JP2011522543A - 二相抽出発酵を用いてブタノールを生産するための方法 - Google Patents

Abstract

組換え微生物宿主を利用する発酵により、ブタノール生成の有効力価、有効速度、および有効収率の増加をもたらす、毒性の課題を克服する、少なくとも１つの発酵性炭素源からブタノールを作製する方法であり、ブタノールは、発酵中に特定の有機抽出剤に抽出される。

Description

本願は、２００８年６月４日に出願された米国仮特許出願第６１／０５８５６７号明細書の便益性を主張する。

本発明は、バイオ燃料の分野に関する。より詳細には、本発明は、微生物発酵を通じてブタノールを生成するための方法に関し、ここでブタノール生成物は、発酵中での水不混和性有機抽出剤への抽出によって取り出される。

ブタノールは、種々の用途、例えば燃料添加剤として、プラスチック産業における化学原料として、さらに食品および香料産業における食品等級の抽出剤としての用途を有する重要な産業化学物質である。毎年、１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段によって生産されており、この化学物質に対する需要は高まる可能性が高い。

いくつかの化学合成方法は既知であるが、ブタノールを生成するこれらの方法は、石油化学に由来する出発原料を使用し、一般に高価であり、環境に優しいとはいえない。発酵によってブタノールを生成するいくつかの方法もまた既知であり、例えばアセトン、１−ブタノールおよびエタノールの混合物を生産する発酵プロセスであるＡＢＥプロセスが挙げられる。クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）によるアセトン−ブタノール−エタノール（ＡＢＥ）発酵は、最古の既知の工業発酵の１つであり、これらの溶媒の生成に関与する経路および遺伝子も同様である。ＡＢＥプロセスによる１−ブタノールの生成は、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に対する１−ブタノールの毒性効果によって制限される。細菌に対して毒性を示さない特定の有機抽出剤を使用する原位置抽出発酵法は、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）を使用する発酵により、１−ブタノールの生成を促進することが報告されている（非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３）。

上記の天然クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に対し、１−ブタノール、２−ブタノール、およびイソブタノール生合成経路を発現する組換え微生物生成宿主についても記載がなされている。これらの組換え宿主は、アセトンおよびエタノールなどの副生成物を生成しないことから、ＡＢＥプロセスと比較して高収率でブタノールを生成する可能性を有する。しかし、これらの組換え宿主に伴う課題は、ブタノールの生物学的生成が、発酵において使用される宿主微生物に対するブタノール毒性閾値によって制限されるように思われることである。抽出発酵法は、組換え微生物株を使用して、ブタノールの生成に適用されていない。

Ｒｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３１：１３５−１４３頁、１９８８年 Ｒｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２：１−１２頁、１９８７年 Ｅｖａｎｓら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：１６６２−１６６７頁、１９８８年

本発明は、上記の需要を満足させ、ブタノールを少なくとも１つの発酵性炭素源から作製する方法を提供し、それは毒性の課題を克服し、組換え微生物宿主を使用する発酵により、ブタノール生成の有効力価、有効速度、および有効収率における増大をもたらし、ここでブタノールは、発酵中、特定の有機抽出剤に抽出される。

本発明は、発酵培地からブタノールを回収するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの発酵性炭素源からブタノールを生成する、ブタノール、水、および遺伝子組換え微生物を含む発酵培地を提供するステップと、
ｂ）発酵培地を、ｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの第１の水不混和性有機抽出剤、ならびに場合によって（ｉｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される第２の水不混和性有機抽出剤と接触させ、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成するステップと、
ｃ）ブタノール含有有機相を水相から分離するステップと、
ｄ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収し、回収ブタノールを生成するステップと、
を含む、方法を提供する。

本発明は、ブタノールを生成するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの発酵性炭素源からブタノールを生成する遺伝子組換え微生物を提供するステップと、
ｂ）微生物を、水相と、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される水不混和性有機抽出剤とを含む二相発酵培地中で成長させるステップであって、ここで前記二相発酵培地は、ブタノールの有機抽出剤への抽出によってブタノール含有有機相を形成することを可能にするのに十分な時間、前記水不混和性有機抽出剤の約３容量％〜約６０容量％を含むステップと、
ｃ）ブタノール含有有機相を水相から分離するステップと、
ｄ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収し、回収ブタノールを生成するステップと、
を含む、方法を提供する。

本発明の実施形態は、ブタノールを生成するための方法であって、：
ａ）少なくとも１つの発酵性炭素源からブタノールを生成する遺伝子組換え微生物を提供するステップと、
ｂ）微生物を発酵培地中で成長させるステップであって、ここで微生物は、前記ブタノールを発酵培地中に生成し、ブタノール含有発酵培地を生成するステップと、
ｃ）ブタノール含有発酵培地を、ｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの第１の水不混和性有機抽出剤、ならびに場合によって（ｉｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される第２の水不混和性有機抽出剤と接触させ、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成するステップと、
ｄ）ブタノール含有有機相を水相から分離するステップと、
ｅ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収するステップと、
を含む、方法を提供する。

本発明の実施形態は、ブタノールを生成するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの発酵性炭素源からブタノールを生成する遺伝子組換え微生物を提供するステップと、
ｂ）微生物を、好気的条件下で、予め選択された成長レベルに達するのに十分な期間、発酵培地中で成長させるステップと、
ｃ）微好気的または嫌気的条件に変更し、発酵培地中でのブタノール生成を刺激し、ブタノール含有発酵培地を形成するステップと、
ｄ）ブタノール含有発酵培地を、ｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの第１の水不混和性有機抽出剤、ならびに場合によって（ｉｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される第２の水不混和性有機抽出剤と接触させ、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成するステップと、
ｅ）ブタノール含有有機相を水相から分離するステップと、
ｆ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収するステップと、
を含む、方法を提供する。

本発明の別の実施形態は、ブタノールを生成するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生成する、ブタノール、水、および遺伝子組換え微生物を含む発酵培地を提供するステップと、
ｂ）発酵培地を、並流または向流抽出剤流を介して、ｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの第１の水不混和性有機抽出剤、ならびに場合によって（ｉｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される第２の水不混和性有機抽出剤と接触させ、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成するステップと、
ｃ）ブタノール含有有機相を水相から分離するステップと、
ｄ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収し、回収ブタノールを生成するステップと、
を含む、方法を提供する。

本抽出発酵法は、すべてのブタノール異性体を含むブタノールを提供し、それは、ガソリンの場合と同様のエネルギー含量を有することで知られており、任意の化石燃料と混和可能である。ブタノールは、標準内燃機関内で燃焼される場合、ＣＯ_２のみを生成し、ＳＯ_ＸまたはＮＯ_Ｘをほとんど生成しないことから、燃料または燃料添加剤として好ましい。さらにブタノールは、今日まで最も好ましい燃料添加剤であるエタノールより腐食性が低い。

本方法から生成されるブタノールは、バイオ燃料または燃料添加剤としてのその有用性に加え、新興の燃料電池産業における水素流通問題に影響を与える可能性を有する。今日、燃料電池は、水素の輸送および流通に関連した安全性の懸念によって悩まされている。ブタノールは、その水素含量において容易に改質し、燃料電池または車両のいずれかにとって要求される純度で、既存のガソリンスタンドを通じて流通させることが可能である。

最終的に、本方法は、ブタノールを植物由来の炭素源から生成し、ブタノール生成のための標準の石油化学プロセスに関連した環境影響を回避する。

実施例６に記載のように有機抽出剤としてのオレイルアルコールとガスストリッピングを併用する発酵（■）中、および実施例７に記載のようにガスストリッピング単独を用いる発酵（●）中での発酵培地（すなわち水相）中のイソブタノールの濃度を示すグラフである。図１は、イソブタノールを生成する組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を使用して得られるデータを表す。 実施例８に記載のように有機抽出剤としてのオレイルアルコールとガスストリッピングを併用する発酵（■）中、および実施例９に記載のようにガスストリッピング単独を用いる発酵（●）中での発酵培地（すなわち水相）中のイソブタノールの濃度を示すグラフである。図２は、イソブタノールを生成する組換えサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を使用して得られるデータを表す。 発酵培地を発酵容器内の抽出剤と接触させる前に、第１の水不混和性抽出剤および任意の第２の水不混和性抽出剤が容器内で結合される、本発明の方法の一実施形態を略図で例示する。 第１の水不混和性抽出剤および任意の第２の水不混和性抽出剤が、発酵培地が抽出剤と接触される発酵容器に別々に加えられる、本発明の方法の一実施形態を略図で例示する。 第１の水不混和性抽出剤および任意の第２の水不混和性抽出剤が、発酵培地と抽出剤との接触のための異なる発酵容器に別々に加えられる、本発明の方法の一実施形態を略図で例示する。 生成物の抽出が発酵槽の下流で行われ、発酵培地を異なる容器内の抽出剤と接触させる前に、第１の水不混和性抽出剤および任意の第２の水不混和性抽出剤が容器内で結合される、本発明の方法の一実施形態を略図で例示する。 生成物の抽出が発酵槽の下流で行われ、第１の水不混和性抽出剤および任意の第２の水不混和性抽出剤が、発酵培地が抽出剤と接触される容器に別々に加えられる、本発明の方法の一実施形態を略図で例示する。 生成物の抽出が発酵槽の下流で行われ、第１の水不混和性抽出剤および任意の第２の水不混和性抽出剤が、発酵培地と抽出剤との接触のための異なる発酵容器に別々に加えられる、本発明の方法の一実施形態を略図で例示する。 生成物の抽出が、少なくとも１つのバッチ発酵槽内で、発酵もろみ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍａｓｈ）の底もしくはその近辺での抽出剤の並流を介して行われ、発酵槽は抽出剤（発酵槽の上部もしくはその近辺で発酵槽から流出する）で充填される、本発明の方法の一実施形態を略図で例示する。

以下の配列は、米国特許施行規則第１．８２１−１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を有する特許出願の要件−配列の規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８年）、ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則の第２０８節および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データにおいて用いられる記号および形式は、米国特許施行規則第１．８２２条に示される規則に従う。

配列番号１１〜２２は、下記の本明細書中の実施例の一般的方法の項に記載される組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株の作製に使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。

配列番号２３は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株Ｋ−１２ ＭＧ１６５５由来のｐｆｌＢ遺伝子のヌクレオチド配列である。

配列番号２４は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株Ｋ−１２ ＭＧ１６５５由来のｌｄｈＡ遺伝子のヌクレオチド配列である。

配列番号２５は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株Ｋ−１２ ＭＧ１６５５由来のａｄｈＥ遺伝子のヌクレオチド配列である。

配列番号２６は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株Ｋ−１２ ＭＧ１６５５由来のｆｒｄＡ遺伝子のヌクレオチド配列である。

配列番号２７は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株Ｋ−１２ ＭＧ１６５５由来のｆｒｄＢ遺伝子のヌクレオチド配列である。

配列番号２８は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株Ｋ−１２ ＭＧ１６５５由来のｆｒｄＣ遺伝子のヌクレオチド配列である。

配列番号２９は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株Ｋ−１２ ＭＧ１６５５由来のｆｒｄＤ遺伝子のヌクレオチド配列である。

配列番号３０は、ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８のヌクレオチド配列である。

配列番号３１は、ＣＵＰ１プロモーターのヌクレオチド配列である。

配列番号３４は、ＣＹＣ１ターミネーターのヌクレオチド配列である。

配列番号３５は、ＩＬＶ５プロモーターのヌクレオチド配列である。

配列番号３８は、ＩＬＶ５ターミネーターのヌクレオチド配列である。

配列番号３９は、ＦＢＡ１プロモーターのヌクレオチド配列である。

配列番号４２は、ｐＬＨ４６８のヌクレオチド配列である。

配列番号４７は、ｐＮＹ８のヌクレオチド配列である。

配列番号４８は、ＧＰＤ１プロモーターのヌクレオチド配列である。

配列番号４９、５０、５４、５５、６２〜７１、７３〜８３および８５〜８６は、実施例において使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。

配列番号５１は、ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢのヌクレオチド配列である。

配列番号５２は、ＧＰＭ１プロモーターのヌクレオチド配列である。

配列番号５３は、ＡＤＨ１ターミネーターのヌクレオチド配列である。

配列番号５６は、ｐＲＳ４２３ ＦＢＡ ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）のヌクレオチド配列である。

配列番号５７は、ＦＢＡターミネーターのヌクレオチド配列である。

配列番号６０は、ＧＰＭ−ｓａｄＢ−ＡＤＨｔセグメントのヌクレオチド配列である。

配列番号６１は、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒのヌクレオチド配列である。

配列番号７２は、ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔセグメントのヌクレオチド配列である。

配列番号８４は、ＵＲＡ３ｒ２鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列である。

上で使用される、また本発明の説明を通じて、以下の用語は、他に指示されない限り、次のように定義されるものとする:
用語「ブタノール」は、本明細書で使用される場合、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、またはこれらの混合物を示す。

用語「好気的条件」は、本明細書で使用される場合、酸素の存在下での成長条件を意味する。

用語「微好気的条件」は、本明細書で使用される場合、低レベルの酸素（すなわち正常な大気中酸素レベル未満）下での成長条件を意味する。

用語「嫌気的条件」は、本明細書で使用される場合、酸素の不在下での成長条件を意味する。

用語「発酵性炭素源」は、本明細書で使用される場合、本明細書で開示される微生物によって代謝されることが可能な炭素源を示す。好適な発酵性炭素源は、限定はされないが、単糖、例えばグルコースまたはフルクトース；二糖、例えば乳糖またはスクロース；オリゴ糖；多糖、例えばデンプンまたはセルロース；１つの炭素基質；およびそれらの混合物を含む。

用語「抽出剤」は、本明細書で使用される場合、任意のブタノール異性体の抽出に使用される有機溶媒を示す。

用語「二相発酵培地」は、本明細書で使用される場合、発酵培地（すなわち水相）および適量の水不混和性有機抽出剤を含む二相成長培地を示す。

用語「ブタノール生合成経路」は、本明細書で使用される場合、１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノールを生成するための酵素経路を示す。

用語「１−ブタノール生合成経路」は、本明細書で使用される場合、アセチル補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）から１−ブタノールを生成するための酵素経路を示す。

用語「２−ブタノール生合成経路」は、本明細書で使用される場合、ピルビン酸塩から２−ブタノールを生成するための酵素経路を示す。

用語「イソブタノール生合成経路」は、本明細書で使用される場合、ピルビン酸塩からイソブタノールを生成するための酵素経路を示す。

用語「脂肪酸」は、本明細書で使用される場合、飽和または不飽和のいずれかである長い脂肪族鎖（すなわちＣ_１１〜Ｃ_２２）を有するカルボキシル酸を示す。

用語「脂肪族アルコール」は、本明細書で使用される場合、飽和または不飽和のいずれかである長い脂肪族鎖（すなわちＣ_１１〜Ｃ_２２）を有するアルコール酸を示す。

用語「脂肪族アルデヒド」は、本明細書で使用される場合、飽和または不飽和のいずれかである長い脂肪族鎖（すなわちＣ_１１〜Ｃ_２２）を有するアルデヒドを示す。

用語「有効力価」は、本明細書で使用される場合、発酵培地の１リットルあたりの発酵によって生成されるブタノールの総量を示す。ブタノールの総量は、発酵培地中のブタノールの量と、ガスストリッピングが用いられる場合での有機抽出剤および気相から回収されるブタノールの量を含む。

用語「最少培地」は、本明細書で使用される場合、一般にアミノ酸が存在しない場合での、成長のために考えられる最少の栄養素を含有する成長培地を示す。最少培地は、典型的には、発酵性炭素源およびさまざまな塩（微生物および成長条件の間で変わりうる）を含有し、ここでこれらの塩は、一般に、微生物におけるタンパク質および核酸の合成を可能にするマグネシウム、窒素、リン、および硫黄などの必須元素を提供する

用語「限定培地」は、本明細書で使用される場合、既知の量のすべての成分、例えば、限定された炭素源および窒素源、ならびに微生物によって必要とされる微量元素およびビタミンを含有する成長培地を示す。

用語「ＯＤ」は、本明細書で使用される場合、光学密度を示す。

用語「ＯＤ_６００」は、本明細書で使用される場合、６００ｎｍの波長での光学密度を示す。

用語「ｉｄ」は、本明細書で使用される場合、内径を示す。

用語「Ａｑ」は、本明細書で使用される場合、水相を示す。

用語「Ｏｒｇ」は、本明細書で使用される場合、有機相を示す。

用語「ＩＰＴＧ」は、本明細書で使用される場合、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを示す。

用語「ｖｖｍ」は、本明細書で使用される場合、容量／容量／分を示す。

用語「ＡＴＣＣ」は、本明細書で使用される場合、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を示す。

用語「ｖｏｌ」は、容量を意味する。

用語「ｒｐｍ」は、回転／分を示す。

用語「ｓｅｃ」は、秒を示す。

用語「ｍｉｎ」は、分を意味する。

用語「ｈ」は、時間を意味する。

用語「μＬ」は、マイクロリットルを意味する。

用語「ｍＬ」は、ミリリットルを意味する。

用語「Ｌ」は、リットルを意味する。

用語「ｍＬ／分」は、ミリリットル／分を意味する。

用語「ｍｍｏｌ」は、ミリモルを示す。

用語「ｍＭ」は、ミリモル濃度を意味する。

用語「Ｍ」は、モル濃度を意味する。

用語「μｍ」は、マイクロメートルを意味する。

用語「ｇ」は、グラムを意味する。

用語「μｇ」は、マイクログラムを意味する。

用語「ｇ／ｇ」は、グラム／グラムを意味する。

用語「ｇ／Ｌ」は、グラム／リットルを意味する。

用語「μｇ／ｍＬ」は、マイクログラム／リットルを意味する。

用語「ｍｇ／Ｌ」は、ミリグラム／リットルを意味する。

用語「ｍｍｏｌ／分／ｍｇ」は、ミリモル／分／ミリグラムを意味する。

用語「ｇ／Ｌ／ｈ」は、グラム／リットル／時間を意味する。

用語「ＨＰＬＣ」は、高圧液体クロマトグラフィーを意味する。

用語「ＧＣ」は、ガスクロマトグラフィーを意味する。

遺伝子組換え微生物
ブタノール生成のための微生物宿主は、細菌、シアノバクテリア、糸状真菌および酵母から選択してもよい。使用される微生物宿主は、収率が宿主に対する生成物の毒性によって制限されないように、生成されるブタノール生成物に対して耐性を示す必要がある。ブタノール生成のための微生物宿主の選択は、下記に詳述される。

高い力価レベルのブタノールで代謝的に活性な微生物は、当該技術分野で周知でない。ブタノール耐性突然変異体は発溶媒性クロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）から単離されているが、他の潜在的に有用な細菌株のブタノール耐性に関する情報はほとんど利用できない。細菌におけるアルコール耐性の比較に関する試験の大部分は、ブタノールがエタノールより毒性があることを示唆している（ｄｅ Ｃａｖａｌｈｏら、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．６４：２１５−２２頁（２００４年）およびＫａｂｅｌｉｔｚら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２０：２２３−２２７頁（２００３年））。Ｔｏｍａｓら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２００６−２０１８頁（２００４年））は、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）における発酵中での１−ブタノールの収率がブタノール毒性によって制限されうることを報告している。クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に対する１−ブタノールの主な効果は、膜機能の破壊である（Ｈｅｒｍａｎｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０：１２３８−１２４３頁（１９８５年））。

ブタノールの生成のために選択される微生物宿主は、ブタノールに耐性を示し、かつ、下記の導入される生合成経路を用いて炭水化物をブタノールに変換できる必要がある。好適な微生物宿主の選択における基準は、次のもの、すなわち、ブタノールに対する固有の耐性、高率の炭水化物利用、遺伝子操作のための遺伝的ツールの利用可能性、および安定な染色体改変をもたらす能力を含む。

ブタノールに対する耐性を有する好適な宿主株は、株の固有の耐性に基づくスクリーニングによって同定してもよい。ブタノールに対する微生物の固有の耐性は、最少培地中で成長する場合での成長速度の５０％阻害（ＩＣ５０）に関与するブタノールの濃度を測定することによって測定可能である。ＩＣ５０値は、当該技術分野で既知の方法を用いて測定可能である。例えば、目的の微生物は、さまざまな量のブタノールの存在下で成長することができ、成長速度は、６００ナノメートルでの光学密度を測定することによって監視することが可能である。倍加時間は、成長曲線の対数部分から計算し、成長速度の尺度として使用することが可能である。成長の５０％阻害をもたらすブタノールの濃度は、成長のパーセント阻害対ブタノール濃度のグラフから判定することが可能である。好ましくは、宿主株は、約０．５％を超える、ブタノールにおけるＩＣ５０を有する必要がある。より好適なのは、ブタノールにおけるＩＣ５０、すなわち約１．５％超を有する宿主株である。特に好適なのは、ブタノールにおけるＩＣ５０、すなわち約２．５％超を有する宿主株である。

ブタノール生成のための微生物宿主はまた、グルコースおよび／または他の炭水化物を高率で利用する必要がある。大部分の微生物は、炭水化物を利用することができる。しかし、特定の環境微生物は、炭水化物を効率的に利用できず、それ故、好適な宿主とならない。

宿主を遺伝的に修飾する能力は、任意の組換え微生物の生成にとって必須である。使用可能な遺伝子導入技術の様式は、エレクトロポレーション、複合、形質導入または天然形質転換によるものを含む。広範囲宿主の複合プラスミドおよび薬剤耐性マーカーが使用可能である。生物とともに使用されるクローニングベクターは、宿主生物に対して、その宿主内で機能可能な抗生物質耐性マーカーの性質に基づいて適合される。

微生物宿主はまた、さまざまな遺伝子を不活性化することによって炭素流における競合経路を不活性化するため、操作してもよい。これは、不活性化を誘導するためのトランスポゾンまたは染色体組込みベクターのいずれかの可用性を必要とする。さらに、化学的突然変異誘発の影響を受けやすい生成宿主は、化学的突然変異誘発および突然変異体スクリーニングを通じて、固有のブタノール耐性における改善を受けうる。

上記の基準に基づき、ブタノールの生成に適した微生物宿主は、限定はされないが、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバーを含む。好ましい宿主は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含む。

上記の微生物は、当該技術分野で既知の方法を用いて、遺伝子組換えを行い、発酵性炭素源をブタノール、具体的には１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノールに変換してもよい。特に好適な微生物は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）を含み、ここでは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびＳ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が特に好ましい。さらに、微生物は、Ｂｒａｍｕｃｃｉら（同時係属中の共同所有される米国特許出願第１１／７６１４９７号明細書；および国際公開第２００７／１４６３７７号パンフレット）によって記載の方法を用いて単離される上掲の微生物のうちの１つのブタノール耐性株であってもよい。１つのかかる株の例が、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株ＰＮ０５１２（ＡＴＣＣ：ＰＴＡ−７７２７、米国特許出願第１１／７６１４９７号明細書において２００６年７月１２日に行われた生物学的寄託物）である。

これらの微生物は、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎらによる国際公開第２００７／０４１２６９号パンフレット（参照により本明細書中に援用される）に記載のように、１−ブタノール生合成経路を含むように、遺伝子組換えを行い、１−ブタノールを生成してもよい。例えば、微生物は、遺伝子組換えを行い、生成物変換に対して次の酵素によって触媒される基質
ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ、
ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、
ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ、
ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ、
ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド、および
ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノール
を含む１−ブタノール生合成経路を発現してもよい。

微生物はまた、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎらによる米国特許公開第２００７／０２５９４１０号明細書および米国特許公開第２００７／０２９２９２７号明細書、国際公開第２００７／１３０５１８号パンフレットおよび国際公開第２００７／１３０５２１号パンフレット（これらのすべては参照により本明細書中に援用される）に記載のように、遺伝子組換えを行い、２−ブタノール生合成経路を発現し、２−ブタノールを生成してもよい。例えば、一実施形態では、微生物は、遺伝子組換えを行い、生成物変換に対して次の酵素によって触媒される基質
ａ）ピルビン酸塩からα−アセト乳酸、
ｂ）α−アセト乳酸からアセトイン、
ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオール、
ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノン、および
ｅ）２−ブタノンから２−ブタノール
を含む２−ブタノール生合成経路を発現してもよい。

微生物はまた、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎらによる米国特許公開第２００７／００９２９５７号明細書および国際公開第２００７／０５０６７１号パンフレット（双方とも参照により本明細書中に援用される）に記載のように、遺伝子組換えを行い、イソブタノール生合成経路を発現し、イソブタノールを生成してもよい。例えば、微生物は、遺伝子組換えを行い、生成物変換に対して次の酵素によって触媒される基質
ａ）ピルビン酸塩からアセト乳酸塩
ｂ）アセト乳酸塩から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸
ｃ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸
ｄ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド、および
ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノール．
を含むイソブタノール生合成経路を含むことが可能である。

発酵性炭素源をブタノールに変換することが可能にする遺伝子組換えがなされた微生物は、上記のようなイソブタノール生合成経路と、イソブタノール生成を制限する競合経路を除外するための次の遺伝子、すなわち（ピルビン酸・ギ酸リアーゼをコードする）配列番号２３として与えられるｐｆｌＢ、（乳酸デヒドロゲナーゼをコードする）配列番号２４として与えられるｌｄｈＡ、（アルコールデヒドロゲナーゼをコードする）配列番号２５として与えられるａｄｈＥ、および（フマル酸レダクターゼをコードする）ｆｒｄＡＢＣＤオペロンを含む少なくとも１つの遺伝子、具体的には配列番号２６として与えられるｆｒｄＡ、配列番号２７として与えられるｆｒｄＢ、配列番号２８として与えられるｆｒｄＣ、および配列番号２９として与えられるｆｒｄＤ、の欠失を含む組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株でありうる。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株は、（ａ）次の遺伝子、すなわち、（配列番号２として与えられる）アセト乳酸シンターゼをコードするクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の（配列番号１として与えられる）ｂｕｄＢ、（配列番号４として与えられる）アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の（配列番号３として与えられる）ｉｌｖＣ、（配列番号６として与えられる）アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の（配列番号５として与えられる）ｉｌｖＤ、（配列番号８として与えられる）分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼをコードするラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）由来の（配列番号７として与えられる）ｋｉｖＤ、および（配列番号１０として与えられる）ブタノールデヒドロゲナーゼをコードするアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来の（配列番号９として与えられる）ｓａｄＢによってコードされるイソブタノール生合成経路と、（ｂ）次の遺伝子、すなわちｐｆｌＢ（配列番号２３）、ｌｄｈＡ（配列番号２４）、ａｄｈＥ（配列番号２５）、およびｆｒｄＢ（配列番号２７）の欠失を含みうる。イソブタノール生合成経路の遺伝子によってコードされる酵素は、上記のようにピルビン酸塩をイソブタノールに変換するための生成物変換に対して基質を触媒する。詳細には、アセト乳酸シンターゼは、ピルビン酸塩のアセト乳酸塩への変換を触媒し、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼは、アセト乳酸塩の２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換を触媒し、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼは、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸のα−ケトイソ吉草酸への変換を触媒し、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼは、α−ケトイソ吉草酸のイソブチルアルデヒドへの変換を触媒し、かつブタノールデヒドロゲナーゼは、イソブチルアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒する。この組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株は、下記の本明細書中の実施例の一般的方法の項に例示されるように、当該技術分野で既知の方法を用いて作製してもよい。

サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、次の遺伝子、すなわち、アセト乳酸シンターゼ（配列番号３３）をコードする枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｌｓＳコード領域（配列番号３２）、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ；配列番号４１）をコードするＳ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＩＬＶ５（配列番号４０）、および／または例えばＰｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８によってコードされる突然変異体ＫＡＲＩ（配列番号３６；タンパク質配列番号３７）、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ（配列番号５９）をコードするストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）由来のｉｌｖＤ（配列番号５８）、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ（配列番号４４）をコードする枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｋｉｖＤ（配列番号４３）、ならびにブタノールデヒドロゲナーゼ（配列番号１０）をコードするアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のｓａｄＢ（配列番号９）によってコードされるイソブタノール生合成経路を含みうる。イソブタノール生合成経路の遺伝子によってコードされる酵素は、本明細書中に記載のように、ピルビン酸塩をイソブタノールに変換するための生成物変換に対して基質を触媒する。

イソブタノール経路を発現する好ましい酵母株は、共同所有された同時係属中の米国特許出願第６１／０５８９７０号明細書（参照により本明細書中に援用される）に記載のように、サイトゾルにおけるアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）活性を有し、かつ内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子の欠失を有する。サイトゾルのＡＬＳおよび還元型ＰＤＣの発現のこの組み合わせにより、ピルビン酸塩からアセト乳酸塩へのフラックス（次いでイソブタノールを生成するための経路に流れる）が顕著に増大することが見出された。

この組換えサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、下記の本明細書中の実施例の一般的方法の項に例示されるように、当該技術分野で既知の方法を用いて作製してもよい。

有機抽出剤
本明細書中に記載の方法において有用な抽出剤は、水不混和性有機溶媒である。好適な有機抽出剤は、ブタノールの生成または回収のための商業的な二相抽出発酵にとって理想的な溶媒における基準を満たす必要がある。詳細には、抽出剤は、（ｉ）例えば、遺伝子組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのブタノール生成微生物に対して無害であり、（ｉｉ）発酵培地と実質的に不混和性であり、（ｉｉｉ）ブタノールの抽出において高い分配係数を有し、（ｉｖ）栄養素の抽出において低い分配係数を有し、（ｖ）発酵培地とエマルジョンを形成する傾向が低く、かつ（ｖｉ）低コストで無害である必要がある。本明細書で開示される方法での使用に適した有機抽出剤は、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される。本明細書で使用される用語「それらの混合物」は、これらの基員の内部の混合物およびそれらの間の混合物の双方、例えばＣ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルコールの内部の混合物とともに、例えばＣ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルコールとＣ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸の間の混合物を包含する。

いくつかの例では、１２炭素鎖長未満を有する抽出剤は、微生物に対して有害であり、それ故、生合成経路を介するブタノールを生成するプロセスに有害でありうる。１１炭素の抽出剤の場合、微生物に対する効果は、条件に依存しうるが、有害でありうる。Ｃ_１１脂肪族アルコール、Ｃ_１１脂肪酸、Ｃ_１２脂肪酸のエステル、Ｃ_１１アルデヒド、およびそれらの混合物がプロセスに対して有害でありうる場合、例えば微生物が使用される条件下でＣ_１１化合物によって悪影響を受ける場合、かかる使用は回避されるべきである。好適な有機抽出剤は、さらに、オレイルアルコール（ＣＡＳ番号１４３−２８−２）、ベヘニルアルコール（ＣＡＳ番号６６１−１９−８）、セチルアルコール（ＣＡＳ番号３６６５３−８２−４）、ラウリルアルコール（１−ドデカノールとも称される）（ＣＡＳ番号１１２−５３−８）、ミリスチルアルコール（１１２−７２−１）、ステアリルアルコール（ＣＡＳ番号１１２−９２−５）、１−ウンデカノール（ＣＡＳ番号１１２−４２−５）、オレイン酸（ＣＡＳ番号１１２−８０−１）、ラウリン酸（ＣＡＳ番号１４３−０７−７）、ミリスチン酸（ＣＡＳ番号５４４−６３−８）、ステアリン酸（ＣＡＳ番号５７−１１−４）、ミリスチン酸メチル（ＣＡＳ番号１２４−１０−７）、オレイン酸メチル（ＣＡＳ番号１１２−６２−９）、ウンデカナール（ＣＡＳ番号１１２−４４−７）、ラウリンアルデヒド（ＣＡＳ番号１１２−５４−９）、２−メチルウンデカナール（ＣＡＳ番号１１０−４１−８）、およびそれらの混合物からなる群から選択される。これらの有機抽出剤は、さまざまなグレードで、さまざまな供給元、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から市販されており、その多くは、ブタノールを生成または回収するための抽出発酵における使用に適しうる。テクニカルグレードは、所望される成分ならびに高級および低級脂肪族成分を含む化合物の混合物を含有する。例えば、１つの市販のテクニカルグレードオレイルアルコールは、約６５％のオレイルアルコールと、高級および低級脂肪族アルコールの混合物とを含有する。

当業者は、有機抽出剤の混合物を使用することが有利でありうることを理解できる。例えば、溶媒混合物を使用し、生成物の分配係数を増加させることが可能である。さらに、溶媒混合物を使用し、溶媒の物理特性、例えば密度、沸点、および粘度を調節し、最適化することが可能である。

二相抽出発酵を用いてブタノールを生成するための方法
微生物は、ブタノールを生成する、好適な発酵槽内の好適な発酵培地中で培養してもよい。撹拌槽発酵槽、エアリフト発酵槽、気泡（ｂｕｂｂｌｅ）発酵槽、またはこれらの任意の組み合わせを含む任意の好適な発酵槽を使用してもよい。微生物培養物の維持および成長のための材料および方法は、微生物学または発酵科学の当業者に周知である（例えば、Ｂａｉｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、第２版、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，、１９８６年を参照）。好適な発酵培地、ｐＨ、温度、および好気的、微好気的、または嫌気的条件に対する要件に対しては、微生物、発酵、およびプロセスの特定の要件に応じて熟慮しなければならない。使用される発酵培地は重要ではないが、それは、使用される微生物の成長を支持し、所望されるブタノール生成物の生成に必要な生合成経路を促進する必要がある。限定はされないが、酵母抽出物またはペプトンなどの有機窒素源および少なくとも１つの発酵性炭素源を含有する複合培地；最少培地；ならびに限定培地を含む従来の発酵培地を使用してもよい。好適な発酵性炭素源は、限定はされないが、単糖、例えばグルコースまたはフルクトース；二糖、例えば乳糖またはスクロース；オリゴ糖；多糖、例えばデンプンまたはセルロース；１つの炭素基質；およびそれらの混合物を含む。好適な炭素源に加え、発酵培地は、当業者に既知の好適な窒素源、例えばアンモニウム塩、酵母抽出物またはペプトン、ミネラル、塩、共同因子、緩衝液および他の成分を含有してもよい（Ｂａｉｌｅｙら、上記）。抽出発酵に適した条件は、使用される特定の微生物に依存し、通常の実験を用いて、当業者によって容易に測定することが可能である。

二相抽出発酵を用いてブタノールを回収するための方法
ブタノールは、ブタノールを少なくとも１つの炭素源から生合成経路を介して生成するため、ブタノール、水、少なくとも１つの発酵性炭素源、および遺伝子組換え（すなわち遺伝子操作）がなされている微生物を含有する発酵培地から回収することが可能である。かかる遺伝子組換え微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択してもよい。同プロセスにおける第１のステップは、発酵培地を上記の水不混和性有機抽出剤と接触させ、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成することである。「接触させる」は発酵培地を意味し、有機抽出剤は、発酵プロセスの間、常に物理的接触状態にされる。一実施形態では、発酵培地はエタノールをさらに含有し、かつブタノール含有有機相はエタノールを含有してもよい。

有機抽出剤は、発酵の開始時に発酵培地と接触させ、二相発酵培地を形成してもよい。あるいは、有機抽出剤は、微生物が所望される量の成長を達成してから（培養物の光学密度を測定することによって判定可能である）、発酵培地と接触させてもよい。

さらに、有機抽出剤は、発酵培地中のブタノールレベルが予め選択されたレベルに達する時点、例えばブタノール濃度が毒性レベルに達する前に発酵培地と接触させてもよい。ブタノール濃度は、当該技術分野で既知の方法、例えばガスクロマトグラフィーまたは高性能液体クロマトグラフィーを用いて発酵中に監視してもよい。

発酵は、光学密度測定によって判定されるように、培養物における予め選択されたレベルの成長を得るための十分な時間、好気的条件下で行ってもよい。次いで、誘導物質を添加し、修飾微生物におけるブタノール生合成経路の発現を誘発してもよく、下記の本明細書中の実施例６において詳述されるように、発酵条件は微好気的または嫌気的条件に変更され、ブタノール生成が刺激される。抽出剤は、微好気的または嫌気的条件への変更後に加えられる。

発酵培地を有機抽出剤と接触後、ブタノール生成物は有機抽出剤に分配され、微生物を含有する水相中の濃度が減少し、それによって生成微生物の阻害性のブタノール生成物への暴露が制限される。使用されるべき有機抽出剤の容量は、下記のように、発酵培地の容量、発酵槽のサイズ、ブタノール生成物に対する抽出剤の分配係数、および選択される発酵方法を含む要素の数に依存する。有機抽出剤の容量は、発酵槽の作動容量の約３％〜約６０％である。

次のステップは、限定はされないが、サイフォニング、デカンテーション、遠心分離、重力沈降槽の使用、膜支援（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）相分離などを含む当該技術分野で既知の方法を用いて、ブタノール含有有機相を水相から分離することである。ブタノール含有有機相からのブタノールの回収は、限定はされないが、蒸留、樹脂による吸着、分子ふるいによる分離、パーベーパレイションなどを含む当該技術分野で既知の方法を用いて行ってもよい。具体的には、蒸留を用いて、ブタノール含有有機相からブタノールを回収してもよい。

ガスストリッピングを有機抽出剤と併用し、ブタノール生成物を発酵培地から取り出してもよい。大気、窒素、または二酸化炭素などの気体を発酵培地に対して通過させることによってガスストリッピングを行い、それによってブタノール含有気相を形成してもよい。ブタノール生成物は、当該技術分野で既知の方法を用いて、例えばブタノールを濃縮するための冷水トラップ（ｃｈｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ ｔｒａｐ）を用いて、または気相を溶媒で洗い落とす（ｓｃｒｕｂｂｉｎｇ）ことにより、ブタノール含有気相から回収してもよい。

発酵の実行終了後、発酵培地中に残留する任意のブタノールは、新しいまたは再生された有機抽出剤を使用する連続抽出によって回収してもよい。あるいは、ブタノールは、当該技術分野で既知の方法、例えば蒸留、共沸蒸留、液体−液体抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、パーベーパレイションなどを用いて、発酵培地から回収してもよい。

二相抽出発酵法は、撹拌槽発酵装置において連続モードで実施してもよい。このモードでは、発酵培地とブタノール含有有機抽出剤の混合物は、発酵槽から取り出される。２つの相は、上記のように、限定はされないが、サイフォニング、デカンテーション、遠心分離、重力沈降槽の使用、膜支援相分離などを含む当該技術分野で既知の手段によって分離される。分離後、発酵培地は、発酵槽へと再利用するかまたは新しい培地と交換してもよい。次いで、抽出剤は、上記のように、処理し、ブタノール生成物が回収される。次いで、抽出剤は、生成物のさらなる抽出のため、発酵槽に戻して再利用してもよい。あるいは、新しい抽出剤を発酵槽に連続添加し、取り出された抽出剤と交換してもよい。運転のこの連続モードは、いくつかの利点を提供する。生成物は反応器から連続的に取り出されることから、より小容量の有機抽出剤が必要とされ、それによってより大容量の発酵培地の使用が可能になる。この結果、より高い生成収率が得られる。有機抽出剤の容量は、発酵槽の作動容量の約３％〜約５０％、発酵槽の作動容量の３％〜約２０％、または発酵槽の作動容量の３％〜約１０％であってもよい。発酵槽内で、可能な限り最も小容量の抽出剤を使用し、水相の容量、ひいては発酵槽内の細胞の量を最大にすることは有益である。本プロセスは、抽出剤が発酵槽と分離装置の間で連続的に再利用され、かつ発酵培地が発酵槽から連続的に取り出され、新しい培地で補充されるような完全連続モードで運転することが可能である。この完全連続モードでは、ブタノール生成物は重大な毒性濃度に達することが許容されず、発酵が長期間実施できるように新しい栄養素が連続的に提供される。これらのモードの二相抽出発酵の実施に使用可能な本装置は、当該技術分野で周知である。例が、例えば米国特許第４，８６５，９７３号明細書中、Ｋｏｌｌｅｒｕｐらによって記載されている。

バッチ式発酵モードもまた使用してもよい。当該技術分野で周知であるバッチ発酵は、発酵培地の組成物が発酵開始時に設定され、かつプロセスの間、人為的改変を受けない閉鎖系である。このモードでは、大量の有機抽出剤が発酵槽に加えられ、かつ抽出剤はプロセスの間に取り出されない。このモードは上記の連続または完全連続モードより簡素であるが、発酵培地中の阻害性ブタノール生成物の濃度を最小限にするには、より大量の有機抽出剤が必要とされる。結果として、発酵培地の容量はより少なく、かつ生成される生成物の容量は、連続モードを使用して得られるものより少ない。バッチ式モードにおける有機溶媒の容量は、発酵槽の作動容量の２０％〜約６０％、または発酵槽の作動容量の３０％〜約６０％であってもよい。上記の理由から、発酵槽内で、可能な限り最も小容量の抽出剤を使用することは有益である。

フェドバッチ発酵モードもまた使用してもよい。フェドバッチ発酵は、標準バッチ系の変形であり、ここでは栄養素、例えばグルコースが発酵中に徐々に加えられる。栄養素の添加の量および速度は、通常の実験によって判定することが可能である。例えば、発酵培地中の重要栄養素の濃度は、発酵中に監視することが可能である。あるいは、ｐＨ、溶解酸素、および排ガス、例えば二酸化炭素の分圧などのより容易に測定される要素は監視可能である。これらの測定されるパラメータから、栄養素添加の速度が判定可能である。このモードで使用される有機溶媒の量は、上記のバッチ式モードで使用されるものと同じである。

生成物の抽出は、原位置ではなく発酵槽の下流で行ってもよい。この外部モードでは、ブタノール生成物の有機抽出剤への抽出は、発酵槽から取り出される発酵培地上で実施される。使用される有機溶媒の量は、発酵槽の作動容量の約２０％〜約６０％、または発酵槽の作動容量の３０％〜約６０％である。発酵培地は、発酵槽から連続的または定期的に取り出してもよく、また有機抽出剤によるブタノール生成物の抽出は、発酵培地からの細胞の除去にかかわらず行ってもよい。細胞は、限定はされないが、濾過または遠心分離を含む当該技術分野で既知の手段により、発酵培地から除去してもよい。上記の手段による抽出剤からの発酵培地の分離後、発酵培地は、発酵槽へと再利用し、廃棄し、または任意の残留ブタノール生成物を取り出すために処理してもよい。同様に、単離細胞はまた、発酵槽へと再利用してもよい。抽出剤は、ブタノール生成物を回収するために処理した後、抽出プロセスにおける使用のため、再利用してもよい。あるいは、新しい抽出剤を使用してもよい。このモードでは、溶媒は発酵槽内に存在しないことから、溶媒の毒性はほとんど問題にならない。細胞が溶媒との接触前に発酵培地から分離される場合、溶媒毒性の問題はさらに低減される。さらに、この外部モードを用いると、エマルジョンを形成する可能性は低下し、かつ溶媒の蒸発は最低限となり、環境影響は緩和される。

少なくとも１つの発酵性炭素源をブタノールに変換可能な、遺伝子組換えがなされている微生物が二相発酵培地中で成長するような、ブタノールを生成するための方法が提供される。二相発酵培地は、上記のように水相および水不混和性有機抽出剤を含み、ここで二相発酵培地は有機抽出剤の容量の約３％〜約６０％を含む。微生物は、ブタノールを抽出剤に抽出するのに十分な時間、二相発酵培地中で成長し、ブタノール含有有機相を形成することが可能である。発酵培地がエタノールをさらに含有する場合、ブタノール含有有機相はエタノールを含有しうる。次いで、ブタノール含有有機相は、上記のように水相から分離される。その後、ブタノールは、上記のようにブタノール含有有機相から回収される。

イソブタノールは、組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を有機抽出剤としてのオレイルアルコールと併用した抽出発酵によって生成してもよい。本明細書中に記載の方法を使用することは、イソブタノールにおいて有効性が高い力価を提供する。Ａｔｓｕｍｉら（Ｎａｔｕｒｅ ４５１（３）：８６−９０頁、２００８年）は、イソブタノール生合成経路を有するように遺伝子組換えがなされた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）での発酵の利用における、イソブタノールの最大で２２ｇ／Ｌの力価について報告している。本明細書で開示される方法によって生成されるブタノールは、発酵培地の２２ｇ／Ｌを超える有効力価を有する。あるいは、開示される方法によって生成されるブタノールは、発酵培地の少なくとも２５ｇ／Ｌの有効力価を有する。あるいは、本明細書中に記載の方法によって生成されるブタノールは、発酵培地の少なくとも３０ｇ／Ｌの有効力価を有する。あるいは、本明細書中に記載の方法によって生成されるブタノールは、発酵培地の少なくとも３７ｇ／Ｌの有効力価を有する。

理論に拘束されることなく、本明細書で開示される抽出発酵法によって得られるブタノール力価が高まることで、部分的には発酵培地からの毒性ブタノール生成物の除去から、同レベルが微生物に対して有害なレベルより低く保持されることになると考えられる。

有機抽出剤としてのオレイルアルコールの使用は、本発明を提示する際、意外にも十分に理解されていないさらなる有益な効果を有する。詳細には、抽出剤としてのオレイルアルコールとガスストリッピングとの併用は、たとえガスストリッピング単独がブタノールを毒性レベル未満に保持する場合に有効であっても、ガスストリッピング単独より有意に高い力価を提供する。オレイルアルコールを含むかまたは本質的にそれからなる有機抽出剤は、本明細書中に記載のプロセスにおいて改善された力価を提供しうる。

ここで図３を参照すると、原位置抽出発酵を用いてブタノールを生成し、回収するためのプロセスの一実施形態の略図が示される。少なくとも１つの発酵性炭素源の水性流１０は、少なくとも１つの発酵性炭素源をブタノールに変換するように遺伝子組換えがなされた少なくとも１つの微生物（図示せず）を含有する発酵槽２０に導入される。第１の水不混和性抽出剤の流れ１２および任意の第２の水不混和性抽出剤の流れ１４は、容器１６に導入され、ここでは抽出剤は結合され、抽出剤１８が形成される。抽出剤の流れ１８は発酵槽２０に導入され、それにより、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成する上での発酵培地と抽出剤との間の接触が生じる。水相および有機相の双方を含む流れ２６は容器３８に導入され、ここで水相と有機相の分離がなされ、ブタノール含有有機相４０および水相４２が生成される。

ここで図４を参照すると、原位置抽出発酵を用いてブタノールを生成し、回収するためのプロセスの一実施形態の略図が示される。少なくとも１つの発酵性炭素源の水性流１０は、少なくとも１つの発酵性炭素源をブタノールに変換するように遺伝子組換えがなされた少なくとも１つの微生物（図示せず）を含有する発酵槽２０に導入される。第１の水不混和性抽出剤の流れ１２および任意の第２の水不混和性抽出剤の流れ１４は、発酵槽２０に別々に導入され、それにより、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成する上での発酵培地と抽出剤との間の接触が生じる。水相および有機相の双方を含む流れ２６は容器３８に導入され、ここでは水相と有機相の分離がなされ、ブタノール含有有機相４０および水相４２が生成される。

ここで図５を参照すると、原位置抽出発酵を用いてブタノールを生成し、回収するためのプロセスの一実施形態の略図が示される。少なくとも１つの発酵性炭素源の水性流１０は、少なくとも１つの発酵性炭素源をブタノールに変換するように遺伝子組換えがなされた少なくとも１つの微生物（図示せず）を含有する第１の発酵槽２０に導入される。第１の水不混和性抽出剤の流れ１２は、発酵槽２０に導入され、かつ第１の溶媒と発酵槽２０の内容物との混合物を含む流れ２２は、第２の発酵槽２４に導入される。任意の第２の水不混和性抽出剤の流れ１４は、第２の発酵槽２４に導入され、それにより、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成する上での発酵培地と抽出剤との間の接触が生じる。水相および有機相の双方を含む流れ２６は、容器３８に導入され、ここでは水相と有機相の分離がなされ、ブタノール含有有機相４０および水相４２が生成される。

ここで図６を参照すると、生成物の抽出が原位置ではなく発酵槽の下流で行われる、ブタノールを生成し、回収するためのプロセスの一実施形態の略図が示される。少なくとも１つの発酵性炭素源の水性流１１０は、少なくとも１つの発酵性炭素源をブタノールに変換するように遺伝子組換えがなされた少なくとも１つの微生物（図示せず）を含有する発酵槽１２０に導入される。第１の水不混和性抽出剤の流れ１１２および任意の第２の水不混和性抽出剤の流れ１１４は、容器１１６に導入され、ここでは水不混和性抽出剤は結合し、抽出剤１１８が形成される。発酵槽１２０内の発酵培地の流れ１２２として示される少なくとも一部は、容器１２４に導入される。抽出剤の流れ１１８はまた、容器１２４に導入され、それにより、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成する上での発酵培地と抽出剤との間の接触が生じる。水相および有機相の双方を含む流れ１２６は、容器１３８に導入され、ここでは水相と有機相の分離がなされ、ブタノール含有有機相１４０および水相１４２が生成される。

ここで図７を参照すると、生成物の抽出が原位置ではなく発酵槽の下流で行われる、ブタノールを生成し、回収するためのプロセスの一実施形態の略図が示される。少なくとも１つの発酵性炭素源の水性流１１０は、少なくとも１つの発酵性炭素源をブタノールに変換するように遺伝子組換えがなされた少なくとも１つの微生物（図示せず）を含有する発酵槽１２０に導入される。第１の水不混和性抽出剤の流れ１１２および任意の第２の水不混和性抽出剤の流れ１１４は、容器１２４に別々に導入され、ここでは水不混和性抽出剤は結合し、抽出剤１１８が形成される。発酵槽１２０内の発酵培地の流れ１２２として示される少なくとも一部はまた、容器１２４に導入され、それにより、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成する上での発酵培地と抽出剤との間の接触が生じる。水相および有機相の双方を含む流れ１２６は、容器１３８に導入され、ここでは水相と有機相の分離がなされ、ブタノール含有有機相１４０および水相１４２が生成される。

ここで図８を参照すると、生成物の抽出が原位置ではなく発酵槽の下流で行われる、ブタノールを生成し、回収するためのプロセスの一実施形態の略図が示される。少なくとも１つの発酵性炭素源の水性流１１０は、少なくとも１つの発酵性炭素源をブタノールに変換するように遺伝子組換えがなされた少なくとも１つの微生物（図示せず）を含有する発酵槽１２０に導入される。第１の水不混和性抽出剤の流れ１１２は、容器１２８に導入され、かつ発酵槽１２０内の発酵培地の流れ１２２として示される少なくとも一部はまた、容器１２８に導入される。第１の水不混和性抽出剤と発酵槽１２０の内容物との混合物を含む流れ１３０は、第２の容器１３２に導入される。任意の第２の水不混和性抽出剤の流れ１１４は、第２の容器１３２に導入され、それにより、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成する上での発酵培地と抽出剤との間の接触が生じる。水相および有機相の双方を含む流れ１３４は、容器１３８に導入され、ここでは水相と有機相の分離がなされ、ブタノール含有有機相１４０および水相１４２が生成される。

本明細書中に記載の抽出プロセスは、バッチプロセスとして作動するか、または連続モードで作動することが可能であり、この場合、新しい抽出剤が加えられ、使用済み抽出剤が、発酵槽内の抽出剤の量が全発酵プロセスの間で一定に保持されるように吐出される。発酵からの生成物および副生成物のかかる連続抽出は、有効な速度、力価および収率を高めうる。

さらに別の実施形態では、一連のバッチ発酵槽が使用される場合、バッチ動作特性における差異を決定づけるフレキシブルな並流またはその代わりとしての向流の方法で、液体−液体抽出を操作することも可能である。このシナリオでは、発酵槽は発酵性マッシュで充填され、それにより、少なくとも１つの発酵性炭素源および微生物が、プラントが稼働している間、連続的な方法で次々と提供される。図９を参照すると、一旦、発酵槽Ｆ１００がマッシュおよび微生物で充填されると、マッシュおよび微生物の供給物は、連続ループで、発酵槽Ｆ１０１、次いで発酵槽Ｆ１０２に進み、次いで発酵槽Ｆ１００に戻される。任意の１つの発酵槽内での発酵は、一旦マッシュおよび微生物が共に存在すると開始され、発酵が完了するまで継続する。マッシュおよび微生物の充填時間は、発酵槽の数で全サイクル時間（充填、発酵、空化および清浄）を除したものに等しい。全サイクル時間が６０時間であり、かつ３つの発酵槽がある場合、充填時間は２０時間である。全サイクル時間が６０時間であり、かつ４つの発酵槽がある場合、充填時間は１５時間である。

適応並流抽出は、より高い培養液相の力価で作動する発酵槽で、ブタノール濃度が最高の抽出溶媒流を用いることが可能であり、最低の培養液相の力価で作動する発酵槽が、ブタノール濃度が最低の抽出溶媒流の便益を得ることを前提とした発酵特性に従う。例えば、再び図９を参照し、発酵槽Ｆ１００が発酵の開始時に、比較的低いブタノール培養液相（Ｂ）の力価で作動している場合を考慮すると、発酵槽Ｆ１０１は、比較的適度なブタノール培養液相の力価で作動する発酵の中間段階であり、かつ発酵槽Ｆ１０２は、比較的高いブタノール培養液相の力価で作動する発酵の終了間際である。この場合、抽出されるブタノールが最小であるかまたは全くない希薄な抽出溶媒（Ｓ）は、発酵槽Ｆ１００に供給可能であり、次いで抽出されるブタノール成分を有する発酵槽Ｆ１００からの「溶媒流出（ｓｏｌｖｅｎｔ ｏｕｔ）」流（Ｓ’）は、その「溶媒流入（ｓｏｌｖｅｎｔ ｉｎ）」流として発酵槽Ｆ１０１に供給可能であり、次いでＦ１０１からの溶媒流出流は、その溶媒流入流として発酵槽Ｆ１０２に供給可能である。次いで、Ｆ１０２からの溶媒流出流は、送出され、処理され、同流中に存在するブタノールが回収されうる。ブタノールの大部分が除去された処理済みの溶媒流は、希薄な抽出溶媒としてシステムに戻すことが可能であり、その場合、上記の発酵槽Ｆ１００への供給される溶媒となる。

発酵が規則正しく進行すると、抽出溶媒マニホールド内の弁は、最も希薄な抽出溶媒を最低のブタノール培養液相の力価で作動する発酵槽に供給するように再配置してもよい。例えば、（ａ）発酵槽Ｆ１０２がその発酵を完了させ、再負荷されてから発酵が再開されると仮定すると、（ｂ）発酵槽Ｆ１００は、適度なブタノール培養液相の力価で作動するその発酵の中間段階であり、かつ（ｃ）発酵槽Ｆ１０１は、比較的より高いブタノール培養液相の力価で作動するその発酵の終了間際である。このシナリオであれは、最も希薄な抽出溶媒は、Ｆ１０２に供給され、Ｆ１０２に残留する抽出溶媒は、発酵槽Ｆ１００に供給され、また発酵槽Ｆ１００に残留する抽出溶媒は、発酵槽Ｆ１０１に供給されることになる。

この方法を実施する利点は、培養液相のブタノールの力価を、できるだけ長期間、できるだけ低く維持し、生産性における改善を実現することでありうる。さらに、より高いブタノール培養液相の力価で運転中の、発酵段階までさらに進行している他の発酵槽内の温度を低下させることは可能でありうる。温度の低下は、より高いブタノール培養液相の力価に対する改善された耐性を許容しうる。

本発明はさらに以下の実施例にて定義される。これらの実施例が本発明の好ましい実施形態を示す一方であくまで例示目的で与えられることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性により、その趣旨および範囲から逸脱することなく本発明に対してさまざまな変更および改良を行うことで、本発明のさまざまな利用および条件への適合が可能であることが確認できる。

すべての溶媒（すなわち抽出剤）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手し、さらなる精製を伴わずに使用した。使用したオレイルアルコールは、オレイルアルコール（６５％）と高級および低級脂肪族アルコールの混合物を含有するテクニカルグレードであった。使用した他の溶媒の純度は、次のとおりであった。オレイン酸、６５〜８８％；オクタン酸、９８％；ノナノール、９８％；１−ドデカノール、９８％；１−ノナナール、９５％、および１−デカノール、９８％。イソブタノールは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、さらなる精製を伴わずに使用した。

一般的方法
組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＮＧＣＩ−０３１の作成
イソブタノール生合成経路と、次の遺伝子、すなわちｐｆｌＢ（配列番号２３、ピルビン酸・ギ酸リアーゼをコード）、ｌｄｈＡ（配列番号２４、乳酸デヒドロゲナーゼをコード）、ａｄｈＥ（配列番号２５、アルコールデヒドロゲナーゼをコード）、およびｆｒｄＢ（配列番号２７、フマル酸レダクターゼのサブユニットをコード）の欠失を含む組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株を下記のように作成した。イソブタノール生合成経路における遺伝子は、（配列番号１として与えられる）クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のｂｕｄＢ、（配列番号３として与えられる）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のｉｌｖＣ、（配列番号５として与えられる）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のｉｌｖＤ、（配列番号７として与えられる）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）由来のｋｉｖＤ、および（配列番号９として与えられる）アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のｓａｄＢであった。組換え株の作成を、２つのステップで行った。まず、上記遺伝子の欠失を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株を作成した。次いで、イソブタノール生合成経路をコードする遺伝子を株に導入した。

ｐｆｌＢ、ｌｄｈＡ、ａｄｈＥおよびｆｒｄＢ遺伝子の欠失を有する組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株の作成
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のＫｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂａｂａら、Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．、２：１−１１頁、２００６年）を、本明細書中で４ノックアウト（ｆｏｕｒ−ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株と称される意図された遺伝子欠失を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の生成に使用した。Ｋｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎは、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒの方法によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＷ２５１１３中で生成される単一の遺伝子ノックアウトのライブラリーである（Ｄａｔｓｅｎｋｏ Ｋ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒ Ｂ．Ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．９７ ６６４０−６６４５頁、２０００年）。Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ中での各欠失遺伝子を、Ｆｌｐリコンビナーゼによって除去可能なＦＲＴで隣接されるカナマイシンマーカーと置換した。４ノックアウト大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、ノックアウト−カナマイシンマーカーをＫｅｉｏドナー株からＰ１形質導入によってレシピエント株に移すことによって作成した。ノックアウトを生成するための各Ｐ１形質導入後、カナマイシンマーカーをＦｌｐリコンビナーゼによって除去した。このマーカーレス株は、次のＰ１形質導入のための新しいドナー株として機能した。

４ノックアウト大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、ＪＷ０８８６に加えて３つのＫｅｉｏ株から調製したＰ１ファージ溶解物でのＰ１_ｖｉｒ形質導入により、Ｋｅｉｏ株ＪＷ０８８６において作成した。使用したＫｅｉｏ株を以下にあげる。
−ＪＷ０８８６：ｋａｎマーカーがｐｆｌＢ遺伝子内に挿入される
−ＪＷ４１１４：ｋａｎマーカーがｆｒｄＢ遺伝子内に挿入される
−ＪＷ１３７５：ｋａｎマーカーがｌｄｈＡ遺伝子内に挿入される
−ＪＷ１２２８：ｋａｎマーカーがａｄｈＥ遺伝子内に挿入される

Ｐ１_ｖｉｒ形質導入は、いくつかの修飾を伴い、Ｍｉｌｌｅｒによる記載のように行われた（Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｈ．、１９９２年、Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ）。つまり、形質導入溶解物を調製するため、ドナー株の細胞を、振とうしながら、Ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）培地中、３７℃で一晩成長させた。これらの細胞の一晩成長を、０．００５Ｍ ＣａＣｌ_２を含有するＬＢ培地中に継代培養し、通気のない３７℃の水槽内に入れた。ファージ添加の１時間前、細胞を、振とうしながら３７℃でインキュベートした。細胞の最終成長後、一定分量１．０ｍＬの培養物を１４ｍＬのチューブに分注し、約１０^７個のＰ１_ｖｉｒファージを加えた。このチューブを３７℃の水槽内で２０分間インキュベートした後に、２．５ｍＬの０．８％ＬＢ上層寒天を各チューブに加えた。チューブの内容物を、ＬＢ寒天プレート上に展開し、３７℃でインキュベートした。翌日、軟質寒天層をこすり、遠心管内に入れた。プレートの表面をＬＢ培地で洗浄し、遠心管に加え、次いでＣＨＣｌ_３数滴を加え、次にチューブをボルテックスミキサーを使用して激しく撹拌した。４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後、Ｐ１_ｖｉｒ溶解物を含有する上清を回収した。

形質導入においては、レシピエント株を、１〜２ｍＬのＬＢ培地中で、振とうしながら。３７℃で一晩成長させた。培養物を、１０，０００ｒｐｍ、室温で１分間の微量遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）での遠心分離によってペレット状にした。細胞ペレットを、等しい容量のＭＣ緩衝液（０．１Ｍ ＭｇＳＯ_４、０．００５Ｍ ＣａＣｌ_２）中に再懸濁し、０．１ｍＬの一定分量でチューブに分注し、０．１ｍＬおよび０．０１ｍＬのＰ１_ｖｉｒ溶解物を加えた。Ｐ１_ｖｉｒ溶解物を全く含有しない対照チューブも含めた。チューブを３７℃で２０分間インキュベートした後、０．２ｍＬの０．１Ｍクエン酸ナトリウムを加えてＰ１の感染を停止させた。チューブを３７℃で１時間インキュベートする前、１ｍＬのＬＢ培地を各チューブに加えた。インキュベーション後、細胞を上記のようにペレット状にし、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレート上に展開する前に５０〜２００μＬのＬＢ中に再懸濁し、３７℃で一晩インキュベートした。形質導入体を、カナマイシンマーカー挿入物の上流および下流の領域に隣接する染色体に特異的なプライマーを使用するコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。

染色体からのカナマイシンマーカーの除去が、カナマイシン−耐性株をプラスミドｐＣＰ２０で形質転換し（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ Ｐ．Ｐ．およびＷａｃｋｅｒｎａｇｅｌ Ｗ．、Ｇｅｎｅ、１５８：９−１４頁、１９９５年）、次いでＬＢアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）プレート上に展開し、３０℃でインキュベートすることによって得られた。ｐＣＰ２０プラスミドは、λ_ＰＲプロモーターの制御下で酵母ＦＬＰリコンビナーゼを有する。このプロモーターからの発現は、プラスミド上に存在するｃＩ８５７温度感受性リプレッサーによって制御される。ｐＣＰ２０の複製の複製起点もまた、温度感受性である。アンピシリン耐性コロニーを、ＬＢ寒天プレート上にストリークし、４２℃でインキュベートした。インキュベーション温度が高くなると同時にＦＬＰリコンビナーゼの発現が誘発され、ｐＣＰ２０プラスミドが細胞から回復された。単離したコロニーを、カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレートと、ＬＢアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）プレートおよびＬＢプレート上のグリッドにパッチした。得られたカナマイシン感受性、アンピシリン感受性コロニーを、コロニーＰＣＲによってスクリーニングし、カナマイシンマーカーの染色体からの除去を確認した。

コロニーＰＣＲ増幅においては、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）；カタログ番号７１８０５−３）を、製造業者のプロトコルに従って使用した。０．２μＭの各染色体に特異的なＰＣＲプライマーを含有する２５μＬのＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ反応物に、少量のコロニーを加えた。増幅を、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））で行った。典型的なコロニーＰＣＲ条件は以下の通り、９５℃で１５分；９５℃で３０秒間を３０サイクル、５０〜５８℃の範囲の３０秒間のアニーリング温度、約１分／ＤＮＡのｋｂの伸長時間、７２℃で伸長されるプライマー；次いで７２℃で１０分間、次いで４℃で保持であった。ＰＣＲ産物サイズを、公知の分子量標準との比較により、ゲル電気泳動によって測定した。

形質転換においては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のエレクトロコンピテント細胞を、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら、（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８７年、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）で記載のように調製した。細胞を、２５〜５０ｍＬのＬＢ培地中、３０〜３７℃で成長させ、１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、０．５〜０．７のＯＤ_６００で収穫した。これらの細胞を、培養物の元の開始容量に等しい容量の無菌氷冷水で２回洗浄する。最終洗浄後、細胞を、滅菌水中に再懸濁し、形質転換されるべきＤＮＡを加えた。細胞およびＤＮＡを、冷却したキュベットに移し、製造業者の使用説明書に従い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩでエレクトロポレートした（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））。

ＪＷ０８８６株（ΔｐｆｌＢ：：ｋａｎ）を、プラスミドｐＣＰ２０で形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢプレート上に３０℃で展開した。次いで、アンピシリン耐性形質転換体を選択し、ＬＢプレート上にストリークし、４２℃で成長させた。単離したコロニーを、アンピシリンおよびカナマイシン選択培地プレートならびにＬＢプレート上にパッチした。カナマイシン感受性およびアンピシリン感受性コロニーを、プライマーｐｆｌＢ ＣｋＵｐ（配列番号１１）およびｐｆｌＢ ＣｋＤｎ（配列番号１２）を伴うコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲ反応ミックスの一定分量１０μＬを、ゲル電気泳動によって分析した。予想された約０．４ｋｂのＰＣＲ産物が認められ、それからマーカーの除去が確認され、「ＪＷ０８８６マーカーレス」株が生成された。この株は、ｐｆｌＢ遺伝子の欠失を有した。

「ＪＷ０８８６マーカーレス」株を、ＪＷ４１１４（ｆｒｄＢ：：ｋａｎ）由来のＰ１_ｖｉｒ溶解物で形質導入し、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレート上にストリークした。カナマイシン耐性形質導入体を、プライマーｆｒｄＢ ＣｋＵｐ（配列番号１３）およびｆｒｄＢ ＣｋＤｎ（配列番号１４）を伴うコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。予想された約１．６ｋｂのＰＣＲ産物を生成するコロニーを、上記のようにエレクトロコンピテントにし、上記のようにマーカーの除去のため、ｐＣＰ２０で形質転換した。形質転換体をまず、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢプレート上に３０℃で展開し、次いでアンピシリン耐性形質転換体を選択し、ＬＢプレート上にストリークし、４２℃で成長させた。単離したコロニーを、アンピシリンおよびカナマイシン選択培地プレートならびにＬＢプレート上にパッチした。カナマイシン選択、アンピシリン選択コロニーを、プライマーｆｒｄＢ ＣｋＵｐ（配列番号１３）およびｆｒｄＢ ＣｋＤｎ（配列番号１４）を伴うＰＣＲによってスクリーニングした。予想された約０．４ｋｂのＰＣＲ産物が認められ、それからマーカーの除去が確認され、二重ノックアウト株「ΔｐｆｌＢ ｆｒｄＢ」が生成された。

二重ノックアウト株を、ＪＷ１３７５（ΔｌｄｈＡ：：ｋａｎ）由来のＰ１_ｖｉｒ溶解物で形質導入し、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレート上に展開した。カナマイシン耐性形質導入体を、プライマーｌｄｈＡ ＣｋＵｐ（配列番号１５）およびｌｄｈＡ ＣｋＤｎ（配列番号１６）を伴うコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。予想された１．１ｋｂのＰＣＲ産物を生成するクローンを、エレクトロコンピテントにし、上記のようにマーカーの除去のため、ｐＣＰ２０で形質転換した。形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢプレート上に３０℃で展開し、アンピシリン耐性形質転換体をＬＢプレート上にストリークし、４２℃で成長させた。単離したコロニーを、アンピシリンおよびカナマイシン選択培地プレートならびにＬＢプレート上にパッチした。カナマイシン選択、アンピシリン選択コロニーを、０．３ｋｂの産物について、プライマーｌｄｈＡ ＣｋＵｐ（配列番号１５）およびｌｄｈＡ ＣｋＤｎ（配列番号１６）を伴うＰＣＲによってスクリーニングした。予想された約０．３ｋｂのＰＣＲ産物を生成するクローンにより、マーカーの除去が確認され、「３ノックアウト株」（ΔｐｆｌＢ ｆｒｄＢ ｌｄｈＡ）と称される三重ノックアウト株が生成された。

「３ノックアウト株」を、ＪＷ１２２８（ΔａｄｈＥ：：ｋａｎ）由来のＰ１_ｖｉｒ溶解物で形質導入し、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレート上に展開した。カナマイシン耐性形質導入体を、プライマーａｄｈＥ ＣｋＵｐ（配列番号１７）およびａｄｈＥ ＣｋＤｎ（配列番号１８）を伴うコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。予想された１．６ｋｂのＰＣＲ産物を生成するクローンを、エレクトロコンピテントにし、マーカーの除去のため、ｐＣＰ２０で形質転換した。形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢプレート上に３０℃で展開した。アンピシリン耐性形質転換体をＬＢプレート上にストリークし、４２℃で成長させた。単離したコロニーを、アンピシリンおよびカナマイシン選択プレートならびにＬＢプレート上にパッチした。カナマイシン選択、アンピシリン選択コロニーを、プライマーａｄｈＥ ＣｋＵｐ（配列番号１７）およびａｄｈＥ ＣｋＤｎ（配列番号１８）を伴うＰＣＲによってスクリーニングした。予想された約０．４ｋｂのＰＣＲ産物を生成するクローンを、「４ノックアウト株」（ΔｐｆｌＢ ｆｒｄＢ ｌｄｈＡ ａｄｈＥ）と称した。

４ノックアウト大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株へのイソブタノール生合成経路をコードする遺伝子セットの導入
プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤを、同時係属中の共同所有される米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書（参照により本明細書中に援用される）の実施例９〜１４中に記載のように作成した。このプラスミドは、次の遺伝子、すなわち、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のアセト乳酸シンターゼをコードするｂｕｄＢ（配列番号１）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼをコードするｉｌｖＣ遺伝子（配列番号３）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤ（配列番号５）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）由来の分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼをコードするｋｉｖＤ（配列番号７）を含んだ。ブタノールデヒドロゲナーゼをコードするアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のｓａｄＢ遺伝子（配列番号９）を、下記のようにｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤプラスミドにサブクローン化した。

（同時係属中の共同所有される米国仮特許出願第６１／０４８２９１号明細書中に開示される）アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のブタノールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片（ＤＮＡ：配列番号９；タンパク質：配列番号１０）を、標準条件を使用して、Ａ．キシロスオキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ゲノムＤＮＡから増幅した。ＤＮＡを、グラム陰性生物に対して推奨されるプロトコルに従い、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）；カタログ番号Ｄ−５５００Ａ）を使用して調製した。ＰＣＲ増幅を、フォワードおよびリバースプライマーのＮ４７３およびＮ４６９（配列番号１９および２０）を使用し、それぞれＰｈｕｓｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））を使用して行った。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ４ ＢＬＵＮＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔクローニングを行い、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ：：ｓａｄＢを生成し、それを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｃｈ−１細胞に形質転換した。それに続き、プラスミドを４つのクローンから単離し、配列を検証した。

次いで、ｓａｄＢコード領域を、ベクターｐＴｒｃ９９ａ（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５頁、１９８８年）にクローン化した。ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ：：ｓａｄＢをＥｃｏＲＩで消化し、ｓａｄＢ断片を放出し、それをＥｃｏＲＩで消化されたｐＴｒｃ９９ａとライゲートし、ｐＴｒｃ９９ａ：：ｓａｄＢを生成した。このプラスミドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｃｈ１細胞に形質転換し、得られた形質転換体をＭａｃｈ１／ｐＴｒｃ９９ａ：：ｓａｄＢと称した。これらの細胞におけるｓａｄＢ遺伝子から発現される酵素の活性は、標準としてイソブチルアルデヒドを使用して分析すると、無細胞抽出液中で３．５ｍｍｏｌ／分／ｍｇのタンパク質であることが判定された。

次いで、ｓａｄＢ遺伝子を、次のように、ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤにサブクローン化した。ｓａｄＢコード領域を、プライマーＮ６９５Ａ（配列番号２１）およびＮ６９６Ａ（配列番号２２）を使用し、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））を使用し、ｐＴｒｃ９９ａ：：ｓａｄＢから増幅した。増幅を、９８℃で１分間の初期変性、次いで９８℃で１０秒間の変性の３０サイクル、６２℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２０秒間の伸長および７２℃で５分間の最終伸長サイクル、次いで４℃で保持の場合に行った。プライマーＮ６９５Ａは、クローニングにおけるＡｖｒＩＩ制限部位と、ｓａｄＢコード領域のＡＴＧ開始コドンの上流にＲＢＳ（リボソーマル結合部位）を有した。Ｎ６９６Ａプライマーは、クローニングにおけるＸｂａＩ部位を含んだ。１．１ｋｂのＰＣＲ産物を、ＡｖｒＩＩおよびＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））で消化し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を使用してゲル精製した。精製断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））を使用し、同じ制限酵素で切断済みのｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤとライゲートした。ライゲーション混合物を、１６℃で一晩インキュベートし、次いで製造業者のプロトコルに従い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｃｈ１（商標）コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天上で成長させた後に得た。形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を使用し、製造業者のプロトコルに従って調製した。得られたプラスミドを、ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｓａｄＢと称した。エレクトロコンピテント４ノックアウト大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を、上記のように調製し、ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｓａｄＢで形質転換した。形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上にストリークした。得られた組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｓａｄＢによってコードされるイソブタノール生合成経路と、ｐｆｌＢ、ｆｒｄＢ、ｌｄｈＡ、およびａｄｈＥ遺伝子の欠失を含み、株ＮＧＣＩ−０３１と称した。

酵母株ＮＧＩ−０４９の作成
ＮＧＩ−０４９は、内因性ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子の挿入不活性化を有し、かつ発現ベクターｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８およびｐＬＨ４６８を有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株である。ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの３つの主要なアイソザイムをコードする。同株は、融合されるかまたはプラスミド上に存在する、イソブタノール生合成経路における酵素をコードする遺伝子を発現する。

発現ベクターｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８
酵母におけるＡＬＳおよびＫＡＲＩの発現のため、ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８プラスミド（配列番号３０）を作成した。ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８は、次のキメラ遺伝子、すなわち、
１）ＣＵＰ１プロモーター（配列番号３１）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のアセト乳酸シンターゼのコード領域（ＡｌｓＳ；配列番号３２；タンパク質配列番号３３）およびＣＹＣ１ターミネーター（配列番号３４）；
２）ＩＬＶ５プロモーター（配列番号３５）、Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８コード領域（配列番号３６；タンパク質配列番号３７）およびＩＬＶ５ターミネーター（配列番号３８）；ならびに
３）ＦＢＡ１プロモーター（配列番号３９）、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＡＲＩコード領域（ＩＬＶ５；配列番号４０；タンパク質配列番号４１）およびＣＹＣ１ターミネーターを有するｐＨＲ８１ベクター（ＡＴＣＣ番号８７５４１）である。

Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８コード領域は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のＫＡＲＩをコードするが、突然変異を有する配列であり、それは共同所有された同時係属中の米国特許出願第１２／３３７７３６号明細書（参照により本明細書中に援用される）中に記載された。Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８でコードされるＫＡＲＩ（配列番号３７）は、天然シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のＫＡＲＩに対して次のアミノ酸変化、すなわち、
Ｃ３３Ｌ（システインが位置３３でロイシンに変化）、
Ｒ４７Ｙ（アルギニンが位置４７でチロシンに変化）、
Ｓ５０Ａ（セリンが位置５０でアラニンに変化）、
Ｔ５２Ｄ（トレオニンが位置５２でアスパラギンに変化）、
Ｖ５３Ａ（バリンが位置５３でアラニンに変化）、
Ｌ６１Ｆ（ロイシンが位置６１でフェニルアラニンに変化）、
Ｔ８０Ｉ（トレオニンが位置８０でイソロイシンに変化）、
Ａ１５６Ｖ（アラニンが位置１５６でトレオニンに変化、および
Ｇ１７０Ａ（グリシンが位置１７０でアラニンに変化）
を有する。

Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８コード領域を、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のために最適化したコドンに基づき、ＤＮＡ２．０（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；配列番号６）によって合成した。

発現ベクターｐＬＨ４６８
ｐＬＨ４６８プラスミド（配列番号４２）を、酵母におけるＤＨＡＤ、ＫｉｖＤおよびＨＡＤＨの発現のために作成した。

枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）およびウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（ＨＡＤＨ）におけるコード領域を、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のために最適化したコドンに基づき、ＤＮＡ２．０によって合成し（各々、配列番号４３および４５）、プラスミドｐＫｉｖＤｙ−ＤＮＡ２．０およびｐＨａｄｈｙ−ＤＮＡ２．０において提供した。コードされるタンパク質は、それぞれ配列番号４４および４６である。ＫｉｖＤおよびＨＡＤＨに対する各発現ベクターを作成した。ｐＬＨ４６７（ｐＲＳ４２６：：Ｐ_ＧＰＤ１−ｋｉｖＤｙ−ＧＰＤ１ｔ）を構築するため、ベクターｐＮＹ８（配列番号４７；ｐＲＳ４２６．ＧＰＤ−ａｌｄ−ＧＰＤｔとも称され、共同所有された同時係属中の米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書の実施例１７（参照により本明細書中に援用される）中に記載）を、ＡｓｃＩおよびＳｆｉＩ酵素で消化することで、ＧＰＤ１プロモーターおよびａｌｄコード領域を切断した。ｐＮＹ８由来のＧＰＤ１プロモーター断片（配列番号４８）をＰＣＲ増幅し、５’プライマーＯＴ１０６８および３’プライマーＯＴ１０６７（配列番号４９および５０）を使用して、５’末端にＡｓｃＩ部位および３’末端にＳｐｅＩ部位を付加した。ＡｓｃＩ／ＳｆｉＩで消化したｐＮＹ８ベクター断片を、ＡｓｃＩおよびＳｐｅＩで消化したＧＰＤ１プロモーターＰＣＲ産物とライゲートし、かつ、コドン最適化したｋｉｖＤコード領域を有するＳｐｅＩ−ＳｆｉＩ断片を、ベクターｐＫｉｖＤ−ＤＮＡ２．０から単離した。３通りのライゲーションにより、ベクターｐＬＨ４６７（ｐＲＳ４２６：：Ｐ_ＧＰＤ１−ｋｉｖＤｙ−ＧＰＤ１ｔ）を生成した。ｐＬＨ４６７を、制限マッピングおよび配列決定によって検証した。

ｐＬＨ４３５（ｐＲＳ４２５：：Ｐ_ＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔ）は、ベクターｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（配列番号５１）（共同所有された同時係属中の米国仮特許出願第６１／０５８９７０号明細書の実施例３（参照により本明細書中に援用される）に記載）から得られた。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢは、ＧＰＭ１プロモーター（配列番号５２）、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼ由来のコード領域（ｓａｄＢ；配列番号９；タンパク質配列番号１０：共同所有された同時係属中の米国仮特許出願第６１／０４８２９１号明細書中に開示）、およびＡＤＨ１ターミネーター（配列番号５３）を有するキメラ遺伝子を有するｐＲＳ４２５ベクター（ＡＴＣＣ番号７７１０６）である。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭｐ−ｓａｄＢは、ｓａｄＢコード領域の５’および３’末端にそれぞれＢｂｖＩおよびＰａｃＩ部位を有する。ＮｈｅＩ部位を、プライマーＯＴ１０７４およびＯＴ１０７５（配列番号５４および５５）を使用する部位特異的突然変異誘発により、ｓａｄＢコード領域の５’末端側に付加し、ベクターｐＲＳ４２５−ＧＰＭｐ−ｓａｄＢ−ＮｈｅＩを生成し、それを配列決定によって検証した。ｐＲＳ４２５：：Ｐ_ＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＮｈｅＩを、ＮｈｅＩおよびＰａｃＩで消化し、ｓａｄＢコード領域を除外し、ベクターｐＨａｄｈｙ−ＤＮＡ２．０由来のコドン最適化したＨＡＤＨコード領域を有するＮｈｅＩ−ＰａｃＩ断片とライゲートし、ｐＬＨ４３５を生成した。

ＫｉｖＤおよびＨＡＤＨの発現カセットを単一ベクター内で結合させるため、酵母ベクターｐＲＳ４１１（ＡＴＣＣ番号８７４７４）をＳａｃＩおよびＮｏｔＩで消化し、３通りのライゲーション反応において、Ｐ_ＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔカセットを有するｐＬＨ４３５由来のＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片とともに、Ｐ_ＧＰＤ１−ｋｉｖＤｙ−ＧＰＤ１ｔカセットを有するｐＬＨ４６７由来のＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片とライゲートした。これによってベクターｐＲＳ４１１：：Ｐ_ＧＰＤ１−ｋｉｖＤｙ−Ｐ_ＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ（ｐＬＨ４４１）を得て、それを制限マッピングによって検証した。

低級イソブタノール経路内の３つの遺伝子ｉｌｖＤ、ｋｉｖＤｙおよびＨａｄｈｙのすべてにおける同時発現ベクターを生成するため、ＩｌｖＤ遺伝子の供給源として、共同所有された同時係属中の米国仮特許出願第６１／１００７９２号明細書に記載のｐＲＳ４２３ ＦＢＡ ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）（配列番号５６）を使用した。このシャトルベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における維持のためのＦ１複製起点（ｎｔ１４２３〜１８７９）および酵母における複製のための２ミクロンの複製起点（ｎｔ８０８２〜９４２６）を有する。ベクターは、ＦＢＡプロモーター（ｎｔ２１１１〜３１０８；配列番号３９）およびＦＢＡターミネーター（ｎｔ４８６１〜５８６０；配列番号５７）を有する。さらに、それは、酵母における選択のためのＨｉｓマーカー（ｎｔ５０４〜１１６３）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択のためのアンピシリン耐性マーカー（ｎｔ７０９２〜７９４９）を有する。ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９（ＡＴＣＣ番号７００６１０）由来のｉｌｖＤコード領域（ｎｔ３１１６〜４８２８；配列番号５８；タンパク質配列番号５９）は、ＦＢＡプロモーターとＦＢＡターミネーターの間に位置し、発現のためのキメラ遺伝子を形成する。さらに、ｉｌｖＤコード領域（ｎｔ４８２９〜４８４９）に融合されたｌｕｍｉｏ ｔａｇがある。

第１のステップは、ｐＲＳ４２３ ＦＢＡ ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）（ｐＲＳ４２３−ＦＢＡ（ＳｐｅＩ）−ＩｌｖＤ（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ））−Ｌｕｍｉｏとも称される）を、ＳａｃＩおよびＳａｃＩＩ（ＳａｃＩＩ部位はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端化された）で線状化し、全長が９，４８２ｂｐのベクターを得ることであった。第２のステップは、ｋｉｖＤｙ−ｈＡＤＨｙカセットを、ｐＬＨ４４１からＳａｃＩおよびＫｐｎＩ（ＫｐｎＩ部位はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化された）で単離し、６，０６３ｂｐの断片を得ることであった。この断片を、ｐＲＳ４２３−ＦＢＡ（ＳｐｅＩ）−ＩｌｖＤ（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ））−Ｌｕｍｉｏ由来の９，４８２ｂｐのベクター断片とライゲートした。この生成されたベクターｐＬＨ４６８（ｐＲＳ４２３：：Ｐ_ＦＢＡ１−ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）Ｌｕｍｉｏ−ＦＢＡ１ｔ−Ｐ_ＧＰＤ１−ｋｉｖＤｙ−ＧＰＤ１ｔ−Ｐ_ＧＰＭ１−ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔ）を、制限マッピングおよび配列決定によって確認した。

ｐｄｃ６：：ＧＰＭｐ１−ｓａｄＢ組込みカセットの作成およびＰＤＣ６の欠失：
ｐｄｃ６：：ＧＰＭ１ｐ−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組込みカセットを、ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（上記）由来のＧＰＭ−ｓａｄＢ−ＡＤＨｔセグメント（配列番号６０）をｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ由来のＵＲＡ３ｒ遺伝子と連結することによって作成した。ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ（配列番号６１）は、インビボでの相同組換えおよびＵＲＡ３マーカーの除去を可能にする、７５ｂｐの相同リピート配列によって隣接されたｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ番号７７１０７）由来のＵＲＡ３マーカーを有する。２つのＤＮＡセグメントを、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；カタログ番号Ｆ−５４０Ｓ）およびプライマー１１４１１７−１１Ａ〜１１４１１７−１１Ｄ（配列番号６２、６３、６４および６５）、ならびに１１４１１７−１３Ａおよび１１４１１７−１３Ｂ（配列番号６６および６７）とともに、鋳型としてｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢおよびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡを使用するＳＯＥ ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎら（１９８９年） Ｇｅｎｅ ７７：６１−６８頁で記載）によって連結した。

ＳＯＥ ＰＣＲにおける外部プライマー（１１４１１７−１３Ａおよび１１４１１７−１３Ｂ）は、ＰＤＣ６プロモーターおよびターミネーターの上流および下流の領域に相同な約５０ｂｐの５’および３’領域をそれぞれ有した。標準の遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、２０１−２０２頁）を用いて、完全カセットＰＣＲ断片を、ＢＹ４７００（ＡＴＣＣ番号２００８６６）に形質転換し、かつ、形質転換体は、２％グルコースを３０℃で補充したウラシル欠損合成完全培地上で維持した。形質転換体は、プライマー１１２５９０−３４Ｇおよび１１２５９０−３４Ｈ（配列番号６８および６９）と１１２５９０−３４Ｆおよび１１２５９０−４９Ｅ（配列番号７０および７１）を使用するＰＣＲによってスクリーニングし、ＰＤＣ６コード領域の欠失を伴うＰＤＣ６遺伝子座での組込みについて検証した。ＵＲＡ３ｒマーカーを、標準プロトコルに従い、３０℃で２％グルコースおよび５−ＦＯＡを補充した合成完全培地上にプレーティングすることによって再生した。マーカーの除去を、５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチすることによって確認し、成長がないことを検証した。得られた同定株は、遺伝子型：ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：Ｐ_ＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔを有する。

ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１−ｉｌｖＤ組込みカセットの作成およびＰＤＣ１の欠失：
ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１ｐ−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組込みカセットを、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；カタログ番号Ｆ−５４０Ｓ）およびプライマー１１４１１７−２７Ａ〜１１４１１７−２７Ｄ（配列番号７３、７４、７５および７６）とともに、鋳型としてｐＬＨ４６８およびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡを使用するＳＯＥ ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎら（１９８９年） Ｇｅｎｅ ７７：６１−６８頁で記載）により、ｐＬＨ４６８（上記）由来のｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔセグメント（配列番号７２）をｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ由来のＵＲＡ３ｒ遺伝子と連結することによって作成した。

ＳＯＥ ＰＣＲにおける外部プライマー（１１４１１７−２７Ａおよび１１４１１７−２７Ｄ）は、ＰＤＣ１プロモーターの下流およびＰＤＣ１コード配列の下流の領域に相同な約５０ｂｐの５’および３’領域を有した。標準の遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、２０１−２０２頁）を用いて、完全カセットＰＣＲ断片を、ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：Ｐ_ＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔに形質転換し、かつ、形質転換体は、２％グルコース
を３０℃で補充したウラシル欠損合成完全培地上で維持した。形質転換体は、プライマー１１４１１７−３６Ｄおよび１３５（配列番号７７および７８）とプライマー１１２５９０−４９Ｅおよび１１２５９０−３０Ｆ（配列番号７０および７９）を使用するＰＣＲによってスクリーニングし、ＰＤＣ１コード配列の欠失を伴うＰＤＣ１遺伝子座での組込みについて検証した。ＵＲＡ３ｒマーカーを、標準プロトコルに従い、３０℃で２％グルコースおよび５−ＦＯＡを補充した合成完全培地上にプレーティングすることによって再生した。マーカーの除去を、５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチすることによって確認し、成長がないことを検証した。得られた同定株「ＮＹＬＡ６７」は、遺伝子型：ＢＹ４７００ｐｄｃ６：：ＧＰＭ１ｐ−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１ｐ−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔを有する。

ＨＩＳ３の欠失
内因性ＨＩＳ３コード領域を欠失させるため、ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３ｒ２カセットをＵＲＡ３ｒ２鋳型ＤＮＡ（配列番号８４）からＰＣＲ増幅した。ＵＲＡ３ｒ２は、インビボでの相同組換えおよびＵＲＡ３マーカーの除去を可能にする、５００ｂｐの相同リピート配列によって隣接されたｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ番号７７１０７）由来のＵＲＡ３マーカーを有する。ＰＣＲを、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼとプライマー１１４１１７−４５Ａおよび１１４１１７−４５Ｂ（配列番号８５および８６）を使用して行い、約２．３ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。各プライマーのＨＩＳ３部分は、ＵＲＡ３ｒ２マーカーの組込みがＨＩＳ３コード領域の置換をもたらすように、ＨＩＳ３プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得られた。標準の遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、２０１−２０２頁）を用いてＰＣＲ産物をＮＹＬＡ６７に形質転換し、かつ、形質転換体は、２％グルコースを３０℃で補充したウラシル欠損合成完全培地上で選択した。形質転換体は、スクリーニングし、形質転換体の２％グルコースを３０℃で補充したヒスチジン欠損合成完全培地上へのレプリカプレーティングによって正確な組込みを検証した。ＵＲＡ３ｒマーカーを、標準プロトコルに従い、２％グルコースおよび５−ＦＯＡを３０℃で補充した合成完全培地上でのプレーティングによって再利用した。マーカーの除去を、５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチすることによって確認し、成長がないことを検証した。得られた同定株「ＮＹＬＡ７３」は、遺伝子型：ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＧＰＭ１ｐ−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１ｐ−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ Δｈｉｓ３を有する。

ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ組込みカセットの作成およびＰＤＣ５の欠失：
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４カセットを、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼとプライマーＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＦおよびＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＲ（配列番号８０および８１）を使用し、ＹＬＲ１３４Ｗ染色体ＤＮＡ株（ＡＴＣＣ番号４０３４０９１）からＰＣＲ増幅し、約２．２ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。各プライマーのＰＤＣ５部分は、ｋａｎＭＸ４マーカーの組込みがＰＤＣ５コード領域の置換をもたらすように、ＰＤＣ５プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得られた。標準の遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、２０１−２０２頁）を用いてＰＣＲ産物をＮＹＬＡ７３に形質転換し、かつ、形質転換体は、１％エタノールおよびジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（２００μｇ／ｍｌ）を３０℃で補充したＹＰ培地上で選択した。形質転換体は、ＰＣＲによってスクリーニングし、プライマーＰＤＣ５ｋｏｆｏｒおよびＮ１７５（配列番号８２および８３）を使用したＰＤＣ５コード領域の置換により、ＰＤＣ遺伝子座での正確な組込みを検証した。同定された正確な形質転換体は、遺伝子型：ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＧＰＭ１ｐ−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１ｐ−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ Δｈｉｓ３ ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４を有する。

プラスミドベクターｐＬＨ４６８およびｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８を、標準の遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を用いて、ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＧＰＭ１ｐ−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１ｐ−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ Δｈｉｓ３ ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４株に同時に形質転換し、１％エタノールを３０℃で補充したヒスチジンおよびウラシル欠損合成完全培地上で維持した。

イソブタノールを測定するためのＧＣ法
次のＧＣ法を用いて、下記の実施例１〜７における水相および有機相中でのイソブタノールの量を測定した。ＧＣ法では、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）製のＨＰ−ＩｎｎｏＷａｘカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ ＩＤ、０．２５μｍのフィルム）を使用した。キャリアガスは、一定の上部圧力、１５０℃での測定された１ｍＬ／分の流速のヘリウムであり、インジェクタスプリット比は２００℃で１：１０であり、オーブン温度は４５℃で１分間、１０℃／分で４５℃〜２３０℃、および２３０℃で３０秒間であった。フレームイオン化検出を、４０ｍＬ／分のヘリウム補給気体（ｍａｋｅｕｐ ｇａｓ）を使用して２６０℃で用いた。培養液試料を、注入前に、０．２μｍの回転フィルタを通して濾過した。所望される分析感度に依存し、０．１μＬまたは０．５μＬのいずれかの注入容量を使用した。較正標準曲線を、次の化合物、すなわちエタノール、イソブタノール、アセトイン、メソ−２，３−ブタンジオール、および（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールについて生成した。また、分析標準を使用し、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、およびイソアミルアルコールにおける保持時間を同定した。これらの条件下で、イソブタノール保持時間は、約５．３３分であった。

水相中でのグルコースおよびイソブタノールを測定するためのＨＰＬＣ法
実施例７および８においては、有機相中のイソブタノールは、上記のＧＣ法を用いて測定した。実施例７および８においては、水相中のイソブタノールおよびグルコース濃度は、溶離剤としてアイソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）な０．０１Ｎの水性硫酸を使用する、８．０ｍｍ×３００ｍｍのＳｈｏｄｅｘ ｓｕｇａｒ ＳＨ１０１１カラム（昭和電工株式会社（神奈川、日本）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｃｌｅａｒ Ｂｒｏｏｋ，ＶＡ）仲介）を使用するＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｍｏｄｅｌ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）またはＡｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））によって測定した。試料を、０．２μｍのシリンジフィルター（ＰＡＬＬ ＧＨＰ膜）を通過させてＨＰＬＣバイアルに入れた。ＨＰＬＣ実行条件は次の通りであった。
注入容量：１０μＬ
流速：０．８０ｍＬ／分
実行時間：３２分
カラム温度：５０℃
検出器：屈折率
検出器温度：４０℃
ＵＶ検出：２１０ｎｍ、４ｎｍの帯域幅

実行後、試料中の濃度を、各化合物について標準曲線から測定した。保持時間は、イソブタノールおよびグルコースに対して２７．０分および８．７分であった。

実施例１
溶媒のスクリーニング
本実施例の目的は、さまざまな有機溶媒を、ブタノールの抽出発酵での使用についてスクリーニングすることであった。検討した溶媒特性は、溶媒と水相の間でのイソブタノールの分配、二相系における溶媒のエマルジョン形成傾向、および溶媒の野生型サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株との生体適合性であった。

水と次の溶媒、すなわちオレイン酸（ＣＡＳ番号１１２−８０−１）、オレイルアルコール（ＣＡＳ番号１４３−２８−２）、オクタン酸（ＣＡＳ番号１２４−０７−２）、１−ノナノール（ＣＡＳ番号２８４７３−２１−４）、１−ドデカノール（ＣＡＳ番号１１２−５３−８）、１−ノナナール（ＣＡＳ番号１２４−１９−６）、および１−デカノール（ＣＡＳ番号１１２−３０−１）との間のイソブタノールの分配について検討した。イソブタノールを水に加え、１０、３０、５０、および７０ｇ／Ｌの最終イソブタノール濃度を有する水溶液を得た。これらの水性ブタノール溶液（１２ｍＬ）を試験管に加え、試験対象の４ｍＬの溶媒を加えた。各溶媒を、各イソブタノール濃度で２通りに試験した。試験管を、３０℃で混合しながら３時間インキュベートした。その時間後、水相および溶媒相を、遠心分離によって各試験管から分離し、本明細書中の上の一般的方法の項に記載のＧＣ法を用いてイソブタノールについて分析した。各溶媒相と水相の間のイソブタノールにおける分配係数（すなわちすなわちＫｐ＝［イソブタノール］_Ｏｒｇ／［イソブタノール］_Ａｑ）を計算した。結果を表２にまとめる。

表中のデータからわかるように、試験されるすべての溶媒は、イソブタノールにおける好ましい分配係数を有した。

各溶媒の生体適合性を、ＡＴＣＣから得たサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４１での振とうフラスコ試験を用いて判定した。７００ｍＬの酵母抽出物／ペプトン／デキストロース（ＹＰＤ）培地を含有するシード振とうフラスコに２００μＬのＳ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４１接種材料を接種し、ＯＤ_６００が約０．５に達するまで、２５０ｒｐｍで振とうしながら、３０℃で一晩インキュベートした。試料を、分光光度計を使用するＯＤ_６００およびＨＰＬＣを使用するグルコース濃度の測定のため、培養物から回収した。

得られたシード培養物を、以下のように８つの１２５ｍＬのフラスコに分けた。対照としての役割を果たす１つのフラスコに、１００ｍＬのシード培養物を加えた。残りの７つのフラスコに、試験対象の７５ｍＬのシード培養物および２５ｍＬの溶媒を加えた。フラスコを、卓上シェーカー（Ｉｎｎｏｖａ ４２３０，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ））において２５０ｒｐｍで振とうしながら、３０℃でインキュベートし、試料を、さまざまな時間に各フラスコから回収し、ＯＤ_６００およびグルコース濃度を測定した。結果を表３および４にまとめる。

表３および４中の結果からわかるように、オレイン酸、オレイルアルコール、および１−ドデカノールの存在下で成長したＳ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、溶媒を伴わない対照とほぼ同じレベルのグルコース利用および成長を示し、これは、これらの溶媒が試験されるＳ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株と生体適合性があることを示す。溶媒のオクタン酸、１−ノナナール、１−デカノール、およびノナノールのすべてが、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株の成長およびグルコース利用を阻害した。

実施例２および実施例３（比較）
イソブタノールおよびオレイルアルコールの存在下でのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の成長
これら実施例の目的は、オレイルアルコールがイソブタノールの毒性をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対して弱めることを示すことであった。野生型サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４１株のグルコース消費速度および成長速度を、オレイルアルコールの存在下（実施例２）およびオレイルアルコールの不在下（実施例３、比較）で、高濃度のイソブタノールを含有する振とうフラスコの培養物中で測定した。

６００ｍＬのＹＰＤ培地を含有する３つのシード振とうフラスコに、１００、３００、および１０００μＬのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４１接種材料をそれぞれ接種した。フラスコを、ＯＤ_６００が約０．１に達するまで、２５０ｒｐｍで振とうしながら、３０℃で一晩インキュベートした。試料を各培養物から回収し、ＯＤ_６００およびグルコース濃度を上記のように測定した。

１２５ｍＬのフラスコに、３００μＬの接種材料に由来する１００ｍＬの培養物を加えた（実施例３、比較）。別の１２５ｍＬのフラスコに、７５ｍＬの培養物および２５ｍＬのオレイルアルコール（すなわち２５ｖｏｌ％）を加えた（実施例２）。フラスコを、１００ｒｐｍで振とうしながら、３０℃でインキュベートした。試料を、ＯＤ_６００およびグルコースの測定のために回収した。ＯＤ_６００が約０．４に達したとき、イソブタノールを、両方のフラスコに、最終濃度が水相の３０ｇ／Ｌになるまで加えた。７５ｍＬの培養物および２５ｖｏｌ％のオレイルアルコールを含有するが、イソブタノールが全く添加されていない第３のフラスコは、陽性対照としての役割を果たした。試料を、ＯＤ_６００およびグルコース濃度の測定のため、さまざまな時間にすべてのフラスコから回収した。光学密度結果およびグルコース結果を、表５および６にそれぞれ示す。

表５および６中のデータからわかるように、オレイルアルコールの不在下、３０ｇ／Ｌの濃度でのイソブタノール（実施例３、比較）は、グルコース利用およびバイオマス成長をほぼ完全に阻害した。しかし、オレイルアルコールを培養物に加えたとき、培養物は、成長し、イソブタノールの存在下、３０ｇ／Ｌの濃度で、グルコースを利用することができた。イソブタノールおよびオレイルアルコールを含有する培養物の成長およびグルコース利用速度は、オレイルアルコールのみを含有する対照のそれらに匹敵した。これらの結果は、オレイルアルコールが、イソブタノールの毒性を試験されるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株に対して弱めることを示す。オレイルアルコールを使用し、他のブタノール同様、イソブタノールの毒性が、組換え株を含むサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の他の株に対して弱められると予想する場合、それは理にかなうこととなる。

実施例４および実施例５（比較）
イソブタノールおよびオレイルアルコールの存在下でのラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の成長
これらの実施例の目的は、オレイルアルコールがイソブタノールの毒性をラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に対して弱めることを示すことであった。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株ＰＮ０５１２のグルコース消費速度および成長速度を、オレイルアルコールの存在下（実施例４）およびオレイルアルコールの不在下（実施例５、比較）で、高濃度のイソブタノールを含有する振とうフラスコの培養物中で測定した。

５０ｍＬのｄｅ Ｍａｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）培地を含有する３つのシード振とうフラスコに、２００、５００、および１０００μＬのラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株ＰＮ０５１２接種材料（ＡＴＣＣ：ＰＴＡ−７７２７、米国特許出願第１１／７６１４９７号明細書において２００６年７月１２日に行われた生物学的寄託物）をそれぞれ接種した。フラスコを、ＯＤ_６００が２〜５の間になるまで、２５０ｒｐｍで振とうしながら、３０℃で一晩インキュベートした。６００ｍＬのＭＲＳ培地を含有する１Ｌのフラスコに、初期ＯＤ_６００＝０．１に対してＯＤ_６００＝３を有する上記シードフラスコの１つから接種し、それを１８０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で培養した。培養の４〜５時間後、ＯＤ_６００は０．５〜１．０の間であった。試料を各培養物から回収し、ＯＤ_６００およびグルコース濃度を上記のように測定した。

１２５ｍＬのフラスコに、上記の１Ｌのフラスコからの１００ｍＬの培養物を加えた（実施例３、比較）。別の１２５ｍＬのフラスコに、７５ｍＬの培養物および２５ｍＬのオレイルアルコール（すなわち２５ｖｏｌ％）を加えた（実施例２）。フラスコを、１００ｒｐｍで振とうしながら、３０℃でインキュベートした。試料を、ＯＤ_６００およびグルコース測定のため、回収した。ＯＤ_６００が約１．５に達したとき、イソブタノールを、最終濃度が水相の３０ｇ／Ｌになるまで両方のフラスコに加えた。７５ｍＬの培養物および２５ｖｏｌ％のオレイルアルコールを含有するが、イソブタノールを全く加えない第３のフラスコは、陽性対照としての役割を果たした。試料を、ＯＤ_６００およびグルコース濃度の測定のため、さまざまな時間にすべてのフラスコから回収した。光学密度結果およびグルコース結果を、それぞれ表７および８に示す。

表７および８中のデータからわかるように、オレイルアルコールの不在下、３０ｇ／Ｌの濃度でのイソブタノール（実施例３、比較）は、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株のグルコース利用およびバイオマス成長をほぼ完全に阻害した。しかし、オレイルアルコールを培養物に加えたとき、培養物は、イソブタノールの存在下、３０ｇ／Ｌの濃度で、成長し、グルコースを利用することができた。イソブタノールおよびオレイルアルコールを含有する培養物の成長およびグルコース利用速度は、オレイルアルコールのみを含有する対照のそれらに匹敵した。これらの結果は、オレイルアルコールがイソブタノールの毒性を試験されるラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の株に対して弱めることを示す。オレイルアルコールを使用し、イソブタノールおよび他のブタノールの毒性を、組換え株を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の他の株に対して弱められると予想する場合、それは理にかなうこととなる。

実施例６
抽出発酵を使用する組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）によるイソブタノールの生成
本実施例の目的は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の組換え株によるイソブタノールの生成が、水不混和性の有機抽出剤としてのオレイルアルコールでの抽出発酵を使用するイソブタノール生合成経路を有することを示すことであった。

使用した株は、本明細書中の上記の一般的方法の項で記載のように作成した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＮＧＣＩ−０３１であった。接種材料の調製におけるすべてのシード培養物を、選択抗生物質としてアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で成長させた。発酵培地は半合成培地であり、その組成物を表９に示す。

表９からの成分１〜１０を、所定濃度で水に加え、発酵槽内での最終容量を１．５Ｌにした。発酵槽の内容物をオートクレーブによって滅菌した。オートクレーブ培地を冷却した上で、成分１１〜１３を、混合し、濾過滅菌し、次いで発酵槽に加えた。発酵培地（水相）の全最終容量は約１．６Ｌであった。

２．０Ｌの作動容量を有するＢｉｏｓｔａｔ−Ｂ ＤＣＵ−３発酵槽（Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｍｅｌｅｓｕｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用して、発酵を行った。全発酵の間、温度を３０℃で維持し、水酸化アンモニウムを使用してｐＨを６．８に維持した。シード培養物（２〜１０ｖｏｌ％）を無菌発酵培地に接種後、発酵槽を、撹拌速度（ｒｐｍ）の自動制御により、０．５ｖｖｍの気流を伴う３０％の溶解酸素（ＤＯ）の設定点で好気的に作動させた。一旦、所望される光学密度（ＯＤ_６００）に達すると（すなわちＯＤ_６００＝１０）、培養物を０．４〜０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導し、イソブタノール生合成経路を過剰発現させた。誘導の４時間後、発酵条件を、撹拌器速度を２００ｒｐｍに低下させることにより、微好気的条件に変更した。微好気的条件への変更により、バイオマス生成用の炭素の量を最小化しながらイソブタノールの生成が開始され、それによりバイオマスの形成とイソブタノールの生成が脱共役された。オレイルアルコール（約７８０ｍＬ）をイソブタノール生成段階中に加え、水相中でのイソブタノールの形成に起因する阻害の問題を緩和した。グルコースを発酵槽にボーラス（５０ｗｔ％のストック溶液）として加え、グルコースのレベルを３０ｇ／Ｌ〜２ｇ／Ｌの間で保持した。

イソブタノールの効率的生成には、生合成経路内でのレドックス均衡を可能にする微好気的条件が要求されることから、空気を発酵槽に０．５ｖｖｍで連続的に供給した。連続的吸気により、発酵槽の水相からのイソブタノールの有意なストリッピングが生じた。ストリッピングに起因するイソブタノールの損失を定量するため、発酵槽からの排気を冷却（６．５℃）水トラップを通してスパージし、イソブタノールを濃縮し、次いでそれを、本明細書中の上記の一般的方法の項に記載のように、ＧＣ法を用いて定量した。あるいは、発酵槽から流出される気流を、質量分析計（Ｐｒｉｍａ ｄＢ質量分析計、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））に直接送り、気流中のイソブタノールの量を定量した。７４または４２の質量対電荷比でのイソブタノールのピークを、連続的に監視し、気流中のイソブタノールの量を定量した。

イソブタノールの生成においては、有効力価、有効速度、および有効収率（いずれもストリッピングに起因するイソブタノールの損失に対して補正された）は、それぞれ３７ｇ／Ｌ、０．４０ｇ／Ｌ／ｈ、および０．３３ｇ／ｇであった。これらの結果を抽出剤としてのオレイルアルコールを使用しない場合に得られる結果と比較してわかるように（実施例７（下記の比較）において示される）、イソブタノール生成における抽出発酵においてオレイルアルコールを使用する結果、有意に高い有効力価、有効速度、および有効収率が得られる。細菌宿主に対して有害なイソブタノール生成物を、オレイルアルコール相に連続的に抽出し、水相中のその濃度が低下し、それにより微生物に対する毒性が低下する。さらに、オレイルアルコールは、イソブタノール生成に対して別の予想外の有益な効果を有するように見られる。これはまた、実施例７（比較）との比較によって認められうる。その実施例では、ガスストリッピング単独でイソブタノールが発酵培地から連続的に除去され、発酵培地中のイソブタノール濃度が、最大で約８〜１０ｇ／Ｌ（すなわちオレイルアルコールでの抽出とガスストリッピングを併用して認められるレベルに匹敵するレベル）に制限された（図１参照）。両方の実施例では、イソブタノール濃度は、発酵の大部分において阻害レベル未満であった。しかし、オレイルアルコール抽出発酵とガスストリッピングの併用の場合（実施例６）、ガスストリッピング単独の場合（実施例７）より有意に高いイソブタノール有効力価、有効速度、および有効収率が得られたが、これはオレイルアルコールがイソブタノールの生成に対して別の予想外の有益な効果を有することを示唆する。

実施例７（比較）
抽出剤の添加を伴わない発酵を用いる、組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）によるイソブタノールの生成
本比較実施例の目的は、オレイルアルコールの添加を伴わない場合、イソブタノールの生成が生成物の毒性によって阻害されることを示すことであった。

発酵を、オレイルアルコールをイソブタノールの生成段階中に発酵培地に加えない点を除き、実施例６に記載のように行った。さらに、次の変更を行った。ＯＤ_６００が６に達した時、培養物をＩＰＴＧに添加によって誘導し、誘導の３時間後、微好気的条件への変更を行った。ストリッピングによるイソブタノールの損失の量を定量するため、発酵槽からの排気を質量分析計（Ｐｒｉｍａ ｄＢ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））に直接送った。７４または４２の質量対電荷比でのイソブタノールのピークを、連続的に監視し、ストリッピングに起因するイソブタノールの損失を定量した。

イソブタノールの生成においては、有効力価、有効速度、および有効収率（いずれもストリッピングに起因するイソブタノールの損失に対して補正された）は、それぞれ１３ｇ／Ｌ、０．２１ｇ／Ｌ／ｈ、および０．２２ｇ／ｇであった。イソブタノールがガスストリッピングによって発酵培地から連続的に除去されたことから、発酵中での水相中のイソブタノール濃度は最大で８〜１０ｇ／Ｌに制限され、発酵の大部分において実際には阻害レベル未満であった（図１参照）。

実施例８
抽出発酵を用いる、組換えサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるイソブタノールの生成
本実施例の目的は、水不混和性有機抽出剤としてオレイルアルコールを伴う抽出発酵を用いる、イソブタノール生合成経路を有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の組換え株によるイソブタノールの生成について示すことであった。

使用した株は、本明細書中の上記の一般的方法の項に記載のように作成したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＮＧＣＩ−０４９であった。接種材料の調製のためのすべてのシード培養物を、アミノ酸ドロップアウト混合物（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｒｏｐｏｕｔ ｍｉｘ）（１．４ｇ／Ｌ）、ロイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびトリプトファン（２０ｍｇ／Ｌ）を補充した、アミノ酸培地を有しない酵母窒素塩基（ＹＮＢ）（６．７ｇ／Ｌ）中で成長させた。１％（ｖ／ｖ）でのエタノールを、すべてのシード培養物のための唯一の炭素源として使用した。発酵培地は半合成培地であり、その組成物を表１１に示す。

表１１からの成分１〜４を所定の濃度で水に加え、発酵槽内の最終容量を０．５４Ｌにした。発酵槽の内容物を、オートクレーブによって滅菌した。オートクレーブ培地を冷却した後、成分５および６を、混合し、濾過滅菌し、発酵槽に加えた。発酵培地（水相）の全最終容量は約０．５４Ｌであった。

作動容量が９００ｍＬの１Ｌのオートクレーブ可能なバイオリアクターＢｉｏ Ｃｏｎｓｏｌｅ ＡＤＩ １０２５（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｉｎｃ（Ｈｏｌｌａｎｄ））を使用して、発酵を行った。温度を、全発酵の間、３０℃で維持し、水酸化ナトリウムを使用してｐＨを５．５で維持した。無菌発酵培地へのシード培養物（１０ｖｏｌ％）の接種後、発酵槽を、撹拌速度（ｒｐｍ）の自動制御により、０．３ｖｖｍの気流を伴う３０％の溶解酸素（ＤＯ）の設定点で好気的に作動させた。一旦、バッチされた２ｇ／Ｌの初期グルコースが消費されると、グルコースを、発酵槽内でグルコースの蓄積が決して０．２ｇ／Ｌを超えない程度の指数的速度でポンプを使用して供給した。一旦、所望される光学密度（ＯＤ_６００）に達すると（すなわちＯＤ_６００＝６）、培養物を、過剰なグルコース（＞２ｇ／Ｌ）が発酵中、常時維持されるようにグルコースを供給することにより、イソブタノール生成段階に誘導した。グルコース過剰の２時間後、６０ｍＬの濾過滅菌した１０×Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｐｅｐｔｏｎｅストック溶液（１０×ＹＥＰ＝１００ｇ／Ｌの酵母抽出物および２００ｇ／Ｌのペプトン）を加えた。ＹＥＰ添加の２時間後、オレイルアルコール（約３００ｍＬ）を、イソブタノール生成段階中に加え、水相中でのイソブタノールおよび他の副生成物の形成に起因する阻害の問題を緩和した。グルコースを発酵槽に加え（５０ｗｔ％のストック溶液）、グルコースのレベルを２ｇ／Ｌ超で保持した。

イソブタノールの効率的生成には、生合成経路内でのレドックス均衡を可能にする微好気的条件が要求されることから、空気を発酵槽に０．５ｖｖｍで連続的に供給した。連続的吸気により、発酵槽の水相からのイソブタノールの有意なストリッピングが生じた。ストリッピングに起因するイソブタノールの損失を定量するため、発酵槽からの排気を、質量分析計（Ｐｒｉｍａ ｄＢ質量分析計、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））に直接送り、気流中のイソブタノールの量を定量した。７４または４２の質量対電荷比でのイソブタノールのピークを、連続的に監視し、気流中のイソブタノールの量を定量した。

水相中のグルコースおよび有機酸を、発酵の間、ＨＰＬＣを用いて監視した。グルコースについても、グルコース分析器（ＹＳＩ，Ｉｎｃ．（Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ））を使用して迅速に監視した。２つの相を発酵槽から定期的に除去し、遠心分離によって分離した後、水相中のイソブタノールをＨＰＬＣによって定量し、オレイルアルコール相中のイソブタノールを、本明細書中の上記の一般的方法の項に記載のＧＣ法を用いて監視した。発酵中の水相中のイソブタノールの濃度を図２に示し、ここでは黒四角（■）は、有機抽出剤としてのオレイルアルコールとガスストリッピングを併用する発酵である実施例８の濃度を示し、黒丸（●）は、ガスストリッピング単独を用いる発酵である実施例９（比較）の濃度を示す。

イソブタノールの生成においては、有効力価、有効速度、および有効収率（いずれもストリッピングに起因するイソブタノールの損失に対して補正された）は、それぞれ５ｇ／Ｌ、０．０６ｇ／Ｌ／ｈ、および０．１６ｇ／ｇであった。これらの結果を抽出剤としてのオレイルアルコールを使用しない場合に得られる結果と比較してわかるように（実施例９（下記の比較）において示される）、イソブタノール生成における抽出発酵においてオレイルアルコールを使用する結果、有意に高い有効力価、有効速度、および有効収率が得られる。宿主に対して有害なイソブタノール生成物を、オレイルアルコール相に連続的に抽出し、水相中のその濃度が低下し、それにより微生物に対する毒性が低下する。さらに、オレイルアルコールは、イソブタノール生成に対して別の予想外の有益な効果を有するように見られる。これはまた、実施例９（比較）との比較によって認められうる。その実施例では、ガスストリッピング単独でイソブタノールが発酵培地から連続的に除去され、発酵培地中のイソブタノール濃度が、最大で約４ｇ／Ｌ（すなわちオレイルアルコールでの抽出とガスストリッピングを併用して認められるレベルに匹敵するレベル）に制限された（図２参照）。両方の実施例では、イソブタノール濃度は、発酵の大部分において阻害レベル未満であった。しかし、オレイルアルコール抽出発酵とガスストリッピングの併用の場合（実施例８）、ガスストリッピング単独の場合（実施例９）より有意に高いイソブタノール有効力価、有効速度、および有効収率が得られたが、これはオレイルアルコールがイソブタノールの生成に対して別の予想外の有益な効果を有することを示唆する。

実施例９（比較）
抽出剤の添加を伴わない発酵を用いる、組換えサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるイソブタノールの生成
本比較実施例の目的は、オレイルアルコールの添加を伴わない場合、イソブタノールの生成が生成物の毒性によって阻害されることを示すことであった。

発酵を、オレイルアルコールをイソブタノールの生成段階中に発酵培地に加えない点を除き、実施例８に記載のように行った。ストリッピングによるイソブタノールの損失の量を定量するため、発酵槽からの排気を質量分析計（Ｐｒｉｍａ ｄＢ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））に直接送った。７４または４２の質量対電荷比でのイソブタノールのピークを、連続的に監視し、ストリッピングに起因するイソブタノールの損失を定量した。

イソブタノールの生成においては、有効力価、有効速度、および有効収率（いずれもストリッピングに起因するイソブタノールの損失に対して補正された）は、それぞれ３ｇ／Ｌ、０．０４ｇ／Ｌ／ｈ、および０．１６ｇ／ｇであった。イソブタノールがガスストリッピングによって発酵培地から連続的に除去されたことから、発酵中での水相中のイソブタノール濃度は、最大で２〜３ｇ／Ｌに制限され、発酵の大部分において実際には阻害レベル未満であった（図２参照）。

実施例１０
２Ｌの発酵槽を使用して、バッチされた初期オレイルアルコールの一部が除去され、新しいオレイルアルコールと交換される点以外では実施例８と同様の、イソブタノールを生成する組換え酵母を使用して発酵を行ってもよい。このプロセスは、発酵槽内のオレイルアルコールの量が全発酵プロセスの間に一定を保たれるように、新しいオレイルアルコールが徐々に漏れ、使用済みオレイルアルコールが吐出される場合、連続モードで実行してもよい。発酵からの生成物および副生成物のかかる連続抽出により、有効速度、力価および収率が増加しうる。

Claims (23)

1. 発酵培地からブタノールを回収するための方法であって、
   ａ）ブタノール、水、および少なくとも１つの発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生産する遺伝子組換え微生物を含む発酵培地を備えるステップと、
   ｂ）発酵培地を、ｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルデヒドおよびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの第１の水不混和性有機抽出剤、および場合により（ｉｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルデヒドおよびそれらの混合物からなる群から選択される第２の水不混和性有機抽出剤と接触させ、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成させるステップと、
   ｃ）ブタノール含有有機相を水相から分離するステップと、
   ｄ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収して回収ブタノールを生産するステップと、
   を含む、方法。
2. ブタノールはイソブタノールである、請求項１に記載の方法。
3. 有機抽出剤は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、１−ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリンアルデヒド、２−メチルウンデカナールおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 有機抽出剤は、オレイルアルコールを含む、請求項３に記載の方法。
5. ブタノールの一部は、
   ａ）ブタノールを、発酵培地から気体と共にストリッピングし、ブタノール含有気相を形成させるステップと、
   ｂ）ブタノールをブタノール含有気相から回収するステップと、
   を含むプロセスにより、発酵培地から同時に取り出される、請求項１に記載の方法。
6. 回収ブタノールは、発酵培地の少なくとも約３７ｇ／Ｌの有効力価を有する、請求項１に記載の方法。
7. 発酵培地はエタノールをさらに含有し、かつブタノール含有有機相はエタノールを含有する、請求項１に記載の方法。
8. ブタノールを生産するための方法であって、
   ａ）少なくとも１つの発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生産する遺伝子組換え微生物を備えるステップと、
   ｂ）微生物を、水相と、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される水不混和性有機抽出剤とを含む二相発酵培地中で増殖させるステップであって、ここで該二相発酵培地は、ブタノールの有機抽出剤への抽出を可能にしてブタノール含有有機相を形成させるのに十分な時間、前記水不混和性有機抽出剤の約３容量％〜約６０容量％を含む、上記ステップと、
   ｃ）ブタノール含有有機相を水相から分離するステップと、
   ｄ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収し、回収ブタノールを生産するステップと、
   を含む、上記方法。
9. ブタノールは、イソブタノールである、請求項８に記載の方法。
10. 有機抽出剤は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、１−ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリンアルデヒド、２−メチルウンデカナールおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
11. 有機抽出剤は、オレイルアルコールを含む、請求項８に記載の方法。
12. ブタノールの一部は
    ａ）ブタノールを、発酵培地から気体と共にストリッピングし、それによりブタノール含有気相を形成させるステップと、
    ｂ）ブタノールをブタノール含有気相から回収するステップと、
    を含むプロセスにより、発酵培地から同時に取り出される、
    請求項８に記載の方法。
13. 回収ブタノールは、水相の少なくとも約３７ｇ／Ｌの有効力価を有する、請求項８に記載の方法。
14. 発酵培地はエタノールをさらに含有し、かつブタノール含有有機相はエタノールを含有する、請求項８に記載の方法。
15. ブタノールを生産するための方法であって、
    ａ）少なくとも１つの発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生産する遺伝子組換え微生物を備えるステップと、
    ｂ）微生物を発酵培地中で増殖させるステップであって、ここで微生物は、ブタノールを発酵培地中に生産して、ブタノール含有発酵培地を生産する、上記ステップと、
    ｃ）ブタノール含有発酵培地を、ｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルデヒドおよびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの第１の水不混和性有機抽出剤、および場合により（ｉｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルデヒドおよびそれらの混合物からなる群から選択される第２の水不混和性有機抽出剤と接触させ、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成させるステップと、
    ｄ）ブタノール含有有機相を水相から分離するステップと、
    ｅ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収するステップと、
    を含む、上記方法。
16. ブタノールは、イソブタノールである、請求項１５に記載の方法。
17. ブタノールを生産するための方法であって、
    ａ）少なくとも１つの発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生産する遺伝子組換え微生物を備えるステップと、
    ｂ）微生物を、好気的条件下で、予め選択された増殖レベルに達するのに十分な期間、発酵培地中で増殖させるステップと、
    ｃ）微好気的または嫌気的条件に切り替えて、発酵培地へのブタノール生産を刺激して、ブタノール含有発酵培地を形成させるステップと、
    ｄ）ブタノール含有発酵培地を、ｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルデヒドおよびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの第１の水不混和性有機抽出剤、および場合により（ｉｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルデヒドおよびそれらの混合物からなる群から選択される第２の水不混和性有機抽出剤と接触させ、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成させるステップと、
    ｅ）ブタノール含有有機相を水相から分離するステップと、
    ｆ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収するステップと、
    を含む、上記方法。
18. ブタノールは、イソブタノールである、請求項１７に記載の方法。
19. ブタノールを生産するための方法であって、
    ａ）ブタノール、水、および少なくとも１つの発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生産する遺伝子組換え微生物を含む発酵培地を備えるステップと、
    ｂ）発酵培地を、並流または向流の抽出剤流れを介して、ｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルデヒドおよびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの第１の水不混和性有機抽出剤、および場合により（ｉｉ）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルデヒドおよびそれらの混合物からなる群から選択される第２の水不混和性有機抽出剤と接触させ、水相およびブタノール含有有機相を含む二相混合物を形成させるステップと、
    ｃ）ブタノール含有有機相を水相から分離するステップと、
    ｄ）ブタノールをブタノール含有有機相から回収し、回収ブタノールを生産するステップと、
    を含む、上記方法。
20. ブタノールは、イソブタノールである、請求項１９に記載の方法。
21. 遺伝子組換え微生物は、細菌、シアノバクテリア、糸状真菌および酵母からなる群から選択される、請求項１、８、１５、１７および１９のいずれか一項に記載の方法。
22. 細菌は、ザイモモナス、エシェリキア、サルモネラ、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、乳酸桿菌、腸球菌、ペディオコッカス、アルカリゲネス、クレブシエラ、パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウムおよびブレビバクテリウムからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
23. 酵母は、ピキア、カンジダ、ハンゼヌラおよびサッカロミセスからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。

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