MX2012014784A

MX2012014784A - Produccion de esteres de alcohol y extraccion del producto in situ durante la fermentacion del alcohol.

Info

Publication number: MX2012014784A
Application number: MX2012014784A
Authority: MX
Inventors: Douglas Robert Anton; Robert Dicosimo; Michael Charles Grady; Bruce A Diner; Brian Michael Roesch; Keith H Burlew; Jelena Cirakovic; Francis J Woerner; Stephane Francois Bazzana
Original assignee: Butamax Tm Advanced Biofuels
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2013-03-22
Also published as: AR083153A1; EP2582825A1; BR112012032352A2; CA2800719A1; AU2011268244A1; CA2801209A1; NZ603659A; KR20130116858A; EP2582826A2; BR112012032166A2; JP2013528400A; CN102947457A; WO2011160030A2; ZA201208372B; CA2801498A1; CN103476936A; KR20130032897A; EP2582827A2; AU2011268169A1; ZA201208677B

Abstract

La presente invención describe un proceso y composición de fermentación de alcohol por la esterificación del producto de alcohol en un método de fermentación con un ácido carboxílico (por ejemplo, ácido graso) y un catalizador (por ejemplo, lipasa) capaz de esterificar el producto de alcohol, tal como butanol, con el ácido carboxílico para formar los ésteres de alcohol. Los ésteres de alcohol se pueden extraer del medio de fermentación y el producto de alcohol se puede recuperar de los ésteres de alcohol. El ácido carboxílico puede ser útil, además, como un extractante para extraer los ésteres de alcohol del medio de fermentación.

Description

PRODUCCION DE ESTERES DE ALCOHOL Y EXTRACCION DEL PRODUCTO IN 3ITU DURANTE LA FERMENTACION DEL ALCOHOL CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a la producción fermentativa de alcoholes, que incluyen etanol y butanol, y de todos los coproductos relacionados, y a los procesos para mejorar la fermentación del alcohol por medio de métodos de extracción del producto in situ.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los alcoholes tienen diversas aplicaciones en la industria y la ciencia, tales como una bebida (es decir, etanol), combustible, reactivos, disolventes y antisépticos. Por ejemplo, el butanol es un alcohol que constituye una sustancia química industrial importante y un componente de combustible para aviación con diversas aplicaciones que incluyen el uso como aditivo combustible renovable, como una sustancia química de materia prima en la industria del plástico y como un extractante de grado alimenticio en la industria de los alimentos y saborizantes . En consecuencia, existe una alta demanda de alcoholes, tales como butanol, así como los métodos de producción eficaces y compatibles con el ambiente .

La producción de alcohol por fermentación con microorganismos es uno de esos métodos de producción REF.: 237390 compatibles con el ambiente. Particularmente, en la producción de butanol, algunos microorganismos que generan una alta producción de butanol tienen, además, umbrales bajos de toxicidad del butanol. La extracción del butanol del recipiente de fermentación a medida que se produce es un medio para manejar estos umbrales bajos de toxicidad del butanol. Por lo tanto, persiste la necesidad de desarrollar métodos y sistemas eficaces para generar una alta producción de butanol a pesar de los umbrales bajos de toxicidad del butanol de los microorganismos productores de butanol en el medio de fermentación.

La extracción del producto in situ (ISPR, por sus siglas en inglés) (mencionada, además, como fermentación extractiva) puede usarse para extraer el butanol (u otro alcohol fermentativo) del recipiente de fermentación a medida que se produce y, de ese modo, permite que el microorganismo genere una alta producción de butanol . Un método de ISPR para extraer alcohol fermentativo descrito en la técnica es la extracción líquido- líquido (publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305370) . Generalmente, con respecto a la fermentación del butanol, el medio de fermentación que incluye el microorganismo se pone en contacto con un extractante orgánico en un momento anterior a que la concentración del butanol alcance un nivel tóxico. El extractante orgánico y el medio de fermentación forman una mezcla bifásica. El butanol se divide en la fase extractante orgánica y disminuye la concentración de butanol en la fase acuosa que contiene el microorganismo, lo que limita la exposición del microorganismo al butanol inhibitorio. Para que sea técnica y económicamente viable, la extracción líquido-líquido requiere el contacto entre el extractante y el caldo de fermentación para transferir la masa, eficazmente, del producto de alcohol al extractante; la separación de fases del extractante a partir del caldo de fermentación (durante y/o después de la fermentación) ; la recuperación y reciclado eficaz del extractante; y la reducción mínima del coeficiente de partición del extractante en una operación a largo plazo.

El extractante se puede contaminar en el tiempo con cada reciclado, por ejemplo, por la acumulación de lípidos presentes en la biomasa que se alimenta al recipiente de fermentación como materia prima de almidón hidrolizable . Como ejemplo, durante la conversión de glucosa a butanol, una templa de maíz licuada cargada en un recipiente de fermentación a 30 % en peso de sólidos de maíz seco puede producir un caldo de fermentación que contiene aproximadamente 1.2 % en peso de aceite de maíz generado por sacarificación y fermentación simultánea (en donde la sacarificación de la templa licuada se produce durante la fermentación por la adición de glucoamilasa para producir glucosa) . La disolución de los lipidos del aceite de maíz en alcohol oleílico (OA, por sus siglas en inglés) útil como extractante durante la ISPR puede producir la acumulación de la concentración de lipidos, en donde cada reciclado de OA reduce el coeficiente de partición para el producto de alcohol en OA a medida que la concentración de lipidos en OA aumenta con cada reciclado de OA.

Además, la presencia de los sólidos no disueltos durante la fermentación extractiva puede afectar negativamente la eficacia de la producción de alcohol. Por ejemplo, la presencia de los sólidos no disueltos puede reducir el coeficiente de transferencia de masa dentro del recipiente de fermentación, dificultar la separación de fases en el recipiente de fermentación, producir la acumulación de aceite de maíz de los sólidos no disueltos en el extractante, lo que reduce la eficacia de la extracción con el tiempo, incrementar la pérdida de disolvente ya que este queda atrapado en sólidos que finalmente se extraen como granos secos de destilería con solubles (DDGS, por sus siglas en inglés) , reducir la velocidad de desacoplamiento de las gotas de extractante del caldo de fermentación y/o reducir la eficacia del volumen del recipiente de fermentación.

Varios métodos para reducir la degradación del coeficiente de partición del extractante usados en la fermentación extractiva han incluido molienda en húmedo, fraccionamiento y extracción de sólidos. La molienda en húmedo es un proceso de etapas múltiples costoso que separa una biomasa (por ejemplo, maíz) en sus componentes principales (germen, fibra del pericarpio, almidón y gluten) para captar valor de cada coproducto en forma separada. Este proceso genera una corriente de almidón purificada; sin embargo, es costoso e incluye la separación de la biomasa en sus componentes distintos al almidón, lo que es innecesario para la producción de alcohol fermentativo. El fraccionamiento elimina fibras y gérmenes que contienen una mayor parte de los lípidos presentes en el maíz entero triturado, lo que produce un maíz fraccionado que tiene un contenido de almidón (endosperma) más alto. El fraccionamiento en seco no separa el germen de la fibra y, por lo tanto, es menos costoso que la molienda en húmedo. Sin embargo, el fraccionamiento no extrae la totalidad de la fibra o germen y no elimina los sólidos completamente. Además, en el fraccionamiento se produce cierta pérdida del almidón. La molienda del maíz en húmedo es más costosa que el fraccionamiento en seco, pero el f accionamiento en seco es más costoso que la trituración en seco del maíz no fraccionado. La extracción de sólidos, que incluyen germen que contiene lípidos, de la templa licuada antes del uso en la fermentación puede eliminar, prácticamente, los sólidos no disueltos, tal como se describe, por ejemplo, en la solicitud provisional de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada con núm. de serie 61/356,290, presentada el 18 de junio de 2010. Sin embargo, sería ventajoso si la degradación del coeficiente de partición del extractante causada por contaminación con lípidos pudiera reducirse aun sin el fraccionamiento o la eliminación de prácticamente todos los sólidos no disueltos. La conversión de los lípidos presentes en una templa licuada en un extractante que se puede usar en ISPR es otro método para reducir la cantidad de lípidos que se alimentan al recipiente de fermentación, tal como se describe, por ejemplo, en la solicitud provisional de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada con núm. de serie 61/368,436 y en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. de serie 61/368,444, ambas presentadas el 28 de julio de 2010.

Persiste la necesidad de métodos de fermentación extractiva alternativos en los cuales no sea necesario dividir el producto de alcohol entre el medio de fermentación y el extractante para ISPR como un medio para reducir el efecto tóxico del producto de alcohol, tal como butanol, en el microorganismo y que, además, puedan reducir la degradación del coeficiente de partición de un extractante del producto de fermentación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION La conversión de alcohol, tal como butanol, producido a partir de un microorganismo en un medio de fermentación en una sustancia menos tóxica puede permitir una mayor producción de alcohol, tal como butanol, para un volumen del recipiente de fermentación determinado. Los ésteres de alcohol pueden formarse por el contacto del alcohol en un medio de fermentación con un ácido carboxílico (por ejemplo, ácidos grasos) y un catalizador capaz de esterificar el alcohol con el ácido carboxílico. Además, el ácido carboxílico puede ser útil como un extractante para ISPR en la cual se dividen los ésteres de alcohol . El ácido carboxílico puede suministrarse al recipiente de fermentación y/o derivarse de la biomasa que proporciona el suministro de carbono fermentable al recipiente de fermentación. Los lípidos presentes en la materia prima se pueden hidrolizar catalíticamente a ácido carboxílico y el mismo catalizador (por ejemplo, enzimas) puede esterificar el ácido carboxílico con el alcohol (por ejemplo, butanol) ; además, los lípidos pueden transesterificarse directamente por medio del catalizador para producir ésteres de alcohol. El catalizador puede suministrarse a la materia prima antes de la fermentación o se puede colocar en el recipiente de fermentación antes o al mismo tiempo que el suministro de la materia prima. Cuando el catalizador se suministra al recipiente de fermentación se pueden obtener ésteres de alcohol por hidrólisis de los lípidos en ácido carboxílico y la esterificación simultánea de ácido carboxílico con butanol presente en el recipiente de fermentación; además, los lípidos pueden transesterificarse con butanol por medio del catalizador para producir esteres de alcohol. El ácido carboxílico y/o aceite natural no derivado de la materia prima puede suministrarse, además, al recipiente de fermentación, con el aceite natural que se hidroliza en ácido carboxílico. El ácido carboxílico y/o aceite natural no derivado de la materia prima se puede suministrar al recipiente de fermentación en una cantidad suficiente de manera que se forme una mezcla de dos fases que comprende una fase orgánica y una fase acuosa. Como tal, en algunas modalidades, cualquier ácido carboxílico no esterificado con el alcohol puede ser útil como el extractante para ISPR o como una parte de este. El extractante que contiene esteres de alcohol puede separarse del medio de fermentación y el alcohol puede recuperarse del extractante. El extractante se puede reciclar al recipiente de fermentación. Por lo tanto, en el caso de la producción de butanol, por ejemplo, la conversión de butanol en un éster reduce la concentración de butanol libre en el medio de fermentación y protege biológicamente al microorganismo frente al efecto tóxico de la concentración de butanol creciente. Además, el grano sin fraccionar puede usarse allí como materia prima sin separación de lípidos, ya que los lípidos se pueden hidrolizar catalíticamente a ácido carboxílico y, por lo tanto, se reduce la velocidad de acumulación de lípidos en el extractante para ISPR.

La presente invención está dirigida a un método para producir ésteres butílicos; el método comprende poner en contacto el butanol producido en un proceso de fermentación con al menos un ácido carboxílico y al menos un catalizador capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar ésteres butílicos del ácido carboxílico; en donde el ácido carboxílico en el proceso de fermentación está presente en una concentración suficiente para producir una mezcla de dos fases. En una modalidad, la producción de butanol y la producción de ésteres butílicos son simultáneas o se producen en secuencia. En una modalidad, una materia prima en el proceso de fermentación comprende uno o más azúcares fermentables . En otra modalidad, la materia prima en el proceso de fermentación comprende uno o más azúcares fermentables derivados de granos de maíz, mazorcas del maíz, residuos de cultivos tales como cáscaras de maíz, rastrojos del maíz, hierbas, trigo, centeno, paja del trigo, cebada, paja de la cebada, heno, paja de arroz, pasto panizo, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, caña de azúcar, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, material celulósico, material lignocelulósico, árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de maderas, aserrín, matas y arbustos, vegetales, frutas, flores, estiércol, y mezclas de estos. En una modalidad; el método comprende, además, proporcionar un aceite natural y convertir al menos una porción del aceite natural en ácido carboxílico por medio del contacto del aceite con una o más enzimas. En una modalidad, el ácido carboxílico comprende ácidos grasos. En otra modalidad, el ácido carboxílico comprende de 12 a 22 carbonos. En una modalidad, el ácido carboxílico es una mezcla de ácidos carboxílieos . En otra modalidad, los ésteres butílicos del ácido carboxílico son ésteres butílicos de ácidos grasos. En una modalidad, el catalizador es una enzima capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar ésteres butílicos del ácido carboxílico. En otra modalidad, la enzima es una esterasa, lipasa, fosfolipasa o lisofosfolipasa .

La presente invención está dirigida, además, a un método para producir butanol y ésteres butílicos a partir de una materia prima; el método comprende: (a) proporcionar una materia prima; (b) licuar la materia prima para crear una biomasa licuada que comprende oligosacáridos ; (c) separar la suspensión de materia prima para producir un producto que comprende una corriente acuosa que comprende oligosacáridos, una corriente de aceite y sólidos; (d) añadir la corriente acuosa en un recipiente de fermentación que contiene un caldo de fermentación; (e) sacarificar los oligosacáridos de la corriente acuosa; (f) fermentar los productos de la sacarificación de los oligosacáridos presentes en la corriente acuosa para producir butanol y, al mismo tiempo, poner en contacto el butanol con al menos un ácido carboxílico y al menos un catalizador capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar ásteres butílicos del ácido carboxílico, en donde el ácido carboxílico está presente en una concentración suficiente para producir una mezcla de dos fases; y, opcionalmente , las etapas (e) y (f) se producen simultáneamente. En una modalidad; el método comprende, además, obtener un aceite de la corriente de aceite y convertir al menos una porción del aceite en ácido carboxílico. En una modalidad, la suspensión de materia prima se separa por medio de centrifugación en decantador de tazón, centrifugación en tricanter, centrifugación en pila de discos, centrifugación por filtración, centrifugación en decantador, filtración, filtración al vacío, filtro de banda, filtración por presión, filtración con tamiz, separación por tamiz, rejilla, rejilla porosa, flotación, hidrociclón, prensa de filtro, prensa de tornillo, sedimentador por gravedad, separador de vórtice, o una combinación de estos. En otra modalidad, el ácido carboxílico comprende ácidos grasos. En una modalidad, el ácido carboxílico comprende 12 a 22 carbonos. En una modalidad; el método comprende, además, añadir el aceite al recipiente de fermentación antes de la etapa de convertir al menos una porción del aceite en ácido carboxílico. En una modalidad; el método comprende, además, añadir ácido carboxílico adicional al recipiente de fermentación. En una modalidad, el aceite se convierte en ácido carboxílico después de la etapa de añadir el ácido carboxílico adicional. En otra modalidad, el ácido carboxílico es ácido graso de aceite de maíz, ácido graso de aceite de soja o una mezcla de ácido graso de aceite de maíz y ácido graso de aceite de soja. En una modalidad, el aceite obtenido de la corriente de aceite comprende glicéridos y el o los catalizadores hidrolizan los glicéridos en ácidos grasos. En otra modalidad, los ésteres butílicos del ácido carboxílico son ésteres butílicos de ácidos grasos. En una modalidad, el catalizador es una enzima capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar ésteres butílicos del ácido carboxílico. En una modalidad, la enzima es una esterasa, lipasa, fosfolipasa o lisofosfolipasa . En una modalidad; el método comprende, además, la etapa de lavar los sólidos con un disolvente. En una modalidad, el disolvente se selecciona de hexano, isobutanol, isohexano, etanol, destilados de petróleo tales como éter de petróleo o mezclas de estos. En otra modalidad, los sólidos se procesan para formar un producto de alimento para animales. En una modalidad, los sólidos se procesan para formar un producto de alimento para animales. En una modalidad, el producto de alimento para animales comprende una o más proteínas crudas, grasa cruda, triglicéridos , ácido graso, éster isobutílico del ácido graso, lisina, fibra detergente neutra (NDF, por sus siglas en inglés) y fibra detergente ácida (ADF, por sus siglas en inglés) . En otra modalidad, el producto de alimento para animales comprende, además, una o más vitaminas, minerales, saborizantes o colorantes. En una modalidad, el producto de alimento para animales comprende 20-35 % en peso de proteína cruda, 1-20 % en peso de grasa cruda, 0-5 % en peso de triglicéridos, 4-10 % en peso de ácidos grasos y 2-6 % en peso de ésteres isobutílicos de ácidos grasos. En una modalidad, la etapa de separar los sólidos de la suspensión de materia prima aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de un coeficiente de transferencia de masa líquido- líquido del butanol del caldo de fermentación al extractante; aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la eficacia de la extracción del butanol con un extractante; aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la velocidad de separación de fases entre el caldo de fermentación y un extractante aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la recuperación y reciclado de un extractante; o aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante la reducción del régimen de flujo de un extractante.

La presente invención está dirigida, además, a un método para producir butanol y ásteres butílicos a partir de una materia prima; el método comprende: (a) proporcionar una materia prima; (b) licuar la materia prima para crear una biomasa licuada que comprende oligosacáridos ; (c) separar la suspensión de materia prima para producir una corriente que comprende oligosacáridos y aceite, y sólidos; (d) añadir la corriente en un recipiente de fermentación que contiene un caldo de fermentación; (e) sacarificar los oligosacáridos de la corriente; (f) fermentar los productos de la sacarificación de los oligosacáridos presentes en la corriente para producir butanol y, al mismo tiempo, poner en contacto el butanol con al menos un ácido carboxílico y al menos un catalizador capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar ésteres butílicos del ácido carboxílico, en donde el ácido carboxílico está presente en una concentración suficiente para producir una mezcla de dos fases; y, opcionalmente , las etapas (e) y (f) se producen simultáneamente. En una modalidad; el método comprende, además, convertir al menos una porción del aceite en ácido carboxílico. En una modalidad, la suspensión de materia prima se separa por medio de centrifugación en decantador de tazón, centrifugación en "tricanter" , centrifugación en pila de discos, centrifugación por filtración, centrifugación en decantador, filtración, filtración al vacío, filtro de banda, filtración por presión, filtración con tamiz, separación por tamiz, rejilla, rejilla porosa, flotación, hidrociclón, prensa de filtro, prensa de tornillo, sedimentador por gravedad, separador de vórtice, o una combinación de estos. En otra modalidad, el ácido carboxílico comprende ácidos grasos. En una modalidad, el ácido carboxílico comprende 12 a 22 carbonos. En una modalidad; el método comprende, además, añadir aceite al recipiente de fermentación. En una modalidad; el método comprende, además, añadir ácido carboxílico adicional al recipiente de fermentación. En una modalidad, el aceite se convierte en ácido carboxílico después de la etapa de añadir el ácido carboxílico adicional. En una modalidad, el ácido carboxílico es ácido graso de aceite de maíz, ácido graso de aceite de soja o una mezcla de ácido graso de aceite de maíz y ácido graso de aceite de soja. En una modalidad, el aceite comprende glicéridos y el o los catalizadores hidrolizan los glicéridos en ácidos grasos. En una modalidad, los ésteres butílicos del ácido carboxílico son ésteres butílicos de ácidos grasos. En una modalidad, el catalizador es una enzima capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar ésteres butílicos del ácido carboxílico. En una modalidad, la enzima es una esterasa, lipasa, fosfolipasa o lisofosfolipasa . En una modalidad; el método comprende, además, la etapa de lavar los sólidos con un disolvente. En una modalidad, el disolvente se selecciona de hexano, isobutanol, isohexano, etanol, destilados de petróleo tales como éter de petróleo o mezclas de estos. En una modalidad, los sólidos se procesan para formar un producto de alimento para animales. En una modalidad, los sólidos se procesan para formar un producto de alimento para animales. En algunas modalidades, el producto de alimento para animales comprende una o más proteínas crudas, grasa cruda, triglicéridos , ácido graso, éster isobutílico del ácido graso, lisina, fibra detergente neutra (NDF, por sus siglas en inglés) y fibra detergente ácida (ADF, por sus siglas en inglés) . En algunas modalidades, el producto de alimento para animales comprende, además, una o más vitaminas, minerales, saborizantes o colorantes. En algunas modalidades, el producto de alimento para animales comprende 20-35 % en peso de proteína cruda, 1-20 % en peso de grasa cruda, 0-5 % en peso de triglicéridos, 4-10 % en peso de ácidos grasos y 2-6 % en peso de ésteres isobutílieos de ácidos grasos. En algunas modalidades, la etapa de separar los sólidos de la suspensión de materia prima aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de un coeficiente de transferencia de masa líquido- líquido del butanol del caldo de fermentación al extractante; aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la eficacia de la extracción del butanol con un extractante; aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la velocidad de separación de fases entre el caldo de fermentación y un extractante aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la recuperación y reciclado de un extractante; o aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante la reducción del régimen de flujo de un extractante .

La presente invención está dirigida, además, a un método para producir butanol; el método comprende (a) poner en contacto el butanol producido en un proceso de fermentación con al menos un ácido carboxílico y al menos un catalizador capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar ésteres butílicos del ácido carboxílico; en donde el ácido carboxílico en el proceso de fermentación está presente en una concentración suficiente para producir una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene éster butílico; (b) separar la fase orgánica que contiene éster butílico de la fase acuosa; y (c) recuperar butanol de los ésteres butílicos. En algunas modalidades, la etapa de recuperar butanol de los ésteres butílicos comprende hidrolizar los ésteres en ácido carboxílico y butanol. En algunas modalidades, los ésteres butílicos se hidrolizan en presencia de un catalizador de hidrólisis. En algunas modalidades, los ésteres butílicos se hidrolizan en presencia de agua, en donde el catalizador de hidrólisis comprende un catalizador ácido, un ácido orgánico, un ácido inorgánico, un ácido soluble en agua o un ácido insoluble en agua. En algunas modalidades, el catalizador de hidrólisis comprende una enzima capaz de hidrolizar los ásteres butílicos para formar un ácido carboxílico y butanol . En algunas modalidades, la enzima es una esterasa, lipasa, fosfolipasa o lisofosfolipasa . En algunas modalidades, las condiciones de reacción enzimática favorecen la hidrólisis enzimática antes que la esterificación . En algunas modalidades, las condiciones de reacción enzimática comprenden un cosolvente . En algunas modalidades, los ásteres butílicos de ácidos grasos, ácidos grasos, isobutanol y agua son solubles en el cosolvente, en donde los ácidos grasos libres no reaccionan con el cosolvente. En algunas modalidades, el cosolvente se selecciona de acetona, terc-butanol , 2 -Me-2 -butanol , 2-Me-2-pentanol y 3-Me-3-pentanol . En algunas modalidades, las condiciones de reacción enzimática comprenden la eliminación del producto final. En algunas modalidades, el producto final es isobutanol o ácidos grasos. En algunas modalidades, el isobutanol se elimina por destilación al vacío, pervaporación, filtración permselectiva o inyección de gas. En algunas modalidades, los ácidos grasos se eliminan por precipitación, filtración permselectiva o electroforéticamente . En algunas modalidades, la reacción de hidrólisis se produce en un recipiente de reacción. En algunas modalidades, la recuperación de butanol de los ésteres butílicos comprende transesterificar los esteres butílicos en butanol y ésteres alquílicos de ácidos grasos o acil glicéridos. En algunas modalidades, los ésteres alquílicos de ácidos grasos comprenden ésteres metílicos de ácidos grasos, ésteres etílicos de ácidos grasos o ésteres propílicos de ácidos grasos. En algunas modalidades; el método comprende, además, proporcionar un aceite natural y convertir al menos una porción del aceite natural en ácido carboxílico por medio del contacto del aceite con una o más enzimas. En algunas modalidades, la enzima es una enzima capaz de hidrolizar o transesterificar los ésteres butílicos para formar butanol. En algunas modalidades, la enzima es una esterasa, lipasa, fosfolipasa o lisofosfolipasa . En algunas modalidades, el ácido carboxílico comprende ácidos grasos. En algunas modalidades, el ácido carboxílico tiene una longitud de cadenas de carbonos de 12 a 22 carbonos. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 10 % de butanol se recupera de los ésteres butílicos. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 50 % de butanol se recupera de los ésteres butílicos. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 90 % de butanol se recupera de los ésteres butílicos. En algunas modalidades, ácido carboxílico se recupera de los ésteres butílicos. En algunas modalidades; el método comprende, además, las etapas de extraer butanol del termentador como corriente de extractante; y añadir la corriente de extractante en dos o más columnas de destilación. En algunas modalidades, la columna de destilación es una columna de destilación superatmosferica con un intercambiado calentado por vapor. En algunas modalidades; el método comprende, además, las etapas de recuperar agua y disolvente de las columnas de destilación; y reciclar el agua y el disolvente. En algunas modalidades; el método comprende, además, las etapas de recuperar calor del proceso de destilación; y reciclar el calor para evaporar agua .

La presente invención está dirigida, además, a un método para producir butanol a partir de una materia prima; el método comprende (a) proporcionar una materia prima; (b) licuar la materia prima para crear una suspensión de materia prima; (c) separar la suspensión de materia prima para producir un producto que comprende una corriente acuosa, una corriente de aceite y sólidos; (d) añadir la corriente acuosa en un recipiente de fermentación que contiene un caldo de fermentación; (e) sacarificar la corriente acuosa; (f) fermentar la corriente acuosa sacarificada para producir butanol y, al mismo tiempo, poner en contacto el butanol con al menos un ácido carboxílico y al menos un catalizador capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar esteres butílicos del ácido carboxílico, en donde el ácido carboxílico está presente en una concentración suficiente para producir una mezcla de dos fases; (g) separar la fase orgánica que contiene éster butílico de la fase acuosa; y (h) recuperar butanol de los ésteres butílicos; y, opcionalmente, las etapas (e) y (f) se producen simultáneamente. En algunas modalidades; el método comprende, además, obtener un aceite de la corriente de aceite y convertir al menos una porción del aceite en ácido carboxílico. En algunas modalidades, la suspensión de materia prima se separa por centrifugación, filtración o decantación. En algunas modalidades, el ácido carboxílico comprende ácidos grasos. En algunas modalidades, el ácido carboxílico tiene una longitud de cadenas de carbonos de 12 a 22 carbonos. En algunas modalidades; el método comprende, además, añadir el aceite al recipiente de fermentación antes de la etapa de convertir al menos una porción del aceite en ácido carboxílico. En algunas modalidades; el método comprende, además, añadir ácido carboxílico adicional al recipiente de fermentación. En algunas modalidades, el aceite se convierte en ácido carboxílico después de la etapa de añadir el ácido carboxílico adicional. En algunas modalidades, el ácido carboxílico es ácido graso de aceite de maíz, ácido graso de aceite de soja o una mezcla de ácido graso de aceite de maíz y ácido graso de aceite de soja. En algunas modalidades, el aceite obtenido de la corriente de aceite comprende glicéridos y el o los catalizadores hidrolizan los glicéridos en ácidos grasos. En algunas modalidades, los ésteres butílicos del ácido carboxílico son ésteres butílicos de ácidos grasos. En algunas modalidades, el catalizador es una enzima capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar ésteres butílicos del ácido carboxílico. En algunas modalidades, la enzima es una esterasa, lipasa, fosfolipasa o lisofosfolipasa . En algunas modalidades, los sólidos se procesan para formar un producto de alimento para animales. En algunas modalidades, la etapa de recuperar butanol de los ésteres butílicos comprende hidrolizar los ésteres en ácido carboxílico y butanol. En algunas modalidades, los ésteres butílicos se hidrolizan en presencia de un catalizador de hidrólisis. En algunas modalidades, los ésteres butílicos se hidrolizan en presencia de agua, en donde el catalizador de hidrólisis comprende un catalizador ácido, un ácido orgánico, un ácido inorgánico, un ácido soluble en agua o un ácido insoluble en agua. En algunas modalidades, el catalizador de hidrólisis comprende una enzima capaz de hidrolizar los ésteres butílicos para formar un ácido carboxílico y butanol. En algunas modalidades, la enzima es una esterasa, lipasa, fosfolipasa o lisofosfolipasa . En algunas modalidades, la reacción de hidrólisis se produce en un recipiente de reacción. En algunas modalidades, la recuperación de butanol de los ésteres butílicos comprende transesterificar los ésteres butílicos en butanol y ésteres alquílicos de ácidos grasos o acil glicéridos. En algunas modalidades, los ésteres alquílicos de ácidos grasos comprenden ésteres metílicos de ácidos grasos, ésteres etílicos de ácidos grasos o ésteres propílicos de ácidos grasos. En algunas modalidades; el método comprende, además, proporcionar un aceite natural y convertir al menos una porción del aceite natural en ácido carboxílico por medio del contacto del aceite con una o más enzimas. En algunas modalidades, la enzima es una enzima capaz de hidrolizar o transesterificar los ésteres butílicos para formar butanol. En algunas modalidades, la enzima es una esterasa, lipasa, fosfolipasa o lisofosfolipasa .

En otras modalidades, un método de fermentación puede incluir: proporcionar una corriente de alimentación acuosa obtenida de la biomasa, en donde la corriente de alimentación acuosa incluye agua, fuente de carbono fermentable derivado de la biomasa y aceite; poner en contacto la corriente de alimentación acuosa con un catalizador por medio de lo cual al menos una porción del aceite se hidroliza en ácidos grasos libres para formar una corriente de alimentación tratada con catalizador que incluye los ácidos grasos libres y el catalizador; poner en contacto la corriente de alimentación tratada con catalizador con un caldo de fermentación en un recipiente de fermentación; fermentar la fuente de carbono fermentable en el recipiente de fermentación para producir un producto de alcohol; y poner en contacto el producto de alcohol con los ácidos grasos libres y el catalizador durante la fermentación para catalizar la esterificación de los ácidos grasos libres y el producto de alcohol en el recipiente de fermentación para producir ésteres de alcohol de ácidos grasos. En algunas modalidades, las etapas de poner en contacto la corriente de alimentación con catalizador y caldo de fermentación y las etapas de fermentar y poner en contacto el producto de alcohol con los ácidos grasos libres y el catalizador pueden producirse simultáneamente. En algunas modalidades, el producto de alcohol es butanol y los ésteres de alcohol de ácidos grasos son ésteres butílicos de ácidos grasos.

La presente invención proporciona métodos para eliminar alcohol de un medio de fermentación durante la fermentación; los métodos incluyen: proporcionar un medio de fermentación que incluye un microorganismo que produce alcohol en el medio de fermentación; y poner en contacto el medio de fermentación durante la fermentación con un ácido carboxílico y un catalizador capaz de esterificar el alcohol con el ácido carboxílico para formar un éster de alcohol. En algunas modalidades, el alcohol producido por el microorganismo es butanol y el éster de alcohol es éster butílico. En algunas modalidades, el medio de fermentación se pone en contacto con un ácido carboxílico prácticamente insoluble en el medio de fermentación y con un catalizador capaz de esterificar el alcohol con el ácido carboxílico para formar un éster de alcohol .

La presente invención proporciona, además, métodos para producir ásteres de alcohol de ácidos grasos durante un proceso de fermentación; los métodos incluyen: proporcionar un medio de fermentación que comprende alcohol, fuente de carbono fermentable y ácidos grasos libres; y poner en contacto el medio de fermentación con una o más enzimas capaces de esterificar los ácidos grasos libres con el alcohol por medio del cual los ácidos grasos libres se esterifican con el alcohol para formar ésteres de alcohol de ácidos grasos. En algunas modalidades, la fuente de carbono fermentable se deriva de biomasa. En algunas modalidades, el microorganismo del medio de fermentación es un microorganismo recombinante . En algunas modalidades, el alcohol es butanol y los ésteres de alcohol de ácidos grasos son ésteres butílicos de ácidos grasos.

En otra modalidad, un método para producir un producto de alcohol puede incluir proporcionar una materia prima de biomasa que incluye agua, fuente de carbono fermentable y aceite, en donde el aceite incluye acilglicéridos ; licuar la materia prima de biomasa para crear una biomasa licuada que comprende oligosacáridos ,- poner en contacto la materia prima de biomasa o la biomasa licuada con una composición que comprende una o más enzimas capaces de convertir al menos una porción de los acilglicéridos en ácidos grasos libres por medio de lo cual los ácidos grasos libres forman un extractante; además, el o las enzimas son capaces de esterificar los ácidos grasos libres con producto de alcohol en ésteres de alcohol de ácidos grasos; poner en contacto la biomasa licuada con una enzima de sacarificación capaz de convertir oligosacáridos en azúcar fermentable; poner en contacto la biomasa licuada con un microorganismo recombinante capaz de convertir el azúcar fermentable en producto de alcohol, por medio de lo cual se produce un producto de fermentación que comprende producto de alcohol; poner en contacto el producto de alcohol con los ácidos grasos libres y la o las enzimas para catalizar la esterificación de los ácidos grasos libres y el producto de alcohol para producir ésteres de alcohol de ácidos grasos; y poner en contacto el producto de fermentación con extractante. En modalidades, el contacto con el extractante produce la formación de una mezcla de dos fases que incluye una fase acuosa y una fase extractante y los ésteres de alcohol de ácidos grasos se dividen en la fase extractante para formar una fase extractante que contiene éster. En algunas modalidades, el producto de alcohol es butanol y los ésteres de alcohol de ácidos grasos son ásteres butílicos de ácidos grasos.

En otra modalidad, un método para producir un producto de alcohol puede incluir proporcionar una materia prima de biomasa que incluye agua, fuente de carbono fermentable y aceite, en donde el aceite incluye acilglicéridos; licuar la materia prima de biomasa para crear una biomasa licuada que comprende oligosacáridos ; poner en contacto la biomasa licuada con una composición que comprende una o más enzimas capaces de convertir al menos una porción de los acilglicéridos en ácidos grasos libres; además, la o las enzimas son capaces de esterificar ácidos grasos libres con producto de alcohol en ésteres de alcohol de ácidos grasos; poner en contacto la biomasa licuada con una enzima de sacarificación capaz de convertir oligosacáridos en azúcar fermentable; poner en contacto la biomasa sacarificada con un microorganismo recombinante capaz de convertir el azúcar fermentable en producto de alcohol durante la fermentación, por medio de lo cual se produce un medio de fermentación que comprende producto de alcohol; poner en contacto el medio de fermentación durante la fermentación con un extractante de ácido carboxílico, en donde el medio de fermentación comprende una o más enzimas capaces de esterificar ácidos grasos libres con producto de alcohol para formar ésteres de alcohol de ácidos grasos. En otras modalidades de este método, el medio de fermentación se pone en contacto con un ácido carboxílico prácticamente insoluble en el medio de fermentación y con un catalizador capaz de esterificar el alcohol con el ácido carboxílico para formar un éster de alcohol. En otras modalidades de este método, el alcohol producido por el microorganismo es butanol y el éster de alcohol es éster butílico.

La presente invención proporciona, además, un proceso para producir un producto de alcohol a partir de una materia prima; el proceso incluye: licuar almidón o una fuente de carbono fermentable en una materia prima para crear una suspensión que tiene oligosacáridos ; centrifugar la suspensión de materia prima para producir un producto de centrífuga que comprende (i) una capa acuosa que comprende oligosacáridos, (ii) una capa de aceite y (iii) sólidos; alimentar la capa acuosa a un recipiente de fermentación que contiene un caldo de fermentación; y fermentar la capa acuosa para producir el producto de alcohol. Después, el producto de alcohol se pone en contacto con el ácido carboxílico y el catalizador por medio de lo cual el ácido carboxílico se esterifica con el producto de alcohol para formar los ésteres de alcohol. En algunas modalidades, el aceite es un aceite derivado de una planta. En otras modalidades, el producto de alcohol es butanol y los ésteres de alcohol de ácidos carboxílicos son ésteres butílicos de ácidos grasos.

En algunas modalidades, un método para producir un producto de alcohol incluye proporcionar una materia prima de biomasa fraccionada que incluye agua, almidón y/o una fuente de carbono fermentable, en donde quedan solamente cantidades residuales de aceite después del fraccionamiento de la biomasa; el aceite residual incluye acilglicéridos ; licuar la materia prima de biomasa fraccionada para crear una biomasa fraccionada licuada que comprende oligosacáridos ,· poner en contacto la biomasa fraccionada licuada con una composición que comprende una o más enzimas capaces de convertir al menos una porción de los acilglicéridos residuales en ácidos grasos libres; además, la o las enzimas son capaces de esterificar ácidos grasos libres con producto de alcohol para formar ésteres de alcohol de ácidos grasos; poner en contacto la biomasa fraccionada licuada con una enzima de sacarificación capaz de convertir oligosacáridos en azúcar fermentable; poner en contacto la biomasa sacarificada con un microorganismo recombinante capaz de convertir el azúcar fermentable en producto de alcohol durante la fermentación, por medio de lo cual se produce un medio de fermentación que comprende producto de alcohol; poner en contacto el medio de fermentación durante la fermentación con un extractante de ácido carboxílico, en donde el medio de fermentación comprende una o más enzimas capaces de esterificar ácidos grasos libres con producto de alcohol para formar ésteres de alcohol de ácidos grasos. En otras modalidades de este método, el medio de fermentación se pone en contacto con un ácido carboxílico en el medio de fermentación y con un catalizador capaz de esterificar el alcohol con el ácido carboxílico para formar un éster de alcohol. En otra modalidad, el ácido carboxílico puede ser prácticamente insoluble en el medio de fermentación. En otras modalidades de este método, el alcohol producido por el microorganismo es butanol y el éster de alcohol es éster butílico.

La presente invención proporciona, además, una composición que incluye: una templa que se forma a partir de biomasa e incluye agua y azúcar fermentable ; un catalizador capaz de esterificar ácidos grasos libres con alcohol en esteres alquílieos de ácidos grasos y, opcionalmente , capaz de hidrolizar acilglicéridos en ácidos grasos libres; alcohol; ácidos grasos libres; y ésteres de alcohol de ácidos grasos formados in si tu a partir de la esterificación de los ácidos grasos libres con el alcohol por medio del catalizador. En algunas modalidades, el alcohol es butanol y los ésteres de alcohol de ácidos grasos son ésteres butílicos de ácidos grasos.

La presente invención proporciona, además, un caldo de fermentación; el caldo de fermentación incluye: un microorganismo recombinante capaz de producir alcohol; una fuente de carbono fermentable ; y ésteres de alcohol de ácidos grasos, en donde los ásteres de alcohol de ácidos grasos se producen durante la fermentación. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante es capaz de producir butanol. En algunas modalidades, los ésteres de alcohol de ácidos grasos son ésteres butílicos de ácidos grasos. En algunas modalidades, la fuente de carbono fermentable comprende azúcar. En algunas modalidades, la fuente de carbono fermentable comprende metano, el microorganismo recombinante es capaz de producir metanol y los ésteres de alcohol de ácidos grasos son ésteres metílicos de ácidos grasos.

Además, en la presente invención se proporcionan células de levadura recombinante útiles para producir productos de alcohol. En modalidades, las células huéspedes recombinantes descritas en la presente descripción pueden ser cualquier huésped de bacteria, levadura u hongo para la ingeniería genética y expresión del gen recombinante. En otras modalidades, una célula huésped recombinante puede ser un miembro de los géneros Clostridium, Zymomonas , Escherichia , Salmonel la , Serratia , Erwinia, Klebsiella , Shigella, Rhodococcus , Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus , Alcal igenes, Klebsiella , Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia , Pichia, Candida , Hansenula , Issatchenkia o Saccharomyces . En otras modalidades, la célula huésped puede ser Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces thermotolerans, Kluyveromyces marxianus , Candida glabrata , Candida albicans, Pichia stipitis , Yarrowia lipolytica , E. coli o L. plantarum . En otras modalidades, la célula huésped es una célula huésped de levadura. En algunas modalidades, la célula huésped es un miembro del género Saccharomyces. En algunas modalidades, la célula huésped es Kluyveromyces lactis, Candida glabrata o Schizosaccharomyces pombe. En algunas modalidades, la célula huésped es Saccharomyces cerevisiae . Las levaduras S. cerevisiae se conocen en la técnica y pueden obtenerse a partir de diversas fuentes que incluyen, pero no se limitan a, American Type Culture Collection (Rockville, MD) , Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre, LeSaffre, Gert Strand AB, Ferm Solutions, North American Bioproducts, Martrex y Lallemand. S. cerevisiae incluyen, pero no se limitan a, BY4741, CE . PK 113-7D, levadura Ethanol Red®, levadura Gert Strand Prestige Turbo, levadura Ferm Pro™, levadura Bio-Ferm® XR, levadura Gert Strand Distillers Yeast, levadura FerMax™ Green, levadura FerMax™ Gold, levadura Thermosacc®, BG-1, PE-2, CAT-1, CBS7959, CBS7960 y CBS7961.

Además, se proporcionan métodos para producir isobutanol que incluyen: proporcionar una célula huésped recombinante que comprende una ruta biosintética de isobutanol, en donde al menos la enzima que cataliza el sustrato para la conversión del producto o¡-cetoisovalerato en isobutiraldehído o la enzima que cataliza el sustrato para la conversión del producto isobut iraldehído en isobutanol están codificadas por medio de polinucleótidos heterólogos integrados en el cromosoma; y poner en contacto la célula huésped recombinante con una fuente de carbono fermentable para formar un caldo de fermentación en condiciones por las cuales se produce isobutanol. En algunas modalidades, los métodos incluyen, además: añadir un extractante para formar una mezcla de dos fases. En otras modalidades, el extractante comprende un ácido carboxílico. En algunas modalidades, el extractante comprende ácidos grasos. En otras modalidades, los métodos incluyen, además: añadir una enzima de esterificación capaz de catalizar la esterificación de isobutanol con el ácido carboxílico.

Además, en la presente descripción se proporcionan métodos que incluyen: proporcionar un medio de fermentación que comprende producto de alcohol, agua, fuente de carbono fermentable y un microorganismo que produce el producto de alcohol; poner en contacto el medio de fermentación durante la fermentación con un extractante para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica; y poner en contacto el medio de fermentación con un ácido carboxílico y una enzima capaz de esterificar el ácido carboxílico con el producto de alcohol. En algunas modalidades, el extractante comprende el ácido carboxílico. En algunas modalidades, el ácido carboxílico se produce por la hidrólisis de aceite a partir de una materia prima de biomasa. En algunas modalidades, el carbono fermentable y el ácido carboxílico se derivan de la misma fuente de materia prima de biomasa. En algunas modalidades, el ácido carboxílico comprende ácidos carboxílicos saturados, monoinsaturados , poli - insaturados que tienen de 12 a 22 carbonos y mezclas de estos. En algunas modalidades, el contacto del medio de fermentación con un extractante y un ácido carboxílico y una enzima se produce simultáneamente. En algunas modalidades, el microorganismo es un microorganismo modificado genéticamente (por ejemplo, un microorganismo recombinante o célula huésped, tal como células de levadura recombinante) .

Además, en la presente descripción se proporcionan composiciones que comprenden: PNY1504, PNY2205 o una célula huésped recombinante; un extractante; y, opcionalmente , una enzima de esterificación . Además, en la presente descripción se proporcionan composiciones que comprenden PNY1504, PNY2205 o una célula huésped recombinante y éster butílico.

En la presente descripción se proporcionan, además, los usos de PNY1504, PNY2205 u otras células de levadura recombinante y composiciones que comprenden células de levadura recombinante para la producción de isobutanol.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las figuras acompañantes, que se incorporan en la presente descripción y forman parte de la invención, ilustran la presente invención y, junto con la descripción, explican además los principios de la invención y permiten que un experto en la técnica pertinente prepare y use la invención.

La Fig. 1 ilustra esquemáticamente un ejemplo de un método y sistema de la presente invención, en los cuales se suministra un catalizador para la esterificación del alcohol en un recipiente de fermentación junto con ácido carboxílico y/o aceite natural.

La Fig. 2 ilustra esquemáticamente un ejemplo de un método y sistema de la presente invención, en los cuales el aceite natural se convierte en ácido carboxílico con el uso de un catalizador y el ácido carboxílico y el catalizador se suministran a un recipiente de fermentación.

La Fig. 3 ilustra esquemáticamente un ejemplo de un método y sistema de la presente invención, en los cuales una biomasa licuada se pone en contacto con un catalizador para la hidrólisis de lípidos antes de la fermentación.

La Fig. 4 ilustra esquemáticamente un ejemplo de un método y sistema de la presente invención, en los cuales la biomasa licuada y sacarificada se pone en contacto con un catalizador para la hidrólisis de los lípidos antes de la fermentación.

La Fig. 5 ilustra esquemáticamente un ejemplo de un método y sistema de la presente invención, en los cuales una cantidad de lípidos y sólidos no disueltos se extraen de una biomasa licuada antes de la fermentación, y en los cuales los lípidos extraídos se convierten en ácido carboxilico con el uso de un catalizador, y el ácido carboxilico y el catalizador se suministran al recipiente de fermentación.

La Fig. 6 muestra las concentraciones de la fase acuosa y disolvente del isobutanol producido por la fermentación con sacarosa como una fuente de carbono. El título de la fase acuosa (Panel A) se reporta en g/1 y las especies de la fase disolvente (isobutanol, Panel B e isobutanol como FABE, Panel C. El Panel D es el isobutanol total en la fase disolvente) en porcentaje en peso.

La Fig. 7 muestra el título eficaz del isobutanol, g/1, en el tiempo. En este ejemplo, el título eficaz se calculó tal como se describe en el texto, en base al volumen del caldo de cultivo acuoso del fermentador después de la inoculación.

La Fig. 8 muestra el consumo de azúcares, reportado en equivalentes de glucosa, en el tiempo.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION A menos que se defina lo contrario, todos los términos científicos y técnicos que se usan en la presente tienen el mismo significado como el entendido comúnmente por una persona con conocimiento ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de disputa, prevalecerá la presente solicitud junto con las definiciones pertinentes. Además, a menos que se requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Todas las publicaciones, patentes y otras referencias mencionadas en la presente descripción se incorporan como referencia en su totalidad para todo propósito .

A menos que se especifique de cualquier otra forma, cuando se usan las siguientes abreviaturas en la presente descripción, estas tendrán el significado indicado a continuación: ADH Alcohol deshidrogenasa ALS Acetolactato sintasa AQ Fracción acuosa BuO-COFA Ester (es) butílico(s) de ácido (s) grasos de aceite de maíz CALB Lipasa B de Candida antárctica COFA Ácido (s) graso (s) de aceite de maíz DDGS Granos secos de destilería con solubles DG Diglicérido (s) DHAD Dihidroxiácido deshidratasa EOR Fin de la prueba EtOH Etanol EtO-COFA Éster(es) etílico(s) de ácido(s) graso(s) de aceite de maíz FABE Este (es) butílico(s) de ácidos grasos FAEE Ester (es) etílico (s) de ácidos grasos FAME Ester (es) metílico (s) de ácidos grasos FFA Ácido (s) graso (s) libre (s) FOA Ácido fluoro-orótico HADH Alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo IBA Isobutanol i-BuOH Isobutanol i-BuO-COFA Ester (es) isobutílico ( s) de ácido (s) graso (s) de aceite de maíz i-BuO- Oleato de isobutilo oleato i-PrOH Isopropanol i-PrO-COFA Éster(es) isopropílico (s) de ácido(s) graso (s) de aceite de maíz ISPR Extracción del producto in situ KARI Cetoácido reductoisomerasa KivD Cetoisovalerato decarboxilasa MAG Monoacilglicérido (s) MeBOH 2-metil-l-butanol eBO-COFA Ester (es) 2-metil-l-butílico (s) de ácido (s) graso (s) de aceite de maíz MeOH Metanol MeO-COFA Ester (es) metílico (s) de ácido (s) graso (s) de aceite de maíz MG Monoglicérido (s) n-BuOH n-butanol OA Alcohol oleílico ORG Fracción orgánica PenOH 1-pentanol PenO-COFA Ester (es) 1-pentílico (s) de ácido (s) graso (s) de aceite de maíz PrOH 1-propanol PrO-COFA Éster(es) 1-propílico (s) de ácido(s) graso(s) de aceite de maíz SOFA Ácidos grasos de aceite de soja SSF Sacarificación y fermentación simultánea t-BuOH Alcohol terc-butílico TG Triglicérido (s) 3M3P 3 -Me-3 -pentanol Para definir adicionalmente esta invención se proporcionan en la presente descripción los siguientes términos y definiciones.

Como se usan en la presente descripción, se entenderá que los términos "comprende" , "que comprende" , "incluye" , "que incluye", "tiene", "que tiene", "contiene" o "que contiene" o cualquier otra variación de estos implican la inclusión de un entero o grupo de enteros mencionado, pero no la exclusión de cualquier otro entero o grupo de enteros. Por ejemplo, una composición, una mezcla, un proceso, un método, un artículo o un aparato que comprende una lista de elementos no se limita, necesariamente, solo a esos elementos, sino que puede incluir otros que no estén expresamente listados o sean inherentes a tal composición, mezcla, proceso, método, artículo o aparato. Además, a menos que se especifique expresamente en contrario, la disyunción se relaciona con un "o" incluyente y no con un "o" excluyente. Por ejemplo, una condición A o B se satisface mediante cualquiera de los siguientes criterios: A es verdadero (o actual) y B es falso (o no actual) , A es falso (o no actual) y B es verdadero (o actual) , y tanto A como B son verdaderos (o actuales) .

Además, los artículos indefinidos "un(a)" y "unos (as)" que preceden a un elemento o componente de la invención están previstos para ser no restrictivos con respecto a la cantidad de instancias, es decir, ocurrencias del elemento o componente Por consiguiente, "un (a)" o "unos (as)" deben interpretarse para incluir uno o al menos uno, y la forma singular de la palabra del elemento o componente incluye, además, el plural, a menos que el número, obviamente, indique que es singular.

El término "invención" o "presente invención" , tal como se usa en la presente descripción, es un término no limitante y no está previsto para referirse a cualquier modalidad individual de la invención particular, sino que abarca todas las modalidades posibles según se describe en la solicitud.

Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente" , que modifica la cantidad de un ingrediente o reactivo empleado en la invención, se refiere a la variación que puede producirse en la cantidad numérica, por ejemplo, a través de procedimientos de manejo de líquidos y de mediciones típicos usados para preparar concentrados o soluciones en el mundo real; a través de errores inadvertidos en estos procedimientos; a través de diferencias en la fabricación, procedencia o pureza de los ingredientes empleados para preparar las composiciones o llevar a cabo los métodos; y similares. El término "aproximadamente" abarca, además, cantidades que difieren debido a condiciones de equilibrio diferentes para una composición que resulta de una mezcla inicial particular. Estén o no modificadas por el término "aproximadamente" , las reivindicaciones incluyen equivalentes para las cantidades. En una modalidad, el término "aproximadamente" significa una cantidad dentro del 10 % del valor numérico reportado, alternativamente, dentro del 5 % del valor numérico reportado.

Como se usa en la presente descripción, "biomasa" se refiere a un producto natural que contiene polisacáridos hidrolizables que proporcionan azúcares fermentables que incluyen cualquier azúcar y almidón derivado de recursos naturales tales como maíz, caña, trigo, material celulósico o lignocelulósico y materiales que comprenden celulosa, hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos , disacáridos y/o monosacáridos y mezclas de estos. La biomasa puede comprender, además, componentes adicionales, tales como proteínas y/o lípidos. La biomasa puede derivarse de una sola fuente o puede comprender una mezcla derivada de más de una fuente. Por ejemplo, la biomasa puede comprender una mezcla de mazorcas del maíz y rastrojos del maíz, o una mezcla de pastos y hojas. La biomasa incluye, pero no se limita a, cultivos bioenergéticos , residuos agrícolas, residuos sólidos municipales, residuos sólidos industriales, sedimentos de la fabricación del papel, residuos orgánicos, residuos de azúcares, residuos forestales y de silvicultura. Los ejemplos de biomasa incluyen, pero no se limitan a, granos de maíz, mazorcas del maíz, residuos de cultivos, tales como cáscaras de maíz, rastrojos del maíz, hierbas, trigo, centeno, paja del trigo, cebada, paja de la cebada, heno, paja de arroz, pasto panizo, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, caña de azúcar, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de maderas, aserrín, matas y arbustos, vegetales, frutas, flores, estiércol y mezclas de estos. Por ejemplo, a partir de la biomasa se puede formar templa, jugo, molasa o hidrolizado por cualquier procesamiento conocido en la técnica para procesar la biomasa para fermentación, tales como molienda, tratamiento y/o licuación, y la biomasa comprende azúcar fermentable y puede comprender agua. Por ejemplo, la biomasa celulósica y/o lignocelulósica puede procesarse para obtener un hidrolizado que contiene azúcares fermentables por cualquier método conocido por una persona con experiencia en la técnica. Particularmente útil es un pretratamiento con bajo contenido de amoníaco, tal como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0031918A1 incorporada en la presente descripción como referencia. Para la sacarificación enzimática de biomasa celulósica y/o lignocelulósica se usa, típicamente, un conjunto de enzimas que descomponen la celulosa y hemicelulosa para producir un hidrolizado que contiene azúcares que incluyen glucosa, xilosa y arabinosa. (Las enzimas de sacarificación adecuadas para la biomasa celulósica y/o lignocelulósica se describen en Lynd, et al. (Microbiol . Mol. Biol . Rev. 66:506-577, 2002).

La templa, jugo, molasa o hidrolisado puede incluir la materia prima 12 y la suspensión de materia prima 16 tal como se describen en la presente descripción. Una corriente de alimentación acuosa se puede derivar o formar a partir de la biomasa por cualquier procesamiento conocido en la técnica para procesar la biomasa para fermentación, tal como molienda, tratamiento y/o licuación y comprende sustrato de carbono fermentable (por ejemplo, azúcar) y puede comprender agua. Una corriente de alimentación acuosa puede incluir materia prima 12 y suspensión de materia prima 16 tal como se describe en la presente descripción.

"Producción de la biomasa" , como se usa en la presente descripción, se refiere a los gramos de biomasa producidos (es decir, producción de biomasa celular) por gramo de sustrato de carbono producido.

Como se usa en la presente descripción, "materia prima" se refiere a un suministro en un proceso de fermentación; el suministro contiene una fuente de carbono fermentable con o sin sólidos no disueltos y, cuando corresponde, el suministro contiene la fuente de carbono fermentable antes o después de que se liberó la fuente de carbono fermentable del almidón o que se obtuvo a partir de la descomposición de los azúcares complejos por procesamiento adicional, tal como licuación, sacarificación u otro proceso. La materia prima incluye o se deriva de una biomasa. Las materias primas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, centeno, trigo, maíz, templa de maíz, caña, templa de caña, cebada, material celulósico, material lignocelulósico o mezclas de estos. Cuando se hace referencia a "aceite de materia prima" se entiende que el término abarca el aceite producido a partir de una materia prima determinada.

"Medio de fermentación" , como se usa en la presente descripción, se refiere a la mezcla de agua, azúcares, sólidos disueltos, opcionalmente , microorganismos que generan alcohol, producto de alcohol y todos los demás constituyentes del material conservados en el recipiente de fermentación en el cual se prepara el producto de alcohol por medio de la reacción de azúcares al alcohol, agua y dióxido de carbono (C02) producida por los microorganismos presentes. Oportunamente, tal como se usa en la presente descripción, el término "caldo de fermentación" puede usarse como sinónimo de "mezcla fermentada" .

"Fuente de carbono fermentable" o "sustrato de carbono fermentable" , como se usa en la presente descripción, se refiere a una fuente de carbono que los microorganismos descritos en la presente descripción pueden metabolizar para la producción de alcohol fermentativo. Las fuentes de carbono fermentable adecuadas incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos , tales como glucosa o fructosa; disacáridos, tales como lactosa o sacarosa; oligosacáridos ; polisacáridos , tales como almidón o celulosa; azúcares C5 , tales como xilosa y arabinosa; sustratos de un carbono que incluyen metano; y mezclas de estos. 4 "Azúcar fermentable" , como se usa en la presente descripción, se refiere a uno o más azúcares que los microorganismos descritos en la presente descripción pueden metabolizar para la producción de alcohol fermentativo.

"Recipiente de fermentación", como se usa en la presente descripción, se refiere al recipiente en el cual se realiza la reacción de fermentación para preparar un producto de alcohol, tal como butanol, a partir de azúcares.

"Recipiente de licuación", como se usa en la presente descripción, se refiere al recipiente en el cual se realiza la licuación. La licuación es el proceso en el cual se liberan oligosacáridos a partir de la materia prima. En algunas modalidades en las cuales la materia prima es maíz, los oligosacáridos se liberan del contenido de almidón de maíz durante la licuación.

"Recipiente de sacarificación" , como se usa en la presente descripción, se refiere al recipiente en el cual se realiza la sacarificación (es decir, la descomposición de oligosacáridos en monosacáridos) . Cuando la fermentación y la sacarificación se producen simultáneamente, el recipiente de sacarificación y el recipiente de fermentación pueden ser el mismo recipiente.

"Azúcar", como se usa en la presente descripción, se refiere a oligosacáridos, disacáridos, monosacáridos y/o mezclas de estos. El término "sacárido" incluye, además, carbohidratos que incluyen almidones, dextranos, glicógenos, celulosa, pentosanos, así como azúcares.

Como se usa en la presente descripción, "enzima de sacarificación" se refiere a una o más enzimas capaces de hidrolizar polisacáridos y/u oligosacáridos , por ejemplo, enlaces alfa-1, 4-glucosídicos de glicógeno o almidón. Las enzimas de sacarificación pueden incluir enzimas capaces de hidrolizar materiales celulósicos y también lignocelulósicos .

"Sólidos no disueltos", como se usa en la presente descripción, se refiere a porciones no fermentables de materia prima, por ejemplo, germen, fibra y gluten. Por ejemplo, las porciones no fermentables de materia prima incluyen la porción de materia prima que se mantiene como un sólido y puede absorber líquido del caldo de fermentación.

Granos secos de destilería con solubles (DDGS, por sus siglas en inglés) , como se usa en la presente descripción, se refiere a un coproducto o subproducto de una fermentación de una materia prima o biomasa (por ejemplo, la fermentación de un grano o mezcla de granos que genera un producto de alcohol) . En algunas modalidades, DDGS puede referirse, además, a un producto de alimento para animales producido a partir de un proceso de preparación de un producto de alcohol (por ejemplo, butanol, isobutanol, etc.) "Producto de alcohol", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier alcohol producido por un microorganismo en un proceso de fermentación en el cual se usa biomasa como una fuente de sustrato de carbono fermentable . Los productos de alcohol incluyen, pero no se limitan a, alcoholes alquílieos de Ci a C8. En algunas modalidades, los productos de alcohol son alcoholes alquílieos de C2 a C8. En otras modalidades, los productos de alcohol son alcoholes alquílicos de C2 a C5. Se apreciará que los alcoholes alquílicos de Ci a Ce incluyen, pero no se limitan a, metanol, etanol, propanol, butanol y pentanol . De manera similar, los alcoholes alquílicos de C2 a C8 incluyen, pero no se limitan a, etanol, propanol, butanol y pentanol. Además, en la presente descripción, el término "alcohol" se usa con referencia a un producto de alcohol.

"Butanol" , como se usa en la presente descripción, se refiere específicamente a los isómeros de butanol 1-butanol (1-BuOH) , 2-butanol (2-BuOH) , terc-butanol (t-BuOH) y/o isobutanol (iBuOH o i-BuOH o I-BUOH, conocidos, además, como 2 -metil-1-propanol ) , ya sea individualmente o como mezclas de estos. Oportunamente, cuando se refieren a los ásteres de butanol, los términos "ésteres butílicos" y "esteres de butanol" pueden usarse indistintamente.

"Propanol", como se usa en la presente descripción, se refiere a los isómeros de propanol isopropanol o 1-propanol.

"Pentanol", como se usa en la presente descripción, se refiere a los isómeros de pentanol 1-pentanol, 3-metil-l-butanol, 2-metil-l-butanol, 2 , 2-dimetil-l-propanol, 3-pentanol, 2-pentanol, 3-metil-2-butanolo 2 -metil-2-butanol .

El término "equivalente de alcohol" , como se usa en la presente descripción, se refiere al peso del alcohol que se obtendría por la hidrólisis perfecta de un éster de alcohol y la recuperación posterior del alcohol a partir de una cantidad de éster de alcohol.

El término "título de la fase acuosa", como se usa en la presente descripción, se refiere a la concentración de un alcohol particular (por ejemplo, butanol) en el caldo de fermentación.

El término "título eficaz", como se usa en la presente descripción, se refiere a la cantidad total de un alcohol específico (por ejemplo, butanol) producido por la fermentación o alcohol equivalente al éster de alcohol producido por la esterificación por litro del medio de fermentación. Por ejemplo, el título eficaz del butanol en una unidad de volumen de una fermentación incluye: (i) la cantidad de butanol en el medio de fermentación; (ii) la cantidad de butanol recuperada del extractante orgánico; (iii) la cantidad de butanol recuperada de la fase de gas, si se usa arrastre con gas; y (iv) el equivalente de alcohol del éster butílico en la fase orgánica o acuosa.

El término "índice eficaz", como se usa en la presente descripción, es el título eficaz dividido por el tiempo de fermentación .

El término "producción eficaz", como se usa en la presente descripción, es la cantidad total de gramos de producto de alcohol producidos por gramo de glucosa consumida.

"Extracción del producto in situ (ISPR)", como se usa en la presente descripción, se refiere a la extracción selectiva de un producto de fermentación específico a partir de un proceso biológico, tal como fermentación, para controlar la concentración del producto en el proceso biológico a medida que el producto se genera.

"Extractante" o "extractante para ISPR", como se usa en la presente descripción, se refiere a un disolvente orgánico usado para extraer cualquier producto de alcohol tal como butanol, o usado para extraer cualquier producto de áster de alcohol producido por un catalizador a partir de un producto de alcohol y un ácido carboxílico o lípido. Oportunamente, como se usa en la presente descripción, el término "disolvente" puede usarse como sinónimo de "extractante" . Para los procesos descritos en la presente descripción, los extractantes son inmiscibles en agua.

Los términos "inmiscible en agua" o "insoluble" se refieren a un componente químico, tal como un extractante o disolvente, que no puede mezclarse con una solución acuosa tal como un caldo de fermentación de manera que se forme una fase líquida.

El término "fase acuosa", como se usa en la presente descripción, se refiere a la fase acuosa de una mezcla bifásica obtenida por el contacto de un caldo de fermentación con un extractante orgánico inmiscible en agua. En una modalidad de un proceso descrito en la presente descripción que incluye la extracción fermentativa, el término "caldo de fermentación" se refiere específicamente a la fase acuosa en la extracción fermentativa bifásica.

El término "fase orgánica" , como se usa en la presente descripción, se refiere a la fase no acuosa de una mezcla bifásica obtenida por el contacto de un caldo de fermentación con un extractante orgánico inmiscible en agua.

El término "ácido carboxílico" , como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier compuesto orgánico con la fórmula química general -C00H, en la cual un átomo de carbono se une a un átomo de oxígeno por un enlace doble para elaborar un grupo carbonilo (-C=0) y a un grupo hidroxilo (-0H) por un enlace simple. Un ácido carboxílico puede estar en la forma del ácido carboxílico protonado, en la forma de una sal de un ácido carboxílico (por ejemplo, una sal de amonio, sodio o potasio) o como una mezcla de ácido carboxílico protonado y sal de un ácido carboxílico. El término ácido carboxílico puede describir una sola especie de sustancia química (por ejemplo, ácido oleico) o una mezcla de ácidos carboxílieos tal como se puede producir, por ejemplo, por la hidrólisis de ésteres de ácidos grasos derivados de biomasa o triglicéridos , diglicéridos , monoglicéridos y fosfolípidos .

El término "ácido graso" , como se usa en la presente descripción, se refiere a un ácido carboxílico (por ejemplo, ácido monocarboxílico alifático) que tiene de C a C28 átomos de carbono (más comúnmente, de C12 a C2 átomos de carbono), saturado o no saturado. Los ácidos grasos pueden ser, además, ramificados o no ramificados. Los ácidos grasos pueden derivarse de o estar contenidos en forma esterificada en una grasa, aceite o cera animal o vegetal. Los ácidos grasos pueden producirse naturalmente en la forma de glicéridos en grasas y aceites grasos o pueden obtenerse por hidrólisis de grasas o por síntesis. El término ácido graso puede describir una sola especie química o una mezcla de ácidos grasos. Además, el término ácido graso abarca ácidos grasos libres.

El término "alcohol graso" , como se usa en la presente descripción, se refiere a un alcohol que tiene una cadena alifática de C4 a C22 átomos de carbono, saturada o insaturada .

El término "aldehido graso", como se usa en la presente descripción, se refiere a un aldehido que tiene una cadena alifática de C4 a C22 átomos de carbono, saturada o insaturada.

El término "amida grasa" , como se usa en la presente descripción, se refiere a una amida que tiene una cadena alifática larga de C4 a C2? átomos de carbono, saturada o insaturada .

El término "éster graso" , como se usa en la presente descripción, se refiere a un éster que tiene una cadena alifática larga de C4 a C22 átomos de carbono, saturada o insaturada .

"Aceite natural", como se usa en la presente descripción, se refiere a lípidos obtenidos de plantas (por ejemplo, biomasa) o animales. "Aceite derivado de plantas", como se usa en la presente descripción, se refiere a lípidos obtenidos, particularmente, de plantas. Oportunamente, "lípidos" puede usarse como sinónimo de "aceite" y "acilglicéridos" . Los aceites naturales incluyen, pero no se limitan a, aceite de sebo, maíz, cañóla, triglicéridos cápricos/caprílieos , ricino, coco, semilla de algodón, pescado, jojoba, lardo, linaza, de pata de buey, de oiticica, palma, cacahuate, semilla de colza, arroz, cártamo, soja, girasol, tung, jatrofa y mezclas de aceites vegetales.

El término "separación", como se usa en la presente descripción, es sinónimo de "recuperación" y se refiere a extraer un compuesto químico de una mezcla inicial para obtener el compuesto con una mayor pureza o a una concentración más alta que la pureza o concentración del compuesto en la mezcla inicial.

El término "ruta biosintética del butanol" , como se usa en la presente descripción, se refiere a una ruta enzimática para producir 1-butanol, 2-butanol o isobutanol.

El término "ruta biosintética del 1-butanol", como se usa en la presente descripción, se refiere a una ruta enzimática para producir 1-butanol a partir de acetil-coenzima A (acetil-CoA) .

El término "ruta biosintética del 2-butanol", como se usa en la presente descripción, se refiere a una ruta enzimática para producir 2-butanol a partir de piruvato.

El término "ruta biosintética del isobutanol", como se usa en la presente descripción, se refiere a una ruta enzimática para producir isobutanol a partir de piruvato.

El término "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que es capaz de expresarse como una proteína específica, opcionalmente, que incluye secuencias reguladoras antes (secuencias no codificantes 5') y después (secuencias no codificantes 3') de la secuencia codificante. "Gen nativo" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo (es decir, gen nativo modificado o que se obtiene de otra fuente) que comprende secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de fuentes diferentes o secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de la misma fuente, pero que están organizadas en una forma diferente a la encontrada en la naturaleza. El "gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su lugar natural en el genoma de un organismo. Un "gen foráneo" o "gen heterólogo" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente como un gen nativo en el organismo huésped, pero que se introduce en el organismo huésped por transferencia de genes. Los genes foráneos pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo o genes quiméricos.

Como se usa en la presente descripción, el término "región codificante" se refiere a una secuencia de ADN que codifica para una secuencia específica de aminoácido. Las "secuencias reguladoras adecuadas" se refieren a las secuencias de nucleótidos que están ubicadas corriente arriba (secuencias no codificantes 5'), dentro, o corriente abajo (secuencias no codificantes 3') de una secuencia codificante y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líderes de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitio de procesamiento del ARN, sitio de unión a efectores y estructura de tallo-lazo.

El término "optimizado por codón" , en lo que se refiere a genes o regiones codificantes de moléculas de ácido nucleico para transformación de diversos huéspedes, se refiere a la alteración de codones en el gen o regiones codificantes de las moléculas de ácido nucleico para reflejar el uso de codones típicos del organismo huésped sin alterar el polipéptido codificado por el ADN. La optimización por codón está dentro del conocimiento común en la técnica.

El término "polinucleótido" pretende abarcar un solo ácido nucleico, así como varios ácidos nucleicos, y se refiere a un constructo o a una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, AR mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp) . Como se usa en la presente descripción, un "gen" es un polinucleótido. Un polinucleótido puede contener la secuencia del nucleotido de la secuencia de ADNc de longitud completa o un fragmento de este, que incluye las secuencias 5' y 3' no traducidas y las secuencias codificantes. El polinucleótido puede componerse de cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado (por ejemplo, ADN heterólogo) Por ejemplo, los polinucleótidos pueden componerse de ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias , ARN monocatenario y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias , moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, más típicamente, bicatenarios o una mezcla de regiones monocatenarias o bicatenarias. El "polinucleótido" abarca formas química, enzimática o metabólicamente modificadas.

Una secuencia de polinucleótido puede mencionarse como "aislado", el que se ha eliminado de su ambiente de origen. Por ejemplo, un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido o un fragmento de polipéptido que tiene actividad de dihidroxiácido deshidratasa contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huéspedes heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o prácticamente) en solución. Los ácidos o nucleicos polinucleótidos aislados de conformidad con la presente invención incluyen, además, las moléculas producidas sintéticamente. Un fragmento del polinucleótido aislado en la forma de un polímero de ADN puede comprender uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

Como se usa en la presente descripción, el término "polipéptido" está previsto para abarcar un "polipéptido" singular y un el plural "polipéptidos" y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente con enlace amídico (conocidos, además, como enlace de péptidos) . El término "polipéptido" se refiere a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. De este modo, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos , "proteína", "cadena de aminoácido" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de "polipéptido" y el término "polipéptido" puede usarse en vez de, o indistintamente con cualquiera de estos términos. Un polipéptido puede derivarse de una fuente biológica natural o ser producido por tecnología recombinante , pero no es, necesariamente, traducido de una secuencia de ácido nucleico designado. Puede generarse de cualquier modo inclusive mediante síntesis química.

Por un polipéptido "aislado" o un fragmento, variante, o derivado de este se entiende un polipéptido que no se encuentra en su medio natural . No se requiere ningún nivel de purificación particular. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede eliminarse de su ambiente natural o de origen. Los péptidos producidos recombinantemente y proteínas expresadas en células huéspedes se consideran aislados para los propósitos de la invención, al igual que los polipéptidos nativos o recombinantes que se separaron, fraccionaron o purificaron parcial o prácticamente por cualquiera técnica adecuada.

Como se usa en la presente descripción, "microorganismo recombinante" se refiere a microorganismos tales como bacterias o levaduras modificados por el uso de técnicas de ADN recombinante, por ejemplo, por medio del diseño por ingeniería genética de una célula huésped de manera que comprenda una ruta biosintética tal como una ruta biosintética para producir un alcohol, tal como butanol .

La presente invención satisface la necesidad de métodos de fermentación extractiva alternativos para los cuales no es necesario dividir el producto de alcohol entre el medio de fermentación y el extractante para ISPR como un medio para reducir el efecto tóxico del producto de alcohol (tal como butanol) en el microorganismo. Además, satisface la necesidad de reducir la degradación del coeficiente de partición de un extractante para ISPR del producto de fermentación para lo cual proporciona métodos para producir alcohol, tal como butanol, en el cual el producto de alcohol se convierte en ésteres de alcohol que pueden ser menos tóxicos para el microorganismo, y en donde se produce una reducción concomitante en la degradación del coeficiente de partición de un extractante del producto de fermentación de manera que la producción de alcohol es mayor (tal como una combinación de alcohol libre y ésteres de alcohol que se pueden convertir otra vez en alcohol después de la separación del medio de fermentación). Además, la presente invención ofrece soluciones para las desventajas de los procesos de extracción de productos de alcohol alternativos de manera que los métodos de la presente descripción pueden combinarse con procesos existentes (por ejemplo, extracción de sólidos) para incrementar la extracción del producto en una forma económica y ambientalmente favorable. Como tal, la presente invención proporciona otras ventajas relacionadas, tal como será evidente a partir de la descripción de las modalidades incluidas más adelante.

La presente invención proporciona métodos para eliminar alcohol de un medio de fermentación por la esterificación del alcohol con ácido carboxílico y la extracción del éster de alcohol resultante del medio de fermentación, después de lo cual el alcohol puede recuperarse a partir del éster de alcohol. El ácido puede añadirse al medio de fermentación directamente como ácido graso libre o puede derivarse de aceite. La presente invención proporciona, además, métodos para eliminar o reducir aceite a partir de un proceso de fermentación de alcohol mediante la hidrolización del aceite derivado de una materia prima en ácido carboxílico que puede usarse para la esterificación de alcohol y/o ser útil como un extractante para ISPR o un componente del extractante para ISPR para extraer el éster de alcohol.

Típicamente, ha sido necesario reducir la cantidad de agua presente en un sistema de reacción o usar un sistema de reacción que emplea solamente uno o más disolventes no acuosos para la esterificación de alcoholes por medio de ácidos carboxílicos cuando se catalizan por medio de enzimas, tales como lipasas. En la presente descripción se describe el hallazgo sorprendente de que las enzimas lipasas pueden catalizar eficazmente la esterificación de un producto de alcohol con un ácido carboxílico durante la fermentación de una fuente de carbono fermentable para producir producto de alcohol. Además, en la presente descripción se describe el hallazgo sorprendente de que la esterificación de un producto de alcohol con un ácido carboxílico durante una fermentación puede proporcionar mejoras en el rendimiento de la fermentación. Por ejemplo, por medio de la captación del producto de alcohol (por ejemplo, butanol) producido en forma de éster se reduce eficazmente la concentración del producto de alcohol en la fase acuosa y, por lo tanto, se mitigan los efectos tóxicos del producto de alcohol en el consumo de glucosa y producción del producto.

La presente invención se describirá con referencia a las figuras. La Fig. 1 ilustra un diagrama de flujo del proceso ilustrativo para la producción de alcohol fermentativo, tal como etanol o butanol, de conformidad con una modalidad de la presente invención. Tal como se muestra, una materia prima 12 puede introducirse por una entrada en un recipiente de licuación 10 y licuarse para producir una suspensión de materia prima 16. La materia prima 12 contiene polisacáridos hidrolizables que suministran un sustrato de carbono fermentable (por ejemplo, azúcar fermentable tal como glucosa) y puede ser una biomasa tal como, pero sin limitarse a, centeno, trigo, caña o maíz o, de cualquier otra forma, puede derivarse de una biomasa. En algunas modalidades, la materia prima 12 puede ser uno o más componentes de una biomasa fraccionada y, en otras modalidades, la materia prima 12 puede ser una biomasa molida no fraccionada. En algunas modalidades, la materia prima 12 puede ser maíz, tal como granos de maíz no fraccionados, molidos en seco y las partículas no disueltas pueden incluir germen, fibra y gluten. Los sólidos no disueltos son porciones no fermentables de materia prima 12. Para los propósitos de la presente descripción con referencia a las modalidades ilustradas en las figuras, la materia prima 12 se describirá, frecuentemente, como maíz no fraccionado molido constituyente en el cual no se separaron los sólidos no disueltos. Sin embargo, debería comprenderse que los métodos y sistemas ilustrativos descritos en la presente descripción pueden modificarse para materias primas diferentes fraccionadas o no, tal como será evidente para una persona con experiencia en la técnica. Además, tal como puede apreciar una persona con experiencia en la técnica, si se maximiza el contenido de materia prima (por ejemplo, contenido de maíz) se puede maximizar el contenido de azúcar además del título del producto. En algunas modalidades, la materia prima 12 puede ser maíz con alto contenido oleico, de manera que el aceite de maíz derivado de ella es un aceite de maíz con alto contenido oleico en el cual el contenido de ácido oleico es de al menos aproximadamente 55 % en peso. En algunas modalidades, el contenido de ácido oleico en el aceite de maíz con alto contenido oleico puede ser de hasta aproximadamente 65 % en peso, en comparación con el contenido de ácido oleico en el aceite de maíz normal que es de aproximadamente 24 % en peso. El aceite con alto contenido oleico puede proporcionar algunas ventajas cuando se usa en los métodos de la presente invención, ya que la hidrólisis del aceite proporciona ácidos grasos libres que tienen un contenido de ácido oleico alto para el contacto con un caldo de fermentación.

El proceso de licuación de la materia prima 12 implica la hidrólisis de polisacáridos en la materia prima 12 en azúcares que incluyen, por ejemplo, dextrinas y oligosacáridos , y es un proceso convencional. Puede usarse cualquier proceso de licuación conocido, así como el recipiente de licuación correspondiente, usado normalmente en la industria que incluye, pero no se limita a, el proceso ácido, el proceso ácido-enzimático o el proceso enzimático. Tales procesos pueden usarse solos o en combinación. En algunas modalidades puede usarse el proceso enzimático y una enzima apropiada 14, por ejemplo, alfa-amilasa se introduce por una entrada en el recipiente de licuación 10. Además, en el recipiente de licuación 10 puede introducirse agua. En algunas modalidades, una enzima de sacarificación, por ejemplo, glucoamilasa puede introducirse, además, en el recipiente de licuación 10. En otras modalidades puede introducirse, además, una lipasa en el recipiente de licuación 10 para catalizar la conversión de uno o más componentes del aceite en ácidos grasos libres.

La suspensión de materia prima 16 producida por medio de la licuación de la materia prima 12 comprende sustrato de carbono fermentable (por ejemplo, azúcar) , aceite y sólidos no disueltos derivados de la materia prima. La suspensión de materia prima 16 puede descargarse desde una salida del recipiente de licuación 10. En algunas modalidades, la materia prima 12 es maíz o granos de maíz y, por lo tanto, la suspensión de materia prima 16 es una suspensión de templa de maíz. En algunas modalidades, la materia prima 12 es una materia prima lignocelulósica y, por lo tanto, la suspensión de materia prima 16 puede ser un hidrolisado lignocelulósico . En algunas modalidades, la materia prima 12 es caña de azúcar .

La suspensión de materia prima 16 se introduce en un recipiente de fermentación 30 junto con un microorganismo 32.

El recipiente de fermentación 30 se configura para fermentar la suspensión 16 para producir alcohol. Particularmente, el microorganismo 32 metaboliza el azúcar fermentable en la suspensión 16 y excreta un producto de alcohol. El microorganismo 32 se selecciona del grupo de bacterias, cianobacterias , hongos filamentosos y levaduras. En algunas modalidades, el microorganismo 32 puede ser una bacteria, tal como E. coli. En algunas modalidades, el microorganismo 32 puede ser un microorganismo recombinante fermentativo. La suspensión puede incluir azúcar, por ejemplo, en la forma de oligosacáridos y agua y, en algunas modalidades, puede comprender menos de aproximadamente 20 g/1 de glucosa monomérica, menos de aproximadamente 10 g/1 o menos de aproximadamente 5 g/1 de glucosa monomérica. La metodología adecuada para determinar la cantidad de glucosa monomérica es muy conocida en la técnica. Tales métodos adecuados conocidos en la técnica incluyen HPLC.

En algunas modalidades, la suspensión 16 se expone a un proceso de sacarificación para descomponer los azúcares complejos (por ejemplo, oligosacáridos) en la suspensión 16 en monosacáridos que el microorganismo 32 puede metabolizar fácilmente. Puede usarse cualquier proceso de sacarificación conocido usado normalmente en la industria que incluye, pero no se limita a, el proceso ácido, el proceso ácido-enzimático o el proceso enzimático. En algunas modalidades, la sacarificación y fermentación simultánea (SSF, por sus siglas en inglés) se puede producir dentro del recipiente de fermentación 30 tal como se muestra en la Fig. 1. En algunas modalidades, una enzima 38, tal como glucoamilasa, puede introducirse por una entrada en el recipiente de fermentación 30 para descomponer el almidón o los oligosacáridos en glucosa que puede ser metabolizada por el microorganismo 32.

El ácido carboxílico 28 y/o el aceite natural 26 se introducen en el recipiente de fermentación 30 junto con un catalizador 42. El catalizador 42 se puede introducir antes, después o al mismo tiempo que la enzima 38. Por lo tanto, en algunas modalidades, la adición de enzima 38 y catalizador 42 puede ser gradual (por ejemplo, catalizador 42, después enzima 38 o viceversa) o prácticamente simultánea (es decir, exactamente en el mismo tiempo que demora una persona o máquina para realizar la adición en una pasada o una enzima/catalizador inmediatamente después del otro catalizador/enzima en el tiempo que demora una persona o máquina para realizar la adición en dos pasadas) . El catalizador 42 puede esterificar el producto de alcohol con ácido carboxílico 28 para formar un éster de alcohol. Por ejemplo, en el caso de la producción de butanol, el catalizador 42 puede esterificar butanol con ácido carboxílico 28 para formar un éster butílico.

En el caso en que el aceite natural 26 se suministre al recipiente de fermentación 30, al menos una porción de los acilglicéridos en aceite 26 se pueden hidrolizar en ácido carboxílico 28 cuando el aceite 26 se pone en contacto con el catalizador 42. La composición de ácido/aceite resultante de la hidrólisis del aceite 26 es, típicamente, al menos aproximadamente 17 % en peso de ácido carboxílico 28 (como ácidos grasos libres). En algunas modalidades, la composición de ácido/aceite resultante de la hidrólisis del aceite 26 es al menos aproximadamente 20 % en peso de ácido carboxílico, al menos aproximadamente 25 O, "O en peso de ácido carboxílico, al menos aproximadamente 30 % en peso de ácido carboxílico, al menos aproximadamente 35 % en peso de ácido carboxílico. al menos aproximadamente 40 o o en peso de ácido carboxílico, al menos aproximadamente 45 % en peso de ácido carboxílico, al menos aproximadamente 50 o, o en peso de ácido carboxílico, al menos aproximadamente 55 0, 0 en peso de ácido carboxílico, al menos aproximadamente 60 g, o en peso de ácido carboxílico, al menos aproximadamente 65 o, *S en peso de ácido carboxílico, al menos aproximadamente 70 o, o en peso de ácido carboxílico, al menos aproximadamente 75 Q, o en peso de ácido carboxílico, al menos aproximadamente 80 % en peso de ácido carboxílico, al menos aproximadamente 85 % en peso de ácido carboxílico, al menos aproximadamente 90 ¾ en peso de ácido carboxílico, al menos aproximadamente 95 % en peso de ácido carboxílico o al menos aproximadamente 99 o. 0 en peso de ácido carboxílico .

En algunas modalidades, la composición de ácido/aceite resultante incluye monoglicéridos y/o diglicéridos de la hidrólisis parcial de los acilglicéridos en el aceite. En algunas modalidades, la composición de ácido/aceite resultante incluye glicerol, un subproducto de la hidrólisis del acilglicérido . En algunas modalidades adicionales, la composición de ácido/aceite resultante incluye lisofosfolípidos de la hidrólisis parcial de fosfolípidos en el aceite.

En algunas modalidades, después de la hidrólisis de los acilglicéridos en aceite 26, el contenido de acilglicéridos restantes en el aceite 26 es de aproximadamente 0 % en peso a por lo menos aproximadamente 2 % en peso de la composición del caldo de fermentación. En algunas modalidades adicionales, después de la hidrólisis de los acilglicéridos en aceite 26, el contenido de acilglicéridos restantes en el aceite 26 es de al menos aproximadamente 0.5 % en peso de la composición del caldo de fermentación. Por lo tanto, en algunas modalidades, los acilglicéridos del aceite 26 se pueden hidrolizar catalíticamente a ácido carboxílico 28 con catalizador 42, y el catalizador 42 puede esterificar, además, ácido carboxílico 28 con el producto de alcohol. En algunas modalidades, un segundo catalizador (no se muestra) puede introducirse en el recipiente de fermentación para la hidrólisis de los acilglicéridos. Además, los acilglicéridos en el aceite derivado de la materia prima 12 y presentes en la suspensión 16 pueden hidrolizarse a ácido carboxílico 28' (ver, por ejemplo, la modalidad de la Fig. 3) . En algunas modalidades, la concentración del ácido carboxílico (tal como ácido graso) en el recipiente de fermentación excede el límite de solubilidad en la fase acuosa y deriva en la producción de una mezcla de fermentación de dos fases que comprende una fase orgánica y una fase acuosa. En algunas modalidades, típicamente, la concentración de ácidos carboxílicos en el caldo de fermentación no es mayor que aproximadamente 0.8 g/1 y está limitada por la solubilidad del ácido carboxílico en el caldo de cultivo.

En algunas modalidades, el catalizador 42 y el segundo catalizador, si se usa, puede ser una o más enzimas, por ejemplo, enzimas lipasas. En algunas modalidades, el catalizador 42 puede ser una o más enzimas, por ejemplo, enzimas hidrolasa, tal como enzimas lipasa. Las enzimas lipasa usadas pueden derivarse de cualquier fuente que incluye, por ejemplo, Absidia, Achromobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Alternaría, Aspergillus, Achromobacter, Aureobasidium, Bacillus, Beauveria, Brochothrix, Candida, Chromobacter, Coprinus, Fusarium, Geotricu , Hansenula, Humicola, Hyphozyma, Lactobacillus, Metarhiziu , Mucor, Nectria, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Pseudomonas, Rhizoctonia, Rhizomucor, Rhizopus, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Sus, Sporobolomyces, Thermomyces, Thiarosporella, Trichoderma, Verticillium y/o una cepa de Yarrowia . En un aspecto preferido, la fuente de la lipasa se selecciona del grupo que consiste en Absidia blakesleena, Absidia corymbifera, Achromobacter iophagus, Alcaligenes sp., Alternaría brassiciola, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus tubingensis, Aureobasidium pullulans, Bacillus pumilus, Bacillus strearothermophilus, Bacillus subtilis, Brochothrix thermosohata, Candida cylindracea (Candida rugosa) , Candida paralipolytica, lipasa A de Candida antárctica, lipasa B de Candida antárctica, Candida ernobii, Candida deformans, Chromobacter viscosum, Coprinus cinerius, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium solani pisi, Fusarium roseum culmorum, Geotricum penicillatum, Hansenula anómala, Hu icola brevispora, Humicola brevis var. thermoidea, Humicola insolens, Lactobacillus curvatus, Rhizopus oryzae, Penicillium cyclopium, Penicillium crustosum, Penicillium expansum, Penicillium sp. I, Penicillium sp . II, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas cepacia (sin. Burkholderia cepacia) , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fragi, Pseudomonas maltophilia, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas mephitica lipolytica, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas plantari, Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri y Pseudomonas wisconsinensis, Rhizoctonia solani , Rhizomucor miehei, Rhizopus japonicus, Rhizopus microsporus, Rhizopus nodosus, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Saccharomyces cerevisiae, Sporobolomyces shibatanus, Sus scrofa, Thermomyces lanuginosus (anteriormente, Humicola lanuginose) , Thiarosporella phaseolina, Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei y Yarrowia lipolytica . En otro aspecto preferido, la lipasa se selecciona del grupo que consiste en lipasa de Thermomcyces lanuginosus, lipasa de Aspergillus sp . , lipasa de Aspergillus niger, lipasa de Aspergillus tubingensis, lipasa B de Candida antárctica, lipasa de Pseudomonas sp . , lipasa de Penicillium roqueforti, lipasa de Penicilliu camembertii , lipasa de Mucor javanicus, lipasa de Burkholderia cepacia, lipasa de Alcaligenes sp., lipasa de Candida rugosa, lipasa de Candida parapsilosis, lipasa de Candida deformans, lipasas A y B de Geotrichum candidum, lipasa de Neurospora crassa, lipasa de Nectria haematococca, lipasa de Fusarium heterosporum, lipasa de Rhizopus delemar, lipasa de Rhizomucor miehei, lipasa de Rhizopus arrhizus y lipasa de Rhizopus oryzae. Las preparaciones de lipasa comerciales adecuadas como catalizador 42 incluyen, pero no se limitan a, Lipolase® 100L, Lipex® 100L, Lipoclean® 2000T, Lipozyme® CALB L, Novozyme® CALA L y Palatase 20000L, disponibles de Novozymes, o Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Mucor miehei, páncreas de cerdo, Candida cylindracea, Candida rugosa, Rhizopus niveus, Candida antárctica, Rhizopus arrhizus o Aspergillus disponibles de SigmaAldrich .

Las fosfolipasas son enzimas que hidrolizan los enlaces éster de fosfolípidos , pero muchas fosfolipasas pueden hidrolizar, además, triglicéridos, diglicéridos y monoglicéridos (actividad de acil hidrolasa de lípidos (LAH) ) . Como se usa en la presente descripción, el término "fosfolipasa" abarca enzimas que tienen cualquier actividad de fosfolipasa, por ejemplo, escisión de un enlace éster glicerolfosfato (que cataliza la hidrólisis de un enlace éster glicerolfosfato) , por ejemplo, en un aceite, tal como un aceite crudo o un aceite vegetal . La actividad de fosfolipasa de la invención puede generar una base fosforilada extraíble con agua y un diglicérido. La actividad de fosfolipasa puede comprender una actividad de fosfolipasa C (PLC) ; una actividad de PI-PLC, una actividad de fosfolipasa A (PLA) tal como una actividad de fosfolipasa Al o fosfolipasa A2 ; una actividad de fosfolipasa B (PLB) tal como una actividad de fosfolipasa Bl o fosfolipasa B2 que incluye actividad de lisofosfolipasa (LPL) y/o actividad de lisofosfolipasa-transacilasa (LPT A) ; una actividad de fosfolipasa D (PLD) tal como una actividad de fosfolipasa DI o una actividad de fosfolipasa D2 ; y/o una actividad de patatina o cualquier combinación de estas.

El término "fosfolipasa" abarca, además, enzimas que tienen actividad de lisofosfolipasa, en donde los dos sustratos de esta enzima son 2-lisofosfatidilcolina y H20, y en donde sus dos productos son glicerofosfocolina y carboxilato. Las enzimas fosfolipasa Al (PLA1) eliminan el ácido graso de la posición 1 para producir ácido graso libre y l-liso-2-acilfosfolípido . Las enzimas fosfolipasa A2 (PLA2) eliminan el ácido graso de la posición 2 para producir ácido graso libre y l-acil-2-lisofosfolípido . Las enzimas PLA1 y PLA2 pueden ser intra o extracelulares , unidas por membranas o solubles. Las enzimas fosfolipasa C (PLC) eliminan la porción fosfato para producir 1,2 diacilglicerol y un éster de fosfato. Las enzimas fosfolipasa D (PLD) producen 1, 2-diacilglicerofosfato y un grupo de base. Una fosfolipasa útil en la presente invención puede obtenerse a partir de diversas fuentes biológicas, por ejemplo, pero sin limitarse a, especies fúngicas filamentosas dentro del género Fusariu , tal como una cepa de F. culmorum, F. heterosporum, F. solani o F. oxysporum; o una especie fúngica filamentosa dentro del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. Además, en la presente invención son útiles las variantes de fosfolipasa de Thermomyces lanuginosus tal como el producto comercial Lecitase® Ultra (Novozymes A'S, Dinamarca) . Una o más fosfolipasas se pueden aplicar como polvo liofilizado, inmovilizadas o en solución acuosa .

Un alcohol (por ejemplo, butanol) que se produce por la fermentación de uno o más azúcares fermentables puede convertirse en un éster de ácido carboxílico por medio de una reacción catalizada por enzimas, en donde el ácido carboxílico se esterifica con el alcohol. Las enzimas tales como lipasa, fosfolipasa y lisofosfolipasa pueden catalizar esta reacción; sin embargo, estas enzimas se pueden inactivar debido a uno o más factores que incluyen, pero no se limitan a, rozamiento hidrodinámico o inactivación en interfases gas-líquido y líquido- líquido . En las fermentaciones en las cuales los oligosacáridos se convierten, además, en uno o más azúcares fermentables, la enzima que convierte oligosacáridos en azúcares fermentables (por ejemplo, glucoamilasa) puede inactivarse, además, por medio de uno o más de estos mismos factores .

La inactivación de enzimas en una interfase gas- líquido (por ejemplo, se puede producir en la interfase de burbujas con el caldo de fermentación) que resulta de la aireación del caldo de fermentación y/o se produce por la evolución de dióxido de carbono gaseoso en el caldo de cultivo durante la fermentación de uno o más azúcares fermentables es muy conocida en la técnica. La inactivación de la lisozima de huevo blanco de gallina y lipasa de Thermomyces lanuginosus producidas en Aspergillus oryzae (Novozymes Lipolase®) se observó en la interfase gas-líquido en tres configuraciones de reactores diferentes: columna de burbujas, recipiente agitado con deflectores (sin aireación por inyección de gas) y película descendente (Ghadge, et al., Chem. Eng. Sci. 58:5125-5134, 2003). El mecanismo de inactivación de la lipasa de Thermomyces lanuginosus (producida en Aspergillus oryzae; Novozymes Lipolase 100L®) en la interfase gas-líquido en un reactor de tanque agitado con deflectores (sin aireación por inyección de gas) se ha descrito (Patil, et al., AIChE J. 46:1280-1283, 2000).

Stahmann, et al. (Eur. J. Biochem. 244:220-225, 1997) han reportado que la lipasa de Ashbya gossypii se inactivo en minutos en mezclas de gas/agua agitada, trioleoilglicerol/agua o ácido oleico/agua debido a la inactivación interfacial en una fase gas/líquido o líquido/líquido . Elias, et al. (Adv. Biochem.

Engineering/Biotechnology 59:47-71, 1998) han reportado que: (i) algunas enzimas se inactivan por rozamiento hidrodinámico aun en ausencia de una interfase gas-líquido; (ii) para enzimas inactivadas por rozamiento hidrodinámico, la velocidad de inactivación aumenta en presencia de la interfase gas-líquido; (iii) algunas enzimas no se inactivan en ausencia de la interfase gas-líquido independientemente del rozamiento hidrodinámico aplicado; y (iv) para enzimas que requieren una interfase gas-líquido para la inactivación, la velocidad de inactivación aumenta cuando se incrementa el rozamiento hidrodinámico. Ross, et al. (J. Mol. Catal . B: Enzymatic 8:183-192, 2000) han descrito la inactivación interfacial de a-quimotripsina, ß-quimotripsina , papaina y esterasa de hígado de cerdo en diversas mezclas de disolvente acuoso/orgánico cuando se pasan gotitas de disolvente hacia arriba a través de una solución enzimática acuosa en un aparato de columna de burbujas. Además, se ha reportado la cinética y mecanismo de inactivación por rozamiento de la lipasa de Candida cylindracea en un reactor de tanque agitado, en donde se encontró que el mecanismo de inactivación se debía a un efecto de la interfase gas-líquido inducido por rozamiento (Lee, et al., Biotechnol . Bioeng. 33 :183-190, 1989) .

En las condiciones de fermentación usadas en algunos métodos descritos en la presente descripción, el rozamiento hidrodinámico y las interfases gas-líquido y líquido-líquido están presentes durante el transcurso de la fermentación y son capaces de producir la inactivación de enzimas. El efecto potencial de cada uno de estos factores en la estabilidad y actividad de una o más de las enzimas (por ejemplo, glucoamilasa, lipasa, fosfolipasa y lisofosfolipasa) presentes en la mezcla de dos fases (por ejemplo, caldo de fermentación y ácido carboxílico) durante la fermentación en las condiciones descritas en la presente descripción no se podrían haber anticipado en base a la técnica anterior. Si bien cada uno de estos factores podría haber resultado en la inactivación de una o más enzimas en la mezcla de fermentación, durante la fermentación se mantuvo una actividad enzimática suficiente para que el ácido carboxílico catalizara la esterificación del producto de alcohol para producir ésteres de ácido carboxílico. En las reacciones en las cuales la mezcla de fermentación de dos fases de caldo de fermentación y ácido carboxílico contenía, además, glucoamilasa se mantuvo, además, una actividad enzimática suficiente (es decir, para convertir el oligosacárido en azúcares fermentables) .

El ácido carboxílico 28 puede ser cualquier ácido carboxílico capaz de esterificarse con un producto de alcohol tal como butanol o etanol para producir un éster de alcohol del ácido carboxílico. Por ejemplo, en algunas modalidades, el ácido carboxílico 28 puede ser ácido graso libre, y en algunas modalidades, el ácido carboxílico o ácido graso libre tiene de 4 a 28 carbonos, de 4 a 22 carbonos en otras modalidades, de 8 a 22 carbonos en otras modalidades, de 10 a 28 carbonos en otras modalidades, de 7 a 22 carbonos en otras modalidades, de 12 a 22 carbonos en otras modalidades, de 4 a 18 carbonos en otras modalidades, de 12 a 22 carbonos en otras modalidades y de 12 a 18 carbonos en aun otras modalidades. En algunas modalidades, el ácido carboxílico 28 es uno o más de los siguientes ácidos grasos: azaleico, cáprico, caprílico, castor, coco (es decir, como una combinación natural de ácidos grasos que incluyen láurico, mirístico, palmítico, caprílico, cáprico, esteárico, caproico, araquídico, oleico y linoleico, por ejemplo), isoesteárico, láurico, linaza, mirístico, oleico, aceite de palma, palmítico, nuez de palma, pelargónico, ricinoleico, sebácico, soja, ácido esteárico, aceite de resina, sebo y ácido hidroxiesteárico núm. 12. En algunas modalidades, el ácido carboxílico 28 es uno o más diácidos.

En algunas modalidades, el ácido carboxílico 28 puede ser una mezcla de dos o más ácidos grasos diferentes. En algunas modalidades, el ácido carboxílico 28 comprende ácido graso libre derivado de la hidrólisis de acilglicéridos por cualquier método conocido en la técnica que incluye la hidrólisis química o enzimática. En algunas modalidades, tal como se mencionó anteriormente, el ácido carboxílico 28 puede derivarse de aceite natural 26 por hidrólisis enzimática de los glicéridos de aceite con el uso de una enzima como catalizador 42. En algunas modalidades, los ácidos grasos o mezclas de estos comprenden ácidos grasos insaturados. La presencia de ácidos grasos insaturados reduce la temperatura de fusión y proporciona ventajas para la manipulación. Entre los ácidos grasos insaturados, aquellos que son monoinsaturados , es decir, que tienen un solo enlace doble carbono-carbono, pueden proporcionar ventajas con respecto a la temperatura de fusión sin sacrificar la estabilidad térmica y oxidativa adecuada para el proceso.

En algunas modalidades, el aceite natural 26 puede ser aceite de sebo, maíz, cañóla, triglicéridos cápricos/caprílieos , ricino, coco, semilla de algodón, pescado, jojoba, lardo, linaza, de pata de buey, de oiticica, palma, cacahuate, semilla de colza, arroz, cártamo, soja, girasol, tung, jatrofa, calabaza, semilla de uva y mezclas de aceites vegetales (o aceites que se pueden purificar en concentraciones mayores de longitudes de cadena diferentes y niveles de insaturación (es decir, 18:1)). En algunas modalidades, el aceite natural 26 es una mezcla de dos o más aceites naturales, tales como una mezcla de aceites de palma y frijol de soja, por ejemplo. En algunas modalidades, el aceite natural 26 es un aceite derivado de plantas. En algunas modalidades, si bien no es necesario, el aceite derivado de plantas puede derivarse de biomasa útil en un proceso de fermentación. La biomasa puede ser la misma fuente o una fuente diferente de la cual se obtiene la materia prima 12. Por lo tanto, por ejemplo, en algunas modalidades, el aceite 26 puede derivarse de maíz, mientras que la materia prima 12 puede ser caña. Por ejemplo, en algunas modalidades, el aceite 26 puede derivarse de maíz y la fuente de biomasa de materia prima 12 es, además, maíz. Puede usarse cualquier combinación posible de fuentes de biomasa diferentes para el aceite 26 en comparación con la materia prima 12, tal como será evidente para una persona con experiencia en la técnica. En algunas modalidades, el aceite 26 se deriva de la biomasa usada en el proceso de fermentación. Por lo tanto, en algunas modalidades, como se describirá más adelante con referencia a la Fig. 3, el aceite 26 se deriva directamente de la materia prima 12 como aceite 26'. Por ejemplo, cuando la materia prima 12 es maíz, entonces el aceite 26' es el aceite de maíz constituyente de la materia prima.

Opcionalmente , el etanol 33 puede suministrarse al recipiente de fermentación 30 de manera que se incluya en el caldo de fermentación. En algunas modalidades, cuando un microorganismo recombinante del cual se redujo o eliminó la ruta biosintética del butanol y/o una expresión de piruvato descarboxilasa se usa como microorganismo 32, el microorganismo 32 puede requerir suplementación de un sustrato de 2 carbonos, por ejemplo, etanol, para la supervivencia y crecimiento. Por lo tanto, en algunas modalidades, el etanol 33 se puede suministrar al recipiente de fermentación 30.

Sin embargo, sorprendentemente, se ha encontrado que los métodos de la presente invención en los cuales el ácido carboxílico, tal como ácido graso, est presente en el recipiente de fermentación, pueden permitir la reducción de la cantidad de etanol 33 suministrada, típicamente, para un microorganismo recombinante determinado sin afectar la vitalidad del microorganismo recombinante. Además, en algunas modalidades de los métodos de la presente invención, la velocidad de producción de alcohol (por ejemplo, butanol) sin suplementación de etanol puede ser comparable con la velocidad de producción que se puede obtener cuando se suplementa etanol 33. Como se demuestra adicionalmente por medio de los ejemplos comparativos de los Ejemplos 1-14 incluidos más adelante, la velocidad de producción del butanol cuando el ácido graso, pero no el etanol, está en el recipiente de fermentación puede ser comparable o mayor que la velocidad de producción del butanol cuando el ácido graso o el etanol no están en el recipiente de fermentación. Por lo tanto, en algunas modalidades, la cantidad de suplementación de etanol 33 se reduce en comparación con los procesos convencionales. Por ejemplo, una cantidad típica de etanol añadida en un recipiente de fermentación para microorganismos que requieren suplementación de un sustrato de 2 carbonos es de aproximadamente 5 g/1 de etanol anhidro (es decir, 5 g de etanol anhidro por litro de medio de fermentación) . En algunas modalidades, la fermentación no se suplementa con etanol 33. En el último caso, la corriente de etanol 33 se elimina completamente del recipiente de fermentación. Por lo tanto, en algunas modalidades de la presente invención, se puede reducir o eliminar el costo asociado con el etanol suplementario 33, como así también la incomodidad asociada con el almacenamiento de contenedores de etanol 33 y el suministro de este al recipiente de fermentación durante la fermentación del butanol u otra fermentación de alcohol que usa un microorganismo que puede requerir suplementación de un sustrato de 2 carbonos para sobrevivir y crecer.

Además, independientemente del suplemento de etanol, en algunas modalidades, los métodos de la presente invención pueden proporcionar una velocidad más alta de captación de glucosa a través del microorganismo 32 debido a la presencia de ácidos grasos durante la fermentación. Los ácidos grasos se pueden introducir en el recipiente de fermentación 30 como ácido carboxílico 28, hidrolizar a partir del aceite suministrado 26 y/o derivar de la hidrólisis del aceite de biomasa constituyente de la suspensión 16. Los métodos para producir un producto de alcohol a partir de un proceso de fermentación en el cual se producen ácidos grasos libres en una etapa en el proceso y se ponen en contacto con cultivos de microorganismos en un recipiente de fermentación para mejorar la velocidad de crecimiento de microorganismos y el consumo de glucosa se describen en la solicitud provisional de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. de serie 61/368,451 presentada el 28 de julio de 2010 e incorporada en la presente descripción en su totalidad como referencia .

En el recipiente de fermentación 30, el alcohol producido por el microorganismo 32 se esterifica con ácido carboxílico 28 por medio del catalizador 42 para formar esteres de alcohol. Por ejemplo, en el caso de la producción de butanol, el butanol producido por el microorganismo 32 se esterifica con ácido carboxílico 28 por medio del catalizador 42 para formar ésteres butílicos. La extracción del producto in situ (ISPR) puede usarse para eliminar los ésteres de alcohol del caldo de fermentación. Tal como se demuestra en la presente descripción, el uso del catalizador para formar ésteres en conjunto con ISPR puede mejorar el rendimiento de la fermentación. En algunas modalidades, el uso del catalizador para formar ésteres en conjunto con ISPR (tal como, por ejemplo, la extracción líquido-líquido) puede aumentar el título eficaz en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 100 % en comparación con el título eficaz en una fermentación análoga cuando se usa ISPR sin un catalizador que forme ésteres. De manera similar, en algunas modalidades, el uso de un catalizador para formar ésteres en conjunto con ISPR (tal como, por ejemplo, extracción líquido-líquido) puede aumentar la velocidad eficaz en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 100 % en comparación con la velocidad eficaz en una fermentación análoga con el uso de ISPR sin un catalizador que forme ésteres (ver, por ejemplo, los Ejemplos 9 y 11-14, Tabla 3). En algunas modalidades, el rendimiento eficaz aumenta en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 % o al menos aproximadamente 50 %. En algunas modalidades, el caldo de fermentación resultante después de la esterificación del alcohol puede comprender alcohol libre (es decir, no esterificado) y en algunas modalidades, la concentración de alcohol libre en el caldo de fermentación después de la esterificación del alcohol no es mayor que 1, 3, 6, 10, 15, 20, 25, 30 25, 40, 45, 50, 55 o 60 g/1 cuando el producto de alcohol es butanol; o cuando el producto de alcohol es etanol, la concentración de alcohol libre en el caldo de fermentación después de la esterificación del alcohol no es mayor que 15, 20, 25, 30 25, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 g/1. En algunas modalidades, la relación entre el éster de alcohol y el alcohol en el recipiente de fermentación puede ser de aproximadamente 1:1. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 ¾, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 % o al menos aproximadamente 90 % del título eficaz de alcohol se convierte en éster de alcohol .

En algunas modalidades, una carga de granos en agua con una concentración suficiente para obtener un título eficaz final de al menos aproximadamente 50 g/1, al menos aproximadamente 75 g/1 o al menos aproximadamente 100 g/1 puede usarse en una fermentación de templa de granos que comprende un microorganismo capaz de producir un alcohol, tal como butanol . En otras modalidades, para la fermentación de la templa de granos se puede usar sacarificación y fermentación simultánea (SSF) y la concentración de glucosa puede mantenerse en un nivel relativamente bajo, por ejemplo, al menos aproximadamente 75 g/1 de glucosa en la fase del caldo de fermentación durante el transcurso de la fermentación .

En algunas modalidades, los ácidos grasos pueden añadirse al termentador en una cantidad menor que aproximadamente 70 % del volumen del termentador, menor que aproximadamente 50 % del volumen del termentador o menor que aproximadamente 30 % del volumen del fermentador. La cantidad de ácido graso añadida al fermentador puede ser un medio para mantener el título de la fase acuosa del butanol durante la fermentación. En otras modalidades, el título de la fase acuosa del butanol se puede mantener en un nivel menor que aproximadamente 35 g/1 de caldo de fermentación, menor que aproximadamente 25 g/1 de caldo de fermentación o menor que aproximadamente 20 g/1 de caldo de fermentación. En otras modalidades, la cantidad de enzima de esterificación activa en el caldo de fermentación puede ser menor que aproximadamente 100 ppm, menor que aproximadamente 50 ppm o menor que aproximadamente 10 ppm de enzima activa. En algunas modalidades, la masa celular usada en un caldo de fermentación puede ser menor que aproximadamente 50 g dcw/1, menor que aproximadamente 20 g dcw/1 o menor que aproximadamente 10 g dcw/1. En otras modalidades, el proceso de fermentación puede durar al menos aproximadamente 30 horas a al menos aproximadamente 100 horas, al menos aproximadamente 40 horas a al menos aproximadamente 80 horas o al menos aproximadamente 50 horas a al menos aproximadamente 70 horas.

En algunas modalidades, puede usarse un valor Brix del agua en una concentración suficiente para obtener un título eficaz final de al menos aproximadamente 30 g de butanol por litro de fase de caldo de fermentación, al menos aproximadamente 45 g de butanol por litro de fase de caldo de fermentación o al menos aproximadamente 60 g de butanol por litro de fase de caldo de fermentación en una fermentación de caña de azúcar que comprende un microorganismo capaz de producir butanol. En algunas modalidades, los ácidos grasos pueden añadirse al termentador en una cantidad menor que aproximadamente 70 % del volumen del termentador, menor que aproximadamente 50 % del volumen del termentador o menor que aproximadamente 30 % del volumen del fermentador. La cantidad de ácido graso añadida al fermentador puede ser un medio para mantener el título de la fase acuosa del butanol durante la fermentación. En otras modalidades, el título de la fase acuosa del butanol se puede mantener en un nivel menor que aproximadamente 35 g/1 de caldo de fermentación, menor que aproximadamente 25 g/1 de caldo de fermentación o menor que aproximadamente 15 g/1 de caldo de fermentación. En otras modalidades, la cantidad de enzima de esterificación activa en el caldo de fermentación puede ser menor que aproximadamente 200 ppm, menor que aproximadamente 100 ppm o menor que aproximadamente 20 ppm de enzima activa. En algunas modalidades, la masa celular usada en un caldo de fermentación puede ser, inicialmente , de al menos aproximadamente 100 g de célula por litro de caldo de cultivo en la carga inicial que ocupa al menos aproximadamente 30 % del volumen del fermentador. Después de 3-7 horas de fermentación, la masa celular se puede diluir hasta al menos aproximadamente 25 g de célula por litro de caldo de fermentación por la adición de un suministro de caña de azúcar. El crecimiento de las células puede continuar hasta alcanzar al menos aproximadamente 30 g de célula por litro de caldo de fermentación durante las 8 a 15 horas del tiempo total de fermentación.

En algunas modalidades, el caldo de fermentación se pone en contacto durante la fermentación con un extractante para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica. En las modalidades puede realizarse convenientemente la ISPR que incluye la extracción líquido-líquido. La extracción líquido-líquido puede realizarse de conformidad con los procesos descritos en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305370, cuya descripción se incorpora completamente en la presente descripción. La publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305370 describe métodos para producir y recuperar butanol a partir de un caldo de fermentación por medio de extracción líquido-líquido; los métodos comprenden la etapa de poner en contacto el caldo de fermentación con un extractante inmiscible en agua para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica. Típicamente, el extractante puede ser un extractante orgánico seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de Ci2 a C22, ácidos grasos de 0?2 a C22, ásteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de Ci2 a C22, amidas grasas de C12 a 22, saturados, monoinsaturados , poliinsaturados (y mezclas de estos) , y mezclas de estos. El extractante puede ser, además, un extractante orgánico seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C a C22, ácidos grasos de C4 a C28/ esteres de ácidos grasos de C4 a C28, aldehidos grasos de C4 a C22, saturados, monoinsaturados, poliinsaturados (y mezclas de estos) , y mezclas de estos. Para usar con los procesos descritos en la presente descripción, el (los) extractante (s) para ISPR son, típicamente, extractantes no alcohólicos para evitar que el ácido carboxílico 28 en el recipiente de fermentación 30 se consuma por la esterif icación catalítica de ácido carboxílico 28 con un extractante de alcohol, por lo cual habría menos ácido carboxílico disponible para esterificación con el producto de alcohol. Por ejemplo, si el alcohol oleílico se usa como un extractante para ISPR, entonces los esteres de alcohol oleílico del ácido carboxílico pueden producirse en el recipiente de fermentación debido a la presencia de catalizador activo 42, como se demuestra, además, en el Ejemplo 24 incluido más abajo.

Con referencia a la modalidad de la Fig. 1, el ácido carboxílico 28 puede ser útil, además, como un extractante para ISPR 28 o un componente de este. Como se mencionó anteriormente, el ácido carboxílico 28 puede suministrarse y/o formarse in situ en el caso en que el aceite natural 26 se suministra al recipiente de fermentación 30 y/o se forma in situ en el caso en que la materia prima 16 incluye aceite que se puede hidrolizar. En algunas modalidades, el extractante para ISPR 28 incluye ácidos grasos libres. En algunas modalidades, el extractante para ISPR 28 incluye ácidos grasos de aceite de maíz (COFA, por sus siglas en inglés) . En algunas modalidades, el aceite 26 es aceite de maíz, por lo cual el extractante para ISPR 28 es COFA. El extractante para ISPR (ácido carboxílico) 28 entra en contacto con el caldo de fermentación y forma una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa 34 y una fase orgánica. El producto de éster de alcohol formado en el recipiente de fermentación se divide, preferentemente, en la fase orgánica para formar una fase orgánica que contiene éster 36. Es decir, los ésteres del producto de alcohol se producen en una concentración que excede la concentración de equilibrio del éster de alcohol presente en la fase acuosa 34 y, por lo tanto, preferentemente, se dividen en la fase orgánica. Además, preferentemente, cualquier producto de alcohol libre en el caldo de fermentación se divide en la fase orgánica que contiene éster. La mezcla bifásica puede eliminarse del recipiente de fermentación 30 como corriente 39 e introducirse en un recipiente 35 en el cual la fase orgánica que contiene éster 36 se separa de la fase acuosa 34. La separación de la mezcla bifásica 39 en la fase orgánica que contiene éster 36 y la fase acuosa 34 se puede realizar por cualquier método conocido en la técnica que incluye, pero no se limita a, sifoneo, aspiración, decantación, centrifugación, mediante el uso de un decantador por gravedad, división de fases asistida por membrana, hidrociclón y similares. Toda o una parte de la fase acuosa 34 puede reciclarse en el recipiente de fermentación 30 como medio de fermentación (tal como se muestra) o, de cualquier otra forma, descartarse y reemplazarse por medio nuevo o tratarse para eliminar cualquier producto de alcohol remanente y, después, reciclarse al recipiente de fermentación 30.

Con referencia a la Fig. 1, la fase orgánica que contiene éster 36 se introduce en un recipiente 50 en el cual los ésteres de alcohol se hacen reaccionar con una o más sustancias 52 para recuperar producto de alcohol 54. El producto de alcohol 54 puede recuperarse con cualquier método conocido en la técnica para obtener un alcohol a partir de un éster de alcohol. Por ejemplo, en algunas modalidades, el producto de alcohol se puede recuperar del éster de alcohol por hidrólisis con base seguida de acidificación. En otras modalidades, el producto de ésteres de alcohol se puede hidrolizar por medio de agua en presencia de un catalizador de hidrólisis como la sustancia 52. Por ejemplo, en algunas modalidades, para la hidrólisis de los ésteres del producto de alcohol en alcohol y ácido carboxílico 28 (por ejemplo, ácido graso cuando el ácido carboxílico 28 es un ácido graso) puede usarse una lipasa, un ácido soluble en agua, un ácido inorgánico, un ácido orgánico o un catalizador ácido sólido como la sustancia 52. Por ejemplo, el ácido sulfúrico puede usarse como un catalizador de ácido inorgánico para la hidrólisis del éster de alcohol. Algunos catalizadores de hidrólisis adecuados son las enzimas lipasa; enzimas esterasa; ácidos inorgánicos fuertes, tales como ácido sulfúrico, ácido clorhídrico o ácido fosfórico; ácidos orgánicos fuertes, tales como ácido toluensulfónico o ácido naftalensulfónico; o catalizadores de ácidos sólidos tales como resinas de poliestireno sulfonadas Amberlyst® o zeolitas. En algunas modalidades, la hidrólisis de los ésteres de alcohol se puede realizar con vapor como sustancia 52, por medio del aumento de la temperatura y/o por la aplicación de presión. En algunas modalidades, la hidrólisis de los ésteres de alcohol puede realizarse en una columna, por ejemplo, una columna de destilación reactiva. Los ejemplos 45 a 54 y 56 a 58 demuestran varios métodos para recuperar el producto de alcohol a partir de un éster de alcohol. En algunas modalidades, los subproductos 56 se obtienen a partir de la recuperación del producto de alcohol 54. Los subproductos 56 no incluyen ácido carboxílico 28 que puede recuperarse a partir de la hidrólisis de los ásteres de alcohol .

En algunas modalidades, cuando se produce la hidrólisis de los ásteres de alcohol de ácidos grasos presentes en la fase orgánica que contiene áster 36 en el producto de alcohol y ácidos grasos libres, la relación entre el ácido graso y agua es de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10 o, en otras modalidades, la relación entre el ácido graso y agua es de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 1:100. En algunas modalidades, los ásteres de alcohol de ácidos grasos se hidrolizan con agua a una temperatura menor que aproximadamente 100 °C. En algunas modalidades, la hidrólisis se produce a una temperatura mayor que 100 °C, mayor que 150 °C, mayor que 200 °C o mayor que 250 °C.

Por ejemplo, en algunas modalidades, los ásteres de alcohol se pueden transesterificar para producir producto de alcohol 54 y, en algunas modalidades, además, puede se producir un segundo áster de alcohol 56, por ejemplo, ásteres alquílicos de ácidos grasos como el subproducto 56. Para alcanzar esa transesterificación, los ásteres de alcohol se pueden poner en contacto con catalizadores capaces de transesterificar los ásteres de alcohol para liberar butanol . En algunas modalidades, los ásteres de alcohol se pueden transesterificar con glicerol para producir producto de alcohol 54 y acilglicéridos como subproducto 56. Los acilglicéridos producidos pueden comprender mono y diacilglicéridos . Algunos catalizadores adecuados para las reacciones de transesterificación son, por ejemplo, enzimas lipasa, sales de alcóxido, particularmente, del segundo alcohol, titanatos de alquilo, ácidos inorgánicos solubles tales como ácido sulfúrico y ácido fosfórico, ácidos orgánicos solubles tales como ácido toluensulfónico y ácido naftalensulfónico y ácidos sólidos tales como resinas de poliestireno sulfonadas Amberlyst® o zeolitas. Las lipasas adecuadas para transesterificaciones o hidrólisis incluyen, pero no se limitan a, lipasas derivadas de Burkholderia espacia. , Thermomyces lanuginosa o Candida antárctica . En algunas modalidades, las lipasas se inmovilizan en un soporte soluble o insoluble por medio de métodos muy conocidos para aquellos con experiencia en la técnica (ver, por ejemplo, Immobilization of Enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, Estados Unidos, 1997) . La inmovilización de enzimas se puede realizar por medio de diversas técnicas que incluyen 1) unión de la enzima a un soporte portador poroso o no poroso, por medio de soporte covalente, adsorción física, unión electrostática o unión por afinidad; 2) entrecruzamiento con reactivos bifuncionales o multifuncionales ; 3) atrapamiento en matrices de gel, polímeros, emulsiones o alguna forma de membrana; y 4) una combinación de cualquiera de estos métodos. En otras modalidades, las lipasas pueden no estar inmovilizadas. En algunas modalidades, las lipasas son solubles. Los ásteres alquílicos de ácidos grasos 56 pueden incluir, por ejemplo, esteres metílicos de ácidos grasos. Otros ésteres alquílicos de ácidos grasos 56 pueden incluir, por ejemplo, ésteres de alcohol de C2 a Ci2 lineal, ramificada y cíclicos. Después, el producto de alcohol 54 puede separarse de la mezcla de reacción que incluye subproductos 56 por cualquier medio de separación conocido en la técnica, tal como destilación. Otros mecanismos de separación adecuados pueden incluir, por ejemplo, extracción y separación por membranas.

En algunas modalidades, al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 99 % del producto de alcohol se recupera de los ésteres de alcohol.

El extractante para ISPR (ácido carboxílico) 28 se puede separar de los ésteres de alcohol antes de la reacción de los ésteres de alcohol para la recuperación del producto de alcohol 54. Alternativamente, el extractante para ISPR 28 puede separarse del producto de alcohol y cualquier subproducto después de la reacción de los ésteres de alcohol . Después, el extractante recuperado resultante 27 se puede reciclar de nuevo al recipiente de fermentación 30, usualmente, combinado con el extractante constitutivo nuevo 28 (que puede derivarse del aceite 26, si se suministra) para la producción y/o extracción adicional de ésteres de alcohol. Alternativamente, el extractante nuevo 28 (o aceite 26) puede añadirse en forma continua al recipiente de fermentación para reemplazar el extractante extraído en la corriente de la mezcla bifásica 39.

En algunas modalidades, el catalizador 42 se puede recuperar de la mezcla bifásica 39 y usarse nuevamente en una etapa del proceso de fermentación, tal como en la fermentación propiamente dicha o en la recuperación del producto de alcohol.

En algunas modalidades, uno o más extractantes para ISPR 29 adicionales (ver la Fig. 2) pueden introducirse en el recipiente de fermentación 30 para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica. En las modalidades, el extractante para ISPR 29 puede ser un extractante orgánico exógeno tal como alcohol oleílico, alcohol behenílico, alcohol cetílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol estearílico, 1-undecanol, ácido oleico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido esteárico, miristato de metilo, oleato de metilo, undecanal, aldehido láurico, 20 -metilundecanal , y mezclas de estos. Sin embargo, por las razones mencionadas anteriormente, el extractante para ISP 29, preferentemente, no es un alcohol. Más bien, el extractante para ISPR 29 es, preferentemente, un ácido carboxílico (por ejemplo, ácidos grasos libres) . En algunas modalidades, el extractante para ISPR 29 es COFA. En algunas modalidades, el extractante para ISPR 29 es ácido graso de aceite de linaza, ácido graso de aceite de soja, ácido graso de aceite de jatrofa o ácidos grasos derivados de aceite de palma, aceite de ricino, aceite de oliva, aceite de coco, aceite de cacahuete o cualquier aceite de semilla. En algunas modalidades, el extractante para ISPR 29 puede ser un extractante de ácido graso seleccionado del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ésteres grasos (particularmente aquellos que comprenden de 1 a 8 átomos de carbono en la porción de alcohol, por ejemplo, ésteres metílicos de ácidos grasos y ésteres de alcohol de bajo peso molecular de ácidos grasos) , ésteres glicólicos de ácido graso, triglicéridos hidroxilados y mezclas de estos, obtenidos a partir de la conversión química de aceite natural, tal como lípidos de biomasa como se describe, por ejemplo, en la solicitud provisional de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada nüm. de serie 61/368,436 presentada el 28 de julio de 2010 e incorporada en la presente descripción como referencia. En algunas modalidades, el extractante para ISPR 29 es un ácido graso libre obtenido por la hidrólisis química de lípidos de biomasa. En algunas modalidades, el extractante para ISPR 29 puede ser un ácido graso libre producido a partir de la hidrólisis enzimática de un aceite natural tal como lípidos de biomasa como se describió, por ejemplo, en la solicitud provisional de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. de serie 61/368,444 presentada el 28 de julio de 2010 e incorporada en la presente descripción como referencia.

La extracción del producto in si tu puede realizarse en modo discontinuo o continuo en el recipiente de fermentación 30. En la extracción del producto in situ en modo continuo, el producto se extrae continuamente del recipiente (o reactor) . En la extracción del producto in situ en modo discontinuo, un volumen de extractante orgánico se añade al recipiente de fermentación y el extractante no se extrae durante el proceso. Para la extracción del producto in situ, el extractante orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación al inicio de la fermentación y formar un medio de fermentación bifásico. Alternativamente, el extractante orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación después de que el microorganismo ha alcanzado el nivel de crecimiento deseado que puede determinarse por la medición de la densidad óptica del cultivo. Además, el extractante orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación en un momento en el cual el nivel del producto de alcohol en el medio de fermentación alcanza un nivel preseleccionado. En el caso de la producción de butanol de conformidad con algunas modalidades de la presente invención, en un momento anterior a que la concentración de butanol alcanza un nivel tóxico, el extractante del ácido carboxílico puede entrar en contacto con el medio de fermentación para esterificar el butanol con el ácido carboxílico para producir ésteres butílicos y, en algunas modalidades, producir una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que comprende los ésteres butílicos. En consecuencia, la concentración de butanol se reduce en el recipiente de fermentación y, como resultado, minimiza los efectos tóxicos del butanol en el microorganismo. Después, la fase orgánica que contiene éster puede eliminarse del recipiente de fermentación (y separarse del caldo de fermentación que constituye la fase acuosa) después de alcanzar un título eficaz deseado para los ésteres butílicos. Por ejemplo, en algunas modalidades, la fase orgánica que contiene éster puede separarse del caldo de fermentación después de que el título eficaz de los ésteres butílicos es mayor que aproximadamente 10 g/kg de caldo de fermentación. En otras modalidades, la fase orgánica que contiene éster puede separarse del medio de fermentación después de que el título eficaz de los ésteres butílicos es mayor que aproximadamente 230 g/kg de caldo de fermentación, mayor que aproximadamente 300 g/kg de caldo de fermentación, mayor que aproximadamente 400 g/kg de caldo de fermentación, mayor que aproximadamente 500 g/kg de caldo de fermentación o mayor que aproximadamente 600 g/kg de caldo de fermentación. En otra modalidad, la fase orgánica que contiene éster puede separarse del medio de fermentación después de que el % de conversión de COFA es de al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 75 % o al menos aproximadamente 100 %. En algunas modalidades, la fase orgánica que contiene éster se separa de la fase acuosa una vez que la fermentación del azúcar fermentable disponible en el recipiente de fermentación prácticamente se haya completado.

En la modalidad ilustrativa representada en la Fig. 1, el éster de alcohol se extrae del caldo de fermentación in situ, y la separación de la mezcla bifásica 39 se produce en un recipiente separado 35. En algunas modalidades, la separación de la mezcla bifásica se puede realizar en el recipiente de fermentación, tal como se muestra en las modalidades ilustrativas de las Figs . 3 y 4 descritas más adelante, en las cuales la corriente de la fase orgánica que contiene éster 36 sale directamente del recipiente de fermentación 30. La corriente de la fase acuosa 34 puede salir, además, directamente del recipiente de fermentación 30, tratarse para eliminar cualquier éster de alcohol o producto de alcohol remanente y reciclarse o descartarse y reemplazarse con medio de fermentación nuevo. La extracción del éster de alcohol y el producto de alcohol por medio del extractante orgánico se puede realizar con o sin la eliminación del microorganismo 32 del caldo de fermentación. El microorganismo 32 puede eliminarse del caldo de fermentación por métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, filtración o centrifugación. Por ejemplo, la corriente de la fase acuosa 34 puede incluir un microorganismo 32, tal como levadura. El microorganismo 32 puede separarse fácilmente de la corriente de la fase acuosa, por ejemplo, en una centrífuga (no se ilustra). Después, el microorganismo 32 puede reciclarse al recipiente de fermentación 30 que, en el tiempo, puede aumentar la velocidad de la producción de alcohol y, en consecuencia, aumentar la eficacia de la producción de alcohol.

En algunas modalidades, el sistema y los procesos de la Fig. 1 pueden modificarse de manera que la sacarificación y fermentación simultánea en el recipiente de fermentación 30 se reemplace con un recipiente de sacarificación separado 60 antes del recipiente de fermentación 30, tal como sería evidente para una persona con experiencia en la técnica (ver, por ejemplo, la modalidad de la Fig. 4) .

En aún otras modalidades, tal como se ilustra, por ejemplo, en la modalidad ilustrativa de la Fig. 2, el aceite natural 26 (en lugar de suministrarse directamente al recipiente de fermentación 30) se suministra a un recipiente 40 al cual se suministra, además, el catalizador 42, por lo cual al menos una porción de los acilglicéridos en aceite 26 se hidrolizan para formar ácido carboxílico 28. Después, se introduce una corriente de producto del recipiente 40 que contiene ácido carboxílico 28 y catalizador 42 en el recipiente de fermentación 30. El ácido carboxílico 28 y catalizador 42 entran en contacto con el producto de alcohol producido en el medio de fermentación, por lo cual se forman in situ ásteres de alcohol del producto de alcohol a partir de la esterificación catalizada del ácido carboxílico con el producto de alcohol, en la misma forma descrita anteriormente con referencia a la Fig. 1. El ácido carboxílico 28 puede ser útil, además, como un extractante para ISPR y, en algunas modalidades, una cantidad suficiente de ácido carboxílico 28 y/o uno o más extractantes para ISPR adicionales 29 pueden introducirse en el recipiente de fermentación 30 para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica con el éster de alcohol que se divide en la fase orgánica. Las operaciones restantes del proceso de la modalidad de la Fig. 2 son idénticas a la Fig. 1 y, por lo tanto, no se describirán otra vez en detalle.

En algunas modalidades de la presente invención, tal como se muestra, por ejemplo, en la modalidad de la Fig. 3, el catalizador 42 puede añadirse a la suspensión de materia prima 16 que comprende aceite 261 derivado de la biomasa a partir de la cual se formó la materia prima 12. En la modalidad ilustrada, el catalizador 42 puede hidrolizar los glicéridos en aceite 26' a ácidos grasos libres 28'. Por lo tanto, después de la introducción del catalizador 42 en la suspensión de materia prima 16 se hidroliza al menos una porción de los glicéridos en aceite 26', lo que produce una suspensión de materia prima 18 que tiene ácidos grasos libres 28' y catalizador 42. Por ejemplo, cuando la materia prima 12 es maíz, entonces el aceite 26' es el aceite de maíz constituyente de la materia prima y los ácidos grasos libres 28' son ácidos grasos de aceite de maíz (COFA, por sus siglas en inglés) .

La suspensión de materia prima 18 se introduce en el recipiente de fermentación 30 junto con el microorganismo que produce alcohol 32 que se incluirá en un medio de fermentación. En algunas modalidades, una enzima 38, tal como glucoamilasa , puede introducirse, además, en el recipiente de fermentación para la sacarificación simultánea de azúcares en la suspensión 18 y la fermentación de alcohol dentro del recipiente de fermentación 30. La presencia de catalizador 42 en el recipiente de fermentación (introducido a través de la 1 4 suspensión 18) cataliza la esterificación del alcohol con los ácidos grasos libres 28' (introducidos a través de la suspensión 18) para formar ésteres de alcohol de ácidos grasos in situ, en la misma forma descrita anteriormente con referencia a la Fig. 1. En algunas modalidades, para la producción de butanol, el microorganismo productor de butanol 32 se introduce en el recipiente de fermentación 30 junto con la suspensión de materia prima 18. El catalizador 42 en el recipiente de fermentación (introducido a través de la suspensión 18) cataliza la esterificación del butanol con los ácidos grasos libres 28' (introducidos a través de la suspensión 18) para formar ésteres butílieos de ácidos grasos (FABE) in situ. Los ácidos grasos libres 28' pueden ser útiles, además, como un extractante para ISPR. Por ejemplo, cuando los ácidos grasos libres 28' son COFA, entonces los ésteres de alcohol de COFA se forman in situ y el COFA es útil como un extractante para ISPR o una porción de este.

En algunas modalidades, uno o más extractantes de ISPR adicionales 29 pueden introducirse en el recipiente de fermentación 30 para dividir, preferentemente, el éster de alcohol (y cualquier alcohol libre) de la fase acuosa. En algunas modalidades, el extractante para ISPR 29 puede ser el ácido carboxílico 28 descrito con referencia a las modalidades de las Figs . 1 y 2. En algunas modalidades, el extractante para ISPR 29 se introduce en el recipiente de fermentación 30 como aceite 26 que, después, se hidroliza en ácidos grasos por medio del catalizador 42 para transformarse en el extractante para ISPR 29. En algunas modalidades, el aceite 26 es aceite de maíz, por lo cual el extractante para ISPR 29 es COFA. En algunas modalidades, el extractante para ISPR 29 puede ser un extractante de ácido graso seleccionado del grupo que consiste en ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, ésteres grasos (particularmente aquellos que comprenden de 1 a 8 átomos de carbono en la porción de alcohol, por ejemplo, ésteres metílicos de ácidos grasos y ésteres de alcohol de bajo peso molecular de ácidos grasos) , ésteres glicólicos de ácido graso, triglicéridos hidroxilados y mezclas de estos, tal como se describió anteriormente con referencia a las modalidades de las Figs. 1 y 2. En aun otras modalidades, el extractante para ISPR 29 puede ser un ácido graso libre obtenido por la hidrólisis química o enzimática de lípidos de biomasa. En las modalidades, los lípidos de biomasa para producir extractante 29 pueden ser de una misma fuente de biomasa o diferente a partir de la cual se obtiene materia prima 12. Por ejemplo, en algunas modalidades, los lípidos de biomasa para producir extractante 29 pueden derivarse de soja, mientras que la fuente de biomasa de la materia prima 12 es maíz. Puede usarse cualquier combinación posible de fuentes de biomasa diferentes para el extractante 29 en comparación con la materia prima 12, tal como será evidente para una persona con experiencia en la técnica. Las operaciones restantes del proceso de la modalidad de la Fig. 2 son idénticas a la Fig. 1 y, por lo tanto, no se describirán otra vez con detalle.

Como ejemplo no limitante previsto, con referencia a la modalidad de la Fig. 3, una suspensión acuosa de grano entero triturado (como materia prima 12) que puede contener, nominalmente , aproximadamente 4 ¾ en peso de aceite de maíz, puede tratarse con amilasa (como enzima de licuación 14) a una temperatura de aproximadamente 85 °C a 120 °C por 30 minutos a 2 horas, y la templa licuada resultante 16 puede enfriarse hasta una temperatura de 65 °C a 30 °C y tratarse con 0.1 ppm a 10 ppm (en algunas modalidades, de 0.5 ppm a 1.0 ppm) de lipasa (como catalizador 42) a pH 4.5 a 7.5 (en algunas modalidades, de pH 5.5 a 6.5) por un tiempo suficiente para producir una conversión de al menos 30 % hasta tanto como al menos 99 % del contenido de ácido graso disponible en lípidos a ácidos grasos libres. La templa tratada con lipasa y licuada 18 puede enfriarse hasta aproximadamente 30 °C (por ejemplo, con el uso de un intercambiador de calor) y cargarse en el recipiente de fermentación 30 con un porcentaje de aproximadamente 25 % a 30 % en peso de sólidos de maíz seco. La sacarificación de la templa licuada 18 durante la fermentación por la adición de glucoamilasa (como enzima de sacarificación 38) puede resultar en la producción de glucosa. El caldo de fermentación resultante puede contener una cantidad significativamente menor que la cantidad de aceite de maíz (por ejemplo, aproximadamente 1.2 % en peso de aceite de maíz) que puede estar presente en un caldo de cultivo con el uso de una templa licuada que no se trató con lipasa 42. Particularmente, el tratamiento con lipasa 42 puede producir la conversión de lipidos de aceite de maíz 26' (triglicéridos (TG) ) en COFA 28' (y algunos diglicéridos (DG) o monoglicéridos (MG) ) , lo que reduce la velocidad de acumulación de lipidos 26 ' en el disolvente de extracción para ISPR de COFA 28' o 29. El tratamiento de lipasa 42 puede producir, además, la conversión del butanol producido durante la fermentación en ásteres butílieos de COFA, en donde los ésteres butílicos de COFA tienen un coeficiente de partición alto para la disolución en la fase de COFA 36 durante la extracción ISPR líquido-líquido. Al final de la fermentación, la fase de COFA 36 que contiene ésteres butílicos de COFA puede separarse del caldo de fermentación (en el recipiente 30/35) y el butanol 54 puede recuperarse (en el recipiente 50) a partir de esta mezcla orgánica 36 con uno de los diversos métodos que incluyen, pero no se limitan a, la hidrólisis del éster, por ejemplo, con una lipasa 52, un catalizador de ácido sólido 52 o vapor 52, para producir butanol 54 y COFA 27.

En aun otras modalidades, tal como se muestra, por ejemplo, en la modalidad de la Fig. 4, el sistema y los procesos de la Fig. 3 pueden modificarse de manera que la sacarificación y fermentación simultánea (SSF) en el recipiente de fermentación 30 se reemplace con un recipiente de sacarificación separado 60 antes al recipiente de fermentación 30. La Fig. 4 es prácticamente idéntica a la Fig. 3, excepto por la inclusión de un recipiente de sacarificación 60 separado que recibe la enzima 38 con el catalizador 42 que se introduce en una corriente de materia prima sacarificada y licuada 62. La suspensión de materia prima 16 se introduce en el recipiente de sacarificación 60 junto con la enzima 38, tal como glucoamilasa , por lo cual los azúcares en la forma de oligosacáridos en suspensión 16 pueden descomponerse en monosacáridos . Una corriente de materia prima sacarificada y licuada 62 sale del recipiente de sacarificación 60 en el cual se introduce el catalizador 42. La corriente de materia prima 62 incluye monosacáridos y aceite 261 y sólidos no disueltos derivados de la materia prima. El aceite 26' se hidroliza por la introducción de catalizador 42 y se obtiene una suspensión de materia prima sacarificada y licuada 64 que tiene ácidos grasos libres 28' y catalizador 42.

Alternativamente, en algunas modalidades, el catalizador 42 puede añadirse junto con la enzima de sacarificación 38 para producir simultáneamente glucosa e hidrolizar los lípidos de aceite 26' en ácidos grasos libres 28', en una forma similar a la introducción del catalizador 42 con la enzima 38 en el recipiente de fermentación 30 para la SSF en la modalidad de la Fig. 1. La adición de enzima 38 y catalizador 42 puede ser gradual (por ejemplo, catalizador 42, después enzima 38 o viceversa) o simultánea. Sin embargo, en contraposición con la modalidad de la Fig. 1, en la cual la adición de catalizador 42 en el recipiente de fermentación 30 durante la SSF convierte, además, el producto de alcohol en los ásteres de alcohol en forma prácticamente simultánea, los ásteres de alcohol no se forman hasta que la suspensión 64 que contiene catalizador 42 se introduce en el recipiente de fermentación 30. Alternativamente, en algunas modalidades, la suspensión 62 puede introducirse en el recipiente de fermentación 30 y el catalizador 42 se añade directamente al recipiente de fermentación 30.

En la modalidad de la Fig. 4, la suspensión 64 se introduce en el recipiente de fermentación 30 junto con el microorganismo productor de alcohol 32 que metaboliza los monosacáridos para producir producto de alcohol. La presencia de catalizador 42 en el recipiente de fermentación (introducido a través de la suspensión 64) cataliza la esterificación del alcohol con los ácidos grasos libres 28' (introducidos a través de la suspensión 62) para formar ésteres de alcohol de ácidos grasos in sifcu, en la misma forma descrita anteriormente con referencia a la Fig. 1. Los ácidos grasos libres 28' pueden ser útiles, además, como un extractante para ISPR para dividir, preferentemente, el éster de alcohol (y cualquier alcohol libre) de la fase acuosa. En algunas modalidades, uno o más extractantes para ISPR adicionales 29 pueden introducirse, además, en el recipiente de fermentación 30 tal como se describió anteriormente con referencia a la Fig. 3. Las operaciones restantes del proceso de la modalidad de la Fig. 4 son idénticas a la Fig. 3 y, por lo tanto, no se describirán otra vez con detalle.

En algunas modalidades, que incluyen cualquiera de las modalidades descritas anteriormente con respecto a las Figs . 1-4, los sólidos no disueltos pueden extraerse de la suspensión de materia prima 16 antes de la introducción en el recipiente de fermentación 30. Por ejemplo, tal como se muestra en la modalidad de la Fig. 5, la suspensión de materia prima 16 se introduce por una entrada de un separador 20 que se configura para descargar los sólidos no disueltos como una fase sólida o torta húmeda 24. Por ejemplo, en algunas modalidades, el separador 20 puede incluir una prensa de filtro, filtración por vacío, filtración por presión mecánica o una centrífuga (por ejemplo, centrífuga de decantador) para separar los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima 16. En algunas modalidades, para separar los sólidos no disueltos puede usarse cualquier centrífuga convencional en la industria, que incluye, por ejemplo, una centrífuga con tazón decantador, una centrífuga "tricanter" , una centrífuga con pila de discos, una centrífuga de filtración o una centrífuga de decantador. En algunas modalidades, la extracción de los sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima 16 se puede realizar mediante filtración, filtración al vacío, filtro de banda, filtración por presión, filtración con tamiz, separación por tamiz, rejillas o enrejado, rejillas porosas, flotación, hidrociclón, prensa de filtro, prensa de tornillo, sedimentador por gravedad, separador de vórtice o cualquier método que puede usarse para separar sólidos de líquidos. Opcionalmente , en algunas modalidades, el separador 20 puede configurarse, además, para extraer una parte o prácticamente todo el aceite 26' presente en la suspensión de materia prima 16. En las modalidades, el separador 20 puede ser cualquier separador adecuado conocido en la técnica para extraer aceite de una corriente de alimentación acuosa que incluye, pero no se limita a, sifoneo, decantación, centrifugación, con el uso de un sedimentador por gravedad, división de fases por medio de membranas y similares. La materia prima restante que incluye azúcar y agua se descarga como una corriente acuosa 22 al recipiente de fermentación 30.

Po ejemplo, en algunas modalidades, el separador 20 incluye una centrífuga "tricanter" 20 que agita o centrifuga la suspensión de materia prima 16 para producir un producto de centrífuga que comprende una capa acuosa que contiene azúcar y agua (es decir, corriente 22) , una capa de sólidos que contiene los sólidos no disueltos (es decir, torta húmeda 24) y una capa de aceite (es decir, corriente de aceite 26'). En el caso, el catalizador 42 puede entrar en contacto con el aceite eliminado 26' para producir una corriente de ácido graso libre 28' y catalizador 42. Después, la corriente de ácido graso libre 28' y catalizador 42 puede introducirse en el recipiente de fermentación 30 para que entre en contacto con el medio de fermentación, por lo cual la esterificación catalítica del producto de alcohol en el medio de fermentación en ésteres de alcohol de ácidos grasos puede obtenerse in situ, en la misma forma que la descrita anteriormente con referencia a la Fig. 1.

Los ácidos grasos libres 28' pueden ser útiles, además, como un extractante para ISPR 28 ' y uno o más extractantes para ISPR adicionales 29 pueden introducirse, además en el recipiente de fermentación 30. Por lo tanto, el aceite de materia prima 26' puede hidrolizarse catalíticamente a ácido carboxílico, y de ese modo, reducir la cantidad de lípidos presentes en un extractante para ISPR y, al mismo tiempo, producir, además, un extractante para ISPR. La fase orgánica que contiene éster 36 puede separarse de la fase acuosa 34 de la mezcla bifásica 39 en el recipiente 35 y el producto de alcohol puede recuperarse de los ésteres de alcohol en el recipiente 50 (ver la Fig. 1). Las operaciones restantes del proceso de la modalidad de la Fig. 5 son idénticas a la Fig. 3 y, por lo tanto, no se describirán otra vez con detalle.

Cuando la torta húmeda 24 se extrae por medio de la centrífuga 20, en algunas modalidades, una porción del aceite de la materia prima 12, tal como aceite de maíz cuando la materia prima es maíz queda en la torta húmeda 2 . La torta húmeda 24 puede lavarse con agua adicional en la centrífuga una vez que la solución acuosa 22 se descargó de la centrífuga 20. El lavado de la torta húmeda 24 recupera el azúcar (por ejemplo, oligosacáridos) presente en la torta húmeda y el azúcar y el agua recuperada pueden reciclarse al recipiente de licuación 10. Después del lavado, la torta húmeda 24 puede combinarse con solubles y, después, secarse para formar granos secos de destilería con solubles (DDGS) a través de cualquier proceso conocido adecuado. La formación de los DDGS a partir de la torta húmeda 24 formada en la centrífuga 20 exhibe diversos beneficios. Dado que los sólidos no disueltos no van al recipiente de fermentación, los DDGS no incluyen extractante y/o producto de alcohol, atrapado, tal como butanol, no están expuestos a las condiciones del recipiente de fermentación y no entran en contacto con los microorganismos presentes en el recipiente de fermentación. Todos estos beneficios facilitan el proceso y la venta de DDGS, por ejemplo, como alimento para animales. En algunas modalidades, el aceite 26' no se descarga en forma separada de la torta húmeda 24, pero, en lugar de ello, el aceite 26' se incluye como parte de la torta húmeda 24 y, en última instancia, está presente en los DDGS. En esos casos, el aceite puede separarse de los DDGS y convertirse en un extractante para ISPR 29 que se usa posteriormente en el mismo proceso de fermentación de alcohol o en uno diferente. Los métodos y sistemas para eliminar sólidos no disueltos de la suspensión de materia prima 16 por medio de centrifugación se describen con detalle en la solicitud provisional de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. de serie 61/356,290 presentada el 18 de junio de 2010 e incorporada en la presente descripción en su totalidad como referencia .

Como se describió anteriormente, el aceite 26' puede separarse de los DDGS con el uso de cualquier proceso conocido adecuado que incluye, por ejemplo, un proceso de extracción por disolvente. En una modalidad de la invención, los DDGS se cargan en un recipiente de extracción y se lavan con un disolvente, tal como hexano, para eliminar el aceite 26'. Otros disolventes que pueden usarse incluyen, por ejemplo, isobutanol, isohexano, etanol, destilados de petróleo, tales como éter de petróleo o mezclas de estos.

Después de la extracción del aceite 261 , los DDGS pueden tratarse para eliminar cualquier disolvente residual. Por ejemplo, los DDGS pueden calentarse para evaporar cualquier disolvente residual con el uso de cualquier método conocido en la técnica. Después de la extracción del disolvente, los DDGS pueden exponerse a un proceso de secado para eliminar el agua residual. Los DDGS procesados pueden usarse como un suplemento alimenticio para animales, tales como aves, ganado vacuno y mascotas domésticas.

Después de la extracción de los DDGS, el aceite resultante 261 y la mezcla de disolvente pueden recolectarse para separar el aceite 26' del disolvente. En una modalidad, la mezcla de aceite 261 /disolvente puede procesarse por evaporación por medio de lo cual el disolvente se evapora y puede recolectarse y reciclarse. El aceite recuperado puede convertirse en un extractante para ISPR 29 para el uso posterior en el mismo proceso de fermentación de alcohol o en uno diferente.

Además de la recuperación de sólidos, se puede preferir recuperar otros subproductos del proceso de fermentación. En una modalidad, los ésteres de ácidos grasos (por ejemplo, ésteres isobutílieos de ácidos grasos) pueden recuperarse, por ejemplo, para aumentar el rendimiento de carbohidratos en producto de alcohol (por ejemplo, butanol) . Esto se puede realizar, por ejemplo, si se usa un disolvente para extraer ásteres isobutílicos de ácidos grasos, por ejemplo, del subproducto formado mediante la combinación y el mezclado de diversas corrientes de subproducto y el secado del producto obtenido en las etapas de combinación y mezclado. El sistema de extracción basado en disolvente para recuperar triglicéridos de aceite de maíz a partir de DDGS se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2010/0092603, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente descripción como referencia.

En una modalidad de la extracción por disolvente de los ásteres de ácidos grasos, los sólidos se pueden separar a partir de residuos de destilación enteros ("sólidos separados") ya que la corriente contendría la mayor porción, mayormente, de ásteres de ácidos grasos en corrientes de subproducto sin combinar. Después, estos sólidos separados se pueden alimentar en un extractor y lavarse con disolvente. En una modalidad, los sólidos separados se dan vuelta al menos una vez para asegurar el lavado con disolvente de todos los lados de los sólidos separados. Después del lavado se recolecta la mezcla resultante de lípido y disolvente, conocida como miscela, para separar el lípido extraído del disolvente. Por ejemplo, la mezcla resultante de lípido y disolvente se puede depositar en un separador para continuar con el procesamiento. Durante el proceso de extracción, dado que el disolvente lava los sólidos separados, el disolvente no solamente transporta el lípido a la solución sino que recolecta las partículas sólidas y finas. Generalmente, estos "finos" son impurezas indeseables en la miscela y, en una modalidad, la miscela se puede descargar del extractor o separador a través de un dispositivo que separa o depura los finos de la miscela.

Para separar el lípido y el disolvente contenidos en la miscela, esta se puede procesar mediante una etapa de destilación. En esta etapa, la miscela puede procesarse, por ejemplo, a través de un evaporador que calienta la miscela hasta una temperatura suficientemente alta como para que el disolvente se vaporice, pero no tan alta como para afectar negativamente o vaporizar el lípido extraído. A medida que el disolvente se evapora, este puede recolectarse, por ejemplo, en un condensador y reciclarse para uso futuro. La separación del disolvente de la miscela genera una provisión de lípidos crudos que pueden procesarse adicionalmente para separar el agua, los ásteres de ácidos grasos (por ejemplo, esteres isobutílicos de ácidos grasos) , los ácidos grasos y los triglicéridos .

Después de la extracción de los lípidos, los sólidos pueden transportarse fuera del extractor y tratarse mediante un proceso de estabilización que elimina el disolvente residual. La recuperación del disolvente residual es importante para la economía del proceso. En una modalidad, los sólidos húmedos pueden transportarse en un ambiente hermético al vapor para preservar y recolectar el disolvente que se evapora temporalmente de los sólidos húmedos a medida que los sólidos se transportan al desolventizador . A medida que los sólidos entran en el desolventizador, estos se pueden calentar hasta vaporizarse y eliminar el disolvente residual. Para calentar los sólidos, el desolventizador puede incluir un mecanismo de distribución de los sólidos sobre una o más bandejas, y los sólidos pueden calentarse directamente, por ejemplo, mediante el contacto directo con aire o vapor caliente o, indirectamente, por ejemplo, por calentamiento de la bandeja que transporta el alimento. Para facilitar la transferencia de los sólidos de una bandeja a la otra, las bandejas que transportan los sólidos pueden incluir aberturas a través de las cuales los sólidos puedan pasar de una bandeja a la siguiente. Los sólidos pueden transportarse desde el desolventizador, opcionalmente, a un mezclador, en donde los sólidos se mezclan con otros subproductos antes de ser transportados al secador. Un ejemplo de la extracción de sólidos se describe en el Ejemplo 63. En este ejemplo, los sólidos se alimentan a un desolventizador, en donde los sólidos entran en contacto con vapor. En una modalidad, los flujos de vapor y sólidos en el desolventizador pueden ser a contracorriente. Después, los sólidos pueden salir del desolventizador y alimentarse a un secador u, opcionalmente, a un mezclador, en donde pueden mezclarse varios subproductos. El vapor que sale del desolventizador puede condensarse y, opcionalmente , mezclarse con miscela y, después, alimentarse a un decantador. La fase rica en agua que sale del decantador puede alimentarse a una columna de destilación, en donde el hexano se elimina de la corriente rica en agua. En una modalidad, la corriente rica en agua de la que se eliminó el hexano sale del fondo de la columna de destilación y puede reciclarse nuevamente al proceso de ferméntación, por ejemplo, puede usarse para mezclar los sólidos de maíz triturados. En otra modalidad, los productos de cabeza y del fondo pueden reciclarse al proceso de fermentación. Por ejemplo, los productos del fondo ricos en lípidos pueden añadirse a la alimentación de un hidrolizador . Los productos de cabeza, por ejemplo, pueden condensarse y alimentarse a un decantador. La corriente rica en hexanos que sale de este decantador puede usarse, opcionalmente, como parte de la alimentación de solvente al extractor. La fase rica en agua que sale de este decantador puede alimentarse a la columna que extrae el hexano del agua. Como puede apreciar una persona con experiencia en la técnica, los métodos de la presente invención pueden modificarse de diversas maneras para optimizar el proceso de fermentación para la producción de un producto de alcohol, tal como butanol .

En otra modalidad de extracción por disolvente de ésteres de ácidos grasos, los sólidos pueden separarse de cerveza y disolvente descargado de la fermentación antes de su introducción en una columna de evaporación instantánea previa como una mezcla heterogénea. Para formar una torta húmeda de estos sólidos se puede usar un dispositivo de separación, tal como un filtro de tamiz o una centrífuga. Una torta de sólidos tamizada se puede lavar por desplazamiento con isobutanol hídrico para extraer los ésteres de ácidos grasos que quedaron retenidos en los sólidos húmedos. Alternativamente, una torta de sólidos centrifugada se puede reducir a pulpa en isobutanol hídrico y separarse otra vez para la extracción de los ésteres de ácidos grasos que quedaron retenidos en los sólidos húmedos. Un ejemplo de esta modalidad de extracción de sólidos se describe en el Ejemplo 63.

En otra modalidad, los subproductos (o coproductos) pueden derivarse de la templa usada en el proceso de fermentación. Por ejemplo, el aceite de maíz puede separarse de la templa y este aceite de maíz puede contener triglicéridos , ácidos grasos libres, diglicéridos , monoglicéridos y fosfolípidos (ver, por ejemplo, el Ejemplo 66) . El aceite de maíz puede añadirse, opcionalmente , a otros subproductos (o coproductos) a intervalos diferentes y, así, por ejemplo, generar la capacidad para modificar la cantidad de triglicéridos en el subproducto resultante. De esta forma, el contenido de grasa del subproducto resultante se puede controlar, por ejemplo, para producir un alimento para animales con alto contenido de proteínas y menos grasa más adecuado a las necesidades de las vacas lecheras que un producto con alto contenido de grasas .

En una modalidad, el aceite de maíz crudo separado de la templa puede procesarse adicionalmente en aceite comestible para consumo o, además, puede usarse como un componente del alimento para animales ya que sería una fuente óptima de energía metabolizable debido a su alto contenido de triglicéridos . En otra modalidad, además, puede usarse como materia prima para biodiesel o diesel renovable.

En una modalidad, el subproducto del extractante puede usarse, total o parcialmente, como un componente de un subproducto de alimento para animales o como materia prima para biodiesel o diesel renovable.

En otra modalidad, los sólidos pueden separarse de la templa y pueden comprender triglicéridos y ácidos grasos libres. Estos sólidos (o corriente) pueden usarse como un alimento para animales, ya sea recuperado como descarga de la centrifugación o después del secado. Los sólidos (o torta húmeda) pueden ser especialmente adecuados como alimento para rumiantes (por ejemplo, vacas lecheras) debido a su alto contenido de lisina disponible y proteína pasante o no degradable en el rumen. Por ejemplo, estos sólidos pueden ser especialmente valiosos en un alimento con alto contenido de proteínas y bajo contenido graso. En otra modalidad, estos sólidos pueden usarse como una base, es decir, otros subproductos, tal como jarabe, pueden añadirse a los sólidos para formar un producto que puede usarse como alimento para animales. En otra modalidad pueden añadirse distintas cantidades de otros subproductos en los sólidos para adaptarse a las propiedades del producto resultante y satisfacer las necesidades de una cierta especie de animales.

La composición de sólidos separados de los residuos de destilación enteros, tal como se describe en el Ejemplo 62, puede incluir, por ejemplo, proteínas crudas, ácidos grasos y ésteres isobutílicos de ácidos grasos. En una modalidad, esta composición (o subproducto) puede usarse, húmeda o seca, como un alimento para animales en los cuales se prefiere, por ejemplo, un alto contenido de proteínas (por ejemplo, alto contenido de lisina) , un bajo contenido de grasas y un alto contenido de fibras. En otra modalidad puede añadirse grasa a esta composición, por ejemplo, a partir de otra corriente de subproducto si se prefiere obtener un alimento para animales con mayor contenido de grasas y bajo contenido de fibras. En una modalidad, este alimento para animales con mayor contenido de grasa y menor contenido de fibras puede usarse para el ganado porcino o aves de corral. En otra modalidad, una composición no acuosa de solubles condensados de destilería (CDS, por sus siglas en inglés) (ver, por ejemplo, el Ejemplo 66) puede incluir, por ejemplo, proteínas, ácidos grasos y ésteres isobutílicos de ácidos grasos además de otros sólidos disueltos y suspendidos, tales como sales y carbohidratos. Esta composición de CDS puede usarse, por ejemplo, como alimento para animales, húmedo o seco, en el cual se prefiere la presencia de un componente de alimentación con alto contenido de proteínas, bajo contenido de grasas y alto contenido de sales minerales. En una modalidad, esta composición puede usarse como un componente de una ración para vacas lecheras .

En otra modalidad, el aceite del proceso de fermentación puede recuperarse mediante evaporación. Esta composición no acuosa puede comprender ésteres isobutílicos de ácidos grasos y ácidos grasos (ver, por ejemplo, el Ejemplo 66) y esta composición (o corriente) puede alimentarse a un hidrolizador para recuperar el isobutanol y los ácidos grasos. En otra modalidad, esta corriente puede usarse como materia prima para la producción de biodiesel .

Las diversas corrientes generadas por la producción de un alcohol (por ejemplo, butanol) mediante un proceso de fermentación pueden combinarse de varias maneras para generar varios coproductos . Por ejemplo, si el maíz crudo de la templa se usa para generar ácidos grasos que se usarán como extractante y los lípidos se extraen por medio de evaporadores para otros propósitos, entonces, las corrientes restantes pueden combinarse y procesarse para crear una composición del coproducto que comprende proteínas crudas, grasas crudas, triglicéridos , ácidos grasos y esteres isobutílicos de ácidos grasos. En una modalidad, esta composición puede comprender al menos aproximadamente 20-35 % en peso de proteína cruda, al menos 1-20 % en peso de grasa cruda, al menos aproximadamente 0-5 % en peso de triglicéridos, al menos aproximadamente 4-10 % en peso de ácido graso y al menos aproximadamente 2-6 % en peso de áster isobutílico de ácido graso. En una modalidad específica, la composición del coproducto puede comprender aproximadamente 25 % en peso de proteína cruda, aproximadamente 10 % en peso de grasa cruda, aproximadamente 0.5 % en peso de triglicéridos, aproximadamente 6 % en peso de ácido graso y aproximadamente 4 % en peso de éster isobutílico de ácido graso .

En otra modalidad, el lípido se extrae por medio de evaporadores y los ácidos grasos se usan para otros propósitos, y aproximadamente 50 % en peso del maíz crudo de la templa y las corrientes restantes se combinan y procesan; la composición del coproducto resultante puede comprender proteínas crudas, grasas crudas, triglicéridos, ácidos grasos y ésteres isobutílicos de ácidos grasos. En una modalidad, esta composición puede comprender al menos aproximadamente 25-31 % en peso de proteína cruda, al menos aproximadamente 6-10 % en peso de grasa cruda, al menos aproximadamente 4-8 % en peso de triglicéridos , al menos aproximadamente 0-2 % en peso de ácido graso y al menos aproximadamente 1-3 % en peso de éster isobutílico de ácido graso. En una modalidad específica, la composición del coproducto puede comprender aproximadamente 28 % en peso de proteína cruda, aproximadamente 8 % en peso de grasa cruda, aproximadamente 6 % en peso de triglicéridos, aproximadamente 0.7 % en peso de ácido graso y aproximadamente 1 % en peso de éster isobutílico de ácido graso.

En otra modalidad, los sólidos separados de los residuos de destilación enteros y 50 % en peso del aceite de maíz extraído de la templa se combinan, y la composición del coproducto resultante puede comprender proteínas crudas, grasas crudas, triglicéridos, ácidos grasos, ésteres isobutílicos de ácidos grasos, lisina, fibra detergente neutra (NDF, por sus siglas en inglés) y fibra detergente ácida (ADF, por sus siglas en inglés) . En una modalidad, esta composición puede comprender al menos aproximadamente 26-34 % en peso de proteína cruda, al menos aproximadamente 15-25 % en peso de grasa cruda, al menos aproximadamente 12-20 % en peso de triglicéridos, al menos aproximadamente 1-2 % en peso de ácido graso, al menos aproximadamente 2-4 % en peso de éster isobutílico de ácido graso, al menos aproximadamente 1-2 % en peso de lisina, al menos aproximadamente 11-23 % en peso de NDF y al menos aproximadamente 5-11 % en peso de ADF. En una modalidad específica, la composición del coproducto puede comprender aproximadamente 29 % en peso de proteína cruda, aproximadamente 21 % en peso de grasa cruda, aproximadamente 16 % en peso de triglicéridos , aproximadamente 1 % en peso de ácido graso, aproximadamente 3 % en peso de éster isobutílico de ácido graso, aproximadamente 1 % en peso de lisina, aproximadamente 17 % en peso de NDF y aproximadamente 8 % en peso de ADF. Esta composición del coproducto con alto contenido de grasa, triglicéridos y lisina y bajo contenido de fibras puede preferirse como alimento para el ganado porcino y aves de corral .

Como se describió anteriormente, las diversas corrientes generadas mediante la producción de un alcohol (por ejemplo, butanol) a través de un proceso de fermentación pueden combinarse de varias maneras para generar una composición del coproducto que comprende proteína cruda, grasa cruda, triglicéridos, ácido graso y éster isobutílico de ácido graso. Por ejemplo, una composición que comprende al menos aproximadamente 6 % de grasa cruda y al menos aproximadamente 28 % de proteína cruda se puede usar como un producto de alimento para animales lecheros. Una composición que comprende al menos aproximadamente 6 % de grasa cruda y al menos aproximadamente 26 % de proteína cruda se puede usar como un producto de alimento para el ganado de lote de engorde mientras que una composición que comprende al menos aproximadamente 1 % de grasa cruda y al menos aproximadamente 27 % de proteína cruda se puede usar como un producto de alimento para ganado de invernada. Una composición que comprende al menos aproximadamente 13 % de grasa cruda y al menos aproximadamente 27 % de proteína cruda se puede usar como un producto de alimento para aves de corral. Una composición que comprende al menos aproximadamente 18 % de grasa cruda y al menos aproximadamente 22 % de proteína cruda se puede usar como un producto de alimento para animales monogástricos . Así, las diversas corrientes pueden combinarse para obtener un producto de alimento adaptado para una especie animal específica.

En una modalidad, una o más corrientes generadas mediante la producción de un alcohol (por ejemplo, butanol) a través de un proceso de fermentación pueden combinarse de varias maneras para generar una composición que comprende al menos aproximadamente 90 % de COFA que puede usarse como una fuente de combustible, tal como biodiesel .

Como ejemplo de una modalidad de los métodos de la invención, el grano molido (por ejemplo, maíz procesado con un molino triturador) y una o más enzimas se combinan para generar una suspensión de granos. Esta suspensión de granos se coce, licúa y, opcionalmente , se vaporiza con vapor instantáneo para producir una templa cocida. Después, la templa cocida se filtra para eliminar los sólidos suspendidos y generar una torta húmeda y un filtrado. La filtración puede realizarse mediante diversos métodos, tales como centrifugación, tamizado o filtración al vacío, y esta etapa de filtración puede eliminar entre al menos aproximadamente 80 % y al menos aproximadamente 99 % de los sólidos suspendidos de la templa.

La torta húmeda se resuspende con agua y se filtra otra vez para eliminar el almidón adicional y generar una torta filtrada lavada. El proceso de resuspensión puede repetirse varias veces, por ejemplo, de una a cinco veces. El agua usada para resuspender la torta húmeda puede ser agua reciclada generada durante el proceso de fermentación. El filtrado producido mediante el proceso de resuspensión/refiltración puede volver a la etapa de mezclado inicial para formar una suspensión con el grano molido. El filtrado puede calentarse o enfriarse antes de la etapa de mezclado.

La torta de filtro lavada puede resuspenderse con cerveza en varias etapas durante el proceso de producción. Por ejemplo, la torta de filtro lavada puede resuspenderse con cerveza después del termentador, antes de la columna de evaporación instantánea previa o en el punto de alimentación al secador de granos de los destiladores. La torta de filtro lavada se puede secar separadamente de otros subproductos o puede usarse directamente como torta húmeda para la generación de DDGS o un producto de alimento para animales.

El filtrado obtenido como resultado de la etapa de mezclado inicial puede procesarse adicionalmente como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, el filtrado puede calentarse mediante vapor o intercambio de calor de proceso a proceso. Una enzima de sacarificación puede añadirse en el filtrado y el almidón disuelto del filtrado se puede sacarificar parcial o completamente. El filtrado sacarificado puede enfriarse por diversos métodos, tales como intercambio de proceso a proceso, intercambio con agua de enfriamiento o intercambio con agua helada.

El filtrado enfriado puede añadirse después a un fermentador además de un microorganismo adecuado para la producción de alcohol, por ejemplo, una levadura recombinante capaz de producir butanol . Adicionalmente, en el fermentador se puede añadir corrientes de amoníaco y reciclado. Este proceso puede incluir al menos un fermentador, al menos dos termentadores, al menos tres termentadores o al menos cuatro termentadores. El dióxido de carbono generado durante la fermentación se puede descargar a un depurador para reducir las emisiones al aire (por ejemplo, emisiones de butanol al aire) y para aumentar el rendimiento del producto.

El disolvente se puede añadir al termentador a través de un circuito reciclado o en forma directa. El disolvente puede ser uno o más compuestos orgánicos que tienen la capacidad de disolverse o reaccionar con el alcohol (por ejemplo, butanol) y puede tener una solubilidad limitada en agua. El disolvente puede extraerse del termentador en forma continua como un material de fase de un solo líquido o como un material de fase de dos líquidos o el disolvente puede extraerse en forma discontinua como un material de fase de uno o dos líquidos.

La cerveza puede desgasificarse. La cerveza puede calentarse antes de la desgasificación, por ejemplo, mediante intercambio de proceso a proceso con templa caliente o intercambio de proceso a proceso con productos de cabeza de la columna de evaporación instantánea previa. Los vapores se pueden descargar a un condensador y, después, a un depurador. La cerveza desgasificada puede calentarse adicionalmente, por ejemplo, mediante intercambio de calor de proceso a proceso con otras corrientes en el área de destilación.

La cerveza y el disolvente precalentados pueden entrar a una columna de evaporación instantánea previa que se puede retroalimentar desde una columna de cerveza de una planta de trituración en seco de combustible de etanol convencional. Esta columna puede funcionar a presión subatmosférica, impulsada mediante vapor de agua provisto por el tren de un evaporador o desde la etapa de cocido de la templa. Los productos de cabeza de la columna de evaporación instantánea previa pueden condensarse mediante intercambio de calor con alguna combinación de agua de enfriamiento e intercambio de calor de proceso a proceso que incluye el intercambio de calor con la alimentación de la columna de evaporación instantánea previa. El condensado líquido puede estar dirigido a un decantador de alcohol/agua (por ejemplo, decantador de butanol/agua) .

Los productos del fondo de la columna de evaporación instantánea previa pueden pasar a un decantador de disolvente. El alcohol libre (por ejemplo, butanol) puede eliminarse sustancialmente de los productos del fondo de la columna de evaporación instantánea previa. El decantador puede ser un pozo de destilación, una centrífuga o un hidrociclón. En este decantador, el agua se separa sustancialmente de la fase disolvente y genera una fase acuosa. La fase acuosa que incluye sólidos suspendidos y disueltos puede centrifugarse para producir una torta húmeda y residuos finos de destilación. La torta húmeda puede combinarse con otras corrientes y secarse para producir DDGS, puede secarse y comercializarse en forma separada de otras corrientes que producen DDGS o puede comercializarse como una torta húmeda. La fase acuosa puede dividirse para proporcionar una contracorriente que se usa, en parte, para resuspender la torta de filtro descrita anteriormente. La separación proporciona, además, residuos finos de destilación que pueden bombearse a evaporadores para su procesamiento posterior .

La fase orgánica producida en el decantador de disolvente puede ser un éster de un alcohol (por ejemplo, butanol) . El disolvente puede hidrolizarse para regenerar el disolvente reactivo y recuperar alcohol adicional (por ejemplo, butanol) . Alternativamente, la fase orgánica puede filtrarse y comercializarse como un producto. La hidrólisis puede activarse térmicamente, catalizarse homogéneamente o catalizarse heterogéneamente. La hidrólisis puede producirse, además, por reacción enzimática. La entrada de calor a este proceso puede ser un calentador por combustión, aceite caliente, entrada eléctrica de calor o corriente de alta presión. El agua añadida para activar la hidrólisis puede ser provista por una corriente de agua reciclada, agua dulce o vapor .

El disolvente hidrolizado enfriado se puede bombear a una columna de disolvente a presión subatmosférica , en donde el alcohol (por ejemplo, butanol) se puede eliminar sustancialmente con vapor. Esta corriente puede ser vapor de agua de los evaporadores, vapor de la etapa de evaporación del proceso de la templa o vapor de un generador (ver, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0171129, incorporada en la presente descripción como referencia) . Una columna rectificadora de una planta de trituración en seco de etanol convencional puede ser adecuada como una columna de disolvente. La columna rectificadora se puede modificar para usarse como una columna de disolvente. Los productos del fondo de la columna de disolvente pueden enfriarse, por ejemplo, mediante agua de enfriamiento o intercambio de calor de proceso a proceso. Los productos del fondo enfriados pueden decantarse para eliminar el agua residual y el agua residual puede reciclarse a otras etapas del proceso o reciclarse a la etapa de formación de la templa .

Los productos de cabeza de la columna de disolvente se pueden enfriar mediante intercambio con agua de enfriamiento o intercambio de calor de proceso a proceso, y el condensado puede dirigirse a un decantador de alcohol/agua (por ejemplo, decantador de butanol/agua) descargado que se puede compartir con los productos de cabeza de la columna de evaporación instantánea previa. En este decantador pueden añadirse otras corrientes mezcladas de agua y alcohol (por ejemplo, butanol) que incluyen los productos del fondo del depurador y el condensado de la etapa de desgasificación. La descarga que comprende dióxido de carbono puede estar dirigida a un depurador de agua. La capa acuosa de este decantador puede alimentarse, además, a la columna de disolvente o puede eliminarse el alcohol (por ejemplo, butanol) de esta en una columna de destilación pequeña específica. La capa acuosa puede precalentarse mediante intercambio de proceso a proceso con los productos de cabeza de la columna de evaporación instantánea previa, productos de cabeza de la columna de disolvente o productos del fondo de la columna de disolvente. Esta columna específica se puede modificar desde el extractor lateral de un proceso de trituración en seco de combustible de etanol convencional.

La capa orgánica del decantador de alcohol/agua (por ejemplo, decantador de butanol/agua) se puede bombear a una columna de alcohol (por ejemplo, butanol) . Esta columna puede ser una columna a presión superatmosférica y puede activarse por la condensación de vapor dentro de un reevaporador . La alimentación a la columna se puede calentar mediante intercambio de calor de proceso a proceso para reducir la cantidad de energía necesaria para que la columna funcione. Este intercambiador de proceso a proceso puede incluir un condensador parcial de la columna de evaporación instantánea previa, un condensador parcial de una columna de disolvente, el producto del hidrolizador, vapor de agua de los evaporadores o los productos del fondo de la columna de butanol. El condensado del vapor de la columna de alcohol (por ejemplo, butanol) se puede enfriar y puede volver al decantador de alcohol/agua (por ejemplo, decantador de butanol/agua) . Los productos del fondo de la columna de alcohol (por ejemplo, butanol) se pueden enfriar mediante intercambio de calor de proceso a proceso que incluye el intercambio con la alimentación de la columna de alcohol (por ejemplo, butanol) y se pueden enfriar, además, con agua de enfriamiento, filtrarse y comercializarse como un producto de alcohol (por ejemplo, butanol) .

Los residuos finos de destilación generados a partir de los productos del fondo de la columna de evaporación instantánea previa, como se describió anteriormente, pueden dirigirse a un evaporador de efecto múltiple. Este evaporador puede tener dos, tres o más etapas. El evaporador puede tener una configuración de cuatro cuerpos y dos efectos, similar al diseño convencional de una planta de combustible de etanol, tres cuerpos y tres efectos u otras configuraciones. Los residuos finos de destilación pueden entrar en cualquiera de los efectos. Al menos uno de los primeros cuerpos de efectos se puede calentar con vapor proveniente de la columna de alcohol (por ejemplo, butanol) a presión superatmosférica . El vapor se puede obtener desde el efecto de menor presión para proporcionar calor en forma de vapor de agua a la columna de evaporación instantánea previa a presión subatmosférica y a la columna de disolvente. El jarabe de los evaporadores puede añadirse en el secador de granos del destilador.

Las emisiones de dióxido de carbono del termentador, desgasificador, decantador de alcohol/agua (por ejemplo, decantador de butanol/agua) y otras fuentes pueden estar dirigidas a un depurador de agua. El agua suministrada a la parte superior de este depurador puede ser agua dulce complementaria o agua reciclada. El agua reciclada se puede tratar (por ejemplo, mediante digestión biológica) para eliminar los compuestos orgánicos volátiles y se puede enfriar. Los productos del fondo del depurador se pueden enviar al decantador de alcohol/agua (por ejemplo, decantador de butanol/agua), a la columna de disolvente o se pueden usar con agua reciclada para resuspender la torta húmeda descrita anteriormente. El condensado de los evaporadores se puede tratar mediante digestión biológica anaeróbica u otros procesos para purificar el agua antes del reciclado y resuspender las tortas de filtro. si la fuente de grano molido es maíz, el aceite de maíz se puede separar de las corrientes del proceso en cualquier punto. Por ejemplo, se puede usar una centrífuga para producir una corriente de aceite de maíz después de la filtración de la templa cocida o la centrífuga de la fase de agua de la columna de evaporación instantánea previa puede producir una corriente de aceite de maíz. El jarabe de concentración intermedia para el jarabe final se puede centrifugar para producir una corriente de aceite de maíz.

En otro ejemplo de una modalidad de los métodos de la invención, el material descargado del termentador se puede procesar en un sistema de separación que implica el uso de dispositivos tales como una centrífuga, un ajustador, un hidrociclón, etc. y combinaciones de estos para recuperar la levadura viva en una forma concentrada que se puede reciclar para reusar en un lote de fermentación posterior ya sea directamente o después de cierto reacondicionamiento. Este sistema de separación puede producir, además, una corriente orgánica que comprende ésteres grasos (por ejemplo, esteres isobutílicos grasos) y un alcohol (por ejemplo, isobutanol) generada a partir de la fermentación y una corriente acuosa que contiene solamente niveles traza de orgánicos inmiscibles. Esta corriente acuosa se puede usar antes o después de extraer el contenido de alcohol (por ejemplo, isobutanol) para reducir a pulpa y bombear los sólidos con bajo contenido de almidón que se separaron y lavaron a partir de la templa licuada. Esto tiene la ventaja de evitar un sistema que puede ser un sistema transmisor impulsado por cadena larga para transferir estos sólidos desde el área de licuación al área de secado de granos y mezcla de jarabe. Además, estos residuos de destilación enteros producidos después de la extracción del alcohol (por ejemplo, isobutanol) se deberán separar en residuos finos de destilación y fracciones de torta húmeda mediante dispositivos de separación existentes o nuevos, y estos residuos finos de destilación formarán parcialmente la contracorriente que vuelve para combinarse con el agua de cocción para preparar un nuevo lote de templa fermentable. Otra ventaja de esta modalidad es que cualquier almidón disuelto residual que quedó retenido en la humedad de los sólidos separados a partir de la templa licuada se pueden captar parcialmente y recuperar a través de esta contracorriente. Alternativamente, la levadura contenida en la corriente de sólidos puede ser considerada no viable y dispersarse nuevamente en la corriente acuosa, y cualquier contenido de alcohol (por ejemplo, butanol) remanente de la fermentación puede destilarse de esta corriente combinada. Además, los organismos no viables se pueden separar para usarse como un nutriente en el proceso de propagación.

En otra modalidad, el material multifase puede extraerse del fondo de la columna de evaporación instantánea previa y procesarse en un sistema de separación como se describió anteriormente. Los sólidos concentrados se pueden redispersar en la corriente acuosa y esta corriente combinada se puede usar para reducir a pulpa y bombear los sólidos con bajo contenido de almidón que se separaron y lavaron a partir de la templa licuada.

El proceso descrito anteriormente, además de otros procesos descritos en la presente invención, pueden demostrarse mediante modelado por computación, tal como modelado Aspen (ver, por ejemplo, la patente de los Estados 1 Unidos núm. 7,666,282). Por ejemplo, la aplicación informática de modelado comercial Aspen Plus® (Aspen Technology, Inc., Burlington, A) se puede usar junto con bases de datos de propiedades físicas, tales como DIPPR, disponible de American Institute of Chemical Engineers, Inc. (New York, NY) para desarrollar un modelo Aspen para un proceso integrado de fermentación de butanol, purificación y manejo de agua. Este modelado del proceso puede realizar cualquier cálculo de ingeniería fundamental, por ejemplo, balance de masa y energía, equilibrio vapor/líquido y cálculos de la tasa de reacción. Para generar un modelo Aspen, los datos que se deben ingresar pueden incluir, por ejemplo, datos experimentales, contenido de agua y composición de la materia prima, temperatura de cocido de la templa y evaporación instantánea, condiciones de sacarificación (por ejemplo, alimentación de enzimas, conversión del almidón, temperatura, presión) , condiciones de fermentación (por ejemplo, alimentación de microorganismos, conversión de glucosa, temperatura, presión) , condiciones de desgasificación, columnas de disolvente, columnas de evaporación instantánea previa, condensadores, evaporadores , centrífugas, etc.

La presente invención proporciona sistemas y métodos para generar un producto fermentativo, tal como un producto de alcohol, a través de fermentación, así como para incrementar la productividad y la eficacia de los costos del procesamiento de la biomasa. En algunas modalidades, el producto de alcohol es butanol . Una materia prima se puede licuar para crear una suspensión de materia prima, en donde la suspensión de materia prima incluye azúcar soluble y sólidos no disueltos. Si la suspensión de materia prima se alimenta directamente al fermentador, los sólidos no disueltos pueden interferir con la eliminación y recuperación eficiente de un producto de alcohol, tal como butanol, del fermentador. Particularmente, cuando se usa la extracción líquido- líquido para extraer butanol del caldo de fermentación, la presencia de los particulados puede generar inconvenientes en el sistema que incluyen, pero no se limitan a, reducir la velocidad de transferencia de masa del butanol al extractante al interferir con el contacto entre el extractante y el caldo de fermentación; crear una emulsión en el fermentador y, de ese modo, interferir con la separación de fases adecuada del extractante y el caldo de fermentación; reducir la eficacia de recuperación y reciclado del extractante porque al menos una porción del extractante y el butanol queda "atrapada" en los sólidos que, en última instancia, se eliminan como DDGS; una menor eficacia del volumen del fermentador porque hay sólidos que ocupan volumen en el fermentador y porque se produce un desacoplamiento más lento del extractante del caldo de fermentación; y el acortamiento del ciclo de vida del extractante por contaminación con aceite de maíz. Todos estos efectos aumentan los costos de capital y operativos. Adicionalmente , el extractante "atrapado" en los DDGS puede reducir el valor de los DDGS y su calificación para la venta como alimento para animales. Así, para evitar y/o minimizar estos problemas, al menos una porción de las partículas no disueltas (o sólidos) se eliminan de la suspensión de materia prima antes de la adición de azúcar presente en la suspensión de materia prima al termentador. La actividad de extracción y la eficacia de la producción de butanol se incrementan cuando la extracción se realiza en un caldo de fermentación que contiene una solución acuosa, en donde se eliminaron las partículas no disueltas con respecto a la extracción realizada en un caldo de fermentación que contiene una solución acuosa, en donde las partículas no disueltas se han eliminado .

La fermentación extractiva sin la presencia de sólidos no disueltos puede generar una velocidad de transferencia de masa más alta del producto de alcohol desde el caldo de cultivo de fermentación hasta el extractante, una separación de fases mejorada del extractante de la fermentación interna o externa al termentador y una menor retención del extractante como resultado de mayores velocidades de elevación de gotitas del extractante. Además, por ejemplo, las gotitas de extractante retenidas en el caldo de cultivo de la fermentación durante la fermentación se liberarán del caldo de cultivo de la fermentación con mayor velocidad y en forma más completa y, de ese modo, producirán menos extractante libre en el caldo de cultivo de la fermentación y pueden reducir la cantidad de extractante perdido en el proceso. Adicionalmente , por ejemplo, el microorganismo se puede reciclar y se pueden eliminar los equipos adicionales en el procesamiento corriente abajo, tales como una columna de cerveza y/o algunas o todas las centrífugas de residuos de destilación enteros. Adicionalmente, por ejemplo, se elimina la posibilidad de pérdida de extractante en los DDGS. Además, por ejemplo, la capacidad para reciclar el microorganismo puede aumentar la velocidad general de producción del producto de alcohol, reducir el requerimiento de título general y/o reducir el requerimiento de título acuoso y producir un microorganismo más saludable y una velocidad de producción más alta. Adicionalmente, por ejemplo, se puede eliminar un agitador en el fermentador para reducir los costos de capital; para aumentar la productividad del fermentador dado que el volumen se usa con mayor eficacia porque se minimiza la retención del extractante y los sólidos no disueltos no están presentes; y/o para usar fermentación continua o termentadores más pequeños en una planta de producción totalmente nueva.

Los ejemplos de la mayor eficacia de extracción pueden incluir, por ejemplo, un coeficiente de partición estabilizado, separación de fases mejorada (por ejemplo, más rápida o más completa) , mayor coeficiente de transferencia de masa líquido- líquido, operación a un título más bajo, mayor capacidad de reciclado de la corriente del proceso, mayor eficacia del volumen de fermentación, mayor alimentación de la carga de materia prima (por ejemplo, maíz) , mayor tolerancia del microorganismo (por ejemplo, un microorganismo recombinante) al título del butanol, reciclado de agua, reducción en la energía, mayor reciclado del extractante y/o reciclado del microorganismo.

Por ejemplo, se reducirá el volumen del fermentador captado por los sólidos. Por lo tanto, el volumen eficaz del fermentador disponible para la fermentación puede aumentar. En algunas modalidades, el volumen del fermentador disponible para la fermentación aumenta en al menos aproximadamente 10 %.

Por ejemplo, el coeficiente de partición se puede estabilizar. Dado que el aceite de maíz en el fermentador se puede reducir mediante la eliminación de los sólidos de la mezcla de materia prima antes de la fermentación, el extractante se expone a una cantidad de aceite de maíz menor que se combina con el extractante y puede reducir el coeficiente de partición si está presente en una cantidad suficiente. Por lo tanto, la reducción del aceite de maíz introducido en el termentador produce un coeficiente de partición más estable de la fase extractante en el termentador. En algunas modalidades, el coeficiente de partición se reduce en menos de aproximadamente 10 % durante 10 ciclos de fermentación.

Por ejemplo, la eficiencia de extracción del butanol con extractante puede aumentar porque la velocidad de transferencia de masa (por ejemplo, en la forma de un coeficiente de transferencia de masa mayor) del producto de alcohol desde el caldo de cultivo de la fermentación al extractante será mayor y la producción del producto de alcohol será más eficaz. En algunas modalidades, el coeficiente de transferencia de masa aumenta al menos al doble (ver los Ejemplos 4 y 5) .

Adicionalmente , puede producirse un aumento en la separación de fases entre el caldo de cultivo de la fermentación y el extractante que reduce la probabilidad de formación de una emulsión y, por lo tanto, mejora la eficacia de producción del producto de alcohol. Por ejemplo, las fases se pueden separar con mayor velocidad o la separación puede ser más completa. En algunas modalidades se puede producir una separación de fases en la cual no se observa una separación de fases previa apreciable en 24 horas. En algunas modalidades, la separación de fases se produce con una rapidez de al menos aproximadamente el doble, al menos aproximadamente cinco veces mayor o al menos aproximadamente 10 veces mayor que la separación de fases en la cual no se extrajeron los sólidos (ver los Ejemplos 6 y 7) .

Adicionalmente , puede haber un aumento en la recuperación y el reciclado del extractante. El extractante no quedará "atrapado" en los sólidos que, en última instancia, se eliminarán como DDGS y, de ese modo, aumentará la eficacia de la producción del producto de alcohol (ver los Ejemplos 8 y 9) . Además, la dilución del extractante con aceite de maíz será menor y la degradación del extractante puede reducirse (ver el Ejemplo 10) .

Además, el régimen de flujo del extractante se puede reducir de manera que se reduzcan también los costos operativos y, en consecuencia, aumente la eficacia de la producción del producto de alcohol.

Adicionalmente, la retención del extractante se reducirá como resultado de las gotitas de extractante que suben a una mayor velocidad, lo que aumenta la eficacia de la producción del producto de alcohol. La reducción de la cantidad de sólidos no disueltos en el fermentador aumentará, además, la eficacia de la producción del producto de alcohol.

Adicionalmente, se puede eliminar un agitador del fermentador ya que no es necesario suspender los sólidos no disueltos para reducir así los costos de capital y energía y aumentar la eficacia de la producción del producto de alcohol .

Las Figuras 1-5 proporcionan varias modalidades no limitantes de métodos y sistemas que implican procesos de fermentación en los cuales se producen esteres de alcohol in si tu, se extraen del medio de fermentación y se hacen reaccionar para recuperar producto de alcohol. Las Figs . 1-5 proporcionan, además, varias modalidades no limitantes de métodos y sistemas para usar ácido carboxílico que se puede esterificar con producto de alcohol y puede servir, contemporáneamente, como un extractante para ISPR. Las Figs. 1-5 proporcionan, además, varias modalidades no limitantes de métodos y sistemas para convertir lípidos en una materia prima en ácido carboxílico que se puede esterificar con producto de alcohol y puede servir, contemporáneamente, como un extractante para ISPR.

En algunas modalidades, que incluyen cualquiera de las modalidades mencionadas anteriormente descritas con referencia a las Figs. 1-5, el caldo de fermentación en el recipiente de fermentación 30 incluye al menos un microorganismo recombinante 32 modificado genéticamente (es decir, diseñado por ingeniería genética) para producir butanol a través de una ruta biosintética de al menos una fuente de carbono fermentable. Particularmente, los microorganismos recombinantes se pueden crecer en un caldo de fermentación que contiene sustratos de carbono adecuados. Los sustratos de carbono adicionales pueden incluir, pero no se limitan a, monosacáridos tales como fructosa y galactosa; oligosacáridos tales como lactosa, maltosa o sacarosa ; polisacáridos tales como almidón o celulosa; o mezclas de estos y mezclas no purificadas de materias primas renovables tales como permeato de suero de queso, licor de maceración del maíz, melaza de remolacha azucarera y malta de cebada. Otros sustratos de carbono pueden incluir etanol, lactato, succinato o glicerol.

Además, los sustratos de carbono también pueden ser sustratos de un solo carbono, tal como dióxido de carbono o metanol, para los que se ha demostrado la conversión metabólica en productos intermedios bioquímicos clave. Además de los sustratos de uno y de dos carbonos, se conoce que los organismos metilotróficos usan, además, diversos compuestos adicionales que contienen carbono, tales como metilamina, glucosamina y diversos aminoácidos para la actividad metabólica. Por ejemplo, se conoce que las levaduras metilotróficas usan el carbono de la metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion et al., Microb. Growth Cl Compd., [Int. Symp.], 7.° (1993), 415-32, Editor (es): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, Reino Unido de Gran Bretaña) . Análogamente, diversas especies de Candida metabolizarán alanina u ácido oleico (Sulter et al., Arch. Microbiol. 153:485-489, 1990). Por lo tanto, se contempla que la fuente de carbono usada en la presente invención puede abarcar una amplia variedad de sustratos que contienen carbono, y el uso estará únicamente limitado por la elección del organismo.

Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono mencionados anteriormente y las mezclas de estos son adecuados, en algunas modalidades, los sustratos de carbono son glucosa, fructosa y sacarosa o mezclas de estos con azúcares de C5, tales como xilosa y/o arabinosa para células de levaduras modificadas para usar azúcares C5. La sacarosa puede derivarse de fuentes de azúcar renovables, tales como caña de azúcar, betabel azucarero, mandioca, sorgo dulce, y mezclas de estos. La glucosa y la dextrosa pueden derivarse de fuentes de granos renovables a través de la sacarificación de materias primas a base de almidón que incluyen granos, tales como maíz, trigo, centeno, cebada, avena, y mezclas de estos. Además, los azúcares fermentables pueden derivarse de biomasa renovable celulósica o lignocelulósica a través de procesos de pretratamiento y sacarificación, tal como se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0031918 Al, incorporada en la presente descripción como referencia. Además de una fuente de carbono apropiada (de la corriente acuosa 22), el caldo de fermentación debe contener minerales, sales, cofactores, amortiguadores y otros componentes adecuados conocidos para las personas con experiencia en la técnica, adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de una ruta enzimática para la producción de un producto de alcohol .

De la descripción precedente y de los ejemplos, una persona con experiencia en la técnica puede determinar las características esenciales de la presente invención y sin apartarse de la presente invención podrá introducir diversos cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones. Por ejemplo, en algunas modalidades, para la esterificación y extracción de alcohol de conformidad con la presente invención puede usarse prefermentación, es decir, durante el cultivo de semillas de microorganismos 32 antes de la fermentación en el recipiente de fermentación 30. Típicamente, los microorganismos 32 tales como levadura se pueden crecer a partir de un cultivo de semillas hasta una concentración de células deseada antes de la recolección e inoculación en el recipiente de fermentación 30, tal como se conoce en la técnica.

La materia prima de la fuente de carbono es un factor de costo importante en la producción de microorganismos tales como la producción de levadura y, en consecuencia, la producción de biomasa en azúcar es un criterio de optimización importante. Dado que la producción de ATP a partir de la fermentación alcohólica es mucho menor que la de la desasimilación del azúcar respiratorio, la ocurrencia de fermentación alcohólica afecta negativamente la producción de biomasa y se intenta evitarla durante la producción de levadura (es decir, cultivo de semillas) . Sin embargo, el cultivo de microorganismos en un medio de cultivo de semillas puede producir una cantidad de producto de fermentación que incluye alcohol. Por ejemplo, en la levadura de S. cerevisiae, la fermentación y respiración alcohólica se producen simultáneamente siempre que el índice de crecimiento específico (µ) y/o la concentración de azúcar en cultivos aeróbicos exceda un valor crítico (ver, por ejemplo, van Hoek, et al., Biotechnol . Bioeng. 68:517-523, 2000). Típicamente, para obtener una alta producción de biomasa, el crecimiento de levadura se controla, por ejemplo, por medio de condiciones respiratorias con tecnología de fermentación por lote alimentado para cultivo de semillas. Por ejemplo, el azúcar se alimenta a una velocidad baja y produce una concentración de azúcar baja en el cultivo y un índice bajo de captación de azúcar de manera que el metabolismo del azúcar pueda ser prácticamente respiratorio. En estas condiciones se puede obtener una producción de biomasa alta y la acumulación de productos tóxicos se puede minimizar. En la práctica, en procesos industriales de lote alimentado a gran escala, las células pueden exponerse a gradientes de concentración debido al mezclado ineficaz (ver, por ejemplo, Enfors, et al., J. Biotechnol . 85:175-185, 2001). La producción y reasimilación de subproductos de fermentación puede ser una de las razones para reducir la producción de biomasa por glucosa en bioreactores de gran escala en comparación con los de laboratorio.

Sin embargo, en estas condiciones, cuando se cultiva levadura productora de butanol, por ejemplo, el producto de fermentación que incluye butanol no se puede reasimilar y puede acumularse en el medio de cultivo que puede ser tóxico para los microorganismos a una concentración alta. Si la acumulación del producto excede las concentraciones inhibidoras del crecimiento celular críticas (por ejemplo, el crecimiento celular es menor que el crecimiento que puede estar limitado por el alimento) , entonces se puede producir una pérdida del control del lote alimentado. De conformidad con la presente invención, el uso de esterificación y extracción de alcohol para eliminar butanol del medio de cultivo puede ser útil para que la fermentación por lote alimentado continúe a pesar de los problemas con la toxicidad del butanol y el mezclado ineficaz .

Por lo tanto, de conformidad con algunas modalidades, el medio de cultivo de semillas se puede poner en contacto con el catalizador 42 y el ácido carboxílico 28 que lleva a la producción de esteres de alcohol por la esterificación del producto de alcohol y, en última instancia, a una mayor producción de biomasa por glucosa en bioreactores a gran escala. Además, la concentración de producto de alcohol en el medio de cultivo se puede controlar por la esterificación del alcohol y, por lo tanto, minimiza o evita los efectos negativos del producto de alcohol en los microorganismos. En algunas modalidades, los ésteres de alcohol pueden extraerse del medio de cultivo de semillas y el alcohol puede recuperarse de los ésteres de alcohol en la misma manera en que se describió anteriormente con respecto a la extracción de ésteres de alcohol del recipiente de fermentación 30 y la recuperación del producto de alcohol 54. En algunas modalidades, la esterificación del alcohol de conformidad con la presente invención puede usarse para esterificar el producto de alcohol en el medio de cultivo de semillas y el medio de fermentación. En las modalidades puede obtenerse una mayor producción del producto de alcohol para el proceso de fermentación en su totalidad mediante la recuperación de los ésteres de alcohol (y producto de alcohol libre) del medio de fermentación y, además, la recuperación de ésteres de alcohol producidos durante el cultivo de semillas (por ejemplo, recuperación de ésteres de alcohol y/o producto de alcohol de un tanque de propagación) . En algunas modalidades, en la esterificación del alcohol de conformidad con la presente invención se puede usar fermentación previa para eliminar el alcohol del medio de cultivo de semillas, mientras que la ISPR convencional del producto de alcohol puede usarse para eliminar el producto de alcohol durante la fermentación en el recipiente de fermentación 30.

Por lo tanto, será evidente que la esterificación y extracción del alcohol de conformidad con la presente invención puede usarse en varias etapas en un proceso de fermentación de alcohol sin apartarse de la presente invención .

Los productos de alcohol producidos por los métodos de la presente invención tienen diversas aplicaciones, por ejemplo, como reactivos, disolventes y combustible. El butanol producido por los métodos reivindicados puede usarse directamente como un combustible (por ejemplo, biocombustible) , un aditivo de combustible, un alcohol útil para la producción de ésteres que se puede usar como combustible diesel o biodiesel, una sustancia química de materia prima en la industria del plástico, un ingrediente en productos formulados tales como cosméticos y un intermedio químico. El butanol puede usarse, además, como disolvente para pinturas, revestimientos, barnices, resinas, gomas, tintes, grasas, ceras, resinas, goma laca, hules y alcaloides. Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos alternativos para producir alcoholes, que incluyen butanol, que pueden solucionar la alta demanda por estas sustancias químicas industriales.

Microorganismos recombinantes y rutas biosintéticas del butanol Sin limitaciones teóricas de ninguna especie, se cree que los procesos descritos en la presente descripción son útiles junto con cualquier microorganismo productor de alcohol, particularmente, microorganismos recombinantes que producen alcohol con títulos superiores a sus niveles de tolerancia .

En la técnica se conocen los microorganismos productores de alcohol. Por ejemplo, la oxidación fermentativa de metano por bacterias metanotróficas (por ejemplo, Methylosinus trichosporium) produce metanol y el contacto del metanol (un alcohol alquílico de Ci) con un ácido carboxílico y un catalizador capaz de esterificar el ácido carboxílico con metanol forma un éster metanólico del ácido carboxílico. La cepa de levadura CEN. PK113-7D (CBS 8340, Centraal Buró voor Schimmelculture; van Dijken, et al., Enzyme Microb. Techno. 26:706-714, 2000) puede producir etanol, y el contacto del etanol con un ácido carboxílico y un catalizador capaz de esterificar el ácido carboxílico con el etanol forma éster etílico (ver, por ejemplo, el Ejemplo 36) .

Además, en la técnica se conocen los microorganismos recombinantes que producen alcohol (por ejemplo, Ohta, et al., Ap l . Environ. Microbiol. 57:893-900, 1991; Underwood, et al., Appl. Environ. Microbiol . 68:1071-1081, 2002; Shen y Liao, Metab. Eng. 10:312-320, 2008; Hahnai, et al . , Ap l . Environ. Microbiol. 73:7814-7818, 2007; patente de los Estados Unidos núm. 5,514,583; patente de los Estados Unidos núm. 5,712,133; publicación de patente del PCT núm. O 1995/028476; Feldmann, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol . 38: 354-361, 1992; Zhang, et al., Science 267:240-243, 1995; publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0031918 Al; patente de los Estados Unidos núm. 7,223,575; patente de los Estados Unidos núm. 7,741,119; publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0203099 Al; publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0246846 Al; y publicación de solicitud del PCT núm. WO 2010/075241, todas ellas incorporadas en la presente descripción como referencia) .

Los microorganismos recombinantes adecuados capaces de producir butanol se conocen en la técnica, y ciertos microorganismos adecuados capaces de producir butanol se describen en la presente descripción. Los microorganismos recombinantes para producir butanol por medio de una ruta biosintética pueden incluir un miembro de los géneros Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Serratia, Erwinia, Klebsiella, Shigella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacteri m, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces,¦ Yarrowia, Pichia, Candida, Hansenula, Issatchenkia o Saccharomyces . En una modalidad, los microorganismos recombinantes pueden seleccionarse del grupo que consiste en Escherichia coli, Lactobacillus plantarum, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus y Saccharomyces cerevisiae . En una modalidad, el microorganismo recombinante es levadura. En una modalidad, el microorganismo recombinante es levadura con efecto "crabtree" positivo seleccionada de Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Dekkera, Torulopsis, Brettanomyces y algunas especies de Candida. Las especies de levadura con efecto "crabtree" positivo incluyen, pero no se limitan a, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri , Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces mikitae, Saccharomyces paradoxus, Zygosaccharomyces rouxii y Candida glabrata .

En algunas modalidades, la célula huésped es Saccharomyces cerevisiae. Las levaduras S. cerevisiae se conocen en la técnica y pueden obtenerse a partir de diversas fuentes que incluyen, pero no se limitan a, American Type Culture Collection (Rockville, MD) , Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre, LeSaffre, Gert Strand AB, Ferm Solutions, North American Bioproducts, Martrex y Lallemand. Las levaduras S. cerevisiae incluyen, pero no se limitan a, BY4741, CEN.PK 113-7D, levadura Ethanol Red®, levadura Ferm Pro™, levadura Bio-Ferm® XR, levadura de alcohol Gert Strand Prestige Batch Turbo, levadura Gert Strand Pot Distillers, levadura Gert Strand Distillers Turbo, levadura FerMax™ Green, levadura FerMax™ Gold, levadura Thermosacc®, BG-1, PE-2, CAT-1, CBS7959, CBS7960 y CBS7961.

La producción de butanol en la que se usa fermentación con un microorganismo, además de los microorganismos que producen butanol, se describe, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305370 incorporada en la presente invención como referencia. En algunas modalidades los microorganismos comprenden una ruta biosintética de butanol. En algunas modalidades, al menos uno, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro polipéptidos que catalizan conversiones de sustrato a producto de una ruta están codificados por polinucleótidos heterólogos en el microorganismo. En algunas modalidades, todos los polipéptidos que catalizan conversiones de sustrato a producto de una ruta están codificados por polinucleótidos heterólogos en el microorganismo. En algunas modalidades, el microorganismo comprende una reducción o eliminación de la actividad decarboxilasa del piruvato. Los microorganismos prácticamente libres de actividad decarboxilasa del piruvato se describen en la publicación de la solicitud de los Estados Unidos núm. 2009/0305363 incorporada en la presente invención como referencia. En la publicación también se describen los microorganismos prácticamente libres de una enzima que tiene actividad glicerol-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD, tal como GPD2.

Las rutas biosintéticas adecuadas para la producción de butanol son conocidas en la técnica y algunas rutas adecuadas se describen en la presente invención. En algunas modalidades, la ruta biosintética del butanol comprende al menos un gen que es heterólogo a la célula huésped. En algunas modalidades, la ruta biosintética del butanol comprende más de un gen que es heterólogo a la célula huésped. En algunas modalidades, la ruta biosintética del butanol comprende genes heterólogos que codifican polipéptidos que corresponden a cada etapa de una ruta biosintética.

Algunas proteínas adecuadas que tienen la capacidad para catalizar el sustrato indicado para producir conversiones se describen en la presente invención y otras proteínas adecuadas se proporcionan en la técnica. Por ejemplo, las publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos núms. 2008/0261230, 2009/0163376 y 2010/0197519, incorporadas en la presente invención como referencia, describen ácido acetohidroxi isomeroreductasas ; la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2010/0081154, incorporada como referencia, describe dihidroxiácido deshidratasas ; un alcohol deshidrogenasa se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0269823 incorporada en la presente invención como referencia .

Una persona con experiencia en la técnica comprenderá que varios niveles de identidad de secuencia son útiles para identificar los polipéptidos de otras especies, en donde los polipéptidos tienen la misma función o actividad o una similar y son adecuados para usar en los microorganismos recombinantes descritos en la presente descripción. Los ejemplos útiles de porcentajes de identidad incluyen, pero no se limitan a, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % o cualquier porcentaje entero de 75 % a 100 % puede ser útil para describir la presente invención, tal como 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % , 80 % , 81 %, 82 %, 83 o. 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % O 99 o Ruta biosintética del 1-butanol Una ruta biosintética útil para la producción de 1-butanol así como para polipéptidos y polinucleótidos adecuados que codifican esos polipéptidos es la descrita por Donaldson, et al., en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2008/0182308 Al, incorporada en la presente descripción como referencia. Esta ruta biosintética comprende las siguientes conversiones de sustrato en producto : a) acetil-CoA en acetoacetil-CoA que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de acetil-CoA acetiltransferasa; b) acetoacetil-CoA en 3 -hidroxibutiril-CoA que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa ; c) 3 -hidroxibutiril -CoA en crotonil-CoA que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de crotonasa; d) crotonil-CoA en butiril-CoA que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de butiril-CoA deshidrogenasa ; e) butiril-CoA en butiraldehído que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de butiraldehído deshidrogenasa; y f) butiraldehído en 1-butanol que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de 1-butanol deshidrogenasa En algunas modalidades, la ruta biosintética del 1-butanol comprende al menos un gen, al menos dos genes, al menos tres genes, al menos cuatro genes o al menos cinco genes heterólogos a la célula de levadura. En algunas modalidades, la célula huésped recombinante comprende un gen heterólogo para cada conversión de sustrato en producto de una ruta biosintética del 1-butanol.

Ruta biosintética del 2-butanol Las rutas biosintéticas útiles para la producción de 2-butanol así como de polipéptidos y polinucleótidos adecuados que codifican esos polipéptidos son las descritas por Donaldson, et al., en las publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos núms . 2007/0259410 Al y 2007/0292927A1 y en la publicación de solicitud del PCT núm. WO 2007/130521, todas ellas incorporadas en la presente descripción como referencia. Una ruta biosintética del 2-butanol comprende las siguientes conversiones de sustrato en producto: a) piruvato en alfa-acetolactato que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de acetolactato sintasa; b) alfa-acetolactato en acetoína que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de acetolactato decarboxilasa ; c) acetoína en 2 , 3 -butanodiol que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de butanodiol deshidrogenasa; d) 2 , 3 -butanodiol en 2-butanona que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de butanodiol deshidratasa ; y e) 2-butanona en 2-butanol que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de 2-butanol deshidrogenasa.

En algunas modalidades, la ruta biosintética del 2-butanol comprende al menos un gen, al menos dos genes, al menos tres genes o al menos cuatro genes heterólogos a la célula de levadura. En algunas modalidades, la célula huésped recombinante comprende un gen heterólogo para cada conversión de sustrato en producto de una ruta biosintética del 2-butanol.

Ruta biosintética del isobutanol Las rutas biosintét icas útiles para la producción de isobutanol así como de polipéptidos y polinucleótidos adecuados que codifican esos polipéptidos son las descritas en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0092957 Al y en la publicación de solicitud del PCT núm. 2007/050671, incorporadas en la presente descripción como referencia. Una ruta biosintética del isobutanol comprende las siguientes conversiones de sustrato en producto: a) piruvato en acetolactato que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de acetolactato sintasa; b) acetolactato en 2 , 3 -dihidroxiisovalerato que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de acetohidroxiácido reductoisomerasa ; c) 2 , 3 -dihidroxiisovalerato en a-cetoisovalerato que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de acetohidroxiácido deshidratasa ; d) a-cetoisovalerato en isobut iraldehído que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de un cetoácido decarboxilasa de cadena ramificada; y e) isobut iraldehído en isobutanol que puede catalizarse, por ejemplo, por medio de un alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada.

Las secuencias de polipéptidos adecuadas que codifican enzimas que catalizan las conversiones de sustrato en producto de la ruta biosintética del isobutanol así como los números E.C. que corresponden a las enzimas adecuadas para las etapas de las rutas indicadas incluyen, pero no se limitan a, las indicadas en las Tablas AA y BB . Las enzimas adecuadas asociadas con los números E.C. proporcionados están disponibles para las personas con experiencia en la técnica, por ejemplo, a través de la base de datos BRENDA (http : //www . brenda- enzymes . org/ ) .

Tabla AA Ejemplos de polipéptidos En la presente descripción se proporcionan microorganismos recombinantes que comprenden una ruta biosintética del isobutanol que comprende las etapas a) -e) (anteriores) , en donde al menos una de las enzimas seleccionadas del grupo de la enzima que cataliza la etapa c) y la enzima que cataliza la etapa e) está codificada por un polinucleótido heterólogo integrado en el cromosoma del microorganismo. En algunas modalidades, una enzima que cataliza la etapa c) está codificada por un polinucleótido heterólogo integrado en el cromosoma del microorganismo y una enzima que cataliza la etapa e) está codificada por un polinucleótido heterólogo integrado en el cromosoma del microorganismo .

En la presente descripción se proporcionan polinucleótidos adecuados para microorganismos recombinantes que comprenden una ruta biosintética del butanol tal como una ruta biosintética del isobutanol. Los polinucleótidos incluyen la región codificante del gen alsS de Bacillus subtilis (posición nt 457-2172 de la sec. con núm. de ident . : 1) y el gen ilvC de Lactococcus lactis (nt 3634-4656 de la sec. con núm. de ident.: 1) así como plásmidos que comprenden uno de ellos o los dos. Además, es adecuado un gen quimérico que tiene la región codificante del gen alsS de Bacillus subtilis (posición nt 457-2172 de la sec. con núm. de ident.: 1) expresado a partir del promotor CUPl de levadura (nt 2-449 de la sec. con núm. de ident. : 1) y seguido por el terminador de CYC1 (nt 2181-2430 de la sec. con núm. de ident.: 1) para la expresión de ALS y un gen quimérico que tiene la región codificante del gen ilvC de Lactococcus lactis (nt 3634-4656 de la sec. con núm. de ident. : 1) expresado a partir del promotor ILV5 de levadura (2433-3626 de la sec. con núm. de ident.: 1) y seguido del terminador de ILV5 (nt 4682-5304 de la sec. con núm. de ident.: 1) para la expresión de KARI así como plásmidos que comprenden uno o ambos genes quiméricos .

Los polinucleótidos adecuados incluyen la región codificante del gen ilvD de Streptococcus mutans (posición nt 3313-4849 de la sec. con núm. de ident.: 2), la región codificante de alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo optimizada por codones (nt 6286-7413 de la sec. con núm. de ident.: 2), la región codificante del gen kivD optimizada por codones de Lactococcus lactis (nt 9249-10895 de la sec. con núm. de ident. : 2) así como plásmidos que comprenden cualquiera o todas o las combinaciones de estos. Además, es adecuado un gen quimérico que tiene la región codificante del gen ilvD de Streptococcus mutans (posición nt 3313-4849 de la sec. con núm. de ident.: 2) expresado a partir del promotor FBA1 de S. cerevisiae (nt 2109 - 3105 de la sec. con núm. de ident.: 2) seguido del terminador de FBA1 (nt 4858 - 5857 de la sec. con núm. de ident. : 2) para la expresión de DHAD; un gen quimérico que tiene la región codificante de alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo optimizada por codones (nt 6286-7413 de la sec. con núm. de ident.: 2) expresado a partir del promotor GPM1 de S. cerevisiae (nt 7425-8181 de la sec. con núm. de ident.: 2) seguido del terminador de ADH1 (nt 5962-6277 de la sec. con núm. de ident.: 2) para la expresión de ADH y un gen quimérico que tiene la región codificante del gen kivD optimizada por codones de Lactococcus lactis (nt 9249-10895 de la sec. con núm. de ident.: 2) expresado a partir del promotor TDH3 (nt 10896-11918 de la sec. con núm. de ident.: 2) seguido del terminador de TDH3 (nt 8237-9235 de la sec. con núm. de ident.-. 2) para la expresión de KivD así como plásmidos que contienen cualquiera o todas las combinaciones de esos genes quiméricos. Además, los polinucleótidos adecuados incluyen aquellos que tienen una identidad de al menos aproximadamente 75 % con respecto a las regiones codificantes y genes quiméricos especificados, así como plásmidos que comprenden esos polinucleótidos .

En algunas modalidades, la ruta biosintética del isobutanol comprende al menos un gen, al menos dos genes, al menos tres genes o al menos cuatro genes heterólogos a la célula de levadura. En algunas modalidades, la célula huésped recombinante comprende un gen heterologo para cada conversión de sustrato en producto de una ruta biosintética del isobutanol .

Las cepas adecuadas incluyen aquellas descritas en algunas solicitudes citadas e incorporadas en la presente descripción como referencia y también en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. de serie 61/380,563, presentada el 7 de septiembre de 2010. La construcción de algunas cepas adecuadas que incluyen aquellas usadas en los ejemplos se proporciona en la presente descripción.

Construcción de la cepa BP1083 de Saccharomyces cerevisiae ("NGCI-070" ; PNY1504) La cepa BP1064 se derivó de CEN.PK 113-7D (CBS 8340; Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre, Países Bajos) y contiene supresiones de los siguientes genes: URA3 , HIS3, PDC1 , PDC5 , PDC6 y GPD2. BP1064 se transformó con plásmidos pYZ090 (sec. con núm. de ident . : 1 descrita en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. de serie 61/246,844) y pLH468 (sec. con núm. de ident.: 2) para crear la cepa NGCI-070 (BP1083, PNY1504).

Las supresiones, que eliminaron completamente toda la secuencia codificante, se crearon mediante recombinación homologa con fragmentos de PCR que contenían regiones de homología corriente arriba y corriente abajo del gen objetivo y un marcador de resistencia de G418 o gen URA3 para la selección de transformantes. El marcador de resistencia G418, flanqueado por sitios loxP, se eliminó con recombinasa Cre . El gen URA3 se eliminó mediante recombinación homologa para crear una supresión sin cicatrices o, cuando estaba flanqueado por sitios loxP, se eliminó con recombinasa Cre.

El procedimiento de supresión sin cicatrices se adaptó de Akada, et al., (Yeast 23:399-405, 2006). Generalmente, el cásete de PCR para cada supresión sin cicatrices se obtuvo mediante la combinación de cuatro fragmentos, A-B-U-C, por PCR de superposición. El cásete de PCR contenía un marcador seleccionable/contraseleccionable , URA3 (fragmento U) , que consistía en el gen nativo URA3 de CEN.PK 113-7D junto con el promotor (250 bp corriente arriba del gen URA3) y el terminador (150 bp corriente abajo del gen URA3). Los fragmentos A y C, cada uno de 500 bp de largo, correspondían a los 500 bp inmediatamente corriente arriba del gen objetivo (fragmento A) y a la región 3' de 500 bp del gen objetivo (fragmento C) . Los fragmentos A y C se usaron para la integración del cásete en el cromosoma mediante recombinación homologa. El fragmento B (500 bp de largo) correspondía a los 500 bp inmediatamente corriente abajo del gen objetivo y se usó para la escisión del marcador URA3 y el fragmento C del cromosoma mediante recombinación homologa, ya que se creó una repetición directa de la secuencia que correspondía al fragmento B cuando el cásete se integró en el cromosoma. Con el cásete ABUC producto de la PCR, primero se integró el marcador URA3 y, después, se realizó la escisión del cromosoma mediante recombinación homologa. La integración inicial suprimió el gen, excepto la región 3' de 500 bp . Cuando se realizó la escisión, la región 3' de 500 bp del gen también se eliminó. Para la integración de los genes con este método, el gen a integrar se incluyó en el cásete de PCR entre los fragmentos A y B.

Deleción de URA3 Para suprimir la región codificante del gen URA3 endógeno se amplificó un cásete ura3 : : loxP-kanMX-loxP por PCR a partir de pLA54 como el ADN plantilla (sec. con núm. de ident.: 3). pLA54 contiene el promotor TEFl de K. lactis y el marcador kanMX, y está flanqueado por sitios loxP para permitir la recombinación con recombinasa Cre y la eliminación del marcador. La PCR se realizó con ADN-polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) e cebadores BK505 y BK506 (sec. con núms . de ident. : 4 y 5) . La porción URA3 de cada cebador se derivó de la región 5' corriente arriba del promotor URA3 y la región 3' corriente abajo de la región codificante de manera que la integración del marcador loxP-kanMX-loxP generó el reemplazo de la región codificante de URA3. El producto de PCR se transformó en CEN.PK 113-7D mediante el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) y los transformantes se seleccionaron en YPD que contenía G418 (100 g/ml) a 30 °C. Los transformantes se analizaron para verificar la integración correcta mediante PCR con cebadores LA468 y LA492 (sec. con núms . de ident . : 6 y 7) y se designaron como CEN.PK 113-7D Aura3 : : kanMX .

Supresión de HIS3 Los cuatro fragmentos para el cásete de PCR para la supresión de HIS3 sin cicatrices se amplificaron con la mezcla Phusion® High Fidelity PCR aster Mix (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y ADN genómico de CEN.PK 113 -7D como plantilla preparado con un estuche Gentra® Puregene® levadura/bact (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento A de HIS3 se amplificó con el cebador OBP452 (sec. con núm. de ident.: 14) y el cebador OBP453 (sec. con núm. de ident. : 15) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento B de HIS3. El fragmento B de HIS3 se amplificó con el cebador OBP454 (sec. con núm. de ident.: 16) que contenía una cola de 5 ' con homología al extremo 3 ' del fragmento A de HIS3 y el cebador ???455 (sec. con núm. de ident. : 17) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento U de HIS3. El fragmento U de HIS3 se amplificó con el cebador OBP456 (sec. con núm. de ident . : 18) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento B de HIS3 y el cebador OBP457 (sec. con núm. de ident.: 19) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento C de HIS3. El fragmento C de HIS3 se amplificó con el cebador OBP458 (sec. con núm. de ident.: 20) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento U de HIS3 y el cebador oBP459 (sec. con núm. de ident. : 21) . Los productos de PCR se purificaron con un estuche de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento AB de HIS3 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento A de HIS3 y el fragmento B de HIS3 y la amplificación con cebadores oBP452 (sec. con núm. de ident.: 14) y OBP455 (sec. con núm. de ident. : 17) . El fragmento UC de HIS3 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento U de HIS3 y el fragmento C de HIS3 y la amplificación con cebadores oBP456 (sec. con núm. de ident.: 18) y oBP459 (sec. con núm. de ident.: 21) . Los productos de PCR resultantes se purificaron en un gel de agarosa y, después, se usó un estuche de extracción con gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete ABUC de HIS3 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento AB de HIS3 y el fragmento UC de HIS3 y la amplificación con cebadores oBP452 (sec. con núm. de ident. : 14) y ???459 (sec. con núm. de ident . : 21) . El producto de PCR se purificó con un estuche de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) .

Se prepararon células competentes de CEN.PK 113 -7D Aura3:: kanMX y se transformaron con el cásete de PCR de ABUC de HIS3 con un estuche Frozen-EZ Yeast Transíormation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se colocaron en placas sobre un medio sintético completo sin uracilo suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes con his3 inactivado se analizaron mediante PCR con cebadores oBP460 (sec. con núm. de ident.: 22) y oBP461 (sec. con núm. de ident.: 23) con ADN genómico preparado con un estuche Gentra® Puregene® levadura/bact (Qiagen, Valencia, CA) . Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa CEN.PK 113 -7D Aura3: : kanMX Ahis3 : :URA3.

Eliminación del marcador KanMX del sitio Aura3 y eliminación del marcador URA3 del sitio Ahis3 El marcador KanMX se eliminó mediante la transformación de CEN.PK 113-7D Aura3 :: kanMX Ahis3 : :URA3 con pRS423 : : PGAL1-cre (sec. con núm. de ident.: 66 descrita en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 61/290,639) con un estuche Frozen-EZ Yeast Transíormation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) y se colocó en placas sobre un medio sintético completo sin histidina y uracilo suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes se cultivaron en YP suplementado con galactosa al 1 % a 30 °C por ~6 horas para inducir la recombinasa Cre y la escisión del marcador KanMX y se colocaron sobre placas de YPD (glucosa al 2 %) a 30 °C para la recuperación. Se creció un aislado de la noche a la mañana en YPD y se colocó en placas sobre medio sintético completo que contenía ácido 5-fluoroorótico (5-FOA, 0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados de los cuales se eliminó el marcador URA3. Los aislados resistentes a 5-FOA se crecieron y colocaron en placas sobre YPD para remover el plásmido pRS423 : : PGALl-cre . Los aislados se controlaron para identificar la eliminación del marcador KanMX, el marcador URA3 y el plásmido pRS423 :: PGALl-cre mediante el ensayo del crecimiento en placas YPD+G418, medio sintético completo sin placas de uracilo y medio sintético completo sin placas de histidina. Un aislado adecuado sensible a G418 y auxotrófico para uracilo e histidina se seleccionó como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 y se designó como BP857. Las supresiones y eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR y secuenciación con cebadores ???450 (sec. con núm. de ident.: 24) y OBP451 (sec. con núm. de ident . : 25) para Aura3 e cebadores OBP460 (sec. con núm. de ident. : 22) y OBP461 (sec. con núm. de ident. : 23) para Ahis3 con ADN genómico preparado con un estuche Gentra® Puregene® levadura/bact (Qiagen, Valencia, CA) .

Deleción de PDC6 Los cuatro fragmentos para el cásete de PCR para la supresión de PDC6 sin cicatrices se amplificaron con la mezcla Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y ADN genómico de CEN.PK 113 -7D como plantilla preparado con un estuche Gentra® Puregene® levadura/bact (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento A de PDC6 se amplificó con el cebador oBP440 (sec. con núm. de ident . : 26) y el cebador OBP441 (sec. con núm. de ident.: 27) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento B de PDC6. El fragmento B de PDC6 se amplificó con el cebador OBP442 (sec. con núm. de ident.: 28) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento A de PDC6 y el cebador OBP443 (sec. con núm. de ident.: 29) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento U de PDC6. El fragmento U de PDC6 se amplificó con el cebador oBP444 (sec. con núm. de ident.: 30) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento B de PDC6 y el cebador OBP445 (sec. con núm. de ident. : 31) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento C de PDC6. El fragmento C de PDC6 se amplificó con el cebador oBP446 (sec. con núm. de ident.: 32) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento U de PDC6 y el cebador oBP447 (sec. con núm. de ident. : 33) . Los productos de PCR se purificaron con un estuche de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento AB de PDC6 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento A de PDC6 y el fragmento B de PDC6 y la amplificación con cebadores ???440 (sec. con núm. de ident . : 26) y OBP443 (sec. con núm. de ident.: 29) . El fragmento UC de PDC6 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento U de PDC6 y el fragmento C de PDC6 y la amplificación con cebadores oBP444 (sec. con núm. de ident.: 30) y OBP447 (sec. con núm. de ident.: 33). Los productos de PCR resultantes se purificaron en un gel de agarosa y, después, se usó un estuche de extracción con gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete ABUC de PDC6 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento AB de PDC6 y el fragmento UC de PDC6 y la amplificación con cebadores oBP440 (sec. con núm. de ident.: 26) y OBP447 (sec. con núm. de ident. : 33) . El producto de PCR se purificó con un estuche de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) .

Se prepararon células competentes de CEN.PK 113 -7D Aura3 : : loxP Ahis3 y se transformaron con el cásete de PCR de ABUC de PDC6 con un estuche Frozen-EZ Yeast Transíormation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se colocaron en placas sobre un medio sintético completo sin uracilo suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes con pdc6 inactivado se analizaron mediante PCR con cebadores ???448 (sec. con núm. de ident . : 34) y OBP449 (sec. con núm. de ident . : 35) con ADN genómico preparado con un estuche Gentra® Puregene® levadura/bact . (Qiagen, Valencia, CA) . Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 : :URA3.

CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6::URA3 se cultivó de la noche a la mañana en YPD y se colocó en placas sobre medio sintético completo que contenía, ácido 5-fluoroorótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados de los cuales se eliminó el marcador URA3. La supresión y eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR y secuenciación con cebadores OBP448 (sec. con núm. de ident.: 34) y OBP449 (sec. con núm. de ident. : 35) con ADN genómico preparado con un estuche Gentra® Puregene® levadura/bact. (Qiagen, Valencia, CA) . La ausencia del gen PDC6 del aislado se demostró mediante un resultado negativo de la PCR con cebadores específicos para la secuencia codificante de PDC6, OBP554 (sec. con núm. de ident.: 36) y OBP555 (sec. con núm. de ident. : 37) . Se seleccionó el aislado adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 y se designó como BP891.

Supresión de PDCl-integración de ilvDSm El gen PDCl se eliminó y se reemplazó con la región codificante de ilvD del Streptococcus mutans núm. de la ATCC 700610. El fragmento A seguido por la región codificante de ilvD de Streptococcus mutans para el cásete de PCR para la supresión de PDCl- integración de ilvDSm se amplificó con la mezcla Phusion® High Fidelity PCR Master ix (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y ADN genómico de NYLA83 como plantilla, preparado con un estuche Gentra® Puregene® levadura/bact . (Qiagen, Valencia, CA) . NYLA83 es una cepa (construcción descrita en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2011/0124060 incorporada en la presente descripción en su totalidad como referencia) que porta la supresión de PDCl -integración de ilvDSm descrita en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305363 incorporada en la presente descripción en su totalidad como referencia) . El fragmento A-ilvDSm de PDCl (sec. con núm. de ident . : 141) se amplificó con el cebador OBP513 (sec. con núm. de ident.: 38) y el cebador OBP515 (sec. con núm. de ident.: 39) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento B de PDCl. Los fragmentos B, U y C para el cásete de PCR para la supresión de PDCl -integración de ilvDSm se amplificaron con la mezcla Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y el ADN genómico de CEN.PK 113-7D como plantilla, preparado con un estuche Gentra® Puregene® levadura/bact. (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento B de PDCl se amplificó con el cebador oBP516 (sec. con núm. de ident.: 40) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento A de PDCl-ilvDSm y el cebador oBP517 (sec. con núm. de ident . : 41) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento U de PDCl. El fragmento U de PDCl se amplificó con el cebador oBP518 (sec. con núm. de ident.: 42) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento B de PDCl y el cebador OBP519 (sec. con núm. de ident.: 43) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento C de PDCl. El fragmento C de PDCl se amplificó con el cebador OBP520 (sec. con núm. de ident.: 44) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento U de PDCl y el cebador OBP521 (sec. con núm. de ident.: 45). Los productos de PCR se purificaron con un estuche de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento A de PDCl- ilvDSm-B se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento A de PDCl-ilvDSm y el fragmento B de PDCl y la amplificación con cebadores OBP513 (sec. con núm. de ident.: 38) y oBP517 (sec. con núm. de ident. : 41) . El fragmento UC de PDCl se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento U de PDCl y el fragmento C de PDCl y la amplificación con cebadores oBP518 (sec. con núm. de ident. : 42) y oBP521 (sec. con núm. de ident.: 45). Los productos de PCR resultantes se purificaron en un gel de agarosa y, después, se usó un estuche de extracción con gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete PDCl A-ilvDSm-BUC (sec. con núm. de ident.: 142) se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento A de PDC1-ilvDSm-B y el fragmento UC de PDCl y la amplificación con cebadores OBP513 (sec. con núm. de ident . : 38) y OBP521 (sec. con núm. de ident. : 45) . El producto de PCR se purificó con un estuche de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) .

Se prepararon células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 y se transformaron con el cásete de PCR de PDCl A-ilvDSm-BUC con un estuche Frozen-EZ Yeast Transíormation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se colocaron en placas sobre un medio sintético completo sin uracilo suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes con pdcl inactivado e integración de ilvDSm se analizaron mediante PCR con cebadores oBP511 (sec. con núm. de ident.: 46) y oBP512 (sec. con núm. de ident.: 47) con ADN genómico preparado con un estuche Gentra® Puregene® levadura/bact . (Qiagen, Valencia, CA) . La ausencia del gen de PDCl del aislado se demostró mediante un resultado negativo de la PCR con cebadores específicos para la secuencia codificante de PDCl, oBP550 (sec. con núm. de ident.: 48) y OBP551 (sec. con núm. de ident.: 49) . Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D ñura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm-URA3.

CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm-URA3 se cultivó de la noche a la mañana en YPD y se colocó en placas sobre medio sintético completo que contenía ácido 5-fluoroorótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados de los cuales se eliminó el marcador URA3. La supresión de PDC1, integración de ilvDSm y eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR y secuenciación con cebadores oBP511 (sec. con núm. de ident.: 46) y oBP512 (sec. con núm. de ident . : 47) con ADN genómico preparado con un estuche Gentra® Puregene® levadura/bact . (Qiagen, Valencia, CA) . Se seleccionó el aislado adecuado como la cepa CEN.PK 113 -7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm y se designó como BP907.

Supresión de PDC5-integración de sadB El gen PDC5 se eliminó y se reemplazó con la región codificante sadB de Achromobacter xylosoxidans. Un segmento del cásete de PCR para la supresión de PDC5 - integración de sadB se clonó primero en el plásmido pUC19-URA3MCS . pUC19-URA3MCS está basado en pUC19 y contiene la secuencia del gen URA3 de Saccharomyces cerevisiae ubicado dentro de un sitio de clonación múltiple ( CS, por sus siglas en inglés) . pUC19 contiene el replicón de pMBl y un gen que codifica la beta-lactamasa para la replicación y selección en Escherichia coli. Adicionalmente a la secuencia codificante para URA3 se incluyeron las secuencias corriente arriba y corriente abajo de este gen para la expresión del gen URA3 en levadura. El vector puede usarse para propósitos de clonación y como un vector de integración de levadura.

El ADN que abarcaba la región codificante URA3 junto con 250 bp corriente arriba y 150 bp corriente abajo de la región codificante URA3 del ADN genómico de CEN.PK 113-7D de Saccharomyces cerevisiae se amplificó con cebadores OBP438 (sec. con núm. de ident.: 12) que contenían sitios de restricción BamHI, AscI, Pmel y Fsel y oBP439 (sec. con núm. de ident.: 13) que contenían sitios de restricción Xbal, Pací y Notl con la mezcla Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) . El ADN genómico se preparó con un estuche Gentra® Puregene® levadura/bact (Qiagen, Valencia, CA) . El producto de PCR y pUC19 (sec. con núm. de ident.: 150) se ligaron con ADN ligasa de T4 después de la digestión con BamHI y Xbal para crear el vector pUC19-URA3MCS. El vector se confirmó mediante PCR y secuenciación con cebadores OBP264 (sec. con núm. de ident.: 10) y oBP265 (sec. con núm. de ident. : 11) .

La secuencia codificante de sadB y el fragmento B de PDC5 se clonaron en pUC19-URA3MCS para crear la porción sadB-BU del cásete de PCR de PDC5 A-sadB-BUC. La secuencia codificante de sadB se amplificó con pLH468-sadB (sec. con núm. de ident.: 67) como plantilla con el cebador oBP530 (sec. con núm. de ident.: 50) que contenía un sitio de restricción de AscI y el cebador oBP531 (sec. con núm. de ident. : 51) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento B de PDC5. El fragmento B de PDC5 se amplificó con el cebador oBP532 (sec. con núm. de ident . : 52) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' de sadB y el cebador ???533 (sec. con núm. de ident.: 53) que contenía un sitio de restricción Pmel . Los productos de PCR se purificaron con un estuche de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento B de sadB-PDC5 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado de los productos de PCR del fragmento B de sadB y PDC5 y la amplificación con los cebadores OBP530 (sec. con núm. de ident.: 50) y OBP533 (sec. con núm. de ident.: 53). Se realizó la digestión del producto de PCR resultante con AscI y Pmel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes de pUC19-URA3MCS después de la digestión con las enzimas apropiadas. El plásmido resultante se usó como plantilla para la amplificación de sadB-fragmento B-fragmento U con cebadores oBP536 (sec. con núm. de ident.: 54) y ???546 (sec. con núm. de ident.: 55) que contenían una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento C de PDC5. El fragmento C de PDC5 se amplificó con el cebador oBP547 (sec. con núm. de ident.: 56) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' de sadB-fragmento B-fragmento U de PDC5 y el cebador OBP539 (sec. con núm. de ident. : 57) . Los productos de PCR se purificaron con un estuche de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El sadB-fragmento B-fragmento U-fragmento C de PDC5 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado de sadB-fragmento B-fragmento U de PDC5 y el fragmento C de PDC5 y la amplificación con cebadores oBP536 (sec. con núm. de ident . : 54) y ???539 (sec. con núm. de ident.: 57) . El producto de PCR resultante se purificó en un gel de agarosa y, después, se usó un estuche de extracción con gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete PDC5 A-sadB-BUC (sec. con núm. de ident.: 143) se creó mediante amplificación de sadB-fragmento B-fragmento U-fragmento C de PDC5 con cebadores ???542 (sec. con núm. de ident. : 58) que contenían una cola de 5' con homología a los 50 nucleótidos ubicados inmediatamente corriente arriba de la secuencia codificante nativa de PDC5 y OBP539 (sec. con núm. de ident. : 57) . El producto de PCR se purificó con un estuche de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) .

Se prepararon células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm y se transformaron con el cásete de PCR de A-sadB-BUC de PDC5 con un estuche Frozen-EZ Yeast Transíormation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se colocaron en placas sobre un medio sintético completo sin uracilo suplementado con etanol al 1 % (sin glucosa) a 30 °C. Los transformantes con pdc5 inactivado e integración de sadB se analizaron mediante PCR con cebadores OBP540 (sec. con núm. de ident.: 59) y OBP541 (sec. con núm. de ident.: 60) con ADN genómico preparado con un estuche Gentra® Puregene® de 5 levadura/bact (Qiagen, Valencia, CA) . La ausencia del gen PDC5 del aislado se demostró mediante un resultado negativo de la PCR con cebadores específicos para la secuencia codificante de PDC5, OBP552 (sec. con núm. de ident . : 61) y oBP553 (sec. con núm. de ident.: 62). Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5 : : sadB-URA3.

CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5 : : sadB-URA3 se cultivó de la noche a la mañana en YPE (etanol al 1 %) y se colocó en placas sobre medio sintético completo suplementado con etanol (sin glucosa) y que contenía ácido 5-fluoroorótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados de los cuales se eliminó el marcador URA3. La supresión de PDC5 , integración de sadB y eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR con cebadores ???540 (sec. con núm. de ident. : 59) y OBP541 (sec. con núm. de ident.: 60) con ADN genómico preparado con un estuche Gentra® Puregene® de levadura/bact (Qiagen, Valencia, CA) . Se seleccionó el aislado adecuado como la cepa CEN.PK 113 -7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5::sadB y se designó como BP913.

Deleción de GPD2 Para suprimir la región codificante del GPD2 endógeno se amplificó un cásete gpd2 : : loxP-URA3-loxP (sec. con núm. de ident. : 151) por PCR con loxP-URA3 -loxP (sec. con núm. de ident . : 68) como ADN plantilla. loxP-URA3 - loxP contiene el marcador U A3 de (núm. de la ATCC 77107) flanqueado por sitios recombinasa loxP. La PCR se realizó con ADN-polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) e cebadores LA512 y LA513 (sec. con núms . de ident.: 8 y 9 ) . La porción GPD2 de cada cebador se derivó de la región 51 corriente arriba de la región codificante de GPD2 y de la región 3' corriente abajo de la región codificante de manera que la integración del marcador loxP-URA3-loxP generó el reemplazo de la región codificante de GPD2. El producto de PCR se transformó en BP913 y los transformantes se seleccionaron sobre un medio sintético completo sin uracilo suplementado con etanol al 1 % (sin glucosa) . Los transformantes se analizaron para verificar la integración correcta mediante PCR con cebadores OBP582 y AA270 (sec. con núms. de ident.: 63 y 64) .

El marcador URA3 se recicló por transformación con pRS423 : : PGALl-cre (sec. con núm. de ident.: 66) y la colocación en placas sobre medio sintético completo sin histidina suplementado con etanol al 1 % a 30 °C. Los transformantes se dispersaron sobre medio sintético completo suplementado con etanol al 1 % y que contenía ácido 5-fluoroorótico (0.1 %) y se incubaron a 30 °C para seleccionar los aislados de los cuales se eliminó el marcador URA3. Los aislados resistentes a 5-FOA se crecieron en YPE (etanol al 1 %) para la eliminación del plásmido pRS423 : : PGALl-cre . La supresión y eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR con los cebadores OBP582 (sec. con núm. de ident.: 63) y OBP591 (sec. con núm. de ident.: 65) . Se seleccionó el aislado adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5::sadB Agpd2 : : loxP y se designó como PNY1503 (BP1064) .

BP1064 se transformó con plásmidos pYZ090 (sec. con núm. de ident.: 1) y pLH468 (sec. con núm. de ident.: 2) para crear la cepa NGCI-070 (BP1083; PNY1504) .

Construcción de la cepa de Saccharomyces cerevisiae PNY2205 La cepa, PNY2205, se derivó de PNY1503 (BP1064) que se describió anteriormente.

Las supresiones que, generalmente, eliminaron la secuencia codificante entera se crearon por recombinación homologa con los fragmentos de PCR que contienen regiones de homología corriente arriba y corriente abajo del gen objetivo y el gen URA3 para la selección de los transformantes. El gen URA3 se eliminó por recombinación homologa para crear una supresión sin cicatriz. Las integraciones de genes se generaron de manera similar.

El procedimiento de supresión sin cicatrices se adaptó de Akada, et al., (Yeast, 23:399, 2006). Generalmente, el cásete de PCR para cada supresión sin cicatrices se obtuvo mediante la combinación de cuatro fragmentos, A-B-U-C, por PCR de superposición. En algunos casos, los fragmentos individuales se clonaron primero en un plásmido antes de la amplificación del cásete entero por PCR para el procedimiento de supresión/integración. El cásete de PCR contenía un marcador seleccionable/contraseleccionable , URA3 (fragmento U) , que consistía en el gen nativo URA3 de CEN.PK 113-7D junto con las regiones del promotor (250 bp corriente arriba del gen URA3 ) y el terminador (150 bp corriente abajo del gen URA3 ) . Los fragmentos A y C, cada uno de ellos con una longitud, generalmente, de 500 bp correspondían a los 500 bp inmediatamente corriente arriba del gen objetivo (fragmento A) y a la región 3' de 500 bp del gen objetivo (fragmento C) . Los fragmentos A y C se usaron para la integración del cásete en el cromosoma mediante recombinación homologa. El fragmento B (500 bp de largo) correspondía a los 500 bp inmediatamente corriente abajo del gen objetivo y se usó para la escisión del marcador URA3 y el fragmento C del cromosoma mediante recombinación homologa, ya que se creó una repetición directa de la secuencia que correspondía al fragmento B cuando el cásete se integró en el cromosoma.

Con el cásete ABUC producto de la PCR, primero se integró el marcador URA3 y después se realizó la escisión del cromosoma mediante recombinación homologa. La integración inicial suprimió el gen, excepto la región 3' de 500 bp . Cuando se realizó la escisión, la región 3' de 500 bp del gen también se eliminó. Para la integración de los genes con este método, el gen a integrar se incluyó en el cásete de PCR entre los fragmentos A y B.

Deleción de FRA2 La supresión de FRA2 se diseñó para suprimir 250 nucleótidos del extremo 31 de la secuencia codificante de manera que los primeros 113 nucleótidos de la secuencia codificante de FRA2 quedaron intactos. Un codón de terminación dentro del marco estuvo presente en 7 nucleótidos corriente abajo de la supresión. Los cuatro fragmentos para el cásete de PCR para la supresión de FRA2 sin cicatrices se amplificaron con la mezcla Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y ADN genómico de CEN.PK 113-7D como plantilla preparado con un estuche Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento A de FRA2 se amplificó con el cebador ???594 (sec. con núm. de ident.: 152) y el cebador OBP595 (sec. con núm. de ident.: 153) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5" del fragmento B de FRA2. El fragmento B de FRA2 se amplificó con el cebador oBP596 (sec. con núm. de ident. : 154) que contenía una cola de 51 con homología al extremo 31 del fragmento A de FRA2 y el cebador OBP597 (sec. con núm. de ident.: 155) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 51 del fragmento U de FRA2. El fragmento U de FRA2 se amplificó con el cebador OBP598 (sec. con núm. de ident.: 156) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento B de FRA2 y el cebador oBP599 (sec. con núm. de ident . : 157) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 51 del fragmento C de FRA2. El fragmento C de FRA2 se amplificó con el cebador 0BP6OO (sec. con núm. de ident.: 158) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento U de FRA2 y el cebador 0BP6OI (sec. con núm. de ident.: 159). Los productos de PCR se purificaron con un estuche de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento AB de FRA2 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento A de FRA2 y el fragmento B de FRA2 y la amplificación con cebadores oBP594 (sec. con núm. de ident.: 152) y oBP597 (sec. con núm. de ident.: 155). El fragmento UC de FRA2 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento U de FRA2 y el fragmento C de FRA2 y la amplificación con cebadores oBP598 (sec. con núm. de ident.: 156) y 0BP6OI (sec. con núm. de ident.: 159) . Los productos de PCR resultantes se purificaron en un gel de agarosa y, después, se usó un estuche de extracción con gel (Qiagen, Valencia, CA) . El cásete ABUC de FRA2 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento AB de FRA2 y el fragmento UC de FRA2 y la amplificación con cebadores OBP594 (sec. con núm. de ident.: 152) y 0BP6OI (sec. con núm. de ident.: 159). El producto de PCR se purificó con un estuche de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) .

Se prepararon células competentes de PNY1503 y se transformaron con el cásete de PCR de ABUC de FRA2 con un estuche Frozen-EZ Yeast Transíormation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se sembraron en placas sobre medio sintético completo sin uracilo suplementado con etanol al 1 % a 30 °C. Los transformantes con un fra2 inactivado se analizaron mediante PCR con cebadores OBP602 (sec. con núm. de ident . : 160) y oBP603 (sec. con núm. de ident.: 161) con ADN genómico preparado con un estuche Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) . Un transformante correcto se creció en YPE (extracto de levadura, peptona, etanol al 1 %) y se sembró en placas sobre medio sintético completo que contenía ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador de URA3. La supresión y eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR con cebadores OBP602 (sec. con núm. de ident.: 160) y OBP603 (sec. con núm. de ident.: 161) con ADN genómico preparado con un estuche Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) . La ausencia del gen de FRA2 del aislado se demostró mediante un resultado negativo de la PCR con cebadores específicos para la secuencia codificante suprimida de FRA2, oBP605 (sec. con núm. de ident.: 162) y 0BP6O6 (sec. con núm. de ident. : 163) . El aislado correcto se seleccionó como la cepa CEN.PK 113-7D MATa ura3A : : loxP his3A pdc6A pdclA: :P[PDC1] -DHAD | ilvD_Sm-PDClt pdc5A: :P[PDC5] -ADH | sadB_Ax-PDC5t gpd2A::loxP fra2A y se designó como PNY1505 (BP1135). Supresión de ADH1 e integración de kivD Ll (y) El gen ADH1 se suprimió y reemplazó con la región codificante de kivD de Lactococcus lactis optimizada por codones para la expresión en Saccharomyces cerevisiae . El cásete sin cicatrices para la supresión de ADH1- integración de kivD_Ll (y) se clonó primero en el plásmido pUC19-URA3MCS , tal como se describe en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. de serie 61/356,379 presentada el 18 de junio de 2010 e incorporada en la presente descripción como referencia. El vector es a base de pUC19 y contiene la secuencia del gen URA3 de la cepa de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D ubicada dentro de un sitio de clonación múltiple (MCS, por sus siglas en inglés) . El pUC19 contiene el replicón pMBl y un gen que codifica para beta-lactamasa para la replicación y selección en Escherichia coli. Además de la secuencia codificante para URA3 , las secuencias corriente arriba (250 pb) y corriente abajo (150 pb) de este gen se encuentran presentes para la expresión del gen URA3 en levadura .

La región codificante kivD de Lactococcus lactis optimizada por codones para la expresión en Saccharomyces cerevisiae se amplificó con pLH468 (solicitud provisional de los Estados Unidos núm. de serie 61/246,709 presentada el 29 de setiembre de 2009) como plantilla con el cebador oBP562 (sec. con núm. de ident . : 164) que contenía un sitio de restricción de Pmel y el cebador ???563 (sec. con núm. de ident. : 165) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento B de ADH1. El fragmento B de ADH1 se amplificó a partir de ADN genómico preparado como se describió anteriormente con el cebador ???564 (sec. con núm. de ident. : 166) que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' de kivD_Ll (y) y el cebador ???565 (sec. con núm. de ident.: 167) que contenía un sitio de restricción de Fsel . Los productos de PCR se purificaron con un estuche de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento B de kivD_Ll (y) -ADH1 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado de los productos de PCR del fragmento B de kivD_Ll(y) y ADH1 y la amplificación con cebadores oBP562 (sec. con núm. de ident.: 164) y OBP565 (sec. con núm. de ident.: 167). Se realizó la digestión del producto de PCR resultante con Pmel y Fsel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes de pUC19-URA3MCS después de la digestión con las enzimas apropiadas. El fragmento A de ADH1 se amplificó a partir de ADN genómico con el cebador oBP505 (sec. con núm. de ident.: 168) que contenía un sitio de restricción de SacI y el cebador OBP506 (sec. con núm. de ident. : 169) que contenía un sitio de restricción de Ascl. Se realizó la digestión del producto de PCR del fragmento A de ADH1 con SacI y AscI y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contenía el fragmento B de kivD_Ll (y) -ADH1. El fragmento C de ADH1 se amplificó a partir de ADN genómico con el cebador oBP507 (sec. con núm. de ident . : 170) que contenía un sitio de restricción de Pací y el cebador oBP508 (sec. con núm. de ident.: 171) que contenía un sitio de restricción de Salí. Se realizó la digestión del producto de PCR del fragmento C de ADHl con Pací y Salí y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contiene el fragmento A-kivD_Ll(y) de ADHl -fragmento B de ADHl. El promotor híbrido UAS ( PGK1 ) - PFBAI se amplificó a partir del vector pRS316-UAS (PGK1) -PFBAI-GUS (sec. con núm. de ident.: 172) con el cebador oBP674 (sec. con núm. de ident.: 173) que contenía un sitio de restricción de AscI y el cebador oBP675 (sec. con núm. de ident.: 174) que contenía un sitio de restricción de Pmel . Se realizó la digestión del producto de PCR UAS ( PGKl ) -PFBAI con AscI y Pmel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contenía kivD_Ll (y) -fragmentos ABC de ADHl. El cásete de integración completo se amplificó a partir del plásmido resultante con los cebadores oBP505 (sec. con núm. de ident.: 168) y OBP508 (sec. con núm. de ident.: 171) y se purificó con un estuche de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) .

Se prepararon células competentes de PNY1505 y se transformaron con el cásete de PCR ADHl-kivD_Ll (y) construido anteriormente con el uso de un estuche Frozen-EZ Yeast Transformation II™ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) . Las mezclas de transformación se sembraron en placas sobre medio sintético completo sin uracilo suplementado con etanol al 1 % a 30 °C. Los transformantes se cultivaron en YPE (etanol al 1 %) y se sembraron en placas sobre medio sintético completo que contenía ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador de URA3. La supresión de ADHl y la integración de kivD_Ll (y) se confirmaron por PCR con los cebadores externos oBP495 (sec. con núm. de ident . : 175) y OBP496 (sec. con núm. de ident.: 176) y con el cebador específico de kivD_Ll (y) oBP562 (sec. con núm. de ident.: 164) y el cebador externo OBP496 (sec. con núm. de ident.: 176) con ADN genómico preparado con un estuche Gentra® Puregene® Yeast/Bact. (Qiagen, Valencia, CA) . El aislado correcto se seleccionó como la cepa CEN.PK 113-7D MATa ura3A::loxP his3A pdc6A pdclA: :P [PDC1] -DHAD | ilvD_Sm-PDCltpdc5A : : P [PDC5] -ADH | sadB_Ax-PDC5t gpd2A::loxP fra2A adhlA : :UAS (PGK1) P [FBA1] -kivD_Ll (y) -ADHlt y se designó como PNY1507 (BP1201) . PNY1507 se transformó con plásmidos de la ruta de isobutanol pYZ090 (sec. con núm. de ident.: 1) y pBP915 (descritos más adelante) .

Construcción del vector pRS316-UAS (PGKl) -FBAlp-GUS Para clonar un cásete UAS (PGKl) -FBAlp (sec. con núm. de ident.: 177 primero se amplificó por PCR un promotor FBA1 de 602bp (FBAlp) a partir de ADN genómico de CEN.PK con los cebadores T-FBAl(SalI) (sec. con núm. de ident.: 178) y B-FBAl(Spel) (sec. con núm. de ident.: 179) y se clonó en sitios Salí y Spel en el plásmido p S358-PGKlp-GUS (sec. con núm. de ident.: 180) después de eliminar el promotor PGKlp con un producto digerido de Sall/Spel del plásmido para producir pWS358 -FBAlp-GUS . El plásmido p S358-PGKlp-GUS se generó por la inserción de un PGKlp y fragmentos de ADN del gen de beta-glucuronidasa (GUS) en un sitio de clonación múltiple de pWS358 que se derivó del vector pRS423 (Christianson, et al., Gene 110:119-122, 1992). Segundo, se realizó la digestión del plásmido pWS358-FBAlp-GUS resultante con Salí y SacI, un fragmento de ADN que contenía un promotor FBAlp, el gen GUS y el terminador FBAt purificado con gel y se clonó en sitios Sall/SacI en pRS316 para crear pRS316-FBAlp-GUS. Tercero, un fragmento de ADN de 118 bp que contenía una secuencia de activación corriente arriba (UAS, por sus siglas en inglés) ubicada entre las posiciones -519 y -402 corriente arriba del marco de lectura abierto de 3-fosfoglicerato quinasa (PGKl), es decir, UAS (PGKl), se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de CEN.PK con cebadores T-U/PGK1 (Kpnl ) (sec. con núm. de ident.: 181) y B-U/PGKl(SalI) (sec. con núm. de ident . : 182). Se realizó la digestión del producto de PCR con Kpnl y Salí y se clonó en sitios Kpnl/Sall en pRS316-FBAlp-GUS para crear pRS316-UAS (PGK1) -FBAlp-GUS .

Construcción del vector de integración pUC19-kan : : pdcl : : FBA-alsS: :TRX1 Para construir el cásete FBA-alsS-CYCt se movió el fragmento BbvCl/PacI de 1.7 kb de pRS426 : : GPD : : alsS : : CYC (publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0092957) a pRS426 : : FBA : : ILV5 : : CYC (publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0092957, para el cual se realizó previamente la digestión con BbvCl/PacI para liberar el gen ILV5) . Las reacciones de ligación se transformaron en células TOP10 de E. coli y los transformantes se analizaron por PCR con los cebadores N98SeqFl (sec. con núm. de ident.: 183) y N99SeqR2 (sec. con núm. de ident.: 184). El cásete FBA-alsS-CYCt se aisló a partir del vector con BglII y Notl para la clonación en pUC19-URA3 : : ilvD-TRXl (tal como se describió en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. de serie 61/356,379 presentada el 18 de junio de 2010 e incorporada en la presente descripción como referencia, clon "B") en el sitio AflII (el fragmento de Klenow se usó para que los extremos sean compatibles para la ligación) . Los transformantes que contienen el cásete de alsS en ambas orientaciones en el vector se obtuvieron y confirmaron por PCR con el uso de cebadores N98SeqF4 (sec. con núm. de ident.: 185) y Nllll (sec. con núm. de ident.: 186) para la configuración "A" y N98SeqF4 (sec. con núm. de ident.: 185) y N1110 (sec. con núm. de ident.: 187) para la configuración "B" . Después, se realizó una versión seleccionable con geneticina del vector de configuración "A" para lo cual se eliminó el gen URA3 (fragmento Notl/Nael de 1.2 kb) y se añadió un cásete de geneticina descrito anteriormente (sec. con núm. de ident.: 655 de la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. de serie 61/356,379 presentada el 18 de junio de 2010 e incorporada en la presente descripción como referencia) . El fragmento de Klenow se usó para hacer que todos los extremos sean compatibles para ligación y los transformantes se analizaron por medio de PCR para seleccionar un clon con el gen de resistencia a la geneticina en la misma orientación que el marcador de URA3 anterior con los cebadores BK468 (sec. con núm. de ident. : 188) y N160SeqF5 (sec. con núm. de ident.: 189). El clon resultante se denominó pUC19-kan: :pdcl : :FBA-alsS : :TRX1 (clon A) (sec. con núm. de ident.: 190) .

El vector de integración pUC19-kan : : pdcl : : FBA-alsS descrito anteriormente se linealizó con Pmel y se transformó en PNY1507 (descrito anteriormente) . Pmel corta el vector dentro de la región intergénica de pdcl-TRXl clonada y, por lo tanto, lleva a la integración prevista en esa ubicación (Rothstein, Methods Enzymol . 194:281-301, 1991). Los transformantes se seleccionaron en YPE más 50 µ9/t?1 de G418. Los transformantes parchados se analizaron por PCR para determinar el evento de integración con los cebadores N160SeqF5 (sec. con núm. de ident . : 189) y OBP512 (sec. con núm. de ident.: 47). Se probaron dos transformantes indirectamente para determinar la función de acetolactato sintasa mediante la evaluación de la capacidad de las cepas para preparar isobutanol . Para lograrlo, se suministraron genes de la ruta del isobutanol adicionales en vectores de lanzadera de levadura de E. coli (pYZ090AalsS y pBP915, descritos más adelante) . Un clon, la cepa MATa ura3A: : loxP his3A pdc6A pdclA : : P [PDC1] -DHAD | ÍlvD_Sm-PDClt-pUC19- loxP-kanMX- loxP-P [FBA1] -ALS | alsS_Bs-CYClt pdc5A : : P [PDC5] - ADHIsadB_Ax-PDC5t gpd2A::loxP fra2A adhlA : :UAS (PGK1) P [FBA1] -kivD_Ll (y) -ADHlt se designó como PNY2204. PNY2205 es PNY2204 transformado con los plásmidos pYZ090AalsS y pBP915.

Plásmidos de la ruta de isobutanol (pYZ090AalsS y pBP915) se realizó la digestión de pYZ090 (sec. con núm. de ident.: 1) con Spel y Notl para eliminar la mayor parte del promotor de CUPl y toda la secuencia codificante de alsS y el terminador de CYC. Después, se realizó la autoligación del vector posterior al tratamiento con el fragmento de Klenow y se transformó en células Stbl3 de E. coli y se seleccionó la resistencia a la ampicilina. La eliminación de la región de ADN se confirmó para dos clones independientes por secuenciación de ADN a través de la unión de ligación por PCR con el cebador N191 (sec. con núm. de ident . : 191). El plásmido resultante se denominó pYZ090AalsS (sec. con núm. de ident . : 192) . pBP915 se construyó a partir de pLH468 (sec. con núm. de ident.: 2; solicitud provisional de los Estados Unidos núm. de serie. 61/246,709 presentada el 29 de setiembre de 2009) por la supresión del gen kivD y 957 pares de bases del promotor de TDH3 corriente arriba de kivD. Se realizó la digestión de pLH468 con SwaI y el fragmento grande (12896 bp) se purificó en un gel de agarosa seguido de un estuche de extracción con gel (Qiagen, Valencia, CA) . El fragmento de ADN aislado se autoligó con ADN ligasa de T4 y se usó para transformar TOP10 Escherichia coli electrocompetente (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Se aislaron plásmidos a partir de transformantes y se controlaron para determinar la supresión apropiada por análisis de restricción con la enzima de restricción SwaI. Además, se realizó la secuenciación de los aislados a través del sitio de supresión con los cebadores OBP556 (sec. con núm. de ident.: 193) y OBP561 (sec. con núm. de ident.: 194). Un clon con la supresión apropiada se designó como pBP915 (pLH468AJivD) (sec. con núm. de ident.: 195) .

Construcción de las cepas NYLA74, NYLA83 y NYLA84 Inserción-inactivación de genes endógenos PDCl y PDC6 de S. cerevisiae. Los genes PDCl, PDC5 y PDC6 codifican las tres isozimas principales de piruvato decarboxilasa y se describen a continuación: Construcción de pRS425 : : GPM-sadB Se clonó un fragmento de ADN que codifica butanol deshidrogenasa (sec. con núm. de ident . : 70) de Achromobacter xylosoxidans (descrito en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0269823) . La región codificante de este gen denominada sadB para el alcohol deshidrogenasa secundario (sec. con núm. de ident.: 69) se amplificó con condiciones estándar del ADN genómico de A. xylosoxidans preparado con un estuche Gentra® Puregene® (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con el protocolo recomendado para organismos gram negativos con los cebadores directo e inverso N473 y N469 (sec. con núms . de ident.: 74 y 75), respectivamente. El producto de PCR se clonó con TOPO®-Blunt en pCR®4 BLUNT ( Invitrogen™ , Carlsbad, CA) para producir pCR4Blunt : : sadB que se transformó en células Mach-1 de E. coli. Posteriormente, el plásmido se aisló de cuatro clones, y se verificó la secuencia.

La región codificante de sadB se amplificó por PCR a partir de pCR4Blunt : : sadB . Los cebadores de PCR contenían secuencias de 5' adicionales que se traslaparían con el promotor de GPM1 de levadura y el terminador de ADH1 (N583 y N584 proporcionados como las sec . con núms . de ident.: 76 y 77 ) . Después, el producto de PCR se clonó con la metodología "reparación de interrupción" en Saccharomyces cerevisiae (Ma, et al., Gene 58:201-216, 1987) de la siguiente manera. Se realizó la digestión del vector de lanzadera de E. coli de levadura pRS425 : : GPM : : kivD: ·.ADH que contiene el promotor de GPM1 (sec. con núm. de ident.: 72), la región codificante de kivD de Lactococcus lactis (sec. con núm. de ident.: 71) y el terminador de ADH1 (sec. con núm. de ident.: 73) (descritos en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0092957 Al, Ejemplo 17) con las enzimas de restricción de BbvCI y Pací para liberar la región codificante de kivD. Se transformó aproximadamente 1 ig del fragmento del vector restante en la cepa de S. cerevisiae BY4741 junto con 1 µg de producto de PCR de sadB. Se seleccionaron transformantes en medio sintético completo sin leucina. El evento de recombinación adecuado, que genera el pRS425 : :GPM-sadB, se confirmó por PCR con los cebadores N142 y N459 (sec. con núms. de ident. : 108 y 109) .

Construcción del cásete de integración pdc6 : : PGPMl-sadB y supresión de PDC6 : Se preparó un cásete de integración pdc6 : : PGPMl-sadB-ADHlt-URA3r por medio de la unión del segmento de GP -sadB-ADHt (sec. con núm. de ident.: 79) de pRS425 : :GPM-sadB (sec. con núm. de ident . : 78) al gen URA3r de pUC19-URA3r. pUC19-URA3r (sec. con núm. de ident.: 80) contiene el marcador de URA3 de pRS426 (núm. de la ATCC 77107) flanqueado por secuencias de repetición homologas de 75 bp para permitir la recombinación homologa in vivo y la eliminación del marcador de URA3. Los dos segmentos de ADN se unieron por medio de PCR SOE (tal como describen Horton, et al., Gene 77:61-68, 1989) con el uso de ADN de los plásmidos pRS425: :GPM-sadB y pUC19-URA3r como plantillas, con ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y los cebadores 114117-11A a través de 114117A-11D (sec. con núms . de ident.: 81, 82, 83 y 84) y 114117-13A y 114117-13B (sec. con núms. de ident.: 85 y 86 ) .

Los cebadores externos para la PCR SOE (114117-13A y 114117-13B) contenían regiones 5' y 3' de -50 pb homologas a las regiones corriente arriba y corriente abajo del promotor y terminador de PDC6, respectivamente. El fragmento de PCR del cásete finalizado se transformó en BY4700 (núm. de la ATCC 200866) y los transformantes se mantuvieron en medios sintéticos completos sin uracilo y suplementados con glucosa al 2 % a 30 30 °C mediante el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) . Los transformantes se analizaron por PCR mediante el uso de cebadores 112590-34G y 112590-34H (sec. con núm. de ident.: 87 y 88) y 112590-34F y 112590-49E (sec. con núm. de ident . : 89 y 90) para verificar la integración en el locus PDC6 con deleción de la región codificante del PDC6. El marcador de URA3r se recicló por cultivo en placas con medios sintéticos completos suplementados con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C de conformidad con protocolos estándar. Se confirmó la eliminación del marcador al colocar parches de colonias de las placas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante tiene el genotipo: BY4700 pdc6 : : PGPMl-sadB-ADHlt .

Construcción del cásete de integración pdcl:: PPDCl-ilvD y supresión de PDCl: Un cásete de integración pdcl : : PPDCl-ilvD-FBAlt-URA3r se preparó mediante la unión del segmento ilvD-FBAlt (sec. con núm. de ident.: 91) de pLH468 (sec. con núm. de ident.: 2) al gen URA3r de pUC19-URA3r por medio de PCR SOE (tal como describen Horton, et al., Gene 77:61-68, 1989) con el uso de ADN de los plásmidos pLH468 y pUC19-URA3r como plantillas, con ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y los cebadores 114117-27A a 114117-27D (sec. con núms . de ident.: 111, 112, 113 y 114).

Los cebadores externos para la PCR SOE (114117-27A y 114117-27D) contenían las regiones 5' y 3' de -50 pb homologas a las regiones corriente abajo del promotor de PDCl y corriente abajo de la secuencia codificante de PDCl. El fragmento de PCR del cásete finalizado se transformó en pdc6 : : PGPMl-sadB-ADHlt de BY4700 y los transformantes se mantuvieron en medios sintéticos completos sin uracilo y suplementados con glucosa al 2 % a 30 °C mediante el uso de técnicas genéticas estándares (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202). Los transformantes se analizaron por PCR mediante el uso de cebadores 114117-36D y 135 (sec. con núms . de ident . : 92 y 93) y los cebadores 112590-49E y 112590-30F (sec. con núms. de ident.: 90 y 94) para verificar la integración en el locus del PDC1 con deleción de la secuencia codificante de PDC1. El marcador de URA3r se recicló por cultivo en placas con medios sintéticos completos suplementados con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C de conformidad con protocolos estándar. Se confirmó la eliminación del marcador al colocar parches de colonias de las placas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa resultante identificada "NYLA67" tiene el genotipo: BY4700 pdc6 : : PGPMl-sadB-ADHlt pdcl:: PPDC1- ilvD-FBAlt .

Supresión de HIS3 Para suprimir la región codificante del gen endógeno HIS3, un cásete his3::URA3r2 se amplificó por PCR a partir de la plantilla de ADN URA3r2 (sec. con núm. de ident.: 95). URA3r2 contiene el marcador de URA3 de pRS426 (núm. de la ATCC 77107) flanqueado por secuencias de repetición homologas de 500 bp para permitir la recombinación homologa in vivo y la eliminación del marcador de URA3. La PCR se realizó con ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) e cebadores 114117-45A y 114117-45B (sec. con núms . de ident. : 96 y 97) que generó un producto de la PCR ~2.3 kb. La porción de HIS3 de cada cebador se derivó de la región 5' corriente arriba del promotor de HIS3 y región 3' corriente abajo de la región codificante para que la integración del marcador de URA3r2 produzca el reemplazo de la región codificante de HIS3. El producto de la PCR se transformó en NYLA67 mediante el uso de técnicas genéticas estándares (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) y se seleccionaron los transformantes sobre medios completos sintéticos sin uracilo y suplementados con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes se analizaron para verificar la integración correcta por sembrado en placas de réplica de transformantes sobre medios completos sintéticos sin histidina y suplementados con glucosa al 2 % a 30 °C. El marcador URA3r se recicló por sembrado en placas sobre medios completos sintéticos suplementados con glucosa al 2 % y 5-FOA a 30 °C de conformidad con los protocolos estándar. Se confirmó la eliminación del marcador al colocar parches de colonias de las placas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante, denominada NYLA73, tiene el genotipo: BY4700 pdc6 : : PGPM1-sadB-ADHlt pdcl:: PPDCl-ilvD-FBAlt Ahis3.

Construcción del cásete de integración pdc5::kanMX y supresión de PDC5 : Se amplificó por PCR un cásete pdc5 : : kanMX4 del ADN cromosómico de la cepa YLR134W (núm. de la ATCC 4034091) con ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) e cebadores PDC5::KanMXF y PDC5 : : KanMXR (sec. con núms . de ident . : 98 y 99) que generó un producto PCR de -2.2 kb. La porción de PDC5 de cada cebador se derivó de la región 5' corriente arriba del promotor de PDC5 y región 3' corriente abajo de la región codificante para que la integración del marcador de kanMX4 produzca el reemplazo de la región codificante de PDC5. El producto de la PCR se transformó en NYLA73 mediante el uso de técnicas genéticas estándares (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) y se seleccionaron transformantes sobre medios YP suplementados con etanol al 1 % y geneticina (200 pg/ml) a 30 °C. Los transformantes se analizaron por PCR para verificar la integración correcta en el locus del PDC con reemplazo de la región codificante de PDC5 mediante el uso de cebadores PDC5kofor y N175 (sec. con núms. de ident.: 100 y 101). Los transformantes correctos identificados tienen el genotipo: BY4700 pdc6:: PGPM1-sadB-ADHlt pdcl:: PPDC1-ilvD-FBAlt Ahis3 pdc5 : : kan X4. La cepa se denominó NYLA74.

Los vectores de los plásmidos pRS423 : : CUPl-alsS+FBA-budA y pRS426 : : FBA-budC+GPM-sadB se transformaron en NYLA74 para crear una cepa productora de butanodiol (NGCI-047) .

Los vectores de los plásmidos pLH475-Z4B8 (sec. con núm. de ident . : 140) y pLH468 se transformaron en NYLA74 para crear una cepa productora de isobutanol (NGCI-049) .

Supresión de HXK2 (hexoquinasa II) : Se amplificó por PCR un cásete de hxk2::URA3r de la plantilla de URA3r2 (descrita anteriormente) con ADN polimerasa Phusion® (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) y los cebadores 384 y 385 (sec. con núms . de ident.: 102 y 103) que generó un producto PCR de -2.3 kb. La HX 2 porción de de cada cebador se derivó de la región 5' corriente arriba del promotor HXK2 y región 3' corriente abajo de la región codificante para que la integración del marcador de URA3r2 produzca el reemplazo de la región codificante de HX 2. El producto de la PCR se transformó en NYLA73 por medio de las técnicas genéticas estándares (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) y los transformantes se seleccionaron sobre los medios completos sintéticos sin uracilo y suplementado con glucosa al 2 ¾ a 30 °C. Los transformantes se analizaron por PCR para verificar la integración correcta en el locus de HXK2 con reemplazo de la región codificante de HXK2 por medio del uso de cebadores N869 y N871 (sec. con núms . de ident.: 104 y 105 ). El marcador URA3r2 se recicló por cultivo en placas con medios sintéticos completos suplementados con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C de conformidad con protocolos estándar. Se confirmó la eliminación del marcador al colocar parches de colonias de las placas 5-FOA sobre los medios SD -URA para verificar la ausencia de crecimiento, y por PCR para verificar la eliminación del marcador correcto por medio del uso de cebadores N946 y N947 (sec. con núms. de ident.: 106 y 107). La cepa identificada resultante, denominada NYLA83, tiene el genotipo: BY4700 pdc6 : : PGPMl-sadB-ADHlt pdcl:: PPDCl-ilvD-FBAlt Ahis3 Ahxk2.

Construcción del cásete de integración pdc5::kanMX y supresión de PDC5 : Un cásete A pdc5::kanMX4 se amplificó por PCR como se describió anteriormente. El fragmento PCR se transformó en NYLA83 y los transformantes se seleccionaron y se analizaron como se describió anteriormente. Los transformantes correctos identificados denominados NYLA84 tiene el genotipo: BY4700 pdc6:: PGPMl-sadB-ADHlt pdcl:: PPDC1- ilvD-FBAlt Ahis3 Ahxk2 pdc5 : :kanMX4.

Los vectores de los plásmidos pLH468 y pLH532 se transformaron simultáneamente en la cepa NYLA84 (BY4700 pdc6 : : PGPMl-sadB-ADHlt pdcl : : PPDCl-ilvD-FBAlt Ahis3 Ahxk2 pdc5 : : kanMX4 ) por medio del uso de técnicas genéticas estándares (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y el "butanológeno NYLA84" resultante se mantuvo sobre los medios completos sintéticos sin histidina ni uracilo y suplementado con etanol al 1 % a 30 °C.

Vector de expresión pLH468 El plásmido pLH468 (sec. con núm. de ident . : 2) se construyó para la expresión de DHAD, KivD y HADH en levadura y se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305363 incorporada en la presente descripción como referencia. pLH486 se construyó de manera que contuviera: un gen quimérico que tiene la región codificante del gen ilvD de Streptococcus mutans (posición nt 3313-4849) expresado a partir del promotor FBA1 de S. cerevisiae (nt 2109 - 3105) seguido del terminador de FBA1 (nt 4858 - 5857) para la expresión de DHAD; un gen quimérico que tiene la región codificante de alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo optimizada por codones (nt 6286-7413) expresado a partir del promotor GPM1 de S. cerevisiae (nt 7425-8181) seguido del terminador de ADH1 (nt 5962-6277) para la expresión de ADH; y un gen quimérico que tiene la región codificante del gen kivD optimizada por codones de Lactococcus lactis (nt 9249-10895) expresado a partir del promotor de TDH3 (nt 10896-11918) seguido del terminador de TDH3 (nt 8237-9235) para la expresión de KivD.

Las regiones codificantes para cetoisovalerato decarboxilasa de Lactococcus lactis (KivD) y alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (HADH) se sintetizaron por DNA2.0 , Inc. (Menlo Park, CA) en base a los codones que se optimizaron para la expresión en Saccharomyces cerevisiae (sec. con núms . de ident . : 71 y 118, respectivamente) y se proporcionaron en plásmidos pKivDy-DNA2.0 y pHadhy-DNA2.0. Las proteínas codificadas son las sec. con núms. de ident.: 117 y 119, respectivamente. Se construyeron los vectores de expresión individuales para KivD y HADH. Para unir pLH467 (pRS426: : PTDH3 -kivDy-TDH3t) , el vector pNY8 (sec. con núm. de ident.: 121; denominado, además, pRS426. GPD-ald-GPDt , descrito en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2008/0182308, ejemplo 17, incorporada en la presente descripción como referencia) se procesó por digestión con las enzimas AscI y Sfil, y así se escindió el promotor de GPD y la región codificante de ald. Un fragmento del promotor de TDH3 (sec. con núm. de ident.: 122) de pNY8 se amplificó por PCR para agregar un sitio AscI en el extremo 5' y un sitio Spel en el extremo 3' con el cebador de 5' OT1068 y el cebador de 3' OT1067 (sec. con núms. de ident.: 123 y 124 ) . El fragmento del vector pNY8 digerido con Ascl/Sfil se unió con el producto de PCR del promotor TDH3 digerido con AscI y Spel y el fragmento Spel-Sfil que contiene la región codificante de kivD optimizada por codones aislada del vector pKivD-DNA2.0. Por medio de la ligación triple se generó el vector pLH467 (pRS426 : : PTDH3 -kivDy-TDH3t) . El vector pLH467 se verificó por mapeo de restricción y secuenciación.

El pLH435 (pRS425: : PGPM1 -Hadhy-ADHlt ) se derivó del vector pRS425 : : GPM-sadB (sec. con núm. de ident . : 78) descrito en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. de serie 61/058,970, Ejemplo 3, incorporada en la presente descripción como referencia. pRS425 : :GPM-sadB es el vector de pRS425 (núm. de la ATCC 77106) con un gen quimérico que contiene el promotor de GPM1 (sec. con núm. de ident.: 72), la región codificante de butanol deshidrogenasa de Ac romojbac er xylosoxidans (sadB; sec. de ADN con núm. de ident.: 69; proteína con la sec. con núm. de ident. 70: descritas en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0269823) y el terminador de ADH1 (sec. con núm. de ident. : 73) . pRS425: :GPMp-sadB contiene los sitios Bbvl y Pací en los extremos 5' y 3' de la región codificante de sadB, respectivamente. Se agregó un sitio Nhel en el extremo 5' de la región codificante de sadB mediante la mutagénesis de sitio dirigido con los cebadores OT1074 y OT1075 (sec. con núms . de ident.: 126 y 127) para generar el vector pRS425-GPMp-sadB-NheI , el que se verificó mediante la secuenciación. pRS425 : : PGPMl-sadB-Nhel se procesó por digestión con Nhel y Pací para abandonar la región codificante sadB, y se unió con el fragmento Nhel -Pací que contiene la región codificante HADH optimizada por codones del vector pHadhy-DNA2.0 para crear el pLH435.

Para combinar los casetes de expresión de KivD y HADH en un solo vector, el vector de levadura pRS411 (núm. de la ATCC 87474) se procesó por digestión con SacI y Notl y se ligó con el fragmento Sacl-Sall de pLH467 que contiene el cásete PTDH3 -kivDy-TDH3t junto con el fragmento Sall-Notl de pLH435 que contiene el cásete PGP l-Hadhy-ADHlt en una reacción de ligación triple. Esto produjo el vector pRS411 : : PTDH3 -kivDy-PGPMl-Hadhy (pLH441) que se verificó con mapeo de restricción.

Para generar un vector de coexpresión para los tres genes en la ruta del isobutanol inferior: ilvD, kivDy y Hadhy se usó pRS423 FBA ilvD(Strep) (sec. con núm. de ident.: 128) que se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2010/0081154 como la fuente del gen IlvD. Este vector lanzadera contiene un origen de replicación Fl (nt 1423 a 1879) para mantenimiento en E. coli y un origen de 2 micrones (nt 8082 a 9426) para replicación en levadura. El vector tiene un promotor FBA1 (nt 2111 a 3108; sec. con núm. de ident.: 120) y un terminador de FBA (nt 4861 a 5860; sec . con núm. de ident . : 129) . Además, porta el marcador His (nt 504 a 1163) para selección en levadura y el marcador de resistencia a la ampicilina (nt 7092 a 7949) para selección en E. coli. La región codificante ilvD (nt 3116 a 4828; sec. con núm. de ident.: 115; Proteína con la sec. con núm. de ident. 116) de Streptococcus mutans UA159 (núm. de la ATCC 700610) está entre el promotor FBA y el terminador FBA y forma un gen quimérico para expresión. Además, una etiqueta Lumio está fusionada a la región codificante de ilvD (nt 4829-4849) .

La primera etapa fue linealizar pRS423 FBA ilvD(Strep) (también denominado pRS423-FBA(SpeI) -IlvD (Streptococcus mutans) -Lumio) con SacI y SacII (con el sitio SacII generado con extremos romos mediante el uso de la T4 ADN polimerasa) , para dar un vector con una longitud total de 9,482 pb. La segunda etapa fue aislar el cásete Jciv y-hADHy de pLH441 con SacI y Kpnl (con el sitio Kpnl generado con extremos romos mediante el uso de la T4 ADN polimerasa) , que da un fragmento de 6,063 pb . Este fragmento se unió con el fragmento del vector de 9,482 bp de pRS423 -FBA (Spel) -IlvD (Streptococcus mutans) -Lumio . Esto generó el vector pLH468 (pRS423 : : PFBA1-ilvD (Strep) Lumio-FBAlt-PTDH3 -kivDy-TDH31-PGPMl-hadhy-ADHlt) que se confirmó por mapeo de restricción y secuenciación .

Construcción de pLH532 El plásmido pLH532 (sec. con núm. de ident.: 130) se construyó para expresión de ALS y KARI en levadura. pLH532 es un vector de pHR81 (núm. de la ATCC 87541) que contiene los siguientes genes quiméricos: 1) el promotor CUP1 (sec con núm. de ident : 139), región codificante de la acetolactato sintasa de Bacillus subtilis (AlsS; sec. con núm. de ident.: 137; Proteína con la sec. con núm. de ident. 138) y el terminador2 de CYC1 (sec. con núm. de ident.: 133); 2) una región promotora ILV5 (sec. con núm. de ident.: 134), región codificante de PfS.IlvC (sec. con núm. de ident.: 132) y el terminador de ILV5 (sec. con núm. de ident.: 135) ; y 3) la región promotora FBA1 (sec. con núm. de ident.: 136), región codificante KARI de S. cerevisiae (ILV5; sec. con núm. de ident. : 131) ,· y el terminador de CYC1.

La región codificante de Pf5.IlvC es una secuencia que codifica KARI derivado de Pseudomonas fluorescens que se describió en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0163376, incorporada en la presente descripción como referencia.

La síntesis de la región codificante de Pf5.IlvC fue realizada por DNA2.0 , Inc. (Menlo Park, CA; sec. con núm. de ident.: 132) con base en los codones que se optimizaron para expresión en la Construcción de pYZ090 pYZ090 (sec. con núm. de ident.: 1) se basa en la cadena principal de pHR81 (núm. de la ATCC 87541) y se construyó de manera que contenga un gen quimérico que tiene la región codificante del gen alsS de Bacillus subtilis (posición nt 457-2172) expresado a partir del promotor CUP1 de levadura (nt 2-449) y seguido del terminador de CYC1 (nt 2181-2430) para la expresión de ALS y un gen quimérico que tiene la región codificante del gen ilvC de Lactococcus lactis (nt 3634-4656) expresado a partir del promotor ILV5 de levadura (2433-3626) y seguido del terminador de ILV5 (nt 4682-5304) para la expresión de KARI.

Construcción de pYZ067 pYZ067 se construyó de manera que contenga los siguientes genes quiméricos: 1) la región codificante del gen ilvD de UA159 de S. mutans (posición nt 2260-3971) expresado a partir del promotor FBA1 de levadura (nt 1161-2250) seguido del terminador de FBA (nt 4005-4317) para la expresión de dihidroxiácido deshidratasa (DHAD) , 2) la región codificante para ADH del hígado de caballo (nt 4680-5807) expresado a partir del promotor GPM de levadura (nt 5819-6575) seguido del terminador de ADH1 (nt 4356-4671) para la expresión del alcohol deshidrogenasa y 3) la región codificante del gen KivD de Lacrococcus lactis (nt 7175-8821) expresado a partir del promotor TDH3 de levadura (nt 8830-9493) seguido del terminador de TDH3 (nt 5682-7161) para la expresión de cetoisovalerato decarboxilasa .

Construcción de pR5423 : : CUPl-alsS+FBA-budA y pRS426::FBA-budC+GPM-sadB y pLH475-Z4B8 La construcción de pRS423 :: CUPl-alsS+FBA-budA y pRS426 : : FBA-budC+GPM-sadB y pLH475-Z4B8 se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305363 incorporada en la presente descripción como referencia.

Construcción de la cepa de Saccharomyces cerevisiae PNY2242 La cepa PNY2242 se construyó en varias etapas a partir de PNY1507 (descrita anteriormente) . Primero, se integró un gen quimérico que comprendía el promotor de FBA1, la región codificante de alsS y el terminador de CYC1 en el cromosoma XII, corriente arriba del gen TR 1. La secuencia del locus modificado se proporciona como la sec . con núm. de ident . : 196. Después, se integraron dos copias de un gen que codifica alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo en los cromosomas VII y XVI. En el cromosoma VII se colocó un gen quimérico que comprendía el promotor de PDC1, la región codificante de hADH y el terminador de ADH1 en el locus de fra2A (la supresión original de FRA2 se describió anteriormente) . La secuencia del locus modificado se proporciona como la sec. con núm. de ident. : 197. En el cromosoma XVI se integró un gen quimérico que comprendía el promotor de PDC5, la región codificante de hADH y el terminado de ADH1 en la región ocupada anteriormente por el elemento de repetición a largo plazo YPRCdeltal5. La secuencia del locus modificado se proporciona como la sec. con núm. de ident.: 198. Después, se suprimieron los genes nativos YMR226c y ALD6. La eliminación de YMR226c fue una supresión sin cicatrices de solamente la región codificante. La secuencia del locus modificado se proporciona como la sec. con núm. de ident.: 199. La región codificante de ALD6 más 700 bp de secuencia corriente arriba se suprimieron por medio de eliminación de marcador mediada por CRE-lox (metodología descrita anteriormente) , de manera que el locus resultante contiene un sitio loxP. La secuencia del locus modificado se proporciona como la sec. con núm. de ident.: 200. Por último, se introdujeron plásmidos en la cepa para expresión de KARI (pLH702, sec. con núm. de ident.: 201) y DHAD (pYZ067DkivDDhADH, sec. con núm. de ident.: 202) lo que produjo la cepa PNY2242.

Cuando el microorganismo recombinante produce isobutanol, en ciertas modalidades, los microorganismos exhiben una productividad específica más alta. Además, el índice volumétrico mejoró en aproximadamente 50 %. sin limitaciones teóricas de ninguna especie, se cree que los métodos descritos en la presente descripción proporcionan métodos de fermentación extractiva con rendimientos de producción del producto de alcohol mejorados. Como se consideró anteriormente, la producción de alcohol por medio de fermentación por microorganismos puede ser ineficaz debido a los umbrales de toxicidad del alcohol del microorganismo. En algunas modalidades, los métodos en la presente descripción proporcionan un medio para convertir el producto de alcohol en una sustancia menos tóxica para el microorganismo. Por ejemplo, el producto de alcohol se puede poner en contacto con ácido carboxílico en presencia de un catalizador que esterifica el alcohol con el ácido carboxílico y, de ese modo, produce ésteres de alcohol que son menos tóxicos para el microorganismo. Además, la generación de ésteres de alcohol del producto de alcohol produce una menor concentración del producto de alcohol en el medio de fermentación. La concentración reducida del producto de alcohol minimiza los efectos tóxicos del producto de alcohol en el microorganismo y, por lo tanto, lleva a rendimientos de la producción del producto de alcohol mejorados .

El ácido carboxílico puede ser útil como un extractante y los ésteres de alcohol pueden dividirse en el extractante. Sin embargo, la contaminación lipídica puede degradar el coeficiente de partición del extractante. Para reducir la degradación del coeficiente de partición del extractante, los lípidos presentes en el medio de fermentación se pueden convertir en extractante y, en consecuencia, minimizar la contaminación lipídica. En algunas modalidades, los métodos de la presente descripción proporcionan un medio para convertir los lipidos presentes en la materia prima o biomasa en un extractante por medio de la hidrólisis catalítica de los lipidos en ácido carboxílico. El ácido carboxílico producido por esta hidrólisis puede ser útil como un extractante o esterificarse con el producto de alcohol para formar ésteres de alcohol. Por lo tanto, los métodos descritos en la presente descripción proporcionan un medio para preservar el coeficiente de partición del extractante (por ejemplo, hidrólisis lipídica) así como para minimizar los efectos tóxicos del producto de alcohol (por ejemplo, esterificación del producto de alcohol.

El ácido carboxílico puede suministrarse al recipiente de fermentación o derivarse por hidrólisis de los lipidos (por ejemplo, biomasa) suministrados al recipiente de fermentación. La cantidad de ácido carboxílico debería ser suficiente para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase orgánica y una fase acuosa. Es decir, el ácido carboxílico (es decir, extractante) en una concentración apropiada entra en contacto con el caldo de fermentación y forma la mezcla de dos fases. Los ésteres de alcohol formados en el caldo de fermentación se dividirán, preferentemente, en la fase orgánica porque estos ésteres se forman con una concentración en exceso de la concentración de equilibrio de la fase acuosa. La fase orgánica que contiene éster de alcohol puede separarse del caldo de fermentación, el producto de alcohol puede recuperarse de la fase orgánica y el extractante puede reciclarse al recipiente de fermentación .

Además, si bien anteriormente se han descrito diversas modalidades de la presente invención, se debería comprender que se han presentado solamente como ejemplos, sin ser limitantes. Resultará evidente para las personas con experiencia en la técnica pertinente que pueden hacerse varios cambios en la forma y detalles de esta sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por lo tanto, la amplitud y el alcance de la presente invención no debería estar limitado por ninguna de las modalidades ilustrativas descritas anteriormente, sino que debería definirse solamente de conformidad con las reivindicaciones y sus equivalentes.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta descripción son indicativas del nivel de conocimiento del experto en la técnica a la que pertenece esta invención y se incorporan en la presente descripción como referencia para todos los propósitos como si se indicara específica e individualmente que cada publicación, patente o solicitud de patente individual se incorpora como referencia.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no limitantes ilustrarán adicionalmente la invención. Debería comprenderse que, si bien en los siguientes ejemplos se usa maíz como materia prima y COFA como ácido carboxílico pueden usarse otras fuentes de biomasa para la materia prima y ácidos distintos a COFA pueden ser útiles como ácido carboxílico, sin apartarse de la presente invención. Además, mientras que los siguientes ejemplos implican la producción de butanol y éster butílico, pueden producirse otros alcoholes que incluyen etanol y ésteres de alcohol sin apartarse de la presente invención.

Como se usan en la presente descripción, las abreviaturas incluidas a continuación tienen el siguiente significado: "g" significa gramo(s), "kg" significa kilogramo (s) , "1" significa litro (s), "mi" significa mililitro (s) , "µ?" significa microlitro (s) , "ml/1" significa mililitro (s) por litro, "ml/min" significa mililitro (s) por min, "DI" significa desionizada, "uM" significa micrómetro (s) , "nm" significa nanómetro (s) , "p/v" significa peso/volumen, "OD" significa densidad óptica, "OD600" significa densidad óptica a una longitud de onda de 600 nM, "dcw" significa peso de la célula seca, "rpm" significa revoluciones por minuto, "°C" significa grado (s) Celsius, "°C/min" significa grados Celsius por minuto, "slpm" significa litro (s) estándar por minuto, "ppm" significa parte por millón, "pdc" significa enzima piruvato decarboxilasa seguida por el número de la enzima.

Métodos generales Crecimiento en matraz de semillas Se cultivó una cepa de Saccharomyces cerevisiae diseñada por ingeniería para producir isobutanol a partir de una fuente de carbohidratos, con pdcl suprimido, pdc5 suprimido y pdc6 suprimido hasta 0.55-1.1 g/1 de dcw (OD6oo 1.3-2.6 - Thermo Helios a Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts ) en matraces de semillas a partir de un cultivo congelado. El cultivo se cultivó a 23- 26 °C en un incubador que rotaba a 300 rpm. El cultivo congelado se almacenó previamente a - 80 °C. El primer matraz de semillas estaba compuesto por: 3.0-5.0 g/1 de dextrosa 3.0-3.5 g/1 de etanol, anhidro 3.7 g/1 de mezcla de aminoácidos completa sintética ForMedium™ (Kaiser) : sin HIS, sin URA (núm. de referencia DSCK162CK) 6.7 g/1 de base de nitrógeno de levadura Difco sin aminoácidos (núm. 291920) .

Se transfirió ocho a doce mililitros del cultivo del primer matraz de semillas a un matraz de 2 1 y se cultivó a 30 °C en un incubador que rotaba a 300 rpm. El segundo matraz de semillas contenía 220 mi del siguiente medio: 30.0 g/1 de dextrosa 5.0 g/1 de etanol, anhidro 3.7 g/1 de mezcla de aminoácidos completa sintética ForMedium™ (Kaiser) : sin HIS, sin URA (núm. de referencia DSCK162CK) 6.7 g/1 de base de nitrógeno de levadura Difco sin aminoácidos (núm. 291920) 0.2 M de amortiguador MES titulado hasta pH 5.5-6.0.

El cultivo se cultivó hasta 0.55-1.1 g/1 de dcw (OD600 1.3-2.6) . Se añadió 30 mi de una solución que contenía 200 g/1 de peptona y 100 g/1 de extracto de levadura a esta concentración celular. Después, se realizó una adición de 250-300 mi de alcohol oleílico 90/95 0.2 uM esterilizado por filtro HD OCENOL® 90/95 (Cognis, Monheim, DE) en el matraz. El cultivo continúa su crecimiento hasta > 4 g/1 de dcw (OD60o > 10) antes de recolectarlo y añadirlo a la fermentación.

Preparación de la fermentación Preparación inicial del recipiente de fermentación Se cargó un recipiente de fermentación de vidrio con camisa de 2 1 (Sartorius AG, Goettingen, Alemania) con agua corriente hasta 66 % del peso de licuación. Se calibró una sonda de pH (Hamilton Easyferm Plus K8 , número de parte: 238627, Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Suiza) según el menú de calibración de la torre de control DCU-3 Sartorius. El cero se calibró en pH=7. La extensión se calibró en pH=4. Después, la sonda se colocó en el recipiente de fermentación a través de la placa frontal de acero inoxidable. Además, se colocó una sonda de oxígeno disuelto (sonda de p02) en el recipiente de fermentación a través de la placa frontal. Los tubos usados para suministrar nutrientes, cultivo de semillas, disolvente de extracción y base se acoplaron a la placa frontal y los extremos se cubrieron con lámina de metal . El recipiente de fermentación completo se colocó en un autoclave Steris (Steris Corporation, Mentor, Ohio) y se esterilizó en un ciclo de líquido por 30 minutos.

El recipiente de fermentación se extrajo del autoclave y se colocó en una celda de carga. La línea de suministro de agua y retorno de la camisa se conectó al agua de la casa y al drenaje de limpieza, respectivamente. Las líneas de entrada y salida del agua de enfriamiento del condensador se conectaron a un baño de temperatura de recirculación de 6 1 que funcionaba a 7 °C. La línea de ventilación que transfiere el gas desde el recipiente de fermentación se conectó a una línea de transferencia que se conectó a un espectrómetro de masa Thermo (Prima dB, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts ) . La línea del tubo rociador se conectó a la línea de suministro de gas. Los tubos para añadir nutrientes, disolvente de extracto, cultivo de semillas y base se conectaron a través de bombas o se sellaron con abrazaderas.

La temperatura del recipiente de fermentación se controló a 55 °C con un termopar y bucle de circulación de agua corriente. Se molieron granos de maíz húmedos (dentado amarillo núm. 2) con un molino triturador con un tamiz de 1.0 mm y los granos de maíz entero molidos resultantes se añadieron al recipiente de fermentación en una carga de 29-30 % (peso de los sólidos de maíz secos) de la masa de reacción de licuación.

Tratamiento con lipasas antes de la licuación Se añadió una solución matriz de enzimas lipasas al recipiente de fermentación hasta obtener una concentración final de lipasas de 10 ppm. El recipiente de fermentación se mantuvo a 55 °C, 300 rpm y 0.3 slpm de recubrimiento de N2 por > 6 h. Una vez completado el tratamiento con lipasas se realizó la licuación tal como se describe más adelante (licuación) .

Licuación Se añadió una alfa-amilasa al recipiente de fermentación según la hoja de especificación correspondiente mientras el recipiente de fermentación se mezclaba a 300-1200 rpm y se añadía N2 corriente estéril a 0.3 slpm a través del tubo rociador. El punto fijo de temperatura se modificó de 55 °C a 85 °C. Cuando la temperatura alcanzó > 80 °C se inició el tiempo de cocción de la licuación y el ciclo de licuación se mantuvo a > 80 °C por 90-120 minutos. El punto fijo de temperatura del recipiente de fermentación se estableció en la temperatura de fermentación de 30 °C después de completar el ciclo de licuación. El N2 se redirigió desde el tubo rociador hasta el espacio de cabeza para evitar la formación de espuma sin la adición de un agente antiespumante químico. Tratamiento con lipasas después de la licuación La temperatura del recipiente de fermentación se determinó en 55 °C en lugar de 30 °C después de completar el ciclo de licuación (licuación) . El pH se controló manualmente a pH=5.8 por medio de adiciones de bolos de ácido o base cuando fue necesario. Se añadió una solución matriz de enzimas lipasas al recipiente de fermentación hasta obtener una concentración final de lipasas de 10 ppm. El recipiente de fermentación se mantuvo a 55 °C, 300 rpm y 0.3 slpm de recubrimiento de N2 por > 6 h. Después de completar el tratamiento con lipasa, la temperatura del recipiente de fermentación se determinó en 30 °C.

Tratamiento de lipasas por medio de inactivación por calor (método de tratamiento de eliminación por calor) La temperatura del recipiente de fermentación se mantuvo a > 80 °C por > 15 minutos para inactivar la lipasa. Después de completar el tratamiento por medio de inactivación por calor, la temperatura del recipiente de fermentación se determinó en 30 °C.

Adición de nutrientes antes de la inoculación Se añadió etanol (7 ml/1, volumen posterior a la inoculación, 200 de graduación del alcohol, anhidro) al recipiente de fermentación inmediatamente antes de la inoculación. Se añadió tiamina hasta una concentración final de 20 mg/1 y, además, se añadió 100 mg/1 de ácido nicotínico inmediatamente antes de la inoculación.

Adición de alcohol oleílico o ácidos grasos de aceite de maíz antes de la inoculación Se añadió 1 1/1 (volumen posterior a la inoculación) de alcohol oleílico o ácidos grasos de aceite de maíz inmediatamente después de la inoculación.

Operación de fermentación Inoculación en el recipiente de fermentación La sonda de p02 de los recipientes de fermentación se calibró a cero mientras se añadía 2 al recipiente de fermentación. La sonda de p02 de los recipientes de fermentación se calibró hasta su extensión con aire estéril inyectado a 300 rpm. El recipiente de fermentación se inoculó, después, del segundo matraz de semillas con > 4 g/1 de dcw. El matraz de agitación se extrajo del incubador/agitador por 5 minutos y se dejó que las fases se separaran en la fase de alcohol oleílico y la fase acuosa. La fase acuosa (110 mi) se transfirió a una botella de inoculación estéril. El inoculo se bombeó al recipiente de fermentación a través de una bomba peristáltica.

Condiciones operativas del recipiente de fermentación El recipiente de fermentación se usó a 30 °C durante las etapas completas de crecimiento y producción. Se dejó que el pH bajara de un pH de 5.7-5.9 a un punto fijo de control de 5.2 sin añadir ácido. El pH se controló para el resto de la etapa de crecimiento y producción a un pH =5.2 con hidróxido de amonio. Se añadió aire estéril al recipiente de fermentación, a través del tubo rociador, a 0.3 slpm para el resto de las etapas de crecimiento y producción. Se configuró el circuito de control de PID de la caja de control DCU-3 Sartorius para controlar el p02 a 3.0 % solamente con el control de agitación, y el valor mínimo del agitador se determinó en 300 rpm y el valor máximo en 2000 rpm. La glucosa se suministró a través de sacarificación y fermentación simultánea de la templa de maíz licuada mediante la adición de una -amilasa (glucoamilasa) . Se mantuvo el exceso de glucosa (1-50 g/1) durante todo el tiempo en que el almidón estaba disponible para la sacarificación.

Analítico Análisis de gas El aire del proceso se analizó en un espectrómetro de masas Thermo Prima (Thermo Fisher Scientific Inc., altham, Massachusetts) . Este era el mismo aire del proceso que se esterilizó y, después, se añadió a cada recipiente de fermentación. El efluente gaseoso de cada recipiente de fermentación se analizó en el mismo espectrómetro de masas. Este equipo Thermo Prima dB incluye una prueba de control de calibración todos los lunes a las 6:00 de la mañana. El control de calibración se programó a través del programa Gas Works vi .0 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts) asociado con el espectrómetro de masa. El equipo se calibró para los siguientes gases: GAS Concentración en mol % Frecuencia para la calibración de la cal Nitrógeno 78 % Semanal Oxígeno 21 % Semanal Isobutanol 0.2 % Anual Argón 1 % Semanal Dióxido de carbono 0.03 % Semanal Se controló el dióxido de carbono a 5 % y 15 % durante el ciclo de calibración con otros gases embotellados conocidos. Se controló el oxígeno a 15 % con otros gases embotellados conocidos. En base al análisis del efluente gaseoso de cada recipiente de fermentación se midió la cantidad de isobutanol extraído, el oxígeno consumido y el dióxido de carbono captado en el efluente gaseoso por medio del análisis de la fracción molar del espectrómetro de masas y los regímenes de flujo del gas (controlador del flujo de masa) al recipiente de fermentación. Se calcula el índice de emisión de gases por hora y, después, ese índice se integra durante el transcurso de la fermentación. 1 Medición de la masa celular Se preparó una solución de azul de tripano al 0.08 % de una dilución 1:5 de azul de tripano al 0.4 % en NaCl (VWR BDH8721-0) con IX PBS . Se extrajo una muestra de 1.0 mi de un recipiente de fermentación y se colocó en un tubo de centrífuga Eppendorf de 1.5 mi y se centrifugó en un Eppendorf, 5415C a 14,000 rpm por 5 minutos. Después de la centrifugación, la capa disolvente superior se eliminó con una pipeta m200 Variable Channel BioHit con puntas de pipeta BioHit de 20-200 µ? . Se cuidó de no eliminar la capa ubicada entre las capas disolvente y acuosa. Una vez que se eliminó la capa disolvente, la muestra se suspendió otra vez con un Vortex-Genie® configurado a 2700 rpm.

Se requería una serie de diluciones para preparar la concentración ideal para los recuentos del hematocitómetro . Con la OD de 10 se realizaría una dilución 1:20 para obtener 0.5 de OD, lo que generaría la cantidad ideal de células para el recuento por cuadrado, 20-30. Para reducir la imprecisión de la dilución debido a la presencia de sólidos de maíz fue necesario realizar múltiples diluciones con puntas de pipeta BioHit de corte 100-1000 µ? . Se cortó aproximadamente 1 cm de las puntas para incrementar la abertura que evitó la obstrucción de la punta. Para una dilución de 1:20 final se preparó una dilución inicial 1:1 de la muestra de fermentación y una solución de NaCl al 0.9 %. Después, se generó una dilución 1:1 de la solución anterior (es decir, la dilución 1:1 inicial) y la solución de NaCl al 0.9 % (la segunda dilución) seguida de una dilución 1:5 de la segunda dilución y solución de azul de tripano. Las muestras se procesaron en vórtice entre cada dilución y las puntas de corte se enjuagaron en las soluciones de NaCl al 0.9 % y azul de tripano.

Se colocó el cubreobjetos cuidadosamente encima del hemacitómetro (Hausser Scientific Bright-Line 1492) . Se extrajo una alícuota (10 µ?) de la dilución final de azul de tripano con una pipeta m20 Variable Channel BioHit con puntas de pipeta BioHit de 2-20 µ? y se inyectó en el hemacitómetro. El hemacitómetro se colocó en el microscopio Zeis Axioskop 40 con una ampliación de 40x. El cuadrante central se dividió en 25 cuadrados y se contaron y registraron los cuatro cuadrados de las esquinas y el centro en ambas cámaras. Después del conteo de ambas cámaras, se tomó el promedio y se multiplicó por el factor de dilución (20) , después, por 25 para la cantidad de cuadrados en el cuadrante en el hemacitómetro y, después, se dividió por 0.0001 mi, que es el volumen del cuadrante que se contó. La suma de este cálculo es el número de células por mi .

Análisis por CL de productos de fermentación en la fase acuosa Las muestras se refrigeraron hasta que estuvieron listas para el procesamiento. Las muestras se extrajeron de la refrigeración y se dejó que alcanzaran la temperatura ambiente (aproximadamente una hora) . Se transfirió aproximadamente 300 µ? de muestra con una pipeta mlOOO Variable Channel BioHit con puntas de pipeta de 100-1000 µ? BioHit a un filtro de centrífuga de 0.2 um (filtro de centrífuga de nailon modificado con MF, Nanosep®) , después, se centrifugó con un Eppendorf 5415C por cinco minutos a 14,000 rpm. Se transfirió aproximadamente 200 µ? de muestra filtrada al vial de un automuestreador de 1.8 con un inserto de vial de vidrio de 250 µ? con soporte polimérico. Se usó una tapa roscada con septos de PTFE para tapar el vial antes de procesar la muestra en vórtice con un Vortex-Genie® configurado a 2700 rpm.

Después, la muestra se trató en un CL serie 1200 de Agilent equipado con bombas isocráticas binarias, desgasificador por vacío, compartimento de columna calentado, sistema de enfriamiento del muestreador, detector DAD de UV y detector de RI . Se usó una columna Aminex HPX-87H, 300 X 7.8 con una recarga Bio-Rad Catión H, con protección 30 X 4.6. La temperatura de la columna fue de 40 °C con una fase móvil de ácido sulfúrico 0.01 N a un régimen de flujo de 0.6 ml/min por 40 minutos. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Tiempos de retención de productos de fermentación en la fase acuosa Análisis por CG de productos de fermentación en la fase disolvente Las muestras se refrigeraron hasta que estuvieron listas para el procesamiento. Las muestras se extrajeron de la refrigeración y se dejó que alcanzaran la temperatura ambiente (aproximadamente una hora) . Se transfirió aproximadamente 150 µ? de muestra con una pipeta mlOOO Variable Channel BioHit con puntas de pipeta de 100-1000 µ? BioHit al vial de un automuestreador de 1.8 con un inserto de vial de vidrio de 250 µ? con soporte polimérico. Se usó una tapa roscada con septos de PTFE para tapar el vial.

Después, la muestra se procesó en un CG Agilent 7890A con un inyector 7683B y un automuestreador G2614A. Se usó una columna HP-Inno ax (30 m x 0.32 mm de ID, película de 0.25 µt?) . Se usó helio como gas portador a un régimen de flujo de 1.5 ml/min medido a 45 °C con una presión de cabeza constante; una división del inyector de 1:50 a 225 °C; una temperatura del horno de 45 °C por 1.5 minutos, 45 °C a 160 °C a 10 °C/min por 0 minutos, después, 230 °C a 35 °C/min por 14 minutos para un tiempo transcurrido de 29 minutos. La detección de ionización de llama se usó a 260 °C con 40 ml/min de gas helio auxiliar. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Tiempos de retención de productos de fermentación en la fase disolvente Las muestras analizadas para determinar los esteres butílicos de ácidos grasos se procesaron en el CG Agilent 6890 con un inyector 7683B y un automuestreador G2614A. Se usó una columna HP-DB-FFAP (15 metros x 0.53 mm de ID (Megabore) , columna con un grosor de película de 1 micrón (30 m x 0.32 mm de ID, película de 0.25 m) . Se usó helio como gas portador a un régimen de flujo de 3.7 ml/min medido a 45 °C con una presión de cabeza constante; una división del inyector de 1:50 a 225 °C; una temperatura del horno de 100 °C por 2.0 minutos, 100 °C a 250 °C a 10 °C/min, después, 250 °C por 9 minutos para un tiempo transcurrido de 26 minutos. La detección de ionización de llama se usó a 300 °C con 40 ml/min de gas helio auxiliar. Se usaron los siguientes estándares de CC (Nu-Chek Prep; Elysian, M ) para confirmar la identidad de los productos de éster isobutílico de ácidos grasos: palmitato de isobutilo, estearato de isobutilo, oleato de isobutilo, linoleato de isobutilo, linolenato de isobutilo, araquidato de isobutilo.

Los Ejemplos 1-14 describen diversas condiciones de fermentación que pueden usarse para los métodos reivindicados. Como ejemplo, algunas fermentaciones se expusieron a licuación previa al tratamiento con lipasas y otras se expusieron a tratamiento con lipasas después de la licuación. En otros ejemplos, la fermentación se expuso a tratamiento por medio de inactivación por calor. Después de la fermentación se midió el título de isobutanol eficaz (título iso ef), es decir, el total de gramos de isobutanol producidos por litro de volumen acuoso. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Ejemplo 1 (control) El identificador del experimento 2010Y014 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de licuación, la adición de nutrientes antes del método de inoculación, el método de inoculación en recipiente de fermentación, el método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo lote entre 0.1 y 1.0 h después de la inoculación. Se usó NGCI-070 como butanológeno. Ejemplo 2 El identificador del experimento 2010Y015 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de licuación, el método de tratamiento con lipasas después de la licuación, el método de adición de nutrientes antes de la inoculación, el método de inoculación en el recipiente de fermentación, el método de las condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo lote entre 0.1 y 1.0 h después de la inoculación. Se usó NGCI-070 como butanológeno. Ejemplo 3 El identificador del experimento 2010Y016 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de licuación, el método de tratamiento con lipasas después de la licuación, el método de adición de nutrientes antes de la inoculación con la excepción de que se excluye el etanol, el método de inoculación en el recipiente de fermentación, el método de las condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo lote entre 0.1 y 1.0 h después de la inoculación. Se usó NGCI-070 como butanológeno.

Ejemplo 4 El identificador del experimento 2010Y017 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de licuación, el método de tratamiento por eliminación con calor después de la licuación, el método de adición de nutrientes antes de la inoculación con la excepción de que se excluye el etanol, el método de inoculación en el recipiente de fermentación, el método de las condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo lote entre 0.1 y 1.0 h después de la inoculación. Se usó NGCI-070 como butanológeno. Ejemplo 5 El identificador del experimento 2010Y018 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de licuación, el método de tratamiento con lipasas después de la licuación con la excepción de que solamente se añade 7.2 ppm de lipasa después de la licuación, el método de tratamiento por eliminación con calor después de la licuación, el método de adición de nutrientes antes de la inoculación, el método de inoculación en el recipiente de fermentación, el método de las condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo lote entre 0.1 y 1.0 h después de la inoculación. Se usó NGCI-070 como butanológeno. Ejemplo 6 (control) El identificador del experimento 2010Y019 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de licuación, el método de tratamiento por eliminación con calor después de la licuación, el método de adición de nutrientes antes de la inoculación, el método de inoculación en el recipiente de fermentación, el método de las condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo lote entre 0.1 y 1.0 h después de la inoculación. Se usó NGCI-070 como butanológeno.

Ejemplo 7 (control) El identificador del experimento 2010Y021 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de tratamiento con lipasas antes de la licuación, el método de licuación, el tratamiento por eliminación con calor durante la licuación, el método de adición de nutrientes antes de la inoculación, el método de inoculación en el recipiente de fermentación, el método de las condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo lote entre 0.1 y 1.0 h después de la inoculación. Se usó NGCI-070 como butanológeno.

Ejemplo 8 El identificador del experimento 2010Y022 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de licuación, la adición de nutrientes antes del método de inoculación, el método de inoculación en recipiente de fermentación, el método de condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo lote entre 0.1 y 1.0 h después de la inoculación. Se usó NGCI-070 como butanológeno. Ejemplo 9 El identificador del experimento 2010Y023 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de licuación, el método de tratamiento con lipasas después de la licuación, sin tratamiento por eliminación con calor, el método de adición de nutrientes antes de la inoculación, el método de inoculación en el recipiente de fermentación, el método de las condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadieron ácidos grasos de aceite de maíz elaborados a partir de aceite de maíz crudo en un solo lote 0.1- 1.0 h después de la inoculación. Se usó NGCI-070 como butanológeno.

Ejemplo 10 El identificador del experimento 2010Y024 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de tratamiento con lipasas antes de la licuación, el método de licuación, el tratamiento de eliminación con calor durante la licuación, el método de adición de nutrientes antes de la inoculación con la excepción de que ahí no se realiza la adición de etanol, el método de inoculación en el recipiente de fermentación, el método de las condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió alcohol oleílico en un solo lote entre 0.1 y 1.0 h después de la inoculación. Se usó NGCI-070 como butanológeno. Ejemplo 11 El identificador del experimento 2010Y029 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de tratamiento con lipasas antes de la licuación, el método de licuación, el tratamiento por eliminación con calor durante la licuación, el método de adición de nutrientes antes de la inoculación, el método de inoculación en el recipiente de fermentación, el método de las condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadieron ácidos grasos de aceite de maíz elaborados a partir de aceite de maíz crudo en un solo lote 0.1- 1.0 h después de la inoculación. Se usó NGCI-070 como butanológeno .

Ejemplo 12 El identificador del experimento 2010Y030 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de tratamiento con lipasas antes de la licuación, el método de licuación, el tratamiento de eliminación con calor durante la licuación, el método de adición de nutrientes antes de la inoculación con la excepción de que ahí no se realiza la adición de etanol, el método de inoculación en el recipiente de fermentación, el método de las condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadieron ácidos grasos de aceite de maíz elaborados a partir de aceite de maíz crudo en un solo lote 0.1- 1.0 h después de la inoculación. Se usó NGCI-070 como butanológeno. Ejemplo 13 (control) El identificador del experimento 2010Y031 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de licuación, el método de tratamiento con lipasas después de la licuación, sin tratamiento por eliminación con calor, el método de adición de nutrientes antes de la inoculación con la excepción de que no se realiza la adición de etanol, el método de inoculación en el recipiente de fermentación, el método de las condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadieron ácidos grasos de aceite de maíz elaborados a partir de aceite de maíz crudo en un solo lote 0.1- 1.0 h después de la inoculación. Se usó NGCI-070 como butanológeno .

Ejemplo 14 El identificador del experimento 2010Y032 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de licuación, el método de tratamiento con lipasas después de la licuación, sin tratamiento por eliminación con calor, el método de adición de nutrientes antes de la inoculación, el método de inoculación en el recipiente de fermentación, el método de las condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadieron ácidos grasos de aceite de maíz elaborados a partir de aceite de maíz crudo en un solo lote 0.1- 1.0 h después de la inoculación. Se usó NGCI-070 como butanológeno.

Tabla 3 Condiciones de fermentación para los Ejemplos 1-14 * "Título iso ef g/1" = total de gramos de isobutanol producidos por litro de volumen acuoso Los Ejemplos 15 y 16 representan una comparación de la fermentación y producción de isobutanol con y sin el tratamiento de lipasas después de la licuación. Los resultados se indican en las Tablas 4 y 5.

Ejemplo 15 El identif icador del experimento 2010Y026 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de licuación, el método de tratamiento con lipasas después de la licuación, el método de adición de nutrientes antes de la inoculación, el método de inoculación en el recipiente de fermentación, el método de las condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió los ácidos grasos de aceite de maíz elaborados a partir de aceite de maíz crudo en un solo lote 0.1- 1.0 h después de la inoculación. El disolvente de extracción de los ácidos grasos de aceite de maíz se añadió en un volumen igual al volumen del caldo de cultivo. Se usó PNY2205 como butanológeno . En un tiempo de 46 h a 61 h de fermentación se realizó la adición de 274 g de una solución de glucosa estéril 50 % p/p porque toda la glucosa preparada de la templa de maíz se había agotado.

Ejemplo 16 El identificador del experimento 2010Y027 incluyó: el método de crecimiento en matraz de semillas, el método de preparación en recipiente de fermentación inicial, el método de licuación, el método de adición de nutrientes antes de la inoculación, el método de inoculación en el recipiente de fermentación, el método de las condiciones operativas del recipiente de fermentación, y todos los métodos analíticos. Se añadió HD OCENOL® 90/95 (alcohol oleílico, núm. del CAS 143-28-2, Cognis, Monheim, DE) en un solo lote 0.1- 1.0 h después de la inoculación. El disolvente de extracción del alcohol oleílico se añadió en un volumen igual al volumen del caldo de cultivo. Se usó PNY2205 como butanologeno.

Tabla 4 Tabla 5 Los Ejemplos 17 a 22 representan una comparación del efecto del extractante nuevo contra el extractante reciclado en la fermentación y la producción de isobutanol. Los resultados se muestran en la Tabla 6. Para estos ejemplos se prepararon fermentaciones de 2 1 y 10 1 tal como se describe más adelante.

Crecimiento previo en matraz de semillas de 10 1 Se creció una cepa de Saccharomyces cerevisiae (cepa PNY2242 descrita anteriormente) diseñada por ingeniería para producir isobutanol a partir de una fuente de carbohidratos de la cual se eliminó el pdcl, el pdc5 y el pdc6 hasta 0.6-0.7 g/1 de dcw (OD60o 1.5-2.5 - Thermo Helios a Thermo Fisher Scientific Inc., altham, assachusetts) en matraces de semillas (10 mi de medio sintético en un matraz de 125 mi 5 aireado) a partir de un cultivo congelado. El cultivo se cultivó a 29-31 °C en un incubador que rotaba a 260 rptn. El cultivo congelado se almacenó previamente a - 80 °C. El medio del matraz de semillas sintético estaba compuesto por: 10.0 g/1 de dextrosa 3.5 ml/1 de etanol, anhidro 3.7 g/1 de mezcla de aminoácidos completa sintética ForMedium™ (Kaiser) : sin HIS, sin URA (núm. de referencia DSCK162CK) 6.7 g/1 de base de nitrógeno de levadura Difco sin aminoácidos (núm. 291920) Ergersterol al 1 % en l:l::Tween 80: etanol Se transfirió dos mililitros del primer cultivo del matraz de semillas a 25 mi en un matraz de 250 mi aireado y se cultivó a 29-31 °C en un incubador que rotaba a 260 rpm. El segundo matraz de semillas contiene el mismo medio sintético usado anteriormente.

El cultivo se cultivó hasta 0.6-0.7 g/1 de dcw (OD60o 1.0-3.0) . Después, se añadió 8 mi de este segundo cultivo de matraz en tres matraces (matraces de 2 1 con deflectores aireado) con 200 mi de medio sintético. El cultivo se cultivó en un incubador a 29-31 °C por 18-24 h. Los tres matraces de semillas contienen el mismo medio sintético usado en los primeros dos matraces de semillas. Estos tres matraces (600 mi de caldo de cultivo de matraz) se usan para inocular el tanque de propagación con un volumen acuoso final de 6 1. Licuación en tanque de propagación de 10 1 Se preparó un fermentador de 10 1, B. Braun BioStat C. En el fermentador se colocó una sonda de pH en línea. El cero se calibró en pH=7. La extensión se calibró en pH=4. Después, la sonda se colocó en el recipiente de fermentación a través de un puerto lateral. Además, se colocó una sonda de oxígeno disuelto (sonda de p02) en el fermentador a través de un puerto lateral. Los tubos usados para suministrar nutrientes, cultivo de semillas, disolvente de extracción y base se acoplaron a la placa frontal y los extremos se cubrieron con lámina de metal. La válvula para la recolección y el muestreo se esterilizó con vapor de baja presión y una trampa de vapor a > 121 °C por > 20 minutos.

La temperatura del recipiente de fermentación se controló a 30 °C con un termopar y bucle de circulación de agua corriente. Se molieron granos de maíz húmedos (dentado amarillo núm. 2) con un molino triturador con un tamiz de 1.0 mm y los granos de maíz entero molidos resultantes se añadieron al recipiente de fermentación en una carga de 10-20 % (peso de los sólidos de maíz secos) de la masa de reacción de licuación. Se añadió extracto de levadura Difco en el fermentador a 0.5 % p/p del peso total del lote.

Se añadió una alfa-amilasa al recipiente de fermentación según la hoja de especificación correspondiente mientras el recipiente de fermentación se mezclaba a 300-1500 rpm y se añadía N2 corriente estéril a 12 slpm a través del tubo rociador. El punto fijo de la temperatura se modificó de 55 °C a 95 °C en etapas de 5 °C con una detención de 5-15 minutos en cada etapa para asegurar el mezclado adecuado. Cuando la temperatura alcanzó > 90 °C se inició el tiempo de cocción de la licuación y el ciclo de licuación se mantuvo a > 90 °C por 60 minutos. El punto fijo de temperatura del recipiente de fermentación se estableció en la temperatura de fermentación de 30 °C después de completar el ciclo de licuación. El N2 se redirigió desde el tubo rociador hasta el espacio de cabeza para evitar la formación de espuma sin la adición de un agente antiespumante químico.

Operación del tanque de propagación de 10 1 La sonda de p02 de los recipientes de fermentación se calibró a cero mientras se añadía N2 al recipiente de fermentación. La sonda de p02 de los recipientes de fermentación se calibró hasta su extensión con aire estéril inyectado a 400 rpm. El recipiente de fermentación se inoculó desde la etapa final de la etapa previa de crecimiento en matraz de semillas. Los tres matraces de agitación se extrajeron del incubador/agitador y se añadieron a un recipiente estéril. El contenido del recipiente estéril se añadió a 5.3-5.5 1 de la templa licuada que se preparó durante el método de licuación en tanque de propagación.

La temperatura de fermentación se controló entre 29-31 °C. La velocidad de agitación se fijó en 400 rpm. El aire se inyectó para toda la fermentación a 2.0 slpm. El pH se controló en 5.4-5.5 con NH4OH y el bucle de control de PID para el termentador. La contrapresión configurada en el termentador fue de 30-50 kPa (0.3-0.5 bar) controlada por un bucle de PID que controlaba una válvula de control de contrapresión . 16-20 h después de la inoculación se añadió una glucoamilasa (1.8 mi de Distillase® L-400, Genencor, Palo Alto, CA) para iniciar la sacarificación y fermentación simultánea de manera que se libere glucosa del almidón disuelto. Además, se añadió 5.5 1 de HD OCENOL® 90/95 (alcohol oleílico, Cognis, Monheim, DE) en el termentador. A 34-36 h se redujo la velocidad del agitador hasta 100 rpm. Después de 10 minutos, el agitador se desactivó y el flujo de aire al termentador se modificó del modo inyección al modo recubrimiento .

Licuación en tanque de producción de 10 1 Se realizó la licuación en un tanque de producción de 10 1 tal como se describió anteriormente. La temperatura del recipiente de fermentación se controló a 30 °C con un termopar y bucle de circulación de agua corriente. Se molieron granos de maíz húmedos (dentado amarillo núm. 2) con un molino triturador con un tamiz de 1.0 mm y los granos de maíz entero molidos resultantes se añadieron al recipiente de fermentación en una carga de 25-35 % (peso de los sólidos de maíz secos) de la masa de reacción de licuación. Se añadió 75 mi de una solución de vitaminas 100X (2 g/1 de tiamina y 10 g/1 de ácido nicotínico) en el fermentador. Se añadió una alfa-amilasa en el recipiente de fermentación tal como se describió anteriormente. Además, se añadió 6-7 ml/1 de etanol anhidro al fermentador después de que la temperatura del fermentador alcanzó otra vez 30 °C Operación del tanque de producción de 10 1 La sonda de p02 de los recipientes de fermentación se calibró a cero mientras se añadía N2 al recipiente de fermentación. La sonda de p02 de los recipientes de fermentación se calibró hasta su extensión con aire estéril inyectado a 400 rpm. El recipiente de fermentación se inoculó desde el tanque de propagación. Se realizó una transferencia aséptica desde el tanque de propagación después de 36 h de tiempo de crecimiento en el tanque de propagación y la agitación de la fermentación se desactivó por > 10 minutos. Esto permitió una separación significativa del alcohol oleílico y la fase acuosa. La transferencia aséptica se realizó desde la válvula de recolección en el tanque de propagación ubicada en el fondo de este fermentador. Se añadió aproximadamente 10 % v/v en el tanque de producción en base al volumen sin disolvente final de los tanques después de la transferencia.

La temperatura de fermentación se controló entre 29-31 °C. La velocidad de agitación se fijó en 400 rpm. El aire se inyectó para toda la fermentación a 2.0 slpm. El pH se controló en 5.2-5.3 con NH40H y el bucle de control de PID para el termentador. La contrapresión configurada en el termentador fue de 30-50 kPa (0.3-0.5 bar) controlada por un bucle de PID que controlaba una válvula de control de contrapresión .

Inmediatamente antes de la inoculación se añadió asépticamente 25-35 % v/v de ácido graso de soja Cognis Emery® 610 en el termentador. El termentador se inoculó con 10 % v/v de caldo de fermentación después de completar el método de operación del tanque de propagación de 10 1. Inmediatamente después de la inoculación se añadió una glucoamilasa (Distillase® L-400) para liberar glucosa del almidón. Se realizaron otras adiciones de glucoamilasa cuando fue necesario para mantener el exceso de glucosa. Inmediatamente después de la inoculación se añadió una lipasa (Novozymes Lipolase® 100 L) al fermentador a 4-15 ppm.

Crecimiento previo en matraz de semillas de 2 1 Se preparó un crecimiento previo en matraz de semillas de 2 1 con la cepa de Saccharomyces cerevisiae (cepa PNY2242 descrita anteriormente) y se cultivó hasta 0.6-0.7 g/1 de dcw (OD60o 1.5-2.5 - Thermo Helios a Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts) en matraces de semillas (10 mi de medio sintético en un matraz 125 mi aireado) de un cultivo congelado. El cultivo se cultivó a 29-31 °C en un incubador que rotaba a 260 rpm. El cultivo congelado se almacenó previamente a - 80 °C. El medio del matraz de semillas sintético estaba compuesto por: 10.0 g/1 de dextrosa 3.5 ml/1 de etanol, anhidro 3.7 g/1 de mezcla de aminoácidos completa sintética ForMedium (Kaiser) : sin HIS, sin URA (núm. de referencia DSCK162CK) 6.7 g/1 de base de nitrógeno de levadura Difco sin aminoácidos (núm. 291920) Ergersterol al 1 % en l:l::Tween 80: etanol Se transfirió dos mililitros del primer cultivo del matraz de semillas a 25 mi en un matraz de 250 mi aireado y se cultivó a 29-31 °C en un incubador que rotaba a 260 rpm. El segundo matraz de semillas contiene el mismo medio sintético usado anteriormente.

El cultivo se cultivó hasta 0.6-0.7 g/1 de dcw (OD60o 1.0-3.0) . Después, 4 mi del cultivo de este segundo matraz se añadió a 100 mi de centrado de templa de maíz en un matraz de 2 1. El cultivo se cultivó en un incubador a 29-31 °C por 18-24 h. Después, se añadió 500 mi de HD OCENOL® 90/95 (alcohol oleílico, Cognis, onheim, DE) en el matraz. Se dejó el matraz en crecimiento por 6-8 h. Después, se añadió 2 mi de un L-400 Distillase® de 1.2 g, (Genencor, Palo Alto, CA) en 80 mi de agua desionizada en el centrado para liberar glucosa del almidón disuelto en el centrado. Se dejó en crecimiento por 18-24 h. La concentración de biomasa final fue de 6-12 g/1 de dcw.

El centrado de la templa de maíz se preparó por medio de licuación de maíz con la siguiente receta: 1150 g de agua corriente 340.5 g de maíz molido tamizado a 1 mm 13.5 g de extracto de levadura (Difco núm. 9102333, baja formación de polvo) 27 g de peptona 4.1 g de urea 40.5 mg de ácido nicotínico 40.5 mg de tiamina.

Después, el material se centrifugó por 30 minutos en una centrífuga Sorval RC5C. El sobrenadante se separó de las bolillas de los sólidos. El sobrenadante se calentó en un autoclave Steris durante un ciclo de líquido de 5 minutos y se obtuvo el centrado.

Preparación de la fermentación de 2 1 Preparación del recipiente de fermentación inicial de 2 1 Se preparó un recipiente de fermentación inicial de 2 1, tal como se describió anteriormente. La temperatura del recipiente de fermentación se controló a 55 °C con un termopar y bucle de circulación de agua corriente. Se molieron granos de maíz húmedos (dentado amarillo núm. 2) con un molino triturador con un tamiz de 1.0 mm y los granos de maíz entero molidos resultantes se añadieron al recipiente de fermentación en una carga de 25-30 % (peso de los sólidos de maíz secos) de la masa de reacción de licuación. Además, se realizó la licuación tal como se describió anteriormente. Se añadió una alfa-amilasa al recipiente de fermentación según la hoja de especificación correspondiente mientras el recipiente de fermentación se mezclaba a 300-1200 rpm y se añadía N2 corriente, estéril, a 0.3 slpm a través del tubo rociador .

Adiciones de 2 1 antes de la inoculación Se añadió los siguientes nutrientes en el recipiente de fermentación antes de la inoculación, después de la licuación, basado en el volumen posterior a la inoculación: 30 mg/1 de ácido nicotínico 30 mg/1 de tiamina 1 ml/1 de una solución p/v de ergersterol al 1 % en l:l:Tween 80:etanol 6.3 ml/1 de etanol 2 g/1 de urea.

Inoculación en el recipiente de fermentación de 2 1 La sonda de p02 de los recipientes de fermentación se calibró a cero mientras se añadía N2 al recipiente de fermentación. La sonda de p02 de los recipientes de fermentación se calibró hasta su extensión con aire estéril inyectado a 300 rpm. El recipiente de fermentación se inoculó desde la etapa final de la etapa previa de crecimiento en matraz de semillas. El matraz de agitación se extrajo del incubador/agitador y se centrifugó por 30 minutos. El líquido (alcohol oleílico y sobrenadante acuoso) se descartó y la bolilla de células se resuspendió en el medio de crecimiento previo en matraz de semillas (medio sintético) . Los 100 mi de la fase acuosa se transfirieron a una botella de inoculación estéril. El inoculo se bombeó al recipiente de fermentación a través de una bomba peristáltica.

Adición de 2 1 de lipasa después de la inoculación Se preparó una solución de Lipolase® (solución matriz de 100 1) hasta una concentración enzimática de 1.2-1.4 mg/ml. La solución se añadió en la fermentación después de inocular el termentador hasta la concentración en partes por millón deseada en base al volumen sin disolvente. La adición se realizó < 1 h después de inocular el fermentador.

Adición de 2 1 de ácido graso de aceite de frijol de soja En el recipiente de fermentación se añadió 0.1-0.5 1/1 (volumen después de la inoculación) de ácido graso SOYA Cognis Emery® 610 virgen o ácidos grasos SOYA 610 Cognis Emery® reciclados que contenían 0-30 por ciento en peso de éster butílico de ácido graso.

Condiciones operativas del recipiente de fermentación de 2 1 El recipiente de fermentación se usó a 30 °C durante las etapas completas de crecimiento y producción. Se dejó que el pH bajara de un pH de 5.7-5.9 a un punto fijo de control de 5.25 sin añadir ácido. El pH se controló para el resto de la etapa de crecimiento y producción a un pH =5.2 con hidróxido de amonio. Se añadió aire estéril al recipiente de fermentación, a través del tubo rociador, a 0.3-0.2 slpm para el resto de las etapas de crecimiento y producción. La p02 no se controló. El agitador se estableció en rpm fijas a 300 rpm. El eje de agitación tenía dos impulsores Rushton debajo del nivel acuoso y un impulsor de paletas inclinadas por encima del nivel acuoso. La glucosa se suministró a través de sacarificación y fermentación simultánea de la templa de maíz licuada mediante la adición de una glucoamilasa . Se mantuvo el exceso de glucosa (1-50 g/1) durante todo el tiempo en que el almidón estaba disponible para la sacarificación.

Se extrajo una muestra de 5-20 mi de un recipiente de fermentación y se colocó en un tubo de centrífuga para medir la masa celular con el procedimiento descrito anteriormente. Además, los métodos analíticos tales como análisis de gas así como el análisis por CL de productos de fermentación en la fase acuosa y análisis por CG de productos de fermentación en la fase disolvente se realizaron tal como se describió anteriormente .

Las condiciones de fermentación para los Ejemplos 17 a 22 se proporcionan a continuación y un resumen de los resultados (ácidos grasos de aceite de frijol de soja virgen y ácidos grasos de frijol de soja reciclado con ésteres butílicos de ácidos grasos) se incluye en la Tabla 6.

Ejemplo 17 El identificador experimental GLNOR1050 incluyó: crecimiento previo en matraz de semillas de 10 1, licuación en tanque de propagación de 10 1, operación del tanque de propagación de 10 1, licuación en tanque de producción de 10 1, operación del tanque de producción de 10 1 con adición de 10 ppm de Lipolase® 100 L (Genencor) en el termentador, extractante: ácido graso de soja Cognis Emery® 610 virgen (ácido graso de frijol de soja virgen) . El disolvente líquido y el material sin disolvente se separaron en una centrífuga Sorval RC-12 y se usaron todos los métodos analíticos.

Ejemplo 18 El identificador experimental GLNOR1051 incluyó: crecimiento previo en matraz de semillas de 10 1, licuación en tanque de propagación de 10 1, operación del tanque de propagación de 10 1, licuación en tanque de producción de 10 1, operación del tanque de producción de 10 1 con adición de 4 ppm de Lipolase® 100 L (Genencor) en el termentador, extractante: ácido graso de soja Cognis Emery® 610 virgen (ácido graso de frijol de soja virgen) . El disolvente líquido y el material sin disolvente se separaron en una centrífuga Sorval RC-12 y se usaron todos los métodos analíticos.

Ejemplo 19 El identificador 2011Y029 incluyó: crecimiento previo en matraz de semillas de 2 1 , preparación de la fermentación de 2 1, licuación de 2 1, adiciones de 2 1 antes de la inoculación, inoculación en recipiente de fermentación de 2 1, adición de 2 1 de lipasa después de la inoculación con una concentración final de 10 ppm, adición de 2 1 de ácidos grasos de aceite de frijol de soja reciclado (ácido graso Cognis Emery® 610 SOYA reciclado y éster butílico de ácido graso del Ejemplo 56A - carga de disolvente de 50 % v/v) , condiciones operativas del recipiente de fermentación de 2 1, y todos los métodos analíticos.

Ejemplo 20 El identificador 2011Y030 incluyó: crecimiento previo en matraz de semillas de 2 1, preparación de la fermentación de 2 1, licuación de 2 1, adiciones de 2 1 antes de la inoculación, inoculación en recipiente de fermentación de 2 1, adición de 2 1 de lipasa después de la inoculación con una concentración final de 10 ppm, 0.4 1/1 (volumen posterior a la inoculación) de ácidos grasos Virgin Cognis Emery® 610 SOYA añadidos que incluían 20-30 % de ésteres butílicos de ácidos grasos, condiciones operativas del recipiente de fermentación de 2 1 , y todos los métodos analíticos.

Ejemplo 21 El identificador 2011Y031 incluyó: crecimiento previo en matraz de semillas de 2 1 , preparación de la fermentación de 2 1, licuación de 2 1, adiciones de 2 1 antes de la inoculación, inoculación en recipiente de fermentación de 2 1, adición de 2 1 de lipasa después de la inoculación con una concentración final de 10 ppm, adición de 2 1 de ácidos grasos de aceite de frijol de soja reciclado (ácido graso Cognis Emery® 610 SOYA reciclado y éster butílico de ácido graso del Ejemplo 56B - carga de disolvente de 10 % v/v) , condiciones operativas del recipiente de fermentación de 2 1 , y todos los métodos analíticos.

Ejemplo 22 El identificador 2011Y032 incluyó: crecimiento previo en matraz de semillas de 2 1 , preparación de la fermentación de 2 1 , licuación de 2 1 , adiciones de 2 1 antes de la inoculación, inoculación en recipiente de fermentación de 2 1, adición de 2 1 de lipasa después de la inoculación con una concentración final de 10 ppm, 0.4 1/1 (volumen posterior a la inoculación) de ácidos grasos Virgin Cognis Emery® 610 SOYA añadidos, condiciones operativas del recipiente de fermentación de 2 1 , y todos los métodos analíticos.

Tabla 6 15 Ejemplo 23 El siguiente ejemplo describe la producción de isobutanol por medio de fermentación con sacarosa como fuente de carbono fermentable.

Generación de biomasa Inoculo: Se preparó un medio de semillas para iniciar el crecimiento del isobutanológeno . El medio de semillas estaba compuesto por: sulfato de amonio, 5 g/1; fosfato de potasio monobásico, 3 g/1; sulfato de magnesio heptahidratado, 0.5 g/1; etanol, 3.2 g/1; extracto de levadura (BBL) , 5 g/1; glucosa, 10 g/1; amortiguador MES, 150 mmol/1; biotina, 50 g/l; y una solución de oligoelementos , 1 ml/1, que contenía 1 1 de agua, 15 g de EDTA, 4.5 g de sulfato de zinc heptahidratado, 0.8 g de cloruro de manganeso deshidratado, 0.3 g de cloruro de cobalto hexahidratado, 0.3 g de sulfato de cobre pentahidratado, 0.4 g de molibdeno disódico deshidratado, 4.5 g de cloruro de calcio dihidratado, 3 g de sulfato de hierro heptahidratado, 1 g de ácido bórico, 0.1 g de yoduro de potasio. El pH se ajustó hasta 5.5 y, después, el filtro del medio se esterilizó a través de un aparato de filtro estéril de 0.22 µ.

Preparación del fermentador de 10 1 para la producción de biomasa Se transfirió un solo vial del isobutanológeno PNY2205 asépticamente a 15 mi de medio de semillas en un matraz de 125 mi aireado para el crecimiento de la noche a la mañana a 30 °C y una agitación a 260 rpm. El cultivo se transfirió asépticamente a 500 mi del mismo medio en un matraz con deflectores aireado de 2 1 para el crecimiento de la noche a la mañana a 30 °C y agitación de 260 rpm y se transfirió a un termentador de 10 1 Sartorius C preparado (Sartorius AG, Goettingen, Alemania) cuando el cultivo alcanzó ODS00 7.

Se preparó un termentador Sartorius C de 10 1 con un volumen inicial de medio de crecimiento de 6 1. La composición y preparación del medio de crecimiento se incluye a continuación: antes de la esterilización, sulfato de amonio, 1 g/1; fosfato de potasio monobásico, 5 g/1; sulfato de magnesio heptahidratado, 2 g/1; extracto de levadura (Amberex™ 695), 2 g/1; antiespuma Sigma 204, 0.5 ml/1; biotina, 100 yg/l; y 1 ml/1 de solución de oligoelementos (preparada en 1 1 de agua: 15 g de EDTA, 4.5 g de sulfato de zinc heptahidratado, 0.8 g de cloruro de manganeso deshidratado, 0.3 g de cloruro de cobalto hexahidratado, 0.3 g de sulfato de cobre pentahidratado, 0.4 g de molibdeno disódico deshidratado, 4.5 g de cloruro de calcio dihidratado, 3 g de sulfato de hierro heptahidratado, 1 g de ácido bórico, 0.1 g de yoduro de potasio) . Después de la esterilización con vapor a 121 °C en el lugar, el recipiente se enfrió y se añadió 60 g del medio de alimentación. El medio de alimentación se preparó de la siguiente manera: sacarosa, solución al 50 %, 2.97 1; biotina, 1.4 mg; 34 mi de la solución mineral traza; titulada a pH 7.5 con hidróxido de sodio 5N y esterilizada con vapor; después de la esterilización y enfriamiento, se añadió 130 mi de etanol y 320 mi de una solución esterilizada por filtro al 20 % (p/v) de extracto de levadura (Ámberex™ 695) . La concentración inicial de azúcar en el termentador de 10 1 era, entonces, de 3.7 g/1 de sacarosa, 0.8 g/1 de glucosa y 0.8 g/1 de fructosa .

La fermentación se controló a pH 5.5 (con adición de hidróxido de amonio), 30 °C, flujo de aire a 2.0 litros estándar por minuto, oxígeno disuelto a 30 % por control de agitación y 0.5 barg de contrapresión. Después de la inoculación se consumió el azúcar hasta que la medición residual de glucosa fue menor que 0.1 g/1 y, después, comenzó el programa de alimentación; esto se realizó 11 horas después de iniciada la fermentación. El programa se estableció para mantener la limitación de sacarosa hasta obtener una OD6oo de 20 (aproximadamente 8 g/1 de peso seco de la célula) con una velocidad de crecimiento programada de 0.1/h. La velocidad de crecimiento real medida en este experimento fue de 0.18/h. La OD6oo objetivo se alcanzó después de un tiempo de fermentación de 20 horas.

Una vez alcanzado el objetivo, el cultivo se recolectó asépticamente y se centrifugó en una centrífuga Sorvall RC12BP. La bolilla resultante se resuspendió hasta un volumen final de 300 mi con el medio de producción de isobutanol descrito más adelante. Este cultivo se usó como el inoculo para los fermentadores de la producción de isobutanol.

Producción de isobutanol Preparación de termentadores de producción: Para producir el isobutanol se usó dos termentadores de vidrio de un litro Applikon (Applikon, Inc, Holanda) asociados con una unidad de control Sartorius BioStat B Plus Twin (Sartorius AG, Goettingen, Alemania) . Los termentadores se prepararon con 1 1 de agua desionizada y se esterilizaron por medio de autoclave a 121 °C por 30 minutos. Una vez que los termentadores se enfriaron, el agua se extrajo asépticamente y se añadió el volumen del medio de producción esterilizado por filtro tal como se indica en la Tabla 7. El medio de producción estaba compuesto por: base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos (Difco) , 6.7 g/1; suplementos de medio selectivo deficiente sintético para levaduras sin histidina, leucina, triptófano y uracilo (Sigma) , 2.70 g/1; triptófano, 1.6 mg/1; leucina, 8 mg/1; etanol, 2.8 g/1; antiespuma Sigma 204, 0.2 ml/l; sacarosa, 25 g/1. Inmediatamente antes de la inoculación la solución de lipasas esterilizada con filtro era tal como se indica en la Tabla 7. La solución de lipasas se preparó por la dilución de Lipolase® L100 (Sigma) en amortiguador fosfato de potasio 10 m , H 7, hasta una concentración final de 1.25 mg de proteína/ml. La solución se preparó y almacenó por un día a 5 °C antes de la adición a los termentadores.

Tabla 7 Los termentadores se controlaron a pH 5.2 (por la adición de hidróxido de potasio al 20 %) ; 30 °C, flujo de aire a 0.2 litros estándar por minuto y oxígeno disuelto a 3 % por medio de control de agitación.

Cada fermentador se inoculó con 40 mi de la biomasa concentrada hasta una OD60o inicial de 20-25 (aproximadamente 8-10 g/1 de peso seco de la célula) . Se añadió 4 mi de una solución de vitaminas esterilizada con filtro (tiamina-HCl , 1 mg/ml; ácido nicotínico, 1 mg/ml, en agua) en la inoculación, al igual que el volumen de ácidos grasos de aceite de soja (SOFA) esterilizados con filtro indicados en la Tabla 7. Se extrajeron muestras (5-10 mi) cada 2-3 horas y se ensayaron para determinar la glucosa y sacarosa por medio de un analizador YSI Select Biochemistry Analyzer (YSI, Inc., Yellow Springs, Ohio) . A medida que la sacarosa se consumía se añadió un suministro de sacarosa al 50 % (p/p) para mantener una concentración de 5-30 g/1. Las fases acuosa y orgánica de las muestras se separaron y analizaron por el método de HPLC descrito anteriormente a través de un HPLC Agilent 1100. Para el análisis de ácidos orgánicos y alcoholes se usó una columna Shodex® Sugar SH1011 con una fase móvil de ácido sulfúrico 0.01 N. Para el análisis de la sacarosa, glucosa y fructosa se usó una columna BioRad Aminex® HPX-87N con una fase móvil de Na2HP04 0.01 M (pH 8) .

Cada termentador con lipasa añadida tenía concentraciones bajas de isobutanol en la fase acuosa e isobutanol libre en la fase disolvente. Las concentraciones de las fases acuosa y disolvente del isobutanol se muestran en la Fig. 6. La adición de más lipasa en la misma carga de disolvente produjo, ademas, títulos acuosos de isobutanol más bajos y menos isobutanol libre en el disolvente y más isobutanol como FABE.

Los cultivos que incluían lipasa produjeron un título eficaz de isobutanol más alto que el termentador de control sin lipasa. La Fig. 7 muestra el título eficaz de isobutanol. En este ejemplo, el título eficaz se calculó en base al peso inicial medido del caldo de cultivo en el termentador después de la inoculación y el peso inicial medido del disolvente cargado en el termentador. Se asumió una densidad del disolvente de 0.88 g/ml y la densidad del caldo de cultivo acuoso de 1.00 g/ml durante toda la fermentación. La adición de más lipasa en la carga más baja del disolvente produjo títulos eficaces de isobutanol (D en comparación con C) más altos, pero no tanto como el aumento del volumen relativo de disolvente (C en comparación con B) .

El azúcar consumido, calculado en equivalentes de glucosa, fue más alto en los termentadores que tenían lipasa añadida, que se ilustra en la Fig. 8. Los equivalentes de glucosa consumidos se calculan a partir de los azúcares medidos alimentados y remanentes en el termentador, con cada mol de sacarosa contado como dos moles de glucosa y cada mol de fructosa contado como un mol de glucosa, que después se convierten en gramos a través del peso molecular de glucosa. La concentración de equivalentes de glucosa consumidos se calcula, además, sobre la base del volumen inicial del caldo de fermentación después de la inoculación.

Ejemplo 24 Tratamiento con lipasa de la templa de maíz licuada para la sacarificación y fermentación simultánea con extracción del producto in situ con alcohol oleílico Las muestras de caldo de cultivo y alcohol oleílico tomadas de las pruebas de fermentaciones, tal como se describió anteriormente en los Ejemplos 1, 2 y 3, se analizaron para determinar el % en peso de lípidos (derivados como esteres metílicos de ácidos grasos, FAME) y el % en peso de ácidos grasos libres (FFA, derivados como ésteres metílicos de ácidos grasos, FAME) de conformidad con el método descrito por E. G. Bligh y W. J. Dyer (Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, 37:911-17, 1959, de aquí en adelante, Referencia 1) . La templa de maíz licuada que se preparó para cada una de las tres fermentaciones se analizó, además, para determinar el % en peso de lípidos y el % en peso de FFA después del tratamiento con Lipolase® 100 1 (Novozymes) (10 ppm de proteína soluble total Lipolase® (análisis de proteínas BCA, Sigma Aldrich) ) por kg de masa de reacción de licuación que contenía 30 % en peso de granos de maíz molidos) . No se añadió lipasa en la templa de maíz licuada en el Ejemplo 1 (control) y las fermentaciones descritas en los Ejemplos 2 y 3 que contienen templa de maíz tratada con lipasa (sin inactivación de la lipasa por calor) eran idénticas, excepto que no se añadió etanol a la fermentación descrita en el Ejemplo 3.

El % de FFA en la templa de maíz licuada tratada con lipasa preparada para las pruebas de fermentaciones tal como se describe en los Ejemplos 2 y 3 era de 88 % y 89 %, respectivamente, en comparación con el 31 % sin tratamiento con lipasa (Ejemplo 1) . A las 70 h (final de la prueba ( EOR ) ) , la concentración de FFA en la fase de OA de la prueba de fermentaciones tal como se describe en los Ejemplos 2 y 3 (que contienen lipasa activa) fue de 14 % y 20 %, respectivamente, y el aumento correspondiente en los lípidos (medidos como derivados de éster metílico de ácido graso de aceite de maíz) se determinó por CG/EM como el resultado de la esteri f i cae ion catalizada por lipasas de COFA por OA, en donde COFA se produjo primero por la hidrólisis catalizada por lipasas de aceite de maíz en la templa de maíz licuada; la producción de palmitato de oleílo, estearato de oleílo y oleato de oleílo se confirmó por CG/EM y un cuarto éster se identificó, tentativamente, como linoleato de oleílo. Los resultados para los análisis de lípidos y FFA se indican en la Tabla 8.

Tabla 8: Contenido de llpidos y ácidos grasos libres de las fermentaciones que contienen alcohol oleílico como el extractante para ISPR y lipasa activa Fermentación Lipasa Tiempo (h) , muestra Lípidos FFA Lípidos FFA Lípidos % de (% en (% en (g) (g) + FFA 5 peso) peso) FFA (g) Ejemplo 1 Ninguno Templa líq. 0.61 0. 28 5. .3 2. .4 7. 7 31 Ejemplo 1 Ninguno 0.8 h, caldo de cultivo 0.49 0. 22 5. .5 2. .5 8. 0 31 Ejemplo 1 Ninguno 31 h, caldo de cultivo 0.19 0. 03 2. .1 0. .3 2. 4 13 Ejemplo 1 Ninguno 31 h, OA 0.36 0. 21 3 , .4 2. .0 5. 3 37 10 Ejemplo 1 Ninguno 70 h; caldo de cultivo 0.15 0. 03 1 , .7 0. .3 2. 0 15 Ejemplo 1 Ninguno 70 h, OA 0.57 0. 25 5. .3 2. .3 7. 7 31 Ejemplo 2 10 ppm Templa líq. 0.13 0. 97 1. .1 8 , .5 9. 6 88 Ejemplo 2 10 ppm 0.8 h, caldo de cultivo 0.15 0. 62 1. .7 7 , .0 8. 7 81 15 Ejemplo 2 10 ppm 31 h; caldo de cultivo 0.16 0. 05 1 , .8 0 , .5 2. 3 23 Ejemplo 2 10 ppm 31 h, OA 0.37 0. 23 3 , .5 2. .2 5. 7 38 Ejemplo 2 10 ppm 70 h, caldo de cultivo 0.17 0. 02 1. .9 0. .3 2. 2 13 Fermentación Lipasa Tiempo (h) , muestra Lípidos FFA Lípidos FFA Lípidos % de (% en (% en (g) (g) + FFA peso) peso) FFA (g) Ejemplo 2 10 ppm 70 h, OA 0.60 0.10 5.7 1.0 6.7 14 Ejemplo 3 10 ppm Templa líq. 0.12 0.97 1.0 8.5 9.5 89 Ejemplo 3 10 ppm 0.8 h, caldo de cultivo 0.32 0.40 3.6 4.5 8.1 56 Ejemplo 3 10 ppm 31 h, caldo de cultivo 0.17 0.05 1.9 0.6 2.5 24 Ejemplo 3 10 ppm 31 h, OA 0.38 0.22 3.6 2.1 5.7 37 Ejemplo 3 10 ppm 70 h, caldo de cultivo 0.15 0.02 1.7 0.2 1.9 13 Ejemplo 3 10 ppm 70 h, OA 0.46 0.12 4.4 1.1 5.6 20 Ejemplo 25 Inactivación de lipasas por calor en la templa de maíz licuada tratada con lipasa para limitar la producción de ásteres de alcohol oleílico de ácidos grasos libres de aceite de maíz Se añadió agua corriente (918.4 g) en un reactor de resina de 2 1 con camisa, después, se añadió 474.6 g de peso húmedo (417.6 g de peso seco) de granos de maíz entero molidos (tamiz de 1.0 mm en molino triturador) con agitación. La mezcla se calentó hasta 55 °C con agitación a 300 rpm y el pH se ajustó hasta 5.8 con ácido sulfúrico 2 N. En la mezcla se añadió 14.0 g de una solución acuosa que contenía 0.672 g de Spezyme®-FRED 1 (Genencor®, Palo Alto, CA) y la temperatura de la mezcla aumentó hasta 85 °C con agitación a 600 rpm y pH 5.8. Después de 120 minutos a 85 °C, la mezcla se enfrió hasta 50 °C y se transfirió alícuotas de 45.0 mi de la templa de maíz licuada resultante a tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mi y se almacenaron congeladas a -80 °C.

En una primera reacción se mezcló 50 g de la templa de maíz licuada tal como se describió anteriormente con 10 ppm de Lipolase® 100 1 (Novozymes) por 6 h a 55 °C y sin inactivación de lipasa a 85 °C por 1 h, la mezcla se enfrió hasta 30 °C. En una segunda reacción se mezcló 50 g de templa de maíz licuada con 10 ppm de Lipolase® por 6 h a 55 °C, después se calentó hasta 85 °C por 1 h (inactivación de lipasa) y se enfrió hasta 30 °C. En una tercera reacción se mezcló 50 g de templa de maíz licuada sin lipasa añadida por 6 h a 55 °C y sin calentamiento a 85 °C por 1 h, la mezcla se enfrió hasta 30 °C, se añadió 38 g de alcohol oleílico y la mezcla resultante se agitó por 73 h a 30 °C. En una cuarta reacción se mezcló 50 g de templa de maíz licuada sin lipasa añadida por 6 h a 55 °C, después, se calentó hasta 85 °C por 1 h y se enfrió hasta 30 °C. Cada una de las cuatro mezclas de reacción se muestreó a las 6 h, después, se añadió 38 g de alcohol oleílico y las mezclas resultantes se agitaron a 30 °C y se muestrearon a las 25 h y 73 h. Las muestras (templa licuada y alcohol oleílico (OA) ) se analizaron para determinar el % en peso de lípidos (derivados como ásteres metílicos de ácidos grasos, FAME) y el % en peso de ácidos grasos libres (FFA, derivados como ésteres metílicos de ácidos grasos, FAME) de conformidad con el método descrito por la Referencia 1.

El % de FFA en la fase de OA de la prueba de la segunda reacción con inactivación de lipasa por calor antes de la adición de OA fue de 99 % a 25 h y 95 % a 73 h en comparación con solo 40 % de FFA y 21 % de FFA a las 25 h y 73 h, respectivamente, cuando la lipasa en la templa de maíz licuada tratada con lipasa no se inactivo por calor (primera reacción) . No se observó un cambio significativo en el % de FFA en las dos reacciones de control sin lipasa añadida. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9: Contenido de lípidos y ácidos grasos libres de una mezcla de templa de maíz licuada y alcohol oleílico en presencia o ausencia de lipasa activa o inactivada por calor Reacción Tiempo Lípidos FFA Lípidos FFA Lípido+ % de Condiciones (h) , (% en (% en (mg) (mg) FFA FFA muestra peso) peso) (mg) 10 ppm de 6 h, 0.08 0.71 41 345 386 89 lipasa templa activa, lie.

Sin 25 h, 0.22 0.06 105 27 132 20 tratamiento templa con calor a lie. 85 °C 25 h, OA 0.58 0.39 212 143 355 40 73 h, 0.25 0.05 121 22 143 18 templa lie. 73 h, OA 0.91 0.24 333 88 420 21 10 ppm de 6 h, 0.06 0.45 28 224 252 89 lipasa templa inactiva, lie.

Reacción Tiempo Lípidos FFA Lípidos FFA Lípido+ Condiciones (h). (% en (% en (mg) (mg) FFA muestra peso) peso) (mg) Tratamiento 25 h, 0.10 0.11 49 54 103 con calor a templa 85 °C lie. 25 h, OA 0.02 0.96 8 366 374 73 h, 0.24 0.15 117 72 189 templa lie. 73 h, OA 0.06 1.11 23 424 447 Sin lipasa, 6 h, 0.80 0.40 401 199 599 templa lie.

Sin 25 h, 0.30 0.05 147 25 173 tratamiento templa con calor a lie. 85 °C 25 h, OA 0.55 0.36 212 139 351 40 73 h, 0.23 0.05 117 26 143 23 templa lie. 73 h, OA 0.79 0.42 305 162 467 34 Reacción Tiempo Lípidos FFA Lípidos FFA Lípido+ % de Condiciones (h) , (% en (% en (mg) (mg) FFA FFA muestra peso) peso) (mg) Sin lipasa, 6 h, 0.74 0.36 370 183 553 33 templa lie.

Tratamiento 25 h, 0.31 0.05 156 27 183 15 con calor a templa 85 °C lie. 25 h, OA 0.60 0.35 233 136 369 37 73 h, 0.20 0.05 99 23 121 23 templa lie. 73 h, OA 0.84 0.41 326 159 486 33 Ejemplo 26 Inactivación por calor de la lipasa en la templa de maíz licuada tratada con lipasa para la sacarificación y fermentación simultánea con extracción del producto in situ con alcohol oleílico Se realizaron tres fermentaciones tal como se describió anteriormente en los Ejemplos 4, 5 y 6. No se añadió lipasa a la templa de maíz licuada en los Ejemplos 4 y 6 antes de la fermentación e inmediatamente después del tratamiento con lipasa de la templa de maíz licuada en la fermentación descrita en el Ejemplo 5 (con 7.2 ppm de proteína soluble total Lipolase®) se realizó el tratamiento de inactivación por calor (para inactivar completamente la lipasa) y a continuación se realizó la adición de nutrientes antes de la inoculación y fermentación. El % de FFA en la templa de maíz licuada preparada sin tratamiento con lipasa para la prueba de fermentaciones tal como se describió en los Ejemplos 4 y 6 fue de 31 % y 34 %, respectivamente, en comparación con el 89 % en el tratamiento con lipasa (Ejemplo 5) . Durante el transcurso de las fermentaciones enumeradas en la Tabla 10, la concentración de FFA en la fase OA no se redujo en ninguna de las tres fermentaciones, incluida la que contenía lipasa inactivada por calor. El % de FFA en la fase OA de la prueba de fermentación de conformidad con el Ejemplo 5 (con inactivación de lipasa por calor antes de la fermentación) fue de 95 % a las 70 h (final de la prueba (EOR, por sus siglas en inglés)) en comparación con solo 33 % de FFA para las dos fermentaciones restantes (Ejemplos 4 y 6) , en donde la templa de maíz licuada no se trató con lipasa. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10: Contenido de lípidos y ácidos grasos libres de fermentaciones que contienen alcohol oleílico como el extractante para ISPR y lipasa inactivada por calor (después del tratamiento con lipasas de la templa licuada) Fermentación Lipasa Tiempo (h) , muestra Lípidos FFA (% Lípidos FFA Lípido % de (% en en (g) (g) + FFA peso) peso) FFA (g) Ejemplo 4 Ninguno Templa licuada 0.65 0.30 7.2 3.3 10.4 31 Ejemplo 4 Ninguno 0.2 h, caldo de 0.56 0.28 6.6 3.3 9.9 33 cultivo Ejemplo 4 Ninguno 4.3 h, caldo de 0.28 0.09 3.3 1.0 4.4 24 cultivo Ejemplo 4 Ninguno 4.3 h, OA 0.45 0.27 4.0 2.4 6.4 37 Ejemplo 4 Ninguno 30 h, caldo de 0.17 0.05 2.0 0.6 2.7 24 cultivo Ejemplo 4 Ninguno 30 h, OA 0.63 0.29 5.7 2.6 8.3 32 Fermentación Lipasa Tiempo (h) , muestra Lípidos FFA (% Lípidos FFA Lípido % de (% en en (g) (g) + FFA peso) peso) FFA (g) Ej emplo 4 Ninguno 53 h, caldo de cultivo 0.13 0.04 1.5 0.5 2.0 23 Ej emplo 4 Ninguno 53 h, OA 0.67 0.32 6.0 2.9 8.9 32 Ej emplo 4 Ninguno 70 h, caldo de cultivo 0.13 0.04 1.5 0.4 1.9 23 Ej emplo 4 Ninguno 70 h, OA 0.64 0.31 5.8 2.8 8.5 33 Ejemplo 5 7.2 ppm Templa licuada 0.11 0.89 1.3 9.9 11.2 89 Ej emplo 5 7.2 ppm 0.2 h, caldo de 0.25 0.83 2.9 9.8 12.8 77 cul ivo Ej emplo 5 7.2 ppm 4.3 h, caldo de 0.14 0.17 1.6 2.1 3.7 56 cultivo Ej emplo 5 7.2 ppm 4.3 h, OA 0.02 0.84 0.2 7.9 8.1 97 Ej emplo 5 7.2 ppm 30 h, caldo de 0.08 0.18 1.0 2.1 3.1 68 cultivo Ej emplo 5 7.2 ppm 30 h, OA 0.04 0.92 0.3 8.6 8.9 96 Fermentación Lipasa Tiempo (h) , muestra Lípidos FFA (% Lípido FFA Lípido % de (% en en (g) (g) + FFA peso) peso) FFA (g) Ej em lo 5 7.2 ppm 53 h, caldo de cultivo 0.07 0.11 0.9 1.3 2.2 61 Ej emplo 5 7.2 ppm 53 h, OA 0.08 0.95 0.7 8.9 9.6 93 Ej emplo 5 7.2 ppm 70 h, caldo de cultivo 0.08 0.10 0.9 1.2 2.1 55 Ej emplo 5 7.2 ppm 70 h, OA 0.05 0.94 0.4 8.8 9.2 95 Ej emplo 6 Ninguno Templa licuada 0.66 0.34 7.3 3.8 11.1 34 Ej emplo 6 Ninguno 0.2 h, caldo de 0.63 0.34 7.6 4.0 11.6 34 cultivo Ej emplo 6 Ninguno 4.3 h, caldo de 0.33 0.10 3.9 1.2 5.1 23 cultivo Ej emplo 6 Ninguno 4.3 h, OA 0.45 0.27 4.0 2.4 6.4 38 Ej emplo 6 Ninguno 30 h, caldo de 0.17 0.06 2.1 0.8 2.8 26 cultivo Ej emplo 6 Ninguno 30 h, OA 0.69 0.33 6.2 3.0 9.1 32 Fermentación Lipasa Tiempo (h) , muestra Lípidos FFA (% Lípidos FFA Lípido % de (% en en (g) (g) + FFA peso) peso) FFA (g) Ejemplo 6 Ninguno 53 h, caldo de 0.14 0.05 1.6 0.5 2.2 25 cul ivo Ejemplo 6 Ninguno 53 h, OA 0.72 0.35 6.4 3.1 9.5 33 Ejemplo 6 Ninguno 70 h, caldo de 0.15 0.05 1.8 0.6 2.4 25 cultivo Ejemplo 6 Ninguno 70 h, OA 0.70 0.34 6.2 3.0 9.2 33 Ejemplo 27 Tratamiento con lipasa de granos de maíz enteros molidos antes de la licuación Se añadió agua corriente (1377.6 g) en cada uno de los dos reactores de resina de 2 1 con camisa, después se añadió granos de maíz entero molidos con un peso húmedo de 711.9 g (peso seco de 625.8 g) (tamiz de 1.0 mm en el molino triturador) en cada reactor con agitación. Cada mezcla se calentó hasta 55 °C con agitación a 300 rpm y el pH se ajustó hasta 5.8 con ácido sulfúrico 2 N. En cada mezcla se añadió 21.0 g de una solución acuosa que contenía 1.008 g de Spe zyme® - FRED 1 (Genencor®, Palo Alto, CA) . Después, en una mezcla se añadió 10.5 mi de solución acuosa Lipolase® 100 L (21 mg de proteína soluble total, concentración final de 10 ppm de lipasa) y en la segunda mezcla se añadió 1.05 mi de solución acuosa Lipolase® 100 L (2.1 mg de proteína soluble total, concentración final de lipasa de 1.0 ppm) . Las muestras se extrajeron de cada mezcla de reacción a 1 h, 2 h, 4 h y 6 h a 55 °C, después, se incrementó la temperatura de la mezcla hasta 85 °C con agitación a 600 rpm y pH 5.8 y se tomó una muestra cuando la mezcla alcanzó los 85 °C por primera vez. Después de 120 minutos a 85 °C se tomó una muestra, las mezclas se enfriaron hasta 50 °C y las muestras finales y templa de maíz licuada resultante se transfirieron a tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mi; todas las muestras se almacenaron congeladas a -80 °C.

En dos reacciones separadas se mezcló una muestra de 50 g de 10 ppm de templa de maíz licuada tratada con lipasa o una muestra de 55 g de 1.0 ppm de templa de maíz licuada tratada con lipasa preparada tal como se describió anteriormente con alcohol oleílico (OA) (38 g) a 30 °C por 20 h, después, la templa licuada y el OA en cada mezcla de reacción se separaron por centrifugación y cada fase se analizó para determinar el % en peso de lípidos (derivados como ésteres metílicos de ácidos grasos, FAME) y el % en peso de ácidos grasos libres (FFA, derivados como ésteres metílicos de ácidos grasos, FAME) de conformidad con el método descrito por la Referencia 1. El % de FFA en la fase de OA de la mezcla templa licuada/OA preparada por medio de inactivación por calor de 10 ppm de lipasa durante la licuación fue de 98 % a 20 h en comparación con solo 62 % de FFA en la fase OA de la mezcla de templa licuada/OA preparada por medio de inactivación por calor de 1.0 ppm de lipasa durante la licuación. Los resultados se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11: Contenido de lipidos y ácidos grasos libres de una mezcla de templa de maíz licuada y alcohol oleílico por medio del tratamiento con lipasas de la suspensión de maíz molido antes de la licuación (inactivación por calor de la lipasa durante la licuación) Reacción Tiempo (h) , Lipidos FFA Lipidos FFA Lipido % Condiciones muestra (% en (% en (mg) (mg) +FFA de peso) peso) (mg) FFA 10 ppm de 1 h, antes de 0 .226 0.627 112 311 424 74 lipasa la licuación a 55 °C 2 h, antes de 0. .199 0.650 99 323 422 77 antes de la licuación la 4 h, antes de 0 , .151 0.673 75 334 410 82 licuación a la licuación 85 °C, 6 h, antes de 0. .101 0.700 50 348 398 87 mezcla con la licuación OA por 20 h 0 h, 85 °C, 0. .129 0.764 64 380 444 86 templa lie. 2 h, 85 °C, 0. .129 0.751 64 373 437 85 templa lie. 20 h, 30 °C, 0. .074 0.068 37 34 71 48 templa lie. 20 h, 30 °C, 0. .015 1.035 5.7 394 400 98 OA 1.0 ppm de 1 h, antes de 0. .408 0.480 226 266 492 54 lipasa la licuación Reacción Tiempo (h) , Lípidos FFA Lípidos FFA Lípido % Condiciones muestra (% en (% en (mg) (mg) +FFA de peso) peso) (mg) FFA a 55 °C 2 h, antes de 0.401 0.424 222 235 457 51 antes de la licuación la 4 h, antes de 0.299 0.433 165 240 405 58 licuación a la licuación 85 °C, 6 h, antes de 0.346 0.453 192 251 442 57 mezcla con la licuación OA por 20 h 0 h, 85 °C, 0.421 0.407 233 225 458 49 templa lie. 2 h, 85 °C, 0.424 0.429 235 237 472 50 templa lie. 20 h, 30 °C, 0.219 0.054 121 30 151 20 templa lie. 20 h, 30 °C, 0.344 0.573 140 233 373 62 OA Ejemplo 28 Análisis de lipasas para el tratamiento de granos de maíz enteros molidos antes de la licuación Se agitó siete mezclas de reacción que contenían agua corriente (67.9 g) y granos de maíz entero molidos (peso húmedo de 35.1 g, molidos con un molino triturador con tamiz de 1.0 mm) a pH 5.8 y 55 °C en matraces con tapón. Se eliminó una muestra de 3 mi (t = O h) de cada matraz y la muestra se congeló inmediatamente sobre hielo seco, después, se añadió aproximadamente 0.5 mi de amortiguador fosfato de sodio 10 mM (pH 7.0) que contenía 1 mg de proteína soluble total (10 ppm de concentración final en la mezcla de reacción) de una de las siguientes lipasas (Novozymes) en cada matraz: Lipolase® 100 L, Lipex® 100 L , Lipoclean® 2000T, Lipozyme® CALB L, Novozyme® CALA L y Palatase 20000 L ; no se añadió lipasa en el séptimo matraz. Las mezclas resultantes se agitaron a 55 °C en matraces con tapón y se extrajeron muestras de 3 mi de cada mezcla de reacción a 1 h, 2 h, 4 h y 6 h e inmediatamente se congelaron sobre hielo seco hasta que se analizaron para determinar el % en peso de lípidos (derivados como ésteres metílicos de ácidos grasos, FAME) y el % en peso de ácidos grasos libres ( FFA , derivados como ésteres metílicos de ácidos grasos, FAME) de conformidad con el método descrito por la Referencia 1 y se calculó el contenido en porcentaje de ácidos grasos libres con respecto a las concentraciones combinadas totales de lípidos y se determinó el contenido de ácidos grasos libres para cada muestra. Los resultados se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12 : Contenido en porcentaje de ácidos grasos libres (% de FFA) de una mezcla de granos de maíz entero molidos por medio del tratamiento con lipasas a 55 °C antes de la licuación % de FFA Tiempo O h 1 h 2 h 4 h 6 h Lipolase® 100 L 33 56 74 76 79 Lipex® 100 L 34 66 81 83 83 Lipoclean® 2000T 38 55 73 69 65 Lipozyme® CALB L 39 38 37 43 41 Novozyme® CALA L 37 40 44 44 45 Palatase® 20000 L 37 49 59 62 66 Sin enzima 38 33 37 41 42 Ejemplo 29 Tratamiento con lipasas de granos de maíz entero molidos antes de la sacarificación y fermentación simultánea con extracción del producto in situ con alcohol oleílico Se realizaron tres fermentaciones tal como se describió anteriormente en los Ejemplos 7, 8 y 10. Para la prueba de fermentaciones, tal como se describió en los Ejemplos 7 y 10, la lipasa (10 ppm de proteína soluble total Lipolase®) se añadió en la suspensión de maíz molido y se calentó a 55 °C por 6 h antes de la licuación para producir una templa de maíz licuada que contenía lipasa inactivada por calor. No se añadió lipasa en la suspensión de maíz molido usada para preparar la templa de maíz licuada para la fermentación descrita en Ejemplo 8, pero la suspensión se expuso a la misma etapa de calentamiento a 55 °C antes de la licuación. El % de FFA en la templa de maíz licuada tratada con lipasa preparada para la prueba de fermentaciones tal como se describió en los Ejemplos 7 y 10 fue de 83 % y 86 %, respectivamente, en comparación con el 41 % de la muestra no tratada con lipasa (Ejemplo 8) . Durante las fermentaciones, la concentración de FFA no se redujo en ninguna de ellas, incluidas aquellas que contenían lipasa inactivada por calor. El % de FFA en la fase de OA de la prueba de fermentación de conformidad con los Ejemplos 7 y 10 (con inactivación de lipasa por calor antes de la fermentación) fue de 97 % a 70 h (final de la prueba (EOR) ) , en comparación con solo el 49 % de FFA para la prueba de fermentación de conformidad con el Ejemplo 8, en donde los granos de maíz entero molidos no se habían tratado con lipasa antes de la licuación. Los resultados se muestran en la Tabla 13.

Tabla 13: Contenido de lípidos y ácidos grasos libres de fermentaciones que contienen alcohol oleílico como el extractante para ISPR y lipasa inactivada por calor (tratamiento con lipasa de suspensión de maíz molido antes de la licuación) Fermentación Lipasa Tiempo (h) , muestra Lípidos FFA Lípidos FFA Lípido % de 5 (% en (% en (g) (g) + FFA peso) peso) FFA (g) Ej emplo 7 10 ppm Antes de la 0.65 0.22 7. .1 2 .4 9. 4 25 lipasa/antes -de la lie.

Ej emplo 7 10 ppm Después de la 0.22 0.65 2 , .4 7 .0 9. 5 74 lipasa/antes de la lie.

Ej emplo 7 10 ppm Templa licuada 0.17 0.79 1 , .8 8 .5 10 .3 83 Ej emplo 7 10 ppm 0.3 h, caldo de cultivo 0.16 0.79 1 , .8 8 .9 10 .7 83 Ej emplo 7 10 ppm 4.8 h, caldo de cultivo 0.14 0.31 1. .6 3 .5 5. 1 69 Ej emplo 7 10 ppm 4.8 h, OA 0.04 0.68 0. .3 5 .4 5. 6 95 15 Ej emplo 7 10 ppm 29 h, caldo de cultivo 0.10 0.12 1 .2 1 .3 2. 5 53 Ej emplo 7 10 ppm 29 h, OA 0.03 1.05 0 .2 8 .2 8. 4 98 Ej emplo 7 10 ppm 53 h, caldo de cultivo Fermentación Lipasa Tiempo (h) , muestra Lípidos FFA Lípidos FFA Lípido % de (% en (% en (g) (g) + FFA peso) peso) FFA (g) Ej emplo 7 10 ppm 53 h, OA 0 .07 1. 14 0. .5 9 .0 9. 5 95 Ej emplo 7 10 ppm 70 h, caldo de cultivo 0 .11 0. 07 1. , 2 0 .8 2. 0 39 5 Ej emplo 7 10 ppm 70 h, OA 0 .03 1. 10 0. .2 8 .7 8. 9 97 Ej emplo 8 Ninguno Antes de la 0 .62 0. 23 6. .7 2 .5 9. 2 27 lipasa/antes de la lie.

Ej emplo 8 Ninguno Después de la 0 .57 0. 26 6. .2 2 .8 9. 0 31 lipasa/antes de la lie.

Ej emplo 8 Ninguno Templa licuada 0 .52 0. 36 5. .6 4 .0 9. 6 41 Ej emplo 8 Ninguno 0.3 h, caldo de cultivo 0 .50 0. 33 5 , .7 3 .8 .9. 4 40 Ej emplo 8 Ninguno 4.8 h, caldo de cultivo 0 .47 0. 14 5. .3 1 .6 6. 9 24 Ej emplo 8 Ninguno 4.8 h, OA 0 .12 0. 32 1 , .0 2 .9 3. 9 73 Ej emplo 8 Ninguno 29 h, caldo de cultivo 0 .30 0. 05 3. .4 0 .6 4. 0 16 Ej emplo 8 Ninguno 29 h, OA 0 .31 0. 46 2 , .7 4 .1 6. 9 60 15 Ej emplo 8 Ninguno 53 h, caldo de cultivo Ej emplo 8 Ninguno 53 h, OA 0 .47 0. 50 4. .2 4 .4 8. 6 51 Ej emplo 8 Ninguno 70 h, caldo de cultivo 0 .22 0. 04 2. .5 0 .5 3. 0 17 Fermentación Lipasa Tiempo (h) , muestra Lípidos FFA Lípidos FFA Lípido % de (% en (% en (g) (g) + FFA peso) peso) FFA (g) Ejemplo 8 Ninguno 70 h, 0.40 0.39 3.6 3.5 7.0 49 5 Ej emplo 10 10 ppm Antes de la 0. .67 0. 23 7. .4 2. 5 9. 9 25 lipasa/antes de la lie.

Ej emplo 10 10 ppm Después de la 0. .19 0. 69 2. .1 7. 6 9. 7 78 lipasa/antes de la lie.

Ej emplo 10 10 ppm Templa L licuada 0. .14 0. 85 1. .6 9. 4 11 .0 86 Ej emplo 10 10 ppm 0.3 h, caldo de cultivo 0. .13 0. 82 1. .5 9. 4 10 .9 86 10 Ej emplo 10 10 ppm 4.8 h, caldo de cultivo 0 , .11 0. 29 1. .3 3. 3 4. 6 72 Ej emplo 10 10 ppm 4.8 h, OA 0. .04 0. 60 0. .3 5. 2 5. 6 94 Ej emplo 10 10 ppm 29 h, caldo de cultivo 0. .09 0. 14 1. .0 1. 6 2. 6 61 Ej emplo 10 10 ppm 29 h, OA 0. .01 0. 96 0. .1 8. 4 8. 5 99 Ej emplo 10 10 ppm 53 h, caldo de cultivo 15 Ej emplo 10 10 ppm 53 h, OA 0. .02 0. 95 0. .2 8. 3 8. 4 98 Ej emplo 10 10 ppm 70 h, caldo de cultivo 0. .09 0. 08 1. , 1 0. 9 1. 9 45 Ej emplo 10 10 ppm 70 h, OA 0. , 03 0. 99 0. .3 8. 7 9. 0 97 Ejemplo 30 Tratamiento con lipasa de granos de maíz entero mol idos o templa de maíz licuada para la sacarificación y_ fermentación s imul t ánea con extracción del producto in situ con ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) Se realizaron cinco fermentaciones tal como se describió anteriormente en los Ejemplos 9, 11, 12, 13 y 14. Para la prueba de fermentaciones tal como se describió en los Ejemplos 9, 13 y 14, la lipasa (10 ppm de proteína soluble total Lipolase®) se añadió después de la licuación y no se realizó la inactivación de lipasa por calor. Para la prueba de fermentaciones, tal como se describió en los Ejemplos 9 y 14 , se añadió 5 g/1 de etanol antes de la inoculación, mientras que para la prueba de de fermentación, tal como se describió en el Ejemplo 13, no se añadió etanol. Para la prueba de fermentaciones, tal como se describió en los Ejemplos 11 y 12, se añadió 10 ppm de proteína soluble total Lipolase® en la suspensión de maíz molido antes de la licuación de manera que la lipasa se inactivo por calor durante la licuación. Para la prueba de fermentación, tal como se describió en el Ejemplo 11, se añadió 5 g/1 de etanol antes de la inoculación, mientras que para la prueba de fermentación, tal como se describió en el Ejemplo 12, no se añadió etanol. La cantidad de gramos totales finales de isobutanol (i-BuOH) presentes en la fase de COFA de las fermentaciones que contenían lipasa activa fue significativamente mayor que la cantidad de gramos totales finales de i-BuOH (que incluye el i-BuOH presente como FABE) presentes en la fase COFA de las fermentaciones que contenían lipasa inactiva. La cantidad de gramos totales finales de isobutanol (i-BuOH) presentes en los caldos de fermentación (fase acuosa) que contenían lipasa activa fue solo ligeramente menor que la cantidad de gramos totales finales de i-BuOH presentes en los caldos de fermentación que contenían lipasa inactiva de manera que la producción general de i-BuOH (como una combinación de i-BuOH libre y esteres isobutílicos de COFA (FABE)) fue significativamente mayor en presencia de lipasa activa cuando se comparó con la obtenida en presencia de lipasa inactivada por calor. Los resultados se indican en las Tablas 14 y 15.

Tabla 14 : Dependencia de la producción de isobutanol libre (i-BuOH) y ésteres isobutílicos de COFA (FABE) en fermentaciones que contienen ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) como el extractante para ISPR en presencia (Ejemplos 9, 13 y 14) o ausencia (Ejemplos 11 y 12) de lipasa activa (análisis de fases de COFA) Fermentación g de i- g de g de i- g totales BuOH / FABE/ BuOH de de i-BuOH FABE/ / Fermentación de Tiempo kg de kg de kg de kg de COFA (h) COFA COFA COFA Ejemplo 9 4.5 2.4 0.0 0 2.4 Ejemplo 9 28.8 5.4 70.9 16.5 22.0 Ejemplo 9 52.4 8.9 199.0 46.4 55.3 Ejemplo 9 69.3 4.9 230.9 53.9 69.3 Ejemplo 11 6.6 2.3 0.0 0.0 2.3 Ejemplo 11 53.5 25.1 2.9 0.6 25.7 Ejemplo 11 71.1 24.4 6.3 1.4 25.8 Ejemplo 12 6.6 2.3 0.0 0.0 2.3 Ejemplo 12 53.5 12.8 1.6 0.4 13.2 Ejemplo 12 71.1 12.8 3.0 0.7 13.5 Ejemplo 13 6.6 2.3 0.0 0.0 2.3 Fermentación g de i- g de g de i- g totales BuOH / FABE/ BuOH de de i-BuOH FABE/ / Fermentación de Tiempo kg de kg de kg de kg de COFA (h) COFA COFA COFA Ejemplo 13 53.5 4.9 72.1 16.0 20 .9 Ejemplo 13 71.1 4.6 91.4 20.3 24 .9 Ejemplo 14 6.6 2.1 0.0 0.0 2. 1 Ejemplo 14 53.5 9.8 197.2 43.8 53 .6 Ejemplo 14 71.1 4.9 244.5 54.3 59 .2 Tabla 15: Dependencia de la producción de isobutanol libre (i-BuOH) y ésteres isobutílicos de COFA (FABE) en fermentaciones que contienen ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) como el extractante para ISPR en presencia (Ejemplos 9, 13 y 14) o ausencia (Ejemplos 11 y 12) de lipasa activa (análisis de caldo de cultivo de fermentación) Fermentación g de i- g de g de i- g totales BuOH / FABE/ BuOH de de i-BuOH FABE/ / Muestra Tiempo (h) kg de kg de kg de kg de caldo de caldo de caldo de caldo de cultivo cultivo cultivo cultivo Ejemplo 9 4.5 0.0 0.0 0 0 Ejemplo 9 28.8 0.0 12.6 2.9 2.9 Fermentación g de i- g de g de i- g totales BuOH / FABE/ BuOH de de i-BuOH FABE/ / Muestra Tiempo (h) kg de kg de kg de kg de caldo de caldo de caldo de caldo de cultivo cultivo cultivo cultivo Ejemplo 9 52.4 0.0 30.3 7.1 7.1 Ejemplo 9 69.3 0.0 24.7 5.8 5.8 Ejemplo 11 6.6 0.0 0.0 0 0.0 Ejemplo 11 53.5 9.8 0.0 0 9.8 Ejemplo 11 71.1 9.5 0.0 0 9.5 Ejemplo 12 6.6 0.0 0.0 0 0 Ejemplo 12 53.5 3.8 0.0 0.0 3.8 Ejemplo 12 71.1 5.1 0.0 0.0 5.1 Ej emplo 13 6.6 0.0 0.0 0 0 Ejemplo 13 53.5 2.1 3.0 0.7 2.8 Ejemplo 13 71.1 2.1 7.4 1.6 3.7 Ejemplo 14 6.6 0.0 0.0 0 0.0 Ejemplo 14 53.5 2.9 22.4 5.0 7.9 Ejemplo 14 71.1 3.3 19.3 4.3 7.6 Ejemplo 31 Producción de ésteres de COFA de isobutilo por reacción catalizada con fosfolipasa de isobutanol y ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) Las mezclas de reacción que contenían amortiguador de ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico acuoso (0.20 M, pH 5.3), isobutanol (2-metil-l-propanol) , fosfolipasa (fosfolipasa A; SigmaAldrich, L3295-250) y ácidos grasos de aceite de maíz preparados a partir de aceite de maíz se agitaron a 30 °C (Tabla 16) y se extrajeron muestras de cada mezcla de reacción en momentos predeterminados, se centrifugaron inmediatamente y las capas acuosa y orgánica se separaron y analizaron para determinar el isobutanol (i-BuOH) y los ésteres isobutílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (i-BuO-COFA) (Tabla 17) .

Tabla 16 : Condiciones de reacción para la conversión de isobutanol (i-BuOH) en ésteres isobutílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (i-BuO-COFA) Amortiguador MES i-BuOH COFA Lipasa Reacción (0.2 M) (g) (g) (g) (ppm) 2 46.1 3.6 14.7 3 3 46.1 3.6 14.7 0 Tabla 17: Pesos de isobutanol (i-BuOH) y ásteres isobutílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (i-BuO-COFA) presentes en la fracción acuosa (AQ) y fracción orgánica (ORG) para las reacciones descritas en la Tabla 16. i-BuOH de i-BuOH i-BuOH i-BuOH i-BuO- i-BuO- total total libre COFA COFA Reacción Tiempo (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (OR (h) 1 0.1 1. .29 2 .39 2 .39 0. .00 0 .00 1 2 1. .24 2 .44 2 .38 0 , .06 0 .26 1 20 1 , .25 2 .43 2 .22 0. .21 0 .96 1 24 1. .26 2 .42 2 .19 0. .23 1 .03 1 44 1. .27 2 .41 2 .13 0 , .28 1 .28 1 48 1. .22 2 .46 2 .15 0. .31 1 .41 2 0.1 1. .27 2 .34 2 .34 0. .00 0 .00 2 2 1. .25 2 .35 2 .33 0 , .02 0 .08 2 20 1 , .24 2 .37 2 .30 0 , .07 0 .30 2 24 1. .22 2 .38 2 .31 0 , .07 0 .32 2 44 1. .33 2 .28 2 .18 0. .10 0 .44 2 48 1. .23 2 .38 2 .27 0. .11 0 .48 i-BuOH de i-BuOH i-BuOH i-BuOH i-BuO- i-BuO- total total libre COFA COFA Reacción Tiempo (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (h) 3 0.1 1.27 2.33 2.33 0.00 0.00 3 2 1.26 2.34 2.34 0.00 0.00 3 20 1.22 2.38 2.37 0.01 0.07 3 24 1.25 2.35 2.33 0.02 0.08 3 44 1.24 2.36 2.32 0.04 0.18 3 48 1.24 2.36 2.32 0.04 0.18 Ejemplo 32 Dependencia de la concentración de áster isobutílico de COFA en la relación de elemento acuoso/COFA en reacciones catalizadas por lipasa Las mezclas de reacción que contenían amortiguador de ácido 2- (iV-morfolino) etanosulfónico acuoso (0.20 M, pH 5.2), isobutanol (2 -metil-1-propanol) , lipasa (Lipolase® 100 L; Novozymes) y ácidos grasos de aceite de maíz preparados a partir de aceite de maíz (Tabla 18) se agitaron a 30 °C y se extrajeron muestras de cada mezcla de reacción en momentos predeterminados, se centrifugaron inmediatamente y las capas acuosa y orgánica se separaron y analizaron para determinar el isobutanol (i-BuOH) y los ésteres isobutílicos de ácidos 7 grasos de aceite de maíz (i-BuO-COFA) (Tabla 19).

Tabla 18: Condiciones de reacción para la conversión de isobutanol (i-BuOH) en ásteres isobutílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (i-BuO-COFA) Tampón MES i-BuOH COFA Lipasa Reacción núm. (0.2 M) (g) (g) (g) (ppm) 1 45.96 3.6 43.4 10 2 45.96 3.6 21.7 10 3 45.96 3.6 10.85 10 4 45.96 3.6 43.4 4 5 45.96 3.6 43.4 0 de ácidos grasos de aceite de maíz (i-BuO-COFA) presentes en la fracción acuosa (AQ) y fracción orgánica (ORG) para las reacciones descritas en la Tabla 18 total i-BuOH de i-BuOH i-BuOH i-BuO- i-BuO- i-BuOH total libre COFA COFA Reacción Tiempo (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (h) 1 0.1 0. , 77 2. .83 2. .77 0 .05 0. .24 1 1 0. , 76 2. .84 2 , .58 0 , .25 1. .13 1 2 0. , 74 2. .86 2. .41 0 , .44 2 , .00 total i-BuOH de i-BuOH i-BuOH i-BuO- i-BuO- i-BuOH total libre COFA COFA Reacción Tiempo (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (h) ? 4 0.66 2.94 2.05 0.89 4.03 1 6 0.63 2.97 1.43 1.54 6.93 1 21.5 0.28 3.32 0.34 2.98 13.4 1 25.5 0.23 3.37 0.29 3.08 13.8 1.17 2.43 2.36 0.07 0.30 1 1.09 2.51 2.26 0.24 1.10 2 1.07 2.53 2.19 0.34 I.52 4 1.03 2.57 1.99 0.59 2.64 6 1.00 2.60 1.70 0.90 4.04 21.5 0.75 2.85 0.58 2.27 10.2 25.5 0.59 3.01 0.49 2.52 II.4 0.1 1.56 2.04 1.98 0.06 0.27 1 1.55 2.05 1.77 0.28 1.24 2 1.49 2.11 1.65 0.46 2.08 4 1.45 2.15 1.28 0.87 3.92 total i-BuOH de i-BuOH i-BuOH i-BuO- i-BuO- i-BuOH total libre COFA COFA Reacción Tiempo (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (h) 3 6 1 , .33 2. .27 0.96 1. .31 5.92 3 21.5 1. .12 2. .48 0.26 2. .22 10.0 3 25.5 0. .88 2 , .72 0.26 2. .46 11.1 4 0.84 2.76 2.75 0.02 0.07 4 0.78 2.82 2.73 0.09 0.40 4 0.83 2.77 2.59 0.17 0.79 4 0.78 2.82 2.44 0.38 1.71 4 0.78 2.82 2.10 0.72 3.25 4 21 0.58 3.02 1.12 1.90 8.57 4 25 0.51 3.09 0.97 2.11 9.51 5 0 0.90 70 2.70 0.00 0.00 5 0.90 70 2.70 0.00 0.00 5 2 0.92 68 2.68 0.00 0.00 5 4 0.89 71 2.70 0.00 0.02 5 6 0.92 68 2.62 0.06 0.29 5 21 0.90 70 2.62 0.08 0.37 5 25 0.89 71 2.62 0.09 0.41 Ejemplo 33 Dependencia de la concentración de éster butílico de COFA del alcohol de esterificación en reacciones catalizadas por lipasa Las mezclas de reacción que contenían amortiguador de ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico acuoso (0.20 M, pH 5.2), isobutanol (2-metil-l-propanol) o n-butanol, lipasa (Lipolase® 100 L; Novozymes) y ácidos grasos de aceite de maíz preparados a partir de aceite de maíz (Tabla 20) se agitaron a 30 °C y se extrajeron muestras de cada mezcla de reacción en momentos predeterminados, se centrifugaron inmediatamente y las capas acuosa y orgánica se separaron y analizaron para determinar el isobutanol (i-BuOH) o n-butanol (n-BuOH) y los ésteres isobutílicos o butílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (BuO-COFA) (Tabla 21) .

Tabla 20: Condiciones de reacción para la conversión de isobutanol (i-BuOH) o n-butanol (n-BuOH) en ésteres butílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (BuO-COFA) Amortiguador Butanol COFA Lipasa MES Reacción Butanol (0.2 M) (g) (g) (g) (ppm) 6 Isobutanol 45.96 3.6 13.5 10 7 n-butanol 45.96 3.6 13.5 10 8 Isobutanol 45.96 3.6 13.5 0 Tabla 21: Pesos de isobutanol (i-BuOH) o n-butanol (n-BuOH) y ásteres butílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (BuO-COFA) presentes en la fracción acuosa (AQ) y fracción orgánica (ORG) para las reacciones descritas en la Tabla 20 i-BuOH de i-BuOH i-BuOH i-BuO- i-BuO- total total i-BuOH COFA COFA Reacción Tiempo (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (h) 6 0.1 1 , .46 2 .14 2 .11 0 .04 0.16 6 2 1. .41 2 .19 1. .63 0 .56 2.51 6 4 1. .27 2 .33 1. .31 1 .02 4.58 6 21 0. .66 2 .94 0. .29 2 .65 12.0 6 25 0. .60 3 .00 0 , .26 2 .73 12.3 6 46 0. .54 3 .06 0 , .22 2 .83 12.8 n-BuOH n-BuO- n-BuOH n-BuOH r¡-BuOH de n- COFA total total BuO-COFA (g) (AQ) (g) (g) (g) (g) (ORG) (ORG) (ORG) (ORG) 7 0.1 1.31 2.29 2.26 0.03 0.11 7 2 1.26 2.34 1.89 0.45 2.03 7 4 1.20 2.40 1.66 0.74 3.35 7 21 0.81 2.79 0.50 2.29 10.3 25 0.77 2.83 0.40 2.43 11.0 46 0.50 3.10 0.23 2.87 12.9 i-BuOH ?-BuO- i-BuOH i-BuOH i-BuOH de i- COFA total total BuO-COFA (g) (AQ) (g) (g) (g) (g) (ORG) (ORG) (ORG) (ORG) 0.1 1.62 1.98 1.98 0.00 0.01 2 1.56 2.04 2.04 0.00 0.00 4 1.59 2.01 2.01 0.00 0.00 21 1.59 2.01 2.00 0.01 0.04 25 1.55 2.05 2.04 0.01 0.04 46 1.45 2.15 2.12 0.02 0.11 i-BuOH i-BuO- i-BuOH i-BuOH i-BuOH de i- COFA total total BuO-COFA (g) (AQ) (g) (g) (g) (g) (ORG) (ORG) (ORG) (ORG) 0.1 1.57 2.03 2.02 0.01 0.04 2 1.54 2.06 1.86 0.19 0.86 4 1.44 2.16 1.79 0.36 1.64 21 1.14 2.46 0.95 1.51 6.82 25 1.10 2.50 0.83 1.67 7.50 46 0.78 2.82 0.44 2.37 10.7 Ejemplo 34 Producción de oleato de isobutilo por medio de la reacción catalizada con lipasas de isobutanol y ácido oleico Las mezclas de reacción que contenían amortiguador de ácido 2 - (N-morfolino) etanosulfónico acuoso (0.20 M, pH 5.2) , isobutanol (2-metil-l-propanol), lipasa (Lipolase® 0 ppm o 10 ppm 100 L ; Novozymes) y ácido oleico (Alfa Aesar) (Tabla 22) se agitaron a 30 °C y se extrajeron muestras de cada mezcla de reacción en momentos predeterminados, se cent ifugaron inmediatamente y las capas acuosa y orgánica se separaron y analizaron para determinar el isobutanol (i-BuOH) y oleato de isobutilo (i-BuO-oleato) (Tabla 23) .

Tabla 22: Condiciones de reacción para la conversión de isobutanol (i-BuOH) en oleato de isobutilo (i-BuO-oleato) Reacción Amortiguador i-BuOH de ácido oleico Lipasa MES núm. (0.2 M) (g) (g) (g) (ppm) 10 46.11 3.64 14.62 Ü~0 11 46.10 3.59 14.40 0 Tabla 23 Pesos de isobutanol (i-BuOH) y oleato de isobutilo (i-BuO-COFA) presentes en la fracción acuosa (AQ) y fracción orgánica (ORG) para las reacciones descritas en la Tabla 22 i-BuOH i-BuOH i-BuOH de i- i-BuO- total total i-BuOH BuO-oleato oleato Reacción Tiempo (g) (g) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (h) (AQ) (ORG) (ORG) 10 0.1 1.37 2.28 2.24 0.04 0.18 10 2 1.30 2.34 1.95 0.40 1.81 10 4 1.28 2.37 1.82 0.55 2.53 10 6 1.22 2.42 1.71 0.72 3.27 10 23 0.92 2.72 0.71 2.01 9.20 10 27 0.89 2.75 0.65 2.11 9.62 10 47 0.81 2.84 0.55 2.29 10.5 10 51 0.82 2.83 0.54 2.29 10.5 11 0.1 1.44 2.16 2.16 0.00 0.00 11 2 1.45 2.15 2.15 0.00 0.00 11 4 1.44 2.16 2.16 0.00 0.00 11 6 1.43 2.16 2.16 0.00 0.00 11 23 1.49 2.10 2.10 0.01 0.02 11 27 1.46 2.14 2.13 0.01 0.04 11 47 1.48 2.12 2.09 0.02 0.10 11 51 1.52 2.07 2.05 0.02 0.11 Ejemplo 35 Comparación de la producción de oleato de isobutilo por medio de reacciones catalizadas por lipasas de isobutanol y ácido oleico Las mezclas de reacción que contenían amortiguador de ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico acuoso (MES, 0.20 M, pH 5.2), isobutanol (2-metil-l-propanol) , ácido oleico (Alfa Aesar) y lipasa (10 ppm) de Lipolase® 100 L, Lipex® 100 L, Lipozyme® CALB L, Novozyme® CALA L, Palatase® de Novozymes o lipasa (10 ppm) de Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Mucor miehei, páncreas de cerdo, Candida cylindracea, Rhizopus niveus, Candida antárctica, Rhizopus arrhizus o Aspergillus de SigmaAldrich (Tabla 24) se agitaron a 30 °C y se extrajeron muestras de cada mezcla de reacción en momentos predeterminados, se centrifugaron inmediatamente y las capas orgánicas se separaron y analizaron para determinar el isobutanol (i-BuOH) y oleato de isobutilo (i-BuO-oleato) (Tabla 25) .

Tabla 24 : Condiciones de reacción para la conversión de isobutanol (i-BuOH) en oleato de isobutilo (i-BuO-oleato) Tampón MES i-BuOH de ácido oleico Lipasa (0.2 M) (g) (g) (g) (ppm) 46.105 3.601 13.72 10 Tabla 25: Pesos de isobutanol (i-BuOH) y oleato de isobutilo (i-BuO-oleato) presentes en la fracción acuosa (AQ) y fracción orgánica (ORG) para las reacciones descritas en la Tabla 24 i-BuOH de i-BuOH i-BuOH i-BuO- i-BuO- total total i-BuOH oleato oleato Lipasa Tiempo (g) (g) (g) (g) (ORG) (g) (h) (AQ) (ORG) (ORG) (ORG) Lipolase® 100 L 23 0.92 2.72 0.71 2 .01 9.20 Lipex® 100 L 23 0.65 . 2.95 0.30 2. .65 12.09 Lipozyme® CALB L 23 1.01 2.59 0.82 1. .77 8.08 Novozyme® CALA L 23 1.39 2.22 2.16 0. .06 0.27 Palatase® 23 1.27 2.33 1.43 0 , .91 4.14 Pseudomonas 23 1.38 2.22 1.97 0 , .25 1.14 fluorescens Pseudomonas 23 1.39 2.21 1.95 0 , .26 1.20 cepacia Mucor miehei 23 1.29 2.31 1.57 0. .75 3.42 Páncreas de cerdo 23 1.40 2.20 2.19 0 , .01 0.04 Candida 23 1.15 2.45 1.08 1 , .37 6.25 cylindracea Rhizopus niveus 23 1.39 2.21 2.19 0 , .02 0.11 Candida 23 1.37 2.24 2.08 0, .15 0.69 antárctica i-BuOH de i-BuOH i-BuOH i-BuO- i-BuO- total total i-BuOH oleato oleato Lipasa Tiempo (g) (g) (g) (g) (ORG) (g) ( ) (AQ) (ORG) (ORG) (ORG) Aspergíllus 23 1.36 2.24 2.06 0.18 0.82 Sin lipasa 23 1.49 2.10 2.10 0.01 0.02 Ejemplo 36 Producción de éster etílico de COFA por medio de la reacción catalizada con lipasa de etanol y ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) Las mezclas de reacción que contenían amortiguador de ácido 2- (iV-morfolino) etanosulfónico acuoso (0.20 M, pH 5.5), etanol, lipasa (Lipolase® 100 L o Lipozyme® CALB L; Novozymes) y ácidos grasos de aceite de maíz preparados a partir de aceite de maíz (Tabla 26) se agitaron a 30 °C y se extrajeron muestras de cada mezcla de reacción en momentos predeterminados, se centrifugaron inmediatamente y las capas acuosa y orgánica se separaron y analizaron para determinar el etanol y los ésteres etílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (EtO-COFA) (Tabla 27) .

Tabla 26: Condiciones de reacción para la conversión de etanol (EtOH) en ásteres etílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (EtO-COFA) Amortiguador Etanol COFA Lipasa MES Reacción (0.2 M) (g) (g) (g) Lipasa (ppm) 12 Lipolase® 10 46.11 3.60 14.48 100 L 13 Lipozyme® 10 46.10 3.60 14.47 CALB L 14 46.11 3.61 14.47 Sin lipasa 0 Tabla 27: Pesos de etanol (EtOH) y ésteres etílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (EtO-COFA) presentes en la fracción acuosa (AQ) y la fracción orgánica (ORG) para las reacciones descritas en la Tabla 26 EtOH EtOH EtOH de ETO- total total EtOH EtO-COFA COFA Reacción Tiempo (h) (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (g) (g) (ORG) (ORG) (ORG) 12 0 2.94 0. .655 0 .634 0 .021 0.01 12 2 3.09 0. .504 0 .105 0 .398 0.81 12 20 2.74 0. .854 0 .030 0 .824 4.46 12 24 2.43 1. .167 0 .032 1 .135 5.25 12 44 2.37 1. .230 0 .022 1 .208 7.28 EtOH EtOH EtOH de ETO- total total EtOH EtO-COFA COFA Reacción Tiempo (h) (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (g) (g) (ORG) (ORG) (ORG) 12 48 2 .24 1 , .360 0 , .022 1. 338 7. 63 13 0 2 .94 0 , .659 0 , .635 0. 024 0. 01 13 2 2 .83 0. .773 0. .074 0. 699 1. 88 13 20 2 .10 1. .501 0. .000 1. 501 9. 72 13 24 2 .07 1. .532 0. .000 1. 532 10 .14 13 44 1 .94 1. .673 0. .014 1. 659 10 .93 13 48 1 .72 1. .882 0. .016 1. 865 11 .05 14 0 2 .96 0. .646 0. .624 0. 023 0. 01 14 2 2 .93 0. .679 0. .661 0. 018 0. 01 14 20 2 .75 0. .857 0. .779 0. 079 0. 02 14 24 2 .87 0. .738 0. .662 0. 075 0. 03 14 44 2 .79 0. , 813 0. .688 0. 126 0. 04 14 48 2 .82 0. , 785 0. .671 0. 114 0. 05 Ejemplo 37 Producción de éster etílico de COFA por medio de la reacción catalizada con lipasas de etanol y ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) durante la fermentación de levadura La cepa de levadura silvestre CEN.PK113-7D se propagó de la noche a la mañana en medio que contenía base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos (6.7 g/1) , dextrosa (25 g/1) y amortiguador MES (0.1 M a pH 5.5) . El cultivo de la noche a la mañana se diluyó en medio nuevo de manera que la densidad óptica resultante a 600 nm fue 0.1. El cultivo diluido se dividió en alícuotas de 25 mi por matraz en seis matraces de agitación de 250 mi con tapa sellada. Cuatro cultivos se suplementaron con cualquiera de las dos soluciones matrices de enzimas lipasa (2 mg de proteína/ml de amortiguador fosfato 10 mM (pH 7.0) de Lipozyme® CALB L o Lipolase® 100 L) hasta una concentración final de lipasa de 10 ppm en el medio. Se añadió ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) en una relación de volumen 1:1 en el cultivo acuoso en tres de los matraces (sin enzima, CALB L o Lipolase® 100 L) . Un matraz no contenía suplementos. Los cultivos se crecieron en un incubador de agitación con temperatura controlada a 30 °C y una velocidad de agitación de 250 rpm por 23 horas. Se dejó que las fases de las muestras para determinar la masa celular se separaran en tubos de fondo cónico de 15 mi. Se midió la densidad óptica de la muestra a 600 nm con una dilución de 20 veces en solución salina. Las muestras (5 mi de solución acuosa o 10 mi de emulsión de cult ivo/COFA) para el análisis cromatográfico se centrifugaron inmediatamente por 5 minutos a 4000 rpm en un rotor de vasos basculantes TX-400 en tubos de fondo cónico de 15 mi . Para las muestras acuosas se usó un filtro de centrifugado de 0.22 \im antes del análisis. Las muestras acuosas se analizaron en una columna Shodex SH1011 con una columna de protección SH-G con una fase móvil de ácido sulfúrico 0.01 M a 50 °C y un régimen de flujo de 0.5 mi por minuto. La detección de azúcares y alcoholes se realizó por índice de refracción y 210 nm de absorción, y la cuantificación se realizó con curvas estándar. Las muestras se tomaron del cultivo acuoso (sin adición de COFA) o emulsión de cultivo/COFA y se analizaron tal como se describió en los ejemplos anteriores para los ásteres etílicos de COFA. Los resultados se indican en las Tablas 28 y 29.

Tabla 28: Pesos de etanol (EtOH), glucosa y subproductos de fermentación presentes en el medio acuoso (AQ) a partir de fermentaciones de 23 h Glucosa Glicerol Acetato Acetoína EtOH (g/1) (g/1) (g/1) (g/1) (g/1) Medio 0 0 .62 1 .01 0 , .08 9. 98 Medio + CALB L 0 0 .72 0 .94 0. .06 9. 94 Medio + Lipolase® 0 0 .61 0 .99 0. .05 9. 87 100 L Medio + COFA 0 0 .68 0 .32 0. .15 7. 73 Medio + COFA + CALB L 0 0 .74 0 .09 0. .11 3. 92 Medio + COFA + 0 0 .63 0 .23 0. .18 7. 19 Lipolase® 100 L Tabla 29 : Pesos de etanol (EtOH) y ásteres etílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (EtO-COFA) presentes en la fracción acuosa (AQ) y la fracción orgánica (ORG) para fermentaciones de 23 h EtOH de EtOH EtOH EtO-COFA ETO-COFA Reacción (g/D ( Q) (g/D (g/D (g/D (ORG) (ORG) (ORG) Medio + COFA 6.7 0.18 1.2 Medio + COFA + CALB L 3.4 0 4.52 30.0 Medio + COFA + Lipolase® 100 L 6.1 0 0.72 4.8 Ejemplo 38 Producción de áster metílico de COFA por medio de la reacción catalizada con lipasa de metanol y ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) Las mezclas de reacción que contenían amortiguador de ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico acuoso (0.20 M, pH 5.5), metanol, lipasa (Lipolase® 100 L (Novozymes) , Lipozyme® CALB L (Novozymes) , lipasa Rhizopus arrhizus (SigmaAldrich) y lipasa Candida cylindracea (SigmaAldrich) y ácidos grasos de aceite de maíz preparados a partir de aceite de maíz (Tabla 30) se agitaron a 30 °C, y las muestras se extrajeron mientras se agitaba de cada mezcla de reacción en momentos predeterminados, se centrifugaron inmediatamente y las capas acuosa y orgánica se separaron y analizaron para determinar el etanol y los ésteres etílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (EtO-COFA) (Tabla 31) .

Tabla 30: Condiciones de reacción para la conversión de metanol (MeOH) en ésteres metílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (MeO-COFA) Amortiguador Metanol COFA Lipasa MES Reacción (0.2 M) (g) (g) (g) Lipasa (ppm) 15 46.11 3.60 14.51 Lipolase® 100 L 10 16 46.10 3.59 14.49 Lipozyme® CALB L 10 17 46.11 3.60 14.49 R. arrhizus 10 18 46.10 3.60 14.48 C. cylindracea 10 19 46.10 3.60 14.51 Sin lipasa 10 Tabla 31: Pesos de metanol (MeOH) y esteres metílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (MeO-COFA) presentes en la fracción acuosa (AQ) y fracción orgánica (ORG) para las reacciones descritas en la Tabla 30 MeOH MeOH MeOH de total total MeOH MeO-COFA MeO-COFA Reacción Tiempo (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (h) 15 0 3.33 0.26 0.05 0.01 0.02 15 2 3.09 0.50 0.05 0.13 0.16 MeOH MeOH MeOH de total total MeOH MeO-COFA MeO-Reacción Tiempo (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) ( (h) 15 20 2. .81 0, .79 0. .04 0. .70 3.03 15 24 2. .72 0. .87 0. .04 0. .79 3.47 15 44 2. .53 1. .06 0. .03 1. .00 4.97 15 48 2. .48 1. , 12 0. .03 1. .05 5.18 16 0 3.07 0.53 0.04 0.02 0.02 16 2 3.01 0.59 0.04 0.20 0.22 16 4 2.92 0.67 0.03 0.56 1.32 16 20 2.54 1.06 0.03 0.99 5.25 16 24 2.43 1.16 0.03 1.09 5.90 16 44 2.28 1.32 0.02 1.27 7.63 16 48 2.22 1.37 0.03 1.32 7.89 17 0 3.09 0.52 0.04 0.02 0.02 17 2 3.05 0.56 0.06 0.05 0.06 17 4 2.98 0.63 0.04 0.25 0.24 17 20 3.03 0.57 0.04 0.32 0.49 17 24 2.98 0.63 0.04 0.35 0.52 17 44 2.99 0.62 0.04 0.38 0.62 17 48 2.94 0.67 0.04 0.40 0.61 18 0 17 43 0.05 0.02 0.02 18 2 12 49 0.04 0.02 0.02 MeOH MeOH MeOH de total total MeOH MeO-COFA MeO-COFA Reacción Tiempo (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (h) 18 20 2.64 0.96 0.03 0.89 3.97 18 24 2.58 1.03 0.03 0.95 4.49 18 44 2.37 1.23 0.03 1.18 6.40 18 48 2.30 1.30 0.03 1.25 6.71 19 0 3. .08 0, .52 0 , .04 0. .03 0.02 19 2 3. .08 0. .52 0. .04 0. .02 0.02 19 4 3 , .04 0. .56 0 , .04 0. .03 0.02 19 20 3. .08 0. .53 0 , .04 0. .03 0.03 19 24 3 , , 04 0. .56 0. .05 0. .03 0.04 19 44 3. .01 0. .59 0. .04 0. .06 0.04 19 48 2. .95 0. .65 0 , .05 0. .06 0.04 Ejemplo 39 Producción de áster 1-propílico de COFA por medio de la reacción catalizada por lipasa de 1-propanol y ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) Las mezclas de reacción que contenían amortiguador de ácido 2 - (N-morfolino) etanosulfónico acuoso (0.20 M, pH 5.5), 1-propanol, lipasa (Lipolase® 100 L (Novozymes ) , Lipozyme® CALB L (Novozymes) , lipasa Rhizopus arrhizus (SigmaAldrich) y lipasa Candida cylindracea (SigmaAldrich) y ácidos grasos de aceite de maíz preparados de aceite de maíz (Tabla 32) se agitaron a 30 °C y las muestras se extrajeron mientras se agitaba de cada mezcla de reacción en momentos predeterminados, se centrifugaron inmediatamente y las capas acuosa y orgánica se separaron y analizaron para determinar el contenido de 1-propanol y ésteres 1-propílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (PrO-COFA) (Tabla 33).

Tabla 32 : Condiciones de reacción para la conversión de 1-propanol (PrOH) en ésteres 1-propílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (PrO-COFA) Amortiguador 1 -propanol COFA Lipasa MES Reacción (0.2 M) (g) (g) (g) Lipasa (ppm) 20 46.11 3.60 14.47 Lipolase® 100 L 10 21 46.12 3.60 14.48 Lipozyme® CALB L 10 22 46.10 3.60 14.48 R. arrhizus 10 23 46.13 3.62 14.49 C. cylindracea 10 Tabla 33: Pesos de 1-propanol (PrOH) y ásteres 1-propílieos de ácidos grasos de aceite de maíz (PrO-COFA) presentes en la fracción acuosa (AQ) y fracción orgánica (ORG) para las reacciones descritas en la Tabla 32 PrOH PrOH PrOH de total total PrOH PrO-COFA PrO-COFA Reacción Tiempo (g) (g) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (h) (AQ) (ORG) 20 0 2 .54 1.05 0.80 0.00 0.02 20 2 2 .39 1.20 0.70 0.11 0.44 20 4 2 .00 1.60 0.61 0.55 1.88 20 20 1 .65 1.95 0.31 1.50 6.96 20 24 1 .51 2.08 0.28 1.69 7.97 20 44 1 .13 2.46 0.16 2.23 11.09 20 48 1 .09 2.51 0.15 2.29 11.27 21 0 2 .44 1.16 0.79 0.00 0.02 21 2 2 .38 1.22 0.65 0.13 0.49 21 4 2 .07 1.53 0.52 0.73 2.94 21 20 1 .16 2.43 0.17 2.18 10.80 21 24 1 .08 2.51 0.16 2.28 11.26 21 44 1 .00 2.60 0.13 2.40 11.86 21 48 0 .98 2.62 0.13 2.42 11.91 22 0 2 .49 1.11 0.80 0.00 0.02 22 2 2 .42 1.18 0.76 0.10 0.38 22 4 2 .23 1.37 0.71 0.29 1.08 22 20 2 .09 1.51 0.56 0.71 2.96 PrOH PrOH PrOH de total total PrOH PrO-COFA PrO-COFA Reacción Tiempo (g) (g) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (h) (AQ) (ORG) 22 44 1.87 1.73 47 58 75 22 48 1.88 1.73 46 60 82 23 0 2.49 1.13 0.80 0.00 0.02 23 2 2.45 1.17 0.77 0.07 0.29 23 4 2.35 1.27 0.71 0.21 0.82 23 20 2.00 1.61 0.50 0.89 3.74 23 24 1.93 1.68 0.49 0.99 4.23 23 44 1.57 2.04 0.33 1.56 6.83 23 48 1.49 2.13 0.31 1.67 7.33 24 0 2.49 1.11 0.81 0.00 0.02 24 2 2.47 1.13 0.81 0.00 0.02 24 4 2.38 1.21 0.78 0.01 0.03 24 20 2.46 1.14 0.79 0.01 0.05 24 24 2.42 1.17 0.79 0.01 0.05 24 44 2.41 1.19 0.76 0.02 0.09 24 48 2.32 1.28 0.77 0.03 0.10 Ejemplo 40 Producción de áster 1-pentílico de COFA por medio de la reacción catalizada por lipasa de 1-pentanol y ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) Las mezclas de reacción que contenían amortiguador de ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico acuoso (0.20 M, pH 5.5), 1-pentanol, lipasa (Lipolase® 100 L (Novozymes) , Lipozyme® CALB L (Novozymes) , lipasa Rhizopus arrhizus (SigmaAldrich) y lipasa Candida cylindracea (SigmaAldrich) y ácidos grasos de aceite de maíz preparados a partir de aceite de maíz (Tabla 34) se agitaron a 30 °C y las muestras se extrajeron mientras se agitaba de cada mezcla de reacción en momentos predeterminados, se centrifugaron inmediatamente y las capas acuosa y orgánica se separaron y analizaron para determinar el contenido de 1-pentanol y ásteres 1-pentílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (PenO-COFA) (Tabla 35) .

Tabla 34: Condiciones de reacción para la conversión de 1-pentanol (PenOH) en ásteres l-pentílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (PenO-COFA) Amortiguador 1-pentanol COFA Lipasa MES Reacción (0.2 M) (g) (g) (g) Lipasa (ppm) 25 46.11 3.60 14.47 Lipolase® 100 L 10 26 46.12 3.60 14.48 Lipozyme® CALB L 10 27 46.10 3.60 14.48 R. arrhizus 10 Amortiguador 1-pentanol COFA Lipasa MES Reacción (0.2 M) (g) (g) (g) Lipasa (ppm) 28 46.13 3.62 14.49 C. cylindracea 10 29 46.13 3.60 14.48 Sin lipasa 0 Tabla 35: Pesos de 1-pentanol (PenOH) y ásteres 1-pentílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (PenO-COFA) presentes en la fracción acuosa (AQ) y fracción orgánica (ORG) para las reacciones descritas en la Tabla 34 PenOH PenOH PenOH PenOH de PenO- total total PenO-COFA COFA Reacción Tiempo (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (g) (ORG) (g) (h) (ORG) (ORG) 25 0 0 .364 3 .238 3. 091 0 .002 0. 006 25 2 0 .339 3 .264 2. 745 0 .446 1. 760 25 4 0 .373 3 .229 2. 761 0 .557 2. 196 25 20 0 .336 3 .266 1. 833 1 .002 3. 953 25 24 0 .325 3 .277 1. 575 1 .257 4. 960 25 44 0 .226 3 .377 0. 921 2 .383 9. 400 25 48 0 .206 3 .396 0. 723 2 .524 9. 957 26 0 0 .364 3 .243 3. 105 0 .002 0. 006 26 2 0 .317 3 .290 2. 462 0 .512 2. 019 26 4 0 .320 3 .287 2. 287 0 .652 2. 574 26 20 0 .130 3 .477 0. 387 3 .007 11 .860 26 24 0 .094 3 .513 0. 215 3 .251 12 .823 PenOH PenOH PenOH PenOH de PenO- total total PenO-COFA COFA Reacción Tiempo (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (g) (ORG) (g) (h) (ORG) (ORG) 26 44 0 .075 3 .532 0 .165 3 .312 13 .067 26 48 0 .081 3 .526 0 .165 3 , .326 13 .120 27 0 0 .384 3 .216 3 .102 0. .002 0. 006 27 2 0 .356 3 .244 2 .957 0 , .437 1. 725 27 4 0 .333 3 .267 2 .912 0 , .388 1. 532 27 20 0 .363 3 .237 2 .664 0 , .433 1. 707 27 24 0 .367 3 .233 2 .597 0. .665 2. 623 27 44 0 .366 3 .234 2 .473 0 , .549 2. 166 27 48 0 .347 3 .253 2 .473 0. .559 2. 205 28 0 0 .369 3 .244 3 .086 0. .002 0. 006 28 2 0 .329 3 .284 2 .523 0. .435 1. 717 28 4 0 .332 3 .281 2 .496 0. .493 1. 944 28 20 0 .304 3 .309 1 .575 1. .321 5. 209 28 24 0 .270 3 .343 1 .292 1. .868 7. 367 28 44 0 .186 3 .427 0 .596 2. .722 10 .735 28 48 0 .162 3 .451 0 .509 2. .846 11 .224 29 0 0 .375 3 .239 3 .102 0. .001 0. 006 29 2 0 .366 3 .248 3 .117 0. .009 0. 034 29 4 0 .377 3 .237 3 .099 0. .023 0. 089 29 20 0 .380 3 .234 3 .092 0. , 032 0. 125 29 24 0 .379 3 .235 3 .058 0. , 039 0. 154 PenOH PenOH PenOH PenOH de PenO- total total PenO-COFA COFA Reacción Tiempo (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (g) (ORG) (g) (h) (ORG) (ORG) 29 44 0.374 3.240 3.013 0.053 0.209 29 48 0.373 3.241 2.950 0.059 0.233 Ejemplo 41 Producción de éster 2-metil-l-butílico de COFA por medio de la reacción catalizada por lipasa de 2-metil-l-butanol y ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) Las mezclas de reacción que contenían amortiguador de ácido 2- (W-morfolino) etanosulfónico acuoso (0.20 M, pH 5.5), 2-metil-l-butanol, lipasa (Lipolase® 100 L (Novozymes) , Lipozyme® CALB L (Novozymes) , lipasa Rhizopus arrhizus (SigmaAldrich) y lipasa Candida cylindracea (SigmaAldrich) y ácidos grasos de aceite de maíz preparados a partir de aceite de maíz (Tabla 36) se agitaron a 30 °C y las muestras se extrajeron mientras se agitaba de cada mezcla de reacción en momentos predeterminados, se centrifugaron inmediatamente y las capas acuosa y orgánica se separaron y analizaron para determinar el contenido de 2-metil-l-butanol y esteres 2-metil-l-butílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (MeBO-COFA) (Tabla 37) .

Tabla 36: Condiciones de reacción para la conversión de 2-metil- 1-butanol (MeBOH) en ásteres 2-metil-l-butílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (MeBO-COFA) Amortiguador 2-metil- MES 1-butanol COFA Lipasa Reacción (0.2 M) (g) (g) (g) Lipasa (ppm) 30 46.27 3.60 14.48 Lipolase® 100 L 10 31 46.14 3.60 14.48 Lipozyme® CALB L 10 32 46.12 3.60 14.47 R. arrhizus 10 33 46.11 3.49 14.47 C. cylindracea 10 34 46.18 3.60 14.47 Sin lipasa 0 Tabla 37 : Pesos de 2-metil-l--butanol (MeBOH) y ásteres 2-metil-l-butílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (MeBO-COFA) presentes en la fracción acuosa (AQ) y la fracción orgánica (ORG) para las reacciones descritas en la Tabla 36 MeBOH MeBOH MeBOH de total total MeBOH MeBO-COFAMeBO-COFA Reacción Tiempo (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (h) 30 0 0. .000 3 , .603 3.103 0.002 0 , .008 30 2 0. .009 3. .593 2.919 0.630 2 , .484 30 4 0. .058 3. .545 2.766 0.673 2. .653 30 20 0. .005 3 , .598 2.041 1.331 5. .250 30 24 0. .029 3 , .574 1.967 1.418 5 , .594 30 44 0. .017 3 , .585 1.218 2.174 8. .577 30 48 0. .008 3 , .595 1.099 2.085 8. .224 MeBOH MeBOH MeBOH de total total MeBOH MeBO-COFAMeBO-COFA icciónTiempo (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG (h) 31 0 0. 000 3 .595 3 .129 0. 003 0. 010 31 2 0. 003 3 .592 2 .665 0. 692 2. 730 31 4 0. 012 3 .583 2 .510 0. 839 3. 308 31 20 0. 001 3 .594 1 .408 1. 932 7. 622 31 24 0. 005 3 .590 1 .293 2. 082 8. 214 31 44 0. 006 3 .589 0 .970 2. 437 9. 612 31 48 0. 007 3 .588 0 .918 2. 495 9. 840 32 0 0. 000 3 , .597 3 .100 0. 003 0. 011 32 2 0. 017 3 , .580 2 .855 0. 588 2. 321 32 4 0. 000 3 , .597 2 .783 0. 675 2. 664 32 20 0. 000 3 , .597 2 .392 1. 027 4. 051 32 24 0. 000 3 , .597 2 .337 1. 081 4. 266 32 44 0. 001 3 , .596 2 .209 1. 191 4. 697 32 48 0. 000 3 , .597 2 .174 1. 216 4. 798 33 0 0. 000 3. .597 3 .093 0. 002 0. 008 33 2 0. 001 3. .596 1 .756 1. 398 5. 514 33 4 0. 003 3. .594 2 .116 1. 026 4. 046 33 20 0. 027 3. .570 0 .607 2. 865 11 .302 33 24 0. 000 3. .597 0 .429 3. 097 12 .216 33 44 0. 007 3. .590 0 .205 3. 345 13 .194 33 48 0. 003 3. .594 0 .202 3. 353 13 .228 MeBOH MeBOH MeBOH de total total MeBOH MeBO-COFAMeBO-COFA icción Tiempo (g) (AQ) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (ORG) (g) (OR< (h) 34 0 0. .000 3 .485 3. 014 0. .003 0. .011 34 2 0. 000 3 .485 2. 991 0. .021 0. .083 34 4 0. .000 3 .485 3. 020 0. .012 0. , 046 34 20 0. 000 3 .485 2. 970 0. .029 0. , 115 34 24 0. 002 3 .483 2. 949 0. .037 0. , 148 34 44 0. 000 3 .485 2. 912 0. .047 0. .185 34 48 0. 000 3 .485 2. 909 0. .051 0. ,200 Ejemplo 42 Producción de áster isopropílico de COFA por medio de la reacción catalizada por lipasa de isopropanol y ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) Las mezclas de reacción que contenían amortiguador de ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico acuoso (0.20 M, pH 5.5), isopropanol (2 -propanol) , lipasa (Lipolase® 100 L (Novozymes) , Lipozyme® CALB L (Novozy es) , lipasa Rhizopus arrhizus (SigmaAldrich) y lipasa Candida cylindracea (SigmaAldrich) y ácidos grasos de aceite de maíz preparados a partir de aceite de maíz (Tabla 38) se agitaron a 30 °C y las muestras se extrajeron mientras se agitaba de cada mezcla de reacción en momentos predeterminados, se centrifugaron inmediatamente y las capas acuosa y orgánica se separaron y analizaron para determinar el isopropanol y ásteres isopropílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (i-PrO-COFA) (Tabla 39) .

Tabla 38: Condiciones de reacción para la conversión de isopropanol (i-PrOH) en ésteres isopropílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (i-PrO-COFA) Amortiguador Isopropanol COFA Lipasa MES Reacción (0.2 M) (g) (g) (g) Lipasa (ppm) 35 46.14 3.60 14.48 Lipozyme® CALB L 10 36 46.11 3.49 14.47 C. cylindracea 10 37 46.18 3.60 14.47 Sin lipasa 0 Tabla 39: Pesos de isopropanol (i-PrOH) y ésteres isopropílicos de ácidos grasos de aceite de maíz (i-PrO- COFA) presentes en la f acción · orgánica (ORG) para las reacciones descritas en la Tabla 38 i-PrOH de i-PrO-COFA i -PRO-COFA Reacción Tiempo (h) (g) (ORG) (g) (ORG) 35 0 0.001 0.00 35 2 0.013 0.07 35 4 0.038 0.20 35 20 0.132 0.71 35 24 0.177 0.94 35 44 0.291 1.55 35 48 0.301 1.61 i-PrOH de i-PrO-COFA i-PRO-COFA Reacción Tiempo (h) (g) (ORG) (g) (ORG) 36 0 0.001 0.01 36 2 0.051 0.27 36 4 0.163 0.87 36 20 0.532 2.84 36 24 0.652 3.48 36 44 0.916 4.89 36 48 0.959 5.12 37 0 0.001 0.01 37 2 0.001 0.01 37 4 0.003 0.02 37 20 0.009 0.05 37 24 0.011 0.06 37 44 0.016 0.09 37 48 0.023 0.12 Ejemplo 43 Comparación de los coeficientes de partición para el isobutanol entre el agua y el extractante Las soluciones acuosas de isobutanol (30 g/1) se mezclaron con ácidos grasos de aceite de maíz (COFA) o triglicéridos de ácido oleico o aceite de maíz y sus coeficientes de partición medidos se reportaron en la tabla con respecto al coeficiente de partición medido para el alcohol oleílico. Los resultados se indican en la Tabla 40. Tabla 40: Coeficientes de partición relativos para el isobutanol (30 g/1) entre el agua y el extractante Coeficiente de partición Extractante del isobutanol con respecto al alcohol oleílico Alcohol oleílico 100 % Ácidos grasos de aceite de maíz 91 % Esteres isobutílicos de ácidos 43 % grasos de aceite de maíz Triglicéridos de aceite de maíz 10 % lüjempio 44 Producción de ácidos grasos de aceite de maíz Se cargó un matraz de fondo redondo de cinco litros (5 L) equipado con un agitador mecánico, termopar, manto de calentamiento, condensador y empalme para nitrógeno con 750 g de aceite de maíz crudo (de calidad no alimenticia, recuperado de una instalación de fermentación de etanol), 2112 g de agua y 285 g de solución de hidróxido de sodio al 50 %. La mezcla se calentó hasta 90 °C y se mantuvo por dos horas, y durante ese tiempo se transformó en una sola fase simple similar a una emulsión espesa. Al final de este periodo, se comprobó por TLC que no quedaba aceite de maíz en la mezcla. Después, la mezcla se enfrió hasta 74 °C y se añadió 900 g de ácido sulfúrico al 25 % para acidificar la mezcla. Después, se enfrió hasta 50 °C y la capa acuosa se drenó. La capa de aceite se lavó dos veces con 1500 mi de agua a 40 °C y, después, una vez con 1 litro de salmuera saturada. Se secó sobre sulfato de magnesio y se filtró a través de Celite. Se obtuvieron 610 g de aceite rojo claro. La valoración para los ácidos grasos libres a través del método AOCS Ca 5a-40 muestra un contenido de ácido graso de 95 % expresado como ácido oleico. Una muestra se silanizó por la reacción de 104 mg con 100 ul de N-metil-N- (trimetilsilil) trifluoroacetamida en 1 mi de piridina seca. El análisis por cromatografía de gas-espectrometría de masa (CGEM) del producto silanizado muestra la presencia de los derivados de TMS de los ácidos 16:0, 18:2, 18:1, 18:0 y 20:0. Ejemplo 45 Síntesis química de FABE Se equipó un matraz de 3 1 con un agitador mecánico, termopar, entrada de nitrógeno, manto de calentamiento y un condensador. El matraz se cargó con COFA (595 g) (preparado como en el Ejemplo 44), isobutanol (595 g) y ácido sulfúrico (12 g) . La mezcla se procesó por reflujo durante 1.5 horas y después de ese tiempo se eliminó el condensador y se reemplazó por una cabeza de destilación. El destilado se recolectó durante tres horas a una temperatura de cabeza inicial de 90 °C y una temperatura de cabeza final de 105 °C. Después, la mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente y se añadió 500 mi de agua desionizada. Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó cinco veces con 500 mi de agua desionizada. Después, se lavó una vez con 500 mi de una solución de cloruro de calcio al 10 % seguida de seis lavados con 500 mi de agua desionizada. Después, el aceite se secó sobre sulfato de magnesio y se filtró a través de un lecho de Celite lo que produjo 601 g de un aceite rojo claro. Por medio del análisis por CG se identificó un contenido de 0.36 % en peso de isobutanol. El análisis por CG/EM muestra la presencia de palmitato de isobutilo, estearato de isobutilo, oleato de isobutilo, linoleato de isobutilo y linolenato de isobutilo.

Ejemplo 46 Recuperación de butanol con un catalizador de ácido inorgánico Se usó un matraz de fondo redondo de 1 litro con agitación magnética y una columna de 30.5 cm (12") empaquetada con anillos de Rasching, con una cabeza de destilación y entrada de nitrógeno en la parte superior. El matraz se cargó con 254 g de FABE sintetizados como en el Ejemplo 45, 255 g de COFA, 100 mi de agua y 5 g de ácido sulfúrico y se calentó hasta que la temperatura del recipiente alcanzó los 93 °C. La temperatura de la cabeza se equilibró en 89.7 °C. El primer corte se recolectó con una relación de reflujo que mantuvo la temperatura de cabeza en 89 a 94 °C.

La reacción se enfrió y se asentó a temperatura ambiente por tres días. El análisis del recipiente por CG demostró que había un total de 1 g de isobutanol en el recipiente. La destilación se reinició y se recolectaron otros tres cortes, cada uno de ellos de 25 mi. Se añadió cien (100) mi en el recipiente después de recolectar el corte núm. 2. Se recolectaron y analizaron cuatro cortes y se obtuvieron los resultados que se indican en la Tabla 41.

El análisis por CG se realizó con un CG Hewlett Packard 6890 con una columna FFAP de 30 m. Las muestras se disolvieron en isopropanol y se añadió 1-pentanol como un estándar interno. Se prepararon curvas estándar para isobutanol, palmitato de isobutilo, estearato de isobutilo, oleato de isobutilo, linoleato de isobutilo, linolenato de isobutilo, araquidato de isobutilo, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico. El contenido de FABE se reporta como la suma de los esteres butílicos y el contenido de COFA como la suma de los ácidos grasos.

Tabla 41: Análisis de la composición de los cortes recolectados Ejemplo 47 Recuperación de butanol con un catalizador de ácido orgánico Se usó un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 1 litro equipado con un agitador magnético, termopar, embudo de adición y cabeza de destilación. El matraz se cargó con 100 g de FABE sintetizados como en el Ejemplo 45, 100 g de COFA, 5 g de ácido p-toluensulfónico y 25 mi de agua. El análisis de isobutanol del recipiente inicial determinó un contenido de 1.1 g de isobutanol (contaminante en FABE) . El recipiente se calentó hasta 125 °C. Cuando la temperatura del recipiente alcanzó los 116 °C la temperatura de cabeza era de 96 °C y se añadió 125 mi de agua durante 2.5 horas. Se recolectaron seis cortes durante la adición de agua y se analizaron por CG como en el Ejemplo 46. Los resultados se proporcionan en la Tabla 42.

Tabla 42: Análisis de la composición de los cortes recolectados El análisis de butanol del recipiente de destilación restante determinó un contenido de 0.9 g de isobutanol libre. La mezcla COFA:FABE inicial analizada fue de 45 % en peso de FABE . El recipiente final analizado contenía 32 % en peso de FABE.

Ejemplo 48 Hidrólisis de FABE con agua a temperatura alta Se cargó un autoclave de 1 litro con FABE sintetizado como en el Ejemplo 45, 300 mi y 300 mi de agua. Se selló y purgó con nitrógeno. La agitación comenzó y, después, se calentó hasta 250 °C durante 45 minutos y las muestras se extrajeron cada hora después de alcanzar la temperatura. Las muestras se analizaron por CG como en el Ejemplo 46. Las muestras de fase aceite mostraron las composiciones como una función de tiempo ilustrada en la Tabla 43.

Tabla 43 : Composición de fase orgánica de las muestras Ejemplo 49 Hidrólisis de FABE con ácido diluido a temperatura alta Se cargó un autoclave de 1 litro con 450 g de una mezcla 75/25 de FABE sintetizado como en el Ejemplo 45 y COFA y 150 g de ácido sulfúrico al 2 %. Se selló y purgó con nitrógeno. La agitación comenzó y, después, se calentó hasta 225 °C durante 45 minutos y las muestras se extrajeron cada hora después de alcanzar la temperatura. Las muestras se analizaron por CG como en el Ejemplo 46. Las muestras de fase aceite mostraron las composiciones como una función de tiempo ilustrada en la Tabla 44.

Tabla 44: Análisis de la composición de los cortes recolectados Ejemplo 50 Hidrólisis de FABE con ácido sulfúrico en disolvente a 100 °C Se preparó una solución de 5 g de FABE sintetizado como en el Ejemplo 45, 5 g de ácido sulfúrico al 25 % y 60 g de éter dimetílico de dietilenglicol. Se añadió diez (10) g de la solución en cada uno de los cinco viales que, después, se sellaron. Todos los viales se calentaron hasta 100 °C y un vial se extrajo del calentador y se analizó cada hora. Las composiciones resultantes se determinaron por CG (tal como se describió en el Ejemplo 46) y se reportan en la Tabla 45.

Tabla 45: Análisis de la composición de los cortes recolectados Ejemplo 51 Hidrólisis de FABE por destilación reactiva Se equipó un matraz de 12 litros con una columna de 5.1 cm x 76.2 cm (2"x30") aislada cubierta en la parte superior con una entrada de suministro y una cabeza de destilación. La columna se empaquetó aleatoriamente con un litro de empaque de destilación Pro-pak® (316 SS 0.41 cm (0.16")) y 500 g de catalizador de ácido sólido Amberlyst® 36 (Dow) . El matraz se cargó con 6 litros de agua y se hirvió. El calor se controló de manera que la velocidad de destilación del agua fuera de aproximadamente 1.8 ml/min. El FABE sintetizado según el método descrito en el Ejemplo 45 se añadió en la parte superior de la columna a una velocidad de 2 g/min. La alimentación continuó por un total de 60 minutos. La destilación continuó por otros 30 minutos. Se recolectó un total de 194 g de destilado que contenía 2.1 g de isobutanol. En base a la cantidad de FABE suministrada, esto representa una conversión del 9 % de FABE en butanol .

Ejemplo 52 Hidrólisis de FABE por vapor de contracorriente El aparato, tal como se describió en el Ejemplo 50, se modificó por la adición de cinta aislante de calor envuelta alrededor de la columna de destilación. La temperatura en la mitad superior de la columna se ajustó hasta 115 °C y la temperatura en la mitad inferior de la columna se ajustó hasta 104 °C. El recipiente se hirvió y el calor del recipiente se ajustó hasta que la velocidad de destilación del agua alcanzó 1.5-2 ml/min. El FABE (346 g) sintetizado según el método descrito en el Ejemplo 45 se añadió por la parte superior de la columna empaquetada durante un periodo de tres horas mientras se realizaba la destilación. Después del periodo de alimentación, la destilación continuó por otros 90 minutos. Se recolectó un total de 486 g de destilado que contenía 30.1 g de isobutanol. Esto representa una conversión de FABE en isobutanol de 39 %.

Ejemplo 53 Hidrólisis catalizada por un ácido orgánico insoluble en agua Se cargó un matraz de fondo redondo 3n de un litro equipado con un baño de aceite, agitador mecánico, entrada de nitrógeno, entrada de agua subsuperficial y una cabeza de destilación con 150 g de FABE, 50 g de agua y 5 g de ácido dodecilbencenosulfónico . Se calentó un baño de aceite hasta 95-100 °C y comenzó un barrido lento con nitrógeno. Se recolectaron cortes de destilado cada media hora por un total de cinco horas. Después de tres horas se suministró agua al recipiente de destilación a una velocidad de 15 ml/h. Los cortes de destilado se analizaron para determinar el butanol por el método de CG descrito en el Ejemplo 46 y los resultados se muestran en la Tabla 46. Se recolectó aproximadamente 44 % del isobutanol contenido en el FABE durante cinco horas.

Tabla 46 Ejemplo 54 Hidrólisis catalizada por un catalizador de ácido sólido Se cargó un matraz de fondo redondo 3n de un litro equipado con un baño de aceite, agitador mecánico, entrada de nitrógeno subsuperficial , entrada de agua subsuperf icial y una cabeza de destilación con 150 g de FABE y 50 g de catalizador de ácido sólido 15 Amberlyst seco. El matraz se calentó hasta 110 °C con el baño de aceite y se añadió agua por medio de una bomba de jeringa a una velocidad de 15 ml/h. Se recolectaron fracciones de destilación cada media hora por un total de cinco horas. Las fracciones se analizaron para determinar el butanol por el método de CG descrito en el Ejemplo 46 y los resultados se muestran en la Tabla 47. Se recolectó aproximadamente 44 % de la cantidad teórica del isobutanol contenido en el FABE durante cinco horas. 5 Tabla 47 Ejemplo 55 Hidrólisis catalizada por catalizador de ácido orgánico soluble en agua Se cargó un matraz de un litro con agitador mecánico, entrada de nitrógeno subsuperficial , entrada de agua subsuperficial y una cabeza de destilación con 200 g de FABE y 10 g de ácido p-toluensulfónico . El matraz se agitó y calentó hasta 110 °C con un baño de aceite y en ese momento se añadió agua a una velocidad de 20 ml/h a través de una bomba de jeringa. Se recolectaron fracciones de destilación cada media hora por un total de tres horas. Las fracciones se analizaron para determinar el butanol por el método de CG descrito en el Ejemplo 46 y los resultados se muestran en la Tabla 48. Se recolectó aproximadamente 30 % de la cantidad teórica del isobutanol contenido en el FABE durante cinco horas .

Tabla 48 Ejemplo 56 Hidrólisis de fases disolventes de la fermentación A. Fase disolvente 1 La fase disolvente de la fermentación que se muestra en el Ejemplo 17 se analizó por el método de CG ilustrado en el Ejemplo 46 y los resultados se indican en la Tabla 49. El análisis determinó, principalmente, la presencia de FABE y ácidos grasos con una pequeña cantidad de material y un tiempo de retención coincidente con FAEE. El análisis de los ácidos y ésteres butílicos únicamente determina una relación de 62 % de FABE y 39 % de ácidos grasos.

Se cargó la fase disolvente (1.25 litros, 1090 g) y 1.25 litros de agua en un autoclave de un galón. El autoclave se selló y calentó hasta 250 °C y se mantuvo a temperatura por cuatro horas. Después, el autoclave se enfrió y se abrió, y se obtuvo una emulsión. La mezcla se filtró a través de un lecho de Celite y las capas se separaron. La capa orgánica se lavó tres veces con un litro de agua. Después, la muestra se calentó hasta 50 °C y se purgó con nitrógeno por seis horas. En el análisis por CG no se detectó i-BuOH y se identificó una relación de 33 % de FABE y 67 % de ácidos grasos. Se obtuvo un aceite color ámbar (993.9 g) . Un análisis detallado de la composición de la fase disolvente original del ejemplo de fermentación 17 y la fase disolvente posterior a la hidrólisis se muestra en la Tabla 50.

B. Fase disolvente 2 La fase disolvente de la fermentación que se muestra en el Ejemplo 18 se analizó por el método de CG ilustrado en el Ejemplo 46 y los resultados se indican en la Tabla 49. El análisis determinó, principalmente, la presencia de FABE y ácidos grasos con una pequeña cantidad de material y un tiempo de retención coincidente con FAEE . El análisis de los ácidos y ésteres butílicos únicamente determina una relación de 45 % de FABE y 55 % de ácidos grasos .

Se cargó el disolvente (1.25 litros, 1100 g) y 1.25 litros de agua en un autoclave de un galón. El autoclave se selló y calentó hasta 250 °C y se mantuvo a temperatura por cuatro horas. Después, el autoclave se enfrió y se abrió, y se obtuvo una emulsión. La mezcla se filtró a través de un lecho de Celite y las capas se separaron. La capa orgánica se lavó tres veces con un litro de agua. Después, la muestra se calentó hasta 50 °C y se purgó con nitrógeno por seis horas. En el análisis por CG no se detectó i-BuOH y se identificó una relación de 28 % de FABE y 72 % de ácidos grasos. Se obtuvo un aceite color ámbar (720.5 g) .

Tabla 49 Tabla 50 Ejemplo 57 Recuperación del producto de alcohol - Hidrólisis con un catalizador de lipasa Se sintetizó FABE a partir de ácido graso de aceite de maíz según el método descrito en el Ejemplo 44. Novozyme 435 (Novo 435, Candida antárctica lipasa B, inmovilizada en una resina de acrílico) se adquirió de Sigma Aldrich (St. Louis, MO) . Candida antárctica lipasa B se adquirió de Novozymes (Franklinton, NC) . El t-BuOH, acetona, etanol, metanol y glicerol se obtuvieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO) . Para el análisis por cromatografía de gases (CG) se usó el cromatógrafo de gases cromatograma CG Hewlett Packard 5890 Series II y pentadecanoato de metilo como un estándar interno .

A. Presión atmosférica, 40 °C En una mezcla de 2 mi de FABE y 5 mi de agua se añadió 40 mg de Novozyme 435 y la mezcla de reacción se colocó en un vial de 20 mi y se incubó a 40 °C en un agitador rotativo (300 rpm) . La mezcla de reacción se analizó por CG durante 24 h de la reacción para generar el siguiente perfil de % de conversión proporcionado en la Tabla 51.

Tabla 51: Perfil de % de conversión para el Ejemplo 57A B. Presión atmosférica, 40 °C( 65 °C y 80 °C, sin disolvente orgánico Junto con la parte A de este ejemplo, estos datos muestran cómo cambia el equilibrio en función de la temperatura .

En una mezcla de 1 mi de FABE y 2 mi de agua se añadió 20 mg de Novozyme 435 y la mezcla de reacción se rotó a 40 °C por 45 h en un vial tapado con septo de 6 mi. La mezcla de reacción se analizó por medio de CG y se determinó un porcentaje de 18.2 % de conversión de FABE en equilibrio.

En una mezcla de 1 g de FABE y 2 mi de agua se añadió 20 mg de Novozyme 435 y la mezcla de reacción se rotó a 65 °C por 42 h en un vial tapado con septo de 6 mi. La mezcla de reacción se analizó por medio de CG y se determinó un porcentaje de 19.8 % de conversión de FABE en equilibrio .

En una mezcla de 1 g de FABE y 2 mi de agua se añadió 20 mg de Novozyme 435 y la mezcla de reacción se rotó a 80 °C por 42 h en un vial tapado con septo de 6 mi . La mezcla de reacción se analizó por medio de CG y se determinó un porcentaje de 21.4 % de conversión de FABE en equilibrio .

C. Ejemplo que muestra el efecto del disolvente orgánico (t-BuOH) en el equilibrio En tres mezclas de reacción que contenían 0.25 mi de FABE, 0.75 mi de t-BuOH y 0.1-0.3 mi de agua se añadió 20 mg de Novozyme 435 y las mezclas en viales tapados con septo de 6 mi se rotaron a 40 °C de la noche a la mañana, momento en el cual ya habían alcanzado el equilibrio. Las mezclas de reacción se analizaron con CG después de 24 h 5 de la reacción para generar las conversiones de 77-82 % de FABE proporcionadas en la Tabla 52. El reemplazo de t-BuOH por 3 -Me - 3 -pentanol en condiciones de reacción similares proporcionó rendimientos de hidrólisis de FABE de 70-80 %. Tabla 52: Perfil de ¾ de conversión para el Ejemplo 57C D. Acetona como disolvente En tres mezclas de reacción que contenían 0.25 mi de FABE, 0.75 mi de acetona y 0.1-0.3 mi de agua se añadió 20 mg de Novozyme 435 y las mezclas en viales tapados con septo de 6 mi se rotaron a 40 °C de la noche a la mañana, momento en el cual ya habían alcanzado el equilibrio. Las mezclas de reacción se analizaron con CG después de 24 h de la reacción para mostrar las conversiones de 71-78 % de FABE proporcionadas en la Tabla 53.

Tabla 53: Perfil de ¾ de conversión para el Ejemplo 57D E. Ejemplo que muestra el efecto de la eliminación del i-BuOH durante la hidrólisis en la conversión de FABE - purga con nitrógeno a presión atmosférica Se cargó un matraz de fondo redondo de 25 mi con 2 mi de FABE, 5 mi de agua y 40 mg de Novozyme 435. La mezcla de reacción se calentó hasta 95 °C y el i-BuOH que se formaba en la reacción se eliminó por burburjeo con nitrógeno a través de la mezcla de reacción. Se tomaron muestras de la mezcla durante la reacción y la fase orgánica se analizó con CG . La conversión de 94 % se obtuvo después de 6 h tal como se muestra en la Tabla 54.

Tabla 54: Perfil de conversión de FABE para el Ejemplo 57E F. Ejemplo que muestra el efecto de la eliminación del i-BuOH durante la hidrólisis en la conversión-destilación al vacío Se cargó un matraz de fondo redondo de 25 mi con 3 mi de FABE, 7.5 mi de agua y 60 mg de Novozyme 435. El matraz estaba acoplado a un aparato de destilación al vacío y la presión se estableció en 12.1 kPa (91 mm Hg) . Después, la mezcla de reacción se calentó hasta 74 °C y el i-BuOH en formación en la reacción se eliminó por destilación. Se tomaron muestras de la mezcla durante la reacción y la fase orgánica se analizó con CG . La conversión de 91 % se obtuvo después de 10 h tal como se muestra en la Tabla 55.

Tabla 55: Perfil de % de conversión para el Ejemplo 57F G. Ejemplo que muestra el efecto de la eliminación del i-BuOH durante la hidrólisis en el ejemplo de conversión-destilación al vacío con variación de la relación inicial de FABE/COFA: 23 % de FABE: 77 % de COFA v/v Se cargó un matraz de fondo redondo de 25 mi con 0.69 mi de FABE, 2.31 mi de COFA, 7.5 mi de agua y 60 mg de Novozyme 435. El matraz estaba acoplado a un aparato de destilación al vacío y la presión se estableció en 12.1 kPa (91 mm Hg) . Después, la mezcla de reacción se calentó hasta 74 °C y el i-BuOH en formación en la reacción se eliminó por destilación. Se tomaron muestras de la mezcla durante la reacción y la fase orgánica se analizó con CG. La conversión de 98 % se obtuvo después de 10 h tal como se muestra en la Tabla 56.

Tabla 56: Perfil de conversión de FABE para el Ejemplo 57G H. Ejemplo que muestra el efecto de la eliminación del i- BuOH durante la hidrólisis en el ejemplo de conversión-destilación al vacío con variación de la relación inicial de FABE/COFA: 70 % de FABE: 30 ¾ de COFA v/v Se cargó un matraz de fondo redondo de 25 mi con 2.1 mi de FABE, 0.9 mi de COFA, 7.5 mi de agua y 60 mg de Novozyme 435. El matraz estaba acoplado a un aparato de destilación al vacío y la presión se estableció en 12.1 kPa (91 mm Hg) . Después, la mezcla de reacción se calentó hasta 74 °C y el i-BuOH en formación en la reacción se eliminó por destilación. Se tomaron muestras de la mezcla durante la reacción y la fase orgánica se analizó con CG . La conversión de 96 % se obtuvo después de 10 h tal como se muestra en la Tabla 57.

Tabla 57: Perfil de conversión de FABE para el Ejemplo 57H I. Ejemplo que muestra la enzima Cal B libre en la hidrólisis de FABE en condiciones de destilación al vacío Se cargó dos matraces de fondo redondo con 3 mi (2.7 g) de FABE y 7.5 mi de H20 cada uno. En una mezcla se añadió 5.9 mg de Candida antárctica lipasa B y en la otra se añadió 0.59 mg de enzima. Los matraces de reacción se conectaron en forma separada al aparato de destilación y se expusieron a una presión de 12.1 kPa (91 mm Hg) . Las mezclas de reacción se calentaron hasta 65-68 °C. Las muestras se tomaron de las mezclas de reacción durante un periodo de diez horas y se analizaron con cromatografía de gases. El porcentaje de conversión final de FABE fue de 96 y 78 %, respectivamente. Los experimentos muestran que la reducción en la cantidad de concentración de enzimas por un factor de diez reduce la velocidad y conversión en 3x y 18 %, respectivamente. Los resultados se muestran en la Tabla 58.

Tabla 58: Perfil de conversión de FABE para el Ejemplo 571 Ejemplo 58 Recuperación de producto de alcohol - Transesterificación Se sintetizó FABE a partir de ácido graso de aceite de maíz según el método descrito en el Ejemplo 44; Novozyme 435 (Candida antárctica lipasa B, inmovilizada en una resina de acrílico) se adquirió de Sigma Aldrich (St. Louis, MO) . Candida antárctica lipasa B se adquirió de Novozymes (Franklinton, NC) . El t-BuOH, acetona, etanol, metanol y glicerol se obtuvieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO) . Para el análisis por CG se usó el cromatógrafo de gases cromatograma CG Hewlett Packard 5890 Series II y pentadecanoato de metilo como un estándar interno. A. Prueba de lipasas - FABE a FAME Se usaron los siguientes reactivos: t-BuOH (Aldrich); MeOH (Aldrich) ; Novozyme 435 (Aldrich) ; PS30 (Burkholderia cepacia, Amano Enzymes, Inc, Elgin, IL) ; Lipolase® 100T (Thermomyces lanuginosa, inmovilizada en sílice, Novozymes, Franklinton, NC) ; Lipolase® 100 L (Thermomyces lanuginosa, Novozymes, Franklinton, NC) ; Lipozyme® TLIM {Thermomyces lanuginosa inmovilizada, Novozymes, Franklinton, NC) ; Lipoclean® 2000T (mezcla de lipasas inmovilizada; Novozymes, Franklinton, NC) ; NZL-103-LYO (Lipasa de Rhizomucor miehi, Novozymes, Franklinton, NC.

En un vial de 6 mi se añadió 500 mg de FABE (1.48 mmol) , 400 µ? de t-BuOH, 60 µ? de MeOH (1.48 mmol), 3 µ? de agua y 2.5 mg de lipasa (ver la Tabla 57). La mezcla resultante se colocó en un incubador/agitador y se dejó a 40 °C de la noche a la mañana. El análisis por CG de la mezcla de reacción determinó una conversión de 9-56 %. Los resultados se muestran en la Tabla 59.

Tabla 59: Concentraciones de equilibrio [mg/ml] y ¾ de conversión de FABE?FAME con lipasas diferentes B. Transformación de FABE a FAME - Optimización de la cantidad de metanol En un vial de 6 mi se añadió 500 mg de FABE (1.48 mmol) , 400 µ? de t-BuOH, 60-240 µ? de MeOH (1.48-5.92 mmol), 3 µ? de agua y 2.5 mg de Novozyme 435. La mezcla resultante se colocó en un incubador/agitador y se dejó a 40 °C de la noche a la mañana. El análisis por CG de la mezcla de reacción determinó una conversión de 53-73 % tal como se muestra en la Tabla 60. Tabla 60: Perfil de % de conversión para el Ejemplo 58B C. Op imización de la cantidad de enzima - FABE a FAME En un vial de 6 mi se añadió 500 mg de FABE (1.48 mmol) , 400 µ? de t-BuOH, 132 µ? de MeOH (3.26 mmol) y 5-25 mg de Novozyme 435. La mezcla resultante se colocó en un incubador/agitador y se dejó a 40 °C de la noche a la mañana. El análisis por CG de la mezcla de reacción determinó una conversión de 76-79 % tal como se muestra en la Tabla 61.

Tabla 61: Perfil de % de conversión para el Ejemplo 58C D. Minimización de la cantidad de disolvente (t-BuOH) FABE a FAME En un vial de 6 mi se añadió 500 mg de FABE (1.48 mmol) , 0-300 µ? de t-BuOH, 132 µ? de MeOH (3.26 mmol) y 10 mg de Novozyme 435. La mezcla resultante se colocó en un incubador/agitador y se dejó a 40 °C de la noche a la mañana. El análisis por CG de la mezcla de reacción determinó una conversión de 30-81 % tal como se muestra en la Tabla 62.

Tabla 62: Perfil de % de conversión para el Ejemplo 58D E. Minimización de la cantidad de disolvente (3-Me-3-pentanol) - FABE a FAME En un vial de 6 mi se añadió 500 mg de FABE (1.48 mmol) , 0-300 µ? de 3 -Me - 3 -pentanol , 132 µ? de MeOH (3.26 mmol) y 10 de Novozyme 435. La mezcla resultante se colocó en un incubador/agitador y se dejó a 40 °C de la noche a la mañana. El análisis por CG de la mezcla de reacción determinó una conversión de 30-78 % tal como se muestra en la Tabla 63.

Tabla 63: Perfil de % de conversión para el Ejemplo 58E F. Conversión de FABE en FAME sin disolvente En una mezcla de FABE (500 mg, 1.48 mmol) y metanol (0.13 µ? , 3.25 mmol) se añadió 40 mg de Novozyme 435 y la mezcla de reacción se agitó a 40 °C de la noche a la mañana. Después, la mezcla se filtró, y en el análisis por CG se determinó una conversión de 76 %.

G. Reciclado de enzimas - FABE en FAME En un vial de 6 mi se añadió 500 mg de FABE (1.48 mmol) , 400 µ? de t-BuOH, 132 µ? de MeOH (3.26 mmol) y 10 mg de Novozyme 435. La mezcla resultante se colocó en un incubador/agitador y se dejó a 40 °C de la noche a la mañana. Después de ese tiempo, la mezcla de reacción se filtró y analizó para determinar la conversión por medio de CG y la torta de filtro que contenía la enzima inmovilizada se usó para otra conversión de FABE en FAME. El proceso se repitió diez veces (Tabla 64) . El experimento muestra que es posible reciclar la enzima hasta diez veces sin perder la conversión en la reacción de la noche a la mañana.

Tabla 64: El perfil del % de conversión para el reciclado de enzimas en las concentraciones del Ejemplo 58G se proporciona en mg/ml H. Conversión de FABE en FAEE En viales de 6 mi tapados con septo se añadió 0.8 mi de FABE (2.08 mmol) y 0.2 mi de EtOH (3.43 mmol) para formar una sola fase. En los viales, no se añadió enzima ni 20 mg de Novozyme 435. Después, los viales se incubaron a 25 °C y 40 °C en el agitador de un incubador (300 rpm) por 17 h después de lo cual la solución se analizó por cromatografía de gas y se obtuvo el contenido y porcentaje de conversión de FABE en FAEE que se muestra en la Tabla 65.

Tabla 65 E emplo 59 Glicerólisis de FABE En un vial de 6 mi tapado con septo se añadió 0.75 mi de t-BuOH, 0.25 mi de FABE, 0.1 mi (0.126 g) de glicerol + 4 µ? de H20, 20 mg cada enzima y se formó una sola fase. Las reacciones se incubaron con varias lipasas a 40 °C en un agitador rotatorio a 300 rpm. Después de 20 h, las muestras se analizaron por cromatografía de gas y se obtuvo el contenido indicado en la Tabla 66. Una comparación del contenido de COFA y FABE indica que los productos son i-BuOH y una mezcla de COFA y acil glicerol (-64 % de acil glicerol/36 % de COFA en base molar) .

Tabla 66: Porcentaje de conversión de FABE en una mezcla de COFA y acil glicerol A. Dependencia del agua y glicerol/FABE En viales de 6 mi tapados con septo se añadió 0.75 mi de t-BuOH, 0.25 mi de FABE, 0.1 o 0.2 g de glicerol + 20 mg de Amano PS-30 o Novozyme 435 de manera que se forme una sola fase. No se añadió agua. Las reacciones se incubaron a 40 °C en un agitador rotatorio a 300 rpm. Después de 20 h, las muestras se analizaron por cromatografía de gas y se obtuvo el contenido indicado en la Tabla 67. Una comparación del contenido de COFA y FABE indica que los productos son i-BuOH y, principalmente, acil glicerol (mayormente, monoglicérido) . Con relación al ejemplo anterior, el porcentaje de producto en la forma de acil glicerol aumenta con la ausencia de agua añadida y con el aumento en glicerol/FABE (-91 % de acil glicerol/9 % de COFA sobre una base molar con 1.6 de glicerol/FABE, mol/mol y -95 % de acil glicerol/5 % de COFA sobre una base molar con 3.2 de glicerol/FABE, mol/mol). La ausencia de agua añadida elimina la actividad enzimática de Amano PS-30. Sin embargo, la enzima Novozyme 435 que contiene agua en la resina acrílica (~3 % p/p) a la cual está inmovilizada continúa activa.

Tabla 67: Porcentaje de conversión de FABE en acil glicérido B. Dependencia de la concentración enzimática En viales de 6 mi tapados con septo se añadió 0.75 mi de t-BuOH, 0.25 mi de FABE, 0.2 g de glicerol (glicerol/FABE 3.2/1, mol/mol) + 2 o 20 mg de Novozyme 435 (Novo 435) . No se añadió agua. Las reacciones se incubaron a 40 °C en un agitador rotatorio a 300 rpm y se hizo el seguimiento de la reacción como una función del tiempo por medio de cromatografía de gases. Los rendimientos se indican en la Tabla 68. Aproximadamente 97 % del FABE reaccionado se convirtió en acil glicerol (mayormente, monoglicérido) sobre una base molar.

Tabla 68 La velocidad de la reacción es lineal con la concentración enzimática con ti2 para 2 y 20 mg de Novozyme 435 de 208 y 20 minutos, respectivamente. Sin embargo, la reacción alcanza prácticamente la misma conversión de FABE después de 24 h.

Estas últimas reacciones se repitieron con 0.75 mi de 3-metil-3 -pentanol en reemplazo de los 0.75 mi de t-BuOH. El alcance de la hidrólisis de FABE después de 24 h fue igual para ambos disolventes. La ventaja del 3-metil-3-pentanol es que con un punto de ebullición de 122 °C, el i-BuOH puede eliminarse por destilación primero en forma pura (b.p. 108 °C) . Después, el 3 -metil-3 -pentanol puede eliminarse por destilación y reciclarse para la reacción de hidrólisis de manera que el material retenido contenga acil glicerol, COFA y glicerol para reciclarse al tanque de fermentación y usarse nuevamente en la generación de FABE . Los alcoholes terciarios actúan como un disolvente solo y tienen la ventaja de no reaccionar con el ácido graso para formar ésteres alquílicos de ácidos grasos en presencia de CALB .

C. Glicerólisis de FABE (FABE en COFA + acil glicerol) en ausencia de cosolvente orgánico - dependencia de la concentración de glicerol Se mezcló un gramo (1 g) de FABE con 2 mi de 50, 70, 90 y 100 % (p/p) de glicerol y se colocó en un vial de 6 mi sellado con septo en presencia de 20 mg de Lipobond (Sprin Technologies, Trieste, Italia) . El vial se hizo rotar por 24 h a 62 °C. Con una concentración de glicerol creciente en la fase acuosa el porcentaje del producto en la forma de acil glicerol aumenta (Tabla 69, mayormente monoglicérido) . Sin embargo, el alcance de la conversión de FABE no exhibió dependencia de la concentración de glicerol.

Tabla 69 Ejemplo 60 Conversión de COFA en FAEE y monoacil glicerol Los siguientes ejemplos muestran que COFA puede esterificarse con EtOH o con glicerol y obtener un alto rendimiento en condiciones moderadas cuando se usa enzima inmovilizada .

Novozyme 435 {Candida antárctica lipasa B, inmovilizada en una resina de acrílico) se adquirió de Sigma Aldrich (St. Louis, MO) . La acetona, t-BuOH, etanol, metanol y glicerol se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO) . Para el análisis por CG se usó el cromatógrafo de gases cromatograma CG Hewlett Packard 5890 Series II y pentadecanoato de metilo como un estándar interno.

A. Conversión de COFA en FAEE + i-BuOH con etanol El ácido graso de aceite de maíz (COFA, 0.25 g) se disolvió en 2.0 mi de EtOH y se formó una sola fase. Se añadió veinte mg de Candida antárctica lipasa B (CALB) inmovilizada en resina acrílica (Novozyme 435) (contiene 1.7 mg de enzima) y la suspensión se incubó por 24 h en un agitador rotatorio (300 rpm) a 40 °C en un vial de vidrio de 6 mi sellado con una tapa de septo. La reacción prácticamente se completó con 98 % del COFA convertido en FAEE (áster etílico de ácido graso) . En el análisis por CG después de 24 h se determinó una conversión de 98 % de COFA en áster etílico de ácido graso tal como se muestra en la Tabla 70.

Tabla 70: Perfil de % de conversión para el Ejemplo 60A B. Conversión de COFA en monoacilglicéridos (MAG) + i-BuOH con glicerol Se disolvió ácido graso de aceite de maíz (COFA, 0.25 g) más 0.325 g de glicerol en 2.0 mi de acetona. Había una fase superior grande en la cual se disolvió la mayor parte de los componentes y una fase pequeña que contenía glicerol residual. Se añadió veinte mg de Candida antárctica lipasa B (CALB) inmovilizada en resina acrílica (Novozyme 435) (contiene 1.7 mg de enzima) y la suspensión se incubó por 24 h en un agitador rotatorio (300 rpm) a 40 °C en un vial de vidrio de 6 mi sellado con una tapa de septo. En la CG de la fase superior se determinó una conversión del 87 % del COFA en acil glicérido (se esperaba que fuera mayormente mono-acilglicérido) . Los resultados se muestran en la Tabla 71. Tabla 71: Perfil de ¾ de conversión para el Ejemplo 60B Ejemplo 61 Conversión de COFA en FA E Los siguientes ejemplos muestran que el COFA puede esterificarse con MeOH, con EtOH y con glicerol y obtener un alto rendimiento en condiciones moderadas cuando se usa lipasa inmovilizada.

A. Conversión de COFA en FAME sin disolvente En un vial de 6 mi se añadió 500 mg de COFA (1.48 mmol) , 132 µ? de MeOH (3.26 mmol) y 10 mg de Novozyme 435. La mezcla resultante se colocó en un incubador/agitador y se dejó a 40 °C de la noche a la mañana. En el análisis con CG de la mezcla de reacción se identificó una conversión del 95 %.

B. Medición del tiempo de la reacción de COFA en FAME En un vial de 6 mi se añadió 500 mg de COFA (1.48 mmol), 132 µ? de MeOH (3.26 mmol) y 10 mg de Novozyme 435. Las muestras se incubaron a 40 °C en un incubador/agitador y se registraron los puntos de tiempo durante la reacción, y se analizaron con CG. Los resultados se muestran en la Tabla 72. Tabla 72 C. Adición de más MeOH en la reacción de C0FA?FAME En un vial de 6 mi se añadió 500 mg de COFA (1.48 mmol) , 180, 240, 300 o 1320 µ? de MeOH (4.44, 5.92, 7.41 y 14.82 mmol) y 10 mg de Novozyme 435. La mezcla resultante se colocó en un incubador/agitador y se dejó a 40 °C de la noche a la mañana. En el análisis con CG de la mezcla de reacción se identificó una conversión del 96-97 %. Los resultados se muestran en la Tabla 73. Tabla 73 Ejemplo 62 Este ejemplo ilustra la eliminación de sólidos de residuos de destilación y la extracción por medio del desolventizador para recuperar ácidos grasos, ésteres y triglicéridos de los sólidos. Durante la fermentación, los sólidos se separan de los residuos de destilación enteros y se alimentan a un desolventizador, en donde entran en contacto con 997.9 kg/h (1.1 tons/h) de vapor. Los regímenes de flujo para los residuos de destilación enteros, torta húmeda (suministro del extractor) , disolvente, miscela del extractor y sólidos de descarga del extractor son tal como se indica en la Tabla 74. Los valores de la tabla son toneladas cortas/h. Tabla 74 Los sólidos que salen del desolventizador se alimentan a un secador. El vapor que sale del desolvent izador contiene 499.0 kg/h (0.55 tons/h) de hexano y 999.7 kg/h (1.102 tons/h) de agua. Esta corriente se condensa y se alimenta a un decantador. La fase rica en agua que sale del decantador contiene aproximadamente 360 ppm de hexano. Esta corriente se alimenta a una columna de destilación, en donde el hexano se elimina de la corriente rica en agua. La corriente enriquecida con hexano que sale de la parte superior de la columna de destilación se condensa y alimenta al decantador. La corriente rica en orgánicos que sale del decantador se alimenta a una columna de destilación. El vapor (9997.2 kg\h (11.02 tons/h)) se suministra en el fondo de la columna de destilación. La composición de los productos de cabeza y del fondo para esta columna se indican en la Tabla 75. Los valores de la tabla son en tons/h .

Tabla 75 Ejemplo 63 Extracción de sólidos Preparación de isobutanol hídrico En un matraz volumétrico de 100 mi se combinó 65 g de isobutanol de grado reactivo anhidro (suministrado por Aldrich) con 10 g de agua destilada y se agitó hasta que se obtuvo una fase homogénea incolora clara. Se añadió otros 10 g de agua destilada en el matraz volumétrico y se agitó otra vez para producir dos capas líquidas incoloras claras persistentes. Se considera que la capa superior es isobutanol hídrico que contiene, típicamente, 20 % en peso de humedad y la capa inferior es, mayormente agua con, típicamente, 8 % en peso de alcohol disuelto.

Extracción por medio de filtración con tamiz y lavado por desplazamiento Se completó una fermentación con ácido graso reciclado (Ejemplo 19) . Una porción de 185 g representativa de la mezcla heterogénea resultante se eliminó y pasó a través de un plato de tamiz con MALLA 80 soportado y sellado dentro de un embudo con filtro de plástico Nalgene® durante 5 minutos con un vacío ligero (-5.0 kPa (-20 en H20) ) en la parte inferior. El filtrado se dividió en 90.5 g de una fase aceite marrón rojizo y 50.9 g de una fase acuosa turbia que contenía finos dispersos, pero no contenía particulados de asentamiento. Una torta húmeda quedó en el plato de análisis.

Se extrajo una muestra de 1.5 g de esta torta húmeda no lavada y se secó al aire. Se extrajo isobutanol hídrico (23 g) de la capa superior dentro del matraz volumétrico y se pasó a través de la torta húmeda durante 5 minutos mientras se mantenía un vacío moderado en la parte inferior del plato del tamiz hasta que no se recolectaron más gotitas líquidas. La masa de filtrado total de 18 g consistía de una pequeña cantidad de una capa acuosa turbia de fondo inmiscible y una capa de isobutanol hídrico amarillo claro. La torta húmeda se extrajo del plato de análisis y se recuperó una masa total de 38.4 g. Se eliminó una muestra de 1.5 g de esta torta húmeda lavada y se secó al aire. La muestra seca de sólidos no lavados se analizó y se determinó que contenía 53.35 % en peso de grasa total sobre una base de triglicéridos y la muestra seca de sólidos lavados seca se analizó y se determinó que contenía 15.9 % en peso de grasa total sobre una base de triglicéridos.

Extracción con centrifugación y lavado de resuspensión Se completó una fermentación con ácido graso reciclado (Ejemplo 19) . Se eliminó una porción de 225 g representativa de la mezcla heterogénea resultante y se centrifugó con una máquina Beckman Coulter Allegra 64R a 10,000 rpm por 10 minutos. Se eliminó por decantación una fase aceite de color marrón rojizo claro de 67.2 g. El material restante se centrifugó otra vez y se eliminó por decantación 95.1 g de un centrado acuoso turbio. Se extrajo una muestra de 1.5 g de los sólidos húmedos y se secó al aire y se recuperaron 56.5 g y se transfirieron a un vaso de 400 mi. Se extrajo isobutanol hídrico (20 g) de la capa superior dentro del matraz volumétrico y se añadió al vaso para reducir a pulpa los sólidos húmedos y se agitó por 5 minutos. Se añadió otros 32 g de isobutanol hídrico junto con 32 g del centrado y los sólidos se agitaron en suspensión acuosa debajo de una capa orgánica inactiva por 5 minutos. Después, la mezcla se centrifugó a 10,000 rpm por 10 minutos para eliminar por decantación una capa de isobutanol hídrico amarillo claro y se centrifugó otra vez para aislar y secar una muestra de 1.5 g de sólidos húmedos lavados. La muestra seca de sólidos húmedos no lavados se analizó y se determinó que contenía 21.6 % en peso de grasa total sobre una base de triglicéridos y la muestra seca de sólidos húmedos lavados se analizó y se determinó que contenía 4.04 % en peso de grasa total sobre una base de triglicéridos.

Ejemplo 64 Extracción del aceite de maíz por medio de la extracción de sólidos no disueltos Se preparó aproximadamente 1000 g de templa de maíz licuada en un reactor de resina de 1 1 con camisa de vidrio.

El reactor se configuró con agitación mecánica, control de temperatura y control del pH. Se usó el siguiente protocolo: se mezcló el maíz triturado con agua corriente (26 % en peso de maíz sobre una base seca) , se calentó la suspensión hasta 55 °C mientras se agitaba, se ajustó el pH hasta 5.8 con NaOH o H2S04, se añadió alfa-amilasa (0.02 % en peso sobre una base de maíz seco) , se continuó el calentamiento hasta 85 °C, se ajustó el pH hasta 5.8, se mantuvo a 85 °C por 2 h mientras se mantenía el pH en 5.8 y se enfrió hasta 25 °C. Se usó maíz amarillo de grano entero de Pioneer (3335) . Se molió en un molino triturador con un tamiz de 1 mm. Según las mediciones, el contenido de humedad del maíz triturado fue de aproximadamente 11.7 % en peso y el contenido de almidón del maíz triturado fue de aproximadamente 71.4 % en peso sobre una base de maíz seco. Se usó la enzima alfa-amilasa Liquozyme® SC DS de Novozymes (Franklinton, NC) . Los ingredientes se usaron en las siguientes cantidades totales: 294.5 g de maíz triturado (11.7 % de humedad), 705.5 g de agua corriente y 0.059 g de Liquozyme® SC DS . Se añadió H20 (4.3 g) para diluir la enzima y un total de 2.3 g de solución de NaOH al 20 % para controlar el pH. Se recuperó aproximadamente 952 g de templa. Debe mencionarse que se produjeron pérdidas debido a la adhesión de templa en las paredes del reactor y botellas de CF.

La templa de maíz licuada se centrifugó a 5000 rpm (7260 g's) por 30 minutos a 40 °C para extraer los sólidos no disueltos de la solución acuosa de oligosacáridos . La extracción de los sólidos por centrifugación produjo, además, la extracción del aceite de maíz libre como una capa líquida orgánica separada en la parte superior de la fase acuosa. Se recuperó aproximadamente 1.5 g de aceite de maíz de la capa orgánica que flotaba en la parte superior de la fase acuosa. Se determinó por medio de extracción con hexanos que el maíz triturado usado para producir la templa licuada contenía aproximadamente 3.5 % en peso de aceite de maíz sobre una base de maíz seco. Esto corresponde a aproximadamente 9 g de aceite de maíz alimentado al proceso de licuación con el maíz triturado .

Se recuperó aproximadamente 1 g de aceite de maíz de la capa orgánica que flotaba en la parte superior de la fase acuosa. Se recuperó aproximadamente 617 g de solución de almidón licuado y quedó aproximadamente 334 g de torta húmeda. La torta húmeda contenía la mayor parte de los sólidos no disueltos que estaban en la templa licuada. La solución de almidón licuada contenía aproximadamente 0.2 % en peso de sólidos no disueltos. La torta húmeda contenía aproximadamente 21 % en peso de sólidos no disueltos. La torta húmeda se lavó con 1000 g de agua corriente para eliminar los oligosacáridos que estaban aun en la torta. Para ello, la torta se mezcló con agua para formar una suspensión. Después, la suspensión se centrifugó en las mismas condiciones usadas para centrifugar la templa original para recuperar los sólidos lavados. La extracción de los sólidos lavados por centrifugación produjo, además, la extracción de cierta cantidad de aceite de maíz libre adicional como una capa líquida orgánica separada en la parte superior de la fase acuosa. Se recuperó el aceite de maíz de la capa orgánica que flotaba en la parte superior de la fase acuosa.

Los sólidos húmedos se lavaron dos veces más, cada una de ellas con 1000 g de agua corriente para eliminar prácticamente todo el almidón licuado. Los sólidos lavados finales se secaron en un horno de vacío de la noche a la mañana a 80 °C y un vacío de aproximadamente 67.7 kPa (20 pulgadas de Hg) . La cantidad de aceite de maíz que quedaba en los sólidos secos, supuestamente, aun en el germen, se determinó por medio de extracción con hexanos . Se determinó por medición que una muestra de 3.60 g de sólidos relativamente secos (aproximadamente 2 % en peso de humedad) contenía 0.22 g de aceite de maíz. Este resultado corresponde a 0.0624 g de aceite de maíz/g de sólidos secos. Esto corresponde a los sólidos lavados, es decir, que no hay oligosacáridos residuales en los sólidos húmedos. Después de centrifugar la templa de maíz licuada para separar la capa de aceite de maíz libre y la solución acuosa de oligosacáridos de la torta húmeda se determinó que quedaban aproximadamente 334 g de torta húmeda que contenía aproximadamente 21 % en peso de sólidos no disueltos. Esto corresponde a la torta 38 húmeda que comprende aproximadamente 70.1 g de sólidos no disueltos. En 0.0624 g de aceite de maíz/g de sólidos secos, los sólidos en la torta húmeda deberían contener aproximadamente 4.4 g de aceite de maíz.

Ejemplo 65 Análisis de lípidos Se realizó el análisis de lípidos por medio de la conversión de las diversas clases de compuestos que contienen ácidos grasos a ésteres metílicos de ácidos grasos ("FAME", por sus siglas en inglés) por medio de transesterificación . Los glicéridos y fosfolípidos se transesterificaron con metóxido de sodio en metanol . Los glicéridos, fosfolípidos y ácidos grasos libres se transesterificaron con cloruro de acetilo en metanol. Los FAME resultantes se analizaron por medio de cromatografía de gases con un CG Agilent 7890 equipado con una columna de 30-m X 0.25 mm (i.d.) OMEGAWAX™ (Supelco, SigmaAldrich, St . Louis, MO) después de la dilución en tolueno/hexano (2:3). La temperatura del horno aumentó de 160 °C a 200 °C a 5 °C/min, después, de 200 °C a 250 °C (retención por 10 min) a 10 °C/min. Se identificaron los picos de FAME registrados por medio de análisis de CG por sus tiempos de retención cuando se compararon con los de ésteres metílicos (ME, por sus siglas en inglés) conocidos, y se cuantificaron mediante la comparación de las áreas pico de FAME con las del estándar interno (triglicérido C15:0 tomado a través del procedimiento de transesterificación con la muestra) de cantidad conocida. Por lo tanto, la cantidad aproximada (mg) de cualquier FAME de ácido graso ( "mg de FAME") se calcula de conformidad con la fórmula: (área del pico de FAME para el ácido graso/área especificado del pico de FAME 15:0) * (mg del estándar interno C15:0 FAME). Después, el resultado de FAME puede corregirse a mg del ácido graso correspondiente por medio de la división por el factor de conversión de peso molecular apropiado de 1.052. Todos los estándares internos y de referencia se obtienen de Nu-Chek Prep, Inc.

Los resultados de ácidos grasos obtenidos de muestras transesterificadas con el uso de metóxido de sodio en metanol se convierten a los niveles de triglicéridos correspondientes por medio de la multiplicación del factor de conversión del peso molecular de 1.045. Generalmente, aproximadamente 80 a 90 % de los glicéridos en los estudios de muestras para este ejemplo consisten en triglicéridos y el resto consiste en diglicéridos . El contenido de monoglicéridos y fosfolípidos es, generalmente, insignificante. Los resultados de los ácidos grasos totales obtenidos para una muestra transesterificada con cloruro de acetilo en metanol se corrigen para el contenido de glicéridos por medio de la resta de los ácidos grasos determinados para la misma muestra con el procedimiento en el que se usa metóxido de sodio. El resultado es el contenido de ácidos grasos libres de la muestra .

La distribución del contenido de glicéridos (monoglicéridos, diglicéridos , triglicéridos y fosfolípidos) se determina por medio de cromatografía en capa delgada. Se mancha una solución del aceite disuelta en 6:1 de cloroformo/metanol cerca del fondo de una placa de vidrio recubierta previamente con gel de sílice. Después, la mancha se analiza por cromatografía de la placa con un sistema disolvente 70:30:1 de hexano/éter dietílico/ácido acético. Después, se mancha la placa con vapor de yodo para detectar manchas separadas que corresponden a monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos y fosfolípidos . Las manchas se extraen de la placa por raspado, se transesterifican con el procedimiento de cloruro de acetilo en metanol y se analizan por medio de cromatografía de gases. Las relaciones entre las áreas pico totales para cada mancha y las áreas pico totales para todas las manchas constituyen la distribución de diversos glicéridos.

Ejemplo 66 Este ejemplo ilustra la recuperación de subproductos a partir de la templa. El aceite de maíz se separó de la templa en las condiciones descritas en el Ejemplo 64, con la diferencia de que se usó una centrífuga tricanter (Flottweg Z23-4, diámetro de tazón 230 mm, relación entre longitud y diámetro 4:1) con estas condiciones: Velocidad del tazón: 5000 rpm Velocidad diferencial: 10 rpm Velocidad de alimentación: 3 gpm Disco separador de fases: 138 mm Configuración del impulsor 144 mm.

El aceite de maíz separado contenía 81 % de triglicéridos , 6 % de ácidos grasos libres, 4 % de diglicéridos y 5 ¾ en total de fosfolípidos y monoglicéridos según se determinó por medio de los métodos descritos en el Ejemplo 65 y por cromatografía en capa delgada.

Los sólidos separados de la templa en las condiciones descritas anteriormente tenían un contenido de humedad de 58 % según se determinó por la pérdida de peso al secarse y un contenido de 1.2 % de triglicéridos y 0.27 % de ácidos grasos libres según se determinó por medio del método descrito en el Ejemplo 65.

La composición de los sólidos separados de los residuos de destilación enteros, el aceite extraído entre las etapas del evaporador, el extractante del subproducto y los solubles condensados de destilería (CDS, por sus siglas en inglés) en la Tabla 78 se calcularon en base al supuesto de que la composición de los residuos de destilación enteros era la indicada en la Tabla 76 y los supuestos contenidos en la Tabla 77 (separación en la centrífuga "tricanter" ) . Los valores de la Tabla 75 se obtuvieron de un modelo Aspen Plus® (Aspen Technology, Inc., Burlington, MA) . Este modelo supone que el aceite de maíz no se extrae de la templa. Se calculó que el contenido de proteína sobre una base seca de células, sólidos disueltos y sólidos suspendidos es de aproximadamente 50 %, 22 % y 35.5 %, respectivamente. Se calcula que el extractante del subproducto está compuesto por 70.7 % de ácido graso y 29.3 % de éster isobutílico de ácido graso sobre una base seca.

Tabla 76 Tabla 77 Tabla 78 Si bien anteriormente se han descrito diversas modalidades de la presente invención, se debería comprender que se han presentado solamente como ejemplo, sin ser limitantes. Resultará evidente para las personas con experiencia en la técnica pertinente que pueden hacerse varios cambios en la forma y detalles de esta sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por lo tanto, la amplitud y el alcance de la presente invención no debería estar limitado por ninguna de las modalidades ilustrativas descritas anteriormente, sino que debería definirse solamente de conformidad con las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para producir ésteres butílieos, caracterizado porque comprende: poner en contacto el butanol producido en un proceso de fermentación con al menos un ácido carboxílico y al menos un catalizador capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar ésteres butílicos del ácido carboxílico; en donde el ácido carboxílico en el proceso de fermentación está presente en una concentración suficiente para producir una mezcla de dos fases.

2. Un método para producir butanol y ésteres butílicos de una materia prima, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una materia prima; (b) licuar la materia prima para crear una biomasa licuada que comprende oligosacáridos; (c) separar la suspensión de materia prima para producir un producto que comprende una corriente acuosa que comprende oligosacáridos, una corriente de aceite y sólidos; (d) añadir la corriente acuosa en un recipiente de fermentación que contiene un caldo de fermentación; (e) sacarificar los oligosacáridos de la corriente acuosa ,· (f) fermentar los productos de la sacarificación de los oligosacáridos presentes en la corriente acuosa para producir butanol y, al mismo tiempo, poner en contacto el butanol con al menos un ácido carboxílico y al menos un catalizador capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar ésteres butílicos del ácido carboxílico, en donde el ácido carboxílico está presente en una concentración suficiente para producir una mezcla de dos fases; y, opcionalmente , las etapas (e) y (f) se producen simultáneamente .

3. Un método para producir butanol y ésteres butílicos de una materia prima, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una materia prima; (b) licuar la materia prima para crear una biomasa licuada que comprende oligosacáridos; (c) separar la suspensión de materia prima para producir una corriente que comprende oligosacáridos y aceite, y sólidos; (d) añadir la corriente en un recipiente de fermentación que contiene un caldo de fermentación; (e) sacarificar los oligosacáridos de la corriente; (f) fermentar los productos de la sacarificación de los oligosacáridos presentes en la corriente para producir butanol y, al mismo tiempo, poner en contacto el butanol con al menos un ácido carboxílico y al menos un catalizador capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar ásteres butílicos del ácido carboxílico, en donde el ácido carboxílico está presente en una concentración suficiente para producir una mezcla de dos fases; y, opcionalmente , las etapas (e) y (f) se producen simultáneamente .

4. Un método para producir butanol de una materia prima, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una materia prima; (b) licuar la materia prima para crear una suspensión de materia prima; (c) separar la suspensión de materia prima para producir un producto que comprende una corriente acuosa, una corriente de aceite y sólidos; (d) añadir la corriente acuosa en un recipiente de fermentación que contiene un caldo de fermentación; (e) sacarificar la corriente acuosa ; (f) fermentar la corriente acuosa sacarificada para producir butanol y, al mismo tiempo, poner en contacto el butanol con al menos un ácido carboxílico y al menos un catalizador capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar ésteres butílicos del ácido carboxílico, en donde el ácido carboxílico está presente en una concentración suficiente para producir una mezcla de dos fases ; (g) separar la fase orgánica que contiene éster butílico de la fase acuosa; y (h) recuperar butanol de los ésteres butílicos; y, opcionalraente , las etapas (e) y (f) se producen simultáneamente .

5. Un método para producir butanol y ésteres butílicos de una materia prima, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una materia prima; (b) licuar la materia prima para crear una biomasa licuada que comprende oligosacáridos; (c) separar la suspensión de materia prima para producir una corriente acuosa que comprende oligosacáridos y aceite, y sólidos; (d) añadir la corriente acuosa en un recipiente de fermentación que contiene un caldo de fermentación; (e) sacarificar los oligosacáridos de la corriente acuosa; (f) fermentar los productos de la sacarificación de los oligosacáridos presentes en la corriente acuosa para producir butanol y, al mismo tiempo, poner en contacto el butanol con al menos un ácido carboxílico y al menos un catalizador capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar ésteres butílicos del ácido carboxílico, en donde el ácido carboxílico está presente en una concentración suficiente para producir una mezcla de dos fases; (g) separar la fase orgánica que contiene éster butílico de la fase acuosa; y (h) recuperar butanol de los ásteres butílicos; y, opcionalmente, las etapas (e) y (f) se producen simultáneamente .

6. Un método para producir butanol, caracterizado porque comprende : (a) poner en contacto el butanol producido en un proceso de fermentación con al menos un ácido carboxílico y al menos un catalizador capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar ésteres butílicos del ácido carboxílico; en donde el ácido carboxílico en el proceso de fermentación está presente en una concentración suficiente para producir una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene éster butílico; (b) separar la fase orgánica que contiene éster butílico de la fase acuosa; y (c) recuperar butanol de los ésteres butílicos.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque comprende: convertir al menos una porción del aceite en ácido carboxílico .

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el ácido carboxílico comprende ácidos grasos.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el ácido carboxílico comprende aceite de maíz.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el ácido carboxílico comprende de 12 a 22 carbonos.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque los ésteres butílicos del ácido carboxílico son ésteres butílicos de ácidos grasos.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el catalizador es una enzima capaz de esterificar el ácido carboxílico con el butanol para formar ésteres butílicos del ácido carboxílico .

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la enzima es una esterasa, lipasa, fosfolipasa o lisofosfolipasa .

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 6, caracterizado porque comprende, la etapa de proporcionar un aceite y convertir al menos una porción del aceite en ácido carboxílico.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque la recuperación de butanol de los ésteres butílicos comprende hidrolizar los ásteres en ácido carboxílico y butanol.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque los ésteres butílicos se hidrolizan en presencia de un catalizador de hidrólisis.

17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque los ésteres butílicos se hidrolizan en presencia de agua, y en donde ademas el catalizador de hidrólisis comprende un catalizador ácido, un ácido orgánico, un ácido inorgánico, un ácido soluble en agua, un ácido insoluble en agua o una base .

18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el catalizador de hidrólisis comprende una enzima capaz de hidrolizar los ésteres butílicos para formar un ácido carboxílico y butanol.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la enzima es una esterasa, lipasa, fosfolipasa o lisofosfolipasa .

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque las condiciones de la reacción enzimática favorecen la hidrólisis enzimática antes que la esterificación .

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque la recuperación de butanol de los ésteres butílicos comprende transesterificar los ésteres butílicos en butanol y ésteres alquílicos de ácidos grasos o acil glicéridos.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque los ésteres alquílicos de ácidos grasos comprenden ésteres metílicos de ácidos grasos, ésteres etílicos de ácidos grasos o ésteres propílicos de ácidos grasos .

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 99 % de butanol se recupera de los ésteres butílicos y, opcionalmente , se recupera ácido carboxílico de los ésteres butílicos.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque comprende, las etapas de: extraer butanol de un recipiente de fermentación como una corriente de extractante; y añadir la corriente de extractante en dos o más columnas de destilación.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la columna de destilación es una columna de destilación superatmosferica con un intercambiador calentado por vapor.

26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque comprende, las etapas de recuperar agua y disolvente de las columnas de destilación; y reciclar el agua y el disolvente.

27. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque comprende, las etapas de recuperar calor del proceso de destilación; y reciclar el calor para evaporar agua .

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque la suspensión de materia prima se separa por medio de centrifugación en decantador de tazón, centrifugación en tricanter, centrifugación en pila de discos, centrifugación por filtración, centrifugación en decantador, filtración, filtración al vacío, filtro de banda, filtración por presión, filtración con tamiz, separación por tamiz, rejilla, rejilla porosa, flotación, hidrociclón, prensa de filtro, prensa de tornillo, sedimentador por gravedad, separador de vórtice o una combinación de estos.

29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque los sólidos se procesan para formar un producto de alimento para animales.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el producto de alimento para animales comprende una o más proteínas crudas, grasa cruda, triglicéridos , ácido graso, éster isobutílico del ácido graso, lisina, fibra detergente neutra (NDF) y fibra detergente ácida (ADF) .

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el producto de alimento para animales comprende, además, una o más vitaminas, minerales, saborizantes o colorantes.

32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el producto de alimento para animales comprende 20-35 % en peso de proteína cruda, 1-20 % en peso de grasa cruda, 0-5 % en peso de triglicéridos, 4-10 % en peso de ácidos grasos y 2-6 % en peso de ésteres isobutílicos de ácidos grasos.

33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque la materia prima en el proceso de fermentación comprende uno o más azúcares fermentables derivados de granos de maíz, mazorcas del maíz, residuos de cultivos tales como cáscaras de maíz, rastrojos del maíz, hierbas, trigo, centeno, paja del trigo, cebada, paja de la cebada, heno, paja de arroz, pasto panizo, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, caña de azúcar, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, material celulósico, material lignocelulósico y mezclas de estos .

34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque comprende, la etapa de lavar los sólidos con un disolvente.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque, el disolvente se selecciona de hexano, isobutanol, isohexano, etanol, destilados de petróleo tales como éter de petróleo o mezclas de estos.

36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque, la etapa de separar los sólidos de la suspensión de materia prima aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de un coeficiente de transferencia de masa líquido-líquido del butanol del caldo de fermentación al extractante; aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la eficacia de la extracción del butanol con un extractante; aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la velocidad de separación de fases entre el caldo de fermentación y un extractante aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante el aumento de la recuperación y reciclado de un extractante; o aumenta la eficacia de la producción de butanol mediante la reducción del régimen de flujo de un extractante.

37. Una composición caracterizada porque comprende: (a) un sustrato de carbono fermentable; (b) un catalizador capaz de esterificar ácidos grasos con butanol y, opcionalmente , capaz de hidrolizar glicéridos en ácidos grasos ; (c) butanol; (d) ácidos grasos; y (e) ésteres butílicos de ácidos grasos.

38. La composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque además el butanol se produce por medio de un organismo recom inante .

39. La composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque además los ésteres butílicos de ácidos grasos se forman in situ a partir de la esterificación de los ácidos grasos con el butanol.

40. La composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque además el catalizador es una o más enzimas lipasa.

41. La composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque comprende además, uno o más de: aceite, glicerol, glicéridos, sólidos no disueltos derivados de biomasa o una enzima de sacarificación capaz de convertir oligosacáridos en azúcar fermentable.

42. La composición de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque además, el aceite, los ácidos grasos y/o el sustrato de carbono fermentable se derivan de la misma fuente de biomasa o de fuentes de biomasa diferentes.

43. La composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque además, el butanol es un isómero de butanol seleccionado de 1-butanol, 2 -butanol e isobutanol y/o los ácidos grasos son ácidos grasos de aceite de maíz.

44. La composición de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque además, la composición contiene un porcentaje menor que aproximadamente 25 % en peso de los sólidos no disueltos.