TW200815596A - Compositions and methods for producing fermentation products and residuals - Google Patents

Description

200815596 九、發明說明： 【先前技術】 工業上在商業過程中使用微生物以產生商業數量之許多 不同的有用有機化合物和無機化合物。此等包括工業化學 製品及醫藥品二者。藉由微生物生成的工業化學製品之實 例包括溶劑、酸（及乙酸酯）及氣體。工業上產生的溶劑包 括醇類（例如，乙醇及丁醇）、酮類（例如，丙酮）及烷烴 類。工業上產生的酸類包括（例如）乙酸（醋）、丙酮酸及乳 ® 酸。工業上產生的氣體包括（例如）氨、甲烷及氫之氣體。 科學人員現在正利用生物技術來產生包括酵素途徑之微生 物進而生成通常藉由微生物不能生成的有用化學製品。 (參見，例如，Martin等人，^Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids, "Nature Biotechnology，2003，21:796.)工程師亦利用此等過程以產生 有商業利用價值的酵素，例如，凝乳酶。在醫藥工業中， _ 微生物可產生抗生素及重組蛋白質。在此等過程中，對該 微生物實施培養並自培養物收穫（例如，分離或移出）有用 的化學製品。 乙醇燃料工業正在迅速地發展。許多聯邦及國家激勵機 制（例如，清潔燃燒燃料規劃）在過去20年裏已經呈指數增 長了 5倍以上。在2004年，高油價、玉米豐收及有限的加 工能力創造了新穎市場機遇並因此使燃料乙醇之記錄產量 達34億加侖以上。如今，乙醇代表美國玉米之第三大市 120117.doc 200815596 :以此步伐’燃料乙醇生產自身正成為農村經濟發展及 裱扰改良之紕成部分。 β、藉由對七現於諸如玉米、高標、馬铃箸、甘蔬等農作 τ ^ 中之澱粉實施發酵及蒸餾來製備乙醇。乙醇 吊係在乾式碾機或濕式摩較備中生產。自

:玉米精加工設備”產生的主要副產物包括富含果糖之^ 搪浆、玉米油、穀蛋白飼料、及穀蛋白粉。來自乾式碾機 過私之副產物包括酒糟及二氧化碳。儘管兩種㈣具有類 :作業成本，但乾式碾機設備通常較小且需要較低初始投 貝攸而使其每加侖之資本成本減少2至4倍。乙醇生產之 勺60 /〇將所有殘餘營養素-蛋白冑、脂肪、礦物質、 及維他命-濃縮成酒#，其係頗有價㈣冑畜飼料。可容 納重約56碎玉米之蒲式耳可產生約2.8加侖乙醇及啊酒 糟0 酒糟可為乳牛、肉牛、豬、家禽、寵物、及水產養殖動 物提供高品質飼料S£給量。該飼料係家畜及家禽飼料中玉 米、大豆粉、及磷酸氫鈣之經濟的部分替代物。酒糟仍然 係用於反离動物膳食之極佳的、經濟的飼料成份。預計， 到2006年DDGS(具可溶物之乾燥酒糟）產量可自2〇〇2年的 3,500,000公噸翻倍增加至7,〇〇〇,〇〇〇公噸以上。酒糟之銷售係 乙醇工業之總收益率及發展的重要部分。倘若乾燥酒糟銷 售滯後於乙醇產量提高，則當前的乙醇工業可能會受到顯 著影響。酒糟作為動物飼料之有效銷售無疑會影響乙醇生 120117.doc 200815596 產設備之效率及整體收益率。 藉由發酵實施的當前乙醇生產方案並未經優化。儘管人 們已經致力於改良乙醇生產，但有很少研究著力於提高會 影響極大部分動物飼料銷售之發酵殘餘物（包括酒糟）的產 值。 因此’仍急需設計為提高發酵設備之產值的組合物及方 法。理想的發酵方案可保持高乙醇產量，且同時產生具有 較咼商業價值的發酵殘餘物。本發明可滿足此需要並亦可 提供相關優點。 【發明内容】 本發明提供經改造微生物及在發酵時使用此等微生物生 成商業產品及較在該發酵反應中藉由未經此改造微生物所 產生發酵殘餘物具有更大商業價值之發酵殘餘物的方法。 在一個實施例中，所增加商業價值係源於殘餘物中營養素 增加’此使該殘餘物成為更佳動物飼料。 在一個態樣中，本發明提供一種包括下列之方法：（勾將 含碳材料與包含基因改造微生物之培養物中混合，該等基 因改造微生物可在發酵過程中生成第一產物及包含營養素 之發酵殘餘物，其中該發酵殘餘物中營養素之含量較在該 發酵過程巾使絲經改造對賴生物時所生錢餘物中營Λ 養素之含量更大；（b)在適用於商業生產該第一產物之條件 下及在適用於生成該營養素之條件下發酵該培養物丨⑷自 該培養物分離該第一產品；及（d)產生發酵殘餘物。 在-個實施例中，微生物包含一含有編碼多肽之外源性 1201I7.doc 200815596 核苦酸序列及控制該外源性多肽表現之調節序列的重租表 現載體’其中與未經改造微生物之外源性多肽表現相比广 該外源性多肽之表現可增加該發酵殘餘物之營養含量。在 另-實施例中，藉由該等微生物所產生營養素係選自由下 列組成之群：脂肪、脂肪酸、脂質、維他命、必需胺基 酸、肽、蛋白質、碳水化合物、固醇、酵素、及微量礦物 質。在額外實施例中，藉由該等微生物所產生營養素係選 自由下列組成之必需胺基酸群組：離胺酸、曱硫胺酸、苯 丙胺酸、蘇胺酸、#白胺酸、色胺酸、纈胺酸、白胺酸、 精胺酸、牛磺酸及組胺酸。 在另一實施例中，外源性序列之表現係處於選自由下列 組成之群調節序列的控制下：熱休克基因之調節序列、毒 性基因之調節序列及孢子形成基因之調節序列。在另一實 加例中’當該發酵反應已完成至少約5 0%時，引發該外源 性序列表現。在又一實施例中，外源性核苷酸序列之表現 取決於葡萄糖濃度。 在一個實施例中，該基因改造可改造營養素合成途徑中 至 一種結構基因。在另一實施例中，該基因改造可改良 營養素合成途徑之調節控制。 在另一實施例中，該合成途徑係用於選自由下列組成之 群的必需胺基酸：離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺 酸、異白胺酸、色胺酸、纈胺酸、白胺酸、精胺酸、牛磺 酸及組胺酸。在再一實施例中，該基因改造可改良至微生 物外部或内部之營養素轉運過程。 i2om.doc 200815596 在一個實施例中’該營養素係選自由下列組成之群的必 需胺基酸·離胺酸、甲硫胺酸、本丙胺酸、蘇胺酸、異白 胺酸、色胺酸、纈胺酸、白胺酸、精胺酸、牛績酸及組胺 酸。在另一實施例中’該營養素係維他命。在另一實施例 中，該維他命係選自由下列組成之群··維他命A、維他命 B1、維他命B2、維他命B3、維他命B5、維他命B6、維他 命B7、維他命B9、維他命B12、維他命c、維他命D1_

D4、生育酚、及維他命K。在額外實施例中，該營養素係 脂質。 在一個實施例中，該第一產物係醇。在另一實 該醇係乙醇。在再一實施例中，該醇係選自由甲醇、丙醇 及丁醇組成之群。在額外實施例中，該醇係藉由蒸餾分 離。另-實施例進一步包括將該醇與另一燃料混合。 在-個實施例中’該第一產物係選自溶劑或氣體。在另 一實施例中，該第一產物係醫藥化合物。 在另只％例中’含碳材料係選自由下列組成之群：纖 維素、木屑、蔬菜、生物質'排池物、動物廢棄物、燕 麥、小麥、玉米、大麥、蜀黍、粟、稻、裸麥、高樑、馬 鈴薯、：：：芋頭、樹薯、水果、果汁、及甘嚴。 Λ〜例中’該發酵殘餘物包括乾燥酒糟、乾燥酒 :勺：可溶物或具有可溶物之乾燥酒糟。額外實施例進一 二% Γ該發酵殘餘物納人動物飼料中。在另—實施例 中’〜養素在發酵基本完成時產生。 個實施例中，該微生物係酵母菌。在另一實施例 120117.doc 200815596 中，該酵母菌係酵母屬。在又一實施例中，該等微生物包 括酵母菌，該碳源包括玉米澱粉或蔗糖，該第一產物包括 乙醇且該營養素係選自離胺酸、甲硫胺酸、色胺酸及蘇胺

在另一實施例中，該微生物包括梭狀芽胞桿菌 (ci〇stridium)。在另—實施例中，該產物係丁醇或丙酮。 在再-實施例中’該等微生物包括梭狀芽胞桿菌，該碳源 包括玉米澱粉m，該第―產物包括乙醇且該營養素係 選自離胺酸、甲硫胺酸、色胺酸及蘇胺酸。在額外實施例 中’該微生物係選自由發酵單胞菌屬（Zym〇m〇nas sp.卜大 腸桿菌（E. C〇1i)、本奉狀桿菌（c〇rynebacterium)、短桿菌屬 (Brevibacterium)及芽孢桿菌屬（⑽細_ )組成之群。一 個實施例進-步包括將[產物及發酵殘餘物商業化。 在另一態樣中，本發明提供—種包括下列之發酵方法. ⑷將含碳材料與包含可在發酵期間產生第一產物及發酵殘 餘t之基㈣微生物的培養物混合，其中該發酵殘餘物 之4貝值較猎由發酵未經改料應微生物所產生發酵殘餘物 之價值更大；（b)在適用於生成該第—產物及適用於生成該 具有更大價值之發酵殘餘物的條件下發料培養物 該培養物分離該第-產物；及（d)收穫發酵殘餘物。 在:個實施例中，該發酵殘餘物包括増加量之工業產品 或醫藥產品。在另一實施例中，兮 "" 理性質。在再w I發酵殘餘物呈現改良物 理〖生貝在再一實施例中，該發酵殘餘 增加或密度增加之改良物理性質。、 ^黏附力 120117.doc -11- 200815596 本發月獒供一種可在發酵過程中產生用 於商業化之第一產物；5由人烛蓋主 屋物及包含言養素之發酵殘餘物的基因改 造微生物，其巾該發酵殘餘物巾營養素之含量較在該發酵 反應中使用未㈣造對應微生物時所產生發酵殘餘物中營 養素之含量更高。 &

在-個實施例中，該基因改造微生物包含一含有編褐多 肽之外源性核苷酸序列及控制該外源性多肽表現之調節序 ，的重組表現载體，其中該外源性多肽之表現與未經改造 微生物之外源性多肽表現相比可增加發酵殘餘物之營養含 量0 在另一實施例中，該營養素係選自由下列組成之群：脂 肪、脂肪酸、脂質、維他命、必需胺基酸、肽、蛋白質、 碳水化合物、固醇、酵素、及微量礦物質。在額外實施例 中，虡含養素係為至少一種飼養動物所必需之胺基酸且外 源性多肽包含該必需胺基酸。在再一實施例中，該必需胺 基酸係選自由下列組成之群：離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺 酸、蘇胺酸、異白胺酸、色胺酸、纈胺酸、白胺酸、精胺 酸、牛確酸及組胺酸。 在一個實施例中，該外源性序列之表現係處於選自由下 列組成之群調節序列的控制下··熱休克基因之調節序列、 毋性基因之調節序列及孢子形成基因之調節序列。在另一 實施例中’基因改造可改造營養素合成途徑中至少一種結 構基因。在再一實施例中，該合成途徑係用於飼養動物之 必需胺基酸。 120117.doc •12- 200815596 在一個實施例中，基因改造可改良營養素合成途徑之調 節控制。在另一實施例中，基因改造可改造可調節含有飼 養動物所用至少一種必需胺基酸之肽合成的結構基因。在 再一實施例中，基因改造可改良至微生物外部或内部之營 養素轉運過程。 在另一實施例中，當該發酵反應已完成至少約5〇%時， 引發外源性序列表現。在另一實施例中，至少約5〇%完成 係藉由葡萄糖含量減少至在開始發酵反應前發酵反應混合 物中所存在葡萄糖之初始含量的小於約50%來證實。在再 一實施例中，外源性核苷酸序列之表現取決於葡萄糖濃 度。 在一個實施例中，該營養素係為至少一種飼養動物所必 需之胺基酸。在另一實施例中，該必需胺基酸係選自由下 列組成之群：離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、異 白胺酸、色胺酸、纈胺酸、白胺酸、精胺酸、牛磺酸及組 胺酸。在額外實施例中，該營養素係維他命。在再一實施 例中，該維他命係選自由下列組成之群：維他命A、維他 命B1、維他命B2、維他命B3、維他命B5、維他命B6、維 他命B7、維他命B9、維他命B12、維他命C、維他命D1-D4、生育酚、及維他命κ。 在另一實施例中，該商業產品係醇。在另一實施例中， 該醇係乙醇。在再一實施例中，該商業產品係選自溶劑或 氣體。在另一實施例中，該商業產品係醫藥化合物。在另 一實施例中，該營養素係脂質。在再一實施例中，醇係選 120117.doc -13 - 200815596 自由甲醇、丙醇及丁醇組成之群。 在一個實施例中，該微生物係酵母菌。在另一實施例 中忒酵母菌係酵母屬。在額外實施例中，該微生物係梭 狀芽胞知菌。在再一實施例中，該微生物係選自由發酵單 胞菌屬、大腸桿菌、棒狀桿菌、短桿菌屬及芽孢桿菌屬組 成之群。

在另恶樣中，本發明提供一種包括下列之發酵培養 物：（a)可在發酵反應中產生用於商業化之第一產品及包含 營養素之發酵殘餘物的基因改造微生物，其中該發酵殘餘 物中呂養素之含量較在該發酵反應中使用未經改造對應微 物夺所產生發酵殘餘物中營養素之含量更高，及（b)包含 用於生成營養素之碳源的發酵培養基，其中培養物 物〇 在7個實施例中，該營養素係選自由下列組成之群：脂 肪月曰肪I、脂質、維他命，必需胺基酸、肽、蛋白質、 石反水化合物、固醇、酵素、及微量礦物質。在另-實施例 中，該碳源係選自纖維素、木屑、蔬菜、生物質、排泄 物、動物廢棄物、燕麥、小麥、玉米、大麥、蜀黍、粟、 稻裸麥、而樑、馬铃箸、甜菜、竿頭、樹箸、水果、果 汁、及甘蔗。 在另一實施例中 該畔係乙醇。在額 及丁醇組成之群。 在一個實施例中 ，該第一產物係醇。在再一實施例中， 外實施例中，該醇係選自由甲醇、丙醇 該第一產物係醫藥化合物。在另一實 120117.doc -14- 200815596 施例中’該第一產物係選自溶劑或氣體。 在另一實施例中，該微生物係酵母菌。在另一實施例 中’該酵母菌係酵母屬。在再一實施例中，該微生物係梭 狀芽胞桿菌。在額外實施例中，該微生物係選自由發酵單 < 胞菌羼、大腸桿菌、棒狀桿菌、短桿菌屬及芽孢桿菌屬組 成之群。 在一個實施例中，體積係至少100公升。在另一實施例 中’該等微生物包括酵母菌，該碳源包括玉来澱粉或蔗 馨 糖’該第一產物包括乙醇且該營養素係選自離胺酸、甲硫 胺酸、色胺酸及蘇胺酸。在額外實施例中，該微生物包含 梭狀芽胞桿菌，該碳源包括玉米澱粉或蔗糖，該第一產物 包括乙醇且該營養素係選自離胺酸、甲硫胺酸、色胺酸及 鍊胺酸。 在另一悲樣中，本發明包括一種包含編碼多肽之外源性 序列的表現載體，該多肽包含飼養動物之至少一種必需胺 Φ 基k其中在產生醇或燒垣之發酵反應已經完成至少約 50%時’引發外源性序列表現。 在一個實施例中，該外源性序列係處於選自由下列組成 ， <群調節序列的控制下：葡萄糖抑制因子操縱子、熱休克 - I因之調節序列、毒性基因之調節序列、孢子形成基因之 調節序列。在另一實施例中，多肽中所含胺基酸殘基之至 少約5%係飼養動物之必需胺基酸。 在另-態樣中，本發明提供來自基因改造微生物之商業 發酵過程的發酵殘餘物，該發酵殘餘物與來自未經此基因 120I17.doc 15 200815596

改造之微生物商I 之營養素。。x酵過程的發酵殘餘物相比具有更大量 在一個實施例中，社& 每协你 以♦酵殘餘物包括乾燥酒糟。在另一

:二該發酵殘餘物包括乾燥酒糟中之可溶物。在再 在，告 > 該發酵殘餘物包括具可溶物之乾燥酒糟。 在另一者：^例中’該發酵殘餘物包括基因改造微生物。 的與兼1^例中’該發酵殘餘物包括選自由下肋成之群 敗 ^月曰肪、脂肪酸、月旨質、維他命、必需胺基酸、 _ Λ妷水化合物、固醇、酵素、及微量礦物質。 灵施例中，該發酵過程產生工業化學製品以供分 離0 j個實施例中’該營養素係選自由下列組成之群的必 :基敎.離胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、甲硫 笨丙胺酸、色胺酸、及精胺酸。在另—實施例中， 該必需胺基酸包含於藉由發酵過程中所用微生物生成的異 源多肽中。在再一實施例中’該異源多肽包含至少約5% 必需胺基酸作為胺基酸殘基。在額外實施财，該必需胺 基酸係以佔發酵殘餘物之超過約3乾重％之量存在。 在另式實例中，該發酵殘餘物補充有調味劑。在另一 實施例中，該發酵殘餘物與關於用作動物飼料之說明書一 起包裝。在再-實施例中，發酵殘餘物與關於用作食物添 加劑之說明書-起包裝。在額外實施財，％全動物飼料 包括至少約15重量％之發酵殘餘物。 在個實施例中，元全動物飼料包括自基因改造微生物 120117.doc -16- 200815596 之商業發酵過程生成的發酵殘餘物，該發酵殘餘物與來自 未經此基因改造之微生物商業發酵過程的發酵殘餘物相比 具有更大量之營養素。在另一實施例中，該完全動物飼料 包括基因改造微生物。在再一實施例中，該完全動物飼料 . 包含相關動物可察覺的矯味劑。在額外實施例中，該營養 素係選自由下列組成之必需胺基酸群組：離胺酸、甲硫胺 酸、蘇胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、 及精胺酸。在另一實施例中，該必需胺基酸包含於藉由發 酵反應中所用微生物生成的異源多肽中。 在另一態樣中，本發明提供一種包含下列之商業方法： (a)對含有基因改造微生物及碳源之培養物實施發酵以產生 弟產物，自該培養物分離該第一產物並收穫發酵殘餘 物，其中該發酵殘餘物較藉由發酵未經改造對應微生物所 產生發酵殘餘物具有更高的商業價值；及（b)銷售或出售該 第一產物及該發酵殘餘物。 • 立在一個實施例中，該發酵殘餘物與在該發酵反應中藉由 =養^經改造對應微生物所產生發酵殘餘物相比具有增加 量之營養素。在另一實施例中，該營養素係選自由下列組 成之m、脂肪酸、脂質、維他命、必需胺基酸、 月太蛋白質、碳水化合物、固醇、酵素、及微量礦物質。 在另-實施例中，該發酵殘餘物具有改良物理性質。在 額1 卜實施例中，該發酵殘餘物具有增加量之工業化合物或 -藥化口物。在再—實施例中，該微生物係酵母菌。在額 外實施例中，該微生物係梭狀芽胞桿菌。 120117.doc 200815596 在另一實施例中，該碳源包括玉米澱粉或蔗糖。在再一 實施例中，該第一產物係選自由乙醇、甲醇、丙醇及丁醇 組成之群的醇。在另-實施例中，該第_產物係生物燃料 且該方法進一步包括將該生物燃料與另一燃料混合以供商 業化。 在一個實施例中，該營養素係選自由下列組成之群：脂 肪、脂肪酸、脂質、維他命、必需胺基酸、肽、蛋白質、 碳水化合物、固醇、酵素、及微量礦物質。在另一實施例 中，該發酵殘餘物包括乾燥酒糟、乾燥酒糟中之可溶物或 具有可溶物之乾燥酒糟。另—實施例包括將該發酵殘餘物 14其他營養素混合以產生用於飼養動物之完全飼料。 在其他態樣中，本發明提供一種包括將發酵殘餘物與營 養素組合在一起之方法及包含補充有外源性營養素之發酵 殘餘物的組合物。 本發明亦體現本文所述組合物及方法之若干變化形式及 所有組合。 本說明書中所提及所有出版物及專利申請案均以引用的 方式併入本文中，其併入程度如同明確地及單獨地指出將 每一個別出版物或專利申請案以引用方式併入一般。 【實施方式】 儘管本文展示並闡述本發明之較佳實施例，但彼等熟習 此項技術者易知此等實施例僅作為實例提供。彼等熟習此 項技術者現在可知不背離本發明之許多變化形式、轉變形 式、及替代形式。應理解，本文所述本發明實施例之各種 120117.doc -18- 200815596 替換形式可用於實踐本發明。 意指屬於動物界之任—有機體且包 於鳥類（例如，家禽）、哺乳動物類 動狗、小鼠及馬)及昆蟲_如，=:產羊養 剛）及甲设類（例如，龍蝦及小蝦）。 本文所用術語"發酵殘餘物"意指自發酵❹ =殘餘物質。在某些情況下，發酵殘餘物 生物以便其與缺少此經改造微生物之發酵殘餘物相 增加營養含量。該等發酵殘餘物可含有來自發酵液之；： 構成成份。舉例而令，$ $ 、且 之^川4發酵殘餘物可含有來自發酵液 於二酵構成成份。該㈣浮構成成份可包括存 々發酵液中之未溶解可溶生、、、 -或多種组份之超飽和時)及/或不溶:二：’：=液經 餘物可包括好酵材科。^發酵殘 如，蕤f 時所存在實質全部乾燥固體(例 包括盆曰一=乾趣發酵湯及藉由發酵所產生生物質）或可 生物;刀。该等發酵殘餘物可包括來自其中經改造微 t可經分餘及/或部分純化以增加該材料之營養素含量 之發酵的粗製發醆吝輪 ’、 殘於物M v 物。發酵殘餘物包括整個殘餘物及總 及且右 ’乾燥固體（如，縠物）、乾燥可溶物 及“乾魅可溶物之乾燥固體(如，穀物 術語"發酵培養物fl έ h，ϋ AH ''扣IS微生物生長所用足夠材料（例 如水及皆養素）之培養基中所含微生物。 術語"商業產U，丨及& 口 “ S欲商業化（例如，用於最終銷售）之 120117.doc -19- 200815596 σπ ° 術ΰ#商業發酵過 自用於商掌w: 可培養微生物以產生可 物(例如，化合物)的發酵過程。 W物)之產 =文所用術語”脂肪酸"意指脂肪族或芳香族單羧酸。 酸之甘、^ 或油，包括但不限於脂肪 I之甘油自日以及有關磷腊、 合物。 u聆知烴、嗣、及相關化

本文所用術語"營養素"意指具有營養價值之任一物質。 其了為動物飼料或用於人類之食物添加劑的—部分。示例 性*養素包括但不限於脂肪、脂肪酸、脂質(例如，磷 脂）、維他命、必需胺基酸、肽、蛋白f、碳水化合物、 固醇、酵素及微量礦物質(例如，鐵、銅、鋅、錳、鈷、 碘、硒、鉬、鎳、氟、釩、錫、及矽）。該營養素可藉由 經改造微生物在發酵湯中分泌或包含於該微生物（例如， 微生物之包含體）中。 π異源多肽"或"異源蛋白質"意指源自（即，自其獲得）與 其對比之其餘實體在基因型上不同的實體，或其基因型不 易區別但與原本未經改造環境或微生物相比以異常高的或 低的濃度產生。 本文所用術語”不飽和脂肪酸”意指具有1個至3個雙鍵之 脂肪酸且”高度不飽和脂肪酸”意指具有4個或更多個雙鍵 之脂肪酸。 "完全動物飼料”係無需進一步補充營養之動物飼料。 120117.doc -20- 200815596

提，殘餘物商業價值之特徵包括(例如)作為動物飼 科之合意性提高及在工業或藥理過程中之實用性提高。提 局作為動物飼料之價值的特性包括（例如）增加營養素及改 良物理特性。-個改良物理特性係黏度增加，其有助於將 該材料更容易地製成顆粒。此可自（例如）膠或㈣出產 生。另-個改良物理特性係密度增加。此可在降解糖之纖 維素酶的生產中產生。提高工業過程中殘餘物價值之實例 係生產用於（例如）塑料之聚合物（例如，聚乳酸）。提高在 藥理過程中價值之實例係生產醫藥產品(例如，抗生素卜 I· 發酵過程 ” 本文所用"發酵”意指培養微生物之過程。發酵可為厭氧 型（缺氧型）以及需氧型（充氧型）。在有氧條件下，諸如酵 母菌細胞等微生物可分解糖生成終產物，例如，及 H2〇。在無氧條件下，酵母菌細胞利用另一途徑產生c〇2 及乙醇。本發明之發酵反應較佳為厭氧型，即，部分或完 全缺氧型。發酵亦可用於指其中需氧代謝與厭氧代謝之間 無明顯區別之生長培養基上微生物的大量生長。發酵可包 括諸多微生物菌株或物種同時生長。 本發明亦涵蓋甲烷發酵。曱烷發酵可在無氧條件下將所 有類別之聚合材料轉化成甲烷及二氧化碳。此可作為在其 中各種微生物（包括發酵微生物（產酸菌）、產生氫之微生 物、形成乙酸之微生物（產乙酸菌）、及產生曱烷之微生物 (產甲烷菌））可和諧地生長並產生還原終產物的環境中聚合 物至甲烧及一氧化碳之連續生物化學分解之結果達成。 120117.doc -21 - 200815596 甲烧發酵係各微生物群組之間的一系列代謝交互作用的 結果。該等微生物分泌可分裂聚合材料並水解該等聚合物 及片段生成諸如葡萄糖及胺基酸等單體的酵素，該等單體 接下來轉化成高度揮發性脂肪酸、Hl、及乙酸。在第二階 段中，產生氫之產乙酸菌將所生成高度揮發性脂肪酸 如，丙酸及丁酸）轉化成&、C〇2、及乙酸。最後，第三 步，產甲烷菌將Hr C〇2、及乙酸轉化成cH4&c〇2。諸如 脂質、蛋白質、及碳水化合物等聚合材料主要可藉由微生 物所分泌細胞外水解酶來水解。水解酵素（脂肪酶、蛋白 酶、纖維素酶、澱粉酶等）可水解其對應聚合物生成較小 分子，主要為單體單元，該等單體單元隨後可由微生物消 耗。 諸如脂肪酶等酵素可將脂質轉化成長鏈脂肪酸。梭狀芽 孢桿菌及微球菌係細胞外脂肪酶生產者之實例。蛋白質通 常可藉助由類菌體、丁酸弧菌、梭狀芽胞桿菌、梭桿菌、 新月形單胞菌、及鏈球菌所分泌蛋白酶水解生成胺基酸。 所生成胺基酸隨後可降解生成諸如乙酸、丙酸、及丁酸等 脂肪酸及如發現於梭狀芽胞桿菌、消化球菌、新月形單胞 菌、彎曲桿菌屬、及類菌體中之氨。 諸如纖維素、澱粉、及果膠等多糖可藉由纖維素酶、澱 粉酶、及果膠酶來水解。最厭氧細菌藉由可生成作為中間 體之丙顯J酸以及NADH之Emden-Meyerhof_Parnas途握 (EMP)來經受：己糖代謝。由此所產生丙酮酸及nadΉ隨後 可藉由可隨微生物物種而變化之其他酶活性轉化成發酵終 120117.doc -22- 200815596 產物’例如’乳酸、丙酸、乙酸及乙醇。 因此，在水解反應及產酸反應中，藉由微生物降解生物 聚合物所生成糖、胺基酸、及脂肪酸可藉由隨微生物物種 而變化之其他酶活性代謝生成發酵終產物，例如，乳酸、

丙酸、乙酸、二氧化碳、及乙醇。諸如甲烷八疊球菌屬 (Methanosarcina spp.)及甲烷絲菌屬（Methan〇thrix s沖·）等 產甲烧菌在厭氧消化中亦為甲烷生產者。儘管乙酸及 私/(：〇2係可在自然環境中利用的主要底物，但甲酸、甲 醇、甲胺、及CO亦可轉化成ch4。 圖1係可產生發酵殘餘物之乙醇生產過程的流程圖，該 等發酵殘餘物包括但不限於本發明之具有可溶物或固體之 乾燥酒糟（DDGS)。許多飼料產物可自該乙醇生產過程生 成，該過程經常利用（例如）玉来作為所述初始材料，但應 理解亦可將其他碳水化合物或殿粉源(例如，其他穀物產 物）納入本發明中。 A.碳源 本發明之發酵過程藉由提供微生物及該等微生物可在 上生長的韻來進行。在某些實施例中，該等微生物指 =自此等碳源進人可生成卫業化學製品之酶通道。舉例 言，酵母菌藉由糖解途徑將葡萄糖轉化成乙醇。有許多 用於本發明發酵過鞋卢 ° 尥私之奴/原。在一個實施例中，該碳源 生物質’即植物材料。用於大多數商業醇生產之原材料 ==作物衍生物’包括穀物及水果。該材料可 整體或可藉由（例如彳仰^礙1 )研磨或碾碎來加工。舉例而言，該 120117.doc -23- 200815596 源可包括玉米、小麥、蜀黍、燕麥、大麥、稻夫 樑、馬鈐箸、乳清、甜菜、芋頭'樹薯、水果、二、局 發明發酵過程中所用碳源可為天然的、經化二 ^ 猎由本發明之經改造微生物來發酵之β

:的實包括但不限於玉米、芸苔、苜蓿、稻、裸:: ^向日葵/、麥、大豆、煙草、騎薯、落花生^ 化甘薯、树薯、咖啡、椰子、掛橘樹、可可果、茶葉、 水果(例如’香蕉、無花果、鳳梨、番石權、芒果):、燕 ^、大麥、蔬菜、觀賞性植物、及針葉植物。較佳碳源: 農作物植物’例如，縠粒及豆類植物、玉蜀黍：小麥、蜀 黍、f麥、莧、稻、高樑、粟、樹薯、大麥、豌I、： 薯、芋頭、馬鈴薯、及其他根農作物、塊莖農作物、或種 子農作物。呈諸如玉米秸稈、稻草、堆肥等來自農業之廢 物形式的生物質及諸如柳枝稷或白揚樹、柳樹等生物質農 作物以及諸如報紙等城市廢物全部均可轉化成醇。該碳源 可包括任一適當的碳源，例如，木材、廢紙、堆肥、乾酪 乳清、蜜糖、甜菜或甘蔗。該碳源亦可包含未經水解玉米 糖漿或玉米澱粉，其係廉價的碳源。該碳源可包括用於諸 如產乙酸菌及產甲烷菌等厭氧菌及用於光合微生物之二氧 化碳。 用於發酵之較佳含碳起始材料係玉米且具體而言，係玉 米澱粉。玉米之約2/3係殺粉，其在發酵及蒸館過程期間 轉化成乙醇及二氧化碳。其餘營養素或發酵殘餘物可形成 濃縮酒糟可溶物或酒糟（例如，DDGS)，其可用於飼料產 120117.doc •24- 200815596 品0 一般而言，該過程涉及齡 v及乾知磨碎或碾碎玉米之初始製 牛:中1後對經加工玉米實施水解並加入酵素以在糖化 提刀解主要的殿粉組份。在添加依照本發明實施例所 ==造微生物㈤如，料g)後可進行下料酵步驟 κ 如一乳化碳等氣體產物。實施該發酵以產生可自 备酵液蒸餾之乙醇。隨後可 11酵乓養基之剩餘物實施乾 =生包含臟S在内的發酵殘餘物。此步驟通常包括 =，心實施的固體/液體分離過程，其中可收集固相組 2 I括過濾及噴霧乾燥技術之其他方法可用於實現此分 離。然後，可對液相組份進一步本 乂 κ靶蒸發步驟，其可濃縮 2糖、甘油及胺基酸等可溶性副產物，之後與固相組份 相合以作為發酵殘餘物㈣乾燥。應理解：該等本發 明組合物可應將基於乾燥磨碎之新穎或已存在的乙醇工 廠以提供亦可產生具有增加價值之發酵殘餘物的完整乙醇 生產過程。 依“、、本發明所生成較佳發酵殘餘物較習用發酵殘餘物且 有更高的商業價值。舉例而言，該等發酵殘餘物可包括且 有較高胺基酸及微量營養素含量之經增強乾燥固體，例 如，DDGS。因此’可提供"金色"DDGS產物，與深色 相tb纟通系暗不具有更高胺基酸可消化性。舉例 而言’依照本文較佳實施例可產生與通常具有較小營養價 值之較深色產物相比具有增加離胺酸濃度之淺色DDGS。 該等產物之顏色在評定發酵殘餘物或DDGS之品f及營養 素可消化性中往往係重要的因數或指標。顏色在引起:糖 120117.doc -25- 200815596 、及游離胺基與糖之MiUard反應(可降低某些胺基 酸=質）期間用作暴露於過量熱量之指標。 目1中所示乾燦磨機或礙機乙醇生產過程之基本 7驟闡述如下.磨碎或礙碎玉米或其他穀物產物、糖化、 酵、及瘵餾。舉例而言’通常可使用錘式磨機或輥式磨 . 齡磨碎或料㈣擇整個玉米核仁。粒徑可影響蒸煮水 合作用及後續酶轉化。經磨碎或礙碎玉米隨後可與水混合 H備擬蒸煮及冷卻之㈣。其可心在此轉化之勒始步 ㈣間納人酵素以降低膠化殺粉之黏度。隨後可將該混合 物^至糖化反應器，保持在選擇溫度（例如，1〇4卞）下， 此t藉由添加糖化酵素將殿粉轉化成可發酵糖，例如，葡 萄糖或麥芽糖。可將經轉化醇液冷卻至期望溫度（例如， 84 F )並供給發酵反應器’在其中藉由使用依照本發明所 提供的經增強酵母菌選擇菌株（其可產生與較傳統成份相 比更具營養性之發酵殘餘物，例如酵母屬酵母菌）將可發 籲#糖轉化成二氧化碳。可閃蒸所得哮酒以分離出二氧化碳 且可將所得液體供給由蒸顧柱及汽提柱構成之回收系統。 : 彳將乙醇蒸氣導人分子篩，在其中藉助吸附技術去除剩餘 纟°經少量汽油變性之純化乙醇可產生燃料級乙醇。另一 _ I物可藉由進—步純化初㈣出物乙醇以去除雜質形成用 於非燃料用途之約99.95%乙醇來製備。 可自蒸餾單元底部收回全部釜餾物並離心以產生渴酒栌 (而G)及稀㈣物（液體）。DWG可以濕度離開離: 機，且可作為濕的牛飼料或作為依照本發明提供的乾燥經 120117.doc • 26 - 200815596 增強發酵殘餘物㈣。此等殘餘物包括本文可稱作乾燥酒 糟（DDG)之經增強終產物。利用蒸發器可將稀純物（液 體）漢縮以形成酒糟可溶物，可將該酒糟可溶物再次添加 至酒糟過程蒸其中並與該蒸汽組合且乾燥。本發明較佳實 施例之此合併產物可作為具有增加胺基酸及微量營養素含 量之含可溶物經增強發酵殘餘物或乾燥酒糟⑽gs)銷 售。應理解：除可制於彼等本文所述相外，本發明之 各概念可應用於該領域中已知的其他乙醇生產及發酵過 程0 本發明乙醇生產過程之說明性實例顯示於圖7中。 本發明亦包括在濕式磨碎過程中實施的發酵。濕式磨碎 過程涉及在㈣之前實施處理以為發_㈣造更純淨的 輸㈣心’對於玉米濕式磨碎過程可用於 去除胚牙、纖維、及穀蛋白，剩餘對其實施發酵之殺粉裝 液。濕式磨碎過程之叫目優點係其可在制結束時回收酵 母函並在後㈣酵中使用該酵母菌。另外，該過程可因合 酵母菌濃度而迅速開妒，^ 止不需要有機體大:L—母菌濃度可能有助於防 本發明之一個實施例係_ ή ，、種刀別發酵各物質並將發酵材 η仔改良發酵輸出物之方法。在此混合之後可跟 隨進-步處理’包括額外的發酵。在歷史上，可以單：： 段發酵難發酵且在為情況下依序藉由多重條件: 酵。娜發酵可提高在多重條件(例如，厭氧及需氧τ); 產生不同的發酵產物之能力。 成乳及而虱）下 120117.doc -27- * 200815596 習知發酵僅藉由順序發 ,山 酵步驟實施。舉例而言，為掣供 啤酒中，將麥芽與蛇麻草 在i備 起發酵。通常，在主要發步驟中— 剩餘物實施額外的發酵過程 、對 後，啤酒已經具有期望㈣ 4㈣的㈣步驟之 一 特性且可將其裝人瓶中。在釀酒工 業中，發酵可用於將播 社曝酒工 將糖轉化成醇。其亦可僅以依序方式實 施。在主要發酵之後，可丰^甘ta 斤万式只 施額外的發酵過程。通當斟^ 了刃餘物貝 如 I吊對一種以上底物實施發酵。舉例 而言，在蘋果酸轉乳酸發酵中 蘋果酸生成乳酸。 吊運用— 人發酵來發酵 在燃料乙醇工業中’常用實踐係實施單_發酵以將所存 在碳水化合物轉化成乙醇。此過程闡釋於圖8中。此步驟 可將90%以上可利用澱粉轉化成產物，例如，乙醇及二氧 =碳業中已知：酵母菌可在處於可實現高生物質、 尚固醇含置、及/或高酵母菌細胞數量之條件下的"接種"罐 中迅速地生長。此等"接種"發酵隨後供後續乙醇發酵過程 使用在d序罐巾^續發酵係單―發酵過程並與單一罐 中皁-發酵達成相同發酵結果1經考慮實施額外的發酵 以進一步發酵殘餘物化合物。 本發明涉及在可產生不同發酵副產物之不同條件下以並 行方式實施發酵的發酵過程。隨後可合併該等不同的發酵 副產物以實施進一步處理，例如，萃取、蒸餾、額外發 酵、脫水、或乾燥。 本發明之一個實施例係其中分別實施及組合至少兩個不 120117.doc -28 - 200815596 同的發酵㈣良整個發酵過程之發酵過程。該等發酵可為 同日守的或不同時的。發酵實踐可能需要該等發酵不具有等 同的時私。-或多個發酵可為連續發酵。在過程巾或在組 口物中τ以不同的方式實施並行發酵。此等不同可包括 下列之一或多個：雪 而礼、厭氧、高增長、低增長、高生物 貝、低生物質、解除抑制基因表現、抑制基因表現、真 核原核、低新陳代謝、高新陳代謝。並行發酵中之培養 基亦可藉由例如包括改變下列性質中之多個而有所不同： /辰度、組成、pH、微量營養素、黏度、發酵過程、接種 率/皿度^拌、流量、懸浮液、壓力或不同的發酵時 間本卷明之一個實施例係使用不同條件以獲得不同步發 酵：其中不同的並行發酵具有一或多個下列特性：較迅· 較緩慢、連續對不連續、連續對分批、分批對分批、用於 迅速生長發酵之較小發酵設備的使用、用於緩慢進行發酵 之較大發酵設備的使用。 本發明之並行發酵可產省以單一階段或連續發酵難以生 成或以不經濟的方式生成之產物。舉例而t，酵母菌（釀 酒酵母）於氧存在時較不存在氧時生長更迅速。因此，若 需要-種含有高比例酵母菌之產物’則較佳可實施並行發 酵，其中-個發酵係在有氧條件下實施以生成高產率酵母 菌生物貝同日卞在無氧條件下實施並行發酵以產生高濃度厭 氧產物，例如，乙醇。此以示意圖方式闡述於圖9中。此 過程能約產生期望結果、含有較多酵母菌之發酵殘餘物並 同時生成乙醇。 120117：d〇c -29- 200815596 本發明之並行發酵亦允許在實施額外處理以生成產物之 前組合兩個物流。圖10展示此通用過程。過程丨可為—可 去除不可經釀酒酵母發酵之殘餘物化合物的第三發酵步 驟。圖11闡述一個可將原材料預處理形成不同物流之本‘ 明方法。此方法使得能夠使用來自玉米核仁之玉米纖維藉 由直接纖維素轉化來發酵或藉由纖維素發酵微生物（^ 如，紅褐肉座菌（Hypocreajec〇rina))來發酵。

-個較佳實施例係利用纖維素酶酵素將纖維素轉化成葡 萄糖。隨後可藉由常見酵母菌發酵該葡萄糖。較佳情形為 在不同條件下實施此發酵以促進纖維素至㈣糖之迅速轉 化。可在發酵2中對殿粉實施發酵以生成乙醇並組合 果以用於進一步加工。 本發明之另„_較佳實施例展示於圖^，其闡明更複雜 的分館流。在改進分館之後可實施改進處理。如在立他實 施例中—般，發酵丨可為需氧型且發酵2可為厭氧型。過程 二可'生成乙醇之發酵液濃縮’過程2可包括乾燥、蒸發 及' 脂肪酸至生物柴油之轉化。 只 本發明之另—實施例分3個並行發酵展示於n 一 t佳實施例，第—發酵細粉之需氧發酵，第二發酵係殿 -之厭巩發酵且第三發酵係纖維素至 為油至生物柴油之轉化。 ㈣或其可 並行發酵方法之另—優點係以不同步 力。藉由對發酵過程實施去耦入7讀酵之能 發酵。特定在最㈣件下實施各 寺疋。之了在適合㈣速生長之獨立設備中實施 1201i7.doc -30- 200815596 k速發酵。此等设備包括較小罐、較佳溫度調控（冷卻）、 改進呂養素投與、及用於改良生長、進料及代謝產物交換 之改進流體流動。 本發明之並行發酵過程可用於增加產物，例如，使各發 料備在不同條件下進行發酵在現代生物燃料生產中具有 ； 高利用率。對於不闕產物生產、料不同生長率和濃 度、及對於不同有機體而言，分別實施各發酵過程可有助 φ 於以不同氧濃度、不同營養素組成、不同基因表現濃度、 不同pH、不同培養基、不同溫度、不同生長模式實施發 酵。 在本發明之另-實施例中，使用酵母菌對玉米殿粉或玉 米粉實施厭氧發酵以在具有限制生物質生長之條件下產生 代謝副產物，使該等細胞在46_48小時内加倍或成四倍。 可在不同條件下以並行方式實施另一發酵。舉例而言，不 同的酵母菌菌株可在具有支持需氧生長至高生物質產率 • 0G%生物f)之額外營養素的底物上以需氧方式生長。二 錢酵可受益於改進通風、改進懸浮液、不同pH、抑制需 : ^、、、田g之額外抗生素、及改進冷卻。此發酵可能需要^小 時完成，此乃因不同的生長特性、較高生物質生長限制、 ‘ 及代謝副產物（例如，乙醇）之生長抑制減少之故。在不同

過程中分別實施各發酵可使得發酵產物達成較高產量 高價值。 X II·動物飼料 本發明之另—態樣係關於具有較高營養素濃度之完全動 120117.doc -31 - 200815596 物飼料，其包括藉由較高營養素濃度表徵之經改造微生 物，該等營養素包括但不限於脂肪、脂肪酸、脂質（例 如，磷脂）、維他命、必需胺基酸、肽、蛋白質、碳水化 合物、固醇、酵素、及微量礦物質（例如鐵、鋼、鋅、 • 錳、鈷、碘、硒、鉬、鎳、氟、釩、錫及矽）。 * 發酵殘餘物 在本發明之發酵過程中，可藉由可生成醇及其他氣體產 物之經改造微生物將碳源水解成其組份糖。氣體產物包括 二氧化碳且醇包括乙醇。在該發酵反應後所獲得發酵殘餘 物通常具有較高商業價值。在一個態樣中，含有經改造微 生物之發酵殘餘物較彼等缺少經改造微生物之殘餘物具有 較高營養素含量。經改造微生物可存於發酵系統、發酵湯 及/或發酵生物質中。可對該發酵湯及/或生物質實施乾燥 (例如，喷霧乾燥）以生成具有較高營養内容物含量之發= 殘餘物。 x • 舉例而言，依照本發明可改進在發酵過程之後回收的廢 乾燥固體以提供改1DD(^DDGS(經常稱作具有可溶物之 乾燥酒糟）。此等發酵殘餘物通常為無毒的、生物可降解 • ^、易㈣得的、廉價的且富含營養素。微生物及發酵條 #之選擇對於產生用作飼料或營養補充物之低毒性或無毒 性發酵殘餘物係十分重要的。儘管葡萄糖係自穀粒殿粉水 解所生成主要糖，但其通常並非碳水化合物所生成唯一的 糖。不同於自傳統乾式磨機乙醇生產過程所產生含有大量 非知^水化合物（例如，以中性去污纖維量測得多達35% 120117.doc -32- 200815596 之纖維素及阿拉伯木聚糖，以乾重計）之ddg 解非澱粉碳水化合物所生成富含營養 ：= 物對於非U動物而言係、更可π且更Μ化的。發酵殘餘 本發明之富含營養素發酵殘餘物之組成可不 乾式磨機乙醇生產過程所產生DDG及其他酒糟副產物：： 成’該卿及其他酒糟副產物係藉由於不存在 改

造微生物時對全㈣碎玉米中所存在《實施發酵來% 得。本發明之富含營養素發酵殘餘物可具有自至少約二 量％至約95重量％之營養素含量。營養素含量之範圍較佳 係至少約1〇重量％_20重量％、2〇重量％_3〇重量％、π重量 %，重量％、40重量％，重量％、5〇重量%姻量％二 ，量％-7〇重量％、及70重量％_8〇重量％。可利用營養素含 量可視食用其之動物及腾食中其餘物之情況、及動物生命 週期之階段而定。舉例而言’肉牛較乳牛需要更少組胺 酸。對於飼養動物之適宜營養素含量之選擇為彼等熟習此 項技術者所熟知。 該等發酵殘餘物可作為噴霧乾燥生物質產物來製備。視 情況，該生物質可藉由已知方法（例如，離心、過濾、分 離、傾析、分離與傾析之組合、超濾或微量過濾）加以分 離。可進一步處理生物質發酵殘餘物以便於繞過瘤胃。在 一個實施例中，該生物質產品可自發酵培養基分離、經噴 霧乾燥並視情況經處理以調控其繞過瘤胃，並將其作為營 養源添加至飼料中。除了可在含有經改造微生物之發酵系 統中產生富含營養素之發酵殘餘物之外，該富含營養素之 120117.doc -33- 200815596 發酵殘餘物亦可在轉基因植物系統中產生。用於產生轉基 口植物系統之方法為此項技術所熟知。或者，當經改造微 生物宿主可分泌營養素内容物時，富含營養素之發酵液可 自猎由發酵所生成生物質分離且澄清發酵液可用作動物飼 料成份，例如，呈液體形式或喷霧乾燥形式。 在利用經改造微生物實施發酵反應之後所獲得發酵殘餘 物可用作動物飼料或用作供人類使用之食物添加劑。該發 酵殘餘物包括至少一種具有源自非動物源（例如，細菌、 酵母菌、及/或植物）之較高營養素含量的成份。特定言 之，該等發酵殘餘物富含下列物質之至少—種或多種··脂 肪月曰肪酉夂月曰貝（例如，磷脂）、維他命、必需胺基酸、 肽蛋白貝、奴水化合物、固醇、酵奮、及微量礦物質 (例如，冑、銅、鋅、錳、鈷、碘、硒、鉬、鎳、氟'、 鈒、錫及石夕）。較佳地，該等肽含有至少一種必需胺基 酸。較佳地，該等必需胺基酸囊封於發酵反應中所用本發 明經改造微生物内部。更佳地，該等必需胺基酸包含於^ 由微生物表現之異源多肽中。當需要時，該等異源多肽可 以存於適宜可發酵微生物（例如，酵母®)中之包含體形式 表現及儲存。 a.動物飼料組合物 在個&樣中’該等本發明經改造發酵殘餘物具有高營 養含量。因此’可在完全動物飼料中使用較高百分

酵殘餘物。在某4b f旆你I * h w a X 貫％例中，飼料組合物包括至少約15曹 里％之發酵殘餘物。在完全顧 飼枓或膳食中，可將此材料與 120117.doc -34- 200815596 其他材料-起供給。視其他材料之營養含量及/或供給該 飼料之動物的營養需求而定，經改造發酵殘餘物可佔飼料 至卿。。在某些實施例中，本發明發酵殘餘物由 於雨言養素含量，因此可降低摻合百分比。在其他實施例 中’该等本發明發酵殘餘物可占非常高的比例（例如，大 於75%)。在適宜實施例中，該飼料組合物包括至μ 麟、至少約25%、至少約鄕、至少約35%、至少約 4〇%、至少㈣％、至少約5G%、至少約咖、至少約观 或至少約75%之本發明發酵殘餘物。經常地，該飼料植人。 物包括至少約20重量％之發酵殘餘物。更經常地，該飼： 組合物包括至少約15_25重量％、25_2〇重量％、2〇姻量 %、3〇%-40重量％、4〇%_5〇重量％、5〇重量％_6〇重量％或 6〇重量。重量％之發酵殘餘物。當需要時，該等本發明 發酵殘餘物可用作飼料之唯一來源，尤其是用於家禽(例 如’雞、鴨及鶴）及豬之飼料。亦可在含有發酵殘餘物之 飼料中添加營養素。 出於各種目的’例如，牛奶生產、增加體重及動物健康 狀況之整體改良’完全動物飼料可具有與一或多種必需胺 基酸相關之較高胺基酸含量。完全動物飼料可具有較高胺 基酸含量’此乃因發酵殘餘物中存在游離胺基酸及/或存 在包含必需胺基酸之蛋白質或肽之故4需胺基酸可包括 組Μ '離胺酸、曱硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、異白胺 酸、及/或色胺酸，其可作為游離胺基酸或作為富含所選 擇胺基酸之蛋白質或肽的一部分存於完全動物飼料中。富 120117.doc -35- 200815596 含至少—種必需胺基酸之肽或蛋白f可具有佔肽或蛋白質 中胺基酸殘基總量之至少1%的必t胺基酸殘基、佔肤或 蛋白質中胺基酸殘基總量之至少5%的必需胺基酸殘基、 或佔蛋白質中胺基酸殘基總量之至少⑽的必需胺基酸殘 基。藉由將營養素平衡膳食供給動物，可最大程度地利用 營養成份，即需要較少飼料來達成相當的生長速率、牛奶 生產、或減少排泄物中所存在營養素，進而減少該等廢物 之生物質負荷。 具有較高必需胺基酸含量之完全動物飼料可具有佔粗蛋 白質重量及胺基酸總含量之至少2.0重量％且更適宜地，具 有佔粗蛋白質重量及胺基酸總含量之至少5〇重量％的必需 胺基酸含量（游離必需胺基酸及存於蛋白質或肽中之必需 胺基酸）。該完全動物飼料組合物包含源自經改造微生物 之其他營養素，包括但不限於脂肪、脂肪酸及脂質（例 如，磷脂）、維他命、碳水化合物、固醇、酵素、及微量 礦物質。 該完全動物飼料組合物可包括完全飼料形式組合物、濃 縮形式組合物、摻合物形式組合物、及基礎形式組合物。 倘若該組合物係呈完全飼料形式，當該等營養素係於發酵 殘餘物中，由經改造微生物獲得時，則營養素百分比濃度 可為約10°/。至約25%，更適宜地，為約14%至約24%，·而若 該組合物係呈濃縮物形式，則營養素濃度可為約3〇%至約 5〇/σ，更適宜地，為約32%至約48%。若該組合物係呈摻 合物形式’則組合物中營養素濃度可為約2〇%至約3〇%， 120117.doc -36- 200815596 更適宜地，為約24%至约26% ;且婪分z 入舲《η r 右該組合物係呈基礎混 a物形式，則組合物中營養素濃度 除非本文另有說明，否則所述百分比 若刪S富含單—營養素（例如;^ 1百分比言卜 作補充物；若其在胺基酸與維他命（心㈣可依低比率用 1¾ ^ ^ ^ Μ (例如，維他命Α和Ε)方 面係千衡的，則其係更完全飼

If I ^ I π 了將其以更高比率供給 兮詗^ 京原枓（如玉米秣草）補充之。 該飼枓組合物可包含存於且 ^ ^ ^ ^ ^ 、/、有至父約2%必需胺基酸含 里之發酵殘餘物中的肽或粗 φ , H, , ^ ^ T糞白貝部分。在適宜實施例 ^ 肽或粗蛋白質部分可且古 /、有至：>、約3%、至少約5%、至 >、約10%、至少約15%、至 .Λ0/ ^ 、力20/°、至少約30。/。、至少約 ° (在適宜實施例中）至少约π〇/ 旦 + * )夕約50%之必需胺基酸含 里0在某些實施例中，兮脱 μ 可為100%必需胺基酸。經常 地，該飼料組合物可包括存 人曰 々 仔於具有咼達約10%必需胺基酸 含Ϊ之發酵殘餘物中的 A 肌次粗蛋白質部分。更經常地，該 飼枓組合物可包括存於呈 .Λ0/ 、/、有、、勺 2-10%、3.0-8.0%、或 4.0- 6·0%必需胺基酸含蕃之级祕& 分。 ^酵殘餘物中的肽或粗蛋白質部 該飼料組合物可包含存 ^ 予於具有至少約2%離胺酸含量之 發酵殘餘物中的肽或粗 . A ^ 貧白貝部分。在適宜實施例中，該 肤或粗蛋白質部分且 ,πο/ 八有至少約3%、至少約5%、至少約 10%、至少約15%、 ^0/ ν約20%、至少約30%、至少約 。、及（在適宜實施例中 赍 4 “ ]千）至少約50%之離胺酸含量。通 吊，該飼料組合物可包 1枯具有多達約1〇0/〇之離胺酸含量的 120117.doc -37. 200815596 肽或粗蛋白質部分。當需要時，該飼料組合物可包括具有 力2_1〇%、3〇_8〇%、或4〇_6〇。乂之離胺酸含量的肽或粗蛋 白質部分。 該飼料組合物可包含以自約1克/公斤乾燥固體至9⑽克/ 公斤乾燥固體存於發酵殘餘物中之營養素。在某些實施例 中，飼料組合物中之營養素可以至少約2克/公斤乾燥固 體、5克/公斤乾燥固體、1〇克/公斤乾燥固體、5〇克/公斤 乾燥固體、100克/公斤乾燥固體、2〇〇克/公斤乾燥固體及 約300克/公斤乾燥固體存在。在適宜實施例中，該等營養 素可以至少約400克/公斤乾燥固體、至少約5〇〇克/公斤乾 燥固體、至少約600克/公斤乾燥固體、至少約7〇〇克/公斤 乾煉固體、至少約800克/公斤乾燥固體及/或至少約9〇〇克/ 公斤乾燥固體存在。 該飼料組合物可包含存於具有約1克/公斤乾燥固體至 900克/公斤乾燥固體之含量的發酵殘餘物中的必需胺基酸 或含有至少一種必需胺基酸之肽。在某些實施例中，飼料 組合物中之必需胺基酸或含有至少一種必需胺基酸之肽可 以至少約2克/公斤乾燥固體、5克/公斤乾燥固體、1〇克/公 斤乾燥固體、50克/公斤乾燥固體、1〇〇克/公斤乾燥固體、 200克/公斤乾燥固體及約300克/公斤乾燥固體存在。在適 宜實施例中，該必需胺基酸或含有至少一種必需胺基酸之 肽可以至少約400克/公斤乾燥固體、至少約5〇〇克/公斤乾 燥固體、至少約600克/公斤乾燥固體、至少約7〇〇克/公斤 乾燥固體、至少約800克/公斤乾燥固體及/或至少約9〇〇克/ 120117.doc -38 - 200815596 公斤乾燥固體存在。

該飼料組合物可包含非動物來源之瘤胃保護胺基酸源， ，、可包括瘤胃保護離胺酸或其他必需胺基酸及，或富含瘤 胃:護胺基酸之蛋白質或肽，更佳為富含必需胺基酸之蛋 白二或肽。游離必需胺基酸或富含必需胺基酸之蛋白質或 肽可藉由與至少-種還原性碳水化合物(例如，還原性糖) 2與至少-種㈣岐應來料瘤胃1线原性碳水化 物可包括木糖、乳糖、及/或葡萄糖。適宜脂肪酸可包 括至少部分經氫化之植物油’例如，大豆油。該瘤胃保護 胺基酸源可能夠將至少㈣％瘤胃保護胺基酸遞送至後瘤 胃。更經常地，該瘤胃保護胺基酸源可能夠將至少約 5〇%、60%、7G%、8G%或鳩瘤胃保護胺基酸遞送至後瘤 胃。 該完全動物飼料組合物可含有呈在發酵期間所形成生物 質形式之富含營養素發酵殘餘物及至少一種額外的營養素 ，在另Λ例中，該飼料組合物可含有溶於或懸浮於 發酵期間所形成發酵液中之富含營養素發酵殘餘物及至少 種額外的★養素組份。在再__實施例巾，該飼料組合物 二有13至夕種虽含必需胺基酸之蛋白質的粗蛋白質部 分》可調㈣飼料組合物以將改良平衡必需胺基酸遞送至 後瘤胃。 該完全飼料形式組合物可含有一或多種成份，例如，粗 =麥粉—(wheat middlings)("小麥粗粉_广）、玉 米、大丑粉、玉米穀蛋白粉、酒糟或具有可溶物、鹽、主 120117.doc -39- 200815596

要礦物質、微量礦物質及維他命之酒糟。其他潛在成份經 常可包括但不限於向日葵粗粉、麥根及大豆皮。摻合物形 式之組合物可含有粗小麥粉、玉米穀蛋白粉、酒糟或具有 可溶物、鹽、主要礦物質、微量礦物質及維他命之酒糟。 替代成份經常可包括但不限於玉米、大豆粉、向日葵粉、 棉軒粉、麥根及大豆皮。基礎形式組合物可含有粗小麥 粉、玉米縠蛋白粉、及酒糟或具有可溶物之酒糟。替代成 份經常可包括但不限於大豆粉、向日葵粉、麥根、主要礦 物貝、被里礦物質及維他命（Messm an等人之美國公開案第 2006/0039955號，該案之全文以引用方式併入本文中）。 經改造微生物中高度不飽和脂肪酸（hufa)在暴露於氧 化條件時可轉化成不期望的不飽和脂肪酸或飽和脂肪酸。 然而，可藉由向飼料中導入合成抗氧化劑或天然抗氧化劑 (β-胡蘿蔔素、維他命E及維他命C)來降低ω_3 HUFA之飽和 度或防止其達飽和。可藉由將合成抗氧化劑（例如， BHT、BHA、TBHQ或乙氧基奎寧）或天然抗氧化劑（例如， 生育酚)加入產物中來將該等抗氧化劑納入食物或飼料產 品中或該等抗氧化劑可藉由在適宜經改造有機體中就地生 成來納人。以A方式所納入抗氧化劑之量可視（例如）後續 用途需要(如，產物調配、封裝方法、及期望存架壽命二 若該過程以人用級別輸人材料開始並觀測整個過程中人 用食品品質標準，則發酵殘餘物或含有本發明發酵殘餘 之完全飼料亦可用作供人_費之營養補充物。如本發明 120117.doc -40- 200815596 所揭示發酵殘餘物或完全飼料具有高營養含量。諸如蛋白 質及纖維等營養素與健康的膳食相關。可在諸如毅物、脆 餅、鶴餅、餅乾、蛋糕、比薩餅皮、夏季香腸、肉丸、混 合飲料（shakes)及任—形式之可食用食物等食物中研究利 用本發明之發酵殘餘物或完全飼料的處方。另—選擇可為 將本發明之發酵殘餘物或完全飼料形成速食或類似於可容 易地食用及方便地分發之甜燕麥穀條（⑽。ia㈣的速食 條（snack bar)。速食條可包含來自穀粒之蛋白質、纖維、 胚芽、維他命、礦物質以及諸如葡萄糖胺、ΗυρΑ等營養 製品或諸如維他命Q-Π)等辅助因子。亦可將本發明之:養 發酵殘餘物納入國内食品規劃（例如，學校供午餐及^車 送餐)中。 "、 可進一步使用期望矯味劑補充動物飼料及包含本發明發 酵殘餘物之供人類使用的食物添加劑。特定矯味劑之選擇 應視食用該飼料之動物而定。該等矯味劑及芳香劑-天然 及人造-可用於製備更易接受及更可口的飼料。此等補充 物可與所有成份充分混合且可以液體或乾燥產品形式獲 得。可補充於動物飼料中之適宜矯味劑及芳香劑包括但^ 限於葫蘆巴、香蕉、櫻桃、迷疊香、孜然芹、胡蘿气、薄 荷牛至、香草、菌香和蘭姆（rum)、槭樹、焦、糖、掛橘 油、丁酸乙酯、茴香醚、蘋果、肉桂、任一其天然或人工 組合。:般而言，包括葫蘆巴、，蕉及樓桃之橋味劑^ 馬而言係尚度期望的，香草槭樹及茴香對於牛而+係一 期望的且朗姆、聚果及椰子對於豬而言係高度期望的^ ^ 120117.doc •41- 200815596 等矯味劑及芳香劑在不同動 ^ 中可相互父換。類似地，可 、種人造或天然水果矯味劑添加至供人類消費之含本發 明發酵殘餘物的食物添加劑中。 存架奇命 本發明之發酵殘餘物或完全飼料之存架壽命通常可能較 ?少經改造微生物之發酵殘餘物的存架壽命更長。該存年 舞命可視諸如下列等因素而定：產物之水份含量、流動經

=進料堆之空氣量、環境條件及防腐劑之使用。可將防腐 別添加μ全飼料以使存架壽命增加至數周或數月。增加 存架壽命之其他方法包括類似於青貯飼料管理之管理，例 如，與其他飼料混合並封裝，用塑料覆蓋或裝袋。冷條 :、^^腐劑及自進料堆排出空氣均可延長濕副產物之存, 壽命。該完全飼料可在燃料倉或青貯袋中儲存。乾燥渴發 酵殘餘物或完全飼料亦可增加產物之存架壽命及改良調度 和品質。 ^ 本發明之完全飼料可長期儲存。可藉由青貯法、添加諸 如有機酸等防腐劑或與諸如大豆皮等其他飼料混合來延長 存架壽命。商品箱或大容量存儲棚可用於儲存完全飼料。 III·經改造微生物 可用於本發明發酵反應之適宜微生物包括原核細胞及真 核細胞。較佳微生物可生成可用作飼料或營養補充物之低 毒或無毒發酵殘餘物。較佳生物系統包括真菌、細菌、及 微藻系統。更佳的生物系統係真菌細胞培養物，更佳者為 酵母菌細胞培養物’且最佳者係釀酒料細胞培養=。4 120117.doc -42- 200815596 藉由經典微生物技術及基因工程技術二者操控真菌。較佳 原核生物係大腸桿菌。用於本發明之較佳微藻包括小球藻 (Chlorella)及原壁菌（Prototheca)。可經改造用於本文所揭 示發酵過程之酵母菌之某些實例包括（僅作為實例）釀酒酵 母、卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis)、乳酸克魯維 酵母菌（Kluyveromyces lactis)、乳酸酵母（Saccharomyces lactis)、馬克斯克魯維酵母菌（Κ· marxianus)、或脆壁克魯 維（K. fragilis)酵母菌、及酒香酵母屬（Brettanomyces sp·) 等。可經改造用於本文所揭示發酵過程之細菌的某些實例 包括（僅作為實例）發酵單胞菌屬.、大腸桿菌、棒狀桿菌、 短桿菌、芽孢桿菌屬等。該發酵可為利用諸如梭狀芽胞桿 菌屬微生物（例如，熱乙酸梭菌（Clostridium thermoacetium) 種或蟻醋酸梭菌（Clostridium £〇〇111(：〇&〇61^11111)種微生物）等 產乙酸菌之同型乙酸發酵。該發酵可為利用乳桿菌屬 (genus Lactobacillus)微生物之乳酸發酵。或者，碳水化合 物來源在利用雙歧桿菌之初始發酵中可轉化成乳酸、乳酸 酯、乙酸、乙酸酯、或其混合物。 該微生物可以使經改造微生物具有較高營養素含量之方 式受到改造。該經改造微生物可富含如下列（僅作為實例） 之營養素：脂肪、脂肪酸、脂質（例如，磷脂）、維他命、 必需胺基酸、肽、蛋白質、碳水化合物、固醇、酵素、及 微量礦物質（例如、鐵、銅、鋅、猛、始、蛾、砸、錮、 鎳、氟、釩、錫及矽）。該等脂肪酸包括飽和脂肪酸及不 飽和脂肪酸，其中不飽和脂肪酸包括ω-3高度不飽和脂肪 120117.doc -43- 200815596 酸。ω-3高度不飽和脂肪酸之實例包括但不限於二十碳五 稀酸、二十二碳五烯酸、α次亞麻油酸、二十二破六烯 酸、及其綴合物。

或者，藻類或真菌，例如，破囊壺菌（Thraustochytrium)、 裂殖壺菌（Schizochytrium)等可發酵碾碎的經水解或未經水 解谷粒以生成ω-3 HUFA。其可用於任一類別之穀粒，包 括但不限於玉米、蜀黍、高樑、稻、小麥、燕麥、裸麥及 粟。此過程亦包括作為廉價來源之未經水解玉米糖漿或諸 如釜餾物等農用/發酵產物、玉米至醇發酵中之廢產物的 可替代使用。穀粒及廢產物可以此項技術中已知任一方法 來水解，例如，對用於並行或連續發酵之一或多種及/或 一或多株微生物實施酸水解或酶水解（其全文以引用方式 併入本文之Barclay，William R·之美國專利第5,656,319 號）。不限於此，一實例係使用分泌α澱粉酶之酵母菌實施 發酵以水解澱粉，繼而用一酵母菌發酵葡萄糖生成乙醇。 微生物之其他實例包括但不限於真菌三孢布拉黴 (Blakeslea trispora)、杜氏鹽藻（Dunaliella salina)、紅發夫 酵母（Phaffia rhodozyma)、雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis)、黃桿菌屬（genus Flavobacterium)、橙色 土壤桿 菌（Agrobacterium aurantiacum)、草生歐文菌（Erwinia herbicola)或嗤夏孢歐文菌（Erwinia uredovora)、副球菌屬 (genus Paracoccus)、土 壤桿菌（Agrobacterium)、及產驗桿 菌屬（Alcaligenes)等。可產生有用的產物之各種微生物陳 述於表A中： 120117.doc -44- 200815596

表A 產乙酸菌 蟻酷酸梭菌 熱酷酸梭菌 伍氏產乙酸菌(A. woodii) 產丁酸菌 丁酸梭菌 熱解糖梭菌 極大螺旋藻(S. maxima) 產丁酸曱基營養菌 產乳酸菌 產丙酸菌 嗜澱粉乳桿菌(L. amylophillus) 丙酸丙酸桿菌 乾酪乳桿菌(L· casei) 短乳桿菌〇L brevis) 布氏熱厭氧菌(T. brockii) 阿拉伯糖丙酸桿菌(P. arabinosum) 產丁酸菌 產琥珀酸菌 丁 酸梭菌(C. butyrimn) R. flavofaciens 熱解糖梭菌(C. thermosaccharolyticum) 產琥拍酸桿菌(B. succinogenes) 極大螺旋藻(S. maxima) 產丁酸曱基營養菌(B. methylotrophicum) 產丙酸菌 產己酸菌 丙酸丙酸桿菌(C. Propionicum) C. kluvyeri 產乳酸菌 產乙醇菌 嗜澱粉乳酸桿菌 熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)菌 乾酪乳桿菌 株LQRI嗜熱硫化氫梭菌(Clostridium 短乳桿菌 thermohydrosulforicum)菌株 39E 布氏熱厭氧菌 布氏熱厭氧菌（Thermoanaerobium brockii)菌株 HTD4 胃八疊球菌(Sarcina ventriculi) 白色瘤胃球菌 產丁醇、丙酮-異丙醇菌 產丁醇、丙酮-異丙醇菌 丙 IRI 丁醇梭桿菌(Clostridium acetobutylicum) 丙酮丁醇梭桿菌 丁醇梭桿菌(Clostridium butylicum) 白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus) 丁醇梭桿菌 當需要時，可選擇細菌或酵母菌之菌株用於生產適口矯 味劑。舉例而言，本發明微生物可以藉由該等微生物產生 一或多種增香劑之方式加以改造。增香劑可源自酵母菌 RNA。酵母菌（如，念珠菌屬）可以高達15〇/〇 rna生長。酵 母屬酵母菌（Saccharomyces yeast)可用於製造香味活性化 合物。與麩胺酸單鈉組合之核苷（諸如肌苷單磷酸鹽及 120117.doc -45- 200815596 鳥嘌呤核苷-5，-單磷酸鹽）等可用於香味改良。 在某些實施财，可依照本發明方&進一步改造可在發 f反應中提⑤醇或烧煙產量之經改造微生物以產生具有較 南營養素含量之本發明微生物。 • μ在本發明之某些實碑例中，本發明微生物可以藉由該等 • 4生物產生—或多種色素或著色劑之方式受到改造。某些 酵母菌（❹，紅發夫酵母）可產生稱為蝦青素之粉色色 _ 素。蝦I素係發現於龍瑕、小瑕、鮭魚及火烈鳥（flaming〇) 中之天然色素。可將本發明之全酵母菌或完全動物飼料供 給蓄養魚或甲殼類動物，在蓄養池中該等動物極少會獲得 自^色，由此為鮭魚或海鮮提供特徵肉色以改善市場銷 〇同時，藉由酵母菌提供之其他營養素亦對魚有益。 &·微生物之改造 在某些只施例中，用於發酵反應之經改造微生物包括經 子改這或級基因改造微生物。較佳地，細胞培養物中所 _ 用、、田胞係藉由基因工程技術（即，重組技術）、經典微生物 子技術或此等技術之組合加以基因改造且其亦包括天然 . 基因變體。某些此等技術通常揭示於（例如）s謹brook等

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor Labs Press 中。Sambrook 等人之參考文獻（同 前）的全文以引用方式併入本文中。 本發月涵盍許多可用於形成較改造前相同微生物在發酵 中可產生更大量營養素之微生物的基因改造方式。所 有此等方法為遺傳學及基因工程領域所熟知。 120117.doc -46- 200815596 在一種方法中，利用傳統誘變法並選擇呈現期望性質之 微生物來產生展現增加營養素產量的微生物。舉例而言， Gasnet-Ramireza闡述利用傳統化學誘變法來誘變處理酵母 菌，繼而選擇顯示增加離胺酸產量之酵母菌細胞。 Stepanova 等人（"Lysine Overproduction Mutations in the

Yeast Saccharomyces cerevisiae Are Introduced into Industrial Yeast Strains，" Russian J· Genetics，（2001) 37:460-463)已對酵 母菌細胞實施誘變以增加離胺酸產量。跟蹤觀察增加對毒 性離胺酸類似物抗性之基因及參與離胺酸生成調節之基因 的變化。 在另一方法中，利用重組遺傳學工具對微生物進行基因 改造。已經對用於本發明方法之許多微生物（包括大腸桿 菌、酵母屬及丙酮丁醇梭菌）的完全基因組進行了測序。 舉例而言，丙酮丁醇梭菌之基因組可於http://www.ncbi. nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=genome&cmd=Retrieve&d opt=:Overview&list_uids= 14097&wi ndow=9525&begin=0發 現。特定言之，大腸桿菌及酵母菌基因學為眾人所知。釀 酒酵母菌基因組具有其專用網站：www.yeastgenome.org。 可很好地表徵酵母菌之生化反應途徑。參與若干途徑 之酵素及編碼此等酵素之基因可於如下網站獲知：http:// pathwayyeastgenomeΌrg:8555AΈAST/new-image?type=OVERVIEWifeforce:::rt ° 圖14提供來自此網址之釀酒酵母菌代謝圖的概況圖，該圖 中對確認胺基酸（離胺酸）、輔因子（FAD)、固醇（麥角固醇） 120117.doc -47- 200815596 及脂質（甘油三酸酯）之合成途徑進行了評注。每一條目均 與催化該反應之酵素及編碼該酵素之基因相關聯。

許多策略可用於對微生物進行基因改造以增加營養素產 量。此等策略包括（例如）將包含必需胺基酸編碼多肽之基 因納入該微生物中；使沿營養素合成途徑之酵素超量表 現；抑制其產物可抑制營養素生成之基因；抑制至細胞外 部之營養素轉運；增加進入細胞之營養素轉運並將編碼酵 素之基因導入細胞中以完成或形成酵素及/或產物合成途 徑。 可改造酵母菌以藉由（例如）使酵素沿合成途徑超量表現 來增加營養素產量。此方法闡述於Lin等人， ’’Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris/1 FEMS Microbiology Reviews (2000) 24:45-66中。此方法之另一實例闡述於He等人之（"Overexpression of a sterol C-24(28) reductase increases ergosterol production in Saccharomyces cerevisiae，” Biotechnology Letters (2003) 25:773· 778中），其中經酵母菌細胞原酶基因轉化之固醇C24(28)增 加麥角固醇產量。Rippert 等人（"Engineering Plant Shikimate

Pathway for Production of Tocotrienol and Improving Herbicide Resistance，" Plant Physiol· (2004) 134:92-100)證

實了藉由用釀酒酵母菌之預苯酸脫氫酶基因轉染煙草並使 該基因超量表現可增加維他命E之產量。此基因可催化維 他命E途徑中之反應。儘管該方法用於煙草，但該基因源 於酵母菌。因此，該策略可應用於酵母菌以增加維他命E 120117.doc -48- 200815596 產量。 用於增加營養素產量之另一策略係解除抑制合成酵素。 此策略已由 Dansen 等人（"Regulation of sterol carrier protein gene expression by the Forkhead transcription Λ factor FOX03a，” J· Lipid Research，45:81-88，January ， 2004)證實。對培養物中人類細胞進行基因改造以減少 • F0X03a(—種抑制固醇生成之固醇載體蛋白質）產量。 F0X03a活性減少可使固醇生成受到較少抑制，而此會致 ^ 使固醇產量增加。 用於增加酵母菌中營養素產量之另一策略通常係在基因 上改變該等細胞以積聚營養素而非分泌營養素。此策略之 一個實例闡述於 Kim 等人之 ’’A role in vacuolar arginine transport for yeast Btnlp and for human CLN3，the protein defective in Batten disease/* PNAS (2003) 100:15458- 15462，其中作者藉由剔除負責精胺酸至空泡轉運之酵母 菌中基因bntl來增加細胞内精胺酸積聚。 相反策略涉及增加可將營養素自細胞外轉運至細胞内之 基因的拷貝數。參見（例如）Sychrova等人，"Kinetic properties of yeast lysine permeases coded by genes on multi-' copy vectors，’’ FEMS Microbiol Lett，（1993) 113(1):57-61。 在另一策略中，對一酵母菌實施改造以在氫化可的松合 成途徑中藉由使用許多基因轉染該酵母菌來生成激素氫化 可的松 0 (Szczbara 等人，"Total biosynthesis of hydrocortisone from a simple carbon source in yeast/1 Nature Biotechnology 120117.doc -49- 200815596 (2003) 21:143)。 基因改造微生物可包括其中以如下方式插人、刪除或改 造(即，”藉由插入、刪除、取代及/或轉化核 苷酸）核酸分子之微生物：此等改造可提供增加微生物内 或培養物上清液中營養素產量之期望效應。如本文所用， 可減少基因表現、降低基因功能或降低基因產物（即，營 養素’例如，#由該基因編碼之蛋白質)功能之基因改造 可稱作基因之滅活（完全或部分）、刪除、間斷、阻斷或下 調。舉例而言，可降低藉由此基因編碼之蛋白質功能之基 因的基因改造可為如下之結果：該基因之完全刪除（即， 該基因不存在且因此該蛋白質不存在）、可致使該蛋白質 不完全或不轉移之基因的誘變（例如，該蛋白質未表現）、 或可降低或廢除該蛋白質天然功能之基因的誘變（例如， 使具有降低或不具有酶活性之蛋白質表現）。可增加基因 表現或提高基因功能之基因改造可稱作基因之擴增、過度 生產、超量表現、活化、增強、添加或上調。增加基因表 現之選殖基因的加入可包括將選殖基因維持在複製質粒上 或將該（等）選殖基因整合入所生成有機體之基因組内。而 且，增加期望選殖基因之表現可包括以可操作方式將該 (專）選殖基因連接至天然或異源性轉錄控制單元。 微生物可藉由此項技術中已知方法加以改造且該等方法 係屬於本發明之範圍。僅作為實例，該方法包括操縱營養 素生物合成途徑中之至少一個結構基因，視情況操縱合成 途徑之調節控制且視情況操縱至微生物外部及内部之營養 120117.doc -50- 200815596 素轉運過程。舉例而言，微生物可在胺基酸生物合成之特 定基因中具有若干突變。該方法較佳包括操縱至少一個結 構基因以調節含有至少一種必需胺基酸之肽的合成。 该等本發明微生物可經改造以超量產生諸如必需胺基 酸、維他命、激素、蛋白質、及/或脂質等營養素。當需 要日守，一或多種營養素之生成係處於可在發酵反應期間以 時間依賴性方式直接或間接控制生產之調節序列的控制

下。杈佳地，該等調節序列可以如下方式直接或間接控制 生產· §發酵反應已完成期望百分比（較佳完成至少約 5〇/。，更佳完成至少約6〇%，且更佳完成至少約7〇%至約 90%，且甚至更佳完成至少約95%)時生成期望營養素。當 以此方式加以控制時，諸如醇及氣體產物等發酵產物之產 量不太可能受到影響。 可猎由各種方式監測發酵之進展。舉例而言，可藉由在 』望發酵中 >肖耗至少5G%之葡萄糖總量（當與類似發酵相比 時，或當已添加50%之葡萄糖總量時，或當所放出及所溶 解氧化石反之總里係類似發酵中所放出總量之5〇%時）來證 實！酵反應完成至少5〇%。更特定而纟，可藉由使葡萄糖 各里減少至發酵反應混合物中所存在葡萄糖初始含量 (即’發酵反應開始前所存在 Μ于仕匍萄糖濃度）之小於約5〇0/〇， 或小於期望臨限值濃度（例如， 、、、勺10 0克母公升發酵反應物） 來證實發酵反應完成至少50%。十土 _ ν )υ/。。或者，可藉由其間發生發 酵反應之時間量（通常為麵彳 、 、吊馮頦似發酵所需時間的至少約一半） 來測定完成程度。發酵時門 ^間之知程可介於約1小時至數 120117.doc -51- 200815596 曰，視所提供微生物及發酵起始材料之相應數量而定。一 個熟習此項技術者可容易地確定當給定微生物及起始材料 之數量時在無需過多實驗之情況下發酵反應之標準時程。 在某些實施例中，本發明包括用於發酵反應之經改造微 生物’其包括編碼多肽（例如，編碼在營養素合成途徑中 之酵素）之外源性序列或其包括至少.一種必需胺基酸殘 基’其中外源性序列之表現係處於調節序列之控制下。較 佳地’該等調節序列可直接或間接抑制外源性序列表現直 至該發酵反應已完成期望百分比，較佳完成至少約5〇%， 更佳完成至少約60%，且更佳完成至少約70%至約9〇〇/0， 且甚至更佳完成至少約95%。各種適宜調節序列可應用於 本發明。在某些實施例中，該等調節序列對環境條件（例 如’葡萄糖濃度或者光或熱強度）敏感。舉例而言，若納 入殘餘物中之目標化合物對該微生物有毒性，則人們可能 希望在商業產品生產已充分進行或即將完成時才開始產生 該化合物。非限制性實例包括Rgtl，一種經常僅在葡萄糖 濃度低於某一濃度時可調節己糖激酶表現之轉錄因子（A.

Palomino，j. (2005) 388，697-703)，或當以可操 作方式連接在一起直至發酵反應已完成（例如）至少5〇。/〇時 可抑制外源性基因表現之序列，以及各種來自熱休克基因 之调節序列（例如，rp〇H基因，如Nagai等人在J 厂 1990 May; 172(5): 2710-2715中所述）、毒性基因及孢子形 成基因。特定言之，葡萄糖抑制因子操縱子之啟動可誘導 編碼期望多肽之外源性序列表現。當發酵反應已完成至少 120117.doc -52- 200815596 約50Λ日寸，可啟動匍萄糖抑制因子操縱子。可藉由監測發 酵混合物之葡萄糖含量或藉由監測在發酵反應期間所形^ 氣體產物之量來監測該發酵反應。 據說，多核苷酸若呈其自然態，則其可編碼多肽或者當 • 藉由彼等熟習此項技術者已知方法加以操控時，其可經: ； 錄及/或轉譯以生成多肽或其片段。據說，此多核苷酸之 ’ 反義鏈亦可編碼該序列。 參 A在某些實施例中，可使用遺傳載體（例如，包括編碼包 含至少一種必需胺基酸殘基之多肽之外源性序列的表現載 體）誘導經改造微生物。所製備用於導入原核宿主或真核 宿主中之多核苷酸構建體通常可（但单非總是）包括該宿主 可識別之複製系統（即，載體），包括編碼期望多肽之預定 夕核苷酸，且可較佳但不一定亦包括以可操作方式連接至 多肽編碼區段之轉錄及轉譯啟動調節序列。表現系統（表 現載體）可包括（例如）複製或自主複製序列（ars)及表現控 φ 序歹】之起源、啟動子、增強子及必需的處理資訊位點， 例如，核糖體結合位點、RNA剪切位點、聚腺苷酸化位 點、轉錄終止子序列、及mRNA穩定化序列。當適當時亦 • 可納入信號肽（較佳來自相同或相關種屬之分泌多肽），此 - 可使蛋白質穿過及/或進駐細胞膜或自細胞分泌。 適用於本發明之諸多遺傳載體為此項技術所知。該等包 病骨〖生表現載體及非病毒性表現載體二者。非限制示例 I4生病t性表現載體係源自諸如逆轉錄病毒等病毒及諸 如腺病毋及腺相關病毒等DNA病毒之載體。非病毒性表現 120117.doc -53 二 200815596 载體包括但不限於質粒、黏粒、及DNA/脂質體複合體。 當需要時，可製造可攜帶調節序列之遺傳載體，該等調節 序列可指導其中所攜帶外源性基因之細胞器特異性表現。 舉例而言，可添加前導或信號序列以指導外源性序列到達 適宜微生物之包含體。可藉由許多適宜方法之任一種將遺 傳載體插入宿主微生物中，該等方法包括電穿孔；採用氯 化鈣、氯化鈿、磷酸鈣、DEAE_葡聚糖或其他物質的轉 染；微彈轟擊法；脂轉染法；及感染。 該表現載體可用於任一胺基酸或肽且可用於大腸桿菌、 酵母菌、或其他微生物以增加胺基酸或肽產量之情況。較 佳地，該肽係由至少一種必需胺基酸構成。 與編碼酵素之多核苷酸具有實質一致性或同源性之變體 或序列可用於實踐本發明。可將此等序列稱作變體或經改 造序列。即’多核苷酸序列可經改造但仍保持編碼呈現期 望活性之多肽的能力。因此，此等變體或經改造序列係等 效形式。一般而言，該變體或經改造序列可具有至少約 40%-60%、較佳約6〇%_8〇%、更佳約8〇%_9〇%、且甚至更 佳約90%·95%之序列與天然序列一致。 釀酒酵母中半乳糖途徑酵素合成之基因控制在某些方面 符合用於大腸桿菌β_半乳糖苷系統之操縱子模型。舉例而 吕’在大腸桿菌中，游離組胺酸可藉由反作用於該途徑中 第一酵素（5’-三磷酸腺苷磷酸核糖基轉移酶HisG)之抑制來 壓抑操縱子。氣傷寒沙門氏菌（s· typhimurium)中hisG基因 之突變可使組胺酸操縱子酵素之細胞内濃度增加3_4倍。 120117.doc -54- 200815596 (參見 Meyers 等人之 j· Bacteriology 1975，124 (3) 1227- 1235 〇 ) 酵母菌可特別適用於表現富含特定胺基酸之肽或蛋白質 及/或游離胺基酸之宿主。在積聚離胺酸之酵母菌中，大 ’ 部分離胺酸可包含於用瘤胃液體培育時穩定的空泡中，但 * 當暴露於胃蛋白酶（一種消化蛋白質之皺胃酵素）時，離胺 酸即刻釋放。因此，此有機體可為用於表現蛋白質及/或 胺基酸及提供可增加可經腸吸收之蛋白質及/或胺基酸數 ϊ之保護飼料補充物的有用宿主。該胺基酸可包括（僅作 為實例）離胺酸、組胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、及蘇胺 酸。畐含胺基酸之產物可藉由此項技術中已知方法生成。 舉例而言，富含離胺酸之發酵液可用作離胺酸來源。富含 離胺酸之發酵液可藉由選擇或製造可超量產生離胺酸之單 細胞有機體（例如，諸如細菌或酵母菌等微生物）來生成。 適宜微生物可包括屬於釀酒酵母屬、埃希氏菌屬、芽胞桿 瞻菌屬、微桿菌屬、節桿菌屬、黏質沙雷氏菌屬、及棒狀桿 菌屬之微生物。因此，諸如大腸桿菌等革蘭氏陰性菌可適 用於生成組胺酸發酵液。 可月b期望使用不含具有内毒素作用之脂多糖（"LPS")的 :微生物宿，例如，諸如棒狀桿菌及短桿菌等革蘭氏陽性細 菌。諸如大腸桿菌等革蘭氏陰性細菌經常含有具有内毒素 作用之LPS。當生物質作為胺基酸來源來製備及使用時， 不含内毒素性LPS之細菌的選擇可為特別重要，此乃因大 多數LPS保持與細菌相關且除非細菌受到裂解，否則該等 120117.doc -55- 200815596 ，不會完全釋放至發酵液中。如此，預計，在發酵後内 骨素性LPS可侷限於生物質内。 在個貝知例中，本發明涵蓋對宿主微生物實施基因改 造以超量表現富含必需胺基酸(特定言之，係離胺酸、甲 硫胺酸、色胺酸或蘇胺酸）之肽或蛋白f。此等多狀可藉 由（例如）提供具有表現載體之微生物來表現，該等表現載 體包3以可操作方式與編碼多肽之核苦酸序列連接之調節 控制序列。在該多肽可自微生物分泌時，有用的多肤較可 有效地被其他微生物吸收之多肽具有更長的長度，進而造 成殘餘物中之胺基酸淨增加。在酵母菌中，此多肽之長度 可為至少4個，更佳為至少10個胺基酸。 特定富含胺基酸之蛋白質或肽可在微生物宿主（例如， 埃希氏菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、芽胞桿㈣、酵母 菌屬）、植物及諸如此類中受到超量表現。在某些實施例 中，*含胺基酸之蛋白質包含必需胺基酸及非必需胺基 酸。在某些較佳實施例中，富含胺基酸之蛋白質僅包含必 需胺基酸。特定富含胺基酸之蛋白f可選自彼等闡述於文 獻中之富含胺基酸蛋白質，例如，來自惡性癔原蟲之富含 組胺酸蛋白質II及一或多種選自稱為，，histatins，，之蛋白質類 別的蛋白質，該等展示抗細菌及抗真菌活性（Mervyn等人 之美國公開案第2006/0008546號，其全文以引用方式併入 本文中）。特定富含胺基酸之蛋白質亦可包括與全長蛋白 質相比具有增加含量該特定胺基酸之已知富含胺基酸蛋白 質的特定片段。舉例而言，來自惡性瘧原蟲之富含組胺酸 120117.doc -56- 200815596 蛋白質II具有約32%之組胺酸組成。此蛋白質自胺基酸61 至130之片段具有約44%之組胺酸組成。此蛋白質自胺基 酸58至80之片段具有約55%之組胺酸組成。另一示例性蛋 白質類別包含富含離胺酸之蛋白質。示例性富含離胺酸之 蛋白質包括天然、重組及/或合成序列。表1中所列舉任一 蛋白質或其片段可藉由本發明微生物來表現。富含胺基酸 之蛋白質無需保持其固有的功能以適用於本文所述組合物 或方法。 表1 :示例性富含離胺酸蛋白質

蛋白質名稱 UniProtKB/Swiss -Pro原始登錄號 核糖體蛋白L44 P17843 40S核糖體蛋白S27a P29504 40S核糖體蛋白S27a P47905 40S核糠體蛋白S27a (牛） P62992 40S核糖體蛋白S27a (豚鼠） P62978 40S核糖體蛋白S27a(人） P62979 40S 核糖體蛋白 S27a 小菜蛾(Plutella xylostella) P68202 40S核糖體蛋白S27a (乳酸克魯維酵母菌 P69061 (Kluyveromyces lactis)(酵母菌)） 40S核糖體蛋白S27a(紅原雞(Gallus gallus)(雞X) P79781 lu40S核糖體蛋白S27a (家鼠(Mus musculus)(小鼠)） P62983 40S核糖體蛋白S27a(褐家鼠(Rattus norvegicus)(大鼠)） P62982 40S 核糖體蛋白 S27a(草地黏蟲(Spodoptera frugiperda) P68203 (秋天行軍蟲)) 60S 核糖體蛋白 L44(阿拉伯芬(Arabidopsis thaliana) 023290 (鼠耳水芹)） 40S核糖體蛋白 P59271 S27a-1(阿拉伯芥(鼠耳水芹)） 40S核糖體蛋白S27a(斑點叉尾細(Ictalums punctatus) P68200 (運河鯰魚)） 40S 核糖體蛋白 S27a(石刁柏(Asparagus officinalis) P31753 (蘆筍(Garden asparagus))) 40S核糖體蛋白S27a-3(阿拉伯芥(鼠耳水芹)） P59233 40S 核糖體蛋白 S27a(黑腹果绳(Drosophila melanogaster) P15357 (果繩)） 120117.doc -57- 200815596

存於ΑΒΡ1中之推定17.7 kDa蛋白(釀酒酵母(麵包酵母菌)） P37263 60S核糖體蛋白L44(紅發夫酵母(酵母菌） 059870 (紅酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous))) 40S核糖體蛋白S27a-2(阿拉伯芥(氟耳水芹 P59232 40S核糖體蛋白S27a(粗縫抱徽(Neurospora crassa)) P14799 存於lcnC中之推定9.7 kDa蛋白 Q00571 (乳酸乳球囷乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis) (乳鏈球菌(Streptococcus lactis))) 衣殼蛋白C(根據類似性)(牛病毒性腹瀉病毒 Q96662 (CP7菌株XBVDV)(黏膜疾病病毒)） 推定蛋白MJ〇331(詹氏曱院球菌(Methanococcus]araiaschii)) Q57777 40S 核糖體蛋白 S27a(普通番祐(Lycopersicon esculentum) P62980 (番茄)） 40S核糖體蛋白S27a(普通馬铃薯(Solanum tuberosum) P62981 (馬鈴薯)） 40S核糖體蛋白S27a(玉米(Zea mays)(玉蜀黍)） P27923 60S核糖體蛋白L44(惡性瘧原蟲(分離物3D7)) 097231 衣殼蛋白C(根據類似性)(牛病毒性腹瀉病毒 P19711 (分離物NADL) (BVDV)(黏膜疾病病毒)） 推定蛋白HI0235(流感嗜企桿菌(Haemophilus influenzae)) P44588 00S 核糖體蛋白 L44(萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)) P49213 60S核糖體蛋白L36a(斑馬擔尼魚(Brachydanio rerio) P61485 (斑馬魚)(Danio rerio)) 60S核糖體蛋白L36a(紅鰭東方豚(Fugu rubripes) P61486 (曰本河豚)(紅鰭多紀豚(TakifUgu rubripes))) 60S核糖體蛋白L36a(斑點叉尾細(Ictalums punctatus) P61487 (運河鯰魚X) 30S 核糖體蛋白 S27ae (嗜熱古菌(Sulfolobus tokodaii)) Q975Q8 40S核糖體蛋白S27a(盤基網柄菌 P14797 (Dictyostelium discoideum)(黏菌)） 50S核糖體蛋白L23 (風產液菌(Aquifex aeolicus)) 066433 60S核糖體蛋白L44(陸地棉(Gossypium hirsutum)(旱地棉)） Q96499 高移動性族群蛋白質(梨形四膜蟲(Tetrahymena pyriformis)) P40625 50S 核糖體蛋白 L33(副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)) Q87T84 核糖體生物合成蛋白質1^€^10(1^1：1^11〇〇〇(^113 11^1^&1\1(^) Q6LWK3 40S核糖體蛋白S27a(旱稻(Oryza sativa)(稻)） P51431 60S核糖體蛋白L31(釀酒酵母(麵包酵母菌)） P14063 50S核糖體蛋白L28(角蒿(Nicotiana tabacum)(常見煙草；)） P30956 60S核糖體蛋白L38(秀麗隱杆線蟲(Caenorhabditis elegans)) 017570 40kDa核仁蛋白(家鼠(小鼠)） Q9ESX4 FAM32A類蛋白(斑馬擔尼魚(斑馬魚)(Danio rerio)) Q6GQN4 Enkurin· /FTId=PRO」)000086976 (家鼠(小鼠)） Q6SP97 60S核糖體蛋白L44(稷酒裂殖酵母 Q9UTI8 (Schizosaccharomyces pombe)(裂殖酵母)） 120117.doc -58- 200815596

60S核糖體蛋白L36a(褐家鼠(大鼠)） P83883 60S核糖體蛋白L36a(野豬(Sus scrofa)(豬)） P83884 60S核糖體蛋白L36a (家鼠(小鼠)） P83882 60S核糖體蛋白L36a(智人(Homo sapiens)(人)） P83881 40S核糖體蛋白S27a (秀麗隱杆線蟲） P37165 40S核糖體蛋白S25(黑腹果蠅(果蠅)） P48588 30S核糖體蛋白S27ae(詹氏曱烷球菌） P54031 30S核糖體蛋白 S27ae(硫葉菌(Sulfolobus solfataricus)) Q97ZY7 40S核糖體蛋白S27a(青稞(Hordeum vulgare)(大麥)） P22277 50S 核糖體蛋白 L33(RhodopirelMa baltica) Q7UMNO 衣殼蛋白C(根據類似性)(豬瘟病毒(Alfort菌株)(CSFV) P19712 (豬霍亂病毒)） 小誘導細胞因子B14 (家鼠(小鼠)） Q9WUQ5 衣殼蛋白C(根據類似性)(牛病毒性腹瀉病毒(菌株SD4) Q01499 (B VDV)(黏膜疾病病毒)） 甲醇脫氫酶亞單位2(扭脫曱基桿菌 P14775 (Methylobacterium extorquens)) 推定蛋白yqbP (枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)) P45932 UPF0291蛋白質Imol 304(單核細胞增生李斯特氏菌 Q8Y7H5 (Listeria monocytogenes)) 60S核糖體蛋白L32(釀酒酵母(麵包酵母菌)) P25348 60S核糖體蛋白L27(秀麗隱杆線蟲） P91914 核仁蛋白 40 kDa (馬來猴(Macaca fascicularis) Q95KF9 (食蟹猴)(短尾猴(Cynomolgus monkey))) 60S核糖體蛋白L44(灰蓋龙傘(Coprinus cinereus) Q9UWE4 (墨汁鬼傘真菌)） 40S核糖體蛋白S27a(稷酒裂殖酵母(裂殖酵母)） P0C016 50S核糖體蛋白L35(嗜熱菌 Q5SKU1 (菌株HB8 / ATCC 27634 / DSM 579)) 50S核糖體蛋白L35(嗜熱菌） P80341 存於nrdB中之推定9.4 kDa蛋白質(噬菌體T4) P39505 存於TAF145中之推定31 ·3 kDa蛋白質(釀酒酵母 P53335 (麵包酵母菌)） 50S核糖體蛋白L33(創傷弧菌(Vibrio vulnificus)) Q8DDY2 50S核糖體蛋白L33(創傷弧菌(YJ016菌株)) Q7MPS5 信號識別顆粒14 kDa(秀麗隱杆線蟲） 016927 内切核酸酶-1 ./FTId=PRO_0000207691 P57487 (财蟲巴克納氏菌亞種(Buchnera aphidicola subsp) 婉豆财(Acyrthosiphon pisum)(S宛豆财共生細菌 (Acyrthosiphon pisum symbiotic bacterium)) 3〇S核糖體蛋白S17(洋蔥黃植物原生質 Q6YR12 (Onion yellows phytoplasma)) 核仁蛋白of40 kDa(智人(人)） Q9NP64 核糖體生物合成蛋白質NoplO(硫葉菌) Q97Z78 DNA拓撲異構酶1(褐家鼠(大鼠)） Q9WUL0 1201I7.doc -59- 200815596

可能的核糖體生物合成蛋白質(智人(人)） Q9UHA3 DNA拓撲異構酶1(家鼠(小鼠)） Q04750 推定蛋白aq_l 894(風產液菌） 067734 DNA拓撲異構酶1(黑線倉鼠(Cricetulus griseus)(中國倉鼠)） Q07050 鋅指蛋白273 (智人(人)） Q14593 DNA拓撲異構酶1(智人(人)） P11387 50S核糖體蛋白L28(魏格沃菌 Q8D2F1 (Wigglesworthia glossinidia brevipalpis)) DNA 拓撲異構酶 1(草原猴(Cercopithecus aethiops) Q7YR26 (綠猴)(黑長尾猴)） RNA外切核酸酶4(光滑念珠菌(Candida glabrata)(酵母菌） Q6FQA0 (光滑球擬酵母(Tomlopsis glabrata))) 40S 核糖體蛋白 S27a(線蟲(Caenorhabditis briggsae)) P37164 30S核糖體蛋白S 14(山羊支原體亞種 P10130 (Mycoplasma capricolum subsp) (加利福尼亞小山羊菌株/ATCC 27343 /NCTC 10154)) 50S核糖體蛋白L28(產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)) Q8XJM2 50S核糖體蛋白L33(腦膜炎萘瑟氏菌血清群A P66225 (Neisseria meningitidis serogroup A)) 50S核糖體蛋白L33(腦膜炎萘瑟氏菌血清群B P66226 (Neisseria meningitidis serogroup B)) 50S核糖體蛋白L33(耶爾森氏桿菌(Yersinia pestis)) Q8ZJP1 40S核糖體蛋白S25(斑點叉尾鮰(運河鯰魚)） Q90YP9 多向因子(家鼠(小鼠)） P63089 60S核糖體蛋白L44(布氏布氏錐蟲(Trypanosoma brucei brucei)) P17843 40S核糖體蛋白S27a(煙草天蛾(Manduca sexta)(煙草天娥)） P29504 40S核糖體蛋白S27a(羽扇豆(Lupinus albus)(白羽扇豆)） P47905 40S核糖體蛋白S27a(普通牛(Bos taurns)(牛)） P62992 40S 核糖體蛋白 S27a( 土撥鼠(Cavia porcellus)(豚鼠)） P62978 40S核糖體蛋白S27a (智人(人)) P62979 40S核糖體蛋白S27a(小菜蛾(菜蛾(Diamondback moth))) P68202 40S核糖體蛋白S27a (乳酸克魯維酵母菌(酵母菌)） P69061 40S核糖體蛋白S27a (紅原雞(雞)） P79781 40S核糖體蛋白S27a (家鼠(小鼠)） P62983 40S核糖體蛋白S27a (褐家鼠(大鼠X) P62982 40S核糖體蛋白S27a(草地黏蟲(秋天行軍蟲)） P68203 60S核糠體蛋白L44(阿拉伯芥(鼠耳水芹)） 023290 40S核糖體蛋白S27a-1(阿拉伯芥(鼠耳水芹)） P59271 40S核糖體蛋白S27a(斑點叉尾鮰(運河鯰魚X) P68200 40S核糖體蛋白S27a P31753 (石刁柏(蘆訇)） 40S核糖體蛋白S27a-3(阿拉伯芥(鼠耳水芹)） P59233 40S核糖體蛋白S27a(黑腹果蠅(果織)） P15357 存於ABP1中之推定17.7 kDa蛋白質(釀酒酵母(麵包酵母菌)） P37263 60S核糖體蛋白L44(紅發夫酵母(酵母）（紅酵母)） 059870 120117.doc -60- 200815596 40S核糖體蛋白S27a-2(阿拉伯芥(鼠耳水芹)） P59232 40S核糖體蛋白S27a(粗糙孢黴） P14799 存於lcnC中之推定9.7kDa蛋白質 Q00571 (乳酸乳球菌乳酸亞種(乳鏈球菌)） 衣殼蛋白C(根據類似性)(牛病毒性腹瀉病毒 Q96662 (菌株CP7) (BVDV)(黏膜疾病病毒)） 推定蛋白MJ0331 (詹氏甲烷球菌） Q57777 40S核糖體蛋白S27a(普通番茄(番茄)） P62980 40S核糖體蛋白S27a (普通馬鈐薯(馬鈴薯)） P62981 40S核糖體蛋白S27a (玉米(玉蜀黍)） P27923 60S核糖體蛋白L44(惡性癔原蟲(分離3D7)) 097231 衣殼蛋白C(根據類似性)(牛病毒性腹瀉病毒 P19711 (分離NADL) (BVDV)(黏膜疾病病毒)） 推定蛋白HI0235 (流感嗜血桿菌） P44588 60S核糖體蛋白L44 (萊茵衣藻） P49213 60S核糖體蛋白L3 6a(斑馬魚斑馬擔尼魚(斑馬魚） P61485 (Danio rerio)) 60S核糖體蛋白L36a(紅鰭東方豚（日本河豚） P61486 (紅鰭東方豚)） 60S核糖體蛋白L36a(斑點叉尾鮰(運河鯰魚)） P61487 30S核糖體蛋白 S27ae (Sulfolobus tokodaii) Q975Q8 40S核糖體蛋白S27a(盤基網柄菌(黏菌)） P14797 50S核糖體蛋白L23 (風產液菌） 066433 60S核糖體蛋白L44(陸地棉(旱地棉)） Q96499 高移動性族群蛋白質(梨形四膜蟲） P40625

可將特定富含胺基酸之肽或蛋白質選殖至表現載體中並 導入適宜宿主細胞中。或者，可將具有所選胺基酸特性曲 線之重組改造蛋白質選殖至表現載體中並導入適宜宿主細 胞（例如，微生物）中。該等重組改造蛋白質可具有較高含 量之一或多種必需胺基酸，或該等蛋白質可具有較高含量 之一或多種用於牛奶生產之其他限制胺基酸，該等可包括 離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、及色 胺酸。因此，可將該等重組改造蛋白質設計為包含具有選 擇特性曲線之胺基酸。重組改造蛋白質中各胺基酸之比率 可根據飼喂研究或預測有所改變或設計為符合經預測對於 120117.doc • 61 - 200815596 乳牛而言係最佳之比例。在—個實施例巾， 如，存於以重組方式產4 土文（〇 Λ. 生蛋貝中之所選特性曲線類 、d特性曲線。在輯好蛋白質並將其基 表現載體中後’該蛋白質可在諸如大腸桿菌、棒狀桿菌、 ^干囷、牙孢桿菌、酵母菌等微生物宿主表現（或超量表 現）〇 為了優化肽或蛋白質在宿主中之表現，

白質之序列以㈣宿主中f遍存在的特異性則A = 者，所選tRNA可在宿主中共表現以便於肽或蛋白質之表 =。或T ’可調節單一及多個密碼子使用圖案以優化產 量、折疊及局部化。該等重組改造肽或蛋白質可包含便於 純化該肽或蛋白質之特異性序列。該等蛋白質亦可包含使 該蛋白質靶向宿主細胞中特定位置（例如，外周質）或分泌 該蛋白質之靶位的"前導序列"。該重組改造肽或蛋白質亦 可包含蛋白酶切割位點以便於切割皺胃中之蛋白質並促進 肽或蛋白質中胺基酸至小腸之遞送。舉例而言，一種此蛋 白酶係胃蛋白酶，一種牛皺胃之消化蛋白質的酵素。胃蛋 白酶在P1及Pl，位置之疏水性（較佳為芳香族）殘基處展現肽 之優選切割。特定言之，胃蛋白酶可於苯丙胺酸、色胺 酸、赂胺酸及白胺酸之羧基側切割蛋白質。較佳地，該多 肽通常可藉由動物蛋白酶容易地切割。 在本發明之某些實施例中，可以使經改造微生物富含維 他咋之方式改造該微生物。該等維他命包括但不限於維他 命A(視黃醇）、維他命B1(硫胺素）、維他命b2(核黃素）、維 120117.doc •62· 200815596 他命B3(煙酸）、維他命B5(泛酸）、維他命ΒΑΧ吼哆素）、維 他命B7(生物素）、維他命B9(葉酸）、維他命B12(氰鈷氨 素）、維他命C[3](抗壞血酸）、維他命Dl-D4(lamistero卜麥 角飼化醇、鈣化醇、雙氫速留醇、7-脫氫穀留醇）、維他命 E(生育酚）、及維他命K (萘醌）。 在另一實施例中，該微生物可經改造以增加諸如維他 命、微量礦物質、抗氧化劑或某些脂質（例如，生育酚）等 微量營養素之量。 在另一實施例中，該微生物可經改造以增加諸如 MADH、FADH、ATP、輔酶a、輔酶Q1〇或鉬蛋白等輔助因 子或辅酶之量。 不同的有機體需要不同的微量有機物質。大多數哺乳動 物（極少例外）與人類需要相同的維他命。一個例外狀況係 維他命C’其可藉由不包括其他高級靈長類及豚鼠之所有 其他哺乳動物來合成。一物種與哺乳動物之相關性越小， 則該等有機體之需求可變得越不同。 本發明包括以經任一方式改造之微生物作為起始材料生 產維他命之方法。本發明包括許多在維他命生物生產中有 用的生物材料及中間體之態樣。舉例而言，維他命E (d-a-生月盼）係人類及動物之重要的營養補充物。a-生育酚、 生育紛及生育酚基酯可自法尼醇（farnesol)或香葉基香葉 醇（GG)生成。法尼醇可用作起始材料來以化學方式合成最 終產物α-生育酚基酯。或者，該法尼醇可以化學方式轉化 成GG。以生物學方式或藉由自法尼醇合成所生成隨後 120117.doc -63- 200815596 可用作I備α_生育㉟基及α•生育紛基si之起始材料。法尼 醇及GG分別係藉由焦鱗酸法尼酉旨（Fpp)及焦碟冑牛龍牛兒 牛邊牛兒S曰(GGPP)之去磷酸化生成的異戊二烯基醇。 FPP及GGPP係類異戍二稀化合物（包括目醇、泛酿、金紅 素夕帖醇、及類胡蘿蔔素）生物合成中之中間體且該等 可用於蛋白貝之轉譯後異戊二烯化。Fpp及GGpp二者均源 自焦磷酸異戊基酯（IPP)。Millis等人之美國專利第 6,410,755號的全文以引用方式併入本文中。 類異戊二烯係最大家族之天然產物，已知有約22,000種 不同結構。所有類異戊二烯均源自Cs化合物Ipp。因此， 所有類異戊二烯化合物之碳骨架均可藉由q單元依序加合 至成長中之聚類異戊二烯上來形成。由兩種途徑可形成 Ipp。真菌（例如，酵母菌）及動物擁有依賴於甲羥戊酸酯之 途徑，其可使用乙醯基CoA作為初始前體。另一方面，細 菌及高等植物可擁有不依賴於甲羥戊酸酯之途徑，亦稱作 非甲羥戊酸酯途徑，自丙酮酸酯及甘油醛3_磷酸形成。 本發明之實施例包括維他命或用於產生維他命之任一起 始材料或中間體在原核或真核細胞培養物及不含細胞之系 統中（無論有機體利用哪種途徑）的生物生產法。舉例而 言，對於所有類異戊二烯之前體的生物合成法而言，Ipp 可利用依賴於或不依賴於甲羥戊酸酯之途徑。較佳地，細 胞培養中所用細胞經基因改造以增加維他命或其中間體或 起始材料的產量。細胞可藉由基因工程技術（即，重組技 術）、傳統微生物學技術、或此等技術之組合進行基因改 120117.doc -64- 200815596 造且其亦可包括天然基因變體。 本發明之實施f列包括藉由培養微生物（較佳為酵母 實施的法尼醇或GG生物生產法，該微生物已進行基因改 造以：調控其類異戊二烯生物合成途徑中一或多種^素之 活性、降低（包括消除）鯊魚烯合成酶活性作用、提言 hmg-cgA還原酶作用、提高GGpp合成酶作用、提高沖: 。成酶作用、或提高磷酸酶作用以增加FPP形成法尼醇 者GGPP形成之轉化率。 匕，’ 可自發酵液或溶解生物質中，至少部分純化特定胺基 酸、具有較高胺基酸含量之肽或蛋白質。舉例而古 : :離胺酸之等電點’單離出離胺酸或富含離胺酸之蛋白 質。類似地，可利用富含離胺酸蛋白質中離胺酸之存在裙 據該蛋白質之等電點來分離該蛋白f。富含特义胺基酸之< 蛋白貝的期望等電點可藉由使用重組技術改變蛋白質之胺 基酸組成（例如，產生具有所選擇離胺酸含量之蛋白質）來 改變。 、 特定胺基酸相對於其他胺基酸之獨特等電點可容許 選擇性地沉澱該胺基酸，優先萃取至有機溶劑中，及與^ 種不同離子交換樹脂或金屬螯合基質結合。特定胺基酸或 肽可結合至諸如鎳（Ni)等過渡金屬且可用於促進蛋白質分 離（例如，藉由將該蛋白質結合至含鎳基質）。可使用二二 過渡金屬，例如，銅（Cu)。另外，特定分子大小之胺基酸 可使用篩析層析法及離子交換樹脂.之獨特組合，自含二^ 他胺基酸及副產物之發酵液中分離該胺基酸。另外^胺基 120117.doc -65- 200815596 酸之獨特pi可使富含該胎^ Α # 田各飞^基酸之蛋白質具有專一且 pi值，因此容許此等蛋白皙 、的 貝自其他細胞蛋白質中選擇性士 沉澱，以供隨後用於飼料或食物。 义，必需胺基酸及非必需胺基酸 本發明之經改造微生物可經改造以產生高濃度之營養 素’包含必需胺基酸及非必需胺基酸。含有此等經改造微

生物之完全飼料或發酵殘餘物可含有高濃度之營養素，包 含必需胺基酸及非必需胺基酸。 匕 言，牛磺酸為貓所必需，但其可並非為狗所必需。某些胺 基酸可自其他胺基酸生成。含硫胺基酸，甲硫胺酸及高半 胱胺酸可相互轉化但二者均不可在人中從頭開始合成^同 樣，半胱胺酸可自高半胱胺酸製備，但不可從頭開始合 成。含硫胺基酸可被視為營養上等效的胺基酸之單一集 合。同樣，可藉由尿素循環相互轉化之精胺酸、鳥胺酸及 有機體之必需胺基酸係該有機體不能夠自其他可利用資 源合成且因此必須作為其腾食之—部分來提供之胺基酸= 該必需胺驗可I種為人類、哺乳動物、鳥或魚所必需 之胺基酸。特別涵蓋者係為飼養動物（例如，家畜或寵物） 所必需之胺基酸。8種胺基酸通常被視為為人類所必需： 離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、$白胺酸二胺 酸：顯胺酸、及白胺酸。另外兩種，組胺酸芩精胺酸可為 兒童及可能為老人所必需。牛磺酸可為保護動脈及膠原柔 韌性所必需。由於不同的新陳代謝能夠合成不同的物質， 因此物種與物種間之該等必需胺基酸有所不同。舉例而 120117.doc -66- 200815596 瓜胺酸可被視為單一集合。 貓之必需胺基酸包括：精胺酸、組胺酸、異白胺酸、白 胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸、 1胺L黃酸。牛續酸係—種為適當地形成膽汁、眼 月健康及“臟適當地運行所必需之胺基酸。書结需要大量 牛石夤酸用於其身體機能，但具有可自諸如甲硫胺酸及半胱 胺酉夂等其他胺基酸產生牛石黃酸之有限酵素。因此，描需要 田a牛石只酸之膳食。倘若牛磺酸缺乏，則可能發生諸如下 J專病症·稱為擴張型心肌病症之心臟病、視網膜變性、 生殖P早礙&異吊小I苗發育。大多數動物可藉由各種過程 製備（其中某些可能需要精胺酸）來生產胺基酸鳥胺酸。在 書田中，產生鳥胺酸之方法係自精胺酸轉化生成鳥胺酸。若 貓缺乏精胺酸，則可能沒有足夠的鳥胺酸結合氨，因此而 出現諸如流涎症、發聲、運動失調等病狀，且甚至可能自 高氨濃度導致死亡。此等病狀經常會在飯後數小時（當產 生大部分氨時）發作。具有高營養含量之本發明完全飼料 可幫助治療或緩和動物之此等病症。離胺酸、甲硫胺酸、 色胺酸或蘇胺酸之任一種均為家畜飼料（例如，牛飼料）之 有價值的添加劑。 各種家畜之平衡營養膳食為此項技術所知。動物營養委 員會（Committee on Animal Nutrition)，國家研究委員會 (National Research Council)已出版了許多用以指導彼等熟 習此項技術者調配平衡動物飼料之準則。參見，例如，

Nutrient Requirements of Beef :第 7修訂版（2000，ISBN 120117.doc ·67· 200815596 0309069343)、Nutritional Requirements of Swine :第 10修 訂版（1998，ISBN 0309059933)、及 Nutritional Requirements of Dairy Cattle:第 7修訂版（2001，ISBN 0309069971)，所有該 等之全文均以引用方式併入本文中。 C.發酵培養基及條件 可在發酵培養基中培養上文所述經改造微生物以產生營 養素。適當的或有效的發酵培養基係指在其中本發明之經 改造微生物在培養時能夠產生營養素之任一培養基。此培 養基通常為包含可同化碳、氮及磷酸鹽來源之水性培養 基。此培養基亦可包含適當的鹽、礦物質、金屬、及其他 營養素。然而，應理解各種發酵條件可為適宜的且可藉由 彼等熟習此項技術者來選擇。 xylose可用於適宜發酵培養基之可同化碳源包括但不限 於糖及其聚合物，包括糊精、蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄 糖、果糖、甘露糖、山梨糖、阿拉伯糖及木糖；脂肪酸； 諸如乙酸等有機酸；諸如乙醇及正丙醇等一級醇；及諸如 甘油等多元醇。本發明之較佳碳源包括單糖、二糖、及三 糠。最佳碳源係葡萄糖。 發酵培養基中碳源（例如，葡萄糖）之濃度應可促進細胞 生長，但不會高達抑制所用微生物生長。通常，使用以達 成期望濃度之生長及生物質的濃度加入的碳源（例如，葡 萄糖）來進行發酵。在其他實施例中，發酵培養基中碳源 (例如，葡萄糖）之濃度係大於約1克/公升，較佳大於約2克/ 公升且更佳大於約5克/公升。另外，發酵培養基中碳源（例 120117.doc -68- 200815596 如’葡萄糖）之濃度可小於約100克/公升、小於約5〇克/公 升匕或小於約20克/公升。應注意：所提及發酵組份濃度 可指初始及/或正在進行發酵之組份濃度。在某些情況 下可月b期望發酵培養基之碳源在發酵期間耗盡。 可用於適宜發酵培養基之可同減的來源包括但不限於 簡：的t源、有機氮源、及複雜的氮源。此等氮源包括無 尺氨鉍鹽、及來源於動物、植物及/或微生物之物質。 適宜氮源包括但不限於蛋白質水解產物、微生物生物質水 解產物f白腺、酵母菌提取物、硫酸銨、尿素、及胺基 酉夂水解奋產物可形成適宜氮源。通常，發酵培養基中氮 源之濃度可為大於約Μ克/公升、大㈣0.25克/公升、或 大於4 1.G克/公升。然而，超出某些濃度後，向發酵培養 基中添加輯可對微生物生長不利。因此，發酵培養基中 氮源之濃度可為小於約20克"公升、小於約10克/公升或小 於4 5克/公升。另夕卜’在某些情況下，可能期望發酵培養 基之氮源在發酵期間耗盡。 有效的發酵培養基可能含有諸如無機鹽、維他命、微量 金屬或生長啟動子等其他化合物。此等其他化合物亦可存 ;“有权養基之碳源、氮源或礦物源中或可特別地添加 至培養基中。 該發酵培養基亦可含有適宜鱗酸鹽源。此等鱗酸鹽源包 括無機磷酸鹽源及有機鱗酸鹽源。較佳鱗酸鹽源包括但不 限於磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉及磷酸鉀、磷酸銨及其混合 物。通常，發酵培養基中磷酸鹽之濃度係大於約1〇克^ 120117.doc -69- 200815596 升’較佳大於約2.0克/公升且更佳大於約5〇克/公升。秋 而，當向發酵培養基中所添加麟酸鹽超出某些濃度時可對 微生物生長不利。因此’發酵培養基中磷酸鹽之濃度通常 係小於約20克/公升，較佳小於約叫/公升，且更佳小於 約10克/公升。

適宜發酵培養基亦可包含鎂源，較佳呈生理學上可接受 之形式’例如’七水合硫酸鎂’但可以達成類似鎮量之濃 度使用其他鎂源°通常，發酵培養基中鎂之濃度係大於約 〇.5克/公升，較佳大於約1〇克/公升，且更佳大於約2〇克/ △升。然@ ’當向發酵培養基中所添加鎂超出某些濃度時 可對微生物生長不利。因此，發酵培養基中鎂之濃度通常 係小於約10克/公升’較佳小於約5克/公升，且更佳小於約 3克/ a升。另外，在某些情況下，可能期望發酵培養基之 鎂源在發酵期間耗盡。 該發酵培養基亦可包含生物上可接受之螯合劑，例如， 才τ板I二鈉之二水合物。在此情況下，發酵培養基中螯合 劑之濃度係大於約〇.2克/公升，較佳大於約〇·5克/公升，且 更/U大於約1克/公升。然而，當向發酵培養基中所添加螯 合劑超出某些濃度時可對微生物生長不利。因此，發酵培 養基中螯合劑之濃度通常係小於約i 〇克/公升，較佳小於 約5克/公升，且更佳小於約2克/公升。 吞&酵養基開始亦可包含生物上可接受之酸或驗以維 持發酵培養基之期望PH。生物上可接受之酸包括但不限於 氫氯^、破酸、硝酸、填酸及其混合物。生物上可接受之 120117.doc 200815596 驗包括但不限於氫氧化銨、氫氧化納、氫氧化鉀及其混合 物。 口 該發酵培養基亦可包含生物上可接受之鈣源，包括但不 限於氯化鈣。通常，發酵培養基中鈣源(例如，二水合氯 化鈣）之濃度係介於約5毫克/公升至約2〇〇〇毫克/公升之 間，較佳介於約20毫克/公升至約1〇〇〇毫克/公升之間，且 更佳介於約50毫克/公升至約500毫克/公升之間。 該發酵培養基亦可包含氯仙。通常，發酵培養基中氯 化鈉之濃度係介於約仏丨克/公升至約5克/公升之間，較佳 介於約^克/公升至約4克/公升之間，且更佳介於約 升至約4克/公升之間。 該發酵培養基亦可包含微量金屬。可將此等微量金屬以 儲備溶液形式添加至發酵培養基中，出於方便目的，該儲 :溶液可以不同於發酵培養基其餘部分之方式來製備二 常’添加至發酵培養基中此微量金屬溶液之量係大於約】 毫升/公升，較佳大於約5毫升/公升，且更佳大於約1〇毫升/ :升。然m ’當向發酵培養基中所添加微量金屬超出某些 辰度時可對微生物生長不利。因此，添加至發酵培養基中 此微量金屬之量通常係小於約刚毫升 Μ升/公升，且更佳小於約戰升/公升。應注意，^ 備洛液中除了添加微量金屬夕卜，亦可分別添加個別組份， 各組份之範圍獨立地對應於由微量金屬溶液之上述範圍所 指定組份之量。 適宜微量金屬溶液可包括但不限於硒酸鈉；硫酸亞鐵七 120117.doc -71 - 200815596 水合物；硫酸銅五光人 別五水合物，硫酸鋅七水合物；鉬酸鈉二 合物；氯化亞鈷；硒或終溶液·丄 飞夜，/、水合物；及硫酸錳單水 5。可向儲備溶液中添加氫氯酸以保持溶液中微量 -轉。 、焉 養基亦可含有維他命。可將此等維他命以儲備 :二=加至發酵培養基中’出於方便目的，該館備溶 料料基其餘部分之 培養基中此維他命之量係大^毫升/公二 二=了：升且更佳大於10毫升/公升。然而，當向發 σ 土中所添加維他命超出某些濃度時可對微生物生長 不利因此’添加歸酵培養基巾此維他命溶液之量通 係J於約50宅升/公升，較佳小於3〇毫升/公 20荟林/八4 丨 X Κ ΛΙ、於 Α 。應注意，在健備溶液中除了添加維他命 ’亦可分別添加個別組份，各組份之範圍獨立地對應於 命儲備溶液之上述範圍所指定組份之量。適宜維他 p K可包括但不限於生物素、泛酸鈣、肌 HC1及硫胺素-HC1之溶液。 多素_ 二發酵培養基亦可包含固醇。此等固醇可以儲備溶液形 m至發酵培養基中，該儲備溶液可以不同於發酵培養 一餘七分之方式來製備。可使用有助於固醇溶解之去、、亏 :來製備固醇儲備溶液。通常，可以如下量向發= 儲備減：發料養基巾固醇之最終濃度係介 克:八^ 3000毫克/公升之間，較佳係介於約2毫 &至2000毫克/公升之間，且更佳介於約5毫克/公升 120117.doc •72- 200815596 至_毫克/㈣H 本發明微生物可以羽 包括但不限於分抵白用^酵拉式來培養，該等發酵模式 酵、及連續發酵/· ·料分批發酵、細胞再循環發 培養基之某些組份 、式中，當在發酵期間 來開始發酵以便在：m用相當高濃度的此等組份 整個發酵期間可=填!之前可支持生長-段時間。在

持此等組份之較佳=所耗盡浪度之此等組份來保 取樣並分析濃戶來t (例如）定期自發酵培養基 祈，辰度來監測發酵培養基 者’當實施標準發酵μ押 且伤之礙度。或 刻以定脖門眩，. 可在整個發酵期間的特定時 條件之機射應於已知濃度實施添加。可在響應發酵罐 ，开機控制下或藉由預執行方案對發酵罐實施添 口…、而’為了避免向發酵培養基中導入外來微生物，可 用如此項技術中已知之無菌添加方法實施添加。另外， 在發酵期間可添加少量消泡劑，或者可採用消泡裝置。發 酵罐可具有任-尺寸，例如，至少1公升、至少10公升、 至少100公升 '至少1000公升、至少10 000公升至少 5〇,〇〇〇公升或至少100,000公升。許多商業發酵罐可操作 25,〇〇〇公升以上。 發酵培養基之溫度可為適用於生長及本發明營養素生成 之任一溫度。舉例而言，在使用接種物接種發酵培養基之 如’可使發酵培養基之溫度達到並保持在介於約2〇〇c至約 45 C之間，該溫度較佳係介於約25至約40°C之間，且更 佳係介於約28°C至約32°C之間。 120ll7.doc -73- 200815596 可藉由向該發酵培養基中添加酸或鹼來控制該發酵培養 基之pH。在使用氨控制pH之彼等情況下，氨亦可方便地 用作發酵培養基冬氮源。較佳地，將pH保持在自約3 〇至 約8.0，更佳保持在自約3·5至約7 〇，且最佳保持在自約4.〇 至約6.5。 在發酵過程中亦可使發酵培養基維持具有溶解氧含量以 維持細胞生長並維持產生營養素之細胞新陳代謝。可使用 已知方法（例如，藉助氧電極）來監測發酵培養基之氧濃 度。可使用此項技術中已知方法（例如，藉由攪拌、搖動 或鼓泡來對培養基實施攪動及通氣）向發酵培養基中添加 氧。較佳地，以氧在發酵培養基中於大氣壓力下且在溫度 介於約2(TC至約4(TC之間時的溶解度為標準，需氧發酵培 養基中之氧濃度可佔該培養基中氧飽和數值之介於約川％ 至約100%之間。在發酵期間，氧濃度可能會定期降低至 低於此範圍，然而，此並不會對發酵造成不利影響。 儘管本文闡述與空氣使用相關之培養基通氣，但可使用 其他氧源。特別有用者係使用含有較環境空氣中氧體積比 例更大之體積比例之氧的通氣氣體。另外，此等通氣氣體 可包含不會.對發酵造成不利影響的其他氣體。在某些實施 例中，發酵係於在此項技術中得到良好發展之條件下實 施。 可使用在適當生長期後足以產生高細胞密度之量的本發 明微生物之活性生長培養物來接種發酵培養基。以該等細 胞之乾重計，典型接種細胞密度係介於約001克/公升至約 120117.doc -74- 200815596 10克/公升之間，較佳係介於約〇·2克/公升至約5克/公升之 間且更佳係介於約〇〇5克/公升至約1〇克/公升之間。然 而’在生產規模發酵罐中，較大接種細胞密度為較佳。該 等細胞隨後生長至如下細胞密度範圍：自約1〇克/公升至 約100克/公升，較佳自約20克/公升至約80克/公升，且更 仫自力50克/公升至約7〇克/公升。在發酵期間微生物達成 期望細胞密度所需滯留時間通常係小於約200小時，較佳 小於約120小時，且更佳小於約％小時。 在本發明之一種作業模式中，於發酵期間監測發酵培養 基之碳源濃度（例如，葡萄糖濃度）。可使用可監測上清液 (例如，發酵培養基之無細胞組份）中葡萄糖濃度之已知技 術（例如，藉助葡萄糖氧化酶酵素測試或高壓液相層析法） f監測發酵培養基之㈣糖濃度。如上文所述，應將碳源 濃度保持在低於發生細胞生長抑制之濃度。儘管此濃度在 不同有機體之間可有所變化，但通常對於葡萄糖作為碳源 而言，細胞生長抑制可在葡萄糖濃度大於約6〇克/公升時 發生且可藉由試驗容易地测定。可將發酵培養基中葡萄糖 濃度維持在介於約…公升至約1〇〇克/公升之間，更佳維 =在介於約2克/公升至㈣克/公升之間，且再更佳維持在 "於约5克/公升至約2〇克/公 如..兄A升之間。儘官可糟由添加（例 只貝、、、淨的葡萄糖溶液來將碳源濃度維持在期望曲 二二由添加等份的初始發酵培養基來維持發酵培養基辰 火2 =可接受的且可為較佳。由於可能需要同時維 、 中其他營養素（例如，氮源及鱗酸鹽源）之濃度， 120117.doc -75 - 200815596 、I犯而要使用等份的初始發酵培養基。同樣，可藉由 %力等&的微s金屬溶液來維持發酵培養基中微量金屬濃 度。 D· f #資之塗產及潜#遗道 • α +田3芎養素之經改造微生物實施進一步處理以便於 : ㈣瘤卜太或蛋白質必須可逃離瘤胃降解並經過小腸以 提供足量的胺基酸。經研究可用以防止胺基酸發酵消化之 φ 要方法匕括·(1)使用可防止產物被瘤胃降解之組合物塗 覆該具有增加胺基酸含量之產物及/或⑺對該胺基酸實施 …構操控以產生展j見降低瘤胃降解之胺基酸類似物。 /、有明顯一級或二級結構（例如，二硫鍵）之蛋白質可顯 不較佳瘤胃保護。除了為反籍動物飼料提供必需胺基酸來 源以外，富含必需胺基酸之蛋白質可非常類似於存於血粉 中之§含必需胺基酸”蛋白質。舉例而言，血粉可包含豬 血紅蛋白α鏈。僅作為實例，經改造微生物中富含必需胺 • 基酸之肽或蛋白質可使用聚合化合物或聚合蛋白質、脂 肪、脂肪及鈣之混合物、脂肪及蛋白質之混合物、及使用 ^ 長鏈脂肪酸之金屬鹽來塗覆。富含必需胺基酸之肽或蛋白 貝亦可使用pH敏感性聚合物來塗覆。阳敏感性聚合物在 ' 瘤胃？11係穩定的，但當其暴露於皺胃pH時會受到降解， 釋放可在皺月中消化並可在小腸中吸收之肽或蛋白質。因 此，可對游離胺基酸實施塗覆以提供針對瘤胃降解之保 濩。必需胺基酸或富含必需胺基酸之肽或蛋白質可與一戋 多種還原碳水化合物（例如，木糖、乳糖、葡萄糖及諸如 120117.doc •76- 200815596 此類）反應。 可使用各種塗覆材料對該等營養素實施塗覆。例如，植 物油（例如’大丑油）、疏水性高熔點化合物及脂質之混合 物。一或多種疏水性高熔點化合物（例如，脂肪酸之礦物 鹽，如商業級硬脂酸鋅）與一或多種脂質之組合可形成可 保護經塗覆成份之含量及功能的塗覆材料。可對此等塗料 實施調配以滿足高溫及高壓處理條件以及保護胺基酸有效 負載免文瘤胃微生物環境破壞的需要。適宜塗料闡述於美 國專利公開案第2003/01480 13號中，該案之全文以引用方 式併入本文中。疏水性高熔點化合物通常具有至少約70°C 且更佳大於100°C之熔點。特定言之，具有介於約ι15^與 130 C間之熔點的脂肪酸鋅鹽係適宜的疏水性高溶點化合 物。 脂質組份通常具有至少約〇它且更適宜地不小於約4〇它 之溶點。該脂質組份可包括植物油，例如，大豆油。在其 他實施例中，該脂質組份可為具有約45_75 之熔點的甘 油三酸基酯。可自包括但不限於下列之群組選擇商業級硬 脂酸作為代表性脂質··硬脂酸、氫化動物脂肪、動物脂肪 (例如，獸脂）、植物油（例如，粗製植物油及/或氫化植物 油’部分或完全經氫化）、卵磷脂、棕櫚酸、動物油、 纖、脂肪酸酯（C8至C24)、脂肪酸（c8至C24)。該塗料可以佔 被塗覆組份重量之自1重量％至2〇〇〇重量％之量存於塗覆產 物中。經常地，該塗料係佔經塗覆成份重量之約15重量％ 至85重量％。更經常地，該塗料係佔經塗覆成份重量之約 120117.doc -77- 200815596 20重$%至60重量％及/或30重量％至4〇重量％。該塗料可 自疏水性混合物加以製備。該塗料可包含表面活性劑。 该塗料可使用一或多種疏水性不溶性化合物與脂質之組 合。舉例而s，商業級硬脂酸鋅具有極高疏水性且完全不 • ’谷於水。與僅向塗料中添加脂質相比，向塗料配方中添加 ； f業級硬脂酸辞可顯著改良該成份之受保護濃度及其功 月匕牛例而〇§經塗覆產物存於水性培養基中時，藉由 I硬脂酸鋅與諸如商業級硬脂酸等某些不溶性脂質組合， Μ塗料化合物可提供針對浸析（即，經塗覆產物之活性成 份的損失）之較佳保護。因此，可在設計用於反籍動物之 飼料中利用本發明塗料組合物之優勢以繞過瘤胃並將活性 成份低送至小腸。 除了可方便地繞過瘤胃以外，該塗料亦可用於防止經塗 覆營養素在生產過程（造粒及擠壓）中經受熱量及壓力的影 響。該塗料組合物可用於其中應用熱及使用熱敏性成份的 φ 戶斤有類別生產過程。可受益於此保護形式之成份係可受到 #破壞或降解之成份’例如，胺基酸、蛋白質、酵素、維 、 他命、色素、及引誘劑。除了可保護成份免受與熱相關之 破襄或損失以外’亦需要防止各成份受到由與其他成份缔 • 纟或發生化學反應引起的破壞或損失。該囊封方法可防止 1、八他成伤發生有害的締合或反應，或受到氧化。因此， 該囊封方法提供預封裝或組合調配物各成份之能力，其中 該等成份經常可分別包裝。 可以許夕方式製備該塗料組合物。較佳地，製備過程包 120117.doc -78- 200815596 括製造鋅有機鹽組份與脂質組份之固體溶液。在—個者於 例中，可將該鋅有機鹽及該脂質組份熔化直至二者均、々解 並形成溶液。隨後可使該溶液固化以形成固體溶液。除了 包含鋅有機酸組份及脂質組份以外，該塗料亦可包含其他 : 成份。舉例而言，該塗料可包含一或多種乳化劑，例如， ， 甘油、多糖、卵磷脂、膠凝劑、及肥皂，其可改良囊封過 程之速度及效能。另外，該塗料可包含一抗氧化劑以提供 針對氧化作用之改良保護。而且，該塗料組合物可包含^ 形成固體溶液之過程中可溶解或可不溶解的其他組份。舉 例而言，該塗料組合物可包含少量氧化鋅及其他成份或化 合物。 適且塗料可自諸如大豆油等部分經氫化植物油製備。至 ^。卩分經氫化之其他適宜植物油包括棕櫚油、棉籽油、玉 米油、花生油、棕櫚仁油、巴巴樹油、向日葵油、紅花 油、及其混合物。適宜塗料可自包含部分經氫化植物油及 _ 頜外構成成份（例如，蠟）之混合物製備。適宜蠟包括蜂 蠟、石油蠟、米糠蠟、蓖麻蠟、微晶蠟、及其混合物。在 某些實施例中，自包含約85_95%之部分經氫化植物油（較 ^ 佳為約90%)及約5-15%蠟（較佳為約1 〇%)之混合物製備適 ’· 宜塗料。該塗料可包含用於改良該經塗覆底物之密度的試 ^ ’例如’表面活性劑，如聚山梨醇酯6〇、聚山梨醇酯 80、丙二醇、琥珀酸二辛基磺酸鈉、月桂基硫酸鈉、脂肪 酸之乳醯基酯、脂肪酸之聚甘油酯、及其混合物。 可藉由對包含L-His及/或富含組胺酸蛋白質之底物噴塗 120117.doc -79- 200815596 包含部分經氫化植物油（85%-95%)及蠟（5%-15%)之疏水性 混合物來製備經塗覆底物（或預塗覆底物）。視情況，可藉 由使用表面活性劑喷塗預塗覆底物之表面以形成經塗覆底 物來進一步塗覆該預塗覆底物。該經塗覆底物可具有下列 組成：底物（40-80%);疏水性混合物（20-60%);表面活性 劑（0-40%)(可選）。該經塗覆底物可具有約0·3_2〇(更適宜 地，約1·3-1 ·5)之比重。在一個實施例中，該經塗覆底物 包含：約50%底物；約35%疏水性混合物；及約15%表面 活性劑。可藉由使用疏水性混合物預塗覆該底物來製備經 塗覆底物且隨後使用表面活性劑塗覆該預塗覆底物。 在製備塗料組合物之後，隨後可使用其來製備受保護營 養素。一種用於製備受保護成份之適宜程序利用囊封技 術，較佳為微囊化技術。微囊化係一個藉助其可使用另一 材料（在此情形中，係塗料組合物）密封或包圍極少量氣 體 程 盤 聚 法 液體或固體成份以保護該成份免受周圍環境影響的過 許多微囊化過程可用於製備經保護成份，例如，旋轉 喷塗、共擠出、及其他化學方法，例如，複合體凝 相分離、及凝膠化。一種適宜微囊化方法係旋轉盤方 在旋轉盤方法中，f Μ π a l備活〖生成伤及塗料組合物之乳液 及/或懸浮液並以重力自泠古4 w 刀自_方式喂送至加熱旋轉盤之表 面。著該盤旋轉，該乳液/懸率 孔，夜/愆汙液猎助離心力散佈於該 盤表面以形成薄層。在号Γ舨 、4在该盤之邊緣，該乳液/懸浮液被剪 切成其中活性成份由該塗料包 匕固之離散液滴。當該i 自盤降落至收集料箱漏斗 液滴 f將該4液滴冷卻以形成微囊 120117.doc 200815596 化成份（即，經塗覆產物）。由於乳液或懸浮液並非藉由孔 擠出，因而此技術可使用較高黏度塗料並容許塗料中有較 高成份負載。用於動物飼料之各成份的微囊化闡述於美國 專利公開案第2003/0148013號中，該案之全文係以引用方 式併入本文中。 亦可以化學方式改變胺基酸（例如，組胺酸）及/或蛋白質 (例如，富含組胺酸之蛋白質）以保護瘤胃中之胺基酸並增 加供給皺胃及小腸之特定胺基酸的供應。舉例而言，曱硫 胺酸羥基類似物（MHA)已經用作胺基酸補充物。另外，胺 基酸可作為胺基酸/礦物螯合物來提供。鋅-甲硫胺酸及辞_ 離胺酸複合體已經用作胺基酸補充物。 胺基酸需要 在哺乳動物之膳食調配物中，可自動物胺基酸需要量減 去自瘤胃發酵形成之預定可消化微生物胺基酸量，如藉由 動物特性曲線所確定。需要供作飼料之不可降解必需胺基 酸（UEAA)的胺基酸量係動物胺基酸需要量與由可消化微 生物胺基酸所提供胺基酸量之差值。可將牛奶之胺基酸特 性曲線與精由經改造微生物在該動物之消化道内所產生胺 基酸之特性曲線（即，微生物胺基酸特性曲線）對比。微生 物與牛奶之胺基酸特性曲線的差別表明胺基酸可能是過量 的或有限的。然而，此胺基酸特性曲線對比僅提供部分所 需資訊以提高所選動物產品之產量。亦可考慮個體將小場 中胺基酸納入所選動物產品之效率。藉由測定輸出/輸入 胺基酸特性曲線比率及藉由測定納入效率，可測定乳牛可 120117.doc -81- 200815596 消化胺基酸需要量。已經確定：組胺酸、離胺酸、甲硫胺 酸、苯丙胺酸及蘇胺酸可為用於乳牛之限制胺基酸。可對 肌肉之胺基酸特性曲線實施類似的測定。 乳牛飼料所需胺基酸被稱為乳牛可消化胺基酸 (nddAAn)。可消化微生物胺基酸量加上該相同胺基酸之瘤 胃未降解可消化必需胺基酸（UEAA)濃度的和係ddAA。乳 牛可消化胺基酸表示供給小腸的全部可消化AA之供應。 產乳動物之全部胺基酸需要量可按照下列加以測定。所需 fe基酸總量（nTAAR’’）等於維持所需量（”維持胺基酸，，或 "MAA”）加產奶所需胺基酸之量（"奶胺基酸輸出"或 ”MAAO")加生長所需胺基酸量（"生長胺基酸，，或 ’’GAA")(即，TAAR=MAA+MAAO+GAA)。 可將限制胺基酸供給動物以藉由使用該限制胺基酸補充 動物飼料來增加所選動物產品（例如，牛奶）之產量。可藉 由分析所選動物產品之胺基酸特性曲線（即，輸出特性曲 線）並將此特性曲線與供給動物之胺基酸的特性曲線（即， 輸入特性曲線）對比來確定限制胺基酸。用於測定胺基酸 茜要ϊ之方法為此項技術所知且闡述於美國專利第 5，145,695號及美國專利第5,219,596號中，該等案件之全文 係以引用方式併入本文中。舉例而言，可將牛奶之胺基酸 特性曲線與藉由微生物在動物消化道内所產生胺基酸之特 性曲線（即，微生物胺基酸特性曲線）進行對比。微生物與 牛奶胺基酸特性曲線間之差別表示其中胺基酸可為過量的 或有限的。 120117.doc -82- 200815596 或者’可使用外源性營養素（即，除彼等已由微生物產 生者之外的營養素）補充藉由發酵經基因改造或未經改造 之微生物所剩餘發酵殘餘物以提高其營養價值進而提高其 商業價值。人們可利用此方法來平衡缺少一或多種營養素 之發酵殘餘物的營養素含量。 Ιν·商業方法 本發明提供了若干商業方法來開發及評定各過程及產物 以提南玉米-至·乙醇副產物（例如，乾燥酒糟）之價值。此 可藉由使用經改造微生物以改良在乙醇生產中所形成此等 副產物之營養含量進而形成富含營養素之動物飼料及其他 增值產物從而提高乙醇生產之經濟效益來達成。乙醇工業 代表美國玉米之第三大市場。燃料乙醇生產係農村經濟發 展、環境改良、及汽油銷售的重要組成部分。本發明之商 業方法提供呈富含營養素之完全飼料形式之有價值副產 物，其可顯著增加乙醇發酵工業之商業價值。 農業及農村經濟一直在遭受低商品價值的影響。概言 之，農民所收穫的許多農產品之價值已經低於生產成本。 此情形已造成許多農民歇業，而此已造成許多農村經濟崩 潰。而且，由於美國不斷增加地進口大量油，美國之能源 ^全已變得不穩m卜，當進口油之利用率以及成本顯 著波動時，可影響美國經濟。本發明之完全飼料可有助於 確定自乙醇生產獲得的增值副產物，其可幫助支持國内生 物乙醇工業發展，提供農村經濟之增加及可持續收入，開 發可代替目前自石油製備之產物的新_生物基產物，及^ 120117.doc -83- 200815596 高可更新能源之國内產值，進而可改良美國之能源安全。 消費者及公眾可藉由穩定燃料可利用率以及刺激汽油價格 而受益於本發明。由於富含營養素之完全飼料係自原始農 產品製備，因此本發明亦可改良農村及農業經濟並保護空 氣及水品質。 本發明之一個態樣係關於一種藉由使用經改造微生物實 施發酵反應來提高發酵工廠之產值；並銷售或出售一或多 種包含該經改造微生物之發酵反應產物的商業方法。以提 高經改造微生物之營養含量的方式改造該微生物。經改造 微生物富含諸如下列（僅作為實例）等營養素：脂肪、脂肪 酸、脂質（例如’磷脂）、維他命、必需胺基酸、肽、蛋白 質、碳水化合物、固醇、酵素、及微量礦物質(例如， 鐵、銅'鋅、錳、鈷、碘、硒、鉬、鎳、氟、釩、錫及 石夕）。本發明之另—態樣係關於—種藉由於經改造微生物 存在下使用含碳材料實施發酵反應以產生較該發酵❹於 不存在該經改造微生物下實施時具有更高商業價值之發酵 殘餘物來提高發酵工廠產值的商業方法。 =物可形成含有較高營養素含量之完全動物飼料。:: &明所生成較佳發酵殘餘物㈣用料殘餘物具 的商業價值。舉例而言，該等發更阿 燥固雜。 ”酵殘餘物可包含經増強乾 _ _ $如，具有較咼胺基酸及其他營養辛含旦 DDGS。 卞I 3里之 本發明之富含營養素發酵殘 式磨機乙隨“ 戈餘物之組成不同於自傳統乾 機乙知生產過程所產生DDG及其他酒糟副產物的: 120117.doc -84 - 200815596 成該專傳統過程之產物係藉由在 時對在於敕加R 个赞明經改造微生物 了于存於正個、碾碎玉米中澱粉實施 之富含爲Hx酵來獲得。本發明 之田3呂養素發酵殘餘物可具有自至 番吾〇/令放兰i人 乂、、、勺1重量％至約95 重里/0之營養素含量。營養素含量之 t # % 20 ^ - 0/ 奴仏乾圍係至少約10 宣里/〇-20重1%、2〇重量％_3〇重 0/ .n . ^ Α 0 30 重量 ％-40 重量 /〇、40重量％_50重量％、5〇重量％ 里 70重量％。 重里4、及60重量％- 在該商業方法之某些實施例中 U重量。之發酵殘餘物。在適宜實施例中=含至少約 含至少約㈣、至少約25%、至少約二= J JU/o、至少約 35%、5 >、約40%、至少約45%、至少約抓 王夕約60%、至少約 70%、或至少約75%之發酵殘 、 , 賴餘物經常地，飼料組合物 匕δ至：>、約20重量％之發酵殘餘物 ^ f㈣組合 物包含至少約15重量％_25重量％、 里 25重篁％-20重量％、20 重…重量％、3〇重量％，重量％、4〇重量刚 %、50重量％_60重量％、或6〇 70重篁％之發酵殘餘 。該飼料組合物亦可含有其他營養素、橋味劑、芳香 劑、防腐劑等。亦可針對具有特定營養素需要之特定動物 特製動物飼料。 酒糟之出售係整個收益率之重要部分且對乙醇工業發展 非常重要。酒糟作為動物飼料之有效銷售對於維持乙醇生 產設備之效率及收益率可為十分關鍵的。該動物飼料可用 於屬於動物界之任一有機體且包括但不限於家禽、牛、 豬、山羊m苗、狗、小鼠、水產養殖動物、馬等。 120117.doc -85 - 200815596 可藉由以使微生物可產生特料用於食用該飼料之動物的 某些營養素之方式改造該微生物來改良動物飼料之營養素 含量。因& ’可使用特定營養素製備心料動物二動物 飼料，此可提供廣闊的動物飼料商業市場並可進而提高飼 料之商業價值。因此，本文所揭示銷售或出售—或多:包 含經改造微生物之發酵反應產物的商業方法可提高發酵= 廢之產值。

在該商業方法之某些實施例中，可在不實f降低藉由該 發酵反應所產生發酵產物之量時實現該產值增加。可在當 發酵基本上已經完成(較佳完成至少約5〇%，更佳完成至： 約观’更佳完成約9G%)時來引發藉由經改造微生物增加 營養素組份之產量。此規則可在無需犧牲諸如醇及氣體副 產物等發酵產物之品質時產生具有較高營養價值之發酵殘 餘物°可藉由量測發酵培養基中葡萄糖含量或量測諸如二 氧化碳等氣體產物來監測該發酵反應之完成狀況。 在該商業方法之-個實施例中，該發酵殘餘物具有較缺 少該經改造微生物之發酵殘餘物存架壽命更長的存架壽 命。因此，該等發酵殘餘物可自生產點轉運至儲存點以及 出〇 2在任點，其可以其原本形式或以經混合製成的 疋王動物飼料形式出售，其完全飼料可包含發酵殘餘物、 其他營養素、防腐劑、矯味劑、及/或芳香劑等。可藉由 使用以使該發酵殘㈣存架壽命更長之方式來改造富含營 養：之經改造微生物來延長發酵殘餘物之存架壽命。舉例 而D微生物可以經改造微生物可使一化合物用作防腐劑 120117.doc -86- 200815596 之方式加以改造。古 — 、、 '、精由採用可生成在不同天翕、、、a 度、或溫度條件下俘拉 ；；J·、、、 下保持不党損之發酵殘餘物的 延長發酵殘餘物之存牟I人l 7%酵過耘來 較少水份含量且因=二此過程可包括產生作為具有 餘物。可_由^ 氣錢件之錢㈣的發酵殘 餘物了猎由Μ使發酵殘餘物保持不受損 存及轉運該發酵殘餘物來 、 >封裝、儲 架壽命。 來進-步延長該等發酵殘餘物之存

在該商業方法之某些實施例中，該等微生物可以使盆舍 含諸如胺基酸（較佳為必需及/或限制胺基酸）等營養素的= 式加以改造。可藉由使用限制胺基酸補充動物飼料來將該 限制胺基酸供給動物以增加所選動物產品（例如，牛奶）之 產量。可藉由分析所選動物產品之胺基酸特性曲線(即， 輸出特性曲線）並將此特性曲線與供給動物之胺基酸特性 曲線（即，輸入特性曲線）對比來確定限制胺基酸。舉例而 言，貓需要大量牛磺酸用於其身體活動，但具有可自諸如 甲硫胺酸及半胱胺酸等其他胺基酸生成牛磺酸之有限酵 素。因此，貓需要富含牛磺酸之膳食。倘若牛磺酸缺乏， 則可能發生諸如下列等病症：稱為擴張型心肌病症之心臟 病、視網膜變性、生殖障礙及異常小貓發育。含有具有高 營養含量之經改造微生物的本發明完全飼料可幫助治療或 緩和動物之此等病症。因此’本發明之完全動物飼料不僅 可為不同的動物而製備而且其亦可為缺少某些營養素之動 物或患有一或多種與體内營養素濃度相關之病症的動物而 製備。 120117.doc -87- 200815596 儘管本文展示並闡述本發明之較佳實關，但彼等熟習 此項技術者應明瞭此等實施例近作為實例提供。現在彼等 熟習此項技術者可知不背離本發明之許多變更形 形式及替代形式。應理解’本文所述本發明實施例之各種 替代方案可用於實踐本發明。下列巾請專利範圍欲界定本 發明之範圍及屬於此等中請專利範圍之方法和結構及涵蓋 於其中之等效物。 實例 表現載體之構建： 依照標準重組技術構建適用於在諸如酵母菌細胞等微生 物中產生外源性序列之表現載體。該載體可包含能夠在酵 母菌細胞中複製之複製操縱子，一以可操作方式連接至控 制表現之調節序列的相關外源性序列。所製備載體視情況 可在諸如細菌等原核生物（即，穿梭載體）中複製以便於選 殖。另外，該載體可包含調節序列，例如，㈣糖抑制因 T操縱子，其經常可抑制外源性序列表現直至培養基中葡 萄糖含量报少或幾乎被耗盡。 通常構建該表現載體以含有可選標記（例如，編碼經該 載體轉化之宿主細胞存活或生長所必需蛋白質之基因）， 但此標記基因可攜帶於共同導入宿主細胞中之另一多核苦 酸序列上。僅有彼等其中已經導入可選基因之宿主細胞可 在選：條件下存活及/或生長。典型選擇基因可編碼如下 蛋白質：（a)賦予抗生素或其他毒素物質（例如，氨节西林 (amP1Clllm)、新黴素（neomycyin)、胺甲喋呤（methotrexate) 120117.doc -88- 200815596 等）抗性者；（b)補充營養缺陷者；或（〇提供自複合培養 基獲付的關鍵營養素者。適當的標記基因之選擇可視宿主 細胞而定，且用於不同宿主之適當基因為此項技術所知。 選殖及表現载體通常亦含有該宿主可識別之複製系統。 示例性表現载體係以可操作方式連接至適宜轉錄控制因

子例如，啟動子、增強子及終止子。對於表現（即，轉 譯）而言，通常亦需要一或多個轉譯控制因子，例如，核 糖u位點、轉譯起始位點及終止密碼子。此等控制 (轉錄及轉譯)因子可源自諸如熱休克基因等調節性基因、 與毒性相關之基因及孢子形成基因。亦可包含編碼信號狀 之多核苦酸相以使編碼外隸序列穿過及/或進駐細胞 膜或者（若需要）自細胞分泌。 外源性序m例如，富含-μ種必需絲酸）之表現： 可精由許多適當的方法（包括電穿孔、轉染、轟擊、及 2染）之任一種將含有相關外源性序列之載體導入酵母菌 宿主細胞。可在選擇性培養基（例如，具有適宜抗生素）中 培養經轉化酵母菌細胞以選擇彼等經表現㈣轉化者。隨 後製偉轉化體的實質同源性培養物㈣於發酵反應。發酵 反應可在標準無氧條件進行以生成醇及氣體產物。發酵反 應之殘餘物因(例如)富含-或多種必需胺基酸(例如，舍人 =胺酸）之外源性序列的過度生產而含有具有較高營= 虽之酵母菌轉化體。 實例1 PKS-1-ST:G060205之構建 120117.doc •89- 200815596 構建含有編碼來自腦膜膿毒性黃桿菌（GO6205)之脯胺酸 特異性内肽酶之開放讀碼框的載體（標稱為pKS-卜 ST:G060205)以在酵母菌細胞之胞質體中表現該内肽酶。 該内肽酶在框中與用於快速蛋白質純化之Strep-Tag和用於 便於藉由西方點潰分析來實施監測之HA-Tag連接。將内肽 酶序列藉由限制酶切位點BamHI及Xhd亞選殖至pKS-1-ST 主鏈。關於pKS-l-ST:G060205中所含其他序列組份可參見 圖3A。特定言之，該pKS-1-ST載體背景攜帶KanMX抗性 標記，即一控制脯胺酸特異性内肽酶基因表現之ADH2啟 動子。該ADH2啟動子通常在酵母菌細胞生長期前期係無 活性的。當該等細胞到達生長曲線之靜止期前期時，培養 基（例如，YPD發酵液）中葡萄糖耗盡，進而引發ADH2啟動 子活性。 實例2 PKS-2_ST:GO6205之構建 構建含有編碼來自腦膜膿毒性黃桿菌（GO6205)之分泌性 脯胺酸特異性内肽酶之開放讀碼框的載體（標稱為pKS-2-ST:G060205)。該内肽酶以可操作方式連接至Suc2前導序 列以指導酵母菌細胞外之合成内肽酶。另外，内肽酶序列 在框中與用於快速蛋白質純化之Strep-Tag和用於便於藉由 西方點潰分析來實施監測之HA-Tag連接。將該内肽酶序列 藉由限制酶切位點BamHI及Xhd亞選殖至pKS-2-ST主鏈。 關於pKS-2-ST:G060205中所含其他序列組份可參見圖3B。 特定言之，該pKS-2-ST載體背景攜帶KanMX抗性標記，一 120117.doc -90- 200815596 ^特異性内肽酶基因表現之adh2啟動子。該 ^2啟動子通常在酵利細胞生長期前期係無活性的。 虽该專細胞到逵峰真A合 生長曲線之靜止期前期時，培養基（例 如’ YPD發酵液）中葡萄糖耗盡，進而引發ADH2啟動子活 性0 外源性序列（例如，富含一或多種必需胺基酸）之表現： 實例3 來自載體购+处⑽6205之脯胺酸特異性内减之胞質 體表現 使用含有編碼脯胺酸特異性内肽酶（一種富含離胺酸之 大蛋白貝）之基因的pKS-l-ST:GO6205載體來轉化可非常有 效地產生乙醇之酵母菌細胞（釀酒酵母菌株4U2)。 脯胺酸特異性内肽酶之胺基酸序列示於圖4入中。除該内肽 酶以外’該表現序列亦含有Strep-Tag、HA抗原決定部 位、及對應於BamHI限制酶切位點之胺基酸殘基。該序列 在兩個位置（在圖4A中以三角形顯示）處受到改造，其中使 用丙胺酸代替野生型絲胺酸及組胺酸殘基以滅活該肽酶活 性。 使經轉化酵母菌細胞在標準生長培養基中生長。藉由 SDS-PAGE分析來自經主鏈載體PKS及載體PKS1 :GO6205轉 化之控制細胞的裂解物。圖6繪示其上溶解有各裂解物蛋 白質（按照其分子量）的凝膠。如圖6中所示，自經 pKSl:GO6205轉化之酵母菌細胞製備的裂解物含有對應於 具有期望分子量（〜79 kDa)之脯胺酸特異性内肽酶的額外 1201I7.doc -91- 200815596 帶。此帶在自經載體pKS2轉化之控制酵母菌細胞製備的裂 解物中不存在。 實例4 脯胺酸特異性内肽酶藉由載體pKS-2-ST:GO6205之表現及 分泌 使用含有編碼脯胺酸特異性内肽酶（一種富含離胺酸之 大蛋白質）之基因的pKS-2-ST:GO6205載體來轉化可非常有 效地產生乙醇之酵母菌（釀酒酵母菌株ATCC 4132)。該編 碼序列示於圖4B中。除該内肽酶以外，該表現序列亦含有 SUC2輸出信號以使蛋白質自經轉化細胞分泌。該編碼序 列亦具有strep-tag、及HA抗原決定部位序列、及對應於 BamHI限制酶切位點之胺基酸殘基。該序列在兩個位置（在 圖4A中以三角形顯示）處受到改造，其中使用丙胺酸代替 野生型絲胺酸及組胺酸殘基以滅活該肽酶活性。使經轉化 酵母菌細胞在標準生長培養基中生長。藉由SDS-PAGE分 析經主鏈載體pKS2及載體pKS2:GO6205轉化之控制細胞的 培養物上清液。圖5A顯示經pSK2:GO6205轉化之細胞及經 pKS2轉化之細胞在培養24小時時培養物上清液之層析圖。 圖5A之凝膠顯示：經pSK2:GO6205轉化之細胞的上清液顯 示一具有MW〜79 kDa之帶，對應於脯胺酸特異性内肽酶 蛋白質，而僅經pSK2轉化之細胞未顯示此帶。圖5B顯示 經pSK2:GO6205轉化之細胞及經pKS2轉化之細胞在培養48 小時時培養物上清液之層析圖。圖5B之凝膠顯示：經 pSK2:GO6205轉化之細胞的上清液顯示一具有MW〜79 120117.doc -92 - 200815596 kDa之帶，對應於脯胺酸特異性内肽酶蛋白質，而僅經 pSK2轉化之細胞未顯示此帶。 【圖式簡單說明】 本說明書中所含圖解闡明本發明之許多優點及特徵。應 理解：本文圖解中所述類似參考編號及字符可指示本發明 之相同或類似特徵。該等圖解及本文所繪示特徵不一定按 比例繪製。 圖1係一闡明可形成乙醇、二氧化碳、及諸如具有可溶 物或固體之乾燥酒糟（DDGS)等發酵殘餘物之示例性乙醇 生產過程的流程圖。 圖2係用於改造本發明發酵反應中所用微生物之示例性 遺傳載體的代表示意圖。 圖3 A係釀酒酵母中富含離胺酸蛋白質之表現所用pKSl-ST:GO6205載體的載體圖。 圖3B係釀酒酵母中富含離胺酸蛋白質之表現及分泌所用 pKS2-ST:GO6205載體的載體圖。 圖4A係來自pKSl-ST:GO6205(—種來自腦膜膿毒性黃桿 菌（F/avoZmcterz’wm 之富含離胺酸的特異 性内肽酶）之表現蛋白質的序列。 圖4B係來自pKS2-ST:GO6205(—種來自含有SUC2輸出信 號之腦膜膿毒性黃桿菌之富含離胺酸的特異性内肽酶）之 表現蛋白質的序列。 圖5 A係在釀酒酵母細胞培養物生長24小時時所取培養物 上清液之SDS-PAGE凝膠圖像，其顯示pKS2-ST:GO6205所 120117.doc •93- 200815596 編碼蛋白質之表現及分泌。 圖5B係在經轉化釀酒酵母細胞培養物生長48小時時所取 培養物上清液之SDS-PAGE凝膠的圖像，其顯示pKS2-ST:GO6205所編碼蛋白質之表現及分泌。 、 圖6係經轉化釀酒酵母細胞培養物之細胞裂解物的SDS- , PAGE凝膠圖像，其顯示細胞内pKSl-ST:GO6205所編碼蛋 _ 白質之表現。 圖7係本發明之乙醇生成發酵過程的示意圖。 W 圖8係此項技術中已知連續發酵過程之圖。 圖9係本發明並行發酵過程之圖。 圖10係進一步闡明下游加工之本發明並行發酵過程之 圖。 圖11係闡明在並行發酵過程前之預處理步驟的本發明並 行發酵過程之圖。 圖12係闡明其他並存過程之本發明並行發酵過程之圖。 ^ 圖13係包含3個並行發酵之本發明並行發酵過程之圖。 圖 14係來自 http://pathway.yeastgenome.org:8555/YEAST/new-image?type=OVERVIEW&force=t之評注網頁。其顯示酵母菌 ' 中之酶通道且尤其可鑑別若干酶通道。該網址含有至沿該 ' 等通道之特異性酵素的鏈接。 120117.doc 94·

Claims (1)

1. 200815596 十、申請專利範圍： 1. -種使料储料進行料时法，其包括·· ⑷將合碳材料與包含基因改造微生物的培養物混 合’該等微生物可在發酵過程中生成第—產物及含營養 素之發酵殘餘物’其巾該發酵殘餘物巾營養素之含量較 在該發酵過程中使用之未經改造對應微生物時所生成殘 餘物中營養素之含量為高; 成殘 ()*在適於冑業生產該第一產物之條件下及在適於生 產該營養素之條件下發酵該培養物； 、 (0自該培養物分離該第一產物；及 (d)生成該發酵殘餘物。 2.如請求们之方法，其中該等微生物包含重組表現載 體’該重組表現载體包含編碼多肽之外源性核苦酸序列 ，控制該外源性多肽表現之調節序列，其中與未經改造 被生物之情形相比’該外源性多肽表現會增加該發酵殘 餘物之營養含量。 3·如喷求項丨之方法，其中該營養素係選自由下列組成之 群：月^肪、脂肪酸、脂質、維他命、必需胺基酸、狀、 蛋白貝、碳水化合物、固醇、酵素、及微量礦物質。 4·如請求们之方法’其中該營養素係選自由下列;且成之 群的必需胺基酸：離胺酸、曱硫胺酸、苯丙胺酸、蘇t 酸:異白胺酸、色胺酸、線胺酸、白胺酸、精：酸稣: 石尹、及組胺酸。 5·如請求項1之方法，其中該外源性序列 双現係處於選 120117.doc 200815596 的調節序列的控制：熱休克基因之調 之調節序列及孢子形成基因之調節序 ’其中係在該發酵反應已經完成至少 源性序列之表現。 ’其中該外源性核：〇：酸序列之表現取 如請求1夕+^ 、 法’其中該基因改造係修飾該營養素合 成途徑中之至少—種結構基因。 ” 9· 如請求;夕士 π κ万法，其中該基因改造係修飾該營養素合 成途徑之調節控制。 如明求項9之方法，其中該合成途徑係用於選自由下列 、、且成之群的必需胺基酸：離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺 酸、蘇胺酸、異白胺酸、色胺酸、纈胺酸、白胺酸、精 胺酸、牛磺酸及組胺酸。

   自由下列組成之群 節序列、毒性基因 列0 6·如請求項1之方法 約50%時誘導該外 7·如請求項1之方法 決於葡萄糖濃度。 8. 11.如明求項1之方法，其中該基因改造法可改造營養素送 進或送出該微生物之轉運過程。 12·如明求項1之方法，其中該營養素係選自由下列組成之 群的必需胺基酸：離胺酸、曱硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺 酸、異白胺酸、色胺酸、纈胺酸、白胺酸、精胺酸、牛 磺酸及組胺酸。 13·如請求項丨之方法，其中該營養素係維他命。 14.如清求項13之方法，其中該維他命係選自由下列組成之 群··維他命A、維他命B1、維他命B2、維他命B3、維他 120117.doc 200815596 命B5、維他命B6、維他命B7、維他命則、維他命此 維他命C、维他命D1-D4、生f紛、及維他衫。 15.如請求項!之方法’其中該營養素係脂質。 16·如請求们之方法，其中該第—產物係醇。 17. 如請求項16之方法，其中該醇係乙醇。 18. 如請求項16之方法，其中該醇係選自由甲醇 醇組成之群。 月求員16之方法，其中該醇係藉由蒸餾來分離。 2〇.如請求項16之方法，其進—步包括將該醇與另_種㈣ 混合。 其中該第一產物係選自溶劑或氣 21·如請求項1之方法， 體。 如月求項1之方法，其中該第一產物係醫藥化合物。 23·如請求们之方法，其中該含碳材料係選自由下列組成 之群:纖維素、木眉…蔬菜、生物質、排泄物、動物廢

   棄物:燕麥、小麥、玉米、大麥、蜀黍、粟 '稻、裸 麥、向樑、馬鈐薯、甜菜、芋頭、樹薯、水果、果汁、 及甘蔗。 彳 24·如請求項!之方法，其中該發酵殘餘物包括乾燥酒糟、 乾燥酒糟中之可溶物或含有可溶物之乾燥酒糟。 25·如睛求項1之方法，其中包括將該發酵殘餘物併入動物 飼料中。 26. 之方法’其中係在發酵"上已完成時生成 120117.doc 200815596 27.如明求項1之方法，其中該微生物係酵母菌。 28·如請求jg” 貝27之方法，其中該酵母菌係酵母屬 (Saccharomyces) 〇 • 29·如明求項1之方法，其中該等微生物包括酵母菌，該碳 '、 、米氣卷或蔗糖，該第一產物包括乙醇且該營養 : f係選自離胺酸、甲硫胺酸、色胺酸及蘇胺酸。 3 0·如請求項1 $古| •貝之方法，其中該微生物係梭狀芽胞桿菌 (Clostridium) 〇 #明求項3〇之方法，其中該產物係丁醇或丙明。 #月长項1之方法，其中該等微生物包括梭狀芽胞桿 菌j石反源包括玉米澱粉或蔗糖，該第一產物包括乙醇 且4營養素係選自離胺酸、甲硫胺酸、色胺酸及蘇胺 酸。 33.如明求項」之方法’其中該微生物係選自由發酵單胞菌 屬（y monas sp.)、大腸桿菌（Ε· c〇li)、棒狀桿菌 Φ ( rynebaCtenUm)、紐桿菌屬（Brevibacterium)及芽孢桿 菌屬（Bacillus ssp.)組成之群。 34·如明求項1之方法’其進-步包括商業化該第一產物及 該發酵殘餘物。 ’ 35· 一種使用含碳材料進行發酵的方法，其包括： ⑷將合碳材料與包含基因改造微生物的培養物混 合，該等微生物可在發酵期間生成第一產物及發酵殘餘 物，其中該發酵殘餘物之價值較藉由未改造之對應微生 物發酵所生成的發酵殘餘物之價值為高·， 120117.doc 200815596 (b)在適用於生成該第—產 南價值之發酵殘餘物的條 、用於生成該具有更 (C)自該培養物 、 X該培養物； η脣物分離該第一產物； (d)收穫該發酵殘餘物。 36·如請求項35之方法，其巾 業產品或醫藥產品。 聋餘物包括增加量之工 37·如請求項35之方 性質。 Z、㈣發酵殘餘物呈現改良之物理

   38·如請求項37之方法 增加或密度增加。 其中該改良之物理性質選自黏附力 39· —種基因改造微生物， 八此隹1酵過耘中生成供商業化 一物及包含營養素之發酵殘餘物，其中該發酵殘 餘:中營養素之含量較在該發酵反應中使用未改造之對 應微生物時所生成發酵殘餘物中營養素之含量為高。

   40·如睛求項39之基因改造微生物，其包含重組表現載體， 該重組表現載體包含編碼多肽之外源性核苷酸序列及控 制該外源性多肽表現之調節序列，其中與未經改造微生 物之情形相比，該外源性多肽表現會增加該發酵殘餘物 之營養含量。 41·如請求項40之基因改造微生物，其中該營養素係選自由 下列組成之群··脂肪、脂肪酸、脂質、維他命、必需胺 基酸 '肽、蛋白質、碳水化合物、固醇、酵素及微量礦 物質。 42·如請求項40之基因改造微生物，其中該營養素係至少一 120117.doc 200815596 種飼養動物之必需胺基酸且該外源性多肽包含該必需胺 基酸。 43 ·如請求項42之基因改造微生物，其中該必需胺基酸係選 自由下列組成之群··離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇 胺酸、異白胺酸、色胺酸、纈胺酸、白胺酸、精胺酸、 牛磺酸及組胺酸。 44,如請求項40之基因改造微生物，其中該外源性序列之表 現係處於選自由下列組成之群的調節序列的控制下：熱 休克基因之調節序列、毒性基因之調節序列及孢子形成 基因之調節序列。 45 · T明求項39之基因改造微生物，其中該基因改造修飾該 營養素合成途徑中的至少一種結構基因。 46·如請求項39之基因改造微生物，其中該合成途徑係用於 飼養動物之必需胺基酸。 其中該基因改造修飾該 47. 如請求項39之基因改造微生物 營養素合成途徑之調節控制。 其中該基因改造修飾可 48. 如請求項39之基因改造微生物 P各有至夕種飼養動物必需胺基酸之肽合成的結構 基因。 、」求項39之基因改造微生物，其中該基因改造法可改 造營養素送進或送出該微生物之轉運過程。 ^求_之基因改造微生物，其中係在發酵反應已經 '至少約5〇〇/。時引發該外源性序列之表現。 A如請求項5〇之基因改造微生物’其中該至少約條完成 120117.doc 200815596 度係藉由發酵反應混合物中葡萄糖含量減少至低於該發 酵反應開始前葡萄糖初始含量的約50%來證實。 52·如請求項39之基因改造微生物，其中該外源性核苷酸序 列之表現取決於葡萄糖濃度。 53·如請求項39之基因改造微生物，其中該營養素係至少一 種飼養動物之必需胺基酸。 54. 如請求項53之基因改造微生物，其中該必需胺基酸係選 自由下列組成之群：離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇 胺酸、異白胺酸、色胺酸、纈胺酸、白胺酸、精胺酸、 牛磺酸及組胺酸。 55. 如請求項39之基因改造微生物，其中該營養素係維他 命。 56·如請求項55之基因改造微生物，其中該維他命係選自由 下列組成之群：維他命A、維他命B1、維他命B2、維他 命幻、維他命B5、維他命B6、維他命B7、維他命B9、 維他命B12、維他命c、維他命di-D4、生育酚、及維他 命K 〇 57·如請求項S5之基 因改造微生物，其中該商業產品係醇。 58·如明求項57之基因改造微生物，其中該醇係乙醇。 5 9 ·如請求馆c $ 5S之基因改造微生物，其中該商業產品係選自 >谷劑或氣體。 60·如請求項 貝55之基因改造微生物，其中該商業產品係醫藥 化合物。 61·如請求項 Μ 39之基因改造微生物，其中該營養素係脂質。 120117.doc 200815596 62·如請求項39之基因改造微生物，其中該醇係選自由甲 醇、丙醇及丁醇組成之群。 63·如請求項39之基因改造微生物，其中該微生物係酵母 菌。 64.如凊求項63之基因改造微生物，其中該酵母菌係酵母 屬。 65·如請求項39之基因改造微生物，其中該微生物係梭狀芽 胞桿菌。 66.如請求項39之基因改造微生物，其中該微生物係選自由 毛酵單胞菌屬、大腸桿菌、棒狀桿菌、短桿菌屬及芽孢 桿菌屬組成之群。 67· —種發酵培養物，其包含·· (a) 基因改造微生物，其可在發酵反應中生成供商業 化之第一產物及包含營養素之發酵殘餘物，其中該發酵 殘餘物中營養素之含量較在該發酵反、應中使用未經改造 對應微生物時所生成發酵殘餘物中的營養素之含量為 南’及 (b) 包含用於生成該營養素之碳源的發酵培養基，其 中該培養物能生成該產物。 68·如請求項67之發酵培養物，其中該營養素係選自由下列 組成之群：脂肪、脂肪酸、脂質、維他命、必需胺基 I肽、蛋白質、碳水化合物、固醇、酵素、及微量礦 物質。 69·如明求項67之發酵培養物，其中該碳源係選自纖維素、 120117.doc 200815596 木屑、蔬菜、生物皙、u 麥、玉米、大麥、蜀黍$動物廢棄物、燕麥、小 薯、甜荚一商 、、粟、稻、裸麥、高樑、馬鈴 箸甜朱、于頭、樹薯 70.如請求項67之發酵拉美⑵ 、 71. 如請求項70之發酵培養物 72. 如請求項67之發酵培養物 或氣體。 73. 如請求項67之發酵培養物 物。 酵培養物’其中該第-產物係醇。 其中該醇係乙醇。 其中該第一產物係選自溶劑 其中該第一產物係醫藥化合 74. 如請求項67之發酵培養物 醇及丁醇組成之群。 75. 如請求項67之發酵培養物 76. 如請求項75之發酵培養物 77_如請求項67之發酵培養物 菌0 ’其中該醇係選自由甲醇、丙 ’其中該微生物係酵母菌。 ’其中該酵母菌係酵母屬。 ’其中該微生物係梭狀芽胞桿

   78·如請求項67之發 單胞菌 σ、物，其中該微生物係選自由發酵 早胞囷屬、大腸桿菌 屬組成之群。 杯狀^、短杯函屬及芽孢桿菌 其具有至少100公升之體 7 9 ·如請求項6 7夕1说 貝67之發酵培養物 積0 80·如請求項67之發 結兮山 酵σ養物，其中該等微生物包括酵母 鹵，該碳源包括玉半m f H ^ . 未歲粉或蔗糖，該第一產物包括乙醇 且4 s養素係選自 辦。 離§文、甲硫胺酸、色胺酸及蘇胺 120117.doc 200815596 81·如請求項67之發酵培養物，其中該等微生物包括梭狀芽 胞桿菌，該碳源包含玉米澱粉或隸，該第-產物包括 乙醇且該營養素係選.雜晚缺 m r, ^ k目離fe酸、甲硫胺酸、色胺酸及蘇 胺酸。 * 82. -種表現載體’其包含編碼多肽之外源性序列，該多肽 ' 包含至少—種飼養動物必需胺基酸，其中係在生成醇或 烧煙之發酵反應已經完成至少約5G%時引發該外源性序 列之表現。 馨83.如請求項82之表現载體’其中該外源性序列之表現係 於選自由下列組成之群的調節序列的控制：葡萄糖抑制 子操縱組、熱休克基因之調節序列、毒性基因之調節序 列、孢子形成基因之調節序列。 84. 如請求項82之表現载體’其中該多肽中所含胺基酸殘基 之至少約5%係飼養動物之必需胺基酸。 85. —種來自基因改造微生物之商業發酵過程的發酵殘餘 • 物’該發酵殘餘物與來自未經此基因改造之微生物的商 業發酵過程之發酵殘餘物相比具有更大量之營養素。 86. 如請求項85之發酵殘餘物，其包括乾燥酒糟。 87. 如請求項85之發酵殘餘物，其包括乾燥酒糟中之可溶 ' 物。 88. 如請求項85之發酵殘餘物，其包括含有可溶物之乾燥酒 糟。 队如請求項85之發酵殘餘物，其包括該基因改造微生物。 9〇·如請求項85之發酵殘餘物’其中該營養素係選自由下列 120117.doc -10- 200815596 組成之群：脂肪、脂肪酸、脂質、維他命、必兩胺基 酸、肽、蛋白質、碳水化合物、固醇、酵素、及：量： 物質。 .如請求項85之發酵殘餘物，其中該發酵過程產生可單離 之工業化學品。 92. 如請求項85之發酵殘餘物’其中該營養素係選自由下列 組成之群的必需胺基酸：離胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、 異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、及精胺酸。 93. 如請求項92之發酵殘餘物，其中該必需胺基酸包含在該 發酵過程所採用微生物生成的異源多肽中。 94. 如請求項93之發酵殘餘物，其中該異源多狀中所含胺基 酸殘基之至少約5%係必需胺基酸。 95. 如請求項85之發酵殘餘物，#中該必需胺基酸含量超過 該發酵殘餘物之約3乾重〇/〇。 其補充有調味劑。 其與說明書一起包裝而用於 其與說明書一起包裝而用於 96·如請求項85之發酵殘餘物 97.如請求項85之發酵殘餘物 動物飼料。 98·如請求項85之發酵殘餘物 食物補充劑。 99. 一種包含至少約15重量％之發酵殘餘物的完全動物飼 料。 100. 如請求項99之完全動物飼料，其中該發酵殘餘物係自基 因改造微生物之商業發酵過程生成，該發酵殘餘物與來 自未經此基因改造之微生物的商業發酵過程之發酵殘餘 120117.doc 200815596 考勿相比具有更高量之營養素。 101·如請求項100之完全動物飼料，其進一步包括該基因改 造微生物。 102·如請求項1⑽之完全動物飼料，其進一步包括可吸引動 • 物之調味劑。 * 103.如請求項1〇〇之完全動物飼料，其中該營養素係選自由 下列組成之群的必需胺基酸：離胺酸、曱硫胺酸、蘇胺 酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、及精胺 酸。 104·如晴求項j 〇3之完全動物飼料，其中必需胺基酸係包含 在該發酵反應中所採用微生物生成的異源多肽中。 105·—種提高發酵工廠產值之商業方法，其包括： U)由含有基因改造微生物及碳源之培養物實施發酵 以生成第一產物，自該培養物分離該第一產物並收穫發 酵殘餘物’其中該發酵殘餘物較藉由未改造之對應微生 拳 物發酵所生成發酵殘餘物具有更高的商業價值；及 (b)行銷或販賣該第一產物(及該發酵殘餘物。 106·如請求項1〇5之商業方法，其中該發酵殘餘物與在該發 酵反應中藉由培養未經改造對應微生物所生成的發酵殘 餘物相比具有增加量之營養素。 107·如請求項106之商業方法，其中該營養素係選自由下列 組成之群：脂肪、脂肪酸、脂質、維他命、必需胺基 酸、肽、蛋白質、碳水化合物、固醇、酵素、及微量礦 物質。 120117.doc -12- 200815596 108.如請求項105之商業方法，其中該發酵殘餘物具有改良 之物理性質。 109·如請求項1〇5之商業方法，其中該發酵殘餘物具有增加 量之工業化合物或醫藥化合物。 110•如請求項106之商業方法，其中該微生物係酵母菌。 111·如請求項106之商業方法，其中該微生物係梭狀芽胞桿 菌。

   112·如請求項1〇6之商業方法 蔗糖。 其中該碳源包括玉米澱粉或 113·如請求項1〇6之商業方法，其中該第一產物係選自由乙 醇、甲醇、丙醇及丁醇組成之群的醇。 114.如請求項1〇6之商業方法，1中該箆一姦 ，、τ邊弟產物係生物燃料 且該方法進一步包括將該生物燃料與另一種商業化燃料 混合。 115.如請求項106之商業方法，其中該營養素係選自由下列 組成之群：脂肪、脂肪酸、脂質、維他命、必需胺其 酸、肽、蛋白質、碳水化合物、固醇、酵素、及：量二 物質。 κ 116·如請求項1〇6之商業方法，其中該發酵殘餘物包括乾燥 酒糟、乾燥酒糟中之可溶物或含有可溶物之乾燥酒糟 U7.如請求項㈣之商業方法，其中包括將該發酵^餘^與 其他營養素混合以生成用於飼養動物之完全飼料。 118· —種包括將發酵殘餘物與營養素組合在一起的方法 119· 一種包含補充有外源性營養素之發酵殘餘物的組合物。 120117.doc -13-