MX2012014687A - Metodos y sistemas para eliminar solidos no disueltos antes de la fermentacion extractiva en la produccion de butanol. - Google Patents

Metodos y sistemas para eliminar solidos no disueltos antes de la fermentacion extractiva en la produccion de butanol.

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Brian Michael Roesch
Keith H Burlew
John W Hallam
David J Lowe
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Abstract

Se proporciona un método y sistema para producir eficazmente un producto de alcohol fermentativo, tal como butanol, por medio de extracción del producto in situ. La eficacia se obtiene por medio de la separación de sólidos no disueltos después de licuar una materia prima determinada para crear una materia prima y antes de la fermentación, por ejemplo, a través de centrifugación. La eliminación de los sólidos no disueltos evita problemas asociados con la presencia de sólidos no disueltos durante la extracción de la producción in situ y, por lo tanto, aumenta la eficacia de la producción de alcohol.

Description

METODOS Y SISTEMAS PARA ELIMINAR SOLIDOS NO DISUELTOS ANTES DE LA FERMENTACION EXTRACTIVA EN LA PRODUCCION DE BUTANOL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a procesos y sistemas para eliminar sólidos no disueltos de una corriente de alimentación de un termentador durante la producción de alcoholes de fermentación, tales como butanol.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El butanol es una sustancia química industrial importante con diversas aplicaciones que incluyen el uso de este como aditivo para combustibles, como materia prima química en la industria de los plásticos y como agente extractante de grado alimenticio en la industria de los alimentos y saborizantes . En consecuencia, existe una alta demanda de butanol, así como también de los métodos de producción eficaces y compatibles con el ambiente.
La producción de butanol por fermentación con microorganismos es uno de esos métodos de producción compatibles con el ambiente. Además, algunos microorganismos que generan una producción alta de butanol tienen umbrales de toxicidad del butanol bajos, de modo que es necesario eliminar el butanol del termentador a medida que se produce. La eliminación del producto in situ (ISPR, por sus siglas en REF. : 236529 inglés) puede usarse para eliminar butanQl del fermentador a medida que se produce y, de ese modo, permite que el microorganismo produzca butanol con un alto rendimiento. Un método para la ISPR que se ha descrito en la técnica es la extracción liquido-líquido (publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305370) . Para que la extracción líquido-líquido sea técnica y económicamente viable se requiere el contacto entre el extractante y el caldo de fermentación de modo que la transferencia de masa sea eficaz; la separación de fases del extractante a partir del caldo de fermentación (durante y después de la fermentación) y/o la recuperación y el reciclado eficaz del disolvente y la degradación y/o contaminación mínima del extractante durante una operación prolongada.
Cuando la corriente acuosa que entra al fermentador contiene sólidos no disueltos de la materia prima, los sólidos no disueltos interfieren con los requerimientos mencionados anteriormente para que la extracción líquido-líquido sea técnica y económicamente viable ya que aumentan los costos de capital y, operativos. Particularmente, la presencia de los sólidos no disueltos durante la fermentación extractiva puede reducir el coeficiente de transferencia de masa dentro del fermentador, dificultar la separación de fáses en el fermentador, producir la acumulación de aceite (por ejemplo, aceite de maíz) de los sólidos no disueltos en el extractante, lo que reduce la eficacia de la extracción con el tiempo, podría incrementar la pérdida de disolvente ya que este queda atrapado en sólidos que finalmente se extraen como granos secos de destilería con solubles (DDGS, por sus siglas en inglés), podría reducir la velocidad de desacoplamiento de las gotas de extractante del caldo de fermentación y/o podría reducir la eficacia del volumen del termentador. Por lo tanto, existe la necesidad continua de desarrollar métodos y sistemas más eficaces para producir productos de alcohol, tal como butanol, por medio de fermentación extractiva.
La presente invención satisface la necesidad mencionada anteriormente y proporciona métodos y sistemas para producir productos de alcohol, tal como butanol, mediante la disminución de la cantidad de sólidos no disueltos que se alimentan al termentador .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a procesos y sistemas para eliminar sólidos no disueltos de una corriente de alimentación de un termentador durante la producción de alcoholes de fermentación tales como butanol .
La presente invención está dirigida a un método que comprende proporcionar una suspensión de materia prima de biomasa que comprende una fuente de carbono fermentable, sólidos no disueltos y agua; separar al menos una porción de los sólidos no disueltos de esa suspensión por medio de lo cual se genera (i) una solución acuosa que comprende una fuente de carbono fermentable y (ii) un coproducto de torta húmeda que comprende sólidos; y añadir la solución acuosa a un caldo de fermentación que comprende microorganismos recombinantes en un recipiente de fermentación por medio de lo cual se genera un producto fermentativo; en donde mejora la productividad del procesamiento de la biomasa. En algunas modalidades, la productividad mejorada del procesamiento de la biomasa comprende un producto fermentativo mejorado y la capacidad de recuperación de un coproducto con respecto a un producto fermentativo producido en presencia de sólidos no disueltos. En algunas modalidades, la productividad mejorada del procesamiento de la biomasa incluye una mayor capacidad de reciclado de la corriente del proceso y/o > una mayor eficacia del volumen del termentador y/o una mayor alimentación de la carga de la materia prima de la biomasa. En algunas modalidades, el método comprende, además, poner en contacto el caldo de fermentación con un extractante, en donde el extractante ha aumentado la eficacia de la extracción con respecto a un caldo de fermentación que comprende sólidos no disueltos. En algunas modalidades, la mayor eficacia de la extracción incluye un coeficiente de partición del extractante estabilizado y/o una separación de fases mejorada del extractante del caldo de fermentación y/o un coeficiente de transferencia de masa líquido-liquido mejorado y/o una mayor recuperación y capacidad de reciclado del extractante y/o un extractante preservado para la recuperación y el reciclado. En algunas modalidades, el extractante es un extractante orgánico. En algunas modalidades, el extractante comprende uno o más extractantes orgánicos inmiscibles seleccionados del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de C12 a C22, ésteres de ácidos grasos de C12 a C22 aldehidos grasos de Ci2 a C22 amidas grasas de C12 a C22 y mezclas de estos. En algunas modalidades, el extractante comprende ácidos grasos de C12 a C22 derivados de aceite de maíz. En algunas modalidades, los sólidos no disueltos se separan de la suspensión de materia prima por medio de centrifugación en decantador de tazón, centrifugación en "tricanter", centrifugación en pila de discos, centrifugación por filtración, centrifugación en decantador, filtración, filtración al vacío, filtro de banda, filtración por presión, filtración con tamiz, separación por tamiz, rejilla, rejilla porosa, flotación, hidrociclón, prensa de filtro, prensa de tornillo, sedimentador por gravedad, separador de vórtice, o una combinación de estos. En algunas modalidades, el método comprende, además, la etapa de licuar la materia prima para crear una suspensión de materia prima de biomasa; en donde la materia prima se selecciona de granos de maíz, mazorcas del maíz, residuos de cultivos tales como cáscaras de maíz, rastrojos del maíz, hierbas, maíz, trigo, centeno, paja del trigo, cebada, paja de la cebada, heno, paja de arroz, pasto panizo, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, caña de azúcar, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, material celulósico, material lignocelulósico, árboles, ramas, raices, hojas, astillas de maderas, aserrín, matas y arbustos, vegetales, frutas, flores, estiércol, y mezclas de estos. En algunas modalidades, la materia prima es maíz. En algunas modalidades, la materia prima está fraccionada o sin fraccionar. En algunas modalidades, la materia prima se muele en húmedo o en seco. En algunas modalidades, el método comprende, además, la etapa de aumentar la temperatura de reacción durante la licuación. En algunas modalidades, la suspensión de materia prima comprende aceite de la materia prima y ese aceite se separa de la suspensión. En algunas modalidades, la torta húmeda comprende aceite de materia prima. En algunas modalidades, la torta húmeda se lava con agua para recuperar los oligosacáridos presentes en la torta húmeda. En algunas modalidades, los oligosacáridos recuperados se añaden al recipiente de fermentación. En algunas modalidades, la torta húmeda se procesa adicionalmente para proporcionar un coproducto mejorado. En algunas modalidades, el coproducto se procesa adicionalmente hasta formar un producto para alimento de animales. En algunas modalidades, la torta húmeda se lava con disolvente para recuperar el aceite presente en la torta húmeda. En algunas modalidades, el disolvente se selecciona de hexano, butanol, isobutanol, isohexano, etanol y destilados de petróleo. En algunas modalidades, el producto fermentativo es un producto de alcohol seleccionado del grupo que consiste en metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol e isómeros de estos. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante comprende una ruta biosintética del butanol diseñada por ingeniería. En algunas modalidades, el método comprende, además, vaporizar, al menos parcialmente, el caldo de fermentación y el producto y, opcionalmente, C02, en donde se produce una corriente de vapor y se recupera el producto de la corriente de vapor. En algunas modalidades, el método comprende, además, poner en contacto la corriente de vapor con una fase liquida de absorción, en donde al menos una porción de la corriente de vapor se absorbe en la fase liquida de absorción; en donde la temperatura de inicio de la absorción de la corriente de vapor en la fase liquida de absorción es mayor que la temperatura de inicio de la condensación de la corriente de vapor en ausencia de la fase liquida de absorción. En algunas modalidades, las etapas de vaporización y contacto se realizan en condiciones de vacio. En algunas modalidades, la separación de una porción sustancial de los sólidos no disueltos de esa suspensión proporciona una mayor presión de vapor del caldo de fermentación con respecto a un caldo de fermentación que comprende sólidos no disueltós. En algunas modalidades, la presión de vapor más alta permite una recuperación más eficaz del producto de vaporización. En algunas modalidades, la recuperación del producto de vaporización más eficaz incluye una menor inversión de capital y/o un equipo de vaporización, absorción, compresión y refrigeración de menor tamaño y/o una mayor velocidad de transferencia de masa y/o una menor energía para la vaporización y/o un régimen de flujo menos absorbente.
La presente invención está dirigida, además, a un método para producir butanol; el método comprende proporcionar una materia prima licuar la materia prima para crear una suspensión de materia prima, en donde la suspensión de materia prima comprende oligosacáridos, aceite y sólidos no disueltos/ separar los sólidos no disueltos a partir de la suspensión de materia prima para crear (i) una solución acuosa que comprende oligosacáridos, (ii) una torta húmeda que comprende sólidos no disueltos y (iii) una fase oleosa; poner la solución acuosa en contacto con un caldo de fermentación en un termentador,· fermentar los oligosacáridos en el termentador para producir butanol; y realizar la eliminación del butanol in situ a partir del caldo de fermentación a medida que se produce el butanol, en donde la extracción de los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima aumenta la eficacia de la producción de butanol. En algunas modalidades, la materia prima es maíz y el aceite es aceite de maíz. En algunas modalidades, los sólidos no disueltos comprenden germen, fibra y gluten. En algunas modalidades, el método comprende, además, moler la materia prima en seco. En algunas modalidades, el maíz no está fraccionado. En algunas modalidades, los sólidos no disueltos se separan por medio de centrifugación en decantador de tazón, centrifugación en "tricanter", centrifugación en pila de discos, centrifugación por filtración, centrifugación en decantador, filtración, filtración al vacío, filtro de banda, filtración por presión, filtración con tamiz, separación por tamiz, rejilla, rejilla porosa, flotación, hidrociclón, prensa de filtro,; prensa de tornillo, sedimentador por gravedad, separador de, vórtice o una combinación de estos. En algunas modalidades, la etapa de separar los sólidos no disueltos' de la suspensión de materia prima comprende centrifugar la suspensión de materia prima. En algunas modalidades, la centrifugación de la suspensión de materia prima separa la materia prima en una primera fase líquida que comprende la solución acuosa, una fase sólida que comprende la torta húmeda y una segunda fase líquida que comprende el aceite. En algunas modalidades, la torta húmeda se lava con agua para recuperar los oligosacáridos presentes en la torta húmeda. En algunas modalidades, la eliminación in situ comprende la extracción liquido-líquido. En algunas modalidades, un extractante para la extracción líquido-líquido es un extractante orgánico. En algunas modalidades, la sacarificación de los oligosacáridos en la solución acuosa se produce simultáneamente con la fermentación de los oligosacáridos en el termentador. En algunas modalidades, el método comprende, además, la etapa de aumentar la temperatura de reacción durante la licuación. En algunas modalidades, el método comprende, además, sacarificar los oligosacáridos antes de fermentar los oligosacáridos en el fermentador. En algunas modalidades, la etapa de eliminar los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima comprende centrifugar la suspensión de materia prima. En algunas modalidades, la centrifugación de la suspensión de materia prima se produce antes de sacarificar el azúcar. En algunas modalidades, el caldo de fermentación comprende un microorganismo recombinante que comprende una ruta biosintética del butanol. En algunas modalidades, el butanol es isobutanol. En algunas modalidades, la etapa de eliminar sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de un coeficiente de transferencia de masa líquido-líquido del butanol del caldo de fermentación al extractante; aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la eficacia de la extracción del butanol con un extractante; aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la velocidad de separación de fasés entre el caldo de fermentación y un extractante aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la recuperación y reciclado de un extractante; o aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante la reducción del régimen de flujo de un extractante. La presente invención está dirigida, además, a un sistema para producir butanol; el recipiente comprende un recipiente de licuación configurado para licuar una materia prima y crear asi una suspensión de materia prima; el recipiente de licuación comprende: una entrada para recibir la materia prima; y una salida para descargar una suspensión de materia prima, en donde la suspensión de materia prima comprende azúcar y sólidos no disueltos; una centrifuga configurada para eliminar los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima para crear (i) una solución acuosa que comprende el azúcar y (ii) una torta húmeda que comprende la porción de los sólidos no disueltos, la centrifuga comprende: una entrada para recibir la suspensión de materia prima; una primera salida para descargar la solución acuosa; y una segunda salida para descargar la torta húmeda; y un termentador configurado para fermentar la solución acuosa para producir butanol, el fermentador comprende: una primera entrada para recibir la solución acuosa; una segunda entrada para recibir un extractante; una primera salida para descargar el extractante rico en butanol; y una segunda salida para descargar caldo de fermentación. En algunas modalidades, la centrifuga comprende, además, una tercera salida para descargar un aceite creado mientras se eliminan los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima. En algunas modalidades, el aparato comprende, además, un recipiente de sacarificación configurado para sacarificar el azúcar en la suspensión de materia prima, el recipiente de sacarificación comprende: una entrada para recibir la suspensión de materia prima; y una salida para descargar la suspensión de materia prima. En algunas modalidades, el aparato comprende, además, un recipiente de sacarificación configurado para sacarificar el azúcar en la solución acuosa; el recipiente de sacarificación comprende: una entrada para recibir la solución acuosa; y una salida para descargar la solución acuosa. En algunas modalidades, el aparato comprende, además, un molino de martillo configurado para triturar la materia prima; el molino de martillo comprende: una entrada para recibir la materia prima; y una salida para descargar materia prima triturada .
La presente invención está dirigida, además, a una composición que comprende: 20-35 % en peso de proteína cruda, 1-20 % en peso de grasa cruda, 0-5 % en peso de triglicéridos, 4-10 % en peso de ácidos grasos y 2-6 % en peso de ésteres isobutilicos de ácidos grasos. La presente invención está dirigida, además, a una composición gue comprende: 25-31 % en peso de proteina cruda, 6-10 % en peso de grasa cruda, 4-8 % en peso de triglicéridos, 0-2 % en peso de ácidos grasos y 1-3 % en peso de ésteres isobutilicos de ácidos grasos. La presente invención está dirigida, además, a una composición que comprende: 20-35 % en peso de proteina cruda, 1-20 % en peso de grasa cruda, 0-5 % en peso de triglicéridos, 4-10 % en peso de ácidos grasos y 2-6 % en peso de ésteres isobutilicos de ácidos grasos. La presente invención está dirigida, además, a una composición que comprende: 26-34 % en peso de proteina cruda, 15-25 % en peso de grasa cruda, 12-20 % en peso de triglicéridos, 1-2 % en peso de ácidos grasos, 2-4 % en peso de ésteres isobutilicos de ácidos grasos, 1-2 % en peso de lisina, 11-23 % en peso de NDF y 5-11 % en peso de ADF.
En algunas modalidades, un método comprende: (a) proporcionar una suspensión de materia prima que comprende carbono fermentable y sólidos no disueltos de esa . biomasa y agua; (b) separar una porción sustancial de los sólidos no disueltos de esa suspensión por medio de lo cual se genera (i) una solución acuosa que comprende carbono fermentable y (ii) un coproducto de torta húmeda que comprende sólidos; y (c) añadir la solución acuosa a un caldo de fermentación que comprende microorganismos recombinantes en un recipiente de fermentación por medio de lo cual se genera un producto fermentativo; en donde mejora la productividad del procesamiento de la biomasa. En algunas modalidades, la productividad mejorada del procesamiento de la biomasa comprende una mayor capacidad de recuperación del producto fermentativo y coproducto con respecto al producto fermentativo producido en presencia de sólidos no disueltos. En algunas modalidades, la productividad mejorada del procesamiento de la biomasa incluye una mayor capacidad de reciclado de la corriente del proceso y/o una mayor eficacia del volumen del fermentador y/o una mayor alimentación de la carga de maíz. En algunas modalidades, una mayor capacidad de reciclado de la corriente del proceso incluye el reciclado de microorganismos recombinantes fermentativos y/o el reciclado de agua y/o la eficacia de energía.
En algunas modalidades, el proceso puede incluir, además, (d) poner en contacto el caldo de fermentación de (c) con un extractante, en donde la eficacia de la extracción del extractante con respecto a un caldo de fermentación que comprende sólidos no disueltos es mayor. En algunas modalidades, la mayor eficacia de la extracción incluye un coeficiente de partición estabilizado y/o una separación de fases mejorada y/o un coeficiente de transferencia de masa mejorado y/o una mayor capacidad de reciclado de la corriente del proceso. En algunas modalidades, la mayor eficacia de la extracción incluye un coeficiente de partición del extractante estabilizado y/o una separación de fases mejorada del extractante del caldo de fermentación y/o un coeficiente de transferencia de masa liquido-líquido mejorado y/o una mayor recuperación y capacidad de reciclado del extractante. En algunas modalidades, la mayor eficacia de la extracción incluye un extractante preservado para reciclado.
En algunas modalidades, la solución acuosa tiene una viscosidad menor que aproximadamente 20 cps . En algunas modalidades, la solución acuosa contiene menos de aproximadamente 20 g/1 de glucosa monomérica.
En algunas modalidades, la mayor capacidad de recuperación del producto proporciona al producto una mayor tolerancia a los microorganismos recombinantes . En algunas modalidades, la mayor tolerancia se obtiene por medio de la eliminación de inhibidores con los sólidos no disueltos y/o por un mayor coeficiente de transferencia de masa líquido-líquido. En algunas modalidades, la mayor eficacia del extractante proporciona una mayor tolerancia a los microorganismos recombinantes. En algunas modalidades, la mayor tolerancia a los microorganismos recombinantes se proporciona por medio de la extracción de inhibidores, subproductos y metabolitos.
En algunas modalidades, la suspensión de materia prima comprende aceite de la materia prima y ese aceite se separa de la suspensión en la etapa (b) . En algunas modalidades, la torta húmeda comprende aceite de materia prima en una cantidad menor que aproximadamente 20 % del contenido de sólidos secos de la torta húmeda.
En algunas modalidades, la porción sustancial de sólidos no disueltos separados de la suspensión de materia prima en la etapa (b) es de al menos aproximadamente 75 % en peso de sólidos no disueltos. En algunas modalidades, la porción sustancial de sólidos no disueltos separados de la suspensión de materia prima en la etapa (b) es de al menos aproximadamente 90 % en peso de sólidos no disueltos. En algunas modalidades, la porción sustancial de sólidos no disueltos separados de la suspensión de materia prima en la etapa (b) es de al menos aproximadamente 95 % en peso de sólidos no disueltos. En algunas modalidades, la etapa (b) comprende centrifugar la suspensión de materia prima. En algunas modalidades, la centrifugación de la suspensión de materia prima separa la materia prima en una primera fase líquida que comprende la solución acuosa y una fase sólida que comprende la torta húmeda. En algunas modalidades, la torta húmeda se lava con agua para recuperar el azúcar o la fuente de azúcar presente en la torta húmeda. En algunas modalidades, la fase líquida que comprende la solución acuosa se centrifuga más de una vez.
En algunas modalidades, el extractante es un extractante orgánico. En algunas modalidades, el extractante comprende uno o más extractantes orgánicos inmiscibles seleccionados del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de Ci2 a C22/ ésteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de Ci2 a .22, amidas grasas de C12 a C22 y mezclas de estos.
En algunas modalidades, el microorganismo recombinante fermentativo es una bacteria o célula de levadura.
En algunas modalidades, el producto es un producto de alcohol seleccionado del grupo que consiste en butanol e isómeros de este.
En algunas modalidades, el método incluye, además, (d) vaporizar, al menos parcialmente, el caldo de fermentación y el producto de (c) y, opcionalmente, CO2, en donde se produce una corriente de vapor y el producto se recupera de la corriente de vapor. En algunas modalidades, el método incluye, además, poner en contacto la corriente de vapor con una fase liquida de absorción, en donde al menos una porción de la corriente de vapor se absorbe en la fase liquida de absorción, en donde la temperatura de inicio de la absorción de la corriente de vapor en la fase liquida de absorción es mayor que la temperatura de inicio de la condensación de la corriente de vapor en ausencia de la fase liquida de absorción. En algunas modalidades, las etapas de vaporización y contacto se realizan en condiciones de vacío. En algunas modalidades, la separación de una porción sustancial de los sólidos no disueltos de esa suspensión puede proporcionar una mayor presión de vapor del caldo de fermentación con respecto a un caldo de fermentación que comprende sólidos no disueltos. En algunas modalidades, la presión de vapor más alta permite una recuperación del producto de vaporización más eficaz. En algunas modalidades, la recuperación del producto de vaporización más eficaz incluye una menor inversión de capital y/o un equipo de vaporización, absorción, compresión y refrigeración de menor tamaño y/o una mayor velocidad de transferencia de masa y/o una menor energía para la vaporización y/o un régimen de flujo menos absorbente .
En algunas modalidades, la separación de una porción sustancial de los sólidos no disueltos se realiza de modo que se minimiza la pérdida de almidón a los sólidos no disueltos. En algunas modalidades, la pérdida de almidón se minimiza por medio de una o más operaciones de optimización que incluyen control de temperatura, concentración de enzimas, pH, tamaño de partículas del maíz triturado y tiempo de reacción durante la licuación; condiciones operativas de la centrifugación; y condiciones de lavado de la torta húmeda.
En algunas modalidades, la torta húmeda se procesa adicionalmente para proporcionar un coproducto mejorado. En algunas modalidades, el coproducto se procesa adicionalmente hasta obtener DDGS . En algunas modalidades, los DDGS tienen un perfil de producto mejorado que comprende menos aceite de materia prima que los DDGS producidos en presencia de sólidos no disueltos. En algunas modalidades, los DDGS tienen un perfil de producto mejorado de modo que los DDGS se producen con un contacto contaminante mínimo con el caldo de fermentación, el microorganismo recombinante, los productos fermentativos y el extractante. En algunas modalidades, los DDGS producidos por los métodos anteriores cumplen los requisitos de etiquetado nutricional para los alimentos orgánicos para animales.
En algunas' modalidades, un caldo de fermentación incluye una porción de producto fermentativo y una porción de aceite de maíz en una relación de al menos aproximadamente 4:1 en peso, en donde ese caldo está prácticamente libre de sólidos no disueltos. En algunas modalidades, la porción de aceite de maíz contiene al menos aproximadamente 15 % en peso de ácidos grasos libres. En algunas modalidades, el caldo de fermentación contiene no más de aproximadamente 15 % en peso de sólidos no disueltos. En algunas modalidades, el caldo de fermentación contiene no más de aproximadamente 10 % en peso de sólidos no disueltos. En algunas modalidades, el caldo de fermentación contiene no más de aproximadamente 5 % en peso de sólidos no disueltos.
En algunas modalidades, el perfil de un producto de centrifuga incluye una capa de sólidos no disueltos, una capa de aceite de maíz y una capa de sobrenadante que comprende azúcares fermentables, en donde una relación entre los azúcares fermentables en la capa de sobrenadante y los sólidos no disueltos en la capa de sólidos no disueltos sobre una base en peso está en el intervalo de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 5:1; una relación entre los azúcares fermentables en la capa de sobrenadante y el aceite de maíz en la capa de aceite de maíz sobre una base en peso está en el intervalo de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 50:1; y una relación entre los sólidos no disueltos en la capa de sólidos no disueltos y el aceite de maíz en la capa de aceite de maíz sobre una base en peso está en el intervalo de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 25:1.
En algunas modalidades, un método para producir butanol incluye las etapas de (a) proporcionar una materia prima de maíz; (b) licuar la materia prima de maíz para crear una suspensión de materia prima, en donde la suspensión de materia prima comprende azúcar, aceite de maíz y sólidos no disueltos; (c) eliminar sólidos no disueltos a partir de la suspensión de materia prima para crear (i) una solución acuosa que comprende azúcar, (ii) una torta húmeda que comprende sólidos no disueltos y (iii) una fase libre de aceite de maíz; (d) poner la solución acuosa en contacto con un caldo en un fermentador (e) fermentar el azúcar en el termentador para producir butanol; y (f) realizar la eliminación del butanol in. situ a partir del caldo a medida que se produce el butanol, en donde la eliminación de los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima aumenta la eficacia de la producción de butanol. En algunas modalidades, los sólidos no disueltos comprenden germen, fibra y gluten. En algunas modalidades, el método incluye, además, moler en seco la materia prima de maíz. En algunas modalidades, el maíz no está fraccionado.
En algunas modalidades, la etapa (c) comprende centrifugar la suspensión de materia prima. En algunas modalidades, la centrifugación de la suspensión de materia prima separa la suspensión de materia prima en una primera fase líquida que comprende la solución acuosa, una fase sólida que comprende la torta húmeda y una segunda fase líquida que comprende el aceite de maíz libre. En algunas modalidades, la torta húmeda se lava con agua para recuperar el azúcar presente en la torta húmeda. En algunas modalidades, la fase líquida que comprende la solución acuosa se centrifuga más de una vez. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 75 % en peso de los sólidos no disueltos se eliminan de la suspensión de materia prima en la etapa (c) . En algunas modalidades, al menos aproximadamente 90 % en peso de los sólidos no disueltos se eliminan de la suspensión de materia prima en la etapa (c) . En algunas modalidades, al menos aproximadamente 95 % en peso de los sólidos no disueltos se eliminan de la suspensión de materia prima en la etapa (c) .
En algunas modalidades, la eliminación in situ comprende la extracción liquido-líquido. En algunas modalidades, un extractante para la extracción líquido-líquido es un extractante orgánico. En algunas modalidades, el extractante orgánico comprende alcohol oleilico.
En algunas modalidades, el caldo comprende un microorganismo. En algunas modalidades, el microorganismo es una bacteria o célula de levadura.
En algunas modalidades, una porción del caldo sale del fermentador, y el método comprende, además, separar de la porción del caldo la levadura presente en ella y colocar nuevamente la levadura separada en el fermentador. En algunas modalidades, la porción del caldo comprende no más de aproximadamente 25 % en peso de los sólidos no disueltos presentes en la suspensión de materia prima. En algunas modalidades, la porción del caldo comprende no más de aproximadamente 10 % en peso de los sólidos no disueltos presentes en la suspensión de materia prima. En algunas modalidades, la porción del caldo comprende no más de aproximadamente 5 % en peso de los sólidos no disueltos presentes en la suspensión de materia prima.
En algunas modalidades, la sacarificación del azúcar en la solución acuosa se produce simultáneamente con la fermentación del azúcar en el fermentador. En algunas modalidades, el método incluye, además, sacarificar el azúcar antes de fermentar el azúcar en el fermentador. En algunas modalidades, la etapa (c) incluye centrifugar la suspensión de materia prima. En algunas modalidades, la centrifugación de la suspensión de materia prima se produce antes de sacarificar el azúcar. En algunas modalidades, la centrifugación de la suspensión de materia prima se produce después de sacarificar el azúcar.
En algunas modalidades, el butanol es isobutanol. En algunas modalidades, la etapa (c) aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de un coeficiente de transferencia de masa liquido-líquido del butanol del caldo al extractante. En algunas modalidades, la etapa (c) aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la eficacia de la extracción del butanol con un extractante. En algunas modalidades, la etapa (c) aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la velocidad de separación de fases entre el caldo y un extractante. En algunas modalidades, la etapa (c) aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la recuperación y el reciclado de un extractante. En algunas modalidades, la etapa (c) aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante la reducción del régimen de flujo de un extractante.
En algunas modalidades, la etapa (c) incluye un coeficiente de partición del extractante estabilizado y/o una mayor frecuencia del volumen del fermentador y/o una mayor alimentación de la carga de maíz y/o un mayor reciclado de microorganismos recombinantes fermentativos y/o un mayor reciclado de agua y/o una mayor eficiencia de la energía y/o una mayor tolerancia de los microorganismos recombinantes al butanol y/o un título menor de la fase acuosa y/o un valor mayor de los DDGS .
En algunas modalidades, un sistema para producir butanol incluye (a) un recipiente de licuación configurado para licuar una materia prima para crear una suspensión de materia prima; el recipiente de licuación comprende una entrada para recibir la materia prima, una salida para descargar una suspensión de materia prima, en donde la suspensión de materia prima comprende azúcar y sólidos no disueltos; (b) una centrífuga configurada para eliminar los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima para crear (i) una solución acuosa que comprende el azúcar y (ii) una torta húmeda que comprende la porción de los sólidos no disueltos, la centrífuga comprende una entrada para recibir la suspensión de materia prima, una primera salida para descargar la solución acuosa y una segunda salida para descargar la torta húmeda; y (c) un fermentador para fermentar la solución acuosa en el fermentador para producir butanol, el fermentador comprende una primera entrada para recibir la solución acuosa, una segunda entrada para recibir un extractante y una primera salida para descargar el extractante rico en butanol y una segunda salida para descargar caldo de fermentación. En algunas modalidades, la centrífuga comprende, además, una tercera salida para descargar un aceite creado mientras se eliminan los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima. En algunas modalidades, el sistema incluye, además, un recipiente de sacarificación configurado para sacarificar el azúcar en la suspensión de materia prima, el recipiente de sacarificación comprende una entrada para recibir la suspensión de materia prima y una salida para descargar la suspensión de materia prima. En algunas modalidades, el sistema incluye, además, un recipiente de sacarificación configurado para sacarificar el azúcar en la solución acuosa, el recipiente de sacarificación comprende una entrada para recibir la solución acuosa y una salida para descargar la solución acuosa. En algunas modalidades, el sistema incluye, además, un molino de martillo configurado para triturar la materia prima, el molino de martillo comprende una entrada para recibir la materia prima y una salida para descargar materia prima triturada.' En algunas modalidades, una torta húmeda formada en una centrífuga a partir de una suspensión de pasta de maíz, en donde la torta húmeda comprende sólidos no disueltos, incluye al menos aproximadamente 75 % en peso de los sólidos no disueltos presentes en la suspensión de pasta de maíz. En algunas modalidades, la torta húmeda incluye al menos aproximadamente 90 % en peso de los sólidos no disueltos presentes en la suspensión de pasta de maíz. En algunas modalidades, la torta húmeda incluye al menos aproximadamente 95 % en peso de los sólidos no disueltos presentes en la suspensión de pasta de maíz.
En algunas modalidades, una solución acuosa formada en una centrífuga a partir de una suspensión de pasta de maíz, en donde la solución acuosa comprende sólidos no disueltos, incluye no más de aproximadamente 25 % en peso de los sólidos no disueltos presentes en la suspensión de pasta de maíz. En algunas modalidades, la solución acuosa incluye no más de aproximadamente 10 % en peso de los sólidos no disueltos presentes en la suspensión de pasta de maíz. En algunas modalidades, la solución acuosa incluye no más de aproximadamente 5 % en peso de los sólidos no disueltos presentes en la suspensión de pasta de maíz.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras acompañantes, que se incorporan en la presente descripción y forman parte de la descripción, ilustran la presente invención y, junto con la descripción, explican además los principios de la invención y permiten que un experto en la técnica pertinente prepare y use la invención .
La Fig. 1 ilustra esquemáticamente un ejemplo de un método y sistema de la presente invención, en el cual los sólidos no disueltos se eliminan en una centrifuga después de la licuación y antes de la fermentación.
La Fig. 2 ilustra esquemáticamente un método y sistema alternativo de la presente invención, .en el cual se muele la materia prima.
La Fig. 3 ilustra esquemáticamente otro ejemplo de un método y sistema de la presente invención, en el cual la centrifuga descarga una corriente de aceite.
La Fig. 4 ilustra esquemáticamente otro ejemplo de un método y sistema alternativo de la presente invención, en el cual se coloca un recipiente de sacarificación entre la centrifuga y el termentador.
La Fig. 5 ilustra esquemáticamente otro ejemplo de un método y sistema alternativo de la presente invención, en el cual se coloca un recipiente de sacarificación entre el recipiente de licuación y la centrifuga.
La Fig. 6 ilustra esquemáticamente otro ejemplo de un método y sistema alternativo de la presente invención, en el cual se usan dos centrifugas en serie para eliminar los sólidos no disueltos.
La Fig. 7 ilustra el efecto de la presencia de sólidos de pasta de maiz no disueltos en el coeficiente de transferencia de masa volumétrica total, kLa, para la transferencia de i-BuOH a partir de una solución acuosa de almidón de maiz licuado (es decir, oligosacáridos) a una dispersión de gotitas de alcohol oleilico que fluyen hacia arriba a través de una columna de burbujas cuando se usa una tobera con un diámetro interno de 2.03 mm para dispersar el alcohol oleilico.
La Fig. 8 ilustra el efecto de la presencia de sólidos de pasta de maiz no disueltos en el coeficiente de transferencia de masa volumétrica total, kLa, para la transferencia de i-BuOH a partir de una solución acuosa de almidón de maiz licuado (es decir, oligosacáridos) a una dispersión de gotitas de alcohol oleilico que fluyen hacia arriba a través de una columna de burbujas cuando se usa una tobera con un diámetro interno de 0.76 mm para dispersar el alcohol oleilico.
La Fig. 9 ilustra la posición de la inferíase liquido-líquido en los tubos de muestra de fermentación como una función del tiempo de asentamiento (gravedad) . Se muestran los datos de la separación de fases para el tiempo transcurrido: tiempo transcurrido: 5.3, 29.3, 53.3 y 70.3 h.
Datos de las muestras de fermentación extractiva en la cual los sólidos se eliminaron del suministro de pasta, y se usó OA como disolvente (2010Y035) .
La Fig. 10 ilustra la posición de la interfase líquido-liquido del caldo de fermentación final como una función del tiempo de asentamiento (gravedad) . Datos de la fermentación extractiva en la cual los sólidos se eliminaron del suministro de pasta, y se usó OA como disolvente (2010Y035) .
La Fig. 11 ilustra la concentración de glucosa en la acuosa de las suspensiones como una función del tiempo el Lote 1 y el Lote 2.
La Fig. 12 ilustra la concentración de glucosa en la acuosa de las suspensiones como una función del tiempo el Lote 3 y el Lote 4.
La Fig. 13 ilustra el efecto de la carga de enzimas y una etapa de temperatura +/- alta aplicada en algún momento durante la licuación en la conversión de almidón.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se defina lo contrario, todos los términos científicos y técnicos que se usan en la presente tienen el mismo significado como el entendido comúnmente por una persona con conocimiento ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente solicitud junto con las definiciones pertinentes.
Además, a menos que se requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Todas las publicaciones, patentes y otras referencias mencionadas en la presente descripción se incorporan como referencia en su totalidad para todo propósito.
Para definir adicionalmente esta invención se proporcionan en la presente descripción los siguientes términos y definiciones.
Como se usan en la presente descripción, se entenderá que los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "tiene", "que tiene", "contiene" o "que contiene" o cualquier otra variación de estos implican la inclusión de un entero o grupo de enteros mencionado, pero no la exclusión de cualquier otro entero o grupo de enteros. Por ejemplo, una composición, una mezcla, un proceso, un método, un articulo o un aparato que comprende una lista de elementos no se limita, necesariamente, solo a esos elementos, sino que puede incluir otros que no estén expresamente listados o sean inherentes a tal composición, mezcla, proceso, método, articulo o aparato. Además, a menos que se especifique expresamente en contrario, la disyunción se relaciona con un "o" incluyente y no con un "o" excluyente. Por ejemplo, una condición A o B se satisface mediante cualquiera de los siguientes criterios: A es verdadero (o actual) y B es falso (o no actual) , A es falso (o no actual) y B es verdadero (o actual), y tanto A como B son verdaderos (o actuales).
Además, los artículos indefinidos "un (a)" y "unos (as)" que preceden a un elemento o componente de la invención están previstos para ser no restrictivos con respecto a la cantidad de instancias, es decir, ocurrencias del elemento o componente. Por consiguiente, "un (a)" o "unos (as)" deben interpretarse para incluir uno o al menos uno, y la forma singular de la palabra del elemento o componente incluye, además, el plural, a menos que el número, obviamente, indique que es singular.
El término "invención" o "presente invención", tal como se usa en la presente descripción, es un término no limitante y no está previsto para referirse a cualquier modalidad individual de la invención particular, sino que abarca todas las modalidades posibles según se describe en la solicitud.
Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente", que modifica la cantidad de un ingrediente o reactivo empleado en la invención, se refiere a la variación que puede producirse en la cantidad numérica, por ejemplo, a través de procedimientos de manejo de líquidos y de mediciones típicos usados para preparar concentrados o soluciones en el mundo real; a través de errores inadvertidos en estos procedimientos; a través de diferencias en la fabricación, procedencia o pureza de los ingredientes empleados para preparar las composiciones o llevar a cabo los métodos; y similares. El término "aproximadamente" abarca, además, cantidades que difieren debido a condiciones de equilibrio diferentes para una composición que resulta de una mezcla inicial particular. Estén o no modificadas por el término "aproximadamente", las reivindicaciones incluyen equivalentes para las cantidades. En una modalidad, el término "aproximadamente" significa una cantidad dentro del 10 % del valor numérico reportado, alternativamente, dentro del 5 % del valor numérico reportado.
Como se usa en la presente descripción, "biomasa" se refiere a un producto natural que contiene polisacáridos hidrolizables que proporcionan azúcares fermentables que incluyen cualquier azúcar y almidón derivado de recursos naturales tales como maíz, caña de azúcar, trigo, material celulósico o lignocelulósico y materiales que comprenden celulosa, hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos, disacáridos y/o monosacáridos y mezclas de estos. La biomasa puede comprender, además, componentes adicionales, tales como proteínas y/o lípidos. La biomasa puede derivarse de una sola fuente o puede comprender una mezcla derivada de más de una fuente. Por ejemplo, la biomasa puede comprender una mezcla de mazorcas del maíz y rastrojos del maíz, o una mezcla de pastos y hojas. La biomasa incluye, pero no se limita a, cultivos bionergéticos , residuos agrícolas, residuos sólidos municipales, residuos sólidos industriales, sedimentos de la fabricación del papel, residuos orgánicos, residuos forestales y de silvicultura. Los ejemplos de biomasa incluyen, pero no se limitan a, granos de maíz, mazorcas del maíz, residuos de cultivos, tales como cáscaras de maíz, rastrojos del maíz, hierbas, trigo, centeno, paja del trigo, cebada, paja de la cebada, heno, paja de arroz, pasto panizo, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, caña de azúcar, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raices, hojas, astillas de maderas, aserrín, matas y arbustos, vegetales, frutas, flores, estiércol y mezclas de estos. Por ejemplo, a partir de la biomasa se puede formar pasta, jugo, molasa o hidrolizado por cualquier procesamiento conocido en la técnica para procesar la biomasa para fermentación, tales como molienda, tratamiento y/o licuación, y la biomasa comprende azúcar fermentable y puede comprender agua. Por ejemplo, la biomasa celulósica y/o lignocelulósica puede procesarse para obtener un hidrolizado que contiene azúcares fermentables por cualquier método conocido por una persona con experiencia en la técnica. Un tratamiento previo con bajo contenido de amoníaco se describe en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0031918A1 incorporada en la presente descripción como referencia. Para la sacarificación enzimática de biomasa celulósica y/o lignocelulósica se usa, típicamente, un conjunto de enzimas que descomponen la celulosa y hemicelulosa para producir un hidrolizado que contiene azúcares que incluyen glucosa, xilosa y arabinosa. (Las enzimas de sacarificación adecuadas para la biomasa celulósica y/o lignocelulósica se describen en Lynd, et al. (Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66:506-577, 2002).
Granos secos de destilería con solubles (DDGS, por sus siglas en inglés), como se usa en la presente descripción, se refiere a un coproducto o subproducto de una fermentación de una materia prima o biomasa (por ejemplo, la fermentación de un grano o mezcla de granos que genera un producto de alcohol) . En algunas modalidades, DDGS puede referirse, además, a un alimento para animales producido a partir de un proceso de preparación de un producto de alcohol (por ejemplo, butanol, isobutanol, etc.) "Fuente de carbono fermentable" o "sustrato de carbono fermentable", como se usa en la presente descripción, se refieren a una fuente de carbono que puede ser metabolizada por microorganismos. Las fuentes de carbono fermentable adecuadas incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos, tales como glucosa o fructosa; disacáridos tales como lactosa o sacarosa; oligosacáridos ; polisacáridos tales como almidón o celulosa; un sustrato de carbono; y mezclas de estos.
"Azúcar fermentable", como se usa en la presente descripción, se refiere a uno o más azúcares que pueden ser metabolizados por los microorganismos descritos en la presente descripción para la producción de alcohol fermentativo .
Como se usa en la presente descripción, "materia prima" se refiere a un suministro en un proceso de fermentación; el suministro contiene una fuente de carbono fermentable con o sin sólidos no disueltos, y cuando corresponde, el suministro contiene la fuente de carbono fermentable antes o después de que se liberó la fuente de carbono fermentable del almidón o que se obtuvo a partir de la descomposición de los azúcares complejos por procesamiento adicional, tal como licuación, sacarificación u otro proceso. La materia prima incluye o se deriva de una biomasa. Las materias primas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, centeno, trigo, maíz, pasta de maíz, caña, pasta de caña, cebada, material celulósico, material lignocelulósico o mezclas de estos. Cuando se hace referencia a "aceite de materia prima" se entiende que el término abarca el aceite producido a partir de üna materia prima determinada.
"Caldo de fermentación", como se usa en la presente descripción, se refiere a la mezcla de agua, azúcares (fuentes de carbono fermentable), sólidos no disueltos, opcionalmente, microorganismos que generan alcohol, producto de alcohol y todos los demás constituyentes del material conservados en el recipiente de fermentación en el cual se prepara el producto de alcohol por medio de la reacción de azúcares al alcohol, agua y dióxido de carbono (C02) producida por los microorganismos presentes. Oportunamente, tal como se usa en la presente descripción, el término "medio fermentado" puede usarse como sinónimo de "caldo de fermentación" .
"Recipiente de fermentación", como se usa en la presente descripción, se refiere al recipiente en el cual se realiza la reacción de fermentación para preparar un producto de alcohol, tal como butanol, a partir de azúcares. El término " fermentador" puede usarse en la presente descripción como sinónimo de "recipiente de fermentación".
"Recipiente de sacarificación", como se usa en la presente descripción, se refiere al recipiente en el cual se realiza la sacarificación (es decir, la descomposición de oligosacáridos en monosacáridos ) . Cuando la fermentación y la sacarificación se producen simultáneamente, el recipiente de sacarificación y los recipientes de fermentación pueden ser el mismo recipiente.
Como se usa en la presente descripción, "enzima de sacarificación" se refiere a una o más enzimas capaces de hidrolizar polisacáridos y/u oligosacáridos, por ejemplo, enlaces alfa-1, 4-glucosídicos de glicógeno o almidón. Las enzimas de sacarificación pueden incluir enzimas capaces de hidrolizar materiales celulósicos y también lignocelulósicos . "Recipiente de licuación", como se usa en la presente descripción, se refiere al recipiente en el cual se realiza la licuación. La licuación es el proceso en el cual se liberan oligosacáridos a partir de la materia prima. En modalidades en las cuales la materia prima es maíz, los oligosacárdos se liberan del contenido de almidón de maíz durante la licuación.
"Azúcar", como se usa en la presente descripción, se refiere a oligosacáridos, disacáridos, monosacáridos y/o mezclas de estos. El término "sacárido" incluye, además, carbohidratos que incluyen almidones, dextranos, glicógenos, celulosa, pentosanos, así como también azúcares.
"Sólidos no disueltos", como se usa en la presente descripción, se refiere a porciones no fermentables de materia prima que no se disuelven en la fase líquida, por ejemplo, germen, fibra y gluten. Por ejemplo, las porciones no fermentables de materia prima incluyen la porción de materia prima que se mantiene como un sólido y puede absorber líquido del caldo de fermentación.
"Extractante", como se usa en la presente descripción, se refiere a un disolvente orgánico usado para extraer cualquier isómero de butanol.
"Eliminación del producto in situ (ISPR)", como se usa en la presente descripción, se refiere a la eliminación selectiva de un producto de fermentación específico a partir de un proceso biológico, tal como fermentación, para controlar la concentración del producto en el proceso biológico a medida que el producto se genera.
"Producto de alcohol", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier alcohol producido por un microorganismo en un proceso de fermentación en el cual se usa biomasa como una fuente de sustrato de carbono fermentable. Los productos de alcohol incluyen, pero no se limitan a, alcoholes alquilicos de Ci a Ce- En algunas modalidades, los productos de alcohol son alcoholes alquilicos de C2 a Cs . En otras modalidades, los productos de alcohol son alcoholes alquilicos de C2 a C5. Se apreciará que los alcoholes alquilicos de Ci a Ce incluyen, pero no se limitan a, metanol, etanol, propanol, butanol y pentanol. De manera similar, los alcoholes alquilicos de C2 a Ce incluyen, pero no se limitan a, etanol, propanol, butanol y pentanol. Además, en la presente descripción, el término "alcohol" se usa con referencia a un producto de alcohol.
"Butanol", como se usa en la presente descripción, se refiere específicamente a los isómeros de butanol 1-butanol (1-BuOH), 2-butanol (2-BuOH), butanol terciario (terc-BuOH) y/o isobutanol (iBuOH, i-BuOH, o I-BUOH) , individualmente o como mezclas de estos.
"Propanol", como se usa en la presente descripción, se refiere a los isómeros de propanol isopropanol o 1-propanol. "Pentanol", como se usa en la presente descripción, se refiere a los isómeros de pentanol 1-pentanol, 3-metil-l-butanol, 2-metil-l-butanol, 2, 2-dimetil-l-propanol, 3-pentanol, 2-pentanolr 3-metil-2-butanolo 2-metil-2-butanol .
El término "titulo de la fase acuosa", como se usa en la presente descripción, se refiere a la concentración de un alcohol particular (por ejemplo, butanol) en el caldo de fermentación .
El término "titulo eficaz", como se usa en la presente descripción, se refiere a la cantidad total de un alcohol especifico (por ejemplo, ' butanol) producido por la fermentación o alcohol equivalente al éster de alcohol producido por la esterificación por litro del medio de fermentación .
Los términos "inmiscible en agua" o "insoluble" se refieren a un componente químico, tal como un extractante o disolvente, que no puede mezclarse con una solución acuosa tal como un caldo de fermentación de manera que se forme una fase líquida.
El término "fase acuosa", como se usa en la presente descripción, se refiere a la fase acuosa de una mezcla bifásica obtenida por el contacto de un caldo de fermentación con un extractante orgánico inmiscible en agua. En una modalidad de un proceso descrito en la presente descripción que incluye la extracción fermentativa, el término "caldo de fermentación" se refiere, específicamente, a la fase acuosa en la extracción fermentativa bifásica.
El término "fase orgánica", como se usa en la presente descripción, se refiere a la fase no acuosa de una mezcla bifásica obtenida por el contacto de un caldo de fermentación con un extractante orgánico inmisible en agua.
La presente invención proporciona sistemas y métodos para generar un producto fermentativo, tal como un producto de alcohol, a través de fermentación, así como también para incrementar la productividad y la eficacia de los costos del procesamiento de la biomasa. En algunas modalidades, el producto de alcohol es butanol. Una materia prima se puede licuar para crear una suspensión de materia prima, en donde la suspensión de materia prima incluye azúcar soluble y sólidos no disueltos. Si la suspensión de materia prima se alimenta directamente al termentador, los sólidos no disueltos pueden interferir con la eliminación y recuperación eficiente de un producto de alcohol, tal como butanol, del fermentador. Particularmente, cuando se usa la extracción líquido-líquido para extraer butanol del caldo de fermentación, la presencia de los particulados puede generar inconvenientes en el sistema que incluyen, pero no se limitan a, reducir la velocidad de transferencia de masa del butanol al extractante al interferir con el contacto entre el extractante y el caldo de fermentación; crear una emulsión en el fermentador y, de ese modo, interferir con la separación de fases adecuada del extractante y el caldo de fermentación; reducir la eficacia de recuperación y reciclado del extractante porque al menos una porción del extractante y el butanol queda "atrapada" en los sólidos que, en última instancia, se eliminan como granos secos de destilería con solubles (DDGS) ; una menor eficacia del volumen del fermentador porque hay sólidos que ocupan volumen en el fermentador y porque se produce un desacoplamiento más lento del extractante del caldo de fermentación; y el acortamiento del ciclo de vida del extractante por contaminación con aceite de maíz. Todos estos efectos aumentan los costos de capital y operativos. Adicionalmente, el extractante "atrapado" en los DDGS puede reducir el valor de los DDGS y su calificación para la venta como alimento para animales. Así, para evitar y/o minimizar estos problemas, al menos una porción de las partículas no disueltas (o sólidos) se eliminan de la suspensión de materia prima antes de la adición de azúcar presente en la suspensión de materia prima al fermentador. La actividad de extracción y la eficacia de la producción de butanol se incrementan cuando la extracción se realiza en un caldo de fermentación que contiene una solución acuosa, en donde se eliminaron las partículas no disueltas con respecto a la extracción realizada en un caldo de fermentación que contiene una solución acuosa, en donde las partículas no disueltas se han eliminado.
Los sistemas y métodos de la presente invención se describirán con referencia a las figuras. En algunas modalidades, tal como se muestra, por ejemplo, en la Fig. 1, el sistema incluye un recipiente de licuación 10 configurado para licuar una materia prima y crear una suspensión de materia prima.
Particularmente, una materia prima 12 puede introducirse por una entrada en un recipiente de licuación 10. La materia prima 12 puede ser cualquier material de biomasa conocido en la industria que incluye, pero no se limita a, centeno, trigo, caña o maíz, que contiene una fuente de carbono fermentable tal como almidón.
El proceso de licuar materia prima 12 implica la hidrólisis del almidón en la materia prima 12 en azúcares solubles en agua y es un proceso convencional. Puede usarse cualquier proceso de licuación conocido, así como también el recipiente de licuación correspondiente, usado normalmente en la industria que incluye, pero no se limita a, el proceso ácido, el proceso ácido-enzimático o el proceso enzimático. Tales procesos pueden usarse solos o en combinación. En algunas modalidades puede usarse el proceso enzimático y una enzima apropiada 14, por ejemplo, alfa-amilasa se introduce por una entrada en el recipiente de licuación 10. Además, en el recipiente de licuación 10 puede introducirse agua.
El proceso de licuar materia prima 12 crea una suspensión de materia prima 16 que incluye azúcar (por ejemplo, carbono fermentable) y sólidos no disueltos de la materia prima o biomasa. Los sólidos no disueltos son porciones no fermentables de materia prima 12. En algunas modalidades, la materia prima 12 puede ser maíz, tal como molido seco, granos de maíz no fraccionados y las partículas no disueltas pueden incluir germen, fibra y gluten. La suspensión de materia prima 16 puede descargarse desde una salida del recipiente de licuación 10. En algunas modalidades, la materia prima 12 es maíz o granos de maíz y la suspensión de materia prima 16 es una suspensión de pasta de maíz.
Una centrífuga 20 configurada para eliminar los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima 16 tiene una entrada para recibir la suspensión de materia prima 16. La centrífuga 20 agita o rota la suspensión de materia prima 16 para crear una fase líquida o solución acuosa 22 y una fase sólida o torta húmeda 24.
La solución acuosa 22 puede incluir el azúcar, por ejemplo, en la forma de oligosacáridos y agua. La solución acuosa puede comprender al menos aproximadamente 10 % en peso de oligosacáridos, al menos aproximadamente 20 % en peso de oligosacáridos o al menos aproximadamente 30 % en peso de oligosacáridos. La solución acuosa 22 puede descargarse desde una salida ubicada cerca de la parte superior de la centrifuga 20. La solución acuosa puede tener una viscosidad menor que aproximadamente 20 centipoise. La solución acuosa puede comprender menos de aproximadamente 20 g/1 de glucosa monomérica, con mayor preferencia, menos de aproximadamente 10 g/l o menos de aproximadamente 5 g/1 de glucosa monomérica. La metodología adecuada para determinar la cantidad de glucosa monomérica es muy conocida en la técnica. Tales métodos adecuados conocidos en la técnica incluyen HPLC.
La torta húmeda 24 puede incluir los sólidos no disueltos. La torta húmeda 24 puede descargarse desde una salida ubicada cerca del fondo de la centrífuga 20. La torta húmeda 24 puede incluir, además, una porción del azúcar y agua. La torta húmeda 24 puede lavarse con agua adicional en la centrífuga 20 una vez que la solución acuosa 22 se descargó de la centrífuga 20. Alternativamente, la torta húmeda 24 puede lavarse con agua adicional en una centrífuga separada. El lavado de la torta húmeda 24 recupera el azúcar o la fuente de azúcar (por ejemplo, oligosacáridos ) presente en la torta húmeda, y el azúcar y el agua recuperada puede reciclarse al recipiente de licuación 10. Después del lavado, la torta húmeda 24 puede secarse para formar granos secos de destilería con solubles (DDGS) a través de cualquier proceso conocido adecuado. La formación de los DDGS a partir de la torta húmeda 24 formada en la centrífuga 20 exhibe diversos beneficios. Dado que los sólidos no disueltos no van al fermentador, el extractante y/o el butanol no queda atrapado en los DDGS, los DDGS no están expuestos a las condiciones del termentador y los DDGS no entran en contacto con los microorganismos presentes en el fermentador. Todos estos efectos proporcionan beneficios para el procesamiento y venta posterior de los DDGS, por ejemplo, como alimento para animales .
La centrífuga 20 puede ser cualquier centrífuga convencional usada en la industria que incluye, por ejemplo, una centrífuga con tazón decantador, una centrífuga "tricanter", una centrífuga con pila de discos, una centrífuga de filtración o una centrífuga de decantador. En algunas modalidades, la eliminación de los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima 16 se puede realizar mediante filtración, filtración al vacío, filtro de banda, filtración por presión, filtración con tamiz, separación por tamiz, rejillas o enrejado, rejillas porosas, flotación, hidrociclón, prensa de filtro, prensa de tornillo, sedimentador por gravedad, ' separador de vórtice o cualquier método que puede usarse para separar sólidos de líquidos. En una modalidad, los sólidos no disueltos se pueden eliminar de la pasta de maíz para formar dos corrientes de producto, por ejemplo, una solución acuosa de oligosacáridos que contiene una concentración de sólidos menor en comparación con la pasta de maíz y una torta húmeda que contiene una concentración de sólidos mayor que la pasta de maíz. Adicionalmente, puede generarse una tercera corriente que contiene aceite de maíz si se usa una centrífuga "tricanter" para eliminar los sólidos de la pasta de maíz. Como tal, se puede generar variar corrientes de producto mediante el uso de técnicas de separación diferentes o una combinación de estas .
En algunas modalidades, la torta húmeda 24 es una composición formada a partir de una suspensión de materia prima 16, por ejemplo, una suspensión de pasta de maíz, en la centrífuga 20, en donde la torta húmeda 24 incluye al menos aproximadamente 50 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, al menos aproximadamente 55 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, al menos aproximadamente 60 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, al menos aproximadamente 65 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, al menos aproximadamente 70 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, al menos aproximadamente 75 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, al menos aproximadamente 80 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, al menos aproximadamente 85 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, al menos aproximadamente 90 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, al menos aproximadamente 95 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima o aproximadamente 99 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima.
En algunas modalidades, la solución acuosa 22 formada a partir de la suspensión de materia prima 16, por ejemplo, una suspensión de pasta de maíz, en la centrífuga 20 incluye no más de aproximadamente 50 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 45 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 40 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 35 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 30 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 25 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 20 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 15 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 10 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 5 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima o aproximadamente 1 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima.
Un fermentador 30 configurado para fermentar la solución acuosa 22 para producir butanol tiene una entrada para recibir la solución acuosa 22. El fermentador 30 puede incluir un caldo de fermentación. Un microorganismo 32 seleccionado del grupo de bacterias, cianobacterias , hongos filamentosos y levaduras se introduce en el fermentador 30 para incluirlo en el caldo de fermentación. En algunas modalidades, el microorganismo 32 puede ser una bacteria tal como E.coli. En algunas modalidades, el microorganismo 32 puede ser S. cerevisiae. El microorganismo 32 consume el azúcar en la solución acuosa '22 y produce butanol. Se conoce la producción de butanol por medio de fermentación con un microorganismo, así como también los microorganismos que producen un rendimiento alto de butanol y se describe, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de los EE.
UU. núm. 2009/0305370, cuya descripción se incorpora en la presente descripción en su totalidad. En algunas modalidades, el microorganismo 32 puede ser un microorganismo recombinante fermentativo .
En algunas modalidades, el microorganismo 32 se diseña por ingeniería de modo que contenga una ruta biosintética. En algunas modalidades, la ruta biosintética es una ruta biosintética de butanol. En algunas modalidades, la ruta biosintética convierte el piruvato en un producto fermentativo. En algunas modalidades, la ruta biosintética comprende al menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que cataliza un sustrato para la conversión de producto de la ruta biosintética. En algunas modalidades, cada conversión de sustrato a producto de la ruta biosintética se cataliza por medio de un polipéptido codificado por un polinucleótido heterólogo.
La eliminación del producto in situ (ISPR) puede usarse para eliminar butanol del fermentador 30 a medida que el microorganismo produce el butanol, por ejemplo, por medio de extracción líquido-líquido. La extracción líquido-líquido se describe brevemente a continuación y puede realizarse de conformidad con los procesos descritos en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305370, cuya descripción se incorpora en la presente descripción en su totalidad.
El termentador 30 tiene una entrada para recibir un extractante 34. El extractante 34 puede ser un extractante orgánico seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de Ci2 a C22> ácidos grasos de C12 a C22, ésteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de C12 a C22, amidas grasas de Ci2 a C22, saturados, monoinsaturados, poliinsaturados (y mezclas de estos), y mezclas de estos. El extractante puede ser, además, un extractante orgánico seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C4 a C22/ ácidos grasos de C4 a C2s, ésteres de ácidos grasos de C4 a C28Í aldehidos grasos de C4 a C22, saturados, monoinsaturados, poliinsaturados (y mezclas de estos), y mezclas de estos. El extractante 34 puede ser un extractante orgánico tal como alcohol oleilico, alcohol behenilico, alcohol cetilico, alcohol laurilico, alcohol miristilico, alcohol estearilico, 1-undecanol, ácido oléico, ácido láurico, ácido miristico, ácido esteárico, miristato de metilo, oleato de metilo, undecanal, aldehido láurico, 20-metilundecanal y mezclas de estos. El extractante 34 entra en contacto con el caldo de fermentación, y el butanol presente en el caldo de fermentación se transfiere al extractante 34. Una corriente 36 de extractante rica en butanol se descarga a través de una salida en el termentador 30. Posteriormente, el butanol se separa del extractante en la corriente 36 con el uso de técnicas convencionales. Puede añadirse corriente de alimento en el fermentador 30. El fermentador 30 puede ser cualquier fermentador adecuado conocido en la técnica.
En algunas modalidades, la sacarificación y la fermentación simultáneas pueden producirse dentro del fermentador 30. Puede usarse cualquier proceso de sacarificación conocido usado normalmente en la industria que incluye, pero no se limita a, el proceso ácido, el proceso ácido-enzimático o el proceso enzimático. En algunas modalidades, una enzima 38 tal como glucoamilasa puede introducirse por una entrada del fermentador 30 para descomponer los azúcares en la forma de oligosacáridos presentes en la solución acuosa 22 en monosacáridos .
En algunas modalidades, el caldo de fermentación 40 puede descargarse por una salida del fermentador 30. El caldo de fermentación 40 descargado puede incluir microorganismos 32 tal como una levadura. El microorganismo 32 puede separarse fácilmente del caldo de fermentación 40, por ejemplo, en una centrifuga (no se ilustra) . Después, el microorganismo 32 puede reciclarse al fermentador 30 que, con el paso del tiempo, puede aumentar el índice de producción del butanol y, de ese modo, aumentar la eficacia de la producción del butanol.
Cuando una porción del caldo de fermentación 40 sale del fermentador 30, el caldo de fermentación 40 incluye no más de aproximadamente 50 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 45 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 40 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 35 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 30 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 25 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 20 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más . de aproximadamente 15 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 10 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima, no más de aproximadamente 5 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima <o no más de aproximadamente 1 % en peso de las partículas no disueltas presentes en la suspensión de materia prima.
En algunas modalidades tal como se muestra, por ejemplo, en la Fig. 2, los sistemas y procesos de la presente invención pueden incluir un molino 50 configurado para moler en seco una materia prima 52. La materia prima 52 puede ser la misma materia prima 12 de la Fig. 1 y puede entrar al molino 50 a través de una entrada. El molino 50 puede moler o triturar la materia prima 52. En algunas modalidades, la materia prima 52 puede no estar fraccionada. En algunas modalidades, la materia prima 52 puede ser granos de maíz no fraccionados. El molino 50 puede ser cualquier molino conocido adecuado, por ejemplo, un molino triturador. La materia prima molida seca 54 se descarga del molino 50 a través de una salida y entra al recipiente de licuación 10. El resto de la Fig. 2 es idéntico a la Fig. 1' y, por lo tanto, no se describe otra vez. En otras modalidades, la materia prima puede fraccionarse y/o molerse en húmedo, tal como se conoce en la industria, como alternativa para la materia prima no fraccionada y/o molida en seco.
El molido en húmedo es un proceso de etapas múltiples que separa una biomasa (por ejemplo, maiz) en sus componentes principales (germen, fibra del pericarpio, almidón y gluten) para captar valor de cada coproducto en forma separada. Este proceso genera una corriente de almidón purificada; sin embargo, es costoso e incluye la separación de la biomasa en sus componentes distintos al almidón, lo que es innecesario para la producción de alcohol fermentativo. El fraccionamiento elimina fibras y gérmenes que contienen una mayor parte de los lipidos presentes en el maiz entero triturado lo que produce un maiz fraccionado que tiene un contenido de almidón (endosperma) más alto. El fraccionamiento en seco no separa el germen de la fibra y, por lo tanto, es menos costoso que la molienda en húmedo. Sin embargo, el fraccionamiento no elimina la totalidad de la fibra o germen y no elimina los sólidos completamente. Además, en el fraccionamiento se produce cierta pérdida del almidón. La molienda del maíz en húmedo es más costosa que el fraccionamiento en seco, pero el fraccionamiento en seco es más costoso que la trituración en seco del maíz no fraccionado .
En algunas modalidades, tal como se muestra, por ejemplo, en la Fig. 3, los sistemas y procesos de la presente invención pueden incluir la descarga de un aceite 26 de una salida de la centrifuga 20. La Fig. 3 es idéntica a la Fig. 1, excepto por la corriente de aceite 26 que sale de la centrifuga 20 y, por lo tanto, no se describirá otra vez con detalle .
La suspensión de materia prima 16 se separa en una primera fase liquida o solución acuosa 22 que contiene el azúcar fermentable, una fase sólida o torta húmeda 24 que contiene el sólido no disuelto y una segunda fase liquida que contiene aceite 26 que puede salir de la centrífuga 20. En algunas modalidades, la materia prima 12 es maíz y el aceite 26 es aceite de maíz libre. El término aceite de maíz libre, como se usa en la presente descripción, se refiere al aceite de maíz que se libera del germen de maíz. Para descargar la solución acuosa 22, la torta húmeda 24 y el aceite 26 puede usarse cualquier centrífuga convencional adecuada, por ejemplo, una centrífuga "tricanter". En algunas modalidades, cuando la materia prima es maíz, una porción del aceite de la materia prima 12, tal como aceite de maíz, queda en la torta húmeda 24. En tales casos, la torta húmeda 24 incluye aceite de maíz en una cantidad de menos de aproximadamente 20 % en peso de contenido de sólidos secos de la torta húmeda 24.
En algunas modalidades, cuando la materia prima 12 (por ejemplo, maiz) y el aceite de maiz 26 se eliminan de la centrífuga 20, el caldo de fermentación en el fermentador 30 incluye una cantidad reducida de aceite de maíz. Por ejemplo, el caldo de fermentación, prácticamente libre de sólidos no disueltos, puede incluir una porción de producto de alcohol (por ejemplo, butanol) y una porción de aceite (por ejemplo, aceite de maíz) en una relación de al menos aproximadamente 4:1 sobre una base en peso. El aceite de maíz puede contener al menos 15 % en peso de ácidos grasos libres, por ejemplo, 16.7 % en peso de ácidos grasos libres. En algunas modalidades, el caldo de fermentación tiene no más de aproximadamente 25 % en peso de sólidos no disueltos, el caldo de fermentación tiene no más de aproximadamente 15 % en peso de sólidos no disueltos, el caldo de fermentación tiene no más de aproximadamente 10 % en peso de sólidos no disueltos, el caldo de fermentación tiene no más de aproximadamente 5 % en peso de sólidos no disueltos, el caldo de fermentación tiene no más de aproximadamente 1 % en peso de sólidos no disueltos o el caldo de fermentación tiene no más de aproximadamente 0.5 % en peso de sólidos no disueltos.
En algunas modalidades, la centrifuga 20 produce un perfil de producto que incluye una capa de sólidos no disueltos, una capa de aceite (por ejemplo, aceite de maiz) y una capa de sobrenadante que incluye los azúcares fermentables . La relación entre los azúcares fermentables en la capa de sobrenadante y los sólidos no disueltos en la capa de sólidos no disueltos sobre una base en peso puede estar en el intervalo de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 5:1; la relación entre los azúcares fermentables en la capa de sobrenadante y el aceite de maiz en la capa de aceite de maiz sobre una base en peso puede estar en el intervalo de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 50:1; y/o la relación entre los sólidos no disueltos en la capa de sólidos no disueltos y el aceite de maiz en la capa de aceite de maiz sobre una base en peso puede estar en el intervalo de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 25:1.
En algunas modalidades, el sistema y proceso de la Fig. 2 puede modificarse de modo que incluya la descarga de una corriente de aceite de la centrifuga 20 tal como se describió anteriormente con respecto al sistema y proceso de la Fig. 3.
Si el aceite 26 no se descarga en forma separada puede eliminarse con la torta húmeda 24. Cuando la torta húmeda 24 se elimina por medio de la centrifuga 20, en algunas modalidades, una porción del aceite de la materia prima 12, tal como aceite de maíz cuando la materia prima es maíz, queda en la torta húmeda 24. La torta húmeda 24 puede lavarse con agua adicional en la centrifuga una vez que la solución acuosa 22 se descargó de la centrifuga 20. El lavado de la torta húmeda 24 recupera el azúcar (por ejemplo, oligosacáridos ) presente en la torta húmeda y el azúcar y el agua recuperada puede reciclarse al recipiente de licuación 10. Después del lavado, la torta húmeda 24 puede combinarse con solubles y, después, secarse para formar granos secos de destilería con solubles (DDGS) a través de cualquier proceso conocido adecuado. La formación de los DDGS a partir de la torta húmeda 24 formada en la centrífuga 20 exhibe diversos beneficios. Dado que los sólidos no disueltos no van al recipiente de fermentación, los DDGS no incluyen extractante y/o producto de alcohol, tal como butanol, atrapado, no están expuestos a las condiciones del recipiente de fermentación y no entran en contacto con los microorganismos presentes en el recipiente de fermentación. Todos estos beneficios facilitan el proceso y la venta de DDGS, por ejemplo, como alimento para animales. En algunas modalidades, el aceite 26 no se descarga en forma separada de la torta húmeda 24, pero, en lugar de ello, el aceite 26 se incluye como parte de la torta húmeda 24 y, en última instancia, está presente en los DDGS. En esos casos, el aceite puede separarse de los DDGS y convertirse en un extractante de ISPR que se usa posteriormente en el mismo proceso de fermentación de alcohol o en uno diferente.
El aceite 26 puede separarse de los DDGS con el uso de cualquier proceso conocido adecuado que incluye, por ejemplo, un proceso de extracción por disolvente. En una modalidad de la invención, los DDGS se cargan en un recipiente de extracción y se lavan con un disolvente tal como hexano para eliminar el aceite 26. Otros disolventes que pueden usarse incluyen, por ejemplo, isobutanol, isohexano, etanol, destilados de petróleo tales como éter de petróleo, o mezclas de estos. Después de la extracción del aceite 26, los DDGS pueden tratarse para eliminar cualquier disolvente residual. Por ejemplo, los DDGS pueden calentarse para evaporar cualquier disolvente residual con el uso de cualquier método conocido en la técnica. Después de la eliminación del disolvente, los DDGS pueden exponerse a un proceso de secado para eliminar el agua residual. Los DDGS procesados pueden usarse como un suplemento alimenticio para animales, tales como aves, ganado vacuno y mascotas domésticas.
Después de la extracción de los DDGS, el aceite resultante 26 y la mezcla de disolvente pueden recolectarse para separar el aceite 26 del disolvente. En una modalidad, la mezcla de aceite 26/disolvente puede procesarse por evaporación por medio de los cual el disolvente se evapora y puede recolectarse y reciclarse. El aceite recuperado puede convertirse en un extractante de ISPR para el uso posterior en el mismo proceso de fermentación de alcohol o en uno diferente .
La eliminación del componente de aceite de la materia prima es ventajosa para la producción de butanol porque el aceite presente en el termentador puede descomponerse en ácidos grasos y glicerina. La glicerina puede acumularse en el agua y reducir la cantidad de agua disponible para reciclado a través del sistema. Por lo tanto, la eliminación del componente de aceite de la materia prima aumenta la eficacia de la producción del producto de alcohol mediante el incremento de la cantidad de agua que puede reciclarse a través del sistema.
En algunas modalidades, tal como se muestra, por ejemplo, en las Figs . 4 y 5, la sacarificación puede producirse en un recipiente de sacarificación separado 60 ubicado entre la centrífuga 20 y el fermentador 30 (Fig. 4) o entre el recipiente de licuación 10 y la centrífuga 20 (Fig. 5) . Las Figs. 4 y 5 son idénticas a la Fig. 1 excepto por la inclusión de un recipiente de sacarificación separado 60 y porque el fermentador 30 no recibe enzimas 38.
Como se consideró anteriormente, puede usarse cualquier proceso de sacarificación conocido usado normalmente en la industria que incluye, pero no se limita a, el proceso ácido, el proceso ácido-enzimático o el proceso enzimático. El recipiente de sacarificación 60 puede ser cualquier recipiente de sacarificación conocido adecuado. En algunas modalidades, una enzima 38, tal como glucoamilasa, puede introducirse por una entrada del recipiente de sacarificación 60 para descomponer los azúcares en la forma de oligosacáridos en monosacáridos . Por ejemplo, en la Fig. 4, los oligosacáridos presentes en la corriente acuosa 22 descargados de la centrifuga 20 y recibidos en el recipiente de sacarificación 60 a través de una entrada se descomponen en monosacáridos. Por lo tanto, una solución acuosa 62 que contiene monosacáridos se descarga del recipiente de sacarificación 60 a través de una salida y se recibe en el fermentador 30. Alternativamente, tal como se muestra en la Fig. 5, los oligosacáridos presentes en la suspensión de materia prima 16 descargados del recipiente de licuación 10 y recibidos en el recipiente de sacarificación 60 a través de una entrada se descomponen en monosacáridos. Por lo tanto, una suspensión de materia prima 64 que contiene monosacáridos se descarga del recipiente de sacarificación 60 a través de una salida y se recibe en la centrifuga 20.
En algunas modalidades, el sistema y los procesos de las Fig. 2 y 3 pueden modificarse de modo que incluyan un recipiente de sacarificación separado 60 tal como se consideró anteriormente con respecto a los sistemas y procesos de las Figs. 4 y 5.
En algunas modalidades, tal como se muestra, por ejemplo, en la Fig. 6, los sistemas y procesos de la presente invención pueden incluir una serie de dos o más centrifugas. La Fig. 6 es idéntica a la Fig. 1, excepto por la adición de una segunda centrifuga 20' y, por lo tanto, no se describirá otra vez con detalle.
La solución acuosa 22 descargada de la centrifuga 20 se puede recibir en una entrada de la centrifuga 20'. La centrifuga 20' puede ser idéntica a la centrifuga 20 y puede funcionar de la misma manera. La centrifuga 20' puede eliminar sólidos no disueltos no separados de la solución acuosa 22 en la centrifuga 20 para crear (i) una corriente acuosa 22' similar a la corriente acuosa 22, pero que contiene cantidades de sólidos no disueltos menores en comparación con la corriente acuosa 22 y (ii) una torta húmeda 24' similar a la torta húmeda 24. Después, la corriente acuosa 22' puede introducirse en el fermentador 30. En algunas modalidades, después de la centrifuga 20' se puede incluir una o más centrifugas adicionales.
En algunas modalidades, los sistemas y procesos de las Figs. 2-6 pueden modificarse de modo que incluyan centrifugas adicionales para eliminar sólidos no disueltos tal como se consideró anteriormente con respecto a los sistemas y procesos de la Fig. 6.
En algunas modalidades, el caldo de fermentación 40 puede descargarse por una salida del fermentador 30. La ausencia o minimización de los sólidos no disueltos que salen del fermentador 30 con el caldo de fermentación 40 exhibe varios beneficios adicionales. Por ejemplo, se puede eliminar la necesidad de incluir unidades y operaciones en el procesamiento en dirección 3' , tales como, por ejemplo, una columna de cerveza o columna de destilación, de modo que aumente la eficacia para la producción del ' producto de alcohol. Además, algunas o todas las centrifugas de residuos de destilación completas pueden eliminarse debido a la menor cantidad de sólidos no disueltos en el caldo final que sale del fermentador.
Los procesos y sistemas descritos en las Figs. 1-6 incluyen la eliminación de los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima 16 y, en consecuencia, mejoran la productividad del procesamiento de la biomasa y el ahorro de costos. La productividad mejorada puede incluir una mayor eficacia de la producción de butanol y/o una mayor actividad de extracción con respecto a los procesos y sistemas que no eliminan sólidos no disueltos antes de la fermentación.
Como se consideró anteriormente, los sólidos no disueltos pueden procesarse adicionalmente para generar otros subproductos tales como DDGS o ésteres de ácidos grasos. Por ejemplo, los ésteres de ácidos grasos pueden recuperarse para aumentar el rendimiento de carbohidratos para producir alcohol (por ejemplo, butanol) . Para ello se puede usar, por ejemplo, un disolvente para extraer ésteres de ácidos grasos, por ejemplo, del subproducto formado mediante la combinación y el mezclado de diversas corrientes de subproducto y el secado del producto obtenido en las etapas de combinación y mezclado. El sistema de extracción basado en disolvente para recuperar triglicéridos de aceite de maíz a partir de DDGS se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2010/0092603, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente descripción como referencia.
En una modalidad de la extracción por disolvente de los ésteres de ácidos grasos, los sólidos se pueden separar a partir de residuos de destilación enteros ("sólidos separados") ya que la corriente contendría la mayor porción, por lejos, de ésteres de ácidos grasos en corrientes de subproducto sin combinar. Después, estos sólidos separados se pueden alimentar en un extractor y lavarse con disolvente. En una modalidad, los sólidos separados se dan vuelta al menos una vez para asegurar el lavado con disolvente de todos los lados de los sólidos separados. Después del lavado se recolecta la mezcla resultante de lípido y disolvente, conocida como miscela, para separar el lipido extraído del disolvente. Por ejemplo, la mezcla resultante de lipido y disolvente se puede depositar en un separador para continuar con el procesamiento. Durante el proceso de extracción, dado que el disolvente lava los sólidos separados, el disolvente no solamente transporta el lipido a la solución sino que recolecta las partículas sólidas y finas. Generalmente, estos "finos" son impurezas indeseables en la miscela y, en una modalidad, la miscela se puede descargar del extractor o separador a través de un dispositivo que separa o depura los finos de la miscela.
Para separar el lipido y el disolvente contenidos en la miscela, esta se puede procesar mediante una etapa de destilación. En esta etapa, la miscela puede procesarse, por ejemplo, a través de un evaporador que calienta la miscela hasta una temperatura suficientemente alta como para que el disolvente se vaporice, pero no tan alta como para afectar negativamente o vaporizar el lipido extraído. A medida que el disolvente se evapora, este puede recolectarse, por ejemplo, en un condensador y reciclarse para uso futuro. La separación del disolvente de la miscela genera una provisión de lípidos crudos que pueden procesarse adicionalmente para separar el agua, los ésteres de ácidos grasos (por ejemplo, ésteres isobutilicos de ácidos grasos), los ácidos grasos y los triglicéridos .
Después de la extracción de los lípidos, los sólidos pueden transportarse fuera del extractor y tratarse mediante un proceso de estabilización que elimina el disolvente residual. La recuperación del disolvente residual es importante para la economía del proceso. En una modalidad, los sólidos húmedos pueden transportarse en un ambiente hermético al vapor para preservar y recolectar el disolvente que se evapora temporalmente de los sólidos húmedos a medida que los sólidos se transportan al desolventizador . A medida que los sólidos entran en el desolventizador, estos se pueden calentar hasta vaporizarse y eliminar el disolvente residual. Para calentar los sólidos, el desolventizador puede incluir un mecanismo de distribución de los sólidos sobre una o más bandejas, y los sólidos pueden calentarse directamente, por ejemplo, mediante el contacto directo con aire o vapor caliente o, indirectamente, por ejemplo, por calentamiento de la bandeja que transporta el alimento. Para facilitar la transferencia de los sólidos de una bandeja a la otra, las bandejas que transportan los sólidos pueden incluir aberturas a través de las cuales los sólidos puedan pasar de una bandeja a la siguiente. Los sólidos pueden transportarse desde el desolventizador, opcionalmente, a un mezclador en donde los sólidos se mezclan con otros subproductos antes de ser transportados al secador. En este ejemplo, los sólidos se alimentan a un desolventizador, en donde los sólidos entran en contacto con vapor. En una modalidad, los flujos de vapor y sólidos en el desolventizador pueden ser a contracorriente. Después, los sólidos pueden salir del desolventizador y pueden alimentarse a un secador u, opcionalmente, a un mezclador, en donde pueden mezclarse varios subproductos. El vapor que sale del desolventizador puede condensarse y, opcionalmente, mezclarse con miscela y, después, alimentarse a un decantador. La fase rica en agua que sale del decantador puede alimentarse a una columna de destilación, en donde el hexano se elimina de la corriente rica en agua. En una modalidad, la corriente rica en agua de la que se eliminó el hexano sale' del fondo de la columna de destilación y puede reciclarse nuevamente al proceso de fermentación, por ejemplo, puede usarse para mezclar los sólidos de maíz triturados. En otra modalidad, los productos de cabeza y del fondo pueden reciclarse al proceso de fermentación. Por ejemplo, los productos del fondo ricos en lipidos pueden añadirse a la alimentación de un hidrolizador . Los productos de cabeza, por ejemplo, pueden condensarse y alimentarse a un decantador. La corriente rica en hexanos que sale de este decantador puede usarse, opcionalmente, como parte de la alimentación de solvente al extractor. La fase rica en agua que sale de este decantador puede alimentarse a la columna que extrae el hexano del agua. Como puede apreciar una persona con experiencia en la técnica, los métodos de la presente invención pueden modificarse de diversas maneras para optimizar el proceso de fermentación para la producción de un producto de alcohol, tal como butanol.
En otra modalidad, los subproductos (o coproductos) pueden derivarse de la pasta usada en el proceso de fermentación. Por ejemplo, el aceite de maíz puede separarse de la pasta y este aceite de maíz puede contener triglicéridos, ácidos grasos libres, diglicéridos, monoglicéridos y fosfolipidos (ver, por ejemplo, el Ejemplo 20) . El aceite de maíz puede añadirse, opcionalmente, a otros subproductos (o coproductos) a intervalos diferentes y, asi, por ejemplo, generar la capacidad para modificar la cantidad de triglicéridos en el subproducto resultante. De esta forma, el contenido de grasa del subproducto resultante se puede controlar, por ejemplo, para producir un alimento para animales con alto contenido de proteínas y menos grasa más adecuado a las necesidades de las vacas lecheras que un producto con alto contenido de grasas.
En una modalidad,, el aceite de maíz crudo separado de la pasta puede procesarse adicionalmente en aceite comestible para consumo o, además, puede usarse como un componente del alimento para animales ya que sería una fuente 'óptima de energía metabolizable debido a su alto contenido de triglicéridos. En otra modalidad, además, puede usarse como materia prima para biodiesel o diesel renovable.
En una modalidad, el subproducto del extractante puede usarse, total o parcialmente, como un componente de un subproducto de alimento para animales o como materia prima para biodiesel o diesel renovable.
En otra modalidad, los sólidos pueden separarse de la pasta y pueden comprender triglicéridos y ácidos grasos libres. Estos sólidos (o corriente) pueden usarse como un alimento para animales, ya sea recuperado como descarga de la centrifugación o después del secado. Los sólidos (o torta húmeda) pueden ser especialmente adecuados como alimento para rumiantes (por ejemplo, vacas lecheras) debido a su alto contenido de lisina disponible y proteína pasante o no degradable en el rumen. Por ejemplo, estos sólidos pueden ser especialmente valiosos en un alimento con alto contenido de proteínas y bajo contenido graso. En otra modalidad, estos sólidos pueden usarse como una base, es decir, otros subproductos, tal como jarabe, pueden añadirse a los sólidos para formar un producto que puede usarse como alimento para animales. En otra modalidad pueden añadirse distintas cantidades de otros subproductos en los sólidos para adaptarse a las propiedades del producto resultante y satisfacer las necesidades de una cierta especie de animales.
La composición de sólidos separados de los residuos de destilación enteros, tal como se describe en el Ejemplo 21, puede incluir, por ejemplo, proteínas crudas, ácidos grasos y ésteres isobutílicos de ácidos grasos. En una modalidad, esta composición (o subproducto) puede usarse, húmeda o seca, como un alimento para animales en los cuales se prefiere, por ejemplo, un alto contenido de proteínas (por ejemplo, alto contenido de lisina) , un bajo contenido de grasas y un alto contenido de fibras. En otra modalidad puede añadirse grasa a esta composición, por ejemplo, a partir de otra corriente de subproducto si se prefiere obtener un alimento para animales con mayor contenido de grasas y bajo contenido de fibras. En una modalidad, este alimento para animales con mayor contenido de grasa y menor contenido de fibras puede usarse para el ganado porcino o aves de corral. En otra modalidad, una composición no acuosa de solubles condensados de destilería (CDS, por sus siglas en inglés) (ver, por ejemplo, el Ejemplo 21) puede incluir, por ejemplo, proteínas, ácidos grasos y ésteres isobutílicos de ácidos grasos¦ además de otros sólidos disueltos y suspendidos, tales como sales y carbohidratos. Esta composición de CDS puede usarse, por ejemplo, como alimento para animales, húmedo o seco, en el cual se prefiere la presencia de un componente de alimentación con alto contenido de proteínas, bajo contenido de grasas y alto contenido de sales minerales. En una modalidad, esta composición puede usarse como un componente de una ración para vacas lecheras.
En otra modalidad, el aceite del proceso de fermentación puede recuperarse mediante evaporación. Esta composición no acuosa puede comprender ásteres isobutilicos de ácidos grasos y ácidos grasos (ver, por ejemplo, el Ejemplo 20) y esta composición (o corriente) puede alimentarse a un hidrolizador para recuperar el isobutanol y los ácidos grasos. En otra modalidad, esta corriente puede usarse como materia prima para la producción de biodiesel.
Las diversas corrientes generadas por la producción de un alcohol (por ejemplo, butano!) mediante un proceso de fermentación pueden combinarse de varias maneras para generar varios coproductos . Por ejemplo, si el maiz crudo de la pasta se usa para generar ácidos grasos que se usarán como extractante y los lipidos se extraen por medio de evaporadores para otros propósitos, entonces, las corrientes restantes pueden combinarse y procesarse para crear una composición del coproducto que comprende proteínas crudas, grasas crudas, triglicéridos , ácidos grasos y ésteres isobutilicos de ácidos grasos. En una modalidad, esta composición puede comprender al menos aproximadamente 20-35 % en peso de proteína cruda, al menos 1-20 % en peso de grasa cruda, al menos aproximadamente 0-5 % en peso de triglicéridos, al menos aproximadamente 4-10 % en peso de ácido graso y al menos aproximadamente 2-6 % en peso de éster isobutílico de ácido graso. En una modalidad específica, la composición del coproducto puede comprender aproximadamente 25 % en peso de proteína cruda, aproximadamente 10 % en peso de grasa cruda, aproximadamente 0.5 % en peso de triglicéridos, aproximadamente 6 % en peso de ácido graso y aproximadamente 4 % en peso de éster isobutílico de ácido graso.
En otra modalidad, el lípido se extrae por medio de evaporadores y los ácidos grasos se usan para otros propósitos, y aproximadamente 50 % en peso del maíz crudo de la pasta y las corrientes restantes se combinan y procesan; la composición del coproducto resultante puede comprender proteínas crudas, grasas crudas, triglicéridos, ácidos grasos y ásteres isobutílicos de ácidos grasos. En una modalidad, esta composición puede comprender al menos aproximadamente 25-31 % en peso de proteína cruda, al menos aproximadamente 6-10 % en peso de grasa cruda, al menos aproximadamente 4-8 % en peso de triglicéridos, al menos aproximadamente 0-2 % en peso de ácido graso y al menos aproximadamente 1-3 % en peso de éster isobutílico de ácido graso. En una modalidad específica, la composición del coproducto puede comprender aproximadamente 28 % en peso de proteína cruda, aproximadamente 8 % en peso de grasa cruda, aproximadamente 6 % en peso de triglicéridos, aproximadamente 0.7 ',% en peso de ácido graso y aproximadamente 1 % en peso de éster isobutílico de ácido graso.
En otra modalidad, los sólidos separados de los residuos de destilación enteros y 50 % en peso del aceite de maíz extraído de la pasta se combinan, y la composición del coproducto resultante puede comprender proteínas crudas, grasas crudas, triglicéridos , ácidos grasos, ásteres isobutílicos de ácidos grasos, lisina, fibra detergente neutra (NDF, por sus siglas en inglés) y fibra detergente ácida (ADF, por sus siglas en inglés) . En una modalidad, esta composición puede comprender al menos aproximadamente 26-34 % en peso de proteína cruda, al menos aproximadamente 15-25 % en peso de grasa cruda, al menos aproximadamente 12-20 % en peso de triglicéridos, al menos aproximadamente 1-2 % en peso de ácido graso, al menos aproximadamente 2-4 % en peso de éster isobutílico de ácido graso, al menos aproximadamente 1- 2 % en peso de lisina, al menos aproximadamente 11-23 % en peso de NDF y al menos aproximadamente 5-11 % en peso de ADF.
En una modalidad especifica, la composición del coproducto puede comprender aproximadamente 29 % en peso dé proteína cruda, aproximadamente 21 % en peso de grasa cruda, aproximadamente 16 % en peso de triglicéridos, aproximadamente 1 % en peso de ácido graso, aproximadamente 3 % en peso de éster isobutílico de ácido graso, aproximadamente 1 % en peso de lisina, aproximadamente 17 % en peso de NDF y aproximadamente 8 % en peso de ADF. Esta composición del coproducto con alto contenido de grasa, triglicéridos y lisina y bajo contenido de fibras puede preferirse como alimento para el ganado porcino y aves de corral .
Como se describió anteriormente, las diversas corrientes generadas mediante la producción de un alcohol (por ejemplo, butanol) a través de un proceso de fermentación pueden combinarse de varias maneras para generar una composición del coproducto que comprende proteina cruda, grasa cruda, triglicéridos, ácido graso y éster isobutilico de ácido graso. Por ejemplo, una composición que comprende al menos aproximadamente 6 % de grasa cruda y al menos aproximadamente 28 % de proteina cruda se puede usar como un producto de alimento para animales lecheros. Una composición que comprende al menos aproximadamente 6 % de grasa cruda y al menos aproximadamente 26 % de proteina cruda se puede usar como un producto de alimento para el ganado de lote de engorde mientras que una composición que comprende al menos aproximadamente 1 % de grasa cruda y al menos aproximadamente 27 % de proteina cruda se puede usar como un producto de alimento para ganado de invernada. Una composición que comprende al menos aproximadamente 13 % de grasa cruda y al menos aproximadamente 27 % de proteina cruda se puede usar como un producto de alimento para aves de corral. Una composición que comprende al menos aproximadamente 18 % de grasa cruda y al menos aproximadamente 22 % de proteina cruda se puede usar como un producto de alimento para animales monogástricos . Así, las diversas corrientes pueden combinarse para obtener un producto de alimento adaptado para una especie animal específica.
Como se describió anteriormente, las diversas corrientes generadas mediante la producción de un alcohol (por ejemplo, butanol) a través de un proceso de fermentación pueden combinarse de varias maneras para generar una composición del coproducto que comprende proteína cruda, grasa cruda, triglicéridos, ácido graso y éster isobutílico de ácido graso. Por ejemplo, una composición que comprende al menos aproximadamente 6 % de grasa cruda y al menos aproximadamente 28 % de proteína cruda se puede usar como un producto de alimento para animales lecheros. Una composición que comprénde al menos aproximadamente 6 % de grasa cruda y al menos aproximadamente 26 % de proteína cruda se puede usar como un producto de alimento para el ganado de lote de engorde mientras que una composición que comprende al menos aproximadamente 1 % de grasa cruda y al menos aproximadamente 27 % de proteína cruda se puede usar como un producto de alimento para ganado de invernada. Una composición que comprende al menos aproximadamente 13 % de grasa cruda y al menos aproximadamente 27 % de proteína cruda se puede usar como un producto de alimento para aves de corral. Una composición que comprende al menos aproximadamente 18 % de grasa cruda y al menos aproximadamente 22 % de proteína cruda se puede usar como un producto de alimento para animales monogástricos . Asi, las diversas corrientes pueden combinarse para obtener un producto de alimento adaptado para una especie animal especifica.
En una modalidad, una o más corrientes generadas mediante la producción de un alcohol (por ejemplo, butanol) a través de un proceso de fermentación pueden combinarse de varias maneras para generar una composición que comprende al menos aproximadamente 90 % de COFA que puede usarse como una fuente de combustible, tal como biodiesel.
Como ejemplo de una modalidad de los métodos de la invención, el grano molido (por ejemplo, maíz procesado con un molino triturador) y una o más enzimas se combinan para generar una suspensión de granos. Esta suspensión de granos se coce, licúa y se vaporiza con vapor instantáneo para producir una pasta cocida. Después, la pasta cocida se filtra para eliminar los sólidos suspendidos y generar una torta húmeda y un filtrado. La filtración puede realizarse mediante diversos métodos, tales como centrifugación, tamizado o filtración al vacío, y esta etapa de filtración puede eliminar entre al menos aproximadamente 80 % y al menos aproximadamente 99 % de los sólidos suspendidos de la pasta.
La torta húmeda se resuspende con agua y se filtra otra vez para eliminar el almidón adicional y generar una torta filtrada lavada. El proceso de resuspensión puede repetirse varias veces, por ejemplo, de una a cinco veces. El agua usada para resuspender la torta húmeda puede ser agua reciclada generada durante el proceso de fermentación. El filtrado producido mediante el proceso de resuspensión/refiltración puede volver a la etapa de mezclado inicial para formar una suspensión con el grano molido. El filtrado puede calentarse o enfriarse antes de la etapa de mezclado.
La torta de filtro lavada puede resuspenderse con cerveza en varias etapas durante el proceso de producción. Por ejemplo, la torta de filtro lavada puede resuspenderse con cerveza después del termentador, antes de la columna de evaporación instantánea previa o en el punto de alimentación al secador de granos de los destiladores. La torta de filtro lavada puede secarse en forma separada de otros subproductos o puede usarse directamente como una torta húmeda para generar DDGS.
El filtrado obtenido como resultado de la etapa de mezclado inicial puede procesarse adicionalmente como se describe en la presente invención. Por ejemplo, el filtrado puede calentarse mediante vapor o intercambio de calor de proceso a proceso. Una enzima de sacarificación puede añadirse en el filtrado y el almidón disuelto del filtrado se puede sacarificar parcial o completamente. El filtrado sacarificado puede enfriarse por diversos métodos, tales como intercambio de proceso a proceso, intercambio con agua de enfriamiento o intercambio con agua helada.
El filtrado enfriado puede añadirse después a un fermentador además de un microorganismo adecuado para la producción de alcohol, por ejemplo, una levadura recombinante capaz de producir butanol. Adicionalmente, en el fermentador se puede añadir corrientes de amoniaco y reciclado. Este proceso puede incluir al menos un fermentador, al menos dos fermentadores, al menos tres termentadores o al menos cuatro fermentadores . El dióxido de carbono generado durante la fermentación se puede descargar a un depurador para reducir las emisiones al aire (por ejemplo, emisiones de butanol al aire) y para aumentar el rendimiento del producto.
El disolvente se puede añadir al fermentador a través de un circuito reciclado o en forma directa. El disolvente puede ser uno o más compuestos orgánicos que tienen la capacidad de disolverse o reaccionar con el alcohol (por ejemplo, butanol) y puede tener una solubilidad limitada en agua. El disolvente puede extraerse del fermentador en forma continua como un material de fase de un solo liquido o como un material de fase de dos líquidos o el disolvente puede extraerse en forma discontinua como un material de fase de uno o dos líquidos.
La cerveza puede desgasificarse. La cerveza puede calentarse antes de la desgasificación, por ejemplo, mediante intercambio de proceso a proceso con pasta caliente o intercambio de proceso a proceso con productos de cabeza de la columna de evaporación instantánea previa. Los vapores se pueden descargar a un condensador y, después, a un depurador. La cerveza desgasificada puede calentarse adicionalmente, por ejemplo, mediante intercambio de calor de proceso a proceso con otras corrientes en el área de destilación.
La cerveza y el disolvente precalentados pueden entrar a una columna de evaporación instantánea previa que se puede retroalimentar desde una columna de cerveza de una planta de trituración en seco de combustible de etanol convencional. Esta columna puede funcionar a presión subatmosférica, impulsada mediante vapor de agua provisto por el tren de un evaporador o desde la etapa de cocido de la pasta. Los productos de cabeza de la columna de evaporación instantánea previa pueden condensarse mediante intercambio de calor con alguna combinación de agua de enfriamiento e intercambio de calor de proceso a proceso que incluye el intercambio de calor con la alimentación de la columna de evaporación instantánea previa. El condensado liquido puede estar dirigido a un decantador de alcohol/agua (por ejemplo, decantador de butanol/agua) .
Los productos del fondo de la columna de evaporación instantánea previa pueden pasar a un decantador de disolvente. El alcohol libre (por ejemplo, butanol) puede eliminarse sustancialmente de los productos del fondo de la columna de evaporación instantánea previa. El decantador puede ser un pozo de destilación, una centrifuga o un hidrociclón. En este decantador, el agua se separa sustancialmente de la fase disolvente y genera una fase acuosa. La fase acuosa que incluye sólidos suspendidos y disueltos puede centrifugarse para producir una torta húmeda y residuos finos de destilación. La torta húmeda puede combinarse con otras corrientes y secarse para producir DDGS, puede secarse y comercializarse en forma separada de otras corrientes que producen DDGS o puede comercializarse como una torta húmeda. La fase acuosa puede dividirse para proporcionar una contracorriente que se usa, en parte, para resuspender la torta de filtro descrita anteriormente. La separación proporciona, además, residuos finos de destilación que pueden bombearse a evaporadores para su procesamiento posterior.
La fase orgánica producida en el decantador de disolvente puede ser un éster de un alcohol (por ejemplo, butanol) . El disolvente puede hidrolizarse para regenerar el disolvente reactivo y recuperar alcohol adicional (por ejemplo, butanol) . Alternativamente, la fase orgánica puede filtrarse y comercializarse como un producto. La hidrólisis puede activarse térmicamente, catalizarse homogéneamente o catalizarse heterogéneamente. La entrada de calor a este proceso puede ser un calentador por combustión, aceite caliente, entrada eléctrica de calor o corriente de alta presión. El agua añadida para activar la hidrólisis puede ser provista por una corriente de agua reciclada, agua dulce o vapor .
El disolvente hidrolizado enfriado se puede bombear a una columna de disolvente a presión subatmosférica, en donde el alcohol (por ejemplo, butanol) se puede eliminar sustancialmente con vapor. Esta corriente puede ser vapor de agua de los evaporadores, vapor de la etapa de evaporación del proceso de la pasta o vapor de un generador (ver, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0171129 incorporada en la presente descripción como referencia) . Una columna rectificadora de una planta de trituración en seco de etanol convencional puede ser adecuada como una columna de disolvente. La columna rectificadora se puede modificar para usarse como una columna de disolvente. Los productos del fondo de la columna de disolvente pueden enfriarse, por ejemplo, mediante agua de enfriamiento o intercambio de calor de proceso a proceso. Los productos del fondo enfriados pueden decantarse para eliminar el agua residual y el agua residual puede reciclarse a otras etapas del proceso o reciclarse a la etapa de formación de la pasta .
Los productos de cabeza de la columna de disolvente se pueden enfriar mediante intercambio con agua de enfriamiento o intercambio de calor de proceso a proceso, y el condensado puede dirigirse a un decantador de alcohol/agua (por ejemplo, decantador de butanol/agua) descargado que se puede compartir con los productos de cabeza de la columna de evaporación instantánea previa. En este decantador pueden añadirse otras corrientes mezcladas de agua y alcohol (por ejemplo, butanol) que incluyen los productos del fondo del depurador y el condensado de la etapa de desgasificación. La descarga que comprende dióxido de carbono puede estar dirigida a un depurador de agua. La capa acuosa de este decantador puede alimentarse, además, a la columna de disolvente o puede eliminarse el alcohol (por ejemplo, butanol) de esta en una columna de destilación pequeña especifica. La capa acuosa puede precalentarse mediante intercambio de proceso a proceso con los productos de cabeza de la columna de evaporación instantánea previa, productos de cabeza de la columna de disolvente o productos del fondo de la columna de disolvente. Esta columna especifica se puede modificar desde el extractor lateral de un proceso de trituración en seco de combustible de etanol convencional.
La capa orgánica del decantador de alcohol/agua (por ejemplo, decantador de butanol/agua) se puede bombear a una columna de alcohol (por ejemplo, butanol) . Esta columna puede ser una columna a presión superatmosférica y puede activarse por la condensación de vapor dentro de un reevaporador . La alimentación a la columna se puede calentar mediante intercambio de calor de proceso a proceso para reducir la cantidad de energía necesaria para que la columna funcione. Este intercambiador de proceso a proceso puede incluir un condensador parcial de la columna de evaporación instantánea previa, un condensador parcial de una columna de disolvente, el producto del hidrolizador , vapor de agua de los evaporadores o los productos del fondo de' la columna de butanol. El condensado del vapor de la columna de alcohol (por ejemplo, butanol) se puede enfriar y puede volver al decantador de alcohoL/agua (por ejemplo, decantador de butanol/agua) . Los productos del fondo de la columna de alcohol (por ejemplo, butanol) se pueden enfriar mediante intercambio de calor de proceso a proceso que incluye el intercambio con la alimentación de la columna de alcohol (por ejemplo, butanol) y se pueden enfriar, además, con agua de enfriamiento, filtrarse y comercializarse como un producto de alcohol (por ejemplo, butanol) .
Los residuos finos de destilación generados a partir de los productos del fondo de la columna de evaporación instantánea previa, como se describió anteriormente, pueden dirigirse a un evaporador de efecto múltiple. Este evaporador puede tener dos, tres o más etapas. El evaporador puede tener una configuración de cuatro cuerpos y dos efectos, similar al diseño convencional de una planta de combustible de etanol, tres cuerpos y tres efectos u otras configuraciones. Los residuos finos de destilación pueden entrar en cualquiera de los efectos. Al menos uno de los primeros cuerpos de efectos se puede calentar con vapor proveniente de la columna de alcohol (por ejemplo, butanol) a presión superatmosférica . El vapor se puede obtener desde el efecto de menor presión para proporcionar calor en forma de vapor de agua a la columna de evaporación instantánea previa a presión subatmosférica y a la columna de disolvente. El jarabe de los evaporadores puede añadirse en el secador de granos del destilador.
Las emisiones de dióxido de carbono del termentador, desgasificador, decantador de alcohol/agua (por ejemplo, decantador de butanol/agua) y otras fuentes pueden estar dirigidas a un depurador de agua. El agua suministrada a la parte superior de este depurador puede ser agua dulce complementaria o agua reciclada. El agua reciclada se puede tratar (por ejemplo, mediante digestión biológica) para eliminar los compuestos orgánicos volátiles y se puede enfriar. Los productos del fondo del depurador se pueden enviar al decantador de alcohol/agua (por ejemplo, decantador de butanol/agua), a la columna de disolvente o se pueden usar con agua reciclada para resuspender la torta húmeda descrita anteriormente. El condensado de los evaporadores se puede tratar mediante digestión biológica anaeróbica u otros procesos para purificar el agua antes del reciclado y resuspender las tortas de filtro.
Si la fuente de grano molido es maíz, el aceite de maíz se puede separar de las corrientes del proceso en cualquier punto. Por ejemplo, se puede usar una centrifuga para producir una corriente de aceite de maiz después de la filtración de la pasta cocida o la centrifuga de la fase de agua de la columna de evaporación instantánea previa puede producir una corriente de aceite de maiz. El jarabe de concentración intermedia o el jarabe final se puede centrifugar para producir una corriente de aceite de maiz.
En otro ejemplo de una modalidad de los métodos de la invención, el material descargado del fermentador se puede procesar en un sistema de separación que implica el uso de dispositivos tales como una centrífuga, un ajustador, un hidrociclón, etc. y combinaciones de estos para recuperar la levadura viva en una forma concentrada que se puede reciclar para reusar en un lote de fermentación posterior ya sea directamente o después de cierto reacondicionamiento. Este sistema de separación puede producir, además, una corriente orgánica que comprende ésteres grasos (por ejemplo, ésteres isobutílicos grasos) y un alcohol (por ejemplo, butanol) generada a partir de la fermentación y una corriente acuosa que contiene solamente niveles traza de orgánicos inmiscibles. Esta corriente acuosa se puede usar antes o después de extraer el contenido de alcohol (por ejemplo, butanol) para reducir a pulpa y bombear los sólidos con bajo contenido de almidón que se separaron y lavaron a partir de la pasta licuada. Esto tiene la ventaja de evitar un sistema que puede ser un sistema transmisor impulsado por cadena larga para transferir estos sólidos desde el área de licuación al área de secado de granos y mezcla de jarabe. Además, estos residuos de destilación enteros producidos después de la extracción del alcohol (por ejemplo, butanol) se deberán separar en residuos finos de destilación y fracciones de torta húmeda mediante dispositivos de separación existentes o nuevos, y estos residuos finos de destilación formarán parcialmente la contracorriente que vuelve para combinarse con el agua de cocción para preparar un nuevo lote de pasta fermentable. Otra ventaja de esta modalidad es que cualquier almidón disuelto residual que quedó retenido en la humedad de los sólidos separados a partir de la pasta licuada se pueden captar parcialmente y recuperar a través de esta contracorriente. Alternativamente, la levadura contenida en la corriente de sólidos puede ser considerada no viable y dispersarse nuevamente en la corriente acuosa, y cualquier contenido de alcohol (por ejemplo, butanol) remanente de la fermentación puede destilarse de esta corriente combinada. Además, los organismos no viables se pueden separar para usarse como un nutriente en el proceso de propagación.
En otra modalidad, el material multifase puede extraerse del fondo de la columna de evaporación instantánea previa y procesarse en un sistema de separación como se describió anteriormente. Los sólidos concentrados se pueden redispersar en la corriente acuosa y esta corriente combinada se puede usar para reducir a pulpa y bombear los sólidos con bajo contenido de almidón que se separaron y lavaron a partir de la pasta licuada.
El proceso descrito anteriormente, además de otros procesos descritos en la presente invención, pueden demostrarse mediante modelado por computación, tal como modelado Aspen (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 7,666,282). Por ejemplo, la aplicación informática de modelado comercial Aspen Plus® (Aspen Technology, Inc., Burlington, A) se puede usar junto con bases de datos de propiedades físicas, tales como DIPPR (Design Institute for Physical Property Research), disponible de American Institute of Chemical Engineers, Inc. (New York, NY) para desarrollar un modelo Aspen para un proceso integrado de fermentación de butanol, purificación y manejo de agua. Este modelado del proceso puede realizar cualquier cálculo de ingeniería fundamental, por ejemplo, balance de masa y energía, equilibrio vapor/líquido y cálculos de la tasa de reacción. Para generar un modelo Aspen, los datos que se deben ingresar pueden incluir, por ejemplo, datos experimentales, contenido de agua y composición de la materia prima, temperatura de cocido de la pasta y evaporación instantánea, condiciones de sacarificación (por ejemplo, alimentación de enzimas, conversión del almidón, temperatura, presión), condiciones de fermentación (por ejemplo, alimentación de microorganismos, conversión de glucosa, temperatura, presión) , condiciones de desgasificación, columnas de disolvente, columnas de evaporación instantánea previa, condensadores, evaporadores , centrífugas, etc.
Los procesos y sistemas descritos anteriormente pueden aumentar la actividad de extracción y/o eficacia en la producción del producto de alcohol como resultado de la eliminación de los sólidos no disueltos. Por ejemplo, la fermentación extractiva sin la presencia de sólidos no disueltos puede generar una velocidad de transferencia de masa más alta del producto de alcohol desde el caldo de cultivo de fermentación hasta el extractante, una separación de fases mejorada del extractante de la fermentación interna o externa al fermentador y una menor retención del extractante como resultado de mayores velocidades de elevación de gotitas del extractante. Además, por ejemplo, las gotitas de extractante retenidas en el caldo de cultivo de la fermentación durante la fermentación se liberarán del caldo de cultivo de la fermentación con mayor velocidad y más completamente y, de ese modo, producirán menos extractante libre en el caldo de cultivo de la fermentación y pueden reducir la cantidad de extractante perdido en el proceso. Adicionalmente, por ejemplo, el microorganismo se puede reciclar y se pueden eliminar los equipos adicionales en el procesamiento en dirección 3' , tales como una columna de cerveza y/o algunas o todas las centrifugas de residuos de destilación enteros. Adicionalmente, por ejemplo, se elimina la posibilidad de pérdida de extractante en los DDGS. Además, por ejemplo, la capacidad para reciclar el microorganismo puede aumentar la velocidad general de producción del producto de alcohol, reducir el requerimiento de titulo general y/o reducir el requerimiento de titulo acuoso y producir un microorganismo más saludable y una velocidad de producción más alta. Adicionalmente, por ejemplo, se puede eliminar un agitador en el termentador para reducir los costos de capital; para aumentar la productividad del termentador dado que el volumen se usa con mayor eficacia porque se minimiza la retención del extractante y los sólidos no disueltos no están presentes; y/o para usar fermentación continua o fermentadores más pequeños en una planta de producción totalmente nueva.
Los ejemplos de la mayor eficacia de extracción pueden incluir, por ejemplo, un coeficiente de partición estabilizado, separación de fases mejorada (por ejemplo, más rápida o más completa) , mayor coeficiente de transferencia de masa líquido-líquido, operación a un título más bajo, mayor capacidad de reciclado de la corriente del proceso, mayor eficacia del volumen de fermentación, mayor alimentación de la carga de materia prima (por ejemplo, maíz), mayor tolerancia del microorganismo (por ejemplo, un microorganismo recombinante ) al título del butanol, reciclado de agua, reducción en la energía, mayor reciclado del extractante y/o reciclado del microorganismo.
Por ejemplo, se reducirá el volumen del termentador captado por los sólidos. Por lo tanto, el volumen eficaz del termentador disponible para la fermentación puede aumentar. En algunas modalidades, el volumen del termentador disponible para la fermentación aumenta en al menos aproximadamente 10 %.
Por ejemplo, el coeficiente de partición se puede estabilizar. Dado que el aceite de maíz en el termentador se puede reducir mediante la eliminación de los sólidos de la mezcla de materia prima antes de la fermentación, el extractante se expone a una cantidad de aceite de maíz menor que se combina con el extractante y puede reducir el coeficiente de partición si está presente en una cantidad suficiente. Por lo tanto, la reducción del aceite de maíz introducido en el termentador produce un coeficiente de partición más estable de la fase extractante en el termentador. En algunas modalidades, el coeficiente de partición se reduce en menos de aproximadamente 10 % durante 10 ciclos de fermentación.
Por ejemplo, la eficiencia de extracción del butanol con extractante puede aumentar porque la velocidad de transferencia de masa (por ejemplo, en la forma de un coeficiente de transferencia de masa mayor) del producto de alcohol desde el caldo de cultivo de la fermentación al extractante será mayor y la producción del producto de alcohol será más eficaz. En algunas modalidades, el coeficiente de transferencia de masa aumenta al menos al doble (ver los Ejemplos 4 y 5) .
Adicionalmente, puede producirse un aumento en la separación de fases entre el caldo de cultivo de la fermentación y el extractante que reduce la probabilidad de formación de una emulsión y, por lo tanto, mejora la eficacia de producción del producto de alcohol. Por ejemplo, las fases se pueden separar con mayor velocidad o la separación puede ser más completa. En algunas modalidades se puede producir una separación de fases en la cual no se observa una separación de fases previa apreciable en 24 horas. En algunas modalidades, la separación de fases se produce con una rapidez de al menos aproximadamente el doble, al menos aproximadamente cinco veces mayor o al menos aproximadamente 10 veces mayor que la separación de fases en la cual no se extrajeron los sólidos (ver los Ejemplos 6 y 7) .
Adicionalmente, puede haber un aumento en la recuperación y el reciclado del extractante. El extractante no quedará "atrapado" en los sólidos que, en última instancia, se eliminarán como DDGS y, de ese modo, aumentará la eficacia de la producción del producto de alcohol (ver los Ejemplos 8 y 9) . Además, la dilución del extractante con aceite de maíz será menor y la degradación del extractante puede reducirse (ver el Ejemplo 10) .
Además, el régimen de flujo del extractante se puede reducir de modo que se reduzcan también los costos operativos y, en consecuencia, aumente la eficacia de la producción del producto de alcohol.
Adicionalmente, la retención del extractante se reducirá como resultado de las gotitas de extractante que suben a una mayor velocidad, lo que aumenta la eficacia de la producción del producto de alcohol. La reducción de la cantidad de sólidos no disueltos en el termentador aumentará, además, la eficacia de la producción del producto de alcohol.
Adicionalmente, se puede eliminar un agitador del fermentador ya que no es necesario suspender los sólidos no disueltos para reducir asi los costos de capital y energía y aumentar la eficacia de la producción del producto de alcohol .
En algunas modalidades, el caldo de fermentación 40 puede descargarse por una salida del fermentador 30. La ausencia o minimización de los sólidos no disueltos que salen del fermentador 30 con el caldo de fermentación 40 exhibe varios beneficios adicionales. Por ejemplo, se puede eliminar la necesidad de incluir unidades y operaciones en el procesamiento en dirección 3' , tales como, por ejemplo, una columna de cerveza o columna de destilación, de modo que aumente la eficacia para la producción del producto de alcohol. Además, dado que los sólidos no disueltos no están presentes en el caldo de fermentación 40 que sale del fermentador 30, no se forman DDGS con el extractante "atrapado". Además, algunas o todas las centrifugas de residuos de destilación completas pueden eliminarse debido a la menor cantidad de sólidos no disueltos en el caldo final que sale del fermentador.
Como se describió anteriormente, los métodos de la presente invención proporcionan varios beneficios que pueden aumentar la producción (por ejemplo, discontinua o continua) de un producto de alcohol, tal como butanol. Por ejemplo, la mejora en la transferencia de masa permite la operación a un titulo acuoso menor que resulta en un microorganismo "más saludable". Una separación de fases mejorada puede aumentar la eficacia del volumen del fermentador asi como también puede permitir el procesamiento de un contenido menor del reactor a través de columnas de cerveza, columnas de destilación, etc. Adicionalmente, la pérdida de disolvente a través de los sólidos es menor y las células pueden reciclarse. Los métodos de la presente invención pueden proporcionar, además, DDGS de mayor calidad.
Adicionalmente, los métodos descritos en la presente descripción permiten la eliminación de aceite (por ejemplo, aceite de maíz) antes de la fermentación lo que después permitiría la adición controlada de aceite a la fermentación. Además, la eliminación de aceite antes de la fermentación permitiría cierta flexibilidad en la cantidad de aceite presente en los DDGS. Es decir, en los DDGS puede añadirse aceite en cantidades diferentes y generar la producción de DDGS con contenido de grasa diferente dependiendo de las necesidades nutricionales de una especie animal específica. Microorganismos recombinantes y rutas biosintéticas del butanol Sin limitaciones teóricas de ninguna especie, se cree que los procesos descritos en la presente descripción son útiles junto con cualquier microorganismo productor de alcohol, particularmente, microorganismos recombinantes que producen alcohol con títulos superiores a sus niveles de tolerancia .
En la técnica se conocen los microorganismos productores de alcohol. Por ejemplo, la oxidación fermentativa de metano por bacterias metanotróficas (por ejemplo, Methylosinus trichosporium) produce metanol y el contacto del metanol (un alcohol alquilico de Ci) con un ácido carboxilico y un catalizador capaz de esterificar el ácido carboxilico con metanol forma un éster metanólico del ácido carboxilico. La cepa de levadura CEN.PK113-7D (CBS 8340, Centraal Buró voor Schimmelculture; van Dijken, et al., Enzyme Microb. Techno. 26:706-714, 2000) puede producir etanol, y el contacto del etanol con un ácido carboxilico y un catalizador capaz de esterificar el ácido carboxilico con el etanol forma éster etílico (ver, por ejemplo, el Ejemplo 36) .
Además, en la técnica se conocen los microorganismos recombinantes que producen alcohol (por ejemplo, Ohta, et al., Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900, 1991;' Underwood, et al., Appl. Environ. Microbiol. 68:1071-1081, 2002; Shen y Liao, Metab. Eng. 10:312-320, 2008; Hahnai, et al., Appl. Environ. Microbiol. 73:7814-7818, 2007; patente de los Estados Unidos núm. 5,514,583; patente de los Estados Unidos núm. 5,712,133; publicación de patente del PCT núm. WO 1995/028476; Feldmann, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 354-361, 1992; Zhang, et al., Science 267:240-243, 1995; publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0031918 Al; patente de los Estados Unidos núm. 7,223,575; patente de los Estados Unidos núm. 7,741,119; patente de los Estados Unidos núm. 7,851,188; publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0203099 Al; publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0246846 Al; y publicación de solicitud del PCT núm. O 2010/075241, todas ellas incorporadas en la presente descripción como referencia) .
Los microorganismos recombinantes adecuados capaces de producir butanol se conocen en la técnica, y ciertos microorganismos adecuados capaces de producir butanol se describen en la presente descripción. Los microorganismos recombinantes para producir butanol por medio de una ruta biosintética pueden incluir un miembro de los géneros Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Serratia, Erwinia, Klebsiella, Shigella , Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacteríum, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia, Pichia, Candida, Hansenula, Issatchenkia o Saccharomyces . En una modalidad, los microorganismos recombinantes pueden seleccionarse del grupo que consiste en Escherichia coli, Lactobacillus plantarum, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus y Saccharomyces cerevisiae. En una modalidad, el microorganismo recombinante es levadura. En una modalidad, el microorganismo recombinante es levadura con efecto "crabtree" positivo seleccionada de Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Dekkera, Torulopsis, Brettánomyces y algunas especies de Candida. Las especies de levadura con efecto "crabtree" positivo incluyen, pero no se limitan a, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces míkitae, Saccharomyces paradoxus, Zygosaccharomyces rouxii y Candida glabrata .
En algunas modalidades, la célula huésped es Saccharomyces cerevisiae. Las levaduras S. cerevisiae se conocen en la técnica y pueden obtenerse a partir de diversas fuentes que incluyen, pero no se limitan a, American Type Culture Collection (Rockville, MD) , Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre, LeSaffre, Gert Strand AB, Ferm Solutions, North American Bioproducts, Martrex y Lallemand. Las levaduras S. cerevisiae incluyen, pero no se limitan a, BY4741, CEN.PK 113-7D, levadura Ethanol Red®, levadura Ferm Pro™, levadura Bio-Ferm® XR, levadura de alcohol Gert Strand Prestige Batch Turbo, levadura Gert Strand Pot Distillers, levadura Gert Strand Distillers Turbo, levadura Fer ax™ Green, levadura FerMax™ Gold, levadura Thermosacc®, BG-1, PE-2, CAT-1, CBS7959, CBS7960 y CBS7961.
La producción de butanol en la que se usa fermentación con un microorganismo, además de los microorganismos que producen butanol, se describe, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305370 incorporada en la presente invención como referencia. En algunas modalidades los microorganismos comprenden una ruta biosintética de butanol. En algunas* modalidades, al menos uno, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro polipéptidos que catalizan conversiones de sustrato a producto de una ruta están codificados por polinucleótidos heterólogos en el microorganismo. En algunas modalidades, todos los polipéptidos que catalizan conversiones de sustrato a producto de una ruta están codificados por polinucleótidos heterólogos en el microorganismo. En algunas modalidades, el microorganismo comprende una reducción o eliminación de la actividad decarboxilasa del piruvato. Los microorganismos prácticamente libres de actividad decarboxilasa del piruvato se describen en la publicación de la solicitud de los Estados Unidos núm. 2009/0305363 incorporada como referencia en la presente descripción. En la publicación se describen, además, los microorganismos prácticamente libres de una enzima .que tiene actividad glicerol-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD, tal como GPD2.
Las rutas biosintéticas adecuadas para la producción de butanol son conocidas en la técnica y algunas rutas adecuadas se describen en la presente invención. En algunas modalidades, la ruta biosintética del butanol comprende al menos un gen que es heterólogo a la célula huésped. En algunas modalidades, la ruta biosintética del butanol comprende más de un gen que es heterólogo a la célula huésped. En algunas modalidades, la ruta biosintética del butanol comprende genes heterólogos que codifican polipéptidos que corresponden a cada etapa de una ruta biosintética .
Algunas proteínas adecuadas que tienen la capacidad para catalizar el sustrato indicado para producir conversiones se describen en la presente descripción y otras proteínas adecuadas se proporcionan en la técnica. Por ejemplo, las publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos núras. 2008/0261230, 2009/0163376 y 2010/0197519, incorporadas en la presente invención como referencia, describen ácido acetohidroxi isomeroreductasas; la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2010/0081154, incorporada como referencia, describe dihidroxiácido dehidratasas ; un alcohol deshidrogenasa se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0269823 incorporada en la presente invención como referencia .
Una persona con experiencia en la técnica comprenderá que varios niveles de identidad de secuencia son útiles para identificar los polipéptidos de otras especies, en donde los polipéptidos tienen la misma función o actividad o una similar y son adecuados para usar en los microorganismos recombinantes descritos en la presente descripción. Los ejemplos útiles de porcentajes de identidad incluyen, pero no se limitan a, 75 %, 80 %, 85 I, 90 % o 95 % o cualquier porcentaje entero de 75 % a 100 % puede ser útil para describir la presente invención, tal como 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.
Las cepas adecuadas incluyen aquellas descritas en algunas solicitudes citadas e incorporadas en la presente descripción como referencia y, además, en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. de serie 61/380,563 presentada el 7 de septiembre de 2010. La construcción de algunas cepas adecuadas que incluyen aquellas usadas en los ejemplos se proporciona en la presente descripción.
Construcción de la cepa BP1083 de Saccharomyces cerevisiae ("NGCI-070"; PNY1504) La cepa BP1064 se derivó de CEN.PK 113-7D (CBS 8340; Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre, Países Bajos) y contiene supresiones de los siguientes genes: URA3, HIS3, PDC1, PDC5, PDC6 y GPD2. BP1064 se transformó con plásmidos pYZ090 (sec. con núm. de ident. : 1 descrita en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. de serie 61/246, 844) y pLH468 (sec. con núm. de ident.: 2) para crear la cepa NGCI-070 (BP1083, PNY1504).
Las supresiones, que eliminaron completamente toda la secuencia codificante, se crearon mediante recombinación homologa con fragmentos de PCR que contenían regiones de homología en dirección 5' y en dirección 3' del gen objetivo y un marcador de resistencia de G418 o gen URA3 para la selección de transformantes. El marcador de resistencia G418, flanqueado por sitios loxP, se eliminó con recombinasa Cre. El gen URA3 se eliminó mediante recombinación homologa para crear una supresión sin cicatrices o, cuando estaba flanqueado por sitios loxP, se eliminó con recombinasa Cre.
El procedimiento de supresión sin cicatrices se adaptó de Akada, et al., (Yeast 23:399-405, 2006). Generalmente, el cásete de PCR para cada supresión sin cicatrices se obtuvo mediante la combinación de cuatro fragmentos, A-B-U-C, por PCR de superposición. El cásete de PCR contenía un marcador seleccionable/contraseleccionable, URA3 (fragmento U) , que consistía en el gen nativo URA3 de CEN.PK 113-7D junto con el promotor (250 bp en dirección 5' del gen URA3) y el terminador (150 bp en dirección 3' del gen URA3) . Los fragmentos A y C, cada uno de 500 bp de largo, correspondían a los 500 bp inmediatamente en dirección 5' del gen objetivo (fragmento A) y a la región 3' de 500 bp del gen objetivo (fragmento C) . Los fragmentos A y C se usaron para la integración del cásete en el cromosoma mediante recombinación homologa. El fragmento B (500 bp de largo) correspondía a los 500 bp inmediatamente en dirección 3' del gen objetivo y se usó para la escisión del marcador URA3 y el fragmento C del cromosoma mediante recombinación homologa, ya que se creó una repetición directa de la secuencia que correspondía al fragmento B cuando el cásete se integró en el cromosoma. Con el cásete ABUC producto de la PCR, primero se integró el marcador URA3 y, después, se realizó la escisión del cromosoma mediante recombinación homologa. La integración inicial suprimió el gen, excepto la región 3' de 500 bp. Cuando se realizó la escisión, la región 3' de 500 bp del gen también se eliminó. Para la integración de los genes con este método, el gen a integrar se incluyó en el cásete de PCR entre los fragmentos A y B.
Supresión de URA3 Para suprimir la región codificante del gen URA3 endógeno se amplificó un cásete ura3 : : loxP-kanMX-loxP por PCR a partir de pLA54 como el ADN plantilla (sec. con núm. de ident.: 3). pLA54 contiene el promotor TEFl de K. lactis y el marcador kanMX, y está flanqueado por sitios loxP para permitir la recombinación con recombinasa Cre- y la eliminación del marcador. La PCR se realizó con ADN-polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, A) e cebadores BK505 y BK506 (sec. con núms . de ident.: 4 y 5) . La porción URA3 de cada cebador se derivó de la región 5' en dirección 5' del promotor URA3 y la región 3' en dirección 3' de la región codificante de modo que la integración del marcador ????-kanMX-loxP generó el reemplazo de la región codificante de ÜRA3. El producto de PCR se transformó en CEN.PK 113-7D mediante el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 201-202) y los transformantes se seleccionaron en YPD que contenía G418 (100 \iq/ml) a 30 °C. Los transformantes se analizaron para verificar la integración correcta mediante PCR con cebadores LA468 y LA492 (sec. con núms . de ident.: 6 y 7) y se designaron como CEN.PK 113-7D Aura3 : : kan X.
Supresión de HIS3 Los cuatro fragmentos para el cásete de PCR para la supresión de HIS3 sin cicatrices se amplificaron con la mezcla · Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs Inc., Ipswich, A) y ADN genómico de CEN.PK 113-7D como plantilla preparado con un kit Gentra® Puregene® levadura/bact (Qiagen, Valencia, CÁ) . El fragmento A de HIS3 se amplificó con el cebador oBP452 (sec. con núm. de ident.: 14) y el cebador oBP453 (sec. con núm. de ident.: 15) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento B de HIS3. El fragmento B de HIS3 se amplificó con el cebador oBP454 (sec. con núm. de ident.: 16) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento A de HIS3 y el cebador oBP455 (sec. con núm. de ident.: 17) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento U de HIS3. El fragmento U de HIS3 se amplificó con el cebador oBP456 (sec. con núm. de ident.: 18) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento B de HIS3 y el cebador ???457 (sec. con núm. de ident.: 19) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento C de HIS3. El fragmento C de HIS3 se amplificó con el cebador ???458 (sec. con núm. de ident.: 20) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento U de HIS3 y el cebador ???459 (sec. con núm. de ident.: 21). Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento AB de HIS3 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento A de HIS3 y el fragmento B de HIS3 y la amplificación con cebadores ???452 (sec. con núm. de ident.: 14) y oBP455 (sec. con núm. de ident.: 17). El fragmento UC de HIS3 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento U de HIS3 y el fragmento C de HIS3 y la amplificación con cebadores oBP456 (sec. con núm. de ident.: 18) y oBP459 (sec. con núm. de ident.: 21). Los productos de PCR resultantes se purificaron en un gel de agarosa y después se usó un kit de extracción con gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete ABUC de HIS3 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento AB de HIS3 y el fragmento UC de HIS3 y la amplificación con cebadores oBP452 (sec. con núm. de ident.: 14) y ???459 (sec. con núm. de ident.: 21). El producto de PCR se purificó con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) .
Se prepararon células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3 : : kan X y se transformaron con el cásete de PCR de ABUC de HIS3 con un kit Frozen-EZ Yeast Transformation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se colocaron en placas sobre un medio sintético completo sin uracilo suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes con his3 inactivado se analizaron mediante PCR con cebadores oBP460 (sec. con núm. de ident.: 22) y oBP461 (sec. con núm. de ident . : 23) con ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® levadura/bact (Qiagen, Valencia, CA) . Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3:: kanMX Ahis3::URA3. Eliminación del marcador KanMX del sitio Aura3 y eliminación del marcador URA3 del sitio Ahis3 El marcador KanMX se eliminó mediante la transformación de CEN.PK 113-7D Aura3:: kanMX Ahis3::URA3 con pRS 23 : : PGAL1-cre (sec. con núm. de ident.: 66 descrita en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 61/290,639) con un kit Frozen-EZ Yeast Transformation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) y se colocó en placas sobre un medio sintético completo sin histidina y uracilo suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes se cultivaron en YP suplementado con galactosa al 1 1 a 30 'C por ~6 horas para inducir la recombinasa Cre y la escisión del marcador KanMX y se colocaron sobre placas de YPD (glucosa al 2 %) a 30 °C para la recuperación. Se cultivó un aislado de la noche a la mañana en YPD y se colocó en placas sobre medio sintético completo que contenia ácido 5-fluorodrótico (5-FOA, 0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados de los cuales se eliminó el marcador URA3. Los aislados resistentes a 5-FOA se cultivaron y colocaron en placas sobre YPD para remover el plásmido pRS423 : : PGALl-cre . Los aislados se controlaron para identificar la eliminación del marcador KanMX, el marcador URA3 y el plásmido pRS423 :: PGALl-cre mediante el ensayo del crecimiento en placas YPD+G418, medio sintético completo sin placas de uracilo y medio sintético completo sin placas de histidina. Un aislado adecuado sensible a G418 y auxotrófico para uracilo e histidina se seleccionó como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP ñhis3 y se designó como BP857. Las supresiones y eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR y secuenciación con cebadores oBP450 (sec. con núm. de ident.: 24) y oBP451 (sec. con núm. de ident.: 25) para Aura3 e cebadores OBP460 (sec. con núm. de ident.: 22) y OBP461 (sec. con núm. de ident.: 23) para Ahis3 con ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® levadura/bact (Qiagen, Valencia, CA) .
Supresión de PDC6 Los cuatro fragmentos para el cásete de PCR para la supresión de PDC6 sin cicatrices se amplificaron con la mezcla Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y ADN genómico de GE . PK 113-7D como plantilla preparado con un kit Gentra® Puregene® levadura/bact (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento A de PDC6 se amplificó con el cebador oBP440 (sec. con núm. de ident . : 26) y el cebador oBP441 (sec. con núm. de ident. : 27) que contenia una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento B de PDC6. El fragmento B de PDC6 se amplificó con el cebador oBP442 (sec. con núm. de ident.: 28) que contenia una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento A de PDC6 y el cebador OBP443 (sec. con núm. de ident.: 29) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento ü* de PDC6. El fragmento U de PDC6 se amplificó con el cebador oBP444 (sec. con núm. de ident.: 30) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento B de PDC6 y el cebador oBP445 (sec. con núm. de ident.: 31) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento C de PDC6. El fragmento C de PDC6 se amplificó con el cebador oBP446 (sec. con núm. de ident.: 32) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento U de PDC6 y el cebador oBP447 (sec. con núm. de ident. : 33) . Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento AB de PDC6 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento A de PDC6 y el fragmento B de PDC5 y la amplificación con cebadores ???440 (sec. con núm. de ident. : 26) y OBP443 (sec. con núm. de ident.: 29). El fragmento UC de PDC6 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento U de PDC6 y el fragmento C de PDC6 y la amplificación con cebadores oBP444 (sec. con núm. de ident.: 30) y oBP447 (sec. con núm. de ident.: 33). Los productos de PCR resultantes se purificaron en un gel de agarosa y, después, se usó un kit de extracción con gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete ABUC de PDC6 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento AB de PDC6 y el fragmento UC de PDC6 y la amplificación con cebadores oBP440 (sec. con núm. de ident.: 26) y OBP447 (sec. con núm. de ident.: 33). El producto de PCR se purificó con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) .
Se prepararon células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 y se transformaron con el cásete de PCR de ABUC de PDC6 con un kit Frozen-EZ Yeast Transíormation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se colocaron en placas sobre un medio sintético completo sin uracilo suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes con pdc6 inactivado se analizaron mediante PCR con cebadores oBP448 (sec. con núm. de ident.: 34) y OBP449 (sec. con núm. de ident.: 35) con ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® levadura/bact . (Qiagen,' Valencia, CA) . Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6: : URA3.
CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6::URA3 se cultivó de la noche a la mañana en YPD y se colocó en placas sobre medio sintético completo que contenia ácido 5-fluoroorótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados de los cuales se eliminó el marcador URA3. La supresión y eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR y secuenciación con cebadores oBP448 (sec. con núm. de ident . : 34) y oBP449 (sec. con núm. de ident.: 35) con ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® levadura/bact . (Qiagen, Valencia, CA) . La ¦ ausencia del gen PDC6 del aislado se demostró mediante un resultado negativo de la PCR con cebadores específicos para la secuencia codificante de PDC6, OBP554 (sec. con núm. de ident.: 36) y oBP555 (sec. con núm. de ident.: 37). Se seleccionó el aislado adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 y se designó como BP891.
Supresión de PDCl-integración de ilvDSm El gen PDC1 se eliminó y se reemplazó con la región codificante de ilvD del Streptococcus mutans ATCC núm. 700610. El fragmento A seguido por la región codificante de ilvD de Streptococcus mutans para el cásete de PCR para la supresión de PDCl-integración de ilvDSm se amplificó con la mezcla Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y ADN genómico de NYLA83 como plantilla preparado con un kit Gentra® Puregene® levadura/bact . (Qiagen, Valencia, CA) . NYLA83 es una cepa (la construcción se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20110124060 incorporada en la presente descripción como referencia en su totalidad) que porta la supresión de PDCl-integración de ilvDSm descrita en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305363 (incorporada en la presente descripción como referencia en su totalidad) . El fragmento A-ilvDSm de PDC1 (sec. con núm. de ident . : 69) se amplificó con el cebador OBP513 (sec. con núm. de ident.: 38) y el cebador OBP515 (sec. con núm. de ident.: 39) que contenia una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento B de PDC1. Los fragmentos B, U y C para el cásete de PCR para la supresión de PDCl-integración de ilvDSm se amplificaron con la mezcla Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y el ADN genómico de CEN . PK 113-7D como plantilla preparado con un kit Gentra® Puregene® levadura/bact. (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento B de PDC1 se amplificó con el cebador OBP516 (sec. con núm. de ident.: 40) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento A de PDCl-ilvDSm y el cebador oBP517 (sec. con núm. de ident.: 41) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento U de PDC1. El fragmento U de PDC1 se amplificó con el cebador oBP518 (sec. con núm. de ident.: 42) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento B de PDCl y el cebador oBP519 (sec. con núm. de ident. : 43) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento C de PDCl. El fragmento C de PDCl se amplificó con el cebador OBP520 (sec. con núm. de ident. : 44) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento U de PDCl y el cebador OBP521 (sec. con núm. de ident.: 45). Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento A de PDCl-ilvDSm-B se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento A de PDCl-ilvDSm y el fragmento B de PDCl y la amplificación con cebadores oBP513 (sec. con núm. de ident.: 38) y oBP517 (sec. con núm. de ident.: 41). El fragmento UC de PDCl se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento U de PDCl y el fragmento C de PDCl y la amplificación con cebadores OBP518 (sec. con núm. de ident.: 42) y oBP521 (sec. con núm. de ident1.: 45). Los productos de PCR resultantes se purificaron en un gel de agarosa y, después, se usó un kit de extracción con gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete PDCl A-ilvDSm-BUC (sec. con núm. de ident.: 70) se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento A de PDCl-ilvDSm-B y el fragmento UC de PDCl y la amplificación con cebadores OBP513 (sec. con núm. de ident.: 38) y OBP521 (sec. con núm. de ident.: 45). El producto de PCR se purificó con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) .
Se prepararon células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 y se transformaron con el cásete de PCR de PDC1 A-ilvDSm-BUC con un kit Frozen-EZ Yeast Transíormation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se colocaron en placas sobre un medio sintético completo sin uracilo suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes con pdcl inactivado e integración de ilvDSm se analizaron mediante PCR con cebadores OBP511 (sec. con núm. de ident . : 46) y oBP512 (sec. con núm. de ident.: 47) con ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® levadura/bact . (Qiagen, Valencia, CA) . La ausencia del gen de PDC1 del aislado se demostró mediante un resultado negativo de la PCR con cebadores específicos para la secuencia codificante de PDC1, OBP550 (sec. con núm. de ident.: 48) y oBP551 (sec. con núm. de ident.: 49). Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 ñpdcl : : ilvDSm-URA3.
CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm-URA3 se cultivó de la noche a la mañana en YPD y se colocó en placas sobre medio sintético completo que contenía ácido 5-fluoroorótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados de los cuales se eliminó el marcador URA3. La supresión de PDC1, integración de ilvDSm y eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR y secuenciación con cebadores oBP511 (sec. con núm. de ident.: 46) y oBP512 (sec. con núm. de ident . : 47) con ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® levadura/bact . (Qiagen, Valencia, CA) . Se seleccionó el aislado adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm y se designó como BP907.
Supresión de PDC5-integración de sadB El gen PDC5 se eliminó y se reemplazó con la región codificante sadB de Achromobacter xylosoxidans . Un segmento del cásete de PCR para la supresión de PDC5-integración de sadB se clonó primero en el plásmido pUC19-URA3 CS . pUC19-URA3MCS está basado en pUC19 y contiene la secuencia del gen ÜRA3 de Saccaromyces cerevisiae ubicado dentro de un sitio de clonación múltiple (MCS, por sus siglas en inglés) . pUC19 contiene el replicón de pMBl y un gen que codifica la beta-lactamasa para la replicación y selección en Escherichia coli. Adicionalmente a la secuencia codificante para URA3 se incluyeron las secuencias en dirección 5' y en dirección 3' de este gen para la expresión del gen URA3 en levadura. El vector puede usarse para propósitos de clonación y como un vector de integración de levadura.
El ADN que abarcaba la región codificante URA3 junto con 250 bp en dirección 5' y 150 bp en dirección 3' de la región codificante URA3 del ADN genómico de CEN.PK 113-7D de Saccaromyces cerevisiae se amplificó con cebadores oBP438 (sec. con núm. de ident.: 12) que contenían sitios de restricción BamHI, AscI, Pmel y Fsel y oBP439 (sec. con núm. de ident.: 13) que contenían sitios de restricción Xbal,- Pací y Notl con la mezcla Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) . El ADN genómico se preparó con un kit Gentra® Puregene® levadura/bact (Qiagen, Valencia, CA) . El producto de PCR y pUC19 (sec. con núm. de ident.: 71) se ligaron con ADN ligasa de T4 después de la digestión con BamHI y Xbal para crear el vector pUC19-URA3MCS. El vector se confirmó mediante PCR y secuenciación con cebadores oBP264 (sec. con núm. de ident.: 10) y oBP265 (sec. con núm. de ident. : 11) .
La secuencia codificante de sadB y el fragmento B de PDC5 se clonaron en pUC19-URA3MCS para crear la porción sadB-BU del cásete de PCR de PDC5 A-sadB-BUC. La secuencia codificante de sadB se amplificó con pLH468-sadB (sec. con núm. de ident.: 67) como plantilla con el cebador oBP530 (sec. con núm. de ident.: 50) que contenía un sitio de restricción de AscI y el cebador oBP531 (sec. con núm. de ident.: 51) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento B de PDC5. El fragmento B de PDC5 se amplificó con el cebador oBP532 (sec. con núm. de ident.: 52) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' de sadB y el cebador oBP533 (sec. con núm. de ident.: 53) que contenía un sitio de restricción Pmel. Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento B de sadB-PDC5 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado de los productos de PCR del fragmento B de sadB y PDC5 y la amplificación con los cebadores oBP530 (sec. con núm. de ident.: 50) y ???533 (sec. con núm. de ident.: 53). Se realizó la digestión del producto de PCR resultante con AscI y Pmel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes de pUC19-URA3MCS después de la digestión con las enzimas apropiadas. El plásmido resultante se usó como plantilla para la amplificación de sadB-fragmento B-fragmento U con cebadores oBP536 (sec. con núm. de ident. : 54) y oBP546 (sec. con núm. de ident.: 55) que contenían una cola de 5' con homología al extremo 5' del ¦fragmento C de PDC5. El fragmento C de PDC5 se amplificó con el cebador OBP547 (sec. con núm. de ident.: 56) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' de sadB-fragmento B-fragmento U de PDC5 y el cebador oBP539 (sec. con núm. de ident.: 57). Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El sadB-fragmento B-fragmento U-fragmento C de PDC5 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado de sadB-fragmento B-fragmento U de PDC5 y el fragmento C de PDC5 y la ampli icación con cebadores oBP536 (sec. con núm. de ident.: 54) y OBP539 (sec. con núm. de ident.: 57). El producto de PCR resultante se purificó en un gel de agarosa y, después, se usó un kit de extracción con gel (Qiagen, Valencia, CA) .
El cásete PDC5 A-sadB-BUC (sec. con núm. de ident.: 72) se creó mediante amplificación de sadB-fragmento B-fragmento U-fragmento C de PDC5 con cebadores oBP542 (sec. con núm. de ident.: 58) que contenían una cola de 5' con homología a los 50 nucleótidos ubicados inmediatamente en dirección 5' de la secuencia codificante nativa de PDC5 y oBP539 (sec. con núm. de ident.: 57). El producto de PCR se purificó con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) .
Se prepararon células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm y se transformaron con el cásete de PCR de A-sadB-BUC de PDC5 con un kit Frozen-EZ Yeast Transíormation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se colocaron en placas sobre un medio sintético completo sin uracilo suplementado con etanol al 1 % (sin glucosa) a 30 °C. Los transformantes con pdc5 inactivado e integración de sadB se analizaron mediante PCR con cebadores OBP540 (sec. con núm. de ident.: 59) y 0BP541 (sec. con núm. de ident. : 60) con ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® de levadura/bact (Qiagen, Valencia, CA) . La ausencia del gen PDC5 del aislado se demostró mediante un resultado negativo de la PCR con cebadores específicos para la secuencia codificante de PDC5, oBP552 (sec. con núm. de ident.: 61) y oBP553 (sec. con núm. de ident.: 62). Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5: : sadB-URA3.
CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5 : : sadB-URA3 se cultivó de la noche a la mañana en YPE (etanol al 1 %) y se colocó en placas sobre medio sintético completo suplementado con etanol (sin glucosa) y que contenia ácido 5-fluoroorótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados de los cuales se eliminó el marcador URA3. La supresión de PDC5, integración de sadB y eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR con cebadores oBP540 (sec. con núm. de ident. : 59) y OBP541 (sec. con núm. de ident . : 60) con ADN genómico preparado con un kit Gentra® Puregene® de levadura/bact (Qiagen, Valencia, CA) . Se seleccionó el aislado adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5::sadB y se designó como BP913.
Supresión de GPD2 Para suprimir la región codificante del GPD2 endógeno se amplificó un cásete gpd2 : : loxP-URA3-loxP (sec. con núm. de ident.: 73) por PCR con loxP-URA3-loxP (sec. con núm. de ident.: 68) como ADN plantilla. loxP-URA3-loxP contiene el marcador URA3 de (ATCC núm. 77107) flanqueado por sitios recombinasa loxP. La PCR se realizó con ADN-polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) e cebadores LA512 y LA513 (sec. con núms . de ident.: 8 y 9) . La porción GPD2 de cada cebador se derivó de la región 5' en dirección 5' de la región codificante de GPD2 y de la región 3' en dirección 3' de la región codificante de modo que la integración del marcador 1OXP-URA3-1OXP generó el reemplazo de la región codificante de GPD2. El producto de PCR se transformó en BP913 y los transformantes se seleccionaron sobre un medio sintético completo sin uracilo suplementado con etanol al 1 % (sin glucosa) . Los transformantes se analizaron para verificar la integración correcta mediante PCR con cebadores 0BP582 y AA270 (sec. con núms . de ident . : 63 y 64) .
El marcador URA3 se recicló por transformación con pRS423 : : PGALl-cre (sec. con núm. de ident.: 66) y la colocación en placas sobre medio sintético completo sin histidina suplementado con etanol al 1 % a 30 °C. Los transformantes se dispersaron sobre medio sintético completo suplementado con etanol al 1 ¾ y que contenia ácido 5-fluoroorótico (0.1 %) y se incubaron a 30 °C para seleccionar los aislados de los cuales se eliminó el marcador URA3. Los aislados resistentes a 5-FOA se cultivaron en YPE (etanol al 1 %) para la eliminación del plásmido pRS423 :: PGALl-cre . La supresión y eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR con los cebadores oBP582 (sec. con núm. de ident. : 63) y oBP591 (sec. con núm. de ident.: 65). Se seleccionó el aislado adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5::sadB Agpd2 : : loxP y se designó como PNY1503 (BP1064) . 113 BP1064 se transformó con plásmidos pYZ090 (sec. con núra. de ident . : 1) y pLH468 (sec. con núm. de ident.: 2) para crear la cepa NGCI-070 (BP1083; PNY1504).
Además, si bien anteriormente se han descrito diversas modalidades de la presente invención, se debería comprender que se han presentado solamente como ejemplos, sin ser limitantes. Resultará evidente para las personas con experiencia en la técnica pertinente que pueden hacerse varios cambios en la forma y detalles de esta sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por lo tanto, la amplitud y el alcance de la presente invención no deberla estar limitado por ninquna de las modalidades ilustrativas descritas anteriormente, sino que debería definirse solamente de conformidad con las reivindicaciones y sus equivalentes.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta descripción son indicativas del nivel de conocimiento del experto en la técnica a la que pertenece esta invención y se incorporan en la presente descripción como referencia para todos los propósitos como si se indicara específica e individualmente que cada publicación, patente o solicitud de patente individual se incorpora como referencia.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no limitantes ilustrarán adicionalmente la invención. Debería entenderse que, si bien en los siguientes ejemplos se usa maíz como materia prima, pueden usarse otras fuentes de biomasa para materia prima sin apartarse de la presente invención.
Como se usan en la presente descripción, las abreviaturas incluidas a continuación tienen el siguiente significado: "g" significa gramo (s), "kg" significa kilogramo (s) , "L" significa litro (s), "mi" significa mililitro (s) , "µ? ' significa microlitro (s) , "ml/1" significa mililitro (s) por litro, "ml/min" significa mililitro (s) por min, "DI" significa desionizada, "uM" significa micrómetro (s) , "nm" significa nanómetro (s) , "p/v" significa peso/volumen, "OD" significa densidad óptica, "OD60o" significa densidad óptica a una longitud de onda de 600 n , "dcw" significa peso de la célula seca, "rpm" significa revoluciones por minuto, "°C" significa grado (s) Celsius, "°C/min" significa grados Celsius por minuto, "slpm" significa litro (s) estándar por minuto, "ppm" significa parte por millón, "pdc" significa enzima piruvato decarboxilasa seguida por el número de la enzima.
Ejemplo 1 Preparación de pasta de maíz Se preparó aproximadamente 100 kg de pasta de maíz licuada en tres lotes equivalentes con un reactor de resina de 30 1 con camisa de vidrio. El reactor se configuró con agitación mecánica, control de temperatura y control del pH. Para los tres lotes se usó el siguiente protocolo: (a) se mezcla el maíz triturado con agua corriente (30 % en peso de maíz sobre una base seca) , (b) se calienta la suspensión hasta 55 °C mientras se agita, (c) se ajusta el pH de la suspensión hasta 5.8 con NaOH o H2SO4, (d) se añade alfa-amilasa (0.02 % en peso sobre una base de maíz seco), (e) se calienta la suspensión hasta 85 °C, (f) se ajusta el pH hasta 5.8, (g) se mantiene la suspensión a 85 °C por 2 h mientras el pH se mantiene a 5.8 y (h) se enfria la suspensión hasta 25 °C.
Se usó maíz amarillo de grano entero de Pioneer (3335) . Se molió en un molino triturador con un tamiz de 1 mm. Según las mediciones, el contenido de humedad del maíz triturado fue de 12 % en peso y el contenido de almidón del maíz triturado fue de 71.4 % en peso sobre una base de maíz seco. Se usó la enzima alfa-amilasa Liquozyme® SC DS disponible de Novozymes ( Franklinton, NC) . Las cantidades totales de los ingredientes usados para los tres lotes combinados fueron: 33.9 kg de maíz triturado (12 % de humedad), 65.4 kg de agua corriente y 0.006 kg de Liquozyme® SC DS . Se añadió un total de 0.297 kg de NaOH (17 % en peso) para controlar el pH. No fue necesario usar H2SO4. La cantidad total de pasta de maíz licuada recuperada de los tres lotes de 30 1 fue de 99.4 kg.
Ejemplo 2 Eliminación de sólidos Los sólidos se eliminaron de la pasta producida en el Ejemplo 1 por medio de centrifugación en una centrifuga de piso grande que contenia seis botellas de 1 1. Se centrifugó 73.4 kg de pasta a 8000 rpm por 20 min a 25 °C para producir 44.4 kg de centrado y 26.9 kg de torta húmeda. Se determinó que el centrado contenia <1 % en peso de sólidos suspendidos y que la torta húmeda contenia aproximadamente 18 % en peso de sólidos suspendidos. Esto implica que la pasta licuada original contenia aproximadamente 7 % en peso de sólidos suspendidos. Esto concuerda con la carga de maíz y contenido de almidón del maiz usado si se asume que la mayor parte del almidón estaba licuada. Si todo el almidón estaba licuado, los 44.4 kg de centrado recuperados directamente de la centrifuga deberían haber contenido aproximadamente 23 % en peso de oligosacáridos disueltos (almidón licuado) . Se añadió aproximadamente 0.6 kg de i-BuOH en 35.4 kg de centrado para preservarlo. Los 36.0 kg de centrado resultantes que contenían 1.6 % en peso de i-BuOH se usaron como solución matriz.
Ejemplo 3 Efecto de los sólidos no disueltos en la velocidad de transferencia de masa El siguiente experimento se realizó para medir el efecto de los sólidos no disueltos en la velocidad de transferencia de masa de i-BuOH de una fase acuosa que simula la composición de un caldo de fermentación derivado de pasta de maíz que está aproximadamente en la mitad de una fermentación y sacarificación simultáneas (SSF, por sus siglas en inglés) (es decir, alrededor de 50 % de conversión de los oligosacáridos) para imitar la composición promedio de la fase líquida para un lote de SSF. El centrado del Ejemplo 2 imita la composición de fase líquida en el inicio de la SSF. Por lo tanto, una porción de esta se diluyó con una cantidad igual de H2O sobre una base de masa para generar el centrado que imita el SSF a aproximadamente 50 % de conversión. Se añadió más i-BuOH para que la concentración final de i-BuOH en el centrado diluido sea de 3.0 % en peso (aprox. 30 g/1) .
El centrado diluido se preparó de la siguiente manera: se mezcló 18 kg de la solución matriz de centrado del Ejemplo 2 que contenía 1.6 % en peso de i-BuOH con 18 kg de agua corriente y se añadió 0.82 kg de i-BuOH. Los 36.8 kg de solución de centrado diluido resultante consistían en aproximadamente 11 % en peso de oligosacáridos y aproximadamente 30 g/1 de i-BuOH. Esta solución imita la fase líquida de una fermentación de pasta de maíz (SSF) a una conversión de aproximadamente 50 % de los oligosacáridos y un título acuoso de 30 g/1 de i-BuOH.
Ejemplo 4 Efecto de la eliminación de los sólidos no disueltos en la transferencia de masa Se realizaron pruebas de transferencia de masa con el uso de la solución obtenida en el Ejemplo 3 como la fase acuosa para imitar el rendimiento de la transferencia de masa en un caldo derivado de pasta de maiz licuada después de que se elimina la mayor parte de los sólidos no disueltos. Las pruebas de transferencia de masa se realizaron para medir el efecto de los sólidos no disueltos en el coeficiente de transferencia de masa volumétrica general (kLa) para la transferencia de i-BuOH de un caldo simulado derivado de pasta de maiz licuada a una dispersión de gotitas de disolvente (extractante) que subían a través del caldo simulado. Las correlaciones de kLa con el diseño clave de los parámetros operativos pueden usarse para extrapolar operaciones de transferencia de masa. Los ejemplos de parámetros que deberían mantenerse constantes para generar correlaciones de kLa a partir de los datos a escalas menores útiles para extrapolación son las propiedades físicas de ambas fases y los parámetros de diseño que determinan el tamaño de la gotita (por ejemplo, diámetro de la tobera, velocidad de la fase que se dispersará a través de la tobera) .
Se usó una columna de vidrio con camisa de 15.2 cm (6 pulgadas) de diámetro y 2.1 metros (7 pies) de alto para medir la kLa para la transferencia de i-BuOH desde una solución acuosa de oligosacáridos (derivados de pasta de maíz licuada) , con y sin sólidos de pasta suspendidos, hasta una dispersión de gotitas de alcohol oleílico (OA, por sus siglas en inglés) que suben a través del caldo simulado. Se añadió i-BuOH en la fase acuosa para producir una concentración inicial de i-BuOH de aproximadamente 30 g/1. Una cierta cantidad de la fase acuosa (típicamente, aproximadamente 35 kg) que contenía aproximadamente 11 % en peso de oligosacáridos y aproximadamente 30 g/1 de i-BuOH se cargó en la columna y la columna se calentó hasta 30 °C por medio del flujo de H20 caliente a través de la camisa. Durante la prueba no hubo flujo de fase acuosa en o fuera de la columna.
Se depuró alcohol oleílico nuevo (grado 80/85 % de Cognis) en el fondo de la columna a través de una sola tobera para crear una dispersión de gotitas de extractante que fluyeron hacia arriba a través de la fase acuosa. Después de alcanzar la parte superior de la fase acuosa, las gotas de extractante formaron una fase orgánica separada que después se desbordó de la parte superior de la columna y se recolectó en un receptor. Típicamente, para una sola prueba fluyó de 11.4 a 18.9 L (3 a 5 galones) de OA a través de la columna.
Las muestras de la fase acuosa se extrajeron de la columna en varios momentos de la prueba y se recolectó una muestra compuesta del OA "rico" total del desborde al final de la prueba. Todas las muestras se analizaron para determinar el i-BuOH con el uso de un CG HP-6890. El perfil de concentración para i-BuOH en la fase acuosa (es decir, concentración de i-BuOH contra tiempo) se usó para calcular el kLa en el conjunto de condiciones operativas proporcionadas. La muestra compuesta final del OA "rico" total recolectado durante la prueba se usó para controlar el balance de la masa para i-BuOH.
El tamaño de la tobera y la velocidad de la tobera (velocidad promedio de OA a través de la tobera de alimentación) se modificaron para observar sus efectos en la kLa. Se realizó una serie de pruebas con el uso de una solución acuosa de oligosacáridos (centrado diluido obtenido de la pasta de maiz licuada) con los sólidos de la pasta eliminados. Se realizó una serie similar de pruebas con el uso de la misma solución acuosa de oligosacáridos después de añadir nuevamente los sólidos de la pasta para simular pasta de maiz licuada (que incluye los sólidos no disueltos) en la mitad de la SSF. Debe mencionarse que con algunas condiciones operativas (por ejemplo, mayores índices de flujo de OA) se obtuvo una separación de fases deficiente en la parte superior de la columna lo que dificultó la obtención de una muestra compuesta representativa del OA "rico" total recolectado durante la prueba. Además, debe mencionarse que con algunas condiciones operativas las muestras de la fase acuosa contenían una cantidad significativa de fase orgánica. Se usaron técnicas especiales de manejo y preparación de muestras para obtener una muestra de la fase acuosa lo más representativa posible de la fase acuosa en la columna en el momento en que se extrajo la muestra.
Se determinó que la fase acuosa en la columna estaba "bien mezclada" para todos propósito práctico, ya que la concentración de i-BuOH no varió demasiado a lo largo de la longitud de la columna en un punto de tiempo determinado. Si se considera que la fase de gotitas de disolvente está, además, bien mezclada, el valor de la transferencia de masa total de i-BuOH a partir de la fase acuosa a la fase disolvente en la columna puede calcularse por medio de la siguiente ecuación: c B,disolvente (1) en donde, rB = masa total de i-BuOH transferida de la fase acuosa a la fase disolvente por unidad de tiempo por unidad de volumen de la fase acuosa, gramos de i-BuOH/litro de fase acuosa/h o g/l/h. kLa = coeficiente de transferencia de masa volumétrica total que describe la transferencia de masa de i-BuOH de la fase acuosa a la fase disolvente, h .
CB, caído = concentración promedio de i-BuOH en la fase (acuosa) de caldo simulada durante toda la prueba, gramos de i-BuOH/litro de fase acuosa o g/1.
B, disolvente = concentración promedio de i-BuOH en la fase disolvente durante toda la prueba, gramos de i-BuOH/litro de fase disolvente o g/1.
KB = coeficiente de distribución de equilibrio promedio para i-BuOH entre el disolvente y la fase acuosa (gramos de i-BuOH/litro de fase disolvente) / (gramos de i-BuOH/litro de fase acuosa) .
Los parámetros rB, CB, caído y CB, disolvente se calcularon para cada prueba a partir de los datos de concentración obtenidos de las muestras de las fases acuosa y disolvente. El parámetro KB se midió independientemente por el mezclado del centrado acuoso a partir de pasta de maíz licuada, OA e i-BuOH y el sistema se mezcló con fuerza hasta que las dos fases líquidas estuvieran en equilibrio. La concentración de i-BuOH se midió en ambas fases para determinar la KB. Después de determinar la rB, CB, caídos CB, disolvente y ¾ para una prueba determinada, la kLa podría calcularse mediante el reordenamiento de la ecuación (1) : Se realizaron pruebas de transferencia de masa con dos toberas de tamaño diferente a velocidades de tobera en el intervalo de 1.52 metros/s (5 pies/s) a 6.40 metros/s (21 pies/s) con el uso del centrado diluido (sólidos eliminados) como la fase acuosa. Se realizaron tres pruebas con una tobera con un diámetro interno (ID) de 0.76 mm y tres pruebas con una tobera con un diámetro interno de 2.03 mm . Todas las pruebas se realizaron a 30 °C en la columna de 15.2 cm (6 pulgadas) de diámetro descrita anteriormente con el uso de OA como el disolvente. La medición del coeficiente de distribución de equilibrio para i-BuOH entre el OA y el centrado diluido obtenido a partir de pasta de maiz licuada por la eliminación de los sólidos determinó un valor de aproximadamente 5. Los resultados de las pruebas de transferencia de masa con el uso de centrado diluido (con los sólidos eliminados) se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1 5 10 Ident . de la tobera, itim: 0.76 0.76 0.76 2.03 2.03 2.03 Velocidad de la tobera, 4.7 11.3 20.6 4.7 10.1 17.4 pies/s 5 RESULTADOS DE LA TRANSFERENCIA DE MASA: [i-B] inicial en la fase 28.2 27.0 29.1 31.3 38.7 30.1 acuosa, g/1: [i-B] final en la fase 25.7 14.8 14.7 24.8 11.5 5.4 10 acuosa, g/1: OA rico recolectado, kg: 4.05 7.47 6.03 7.37 12.82 14.0 [i-B] en OA recolectado, 2.22 5.72 8.17 2.83 5.93 5.04 % en peso: Tiempo de la prueba, min: 122 94 41.5 31.0 25.3 16.0 Velocidad general de T.M. 1.23 7.81 20.76 12.62 64.52 92.52 del i-BuOH, g/l/h kLa, ??(~1) 0.05 0.70 2.58 0.54 4.29 10.06 (kLa/Us) 0.12 0.69 1.40 0.18 0.67 0.91 Ejemplo 5 Efecto de los sólidos no disueltos en la transferencia de masa Se sintetizó una fase acuosa que simula un caldo de fermentación de pasta de maíz licuada (que contiene sólidos no disueltos) en la mitad de la SSF mediante la adición de una parte de la torta húmeda del Ejemplo 2 (que se obtuvo inicialmente a partir de la eliminación de los sólidos de la pasta de maíz licuada) al centrado diluido (que se usó para las pruebas de transferencia de masa descritas anteriormente en el Ejemplo 4) . Además, se añadió una parte de agua para diluir la fase líquida mantenida en la torta húmeda porque este líquido tiene la misma composición que el centrado concentrado. Se mezcló 17.8 kg de sobrenadante diluido, 13.0 kg de torta húmeda (contiene ~18 % en peso de sólidos de pasta no disueltos) , 5.0 kg de H20 y 0.83 kg de i-BuOH entre sí y se obtuvo 36.6 kg de una suspensión que contenía aproximadamente 6.3 % en peso de sólidos no disueltos y una fase líquida que consistía en aproximadamente 13 % en peso de almidón licuado y aproximadamente 2.4 % en peso de i-BuOH (el resto fue H20) . La suspensión imita la composición de un caldo de fermentación en la mitad de la SSF de maíz a i-BuOH a una carga de maíz de aproximadamente 30 % porque el nivel de sólidos no disueltos y oligosacáridos encontrados en estos tipos de caldos es de aproximadamente 6-8 % en peso y 10-12 % en peso, respectivamente.
Se realizaron pruebas de transferencia de masa con dos toberas de diferente tamaño a velocidades de tobera en el intervalo de 1.52 metros/s (5 pies/s) a 6.71 metros/s (22 pies/s) con el uso de la suspensión del centrado diluido y sólidos de pasta no disueltos como la fase acuosa. Se realizaron tres pruebas con una tobera que tiene un diámetro interno de 0.76 mm y tres pruebas con una tobera que tiene un diámetro interno de 2.03 mm . Todas las pruebas se realizaron a 30 °C en la columna de 15.2 cm (6 pulgadas) de diámetro descrita anteriormente con el uso de OA como el disolvente. Los resultados de las pruebas de transferencia de masa con el uso de la suspensión de centrado diluido y sólidos de pasta no disueltos se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2 ELN Ref . : D101488- 52 53 54 49 50 51 CONDICIONES DE PRUEBA DE LA TRANSFERENCIA DE MASA Centrado Centrado Centrado Centrado Centrado Centrado diluido de diluido de diluido de diluido de diluido de diluido de la pasta la pasta la pasta la pasta la pasta la pasta liquida, liquida, liquida, liquida, liquida, liquida, +6.3 % en +6.3 % en +6.3 % en +6.3 % en +6.3 % en +6.3 % en peso de peso de peso de peso de peso de peso de sólidos sólidos sólidos sólidos sólidos sólidos Fase acuosa eliminados eliminados eliminados eliminados eliminados eliminados Volumen de la fase 35.5 35.5 32.5 31.5 30 31.6 acuosa, L: Velocidad de alimentación 40 64 157 249 549 853 del disolvente, g/min: Liq. superficial 0.51 0.81 1.99 3.16 6.97 10.83 Velocidad (Us) , pies/h: Ident . de la tobera, rana: 0.76 0.76 0.76 2.03 2.03 2.03 5 Velocidad de la tobera, 5.7 9.1 22.3 4.9 10.9 17.0 pies/s [i-B] inicial en la fase 28.1 26.0 26.2 27.6 26.3 36.8 acuosa, g/1: 10 [i-B] final en la fase 26.3 23.8 14.0 24.6 13.8 16.1 acuosa, g/1: OA rico recolectado, kg: 6.02 5.75 10.23 15.05 16.58 13.22 [i-B] en OA 1.05 1.35 3.86 0.68 2.30 5.00 recolectado, % en peso: 15 Tiempo de la prueba, min: 150 90 65 60 30 15.5 Velocidad general de T.M. 0.71 1.46 11.2 3.0 25.0 80.0 . del i-BuOH, g/l/h 0.03 0 06 0.83 0.12 • 1 55 4.45 kLa, hA(-l) 0.06 0 07 0.42 0 04 0 22 0.41 (kLa/Us) 5 La Figura 7 ilustra el efecto de la presencia de sólidos de pasta de maíz no disueltos en el coeficiente de transferencia de masa volumétrica total, kLa, para la transferencia de i-BuOH a partir de una solución acuosa de almidón de maíz licuado (es decir, oligosacáridos) a una dispersión de gotitas de alcohol oleilico que fluyen hacia arriba a través de una columna de burbujas. El OA se alimentó a la columna a través de una tobera de 2.03 mm de diámetro interno. Se descubrió que la relación entre el kLa para un sistema del cual se eliminaron los sólidos y un kLa para un sistema del cual no se eliminaron los sólidos es de 2 a 5 dependiendo de la velocidad de la tobera para una tobera de 2.03 mm.
La Figura 8 ilustra el efecto de la presencia de sólidos de pasta de maiz no disueltos en el coeficiente de transferencia de masa volumétrica total, kLá, para la transferencia de i-BuOH a partir de una solución acuosa de almidón de maiz licuado (es decir, oligosacáridos) a una dispersión de gotitas de alcohol oleilico que fluyen hacia arriba a través de una columna de burbujas. El OA se alimentó a la columna a través de una tobera de 0.76 mm de diámetro interno. Se descubrió que la relación entre el kLa para un sistema del cual se eliminaron los sólidos y un kLa para un sistema del cual no se eliminaron los sólidos es de 2 a 4 dependiendo de la velocidad de la tobera para una tobera de 0.76 mm.
Ejemplo 6 Efecto de la eliminación de sólidos no disueltos en la separación de fases entre una fase acuosa y una fase disolvente Este ejemplo ilustra una mejor separación dé fases entre una solución acuosa de oligosacáridos derivados de pasta de maíz licuada de la cual se eliminaron los sólidos no disueltos y una fase disolvente en comparación con una solución acuosa de oligosacáridos derivada de pasta de maíz licuada de la cual no se eliminaron sólidos no disueltos y el mismo disolvente. Ambos sistemas contenían i-BuOH. La separación adecuada de la fase disolvente de la fase acuosa es importante para que la extracción líquido-líquido sea un método de separación viable para la eliminación del producto in situ (ISPR) .
Se preparó aproximadamente 900 g de pasta de maíz licuada en un reactor de resina de 1 1 con camisa de vidrio. El reactor se configuró con agitación mecánica, control de temperatura y control del pH. Se usó el siguiente protocolo: se mezcló el maíz triturado con agua corriente (26 % en peso de maíz sobre una base seca) , se calentó la suspensión hasta 55 °C mientras se agitaba, se ajustó el pH hasta 5.8 con NaOH o H2S04, se añadió alfa-amilasa (0.02 % en peso sobre una base de maíz seco) , se continuó el calentamiento hasta 85 °C, se ajustó el pH hasta 5.8, se mantuvo a 85 "C por 2 h mientras se mantenía el pH en 5.8, se enfrió hasta 25 °C. Se usó maíz amarillo de grano entero de Pioneer (3335) . Se molió en un molino triturador con un tamiz de 1 mm. Según las mediciones, el contenido de humedad del maíz triturado fue de 12 % en peso y el contenido de almidón del maíz triturado fue de 71.4 % en peso sobre una base de maíz seco. Se usó la enzima alfa-amilasa Liquozyme® SC DS de Novozymes ( Franklinton, NC) . Los ingredientes se usaron en las siguientes cantidades totales: 265.9 g de maíz triturado (12 % de humedad), 634.3 g de agua corriente y 0.056 g de Liquozyme® SC DS. La cantidad total de pasta de maíz licuada recuperada fue de 883.5 g.
Una parte de la pasta de maíz licuada se usó directamente sin eliminar los sólidos no disueltos para preparar la fase acuosa para las pruebas de separación de fases en presencia de sólidos. Una parte de la pasta de maíz licuada se centrifugó para eliminar la mayor parte de los sólidos no disueltos y se usó para preparar la fase acuosa para las pruebas de separación de fases en ausencia de sólidos .
Los sólidos se eliminaron de la pasta mediante centrifugación en una centrífuga de piso grande. Se centrifugó 583.5 g de pasta a 5000 rpm por 20 min a 35 °C para producir 394.4 g de centrado y 189.0 g de torta húmeda.
Se determinó que el centrado contenia aproximadamente 0.5 % en peso de sólidos suspendidos y que la torta hymeda contenia aproximadamente 20 % en peso de sólidos suspendidos. Esto implica que la pasta licuada original contenia aproximadamente 7 % en peso de sólidos suspendidos. Esto concuerda con la carga de maíz y contenido de almidón del maíz usado si se asume que la mayor parte del almidón estaba licuada. Si todo el almidón estaba licuado, el centrado, recuperado directamente de la centrifuga debería haber contenido aproximadamente 20 % en peso de oligosacáridos disueltos (almidón licuado) sobre una base libre de sólidos.
La prueba de separación de fases se realizo con el fin de medir el efecto de los sólidos no disueltos en el grado de separación de fases entre una fase disolvente y una fase acuosa que simula un caldo que se deriva de la pasta licuada de maíz. La fase líquida acuosa contenía aproximadamente 20 % en peso de oligosacáridos y la fase orgánica contenía alcohol oleílico (OA) en todas las pruebas. Además, se añadió i-BuOH en todas las pruebas para producir aproximadamente 25 g/1 en la fase acuosa cuando las fases estaban en equilibrio. Se realizaron dos pruebas de agitación. La fase acuosa para la primera prueba (con sólidos) se preparó mediante el mezclado de 60.0 g de pasta de maíz licuada con 3.5 g de i-BuOH. La fase acuosa para la segunda prueba (sólidos eliminados) se preparó .mediante el mezclado de 60.0 g de centrado que se obtuvieron de la pasta de maíz licuada por medio de la eliminación de los sólidos con 3.5 g de i-BuOH. Se añadió 15.0 g de alcohol oleílico (grado 80/85 % de Cognis) en cada botella de la prueba de agitación. El OA formó una fase liquida separada en la parte superior de la fase acuosa en ambas botellas y produjo una relación de masa de fases: fase acuosa/fase disolvente de aproximadamente 1/4. Ambas botellas se agitaron vigorosamente por 2 minutos para que las fases acuosa y orgánica entraran en contacto y para que el i-BuOH alcanzara el equilibrio entre las dos fases. Se dejó que las botellas se asentaran por 1 hora. Se tomaron fotografías en diversos momentos (0, 15, 30 y 60 minutos) para observar el efecto de sólidos no disueltos en la separación de fases en sistemas que contienen una fase acuosa derivada de la pasta de maíz licuada, una fase disolvente que contiene OA e i-BuOH. El momento cero (0) corresponde al momento inmediatamente posterior al punto de tiempo , en que se completa el periodo de agitación de dos minutos.
El grado de separación entre la fase orgánica (disolvente) y la fase acuosa como una función del tiempo para el sistema con sólidos (de la pasta de maiz licuada) y el sistema del cual se eliminaron los sólidos (centrado líquido de la pasta de maíz licuada) parecían ser aproximadamente iguales en ambos sistemas en cualquier punto de tiempo. La fase orgánica estaba un poco más oscura y turbia y la interfase era un poco menos distintiva (capa de "emulsión" más espesa alrededor de la interfase) cuando había sólidos. Sin embargo, para una fermentación extractiva en la cual se usa continuamente el disolvente, la composición de la parte superior de la fase orgánica es importante para el proceso en dirección 3' de la fermentación extractiva, en donde la siguiente etapa es una destilación.
Puede ser favorable minimizar la cantidad de microorganismos en la parte superior de la fase orgánica porque los microorganismos se desactivarán térmicamente en la columna de destilación. Puede ser favorable minimizar la cantidad de disolventes no disueltos en la parte superior de la fase orgánica porque podrían tapar la columna de destilación, obstruir el reevaporador, producir una separación de fases deficiente en el decantador de disolvente/agua ubicado en la base de la columna o cualquier combinación de las cuestiones mencionadas anteriormente. Puede ser favorable minimizar la cantidad de agua de fase en la parte superior de la fase orgánica. El agua de fase es agua que existe como una fase acuosa separada. Las cantidades adicionales de fase acuosa incrementarán los requerimientos de carga y energía en la columna de destilación. Se eliminaron muestras de diez mililitros de la parte superior de las capas orgánicas de las botellas "con sólidos" y "sólidos eliminados" y ambas muestras se centrifugaron para revelar y comparar la composición de las fases orgánicas en las botellas "con sólidos" y "sólidos eliminados" después de un tiempo de asentamiento de 60 minutos. Los resultados muestran que las "fases orgánicas" al final de ambas pruebas de agitación contenían una o varias fases no deseadas (ambas fases orgánicas están turbias) . Sin embargo, los resultados muestran, además, que la capa superior de la prueba de separación de fases con centrado, de la cual se eliminaron los sólidos, prácticamente no contenía sólidos no disueltos. Por otra parte, se observan claramente sólidos no disueltos en el fondo de la muestra de 10 mi extraída de la parte superior de la fase orgánica de la prueba con pasta. Se calculó que 3 % de la muestra extraída de la parte superior de la capa orgánica fueron sólidos de pasta. Si la fase rica en disolvente que sale del fermentador de un proceso de fermentación extractiva contiene 3 % de sólidos no disueltos se puede producir uno o más de los siguientes problemas: pérdida de una cantidad significativa de microorganismos, obstrucción del reevaporador de columna de disolvente, taponamiento de la columna de disolvente. Los resultados demuestran, además, que la capa superior de la prueba de separación de fases con centrado contenía menos agua de fase. La Tabla 3 muestra un cálculo de la cantidad relativa de fases que se dispersaron a través de las capas "orgánicas" superiores en ambas botellas de prueba de agitación después de un tiempo de asentamiento de 60 minutos.
Tabla 3. Composición aproximada de la capa orgánica (superior) de las pruebas de agitación Después de 60 minutos Este ejemplo muestra que la eliminación de la mayor parte de los sólidos no disueltos de la pasta de maíz licuada produce una mejor separación de fases después de que la fase líquida acuosa obtenida de la pasta entra en contacto con un disolvente, tal como alcohol oleílico. Este ejemplo muestra que la fase superior obtenida después de la separación de fases contendrá una cantidad de sólidos no disueltos significativamente menor si los sólidos se eliminan primero antes del contacto de la parte líquida de la pasta con un disolvente orgánico. Esto demuestra las ventajas de minimizar el contenido de sólidos no disueltos de la pasta en la capa superior ("orgánica") de la separación de fases para una fermentación extractiva.
Ejemplo 7 Efecto de la eliminación de sólidos no disueltos en la separación de fases entre una fase acuosa y una fase disolvente De manera similar al Ejemplo 6, este ejemplo ilustra una mejor separación de fases entre una solución acuosa de oligosacáridos derivados de pasta de maiz licuada de la cual se han eliminado los sólidos no disueltos y una fase disolvente en comparación con una solución acuosa de oligosacáridos derivados de pasta de maíz licuada de la cual no se eliminaron sólidos no disueltos y el mismo disolvente. Ambos sistemas contenían i-BuOH. La separación adecuada de la fase disolvente de la fase acuosa es importante para que la extracción líquido-líquido sea un método de separación viable para la eliminación del producto in-situ (ISPR).
En este ejemplo se usaron las mismas mezclas preparadas para el Ejemplo 6. La única diferencia fue que las muestras se dejaron asentar por varios días después de completar la preparación de la muestra tal como se describe en el Ejemplo 6 antes de repetir la prueba de agitación de separación de fases descrita en este ejemplo. La muestra marcada "con * sólidos" consistía en pasta de maíz licuada, i-BuOH y alcohol oleílico. La muestra marcada "sólidos eliminados" consistía en centrado producido por medio de la eliminación de la mayor parte de los sólidos no disueltos de la pasta de maíz licuada, i-BuOH y alcohol oleilico. La pasta licuada contenia aproximadamente 7 % en peso de sólidos suspendidos y el centrado obtenido a partir de la pasta contenia aproximadamente 0.5 % en peso de sólidos suspendidos. Si todo el almidón del maíz triturado estaba licuado, la fase liquida en la pasta licuada y el centrado producido a partir de la pasta deberían haber contenido aproximadamente 20 % en peso de oligosacáridos disueltos (almidón licuado) sobre una base libre de sólidos. Ambas muestras contenían alcohol oleilico en una cantidad adecuada para producir una relación de masa de fases: fase disol ente/fase acuosa de aproximadamente 1/4. Además, se añadió i-BuOH en todas las pruebas para producir aproximadamente 25 g/1 en la fase acuosa cuando las fases estaban en equilibrio.
El objetivo de la prueba de separación de fases era medir el efecto de los sólidos no disueltos en el grado de separación de fases entre una fase disolvente (que contenía OA) y una fase acuosa derivada de la pasta de maíz licuada (con y sin sólidos) después del añejamiento de las mezclas de fases múltiples a temperatura' ambiente por varios días para imitar el cambio potencial en las propiedades del sistema a través de una fermentación extractiva. Se realizaron dos pruebas de agitación. Ambas botellas se agitaron vigorosamente por 2 minutos para que las fases acuosa y orgánica entraran en contacto. Se dejó que las botellas se asentaran por 1 hora. Se tomaron fotografías en diversos momentos (0, 2, 5, 10, 20 y 60 minutos) para observar el efecto de los sólidos no disueltos en la separación de fases en esos sistemas que se habían añejado por varios días. El momento cero (0) corresponde al momento inmediatamente posterior al punto de tiempo en que las botellas se colocaron en el banco.
La separación de fases se inició en la muestra de la cual se eliminaron los sólidos después de dos minutos. Se dedujo que se había producido una separación de fases casi completa en la muestra de la cual se habían eliminado los sólidos después de solamente 5-10 minutos en base al hecho de que la fase orgánica ocupaba aproximadamente 25 % del volumen total de la mezcla de dos fases. Un indicio de que se produjo la separación completa sería el caso en el cual la fase orgánica ocupa aproximadamente 20 % del volumen total, ya que este valor corresponde a la relación inicial de fases. No se produjo una separación de fases aparente en la muestra de la cual los sólidos no se eliminaron aun después de una hora.
Además, la composición de la fase superior se comparó para ambas muestras. La composición de la fase superior afecta el proceso en dirección 3' de la fermentación extractiva en donde la etapa siguiente es una destilación. Es favorable minimizar la cantidad de microorganismos en la parte superior de la fase orgánica porque los microorganismos se desactivarán térmicamente en la columna de destilación. Otro componente para minimizar en la parte superior de la fase orgánica es la cantidad de sólidos no disueltos porque los sólidos podrían tapar la columna de destilación, obstruir el reevaporador, producir una separación de fases deficiente en el decantador de disolvente/agua ubicado en la base de la columna o cualquier combinación de las cuestiones mencionadas anteriormente. Adicionalmente, otro componente para minimizar en la parte superior de la fase orgánica es la cantidad de agua de fase presente como una fase acuosa separada, porque esta cantidad adicional de fase acuosa aumentará el requerimiento de carga y energía en la columna de destilación posterior .
Se eliminaron muestras de diez mililitros de la parte superior de las capas orgánicas de las botellas "con sólidos" y "sólidos eliminados" y ambas muestras se centrifugaron para revelar y comparar la composición de las fases orgánicas en las botellas "con sólidos" y "sólidos eliminados" después de un tiempo de asentamiento de 60 minutos. La composición de la muestra extraída de la parte superior de la muestra "con sólidos" confirma que prácticamente no se produjo una separación de fases en la muestra dentro de los 60 minutos. Específicamente, la relación entre la fase disolvente y la fase acuosa total (líquido acuoso + sólidos suspendidos) en la muestra extraída de la parte superior de la botella de prueba de agitación "con sólidos" es de aproximadamente 1/4 p/p, que es la misma relación usada para preparar la muestra antes de la prueba. Además, la cantidad de sólidos no disueltos en la muestra extraída de la parte superior de la botella de prueba de agitación "con sólidos" es aproximadamente igual a la encontrada en la pasta de maíz licuada que muestra que prácticamente no se asentaron sólidos en esta botella de prueba de agitación dentro de los 60 minutos. Por otra parte, la capa superior de la prueba de separación de fases con centrado ("sólidos eliminados") de la cual se eliminaron los sólidos prácticamente no contenia sólidos no disueltos. Los resultados demuestran, además, que la capa superior de la prueba de separación de fases con centrado contenia menos agua de fase. Esto se indica por medio del hecho de que la relación entre la fase disolvente y la fase acuosa en esa botella de muestra es de aproximadamente 1/1 p/p, lo que muestra que la fase orgánica se enriqueció con disolvente (OA) en la prueba de la cual se eliminaron los sólidos. La Tabla 4 muestra un cálculo de la cantidad relativa de fases que se dispersaron a través de las capas "orgánicas" superiores en ambas botellas de prueba de agitación después de un tiempo de asentamiento de 60 minutos .
Tabla 4 : Composición aproximada de la capa orgánica (superior) de las pruebas de agitación después de 60 minutos Este ejemplo muestra que la eliminación de sólidos no disueltos de la pasta de maíz licuada que contiene i-BuOH, el contacto de esta con una fase disolvente, la espera de varios días para que se asiente y el remezclado de las fases producen una separación de fases mejorada cuando se compara con una muestra de la cual no se eliminaron sólidos no disueltos de la pasta licuada. De hecho, este ejemplo muestra que no se produce prácticamente una separación de fases en la muestra de la cual no se eliminaron sólidos no disueltos aun después de 60 minutos. Este ejemplo muestra que la fase superior obtenida después de la separación de fases contiene una cantidad de sólidos no disueltos significativamente menor si los sólidos se eliminan primero antes del contacto de la parte liquida de la pasta con un disolvente orgánico. Esto es importante porque dos de las especies más importantes que se deberían minimizar en la capa superior ("orgánica") de la separación de fases para una fermentación extractiva son el nivel de microorganismos y el nivel de sólidos no disueltos de la pasta. El ejemplo anterior mostró que la eliminación de sólidos de la pasta de maíz licuada produce una separación de fases mejorada poco después de que la fase acuosa entra en contacto con una fase disolvente. Esto permitiría la viabilidad de la fermentación extractiva en etapas más tempranas de la fermentación. Este ejemplo muestra, además, que la eliminación de sólidos de la pasta de maíz licuada produce una separación de fases mejorada en las muestras añejadas que contienen una fase acuosa (solución de oligosacáridos con sólidos eliminados) que se puso en contacto con una fase disolvente. Esto permitiría, además, la viabilidad de la fermentación extractiva en etapas tardías de la fermentación.
Ejemplo 8 Efecto de la eliminación de sólidos no disueltos en la pérdida de disolvente de extracción de ISPR - centrífuga con pila de discos Este ejemplo demuestra el potencial para reducir las pérdidas de disolvente por medio de DDGS generados por el proceso de fermentación extractiva mediante la eliminación de sólidos no disueltos de la pasta de maíz antes de la fermentación con el uso de una centrifuga con pila de discos semicontinua .
Se preparó aproximadamente 216 kg de pasta de maíz licuada en un reactor de acero inoxidable con camisa. El reactor se configuró con agitación mecánica, control de temperatura y control del pH. Se usó el siguiente protocolo: se mezcló maíz triturado con agua corriente (25 % en peso de maíz sobre una base seca) , se calentó la suspensión hasta 55 °C mientras se agitaba a 400 rpm, se ajustó el pH hasta 5.8 con NaOH o H2S04, se añadió alfa-amilasa (0.02 % en peso sobre una base de maíz seco) , se continuó el calentamiento hasta 85 °C, se ajustó el pH hasta 5.8, se mantuvo a 85 °C por 30 minutos mientras se mantenía el pH a 5.8, se calentó hasta 121 °C con el uso de inyección de vapor activo, se mantuvo a 121 °C por 30 minutos para simular un equipo para cocción por chorro de vapor, se enfrió hasta 85 °C, se ajustó el pH hasta 5.8, se añadió una segunda carga de alfa-amilasa (0.02 % en peso sobre una base de maíz seco), se mantuvo a 85 °C por 60 minutos mientras se mantuvo el pH a 5.8 para completar la licuación. Después, la pasta se enfrió hasta 60 °C y se transfirió al tanque de alimentación de la centrífuga.
Se usó maíz amarillo de grano entero de Pioneer (3335) . Se molió en un molino triturador con un tamiz de 1 mm. Según las mediciones, el contenido de humedad del maíz triturado fue de 12 % en peso y el contenido de almidón del maíz triturado fue de 71.4 % en peso sobre una base de maíz seco. Se usó la enzima alfa-amilasa Liquozyme® SC DS de Novozymes ( Franklinton, NC) . Los ingredientes se usaron en las siguientes cantidades: 61.8 kg de maíz triturado (12 % de humedad), 147.3 kg de agua corriente, una solución de 0.0109 kg de Liquozyme® SC DS en 1 kg de agua para la primera carga de alfa-amilasa, otra solución de 0.0109 kg de Liquozyme® SC DS en 1 kg de agua para la segunda carga de alfa-amilasa (después de la etapa de cocción) . Se añadió aproximadamente 5 kg de H20 en el lote a través del condensado de vapor durante la etapa de cocción. Se añadió un total de 0.25 kg de NaOH (12.5 % en peso) y 0.12 kg de H2S04 (12.5 % en peso) durante la prueba para controlar el pH . La cantidad total de pasta de maíz licuada recuperada fue de 216 kg.
La composición de la suspensión de pasta de maíz licuada final se calculó en aproximadamente 7 % en peso de sólidos no disueltos y 93 % en peso de liquido. La fase liquida contenia aproximadamente 19 % en peso (190 g/1) de almidón licuado (oligosacáridos solubles). La reologia de la pasta es importante con respecto a la capacidad para separar la suspensión en sus componentes. Se determinó que la fase liquida en la pasta era un fluido Newtoniano con una viscosidad de aproximadamente 5.5 cP a 30 °C. Se determinó que la suspensión de la pasta era un fluido visgoelástico con una viscosidad de compresión de aproximadamente 10 a 70 cP a 85 °C dependiendo del índice de esfuerzo cortante.
Se centrifugó 209 kg (190 L) de la pasta licuada con una centrífuga de tazón dividido con pila de discos Alfa Laval. La centrífuga se usó en modo semicontinuo con alimentación continua, salida de centrado continua y descarga discontinua de la torta húmeda. La pasta de maíz licuada se alimentó continuamente a una velocidad de 1 1 /minuto, el centrado clarificado se eliminó continuamente y la torta húmeda se descargó periódicamente cada 4 minutos. Para determinar un intervalo de descarga apropiado para los sólidos de la pila de discos se centrifugó una muestra de la pasta que se alimentaría a la pila de discos en una centrífuga de alta velocidad para laboratorio. La pasta (48.5 g) se centrifugó a 11,000 rpm (aproximadamente 21,000 g's) por aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente. Se recuperó el centrado clarificado (36.1 g) y 12.4 g de gránulo (torta húmeda). Se determinó que el centrado clarificado contenía aproximadamente 0.3 % en peso de sólidos no disueltos y que el gránulo (torta húmeda) contenía aproximadamente 27 % en peso de sólidos no disueltos. En base a estos datos se eligió un intervalo de descarga de 4 minutos para la operación de la centrífuga con pila de discos.
La centrífuga con pila de discos se usó a 9000 rpm (6100 g's) con una velocidad de alimentación de la pasta de maíz licuada de 1 1/min y aproximadamente 60 °C. La pasta (209 kg) se separó en 155 kg de centrado clarificado y 55 kg de torta húmeda. La separación, definida como (cantidad de centrado) / (cantidad de pasta alimentada) , obtenida con la pila de discos semicontinua fue similar a la separación obtenida con la centrífuga discontinua. La separación para la centrífuga semidiscontinua con pila de discos usada a 6100 g's, velocidad de alimentación de 1 1/min y un intervalo de descarga de 4 minutos fue (155 kg/209 kg) = 74 % y la separación para la centrífuga discontinua de laboratorio usada a 21,000 g's por 10 minutos fue (36.1 g/48.5 g) = 74 %.
Una muestra de 45 mi del centrado clarificado recuperado de la centrífuga con pila de discos se centrifugó en una centrífuga de laboratorio a 21,000 g's por 10 minutos para determinar el nivel de sólidos suspendidos en el centrado. Se recuperaron aproximadamente 0.15-0.3 g de sólidos no disueltos de los 45 mi del centrado. Esto corresponde a 0.3-0.7 % en peso de sólidos no disueltos en el centrado que es una reducción de aproximadamente diez veces en los sólidos no disueltos de la pasta alimentada a la centrífuga. Es razonable asumir que las pérdidas de disolvente de extracción de ISPR a través de los DDGS podrían reducirse en aproximadamente un orden de magnitud si el nivel de sólidos no disueltos presentes en la fermentación extractiva se reduce en un orden de magnitud con el uso de un dispositivo o combinación de dispositivos de separación de sólido/liquido para eliminar sólidos suspendidos de la pasta de maíz antes de la fermentación. La minimización de las pérdidas de disolvente a través de DDGS es un factor importante en la economía y la calidad de los DDGS para un proceso de fermentación extractiva.
Ejemplo 9 Efecto de la eliminación de sólidos no disueltos en la pérdida de disolvente de extracción de ISPR - Prueba de centrifugado en botella Este ejemplo demuestra el potencial para reducir las pérdidas de disolvente por medio de DDGS generados por el proceso de fermentación extractiva mediante la eliminación de sólidos no disueltos de la pasta de maíz antes de la fermentación con el uso de una centrífuga.
Se realizó una prueba de centrifugado en botella a escala de laboratorio con el uso de pasta de maíz licuada. La prueba simula las condiciones operativas de una centrífuga con decantador típica usada para eliminar sólidos no disueltos de residuos de destilación enteros en una planta de etanol (EtOH) comercial. Las centrífugas con decantador en plantas de EtOH comercial se usan, típicamente, a una fuerza centrífuga relativa (RCF, por sus siglas en inglés) de aproximadamente 3000 g's y un tiempo de permanencia de los residuos de destilación enteros de aproximadamente 30 segundos. Típicamente, estas centrífugas eliminan aproximadamente 90 % de los sólidos suspendidos en residuos de destilación enteros que contienen de aproximadamente 5 % a 6 % de sólidos suspendidos (después de la columna de cerveza) y producen residuos de destilación finos que contienen aproximadamente 0.5 % de sólidos suspendidos.
La pasta de maíz licuada se preparó de conformidad con el protocolo descrito en el Ejemplo 6. Se colocó aproximadamente 10 mi de pasta en un tubo de centrífuga. La muestra se centrifugó a una RCF de aproximadamente 3000 g' s (velocidad de 4400 rpm del rotor) por un total de 1 minuto. La muestra se procesó durante aproximadamente 30-40 segundos a 3000 g's y un total de 20-30 segundos a velocidades menores que 3000 g's debido a las aceleraciones y desaceleraciones de la centrífuga. La temperatura de la muestra fue de aproximadamente 60 °C.
Los 10 mi de pasta que contenían aproximadamente 7 % en peso de sólidos suspendidos se separaron en aproximadamente 6.25 mi de centrado clarificado y 3.75 mi de torta húmeda (gránulo en el fondo del tubo de la centrífuga) . La separación, definida como (cantidad de centrado) / (cantidad de pasta original cargada) , obtenida por medio de la prueba de centrifugado en botella fue de aproximadamente 62 % . Se determinó que el centrado clarificado contenia aproximadamente 0.5 % en peso de sólidos suspendidos que constituye una reducción mayor a diez veces en los sólidos suspendidos en comparación con el nivel de sólidos suspendidos en la pasta original. Además, se determinó que el gránulo clarificado contenia aproximadamente 18 % en peso de sólidos suspendidos.
La Tabla 5 resume el balance de masa de los sólidos suspendidos (no disueltos) para la prueba de centrifugado en botella en condiciones representativas de la operación de una centrifuga con decantador para convertir los residuos de destilación enteros en residuos de destilación finos en un proceso de EtOH comercial. Todos los valores proporcionados en la Tabla 5 son aproximados .
Tabla 5 Además, se determinó que el centrado contenia aproximadamente 190 g/1 de oligosacáridos disueltos (almidón licuado) . Esto concuerda con la presunción de que la mayor parte del almidón en el maiz triturado se licuó (es decir, se hidrolizó a oligosacáridos solubles) en el proceso de licuación basado en la carga de maiz usada (aproximadamente 26 % en peso sobre una base de maiz seco) y el contenido de almidón del maiz usado para producir la pasta licuada (aproximadamente 71.4 % en peso de almidón sobre una base de maiz seco) . La hidrólisis de la mayor parte del almidón en el maiz triturado a una carga de maiz seco del 26 % producirá aproximadamente 7 % en peso de sólidos suspendidos (no disueltos) en la pasta de maiz licuada cargada en la centrifuga usada para la prueba de centrifugación en botella.
El hecho de que el centrado clarificado contenía solo aproximadamente 0.5 % en peso de sólidos no disueltos indica que las condiciones usadas en la prueba de centrifugación en botella produjeron una reducción mayor que diez veces en los sólidos no disueltos de la pasta cargada. Si se puede obtener este mismo rendimiento de eliminación de sólidos con una centrifuga con decantador continua antes de la fermentación, es razonable suponer que las pérdidas de disolvente de extracción de ISPR en los DDGS podrían reducirse en aproximadamente un orden de magnitud. La minimización de las pérdidas de disolvente a través de DDGS es un factor importante en la economía y la calidad de los DDGS para un proceso de fermentación extractiva.
Ejemplo 10 Eliminación del aceite de maíz por medio de la eliminación de sólidos no disueltos Este ejemplo demuestra el potencial para eliminar y recuperar aceite de maíz de la pasta de maíz mediante la eliminación de sólidos no disueltos antes de la fermentación. La eficacia del disolvente de extracción se puede mejorar si el aceite de maíz se elimina por medio de eliminación de los sólidos no disueltos. Adicionalmente, la eliminación de aceite de maíz por medio de la eliminación de los sólidos no disueltos puede minimizar, además, cualquier reducción en el coeficiente de partición del disolvente y producir, potencialmente, un proceso de fermentación extractiva mejorado .
Se preparó aproximadamente 1000 g de pasta de maíz licuada en un reactor de resina de 1 1 con camisa de vidrio. El reactor se configuró con agitación mecánica, control de temperatura y control del pH. Se usó el siguiente protocolo: se mezcló el maíz triturado con agua corriente (26 % en peso de maíz sobre una base seca) , se calentó la suspensión hasta 55 °C mientras se agitaba, se ajustó el pH hasta 5.8 con NaOH o H2SO4, se añadió alfa-amilasa (0.02 % en peso sobre una base de maiz seco), se continuó el calentamiento hasta 85 °C, se ajustó el pH hasta 5.8, se mantuvo a 85 °C por 2 h mientras se mantenía el pH en 5.8, se enfrió hasta 25 °C. Se usó maíz amarillo de grano entero de Pioneer (3335) . Se molió en un molino triturador con un tamiz de 1 mm. Según las mediciones, el contenido de humedad del maíz triturado fue de aproximadamente 11.7 % en peso y el contenido de almidón del maíz triturado fue de aproximadamente 71.4 % en peso sobre una base de maíz seco. Se usó la enzima alfa-amilasa Liquozyme® SC DS de Novozymes ( Franklinton, NC) . Los ingredientes se usaron en las siguientes cantidades totales: 294.5 g de maíz triturado (11.7 % de humedad), 705.5 g de agua corriente y 0.059 g de Liquozyme® SC DS . Se añadió agua (4.3 g) para diluir la enzima y un total de 2.3 g de solución de NaOH al 20 % para controlar el pH. Se recuperó aproximadamente 952 g de pasta.
La pasta de maíz licuada se centrifugó a 5000 rpm (7260 g's) por 30 minutos a 40 °C para eliminar los sólidos no disueltos de la solución acuosa de oligosacáridos . La eliminación de los sólidos por centrifugación produjo, además, la eliminación del aceite de maíz libre como una capa liquida orgánica separada en la parte superior de la fase acuosa. Se recuperó aproximadamente 1.5 g de aceite de maíz de la capa orgánica que flotaba en la parte superior de la fase acuosa. Se determinó por medio de extracción con hexanos que el maíz triturado usado para producir la pasta licuada contenía aproximadamente 3.5 % en peso de aceite de maíz sobre una base de maíz seco. Esto corresponde a aproximadamente 9 g de aceite de maíz alimentado al proceso de licuación con el maíz triturado.
Después de recuperar el aceite de maíz de la pasta licuada, la solución acuosa de oligosacáridos se decantó fuera de la torta húmeda. Se recuperó aproximadamente 617 g de solución de almidón licuado y quedó aproximadamente 334 g de torta húmeda. La torta húmeda contenía la mayor parte de los sólidos no disueltos que estaban en la pasta licuada. La solución de almidón licuada contenía aproximadamente 0.2 % en peso de sólidos no disueltos. La torta húmeda contenía aproximadamente 21 % en peso de sólidos no disueltos. La torta húmeda se lavó con 1000 g de agua corriente para eliminar los oligosacáridos que estaban aun en la torta. Para esto, la torta se mezcló con agua para formar una suspensión. Después, la suspensión se centrifugó en las mismas condiciones usadas para centrifugar la pasta original para recuperar los sólidos lavados. La eliminación de los sólidos lavados por medio de centrifugación de la suspensión de lavado produjo, además, la eliminación de aceite de maiz libre adicional que debe haber quedado con la torta húmeda original producida de la pasta licuada. Este aceite de maiz adicional se observó como una capa liquida orgánica, delgada, separada en la parte superior de la fase acuosa de la mezcla de lavado centrifugada. Se recuperó aproximadamente 1 g de aceite de maiz adicional del proceso de lavado.
Los sólidos húmedos se lavaron dos veces más, cada una de ellas con 1000 g de agua corriente para eliminar prácticamente todo el almidón licuado. No se eliminó aceite de maiz adicional visible del 2. y 3. lavado con agua de los sólidos de la pasta. Los sólidos lavados finales se secaron en un horno de vacio de la noche a la mañana a 80 °C y un vacio de aproximadamente 67.7 kPa (20 pulgadas de Hg) . La cantidad de aceite de maiz que quedaba en los sólidos secos, supuestamente, aun en el germen, se determinó por medio de extracción con hexanos. Se determinó por medición que una muestra de 3.60 g de sólidos relativamente secos (aproximadamente 2 % en peso de humedad) contenia 0.22 g de aceite de maíz. Este resultado corresponde a 0.0624 g de aceite de maiz/g de sólidos secos. Esto corresponde a los sólidos lavados, es decir, que no hay oligosacáridos residuales en los sólidos húmedos. Después de centrifugar la pasta de maíz licuada para separar la capa de aceite de maíz libre y la solución acuosa de oligosacáridos de la torta húmeda se determinó que quedaban aproximadamente 334 g de torta húmeda que contenía aproximadamente 21 % en peso de sólidos no disueltos. Esto corresponde a la torta húmeda que comprende aproximadamente 70.1 g de sólidos no disueltos. En 0.0624 g de aceite de maiz/g de sólidos secos, los sólidos en la torta húmeda deberían contener aproximadamente 4.4 g de aceite de maíz.
En síntesis, se recuperó aproximadamente 1.5 g de aceite de maíz libre mediante centrifugación de la pasta licuada. Se recuperó 1 g adicional de aceite de maíz libre mediante centrifugación de la primera suspensión de lavado (agua) que se generó para lavar la torta húmeda original producida de la pasta. Por último, se determinó que los sólidos lavados aún contenían aproximadamente 4.4 g de aceite de maíz. Además, se determinó que el maíz cargado en la licuación contenía aproximadamente 9 g de aceite de maíz. Por lo tanto, se recuperó un total de 6.9 g de aceite de maíz de las siguientes etapas del proceso: licuación, eliminación de sólidos de la pasta licuada, lavado de los sólidos de la pasta y de los sólidos lavados finales. En consecuencia, aproximadamente 76 % del aceite de maíz total en el maíz alimentado a la licuación se recuperó durante el proceso de licuación y eliminación de sólidos descritos en la presente descripción .
Ejemplo 11 Fermentación extractiva con pasta y centrado como la fuente de azúcar Este ejemplo describe las fermentaciones extractivas realizadas con pasta de maíz y centrado de pasta de maiz como la fuente de azúcar. Se produjo centrado de pasta de maíz por medio de la eliminación de sólidos no disueltos de la pasta de maíz antes de la fermentación. Se realizaron cuatro fermentaciones extractivas lado a lado, dos con pasta de maíz licuada como la fuente de azúcar (sólidos no eliminados) y dos con centrado de pasta licuada (solución acuosa de oligosacáridos ) obtenida por la eliminación de la mayor parte de los sólidos no disueltos de la pasta de maíz licuada. Se añadió alcohol oleílico (OA) a dos de las fermentaciones, una con sólidos y una con sólidos eliminados, para extraer el producto (i-BuOH) del caldo a medida que se formaba. Se añadió una mezcla de ácidos grasos de aceite de maíz (COFA, por sus siglas en inglés) a las otras dos fermentaciones, una con sólidos y otra con sólidos eliminados, para extraer el producto del caldo a medida que se formaba. El COFA se preparó por la hidrólisis del aceite de maiz. Estas fermentaciones se realizaron con el propósito de probar el efecto de eliminar sólidos en la separación de fases entre el disolvente y el caldo (ver el Ejemplo 11) y medir la cantidad de disolvente residual atrapado en los sólidos no disueltos recuperados de los caldos de fermentación de los cuales se eliminaron o no los sólidos (ver el Ejemplo 12) .
Preparación de pasta de maíz licuada Se preparó aproximadamente 31 kg de pasta de maíz licuada en un reactor de resina de 30 1 con camisa de vidrio. El reactor se configuró con agitación mecánica, control de la temperatura y control del pH. Se usó el siguiente protocolo: se mezcla maíz triturado con agua corriente (40 % en peso de maíz sobre una base seca) , se calienta la suspensión hasta 55 °C mientras se agita a 250 rpm, se ajusta el pH hasta 5.8 con NaOH o H2S04/ se añade una solución acuosa diluida de alfa-amilasa (0.16 % en peso sobre una base de maíz seco), se mantiene a 55 °C por 60 minutos, se calienta hasta 95 °C, se ajusta el pH hasta 5.8, se mantiene a 95 °C por 120 minutos mientras el pH se mantiene a 5.8 para completar la licuación. La pasta se transfirió a botellas de centrífuga estériles para evitar la contaminación.
Se usó maíz amarillo de grano entero de Pioneer. Se trituró en un molino triturador a escala piloto con un tamiz de 1 mm. Según las mediciones, el contenido de humedad del maíz triturado fue de aproximadamente 12 % en peso y el contenido de almidón del maíz triturado fue de aproximadamente 71.4 % en peso sobre una base de maíz seco. Se usó la enzima alfa-amilasa Spezyme® Fred-LSpezyme® Genencor® (Palo Alto, CA) . Los ingredientes se usaron en las siguientes cantidades: 14.1 kg de maíz triturado (12 % de humedad), 16.9 kg de agua corriente, una solución de alfa-amilasa que consistía en 19.5 g de Spezyme® Fred-L en 2.0 kg de agua. La alfa-amilasa se esterilizó por filtrado. Se añadió un total de 0.21 kg de NaOH (17 % en peso) durante la prueba para controlar el pH.
Se calculó que la pasta de maíz licuada contenía aproximadamente 28 % en peso (aproximadamente 280 g/1) de almidón licuado basado en la carga de maíz usada, el contenido de almidón del maíz y la presunción de que todo el almidón se hidrolizó durante la licuación. La pasta se preparó con una concentración de oligosacáridos más alta que la deseada en las fermentaciones para permitir la dilución cuando se añaden los nutrientes, el inoculo, la glucoamilasa y la base al caldo de fermentación inicial. Después de la dilución por medio de la adición de nutrientes, inoculo, glucoamilasa y base se esperaba un contenido total inicial de azúcares solubles en la pasta (sólidos no eliminados) de aproximadamente 250 g/1.
Se centrifugó aproximadamente 13.9 kg de la pasta licuada con una centrifuga de botella que contenia seis botellas de 1 1. La centrifuga se usó a 5000 rpm (7260 RCF) por 20 minutos a temperatura ambiente. La pasta se separó en aproximadamente 5.5 kg de centrado clarificado y aproximadamente 8. kg de torta húmeda (el gránulo en el fondo de las botellas de centrifuga) . La separación, definida como (cantidad de centrado) / (cantidad de pasta alimentada), fue de aproximadamente (5.5 kg/13.9 kg) = 40 %.
Los sólidos no se eliminaron de la pasta cargada en las fermentaciones 2010Y034 y 2010Y036 descritas más abajo. El centrado cargado en las fermentaciones 2010Y033 y 2010Y035 (descritas, además, más abajo) se produjo por medio de la eliminación (por centrifugación) de la mayor parte de los sólidos suspendidos de la pasta de conformidad con los protocolos anteriores.
Métodos generales para la fermentación Crecimiento en matraz de semillas Se cultivó una cepa de Saccharomyces cerevisiae diseñada por ingeniería para producir isobutanol a partir de una fuente de carbohidratos, con pdcl eliminado, pdc5 eliminado y pdc6 eliminado hasta 0.55-1.1 g/1 de dcw (ODeoo 1.3-2.6 -Thermo Helios a Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts) en matraces de semilla a partir de un cultivo congelado. El cultivo se creció a 26 °C en un incubador que rotaba a 300 rpm. El cultivo congelado se almacenó previamente a - 80 °C. La composición del medio del primer matraz de semillas fue: 3.0 g/1 de dextrosa 3.0 g/1 de etanol, anhidro 3.7 g/1 de mezcla de aminoácidos completa sintética ForMedium™ (Kaiser) : sin HIS, sin URA (núm. de referencia DSCK162CK) 6.7 g/1 de base de nitrógeno de levadura Difco sin aminoácidos (núm. 291920) .
Se transfirió doce mililitros del cultivo del primer matraz de semillas a un matraz de 2 1 y se cultivó a 30 °C en un incubador que rotaba a 300 rpm. El segundo matraz de semillas tiene 220 mi del siguiente medio: 30.0 g/1 de dextrosa 5.0 g/1 de etanol, anhidro 3.7 g/1 de mezcla de aminoácidos completa sintética ForMedium™ (Kaiser) : sin HIS, sin URA (núm. de referencia DSCK162CK) 6.7 g/1 de base de nitrógeno de levadura Difco sin aminoácidos (núm. 291920) 0.2 M de tampón MES titulado hasta pH 5.5-6.0.
El cultivo se creció hasta 0.55-1.1 g/1 de dcw (OD6oo 1.3-2.6). Se añadió 30 mi de una solución que contenia 200 g/1 de peptona y 100 g/1 de extracto de levadura a esta concentración celular. Después, se añadió en el matraz 300 mi de alcohol oleilico al 90-95 % de Cognis esterilizado en un filtro de 0.2 uM. El cultivo continúa su crecimiento hasta > 4 g/1 de dc (?06?? > 10) antes de recolectarlo y añadirlo a la fermentación.
Preparación de la fermentación Preparación inicial del fermentador Se cargó un fermentador de 2 1 con camisa de vidrio (Sartorius AG, Goettingen, Alemania) con pasta licuada con o sin sólidos (centrado) . Se calibró una sonda de pH (Hamilton Easyferm Plus K8, número de parte: 238627, Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Suiza) según el menú de calibración de la torre de control DCU-3 Sartorius. El cero se calibró en pH=7. La extensión se calibró en pH= . Después, la sonda se colocó en el fermentador a través de la placa frontal de acero inoxidable. Además, se colocó una sonda de oxigeno disuelto (sonda de p02) en el fermentador a través de la placa frontal. Los tubos usados para suministrar nutrientes, cultivo de semillas, disolvente de extracción y base se acoplaron a la placa frontal y los extremos se cubrieron con lámina de metal. El fermentador completo se colocó en un autoclave Steris (Steris Corporation, Mentor, Ohio) y se esterilizó en un ciclo de liquido por 30 minutos.
El fermentador se extrajo del autoclave y sé colocó sobre una celda de carga. La línea de suministro de agua y retorno de la camisa se conectó al agua de la casa y al drenaje de limpieza, respectivamente. Las líneas de entrada y salida del agua de enfriamiento del condensador se conectaron a un baño de temperatura de recirculación de 6 L que funcionaba a 7 °C. La línea de ventilación que transfiere el gas desde el termentador se conectó a una línea de transferencia que se conectó a un espectrómetro de masa Thermo (Prima dB, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts) . La línea del tubo rociador se conectó a la linea de suministro de gas. Los tubos para añadir nutrientes, disolvente de extracto, cultivo de semillas y base se conectaron a través de bombas o se sellaron con abrazaderas. El material del autoclave, NaCl al 0.9 % p/v, se drenó antes de la adición de pasta licuada.
Tratamiento con lipasas después de la licuación La temperatura del fermentador se determinó en 55 °C en lugar de 30 °C después de completar el ciclo de licuación (licuación). El pH se controló manualmente a pH=5.8 por medio de adiciones de bolos de ácido o base cuando fue necesario. Se añadió una solución matriz de enzimas lipasas al fermentador hasta obtener una concentración final de lipasas de 10 ppm. El fermentador se mantuvo a 55 °C, 300 rpm y 0.3 slpm de recubrimiento de N2 por >6 h. Una vez que se completó el tratamiento con lipasas la temperatura del fermentador se determinó en 30 °C.
Adición de nutrientes antes de la inoculación Se añade 7.0 ml/1 (volumen posterior a la inoculación) de etanol (200 de graduación del alcohol, anhidro) justo antes de la inoculación. Se añade tiamina hasta una concentración final de 20 mg/1 justo antes de la inoculación. Se añade 100 mg/1 de ácido nicotinico justo antes de la inoculación .
Inoculación en fermentador La sonda de p02 del fermentador se calibró hasta cero mientras se añadió N2 al fermentador. La sonda de p02 del fermentador se calibró hasta su extensión con aire estéril depurado a 300 rpm. El fermentador se inoculó después de que el segundo matraz de semillas alcanzó > 4 g/1 de dcw. El matraz de agitación se extrajo del incubador/agitador por 5 minutos y se dejó que las fases se separaran en la fase de alcohol oleilico y la fase acuosa. Los 55 mi de la fase acuosa se transfirieron a una botella de inoculación estéril. El inoculo se bombeó al fermentador a través de una bomba peristáltica .
Adición de alcohol oleilico o ácidos grasos de aceite de maiz después de la inoculación Se añadió 1 1/1 (volumen posterior a la inoculación) de alcohol oleilico o ácidos grasos de aceite de maiz inmediatamente después de la inoculación.
Condiciones operativas del fermentador El fermentador se usó a 30 °C para todas las etapas de crecimiento y producción. Se dejó que el pH bajara de un pH de 5.7-5.9 a un punto fijo de control de 5.2 sin añadir ácido. El pH se controló para el resto de la etapa de crecimiento y producción a un pH =5.2 con hidróxido de amonio. Se añadió aire estéril al fermentador, a través del tubo rociador, a 0.3 slpm para el resto de las etapas de crecimiento y producción. Se configuró el circuito de control de PID de la caja de control Sartorius DCU-3 para controlar el pC>2 a 3.0 % solamente con el control de agitación, y el valor mínimo del agitador se determinó en 300 rpm y el valor máximo en 2000 rpm. La glucosa se suministró a través de sacarificación y fermentación simultánea de la pasta de maíz licuada mediante la adición de una a-amilasa (glucoamilasa ) . Se mantuvo el exceso de glucosa (1-50 g/1) durante todo el tiempo en que el almidón estaba disponible para la sacarificación .
Analítico Análisis de gas El aire del proceso se analizó en un espectrómetro de masas Thermo Prima (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts ) . Este era el mismo aire del proceso que se esterilizó y, después, se añadió a cada fermentador. El efluente gaseoso de cada fermentador se analizó en el mismo espectrómetro de masas. Este equipo Thermo Prima dB tiene una prueba de control de calibración todos los lunes a las 6:00 de la mañana. El control de calibración se programó a través del programa Gas Works vi .0 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts) asociado con el espectrómetro de masa. El equipo se calibró para los siguientes gases: GAS Concentración en mol % Frecuencia de la para la calibración cal Nitrógeno 78 % Semanal Oxigeno 21 % Semanal Isobutanol 0.2 % Anual Argón 1 % Semanal Dióxido de carbono 0.03 o o Semanal Se controló el dióxido de carbono a 5 % y 15 % durante el ciclo de calibración con otros gases embotellados conocidos. Se controló el oxigeno a 15 % con otros gases embotellados conocidos. En base al análisis del efluente gaseoso de cada termentador se midió la cantidad de isobutanol extraído, el oxigeno consumido y el dióxido de carbono captado en el efluente gaseoso por medio del análisis de la fracción molar del espectrómetro de masas y los regímenes de flujo del gas (controlador del flujo de masa) al fermentador. Se calcula el índice de emisión de gases por hora y, después, ese índice se integra durante el transcurso de la fermentación.
Medición de la biomasa Se preparó una solución de azul de tripán al 0.08 % de una dilución 1:5 de azul de tripán al 0.4 % en NaCl (VWR BDH8721-0) con IX PBS . Se extrajo una muestra de 1.0 mi de un fermentador y se colocó en un tubo de centrifuga Eppendorf de 1.5 mi y se centrifugó en un Eppendorf, 5415C a 14, 000 rpm por 5 minutos. Después de la centrifugación, la capa disolvente superior se eliminó con una pipeta m200 Variable Channel BioHit con puntas de pipeta BioHit de 20-200 µ?. Se cuidó de no eliminar la capa ubicada entre las capas disolvente y acuosa. Una vez que se eliminó la capa disolvente, la muestra se suspendió otra vez con un Vortex-Genie® configurado a 2700 rpm.
Fue necesario realizar una serie de diluciones para obtener la concentración ideal de las células para los conteos del hematocitómetro . Con un OD de 10 se realizaría una dilución 1:20 para obtener 0.5 de OD lo que generaría la cantidad ideal de células para el recuento por cuadrado, 20-30. Para reducir la imprecisión de la dilución debido a la presencia de sólidos de maíz fue necesario realizar múltiples diluciones con puntas de pipeta BioHit de corte 100-1000 µ?. Se cortó aproximadamente 1 cm de las puntas para incrementar la abertura que evitó la obstrucción de la punta. Para una dilución de 1:20 final se realizó una dilución inicial 1:1 de la muestra de fermentación y solución de NaCl al 0.9 %. Después, se realizó una dilución 1:1 de la solución previa y la solución de NaCl al 0.9 %, después, finalmente, una dilución de 1:5 con la solución previa y solución de azul de tripán. Las muestras se procesaron en vórtice entre cada dilución y las puntas de corte se enjuagaron en las soluciones de NaCl al 0.9 % y azul de tripán.
Se colocó el cubreobjetos cuidadosamente encima del hemacitometro Hausser Scientific Bright-Line 1492. Se extrajo 10 ul de la dilución final de azul de tripán con una pipeta m20 Variable Channel BioHit con puntas de pipeta BioHit de 2-20 µ? y se inyectó en el hemacitometro. El hemacitometro se colocó en el microscopio Zeis Axioskop 40 con una ampliación de 40x. El cuadrante central se dividió en 25 cuadrados y se contaron y registraron los cuatro cuadrados de las esquinas y el centro en ambas cámaras. Después del conteo de ambas cámaras, se tomó el promedio y se multiplicó por el factor de dilución (20), después por 25 para la cantidad de cuadrados en el cuadrante en el hemacitometro y, después, se dividió por 0.0001 mi, que es el volumen del cuadrante que se contó. La suma de este cálculo es el número de células por mi.
Análisis por CL de productos de fermentación en la fase acuosa Las muestras se refrigeraron hasta que estuvieron listas para el procesamiento. Las muestras se extrajeron de la refrigeración por una hora para que alcancen la temperatura ambiente. Se transfirió aproximadamente 300 ul de muestra con una pipeta mlOOO Variable Channel BioHit con puntas de pipeta de 100-1000 µ? BioHit a un filtro de centrifuga de 0.2 um (filtro de centrifuga de nailon modificado con F Nanosep) , después, se centrifugó con un Eppendorf 5415C por cinco minutos a 14 , 000 rpiti. Se transfirió aproximadamente 200 ul de muestra filtrada al vial de un automuestreador de 1.8 con un inserto de vial de vidrio de 250 ul con soporte polimérico. Se usó una tapa roscada con septos de PTFE para tapar el vial antes de procesar la muestra en vórtice con un Vortex-Genie® configurado a 2700 rpm.
Después, la muestra se trató en un CL serie 1200 de Agilent equipado con bombas isocráticas binarias, desgasificador por vacio, compartimento de columna calentado, sistema de enfriamiento del muestreador, detector DAD de UV y detector de RI. Se usó una columna Aminex HPX-87H, 300 X 7.8 con una recarga Bio-Rad Catión H, con protección 30X4.6. La temperatura de la columna fue de 40 °C con una fase móvil de ácido sulfúrico 0.01 N a un régimen de flujo de 0.6 ml/min por 40 minutos. Los resultados se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6. Tiempos de retención de productos de fermentación en la fase acuosa Análisis por CG de productos de fermentación en la fase disolvente Las muestras se refrigeraron hasta que estuvieron listas para el procesamiento. Las muestras se extrajeron del refrigerador por una hora para que alcancen la temperatura ambiente. Se transfirió aproximadamente 150 ul de muestra con una pipeta mlOOO Variable Channel BioHit con puntas de pipeta de 100-1000 µ? BioHit al vial de un automuest reador de 1.8 con un inserto de vial de vidrio de 250 ul con soporte polimérico. Se usó una tapa roscada con septos de P FE para tapar el vial.
Después, la muestra se procesó en un CG Agilent 7890A con un inyector 7683B y un automuest reador G2614A. Se usó una columna HP-InnoWax (30 m x 0.32 mm de diámetro interno, película de 0.25 ym) . Se usó helio como gas portador a un régimen de flujo de 1.5 ml/min medido a 45 °C con una presión de cabeza constante; una división del inyector de 1:50 a 225 °C; una temperatura del horno de 45 °C por 1.5 min, 45 °C a 160 °C a 10 °C/min por 0 min, después, 230 °C a 35 °C/min por 14 minutos para un tiempo transcurrido de 29 minutos. La detección de ionización de llama se usó a 260 °C con 40 ml/min de gas helio auxiliar. Los resultados se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7. Tiempos de retención de productos de fermentación en la fase disolvente Las muestras analizadas para determinar los ésteres butilicos de ácidos grasos se procesaron en el CG Agilent 6890 con un inyector 7683B y un automuestreador G2614A. Se usó una columna HP-DB-FFAP (15 metros x 0.53 mm de diámetro interno (Megabore) , columna con un grosor de película de 1 micrón (30 m x 0.32 mm de diámetro interno, película de 0.25 µp?) . Se usó helio como gas portador a un régimen de flujo de 3.7 ml/min medido a 45 °C con una presión de cabeza constante; una división del inyector de 1:50 a 225 °C; una temperatura del horno de 100 °C por 2.0 min, 100 °C a 250 °C a 10 °C/min, después, 250 °C por 9 min para un tiempo transcurrido de 26 minutos. La detección de ionización de llama se usó a 300 °C con 40 ml/min de gas helio auxiliar. Se usaron los siguientes estándares de CC (Nu-Chek Prep; Elysian, MN) para confirmar la identidad de los productos de éster isobutilico de ácidos grasos: palmitato de isobutilo, estearato de isobutilo, oleato de isobutilo, linoleato de isobutilo, linolenato de isobutilo, araquidato de isobutilo.
Ejemplo 11A El identificador del experimento 2010Y033 incluyó: método de crecimiento en matraz de semillas, método de preparación inicial en el fermentador con pasta de maíz que excluye sólidos, licuación posterior al tratamiento con lipasa, adición de nutrientes antes del método de inoculación, método de inoculación del fermentador, método de condiciones operativas del fermentador y todos los demás métodos analíticos. Se añadió ácido graso de aceite de maíz en un solo lote entre 0.1 y 1.0 h después de la inoculación. El " but ano 1 ógeno " fue CEN.PK113-7D Aura3: :loxP ñhis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5::sadB Agpd2: :loxP / pYZ090 + pLH468 (NGCI-070) .
Ejemplo 11B El identificador del experimento 2010Y034 incluyó: método de crecimiento en matraz de semillas, método de preparación inicial en el fermentador con pasta de maíz que incluye sólidos, licuación posterior al tratamiento con lipasa, adición de nutrientes antes del método de inoculación, método de inoculación del fermentador, método de condiciones operativas del fermentador y todos los demás métodos analíticos. Se añadió ácido graso de aceite de maíz en un solo lote entre 0.1 y 1.0 h después de la inoculación. El "butanologeno" fue CEN.PK113-7D Aura3: :loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5: :sadB Agpd2: :loxP / pYZ090 + pLH468 (NGCI-070) .
Ejemplo 11C El identificador del experimento 2010Y035 incluyó: método de crecimiento en matraz de semillas, método de preparación inicial en el fermentador con pasta de maíz que excluye sólidos, adición de nutrientes antes del método de inoculación, método de inoculación del fermentador, método de condiciones operativas del fermentador y todos los demás métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo lote entre 0.1 y 1.0 h después de la inoculación. El "butanológeno" fue CEN.PK113-7D Aura3: :loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5: :sadB Agpd2: :loxP / pYZ090 + pLH468 (NGCI-070) .
Ejemplo 11D El identif icador del experimento 2010Y036 incluyó: método de crecimiento en matraz de semillas, método de preparación inicial en el fermentador con pasta de maiz que incluye sólidos, adición de nutrientes antes del método de inoculación, método de inoculación del fermentador, método de condiciones operativas del fermentador y todos los demás métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo lote entre 0.1 y 1.0 h después de la inoculación. El "butanológeno" fue CEN.PK113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : i lvDSm Apdc5::sadB Agpd2: :loxP / pYZ090 + pLH468 (NGCI-070) .
Los resultados para los Ejemplos 11A-11D se muestran en la Tabla 8 Tabla 8. Condiciones y resultados de la fermentación para los Ejemplos 11A-11D Ejemplo 12 Efecto de la eliminación de sólidos no disueltos del suministro del fermentador en la mejora de la eficacia del volumen del fermentador Este ejemplo demuestra el efecto de la eliminación de sólidos no disueltos de la pasta antes de la fermentación en la eficacia del volumen del fermentador. Los sólidos no disueltos en la pasta de maíz ocupan al menos 5 % del volumen de la pasta dependiendo de la carga de maíz y el contenido de almidón. La eliminación de sólidos antes de la fermentación permite cargar al menos 5 % más de azúcar en el fermentador y, por lo tanto, incrementar la productividad del lote.
Se calcula que la pasta de maíz licuada producida en el Ejemplo 10 contenía aproximadamente 28 % en peso (280 g/1) de almidón licuado basado en la carga de maíz usada (base de 40 % de maíz seco), el contenido de almidón del maíz (base de 71.4 % de maíz seco) y la presunción de que todo el almidón se hidrolizó a oligosacáridos solubles durante la licuación. La pasta se preparó con una concentración de oligosacáridos más alta que la deseada en las fermentaciones, tal como se describió en el Ejemplo 11, para permitir la dilución cuando se añaden los nutrientes, el inoculo, la glucoamilasa y la base al caldo de fermentación inicial. La pasta se diluyó aproximadamente 10 % después de añadir estos ingredientes. Por lo tanto, la concentración esperada de almidón licuado en la pasta (que incluye sólidos) al comienzo de las fermentaciones 2010Y034 y 2010Y036 fue de aproximadamente 250 g/1. Según las mediciones se determinó un valor de los equivalentes de glucosa reales cargados en las fermentaciones 2010Y034 y 2010Y036 de 239 g/kg y 241 g/kg, respectivamente (ver la Tabla 8). En comparación, se determinaron los valores de los equivalentes de glucosa cargados en las fermentaciones 2010Y033 y 2010Y035 en 257 g/kg y 263 g/kg, respectivamente. Debe mencionarse que se usó centrado como suministro para estas fermentaciones (pasta de la cual se eliminó la mayor parte de los sólidos) . Se cargó aproximadamente 1.2 1 de la fuente de azúcar (pasta o centrado) en cada fermentación. Por lo tanto, en base a estos datos, se cargó aproximadamente 8.3 % más de azúcar en los termentadores en los que se usó centrado (2010Y033 y 2010Y035) en comparación con pasta (2010Y034 y 2010Y036) . Estos resultados demuestran que la eliminación de sólidos no disueltos de la pasta de maíz antes de la fermentación puede producir un aumento significativo en el azúcar cargado por unidad de volumen. Esto implica que cuando los sólidos están presentes, estos ocupan un volumen importante del termentador. Si los sólidos se eliminan del suministro, puede añadirse más azúcar ("ajuste") al termentador debido a la ausencia de sólidos no disueltos. Este ejemplo demuestra que la eficacia del volumen del termentador puede mejorarse significativamente si se eliminan sólidos no disueltos de la pasta antes de la fermentación.
Ejemplo 13 Efecto de eliminar sólidos no disueltos en la separación de fases entre el disolvente de extracción y el caldo -Fermentación extractiva Este ejemplo demuestra una mejor separación entre la fase disolvente y la fase de caldo durante y después de un proceso de fermentación extractiva mediante la eliminación de sólidos no disueltos de la pasta de maíz antes de la fermentación. Se realizaron dos fermentaciones extractivas lado a lado, una con pasta de maíz licuada como la fuente de azúcar (sólidos no eliminados) y una con centrado (solución acuosa de oligosacáridos) que se generó por la eliminación de la mayor parte de los sólidos no disueltos de la pasta de maíz licuada. Se añadió alcohol oleilico (OA) a ambas fermentaciones para extraer el producto (i-BuOH) del caldo a medida que se formaba. El caldo de fermentación mencionado en este ejemplo del cual no se eliminaron los sólidos del suministro (pasta de maíz usada) fue 2010Y036 tal como se describió en el Ejemplo 10. El caldo de fermentación mencionado en este ejemplo del cual se eliminaron los sólidos del suministro (centrado usado producido a partir de pasta de maíz) fue 2010Y035 tal como se describió en el Ejemplo 10. El alcohol oleilico fue el disolvente de extracción usado en ambas fermentaciones. La velocidad y el grado de separación de fases se midió y comparó en todas las fermentaciones asi como también para los caldos de fermentación finales. La separación de fases adecuada en un proceso de fermentación extractiva puede derivar en una pérdida mínima del microorganismo y pérdidas mínimas de disolvente así como también en un menor costo de capital y operativo del procesamiento en dirección 3' .
Separación de fases entre las fases disolvente y de caldo durante la fermentación Se extrajeron muestras de aproximadamente 10 mi de cada fermentador a 5.3, 29.3, 53.3 y 70.3 h, y se comparó la separación de fases para las muestras de la fermentación de las cuales se eliminaron los sólidos (2010Y035) y de las muestras de las cuales no se eliminaron los sólidos (2010Y036) . Se observó y comparó la separación de fases para todas las muestras en todos los tiempos transcurridos para lo cual se dejó que las muestras se asentaran por aproximadamente 2 h y se controló la posición de la inferfase líquido-líquido. Prácticamente no se observó separación de fases en ninguna de las muestras extraídas de la fermentación de las cuales no se eliminaron los sólidos. La separación de fases se observó para todas las muestras de la fermentación de las cuales se eliminaron sólidos de la pasta de maíz licuada antes de la fermentación. La separación comenzó a producirse dentro de aproximadamente 10-15 minutos de la extracción de las muestras de la prueba en la cual se eliminaron los sólidos para todos los tiempos de fermentación y avanzó durante un periodo de 2 horas. La separación de fases comenzó a producirse en la muestra extraída a un tiempo transcurrido de la fermentación de 5.3 horas de la fermentación del centrado (sólidos eliminados) después de aproximadamente 7 minutos de asentamiento. La separación de fases comenzó a producirse en la muestra extraída a 53.3 horas de la fermentación del centrado (sólidos eliminados) después de aproximadamente 17 minutos de asentamiento.
La Fig . 9 es un gráfico de la posición de la interfase líquido-líquido en los tubos de la muestra de fermentación como una función del tiempo de asentamiento (gravedad) . Los datos corresponden a las muestras extraídas de la fermentación extractiva a la cual se suministró el centrado (sólidos eliminados de la pasta de maíz) como la fuente de azúcar y el OA se usó como disolvente de extracción de ISPR (prueba 2010Y035 en el Ejemplo 10) . Los datos de la separación de fases en este gráfico corresponden a las muestras extraídas a 5.3, 29.3, 53.3 y 70.3 horas de tiempo transcurrido de la fermentación 2010Y035. La posición de la interfase se reporta como un porcentaje de la altura total del caldo en el tubo de muestra. Por ejemplo, la posición de la interfase en la muestra extraída a 5.3 h de tiempo transcurrido de la fermentación 2010Y035 ( centrado/OA) aumentó desde el fondo del tubo de la muestra (sin separación) hasta 3.5 mi después de 120 minutos de asentamiento. Ese tubo de muestra especifico contenia aproximadamente 10 mi de caldo total. Por lo tanto, la posición de la interfase para esa muestra se reportó como 35 % en la Fig. 9. De manera similar, la posición de la interfase en la muestra extraída a 53.3 h de tiempo transcurrido de la fermentación 2010Y035 (centrado/OA) aumentó desde el fondo del tubo de la muestra (sin separación) hasta aproximadamente 3.9 mi después de 125 minutos de asentamiento. Ese tubo de muestra específico contenía había aproximadamente 10 mi de caldo total. Por lo tanto, la posición de la interfase para esa muestra se reportó como 39 % en la Fig. 9.
Separación de fases entre las fases disolvente y de caldo después de completar la fermentación Después de un tiempo transcurrido de 70 h, las fermentaciones se interrumpieron y los dos caldos de las fermentaciones extractivas de OA se transfirieron a cilindros graduados de vidrio de 2 1 separados. Se observó y comparó la separación de las fases disolvente y de caldo. Prácticamente no se observó separación de fases después de aproximadamente 3 horas para el caldo del cual no se eliminaron los sólidos antes de la fermentación (prueba 2010Y036) . La separación de fases se observó para el caldo del cual se eliminaron los sólidos de la pasta de maíz licuada antes de la fermentación (prueba 2010Y035) . La separación comenzó a producirse después de aproximadamente 15 minutos de asentamiento y avanzó durante un periodo de 3 horas. Después de 15 minutos se determinó una interfase líquido-líquido en un nivel de aproximadamente 10 % de la altura total de la mezcla de dos fases. Esto indica que la fase acuosa primero se separa de la dispersión y comienza a acumularse en el fondo de la mezcla. A medida que transcurría el tiempo, una mayor cantidad de fase acuosa se acumulaba en el fondo de la mezcla y, por lo tanto, la posición de la interfase subía. Después de un tiempo de asentamiento de aproximadamente 3 horas, la interfase había aumentado hasta un nivel de aproximadamente 40 % de la altura total de la mezcla de dos fases. Esto indica que se había producido la separación de fases casi completa después de un tiempo de asentamiento (gravedad) de aproximadamente 3 horas para el caldo de dos fases final del cual se habían eliminado los sólidos en base a las cantidades de centrado y OA cargados inicialmente en la fermentación. En ambas fermentaciones se cargaron volúmenes iniciales aproximadamente iguales de centrado y disolvente. Se cargó aproximadamente 1.2 1 de pasta de ' maíz licuada y aproximadamente 1.1 1 de OA en la fermentación 2010Y036. Se cargó aproximadamente 1.2 1 de centrado producido a partir del mismo lote de pasta y aproximadamente 1.1 1 de OA en la fermentación 2010Y035. Después de justificar el hecho de que se consumió aproximadamente 100 g/kg del azúcar inicial en la fase acuosa y de que aproximadamente 75 % del i-BuOH producido estaba en la fase disolvente, debería esperarse que los volúmenes relativos de las fases orgánica y acuosa finales sean de aproximadamente 1:1 si se produce la separación completa. La Fig. 10 es un gráfico de la posición de la interfase líquido-líquido como una función del tiempo de asentamiento (gravedad) para el caldo de dos fases final de la fermentación extractiva de la cual se eliminaron los sólidos (2010Y035) . La posición de la interfase se reporta como un porcentaje de la altura total del caldo en el cilindro de 2 1 graduado usado para observar la separación de fases del caldo final. La posición de la interfase del caldo final de la fermentación de 2010Y035 aumentó desde el fondo del cilindro graduado (sin separación) hasta un nivel de aproximadamente 40 % de la altura total de la mezcla de dos fases después de un tiempo de asentamiento de 175 min. Por lo tanto, se produjo la separación casi completa de las dos fases en el caldo final después de un tiempo de asentamiento de 3 horas. Una posición de la interfase de aproximadamente 50 % correspondería a la separación completa.
Se extrajo una muestra de 10 mi de la parte superior de la fase orgánica del caldo final (que se había asentado por aproximadamente 3 horas) de la fermentación de la cual se habían eliminado los sólidos. La muestra se centrifugó en una centrífuga de laboratorio de alta velocidad para determinar la cantidad de fase acuosa presente en la fase orgánica después de permitir que el caldo se asentara por 3 horas. Los resultados muestran que aproximadamente 90 % de la capa superior del caldo final estaba formada por fase disolvente. Aproximadamente 10 % de la capa superior del caldo final estaba formada por fase acuosa, incluida una cantidad relativamente pequeña de sólidos no disueltos. Algunos sólidos estaban ubicados en el fondo de la fase acuosa (más densos que la fase acuosa) y, además, una pequeña cantidad de sólidos se acumuló en la interfase líquido-líquido.
Además, se extrajo una muestra de 10 mi de la fase del fondo del caldo final (que se había asentado por aproximadamente 3 horas) de la fermentación de la cual se habían eliminado los sólidos. La muestra se centrifugó en una centrífuga de laboratorio de alta velocidad para determinar la cantidad de fase orgánica presente en la fase acuosa después de permitir que el caldo se asentara por 3 horas. Se determinó que prácticamente no había fase orgánica presente en la fase del fondo (acuosa) del caldo final de la fermentación de la cual se habían eliminado los sólidos después de que el caldo se asentara por 3 horas. Estos resultados confirman que se había producido la separación de fases casi completa para el caldo final de la fermentación de la cual se habían eliminado los sólidos. Prácticamente no se observó separación de fases para el caldo final de la fermentación de la cual no se habían eliminado los sólidos. Estos datos implican que la eliminación de sólidos de la pasta de maíz licuada antes de la fermentación extractiva puede permitir una mejora significativa en la separación de fases durante y después de la fermentación, lo que produce una pérdida menor del microorganismo, sólidos no disueltos y agua para el procesamiento en dirección 3' .
Se extrajo una muestra de 10 mi de la parte superior del caldo final de la fermentación de la cual no se habían eliminado sólidos después de que el caldo se asentara por aproximadamente 3 horas. La muestra se centrifugó en una centrífuga de laboratorio de alta velocidad para determinar la cantidad relativa de fases disolvente y acuosa en la parte superior del caldo final. Este caldo contenía todos los sólidos de la pasta de maíz licuada. Aproximadamente la mitad de la muestra estaba formada por fase acuosa y aproximadamente la otra mitad estaba formada por fase orgánica. La fase acuosa contenía significativamente más sólidos no disueltos (de la pasta licuada) en comparación con la muestra de la capa superior del caldo del cual se eliminaron los sólidos. Las cantidades de las fases acuosa y disolvente en la muestra son aproximadamente iguales y eso indica que prácticamente no se produjo separación de fases en el caldo final del cual no se eliminaron sólidos (aun después de un tiempo de asentamiento de 3 horas) . Estos datos implican que si los sólidos no se eliminan de la pasta de maíz licuada antes de una fermentación extractiva, probablemente no se produzca la separación de fases o esta sea mínima durante y después de la fermentación. Esto podría producir una pérdida significativa del microorganismo, sólidos no disueltos y agua para el procesamiento en dirección 3' .
Ejemplo 14 Efecto de la eliminación de sólidos no disueltos en la pérdida de disolvente de extracción de ISPR - Fermentación extractiva Este ejemplo demuestra el potencial para reducir las pérdidas de disolvente con los DDGS al final de un proceso de fermentación extractiva mediante la eliminación de sólidos no disueltos de la pasta de maíz antes de la fermentación. El Ejemplo 10 describió dos fermentaciones extractivas realizadas lado a lado, una con pasta de maíz licuada como la fuente de azúcar (2010Y036 - sólidos no eliminados) y una con centrado de pasta licuada (2010Y035 -solución acuosa de oligosacáridos ) obtenida por la eliminación de la mayor parte de los sólidos no disueltos de la pasta de maíz licuada. Se añadió alcohol oleílico (OA) a ambas fermentaciones para extraer el producto de isobutanol (i-BuOH) del caldo ; a medida que se formaba. Se midió y comparó la cantidad de disolvente residual atrapado en los sólidos no disueltos recuperado de los caldos de fermentación finales.
Después de completar las fermentaciones 2010Y035 y 2010Y036 descritas en el Ejemplo 10, los caldos se recolectaron y usaron para realizar las pruebas de separación de fases descritas en el Ejemplo 11. Después, los sólidos no disueltos (finos de la pasta de maíz que no se eliminaron antes de la fermentación) se recuperaron de cada caldo y se analizaron para determinar los aceites extraíbles totales. El aceite recuperado de cada lote de sólidos se analizó para determinar el OA y el aceite de maíz. Para ambos caldos se usó el siguiente protocolo: • El caldo se centrifugó para separar las fases orgánica, acuosa y sólida.
• Las fases orgánica y acuosa se decantaron fuera de los sólidos para dejar una torta húmeda en el fondo de la botella de la centrífuga.
• La torta húmeda se lavó a fondo con agua para eliminar prácticamente todos los sólidos disueltos retenidos en la torta, tales como oligosacáridos residuales, glucosa, sales, enzimas, etc.
• La torta húmeda lavada se secó en un horno de vacío de la noche a la mañana (vacío interno a 80 °C) para eliminar prácticamente toda el agua de la torta. • Una porción de los sólidos secos se puso en contacto con hexano en un extractor Soxhlet para eliminar el aceite de los sólidos.
• El aceite recuperado de los sólidos se analizó por medio de CG para determinar la cantidad relativa de OA y aceite de maíz presente en el aceite recuperado de los sólidos.
• Se midió una distribución del tamaño de partícula (PSD, por sus siglas en inglés) para los sólidos recuperados de los dos caldos de fermentación.
Los datos para la recuperación y extracción de hexanos de los sólidos no disueltos de los dos caldos de fermentación, se muestran en la Tabla 8 bis. Los datos muestran que los sólidos absorbieron aproximadamente la misma cantidad de aceite- (por unidad de masa de sólidos) en las dos fermentaciones .
Tabla 8 bis Ejemplo 15 Recuperación de almidón soluble de una torta húmeda generada por la eliminación de sólidos de pasta de maíz licuada por medio del lavado de la torta húmeda con agua - Proceso de dos etapas Este ejemplo demostró la recuperación de almidón soluble de una torta húmeda por medio del lavado de la torta dos veces con agua, en donde se generó la torta por el centrifugado de la pasta licuada. La pasta de maíz licuada se alimentó a una centrifuga con decantador continua para producir una corriente de centrado (C-l) y una torta húmeda (WC-1) . Como centrado se usó una solución acuosa de almidón soluble relativamente libre de sólidos y la torta húmeda se concentró en sólidos en comparación con la pasta de alimentación. Se mezcló una porción de la torta húmeda con agua caliente para formar una suspensión (S-l) . La suspensión se bombeó de nuevo a través de la centrifuga con decantador para producir un centrado de agua de lavado (C-2) y una torta húmeda lavada (WC-2) . El C-2 era una solución acuosa de almidón soluble diluida relativamente libre de sólidos. La concentración de almidón soluble en C-2 era menor que la concentración de almidón soluble en el centrado producido a partir de la separación de la pasta. La fase líquida mantenida en WC-2 estaba más diluida en almidón que el líquido en la torta húmeda producida a partir de la separación de la pasta. La torta húmeda lavada (WC-2) se mezcló con agua caliente para formar una suspensión (S-2) . La relación entre el agua cargada y la cantidad de almidón soluble en la torta húmeda cargada fue igual en ambas etapas de lavado. La segunda suspensión de lavado se bombeó > de nuevo a través de la centrífuga con decantador para producir un segundo centrado de agua de lavado (C-3) y una torta húmeda (WC-3) que se había lavado dos veces. El C-3 era una solución acuosa de almidón soluble diluida relativamente libre de sólidos. La concentración de almidón soluble en C-3 era menor que la concentración de almidón soluble en el centrado producido en la primera etapa de lavado (C-2) y, por lo tanto, la fase líquida retenida en WC-3 (segunda torta húmeda lavada) estaba más diluida en almidón que en WC-2 (primera torta húmeda lavada) . El almidón soluble total en los dos centrados de lavado (C-2 y C-3) es el almidón que se recuperó y podría reciclarse de nuevo a la licuación. El almidón soluble en el liquido retenido en la torta húmeda lavada final es mucho menor que en la torta húmeda producida en la separación original de la pasta.
Producción de pasta de maíz licuada Se produjo aproximadamente 3785.4 1 (1000 galones) de pasta de maíz licuada en un sistema de licuación de trituración en seco continuo que consiste en un molino triturador, un mezclador de suspensión, un tanque de suspensión y un tanque de licuación. Se alimentó maíz triturado, agua y alfa-amilasa en forma continua. Los reactores se equiparon con agitación mecánica, control de temperatura y control de pH con el uso de amoníaco o ácido sulfúrico. Las condiciones de la reacción fueron las siguientes : • Tamaño de tamiz del molino triturador: 0.28 cm (7/64") • Velocidades de alimentación al mezclador de la suspensión - Maíz triturado: 254.0 kg/h (560 lbm/h) (14.1 % en peso de humedad) - Agua del proceso: 7.5 kg/h (16.6 lbm/min) (93.3 °C (200 °F) ) - Alfa-amilasa : 61 g/h (Genecor: Spezyme® ALPHA) Condiciones del tanque de suspensión: - Temperatura: 85 °C (185 °F) - pH: 5.8 - Tiempo de permanencia: 0.5 h - Carga de maíz seco: 31 % en peso - Carga de enzimas: 0.028 % en peso (base de maíz seco) • Condiciones del tanque de licuación: - Temperatura: 85 °C (185 °F) - pH : 5.8 - Tiempo de permanencia: aproximadamente 3 h - Sin adición de enzima adicional.
La velocidad de producción de la pasta de maíz licuada fue de aproximadamente 3 gpm. El contenido de almidón del maíz triturado se midió en aproximadamente 70 % en peso sobre una base de maíz seco. La pasta licuada contenía un porcentaje de sólidos totales (TS, por sus siglas en inglés) de aproximadamente 31 % en peso y el porcentaje total de sólidos suspendidos (TSS, por sus siglas en inglés) fue de aproximadamente 7 % en peso. La fase líquida contenía aproximadamente 23-24 % en peso de almidón licuado según se midió por medio de HPLC (oligosacáridos solubles) .
La pasta licuada se centrifugó en una centrífuga con decantador continua en las siguientes condiciones: · Velocidad del tazón: 5000 rpm (aproximadamente 3600 g's) • Velocidad diferencial: 15 rpm • Diámetro de la presa: 185 mrn (placa de la placa de presa eliminada) · Velocidad de alimentación: De 5 a 20 gpm.
Se produjo aproximadamente 3217.6 1 (850 gal) de centrado y aproximadamente 635.0 kg (1400 lbm) de torta húmeda por el centrifugado de la pasta. Según las mediciones, la torta húmeda contenía un porcentaje de sólidos totales de aproximadamente 46.3 % (suspendidos + disueltos) en el balance de humedad. Dado un contenido de aproximadamente 23 % en peso de almidón soluble en la fase líquida, se calculó que el total de sólidos suspendidos en la torta húmeda era de aproximadamente 28 % en peso. Se calculó que la torta húmeda contenia aproximadamente 12 % del almidón soluble presente en la pasta licuada antes de la operación de la centrífuga.
Recuperación de almidón soluble de la torta húmeda por medio de lavado de los sólidos con agua - 1. lavado Se mezcló aproximadamente 320.7 kg (707 lbm) de la torta húmeda recuperada de la separación de la pasta licuada con 624.6 1 (165 gal) de agua caliente (91 °C) en un recipiente de acero inoxidable de 1135.6 1 (300 galones). La suspensión resultante se mezcló por aproximadamente 30 minutos. La suspensión se alimentó continuamente a una centrífuga con decantador para eliminar los sólidos lavados de la suspensión.
Para separar la suspensión de lavado se usó la misma centrífuga usada para eliminar sólidos de la pasta licuada anterior, y se enjuagó- con agua nueva antes de alimentar la suspensión. La centrífuga se usó en las siguientes condiciones para eliminar sólidos de la suspensión de pasta: • Velocidad del tazón: 5000 rpm (aproximadamente 3600 g's) • Velocidad diferencial: 5 rpm · Diámetro de la presa: 185 mm (placa de la presa eliminada) • Velocidad de alimentación: 5 gpm.
Se produjo aproximadamente 272.2 kg (600 lbm) de torta húmeda lavada por medio de la centrífuga, pero solo se recuperó 181.4 kg (400 lbm) debido a la pérdida de material.
Según las mediciones, la torta húmeda contenia un porcentaje de sólidos totales de aproximadamente 36.7 % (suspendidos + disueltos) en el balance de humedad. Según las mediciones por medio de HPLC, la cantidad de almidón soluble total (suma de glucosa, DP2, DP3 y DP4+ ) en la fase liquida de la suspensión y en el centrado de agua de lavado (obtenido de la suspensión) fue de aproximadamente 6.7 % en peso y 6.9 % en peso, respectivamente. DP2 se refiere a un polímero de dextrosa que contiene dos unidades de glucosa (dímero de glucosa) . DP3 se refiere a un polímero de dextrosa que contiene tres unidades de glucosa (trímero de glucosa) . DP4+-se refiere a un polímero de dextrosa que contiene cuatro o más unidades de glucosa (tetrámero de glucosa y superior) . Esto confirmó que se obtuvo una etapa de lavado de dilución bien mezclada. Por lo tanto, la concentración de almidón soluble en la fase líquida mantenida en la torta húmeda lavada debe haber sido aproximadamente 6.8 % en peso (en balance de masa) para este lavado de dilución. En base a los datos de sólidos totales y oligosacáridos disueltos se calculó que la cantidad de sólidos suspendidos totales en la torta húmeda lavada fue de aproximadamente 32 % en peso. Se calculó que la torta húmeda lavada contenía aproximadamente 2.6 % del almidón soluble presente en la pasta licuada original si se había lavado los 272.2 kg (600 lbm) de la torta producida por centrífuga. Esto representa una reducción de aproximadamente 78 % del almidón soluble en la torta húmeda lavada en comparación con la torta húmeda de la pasta antes del lavado. Si la torta húmeda producida a partir de la separación de pasta licuada no estuviera lavada, se perdería aproximadamente 12 % del almidón total en la pasta como almidón soluble (licuado) . Si la torta húmeda producida a partir de la separación de la pasta estuviera lavada con agua en las condiciones demostradas en este ejemplo, se perdería 2.6 % del almidón total de la pasta como almidón soluble (licuado) .
Se mezcló aproximadamente 181.4 kg (400 lbm) de la torta húmeda lavada recuperada del lavado de la primera resuspensión de la torta húmeda de la pasta licuada con 416.4 1 (110 gal) de agua caliente (90 °C) en un recipiente de acero inoxidable de 1135.6 1 (300 galones). La suspensión resultante se mezcló por aproximadamente 30 minutos. La suspensión se alimentó continuamente a una centrífuga con decantador para eliminar los sólidos lavados de la suspensión. Para separar la suspensión del segundo lavado se usó la misma centrífuga usada en el primer lavado anterior, y se enjuagó con agua nueva antes de alimentar la suspensión del segundo lavado. La centrífuga se usó en las siguientes condiciones para eliminar sólidos de la suspensión de pasta: • Velocidad del tazón: 5000 rpra (aproximadamente 3600 g's) • Velocidad diferencial: 5 rpm • Diámetro de la presa: 185 mm (placa de la presa eliminada) • Velocidad de alimentación: 4 gpm.
Se produjo aproximadamente 146.1 kg (322 lbm) de torta húmeda lavada por medio de la centrifuga. Según las mediciones, la torta húmeda del segunda lavado contenia un porcentaje de sólidos totales de aproximadamente 37.4 % (suspendidos + disueltos) en el balance de humedad. Según las mediciones por medio de HPLC, la cantidad de almidón soluble total (suma de glucosa, DP2, DP3 y DP4+ ) en la fase liquida de la suspensión y en el centrado de agua de lavado (obtenido de la suspensión) fue de aproximadamente 1.6 % en peso y 1.6 % en peso, respectivamente. Esto confirmó que se obtuvo una etapa de lavado de dilución bien mezclada en el segundo lavado. Por lo tanto, la concentración de almidón soluble en la fase liquida mantenida en la torta húmeda lavada debe haber sido de aproximadamente 1.6 % en peso (en balance de masa) para el lavado de esta dilución. En base a los datos de sólidos totales y oligosacáridos disueltos, se calculó que el total de sólidos suspendidos en la torta húmeda lavada fue de aproximadamente 36 % en peso. Se calculó que la torta húmeda lavada contenía aproximadamente 0.5 % del almidón soluble presente en la pasta licuada original si los 272.2 kg (600 lbm) de la torta producidos en la etapa del primer lavado se hubieran lavado. Esto representa una reducción general en el almidón soluble en la torta húmeda doblemente lavada en comparación con la torta húmeda de la pasta antes del lavado de aproximadamente 96 %. Si la torta húmeda producida a partir de la separación de pasta licuada no estuviera lavada, se perdería aproximadamente 12 % del almidón total en la pasta como almidón soluble (licuado) . Si la torta húmeda producida de la separación de pasta se lava dos veces con agua en las condiciones demostradas en este ejemplo, 0.5 % del almidón total de la pasta se perdería como almidón soluble (licuado) .
Ejemplo 16 Efecto de la etapa de temperatura alta durante la licuación en la conversión de almidón en sólidos de maíz a almidón soluble (licuado) Este ejemplo demuestra que cuando se realiza la licuación con una etapa de alta temperatura (o "cocción") en algún momento de la reacción, puede aumentar la conversión del almidón de los sólidos de maíz a almidón soluble (licuado). La etapa de "cocción" demostrada en este ejemplo implica el aumento de la temperatura de licuación en algún punto después de iniciada la licuación, el mantenimiento de la temperatura más alta por algún periodo de tiempo y, después, la reducción de la temperatura de nuevo hasta el valor original para completar la licuación.
A. Procedimiento para medir el almidón no hidrolizado que queda en los sólidos después de la licuación La pasta de maíz licuada se preparó en una prueba de conformidad con el protocolo del Ejemplo 1 (sin la etapa intermedia de alta temperatura) . La pasta de maíz licuada se preparó en otra prueba en las mismas condiciones que la primera prueba con la diferencia de que se añadió una etapa intermedia de alta temperatura. La pasta de las dos pruebas se generó de conformidad con las siguientes etapas. Se centrifugó para separar la solución acuosa de la pasta licuada de los sólidos no disueltos. La solución acuosa de almidón licuado se eliminó por decantación para recuperar la torta húmeda. La torta húmeda contenia la mayor parte de los sólidos no disueltos de la pasta, pero los sólidos aún estaban humedecidos por la solución de almidón licuada. La torta húmeda se lavó bien con agua y la suspensión posterior se centrifugó para separar la capa acuosa de los sólidos no disueltos. La torta se lavó un total de cinco veces con agua suficiente para eliminar aproximadamente todo el almidón soluble que se mantuvo en la torta húmeda original recuperada de la licuación. En consecuencia, la fase liquida mantenida en la torta húmeda lavada final consistía en agua que prácticamente no contenia almidón soluble.
La torta húmeda lavada final se resuspendió en agua y se añadió excedentes significativos de alfa-amilasa y glucoamilasa . La suspensión se mezcló por al menos 24 h mientras se controlaba la temperatura y el pH para permitir que la alfa-amilasa convirtiera prácticamente todo el almidón no hidrolizado restante en los sólidos no disueltos en oligosacáridos solubles. Posteriormente, la glucoamilasa presente convirtió los oligosacáridos solubles generados del almidón residual (que no se hidrolizó durante la licuación en las condiciones de interés) en glucosa. La concentración de glucosa se controló en función del tiempo por medio de HPLC para verificar que todos los oligosacáridos generados a partir del almidón residual se convirtieran en glucosa y que la concentración de glucosa dejara de aumentar con el tiempo.
B. Producción de pasta de maíz licuada Se preparó dos lotes de pasta de maíz licuada (aproximadamente 1 L cada uno) a 85 °C con el uso de Liquozyme® SC DS (alfa-amilasa de Novozymes, Franklinton, NC) . Ambos lotes estuvieron a una temperatura de 85 °C por poco más de 2 horas. Sin embargo, se añadió un periodo de "cocción" en la mitad del segundo lote ("Lote 2") . El perfil de temperatura para el Lote 2 fue de aproximadamente 30 minutos a 85 °C, el aumento de la temperatura de 85 °C a 101 °C, la retención a 101 °C por aproximadamente 30 minutos, el enfriamiento hasta 85 °C y la licuación por otros 120 minutos. El maíz triturado usado en ambos lotes fue el mismo que en el Ejemplo 1. En ambos lotes se usó una carga de maíz de 26 % en peso (base de maíz seco) . La cantidad total de enzima usada en ambas pruebas correspondía a 0.08 % en peso (base de maíz seco). El pH se controló en 5.8 durante ambas pruebas de licuación. Las licuaciones se realizaron en un reactor de resina con camisa de vidrio. El reactor se configuró con agitación mecánica, control de temperatura y control del pH .
La pasta de maíz licuada para el Lote 1 se preparó de conformidad con el siguiente protocolo: • Se diluyó la alfa-amilasa en agua corriente (0.418 g de enzima en 20.802 g de agua) • Se cargó 704.5 g de agua corriente en el reactor • Se activó el agitador • Se realizó la primera carga de maíz triturado, 198 g • Se calentó hasta 55 °C mientras se agitaba • Se ajustó el pH . hasta 5.8 con el uso de H2SO4 o NaOH • Se realizó la primera carga de solución de alfa- amilasa, 7.111 g • Se calentó hasta 85 °C • Se mantuvo a 85 °C por 30 minutos • Se realizó la segunda carga de solución de alfa- amilasa, 3.501 g • Se realizó la segunda carga de maíz triturado, 97.5 g • La prueba continuó a 85 °C por otros 100 minutos .
• Después de completar la licuación, se enfrió hasta 60 °C • El reactor se vació y se recuperó 998.5 g de pasta licuada.
La pasta de maíz licuada para el Lote 2 se preparó de conformidad con el siguiente protocolo: • Se diluyó la alfa-amilasa en agua corriente (0.3366 g de enzima en 16.642 g de agua) • Se cargó 562.6 g de agua corriente en el reactor • Se activó el agitador • Se cargó maíz triturado, 237.5 g • Se calentó hasta 55 °C mientras se agitaba • Se ajustó el pH hasta 5.8 con el uso de H2SO4 o NaOH diluido • Se realizó la primera carga de solución de alfa- amilasa, 4.25 g • Se calentó hasta 85 °C • Se mantuvo a 85 °C por 30 minutos • Se calentó hasta 101 °C • Se mantuvo a 101 °C por 30 minutos • Se redujo la temperatura de la pasta de nuevo hasta 85 °C • Se ajustó el pH hasta 5.8 con el uso de H2S04 o NaOH diluido • Se realizó la segunda carga de solución de alfa- amilasa, 4.2439 g • La prueba continuó a 85 °C por otros 120 minutos .
• Después de completar la licuación, se enfrió hasta 60 °C.
C. Eliminación de sólidos no disueltos de la pasta licuada y lavado de la torta húmeda con agua para eliminar el almidón soluble Se eliminó la mayor parte de los sólidos de ambos lotes de pasta licuada por el centrifugado de estos en una centrifuga de piso grande a 5000 rpm por 20 minutos a temperatura ambiente. La centrifugación de 500 g de pasta del Lote 1 produjo 334.1 g de centrado y 165.9 g de torta húmeda. La centrifugación de 872 g de pasta del Lote 2 produjo 654.7 g de centrado y 217 g de torta húmeda. Las tortas húmedas recuperadas de cada lote de pasta licuada se lavaron cinco veces con agua corriente para eliminar prác icamente todo el almidón soluble retenido en las tortas. Los lavados se realizaron en la misma botella usada para centrifugar la pasta original para evitar transferir la torta entre recipientes. Para cada etapa de lavado se mezcló la torta con agua y la suspensión de lavado resultante se centrifugó (5000 rpm por 20 minutos) a temperatura ambiente. Esto se hizo para las cinco etapas de lavado realizadas en las tortas húmedas recuperadas de ambos lotes de pasta. Cada uno de los cinco lavados de la torta húmeda del Lote 1 se realizó con aproximadamente 165 g de agua y resultó en una cantidad total de 828.7 g de agua usada para lavar la torta húmeda del Lote 1. Cada uno de los cinco lavados de la torta húmeda del Lote 2 se realizó con aproximadamente 500 g de agua y resultó en una cantidad total de 2500 g de agua usada para lavar la torta húmeda del Lote 2. El centrado del lavado total recuperado de los cinco lavados con agua de la torta húmeda del Lote 1 fue 893.1 g. El centrado del lavado total recuperado de los cinco lavados con agua de la torta húmeda del Lote 2 fue 2566.3 g. La torta húmeda lavada final recuperada del Lote 1 fue 101.5 g, y la torta húmeda lavada final recuperada del Lote 2 fue de 151.0 g. Las tortas húmedas lavadas finales obtenidas de cada lote prácticamente no contenían almidón soluble; por lo tanto, el líquido retenido en cada torta era, mayormente, agua. Los sólidos totales (TS, por sus siglas en inglés) de las tortas húmedas se calcularon por medio de balance de humedad. La cantidad de sólidos totales de la torta húmeda del Lote 1 fue de 21.63 % en peso y la cantidad de TS de la torta húmeda del Lote 2 fue de 23.66 % en peso .
D. Licuación/Sacarificación de la torta húmeda lavada para determinar el nivel de almidón no hidrolizado que queda en los sólidos no disueltos después de la licuación El nivel de almidón no hidrolizado que queda en los sólidos presentes en ambas tortas húmedas lavadas se midió por medio de la resuspensión de las tortas en agua y la adición de alfa-amilasa en exceso y glucoamilasa en exceso.
La alfa-amilasa convierte el almidón no hidrolizado residual en los sólidos a oligosacáridos solubles que se disuelven en la fase acuosa de la suspensión. Posteriormente, la glucoamilasa convierte los oligosacáridos solubles generados por la alfa-amilasa en glucosa. Las reacciones se realizaron a 55 °C (temperatura máxima recomendada para la glucoamilasa) por al menos 24 horas para asegurar que todo el almidón residual en los sólidos se convirtiera a oligosacáridos solubles y que todos los oligosacáridos solubles se convirtieran a glucosa. El almidón no hidrolizado residual que estaba en los sólidos, que es el almidón que no se hidrolizó durante la licuación, puede calcularse a partir de la cantidad de glucosa generada por este procedimiento.
Las enzimas alfa-amilasa y glucoamilasa usadas en los siguientes protocolos fueron Liquozyme® SC DS y Spirizyme® Fuel, respectivamente (Novozymes, Franklinton, NC) . Como recipiente para tratar las tortas húmedas lavadas se usó un reactor de resina con camisa de vidrio equipado con agitación mecánica, control de temperatura y control del pH. La cantidad de Liquozyme® usada corresponde a una carga de enzimas de 0.08 % en peso sobre una "base de maiz seco". La cantidad de Spirizyme® usada corresponde a una carga de enzimas de 0.2 % en peso sobre una "base de maiz seco". Esta base se define como la cantidad de maiz triturado necesaria para producir la cantidad de sólidos no disueltos mantenidas en las tortas lavadas bajo la presunción de que todo el almidón se hidroliza a oligosacáridos solubles. Se considera que los sólidos no disueltos retenidos en las tortas lavadas son, mayormente, la parte no fermentable, distinta al almidón, del maiz. Estas cargas de enzimas son al menos cuatro veces mayores que las necesarias para producir la licuación y sacarificación completa a una carga de maiz del 26 %. El excedente de las enzimas usadas fue alto para garantizar la hidrólisis completa del almidón residual en los sólidos y la conversión completa de los oligosacáridos en glucosa .
Para determinar el nivel de almidón no hidrolizado en los sólidos presentes en la torta húmeda lavada a partir de la pasta del Lote 1 se usó el siguiente protocolo: • Se diluyó la alfa-amilasa en agua corriente (0.1297 g de enzima en 10.3607 g de agua) • La glucoamilasa se diluyó en agua corriente (0.3212 g de enzima en 15.6054 g de agua) • Se cargó 132 g de agua corriente en el reactor « Se activó el agitador • Se cargó 68 g de la torta húmeda lavada producida del Lote de licuación 1 (TS=21.63 % en peso) • Se calentó hasta 55 °C mientras se agitaba · Se ajustó el pH hasta 5.5 con el uso de H2S04 o NaOH diluido • Se cargó la solución de alfa-amilasa, 3.4992 g • Se cargó la solución de glucoamilasa, 5.319 g • Se realizó la prueba a 55 °C por 24 horas mientras se controló el pH a 5.5 y se muestreaba periódicamente la suspensión con respecto a la glucosa .
Para determinar el nivel de almidón no hidrolizado en los sólidos presentes en la torta húmeda lavada a partir del Lote 2 se usó el siguiente protocolo.
• Se diluyó la alfa-amilasa en agua corriente (0.2384 g de enzima en 11.709 g de agua) • La glucoamilasa se diluyó en agua corriente (0.3509 g de enzima en 17.5538 g de agua) · Se cargó 154.3 g de agua corriente en el reactor • Se activó el agitador • Se cargó 70.7 g de la torta húmeda lavada producida del lote de licuación 1 (TS=23.66 % en peso) • Se calentó hasta 55 °C mientras se agitaba • Se ajustó el pH hasta 5.5 con el uso de H2S04 o NaOH diluido • Se cargó la solución de alfa-amilasa, 2.393 g • Se cargó la solución de glucoamilasa, 5.9701 g • Se realizó la prueba a 55 °C por 24 horas mientras se controlaba el pH a 5.5 y se muestreaba periódicamente la suspensión con respecto a la glucosa.
Comparación de los resultados para la licuación/sacarificación de las tortas húmedas lavadas Tal como se describió anteriormente, las tortas húmedas lavadas de los Lotes 1 y 2 se suspendieron otra vez en agua y se añadió excesos significativos de alfa-amilasa y glucoamilasa en las suspensiones para hidrolizar cualquier almidón restante en los sólidos y convertirlo en glucosa. La Fig. 11 muestra la concentración de glucosa en la fase acuosa de las suspensiones como una función del tiempo.
La concentración de glucosa aumentó con el tiempo y se niveló en un valor máximo a aproximadamente 24 horas para ambas reacciones. La reducción mínima observada en la glucosa entre 24 y 48 horas podría haber sido producida por contaminación microbiana; por lo tanto, el nivel máximo de glucosa alcanzado en cada sistema se usó para calcular el nivel de almidón residual no hidrolizado que estaba en los sólidos de la torta húmeda lavada. El nivel máximo de glucosa alcanzado mediante la reacción (en presencia de alfa-amilasa y glucoamilasa ) de la torta húmeda lavada obtenida de la licuación del Lote 1 fue de 4.48 g/1. Por comparación, el nivel de glucosa máximo alcanzado mediante la reacción (en presencia de alfa-amilasa y glucoamilasa) de la torta húmeda lavada obtenida de la licuación del Lote 2 fue de 2.39 g/1.
El nivel de almidón no hidrolizado residual que estaba en los sólidos no disueltos en la pasta licuada (que no se hidrolizó durante la licuación) se calculó en base a los datos de glucosa obtenidos de la torta húmeda lavada obtenida del lote de pasta correspondiente.
• Lote de licuación 1: El almidón residual no hidrolizado en los sólidos corresponde a 2.1 % del almidón total en el maíz alimentado a la licuación. Esto implica que 2.1 % del almidón en el maíz no se hidrolizó durante las condiciones de licuación del Lote 1. No se realizó una etapa intermedia de temperatura alta ("cocción") durante el Lote de licuación 1.
• Lote de licuación 2: El almidón residual no hidrolizado en los sólidos corresponde a 1.1 % del almidón total en el maíz alimentado a la licuación. Esto implica que 1.1 % del almidón en el maíz no se hidrolizó durante las condiciones de licuación del Lote 2. Durante el Lote de licuación 2 se realizó una etapa de alta temperatura ("cocción") .
Este ejemplo demuestra que la adición de una etapa de "cocción" a temperatura alta en algún tiempo durante la licuación podría producir una mayor conversión del almidón. Esto producirá menos almidón residual no hidrolizado restante en los sólidos no disueltos en la pasta de maíz licuada y llevará a una pérdida de almidón menor en un proceso en el cual se eliminan los sólidos no disueltos de la pasta antes de la licuación.
Ejemplo 17 Efecto de la etapa de temperatura alta durante la licuación en la conversión de almidón en sólidos de maíz a almidón soluble (licuado) Se preparó dos lotes de pasta de maíz licuada (Lote 3 y Lote 4) a 85 °C con el uso de Liquozyme® SC DS (alfa-amilasa de Novozymes, Franklinton, NC) . Ambos lotes se mantuvieron a 85 °C por poco más de 2 horas. Sin embargo, se añadió un periodo de "cocción" en la mitad del Lote 4. El perfil de temperatura para el Lote 4 fue de aproximadamente 30 minutos a 85 °C, el aumento de la temperatura de 85 °C a 121 °C, la retención a 121 °C por aproximadamente 30 minutos, el enfriamiento hasta 85 °C y la licuación por otros 90 minutos. El maiz triturado usado en ambos lotes fue el mismo que en el Ejemplo 1. En ambos lotes se usó una carga de maíz de 26 % en peso (base de maiz seco) . La cantidad total de enzima usada en ambas pruebas correspondía a 0.04 % en peso (base de maíz seco). El pH se controló en 5.8 durante ambas pruebas de licuación. La licuación para el Lote 3 se realizó en un reactor de resina con camisa de vidrio de 1 L y la licuación para el Lote 4 se realizó en un fermentador de acero inoxidable de 200 L. Ambos reactores se equiparon con agitación mecánica, control de temperatura y control del pH.
Las condiciones experimentales para este ejemplo fueron similares a las descritas para el Ejemplo 14 con las siguientes diferencias: Para la producción de pasta de maíz licuada para el Lote 3: se diluyó 0.211 g de alfa-amilasa en 10.403 g de agua corriente. La primera carga de solución de alfa-amilasa fue de 3.556 g. La segunda carga de solución de alfa-amilasa fue de 1.755 g y la reacción continuó a 85 °C por otros 90 minutos .
Para la producción de pasta de maíz licuada para el Lote 4: Se diluyó 22 g de alfa-amilasa en 2 kg de agua corriente, se cargó 147.9 kg de agua corriente en el fermentador y se cargó 61.8 kg de maíz triturado. La primera carga de solución de alfa-amilasa fue de 1.0 kg, la reacción se calentó hasta 85 °C y se mantuvo a 85 °C por 30 minutos, después, la reacción se calentó hasta 121 °C y se mantuvo a 121 °C por 30 minutos. La segunda carga de solución de alfa-amilasa fue de 1 kg y la reacción continuó a 85 °C por otros 90 minutos.
Eliminación de sólidos no disueltos de la pasta licuada y lavado de la torta húmeda con agua para eliminar el almidón soluble Se eliminó la mayor parte de los sólidos de ambos lotes de pasta licuada por el centrifugado de estos en una centrifuga de piso grande a 5000 rpm por 15 minutos a temperatura ambiente. La centrifugación de 500.1 g de pasta del Lote 3 produjo 337.2 g de centrado y 162.9 g de torta húmeda. La centrifugación de 509.7 g de pasta del Lote 4 produjo 346.3 g de centrado y 163.4 g de torta húmeda. Las tortas húmedas recuperadas de cada lote de pasta licuada se lavaron cinco veces con agua corriente para eliminar prácticamente todo el almidón soluble retenido en las tortas. Los lavados se realizaron en la misma botella usada para centrifugar la pasta original para evitar transferir la torta entre recipientes. Para cada etapa de lavado se mezcló la torta con agua y la suspensión de lavado resultante se centrifugó (5000 rpm por 15 minutos) a temperatura ambiente.
Esto se hizo para las cinco etapas de lavado realizadas en las tortas húmedas recuperadas de ambos lotes de pasta. Cada uno de los cinco lavados de la torta húmeda del Lote 3 se realizó con aproximadamente 164 g de agua y resultó en una cantidad total de 819.8 g de agua usada para lavar la torta húmeda del Lote 3. Cada uno de los cinco lavados de la torta húmeda del Lote 4 se realizó con aproximadamente 400 g de agua y resultó en una cantidad total de 2000 g de agua usada para lavar la torta húmeda del Lote 4. El centrado del lavado total recuperado de los cinco lavados con agua de la torta húmeda del Lote 3 fue 879.5 g. El centrado del lavado total recuperado de los cinco lavados con agua de la torta húmeda del Lote 4 fue 2048.8 g. La torta húmeda lavada final recuperada del Lote 3 fue de 103.2 g, y la torta húmeda lavada final recuperada del Lote 4 fue de 114.6 g. Las tortas húmedas lavadas finales obtenidas de cada lote prácticamente no contenían almidón soluble; por lo tanto, el líquido retenido en cada torta era mayormente agua. Los sólidos totales (TS, por sus siglas en inglés) de las tortas húmedas se midieron por medio de balance de humedad. La cantidad de sólidos totales de la torta húmeda del Lote 3 fue de 21.88 % en peso, y la cantidad de TS para la torta húmeda del Lote 4 fue de 18.1 % en peso.
Las condiciones experimentales para este ejemplo fueron similares a las descritas para el Ejemplo 14 con las siguientes diferencias: Para la licuación/sacarificación de la torta húmeda lavada para determinar el nivel de almidón no hidrolizado que queda en los sólidos no disueltos después de la licuación para el Lote 3 Se cargó 68 g de la torta húmeda lavada producida por la licuación del Lote 3 (TS = 21.88 % en peso) . Se cargó 3.4984 g de solución de alfa-amilasa y 5.3042 g de glucoamilasa . La reacción se realizó a 55 °C por 47 h mientras se controlaba el pH a 5.5 y se muestreaba periódicamente la suspensión para determinar la glucosa.
Para la licuación/sacarificación de la torta húmeda lavada para determinar el nivel de almidón no hidrolizado que queda en los sólidos no disueltos después de la licuación para el Lote 4 Se diluyó 0.1663 g de alfa-amilasa en 13.8139 g de agua corriente y se diluyó 0.213 g de glucoamilasa en 20.8002 g de agua corriente. Se cargó 117.8 g de agua corriente en el reactor. Se cargó 82.24 g de la torta húmeda lavada producida por la licuación del Lote 4 (TS = 18.1 % en peso) . Se cargó 3.4952 g de solución de alfa-amilasa y 10.510 g de glucoamilasa. La reacción se realizó a 55 °C por 50 horas mientras se controlaba el pH a 5.5 y se muestreaba periódicamente la suspensión para determinar la glucosa.
Comparación de los resultados para la licuación/sacarificación de las tortas húmedas lavadas Tal como se describió anteriormente, las tortas húmedas lavadas de los Lotes 3 y 4 se suspendieron otra vez en agua y se añadió excesos significativos de alfa-amilasa y glucoamilasa en las suspensiones para hidrolizar cualquier almidón restante en los sólidos y convertirlo en glucosa. La Figura 12 muestra la concentración de glucosa en la fase acuosa de las suspensiones como una función del tiempo.
La concentración de glucosa aumentó con el tiempo y se niveló en un valor máximo a aproximadamente 26 horas para la torta húmeda lavada del Lote 3. Para la torta húmeda lavada del Lote 4, la concentración de glucosa continuó aumentado ligeramente entre las 24 horas y las 47 horas. Se asume que la concentración de glucosa medida a 47 h para la torta húmeda del Lote 4 es aproximadamente igual al valor máximo. El nivel máximo de glucosa alcanzado mediante la reacción (en presencia de alfa-amilasa y glucoamilasa) de la torta húmeda lavada obtenida de la licuación del Lote 3 fue de 8.33 g/1. Por comparación, el nivel de glucosa máximo alcanzado mediante la reacción (en presencia de alfa-amilasa y glucoamilasa) de la torta húmeda lavada obtenida de la licuación del Lote 4 fue de 4.92 g/1.
El nivel de almidón no hidrolizado residual que estaba en los sólidos no disueltos en la pasta licuada (que no se hidrolizó durante la licuación) se calculó en base a los datos de glucosa obtenidos de la "hidrólisis" de la torta húmeda lavada (en presencia de un exceso de alfa-amilasa y glucoamilasa) obtenida del lote de pasta correspondiente.
• Lote de licuación 3: El almidón residual no hidrolizado en los sólidos corresponde a 3.8 % del almidón total en el maiz alimentado a la licuación. Esto implica que 3.8 % del almidón en el maiz no se hidrolizó durante las condiciones de licuación del Lote 3. No se realizó una etapa intermedia de temperatura alta ("cocción") durante el Lote de licuación 3.
• Lote de licuación 4: El almidón residual no hidrolizado en los sólidos corresponde a 2.2 % del almidón total en el maiz alimentado a la licuación. Esto implica que 2.2 % del almidón en el maiz no se hidrolizó durante las condiciones de licuación del Lote 4. Durante el Lote de licuación 4 se realizó una etapa de alta temperatura ("cocción") .
Este ejemplo demuestra que la adición de una etapa de "cocción" a temperatura alta en algún tiempo durante la licuación podría producir una mayor conversión del almidón. Esto producirá menos almidón residual no hidrolizado restante en los sólidos no disueltos en la pasta de maíz licuada y llevará a una pérdida de almidón menor en un proceso en el cual se eliminan los sólidos no disueltos de la pasta antes de la licuación.
Resumen y comparación de los Ejemplos 16 y 17 Las condiciones de licuación pueden influir en la conversión del almidón en los sólidos de maíz a almidón soluble (licuado) . Las condiciones de licuación posibles que podrían afectar la conversión de almidón en el maíz triturado a almidón soluble son la temperatura, la carga de enzimas (alfa-amilasa) y +/- una etapa de alta temperatura ("cocción") que se produce en el mismo tiempo durante la licuación. Los Ejemplos 16 y 17 demostraron que la implementación de una¦ etapa de alta temperatura ("cocción") en algún momento durante la licuación puede producir una conversión mayor del almidón en los sólidos de maíz a almidón soluble (licuado) . La etapa de alta temperatura en las licuaciones descritas en los Ejemplos 16 y 17 implicó elevar la temperatura de licuación en algún punto después de iniciada la licuación, mantener a la temperatura más alta por algún periodo de tiempo y, después, reducir la temperatura de nuevo hasta el valor original para completar la licuación.' Las reacciones de licuación comparadas en el Ejemplo 16 se realizaron a una carga de enzimas diferente a la de las reacciones comparadas en el Ejemplo 17. Estos ejemplos demuestran el efecto de las dos condiciones de licuación principales en la conversión del almidón: (1) carga de enzimas, y (2) +/- una etapa de alta temperatura que se aplica en algún momento durante la licuación.
Las condiciones usadas para preparar los cuatro lotes de pasta de maíz licuada descritos en os Ejemplos 16 y 17 se resumen a continuación y en la Tabla 9.
Condiciones comunes para todos los lotes: • Temperatura de licuación - 85 °C • Tiempo total a la temperatura de licuación aproximadamente 2 h • Tamaño del tamiz usado para triturar el maíz - 1 mm • pH - 5.8 • Carga del maíz seco - 26 % • Alfa-amilasa - Liquozyme® SC DS (Novozymes, Franklinton, NC) .
Tabla 9 El perfil de temperatura para los Lotes 2 y 4 fue el siguiente (todos los valores son aproximados) : 85 °C por 30 minutos, etapa de temperatura alta por 30 minutos, 85 °C por 90 min. Se añadió la mitad de la enzima antes del periodo inicial de 85 °C y la otra mitad se añadió después de la etapa de alta temperatura para el periodo final de 85 °C.
La FIG. 13 ilustra el efecto de la carga de enzimas y una +/- una etapa de temperatura alta aplicada en algún momento durante la licuación en la conversión de almidón. El nivel de almidón residual no hidrolizado en los sólidos es el almidón que no se hidrolizó durante las condiciones de licuación de interés. La Figura 13 muestra que el nivel de almidón no hidrolizado en los sólidos se redujo en casi la mitad por la aplicación de una etapa de temperatura alta ("cocción") en algún punto durante la licuación. Esto se demostró en dos cargas de enzimas diferentes. Los datos en la Figura 13 demuestran, además, que al duplicar la carga de enzimas se produjo casi la mitad del nivel de almidón no hidrolizado restante en los sólidos independientemente de que se haya aplicado una etapa de alta temperatura durante la licuación o no. Estos ejemplos demuestran que cuando se realiza la licuación con una carga mayor de enzima (alfa-amilasa) y/o con la adición de una etapa de temperatura alta ("cocción") en algún momento de la reacción podría producirse una reducción significativa en el almidón no hidrolizado en los sólidos no disueltos presentes en la pasta de maíz licuada y puede reducir la pérdida de almidón en un proceso en el cual los sólidos no disueltos se eliminan de la pasta antes de la licuación. Cualquier almidón residual en los sólidos después de la licuación no podrá hidrolizarse durante la fermentación en un proceso en el cual los sólidos se eliminan antes de la fermentación.
Ejemplo 18 Separación en tamiz del almidón y los no solubles después de la digestión con enzimas a 85 °C La pasta (301 gramos) preparada según el método descrito en el Ejemplo 1 se mantuvo a pH 5.8 con el uso de gotas de solución de NaOH en los casos en que se requirió un ajuste, se trató con una dosis especifica del proveedor de aproximadamente 0.064 gramos de enzima alfa-amilasa Liquozyme® (Novozyme, Franklinton, NC) y se mantuvo a 85 °C por cinco horas. El producto se refrigeró.
El producto refrigerado se calentó hasta aproximadamente 50 °C y se vertió 48 g sobre una unidad de filtro que contenia un tamiz de malla 100 y que estaba conectado a una fuente de vacío casera a una presión de -50.8 a -67.7 kPa (-15 pulg de Hg y -20 pulg de Hg) . El plato del tamiz tenia un área de superficie del tamiz expuesta de 44 cm2 y estaba sellado dentro de un alojamiento de filtro de plástico provisto por Nalgene® (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY) . La suspensión se filtró para formar una torta húmeda en la malla y un filtrado amarillo turbio de 40.4 g en la botella receptora. La torta húmeda se lavó inmediatamente en el lugar con agua y, después, se interrumpió mientras la fuente de vacío extraía cualquier resto de humedad libre a través de la torta lavada final. La filtración concluyó cuando cesó el goteo de la parte inferior del filtro. Se recolectó 28.5 g adicionales de filtrado de lavado durante 3 etapas en donde la etapa final del filtrado reveló el menor color y turbidez. La masa de la torta húmeda final de 7.6 g se secó al aire hasta 2.1 g durante 24 horas a temperatura ambiente. Se determinó que los 2.1 g contenían 7.73 % de agua después del secado con una lámpara de calor. La filtración al vacío de este experimento generó una torta húmeda que contenía 25 % de sólidos secos totales.
Se combinó una muestra de filtrado con alcohol oleílico a temperatura ambiente, se mezcló vigorosamente, y se dejó asentar. La interfase se restauró en aproximadamente 15 minutos, pero quedó una capa de emulsión turbia.
La solución de Lugol (indicador de almidón) que consistía en 1 g de yodo al >99.99 % (base de metales traza), 2 g de yoduro de potasio de calidad ReagentPlus® (>99 %) (ambos de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y 17 g de agua desionizada casera en la cantidad de una gota se añadió a las muestras del filtrado, sólidos de torta seca resuspendidos en agua y una muestra de control de agua. El color del filtrado cambió a azul oscuro o púrpura, el color de la suspensión de sólidos cambió a azul muy oscuro y el color del agua cambió a ámbar claro. Cualquier color más oscuro que el ámbar indica la presencia de oligosacáridos con una longitud mayor que 12 unidades .
Este experimento ilustró que la mayor parte de los sólidos suspendidos podrían separarse de la solución de almidón preparada tal como se describió anteriormente a una velocidad moderada en un tamiz de malla 100 y que el almidón queda retenido con los sólidos de la torta de filtro. Esto indica un lavado incompleto de la torta, en donde queda una porción de almidón hidrolizado.
Este experimento se repitió con 156 gramos de pasta en un tamiz de malla 100 de 63 mm de diámetro. La temperatura máxima fue de 102 °C, la enzima fue Spezyme®, y la suspensión se mantuvo a una temperatura superior a 85 °C por tres horas. Se midió la velocidad de tamizado y se determinó que esta velocidad era de 0.16 o menos litros por minuto por metro cuadrado (0.004 o menos galones por minuto por pie cuadrado) de área de tamiz.
Ejemplo 19 Separación en tamiz del almidón y los no solubles después de la digestión con enzimas a 115 °C Se cargó agua desionizada casera (200 g) en un recipiente de presión de 1 litro Parr Modelo 4635 abierto (Moline, IL) y se calentó hasta una temperatura de 85 °C. El agua se agitó con una barra agitadora magnética. Se agregaron cucharadas de maíz triturado seco (90 g) preparado tal como se describe en el Ejemplo 1. El pH se incrementó de 5.2 a casi 6.0 con solución de amoniaco acuosa matriz. Se añadió aproximadamente 0.064 gramos de solución de Liquozyme® con una pipeta calibrada pequeña. Se selló la tapa del recipiente de presión y el recipiente se presurizó hasta 50 psig con nitrógeno casero. La mezcla agitada se calentó hasta 110 °C dentro de 6 minutos y se mantuvo a una temperatura de 106 a 116 °C por un total de 20 minutos. El calentamiento se redujo, la presión se alivió y el recipiente se abrió. Se añadió 0.064 g de Liquozyme® adicional y la temperatura se mantuvo a 63-75 °C por otros 142 minutos.
Se tomó una cantidad pequeña de la suspensión del recipiente Parr y se tamizó por gravedad a través de una pila de tamices de malla 100, 140 y 170. Los sólidos se retuvieron solamente en el tamiz de malla 100.
Se transfirió una porción de aproximadamente 40 % de la suspensión mientras estaba caliente sobre la parte superior de una unidad de tamiz doble de platos de malla 100 y 200 con un diámetro de 75 milímetros. Se produjo cierta filtración pro gravedad. Se extrajo un vacio, -50.8 a -67.7 kPa (-15 a -20 pulgadas de mercurio) , al receptor del filtrado y se estableció una filtración firme. El filtrado era amarillo y turbio, pero con una dispersión estable. La superficie de la torta se expuso dentro de los 5 minutos. La torta se lavó con un rociador de agua desionizada por 2 a 3 minuto y se repitió con un cambio del receptor hasta que la turbidez del filtrado fue constante: un total de cinco rociados. Los tamices se examinaron y se llegó a la conclusión de que todos los sólidos estaban en el tamiz de malla 100 y que no había ninguno en el de malla 200. La torta húmeda tenía un grosor de 5 mm. El valor medido para la masa de torta húmeda fue de 18.9 g y de 192 g para las masas de filtrado combinadas.
La masa de suspensión restante se transfirió a la unidad de filtro con un tamiz de malla 100 a 65 °C y se filtró durante 5 a 10 minutos. La torta se lavó con un rociador de agua desionizada por 3 a 4 minutos y se repitió con un cambio del receptor hasta que la turbidez del filtrado fue constante: un total de ocho rociados. El vacio continuó hasta que no se observaron más gotas cayendo de la parte inferior del filtro. La torta húmeda tenia un espesor de 8 mm y un diámetro de 75 mm con una masa de 36.6 g. Los filtrados combinados pesaron 261 g.
Se probaron tres viales para determinar el almidón por medio del método descrito anteriormente. Un vial contenia agua y los otros dos contenían muestras de torta húmeda suspendida en agua desionizada. Todos los viales cambiaron a un color amarillo-ámbar. A partir de ello se interpretó que la torta de filtro se lavó de modo que quedara libre de oligosacáridos de almidón. Después, estos sólidos se analizaron detalladamente con licuación prolongada y sacarificación posterior para confirmar que sobre una base de glucosa la torta húmeda no contenia más de 0.2 % del almidón total presente en el maíz original.
Se combinó una muestra de filtrado con alcohol oleílico en un vial, se mezcló vigorosamente y se dejó asentar. Se obtuvo rápidamente una capa de aceite claro y la interfase estaba bien definida con una pequeña capa de emulsión. Este ejemplo ilustra que en un proceso en el cual se calienta pasta de maíz hasta condiciones hidrotérmicas de ~110 °C por 20 minutos de cocción y, además, se licúa por más de dos horas a 85 °C antes de su filtración y lavado; el filtrado total contiene prácticamente todo el almidón suministrado en el grano. Además, no se observó una interferencia significativa entre el alcohol oleilico y las impurezas contenidas en el filtrado.
Este experimento se repitió con 247 gramos de pasta en un tamiz de malla 80 de 75 mm de diámetro. La temperatura de cocción máxima fue de 115 °C, la enzima usada fue Liquozyme® y la suspensión se mantuvo en o mayor que 85 °C por tres horas. Se midió la velocidad de tamizado y se determinó que esta velocidad era mayor que 4.13 1 por minuto por metro cuadrado (0.1 galones por minuto por pie cuadrado) de área de tamiz .
Ejemplo 20 Análisis de lipidos Se realizó el análisis de lipidos por medio de la conversión de las diversas clases de compuestos que contienen ácidos grasos a ásteres metílicos de ácidos grasos ( "FAME", por sus siglas en inglés) por medio de transesterificacíón . Los glicéridos y fosfolípidos se transesterificaron con metóxido de sodio en metanol. Los glicéridos, fosfolípidos y ácidos grasos libres se transesterificaron con cloruro de acetilo en metanol. Los FAME resultantes se analizaron por medio de cromatografía de gases con un CG Agilent 7890 equipado con una columna de 30-m X 0.25 mm (i.d.) OMEGAWAX™ (Supelco, SigmaAldrich, St. Louis, MO) después de la dilución en tolueno/hexano (2:3) . La temperatura del horno aumentó de 160 °C a 200 °C a 5 °C/min, después, de 200 °C a 250 °C (retención por 10 min) a 10 °C/min. Se identificaron los picos de FAME registrados por medio de análisis de CG por sus tiempos de retención cuando se compararon con los de ésteres metílicos (ME, por sus siglas en inglés) conocidos, y se cuantificaron mediante la comparación de las áreas pico de FAME con las del estándar interno ( riglicérido C15:0 tomado a través del procedimiento de transesterificación con la muestra) de cantidad conocida. Por lo tanto, la cantidad aproximada (mg) de cualquier FAME de ácido graso ("mg de FAME") se calcula de conformidad con la fórmula: (área del pico de FAME para el ácido graso/área especificado del pico de FAME 15:0) * (mg del estándar interno C15:0 FAME). Después, el resultado de FAME puede corregirse a mg del ácido graso correspondiente por medio de la división por el factor de conversión de peso molecular apropiado de 1.052. Todos los estándares internos y de referencia se obtienen de Nu-Chek Prep, Inc.
Los resultados de ácidos grasos obtenidos de muestras transesterificadas con el uso de metóxido de sodio en metanol se convierten a los niveles de triglicéridos- correspondientes por medio de la multiplicación del factor de conversión del peso molecular de 1.045. Generalmente, aproximadamente 80 a 90 % de los glicéridos en los estudios de muestras para este ejemplo consisten en t riglicéridos y el resto consiste en diglicéridos . El contenido de monoglicéridos y fosfolípidos es, generalmente, insignificante. Los resultados de los ácidos grasos totales obtenidos para una muestra transesterificada con cloruro de acetilo en metanol se corrigen para el contenido de glicéridos por medio de la resta de los ácidos grasos determinados para la misma muestra con el procedimiento en el que se usa metóxido de sodio. El resultado es el contenido de ácidos grasos libres de la muestra.
La distribución del contenido de glicéridos (monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos y fosfolípidos) se determina por medio de cromatografía en capa delgada. Se mancha una solución 'del aceite disuelta en 6:1 de clorof ormo/metanol cerca del fondo de una placa de vidrio recubierta previamente con gel de sílice. Después, la mancha se · analiza por cromatografía de la placa con un sistema disolvente 70:30:1 de he xano/éter dietílico/ácido acético. Después, se mancha la placa con vapor de yodo para detectar manchas separadas que corresponden a monoglicéridos , diglicéridos , t r igl icér ido s y fos fo 1 í pidos . Las manchas se extraen de la placa por raspado, se transesterif ican con el procedimiento de cloruro de acetilo en metanol y se analizan por medio de cromatografía de gases. Las relaciones entre las áreas pico totales para cada mancha y las áreas pico totales para todas las manchas constituyen la distribución de diversos glicéridos.
Ejemplo 21 Este ejemplo ilustra la eliminación de sólidos de residuos de destilación y la extracción por medio del desolventizador para recuperar ácidos grasos, ésteres y t riglicéridos de los sólidos. Durante la fermentación, los sólidos se separan de los residuos de destilación enteros y se alimentan1 a un desolventizador en donde entran en contacto con 997.9 kg/h (1.1 tons/h) de vapor. Los regímenes de flujo para los residuos de destilación enteros, torta húmeda (suministro del extractor), disolvente, miscela del extractor y sólidos de descarga del extractor son tal como se muestra en la Tabla 10. Los valores de la tabla se expresan en kg/h (tons/h) .
Tabla 10 Los sólidos que salen del desolventizador se alimentan a un secador. El vapor que sale del desolventizador contiene 499.0 kg/h (0.55 tons/h) de hexano y 99.9.72 kg/h (1.102 tons/h) de agua. Esta corriente se condensa y alimenta a un decantador. La fase rica en agua que sale del decantador contiene aproximadamente 360 ppm de hexano. Esta corriente se alimenta a una columna de destilación, en donde el hexano se elimina de la corriente rica en agua. La corriente enriquecida con hexano que sale de la parte superior de la columna de destilación se condensa y alimenta al decantador. La corriente rica en orgánicos que sale del decantador se alimenta a una columna de destilación. El vapor (999.72 kg/h (11.02 tons/h)) se suministra en el fondo de la columna de destilación. La composición de los productos de cabeza y del fondo para esta columna se indica en la Tabla 11. Los valores de la tabla se expresan en kg/h (tons/h) .
Tabla 11 Ejemplo 22 Este ejemplo ilustra la recuperación de subproductos a partir de la pasta. El aceite de maíz se separó de la pasta en las condiciones descritas en el Ejemplo 10, con la diferencia de que se usó una centrífuga "tricanter" (Flottweg Z23- diámetro de tazón 4, 230 mm, relación entre longitud y diámetro 4:1) con estas condiciones: • Velocidad del tazón: 5000 rpm • Velocidad diferencial: 10 rpm • Velocidad de alimentación: 3 gpm • Disco separador de fases: 138 mm • Configuración del impulsor: 144 mm.
El aceite de maíz separado contenia 81 % de t riglicéridos , 6 % de ácidos grasos libres, 4 % de diglicéridos y 5 % en total de fosfolipidos y monoglicéridos según se determinó por medio de los métodos descritos en el Ejemplo 18 y por cromatografía en capa delgada.
Los sólidos separados de la pasta en las condiciones descritas anteriormente tenían un contenido de humedad de 58 % según se determinó por la pérdida de peso al secarse y un contenido de 1.2 % de t riglicéridos y 0.27 % de ácidos grasos libres según se determinó por medio del método descrito en el Ejemplo 18.
La composición de los sólidos separados de los residuos de destilación enteros, el aceite extraído entre las etapas del evaporador, el extractante del subproducto y los solubles condensados de destilaría (CDS) en la Tabla 14 se calcularon en base al supuesto de que la composición de los residuos de destilación enteros era la indicada en la Tabla 12 y los supuestos contenidos en la Tabla 13 (separación en la centrifuga "tricanter") . Los valores de la Tabla 11 se obtuvieron de un modelo Aspen Plus® (Aspen Technology, Inc., Burlington, MA) . Este modelo supone que el aceite de maíz no se extrae de la pasta. Se calculó que el contenido de proteina sobre una base seca de células, sólidos disueltos y sólidos suspendidos es de aproximadamente 50 %, 22 % y 35.5 %, respecti amente. Se calcula que el extractante del subproducto está compuesto por 70.7 % de ácido graso y 29.3 % de éster isobutilico de ácido graso sobre una base seca.
Tabla 12 Tabla 13 Tabla 14 Si bien anteriormente se han descrito diversas modalidades de la presente invención, se deberla comprender que se han presentado solamente como ejemplo, sin ser limitantes. Resultará evidente para las personas con experiencia en la técnica relevante que pueden hacerse varios cambios en la forma y detalle en ella sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por lo tanto, la amplitud y el alcance de la presente invención no debería estar limitado por ninguna de las modalidades ilustrativas descritas anteriormente, sino que debería definirse solamente de conformidad con las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes .
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta descripción son indicativas del nivel de conocimiento del experto en la técnica a la que pertenece esta invención y se incorporan en la presente descripción como referencia para todos los propósitos como si se indicara especifica e individualmente que cada publicación, patente o solicitud de patente individual se incorpora como referencia.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. ·

Claims (57)

REIVI DICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un método caracterizado porque comprende: proporcionar una suspensión de materia prima de biomasa que comprende una fuente de carbono fermentable, sólidos no disueltos y agua; separar al menos una porción de los sólidos no disueltos a partir de la suspensión, por medio de lo cual se genera (i) una solución acuosa que comprende una fuente de carbono fermentable y (ii) un coproducto de torta húmeda que comprende sólidos; y añadir la solución acuosa a un caldo de fermentación que comprende microorganismos recombinantes en un recipiente de fermentación por medio de lo cual se produce un producto fermentativo; en donde mejora la productividad del procesamiento de la biomasa.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la productividad del procesamiento de la biomasa mejorada comprende un producto fermentativo mejorado y recuperabilidad del coproducto con respecto a un producto fermentativo producido en presencia de sólidos no disueltos .
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la productividad del procesamiento de la biomasa mejorada incluye uno o más de una mayor capacidad de reciclado de la corriente del proceso, una mayor eficiencia del volumen del termentador y una mayor alimentación de la carga de la materia prima de la biomasa.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende poner en contacto el caldo de fermentación con un extractante, en donde el extractante ha aumentado la eficacia de la extracción con respecto a un caldo de fermentación que comprende sólidos no disueltos .
5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la mayor eficacia de la extracción incluye uno o más de un coeficiente de partición del extractante estabilizado, una separación de fases mejorada del extractante a partir del caldo de fermentación, un coeficiente de masa liquido-líquido mejorado, una mayor recuperación y capacidad de reciclado del extractante y un extractante preservado para la recuperación y el reciclado.
6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el extractante es un extractante orgánico .
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el extractante comprende uno o más extractantes orgánicos inmiscibles seleccionados del grupo que consiste en alcoholes grasos de Ci2 a C22, ácidos grasos de C12 a C22, ásteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de Ci2 a C22, amidas grasas de C12 a C22 y mezclas de estos .
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el extractante comprende ácidos grasos de C12 a C22 derivados de aceite de maíz.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los sólidos no disueltos se separan de la suspensión de materia prima por medio de centrifugación en decantador de tazón, centrifugación en tricanter, centrifugación- en pila de discos, centrifugación por filtración, centrifugación en decantador, filtración, filtración al vacio, filtro de banda, filtración por presión, filtración con tamiz, separación por tamiz, rejilla, rejilla porosa, flotación, hidrociclón, prensa de filtro, prensa de tornillo, sedimentador por gravedad, separador de vórtice o una combinación de estos.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende la etapa de licuar una materia prima para crear una suspensión de materia prima de biomasa; en donde la materia prima se selecciona de granos de maíz, mazorcas del maíz, residuos de cultivos, tales como cáscaras de maíz, rastrojos del maíz, hierbas, trigo, centeno, paja del trigo, cebada, paja de la cebada, heno, paja de arroz, pasto panizo, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, caña de azúcar, soya, componentes obtenidos de la molienda de granos, material celulósico, material lignocelulósico, árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de maderas, aserrín, matas y arbustos, vegetales, frutas, flores, estiércol y mezclas de estos.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la materia prima es maíz.
12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la materia prima está fraccionada o no fraccionada.
13. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la materia prima está molida en húmedo o molida en seco.
14. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque además comprende la etapa de aumentar la temperatura de reacción durante la licuación.
15. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la suspensión de materia prima comprende aceite de la materia prima y el aceite se separa de la suspensión.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la torta húmeda comprende aceite de materia prima.
17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la torta húmeda se lava con agua para recuperar los oligosacáridos presentes en la torta húmeda.
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque los oligosacáridos recuperados se añaden al recipiente de fermentación.
19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la torta húmeda se procesa aun más para proporcionar un coproducto mejorado.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el coproducto se procesa aun más para formar un producto de alimento para animales.
21. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la torta húmeda se lava con disolvente para recuperar el aceite presente en la torta húmeda .
22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el disolvente se selecciona de hexano, butanol, isobutanol, isohexano, etanol y destilados de petróleo.
23. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el producto fermentativo es un producto de alcohol seleccionado del grupo que consiste en metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol e isómeros de estos .
24. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo recombinante comprende una ruta biosintética del butanol diseñada por ingeniería .
25. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende: vaporizar, al menos parcialmente, el caldo de fermentación y el producto y, opcionalmente, C02, en donde se produce una corriente de vapor y porque el producto se recupera de la corriente de vapor.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque además comprende poner en contacto la corriente de vapor con una fase de líquido de absorción, en donde al menos una porción de la corriente de vapor se absorbe en la fase del líquido de absorción; en donde la temperatura del inicio de la absorción de la corriente de vapor en la fase de líquido de absorción es mayor que la temperatura del inicio de la condensación de la corriente de vapor en ausencia de la fase de líquido de absorción .
27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque las etapas de vaporización y contacto se realizan en condiciones de vacio.
28. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la separación de una porción sustancial de los sólidos no disueltos de esa suspensión proporciona una mayor presión de vapor del caldo de fermentación con respecto a un caldo de fermentación que comprende sólidos no disueltos.
29.· El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la presión de vapor más alta proporciona una recuperación más eficaz del producto de vaporización .
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la recuperación más eficaz del producto de vaporización incluye una menor inversión de capital y/o un equipo de vaporización, absorción, compresión y refrigeración de menor tamaño y/o una mayor velocidad de transferencia de masa y/o una menor energía para la vaporización y/o un régimen de flujo menos absorbente.
31. Un método para producir butanol, caracterizado porque comprende: proporcionar una materia prima; licuar la materia prima para crear una suspensión de materia prima, en donde la suspensión de materia prima comprende oligosacáridos, aceite, y sólidos no disueltos; separar los sólidos no disueltos de la suspensión" de materia prima para crear (i) una solución acuosa que comprende oligosacáridos, (ii) una torta húmeda que comprende sólidos no disueltos y (iii) una fase oleosa; poner la solución acuosa en contacto con un caldo de fermentación en un termentador; fermentar los oligosacáridos en el termentador para producir butanol; y realizar la eliminación in situ del butanol a partir del caldo de fermentación a medida que se produce el butanol, en donde la eliminación de los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima aumenta la eficacia de la producción de butanol.
32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la materia prima es maíz y el aceite es aceite de maíz.
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque los sólidos no disueltos comprenden germen, fibra y gluten.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque además comprende moler la materia prima en seco.
35. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el maíz no está fraccionado.
36. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque los sólidos no disueltos se separan de la suspensión de materia prima por medio de centrifugación en decantador de tazón, centrifugación en tricanter, centrifugación en pila de discos, centrifugación por filtración, centrifugación en decantador, filtración, filtración al vacio, filtro de banda, filtración por presión, filtración con tamiz, separación por tamiz, rejilla, rejilla porosa, flotación, hidrociclón, prensa de filtro, prensa de tornillo, sedimentador por gravedad, separador de vórtice o una combinación de estos .
37. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la etapa de separar los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima comprende centrifugar la suspensión de materia prima.
38. . El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque centrifugar la suspensión de materia prima separa la suspensión de materia prima en una primera fase liquida que comprende la solución acuosa, una fase sólida que comprende la torta húmeda y una segunda fase liquida que comprende el aceite.
39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la torta húmeda se lava con agua para recuperar los oligosacáridos presentes en la torta húmeda .
40. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la eliminación in situ comprende la extracción líquido-liquido.
41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque un extractante para la extracción liquido-líquido es un extractante orgánico.
42. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la sacarificación de los oligosacáridos en la solución acuosa se produce simultáneamente con la fermentación de los oligosacáridos en el fermentador.
43. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque además comprende la etapa de aumentar la temperatura de reacción durante la licuación.
44. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque además comprende la etapa de sacarificar los oligosacáridos antes de fermentar los oligosacáridos en el fermentador.
45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la etapa de eliminar los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima comprende centrifugar la suspensión de materia prima.
46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la centrifugación de la suspensión de materia prima se produce antes de sacarificar el azúcar.
47. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el caldo de fermentación comprende un microorganismo recombinante que comprende una rut biosintética del butanol.
48. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el butanol es isobutanol.
49. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la etapa de eliminar los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de un coeficiente de transferencia de masa liquido-líquido del butanol del caldo de fermentación al extractante; aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la eficacia del butanol con un extractante; aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de un índice de separación de fases entre el caldo de fermentación y un extractante; aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la recuperación y reciclado de un extractante; o aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante la reducción del régimen de flujo de un extractante.
50. Un sistema para producir butanol, caracterizado porque comprende: un recipiente de licuación configurado para licuar una materia prima para crear una suspensión de materia prima; el recipiente de licuación comprende: una entrada para recibir la materia prima; y una salida para descargar una suspensión de materia prima, en donde la suspensión de materia prima comprende azúcar y sólidos no disueltos ; una centrifuga configurada para eliminar los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima para crear (i) una solución acuosa que comprende el azúcar y (ii) una torta húmeda que comprende la porción de los sólidos no disueltos, la centrifuga comprende: una entrada para recibir la suspensión de materia prima; una primera salida para descargar la solución acuosa; y una segunda salida para descargar la torta húmeda; y un fermentador configurado para fermentar la solución acuosa para producir butanol, el fermentador comprende: una primera entrada para recibir la solución acuosa ; una segunda entrada para recibir un extractante; una primera salida para descargar el extractante rico en butanol; y una segunda salida para descargar caldo de fermentación.
51. El sistema de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la centrifuga comprende, además, una tercera salida para descargar un aceite creado mientras se eliminan los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima .
52. El sistema de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque además comprende un recipiente de sacarificación configurado para sacarificar el azúcar en la suspensión de materia prima, el recipiente de sacarificación comprende : una entrada para recibir la suspensión de materia prima; y una salida para descargar la suspensión de materia prima.
53. El sistema de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque además comprende un recipiente de sacarificación configurado para sacarificar el azúcar en la solución acuosa; el recipiente de sacarificación comprende: una entrada para recibir la solución acuosa; y una salida para descargar la solución acuosa.
54. El sistema de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque además comprende un molino de martillo configurado para triturar la materia prima; el molino de martillo comprende: una entrada para recibir la materia prima; y una salida para descargar materia prima triturada .
55. Una composición caracterizada porque comprende: 20-35 % en peso de proteina cruda, 1-20 % en peso de grasa cruda, 0-5 % en peso de triglicéridos, 4-10 % en peso de ácidos grasos y 2-6 % en peso de ésteres isobutilicos de ácidos grasos .
56. Una composición caracterizada porque comprende: 25-31 % en peso de proteina cruda, 6-10 % en peso de grasa cruda, 4-8 % en peso de triglicéridos, 0-2 % en peso de ácidos grasos y 1-3 % en peso de ésteres isobutilicos de ácidos grasos.
57. Una composición caracterizada porque comprende: 20-35 % en peso de proteina cruda, 1-20 % en peso de grasa cruda, 0-5 % en peso de triglicéridos, 4-10 % en peso de ácidos grasos y 2- 6 % en peso de ésteres isobutilicos de ácidos grasos . Una composición caracterizada porque comprende: 26-34 % en peso de proteina cruda, 15-25 % en peso de grasa cruda, 12-20 % en peso de triglicéridos, 1-2 % en peso de ácidos grasos, 2-4 % en peso de ésteres isobutilicos de ácidos grasos , I-2 % en peso de lisina, II-23 % en peso de NDF y 5-11 % en peso de ADF.
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