CN102947457B - 用于在丁醇生产中的提取发酵之前移除不溶解固体的方法和体系 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了利用原位产物提取高效地生产发酵产物醇如丁醇的方法和体系。通过在液化给定原料后、在发酵前分离(例如通过离心)不溶解固体产生原料来获得所述效率。所述不溶解固体的移除避免了与在原位生产提取期间存在的不溶解固体相关联的问题，从而提高醇生产的效率。
Description
本专利申请要求提交于2010年6月18日的美国临时申请61/356,290；提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,451；提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,436；提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,444；提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,429；提交于2010年9月2日的美国临时申请61/379,546；以及提交于2011年2月7日的美国临时申请61/440,034；提交于2011年6月15日的美国专利公开申请13/160,766；的权益，其全部内容均以引用方式并入本文。
与本专利申请相关联的序列表经由EFS-Web以电子表格形式提交并全文以引用方式并入本说明书。
发明领域
本发明涉及用于在发酵醇如丁醇生产中从发酵罐进料流中移除不溶解固体的方法和体系。
发明背景
背景技术
丁醇是一种重要的工业化学品，其具有多种用途，包括用作燃料添加剂，在塑料工业中用作化学原料，以及在食品和食用香料工业中用作食品级的提取剂。因此，高度地需要丁醇以及高效环保的生产方法。
利用微生物发酵生产丁醇是一种这样的环保生产方法。一些生产高生产能力丁醇的微生物也具有低的丁醇毒性阀值，使得当生产丁醇时需要从发酵罐中移除丁醇。当生产丁醇时，可使用原位产物移除(ISPR)从发酵罐中移除丁醇，从而使得微生物以高生产能力生产丁醇。用于本领域已经描述的ISPR的一种方法是液-液提取(美国专利公开申请公布2009/0305370)。为了技术和经济上的可行性，液-液提取需要接触提取剂和发酵液体培养基以高效传质；提取剂从发酵液体培养基中相分离(在发酵期间及发酵之后)；和/或高效地可回收并再利用溶剂以及在长期运行期间最小化提取剂的降解和/或污染。
当进入发酵罐的含水物流包含来自原料的不溶解固体时，因为不溶解固体增加资金和运行成本而妨碍了对技术和经济上可行的液-液提取的上述需求。具体地讲，在提取发酵期间存在的不溶解固体可降低发酵罐中的传质系数，阻止发酵罐中的相分离，可引起来自提取剂中的不溶解固体的油(例如玉米油)积聚，导致提取效率随时间降低，可提高溶剂损失，因为它与固体一起最后作为干酒糟及可溶物(Dried Distillers′Grains withSolubles，DDGS)被移除，可减缓提取剂液滴从发酵液体培养基中的分离，和/或可导致更低的发酵罐体积效率。因此，一直需要通过提取发酵开发用于生产产物醇如丁醇的更有效的方法和体系。
本发明满足了上述需要并提供了通过减少进料于发酵罐的不溶解固体量生产产物醇如丁醇的方法和体系。
发明概述
本发明涉及用于在发酵醇如丁醇生产中从发酵罐进料流中移除不溶解固体的方法和体系。
本发明涉及的方法包括提供包含可发酵碳源、不溶解固体和水的生物质原料浆液；从所述浆液中分离所述不溶解固体的至少一部分，从而产生(i)包含可发酵碳源的水溶液和(ii)包含固体的湿饼共产物；以及将所述水溶液加到在发酵容器中包含重组微生物的发酵液体培养基中，从而产生发酵产物；其中改善了所述生物质加工生产能力。在一些实施方案中，所述改善的生物质加工生产能力包括相对于在不溶解固体存在的情况下产生的发酵产物改善的发酵产物和共产物的可回收能力。在一些实施方案中，所述改善的生物质加工生产能力包括下列中的一个或多个：提高的工艺流再循环能力、提高的发酵罐体积效率、以及提高的生物质原料负荷供给。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述发酵液体培养基与提取剂接触，其中所述提取剂相对于包含不溶解固体的发酵液体培养基具有提高的提取效率。在一些实施方案中，提高的提取效率包括下列中的一个或多个：稳定的提取剂分配系数、增加的提取剂与发酵液体培养基的相分离、增加的液-液传质系数、提高的提取剂回收和再循环能力、以及用于回收和再循环的保存的提取剂。在一些实施方案中，所述提取剂是有机提取剂。在一些实施方案中，所述提取剂包括一种或多种不可混溶的有机提取剂，所述不可混溶的有机提取剂选自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、以及它们的混合物。在一些实施方案中，所述提取剂包括来源于玉米油的C12-C22脂肪酸。在一些实施方案中，所述不溶解固体通过卧式螺旋-碟式离心、三相卧螺离心、盘叠式离心、过滤离心、滗析器离心、过滤、真空过滤、带式过滤器、压滤、使用筛网的过滤、筛分、栅滤、多孔栅滤、浮选、水力旋流器、压滤器、螺旋压榨器、重力沉降器、涡旋分离器、或它们的组合从原料浆液中分离。在一些实施方案中，所述方法还包括液化原料以产生生物质原料浆液的步骤；其中所述原料选自玉米粒、玉米棒、作物残余物如玉米壳、玉米秸秆、草、玉米、小麦、黑麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、由谷物的研磨获得的组分、纤维素材料、木质纤维素材料、树、枝、根、叶、木片、木屑、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。在一些实施方案中，所述原料是玉米。在一些实施方案中，所述原料是分级的或未分级的。在一些实施方案中，所述原料是湿磨的或干磨的。在一些实施方案中，所述方法还包括在液化期间提高反应温度的步骤。在一些实施方案中，所述原料浆液包含来自所述原料的油，并且从所述浆液中分离所述油。在一些实施方案中，所述湿饼包含原料油。在一些实施方案中，用水洗涤所述湿饼以回收存在于所述湿饼中的低聚糖。在一些实施方案中，将所述回收的低聚糖加到所述发酵容器中。在一些实施方案中，进一步加工所述湿饼以提供改善的共产物。在一些实施方案中，进一步加工所述共产物以形成动物饲料产品。在一些实施方案中，用溶剂洗涤所述湿饼以回收存在于所述湿饼中的油。在一些实施方案中，所述溶剂选自己烷、丁醇、异丁醇、异己烷、乙醇和石油馏分。在一些实施方案中，所述发酵产物是产物醇，所述产物醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、以及它们的异构体。在一些实施方案中，所述重组微生物包含工程化的丁醇生物合成途径。在一些实施方案中，所述方法还包括至少部分地蒸发所述发酵液体培养基和产物以及任选的CO2，其中产生蒸气流，并且从所述蒸气流中回收所述产物。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述蒸气流与吸收液相接触，其中所述蒸气流的至少一部分被吸收到所述吸收液相中；其中在所述蒸气流被吸收到所述吸收液相中的开始的温度大于在所述吸收液相不存在的情况下冷凝所述蒸气流的开始的温度。在一些实施方案中，所述蒸发和接触步骤在真空条件下进行。在一些实施方案中，从所述浆液中分离所述不溶解固体的主要部分提供了所述发酵液体培养基的相对于包含不溶解固体的发酵液体培养基的更高的蒸气压。在一些实施方案中，所述更高的蒸气压提供更有效的蒸发产物回收。在一些实施方案中，所述更有效的蒸发产物回收包括下列中的一个或多个：更低的资金投资，更小的蒸发、吸收、压缩和冷却设备，改善的传质速率，更少的蒸发能量，以及更低的吸收剂流速。
本发明也涉及生产丁醇的方法，所述方法包括：提供原料；液化所述原料以产生原料浆液，其中所述原料浆液包含低聚糖、油和不溶解固体；从所述原料浆液中分离不溶解固体以产生(i)包含低聚糖的水溶液，(ii)包含不溶解固体的湿饼，和(iii)油相；在发酵罐中使所述水溶液与发酵液体培养基接触；发酵所述发酵罐中的低聚糖以产生丁醇；以及当所述丁醇产生时，从所述发酵液体培养基中进行所述丁醇的原位移除，其中从所述原料浆液中移除所述不溶解固体提高所述丁醇生产的效率。在一些实施方案中，所述原料是玉米，并且所述油是玉米油。在一些实施方案中，所述不溶解固体包括胚芽、纤维和谷蛋白。在一些实施方案中，所述方法还包括干磨所述原料。在一些实施方案中，所述玉米是未分级的。在一些实施方案中，所述不溶解固体通过卧式螺旋-碟式离心、三相卧螺离心、盘叠式离心、过滤离心、滗析器离心、过滤、真空过滤、带式过滤器、压滤、使用筛网的过滤、筛分、栅滤、多孔栅滤、浮选、水力旋流器、压滤器、螺旋压榨器、重力沉降器、涡旋分离器、或它们的组合进行分离。在一些实施方案中，从所述原料浆液中分离不溶解固体的步骤包括离心所述原料浆液。在一些实施方案中，离心所述原料浆液将所述原料分离成包含所述水溶液的第一液相、包含所述湿饼的固相、以及包含所述油的第二液相。在一些实施方案中，用水洗涤所述湿饼以回收存在于所述湿饼中的低聚糖。在一些实施方案中，所述原位移除包括液-液提取。在一些实施方案中，用于所述液-液提取的提取剂是有机提取剂。在一些实施方案中，糖化所述水溶液中的低聚糖与发酵所述发酵罐中的低聚糖同时发生。在一些实施方案中，所述方法还包括在液化期间提高反应温度的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括在发酵所述发酵罐中的低聚糖之前糖化所述低聚糖。在一些实施方案中，从所述原料浆液中移除不溶解固体的步骤包括离心所述原料浆液。在一些实施方案中，在糖化所述糖之前离心所述原料浆液。在一些实施方案中，所述发酵液体培养基包含重组微生物，所述重组微生物包含丁醇生物合成途径。在一些实施方案中，所述丁醇是异丁醇。在一些实施方案中，从所述原料浆液中移除不溶解固体的步骤通过提高所述丁醇从所述发酵液体培养基到所述提取剂的液-液传质系数而提高所述丁醇生产的效率；通过提高所述丁醇用提取剂的提取效率而提高所述丁醇生产的效率；通过提高所述发酵液体培养基和提取剂之间的相分离速率而提高所述丁醇生产的效率；通过提高提取剂的回收和再循环而提高所述丁醇生产的效率；或通过降低提取剂的流速而提高所述丁醇生产的效率。本发明也涉及生产丁醇的体系，所述体系包括：被构造成液化原料以产生原料浆液的液化容器，所述液化容器包括：用于接纳所述原料的入口；和用于排出原料浆液的出口，其中所述原料浆液包含糖和不溶解固体；离心机，其被构造成从所述原料浆液中移除所述不溶解固体以产生(i)包含所述糖的水溶液和(ii)包含所述不溶解固体部分的湿饼，所述离心机包括：用于接纳所述原料浆液的入口；用于排出所述水溶液的第一出口；用于排出所述湿饼的第二出口；和被构造成发酵所述水溶液以产生丁醇的发酵罐，所述发酵罐包括：用于接纳所述水溶液的第一入口；用于接纳提取剂的第二入口；用于排出所述富含丁醇的提取剂的第一出口；用于排出发酵液体培养基的第二出口。在一些实施方案中，所述离心机还包括用于排出油的第三出口，所述油是在从所述原料浆液中移除所述不溶解固体时产生的。在一些实施方案中，所述设备还包括被构造成糖化所述原料浆液中的糖的糖化容器，所述糖化容器包括：用于接纳所述原料浆液的入口；和用于排出所述原料浆液的出口。在一些实施方案中，所述设备还包括被构造成糖化所述水溶液中的糖的糖化容器，所述糖化容器包括：用于接纳所述水溶液的入口；和用于排出所述水溶液的出口。在一些实施方案中，所述设备还包括被构造成碾磨所述原料的干磨机，所述干磨机包括：用于接纳所述原料的入口；和用于排出经碾磨的原料的出口。
本发明还涉及组合物，其包含：20-35重量％的粗蛋白、1-20重量％的粗脂肪、0-5重量％的甘油三酯、4-10重量％的脂肪酸和2-6重量％的脂肪酸异丁酯。本发明还涉及组合物，其包含：25-31重量％的粗蛋白、6-10重量％的粗脂肪、4-8重量％的甘油三酯、0-2重量％的脂肪酸和1-3重量％的脂肪酸异丁酯。本发明还涉及组合物，其包含：20-35重量％的粗蛋白、1-20重量％的粗脂肪、0-5重量％的甘油三酯、4-10重量％的脂肪酸和2-6重量％的脂肪酸异丁酯。本发明还涉及组合物，其包含：26-34重量％的粗蛋白、15-25重量％的粗脂肪、12-20重量％的甘油三酯、1-2重量％的脂肪酸、2-4重量％的脂肪酸异丁酯、1-2重量％的赖氨酸、11-23重量％的NDF和5-11重量％的ADF。
在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包含可发酵碳和来自所述生物质的不溶解固体以及水的原料浆液；(b)从所述浆液中分离所述不溶解固体的主要部分，从而产生(i)包含可发酵碳的水溶液和(ii)包含固体的湿饼共产物；以及(c)将所述水溶液加到在发酵容器中包含重组微生物的发酵液体培养基中，从而产生发酵产物；其中改善了所述生物质加工生产能力。在一些实施方案中，所述改善的生物质加工生产能力包括相对于在不溶解固体存在的情况下产生的发酵产物改善的发酵产物和共产物的可回收能力。在一些实施方案中，所述改善的生物质加工生产能力包括下列中的一个或多个：提高的工艺流再循环能力、提高的发酵罐体积效率、以及提高的玉米负荷供给。在一些实施方案中，提高的工艺流再循环能力包括一个或多个发酵重组微生物循环、水循环和能量效率。
在一些实施方案中，所述方法还可包括(d)使(c)的发酵液体培养基与提取剂接触，其中所述提取剂相对于包含不溶解固体的发酵液体培养基具有提高的提取效率。在一些实施方案中，提高的提取效率包括下列中的一个或多个：稳定的分配系数、增加的相分离、增加的传质系数、以及提高的工艺流再循环能力。在一些实施方案中，提高的提取效率包括下列中的一个或多个：稳定的提取剂分配系数、增加的提取剂与发酵液体培养基的相分离、增加的液-液传质系数、以及提高的提取剂回收和再循环能力。在一些实施方案中，提高的提取效率包括用于再循环的保存的提取剂。
在一些实施方案中，所述水溶液具有小于约20cps的粘度。在一些实施方案中，所述水溶液包含小于约20g/L的单体葡萄糖。
在一些实施方案中，所述改善的产物可回收能力为产物提供改善的重组微生物耐受性。在一些实施方案中，所述改善的耐受性通过下列中的一个或多个提供：移除抑制剂与不溶解固体或提高液-液传质系数。在一些实施方案中，所述改善的提取剂效率提供改善的重组微生物耐受性。在一些实施方案中，所述改善的重组微生物耐受性通过提取抑制剂、副产物和代谢物提供。
在一些实施方案中，原料浆液包含来自原料的油，并且从步骤(b)中的浆液中分离所述油。在一些实施方案中，所述湿饼包含的原料油的量小于约20％的湿饼干固体含量。
在一些实施方案中，从步骤(b)的原料浆液中分离的不溶解固体的主要部分为按重量计至少约75％的不溶解固体。在一些实施方案中，从步骤(b)的原料浆液中分离的不溶解固体的主要部分为按重量计至少约90％的不溶解固体。在一些实施方案中，从步骤(b)的原料浆液中分离的不溶解固体的主要部分为按重量计至少约95％的不溶解固体。在一些实施方案中，步骤(b)包括离心所述原料浆液。在一些实施方案中，离心所述原料浆液将所述原料分离成包含所述水溶液的第一液相、以及包含所述湿饼的固相。在一些实施方案中，用水洗涤所述湿饼以回收存在于所述湿饼中的糖或糖源。在一些实施方案中，所述包含水溶液的液相被离心超过一次。
在一些实施方案中，所述提取剂是有机提取剂。在一些实施方案中，所述提取剂包括一种或多种不可混溶的有机提取剂，所述不可混溶的有机提取剂选自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、以及它们的混合物。
在一些实施方案中，所述发酵重组微生物是细菌或酵母细胞。
在一些实施方案中，所述产物是产物醇，所述产物醇选自丁醇及其异构体。
在一些实施方案中，所述方法还包括(d)至少部分地蒸发所述发酵液体培养基和(c)的产物以及任选的CO2，其中产生蒸气流，并且从所述蒸气流中回收所述产物。在一些实施方案中，所述方法还包括使蒸气流与吸收液相接触，其中所述蒸气流的至少一部分被吸收到所述吸收液相中，其中在所述蒸气流被吸收到所述吸收液相中的开始的温度大于在所述吸收液相不存在的情况下冷凝所述蒸气流的开始的温度。在一些实施方案中，所述蒸发和接触步骤在真空条件下进行。在一些实施方案中，从所述浆液中分离所述不溶解固体的主要部分可提供所述发酵液体培养基的相对于包含不溶解固体的发酵液体培养基的更高的蒸气压。在一些实施方案中，所述更高的蒸气压提供更有效的蒸发产物回收。在一些实施方案中，所述更有效的蒸发产物回收包括下列中的一个或多个：更低的资金投资，更小的蒸发、吸收、压缩和冷却设备，改善的传质速率，更少的蒸发能量，以及更低的吸收剂流速。
在一些实施方案中，分离不溶解固体的主要部分以使不溶解固体的淀粉损失最小化。在一些实施方案中，通过进行一个或多个最优化操作最小化淀粉损失，所述最优化操作包括控制温度、酶浓度、pH、玉米粉粒度和液化期间的反应时间；离心操作条件；和湿饼洗涤条件。
在一些实施方案中，进一步加工所述湿饼以提供改善的共产物。在一些实施方案中，将所述共产物进一步加工成DDGS。在一些实施方案中，所述DDGS具有改善的产物特征，其包含相对于在不溶解固体存在的情况下产生的DDGS更少的原料油。在一些实施方案中，所述DDGS具有改善的产物特征，使得所述DDGS的生产具有与发酵液体培养基、重组微生物、发酵产物、和提取剂最少的接触污染。在一些实施方案中，通过上述方法产生的DDGS符合有机动物饲料的膳食标签要求。
在一些实施方案中，发酵液体培养基包括发酵产物部分和玉米油部分，其比率为按重量计至少约4∶1，其中所述液体培养基基本上不含不溶解固体。在一些实施方案中，所述玉米油部分包含至少约15重量％的游离脂肪酸。在一些实施方案中，所述发酵液体培养基包含按重量计不超过约15％的不溶解固体。在一些实施方案中，所述发酵液体培养基包含按重量计不超过约10％的不溶解固体。在一些实施方案中，所述发酵液体培养基包含按重量计不超过约5％的不溶解固体。
在一些实施方案中，离心产物特征包括一层不溶解固体、一个玉米油层和一个包含可发酵糖的上清液层，其中在上清液层中的可发酵糖对不溶解固体层中的不溶解固体的重量比在约2∶1至约5∶1的范围内；在上清液层中的可发酵糖对玉米油层中的玉米油的重量比在约10∶1至约50∶1的范围内；并且在不溶解固体层中的不溶解固体对玉米油层中的玉米油的重量比在约2∶1至约25∶1的范围内。
在一些实施方案中，生产丁醇的方法包括以下步骤：(a)提供玉米原料；(b)液化所述玉米原料以产生原料浆液，其中所述原料浆液包含糖、玉米油和不溶解固体；(c)从所述原料浆液中移除不溶解固体以产生(i)包含糖的水溶液，(ii)包含不溶解固体的湿饼，和(iii)游离玉米油相；(d)在发酵罐中使所述水溶液与液体培养基接触；(e)使所述发酵罐中的糖发酵以产生丁醇；以及(f)当所述丁醇产生时，从所述液体培养基中进行所述丁醇的原位移除，其中从所述原料浆液中移除所述不溶解固体提高所述丁醇生产的效率。在一些实施方案中，不溶解固体包括胚芽、纤维和谷蛋白。在一些实施方案中，所述方法还包括干磨玉米原料。在一些实施方案中，所述玉米是未分级的。
在一些实施方案中，步骤(c)包括离心所述原料浆液。在一些实施方案中，离心所述原料浆液将所述原料浆液分离成包含所述水溶液的第一液相、包含所述湿饼的固相、以及包含所述游离玉米油的第二液相。在一些实施方案中，用水洗涤所述湿饼以回收存在于所述湿饼中的糖。在一些实施方案中，所述包含水溶液的液相被离心超过一次。在一些实施方案中，从步骤(c)的原料浆液中移除按重量计至少约75％的不溶解固体。在一些实施方案中，从步骤(c)的原料浆液中移除按重量计至少约90％的不溶解固体。在一些实施方案中，从步骤(c)的原料浆液中移除按重量计至少约95％的不溶解固体。
在一些实施方案中，所述原位移除包括液-液提取。在一些实施方案中，用于所述液-液提取的提取剂是有机提取剂。在一些实施方案中，所述有机提取剂包括油醇。
在一些实施方案中，所述液体培养基包含微生物。在一些实施方案中，所述微生物是细菌或酵母细胞。
在一些实施方案中，一部分液体培养基流出发酵罐并且所述方法还包括从中分离存在于液体培养基部分中的酵母并将分离的酵母返送回发酵罐中。在一些实施方案中，部分液体培养基包含存在于原料浆液中的按重量计不超过约25％的不溶解固体。在一些实施方案中，部分液体培养基包含存在于原料浆液中的按重量计不超过约10％的不溶解固体。在一些实施方案中，部分液体培养基包含存在于原料浆液中的按重量计不超过约5％的不溶解固体。
在一些实施方案中，糖化所述水溶液中的糖与发酵所述发酵罐中的糖同时发生。在一些实施方案中，所述方法还包括在发酵所述发酵罐中的糖之前糖化所述糖。在一些实施方案中，步骤(c)包括离心所述原料浆液。在一些实施方案中，离心所述原料浆液发生在糖化所述糖之前。在一些实施方案中，离心所述原料浆液发生在糖化所述糖之后。
在一些实施方案中，所述丁醇是异丁醇。在一些实施方案中，步骤(c)通过提高所述丁醇从所述液体培养基到所述提取剂的液-液传质系数而提高所述丁醇生产的效率。在一些实施方案中，步骤(c)通过提高所述丁醇用提取剂的提取效率而提高所述丁醇生产的效率。在一些实施方案中，步骤(c)通过提高所述液体培养基和提取剂之间的相分离速率而提高所述丁醇生产的效率。在一些实施方案中，步骤(c)通过提高提取剂的回收和再循环而提高所述丁醇生产的效率。在一些实施方案中，步骤(c)通过降低提取剂的流速而提高所述丁醇生产的效率。
在一些实施方案中，步骤(c)包括下列中的一个或多个：稳定的提取剂分配系数、提高的发酵罐体积频率、提高的玉米负荷供给、提高的发酵重组微生物再循环、提高的水的再循环、提高的能量效率、改善的重组微生物对丁醇的耐受性、降低的水相滴度、以及改善的DDGS价值。
在一些实施方案中，生产丁醇的体系包括：(a)被构造成液化原料以产生原料浆液的液化容器，所述液化容器包括：用于接纳所述原料的入口，用于排出原料浆液的出口，其中所述原料浆液包含糖和不溶解固体；(b)离心机，其被构造成从所述原料浆液中移除所述不溶解固体以产生(i)包含所述糖的水溶液和(ii)包含所述不溶解固体部分的湿饼，所述离心机包括：用于接纳所述原料浆液的入口，用于排出所述水溶液的第一出口，和用于排出所述湿饼的第二出口；和(c)用于发酵所述发酵罐中的水溶液以产生丁醇的发酵罐，所述发酵罐包括：用于接纳所述水溶液的第一入口，用于接纳提取剂的第二入口，以及用于排出所述富含丁醇的提取剂的第一出口，和用于排出发酵液体培养基的第二出口。在一些实施方案中，所述离心机还包括用于排出油的第三出口，所述油是在从所述原料浆液中移除所述不溶解固体时产生的。在一些实施方案中，所述体系还包括被构造成糖化所述原料浆液中的糖的糖化容器，所述糖化容器包括：用于接纳所述原料浆液的入口，和用于排出所述原料浆液的出口。在一些实施方案中，所述体系还包括被构造成糖化所述水溶液中的糖的糖化容器，所述糖化容器包括：用于接纳所述水溶液的入口和用于排出所述水溶液的出口。在一些实施方案中，所述体系还包括被构造成碾磨所述原料的干磨机，所述干磨机包括：用于接纳所述原料的入口，和用于排出经碾磨的原料的出口。
在一些实施方案中，在离心机中从玉米醪浆液中形成的湿饼(其中所述湿饼包含不溶解固体)包括存在于玉米醪浆液中的按重量计至少约75％的不溶解固体。在一些实施方案中，所述湿饼包括存在于玉米醪浆液中的按重量计至少约90％的不溶解固体。在一些实施方案中，所述湿饼包括存在于玉米醪浆液中的按重量计至少约95％的不溶解固体。
在一些实施方案中，在离心机中从玉米醪浆液中形成的水溶液(其中所述水溶液包含不溶解固体)包括存在于玉米醪浆液中的按重量计不超过约25％的不溶解固体。在一些实施方案中，所述水溶液包括存在于玉米醪浆液中的按重量计不超过约10％的不溶解固体。在一些实施方案中，所述水溶液包括存在于玉米醪浆液中的按重量计不超过约5％的不溶解固体。
附图简述
并入本文并成为说明书的一部分的附图示出了本发明并且与说明书一起进一步解释本发明的原理并使得本领域的技术人员能够利用本发明。
图1图示了本发明的示例性方法和体系，其中不溶解固体在液化后并且在发酵之前从离心机中移除。
图2图示了本发明示例性的替代方法和体系，其中原料被碾磨。
图3图示了本发明另一个示例性的替代方法和体系，其中所述离心机排出油流。
图4图示了本发明另一个示例性的替代方法和体系，其中将糖化容器置于离心机和发酵罐之间。
图5图示了本发明另一个示例性的替代方法和体系，其中将糖化容器置于液化容器和离心机之间。
图6图示了本发明另一个示例性的替代方法和体系，其中利用两个连续离心机移除不溶解固体。
图7示出了存在的不溶解玉米醪固体对总体积传质系数kLa的效应，该传质系数用于将i-BuOH从液化玉米淀粉(即，低聚糖)的水溶液传送到油醇液滴的分散体中，所述液滴当使用具有2.03mm内径的喷嘴分散油醇时流经鼓泡塔反应器。
图8示出了存在的不溶解玉米醪固体对总体积传质系数kLa的效应，该传质系数用于将i-BuOH从液化玉米淀粉(即，低聚糖)的水溶液传送到油醇液滴的分散体中，所述液滴当使用具有0.76mm内径的喷嘴分散油醇时流经鼓泡塔反应器。
图9示出了发酵样品管中根据(重力)沉降时间的液-液界面的位置。相分离数据示出运行时间：5.3小时、29.3小时、53.3小时和70.3小时的运行时间。来自提取发酵的样品数据，其中从醪进料中移除固体，并且OA是溶剂(2010Y035)。
图10示出了最终液体培养基中根据(重力)沉降时间的液-液界面的位置。来自提取发酵的数据，其中从醪进料中移除固体，并且OA是溶剂(2010Y035)。
图11示出了根据批次1和批次2时间的浆液水相中的葡萄糖浓度。
图12示出了根据批次3和批次4时间的浆液水相中的葡萄糖浓度。
图13示出了酶负荷和在液化期间某些时段施用+/-高温阶段对淀粉转化的效应。
发明详述
除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本专利申请(包括其定义)为准。此外，除非上下文另有所需，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。为所有目的，所有的出版物、专利、以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。
为了进一步限定本发明，本文提供了以下术语和定义。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它们的任何其它变型将被理解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另外特别说明，否则“或”是指包含性的或，而不是指排他性的或。例如，以下任何一个均表示满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
同样，涉及元素或组分实例(即次数)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”为非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施方案，而是涵盖如专利申请所述的所有可能的实施方案。
如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于产生浓缩物或溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等。术语“约”还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施方案中，术语“约”指在报告数值的10％范围内，或者在报告数值的5％范围内。
如本文所用，“生物质”指包含可水解多糖的天然产物，所述多糖提供可发酵糖，包括来源于天然来源如玉米、甘蔗、小麦、纤维素或木质纤维素材料以及包含纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖、二糖和/或单糖、以及它们的混合物的材料的任何糖和淀粉。生物质也可包含附加组分如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物。例如，生物质可包括玉米棒和玉米秸秆的混合物，或草和叶的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于：玉米粒、玉米棒、作物残余物如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、黑麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、由谷物的研磨获得的组分、树、枝、根、叶、木片、木屑、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。例如，可通过本领域已知的任何加工方法，利用发酵加工生物质以从生物质中形成麦芽浆、果汁、糖蜜或水解产物，所述方法例如研磨、处理和/或液化，并且它们包含可发酵糖并可包含水。例如，可通过本领域技术人员已知的任何方法来加工纤维素和/或木质纤维素生物质以获得包含可发酵糖的水解产物。在美国专利公开申请公布2007/0031918A1中公开了低氨预处理，该专利申请以引用方式并入本文。纤维素和/或木质纤维素生物质的酶促糖化通常利用酶聚生体来降解纤维素和半纤维素以产生包含糖的水解产物，所述糖包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。(适用于纤维素和/或木质纤维素生物质的糖化酶参见Lynd等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.66：506-577，2002)。
如本文所用，干酒糟及可溶物(Dried Distillers′Grains with Solubles，DDGS)指来自原料或生物质发酵的共产物或副产物(例如发酵谷物或谷物混合物产生产物醇)。在一些实施方案中，DDGS也可指由产物醇(例如丁醇、异丁醇等)制备方法产生的动物饲料。
如本文所用，“可发酵的碳源”或“可发酵的碳底物”是指能被微生物代谢的碳源。适宜的可发酵碳源包括但不限于单糖，如葡萄糖或果糖；二糖，如乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖，如淀粉或纤维素；一碳底物；以及它们的混合物。
如本文所用，“可发酵糖”是指能够由本文所公开的微生物代谢以产生发酵醇的一种或多种糖。
如本文所用，“原料”是指发酵过程中的原料，所述原料包含具有或不具有不溶固体的可发酵碳源，并且如果适用，所述原料在通过进一步加工(例如通过液化、糖化、或其它方法)已经从淀粉中释放可发酵碳源或从复糖降解中获取可发酵碳源之前或之后包含可发酵碳源。原料包括或来源于生物质。合适的原料包括但不限于黑麦、小麦、玉米、玉米醪、甘蔗、甘蔗醪、大麦、纤维素材料、木质纤维素材料、或它们的混合物。至于“原料油，”应当理解该术语涵盖由给定原料产生的油。
如本文所用，“发酵液体培养基”是指水、糖(可发酵碳源)、液化固体、任选地微生物产生的醇、产物醇及发酵容器内具有的所有其它物质组分的混合物，其中产物醇通过在微生物存在的情况下使糖反应生成醇、水和二氧化碳(CO2)而制得。有时，如本文所用，术语“发酵培养基”和“发酵混合物”可与“发酵液体培养基”同义使用。
如本文所用，“发酵容器”是指其中进行发酵反应的容器，产物醇如丁醇通过发酵反应由糖制备。本文中术语“发酵罐”可与“发酵容器”同义使用。
如本文所用，“糖化容器”指其中进行糖化(即，将低聚糖降解成单糖)的容器。在发酵和糖化同时发生的情况下，所述糖化容器和发酵容器可为相同容器。
如本文所用，“糖化酶”指能够水解多糖和/或低聚糖例如糖原或淀粉的α-1，4-糖苷键的一种或多种酶。糖化酶也可包括能够水解纤维素或木质纤维素材料的酶。
如本文所用，“液化容器”指其中进行液化的容器。液化是其中低聚糖从原料中释放出来的过程。在其中原料是玉米的实施方案中，低聚糖在液化期间从玉米淀粉内容物中释放出来。
如本文所用，“糖”指低聚糖、二糖、单糖、和/或它们的混合物。术语“糖类”也包括碳水化合物，包括淀粉、右旋糖苷、糖原、纤维素、戊聚糖、以及糖。
如本文所用，“不溶解固体”指原料的不可发酵部分，其不溶解在液相中，例如胚芽、纤维和谷蛋白。例如，原料的不可发酵部分包括保持固体状态并且能够从发酵液体培养基中吸收液体的原料部分。
如本文所用，“提取剂”指用于提取任何丁醇异构体的有机溶剂。
如本文所用，“原位产物移除(ISPR)”指从诸如发酵的生物过程中，当产物生成时选择性移出具体的发酵产物以控制生物过程中的产物浓度。
如本文所用，“产物醇”指在发酵过程中能够由微生物产生的任何醇，所述微生物利用生物质作为可发酵碳底物的来源。产物醇包括但不限于C1-C8烷醇。在一些实施方案中，产物醇为C2-C8烷醇。在其他实施方案中，产物醇为C2-C5烷醇。应当理解，C1-C8烷醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。同样地，C2-C8烷醇包括但不限于乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。“醇”在本文中也用于指产物醇。
如本文所用，“丁醇”特指以单独或其混合物形式的丁醇异构体1-丁醇(1-BuOH)、2-丁醇(2-BuOH)、叔丁醇(叔-BuOH)、和/或异丁醇(iBuOH、i-BuOH或I-BUOH)。
如本文所用，“丙醇”指丙醇异构体异丙醇或1-丙醇。
如本文所用，“戊醇”指戊醇异构体1-戊醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、2，2-二甲基-1-丙醇、3-戊醇、2-戊醇、3-甲基-2-丁醇、或2-甲基-2-丁醇。
如本文所用，术语“水相滴度”是指发酵液体培养基中特定醇(例如丁醇)的浓度。
如本文所用，术语“有效滴度”指每升发酵培养基发酵产生的特定醇(例如丁醇)总量或醇酯化产生的醇酯的当量醇。
术语“与水不混溶的”或“不溶解的”是指化学组分如提取剂或溶剂不能够以形成单一液相的形式与水溶液如发酵液体培养基混合。
如本文所用，术语“水相”是指通过使发酵液体培养基接触与水不混溶的有机提取剂而获得的两相混合物中的水相。在本文所述包括发酵提取的方法的一个实施方案中，术语“发酵液体培养基”具体地指在双相发酵提取中的水相。
如本文所用，术语“有机相”是指通过使发酵液体培养基接触与水不混溶的有机提取剂而获得的两相混合物中的非水相。
本发明提供通过发酵生产发酵产物如产物醇以及提高生物质加工生产能力和成本效果的体系和方法。在一些实施方案中，产物醇为丁醇。可液化原料以产生原料浆液，其中原料浆液包括可液化的糖和不溶解固体。如果将原料浆液直接进料于发酵罐，所述不溶解固体可妨碍从发酵罐中有效地移除并回收产物醇如丁醇。具体地讲，当利用液-液提取从发酵液体培养基中提取丁醇时，存在的不溶解颗粒可通过妨碍提取剂和发酵液体培养基间的接触引起体系失效，包括但不限于降低丁醇到提取剂的传质速率；在发酵罐中产生乳液并从而妨碍提取剂和发酵液体培养基的良好相分离；降低提取剂的回收和再利用效率，因为至少一部分提取剂和丁醇被“捕集”在固体中，它们最后作为干酒糟及可溶物(DriedDistillers′Grains with Solubles，DDGS)被移除；降低发酵罐体积效率，因为固体占据发酵罐的体积并且因为提取剂从发酵液体培养基中分离更慢；以及通过污染玉米油缩短提取剂的循环寿命。所有这些效应导致更高的资金和运行成本。此外，被“捕集”在DDGS中的提取剂可降低作为动物饲料销售的DDGS的价值和资质。因此，为了避免和/或最小化这些问题，在将原料浆液中存在的糖加入发酵罐之前从原料浆液中移除至少一部分不溶解颗粒(或固体)。相对于对包含其中尚未移除不溶解颗粒的水溶液的发酵液体培养基进行的提取，当对包含其中已经移除了不溶解颗粒的水溶液的发酵液体培养基进行提取时，提取活性和丁醇生产效率提高。
本发明的体系和方法将根据所述图进行描述。在一些实施方案中，例如如图1所示，所述体系包括液化容器10，它被构造成液化原料以产生原料浆液。
具体地讲，可将原料12导入液化容器10的入口。原料12可为工业中已知的任何合适的生物质材料，包括但不限于黑麦、小麦、甘蔗、或玉米，它们包含可发酵碳源如淀粉。
液化原料12的方法涉及将原料12中的淀粉水解成水溶性糖，并且它是一种常规方法。可使用工业上通常利用的任何已知的液化方法以及相应的液化容器，包括但不限于酸方法、酸-酶方法、或酶方法。可单独或组合使用此类方法。在一些实施方案中，可利用所述酶方法并且可将适用的酶14例如α-淀粉酶导入液化容器10的入口。也可将水导入液化容器10。
液化原料12的方法产生原料浆液16，其包括来自原料或生物质的糖(例如可发酵碳)和不溶解固体。不溶解固体是原料12的不可发酵部分。在一些实施方案中，原料12可为玉米，例如干磨的、未分级的玉米籽粒，并且不溶解的颗粒可包括胚芽、纤维和谷蛋白。原料浆液16可从液化容器10的出口排出。在一些实施方案中，原料12是玉米或玉米籽粒，并且原料浆液16是玉米醪浆液。
离心机20被构造成从原料浆液16中移除不溶解固体，它具有用于接纳原料浆液16的入口。离心机20搅拌或旋转原料浆液16以产生液相或水溶液22和固相或湿饼24。
水溶液22可包括糖例如低聚糖形式的糖、以及水。水溶液可包含按重量计至少约10％的低聚糖，按重量计至少约20％的低聚糖，或者按重量计至少约30％的低聚糖。水溶液22可从位于靠近离心机20顶部处的出口排出。水溶液可具有小于约20厘泊的粘度。水溶液可包含小于约20g/L的单体葡萄糖，更优选地小于约10g/L，或小于约5g/L的单体葡萄糖。用于测定单体葡萄糖量的适用方法是本领域熟知的。本领域已知的此类适用方法包括HPLC。
湿饼24可包括不溶解固体。湿饼24可从出口排出，所述出口位于靠近离心机20底部的地方。湿饼24也可包括一部分糖和水。一旦已经从离心机20中排出了水溶液22，可用附加的水在离心机20中洗涤湿饼24。作为另外一种选择，可用附加的水在另外的离心机中洗涤湿饼24。洗涤湿饼24将回收存在于湿饼中的糖或糖源(例如低聚糖)，并且可将回收的糖和水再循环到液化容器10中。在洗涤后，可通过任何合适的已知方法干燥湿饼24以形成干酒糟及可溶物(Dried Distillers′Grains with Solubles，DDGS)。由在离心机20中形成的湿饼24形成DDGS具有多个优点。因为不溶解固体不进入发酵罐，提取剂和/或丁醇不被捕集在DDGS中，DDGS不经受发酵罐的条件，并且DDGS不接触发酵罐中存在的微生物。所有这些效果为随后的DDGS(例如作为动物饲料)加工和销售提供有益效果。
离心机20可为工业中利用的任何常规离心机，包括例如卧式螺旋-碟式离心机、三相卧螺离心机、盘叠式离心机、过滤离心机、或滗析器离心机。在一些实施方案中，从原料浆液16中移除不溶解固体可通过过滤、真空过滤、带式过滤、压滤、使用筛网的过滤、筛分、栅或栅滤、多孔栅滤、浮选、水力旋流器、压滤器、螺旋压榨器、重力沉降器、涡旋分离器、或可用于从液体中分离固体的任何方法来完成。在一个实施方案中，可从玉米醪中移除不溶解固体以形成两种产物流，例如与玉米醪相比包含更低浓度固体的低聚糖水溶液和与玉米醪相比湿饼包含更高浓度固体的湿饼。此外，如果利用三相卧螺离心机从玉米醪中移除固体，可产生包含玉米油的第三物流。同样地，可使用不同的分离技术或其组合产生多个产物流。
在一些实施方案中，湿饼24是由原料浆液16形成的组合物，例如在离心机20中的玉米醪浆液，其中湿饼24包括存在于原料浆液中的按重量计至少约50％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计至少约55％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计至少约60％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计至少约65％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计至少约70％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计至少约75％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计至少约80％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计至少约85％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计至少约90％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计至少约95％的不溶解颗粒，或存在于原料浆液中的按重量计约99％的不溶解颗粒.
在一些实施方案中，水溶液22由原料浆液16形成，例如在离心机20中的玉米醪浆液包括存在于原料浆液中的按重量计不超过约50％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约45％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约40％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约35％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约30％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约25％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约20％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约15％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约10％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约5％的不溶解颗粒，或存在于原料浆液中的按重量计约1％的不溶解颗粒。
发酵罐30被构造成发酵水溶液22以产生丁醇，其具有用于接纳水溶液22的入口。发酵罐30可包括发酵液体培养基。微生物32选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母，将其导入发酵罐30，包括中发酵液体培养基中。在一些实施方案中，微生物32可为细菌如大肠杆菌。在一些实施方案中，微生物32可为酿酒酵母。微生物32消耗水溶液22中的糖并产生丁醇。利用微生物以及产生高生产能力丁醇的微生物发酵生产丁醇是已知的，并且被公开在例如美国专利公开申请公布2009/0305370中，其公开内容全文并入本文。在一些实施方案中，微生物32可为发酵重组微生物。
在一些实施方案中，微生物32经工程化以包含生物合成途径。在一些实施方案中，生物合成途径是丁醇生物合成途径。在一些实施方案中，生物合成途径将丙酮酸转化成发酵产物。在一些实施方案中，生物合成途径包含至少一种异源性多核苷酸，其编码的多肽催化底物到产物的转化的生物合成途径。在一些实施方案中，每个底物到产物的转化的生物合成途径由异源多核苷酸编码的多肽催化。
当微生物产生丁醇时，可利用原位产物移除(ISPR)例如液-液提取从发酵罐30中移除丁醇。下文简述了液-液提取并且可根据美国专利公开申请公布2009/0305370所述的方法进行液-液提取，其公开内容全文并入本文。
发酵罐30具有用于接纳提取剂34的入口。提取剂34可为有机提取剂，其选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们的混合物)C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、以及它们的混合物。提取剂还可为有机提取剂，其选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们的混合物)C4-C22脂肪醇、C4-C28脂肪酸、C4-C28脂肪酸酯、C4-C22脂肪醛、以及它们的混合物。提取剂34可为所述有机提取剂例如油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、十四醇、硬脂醇、1-十一醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、十一醛、月桂醛、20-甲基十一醛、以及它们的混合物。提取剂34接触发酵液体培养基并且将存在于发酵液体培养基中的丁醇转移到提取剂34中。富含丁醇的提取剂流36通过发酵罐30中的出口排出。随后使用常规技术从物流36中的提取剂中分离丁醇。可将进料流加到发酵罐30中。发酵罐30可为本领域已知的任何适用发酵罐。
在一些实施方案中，可在发酵罐30中发生同步糖化和发酵。可使用工业上通常利用的任何已知的糖化方法，包括但不限于酸方法、酸-酶方法、或酶方法。在一些实施方案中，可将酶38如葡糖淀粉酶导入发酵罐30中的入口以将存在于水溶液22中的低聚糖形式的糖降解成单糖。
在一些实施方案中，可从发酵罐30的出口排出发酵液体培养基40。排出的发酵液体培养基40可包括微生物32如酵母。微生物32可容易地与发酵液体培养基40分离，例如在离心机(未示出)中分离。微生物32然后可再循环到发酵罐30中，其随时间可提高丁醇的生产速率，从而导致丁醇生产效率的提高。
当一部分发酵液体培养基40流出发酵罐30时，发酵液体培养基40包括存在于原料浆液中的按重量计不超过约50％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约45％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约40％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约35％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约30％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约25％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约20％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约15％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约10％的不溶解颗粒，存在于原料浆液中的按重量计不超过约5％的不溶解颗粒，或存在于原料浆液中的按重量计不超过约1％的不溶解颗粒。
在一些实施方案中，例如如图2所示，本发明的体系和方法可包括被构造成干磨原料52的干磨机50。原料52可为与图1的原料12相同的原料，并且可通过入口进入干磨机50。干磨机50可干磨或碾磨原料52。在一些实施方案中，原料52可为未分级的。在一些实施方案中，原料52可为未分级的玉米籽粒。干磨机50可为任何适用的已知干磨机，例如锤磨机。经干磨的原料54通过出口从干磨机50中排出并进入液化容器10。图2的剩余部分与图1相同并且未再进行描述。在其它实施方案中，原料可为分级的和/或湿磨的，这已知在工业中作为未分级的和/或干磨的替代。
湿磨法是多步方法，其将生物质(例如玉米)分离成它的主要组分(胚芽、果皮纤维、淀粉和谷蛋白)以分别从每个共产物获取价值。这个方法提供纯化的淀粉流；然而，它是昂贵的并且包括将生物质分离成它的非淀粉组分，这对醇的发酵生产是不必要的。分级移除纤维和胚芽，其包含存在于经碾磨的完整玉米中的大部分脂质，产生具有更高淀粉(胚乳)含量的分级玉米。干燥分级不会从纤维中分离胚芽，因此它比湿磨法更便宜。然而，分级不会移除全部纤维或胚芽，并且不移除全部固体。此外，在分级过程中存在一些淀粉损失。湿磨玉米比干燥分级更昂贵，但是干燥分级比干磨未分级的玉米更昂贵。
在一些实施方案中，例如如图3所示，本发明的体系和方法可包括从离心机20的出口排出油26。图3与图1相同，不同的是油流26流出离心机20并因此将不再次进行详述。
原料浆液16分离成包含可发酵糖的第一液相或水溶液22、包含不溶解固体的固相或湿饼24、以及包含可流出离心机20的油26的第二液相。在一些实施方案中，原料12是玉米，并且油26是游离玉米油。如本文所用，术语游离玉米油指从玉米胚芽中游离出的玉米油。可使用任何合适的常规离心机如三相卧螺离心机排出水溶液22、湿饼24和油26。在一些实施方案中，当原料是玉米时，来自原料12的一部分油如玉米油保留在湿饼24中。在此类情况下，湿饼24包含的玉米油量为按重量计小于约20％的湿饼24的干固体含量。
在一些实施方案中，当从离心机20中移除原料12(例如玉米)和玉米油26时，发酵罐30中的发酵液体培养基包括减量的玉米油。例如，发酵液体培养基基本上不含不溶解固体，它可包括重量比为至少约4∶1的产物醇部分(例如丁醇)和油部分(例如玉米油)。玉米油可包含按重量计至少15％的游离脂肪酸，例如按重量计16.7％的游离脂肪酸。在一些实施方案中，所述发酵液体培养基具有按重量计不超过约25％的不溶解固体，所述发酵液体培养基具有按重量计不超过约15％的不溶解固体，所述发酵液体培养基具有按重量计不超过约10％的不溶解固体，所述发酵液体培养基具有按重量计不超过约5％的不溶解固体，所述发酵液体培养基具有按重量计不超过约1％的不溶解固体，或者所述发酵液体培养基具有按重量计不超过约0.5％的不溶解固体。
在一些实施方案中，离心机20产生的产物特征包括一层不溶解固体、一层油(例如玉米油)和一个包含可发酵糖的上清液层。在上清液层中的可发酵糖对在不溶解固体层中的不溶解固体的重量比可在约2∶1至约5∶1的范围内；在上清液层中的可发酵糖对玉米油层中的玉米油的重量比可在约10∶1至约50∶1的范围内；和/或在不溶解固体层中的不溶解固体对玉米油层中的玉米油的重量比可在约2∶1至约25∶1的范围内。
在一些实施方案中，除图3的体系和方法之外，可修改图2的体系和方法以包括如上所述从离心机20中排出油流。
如果不单独排出油26，它可与湿饼24一起被移除。当经由离心机20移除湿饼24时，在一些实施方案中，当原料是玉米时，来自原料12的一部分油如玉米油保留在湿饼24中。一旦已经从离心机20中排出水溶液22，可用附加的水在离心机中洗涤湿饼24。洗涤湿饼24将回收存在于湿饼中的糖(例如低聚糖)，并且可将回收的糖和水再循环到液化容器10中。在洗涤后，湿饼24可与可液化物结合，然后通过任何合适的已知方法进行干燥以形成干酒糟及可溶物(Dried Distillers′Grains with Solubles，DDGS)。由在离心机20中形成的湿饼24形成DDGS具有多个优点。因为不溶解固体不进入发酵容器中，提取剂和/或产物醇如丁醇不被捕集在DDGS中，它不经受发酵容器的条件，并且它不接触发酵容器中存在的微生物。所有这些有益效果使它更易于加工和销售DDGS，例如以动物饲料形式加工和销售。在一些实施方案中，油26不与湿饼24分开排出，而是将油26包括在湿饼24中，作为它的一部分，并且最终存在于DDGS中。在此类情况下，所述油可与DDGS分开并且转化成ISPR提取剂，随后用于相同或不同的醇发酵方法。
可使用任何合适的已知方法将油26与DDGS分开，所述方法包括例如溶剂提取方法。在本发明的一个实施方案中，将DDGS载入提取容器中并用溶剂如己烷洗涤以移除油26。可利用的其他溶剂包括例如异丁醇、异己烷、乙醇、石油馏分如石油醚、或它们的混合物。在油26提取后，可处理DDGS以移除任何残余的溶剂。例如，可使用任何本领域已知的方法加热DDGS以蒸发任何残余的溶剂。在移除溶剂后，DDGS可经受干燥过程以移除任何残余的水。经加工的DDGS可用作动物如家禽、牲畜、和家养宠物的饲料补充剂。
在从DDGS中提取后，可收集所得油26和溶剂混合物以从溶剂中分离油26。在一个实施方案中，可通过蒸发加工油26/溶剂混合物，从而蒸发和收集、再利用溶剂。可将回收的油转化成ISPR提取剂，随后用于相同或不同的醇发酵过程。
移除原料的油组分有利于丁醇生产，因为存在于发酵罐中的油可降解成脂肪酸和甘油。甘油可在水中积聚并减少可用于整个体系再循环的水量。因此，移除原料的油组分通过提高可通过所述体系再循环的水量提高产物醇的生产效率。
在一些实施方案中，例如如图4和图5所示，糖化可发生在分开的糖化容器60中，其位于离心机20和发酵罐30之间(图4)或位于液化容器10和离心机20之间(图5)。图4和5与图1相同，不同的是包括分开的糖化容器60并且发酵罐30不接纳酶38。
如上所述，可使用工业上通常利用的任何已知的糖化方法，包括但不限于酸方法、酸-酶方法、或酶方法。糖化容器60可为任何合适的已知糖化容器。在一些实施方案中，可将酶38如葡糖淀粉酶导入糖化容器60中的入口以将低聚糖形式的糖降解成单糖。例如在图4中，存在于从离心机20中排出并通过入口被接纳在糖化容器60中的含水物流22中的低聚糖降解成单糖。因此，包含单糖的水溶液62通过出口从糖化容器60中排出并流入发酵罐30中。作为另外一种选择，如图5所示，存在于从液化容器10中排出并通过入口被接纳在糖化容器60中的原料物流16中的低聚糖降解成单糖。因此，包含单糖的原料物流64通过出口从糖化容器60中排出并流入离心机20中。
在一些实施方案中，除图4和5的体系和方法之外，可修改图2和3的体系和方法以包括如上所述分开的糖化容器60。
在一些实施方案中，例如如图6所示，本发明的体系和方法可包括两个或更多个系列离心机。图6与图1相同，不同的是添加了第二离心机20′并因此将不再次进行详述。
排出离心机20的水溶液22可被离心机20′的入口接纳。离心机20′可与离心机20相同并且可以相同方式运行。离心机20′可移除不溶解固体，其在离心机20中不与水溶液22分开，从而产生(i)类似于含水物流22，但是与含水物流22相比包含更少量不溶解固体的含水物流22′，和(ii)类似于湿饼24的湿饼24′。然后可将含水物流22′导入发酵罐30。在一些实施方案中，在离心机20′后可存在一个或多个附加的离心机。
在一些实施方案中，除图6的体系和方法之外，可如上所述修改图2-6的体系和方法以包括附加的离心机用于移除不溶解固体。
在一些实施方案中，可从发酵罐30的出口排出发酵液体培养基40。缺乏或最小化与发酵液体培养基40一起排出发酵罐30的不溶解固体具有多个附加的有益效果。例如，可无需下游加工中的单位和操作，例如醪塔或蒸馏塔，从而产生产物醇生产的效率提高。可移除一些或全部完全釜馏物离心机，因此在流出发酵罐的最终液体培养基中不溶解固体更少。
图1-6中公开的方法和体系包括从原料浆液16中移除不溶解固体并因此改善生物质的加工生产能力和成本效果。改善的生产能力可包括相对于在发酵之前不移除不溶解固体的体系和方法提高的丁醇生产效率和/或提高的提取活性。
如上所述，还可进一步加工不溶解固体以产生其他副产物如DDGS或脂肪酸酯。例如，可回收脂肪酸酯以提高碳水化合物至产物醇(例如丁醇)的生产能力。这可通过使用溶剂从例如通过组合并混合多个副产物流并干燥组合与混合步骤的产物形成的副产物中提取脂肪酸酯来完成。这种用于从DDGS中回收玉米油甘油三酯的溶剂型提取体系在美国专利公开申请公布2010/0092603中进行了描述，其教导以引用方式并入本文。
在脂肪酸酯的溶剂提取的一个实施方案中，可从完整釜馏物(“分离固体”)中分离固体，因为所述流将包含在未组合副产物流中最大部分的脂肪酸酯。然后可将这些分离的固体进料于提取器并用溶剂洗涤。在一个实施方案中，翻转分离固体至少一次以确保分离固体的所有侧面受到溶剂洗涤。在洗涤后，收集已知作为混杂油的所得脂质和溶剂的混合物，从而从溶剂中分离提取的脂质。例如，可将所得脂质和溶剂的混合物沉淀到分隔体中进行进一步加工。在提取过程中，当溶剂洗涤分离固体时，该溶剂不仅将脂质带入溶液，而且它收集细小的固体颗粒。这些“细小颗粒”一般是混杂油中的非期望杂质，并且在一个实施方案中，所述混杂油可从提取器或分隔体中通过将所述细小颗粒从混杂油中分离或洗掉的装置排出。
为了分离混杂油中包含的脂质和溶剂，所述混杂油可经受蒸馏步骤。在这个步骤中，所述混杂油可例如通过蒸发器进行加工，所述蒸发器将混杂油加热到足够高的温度以引起溶剂的蒸发，但是该温度不足以不利地影响或蒸发提取的脂质。当溶剂蒸发时，可将其收集，例如在冷凝器中收集，并在将来再利用。从混杂油中分离溶剂产生粗脂质原液，可进一步将其加工以分离水、脂肪酸酯(例如脂肪酸异丁酯)、脂肪酸和甘油三酯。
在提取脂质后，可将所述固体移出提取器并经受反提取加工，移除残余溶剂。回收残余溶剂对方法的经济性来说是重要的。在一个实施方案中，可将湿固体转移到气密环境中以保存并收集当它被转移到除溶剂器时，短时间内从湿固体中蒸发的溶剂。当固体进入除溶剂器时，可加热它们以蒸发并移除残余溶剂。为了加热所述固体，所述除溶剂器可包括用于将固体分配到一个或多个托盘上的机构，并且可直接加热该固体，例如通过直接接触热空气或热蒸汽来加热，或者间接地进行加热，例如通过加热输送粗粉的托盘来加热。为了有利于将固体从一个托盘转移到另一个托盘上，携带固体的托盘可包括开口，其允许固体从一个托盘移到下一个托盘上。所述固体可从除溶剂器转移到任选地混合器中，其中所述固体在被转移到烘干机前与其他副产物混合。在这个实例中，将固体进料于除溶剂器，其中固体接触蒸汽。在一个实施方案中，除溶剂器中的蒸汽流和固体可互为逆流。固体然后可排出除溶剂器并且可进料到烘干机或任选地混合器中，其中可混合多个副产物。可冷凝排出除溶剂器的蒸气并任选地与混杂油混合，然后进料到滗析器中。排出滗析器的富水相可进料到蒸馏塔中，其中从富水物流中移除己烷。在一个实施方案中，耗尽了己烷的富水物流流出蒸馏塔底部并且可再循环用于发酵过程，例如，它可用于与经碾磨的玉米固体形成浆液。在另一个实施方案中，塔顶和塔底产物可再循环用于发酵过程。例如，可将富含脂质的塔底产物加到水解器的进料中。可将塔顶产物例如冷凝并进料于滗析器。流出这个滗析器的富含己烷的物流可任选地用作溶剂的一部分，进料于提取器。流出这个滗析器的富水相可进料于将己烷从水中抽提出的塔。本领域的技术人员能够理解，可以多种方式修改本发明的方法以优化用于生产产物醇如丁醇的发酵方法。
在另一个实施方案中，副产物(或共产物)可来源于用于发酵方法的醪。例如玉米油可与醪分离，并且该玉米油可包含甘油三酯、游离脂肪酸、甘油二酯、单酸甘油酯、和磷脂(参见例如实施例20)。可将所述玉米油任选地以不同比率加到其他副产物(或共产物)中，并且因此例如能够产生在所得副产物中不同量的甘油三酯。以这种方式可控制例如所得副产物的脂肪含量以产生更低脂肪、高蛋白的动物饲料，其与高脂肪产品相比将更好地适应奶牛的需要。
在一个实施方案中，可将分离自醪的粗制玉米油进一步加工成食用油供消费者使用，或者它也可用作动物饲料的组分，因为它的高甘油三酯含量将使它成为代谢能的优异来源。在另一个实施方案中，它也可用作生物柴油或可再生柴油的原料。
在一个实施方案中，可使用全部或部分提取剂副产物作为动物饲料副产物的组分，或者它可用作生物柴油或可再生柴油的原料。
在另一个实施方案中，固体可与醪分离并且可包含甘油三酯和游离脂肪酸。这些固体(或物流)可用作动物饲料，其或者当离心排出时回收或者在干燥后回收。这些固体(或湿饼)可尤其适用作反刍动物(例如奶牛)的饲料，这是因为它具有高含量的可利用赖氨酸和旁路或瘤胃不可降解的蛋白。例如这些固体可为特定值的高蛋白、低脂肪饲料。在另一个实施方案中，这些固体可用作基料，即，可将其他副产物如糖浆加到固体中以形成产物，其可用作动物饲料。在另一个实施方案中，可将不同量的其他副产物加到固体中以调整所得产物的特性，从而符合某些动物种类的需要。
如实施例21所述分离自完整釜馏物的固体组合物可包括例如粗蛋白、脂肪酸和脂肪酸异丁酯。在一个实施方案中，可使用这一组合物(或副产物)(湿的或干的)作为动物饲料，其中例如高蛋白(例如高赖氨酸)、低脂肪、和高纤维含量是期望的。在另一个实施方案中，可将脂肪加到这一组合物中，例如，如果期望高脂肪、低纤维的动物饲料，从另一个副产物物流中加入脂肪。在一个实施方案中，这一更高脂肪、低纤维的动物饲料可用于猪或家禽。在另一个实施方案中，浓缩酒糟可溶物(Condensed DistillersSolubles，CDS)的非水性组合物(参见例如实施例21)可包括例如蛋白质、脂肪和脂肪酸异丁酯以及其他液化的和悬浮的固体如盐和碳水化合物。这种CDS组合物可用作例如动物饲料(湿的或干的)，其中期望高蛋白、低脂肪、高矿物盐的饲料组分。在一个实施方案中，这一组合物可用作奶牛饲料的组分。
在另一个实施方案中，可通过蒸发回收来自发酵方法的油。这种非水性的组合物可包含脂肪酸异丁酯和脂肪酸(参见例如实施例20)，并且这种组合物(或物流)可进料于水解器以回收异丁醇和脂肪酸。在另一个实施方案中，这一物流可用作生物柴油生产的原料。
经由发酵方法生产醇(例如丁醇)产生的不同物流可以多种方式混合以产生多个共产物。例如，如果来自醪的粗制玉米用于产生用作提取剂的脂肪酸，并且脂质通过蒸发器进行提取用于其他目的，然后可混合并加工剩余的物流以产生共产物组合物，其包含粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸和脂肪酸异丁酯。在一个实施方案中，这个组合物可包含至少约20-35重量％的粗蛋白、至少约1-20重量％的粗脂肪、至少约0-5重量％的甘油三酯、至少约4-10重量％的脂肪酸、和至少约2-6重量％的脂肪酸异丁酯。在一个特定实施方案中，所述共产物组合物可包含约25重量％的粗蛋白、约10重量％的粗脂肪、约0.5重量％的甘油三酯、约6重量％的脂肪酸、和约4重量％的脂肪酸异丁酯。
在另一个实施方案中，脂质通过蒸发器进行提取并且所述脂肪酸用于其他目的，并且混合并加工来自醪的约50重量％的粗制玉米和剩余的物流，所得共产物组合物可包含粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸和脂肪酸异丁酯。在一个实施方案中，这个组合物可包含至少约25-31重量％的粗蛋白、至少约6-10重量％的粗脂肪、至少约4-8重量％的甘油三酯、至少约0-2重量％的脂肪酸、和至少约1-3重量％的脂肪酸异丁酯。在一个特定实施方案中，所述共产物组合物可包含约28重量％的粗蛋白、约8重量％的粗脂肪、约6重量％的甘油三酯、约0.7重量％的脂肪酸、和约1重量％的脂肪酸异丁酯。
在另一个实施方案中，混合分离自完整釜馏物的固体和提取自醪的50重量％的玉米油，并且所得共产物组合物可包含粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸、脂肪酸异丁酯、赖氨酸、中性洗涤剂纤维(NDF)和酸性洗涤剂纤维(ADF)。在一个实施方案中，这个组合物可包含至少约26-34重量％的粗蛋白、至少约15-25重量％的粗脂肪、至少约12-20重量％的甘油三酯、至少约1-2重量％的脂肪酸、至少约2-4重量％的脂肪酸异丁酯、至少约1-2重量％的赖氨酸、至少约11-23重量％的NDF、和至少约5-11重量％的ADF。在一个特定实施方案中，所述共产物组合物可包含约29重量％的粗蛋白、约21重量％的粗脂肪、约16重量％的甘油三酯、约1重量％的脂肪酸、约3重量％的脂肪酸异丁酯、约1重量％的赖氨酸、约17重量％的NDF、和约8重量％的ADF。所述高脂肪、甘油三酯、和赖氨酸含量以及更低纤维含量的这种共产物组合物可为猪和家禽期望的饲料。
如上所述，可以多种方式混合经由发酵方法生产醇(例如丁醇)产生的不同物流以产生共产物组合物，其包含粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸和脂肪酸异丁酯。例如可利用包含至少约6％的粗脂肪和至少约28％的粗蛋白的组合物作为产乳动物的动物饲料产品。包含至少约6％的粗脂肪和至少约26％的粗蛋白的组合物可用作肥育舍饲牛的动物饲料产品，而包含至少约1％的粗脂肪和至少约27％的粗蛋白的组合物可用作越冬牛的动物饲料产品。可利用包含至少约13％的粗脂肪和至少约27％的粗蛋白的组合物作为家禽的动物饲料产品。可利用包含至少约18％的粗脂肪和至少约22％的粗蛋白的组合物作为单胃动物的动物饲料产品。因此可以此种方式混合多种物流以定制用于特定动物种类的饲料产品。
如上所述，可以多种方式混合经由发酵方法生产醇(例如丁醇)产生的不同物流以产生共产物组合物，其包含粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸和脂肪酸异丁酯。例如可利用包含至少约6％的粗脂肪和至少约28％的粗蛋白的组合物作为产乳动物的动物饲料产品。包含至少约6％的粗脂肪和至少约26％的粗蛋白的组合物可用作肥育舍饲牛的动物饲料产品，而包含至少约1％的粗脂肪和至少约27％的粗蛋白的组合物可用作越冬牛的动物饲料产品。可利用包含至少约13％的粗脂肪和至少约27％的粗蛋白的组合物作为家禽的动物饲料产品。可利用包含至少约18％的粗脂肪和至少约22％的粗蛋白的组合物作为单胃动物的动物饲料产品。因此可以此种方式混合多种物流以定制用于特定动物种类的饲料产品。
在一个实施方案中，可以多种方式混合经由发酵方法生产醇(例如丁醇)产生的一个或多个物流以产生包含至少约90％COFA的组合物，其可用作燃料源如生物柴油。
例如本发明方法的一个实施方案，混合经碾磨的谷物(例如通过锤磨机经加工的玉米)和一个或多个酶以生成浆液化的谷物。烹煮、液化、并用闪急蒸气闪蒸这种浆液化的谷物以产生经烹煮的醪。然后过滤经烹煮的醪以移除悬浮固体，产生湿饼和滤液。可通过多种方法完成过滤，例如离心、筛滤、或真空过滤，并且这一过滤步骤可从所述醪中移除至少约80％至至少约99％的悬浮固体。
用水再次形成浆液并且进行再过滤所述湿饼以移除附加的淀粉以产生经洗涤的滤饼。所述再浆液化方法可重复多次，例如一至五次。用于再浆液化所述湿饼的水可为发酵过程中产生的再循环水。由再浆液化/再过滤方法产生的滤液可返回初始混合步骤以与经碾磨的谷物形成浆液。可在混合步骤前加热或冷却滤液。
在生产过程中经洗涤的滤饼可用醪在多个塔板上再浆液化。例如，经洗涤的滤饼可用醪在发酵罐后、在预闪蒸塔前、或在酒糟谷物烘干机的进料点用醪再浆液化。经洗涤的滤饼可与其他副产物分开干燥或者可直接以湿饼形式使用以产生DDGS。
初始混合步骤产生的滤液可如本文所述进行进一步加工。例如，可用蒸汽或流程间换热器加热滤液。可将糖化酶加到滤液中并且所述滤液的液化淀粉可被部分或完全地糖化。可通过多种装置冷却糖化滤液，例如流程间交换、与冷却水的交换、或与冷水的交换。
然后可将冷却滤液加到发酵罐中，其具有适用于醇生产的微生物，例如能够生产丁醇的重组酵母。此外，还可将氨和循环物流加到发酵罐中。这一方法可包括至少一个发酵罐、至少两个发酵罐、至少三个发酵罐、或至少四个发酵罐。在发酵期间产生的二氧化碳可排出到涤气器以减少排气(例如丁醇气体排出)以及提高生产能力。
可经由再循环回路将溶剂加到发酵罐中，或者可直接将溶剂加到发酵罐中。所述溶剂可为一种或多种有机化合物，其具有液化或与醇(例如丁醇)反应的能力并且可具有有限的水中液化度。所述溶剂可以单液相或双液相材料形式从发酵罐中连续取出，或者所述溶剂可分批以单液相或双液相材料形式取出。
可对醪脱气。可在脱气之前加热醪，例如通过与热醪的流程间交换或与预闪蒸塔顶部的流程间交换进行加热。可将蒸气排出到冷凝器中，然后排出到涤气器中。可进一步加热脱气的醪，例如通过与蒸气区域中的其他物流的流程间热交换进行加热。
经预热的醪和溶剂可进入预闪蒸塔，它可从常规干磨燃料乙醇工厂的醪塔改建得到。这种塔可在亚大气压下运行，由获取自蒸发器管系或醪烹煮步骤的水蒸气驱动。预闪蒸塔的顶部可通过与冷却水和流程间热交换(包括与预闪蒸塔进料的热交换)的一些组合的热交换进行冷凝。可将液体冷凝物导入醇/水滗析器(例如丁醇/水滗析器)。
预闪蒸塔底部可在溶剂滗析器之前。预闪蒸塔底部可基本上不含游离醇(例如丁醇)。所述滗析器可为稳水器、离心机、或水力旋流器。水基本上与这个滗析器中的溶剂相分开，产生水相。水相包括悬浮和液化的固体，它可进行离心以产生湿饼和稀釜馏物。湿饼可与其他物流混合并干燥产生DDGS，它可被干燥并与其他产生DDGS的物流分开售卖，或者它可以湿饼形式售卖。可分流水相以提供逆流，它部分地用于将上述滤饼再浆液化。分流也提供稀釜馏物，可将其泵入蒸发器用于进一步加工。
在溶剂滗析器中产生的有机相可为醇(例如丁醇)酯。可水解溶剂以再生反应性溶剂并回收附加的醇(例如丁醇)。作为另外一种选择，可过滤有机相并作为产品售卖。水解可为热驱动的、同质催化的、或异质催化的。这一方法的输入热可为焙烧加热器、热油、电热输入、或高压蒸汽。加入以驱动水解的水可来自再循环水流、新水、或蒸汽。
可将冷却的水解溶剂泵入亚大气压溶剂塔，其中它可用蒸汽基本上除去醇(例如丁醇)。这种蒸汽可为来自蒸发器的水蒸气，它可为来自醪加工的闪蒸步骤的蒸汽，或者它可为来自热水器的蒸汽(参见例如美国专利公开申请公布2009/0171129，其以引用方式并入本文)。从常规干磨乙醇工厂改建获得的塔可适用作溶剂塔。可改进所述改建塔以用作溶剂塔。溶剂塔的底部可通过例如冷却水或流程间热交换进行冷却。可滗析所述冷却后的底部以移除残余的水，并且所述水可再循环到所述方法的其他步骤中或再循环到醪化步骤中。
溶剂塔顶部可通过与冷却水或流程间热交换的交换进行冷却，并且可将冷凝物导入排醇/水的滗析器(例如丁醇/水滗析器)，其可与预闪蒸塔顶部共用。可将其他混合水和醇(例如丁醇)物流加到这个滗析器中，其包括涤气器底部和来自脱气步骤的缩合物。可将包含二氧化碳的排气导入水涤气器。这个滗析器的含水层也可进料于溶剂塔，或者可在小的专用蒸馏塔中除去醇(例如丁醇)。可通过与预闪蒸塔顶部、溶剂塔顶部、或溶剂塔底部的流程间交换预热含水层。这一专用塔可从常规干磨燃料乙醇方法的副汽提塔改建得到。
可将醇/水滗析器(例如丁醇/水滗析器)的有机层泵入醇(例如丁醇)塔。这个塔可为超大气压塔并且可通过再沸器内的蒸汽冷凝驱动。所述塔的进料可通过流程间热交换进行加热，从而减少所述塔运行的能量需求。这种流程间换热器可包括预闪蒸塔的部分冷凝器、溶剂塔的部分冷凝器、水解器的产物、来自蒸发器的水蒸气、或丁醇塔底部。可冷却醇(例如丁醇)塔蒸气的冷凝物并使其返回醇/水滗析器(例如丁醇/水滗析器)。醇(例如丁醇)塔底部可通过包括与醇(例如丁醇)塔进料的交换在内的流程间热交换进行冷却，并且可用冷却水进一步冷却、过滤、并以产品醇(例如丁醇)售卖。
可将如上所述从预闪蒸塔底部产生的稀釜馏物导入多效蒸发器。这个蒸发器可具有两个、三个或更多个塔板。所述蒸发器可具有类似于常规设计的燃料乙醇工厂的双效四体构型，它可具有三效三体构型，或者它可具有其他构型。稀釜馏物可进入任何效。至少一个第一效主体可用来自超大气压醇(例如丁醇)塔的蒸气加热。蒸气可来自最低压效以提供水蒸气形式的热到亚大气压预闪蒸塔和溶剂塔。可将来自蒸发器的糖浆加到酒糟谷物烘干机中。
可将发酵罐、脱气器、醇/水滗析器(例如丁醇/水滗析器)或其他来源排出的二氧化碳导入水涤气器。供应于这个涤气器顶部的水可为新制的水或者可为再循环水。可处理(例如生物消化)再循环水以移除挥发性有机化合物并进行冷却。可将涤气器底部产物递送到醇/水滗析器(例如丁醇/水滗析器)、递送到溶剂塔、或者可与其他再循环水一起用于将上述湿饼再浆液化。来自蒸发器的冷凝物可用厌氧生物消化或其他方法进行处理以在再循环以再浆液化滤饼之前纯化所述水。
如果将玉米用作碾磨谷物的来源，可在多个点中的任何一个上从所述工艺流中分离玉米油。例如，可进行离心以在过滤经烹煮的醪后产生玉米油流，或者可进行预闪蒸塔水相离心以产生玉米油流。可离心浓缩糖浆中间体或最终的糖浆以产生玉米油流。
在本发明方法的实施方案的另一个实例中，从发酵罐中排出的材料可在分离体系中进行加工，所述体系涉及装置如离心机、沉降器、水力旋流器等，以及它们的组合，从而影响浓缩形式的活酵母的回收，所述酵母可再循环以在随后的发酵批中直接地或在经过一些再处理后再使用。这个分离体系也可产生有机物流，其包含发酵产生的脂肪酯(例如脂肪异丁酯)和醇(例如丁醇)，以及仅包含痕量不可混溶有机物的含水物流。这一含水物流可在将它的醇(例如丁醇)内容物移除以再浆液化并泵送低淀粉固体之前或之后使用，所述固体从液化醪中分离并洗涤。这种做法的优点是避免可能出现的长带驱动的传送体系，该体系用于将这些固体从液化区送到谷物干燥和糖浆混合区。此外，在已经移除醇(例如丁醇)之后产生的这一完整釜馏物将需要使用现有的或新的分离装置分离进入稀釜馏物和湿饼部分，并且这一稀釜馏物将部分形成逆流，其返回与烹煮水混合以制备新一批的可发酵醪。这个实施方案的另一个优点是保留在分离自液化醪的固体水分中的任何残余液化淀粉将部分地通过这一逆流被捕集并回收。作为另外一种选择，可认为固体物流中包含的酵母无活性并且可再分散在含水物流和这种混合流中，所述混合流是发酵保留的任何醇(例如丁醇)内容物的蒸馏物。还可分离无活性生物以用作增殖过程中的营养素。
在另一个实施方案中，多相材料可离开预闪蒸塔的底部并且可在如上所述的分离体系中进行加工。浓缩固体可再分散在含水物流中并且这种混合流可用于再浆液化并泵送低淀粉固体，所述固体分离自液化醪并进行洗涤。
上述方法以及本文所述的其他方法可使用计算机建模如Aspen建模(参见例如美国专利公开7,666,282)来展示。例如，商业建模软件Aspen(Aspen Technology，Inc.，Burlington，MA)可与物理特性数据库如购自American Institute of ChemicalEngineers，Inc.(New York，NY)的DIPPR(Design Institute for Physical PropertyResearch)联合使用以开发完整的丁醇发酵、纯化、和水管理方法的Aspen模型。这一过程模型可进行许多基本的工程计算，例如质量和能量平衡，气/液平衡以及反应速率计算。为了产生Aspen模型，信息输入可包括例如实验数据、水含量和原料组成、醪烹煮和闪蒸的温度、糖化条件(例如酶进料、淀粉转化、温度、压力)、发酵条件(例如微生物进料、葡萄糖转化、温度、压力)、脱气条件、溶剂塔、预闪蒸塔、冷凝器、蒸发器、离心机等。
上述方法和体系可在产物醇生产中产生提高的提取活性和/或效率，这是移除了不溶解固体的结果。例如，不存在不溶解固体的提取发酵可产引起产物醇从发酵液体培养基到提取剂的更高的传质速率、提取剂与发酵罐中部或外部发酵的更好的相分离、以及由更高的提取剂液滴增大速率引起的更低的提取剂保留。例如在发酵期间保留在发酵液体培养基中的提取剂液滴也将更快并更完全地脱离发酵液体培养基，从而导致在发酵液体培养基中存在更少的游离提取剂并且能够减少过程中的提取剂损失量。此外，例如可再利用微生物并且可无需在下游加工中使用附加的设备，例如醪塔和/或一些或全部完整釜馏物离心机。此外，例如消除了DDGS中的提取剂损失的可能性。例如，再利用微生物的能力也能够提高产物醇生产的总速率、降低总滴度需求、和/或降低含水滴度需求，从而产生更健康的微生物和更高的生产速率。此外，例如发酵罐中无需搅拌器是可能的，从而减少了资金成本；提高了发酵罐生产能力，因为最小化保留的提取剂以及不存在不溶解固体，更有效地利用了体积；和/或在新建工厂中使用连续发酵或更小的发酵罐。
提高提取效率的实例可包括例如稳定的分配系数、增加的(例如更快的或更完全的)相分离、增加的液-液传质系数、在更低滴度下运行、提高的工艺流再循环能力、提高的发酵体积效率、提高的原料(例如玉米)负荷供给、提高的微生物(例如重组微生物)丁醇滴度耐受性、水回收利用率、减少能量消耗、提高的提取剂回收利用率、和/或微生物的回收利用。
例如，固体占据的发酵罐体积将减少。因此，能够增加可用于发酵的发酵罐的有效体积。在一些实施方案中，用于发酵的发酵罐的体积提高了至少约10％。
例如，可稳定分配系数。因为可通过在发酵之前从原料浆液中移除固体来减少发酵罐中的玉米油，所述提取剂暴露于更少的玉米油，如果玉米油的量足够大，它与提取剂结合并可降低分配系数。因此，减少导入发酵罐的玉米油导致提取剂相在发酵罐中更稳定的分配系数。在一些实施方案中，分配系数经过10个发酵循环降低了小于约10％。
例如，提取剂对丁醇的提取效率可能提高，因为将有产物醇从发酵液体培养基到提取剂的更高的传质速率(例如更高的传质系数形式)，从而产生产物醇生产的更高效率。在一些实施方案中，传质系数提高了至少2倍(参见实施例4和5)。
此外，在发酵液体培养基和提取剂之间的相分离可能增加，减少了形成乳液的可能性，从而导致提高的产物醇生产效率。例如，相分离能够更快速地或能够更完全地发生。在一些实施方案中可发生相分离，其中之前在24小时内未观察到明显的相分离。在一些实施方案中，相分离与其中尚未移除固体的相分离相比，发生速率快至少约2x、至少约5x、或至少约10x(参见实施例6和7)。
此外，提取剂的回收和再利用可能提高。所述提取剂将不被“捕集”在固体中，所述固体最终可作为DDGS被移除，从而导致产物醇生产效率提高(参见实施例8和9)。玉米油对提取剂的稀释也将减少，并且可能有更少的提取剂降解(参见实施例10)。
提取剂的流速也可能降低，这将降低运行成本，从而导致产物醇生产效率提高。
此外，提取剂的保留仍将降低，这是因为提取剂液滴以更高速度增大，从而导致产物醇生产效率提高。减少发酵罐中的不溶解固体量也提高产物醇生产效率。
此外，可从发酵罐中移除搅拌器，因为它不再需要悬浮不溶解固体，从而减少资金成本和能耗，并提高产物醇生产效率。
在一些实施方案中，发酵液体培养基40可从发酵罐30的出口排出。缺乏或最小化与发酵液体培养基40一起排出发酵罐30的不溶解固体具有多个附加的有益效果。例如，可无需下游加工中的单位和操作，例如醪塔或蒸馏塔，从而产生产物醇生产的效率提高。此外，因为不溶解固体不存在于流出发酵罐30的发酵液体培养基40中，无DDGS与“捕集”的提取剂一起形成。可移除一些或全部完全釜馏物离心机，因此在流出发酵罐的最终液体培养基中的不溶解固体更少。
如上所述，本发明的方法提供许多有益效果，它们能够改善产物醇如丁醇的生产(例如分批或连续生产)。例如，传质的改善能够以更低的含水滴度运行，产生“更健康的”微生物。更好的相分离能够导致改善的发酵罐体积效率以及通过醪塔、蒸馏塔等加工更少的反应器内容物的可能性。此外，有更少的由于固体导致的溶剂损失并且有回收利用细胞的可能性。本发明的方法也可提供更高质量的DDGS。
此外，本文所述方法在发酵之前移除油(例如玉米油)，这将随后允许控制发酵中加入的油。此外，在发酵之前移除油将使DDGS中存在的油量具有一些灵活性。即，可加入不同量的油到DDGS中，导致DDGS与不同脂肪内容物的生产取决于特定动物种类的营养需求。
重组微生物和丁醇生物合成途径
不受理论的束缚，据信本文所述方法与任何醇生产微生物、尤其是以高于它们的耐受性水平的滴度生产醇的重组微生物联合使用。
醇生产微生物是本领域已知的。例如，通过嗜甲烷菌(例如发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium))发酵氧化甲烷以生产甲醇，并使甲醇(C1烷基醇)接触羧酸和能够酯化羧酸与甲醇的催化剂形成羧酸甲酯。酵母菌株CEN.PK113-7D(CBS 8340，theCentraal Buro voor Schimmelculture；van Dijken等人，Enzyme Microb.Techno.26：706-714，2000)能够产生乙醇，并且使乙醇接触羧酸和能够酯化羧酸与乙醇的催化剂形成乙酯(参见例如实施例36)。
生产醇的重组微生物也是本领域已知的(例如Ohta等人，Appl.Environ.Microbiol.57：893-900，1991；Underwood等人，Appl.Environ.Microbiol.68：1071-1081，2002；Shen和Liao，Metab.Eng.10：312-320，2008；Hahnai等人，Appl.Environ.Microbiol.73：7814-7818，2007；美国专利公开5,514,583；美国专利公开5,712,133；PCT专利申请公布WO1995/028476；Feldmann等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.38：354-361，1992；Zhang等人，Science 267：240-243，1995；美国专利公开申请公布2007/0031918A1；美国专利公开7,223,575；美国专利公开7,741,119；美国专利公开7,851,188；美国专利公开申请公布2009/0203099A1；美国专利公开申请公布2009/0246846A1；和PCT专利申请公布WO 2010/075241，它们全部以引用方式并入本文)。
能够生产丁醇的适用重组微生物是本领域已知的，并且本文描述了某些能够生产丁醇的适用微生物。借助生物合成途径生产丁醇的重组微生物可包括以下菌属中的一种：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、伊萨酵母属(Issatchenkia)或酵母属(Saccharomyces)。在一个实施方案中，重组微生物可选自大肠杆菌(Escherichia coli)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一个实施方案中，所述重组微生物是酵母。在一个实施方案中，重组微生物为克拉布特里阳性酵母，其选自酵母属、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、裂殖酵母属、德克酵母属(Dekkera)、球拟酵母属(Torulopsis)、酒香酵母属(Brettanomyces)、以及假丝酵母属的一些菌种。克拉布特里阳性酵母的菌种包括但不限于啤酒糖酵母、克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、芽殖酵母(Saccharomyces mikitae)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)和光滑假丝酵母(Candidaglabrata)。
在一些实施方案中，所述宿主细胞是啤酒糖酵母。酿酒酵母(S.cerevisiae)是本领域已知的并且购自多种来源，包括但不限于美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)、Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre、LeSaffre、Gert Strand AB、FermSolutions、North American Bioproducts、Martrex和Lallemand。酿酒酵母(S.cerevisiae)包括但不限于BY4741、CEN.PK 113-7D、Ethanol酵母、FermProTM酵母、Bio-XR酵母、Gert Strand Prestige Batch Turbo醇酵母、Gert StrandPot Distillers酵母、Gert Strand Distillers Turbo酵母、FerMaxTM Green酵母、FerMaxTM Gold酵母、酵母、BG-1、PE-2、CAT-1、CBS7959、CBS7960和CBS7961。
利用微生物以及生产丁醇的微生物的发酵生产丁醇在例如美国专利公开申请公布2009/0305370中公开，该文献以引用方式并入本文。在一些实施方案中，微生物包含丁醇生物合成途径。在一些实施方案中，微生物中的异源性多核苷酸编码至少一个、至少两个、至少三个、或至少四个多肽，它们催化途径中底物到产物的转化。在一些实施方案中，微生物中的异源性多核苷酸编码所有多肽，它们催化途径中底物到产物的转化。在一些实施方案中，所述微生物包含减少或消除了的丙酮酸脱羧酶活性。基本上不含丙酮酸脱羧酶活性的微生物在美国专利申请公布2009/0305363中进行了描述，其以引用方式并入本文。本文也描述了基本上不含具有NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶活性如GPD2的酶的微生物。
生产丁醇的适当的生物合成途径是本领域中已知的，并且某些适当的途径描述于本文中。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含至少一种对宿主细胞是异源的基因。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含一种以上对宿主细胞是异源的基因。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含异源基因，所述异源基因编码的多肽对应于生物合成途径的每一步骤。
本文描述了具有催化所指示的底物向产物的转化的能力的某些适当的蛋白质，并且本领域中提供了其他适当的蛋白质。例如，以引用方式并入本文的美国专利公开申请公布2008/0261230、2009/0163376和2010/0197519描述了乙酰羟酸异构还原酶；以引用方式并入本文的美国专利公开申请公布2010/0081154描述了二羟酸脱水酶；以引用方式并入本文的美国专利公开申请公布2009/0269823描述了醇脱氢酶。
本领域的技术人员充分理解许多水平的序列一致性对鉴定来自其它物种的多肽有用，其中此类多肽具有相同或相似功能或活性，并且适用于本文所述的重组微生物。百分比同一性的有用实例包括但不限于75％、80％、85％、90％、或95％、或从75％至100％的任何整数百分比，它们可用于描述本发明，例如75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
适用的菌株包括在某些引用并以引用方式并入本文的专利申请、以及在提交于2010年9月7日的美国临时申请61/380,563中描述的那些。本文提供了某些适用菌株的构建，包括在实施例中使用的那些。
啤酒糖酵母菌株BP1083(“NGCI-070”；PNY1504)的构建
所述菌株BP1064来源于CEN.PK 113-7D(CBS 8340；CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre，Netherlands)并包含下列基因的缺失：URA3、HIS3、PDC1、PDC5、PDC6和GPD2。BP1064用质粒pYZ090(SEQ ID NO：1，描述于美国临时申请61/246,844)和pLH468(SEQ ID NO：2)进行转化以产生菌株NGCI-070(BP1083，PNY1504)。
缺失，即完全移除整个编码序列，其通过与聚合酶链反应片段同源性重组而创建，所述聚合酶链反应片段包含靶基因的上游和下游同源性区以及用于选择转化子的G418抗性标记或URA3基因。其侧翼为的G418抗性标记，用Cre重组酶移除。通过同源性重组移除所述URA3基因以创建无痕缺失，或如果侧翼为loxP位点则用Cre重组酶移除。
所述无痕的缺失步骤改编自Akada等人(Yeast 23：399-405，2006)。一般来讲，每个无痕缺失的聚合酶链反应盒是通过重叠聚合酶链反应组合四个片段，A-B-U-C，得到的。所述聚合酶链反应盒包含可选的/反可选的标记，URA3(片段U)，其包含原生CEN.PK 113-7DURA3基因，连同启动子(URA3基因上游250bp)和终止子(URA3基因下游150bp)。片段A和C每个长500bp，它们对应于紧接靶基因(片段A)上游的500bp和靶基因3′的500bp(片段C)。片段A和C用于通过同源重组将盒整合到染色体中。片段B(500bp长)对应于紧接靶基因下游的500bp并用于通过同源性重组，从染色体上切除URA3标记和片段C，在盒整合到染色体时生成作为对应片段B的直接重复序列使用PCR产物ABUC盒，首先将URA3标记整合进基因组，然后通过同源重组从基因组中切除。初始整合删除了除3′的500bp之外的基因。在切除时，也删除了所述基因3′的500bp区域。对于使用这个方法的基因整合，将要整合的基因包含在聚合酶链反应和的片段A和B之间。
URA3缺失
为删除内源URA3编码区，ura3::loxP-kanMX-loxP以盒聚合酶链反应扩增自pLA54模板DNA(SEQ ID NO：3)。pLA54包含乳酸克鲁维酵母TEF1启动子和kanMX标记，并且侧翼序列为oxP位点，允许Cre重组酶参与重组并移除标记。使用DNA聚合酶(NewEngland BioLabs Inc.，Ipswich，MA)和引物BK505与BK506(SEQ ID NO：4和5)进行PCR。所述每个引物的URA3部分来源于URA3启动子上游5′区，和编码区下游3′区，使得loxP-kanMX-loxP标记的整合导致URA3编码区的替换。使用标准基因技术将所述聚合酶链反应产物转化到CEN.PK 113-7D中(Methods inYeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold SpringHarbor，NY，第201-202页)并且转化子在30℃包含G418(100μg/mL)的YPD上选择。筛选的转化子的正确整合通过聚合酶链反应来验证，使用引物LA468和LA492(SEQ ID NO：6和7)，并命名为CEN.PK 113-7DΔura3::kanMX。
HIS3缺失
无痕HIS3缺失的聚合酶链反应盒的四个片段的扩增使用高保真聚合酶链反应Master Mix(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)并以CEN.PK 113-7D基因组DNA为模板，用Yeast/Bact试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。HIS3片段A采用引物oBP452(SEQID NO：14)和引物oBP453(SEQ ID NO：15)进行扩增，其包含与HIS3片段B的5′端同源的5′尾。HIS3片段B使用以下引物进行扩增：引物oBP454(SEQ ID NO：16)，其包含与HIS3片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP455(SEQ ID NO：17)，其包含与HIS3片段U的5′端同源的5′尾。HIS3片段U使用以下引物进行扩增：引物oBP456(SEQ ID NO：18)，其包含与HIS3片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP457(SEQ ID NO：19)，其包含与HIS3片段C的5′端同源的5′尾。HIS3片段C使用以下引物进行扩增：引物oBP458(SEQ ID NO：20)，其包含与HIS3片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP459(SEQ ID NO：21)。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。HIS3片段AB通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合HIS3片段A和HIS3片段B并用引物oBP452(SEQID NO：14)和oBP455(SEQ ID NO：17)进行扩增。HIS3片段UC通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456(SEQ ID NO：18)和oBP459(SEQ ID NO：21)进行扩增。所得聚合酶链反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。HIS3ABUC盒通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合HIS3片段AB和HIS3片段UC并用引物oBP452(SEQ IDNO：14)和oBP459(SEQ ID NO：21)进行扩增。PCR产物用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化。
制备CEN.PK 113-7DΔura3::kanMX的感受态细胞，并用HIS3 ABUC聚合酶链反应盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(Zymo ResearchCorporation，Irvine，CA)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以2％的葡萄糖的合成完全培养基上。具有his3敲除的转化子用聚合酶链反应进行筛选，所用引物为oBP460(SEQID NO：22)和oBP461(SEQ ID NO：23)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。正确的转化子选择为菌株CEN.PK113-7DΔura3::kanMXΔhis3::URA3。
从Δura3位点移除KanMX标记以及从Δhis3位点移除URA3标记
所述KanMX标记通过转化CEN.PK 113-7DΔura3::kanMXΔhis3::URA3withpRS423::PGAL1-cre(SEQ ID NO：66，如美国临时申请61/290,639中所述)而移除，使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(ZymoResearch Corporation，Irvine，CA)并在30℃接种到缺乏组氨酸和尿嘧啶辅以2％的葡萄糖的合成完全培养基上。转化子在30℃的辅以1％的半乳糖的YP上生长6个小时以诱导Cre重组酶和KanMX标记切除，并在30℃接种到YPD(2％葡萄糖)平板上以复苏。分离物过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(5-FOA，0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。抗5-氟-乳清酸的分离物生长和接种到YPD中以移除pRS423::PGAL1-cre质粒。检测分离物中KanMX标记和URA3标记的丢失，并通过在YPD+G418平板、缺乏尿嘧啶的合成完全培养基平板、和缺乏组氨酸的合成完全培养基平板的生长检测，检测IpRS423::PGAL1-cre质粒的丢失。对G418敏感并为尿嘧啶和组氨酸营养缺陷性的正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3::loxPΔhis3并命名为BP857。所述缺失和标记移除通过聚合酶链反应和测序确认，所用引物为oBP450(SEQ ID NO：24)和oBP451(SEQ ID NO：25)，用于Δura3，以及引物oBP460(SEQ ID NO：22)和oBP461(SEQ ID NO：23)，用于Δhis3，使用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。
PDC6缺失
用于无痕PDC6缺失的聚合酶链反应盒的四个片段的扩增使用高保真聚合酶链反应Master Mix(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)并以CEN.PK 113-7D基因组DNA为模板，用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。PDC6片段A使用以下引物进行扩增：oBP440(SEQ ID NO：26)，和引物oBP441(SEQ ID NO：27)，其包含与PDC6片段B的5′端同源的5′尾。PDC6片段B使用以下引物进行扩增：oBP442(SEQ ID NO：28)，其包含与PDC6片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP443(SEQ ID NO：29)，其包含与PDC6片段U的5′端同源的5′尾。PDC6片段U使用以下引物进行扩增：oBP444(SEQ IDNO：30)，其包含与PDC6片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP445(SEQ IDNO：31)，其包含与PDC6片段C的5′端同源的5′尾。PDC6片段C使用以下引物进行扩增：oBP446(SEQ ID NO：32)，其包含与PDC6片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP447(SEQ ID NO：33)。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。PDC6片段AB通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC6片段A和PDC6片段B并用引物oBP440(SEQ ID NO：26)和oBP443(SEQ ID NO：29)进行扩增。PDC6片段UC通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC6片段U和PDC6片段C并用引物oBP444(SEQ ID NO：30)和oBP447(SEQ ID NO：33)进行扩增。所得聚合酶链反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。所述PDC6ABUC盒通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC6片段AB和PDC6片段UC并用引物oBP440(SEQID NO：26)和oBP447(SEQ ID NO：33)进行扩增。PCR产物用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化。
制备CEN.PK 113-7DΔura3::loxPΔhis3的感受态细胞，并用PDC6ABUC聚合酶链反应盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(Zymo ResearchCorporation，Irvine，CA)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以2％的葡萄糖的合成完全培养基上。带有pdc6敲除的转化子通过聚合酶链反应进行筛选，所用引物为oBP448(SEQ ID NO：34)和oBP449(SEQ ID NO：35)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3::loxP Δhis3Δpdc6::URA3。
CEN.PK 113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6::URA3分离物过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。所述缺失和标记移除通过聚合酶链反应和测序确认，所用引物为oBP448(SEQID NO：34)和oBP449(SEQID NO：35)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。来自分离物的PDC6基因的缺乏通过聚合酶链反应阴性结果来证明，所用PDC6的编码区的特异性引物为oBP554(SEQ ID NO：36)和oBP555(SEQ IDNO：37)。正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6并被命名为BP891。
PDC1缺失ilvDSm整合
所述PDC1基因被删除并被ilvD替换，其编码区来自变异链球菌(Streptococcusmutans)ATCC 700610。所述A片段接着ilvD编码区，其来自变异链球菌(Streptococcusmutans)，对于用于PDC1缺失-ilvDSm整合的聚合酶链反应盒使用High FidelityPCR Master Mix(New EnglandBioLabs Inc.，Ipswich，MA)进行扩增并用NYLA83基因组DNA作为模板，所述基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。NYLA83是携带PDC1缺失-ilvDSm整合的菌株(其构建如美国专利申请公布20110124060所述，其全文以引用方式并入本文)，如美国专利公开申请公布2009/0305363所述(该文献全文以引用方式并入本文)。PDC1片段A-ilvDSm(SEQ ID NO：69)用引物oBP513(SEQ ID NO：38)和引物oBP515(SEQ ID NO：39)扩增，后者包含与PDC1片段B的5′端同源的5′尾。用于PDC1缺失-ilvDSm整合的PCR盒的B、U和C片段用High Fidelity PCRMaster Mix(New EnglandBioLabs Inc.，Ipswich，MA)和作为模板的CEN.PK 113-7D基因组DNA进行扩增，用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。PDC1片段B使用以下引物进行扩增：oBP516(SEQ ID NO：40)，其包含与PDC1片段A-ilvDSm的3′端同源的5′尾，和引物oBP517(SEQ IDNO：41)，其包含与PDC1片段U的5′端同源的5′尾。PDC1片段U使用以下引物进行扩增：oBP518(SEQ ID NO：42)，其包含与PDC1片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP519(SEQ ID NO：43)，其包含与PDC1片段C的5′端同源的5′尾。PDC1片段C使用以下引物进行扩增：oBP520(SEQ IDNO：44)，其包含与PDC1片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP521(SEQ ID NO：45)。聚合酶链反应产物用聚合酶链反应纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA进行纯化。PDC1片段A-ilvDSm-B通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC1片段A-ilvDSm和PDC1片段B并用引物oBP513(SEQ ID NO：38)和oBP517(SEQ ID NO：41)进行扩增。PDC1片段UC通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC1片段U和PDC1片段C并用引物oBP518(SEQ ID NO：42)和oBP521(SEQ ID NO：45)进行扩增。所得聚合酶链反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。所述PDC1 A-ilvDSm-BUC盒(SEQ ID NO：70)通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC1片段A-ilvDSm-B和PDC1片段UC并使用引物oBP513(SEQ ID NO：38)和oBP521(SEQ ID NO：45)进行扩增。PCR产物用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化。
制备CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6的感受态细胞，并用PDC1 A-ilvDSm-BUC聚合酶链反应盒转化，使用Frozen-EZ YeastTransformation IITM试剂盒(ZymoResearch Corporation，Irvine，CA)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以2％的葡萄糖的合成完全培养基上。具有PDC1敲除-ilvDSm整合的转化子用聚合酶链反应进行筛选，所用引物为oBP511(SEQ ID NO：46)和oBP512(SEQ ID NO：47)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。来自分离物的PDC1基因的缺乏通过聚合酶链反应阴性结果来证明，使用PDC1编码区特异性的引物oBP550(SEQID NO：48)和oBP551(SEQID NO：49)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm-URA3。
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm-URA3过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。所述PDC1的缺失、ilvDSm的整合以及标记的移除通过聚合酶链反应和测序来确认，所用引物为oBP511(SEQ ID NO：46)和oBP512(SEQ ID NO：47)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6Δpdc1::ilvDSm并命名为BP907。
PDC5缺失sadB整合
所述PDC5gene被删除并被sadB编码区替换，所述编码区来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)。对于PDC5缺失-sadB整合的聚合酶链反应盒的一个片段首先克隆到质粒pUC19-URA3MCS中。
pUC19-URA3MCS是基于pUC19的并包含处于多克隆位点(MCS)内的URA3基因，其来自酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)。pUC19包含pMB1复制子和一个编码β-内酰胺酶的基因，该基因负责在大肠杆菌中的复制与选择。除URA3的编码序列外，该基因的上游至下游序列都被包括用于在酵母中表达URA3。所述载体能用于克隆的目的，并且能用做酵母整合载体。
所述DNA涵盖了URA3编码区，连同URA3编码区上游250bp和下游150bp，所述序列来自酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)，CEN.PK 113-7D基因座DNA的扩增所用引物为oBP438(SEQ ID NO：12)，其包含BamHI、AscI、PmeI和FseI，和oBP439(SEQ ID NO：13)，其包含XbaI、PacI和NotI限制性位点，使用HighFidelity PCR Master Mix(NewEngland BioLabs Inc.，Ipswich，MA)。基因组DNA用 Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。在使用BamHI和XbaI消化后，所述聚合酶链反应产物和pUC19(SEQ ID NO：71)用T4DNA连接酶连接生成载体pUC 19-URA3MCS。所述载体通过聚合酶链反应和测序确认，所用引物为oBP264(SEQ ID NO：10)和oBP265(SEQ IDNO：11)。
所述sadB编码序列和PDC5片段B克隆到pUC19-URA3MCS生成PDC5A-sadB-BUC聚合酶链反应盒的sadB-BU部分。所述sadB编码序列扩增以pLH468-sadB(SEQ ID NO：67)作为模板，所用引物为oBP530(SEQID NO：50)，其包含AscI限制性位点，和引物oBP531(SEQ ID NO：51)，其包含与PDC5片段B的5′端同源的5′尾。PDC5片段B扩增所用引物为oBP532(SEQ IDNO：52)，其包含与sadB的3′端同源的5′尾，和引物oBP533(SEQ ID NO：53)，其包含PmeI限制性位点。聚合酶链反应产物用聚合酶链反应纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化。sadB-PDC5片段B通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合sadB片段U和PDC5片段B并用引物oBP530(SEQ ID NO：50)和oBP533(SEQ ID NO：53)进行扩增。在用合适的酶消化后，所得聚合酶链反应产物经AscI和PmeI消化用T4DNA连接酶连接到pUC19-URA3MCS对应的位点上。所得质粒用作模板以扩增sadB-片段B-片段U，所用引物为oBP536(SEQ ID NO：54)和oBP546(SEQ ID NO：55)，其包含与PDC5片段C的5′端同源的5′尾。PDC5片段C扩增所用引物为oBP547(SEQ ID NO：56)，其包含与PDC5sadB-片段B-片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP539(SEQ ID NO：57)。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。PDC5sadB-片段B-片段U-片段C通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC5 sadB-片段B-片段U和PDC5片段C并用引物oBP536(SEQ ID NO：54)和oBP539(SEQ ID NO：57)进行扩增。所得聚合酶链反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。所述PDC5A-sadB-BUC盒(SEQ ID NO：72)通过扩增PDC5 sadB-片段B-片段U-片段C而生成，所用引物为oBP542(SEQ ID NO：58)，其包含与原生PDC5编码序列上游50个核苷酸同源的5′尾，和oBP539(SEQ IDNO：57)。PCR产物用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化。
制备CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm的感受态细胞，并用PDC5A-sadB-BUC聚合酶链反应盒转化，使用Frozen-EZ YeastTransformation IITM试剂盒(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以1％的乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上。具有pdc5敲除sadB整合的转化子通过聚合酶链反应进行筛选，所用引物为oBP540(SEQ ID NO：59)和oBP541(SEQ ID NO：60)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。来自分离物的PDC5基因的缺乏通过聚合酶链反应阴性结果来证明，使用PDC5编码区特异性的引物oBP552(SEQ ID NO：61)和oBP553(SEQ ID NO：62)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB-URA3。
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3Δ pdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB-URA3过夜生长在YPD(0.1％乙醇)中并在30℃接种到合成完全培养基上，辅以乙醇(无葡萄糖)并包含包含5-氟-乳清酸(0.1％)，以选择失去了URA3标记的分离物。所述PDC5缺失、sadB整合以及标记移除是通过聚合酶链反应确认的，所用引物为oBP540(SEQ ID NO：59)和oBP541(SEQ ID NO：60)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。所述正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxPΔhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB并命名为BP913。
GPD2缺失
为删除内源的GPD2编码区，gpd2::loxP-URA3-loxP盒(SEQ ID NO：73)进行聚合酶链反应扩增，使用loxP-URA3-loxP(SEQ ID NO：68)作为模板DNA。loxP-URA3-loxP包含来自(ATCC编号77107)的URA3标记，其侧翼序列为loxP重组酶位点。使用DNA聚合酶(NewEngland BioLabs Inc.，Ipswich，MA)和引物LA512与LA513(SEQ ID NO：8和9)。每个引物的GPD2部分来源于GPD2编码区上游5′区和编码区下游3′区，使得loxP-URA3-loxP标记的整合导致GPD2编码区的替换。所述聚合酶链反应产物转化成BP913并且转化子在缺乏尿嘧啶的辅以1％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上筛选。筛选的转化子的正确整合通过聚合酶链反应验证，所用引物为oBP582和AA270(SEQ ID NO：63和64)。
所述URA3标记的循环是通过转化pRS423::PGAL1-cre(SEQ ID NO：66)并在30℃接种到缺乏组氨酸，辅以1％的乙醇的合成完全培养基上。在辅以1％的乙醇的，并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，转化子是有条斑纹状的，并且在30℃孵育以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。抗5-氟-乳清酸的分离物生长在YPE(1％乙醇)上以移除pRS423::PGAL1-cre质粒。通过聚合酶链反应确认缺失和标记移除，所述聚合酶链反应具有引物oBP582(SEQ ID NO：63)和oBP591(SEQ ID NO：65)。所述正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB Δgpd2::loxP并命名为PNY1503(BP1064)。
BP1064用质粒pYZ090(SEQ ID NO：1)和pLH468(SEQ ID NO：2)进行转化以产生菌株NGCI-070(BP1083；PNY1504)。
此外，尽管本发明的多个实施方案已如上描述，但是应当理解它们仅仅以举例的方式存在，并且不受限制。对相关领域的技术人员将显而易见的是能够在不脱离本发明的实质和范围下能够对其进行形式和细节的多种变型。因此，本发明的广度和范围应不受任何上述示例性实施方案的限制，但应仅仅根据所述权利要求及其等同物限定。
在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均指示本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且以引用方式并入本文至如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体且单独地指明为以引用方式并入的相同程度。
实施例
以下非限制性实施例将进一步示出本发明。应当理解，当以下实施例涉及用玉米作为原料时，其他生物质来源可用作原料，这不背离本发明的精神。
如本文所用，使用的缩写的含义如下：“g”指克，“kg”指千克，“L”指升，“mL”指毫升，“μL”指微升，“mL/L”指毫升每升，“mL/min”指毫升每分钟，“DI”指去离子，“uM”指微米，“nm”指纳米，“w/v”指重量/体积，“OD”指光密度，“OD600”指在波长600nM的光密度，“dcw”指干细胞重量，“rpm”指每分钟转数，“℃”指摄氏度，“℃/min”指每分钟摄氏度，“slpm”指标准升每分钟，“ppm”指每百万份数，“pdc”指丙酮酸脱羧酶酶数。
实施例1
制备玉米醪
使用30L玻璃带夹套树脂釜分三等批制备大约100kg液化玉米醪。所述釜带有机械搅拌、温度控制和pH控制机构。所有三批使用的规程如下：(a)混合玉米粉与自来水(以干燥基计30重量％的玉米)，(b)将所述浆液加热到55℃，同时搅拌，(c)用氢氧化钠或H2SO4将浆液pH调节至5.8，(d)加入α-淀粉酶(以干燥玉米基计0.02重量％)，(e)加热浆液至85℃，(f)调节pH至5.8，(g)将浆液保持在85℃2小时，同时保持pH在5.8，并且(h)冷却浆液至25℃。
使用的玉米是完整的来自Pioneer(3335)的黄玉米粒。它在锤磨机中使用1mm的筛网碾碎。测得玉米粉的含水量为12重量％，并且测得玉米粉的淀粉含量为以干燥玉米基计71.4重量％。α-淀粉酶为SCDS，购自Novozymes(Franklinton，NC)。所有三批一起使用的成分总量为：33.9kg的玉米粉(12％的水分)，65.4kg的自来水，和0.006kg的SC DS。加入总计0.297kg的氢氧化钠(17重量％)以控制pH。不需要H2SO4。从三个30L的批中回收的液化玉米醪的总量为99.4kg。
实施例2
移除固体
通过在大型落地式离心机中离心从实施例1中产生的醪中移除固体，所述离心机包含六个1L的瓶子。73.4kg的醪在25℃以8000rpm离心20min，产生44.4kg的浓缩物和26.9kg湿饼。测得浓缩物包含＜1重量％的悬浮固体，并且湿饼包含大约18重量％的悬浮固体。这暗示初始的液化醪包含大约7重量％的悬浮固体。这与玉米负荷和使用的玉米的淀粉含量一致，假定大多数淀粉液化。如果所有淀粉均液化，直接从离心机中回收的44.4kg浓缩物将已经包含大约23重量％的液化的低聚糖(液化淀粉)。将约0.6kg的i-BuOH加到35.4kg的浓缩物中以保存它。所得36.0kg的浓缩物包含1.6重量％的i-BuOH，将其用作原液。
实施例3
不溶解固体对传质速率的效应
进行以下实验以测量不溶解固体对来自水相的i-BuOH的传质速率效应，所述水相模拟来源于玉米醪的发酵液体培养基的组成，其大约一半通过SSF(同步糖化和发酵)发酵(即，大约50％转化成低聚糖)以模拟SSF分批发酵的液相的平均组成。来自实施例2的浓缩物模拟SSF开始时的液相组成。因此，它的一部分用等量的H2O基于质量稀释以生成模拟约50％转化率的SSF的浓缩物。加入更多的i-BuOH以使在稀释浓缩物中的i-BuOH的最终浓度为3.0重量％(约30g/L)。
如下制备稀释的浓缩物：来自实施例2的18kg浓缩物原液包含1.6重量％的i-BuOH，它与18kg自来水混合并加入0.82kg i-BuOH。所得36.8kg稀释浓缩物的溶液由大约11重量％的低聚糖和大约30g/L的i-BuOH组成。这种溶液模拟玉米醪发酵(SSF)的液相，所述发酵有大约50％的低聚糖转化率和30g/L i-BuOH的含水滴度。
实施例4
移除不溶解固体对传质的效应
使用在实施例3中获得的溶液进行传质测试，将所述溶液作为水相以模拟液体培养基的传质性能，所述液体培养基来源于移除大部分不溶解固体后的液化玉米醪。传质测试的目的在于测量不溶解固体对将来自模拟液体培养基的i-BuOH传递到通过模拟液体培养基增大的溶剂(提取剂)液滴的分散体中的总体积传质系数(kLa)的效应，所述液体培养基来源于液化玉米醪。kLa与运行参数的关键设计的关联可用于促进传质运行。应尽可能保持恒定以产生kLa与更小级别数据(所述数据用于级联放大)关联的参数的实例是相的物理特性和决定液滴尺寸的设计参数(例如喷嘴直径、通过喷嘴分散相的速度)。
使用一个6英寸直径、7英尺高度的带夹套的玻璃塔来测量将i-BuOH从低聚糖(来源于液化玉米醪)的水溶液(具有或不具有悬浮醪固体)转移到通过模拟液体培养基增大的油醇(OA)液滴分散体的kLa。将i-BuOH加到水相中以提供初始浓度为大约30g/L的i-BuOH。使包含大约11重量％的低聚糖和大约30g/L的i-BuOH的一定量的水相(通常约35kg)进入所述塔，用流过夹套的热H2O来将所述塔加热到30℃。在测试期间无水相流入或流出所述塔。
通过单个喷嘴将新的油醇(80/85％等级，来自Cognis)喷洒到所述塔底部以产生提取剂液滴的分散体，所述液滴流经水相。在到达水相顶部时，形成分离有机相的提取剂液滴，所述有机相然后从所述塔顶部溢出并汇集在接收器中。通常在单次测试中3至5加仑的OA流经所述塔。
在整个测试过程中分多次将水相样品从塔中取出，并且在测试末期取出从溢流中收集的总“富含”OA的复合样品。使用HP-6890GC分析所有样品的i-BuOH。使用水相中的i-BuOH浓度分布(即，i-BuOH浓度对时间)计算在给定运行条件下的kLa。在测试期间收集的总“富含”OA的最终复合样品用于检查i-BuOH的质量余量。
改变喷嘴尺寸和喷嘴速度(OA通过进料喷嘴的平均速度)来观察它们对kLa的效应。使用移除醪固体的低聚糖水溶液(稀释从液化玉米醪中获得的浓缩物得到)进行一系列测试。在重新加入醪固体以模拟在SSF中央的液化玉米醪(包括不溶解固体)后，使用相同的低聚糖水溶液进行一系列类似的测试。注意到在一些运行条件下(例如更高的OA流速下)，在塔顶部的相分离不佳，这使得难以获取在测试期间收集的总“富含”OA的代表性复合样品。也注意到在一些运行条件下，水相样品包含显著量的有机相。使用特殊的样品处理和制备技术以获取水相样品，该样品在被取样时是塔中尽可能有代表性的水相样品。
测定出塔中的水相实际上被“充分混合”，因为i-BuOH的浓度在给定时间点上在整个塔中变化不大。假定溶剂液滴相也被充分混合，塔中从水相到溶剂相的i-BuOH的总体传质可近似于下式：
其中，
rB＝每单位时间每单位体积水相从水相转移到溶剂相的i-BuOH总质量，克i-BuOH/升水相/小时或g/L/hr。
kLa＝总体积传质系数，描述从水相到溶剂相的i-BuOH传质，hr-1。
CB，液体培养基＝整个测试模拟液体培养基(水)相中的i-BuOH平均浓度，克i-BuOH/升水相或g/L。
CB，溶剂＝整个测试溶剂相中的i-BuOH平均浓度，克i-BuOH/升溶剂相或g/L。
KB＝在溶剂和水相之间的i-BuOH平均平衡分配系数，(克i-BuOH/升溶剂相)/(克i-BuOH/升水相)。
从获取自水相和溶剂相样品的浓度数据计算每次测试的参数rB、CB，液体培养基和CB，溶剂。通过混合来自玉米醪、OA和i-BuOH的含水浓缩物并剧烈混合所述体系直至两个液相平衡来独立地测量液化参数KB。测量两相中的i-BuOH浓度以测定KB。在测定给定测试的rB、CB，液体培养基、CB，溶剂和KB后，可通过重组公式(1)来计算kLa：
用两个不同尺寸的喷嘴进行传质测试，喷嘴速度位于5ft/s至21ft/s的范围内，使用稀释浓缩物(移除固体)作为水相。使用内径(ID)为0.76mm的喷嘴完成三次测试，并且使用ID为2.03mm的喷嘴完成三次测试。所有测试在30℃下，在上述6英寸直径的塔中进行，使用OA作为溶剂。OA和稀释浓缩物之间的i-BuOH平衡分配系数经测量为大约5，所述稀释浓缩物通过移除固体从液化玉米醪中获得。使用稀释浓缩物(移除固体)的传质测试的结果在表1中示出。
表1
实施例5
不溶解固体对传质的效应
通过加入一些来自实施例2的湿饼(其最初通过从液化玉米醪中移除固体来获取)以稀释浓缩物(其用于如上文实施例4所述的传质测试)来合成模拟来自一半通过SSF的液化玉米醪(包含不溶解固体)的发酵液体培养基的水相。也加入一些水以稀释湿饼中保持的液相，因为这种液体具有与浓缩物相同的组成。将17.8kg稀释上清液、13.0kg湿饼(包含～18重量％的不溶解醪固体)、5.0kg H2O和0.83kg i-BuOH混合到一起，产生36.6kg的浆液，其包含大约6.3重量％的不溶解固体和液相，所述液相由大约13重量％的液化淀粉和大约2.4重量％的i-BuOH(余量为H2O)组成。这种浆液模拟发酵液体培养基的组成，所述发酵液体培养基一半通过玉米至i-BuOH的SSF，玉米负荷为大约30％，因为这些类型的液体培养基中存在的不溶解固体和低聚糖含量分别为大约6-8重量％和10-12重量％。
用两个不同尺寸的喷嘴进行传质测试，喷嘴速度位于5ft/s至22ft/s的范围内，使用稀释浓缩物和不溶解醪固体的浆液作为水相。使用ID为0.76mm的喷嘴完成三次测试，并且使用ID为2.03mm的喷嘴完成三次测试。所有测试在30℃下，在上述6英寸直径的塔中进行，使用OA作为溶剂。使用稀释浓缩物和不溶解醪固体的浆液的传质测试的结果在表2中示出。
表2
图7展示了存在的不溶解玉米醪固体对总体积传质系数kLa的效应，所述传质系数为将i-BuOH从液化玉米淀粉(即，低聚糖)的水溶液中传递到流经鼓泡塔反应器的油醇液滴分散体中的传质系数。通过2.03mm ID的喷嘴将OA进料到塔中。发现其中已经移除固体的体系的kLa对其中尚未移除固体的体系的kLa的比率为2至5，这取决于2.03mm喷嘴的喷嘴速度。
图8展示了存在的不溶解玉米醪固体对总体积传质系数kLa的效应，所述传质系数为将i-BuOH从液化玉米淀粉(即，低聚糖)的水溶液中传递到流经鼓泡塔反应器的油醇液滴分散体中的传质系数。通过0.76mm ID的喷嘴将OA进料到塔中。发现其中已经移除固体的体系的kLa对其中尚未移除固体的体系的kLa的比率为2至4，这取决于0.76mm喷嘴的喷嘴速度。
实施例6
移除不溶解固体对水相和溶剂相的相分离的效应
这个实施例展示了与来源于液化玉米醪(其中尚未移除不溶解固体)的低聚糖的水溶液和溶剂相之间的相分离相比，来源于液化玉米醪(其中已经移除了不溶解固体)的低聚糖的水溶液和相同溶剂相之间改善的相分离。两个体系均包含i-BuOH。溶剂相和水相之间的充分分离对液-液提取成为一种适用的分离方法以实施原位产物移除(ISPR)来说是重要的。
在1L玻璃带夹套树脂釜中制备大约900g液化玉米醪。所述釜带有机械搅拌、温度控制和pH控制机构。使用以下规程：混合玉米粉与自来水(以干燥基计26重量％的玉米)，将所述浆液加热到55℃，同时搅拌，用氢氧化钠或H2SO4将pH调节至5.8，加入α-淀粉酶(以干燥玉米基计0.02重量％)，继续加热至85℃，调节pH至5.8，保持85℃2小时，同时保持pH在5.8，冷却至25℃。使用的玉米是完整的黄玉米粒，来自Pioneer(3335)。它在锤磨机中使用1mm的筛网碾碎。测得玉米粉的含水量为12重量％，并且测得玉米粉的淀粉含量为以干燥玉米基计71.4重量％。α-淀粉酶为SC DS，购自Novozymes(Franklinton，NC)。使用的成分的总量为：265.9g的玉米粉(12％的水分)，634.3g的自来水和0.056g的SC DS。回收的液化玉米醪的总量为883.5g。
直接使用部分液化玉米醪(不移除不溶解固体)以制备水相用于涉及固体的相分离测试。离心部分液化玉米醪以移除大部分不溶解固体并用于制备水相用于涉及无固体的相分离测试。
通过在大型落地式离心机中离心从所述醪中移除固体。583.5g的醪在35℃以5000rpm离心20min，产生394.4g的浓缩物和189.0g湿饼。测得浓缩物包含大约0.5重量％的悬浮固体，并且湿饼包含大约20重量％的悬浮固体。这暗示初始的液化醪包含大约7重量％的悬浮固体。这与玉米负荷和使用的玉米的淀粉含量一致，假定大多数淀粉液化。如果所有淀粉均液化，直接从离心机中回收的浓缩物将已经包含按不含固体计大约20重量％的液化的低聚糖(液化淀粉)。
相分离测试的目的是为了测量不溶解固体对溶剂相和水相之间的相分离的效应，所述水相模拟来源于液化玉米醪的液体培养基。在所有测试中含水液相包含约20重量％的低聚糖，并且有机相包含油醇(OA)。此外，将i-BuOH加到所有测试中以提供当相平衡时在水相中大约25g/L的浓度。进行两次振荡测试。通过混合60.0g液化玉米醪与3.5g i-BuOH来制备第一次测试的水相(包含固体)。通过混合由移除所述固体获取自液化玉米醪的60.0g浓缩物与3.5g i-BuOH来制备第二次测试的水相(移除固体)。将15.0g油醇(80/85％等级，来自Cognis)加到各个振荡测试瓶中。所述OA在两个瓶中均形成在水相顶部的分离液相，使得水相/溶剂相的质量比为约1/4。剧烈振荡两个瓶2min以紧密接触水相和有机相并使i-BuOH能够在两相之间达到平衡。静置所述瓶1小时。在不同时间(0min、15min、30min和60min)拍照以观察不溶解固体对体系中相分离的效应，所述体系包含来源于液化玉米醪的水相、包含OA的溶剂相和i-BuOH。零(0)时对应于紧接着2min振荡结束后的时间。
包含固体的体系(来自液化玉米醪)和移除固体的体系(来自液化玉米醪的液体浓缩物)根据时间的有机(溶剂)相和水相之间的分离程度在任何时间点上似乎是大约相同的。包含固体的体系其有机相轻微地更暗并更浑浊，并且两相界面处轻微地不太明显(更厚的“混杂”层围绕着所述界面)。然而，对于其中溶剂持续作用的提取发酵，有机相顶部的组成是受提取发酵下游工艺关注的，其中下一步骤是蒸馏。
最小化有机相顶部中的微生物量可为有利的，因为所述微生物将在蒸馏塔中被热灭活。最小化有机相顶部中的不溶解溶剂的量可为有利的，因为它们可能堵塞蒸馏塔、污染再沸器、引起位于塔底部的溶剂/水滗析器中的不良相分离、或者前文提到的问题的任何组合。最小化有机相顶部中的水相的量可为有利的。水相是以分离水相形式存在的水。附加量的水相将增加蒸馏塔中的负荷和能量需求。从来自“包含固体的”和“移除固体的”瓶中的有机层顶部移除十毫升样品，并且离心两种样品以显示并比较在60min的沉降时间后在“包含固体的”和“移除固体的”瓶中的有机相组成。结果显示在两个振荡测试末期的“有机相”包含一些非期望的相(两个有机相都是浑浊的)。然而，结果也显示来自涉及浓缩物(其中移除固体)相分离测试的顶层基本上不含不溶解固体。另一方面，在10mL样品的底部清楚地看到不溶解固体，所述样品取样自涉及醪的测试有机相顶部。预测3％的从有机层顶部取出的样品洗涤醪固体。如果富含溶剂的相流出包含3％不溶解固体的提取发酵过程的发酵罐，可能发生一个或多个以下问题：显著量的微生物损失、溶剂塔再沸器的污染、溶剂塔的堵塞。结果也显示来自相分离测试的顶层涉及包含更少水相的浓缩物。表3示出对在60min沉降时间后两个振荡测试瓶中分散到上层“有机”层中的相的相对量的预测。
表3：来自振荡测试的有机(顶部)层的大约组成60min后
这个实施例示出从液化玉米醪中移除大部分不溶解固体导致在所述液体(获取自醪的水相)接触溶剂如油醇后相分离改善。这个实施例示出如果在接触醪的液体部分与有机溶剂之前移除固体，在相分离后获取的上层相将包含显著更少的不溶解固体。这展示了最小化在提取发酵相分离的上(“有机”)层中的醪的不溶解固体含量的优点。
实施例7
移除不溶解固体对水相和溶剂相之间的相分离的效应
类似于实施例6，这个实施例展示了与来源于液化玉米醪(其中尚未移除不溶解固体)的低聚糖的水溶液和溶剂相之间的相分离相比，来源于液化玉米醪(其中已经移除了不溶解固体)的低聚糖的水溶液和相同溶剂相之间改善的相分离。两个体系均包含i-BuOH。溶剂相和水相之间的充分分离对液-液提取成为一种适用的分离方法以实施原位产物移除(ISPR)来说是重要的。
在这个实施例中使用为实施例6制备的相同混合物。仅有的差异是允许样品在完成如实施例6所述的样品制备后，在重复如这一实施例所述的相分离振荡测试之前静置若干天。标记为“包含固体”的样品由液化玉米醪、i-BuOH和油醇组成。标记为“移除固体”的样品由浓缩物组成，所述浓缩物通过从液化玉米醪、i-BuOH、和油醇中移除大部分不溶解固体产生。液化醪包含大约7重量％的悬浮固体，并且从醪中产生的浓缩物包含大约0.5重量％的悬浮固体。如果液化了玉米粉中所有淀粉，在液化醪和由醪制备的浓缩物中的液相将已经包含按不含固体计大约20重量％的液化低聚糖(液化淀粉)。两个样品包含的油醇量具有的相质量比：溶剂相/水相为约1/4。此外，将i-BuOH加到所有测试中以提供当相平衡时在水相中大约25g/L的浓度。
相分离测试的目的是为了测量不溶解固体对溶剂相(包含OA)和水相之间的相分离程度的效应，所述水相来源于在多相混合物在室温下老化若干天后的液化玉米醪(包含及不含固体)，所述老化用于模拟进行提取发酵的体系潜在的特性改变。进行两次振荡测试。剧烈振荡两个瓶2min以紧密接触水相和有机相。静置所述瓶1小时。在不同时间(0min、2min、5min、10min、20min和60min)拍照以观察不溶解固体对这些体系中相分离的效应，所述体系已经老化了若干天。零(0)时对应于紧接着将瓶置于工作台上之后的时间。
2min后相分离开始在其中移除固体的样品中发生。仅在5-10min后，似乎在其中已经移除固体的样品中已经发生了几乎完全的相分离，这基于如下事实：有机相占据了大约25％的两相混合物总体积。将期望如果有机相占据大约20％的总体积，将指示完全分离，因为这对应于相的初始比率。甚至在一小时后在其中未移除固体的样品中不发生明显的相分离。
也比较两个样品中上层相的组成。上层相的组成指示提取发酵的下游工艺，其中下一步骤是蒸馏。最小化有机相顶部中的微生物量是有利的，因为所述微生物将在蒸馏塔中被热灭活。最小化有机相顶部中的另一种组分是不溶解固体的量，因为所述固体可能堵塞蒸馏塔、污染再沸器、引起位于塔底部的溶剂/水滗析器中的不良相分离、或者前文提到的问题的任何组合。此外，最小化有机相顶部中的另一种组分是水相的量，水相是以分离水相形式存在的水，因为这种附加量的水相将增加随后的蒸馏塔中的负荷和能量需求。
从来自“包含固体的”和“移除固体的”瓶中的有机层顶部移除十毫升样品，并且离心两种样品以显示并比较在60min的沉降时间后在“包含固体的”和“移除固体的”瓶中的有机相组成。从“包含固体的”样品顶部取出的样品的组成证实基本上在60min内在该样品中不发生相分离。具体地讲，在从“包含固体的”振荡测试瓶顶部取出的样品中溶剂相对总水相(含水液体+悬浮固体)的比率为大约1/4重量/重量，这是与用于在测试前制备样品相同的比率。在从“包含固体的”振荡测试瓶顶部取出的样品中的不溶解固体量也大约与存在于液化玉米醪中的不溶解固体量相同，其显示在60min内基本上无固体沉降在这个振荡测试瓶中。另一方面，来自涉及其中移除固体的浓缩物(“移除固体的”)的相分离测试的顶层基本上不含不溶解固体。结果也显示来自相分离测试的顶层涉及包含更少水相的浓缩物。以下事实指示了这一点：在该样品瓶中溶剂相对水相的比率为大约1/1重量/重量，这显示在其中移除固体的测试中的有机相富含溶剂(OA)。表4示出对在60min沉降时间后两个振荡测试瓶中分散到上层“有机”层中的相的相对量的预测。
表4：来自振荡测试的有机(顶部)层的大约组成在60min后
这个实施例示出在与其中不从液化醪中移除不溶解固体的样品进行比较时，从包含i-BuOH的液化玉米醪中移除不溶解固体、使它接触溶剂相、使它沉降若干天、并再次混合所述相导致改善的相分离。实际上，这个实施例示出甚至在60min后，在其中不移除不溶解固体的样品中基本上不发生相分离。这个实施例示出如果在接触醪的液体部分与有机溶剂之前移除固体，在相分离后获取的上层相包含显著更少的不溶解固体。这是重要的，因为应在提取发酵的相分离的上(“有机”)层中最小化的两种最重要的物质是微生物含量和来自醪的不溶解固体的含量。在前的实施例显示紧接着水相接触溶剂相之后，从液化玉米醪中移除固体导致改善的相分离。这将使在发酵中在更早的时间进行提取发酵变得可行。这个实施例也显示从液化玉米醪中移除固体导致在老化样品中改善的相分离，所述样品包含已经接触溶剂相的水相(移除固体的低聚糖溶液)。这也将使在发酵中在更晚的时间进行提取发酵变得可行。
实施例8
移除不溶解固体对ISPR提取溶剂-盘叠式离心损失的效应
这个实施例展示了经由提取发酵方法产生的DDGS减少溶剂损失的潜力，所述提取发酵通过在发酵前使用半连续玉米醪盘叠式离心从玉米醪中移除不溶解固体。
在带夹套不锈钢反应器中制备大约216kg液化玉米醪。所述反应器带有机械搅拌、温度控制和pH控制机构。使用的规程如下：混合玉米粉与自来水(以干燥基计25重量％的玉米)，将所述浆液加热到55℃，同时以400rpm搅拌，用氢氧化钠或H2SO4将pH调节至5.8，加入α-淀粉酶(0.02重量％的干燥玉米基)，继续加热至85℃，调节pH至5.8，保持85℃30min，同时保持pH在5.8，使用现场注汽加热至121℃，保持在121℃30min以模拟蒸汽加压锅，冷却至85℃，调节pH至5.8，第二次加入α-淀粉酶(0.02重量％的干燥玉米基)，保持在85℃60min，同时保持pH在5.8以完成液化。然后将醪冷却至60℃并转移到离心机进料罐中。
使用的玉米是完整的黄玉米粒，来自Pioneer(3335)。它在锤磨机中使用1mm的筛网碾碎。测得玉米粉的含水量为12重量％，并且测得玉米粉的淀粉含量为以干燥玉米基计71.4重量％。α-淀粉酶为SCDS，购自Novozymes(Franklinton，NC)。使用的成分的量为：61.8kg的玉米粉(12％水分)，147.3kg的自来水，0.0109kgSC DS在1kg水中的溶液(用于第一次加入α-淀粉酶)，0.0109kgSC DS在1kg水中的另一种溶液(用于第二次加入α-淀粉酶)(在烹煮阶段后)。在烹煮阶段期间经由蒸汽缩合物将约5kg的H2O加到批中。在运行期间加入总计0.25kg的氢氧化钠(12.5重量％)和0.12kg的H2SO4(12.5重量％)以控制pH。回收的液化玉米醪的总量为216kg。
预测最终的液化玉米醪浆液的组成为大约7重量％的不溶解固体和93重量％的液体。液相包含约19重量％(190g/L)的液化淀粉(可液化的低聚糖)。所述醪的流变学对于将所述浆液分成其组分的能力来说是重要的。醪中的液相经测定为牛顿流体，在30℃下具有约5.5cP的粘度。所述醪的浆液经测定为剪切致稀流体，取决于剪切速率，在85℃具有的体积粘度为约10cP至70cP。
使用Alfa Laval盘叠式分流-碟式离心机离心209kg(190L)的液化醪。以半成批模式运行的离心机具有连续进料、连续浓缩物出口、和分批排出湿饼。以1L/min的速率连续进料液化玉米醪，连续移除澄清的浓缩物，并每隔4min定期排出湿饼。为了确定来自盘叠的固体的合适排出间隔，在高速实验室离心机中离心进料于盘叠的醪样品。醪(48.5g)在室温下以11,000rpm(约21,000g’s)旋转约10min。回收澄清的浓缩物(36.1g)和12.4g的粒料(湿饼)。确定了澄清的浓缩物包含约0.3重量％的不溶解固体并且粒料(湿饼)包含约27重量％的不溶解固体。基于这一数据，选择4min的排出间隔以运行盘叠式离心机。
所述盘叠式离心机以9000rpm(6100g’s)运行，液化玉米醪的进料速率为1L/min，温度为约60℃。醪(209kg)分离成155kg的澄清浓缩物和55kg的湿饼。分流定义为(浓缩物的量)/(醪进料的量)，它通过半连续盘叠式离心获得，类似于分批离心中获得的分流。以6100g’s、1L/min的进料速率、和4min排出间隔运行的盘叠式半成批离心机的分流为(155kg/209kg)＝74％，并且以21,000g’s运行10min的实验室成批离心机的分流为(36.1g/48.5g)＝74％。
从盘叠式离心机中回收的澄清浓缩物的45mL样品在实验室离心机中以21,000g’s旋转沉降10min以预测浓缩物中悬浮固体的含量。从45mL浓缩物中回收约0.15-0.3g不溶解固体。这对应于在浓缩物中的0.3-0.7重量％的不溶解固体，所述浓缩物的不溶解固体比进料于离心机的醪中的不溶解固体减少了约十倍。以下假定是合理的：如果在发酵前使用一些固体/液体分离装置或装置的组合从玉米醪中移除悬浮固体，使得在提取发酵中存在的不溶解固体的含量减少一个数量级，那么经由DDGS的ISPR提取溶剂损失可减少约一个数量级。经由DDGS最小化溶剂损失是提取发酵方法的经济性和DDGS质量的一个重要因素。
实施例9
移除不溶解固体对ISPR提取溶剂-瓶旋转测试的效应
这个实施例展示了经由提取发酵方法产生的DDGS减少溶剂损失的潜力，所述提取发酵通过在发酵前使用离心机从玉米醪中移除不溶解固体。
使用液化玉米醪进行实验室规模的瓶旋转测试。该测试模拟典型的滗析器离心机的运行条件，所述滗析器离心机用于从商业乙醇(EtOH)工厂的完整釜馏物中移除不溶解固体。商业EtOH工厂中的滗析器离心机通常在约3000g’s的相对离心力(RCF)和约30秒的完整釜馏物停留时间下运行。这些离心机通常移除完整釜馏物中约90％的悬浮固体，所述釜馏物包含约5％至6％的悬浮固体(在醪塔后)，产生包含约0.5％悬浮固体的稀釜馏物。
根据如实施例6所述的规程制备液化玉米醪。将约10mL醪置于离心管中。以约3000g’s(4400rpm的转子速度)的RCF离心样品总计1min。以3000g′s离心样品约30-40秒并以小于3000g’s的速度(由于离心机的加速和减速)离心样品总计20-30秒。样品温度为约60℃。
将包含约7重量％悬浮固体的10mL醪分离成约6.25mL的澄清浓缩物和3.75mL的湿饼(在离心管底部的粒料)。分流定义为(浓缩物的量)/(初始加入的醪的量)，它通过瓶旋转测试获得，为约62％。测得澄清浓缩物包含约0.5重量％的悬浮固体，其悬浮固体含量与初始醪中的悬浮固体含量相比减少了超过十倍。也测得澄清的粒料包含约18重量％的悬浮固体。
表5概述了瓶旋转测试的悬浮(不溶解的)固体质量余量，所述测试的条件是商业EtOH方法中将完整釜馏物转化成稀釜馏物的代表性的滗析器离心机运行条件。表5给出的所有值是近似值。
表5
也测得浓缩物包含约190g/L的液化低聚糖(液化淀粉)。这与以下假定一致：玉米粉中的大部分淀粉在液化过程中液化(即，水解成可液化的低聚糖)，所述液化过程基于使用的玉米负荷(以干燥玉米基计约26重量％)和用于产生液化醪的玉米的淀粉含量(以干燥玉米基计约71.4重量％的淀粉)。水解26％干玉米负荷的玉米粉中的大部分淀粉将产生在液化玉米醪中的约7重量％的悬浮(不溶解)固体，将所述玉米醪加到离心机中用于瓶旋转测试。
澄清浓缩物仅包含约0.5重量％的不溶解固体，这一事实表明瓶旋转测试使用的条件导致来自加入醪的不溶解固体减少了超过十倍。如果在发酵前通过连续滗析器离心机可获得这种相同的固体移除性能，以下假定是合理的：DDGS中的ISPR提取溶剂损失可减少约一个数量级。经由DDGS最小化溶剂损失是提取发酵方法的经济性和DDGS质量的一个重要因素。
实旋例10
通过移除不溶解固体移除玉米油
这个实施例展示了通过在发酵前移除不溶解固体以从玉米醪中移除并回收玉米油的潜力。如果经由移除不溶解固体移除玉米油，可改善提取溶剂的效果。此外，经由移除不溶解固体移除玉米油也可最小化溶剂分配系数的任何降低并潜在地导致改善的提取发酵方法。
在1LL玻璃带夹套树脂釜中制备大约1000g液化玉米醪。所述釜带有机械搅拌、温度控制和pH控制机构。使用以下规程：混合玉米粉与自来水(以干燥基计26重量％的玉米)，将所述浆液加热到55℃，同时搅拌，用氢氧化钠或H2SO4将pH调节至5.8，加入α-淀粉酶(以干燥玉米基计0.02重量％)，继续加热至85℃，调节pH至5.8，保持85℃2小时，同时保持pH在5.8，冷却至25℃。使用的玉米是完整的黄玉米粒，来自Pioneer(3335)。它在锤磨机中使用1mm的筛网碾碎。测得玉米粉的含水量为约11.7重量％，并且测得玉米粉的淀粉含量为以干燥玉米基计约71.4重量％。α-淀粉酶为SC DS，购自Novozymes(Franklinton，NC)。使用的成分的总量为：294.5g的玉米粉(11.7％的水分)，705.5g的自来水和0.059g的SC DS。加入水(4.3g)以稀释所述酶，并且加入总计2.3g的20％氢氧化钠溶液以控制pH。回收约952g的醪。
在40℃下以5000rpm(7260g’s)离心液化玉米醪30min以从低聚糖的水溶液中移除不溶解固体。通过离心移除固体也移除了水相顶部以分离的有机液体层形式存在的游离玉米油。从浮在水相顶部的有机层中回收大约1.5g玉米油。通过己烷提取测得用于产生液化醪的玉米粉包含以干燥玉米基计约3.5重量％的玉米油。这对应于与玉米粉一起进料于液化过程的约9g的玉米油。
在从液化醪中回收玉米油后，将低聚糖的水溶液从湿饼中滗析出来。回收约617g液化的淀粉溶液，留下约334g湿饼。所述湿饼包含大部分不溶解固体，它们位于液化醪中。液化的淀粉溶液包含约0.2重量％的不溶解固体。所述湿饼包含约21重量％的不溶解固体。用1000g自来水洗涤湿饼以移除仍在饼中的低聚糖。这通过混合所述饼与水以形成浆液来完成。然后在与用于离心初始醪的条件相同的条件下离心所述浆液以回收洗涤固体。通过离心所述洗涤浆液以移除洗涤固体也导致移除一些附加的游离玉米油，它们必定已经与从液化醪中产生的初始湿饼一起保留下来。观察到这种附加的玉米油是在离心洗涤混合物的水相顶部的分离的薄有机液体层。从洗涤过程中回收大约1g附加的玉米油。
使用1000g自来水将湿固体洗涤两次，每次基本上移除所有液化的淀粉。无可见的附加玉米油从第2次和第3次醪固体水洗中被移除。最终的洗涤固体在80℃和约20英寸汞柱真空条件下在真空炉中干燥过夜。据推测仍以胚芽形式保留在干燥固体中的玉米油的量通过己烷提取进行测定。测得相对干燥固体(约2重量％水分)的3.60g样品包含0.22g玉米油。这一结果对应于0.0624g的玉米油/g干燥固体。这对洗涤固体而言意味着无残余的低聚糖存在于湿固体中。在离心液化玉米醪以从湿饼中分离游离玉米油层和低聚糖水溶液层后，测得约334g的湿饼包含约21重量％的不溶解固体。这对应于湿饼包含约70.1g不溶解固体。在0.0624g玉米油/g干固体下，湿饼中的固体将包含约4.4g玉米油。
概括地说，通过离心液化醪回收大约1.5g游离玉米油。通过离心第一(水)洗涤浆液回收附加的1g游离玉米油，生成所述第一洗涤浆液以洗涤从醪中产生的初始湿饼。最后，测得洗涤固体仍包含约4.4g玉米油。也测得进行液化的玉米包含约9g玉米油。因此，从以下加工步骤中回收总计6.9g的玉米油：液化，从液化醪中移除固体，洗涤醪中的固体，并且最后洗涤固体。因此，进料以进行液化的玉米中大约76％的总玉米油在本文所述的液化和固体移除过程期间被回收。
实施例11
使用醪和浓缩物作为糖源的提取发酵
这个实施例描述了使用玉米醪和玉米醪浓缩物作为糖原进行的提取发酵。玉米醪浓缩物通过在发酵之前从玉米醪中移除不溶解固体进行制备。并列进行四次提取发酵，两次用液化玉米醪作为碳源(不移除固体)，两次用通过从液化玉米醪中移除大部分不溶解固体获取的液化醪浓缩物(低聚糖水溶液)。将油醇(OA)加到两次发酵中，一次包含固体，一次移除固体，从而从液体培养基中提取产物(i-BuOH)(当它形成时)。将玉米油脂肪酸(COFA)的混合物加到其他两次发酵中，一次包含固体，一次移除固体，从而从液体培养基中提取产物(当它形成时)。通过水解玉米油制备COFA。这些发酵的目的是为了测试移除固体对溶剂和液体培养基之间的相分离的效应(参见实施例11)并测量在从发酵液体培养基(其中移除固体或不移除固体)中回收的不溶解固体中捕集的残余溶剂量(参见实施例12)。
制备液化玉米醪
在30L玻璃带夹套树脂釜中制备大约31kg液化玉米醪。所述反应器全配有机械搅拌、温度控制和pH控制机构。使用的规程如下：混合玉米粉与自来水(以干燥基计40重量％的玉米)，将所述浆液加热到55℃，同时以250rpm搅拌，用氢氧化钠或H2SO4将pH调节至5.8，加入α-淀粉酶的稀释水溶液(以干燥玉米基计0.16重量％)，保持在55℃60min，加热至95℃，调节pH至5.8，保持在95℃120min，同时保持pH在5.8以完成液化。将醪转移到无菌离心瓶中以防止污染。
使用的玉米是完整的黄玉米粒，来自Pioneer。它在中试规模的锤磨机中使用1mm筛网碾碎。测得玉米粉的含水量为约12重量％，并且测得玉米粉的淀粉含量为以干燥玉米基计约71.4重量％。使用的α-淀粉酶是Fred-L(Palo Alto，CA)。使用的成分的量为：14.1kg玉米粉(12％水分)，16.9kg自来水，α-淀粉酶溶液，其由19.5gFred-L在2.0kg水中形成。α-淀粉酶进行无菌过滤。总计0.21kg的氢氧化钠(17重量％)在整个运行期间加入以控制pH。
预测液化玉米醪包含基于使用的玉米负荷计大约28重量％(约280g/L)的液化淀粉(玉米淀粉含量)，并且假定在液化期间水解所有淀粉。所述醪用比发酵中期望的低聚糖浓度更高的低聚糖浓度制备，从而允许当加入营养素、种菌、葡糖淀粉酶和碱到初始发酵液体培养基中时进行稀释。在加入营养素、种菌、葡糖淀粉酶和碱进行稀释后，期望的醪(不移除固体)中的总初始可液化糖为约250g/L。
使用具瓶离心机离心约13.9kg液化醪，所述离心机包含六个1L瓶。离心机在室温下以5000rpm(7260RCF)运行20min。将醪分离成约5.5kg的澄清浓缩物和约8.4kg的湿饼(在离心瓶底部的粒料)。分流定义为(浓缩物的量)/(加入的醪的量)，它为约(5.5kg/13.9kg)＝40％。
不从加到如下所述的2010Y034和2010Y036发酵的醪中移除固体。加到发酵2010Y033和2010Y035(也如下所述)中的浓缩物通过根据上述规程从醪中移除(通过离心)大部分悬浮固体产生。
发酵的一般方法
种子瓶生长
啤酒糖酵母菌株经工程化以从碳水化合物源中产生异丁醇，该菌株缺失pdc1、缺失pdc5、并且缺失pdc6，它在种子烧瓶中从冷冻培养物生长至0.55-1.1g/L干细胞重量(OD600 1.3-2.6-Thermo Helios αThermo FisherScientific Inc.，Waltham，Massachusetts)。所述培养物在以300rpm旋转的培养箱中在26℃下生长。所述冷冻培养物之前在-80℃贮存。第一种子烧瓶培养基的组成是：
3.0g/L右旋糖
3.0g/L无水乙醇
3.7g/L ForMediumTM Synthetic Complete Amino Acid(Kaiser)Drop-Out：
无HIS，无URA(参考DSCK162CK)
6.7g/L Difco Yeast Nitrogen Base，无氨基酸(291920)。
将来自第一种子烧瓶培养物的十二毫升样品转移到2L烧瓶中并在30℃下以300rpm旋转的培养箱中生长。第二种子烧瓶具有
220mL的以下培养基：
30.0g/L右旋糖
5.0g/L无水乙醇
3.7g/L ForMediumTM Synthetic Complete Amino Acid(Kaiser)Drop-Out：
无HIS，无URA(参考DSCK162CK)
6.7g/L Difco Yeast Nitrogen Base，无氨基酸(291920)
0.2M MES缓冲液滴定至pH 5.5-6.0。
所述培养物生长至0.55-1.1g/L干细胞重量(OD600 1.3-2.6)。在这一细胞浓度加入30mL包含200g/L蛋白胨和100g/L酵母提取物的溶液。然后加入300mL 0.2uM过滤除菌的Cognis，将90-95％油醇加到烧瓶中。所述培养物在收获之前继续生长至＞4g/L干细胞重量(OD600＞10)并加到发酵中。
发酵准备
初始发酵罐准备
向带玻璃夹套的2L发酵罐(Sartorius AG，Goettingen，Germany)加入包含固体或包含固体的液化醪(浓缩物)。pH探针(Hamilton EasyfermPlus K8，部件号：238627，Hamilton Bonaduz AG，Bonaduz，Switzerland)通过Sartorius DCU-3 Control TowerCalibration菜单进行校准。零在pH＝7时校准。跨度在pH＝4时校准。然后通过不锈顶板将探针置于发酵罐中。也将液化氧探针(pO2探针)通过顶板置于发酵罐中。用于递送营养素、种子培养物、提取溶剂和碱的管与顶板相连并且末端被箔封。将整个发酵罐置于Steris(Steris Corporation，Mentor，Ohio)高压釜中并在液体循环中灭菌30min。
从高压釜中移出发酵罐并置于负荷传感器上。将夹套水供应和回流管线分别连接到壳水和清洁排水上。将冷凝器冷却水的进水管和排水管连接到7℃运行的6-L再循环温浴上。将从发酵罐中导气的排气管连接到传送管上，所述传送管与Thermo质谱仪(Prima dB，Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，Massachusetts)相连。将喷洒管与供气管相连。将加入营养素、种子培养物、提取溶剂和碱的管向下通过泵或夹住闭合。高压釜处理的材料0.9％w/v的氯化钠在加入液化醪之前排出。
液化后的脂肪酶处理
在液化循环(Liquefaction)结束后将发酵罐温度设为55℃而不是30℃。通过当需要时成块加入酸或碱将pH人工控制在pH＝5.8。将脂肪酶原液加到发酵罐中使最终脂肪酶浓度为10ppm。将发酵罐保持在55℃，300rpm，并且用0.3slpm N2填充上部空间＞6小时。在完成脂肪酶处理后将发酵罐温度设为30℃。
接种前的营养物质添加
恰在接种之前加入7.0mL/L(接种后体积)乙醇(200proof，无水的)。恰在接种之前加入硫胺素，其最终浓度为20mg/L。恰在接种之前加入100mg/L烟酸。
发酵罐接种
当将N2加入发酵罐时，将发酵罐pO2探针校准至零。用以300rpm喷射的无菌空气对发酵罐pO2探针的跨度进行校准。在第二种子烧瓶为＞4g/L干细胞重量后接种发酵罐。从培养箱/振荡器中移出摇瓶5min，以使油醇相和水相发生相分离。将55mL的水相转移到无菌的接种瓶中。将种菌通过蠕动泵泵送到发酵罐中。
在接种后加入油醇或玉米油脂肪酸
在接种后立即加入1L/L(接种后体积)油醇或玉米油脂肪酸
发酵罐运行条件
在整个生长和生产阶段所述发酵罐在30℃下运行。在不加入任何酸的情况下允许pH从5.7-5.9下降至对照设置点5.2。用氢氧化铵控制pH用于pH＝5.2的残留物生长和生产阶段。通过喷射器将无菌空气以0.3slpm加入发酵罐中以供残留物的生长和生产阶段。通过Sartorius DCU-3Control BoxPID控制环流反应器，使用最低设置在300rpm和最高设置在2000rpm的搅拌器设置pO2以控制在3.0％。通过加入α-淀粉酶(葡糖淀粉酶)进行液化玉米醪的同步糖化和发酵来供应葡萄糖。一旦淀粉可用于糖化，葡萄糖保持过量(1-50g/L)状态。
分析
气体分析
在Thermo Prima(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，Massachusetts)质谱仪上分析过程气体。这是相同的过程气体，它是无菌的，并且然后将其加到每个发酵罐中。在相同质谱仪上分析每个发酵罐的废气。这个Thermo Prima dB在每周一早上6:00am具有校准检查运行。通过与质谱仪相关联的Gas Works v1.0(Thermo Fisher ScientificInc.，Waltham，Massachusetts)软件进行定期的校准检查。校准气体用于：
在校准循环期间用其他已知的瓶装气体检查二氧化碳，结果为5％和15％。用其他已知的瓶装气体检查氧气，结果为15％。基于对每个发酵罐的废气的分析，使用质谱仪的摩尔分数分析和进行发酵罐的气体流量(质量流控制器)测量汽提的异丁醇、消耗的氧气、和排入废气中的二氧化碳的量。计算每小时的放气速率，然后合并整个发酵期间的该速率。
生物质测量
用1X PBS将0.4％的台盼蓝以1∶5稀释在氯化钠(VWR BDH8721-0)中，制备0.08％的台盼蓝溶液。从发酵罐中取出1.0mL的样品并置于1.5mLEppendorf离心管中，在Eppendorf，5415C中以14,000rpm离心5min。在离心后，用带有20-200μL BioHit移液管尖的m200 Variable Channel BioHit移液管移除顶部的溶剂层。仔细操作以免移除溶剂层和含水层之间的层。一旦移除了溶剂层，使用设置在2700rpm的Vortex重悬样品。
需要进行一系列稀释以使细胞达到理想的浓度，用于血球计数器计数。如果OD为10，进行1∶20的稀释以达到0.5OD，这将提供理想的细胞量，每个方格计数为20-30。为了减少由于玉米固体带来的不精确稀释，需要用切过的100-1000μL BioHit移液管尖进行多倍稀释。从尖端切除大约1cm以增大开口，这将防止尖端堵塞。对于1∶20的最终稀释，用发酵样品和0.9％氯化钠溶液进行初始1∶1的稀释。然后用之前的溶液和0.9％氯化钠溶液进行1∶1的稀释，随后用之前的溶液和台盼蓝溶液进行最终1∶5的稀释。在每次稀释之间涡旋处理样品并将切过的尖端浸入0.9％氯化钠和台盼蓝溶液中。
将盖片仔细地置于Hausser Scientific Bright-Line 1492血球计数器顶部。用带有2-20μL BioHit移液管尖的m20 Variable Channel BioHit移液管取出10uL最终的台盼蓝稀释液并注入血球计数器。将血球计数器置于40x放大倍数的Zeis Axioskop 40显微镜上。中央的象限分成25个方格，然后对两个室的四个角和中央方格计数并记录。在对两个室计数后，取平均值并乘以稀释因数(20)，然后乘以25，这是血球计数器中的象限内的方格数，然后除以0.0001mL，这是进行计数的象限的体积。这个计算的总数是每mL细胞数。
水相中的发酵产物的LC分析
冷藏样品备用于加工。从冷藏处移出样品一个小时以达到室温。用带有100-1000μL BioHit移液管尖的m1000Variable Channel BioHit移液管转移大约300uL样品到0.2um离心过滤器(Nanosep MF改型尼龙离心过滤器)中，然后使用Eppendorf 5415C以14,000rpm离心5min。大约200uL过滤样品被转移到1.8自动取样小瓶中，其具有带聚合物底的250uL玻璃小瓶插入件。在用设为2700rpm的Vortex-涡旋处理样品前用带有PTFE隔膜的螺帽盖上小瓶。
然后在Agilent 1200系列LC上运行样品，该设备配有二元蠕动泵、真空脱气机、加热柱室、样品冷却系统、UV DAD检测器和RI检测器。所用的柱为Aminex HPX-87H，300×7.8，其带有Bio-Rad Cation H refill，30×4.6防护柱。柱温为40℃，移动相为0.01N硫酸，流速为0.6mL/min，流动40min。结果示于表6中。
表6：水相中发酵产物的保留时间
溶剂相中发酵产物的GC分析
冷藏样品备用于加工。从冷藏处移出样品一个小时以达到室温。用带有100-1000μL BioHit移液管尖的m1000Variable Channel BioHit移液管转移大约150uL样品到1.8自动取样小瓶中，其具有带聚合物底的250uL玻璃小瓶插入件。用带有PTFE隔膜的螺帽盖上小瓶。
然后样品在Agilent 7890A GC上运行，该设备带有7683B喷射器和G2614A自动取样器。所述柱为HP-InnoWax柱(30m×0.32mm ID，0.25μm的膜)。载气为流速1.5mL/min的氦气，测量于45℃、恒定的头部压力；喷射器分流为1∶50，温度为225℃；炉温为45℃1.5min，以10℃/min从45℃升温至160℃，持续0min，然后以35℃/min升温至230℃，持续14min，运行时间为29min。火焰离子化检测器将在260℃、40mL/min的氦气补气条件下使用。结果示于表7中。
表7：溶剂相中的发酵产物的保留时间
分析其脂肪酸丁酯的样品在带有7683B喷射器和G2614A自动取样器的Agilent6890 GC上运行。所述柱是HP-DB-FFAP柱(15m×0.53mm ID(Megabore)，1-微米薄膜厚度柱(30m×0.32mm ID，0.25μm的膜)。载气为流速3.7mL/min的氦气，测量于45℃、恒定的头部压力；喷射器分流为1∶50，温度为225℃；炉温为100℃2.0min，以10℃/min从100℃升温至250℃，然后保持在250℃9min，运行时间为26min。火焰离子化检测器将在300℃、40mL/min的氦气补气条件下使用。使用以下GC标准物(Nu-Chek Prep；Elysian，MN)确认脂肪酸异丁酯产物的同一性：异丁基棕榈酸酯、异硬脂酸丁酯、异油酸丁酯、异丁基亚油酸酯、异丁基亚麻酸酯、异丁基花生酸酯。
实施例11A
实验标识符2010Y033包括：种子烧瓶生长方法、具有移除固体的玉米醪的初始发酵罐制备方法、液化后脂肪酶处理、接种前营养素加入方法、发酵罐接种方法、发酵罐运行条件方法、和所有分析方法。在接种后0.1-1.0小时之间将玉米油脂肪酸加到单批中。产丁醇生物是CEN.PK113-7DΔura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc 1::ilvDSm Δpdc5::sadBΔgpd2::loxP/pYZ090+pLH468(NGCI-070)。
实施例11R
实验标识符2010Y034包括：种子烧瓶生长方法、具有包括固体的玉米醪的初始发酵罐制备方法、液化后脂肪酶处理、接种前营养素加入方法、发酵罐接种方法、发酵罐运行条件方法、和所有分析方法。在接种后0.1-1.0小时之间将玉米油脂肪酸加到单批中。产丁醇生物是CEN.PK113-7DΔura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc 1::ilvDSm Δpdc5::sadBΔgpd2::loxP/pYZ090+pLH468(NGCI-070)。
实施例11C
实验标识符2010Y035包括：种子烧瓶生长方法、具有移除固体的玉米醪的初始发酵罐制备方法、接种前营养素加入方法、发酵罐接种方法、发酵罐运行条件方法、和所有分析方法。在接种后0.1-1.0小时之间将油醇加到单批中。产丁醇生物是CEN.PK113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6Δpdc 1::ilvDSm Δpdc5::sadB Δgpd2::loxP/pYZ090+pLH468(NGCI-070)。
实施例11D
实验标识符2010Y036包括：种子烧瓶生长方法、具有包括固体的玉米醪的初始发酵罐制备方法、接种前营养素加入方法、发酵罐接种方法、发酵罐运行条件方法、和所有分析方法。在接种后0.1-1.0小时之间将油醇加到单批中。产丁醇生物是CEN.PK113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6Δpdc 1::ilvDSm Δpdc5::sadB Δgpd2::loxP/pYZ090+pLH468(NGCI-070)。
实施例11A-11D的结果在表8中示出
表8：实施例11A-11D的发酵条件和结果
实施例12
从发酵罐进料中移除不溶解固体对发酵罐体积效率改善的效应
这个实施例展示在发酵之前从醪中移除不溶解固体对发酵罐体积效率的效应。取决于玉米负荷和淀粉含量，玉米醪中的不溶解固体占醪体积的至少5％。在发酵前移除固体将至少5％的更多的糖加入发酵罐中，因此提高了批生产能力。
预测在实施例10中产生的液化玉米醪包含大约28重量％(280g/L)的液化淀粉，这基于使用的玉米负荷(以干燥玉米基计40％)、玉米的淀粉含量(以干燥玉米基计71.4％)，并且假定在液化期间所有淀粉水解成可液化的低聚糖。所述醪用比如实施例11所述的发酵中期望的低聚糖浓度更高的低聚糖浓度制备，从而允许当加入营养素、种菌、葡糖淀粉酶和碱到初始发酵液体培养基中时进行稀释。在加入这些成分后将醪稀释大约10％。因此，在发酵2010Y034和2010Y036开始时所述醪(包括固体)中的液化淀粉的期望浓度为约250g/L。加到2010Y034和2010Y036发酵中的实际葡萄糖等同物经测量分别为239g/kg和241g/kg(参见表8)。通过比较，加到2010Y033和2010Y035发酵中的葡萄糖等同物经测量分别为257g/kg和263g/kg。注意这些发酵的进料为浓缩物(来自其中已经移除了大多数固体的醪)。将大约1.2L糖源(醪或浓缩物)加到每个发酵中。因此，基于这一数据，将比醪(2010Y034和2010Y036)多大约8.3％的糖加到发酵罐中，所述发酵罐使用浓缩物(2010Y033和2010Y035)。这些结果展示在发酵前从玉米醪中移除不溶解固体能够导致每单位体积加入的糖显著增加。这暗示当存在固体时，它们占据了宝贵的发酵罐体积。如果从进料中移除固体，由于缺少不溶解固体，可将更多的糖加到(“装入”)发酵罐中。这个实施例展示发酵罐体积效率可通过在发酵前从玉米醪中移除不溶解固体而得到显著改善。
实施例13
移除不溶解固体对提取溶剂和液体培养基之间的相分离的效应-提取发酵
这个实施例展示了通过在发酵之前从玉米醪中移除不溶解固体，在提取发酵过程期间和之后改善溶剂相和液体培养基相之间的分离。并列进行两次提取发酵，一次用液化玉米醪作为碳源(不移除固体)，一次用通过从液化玉米醪中移除大部分不溶解固体产生的浓缩物(低聚糖水溶液)。将油醇(OA)加到两次发酵中以从液体培养基中提取产物(i-BuOH)(当它形成时)。在这个其中不从进料(使用的玉米醪)中移除固体的实施例中提及的发酵液体培养基是如实施例10所述的2010Y036。在这个其中从进料(使用的从玉米醪中产生的浓缩物)中移除固体的实施例中提及的发酵液体培养基是如实施例10所述的2010Y035。油醇是两次发酵中使用的提取溶剂。测量并比较整个发酵期间以及最终液体培养基的相分离速率和程度。在提取发酵中充分的相分离可导致最小的微生物损失和最小的溶剂损失以及下游加工中更低的资金和运行成本。
发酵期间溶剂和液体培养基相之间的相分离
在5.3小时、29.3小时、53.3小时和70.3小时从每个发酵罐中取出大约10mL样品，并且比较来自其中移除固体(2010Y035)的发酵的样品和其中未移除固体的样品(2010Y036)的相分离。通过使样品静置约2小时并跟踪液-液界面的位置来观察并比较所有样品所有运行时间的相分离。基本上取自其中不移除固体的发酵的任何样品未观察到相分离。从其中在发酵前从液化玉米醪中移除固体的发酵中取出的样品观察到相分离。在所有发酵时间从其中移除固体的运行中取出的样品在约10-15min内开始发生分离，并且在2小时的时间内持续改善。在约7min的沉降时间后在来自浓缩物发酵(移除固体)的5.3小时发酵运行时间的样品中开始发生相分离。在约17min的沉降时间后在来自浓缩物发酵(移除固体)的53.3小时的样品中开始发生相分离。
图9是发酵样品管中根据(重力)沉降时间的液-液界面的位置的曲线图。所述数据是从其中进料浓缩物(从玉米醪中移除固体)作为糖源和OA作为ISPR提取溶剂的提取发酵中取样的数据(在实施例10中的运行2010Y035)。在这个曲线图中的相分离数据为来自发酵2010Y035的5.3小时、29.3小时、53.3小时和70.3小时运行时间的样品数据。将界面位置报告为样品管中的总液体培养基高度的百分比。例如，在2010Y035发酵(浓缩物/OA)的5.3小时运行时间取样的样品中的界面位置在120min的沉降时间后从样品管底部(无分离)升高到3.5mL。在该特定样品管中有约10mL总液体培养基。因此，该样品的界面位置在图9中报告为35％。类似地，在2010Y035发酵(浓缩物/OA)的53.3小时运行时间取样的样品中的界面位置在125min的沉降时间后从样品管底部(无分离)升高到约3.9mL。在该特定样品管中有约10mL总液体培养基。因此，该样品的界面位置在图9中报告为39％。
在完成发酵后溶剂和液体培养基相之间的相分离
在70小时的运行时间后，停止发酵，将来自OA提取发酵的两种液体培养基转移到分开的2L玻璃刻度量筒中。观察并比较溶剂和液体培养基相的分离。在约3小时后其中在发酵(运行2010Y036)前不移除固体的液体培养基几乎观察不到相分离。其中在发酵(运行2010Y035)前从液化玉米醪中移除固体的液体培养基观察到相分离。分离在约15min的沉降时间后开始发生并且经3小时持续改善。在15min后，在约10％的两相混合物总高度上形成液-液界面。这表明水相首先从分散体中分流出来并开始积聚在混合物底部。随着时间，更多的水相积聚在混合物底部，引起界面位置升高。在约3小时的沉降时间后，界面已经升高到约40％的两相混合物总高度的水平。这指示最终的两相液体培养基(其中基于最初加入发酵的浓缩物和OA的量移除固体)在3小时的(重力)沉降时间后几乎已经发生了完全的相分离。将大约相等体积的初始浓缩物和溶剂加到两个发酵中。将大约1.2L液化玉米醪和大约1.1L OA加到发酵2010Y036中。将从相同批醪中制备的大约1.2L浓缩物和大约1.1LOA加到发酵2010Y035中。在考虑到水相中大约100g/kg的初始糖被消耗的事实和产生的约75％的i-BuOH位于溶剂相中的事实后，如果完全分离发生，将期望相对体积的最终水相和有机相将为约1∶1。图10是根据(重力)沉降时间的最终两相液体培养基的液-液界面位置的曲线图，所述液体培养基来自其中移除固体的提取发酵(2010Y035)。将界面位置报告为用于观察最终液体培养基的相分离的2L刻度量筒中总液体培养基高度的百分比。来自2010Y035发酵的最终液体培养基的界面位置在175min的沉降时间后从刻度量筒的底部(无分离)升高到约40％的两相混合物总高度的水平。因此，在3小时的沉降时间后在最终液体培养基中发生两相的几乎完全分离。大约50％的界面位置将相当于完全分离。
10mL的样品取自最终液体培养基(它已经沉降了约3小时)的有机相顶部，所述发酵液体培养基来自其中已经移除固体的发酵。所述样品在高速实验室离心机中旋转以确定在液体培养基沉降3小时后有机相中存在的水相的量。结果显示约90％的最终液体培养基顶层是溶剂相。约10％的最终液体培养基顶层是水相，包括相对小量的不溶解固体。一些固体位于水相底部(比水相更粘稠)，并且小量固体也积聚在液-液界面上。
10mL的样品也取自最终液体培养基(它已经沉降了约3小时)的底部相，所述发酵液体培养基来自其中已经移除固体的发酵。所述样品在高速实验室离心机中旋转以确定在液体培养基沉降3小时后有机相中存在的水相的量。确定了在液体培养基已经沉降3小时后，基本上无有机相存在于来自其中已经移除固体的发酵的最终液体培养基的底部(水)相。这些结果证实来自其中已经移除固体的发酵的最终液体培养基已经发生了几乎完全的相分离。来自其中尚未移除固体的发酵的最终液体培养基几乎无明显的相分离。这一数据暗示在提取发酵之前从液化玉米醪中移除固体可在发酵期间和之后产生显著改善的相分离，导致下游加工中更少的微生物、不溶解固体和水损失。
在液体培养基已经静置约3小时后从来自其中尚未移除固体的发酵的最终液体培养基顶部取出10mL样品。所述样品在高速实验室离心机中旋转以确定最终液体培养基顶部的溶剂相和水相的相对量。这种液体培养基包含来自液化玉米醪固体的所有固体。约一半的样品是水相，并且约一半的样品时有机相。与来自其中移除固体的液体培养基顶层的样品相比，水相包含显著更多的不溶解固体(来自液化醪)。样品中的水相和溶剂相的量是大约相同的，指示在其中不移除固体的最终液体培养基中基本上不发生相分离(甚至在3小时的沉降时间后)。这一数据暗示如果不在提取发酵前从液化玉米醪中移除固体，在发酵期间和发酵后不太可能发生或不可能发生相分离。这可导致下游加工中显著的微生物、不溶解固体和水的损失。
实施例14
移除不溶解固体对ISPR提取溶剂损失的效应-提取发酵
这个实施例展示了产自提取发酵方法工艺末端的DDGS减少溶剂损失的潜力，所述提取发酵在发酵前从玉米醪中移除不溶解固体。实施例10描述了并列进行的两次提取发酵，一次用液化玉米醪作为碳源(2010Y036-不移除固体)，一次用通过从液化玉米醪中移除大部分不溶解固体获取的液化醪浓缩物(2010Y035-低聚糖水溶液)。将油醇(OA)加到两次发酵中以从液体培养基中提取产物异丁醇(i-BuOH)(当它形成时)。测量并比较回收自最终液体培养基的不溶解固体捕集的残余溶剂的量。
在完成如实施例10所述的发酵2010Y035和2010Y036后，收获液体培养基并用于进行如实施例11所述的相分离测试。然后从每种液体培养基中回收不溶解固体(来自玉米醪的微粒，所述玉米醪在发酵之前不被移除)并分析总的可提取油。分析从每批固体中回收的油的OA和玉米油。两种液体培养基遵循以下规程：
●离心所述液体培养基以分离有机相、水相和固体相。
●从固体中滗析出有机相和水相，留下湿饼在离心瓶底部。
●用水彻底洗涤湿饼以基本上移除保持在饼中的所有液化固体，例如残余的低聚糖、葡萄糖、盐、酶等。
●在真空炉中过夜(室-真空，温度80℃)干燥洗涤湿饼以移除基本上所有饼中的水。
●一部分干燥固体在Soxhlet提取器中充分接触己烷以从固体中移除油。
●通过GC分析从固体中回收的油以测定从固体中回收的油中存在的OA和玉米油的相对量。
●测量从两种发酵液体培养基中回收的固体的粒度分布(PSD)。
表8示出回收并己烷提取来自两种发酵液体培养基的不溶解固体的数据。数据显示两种发酵中的固体(每单位质量固体)吸收大约相同量的油。
表8
实施例15
从湿饼中回收可液化淀粉，所述湿饼通过用水洗涤湿饼从液化玉米醪中移除固体
产生-两阶段方法
这个实施例展示通过用水洗涤饼两次从湿饼中回收可液化淀粉，其中所述饼通过离心液化醪产生。将液化玉米醪进料到连续的滗析器离心机以产生浓缩物流(C-1)和湿饼(WC-1)。浓缩物是相对不含固体的可液化淀粉的水溶液，并且湿饼与进料醪相比浓缩了固体。一部分湿饼与热水混合以形成浆液(S-1)。将浆液泵回通过滗析器离心机以产生洗涤水浓缩物(C-2)和洗涤的湿饼(WC-2)。C-2是相对不含固体的、可液化淀粉的稀释水溶液。C-2中的可液化淀粉的浓度小于产自醪分离的浓缩物中的可液化淀粉的浓度。保留在WC-2中的液相中的淀粉比产自醪分离的湿饼中的液体中的淀粉更稀。洗涤湿饼(WC-2)与热水混合以形成浆液(S-2)。加入的水量对加入的湿饼中的可液化淀粉的量的比率在两个洗涤步骤中相同。将第二洗涤浆液泵回通过滗析器离心机以产生第二洗涤水浓缩物(C-3)和已经被洗涤两次的湿饼(WC-3)。C-3是相对不含固体的、可液化淀粉的稀释水溶液。C-3中的可液化淀粉的浓度小于在第一洗涤阶段(C-2)产生的浓缩物中的可液化淀粉的浓度，并因此保留在WC-3(第二洗涤湿饼)中的液相的淀粉比WC-2(第一洗涤湿饼)中的液相的淀粉更稀。在两种洗涤浓缩物(C-2和C-3)中的总可液化淀粉是被回收并能再循环重新液化的淀粉。保留在最终洗涤湿饼中的液体中的可液化淀粉比在初始醪分离中产生的湿饼中的可液化淀粉少得多。
产生液化玉米醪
大约1000加仑液化玉米醪在连续的干磨液化体系中产生，所述体系由锤磨机、浆液混合器、浆液罐、和液化罐组成。连续进料玉米粉、水、和α-淀粉酶。所述反应器外配有机械搅拌、温度控制、和使用氨或硫酸的pH控制装置。反应条件如下：
●锤磨机筛网尺寸：7/64″
●浆液混合器的进料速率
-玉米粉： 560lbm/hr(14.1重量％的水分)
-加工水： 16.6lbm/min(200F)
-α-淀粉酶： 61g/hr(Genecor：ALPHA)
●浆液罐条件：
-温度： 185°F(85℃)
-pH： 5.8
-停留时间： 0.5小时
-干玉米负荷：31重量％
-酶负荷： 0.028重量％(基于干玉米计)
●液化罐条件：
-温度： 185°F(85℃)
-pH： 5.8
-停留时间： 约3小时
-不加入附加的酶。
液化玉米醪的生产能力约为3gpm。玉米粉的淀粉含量经测量为以干燥玉米基计约70重量％。液化醪的总固体(TS)为约31重量％，并且总悬浮固体(TSS)为大约7重量％。液相包含约23-24重量％的液化淀粉，这通过HPLC测得(可液化的低聚糖)。
液化醪在连续滗析器离心机中以以下条件离心：
●碟速度： 5000rpm(约3600g’s)
●不同速度： 15rpm
●堰直径： 185mm(移除堰板)
●进料速率： 5-20gpm不等。
通过离心醪产生大约850加仑浓缩物和大约1400lbm湿饼。测得湿饼中的总固体为按水分余量计约46.3％(悬浮的+液化的)。已知液相包含约23重量％的可液化淀粉，预测湿饼中的总悬浮固体为约28重量％。预测湿饼包含大约12％的可液化淀粉，其在离心机运行之前存在于液化醪中。
通过用水洗涤固体从湿饼中回收可液化淀粉-第1次洗涤
从液化醪分离中回收的约707lbm湿饼与165加仑热水(91℃)在300加仑不锈钢容器中混合。混合所得浆液约30min。将浆液连续进料到滗析器离心机以从浆液中移除洗涤固体。用于分离洗涤浆液的离心机与从上述液化醪中移除固体所用的离心机相同，并且它在进料浆液之前用新水冲洗。所述离心机在以下条件下运行以从洗涤浆液中移除固体：
●碟速度： 5000rpm(约3600g’s)
●不同速度： 5rpm
●堰直径： 185mm(移除堰板)
●进料速率： 5gpm。
通过离心制备大约600lbm洗涤湿饼，但是由于材料损失，仅回收了400lbm。测得湿饼中的总固体为按水分余量计约36.7％(悬浮的+液化的)。通过HPLC测得在浆液液相和洗涤水浓缩物(获取自浆液)中的总可液化淀粉(葡萄糖、DP2、DP3和DP4+的总量)分别为约6.7重量％和6.9重量％。DP2指右旋糖聚合物，它包含两个葡萄糖单位(葡萄糖二聚体)。DP3指右旋糖聚合物，它包含三个葡萄糖单位(葡萄糖三聚体)。DP4+指右旋糖聚合物，它包含四个或更多个葡萄糖单位(葡萄糖四聚体或多聚体)。这证实获得了良好混合的稀释洗涤阶段。因此，在洗涤湿饼中保留的液相中的可液化淀粉浓度必定已经为这一稀释洗涤的约6.8重量％(按质量余量计)。基于总固体和液化低聚糖数据，预测在洗涤湿饼中的总悬浮固体为约32重量％。如果所有通过离心产生的600lbm的饼可能已经被洗涤，预测洗涤湿饼包含大约2.6％的可液化淀粉，其存在于初始液化醪中。这代表与洗涤前的醪湿饼相比，在洗涤湿饼中的可液化淀粉减少了约78％。如果不洗涤通过液化醪分离产生的湿饼，在醪中约12％的总淀粉将以可液化的(液化的)淀粉形式损失。如果在这个实施例展示的条件下用水洗涤通过醪分离产生的湿饼，来自醪的2.6％的总淀粉将以可液化的(液化的)淀粉形式损失。
从液化醪湿饼的第一再浆液化洗涤中回收的约400lbm的洗涤湿饼与110加仑热水(90℃)在300加仑不锈钢容器中混合。混合所得浆液约30min。将浆液连续进料到滗析器离心机以从浆液中移除洗涤固体。用于分离第二洗涤浆液的离心机与从上述第一洗涤所用的离心机相同，并且它在进料第二洗涤浆液之前用新水冲洗。所述离心机在以下条件下运行以从洗涤浆液中移除固体：
●碟速度： 5000rpm(约3600g’s)
●不同速度： 5rpm
●堰直径： 185mm(移除堰板)
●进料速率： 4gpm。
通过离心产生大约322lbm洗涤湿饼。测得在来自第二洗涤的湿饼中的总固体为按水分余量计约37.4％(悬浮的+液化的)。通过HPLC测得在浆液液相和洗涤水浓缩物(获取自浆液)中的总可液化淀粉(葡萄糖、DP2、DP3和DP4+的总量)分别为约1.6重量％和1.6重量％。这证实在第二洗涤中获得了良好混合的稀释洗涤阶段。因此，在洗涤湿饼中保留的液相中的可液化淀粉浓度必定已经为这一稀释洗涤的约1.6重量％(按质量余量计)。基于总固体和液化低聚糖数据，预测在洗涤湿饼中的总悬浮固体为约36重量％。如果所有在第一洗涤阶段产生的600lbm的饼可能已经被洗涤，预测洗涤湿饼包含大约0.5％的可液化淀粉，其存在于初始液化醪中。这代表与洗涤前的醪湿饼相比，在二次洗涤湿饼中的可液化淀粉总体上减少了约96％。如果不洗涤通过液化醪分离产生的湿饼，在醪中约12％的总淀粉将以可液化的(液化的)淀粉形式损失。如果在这个实施例展示的条件下用水洗涤通过醪分离产生的湿饼两次，来自醪的0.5％的总淀粉将以可液化的(液化的)淀粉形式损失。
实施例16
在液化期间高温阶段对玉米固体中的淀粉转化成可液化的(液化的)淀粉的效应
这个实施例展示了在反应中期的某一时间用高温(或“烹煮”)阶段进行液化能够导致玉米固体中的淀粉更多的转化成可液化的(液化的)淀粉。在这一实施例中展示的“烹煮”阶段涉及在液化开始后的一些时间点提高液化温度、保持更高温度一定的时间、然后降低温度至初始值以完成液化。
A.测量液化后保留在固体中的未水解淀粉的方法
根据实施例1中的规程在一次运行中制备液化玉米醪(无中间的高温阶段)。在与第一次运行相同的条件下在另一次运行中制备液化玉米醪，不同的是增加了中间的高温阶段。根据以下步骤处理来自两次运行的醪。将其离心以从不溶解固体中分离出液化淀粉的水溶液。滗析出液化淀粉的水溶液以回收所述湿饼。所述湿饼包含来自醪的大部分不溶解固体，但是所述固体仍旧用液化淀粉溶液润湿。用水彻底洗涤所述湿饼，并且离心所得浆液以从不溶解固体中分离出含水层。用足量的水洗涤所述饼总计五次以移除大约全部的可液化淀粉，所述可液化淀粉保留在从液化中回收的初始湿饼中。因此，保留在最终的洗涤湿饼中的液相由水组成，基本上不含可液化淀粉。
最终的洗涤湿饼在水中进行再浆液化，加入大幅过量的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。混合所述浆液至少24小时，同时控制温度和pH以使α-淀粉酶能够将基本上所有保留在不溶解固体中的未水解淀粉转化成可液化的低聚糖。从残余淀粉(其在受关注的条件下进行液化期间不水解)中产生的可液化低聚糖随后被存在的葡糖淀粉酶转化成葡萄糖。通过HPLC随时间监控葡萄糖浓度以确保所有从残余淀粉中产生的低聚糖转化成葡萄糖，并且葡萄糖浓度不再随时间提高。
B产生液化玉米醪
在85℃使用SC DS(α-淀粉酶，得自Novozymes，Franklinton，NC)制备两批液化玉米醪(每批大约1L)。两批均在85℃运行略多于2小时。然而，在第二批(“批次2”)的中间阶段增加“烹煮”时期。批次2的温度特征图为在85℃约30min，将温度从85℃提高到101℃，保持在101℃约30min，冷却至85℃，继续再液化120min。在两批中使用的玉米粉与实施例1中使用的玉米粉相同。在两批中使用26重量％(干燥玉米基)的玉米负荷。在两次运行中使用的总酶量对应于0.08重量％(干燥玉米基)。在两次液化运行期间控制pH为5.8。在玻璃带夹套树脂釜中进行液化。所述釜带有机械搅拌、温度控制和pH控制机构。
按照以下规程制备批次1的液化玉米醪：
●在自来水中稀释α-淀粉酶(在20.802g水中的0.418g酶)
●将704.5g自来水加到釜中
●开启搅拌器
●第一次加入玉米粉，198g
●加热至55℃，同时搅拌
●用H2SO4或氢氧化钠调节pH至5.8
●第一次加入α-淀粉酶溶液，7.111g
●加热至85℃
●在85℃加热30min
●第二次加入α-淀粉酶溶液，3.501g
●第二次加入玉米粉，97.5g
●继续在85℃再运行100min。
●完成液化后，冷却至60℃
●倾倒反应器并回收998.5g液化醪。
按照以下规程制备批次2的液化玉米醪：
●在自来水中稀释α-淀粉酶(在16.642g水中的0.3366g酶)
●将562.6g自来水加到釜中
●开启搅拌器
●加入玉米粉，237.5g
●加热至55℃，同时搅拌
●使用稀H2SO4或氢氧化钠调节pH至5.8
●第一次加入α-淀粉酶溶液，4.25g
●加热至85℃
●在85℃加热30min
●加热至101℃
●在101℃加热30min
●将醪的温度降至85℃
●使用稀H2SO4或氢氧化钠调节pH至5.8
●第二次加入α-淀粉酶溶液，4.2439g
●继续在85℃再运行120min。
●完成液化后，冷却至60℃。
C.从液化醪中移除不溶解固体并用水洗涤湿饼以移除可液化淀粉
通过在大型落地式离心机中在室温下以5000rpm离心两批液化醪20min，从中移除大部分固体。离心来自批次1的500g醪，产生334.1g浓缩物和165.9g湿饼。离心来自批次2的872g醪，产生654.7g浓缩物和217g湿饼。从每批液化醪中回收的用自来水洗涤湿饼五次以基本上移除所有保留在饼中的可液化淀粉。在用于离心初始醪的相同瓶中进行洗涤以避免容器间的饼传送。对于每个洗涤阶段，所述饼与水混合，并在室温下离心(5000rpm，20min)所得洗涤浆液。所有五个对湿饼进行的洗涤阶段均完成这一步骤，所述湿饼回收自两批醪。在五次洗涤湿饼(来自批次1)中的每一次使用大约165g水，导致用于洗涤来自批次1的湿饼的水总计为828.7g。在五次洗涤湿饼(来自批次2)中的每一次使用大约500g水，导致用于洗涤来自批次2的湿饼的水总计为2500g。从所有五次水洗涤来自批次1的湿饼过程中回收的洗涤浓缩物共计893.1g。从所有五次水洗涤来自批次2的湿饼过程中回收的洗涤浓缩物共计2566.3g。从批次1回收的最终洗涤湿饼为101.5g，并且从批次2回收的最终洗涤湿饼为151.0g。从每批中获取的最终洗涤湿饼基本上不含可液化淀粉；因此，保留在各个饼中的液体主要是水。使用水分余量测量湿饼的总固体(TS)。来自批次1的湿饼总固体为21.63重量％，并且来自批次2的湿饼的TS为23.66重量％。
D.液化/糖化洗涤湿饼以测定液化后保留在不溶解固体中的未水解淀粉的含量
保留在两种洗涤湿饼中存在的固体中的未水解淀粉的含量通过用水再浆液化所述饼并加入过量α-淀粉酶和过量葡糖淀粉酶进行测量。所述α-淀粉酶将固体中残余的未水解淀粉转化成可液化的低聚糖，其液化在浆液的水相中。所述葡糖淀粉酶随后将通过α-淀粉酶产生的可液化低聚糖转化成葡萄糖。反应在55℃(推荐的葡糖淀粉酶最大温度)下进行至少24小时以确保固体中的所有残余淀粉转化成可液化低聚糖并且所有可液化低聚糖转化成葡萄糖。固体中的残余未水解淀粉是在液化期间不被水解的淀粉，它能够从通过这一方法产生的葡萄糖量计算出来。
在以下规程中使用的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶分别是SC DS和Fuel(Novozymes，Franklinton，NC)。用于处理洗涤湿饼的容器是250mL带夹套玻璃树脂釜，其配有机械搅拌、温度控制和pH控制机构。使用的的量对应于基于“干燥玉米基”计0.08重量％的酶负荷。使用的的量对应于基于“干燥玉米基”计0.2重量％的酶负荷。将这一玉米基定义为假定所有淀粉被水解成可液化低聚糖，提供保留在洗涤饼中的不溶解固体量所需的玉米粉的量。认为保留在洗涤湿饼中的不溶解固体是玉米最大的无淀粉、不可发酵的部分。这些加入的酶比完全液化和糖化26％的玉米负荷所有的酶量高至少四倍。以大幅过量的方式使用酶用于确保固体中的残余淀粉完全水解并将低聚糖完全转化成葡萄糖。
按照以下规程测定存在于来自批次1醪的洗涤湿饼中的固体中的未水解淀粉含量：
●在自来水中稀释α-淀粉酶(在10.3607g水中的0.1297g酶)
●在自来水中稀释葡糖淀粉酶(在15.6054g水中的0.3212g酶)
●将132g自来水加到釜中
●开启搅拌器
●加入68g洗涤湿饼，其产自液化批1(TS＝21.63重量％)
●加热至55℃，同时搅拌
●使用稀H2SO4或氢氧化钠调节pH至5.5
●加入α-淀粉酶溶液，3.4992g
●加入葡糖淀粉酶溶液，5.319g
●在55℃运行24小时，同时控制pH在5.5并定期对浆液取样测量葡萄糖。
按照以下规程测定存在于来自批次2的洗涤湿饼中的固体中的未水解淀粉含量。
●在自来水中稀释α-淀粉酶(在11.709g水中的0.2384g酶)
●在自来水中稀释葡糖淀粉酶(在17.5538g水中的0.3509g酶)
●将154.3g自来水加到釜中
●开启搅拌器
●加入70.7g洗涤湿饼，其产自液化批1(TS＝23.66重量％)
●加热至55℃，同时搅拌
●使用稀H2SO4或氢氧化钠调节pH至5.5
●加入α-淀粉酶溶液，2.393g
●加入葡糖淀粉酶溶液，5.9701g
●在55℃运行24小时，同时控制pH在5.5并定期对浆液取样测量葡萄糖。
比较洗涤湿饼液化/糖化的结果
如上所述，来自批次1和批次2的洗涤湿饼在水中进行再浆液化，并将大幅过量的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶加到浆液中以水解任何保留在固体中的淀粉并将它转化成葡萄糖。图11显示根据时间的浆液水相中的葡萄糖浓度。
葡萄糖浓度随时间提高并且在两个反应大约24小时时超出最大值。在24和48小时之间葡萄糖水平略微降低，这可能是由于微生物污染；因此，在每个体系中达到的最大葡萄糖含量被用于计算洗涤湿饼的固体中的残余未水解淀粉的含量。通过反应(在α-淀粉酶和葡糖淀粉酶存在的情况下)获取自批次1液化的洗涤湿饼达到的最大葡萄糖含量是4.48g/L。通过比较，通过反应(在α-淀粉酶和葡糖淀粉酶存在的情况下)获取自批次2液化的洗涤湿饼达到的最大葡萄糖含量是2.39g/L。
在液化醪(其在液化期间不发生水解)中的不溶解固体中的残余未水解淀粉的含量根据获取自洗涤湿饼的葡萄糖数据进行计算，所述洗涤湿饼从对应的醪批中获得。
●液化批1：在固体中的残余未水解淀粉对应于进料于液化的玉米中的2.1％总淀粉。这暗示玉米中2.1％的淀粉在批次1液化期间未水解。在液化批1期间无中间的高温(“烹煮”)阶段。
●液化批2：在固体中的残余未水解淀粉对应于进料于液化的玉米中的1.1％总淀粉。这暗示玉米中1.1％的淀粉在批次2液化期间未水解。在液化批2期间存在高温(“烹煮”)阶段。
这个实施例展示在液化期间的某个时段增加高温“烹煮”阶段可导致更高的淀粉转化率。这将导致更少的残余未水解淀粉保留在液化玉米醪中的不溶解固体中，并且将导致其中在液化前从醪中移除不溶解固体的方法中更少的淀粉损失。
实施例17
在液化期间高温阶段对玉米固体中的淀粉转化成可液化的(液化的)淀粉的效应
在85℃使用SC DS(α-淀粉酶，得自Novozymes，Franklinton，NC)制备两批液化玉米醪(批次3和批次4)。两批均在85℃运行略多于2小时。然而，在批次4的中间阶段增加“烹煮”时期。批次4的温度特征图为在85℃约30min，将温度从85℃提高到121℃，保持在121℃约30min，冷却至85℃，继续再液化90min。在两批中使用的玉米粉与实施例1中使用的玉米粉相同。在两批中使用26重量％(干燥玉米基)的玉米负荷。在两次运行中使用的总酶量对应于0.04重量％(干燥玉米基)。在两次液化运行期间控制pH为5.8。批次3的液化在1L玻璃带夹套树脂釜中进行，并且批次4的液化在200L不锈钢发酵罐中进行。两个反应器均全配有机械搅拌、温度控制和pH控制机构。
这个实施例的实验条件类似于在实施例14中描述的那些，具有以下差异：
对于批次3的液化玉米醪的生产：0.211g α-淀粉酶被稀释于10.403g自来水中。第一次加入的α-淀粉酶溶液为3.556g。第二次加入的α-淀粉酶溶液为1.755g，并且允许反应在85℃继续再运行90min。
对于批次4的液化玉米醪的生产：将22g α-淀粉酶稀释在2kg自来水中，加入147.9kg自来水到发酵罐中，并加入61.8kg玉米粉。第一次加入的α-淀粉酶溶液为1.0kg，将反应加热到85℃并保持在85℃30min，然后将反应加热到121℃并保持在121℃ 30min。第二次加入的α-淀粉酶溶液为1kg，并且允许反应在85℃继续再运行90min。
从液化醪中移除不溶解固体并用水洗涤湿饼以移除可液化淀粉
通过在大型落地式离心机中在室温下以5000rpm离心两批液化醪15min，从中移除大部分固体。离心来自批次3的500.1g醪，产生337.2g浓缩物和162.9g湿饼。离心来自批次4的509.7g醪，产生346.3g浓缩物和163.4g湿饼。从每批液化醪中回收的用自来水洗涤湿饼五次以基本上移除所有保留在饼中的可液化淀粉。在用于离心初始醪的相同瓶中进行洗涤以避免容器间的饼传送。对于每个洗涤阶段，所述饼与水混合，并在室温下离心(5000rpm，15min)所得洗涤浆液。所有五个对湿饼进行的洗涤阶段均完成这一步骤，所述湿饼回收自两批醪。在五次洗涤湿饼(来自批次3)中的每一次使用大约164g水，导致用于洗涤来自批次3的湿饼的水总计为819.8g。在五次洗涤湿饼(来自批次4)中的每一次使用大约400g水，导致用于洗涤来自批次4的湿饼的水总计为2000g。从所有五次水洗涤来自批次3的湿饼过程中回收的洗涤浓缩物共计879.5g。从所有五次水洗涤来自批次4的湿饼过程中回收的洗涤浓缩物共计2048.8g。从批次3回收的最终洗涤湿饼为103.2g，并且从批次4回收的最终洗涤湿饼为114.6g。从每批中获取的最终洗涤湿饼基本上不含可液化淀粉；因此，保留在各个饼中的液体主要是水。使用水分余量测量湿饼的总固体(TS)。来自批次3的湿饼总固体为21.88重量％，并且来自批次4的湿饼的TS为18.1重量％。
这个实施例的实验条件类似于在实施例14中描述的那些，具有以下差异：
液化/糖化洗涤湿饼以测定批次3液化后保留在不溶解固体中的未水解淀粉的含量：加入68g洗涤湿饼，其产自液化批3(TS＝21.88重量％)加入3.4984g α-淀粉酶溶液和5.3042g葡糖淀粉酶。所述反应在55℃运行47小时，同时控制pH在5.5并定期对浆液取样测量葡萄糖。
液化/糖化洗涤湿饼以测定批次4液化后保留在不溶解固体中的未水解淀粉的含量：将0.1663g α-淀粉酶稀释在13.8139g自来水中，并将0.213g葡糖淀粉酶稀释在20.8002g自来水中。将117.8g自来水加到釜中。加入82.24g洗涤湿饼，其产自液化批4(TS＝18.1重量％)加入3.4952g α-淀粉酶溶液和10.510g葡糖淀粉酶。所述反应在55℃运行50小时，同时控制pH在5.5并定期对浆液取样测量葡萄糖。
比较洗涤湿饼液化/糖化的结果
如上所述，来自批次3和批次4的洗涤湿饼在水中进行再浆液化，并将大幅过量的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶加到浆液中以水解任何保留在固体中的淀粉并将它转化成葡萄糖。图12显示根据时间的浆液水相中的葡萄糖浓度。
葡萄糖浓度随时间提高并且对于批次3的洗涤湿饼在大约26小时时超出最大值。对于批次4的洗涤湿饼，在24小时和47小时之间葡萄糖浓度持续地略微提高。假设批次4的湿饼在47小时测得的葡萄糖浓度为大约等于最大值。通过反应(在α-淀粉酶和葡糖淀粉酶存在的情况下)获取自批次3液化的洗涤湿饼达到的最大葡萄糖含量是8.33g/L。通过比较，通过反应(在α-淀粉酶和葡糖淀粉酶存在的情况下)获取自批次4液化的洗涤湿饼达到的最大葡萄糖含量是4.92g/L。
在液化醪(其在液化期间不发生水解)中的不溶解固体中的残余未水解淀粉的含量根据获取自“水解”洗涤湿饼(在过量α-淀粉酶和葡糖淀粉酶存在的情况下)的葡萄糖数据进行计算，所述洗涤湿饼从对应的醪批中获得。
●液化批3：在固体中的残余未水解淀粉对应于进料于液化的玉米中的3.8％总淀粉。这暗示玉米中3.8％的淀粉在批次3液化期间未水解。在液化批3期间无中间的高温(“烹煮”)阶段。
●液化批4：在固体中的残余未水解淀粉对应于进料于液化的玉米中的2.2％总淀粉。这暗示玉米中2.2％的淀粉在批次4液化期间未水解。在液化批4期间存在高温(“烹煮”)阶段。
这个实施例展示在液化期间的某个时段增加高温“烹煮”阶段可导致更高的淀粉转化率。这将导致更少的残余未水解淀粉保留在液化玉米醪中的不溶解固体中，并且将导致其中在液化前从醪中移除不溶解固体的方法中更少的淀粉损失。
实施例16和17的概述和比较
液化条件能够影响玉米固体中的淀粉向可液化(液化)淀粉的转化。能够影响玉米粉中的淀粉转化成可液化淀粉的可能液化条件是温度、酶(α-淀粉酶)负荷、和在液化期间的某些时间+/-高温(“烹煮”)阶段。实施例16和17展示了在液化期间某些时间实施高温(“烹煮”)阶段能够导致玉米固体中的淀粉更多地向可液化(液化)淀粉转化。在实施例16和17中描述的液化中的高温阶段涉及在液化开始后的某些时间点提高液化温度、保持更高温度一定的时间、然后降低温度至初始值以完成液化。
与实施例16相比较的液化反应在与实施例17相比较的反应不同的酶负荷下运行。这些实施例展示了两个关键液化条件对淀粉转化率的效应：(1)酶负荷，和(2)在液化期间某些时间+/-实施高温阶段。
用于制备在实施例16和17中描述的四批液化玉米醪的条件在下文和表9中概述。
所有批次的常用条件：
●液化温度-85℃
●在液化温度下的总时间-大约2小时
●用于碾磨玉米的筛网尺寸-1mm
●pH-5.8
●干玉米负荷-26％
●α-淀粉酶-SC DS(Novozymes，Franklinton，NC)。
表9
批次2和4的温度特征图是(所有值为近似值)：85℃30min，高温阶段30min，85℃90min。在初始85℃时期加入一半酶，并且在最终的85℃时期高温阶段后加入另一半酶。
图13示出了酶负荷和在液化期间某些时段施用+/-高温阶段对淀粉转化的效应。在固体中的残余未水解淀粉的含量是在受关注的液化条件期间不水解的淀粉含量。图13示出通过在液化期间的某些时间点实施高温(“烹煮”)阶段将在固体中的未水解淀粉的含量减少几乎一半。这在两个不同的酶负荷上得到证明。图13的数据也显示无论是否在液化期间实施高温阶段，倍增酶负荷导致几乎一半的未水解淀粉含量保留在固体中。这些实施例展示了用更高的酶(α-淀粉酶)负荷进行液化和/或在反应期间的某个时间增加高温(“烹煮”)阶段能够导致存在于液化玉米醪中的不溶解固体中的残余未水解淀粉显著减少并能够减少其中在液化前从醪中移除不溶解固体的方法中的淀粉损失。在其中在发酵前移除固体的方法中，在液化后固体中的任何残余淀粉将没有机会在发酵期间水解。
实施例18
在85℃酶消化后筛网分离淀粉和不溶解物
当调节是必需的时，按照实施例1所述的方法制备的醪(301克)用氢氧化钠溶液滴剂保持在pH5.8，用供应商指定的α-淀粉酶(Novozyme，Franklinton，NC)剂量(大约0.064克)处理并保持在85℃五小时。冷藏所述产物。
加热冷藏产物至大约50℃并将48g产物加载到过滤器组合件上，所述组合件包含100目筛网并连接到介于-15英寸汞柱和-20英寸汞柱之间的低真空源上。所述筛网盘具有44cm2的暴露筛网表面积并被密封在由(Thermo Fisher Scientific，Rochester，NY)提供的塑料过滤器外壳内。过滤所述浆液以在筛网上形成湿饼并在接收瓶中形成40.4g黄色浑浊滤液。所述湿饼立即原位用水洗涤，随后停止，同时真空源继续将任何游离水分从最终的洗涤饼中吸出。当过滤器下侧无滴水时，停止过滤。经3个阶段收集附加的28.5g洗涤滤液，其中过滤的最后阶段显示了最淡的颜色和最低的浊度。在室温下经24小时将7.6g的最终湿饼质量风干至2.1g。在用热灯干燥后测定出2.1g包含7.73％的水。这个实验的真空过滤产生包含25％总干燥固体的湿饼。
滤液样品与油醇在室温下合并、剧烈混合并沉降。在大约15min后恢复界面，但是保留了浑浊的混杂层。
Lugol’s溶液(淀粉指示剂)由1g(＞99.99％)(基于微量元素)碘、2g级(＞99％)碘化钾(都来自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、和17g实验室去离子水(一滴的量)组成，将其加入滤液样品，干燥饼固体在水和水对照样品中进行再浆液化。所述滤液变为深蓝色或紫色，固体浆液变为深蓝色并且水变为淡琥珀色。比琥珀色更深的任何颜色指示存在大于12个单位长度的低聚糖。
这个实验示出大多数悬浮固体能够从淀粉溶液中分离出来，所述淀粉溶液如上所述在100目筛网上以中速进行制备，并且该淀粉与滤饼固体保留在一起。这指示饼的不完全洗涤，其中一部分水解淀粉被留下。
用156克的醪在63mm直径的100目筛网筛网上重复这一实验。最大温度为102℃，所述酶是并且所述浆液保持在高于85℃三小时。测量并测定筛网速率为0.004加仑每min每平方英尺筛网面积或更低。
实施例19
在115℃酶消化后筛网分离淀粉和不溶解物
将实验室去离子水(200g)加入开口的Parr Model 46351升压力容器(Moline，IL)中并加热至85℃。用磁性搅拌棒搅拌水。以匙加入如实施例1所述制备的干玉米粉(90g)。用氨水溶液原液将pH从5.2提高到接近6.0。用小的校准移液管加入大约0.064克溶液。密封压力容器的封盖并用氮气罐将容器加压至50psig。在6min内将搅拌的混合物加热至110℃并保持在106℃至116℃之间共计20min。减少加热，减轻压力，并打开容器。加入附加的0.064g并将温度保持在63-75℃附加的142min。
从Parr容器中取出小量浆液并通过堆叠的100、140、和170目筛网进行重力过滤。固体仅保留在100目筛网上。
转移一部分约40％的浆液，同时加热直径为75毫米的100和200目盘双筛网组合件的顶部。发生一些重力过滤。向滤液接收器施加介于-15和-20英寸汞柱之间的真空并进行稳定的过滤。滤液是黄色浑浊的，但是是稳定的分散体。饼表面暴露不超过5min。用去离子水喷雾器洗涤饼2-3min，并改变接收器重复该过程，直至滤液的浊度恒定-总计五次喷雾。检查筛网，结论是所有固体位于100目筛网上，并且无固体位于200目筛网上。湿饼厚度为5mm。测得湿饼质量为18.9g并且合并的滤液质量为192g。
在65℃将浆液的保留质量转移到具有原位100目筛网的过滤器组合件中并过滤5-10min。用去离子水喷雾器洗涤饼3-4min，并改变接收器重复该过程，直至滤液的浊度恒定-总计八次喷雾。保持真空直至从过滤器下侧观察不到液滴滴下。湿饼厚度为8mm，直径为75mm，质量为36.6g。合并的滤液重261g。
按照上述方法测试三个小瓶的淀粉。一个小瓶包含水，并且其他两个小瓶包含在去离子水中浆液化的湿饼样品。所有小瓶变为黄色-琥珀色。这理解为滤饼被洗涤至无淀粉的低聚糖。这些固体随后用长时间的液化和随后的糖化进行严格分析以确认基于葡萄糖计，所述湿饼包含不超过0.2％的初始玉米中的总淀粉。
滤液样品与油醇在小瓶中合并、剧烈混合并沉降。快速形成一个清澈的油层，并且界面分界良好，很少有混杂的层。这个实施例展示了在其中将玉米醪加热至～110℃的水热条件烹煮20min、在85℃进一步液化超过两小时、随后过滤并洗涤的方法中，总滤液基本上包含谷物中提供的所有淀粉。此外，在油醇和滤液中包含的杂质之间无显著的干涉作用。
用247克的醪在75mm直径的80目筛网筛网上重复这一实验。最高烹煮温度为115℃，所述酶为并且所述浆液保持在85℃或更高温度下三小时。测量并测定筛网速率为超过0.1加仑每min每平方英尺筛网面积。
实施例20
脂质分析
通过用酯交换将多种包含脂肪酸的化合物转化成脂肪酸甲酯(“FAME”)进行脂质分析。甘油酯和磷脂使用甲醇钠在甲醇中进行酯交换。甘油酯、磷脂和游离脂肪酸使用乙酰氯在甲醇中进行酯交换。通过气相色谱，使用配有30-m×0.25mm(i.d.)的Agilent 7890GC分析所得FAME。OMEGAWAXTM(Supelco，SigmaAldrich，St.Louis，MO)柱在用甲苯/己烷(2∶3)稀释后。炉温以5℃/min的速度从160℃升高至200℃，然后以10℃/min的速度从200℃升高至250℃(保持10min)。在与已知甲酯(ME)进行比较时，经由GC分析记录的FAME峰通过它们的保留时间进行鉴定，并且通过比较FAME峰面积与已知量内标(C15:0甘油三酯，通过酯交换方法与样品一起取出)的峰面积进行定量。因此，根据下式计算任何脂肪酸FAME的近似量(mg)(“mg FAME”)：(特定脂肪酸的FAME峰面积/15:0FAME峰面积)*(内标C15:0 FAME mg)。然后可通过除以合适的分子量转换因子1.052将FAME结果修正至对应脂肪酸mg。所有内标和参考标准物获取自Nu-Chek Prep，Inc。
提高乘以分子量转换因子1.045将使用甲醇钠在甲醇中进行样品酯交换获得的脂肪酸结果转化成对应的甘油三酯含量。甘油三酯一般占这个实施例样品研究中大约80％至90％的甘油酯，剩余的甘油酯是甘油二酯。单酸甘油酯和磷脂含量一般可忽略不计。通过减去使用甲醇钠方法的相同样品测得的脂肪酸对使用乙酰氯在甲醇中进行样品酯交换获得的总脂肪酸结果进行甘油酯含量修正。所述结果是样品的游离脂肪酸含量。
使用薄层色谱法测定甘油酯内容物(单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、和磷脂)的分配。将液化在6∶1氯仿/甲醇中的油溶液点在靠近玻璃板底部，所述玻璃板预涂有硅胶。然后使用70∶30∶1的己烷/乙醚/乙酸溶剂体系使所述点在板上向上层析。然后通过用碘蒸气给所述板染色检测对应于单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、和磷脂的分开的点。然后将所述点从板上刮掉，使用乙酰氯在甲醇中进行酯交换，并通过气相色谱进行分析。每个点的总峰面积对所有点的总峰面积的比率是不同甘油酯的分配。
实施例21
这个实施例展示了从釜馏物中移除固体并通过除溶剂器提取来从固体中回收脂肪酸、酯、和甘油三酯。在发酵期间，从完整釜馏物中分离出固体并进料于除溶剂器中，其中它们接触1.1吨/小时的蒸汽。完整釜馏物湿饼(提取器进料)、溶剂、提取器混杂油、以及提取器排出固体的流速在表10中示出。表中的值是吨/小时。
表10
排出除溶剂器的固体进料于烘干机。排出除溶剂器的蒸气包含0.55吨/小时的己烷和1.102吨/小时的水。冷凝这一气流并进料于滗析器。排出滗析器的富水相包含约360ppm的己烷。将这一物流进料于蒸馏塔，其中从富水物流中移除己烷。冷凝排出蒸馏塔顶部的富含己烷的物流并进料于滗析器。排出滗析器的富含有机物的物流进料于蒸馏塔。蒸汽(11.02吨/小时)进料于蒸馏塔底部。这种塔塔顶和底部产物的组成在表11中示出。表中的值是吨/小时。
表11
| 底部 | 顶部 | |
| 脂肪酸 | 0.0981 | 0 |
| 脂肪酸丁酯 | 2.8232 | 0 |
| 己烷 | 0.0011 | 11.12 |
| 甘油三酯 | 0.9812 | 0 |
| 水 | 0 | 11.02 |
实施例22
这个实施例展示了从醪中回收副产物。在实施例10所述的条件下从醪中分离出玉米油，不同的是使用三相卧螺离心机(Flottweg Z23-4碟直径为230mm，长径比为4∶1)，条件如下：
●碟速度： 5000rpm
●不同速度： 10rpm
●进料速率： 3gpm
●相分隔体盘： 138mm
●叶轮设置： 144mm。
分离的玉米油具有81％的甘油三酯，6％的游离脂肪酸，4％的甘油二酯，和5％的总磷脂以及单酸甘油酯，它们根据实施例18所述的方法和薄层色谱法进行测定。
在上述条件下从醪中分离的固体具有58％的含水量(其根据干燥时的重量损失进行测定)并具有1.2％的甘油三酯和0.27％的游离脂肪酸(其根据如实施例18所述的方法进行测定)。
假定在表12中示出完整釜馏物的组成并假定在表13中示出完整釜馏物的组成，计算表14中分离自完整釜馏物的固体、在蒸发器塔板之间提取的油、副产物提取剂和浓缩酒糟可溶物(Condensed Distillers Solubles，CDS)的组成(在三相卧螺离心机中分离。表11的值获取自Aspen型(Aspen Technology，Inc.，Burlington，MA)。这种型号假定玉米油不从醪中提取。预测以细胞、液化固体、和悬浮固体的干燥基计的蛋白质含量分别为大约50％、22％和35.5％。预测副产物提取剂的组成为以干燥基计70.7％的脂肪酸和29.3％的脂肪酸异丁酯。
表12
| 组分 | 质量％ |
| 水 | 57.386％ |
| 细胞 | 0.502％ |
| 脂肪酸 | 6.737％ |
| 脂肪酸异丁酯 | 30.817％ |
| 甘油三酯 | 0.035％ |
| 悬浮固体 | 0.416％ |
| 液化固体 | 4.107％ |
表13
| 水解的进料 | 稀釜馏物 | 固体 | |
| 有机物 | 99.175％ | 0.75％ | 0.08％ |
| 水和液化固体 | 1％ | 96％ | 3％ |
| 悬浮固体和细胞 | 1％ | 2％ | 97％ |
表14
| 物流 | C.蛋白 | 甘油三酯 | FFA | FABE |
| 完整釜馏物湿饼 | 40％ | 痕量 | 0.5％ | 2.2％ |
| 在蒸发器上的油 | 0％ | 0.08％ | 16.1％ | 73.8％ |
| CDS | 22％ | 痕量％ | 0.37％ | 1.71％ |
尽管本发明的多个实施方案已如上描述，但是应当理解它们仅仅以举例的方式存在，并且不受限制。对相关领域的技术人员将显而易见的是能够在不脱离本发明的实质和范围下能够对其进行形式和细节的多种变型。因此，本发明的广度和范围应不受任何上述示例性实施方案的限制，但应仅仅根据以下权利要求及其等同物限定。
在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均指示本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且以引用方式并入本文至如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体且单独地指明为以引用方式并入的相同程度。
Claims (42)
1.发酵方法，包括：
提供包含可发酵碳源、不溶解固体、油和水的原料浆液；
在单个容器中从所述原料浆液中分离不溶解固体以产生(i)包含可发酵碳源的水溶液，(ii)包含固体的湿饼，和(iii)油；以及
将所述水溶液加到在发酵器中包含重组微生物的发酵液体培养基中，从而产生发酵产物，
其中，在发酵之前从原料浆液中分离油得到湿饼中更少的油和对于DDGS的改善的产物特征。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括使所述发酵液体培养基与提取剂接触，并从所述发酵液体培养基提取发酵产物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述提取剂是有机提取剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述提取剂包括一种或多种不可混溶的有机提取剂，所述不可混溶的有机提取剂选自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、以及它们的混合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述提取剂包括来源于玉米油的C12-C22脂肪酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述原料浆液通过三相卧螺离心、盘叠式离心、滗析器离心、浮选、水力旋流器、重力沉降器、
涡旋分离器、或它们的组合进行分离。
7.根据权利要求1所述的方法，还包括液化原料以产生原料浆液的步骤；其中所述原料选自玉米粒、玉米棒、作物残余物如玉米壳、玉米秸秆、草、玉米、小麦、黑麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、由谷物的研磨获得的组分、纤维素材料、木质纤维素材料、树、枝、根、
叶、木片、木屑、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述原料是玉米。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述原料是分级的或未分级的。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述原料是湿磨的或干磨的。
11.根据权利要求7所述的方法，还包括在液化期间提高反应温度的步骤。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述湿饼包含油。
13.根据权利要求1所述的方法，其中用水洗涤所述湿饼以回收存在于所述湿饼中的低聚糖。
14.根据权利要求13所述的方法，其中将所述回收的低聚糖加到所述发酵器中。
15.根据权利要求1所述的方法，其中进一步加工所述湿饼以形成动物饲料产品。
16.根据权利要求12所述的方法，其中用溶剂洗涤所述湿饼以回收存在于所述湿饼中的油。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述溶剂选自己烷、丁醇、异丁醇、异己烷、乙醇和石油馏分。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵产物是产物醇，所述产物醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、以及它们的异构体。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物包含工程化的丁醇生物合成途径。
20.根据权利要求1所述的方法，还包括：
至少部分地蒸发所述发酵液体培养基和产物以及任选的CO2，其中产生蒸气流，并且从所述蒸气流中回收所述产物。
21.根据权利要求20所述的方法，还包括使所述蒸气流与吸收液相接触，其中所述蒸气流的至少一部分被吸收到所述吸收液相中；
其中在所述蒸气流被吸收到所述吸收液相中的开始的温度大于在所述吸收液相不存在的情况下冷凝所述蒸气流的开始的温度。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述蒸发和接触步骤在真空条件下进行。
23.根据权利要求20所述的方法，其中从所述浆液中分离所述不溶解固体的主要部分提供了所述发酵液体培养基的相对于包含不溶解固体的发酵液体培养基的更高的蒸气压。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述更高的蒸气压提供更有效的蒸发产物回收。
25.生产丁醇的方法，包括：
提供原料；
液化所述原料以产生原料浆液，其中所述原料浆液包含低聚糖、油和不溶解固体；
在单个容器中从所述原料浆液中分离不溶解固体以产生(i)包含低聚糖的水溶液，(ii)包含不溶解固体的湿饼，和(iii)油；
在发酵罐中使所述水溶液与发酵液体培养基接触；
添加包含丁醇生物合成途径的重组微生物；
发酵所述发酵罐中的低聚糖以产生丁醇；以及
当所述丁醇产生时，从所述发酵液体培养基中进行液-液提取以移除所述丁醇，
其中，从原料浆液中分离油使得提取剂的分配系数稳定。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述原料是玉米，并且所述油是玉米油。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述不溶解固体包括胚芽、纤维和谷蛋白。
28.根据权利要求27所述的方法，还包括干磨所述原料。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述玉米是未分级的。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述原料浆液通过三相卧螺离心、盘叠式离心、滗析器离心、浮选、水力旋流器、重力沉降器、
涡旋分离器、或它们的组合进行分离。
31.根据权利要求25所述的方法，其中分离所述原料浆液的步骤包括离心所述原料浆液。
32.根据权利要求25所述的方法，其中用水洗涤所述湿饼以回收存在于所述湿饼中的低聚糖。
33.根据权利要求25所述的方法，其中用于所述液-液提取的提取剂是有机提取剂。
34.根据权利要求25所述的方法，其中糖化所述水溶液中的低聚糖与发酵所述发酵罐中的低聚糖同时发生。
35.根据权利要求25所述的方法，还包括在液化期间提高反应温度的步骤。
36.根据权利要求25所述的方法，还包括在发酵所述发酵罐中的低聚糖之前糖化所述低聚糖。
37.根据权利要求25所述的方法，其中在糖化所述糖之前分离所述原料浆液。
38.根据权利要求25所述的方法，其中所述丁醇是异丁醇。
39.生产丁醇的体系，包括：
被构造成液化原料以产生原料浆液的液化容器，所述液化容器包括：
用于接纳所述原料的入口；和
用于排出原料浆液的出口，其中所述原料浆液包含低聚糖、油和不溶解固体；
分离装置，其被构造成分离所述原料浆液以产生(i)包含所述低聚糖的水溶液，(ii)包含所述不溶解固体的湿饼，和(iii)油，所述分离装置包括：
用于接纳所述原料浆液的入口；
用于排出所述水溶液的第一出口；
用于排出所述湿饼的第二出口；和
用于排出油的第三出口；以及
被构造成发酵所述水溶液以产生丁醇的发酵罐，所述发酵罐包括：
用于接纳所述水溶液的第一入口；
用于接纳提取剂的第二入口；
用于排出所述富含丁醇的提取剂的第一出口；和
用于排出发酵液体培养基的第二出口。
40.根据权利要求39所述的体系，还包括被构造成糖化所述原料浆液中的糖的糖化容器，所述糖化容器包括：
用于接纳所述原料浆液的入口；和
用于排出所述原料浆液的出口。
41.根据权利要求40所述的体系，还包括被构造成糖化所述水溶液中的糖的糖化容器，所述糖化容器包括：
用于接纳所述水溶液的入口；和
用于排出所述水溶液的出口。
42.根据权利要求39所述的体系，还包括被构造成碾磨所述原料的干磨机，所述干磨机包括：
用于接纳所述原料的入口；和
用于排出经碾磨的原料的出口。
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