningosepticum contendo um sinal de exportação SUC2.

A figura 5A é uma imagem de um gel de SDS-PAGE do sobre-nadante de cultura empregado por 24 horas no crescimento de uma culturacelular de Saccharomyees cerivisiae mostrando expressão e secreção daproteína codificada por pKS2-ST:G06205.

A figura 5B é uma imagem de um gel de SDS-PAGE do sobre-nadante de cultura empregado por 48 horas no crescimento de uma culturacelular de Saccharomyces cerivisiae transformada mostrando expressão esecreção da proteína codificada por pKS2-ST:G06205.

A figura 6 é uma imagem de um gel de SDS-PAGE de Iisadoscelulares de uma cultura celular de Saccharomyces cerivisiae transformadamostrando expressão da proteína codificada por pKS1-ST:G06205 dentroda célula.

A figura 7 é um diagrama esquemático de um processo de fer-mentação produtor de etanol da invenção.

A figura 8 é um diagrama de um processo de fermentação se-qüencial conhecido na técnica.

A figura 9 é um diagrama de um processo de fermentação para-lelo da presente invenção.

A figura 10 é um diagrama de um processo de fermentação para-lelo da presente invenção ilustrando processamento a jusante adicional.

A figura 11 é um diagrama de um processo de fermentação para-leio da presente invenção ilustrando etapas de pré-processamento antes dafermentação paralela.

A figura 12 é um diagrama de um processo de fermentação para-leia da presente invenção ilustrando outros processos concomitantes.

A figura 13 é um diagrama de um processo de fermentação pa-ralela da presente invenção incluindo 3 fermentações em paralelo.

A figura 14 é o site da internet comentado dehttp://pathway.yeastgenome.org:8555/YEAST/new-image?type=OVERVIEW&force=t. Ele mostra vias enzimáticas em levedurae identifica várias em particular. O site da internet contém links para enzimasespecíficas ao longo das vias.

Descrição Detalhada da Invenção

Embora modalidades preferidas da invenção tenham sido mos-tradas e descritas aqui, será óbvio para aqueles versados na técnica que taismodalidades são fornecidas apenas como forma de exemplo. Várias varia-ções, alterações, e substituições serão vislumbradas por aqueles versadosna técnica sem desconsiderar a invenção. Deve ser compreendido que vá-rias alternativas para as modalidades da invenção descritas aqui podem serempregadas na prática da invenção.

O termo "animal" significa qualquer organismo que pertence aoreino Animalia e inclui, sem limitação, aves (por exemplo, aves domésticas),mamíferos (por exemplo, gado, suínos, cabra, ovelha, cão, camundongo ecavalo) e insetos (por exemplo, bicho da seda) assim como animais usadosem aqüicultura, por exemplo, peixes (por exemplo, truta e salmão), moluscos,(por exemplo, vôngoles) e crustáceos (por exemplo, lagosta e camarão).

O termo "resíduos de fermentação" conforme aqui utilizado signi-fica qualquer substância residual que resulte diretamente de uma reação defermentação. Em alguns casos, um resíduo de fermentação contém microor-ganismos modificados tal que ele tenha um conteúdo nutricional aumentadoquando comparado a um resíduo de fermentação que é deficiente em talmicroorganismo modificado. Os resíduos de fermentação podem conter cons-tituinte(s) adequado(s) de um caldo de fermentação. Por exemplo, os resíduosde fermentação podem incluir constituintes dissolvidos e/ou suspensos de umcaldo de fermentação. Os constituintes suspensos podem incluir constituintessolúveis não-dissolvidos (por exemplo, quando a solução é supersaturadacom um ou mais componentes) e/ou materiais insolúveis presentes no caldode fermentação. Os resíduos de fermentação podem incluir substancialmentetodos os sólidos secos presentes no final de uma fermentação (por exemplo,por secagem por atomização de um caldo de fermentação e da biomassaproduzida pela fermentação) ou pode incluir uma porção deste. Os resíduosde fermentação podem incluir produto de fermentação bruto da fermentaçãoonde um microorganismo modificado pode ser fracionado e/ou parcialmentepurificado para aumentar o conteúdo de nutrientes do material. Resíduos defermentação abrangem resíduos inteiros e frações do resíduo total, por e-xemplo, resíduos secos (por exemplo, grãos), solúveis secos e sólidos secos(por exemplo, grãos) com solúveis secos.

O termo "cultura de fermentação" refere-se a microorganismoscontidos em um meio que compreende materiais suficientes para o cresci-mento dos microorganismos, por exemplo, água a nutrientes.

O termo "produto comercial" refere-se a um produto pretendidopara comercialização, por exemplo, para venda ao consumidor final.

O termo "processo de fermentação comercial" refere-se a umprocesso de fermentação no qual microorganismos são cultivados para pro-duzir um produto, por exemplo, um composto, que é isolado da cultura defermentação para comercialização, deixando um resíduo de fermentação.

O termo "ácido graxo" conforme aqui utilizado significa um ácidomonocarboxílico alifático ou aromático.

O termo "lipídios" conforme aqui utilizado significa gorduras ouóleos incluindo sem limitação os ésteres de glicerídeo de ácidos graxos juntocom fosfatídeos, esteróis, alcoóis, hidrocarbonetos, cetonas e compostosrelacionados associados.

O termo "nutriente" conforme aqui utilizado significa qualquersubstância com valor nutricional. Ele pode ser parte de uma ração animal oude um suplemento alimentar para seres humanos. Nutrientes exemplaresincluem, mas não são limitados a gorduras, ácidos graxos, lipídios (tais co-mo fosfatídeos), vitaminas, aminoácidos essenciais, peptídeos, proteínas,carboidratos, esteróis, enzimas, e minerais-traço (tais como, ferro, cobre,zinco, manganês, cobalto, iodo, selênio, molibdênio, níquel, flúor, vanádio,estanho e silicone). O nutriente pode ser secretado por um microorganismomodificado em um caldo de fermentação ou estar contido dentro do microor-ganismo (por exemplo, corpos de inclusão no microorganismo).

"Polipeptídeo heterólogo" ou "proteína heteróloga" significa deri-vada de (isto é, obtida de) uma entidade genotipicamente distinta do resto daentidade com a qual ele está sendo comparado, ou que é geneticamenteindistinto, mas produzido em uma concentração anormalmente alta ou baixaquando comparado a um ambiente ou microorganismo nativo.

O termo "ácido graxo insaturado" conforme aqui utilizado signifi-ca um ácido graxo com 1 a 3 ligações duplas e um "ácido graxo altamenteinsaturado" significa um ácido graxo com 4 ou mais ligações duplas.

Uma "ração animal completa" é uma ração para um animal quenão requer suplementação nutricional.

Características que aumentam o valor comercial de um resíduode fermentação incluem, por exemplo, desejo como ração animal e utilidadeaumentada em processos industriais e farmacológicos. Características queaumentam o valor como ração animal incluem, por exemplo, aumentos nosnutrientes e características físicas aperfeiçoadas. Uma característica físicaaperfeiçoada é aderência aumentada, a qual permite que o material seja fa-cilmente transformado em péletes. Isso pode resultar, por exemplo, de ex-pressão de goma ou cera. Outra característica física aperfeiçoada é densi-dade aumentada. Isso pode resultar da produção de celulases que decom-põe o farelo. Um exemplo de algo que aumenta o valor de um resíduo emum processo industrial é a produção de polímeros úteis, por exemplo, paraplásticos, tal como ácido polilático. Um exemplo de algo que aumenta o valorem um processo farmacológico é a produção de produtos farmacológicos,tais como antibióticos.Processo de Fermentação

"Fermentação" como aqui utilizada significa um processo de cul-tivar microorganismos. A fermentação pode ser anaeróbica (deficiente emoxigênio) ou aeróbica (oxigenada). Sob condições aeróbicas, os microorga-nismos, tais como células de levedura, podem degradar açúcares para pro-dutos finais tais como CO2 e H2O. Sob condições anaeróbicas, as células delevedura utilizam uma via alternativa para produzir CO2 e etanol. A reaçãode fermentação da presente invenção é preferivelmente anaeróbica, isto é,parcialmente ou completamente deficiente em oxigênio. A fermentação tam-bém pode ser usada para referir-se ao crescimento de uma massa de micro-organismos em um meio de crescimento onde não é feita distinção entremetabolismo aeróbico e anaeróbico. A fermentação pode incluir crescimentosimultâneo de múltiplas cepas ou espécies de microorganismos.

A presente invenção também abrange fermentação de metano. Afermentação de metano pode converter todos os tipos de materiais poliméri-cos para metano e dióxido de carbono sob condições anaeróbicas. Isso po-de ser obtido como um resultado da quebra química consecutiva de políme-ros para metano e dióxido de carbono em um ambiente no qual uma varie-dade de microorganismos incluindo micróbios fermentativos (acidógenos),micróbios produtores de hidrogênio, formadores de acetato (acetógenos), emicróbios produtores de metano (metanógenos), crescem harmoniosamentee produzem os produtos finais reduzidos.

A fermentação de metano é a conseqüência de uma série de in-terações metabólicas entre vários grupos de microorganismos. Os microor-ganismos secretam enzimas que fragmentam materiais poliméricos e hidroli-sam os polímeros e fragmentos para monômeros tais como glicose e amino-ácidos, os quais são subseqüentemente convertidos para ácidos graxos vo-láteis maiores, H2, e ácido acético. No segundo estágio, bactérias acetogêni- cas produtoras de hidrogênio convertem, os ácidos graxos voláteis maiores,por exemplo, ácidos propiônico e butírico, produzidos, para H2, CO2 e ácidoacético. Finalmente, o terceiro grupo, bactérias metanogênicas convertemH2, CO2 e acetato em CH4 e CO2. Materiais poliméricos tais como lipídios,proteínas, e carboidratos podem ser primariamente hidrolisados por hidrola-ses extracelulares secretadas por microorganismos. Enzimas hidrolíticas(lipases, proteinases, celulases, amilases, etc.) podem hidrolisar seus res-pectivos polímeros em moléculas menores, primeiramente unidades mono-méricas, as quais podem então ser consumidas por microorganismos.

Enzimas tais como, Iipases podem converter lipídios para ácidosgraxos de cadeia longa, clostrídios e os micrococos são os exemplos deprodutores de Iipases extracelulares. As proteínas podem ser hidrolisadasusualmente para aminoácidos por proteases, secretadas por Bacteroides,Butyrivibrio, Clostridium, Fusobacterium, Selenomonas e Streptococcus. Osaminoácidos produzidos podem então ser degradados para ácidos graxostais como acetato, propionato, e butirato e para amônia como encontrado emClostridium, Peptococcus, Selenomonas, Campylobacter e Bacteroides.

Polissacarídeos tais como celulose, amido, e pectina podem serhidrolisados por celulases, amilases e pectinases. A maioria das bactériasanaeróbias sofrem metabolismo de hexose através da via de Emden-Meyerhof-Parnas (EMP) a qual produz piruvato como um intermediário juntocom NADH. O piruvato e o NADH assim gerados podem então ser transfor-mados em produtos finais de fermentação tal como Iactato1 propionato, ace-tato e etanol por outras atividades enzimáticas que podem variar com espé-cies de microorganismos.

Dessa forma, na hidrólise e acidogênese, açúcares, aminoáci-dos, e ácidos graxos produzidos por microorganismo pela degradação debiopolímeros são metabolizados para endoprodutos de fermentação tais co-mo lactato, propionato, acetato, dióxido de carbono, e etanol por outras ativi-dades enzimáticas que variam com a espécie de microorganismo. Metanó-genos, tais como Methanosarcina spp. e Methanothrix spp., também sãoprodutores de metano na digestão anaeróbica. Embora o acetato e H2/CO2sejam os principais substratos disponíveis no ambiente natural, formato, me-tanol, metilaminas e CO também podem ser convertidos para CH4.

A figura 1 é um fluxograma de um processo de fabricação de e-tanol que resulta na produção de resíduos de fermentação que incluem, masnão são limitados a grão seco de destilador com solúveis ou sólidos (DDGS)de acordo com a invenção. Muitos produtos de ração podem resultar do pro-cesso de fabricação de etanol que freqüentemente utiliza milho como o ma-terial inicial, por exemplo, conforme ilustrado, mas deve ser compreendidoque outras fontes de carboidrato ou amido tais como outros produtos de grãotambém podem ser incorporados à invenção.A. Fontes de Carbono

Os processos de fermentação desta invenção prosseguem porfornecer aos microorganismos uma fonte de carbono na qual eles podemcrescer. Em certas modalidades, os microorganismos direcionam carbonodestas fontes de carbono para dentro de vias enzimáticas que produzemquímicos industriais. Por exemplo, a levedura converte glicose em etanolatravés da via de glicólise. Há uma variedade de fontes de carbono que po-dem ser usadas no processo de fermentação da presente invenção. Em umamodalidade, a fonte de carbono é uma biomassa, isto é, material de planta.A matéria-prima para a maior parte da produção de álcool inclui um cultivoou derivado de cultivo, incluindo grãos e frutos. O material pode ser inteiroou pode ser processado, por exemplo, por moagem ou trituração. Por exem-pio, a fonte de carbono pode incluir milho, trigo, milo, aveia, cevada, arroz,centeio, sorgo, batata, soro de leite, beterraba, inhame, mandioca, frutas,sucos de fruitas, e cana de açúcar. As fontes de carbono usadas no proces-so de fermentação da presente invenção podem ser naturais, modificadasquimicamente, ou modificadas geneticamente. Os exemplos de fonte de car-bono que pode ser fermentada por microorganismos modificados da presen-te invenção incluem, mas não são limitados a milho, canola, alfafa, arroz,centeio, sorgo, girassol, trigo, soja, tabaco, batata, amendoim, algodão, bata-ta doce, mandioca, café, coco, árvores de cítricos, cacau, chá, frutas taiscomo banana, figo, abacaxi, goiaba, manga, aveia, cevada, vegetais, orna-mentais, e coníferas. Fontes de carbono preferíveis são plantas de cultivo,por exemplo, cereais, e "grãos", milho, trigo, milo, aveia, amaranto, arroz,sorgo, painço, mandioca, cevada, ervilha, tapioca, batatas, e outras raízesde tubérculos ou sementes de cultivo. Uma biomassa na forma de resíduosda agricultura tal como restos de milho, talo de arroz, adubo, etc., e cultivosde biomassa tais como grama ou choupo, salgueiros e ainda resíduos muni-cipais tais como jornais podem ser convertidos em álcool.A fonte de carbono pode incluir qualquer fonte de carbono apropriada talcomo madeira, restos de papel, adubo, soro de queijo, melado, beterraba oucana de açúcar. Esta fonte de carbono pode incluir xarope de milho não-hidrolisado ou amido de milho que é uma fonte de carbono barata. A fontede carbono pode incluir dióxido de carbono para anaeróbios tais como ace-tógenos e metanógenos, e para microorganismos fotossintéticos.

Um material partida que contém carbono preferido para a fer-mentação é milho e em particular amido de milho. O milho tem cerca de doisterços de amido, o qual é convertido durante um processo de fermentação edestilação em etanol e dióxido de carbono. Os nutrientes restantes ou resí-duos de fermentação podem resultar em solúveis de destilador condensadosou grãos de destilador tal como DDGS, o qual pode ser usado em produtosde reação. Em geral, o processo envolve uma etapa de preparação inicial detrituração ou moagem seca do milho. O milho processado é então submetidoà hidrólise e enzimas adicionadas para quebrar o componente de amido prin-cipal é uma etapa de sacarificação. A etapa seguinte da fermentação é deixa-da ocorrer pela adição de um microorganismo modificado (por exemplo, leve-dura) fornecido de acordo com uma modalidade da invenção para produzirprodutos gasosos tal como dióxido de carbono. A fermentação é conduzidapara a produção de etanol o qual pode ser destilado do caldo de fermentação.O resto do meio de fermentação pode ser então seco para produzir resíduosde fermentação incluindo DDGS. Esta etapa geralmente inclui um processode separação sólido/líquido por centrifugação em que um componente de fasesólida pode ser coletado. Outros métodos incluindo técnicas de filtração e se-cagem por atomização podem ser empregados para efetuar tal separação. Oscomponentes da fase líquida podem ser submetidos posteriormente a umaetapa de evaporação que pode concentrar subprodutos solúveis, tais comoaçúcares, glicerol e aminoácidos, antes de serem recombinados com o com-ponente da fase sólida para serem secos como resíduos de fermentação. De-ve ser compreendido que as composições em questão podem ser aplicadasa fábricas de etanol novas ou já existentes com base na trituração seca parafornecer um processo de produção de etanol integrado que também produzresíduos de fermentação com valor aumentado.Resíduos de fermentação preferidos produzidos de acordo coma presente invenção têm um valor comercial mais elevado do que os resí-duos de fermentação convencionas. Por exemplo, os resíduos de fermenta-ção podem incluir sólidos secos intensificados tal como DDGS com conteúdode aminoácido e de micronutrientes melhorado. Um produto de DDGS de"cor dourada" pode então ser fornecido, o qual geralmente indica maior di-gestibilidade de aminoácido em comparação a DDGS de cor mais escura.Por exemplo, DDGS de cor clara pode ser produzido com uma concentraçãode Iisina aumentada de acordo com uma modalidade preferível aqui contidaem comparação com um produto de cor mais escura geralmente com menorvalor nutricional. A cor dos produtos tende a ser um importante fator ou indi-cador na avaliação da qualidade e digestibilidade do nutriente dos resíduosde fermentação ou DDGS. A cor é usada como um indicador da exposição aexcesso de calor durante a secagem causando caramelização e reações deMillard dos grupos amina livres e açúcares, reduzindo a qualidade de algunsaminoácidos.

As etapas básicas em um processo de fabricação de etanol portrituração ou moagem seca como mostrado na figura 1 podem ser descritascomo segue: trituração ou moagem do milho ou outro produto de grão, saca-rificação, fermentação, e destilação. Por exemplo, sementes de milho inte-rais podem ser trituradas ou moídas tipicamente com moinhos de martelo oumoinhos de cilindro. O tamanho da partícula pode influenciar da hidrataçãodo cozimento e subseqüente conversão enzimática. O milho triturado ou mo-ído pode então ser misturado com água para fazer uma massa que é cozidae resfriada. Pode ser útil incluir enzimas durante as etapas iniciais destaconversão para diminuir a viscosidade do amido gelatinizado. A mistura po-de então ser transferida para um reator de sacarificação, mantida em tempe-raturas selecionadas tal como 40°C (104°F), onde o amido é convertido pelaadição de enzimas de sacarificação a açúcares fermentáveis tal como glico-se ou maltose. A massa convertida pode ser resfriada para temperaturasdesejadas tal como 28,9°C (84°F), e alimentada em reatores de fermentaçãoonde os açúcares fermentáveis são convertidos em dióxido de carbono pelouso de cepas selecionadas de leveduras aperfeiçoadas fornecidas de acordocom a invenção, o que resulta em resíduos de fermentação mais nutritivosem comparação com ingredientes mais tradicionais tais como leveduras deSaccharomyces. A cerveja resultante pode ser quebrada para separar o dió-xido de carbono e o líquido resultante pode ser alimentado em um sistemade recuperação que consiste em colunas de destilação e uma coluna de ar-rastamento. O fluxo de etanol pode ser direcionado para uma peneira mole-cular onde a água restante é removida usando tecnologia de adsorção. Oetanol purificado, desnaturado com uma pequena quantidade de gasolinapode produzir etanol de grau combustível. Outro produto pode ser produzidopor purificação adicional do etanol destilado inicial, para remover impurezas,resultando etanol a cerca de 99,95% para usos como não-combustíveis.

Toda a vinhaça pode ser retirada do fundo da unidade de desti-lação e centrifugada para produzir grãos úmidos (DGW) e vinhaça diluída(líquida). O DGW pode deixar a centrífuga com 55-65% de umidade, e podeainda ser vendido como ração para gado ou seco como resíduos de fermen-tação intensificados fornecidos de acordo com a invenção. Os resíduos in-cluem um produto final intensificado que pode ser referido aqui como grãossecos de destilador (DDG). Usando um evaporador, a vinhaça diluída (líqui-da) pode ser concentrada para formar solúveis de destilador, os quais po-dem ser adicionados de volta e combinados com um fluxo de processamentode grãos de destilador e secos. Este produto combinado de acordo com umamodalidade preferível da invenção pode ser vendido como um resíduo defermentação aperfeiçoado ou grãos secos de destilador com solúveis(DDGS) tendo melhor conteúdo de aminoácido e micronutrientes. Deve sercompreendido que vários conceitos da invenção podem ser aplicados a ou-tros processos de fabricação e fermentação e etanol conhecidos no campodiferentes daqueles ilustrados aqui.

Um exemplo ilustrativo de processo de produção de etanol dapresente invenção é mostrado na figura 7.

A presente invenção também compreende fermentações reali-zadas em um processo de trituração úmida. Um processo de trituração úmi-da envolve realizar o processamento antes da fermentação a fim de criar ummaterial de entrada mais puro para o processo de fermentação. Por exem-plo, com milho, o processo de fermentação úmida é usado para remover ogérmen, a fibra e o glúten deixando uma pasta fluida de amido que é subme-tida à fermentação. Uma vantagem para o processo de trituração úmida éque ele torna possível recuperar a levedura no final da fermentação e usar alevedura em fermentações subseqüentes. Além disso, o processo pode serfeito para começar rapidamente por causa de altas concentrações de leve-dura, e as concentrações de levedura mais elevadas pode ajudar a evitarque os organismos indesejados cresçam.

Uma modalidade da invenção é um método para fermentar subs-tâncias separadamente, e misturar os materiais fermentados para se obterprodutos de fermentação melhorados. Após tal mistura, processamento pos-terior, incluindo fermentação adicional pode ser realizado. Historicamente, afermentação tem sido feita em um único estágio de fermentação, e algunscasos, fermentação por múltiplas condições seqüencialmente. A fermenta-ção em múltiplos estágios aumenta a habilidade de se produzir diferentesprodutos de fermentação sob múltiplas condições, por exemplo, anaeróbicase aeróbicas.

Fermentação convencional é realizada apenas por etapas defermentação seqüenciais. Por exemplo, na produção de cerveja, malte e lú-pulo são fermentados juntos em um único estágio ou em múltiplas etapas.Geralmente, após a fermentação primária, alguns produtos de fermentaçãosão removidos e o restante é submetido a processos de fermentação adicio-nais. Após as etapas de fermentação adicionais, a cerveja obteve as carac-terísticas desejadas e pode ser engarrafada. Na indústria de vinhos, a fer-mentação é usada para converter açúcares em álcool. Isto também é feitoapenas seqüencialmente. Após a fermentação primária, alguns produtos defermentação são removidos e o restante é submetido a processos de fer-mentação adicionais. Freqüentemente mais do que um substrato é fermen-tado. Por exemplo, a fermentação secundária é freqüentemente empregadapara fermentar ácido málico para ácido lático na fermentação malolática.Na indústria do etanol combustível é prática comum realizar umaúnica fermentação para converter os carboidratos presentes em etanol. Talprocesso está ilustrado na figura 8. Esta etapa converte mais do que 90% doamido disponível para os produtos, tais como etanol e dióxido de carbono.

Sabe-se dentro da indústria que levedura pode ser cultivada rapidamentenos tanques de "semeadura" sob circunstâncias para se atingir biomassaelevada, conteúdo elevado de esterol, e/ou o número elevado de células delevedura. Estas fermentações em "semeadura" alimentam então processossubseqüentes de fermentação de etanol. A fermentação contínua nos tan-ques seqüenciais é um único processo de fermentação, e consegue osmesmos resultados de fermentação que uma única fermentação em um úni-co tanque. A fermentação adicional foi considerada para compostos residu-ais do fermento adicionais.

A presente invenção envolve o processo de fermentação que éfermentação em paralelo sob condições diferentes para produzir diferentessubprodutos de fermentação. Os diferentes subprodutos de fermentaçãopodem então ser combinados para processamento adicional, tal como extra-ção, destilação, fermentação adicional, remoção de água ou secagem.

Uma modalidade da invenção é um processo de fermentação emque pelo menos duas fermentações diferentes são conduzidas separada-mente e combinadas para gerar a melhoria no processo geral de fermenta-ção. As fermentações podem ser sincronizadas ou assíncronas. Práticas defermentação podem requerer que as fermentações não sejam de duraçãoidêntica. Uma ou mais das fermentações pode ser uma fermentação contí-nua. As fermentações paralelas são conduzidas diferentemente, no proces-so, ou na composição. Estas diferenças podem incluir um ou mais do se-guinte; aeróbica, anaeróbica, crescimento elevado, crescimento baixo, bio-massa elevada, biomassa baixa, expressão gênica desreprimida, expressãogênica reprimida, eucariótico, procariótico, metabolismo baixo, metabolismoelevado. Os meios nas fermentações paralelas podem também ser diferen-tes, por exemplo, incluindo por variar mais das seguintes propriedades: con-centração, composição, pH, micronutrientes, viscosidade, processos de fer-mentação, taxas de inoculação, temperatura, agitação, fluxo, suspensão,pressão, ou tempos de fermentação diferentes. Uma modalidade da inven-ção é usar as diferentes condições para obter fermentação assíncrona, comas diferentes fermentações paralelas tendo uma ou mais das seguintes ca-racterísticas: mais rápida/mais lenta, contínua vs. não-contínua, contínua vs.batelada, batelada vs. batelada, uso de pequenas instalações de fermenta-ção para fermentações de crescimento rápido, uso de grandes instalaçõesde fermentação para fermentações de crescimento lentas.

A fermentação em paralelo da presente invenção permite a pro-dução de produtos que podem ser difíceis ou caros demais para produzir emum único estágio, ou fermentação contínua. Por exemplo, a levedura (Sac-charomyces cerevisiae) cresce mais rapidamente na presença de oxigêniodo que em sua ausência. Assim, se um produto contendo uma proporçãoelevada de levedura for desejado, pode ser vantajoso conduzir fermentaçõesparalelas, em que uma das fermentações foi conduzida aerobicamente paragerar um rendimento elevado de biomassa de levedura, enquanto uma fer-mentação paralela foi conduzida anaerobicamente para gerar uma concen-tração elevada de um produto anaeróbico, por exemplo, etanol. Isto é ilus-trado esquematicamente na figura 9. Este processo permite o resultado de-sejado, resíduo de fermentação contendo alto conteúdo de levedura, e aprodução simultânea de etanol.

As fermentações paralelas da presente invenção também permi-tem a combinação dos dois fluxos de fermentação antes de processamentoadicional para gerar produtos. A figura 10 mostra este processo generaliza-do. O processo 1 pode ser uma terceira etapa da fermentação para removeros compostos residuais não-fermentáveis por Saccharomyces cerevisiae. Afigura 11 ilustra um processo da presente invenção que permite o pré-processamento das matérias-primas em diferentes fluxos. Este processopode permitir a fermentação da fibra do milho a partir da semente do milhoatravés da conversão direta da celulose ou da fermentação por um microor-ganismo fermentador de celulose, tal como Hypoerea jecorina.

Uma modalidade preferida é utilizar enzimas celulase para con-verter a celulose à glicose. A glicose pode então ser fermentada através deleveduras comuns. Pode ser desejável executar esta fermentação sob con-dições diferentes para permitir a conversão rápida da celulose em glicose. Oamido poderia ser fermentado na fermentação 2 para etanol e nos resulta- dos combinados para processamento adicional.

Outra modalidade preferida da invenção é mostrada na figura 12,que ilustra um fluxo de fracionamento mais completo. O fracionamento in-tensificado é seguido de processamento intensificado. Como nas outras mo-dalidades, a fermentação 1 pode ser aeróbica, e a fermentação 2 pode seranaeróbica. O processo 1 pode ser a concentração dos caldos da fermenta-ção para produzir etanol, o processo dois pode incluir secagem, evaporação,e a conversão de ácidos graxos em biodiesel.

Outra modalidade da invenção é mostrada na figura 13 para trêsfermentações paralelas. Uma modalidade preferida, a primeira fermentação é fermentação aeróbica do amido, a segunda fermentação, a fermentaçãoanaeróbica do amido e a terceira fermentação a conversão da celulose paraetanol, ou pode ser a conversão dos óleos no biodiesel.

Uma vantagem adicional para o método paralelo de fermentaçãoé a habilidade de conduzir fermentações de forma não-sincronizada. Por desacoplar os processos de fermentação, cada fermentação pode ser con-duzida sob condições ótimas. Em particular, fermentações que são rápidaspodem ser conduzidas em instalações separadas projetadas para cresci-mento rápido. Estas instalações incluem tanques menores, melhor regula-mento de temperatura (refrigeração), dosagem de nutriente intensificada, e fluxo de fluido intensificado para crescimento melhorado, alimentação, e tro-ca de metabólitos.

O processo de fermentação paralela da presente invenção podeser usado melhorar produtos, por exemplo, ter instalações de fermentaçãoseparadas para realizar fermentações de condições diferentes tem grandeutilidade na produção moderna do biocombustível. Separar os processos defermentação permite fermentações com diferentes níveis de oxigênio, com-posição de nutrientes diferente, níveis de expressão gênica diferentes, pHdiferente, meios diferentes, temperatura diferente, modos de crescimentodiferentes, para produção de subprodutos diferentes, para taxas de cresci-mento e níveis diferente, e para organismos diferentes.

Em outra modalidade da invenção, uma fermentação anaeróbicacom levedura em amido de milho, ou farelo de milho, é realizada para pro-duzir um subproduto metabólico sob condições que limitaram o crescimentode biomassa, permitindo que as células dobrem ou quadrupliquem em 46 a48 horas. Uma fermentação separada, executada em paralelo estaria sobcondições diferentes. Por exemplo, uma cepa diferente de levedura poderiaser cultivada aerobicamente sobre um substrato com nutrientes adicionaispara suportar o crescimento aeróbico para rendimento elevado de biomassa(biomassa de 10%). A segunda fermentação poderia beneficiar-se da aera-ção intensificada, suspensão intensificada, pH diferente, antibióticos adicio-nais para suprimir as bactérias aeróbicas, e de refrigerar intensificada. Estafermentação pode levar 72 horas para terminar por causa das característicasdiferentes de crescimento, do limite mais elevado de crescimento da bio-massa, e de uma redução na inibição do crescimento dos subprodutos me-tabólicos, tal como o etanol. Separar as fermentações em processos sepa-rados permite a produção intensificada e valor intensificado aos produtos dafermentação.

Ração Animal

Outro aspecto da presente invenção é dirigido para rações ani-mais completas com uma concentração intensificada de nutrientes que in-cluem microorganismos modificados caracterizados por uma concentraçãointensificada de nutrientes tais como, mas não limitados a, gorduras, ácidosgraxos, lipídios tal como o fosfolipídio, vitaminas, aminoácidos essenciais,peptídeos, proteínas, carboidratos, esteróis, enzima, e minerais-traço taiscomo, ferro, cobre, zinco, manganês, cobalto, iodo, selênio, molibdênio, ní-quel, flúor, vanádio, estanho e silicone.Resíduos da fermentação

Em um processo de fermentação da presente invenção, umafonte de carbono pode ser hidrolisada aos seus açúcares componentes pormicroorganismos modificados para produzir álcool e outros produtos gaso-sos. O produto gasoso inclui dióxido de carbono e o álcool inclui etanol. Osresíduos de fermentação obtidos após a reação de fermentação são tipica-mente de um valor comercial mais elevado. Em um aspecto, os resíduos dafermentação contêm os microorganismos modificados que têm conteúdo denutrientes maior do que aqueles resíduos deficientes nos microorganismosmodificados. Os microorganismos modificados podem estar presentes em umsistema de fermentação, no caldo da fermentação e/ou na biomassa da fer-mentação. O caldo e/ou a biomassa da fermentação podem ser secos (porexemplo, secos por atomização), para produzir os resíduos de fermentaçãocom um conteúdo aumentado dos conteúdos nutritivos.

Por exemplo, os sólidos exauridos secos recuperados depois doprocesso da fermentação são aumentados de acordo com a invenção parafornecer DDG ou DDGS melhorado (geralmente referido como grão seco dedestilador com solúveis). Estes resíduos de fermentação são geralmentenão-tóxicos, biodegradáveis, facilmente disponíveis, baratos, e ricos em nu-trientes. A escolha do microorganismo e das condições de fermentação éimportante para produzir uma toxicidade baixa ou resíduos de fermentaçãonão-tóxicos para o uso como uma ração ou um suplemento nutritivo. Emboraa glicose seja principal açúcar produzido a partir da hidrólise do amido dosgrãos, ela não é o único açúcar produzido geralmente em carboidratos. Aocontrário do DDG produzido a partir do processo tradicional de produção deetanol com moagem seca, que contém uma quantidade grande de carboidra-tos não-amido (por exemplo, tanto quanto 35% de celulose e arabinoxilanosmedidos como fibra detergente neutra, em peso seco), os resíduos de fer-mentação enriquecidos com nutriente em questão produzidos pela hidróliseenzimática dos carboidratos não-amido são mais saborosos e digestíveispara o não-ruminante.

A composição dos resíduos de fermentação enriquecidos comnutriente da presente invenção pode ser diferente daquela de DDG e de ou-tros subprodutos de destilador produzidos a partir do processo tradicional deprodução de etanol com moagem seca, os quais são obtidos através da fer-mentação do amido atual no milho triturado sem os microorganismos modifi-cados em questão. O resíduo de fermentação enriquecido com nutrientesdesta invenção pode ter um conteúdo de nutriente de pelo menos cerca de1% a cerca de 95% em peso. O conteúdo de nutriente está preferivelmentena faixa de pelo menos de cerca de 10% a 20%, 20% a 30%, 30% a 40%,40% a 50%, 50% a 60%, 60% a 70%, e 70% a 80% em peso. O conteúdo denutriente disponível pode depender do animal ao qual é alimentado e docontexto do restante da dieta, e do estágio no ciclo de vida do animal. Porexemplo, o gado de corte requer menos histidina do que vacas leiteiras. Aseleção do conteúdo de nutriente adequado para alimentar animais é bemconhecida daqueles versados na técnica.

Os resíduos de fermentação podem ser preparados como um pro-duto de biomassa seco por atomização. Opcionalmente, a biomassa pode serseparada por métodos conhecidos, tais como centrifugação, filtração, separa-ção, decantação, uma combinação de separação e decantação, ultrafiltraçãoou microfiltração. Os resíduos da fermentação da biomassa podem ainda sertratados adicionalmente para facilitar a passagem pelo rúmen. Em uma modali-dade, o produto da biomassa pode ser separado do meio da fermentação, secopor atomização, e opcionalmente tratado para modular a passagem pelo rú-men, e adicionado à ração como uma fonte nutritiva. Além de produzir resíduosde fermentação enriquecidos nutricionalmente em um sistema de fermentaçãoque contém microorganismos modificados, os resíduos de fermentação enri-quecidos nutricionalmente também podem ser produzidos em sistemas de plan-tas transgênicas. Métodos para produzir sistemas de plantas transgênicas sãoconhecidos na técnica. Alternativamente, onde o hospedeiro do microorganis-mo modificado excreta os conteúdos nutritivos, o caldo enriquecido nutricional-mente pode ser separado da biomassa produzida pela fermentação e o caldoclarificado pode ser usado como um ingrediente da ração animal, por exemplo,na forma líquida ou na forma seca por atomização.Os resíduos da fermentação obtidos após a reação de fermenta-ção usando microorganismos modificados podem ser usados como uma ra-ção animal ou como suplemento alimentar para seres humanos. Os resíduosda fermentação incluem pelo menos um ingrediente que tem um conteúdonutritivo aumentado o qual é derivado de uma fonte não-animal (por exem-plo, uma bactéria, levedura, e/ou planta). Em particular, os resíduos da fer-mentação são ricos em pelo menos uma ou mais dentre gorduras, ácidosgraxos, lipídios tal como fosfolipídio, vitaminas, aminoácidos essenciais, pep-tídeos, proteínas, carboidratos, esteróis, enzimas, e minerais-traço tais co-mo, ferro, cobre, zinco, manganês, cobalto, iodo, selênio, molibdênio, níquel,flúor, vanádio, estanho e silicone. Preferivelmente, os peptídeos contêm pelomenos um aminoácido essencial. Preferivelmente, os aminoácidos essenci-ais são encapsulados dentro de um microorganismo modificado em questãousado em uma reação de fermentação. Mais preferivelmente, os aminoáci-dos essenciais são contidos nos polipeptídeos heterólogos expressos pelomicroorganismo. Onde desejado, os polipeptídeos heterólogos são expres-sos e armazenados nos corpos de inclusão em um microorganismo fermen-tativo adequado (por exemplo, levedura).

B. Composições de ração animal

Em um aspecto, os resíduos de fermentação modificados emquestão têm um conteúdo nutritivo elevado. Em conseqüência, uma porcen-tagem mais elevada dos resíduos de fermentação pode ser usada em umaração animal completa. Em algumas modalidades, a composição da raçãocompreende pelo menos cerca de 15% de resíduos de fermentação em pe-so. Em uma ração completa, ou dieta, este material será alimentado comoutros materiais. Dependendo em cima do conteúdo nutritivo dos outros ma-teriais, e/ou das exigências nutricionais do animal ao qual a ração é fornecida,os resíduos de fermentação modificados podem variar de 15% da ração a100% da ração. Em algumas modalidades, os resíduos de fermentação emquestão podem fornecer menor porcentagem de mistura devido ao alto conte-údo de nutrientes. Em outras modalidades, os resíduos de fermentação emquestão podem fornecer uma fração muito alta da ração, por exemplo mais de75%. Em modalidades adequadas, a composição de ração compreende pelomenos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%,pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cercade 70%, ou pelo menos cerca de 75% do resíduo de fermentação em ques-tão. Geralmente, a composição de ração compreende pelo menos cerca de20% de resíduos da fermentação pelo peso. Mais geralmente, a composiçãode ração compreende pelo menos cerca de 15 a 25%, 25 a 20%, 20 a 25%,30% a 40%, 40% a 50%, 50% a 60%, ou 60% a 70% em peso de resíduos defermentação. Onde desejado, os resíduos de fermentação em questão podemser usados como uma única fonte da ração, particularmente para aves do-mésticas (por exemplo, galinha, patos e gansos) e porcos. Um nutriente podetambém ser adicionado à ração contendo os resíduos de fermentação.

A ração animal completa pode ter conteúdo de aminoácido au-mentado no que diz respeito a um ou mais aminoácidos essenciais para umavariedade de finalidades, por exemplo, para a produção de leite, para o au-mento do peso e para melhoria geral da saúde de animais. A ração animalcompleta pode ter um conteúdo de aminoácido aumentado por causa da pre-sença de aminoácidos livres e/ou da presença de proteínas ou peptídeos queincluem um aminoácido essencial, nos resíduos da fermentação. Os aminoá-cidos essenciais podem incluir histidina, lisina, metionina, fenilalanina, treoni-na, isoleucina, e/ou triptofano, os quais podem estar presentes na ração ani-mal completa como um aminoácido livre ou como parte de uma proteína ou deum peptídeo que é rico no aminoácido selecionado. Pelo menos um peptídeoou uma proteína rica em aminoácido essencial pode ter pelo menos 1% deresíduos de aminoácido essencial do total dos resíduos de aminoácido nopeptídeo ou na proteína, pelo menos 5% de resíduos de aminoácido essencialdo total de resíduos de aminoácido no peptídeo ou proteína, ou pelo menos10% de resíduos de aminoácido essencial do total de resíduos de aminoácidona proteína. Por dar uma dieta balanceada em nutrientes aos animais, é feitouso máximo do conteúdo nutritivo, requerendo menos ração para conseguirtaxas de crescimento comparáveis, produção de leite, ou uma redução nosnutrientes presentes nos excretas reduzindo a biocarga dos dejetos.

Uma ração animal completa com um conteúdo aumentado de umaminoácido essencial pode ter um conteúdo de aminoácido essencial (inclu-indo aminoácido essencial livre e aminoácido essencial presente em umaproteína ou peptídeo) de pelo menos de 2,0% em peso em relação ao pesoda proteína bruta e do conteúdo de aminoácido total, e mais adequadamentepelo menos 5,0% em peso em relação ao peso da proteína bruta e do con-teúdo total de aminoácido. A composição de ração animal completa incluioutros nutrientes derivados de microorganismos modificados incluindo, masnão limitados a, gorduras, ácidos graxos, Iipfdios tal como fosfolipídio, vita-minas, carboidratos, esteróis, enzimas, e minerais-traço.

A composição de ração animal completa pode incluir a composi-ção na forma de ração completa, composição na forma concentrada, com-posição na forma misturada, e composição na forma de base. Se a composi-ção estiver na forma de uma ração completa, o nível percentual de nutrien-tes, onde os nutrientes são obtidos do microorganismo modificado em umresíduo de fermentação, pode ser cerca de 10 a cerca de 25 por cento, maisadequadamente cerca de 14 a cerca de 24 por cento; enquanto que, se acomposição estiver na forma de um concentrado, o nível nutrientes pode serde cerca de 30 a cerca de 50 por cento, mais adequadamente cerca de 32 acerca de 48 por cento. Se a composição estiver na forma de uma mistura, onível de nutrientes na composição pode ser de cerca de 20 a cerca de 30por cento, mais adequadamente cerca de 24 a cerca de 26 por cento; e se acomposição estiver na forma de uma mistura de base, o nível de nutrientesna composição pode ser de cerca de 55 a cerca de 65 por cento. A menosque indicado de outra maneira aqui, as porcentagens são indicadas em umabase de porcentagem do peso. Se o DDGS for elevado em um único nutrien-te, por exemplo Lys, ele será usado como um suplemento em uma taxa bai-xa; se for balanceado nos aminoácidos e nas vitaminas, por exemplo, vita-mina AeE, ele será uma ração mais completa e será alimentado em umataxa mais elevada e suplementado com um estoque de reação com poucosnutrientes e pouca proteína, como forragem de milho.A composição de ração pode incluir um peptídeo ou uma fraçãode proteína bruta presente em um resíduo da fermentação que têm um con-teúdo do aminoácido essencial de pelo menos cerca de 2%. Em modalida-des adequadas, uma fração do peptídeo ou da proteína bruta pode ter umconteúdo de aminoácido essencial de pelo menos cerca de 3%, pelo menoscerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo me-nos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, eem modalidades adequadas, pelo menos cerca de 50%. Em algumas modali-dades, o peptídeo pode ser formado de 100% de aminoácidos essenciais.Geralmente, a composição de ração pode incluir uma fração de peptídeo ouproteína bruta presente em um resíduo de fermentação tendo um conteúdo deaminoácido essencial de até cerca de 10%. Mais geralmente, a composiçãode ração pode incluir uma fração de peptídeo ou de proteína bruta presenteem um resíduo de fermentação tendo um conteúdo do aminoácido essencialde cerca de 2 a 10%, 3,0 a 8,0%, ou 4,0 a 6,0%.

A composição de ração pode incluir uma fração de peptídeo ouproteína bruta presente em um resíduo de fermentação tendo um conteúdode Iisina de pelo menos cerca de 2%. Em modalidades adequadas, a fraçãode peptídeo ou proteína bruta pode ter um conteúdo de Iisina de pelo menoscerca de 3%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo me-nos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%,pelo menos cerca de 40%, e em modalidades apropriadas, pelo menos cer-ca de 50%. Tipicamente, a composição de ração pode incluir a fração depeptídeo ou proteína bruta tendo um conteúdo de Iisina de até cerca de10%. Onde desejado, a composição de ração pode incluir uma fração depeptídeo ou proteína bruta que tendo um conteúdo de Iisina de cerca de 2 a10%, de 3,0 a 8,0%, ou de 4,0 a 6,0%.

A composição de ração pode incluir nutrientes no resíduo de fer-mentação de cerca de 1 g/kg de sólidos secos a 900g/kg de sólidos secos. Emalgumas modalidades, os nutrientes em uma composição de ração podemestar presentes em pelo menos cerca de 2g/kg de sólidos secos, 5g/kg desólidos secos, 10g/kg de sólidos secos, 50g/kg de sólidos secos, 100g/kg desólidos secos, 200g/kg de sólidos secos, e cerca de 300 g/kg sólidos secos.Em modalidades adequadas, os nutrientes podem estar presentes em pelomenos cerca de 400g/kg de sólidos secos, pelo menos cerca de 500g/kg desólidos secos, pelo menos cerca de 600g/kg de sólidos secos, pelo menoscerca de 700g/kg de sólidos secos, pelo menos cerca de 800g/kg de sólidossecos e/ou pelo menos cerca de 900g/kg de sólidos secos.

A composição de ração pode incluir um aminoácido essencial ouum peptídeo que contêm pelo menos um aminoácido essencial presente emum resíduo de fermentação que têm um conteúdo de cerca de 1g/kg de sóli-dos secos a 900g/kg de sólidos secos. Em algumas modalidades, o aminoá-cido essencial ou um peptídeo que contêm pelo menos um aminoácido es-sencial em uma composição de ração pode estar presente em pelo menoscerca de 2g/kg de sólidos secos, 5g/kg de sólidos secos, 10g/kg de sólidossecos, 50g/kg de sólidos secos, 100g/kg de sólidos secos, 200g/kg de sóli-dos secos, e cerca de 300 g/kg de sólidos secos. Em modalidades adequa-das, o aminoácido essencial ou um peptídeo que contêm pelo menos umaminoácido essencial pode estar presente em pelo menos cerca de 400g/kgde sólidos secos, pelo menos cerca de 500g/kg de sólidos secos, pelo me-nos cerca de 600g/kg de sólidos secos, pelo menos cerca de 700g/kg desólidos secos, pelo menos cerca de 800g/kg de sólidos secos e/ou pelo me-nos cerca de 900g/kg de sólidos secos.

A composição de ração pode incluir uma fonte de aminoácido comproteção contra o rúmen de origem não-animal que pode incluir a Iisina comproteção contra o rúmen ou outros aminoácidos essenciais e/ou uma proteínaou peptídeo rico em aminoácido com proteção contra o rúmen, mais preferi-velmente uma proteína ou um peptídeo do rico do aminoácido essencial. Oaminoácido essencial livre ou a proteína ou o peptídeo rico em aminoácidoessencial podem ser protegidos do rúmen por reagir com pelo menos o umcarboidrato redutor (por exemplo, um açúcar redutor) ou com pelo menos umácido graxo. Carboidratos redutores adequados podem incluir xilose, lactose,e/ou glicose. Ácidos graxos adequados podem incluir óleos vegetais pelo me-nos parcialmente hidrogenados, tal como óleo de soja. A fonte de aminoácidocom proteção contra o rúmen pode ser capaz de liberar pelo menos cerca de40% de aminoácido com proteção contra o rúmen pós-ruminalmente. Maisgeralmente, a fonte de aminoácido com proteção contra o rúmen pode sercapaz de liberar pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% de ami-noácido com proteção contra o rúmen pós-ruminalmente.

A composição de ração animal completa pode conter resíduosde fermentação enriquecidos com nutrientes na forma de uma biomassaformada durante a fermentação e pelo menos um componente nutriente adi-cional. Em outro exemplo, a composição de ração contém um resíduo defermentação enriquecido com nutrientes que é dissolvido e suspenso a partirde um caldo de fermentação formado durante a fermentação e pelo menosum componente nutriente adicional. Em uma modalidade adicional, a com-posição de ração tem uma fração de proteína bruta que inclui pelo menosuma proteína rica em aminoácido essencial. A composição de ração podeser formulada para liberar um balanço melhorado de aminoácidos essenciaispós-ruminalmente.

A composição na forma de ração completa pode conter um oumais ingrediente tais como intermediários de trigo ("mids de trigo"), milho, fa-relo de soja, farelo de glúten de milho, grãos de destilador ou grãos de desti-lador com solúveis, sal, macrominerais, minerais-traço e vitaminas. Outrosingredientes potenciais podem geralmente incluir, mas não estar limitados afarelo de girassol, brotos de malte e cascas de soja. A composição na forma damistura pode conter intermediários de trigo, farelo de glúten de milho, grãos dedestilador ou grãos de destilador com solúveis, sal, macrominerais, minerais-traço e vitaminas. Ingredientes alternativos incluiriam geralmente, mas não se-riam limitados a, milho, farelo de soja, farelo de girassol, farelo de semente dealgodão, broto de malte e cascas de soja. A composição na forma de base po-de conter intermediários de trigo, farelo de glúten de milho, e grãos de destila-dor ou grãos de destilador com solúveis. Os ingredientes alternativos incluiriamgeralmente, mas não são limitados a, farelo de soja, farelo de girassol, brotode malte, macrominerais, minerais-traço e vitaminas (Messman et al. Publica-ção U.S. N5 2006/0039955, que está incorporada aqui em sua totalidade).Ácidos graxos altamente insaturados (HUFAs) em microorganis-mos modificados, quando expostos a condições oxidantes podem ser conver-tidos em ácidos graxos insaturados menos desejáveis ou em ácidos graxossaturados. Entretanto, a saturação de HUFAs de ômega-3 pode ser reduzidaou impedida pela introdução de antioxidantes sintéticos ou de antioxidantesnaturais, tais como o beta-caroteno, a vitamina Eea vitamina C, na ração. Osantioxidantes sintéticos, tais como BHT, BHA, TBHQ ou etoxiquina, ou antio-xidantes naturais tais como tocoferóis, podem ser incorporados nos produtosde alimento ou ração por adicioná-los aos produtos, ou eles podem ser incor-porados pela produção in situ em um organismo adequadamente modificado.A quantidade de antioxidantes incorporados desta maneira depende, por e-xemplo, das exigências subseqüentes do uso, tais como da formulação doproduto, dos métodos de empacotamento, e da vida útil desejada.

Resíduo de fermentação ou ração completa contendo o resíduode fermentação da presente invenção, também pode ser utilizado como umsuplemento nutricional para o consumo humano se o processo começar comos materiais de entrada de grau humano, e padrões de qualidade para ali-mentos humanos sejam observados durante todo o processo. O resíduo defermentação ou ração completa descrita na invenção tem alto conteúdo nu-tricional. Os nutrientes, tal como proteína e fibra, estão associados com die-tas saudáveis. Podem ser desenvolvidas receitas para utilizar resíduos defermentação ou a ração completa da invenção em alimentos tais como cere-al, bolachas, tortas, biscoitos, bolos, massa de pizza, molho de verão, al-môndegas, vitaminas e qualquer forma de alimento comestível. Outra esco-lha pode ser desenvolver os resíduos de fermentação ou a ração completada invenção em petiscos ou uma barra, similares a uma barra de granolaque poderia ser facilmente comida, conveniente para distribuição. Uma barrapode incluir proteína, fibra, gérmen, vitaminas, minerais, do grão, dos nutra-cêuticos tais como glicosamina, HUFAs, ou co-fatores, tais como vitamina Q-10. O resíduo de fermentação nutricional da invenção também pode ser in-corporado em programas domésticos de alimentação tais como merendaescolar e veículos para venda de alimentos.A ração animal ou suplemento alimentar para seres humanosque compreende os resíduos de fermentação em questão pode ser suple-mentado adicionalmente com sabores desejáveis. A escolha de um saborparticular depende do animal ao qual a ração é proporcionada. Os sabores earomas, tanto naturais como artificiais, podem ser usados ao fazer raçõesmais aceitáveis e saborosas. Essas suplementações podem se misturar bemcom todos os ingredientes e podem estar disponíveis como uma forma deproduto líquido ou seco. Sabores e aromas adequados a ser suplementadosnas rações animais incluem, mas não são limitados ao feno-grego, banana,cereja, alecrim, cominho, cenoura, orégano, hortelã, baunilha, anis, rum,bordo, caramelo, óleos cítricos, butirato de etila, anetol, maçã, canela, equalquer combinação natural ou artificial disso. Em geral, sabores que inclu-em feno-grego, banana, e cereja são altamente desejáveis para cavalos,bordo, baunilha e anis para vacas, e rum, baga e coco para porcos. Os sa-bores e os aromas podem ser trocados entre animais diferentes. Similarmen-te, uma variedade de sabores da fruta, artificiais ou naturais, pode ser adi-cionada aos suplementos alimentares que compreendem os resíduos defermentação em questão para o consumo humano.

C. Vida útil

A vida útil dos resíduos de fermentação ou da ração completa dapresente invenção pode tipicamente ser mais longa do que a vida útil de umresíduo de fermentação que é deficiente no microorganismo modificado. Avida útil pode depender de fatores tais como, o conteúdo de umidade doproduto, quanto ar pode correr através da massa da ração, das condiçõesambientais e do uso dos conservantes. Um conservante pode ser adicionadoà ração completa para aumentar a vida útil para semanas e meses. Outrosmétodos para aumentar a vida útil incluem controle similar ao controle dasilagem tal como misturar com outras rações e embalar, cobrir com plásticoou ensacar. Condições frescas, conservantes e retirar o ar da massa da ra-ção estendem a vida útil de subprodutos úmidos. A ração completa pode serarmazenada em caixas ou sacos de silo. Secar os resíduos de fermentaçãoúmidos ou ração completa também pode aumentar a vida útil do produto emelhorar a consistência e a qualidade.

A ração completa da presente invenção pode ser armazenada porlongos períodos de tempo. A vida útil pode ser estendida por ensilar, adicionarconservantes tais como ácidos orgânicos, ou misturar com outras alimenta-ções tais como casca de soja. Caixas de produto ou galpões de armazena-mento em massa podem ser usados para armazenar as rações completas.

III. MICROORGANISMOS MODIFICADOS

Microorganismos adequados que podem ser usados na reaçãode fermentação da presente invenção incluem células procarióticas e eucari-óticas. Microorganismos preferidos produzem uma toxicidade baixa ou unsresíduos de fermentação não-tóxicos para uso como uma ração ou suple-mento nutricional. Sistemas biológicos preferidos incluem sistemas fúngicos,bacterianos, e de microalgas. Sistemas biológicos mais preferidos são cultu-ras de células fúngicas, mais preferivelmente uma cultura de célula de Ieve-dura, e o mais preferivelmente uma cultura de célula de Saccharomyces ee-revisiae. Os fungos podem ser manipulados por técnicas microbiológicasclássicas e de manipulação genética. O procarioto preferido é E. coli. A mi-croalga preferida para o uso na presente invenção inclui Chlorella e Proto-theca. Alguns dos exemplos de levedura que podem ser modificados para oprocesso de fermentação aqui descrito incluem, apenas como forma de e-xemplo, leveduras Saccharomyces eerevisiae, Saccharomyees earlsbergen-sis, Kluyveromyces laetis, Saccharomyees laetis, K. marxianus, ou K. fragilise Brettanomyees sp. etc. Alguns dos exemplos das bactérias que podem sermodificadas para o processo da fermentação descrito aqui incluem, apenascomo forma de exemplo, Zymomonas sp., E. coli, Corynebaeterium, Brevi-baeterium, Bacillus ssp. etc. A fermentação pode ser uma fermentação ho-moacética usando um acetógeno tal como um microorganismo do gêneroClostridium, por exemplo, microorganismos da espécie Clostridium thermoa-eetieum ou Clostridium formicoaeetieum. A fermentação pode ser fermenta-ção de ácido lático usando um microorganismo do gênero Lactobaeillus. Al-ternativamente, a fonte do carboidrato pode ser convertida em ácido lático,lactato, ácido acético, acetato, ou misturas disso em uma fermentação inicialusando uma bifido bactéria.

O microorganismo é modificado de tal maneira que o microorga-nismo modificado tem conteúdo nutricional aumentado. O microorganismomodificado pode ser enriquecido em nutrientes como, apenas como formade exemplo, gorduras, ácidos graxos, lipídios tais como fosfolipídio, vitami-nas, aminoácidos essenciais, peptídeos, proteínas, carboidratos, esteróis,enzimas, e minerais-traço tais como, ferro, cobre, zinco, manganês, cobalto,iodo, selênio, molibdênio, níquel, flúor, vanádio, estanho e silicone. Os áci-dos graxos incluem ácidos graxos saturados e insaturados onde os ácidosgraxos insaturados incluem ácido graxo altamente insaturado ômega-3. Osexemplos de ácido graxo altamente insaturado ômega-3 incluem, mas nãosão limitados a, ácido eicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico, ácidoalfa linolênico, ácido docosaexaenóico, e conjugados dos mesmos.

Alternativamente, algas ou fungos, por exemplo, Thraustochytri-um, Schizochytrium etc. podem fermentar grãos hidrolisados ou não-hidrolisados triturado para produzir HUFAs de ômega-3. Isso pode ser usadopara qualquer tipo de grão, incluindo sem limitação, milho, milo, sorgo, arroz,trigo, aveia, centeio e painço. Este processo adicional inclui o uso alternativode xarope de milho não-hidrolisado ou de produtos agrícolas/de fermentaçãotal como a vinhaça, um produto residual em milho para fermentações alcoó-licas, como uma fonte barata. Grãos e os produtos residuais podem ser hi-drolisados por qualquer método conhecido na técnica, tal como hidrólise áci-da ou hidrólise enzimática (Barclay, William R. Patente U.S. Ns 5.656.319,incorporada aqui por referência em sua totalidade) com um ou mais tipose/ou cepas de microorganismos para fermentação paralela ou seqüencial.Sem limitação, um exemplo é fermentação com a levedura que secreta aalfa amilase para hidrolisar amido, seguido por uma levedura para fermentara glicose em etanol.

Outros exemplos de microorganismos incluem, mas não são Iimi-tados a, fungos Blakeslea trispora, Dunaliella salina, Phaffia rhodozyma, Ha-ematococcus pluvialis, gênero Flavobacterium, Agrobacterium aurantiacum,Erwinia herbicola ou Erwinia uredovora, gênero Paracoccus, Agrobacterium,e Alcaligenes etc. Vários microorganismos que produzem produtos úteis sãodescritos na

TABELA A:

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Onde desejado, cepas de bactérias ou levedura podem ser sele-cionadas para produção de sabores agradáveis. Por exemplo, os microorga-nismos em questão podem ser modificados de tal maneira que uma ou maisintensificadores de sabor sejam produzidos pelos microorganismos. Intensi-ficadores de sabor podem ser derivados de RNA de levedura. Levedurascomo a Candida podem ser cultivadas com tanto quanto 15% de RNA. Le-veduras Saccharomyces podem ser usadas fazer compostos ativos de sa-bor. Nucleosídeos como, inosina-5'-morfofosfato e guanosina-5'-monofofosfato os quais em combinação com glutamato monossódico, po-dem ser usados para a melhoria do sabor.

Em algumas modalidades, os microorganismos que foram modi-ficados para aumentar a produção de álcool ou alcano em uma reação defermentação podem ser modificados adicionalmente de acordo com os mé-todos em questão para gerar os microorganismos em questão que têm umconteúdo nutritivo intensificado.

Em algumas modalidades da presente invenção, os microorga-nismos em questão podem ser modificados de tal maneira que um ou maispigmentos ou corantes sejam produzidos pelo microorganismo. Algumasleveduras, por exemplo, Phaffia rhodozyma, produzem um pigmento cor-de-rosa chamado de astaxantina. A astaxantina é a cor natural encontrada naslagostas, camarão, salmão e nos flamingos. A levedura inteira ou a raçãoanimal completa da presente invenção podem ser alimentados a peixes oucrustáceos criados em cativeiro, onde raramente ganham a cor natural, for-necendo desse modo a cor característica da carne aos salmões ou aos fru-tos do mar para melhorar a comercialização. Ao mesmo tempo, outros nutri-entes fornecidos pela levedura também são de benefício para os peixes.

A. Modificaeão de microorganismo

Em algumas modalidades, o microorganismo modificado útil parauma reação de fermentação compreende um microorganismo quimicamentemodificado ou geneticamente modificado. Preferivelmente as células usadasna cultura celular são modificadas geneticamente por técnicas de manipula-ção genética (isto é, tecnologia recombinante), técnicas microbiológicasclássicas, ou por uma combinação de tais técnicas e também podem incluirvariantes genéticas naturais. Algumas de tais técnicas são descritas geral-mente, por exemplo, em Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Labo-ratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press. A referência Sambrook et al.,ibid, está incorporada aqui por referência em sua totalidade.

Esta invenção contempla várias maneiras nas quais modifica-ções genéticas podem ser usadas para criar um microorganismo que produ-za uma quantidade maior de um nutriente em um processo de fermentaçãodo que o mesmo microorganismo antes da modificação. Todos estes méto-dos são bem conhecidos no campo de genética e engenharia genética.

Em uma abordagem, os microorganismos que demonstram pro-dução aumentada de um nutriente são produzidos usando mutagênese tra-dicional e seleção de microorganismos que exibem as propriedades deseja-das. Por exemplo, Gasnet-Ramireza descreveu o uso de mutagênese quími-ca tradicional para mutagenizar levedura, seguida pela seleção das célulasde levedura que mostram produção aumentada de lisina. Stepanova et al.("Lysine Overproduction Mutations in the Yeast Saccharomyces cerevisiaeAre Introduced into Industrial Yeast Strains," Russian J. Genetics, (2001)37:460-463) mutagenizaram células de levedura para aumentar a produçãode lisina. As mudanças foram direcionadas a um gene que aumentou a re-sistência a um análoga tóxico de lisina e a um gene envolvido no regulamen-to da produção de lisina.

Em outra abordagem, os microorganismos são modificados ge-neticamente usando as ferramentas de genética recombinante. Os genomascompletos de vários microorganismos úteis nos métodos desta invenção fo-ram seqüenciados, incluindo E. eoli, Saccharomyees e Clostridium aeetobut-ylieum. O genoma de C. aeetobutílieo, por exemplo, pode ser encontradoem:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=genome&cmd=Retrieve&dopt=0verview&list_uids=14097&window=9525&begin=0. Genéti-ca de E. eoli e de levedura, em particular, é bem compreendida. O genomade S. cerevisiae tem um site da internet devotado a ele:www.yeastgenome.org. Vias bioquímicas em levedura estão bem caracteri-zadas. As enzimas de dúzias de vias e os genes que codificam estas enzi-mas estão disponíveis na internet:

http://pathway.yeastgenome.org:8555/YEAST/new-image?type=OVERVIEW&force=t. A figura 14 fornece uma visão geral domapa metabólico de S. cerevisiae deste site da internet, com notas para i-dentificar vias sintéticas para um aminoácido (Iisina) um cofator (FAD), umaesteróide (ergosterol) e um lipídio (triglicerídeo). Cada item se liga à enzimaque catalisa a reação e ao gene que codifica a enzima.

Muitas estratégias estão disponíveis para modificar genetica-mente um microorganismo para aumentar a produção de um nutriente. Estasincluem, por exemplo, introduzir no microorganismo um gene que codificaum polipeptídeo que compreende um aminoácido essencial; superexpressaruma enzimas ao longo de uma via sintética para o nutriente, reprimir um ge-ne cujo produto inibe a produção do nutriente, inibir o transporte de um nutri-ente para fora de uma célula, aumentar o transporte de um nutriente paradentro de uma célula e introduzir genes nas células os quais codificam en-zimas para terminar ou criar uma via sintética para a enzima e/ou produto.

A levedura pode ser modificada para aumentar a produção denutrientes, por exemplo, por superexpressar enzimas ao longo das vias sin-téticas. Esta abordagem é descrita em Lin et al., "Heterologous protein ex-pression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris," FEMS MicrobiologyReviews (2000) 24:45-66. Um outro exemplo disso é He et al. ("Overexpres-sion of a sterol C-24(28) reductase increases ergosterol production in Sac-charomyces cerevisiae," Biotechnology Letters (2003) 25:773-778) no qualas células de levedura transformadas com genes de esterol redutaseC24(28) aumentaram a produção de ergosterol. Rippert et al. ("EngineeringPlant Shikimate Pathway for Production of Tocotrienol and Improving Herbi-cide Resistance," Plant Physiol. (2004) 134:92-100) demonstraram produçãoaumentada de vitamina E por transfectar tabaco com o gene de prefenatodesidrogenase de S. cerevisiae e superexpressar o gene. Este gene catalisauma reação na via da vitamina E. Embora o método tenha sido usado emtabaco, o gene era originado de levedura. Portanto, a mesma estratégia po-de ser aplicada à levedura para aumentar a produção de vitamina E.Outra estratégia para aumentar a produção de um nutriente édesrepressão de uma enzima sintética. Esta estratégia foi demonstrada porDansen et al. ("Regulation of sterol carrier protein gene expression by theForkhead transcription factor F0X03a," J. Lipid Research, 45:81-88, January2004). Células humanas em cultura foram modificadas geneticamente paradiminuir a produção de F0X03a, uma proteína transportadora de esterol quereprime a produção de esterol. A diminuição na atividade de F0X03a resul-tou em menos repressão da produção de esterol, que, por sua vez, resultouem aumento da produção de esterol.

Outra estratégia para aumentar a produção de um nutriente emlevedura é alterar geneticamente as células para acumular o nutriente aoinvés de excretá-lo. Um exemplo disto é Kim et al. ("A role in vacuolar argini-ne transport for yeast Btnlp and for human CLN3, the protein defective inBatten disease," PNAS (2003) 100:15458-15462), onde os autores aumenta-ram a acumulação de arginina intracelular fazendo "knocking out" de um ge-ne de levedura, bnt1, responsável pelo transporte da arginina para dentro devacúolos.

Uma estratégia oposta envolve aumentar o número de cópias deum gene que transporta nutrientes de fora da célula para o interior. Veja, porexemplo, Sychrova et al., "Kinetic properties of yeast Iysine permeases codedby genes on multi-copy vectors," FEMS Microbiol Lett, (1993) 113(1 ):57-61.

Em outra estratégia, uma levedura foi modificada para produzir ohormônio hidrocortisona por transfectar a levedura com vários genes da viasintética de hidrocortisona. (Szczbara et al., "Total biosynthesis of hydrocor-tisone from a simple carbon source in yeast," Nature Biotechnology (2003)21:143).

Um microorganismo modificado geneticamente pode incluir ummicroorganismo no qual as moléculas de ácido nucléico foram introduzidas,suprimidas ou modificadas (isto é, mutadas; por exemplo, pela inserção, de-leção, substituição, e/ou inversão de nucleotídeos), de tal maneira que taismodificações fornecem o efeito desejado de rendimentos aumentado de nu-trientes dentro do microorganismo ou no sobrenadante da cultura. Comousado aqui, as modificações genéticas que resultam em uma diminuição naexpressão do gene, na função do gene, ou na função do produto do gene(isto é, o nutriente, tal como proteína codificada pelo gene) podem ser referi-das como inativação (completa ou parcial), deleção, interrupção, bloqueio ouregulação negativa de um gene. Por exemplo, uma modificação genética emum gene a qual resulta em uma diminuição na função da proteína codificadapor tal gene, pode ser o resultado de uma deleção completa do gene (isto é,o gene não existe, e portanto a proteína não existe), uma mutação no geneque resulta em tradução incompleta ou abolida da proteína (por exemplo, aproteína não é expressa), ou uma mutação no gene que diminui ou abole afunção natural da proteína (por exemplo, uma proteína é expressa a qualtem atividade enzimática diminuída ou abolida). As modificações genéticasque resultam em um aumento na expressão ou na função do gene podemser referidas como amplificação, superprodução, superexpressão, ativação,intensificação, adição, ou regulação positiva de um gene. A adição de genesclonados para aumentar a expressão do gene pode incluir manter o(s) ge-ne(s) clonado(s) em plasmídeos em replicação ou integrar o(s) gené(s) clo-nado (s) no genoma do organismo da produção. Além disso, aumentar a ex-pressão de genes clonados desejados pode incluir ligar operativamente o(s)gene(s) clonado(s) aos elementos de controle transcricional nativos ou hete-rólogos.

Um microorganismo pode ser modificado por métodos conheci-dos na técnica e estão dentro do escopo da invenção. Apenas como exem-plo, o método inclui manipular pelo menos um dos genes estruturais na viabiossintética dos nutrientes, opcionalmente manipular os controles regulató-rios da via sintética, e opcionalmente manipular os processos de transportedos nutrientes para fora e para dentro do microorganismo. Por exemplo, omicroorganismo pode ter mutações em um gene particular para a biossínte-se do aminoácido. O método inclui preferivelmente manipular pelo menosum dos genes estruturais para regular a síntese de um peptídeo que contémpelo menos um aminoácido essencial.

Os microorganismos em questão podem ser modificados parasuperproduzir um nutriente tal como um aminoácido essencial, uma vitami-na, um hormônio, uma proteína, e/ou um lipídio. Onde desejado, a produçãode um ou mais nutrientes está sob o controle de uma seqüência regulatóriaque controla diretamente ou indiretamente a produção em uma forma de-pendente do tempo durante uma reação de fermentação. Preferivelmente, asseqüências regulatórias controlam diretamente ou indiretamente a produçãotal que o nutriente desejado é produzido quando a reação de fermentaçãoalcançou uma porcentagem desejada do término, preferivelmente pelo me-nos cerca de 50% do término, mais preferivelmente pelo menos cerca de60% do término, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 70% até decerca de 90% do término, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%do término. Quando controlado desta maneira, o rendimento de produtos dafermentação, tais como álcool e produtos gasosos é improvável ser afetado.

A progressão da fermentação pode ser monitorada por uma vari-edade das maneiras. Por exemplo, pelo menos 50% do término de uma rea-ção de fermentação podem ser pelo consumo de pelo menos 50% da glicosetotal na fermentação desejada, quando comparada a fermentações simila-res, ou quando 50% da glicose total foi adicionada, ou quando a quantidadetotal de dióxido de carbono emitido e dissolvido é 50% da quantidade totalemitida em fermentações similares. Mais especificamente, pelo menos 50%do término de uma reação de fermentação podem ser evidenciados por umadiminioção no conteúdo de glicose para menos do que cerca de 50% do con-teúdo inicial de glicose presente em uma mistura de reação de fermentação(isto é, o nível de glicose presente antes do começo da reação de fermenta-ção), ou menor do que um nível de limite desejado (por exemplo, cerca de100 gramas por litro de reação de fermentação). Alternativamente, a porcen-tagem para o término pode ser determinada pela quantidade de tempo du-rante o qual a fermentação ocorreu, tipicamente, pelo menos cerca da meta-de do tempo levado por uma fermentação similar. A duração do tempo dafermentação pode variar de cerca de uma hora a vários dias, dependendodas quantidades relevantes de microorganismos e de material inicial de fer-mentação fornecidos. Um versado na técnica pode verificar prontamente aduração normal de uma reação de fermentação sem experimentação exces-siva quando dadas as quantidades de microorganismos e de materiais inici-ais.

Em algumas modalidades, a invenção inclui um microorganismomodificado útil para uma reação de fermentação, compreendendo uma se-qüência exógena que codifica um polipeptídeo, por exemplo, que codificauma enzima em uma via sintética para um nutriente ou que compreende pe-lo menos um resíduo de aminoácido essencial, em que a expressão da se-qüência exógena está sob o controle de uma seqüência regulató-ria. PreferiveImente, as seqüências regulatórias suprimem diretamente ouindiretamente a expressão da seqüência exógena até que a reação de fer-mentação tenha atingido uma porcentagem desejada do término, preferivel-mente pelo menos cerca de 50% do término, mais preferivelmente pelo me-nos cerca de 60% do término, e mais preferivelmente pelo menos o cerca de70% até cerca de 90%, do término e mais preferivelmente pelo menos cercade 95% do término. Uma variedade de seqüências regulatórias adequadaspode ser empregada na presente invenção. Em certas modalidades, as se-qüências regulatórias são sensíveis às condições ambientais, tais como aconcentração de glicose ou o grau de calor ou de luz. Por exemplo, se ocomposto pretendido para inclusão nos resíduos for tóxico para o microor-ganismo, pode-se querer começar a produção até que a produção do produ-to comercial tenha ocorrido ou esteja quase completa. Exemplos não-Iimitantes incluem Rgtl, um fator de transcrição normalmente regula a ex-pressão de hexoquinase (A. Palomino, Biochem. J. (2005) 388, 697-703)somente quando a concentração de glicose cai abaixo de um determinadonível, ou uma seqüência que suprime a expressão do gene exógeno quandoligada operativamente até que a fermentação tenha atingido por exemplopelo menos 50% do término, assim como uma ampla gama de seqüênciasregulatórias dos genes de choque térmico (por exemplo, gene rpoH, comodescrito em Nagai et ai. J Bacteriol. 1990 maio; 172(5): 2710-2715), genesde toxicidade, e genes de formação de esporo. Em particular, o início do o-peron supressor de glicose pode causar a indução de expressão da seqüên-cia exógena que codifica um polipeptídeo desejado. O operon supressor deglicose pode ser iniciado quando a reação de fermentação atingiu pelo me-nos de cerca de 50% do término. A reação de fermentação pode ser contro-lada por monitorar o conteúdo de glicose da mistura de fermentação ou pormonitorar a quantidade do produto gasoso formado durante a reação defermentação.

Um polinucleotídeo é dito codificar um polipeptídeo se, em seuestado nativo ou quando manipulado por métodos conhecidos daqueles ver-sados na técnica, ele puder ser transcrito e/ou traduzido para produzir o po- lipeptídeo ou um fragmento disso. A fita anti-sentido de tal polinucleotídeotambém é dita codificar a seqüência.

Em algumas modalidades, um microorganismo modificado é in-duzido com um veículo genético tal como, um vetor de expressão que com-preende uma seqüência exógena que codifica um polipeptídeo que compre-ende pelo menos um resíduo de aminoácido essencial. Construtos de poli-nucleotídeo preparados para introdução em um hospedeiro procariótico oueucariótico podem tipicamente, mas não sempre, compreender um sistemada replicação (isto é, vetor) reconhecido pelo hospedeiro, incluindo o frag-mento de polinucleotídeo pretendido que codifica o polipeptídeo desejado, epodem preferivelmente, mas não necessariamente, incluir também seqüên-cias regulatórias de início de transcrição e de tradução ligadas operativa-mente ao segmento que codifica o polipeptídeo. Os sistemas de expressão(vetores de expressão) podem incluir, por exemplo, uma origem de replica-ção de seqüência de replicação autônoma (ARS) e seqüências de controlede expressão, um promotor, um intensificador e sítios de informação de pro-cessamento necessárias, tais como sítios de ligação de ribossomo, sítios desplice de RNA, sítios de poliadenilação, seqüências de terminação de trans-crição e seqüências estabilizadoras do mRNA. Peptídeos de sinal tambémpodem ser incluídos onde apropriado, preferivelmente a partir de polipeptí-deos secretados da mesma espécie ou de espécies relacionadas, os quaispermitem que a proteína atravesse e/ou se aloje nas membranas da célulaou seja secretada da célula.Um grande número de veículos genéticos adequados para apresente invenção está disponível na técnica. Eles incluem vetores de ex-pressão virais e não-virais. Os vetores de expressão virais exemplares não-Iimitantes são vetores derivados de vírus de RNA tais como retrovírus, e ví-rus de DNA tais como adenovírus e vírus adeno-associados. Os vetores deexpressão não-virais incluem, mas não são limitados a plasmídeos, cosmí-deos, e complexos de DNA/lipossoma. Onde desejado, os veículos genéti-cos podem ser manipulados para carregar as seqüências regulatórias quedirecionam a expressão organela-específica dos genes exógenos carrega-dos por eles. Por exemplo, seqüência-líder ou de sinal pode ser adicionadapara direcionar a seqüência exógena para os corpos de inclusão de um mi-croorganismo adequado. Os veículos genéticos podem ser introduzidos emum microorganismo hospedeiro por qualquer um de vários de meios ade-quados, incluindo eletroporação, transfecção empregando cloreto de cálcio,cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextran, ou outras substâncias,bombardeio de microprojéteis, lipofecção, e infecção.

O vetor de expressão pode ser empregado para qualquer ami-noácido ou peptídeo e pode ser usado no caso de E. coli, levedura, ou ou-tros microorganismos para aumentar a produção de aminoácido ou de peptí-deo. Preferivelmente, o peptídeo consiste pelo menos em um aminoácidoessencial.

As variantes ou as seqüências que têm identidade ou homologiasubstancial com os polinucleotídeos que codificam as enzimas podem serutilizadas na prática da invenção. Tais seqüências podem ser referidas comovariantes ou seqüências modificadas. Isto é, uma seqüência de polinucleotí-deo pode ser modificada, contudo ainda retendo a habilidade de codificar umpolipeptídeo que exibe a atividade desejada. Tais variantes ou seqüênciasmodificadas são assim equivalentes. Geralmente, a seqüência variante oumodificada pode compreender pelo menos cerca de 40% a 60%, preferivel-mente cerca de 60% a 80%, mais preferivelmente cerca de 80% a 90%, eainda mais preferivelmente cerca de 90% a 95% de identidade de seqüênciacom a seqüência nativa.O controle genético da síntese das enzimas da via da galactoseem Saccharomyces cerevisiae obedece, em certos aspectos, o modelo dooperon para o sistema de β-galactosídeo de E. coli. Por exemplo, em E. coli,histidina livre reprime o operon através da inibição por retroalimentação daprimeira enzima na via, 5'-trifosfato de adenosina fosforribosiltransferase,HisG. A mutação do gene hisG em S. typhimurium pode resultar em um au-mento de 3 a 4 na concentração intracelular das enzimas do operon da histi-dina. (Vide Meyers et al., J. Bacteriology 1975, 124 (3) 1227-1235).

A levedura pode ser um hospedeiro particularmente adequadopara expressar um peptídeo ou proteína rico em um aminoácido particulare/ou aminoácidos livres. Em levedura acumuladora de lisina, a maior parteda lisina pode estar contida nos vacúolos que são estáveis quando incuba-dos com líquido do rúmen, mas é liberada imediatamente quando expostos àpepsina, uma das enzimas de digestão de proteína do abomaso. Assim, esteorganismo pode ser um hospedeiro útil para expressar proteínas e/ou ami-noácidos e fornecer uma suplemento de ração protegido que pode aumentara quantidade de proteínas e/ou de aminoácidos disponíveis para a absorçãointestinal. O aminoácido pode incluir, apenas como exemplo, lisina, histidina,metionina, fenilalanina, e treonina. Os produtos ricos em aminoácido podemser produzidos por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um caldode fermentação rico em lisina pode ser usado como uma fonte da lisina. Ocaldo de fermentação rico em lisina pode ser produzido por organismos uni-celulares (por exemplo, microorganismos tais como bactérias ou levedura)que são selecionados ou manipulados para superproduzir lisina. Microorga-nismos adequados podem incluir microorganismos que pertencem ao gênerode Saccharomyces cerevisiae, Escherichia, Bacillus, Microbacterium, Arthro-bacter, Serratia, e Corynebacterium. Como tal, bactérias gram-negativas taiscomo E. coli podem ser adequadas para produzir um caldo de histidina.

Pode ser desejável usar hospedeiros microbianos que não con-têm lipopolissacarídeos ("LPS") os quais têm efeitos endotóxicos, por exem-plo, bactérias Gram-positivas, tais como Corynebacteria e Brevibacterium.Bactérias Gram-negativas, tais como E. coli, incluem freqüentemente LPS, oqual tem um efeito endotóxico. A seleção de uma bactéria que não incluiLPS endotóxico pode ser particularmente importante quando uma biomassafor preparada e usada como uma fonte de aminoácido, porque a maioria dosLPS permanece associada as bactérias e não é liberada substancialmenteno caldo de fermentação a menos que as bactérias sejam lisadas. Como tal,é esperado que LPS endotóxico esteja localizado dentro da biomassa após afermentação.

Em uma modalidade, esta invenção contempla modificar geneti-camente um microorganismo hospedeiro que superexpressa um peptídeo ouuma proteína que é rica em um aminoácido essencial, em particular lisina,metionina, triptofano ou treonina. Tais polipeptídeos podem ser expressos,por exemplo, por fornecer o microorganismo com um vetor de expressão quecompreende uma seqüência de controle regulatória operativamente ligada auma seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Contanto que opolipeptídeo seja secretado pelo microorganismo, o polipeptídeo tem, deforma útil, um comprimento maior do que aquele que pode ser absorvido deforma eficaz por outros microorganismos, resultando assim em um aumentolíquido do aminoácido no resíduo. Em levedura, tal polipeptídeo deve ter pe-lo menos 4, mais preferivelmente pelo menos 10 aminoácidos de extensão.

Uma proteína ou um peptídeo particular rico em aminoácido po-de ser superexpresso em um hospedeiro microbiano (tal como uma espéciede Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, levedura), emplantas e similares. Em algumas modalidades preferidas, a proteína rica emaminoácido é composta de aminoácidos essenciais e não-essenciais. Emalgumas modalidades preferidas, a proteína rica em aminoácido é compostaapenas de aminoácidos essenciais. Uma proteína particular rica em aminoá-cido particular pode ser selecionada daquelas proteínas ricas em aminoácidodescritas na literatura, por exemplo, uma proteína Il rica em histidina dePlasmodium falciparum e uma ou mais das proteínas da classe das proteí-nas chamadas de "histatinas," as quais demonstram atividades antibacteria-nas e antifúngicas (Mervyn et al. Pub U.S. N2 2006/0008546, incorporadaaqui por referência em sua totalidade). Uma proteína rica em aminoácidoparticular também pode compreender fragmentos específicos de proteínasricas em aminoácido conhecidas que têm um conteúdo aumentado desteaminoácido particular comparado à proteína de extensão completa. Por e-xemplo, uma proteína Il rica em histidina de Plasmodium falciparum tem umacomposição de histidina de cerca de 32%. O fragmento do aminoácido 61 ao130 desta proteína tem uma composição de histidina de cerca de 44%.O fragmento do aminoácido 58 ao 80 desta proteína tem uma composiçãode histidina de cerca de 55%. Outra classe exemplar de proteínas compre-ende proteínas ricas em lisina. Proteínas ricas em Iisina exemplares incluemseqüências naturais, recombinantes e/ou sintéticas. Qualquer uma das pro-teínas ou fragmentos listados na tabela 1 podem ser expressos pelos micro-organismos em questão. Uma proteína rica em aminoácido não precisa retersua função nativa para ser adequada para as composições ou os métodosaqui descritos.

Tabela 1. Proteínas ricas em lisina exemplares

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Um peptídeo ou proteína rica em aminoácido particular pode serclonada em um vetor de expressão e introduzida em uma célula hospedeiraadequada. Alternativamente, uma proteína manipulada recombinantementeque tem um perfil de aminoácido escolhido pode ser clonado em um vetor deexpressão e introduzido em uma célula hospedeira adequada (por exemplo,microorganismo). As proteínas manipuladas recombinantemente podem terum conteúdo aumentado de um ou mais aminoácidos essenciais, ou as pro-teínas podem ter um conteúdo aumentado de um ou mais dos outros amino-ácidos Iimitantes para a produção de leite, os quais podem incluir lisina, me-tionina, fenilalanina, treonina, isoleucina, e triptofano. Como tais, as proteí-nas manipuladas recombinantemente podem ser manipuladas para incluirum perfil selecionado de aminoácidos. As proporções dos aminoácidos nasproteínas manipuladas recombinantemente podem ser variadas ou manipu-ladas para combinar as proporções que são previstas para serem ótimaspara o gado leiteiro baseado em estudos ou em previsões de alimentação.Em uma modalidade, o perfil selecionado dos aminoácidos, por exemplo, emuma proteína produzida recombinantemente, é similar ao perfil do farinha desangue. Depois que uma proteína foi manipulada e seu gene foi clonado emum vetor de expressão, a proteína pode ser expressa (ou superexpressa)em um hospedeiro microbiano tal como E. coli. Corynebacterium, Brevibac-terium, Bacillus, levedura, etc.

A fim de otimizar a expressão do peptídeo ou da proteína nohospedeiro, a seqüência do peptídeo ou da proteína pode ser selecionadapara utilizar tRNAs específicos que são prevalentes no hospedeiro. Alternati-vamente, os tRNAs selecionados podem ser co-expressos no hospedeiropara facilitar a expressão do peptídeo ou proteína. Alternativamente, pa-drões únicos e múltiplos de uso de códon podem ser ajustados para rendi-mento, enovelamento, e localização ótimos. O peptídeo ou proteínas mani-puladas recombinantemente podem incluir seqüências específicas para faci-litar a purificação do peptídeo ou proteínas. As proteínas podem tambémincluir "seqüências-líder" para direcionar a proteína para locais específicosna célula do hospedeiro tal como o periplasma, ou para direcionar a proteínapara secreção. O peptídeo ou proteínas manipuladas recombinantementepodem também incluir sítios de clivagem por protease para facilitar a cliva-gem das proteínas no abomaso e para aumentar a liberação dos aminoáci-dos no peptídeo ou na proteína para o intestino delgado. Por exemplo, umatal protease é a pepsina, uma das enzimas de digestão de proteína do abo-maso em gado. A pepsina demonstra uma clivagem preferencial de peptí-deos nos resíduos hidrofóbicos preferivelmente aromáticos nas posições P1e P1\ Em particular, a pepsina cliva proteínas no lado carbóxi da fenilalani-na, do triptofano, da tirosina, e da leucina. Mais favoravelmente, o polipeptí-deo é facilmente clivável por proteases animais geralmente.

Em algumas modalidades da invenção, um microorganismo émodificado de tal maneira que o microorganismo modificado seja enriqueci-do em vitaminas. As vitaminas incluem, mas não são limitadas a, vitamina A(retinol), vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina B3 (Niaci-na), vitamina B5 (ácido pantotênico), vitamina B6 (Piridoxina), vitamina B7(Biotina), vitamina B9 (ácido fólico), vitamina B12 (cianocobalamina), vitami-na C[3] (ácido ascórbico), vitamina D1 a D4 (lamisterol, ergocalciferol, calcife-rol, diidrotaquisterol, desidrositosterol 7), vitamina E (tocoferol), e vitamina K(naftoquinona).

Em outra modalidade, o microorganismo é modificado para au-mentar a quantidade de um micronutriente, tal como uma vitamina, um mine-ral-traço, um antioxidante, ou determinados lipídios, por exemplo, os tocofe-róis.

Em outra modalidade, o microorganismo é modificado para au-mentar a quantidade de um cofator ou uma coenzima, tal como NADH1 FA-DH, ATP, coenzima A, coenzima Qio ou molibdopterina.

Organismos diferentes precisam de substâncias orgânicas-traçodiferentes. A maioria dos mamíferos necessita, com poucas exceções, dasmesmas vitaminas que os seres humanos. Uma exceção é a vitamina c, quepode ser sintetizada por todos os outros mamíferos exceto outros primatassuperiores e porcos da guiné. Quanto menos a espécie for relacionada aosmamíferos, mais diferentes as necessidades dos organismos podem se tor-nar.

A presente invenção inclui métodos de produzir vitaminas emmicroorganismos modificados qualquer meio como o material inicial. A pre-sente invenção inclui vários aspectos de materiais e intermediários biológi-cos úteis na produção biológica de vitaminas. Por exemplo, a vitamina E (d-a-tocoferol) é um suplemento nutricional importante em humanos e nos ani-mais. Os ésteres de α-tocoferol, tocoferol e a-tocoferila podem ser produzi-dos a partir de farnesol ou de geranilgeranio! (GG). Famesol pode ser usadocomo um material inicial para sintetizar quimicamente o produto final, ésteresde α-tocoferila. Alternativamente, o farnesol pode ser convertido quimica-mente em GG. GG produzido biologicamente ou pela síntese a partir de far-nesol, pode então ser usado como um material inicial para fazer a-tocoferilae ésteres de α-tocoferila. Farnesol e GG são álcoois de prenila produzidospela desfosforilação de farnesilprirofosfato (FPP) e de geranilgeranilpirofos-fato (GGPP), respectivamente. FPP e GGPP são intermediários na biossín-tese de compostos de isoprenóide, incluindo esteróis, ubiquinonas, heme,dolicóis, e carotenóides, e são usados na prenilação pós-traducional e prote-ínas. FPP e GGPP são derivados do isopentilpirofosfato (IPP). Millis et al.Patente U.S. N- 6.410.755, incorporados aqui por referência na sua totalida-de.

Os isoprenóides são a maior família de produtos naturais, comcerca de 22.000 estruturas diferentes conhecidas. Todos os isoprenóidessão derivados do composto C5 IPP. Assim, os esqueletos de carbono de to-dos os compostos do isoprenóide são criados por adições seqüenciais dasunidades C5 à cadeia crescente de poliprenóide. Existem duas vias diferen-tes que levam a IPP. Fungos (tal como a levedura) e animais possuem a viadependente de mevalonato que pode usar a acetil CoA como o precursorinicial. As bactérias e plantas superiores, por um lado, podem possuir umavia independente do mevalonato, também referida como a via de não-mevalonato, partindo de piruvato e gliceraldeído 3-fosfato.

Modalidades da presente invenção incluem a produção biológicade vitaminas ou de qualquer material ou intermediário inicial para a produçãode vitaminas, em culturas de células procarióticas ou eucarióticas e em sis-temas livres de célula, independente de qual via o organismo utilize. Por e-xemplo, a biossíntese do precursor de todos os isoprenóides, IPP utiliza avia dependente de mevalonato ou a independente. Preferivelmente as célu-Ias usadas na cultura celular são modificadas geneticamente para aumentaro rendimento de vitaminas ou intermediário ou de um material inicial paraestes. As células podem ser modificadas geneticamente por técnicas de ma-nipulação genética (isto é, tecnologia recombinante), por técnicas microbio-lógicas clássicas, ou por uma combinação de tais técnicas e também podemincluir variantes genéticas naturais.

Modalidades da presente invenção incluem a produção biológicade farnesol ou de GG por cultivar um microorganismo, preferivelmente a le-vedura, que foi modificada geneticamente para modular a atividade de umaou mais das enzimas em sua via biossintética de isoprenóide, diminuir (inclu-indo eliminar) a ação da atividade da esqualeno sintase, aumentar a ação daHMG-CoA redutase, aumentar a ação da GGPP sintase, aumentar a açãoda FPP sintase, ou aumentar a ação da fosfatase para aumentar a conver-são de FPP em farnesol ou de GGPP a GG.

Um aminoácido, um peptídeo ou uma proteína particular que temum conteúdo de aminoácido aumentado podem ser pelo menos parcialmen-te purificado do caldo de fermentação ou da biomassa lisada. Por exemplo,lisina ou proteínas ricas em Iisina podem ser isoladas com base no pontoisoelétrico da lisina. Similarmente, a presença da Iisina em uma proteína ricaem lisina pode ser usada isolar a proteína, com base no ponto isoelétrico daproteína. O ponto isoelétrico desejado para uma proteína particular rica emum aminoácido pode ser variado usando tecnologia recombinante para alte-rar a composição do aminoácido da proteína (por exemplo, criar uma proteí-na que tem um conteúdo selecionado de lisina).

O ponto isoelétrico (pl) único de um aminoácido particular com-parado a outros aminoácidos pode permitir a precipitação seletiva desse a-minoácido, a extração preferencial em solventes orgânicos, e ligação a vá-rias matrizes de quelação de metal resina ou de troca de íon. Um aminoáci-do ou um peptídeo particular pode se ligar a metais de transição tais comoníquel (Ni) e pode se usado para facilitar o isolamento da proteína (por e-xemplo, por ligar a proteína a uma matriz contendo níquel). Outros metais datransição podem ser usados, tal como o cobre (Cu). Além disso, um tama-nho do aminoácido pode permitir o uso de combinações únicas de cromato-grafia de exclusão de tamanho e de resinas de troca de íon isolar esse ami-noácido do caldo de fermentação contendo outros aminoácidos e subprodu-tos. Adicionalmente, o pl único de um aminoácido pode resultar em valoresde pl específicos e únicos para essa proteína rica em aminoácido que permi-te assim a precipitação seletiva destas proteínas a partir de outras proteínascelulares para uso em ração ou alimento.

B. Aminoácidos essenciais e não-essenciais

Os microorganismos modificados da presente invenção podemser modificados para produzir níveis elevados de nutrientes incluindo amino-ácidos essenciais e não-essenciais. A ração completa ou os resíduos defermentação que contêm tais microorganismos modificados contêm níveiselevados dos nutrientes incluindo aminoácidos essenciais e não-essenciais.

Um aminoácido essencial para um organismo é um aminoácidoque não pode ser sintetizado pelo organismo a partir de outros recursos dis-poníveis, e deve conseqüentemente ser fornecido como parte de sua dieta.O aminoácido essencial pode ser um que é essencial para um ser humano,um mamífero, um pássaro ou um peixe. São contemplados particularmenteos aminoácidos essenciais para animais domésticos, por exemplo, animaisde fazenda ou animais de estimação. Oito aminoácidos são consideradosgeralmente como essenciais para seres humanos: lisina, metionina, fenilala-nina, treonina, isoleucina, triptofano, valina, e leucina. Dois outros, histidina earginina podem ser essenciais nas crianças e possivelmente nos idosos.A taurina pode ser necessária para conservar a maleabilidade arterial e docolágeno. Os aminoácidos essenciais variam de espécie para espécie, jáque metabolismos diferentes são capazes de sintetizar substâncias diferen-tes. Por exemplo, a taurina é essencial para gatos, mas pode não ser paracães. Alguns aminoácidos podem ser produzidos a partir de outros. Os ami-noácidos que contêm enxofre, metionina e homocisteína, podem ser conver-tidos um nos outros, mas nenhum deles pode ser sintetizado de novo emseres humanos. Do mesmo modo, a cisteína pode ser feita a partir de homo-cisteína, mas não de novo. Os aminoácidos contendo enxofre podem serconsiderados como um único grupo de aminoácidos equivalentes nutricio-nalmente. Do mesmo modo, arginina, ornitina, e citrulina, que são intercon-versíveis pelo ciclo da uréia, podem ser considerados como um único grupo.Os aminoácidos essenciais para gatos incluem: arginina, histidi-na, isoleucina, leucina, Iisina1 metionina, fenilalanina, treonina, triptofano,valina, e taurina. A taurina é um aminoácido que é necessário para a forma-ção adequada da bile, da saúde do olho, e da função adequada do coração.

Os gatos requerem uma quantidade elevada de taurina para suas funçõescorporais, contudo têm enzimas limitadas que podem produzir taurina a par-tir de outros aminoácidos tais como metionina e cisteína. Conseqüentemen-te, eles precisam de uma dieta rica em taurina. Se a taurina não for suficien-te, sinais tais como uma condição cardíaca chamada cardiomiopatia dilata-da, degeneração da retina, falha reprodutora, e desenvolvimento anormaldos filhotes podem ocorrer. A maioria dos animais pode produzir o aminoá-cido ornitina a partir de vários processos, alguns dos quais podem requererarginina. Em gatos, o método para produzir a ornitina é convertê-la a partirde arginina. Se gatos forem deficientes em arginina, não pode haver ornitinasuficiente para se ligar à amônia, e sinais severos tais como salivação, voca-lização, ataxia, e até mesmo morte podem resultar dos níveis elevados deamônia. Estes sinais ocorrem freqüentemente várias horas após uma refei-ção, quando a maioria da amônia é produzida. A ração completa com conte-údo nutritivo elevado conforme a presente invenção pode ajudar a tratar oualiviar estes distúrbios nos animais. Qualquer um dentre lisina, metionina,triptofano ou treonina é uma adição valiosa à ração de animal de fazenda,por exemplo, ração de gado.

Uma dieta nutritiva equilibrada para uma variedade de animaisdomésticos é conhecida na técnica. O Committee on Animal Nutrition, Natio-nal Research Council publicou várias diretrizes para facilitar aqueles versa-dos na técnica a formular uma ração animal equilibrada. Veja, por exemplo,Nutrient Requirements of Beef Cattle: 7- Edição revisada (2000, ISBN0309069343), Nutritional Requirements of Swine: 10§ Edição revisada (1998,ISBN 0309059933), de Nutritional Requirements of Dairy Cattle: 1- Ediçãorevisada (2001, ISBN 0309069971), os quais estão incorporados aqui porreferência em sua totalidade.

C. Meios e condições da fermentaçãoO microorganismo modificado como discutido acima pode sercultivado em um meio de fermentação para a produção de nutrientes. Ummeio de fermentação adequado ou eficaz, refere-se a qualquer meio em queum microorganismo modificado da presente invenção, quando cultivado, forcapaz de produzir nutrientes. Tal meio é tipicamente um meio aquoso quecompreende fontes assimiláveis de carbono, nitrogênio e fosfato. Tal meiopode também incluir sais, minerais, metais, e outros nutrientes adequados.Deve-se reconhecer, entretanto, que várias condições da fermentação sãoadequadas e podem ser selecionadas por aqueles versados na técnica.

As fontes de carbono assimiláveis que podem ser usadas em ummeio adequado de fermentação incluem, mas não são limitadas a, açúcarese seus polímeros, incluindo, dextrina, sacarose, maltose, lactose, glicose,frutose, manose, sorbose, arabinose e xilose; ácidos graxos; ácidos orgâni-cos tais como acetato; alcoóis primários tais como etanol e n-propanol; epolialcoóis tais como glicerina. As fontes preferidas do carbono na presenteinvenção incluem monossacarídeos, dissacarídeos e trissacarídeos. A fontede carbono a mais preferida é glicose.

A concentração de uma fonte de carbono, tal como glicose, nomeio de fermentação deve promover o crescimento da célula, mas não seralta o suficiente para reprimir o crescimento do microorganismo usado. Tipi-camente, as fermentações são realizadas com uma fonte de carbono, talcomo glicose, sendo adicionada em níveis para se obter o nível desejado decrescimento e de biomassa. Em outras modalidades, a concentração de umafonte de carbono, tal como glicose, no meio da fermentação é maior do quecerca de 1 g/L, preferivelmente maior do que cerca de 2 g/L, e mais preferi-velmente maior do que cerca de e 5 g/L. Além disso, a concentração de umafonte de carbono, tal como a glicose, no meio de fermentação pode ser me-nor do que cerca de 100 g/L, menor do que cerca de 50 g/L, ou menor doque cerca de 20 g/L. Deve-se observar que as referências às concentraçõesde componentes da fermentação podem referir-se à inicial e/ou às concen-trações de componentes inicias ou produtos. Em alguns casos, pode ser de-sejável permitir que o meio de fermentação torne-se esgotado de uma fontede carbono durante a fermentação.

Fontes de nitrogênio assimiláveis que podem ser usadas em ummeio adequado de fermentação incluem, mas não são limitadas a, fontessimples do nitrogênio, fontes orgânicas de nitrogênio, e fontes complexas denitrogênio. Tais fontes do nitrogênio incluem amônia anidra, sais de amônio,e substâncias de origem animal, vegetal, e/ou microbiana. Fontes adequa-das de nitrogênio incluem, mas não são limitadas a, hidrolisados de proteína,hidrolisados de biomassa microbiana, peptona, extrato de levedura, sulfatode amônio, uréia, e aminoácidos. Produtos de grão hidrolisado formam auma fonte adequada de nitrogênio. Tipicamente, a concentração de fontesde nitrogênio, no meio de fermentação pode ser maior do que cerca de 0,1g/L, maior do que cerca de 0,25 g/L, ou maior do que cerca de 1,0 g/L. Alémde determinadas concentrações, entretanto, a adição de uma fonte de nitro-gênio ao meio de fermentação não é vantajosa para o crescimento dos mi-croorganismos. Em conseqüência, a concentração das fontes de nitrogênio,no meio de fermentação pode ser menor do que cerca de 20 g/L, menor doque cerca de 10 g/L ou menor do que cerca de 5 g/L. Além disso, em algunscasos pode ser desejável permitir que o meio da fermentação se torne esgo-tado de fontes do nitrogênio durante a fermentação.

O meio eficaz de fermentação pode conter outros compostos taiscomo sais inorgânicos, vitaminas, metais-traço, ou promotores de cresci-mento. Tais outros compostos também podem estar presentes em fontes decarbono, nitrogênio ou mineral no meio eficaz ou podem ser adicionadosespecificamente ao meio.

O meio de fermentação também pode conter uma fonte adequa-da de fosfato. Tais fontes de fosfato incluem fontes inorgânicas e orgânicasde fosfato. As fontes preferidas de fosfato incluem, mas não são limitadas a,sais de fosfato tais como fosfatos de sódio e potássio mono ou dibásicos,fosfato de amônio e misturas dos mesmos. Tipicamente, a concentração defosfato no meio de fermentação é maior do que cerca de 1,0 g/L, preferivel-mente maior do que cerca de 2,0 g/L e mais preferivelmente maior do quecerca de 5,0 g/L. Além de determinadas concentrações, entretanto, a adiçãode fosfato ao meio de fermentação não é vantajosa para o crescimento dosmicroorganismos. Conseqüentemente, a concentração de fosfato no meio defermentação é tipicamente menor do que cerca de 20 g/L, preferivelmentemenor do que cerca de 15 g/L, e mais preferivelmente menor do que cercade 10 g/L.

Um meio adequado de fermentação pode incluir também umafonte de magnésio, preferivelmente na forma de um sal fisiologicamente a -ceitável, tal como o sulfato de magnésio heptahidrato, embora outras fontesde magnésio em concentrações que contribuem com quantidades similaresde magnésio possam ser usadas. Tipicamente, a concentração de magnésiono meio da fermentação é maior do que cerca de 0,5 g/L, preferivelmentemaior do que cerca de 1,0 g/L, e mais preferivelmente maior do que cerca de2,0 g/L. Além de determinadas concentrações, entretanto, a adição de mag-nésio ao meio de fermentação não é vantajosa para o crescimento dos mi-croorganismos. Conseqüentemente, a concentração de magnésio no meiode fermentação é tipicamente menor do que cerca de 10 g/L, preferivelmentemenor do que cerca de 5 g/L, e mais preferivelmente menor do que cerca de3 g/L. Além disso, em alguns casos pode ser desejável permitir que o meiode fermentação se torne esgotado de uma fonte do magnésio durante a fer-mentação.

O meio de fermentação pode também incluir um agente quelantebiologicamente aceitável, tal como o diidrato de citrato trissódico. Em tal ca-so, a concentração de um agente quelante no meio de fermentação é maiordo que cerca de 0,2 g/L, preferivelmente maior do que cerca de 0,5 g/L, emais preferivelmente maior do que cerca de 1 g/L. Além de determinadasconcentrações, entretanto, a adição de um agente quelante ao meio de fer-mentação não é vantajosa para o crescimento dos microorganismos. Con-seqüentemente, a concentração de um agente quelante no meio de fermen-tação é tipicamente menor do que cerca de 10 g/L, preferivelmente menor doque cerca de 5 g/L, e mais preferivelmente menor do que cerca de 2 g/L.

O meio de fermentação também pode incluir inicialmente um á-cido ou uma base biologicamente aceitável para manter o pH desejado domeio de fermentação. Os ácidos biologicamente aceitáveis incluem, mas nãosão limitados a, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfóricoe misturas dos mesmos. As bases biologicamente aceitáveis incluem, masnão são limitadas a, hidróxido de amônio, hidróxido de sódio, hidróxido depotássio e misturas dos mesmos.

O meio de fermentação também pode incluir uma fonte biologi-camente aceitável de cálcio, incluindo, mas não limitada a, cloreto de cálcio.Tipicamente, a concentração da fonte de cálcio, tal como cloreto de cálcio,diidrato, no meio de fermentação está dentro da faixa de cerca de 5 mg/L aomg a cerca de 2000/L, preferivelmente dentro da faixa de cerca de 20 mg/L acerca de 1000 mg/L, e mais preferivelmente na faixa de cerca de 50 mg/L acerca de 500 mg/L.

O meio de fermentação também pode incluir cloreto de sódio. Ti-picamente, a concentração de cloreto de sódio no meio de fermentação estádentro da faixa de cerca de 0,1 g/L a cerca de 5 g/L, preferivelmente dentroda faixa de cerca de 1 g/L a cerca de 4 g/L, e mais preferivelmente na faixade cerca de 2 g/L a cerca de 4 g/L.

O meio de fermentação também pode incluir metais-traço. Taismetais-traço podem ser adicionados ao meio de fermentação como uma so-lução estoque que, por conveniência, pode ser preparada separadamente doresto do meio de fermentação. Tipicamente, a quantidade de tal solução dosmetais-traço adicionada ao meio da fermentação é maior do que cerca de 1ml/L, preferivelmente maior do que cerca de 5 ml/L, e mais preferivelmentemaior do que cerca de 10 ml/L. Além de determinadas concentrações, entre-tanto, a adição de metais-traço ao meio da fermentação não são vantajosospara o crescimento dos microorganismos. Conseqüentemente, a quantidadede tal solução dos metais-traço adicionada ao meio de fermentação é tipi-camente menor do que cerca de 100 ml/L, preferivelmente menor do quecerca de 50 ml/L, e mais preferivelmente menor do que cerca de 30 ml/L.Deve-se observar que, além de adicionar metais-traço em uma solução es-toque, os componentes individuais podem ser adicionados separadamentecada um dentro das faixas que correspondem independentemente às quan-tidades dos componentes ditadas pelas faixas acima da solução dos metais-traço.

Uma solução adequada de metais-traço pode incluir, mas não élimitada ao selenato de sódio; sulfato ferroso; heptaidrato; sulfato cúprico,pentaidrato; sulfato de zinco, heptaidrato; molibdato de sódio, diidrato; clore-to de cobalto; solução de selênio ou de cromo; hexaidrato; e monoidrato desulfato do manganês. O ácido clorídrico pode ser adicionado à solução esto-que para manter os sais de metal-traço em solução.

O meio de fermentação também pode incluir vitaminas. Tais vi- taminas podem ser adicionadas ao meio de fermentação como uma soluçãoestoque que, por conveniência, pode ser preparada separadamente do restodo meio de fermentação. Tipicamente, a quantidade de tal solução de vita-mina adicionada ao meio de fermentação é maior do que 1 ml/L, preferivel-mente maior de 5 ml/L e mais preferivelmente maior de 10 ml/L. Além dedeterminadas concentrações, entretanto, a adição das vitaminas ao meio defermentação não é vantajosa para o crescimento dos microorganismos.Conseqüentemente, a quantidade de tal solução da vitamina adicionada aomeio de fermentação é tipicamente menor do que cerca de 50 ml/L, preferi-velmente menor do que 30 ml/L e mais preferivelmente menor do que 20ml/L. Deve-se notar que, além de adicionar vitaminas em uma solução esto-que, os componentes individuais podem ser adicionados separadamentecada um dentro das faixas que correspondem independentemente às quan-tidades dos componentes ditadas pelas faixas acima da solução estoque devitamina. Uma solução de vitamina adequada pode incluir, mas não é Iimita- da a, biotina, pantotenato de cálcio, inositol, HCI de piridoxina e HCI de tia-mina.

O meio de fermentação pode também incluir esteróis. Tais este-róis podem ser adicionados ao meio de fermentação como uma soluçãoconservada em estoque que é preparada separadamente do resto do meiode fermentação. As soluções estoque do esterol podem ser preparadas u-sando um detergente para auxiliar na solubilização do esterol. Tipicamente,uma quantidade de solução estoque de esterol é adicionada ao meio de fer-mentação tal que a concentração final de esterol no meio de fermentaçãoestá dentro da faixa de cerca de 1 mg/L a 3000 mg/L, preferivelmente dentroda faixa de cerca de 2 mg/L a mg 2000/L, e mais preferivelmente dentro dafaixa de cerca de 5 mg/L a 2000 mg /L.

Os microorganismos da presente invenção podem ser cultivadospor modos de fermentação convencionais, que incluem, mas não são limita-dos a, batelada, batelada alimentada, reciclagem de célula, e contínua. Emum modo de batelada alimentada, quando durante a fermentação alguns doscomponentes do meio são esgotados, pode ser possível iniciar a fermenta-ção com concentrações relativamente altas de tais componentes de modoque o crescimento seja suportado por um período de tempo antes que asadições sejam necessárias. As faixas preferidas destes componentes sãomantidas durante toda a fermentação por fazer adições conforme os níveissão esgotados pela fermentação. Os níveis dos componentes no meio defermentação podem ser monitorados, por exemplo, por amostrar o meio defermentação periodicamente e testar as concentrações. Alternativamente,uma vez que um procedimento de fermentação padrão é desenvolvido, asadições podem ser feitas em intervalos programados que correspondem aníveis conhecidos em momentos particulares durante toda a fermenta-ção. As adições ao fermentador podem ser feitas sob o controle de um com-putador em resposta às condições do fermentador ou por uma programaçãopré-programada. Além disso, para evitar a introdução de microorganismosestranhos no meio de fermentação, a adição é executada usando métodosde adição assépticos, como é conhecido na técnica. Além disso, uma pe-quena quantidade de agente antiespumante pode ser adicionada durante afermentação, ou dispositivo antiespumante pode ser empregado. Os fermen-tadores podem ser de qualquer tamanho, por exemplo, pelo menos 1 L, pelomenos 10 L, pelo menos 100 L1 pelo menos 1000 L, pelo menos 10.000 L,pelo menos 50.000 L ou pelo menos 100.000 L. Muitos fermentadores co-merciais têm capacidade de mais do que 25.000 L.

A temperatura do meio de fermentação pode ser qualquer tem-peratura adequada para o crescimento e a produção dos nutrientes da pre-sente invenção. Por exemplo, antes da inoculação do meio de fermentaçãocom um inóculo, o meio de fermentação pode ser trazido e mantido em umatemperatura na faixa de cerca de 20QC a cerca de 459C, preferivelmente pa-ra uma temperatura na faixa de cerca de 25eC a cerca de 40eC, e mais pre-ferivelmente na faixa de cerca de 289C a cerca de 32eC.

O pH do meio de fermentação pode ser controlado pela adiçãode ácido ou base ao meio de fermentação. Em tais casos quando amônia éusada para controlar o pH, ela também serve convenientemente como umafonte de nitrogênio no meio de fermentação. Preferivelmente, o pH é mantidode cerca de 3,0 a cerca de 8,0, mais preferivelmente de cerca de 3,5 a cercade 7,0, e o mais preferivelmente de cerca de 4,0 a cerca de 6,5.

O meio de fermentação pode também ser mantido para ter umconteúdo dissolvido de oxigênio durante a fermentação para manter o cres-cimento da célula e para manter o metabolismo da célula para a produçãodos nutrientes. A concentração de oxigênio do meio de fermentação podeser monitorada usando métodos conhecidos, como através do uso de umelétrodo de oxigênio. O oxigênio pode ser adicionado ao meio de fermenta-ção usando métodos conhecidos na técnica, através de agitação e aeraçãodo meio por agitar, sacudir ou borrifar. Preferivelmente, a concentração deoxigênio em um meio de fermentação aeróbica pode estar na faixa de cercade 20% a cerca de 100% do valor de saturação de oxigênio no meio basea-do na solubilidade de oxigênio no meio de fermentação em pressão atmosfé-rica e em uma temperatura na faixa cerca de 209C a cerca de 409C. Redu-ções periódicas na concentração de oxigênio abaixo desta faixa podem ocor-rer durante a fermentação, entretanto, sem afetar adversamente a fermenta-ção.

Embora a aeração do meio tenha sido descrita aqui em relaçãoao uso de ar, outras fontes de oxigênio podem ser usadas. Particularmenteútil é o uso de um gás de aeração que contém uma fração do volume do oxi-gênio maior do que a fração de volume de oxigênio no ar ambiental. Adicio-nalmente, tais gases de aeração podem incluir outros gases que não afetamnegativamente a fermentação. Em algumas modalidades, a fermentação éexecutada sob condições bem estabelecidas na técnica.

O meio de fermentação pode ser inoculado com uma cultura demicroorganismos da presente invenção em crescimento ativo em uma quan-tidade suficiente para produzir, após um período de crescimento razoável,uma densidade elevada de células. As densidades celulares típicas de ino-culação estão dentro da faixa de cerca de 0,01 g/L a cerca de 10 g/L, prefe-rivelmente de cerca de 0,2 g/L a cerca de 5 g/L e mais preferivelmente decerca de 0,05 g/L a cerca de 1,0 g/L, com base no peso seco das células.Em fermentadores de escala de produção, entretanto, densidades celularesmaiores do inóculo são preferidas. As células são então cultivadas para umadensidade celular na faixa de cerca de 10 g/L a cerca de 100 g/L preferivel-mente de cerca de 20 g/L a cerca de 80 g/L, e mais preferivelmente de cercade 50 g/L a cerca de 70 g/L. Os tempos de residência para os microorganis-mos alcançarem as densidades celulares desejadas durante a fermentaçãosão tipicamente de menos do que cerca de 200 horas, preferivelmente me-nos do que cerca de 120 horas, e mais preferivelmente menos do que cercade 96 horas.

Em uma modo de operação da presente invenção, a concentra-ção da fonte de carbono, tal como a concentração de glicose, do meio defermentação é monitorada durante a fermentação. A concentração de glico-se do meio de fermentação pode ser monitorada usando técnicas conheci-das, como, por exemplo, uso do teste da enzima glicose oxidase ou de cro-matografia líquida de alta pressão, os quais podem ser usados monitorar aconcentração de glicose no sobrenadante, por exemplo, um componentelivre de célula do meio de fermentação. Como indicado previamente, a con-centração da fonte de carbono deve ser mantida abaixo do nível em que ainibição do crescimento celular ocorre. Embora tal concentração possa variarde organismo para organismo, tipicamente para glicose como uma fonte decarbono, a inibição do crescimento celular pode ocorrer em concentraçõesde glicose maiores do que em cerca de 60 g/L, e pode ser facilmente deter-minada por experimentação. A concentração de glicose no meio de fermen-tação é mantida na faixa de cerca de 1 g/L a cerca de 100 g/L, mais preferi-velmente na faixa de cerca de 2 g/L a cerca de 50 g/L, e ainda mais preferi-velmente na faixa de cerca de 5 g/L a cerca de 20 g/L embora a concentra-ção da fonte de carbono possa ser mantida dentro de níveis desejados pelaadição de, por exemplo, uma solução substancialmente pura de glicose, éaceitável, e pode ser preferido, manter a concentração da fonte de carbonodo meio de fermentação pela adição de alíquotas do meio de fermentaçãooriginal. O uso de alíquotas do meio de fermentação original pode ser dese-jável porque as concentrações de outros nutrientes no meio (as fontes, porexemplo, de nitrogênio e fosfato) podem ser mantidas simultaneamente. Domesmo modo, as concentrações de metais-traço podem ser mantidas nomeio de fermentação pela adição de alíquotas da solução dos metais-traço.

D. Revestimento e modificação estrutural dos nutrientes

O microorganismo modificado enriquecido nutricionalmente podeainda ser tratado para facilitar a passagem pelo rúmen. O peptídeo ou a pro-teína devem escapar da degradação ruminal e passar para o intestino del-gado para fornecer quantidades suficientes de aminoácidos. Métodos preli-minares desenvolvidos para impedir a digestão fermentativa de aminoácidosincluem (1) revestimento de um produto que tem um conteúdo aumentadode aminoácido com uma composição que protege o produto da degradaçãono rúmen e/ou (2) manipulação estrutural do aminoácido para produzir aná-logos de aminoácido que demonstram degradação reduzida no rúmen.

As proteínas com estrutura secundária ou terciária significativa(por exemplo, ligações de dissulfeto) podem apresentar melhor proteção dorúmen. Além de fornecer uma fonte de aminoácidos essenciais para a raçãodo ruminante, uma proteína rica em aminoácido essencial pode assemelhar-se intimamente às proteínas "ricas em aminoácido essencial" que estão pre-sentes na farinha de sangue. Por exemplo, a farinha de sangue pode incluira cadeia de alfa hemoglobina de porco. Apenas como exemplo, um peptídeoou proteína rica em aminoácido essencial em um microorganismo modifica-do pode ser revestido com os compostos poliméricos, ou ser polimerizados,com proteína, gordura, misturas de gordura e cálcio, misturas da gordura eproteína, e com os sais de metal de ácidos graxos de cadeia longa. O peptí-deo ou proteína rica em aminoácido essencial pode também ser revestidacom polímeros sensíveis ao pH. Um polímero sensível ao pH é estável nopH ruminal, mas desnatura quando é exposto ao pH do abomaso, liberandoo peptídeo ou a proteína para digestão nos abomasos e absorção no intesti-no delgado. Como tais, aminoácidos livres podem ser revestidos para forne-cer proteção da degradação no rúmen. O aminoácido essencial ou o peptí-deo ou proteína rico em aminoácido essencial podem ser reagidos com umou mais carboidratos redutores (por exemplo, xilose, lactose, glicose, e similares).

Os nutrientes podem ser revestidos com uma variedade de ma-teriais de revestimento. Por exemplo, óleos vegetais (tais como óleo de fei-jão de soja), uma mistura de um composto hidrofóbico, de elevado ponto defusão e um lipídio. A combinação de um ou mais compostos hidrofóbicos deelevado ponto de fusão (por exemplo, sais minerais de ácidos graxos, taiscomo estearato de zinco de classe comercial) com um ou mais tipos de lipí-dio forma um material de revestimento que pode proteger o conteúdo e afuncionalidade do(s) ingrediente(s) revestido(s). Estes revestimentos podemser formulados para satisfazer as necessidades das condições de proces-samento em alta temperatura e pressão assim como proteção da carga deaminoácido do ambiente microbiano do rúmén. Revestimentos adequadossão descritos de patente U.S. Ne 2003/0148013, que está incorporada aquipor referência em sua totalidade. Os compostos hidrofóbicos de elevadosponto de fusão têm tipicamente um ponto de fusão de pelo menos cerca de70SC, e mais desejavelmente, maior do que IOO5C. Em particular, sais dezinco de ácidos graxos, que têm um ponto de derretimento entre cerca de115eC e 130eC, são compostos hidrofóbicos de elevado ponto de fusão ade-quados.

O componente de lipídio tem tipicamente um ponto de fusão depelo menos cerca de O9C e mais adequadamente não menos do que cercade 40QC. O componente de lipídio pode incluir óleo vegetal, tal como o óleode soja. Em outras modalidades, o componente de lipídio pode ser um tria-cilglicerol com um ponto de fusão de cerca de 45 a 75eC. Ácido esteárico declasse comercial pode ser selecionado como um lipídio representativo de umgrupo que inclui mas não é limitado a: ácido esteárico, gordura animal hidro-genada, gordura animal (por exemplo, sebo animal), óleo vegetal, (tal comoóleo vegetal bruto e/ou óleo vegetal hidrogenado, parcialmente ou comple-tamente hidrogenado), lecitina, ácido palmítico, óleos animais, cera, ésteresde ácidos graxos (C8 a C24), ácidos graxos (C8 a C24O). O revestimento podeestar presente no produto revestido em uma quantidade de 1 a 2000% empeso, em relação ao peso do ingrediente revestido. Geralmente, o revesti-mento representa cerca de 15 a 85% em peso, em relação ao peso do in-grediente revestido. Mais geralmente, o revestimento representa cerca de 20a 60% em peso e/ou 30 a 40% em peso, em relação ao peso do ingredienterevestido. O revestimento pode ser preparado a partir de mistura hidrofóbica.O revestimento pode incluir um tensoativo.

O revestimento pode usar um ou mais compostos hidrofóbicosinsolúveis combinados com um lipídio. Por exemplo, estearato de zinco degrau comercial é extremamente hidrofóbico e completamente insolúvel emágua. A adição de estearato de zinco de grau comercial à fórmula de reves-timento pode melhorar o nível de proteção do ingrediente e sua funcionali-dade, de forma significativa quando comparado a um revestimento apenasde lipídio. Por exemplo, por combinar estearato de zinco com um lipídio umtanto insolúvel tal como ácido esteárico de grau comercial, o composto derevestimento pode fornecer melhor proteção de lixiviação (isto é, perda doingrediente ativo do produto revestido), quando o produto revestido está emum meio aquoso. Como tal, o benefício da presente composição de revesti-mento pode ser utilizado em rações feitas para ruminantes para passar pelorúmen e liberar o ingrediente ativo no intestino delgado.

Além de facilitar a passagem pelo rúmen, o revestimento tam-bém pode ser útil para proteger os nutrientes revestidos contra o calor epressão sofridas durante o processo de fabricação (peletização e extrusão).A composição de revestimento pode ser útil em todos os tipos de processosde produção onde calor é aplicado e ingredientes suscetíveis do calor sãousados. Ingredientes que podem se beneficiar desta forma de proteção sãoos ingredientes que são submetidos a dano ou degradação por calor, taiscomo aminoácidos, proteínas, enzimas, vitaminas, pigmentos e "attractants".Além de proteger os ingredientes do dano ou perda relacionada ao calor,também há a necessidade de proteger os ingredientes de dano ou perdaatribuível à associação ou reação química com outros ingredientes. O méto-do de encapsulamento pode impedir a associação prejudicial, ou reaçõescom outros ingredientes, ou oxidação. Como tal, o método do encapsula-mento fornece a habilidade de pré-empacotar ou combinar ingredientes emuma formulação, onde os ingredientes seriam geralmente empacotados indi-vidualmente.

A composição de revestimento pode ser preparada de várias demaneiras. Preferivelmente, o processo de preparação inclui fazer uma solu-ção sólida do componente de sal orgânico de zinco e do componente de lipí-dio. Em uma modalidade, o sal orgânico de zinco e o componente de lipídiopodem ser derretidos até que ambos se dissolvam e formem uma solução. Asolução pode então ser deixada solidificar para formar uma solução sólida.Além do componente de ácido orgânico de zinco e do componente de lipídio,o revestimento pode incluir outros ingredientes. Por exemplo, o revestimentopode incluir um ou mais agentes emulsificantes tais como glicerina, polissa-carídeos, lecitina, agentes de gelificação, e sabões, os quais podem melho-rar a velocidade e a eficácia do processo de encapsulamento. Adicionalmen-te, o revestimento pode incluir um antioxidante para fornecer proteção me-lhorada contra os efeitos da oxidação. Além disso, a composição de revesti-mento pode incluir outros componentes que podem ou não se dissolver noprocesso de formação da solução sólida. Por exemplo, a composição de re-vestimento pode incluir pequenas quantidades de oxido de zinco e outroselementos ou compostos.

Um revestimento adequado pode ser preparado a partir de umóleo vegetal parcialmente hidrogenado tal como o óleo de soja. Outros óleosvegetais adequados, que são pelo menos parcialmente hidrogenados, inclu-em óleo de palma, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de a-mendoim, óleo de semente de palma, óleo de babaçu, óleo de girassol, óleode açafroa, e misturas das mesmas. Um revestimento adequado pode serpreparado a partir de uma mistura que inclui um óleo vegetal parcialmentehidrogenado e constituintes adicionais, tal como uma cera. Ceras adequadasincluem cera de abelha, cera de petróleo, cera de farelo de arroz, cera derícino, cera microcristalina, e misturas disso. Em algumas modalidades, umrevestimento adequado é preparado a partir de uma mistura que inclui cercade 85 a 95% (preferivelmente cerca de 90%) de óleo vegetal parcialmentehidrogenado e cerca de 5 a 15% (preferivelmente cerca de 10%) de cera. Orevestimento pode incluir um agente para modificar a densidade do substratorevestido, por exemplo, um tensoativo, tal como polissorbato 60, polissorbato80, propileno glicol, dioctilsulfossuccinato de sódio, Iauril sulfato de sódio,ésteres lactílicos de ácidos graxos, ésteres de poliglicerol de ácidos graxos,e misturas dos mesmos.

Um substrato revestido (ou substrato pré-revestido) pode serpreparado por pulverizar uma mistura hidrofóbica que inclui um óleo vegetalparcialmente hidrogenado (85% a 95%) e uma cera (5% a 15%) sobre umsubstrato que inclui o L-His e/ou uma proteína rica em histidina. Opcional-mente, um substrato pré-revestido pode ainda ser revestido por pulverizar asuperfície do substrato pré-revestido com um tensoativo para formar umsubstrato revestido. O substrato revestido pode ter a seguinte composição:substrato (40 a 80%); mistura hidrofóbica (20 a 60%); tensoativo (0 a 40%)(opcional). O substrato revestido pode ter uma gravidade específica de cercade 0,3 a 2,0 (mais adequadamente cerca de 1,3 a 1,5). Em uma modalidade,o substrato revestido inclui: cerca de 50% de substrato; cerca de 35% demistura hidrofóbica; e cerca de 15% de tensoativo. O substrato revestidopode ser preparado por pré-revestir o substrato com uma mistura hidrofóbi-ca, e subseqüentemente revestir o substrato pré-revestido com um tensoati-vo.

Depois que a composição de revestimento é preparada, ela podeentão ser usada para preparar o nutriente protegido. Um procedimento ade-quado para preparar o ingrediente protegido usa a tecnologia de encapsula-mento, preferivelmente tecnologia de microencapsulamento. O microencap-sulamento é um processo pelo qual pequenas quantidades de gás, líquido,ou ingredientes sólidos são incluídos ou envolvidos por um segundo materi-al, neste caso uma composição de revestimento, para proteger o ingredientedo ambiente circundante. Vários processos de microencapsulamento podemser usados para preparar o ingrediente protegido tal como disco giratório,pulverização, co-extrusão, e outros métodos químicos tais como o coacerva-ção complexa, separação de fase, e gelatinização. Um método adequado emicroencapsulamento é o método de disco rotatório. No método de discorotatório, uma emulsão e/ou suspensão do ingrediente ativo e da composi-ção de revestimento é preparada e alimentada por gravidade à superfície deum disco rotatório aquecido. Enquanto o disco gira, a emulsão/suspensão seespalha ao longo da superfície do disco para formar uma fina camada porcausa das forças centrífugas. Na borda do disco, a emulsão/suspensão écisalhada em gotas distintas nas quais o ingrediente ativo está envolvidopelo revestimento. Conforme as gotas caem do disco para um funil de cole-ta, as gotas esfriam para formar um ingrediente microencapsulado (isto é,um produto revestido). Pelo fato da emulsão ou suspensão não ser expelidaatravés dos orifícios, esta técnica permite o uso de um revestimento de vis-cosidade mais elevada e permite um carregamento maior de ingrediente norevestimento. O encapsulamento dos ingredientes para o uso nas raçõesanimais é descrito na Publicação de Patente U.S. N9 2003/0148013, que es-tá incorporada aqui por referência em sua totalidade.

Aminoácidos (tal como histidina) e/ou proteínas (tais como prote-ínas ricas em histidina) também podem ser alterados quimicamente paraproteger o aminoácido no rúmen e para aumentar a oferta de aminoácidosespecíficos fornecidos ao abomaso e ao intestino delgado. Por exemplo, ametionina hidroxila análoga (MHA) tem sido usada como um suplemento deaminoácido. Além disso, os aminoácidos podem ser fornecidos como quela-tos de aminoácido/mineral. Complexos de zinco-metionina e zinco-lisina têmsido usados como suplementos de aminoácido.

E. Necessidade de aminoácido

Na formulação de dieta para um mamífero, uma contribuiçãoprevista de aminoácidos microbianos digeríveis a partir da fermentação dorúmen é subtraída das necessidades de aminoácido do animal, conformedeterminado pelo perfil do animal. A quantidade de aminoácidos que precisaser fornecida como aminoácido essencial não-degradável (UEAA) a partir daração é a diferença entre as necessidades de aminoácido do animal e osaminoácidos fornecidos pelos aminoácidos microbianos digeríveis. O perfilde aminoácidos do leite pode ser comparado ao perfil dos aminoácidos pro-duzidos por microorganismos modificados dentro do trato digestivo do ani-mal (isto é, perfil de aminoácido microbiano). As diferenças entre os perfis deaminoácido microbiano e do leite indicam os aminoácidos que podem estarem excesso ou restrição. Entretanto, esta comparação de perfil de aminoá-cido fornece somente parte da informação necessária a fim de aumentar aprodução de um produto animal escolhido. A eficiência com a qual o corpoincorpora aminoácidos no intestino delgado em um produto animal escolhidotambém pode ser considerada. Por determinar a relação do perfil de saí-da/entrada do aminoácido e por determinar a eficiência da incorporação, asnecessidades de aminoácidos digeríveis do leite podem ser determina-das. Foi estabelecido que histidina, lisina, metionina, fenilalanina, e treoninasão prováveis aminoácidos Iimitantes para a produção de leite em vacas Iei-teiras. Uma determinação similar pode ser executada para o perfil de amino-ácidos do músculo.

Os aminoácidos necessários nas rações para vacas leiteiras sãochamados Aminoácidos Digeríveis do Leite ("ddAA"). A soma do aminoácidomicrobiano digerível mais a concentração de aminoácido essencial não-degradada no rúmen digerível (UEAA) desse mesmo aminoácido é o ddAA.Os Aminoácidos Digeríveis do Leite representam o suprimento de AA digerí-vel total para o intestino delgado. As necessidades de aminoácidos totais deum animal leiteiro podem ser determinadas como segue. A quantidade totalde um aminoácido necessário ("TAAR") é igual à quantidade necessária paraa manutenção ("Aminoácido de Manutenção" ou "MAA") mais a quantidade,do aminoácido necessária para a produção de leite ("Saída de Aminoácidodo Leite" ou "MAAO") mais a quantidade do aminoácido necessária para ocrescimento ("Aminoácido de Crescimento" ou "GAA") (isto é, TA-AR=MAA+MAAO+GAA).

Aminoácidos Iimitantes podem ser fornecidos a um animal paraaumentar a produção de um produto animal escolhido (por exemplo, leite)por suplementar a ração animal com o aminoácido limitante. Aminoácidoslimitantes podem ser identificados por analisar o perfil de aminoácido doproduto animal escolhido (isto é, perfil de saída) e comparar este perfil aoperfil de aminoácidos fornecidos ao animal (isto é, perfil de entrada). Méto-dos para determinar as necessidades de aminoácido são conhecidos na téc-nica e descritos na Patente U.S. N2 5.145.695 e Patente U.S. Ns 5.219.596,as quais estão incorporadas aqui por referência em suas totalidades. Porexemplo, o perfil de aminoácido do leite pode ser comparado ao perfil deaminoácidos produzidos por micróbios dentro do trato digestivo do animal(isto é, perfil de aminoácido microbiano). As diferenças entre os perfis deaminoácido microbiano e do leite indicam onde os aminoácidos podem estarem excesso ou restrição.

Alternativamente, os resíduos de fermentação deixados pelafermentação de microorganismos geneticamente modificados ou não-modificados podem ser suplementados com os nutrientes exogenamente(isto é, com nutrientes além daqueles já produzidos pelos microorganismos)para aumentar seu valor nutritivo e, portanto, seu valor comercial. Isto permi-te que se balanceie o conteúdo nutricional de resíduos de fermentação quepode ser deficiente em um ou mais nutrientes

IV. MÉTODOS COMERCIAIS

A presente invenção fornece métodos comerciais para desenvol-ver e avaliar processos e produtos para aumentar o valor de subprodutos domilho-ao-etanol, tais como grãos secos de destilador. Isso é conseguido porusar microorganismos modificados para melhorar o conteúdo nutricional des-tes subprodutos formados na produção do etanol para formar ração animalenriquecida com nutriente e outros produtos de valor adicionado, assim au-mentando a economia da produção de etanol. A indústria do etanol repre-senta o terceiro mercado o maior para o milho dos Estados Unidos. A produ-ção de etanol combustível é uma parte integrante do desenvolvimento eco-nômico rural, da melhoria ambiental, e do comércio de gasolina. O métodocomercial da invenção fornece subprodutos valiosos na forma da raçãocompleta enriquecida nutricionalmente que adicionaria valor comercial signi-ficativo à indústria de fermentação do etanol.

As economias agrícolas e rurais têm sofrido com os efeitos depreços baixos das mercadorias. Falando de forma geral, o preço de muitasmercadorias agrícolas recebido pelo fazendeiro tem estado abaixo do custode produção. Esta situação fez com que muitos fazendeiros saíssem do ne-gócio o que, por sua vez, causou o colapso de muitas economias rurais. A-lém disso, a segurança energética dos Estados Unidos se tornou instávelporque os Estados Unidos importam, cada vez mais, grandes quantidadesde petróleo. Adicionalmente, a economia dos Estados Unidos sofre quando adisponibilidade, e assim o custo, do petróleo importado flutua acentuada-mente. A ração completa da presente invenção ajuda a estabelecer subpro-dutos de valor adicionado obtidos a partir da produção de etanol, os quaisajudariam a sustentar o desenvolvimento da indústria doméstica de bioeta-nol, fornecer rendimentos aumentados e sustentáveis em economias rurais,desenvolver novos produtos bio-baseados que substituirão os produtos fei-tos atualmente a partir do petróleo, e aumentar a produção doméstica deenergia renovável que, por sua vez, pode melhorar a segurança energéticados Estados Unidos. O consumidor e o público em geral podem se beneficiarda presente invenção através da estabilização da disponibilidade do com-bustível assim como do preço da gasolina na bomba. Já que a ração com-pleta enriquecida nutricionalmente é feita de mercadorias agrícolas, a pre-sente invenção irá melhorar também as economias rurais e agrícolas, e pre-servar a qualidade do ar e da água.

Um aspecto da invenção refere-se a um método comercial deaumentar valor do rendimento de uma fábrica de fermentação, por executaruma reação de fermentação com o uso de um microorganismo modificado; ecomercializar ou vender um ou mais dos produtos da reação de fermentaçãoque compreendem o microorganismo modificado. O microorganismo é modi-ficado de tal maneira que o microorganismo modificado tem seu conteúdonutricional aumentado. O microorganismo modificado é enriquecido em nu-trientes tais como, apenas como exemplo, gorduras, ácidos graxos, lipídiostais como fosfolipídio, vitaminas, aminoácidos essenciais, peptídeos, proteí-nas, carboidratos, esteróis, enzimas, e minerais-traço tais como, ferro, cobre,zinco, manganês, cobalto, iodo, selênio, molibdênio, níquel, flúor, vanádio,estanho e silicone. Um outro aspecto da presente invenção é um métodocomercial de aumentar o valor de rendimento de uma fábrica de fermenta-ção, por executar uma reação de fermentação usando material contendocarbono na presença de um microorganismo modificado para gerar os resí-duos de fermentação que têm um valor comercial mais elevado do que se areação de fermentação fosse executada na ausência dos microorganismosmodificados. Os resíduos de fermentação enriquecidos em nutrientes levama rações animais completas que contêm um conteúdo nutricional elevado.

Os resíduos de fermentação preferíveis produzidos de acordo com a presen-te invenção têm um valor comercial maior do que o resíduos de fermentaçãoconvencionais. Por exemplo, os resíduos de fermentação podem incluir au-mento de sólidos secos tais como DDGS conteúdo de aminoácido e outronutriente melhorado.

A composição dos resíduos de fermentação enriquecidos em nu-trientes da presente invenção difere daquela de DDG e de outros subprodu-tos de destilador produzidos a partir do processo de produção tradicional deetanol com moagem seca, os quais são obtidos através da fermentação doamido presente no milho inteiro triturado sem os microorganismos modifica-dos em questão. Os resíduos de fermentação enriquecidos com nutrientesdesta invenção podem ter um conteúdo de nutriente pelo menos de cerca de1% a cerca de 95% em peso. O conteúdo de nutrientes está preferivelmentena faixa de pelo menos cerca de 10% a 20%, 20% a 30%, 30% a 40%, 40%a 50%, 50% a 60%, e 60% a 70% em peso.

Em algumas modalidades do método comercial, a composiçãode ração compreende pelo menos cerca de 15% de resíduos de fermenta-ção em peso. Em modalidades adequadas, a composição de ração compre-ende pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cer-ca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo me-nos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%,pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 75%. Geralmente, acomposição de ração compreende pelo menos cerca de 20% de resíduos defermentação em peso. Mais geralmente, a composição de ração compreen-de pelo menos cerca de 15 a 25%, 25 a 20%, 20 a 25%, 30% a 40%, 40% a50%, 50% a 60%, ou 60% a 70% pelo peso dos resíduos de fermentação.As composições de ração podem adicionalmente conter outros nutrientes,sabores, aromas, conservantes etc. A ração animal pode também ser cus-tomizada para um animal específico com necessidades de nutrientes especí-ficas.

A venda do grão do destilador é uma parte importante da renta-bilidade total e é crucial para o crescimento da indústria do etanol. A comer-cialização eficaz do grão de destilador como ração animal seria essencialpara manter a eficiência e a rentabilidade das fábricas de etanol. A raçãoanimal pode ser usada para qualquer organismo que pertença ao reino Ani-malia e inclui, sem limitação, aves domésticas, gado, suínos, cabra, carnei-ros, gato, cão, rato, aquicultura, cavalo, e etc. O conteúdo de nutriente daração animal pode ser modificado por modificar os microorganismos de talmaneira que os microorganismos produzam certos nutrientes particularespara um animal para o qual a ração é feita. Portanto, as rações animais po-dem ser feitas para o animal específico com nutrientes específicos, forne-cendo uma parcela inteira do mercado de rações animais e assim aumen-tando o valor comercial da ração. Assim, o método comercial descrito aquide comercializar ou vender um ou mais dos produtos da reação de fermen-tação que compreende o microorganismo modificado, aumentaria o valor derendimento de uma fábrica de fermentação.

Em algumas modalidades do método comercial, o aumento novalor do rendimento é conseguido sem diminuir substancialmente a quanti-dade de produtos de fermentação que são produzidos pela reação da fer-mentação. O aumento na produção do componente nutricional pelos micro-organismos modificados pode ser induzido em um momento em que a fer-mentação tiver substancialmente terminado, preferivelmente pelo menoscerca de 50% do término, mais preferivelmente pelo menos cerca de 70% dotérmino, mais preferivelmente cerca de 90% do término. Tal regulação per-mite a produção de resíduos de fermentação com valor nutritivo aumentadosem sacrificar a quantidade de produtos de fermentação tais como alcoóis esubprodutos gasosos. O término da reação da fermentação pode ser monito-rado por medir o conteúdo de glicose no meio de fermentação ou medir osprodutos gasosos tais como o dióxido de carbono.

Em uma modalidade do método comercial, os resíduos de fer-mentação têm uma vida útil que é mais longa do que aquela de um resíduode fermentação é sejam deficientes no dito microorganismo modificado. Osresíduos de fermentação como tais podem ser transportados de um local defabricação para um local de armazenamento e ainda para um local de ven-da. Em qualquer local, ele pode ser vendido como é, ou ser misturado parafazer uma ração animal completa, cuja ração completa pode compreenderresíduos de fermentação, outro nutrientes, conservantes, sabores, e/ou osaromas etc. A vida útil dos resíduos de fermentação pode ser aumentadapelo uso de microorganismos modificados enriquecidos com nutriente quepodem ser modificados de tal maneira que a vida útil do resíduos de fermen-tação é maior. Por exemplo, os microorganismos podem ser modificados detal maneira que o microorganismo modificado faça um composto que servecomo conservante. A vida útil do resíduo de fermentação também pode seraumentada por empregar um processo de fermentação que produz resíduosde fermentação que permanecem intactos em diferentes condições de clima,umidade, temperatura. Este processo pode incluir produzir resíduos de fer-mentação como sólidos secos que têm menor conteúdo de umidade e porisso, são estáveis em condições climáticas quentes. A vida útil dos resíduosde fermentação pode ainda ser aumentada por embalar, armazenar e trans-portar os resíduos de fermentação de tal maneira que os resíduos de fer-mentação permaneçam intactos.

Em algumas modalidades do método comercial, os microorga-nismos são modificados de tal maneira que eles são enriquecidos em nutri-entes tais como aminoácidos, preferivelmente aminoácidos essenciais e/oulimitantes. Aminoácidos Iimitantes podem ser fornecidos a um animal paraaumentar a produção de um produto animal escolhido (por exemplo, leite)por suplementar a ração do animal com o aminoácido limitante. Aminoácidoslimitantes podem ser identificados por analisar o perfil de aminoácido doproduto animal escolhido (isto é, perfil de saída) e comparar este perfil aoperfil dos aminoácidos fornecidos ao animal (isto é, perfil de entrada). Porexemplo, os gatos requerem uma quantidade elevada de taurina para suasfunções corporais, contudo eles têm enzimas limitadas que podem produzirtaurina a partir de outros aminoácidos tais como metionina e cisteína. Con-seqüentemente, eles precisam de uma dieta rica em taurina. Se a taurinaestiver escassa, sinais tais como uma condição cardíaca chamada cardiomi-opatia dilatada, degeneração da retina, deficiência reprodutora e desenvol-vimento anormal dos filhotes podem ocorrer. A ração completa da invençãoque contém microorganismos modificados com conteúdo nutricional elevadopode ajudar a tratar ou aliviar estas desordens nos animais. Portanto, as ra-ções animais completas da presente invenção não podem apenas ser feitaspara animais diferentes mas também podem ser feitas para animais deficien-tes em um determinado nutriente ou os animais que estão sofrendo de umou de mais distúrbios relacionados aos níveis dos nutrientes no corpo.

Embora as modalidades preferidas da presente invenção tenhamsido mostradas e descritas aqui, será óbvio para aqueles versados na técni-ca que tais modalidades são fornecidas apenas como exemplo. Várias alte-rações, mudanças, e substituições serão agora sugeridas para aqueles ver-sados na técnica sem desconsiderar a invenção. Deve ser compreendidoque várias alternativas às modalidades da invenção descrita aqui podem serempregadas na prática da invenção. Pretende-se que as reivindicações aseguir definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentrodo escopo destas reivindicações e seus equivalentes estejam, desse modo,cobertos.

(iv) EXEMPLOSConstrução de vetores de expressão:

Um vetor de expressão adequado para produzir uma seqüênciaexógena em um microorganismo tal como uma célula de levedura é constru-ído de acordo com técnicas recombinantes usuais. O vetor compreende umoperon de replicação capaz da replicação em célula de levedura, uma se-qüência exógena de interesse que é operativamente ligada a uma seqüênciaregulatória que controla a expressão. O vetor é feito opcionalmente replicá-vel em procariotos (isto é, um vetor "shuttle") tal como uma bactéria parafacilitar a clonagem. Além disso, o vetor compreende uma seqüência regula-tória tal como um operon supressor de glicose que normalmente suprime aexpressão das seqüências exógenas até mesmo quando o conteúdo de gli-cose no meio está baixo ou quase depletado.

O vetor de expressão é construído tipicamente para conter ummarcador selecionável (por exemplo, um gene que codifica uma proteínanecessária para a sobrevivência ou crescimento de uma célula hospedeiratransformada com o vetor), embora tal gene marcador possa ser carregadoem outra seqüência de polinucleotídeo co-introduzida na célula hospedeira.Somente aquelas células hospedeiras dentro das quais um gene selecioná-vel foi introduzido sobreviverão e/ou crescerão sob condições seletivas. Osgenes típicos de seleção codificam proteína(s) que (a) conferem resistênciaa antibióticos ou outras substâncias tóxicas, por exemplo, ampicilina, neomi-cina, metotrexato, etc.; (b) complementam deficiências auxotróficas; ou (c)fornecem nutrientes críticos não disponíveis nos meios complexos. A esco-lha do gene adequado do marcador dependerá da célula hospedeira, e osgenes adequados para diferentes hospedeiros são conhecidos na técnica.Vetores de clonagem e de expressão também contêm tipicamente um siste-ma de replicação reconhecido pelo hospedeiro.

O vetor de expressão exemplar é ligado operativamente a ele-mentos de controle transcricional adequados, tais como promotores, intensifi-cadores e terminadores. Para a expressão (isto é, transdução), um ou os maiselementos de controle traducional são também geralmente requeridos, taiscomo sítios de ligação de ribossomo, sítios de iniciação de transdução e có-dons de parada. Estes elementos de controle (transcricional e transducional)podem ser derivados de genes regulatórios tais como genes de choque térmi-co, genes implicados na toxicidade e genes de formação de esporo. Uma se-qüência de polinucleotídeo que codifica um peptídeo de sinal também podeser incluída para permitir que a seqüência exógena codificada cruze e/ou sealoje nas membranas da célula ou seja secretada da célula, se desejado.Expressão de seqüência exógena (por exemplo, enriquecida em um ou maisaminoácidos essenciais):

Os vetores que contêm a seqüência exógena de interesse po-dem ser introduzidos na célula hospedeira de levedura por qualquer um devários meios apropriados, incluindo eletroporação, transfecção, bombardeio,e infecção. As células de levedura transformadas são cultivadas em meioseletivo (por exemplo, com antibióticos adequados) para selecionar aquelasque estão sendo transformadas com o vetor de expressão. Uma culturasubstancialmente homogênea dos transformantes é então preparada parauso em uma reação de fermentação. A reação de fermentação é deixadaprosseguir sob condições anaeróbicas usuais para produzir álcool e produ-tos gasosos. Os resíduos da reação de fermentação contêm transformantesde levedura que têm conteúdo nutricional aumentado, devido, por exemplo,a superprodução de seqüências exógenas que são enriquecidas em um oumais aminoácidos essenciais (por exemplo, ricas em lisina).

EXEMPLO 1

Construção de pKS-1-ST:G060205

Um vetor designado pKS-1-ST:G060205 que contém uma faseaberta de leitura que codifica uma endopeptidase prolina-específica de Fla-vobacterium meningosepticum (G06205) foi construído para expressar aendopeptidase no citoplasma de uma célula de levedura. A endopeptidase éligada em fase com um Strep-Tag para a purificação rápida da proteína e umHA-Tag para facilidade de detecção por Western blotting. A seqüência daendopetidase é subclonada na estrutura principal de pKS-1-ST através doslocais de restrição de BamHI e Xhd. Veja a figura 3A para os componentesde seqüência adicionais contidos em pKS-1-ST:G060205. Em particular, aconfiguração do vetor de pKS-1-ST carrega um marcador de resistênciaKanMX, um promotor ADH2 que controla a expressão do gene de endopep-tidase prolina-específico. O promotor ADH2 é tipicamente inativo durante afase inicial da fase de crescimento das células de levedura. Uma vez que ascélulas alcançam a fase estacionária inicial da curva de crescimento, a glico-se é esgotada do meio, por exemplo, o caldo YPD1 induzindo desse modo aatividade do promotor ADH2.

EXEMPLO 2

Construção de PKS-2-ST:GQ6205

Um vetor designado pKS-2-ST:G060205 que contém uma faseaberta de leitura que codifica uma endopeptidase prolina-específica de Fla-vobacterium meningosepticum (G06205) foi construído. A endopeptidase éoperativamente ligada a uma seqüência-líder Suc2 para direcionar a endo-peptidase sintetizada para fora de uma célula de levedura. Além disso, aseqüência de endopeptidase é ligada em fase com um Strep-Tag para a pu-rificação rápida da proteína e um HA-Tag para facilidade de detecção porWestern blotting. A seqüência de endopetidase é subclonada na estruturaprincipal de pKS-2-ST através dos sítios de restrição de BamHI e Xhd. Vejaa figura 3B para os componentes de seqüência adicionais contidos em pKS-2-ST:G060205. Em particular, a configuração do vetor pKS-2-ST carrega ummarcador de resistência KanMX, um promotor ADH2 esse controla a expres-são do gene de endopeptidase prolina-específico. O promotor ADH2 é tipi-camente inativo durante a fase inicial do crescimento das células de levedu-ra. Uma vez que as células alcançam a fase estacionária inicial da curva decrescimento, a glicose é esgotada do meio, por exemplo, o caldo YPD, indu-zindo desse modo a atividade do promotor ADH2.

Expressão da seqüência exógena (por exemplo, enriquecida emum ou mais aminoácidos essenciais):

EXEMPLO 3

Expressão citoplasmática de endopeptidase prolina-específica a partir dovetor pKS-1 -ST:GQ6205

As células de levedura (cepa de Saccharomyces cerevisiaeATCC 4132) que são altamente eficientes na produção de etanol foramtransformadas com os vetores pKS-1-ST:G06205 contendo um gene quecodifica endopeptidase prolina-específica, uma grande proteína rica em Iisi-na. A seqüência de aminoácido da endopeptidase prolina-específica é mos-trada na figura 4A. Além da endopeptidase, a seqüência expressa contémum Strep-Tag, um epítopo de HA, e os resíduos de aminoácido que corres-pondem ao sítio de restrição de BamHI. A seqüência foi modificada em duasposições (mostradas nos triângulos na figura 4A), onde os resíduos de seri-na e histidina selvagens foram substituídos por alanina a fim de inativar aatividade da peptidase.

As células de levedura transformadas foram deixadas crescer nomeio de crescimento padrão. Lisados das células de controle transformadascom o vetor de estrutura principal pKS e com o vetor pKS1:G06205 foramanalisados através de SDS-PAGE. A figura 6 descreve um gel no qual asrespectivas proteínas do Iisado foram separadas de acordo com seus pesosmoleculares. Como mostrado na figura 6, os Iisados preparados a partir dascélulas de levedura transformadas com pKS1:G06205 continham uma ban-da extra correspondendo ao peso molecular esperado (kDa -79) da endo-peptidase prolina-específica. Tal banda está ausente no Iisado preparado apartir das células de levedura de controle transformadas com o vetor pKS2.

EXEMPLO 4

Expressão e secreção de endopeptidase prolina-específica através do vetorpKS-2-ST:GQ6205

As leveduras (cepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4132)que eram altamente eficientes na produção de etanol foram transformadascom os vetores pKS-2-ST: G06205 contendo um gene que codifica aendopeptidase prolina-específica, uma grande proteína rica em lisina. Aseqüência codificada é mostrada na figura 4B. Além da endopeptidase, aseqüência expressa continha um sinal de exportação SUC2 para causar asecreção da proteína a partir das células transformadas. A seqüênciacodificada também tinha uma seqüência de Strep-Tag, e do epítopo de HA,e os resíduos de aminoácido que correspondem ao sítio de restrição deBamHI. A seqüência foi modificada em duas posições (mostradas nostriângulos na figura 4A), onde os resíduos de serina e histidina selvagensforam substituídos por alanina a fim de inativar a atividade da peptidase. Ascélulas de levedura transformadas foram deixadas crescer em meio decrescimento padrão. Os sobrenadantes da cultura das células de controletransformadas com o vetor de arcabouço pKS2 e com o vetor pKS2:GO6205foram analisados através de SDS-PAGE. A figura 5A mostra umcromatograma do sobrenadante da cultura em 24 horas para as célulastransformadas com pSK2:GO6205, e para as células transformadas compKS2. O gel na figura 5A mostra que o sobrenadante das célulastransformadas com pSK2:GO6205 mostra uma banda com MW ~ 79 kDa,correspondendo à proteína endopeptidase prolina-específica, enquanto queas células apenas com pSK2 não mostram esta banda. A figura 5B mostraum cromatograma do sobrenadante da cultura após 48 horas para as célulastransformadas com pSK2:GO6205, e para as células transformadas compKS2. O gel na figura 5B mostra que o sobrenadante das célulastransformadas com pSK2:GO6205 mostra uma banda com MW ~ 79 kDa,correspondendo à proteína endopeptidase prolina-específica, enquanto queas células apenas com pSK2 não têm esta banda.

Claims

1. Método de fermentação usando material que contém carbono,compreendendo:(a) misturar um material que contém carbono com uma culturaque compreende microorganismos geneticamente modificados que, em umprocesso de fermentação, produzem um primeiro produto e um resíduo defermentação que compreende um nutriente, em que o conteúdo do nutrienteno resíduo de fermentação é maior do que aquele de microorganismos cor-respondentes não-modificados quando usados no processo de fermentação;(b) fermentar a cultura sob condições adequadas para a pro-dução comercial do primeiro produto e sob condições adequadas para aprodução do nutriente;(c) separar o primeiro produto da cultura; e(d) produzir o resíduo da fermentação.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os microor-ganismos compreendem um vetor de expressão recombinante que compre-ende uma seqüência de nucleotídeo exógena que codifica um polipeptídeo euma seqüência regulatória que controla a expressão do polipeptídeo exóge-no, em que a expressão do polipeptídeo exógeno resulta em aumento doconteúdo nutricional do resíduo de fermentação comparado com aquele domicroorganismo não-modificado.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o nutriente éselecionado do grupo que consiste em uma gordura, um ácido graxo, umlipídio, uma vitamina, um aminoácido essencial, um peptídeo, uma proteína,um carboidrato, um esterol, uma enzima, e um mineral-traço.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o nutriente éum aminoácido essencial selecionado do grupo que consiste em lisina, meti-onina, fenilalanina, treonina, isoleucina, triptofano, valina, leucina, arginina,taurina e histidina.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a expressãoda seqüência exógena está sob o controle de uma seqüência regulatóriaselecionada do grupo que consiste em uma seqüência regulatória de umgene de choque térmico, em uma seqüência regulatória de um gene de toxi-cidade e uma seqüência regulatória de um gene de formação de esporo.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a expressãoda seqüência exógena é induzida quando a reação de fermentação tiver a-tingido pelo menos cerca de 50% do término.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a expressãoda seqüência de nucleotídeo exógena depende da concentração de glicose.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a modifica-ção genética modifica pelo menos um dos genes estruturais na via sintéticado nutriente.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a modifica-ção genética modifica um controle regulatório da via sintética do nutriente.

10. Método de acordo com a reivindicação 9. Método de acordocom a reivindicação 1, em que a modificação genética modifica um controleregulatório da via sintética do nutriente, em que a via sintética é para um a-minoácido essencial selecionado do grupo que consiste em lisina, metionina,fenilalanina, treonina, isoleucina, triptofano, valina, Ieucina1 arginina, taurinae histidina.

11. Método de acordo com a reivindicação 1. Método de fermen-tação usando material que contém carbono, compreendendoem que a modi-ficação genética modifica os processos de transporte do nutriente para foraou para dentro do microorganismo.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o nutrienteé um aminoácido essencial selecionado do grupo que consiste em lisina,metionina, fenilalanina, treonina, isoleucina, triptofano, valina, leucina, argi-nina, taurina e histidina.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o nutrienteé uma vitamina.

14. Método de acordo com a reivindicação 13,13. Método de a-cordo com a reivindicação 1, em que o nutriente é uma vitamina, em que avitamina é selecionada do grupo que consiste em vitamina A, vitamina B1,vitamina B2, vitamina B3, vitamina B5, vitamina B6, vitamina B7, vitaminaΒ9, vitamina B12, vitamina C, vitamina D1 a D4, um tocoferol, e vitamina K.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o nutrienteé um lipídio.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiroproduto é um álcool.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o álcool éetanol.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o álcool éselecionado do grupo que consiste em metanol, propanol e butanol.

19. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o álcool éseparado por destilação.

20. Método de acordo com a reivindicação 16, compreendendoadicionalmente misturar o álcool com outro combustível.

21. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiroproduto é selecionado de um solvente ou um gás.

22. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiroproduto é um composto farmacêutico.

23. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o materialque contém carbono é selecionado do grupo que consiste em celulose, Ias-cas de madeira, vegetais, biomassa, excretas, resíduos animais, aveia, trigo,milho, cevada, inhame, painço, do arroz, do centeio, sorgo, batata, beterra-ba, cará, mandioca, frutas, sucos de fruta, e cana-de-açúcar.

24. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o resíduode fermentação compreende grãos secos de destilador, solúveis secos dedestilador ou grãos secos de destilador com solúveis.

25. Método de acordo com a reivindicação 1, que compreendeincorporar o resíduo de fermentação em ração animal.

26. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o nutrienteé produzido quando a fermentação estiver substancialmente terminada.

27. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o microor-ganismo é levedura.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que a Ievedu-ra é Saccharomyces.

29. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os micro-organismos compreendem a levedura, a fonte de carbono compreende oamido de milho ou sacarose, o primeiro produto compreende o etanol e onutriente é selecionado de lisina, metionina, triptofano e treonina.

30. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o microor-ganismo é Clostrídium.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o produtoé butanol ou acetona.

32. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os micro-organismos compreendem o Clostrídium, a fonte de carbono compreendeamido de milho ou sacarose, o primeiro produto compreende etanol e o nu-triente é selecionado de lisina, metionina, triptofano e treonina.

33. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o microor-ganismo é selecionado do grupo que consiste em Zymomonas sp., E. coli,Corynebacteríum, Brevibacterium e Bacillus ssp.

34. Método de acordo com a reivindicação 1, ainda compreen-dendo comercializar o primeiro produto e o resíduo da fermentação.

35. Método de fermentação usando o material que contém car-bono, compreendendo:(a) misturar um material que contém carbono com uma culturaque compreende microorganismos geneticamente modificados que, durantea fermentação, produzem um primeiro produto e um resíduo de fermentação,em que o valor do resíduo de fermentação é maior do que aquele de um re-síduo de fermentação produzido por fermentar um microorganismo corres-pondente não-modificado;(b) fermentar a cultura sob condições adequadas para a produ-ção do primeiro produto e para a produção do resíduo de fermentação quetem o maior valor;(c) separar o primeiro produto da cultura; e(d) coletar o resíduo de fermentação.

36. Método da reivindicação 35. Método de fermentação usandoo material que contém carbono, compreendendo: em que o resíduo de fer-mentação compreende uma quantidade aumentada de um produto industrialou farmacêutico.

37. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o resíduode fermentação exibe uma propriedade física melhorada.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, em que a proprie-dade física melhorada é selecionada dentre aderência aumentada ou a den-sidade aumentada.

39. Microorganismo geneticamente modificado que, em um pro-cesso de fermentação, produz um primeiro produto para comercialização eum resíduo de fermentação que compreende um nutriente, em que o conte-údo do nutriente no resíduo de fermentação é maior do que aquele de ummicroorganismo correspondente não-modificado quando usado na reação defermentação.

40. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 39, compreendendo um vetor de expressão recombinante quecompreende uma seqüência de nucleotídeo exógena que codifica um poli-peptídeo e uma seqüência regulatória que controla a expressão do polipep-tídeo exógeno, em que a expressão do polipeptídeo exógeno resulta emconteúdo nutricional aumentado do resíduo de fermentação comparado comaquele do microorganismo não-modificado.

41. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 40, em que o nutriente é selecionado do grupo que consisteem uma gordura, um ácido graxo, um lipídio, uma vitamina, um aminoácidoessencial, um peptídeo, uma proteína, um carboidrato, um esterol, uma en-zima, e um mineral-traço.

42. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 40, em que o nutriente é um aminoácido essencial para pelomenos um animal domesticado e o polipeptídeo exógeno compreende o a -minoácido essencial.

43. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 42, em que o aminoácido essencial é selecionado do grupoque consiste em lisina, metionina, fenilalanina, treonina, isoleucina, triptofa-no, valina, leucina, arginina, taurina e histidina.

44. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 40, em que a expressão da seqüência exógena está sob ocontrole de uma seqüência regulatória selecionada do grupo que consisteem uma seqüência regulatória de um gene de choque térmico, uma seqüên-cia regulatória de um gene de toxicidade e uma seqüência regulatória de umgene de formação de esporo.

45. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 39, em que a modificação genética modifica pelo menos umdos genes estruturais na via sintética do nutriente.

46. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 39, em que a via sintética é para um aminoácido essencial pa-ra um animal domesticado.

47. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 39, em que a modificação genética modifica um controle regu-latório da via sintética do nutriente.

48. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 39, em que a modificação genética modifica um gene estruturalque regula a síntese de um peptídeo que contém pelo menos um aminoáci-do essencial para um animal domesticado.

49. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 39, em que a modificação genética modifica os processos detransporte do nutriente para fora ou para dentro do microorganismo.

50. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 40, em que a expressão da seqüência exógena é induzidaquando a reação de fermentação tiver atingido pelo menos cerca de 50% dotérmino.

51. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 50, em que pelo menos 50% do término é evidenciado por umadiminuição no conteúdo de glicose para menos do que cerca de 50% do con-teúdo de glicose inicial presente em uma mistura de reação de fermentaçãoantes de começar a reação de fermentação.

52. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 31, em que a expressão da seqüência de nucleotídeo exógenadepende da concentração de glicose.

53. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 39, em que o nutriente é um aminoácido essencial para pelomenos um animal domesticado.

54. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 53, em que o aminoácido essencial é selecionado do grupoque consiste em lisina, metionina, fenilalanina, treonina, isoleucina, triptofa-no, valina, leucina, arginina, taurina e histidina.

55. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 39, em que o nutriente é uma vitamina.

56. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 55, em que a vitamina é selecionada do grupo que consiste emvitamina A, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B3, vitamina B5, vitamina B6,vitamina B7, vitamina B9, vitamina B12, vitamina C, vitamina D1 a D4, umtocoferol, e vitamina K.

57. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 55, em que o produto comercial é um álcool.

58. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 57, em que o álcool é etanol.

59. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 55, em que o produto comercial é selecionado dentre um sol-vente ou um gás.

60. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 55, em que o produto comercial é um composto farmacêutico.

61. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 39, em que o nutriente é um lipídio.

62. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 39, em que o álcool é selecionado do grupo que consiste emmetanol, propanol, e butanol.

63. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 39, em que o microorganismo é levedura.

64. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 63, em que a levedura é Saccharomyces.

65. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 39, em que o microorganismo é Clostridium.

66. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com areivindicação 39, em que o microorganismo é selecionado do grupo queconsiste em Zymomonas sp., E. coli, Corynebacterium, Brevibacterium eBacillus ssp.

67. Cultura de fermentação que compreende:(a) um microorganismo geneticamente modificado que, emuma reação de fermentação, produz um primeiro produto para comercializa-ção e um resíduo de fermentação que compreende um nutriente, em que oconteúdo do nutriente no resíduo de fermentação é maior do que aquele deum microorganismo correspondente não-modificado quando usado na rea-ção de fermentação e(b) um meio de fermentação que compreende uma fonte docarbono para a produção do nutriente,em que a cultura produz o produto.

68. Cultura de fermentação de acordo com a reivindicação 67,em que o nutriente é selecionado do grupo que consiste em uma gordura,um ácido graxo, um lipídio, uma vitamina, um aminoácido essencial, um pep-tídeo, uma proteína, um carboidrato, um esterol, uma enzima, e um mineral-traço.

69. Cultura de fermentação de acordo com a reivindicação 67,em que a fonte de carbono é selecionada de celulose, de lascas de madeira,vegetais, biomassa, excretas, resíduos animais, aveia, trigo, milho, da ceva-da, milho, painço, arroz, centeio, sorgo, batata, beterraba, inhame, mandio-ca, frutas, sucos de fruta, e cana-de-açúcar.

70. Cultura de fermentação de acordo com a reivindicação 67,em que o primeiro produto é um álcool.

71. Cultura de fermentação de acordo com a reivindicação 70,em que o álcool é etanol.

72. Cultura de fermentação de acordo com a reivindicação 67,em que o primeiro produto é selecionado dentre um solvente ou um gás.

73. Cultura de fermentação de acordo com a reivindicação 67,em que o primeiro produto é um composto farmacêutico.

74. Cultura de fermentação de acordo com a reivindicação 67,em que o álcool é selecionado do grupo que consiste em metanol, propanol,e butanol.

75. Cultura de fermentação de acordo com a reivindicação 67,em que o microorganismo é levedura.

76. Cultura de fermentação de acordo com a reivindicação 75,em que a levedura é Saccharomyces.

77. Cultura de fermentação de acordo com a reivindicação 67,em que o microorganismo é Clostridium.

78. Cultura de fermentação de acordo com a reivindicação 67,em que o microorganismo é selecionado do grupo que consiste em Zymo-monas sp., E. colí, Corynebacterium, Brevibacterium e Bacillus ssp.

79. Cultura de fermentação de acordo com a reivindicação 67,tendo um volume de pelo menos 100 litros.

80. Cultura de fermentação de acordo com a reivindicação 67,em que os microorganismos compreendem levedura, a fonte de carbonocompreende amido de milho ou sacarose, o primeiro produto compreendeetanol e o nutriente é selecionado dentre lisina, metionina, triptofano e treo-nina.

81. Cultura de fermentação de acordo com a reivindicação 67,em que os microorganismos compreendem Clostridium, a fonte de carbonocompreende amido de milho ou sacarose, o primeiro produto compreendeetanol e o nutriente é selecionado dentre lisina, metionina, triptofano e treo-nina.

82. Vetor da expressão que compreende uma seqüência exóge-na que codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos um aminoáci-do essencial para um animal domesticado, em que a expressão da seqüên-cia exógena é induzida quando uma reação de fermentação que produz umálcool ou um alcano tiver atingido pelo menos cerca de 50% do término.

83. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 82, emque a expressão da seqüência exógena está sob o controle de uma seqüên-cia regulatória selecionada do grupo que consiste em um operon do supres-sor de glicose, seqüência regulatória de um gene de choque térmico, se-qüência regulatória de um gene de toxicidade, seqüência regulatória de umgene de formação de esporo.

84. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 82, emque pelo menos cerca de 5% dos resíduos de aminoácido contidos no poli-peptídeo são aminoácidos essenciais para um animal domesticado.

85. Resíduo de fermentação de um processo de fermentaçãocomercial de um microorganismo geneticamente modificado, o dito resíduode fermentação tendo uma quantidade maior de um nutriente em compara-ção a um resíduo de fermentação de um processo de fermentação comercialde um microorganismo não-modificado geneticamente.

86. Resíduo de fermentação de acordo com a reivindicação 85,compreendendo grãos secos de destilador.

87. Resíduo de fermentação de acordo com a reivindicação 85,compreendendo solúveis secos de destilador.

88. Resíduo de fermentação de acordo com a reivindicação 85,compreendendo grãos secos de destilador com solúveis.

89. Resíduo de fermentação de acordo com a reivindicação 85,compreendendo o microorganismo geneticamente modificado.

90. Resíduo de fermentação de acordo com a reivindicação 85,em que o nutriente é selecionado do grupo que consiste em uma gordura,um ácido graxo, um lipídio, uma vitamina, um aminoácido essencial, um pep-tídeo, uma proteína, um carboidrato, um esterol, uma enzima, e um mineral-traço.

91. Resíduo de fermentação de acordo com a reivindicação 85,em que o processo de fermentação produziu um produto químico industrialpara isolamento.

92. Resíduo de fermentação de acordo com a reivindicação 85,em que o nutriente é um aminoácido essencial selecionado do grupo queconsiste em lisina, metionina, treonina, isoleucina, metionina, fenilalanina,triptofano, e arginina.

93. Resíduo de fermentação de acordo com a reivindicação 92,em que o aminoácido essencial está contido em um polipeptídeo heterólogoproduzido por um microorganismo usado no processo de fermentação.

94. Resíduo de fermentação de acordo com a reivindicação 93,em que pelo menos cerca de 5% dos resíduos do aminoácido contidos nopolipeptídeo heterólogo são aminoácidos essenciais.

95. Resíduo de fermentação de acordo com a reivindicação 85,em que o aminoácido essencial está presente em uma quantidade que ex-cede cerca de 3% do resíduo de fermentação em peso seco.

96. Resíduo de fermentação de acordo com a reivindicação 85,que é suplementado com um flavorizante.

97. Resíduo de fermentação de acordo com a reivindicação 85,que é embalado com instruções para uso como ração animal.

98. Resíduo de fermentação de acordo com a reivindicação 85,que é embalado com instruções para uso como suplemento alimentar.

99. Ração animal completa que compreende pelo menos cercade 15% do resíduo de fermentação por peso.

100. Ração animal completa de acordo com a reivindicação 99,em que o resíduo de fermentação resulta de um processo de fermentaçãocomercial de um microorganismo geneticamente modificado, o dito resíduode fermentação tendo uma quantidade maior de um nutriente em compara-ção a um resíduo de fermentação de um processo de fermentação comercialde um microorganismo não-modificado geneticamente.

101. Ração animal completa de acordo com a reivindicação 100,compreendendo adicionalmente o microorganismo geneticamente modifica-do.

102. Ração animal completa de acordo com a reivindicação 100,compreendendo adicionalmente um sabor evidente para um animal de inte-resse.

103. Ração animal completa de acordo com a reivindicação 100,em que o nutriente é um aminoácido essencial selecionado do grupo queconsiste em lisina, metionina, treonina, isoleucina, metionina, fenilalanina,triptofano, e arginina.

104. Ração animal completa de acordo com a reivindicação 103,em que o aminoácido essencial está contido em um polipeptídeo heterólogoproduzido por um microorganismo usado na reação de fermentação.

105. Método comercial de aumentar o valor de uma instalaçãode fermentação, compreendendo:(a) fermentar uma cultura que contém microorganismosgeneticamente modificados e uma fonte de carbono para produzir um primei-ro produto, separar o primeiro produto da cultura e coletar um resíduo defermentação, em que o resíduo de fermentação que tem um valor comercialmais elevado do que um resíduo de fermentação produzido por fermentarum microorganismo correspondente não-modificado; e(b) comercializar ou vender o primeiro produto e o resíduoda fermentação.

106. Método comercial de acordo com a reivindicação 105, emque o resíduo de fermentação tem uma quantidade aumentada de um nutri-ente comparado com um resíduo de fermentação produzido por cultivar ummicroorganismo correspondente não-modificado na reação de fermentação.

107. Método comercial de acordo com a reivindicação 106, emque o nutriente é selecionado do grupo que consiste em uma gordura, umácido graxo, um lipídio, uma vitamina, um aminoácido essencial, um peptí-deo, uma proteína, um carboidrato, um esterol, uma enzima, e um mineral-traço.

108. Método comercial de acordo com a reivindicação 105, emque o resíduo de fermentação tem propriedades físicas melhoradas.

109. Método comercial de acordo com a reivindicação 105, emque o resíduo de fermentação tem uma quantidade aumentada de um com-posto industrial ou farmacêutico.

110. Método comercial de acordo com a reivindicação 106, emque o microorganismo é levedura.

111. Método comercial de acordo com a reivindicação 106, emque o microorganismo é Clostridium.

112. Método comercial de acordo com a reivindicação 106, emque a fonte de carbono compreende amido de milho ou sacarose.

113. Método comercial de acordo com a reivindicação 106, emque o primeiro produto é um álcool selecionado do grupo que consiste em etanol, metanol, propanol, e butanol.

114. Método comercial de acordo com a reivindicação 106, emque o primeiro produto é um biocombustível e o método compreende adicio-nalmente misturar o biocombustível com outro combustível para a comercia-lização.

115. Método comercial de acordo com a reivindicação 106, emque o nutriente é selecionado do grupo que consiste em uma gordura, umácido graxo, um lipídio, uma vitamina, um aminoácido essencial, um peptí-deo, uma proteína, um carboidrato, um esterol, uma enzima, e um mineral-traço.

116. Método comercial de acordo com a reivindicação 106, emque o resíduo de fermentação compreende grãos secos de destilador, solú-veis secos de destilador ou grãos secos de destilador com solúveis.

117. Método comercial de acordo com a reivindicação 106, quecompreende misturar o resíduo de fermentação com outros nutrientes paraproduzir uma ração completa para um animal domesticado.

118. Processo que compreende combinar um resíduo de fermen-tação com um nutriente.

119. Composição que compreende um resíduo de fermentaçãosuplementado com um nutriente exógeno.