JP2014516581A - バイオ燃料製造工程からの共産物及びその製造方法 - Google Patents

バイオ燃料製造工程からの共産物及びその製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、バイオ燃料製造工程から得られる、動物飼料用の共産物として有用な動物飼料用の共産物及び組成物を製造する方法を含む。より具体的には、本発明は、油の加水分解からの脂肪酸、低濃度蒸留廃液の蒸発からの脂質、シロップ、蒸留穀粒残渣、可溶性物質添加の蒸留穀粒残渣、発酵前のマッシュからの固形分、並びに発酵後の全蒸留廃液からの固形分などの、少なくとも１つのプロセス供給流から得られる動物飼料用の共産物を含む。

Description

本発明は、バイオ燃料製造工程から得られる共産物として有用な共産物及び組成物を製造する方法に関する。例えば、本発明は、油の加水分解からの脂肪酸、低濃度蒸留廃液の蒸発からの脂質、シロップ、蒸留穀粒残渣（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒ ｇｒａｉｎｓ）、可溶性物質添加の蒸留穀粒残渣（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ ｇｒａｉｎｓ ａｎｄ ｓｏｌｕｂｕｌｅｓ）、発酵前のマッシュからの固形分、並びに発酵後の全蒸留廃液からの固形分などの、少なくとも１つのプロセス供給流から得られる動物飼料用の共産物に関する。
バイオ燃料は、何らかの方法でバイオマスに由来する多様な燃料である。バイオ燃料は、原油価格の高騰、高まるエネルギー安全保障の必要性、化石燃料からの温室効果ガス排出に関する懸念、並びに政府補助金などの要因によって、一般的及び科学的関心が高まっている。バイオ燃料は、２００８年に世界の輸送燃料の１．８％を提供した。バイオ燃料生産能力への投資は、２００７年に全世界で４０億ドルを超え、成長を続けている。国際エネルギー機関（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｇｅｎｃｙ）によれば、バイオ燃料は、２０５０年までに輸送燃料の世界需要の１／４超を満たす可能性を有する。
バイオ燃料に加えて、バイオ燃料製造工程（例えば、エタノール及びブタノール製造工程）では、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀粒残渣（ＤＤＧＳ）（「蒸留共産物（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ ｃｏ−ｐｒｏｄｕｃｔ）」）などの副産物も生成される。蒸留共産物は、アルコール製造業者に経済的な利益をもたらすことができる。例えば、ＤＤＧＳは、動物飼料、食品成分、及び工業製品としての使用を目的として、変換することができる。蒸留共産物の代替使用の開発は、発酵副産物の廃棄のための必要性及び費用を最小限にする。
蒸留共産物の栄養素プロフィールには、ばらつきが起こりうる。このばらつきは、例えば、バイオ燃料製造工程で用いる様々な原料の供給源に左右されうる。従って、蒸留共産物を製造する方法、並びに特定の動物飼料若しくは動物飼料市場（例えば、家畜、反芻動物、畜牛、酪農動物、ブタ、ヤギ、ヒツジ、家禽、ウマ、水産養殖魚、又はイヌ、ネコ、及びウサギのようなペット）用に、蒸留共産物を栄養的にカスタマイズするための方法を開発することが求められる。例えば、リシンは、精肉生産用の特定の動物（ブタ及びニワトリなど）の成長を最適化する場合の制限アミノ酸であるため、動物飼料に対する重要な栄養添加剤である。リシンの補充は、高い成長速度を維持すると同時に、窒素排泄物からの汚染を制限しながら、低価格植物タンパク質（例えば、ダイズではなく、トウモロコシ）の使用が可能になる。また、さらに長期の貯蔵期間を有する、一貫した再現性品質の蒸留共産物も求められている。
本発明は、前述及びその他の要求を満たし、さらに、関連する利点を提供するものであり、以下に示す実施形態の説明によって明らかにされるであろう。
本発明は、蒸留共産物を製造する方法であって、少なくとも２つのプロセス供給流を有するアルコール製造工程を用意することを含む方法に関し、この方法では、少なくとも２つのプロセス供給流を組み合わせて、蒸留共産物を製造する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのプロセス供給流は、（ｉ）油の加水分解からの脂肪酸、（ｉｉ）低濃度蒸留廃液の蒸発からの脂質、（ｉｉｉ）シロップ、（ｉｖ）蒸留穀粒残渣（ＤＧ）、（ｖ）可溶性物質添加の蒸留穀粒残渣（ＤＧＳ）、（ｖｉ）発酵前のマッシュからの固形分；（ｖｉｉ）発酵後の全蒸留廃液からの固形分、（ｖｉｉｉ）油、並びに（ｉｘ）微生物のうち少なくとも２つを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、トウモロコシ油の加水分解から得られるものである。いくつかの実施形態では、ＤＧは、乾燥蒸留穀粒残渣（ＤＤＧ）又は湿潤蒸留穀粒残渣（ＷＤＧ）である。いくつかの実施形態では、ＤＧＳは、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀粒残渣（ＤＤＧＳ）又は可溶性物質添加の湿潤蒸留穀粒残渣（ＷＤＧＳ）である。いくつかの実施形態では、アルコール製造工程は、ブタノール製造工程である。
本発明の実施形態は、アルコール工程から動物飼料用の蒸留共産物を製造する方法であって、少なくとも１つのプロセス供給流を有するアルコール（例えば、ブタノール）製造工程を用意することを含む方法に関し、本方法では、少なくとも１つのプロセス供給流を用いて、粗タンパク質及び粗脂肪含量が改善された動物飼料用の蒸留共産物を製造する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つ又は少なくとも３つのプロセス供給流が存在し、これらのプロセス供給流を組み合わせることにより、動物飼料用の蒸留共産物を製造する。いくつかの実施形態では、上記プロセス供給流は、（ｉ）脂肪酸、（ｉｉ）脂質、（ｉｉｉ）シロップ、（ｉｖ）蒸留穀粒残渣（ＤＧ）、（ｖ）蒸留穀粒残渣及び可溶性物質（ＤＧＳ）、（ｖｉ）発酵前のマッシュからの固形分；（ｖｉｉ）発酵後の全蒸留廃液からの固形分；（ｖｉｉｉ）油、並びに／又は（ｉｘ）微生物を含みうる。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、油の加水分解から得られるものでよい。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、トウモロコシ油の加水分解から得られるものである（ＣＯＦＡ）。いくつかの実施形態では、脂質は、蒸留廃液の蒸発から得られるものでよい。いくつかの実施形態では、ＤＧは、乾燥蒸留穀粒残渣（ＤＤＧ）、湿潤蒸留穀粒残渣（ＷＤＧ）、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀粒残渣（ＤＤＧＳ）、又は可溶性物質添加の湿潤蒸留穀粒残渣（ＷＤＧＳ）である。いくつかの実施形態では、動物飼料は、少なくとも約２０％の粗タンパク質含量を有してよい。いくつかの実施形態では、動物飼料は、少なくとも約２５％の粗タンパク質含量を有してよい。いくつかの実施形態では、動物飼料用の蒸留共産物は、１５％未満の粗脂肪含量を有する。いくつかの実施形態では、動物飼料用の蒸留共産物は、１０％未満の粗脂肪含量を有する。いくつかの実施形態では、動物飼料用の蒸留共産物は、約１０％未満の脂肪酸含量を有する。いくつかの実施形態では、脂肪酸含量は、動物飼料用の蒸留共産物を含む動物飼料組成物のための追加エネルギー及び栄養素を付与する。いくつかの実施形態では、アルコール製造工程は、ブタノール製造工程である。いくつかの実施形態では、ブタノール製造工程で製造されたブタノールを、ブタノール製造工程の少なくとも１つの供給流用の溶媒として用いる。いくつかの実施形態では、第１供給流を第２供給流と組み合わせることにより、貯蔵安定性がより高い動物飼料用の蒸留共産物を製造する。いくつかの実施形態では、動物飼料用の蒸留共産物は、改善されたカラープロフィール（ｃｏｌｏｒ ｐｒｏｆｉｌｅ）を有する。
本発明は、蒸留共産物の少なくとも約２０重量％の粗タンパク質と、約１０重量％未満の粗脂肪を含む、動物飼料組成物用の蒸留共産物に関し、ここで、組成物は、動物飼料又は動物飼料市場のための改善された栄養プロフィールを有する。いくつかの実施形態では、約１０重量％未満の脂肪酸をさらに含む、動物飼料組成物用の蒸留共産物。いくつかの実施形態では、約１０重量％未満の脂肪酸エステルをさらに含む、動物飼料組成物用の蒸留共産物。いくつかの実施形態では、約５重量％以下のリシンをさらに含む、動物飼料組成物用の蒸留共産物。いくつかの実施形態では、動物飼料組成物用の蒸留共産物は、畜牛、酪農動物、家畜、ブタ、家禽、ウマ、水産養殖魚、又はペット用飼料市場のための栄養プロフィールを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、栄養素、調味料、消化促進剤、若しくは着色料（ｃｏｌｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｒ）から選択される１つまたは複数の別の成分を動物飼料組成物用の蒸留共産物に添加することをさらに含む、動物飼料組成物用の蒸留共産物。
本発明の実施形態は、動物飼料用の蒸留共産物を製造する方法であって、少なくとも３つのプロセス供給流を有するブタノール製造工程を用意することを含む方法に関し、本方法では、少なくとも３つのプロセス供給流を組み合わせることにより、少なくとも約２０％の粗タンパク質含量を有する動物飼料用の蒸留共産物を製造する。いくつかの実施形態では、上記プロセス供給流は、（ｉ）油の加水分解からの脂肪酸、（ｉｉ）低濃度蒸留廃液の蒸発からの脂質、（ｉｉｉ）シロップ、（ｉｖ）蒸留穀粒残渣（ＤＧ）、（ｖ）可溶性物質添加の蒸留穀粒残渣（ＤＧＳ）、（ｖｉ）発酵前のマッシュからの固形分；及び（ｖｉｉ）発酵後の全蒸留廃液からの固形分のうち少なくとも３つを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、トウモロコシ油の加水分解から得られるものである（ＣＯＦＡ）。いくつかの実施形態では、ＤＧは、乾燥蒸留穀粒残渣（ＤＤＧ）、湿潤蒸留穀粒残渣（ＷＤＧ）、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀粒残渣及び可溶性物質（ＤＤＧＳ）、又は可溶性物質添加の湿潤蒸留穀粒残渣（ＷＤＧＳ）である。いくつかの実施形態では、動物飼料用の蒸留共産物は、１０％未満の粗脂肪含量を有する。いくつかの実施形態では、動物飼料用の蒸留共産物は、約１０％未満の脂肪酸含量を有する。
本発明の実施形態はまた、ブタノール製造工程から高有用性の動物飼料成分を製造する方法に関し、この方法は、動物飼料又は動物飼料市場用に粗タンパク質及び粗脂肪含量を最適化するための少なくとも１つのプロセス供給流を有するブタノール製造工程を用意することを含む。
本発明の実施形態はまた、動物飼料用の蒸留共産物の製造に対する発酵汚染物の影響を軽減する方法に関し、この方法は、発酵前にブタノール製造工程の少なくとも１つの供給流を分離するステップを含む。
本発明の実施形態はまた、動物飼料用の蒸留共産物におけるマイコトキシン汚染を軽減する方法に関し、この方法は、動物飼料製造用の蒸留共産物に寄与するブタノール製造工程の供給流を分離するステップ、及びマイコトキシン汚染の可能性がある供給流を排除若しくは精製するステップを含む。
本発明の実施形態はまた、動物飼料用の蒸留共産物の脂質含量のばらつきを低減する方法に関し、この方法は、動物飼料製造用の蒸留共産物に寄与するブタノール製造工程の供給流を分離するステップ、及びこれらの供給流を組み合わせることによって、制御された脂質含量を達成するステップを含む。
本発明の実施形態はまた、動物飼料用の蒸留共産物のトリグリセリド含量を増加する方法に関し、この方法は、動物飼料組成物用の特定の蒸留共産物のために、低トリグリセリド含有供給流と比較して、ブタノール製造工程の高トリグリセリド含有供給流を、より高い比率で組み合わせることを含む。
本発明の実施形態はまた、本発明の方法によって製造される動物飼料用の蒸留共産物に関する。
本発明の実施形態はまた、少なくとも約２０％又は少なくとも約２５％の粗タンパク質と、約１０％未満若しくは約１５％未満の粗脂肪を含む、動物飼料組成物用の蒸留共産物に関し、組成物は、動物飼料又は動物飼料市場のための栄養プロフィールを有する。いくつかの実施形態では、動物飼料組成物用の蒸留共産物は、約１０％未満の脂肪酸イソブチルエステルをさらに含む。いくつかの実施形態では、動物飼料組成物用の蒸留共産物は、約５％未満のリシンをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ブタ飼料市場、酪農動物飼料市場（例えば、乳牛飼料市場）、畜牛飼料市場、家禽飼料市場（例えば、ニワトリ飼料市場）、ウマ飼料市場、水産養殖魚飼料市場、家畜飼料市場、及び／又はペット飼料市場のための栄養プロフィールを有する。
本発明の発酵工程の最終生成物は、生成物アルコール、例えば、ブタノール又はエタノールである。本発明の方法に従い製造される最終生成物は、発酵媒質から分離及び／又は精製することができる。分離及び精製方法は、公知であり、例えば、媒質を抽出、浸透蒸発、又は蒸留に付すことによるものがある。いくつかの実施形態では、マッシュは、例えば、液相及び固相への遠心分離によって分離することができ、アルコールなどの最終生成物と固形分が回収される。アルコールは、蒸留及び分子ふるい脱水又は超濾過などの手段によって回収することができる。
いくつかの実施形態では、ブタノールの収率は、約８容量％、約１０容量％、約１２容量％、約１４容量％、約１６容量％若しくは約１８容量％より高くすることができる。
いくつかの実施形態では、ブタノールは、１−ブタノール（１−ＢｕＯＨ）、２−ブタノール（２−ＢｕＯＨ）、第３ブタノール（ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ）、及び／又はイソブタノール（ｉＢｕＯＨ、ｉ−ＢｕＯＨ、若しくはＩ−ＢｕＯＨ）であり、単独若しくはそれらの混合物のいずれでもよい、
本明細書に記載した実施形態のさらなる特徴及び利点、並びに様々な実施形態の構造及び操作は、添付の図面を参照にしながら、以下に詳しく説明する。以下に説明する実施形態は、本明細書に記載する特定の実施形態に限定されるわけではないことに留意されたい。このような実施形態は、例示を目的として提示されるにすぎない。別の実施形態も、本明細書に含まれる教示内容に基づき、当業者には明らかとなるであろう。
本発明の方法及びシステム例のプロセス供給流を概略的に示す。 原料を処理するための湿式粉砕工程の一例を示す。 原料を処理するための乾式粉砕工程の一例を示す。 発酵前に固形分を取り出す、本発明の方法及びシステムの一例を概略的に示す。 発酵前に固形分を取り出す、本発明の別の方法及びシステムの一例を概略的に示す。 発酵前に固形分と油を取り出す、本発明の別の方法及びシステムの一例を概略的に示す。 発酵前に固形分を取り出す、本発明の別の方法及びシステムの一例を概略的に示す。 生成物アルコールの製造のための本発明の別の方法及びシステムの一例を概略的に示す。 発酵前に固形分を取り出す、生成物アルコールの製造のための本発明の別の方法及びシステムの一例を概略的に示す。 発酵前に固形分を取り出す、生成物アルコールの製造のための本発明の別の方法及びシステムの別の例を概略的に示す。 動物飼料用の蒸留共産物例のプロセス供給流の質量バランスを示す。
尚、図面において、類似の参照番号は、同じ、又は機能的に類似する要素を示す。
別に定義されていない限り、本明細書で用いる技術及び科学用語の全ては、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。不一致が生じる場合には、その定義を含む本願が優先されるものとする。また、本文で別に要求されていない限り、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書で挙げたすべての刊行物、特許、及びその他の参照文献は、あらゆる目的のためにその全文を参照として本明細書に組み込む。別途記載のない限り、本明細書に記載するパーセンテージの値は、必要に応じて、プロセス供給流、蒸留共産物、又は組成物の重量のパーセンテージに関するものである。
本発明をさらに明確にするために、以下の用語及び定義を本明細書に記載する。
本明細書で用いる場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又はこれらの任意の他の変化形は、記載される整数又は整数群の包含を意味すると理解されるが、いずれか他の整数又は整数群の除外を意味するわけではない。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、工程、方法、製品、又は装置は、これらの要素に必ずしも限定されるわけではなく、明示的に列挙されなかったその他の要素、又はこのような組成物、混合物、工程、方法、製品、又は装置に固有の要素も含みうる。さらに、逆のことが明示されていない限り、「又は」は、包含的「又は」を指し、排他的「又は」ではない。例えば、条件Ａ又はＢは、以下のいずれか１つによって満たされる：Ａは真であり（又は存在する）、かつＢは偽である（又は存在しない）、Ａは偽であり（又は存在しない）、かつＢは真である（又は存在する）、並びにＡ及びは真である（又は存在する）。
また、本発明の要素又は成分の前に位置する不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、事例、すなわち、要素又は成分の発生、すなわち存在、の数に関して、非制限的であるものとする。従って、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ又は少なくとも１つを含むと解釈すべきであり、要素又は成分の単数形は、数字が、明らかに単数であることを意味しているのでない限り、複数形も包含する。
本明細書で用いる「発明」又は「本発明」という用語は、非限定的用語であり、特定の発明のいずれか単一の実施形態を指すことを意図するものではなく、本願に記載するような任意の可能な実施形態を包含する。
本明細書で用いる場合、本発明の成分又は反応体の量を加減する「約」という用語は、例えば、実際に、濃縮物若しくは溶液を製造するのに用いられる典型的測定手順及び液体処理手順によって；これらの手順における故意ではない誤りによって；本組成物の製造又は本方法の実施に用いられる成分の製造、供給源、若しくは純度の相違などによって、起こりうる数値的量の変動を指す。用語「約」はまた、特定の初期混合物から生じる組成物についての異なる平衡条件によって変わる量も包含する。用語「約」による加減の有無にかかわらず、特許請求の範囲には、これらの量の同等量も含まれる。いくつかの実施形態では、用語「約」は、記載する数値の１０％以内、あるいは、記載する数値の５％以内を意味する。
本明細書で用いる「アルコール」又は「生成物アルコール」は、発酵性炭素物質の供給源としてバイオマスを使用する発酵工程において、微生物によって生成させることができる任意のアルコールを指す。アルコールとしては、限定するものではないが、Ｃ１〜Ｃ８アルキルアルコールがある。別の実施形態では、アルコールは、Ｃ２〜Ｃ８アルキルアルコールである。別の実施形態では、アルコールは、Ｃ２〜Ｃ５アルキルアルコールである。Ｃ１〜Ｃ８アルキルアルコールとしては、限定するものではないが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、及びペンタノールがあることは理解されよう。同様に、Ｃ２〜Ｃ８アルキルアルコールとしては、限定するものではないが、エタノール、プロパノール、ブタノール、及びペンタノールがある。
本明細書で用いる「ブタノール」は、具体的には、ブタノール異性体：１−ブタノール（１−ＢｕＯＨ）、２−ブタノール（２−ＢｕＯＨ）、第３ブタノール（ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ）、及び／又はイソブタノール（ｉＢｕＯＨ、ｉ−ＢｕＯＨ、若しくはＩ−ＢｕＯＨ）を指し、単独若しくはこれらの混合物のいずれであってもよい。
本明細書で用いる「バイオマス」は、トウモロコシ、サトウキビ、コムギ、セルロース若しくはリグノセルロース材料、並びにセルロース、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖、二糖及び／又は単糖、並びにこれらの混合物のような天然の供給源から得られる任意の糖及びデンプンなどの発酵性糖をもたらす、加水分解性多糖を含む天然の産物を指す。バイオマスはまた、タンパク質及び／又は脂質のような別の成分を含んでもよい。バイオマスは、単一の供給源に由来するものであってもよいし、あるいは、バイオマスは、２つ以上の供給源に由来する混合物を含んでもよい。例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸及びトウモロコシ茎葉、又は草及び葉の混合物を含んでよい。バイオマスとしては、限定するものではないが、バイオエネルギー作物、農産廃棄物、都市廃棄物、工業固形廃棄物、製紙からのスラッジ、庭廃棄物、木材及び林業廃棄物などがある。バイオマスの例として、限定するものではないが、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ繊維、トウモロコシ皮、トウモロコシ茎葉のようなトウモロコシ残渣、草類、コムギ、ライムギ、麦藁、オオムギ、大麦藁、干し草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、モロコシ、サトウキビ、ダイズ、穀粒の粉砕から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木及び灌木、野菜、果物、草花及び動物肥料、並びにこれらの混合物などがある。例えば、マッシュ、ジュース、糖液、若しくは加水分解産物は、粉砕、処理、及び液化など、発酵の目的でのバイオマスの処理のために当分野では公知のいずれかの処理によってバイオマスから形成することができ、発酵性糖を含んでおり、水を含んでもよい。例えば、セルロース系及び／又はリグノセルロース系バイオマスは、当業者には公知のいずれかの方法によって処理することにより、発酵性糖を含む加水分解産物を得ることができる。低アンモニア前処理は、米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号明細書に開示されている（この文献は、参照として本明細書に組み込む）。セルロース系及び／又はリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化では、典型的に、セルロース及びヘミセルロースを分解するために酵素コンソーシアムを使用して、グルコース、キシロース及びアラビノースなどの糖を含む加水分解産物を生成する。セルロース系及び／又はリグノセルロース系バイオマスに好適な糖化酵素については、Ｌｙｎｄら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６６：５０６−５７７，２００２）を参照されたい。
本明細書で用いる「原料」とは、発酵工程における供給物を意味し、供給物は、非溶解固形分と共に、若しくはこれを含まずに発酵性炭素源を含有し、必要に応じて、発酵性炭素源が、デンプンから遊離されるか、又は液化、糖化、若しくはその他の工程などのさらなる処理により、糖錯体の分解から得られる前の、又はその後の発酵性炭素源を含有する。原料は、バイオマスを含むか、又はバイオマスから得られる。好適な原料として、限定するものではないが、ライムギ、コムギ、トウモロコシ、トウモロコシマッシュ、サトウキビ、サトウキビマッシュ、オオムギ、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、又はこれらの混合物が挙げられる。
本明細書で用いる「発酵性炭素源」又は「発酵性炭素物質」とは、発酵性アルコールの生産のために、微生物が代謝することができる炭素源を意味する。好適な発酵性炭素源として、限定するものではないが、グルコース若しくはフルクトースのような単糖；ラクトース若しくはスクロースのような二糖；オリゴ糖；デンプン若しくはセルロースのような多糖；キシロース及びアラビノースのようなＣ５糖；メタンなどの１炭素物質；並びにこれらの混合物が挙げられる。
本明細書で用いる場合、「発酵性糖」という用語は、発酵微生物を用いた発酵によって、最終生成物に変換することができる１種または複数種の糖（例えば、オリゴ糖及び単糖）を指す。
本明細書で用いる「糖（ｓｕｇａｒ）」は、オリゴ糖、二糖、単糖、及び／又はこれらの混合物を指す。「サッカリド（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」という用語は、糖と共に、デンプン、デキストラン、グリコーゲン、セルロース、ペントサンなどの炭水化物も含む。
本明細書で用いる場合、「粉砕された」という用語は、摩砕、破砕、分別、又はその他の微粉化の任意の手段により、粉砕された植物材料を指す。
本明細書で用いる場合、「マッシュ」という用語は、発酵製品の生産に用いられる液体中の発酵性物質の混合物を指す。この用語は、１種または複数種のデンプン加水分解酵素及び発酵生物と発酵性物質の初期混合から、発酵工程の完了まで、発酵の任意の段階を指す。場合によっては、本明細書で用いる場合、用語「マッシュ」及び「原料スラリー」は、同義として用いることができる。
本明細書で用いる場合、「発酵」という用語は、微生物による有機物質の酵素的及び／又は嫌気性分解によって、より単純な有機化合物を生成することを指す。発酵は、嫌気条件下で起こりうるが、好気（例えば、酸素の存在下で）又は微好気条件下でも発酵は起こりうるため、この用語が厳密な嫌気条件だけに限定されることを意図するわけではない。
本明細書で用いる「発酵ブロス」は、発酵容器又は発酵槽内に保持される水、糖（発酵性炭素源）、溶解固形分、任意選択でアルコールを生成する微生物、生成物アルコール、及び上記容器内の材料の他の任意の成分の混合物を意味し、ここで、存在する微生物による、糖と、アルコール、水及び二酸化炭素（ＣＯ２）の反応によって、生成物アルコールが生成される。本明細書で用いる場合、「発酵ブロス」という用語は、「発酵媒質」と同義で用いることができる。
本明細書で用いる場合、「蒸留共産物」という用語は、発酵前又は発酵中に単離することができる、アルコール（例えば、ブタノール若しくはエタノール）からの副産物を指す。蒸留共産物は、発酵マッシュからアルコールを取り出した後に残る非発酵性生成物、及びマッシュから単離した固形分も含む。本明細書で用いる場合、蒸留共産物は、様々な動物飼料及び非動物飼料用途に用いることができる。蒸留共産物の例として、限定するものではないが、油の加水分解からの脂肪酸、低濃度蒸留廃液の蒸発からの脂質、シロップ、蒸留穀粒残渣、可溶性物質添加の蒸留穀粒残渣、発酵前のマッシュからの固形分、発酵後の全蒸留廃液からの固形分、バイオディーゼル、並びにアシルグリセリドが挙げられる。
本明細書で用いる場合、「動物飼料用蒸留共産物」という用語は、動物飼料中での使用、又は動物飼料としての使用に適した蒸留共産物を指す。動物飼料用蒸留共産物の例としては、限定するものではないが、油の加水分解からの脂肪酸、低濃度蒸留廃液の蒸発からの脂質、シロップ、蒸留穀粒残渣、可溶性物質添加の蒸留穀粒残渣、発酵前のマッシュからの固形分、発酵後の全蒸留廃液からの固形分が挙げられる。
本明細書で用いる場合、「蒸留穀粒残渣」若しくは「ＤＧ」という用語は、発酵マッシュからアルコール（例えば、エタノール及び／又はブタノール）を取り出した後に残る非発酵性生成物を指す。乾燥させた蒸留穀粒残渣は、「乾燥蒸留穀粒残渣」若しくは「ＤＤＧ」として知られる。乾燥されていない蒸留穀粒残渣は、「湿潤蒸留穀粒残渣」若しくは「ＷＤＧ」として知られる。
本明細書で用いる場合、「可溶性物質添加の蒸留穀粒残渣」若しくは「ＤＧＳ」という用語は、可溶性物質とブレンドした発酵マッシュからアルコール（例えば、エタノール及び／又はブタノール）を取り出した後に残る非発酵性生成物を指す。乾燥させた可溶性物質添加の蒸留穀粒残渣は、「可溶性物質添加の乾燥蒸留穀粒残渣」若しくは「ＤＤＧＳ」として知られる。乾燥されていない可溶性物質添加の蒸留穀粒残渣は、「可溶性物質添加の湿潤蒸留穀粒残渣」若しくは「ＷＤＧＳ」として知られる。
本明細書において、プロセス供給流に関して用いられる「油の加水分解からの脂肪酸」という用語は、アルコール（例えば、エタノール若しくはブタノール）製造工程中、油を加水分解することによって生成された脂肪酸副産物を意味する。脂肪酸副産物は、アルコール（例えば、エタノール若しくはブタノール）製造工程における発酵後に、全蒸留廃液の遠心分離及び加水分解によって形成することができる。脂肪酸副産物は、例えば、トウモロコシ油を加水分解することにより、「トウモロコシ油の加水分解からの脂肪酸」を形成することによって、生成することができる。
本明細書で用いる場合、「脂質」という用語は、脂肪酸、中立脂肪、蝋、及びステロイドなどの脂肪のヘテロ群及び脂肪様物質のいずれかを指し、これらは、水不溶性で、無極性溶媒に可溶性である。脂質の例として、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、及びリン脂質がある。
本明細書において、プロセス供給流に関して用いられる「蒸発からの脂質」という用語は、アルコール（例えば、エタノール若しくはブタノール）製造工程における発酵後に、蒸留廃液の蒸発及び遠心分離によって生成される液体副産物を意味する。
本明細書において、プロセス供給流に関して用いられる「シロップ」又は「濃縮した蒸留可溶性物質」（ＣＤＳ）は、アルコール（例えば、エタノール若しくはブタノール）製造工程における発酵後に、蒸留廃液の蒸発によって生成される副産物を意味する。
本明細書で用いる場合、「プロセス供給流」は、アルコール（例えば、エタノール若しくはブタノール）製造工程の前又は工程中に形成された任意の副産物を指す。プロセス供給流の例として、限定するものではないが、ＣＯＦＡ、蒸発からの脂質、シロップ、ＤＧ、ＤＤＧ、ＷＤＧ、ＤＧＳ、ＤＤＧＳ、及びＷＤＧＳが挙げられる。プロセス供給流の別の例として、エタノール若しくはブタノール製造工程における発酵前のマッシュから取り出された（例えば、遠心分離により）固形分（例えば、発酵前のトウモロコシマッシュから取り出された固形分）がある。これらの固形分は、乾燥させていない場合には「ウェットケーク」と呼ばれ、乾燥させると「ドライケーク」と呼ばれる。プロセス供給流の別の例として、アルコール（例えば、エタノール若しくはブタノール）製造工程における発酵後に、全蒸留廃液から取り出された（例えば、遠心分離により）固形分がある。これらの固形分は、乾燥させていない場合には「ＷＳウェットケーク」と呼ばれ、乾燥させると「ＷＳドライケーク」と呼ばれる。
本明細書で用いる「水相」という用語は、発酵ブロスを抽出剤と接触させることによって得られる二相混合物の水相を指す。いくつかの実施形態では、「発酵ブロス」という用語は、二相発酵性抽出物中の水相を指す。さらに、二相混合物が、水相に分散させることができる非溶解固形分を含むように、非溶解固形分（例えば、穀粒固形分）が発酵ブロス中に存在していてもよい。
本明細書で用いる「有機相」という用語は、発酵ブロスを抽出剤と接触させることによって得られる二相混合物の非水相を指す。
本明細書で用いる「抽出剤」という用語は、ブタノールなどのアルコールを抽出するのに用いられる溶媒、又はアルコールエステル（例えば、アルコール及びカルボン酸若しくは脂質の触媒作用によって生成される）を抽出するのに用いられる溶媒を意味する。場合によっては、本明細書で用いる「溶媒」という用語は、「抽出剤」と同義で用いてもよい。いくつかの実施形態では、抽出剤は、有機溶媒である。いくつかの実施形態では、抽出剤は、水非混和性有機溶媒であってよい。
「水非混和性」という用語は、１つの液相を形成する様式で、発酵ブロスのような水溶液と混合することができない、抽出剤又は溶媒などの化学成分を指す。
本明細書で用いる「カルボン酸」という用語は、炭素原子が、二重結合によって酸素原子に結合して、カルボニル基（−Ｃ＝Ｏ）を形成し、単結合によってヒドロキシ基（−ＯＨ）に結合される一般化学式−ＣＯＯＨを有するいずれかの有機化合物を指す。カルボン酸は、プロトン化カルボン酸の形態、カルボン酸の塩の形態（例えば、アンモニウム、ナトリウム、若しくはカリウム塩）、又はプロトン化カルボン酸とカルボン酸の塩の混合物のいずれであってもよい。カルボン酸という用語は、例えば、バイオマス由来の脂肪酸又はトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、及びリン脂質の加水分解によって生成されうるような単一化学種（例えば、オレイン酸）若しくはカルボン酸の混合物を表す場合もある。
本明細書で用いる「脂肪酸」という用語は、Ｃ４〜Ｃ２８炭素原子（最も一般的にはＣ１２〜Ｃ２４炭素原子）を有するカルボン酸（例えば、脂肪族モノカルボン酸）を指し、飽和若しくは不飽和のいずれかである。脂肪酸は、分枝又は非分枝のいずれであってもよい。脂肪酸は、動物若しくは植物脂肪、油、若しくは蝋に由来するものであってもよいし、あるいは、それらのエステル化形態に含有されていてもよい。脂肪酸は、脂肪及び脂肪油中にグリセリドの形態で天然に存在するものであってもよいし、あるいは、脂肪の加水分解によって、又は合成によって得ることもできる。脂肪酸という用語は、単一化学種又は脂肪酸の混合物を表す場合もある。さらに、脂肪酸という用語は、遊離脂肪酸も包含する。
本明細書で用いる「脂肪アルコール」という用語は、飽和又は不飽和のいずれかの、Ｃ４〜Ｃ２２炭素原子の脂肪鎖を有するアルコールを指す。
本明細書で用いる「脂肪アルデヒド」という用語は、飽和又は不飽和のいずれかの、Ｃ４〜Ｃ２２炭素原子の脂肪鎖を有するアルデヒドを指す。
本明細書で用いる「脂肪酸アミド」という用語は、飽和又は不飽和のいずれかの、Ｃ４〜Ｃ２２炭素原子の長い脂肪鎖を有するアミドを指す。
本明細書で用いる「脂肪酸エステル」という用語は、飽和又は不飽和のいずれかの、Ｃ４〜Ｃ２２炭素原子の長い脂肪鎖を有するエステルを指す。
本明細書において、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して用いられる「異種」という用語は、宿主細胞に天然に存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。この用語は、天然に存在する遺伝子、突然変異遺伝子、合成遺伝子及び／又は過剰発現遺伝子によってコードされるタンパク質を含むものとする。
本明細書において、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して用いられる「相同的」という用語は、宿主細胞に天然に存在するポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。
本明細書で用いる「最終生成物」という用語は、発酵性物質から酵素により変換される、任意の炭素源に由来する生成物を指す。いくつかの実施形態では、最終生成物は、エタノール若しくはブタノールなどのアルコールである。
本明細書で用いる「共産物」という用語は、別の生成物と一緒に生産される生成物、すなわち同時生産生成物を指す。場合によっては、本明細書で用いる用語「共産物」は、用語「副産物」と同義で用いられうる。
本明細書で用いる「副産物」という用語は、別の製品の製造中に生産される副次産物を指す。
本明細書で用いる「栄養プロフィール」という用語は、食品又は食事の栄養組成を指す。
本明細書で用いる「発酵生物」という用語は、最終生成物を直接又は間接的に製造するための、発酵での使用に適した任意の微生物又は細胞を指す。
本明細書で用いる「エタノール生産物」、「エタノール生産微生物」、又は「エタノロゲン」という用語は、発酵性炭素源（例えば、単糖若しくはオリゴ糖）からエタノールを生成することができる発酵生物を指す。
本明細書で用いる「ブタノール生産物」、「ブタノール生産微生物」、又は「ブタノトゲン」という用語は、発酵性炭素源（例えば、単糖若しくはオリゴ糖）からブタノールを生成することができる発酵生物を指す。
本明細書で用いる「イソブタノール生産物」、「イソブタノール生産微生物」、又は「イソブタノロゲン」という用語は、発酵性炭素源（例えば、単糖若しくはオリゴ糖）からイソブタノールを生成することができる発酵生物を指す。
本明細書において、タンパク質、細胞、核酸若しくはアミノ酸に関して用いる「回収した」、「単離した」、及び「分離した」と言う用語は、天然に結合している少なくとも１つの成分から取り出したタンパク質、細胞、核酸若しくはアミノ酸を指す。
本明細書で用いる「由来する」という用語は、以下：「〜を起原とする」、「得られる」、「〜から取得できる」、及び「〜から単離した」の用語を包含する。いくつかの実施形態では、用語「由来する」は、あるヌクレオチドが天然に存在するか、又はそのヌクレオチドが挿入された細胞から産生される、同ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを指す。
本明細書で用いる「収率」という用語は、本発明の方法を用いて、製造される最終生成物の量を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、最終生成物の量を指し、別の実施形態では、この用語は、最終生成物の濃度を指す。
本明細書で用いる「ＣＯＦＡ」という用語は、トウモロコシ脂肪酸（例えば、トウモロコシ油の加水分解からの脂肪酸）を指す。
本明細書で用いる「ＦＡＢＥ」という用語は、脂肪酸ブチルエステル（例えば、イソブチルエステル）を指す。
本明細書で用いる「ＦＡＥＥ」という用語は、脂肪酸エチルエステル（例えば、エチルエステル）を指す。
本明細書で用いる「ＦＡＭＥ」という用語は、脂肪酸メチルエステル（例えば、メチルエステル）を指す。
本明細書で用いる「ＷＳ」という用語は、発酵カラムの全蒸留廃液を指す。
エタノール及びブタノールなどのアルコールは、糖の発酵によって製造することができる。これらの発酵性糖は、トウモロコシ、サトウキビ、セルロース系、若しくはリグノセルロース系材料などのいずれの供給源に由来するものであってもよく、このバイオマスは、例えば、液化及び／又は糖化によりマッシュを形成し、これを酵母などの微生物によって発酵させることにより、処理してもよい。発酵工程中、様々な供給流が形成され、これらの供給流の共産物及び／又は副産物を用いて、動物飼料、燃料（例えば、バイオディーゼル）、工業製品（例えば、樹脂、ブラスチック、潤滑剤）などの製品、並びに消費者及び／又は工業用途のためのその他の製品を製造することもできる。
本発明は、アルコール発酵工程の共産物及び／又は副産物、並びに共産物及び／又は副産物を生成する方法を提供する。本発明は、蒸留共産物、及び、動物飼料用蒸留共産物などの蒸留共産物を製造する方法、並びに蒸留共産物を製造する方法を提供する。本発明の動物飼料用の蒸留共産物は、動物飼料用として用いるか、又は動物飼料中の成分として用いることができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つのプロセス供給流を有するアルコール（例えば、エタノール若しくはブタノール）製造工程を用意することを含み、少なくとも１つのプロセス供給流を用いて、少なくとも約２０％若しくは少なくとも約２５％の粗タンパク質含量を有する、動物飼料用蒸留共産物を製造する。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物は、アルコール製造工程の１つまたは複数のプロセス供給流を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物は、アルコール（例えば、ブタノール若しくはエタノール）製造工程の少なくとも２つ又は少なくとも３つのプロセス供給流を含む。いくつかの実施形態では、プロセス供給流は、（ｉ）脂肪酸、（ｉｉ）脂質、（ｉｉｉ）シロップ、（ｉｖ）蒸留穀粒残渣（ＤＧ）、（ｖ）可溶性物質添加の蒸留穀粒残渣（ＤＧＳ）、（ｖｉ）発酵前のマッシュからの固形分；（ｖｉｉ）発酵後の全蒸留廃液からの固形分、又はこれらのいずれかの組合せである。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、油の加水分解から得られるものであってよい。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、トウモロコシ油の加水分解から得られるものである。いくつかの実施形態では、脂質は、蒸留廃液の蒸発から得られるものでよい。いくつかの実施形態では、ＤＧは、乾燥蒸留穀粒残渣（ＤＤＧ）、湿潤蒸留穀粒残渣（ＷＤＧ）、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀粒残渣（ＤＤＧＳ）、可溶性物質添加の湿潤蒸留穀粒残渣（ＷＤＧＳ）、又はこれらのいずれかの組合せである。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物は、アルコール製造工程の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又はそれを上回る数のプロセス供給流を含む。いくつかの実施形態では、プロセス供給流は、アルコール製造工程で再循環させる。
本発明のシステム及び方法によって、タンパク質、脂肪、繊維、灰分、脂質、アミノ酸、ビタミン、及びミネラルのうち１つまたは複数の含量が制御若しくは最適化された蒸留共産物が製造され、これは、有用性の高い動物飼料として用いることもできるし、あるいは、有用性の高い動物飼料を製造するのに用いることもできる。アミノ酸としては、例えば、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、及びバリンなどの必須アミノ酸、並びにアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、オルニチン、プロリン、セリン、及びチロシンがある。ミネラルとしては、例えば、カルシウム、塩化物、コバルト、銅、フッ化物、ヨウ素、鉄、マグネシウム、マンガン、リン、カリウム、セレン、ナトリウム、イオウ、及び亜鉛がある。ビタミンとしては、例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、及びＢ（チアミン、リボフラビン、ニアシン、パントテン酸、ビオチン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１６及び葉酸）がある。
蒸留共産物は、蒸留共産物を製造するのに用いられるアルコール製造工程の特定のプロセス供給流の選択に基づき、特定の動物飼料又は動物飼料市場に合わせて改変することもできる。蒸留共産物はまた、蒸留共産物を製造するために組み合わせようとするアルコール製造工程の特定のプロセス供給流の選択に基づき、特定の動物飼料又は動物飼料市場に合わせて改変してもよい。本発明の蒸留共産物は、動物飼料に、より高い割合で蒸留共産物を含有させることができるという経済的利点を有する。また、本発明の蒸留共産物の製造には、より少ないエネルギーしか必要としない。
本発明のシステム及び方法の例を、図１ａを参照しながら説明する。図１ａは、本発明のプロセス供給流を示す、発酵システム及び方法例を表示する。図１ａは、プロセス供給流例を参照しながら説明するが、所望される特定の動物飼料に応じて、組み合わされるプロセス供給流、並びにそれらのユニット操作及び作業設定は、図１ａの方法及びシステム例から変動しうることは理解すべきである。
エタノール及びブタノールなどのアルコールは、バイオマス由来の原料から製造することができる。この原料を乾式若しくは湿式粉砕によって処理してもよく、また、原料は、液化及び／又は糖化に付すことにより、発酵性糖及び非溶解固形分を含む原料スラリー又はマッシュを形成してもよい。発酵のためにバイオマスを処理し、非溶解固形分を分離するための方法及びシステムの説明については、例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１１／１６００３０号パンフレットを参照されたい。尚、この文献の全内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。
図１を参照にして、１種または複数種の発酵性炭素源と、１種または複数種の微生物を含むマッシュ（又は原料スラリー）を発酵１００に添加してもよく、ここで、微生物によってマッシュを発酵させることにより、エタノール又はブタノールなどのアルコールを製造する。いくつかの実施形態では、微生物（例えば、酵母）によって、約１５℃〜約４０℃、約２０℃〜約３８℃、また約２５℃〜約３５℃の範囲の温度で；約ｐＨ３．０〜約６．５；また約ｐＨ３．０〜約６．０；約ｐＨ３．０〜約５．５；約ｐＨ３．５〜約５．０及びまた、約ｐＨ３．５〜約４．５のｐＨ範囲で、約５時間〜約１２０時間、好ましくは約１２時間〜約１２０時間、またさらに好ましくは約２４時間〜約９０時間にわたって、マッシュを発酵させることにより、ブタノールなどの生成物アルコールを製造する。いくつかの実施形態では、アルコール（エタノール又はブタノール）製造工程は、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、オーツ、若しくはサトウキビの発酵を含む。
アルコールを含む発酵供給流１０５をビールカラム１２０に移してもよい。アルコールは、ビールカラム１２０内で蒸発させ、アルコールリッチ蒸気流１２２をアルコールのさらなる処理のためにアルコール回収１９０（例えば、蒸留）に送ることができる。ビールカラムの残液流１２５は、全蒸留廃液であり、これは、非発酵固形分（例えば、蒸留穀粒残渣）、溶解材料及び水を含む。残液供給流１２５は、固形分分離１４０で処理し、固形分１４５（例えば、ウェットケーク）及び蒸留廃液１４２として知られる液体流に分離してよい。固形分分離は、限定するものではないが、遠心分離、濾過、スクリーン分離、液体クローン（ｈｙｄｒｏｃｌｏｎｅ）、若しくは固形分から液体を分離するその他の任意の手段など、多数の手段によって達成することができる。蒸留廃液１４２は、水の除去のために、蒸発システム１６０（例えば、２つの体系による４つの作用）に送ってもよい。蒸発システムの例は、米国特許出願公開第２０１１／０３１５５４１号明細書（その全内容は、参照として本明細書に組み込む）に記載されている。蒸発システム１６０は、蒸留廃液１４２から水を漸次蒸発させて、最終的には、シロップ１６５を生成する。いくつかの実施形態では、蒸発システム１６０は、シロップ１６５中の水の重量濃度が、約４０％〜約８０％、約５０％〜約７０％、又は約５５％〜約６５％となるように、蒸留廃液１４２から水を蒸発させる。いくつかの実施形態では、シロップ１６５をミキサー１５０内でウェットケーク１４５と合わせて、混合供給物１５５を製造し、これを乾燥機１８０内で乾燥させて、ＤＤＧＳを取得してもよい。
前述したように、原料を乾式又は湿式粉砕工程によって処理してもよい。湿式粉砕は、各共産物から個別に有価物を捕捉するために、バイオマス（例えば、トウモロコシ）をその基本成分（胚芽、果皮繊維、デンプン、及びグルテン）に分離する、マルチステップ工程である。トウモロコシを原料として用いる場合、この方法によって、複数の共産物：デンプン、グルテン供給物、グルテンミール、及びトウモロコシ油供給流が製造される。これらの供給流を再度組み合わせて、処理することにより、食品産業用のカスタマイズされた製品を製造することもできる。図１ｂを参照にすると、原料（例えば、トウモロコシ）は、浸漬タンクに送られ、ここで、例えば、約１２０〜１３０°Ｆで、約３０〜５０時間にわたって、二酸化ナトリウム溶液中に浸漬される。水に放出された栄養素を回収して、蒸発させることにより、濃縮した発酵エキス（又は浸漬液）を製造することができる。浸漬した原料から胚芽を取り出し、さらに処理することにより、油及び胚芽ミールを回収してもよい。胚芽を取り出した後、原料の残留部分を処理して、フスマを除去し、デンプン及びグルテンスラリーを製造することもできる。スラリーをさらに処理することにより、デンプンとグルテンタンパク質に分離し、グルテンタンパク質を乾燥させて、グルテンミールを形成することもできる。デンプン供給流は、発酵によりさらに処理して、アルコールを製造してもよいし、あるいは、食品、製紙、又は織物産業に使用してもよい。例えば、デンプン供給流を用いて、甘味料を製造することができる。グルテンミール及びグルテン供給流は、いずれもタンパク質、脂肪、及び繊維を含んでおり、乳牛及び肉牛、家禽、ブタ、家畜、ウマ、水産養殖魚、及びペット用の飼料に用いてもよい。グルテン供給物はまた、添加微量栄養素のための担体として用いることもできる。また、グルテンミールは、メチオニン及びキサントフィルも含んでおり、例えば、家禽飼料中の顔料成分として用いてもよい（例えば、顔料は、卵黄に黄色の着色を付与する。濃縮した発酵エキスは、タンパク質、成長因子、ビタミンＢ、及びミネラルを含み、高エネルギー液体飼料成分として用いることができる。濃縮エキスはまた、ペレット結合剤として用いてもよい。
分別により、粉砕全トウモロコシ中に存在する脂質の大部分を含む、繊維及び胚芽を取り出すことによって、より高いデンプン（胚乳）含量を有する分別トウモロコシが得られる。乾式分別では、繊維から胚芽を分離しないことから、湿式粉砕より安価である。しかし、分別では、繊維又は胚芽全部を除去するわけではないため、固形分が完全に排除されるわけではない。さらに、分別では、いくらかのデンプンの損失が起こる。
乾式粉砕はまた、原料の処理に用いてもよい。図１ｃを参照にすると、例えば、ハンマーミルを用いて、原料を粉砕することにより、ミールを製造し、次にこれを水と混合して、スラリーを形成してもよい。アミラーゼのような酵素の添加による液化にスラリーを付して、デンプンを糖に加水分解して、マッシュを形成することができる。マッシュを加熱する（「煮る」）ことにより、酵素を不活性化した後、発酵に添加するために冷却することができる。冷却したマッシュ（すなわち、発酵ブロス）、微生物、及びグルコアミラーゼなどの酵素を、アルコール（例えば、エタノール又はブタノール）製造のために発酵に添加することができる。発酵後、発酵ブロスを蒸留に送り、アルコールを回収することができる。蒸留塔の残液蒸気は、全蒸留廃液であり、非発酵固形分（例えば、蒸留穀粒残渣固形分）、溶解材料、及び水を含み、これをさらなる処理のために回収することができる。全蒸留廃液を固形分（例えば、ウェットケーク）と蒸留廃液に分離してもよい。固形分の分離は、限定するものではないが、遠心分離、濾過、スクリーン分離、液体サイクロン、若しくは固形分から液体を分離するその他の任意の手段など、多数の手段によって達成することができる。蒸留廃液を蒸発に送って、濃縮蒸留可溶性物質（ＣＤＳ）若しくはシロップを形成してもよい。蒸留廃液は、可溶性栄養素、微小穀粒固形分（若しくは微粉）、及び微生物（例えば、酵母）を含みうる。固形分（ウェットケーク）をシロップと合わせた後、乾燥させることにより、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀粒残渣（ＤＤＧＳ）を形成してもよい。シロップは、タンパク質、脂肪及び繊維、さらには、ビタミン、並びにリン及びカリウムなどのミネラルを含んでおり；栄養価及び嗜好性のために動物飼料に添加してもよい。ＤＤＧＳは、タンパク質、脂肪及び繊維を含んでおり；バイパスタンパク質源を提供する。ＤＤＧＳは、乳牛及び肉牛、家禽、ブタ、家畜、ウマ、水産養殖魚、及びペット用の動物飼料に用いてもよい。
前述のように、原料を液化して、発酵性糖及び非溶解固形分を含む原料スラリーを製造してもよい。原料スラリーを発酵槽に直接供給する場合には、非溶解固形分が、発酵槽からのアルコール（例えば、エタノール又はブタノール）の効率的取り出し及び回収を妨げるおそれがある。例えば、発酵ブロスからアルコールを抽出するのに、液−液抽出を用いる場合、非溶解固形分が存在すると、例えば、限定するものではないが、抽出剤と発酵ブロスとの接触を妨害することにより、抽出剤へのアルコールの大量輸送速度を低下させたり、抽出剤及びアルコールの少なくとも一部が固形分中に「閉じ込められる」ことになり、これは後にＤＤＧＳとして取り出されるため、抽出剤の回収及び再循環の効率を低下させたりするなどのシステム非効率性を引き起こしうる。従って、これらの問題を回避及び／又は最小限にするために、非溶解固形分の少なくとも一部は、発酵槽に原料スラリーを添加する前に、原料スラリーから除去してもよい。非溶解固形分を除去していない水溶液を含む発酵ブロスと比較して、非溶解固形分を除去した水溶液を含む発酵ブロスに対して抽出を実施する場合、抽出活性及びアルコール製造の効率が増加する（例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１１／１６００３０号パンフレットを参照）。
原料スラリーからの非溶解固形分の除去には、さらにいくつかの利点がある。例えば、非溶解固形分を発酵容器に送らないため、微生物が非溶解固形分と接触しない。非溶解固形分が、微生物、並びに抽出剤、生成物アルコール、又は発酵のその他の副産物に暴露されないため、これらの固形分の動物飼料のための処理が改善されうる。さらに、発酵前の非溶解固形分の除去により、微生物の分離及び再循環を可能にすることができる。微生物を再循環させることができれば、発酵工程のための追加の微生物を増殖させる必要性、並びに微生物増殖の追加設備（例えば、増殖タンク）の必要性を低減若しくは排除することが可能である。
原料スラリーの分離によって、固相（例えば、ウェットケーク）が製造されるが、これをさらに処理してもよい。ウェットケークは、発酵性糖の一部を含みうる。ウェットケークの処理の一例として、ウェットケークを水で洗浄し、ウェットケーク中に存在する発酵性糖を回収し、回収した発酵性糖を再循環させ、例えば、液化工程に用いてもよい。洗浄した後、例えば、動物飼料を形成するために、ウェットケークをさらに処理してもよい。
固形分の除去工程は、分離工程からの油蒸気の排出を含むように、改変してもよい。例えば、トウモロコシが原料の場合、原料の製造中にトウモロコシ油も製造することができる。油は、非溶解固形分から個別に排出することはできないため、最終的にウェットケーク中に存在しうる。ウェットケークを遠心分離又は本明細書に記載の他の分離手段によって取り出す場合には、原料からの油の一部（例えば、トウモロコシ原料からのトウモロコシ油）がウェットケーク中に残っている可能性がある。ウェットケークは、例えば、遠心分離機若しくはその他の分離装置内で、追加の水で洗浄してもよい。いくつかの実施形態では、ウェットケークから油を分離し、例えば、同じ又は異なる発酵工程での後の使用のために抽出剤に変換してもよい。
本発明のシステム及び方法の一例について、図２を参照にしながら説明する。原料を液化して、非溶解固形分及び発酵性糖を含む液化マッシュ（又は原料スラリー）を製造することができる。液化マッシュは、固形分分離２１０に入って、非溶解固形分と、溶解した発酵性糖（例えば、シンマッシュ）２１２の清澄化溶液を含むウェットケーク２１５を形成することができる。非溶解固形分は、多数の手段によって液化マッシュ（又は原料スラリー）から分離することができ、このような手段として、限定するものではないが、デカンター型ボウル型遠心分離、トリカンター型遠心分離、ディスクスタック遠心分離、濾過遠心分離、デカンター型遠心分離、濾過、真空濾過、ベルトフィルター、圧力濾過、スクリーンを用いた濾過、スクリーン分離、グレーティング（ｇｒａｔｉｎｇ）、多孔性グレーティング（ｐｏｒｏｕｓ ｇｒａｔｉｎｇ）、浮選、ハイドロサイクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降タンク、ボルテックスセパレータ、又はこれらの組合せが挙げられる。ウェットケーク２１５を固形分洗浄２３０に送ることにより、ウェットケーク２１５から発酵性糖を回収することができる。洗浄したウェットケーク２３５を形成し、固形分洗浄２３０で発生した全洗浄液を再循環させ、例えば、液化工程で用いてもよい。洗浄したウェットケーク２３５を乾燥機２８０中でシロップ２６５と合わせて、ＤＤＧＳを製造することもできる。
シンマッシュ２１２及び微生物を発酵２００に添加してもよく、ここで、マッシュを微生物によって発酵させることにより、エタノール又はブタノールなどのアルコールを含む発酵供給流２０５を製造する。発酵供給流２０５をビールカラム２２０に送り、アルコールリッチ供給流２２２及び残液供給流２２５を製造することができる。アルコールリッチ供給流２２２は、生成物アルコールの回収のために、アルコール回収２９０に送ってもよい。発酵前に除去された固形分の大部分と共に、蒸留廃液を含む残液供給流２２５を蒸発システム２６０による蒸発によって濃縮させ、シロップ２６５を形成してもよい。
前述したように、原料を処理して、発酵性糖及び非溶解固形分を含む原料スラリーを製造することができる。図３〜５は、原料を処理するのに用いることができるシステム及び方法の例を提供する。いくつかの実施形態では、図示するように、例えば、図３において、システムは、原料を液化して、原料スラリーを形成するように設計された液化容器３１０を含む。特に、原料３１２は、液化容器３１０の入口に導入することができる。原料３１２は、デンプンなどの発酵性炭素源を含む、当分野では公知の任意の好適なバイオマス材料であってよく、限定するものではないが、ライムギ、コムギ、サトウキビ、若しくはトウモロコシが挙げられる。
原料を液化する方法は、原料３１２中のデンプンを水溶性糖に加水分解することを含む。当分野で通常使用される、任意の公知の液化方法、並びに対応する液化容器を用いることができ、このようなものとして、限定するものではないが、酸性法、酸性酵素法、又は酵素法がある。このような方法は、単独でも、組み合わせて用いてもよい。いくつかの実施形態では、酵素法を用いることができ、適切な酵素３１４、例えば、α−アミラーゼを液化容器３１０の入口に導入する。水も液化容器３１０に導入することができる。
原料３１２を液化する方法は、原料又はバイオマスからの糖（例えば、発酵性炭素）及び非溶解固形分を含む原料スラリー３１５を形成する。非溶解固形分は、原料３１２の非発酵性部分である。いくつかの実施形態では、原料３１２は、乾式粉砕した、非分別トウモロコシ穀粒などのトウモロコシであってよく、非溶解粒子は、胚芽、繊維、及びグルテンを含んでよい。原料スラリー３１５は、液化容器３１０の出口から排出することができる。いくつかの実施形態では、原料３１２は、トウモロコシ又はトウモロコシ穀粒であり、原料スラリー３１５は、トウモロコシマッシュスラリーである。
原料スラリー３１５から非溶解固形分を除去するように設計された分離３２０は、原料スラリー３１５を受け入れるための入口を有する。分離３２０は、原料スラリー３１５を撹拌若しくはスピンさせることにより、液相又は水溶液３２２及び固相又はウェットケーク３２５を形成する。
水溶液３２２は、糖（例えば、オリゴ糖の形態で）、及び水を含みうる。水溶液は、少なくとも約１０重量％のオリゴ糖、少なくとも約２０重量％のオリゴ糖、又は少なくとも約３０重量％のオリゴ糖を含みうる。水溶液３２２は、分離３２０の上部付近に位置する出口から排出することができる。水溶液は、約２０センチポアズ未満、又は約１５センチポアズ未満、又は約１０センチポアズ未満、又は約５センチポアズ未満の粘度を有してよい。水溶液は、約２０ｇ／Ｌ未満のモノマーグルコース、又は約１０ｇ／Ｌ未満のモノマーグルコース、又は約５ｇ／Ｌ未満のモノマーグルコースを含んでもよい。モノマーグルコースの量を測定する好適な方法は、当分野では公知である。当分野で公知のこうした好適な方法として、ＨＰＬＣがある。
ウェットケーク３２５は、非溶解固形分を含みうる。ウェットケーク３２５は、分離３２０の底部付近に位置する出口から排出することができる。ウェットケーク３２５はまた、糖の一部及び水も含みうる。ウェットケーク３２５は、水溶液３２２が、分離３２０から排出されたら、分離３２０内の追加の水で洗浄することができる。あるいは、ウェットケーク３２５は、別の分離装置内の追加の水で洗浄することもできる。ウェットケーク３２５を洗浄することによって、ウェットケーク中に存在する糖若しくは糖供給源（例えば、オリゴ糖）を回収し、回収された糖及び水は、液化３１０に再循環させてもよい。洗浄後、ウェットケーク３２５をさらに処理することによって、いずれかの好適な公知の方法で、ＤＤＧＳを形成してもよい。分離３２０で形成されたウェットケーク３２５からのＤＤＧＳの形成には、複数の利点がある。非溶解固形分は発酵槽に向かわず、抽出剤、及び／又はアルコールはＤＤＧＳ中に閉じ込められないことから、ＤＤＧＳが発酵槽の条件にさらされることはなく、従って、ＤＤＧＳは、発酵槽中に存在する微生物と接触しない。これらの効果のすべてが、後の処理及びＤＤＧＳの販売（例えば、動物飼料として）に利益をもたらす。
分離３２０は、例えば、デカンター型ボウル型遠心分離機、トリカンター型遠心分離機、ディスクスタック遠心分離機、濾過遠心分離機、若しくはデカンター型遠心分離機など、当分野で使用されている従来の遠心分離機のいずれとすることもできる。いくつかの実施形態では、原料スラリー３１５からの非溶解固形分の除去は、濾過、真空濾過、ベルトフィルター、圧力濾過、スクリーンを用いた濾過、スクリーン分離、グレート（ｇｒａｔｅｓ）若しくはグレーティング、多孔性グレーティング、浮選、ハイドロサイクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降タンク、ボルテックスセパレータ、又は液体から固形分を分離するのに用いることができる任意の方法によって達成することができる。
原料としてトウモロコシを用いる場合、非溶解固形分をトウモロコシマッシュから除去して、２つの産物供給流、例えば、トウモロコシマッシュより低い濃度の固形分を含むオリゴ糖の水溶液と、トウモロコシマッシュより高い濃度の固形分を含むウェットケークを形成することができる。さらに、例えば、トウモロコシマッシュから固形分を除去するのにトリカンター型遠心分離機を用いる場合には、トウモロコシ油を含有する第３の供給流を形成することができる。トリカンター型遠心分離機は、２つの液相（例えば、水性供給流と油供給流）及び固相（例えば、固形分）の分離のような３相分離に用いることができる（例えば、Ｆｌｏｔｔｗｅｇ Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標），Ｆｌｏｔｔｗｅｇ ＡＧ、Ｖｉｌｓｉｂｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）Ｏｉｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，ＩＣＭ，Ｉｎｃ，．Ｃｏｌｗｉｃｈ，ＫＳ；を参照）。相互汚染を防止するために、２つの液相を分離し、ボウルから２つの排出システムを介して移動させてもよく、また、固相を個別の排出システムから除去してもよい。このように、様々な分離技術又はそれらの組合せを用いて、多数の産物供給流を形成することができる。
水溶液３２２を発酵させて、アルコールを生成するように設計された発酵３００は、水溶液３２２を引き入れるための入口を有する。発酵３００は、発酵ブロスを収容することができる。微生物３０２を発酵３００に導入し、発酵ブロス中に含有させてもよい。微生物３０２は、水溶液３２２中の糖を消費する。いくつかの実施形態では、微生物３０２は、水溶液３２２中の糖を消費して、エタノール若しくはブタノールなどのアルコールを生成する。アルコールを含む供給流３０６は、発酵３００から排出して、アルコールの回収のためにさらに処理することができる。
いくつかの実施形態では、同時糖化及び発酵（ＳＳＦ）が発酵３００内で起こりうる。当分野で通常使用されている公知の糖化方法のいずれを用いてもよく、こうした方法として、限定するものではないが、酸性法、酸性酵素法、又は酵素法などがある。いくつかの実施形態では、水溶液３２２中に存在するオリゴ糖の形態の糖の分解を触媒するために、グルコアミラーゼなどの酵素３０８を発酵３００の入口に導入することができる。
いくつかの実施形態では、発酵ブロス３０４を発酵３００の出口から排出することができる。排出された発酵ブロス３０４は、酵母などの微生物３０２を含んでよい。微生物３０２は、いずれかの好適な分離装置、例えば、遠心分離機を用いて、発酵ブロス３０４から容易に分離することができる。次に、微生物３０２は、発酵３００に再循環させることができ、これは、時間が経過すると、アルコールの生成速度を増加し、これによって、アルコール製造の効率を高めることができる。
いくつかの実施形態では、例えば、図４に示すように、本発明のシステム及び方法は、分離４２０の出口からの油４２６の排出を含むことができる。図４は、分離４２０から出る油４２６の排出を除けば、図３と同じであるため、改めて詳細に説明はしない。
原料スラリー４１５は、発酵性糖を含有する第１液相若しくは水溶液４２２、非溶解固形分を含有する固相若しくはウェットケーク４２５、並びに分離４２０から排出可能な油４２６を含有する第２液相に分離される。いくつかの実施形態では、原料４１２は、トウモロコシであり、油４２６は、トウモロコシ油である。いずれか好適な分離装置（例えば、トリカンター型遠心分離機）を用いて、水溶液４２２、ウェットケーク４２５、及び油４２６を排出することができる。いくつかの実施形態では、原料がトウモロコシである場合、トウモロコシ油など、原料４１２からの油の一部が、ウェットケーク４２５中に残留する。いくつかの実施形態では、ウェットケーク４２５は、ウェットケーク４２５の乾燥固形分の約２０％未満の量でトウモロコシ油を含有する。
いくつかの実施形態では、原料４１２（例えば、トウモロコシ）及びトウモロコシ油４２６が、分離４２０から取り出されると、発酵４００中の発酵ブロスは、減少した量のトウモロコシ油を含有する。例えば、非溶解固形分を実質的に含まない発酵ブロスは、重量基準で、少なくとも約４：１、重量基準で、少なくとも約３：１、重量基準で、少なくとも約２：１の比で、アルコール部分（例えば、ブタノール）と油部分（例えば、トウモロコシ油）を含有しうる。トウモロコシ油は、例えば、少なくとも１５重量％の遊離脂肪酸又は少なくとも１６．７重量％の遊離脂肪酸を含みうる。
いくつかの実施形態では、分離４２０は、１層の非溶解固形分、１層の油（例えば、トウモロコシ油）、及び発酵性糖を含有する上澄み層を含む産物プロフィールを形成する。上澄み層中の発酵性糖と非溶解固形分層中の非溶解固形分の比は、重量基準で、約２：１〜約５：１であり；上澄み層中の発酵性糖とトウモロコシ油層中のトウモロコシ油の比は、重量基準で、約１０：１〜約５０：１であり；及び／又は非溶解固形分層中の非溶解固形分とトウモロコシ油層中のトウモロコシ油の比は、重量基準で、約２：１〜約２５：１である。
油４２６を個別に排出しない場合、これをウェットケーク４２５と一緒に取り出すことができる。ウェットケーク４２５が分離４２０から取り出されると、いくつかの実施形態では、原料がトウモロコシの場合、トウモロコシ油などの原料４１２からの油の一部がウェットケーク４２５中に残留する。ウェットケーク４２５は、水溶液４２２が、分離４２０から排出されたら、分離４２０内の追加の水で洗浄することができる。ウェットケーク４２５を洗浄することにより、ウェットケーク中に存在する糖（例えば、オリゴ糖）を回収し、回収された糖及び水を液化４１０に再循環させることができる。洗浄後、いずれかの好適な公知の方法で、ウェットケーク４２５を可溶性物質と混合した後、乾燥させることによって、ＤＤＧＳを形成することができる。分離４２０で形成されたウェットケーク４２５からのＤＤＧＳの形成には、複数の利点がある。いくつかの実施形態では、油４２６をウェットケーク４２５から個別に排出しないで、油４２６をウェットケーク４２５の一部として含有させ、最終的にＤＤＧＳ中に存在させる。このような場合、ＤＤＧＳから油を分離し、同じ又は異なるアルコール発酵工程での後の使用のために抽出剤（例えば、ＩＳＰＲ用の抽出剤）に変換してもよい。
油４２６は、例えば、溶媒抽出法などのいずれか好適な公知の方法を用いて、ＤＤＧＳから分離することができる。本発明のいくつかの実施形態では、ＤＤＧＳを抽出容器にロードし、ヘキサンなどの溶媒で洗浄することにより、油４２６を除去する。使用することができる他の溶媒として、例えば、イソブタノール、イソヘキサン、エタノール、石油エーテルのような石油蒸留物、又はこれらの混合物がある。油４２６の抽出後、ＤＤＧＳを処理して、すべての残留溶媒を除去することができる。例えば、当分野では公知の方法のいずれかを用いて、ＤＤＧＳを加熱して、いずれの残留溶媒も蒸発させることができる。溶媒除去後、ＤＤＧＳを乾燥工程に付すことにより、すべての残留水分を除去することができる。処理したＤＤＧＳは、例えば、家禽、家畜、反芻動物、畜牛、酪農動物、ブタ、ヤギ、ヒツジ、水産養殖魚（例えば、サケ、ナマズ、マス、エビ）、ウマ、及びペットなどの動物用の飼料補助添加物として用いることができる。
ＤＤＧＳの除去後、得られた油４２６及び溶媒混合物を、溶媒からの油４２６の分離のために収集することができる。いくつかの実施形態では、油４２６／溶媒混合物を蒸発により処理することにより、溶媒を蒸発させ、回収して再循環させることができる。回収した油は、同じ又は異なるアルコール発酵工程での後の使用のために抽出剤（例えば、ＩＳＰＲ用の抽出剤）に変換することができる。
発酵槽内に存在する油は、脂肪酸及びグリセリンに分解することができるため、原料の油成分の除去は、アルコール製造に有利である。グリセリンは、水中に蓄積して、システム全体に再循環させるのに利用可能な水の量を減少させる可能性がある。従って、原料の油成分を除去すれば、システム全体に再循環させることができる水の量が増加し、これによってアルコール製造の効率が高められる。
いくつかの実施形態では、例えば、図５に示すように、本発明のシステム及び方法は、一組の２つ以上の分離装置（例えば、遠心分離機）を備えていてもよい。図５は、第２の分離装置５２０’の追加以外は図３と同じであるため、改めて詳細な説明はしない。
分離５２０から排出された水溶液５２２は、分離５２０’の入口に引き入れることができる。分離５２０’は分離５２０と同じであってよく、同じように動作することができる。分離５２０’は、分離５２０における水溶液５２２から分離されていない非溶解固形分を除去して、（ｉ）水溶液５２２に類似しているが、水溶液５２２より非溶解固形分の含有量が少ない水性供給流５２２’と、（ｉｉ）ウェットケーク５２５と類似するウェットケーク５２５’を形成することができる。次に、水性供給流５２２’を発酵５００に導入することができる。いくつかの実施形態では、分離５２０’の後に１つまたは複数の追加的分離があってもよい。微生物５０２及び酵素５０８を発酵５００に添加して、アルコール供給流５０６を形成することができ、これをアルコールの回収のためにさらに処理してもよい。
発酵ブロス５０４を発酵５００から排出することができる。排出された発酵ブロス５０４は、微生物５０２を含みうる。微生物５０２は、いずれかの好適な装置、例えば、遠心分離機を用いて、発酵ブロス５０４から分離することができる。次に、微生物５０２を発酵５００に再循環させることができ、これは、時間の経過により、アルコールの製造速度を高めることができるため、アルコール製造の効率が上昇する。
粉砕穀粒の供給源としてトウモロコシを用いる場合、複数の地点のどこでも、トウモロコシ油をプロセス供給流から分離することができる。例えば、加熱済マッシュの濾過後、遠心分離機を作動して、トウモロコシ油を製造することができる。中間濃縮シロップ又は最終シロップを遠心分離することにより、トウモロコシ油供給流を形成することができる。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、発酵槽から排出された材料を、遠心分離機、沈降タンク、ハイドロサイクロンなどの装置、及びこれらの組合せを含む分離システムで処理して、濃縮形態の生酵母を回収することができ、これは、直接又はある程度の再条件付けの後、後の発酵での再使用のために再循環させることができる。この分離システムはまた、脂肪エステル（例えば、イソブチル脂肪エステル）及び発酵から生成されたアルコール（例えば、ブタノール）を含む有機供給流と、微量レベルの非混和性有機物しか含有しない水性供給流も形成することができる。この水性供給流は、アルコール（例えば、ブタノール）分のストリッピング前又は後のいずれかに用いて、液化マッシュから分離及び洗浄した低デンプン固形分を再パルプ化して、吸入排出することができる。いくつかの実施形態では、多相物質は、カラムの底部に残る可能性があり、これを前述した分離システムで処理することができる。濃縮した固形分を水性供給流中に再分散させて、この混合供給流を用いて、液化マッシュから分離及び洗浄した低デンプン固形分を再パルプ化して、吸入排出することができる。
ブタノールなどのアルコールは、抽出発酵により発酵ブロスから回収してもよい。一般に、発酵ブロスを抽出剤と接触させて、アルコール含有有機相と水相を含む二相、すなわち２相の混合物を形成する。抽出工程は、発酵容器内（すなわち、ｉｎ ｓｉｔｕ生成物除去）又は発酵容器の下流のいずれで行ってもよい。ｉｎ ｓｉｔｕ生成物除去（ＩＳＰＲ）は、バッチ方式、流加バッチ方式、又は連続方式のいずれで実施してもよい。抽出発酵を用いた発酵からアルコールを製造及び回収する方法は、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０２２１８０２号明細書；米国特許出願公開第２０１１／００９７７７３号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４４号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４３号明細書に記載されており；これらの各々は、その全内容を参照として本明細書に組み込むものとする。
抽出発酵の一例を図６に示す。発酵ブロス６０４は、連続的又は定期的に発酵６００から取り出すことができ、抽出剤６０２を発酵ブロス６０４に添加して、発酵ブロス６０４を抽出剤６０２と接触させることによって得られる二相混合物６０５を取得する。二相混合物を容器６１０に導入して、水性及び有機相の分離を実施することにより、アルコール含有有機相６１５及び水相６１２を形成する。抽出剤６０２は、水非混和性有機溶媒又は溶媒混合物であってよい。
抽出剤によるアルコール生成物の抽出は、発酵ブロスからの微生物の除去と一緒に、又は除去なしで実施してよい。微生物は、限定するものではないが、濾過若しくは遠心分離などの当分野で公知の手段により、発酵ブロスから除去することができる。いくつかの実施形態では、容器６１０に導入する前に、抽出剤６０２を、個別の容器に入っている発酵ブロス６０４に添加してもよい。あるいは、容器６１０に導入した後、抽出剤６０２を発酵ブロス６０４と接触させて、二相混合物６０５を取得してもよく、次に、これを有機相及び水相に分離する。アルコール含有有機相６１５は、限定するものではないが、サイフォン吸引、デカンテーション、遠心分離、重力沈降タンク、膜援用分相などの当分野では公知の方法を用いて、二相発酵ブロスの水相６１２から分離することができる。
図６に示すように、生成物アルコールは、発酵６００の下流で、発酵ブロスから抽出することができる。あるいは、二相抽出発酵方法をｉｎ ｓｉｔｕで、発酵槽においてバッチ方式又は連続方式で実施してもよい。ｉｎ ｓｉｔｕ抽出発酵の場合、二相発酵を形成する発酵の開始時に、抽出剤を発酵ブロスと接触させてもよい。あるいは、微生物が所望の量の増殖を達成した（最適密度の培養を測定することによって決定することができる）後、抽出剤を発酵ブロスと接触させてもよい。さらに、抽出剤は、発酵ブロス中のアルコールレベルが、予め選択したレベルに達する時点で、例えば、アルコール濃度が、毒性レベルに達する前に、発酵ブロスと接触させてもよい。発酵ブロスを抽出剤と接触させると、生成物アルコールは抽出剤中に分配されて、微生物を含む水相中の濃度が低下するため、生産微生物の阻害性生成物アルコール（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｌｃｏｈｏｌ）に対する暴露を制限する。使用すべき抽出剤の量は、発酵ブロスの量、発酵槽のサイズ、生成物アルコール用の抽出剤の分配係数、選択した発酵方法など、多数の要因によって変動する。
連続方式のｉｎ ｓｉｔｕ抽出発酵の場合、一実施形態では、抽出剤６０２を発酵６００に導入することにより、二相混合物６０５をそこで取得することができ、この混合物は、アルコール含有有機相供給流６１５と水性供給流６１２を含み、発酵６００から直接出る。別の実施形態では、発酵ブロス及びアルコール含有抽出剤の混合物を発酵６００から除去した後、アルコール含有有機相を水相から分離する。発酵ブロスは、発酵６００に再循環させてもよいし、あるいは、新鮮なブロスと交換してもよい。次に、抽出剤を処理して、生成物アルコールを回収した後、生成物アルコールのさらなる抽出のために、抽出剤を発酵６００に戻し循環させてもよい。あるいは、除去した抽出剤を交換するために、新鮮な抽出剤を発酵６００に連続的に添加してもよい。バッチ方式のｉｎ ｓｉｔｕ抽出発酵の場合には、特定の量の抽出剤を発酵槽に添加することにより、２相混合物を形成し、この工程の間、抽出剤は除去しない。
前述した手段によって抽出剤から発酵ブロスを分離した後、発酵ブロスを発酵６００に再循環させてもよいし、廃棄するか、又は残留生成物アルコールの除去のために処理してもよい。抽出剤からの発酵ブロスの分離後、水相６１２を供給流６１４と再循環供給流６１８に分離する。再循環流６１８は、発酵ブロスの一部を発酵６００に戻す。同様に、抽出剤との接触前に、微生物を発酵ブロスから除去する場合には、単離した微生物を発酵６００に再循環させてもよい。供給流６１４は、生成物アルコールの回収のために、ビールカラム６２０に導入する。
発酵ブロスから生成物アルコールを抽出した後、生成物アルコールをアルコール含有有機相６１５から回収する。アルコール含有有機相６１５は、典型的に、抽出剤、水、生成物アルコール、及び任意選択で不凝結ガスを含む。アルコール含有有機相６１５は、任意選択で、抽出剤相に分配されるのに十分な可溶性を有する発酵副産物をさらに含んでもよい。
アルコール含有有機相からの生成物アルコールの回収は、限定するものではないが、蒸留、樹脂による吸着、分子篩による分離、浸透蒸発など、当分野では公知の方法を用いて、実施してよい。図６のシステム例は、アルコール含有有機相６１５から生成物アルコールを回収するために、蒸留とデカンテーションの組合せを含む。アルコール含有有機相６１５から生成物アルコールを回収するための蒸留は、少なくとも２つの蒸留塔：溶媒カラム６３０及びアルコール（例えば、ブタノール）カラム６６０の使用を含む。溶媒カラム６３０は、デカンテーションと組み合わせて、任意の不凝結ガス（例えば、二酸化炭素）、生成物アルコール、水の分離を実施する。
アルコール含有有機相６１５を溶媒カラム６３０内で蒸留することにより、水、生成物アルコール、及び不凝結ガス（供給物中にもし存在すれば）を含む生成物アルコールリッチ蒸気塔頂流６３５と、抽出剤及び水を含み、生成物アルコールを実質的に含まない溶媒リッチ残液流６３２を形成する。いくつかの実施形態では、回収された抽出剤供給流６３２は、抽出発酵工程に再循環させてもよい。例えば、回収した抽出剤供給流６３２は、発酵ブロス６０４と接触させる抽出剤６０２として用いてもよい。
蒸気塔頂流６３５は、約６５重量％以下の生成物アルコールと、少なくとも約３０重量％の水を含みうる。いくつかの実施形態では、蒸気塔頂流は、約６５重量％以上の生成物アルコールと、少なくとも約３２重量％の水を含み、別の実施形態では、約６０重量％以上の生成物アルコールと、少なくとも約３５重量％の水を含み、また別の実施形態では、約５５重量％以上の生成物アルコールと、少なくとも約４０重量％の水を含み、別の実施形態では、約５０重量％〜約５５重量％の生成物アルコールと、約４５重量％〜約５０重量％の水を含む。いくつかの実施形態では、蒸気塔頂流６３５中の抽出剤の量は、２％未満である。いくつかの実施形態では、蒸気塔頂流６３５を、冷却器内で冷却及び凝縮させ、ミキサー６４０内で、ビールカラム６２０及びカラム６６０からの凝縮した蒸気塔頂流６２５及び６６２とそれぞれ混合してもよい。混合した供給流６４５は、デカンター６５０内のアルコールリッチ液相及び希薄アルコール液相に注ぎ込んでもよい。例えば、液体アルコール相は、約３０重量％未満の水、又は約２０重量％〜約３０重量％の水、又は約１６重量％〜約３０重量％の水、又は約１０重量％〜約２０重量％の水を含んでもよく、また、塔頂から溶媒カラム６３０に入って来る残留抽出剤を約０．００１重量％未満含む。液体水相は、約１０重量％未満の生成物アルコールを含み、あるいは、いくつかの実施形態では、約３重量％〜約１０重量％の生成物アルコールを含んでよい。デカンター６５０からの液体水相の全部又は一部を還流供給流６５２として溶媒カラム６３０に戻してもよい。デカンター６５０からアルコールリッチ液相流６３５を分離し、一部を還流供給流６５４として溶媒カラム６３０に、残り部分６５８をカラム６６０に戻してもよい。カラム６６０は、生成物アルコールと水の分離を実施し、生成物アルコール残液流６６５を形成するが、これは、ほぼ１００重量％の生成物アルコールであり、水を実質的に含まない。蒸気塔頂流６６２は、例えば、約６７重量％の生成物アルコールと約３３重量％の水、例えば、約６０重量％の生成物アルコールと約４０重量％の水、又は約５５重量％の生成物アルコールと約４５重量％の水を含む。いくつかの実施形態では、蒸気塔頂流６６２は、冷却器内で凝縮させ、ミキサー６４０を介してデカンター６５０に戻してもよい。
抽出剤から発酵ブロスを分離した後、水相供給流６１４をビールカラム６２０に導入して、水、生成物アルコール、及び不凝結ガス（もし供給物中に存在すれば）を含む生成物アルコールリッチ蒸気塔頂流６２５と、生成物アルコールが希薄なビール残液流６２２を形成する。ビール残液供給流６２２は、蒸留穀粒残渣及び蒸留廃液などの副産物を含む。
ビール残渣副産物は、原料としての価値があるため、ビール残液を廃棄物として廃棄するのではなく、これらの副産物の全部若しくは一部を、ＤＤＧ、ＷＤＧ、乾燥蒸留可溶性物質（ＤＤＳ）、ＣＤＳ、ＤＤＧＳ、トウモロコシ油、及び／又はＣＯＦＡのうちの１つまたは複数にさらに処理することが望ましい。図６の実施形態では、ビール残液流６２２をさらに処理して、ＤＤＧＳ６９７を製造する。このために、ビール残液流６２２を分離装置６７０に導入するが、この装置は、主に水を含む蒸留廃液から、ビール残液の穀粒残渣６７５を分離するための、機械的分離装置（例えば、遠心分離若しくはフィルタープレス）であってよい。蒸留廃液の一部６７２’を、発酵６００に導入される供給物に再循環してもよい。残りの蒸留廃液６７２は、そこから相当量の水を蒸発システム６８０において蒸発させることにより、シロップ６８５に濃縮することができる。いくつかの実施形態では、蒸発システム６８０は、シロップ６８５中の水の重量濃度が約４０％〜約６５％であるように、蒸留廃液６７２からの水の蒸発を達成する。いくつかの実施形態では、シロップ６８５中の水の重量濃度は、約４５％〜約６０％である。いくつかの実施形態では、蒸留廃液６７２中の水の重量濃度は、約８５％〜約９５％であり、いくつかの実施形態では、蒸留廃液６７２中の水の重量濃度は、約９０％である。次に、シロップ６８５をミキサー６９０内で、穀粒残渣６７５と合わせてもよく、穀粒とシロップの混合流６９２を乾燥機６９５内で乾燥させて、ＤＤＧＳ６９７を製造することができる。
図７は、本発明のシステム及び方法の別の実施形態を示す。原料を液化して、非溶解固形分及び発酵性糖を含む液化マッシュ（若しくは原料スラリー）を製造することができる。液化マッシュは、固形分分離７１０に入り、非溶解固形分と、溶解発酵性糖の清澄化溶液（例えば、シンマッシュ）７１２を含むウェットケーク７１５を形成することができる。液化マッシュ（若しくは原料スラリー）からの非溶解固形分の分離は、多数の手段によって実施してよく、このような手段として、限定するものではないが、デカンター型ボウル型遠心分離、トリカンター型遠心分離、ディスクスタック遠心分離機、濾過遠心分離、デカンター型遠心分離、濾過、真空濾過、ベルトフィルター、圧力濾過、スクリーンを用いた濾過、スクリーン分離、グレーティング、多孔性グレーティング、浮選、ハイドロサイクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降タンク、ボルテックスセパレータ、又はこれらの組合せなどがある。ウェットケーク７１５を固形分洗浄７３０に送達し、ウェットケーク７１５から発酵性糖を回収してもよい。洗浄済ウェットケーク７３５が形成されるが、これを乾燥機７８０に送達し、ＤＤＧＳを製造することもできる。
シンマッシュ７１２、微生物、及び抽出剤を発酵７００に添加し、ここで、マッシュを微生物により発酵させることによって、二相供給流７０５を形成する。二相供給流７０５を抽出剤カラム７２０に送達し、蒸気流７２２及び残液流７２５を形成することができる。蒸気流７２２は、生成物アルコールの回収のために、アルコール回収７９０に送ってもよい。残液流７２５を抽出剤分離７６０に送達して、この供給流を蒸留廃液７６５と抽出剤に分離してもよい。いくつかの実施形態では、回収した抽出剤を発酵７００に再循環させてもよい。蒸留廃液３０８は、発酵前に取り出された固形分の大部分と一緒に、蒸発システム７７０を介した蒸発によって濃縮させて、シロップ７７５を形成することができる。シロップ７７５を乾燥機７８０内でウェットケーク７３５と合わせて、ＤＤＧＳを製造することができる。
図８は、図７に示した方法の変形例を示し、ここで、抽出剤は、油（例えば、トウモロコシ油）由来の脂肪酸である。脂肪酸エステルの形成のために、エステル化触媒を付与して、脂肪酸と生成物アルコール（例えば、ブタノール）の化学反応を促進してもよい。発酵中に生成される生成物アルコールの一部が、脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸ブチルエステル）として化学的に封鎖されるように、微生物、シンマッシュ８１２、及び抽出剤と一緒に、発酵８００に酵素（例えば、リパーゼ）を添加してもよい。発酵排出８０５は、幾分かの生成物アルコールを含有しうるが、これをビールカラム８２０内に回収してもよい。二相残液流８２５は、エステル生成物を含有している可能性があり、これを抽出剤分離８４０において分離することにより、脂肪酸供給流８４２及び蒸留廃液８４５を形成することができる。いくつかの実施形態では、蒸留廃液８４５は、エステルを含有している可能性があり、蒸発システム８５０内で蒸発させるとき、エステルを供給流８５２として回収してもよい。供給流８４２及び供給流８５２に含まれる脂肪エステルの混合物を加水分解装置８６０で化学的に処理することにより、脂肪エステルを脂肪酸と生成物アルコールに変換してもよい。加水分解装置８６０からの二相供給流８６５を抽出剤カラム８７０に送達して、生成物アルコールを回収してもよい。抽出剤カラム８７０の残液は、脂肪酸を含んでおり、これを発酵８００に再循環させてもよい。
本明細書に記載した方法に用いることができる抽出剤として、例えば、有機溶媒がある。いくつかの実施形態では、抽出剤は、非水混和性有機溶媒であってよい。例えば、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪酸アミド、及びこれらの混合物などの抽出剤を本明細書に記載の方法に用いてよい。いくつかの実施形態では、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸アミド、及びこれらの混合物から、抽出剤を選択してよい。いくつかの実施形態では、抽出剤は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸アミド、及びこれらの混合物から選択される第１抽出剤；並びにＣ７〜Ｃ１１脂肪アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１脂肪酸、Ｃ７〜Ｃ１１脂肪酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１脂肪アルデヒド、及びこれらの混合物から選択される第２抽出剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、抽出剤は、カルボン酸であってよい。抽出剤の別の例としては、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ラウリン酸アルデヒド、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、２−ウンデカノール、１−ノナナール、及びこれらの混合物がある。
抽出発酵を用いて、発酵ブロスから生成物アルコールを生成及び回収する方法は、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０２２１８０２号明細書；米国特許出願公開第２０１１／００９７７７３号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４４号明細書；及び米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４３号明細書：米国特許出願公開第２０１０／０１４３９９２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０１４３９９３号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０１４３９９４号明細書；並びに米国特許出願公開第２０１０／０１４３９９５号明細書に記載されており；これらの各々は、その全内容を参照として本明細書に組み込む。
本明細書に記載の抽出発酵を用いると、抽出剤（例えば、脂肪酸、ＣＯＦＡ、脂肪酸エステル）又は油が、蒸留共産物中に存在していてもよい。いくつかの実施形態では、抽出剤及び／又は油を蒸留共産物から除去してもよい。例えば、スクリュープレス若しくは遠心分離機などの機械的手段、又はヘキサン若しくはアルコール（例えば、ブタノール）による抽出、過酸化水素での処理、イオン交換、若しくは蒸留などの化学的手段を用いて、蒸留共産物から抽出剤及び／又は油を除去することができる。抽出剤及び／又は油の除去は、脂肪分を低減し、蒸留共産物のタンパク質含量を高めることによって、蒸留共産物の品質を改善しうる。
本明細書に記載する工程及びシステムにおいて形成される様々な供給流をさらに処理して、ＤＤＧＳ又は脂肪酸エステルなどの共産物を生成してもよい。共産物は、ある供給流からの副産物を回収するか、又は複数の供給流を合わせ、これらを混合することによって、形成することができる。例えば、脂肪酸エステルは、溶媒を用いて、蒸留廃液流又はウェットケークからエステルを抽出することによって、回収してもよい。溶媒による抽出システムは、米国特許出願公開第２０１０／００９２６０３号明細書に記載されており；その教示内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。
脂肪酸エステルの溶媒抽出のいくつかの実施形態では、蒸留廃液の供給流が、混合されていない副産物流中の脂肪酸エステルの最も大きい部分を含有する可能性があるため、全蒸留廃液から固形分を分離することができる（「分離固形分」）。これらの分離固形分を抽出装置に供給して、溶媒で洗浄することができる。いくつかの実施形態では、分離固形分の全側面が溶媒で洗浄されることを確実にするために、分離固形分を少なくとも１回回転させる。洗浄後、得られた脂質と溶媒の混合物（ミセラとして知られる）を、溶媒からの抽出脂質の分離のために回収する。例えば、得られた脂質と溶媒の混合物を分離装置に導入し、さらなる処理に付すことができる。抽出工程中に、溶媒で分離固形分を洗浄し終えると、溶媒は、脂質を溶液中にもたらすだけでなく、微細な固体粒子も収集する。これらの「微粉」は、一般に、ミセラ中の不要な不純物であり、いくつかの実施形態では、ミセラから微粉を分離若しくは除去する装置により、ミセラを抽出装置又は分離装置から排出することができる。
ミセラ中に含まれる脂質及び溶媒を分離するために、ミセラを蒸留ステップに付すことができる。このステップでは、例えば、溶媒の蒸発を引き起こすのに十分高いが、抽出した脂質に有害に作用したり、これを蒸発させたりするほど高くはない温度にミセラを加熱するエバポレータによって、ミセラを処理することができる。溶媒が蒸発したら、例えば、凝縮装置内にこれを収集して、後の使用のために再循環させてよい。ミセラからの溶媒の分離によって、粗脂質のストックが得られるが、これをさらに処理して、水、脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸イソブチルエステル）、脂肪酸、及びトリグリセリドを分離することができる。
脂質の抽出後、固形分を抽出装置から移動して、ストリッピング工程に付すが、ここで、残留溶媒を除去する。残留溶媒の回収は、製造法の経済性に重要である。いくつかの実施形態では、湿潤固形分を気密環境に移動させて、脱溶媒装置に送る間、湿潤固形分から一時的に蒸発した溶媒を保存及び収集することができる。固形分が脱溶媒装置に入ったら、これらを加熱して、残留溶媒を蒸発及び除去することができる。固形分を加熱するために、脱溶媒装置は、固形分を１つまたは複数のトレーに分配するための機構を含んでもよく、固形分は、例えば、加熱空気若しくは蒸気との直接接触などにより、直接加熱してもよいし、あるいは、固形分を運ぶトレーを加熱するなどにより、間接的に加熱してもよい。１つのトレーから別のトレーへの固形分の移動を容易にするために、固形分を運ぶトレーは、１つのトレーから次のトレーに固形分を移すことができる開口部を含んでもよい。脱溶媒装置から、任意選択で、固形分をミキサーに送ってもよく、ここで、固形分を別の副産物と混合した後、乾燥機に送る。この例では、固形分を脱溶媒装置に供給し、そこで、固形分を蒸気に接触させる。いくつかの実施形態では、脱溶媒装置における蒸気と固形分の流れを反対方向にしてもよい。次に、固形分は、脱溶媒装置から出て、乾燥機に送ってもよいし、又は任意選択でミキサーに送り、そこで、様々な副産物を混合してもよい。脱溶媒装置を出た蒸気は、凝結して、任意選択で、ミセラと混合した後、デカンターに供給してもよい。デカンターを出た高水分相は、蒸留塔に供給することができ、そこで、高水分蒸気からヘキサンを除去する。いくつかの実施形態では、ヘキサンを除去した高水分蒸気は、蒸留塔の底部から出るが、これを発酵工程に戻して再循環させてもよく、例えば、粉砕トウモロコシ固形分をスラリー化するのに、これを用いることができる。いくつかの実施形態では、塔頂及び底部生成物を発酵工程に再循環させてもよい。例えば、液体を多く含む残渣を加水分解装置の供給物に添加してもよい。塔頂生成物は、例えば、濃縮して、デカンターに供給してもよい。このデカンターを出るヘキサンリッチ供給流は、任意選択で、抽出装置への溶媒供給物の一部として用いてもよい。このデカンターを出る高水分相を蒸留塔に供給してもよく、そこで、水からヘキサンを除去する。当業者であれば理解されるように、本発明の方法は、ブタノールなどのアルコールの製造用の発酵工程を最適化するために、様々な方法で改変することができる。
いくつかの実施形態では、発酵工程で用いるマッシュから共産物を得てもよい。例えば、トウモロコシを原料として使用する場合には、トウモロコシ油をマッシュから分離することができるが、このトウモロコシ油は、トリグリセリド、脂肪酸、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、及びトコフェロールなどの抗酸化物質を含有する。いくつかの実施形態では、トウモロコシ油が多く含むトリグリセリドは、代謝エネルギーの供給源であるため、トウモロコシ油を動物飼料の成分として用いることができる。さらに、トウモロコシ油中の天然抗酸化物質は、ビタミンＥの供給源を提供すると共に、酸敗の発生を低減する。
トウモロコシ油は、任意選択で、様々な割合で他の共産物に添加してよく、例えば、得られる共産物中のトリグリセリドの量を増減できるようにする。このようにして、例えば、高脂肪製品と比較して、乳牛の需要に、より適合する低脂肪かつ高タンパク質の動物飼料を生産するように、得られる共産物の脂肪分を制御することができる。
いくつかの実施形態では、マッシュから分離した粗トウモロコシ油をさらに処理して、食品産業又は消費者による直接使用のための食用油にしてもよい。例えば、ホスファチド除去のための精錬、遊離脂肪酸を中和するためのアルカリ精製、色素実体（Ｃｏｌｏｒ ｂｏｄｉｅｓ）及び微量元素を除去するための脱色、蝋を除去するためのウィンターライジング（ｗｉｎｔｅｒｉｚｉｎｇ）、及び脱臭により、粗トウモロコシ油をさらに処理して、精製トウモロコシ油を製造してもよい（例えば、Ｃｏｒｎ Ｏｉｌ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｒｎ Ｒｅｆｉｎｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２００６を参照）。精製したトウモロコシ油は、例えば、食品製造のために、食品製造業者が使用することができる。アルカリ精製により除去した遊離脂肪酸は、石鹸原料として用いることができ、また、ウィンターライジングステップから回収した蝋は、動物飼料に用いることができる。
いくつかの実施形態では、トウモロコシ油などの植物油は、抽出発酵用の抽出剤を製造するための原料として用いることもできる。例えば、バイオマス由来の油を、発酵ブロスから、ブタノールなどの生成物アルコールを除去するのに利用可能な抽出剤に変換してもよい。油中のグリセリドを化学的、又は酵素により、反応生成物、例えば、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸アミド、脂肪酸アルキルエステル、脂肪酸グリコールエステル、及び加水分解されたトリグリセリド、又はこれらの混合物などに変換してもよく、これらは、発酵生成物抽出剤として用いることができる。一例としてトウモロコシ油を用いると、トウモロコシ油トリグリセリドを水酸化アンモニア又は水酸化ナトリウムのような塩基と反応させて、脂肪酸アミド、脂肪酸、及びグリセロールと反応させてもよい。これらの脂肪酸アミド、脂肪酸、又はそれらの混合物は抽出剤として用いることができる。いくつかの実施形態では、トウモロコシ油などの植物油をリパーゼなどの酵素により、加水分解して、脂肪酸（例えば、トウモロコシ油脂肪酸）を形成することができる。バイオマスから抽出剤を得る方法は、米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４４号明細書及びＰＣＴ国際公開第２０１１／１５９９９８号パンフレットを参照されたい。尚、これらの文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
いくつかの実施形態では、トウモロコシ油は、樹脂、プラスチック、ポリマー、及び潤滑剤の製造にも用いることができ、また、医薬製剤の成分として製薬業でも使用されうる。トウモロコシ油はまた、印刷用インク、塗料及びワニス、石鹸、及び織物などの製品の製造にも用いられうる。
いくつかの実施形態では、トウモロコシ油は、バイオディーゼル又は再生可能ディーゼル用の原料としても用いることができる。いくつかの実施形態では、植物油又は植物油の組合せは、バイオディーゼル又は再生可能ディーゼル用の原料としても用いることができる。植物油として、限定するものではないが、キャノーラ油、ヒマシ油、ホホバ油、カランジャ油、マフア油、アマニ油、ダイズ油、パーム油、ピーナッツ油、ナタネ油、コメ油、ベニバナ油、及びヒマワリ油が挙げられる。バイオディーゼルは、メタノール、エタノール、及びブタノールなどのアルコールと、植物油のエステル交換及びエステル化のいずれかによって得ることができる。例えば、バイオディーゼルは、酸触媒、アルカリ触媒、若しくは酵素触媒のエステル交換又はエステル化（例えば、植物油由来のトリグリセリドのエステル交換又は植物油由来の脂肪酸のエステル化）によって製造することができる。硫酸、塩酸、及びリン酸などの無機酸、トルエンスルホン酸及びナフタレンスルホン酸などの有機酸、又はＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）スルホン化ポリスチレン樹脂若しくはゼオライトなどの固体酸を、酸触媒エステル交換又はエステル化のための触媒として用いることができる。水酸化カリウム、カリウムメトキシド、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、又は水酸化カルシウムなどの塩基を、塩基触媒エステル交換又はエステル化のための触媒として用いることができる。いくつかの実施形態では、バイオディーゼルは、統合方法、例えば、トリグリセリドの塩基触媒エステル交換後に、遊離脂肪酸の酸触媒エステル化を実施することによって製造することもできる。
リパーゼ又はエステラーゼなどの酵素を用いて、エステル交換又はエステル化反応を触媒してもよい。リパーゼは、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、サーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、及びリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属などの細菌又は真菌に由来するものでよい。いくつかの実施形態では、リパーゼは、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、サーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、又はカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｔａｒｃｔｉｃａ）に由来するものでよい。いくつかの実施形態では、酵素は、可溶性又は不溶性支持体上に固定化してもよい。酵素の固定化は、以下に挙げる様々な方法を用いて、実施することができる：１）共有結合性支持、物理的吸着、静電結合、若しくは親和性結合による、多孔質又は非孔質担体支持体への酵素の結合；２）二官能価若しくは多官能価試薬を用いた架橋；３）ゲルマトリックス、ポリマー、エマルション、若しくは何らかの形態の膜内への閉じ込め；並びに４）これらの方法のいずれかの組合せ。いくつかの実施形態では、リパーゼを例えば、アクリル樹脂、シリカ、若しくはビーズ（例えば、ポリメタクリレートビーズ）上に固定化してもよい。いくつかの実施形態では、リパーゼは、可溶性であってもよい。
バイオディーゼル製造のための反応器構成は、例えば、バッチ撹拌タンク反応器、連続撹拌タンク反応器、充填層反応器、流動層反応器、膨脹層反応器、及び再循環膜反応器を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するバイオディーゼルは、以下に挙げる脂肪酸アルキルエステル（ＦＡＡＥ）の１つまたは複数を含んでもよい：脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）、脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）、及び脂肪酸ブチルエステル（ＦＡＢＥ）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するバイオディーゼルは、以下の１つまたは複数を含んでもよい：ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、オレイン酸塩、リノレン酸塩、アラキジン酸塩、及びベヘン酸塩。
いくつかの実施形態では、抽出剤副産物の全部又は一部を、動物飼料副産物の成分として用いてもよいし、又はこれをバイオディーゼル若しくは再生可能ディーゼルの原料として用いることができる。いくつかの実施形態では、発酵工程からの油は蒸発によって回収することができる。この非水性組成物は、脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸イソブチルエステル）及び脂肪酸を含んでいる可能性があり、この組成物（若しくは供給流）を加水分解装置に供給して、イソブタノール及び脂肪酸を回収することができる。別の実施形態では、この供給流をバイオディーゼル製造のための原料として用いることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するバイオディーゼルは、米国材料試験協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）（ＡＳＴＭ）Ｄ６７５１の規定を満たしている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するバイオディーゼルは、欧州規格（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｓｔａｎｄａｒｄ）ＥＮ１４２１４の規定を満たしている。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも２％のバイオディーゼル、少なくとも５％のバイオディーゼル、少なくとも１０％のバイオディーゼル、少なくとも２０％のバイオディーゼル、少なくとも３０％のバイオディーゼル、少なくとも４０％のバイオディーゼル、少なくとも５０％のバイオディーゼル、少なくとも６０％のバイオディーゼル、少なくとも７０％のバイオディーゼル、少なくとも８０％のバイオディーゼル、少なくとも９０％のバイオディーゼル、又は少なくとも１００％のバイオディーゼルを含有しうる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するディーゼルを石油ベースのディーゼル燃料とブレンドすることにより、バイオディーゼルブレンドを形成してもよい。いくつかの実施形態では、バイオディーゼルブレンドは、少なくとも２容量％のバイオディーゼル、少なくとも３容量％のバイオディーゼル、少なくとも４容量％のバイオディーゼル、少なくとも５％重量のバイオディーゼル、少なくとも６重量％のバイオディーゼル、少なくとも７容量％のバイオディーゼル、少なくとも８容量％のバイオディーゼル、少なくとも９容量％のバイオディーゼル、少なくとも１０容量％のバイオディーゼル、少なくとも１１容量％のバイオディーゼル、少なくとも１２容量％のバイオディーゼル、少なくとも１３容量％のバイオディーゼル、少なくとも１４容量％のバイオディーゼル、少なくとも１５％重量のバイオディーゼル、少なくとも１６重量％のバイオディーゼル、少なくとも１７容量％のバイオディーゼル、少なくとも１８容量％のバイオディーゼル、少なくとも１９容量％のバイオディーゼル、少なくとも２０容量％のバイオディーゼルを含有しうる。いくつかの実施形態では、バイオディーゼルブレンドは、約２０容量％以下のバイオディーゼルを含有しうる。
バイオディーゼルの副産物はグリセロールである。さらに、グリセロールは、植物油からの抽出剤の生成及び発酵工程の副産物でもありうる。バイオディーゼルの原料は、ＣＯＦＡ含有供給流をグリセロールと反応させることによって、製造することができる。反応は、硫酸などの強い無機酸により、又はＡｍｇｅｒｌｙｓｔ（商標）などの固体酸触媒により、並びにイオン交換樹脂によって触媒してもよい。反応塊から水を除去することにより、高度の変換を達成することができる。反応生成物は、反応体の比率及び反応の程度によって決定される割合で、モノ−、ジ−、及びトリグリセリドを含む。グリセリド混合物は、バイオディーゼルを製造するのに通常用いられるトリグリセリド供給物の代わりに用いることができる。いくつかの実施形態では、グリセリドは、バイオディーゼル用の界面活性剤又は原料として用いてもよい。
いくつかの実施形態では、マッシュから固形分を分離することができ、これは、トリグリセリドと遊離脂肪酸を含みうる。これらの固形分（若しくは供給流）は、動物飼料として用いることができ、遠心分離からの排出として、又は乾燥後に回収することができる。固形分（若しくはウェットケーク）は、利用可能リシン及びバイパス又は第一胃非分解性タンパク質を多く含有しているため、反芻動物（例えば、乳牛）用の飼料として特に好適となりうる。例えば、これらの固形分は、高タンパク質、低脂肪飼料において特に有用となりうる。いくつかの実施形態では、これらの固形分は、基材として用いることができる。すなわち、シロップなどの他の副産物をこれらの固形分に添加して、動物飼料として用いることができる製品を形成することができる。いくつかの実施形態では、様々な量の他の副産物を固形分に添加して、特定の動物種のニーズを満たすように、得られる製品の特性を調整することができる。
全蒸留廃液から分離された固形分の組成物は、例えば、粗タンパク質、脂肪酸、及び脂肪酸エステルを含有している可能性がある。いくつかの実施形態では、この組成物（若しくは副産物）は、湿潤若しくは乾燥のいずれでも、例えば、高タンパク質（例えば、高リシン）、低脂肪、及び高繊維が所望される動物飼料として、用いることができる。いくつかの実施形態では、より高脂肪、低繊維の動物飼料が所望される場合、例えば、別の副産物流からの脂肪をこの組成物に添加してもよい。いくつかの実施形態では、この高脂肪、低繊維動物飼料は、ブタ又は家禽に用いることができる。別の実施形態では、ＣＤＳの非水性組成物は、例えば、タンパク質、脂肪酸、及び脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸エステルイソブチルエステル）並びに塩及び炭水化物などの他の溶解及び懸濁固形分を含有している可能性がある。このＣＤＳ組成物は、例えば、湿潤若しくは乾燥のいずれでも、タンパク質、低脂肪、及び高ミネラル塩の飼料成分が所望される動物飼料として、用いることができる。いくつかの実施形態では、この組成物は、酪農動物飼料の成分として、用いることができる。いくつかの実施形態では、ＷＤＧは、タンパク質、繊維、脂肪、及び約７０％までの水分を含有しうる。いくつかの実施形態では、ＤＤＧＳは、約１０〜１２％の水分を含有しうる。
発酵工程によるアルコール（例えば、ブタノール）の製造によって生成される様々な供給流を様々な方法で組み合わせて、多数の共産物を生成することができる。例えば、マッシュからの粗トウモロコシを用いて、抽出剤として用いる脂肪酸を生成し、別の目的のためにエバポレータによって脂質を抽出した後、残る供給流を合わせてから、処理することによって、粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、及び脂肪酸イソブチルエステルなどの脂肪酸エステル（蒸留共産物）を形成することができる。
いくつかの実施形態では、蒸留共産物（例えば、動物飼料用の蒸留共産物）の粗タンパク質含有率は、少なくとも約２０％（蒸留共産物の重量パーセンテージ）、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％であってよい。いくつかの実施形態では、粗タンパク質含有率は、本明細書に開示するいずれかの範囲の値であり、例えば、約２０％〜約９５％、約２５％〜約９５％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約９５％、約５０％〜約９５％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約９５％、約５０％〜約９５％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約８０％、約４０％〜約８０％、約５０％〜約８０％、約２０％〜約５０％、約３０％〜約５０％、約２０％〜約４５％、又は約２５％〜約４５％、約３０％〜約４５％、約２０％〜約４０％、又は約２５％〜約４０％、約３０％〜約４０％、約２０％〜約３５％、約２５％〜約３５％、約３０％〜約３５％である。
いくつかの実施形態では、蒸留共産物（例えば、動物飼料用の蒸留共産物）の粗脂肪含有率は、約１０％未満（蒸留共産物の重量パーセンテージ）、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満であってよい。いくつかの実施形態では、粗脂肪含有率は、本明細書に開示する値のいずれかの範囲、例えば、約１％〜約１０％、約２％〜約１０％、約３％〜約１０％、約４％〜約１０％、約５％〜約１０％、約１％〜約８％、約２％〜約８％、約３％〜約８％、約４％〜約８％、約１％〜約５％、又は約５％〜約１０％である。
いくつかの実施形態では、蒸留共産物の脂肪酸含有率は、約１０％未満（蒸留共産物の重量パーセンテージ）、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満であってよい。いくつかの実施形態では、脂肪酸含有率は、本明細書に開示する値のいずれかの範囲、例えば、約１％〜約１０％、約２％〜約１０％、約３％〜約１０％、約４％〜約１０％、約５％〜約１０％、約１％〜約８％、約２％〜約８％、約３％〜約８％、約４％〜約８％、約１％〜約５％、又は約５％〜約１０％である。
本発明のいくつかの実施形態では、蒸留共産物のトリグリセリド含有率は、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満であってよい。いくつかの実施形態では、トリグリセリド含有率は、本明細書に開示するいずれかの値の範囲、例えば、約１％〜約１０％、約２％〜約１０％、約３％〜約１０％、約４％〜約１０％、約５％〜約１０％、約１％〜約８％、約２％〜約８％、約３％〜約８％、約４％〜約８％、約１％〜約５％、又は約５％〜約１０％である。
いくつかの実施形態では、蒸留共産物のリシン含有率は、約１０％未満（蒸留共産物の重量パーセンテージ）、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満であってよい。いくつかの実施形態では、リシン含有率は、本明細書に開示するいずれかの値の範囲、例えば、約１％〜約１０％、約２％〜約１０％、約３％〜約１０％、約４％〜約１０％、約５％〜約１０％、約１％〜約８％、約２％〜約８％、約３％〜約８％、約４％〜約８％、約１％〜約５％、又は約５％〜約１０％である。
いくつかの実施形態では、蒸留共産物の脂肪酸エステル含有率は、約１０％未満（蒸留共産物の重量パーセンテージ）、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満であってよい。いくつかの実施形態では、脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸イソブチルエステル）含有率は、本明細書に開示するいずれかの値の範囲、例えば、約１％〜約１０％、約２％〜約１０％、約３％〜約１０％、約４％〜約１０％、約５％〜約１０％、約１％〜約８％、約２％〜約８％、約３％〜約８％、約４％〜約８％、約１％〜約５％、又は約５％〜約１０％である。
いくつかの実施形態では、蒸留共産物（例えば、動物飼料用の蒸留共産物）は、少なくとも約２０％〜約３５％の粗タンパク質（蒸留共産物の重量パーセンテージ）、少なくとも約１％〜約２０％の粗脂肪、少なくとも約０％〜約５％のトリグリセリド、少なくとも約４％〜約１０％の脂肪酸、及び少なくとも約２％〜約６％の脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸イソブチルエステル）を含む。いくつかの実施形態では、蒸留共産物は、約２５％の粗タンパク質、約１０％の粗脂肪、約０．５％のトリグリセリド、約６％の脂肪酸、及び約４％の脂肪酸イソブチルエステルを含む。
いくつかの実施形態では、蒸留共産物（例えば、動物飼料用の蒸留共産物）は、以下：タンパク質、脂肪、繊維、ビタミン、及びミネラルのうち１つまたは複数を含みうる。いくつかの実施形態では、蒸留共産物に、アミノ酸、ビタミン、及びミネラルを補充してもよい。例えば、蒸留共産物に、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、及びバリンなどのアミノ酸、アラニン、アルギニン、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、ランチオニン、オルニチン、プロリン、セリン、及びチロシンなどの他のアミン酸（ａｍｉｎｅ ａｃｉｄｓ）を補充してもよい。蒸留共産物には、カルシウム、塩化物、コバルト、銅、フッ化物、ヨウ素、鉄、マグネシウム、マンガン、リン、カリウム、セレン、ナトリウム、イオウ、及び亜鉛などのミネラルを補充してもよい。蒸留共産物には、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、及びＢ（チアミン、リボフラビン、ニアシン、パントテン酸、ビオチン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２及び葉酸）などのビタミンを補充してもよい。いくつかの実施形態では、蒸留共産物は、トリグリセリド、脂肪酸、脂肪酸エステル、及びグリセロールを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、蒸留共産物の水分、タンパク質、脂肪、繊維、及び灰分の含量を測定することができる（例えば、ｗｗｗ．ａｏａｃ．ｏｒｇ、ｗｗｗ．ｆｏｒａｇｅｔｅｓｔｉｎｇ．ｏｒｇ、ｗｗｗ．ａｏｃｓ．ｏｒｇを参照されたい）。いくつかの実施形態では、蒸留共産物の水分は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ（ＡＯＡＣ）９３４．０１、ＡＯＡＣ９３５．２９、ＡＯＡＣ９３０．１５、ＡＯＡＣ２００１．１２、及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｇａｉｎｇ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＦＴＡ）２．２．２．５などの分析方法を用いて測定してよい。いくつかの実施形態では、蒸留共産物のタンパク質含量は、ＡＯＡＣ９９０．０３及びＡＯＡＣ２００１．１１などの分析方法を用いて測定してよい。いくつかの実施形態では、蒸留共産物の脂肪分は、ＡＯＡＣ２００３．５、ＡＣ２００３．０６、ＡＯＡＣ９２０．３９、ＡＯＡＣ９４５．０２、及びＡＯＡＣ９４５．１６などの分析方法を用いて測定してよい。いくつかの実施形態では、蒸留共産物の繊維含量は、ＡＯＡＣ９７８．１０、ＡＯＡＣ９６２．０９、及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＡＯＣＳ）Ｂａ ６ａ−０５などの分析方法を用いて測定してよい。いくつかの実施形態では、蒸留共産物の灰分含量は、ＡＯＡＣ９４２．０５などの分析方法を用いて測定してよい。
本発明のいくつかの実施形態では、エタノール又はブタノール製造工程から、有用性の高い動物飼料成分を製造する方法に関し、この方法は、動物飼料市場用の粗タンパク質及び粗脂肪含量を最適化するための少なくとも１つのプロセス供給流を有するエタノール又はブタノール製造工程を用意することを含む。いくつかの実施形態では、動物飼料又は動物飼料市場のための粗タンパク質及び粗脂肪含量を最適化するために、少なくとも２つのプロセス供給流を組み合わせる。いくつかの実施形態では、動物飼料又は動物飼料市場のための粗タンパク質及び粗脂肪含量を最適化するために、少なくとも３つのプロセス供給流を組み合わせる。
いくつかの実施形態では、動物飼料組成物用の蒸留共産物又は動物飼料用の蒸留共産物を製造する方法は、利用可能な供給流の種類に合わせて最適化されている。いくつかの実施形態では、畜牛飼料市場のための動物飼料用の蒸留共産物を製造する方法の、畜牛飼料市場のための動物飼料用の蒸留共産物は、湿式プロセス供給流、例えば、ＷＤＧＳ又はＷＤＧを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物に関する動物飼料市場は、家畜飼料市場、反芻動物飼料市場、畜牛飼料市場、酪農動物飼料市場、ブタ飼料市場、ヤギ飼料市場、ヒツジ飼料市場、家禽飼料市場、ウマ飼料市場、水産養殖魚飼料市場、ペット飼料市場、又はこれらのいずれかの組合せである。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物に関する動物飼料は、家畜飼料、反芻動物飼料、畜牛飼料、酪農動物飼料（例えば、乳牛飼料）、ブタ飼料、ヤギ飼料、ヒツジ飼料、家禽飼料、ウマ飼料、水産養殖魚飼料、ペット飼料、又はこれらのいずれかの組合せである。
いくつかの実施形態では、蒸留共産物は、表６に記載の脂肪及びタンパク質含量（例えば、ＤＣＰ１、ＤＣＰ２，又はＤＣＰ３）、又は表６に記載のものと実質的に同様の脂肪及びタンパク質含量を含む。いくつかの実施形態では、蒸留共産物は、表６に記載の脂肪、タンパク質及び脂質含量（例えば、ＤＣＰ１、ＤＣＰ２，又はＤＣＰ３）、又は表６に記載のものと実質的に同様の脂肪及びタンパク質含量を含む。いくつかの実施形態では、蒸留共産物は、表６に記載の脂肪、タンパク質、脂質及びリシン含量（例えば、ＤＣＰ１、ＤＣＰ２，又はＤＣＰ３）、又は表６に記載のものと実質的に同様の脂肪及びタンパク質含量を含む。
いくつかの実施形態では、表６のＤＣＰ１の脂肪及びタンパク質含量、又は表６のＤＣＰ１と実質的に同様の脂肪及びタンパク質含量を含む蒸留共産物は、畜牛飼料、酪農動物飼料（例えば、乳牛飼料）、若しくはブタ飼料、又は畜牛飼料市場、酪農動物飼料市場（例えば、乳牛飼料市場）、若しくはブタ飼料市場用の栄養プロフィールを有する。いくつかの実施形態では、表６のＤＣＰ１の脂肪、タンパク質、及び脂質含量、又は表６のＤＣＰ１と実質的に同様の脂肪、タンパク質、及び脂質含量を含む蒸留共産物は、畜牛飼料、酪農動物飼料（例えば、乳牛飼料）、若しくはブタ飼料、又は畜牛飼料市場、酪農動物飼料市場（例えば、乳牛飼料市場）、若しくはブタ飼料市場用の栄養プロフィールを有する。いくつかの実施形態では、表６のＤＣＰ１の脂肪、タンパク質、脂質、及びリシン含量、又は表６のＤＣＰ１と実質的に同様の脂肪、タンパク質、脂質、及びリシン含量を含む蒸留共産物は、畜牛飼料、酪農動物飼料（例えば、乳牛飼料）、若しくはブタ飼料、又は畜牛飼料市場、酪農動物飼料市場（例えば、乳牛飼料市場）、若しくはブタ飼料市場用の栄養プロフィールを有する。
いくつかの実施形態では、表６のＤＣＰ２の脂肪及びタンパク質含量、又は表６のＤＣＰ２と実質的に同様の脂肪及びタンパク質含量を含む蒸留共産物は、畜牛飼料若しくは酪農動物飼料（例えば、乳牛飼料）、又は畜牛飼料市場若しくは酪農動物飼料市場（例えば、乳牛飼料市場）用の栄養プロフィールを有する。いくつかの実施形態では、表６のＤＣＰ２の脂肪、タンパク質、及び脂質含量、又は表６のＤＣＰ２と実質的に同様の脂肪、タンパク質、及び脂質含量を含む蒸留共産物は、畜牛飼料若しくは酪農動物飼料（例えば、乳牛飼料）、又は畜牛飼料市場若しくは酪農動物飼料市場（例えば、乳牛飼料市場用の栄養プロフィールを有する。いくつかの実施形態では、表６のＤＣＰ２の脂肪、タンパク質、脂質、及びリシン含量、又は表６のＤＣＰ２と実質的に同様の脂肪、タンパク質、脂質、及びリシン含量を含む蒸留共産物は、畜牛飼料若しくは酪農動物飼料（例えば、乳牛飼料）、又は畜牛飼料市場若しくは酪農動物飼料市場（例えば、乳牛飼料市場）用の栄養プロフィールを有する。
いくつかの実施形態では、表６のＤＣＰ３の脂肪及びタンパク質含量、又は表６のＤＣＰ３と実質的に同様の脂肪及びタンパク質含量を含む蒸留共産物は、畜牛飼料、酪農動物飼料（例えば、乳牛飼料）、ブタ飼料、若しくは家禽飼料（例えば、ニワトリ飼料）、又は畜牛飼料市場、酪農動物飼料市場（例えば、乳牛飼料市場）、ブタ飼料市場、若しくは家禽飼料市場（例えば、ニワトリ飼料市場）用の栄養プロフィールを有する。いくつかの実施形態では、表６のＤＣＰ３の脂肪、タンパク質、及び脂質含量、又は表６のＤＣＰ３と実質的に同様の脂肪、タンパク質、及び脂質含量を含む蒸留共産物は、畜牛飼料、酪農動物飼料（例えば、乳牛飼料）、ブタ飼料、若しくは家禽飼料（例えば、ニワトリ飼料）、又は畜牛飼料市場、酪農動物飼料市場（例えば、乳牛飼料市場）、ブタ飼料市場、若しくは家禽飼料市場（例えば、ニワトリ飼料市場）用の栄養プロフィールを有する。いくつかの実施形態では、表６のＤＣＰ３の脂肪、タンパク質、脂質及びリシン含量、又は表６のＤＣＰ３と実質的に同様の脂肪、タンパク質、脂質及びリシン含量を含む蒸留共産物は、畜牛飼料、酪農動物飼料（例えば、乳牛飼料）、ブタ飼料、若しくは家禽飼料（例えば、ニワトリ飼料）、又は畜牛飼料市場、酪農動物飼料市場（例えば、乳牛飼料市場）、ブタ飼料市場、若しくは家禽飼料市場（例えば、ニワトリ飼料市場）用の栄養プロフィールを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、蒸留共産物（例えば、動物飼料用蒸留共産物）に１つまたは複数の追加成分を補充することをさらに含む。いくつかの実施形態では、追加成分は、栄養素、調味料、消化促進剤、又は着色料である。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、さらに、少なくとも１つの供給流をエタノール又はブタノール製造工程に再循環させることを含む。
いくつかの実施形態では、動物飼料用蒸留共産物のタンパク質含量に、酵母細胞集団を補充するが、この酵母細胞集団は、動物飼料用蒸留共産物のタンパク質含量を増加する。いくつかの実施形態では、脂肪酸含量は、動物飼料用蒸留共産物を含む動物飼料組成物のための追加のエネルギー及び栄養素を付与する。いくつかの実施形態では、ブタノール製造工程で製造されるブタノールを、ブタノール製造工程の少なくとも１つの供給流のための溶媒洗浄液として用いる。いくつかの実施形態では、アルコール製造工程で製造されるアルコールを、エタノール製造工程の少なくとも１つの供給流のための溶媒洗浄液として用いる。いくつかの実施形態では、第１供給流を第２供給流と合わせることにより、貯蔵安定性が増大した動物飼料用蒸留共産物を製造する。いくつかの実施形態では、蒸留共産物（例えば、動物飼料用蒸留共産物）は、改善されたカラープロフィールを有する。
本発明のいくつかの実施形態は、少なくとも約２５％の粗タンパク質（組成物の重量パーセンテージ）を含む動物飼料組成物用蒸留共産物に関する。いくつかの実施形態では、動物飼料組成物用蒸留共産物は、約１０％未満の粗脂肪をさらに含む。いくつかの実施形態では、動物飼料組成物用蒸留共産物は、約７％の粗脂肪と少なくとも１３％の粗タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、動物飼料組成物用蒸留共産物は、約１０％未満の脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸イソブチルエステル）を含む。いくつかの実施形態では、動物飼料組成物用蒸留共産物は、約５％未満のリシンを含む。いくつかの実施形態では、このような組成物は、動物飼料又は動物飼料市場用の栄養プロフィールを有する。
いくつかの実施形態では、動物飼料組成物用蒸留共産物は、高レベルの脂肪酸を有し、ブタ若しくは家禽飼料又はブタ若しくは家禽飼料市場用の栄養プロフィールを有する。いくつかの実施形態では、動物飼料組成物用蒸留共産物は、高レベルの脂肪酸及び繊維を有し、また、栄養プロフィールを有する。
いくつかの実施形態では、発酵前のマッシュ（例えば、ウェットケーク）から取り出した固形分のプロセス供給流は、高タンパク質及び低脂肪含量を有する。いくつかの実施形態では、このような供給流を含む動物飼料組成物用蒸留共産物は、酪農動物飼料又は酪農動物飼料市場用の栄養プロフィールを有する。
いくつかの実施形態では、脂質をエバポレータによって生成し、脂肪酸を別の目的で使用し、マッシュからの粗トウモロコシの約５０％（重量パーセンテージ）と、残りの供給流を混合して、処理すると、得られた蒸留共産物は、粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、及び脂肪酸エステルを含みうる。いくつかの実施形態では、蒸留共産物は、少なくとも約２５％〜約３１％の粗タンパク質、少なくとも約６％〜約１０％の粗脂肪、少なくとも約４％〜約８％のトリグリセリド、少なくとも約０％〜約２％の脂肪酸、及び少なくとも約１％〜約３％の脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸イソブチルエステル）を含む。いくつかの実施形態では、蒸留共産物は、約２８％の粗タンパク質、約８％の粗脂肪、約６％のトリグリセリド、約０．７％の脂肪酸、及び約１％の脂肪酸（例えば、）を含む。
いくつかの実施形態では、全蒸留廃液から分離した固形分と、マッシュから抽出したトウモロコシ油の約５０％を混合して、得られた蒸留共産物組成物は、粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、脂肪酸イソブチルエステル、リシン、ＮＤＦ、及びＡＤＦを含有しうる。いくつかの実施形態では、蒸留共産物は、少なくとも約２６％〜約３４％の粗タンパク質、少なくとも約１５％〜約２５％の粗脂肪、少なくとも約１２％〜約２０％のトリグリセリド、少なくとも約１％〜約２％の脂肪酸、及び少なくとも約２％〜約４％の脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸イソブチルエステル）、少なくとも約１％〜約２％のリシン、少なくとも約１１％〜約２３％のＮＤＦ、及び少なくとも約５％〜約１１％のＡＤＦを含む。いくつかの実施形態では、蒸留共産物は、約２９％の粗タンパク質、約２１％の粗脂肪、約１６％のトリグリセリド、少なくとも約１％の脂肪酸、及び約３％の脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸イソブチルエステル）、約１％のリシン、約１７％のＮＤＦ、及び約８％のＡＤＦを含む。高含量の脂肪、トリグリセリド、及びリシンで、しかもより低い繊維含量の上記蒸留共産物が、ブタ及び家禽用の飼料として好ましい。
いくつかの実施形態では、ＤＤＧＳなどの蒸留共産物は、以下のうち１つまたは複数を含有しうる：約２０％〜約３５％の粗タンパク質、約５％〜約１５％の粗脂肪、約５％〜約１０％の粗繊維、約０％〜約１０％の灰分、約０〜２％のアルギニン、約０〜０．５％のトリプトファン、約０〜１％のメチオニン、及び約０〜１％のリン。
いくつかの実施形態では、蒸留共産物は、緻密化又はペレット化によって処理してもよい。例えば、動物飼料用ＤＤＧＳのペレット化は、飼料の摂取を刺激し（すなわち、嗜好性の改善）；栄養及び嵩密度を改善すると共に；供給ビン内での耐久性、取扱い、及び流動性を改善しうる。ペレット化蒸留共産物は、輸送費も削減しうる。ＤＤＧＳの物理的特徴（例えば、粒度、密度、及び栄養特徴（例えば、タンパク質、脂肪、繊維、水分、油含量）並びにペレットミル粉砕操作（例えば、ダイ仕様、ダイ速度、ダイ形状、条件付け時間及び温度）などの複数の要因が、ペレット品質に影響を与えうる。いくつかの実施形態では、蒸留共産物をペレット化する方法は、ダイ仕様、ダイ速度、ダイ形状、条件付け時間、及び条件付け温度を調節して、蒸留共産物の品質を改善することを含む。いくつかの実施形態では、ペレット化した蒸留共産物は、球、円筒、又は立方体の形状をしていてよい。
いくつかの実施形態では、ＤＤＧＳをさらに処理して、繊維を分離することにより、繊維が減少し、しかも脂肪及びタンパク質含量が増加したＤＤＧＳを製造することができる。いくつかの実施形態では、水簸及び／又は篩い分けによって、繊維をＤＤＧＳから除去する（例えば、Ｓｒｉｎｉｖａｓｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ，８３：３２４−３３０，２００６を参照）。ＤＤＧＳから除去した繊維は、反芻動物用の飼料に用いてもよいし、又はファイバーオイル、ファイバーガム、若しくはキシリトールを製造するのに用いてもよい。繊維はまた、エネルギー源として用いてもよい。
いくつかの実施形態では、ＤＤＧＳなどの本発明の共産物は、ヒトの消費用に用いてもよい。例えば、ＤＤＧＳは、例えば、焼いた食べ物での、穀粉補助物質として用いてもよい。またＤＤＧＳは、例えば、肥料などの、土壌の補助物質として、農業に使用してもよい。いくつかの実施形態では、蒸留共産物を用いて、嫌気性消化装置によりバイオガス（例えば、メタン、ＣＯ２）を製造することもでき、バイオガスは、例えば、熱及び電気生成のためのエネルギー源として用いることができる。いくつかの実施形態では、ペレット化した蒸留共産物を燃料として用いてもよい。例えば、ペレット化ＤＤＧＳを石炭と混合して、燃料ブレンドを形成し、これをエネルギー源として用いることができる。
いくつかの実施形態では、発酵性糖を含むマッシュをさらに、高フルクトース糖などの最終生成物に変換することができる。別の実施形態では、発酵性糖を、発酵微生物による発酵に付す。接触ステップと発酵ステップは、同じ反応容器内で同時に実施してもよいし、逐次実施してもよい。一般に、発酵工程は、以下の文献に記載されている：Ｔｈｅ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ３ｒｄ ＥＤ，Ａ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｅｖｅｒａｇｅ，Ｆｕｅｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｅｄｓ Ｊａｃｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＵＫ。
いくつかの実施形態では、本発明に関するブタノール製造工程からのブタノール収率は、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、又は少なくとも約５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、ブタノール収率は、本明細書に記載する値、例えば、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、又は約１ｇ／Ｌ〜約２／Ｌのいずれの範囲であってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明に関するエタノール製造工程からのエタノール収率は、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、又は少なくとも約５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、ブタノール収率は、本明細書に記載する値、例えば、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、又は約１ｇ／Ｌ〜約２／Ｌのいずれの範囲であってもよい。
本発明の他の実施形態は、動物飼料用の蒸留共産物の製造への発酵汚染の影響を軽減する方法に関し、この方法は、発酵前にエタノール又はブタノール製造工程の少なくとも１つの供給流を分離することを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、動物飼料用の蒸留共産物の脂肪含量の変動性を低減する方法に関し、動物飼料製造用の蒸留共産物に寄与する、エタノール又はブタノール製造工程の供給流を分離し、これらの供給流を混合することにより、制御された脂質含量を達成することを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、動物飼料用の蒸留共産物のトリグリセリド含量を増加する方法に関し、この方法は、動物飼料組成物のための特定の蒸留共産物用の低トリグリセリド含有供給流よりも高い割合で、エタノール又はブタノール製造工程の供給流の高トリグリセリド含有供給流を混合することを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、動物飼料用の蒸留共産物におけるマイコトキシン汚染を軽減する方法に関する。アフラトキシン、デオキシニバレノール（ボミトキシン）及びＴ−２トキシンなどのトリコテセン、フモニシン、ゼアラレノンなどのマイコトキシンが、蒸留共産物中に存在しうる。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー、ガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）、又は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、蒸留共産物をマイコトキシンの存在について分析することができる（例えば、Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌａｎｓｉｎｇ，ＭＩを参照）。いくつかの実施形態では、本発明は、動物飼料用の蒸留共産物におけるマイコトキシン汚染を軽減する方法に関し、この方法は、動物飼料製造用の蒸留共産物に寄与する、アルコール製造工程の供給流を分離するステップ、この供給流をマイコトキシンについて試験するステップ、及びマイコトキシン汚染の可能性がある供給流を排除又は精製するステップを含む。いくつかの実施形態では、汚染された供給流を処理することにより、汚染を除去してもよい。例えば、マイコトキシン汚染穀粒をアンモニア処理によって処理してもよい。いくつかの実施形態では、カビ阻害剤を蒸留共産物に添加してもよい。例えば、アンモニア；プロピオン酸、ソルビン酸、安息香酸、及び酢酸のような有機酸、並びにプロピオン酸カルシウム及びソルビン酸カリウムのような有機酸の塩などのカビ阻害剤を蒸留共産物に添加することができる。マイコトキシン汚染を最小限に抑えるために、クレー及び活性炭などの吸着剤を蒸留共産物に添加してもよい。また、マイコトキシン汚染は、アルコールをエステルに変換することによって生成されたエステルの存在によって最小限に抑えることもできる。例えば、本明細書に記載する方法は、アルコールを用いた脂肪酸のエステル化によって、アルコールエステル（例えば、ブチルエステル）を製造する。いくつかの実施形態では、蒸留共産物は、マイコトキシン汚染を最小限にするための手段として、ブチルエステルなどのエステルを含んでもよい。
一般に、発酵ブロスｍｌ当たり１０４〜１０１２生酵母数の量で、酵母細胞が供給される。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、発酵ブロスｍｌ当たり１０７〜１０１０生酵母数の量で供給される。発酵は、発酵微生物（例えば、酵母）栄養素以外にも、任意選択で、酸性及び別の酵素を含んでもよい。いくつかの実施形態では、前述した原料に加えて、発酵媒質は、限定するものではないが、ビタミン（例えば、ビオチン、葉酸、ニコチン酸、リボフラビン）、補因子、並びに主要栄養素及び微量栄養素、並びに塩（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４；Ｋ２ＨＰＯ４；ＮａＣｌ；ＭｇＳＯ４；Ｈ３ＢＯ３；ＺｎＣｌ２；及びＣａＣｌ２）などの補助物質を含んでいてもよい。
特定の理論に拘束されることを意図するわけではないが、本明細書に記載の方法は、いずれのアルコール生成微生物に関しても有用であると考えられる。アルコール生成微生物は当分野では公知である。例えば、メタン資化性細菌（例：メチロサイナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ））によるメタンの発酵酸化によって、メタノールが生成され、メタノール（Ｃ１アルキルアルコール）を、カルボン酸、及びメタノールとカルボン酸をエステル化することができる触媒と接触させると、カルボン酸のメタノールエステルが形成される。酵母株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＣＢＳ ８３４０，ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｏ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｅｃｕｌｔｕｒｅ；ｖａｎ Ｄｉｊｋｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏ．２６：７０６−７１４，２０００）は、エタノールを生成することができ、エタノールを、カルボン酸、及びエタノールとカルボン酸をエステル化することができる触媒と接触させると、エチルエステルが形成される。
アルコールを生成する組換え微生物も当分野では公知である（例えば、Ｏｈｔａ，ｅｔ
ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：８９３−９００、１９９１；Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１−１０８１、２００２；Ｓｈｅｎ及びＬｉａｏ，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．１０：３１２−３２０、２００８；Ｈａｈｎａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３：７８１４−７８１８、２００７；米国特許第５，５１４，５８３号明細書；米国特許第５，７１２，１３３号明細書；ＰＣＴ国際公開第１９９５／０２８４７６号パンフレット；Ｆｅｌｄｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：３５４−３６１、１９９２；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：２４０−２４３，１９９５；米国特許出願公開第２００７／００３１９１８号明細書；米国特許第７，２２３，５７５号明細書；米国特許第７，７４１，１１９号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２０３０９９号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２４６８４６号明細書；及びＰＣＴ国際公開第２０１０／０７５２４１号パンフレット；これらの文献は参照として本明細書に組み込む）。
前述したように、微生物の代謝経路は、アルコール（例えば、ブタノール）を生成するように、遺伝子的に改変してもよい。例えば、ブタノール生合成経路、又は１−ブタノール、２−ブタノール、若しくはイソブタノールなどのブタノール異性体の生合成経路を含有するように、微生物を改変してもよい。
いくつかの実施形態では、生合成経路は、各基質の生合成経路の産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、基質の生合成経路の産物への変換は、異種ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒される。これらの生合成経路も、不要な代謝物を低減又は排除することによって、アルコールの収率を改善するように、改変してもよい。
微生物によるブタノールの生成については、例えば、以下：米国特許出願公開第２００７／００９２５７号明細書；第２００７／０２５９４１０号明細書；第２００７／０２９２９２７号明細書；第２００８／０１８２３０８号明細書；第２００８／０２７４５２５号；第２００９／０３０５３６３号；及び第２００９／０３０５３７０号明細書に開示されており、これらの各々の全内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。
ブタノールを生成することができる好適な組換え微生物は当分野では公知であり、ブタノールを生成することができるいくつかの好適な微生物を本明細書に記載する。生合成経路を介してブタノールを生成する組換え微生物として、以下：クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｂｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノミセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、又はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の属のメンバーを挙げることができる。いくつかの実施形態では、以下：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチルス・リケニフォンニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｎｎｎｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｌｉｓ）、シュードモナス・ｐｕｔｉｄａ（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナリウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、カンジダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、カンジダ・メタノソルボサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、デバリオミセス・ハンセニ（Ｄｅｂｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から組換え微生物を選択することができる。いくつかの実施形態では、組換え微生物は、酵母である。いくつかの実施形態では、組換え微生物は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デッケラ（Ｄｅｋｋｅｒａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ブレタノミセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）のいくつかの種から選択されるクラブトリー（ｃｒａｂｔｒｅｅ）陽性酵母である。クラブトリー（ｃｒａｂｔｒｅｅ）陽性酵母の種としては、限定するものではないが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・ミキタエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｉｋｉｔａｅ）、サッカロミセス・パラドキサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロミセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、サッカロミセス・カステリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ジゴサッカロミセス・ロキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）、ジゴサッカロミセス・バイリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｌｉ）、及びカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）が挙げられる。好適な株としては、本明細書で引用し、参照として本明細書に組み込まれる特定の出願、並びに２０１０年９月７日に提出された米国特許出願公開第６１／３８０，５６３号明細書及びＰＣＴ国際公開第２０１２／０３３８３２号パンフレットに記載されているものがある。また、好適な株及び方法には、２０１０年９月２９日に提出された米国特許出願公開第６１／２４６，７０９号明細書（参照として本明細書に組み込まれる）に記載のものも含まれる。
エタノールを生成する生物、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアルコールピルビン酸デヒドロゲナーゼを発現し、ザイモモナス・モブリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｌｉｓ）から得ることができるエタノール生成菌などの他の発酵生物のいくつかの例（例えば、米国特許第５，０００，０００号明細書；米国特許第５，０２８，５３９号明細書；米国特許第５，４２４，２０２号明細書；米国特許第５，５１４，５８３号明細書；及び米国特許第５，５５４，５２０号明細書を参照）をブタノール生成のために改変することができる。別の実施形態では、イソブタノロゲンは、キシロースをキシルロースに変換するのに用いられる酵素である、キシロースレダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼを発現する。いくつかの実施形態では、キシロースイソメラーゼを用いて、キシロースをキシルロースに変換する。いくつかの実施形態では、ペントース及びヘキソースの両方をブタノールに発酵することができる微生物を用いる。
いくつかの実施形態では、微生物は、ブタノール生合成経路を含む。いくつかの実施形態では、基質の経路の産物への変換を触媒する少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つのポリペプチドが、微生物の異種ポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、基質の経路の産物への変換を触媒するポリヌクレオチドはすべて、微生物の異種ポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、微生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の低減又は排除を含む。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を実質的に含まない微生物は、米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書（本明細書に参照として組み込む）に記載されている。ＧＰＤ２などのＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を実質的に含まない微生物も上記の文献に記載されている。
ブタノール生成のための好適な生合成経路は、当分野では公知であり、いくつかの好適な経路が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ブタノール生合成経路は、宿主細胞に対し異種である少なくとも１つの遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ブタノール生合成経路は、宿主細胞に対し異種である２つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ブタノール生合成経路は、生合成経路のすべてのステップに対応するポリペプチドをコードする異種遺伝子を含む。
用いることができるイソブタノール生成のための生合成経路は、米国特許第７，８５１，１８８号明細書（本明細書に参照として組み込む）に記載されているものがある。一実施形態では、イソブタノール生合成経路は、以下：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒されうる、ピルビン酸からアセト乳酸へ；
ｂ）例えば、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによって触媒されうる、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ；
ｃ）例えば、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されうる、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ；
ｄ）例えば、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒されうる、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへ；及び
ｅ）例えば、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへ
の基質の産物変換を含む。
別の実施形態では、イソブタノール生合成経路は、以下：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒されうる、ピルビン酸からアセト乳酸へ；
ｂ）例えば、ケトール酸レダクトイソメラーゼによって触媒されうる、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ；
ｃ）例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されうる、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ；
ｄ）例えば、トランスアミナーゼ又はバリンデヒドロゲナーゼによって触媒されうる、α−ケトイソ吉草酸からバリンへ；
ｅ）例えば、バリンカルボキシラーゼによって触媒されうる、バリンからイソブチルアミンへ；
ｆ）例えば、オメガトランスアミナーゼによって触媒されうる、イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへ；及び
ｇ）例えば、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへ
の基質の産物変換を含む。
別の実施形態では、イソブタノール生合成経路は、以下：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒されうる、ピルビン酸からアセト乳酸へ；
ｂ）例えば、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによって触媒されうる、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へ；
ｃ）例えば、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されうる、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ；
ｄ）例えば、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼによって触媒されうる、α−ケトイソ吉草酸からイソブチル−ＣｏＡへ；
ｅ）例えば、アセチル化アルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されうる、イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへ；及び
ｆ）例えば、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへ
の基質の産物変換を含む。
用いることができる１−ブタノール生成のための生合成経路としては、米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書（本明細書に参照として組み込む）に記載されているものがある。一実施形態では、１−ブタノール生合成経路は、以下：
ａ）例えば、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒されうる、アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへ；
ｂ）例えば、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されうる、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへ；
ｃ）例えば、クロトナーゼによって触媒されうる、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへ；
ｄ）例えば、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されうる、クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへ；
ｅ）例えば、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されうる、ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへ；及び
ｆ）例えば、ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる、ブチルアルデヒドから１−ブタノールへ
の基質の産物変換を含む。
用いることができる２−ブタノール生成のための生合成経路としては、米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書及び米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書（本明細書に参照として組み込む）に記載されているものがある。一実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、以下：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒されうる、ピルビン酸からα−アセト乳酸へ；
ｂ）例えば、アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されうる、α−アセト乳酸からアセトインへ；
ｃ）例えば、アセトニンアミナーゼによって触媒されうる、アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ；
ｄ）例えば、アミノブタノールキナーゼによって触媒されうる、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸へ；
ｅ）例えば、アミノブタノールリン酸ホスホリラーゼによって触媒されうる、３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへ；及び
ｆ）例えば、ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる、２−ブタノンから２−ブタノールへ
の基質の産物変換を含む。
別の実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、以下：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒されうる、ピルビン酸からα−アセト乳酸へ；
ｂ）例えば、アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されうる、α−アセト乳酸からアセトインへ；
ｃ）例えば、ブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる、アセトインから２，３−ブタンジオールへ；
ｄ）例えば、ジアールデヒドラターゼによって触媒されうる、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへ；及び
ｅ）例えば、ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる、２−ブタノンから２−ブタノールへ
の基質の産物変換を含む。
用いることができる２−ブタノン生成のための生合成経路としては、米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書及び米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書（本明細書に参照として組み込む）に記載されているものがある。一実施形態では、２−ブタノン生合成経路は、以下：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒されうる、ピルビン酸からα−アセト乳酸へ；
ｂ）例えば、アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されうる、α−アセト乳酸からアセトインへ；
ｃ）例えば、アセトニンアミナーゼによって触媒されうる、アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ；
ｄ）例えば、アミノブタノールキナーゼによって触媒されうる、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸へ；及び
ｅ）例えば、アミノブタノールリン酸ホスホリラーゼによって触媒されうる、３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへ
の基質の産物変換を含む。
別の実施形態では、２−ブタノン生合成経路は、以下：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒されうる、ピルビン酸からα−アセト乳酸へ；
ｂ）例えば、アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されうる、α−アセト乳酸からアセトインへ；
ｃ）例えば、ブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる、アセトインから２，３−ブタンジオールへ；
ｄ）例えば、ジオールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへ
の基質の産物変換を含む。
一実施形態では、本発明は、植物由来の炭素源からブタノールを生成し、ブタノール製造のための標準的石油化学方法に関連するマイナスの環境への影響を回避する。一実施形態では、本発明は、ブタノール経路を含む組換え工業宿主細胞を用いたブタノールの製造方法を提供する。
いくつかの実施形態では、イソブタノールの生合成経路は、宿主細胞には異種である少なくとも１つのポリヌクレオチド、少なくとも２つのポリヌクレオチド、少なくとも３つのポリヌクレオチド、又は少なくとも４つのポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え宿主における各基質のイソブタノール生合成経路の産物への変換は、異種ポリペプチドによって触媒される。いくつかの実施形態では、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシ吉草酸への基質の産物変換を触媒するポリペプチド及び／又はイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質の産物変換を触媒するポリペプチドは、ＮＡＤＨを補因子として用いることができる。
「アセトヒドロキシ酸シンターゼ」、「アセト乳酸シンターゼ」、及び「アセト乳酸シンセターゼ」（「ＡＬＳ」と略称する）は、本明細書において置換え可能に用いられ、ピルビン酸からアセト乳酸及びＣＯ２への変換を触媒する酵素を指す。アセト乳酸シンターゼの例は、ＥＣ番号２．２．１．６（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃａｔｕｒｅ １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）により公知である。これらの非改変酵素は、多数の供給源から入手可能であり、このようなものとして、限定するものではないが、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１５６１８、Ｚ９９１２２）、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）各々のアミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５０７９）、Ｍ７８４２）、及び乳酸レンサ球菌（Ｌａｃｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５１６１、Ｌ１６９７５）が挙げられる。
「ケトール酸レダクトイソメラーゼ」（「ＫＡＲＩ」）、「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ」、及び「アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ」という用語は、置換え可能に用いられ、（Ｓ）−アセト乳酸の２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への反応を触媒することができる酵素を指す。ＫＡＲＩ酵素の例は、ＥＣ番号：ＥＣ１．１．１．８６（Ｅｎｙｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）として分類することができ、限定するものではないが、以下に挙げるものを含む、膨大な数の微生物から入手可能である：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１８２２２、ＮＣ＿０００９１３）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１３４５９、ＮＣ＿００１１４４）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＦ３０２１０、ＢＸ９５７２２０）、及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４７８９、Ｚ９９１１８）。ＫＡＲＩには、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｃａｃａｅ）ＫＡＲＩ変異体「Ｋ９Ｇ９」及び「Ｋ９Ｄ３」が含まれる。ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素は、米国特許出願公開第２００８／０２６１２３０号明細書、第２００９／０１６３３７６号明細書、及び第２０１０／０１９７５１９号明細書、並びにＰＣＴ国際公開第２０１１／０４１４１５号パンフレット（これらは、本明細書に参照として組み込む）に記載されている。上記の文献に開示されているＫＡＲＩの例は、乳酸レンサ球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡ０１、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５突然変異体である。いくつかの実施形態では、ＫＡＲＩは、ＮＡＤＨを用いる。いくつかの実施形態では、ＫＡＲＩは、ＮＡＤＰＨを用いる。
「アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ」及び「ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ」（「ＤＨＡＤ」）という用語は、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への変換を触媒する酵素を指す。アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼの例は、ＥＣ番号４．２．１．９によって知られる。このような酵素は、限定するものではないが、以下に挙げるものを含む、膨大な数の微生物から入手可能である：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０２６２４８、ＮＣ０００９１３）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１２５５０、ＮＣ００１１４２）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＦ２９８７４、ＢＸ９５７２１９）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４１０５、Ｚ９９１１５）、乳酸レンサ球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、及びアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）。米国特許出願公開第２０１０／００８１１５４号明細書及び米国特許第７，８５１，１８８号明細書には、ミュータンスレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）由来のＤＨＡＤなどのジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）が記載されている。
「分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ」、「α−ケト酸デカルボキシラーゼ」、「α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ」、又は「２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ」（「ＫＩＶＤ」）という用語は、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド及びＣＯ２への変換を触媒する酵素を指す。分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼの例は、ＥＣ番号４．１．１．７２によって知られ、限定するものではないが、以下に挙げるものを含む、多数の供給源から入手可能である：乳酸レンサ球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＳ４９１６６、ＡＹ５４８７６０；ＣＡＧ３４２２６、ＡＪ７４６３６４、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４６１３４６、ＮＣ＿００３１９７）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９１８９、ＮＣ＿００１９８８）、ミクロコッカス・カゾリティカス（Ｍ．ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、及びリステリア・グレイ（Ｌ．ｇｒａｙｉ）。
「分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」（「ＡＤＨ」）という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する酵素を指す。分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼの例は、ＥＣ番号１．１．１．２６５によって知られるが、他のアルコールデヒドロゲナーゼ（特に、ＥＣ１．１．１．１又はＥＣ１．１．１．２）に分類することもできる。アルコールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＰＨ依存性又はＮＡＤＨ依存性のいずれであってもよい。このような酵素は、限定するものではないが、以下に挙げるものを含む、多数の供給源から入手可能である：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１０６５６、ＮＣ＿０１１３６、ＮＰ＿０１４０５１、ＮＣ＿００１１４５）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１７４８４、ＮＣ＿０００９１３）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９８９２、ＮＣ＿００３０３０、ＮＣ＿３４９８９１、ＮＣ＿００３０３０）。米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書には、アクロモバクター・シキロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）である、ＳａｄＢが記載されている。また、アルコールデヒドロゲナーゼには、ウマ肝臓ＡＤＨ及びベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉａ ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨも含まれる（本明細書に参照として組み込む米国特許出願公開第２０１１／０２６９１９９号明細書に記載の通り）。
「ブタノールデヒドロゲナーゼ」という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換、又は２−ブタノン及び２−ブタノールの変換を触媒する酵素活性を有する１つまたは複数のポリペプチドを指す。ブタノールデヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼの大きなファミリーのサブセットである。ブタノールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ−又はＮＡＤＰ依存性のいずれであってもよい。ＮＡＤ依存性酵素は、ＥＣ１．１．１．１として知られており、例えば、ロドコッカス・ルーバ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＤ３６４７５、ＡＪ４９１３０７）から入手可能である。ＮＡＤＰ依存性酵素は、ＥＣ１．１．１．２として知られており、例えば、ピロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ２５５５６、ＡＦ０１３１６９）から入手可能である。さらに、ブタノールデヒドロゲナーゼは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ４１７４８４、ＮＣ＿０００９１３）からも入手可能であり、シクロヘキサノールデヒドロゲナーゼは、アシネトバクター種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＧ１００２６、ＡＦ２８２２４０）から入手可能である。用語「ブタノールデヒドロゲナーゼ」はまた、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨのいずれかを補因子として用いて、ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの変換を触媒する酵素も指す。ブタノールデヒドロゲナーゼは、例えば、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９３２５、ＮＣ＿００１９８８；注：この酵素は、アルデヒド及びアルコールデヒドロゲナーゼ活性の両方を有する）；ＮＣ＿３４９８９１、ＮＣ＿００３０３０、ＮＰ＿３４９８９２、ＮＣ＿００３０３０）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１７−４８４、ＮＣ＿０００９１３）から入手可能である。
「分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ」という用語は、典型的に、電子受容体としてＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を用いて、α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡ（イソブチリル−補酵素Ａ）への変換を触媒する酵素を指す。分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼの例は、ＥＣ番号１．２．４．４によって知られる。このような分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは、４つのサブユニットから成り、全サブユニットからの配列は、限定するものではないが、以下に挙げるものを含む、膨大な数の微生物から入手可能である：枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４３３６、Ｚ９９１１６、ＣＡＢ１４３３５、Ｚ９９１１６、ＣＡＢ１４３３４、Ｚ９９１１６、ＣＡＢ１４３３７、Ｚ９９１１６）及びシュードモナス・プチダ（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ６５６１４、Ｍ５７６１３、ＡＡＡ６５６１５、Ｍ５７６１３、ＡＡＡ６５６１７、Ｍ５７６１３、ＡＡＡ６５６１８、Ｍ５７６１３）。
「アシル化アルコールデヒドロゲナーゼ」という用語は、典型的に、電子供与体としてＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨのいずれかを用いて、イソブチリル−ＣｏＡからイソブチリルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を指す。アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼの例は、ＥＣ番号１．２．１．１０及び１．２．１．５７によって知られる。このような酵素は、限定するものではないが、以下に挙げるものを含む、多数の供給源から入手可能である：クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＤ３１８４１、ＡＦ１５７３０６）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９３２５、ＮＣ＿００１９８８、ＮＰ＿１４９１９９、ＮＣ＿００１９８８）、シュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ８９１０５、Ｕ１３２３２）、及びサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿１４５４８６、ＮＣ＿００６４６１）。
「トランスアミナーゼ」という用語は、アミン供与体としてアラニン又はグルタミン酸のいずれかを用いて、α−ケトイソ吉草酸からＬ−バリンへの変換を触媒する酵素を指す。トランスアミナーゼの例は、ＥＣ番号２．６．１．４２及び２．６．１．６６によって知られる。このような酵素は、多数の供給源から入手可能である。アラニン依存性酵素の供給源の例として、限定するものではないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０２６２３１、ＮＣ＿０００９１３）及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０９３７４３、ＮＣ＿００６３２２）がある。グルタミン酸依存性酵素の供給源の例としては、限定するものではないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０２６２４７、ＮＣ＿０００９１３）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１２６８２、ＮＣ＿０１１４２）及びメタン生成菌（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿２７６５４６、ＮＣ＿０００９１６）が挙げられる。
「バリンデヒドロゲナーゼ」という用語は、典型的に、電子供与体としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用い、またアミン供与体としてアンモニアを用いて、α−ケトイソ吉草酸からＬ−バリンへの変換を触媒する酵素を指す。バリンデヒドロゲナーゼの例は、ＥＣ番号１．４．１．８及び１．４．１．９によって知られ、このような酵素は、限定するものではないが、以下を含む多数の供給源から入手可能である：ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿６３８２７０、ＮＣ＿００３８８８）及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４３３６、Ｚ９９１１６）。
「バリンデカルボキシラーゼ」という用語は、Ｌ−バリンからイソブチルアミン及びＣＯ２への変換を触媒する酵素を指す。バリンデカルボキシラーゼの例は、ＥＣ番号４．１．１．１４によって知られる。このような酵素は、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、例えば、ストレプトミセス・ビリディファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＮ１０２４２、ＡＹ１１６６４４）にみいだされる。
「オメガトランスアミナーゼ」という用語は、アミン供与対として好適なアミノ酸を用いて、イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を指す。オメガトランスアミナーゼの例は、ＥＣ番号２．６．１．１８によって知られ、限定するものではないが、以下を含む多数の供給源から入手可能である：アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＰ９２６７２、ＡＹ３２０２２０）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿２９４４７４、ＮＣ＿００７３４７）、シェラネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿７１９０４６、ＮＣ＿００４３４７）、及びシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＮ６６２２３、ＡＥ０１６７７６）。
「アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ」という用語は、アセチル−ＣｏＡの２つの分子からアセトアセチル−ＣｏＡ及び補因子Ａ（ＣｏＡ）への変換を触媒する酵素を指す。アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの例は、短鎖アシル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡに対する基質選択性（順方向の反応）を有するアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼであり、Ｅ．Ｃ．２．３．１．９に分類される［Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｃｌａｔｕｒｅ １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ］；しかし、さらに広範な基質を有する酵素（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１６）も同様に機能しうる。アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、多数の供給源から入手可能であり、例えば、以下のものがある：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１６７２８、ＮＣ＿０００９１３；ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）アミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９４７６．１、ＮＣ＿００３０３０；ＮＰ＿１４９２４２、ＮＣ＿００１９８８、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３９０２９７、ＮＣ＿０００９６４）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１５２９７、ＮＣ＿００１１４８）。
「３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素を指す。３−例ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ又は（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選択性を有する、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）依存性のものであってよい。これらの例は、それぞれ、Ｅ．Ｃ．１．１．１．３５及びＥ．Ｃ．１．１．１．３０として分類することができる。さらに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ又は（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選択性を有する、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）依存性のものであってもよく、それぞれ、Ｅ．Ｃ．１．１．１．１５７及びＥ．Ｃ．１．１．１．３６として分類される。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、多数の供給源から入手可能であり、例えば、以下のものがある：クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９３１４、ＮＣ＿００３０３０）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＢ０９６１４、Ｕ２９０８４）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿２９４４８１、ＮＣ＿００７３４７）、アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２１９７３、Ｊ０４９８７）。
「クロトナーゼ」という用語は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ及びＨ２Ｏへの変換を触媒する酵素を指す。クロトナーゼは、例えば、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ又は（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選択性を有するものでよく、それぞれ、Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７及びＥ．Ｃ．４．２．１．５５として分類することができる。クロトナーゼは、多数の供給源から入手可能であり、例えば、以下のものがある：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１５９１１、ＮＣ＿０００９１３）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９３１８、ＮＣ＿００３０３０）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１３７０５、Ｚ９９１１３）、及びエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＢＡＡ２１８１６、Ｄ８８８２５）。
「ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素を指す。ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの例は、ＮＡＤＨ−依存性、ＮＡＤＰＨ−依存性、又はフラビン依存性であってよく、それぞれ、Ｅ．Ｃ．１．３．１．４４、Ｅ．Ｃ．１．３．１．３８、及びＥ．Ｃ．１．３．９９．２として分類することができる。ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、多数の供給源から入手可能であり、例えば、以下のものがある：クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４７１０２、ＮＣ＿００３０３０）、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：Ｑ５ＥＵ９０）、ＡＹ７４１５８２）、ストレプトミセス・コリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｌｌｉｎｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ９２８９０、Ｕ３７１３５）、及びストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＡ２２７２１、ＡＬ９３９１２７）。
「ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ」という用語は、補因子としてＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを用いて、ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を指す。ＮＡＤＨへの選択性を有するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、Ｅ．Ｃ．１．２．１．５７として知られ、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＤ３１８４１、ＡＦ１５７３０６）及びクロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃ
ｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ．ｓｕｂ．−１４９３２５、ＮＣ．ｓｕｂ．−００１９８８）から入手可能である。
「イソブチリル−ＣｏＡムターゼ」という用語は、ブチリル−ＣｏＡからイソブチル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素を指す。この酵素は、補因子として補酵素Ｂ１２を用いる。イソブチリル−ＣｏＡムターゼの例は、ＥＣ番号５．４．９９．１３として知られる、これらの酵素は、多数のストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、限定するものではないが、以下のものがある：ストレプトミセス・シンナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ０８７１３、Ｕ６７６１２，ＣＡＢ５９６３３、ＡＪ２４６００５）、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ７０６４５、ＡＬ９３９１２３、ＣＡＢ９２６６３、ＡＬ９３９１２１）、及びストレプトミセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿８２４００８、ＮＣ＿００３１５５、ＮＰ＿８２４６３７、ＮＣ＿００３１５５）。
「アセト乳酸デカルボキシラーゼ」という用語は、α−アセト乳酸からアセトインへの変換を触媒する酵素活性を有する１つまたは複数のポリペプチドを指す。アセト乳酸デカルボキシラーゼの例は、ＥＣ．４．１．１．５として知られ、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２２２２３、Ｌ０４４７０）、クレブシエラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５０５４、Ｌ０４５０７）及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｒｕｍｏｎｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＵ４３７７４、ＡＹ７２２０５６）から入手可能である。
「アセトインアミナーゼ」又は「アセトイントランスアミナーゼ」という用語は、アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの変換を触媒する酵素活性を有する１つまたは複数のポリペプチドを指す。アセトインアミナーゼは、補因子ピリドキサル５’−リン酸又はＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）若しくはＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を用いるものでよい。得られる生成物は、３位に（Ｒ）又は（Ｓ）立体化学を有しうる。ピリドキサルリン酸依存性酵素は、アミノ供与体として、アラニン若しくはグルタミン酸などのアミノ酸を用いるものでよい。ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ依存性酵素は、第２基質としてアンモニアを用いるものでよい。ＮＡＤＨ依存性アセトインアミラーゼ（アミノアルコールデヒドロゲナーゼとしても知られる）の好適な例は、Ｉｔｏら（米国特許第６，４３２，６８８号明細書）に記載されている。ピリドキサル依存性アセトインアミラーゼの例は、アミン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（アミン：ピルビン酸トランスアミナーゼとしても知られる）であり、Ｓｈｉｎ及びＫｉｍ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：２８４８−２８５３，２００２）に記載されている。
「アセトインキナーゼ」という用語は、アセトインからホスホアセトインへの変換を触媒する酵素活性を有する１つまたは複数のポリペプチドを指す。アセトインキナーゼは、反応におけるリン酸供与体としてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）又はホスホエノールピルビン酸を用いうる。同様の基質ジヒドロキシアセトンに対する類似の反応を触媒する酵素として、ＥＣ．２．７．１．２９として知られる酵素がある（Ｇａｒｃｉａ−Ａｌｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：１３０３７−１３０４６，２００４）。
「アセトインリン酸アミラーゼ」という用語は、ホスホアセトインから３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸への変換を触媒する酵素活性を有する１つまたは複数のポリペプチドを指す。アセトインリン酸アミラーゼは、補因子ピリドキサル５’−リン酸、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを用いうる。得られる生成物は、３位に（Ｒ）又は（Ｓ）立体化学を有しうる。ピリドキサルリン酸依存性酵素は、アラニン若しくはグルタミン酸などのアミノ酸を用いうる。ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ依存性酵素は、第２基質としてアンモニアを用いうる。ホスホアセトインに対するこの反応を触媒する酵素の報告はないが、同様の基質セリノールリン酸に対する類似の反応を実施すると主張されているピリドキサルリン酸依存性酵素がある（Ｙａｓｕｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．６７：４９９９−５００９，２００１）。
「アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼ」、また「アミノアルコールＯ−リン酸リアーゼ」ともよばれる用語は、３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸から２−ブタノンへの変換を触媒する酵素活性を有する１つまたは複数のポリペプチドを指す。アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼは、補因子ピリドキサル５’−リン酸を用いうる。同様の基質１−アミノ−２−プロパノール−リン酸に対する類似の反応を触媒する酵素の報告がある（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．１３４：１６７−１８２，１９７３）。米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書には、生物エルウィニア・カルトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）由来のアミノブタノールリン酸ホスホ−リアーゼが記載されている。
「アミノブタノールキナーゼ」という用語は、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２ブタノールＯ−リン酸への変換を触媒する酵素活性を有する１つまたは複数のポリペプチドを指す。アミノブタノールキナーゼは、リン酸供与体として、ＡＴＰを用いうる。３−アミノ−２−ブタノールに対するこの反応を触媒する酵素の報告はないが、同様の基質エタノールアミン及び１−アミノ−２−プロパノールに対する類似の反応を触媒する酵素の報告がある（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，前掲）。米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書には、実施例１４に、エルウィニア・カルトボーラ亜種アストロセプチカ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ．Ａｓｔｒｏｓｐｅｔｉｃａ）のアミノアルコールキナーゼが記載されている。
「ブタンジオールデヒドロゲナーゼ」という用語は、アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素活性を有する１つまたは複数のポリペプチドを指す。ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼの広範なファミリーのサブセットである。ブタンジオールデヒドロゲナーゼ酵素は、アルコール生成物における（Ｒ）又は（Ｓ）立体化学の生成に特異性を有しうる。（Ｓ）特異的ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、ＥＣ．１．１．１．７６として知られ、例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＢＢＡ１３０８５、Ｄ８６４１２）から入手可能である。（Ｒ）特異的ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、ＥＣ．１．１．１．４として知られ、例えば、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ ８３０４８１、ＮＣ＿００４７２２；ＡＡＰ０７６８２、ＡＥ０１７０００）、及び乳酸レンサ球菌（Ｌａｃｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＫ０４９９５、ＡＥ００６３２３）から入手可能である。
「ブタンジオールデヒドラターゼ」、また「ジアールデヒドラターゼ」又は「プロパンジオールデヒドラターゼ」としても知られる用語は、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換を触媒する酵素活性を有する１つまたは複数のポリペプチドを指す。ブタンジオールデヒドラターゼは、補因子アデノシルコバラミン（補因子Ｂｗ又はビタミンＢ１２としても知られるが；ビタミンＢ１２は、補酵素Ｂ１２ではない他の形態のコバラミンを指す場合もある）を用いうる。アデノシルコバラミン依存性酵素は、ＥＣ４．２．１．２８として知られ、例えば、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡ０８０９９（αサブユニット）、Ｄ４５０７１；ＢＡＡ０８１００（βサブユニット）、Ｄ４５０７１；及びＢＢＡ０８１０１（γサブユニット）、Ｄ４５０７１（活性のために３つのサブユニットすべてが必要であることに注意）］、並びにクレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ９８３８４（αサブユニット）、ＡＦ１０２０６４；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ９８３８５（βサブユニット）、ＡＦ１０２０６４、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ９８３８６（γサブユニット）、ＡＦ１０２０６４）から入手可能である。他の好適なジアールデヒドラターゼとして、限定するものではないが、以下から入手可能なＢ１２依存性ジアールデヒドラターゼ：例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＢ８４１０２（大サブユニット）、ＡＦ０２６２７０；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＢ８４１０３（中間サブユニット）、ＡＦ０２６２７０；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＢ８４１０４（小サブユニット）、ＡＦ０２６２７０）；及びラクトバチルス・コリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＣ８２５４１（大サブユニット）、ＡＪ２９７７２３；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＣ８２５４２（中サブユニット）、ＡＪ２９７７２３；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＤ０１０９１（小サブユニット）、ＡＪ２９７７２３）；並びにラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（特に、株ＣＮＲＺ７３４及びＣＮＲＺ７３５、Ｓｐｅｒａｎｚａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．４５：３４７６−３４８０，１９９７）由来の酵素、及びこれらの対応する酵素をコードするヌクレオチド配列（例えば、米国特許第５，６８６，２７６号明細書）が挙げられる。
「ピルビン酸デカルボキシラーゼ」という用語は、ピルビン酸からアセトアルデヒド及び二酸化炭素への変換を触媒する酵素を指す。ピルビン酸デカルボキシラーゼは、ＥＣ番号４．１．１．１として知られる。これらの酵素は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＡ９７５７５、ＣＡＡ９７７０５、ＣＡＡ９７０９１）など、多数の酵素にみいだされる。
本明細書に記載するイソブタノール生合成経路を含む宿主細胞が、１種または複数種の別の改変をさらに含んでもよいことは理解されよう。米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書（参照として本明細書に組み込む）には、サイトゾル局在化アセト乳酸シンターゼの発現と、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の実質的排除のために酵母を操作することによる、ピルビン酸からアセト乳酸への変換の増大が開示されている。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、以下を含む：米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書（参照として本明細書に組み込む）に記載のようなグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減するための改変及び／若しくはピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の破壊又はピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を制御する調節エレメントをコードする少なくとも１つの遺伝子の破壊；米国特許出願公開第２０１０／０１２０１０５号明細書（参照として本明細書に組み込む）に記載のようなエントナー・ドドゥロフの経路（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ Ｐａｔｈｗａｙ）又は等価物均衡（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ ｂａｌａｎｃｅ）低下による炭素フラックスの増加をもたらす宿主細胞への改変を含む。他の改変として、ピルビン酸利用生合成経路における１ステップを触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの組込みがある。その他の改変として、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内生ポリヌクレオチドの少なくとも１つの欠失、突然変異、及び／又は置換がある。さらに別の改変としては、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及び／又はアルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内生ポリヌクレオチドの欠失、突然変異、及び／又は置換がある。いくつかの実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＡＬＤ６又はその相同体である。酵素生産宿主細胞がｐｄｃ−である、グルコース抑制の低減作用を有する遺伝子改変が、米国特許出願公開第２０１１／０１２４０６０号明細書（参照として本明細書に組み込む）に記載されている。いくつかの実施形態では、ピルビン酸デカルボキシラーゼの欠失又は下方制御は、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、及びこれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、グリセルアルデヒド−３−リン酸からグリセリン酸１，３二リン酸への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの欠失又は下方制御を含む。いくつかの実施形態では、この反応を触媒する酵素は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼである。
表示した基質の生成物変換を触媒する能力を有するいくつかの好適なタンパク質を本明細書に記載するが、他の好適なタンパク質は、当分野において記載されている。例えば、米国特許出願公開第２００８／０２６１２３０号明細書、米国特許出願公開第２００９／０１６３３７６号明細書、及び米国特許出願公開第２０１０／０１９７５１９号明細書（参照として本明細書に組み込む）には、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼが記載され；米国特許出願公開第２０１０／００８１１５４号明細書（参照として本明細書に組み込む）には、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼが記載され；米国特許出願公開第２００９／０２６８８２３号明細書（参照として本明細書に組み込む）には、アルコールデヒドロゲナーゼが記載されている。
当業者であれば、他の種からのポリペプチドを同定する上で、様々なレベルの配列同一性が有用であることは、十分に理解され、このようなポリペプチドは、同じ若しくは類似の機能又は活性を有し、本明細書に記載の組換え微生物での使用に好適である。有用な同一性（％）の例として、限定するものではないが、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％が挙げられ、あるいは、７５％〜１００％のいずれかの整数パーセンテージ、例えば、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が、本発明を説明する上で有用となりうる。
本発明で用いる標準的組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当分野では公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，により、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；並びにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．及びＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．により、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；並びにＡｕｓｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．らにより、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｃｏｔｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）により刊行）に記載されている。本発明で用いる別の方法は、以下に記載されている：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｇｕｒｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｇｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。
前述した標的遺伝子の遺伝子発現を増大又は低減するための方法は、当業者には公知である。酵母における遺伝子発現の方法は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｇｕｒｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｇｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）に記載されているように、当分野では公知である。例えば、発現を増大する方法は、標的タンパク質を発現するゲノム内又はプラスミド上に組み込む遺伝子の数の増加、並びに天然プロモーターより高レベルで発現されるプロモーターの使用などがある。発現用の構築キメラ遺伝子に機能的に連結することができるプロモーターとして、例えば、構成性プロモーターＦＢＡ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨ１、及びＧＰＭ１、並びに誘導性プロモーターＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、及びＧＰＭ１がある。発現用のキメラ遺伝子構築物に用いることができる好適な転写終結因子としては、限定するものではないが、ＦＡＢ１ｔ、ＴＤＨ３ｔ、ＧＰＭ１ｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１ｔ、及びＡＤＨ１ｔが挙げられる。
好適なプロモーター、転写終結因子、及びコード領域を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクターにクローニングした後、酵母細胞に形質転換してもよい。これらのベクターによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び酵母株両方における増殖が可能になる。典型的に、ベクターは、所望の宿主における自律複製又は染色体組込みを可能にする選択マーカ及び配列を含有する。酵母に用いられるプラスミドは、例えば、シャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、及びｐＲＳ４２６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）であり、これらは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点（例えば、ｐＭＢ１）、酵母２μ複製起点、及び栄養選択用マーカを含む。これら４つのベクターの選択マーカは、ＨＩＳ３（ベクターｐＲＳ４２３）、ＴＲＰ１（ベクターｐＲＳ４２４）、ＬＥＵ（ベクターｐＲＳ４２５）及びＵＲＡ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。発現ベクターの構築は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での標準的分子クローニング技術又は酵母におけるギャップ修復組換え方法のいずれによって実施してもよい。
以上、本発明の様々な実施形態を記載してきたが、これらが、例として提示されるにすぎず、限定ではないことは理解すべきである。本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、形状及び詳細の様々な変更を実施できることは、当業者には明らかであろう。従って、本発明の広さ及び範囲は、前述した実施形態例のいずれによっても限定されるべきではなく、特許請求の範囲及びその均等物に従ってのみ、定められるべきである。
本明細書に挙げるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、本発明が関する分野の当業者のレベルを示すものであり、各々の刊行物、特許、及び特許出願が、参照として組み込まれると明確かつ個別に示されているのと同じ程度まで、本明細書に参照として組み込むものとする。
以下の非制限的実施例により、本発明をさらに説明する。以下の実施例は、原料としてトウモロコシを含むが、本発明から逸脱することなく、他のバイオマス供給源を原料に用いてもよいことは理解すべきである。
本明細書で用いる略語の意味は、以下の通りである：「ｇ」は、グラム、「ｋｇ」は、キログラム、「Ｌ」は、リットル、「ｍＬ」は、ミリリットル、「ｍＬ／Ｌ」は、ミリリットル毎リットル、「ｍＬ／分」は、ミリリットル毎分、「ＤＩ」は、脱イオン（した）、「μＭ」は、マイクロメートル、「ｎｍ」は、ナノメートル、「ｗ／ｖ」は重量／容量、「ｒｐｍ」は、回転数毎分、「℃」は、摂氏度、及び「ｓｌｐｍ」は、標準リットル毎分をそれぞれ意味する。具体的実施形態についての上の説明により、本発明の大まかな本質が十分に明らかにされるため、当分野の技術の範囲内の知識を応用することによって、本発明の全体的概念から逸脱することなく、必要以上の実験なしで、このような具体的実施形態を容易に改変すること、及び／又は様々な用途に合わせて設計することができる。
実施例１
トウモロコシマッシュの製造
３０Ｌのガラス製ジャケット付きレジンケトルを用いて、約１００ｋｇの液化トウモロコシマッシュを３つの等量バッチに製造した。ケトルは、機械的撹拌、温度調節、及びｐＨ制御を設定して準備した。３つのバッチすべてについて用いたプロトコルは以下の通りである：（ａ）粉砕トウモロコシを水道水と混合し（乾量基準で３０重量％のトウモロコシ）、（ｂ）撹拌しながら、スラリーを５５℃に加熱し、（ｃ）ＮａＯＨ又はＨ２ＳＯ４のいずれかで、スラリーのｐＨを５．８に調節し、（ｄ）α−アミラーゼを添加し（乾燥トウモロコシ基準で０．０２重量％）、（ｅ）スラリーを８５℃に加熱し、（ｆ）ｐＨを５．８に調節し、（ｇ）ｐＨを５．８に維持しながら、スラリーを８５℃で２時間保持した後、（ｈ）スラリーを２５℃に冷却する。
用いたトウモロコシは、Ｐｉｏｎｅｅｒ（３３３５）から入手した全粒イエローコーンであった。これを、１ｍｍスクリーンを用いたハンマーミルで粉砕した。粉砕トウモロコシの水分を測定したところ、１２重量％であり、粉砕トウモロコシのデンプン含量を測定すると、乾燥トウモロコシ基準で、７１．４重量％であった。α−アミラーゼ酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）から入手可能なＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ ＤＣであった。合計３つのバッチに用いた成分の総量は、次の通りであった：３３．９ｋｇの粉砕トウモロコシ（１２％水分）、６５．４ｋｇの水道水、及び０．００６ｋｇのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ ＤＣ。合計０．２９７ｋｇのＮａＯＨ（１７重量％）を添加して、ｐＨを調節した。Ｈ２ＳＯ４は一切必要なかった。３つの３０Ｌバッチから回収した液化トウモロコシマッシュの総量は、９９．４ｋｇであった。
実施例２
固形分の除去
６つの１Ｌボトルを含む、底面の大きい遠心分離機での遠心分離により、実施例１で製造したマッシュから固形分を取り出した。７３．４ｋｇのマッシュを２５℃で２０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離して、遠心分離液と２６．９ｋｇのウェットケークを得た。測定により、遠心分離液は＜１重量％の懸濁固形分を含み、また、ウェットケークは約１８重量％の懸濁固形分を含むことがわかった。これは、元の液化マッシュが、約７重量％の懸濁固形分を含むことを意味する。このことは、デンプンの大部分が液化したと仮定して、トウモロコシの投入及び用いたトウモロコシのデンプン含量と一致する。デンプンの全部が液化したとすると、遠心分離から直接回収した４４．４ｋｇの遠心分離液は、約２３重量％の溶解オリゴ糖（液化デンプン）を含んでいたはずである。約０．６ｋｇのイソブタノールを３５．４ｋｇの遠心分離液に添加することにより、これを保存した。得られた３６．０ｋｇの遠心分離液（１．６重量％のイソブタノールを含む）を原液として用いた。
実施例３
非溶解固形分の除去によるトウモロコシ油の取り出し
この実施例では、発酵前に非溶解固形分を除去することにより、トウモロコシマッシュからトウモロコシ油を取り出し、回収する可能性を実証する。抽出溶媒の有効性は、それがトウモロコシ油で希釈されると、損なわれうる。液体−液体抽出が、ｉｎ ｓｉｔｕ生成物除去（ＩＳＰＲ）を実施する上での実行可能な分離方法であるためには、抽出発酵工程において、溶媒の分配係数の低下を最小限にしなければならない。
１Ｌガラス製ジャケット付きレジンケトルにおいて、約１０００ｇの液化トウモロコシマッシュを製造した。ケトルは、機械的撹拌、温度調節、及びｐＨ制御を設定して準備した。以下のプロトコルを用いた：粉砕トウモロコシを水道水と混合し（乾量基準で２６重量％のトウモロコシ）、撹拌しながら、スラリーを５５℃に加熱し、ＮａＯＨ又はＨ２ＳＯ４のいずれかで、スラリーのｐＨを５．８に調節し、α−アミラーゼを添加し（乾燥トウモロコシ基準で０．０２重量％）、スラリーを８５℃に加熱し続け、ｐＨを５．８に調節し、ｐＨを５．８に維持しながら、８５℃で２時間保持した後、２５℃に冷却する。用いたトウモロコシは、Ｐｉｏｎｅｅｒ（３３３５）からの全粒イエローコーンであった。これを、１ｍｍスクリーンを用いたハンマーミルで粉砕した。粉砕トウモロコシの水分を測定したところ、約１１．７重量％であり、粉砕トウモロコシのデンプン含量を測定すると、乾燥トウモロコシ基準で、約７１．４重量％であった。α−アミラーゼ酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）からのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ ＤＣであった。用いた成分の総量は、２９４．５ｇの粉砕トウモロコシ（１１．７％水分）、７０５．５ｇの水道水であり、０．０５９ｇのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ ＤＣを添加して酵素を希釈し、合計２．３ｇの２０％ＮａＯＨ溶液を添加してｐＨを調節した。約９５２ｇのマッシュを回収した。ケトル及びＣＦボトルの壁にマッシュが付着したため、損失があったことに留意されたい。
液化トウモロコシマッシュを４０℃で３０分間、５０００ｒｐｍ（７２６０ｇ）で遠心分離して、オリゴ糖の水溶液から非溶解固形分を除去した。遠心分離による固形分の除去によって、例えば、図１２に示すように、水相上部の個別の有機液層として、遊離トウモロコシ油も取り出された。図９に示す水相上部に浮遊する有機層から、約１．５ｇのトウモロコシ油を回収した。ヘキサン抽出によって、液化マッシュを製造するのに用いた粉砕トウモロコシは、乾燥トウモロコシ基準で、約３．５重量％のトウモロコシ油を含有することがわかった。これは、粉砕トウモロコシと一緒に液化工程に供給した約９ｇのトウモロコシ油と一致する。
水相上部に浮遊する有機層から、約１ｇのトウモロコシ油を回収した。約６１７ｇの液化デンプン溶液を回収したところ、約３３４ｇのウェットケークが残った。ウェットケークは、液化マッシュ中にあった非溶解固形分の大部分を含んでいた。液化デンプン溶液は、約０．２重量％の非溶解固形分を含有した。ウェットケークは、約２１重量％の非溶解固形分を含有した。ウェットケークを１０００ｇの水道水で洗浄して、ケーク中にまだ残っているオリゴ糖を除去した。これは、ケークと水を混合して、スラリーを形成することによって実施した。次に、洗浄した固形分を回収するために、元のマッシュを遠心分離するのに用いたのと同じ条件下で、スラリーを遠心分離した。遠心分離による洗浄固形分の除去によって、水相上部の個別の有機液層として、幾分かのさらなる遊離トウモロコシ油も取り出された。水相上部に浮遊する有機層から、トウモロコシ油を回収した。
毎回１０００ｇの水道水を用いて、湿潤固形分をさらに２回洗浄して、液化デンプンのほぼ全部を除去した。最終洗浄固形分を、８０℃及び約２０インチＨｇｖａｃで、真空オーブンにおいて一晩乾燥させた。乾燥固形分中に残るトウモロコシ油（恐らくまだ胚芽中にある）の量をヘキサン抽出によって決定した。測定により、３．６０ｇサンプルの比較的乾燥した固形分（約２重量％の水分）が、０．２２ｇのトウモロコシ油を含有することがわかった。この結果は、０．０６２４ｇトウモロコシ油／ｇ乾燥固形分に相当する。これは、洗浄した固形分の場合であり、湿潤固形分中に残留オリゴ糖が存在しないことを意味する。液化トウモロコシマッシュを遠心分離して、ウェットケークから遊離トウモロコシ油の層とオリゴ糖の水溶液を分離した後、測定により、約２１重量％の非溶解固形分を含む約３３４ｇのウェットケークが残ったことがわかった。これは、７０．１ｇの非溶解固形分を含むウェットケークに相当する。０．０６２４ｇトウモロコシ油／ｇ乾燥固形分で、ウェットケーク中の固形分は、約４．４ｇのトウモロコシ油を含有するはずである。
実施例４
発酵の一般的方法
シードフラスコ（Ｓｅｅｄ Ｆｌａｓｋ）増殖
ｐｄｃ１欠失、ｐｄｃ５欠失、及びｐｄｃ６欠失を有し、炭水化物供給源からイソブタノールを生成するように操作したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を、凍結培養物からシードフラスコ中で、０．５５〜１．１ｇ／Ｌ ｄｃｗ（ＯＤ６００ １．３〜２．６−Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｅｌｉｏｓ α Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）まで増殖させた。培養物は、３００ｒｍで回転するインキュベータにおいて、２６℃で増殖させた。凍結培養物は、事前に−８０℃で保存しておいた。第１シードフラスコ培地の組成は、以下の通りである：
３．０ｇ／Ｌ デキストロース
３．０ｇ／Ｌ エタノール、無水
３．７ｇ／Ｌ ＦｏｒＭｅｄｉｕｍ（商標）合成完全アミノ酸（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ）（Ｋａｉｓｅｒ）ドロップアウト（Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ）：ＨＩＳなし、ＵＲＡなし（参照番号：ＤＳＣＫ１６２ＣＫ）
６．７ｇ／Ｌ アミノ酸を含まないＤｉｆｃｏ酵母窒素原礎培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ）（Ｎｏ．２９１９２０）。
第１シードフラスコ培養物からの１２ミリリットルを２Ｌフラスコに移し、３００ｒｐｍで回転するインキュベータにおいて、３０℃で増殖させた。第２シードフラスコは、２２０ｍＬの以下の培地を有する：
３０．０ｇ／Ｌ デキストロース
５．０ｇ／Ｌ エタノール、無水
３．７ｇ／Ｌ ＦｏｒＭｅｄｉｕｍ（商標）合成完全アミノ酸（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ）（Ｋａｉｓｅｒ）ドロップアウト（Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ）：ＨＩＳなし、ＵＲＡなし（参照番号：ＤＳＣＫ１６２ＣＫ）
６．７ｇ／Ｌ アミノ酸を含まないＤｉｆｃｏ酵母窒素原礎培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ）（Ｎｏ．２９１９２０）
０．２Ｍ ｐＨ５．５〜６．０に滴定したＭＥＳバッファー。
培養物を０．５５〜１．１ｇ／Ｌ ｄｃｗ（ＯＤ６００ １．３〜２．６）まで増殖させた。この細胞濃縮物に、２００ｇ／Ｌペプトンと１００ｇ／Ｌ酵母抽出物を含む３０ｍＬの溶液を添加した。次に、３００ｍＬの０．２μＭフィルター滅菌Ｃｏｇｎｉｓ（９０〜９５％オレイルアルコール）をフラスコに添加した。培養物を＞４ｇ／Ｌ ｄｃｗ（ＯＤ６００＞１０）まで増殖を続けた後、回収し、発酵に添加した。
発酵調製物
初期発酵槽調製物
ガラス製ジャケット付き２Ｌ発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に、固形分と一緒に、又は固形分なし（遠心分離液）のいずれかで、液化マッシュを投入した。ｐＨプローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｅａｓｙｆｅｒｍ Ｐｌｕｓ Ｋ８、部品番号；２３８６２７、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ，Ｂｏｎａｄｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をＳａｒｔｏｒｉｕｓ ＤＣＵ−３ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｏｗｅｒ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎメニューにより較正した。ゼロをｐＨ＝７に定めた。目盛幅をｐＨ＝４に定めた。次に、ステンレス鋼ヘッドプレートを通じて、プローブを発酵槽中に配置した。また、溶解酸素プローブ（ｐＯ２プローブ）も、ヘッドプレートから発酵槽に配置した。栄養素、シード培養物、抽出溶媒、及び塩基を送達するために用いる管路をヘッドプレートに取り付け、末端をホイルで覆った。発酵槽全体をＳｔｅｒｉｓ（Ｓｔｅｒｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｎｔｏｒ，Ｏｈｉｏ）オートグレーブ内に配置し、液体循環中で３０分間滅菌した。
発酵槽をオートクレーブから取り出し、ロードセルに載せた。ジャケット給水管及び帰り管を屋内水道及び清潔な排水管にそれぞれ接続した。冷却器冷却水の引込み及び吐出し管を、７℃で流れる６Ｌ再循環温度浴に接続した。発酵槽からのガスを送る通気管を輸送管に接続し、輸送管を、Ｔｈｅｒｍｏ質量分析計（Ｐｒｉｍａ ｄＢ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に接続した。スパージャ管をガス供給管に接続した。栄養素、抽出溶媒、シード培養物、及び塩基を添加するための管路は、ポンプを介して配管するか、又は締め付けにより閉鎖した。オートクレーブで滅菌した材料、０．９％ｗ／ｖＮａＣｌを排出した後、液化マッシュを添加した。
液化後のリパーゼ処理
液化サイクルが完了した（液化）後、発酵槽温度を３０℃ではなく、５５℃に設定した。必要に応じて、酸又は塩基の急速添加を実施することにより、ｐＨをｐＨ＝５．８に手動で調節した。リパーゼ酵素原液を最終リパーゼ濃度１０ｐｐｍまで発酵槽に添加した。５５℃、３００ｒｐｍ、及び０．３ｓｌｐｍＮ２オーバーレイで、発酵槽を＞６時間にわたって維持した。リパーゼ処理が完了した後、発酵槽温度を３０℃に設定した。
接種前の栄養素添加
接種直前に、７．０ｍＬ／Ｌ（接種後の量）のエタノール（２００ｐｒｏｏｆ、無水）を添加した。接種直前に、２０ｍＬ／Ｌの最終濃度までチアミンを添加する。接種直前に、１００ｍＬ／Ｌのニコチン酸を添加する。
発酵槽接種
Ｎ２を発酵槽に添加しながら、発酵槽ｐＯ２プローブの目盛をゼロに定めた。３００ｒｐｍでの無菌空気のスパージングと共に、発酵槽ｐＯ２プローブをその目盛幅に定めた。第２シードフラスコが、＞４ｇ／Ｌｄｃｗとなった後、発酵槽に接種した。振盪フラスコをインキュベータ／シェーカから５分間取り出すことにより、オレイルアルコール相と水相を相分離させた。５５ｍＬの水相を滅菌の接種ボトルに移した。ペリスタルティックポンプのポンプ作用により、接種材料を発酵槽に導入した。
接種後のオレイルアルコール又はトウモロコシ油脂肪酸の添加
接種後直ちに、１Ｌ／Ｌ（接種後の量）のオレイルアルコール又はトウモロコシ油脂肪酸を添加した。
発酵槽の運転条件
発酵槽は、すべての増殖及び生産段階について３０℃で運転した。ｐＨは、酸を一切添加することなく、ｐＨ５．７〜５．９から、制御整定値５．２まで低下させた。残る増殖及び生産段階の間、ｐＨは、水酸化アンモニウムを用いて、ｐＨ＝５．２に制御した。残る増殖及び生産段階の間、スパージャを介し、０．３ｓｌｐｍで、発酵槽に無菌空気を添加した。ｐＯ２は、最小３００ｒｐｍ及び最大２０００ｒｐｍに設定した撹拌機による撹拌制御のみを用いて、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＤＣＵ−３ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂｏｘ ＰＩＤ制御ループによって、３．０％に制御されるように設定した。液化トウモロコシマッシュの同時糖化及び発酵を通じて、α−アミラーゼ（グルコアミラーゼ）を添加することにより、グルコースを供給した。糖化のためにデンプンが利用可能である限り、グルコースは過剰量（１〜５０ｇ／Ｌ）を維持した。
実施例５
液化トウモロコシマッシュからの固形分の取り出しから得られるウェットケーク
この実施例では、ウェットケークを回収した後、ウェットケークを２回水で洗浄することによる、ウェットケークからのデンプンの回収を実証する。尚、ウェットケークは、液化マッシュを遠心分離することによって形成した。液化トウモロコシマッシュを連続式デカンター型遠心分離機に供給して、遠心分離液流（Ｃ−１）とウェットケーク（ＷＣ−１）を形成した。遠心分離液は、可溶性デンプンの比較的固形分のない水溶液であり、ウェットケークは、供給マッシュに比べ、固形分が濃縮されていた。ウェットケークの一部を熱水と混合して、スラリー（Ｓ−１）を形成した。このスラリーを、デカンター型遠心分離機によって送り戻すことにより、洗浄水遠心分離液（Ｃ−２）と洗浄済ウェットケーク（ＷＣ−２）を形成した。Ｃ−２は、可溶性デンプンの、比較的固形分のない希薄水溶液であった。Ｃ−２中の可溶性デンプンの濃度は、マッシュの分離から得られた遠心分離液中の可溶性デンプンの濃度より低かった。ＷＣ−２中に残った液相は、マッシュの分離から得られたウェットケーク中の液体よりデンプンが希薄であった。洗浄済ウェットケーク（ＷＣ−２）を熱水と混合して、スラリー（Ｓ−２）を形成した。投入した水と、投入したウェットケーク中の可溶性デンプンの量との比は、いずれの洗浄ステップでも同じであった。第２洗浄スラリーを、デカンター型遠心分離機によって送り戻すことにより、第２洗浄水遠心分離液（Ｃ−３）とウェットケーク（ＷＣ−３）を形成し、ウェットケークを２回洗浄した。Ｃ−３は、可溶性デンプンの、比較的固形分のない、希薄水溶液であった。Ｃ−３中の可溶性デンプンの濃度は、第１洗浄段階で得られた遠心分離液（Ｃ−２）中の可溶性デンプンの濃度より低かったため、ＷＣ−３（第２洗浄済ウェットケーク）中に残った液相は、ＷＣ−２（第１洗浄済ウェットケーク）よりデンプンが希薄であった。２つの洗浄遠心分離液（Ｃ−２及びＣ３）中の総可溶性デンプンは、デンプンであり、これを回収し、液化に戻して再循環させることができた。最終洗浄済ウェットケークに残った液体中の可溶性デンプンは、マッシュの最初の分離で得られたウェットケークのものよりはるかに少ない。
液化トウモロコシマッシュの製造
ハンマーミル、スラリーミキサー、スラリータンク、及び液化タンクからなる連続的乾式粉砕液化システムで、約１０００ガロンの液化トウモロコシマッシュを製造した。粉砕したトウモロコシ、水、及びα−アミラーゼを連続的に供給した。反応器は、機械的撹拌、温度制御、及びアンモニア又は硫酸のいずれかを用いたｐＨ制御を備えていた。反応条件は以下の通りであった：
ハンマーミルスクリーンサイズ：７／６４”
スラリーミキサーへの供給速度
− 粉砕トウモロコシ：５６０ｌｂｍ／時（１４．１重量％の水分）
− プロセス水：１６．６ｌｂｍ／分（２００Ｆ）
− α−アミラーゼ：６１ｇ／時（Ｇｅｎｅｃｏｒ：Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＬＰＨＡ）
スラリータンク条件：
− 温度：１８５°Ｆ（８５℃）
− ｐＨ：５．８
− 滞留時間：０．５時間
− 乾燥トウモロコシ投入：３１重量％
− 酵母投入：０．０２８重量％（乾燥トウモロコシ基準）
液化タンク条件：
− 温度：１８５°Ｆ（８５℃）
− ｐＨ：５．８
− 滞留時間：約３時間
− 追加酵素は添加しなかった。
液化トウモロコシマッシュの製造速度は、約３ｇｐｍであった。粉砕トウモロコシのデンプン含量を測定したところ、乾燥トウモロコシ基準で、約７０重量％であった。液化マッシュの総固形分（ＴＳ）は、約３１重量％であり、総懸濁固形分（ＴＳＳ）は、約７重量％であった。液相は、ＨＰＬＣによる測定で、約２３〜２４重量％の液化デンプン（可溶性オリゴ糖）を含有していた。
以下の条件で、液化マッシュを連続的デカンター型遠心分離機で遠心分離した（製造（ｍａｋｅ）、モデル（ｍｏｄｅｌ））：
ボウル速度：５０００ｒｐｍ（約３６００ｇ）
差速：１５ｒｐｍ
堰直径：１８５ｍｍ（堰板を取り除いて）
供給速度：５〜２０ｇｐｍの間で変動
マッシュを遠心分離することにより、約８５０ガルの遠心分離液と約１４００ｌｂｍのウェットケークを形成した。ウェットケーク中の総固形分を測定したところ、水分均衡により、約４６．３％（懸濁及び溶解）であった。液相が約２３重量％の可溶性デンプンを含むことがわかっており、ウェットケーク中の総懸濁固形分は約２８重量％であると推定された。ウェットケークは、遠心分離操作の前に液化マッシュ中に存在した可溶性デンプンの約１２％を含むと推定された。
実施例６
液体分析
エステル交換による、様々な脂肪酸含有化合物クラスの脂肪酸メチルエステル（「ＦＡＭＥ」）への変換によって、液体分析を実施した。メタノール中のナトリウムメトキシドを用いて、グリセリドとリン脂質をエステル交換した。メタノール中の塩化アセチルを用いて、グリセリド、リン脂質、及び遊離脂肪酸をエステル交換した。トルエン／ヘキサン（２：３）で希釈後、得られたＦＡＭＥの分析を、３０−ｍＸ０．２５ｍｍ（同上）ＯＭＥＧＡＷＡＸ（商標）（Ｓｕｐｅｌｃｏ，ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）カラムを備えるＡｇｉｌｅｎｔ ７８９０ ＧＣを用いたガスクロマトグラフィーにより実施した。オーブン温度を５℃／分で１６０℃から２００℃まで上昇させた後、１０℃／分で２００℃から２５０℃（１０分間保持）まで上昇させた。ＧＣ分析で記録したＦＡＭＥピークを、既知メチルエステル（ＭＥ）のそれと比較して、その保持時間により識別し、ＦＡＭＥピーク面積を、既知量の内標準のそれ（Ｃ１５：０トリグリセリド；同サンプルを用いたエステル交換方法により得られたもの）と比較することによって定量した。このようにして、任意の脂肪酸ＦＡＭＥの近似量（ｍｇ）（「ｍｇＦＡＭＥ」）を式：（指定脂肪酸のＦＡＭＥピークの面積／１５：０ＦＡＭＥピーク）＊（内標準１５：０ＦＡＭＥのｍｇ）に従って計算する。次に、ＦＡＭＥの結果を、適切な分子量変換係数：１．０５２で割ることにより、対応する脂肪酸のｍｇに補正することができる。内標準及び参照標準はすべて、Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．から得たものである。
メタノール中のナトリウムメトキシドを用いて、エステル交換したサンプルについて得られた脂肪酸結果は、分子量変換係数：１．０４５を掛けることにより、対応するトリグリセリドレベルに変換する。トリグリセリドは、概して、この実施例のサンプル試験においてグリセリドの約８０％〜９０％を占め、残りはジグリセリドである。モノグリセリド及びリン脂質含量は、一般に無視できる程度である。メタノール中の塩化アセチルを用いてエステル交換したサンプルについて得られた総脂肪酸の結果は、ナトリウムメトキシド法を用いて同じサンプルについて決定した脂肪酸を差し引くことにより、グリセリド含量について補正する。この結果は、サンプルの遊離脂肪酸含量である。
薄層クロマトグラフィーを用いて、グリセリド（モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、及びリン脂質）含量の分布を決定する。６：１クロロホルム／メタノール中に溶解させた油の溶液を、シリカゲルを予めコーティングしておいたガラスプレートの底部付近にスポットした。次に、スポットを７０：３０：１ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸溶媒系を用いたプレートで色層分析した。次に、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、及びリン脂質に対応する、分離したスポットを、ヨウ素蒸気でプレートを染色することによって検出する。次に、スポットをプレートからこすり落とし、メタノール処理中、塩化アセチル法を用いてエステル交換した後、ガスクロマトグラフィーにより分析した。全スポットについての合計ピーク面積に対する、各スポットについての合計ピーク面積の割合が、各種グリセリドの分布である。
実施例７
蒸留廃液からの固形分、並びに脂肪酸、エステル、及びトリグリセリドを回収するための脱溶媒装置による抽出
この実施例では、蒸留廃液からの固形分の除去、並びに脂肪酸、エステル、及びトリグリセリドを回収するための脱溶媒装置による抽出を説明する。発酵中、固形分を全蒸留廃液から分離し、脱溶媒装置に供給して、そこで、１．１トン／時の蒸気と接触させる。全蒸留廃液ウェットケーク（抽出装置フィード）、溶媒、抽出装置ミセラ、及び抽出装置排出固形分についての流量は、表１に示す通りである。表の値は、トン／時を省略している。
Figure 2014516581
脱溶媒装置から出た固形分は、乾燥機に送られる。脱溶媒装置から出た蒸気は、０．５５トン／時のヘキサンと、１．１０２トン／時の水を含む。この蒸気流は、濃縮されて、デカンターに供給される。デカンターから出た高水分相は、約３６０ｐｐｍのヘキサンを含有する。この蒸気流は、蒸留塔に送られ、そこで、高水分蒸気流からヘキサンが除去される。蒸留塔の上部から出たヘキサン濃縮蒸気流は凝結されて、デカンターに送られる。蒸気流（１１．０２トン／時）は、蒸留塔の底部に供給される。この蒸留塔についての塔頂及び底部生成物の組成物を表２に示す。表の値は、トン／時である。
Figure 2014516581
実施例８
マッシュからの副産物の回収
この実施例では、マッシュからの副産物の回収を説明する。トリカンター型遠心分離機（Ｆｌｏｔｔｗｅｇ Ｚ２３−４ボウル直径、２３０ｍｍ、長さ：直径比４：１）を以下の条件で用いた以外は、実施例３に記載した条件下でマッシュからトウモロコシ油を分離した：
ボウル速度：５０００ｒｐｍ
差速：１０ｒｐｍ
供給速度：３ｇｐｍ
フェーズセパレータディスク：１３８ｍｍ
インペラー設定値：１４４ｍｍ
分離したトウモロコシ油は、実施例６に記載の方法及び薄層クロマトグラフィーにより測定したところ、８１％トリグリセリド、６％遊離脂肪酸、４％ジグリセリド、及び合計５％のリン脂質及びモノグリセリドを含有していた。
前述した条件下でマッシュから分離した固形分は、乾燥時の損失重量により測定して、５８％の水分を有し、また、実施例６に記載の方法より測定して、１．２％トリグリセリド、０．２７％遊離脂肪酸を含有していた。
表３に示す全蒸留廃液の組成物及び表３の仮定（トリカンター型遠心分離機での分離）を想定して、表５に示す全蒸留廃液から分離した固形分、蒸発器段階の間に抽出した油、副産物抽出剤及び濃縮蒸留可溶性物質（ＣＤＳ）の組成を計算した。表２の値はＡｓｐｅｎ Ｐｌｕｓ（登録商標）モデル（Ａｓｐｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から取得した。このモデルは、トウモロコシ油がマッシュから抽出されていないことを前提とする。細胞、溶解固形分、及び懸濁固形分のタンパク質含量は、乾量基準で、それぞれ、約５０％、２２％、及び３５．５％であると推定される。副産物抽出剤の組成は、乾量基準で、７０．７％脂肪酸、及び２９．３％脂肪酸イソブチルエステルであると推定される。
Figure 2014516581
Figure 2014516581
Figure 2014516581
実施例９
実施例９は、本明細書に図示し、かつ記載する方法に従う、プロセス供給流の組合せを示す、方法及びシステムの一例を提供する。
例えば、実施例１に記載のように液化トウモロコシマッシュを製造し、例えば、実施例２、３、及び／又は５に記載のようにトウモロコシ油と固形分を取り出し、トウモロコシ油及びウェットケークを形成した。例えば、実施例４に記載したように発酵を実施後、固形分を除去して、例えば、実施例５に記載のように、ウェットケークを形成した。本明細書に記載のように、シロップ及び液体プロセス供給流を製造した。トウモロコシ油の加水分解からの脂肪酸のプロセス供給流（ＣＯＦＡ、トウモロコシ油の加水分解からの脂肪酸のプロセス供給流）を本明細書に記載のように製造した。ＣＯＦＡ（ＦＡＢＥ）のトリグリセリド（ＴＧ）、脂肪酸（ＦＡ）及びイソブチルエステルの乾量に基づくパーセンテージを、例えば、実施例６及び７に記載するプロセス供給流について決定した。粗脂肪、粗タンパク質、リシン、中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、及び酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）の重量パーセンテージ、並びにウェットケークに対する乾燥材料（ＤＭ）の割合も、標準的方法を用いて、プロセス供給流について決定した。さらに、以下のプロセス供給流の３つの組合せについて、これらのサンプルの値を決定した：（１）ウェットケーク、ＷＳウェットケーク、シロップ、及びＣＯＦＡ（ＤＣＰ１）；（２）ウェットケーク、ＷＳウェットケーク、及びシロップ（ＤＣＰ２）；並びに（３）トウモロコシ油（６５％）、ウェットケーク、ＷＳウェットケーク、及びシロップ。これらの分析の結果を表６に示す。
Figure 2014516581
これらの結果は、特定の動物飼料又は動物飼料市場（例えば、家畜、反芻動物、畜牛、酪農動物、ブタ、ヤギ、ヒツジ、家禽、ウマ、水産養殖魚、ペット用飼料市場）のための成分を製造するために、プロセス供給流を用いることができることを示している。さらに、プロセス供給流の組合せを用いて、特定の動物飼料又は動物飼料市場のために脂質、脂肪、タンパク質若しくはリシン含量を最適化することもできる。
実施例１０
ＣＯＦＡからＦＡＥＥ及びモノアシルグリセロールへの変換
以下の実施例は、固定化酵素を用いた穏やかな条件下で、ＣＯＦＡが、高収率で、エタノール（ＥｔＯＨ）又はグリセロールとエステル交換することができることを証明する。
ノボザイム４３５（カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ（アクリル樹脂上に固定化）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）から購入した。アセトン、ｔ−ＢｕＯＨ、エタノール、メタノール、及びグリセロールはすべて、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）から購入した。ＧＣ分析のために、用いたガスクロマトグラフは、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ５８９０ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩ ＧＣクロマトグラムであり、ペンタデカン酸メチルを内標準として用いた。
ＣＯＦＡからＦＡＥＥへの変換
トウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ、０．２５ｇ）を２．０ｍＬのＥｔＯＨに溶解させて、単相を形成した。アクリル樹脂上に固定化したカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ（ＣＡＬＢ）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ ４３５）２０ｍｇを添加し（１．７ｍｇの酵素を含有する）、隔膜キャップ（ｓｅｐｔｕｍ ｃａｐ）で密封した６ｍＬガラス製バイアルにおいて、４０℃の回転シェーカ（３００ｒｐｍ）上で、懸濁液を２４時間インキュベートした。反応をほぼ完了まで進行させたところ、９８％のＣＯＦＡがＦＡＥＥ（脂肪酸エチルエステル）に変換された。２４時間後のＧＣ分析によって、９８％のＣＯＦＡの、脂肪酸エチルエステルへの変換が明らかになった。
ＣＯＦＡからモノアシルグリセリドへの変換
トウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ、０．２５ｇ）と０．３２５ｇのグリセロールを２．０ｍＬのアセトンに溶解させた。成分の大部分が溶解している大きな上部相と、残りのグリセロールを含有する小さな相が形成された。アクリル樹脂上に固定化したカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ（ＣＡＬＢ）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ ４３５）２０ｍｇを添加し（１．７ｍｇの酵素を含有する）、隔膜キャップで密封した６ｍＬガラス製バイアルにおいて、４０℃の回転シェーカ（３００ｒｐｍ）上で、懸濁液を２４時間インキュベートした。上部相のＧＣは、８７％のＣＯＦＡがアシルグリセリド（ほとんどがモノアシルグリセリドであると考えられる）に変換されたことを示した。
実施例１１
ＣＯＦＡからＦＡＭＥへの変換
以下の実施例は、固定化リパーゼを用いた穏やかな条件下で、ＣＯＦＡが、高収率で、メタノール（ＭｅＯＨ）、ＥｔＯＨ、及びグリセロールとエステル化することができることを証明する。
溶媒なしでのＣＯＦＡからＦＡＥＥへの変換
６ｍＬバイアルに、５００ｍｇのＣＯＦＡ（１．４８ｍモル）、１３２μＬのＭｅＯＨ（３．２６ｍモル）、及び１０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ ４３５を添加した。得られた混合物をインキュベータ／シェーカ内に配置し、４０℃で一晩放置した。反応混合物のＧＣ分析により、９５％の変換が明らかになった。
ＣＯＦＡ→ＦＡＭＥ反応へのＭｅＯＨの添加
６ｍＬバイアルに、５００ｍｇのＣＯＦＡ（１．４８ｍモル）、１８０、２４０、３００、若しくは１３２０μＬのＭｅＯＨ（４．４４、５．９２、７．４１、及び１４，８２ｍモル）、並びに１０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ ４３５を添加した。得られた混合物をインキュベータ／シェーカ内に配置し、４０℃で一晩放置した。反応混合物のＧＣ分析により、９６〜９７％の変換が明らかになった。
本発明の様々な実施形態を上に記載してきたが、これらは、例として提示されたに過ぎず、限定ではないことを理解すべきである。当業者には、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、形状及び細目に様々な変更を実施できることは明らかであろう。従って、本発明の広さ及び範囲は、上に記載した例示的実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲及びそれらの均等物に従ってのみ定められるべきである。
本明細書で述べたすべての刊行物、特許及び特許出願は、本発明が関連する分野の当業者のレベルを示すものであり、各々の刊行物、特許及び特許出願が、明確かつ個別に、参照として組み込まれることが示されているのと同じ程度まで、本明細書に参照として組み込まれるものとする。

Claims (35)

  1. 蒸留共産物の生成方法であって、少なくとも２つのプロセス供給流を有するアルコール生成プロセスを備えるステップを含み、ここで少なくとも２つのプロセス供給流を組み合わせて、蒸留共産物を生じさせる、上記方法。
  2. 少なくとも２つのプロセス供給流が、（ｉ）油の加水分解からの脂肪酸、（ｉｉ）低濃度蒸留廃液の蒸発からの脂質、（ｉｉｉ）シロップ、（ｉｖ）蒸留穀粒残渣（ＤＧ）、（ｖ）可溶性物質添加の蒸留穀粒残渣（ＤＧＳ）、（ｖｉ）発酵前のマッシュからの固形分；（ｖｉｉ）発酵後の全蒸留廃液からの固形分、（ｖｉｉｉ）油、並びに（ｉｘ）微生物のうち少なくとも２つを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 脂肪酸が、トウモロコシ油の加水分解からのものである、請求項２に記載の方法。
  4. ＤＧが、乾燥蒸留穀粒残渣（ＤＤＧ）又は湿潤蒸留穀粒残渣（ＷＤＧ）である、請求項２に記載の方法。
  5. ＤＧＳが、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀粒残渣（ＤＤＧＳ）又は可溶性物質添加の湿潤蒸留穀粒残渣（ＷＤＧＳ）である、請求項２に記載の方法。
  6. アルコール生産プロセスが、ブタノール生産プロセスである、請求項１に記載の方法。
  7. アルコール生産プロセスから動物飼料用の蒸留共産物を生成する方法であって、ここで動物飼料又は動物飼料市場向けに粗タンパク質及び粗脂肪含量を改善するための、少なくとも１つのプロセス供給流を有するアルコール生産プロセスを備えるステップを含む、上記方法。
  8. 動物飼料又は動物飼料市場向けに粗タンパク質及び粗脂肪含量を改善するために、少なくとも２つのプロセス供給流を組み合わせる、請求項７に記載の方法。
  9. 動物飼料又は動物飼料市場向けに粗タンパク質及び粗脂肪含量を改善するために、少なくとも３つのプロセス供給流を組み合わせる、請求項７に記載の方法。
  10. 少なくとも１つのプロセス供給流が、（ｉ）油の加水分解からの脂肪酸、（ｉｉ）低濃度蒸留廃液の蒸発からの脂質、（ｉｉｉ）シロップ、（ｉｖ）ＤＧ、（ｖ）ＤＧＳ、（ｖｉ）発酵前のマッシュからの固形分；（ｖｉｉ）発酵後の全蒸留廃液からの固形分；（ｖｉｉｉ）油、又は（ｉｘ）微生物である、請求項７に記載の方法。
  11. 脂肪酸が、トウモロコシ油の加水分解からのものである、請求項１０に記載の方法。
  12. ＤＧが、ＤＤＧ又はＷＤＧである、請求項１０に記載の方法。
  13. ＤＧＳが、ＤＤＧＳ又はＷＤＧＳである、請求項１０に記載の方法。
  14. 動物飼料用の蒸留共産物が、蒸留共産物の約１０％未満の粗脂肪含量を有する、請求項７に記載の方法。
  15. 動物飼料用の蒸留共産物が、蒸留共産物の約１０％未満の脂肪酸含量を有する、請求項１０に記載の方法。
  16. 動物飼料用の蒸留共産物のタンパク質含量に、酵母細胞マスを補充し、ここで酵母細胞マスによって、動物飼料用の蒸留共産物のタンパク質含量が増加する、請求項７に記載の方法。
  17. 脂肪酸含量によって、動物飼料用の蒸留共産物を含む動物飼料組成物向けに追加エネルギー及び栄養素が供給される、請求項１０に記載の方法。
  18. アルコール生産プロセスが、ブタノール生産プロセスである、請求項７に記載の方法。
  19. ブタノール生産プロセスで生産されたブタノールを、ブタノール生産プロセスの少なくとも１つの供給流用の溶媒洗浄液として用いる、請求項１８に記載の方法。
  20. 増大した貯蔵安定性を備えた動物飼料用の蒸留共産物を生産するために、第１供給流を第２供給流と組み合わせる、請求項７に記載の方法。
  21. 動物飼料用の蒸留共産物が、改善されたカラープロフィールを有する、請求項７に記載の方法。
  22. 蒸留共産物の少なくとも約２０質量％の粗タンパク質と、約１０質量％未満の粗脂肪を含む動物飼料組成物用の蒸留共産物であって、ここで組成物が、動物飼料又は動物飼料市場向けに改善された栄養プロフィールを有する、上記蒸留共産物。
  23. 約１０質量％未満の脂肪酸をさらに含む、請求項２２に記載の動物飼料組成物用の蒸留共産物。
  24. 約１０質量％未満の脂肪酸エステルをさらに含む、請求項２２に記載の動物飼料組成物用の蒸留共産物。
  25. 約５質量％以下のリシンをさらに含む、請求項２２に記載の動物飼料組成物用の蒸留共産物。
  26. 組成物が、畜牛、酪農、家畜、ブタ、家禽、ウマ、水産養殖、又は飼育ペット用飼料市場向けの栄養プロフィールを有する、請求項２２に記載の動物飼料組成物用の蒸留共産物。
  27. アミノ酸、ビタミン、ミネラル、栄養素、調味料、消化刺激剤、若しくは着色料から選択される１つまたは複数の別の成分を動物飼料組成物用の蒸留共産物に補充することをさらに含む、請求項２２に記載の動物飼料組成物用の蒸留共産物。
  28. 動物飼料用の蒸留共産物の生産に対する発酵汚染物の影響を緩和する方法であって、発酵前にアルコール生産プロセスの少なくとも１つの供給流を分離するステップを含む、上記方法。
  29. 動物飼料用の蒸留共産物におけるマイコトキシン汚染を低減する方法であって、動物飼料生産用の蒸留共産物に寄与するアルコール生産プロセスの供給流を分離するステップと、マイコトキシン汚染の可能性がある供給流を排除又は精製するステップとを含む、上記方法。
  30. 動物飼料用の蒸留共産物の脂質含量のばらつきを低減する方法であって、動物飼料生産用の蒸留共産物に寄与するアルコール生産プロセスの供給流を分離するステップと、供給流を組み合わせることによって、制御された脂質含量を達成するステップとを含む、上記方法。
  31. 動物飼料用の蒸留共産物のトリグリセリド含量を増加させる方法であって、動物飼料組成物用の蒸留共産物を含むアルコール生産プロセスの高トリグリセリド含有供給流を、増加比で組み合わせることを含む、方法。
  32. ブタノール生産プロセスを備えるステップを含む燃料用蒸留共産物の生産方法であって、ここでブタノール生産プロセスの少なくとも１つのプロセス供給流を用いて、燃料用蒸留共産物を生成する、方法。
  33. 燃料用蒸留共産物が、ＣＯＦＡである、請求項３２に記載の方法。
  34. ブタノール生産プロセスを備えるステップを含むバイオディーゼル用蒸留共産物の生産方法であって、ブタノール生産プロセスの少なくとも１つのプロセス供給流を用いて、バイオディーゼル用蒸留共産物を生成する、方法。
  35. バイオディーゼル用蒸留共産物が、ＣＯＦＡである、請求項３４に記載の方法。
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