CN103003436A

CN103003436A - 来源于在提取发酵中用于醇移除的油的提取溶剂

Info

Publication number: CN103003436A
Application number: CN2011800301253A
Authority: CN
Inventors: D.R.安顿; J.齐拉科维奇; B.A.迪纳; M.C.格雷迪; F.J.维尔纳
Original assignee: Butamax Advanced Biofuels LLC
Current assignee: Butamax Advanced Biofuels LLC
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2013-03-27
Also published as: CA2801209A1; MX2012014551A; MX2012014683A; BR112012032166A2; EP2582823A1; JP2013528400A; BR112012032352A2; AU2011268215A1; MX2012014687A; AU2011268201A1; CN102947457B; NZ603659A; JP2013533742A; WO2011159991A1; NZ603467A; CN102947456A; KR20130116858A; MX2012014784A; CA2801498A1; WO2011160030A2

Abstract

在醇发酵方法中，将来源于生物质的油化学地转化成提取剂可用于对来自发酵液体培养基的产物醇(如丁醇)的原位移除。在所述油中的甘油酯能够被化学地转化成反应产物(如脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙二醇酯和羟基化甘油三酯、以及它们的混合物)，其形成了发酵产物提取剂，所述提取剂对于产物醇的分配系数大于所述生物质的油对于产物醇的分配系数。来源于醇发酵方法的原料的油能够被化学地转化成发酵产物提取剂。所述油能够在所述原料被输送进发酵容器之前从所述原料中分离，并且所述分离的油能够被化学地转化成发酵产物提取剂，其能够随后与包含产物醇的发酵产物接触，从而从所述发酵产物中分离所述产物醇。

Description

来源于在提取发酵中用于醇移除的油的提取溶剂

本申请要求提交于2010年6月18日的美国临时申请61/356,290；提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,451；提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,436；提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,444；提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,429；提交于2010年9月2日的美国临时申请61/379,546；和提交于2011年2月7日的美国临时申请61/440,034；提交于2011年6月15日的美国临时申请13/160,766的权益；其全部内容以引用方式并入本文。

与本申请相关的序列表经由网上电子专利申请系统以电子表格形式提交，其全文以引用方式并入说明书。

发明领域

本发明涉及发酵醇如丁醇的生产，具体地涉及用于提取发酵的提取溶剂，以及将来源于生物质的油转化成提取溶剂的方法。

发明背景

丁醇是一种重要的工业化学品，具有多种应用，例如用作燃料添加剂，在塑料工业中用作化学原料，以及在食品和香料工业中用作食品级的提取剂。因此，高度需要丁醇以及高效和环境友好的生产方法。

利用微生物发酵来生产丁醇是一种环境友好的生产方法。一些丁醇产量高的微生物也具有低的丁醇毒性阈值，使得在生产丁醇过程中需要从发酵容器中移除丁醇。原位产物移除(ISPR)(也被称为提取发酵)从其被生产的发酵容器中移除丁醇，从而使微生物以高产量生产丁醇。本领域已描述的一种用于原位产物移除的方法是液-液提取(美国专利公开申请2009/0305370)。为了在技术上和经济上可行的，理想的是，液-液提取需要提取剂和发酵液体培养基之间的良好接触以便将产物醇有效地传质传送到提取剂中；提取剂与发酵液体培养基(在发酵期间和发酵之后)的良好的相分离；提取剂的有效回收和再利用；提取剂提取产物醇(通过例如防止降低对于产物醇进入提取剂的分配系数)的能力的最小劣化和提取剂的污染，所述污染是由长期操作过程中会降低分配系数的脂质造成的。

具体地，随着时间推移和每次再利用，提取剂可被油污染，例如通过生物质中存在的油的积聚，生物质是作为可水解的淀粉原料输送进发酵容器中。例如，在通过同时糖化和发酵(SSF)(在通过添加葡糖淀粉酶以产生葡萄糖的发酵过程中伴随着液化浆的糖化)将葡萄糖转化成丁醇的过程中，加载到发酵容器中的含30重量％干玉米固体的液化的玉米浆能产生含有约1.2重量％玉米油的发酵液体培养基。在原位产物移除过程中作为提取剂溶解在油醇(OA)中的玉米油质可导致随着每次油醇再利用脂质浓度的积聚；随着油醇的每次再利用时油醇中的脂质浓度增加，产物醇在油醇中的分配系数降低。

此外，在提取发酵期间不溶解固体的存在可对醇生产的效率产生负面影响。例如，不溶解固体的存在可降低发酵容器中的传质系数，阻止发酵容器中的相分离，随着时间的推移导致提取剂中来自不溶解固体的玉米油的积聚从而导致提取效率降低和溶剂损失增加，因为其被截留在作为干酒糟可溶物(DDGS)而被最终移除的固体中，减缓提取剂液滴与发酵液体培养基的解脱过程、和/或导致发酵容器体积效率降低。

若干个用于降低提取发酵中使用的提取剂分配系数的劣化的方法包括湿磨法、分馏和固体移除。湿磨法是一种昂贵的多步方法，其为了单独捕集来自每种副产品的价值而将生物质(例如玉米)分离成其所有重要组分(胚芽、果皮纤维、淀粉、和谷蛋白)。该方法提供了纯化的淀粉流；然而，它非常昂贵并且包括将生物质分离成其非淀粉组分，这对于发酵醇生产是不需要的。分馏移除了纤维和胚芽，所述纤维和胚芽包含存在于研碎全玉米中的大部分油，导致玉米具有更高的淀粉(胚乳)含量。干分馏不分离胚芽和纤维，因此它比湿磨法更便宜。然而，分馏不移除全部的纤维或胚芽，并且不会导致固体的全部消除。此外，在分馏中会损失一些淀粉。玉米的湿磨法比干分馏更昂贵，但干分馏比干磨未分馏玉米更昂贵。如例如于2010年6月18日提交的共同未决的、普通拥有的美国临时专利申请61/356,290中所述，从用于发酵前的液化浆中移除固体，包括包含脂质的胚芽，可基本上移除不溶解固体。然而，即使不分馏或移除不溶解固体，如果能降低提取剂的分配系数的劣化，也将是有利的。因此，持续需要开发更有效的方法和系统来通过提取发酵产生产物醇如丁醇，在提取发酵中降低了提取剂的分配系数的劣化。

此外，通常提取剂(例如，油醇)是加入到工艺中的，而不是在工艺的一个步骤中产生的。因此，提取剂是原材料支出。由于提取剂可由于吸附在非发酵性固体上而损失并被引入到这个工艺中的脂质所稀释，因此提取剂的回收和再利用的效率可影响醇生产方法的经济性。因此，持续需要用于原位产物移除的替代性提取剂，提取剂通过降低资本和/或运营成本可导致一个更经济的方法。

发明概述

本发明通过提供产生产物醇如丁醇的方法满足了以上需求，其中生物质中的脂质被转化成可用于原位产物移除的提取剂，并且其中降低了与原料和/或在提取剂再利用时输送进发酵容器的脂质的量。本发明还提供了相关的优点，这些优点通过下列的实施方案的描述将变得更显而易见。

将来源于生物质的脂质化学地转化成提取剂可降低存在于原位产物移除提取剂中的脂质的量，所述提取剂包括脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酯、脂肪酸乙二醇酯和甘油三酯、以及它们的混合物(本文中统称为“脂肪酸提取剂”)。甘油三酯可被羟基化或烷氧基化(例如，甲氧基化、乙氧基化)。脂肪酸提取剂预期不会和脂质一样程度地降低产物醇如异丁醇在提取剂相中的分配系数。此外，脂肪酸提取剂可用作原位产物移除提取剂。脂肪酸提取剂可来源于供应输送进发酵容器的可发酵碳的生物质。因此，脂肪酸提取剂可在醇生产工艺的步骤中产生，并用于替代、或添加到供应的不在所述工艺中产生的外源原位产物移除提取剂(如外部提供的油醇)中，从而降低或甚至省去用于原位产物移除提取剂的原材料支出。

此外，提取剂也可通过在高温和/或高压条件下，由将来源于生物质或原料的油转化成脂肪酸而产生。此外，来源于生物质或原料的油可用一种或多种脂肪酶处理以产生脂肪酸或进行氢化反应以产生脂肪醇。

本发明涉及组合物，所述组合物包含能够由原料产生醇的重组微生物；醇；和至少一种提取剂，所述提取剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、甘油三酯、以及它们的混合物；其中所述提取剂由所述原料产生。在一个实施方案中，所述提取剂是脂肪酰胺的混合物，并且在另一个实施方案中，所述脂肪酰胺的混合物包含亚油酰胺、油酰胺、棕榈酸酰胺或硬脂酰胺。在另一个实施方案中，所述提取剂是脂肪酰胺和脂肪酸的混合物，并且在另一个实施方案中，所述脂肪酰胺和脂肪酸的混合物包含亚油酰胺、亚油酸、油酰胺、油酸、棕榈酸酰胺、棕榈酸、硬脂酰胺或硬脂酸。在一个实施方案中，所述提取剂选自羟基化甘油三酯、烷氧基化甘油三酯、羟基化脂肪酸、烷氧基化脂肪酸、羟基化脂肪醇和烷氧基化脂肪醇。在一个实施方案中，甘油三酯可为甲氧基化的或乙氧基化的。在另一个实施方案中，所述提取剂选自饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、饱和脂肪醇、不饱和脂肪醇、饱和脂肪酰胺、不饱和脂肪酰胺、饱和脂肪酯、不饱和脂肪酯、以及它们的混合物。在一个实施方案中，所述提取剂可以是液体或固体。在另一个实施方案中，所述提取剂可以是珠粒的形式。在一个实施方案中，所述醇是C₁-C₈烷基醇。在另一个实施方案中，所述原料包括黑麦、小麦、玉米、甘蔗、大麦、纤维素材料、木质纤维素材料、或它们的混合物。

在一个实施方案中，所述提取剂包括式R(C＝O)N(R’)(R”)的一种或多种脂肪酰胺，其中

R独立地选自任选地以一个或多个双键间隔的C₃-C₂₇烷基基团，并且

R’和R”独立地选自氢和任选地包含一个或多个羟基基团的C₁-C₆烷基基团。

在另一个实施方案中，所述提取剂包括式R-(C＝O)-OCHR’CHR”-OH的一种或多种脂肪酯，其中

R’和R”独立地选自氢和C₁-C₄烷基基团。

在一个实施方案中，所述提取剂包括式R-(C＝O)-OR’的一种或多种脂肪酯，其中

R’是8个碳或更少的烷基基团。

本发明涉及产生提取剂的方法，所述方法包括提供包含油的生物质；使所述油与一种或多种能够将所述油化学地转化成提取剂的物质接触，从而将所述油的至少一部分转化成所述提取剂，所述提取剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酯、甘油三酯、以及它们的混合物。在一个实施方案中，甘油三酯可为羟基化的或烷氧基化的(例如，甲氧基化、乙氧基化)。在一个实施方案中，所述提取剂可以是液体或固体。在另一个实施方案中，所述提取剂可以是珠粒的形式。在一个实施方案中，所述方法还包括在使所述油与一种或多种物质接触之前，从所述生物质中分离所述油。在一个实施方案中，所述一种或多种物质选自含水氢氧化铵、无水氨、醋酸铵、氨水、过氧化氢、甲苯、冰醋酸、脂肪酶和阳离子交换树脂。在另一个实施方案中，所述提取剂对于产物醇的分配系数大于在所述油被转化成提取剂之前所述油对于产物醇的分配系数。在一个实施方案中，所述醇是C₁-C₈烷基醇。在另一个实施方案中，所述生物质包括玉米粒、玉米棒、作物残余物如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、黑麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、从谷物的研磨中获得的组分、纤维素材料、木质纤维素材料、树、枝、根、叶、木片、木屑、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、或它们的混合物。

本发明也涉及产生产物醇的方法，所述方法包括：(a)提供包含低聚糖和油的生物质；(b)使所述生物质与能够将低聚糖转化成单糖的糖化酶接触；(c)从(a)或(b)的生物质中分离所述油；(d)使所述分离的油与一种或多种反应剂或溶剂接触以形成提取剂；(e)使所述生物质与包含能够将所述单糖转化成产物醇的重组微生物的发酵液体培养基接触，从而产生产物醇；以及(f)使所述产物醇与所述提取剂接触，其中所述提取剂对于产物醇的分配系数大于所述生物质的油对于产物醇的分配系数。在一个实施方案中，一种或多种反应剂或溶剂选自含水氢氧化铵、无水氨、醋酸铵、氨水、过氧化氢、甲苯、冰醋酸、脂肪酶和阳离子交换树脂。在一个实施方案中，所述提取剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酯、甘油三酯、以及它们的混合物。在一个实施方案中，所述提取剂选自羟基化甘油三酯、烷氧基化甘油三酯(例如，甲氧基化、乙氧基化)、羟基化脂肪酸、烷基化脂肪酸、羟基化脂肪醇和烷氧基化脂肪醇。在另一个实施方案中，所述提取剂选自饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、饱和脂肪醇、不饱和脂肪醇、饱和脂肪酰胺、不饱和脂肪酰胺、饱和脂肪酯、不饱和脂肪酯、以及它们的混合物。在一个实施方案中，所述提取剂可以是液体或固体。在另一个实施方案中，所述提取剂可以是珠粒的形式。在一个实施方案中，醇是C₁-C₈烷基醇。在另一个实施方案中，所述油包括选自下列的一种或多种油：牛脂油、玉米油、卡诺拉油、癸酸/辛酸甘油三酯、蓖麻油、椰子油、棉籽油、鱼油、霍霍巴油、猪油、亚麻籽油、牛蹄油、奥蒂油、棕榈油、花生油、油菜籽油、稻米油、红花油、大豆油、向日葵油、桐油、麻风树油、小麦油、黑麦油、大麦油和植物油共混物。

R’和R”独立地选自氢和C₁-C₄烷基基团。

R’是8个碳或更少的烷基基团。

本发明涉及产生产物醇的方法，所述方法包括：(a)提供包含能够在发酵容器中产生产物醇的重组微生物的发酵液体培养基，从而产生产物醇；(b)使所述发酵液体培养基与提取剂接触以形成包含水相和有机相的两相混合物，其中所述产物醇和所述油分配到所述有机相中，使得所述有机相包含所述产物醇和所述油；(c)将所述有机相与所述水相分离；(d)从所述有机相中分离所述产物醇；并且任选地步骤(b)和(c)同时进行。在一个实施方案中，所述方法还包括产生原料浆液；分离所述原料浆液以产生(i)水层，(ii)油层，和(iii)固体层；以及将所述水层输送进所述发酵容器。在另一个实施方案中，所述方法还包括：使所述油层的油与一种或多种能够将所述油化学地转化成提取剂的物质接触，从而将所述油的至少一部分转化成所述提取剂，所述提取剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酯、甘油三酯、以及它们的混合物。

在一个实施方案中，所述提取剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酯、甘油三酯、以及它们的混合物。在另一个实施方案中，所述提取剂选自羟基化甘油三酯、烷氧基化甘油三酯(例如，甲氧基化、乙氧基化)、羟基化脂肪酸、烷基化脂肪酸、羟基化脂肪醇和烷氧基化脂肪醇。在一个实施方案中，所述提取剂选自饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、饱和脂肪醇、不饱和脂肪醇、饱和脂肪酰胺、不饱和脂肪酰胺、饱和脂肪酯、不饱和脂肪酯、以及它们的混合物。在一个实施方案中，所述提取剂可以是液体或固体。在另一个实施方案中，所述提取剂可以是珠粒的形式。在一个实施方案中，所述醇是C₁-C₈烷基醇。在另一个实施方案中，所述提取剂对于产物醇的分配系数大于所述油层的油对于产物醇的分配系数。在一个实施方案中，所述醇是C₁-C₈烷基醇。在另一个实施方案中，所述油包括选自下列的一种或多种油：牛脂油、玉米油、卡诺拉油、癸酸/辛酸甘油三酯、蓖麻油、椰子油、棉籽油、鱼油、霍霍巴油、猪油、亚麻籽油、牛蹄油、奥蒂油、棕榈油、花生油、油菜籽油、稻米油、红花油、大豆油、向日葵油、桐油、麻风树油、小麦油、黑麦油、大麦油和植物油共混物。

在一些实施方案中，从发酵工艺中移除来源于生物质的油的方法包括：使包括一定量油的生物质原料流与一种或多种能够将油化学地转化成提取剂的物质接触，从而将所述油的至少一部分转化成提取剂，所述提取剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙二醇酯、甘油三酯、以及它们的混合物。甘油三酯可被羟基化或烷氧基化(例如，甲氧基化、乙氧基化)。所述提取剂对于发酵醇的分配系数大于所述油对于发酵醇的分配系数。在一些实施方案中，生物质原料流为研磨的玉米，并且所述油为玉米油。在一些实施方案中，所述方法也包括使具有提取剂的生物质原料流与发酵液体培养基接触，所述发酵液体培养基包括发酵醇，其中所述发酵醇分配到提取剂中。

本发明涉及产生提取剂的方法，所述方法包括提供包含油的生物质；以及将所述油的至少一部分转化成提取剂，所述提取剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酯、甘油三酯、以及它们的混合物。在一个实施方案中，将所述油转化成提取剂包括下列步骤中的一个或多个：在四氢呋喃和氢化铝锂存在的情况下孵育所述油；将所述油与氢氧化钠孵育；将所述油与硫酸和甲醇孵育；在醋酸铵存在的情况下，将所述油与无水氨孵育；将所述油与氨水孵育；使所述油与甲苯、阳离子交换树脂、冰醋酸、脂肪酶和过氧化氢接触；在高温条件下孵育所述油，或在高压条件下孵育所述油。

在一些实施方案中，用于产物醇原位移除的提取剂的原位生产方法包括：(a)提供包含可发酵糖和油的生物质，所述油包括甘油三酯；(b)从(a)的生物质中分离所述油；以及(c)使所述分离的油与一种或多种反应剂或溶剂接触，所述反应剂或溶剂可与甘油三酯化学地反应以获得反应产物，其选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酰胺和脂肪酸的混合物、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙二醇酯、甘油三酯、以及它们的混合物，从而所述油中的甘油三酯被转化成反应产物。甘油三酯可被羟基化或烷氧基化(例如，甲氧基化、乙氧基化)。反应产物形成发酵产物提取剂，所述提取剂对于产物醇的分配系数大于所述生物质的油对于产物醇的分配系数。

在一些实施方案中，产生丁醇的方法包括：(a)提供包含低聚糖和油的生物质，所述油包括甘油酯；(b)使所述生物质与能够将低聚糖转化成单糖的糖化酶接触；(c)从(a)或(b)的生物质中分离所述油；(d)使所述分离的油与包含一种或多种反应剂或溶剂的组合物接触，从而油中的甘油酯形成提取剂；(e)使生物质与能够将单糖转化成丁醇的重组微生物接触，从而生产出包含丁醇的发酵产物；以及(f)使发酵产物与(d)的提取剂接触，从而从发酵产物中分离丁醇。所述提取剂对于丁醇的分配系数大于所述生物质的油对于丁醇的分配系数。在一些实施方案中，步骤(d)的提取剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酰胺和脂肪酸的混合物、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙二醇酯、甘油三酯、以及它们的混合物。甘油三酯可被羟基化或烷氧基化(例如，甲氧基化、乙氧基化)。

在一些实施方案中，一种方法包括：在从原料产生产物醇过程的步骤中，将植物来源的油的至少一部分转化成提取剂，所述提取剂对于产物醇的分配系数大于植物来源的油对于产物醇的分配系数。在一些实施方案中，植物来源的油来源于原料。

在一些实施方案中，所述产物醇是异丁醇，提取剂分配系数为至少约0.28。在一些实施方案中，提取剂对于异丁醇的分配系数为至少约1。在一些实施方案中，提取剂对于异丁醇的分配系数为至少约2。

在一些实施方案中，由原料产生产物醇的方法包括(a)产生原料浆液；(b)分离(a)的原料浆液以产生产物，包括(i)水层，(ii)油层，和(iii)固体层；以及(c)将(b)的水层输送进所述发酵容器。在一些实施方案中，分离原料浆液的步骤通过离心进行。在一些实施方案中，所述油层为植物来源的油层。在一些实施方案中，所述方法还包括从植物来源的油层获得植物来源的油层的至少一部分。

在一些实施方案中，所述方法还包括将提取剂添加到发酵容器中，以形成包含水相和含产物醇的有机相的两相混合物，从而产物醇分配到含产物醇的有机相中。

在一些实施方案中，所述方法还包括发酵所述水相的糖以产生产物醇，从而产物醇分配到含产物醇的有机相中。

在一些实施方案中，移除来自发酵过程的来源于生物质的油的方法包括(a)提供包含产物醇和来源于生物质的油的发酵液体培养基，所述油包括甘油酯；(b)使发酵液体培养基与提取剂接触以形成包含水相和有机相的两相混合物，所述产物醇和所述油分配到所述有机相中，使得所述有机相包含所述产物醇和所述油；(c)将所述有机相与水相分离；(d)从所述有机相中分离所述产物醇；以及(e)使有机相与组合物接触，所述组合物包含一种或多种反应剂或溶剂，从而油中的甘油酯形成附加的提取剂；和(f)通过将发酵液体培养基与步骤(e)的附加的提取剂接触，重复步骤(b)。

在一些实施方案中，附加的提取剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙二醇酯、甘油三酯、以及它们的混合物。甘油三酯可被羟基化或烷氧基化(例如，甲氧基化、乙氧基化)。

在一些实施方案中，所述产物醇是丁醇。

在一些实施方案中，原位发酵提取剂形成的组合物包含(a)来源于生物质的油；(b)一种或多种能够将油化学地转化成一种或多种产物的物质，其选自脂肪酸、脂肪酰胺、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙二醇酯和甘油三酯；和(c)一种或多种产物，其中所述一种或多种产物的量是所述组合物量的约50重量％至约99重量％。甘油三酯可被羟基化或烷氧基化(例如，甲氧基化、乙氧基化)。

在一些实施方案中，组合物包含可产生丁醇的重组微生物、丁醇和至少一种溶剂，所述溶剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙二醇酯、甘油三酯、以及它们的混合物。甘油三酯可羟基化或烷氧基化(例如，甲氧基化、乙氧基化)。

在一些实施方案中，组合物包含可产生丁醇的重组微生物、丁醇和脂肪醇。

在一些实施方案中，组合物包含可产生丁醇的重组微生物、丁醇和脂肪酰胺混合物，其中所述脂肪酰胺混合物包含亚油酰胺、油酰胺、棕榈酸酰胺和硬脂酰胺。

在一些实施方案中，组合物包含的成分包含可产生丁醇的重组微生物，丁醇和玉米油，其中玉米油为约28％至约67％羟基化的。

附图简述

并入本文并成为说明书的一部分的附图示出了本发明，并且与说明书一起进一步用来解释本发明的原理并使得本领域的技术人员能够利用本发明。

图1示意性地示出了本发明的示例性方法和系统，其中在发酵前从液化生物质中移除了脂质，并且其中将所述移除的脂质转化成提取剂并且供给发酵容器。

图2示意性地示出了本发明的示例性方法和系统，其中在发酵前从液化和糖化生物质中移除了脂质，并且其中将所述移除的脂质转化成提取剂并且供给发酵容器。

图3示意性地示出了本发明的示例性方法和系统，其中脂质从生物质中移除并且转化成供给发酵容器的提取剂。

图4示意性地示出了本发明的示例性方法和系统，其中将生物质原料流中的脂质转化成提取剂并且供给发酵容器。

图5示意性地示出了本发明的示例性方法和系统，其中将在排出发酵容器的第一种提取剂中存在的脂质与所述第一种提取剂进行分离并且转化成供给发酵容器的第二种提取剂。

发明详述

除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本专利申请(包括其定义)为准。此外，除非上下文另有所需，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。为所有目的，所有的出版物、专利以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。

为了进一步限定本发明，本文提供了以下术语和定义。

如本文所用，术语“包含”、“包含的”、“包括”、“包括的”、“具有”、“具有的”、“含有”或“含有的”、或它们的任意其它变体，应理解为包含意指所申明的整量或整量的群体的，但是并不排除任意其它整量或整量的群体。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另外特别说明，否则“或”是指包含性的或，而不是指排它性的或。例如，以下任何一个均表示满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。

同样，涉及元素或组分实例(即次数)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，“一个”或“一种”应解读为包括一个或至少一个，并且所述元素或组分的单数形式还包括复数，除非该数字明显地是指单数。

如本文所用，术语“发明”或“本发明”为非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施方案，而是涵盖如申请所述的所有可能的实施方案。

如本文所用，修饰本发明的成分或反应剂的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于产生浓缩物或溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等。术语“约”还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否被所述术语“约”的修饰，本权利要求包括所述量的等价物。在一个实施方案中，术语“约”指在报告数值的10％范围内，或者在报告数值的5％范围内。

如本文所用，“生物质”指的是包含可水解多糖的天然产物，其提供了可发酵糖，包括来自天然来源的任意糖和淀粉如玉米、甘蔗、小麦、纤维素或木质纤维素材料以及包含纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖、双糖和/或单糖的材料、以及它们的混合物。生物质还可包含另外的组分，诸如蛋白质和/或脂质。生物质可来自于单一来源，或者生物质可包含来自超过一种来源的混合物。例如，生物质可包括玉米棒和玉米秸秆的混合物，或草和叶的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于玉米粒、玉米棒、作物残余物如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、黑麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、从谷物研磨中获得的组分、树、枝、根、叶、木片、木屑、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。例如，可通过本领域已知的出于发酵目的而加工所述生物质的任意加工过程(诸如通过研磨、处理和/或液化)由生物质形成浆料、汁液、糖浆或水解产物，并且其包含可发酵糖，并可包含水。例如，可通过本领域技术人员已知的任何方法来加工纤维素和/或木质纤维素生物质以获得包含可发酵糖的水解产物。美国专利申请公开2007/0031918A1中公开了低氨预处理，其以引用的方式并入本文。纤维素和/或木质纤维素生物质的酶促糖化通常利用酶聚生体来分解纤维素和半纤维素以产生包含糖的水解产物，所述糖包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。(Lynd等(Microbiol.Mol.Biol.Rev.66：506-577，2002)中综述了适用于纤维素和/或木质纤维素生物质的糖化酶)。

根据本文所述，浆料、汁液、糖浆或水解产物可包括原料12和原料浆液16。水性原料流可通过本领域已知的出于发酵目的而加工所述生物质的任意加工过程(诸如通过研磨、处理和/或液化)来自或形成自生物质，并且其包含可发酵的碳底物(如糖)并可包含水。根据本文所述，水性原料流可包括原料12和原料浆液16。

如本文所用，“原料”是指在发酵过程中的进料，所述进料包含具有或不具有不溶解固体的可发酵碳源，并且在适用的情况下，在所述可发酵碳源从淀粉中释放或通过进一步的加工过程(诸如通过液化、糖化或其它加工过程)由分解复合糖而获得之前或之后，所述进料包含该可发酵碳源。原料包括或来源于生物质。适当的原料包括但不限于黑麦、小麦、玉米、甘蔗、大麦、纤维素材料、木质纤维素材料、或它们的混合物。在引述“玉米油”的情况下，应了解该术语包括了在本发明的其它实施方案中由给定的原料所生产的油。

如本文所用，“发酵液体培养基”是指水、糖、溶解固体的混合物，任选地有产生醇的微生物、产物醇以及所述发酵容器内所容纳物质的全部其它组成，所述发酵容器中通过以所存在的微生物进行的由糖形成醇、水和二氧化碳(CO₂)的反应而制备了产物醇。具体地，如本文所用，术语“发酵培养基”和“发酵混合物”可与“发酵液体培养基”相同含义地使用。

如本文所用，“可发酵碳源”或“可发酵碳底物”是指能够由本文公开的微生物代谢以产生发酵醇的碳源。适当的可发酵碳源包括但不限于单糖(诸如葡萄糖或果糖)；双糖(诸如乳糖或蔗糖)；低聚糖；多糖(诸如淀粉或纤维素)；一碳底物；以及它们的混合物。

如本文所用，“可发酵糖”是指能够由本文所公开的微生物代谢以产生发酵醇的糖。

如本文所用，“发酵容器”是指在其中进行发酵反应的容器，通过所述发酵反应由糖制备了产物醇，诸如丁醇。

如本文所用，“液化容器”是指在其中进行液化的容器。液化是从原料中释放低聚糖的加工过程。在所述原料是玉米的一些实施方案中，在液化期间从该玉米淀粉中释放低聚糖。

如本文所用，“糖化容器”是指在其中进行糖化(即，低聚糖分解成为单糖)的容器。在发酵和糖化同步进行的情况下，所述糖化容器和所述发酵容器可以是相同的容器。

如本文所用，“糖”指的是低聚糖、双糖和/或单糖。

如本文所用，“糖化酶类”是指能够水解多糖和/或低聚糖(例如，糖原或淀粉的α-1，4-糖苷键)的一种或多种酶。糖化酶类还可包括能够水解纤维素或木质纤维素材料的酶。

如本文所用，“不溶解固体”是指原料的非可发酵部分，例如胚芽、纤维和麸质。

如本文所用，“产物醇”指的是可通过微生物在发酵过程中产生的任意醇，所述发酵过程利用生物质作为可发酵碳底物的来源。产物醇包括但不限于C₁-C₈烷基醇。一些实施方案中，所述产物醇是C₂-C₈烷基醇。在其它实施方案中，所述产物醇是C₂-C₅烷基醇。应当了解C₁-C₈烷基醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。类似地，C₂-C₈烷基醇包括但不限于乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。“醇”在本文也用于指产物醇。

如本文所用，“丁醇”具体地指丁醇的异构体1-丁醇(1-BuOH)、2-丁醇(2-BuOH)和/或异丁醇(iBuOH或I-BUOH，亦称为2-甲基-1-丙醇)，其单独存在或以其混合物存在。

如本文所用，“丙醇”指的是丙醇异构体异丙醇或1-丙醇。

如本文所用，“戊醇”指的是戊醇异构体1-戊醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、2，2-二甲基-1-丙醇、3-戊醇、2-戊醇、3-甲基-2-丁醇或2-甲基-2-丁醇。

如本文所用，术语“醇当量”指的是通过对一定量醇酯的完美水解和回收而获得的醇的重量。

如本文所用，术语“水相滴度”指的是特定醇(如，丁醇)在发酵液体培养基中的浓度。

如本文所用，术语“有效滴度”指的是每升发酵培养基中通过发酵而产生的特定醇(如，丁醇)的总量或通过醇酯化而产生的醇酯的醇当量。例如，单位体积发酵物中的丁醇有效滴度包括：(i)发酵培养基中的丁醇量；(ii)由有机提取剂回收的丁醇量；(iii)在使用了汽提的情况下从气相中回收的丁醇量，以及(iv)在有机相或水相中的丁醇酯的醇当量。

如本文所用，“原位产物移除(ISPR)”是指特定发酵产物从生物过程(诸如发酵)中的选择性移除，从而在生产所述产物时控制了所述生物过程中的产物浓度。

如本文所用，“提取剂”或“ISPR提取剂”是指用于提取任何产物醇(诸如丁醇异构体)的有机溶剂。所述提取剂在发酵温度下可以是固体或液体。具体地，如本文所用，术语“溶剂”可与“提取剂”相同含义地使用。

如本文所用，“脂肪酸提取剂”是指产生自天然油的提取剂，其通过将所述天然油中的甘油酯与一种或多种溶剂或反应剂进行化学反应以获得一种或多种反应产物而产生，所述反应剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙二醇酯、甘油三酯、以及它们的混合物。所述甘油三酯可被羟基化或烷氧基化(如甲氧基化、乙氧基化)。

如本文所用，“天然油”指的是获自植物(如，生物质)或动物的脂质。如本文所用，“来自植物的油”特别指的是获自植物的脂质。具体地，“脂质”可与“油”和“甘油三酯”相同含义地使用。天然油包括但不限于牛脂油、玉米油、卡诺拉油、癸酸/辛酸甘油三酯、蓖麻油、椰子油、棉籽油、鱼油、霍霍巴油、猪油、亚麻籽油、牛蹄油、奥蒂油、棕榈油、花生油、油菜籽油、稻米油、红花油、大豆油、向日葵油、桐油、麻风树油和植物油共混物。

如本文所用，术语“脂肪酸”指的是具有C₄-C₂₈碳原子(最常见的是C₁₂-C₂₄碳原子)的饱和或不饱和羧酸(如，脂肪族单羧酸)。脂肪酸还可以是有支链的或无支链的。脂肪酸可来自或以酯化形式包含于动物或植物脂肪、油或蜡中。脂肪酸可以以甘油三酯的形式天然存在于脂肪或脂肪油中，或者可通过脂肪水解或合成而获得。所述术语脂肪酸可描述单一化学种类或脂肪酸的混合物。此外，所述术语脂肪酸还包括游离脂肪酸。

如本文所用，术语“脂肪醇”是指具有C₄-C₂₂碳原子的长脂族链的醇，所述脂族链为饱和的或不饱和的。

如本文所用，术语“脂肪醛”是指具有C₄-C₂₂碳原子的长脂族链的醛，所述脂族链为饱和的或不饱和的。

如本文所用，术语“脂肪酰胺”是指具有C₄-C₂₂碳原子的长脂族链的酰胺，所述脂族链为饱和的或不饱和的。

如本文所用，术语“脂肪酯”是指具有C₄-C₂₂碳原子的长脂族链的酯，所述脂族链为饱和的或不饱和的。

术语“与水不相混的”是指诸如提取剂或溶剂这样的化学组分，其与水溶液(诸如发酵液体培养基)不能通过形成单一液相的方式相混合。

如本文所用，术语“水相”指的是两相混合物的水相，其通过将发酵液体培养基和与水不相混的有机提取剂进行接触而获得。在本文描述的包括发酵提取的加工过程的一个实施方案中，则术语“发酵液体培养基”特指两相发酵提取物中的水相。

如本文所用，术语“有机相”指的是两相混合物的非水相，其通过将发酵液体培养基和与水不相混的有机提取剂进行接触而获得。

如本文所用，术语“分离”与“回收”同义，并且是指从初始混合物中移除化合物以获得纯度或浓度比初始混合物中的化合物纯度或浓度更高的化合物。

如本文所用，“重组微生物”指的是诸如细菌或酵母这样的微生物，其通过使用重组DNA技术进行了修饰，例如，通过对宿主细胞进行工程改造以包含生物合成途径，诸如产生醇(诸如丁醇)的生物合成途径。

本发明提供了提取剂以及制备所述提取剂的方法，所述提取剂通过对产生自生物质的油进行化学地转化而获得。特别地，可将所述油中的甘油酯化学地转化成一种或多种产物，其包括脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙二醇酯和甘油三酯、以及它们的混合物，其在本文中总体上指的是脂肪酸提取剂。所述甘油三酯可被羟基化或烷氧基化(如甲氧基化、乙氧基化)。脂肪酸提取剂可作为用于从发酵液体培养基中对产物醇(诸如丁醇)进行原位移除的提取剂。因此，本发明还提供了通过使用提取剂进行的提取发酵而制备产物醇(诸如丁醇)的方法，所述提取剂从生物质油中产生。本发明还提供了通过分离产生自原料的油而从醇发酵过程中移除油的方法。可液化所述原料以在油移除前产生浆液。因此，所述浆液包括可发酵碳源、油和不溶解固体。可在将所述浆液引入所述发酵容器之前从该浆液中移除所述油以及在一些实施方案中的不溶解固体。对所述油以及在一些实施方案中的不溶解固体的移除可减少损失、降低所述提取剂分配系数随时间的退化，其由该油(以及在一些实施方案中的不溶解固体)在该发酵容器中的存在而引起。此外，可将所述分离的油化学地转化成脂肪酸提取剂，其可引入所述发酵容器。所述脂肪酸提取剂对于发酵醇的分配系数大于所述油对于发酵醇的分配系数。此外，所述脂肪酸提取剂可代替商业外源提取剂(诸如油醇)或在其基础上进行使用，所述商业外源提取剂并非根据本发明的方法通过所述原料化学地转化而成。因此，通过在发酵过程的步骤中由产生自原料的油进行化学地转化而制备提取剂，本发明的方法可降低与所述外源提取剂相关的原材料费用。

本发明将参照附图进行描述。图1示出了根据本发明的实施方案进行发酵醇生产的示例性加工流程图。根据示出，可将原料12引入液化容器10的入口并且经液化以产生原料浆液16。原料12包含提供可发酵碳源的可水解淀粉(如可发酵糖，诸如葡萄糖)，并且可以是生物质，诸如但不限于黑麦、小麦、玉米、甘蔗、大麦、纤维素材料、木质纤维素材料、或它们的混合物，或者也可以产生自生物质。在一些实施方案中，原料12可以是分级生物质的一种或多种组分，并且在其它的实施方案中，原料12可以是经研磨的未分级生物质。在一些实施方案中，原料12可以是玉米，诸如干研磨的未分级玉米粒，并且所述不溶解颗粒可包括胚芽、纤维和麸质。所述不溶解固体是原料12的非可发酵部分。出于本文参照附图所示的实施方案进行讨论的目的，通常描述原料12为包含经研磨的未分级玉米，其中所述不溶解固体并未从中分离。然而应当了解，正如本领域的技术人员所明了，可针对不同的原料(无论其经过分级与否)改进本文所述的示例性方法和系统。在一些实施方案中，原料12可以是高油酸玉米，从而使由其产生的玉米油是具有至少约55重量％油酸的油酸含量的高油酸玉米油。在一些实施方案中，与约为24重量％的普通玉米油的油酸含量相比，高油酸玉米油的油酸含量可最高达约65重量％。高油酸油可提供一些益处以用于本发明的方法，这是因为所述油的水解可提供具有高油酸含量的脂肪酸提取剂以用于接触发酵液体培养基。在一些实施方案中，所述脂肪酸或其混合物包含不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸的存在降低了融点，这提供了操作上的益处。在不饱和脂肪酸中，具有单一碳碳双键的单不饱和脂肪酸可提供融点方面的益处而不牺牲出于加工考虑的适当热力学稳定性和氧化稳定性。

液化原料12的加工过程涉及原料12中的淀粉水解形成糖并且其为传统的加工过程，所述糖包括，例如，糊精和低聚糖。可以使用业界常用的任意已知的液化过程以及对应的液化容器，其包括但不限于酸加工、酸-酶加工或酶加工。这些加工过程可单独使用或组合使用。在一些实施方案中，可使用所述酶加工并且将适当的酶14(例如α-淀粉酶)引入液化容器10的入口。还可将水引入液化容器10。

由液化原料12而产生的原料浆液16包括由该原料产生的糖、油以及不溶解固体。可从液化容器10的出口排出原料浆液16。在一些实施方案中，原料12是玉米或玉米粒，并且因此原料浆液16是玉米浆料液。

将原料浆液16引入分离器20的入口，所述分离器20经配置以移除所述原料浆液16中存在的一些油或优选地实质上全部的油。所述被移除的油作为物流26提供给反应容器40，并且将包括糖和水的剩余原料作为水性物流22排出给发酵容器30。水性物流22可包括所述浆16的不溶解固体，但是由于通过分离器20移除了所述油26，发酵容器30中的发酵液体培养基仍然具有降低量的油。从分离器20中排出的所述油物流26具有一定量的甘油酯，尤其是甘油三酯，其在反应容器40中与一种或多种物质42接触。物质42是能够将油26中的甘油酯的至少一部分化学地转化成脂肪酸提取剂28的反应剂或溶剂。在一些实施方案中，来自经物质42进行的对所述甘油酯的化学地转化的脂肪酸提取剂28在所述油中的量可以是至少约17重量％、至少约20重量％、至少约30重量％、至少约40重量％、至少约50重量％、至少约60重量％、至少约65重量％、至少约70重量％、至少约75重量％、至少约80重量％、至少约85重量％、至少约90重量％、至少约95重量％或者至少约99重量％。

分离器20可以是本领域中已知的用于从水性原料流中移除油的任意适当的分离器，其包括但不限于虹吸管、吸式倾析、离心、使用重力沉降容器、膜辅助的相分离等等。在一些实施方案中，分离器20还可移除原料浆液16中的不溶解固体并且将所述不溶解固体作为固相或湿饼24进行排出。例如，在一些实施方案中，分离器20可包括压滤机、真空滤器或离心机以用于从原料浆液16中分离所述不溶解固体。例如，在一些实施方案中，分离器20包括三相离心机20，其搅动或旋转原料浆液16以产生包含含有糖和水的水层(即，物流22)、含有不溶解固体的固体层(即，湿饼24)以及油层(即，油物流26)的离心产物。当浆16为玉米浆料液时，油26是游离玉米油。如本文所用，术语游离玉米油是指从玉米胚芽中释放的玉米油。对于作为原料浆液16的玉米浆料液，湿饼24包括了所述原料浆液中存在的不溶解颗粒重量的至少约50％、所述原料浆液中存在的不溶解颗粒重量的至少约55％、所述原料浆液中存在的不溶解颗粒重量的至少约60％、所述原料浆液中存在的不溶解颗粒重量的至少约65％、所述原料浆液中存在的不溶解颗粒重量的至少约70％、所述原料浆液中存在的不溶解颗粒重量的至少约75％、所述原料浆液中存在的不溶解颗粒重量的至少约80％、所述原料浆液中存在的不溶解颗粒重量的至少约85％、所述原料浆液中存在的不溶解颗粒重量的至少约90％、所述原料浆液中存在的不溶解颗粒重量的至少约95％或所述原料浆液中存在的不溶解颗粒重量的约99％。

当通过离心机20移除湿饼24时，在一些实施方案中，来自原料12的油(诸如当所述原料是玉米时的玉米油)的一部分存留于湿饼24中。在这种情况下，湿饼24包括占湿饼24干固体含量的重量低于约20％的量的玉米油。湿饼24可被排出位于离心机20底部附近的出口。湿饼24还可包括所述可发酵碳和水的一部分。一旦水溶液22已从所述离心机20中排出，可以使用另外的水在所述离心机中洗涤湿饼24。对湿饼24的洗涤应回收所述湿饼中存在的糖(如低聚糖)并且所述被回收的糖和水可重循环进入液化容器10。在洗涤后，可通过任意适当的已知加工过程干燥湿饼24以形成干酒糟可溶物(DDGS)。由在离心机20中形成的湿饼24形成所述DDGS具有多种益处。由于所述不溶解固体并不进入所述发酵容器，该DDGS并不具有持留的提取剂和/或产物醇(诸如丁醇)，其并不经受所述发酵容器的条件，并且其不接触所述发酵容器中存在的微生物。这些益处使得加工和销售DDGS(例如作为动物饲料)更为容易。用于通过离心从原料16中移除不溶解固体的方法和系统详细地描述于2010年6月18日提交的共同待决的共同拥有的美国临时专利申请61/356,290中，其全文以引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，油26并非与湿饼24分别地排出，而是油26包括于作为湿饼24的一部分并且最终存在于所述DDGS中。在这种情况下，所述油可从所述DDGS中分离并且转化成脂肪酸提取剂以随后用于相同或不同的醇发酵加工。在任何情况下，对所述原料的油组分的移除有利于醇生产(诸如丁醇生产)，这是因为所述发酵容器中存在的油可稀释ISPR提取剂并且可降低所述发酵醇进入有机相的分配系数。此外，所述油可分解成为脂肪酸和甘油，其可在所述水中积累并且降低可用于在全系统中循环的水量。因此，对所述原料的油组分的移除还可通过提高可在全系统中循环的水量而提高所述产物醇生产的效率。

向发酵容器30中引入水性物流22和微生物32以将其包含入发酵容器30中容纳的发酵液体培养基中。发酵容器30经设置以对水性物流22进行发酵从而产生产物醇，诸如丁醇。特别地，微生物32代谢了浆液16中的可发酵糖并且分泌产物醇。微生物32选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。在一些实施方案中，微生物32可以是细菌，诸如大肠杆菌(E.coli.)。在一些实施方案中，微生物32可以是发酵型重组微生物。水溶液22可包括糖(例如以低聚糖的形式)和水，并且可包含低于约20g/L的单体葡萄糖，更优选地低于约10g/L或低于5g/L的单体葡萄糖。测定单体葡萄糖的量的适当方法在本领域中是众所周知的。本领域中已知的这些适当方法包括HPLC。

在一些实施方案中，水性物流22被糖化加工以将物流22中的复合糖(如低聚糖)分解成为微生物32易于代谢的单糖。可以使用业界常用的任意已知的糖化过程，其包括但不限于酸加工、酸-酶加工或酶加工。在一些实施方案中，可在发酵容器30中进行同步糖化和发酵(SSF)。在一些实施方案中，可将酶38(诸如葡糖淀粉酶)引入发酵容器30的入口以将淀粉分解成为微生物32可代谢的葡萄糖。

在微生物32产生产物醇时，可使用原位产物移除(ISPR)以从发酵容器30中移除所述产物醇。对于提取发酵，这一ISPR包括液-液提取。可根据描述于美国专利申请公开2009/0305370中的加工过程实施液-液提取，其公开内容全文特此以引用的方式并入。美国专利申请公开2009/030537描述了用于以提取发酵生产和从发酵液体培养基中回收丁醇的方法，所述方法包括使所述发酵液体培养基和与水不相混的提取剂接触的步骤。所述提取剂一般可以是用于形成包含水相和有机相的两相混合物的有机提取剂，其选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酰胺和脂肪酸的混合物、脂肪酯、脂肪醛、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙二醇酯、甘油三酯、以及它们的混合物。对于图1的实施方案，发酵容器30具有一个或多个入口用于接收一种或多种与水不相混的ISPR提取剂，其包括来自容器40的脂肪酸提取剂28。脂肪酸提取剂28接触了发酵液体培养基并且形成包含水相和有机相的两相混合物。所述发酵液体培养基中存在的产物醇分配到所述有机相。所述两相混合物可作为物流39从发酵容器30中移除并引入容器35，所述容器中进行了对水相和有机相的分离以制备包含醇的有机相36和水相34。使用本领域已知的方法将所述包含醇的有机相36与所述两相混合物39中的水相分离，所述方法包括但不限于虹吸管、倾析、离心、使用重力沉降容器、膜辅助的相分离等等。所述水相34的全部或部分可作为发酵培养基重新循环进入发酵容器30(如所示)，或者废弃并且代之以新鲜培养基，或经处理以移除任何存留的产物醇并随后重新循环至发酵容器30。所述包含醇的有机相36经处理以回收所述产物醇，并且所产生的低醇提取剂可随后通常与新鲜的补料提取剂28相结合重新循环回到(未示出)发酵容器30，以用于所述产物醇的进一步提取。或者，可将新鲜的提取剂28连续地加入所述发酵容器以取代在双相混合物物流39中移除的提取剂。

在一些实施方案中，可将一种或多种另外的ISPR提取剂(诸如图3-5中示出的提取剂29)引入发酵容器30以形成包含水相和有机相的两相混合物，所述产物醇分配到该有机相。该一种或多种另外的提取剂29可以是另一种脂肪酸提取剂和/或外源有机提取剂，诸如油醇、山嵛醇、鲸蜡醇、月桂醇、肉豆寇醇、硬脂醇、1-十一醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、十一醛、月桂醛、20-甲基十一醛、以及它们的混合物。在一些实施方案中，ISPR提取剂29可以是羧酸，并且在一些实施方案中，ISPR提取剂29可以是游离的脂肪酸。在一个实施方案中，所述羧酸或游离脂肪酸可具有4个至28个碳的链，在另一些实施方案为4至22碳的链，在另一些实施方案为8个至22个碳的链，在另一些实施方案为10个至28个碳的链，在另一些实施方案为7个至22个碳的链，在另一些实施方案为12个至22个碳的链，在另一些实施方案为4个至18个碳的链，在另一些实施方案为12个至22个碳的链，并且在又一些实施方案为12个至18个碳的链。

在一些实施方案中，ISPR提取剂29是一种或多种以下脂肪酸：杜鹃花酸、癸酸、辛酸、蓖麻油酸、椰子油酸(即，包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、辛酸、癸酸、硬脂酸、已酸、花生酸、油酸和亚油酸在内的脂肪酸天然组合物)、二聚酸、异硬脂酸、月桂酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、棕榈酸、棕榈仁油酸、壬酸、蓖麻酸、癸二酸、豆油酸、硬脂酸、妥尔油、牛脂油以及12羟基硬脂酸。在一些实施方案中，ISPR提取剂29是一种或多种二酸，如壬二酸和癸二酸。因此，在一些实施方案中，ISPR提取剂29可以是两种或更多种不同脂肪酸的混合物。在一些实施方案中，根据(例如)2010年7月28日提交的共同待决的共同拥有的美国临时专利申请61/368,444中所述，ISPR提取剂29可以是通过对天然油(诸如生物质)的酶水解而产生的游离脂肪酸，在这些实施方案中，用于制备提取剂29的生物质脂质可来自于与获取原料12的生物质相同的或不同的生物质来源。例如，在一些实施方案中，用于制备提取剂29的生物质脂质可来自大豆，而原料12的生物质来源是玉米。可使用提取剂29与原料12的不同生物质来源的任何可能组合，这对于本领域的技术人员是明了的。

在图1的实施方案中，从所述发酵液体培养基中原位提取了所述产物醇，而所述两相混合物39的分离在分离容器35中进行。原位提取发酵可以在发酵容器30中以批次模式或连续模式进行。对于原位提取发酵，有机提取剂可在形成两相发酵培养基的发酵开始时接触发酵培养基。作为另外一种选择，有机提取剂可在微生物达到期望的生长量之后与发酵培养基接触，其中所述生长量的达到可通过测定培养物的光密度确定。此外，所述有机提取剂可在所述发酵培养基中的产物醇水平达到预定水平时接触发酵培养基。例如，对于丁醇生产，所述ISPR提取剂可在所述丁醇浓度达到毒性水平之前接触发酵培养基。在将发酵培养基接触所述ISPR提取剂之后，丁醇产物分配到该提取剂，这降低了包含微生物的水相中的丁醇浓度，由此而限制了所述生产微生物对抑制性丁醇产物的暴露。

根据下文所述，所使用的ISPR提取剂的体积取决于多种因素，其包括发酵培养基体积、发酵容器大小、该提取剂对于丁醇产物的分配系数，以及所选用的发酵模式。所述提取剂的体积可以是该发酵容器工作体积的约3％至约60％。根据提取的效率，发酵培养基中的丁醇水相滴度可以是，例如，约5g/L至约85g/L、约10g/L至约40g/L、约10g/L至约20g/L、约15g/L至约50g/L或约20g/L至约60g/L。不受理论的限制，使用提取发酵方法据信可获得较高的丁醇滴度，这部分地通过从发酵培养基中移除毒性的丁醇产物，由此而将该水平保持低于对微生物具有毒性的水平。

在原位提取发酵的批次模式中，向发酵容器中加入了一定体积的有机提取剂并且在加工期间并不移除所述提取剂。该模式需要较大体积的有机提取剂以最小化发酵培养基中抑制的丁醇产物的浓度。因此，发酵培养基的体积相对更少，所生产的产物的量也比采用上述连续模式时所获得的更少。例如，在一个实施方案中所述批次模式中的提取剂的体积可以是发酵容器工作体积的约20％至约60％，并且在另一个实施方案中为约30％至约60％。

汽提(未示出)可与所述有机提取剂同时使用以从发酵培养基中移除产物醇。

在一些实施方案中，根据下文描述的图4和图5的实施方案中所示出，所述两相混合物的分离可在发酵容器中进行。特别地，在一个实施方案中，在原位提取发酵的连续模式中，可将提取剂28引入发酵容器30以在其中获得两相混合物，而包含醇的有机相物流36直接脱离发酵容器30中。水相物流34也可直接脱离实施例30，经处理以移除任何存留的产物醇并且进行重新循环，或废弃并且代之以新鲜发酵培养基。可在进行或不进行微生物32从所述发酵液体培养基中的移除的情况下完成以所述ISPR提取剂对所述产物醇的提取。可通过本领域中已知的任意方法从所述发酵液体培养基中移除微生物32，其包括但不限于过滤或离心。例如，水相物流34可包括微生物32，诸如酵母。可容易地从所述水相物流中分离微生物32，例如在离心机中分离(未示出)。微生物32可随后重新循环至实施例30，其可随时间提高醇生产的生产率，由此而导致所述醇生产的效率提高。

在原位提取发酵的连续模式中，所述提取剂的体积在一个实施方案中可以是所述发酵容器工作体积的约3％至约50％，在另一个实施方案中约3％至约30％，在另一个实施方案中3％至约20％，在另一个实施方案中3％至约10％。由于所述产物从反应器中连续地移除，因此需要较小体积的提取剂，这实现了对较大体积的发酵培养基的使用。

作为原位提取发酵的另外选择，所述产物醇可从发酵容器30的下游发酵液体培养基中提取。在这一情况下，可从发酵容器30中移除所述发酵液体培养基并将其引入容器35。可随后将提取剂28引入容器35并且与所述发酵液体培养基接触以在容器35中获得两相混合物39，其随后分离成为有机相36和水相34。或者，可在引入容器35之前，在另一容器中将提取剂28加至所述发酵液体培养基。

脂肪酸提取剂28对于所述产物醇的分配系数大于油26对于所述产物醇的分配系数。例如，在原料12为玉米的情况下，玉米油26(如果存在于所述发酵液体培养基中)可具有对于所述产物醇低于约0.28的分配系数，而产生自玉米油26的脂肪酸提取剂28可具有约0.28或更高的分配系数。在一个实施方案中，脂肪酸提取剂28具有对于所述产物醇(诸如丁醇)至少约1的分配系数，在另一个实施方案中至少约2，在另一个实施方案中至少约2.5，在另一个实施方案中至少约2.75，在另一个实施方案中至少约3。因此，通过不仅降低所述ISPR提取剂的分配系数退化的威胁而且还作为脂肪酸提取剂生产的原材料发挥作用，所述原料的油组分在提取发酵中提高了所述产物醇生产的效率，相比所述油自身该脂肪酸提取剂可将更多的产物醇从所述水相中分出。此外，来自原料12中的油26的脂肪酸提取剂28可单独使用或结合外源提取剂(如，由外部供应的油醇)使用，由此而降低或消除所述外部提取剂相关的成本。

此外，在脂肪酸提取剂28包括游离脂肪酸的情况下，发酵容器30中的微生物32的葡萄糖消耗速度在这些游离脂肪酸存在的情况下可高于不存在这些游离脂肪酸的情况，因此，在本发明的一些实施方案中，所述发酵液体培养基可接触具有游离脂肪酸的脂肪酸提取剂，在提取发酵中，相对于使用无游离脂肪酸的ISPR提取剂(如油醇)时的葡萄糖摄取所述游离脂肪酸以此可提高微生物32的葡萄糖摄取。例如，根据下文所述实施例2的表1所示出，与使用油醇作为提取剂的情况相比，在提取发酵中作为脂肪酸提取剂使用的脂肪酰胺/脂肪酸混合物可提供酵母菌属丁醇菌原(Saccharomycesbutanologen)的较高葡萄糖摄取率。2010年7月28日提交的共同待决的共同拥有的美国临时专利申请61/368,451中描述了用于通过发酵加工产生产物醇的方法，其中在所述加工的步骤中产生了游离脂肪酸并且其在发酵容器中接触微生物培养物以改善微生物生长速度和葡萄糖消耗，所述专利申请全文以引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，可改进图1的系统和加工以使用分离器20和发酵容器30之间的独立糖化容器60代替发酵容器30中的同步糖化和发酵，其对于本领域的技术人员应是明了的。

根据示出，在另外的实施方案中，例如在图2的实施方案中，糖化可在位于分离器20和液化容器10之间的独立糖化容器60中进行。图2实质上等同于图1，除包含入接收酶38的独立糖化容器60之外，其中油物流26与液化的糖化原料物质62相分离。原料浆液16与酶38(诸如葡糖淀粉酶)一同引入糖化容器60，浆液16中低聚糖形式的糖以此而分解为单糖。液化的糖化原料物流62脱离糖化容器60并且引入分离器20。原料物流62包括来自原料的单糖、油和不溶解固体。在分离器20中，原料物流62分离成为油物流26和实质上的水性物流23，其引入了发酵容器30。在所示出的实施方案中，水性物流23包括不溶解固体。或者，根据对于图1的实施方案的描述，所述固体可在分离器20作为湿饼24移除。从分离器20中排出的所述油物流26具有一定量的甘油酯，尤其是甘油三酯，其在反应容器40中接触以一种或多种物质42。物质42将来自油26的至少部分甘油酯类化学地转化成脂肪酸提取剂28，其引入了发酵容器30。图2的实施方案的其它加工操作与图1相同，并且因此不再详述。

根据示出，在本发明的一些实施方案中，例如图3的实施方案中，提取发酵可使用脂肪酸提取剂28′，其产生自与原料12相同或不同的生物质，但是其并非产生自原料12中包含的已存在油。例如，当原料12是玉米时，脂肪酸提取剂28′可产生自玉米油，但是产生提取剂28′的玉米油并非根据图1的实施方案所提供的原料12中所包含并且分离至反应容器40的玉米油。作为另一实例，脂肪酸提取剂28′可产生自作为生物质来源的黄豆(或大豆)，而原料12的生物质来源是玉米。可使用提取剂28′与原料12的不同生物质来源的任何可能组合，这对于本领域的技术人员应是明了的。

在一些实施方案中，脂肪酸提取剂28′来自于任何天然油，并且因此而可以来自于生物质来源或动物来源。

在图3的实施方案中，将液化的水性物流22与糖化酶38和微生物32一同引入发酵容器30，由此而通过同步糖化和发酵(SSF)产生产物醇。在一些实施方案中，糖化可在独立的容器中进行，诸如对于图2的实施方案的描述。在一些实施方案中，优选地液化水性物流22已经通过分离器20(参见图1)移除了至少油26，并且在一些实施方案中，还在引入发酵容器30之前将不溶解固体作为湿饼24移除(参见图1)。将天然油(诸如植物来源的油)作为物流26′与物质42一同引入反应器40以将油26′的至少一部分化学地转化成脂肪酸提取剂28′。油物流26′并非来自原料浆液16上游的油26(参见图1)。可经化学地转化成脂肪酸提取剂28′以用于ISPR的任何植物来源的油或其它天然油。随后将来自反应容器40的脂肪酸提取剂28′引入发酵容器30，由此而使所述产物醇以较高程度分配到脂肪酸提取剂28′，如果所述发酵容器中存在油26′则所述产物醇将以该程度分配到油26′。

因此，在一些实施方案中，使用获自植物来源的油26′的脂肪酸提取剂28′提取了所述产物醇，所述油26′与最初经过原料12引入所述加工的油26并不相同。任选地，一种或多种另外的提取剂29可引入发酵容器30以用于将产物醇从水相中优先地分出。所述一种或多种另外的提取剂29可以是外源提取剂，诸如外部供应的油醇，其并未在所述加工中产生，并且/或者是另一种脂肪酸提取剂。在一些实施方案中，这些另外的脂肪酸提取剂29可通过油产生，来自于与发酵容器原料物质22和油物流26′的生物质来源相同或不同的生物质。

除未显示水相34被引回发酵容器30之外，图3的实施方案的其它加工操作与图1和图2相同，并且因此将不再详述。但是应当了解，在本文给出的任意实施方案中，全部或部分水相34可根据对于图1的描述进行重新循环、废弃和/或进一步处理以移除产物醇。

在本发明的一些实施方案中，来自原料12的油并非在分离器20中分离，而是原位经化学地转化成脂肪酸提取剂，例如，在液化之前或其间在原料12中进行、在浆液16中进行或在糖化物流62中进行(参见图2)。例如，在图4的实施方案中，将原料12与适当的酶14(例如，α-淀粉酶)一同引入液化容器10，从而水解所述原料12中的淀粉以产生液化原料。在原料12的液化之前、期间或之后还向液化容器10中引入了一种或多种物质42以用于将原料12中存在的油化学地转化成脂肪酸提取剂28。可在加入酶14之前或之后将物质42引入液化容器10，并且可在原料12的液化之前、期间或之后将原料12中的油转化成提取剂28。在任何情况下，将原料12中的油转化成脂肪酸提取剂28从而使两相物流18脱离液化容器10。两相物流18包括脂肪酸提取剂28以及形成液化水相22的糖、水和不溶解固体。在脂肪酸提取剂包括脂肪酸的一些实施方案中，双相物流18的水相22可包括来自油中的甘油酯类向脂肪酸的转化的甘油。在一些实施方案中，可在引入发酵容器30前从所述物流18中移除这些甘油(如果存在)。

对于图4，两相物流18(即物流22、28)在发酵容器30中接触发酵液体培养基以形成两相混合物。在发酵容器30中，通过SSF产生的产物醇分配到包括脂肪酸提取剂28的有机相。或者，在一些实施方案中，可根据与图2相关联的讨论改进所述加工以包括独立的糖化容器。所述两相混合物的分离在发酵容器30中进行，从而使包含醇的有机相物流36和水相物流34直接从发酵容器30中脱离。或者，对所述两相混合物的分离可在图1-3的实施方案中提供的分离容器35中进行。任选地，一种或多种另外的提取剂29可引入发酵容器30以用于形成有机相，其将产物醇从水相中优先地分出。图4的实施方案的其它加工操作与前文所述的附图相同，并且因此不再详述。

在本发明的一些实施方案中，可在醇发酵之后的步骤中从所述加工物流中分离原料12中存在的生物质油。可随后将所述发酵后分离的油转化成脂肪酸提取剂，并且作为ISPR提取剂引入该发酵容器。例如，在图5的实施方案中，将原料12液化以产生原料浆液16，其包括来自所述原料的油26。原料浆液16还可包括来自所述原料的不溶解固体。或者，可通过分离器(诸如离心机(未示出))从浆液16中分离所述不溶解固体。将包含油26的原料浆液16直接引入包含发酵液体培养基的发酵容器30，所述发酵液体培养基包括糖化酶38和微生物32。通过SSF在发酵容器30中产生了产物醇。或者，在一些实施方案中，可根据与图2相关联的讨论改进所述加工以包括独立的糖化容器。

将ISPR提取剂29引入发酵容器30以形成两相混合物，并且所述产物醇通过分配到所述ISPR提取剂29的有机相而移除。油26也分配到所述有机相。ISPR提取剂29可以是一种或多种脂肪酸提取剂和/或并非来自天然油的外源有机提取剂(如，油醇)。如果提取剂29是脂肪酸提取剂，所述提取剂29可以是由天然油产生的脂肪酸提取剂28′(参见图3)，诸如与最初通过原料12引入所述加工的油并不相同的植物来源的油。

所述两相混合物的分离在发酵容器30中进行，从而使包含醇的有机相物流36和水相物流34直接从发酵容器30中脱离。或者，对所述两相混合物的分离可在图1-3的实施方案中提供的分离容器35中进行。将包括油26的有机相物流36引入分离器50以从提取剂29中移除产物醇54。所产生的低醇提取剂27包括回收的提取剂29和油26。将包括油26的提取剂27引入反应容器40并且将其接触一种或多种物质42(如，反应剂和/或溶剂)，其将油26的至少一部分化学地转化成脂肪酸提取剂28。

包含入脂肪酸提取剂28的提取剂27可随后重新循环回到发酵容器30。这一重新循环的提取剂物质27可以是独立的物流或是与新鲜的补料提取剂物流29的结合物流。除油26与所述产物醇之外，对包含醇的有机相36进行的后续收取还可随即包括脂肪酸提取剂28和ISPR提取剂29。随后可处理有机相36以回收所述产物醇，将所述油进行反应以形成脂肪酸提取剂，并且作为所产生的低醇脂肪酸提取剂28和低醇提取剂29进行重新循环以回到发酵容器30。在一些实施方案中，在随时间运行所述发酵加工时可以取消提取剂29的使用，这是因为所述加工自身可产生足以提取所述产物醇的脂肪酸提取剂28。因此，所述ISPR提取剂可以是通过反应容器40重新循环的提取剂27和作为补料ISPR提取剂的脂肪酸提取剂28。

或者，在一些实施方案中，可在在分离器50中进行产物醇回收54之前将包括油26的有机相物流36引入反应容器40。在这些实施方案中，可将有机相物流36引入反应容器50并且接触一种或多种物质以用于产生脂肪酸提取剂28。所产生的包括脂肪酸提取剂28的有机相物流36可随后引入分离器50以回收产物醇54，并且所产生的低醇提取剂可随后作为包含脂肪酸提取剂28的提取剂物流27重新循环进入发酵容器30。在另外的实施方案中，可在油26接触物质42之前从有机相物流36或提取剂物流27中分离油26以用于产生脂肪酸提取剂28。脂肪酸提取剂28可随后作为ISPR提取剂使用，其引入发酵容器30、不同发酵容器(如，在醇制造设施中与发酵容器30平行或串行运行)或储存用于其后的使用。

因此，图1-5提供了方法和系统的多种非限制性实施方案，其涉及发酵加工以及通过来自生物质的油26所产生的脂肪酸提取剂28和通过天然油产生的脂肪酸提取剂28′，诸如植物来源的油26′，所述提取剂可用于在提取发酵中移除产物醇。这些脂肪酸提取剂28和28′可选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙二醇酯、甘油三酯、以及它们的混合物。所述甘油三酯可经羟基化或烷氧基化(如甲氧基化、乙氧基化)。甘油酯从天然油向本文所述的脂肪酸提取剂的化学地转化可使用本领域已知的任意反应体系进行。例如，对于植物来源的油(诸如玉米油)，在一些实施方案中，作为脂肪酸提取剂28或28′的羟基化甘油三酯可通过将作为油26或26′的玉米油接触多种反应剂和溶剂42(细节参见下文参见实施例1)以实现方程I中示出的羟基化：

在一些实施方案中，作为油26和26′的玉米油甘油三酯可以与作为反应剂42的含水氢氧化铵反应以获得脂肪酰胺和脂肪酸，其可共同或分别作为脂肪酸提取剂28或28′使用，如Roe等，Am.Oil Chem.Soc.29：18-22，1952中所述以及方程II示出，例如：

在一些实施方案中，含水氢氧化铵是水中约28重量％的氨。在一些实施方案中，根据方程(II)产生的玉米油脂肪酰胺与玉米油脂肪酸的混合物可用于制备单一脂肪酸提取剂28或28′。在一些实施方案中，脂肪酰胺和脂肪酸的混合物可包括亚油酰胺、亚油酸、油酰胺、油酸、棕榈酰胺、棕榈酸、硬脂酰胺和硬脂酸。在这些实施方案中，该混合物可包含约37重量％的亚油酰胺、约18％的亚油酸、约19重量％的油酰胺、约9重量％的油酸、约8.7重量％的棕榈酰胺、约4.3重量％的棕榈酸、约1.2重量％的硬脂酰胺和约0.7重量％的硬脂酸。应当了解，其它组成量是可能的并且可取决于所使用的玉米油中亚油酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸的天然存在量。例如，据预计可具有(例如)最高达约65重量％油酸含量的高油酸玉米作为油26或26′根据方程(II)的反应将产生比使用正常玉米油时更高的油酰胺和油酸的混合物，所述正常玉米油约为24重量％的油酸含量。在一些实施方案中，根据方程(II)所产生的玉米油脂肪酰胺和玉米油脂肪酸可与脂肪酸相混合以改变所述脂肪酸提取剂28或28′中的脂肪酰胺与脂肪酸的比率。在一些实施方案中，脂肪酰胺与脂肪酸的混合物可以是处于约2∶1至约1∶2比率的混合物。

在一些实施方案中，可使用物质42无水氨作为反应剂以醋酸铵作为催化剂从作为油26或26′的玉米油中合成纯玉米油脂肪酰胺作为脂肪酸提取剂28或28′，例如根据Kohlhase等，J.Am.Oil Chem.Soc.48：265-270，1971中的描述。在一些实施方案中，所述纯玉米油脂肪酰胺可包括亚油酰胺、油酰胺、棕榈酰胺和硬脂酰胺。在这些实施方案中，所述纯玉米油脂肪酰胺可包含约55重量％的亚油酰胺、约28重量％的油酰胺、约13重量％的棕榈酰、以及约2重量％的硬脂酰胺。根据上文指出，应当了解其它组成量是可能的并且可取决于所使用的玉米油中亚油酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸的天然存在量。

在一些实施方案中，脂肪酸提取剂28或28′可包括式R(C＝O)N(R’)(R”)的脂肪酰胺，其中R独立地选自任选地以一个或多个双键间隔的C₃-C₂₇烷基基团，并且R’和R”独立地选自氢和任选地包含一个或多个羟基基团的C₁-C₆烷基基团。

在一些实施方案中，可通过碱水解使用NaOH和水作为物质42(例如，参见下文实施例4)由作为油26或26′的玉米油合成玉米油脂肪酸作为脂肪酸提取剂28或28′，其根据方程III的反应，例如：

在一些实施方案中，纯玉米油脂肪酰胺与纯玉米油脂肪酸可进行混合以用于制备单一脂肪酸提取剂28或28′。例如，脂肪酰胺与脂肪酸的这些混合物可以是2∶1的混合物，并在其另外的实施方案中为1∶2。

在一些实施方案中，可通过还原使用四氢呋喃(THF)和LiAlH₄作为物质42(例如，参见下文实施例3)由作为油26或26′的玉米油产生脂肪醇作为脂肪酸提取剂28或28′，其根据方程IV的反应，例如：

在一些实施方案中，作为油26或26′的玉米油可接触作为物质42的甲醇和酸催化剂以产生作为脂肪酸提取剂28或28′的脂肪酯。例如，玉米油可在硫酸存在的情况下与醇(包括但不限于8个碳或更少的醇)反应以产生脂肪酯(例如，参见下文实施例4)，其根据方程V的反应：

在一些实施方案中，可通过产生脂肪酸甲酯(FAME)(参见上文方程V)并进一步将FAME与作为另外物质42的乙二醇反应(例如，参见下文实施例5)而将作为油26或26′的玉米油转化成玉米油乙二醇酯(FAGE)，其根据方程VI的反应，例如：

(VI)

R-(C＝O)-OMe+HO-CH₂CH₂-OH-→R-(C＝O)-O-CH₂CH₂-OH

在一些实施方案中，脂肪醇可进行羟基化并且用作为提取剂。例如，脂肪醇可与过醋酸反应并且随后与含水酸类反应以沿链羟基化双键(例如，参见实施例8)，其根据方程VII所示：

在一些实施方案中，所述提取剂可以是液体或固体，诸如珠粒。可以固体形式(诸如珠粒)存在的提取剂在制造加工中可以容易地操作。此外，可从这一提取剂中回收所述产物醇(如丁醇)，例如，通过汽提、在另一溶剂中溶解或本领域的技术人员所知的任何其它适用方法。

在包括前文针对图1-5所描述的实施方案在内的一些实施方案中，发酵容器30中的发酵液体培养基包括至少一种重组微生物32，其经基因修饰(即，基因工程改造)以通过由至少一种可发酵碳源成为丁醇的生物合成途径产生丁醇。特别地，可在包含适当碳底物的发酵液体培养基中生长重组微生物。另外的碳底物可包括但不限于单糖(诸如果糖)；低聚糖(诸如乳糖、麦芽糖或蔗糖)；多糖(诸如淀粉和纤维素)；或它们的混合物，以及来自可再生原料(诸如奶酪乳清浸透物、玉米浆、甜菜粕和大麦芽)的未纯化混合物。其它碳底物可包括乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐或甘油。

此外，所述碳底物还可以是已经表现出形成关键生化中间物的代谢转化的单碳底物，诸如二氧化碳或甲醇。除单碳和双碳底物外，还已知利用大量其它含碳化合物(诸如甲胺、葡萄糖胺以及多种氨基酸)进行代谢活动的甲基营养型生物体。例如，甲基营养型酵母已知利用来自甲胺的碳形成海藻糖或甘油(Bellion等，Microb.Growth C1 Compd.，[Int.Symp.]，第7版(1993)，415-32，编辑：Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.Publisher：Intercept，Andover，UK)。类似地，假丝酵母的多个菌种可代谢丙氨酸或油酸(Sulter等，Arch.Microbiol.153：485-489，1990)，所述的方法测定氧化多糖的氧化度。因此，预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并将仅受限于生物体的选择。

尽管据设想全部上述碳底物及其混合物是适当的，在一些实施方案中，所述碳源为葡萄糖、果糖和蔗糖，或这些糖与C5糖(诸如木糖和/或阿拉伯糖)的混合物，其用于经修饰利用C5糖的酵母细胞。蔗糖可来源于可再生的糖源例如甘蔗、甜菜、木薯、甜高粱、以及它们的混合物。葡萄糖和右旋糖可通过糖化淀粉基原料来源于可再生的谷物来源，包括谷物如玉米、小麦、黑麦、大麦、燕麦、以及它们的混合物。此外，根据(例如)美国专利申请公开2007/0031918A1中所述，可发酵糖可通过预处理和糖化而来自可再生纤维素或木质纤维素生物质，所述专利申请以引用的方式并入本文。除适当的碳源外(来自水性物流22)，发酵液体培养基必须包含本领域的技术人员所知的适当矿物质、盐类、辅因子、缓冲剂以及其它组分，其适用于所述培养物的生长和包含二羟酸脱氢酶(DHAD)的酶学途径的促进。

用于通过生物合成途径产生丁醇的重组微生物可包括梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、发酵单孢菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、亚罗酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)或酵母菌属(Saccharomyces)的成员。在一个实施方案中，重组微生物可选自大肠杆菌(Escherichia coli)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一个实施方案中，所述重组微生物是克拉布特里阳性酵母，其选自酵母菌属、接合酵母菌属(Zygosaccharomyces)、裂殖酵母菌属、德克酵母菌属(Dekkera)、球拟酵母菌(Torulopsis)、酒香酵母菌属(Brettanomyces)以及假丝酵母菌属的某些菌种。克拉布特里阳性酵母的菌种包括但不限于啤酒糖酵母、克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、芽殖酵母(Saccharomyces mikitae)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)和光滑假丝酵母(Candida glabrata)。例如，利用以微生物进行发酵的丁醇生产以及生产丁醇的微生物是已知的，并且公开于(例如)美国专利申请公开2009/0305370，其以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，微生物包含丁醇生物合成途径。适当的异丁醇生物合成途径在本领域中是已知的(例如，参见美国专利申请公开2007/0092957，其以引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，催化底物朝向途径中的产物转化的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种多肽由所述微生物中的异源聚核苷酸编码。在一些实施方案中，催化底物朝向途径的产物转化的全部多肽均由所述微生物中的外源聚核苷酸编码。在一些实施方案中，所述微生物包含丙酮酸脱羧酶活性的降低或消除。实质上无丙酮酸脱羧酶活性的微生物描述于美国专利申请公开2009/0305363中，其以引用的方式并入本文。

本文提供了特定菌株的构建，其包括实施例中使用的菌株。

酿酒酵母菌株BP1064和异丁醇菌原BP1083(NGCI-070)的构建

所述菌株BP1064来源于CEN.PK 113-7D(CBS 8340；Centraalbureauvoor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre，Netherlands)并包含下列基因的缺失：URA3、HIS3、PDC1、PDC5、PDC6和GPD2。使用质粒pYZ090(SEQ ID NO：1，其构建描述于2009年9月29日提交的美国专利申请61/246,844，其以引用的方式并入本文)和pLH468(SEQ ID NO：2)转化BP1064以产生异丁醇菌原菌株NGCI-070(BP1083)。

缺失，即完全移除整个编码序列，通过与PCR片段同源重组而产生，所述PCR片段包含靶基因的上游和下游同源区域以及用于选择转化子的G418抗性标记或URA3基因。侧翼为loxP位点的G418抗性标记使用Cre重组酶移除。通过同源重组移除所述URA3基因以产生无痕缺失，或在侧翼为loxP位点的情况下使用Cre重组酶移除。

所述无痕缺失方法改造自Akada等，(Yeast 23：399-405，2006)。一般来讲，每个无痕缺失的PCR盒是通过重叠PCR组合四个片段A-B-U-C得到的。所述PCR盒包含可选的/反可选的标记URA3(片段U)，其包含原生CEN.PK 113-7D URA3基因，连同启动子(URA3基因上游250bp)和终止子(URA3基因下游150bp)。片段A和C每个长500bp，它们对应于紧接靶基因上游的500bp(片段A)和靶基因3′的500bp(片段C)。片段A和C用于通过同源重组将盒整合到染色体中。片段B(500bp长)对应于紧接靶基因下游的500bp并用于通过同源重组，从染色体上切除URA3标记和片段C，在盒整合到染色体时生成作为对应片段B的直接重复序列使用PCR产物ABUC盒，首先将URA3标记整合进基因组，然后通过同源重组从基因组中切除。初始整合删除了除3′的500bp之外的基因。在切除时，也删除了基因3′的500bp区域。对于使用这个方法的基因整合，将要整合的基因包含在PCR盒的片段A和B之间。

URA3缺失

为删除内源URA3编码区，ura3::loxP-kanMX-loxP盒以PCR扩增自pLA54模板DNA(SEQ ID NO：3)。pLA54包含乳酸克鲁维酵母TEF1启动子和kanMX标记，并且侧翼为loxP位点，以允许使用Cre重组酶参与重组并移除标记。PCR使用

DNA聚合酶(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)以及引物BK505和BK506(SEQ ID NO：4和5)进行。每个引物的URA3部分来源于URA3启动子上游5′区和编码区下游3′区，使得loxP-kanMX-loxP标记的整合导致URA3编码区的取代。使用标准遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，第201-202页)，将所述PCR产物转化进入CEN.PK 113-7D，并在30℃下在包含G418(100μg/mL)的YPD上筛选转化子。筛选的转化子的正确整合通过PCR来验证LA468，所用LA492引物为和(SEQ ID NO：6和7)并且命名为CEN.PK 113-7D Δura3::kanMX。

HIS3缺失

使用

DNA聚合酶进行(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)并且以CEN.PK 113-7D基因组DNA为模板扩增用于无痕HIS3缺失的盒式PCR的四个片段，所述基因组DNA使用

Yeast/Bact试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。HIS3片段A的扩增采用引物oBP452(SEQ IDNO：14)和引物oBP453(SEQ ID NO：15)，其包含与HIS3片段B的5′末端具有同源性的5′尾部。HIS3片段B的扩增采用引物oBP454(SEQ ID NO：16)，其包含与HIS3片段A的3′末端具有同源性的5′尾部，以及引物oBP455(SEQ ID NO：17)，其包含与HIS3片段U的5′末端具有同源性的5′尾部。HIS3片段U的扩增采用引物oBP456(SEQ ID NO：18)，其包含与HIS3片段B的3′末端具有同源性的5′尾部，以及引物oBP457(SEQ ID NO：19)，其包含与HIS3片段C的5′末端具有同源性的5′尾部。HIS3片段C的扩增采用引物oBP458(SEQ ID NO：20)，其包含与HIS3片段U的3′末端具有同源性的5′尾部，以及引物oBP459(SEQ ID NO：21)。使用PCR Purification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。HIS3片段AB通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段A和HIS3片段B并用引物oBP452(SEQ ID NO：14)和oBP455(SEQ ID NO：17)。HIS3片段UC通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456(SEQ ID NO：18)和oBP459(SEQ ID NO：21)。通过琼脂糖凝胶并继之以Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化所产生的PCR产物。HIS3 ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段AB和HIS3片段UC并用引物oBP452(SEQID NO：14)和oBP459(SEQ ID NO：21)。使用PCR Purification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化所述PCR产物。

制备了CEN.PK 113-7DΔura3::kanMX的感受态细胞并且使用Frozen-EZ Yeast Transformation II^TM试剂盒(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)以HIS3 ABUC PCR盒对其进行转化。在30℃下将转化混合物平铺于补充以2％的葡萄糖的缺乏尿嘧啶的合成完全培养基上。具有his3敲除的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP460(SEQ ID NO：22)和oBP461(SEQ ID NO：23)，使用以Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备的基因组DNA。正确的转化子选择为菌株CEN.PK 113-7DΔura3::kanMXΔhis3::URA3。

从Δura3位点移除KanMX标记以及从Δhis3位点移除URA3标记

通过使用Frozen-EZ Yeast Transformation II^TM试剂盒(Zymo ResearchCorporation，Irvine，CA)以pRS423::PGAL1-cre(SEQ ID NO：66，其描述于美国专利临时申请61/290,639)转化CEN.PK 113-7DΔura3::kanMXΔhis3::URA3并在30℃下平铺于缺乏组氨酸和尿嘧啶并补充以2％葡萄糖的合成完全培养基之上，从而移除了所述KanMX标记。转化子在30℃下在补充以1％半乳糖的YP中生长～6小时以诱导所述Cre重组酶和KanMX标记切除并在30℃下将其平铺于YPD(2％葡萄糖)之上进行回复。分离株在YPD中生长过夜并在30℃下平铺于包含5-氟-乳清酸(5-FOA，0.1％)的合成完全培养基上以选择缺失所述URA3标记的分离株。在YPD中生长5-FOA抗性分离株并平铺于YPD上以移除pRS423::PGAL1-cre质粒。通过分析在YPD+G418平板、缺乏尿嘧啶的合成完全培养基婆娘改版以及缺乏组氨酸的合成完全培养基平板上的生长而检验了分离株对所述KanMX标记、URA3标记和pRS423::PGAL1-cre质粒的缺失。对G418敏感并为尿嘧啶和组氨酸营养缺陷性的正确的分离株被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3::loxPΔhis3并命名为BP857。所述缺失和标记移除通过PCR和测序确认，对于Δura3，所用引物为oBP450(SEQ ID NO：24)和oBP451(SEQ ID NO：25)，并且对于Δhis3，所用引物为oBP460(SEQ ID NO：22)和oBP461(SEQ ID NO：23)，使用以

Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备的基因组DNA。

PDC6缺失

使用

DNA聚合酶进行(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)并且以CEN.PK 113-7D基因组DNA为模板扩增用于无痕PDC6缺失的PCR盒的四个片段，所述基因组DNA使用

Yeast/Bact试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。PDC6片段A的扩增采用引物oBP440(SEQ IDNO：26)和引物oBP441(SEQ ID NO：27)，其包含与PDC6片段B的5′末端具有同源性的5′尾部。PDC6片段B的扩增采用引物oBP442(SEQ ID NO：28)，其包含与PDC6片段A的3′末端具有同源性的5′尾部，以及引物oBP443(SEQ ID NO：29)，其包含与PDC6片段U的5′末端具有同源性的5′尾部。PDC6片段U的扩增采用引物oBP444(SEQ ID NO：30)，其包含与PDC6片段B的3′末端具有同源性的5′尾部，以及引物oBP445(SEQ ID NO：31)，其包含与PDC6片段C的5′末端具有同源性的5′尾部。PDC6片段C的扩增采用引物oBP446(SEQ ID NO：32)，其包含与PDC6片段U的3′末端具有同源性的5′尾部，以及引物oBP447(SEQ ID NO：33)。使用PCRPurification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。PDC6片段AB通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段A和PDC6片段B并用引物oBP440(SEQ ID NO：26)和oBP443(SEQ ID NO：29)。PDC6片段UC通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段U和PDC6片段C并用引物oBP444(SEQID NO：30)和oBP447(SEQ ID NO：33)。通过琼脂糖凝胶并继之以GelExtraction试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化所产生的PCR产物。所述PDC6ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段AB和PDC6片段UC并用引物oBP440(SEQ ID NO：26)和oBP447(SEQ ID NO：33)。使用PCRPurification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化所述PCR产物。

制备了CEN.PK 113-7DΔura3::loxPΔhis3的感受态细胞并且使用Frozen-EZ Yeast Transformation II^TM试剂盒(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)以PDC6 ABUC PCR盒对其进行转化。在30℃下将转化混合物平铺于补充以2％的葡萄糖的缺乏尿嘧啶的合成完全培养基上。带有pdc6敲除的转化子通过PCR进行筛选，所用引物为oBP448(SEQ ID NO：34)和oBP449(SEQID NO：35)，使用以

Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备的基因组DNA。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3::loxP Δhis3 Δpdc6::URA3。

CEN.PK113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6::URA3在YPD中生长过夜并在30℃下平铺于包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上以选择缺失所述URA3标记的分离株。所述缺失和标记移除通过PCR和测序确认，所用引物为oBP448(SEQ ID NO：34)和oBP449(SEQ ID NO：35)，使用以

Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备的基因组DNA。来自分离株的PDC6基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，所用PDC6的编码区的特异性引物为oBP554(SEQ ID NO：36)和oBP555(SEQ ID NO：37)。正确的分离株被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6并被命名为BP891。

PDC1缺失ilvDSm整合

将PDC1基因删除并代之以来自变异链球菌(Streptococcusmutans)ATCC No.700610的ilvD编码区。使用

High Fidelity PCRMaster Mix(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)并以使用

Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备的NYLA83(其在本文以及美国专利临时申请61/246,709有所描述)基因组DNA作为模板，扩增了后接有来自变异链球菌的ilvD编码区的A片段，其用于进行PDC1缺失-ilvDsm整合的PCR盒。PDC1片段A-ilvDSm(SEQ ID NO：138)的扩增采用引物oBP513(SEQ ID NO：38)和引物oBP515(SEQ ID NO：39)，其包含与PDC1片段B的5′末端具有同源性的5′尾部。使用

DNA聚合酶进行(NewEngland BioLabs Inc.，Ipswich，MA)并且以CEN.PK 113-7D基因组DNA为模板扩增用于PDC1缺失-ilvDsm整合的PCR盒的B、U和C片段，所述基因组DNA使用

Yeast/Bact试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。PDC1片段B的扩增采用引物oBP516(SEQ ID NO：40)，其包含与PDC1片段A-ilvDSm的3′末端具有同源性的5′尾部，以及引物oBP517(SEQ ID NO：41)，其包含与PDC1片段U的5′末端具有同源性的5′尾部。PDC1片段U的扩增采用引物oBP518(SEQ ID NO：42)，其包含与PDC1片段B的3′末端具有同源性的5′尾部，以及引物oBP519(SEQ ID NO：43)，其包含与PDC1片段C的5′末端具有同源性的5′尾部。PDC1片段C的扩增采用引物oBP520(SEQ ID NO：44)，其包含与PDC1片段U的3′末端具有同源性的5′尾部，以及引物oBP521(SEQ ID NO：45)。使用PCR Purification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。通过将混合PCD1片段A-ilvDSm和PDC1片段B并以引物oBP513(SEQ ID NO：38)和oBP517(SEQ ID NO：41)扩增而进行的重叠PCR产生了PDC1片段A-ilvDSm-B。通过混合PDC1片段U和PDC1片段C并以引物oBP518(SEQ ID NO：42)和oBP521(SEQ ID NO：45)扩增而进行的重叠PCR产生了PDC1片段UC。通过琼脂糖凝胶并继之以Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化所产生的PCR产物。通过混合PDC1片段A-ilvDSm-B和PDC1片段UC并以引物oBP513(SEQ ID NO：38)和oBP521(SEQ ID NO：45)扩增而进行的重叠PCR产生了所述PDC1A-ilvDSm-BUC盒。使用PCR Purification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化所述PCR产物。

制备了CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6的感受态细胞并且使用Frozen-EZ Yeast Transformation II^TM试剂盒(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)以PDC1 A-ilvDSm-BUC PCR盒对其进行转化。在30℃下将转化混合物平铺于补充以2％的葡萄糖的缺乏尿嘧啶的合成完全培养基上。具有PDC1缺失-ilvDSm整合的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP511(SEQ IDNO：46)和oBP512(SEQ ID NO：47)，使用以Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备的基因组DNA。来自分离株的PDC1基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，使用PDC1编码区特异性的引物oBP550(SEQ ID NO：48)和oBP551(SEQ ID NO：49)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm-URA3。

CEN.PK113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm-URA3在YPD中生长过夜并在30℃下平铺于包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上以选择缺失所述URA3标记的分离株。所述PDC1的缺失、ilvDSm的整合以及标记的移除通过PCR和测序来确认，所用引物为oBP511(SEQ ID NO：46)和oBP512(SEQ ID NO：47)，使用以Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备的基因组DNA。正确的分离株被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm并命名为BP907。

PDC5缺失sadB整合

将所述PDC5基因删除并代之以来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)的sadB编码区。首先将PDC5缺失-sadB整合的PCR盒的一个片段克隆到质粒pUC19-URA3MCS中。

pUC19-URA3MCS基于pUC19，并且包含来自酿酒酵母的URA3基因序列，其位于多克隆位点(MCS)之中。pUC19包含用于在大肠杆菌中进行复制和筛选的pMB1复制子和编码β-内酰胺酶的基因。除URA3的编码序列外，该基因的上游至下游序列都被包括用于在酵母中表达URA3。所述载体能用于克隆的目的，并且能用做酵母整合载体。

使用

High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)，以包含限制性位点BamHI、AscI、PmeI和FseI的引物oBP438(SEQ ID NO：12)和包含限制性位点XbaI、PacI和NotI的引物oBP439(SEQ ID NO：13)扩增了包含来自酿酒酵母CEN.PK 113-7D基因组DNA的URA3编码区以及URA3编码区的250bp上游区域和150bp下游区域的DNA。使用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备了基因组DNA。在使用BamHI和XbaI消化后，所述PCR产物和pUC19(SEQ ID NO：140)用T4DNA连接酶连接生成载体pUC19-URA3MCS。所述载体通过PCR和测序确认，所用引物为oBP264(SEQ IDNO：10)和oBP265(SEQ ID NO：11)。

所述sadB编码序列和PDC5片段B克隆到pUC19-URA3MCS生成PDC5A-sadB-BUCPCR盒的sadB-BU部分。所述sadB编码序列扩增以pLH468-sadB(SEQ ID NO：67)作为模板，所用引物为引物oBP530(SEQ IDNO：50)，其包含限制性位点AscI，以及引物oBP531(SEQ ID NO：51)，其包含与PDC5片段B的5′末端具有同源性的5′尾部。PDC5片段B的扩增采用引物oBP532(SEQ ID NO：52)，其包含与sadB的3′末端具有同源性的5′尾部，以及引物oBP533(SEQ ID NO：53)，其包含限制性位点PmeI。使用PCRPurification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。通过混合所述sadB和PDC5片段B的PCR产物并以引物oBP530(SEQ ID NO：50)和oBP533(SEQ ID NO：53)扩增进行的重叠PCR，产生了sadB-PDC5片段B。在用合适的酶消化后，所得PCR产物经AscI和PmeI消化用T4DNA连接酶连接到pUC19-URA3MCS对应的位点上。所得质粒用作模板以扩增sadB-片段B-片段U，所用引物为oBP536(SEQ ID NO：54)和oBP546(SEQ ID NO：55)，其包含与PDC5片段C的5′末端具有同源性的5′尾部。PDC5片段C的扩增使用了引物oBP547(SEQ ID NO：56)，其包含与PDC5 sadB-片段B-片段U的3′端具有同源性的5′尾部，以及引物oBP539(SEQ ID NO：57)。使用PCR Purification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。通过混合PDC5 sadB-片段B-片段U和PDC5片段C并以引物oBP536(SEQ ID NO：54)和oBP539(SEQ ID NO：57)扩增进行的重叠PCR，产生了PDC5 sadB-片段B-片段U-片段C。通过琼脂糖凝胶并继之以Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化所产生的PCR产物。所述PDC5A-sadB-BUC盒(SEQ IDNO：141)通过扩增PDC5 sadB-片段B-片段U-片段C而生成，所用引物为oBP542(SEQ ID NO：58)，其包含与天然PDC5编码序列上游紧邻的50个核苷酸具有同源性的5′尾部，以及oBP539(SEQ ID NO：57)。使用PCRPurification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化所述PCR产物。

制备了CEN.PK 113-7DΔura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm的感受态细胞并且使用Frozen-EZ Yeast Transformation II^TM试剂盒(Zymo ResearchCorporation，Irvine，CA)以PDC5 A-sadB-BUC PCR盒对其进行转化。在30℃下将转化混合物平铺于补充以1％的乙醇(无葡萄糖)的缺乏尿嘧啶的合成完全培养基上。具有pdc5敲除sadB整合的转化子通过PCR进行筛选，所用引物为oBP540(SEQ ID NO：59)和oBP541(SEQ ID NO：60)，使用以

Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备的基因组DNA。来自分离株的PDC5基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，使用PDC5编码区特异性的引物oBP552(SEQ ID NO：61)和oBP553(SEQ ID NO：62)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadB-URA3。

CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB-URA3在YPE(1％乙醇)中生长过夜并在30℃下平铺于补充以乙醇(无葡萄糖)并且包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上以选择缺失所述URA3标记的分离株。所述PDC5缺失、sadB整合以及标记移除是通过PCR确认的，所用引物为oBP540(SEQ ID NO：59)和oBP541(SEQ ID NO：60)，使用以

Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备的基因组DNA。所述正确的分离株被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB并命名为BP913。

GPD2缺失

为删除内源的GPD2编码区，使用loxP-URA3-loxP(SEQ ID NO：68)作为模板DNA对gpd2::loxP-URA3-loxP盒(SEQ ID NO：142)进行PCR扩增。loxP-URA3-loxP包含来自(ATCC No.77107)的URA3标记，其侧翼为loxP重组酶位点。PCR使用

DNA聚合酶(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)以及引物LA512和LA513(SEQ ID No：8和9)进行。每个引物的GPD2部分来源于GPD2编码区上游5′区和编码区下游3′区，使得loxP-URA3-loxP标记的整合导致GPD2编码区的取代。所述PCR产物转化到BP913并且转化子在缺乏尿嘧啶的辅以1％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上筛选。筛选的转化子的正确整合通过PCR来验证，所用引物为oBP582和AA270(SEQ ID No：63和64)。

通过以pRS423::PGAL1-cre(SEQ ID NO：66)进行的转化并且在30℃下平铺于缺乏组氨酸的补充以1％的乙醇的合成完全培养基之上再利用了所述URA3标记。将转化子划线于补充以1％乙醇并且包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，并且在30℃下进行孵育以筛选缺失URA3标记的分离株。在YPE(1％乙醇)中生长5-FOA抗性分离株以移除pRS423::PGAL1-cre质粒。通过PCR确认删除和标记移除，所述PCR具有引物oBP582(SEQ IDNO：63)和oBP591(SEQ ID NO：65)。筛选作为菌株CEN.PK 113-7DΔura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc 1::ilvDSm Δpdc5::sadB Δgpd2::loxP的正确分离株并命名为PNY1503(BP1064)。

使用质粒pYZ090(SEQ ID NO：1)和pLH468(SEQ ID NO：2)转化BP1064以产生菌株NGCI-070(BP1083；PNY1504)。

菌株NYLA74和NYLA83的构建

酿酒酵母内源PDC1和PDC6基因的插入灭活PDC1、PDC5和PDC6基因编码丙酮酸脱羧酶的三种主要同功酶，其描述如下：

pRS425::GPM-sadB的构建

克隆了编码来自木糖氧化无色杆菌的丁醇脱氢酶的DNA片段(SEQ IDNO：70)(其公开于美国专利申请公开2009/0269823中)。使用标准条件，从木糖氧化无色杆菌基因组DNA中扩增了称为sadB的这一仲醇脱氢酶基因的编码序列(SEQ ID NO：69)，其使用的正向和反向引物分别为N473和N469(SEQ ID NO：74和75)，所述基因组DNA使用

试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)根据针对革兰氏阴性生物的推荐方案进行制备。对所述PCR产物进行

克隆以进入

4BLUNT(In vitrogen^TM，Carlsbad，CA)，从而产生pCR4Blunt::sadB，其转化进入大肠杆菌Mach-1细胞。随后从四个克隆中分离质粒并确认序列。

从pCR4Blunt::sadB中对所述sadB编码区进行PCR扩增。PCR引物包含额外的5′序列，其应与酵母GPM1启动子和ADH1终止子重叠(N583和N584，以SEQ ID No：76和77提供)。随后如下文使用“缺口修复”方法在酿酒酵母中克隆所述PCR产物(Ma等，Gene 58：201-216，1987)。使用BbvCI和PacI限制性酶消化酵母大肠杆菌穿梭载体pRS425::GPM::kivD::ADH以释放kivD编码区，所述载体其包含GPM1启动子(SEQ ID NO：72)、来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的kiv编码区(SEQ ID NO：71)以及ADH1终止子(SEQ ID NO：73)(描述于美国专利申请公开2007/0092957A1的实施例17中)。将约1μg的存留载体片段与1μg的sadB PCR产物一同转化进入酿酒酵母菌株BY4741。在缺乏亮氨酸的合成完全培养基上筛选转化子。使用引物N142和N459(SEQ ID No：108和109)以PCR确认产生pRS425::GPM-sadB(SEQ ID NO：124)的正确重组事件。

pdc6::P _GPM1 -sadB整合盒和PDC6缺失的构建

通过将来自pRS425::GPM-sadB(SEQ ID NO：78)的GPM-sadB-ADHt片段与来自pUC19-URA3r的URA3r基因进行连接而制备了pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t-URA3r整合盒。pUC19-URA3r(SEQ ID NO：80)包含来自pRS426(ATCC No.77107)的URA3标记，其侧翼为75bp同源重复序列以实现体内同源重组和对所述URA3标记的移除。通过SOE PCR(根据Horton等.，Gene 77：61-68，1989的描述)使用模板pRS425::GPM-sadB和pUC19-URA3r质粒DNA，以

DNA聚合酶(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)和引物114117-11A至114117-11D(SEQ ID No：81、82、83和84)以及114117-13A和114117-13B(SEQ ID No：85和86)连接了所述两种DNA片段。

SOE PCR的外侧引物(114117-13A和114117-13B)包含5′和3′～50bp分别与PDC6启动子和终止子的上游和下游区域同源的区域。使用标准遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，第201-202页)，将所述完成的盒式PCR片段转化进入BY4700(ATCC No：200866)并且在30℃下将转化子在缺乏尿嘧啶并补充以2％葡萄糖的合成完全培养基上维持。使用引物112590-34G和112590-34H(SEQ ID NO：87和88)，以及112590-34F和112590-49E(SEQ ID NO：89和90)通过PCR筛选转化子，以确定在带有PDC6编码区的缺失的PDC6基因座的整合。通过按照标准规程在30℃涂布于补充2％葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上，对所述URA3r标记进行回收利用。通过将菌落由所述5-FOC平板贴附于SD-URA培养基上以验证生长缺乏，从而证实了标记的移除。得到的经过鉴定的菌株具有下列基因型：BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t。

pdc1::PPDC1-ilvD整合盒和PDC1缺失的构建

通过将来自pLH468(SEQ ID NO：2)的ilvD-FBA1t片段(SEQ ID NO：91)与来自pUC19-URA3r的URA3基因进行连接而制备了pdc1::PPDC1-ilvD-FBA1t-URA3r整合盒，所述连接通过SOE PCR(根据Horton等.，Gene77：61-68，1989的描述)使用模板pLH468和pUC19-URA3r质粒DNA，以

DNA聚合酶(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)和引物114117-27A至114117-27D(SEQ ID No：110、111、112和113)进行。

SOE PCR的外侧引物(114117-27A和114117-27D)包含5′和3′～50bp与PDC1启动子的下游区域和PDC1编码序列的下游区域同源的区域。使用标准遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)，将所述完成的盒式PCR片段转化进入BY4700 pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t并且在30℃下将转化子在缺乏尿嘧啶并补充以2％葡萄糖的合成完全培养基上维持。使用引物114117-36D和135(SEQ ID NO：92和93)以及引物112590-49E和112590-30F(SEQ ID NO：90和94)通过PCR筛选转化子，以确定在带有PDC1编码序列的缺失的PDC1基因座的整合。通过按照标准规程在30℃涂布于补充2％葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上，对所述URA3r标记进行回收利用。通过将菌落由所述5-FOC平板贴附于SD-URA培养基上以验证生长缺乏，从而证实了标记的移除。得到的经过鉴定的菌株“NYLA67”具有下列基因型：BY4700 pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t pdc1::PPDC1-ilvD-FBA1t。

HIS3缺失

为了删除内源HIS3编码区，通过PCR从URA3r2模板DNA(SEQ IDNO：95)中扩增his3::URA3r2盒。URA3r2包含来自pRS426(ATCC No.77107)的URA3标记，其侧翼为500bp同源重复序列以实现体内同源重组和对所述URA3标记的移除。使用

DNA聚合物(New England BioLabsInc.，Ipswich，MA)和引物114117-45A与114117-45B(SEQ ID NO：96和97)进行PCR，产生～2.3kb的PCR产物。每种引物的HIS3部分来源于HIS3启动子上游的5′区和编码区下游的3′区，如此URA3r2标记的整合导致HIS3编码区的取代。利用标准遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)，将PCR产物转化到NYLA67中，并将转化子在30℃培养于不含尿嘧啶且补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上。通过在30℃下将转化子重复接种到缺乏组氨酸并补充有2％葡萄糖的合成完全培养基上来筛选转化子以验证整合正确。通过按照标准规程在30℃下置于补充有2％葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上再利用URA3r标记。通过将菌落由所述5-FOC平板贴附于SD-URA培养基上以验证生长缺乏，从而证实了标记的移除。所得经鉴定的菌株NYLA73具有下列基因型：BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tpdc1::PPDC1-ilvD-FBA1t Δhis3。

Ddc5::kanMX整合盒和PDC5缺失的构建

使用

DNA聚合物(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)和引物PDC5::KanMXF与PDC5::KanMXR(SEQ ID NO：98和99)从菌株YLR134W染色体DNA(ATCC No.4034091)中对pdc5::kanMX4盒进行PCR扩增，产生～2.3kb的PCR产物。每种引物的PDC5部分来源于PDC5启动子上游的5′区和编码区下游的3′区，使得kanMX4标记的整合导致PDC5编码区的取代。使用标准遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)将所述PCR产物转化进入NYLA73，并在30℃下在补充以1％乙醇和遗传霉素(200μg/mL)的YPD上筛选转化子。使用引物PDC5kofor和N175(SEQ ID NO：100和101)通过PCR筛选转化子，以确定PDC5编码区取代在PDC基因座的正确整合。经鉴定的正确的转化子具有下列基因型：BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t pdc1::PPDC1-ilvD-FBA1t Δhis3 pdc5::kanMX4。该菌株被命名为NYLA74。

HXK2(己糖激酶II)缺失

使用

DNA聚合物(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)和引物384与385(SEQ ID NO：102和103)从URA3r2模板中对hxk2::URA3r盒进行PCR扩增，产生～2.3kb的PCR产物。每种引物的HXK2部分来源于HXK2启动子上游的5′区和编码区下游的3′区，如此URA3r2标记的整合导致编码区的取代。使用标准遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)将所述PCR产物转化进入NYLA73，并在30℃下在缺乏尿嘧啶并补充以2％葡萄糖的合成完全培养基上筛选转化子。使用引物N869和N871(SEQ IDNO：104和105)通过PCR筛选转化子，以确定HXK2编码区取代在HXK2基因座的正确整合。通过按照标准规程在30℃涂布于补充2％葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上，对所述URA3r2标记进行回收利用。通过将菌落由所述5-FOC平板贴附于SD-URA培养基上以验证生长缺乏，并且使用引物N946和N947(SEQ ID NO：106和107)通过PCR以验证正确的标记移除，从而证实了标记的移除。所得经鉴定的菌株被命名为NYLA83，其具有下列基因型：BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t pdc1::PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3 Δhxk2。

NYLA93的构建

下文描述了对酿酒酵母内源PDC1、PDC5和PDC6基因的插入-灭活。所产生的PDC灭活菌株用作为表达载体pYZ067(SEQ ID NO：129)和pYZ090(SEQ ID NO：1)的宿主，所述载体的构建描述于2009年9月29日提交的美国专利申请61/246,844，其以引用的方式并入本文。

NAD依赖型甘油3-磷酸脱氢酶缺失

使用

DNA聚合物(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)和引物LA512与LA513(SEQ ID NO：8和9)从pUC19::loxP-URA3-loxP质粒模板中对gpd2::loxP-URA3-loxP盒进行了PCR扩增，其产生了～1.6kb的PCR产物。pUC19::loxP-URA3-loxP包含来自(SEQ ID NO：130)的URA3标记，其侧翼为loxP重组酶位点。各引物的GPD2部分来自GPD2启动子上游的5′区和该编码区下游的3′区，从而使所述loxP-URA3-loxP标记的整合产生了该GPD2编码区的取代。使用标准遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)将所述PCR产物转化进入NYLA83，并在30℃下在缺乏尿嘧啶并补充以2％葡萄糖的合成完全培养基上筛选转化子。使用引物LA516和N175(SEQID NO：132和101)通过PCR筛选转化子，以确定HXK2编码区取代在GPD2基因座的正确整合。通过以pRS423::P_GAL1-cre(SEQ ID NO：131)进行的转化并且在30℃下平铺于缺乏组氨酸的补充以2％的葡萄糖的合成完全培养基之上再利用了所述URA3标记。在30℃下将菌落贴附于YP(1％半乳糖)平板之上以诱导URA3标记的切除并在30℃下转移至YPD平板之上以进行回复。通过将菌落由所述YPD平板贴附于缺乏尿嘧啶的合成完全培养基上以验证生长缺乏，从而证实了URA3标记的移除。经鉴定的正确的克隆具有下列基因型：BBY4700 pdc6::P_GPM1-sadB-ADH1t pdcl::P_PDC1-ilvD-FBA1tΔhis3 Δhxk2 Δgpd2::loxP。该菌株被命名为NYLA92。

pdc5::loxP-kanMX-loxP整合盒和PDC5缺失的构建

使用

DNA聚合物(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)以及引物LA249和LA397(SEQ ID NO：136和137)从pUC19::loxP-kanMX-loxP(SEQ ID NO：135)质粒中对pdc5::loxP-kanMX-loxP盒进行了PCR扩增，其产生了～2.2kb的PCR产物。pUC19::loxP-kanMX-loxP(SEQ ID NO：135)包含来自pFA6(Wach，et al.，Yeast 10：1793-1808，1994)的kanMX基因以及乳酸乳球菌的TEF1启动子和终止子，其侧翼为loxP重组酶位点。各引物的PDC5部分来自PDC5启动子上游的5′区和该编码区下游的3′区，从而使所述loxP-kanMX-loxP标记的整合产生了该PDC5编码区的取代。使用标准遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)将所述PCR产物转化进入NYLA92，并在30℃下在补充以1％乙醇和遗传霉素(200μg/ml)的YPD上筛选转化子。使用引物LA363和LA364(SEQ ID NO：133和134)通过PCR筛选转化子，以确定PDC5编码区取代在PDC5基因座的正确整合。经鉴定的正确的转化体具有下列基因型：BY4700pdc6::P_GPM1-sadB-ADH1tpdc1::P_PDC1-ilvD-FBA1t Δhis3 Δhxk2 Δgpd2::loxP Δpdc5:loxP-kanMX-loxP。该菌株被命名为NYLA93。

NYLA93(pYZ067/pYZ090)

使用标准遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold SpringHarbor Laboratoty Press，Cold Spring Harbor，NY)将pYZ067和pYZ090同时转化进入菌株NYLA93(BY4700pdc6::P_GPM1-sadB-ADH1t pdc1::P_PDC1-ilvD-FBA1t Δhis3 Δhxk2 Δgpd2::loxP Δpdc5:loxP-kanMX-loxP)，并在30℃下将所产生的菌株(异丁醇菌原NYLA93，亦称为NGCI-065)在缺乏组氨酸和尿嘧啶并补充以1％乙醇的合成完全培养基上维持。

表达载体pLH468

构建了pLH468质粒(SEQ ID NO：2)，其用于在酵母中表达DHAD、酮异戊酸脱羧酶(KivD)和马肝脏醇脱氢酶(HADH)。

基于在酿酒酵母中的表达优化的密码子，由DNA2.0合成乳酸乳球菌酮异戊酸脱羧酶(KivD)和马肝脏醇脱氢酶(HADH)的编码区(分别为SEQ ID NO：71和117)并在质粒pKivDy-DNA2.0和pHadhy-DNA2.0中提供。所编码的蛋白质分别是SEQ ID No：116和118。构建了KivD和HADH的单独表达载体。为了装配pLH467(pRS426::P_TDH3-kivDy-TDH3t)，用AscI和SfiI酶消化载体pNY8(SEQ ID NO：120；亦称为pRS426.GPD-ald-GPDt，其描述于美国专利申请公开2008/0182308的实施例17中，其以引用的方式并入本文)，由此而切割了GPD启动子和ald编码区。使用5′引物OT1068和3′引物OT1067(SEQ ID No：122和123)从pNY8中对TDH3启动子片段进行了PCR扩增以在5′末端添加AscI位点并在3′末端添加SpeI位点。将所述经AscI/SfiI消化的pNY8载体片段，与经AscI和SpeI消化的TDH3启动子PCR产物，以及分离自载体pKivD-DNA2.0的包含经密码子优化的kivD编码区的SpeI-SfiI片段相连接。所述三元连接产生了载体pLH467(pRS426::P_TDH3-kivDy-TDH3t)。通过限制性图谱分析和测序验证pLH467。

pLH435(pRS425::P_GPM1-Hadhy-ADH1t)来源于在美国临时专利申请61/058970实施例3中所公开的pRS425::GPM-sadB(SEQ ID NO：78)，其描述于美国专利申请公开61/058970的实施例3中，其以引用的方式并入本文。pRS425::GPM-sadB是具有包含GPM1启动子(SEQ ID NO：72)、来自木糖氧化无色杆菌丁醇脱氢酶的编码区(sadB；DNA SEQ ID NO：69；蛋白质SEQID NO：70，其公开于美国专利申请公开2009/0269823)和ADH1终止子(SEQID NO：73)的嵌合基因的pRS425载体(ATCC No.77106)。pRS425::GPMp-sadB在所述sadB编码区的5′和3′末端分别包含BbvI和PacI位点。使用引物OT1074和OT1075(SEQ ID NO：125和126)通过位点特异性突变发生在所述sadB编码区的5′末端添加NheI位点，从而产生了载体pRS425-GPMp-sadB-NheI，其通过测序进行验证。使用NheI和PacI消化pRS425::P_GPM1-sadB-NheI以移除所述sadB编码区，并将其与来自载体pHadhy-DNA2.0的包含经密码子优化的HADH编码区的NheI-PacI片段进行连接，从而产生了pLH435。

为将KivD和HADH表达盒结合于同一载体中，使用SacI和NotI消化酵母载体pRS411(ATCC No.87474)，并在三元连接反应中将其与来自pLH467的SacI-SalI片段(包含P_TDH3-kivDy-TDH3t盒)以及来自pLH435的SalI-NotI片段(包含P_GPM1-Hadhy-ADH1t盒)进行连接。这样就产生了载体pRS411::P_TDH3-kivDy-P_GPM1-Hadhy(pLH441)，该载体经过了限制性图谱验证。

为了产生下游异丁醇途径中的全部三种基因(ilvD、kivDy和Hadhy)的共表达载体，使用pRS423FBA ilvD(Strep)(SEQ ID NO：127)作为IlvD基因的来源，其描述于美国临时专利申请61/100,792。这种穿梭载体包含在大肠杆菌中共生所需的F1复制起点(nt 1423至1879)和在酵母中复制所需的2micron复制起点(nt 8082至9426)。所述载体具有FBA1启动子(nt 2111至3108；SEQ ID NO：119)和FBA终止子(nt 4861至5860；SEQ ID NO：128)。此外，它还携带用于在酵母中进行选择的His标记(nt 504至1163)和用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄青霉素抗性标记(nt 7092至7949)。来自变异链球菌UA159(ATCC #700610)的ilvD编码区(nt 3116至4828；SEQ ID NO：1154蛋白质SEQ ID NO：115)位于FBA启动子和FBA终止子之间，从而形成了用于表达的嵌合基因。此外，上述ilvD编码区还融合了一个lumio标签(nt 4829-4849)。

第一步是用SacI和SacII将pRS423FBA ilvD(Strep)(也叫做pRS423-FBA(SpeI)-IlvD(变异链球菌)-Lumio)线性化(并利用T4DNA聚合酶将SacII位点平末端化)，从而得到全长为9,482bp的载体。第二步是使用SacI和KpnI从pLH441中分离kivDy-hADHy盒(使用T4DNA聚合酶将KpnI位点平端化)，其产生了6,063bp的片段。将这个片段与来自pRS423-FBA(SpeI)-IlvD(变异链球菌)-Lumio的9,482bp的载体片段相连接。这产生载体pLH468(pRS423::P_FBA1-ilvD(Strep)Lumio-FBA1t-P_TDH3-kivDy-TDH3t-P_GPM1-hadhy-ADH1t)，该载体经过了限制性图谱和测序确认。

pYZ090和pYZ067

构建了pYZ090以包含具有来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的alsS基因的编码区(nt位置457-2172)的嵌合基因，其通过酵母CUP1启动子(nt 2-449)表达并且后接以CYC1终止子(nt 2181-2430)以用于表达乙酰乳酸合成酶(ALS)，以及具有来自乳酸乳球菌的ilvC基因的编码区(nt 3634-4656)的嵌合基因，其通过酵母ILV5启动子(2433-3626)进行表达并后接以IL5终止子(nt4670-5292)以用于表达酮醇酸还原异构酶(KARI)。

构建了pYZ067以包含以下嵌合基因：1)来自变异链球菌UA159的ilVD基因编码区(nt位置2260-3971)，其通过酵母FBA1启动子(nt 1161-2250)进行表达并后接以FBA终止子(nt 4005-4317)以表达DHAD，2)HADH的编码区(nt 4680-5807)，其通过酵母GPM启动子(nt 5819-6575)进行表达并后接以ADH1终止子(nt 4356-4671)以表达醇脱氢酶，以及3)来自乳酸乳球菌的KivD基因的编码区(nt 7175-8821)，其通过酵母TDH3启动子(nt 8830-9493)进行表达并后接以TDH3终止子(nt 5682-7161)以表达酮异戊酸脱羧酶。

此外，尽管上文已经描述了本发明的多种实施方案，应当了解其仅以实例的方式给出，并非限制。对相关领域的技术人员将显而易见的是能够在不脱离本发明的实质和范围下能够对其进行形式和细节的多种变型。因此，本发明的广泛性和范围不应受到任何上述示例性实施方案的限制，而是应仅仅根据权利要求及其对等物加以定义。

本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均表明了本发明涉及的当前领域中的技术人员的技术水平，并且以引用的形式并入本文，其程度正如各出版物、专利或专利申请被具体地并且各自地以引用的形式被并入。

实施例

以下非限制性实施例将进一步说明本发明，其中展示了脂肪酸提取剂对于丁醇的分配系数。应当了解，虽然上文提及的化学地转化和下列实施例涉及玉米油作为植物来源的用于产生脂肪酸提取剂的油，但是可使用其它天然油(诸如植物来源的油)而不背离本发明。通过上文讨论和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的基本特征并且可对本发明作出多种变动和改进以适应多种用途和条件而不背离本发明。

如本文所用，所使用的缩写的含义如下：“g”是指克，“kg”是指千克，“L”是指升，“mL”是指毫升，“mL/L”是指毫升每升，“mL/min”是指毫升每分钟，“μL”是指微升，“DI”是指去离子，“uM”是指微米，“nM”是指纳米，“w/v”是指重量/体积，“GC”是指气相色谱，“OD”是指光密度，“OD₆₀₀”是指600nM波长下的光密度，“dcw”是指干细胞重量，“rpm”是指每分钟转数，“℃”是指摄氏度，“℃/min”是指摄氏度每分钟，“slpm”是指标准升每分钟，“ppm”是指百万分之，“pdc”是指后接以酶编号的丙酮酸脱羧酶。

实施例1-6描述了示例性方法，其用于将玉米油化学地转化成以下脂肪酸提取剂：羟基化甘油三酯(实施例1)、脂肪酰胺和其与脂肪酸的混合物(实施例2)、脂肪醇(实施例3)、脂肪酸(实施例4)、脂肪酸甲酯(实施例5)、以及脂肪酸乙二醇酯(实施例6)。实施例7提供了提取发酵实验的一系列比较实施例，所述实验使用列于表3和表7-10中的与水不相混的提取剂进行，在表11中概述了所述提取剂的性能数据。

实施例1

来自玉米油的羟基化甘油三酯

A.玉米油羟基化(63％的羟基化)

向装配以机械搅拌器和添加漏斗的三颈500mL烧瓶加入玉米油(50.0g)、甲苯(25.0mL)、Amberlyte IR-120树脂(12.5g)和冰醋酸(7.5g)。将所产生的混合物加热至60℃，并且随后在一小时中逐滴加入过氧化氢(41.8g处于水中的30％H₂O₂)。在60℃下搅拌所述混合物2小时，然后处理反应混合物：通过过滤移除树脂并且将滤过物在醋酸乙酯(75ml)和水之间进行分配(50mL)。层分离之后，使用饱和NaHCO₃水溶液(50mL)和浓盐水(50mL)洗涤该有机层。在无水Na₂SO₄上干燥所述有机层，并且在真空中浓缩以获得48.9g黄色油。对粗反应产物的₁H NMR分析显示63％的双键被环氧化。

向500mL圆底烧瓶中加入环氧化玉米油(20.0g)、四氢呋喃(THF)(100.0mL)以及硫酸(50mL的1.7M水溶液)。在50℃下搅拌云雾状混浊混合物2小时并且随后通过在水(100mL)和醋酸乙酯(200mL)之间分配而进行处理。使用水(3×50mL)并随后使用浓盐水(50mL)洗涤该有机层。在无水Na₂SO₄上干燥所述有机层，并且在真空中浓缩以获得19.9g深黄色油(63％羟基化玉米油)。

B.玉米油羟基化(47％的羟基化)

向装配以机械搅拌器和添加漏斗的三颈500mL烧瓶加入玉米油(50.0g)、甲苯(25.0mL)、Amberlyte IR-120树脂(12.5g)和冰醋酸(7.5g)。将所产生的混合物加热至60℃，并且随后在一小时中逐滴加入过氧化氢(41.8g处于水中的30％H₂O₂)。在60℃下搅拌所述混合物1小时，然后处理反应混合物：通过过滤移除树脂并且将滤过物在醋酸乙酯(75ml)和水之间进行分配(50mL)。层分离之后，使用饱和NaHCO₃水溶液(50mL)和浓盐水(50mL)洗涤该有机层。在无水Na₂SO₄上干燥所述有机层，并且在真空中浓缩以获得49.8g黄色油。对粗反应产物的¹H NMR分析显示47％的双键被环氧化。

向500mL圆底烧瓶中加入环氧化玉米油(20.0g)、THF(100.0mL)以及硫酸(50mL的1.7M水溶液)。在50℃下搅拌云雾状混浊混合物2小时并且随后通过在水(100mL)和醋酸乙酯(200mL)之间分配而进行处理。使用水(3×50mL)并随后使用浓盐水(50mL)洗涤该有机层。在无水Na₂SO₄上干燥所述有机层，并且在真空中浓缩以获得19.2g深黄色油(47％羟基化玉米油)。

C.玉米油羟基化(28％的羟基化)

向装配以机械搅拌器和添加漏斗的三颈500mL烧瓶加入玉米油(50.0g)、甲苯(25.0mL)、Amberlyte IR-120树脂(12.5g)和冰醋酸(7.5g)。将所产生的混合物加热至60℃，并且随后在一小时中逐滴加入过氧化氢(41.8g处于水中的30％H₂O₂)。在60℃下搅拌所述混合物2小时，然后处理反应混合物：通过过滤移除树脂并且将滤过物在醋酸乙酯(75ml)和水之间进行分配(50mL)。层分离之后，使用饱和NaHCO₃水溶液(50mL)和浓盐水(50mL)洗涤该有机层。在无水Na₂SO₄上干燥所述有机层，并且在真空中浓缩以获得47.2g黄色油。对粗反应产物的¹H NMR分析显示28％的双键被环氧化。

向500mL圆底烧瓶中加入环氧化玉米油(20.0g)、THF(100.0mL)以及硫酸(50mL的1.7M水溶液)。在50℃下搅拌云雾状混浊混合物2小时并且随后通过在水(100mL)和醋酸乙酯(200mL)之间分配而进行处理。使用水(3×50mL)并随后使用浓盐水(50mL)洗涤该有机层。在无水Na₂SO₄上干燥所述有机层，并且在真空中浓缩以获得20.3g深黄色油(28％羟基化玉米油)。

分配系数测量

向5mL小瓶中加入0.910g所述67％羟基化玉米油以及0.910mL的3重量％iBuOH水溶液。使用Vortex

剧烈地搅拌所述两相混合物10分钟。进行混合后，通过使用Fisher Scientific Centrific 228离心机(3300rpm)离心所述混合物10分钟而辅助层的分离。两种层各收取0.100g。使用乙二醇二乙醚的甲苯溶液(10.1mg/mL)稀释所述有机上层至1.00mL，并且使用乙二醇二乙醚的甲醇溶液(10.2mg/mL)稀释所述水层至1.00mL。使用校正气相色谱(GC)测量两种相中的i-BuOH浓度。针对47％和28％的羟基化玉米油重复相同的过程。由此而测得的分配系数对于67％羟基化玉米油为3.2，对于47％羟基化玉米油为2.3，并且对于28％羟基化玉米油为2.1。

使用6％的i-BuOH水溶液重复上述过程。所述分配系数对于67％-、47％-和28％-羟基化玉米油分别为2.9、2.9和2.0。

实施例2

来自玉米油的脂肪酰胺加脂肪酸以及纯脂肪酰胺

将玉米油与含水氢氧化铵进行反应，其方式类似于Roe等，J.Am.OilChem.Soc.29：18-22，1952的描述。将

玉米油(0.818L，755g)置入1加仑不锈钢反应器中，其内加入了1.71L(1540g)含水氢氧化铵(28％的NH₃)。将所述反应器加热至160℃同时进行搅拌，并且在该温度下维持7h并加以搅拌，在此期间压力达到400psi。冷却所述反应器并且移除该产物(乳状白色固体)并使用醋酸乙酯清洗该反应器。将所述产物溶解于5L醋酸乙酯之中，并使用500mL水洗涤5次，各次的水均以H₂SO₄进行中和。随后在无水Na₂SO₄上干燥所述醋酸乙酯，并且在旋转蒸发器上移除该溶剂，留下浅褐色软固体。

CDCl₃的¹³C NMR表明，所述产物包含约2∶1比率的脂肪酰胺与脂肪酸，并且所述玉米油向产物的转化是定量的。所述产物具有57-58℃的融点，但是以水进行饱和时下降约11℃。

根据Kohlhase等，J.Am.Oil Chem.Soc.48：265-270，1971，使用无水氨以醋酸铵作为催化剂通过玉米油合成了纯玉米油脂肪酰胺。

将3克醋酸铵置于400mL的不锈钢振荡管中，其内加入了51.8g玉米油。随后加入无水氨(89.7g)并且密封所述反应器并在125℃下加热7h，在此期间压力达到1300psi。冷却所述反应器并且移除所述浅色固体并使用醋酸乙酯清洗该反应器。随后，如上文脂肪酰胺/脂肪酸混合物的情况处理溶解于醋酸乙酯中的产物。

根据下文实施例4所述，通过使用NaOH进行的碱水解以玉米油合成脂肪酸。

三种制备物：(1)来自氨水的玉米油脂肪酰胺与玉米油脂肪酸的2∶1混合物，(2)纯玉米油脂肪酰胺∶纯玉米油脂肪酸的2∶1混合物，以及(3)纯玉米油脂肪酰胺∶玉米油脂肪酸的1∶2混合物，全部针对其从3％的水溶液中提取异丁醇的能力进行了测试。在20mL闪烁瓶中将700毫克各制备物加入包含3％异丁醇的2.1mL水中，并在30℃下置于旋转振荡器上过夜。在全部三种情况下，所述有机相在该温度下变成液体，这表明通过摄取异丙醇而使融点进一步降低。使用包含乙二醇二乙醚(10.068mg/mL)作为GC标准物的200μl甲苯或包含相同浓度乙二醇二乙醚的200μl异丙醇稀释50微升的上层相。使用包含相同浓度乙二醇二乙醚的150μl甲醇和50μl异丙醇稀释50微升的下层相。使用校正GC测定两种相中的异丁醇浓度。所测得的分配系数如下：(1)为3.81，(2)为4.31并且(3)为3.58。

在摇瓶中将脂肪酰胺/脂肪酸氨水制备物(1)以及通过将制备物(1)1∶1地混以纯玉米油脂肪酸(相当于1∶2的脂肪酰胺∶脂肪酸)而形成的制备物(1a)与发酵液体培养基在3份液体培养基对1份酰胺/酸混合物的比率下进行孵育，所述发酵液体培养基包含酵母菌属丁醇菌原NGCI-070。制备物(1)是软固体，而制备物(1a)在30℃下是液体。在8.35g/L的葡萄糖浓度下起始，随后在孵育摇床上孵育所述摇瓶25h，并且葡萄糖的消耗为时间的函数。表1显示，在两种比率下的脂肪酰胺/脂肪酸混合物对所述丁醇菌原不具毒性，并且甚至表现出与油醇相比更高的葡萄糖摄取速度。

表1：

实施例3

来自玉米油的脂肪醇

参照通过玉米油制备脂肪醇的上文方程IV的反应，在氮气下对装配以机械搅拌器、具有N₂源的回流冷凝器、添加漏斗、内部热电偶和橡胶隔膜的22L圆底烧瓶进行直火干燥。将所述烧瓶充以132g(3.30摩尔)的95％氢化铝锂粉末，其在干燥的盒中称重并且加载入固体添加漏斗。使用冰浴冷却所述22L烧瓶，并通过套管将9.0升无水THF加入所述反应器。将所产生的浆液冷却至0-5℃，并将处于1.00升无水THF的956g(1.10摩尔)的

玉米油溶液在2-3小时中逐滴加入，同时保持所述反应温度在5-20℃。在加入所述玉米油后，在常温下搅拌所述浆液过夜。当根据TLC色谱验证所述反应完成时，通过逐滴加入溶于370mL THF的130g水溶液而对其终止。随后加入130g 15％NaOH水溶液，继之以加入400g水。剧烈搅拌所述混合物，同时加温至室温，并且产生了白色颗粒状固体。使用烧结玻璃过滤漏斗滤出所述固体，并以另外的THF进行洗涤。在旋转蒸发器上移除THF并且将该残余物吸收于3.00升醋酸乙酯中。使用2×1.00L水，1×1.00L浓盐水洗涤所述产物溶液，在Na₂SO₄上干燥，过滤并且在真空中浓缩以得到836g(97％)脂肪醇，其为黄色油。随后蒸馏所述粗脂肪醇混合物(140℃/1mmHg)，并用于下列分配系数实验。

分配系数实验

在5个5-mL小瓶中各加入1mL脂肪醇混合物以及1mL的3重量％iBuOH水溶液。使用Vortex

分别剧烈地搅拌所述两相混合物10分钟、20分钟、30分钟、40分钟和60分钟。进行混合后，通过使用FisherScientific Centrific 228离心机(3300rpm)离心所述混合物10分钟而辅助层的分离。两种层各收取0.100mL。使用乙二醇二乙醚的甲苯溶液稀释所述有机上层至1.00mL，并且使用乙二醇二乙醚的甲醇溶液稀释所述水层至1.00mL。使用校正GC测量两种相中的i-BuOH浓度。由此测得的分配系数为2.70。

对6重量％的i-BuOH浓度运行根据上文所述的相同的分配系数测量。由此测得的分配系数为3.06。

在以下的实施例4-6中，用于测定所述提取剂的分配系数的方法为静态法(quiescent method)。对于所述静态法，将5mL的3％或6％(w/v)异丁醇水溶液加入小瓶内，并且将5mL的目标溶剂小心地加至所述水溶液的顶部，从而并不混合物理分相。在所标明的时间后，移除所述溶剂相和水相的澄清部分的样品并通过GC针对异丁醇含量进行分析。本分析忽略任何乳液层。对于所述GC分析，将100uL的所述样品加入400uL异丙醇。加入500uL的乙二醇二乙醚溶液(内部标准物)并且将该溶液注入具有FID检测器的

柱，并测定异丁醇浓度。

也可使用本领域中已知的其它方法测定根据本发明的提取剂的分配系数。例如，可以使用振荡方法。作为所述振荡方法的实例，将5mL的3％或6％(w/v)异丁醇水溶液与5mL的目标溶剂一同加入离心管中。剧烈振荡该管1分钟。可随后以约12500G将所述管在离心机中离心15分钟。可移除所述澄清溶剂层和澄清水层的样品并且通过上文所述的方法针对异丁醇含量进行分析。

实施例4

玉米油脂肪酸

将圆底烧瓶(5L)装配以机械搅拌器、热电偶、加热罩、冷凝器和氮气阀(nitrogen tee)。充以500g食品级玉米油、1L水和75g氢氧化钠。将混合物加热至90℃并维持3小时，在此期间其变成单一的粘稠乳液状单一相。在此期间结束时，TLC显示所述混合物内无残留玉米油。随后将所述混合物冷却至72℃并且将500mL的25％硫酸加入以酸化该混合物。其随后冷却至室温并且加入2L二乙醚。以3×1L的1％硫酸、1×1L的饱和浓盐水洗涤所述醚层，在MgSO₄上干燥并过滤。通过旋转蒸发移除所述醚，并随后使用氮气净化所述油过夜，获得了470g黄色油，其部分地过夜结晶。通过AOCS方法Ca 5a-40对游离脂肪酸的滴定显示95％的脂肪酸含量，其以油酸表达。通过将在1mL干吡啶中将104mg与100uL的N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺进行反应而对样品进行硅烷化。对所述硅烷化产物的气相色谱-质谱(GCMS)分析显示了16:0、18:2、18:1、18:0和20:0酸的TMS衍生物的存在。

根据所述静态法的测定，在最初6％的i-BuOH浓度下，经168小时后异丁醇在COFA/水系统中的分配系数为2.8。

实施例5

玉米油脂肪酸甲酯(FAME)

圆底烧瓶(5L)装配以机械搅拌器、热电偶、加热罩、冷凝器和氮气阀。充以1500g食品级玉米油、1500g甲醇和30g浓硫酸。所述混合物进行24小时会后并继之以薄层层析。随后冷却所述反应并且对层进行分离。使用1×1L水、1×1L饱和重碳酸钠、2×1L水、1×1L饱和浓盐水洗涤所述有机层，随后在MgSO₄上干燥。产量为1416g的淡黄色油。GCMS分析显示了16:0、18:2、18:1、18:0、20:1和20:0酸的甲酯的存在。通过AOCS方法Ca5a-40对游离脂肪酸的滴定显示0.2％的脂肪酸含量，其以油酸表达。

根据所述静态法的测定，在最初6％的i-BuOH浓度下，经236小时后异丁醇在FAME/水系统中的分配系数为1.06。

实施例6

玉米油乙二醇酯(FAGE)

将圆底烧瓶(3L)装配以机械搅拌器、热电偶、加热罩、Dean-Stark分离器、冷凝器、氮气吹洗管和氮气阀；并且充以1000g玉米油脂肪酸甲酯(FAME)和1000g乙二醇。将2g纯钠加入所述混合物并加热至60℃。90分钟后，将温度提高至100℃并且将氮气缓慢地向所述反应中进行表面下喷射。在Dean-Stark分离器中收集甲醇。在3小时中将温度缓慢提高至160℃，并且甲醇继续从所述反应中蒸馏出。经另外的2小时后，收集总计100mL甲醇。将所述反应冷却至室温并且使用20g 25％硫酸中和。对层进行分离并且使用4×200ml的10％氯化钙溶液洗涤顶层。形成了乳液，但是其将随时间分离。使用250mL饱和浓盐水洗涤所述有机层，在MgSO₄上干燥并且过滤以获得916g澄清黄色油。通过AOCS方法Ca 5a-40对游离脂肪酸的滴定显示存在2.9％的酸-其以油酸表达。通过将在1mL干吡啶中将109mg与100uL的N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺进行反应而对样品进行硅烷化。对所述硅烷化产物的GCMS分析显示了16:0、18:2和18:1酸的TMS衍生物与16:0、18:2、18:1和18:0乙二醇单酯的共同存在。

根据所述静态法的测定，在最初6％的I-BuOH浓度下，经192小时后异丁醇在FAGE/水系统中的分配系数为2.3。

实施例7

比较发酵实施例

实施例7的比较实施例中使用了列于表2中的材料。所有商购试剂均按原样使用。由玉米油合成的溶剂也按原样使用。

表2：

材料

一般方法

使用Amersham Biosciences Ultrospec 2100Pro分光光度计测量光密度。测量一般在600纳米的波长下进行。

使用YSI Life Sciences 2700 Select Biochemistry Analyzer测量葡萄糖浓度。在1.7mL微离心管中以13,200rpm离心发酵样品2分钟并且针对葡萄糖浓度分析水相上清液。

发酵条件：30％pO₂；温度：30℃；pH 5.5(除非另行指出)；初始批次葡萄糖：20g/L，在生产期间对其维持。

HPLC和GC分析用于对水相和溶剂相中的丁醇分别进行定量。在通过0.2um尼龙滤器进行过滤后，所述水相中的丁醇以HPLC(Agilent 1100，Agilent，Santa Clara，CA)在下列条件下测量：

色谱柱：Bio-Rad，Aminex HPX-87H，No.125-0143

流动相：0.01M Na₂HPO₄，pH＝8.0

注射体积：10uL

流速：0.6mL/min

运行时间：22.5分钟

柱温：65℃

检测器：折射指数

检测器温度：40℃

UV检测210nm，4nm带宽，Ref360nm，100nm带宽。

所述溶剂相使用GC(HP6890，Agilent，Santa Clara，CA)在下列条件下测量：

色谱柱：J&W Scientific DB Waxter(50m×0.32mm ID，1um薄膜)

载气：氦气4mL/min

注射体积：2uL

处理流速15ml/min

运行时间：29分钟

烘箱温度：40℃进行5min，40℃至230℃10℃/min.，5min 230℃

分流进样：1∶5250℃

火焰电离检测器：250℃

比较实施例：来自玉米油的提取剂及其组成GLNOR635A-640A

使用表3所列出的与水不相混的提取剂进行了一系列比较实施例。在零时间将所述提取剂加入所述发酵液体培养基，将所述培养物在发酵期间暴露于该溶剂。测量了在水相和有机相中的异丁醇浓度以计算所述提取剂溶剂的分配系数。使用葡萄糖利用测定所述微生物对所述提取剂的生物相容性。

表3：

用于发酵实施例GLNOR635-640A的提取剂组合物

实施例	提取剂
		GLNOR635A	油醇
GLNOR636A	玉米油脂肪酸(COFA)
		GLNOR637A	油酸
GLNOR638A	油酸
		GLNOR639A	油酸
GLNOR640A	油酸

根据对菌株NGCI-065的描述进行所述发酵。对接种物进行两期制备并且在30℃和250rpm下孵育于温箱摇床中(Innova 4200，New BrunswickScientific，Edison，NJ)。由冷冻甘油储藏种接种第一期或预菌种，将两瓶置入具有30mL过滤消毒的预菌种培养基(表4)的250mL烧瓶中并且生长24小时至OD约为2。随后将15mL所述预菌种转移入具有270mL过滤消毒的菌种培养基(表5)的2L烧瓶中以用于第二期，将其孵育24小时。随后加入30mL过滤消毒的10×YEP和300mL过滤消毒的90-95％油醇，并且进行另外24小时的孵育，直至所述菌种培养物水相的最终OD约为5-10。对于实施例GLNOR639和GLNOR640，pH为4.5。

表4：

预菌种/1期培养基组合物

预菌种培养基组分	每升的量
		Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	6.7g
Yeast Dropout Mix	1.4g
		L-亮氨酸(1％w/v储备液)	1.4g
L-亮氨酸(1％w/v储备液)	4mL
		乙醇	3.0mL
50％w/w葡萄糖溶液	5.4mL

表5：

菌种/2期培养基组合物

菌种培养基组分	每升的量
		Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	6.7g
Yeast Dropout Mix	2.8g
		L-亮氨酸(1％w/v储备液)	20mL
L-亮氨酸(1％w/v储备液)	4mL
		乙醇	3.0mL
50％w/w葡萄糖溶液	50.4mL
		MES缓冲剂	38.4g
接种24小时后添加物	每烧瓶的量
		10×酵母提取物蛋白胨(100g/L YE和200g/L蛋白胨)	30mL
90-95％油醇	300mL

使用diH₂O对发酵容器(Applikon AD1010 Bioreactor，ApplikonBiotechnology，Dover，NJ)消毒30分钟(Amsco Renaissance 3033 Revas SteamSterilizer，Steris Corporation，Mentor，OH)。一旦所述发酵容器在灭菌锅中完成消毒并且冷却至30℃，移除所述无菌diH₂O并且加入体积为280mL的过滤消毒的发酵培养基。将70mL来自所述第二期菌种烧瓶的水相加入所述发酵容器，以得到350mL的最终水相体积。紧接于接种之后，加入100mL的10×YEP液体培养基添加物以及450mL的各对应提取溶剂，以得到约1∶1的最终溶剂与液体培养基比率。发酵设定条件为温度30℃，pO₂30％，对于GLNOR635A-638A为pH 5.5，对于GLNOR639A-640A为pH 4.5。从接种时间开始，约每8小时对所述发酵进行取样以监测葡萄糖浓度，所述浓度通过添加50％w/w的葡萄糖溶液而维持于5-20g/L，并针对水相和提取剂相中的异丁醇积累进行分析。在各时间点收取足量的样品体积以从两种相中获得样品，随后对这些样品进行离心以确保各自的干净分离。

表6：

发酵培养基组合物

发酵培养基组分	每升的量
		Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	6.7g
Yeast Dropout Mix	2.8g
		L-亮氨酸(1％w/v储备液)	20mL
L-亮氨酸(1％w/v储备液)	4mL
		乙醇	4.5mL
50％w/w葡萄糖溶液	40.0g
		处于50∶50v/v的乙醇∶tween80中的1％麦角固醇	1.0mL
接种后添加物
		10×酵母提取物蛋白胨(100g/L YE和200g/L蛋白胨)	100mL
90-95％油醇	450mL

比较实施例：来自玉米油的提取剂及其组成的GLNOR661A-666A

使用表7所列出的与水不相混的提取剂进行了比较实施例GLNOR661A-666A。本组中的实施例与前文实施例GLNOR635A-640A相同地进行，其例外在于零时间的菌种、pH和补充物添加。对于本系列的实施例，使用了菌种NGCI-070，pH设定为5.5，并且加入4mL的尼克酸/硫胺素培养基补充物而非100mL酵母提取物蛋白胨。

表7：

用于发酵实施例GLNOR661-666A的提取剂组合物

实施例	提取剂
		GLNOR661A	油醇
GLNOR662A	无溶剂
		GLNOR663A	玉米油脂肪酸
GLNOR664A	玉米油脂肪酸
		GLNOR665A	油酸
GLNOR666A	油酸

比较实施例：来自玉米油的提取剂及其组成的GLNOR690A-695A

使用表8所列出的与水不相混的提取剂进行了比较实施例GLNOR690A-695A。本组中的实施例与前文实施例GLNOR661A-666A相同地进行。使用了菌株NGCI-070。

表8：

用于发酵实施例GLNOR690-695A的提取剂组合物

实施例	提取剂
		GLNOR690A	油醇
GLNOR691A	油醇
		GLNOR692A	玉米油脂肪醇*
GLNOR693A	玉米油脂肪醇*
		GLNOR694A	玉米油乙二醇酯
GLNOR695A	玉米油乙二醇酯

*合成玉米油脂肪醇，制备物A

比较实施例：来自玉米油的提取剂及其组成的GLNOR721A-726A

使用表9所列出的与水不相混的提取剂进行了比较实施例GLNOR721A-726A。本组中的实施例与前文实施例GLNOR690A-695A相同地进行。使用了菌株NGCI-070。

表9：

用于发酵实施例GLNOR721-726A的提取剂组合物

实施例	提取剂
		GLNOR721A	玉米油脂肪酸甲酯+1，2-丙二醇
GLNOR722A	玉米油脂肪酸甲酯+1，2-丙二醇
		GLNOR723A	玉米油脂肪醇**
GLNOR724A	玉米油脂肪醇**
		GLNOR725A	玉米油脂肪酰胺/酸*
GLNOR726A	玉米油脂肪酰胺/酸*

*实施例2的2∶1合成脂肪酰胺∶脂肪酸混合物(制备物(1))

**合成玉米油脂肪醇，制备物B

比较实施例：来自玉米油的提取剂及其组成的GLNOR749A-754A

使用表10所列出的与水不相混的提取剂进行了比较实施例GLNOR749A-754A。本组中的实施例与前文实施例GLNOR721A-726A相同地进行。使用了菌株NGCI-070。

表10：

用于发酵实施例GLNOR749-754A的提取剂组合物

实施例	提取剂
		GLNOR749A	Isofol^TM 12**
GLNOR750A	Isofol^TM 12
		GLNOR751A	玉米油脂肪酸
GLNOR752A	玉米油脂肪酸
		GLNOR753A	玉米油脂肪酰胺/酸*
GLNOR754A	玉米油脂肪酰胺/酸*

*实施例2的1∶1合成脂肪酰胺脂肪酸混合物∶纯脂肪酸(制备物(1a))

**Isofol^TM 12∶2-丁基-1-辛醇

表11中概述了所述发酵实施例GLNOR635A-640A、GLNOR661A-666A、GLNOR690A-695A、GLNOR721A-726A、GLNOR749A-754A的性能数据，其提供了示例性的来自玉米油的提取剂及其组成的水相异丁醇浓度(g/L)、溶剂相异丁醇浓度(g/L)和溶剂分配系数(K_p)，比较了传统商业溶剂油醇和Isofol^TM。

表11：

实施例8

脂肪醇羟基化(65％羟基化)

向装配以机械搅拌器和添加漏斗的三颈250mL烧瓶加入脂肪醇混合物(43g，0.16mmol)、甲苯(25.0mL)、Amberlyte IR-120树脂(12.5g)和冰醋酸(7.5g)。将所产生的混合物加热至60℃，并且随后在30分钟中逐滴加入过氧化氢(41.8g处于水中的30％H₂O₂)。在60℃下搅拌所述混合物2小时，然后处理反应混合物：通过过滤移除树脂并且将滤过物在醋酸乙酯(75ml)和水之间进行分配(50mL)。层分离之后，使用饱和NaHCO₃水溶液(50mL)和浓盐水(50mL)洗涤该有机层。在无水Na₂SO₄上干燥所述有机层，并且在真空中浓缩以获得50g黄色油。对粗反应产物的¹H NMR分析显示65％的双键被环氧化。收取所产生的混合物不经纯化进行下一步骤。

向500mL圆底烧瓶中加入环氧化脂肪醇(14.5g)、THF(200.0mL)以及硫酸(100mL的1.7M水溶液)。在50℃下搅拌云雾状混浊混合物过夜并且随后通过在水(100mL)和醋酸乙酯(200mL)之间分配而进行处理。使用水(2×100mL)、随后以饱和NaHCO₃水溶液(100mL)和浓盐水(100mL)洗涤该有机层。在无水Na₂SO₄上干燥所述有机层，并且在真空中浓缩以获得14.7g粘稠澄清液体和白色固体的混合物。

分配系数的测量

向1mL的3％i-BuOH水溶液中加入1mL所述羟基化脂肪醇混合物，并使用漩涡混合器剧烈搅拌所产生的两相混合物10分钟。重复进行本实验，并在6％的i-BuOH溶液上进行。所述混合之后，对层进行分离，并且从两层中收取所述样品以使用GC测量i-BuOH浓度(表12)。观测到了3.7的分配系数。

表12：在水和羟基化脂肪醇之间分配的i-BuOH的分配系数测量数据

尽管本发明的多个实施方案已如上描述，但是应当理解它们仅仅以举例的方式存在，并且不受限制。对相关领域的技术人员将显而易见的是能够在不脱离本发明的实质和范围下能够对其进行形式和细节的多种变型。因此，本发明的广度和范围应不受任何上述示例性实施方案的限制，但应仅仅根据以下权利要求及其等同物限定。

在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均指示本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且以引用方式并入本文至如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体且单独地指明为以引用方式并入的相同程度。

Claims

1.组合物，包含：

能够由原料产生醇的重组微生物；

醇；和

至少一种提取剂，所述提取剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酯、甘油三酯、以及它们的混合物；

其中所述提取剂由所述原料产生。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述提取剂包括式R(C＝O)N(R’)(R”)的一种或多种脂肪酰胺，其中

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述提取剂包括式R-(C＝O)-OCHR’CHR”-OH的一种或多种脂肪酯，其中

R’和R”独立地选自氢和C₁-C₄烷基基团。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述提取剂包括式R-(C＝O)-OR’的一种或多种脂肪酯，其中

R’是8个碳或更少的烷基基团。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述提取剂是脂肪酰胺的混合物，并且其中所述脂肪酰胺的混合物包含亚油酰胺、油酰胺、棕榈酰胺或硬脂酰胺。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述提取剂是脂肪酰胺和脂肪酸的混合物，并且其中所述脂肪酰胺和脂肪酸的混合物包含亚油酰胺、亚油酸、油酰胺、油酸、棕榈酰胺、棕榈酸、硬脂酰胺或硬脂酸。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述提取剂选自羟基化甘油三酯、烷氧基化甘油三酯、羟基化脂肪酸、烷氧基化脂肪酸、羟基化脂肪醇和烷氧基化脂肪醇。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述提取剂选自饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、饱和脂肪醇、不饱和脂肪醇、饱和脂肪酰胺、不饱和脂肪酰胺、饱和脂肪酯、不饱和脂肪酯、以及它们的混合物。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述醇是C₁-C₈烷基醇。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述原料包括黑麦、小麦、玉米、甘蔗、大麦、纤维素材料、木质纤维素材料、或它们的混合物。

11.产生提取剂的方法，包括：

提供包含油的生物质；

使所述油与一种或多种能够将所述油化学地转化成提取剂的物质接触，从而将所述油的至少一部分转化成所述提取剂，所述提取剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酯、甘油三酯、以及它们的混合物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种物质选自含水氢氧化铵、无水氨、醋酸铵、氨水、过氧化氢、甲苯、冰醋酸、脂肪酶和阳离子交换树脂。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述提取剂对于产物醇的分配系数大于在所述油被转化成提取剂之前所述油对于所述产物醇的分配系数。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述产物醇是C₁-C₈烷基醇。

15.根据权利要求11所述的方法，还包括：

在使所述油与所述一种或多种物质接触之前，从所述生物质中分离所述油。

16.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物质包括玉米粒、玉米棒、作物残余物如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、黑麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、从谷物的研磨中获得的组分、纤维素材料、木质纤维素材料、树、枝、根、叶、木片、木屑、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、或它们的混合物。

17.产生产物醇的方法，包括：

(a)提供包含低聚糖和油的生物质；

(b)使所述生物质与能够将低聚糖转化成单糖的糖化酶接触；

(c)从(a)或(b)的生物质中分离所述油；

(d)使所述分离的油与一种或多种反应剂或溶剂接触以形成提取剂；

(e)使所述生物质与包含能够将所述单糖转化成产物醇的重组微生物的发酵液体培养基接触，从而产生产物醇；以及

(f)使所述产物醇与所述提取剂接触，

其中所述提取剂对于所述产物醇的分配系数大于所述生物质的油对于所述产物醇的分配系数。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述提取剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酯、甘油三酯、以及它们的混合物。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述提取剂包括式R(C＝O)N(R’)(R”)的一种或多种脂肪酰胺，其中

20.根据权利要求18所述的组合物，其中所述提取剂包括式R-(C＝O)-OCHR’CHR”-OH的一种或多种脂肪酯，其中

R’和R”独立地选自氢和C₁-C₄烷基基团。

21.根据权利要求18所述的组合物，其中所述提取剂包括式R-(C＝O)-OR’的一种或多种脂肪酯，其中

R’是8个碳或更少的烷基基团。

22.根据权利要求17所述的方法，其中所述提取剂选自羟基化甘油三酯、烷氧基化甘油三酯、羟基化脂肪酸、烷氧基化脂肪酸、羟基化脂肪醇和烷氧基化脂肪醇。

23.根据权利要求17所述的方法，其中所述提取剂选自饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、饱和脂肪醇、不饱和脂肪醇、饱和脂肪酰胺、不饱和脂肪酰胺、饱和脂肪酯、不饱和脂肪酯、以及它们的混合物。

24.根据权利要求17所述的方法，其中所述一种或多种反应剂或溶剂选自含水氢氧化铵、无水氨、醋酸铵、氨水、过氧化氢、甲苯、冰醋酸、脂肪酶和阳离子交换树脂。

25.根据权利要求17所述的方法，其中所述产物醇是C₁-C₈烷基醇。

26.根据权利要求17所述的方法，其中所述油包括选自下列的一种或多种油：牛脂油、玉米油、卡诺拉油、癸酸/辛酸甘油三酯、蓖麻油、椰子油、棉籽油、鱼油、霍霍巴油、猪油、亚麻籽油、牛蹄油、奥蒂油、棕榈油、花生油、油菜籽油、稻米油、红花油、大豆油、向日葵油、桐油、麻风树油、小麦油、黑麦油、大麦油和植物油共混物。

27.产生产物醇的方法，包括：

(a)提供包含能够在发酵容器中产生产物醇的重组微生物的发酵液体培养基，从而产生产物醇；

(b)使所述发酵液体培养基与提取剂接触以形成包含水相和有机相的两相混合物，其中所述产物醇和所述油分配到所述有机相中，使得所述有机相包含所述产物醇和所述油；

(c)将所述有机相与所述水相分离；

(d)从所述有机相中分离所述产物醇；

并且任选地步骤(b)和(c)同时进行。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述提取剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酯、甘油三酯、以及它们的混合物。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述提取剂选自羟基化甘油三酯、烷氧基化甘油三酯、羟基化脂肪酸、烷氧基化脂肪酸、羟基化脂肪醇和烷氧基化脂肪醇。

30.根据权利要求28所述的方法，其中所述提取剂选自饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、饱和脂肪醇、不饱和脂肪醇、饱和脂肪酰胺、不饱和脂肪酰胺、饱和脂肪酯、不饱和脂肪酯、以及它们的混合物。

31.根据权利要求27所述的方法，其中所述产物醇是C₁-C₈烷基醇。

32.根据权利要求27所述的方法，还包括：

产生原料浆液；

分离所述原料浆液以产生(i)水层，(ii)油层，和(iii)固体层；以及

将所述水层输送进所述发酵容器。

33.根据权利要求27所述的方法，还包括：

使所述油层的油与一种或多种能够将所述油化学地转化成提取剂的物质接触，从而将所述油的至少一部分转化成所述提取剂，所述提取剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酯、甘油三酯、以及它们的混合物。

34.根据权利要求27所述的方法，其中所述提取剂对于所述产物醇的分配系数大于所述油层的油对于所述产物醇的分配系数。

35.根据权利要求27所述的方法，其中所述产物醇是C₁-C₈烷基醇。

36.根据权利要求27所述的方法，其中所述油包括选自下列的一种或多种油：牛脂油、玉米油、卡诺拉油、癸酸/辛酸甘油三酯、蓖麻油、椰子油、棉籽油、鱼油、霍霍巴油、猪油、亚麻籽油、牛蹄油、奥蒂油、棕榈油、花生油、油菜籽油、稻米油、红花油、大豆油、向日葵油、桐油、麻风树油、小麦油、黑麦油、大麦油和植物油共混物。

37.产生提取剂的方法，包括：

提供包含油的生物质；以及

将所述油的至少一部分转化成提取剂，所述提取剂选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酯、甘油三酯、以及它们的混合物。

38.根据权利要求37所述的方法，其中将所述油转化成提取剂包括下列步骤中的一个或多个：在四氢呋喃和氢化锂铝存在的情况下孵育所述油；将所述油与氢氧化钠孵育；将所述油与硫酸和甲醇孵育；在醋酸铵存在的情况下，将所述油与无水氨孵育；将所述油与氨水孵育；使所述油与甲苯、阳离子交换树脂、冰醋酸、脂肪酶和过氧化氢接触；在高温条件下孵育所述油，或在高压条件下孵育所述油。