KR102148462B1 - 종속영양 미생물유기체로부터 생성된 맞춤 오일 - Google Patents

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Abstract

오일-함유 미생물 유기체 및 이러한 미생물 유기체의 저비용 배양방법을 포함하는, 오일, 연료, 함유화학물질, 및 재조합 미생물 유기체 내 다른 화합물의 생성을 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 예를 들어 리파제, 수크로스 수송체, 수크로스 인버타제, 프럭토키나제, 다당류-분해 효소, 케토 아실-ACP 신타제 효소, 지방 아실-ACP 티오에스터라제, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소, 지방 아실-CoA 환원효소, 지방 알데하이드 환원효소, 지방 알데하이드 데카보닐라제를 함유하는 미세조류 세포, 및/또는 아실 운반체 단백질은 재생 디젤, 바이오디젤, 및 재생 제트 연료와 같은 운송 연료의 제조뿐만 아니라 기능성 유체, 계면활성제, 비누 및 윤활제의 제조에 유용하다.

Description

종속영양 미생물유기체로부터 생성된 맞춤 오일{TAILORED OILS PRODUCED FROM RECOMBINANT HETEROTROPHIC MICROORGANISMS}
관련출원과의 상호참조
본 출원은 미국 특허법(35 U.S.C. 119(e)) 하에서 2010년 5월 28일 출원된 미국 가특허출원 제61/349,774호, 2010년 8월 18일 출원된 미국 가특허출원 제61/374,992호, 2010년 11월 16일 출원된 미국 가특허출원 제61/414,393호, 및 2010년 12월 29일 출원된 미국 가특허출원 제61/428,192호의 우선권을 주장한다. 각각의 이들 출원은 그것의 전문이 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참조로 포함된다.
서열목록에 대한 참조
본 출원은 본 명세서에 첨부된 1 내지 195 페이지에 나타낸 것과 같은 서열목록을 포함한다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 미생물 유기체로부터 만들어진 오일, 연료, 및 함유화학물질(oleochemical)의 생산에 관한 것이다. 특히, 본 명세서는 오일-함유 미세조류(microalgae), 지질, 지방산 에스터, 지방산, 알데하이드, 알코올, 및 알칸을 포함하는 유용한 화합물의 생산을 위해 그것들을 배양하는 방법, 및 그것들을 유전적으로 변경하여 생산 효율을 개선하고 그것들에 의해 생성된 오일의 유형 및 조성을 변경시키는 방법 및 시약에 관한 것이다.
화석연료는 유기물질의 매장된 가연성 퇴적물에 대한 일반적 용어이며, 부패한 식물 및 동물이 수억년에 걸쳐 지각 내 열 및 압력에 노출됨으로써 원유, 석탄, 천연가스 또는 중유로 변환되어 형성된다. 화석연료는 한정된 비-재생 자원이다. 세계 경제에 의해 증가된 에너지 수요는 또한 탄화수소 비용 증가의 압력에 놓여있다. 에너지 이외에, 플라스틱 및 화학물질 제조자를 포함하는 다수의 산업은 그들의 공정을 위한 공급원료로서 탄화수소의 유용성에 크게 의존한다. 현존하는 공급원에 대해 비용-효과적인 대체물은 증가하는 에너지 및 이들 원료 비용상의 압력을 완화시킬 수 있었다.
국제특허 공개 제2008/151149호는 오일생성을 위한 미세조류 배양 방법 및 재료를 기재하며, 특히 미세조류 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides)에 의해 생성된 오일로부터 디젤 연료의 생성을 예시한다. 미세조류 내 오일 생성을 위한 개선된 방법, 특히 더 짧은 쇄 길이 및 더 높은 포화도를 가지며, 색소가 없는 오일을 더 큰 수율과 효율로 생성하는 방법에 대한 필요가 남아있다. 본 방법은 이런 필요를 충족시킨다.
본 발명은 별개의 지질 프로파일을 가지는 유지성 미생물 세포, 바람직하게는 미세조류 세포를 제공하며, 지방-아실 ACP 티오에스터라제와 같은 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 발현시키는 재조합 세포를 포함한다. 본 발명은 또한 이러한 세포로부터 바이오디젤, 재생 디젤 및 제트 연료를 포함하는 지질 및 오일-기재 제품(oil-based product)을 만드는 방법을 제공한다.
제1 양태에서, 본 발명은 적어도 1% 또는 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 3%의 C8:0인 지질 프로파일을 가지는 유지성 미생물 세포, 바람직하게는 미세조류 세포를 제공한다. 일부 경우에, 지질 프로파일은 적어도 10% 또는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 12%, C8:0이다. 일부 실시형태에서, 세포는 재조합 세포이다. 일부 경우에, 재조합 세포는 쇄 길이 C8의 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수분해 활성을 가지는 아실-ACP 티오에스터라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 유전자는 쿠페아 팔루스트리스(Cuphea palustris) 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화한다. 일부 경우에, 세포는 프로토테카(prototheca) 세포이다. 일부 경우에, 세포는 표 1에서 확인되는 미세조류로부터 선택되는 미세조류 속 또는 종을 가진다.
제2 양태에서, 본 발명은 적어도 4%의 C10:0인 지질 프로파일을 가지는 유지성 미생물 세포, 바람직하게는 미세조류 세포를 제공한다. 일부 경우에, 지질 프로파일은 적어도 20%, 적어도 25% 또는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 24%, C10:0이다. 일부 경우에, C10:0 대 C12:0의 비는 적어도 6:1이다. 일부 실시형태에서, 세포는 재조합 세포이다. 일부 경우에, 재조합 세포는 쇄 길이 C10의 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수분해 활성을 가지는 아실-ACP 티오에스터라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 유전자는 쿠페아 후커리아나(Cuphea hookeriana) 및 미국 느릅나무(Ulmus americana)로 이루어진 군으로부터 선택된 종으로부터의 아실-ACP 티오에스터라제 단백질을 암호화한다. 일부 경우에, 세포는 프로노테카 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 표 1에서 확인되는 미세조류로부터 선택된 미세조류속 또는 종을 가진다.
제3 양태에서, 본 발명은 적어도 10% 또는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 13%, C12:0인 지질 프로파일을 가지는 유지성 미생물 세포, 바람직하게는 미세조류 세포를 제공한다. 일부 경우에, 지질 프로파일은 적어도 30%, 적어도 35% 또는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 34%, C12:0이다. 일부 경우에, C12 대 C14의 비는 적어도 5:1이다. 일부 경우에, 세포는 재조합 세포이다. 일부 실시형태에서, 재조합 세포는 쇄 길이 C12의 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수분해 활성을 가지는 아실-ACP 티오에스터라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 재조합 세포는 쇄 길이 C12의 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수분해 활성을 가지는 캘리포니아 월계수(Umbellularia californica) 및 녹나무(Cinnamomum camphora)로부터의 아실-ACP 티오에스터라제 단백질을 암호화하는 적어도 2개의 외인성 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 프로토테카 세포이다.
제4양태에서, 본 발명은 적어도 5% 또는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 10%, C14:0인 지질 프로파일을 가지는 유지성 미생물 세포, 바람직하게는 미세조류 세포를 제공한다. 일부 경우에, 지질 프로파일은 적어도 40%, 적어도 45%, 또는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 43%, C14:0이다. 일부 경우에, C14:0 대 C12:0의 비는 적어도 7:1이다. 일부 경우에, 세포는 재조합 세포이다. 일부 실시형태에서, 재조합 세포는 장쇄 C14의 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수분해 활성을 가지는 아실-ACP 티오에스터라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아실-ACP 티오에스터라제 단백질은 녹나무 및 미국 느릅나무로 이루어진 군으로부터 선택된 종으로부터 유래된다. 일부 경우에, 세포는 프로토테카 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 표 1에서 확인되는 미세조류로부터 선택된 미세조류 속 또는 종을 가진다.
제5 양태에서, 본 발명은 적어도 10% 또는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 15%, C16:0인 지질 프로파일을 가지는 유지성 미생물 세포, 바람직하게는 미세조류 세포를 제공한다. 일부 경우에, 지질 프로파일은 적어도 30%, 적어도 35% 또는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 37%, C16:0. 일부 경우에, 세포는 재조합 세포이다. 일부 실시형태에서, 재조합 세포는 쇄 길이 C16의 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수분해 활성을 가지는 아실-ACP 티오에스터라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 세포는 쇄 길이 C16의 지방 아실-ACP 기질에 대한 가수분해 활성을 가지는 캘리포니아 월계수 및 녹나무로부터의 아실-ACP 티오에스터라제 단백질을 암호화하는 적어도 2개의 외인성 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 세포는 프로토테카 세포이다.
제6 양태에서, 본 발명은 적어도 55% 또는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 60%, 포화 지방산인 지질 프로파일을 가지는 유지성 미생물 세포, 바람직하게는 미세조류 세포를 제공한다. 일부 경우에, 세포는 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 86%, 포화된 지방산인 지질 프로파일을 가진다. 일부 경우에, 세포는 재조합 세포이다. 일부 실시형태에서, 재조합 세포는 쇄 길이 C10-C16의 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수분해 활성을 가지는 아실-ACP 티오에스터라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 케토아실 신타제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 세포는 프로토테카 세포이다.
제7 양태에서, 본 발명은 돌연변이된 내인성 불포화효소 유전자를 포함하는, 유지성 미생물 세포, 바람직하게는 미세조류 세포를 제공하되, 해당 돌연변이는 유전자 또는 불포화효소 불활성을 제공한다. 일부 경우에, 세포는 적어도 40% 또는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 45%, 포화된 지방산인 지질 프로파일을 가진다. 일부 경우에, 세포는 적어도 15%, 적어도 20% 또는 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 19%, C18:0인 지질 프로파일을 가진다. 일부 실시형태에서, 세포는 야생형 세포와 비교하여 C18:0 지방산에서 적어도 2배 증가를 초래하는 돌연변이된 내인성 불포화효소를 포함한다. 일부 경우에, 미세조류 세포는 1% 이하 또는 5% 이하, 바람직하게는 2% 이하, C18:2인 지질 프로파일이다. 일부 실시형태에서, 미세조류 세포는 5% 이하, 또는 10% 이하, 바람직하게는 7%, 18:1인 지질 프로파일을 가진다.
본 명세서에 논의되는 재조합 세포의 일부 실시형태에서, 해당 세포는 돌연변이된 내인성 불포화효소 유전자를 포함하되, 해당 돌연변이는 유전자 또는 불포화효소 불활성을 제공한다.
제8 양태에서, 본 발명은 지질 제조 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 (a) 상기 세포가 건조중량으로 적어도 15% 또는 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 20%의 지질일 때까지 상기 논의한 세포를 배양하는 단계, 및 (b) 수용성 바이오매스 성분으로부터 지질을 분리하는 단계를 포함한다.
제9 양태에서, 본 발명은 다른 지질 제조방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 방법은 (a) 두 개의 별개의 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 외인성 유전자를 함유하는 유지성 미생물, 바람직하게는 미세조류 세포를 배양하는 단계(해당 세포의 지질 프로파일은 (i) 외인성 유전자가 없는 세포의 프로파일, 및 (ii) 외인성 유전자 중 단지 하나를 가지는 세포의 프로파일과 다름), (b) 수용성 바이오매스 성분으로부터 지질을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 외인성 유전자 중 적어도 하나는 표 4에서 확인된 티오에스터라제로 이루어진 군으로부터 선택된 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화한다.
제10 양태에서, 본 발명은 오일-기재 제품을 만드는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 해당 방법은 (a) 세포가 건조중량으로 적어도 5% 또는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 10%의 지질이 될 때까지 상기 논의한 바와 같은 세포를 배양하는 단계, (b) 수용성 바이오매스 성분으로부터 지질을 분리하는 단계, 및 (c) 지질에 비누화, 복분해; 산 가수분해; 알칼리 가수분해; 효소적 가수분해; 촉매적 가수분해; 열간 압수(hot-compressed water) 가수분해; 촉매적 가수분해 반응(해당 지질은 글라이세롤 및 지방산으로 분할된다); 지방 질소 화합물을 생성하기 위한 아미노화 반응; 1염기성 및 2염기성-산을 생성하기 위한 오존분해 반응; 효소적 분열 및 압력 분열로 이루어진 군으로부터 선택된 트라이글라이세라이드 분열 반응; 가수분해 반응 다음의 축합 반응; 수소화 처리 반응; 수소화처리 반응 및 탈산소 반응 또는 수소화처리 전 또는 동시에 축합 반응; 기체 제거 반응; 수소화개열반응(hydrogenolysis reaction), 수소화, 연속적 수소화-수소화개열 반응, 연속적 수소화개열반응-수소화 반응, 및 조합된 수소화-수소화개열 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 탈산소 반응; 탈산소 반응 후 축합 반응; 에스터화 반응; 에스터교환 반응(interesterification); 에스터결합전이(transesterification) 반응; 하이드록실화 반응; 및 하이드록실화 반응 후 축합 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화학 반응을 실시하는 단계를 포함하며, 이에 의해 오일-기재 제품이 생성된다.
일부 경우에, 오일-기재 제품은 비누 또는 연료 제품으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 오일-기재 제품은 바이오디젤, 재생 디젤, 및 제트 연료로 이루어진 군으로부터 선택된 연료 제품이다. 일부 경우에, 연료 제품은 다음의 속성 중 하나 이상을 갖는 바이오디젤이다: (i) 0.01-0.5mcg/g, 0.025-0.3mcg/g, 바람직하게는 0.05-0.244mcg/g, 전체 카로테노이드; (ii) 0.01 mcg/g 미만, 0.005 mcg/g 미만, 바람직하게는 0.003 mcg/g 미만, 라이코펜; (iii) 0.01 mcg/g 미만, 0.005 mcg/g 미만, 바람직하게는 0.003 mcg/g 미만, 베타 카로텐; (iv) 0.01-0.5mcg/g, 0.025-0.3mcg/g, 바람직하게는 0.045-0.268mcg/g, 엽록소 A; (v) 1-500mcg/g, 35-175mcg/g, 바람직하게는 38.3-164mcg/g, 감마 토코페롤; (vi) 1% 미만, 0.5% 미만, 바람직하게는 0.25% 미만, 브라시카스테롤, 캄페스테롤, 스티그나스테롤, 또는 베타-시토스테롤; (vii) 100-500mcg/g, 225-350mcg/g, 바람직하게는 249.6-325.3mcg/g, 전체 토코트라이엔올; (viii) 0.001-0.1mcg/g, 0.0025-0.05mcg/g, 바람직하게는 0.003-0.039mcg/g, 루테인; 또는 (ix) 10-500mcg/g, 50-300mcg/g, 바람직하게는 60.8-261.7mcg/g, 토코페롤. 일부 경우에, 연료 제품은 적어도 20℃, 40℃ 또는 60℃의 T10-T90을 가지는 재생 디젤이다. 일부 경우에, 연료 제품은 HRJ-5 및/또는 ASTM 세부항목 D1655를 충족시키는 제트 연료이다.
제11 양태에서, 본 발명은 (a) 적어도 3% C8:0, 적어도 4% C10:0, 적어도 13% C12:0, 적어도 10% C14:0, 및/또는 적어도 60% 포화된 지방산의 지질 프로파일, 및 (b) 다음의 속성 중 하나 이상: (i) 0.01-0.5mcg/g, 0.025-0.3mcg/g, 바람직하게는 0.05-0.244mcg/g, 전체 카로테노이드; (ii) 0.01 mcg/g 미만, 0.005 mcg/g 미만, 바람직하게는 0.003 mcg/g 미만, 라이코펜; (iii) 0.01 mcg/g 미만, 0.005 mcg/g 미만, 바람직하게는 0.003 mcg/g 미만, 베타 카로텐; (iv) 0.01-0.5mcg/g, 0.025-0.3mcg/g, 바람직하게는 0.045-0.268mcg/g, 엽록소 A; (v) 1-300mcg/g, 35-175mcg/g, 바람직하게는 38.3-164mcg/g, 감마 토코페롤; (vi) 1% 미만, 0.5% 미만, 바람직하게는 0.25% 미만, 브라시카스테롤, 캄페스테롤, 스티그나스테롤, 또는 베타-시토스테롤; (vii) 100-500mcg/g, 225-350mcg/g, 바람직하게는 249.6-325.3mcg/g, 전체 토코트라이엔올; (viii) 0.001-0.1mcg/g, 0.0025-0.05mcg/g, 바람직하게는 0.003-0.039mcg/g, 루테인; 또는 (ix) 10-500mcg/g, 50-300mcg/g, 바람직하게는 60.8-261.7mcg/g, 토코페롤을 포함하는 트라이글라이세라이드 오일을 제공한다.
제12 양태에서, 본 발명은 적어도 5:1의 C8:C10 지방산 비를 가지는 미세조류로부터 분리된 오일을 제공한다. 관련된 양태에서, 본 발명은 적어도 50% 내지 75%, 바람직하게는 적어도 60%, 포화된 지방산을 갖는 미세조류로부터 분리된 오일을 제공한다. 다른 관련 양태에서, 본 발명은 약 2:1의 C16:14 지방산 비를 가지는 미세조류로부터 분리된 오일을 제공한다. 또 다른 관련된 양태에서, 본 발명은 적어도 5:1의 C12:C14 지방산 비를 가지는 미세조류로부터 분리된 오일을 제공한다. 일부 실시형태에서, 미세조류는 적어도 하나의 외인성 유전자를 함유한다. 일부 경우에, 미세조류는 프로토테카 속이다.
제13 양태에서, 본 발명은 (a) 5% 미만 또는 2% 미만, 바람직하게는 1% 미만의 지질 프로파일, <C12; 1%-10%, 바람직하게는 2%-7%, C14:0; 20%-35%, 바람직하게는 23%-30%, C16:0; 5%-20%, 바람직하게는 7%-15%, C18:0; 35-60%, 바람직하게는 40-55%, C18:1; 및 1%-20%, 바람직하게는 2-15%, C18:2 지방산; 및 (b) 다음 속성 중 하나 이상: (i) 0.01-0.5mcg/g, 0.025-0.3mcg/g, 바람직하게는 0.05-0.244mcg/g, 총 카르테노이드; (ii) 0.01 mcg/g 미만, 0.005mcg/g, 바람직하게는 0.003 mcg/g 미만, 라이코펜; (iii) 0.01 mcg/g 미만, 바람직하게는 0.005 mcg/g 미만, 0.003 mcg/g 미만, 베타 카로텐; (iv) 0.01-0.5mcg/g, 0.025-0.3mcg/g, 바람직하게는 0.045-0.268mcg/g, 엽록소 A; (v) 1-300mcg/g, 35-175mcg/g, 바람직하게는 38.3-164mcg/g, 감마 토코페롤; (vi) 1% 미만, 0.5%, 바람직하게는 0.25% 미만, 브라시카스테롤, 캄페스테롤, 스티그나스테롤, 또는 베타-시토스테롤; (vii) 100-500mcg/g, 225-350mcg/g, 바람직하게는 249.6-325.3mcg/g, 전체 토코트라이엔올; (viii) 0.001-0.1mcg/g, 0.0025-0.05mcg/g, 바람직하게는 0.003-0.039mcg/g, 루테인; 또는 (ix) 10-500mcg/g, 50-300, 바람직하게는 60.8-261.7mcg/g, 토코페롤을 포함하는 트라이글라이세라이드 오일을 제공한다.
일부 경우에, 트라이글라이세라이드 오일은 하나 이상의 외인성 유전자를 포함하는 미생물로부터 분리된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 유전자는 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화한다. 일부 경우에, 쇄 길이 C14의 지방 아실-ACP 티오에스터라제는 지방 아실-ACP 기질에 대해 가수분해 활성을 가진다. 일부 실시형태에서, 미생물은 돌연변이된 내인성 불포화효소 유전자를 추가로 포함하되, 돌연변이는 유전자 또는 불포화효소 불활성을 제공한다.
제14 양태에서, 본 발명은 5% 미만, 또는 2% 미만, 바람직하게는 1% 미만의 지질 프로파일, <C12; 1%-10%, 바람직하게는 2%-7%, C14:0; 20%-35%, 바람직하게는 23%-30%, C16:0; 5%-20%, 바람직하게는 7%-15%, C18:0; 35%-60%, 바람직하게는 40-55%, C18:1; 및 1%-20%, 바람직하게는 2-15%, C18:2 지방산을 포함하는 트라이글라이세라이드 오일의 생성 방법을 제공하되, 트라이글라이세라이드 오일은 하나 이상의 외인성 유전자를 포함하는 미생물로부터 분리된다. 일부 경우에, 트라이글라이세라이드 오일은 1%-10%, 바람직하게는 3-5%, C14:0; 20%-30%, 바람직하게는 25-27%, C16:0; 5%-20%, 바람직하게는 10-15%, C18:0; 및 35%-50%, 바람직하게는 40-45%, C18:1의 지질 프로파일을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 유전자는 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화한다. 일부 경우에, 지방 아실-ACP 티오에스터라제는 쇄 길이 C14의 지방 아실-ACP 기질에 대한 가수분해 활성을 가진다. 일부 경우에, 미생물은 돌연변이된 내인성 불포화효소 유전자를 추가로 포함하되, 해당 돌연변이는 유전자 또는 불포화효소 불활성을 제공한다. 일부 경우에, 하나 이상의 외인성 유전자는 수크로스 인버타제이다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 내인성 불포화효소 유전자는 스테아로일-아실 운반체 단백질 불포화효소(stearyl-acyl carrier protein desaturase, SAD)(예를 들어, 서열번호 199 내지 200)이다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 내인성 불포화효소 유전자는 지방산 불포화효소(fatty desaturase, FAD)이다.
제15 양태에서, 본 발명은 트라이글라이세라이드 오일을 포함하는 유지성 미생물 세포, 바람직하게는 미세조류 세포를 제공하되, 트라이글라이세라이드 오일의 지방산 프로파일은 적어도 약 1% C8:0, 적어도 약 1% C10:0, 적어도 약 1% C12:0, 적어도 약 2% C14:0, 적어도 약 30% C16:0, 적어도 약 5% C18:0, 적어도 약 60% C18:1, 약 7% 미만의 C18:2, 및 적어도 약 35% 포화된 지방산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 유지성 미생물 세포는 외인성 유전자를 포함하며, 선택적으로 유지성 미생물 세포의 내인성 불포화효소는 더 적은 효소적 활성을 가지도록 불활성화되거나 또는 돌연변이될 수 있었다.
일부 경우에, 트라이글라이세라이드 오일의 지방산 프로파일은 자연적으로 발생하는 오일의 지방산 프로파일과 유사하다. 일부 경우에, 자연적으로 발생하는 오일은 코코아 버터, 코코넛 오일, 팜 오일, 팜커넬 오일, 쉬어 버터, 탤로 및 라드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 트라이글라이세라이드 오일의 지방산 프로파일은 C8:0 및 C10:0의 전체 조합량이 적어도 약 10%이고, C10:0, C12:0, 및 C14:0의 전체 조합량이 적어도 약 50%이며, C16:0, C18:0 및 C18:1의 전체 조합량은 적어도 약 60%이고, C18:0, C18:1 및 C18:2의 전체 조합량은 적어도 약 60%이며, C14:0, C16:0, C18:0 및 C18:1의 전체 조합량은 적어도 약 60%이고, C18:1 및 C18:2의 전체 조합량은 약 30% 미만인 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로파일을 포함한다. 일부 경우에, 트라이글라이세라이드 오일의 지방산 프로파일은 적어도 약 5 대 1의 C8:0 대 C10:0 비, 적어도 약 6 대 1의 C10:0 대 C12:0, 적어도 약 5 대 1의 C12:0 대 C14:0 비, 적어도 약 7:1의 C14:0 대 C12:0, 및 적어도 약 1 내지 2의 C14:0 대 C16:0 비로 이루어진 군으로부터 선택된 지방산의 비를 포함한다.
일부 경우에, 내인성 불포화효소는 스테아릴 ACP 불포화효소 및 델타 12 지방산 불포화효소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 외인성 유전자는 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 외인성 유전자는 표 4에서 확인되는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화한다. 일부 경우에, 유지성 미생물 세포는 수크로스 인버타제를 암호화하는 유전자를 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 유지성 미생물 세포는 아크난데스 오리엔탈리스(Achnanthes orientalis), 아그메넬룸(Agmenellum), 암피프로라 하이알린(Amphiprora hyaline), 암포라 코페이포미스(Amphora coffeiformis), 암포라 코페이포미스 리네아(Amphora coffeiformis linea), 암포라 코페이포미스 펑타타(Amphora coffeiformis punctata), 암포라 코페이포미스 테일로리(Amphora coffeiformis taylori), 암포라 코페이포미스 테누스(Amphora coffeiformis tenuis), 암포라 델리카티시마(Amphora delicatissima), 암포라 델리카티시마 카피타타(Amphora delicatissima capitata), 암포라 속(Amphora sp .), 아나배나(Anabaena), 안키스트로데스무스(Ankistrodesmus), 안키스트로데스무스 팔카투스(Ankistrodesmus falcatus), 보에켈로비아 후글란디(Boekelovia hooglandii), 보로디넬라 속(Borodinella sp .), 보트라이오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 보트라이오코커스 스데티쿠스(Botryococcus sudeticus), 카르테리아(Carteria), 캐토세로스 그라실리스(Chaetoceros gracilis), 캐토세로스 무엘러리(Chaetoceros muelleri), 캐토세로스 무엘러리 서브살숨(Chaetoceros muelleri subsalsum), 캐토세로스 속(Chaetoceros sp .), 클로렐라 아니트라타(Chlorella anitrata), 클로렐라 안탁티카(Chlorella Antarctica), 클로렐라 오레오비리디스(Chlorella aureoviridis), 클로렐라 칸디다(Chlorella candida), 클로렐라 캡슐레이트(Chlorella capsulate), 클로렐라 데시케이트(Chlorella desiccate), 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea), 클로렐라 에머소니(Chlorella emersonii), 클로렐라 푸스카(Chlorella fusca), 클로렐라 푸스카 변종 바큐오라타(Chlorella fusca var. vacuolata), 클로렐라 글루코트로파(Chlorella glucotropha), 클로렐라 인퓨지오눔(Chlorella infusionum), 클로렐라 인퓨지오눔 변종 악토필라(Chlorella infusionum var. actophila), 클로렐라 인퓨지오눔 변종 악세노필라(Chlorella infusionum var. auxenophila), 클로렐라 케슬러리(Chlorella kessleri), 클로렐라 로보포라(Chlorella lobophora)(균주 SAG 37.88), 클로렐라 루테오비리디스(Chlorella luteoviridis), 클로렐라 루테오비리디스 변종 아우레오비리디스(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis), 클로렐라 루테오비리디스 변종 루테센스(Chlorella luteoviridis var. lutescens), 클로렐라 미니아타(Chlorella miniata), 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로렐라 무타빌리스(Chlorella mutabilis), 클로렐라 녹투나(Chlorella nocturna), 클로렐라 파바(Chlorella parva), 클로렐라 포토필라(Chlorella photophila), 클로렐라 프링세이미(Chlorella pringsheimii), 클로렐라 프로토테코이데스(임의의 UTEX 균주 1806, 411, 264, 256, 255, 250, 249, 31, 29, 25, 및 CCAP 균주 211/17 및 211/8d를 포함), 클로렐라 프로토테코이데스 변종 아시디콜라(Chlorella protothecoides var. acidicola), 클로렐라 레글라리스(Chlorella regularis), 클로렐라 레글라리스 변종 미니마(Chlorella regularis var. minima), 클로렐라 레글라리스 변종 엄브리카타(Chlorella regularis var. umbricata), 클로렐라 레이시글라이(Chlorella reisiglii), 클로렐라 사카로필라(Chlorella saccharophila), 클로렐라 사카로필라 변종 엘립소이데아(Chlorella saccharophila var. ellipsoidea), 클로렐라 살리나(Chlorella salina), 클로렐라 심플렉스(Chlorella simplex), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 클로렐라 속(Chlorella sp .), 클로렐라 스패리카(Chlorella sphaerica), 클로렐라 스티그마토포라(Chlorella stigmatophora), 클로렐라 반니엘리(Chlorella vanniellii), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 불가리스 품종 테르티아(Chlorella vulgaris f. tertia), 클로렐라 불가리스 변종 오토트로피카(Chlorella vulgaris var. autotrophica), 클로렐라 불가리스 변종 비리디스(Chlorella vulgaris var. viridis), 클로렐라 불가리스 변종 불가리스(Chlorella vulgaris var. vulgaris), 클로렐라 불가리스 변종 불가리스 품종 테르티아(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia), 클로렐라 불가리스 변종 불가리스 품종 비리디스(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis), 클로렐라 잔텔라(Chlorella xanthella), 클로렐라 조핀지엔시스(Chlorella zofingiensis), 클로렐라 트레복시오이데스(Chlorella trebouxioides), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로로코컴 인퓨시오눔(Chlorococcum infusionum), 클로로코컴 속(Chlorococcum sp .), 클로로고늄(Chlorogonium), 크루모나스 속(Chroomonas sp .), 크립소스패라 속(Chrysosphaera sp .), 크리코스패라 속(Cricosphaera sp .), 크립토모나스 속(Cryptomonas sp .), 사이클로텔라 크립티카(Cyclotella cryptica), 사이클로텔라 메네기니아나(Cyclotella meneghiniana), 사이클로텔라 속(Cyclotella sp .), 두날리엘라 속(Dunaliella sp .), 두날리엘라 바다윌(Dunaliella bardawil), 두날리엘라 바이오쿨라타(Dunaliella bioculata), 두날리엘라 그라눌레이트(Dunaliella granulate), 두날리엘라 마리티메(Dunaliella maritime), 두날리엘라 미누타(Dunaliella minuta), 두날리엘라 파바(Dunaliella parva), 두날리엘라 페이세이(Dunaliella peircei), 두날리엘라 프리몰렉타(Dunaliella primolecta), 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina), 두날리엘라 테리콜라(Dunaliella terricola), 두날리엘라 테티올렉타(Dunaliella tertiolecta), 두날리엘라 비리디스(Dunaliella viridis), 두날리엘라 테르티올렉타(Dunaliella tertiolecta), 에레모스패라 비리디스(Eremosphaera viridis), 에레모스패라 속(Eremosphaera sp .), 엘립소이돈 속(Ellipsoidon sp .), 유글레나(Euglena), 프란세이아 속(Franceia sp .), 프라질라리아 크로토넨시스(Fragilaria crotonensis), 프라질라리아 속(Fragilaria sp .), 글레오캡사 속(Gleocapsa sp .), 글로에오타미니온 속(Gloeothamnion sp .), 하이메노모나스 속(Hymenomonas sp .), 아이소크리시스 아피니스 갈바나(Isochrysis aff . galbana), 아이소크리시스 갈바나(Isochrysis galbana), 레포신클리스(Lepocinclis), 마이크락티늄(Micractinium), 마이크락티늄(Micractinium)(UTEX LB 2614), 모노라피듐 미누툼(MonoraphidiumMinutum), 모노라피둠 속(Monoraphidium sp .), 나노클로리스 속(Nannochloris sp .), 난노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina), 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp .), 나비쿨라 아셉타타(Navicula acceptata), 나비쿨라 비스칸테래(Navicula biskanterae), 나비쿨라 슈도테넬로이데스(Navicula pseudotenelloides), 나비쿨라 펠리쿨로사(Navicula pelliculosa), 나비쿨라 사프로파일라(Navicula saprophila), 나비쿨라 속(Navicula sp .), 네프로클로리스 속(Nephrochloris sp.), 네프로셀미스 속(Nephroselmis sp .), 니츠키아 코뮤니스(Nitschia communis), 니츠키아 알렉산드리나(Nitzschia alexandrina), 니츠키아 코뮤니스(Nitzschia communis), 니츠키아 디시파타(Nitzschia dissipata), 니츠키아 프러츨럼(Nitzschia frustulum), 니츠키아 한츠키아나(Nitzschia hantzschiana), 니츠키아 인컨스피쿠아(Nitzschia inconspicua), 니츠키아 인터메디아(Nitzschia intermedia), 니츠키아 마이크로세팔라(Nitzschia microcephala), 니츠키아 푸실라(Nitzschia pusilla), 니츠키아 퍼실라 엘립티카(Nitzschia pusilla elliptica), 니츠키아 퍼실라 모노엔시스(Nitzschia pusilla monoensis), 니츠키아 쿼드란글라(Nitzschia quadrangular), 니츠키아 속(Nitzschia sp .), 오크로모나스 속(Ochromonas sp .), 오시스티스 파바(Oocystis parva), 오시스티스 퍼실라(Oocystis pusilla), 오시스티스 속(Oocystis sp .), 오실라토리아 림네티카(Oscillatoria limnetic), 오실락토리아 속(Oscillatoria sp .), 오실라토리아 서브브레비스(Oscillatoria subbrevis), 파셰리아 아시도필라(Pascheria acidophila), 파블로바 속(Pavlova sp .), 파구스(Phagus), 포르미디움(Phormidium), 플라티모나스 속(Platymonas sp .), 플레우로크리시스 카르테래(Pleurochrysis carterae), 플레우로크리시스 덴테이트(Pleurochrysis dentate), 플레우로크리시스 속(Pleurochrysis sp .), 프로토테카 윅케르하미(Prototheca wickerhamii), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora), 프로토테카 포르토리센시스(Prototheca portoricensis), 프로토테카 모리포미스(Prototheca moriformis), 프로토테카 좁피(Prototheca zopfii), 파이라미모나스 속(Pyramimonas sp .), 피로보트라이스(Pyrobotrys), 사르시노이드 크리소파이트(Sarcinoid chrysophyte), 센데스무스 아르마투스(Scenedesmus armatus), 스피로지라(Spirogyra), 스피룰리나 플라텐시스(Spirulina platensis), 스티코코커스 속(Stichococcus sp .), 시네코코커스 속(Synechococcus sp .), 테트래드론(Tetraedron), 테트라셀미스 속(Tetraselmis sp .), 테트라셀미스 수에시카(Tetraselmis suecica), 탈라시오시라 웨이스프로기(Thalassiosira weissflogii), 및 비리디엘라 프리데리시아나(Viridiella fridericiana)로부터 선택된 미세조류 속 또는 종의 세포이다.
일부 경우에, 유지성 미생물 세포는 프로토테카 속의 세포이다. 일부 경우에, 유지성 미생물 세포는 프로토테카 모리포미스 속의 세포이다.
일부 경우에, 유지성 미생물 세포는 유지성 효모 세포이다. 일부 경우에, 유지성 미생물 세포는 유지성 박테리아 세포이다.
일부 경우에, 자연적으로 발생하는 오일은 코코아 버터이며 외인성 유전자는 카르타무스 틴토리우스(Carthamus tinctorius) 티오에스터라제 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 자연적으로 발생하는 오일은 코코넛 오일이다. 일부 경우에, 자연적으로 발생하는 오일은 팜 오일이며 외인성 유전자는 인도네시아 기름야자(Elaeis guineensis) 티오에스터라제 유전자, 쿠페아 후커리아나 티오에스터라제 유전자, 쿠페아 후커리아나 KAS IV 유전자 및 쿠페아 라이티(Cuphea wrightii) FATB2 유전자, 또는 내인성 KAS II 유전자를 파괴하도록 설계된 구성체를 포함한다. 일부 경우에, 자연적으로 발생하는 오일은 팜커넬 오일이며, 외인성 유전자는 쿠페아 라이티 FATB2 유전자 및 내인성 SAD2B 유전자를 파괴하도록 설계된 구성체의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 자연적으로 발생하는 오일은 쉬어 버터이다. 일부 경우에, 자연적으로 발생하는 오일은 탤로이다. 일부 경우에, 자연적으로 발생하는 오일은 라드이며, 외인성 유전자는 캘리포니아 월계수 티오에스터라제 유전자와 외인성 SAD2B 유전자를 파괴하도록 설계된 구성체의 조합, 가르시니아 망고스타나(Garcinia mangostana) 티오에스터라제 유전자와 외인성 SAD2B 유전자를 파괴하도록 설계된 구성체의 조합, 브라시카 나푸스 티오에스터라제 유전자, 또는 쿠페아 후커리아나 티오에스터라제 유전자를 포함한다.
제16 양태에서, 본 발명은 유지성 미생물 트라이글라이세라이드 오일 조성물을 제공하되, 해당 트라이글라이세라이드 오일의 지방산 프로파일은 적어도 약 1% C8:0, 적어도 약 1% C10:0, 적어도 약 1% C12:0, 적어도 약 2% C14:0, 적어도 약 30% C16:0, 적어도 약 5% C18:0, 적어도 약 60% C18:1, 약 7% C18:2 미만, 및 적어도 약 35% 포화된 지방산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 실시형태에서, 트라이글라이세라이드 오일 조성물은 배양 배지 내에서 유지성 미생물 세포 또는 재조합 유지성 미생물 세포의 집단을 배양하는 것에 의해 생성되되, 해당 유지성 미생물 세포는 상기 기재한 것, 특히 본 발명의 제15 양태와 관련하여 상기 기재한 것이다.
일부 경우에, 유지성 미생물 트라이글라이세라이드 오일 조성물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 속성을 추가로 포함한다: (i) 0.3 mcg/g 미만 총 카르테노이드; (ii) 0.005 mcg/g 미만 라이코펜; (iii) 0.005 mcg/g 미만 베타 카로텐; (iv) 0.3 mcg/g 미만 엽록소 A; (v) 175 mcg/g 미만 감마 토코페롤; (vi) 0.25% 미만 브라시카스테롤, 캄페스테롤, 스티그나스테롤, 또는 베타-시토스테롤; (vii) 350 mcg/g 미만 전체 토코트라이엔올; (viii) 0.05 mcg/g 미만 루테인; 또는 (ix) 275 mcg/g 미만 토코페롤.
제17 양태에서, 본 발명은 적어도 약 1% C8:0, 적어도 약 1% C10:0, 적어도 약 1% C12:0, 적어도 약 2% C14:0, 적어도 약 30% C16:0, 적어도 약 5% C18:0, 적어도 약 60% C18:1, 7% 미만 C18:2, 및 적어도 약 35% 포화된 지방산으로 이루어진 군으로부터 선택된 지방산 프로파일을 가지는 유지성 미생물 트라이글라이세라이드 오일 조성물을 생성하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 (a) 적어도 10%의 건조 세포 중량의 유지성 미생물 세포가 트라이글라이세라이드 오일이 될 때까지 배양 배지 내에서 유지성 미생물 세포 집단을 배양하는 단계; 및 (b) 유지성 미생물 세포로부터 트라이글라이세라이드 오일 조성물을 분리하는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 트라이글라이세라이드 오일 조성물은 유지성 미생물 세포 또는 상기 기재한 것, 특히 본 발명의 제5 양태와 관련하여 상기 기재한 것과 같은 재조합 유지성 미생물 세포 집단의 배양을 통해 생성된다.
제18 양태에서, 본 발명은 오일-기재 제품의 제조 방법을 제공하되, 해당 방법은 (a) 본 발명의 제16 양태와 관련하여 상기 기재한 것과 같은 유지성 미생물 트라이글라이세라이드 오일 조성물에 비누화, 복분해; 산 가수분해; 알칼리 가수분해; 효소적 가수분해; 촉매적 가수분해; 열간 압수 가수분해; 촉매적 가수분해 반응(해당 지질은 글라이세롤 및 지방산으로 분할된다); 지방 질소 화합물을 생성하기 위한 아미노화 반응; 1염기성 및 2염기성-산을 생성하기 위한 오존분해 반응; 효소적 분열 및 압력 분열로 이루어진 군으로부터 선택된 트라이글라이세라이드 분열 반응; 가수분해 반응 다음의 축합 반응; 수소화 처리 반응; 수소화처리 반응 및 탈산소 반응 또는 수소화처리 전 또는 동시에 축합 반응; 기체 제거 반응; 수소화개열반응, 수소화, 연속적 수소화-수소화개열 반응, 연속적 수소화개열반응-수소화 반응, 및 조합된 수소화-수소화개열 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 탈산소 반응; 탈산소 반응 후 축합 반응; 에스터화 반응; 에스터교환 반응; 에스터결합 전이반응; 하이드록실화 반응; 및 하이드록실화 반응 후 축합 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화학 반응을 실시하는 단계; 및 (b) 다른 성분으로부터 반응 생성물을 분리하는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 오일-기재 제품은 비누, 연료, 절연용제, 유압액, 가소제, 윤활제, 열전달유체, 및 금속 작업 유체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 오일-기재 제품은 (a) 바이오디젤; (b) 재생 디젤; 및 (c) 제트 연료로 이루어진 군으로부터 선택된 연료 제품이다.
일부 경우에, 연료 제품은 다음의 속성 중 하나 이상을 갖는 바이오디젤이다: (i) 0.3 mcg/g 미만 전체 카로테노이드; (ii) 0.005 mcg/g 미만 라이코펜; (iii) 0.005 mcg/g 미만 베타 카로텐; (iv) 0.3 mcg/g 미만 엽록소 A; (v) 175 mcg/g 미만 감마 토코페롤; (vi) 0.25% 미만 브라시카스테롤, 캄페스테롤, 스티그나스테롤, 또는 베타-시토스테롤; (vii) 350 mcg/g 미만 전체 토코트라이엔올; (viii) 0.05 mcg/g 미만 루테인; 또는 (ix) 275 mcg/g 미만 토코페롤.
일부 경우에, 연료 제품은 적어도 20℃, 40℃ 또는 60℃의 T10-T90을 갖는 재생 디젤이다.
일부 경우에, 연료 제품은 HRJ-5 및/또는 ASTM 세부항목 D1655를 충족시키는 제트 연료이다.
본 발명의 이들 및 다른 양태 및 실시형태는 수반하는 도면, 바로 다음의 간단한 설명, 이하의 본 발명의 상세한 설명에 기재되며, 이하의 실시예에서 예시된다. 상기 및 본 명세서를 통해 논의한 임의의 또는 모든 특징은 본 발명의 다양한 실시형태에서 조합될 수 있다.
도 1은 프로토테카 트라이글라이세라이드 오일로부터 생성된 재생 디젤의 크로마토그램.
본 발명은 프로토테카 및 특정 관련 미생물 유기체가 경제적으로 및 다량으로 오일, 연료 및 다른 탄화수소 또는 지질 조성물을 생산하기 위한 예상치 못한 유리한 특성을 가진다는 발견뿐만 아니라 이들 특성을 개선시키는 이들 미생물 유기체를 유전적으로 변경시키기 위한 방법 및 시약의 발견으로부터 발생한다. 이들 미생물 유기체에 의해 생성된 오일은 특히 운송 연료, 함유화학물질 및/또는 식품 및 화장품 산업에 사용될 수 있다. 지질의 에스터결합 전이반응으로 바이오디젤로 유용한 장쇄 지방산 에스터를 수득한다. 다른 효소적 및 화학적 공정은 지방산, 알데하이드, 알코올, 알칸, 및 알켄을 수득하도록 맞춰질 수 있다. 일부 적용에서, 재생 디젤, 제트 연료, 또는 다른 탄화수소 화합물이 생성된다. 본 발명은 또한 증가된 생산성 및 증가된 지질 수율을 위해 및/또는 본 명세서에 설명된 조성물의 더 비용 효과적인 생산을 위해 미세조류를 배양하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이런 상세한 설명은 제공의 편리함을 위해 부분이 나누어진다. 부문 I은 본 명세서에 사용된 용어의 정의를 제공한다. 부분 II는 본 명세서의 방법에 유용한 배양 조건의 설명을 제공한다. 부문 III은 유전자 조작 방법 및 재료의 설명을 제공한다. 부문 IV는 수크로스 이용을 가능하게 하는 미생물 유기체(예를 들어, 프로토테카)의 유전자 조작의 설명을 제공한다. 부문 V는 지질 생합성을 변형하기 위한 미생물 유기체(예를 들어 프로토테카)의 유전자 조작의 설명을 제공한다. 부문 VI은 연료 및 화학물질의 제조방법을 기재한다. 부문 VII은 본 발명의 실시예 및 실시형태를 개시한다. 본 발명의 상세한 설명 다음에는 본 발명의 다양한 양태 및 실시형태를 설명하는 실시예가 제공된다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 경우, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명의 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가진다. 하기의 참조문헌은 본 발명에 사용되는 많은 용어의 일반적인 정의를 당업자에게 제공한다: 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)]. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 하기의 용어는 달리 특정되지 않는 경우 이들 본래의 의미를 가진다.
"미세조류에서 활성"은 미세조류에서 기능성인 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 유전자 이식 미세조류에 항생제 내성을 부여하는 항생제 내성 유전자를 구동하기 위해 사용된 프로모터는 미세조류에서 활성이다.
"아실 운반 단백질" 또는 "ACP"는 4'-포스포판테테인 모이어티의 말단 티올에서 티올 에스터로서 지방산 합성 동안에 성장하는 아실 쇄와 결합하며 지방산 신타제 복합체의 성분을 포함하는 단백질이다.
"아실-CoA 분자" 또는 "아실-CoA"는 조효소 A의 4'-포스포판테테인 모이어티의 말단 티올에서 티올 에스터 연결을 통해 조효소 A에 공유적으로 부착된 아실 모이어티를 포함하는 분자이다.
"면적%"는 FAME GC/FID 검출 방법을 사용하여 관찰된 피크 면적을 말하는데, 여기서, 샘플내 모든 지방산은 검출 전에 지방산 메틸 에스터(fatty acid methyl ester, FAME)로 전환된다. 예를 들어, 분리 피크는 C14:1과 같은 임의의 다른 지방산과 비교하여 불포화성을 갖지 않는 14개 탄소 공급원자의 지방산(C14:0)에 대해서 관찰된다. 각각의 부류의 FAME에 대한 면적%는 혼합물 내 이의 조성물%과 직접적으로 비례하고 샘플 내 존재하는 모든 피크의 합계를 기준으로 계산된다(즉, [특정 피크하의 면적/모든 측정된 피크의 총 면적] X 100). 본 발명의 오일 및 세포의 지질 프로파일을 언급하는 경우, "적어도 4%의 C8-C14"는 세포 내 또는 추출된 글라이세로지질 조성물 내 총 지방산의 적어도 4%가 8, 10, 12 또는 14개의 탄소 공급원자를 포함하는 쇄 길이를 가진다는 것을 의미한다.
"무균성"은 다른 살아있는 유기체에 의해 오염되지 않은 유기체 배양물이다.
"바이오디젤"은 디젤 엔진에서 연료로서 사용하기에 적합한 생물학적으로 생산된 지방산 알킬 에스터이다.
"바이오매스"는 세포의 성장 및/또는 번식에 의해 생성된 물질이다. 바이오매스는 세포 및/또는 세포 내 내용물을 함유할 뿐만 아니라, 이에 제한되는 것은 아니지만 세포에 의해 분비되는 화합물을 포함한다.
"생물반응기"는 선택적으로 현탁액 중에서 세포가 배양되는 인클로저(enclosure) 또는 부분적 인클로저이다.
"촉매"는 생성물의 일부가 되지 않고 반응물에서 생성물로의 화학적 반응을 용이하게 하거나 촉진할 수 있는 분자 또는 거대분자 복합체와 같은 작용제(agent)이다. 촉매는 반응 속도를 증가시키고 이후 촉매는 다른 반응물에 작용하여 생성물을 형성할 수 있다. 촉매는 일반적으로 반응에 필요한 전체 활성화 에너지를 낮추어서 반응이 더 빨리 또는 더 저온에서 진행되도록 한다. 따라서, 반응 평형은 더 빠르게 달성될 수 있다. 촉매의 예는 생물학적 촉매인 효소; 비생물학적 촉매인 열; 및 화석 오일 정련 공정에 사용되는 금속을 포함한다.
"셀룰로스 물질"은 글루코스 및 자일로스, 및 선택적으로 이당류, 올리고당, 리그닌, 푸르푸랄 및 기타 화합물과 같은 추가적인 화합물을 포함하는, 셀룰로스의 분해 생성물이다. 셀룰로스 물질의 공급원의 비 제한적인 예는 사탕수수 바가스, 사탕무 펄프, 옥수수 스토버, 목재 칩, 톱밥 및 지팽이풀을 포함한다.
"공동-배양", 및 이의 변형어구인 "공동-배양하다" 및 "공동-발효"는 동일한 생물반응기에 2개 이상의 세포 유형이 존재함을 언급한다. 2개 이상의 세포 유형은 미세조류와 같은 미생물 유기체일 수 있거나 상이한 세포 유형과 함께 배양되는 미세조류 세포일 수 있다. 상기 배양 조건은 2개 이상의 세포 유형의 성장 및/또는 번식을 조성하는 것 또는 2개 이상의 세포 중 하나 또는 서브세트의 성장 및/또는 번식을 촉진시키는 한편, 나머지에 대한 세포 성장을 유지하는 것일 수 있다.
"조인자"는 이의 효소 활성을 수행하는 효소에 필요한 기질 이외의 임의의 분자이다.
"상보적 DNA" 또는 "cDNA"는 전령 RNA(mRNA)의 역전사 또는 증폭(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, "PCR")을 통한)에 의해 보통 얻어지는 mRNA의 DNA 복제물이다.
"배양된" 및 이것의 변형어, 예를 들어 "배양된" 및 "발효된"은 선택되고/되거나 제어된 조건을 사용함에 의한 하나 이상의 세포의 성장(세포 크기, 세포 함량 및/또는 세포 활성의 증가) 및/또는 번식(유사 분열을 통한 세포 수의 증가)의 의도적인 조성을 말한다. 성장 및 번식 둘 다의 조합은 증식으로 칭해질 수 있다. 선택되고/되거나 제어된 조건의 예는 한정된 배지(pH, 이온 강도 및 탄소 공급원과 같은 공지된 특성과 함께), 특정 온도, 산소압, 이산화탄소 수준 및 생물반응기에서 성장의 사용을 포함한다. 배양은 천연적인 또 다르게는 사람 간섭이 없는 미생물 유기체의 성장 또는 번식을 말하지 않으며; 예를 들어, 궁극적으로 지질학적 원유를 생성하도록 화석화된 유기체의 자연적 성장은 배양이 아니다.
"세포용해"는 저장성 환경에서의 세포의 용해이다. 세포 용해는 세포 내부에 대한 과도한 삼투압, 또는 물의 이동(과수화)에 의해 유발된다. 해당 세포는 내부 물의 삼투압을 견뎌낼 수 없어서 터진다.
"탈지질화된 음식물" 및 "탈지질화된 미생물 바이오매스"는 오일(지질을 포함)이 기계적 추출(즉, 익스펠러 프레스에 의해 수행됨) 또는 용매 추출 또는 이 둘 다를 통해 이로부터 추출되거나 분리된 후의 미생물 바이오매스이다. 탈지질화된 음식물은 미생물 바이오매스로부터 오일/지질의 추출 또는 분리 전과 비교하여 감소된 양의 오일/지질을 갖지만 일부 잔류하는 오일/지질을 함유한다.
"발현 벡터" 또는 "발현 구성체" 또는 "플라스미드" 또는 "재조합 DNA 구성체"는 숙주 세포에서 특정 핵산을 전사 및/번역하도록 하는 일련의 구체화된 핵산 요소에 의한 재조합 수단 또는 직접적인 화학적 합성에 의하는 것을 포함하는, 인간 개입을 통해 만들어진 핵산을 말한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편의 부분일 수 있다. 전형적으로, 상기 발현 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 전사된 핵산을 포함한다.
"외인성 유전자"는 세포에 도입된("형질전환된") RNA 및/또는 단백질의 발현을 위해 암호화하는 핵산이다. 형질전환된 세포는 추가의 외인성 유전자(들)가 도입될 수 있는 재조합 세포로서 언급될 수 있다. 상기 외인성 유전자는 형질전환된 세포에 대해 상이한 종(및 따라서 이종성) 또는 동일한 종(및 따라서 동종성)으로부터 유래될 수 있다. 따라서, 외인성 유전자는 유전자의 내인성 복제물에 비해 세포의 게놈 내에서 상이한 위치를 차지하거나 상이한 제어 하에 있는 동종성 유전자를 포함한다. 외인성 유전자는 세포 내에서 하나 이상의 복제물로 존재할 수 있다. 외인성 유전자는 게놈 내로 삽입물로서 또는 에피좀 분자로서 세포 내에서 유지될 수 있다.
"외인성으로 제공된"은 세포 배양의 배양 배지에 공급된 분자를 말한다.
"익스펠러 프레싱"은 대두 및 평지씨와 같은 원료로부터 오일을 추출하는 기계적 방법이다. 익스펠러 프레스는 스크류형의 기계이고 케이지 배럴-유사 구멍을 통해 재료를 압착시킨다. 원료는 프레스의 한 측면으로 들어가고, 소모된 케이크는 다른 측면에서 빠져나오는 한편, 오일은 케이지 내 막대 사이에서 스며나오고 수집된다. 상기 기계는 원료를 움직이고 압착시키는 스크류 구동체로부터의 마찰 및 연속적인 압력을 사용한다. 상기 오일은 고체가 통과하지 못하도록 하는 작은 구멍을 통해 스며나온다. 원료가 압착됨에 따라, 마찰은 전형적으로 이를 가열시킨다.
"지방 아실-ACP 티오에스터라제"는 지질 합성 동안 아실 운반 단백질(ACP)로부터 지방산의 절단을 촉매하는 효소이다.
"지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소"는 아실-CoA 분자의 1차 알코올로 환원을 촉매하는 효소이다.
"지방 아실-CoA 환원효소"는 아실-CoA 분자의 알데하이드로의 환원을 촉매하는 효소이다.
"지방 알데하이드 데카보닐라제"는 지방 알데하이드의 알칸으로의 전환을 촉매하는 효소이다.
"지방 알데하이드 환원효소"는 알데하이드의 1차 알코올로 환원을 촉매하는 효소이다.
"고정된 탄소 공급원"은 배양되는 미생물에 의해 이용될 수 있는 배양 배지 내에서 고체 또는 액체 형태로 주변 온도 및 압력에서 존재하는 탄소, 전형적으로 유기 분자를 함유하는 분자(들)이다.
"호모제네이트"는 생리적으로 파괴된 바이오매스이다.
"탄화수소"는 (a) 수소 및 탄소 원자만을 함유하는 분자이고, 여기서, 탄소 공급원자는 공유 결합되어 선형, 분지형, 고리형 또는 부분적으로 고리형인, 수소 원자가 부착된 백본을 형성한다. 탄화수소 화합물의 분자 구조는 천연 가스 구성 성분인 가장 단순한 메탄(CH4) 형태로부터 매우 무겁고 복잡한, 예를 들어, 원유, 석유 및 역청에서 발견되는 아스팔텐과 같은 일부 분자까지 다양하다. 탄화수소는 가스, 액체 또는 고체 형태, 또는 이들 형태의 임의의 조합일 수 있고, 골격 내 인접한 탄소 공급원자 사이에 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 가질 수 있다. 따라서, 해당 용어는 선형, 분지형, 고리형 또는 부분적으로 고리형인 알칸, 알켄, 지질 및 파라핀을 포함한다. 이의 예는 프로판, 뷰탄, 펜탄, 헥산, 옥탄, 및 스쿠알렌을 포함한다.
"수소:탄소 비"는 원자 대 원자를 기준으로 분자 내 탄소 원자에 대한 수소 원자의 비이다. 해당 비율은 탄화수소 분자 내 탄소 및 수소 원자의 수를 언급하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 가장 높은 비의 탄화수소는 메탄 CH4(4:1)이다.
"소수성 분획"은 수성 상과 비교하여 소수성 상에서 더 가용성인 물질의 일부 또는 분획이다. 소수성 분획은 실질적으로 물에 불용성이고 보통 비극성이다.
"지질 수율을 증가시킨다"는, 예를 들어 배양물의 리터당 세포의 건조 중량을 증가시키거나, 지질을 구성하는 세포의 %를 증가시키거나, 단위 시간당 배양물 부피의 리터당 지질의 전체 양을 증가시키는 것에 의한 미생물 배양물의 생산성 증가를 말한다.
"유도성 프로모터"는 특정 자극에 응하여 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 매개하는 프로모터이다. 이러한 프로모터의 예는 pH 또는 질소 수준을 변화시키는 조건에서 유발된 프로모터 서열일 수 있다.
"작동가능한 연결에서"는 2개의 핵산 서열 간, 예를 들어, 제어 서열(전형적으로 프로모터)과 연결된 서열(전형적으로 단백질을 암호화하는 서열, 또한 소위 암호화 서열)간의 기능적 연결이다. 프로모터는 이것이 유전자의 전사를 매개할 수 있다면 외인성 유전자와 작동가능하게 연결되어 있다.
"인시츄"는 "제자리" 또는 "그것의 본래의 위치"를 의미한다.
"영양분의 제한 농도"는 배양된 유기체의 번식을 제한하는 배양물 내 화합물의 농도이다. "영양분의 비제한 농도"는 주어진 배양기간 동안 최대 번식을 지원하는 농도이다. 따라서, 소정의 배양기간 동안 생성되는 세포의 수는 영양분이 비제한적일 때보다 영양분의 제한 농도의 존재에서 더 낮다. 영양분은 영양분이 최대 번식을 지지하는 것보다 큰 농도로 존재하는 경우 배양물에서 과량인 것으로 언급된다.
"리파제"는 수불용성 지질 기질에서 에스터 결합의 가수분해를 촉매하는 수용성 효소이다. 리파제는 지질의 글라이세롤 및 지방산으로의 가수분해를 촉매한다.
"지질 변형 효소"는 지질의 공유 구조를 변경하는 효소를 말한다. 지질 변형 효소의 예는 리파제, 지방 아실-ACP 티오에스터라제, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소, 지방 아실-CoA 환원효소, 지방 알데하이드 환원효소, 스테아릴 아실 운반 단백질 불포화효소(SAD) 및 지방 아실 불포화효소(FAD)를 포함하는 불포화효소 및 지방 알데하이드 데카보닐라제를 포함한다.
"지질 경로 효소"는 지질 대사, 즉 지질 합성, 변형 또는 분해에 역할을 하는 임의의 효소 및 지질을 화학적으로 변형시키는 임의의 단백질뿐만 아니라 운반 단백질이다.
"지질"은 비극성 용매(예를 들어, 에테르 및 클로로포름)에 가용성이고 물에 상대적으로 또는 완전히 불용성인 부류의 분자이다. 지질 분자는 이들이 주로 자연에서 소수성인 대다수의 긴 탄화수소 꼬리로 이루어지기 때문에 상기 성질을 가진다. 지질의 예는 지방산(포화 및 불포화); 글라이세라이드 또는 글라이세로지질(예를 들어, 모노글라이세라이드, 다이글라이세라이드, 트라이글라이세라이드 또는 중성 지방 및 포스포글라이세라이드 또는 글라이세로인지질); 비글라이세라이드(nonglyceride)(스핑고지질, 콜레스테롤 및 스테로이드 호르몬을 포함하는 스테롤 지질, 터페노이드를 포함하는 프레놀 지질, 지방 알코올, 왁스 및 폴리케타이드); 및 복합 지질 유도체(당-연결 지질 또는 당지질 및 단백질 연결된 지질)를 포함한다. "지방"은 소위 "트라이글라이세라이드"인 지질의 하위그룹이다.
"용해물"은 용해된 세포의 내용물을 함유하는 용액이다.
"용해"는 종종 유기체의 완전함을 손상시키는 기계적, 바이러스 또는 삼투압 메커니즘에 의한, 적어도 일부의 세포 내 내용물을 방출하기에 충분한 생물학적 유기체의 원형질막 및 선택적으로 세포벽의 파괴이다.
"용해하는"은 적어도 일부 세포 내 내용물을 방출하기에 충분한 생물학적 유기체 또는 세포의 세포막 및 선택적으로 세포벽을 파괴하는 것이다.
"미세조류"는 엽록체 또는 플라스티드를 함유하고, 선택적으로 광합성을 수행할 수 있는 진핵 미생물 유기체, 또는 광합성을 수행할 수 있는 원핵 미생물 유기체이다. 미세조류는 에너지로서 고정된 탄소 공급원을 대사시킬 수 없는 절대 광합성독립영양생물뿐만 아니라 고정된 탄소 공급원으로부터 유일하게 생존할 수 있는 종속영양생물을 포함한다. 미세조류는 세포 분열 후 단시간에 자매세포로부터 분리되는 단일 세포 유기체, 예를 들어, 클라미도모나스(Chlamydomonas)뿐만 아니라 2개의 별개의 세포 유형의 단순한 다중세포 광합성 미생물인, 예를 들어, 볼복스(Volvox)와 같은 미생물을 포함한다. 미세조류는 클로렐라, 두날리엘라, 및 프로토테카와 같은 세포를 포함한다. 미세조류는 또한 아그메넬룸(Agmenellum), 아나바에나(Anabaena), 및 피로보트라이스(Pyrobotrys)와 같은 세포-세포 접착을 나타내는 다른 미생물 광합성 유기체를 포함한다. 미세조류는 또한 특정 디노플라겔레이트 조류 종 및 프로토테카 속의 종과 같은 광합성을 수행하는 능력을 상실한 절대 종속영양 미생물 유기체를 포함한다.
"미생물 유기체" 및 "미생물(microbe)"은 현미경적 단일 세포 유기체이다.
2개의 단백질 또는 유전자와 관련하여 "자연적으로 공동 발현된"은 단백질 또는 이들의 유전자가 이들이 유래된 조직 또는 유기체에서 자연적으로 공동 발현됨을 의미하는데, 이는 예를 들어 2개의 단백질을 암호화하는 유전자가 공통된 조절 서열의 제어 하에 있거나 또는 이들이 동일한 자극에 응하여 발현되기 때문이다.
"삽투압 쇼크"는 삼투압의 급작스런 감소 후 용액 내 세포의 붕괴이다. 삽투압 쇼크는 때때로 상기 세포의 세포 성분을 용액 내로 방출하도록 유도된다.
"다당류-분해 효소"는 임의의 다당류의 가수분해 또는 당화를 촉매할 수 있는 임의의 효소이다. 예를 들어 셀룰라제는 셀룰로스의 가수분해를 촉매한다.
"다당류" 또는 "글라이칸"은 글라이코사이드 결합에 의해 서로 함께 연결된 단당류로 구성된 탄수화물이다. 셀룰로스는 특정 식물 세포 벽을 구성하는 다당류이다. 셀룰로스는 자일로스 및 글루코스와 같은 단당류뿐만 아니라 더 큰 이당류 및 올리고당을 수득하기 위하여 효소에 의해 탈중합될 수 있다.
"프로모터"는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 서열이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 프로모터는 전사 개시 부위 근처에 필수 핵산 서열, 예를 들어, 폴리머라제 II형 프로모터의 경우 TATA 요소를 포함한다. 프로모터는 또한 선택적으로 전사 개시 부위로부터 수천 염기쌍 정도로 멀리 위치할 수 있는 말단 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함한다.
"재조합체"는 외인성 핵산의 도입 또는 본래 핵산의 변경으로 인해 변형된 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터이다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 본래(비-재조합) 형태의 세포 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 비-재조합 세포에 의해 발현되는 유전자와는 상이하게 본래 유전자를 발현한다. "재조합 핵산"은 예를 들어, 폴리머라제 및 엔도뉴클레아제를 사용하는 핵산의 조작에 의해 일반적으로 시험관 내 형성된 본래의 핵산이거나 통상적으로 천연에서 존재하지 않는 형태로 존재한다. 예를 들어 작동가능한 연결에서 2개 이상의 핵산을 위치시키기 위해 재조합 핵산이 생성될 수 있다. 따라서, 통상적으로 천연에서 연결되어 있지 않은 DNA 분자를 결찰하는 것에 의해 시험관 내 형성된 분리된 핵산 또는 발현 벡터는 둘 다 본 발명의 목적을 위한 재조합체인 것으로 고려된다. 일단 재조합 핵산이 제조되고 숙주 세포 또는 유기체로 도입되면, 이것은 숙주 세포의 생체 내 세포 기구를 사용하여 복제할 수 있지만; 일단 재조합적으로 생성되면, 이러한 핵산은 후속적으로 세포 내에서 복제된다 하더라도 여전히 본 발명의 목적을 위한 재조합체인 것으로 고려된다. 유사하게, "재조합 단백질"은, 즉, 재조합 핵산의 발현을 통해 재조합 기술을 사용하여 제조된 단백질이다.
"재생 디젤"은 지질의 수소화 및 탈산소화를 통해 생성된 알칸(예를 들어, C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 및 C18:0)의 혼합물이다.
"당화"는 바이오매스, 통상적으로 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스를 글루코스 및 자일로스와 같은 단량체성 당으로 전환시키는 공정이다. "당화된" 또는 "탈중합된" 셀룰로스 물질 또는 바이오매스는 당화를 통해 단량체 당으로 전환되는 셀룰로스 물질 또는 바이오매스를 말한다.
용어 "유사한"은 자연적으로 발생하는 오일과 비교하는 내용에서 사용될 때, 추가 정량화 없이, 자연적으로 발생하는 오일과 비교되는 오일이 자연적으로 발생하는 오일의 최고 2가지 트라이글라이세라이드의 약 +/- 15%, 또는 +/- 10%를 함유하는 것을 의미한다. 예를 들어 쉬어버터(부티로스퍼멈 파키(B. Parkii)의 오일)는 2가지의 가장 흔한 트라이글라이세라이드 성분으로서 41.2-56.8% C18:0 및 34.0-46.9% C18:1을 함유한다(표 5를 참조). +/- 10% 내의 "유사한" 오일은 2가지 가장 흔한 트라이글라이세라이드로서 약 37% 내지 약 62% C18:0 및 31% 내지 약 52% C18:1을 함유한다. 이 내용에서 사용될 때, 용어 "유사한"은 +/- 9%, +/- 8%, +/- 7%, +/- 6%, +/- 5%, +/- 4%, +/- 3%, +/- 2%, 또는 +/- 1%를 포함하며, 자연적으로 발생하는 오일의 최고 3가지 또는 최고 4가지의 트라이글라이세라이드, 또는 최고 3가지 트라이글라이세라이드 이외의 2가지, 또는 최고 4가지 트라이글라이세라이드 이외의 3가지와 비교를 추가로 표시할 수 있다.
"초음파 처리"는 초음파 에너지를 사용하여 세포와 같은 생물학적 물질을 파괴시키는 공정이다.
"푸르푸랄 종"은 동일한 염기성 구조 특성을 보유한 2-푸란카복스알데하이드 또는 유도체이다.
"스토버"는 낟알이 채취된 후 남아있는 작물의 무수 줄기 및 잎이다.
"수크로스 이용 유전자"는 발현되는 경우 에너지원으로서 수크로스를 이용하는 세포의 능력을 도와주는 유전자이다. 수크로스 이용 유전자에 의해 암호화된 단백질은 본 명세서에서 "수크로스 이용 효소"로 언급되고 수크로스 수송체, 수크로스 인버타제, 및 글루코키나제 및 프럭토키나제와 같은 헥소키나제를 포함한다.
II. 배양
본 발명은 지질의 생성을 위해 일반적으로 미생물 유기체(예를 들어, 미세조류, 유지성 효모, 진균 및 박테리아), 특히 재조합 프로토테카 균주를 포함하는 미세조류 균주를 배양하는 것에 관한 것이다. 독자의 편이를 위해, 본 부분은 여러 하위부문으로 세분된다. 하위부문 1은 프로토테카 종 및 균주를 기재하고 게놈 DNA 비교에 의해 새로운 프로토테카 종 및 균주 및 관련 미세조류뿐만 아니라 다른 미생물 유기체를 확인하는 방법을 기재한다. 하위부문 2는 배양에 유용한 생물반응기를 기재한다. 하위부문 3은 배양을 위한 배지를 기재한다. 하위부문 4는 본 발명의 예시적인 배양 방법에 따른 오일 생성을 기재한다. 이들 기재는 또한 다른 미생물 유기체에 대해 더 일반적으로 적용가능하다.
1. 프로토테카 종 및 균주 및 다른 미생물 유기체
프로토테카는 고수준의 지질, 특히, 연료 생산을 위해 적합한 지질을 생산할 수 있기 때문에 지질의 생산에 사용하기 위해 주목할만한 미생물이다. 프로토테카에 의해 생산된 지질은 다른 미세조류에 의해 생산되는 것보다 단쇄 길이 및 고도의 포화를 갖는 탄화수소 쇄를 가진다. 더욱이, 프로토테카 지질은 일반적으로 색소 부재(엽록소 및 특정 카로테노이드의 낮거나 검출가능하지 않은 수준)이고 임의의 경우에 다른 미세조류 유래의 지질 보다 색소를 훨씬 적게 포함한다. 더욱이 본 발명에 의해 제공된 재조합 프로토테카 세포는 다른 미생물로부터 지질을 생산하는 것과 비교하여 보다 큰 수율 및 효율로 저렴하게 지질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 예시적인 프로토테카 균주가 포함된다. 추가로, 상기 미세조류는 종속영양적으로 성장하고 프로토테카 프로토테카 윅케르하미, 프로토테카 스타그노라(UTEX 327을 포함), 프로토테카 포르토리센시스, 프로토테카 모리포미스(UTEX 균주 1441, 1435를 포함), 및 프로토테카 좁피로서 유전자 조작될 수 있다. 프로토테카 속의 종은 절대 종속영양생물이다.
본 발명에 사용하기 위한 프로토테카 종은 게놈의 특정 표적 영역의 증폭으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 특정 프로토테카 종 또는 균주의 확인은 프라이머 및 게놈의 임의의 영역을 사용하는 방법, 예를 들어, 문헌[Wu et al., Bot. Bull. Acad. Sin. (2001) 42: 115-121 Identification of Chlorella spp . isolates using ribosomal DNA sequences]에 기재된 방법을 사용하여 핵 및/또는 엽록체 DNA의 증폭 및 서열분석을 통해 달성할 수 있다. 리보솜 내부 전사된 스페이서(ITS1 및 ITS2 rDNA), 23S rRNA, 18S rRNA, 및 기타 보존된 게놈 영역의 증폭 및 서열분석과 같은 계통발생적 분석에 대해 널리 확립된 방법은 당업자에 의해 사용되어 프로토테카의 종뿐만 아니라 유사한 지질 프로파일 및 생산 능력을 갖는 다른 탄화수소 및 지질 생산 미생물 종을 확인할 수 있다. 조류의 확인 및 분류 방법에 대한 예는 또한 문헌[Genetics, 2005 Aug;170(4): 1601-10 및 RNA, 2005 Apr;11(4):361-4]을 참조한다.
따라서, 게놈 DNA 비교를 사용하여 본 발명에 사용되는 미세조류의 적합한 종을 확인할 수 있다. 이에 제한되지 않는 23S rRNA를 암호화하는 DNA와 같은 보존된 게놈 DNA의 영역은 미세조류 종으로부터 증폭시키고 컨센서스 서열과 비교하여 본 발명에 사용되는 바람직한 미세조류와 분류학적으로 관련된 미세조류 종을 스크리닝할 수 있다. 프로토테카 속 내의 종에 대한 상기 DNA 서열 비교의 예는 하기에 나타낸다. 게놈 DNA 비교는 또한 균주 수거에서 잘못 확인된 미생물 종을 확인하는데 유용할 수 있다. 흔히 균주 수거는 표현형 및 형태적 특성을 기본으로 미세조류 종을 확인한다. 이들 특성의 사용은 미세조류의 종 또는 속의 잘못된 분류를 유도할 수 있다. 게놈 DNA 비교를 사용하는 것이 이들의 계통발생 관계를 기준으로 미세조류 종을 분류하는데 더 우수한 방법일 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 미세조류는 전형적으로 서열번호 11 내지 19에 열거된 서열 중 하나 이상과 적어도 99%, 적어도 95%, 적어도 90%, 또는 적어도 85%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 23S rRNA를 암호화하는 게놈 DNA 서열을 가진다.
뉴클레오타이드 또는 아미노산 동일성%을 결정하기 위한 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 기준 서열로 작용하고 이것과 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고 경우에 따라 세부서열의 좌표를 지정하며 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 이어서 서열 비교 알고리즘을 사용하여 지정된 프로그램 파라미터를 기준으로 표준 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성%를 계산한다.
비교용 서열의 최적의 정렬은 예를 들어, 문헌[Smith & Waterman, Adv . Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol . 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat'l . Acad . Sci . USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법, (Wisconsin Genetics 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, 위스콘신주 매디슨시 사이언스 드라이브 575에 소재한 Genetics Computer Group)]의 당해 알고리즘의 컴퓨터에 의한 수행, 또는 육안 검사(일반적으로 문헌[Ausubel et al., 상기 참조])에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 %를 결정하기 위해 적합한 또 다른 예시적 알고리즘은 문헌[Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-410 (1990)]에 기재된 BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국가생물공학센터(National Center for Biotechnology Information)(웹 주소: www.ncbi.nlm.nih.gov)를 통해 입수할 수 있다. 상기 알고리즘은 먼저 탐색 서열에서 길이에 대한 단축어 W를 확인하는 것으로 높은 점수의 서열 쌍(high scoring sequence pair, HSP)을 확인하는 것을 포함하고 이는 데이타베이스 서열 중에 동일한 길이의 단어와 정렬되는 경우 몇몇 양성 값의 역치 점수 T와 일치하거나 이를 충족시킨다. T는 이웃 단어 점수 역치로서 언급된다(Altschul et al., 상기 참조). 이들 초기 이웃 단어 히트는 이들을 함유하는 보다 긴 HSP를 발견하기 위한 검색을 개시하기 위한 근거로서 작용한다. 단어 히트를 이어서 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양방향으로 확장시킨다. 누적 점수는 뉴클레오타이드 서열에 대해 파라미터 M(일치하는 잔기 쌍에 대한 보상 점수: 항상 > 0임) 및 N(불일치 잔기에 대한 페널티 점수: 항상 < 0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열에 대해, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각각의 방향에서의 단어 히트의 확장은 다음의 경우에 중지한다: 누적 정렬 점수가 이의 최대 달성 값으로부터 X 양으로 이탈하는 경우; 누적 점수가 하나 이상의 음성 스코어링 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하로 되는 경우; 또는 서열의 말단에 도달하는 경우. 핵산 또는 폴리펩타이드가 본 발명의 범위 내에 있는지의 여부를 확인하기 위해, BLAST 프로그램의 디폴트(default) 파라미터가 적합하다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열용)은 11의 단어 길이(W), 10의 예상치(E), M=5, N=-4, 및 양쪽 서열가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다. 아미노산 서열을 위해, BLASTP 프로그램은 3의 단어 길이(W), 10의 예상치(E) 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 디폴트로서 사용한다. TBLATN 프로그램(뉴클레오타이드 서열용 단백질 서열을 사용하는)은 3의 단어 길이(W), 10의 예상값(E) 및 BLOSUM 62 스코어링 매트릭스를 디폴트로서 사용한다(문헌[Henikoff & Henikoff, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915 (1989)] 참조).
서열 동일성%를 계산하는 것뿐만 아니라, BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 간의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin & Altschul, Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 90:5873-5787(1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 한가지의 유사성 측정은 최소 합계 가능성(P(N))이고 이는 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 간의 일치가 우연히 발생할 가능성을 지적한다. 예를 들어, 표준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에 있어서 최소의 합계 가능성이 약 0.1 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
본 발명에 사용하기 위한 미생물의 선택에 영향을 주는 다른 고려사항은 오일, 연료 및 함유화학물질의 생산을 위해 적합한 지질 또는 탄화수소의 생성 뿐만 아니라 다음을 포함한다: (1) 세포 중량%로서 고지질 함량; (2) 성장의 용이함; (3) 유전자 가공의 용이함; 및 (4) 바이오매스 가공처리의 용이함. 특정 양태에서, 야생형 또는 유전자 조작된 미생물은 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 또는 적어도 70%의 지질인 세포가 생성되도록 한다. 바람직한 유기체는 (빛의 부재 하에 당에서) 종속영양적으로 성장한다.
본 발명의 실행에 사용될 수 있는 조류의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 표 1에 열거된 다음의 조류를 포함한다.
Figure 112018108415035-pat00001
본 발명의 실행에 사용될 수 있는 유지성 효모의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 표 26에서 열거되는 다음의 유지성 효모를 포함한다.
Figure 112018108415035-pat00002
본 발명의 실행에 사용될 수 있는 다른 진균의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 표 27에 열거된 다음의 진균을 포함한다.
Figure 112018108415035-pat00003
본 발명의 일부 실시형태에서, 미생물 유기체는 박테리아이다. 대장균(E. coli)와 같은 박테리아의 외인성 유전자의 발현 예는 잘 공지되어 있다; 예를 들어 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. (3d edition, 2001, Cold Spring Harbor Press)]을 참조한다.
2. 생물반응기
미생물은 유전적 유전자 조작을 수행하고 탄화수소(예를 들어, 지질, 지방산, 알데하이드, 알코올 및 알칸)를 생성할 2가지 목적을 위해 배양한다. 전자 유형의 배양은 소규모 및 처음에는 적어도 출발 미생물이 성장할 수 있는 조건 하에서 수행한다. 탄화수소를 생산하기 위한 배양은 생물반응기에서 통상적으로 대규모(예를 들어, 10,000ℓ, 40,000ℓ, 100,000ℓ 또는 더 대형의 생물반응기)로 수행한다. 프로토테카 종을 포함하는 미세조류는 전형적으로 생물반응기 내 액체 배지 중에서 본 발명의 방법으로 배양한다. 전형적으로, 생물반응기는 빛이 입사되지 않도록 한다.
생물반응기 또는 발효기를 사용하여 다양한 단계의 생리적 주기를 통해 유지성 미생물 세포, 바람직하게는 미세조류 세포를 배양한다. 생물반응기는 종속영양 성장 및 번식 방법에 사용하기 위해 많은 이점을 제공한다. 식품에 사용하기 위한 바이오매스를 생산하기 위해 미세조류를 예로서 현탁액 배양물과 같은 액체 중에서 다량으로 바람직하게 발효시킨다. 강철 발효기와 같은 생물반응기는 매우 큰 배양 부피(40,000 리터 이상의 용량을 갖는 생물반응기가 본 발명의 다양한 양태에서 사용된다)을 수용할 수 있다. 생물반응기는 또한 전형적으로 온도, pH, 산소압 및 이산화탄소 수준과 같은 배양 조건의 제어를 허용한다. 예를 들어, 생물반응기는 전형적으로 예를 들어, 튜빙에 부착된 포트를 사용하여 산소 또는 질소와 같은 가스 성분이 액체 배양물을 통해 기포 주입될 수 있도록 하는 형태를 취할 수 있다. 배양 배지의 pH, 미량 요소의 종류 및 농도 및 기타 배지 성분과 같은 다른 배양 파라미터가 또한 생물반응기를 사용하여 더 용이하게 조작될 수 있다.
생물반응기는 미세조류가 증식하고 수적으로 증가하는 전반적인 시간에 걸쳐 생물반응기를 통해 배양 배지가 유입되도록 하는 형태를 취할 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 배지는 접종 후 세포가 목적하는 밀도에 도달하기 전에 생물반응기로 주입될 수 있다. 다른 경우에, 생물반응기에는 배양 초기에 배양 배지가 충전되고 배양물이 접종된 후에는 더 이상의 배양 배지가 주입되지 않는다. 다른 말로, 미세조류 바이오매스는 미세조류가 증식하고 수적으로 증가하는 기간 동안 수성 배지에서 배양되지만 수성 배양 배지의 양이 그 기간에 걸쳐 생물반응기를 통해 유입되지 않는다. 따라서, 일부 경우에, 수성 배양 배지는 접종 후 생물반응기를 통해 유입되지 않는다.
회전 블레이드 및 임펠러, 잠금 기구, 교반 막대, 가압 가스 주입용 수단과 같은 장치가 장착된 생물반응기를 사용하여 미세조류 배양물이 혼합되도록 할 수 있다. 혼합은 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 가스 주입 및 배지 주입의 난기류가 목적하는 수로 미세조류가 증가할 때까지는 미세조류의 증식 동안 유지되지 않는다.
생물반응기 포트를 사용하여 가스, 고체, 반고체 및 액체를, 미세조류를 함유하는 생물반응기 챔버에 도입하거나 추출할 수 있다. 많은 생물반응기는 하나 이상의 포트(예를 들어, 배지 주입을 위한 하나 및 샘플링을 위한 또 다른 하나)를 갖고 단지 하나의 물질이 포트를 출입할 필요는 없다. 예를 들어, 포트를 사용하여 배양 배지가 생물반응기로 유입될 수 있도록 하고 이후에 샘플링, 가스 주입, 가스 배출 또는 기타 목적을 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 샘플링 포트는 배양의 무균 특성을 손상시키지 않고 반복적으로 사용될 수 있다. 샘플링 포트는 샘플의 흐름이 중지되고 개시되거나 연속 샘플링의 수단을 제공하도록 하는 밸브 또는 기타 장치로 구성될 수 있다. 생물반응기는 전형적으로 배양의 접종을 허용하는 하나 이상의 포트를 갖고 상기 포트는 또한 배지 또는 가스 주입과 같은 다른 목적을 위해 사용될 수 있다.
생물반응기 포트는 미세조류의 배양의 가스 함량이 조작되도록 할 수 있다. 설명하자면 생물반응기 부피의 일부는 액체보다는 가스일 수 있고 생물반응기의 가스 주입구는 가스를 생물반응기로 펌핑될 수 있도록 한다. 생물반응기 내로 유리하게 펌핑될 수 있는 가스는 공기, 공기/CO2 혼합물, 비활성기체(예를 들어, 아르곤) 및 기타 가스를 포함한다. 생물반응기는 전형적으로 사용자가 생물반응기로의 가스 주입 속도를 조절할 수 있도록 구성된다. 상기된 바와 같이, 생물반응기로의 가스 주입 증가를 사용하여 배양물의 혼합을 증가시킬 수 있다.
증가된 가스 유입은 또한 배양물의 탁도에 영향을 미친다. 난기류는 수성 배양 배지의 수위 하부에 가스 주입 포트를 위치시켜 생물반응기로 주입되는 가스가 배양 표면으로 기포 주입되도록 함에 의해 달성할 수 있다. 하나 이상의 가스 배출 포트는 가스가 배출되도록 하여 생물반응기 내 압력 증강을 차단한다. 바람직하게, 가스 배출 포트는 생물반응기로 오염 미생물이 들어가는 것을 차단하는 '원-웨이' 밸브를 유도한다.
3. 배지
미생물 배양 배지는 전형적으로 고정 질소 공급원, 고정 탄소 공급원, 미량 요소, 임의로 pH 유지를 위한 완충제 및 포스페이트(전형적으로 포스페이트 염으로서 제공됨)과 같은 성분들을 함유한다. 기타 성분은 특히 해양 미세조류를 위해 염화나트륨과 같은 염을 함유할 수 있다. 질소 공급원은 예를 들어, 제한 없이 분자 질소, 나이트레이트, 나이트레이트 염, 암모니아(순수 형태 또는 염 형태, 예를 들어, (NH4)2SO4 및 NH4OH), 단백질, 대두 음식물, 옥수수 침지액, 및 효모 추출물을 포함하는 유기 및 무기 질소 공급원을 함유한다. 미량 요소의 예는 아연, 붕소, 코발트, 구리, 망간, 및 몰리브덴을 포함하고 예를 들어, 이의 각각의 형태는 ZnCl2, H3BO3, CoCl2ㆍ6H2O, CuCl2ㆍ2H2O, MnCl2ㆍ4H2O 및 (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O이다.
본 발명의 방법에 따라 유용한 미생물은 전세계적으로 다양한 장소 및 환경에서 발견된다. 다른 종 및 이들의 궁극적인 분화 분기점으로부터의 분리 결과로서, 최적의 성장 및 지질 및/또는 탄화수소 구성성분들의 최적의 생산을 위한 특정 성장 배지는 예측하기 어려울 수 있다. 일부 경우에, 특정 미생물 균주는 몇몇 억제 성분의 존재 또는 특정 미생물 균주에 의해 요구되는 임의의 필수 영양 요구성 물질의 부재 때문에 특정 성장 배지 상에서 성장할 수 없다.
고체 및 액체 성장 배지는 일반적으로 다양한 공급원으로부터 시판되고 광범위한 미생물 균주를 위해 적합한 특정 배지를 제조하기 위한 지침은, 예를 들어 조류의 배양물 수집을 위해 미국 텍사스주 78712-0183 오스틴시 유니버시티 스테이션 A6700 1에 소재한 오스틴 텍사스 유니버시티(UTEX)에서 운영하는 온라인 사이트(http://www.utex.org/)에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 다양한 담수 및 염수 배지는 본 명세서에 참조로서 포함된 국제특허출원 공개번호 2008/151149에 기재된 것들을 포함한다.
특정 예에서, 프로테오스 배지(Proteose Medium)는 무균 조건에 적합하고 배지의 1ℓ 부피의 배지(pH ~ 6.8)는 1리터의 Bristol 배지에 1g의 프로테오스 펩톤을 첨가하여 제조할 수 있다. Bristol 배지는 수용액 중에 2.94 mm NaNO3, 0.17 mm CaCl2ㆍ2H2O, 0.3 mmMgSO4ㆍ7H2O, 0.43 mM, 1.29 mm KH2PO4, 및 1.43 mm NaCl를 포함한다. 1.5% 한천 배지에 대해, 15g의 한천을 1ℓ의 용액에 첨가할 수 있다. 상기 용액을 덮고 오토클레이빙하고 이어서 사용 전에 냉장 온도에 저장한다. 또 다른 예는 10g/ℓ의 수소칼륨 프탈레이트(postassium hydrogen phthalate, KHP), 0.9g/ℓ의 수산화나트륨, 0.1g/ℓ의 황산마그네슘, 0.2g/ℓ의 인산수소칼륨, 0.3g/ℓ의 염화암모늄, 10g/ℓ의 글루코스, 0.001g/ℓ의 티아민 하이드로클로라이드, 20g/ℓ 한천, 0.25g/ℓ의 5-플루오로사이토신을 포함하고 pH 범위가 5.0 내지 5.2인 프로토테카 분리 배지(Prototheca isolation medium, PIM)이다(Pore, 1973, App. Microbiology, 26: 648-649). 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 다른 배지는 상기된 URL에 문의하거나 미생물 배양물을 유지하는 다른 기관(예를 들어, SAG, CCAP, 또는 CCALA)에 문의하여 용이하게 확인할 수 있다. SAG는 괴팅겐 유니버시티(University of Gottingen)(독일 괴팅겐에 소재)에서의 조류 배양 수거물을 언급하고, CCAP는 스코틀랜드 해양연구기관(Scottish Association for Marine Science)(영국 스코틀랜드에 소재)에 의해 관리되는 조류 및 원생동물의 배양 수거물을 언급하고, CCALA는 식물학 연구소(Institute of Botany)(체코 공화국 트레본에 소재)의 조류 연구소의 배양 수거물을 언급한다. 추가로, 미국 특허 제5,900,370호는 프로토테카 종의 종속영양 발효에 적합한 배지 제형 및 조건을 기재하고 있다.
오일 생산을 위해, 고정 탄소 공급원의 선택이 중요한데 그 이유는 고정 탄소 공급원의 비용이 경제적인 오일 생산을 위해 충분히 낮아야 하기 때문이다. 따라서, 적합한 탄소 공급원은 예를 들어, 아세테이트, 플로리도사이드, 프럭토스, 갈락토스, 글루쿠론산, 글루코스, 글라이세롤, 락토스, 만노스, N-아세틸글루코사민, 람노스, 수크로스, 및/또는 자일로스를 포함하고 상기 화합물을 함유하는 공급원료의 선택이 본 발명의 방법의 중요한 측면이다. 본 발명의 방법에 따라 유용한 적합한 공급원료는 예를 들어, 블랙 음료, 옥수수 전분, 탈중합된 셀룰로스 물질, 유청, 당밀, 감자, 수수, 수크로스, 사탕수수, 사탕무, 쌀 및 밀을 포함한다. 탄소 공급원은 또한 수크로스와 탈중합된 사탕무 펄프의 혼합물과 같은 혼합물로서 제공될 수 있다. 하나 이상의 탄소 공급원(들)은 하나 이상의 외인성으로 제공된 고정 탄소 공급원(들)의 적어도 약 50μM, 적어도 약 100μM, 적어도 약 500μM, 적어도 약 5 mM, 적어도 약 50 mM, 및 적어도 약 500 mM의 농도로 제공될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 특히 유리한 탄소 공급원은 셀룰로스(탈중합된 형태), 글라이세롤, 수크로스 및 수수를 포함하고, 이들 각각은 이하에서 더욱 상세하게 논의된다
본 발명에 따라, 미생물은 공급원료로서 탈중합된 셀룰로스 바이오매스를 사용하여 배양할 수 있다. 셀룰로스 바이오매스(예를 들어, 스토버)는 저렴하고 용이하게 입수할 수 있지만, 효모용 공급원료서 상기 물질을 사용하기 위한 시도는 실패했었다. 특히, 상기 공급원료는 효모 성장에 억제 작용을 하는 것으로 밝혀졌고 효모는 셀룰로스 물질로부터 생성된 5탄당(예를 들어, 헤미-셀룰로스 유래의 자일로스)을 사용할 수 없다. 대조적으로, 미세조류는 가공된 셀룰로스 물질상에서 성장할 수 있다. 셀룰로스 물질은 일반적으로 약 40-60%의 셀룰로스; 약 20-40%의 헤미셀룰로스 및 10-30%의 리그닌을 포함한다.
적합한 셀룰로스 물질은 농작물, 즉, 식물 일부, 1차 식품 또는 섬유 생성물과 함께 야생에서 제거되지 않는 주로 줄기 및 잎뿐만 아니라 초본성 및 목재 에너지 작물로부터의 잔사를 포함한다. 이의 예는 농업 폐기물, 예를 들어, 사탕 수수 바가스, 쌀겨, 옥수수 섬유(줄기, 잎, 껍질 및 코브), 밀짚, 쌀짚, 사탕무 펄프, 감귤 펄프, 감귤 과피; 산림 폐기물, 예를 들어, 경목재 및 연목재 간벌, 및 수목 작업으로부터의 경목재 및 연목재 잔사; 목재 폐기물, 예를 들어, 톱 가루 폐기물(목재 칩, 톱밥) 및 펄프 가루 폐기물; 도시 폐기물, 예를 들어, 시의 고형 폐기물의 종이 분획물, 도시 목재 폐기물 및 도시 녹색 폐기물, 예를 들어, 시의 유리 클립핑; 및 목재 건축 폐기물을 포함한다. 추가의 셀룰로스는 스위치그래스, 하이브리드 포플라 목재 및 미스칸투스, 섬유질 케인(cane) 및 섬유질 수수와 같은 전용 셀룰로스 작물을 포함한다. 상기 물질로부터 생성된 5탄당은 자일로스를 포함한다.
셀룰로스 물질은 상기 물질내 함유된 당(들)을 미생물이 이용할 수 있도록 효율이 증가되도록 처리된다. 본 발명은 산 분해 후 셀룰로스 물질을 처리하여 물질이 미생물(예를 들어, 미세조류 및 유성 효모)의 종속영양성 배양에 사용하기에 적합하도록 하는 신규 방법을 제공한다. 상기 논의된 바와 같이, 리그노셀룰로스 바이오매스는 셀룰로스, 베타 1,4 연결된 글루코스(6탄당)의 결정성 중합체, 헤미셀룰로스, 자일로스(5탄당)로 주로 구성된 더 느슨하게 연합된 중합체 및 더 드문 정도의 만노스, 갈락토스, 아라비노스, 리그닌, 시나필 알코올 및 이의 유도체로 구성된 복합 방향족 중합체, 및 알파 1,4-연결된 폴리갈락투론산의 직쇄인 펙틴을 포함하는, 다양한 분획물로 구성된다. 셀룰로스 및 헤미셀룰로스의 중합체 구조때문에 이들내 당(예를 들어, 단량체 글루코스 및 자일로스)은 많은 미생물에 의해 효율적으로 사용될 수 있는(대사되는) 형태로 존재하지 않는다. 상기 미생물을 위해 중합체를 구성하는 단량체 당을 생성하도록 셀룰로스 바이오매스를 추가로 가공하면 셀룰로스 물질이 공급원료(탄소 공급원)로서 효율적으로 확실히 사용되는데 매우 도움이 될 수 있다.
셀룰로스 또는 셀룰로스 바이오매스는, 바이오매스가 승온 및 승압에서 희석 황산(또는 다른 산)으로 처리되는 "폭발(explosion)"로 칭해지는 공정에 적용된다. 상기 공정 조건은 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 분획물의 글루코스 및 자일로스 단량체로 효소적 가수분해에 바이오매스가 효율적으로 적용될 수 있도록 한다. 수득한 단량체 당은 셀룰로스 당으로 호칭된다. 셀룰로스 당은 이어서 미생물에 의해 이용되어 다양한 대사물(예를 들어, 지질)이 생성될 수 있도록 한다. 산 분해 단계는 헤미셀룰로스 분획물이 구성 모노사카라이드로 부분 가수분해 되도록 한다. 이들 당은 추가의 처리로 바이오매스로부터 완전히 유리될 수 있다. 일부 경우에, 추가의 처리는 열수 처리이고 이는 분해된 물질을 고온수로 세척하여 염과 같은 오염물을 제거하도록 함을 포함한다. 상기 단계는 상기 공정에 사용되는 더 희석된 당 농도로 인해 셀룰로스 에탄올 발효를 위해 필요하지 않다. 다른 양태에서, 추가의 처리는 추가의 산 처리이다. 여전히 다른 양태에서, 추가의 처리는 분해된 물질의 효소적 가수분해이다. 이들 처리는 또한 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 처리 유형은 유리되는 당(예를 들어, 5탄당 대 6탄당), 및 이들이 당해 공정에서 유리되는 단계의 유형에 영향을 미칠 수 있다. 결과로서, 이들이 5탄당 또는 6탄당이든 상관없이 상이한 당 스트림이 생성될 수 있다. 이들 집적된 5탄당 또는 6탄당 스트림은 따라서 상이한 탄소 이용 능력을 갖는 특이적 미생물에 지시될 수 있다.
본 발명의 방법은 전형적으로 에탄올 발효에서 달성되는 것보다 높은 세포 밀도로 발효시키는 단계를 포함한다. 종속 영양성 셀룰로스 오일 생산을 위한 배양물의 보다 높은 밀도 때문에, 고정 탄소 공급원(예를 들어, 셀룰로스 유래된 당 스트림(들))은 바람직하게 농축된 형태로 존재한다. 탈중합된 셀룰로스 물질의 글루코스 수준은 바람직하게 배양 단계 전에 바람직하게는 적어도 300g/리터, 적어도 400g/리터, 적어도 500g/리터 또는 적어도 600g/리터이고, 상기 배양 단계는 임의로 유가식 배양이며, 여기서 상기 물질은 세포가 성장하고 지질을 축적시킴으로써 시간 경과에 따라 세포에 공급된다. 셀룰로스 당 스트림은 셀룰로스 에탄올 생산에서 상기 농도 범위에서 또는 이의 근처에서 사용되지 않는다. 따라서, 리그노셀룰로스 오일의 생성 동안에 매우 높은 세포 밀도를 생성하고 유지하기 위해서는 탄소 공급원료(들)가 고농축된 형태로 종속영양 배양물로 전달되어야만 한다. 그러나, 이에 대한 기질이 아니고 유성 미생물에 의해 대사되지 않는 공급 스트림에서 임의의 성분은 생물반응기에 축적되고 이것은 성분이 목적하는 최종 생성물의 생산에 독성이거나 억제성인 경우 문제를 유발할 수 있다. 분해 공정 및 후속적인 중화 공정 둘 다에서 셀룰로스 물질의 생성으로부터 유래된 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄 및 염과 같은 리그닌 및 리그닌 유래 부산물, 탄수화물 유래된 부산물 및 심지어 비대사된 펜토스/헥소스 당은 에탄올 발효에서 문제점을 제공할 수 있고 이들 효과는 초기 공급원료에서 이들의 농도가 높은 공정에서 상당히 증폭된다. 본 발명에 기재된 리그노셀룰로스 오일의 대규모 생산에 사용될 수 있는 6탄당에 대한 300g/ℓ 범위 (또는 이보다 높은)의 당 농도를 달성하기 위해, 이들 독성 물질의 농도는 셀룰로스 바이오매스의 에탄올 발효에 전형적으로 존재하는 농도 보다 20배 높을 수 있다.
셀룰로스 물질의 폭발 공정 처리는 상당한 양의 황산, 열 및 압력을 사용함으로써, 탄수화물의 부산물, 즉 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄을 유리시킨다. 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄은 크실로스의 푸르푸랄 및 물로의 탈수를 통한 헤미셀룰로스의 가수분해 동안 생성된다. 본 발명의 일부 경우에, 이들 부산물(예를 들어, 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄)은 생물반응기로 도입하기 전에 당화된 리그노셀룰로스 물질로부터 제거된다. 본 발명의 특정 양태에서, 탄수화물의 부산물의 제거 공정은 분해된 셀룰로스 물질의 열수 처리이다. 또한, 본 발명은 푸르푸랄 또는 하이드록시메틸 푸르푸랄과 같은 화합물에 내성일 수 있는 균주가 리그노셀룰로스 오일 생산에 사용되는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 발효 배지에서 푸르푸랄에 내성일 수 있는 것뿐만 아니라 실제로 리그노셀룰로스 오일의 생산 동안에 당해 부산물을 대사시킬 수 있는 미생물 및 방법을 제공한다.
상기 분해 공정은 또한 상당한 수준의 염을 생성한다. 예를 들어, 분해를 위한 전형적인 조건은 분해된 셀룰로스 바이오매스가 10:1의 물:고체(건조 중량)로 재현탁되는 경우 5 mS/㎝ 초과의 전도성을 유도할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 희석된 분해된 바이오매스는 효소 당화에 적용되고 수득한 현탁액은 생물반응기에 사용하기 위해 25배까지 농축된다. 농축된 당 스트림(들)에서 염 수준(전도성에 의해 측정된 바와 같이)은 허용가능하지 않게 높을 수 있다(1.5M까지의 Na+ 당량). 추가의 염은 또한 후속적인 효소 당화 공정을 위해 분해된 물질의 중화 즉시 생성된다. 본 발명은 이들 염을 제거하기 위한 방법을 제공하여 수득한 농축된 셀룰로스 당 스트림(들)은 리그노셀룰로스 오일을 생산하기 위한 종속영양 공정에 사용될 수 있도록 한다. 일부 경우에, 상기 염을 제거하는 방법은 예를 들어, 이에 제한되지 않지만 DOWEX Marathon MR3과 같은 수지를 사용한 탈이온화이다. 특정 양태에서, 수지 단계를 사용하는 탈이온화는 당화 전에, 당 농축 또는 pH 조정 전 및 바이오매스의 열수 처리 전 또는 이들의 임의의 조합 전에 수행한다; 다른 양태에서, 상기 단계는 이들 공정 중 하나 이상 후에 수행한다. 다른 양태에서, 분해 공정 자체는 허용가능하지 않게 고수준으로 염의 생성을 피하도록 변화시킨다. 예를 들어, 셀룰로스 바이오매스의 황산(또는 다른 산) 분해에 대한 적합한 대용법은 기계적 펄핑으로 셀룰로스 바이오매스가 효소적 가수분해(당화)에 민감해지도록 하는 것이다. 여전히 다른 양태에서, 고수준의 염에 내성인 미생물의 본래의 균주 또는 고수준의 염에 내성을 갖는 유전자 조작된 균주가 사용된다.
유성 미생물을 사용하는 종속영양 오일 생산에 사용하기 위한 분해된 셀룰로스 바이오매스를 제조하는 방법. 제1 단계는 재현탁된 분해된 셀룰로스 바이오매스를 5.0 내지 5.3의 범위로 pH를 조정하고 이어서 셀룰로스 바이오매스를 3회 세척함을 포함한다. 상기 세척 단계는 탈염 및 이온 교환 수지, 역삼투압, 열수 처리(상기 기재) 또는 단지 반복적인 재현탁 및 탈이온수중에서 원심분리의 사용을 포함하는 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 상기 세척 단계는 전도성이 100-300 μS/cm인 셀룰로스 스트림을 유도하고 상당한 양의 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄을 제거시킨다. 상기 세척 단계로부터 이동은 헤미셀룰로스 분획물로부터 유리된 5탄당을 농축시키는 단계를 배제할 수 있다. 제2 단계는 세척된 셀룰로스 바이오매스의 효소적 당화를 포함한다. 바람직한 양태에서, 아셀레라제(Genencor)를 사용한다. 제3 단계는 상기 당화된 바이오매스의 원심분리 또는 이동시키기 및 세정을 통한 당의 회수를 포함한다. 수득한 바이오매스(고체)는 연료로서 사용될 수 있거나 폐기물로 보내질 수 있는 에너지 집적된 리그닌 풍부 성분이다. 원심분리/이동시키기 및 세정 공정에서 회수된 당 스트림을 수거한다. 제4 단계는 투과물의 회수와 함께 오염 고체를 제거하기 위한 마이크로여과를 포함한다. 제5 단계는 진공 증발기를 사용하여 달성될 수 있는 농축 단계를 포함한다. 상기 단계는 수득한 당 공급원료의 단백질 함량으로 인해 때때로 필요한 P'2000(Sigma/Fluka)과 같은 소포제의 첨가를 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 또 다른 양태에서, 탄소 공급원은 바이오디젤 에스터결합 전이반응으로부터 산성화되고 비-산성화된 글라이세롤 부산물을 포함하는 글라이세롤이다. 하나의 양태에서, 탄소 공급원은 글라이세롤 및 하나 이상의 다른 탄소 공급원을 포함한다. 일부 경우에, 글라이세롤 및 하나 이상의 다른 고정 탄소 공급원 모두는 발효 초기에 미생물에 제공된다. 일부 경우에, 글라이세롤 및 하나 이상의 다른 고정 탄소 공급원이 사전 결정된 비율로 동시에 미생물에 제공된다. 일부 경우에, 글라이세롤 및 하나 이상의 다른 고정 탄소 공급원은 발효 과정 동안에 소정의 속도로 미생물에 공급된다.
몇몇 미세조류는 글루코스의 존재에서보다 글라이세롤의 존재 하에서 보다 빠르게 세포 분열을 진행한다(국제특허출원 공개번호 제2008/151149호 참조). 이들 경우에, 처음에 세포에게 글라이세롤을 공급하여 세포 밀도를 신속하게 증가시킴에 이어서 글루코스를 공급하여 지질을 축적시키는 2단계 성장 공정은 지질이 생산되는 효율을 개선시킬 수 있다. 에스터결합 전이반응 공정의 글라이세롤 부산물의 사용은 생산 공정으로 도입되는 경우 상당한 경제적인 이점을 제공한다. 글라이세롤 및 글루코스의 혼합물과 같은 다른 공급 방법이 제공된다. 상기 혼합물의 공급은 또한 동일한 경제적 이득을 취득한다. 또한, 본 발명은 글라이세롤과 다양하게 배합된 수크로스와 같은 대안적인 당을 미생물에 공급하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 탄소 공급원은 전화당이다. 전화당은 수크로스를 그것의 단당류 성분인 프럭토스 및 글루코스로 분할하는 것으로 생성된다. 전화당의 생성은 당업계에 공지된 몇몇 방법을 통해 달성될 수 있다. 하나의 이러한 방법은 수크로스 수용액을 가열하는 것이다. 종종, 촉매는 수크로스를 전화당으로 전환하는 것을 가속화하기 위하여 사용된다. 이들 촉매는 예를 들어 인버타제와 같은 생물학적 효소일 수 있고, 수크라제는 수크로스에 첨가되어 전화당을 생성하는 가수분해 반응을 가속화할 수 있다. 산은 비생물학적 촉매의 예이며, 가열과 짝지어질 때 가수분해 반응을 가속화할 수 있다. 일단 전화당이 만들어지면, 수크로스와 비교하여 결정화되는 경향이 더 적으며, 따라서 미세조류를 포함하는 미생물의 종속 영양 배양의 경우에, 농축된 탄소 공급원에 대한 필요가 있다. 한 실시형태에서, 탄소 공급원은 전화당으로서, 바람직하게는 농축된 형태이며, 배양 단계 전 바람직하게는 적어도 800g/리터, 적어도 900g/리터, 적어도 1000g/리터 또는 적어도 1100g/리터인데, 이는 선택적으로 유가배양물이다. 바람직하게는 농축된 형태인 전화당은 세포가 성장하고 지질을 축적함에 따라 시간에 걸쳐 세포에 공급된다.
본 발명의 방법의 또 다른 양태에서, 탄소 공급원은 수크로스이고 사탕무 가공으로부터의 진한 사탕무 액즙과 같이 수크로스를 함유하는 복합 공급원료를 포함한다. 종속 영양 오일 생성을 위한 배양물의 더 높은 밀도 때문에, 고정된 탄소 공급원(예를 들어, 수크로스, 글루코스 등)은 바람직하게는 농축된 형태이며, 배양 단계 전 바람직하게는 적어도 500g/리터, 적어도 600g/리터, 적어도 700g/리터 또는 적어도 800g/리터의 고정된 탄소 공급원인데, 이는 선택적으로 유가배양물이며, 이때 해당 물질은 세포가 성장하고 지질을 축적함에 따라 시간에 걸쳐 세포에 공급된다. 일부 경우에, 탄소 공급원은 배양 단계 전 사탕무 액즙의 형태, 바람직하게는 농축된 형태로, 바람직하게는 적어도 60% 고체 또는 약 770g/리터 당, 적어도 70% 고체 또는 약 925g/리터 당, 또는 적어도 80% 고체 또는 약 1125g/리터 당이며, 이는 선택적으로 유가배양물이다. 농축된 사탕무 액즙은 세포가 성장하고 지질을 축적함에 따라 시간에 걸쳐 세포에 공급된다.
하나의 양태에서, 배양 배지는 추가로 하나 이상의 수크로스 이용효소를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 배양 배지는 수크로스 인버타제를 포함한다. 하나의 양태에서, 수크로스 인버타제 효소는 미생물 집단에 의해 발현되는 외인성 수크로스 인버타제 유전자에 의해 암호화된 분비가능한 수크로스 인버타제 효소이다. 따라서, 일부 경우에 하기 부문 IV에 더 상세하게 기재되는 바와 같이, 미세조류는 수크로스 수송체, 수크로스 인버타제, 헥소키나제, 글루코키나제 또는 프럭토키나제와 같은 수크로스 이용 효소를 발현하도록 유전적으로 유전자 조작하였다.
수크로스를 함유하는 복합 공급원료는 사탕무 가공 유래의 폐기 당밀을 포함한다: 사탕무 가공의 낮은 가치의 폐기물의 사용은 탄화수소 및 기타 오일의 제조에 상당한 비용 절감을 제공할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 또 다른 복합 공급원료는 수수 시럽 및 순수한 수수를 포함하는 수수이다. 수수 시럽은 단맛의 사탕수수의 액즙로부터 생산된다. 이의 당 프로파일은 주로 글루코스(덱스트로스), 프럭토스 및 수크로스로 이루어진다.
4. 오일 생성
본 발명의 방법에 따른 오일 생성을 위해, 예를 들어, 빛이 배양물에 입사되지 않도록 하는 매우 대용량(40,000 리터 이상)의 발효기를 사용하는 경우에서와 같이 암실에서 세포를 배양하는 것이 바람직할 수 있다. 프로토테카 종은 고정 탄소 공급원을 함유하는 배지에서 빛의 부재 하에 오일 생성을 위해 성장시키고 번식시킨다; 상기 성장은 종속영양 성장으로서 공지되어 있다.
예로서, 지질-생성 유지성 미생물 세포, 바람직하게는 미세조류 세포의 접종물을 배지에 도입하고 세포가 번식을 시작하기 전에 지체(lag) 기간(지체 단계)이 있다. 지체 기간 후, 번식률은 일정하게 증가하고 로그 또는 대수증식기로 진입한다. 대수증식기에 이어서 질소와 같은 영양물의 감소 및 독성 물질의 증가 및 정족수 감지 메커니즘으로 번식이 느려진다. 상기와 같이 느려진 후, 번식은 멈추고 세포는 정체기 또는 일정한 성장 상태로 진입하고 이는 세포에 제공된 특정 환경에 의존한다. 지질 풍부 바이오매스를 수득하기 위해, 상기 배양물은 전형적으로 질소 또는 또 다른 주요 영양물(탄소 이외의 다른 영양물)이 고갈됨으로써 조기에 종결되어 세포가 과량으로 존재하는 탄소 공급원을 지질로 전환하도록 강요되는 대수증식기 말기 후에 수거한다. 배양 조건 파라미터는 총 오일 생산, 생산된 지질 종의 배합 및/또는 특정 오일의 생성을 최적화하도록 조작될 수 있다.
상기 논의한 바와 같이, 생물반응기 또는 발효기는 세포가 이들의 성장 주기의 다양한 단계를 진행하도록 사용된다. 하나의 예로서, 지질 생산 세포의 접종물은 배지에 도입될 수 있고 이어서 세포가 성장을 시작하기 전에 지체 기간(지체 기)이 도래한다. 상기 지체 기간 후, 성장 속도는 일정하게 증가하고 로그기 또는 대수증식기로 진입한다. 대수증식기에 이어서 영양물의 감소 및/또는 독성 물질의 증가로 인해 성장이 느려진다. 이런 느려지는 단계 후, 성장은 멈추고 당해 세포는 정체기 또는 일정 상태로 진입하고 이는 세포에 제공되는 특정 환경에 의존한다. 본 명세서에 기재된 세포에 의한 지질 생산은 영양물이 공급되거나 세포 분열의 부재 하에 계속적인 지질 생산을 허용하기에 여전히 가용한 정체기를 포함하는, 로그기 또는 이후 기간 동안에 일어날 수 있다.
바람직하게, 본 명세서에 기재되고 당업계에 공지된 조건을 사용하여 성장한 미생물은 적어도 약 20중량%의 지질, 바람직하게는 적어도 약 40중량%의 지질, 더 바람직하게는 적어도 약 50중량%의 지질 및 가장 바람직하게는 약 60중량% 지질을 포함한다. 가공 조건은 특정 용도를 위해 적합한 지질의 수율을 증가시키도록 및/또는 생산 비용을 절감시키도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 특정 양태에서, 미세조류는 예를 들어, 질소, 인 또는 황과 같은 하나 이상의 영양물의 제한 농도의 존재 하에 배양하고 글루코스와 같은 과량의 고정 탄소 에너지를 제공한다. 질소 제한은 질소가 과량으로 공급된 배양물에서의 미생물 지질 수율 이상으로 미생물 지질 수율을 증가시키는 경향이 있다. 특정 양태에서, 지질 수율의 증가는 적어도 약 10%, 50%, 100%, 200%, 또는 500%이다. 상기 미생물은 전체 배양 기간중 일부 동안 또는 전체 기간 동안 제한된 양의 영양물의 존재 하에 배양할 수 있다. 특정 양태에서, 총 배양 기간 동안 2회 이상 영양물 농도는 제한 농도와 비제한 농도 사이에서 순환한다. 세포의 지질 함량은 과량의 탄소를 제공하지만 질소를 제한하거나 제공하지 않으면서 증가된 기간 동안 배양을 계속하여 증가시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 지질 수율은 지질 경로 효소(예를 들어, 지방산 합성 효소)를 위한 하나 이상의 조인자(들)의 존재 하에 지질 생산 미생물(예를 들어, 미세조류)를 배양함에 의해 증가된다. 일반적으로, 조인자(들)의 농도는 조인자(들)의 부재 하에 미생물 지질 수율 보다 미생물 지질(예를 들어, 지방산) 수율을 증가시키기에 충분하다. 특정 양태에서, 상기 조인자(들)는 배양물에 조인자(들)를 암호화하는 외인성 유전자를 함유하는 미생물(예를 들어, 미세조류)을 포함시킴으로써 배양물에 제공된다. 또는, 조인자(들)는 조인자의 합성에 관여하는 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 함유하는 미생물(예를 들어, 미세조류)을 포함시킴으로써 배양물에 제공할 수 있다. 특정 양태에서, 적합한 조인자는 예를 들어, 바이오틴 또는 판토테네이트와 같은 지질 경로 효소에 의해 요구되는 임의의 비타민을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 조인자를 암호화하거나 상기 조인자의 합성에 관여하는 유전자는 널리 공지되어 있고 상기된 것들과 같은 기법 및 전략을 사용하여 미생물(예를 들어, 미세조류)에 도입될 수 있다.
본 명세서에 기재된 생물반응기, 배양 조건 및 종속영양 성장 및 번식 방법의 특정 예는 임의의 적합한 방식으로 조합하여 미생물 성장 및 지질 및/또는 단백질 생산의 효율을 개선시킬 수 있다.
건조 중량으로 높은 %의 오일/지질 축적과 함께 미세조류 바이오매스는 당업계에 공지된 상이한 배양 방법을 사용하여 생산되었다(국제특허출원 공개번호 제2008/151149호 참조). 본 명세서에 기재되고 본 발명에 따라 유용한 배양 방법에 의해 생성된 미세조류 바이오매스는 건조 중량으로 적어도 10%의 미세조류 오일을 포함한다. 일부 경우에, 미생물 바이오매스는 건조 중량으로 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 55%, 또는 적어도 60%의 미세조류 오일을 포함한다. 일부 경우에, 미세조류 바이오매스는 건조 중량으로 10-90%의 미세조류 오일, 25-75%의 미세조류 오일, 40-75%의 미세조류 오일 또는 50-70%의 미세조류 오일을 함유한다.
본 명세서에 기재된 바이오매스의 미세조류 오일 또는 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기 위해 바이오매스로부터 추출된 오일은 하나 이상의 독특한 지방산 에스터 측쇄를 갖는 글라이세로지질을 포함할 수 있다. 글라이세로지질은 다양한 길이 및 다양한 정도의 포화를 가질 수 있는 1개, 2개 또는 3개의 지방산 분자에 에스터화된 글라이세롤 분자로 구성된다. 지방산 분자(및 미세조류 오일)의 길이 및 포화 특성은 하기 부문 IV에서 보다 상세하게 기재된 바와 같은 배양 조건을 통해 또는 지질 경로 가공을 통해 본 발명의 미세조류 오일 내에서 지방산 분자의 성질 또는 비율을 변형시키기 위해 유전자 조작될 수 있다. 따라서, 조류 오일의 특이적 블렌드는 2개 이상의 미세조류 종으로부터 바이오매스 또는 조류 오일을 함께 혼합함에 의해 또는 대두, 평지씨, 카놀라, 팜, 팜커넬, 코코넛, 옥수수, 폐기 식물, 차이니즈 탈로우, 올리브, 해바라기, 면화씨, 치킨 지방, 소 탈로우, 돼지 탈로우, 미세조류, 거대조류, 미생물, 쿠페아, 아마, 피넛, 쵸이스 백색 그리스, 라드, 카멜리나 사티바, 머스타드 씨, 캐슈 너트, 귀리, 루핀, 케나프, 금잔화, 헴프, 커피, 아마인(아마), 헤이즐넛, 유포비아, 호박씨, 코리안더, 카멜리아, 참깨, 홍화, 쌀, 유동, 코코아, 코프라, 양귀비, 아주까리, 피칸, 호호바, 마카다미아, 브라질 너트, 아보카도, 석유 또는 상기 오일 중 임의의 증류 분획물과 같은 다른 공급원 유래의 오일과 본 발명의 조류 오일을 배합함으로써 조류의 단일 종 내에서 생성할 수 있다.
오일 조성물, 즉, 글라이세로지질의 지방산 성분의 성질 및 비율은 또한 2개 이상의 독특한 종의 미세조류 유래의 바이오매스 또는 오일을 배함하여 조작할 수 있다. 일부 경우에, 독특한 종의 미세조류 중 2개 이상은 상이한 글라이세로지질 프로파일을 가진다. 미세조류의 독특한 종은 바람직하게 종속영양 조건하에 본 명세서에 기재된 바와 같이 함께 배양하거나 별도로 배양하여 각각의 오일을 생성할 수 있다. 상이한 종의 미세조류는 세포의 글라이세로지질 내 상이한 백분율의 독특한 지방산 성분을 함유할 수 있다.
일반적으로, 프로토테카 균주는 쇄 길이가 C8-C14인 지방산을 거의 갖지 않는다. 예를 들어, 프로토테타 모리포미스(UTEX 1435), 프로토테카 크루가니(Prototheca krugani)(UTEX 329), 프로토테카 스타그노라(UTEX 1442) 및 프로토테카 좁피(UTEX 1438)는 C8 지방산을 함유하지 않고(검출가능하지 않은 양) C10 지방산이 0 내지 0.01%이고 C12 지방산은 0.03 내지 2.1%이고 C14 지방산은 1.0 내지 1.7%이다.
일부 경우에, 쇄 길이가 C8 또는 C8-10의 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 이식유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 적어도 1%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 12%, 또는 적어도 15% 또는 그 이상의 쇄 길이 C8인 지방산을 가진다. 다른 예에서, 쇄 길이 C10의 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 이식유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 24%, 또는 적어도 25% 또는 그 이상의 쇄 길이 C10인 지방산을 가진다. 다른 경우에, 쇄 길이가 C12인 지방 아실-ACP 기질에 대해 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 이식유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 34%, 적어도 35% 또는 적어도 40% 또는 그 이상의 쇄 길이 C12인 지방산을 가진다. 다른 경우에, 쇄 길이가 C14인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 이식유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 30%, 적어도 43%, 또는 적어도 45% 또는 그 이상의 쇄 길이가 C14인 지방산을 가진다.
비제한적인 예에서, 쇄 길이 C8의 지방 아실-ACP 기질에 대해 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 이식유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 1%-25%, 또는 1%-15%, 바람직하게는 1.8-12.29%의 쇄 길이 C8의 지방산을 가진다. 다른 비제한적 예에서, 쇄 길이 C10의 지방 아실-ACP 기질에 대해 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 이식유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 1%-50%, 또는 1%-25%, 바람직하게는 1.91-23.97%의 쇄 길이 C10의 지방산을 가진다. 다른 비제한적 예에서, 쇄 길이 C12의 지방 아실-ACP 기질에 대해 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 이식유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 5%-50%, 또는 10%-40, 바람직하게는 13.55-34.01%의 쇄 길이 C12의 지방산을 가진다. 다른 비제한적 예에서, 쇄 길이 C14의 지방 아실-ACP 기질에 대해 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 이식유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 1%-60%, 또는 2%-45%, 바람직하게는 2.59-43.27 %, 쇄 길이 C14의 지방산을 가진다. 다른 비제한적 예에서, 다양한 쇄 길이의 지방 아실-ACP 기질에 대해 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 이식유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 30%까지, 35%까지, 또는 바람직하게는 39.45%까지의 쇄 길이 C16의 지방산을 가진다. 일부 경우에, C8 내지 C14쇄 길이의 지방 아실-ACP 기질에 대해 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 이식유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 1%-75%, 또는 2%-60%, 바람직하게는 2.69-57.98%의 중간 쇄(C8-C14) 지방산을 가진다. 일부 경우에, C12 내지 C14쇄 길이의 지방 아실-ACP 기질에 대해 활성을 가지는 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 이식유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 49% C12-C14 지방산을 가진다. 일부 예에서, 외인성 유전자를 보유하기 위하여 일정하고 높은 선택적 압력하에 유전자이식 프로토테카 균주를 유지하는 것은 특정 쇄 길이의 원하는 지방산의 증가 때문에 유리하다. 높은 수준의 외인성 유전자 보유는 또한 본 명세서에 개시된 상동성 재조합 벡터 및 방법을 사용하여 세포의 핵 염색체 내로 외인성 유전자를 삽입함으로써 달성될 수 있다. 핵 염색체 내로 통합된 외인성 유전자를 함유하는 재조합 세포가 본 발명의 목적이다.
미세조류 오일은 또한 미세조류에 의해 생성되고, 또는 배양 배지로부터 유래된 미세조류 오일에 포함된 다른 구성성분을 포함할 수 있다. 이들 구성성분은 미세조류, 미세조류의 종을 배양하기 위하여 사용된 배양 조건, 미세조류 오일 조성에 영향을 미칠 수 있는 바이오매스 또는 다른 인자로부터 미세조류 오일을 회수하는데 사용되는 추출방법에 따라서 다양한 양으로 제시될 수 있다. 이러한 구성성분의 비제한적 예는 0.01-0.5mcg/g, 0.025-0.3mcg/g, 바람직하게는 0.05 내지 0.244 미생물 유기체/그램의 오일로 존재하는 카로테노이드; 0.01-0.5mcg/g, 0.025-0.3mcg/g, 바람직하게는 0.045 내지 0.268 미생물 유기체/그램의 오일로 존재하는 엽록소 A; 0.1 mcg/g 미만, 0.05 mcg/g 미만, 바람직하게는 0.025 미만 미생물 유기체/그램의 오일의 전체 엽록소; 1-300mcg/g, 35-175mcg/g, 바람직하게는 38.3-164 미생물 유기체/그램의 오일로 존재하는 감마 토코페롤; 10-500mcg/g, 50-300mcg/g, 바람직하게는 60.8 내지 261.7 마이크로그램/그램의 오일로 존재하는 전체 토코페롤; 1% 미만, 0.5% 미만, 바람직하게는 0.25% 미만의 브라시카스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 또는 베타시토스테롤; 400 mcg/g 미만, 바람직하게는 300 미생물 유기체/그램 미만의 오일인 전체 토코트라이엔올; 또는 100-500mcg/g, 225-350mcg/g, 바람직하게는 249.6 내지 325.3 미생물 유기체/그램의 오일로 제공되는 전체 토코트라이엔올을 포함한다.
다른 구성성분은, 제한 없이, 인지질, 토코페롤, 토코트라이에놀, 카로테노이드(예를 들어, 알파-카로틴, 베타-카로틴, 라이코펜 등), 크산토필(예를 들어, 루테인, 제악산틴, 알파-크립토산틴 및 베타-크립토산틴), 및 다양한 유기 또는 무기 화합물을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 프로토테카 종으로부터 추출된 오일은 0.001-0.01mcg/g, 0.0025-0.05mcg/g, 바람직하게는 0.003 내지 0.039 마이크로그램 루테인/그램의 오일, 0.01 mcg/g 미만, 0.005 mcg/g 미만, 바람직하게는 0.003 마이크로그램 미만 라이코펜/그램의 오일; 및 0.01 mcg/g 미만, 0.005 mcg/g 미만, 바람직하게는 0.003 마이크로그램 미만 베타 카로텐/그램의 오일을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 트라이글라이세라이드 오일을 포함하는 유지성 미생물 세포를 제공하되, 해당 트라이글라이세라이드 오일의 지방산은 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 7%, 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 15%, C8:0에서; 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 30%에서, C10:0; 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%에서, C12:0; 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%에서, C14:0; 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%에서, C16:0; 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%에서, C18:0; 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%에서, C18:1; 약 7% 미만, 약 5% 미만, 약 3% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0%에서, C18:2; 및 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%에서, 포화된 지방산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 유지성 미생물 세포는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%에서의 C8:0 및 C10:0의 전체 조합량; 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%에서의 C10:0, C12:0, 및 C14:0의 전체 조합량; 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%에서의 C16:0, C18:0 및 C18:1의 전체 조합량; 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%에서의 C18:0, C18:1 및 C18:2의 전체 조합량; 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%에서의 C14:0, C16:0, C18:0 및 C18:1의 전체 조합량; 및 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 0%의 C18:1 및 C18:2의 전체 조합량으로 이루어진 군으로부터 선택된 지방산 프로파일을 포함하는 트라이글라이세라이드 오일을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유지성 미생물 세포는 적어도 약 5 대 1, 적어도 6 대 1, 적어도 7 대 1, 적어도 8 대 1, 적어도 9 대 1, 또는 적어도 10 대 1에서의 C8:0 대 C10:0 비; 적어도 약 6 대 1, 적어도 7 대 1, 적어도 8 대 1, 적어도 9 대 1, 또는 적어도 10 대 1에서의 C10:0 대 C12:0 비; 적어도 약 5 대 1, 적어도 6 대 1, 적어도 7 대 1, 적어도 8 대 1, 적어도 9 대 1, 또는 적어도 10 대 1에서의 C12:0 대 C14:0 비; 적어도 7 대 1, 적어도 8 대 1, 적어도 9 대 1, 또는 적어도 10 대 1에서의 C14:0 대 C12:0 비; 및 적어도 1 대 2, 적어도 1 대 3, 적어도 1 대 4, 적어도 1 대 5, 적어도 1 대 6, 적어도 1 대 7, 적어도 1 대 8, 적어도 1 대 9, 또는 적어도 1 대 10의 C14:0 대 C16:0 비로 이루어진 군으로부터 선택된 지방산 비를 포함하는 지방산 프로파일을 가지는 트라이글라이세라이드 오일을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 유지성 미생물 트라이글라이세라이드 오일 조성물을 제공하되, 해당 트라이글라이세라이드 오일의 지방산 프로파일은 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 7%, 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 15%에서, C8:0; 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 30%에서 C10:0; 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%에서, C12:0; 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%에서, C14:0; 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%에서, C16:0; 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%에서, C18:0; 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%에서, C18:1; 약 7% 미만, 약 5% 미만, 약 3% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0%에서, C18:2; 및 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%에서 포화된 지방산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 유지성 미생물 트라이글라이세라이드 오일 조성물은 지방산 프로파일을 포함하는 트라이글라이세라이드 오일을 포함하며, 이때 C10:0, C12:0 및 C14:0의 전체 조합량은 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%에 있으며; C16:0, C18:0 및 C18:1의 전체 조합량은 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%에 있고; C18:0, C18:1 및 C18:2의 전체 조합량은 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%에 있으며; C14:0, C16:0, C18:0 및 C18:1의 전체 조합량은 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%에 있고; C8:0 및 C10:0의 전체 조합량은 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 0%이다.
일부 실시형태에서, 유지성 미생물 트라이글라이세라이드 오일 조성물은 적어도 약 5 대 1, 적어도 약 6 대 1, 적어도 약 7 대 1, 적어도 약 8 대 1, 적어도 약 9 대 1, 또는 적어도 약 10 대 1에서의 C8:0 대 C10:0 비; 적어도 약 6 대 1, 적어도 약 7 대 1, 적어도 약 8 대 1, 적어도 약 9 대 1, 또는 적어도 약 10 대 1에서의 C10:0 대 C12:0 비; 적어도 약 5 대 1, 적어도 약 6 대 1, 적어도 약 7 대 1, 적어도 약 8 대 1, 적어도 약 9 대 1, 또는 적어도 약 10 대 1에서의 C12:0 대 C14:0 비; 적어도 약 7 대 1, 적어도 약 8 대 1, 적어도 약 9 대 1, 또는 적어도 약 10 대 1에서의 C14:0 대 C12:0 비; 적어도 약 1 내지 2, 적어도 약 1 대 3, 적어도 약 1 대 4, 적어도 약 1 대 5, 적어도 약 1 대 6, 적어도 약 1 대 7, 적어도 약 1 대 8, 적어도 약 1 대 9, 또는 적어도 약 1 대 10의 C14:0 대 C16:0 비로 이루어진 군으로부터 선택된 지방산의 비를 포함하는 지방산 프로파일을 가지는 트라이글라이세라이드 오일을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 7%, 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 15%에서, C8:0; 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 30%에서, C10:0; 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%에서, C12:0; 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%에서, C14:0; 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%에서, C16:0; 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%에서 C18:0; 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%에서, C18:1; 약 7% 미만, 약 5% 미만, 약 3% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0%, C18:2; 및 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 포화된 지방산으로 이루어진 군으로부터 선택된 지방산을 가지는 유지성 미생물 트라이글라이세라이드 오일 조성물의 생산 방법을 제공하되, 해당 방법은 (a) 유지성 미생물 세포의 건조 세포 중량의 적어도 10%가 트라이글라이세라이드 오일이 될 때까지 배양 배지 내 유지성 미생물 세포의 집단을 배양하는 단계; 및 (b) 유지성 미생물 세포로부터 유래된 트라이글라이세라이드 오일을 분리하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 유지성 미생물 트라이글라이세라이드 오일 조성물의 제조방법은 지방산 프로파일을 포함하는 트라이글라이세라이드 오일을 수득하며, 이때: C10:0, C12:0 및 C14:0의 전체 조합량은 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%에 있고; C16:0, C18:0 및 C18:1의 전체 조합량은 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%에 있고; C18:0, C18:1 및 C18:2의 전체 조합량은 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%에 있으며; C14:0, C16:0, C18:0 및 C18:1의 전체 조합량은 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%에 있고; C8:0 및 C10:0의 전체 조합량은 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 0%이다.
일부 실시형태에서, 유지성 미생물 트라이글라이세라이드 오일 조성물의 제조방법은 적어도 약 5 대 1, 적어도 약 6 대 1, 적어도 약 7 대 1, 적어도 약 8 대 1, 적어도 약 9 대 1, 또는 적어도 약 10 대 1에서의 C8:0 대 C10:0 비; 적어도 약 6 대 1, 적어도 약 7 대 1, 적어도 약 8 대 1, 적어도 약 9 대 1, 또는 적어도 약 10 대 1에서의 C10:0 대 C12:0 비; 적어도 약 5 대 1, 적어도 약 6 대 1, 적어도 약 7 대 1, 적어도 약 8 대 1, 적어도 약 9 대 1, 또는 적어도 약 10 대 1에서의 C12:0 대 C14:0 비; 적어도 약 7 대 1, 적어도 약 8 대 1, 적어도 약 9 대 1, 또는 적어도 약 10 대 1에서의 C14:0 대 C12:0 비; 및 적어도 약 1 대 2, 적어도 약 1 대 3, 적어도 약 1 대 4, 적어도 약 1 대 5, 적어도 약 1 대 6, 적어도 약 1 대 7, 적어도 약 1 대 8, 적어도 약 1 대 9, 또는 적어도 약 1 대 10에서의 C14:0 대 C16:0 비로 이루어진 군으로부터 선택된 트라이글라이세라이드 오일의 비를 포함하는 지방산 프로파일을 가지는 트라이글라이세라이드 오일을 수득한다.
III. 유전자 조작 방법 및 재료
본 발명은 프로토테카 세포를 유전자 변형시키기 위한 방법 및 재료 및 본 발명의 방법에 유용한 재조합 숙주 세포를 제공하고, 당해 숙주 세포는 재조합 프로토테카 모리포미스, 프로토테카 좁피, 프로토테카 크루가니 및 프로토테카 스타그노라 숙주 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 방법 및 재료의 기재는 독자의 편의를 위해 하위부문으로 나눈다. 하위부문 1에서, 형질전환 방법이 기재된다. 하위부문 2에서 상동성 재조합을 사용한 유전적 유전자 조작 방법이 기재된다. 하위부문 3에서 발현 벡터 및 성분이 기재된다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 지질 생성을 향상시키고, 미생물 유기체에 의해 만들어진 성분의 특성 또는 비율을 변형시키거나, 또는 다양한 공급원료 재료 상의 데노보(de novo) 성장 특징을 개선하거나 제공하기 위해 미생물 유기체를 유전자적으로 변형시키는 것이 바람직하다. 다른 클로렐라 종뿐만 아니라 다른 다양한 미생물 유기체가 사용될 수 있지만, 클로렐라 프로토테코이데스, 클로렐라 미누티시마, 클로렐라 소로키니아나, 클로렐라 엘립소이데아, 클로렐라 속, 및 클로렐라 에머소니는 본 명세서에 기재된 유전적 유전자조작 방법에서 사용을 위해 선호되는 미생물 유기체이다.
프로모터, cDNA, 및 3'UTR뿐만 아니라 다른 벡터 구성요소는 천연 공급원으로부터 분리된 단편을 사용하는 클로닝 기법을 통해 만들어질 수 있다(예를 들어 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. 3d edition, 2001, Cold Spring Harbor Press]; 및 미국특허 제4,683,202호 참조). 대안으로, 구성요소는 공지된 방법을 사용하여 합성적으로 만들어질 수 있다(예를 들어 문헌[Gene. 1995 Oct 16;164(1):49-53] 참조).
1. 유전자 조작 방법 - 형질전환
예를 들어 유전자주입, 전기천공(문헌[Maruyama et al. (2004), Biotechnology Techniques 8:821-826] 참조), 유리 비드 형질전환 및 탄화규소 휘스커 형질전환을 포함하는 임의의 적합한 기술에 의해 세포를 형질전환할 수 있다. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 원형질 세포를 형성하고 CaCl2 및 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol, PEG)을 사용하여 재조합 DNA를 미세조류 세포에 도입하는 것이다(문헌[Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73]을 참조하며, 이 문헌은 클로렐라 엘리프소이데아의 형질전환을 위해 상기 방법의 사용을 보고한다). 미세조류의 동시 형질전환을 사용하여 2개의 독특한 벡터 분자를 세포에 동시에 도입할 수 있다(예를 들어 문헌[Protist 2004 Dec;155(4):381-93] 참조).
또한 유전자 주입 방법(예를 들어, 문헌[Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6:299 302], 미국특허 제4,945,050호 참조); 전기천공(문헌[Fromm et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA)(1985) 82:5824 5828] 참조); 레이져 빔, 미세주입 또는 DNA를 미세조류로 도입할 수 있는 임의의 다른 방법의 사용으로 프로토테카 세포를 형질전환시킬 수 있다.
클로렐라와 같은 미생물 유기체 내로 이식유전자를 도입하는 임의의 편리한 기법은 본 발명에서 사용될 수 있다. 문헌[Dawson et al. (1997)(상기 참조)]은 NR-결핍 클로렐라 소로키니아나 돌연변이체 내에 클로렐라 불가리스로부터 유래된 나이트레이트 환원효소(nitrate reductase, NR) 유전자를 도입하여, 안정 형질전환체를 초래하는 입자총 방법(micro-projectile bombardment)의 사용을 기재한다. 간략하게, 0.4 마이크론 텅스텐 비드를 플라스미드로 코팅하였고; 3 X 107개의 클로렐라 소로키니아나 세포를 비선택적 한천 플레이트의 삼등분의 중앙에서 도말하였고, PDS-1000/He Biolistic Particle Delivery(등록상표) 시스템(Bio-Rad)으로 충격을 주었다.
클로렐라와 같은 미생물 유기체 내에 이식유전자를 도입하는 바람직한 방법은 문헌[Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol . 4:63-73]에 의해 기재된 방법이다. K김(Kim)은 CaCl2 및 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)을 사용하여 클로렐라 엘립소이데아 원형질체의 형질전환을 보고한다. 특히, 원형질체는 1-2 X 108/㎖의 밀도에서 클로렐라 엘립소이데아 세포를 성장시킴으로써 제조하였다. 세포를 회수하였고, 1600 g에서 5분 동안 원심분리로 세척하였으며, 0.6 M 소르비톨, 0.6 M 만니톨, 4%(중량/부피) 셀룰로스(Calbiochem), 2%(중량/부피) 마세라제(Calbiochem), 및 50 유닛 펙티나제(Sigma)를 함유하는 5 Ml의 인산염 완충제(Ph 6.0) 중에서 재현탁하였다. 세포 현탁액을 암실에서 25℃로 16시간 동안 부드럽게 진탕하면서 인큐베이션하였다. 결과물 원형질체를 400 g에서 원심분리로 5분 동안 회수하였다. 펠렛을 0.6 M 소르비톨 및 0.6 M 만니톨을 함유하는 5 Ml의 f/2 배지 내에서 부드럽게 재현탁하였고, 400 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 이 펠렛을 50 mMCaCl2를 함유하는 1 Ml의 0.6M 소르비톨/만니톨 용액 내에서 재현탁하였다. 그 다음에 5㎎의 이식유전자 DNA를 25㎍ 송아지 흉선 DNA(Sigma)와 함께 0.4 Ml 내 107-108 원형질체에 첨가하였다. 실온에서 15분 후, 200㎕의 PNC(40% 폴리에틸렌 글라이콜 4000, 0.8 M NaCl, 50 mm CaCl2)를 첨가하였고, 실온에서 30분 동안 부드럽게 혼합하였다. 이후에, 0.6 M 소르비톨/만니톨 용액, 1% 효모 추출물 및 1% 글루코스로 보충한 0.6 Ml의 f/2 배지를 첨가하였고, 형질전환된 세포를 암실에서 25℃로 12시간 동안 세포벽 재생을 위해 인큐베이션하였다. 클로렐라 속 DT 내에 수은 환원효소를 도입하기 위하여 유사한 방법을 문헌[Huang et al. (2007)(상기 참조)]에서 사용하였다.
클로렐라와 같은 미생물을 형질전환하기 위하여 전기천공을 사용하였다. 문헌[Maruyama et al. (2004), Biotechnology Techniques 8:821-826(본 명세서에 그것의 전문이 참조로 포함됨)]에서 보고되는 바와 같이, 이 기법은 고정상 내 세포로부터 제조된 클로렐라 사카로필라 c-211-1a의 원형질체 내로 이식유전자를 도입하기 위하여 사용되었다. 도입된 플라스미드의 일시적 발현을 600 내지 900 V/㎝의 전계 강도(field strength), 및 약 400 ms의 펄스 지속시간 하에 관찰하였으며, 여기서 70-kDa FITC-덱스트란에 대해 높은 막 침투성이 확인되었다.
클로렐라와 같은 미생물 내 이식유전자 발현의 예를 문헌에서 발견할 수 있다(예를 들어 [Current Microbiology Vol. 35 (1997), pp. 356-362; Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2000 Jul;16(4):443-6; Current Microbiology Vol. 38 (1999), pp. 335-341; Appl Microbiol Biotechnol (2006) 72: 197-205; Marine Biotechnology 4, 63-73, 2002; Current Genetics 39:5, 365-370 (2001); Plant Cell Reports 18:9, 778-780, (1999); Biologia Plantarium 42(2): 209-216, (1999); Plant Pathol. J 21(1): 13-20, (2005)] 참조). 또한 본 명세서의 실시예를 참조한다.
유지성 효모(예를 들어, 야로이야 리폴리티카) 내 이식유전자 발현의 예를 문헌에서 발견할 수 있다(예를 들어, 문헌[Bordes et al., J Microbiol Methods, Jun 27 (2007)] 참조). 진균(예를 들어, 모르티에렐라 알핀, 무코르 시르시넬로이데스, acl 아스페르길루스 오크라세우스) 내 이식유전자 발현의 예는 문헌에서 발견할 수 있다(예를 들어 문헌[Microbiology, Jul; 153(Pt. 7):2013-25 (2007); Mol Genet Genomics, Jun; 271(5):595-602 (2004); Curr Genet, Mar;21(3):215-23 (1992); Current Microbiology, 30(2):83-86 (1995); Sakuradani, NISR Research Grant, "Studies of Metabolic Engineering of Useful Lipid-producing Microorganisms" (2004); 및 PCT/JP2004/012021] 참조). 대장균과 같은 박테리아 내 외인성 유전자 발현의 예는 잘 공지되어 있으며; 예를 들어 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al.(3d edition, 2001, Cold Spring Harbor Press]을 참조한다.
본 발명에 따르는 미생물 유기체의 형질전환을 위한 벡터는 당업자에게 친숙한 공지된 기법으로 제조될 수 있다. 다양한 클로렐라 종의 형질전환을 위해 사용단 구성체의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 8에 대응한다. 한 실시형태에서, 미세조류와 같은 미생물 유기체 내 리파제 유전자의 발현을 위한 예시적인 벡터 설계는 미세조류 내 프로모터 활성을 갖는 작동가능한 연결에서 리파제를 암호화하는 유전자를 함유한다. 대안으로 벡터가 관심의 유전자를 갖는 작동가능한 연결에서 프로모터를 함유하지 않는다면, 유전자는 벡터 통합 지점에서 내인성 프로모터에 작동가능하게 연결되도록 세포로 형질전환될 수 있다. 프로모터가 없는 형질전환 방법은 미세조류 내에서 작동하는 경향이 있다(예를 들어, 문헌[Plant Journal 14:4, (1998), pp.441-447] 참조). 해당 벡터는 또한 예를 들어 항생제 또는 제초제에 내성을 부여하는 단백질, 즉 선택가능한 마커를 암호화하는 제2 유전자를 함유할 수 있다. 선택적으로, 하나 또는 둘 다의 유전자(들)는 그 뒤에 폴리아데닐화 신호를 함유하는 3' 미번역 서열이 있다. 두 유전자를 암호화하는 발현 카세트는 벡터 내 또는 별개의 벡터 상에 물리적으로 연결될 수 있다. 미세조류의 공동 형질전환이 또한 사용될 수 있으며, 이때 별개의 벡터 분자는 동시에 사용되어 세포를 형질전환한다(예를 들어 문헌[Protist 2004 Dec;155(4):381-93] 참조). 형질전환된 세포는 내성 카세트가 없는 세포가 성장하지 않는 조건 하에서 항생제 또는 다른 선택가능한 마커의 존재에서 성장하는 능력을 기반으로 선택적으로 선택될 수 있다.
2. 유전자 조작 방법 - 상동성 재조합
상동성 재조합은 상동성 영역을 정렬하고 교환하는 상보적 DNA 서열의 능력이다. 표적화된 게놈 서열("주형")과 상동성인 서열을 함유하는 유전자전이 DNA ("공여체")를 유기체에 도입함에 이어서 대응하는 게놈 상동성 서열 부위에서 게놈으로 재조합을 진행한다. 많은 경우에 상기 공정의 기계론적 단위는 다음을 포함한다: (1) 상동성 DNA 절편의 쌍형성; (2) 이중가닥 브레이크의 공여체 DNA 분자로의 도입; (3) 유리된 공여체 DNA 말단에 의한 주형 DNA 분자의 공격에 이어서 DNA의 합성; 및 (4) 이중가닥 파손 복구 반응으로 최종 재조합 생성물 생성.
숙주 유기체에서 상동성 재조합을 수행하기 위한 능력은 분자 유전학적 수준에서 수행될 수 있는 것에 대한 많은 실제 연관성을 갖고 맞춤 오일을 생성할 수 있는 유성 미생물의 생성에 유용한 많은 실제 연관성을 갖는다. 이의 본래의 상동성 재조합은 정확한 유전자 표적화 반응이고 따라서 동일한 표적화 서열로 생성된 대부분의 유전자 전이 계열은 근본적으로 표현형과 관련해서 동일하고 극소수의 형질전환 반응의 스크리닝을 필요로 한다. 상동성 재조합은 또한 숙주 염색체로의 유전자 삽입 반응을 표적화하여 유전자 선택 부재 하에서도 우수한 유전학적 안정성을 수득한다. 상이한 염색체 유전자 좌위는 심지어 이종성 프로모터/UTR로부터 유전자 발현에 영향을 줄 가능성이 있기 때문에 상동성 재조합은 유사하지 않은 게놈 환경내에서 유전자 좌위를 탐색하고 유전자 발현에 대한 이들 환경의 영향을 평가하는 방법일 수 있다.
상동성 재조합을 사용하는 특히 유용한 유전자 조작 응용은 고도로 특이적인 방식으로 이종성 유전자 발현을 구동시키는 프로모터/UTR과 같은 특이적 숙주 조절 요소를 끌어들이는 것이다. 예를 들어, 선택적 마커를 암호화하는 이종성 유전자를 갖는 불포화효소 유전자들/유전자 패밀리의 절제 또는 녹아웃은 숙주 세포에서 생성된 포화된 지방산의 전체 백분율을 증가시키는 것으로 기대될 수 있다. 실시예 11은 프로토테카 모리포르미스에서 생성된 이러한 불포화효소 유전자 절제 또는 녹아웃의 상동성 재조합 표적 구성체 및 작업예를 기재한다.
상동성 재조합은 정확한 유전자 표적화 반응이기 때문에, 충분한 옆에 있는 영역이 확인된다면, 원하는 유전자 또는 영역내 임의의 뉴클레오타이드(들)를 정확히 변형시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 상동성 재조합은 RNA 및/또는 단백질의 유전자 발현에 영향을 주는 조절 서열을 변형시키기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 이것은 또한 기질 특이성, 친화성 및 Km과 같은 효소 활성을 변형시킴에 따라서 숙주 세포 대사의 목적하는 변화에 영향을 주고자 단백질 암호화 영역을 변형시키는데 사용될 수 있다. 상동성 재조합은 유전자 표적화, 유전자 전환, 유전자 결실, 유전자 복제, 유전자 역위를 유도하고 프로모터, 인핸서 및 3'UTR과 같은 유전자 발현 조절요소를 교환하여 고스트(gost) 게놈을 조작하기 위한 강력한 수단을 제공한다.
상동성 재조합은 내인성 숙주 세포 게놈내에 목적하는 유전자 또는 영역을 "표적화"하기 위한 내인성 서열 조각을 함유하는 표적화 구성체을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 표적화 서열은 관심의 유전자 또는 영역의 5'에 위치하거나, 관심의 유전자/영역의 3'에 위치하거나, 심지어 관심의 유전자/영역 옆에도 위치할 수 있다. 상기 표적화 구성체은 추가의 벡터 골격과 함께 슈퍼코일된 플라스미드 DNA로서, 벡터 골격을 갖지 않는 PCR 생성물로서 또는 선형화된 분자로서 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 일부 경우에, 이것은 제한 효소에 유전자 전이 DNA(공여체 DNA) 내의 상동성 서열을 우선 노출시키는 것이 유리할 수 있다. 상기 단계는 재조합 효율을 증가시킬 수 있고 목적하지 않은 반응의 발생을 감소시킬 수 있다. 재조합 효율을 증가시키는 다른 방법은 PCR을 사용하여 표적화된 게놈 서열에 상동성인 선형 말단을 함유하는 형질전환 유전자전이 DNA를 생성하는 것을 포함한다.
비제한적 예시의 목적을 위해, 상동성 재조합에 유용한 공여체 DNA 서열의 영역은 프로토테카 모리포미스 내 DNA의 KE858 영역을 포함한다. KE858은 1.3 kb이며, 단백질의 전달 RNA(tRNA) 패밀리와 상동성을 공유하는 단백질을 위한 암호화 영역의 부분을 포함하는 게놈 단편이다. 사우던 블롯은 KE858 서열이 프로토테카 모리포미스(UTEX 1435) 게놈 내 단일 복제물로 존재한다는 것을 나타내었다. 이 영역 및 상동성 재조합 표적화를 위해 이 영역을 사용하는 예는 국제특허출원 PCT/US2009/66142호에 기재되어 있다. 유용한 공여체 DNA의 다른 영역은 6S rRNA 게놈 서열의 일부이다. 프로토테카 모리포미스 내 상동성 재조합 내 이 서열의 사용은 이하의 실시예에서 기재한다.
3. 벡터 및 벡터 성분
본 발명에 따르는 미생물 유기체의 형질전환을 위한 벡터는 본 명세서에 기재된 바를 토대로 당업자에게 유사한 공지된 기술에 의해 제조할 수 있다. 벡터는 전형적으로 하나 이상의 유전자를 함유하고 여기서 각각의 유전자는 목적하는 생성물(유전자 생성물)의 발현을 암호화하고 유전자 발현을 조절하거나 유전자 생성물을 재조합 세포 내 특정 위치에 표적화하는 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 독자를 도와주기 위해 본 하위부문은 여러 하위부문으로 나누어진다. 하위부문 A는 본 발명에 의해 제공된 신규 제어 서열뿐만 아니라 전형적으로 벡터상에 함유된 제어 서열을 기재한다. 하위부문 B는 신규 최적화 방법 및 본 발명에 의해 제공된 것들을 사용하여 제조된 유전자뿐만 아니라 벡터 내에 전형적으로 함유된 유전자를 기재한다.
A. 제어 서열
제어 서열은 암호화 서열의 발현을 조절하거나 유전자 생성물을 세포 내부 또는 외부의 특정 위치로 지시하는 핵산이다. 발현을 조절하는 제어 서열은 예를 들어, 암호화 서열의 전사를 조절하는 프로모터 및 암호화 서열의 전사를 종결시키는 종결자를 포함한다. 또 다른 제어 서열은 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 암호화 서열의 말단에 위치한 3' 비해독 서열이다. 유전자 생성물을 특정 위치로 지시하는 제어 서열은 단백질이 세포 내부 또는 외부의 특정 위치에 부착되는 위치로 지시하는 신호 펩타이드를 암호화하는 것들을 포함한다.
따라서, 미세조류내 외인성 유전자의 발현을 위한 예시적인 벡터 설계는 미세조류내에서 활성인 프로모터에 작동적으로 연결된 목적하는 유전자 생성물(예를 들어, 선택가능한 마커, 지질 경로 변형 효소 또는 수크로스 이용 효소)에 대한 암호화 서열을 함유한다. 또한, 벡터가 목적하는 암호화 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하지 않는 경우, 상기 암호화 서열은 이것이 벡터 통합 부위에서 내인성 프로모터와 작동가능하게 연결되도록 세포를 형질전환시킬 수 있다. 형질전환의 프로모터 부재 방법은 미세조류에서 작동하는 것으로 입증되었다(예를 들어[문헌 Plant Journal 14:4, (1998), pp.441-447] 참조).
많은 프로모터는 미세조류 내에서 활성이고 형질전환된 조류에 내인성이 아닌 프로모터(즉, 다른 조류 유래의 프로모터, 고등 식물 유래의 프로모터 및 식물 바이러스 또는 조류 바이러스 유래의 프로모터)뿐만 아니라 형질전환된 조류에 내인성인 프로모터를 포함한다. 미세조류내에서 활성인 예시적인 외인성 및/또는 내인성 프로모터(또한 미세조류에서 기능하는 항생제 내성 유전자)는 국제특허출원 공개 번호 제2008/151149호 및 본 명세서에 인용된 문헌에 기재되어 있다.
외인성 유전자를 발현시키기 위해 사용되는 프로모터는 천연적으로 상기 유전자 또는 이종성 유전자에 연결된 프로모터일 수 있다. 몇몇 프로모터는 하나 이상의 미세조류 종에서 활성이다. 다른 프로모터는 종 특이적이다. 예시적인 프로모터는 하기 실시예에 사용된 클라미도모나스 레인하르드티(Chlamydomas reinhardtii) 유래의 β-튜불린과 같은 프로모터 및 다수의 미세조류 종에서 활성인 것으로 밝혀진 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus, CMV) 및 클로렐라 바이러스와 같은 바이러스 프로모터를 포함한다(예를 들어, 문헌[Plant Cell Rep. 2005 Mar;23(10-11):727-35; J Microbiol. 2005 Aug;43(4):361-5; Mar Biotechnol (NY). 2002 Jan;4(1):63-73] 참조). 프로토테카에서 외인성 유전자의 발현에 사용하기에 적합할 수 있는 또 다른 프로모터는 클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 탈수소효소 프로모터/5 'UTR이다. 선택적으로, 프로모터를 함유하는 상기 서열 중 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60개의 뉴클레오타이드가 사용되다. 프로토테카 외인성 유전자의 발현에 유용한 프로모터는 본 명세서의 서열 목록에 열거되어 있고 예를 들어 클로렐라 HUP1 유전자(서열번호 1)의 프로모터 및 클로렐라 엘립소이데아 나이트레이트 환원효소 프로모터(서열번호 2)가 있다. 클로렐라 바이러스 프로모터는 또한 프로토테카에서 미국 특허 제6,395,965호의 서열번호 1 내지 7과 같은 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있다. 프로토테카에서 활성인 추가의 프로모터는 예를 들어 문헌[Biochem Biophys Res Commun. 1994 Oct 14;204(1): 187-94; Plant Mol Biol. 1994 Oct;26(1):85-93; Virology. 2004 Aug 15;326(1): 150-9; 및 Virology. 2004 Jan 5;318(1):214-23]에서 찾을 수 있다.
프로모터는 일반적으로 항상성이거나 유도성인 것으로서 특성화될 수 있다. 항상성 프로모터는 일반적으로 동일한 수준에서 항상(또는 세포 생활 주기에서 특정 시점에서) 활성이거나 기능성이다. 역으로, 유도성 프로모터는 활성(또는 불활성)이거나 단지 자극에 응답하여 상당히 상향 조절되거나 하향 조절된다. 상기 프로모터 유형 둘 다는 본 명세서의 방법에 적용된다. 본 발명에서 유용한 유도성 프로모터는 외인성으로 제공된 소분자(예를 들어, 서열번호 1에서와 같이 글루코스), 온도(가열 또는 냉각), 배양 배지 내 질소 부재 등과 같은 자극에 응답하여 작동적으로 연결된 유전자의 전사를 매개하는 것들을 포함한다. 적합한 프로모터는 근본적으로 사일런트 유전자의 전사를 활성화하거나 바람직하게는 실질적으로 낮은 수준으로 전사된 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 상향 조절할 수 있다. 이하의 실시예는 프로토테카 세포에 유용한 추가적인 유도성 프로모터를 기재한다.
종결 영역 제어 서열의 내포는 선택적이고 사용되는 경우 상기 선택은 상기 종결 영역이 비교적 상호호환가능하므로 주로 편의를 위한 것이다. 상기 종결 영역은 전사 개시 영역(프로모터)에 특정된 것일 수 있거나 목적하는 DNA 서열에 특정된 것일 수 있거나 또 다른 공급원으로부터 수득할 수 있다(문헌[예를 들어, Chen and Orozco, Nucleic Acids Res. (1988) 16:8411] 참조).
본 발명은 또한 제어 서열 및 재조합 유전자, 및 목적하는 유전자의 구분된 발현을 제공하는 것들을 함유하는 벡터를 제공한다. 표적화를 위한 기관은 엽록체, 플라스티드, 미토콘드리아, 및 소포체이다. 또한, 본 발명은 제어 서열 및 재조합 유전자, 및 세포 외부로의 단백질의 분비를 제공하는 것들을 함유하는 벡터를 제공한다.
프로토테카 핵 게놈에서 발현되는 단백질은 플라스티드 표적화 신호를 사용하여 플라스티드로 표적화될 수 있다. 클로렐라에 내인성인 플라스티드 표적화 서열은 공지되어 있고 예를 들어, 플라스티드로 표적화되는 단백질을 암호화하는 클로렐라 핵 게놈내 유전자들이 있고(예를 들어, GenBank 등록 번호 AY646197 및 AF499684를 참조), 하나의 양태에서, 상기 제어 서열은 단백질의 발현을 프로토테카 플라스티드로 표적화하는 본 발명의 벡터 내에 사용된다.
이하의 실시예는 숙주 세포 내 올바른 구획으로 이종성 단백질을 표적화하는 조류 플라스티드 표적화 서열의 용도를 기재한다. cDNA 라이브러리는 프로토테카 모리포르미스 및 클로렐라 프로토테코디에스 세포를 사용하여 제조되며 국제특허출원 PCT/US2009/066142에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 프로토테카 내에서 폴리펩타이드의 발현은 소포체로 표적화된다. 발현 벡터 내 적절한 보유 또는 분류 신호의 내포는 단백질이 소포체(endoplasmic reticulum, ER)에 보유되고 골지체로 다운스트림되지 않도록 하는 것을 보장한다. 예를 들어, Wageningen UR- Plant Research International제의 IMPACT VECTOR 1.3 벡터는 널리 공지된 KDEL 보유 또는 분류 신호를 포함한다. 상기 벡터와 함께, ER 보유는 이것이 발현 수준을 5배 이상으로 개선한다는 것이 보고되었다는 점에서 실제 이점을 갖는다. 이에 대한 주요 이유는 ER이 세포질 내 존재하는 것보다 발현된 단백질의 해독 후 분해에 관여하는 프로테아제가 보다 낮은 농도이고/이거나 상이하다는 점에 있는 것으로 나타난다. 녹색 미세조류에서 기능하는 ER 보유 신호는 예를 들어, 문헌[Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Apr 26;102(17):6225-30]에 공지되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 폴리펩타이드는 배양 배지 내로 세포 외부로의 분비를 위해 표적화된다. 프로토테카에서 본 발명에 방법에 따라 사용될 수 있는 클로렐라중에서 활성인 분비 신호에 대한 예는 문헌[Hawkins et al., Current Microbiology Vol. 38 (1999), pp. 335-341]을 참조한다.
다수의 프로모터는 형질전환된 조류에 내인성인 프로모터뿐만 아니라 형질전환된 조류에 내인성이 아닌 프로모터(즉, 다른 조류로부터의 프로모터, 더 높은 식물로부터의 프로모터, 및 식물 바이러스 또는 조류 바이러스로부터의 프로모터)를 포함하는 미세조류에서 활성이다. 미세조류에 활성인 외인성 및/또는 내인성 프로모터, 및 미세조류에 작용성인 항생제 내성 유전자는, 예를 들어 문헌[Curr Microbiol. 1997 Dec;35(6):356-62(클로렐라 불가리스); Mar Biotechnol(NY). 2002 Jan;4(1):63-73(클로렐라 엘립소이데아); Mol Gen Genet. 1996 Oct 16;252(5):572-9(파이오덱틸룸 트라이코뉴툼(Phaeodactylum tricornutum)); Plant Mol Biol. 1996 Apr;31(1):1-12(볼복스 카르테리(Volvox carteri)); Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Nov 22;91(24):11562-6(볼복스 카르테리); Falciatore A, Casotti R, Leblanc C, Abrescia C, Bowler C, PMID: 10383998, 1999 May;1(3):239-251(이탈리아 나폴리 아이-80121 빌라 코무날레 스타지오네 주로지카에 소재한 Laboratory of Molecular Plant Biology)(파이오덱틸룸 트라이코뉴툼 및 탈라시오시라 웨이스프로기); Plant Physiol. 2002 May;129(1):7-12.(포르피리디움 속); Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jan 21;100(2):438-42.(클라미도모나스 레인하르드티); Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Feb;87(3):1228-32.(클라미도모나스 레인하르드티); Nucleic Acids Res. 1992 Jun 25;20(12):2959-65; Mar Biotechnol(NY). 2002 Jan;4(1):63-73(클로렐라); BiochemMol Biol Int. 1995 Aug;36(5):1025-35(클라미도모나스 레인하르드티); J Microbiol. 2005 Aug;43(4):361-5(두날리엘라); Yi Chuan Xue Bao. 2005 Apr;32(4):424-33(두날리엘라); Mar Biotechnol (NY). 1999 May;1(3):239-251.(탈라시오시라 및 패닥틸룸(Phaedactylum)); Koksharova, Appl Microbiol Biotechnol 2002 Feb;58(2):123-37(다양한 종); Mol Genet Genomics. 2004 Feb;271(1):50-9(서모시네코코커스 연장체); J. Bacteriol. (2000), 182, 211-215; FEMS Microbiol Lett. 2003 Apr 25;221(2):155-9; Plant Physiol. 1994 Jun;105(2):635-41; Plant Mol Biol. 1995 Dec;29(5):897-907(시네코코커스 PCC 7942); Mar Pollut Bull. 2002;45(1-12):163-7(아나배나 PCC 7120); Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Mar;81(5):1561-5(아나배나(다양한 균주)); Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Mar 27;98(7):4243-8(시네코사이스티스); Wirth, Mol Gen Genet 1989 Mar;216(1):175-7(다양한 종); Mol Microbiol, 2002 Jun;44(6):1517-31 and Plasmid, 1993 Sep;30(2):90-105(프레미엘라 디플로시폰(Fremyella diplosiphon)); Hall et al. (1993) Gene 124: 75-81(클라미도모나스 레인하르드티); Gruber et al. (1991). Current Micro. 22: 15-20; Jarvis et al. (1991) Current Genet. 19: 317-322(클로렐라)]에 기재되며; 추가적인 프로모터에 대해 또한 미국특허 제6,027,900호의 표 1을 참조한다.
외인성 유전자를 발현하기 위해 사용되는 프로모터는 유전자에 자연적으로 연결된 프로모터일 수 있고 또는 이종성 유전자일 수 있다. 일부 프로모터는 한 종 이상의 미세조류에서 활성이다. 다른 프로모터는 종 특이적이다. 바람직한 프로모터는 클라미도모나스 레인하르드티로부터 유래된 RBCS2와 같은 프로모터 및 카울리플라워 모자이크 바이러스(CMV) 및 바이러스 프로모터와 같은 바이러스 프로모터를 포함하는데, 이들은 다양한 종의 미세조류에서 활성인 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Plant Cell Rep. 2005 Mar;23(10-11):727-35; J Microbiol. 2005 Aug;43(4):361-5; Mar Biotechnol (NY). 2002 Jan;4(1):63-73] 참조). 다른 실시형태에서, 보트라이오코커스 말레이트(Botryococcus malate) 탈수소효소 프로모터, 서열번호 150의 임의의 부분을 포함하는 핵산, 또는 클라미도모나스 레인하르티 RBCS2 프로모터(서열번호 151)이 사용될 수 있다. 선택적으로, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60개의 뉴클레오타이드 또는 프로모터를 함유하는 더 많은 이들 서열이 사용된다. 클로렐라 속의 종에 내인성인 바람직한 프로모터는 서열번호 1 및 서열번호 2이다.
클로렐라 내 외인성 유전자의 발현에 유용한 바람직한 프로모터는 클로렐라 HUP1 유전자(서열번호 1)의 프로모터 및 클로렐라 엘립소이데아 나이트레이트 환원효소 프로모터(서열번호 2)와 같은 본 출원의 서열목록에 열거된다. 클로렐라 바이러스 프로모터는 또한 미국특허 제6,395,965호의 서열번호 1 내지 7과 같은 클로렐라 내 유전자를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 클로렐라 내 활성인 추가적인 프로모터는, 예를 들어 문헌[Biochem Biophys Res Commun. 1994 Oct 14;204(1):187-94; Plant Mol Biol. 1994 Oct;26(1):85-93; Virology. 2004 Aug 15;326(1):150-9; 및 Virology. 2004 Jan 5;318(1):214-23]에서 발견될 수 있다.
B. 유전자 및 코돈 최적화
전형적으로, 유전자는 프로모터, 암호화 서열 및 종결 제어 서열을 포함한다. 재조합 DNA 기술에 의해 조립될 때, 유전자는 발현 카세트로 칭해질 수 있고 재조합 유전자를 숙주 세포로 도입하는데 사용되는 벡터로의 편리한 삽입을 위한 제한 부위 옆에 있을 수 있다. 상기 발현 카세트는 상동성 재조합에 의한 발현 카세트의 게놈으로의 안정적인 통합을 촉진하는, 게놈 또는 다른 핵산 표적 유래의 DNA 서열 옆에 있을 수 있다. 또는, 상기 벡터 및 이의 발현 카세트는 통합되지 않은 상태로 유지될 수 있고, 이 경우에, 상기 벡터는 전형적으로, 이종성 벡터 DNA의 복제를 제공할 수 있는 복제원점을 포함한다.
벡터 상에 존재하는 통상의 유전자는 단백질을 암호화하는 유전자이고 이의 발현은 상기 단백질을 함유하는 재조합 세포가 상기 단백질을 발현하지 않는 세포로부터 구분될 수 있도록 한다. 상기 유전자 및 이의 대응하는 유전자 생성물은 선택가능한 마커로 칭한다. 임의의 광범위한 선택가능한 마커는 프로토테카를 형질전환시키기 위해 유용한 이식유전자 구성체에 사용될 수 있다. 적합한 선택가능한 마커의 예는 G418 내성 유전자, 나이트레이트 환원효소 유전자(문헌[Dawson et al. (1997), Current Microbiology 35:356-362] 참조), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(hygromycin phosphotransferase gene, HPT; 문헌[Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73] 참조), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 및 플레오마이신(문헌[Huang et al. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:197-205] 참조)에 대해 내성을 부여하는 ble 유전자, 및 카나마이신에 내성을 부여하는 아미노글라이코사이드-3'-O-포스포트랜스퍼라제(서열번호 194)를 포함한다. 항생제에 대한 미세조류의 민감성을 측정하는 방법은 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Mol Gen Genet. 1996 Oct 16;252(5):572-9] 참조).
항생제 기반이 아닌 다른 선택가능한 마커는 또한 일반적으로 프로토테카 종을 포함하는 미세조류를 형질전환하는데 유용한 이식유전자 구성체에 사용될 수 있다. 미세조류에 의해 이전에 이용될 수 없었던 특정 탄소 공급원을 이용하는 능력을 부여하는 유전자가 또한 선택가능한 마커로서 사용될 수 있다. 예로서, 프로토테카 모리포미스 균주는 전형적으로 수크로스 상에서 성장한다고 하더라고, 불량하게 성장한다. 수크로스 인버타제 유전자를 함유하는 구성체를 사용하는 것은 탄소 기질로서 수크로스를 성장시키는 포지티브 형질전환체의 능력을 부여할 수 있다. 다른 선택가능한 마커와 함께 선택가능한 마커로서 수크로스 이용에 대한 추가적인 상세한 설명은 이하의 하위부문 IV에서 논의한다.
발명의 목적을 위해, 본 발명의 재조합 숙주 세포를 제조하기 위해 사용되는 발현 벡터는 상기 유전자들 중 하나가 선택가능한 마커인 경우, 2개 이상 및 흔히 3개의 유전자를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 유전자 조작된 프로토테카는 선택가능한 마커뿐만 아니라 하나 이상의 외인성 유전자, 예를 들어, 수크로스 인버타제 유전자 또는 아실 ACP-티오에스터라제 유전자를 포함하는 본 발명의 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 하나 또는 2개의 유전자는 지질 수율 및 지방산 에스터로의 전환을 증진시키기 위해 상기 유전자들의 발현과 관련된 타이밍을 허용하는 유도성 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 2개 이상의 외인성 유전자의 발현은 동일한 유도성 프로모터의 제어 하에 또는 상이한 유도성(또는 항상성) 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 후자 상황에서, 제1 외인성 유전자의 발현은 제1 기간 동안 유도될 수 있고(이 동안 제2 외인성 유전자의 발현은 유도되거나 유도되지 않을 수 있다) 제2 외인성 유전자의 발현은 제2 기간 동안 유도될 수 있다(이 동안 제1 외인성 유전자의 발현은 유도되거나 유도되지 않을 수 있다).
다른 양태에서, 2개 이상의 외인성 유전자(임의의 선택가능한 마커에 추가로)는 지방 아실-ACP 티오에스터라제 및 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소이고, 상기 수율의 조합 작용은 알코올 생성물을 생성시킨다. 추가로 제한 없이 알데하이드를 생성하기 위한 지방 아실-ACP 티오에스터라제 및 지방 아실-CoA 환원효소를 포함하는 외인성 유전자의 다른 조합이 제공된다. 하나의 양태에서, 벡터는 알칸을 생성하기 위해 지방 아실-ACP 티오에스터라제, 지방 아실-CoA 환원효소 및 지방 알데하이드 데카보닐라제의 조합을 제공한다. 이들 각각의 양태에서, 외인성 유전자중 하나 이상은 유도성 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다.
2개 이상의 외인성 유전자를 발현하는 본 발명의 다른 예시적인 벡터는 수크로스 수송체 및 수크로스 인버타제 효소 둘 다를 암호화하는 것들 및 선택가능한 마커 및 분비된 수크로스 인버타제 둘 다를 암호화하는 것들을 포함한다. 벡터 중 어느 하나의 유형으로 형질전환된 재조합 프로토테카는 탄소 공급원으로서 사탕무(및 사탕무 유래 당)를 사용하기 위한 유전자 조작된 능력 때문에 더 낮은 제조 비용으로 지질을 생산한다. 상기된 2개의 외인성 유전자의 삽입은, 보다 큰 탄소 유입이 지질 생산과 맞물리도록 지시되고/되거나 무작위 돌연변이 유발을 통해 다당류 생합성의 파괴와 조합될 수 있다. 개별적으로 및 조합적으로, 영양성 전환, 지질 생산을 변화시키기 위한 조작 및 외인성 효소를 사용한 처리는 미생물에 의해 생산되는 지질 조성물을 변형시킨다. 상기 변형은 미생물 내에서 생산되는 지질의 양의 변화, 다른 지질과 비교하여 생산되는 하나 이상의 탄화수소 종의 양 및/또는 생산되는 지질 종의 유형의 변화일 수 있다. 예를 들어, 미세조류는 더 높은 양 및/또는 %의 TAG를 생산하도록 유전자 조작될 수 있다.
재조합 단백질의 최적의 발현을 위해, 형질전환된 숙주 세포에 의해 우선적으로 사용되는 코돈으로 mRNA를 생산하는 암호화 서열을 사용하는 것이 유리하다. 따라서, 전이유전자의 적당한 발현은 전이유전자의 코돈 용법이 전이유전자가 발현되는 유기체의 특이적 코돈 편력에 부합되도록 하는 것이 요구될 수 있다. 상기 효과가 근거하는 정확한 메커니즘은 많지만, 상기 필요성이 충족되는 경우 전이유전자 전령 RNA(mRNA)의 보다 효율적인 해독과 커플링되는, 세포 내에서 합성되는 단백질과 가용하게 아미노아실화된 tRNA 풀의 적당한 균형을 포함한다. 이식 유전자 내 코돈 용법이 최적화되지 않은 경우, 가용한 tRNA 풀은 이종성 mRNA의 효율적인 해독을 허용하기에 충분하지 않고 리보솜 멈춤(stalling) 및 종결 및 유전자이식mRNA의 가능한 불안정성을 유도한다.
본 발명은 프로토테카 내에서 재조합 단백질의 성공적인 발현을 위해 유용한 코돈 최적화된 핵산을 제공한다. 프로토테카 종에서 코돈 용법은 프로토테카 모리포르미스로부터 분리된 cDNA 서열을 연구함에 의해 분석된다. 이 분석은 24,000개 코돈에 대한 탐색이고 이의 결과는 이하의 표 2에 나타낸다.
Figure 112018108415035-pat00004
다른 양태에서, 재조합 벡터내 유전자는 프로토테카 균주 이외의 다른 미세조류 균주를 참조하여 코돈 최적화되었다. 예를 들어, 미세조류내 발현용 유전자를 재암호화하는 방법은 미국 특허 제7,135,290호에 기재되어 있다. 암호화 최적화를 위한 추가의 정보는 예를 들어, GenBank의 코돈 용법 데이타베이스에서 입수할 수 있다.
클로렐라 피레노이도사, 두나리엘라살리나, 및 클로렐라 프로토테코이데스 내 코돈 사용 빈도(codon usage)의 다른 비제한적 예는 표 28, 표 29 및 표 30에서 각각 나타낸다.
Figure 112018108415035-pat00005
Figure 112018108415035-pat00006
Figure 112018108415035-pat00007
C. 유도성 발현
본 발명은 또한 관심의 유전자를 발현하기 위한 유도성 프로모터의 사용을 제공한다. 특히, 리파제 유전자의 유도성 프로모터 사용은 필요하다면 조건이 조절된 때, 예를 들어 세포의 파괴, 반응 혼합물의 물 함량 감소 후, 및/또는 TAG를 지방산 에스터로 전환을 구동시키는 충분한 알코올의 첨가 후 미생물 유기체의 성장 후 리파제를 생성시킨다.
본 발명에 유용한 유도성 프로모터는 자극에 반응하는 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 매개하는 것, 예컨대 외인성으로 제공된 소분자(예를 들어 서열번호 1에서와 같은 글루코스), 온도(가열 또는 냉각), 빛 등을 포함한다. 적합한 프로모터는 본질적으로 침묵 유전자의 전사를 활성화할 수 있고, 바람직하게는 실질적으로 낮은 수준에서 전사된 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 상향조절할 수 있다. 후자의 경우에, 리파제의 전사 수준은 바람직하게는 그것이 발현된 미생물 유기체의 성장을 상당히 방해하지 않는다.
클로렐라 내 이식유전자의 발현은 클로렐라 헥소스 수송체 유전자(서열번호 1)을 구동시키는 프로모터와 같은 프로모터를 통해 유도가능하게 수행될 수 있다. 이 프로모터는 배양 배지 내 글루코스의 존재에 의해 강하게 활성화된다.
D. 2 이상의 외인성 유전자의 발현
추가로, 미세조류와 같은 유전자적으로 조작된 미생물 유기체는 예를 들어 리파제와 같은 2 이상의 외인성 유전자 및 예를 들어 다당류 분해 효소를 암호화하는 용균성 유전자를 포함하고 발현할 수 있다. 하나 또는 유전자 둘 다는 지질 수율 및 지방산 에스터로 전환을 향상시키도록 제어되는 이들 유전자를 상대적 발현 시간을 허용하는 유도성 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 2 이상의 외인성 유전자 발현은 동일한 유도성 프로모터의 제어 하에 또는 상이한 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 후자의 상황에서, 제1 외인성 유전자 발현은 제1 시간 기간 동안(이 동안 제2 외인성 유전자의 발현이 유도되거나 유도되지 않을 수 있음) 유도될 수 있고, 제2 외인성 유전자의 발현은 제2 시간 기간 동안 유도될 수 있다( 이 동안 제1 외인성 유전자의 발현은 유도되거나 유도되지 않을 수 있음). 수크로스를 대사 작용하기 위한 지질-생성 미생물을 유전자 조작하기 위한 벡터 및 방법이 본 명세서에서 제공되는데, 이는 사탕수수 공급원료를 지질로 전환하기 위한 세포를 유전자조작하기 때문에 유리한 특성이다.
2 이상의 외인성 유전자, 예를 들어 지방 아실-ACP 티오에스터라제 및 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소를 발현시키는 미생물(예를 들어, 미세조류, 유지성 효모, 박테리아 또는 진균)의 유전자 조작된 균주가 본 명세서에 제공되며, 이것의 조합된 작용으로 알코올 생성물을 수득한다. 알데하이드를 만들어내기 위해 제한 없이, 지방 아실-ACP 티오에스터라제 및 지방 아실-CoA 환원효소를 포함하는 외인성 유전자의 다른 조합이 추가로 제공된다. 추가로, 이 출원은 알칸을 만들어내기 위해 지방 아실-ACP 티오에스터라제, 지방 아실-CoA 환원효소, 및 지방 알데하이드 데카보닐라제의 조합을 제공한다. 하나 이상의 외인성 유전자는 유도성 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다.
본 발명의 사용에 적합한 추가 변형의 예는, 하나는 고정된 탄소 공급원(예컨대 수크로스)의 수송체를 암호화하고, 두 번째는 수크로스 인버타제 효소를 암호화하는, 2 이상의 외인성 유전자를 발현시키기 위해 미세조류의 유전자 조작된 균주를 포함한다. 얻어진 발효가능한 유기체는 이전에 알려진 방법의 생물학적 탄화수소 생성으로 얻을 수 있는 것보다 더 낮은 제조 비용으로 탄화수소를 생성한다. 상기 기재한 2개의 외인성 유전자 삽입은 탄화수소 생성으로 훨씬 더 큰 탄소 유입을 조종하는 직접 및/또는 무작위 돌연변이를 통해 다당류 생합성의 파괴와 조합될 수 있다. 개개로 및 조합으로, 외인성 효소에 의한 탄화수소 생성 및 처리를 변경하는 유전자 조작인 영양 전환은 미생물 유기체에 의해 생성된 탄화수소 조성물을 변경한다. 해당 변경은 생성된 탄화수소의 양, 다른 탄화수소에 대해 생성된 하나 이상의 탄화수소 종의 양 및/또는 미생물 유기체에 대해 생성된 하나 이상의 탄화수소 종의 양을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 미세조류는 더 많은 양 및/또는 백분율의 TAG를 생성하도록 유전자조작될 수 있다.
E. 구분된 발현
본 발명은 또한 관심 유전자의 구분된 발현을 제공한다. 특히, 특정 실시형태에서, 에스터결합전이 반응의 개시까지 대부분의 세포 지질로부터 격리되는 하나 이상의 세포 구획에 대해 리파제의 발현을 표적화시키는 것이 유리할 수 있다. 표적화를 위한 바람직한 세포 기관은 엽록체, 미토콘드리아, 및 소포체이다.
(1) 엽록체 내 발현
본 발명의 한 실시형태에서, 미생물 유기체 내 폴리펩타이드의 발현은 엽록체에 표적화된다. 엽록체에 대해 이종성인 유전자의 발현을 표적화하는 방법은 공지되어 있으며 본 발명에서 사용될 수 있다. 엽록체 내로 외래 유전자 생성물을 표적화하는 방법은 문헌[Shrier et al., EMBO J. (1985) 4:25 32]에 기재되어 있다. 또한 핵 유전자를 엽록체에 전위시키는 수송 펩타이드의 사용에 대해 문헌[Tomai et al. Gen. Biol. Chem. (1988) 263:15104 15109] 및 미국특허 제4,940,835호를 참조한다. 엽록체에 단백질의 수송을 지시하는 방법은 또한 문헌[Kenauf TIBTECH (1987) 5:40 47]에서 검토된다. 클로렐라에 내인성인 서열을 표적화하는 엽록체는, 예컨대 엽록체에 표적화된 단백질을 암호화하는 클로렐라 핵 게놈 내 유전자가 공지되어 있으며; 예를 들어 GenBank 등록번호 AY646197 및 AF499684를 참조한다.
와게닝겐 UR- 식물 연구 국제기구(Wageningen UR- Plant Research International)는 이중 막 시스템을 가로질러 왕복하는 엽록체 스트로마(세포질) 환경 내로 이종성 단백질을 전달하기 위한 크립산테뭄 모리폴리움 소단위체 단백질의 분비 신호를 사용하는 IMPACTVECTOR1.4 벡터를 판매한다. 해당 단백질은 신호 펩타이드의 적절한 처리를 위하여 성숙 루비스코 단백질의 처음 11개 아미노산에 융합된다(Wong et al., Plant Molecular Biology 20: 81-93 (1992)). 신호 펩타이드는 RbcS 유전자로부터 본래의 인트론을 함유한다.
다른 접근에서, 엽록체 게놈은 이종성 단백질을 발현하도록 유전자 조작된다. 외래 DNA로 코팅된 고속 텅스텐 입자총에 의한 수용 세포의 충격을 사용하는 클라미도모나스 레인하르티(녹조류) 엽록체의 안정한 형질전환이 기재되었다. 예를 들어, 문헌[Boynton et al., Science (1988) 240: 1534 1538; Blowers et al. Plant Cell (1989) 1:123 132 및 Debuchy et al., EMBO J. (1989) 8: 2803 2809]을 참조한다. 텅스텐 입자총을 사용하는 형질전환 기법은 문헌[Klein et al., Nature (London)(1987) 7:70 73]에 의해 기재된다. 식물과 미세조류 둘 다에 대한 엽록체 형질전환의 다른 방법은 공지되어 있다. 예를 들어 미국특허 제5,693,507호; 제6,680,426호; 및 문헌[Plant Physiol. 2002 May;129(1):7-12; 및 Plant Biotechnol J. 2007 May;5(3):402-12]을 참조한다.
미국특허 제6,320,101호(Kaplan 등에 대해 2001년 11월 20일 발행됨; 본 명세서에 참조로 포함됨)에서 기재된 바와 같이, 세포는 약 하나의 세포마다 엽록체 수를 감소시키기 위하여 화학적으로 처리될 수 있다. 그 다음에, 이종성 핵산은 엽록체 내에 적어도 하나의 이종성 핵산 분자를 도입하는 목적으로 입자 충격을 통해 세포 내에 도입될 수 있다. 이종성 핵산은 엽록체에 내재된 효소에 의해 용이하게 달성되는 상동성 재조합을 통해 엽록체의 게놈 내로 통합가능하도록 선택된다. 이것의 마지막에, 이종성 핵산은 관심의 유전자에 더하여, 엽록체 게놈으로부터 유래된 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 추가로, 이종성 핵산은 전형적으로 선택가능한 마커를 포함한다. 이 기법에 대한 추가적인 상세한 설명은 본 명세서에 참조로 포함된 미국특허 제4,945,050호 및 제5,693,507호에서 발견된다. 따라서 폴리펩타이드는 엽록체의 단백질 발현 시스템에 의해 생성될 수 있다.
미국특허 제7,135,620호(Daniell에 대해 2006년 11월 14일 발행됨; 본 명세서에 참조로 포함됨)는 엽록체 발현 벡터 및 관련 방법을 기재한다. 발현 카세트는 엽록체 내 암호화 서열의 적절한 발현을 제공하기 위한 암호화 서열 및 적합한 제어 서열을 포함하는 DNA 구성체이다. 전형적인 발현 카세트는 다음의 성분을 포함한다: 엽록체 내 관심의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 전사 및 번역을 제공하는 psbA와 같은 미생물 유기체 유전자 또는 엽록체로부터 유래된 5' 미번역 영역; 관심의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열; 및 도입된 유전자의 RNA를 안정화하고, 이에 의해 외래 유전자 발현을 향상시킬 수 있는 엽록체 유전자의 3' 전화 반복 영역과 같은 번역 및 전사 종결 영역. 카세트는 선택적으로 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있다.
전형적으로 발현 카세트는 적절한 게놈 내로 삽입을 위해 편리한 제한 부위 옆에 있다. 발현 카세트는 엽록체 DNA로부터 DNA 서열 옆에 위치하여 특히 상동성 재조합에 의해 엽록체 게놈 내로 발현 카세트의 안정한 통합을 용이하게 할 수 있다. 대안적으로, 발현 카세트는 통합되지 않고 남아있을 수도 있는데, 이 경우에 해당 발현 카세트는 엽록체 내에서 이종성인 복제를 제공할 수 있는 엽록체 복제원점을 전형적으로 포함한다.
발현 카세트는 일반적으로 엽록체 내에서 발현시킬 수 있는 유전자로부터 유래된 프로모터 영역을 포함한다. 프로모터 영역은 엽록체 유전자, 예컨대 시금치 또는 완두콩으로부터의 psbA 유전자로부터 얻을 수 있는 프로모터, 또는 메이즈 및 Rrna 프로모터로부터의 rbcL 및 atpB 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 프로모터의 예는 문헌[Hanley-Bowdoin and Chua, TIBS (1987) 12:67 70; Mullet et al., Plant Molec Biol. (1985) 4: 39 54; Hanley-Bowdoin (1986) PhD. Dissertation, the Rockefeller University; Krebbers et al., Nucleic Acids Res. (1982) 10: 4985 5002; Zurawaki et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9:3251 3270; 및 Zurawski et al., Proc. Nat'l Acad Sci. U.S.A. (1982) 79: 7699 7703]에 기재되어 있다. 다른 프로모터가 확인될 수 있고, 이렇게 확인된 프로모터의 상대적 강도는 관심의 5'프로모터를 프로모터가 없는 마커 유전자에 위치시키고, 예를 들어 psbA 유전자로부터의 프로모터, 상대적으로 강한 엽록체 프로모터로부터 얻은 전사에 대해 그것의 유효성을 관찰함으로써 평가될 수 있다. 이종성 유전자 발현의 효율은 임의의 다양한 기법에 의해 향상될 수 있다. 이들은 이종성 유전자, 예를 들어 이중 psbA 프로모터에 나란히 5'에서 삽입된 다양한 프로모터 사용, 인핸서 서열 등의 추가를 포함한다.
클로렐라 엽록체에서 활성인 수많은 프로모터는 클로렐라 엽록체 내 외인성 유전자, 예컨대 GenBank 등록번호 NC_001865(클로렐라 불가리스 엽록체, 완전 게놈)에서 발견되는 것의 발현을 위해 사용될 수 있다.
이종성 유전자의 유도성 발현을 제공하도록 설계된 경우, 전사 및/또는 번ㅇ겨(3'말단에서) 수준의 조절을 제공하는 서열을 함유하는 유도성 프로모터 및/또는 5'미번역 영역은 발현 카세트 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 5'미번역 영역은 발현이 빛에 의해 조절가능한 유전자로부터 유래될 수 있다. 유사하게, 3' 역반복 말단은 이종성 유전자의 RNA를 안정화하기 위하여 사용될 수 있었다. 유도성 유전자는 관심의 특정 자극에 반응하는 발현이 향상되는 것과 자극의 부재에서 발현이 낮거나 없는 것으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 빛-유도성 유전자는 향상된 발현이 빛에 의한 조사 동안 생기는 경우를 확인할 수 있는 한편, 빛이 낮거나 없을 때 발현은 실질적으로 감소되거나 발현이 일어나지 않는다. 녹색 미세조류로부터 유래된 빛 조절 프로모터는 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Mol Genet Genomics. 2005 Dec;274(6):625-36] 참조).
사용되는 종결 영역은 주로 편리함을 위한 것인데, 종결 영역은 엽록체 및 박테리아 중에서 상대적으로 상호호관가능한 것으로 나타났기 때문이다. 종결 영역은 전사 개시 영역에 본래 있을 수도 있고, 관심의 DNA 서열에 본래 있을 수도 있으며, 또는 다른 공급원으로부터 얻을 수도 있다. 예를 들어 문헌[Chen and Orozco, Nucleic Acids Res. (1988) 16:8411]을 참조한다.
발현 카세트는 임의의 다수의 방법에 의해 관심의 식물 세포로 형질전환될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어 바이오리스틱(biolistic) 방법을 포함한다(예를 들어, 문헌[Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6:299 302], 미국특허 제4,945,050호); 전기천공(Fromm et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA)(1985) 82:5824 5828); 레이저 빔, 미소주입 또는 엽록체에 DNA를 도입할 수 있는 임의의 다른 방법을 포함한다.
미세조류와 같은 미생물 유기체에서 사용에 적합한 엽록체 발현 벡터의 추가적인 기재는 미국특허 제7,081,567호 (Xue에 대해 2006년 7월 25일 발행); 제6,680,426호(Daniell 등에 대해 2004년 1월 20일 발행); 및 5,693,507(Daniell 등에 대해 1997년 12월 2일 발행)에서 발견된다.
클로렐라의 핵 게놈에서 발현된 단백질은 엽록체 표적화 신호를 사용하여 엽록체에 표적화될 수 있다. 클로렐라에 내인성인 엽록체 표적화 서열은 예컨대 엽록체에 표적화된 단백질을 암호화하는 클로렐라 핵 게놈 내 유전자가 공지되어 있으며; 예를 들어 GenBank 등록번호 AY646197 및 AF499684를 참조한다. 단백질은 또한 엽록체 게놈 내에 직접적으로 유전자의 삽입에 의해 클로렐라 엽록체 내에서 발현될 수 있다. 엽록체 형질전환은 전형적으로 상동성 재조합을 통해 일어나며, 엽록체 게놈이 표적화 벡터의 생성에 대해 알려져 있다면, 엽록체 형질전환이 수행될 수 있다(예를 들어 클로렐라 엽록체의 완전한 게놈 서열; Genbank 등록번호 NC_001865를 참조). 엽록체 형질전환의 상세한 설명에 대해 본 명세서의 앞의 부문을 참조한다.
(2) 미토콘드리아 내 발현
본 발명의 다른 실시형태에서, 미생물 유기체 내 폴리펩타이드의 발현은 미토콘드리아로 표적화된다. 녹색 미세조류를 포함하는 미토콘드리아에 외래 유전자 생성물을 표적화하기 위한 방법(Boutry et al. Nature (London)(1987) 328:340 342)은 기재되었다(예를 들어, 문헌[Mol Gen Genet. 1993 Jan;236(2-3):235-44] 참조).
예를 들어, 적합한 분비 신호를 암호화하는 발현 벡터는 미토콘드리아에 이종성인 단백질을 표적화할 수 있다. 와게닝겐 UR- 식물 연구 국제기구제의 MPACTVECTOR1.5 벡터는 미토콘드리아 매트릭스 내에서 단백질을 전달하는 것으로 나타난 효모 CoxIV 분비 신호를 사용한다. 단백질은 신호 펩타이드를 적절하게 처리하기 위하여 효모 CoxIV 단백질의 처음 4개 아미노산에 융합된다(Kohler et al. Plant J 11: 613-621 (1997)). 녹색 미세조류에서 기능적인 것을 포함하는 다른 미토콘드리아 표적화 서열은 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[FEBS Lett. 1990 Jan 29;260(2):165-8; 및 J Biol Chem. 2002 Feb 22;277(8):6051-8]을 참조한다.
클로렐라의 핵 게놈에서 발현된 단백질은 미토콘드리아 표적화 신호를 사용하여 미토콘드리아에 표적화될 수 있다. 미토콘드리아 단백질 표적화 및 형질전환의 상세한 설명에 대해 본 명세서의 이전의 부문을 참조한다.
(3) 소포체 내 발현
본 발명의 다른 실시형태에서, 미생물 유기체 내 폴리펩타이드의 발현은 소포체로 표적화된다. 발현 벡터 내 적절한 보유 또는 분류 신호의 포함은 단백질이 소포체(ER) 내에 유지되고, 골지체 내로 하류로 가지 않는다는 것을 보장한다. 예를 들어, 와게닝겐 UR- 식물 연구 국제기구제의 IMPACTVECTOR1.3 벡터는 잘 공지된 KDEL 보유 또는 정렬 신호를 포함한다. 이 벡터에 의해, ER 보유는 현실적 이점을 가지며, 즉, 발현 수준을 5배 또는 그 이상으로 개선시키는 것으로 보고되었다. 이에 대한 주된 이유는 ER이 세포질에 존재하는 발현된 단백질의 번역 후 분해를 초래하는 더 낮은 농도 및/또는 상이한 프로테아제를 함유한다는 것을 나타낸다. 녹색 미세조류에서 기능적인 ER 보유 신호는 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Apr 26;102(17):6225-30]을 참조한다.
본 발명의 방법 및 재료가 미생물 유기체 내애 임의의 외인성 유전자를 도입시키는 반면, 수크로스 이용 및 지질 경로 변형에 대한 유전자는 다음의 부문에서 논의되는 것과 같은 특정 관심을 가진다.
IV. 선택가능한 마커
1. 수크로스 이용
하나의 양태에서, 본 발명의 재조합 프로토테카 세포는 하나 이상의 외인성 수크로스 이용 유전자를 함유한다. 다양한 양태에서, 하나 이상의 유전자는 프럭토키나제, 글루코키나제, 헥소키나제, 수크로스 인버타제 및 수크로스 수송체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 수크로스 수송체 및 수크로스 인버타제의 발현은 프로토테카가 수크로스를 배양 배지로부터 세포에 수송하여 수크로스를 가수분해시켜 글루코스 및 프럭토스를 생성하도록 한다. 임의로, 내인성 헥소키나제 활성이 프럭토스의 최대 인산화를 위해 불충분한 경우에도 프럭토키나제는 발현될 수 있다. 적합한 수크로스 수송체의 예는 Genbank 등록번호 제CAD91334호, 제CAB92307호, 및 제CAA53390호이다. 적합한 프럭토키나제의 예는 Genbank 등록번호 제P26984호, 제P26420호 및 제CAA43322호이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 수크로스 인버타제를 분비하는 프로토테카 숙주 세포를 제공한다. 수크로스 인버타제의 분비는 수크로스를 세포 내로 수송할 수 있는 수송체를 발현할 필요성을 제거한다. 이것은 분비된 인버타제가 수크로스 분자의 글루코스 및 프럭토스 분자로의 전환을 촉매하기 때문이고, 이들 분자 둘 다는 본 발명에 의해 제공된 미생물에 의해 수송되고 이용될 수 있다. 예를 들어, 분비 신호 (예를 들어, 서열번호 4의 신호(효모 유래), 예를 들어, 서열번호 5의 신호(고등 식물 유래), 서열번호 6의 신호(진핵 컨센서스 분비 신호) 및 서열번호 7의 신호(고등 식물 및 진핵 컨센서스 유래의 신호 서열의 조합체))와 함께 수크로스 인버타제(예를 들어, 서열번호 3)의 발현은 세포 외부에서 인버타제 활성을 생성시킨다. 본 명세서에 기재된 유전자 조작 방법에 가능한 상기 단백질의 발현은 이미 에너지원으로서 세포외 글루코스를 이용할 수 있는 세포가 세포외 에너지원으로 수크로스를 이용할 수 있게 해준다.
수크로스 함유 배지에서 인버타제를 발현하는 프로토테카 종은 오일 생산을 위해 바람직한 미세조류 종이다. 이런 완전히 활성인 단백질의 발현 및 세포외 표적화는 수득한 숙주 세포가 수크로스 상에서 성장하도록 하는 반면, 이들의 비형질전환된 대응 숙주 세포는 성장할 수 없다. 따라서, 본 발명은 효모 인버타제 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 코돈 최적화된 인버타제 유전자를 갖는 프로토테카 재조합 세포를 제공하고, 이때 상기 효모 인버타제 유전자는 게놈에 통합되어 있어 상기 인버타제 유전자는 인버타제 활성 및 수크로스 가수분해에 의해 평가되는 바와 같이 발현된다. 본 발명은 또한 세포가 수크로스상에 성장할 수 있는 반면 이들의 비형질전환된 대응 세포는 발현할 수 없으므로 프로토테카 재조합 세포에서 선택가능한 마커로서 유용한 인버타제 유전자; 및 조류 분자 유전자에 대한 강력한 선택가능한 마커로서 인버타제를 사용하여 재조합 숙주 세포를 선택하기 위한 방법을 제공한다.
프로토테카에서 수크로스 인버타제의 성공적인 발현은 또한 이것이, 이종성(재조합) 단백질이 완전한 활성 및 기능적 형태로서 세포 외부로 및 배양 배지 내로 성공적으로 분비됨을 입증한다는 점에서 본 발명의 또 다른 측면을 설명한다. 따라서, 본 발명은 미세조류 내 광범위한 이종성 단백질을 발현하고 이들을 숙주 세포 외부로 분비시키기 위한 방법 및 시약을 제공한다. 상기 단백질은 예를 들어, 산업용 효소, 예를 들어, 리파제, 프로테아제, 셀룰라제, 펙티나제, 아밀라제(예를 들어, 서열번호 190 내지 191), 에스터라제, 옥시도환원효소, 트랜스퍼라제, 락타제, 아이소머라제 및 인버타제, 및 치료학적 단백질, 예를 들어, 성장 인자, 사이토킨, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 전장 항체, Fab, scFv(단일쇄 가변 단편), 카멜리드형 항체, 항체 단편, 항체-단편 융합체, 항체-수용체 융합체, 인슐린, 인터페론 및 인슐린형 성장 인자를 포함한다.
프로토테카내 수크로스 인버타제의 성공적인 발현은 또한 이것이 프로토테카내 단백질의 분비를 지시하기 위한 조류 내 진균류 수송 펩타이드의 사용을 위한 방법 및 시약을 제공하고 펩타이드가 기능할 수 있는지의 여부 및 이것이 프로토테카 세포에서 수송 펩타이드로서 기능하는 능력을 결정하기 위한 방법 및 시약을 제공한다는 점에서 본 발명의 또 다른 측면을 설명한다. 본 발명의 방법 및 시약은 단백질을 세포 외로 성공적으로 수송할 수 있는 다른 수송 펩타이드를 확인하기 위한 도구 및 플랫폼으로서 사용될 수 있고, 이때 효모 인버타제가 이들 방법에서 우수한 용도를 갖는다. 본 실시예에서 입증된 바와 같이, 내인성 효모 인버타제 수송 펩타이드의 제거 및 숙주 조류에 내인성이거나 다른 공급원(진핵, 원핵 및 바이러스)으로부터 유래하는 다른 수송 펩타이드로 이의 대체가 목적하는 임의의 펩타이드가 세포로부터 단백질의 방출을 유도하는 수송 펩타이드로서 기능할 수 있는지의 여부를 확인할 수 있다.
적합한 수크로스 인버타제의 예는 Genbank 등록번호 제CAB95010호, 제NP_012104호 및 제CAA06839호에 의해 확인된 것들을 포함한다. 적합한 인버타제의 비제한적인 예는 하기 표 3에 열거되어 있다. 각각의 열거된 인버타제에 대한 아미노산 서열은 하기의 서열 목록에 포함된다. 일부 경우에, 본 발명의 방법 및 벡터에 사용하기에 적합한 외인성 수크로스 이용 유전자는 표 3로으부터 선택되는 수크로스 인버타제와 40, 50, 60, 75, 또는 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 수크로스 인버타제를 암호화한다.
Figure 112018108415035-pat00008
프로토테카에 의한 배양 배지로의 인버타제의 분비는 세포가 이들이 순수 시약 등급의 글루코스 상에 성장하는 바와 같이 사탕무 가공으로부터 비롯된 폐기 당밀상에서 성장할 수 있도록 해주고 사탕무 가공의 상기 낮은 가치의 폐기물의 사용은 지질 및 다른 오일의 제조에서 상당한 비용 절감을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 (i) 수크로스 및 (ii) 수크로스 인버타제 효소를 포함하는 배양 배지 및 프로토테카 미생물 집단을 함유하는 미생물 배양물을 제공한다. 다양한 양태에서 배양물내 수크로스는 수수, 사탕무, 사탕 수수, 당밀 또는 탈중합된 셀룰로스 물질(이것은 임의로 리그닌을 함유할 수 있다)로부터 유래한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 방법 및 시약은 재조합 프로토테카에 의해 사용될 수 있는 공급원료의 수 및 유형을 상당히 증가시킨다. 본 명세서에 예시된 미생물은 이들이 수크로스를 이용할 수 있도록 변형되고 본 발명의 방법 및 시약이 적용되어 셀룰로스와 같은 공급원료가 셀룰라제, 펙티나제, 아이소머라제 등을 분비하는 능력을 갖는 본 발명의 유전자조작된 숙주 미생물에 의해 이용될 수 있도록 하고 효소 반응의 분해 생성물은 더 이상 단순히 내성이 아니고 숙주에 의해 탄소 공급원으로 이용된다. 이것의 예는 이하에서 및 농업폐기물 스트림에서 발견되는 2가지의 올리고당인 라피노스 및 스타키오스에 함유된 것과 같은 올리고당 내 α-갈락토실 결합을 가수분해하는 능력을 부여하는 선택가능한 α-갈락토시다제로 유전자 조작된 미생물의 예에서 기재된다.
2. 알파-갈락토시다제 발현
상기 기재한 바와 같은 수크로스 인버타제의 발현이 탄소 공급원과 같은 수크로스를 더 효율적으로 이용하기 위하여 프로토테카 세포에 대해 능력을 부여하는 한편(이당류 수크로스 내 프럭토스와 글루코스 분자 사이의 α-연결을 가수분해하는 효소를 통해), 올리고당 내 다른 유형의 α-연결을 가수분해하는 다른 효소의 발현은 다른 탄소 공급원을 이용하기 위하여 프로토테카 세포에 대한 능력을 부여할 수 있다. 이들 효소의 발현(및 프로토테카 및 다른 미세조류 세포가 보통 사용될 수 없는 탄소 공급원을 이용하는 결과 능력)은 이들 탄소 공급원을 성장시킬 수 있는 포지티브 클론을 선택하도록 하여 이들 유전자 이식 프로토테카 세포에 대한 선택가능한 마커로 사용될 수 있다.
실시형태에서, 본 발명의 재조합 프로토테카 세포는 다당류 분해 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 유전자를 추가로 함유한다. 다양한 실시형태에서, 다당류 분해 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자는 분비된 α-갈락토시다제를 암호화하는 유전자이다. 프로토테카 세포 내 외인성의 분비된 α-갈락토시다제의 발현은 갈락토스와 글루코스 단당류 단위 사이의 α-연결과 같은 D-갈락토실 연결을 함유하는 당(탄소 공급원)에서 성장하는 이러한 형질전환된 균주의 능력을 부여한다. 외인성의 분비된 α-갈락토시다제를 발현하는 프로토테카 균주는 멜리비오스(α-D-갈락토스-글루코스로 구성된 이당류)와 같은 이당류를 이용할 수 있다.
라피노스(α-연결된 갈락토스-글루코스-프럭토스를 포함하는 삼당류) 및 스타키오스(2개의 α-연결 D-갈락토스 단위 다음에 α-연결된 글루코스 및 프럭토스로 구성되는 삼당류)와 같은 당은 사탕 무박(라피노스) 및 대두 음식물(스타키오스)와 같은 농업폐기물 스트림에서 상당한 비율로 존재한다. 이러한 농업 잔여물은 그것을 이용할 수 있는 미생물(프로토테카를 포함)에 의해 오일로 전환을 위하여 상당한 이용되지 않은 탄소 공급원을 표시한다.
프로토테카 균주는 임의의 상당한 양으로 또는 전혀 라피노스 및 스타키오스와 같은 올리고당을 이용할 수 없었다. 라피노스 및 스타키오스의 경우에, 수크로스 인버타제를 발현하는 유전자이식 균주(상기 기재함)가 수크로스의 α-갈락토실 유도체 내 프럭토스와 글루코스 사이의 α-연결을 가수분해하는 능력을 가지지만, 수크로스 인버타제가 이러한 당 내 남아있는 α-연결을 절단하지 않고, 결과 이당류가 이용가능하지 않기 때문에 올리고당의 나머지는 이용되지 않고 남아있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 재조합 프로토테카 세포는 수크로스 인버타제를 암호화하는 외인성 유전자와 α-갈락토시다제를 암호화하는 외인성를 둘 다 포함한다. 따라서 수크로스 인버타제와 α-갈락토시다제를 둘 다 발현하는 균주는 성분 모노머를 소모시키는 라피노스 및 스타키오스와 같은 올리고당을 완전히 가수분해할 것이다. 추가로, α-갈락토시다제 암호화 유전자는 형질전환을 위한 선택가능한 마커로 사용될 수 있다. 외인성 α-갈락토시다제 유전자를 함유하는 클론은 멜리비오스 상에서 성장하는 능력을 가질 것이다. 프로토테카 균주 내 사용을 위한 적합한 α-갈락토시다제의 예는 사카로마이세스 카를베겐시스(Saccharomyces carlbergensis)로부터 유래된 MEL1 유전자, 아스퍼질러스 니거(Aspergilus niger)로부터 유래된 AglC 유전자를 포함한다. 흥미롭게도, α-갈락토시다제 유전자는 해당 유전자가 프로토테카 균주 내 선호되는 코돈 사용빈도에 따라서 최적화될 때조차, 프로토테카 종에서 반드시 기능적인 것은 아니다. 이하의 예는 사카로마이세스 카를베겐시스의 코돈 최적화된 MEL1 유전자와 아스퍼질러스 니거로부터의 AglC 유전자에 의해 형질전환될 때 멜리비오스 상에서 성장하는 유전자이식 프로토테카 세포의 능력을 증명하지만, 더 고차의 식물, 시아몹시스 테트라고노볼라(Cyamopsis tetragonobola)(구아콩)로부터 유래된 α-갈락토시다제 암호화 유전자는 그렇지 않다.
3. 티아민 영양요구성 상보성
프로토테카 모리포미스를 포함하는 프로토테카 균주는 티아민 영양요구성인 것으로 공지되어 있는데(예를 들어 문헌[Ciferri, O. (1956) Nature, v.178, pp. 1475-1476] 참조), 이는 이들 균주가 성장을 위한 영양 배지에서 티아민을 필요로 한다는 것을 의미한다. 티아민 영양요구성은 티아민 생합성 경로에서 돌연변이 또는 효소 발현의 결여의 결과일 수 있다. 티아민 생합성 경로에서 없어진 효소(들)를 발현하는 상보적 유전자이식 균주는 그 다음에 첨가되는 티아민 없이 성장될 수 있으며, 따라서 영양 배지 비용을 감소시킬 뿐만 아니라 동물 영양 관점으로부터 더 바람직한 결과의 미세조류 바이오매스를 제공한다.티아민 생합성 경로 효소와 상보성은 또한 유전자이식 유전자가 티아민을 함유하지 않는 플레이트/배지 상에서 성장하는 능력을 부여함에 따라 선택가능한 마커로 사용될 수 있다.
실시형태에서, 본 발명의 재조합 프로토테카 세포는 티아민 생합성 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 유전자를 추가로 함유한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 재조합 프로토테카 세포는 조류, 식물 또는 시아노박테리아 공급원으로부터의 하이드록시메틸피리미딘 포스페이트 신타제를 암호화하는 외인성 유전자(예를 들어 서열번호 192)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 하이드록시메틸피리미딘 포스페이트 신타제는 THIC 유전자에 의해 암호화된다. 또 다른 실시형태에서, THIC 유전자는 콕코믹사(Coccomyxa) C-169 THIC, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) THIC, 시네코시스티스 속(Synechocystis sp .) PCC 6803 THIC, 또는 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 티피무리움 THIC(Salmonella enterica subsp . enterica serovar Typhimurium str . THIC)(서열번호 193)이다. 이하의 예는 회복된 티아민 영양원에 의한 프로토테카 모리포미스 UTEX 1435의 유전자 조작을 상술한다.
4. 다른 선택가능한 마커
임의의 매우 다양한 선택가능한 마커는 클로렐라와 같은 미생물 유기체를 형질전환하는데 유용한 이식유전자 구성체 내에서 사용될 수 있다. 적합한 선택가능한 마커의 예는 나이트레이트 환원효소 유전자, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(HPT), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 및 플레오마이신에 내성을 부여하는 ble 유전자를 포함한다. 항생제에 대한 미세조류의 민감성을 결정하는 방법은 잘 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Mol Gen Genet. 1996 Oct 16;252(5):572-9]을 참조한다.
더 구체적으로, 문헌[Dawson et al. (1997), Current Microbiology 35:356-362(그것의 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨)]은 NR-결여 클로렐라 소로키니아나 돌연변이체에 대한 선택가능한 마커로서 클로렐라 불가리스로부터의 나이트레이트 환원효소(NR)의 사용을 기재한다. 문헌[Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73(그것의 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨)]은 클로렐라 엘립소이데아를 형질전환하기 위한 선택가능한 마커로서 HPT 유전자의 사용을 개시한다. 문헌[Huang et al. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:197-205(그것의 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨)]은 클로렐라 속 DT에 대한 선택가능한 마커로서 Sh ble의 사용에 보고되었다.
V. 지질 경로 유전자조작
수크로스-함유 공급원료와 같은 공급원료를 사용하는 프로토테카와 같은 미생물 유기체(예를 들어, 미세조류, 유지성 효모, 진균 또는 박테리아)의 능력을 변형시키는 것에 추가로, 본 발명은 또한 생산된 지질의 성질 및/또는 비율이 변화하도록 변형된 재조합 미생물 유기체(예를 들어, 프로토테카)를 제공한다. 상기 경로는 추가로 또는 대안적으로 지방산 경로에서 지질 및 중간체의 효소적 가공을 통해 생성된 다양한 지질 분자의 성질 및/또는 비율이 변화되도록 변형될 수 있다. 다양한 양태에서, 본 발명의 재조합 미생물 유기체(예를 들어, 프로토테카 세포)는 이들의 비형질전환된 대응 세포에 비해 단위 부피당 및/또는 단위 시간당 최적화된 지질 수율, 탄소 쇄 길이(예를 들어, 재생가능한 디젤 생산 또는 지질 공급원료를 요구하는 산업적 화학 제품), 감소된 수의 이중 결합 또는 삼중 결합, 임의로 0개를 갖고 지질 또는 독특한 지질 집단의 수소:탄소 비율을 증가시킨다. 추가로, 바람직한 탄화수소를 생성하는 미생물 유기체는 더 높은 양으로, 또는 더 큰 특이성을 가지는 이러한 성분을 생성하도록 유전자조작될 수 있다.
미세조류의 경우에, 일부 야생형 세포는 이미 양호한 성장 특징을 가지지만, 원하는 유형 또는 양의 지질을 생성하지 않는다. 예는, 제한 없이, 피로보트라이스, 포르미디움, 아그메넬룸, 카테리아, 레포신클리스, 피로보트라이스, 니츠키아, 레포신클리스, 아나배나, 유글레나, 스피로지라, 클로로코쿰, 테트래드론, 오실라토리아, 파구스 및 클로로고늄을 포함하며, 이들은 도시하수 또는 폐수에서 성장하는 바람직한 성장 특징을 가진다. 이들 세포뿐만 아니라 클로렐라, 프로토테카 및 다른 미생물 종은 개선된 지질 생성 특징을 가지도록 유전자조작될 수 있다. 원하는 특징은 단위 부피 당 및/또는 단위 시간 당 지질 수율, 탄소 쇄 길이(예를 들어 바이오디젤 생성을 위해 또는 탄화수소 공급원료를 필요로 하는 산업적 용도를 위해)를 최적화하는 것, 이중 또는 삼중 결합 수를 선택적으로 0으로 감소하는 것, 고리 및 고리형 구조를 제거하거나 없애는 것, 및 특정 지질 종의 또는 별개의 지질 집단의 수소:탄소 비를 증가시키는 것을 포함한다. 추가로, 적합한 탄화수소를 생성하는 미세조류는 또한 심지어 더 바람직한 탄화수소 결과를 가지도록 유전자조작될 수 있다. 이러한 미세조류의 예는 클로렐라속 및 프로토테카 속의 종을 포함한다.
특정 실시형태에서, 지방산 합성에 대한 대사에서 분지 지점을 제어하는 하나 이상의 중요한 효소는 지질 생성을 개선하도록 상향조절 또는 하향조절되었다. 상향 조절은, 예를 들어 관심의 효소를 암호화하는 유전자가 발현되는 발현 구성체를 가지는 세포를 형질전환하는 것에 의해, 예를 들어 전사를 증가시키는 강한 프로모터 및/또는 인핸서 구성요소를 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 구성체는 형질전환체가 선택될 수 있도록 하기 위한 선택가능한 마커를 포함하는데, 이는 구성체의 증폭 및 암호화된 효소 발현 수준의 증가를 초래할 수 있다. 본 발명의 방법에 따르는 상향 조절에 적합한 효소의 예는 파이루베이트를 아세틸-CoA로 전환하는 역할을 하는 파이루베이트 탈수소효소를 포함한다(예를 들어, 미세조류의 일부는 Genbank 등록번호 NP_415392; AAA53047; Q1XDM1; 및 CAF05587을 포함한다). 파이루베이트 탈수소효소의 상향조절은 아세틸-CoA의 생산을 증가시키고, 이에 의해 지방산 합성을 증가시킬 수 있다. 아세틸-CoA 카복실라제는 지방산 합성 내 초기 단계를 촉매한다. 따라서, 이 효소는 지방산의 생성을 증가시키도록 상향조절될 수 있다(예를 들어 미세조류의 일부는 Genbank 등록번호 BAA94752; AAA75528; AAA81471; YP_537052; YP_536879; NP_045833; 및 BAA57908을 포함한다). 지방산 생성은 또한 지방산 합성 동안 성장하는 아실 쇄를 운반하는 아실 운반체 단백질(acyl carrier protein, ACP)의 상향 조절에 의해 증가될 수 있다(예를 들어, 미세조류의 일부는 Genbank 등록번호 A0T0F8; P51280; NP_849041; YP_874433를 포함한다). 글라이세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제는 지방산 합성의 속도-제한 단계를 촉매한다. 이 효소의 상향 조절은 지방상 생성을 증가시킬 수 있다(예를 들어 일부 미세조류는 Genbank 등록번호 AAA74319; AAA33122; AAA37647; P44857; 및 ABO94442를 포함한다).
유전자의 상향- 및/또는 하향-조절은 지방산 생합성 경로의 유전자 발현을 제어하는 전체적 조절자에 적용될 수 있다. 따라서, 지방산 합성의 하나 이상의 전체 조절자는 적절하게 상향- 또는 하향-조절되어 다수의 지방산 합성 유전자 발현을 각각 억제하거나 향상시키고, 궁극적으로 지질 생성을 증가시킬 수 있다. 예는 스테롤 조절 요소 결합 단백질(sterol regulatory element binding protein, SREBP), 예컨대 SREBP-1a 및 SREBP-1c(예를 들어 Genbank 등록번호 NP_035610 및 Q9WTN3 참조)을 포함한다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 지방 아실-ACP 티오에스터라제(예를 들어, 카파리스 칼로필라(C. callophylla)(서열번호 145 및 서열번호 146; 또한 표 4를 참조), 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소(표 6 참조), 지방 아실-CoA 환원효소(표 7 참조), 지방 알데하이드 데카보닐라제(표 8 참조), 지방 알데하이드 환원효소, 불포화효소(예컨대 스테아릴-ACP 불포화효소(예를 들어, 코돈 최적화된 리시누스 코뮤니스(R. communis) SAD, 서열번호 147 및 서열번호 148) 및 지방 아실 불포화효소 및 스쿠알렌 신타제(GenBank 등록번호 AF205791)와 같은 지질 변형 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 유전자를 함유하도록 변형된 재조합 미생물 유기체(예를 들어, 프로토테카 세포)를 제공한다. 일부 실시형태에서, 지방 아실-ACP 티오에스터라제 및 자연적으로 공동발현된 아실 운반체 단백질을 암호화하는 유전자는 프로토테카 세포로, 선택적으로 다른 지질 변형 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자와 함께 형질전환된다. 다른 실시형태에서, ACP 및 지방 아실-ACP 티오에스터라제는 서로에 대한 친화성을 가질 수 있는데, 이는 이들이 특정 조직 또는 유기체 중에서 자연적으로 동시 발현되든 발현되지 않든 2개가 함께 본 발명의 미생물 및 방법에 사용될 때 이점을 부여한다. 따라서, 본 발명은 ACP로부터 길이 특이적 탄소 쇄의 절단을 촉진시키기 위해 서로 간에 상호작용하는 친화성을 공유하는 것뿐만 아니라 이들 효소의 동시 발현된 쌍 둘 다를 고려한다.
또 다른 실시형태에서, 불포화효소를 암호화하는 외인성 유전자는 지질 포화와 관련하여 변형을 제공하기 위해 다른 지질 변형 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자와 함께 미생물 유기체(예를 들어, 프로토테카 세포)로 형질전환된다. 다른 실시형태에서, 내인성 불포화효소는 미생물 유기체(예를 들어 프로토테카 세포)에서 과발현된다(예를 들어 해당 유전자의 추가적인 복제물이 없는 도입을 통해) 과발현된다. 스테아로일-ACP 불포화효소(예를 들어, 문헌[GenBank 등록번호 제AAF15308호; 제ABM45911호; 및 제AAY86086호])는, 예를 들어 스테아로일-ACP의 올레오일-ACP로의 전환을 촉매한다. 상기 유전자의 상향 조절은 세포에 의해 생산된 단일불포화 지방산의 비율을 증가시킬 수 있는 반면; 하향 조절은 단일불포화 비율을 감소시킬 수 있다. 예시적 목적을 위해, 스테아릴-ACP 불포화효소(SAD)는 C18:0 전구체로부터 C18:1 지방산의 합성을 초래한다. 불포화효소의 다른 패밀리는 델타 12 지방산 불포화효소(Δ12 FAD)를 포함하는 지방 아실 불포화효소(FAD)이다. 이들 불포화효소는 또한 지질 포화에 대해 변형을 제공한다. 예시적 목적을 위해, 델타 12 지방산 불포화효소는 C18:1 전구체로부터 C18:2 지방산의 합성을 초래한다. 유사하게, ω-6 지방산 불포화효소, ω-3 지방산 불포화효소, 또는 ω-6-올레이트 불포화효소와 같은 하나 이상의 글라이세로지질 불포화효소의 발현은 포화 지방산에 대한 불포화 지방산의 비율을 변화시키기 위해 제어될 수 있다. 일부 실시형태에서, 불포화효소는 불포화효소가 특정 탄소-길이 기질 또는 특정 범위 내 탄소-길이를 갖는 기질 내에서 위치 특이적 변형을 만들 수 있도록 목적하는 탄소 쇄 길이와 관련하여 선택될 수 있다. 다른 실시형태에서, 원하는 지방산 프로파일이 단일불포화물(예컨대 C16:1 및/또는 C18:1)에서 증가된다면, SAD의 과발현 또는 이종성 SAD의 발현은 지방 아실 불포화효소(FAD)의 침묵 또는 불활성화(예를 들어, 돌연변이, RNAi, 내인성 불포화효소 유전자의 녹아웃 등을 통해)와 결합될 수 있다.
다른 실시형태에서, 미생물 유기체(예를 들어 프로토테카 세포)는 돌연변이된 불포화효소 유전자를 가지도록 변형되되, 해당 돌연변이는 유전자 또는 불포화효소 불활성을 제공한다. 일부 경우에, 해당 돌연변이 내인성 불포화효소 유전자는 지방산 불포화효소(FAD)이다. 다른 경우에, 돌연변이된 내인성 불포화효소 유전자는 스테라일 아실 운반체 단백질 불포화효소(SAD)이다. 이하의 실시예 11은 스테아릴-ACP 불포화효소 및 델타 12 지방산 불포화효소의 표적화된 절제 또는 녹아웃을 기재한다.
일부 경우에, 원하는 지질 프로파일을 생성하는 유전자이식 세포를 달성하기 위한 하나 이상의 유전자 조작 기법과 쌍을 이루기에 유리할 수 있다. 한 실시형태에서, 미생물 유기체(예를 들어, 프로토테카 세포)는 돌연변이된 내인성 불포화효소 유전자 및 하나 이상의 외인성 유전자를 포함한다. 비제한적 예에서, 돌연변이된 내인성 불포화효소 유전자를 갖는 프로토테카 세포는 또한 외인성 지방 아실-ACP 티오에스터라제 유전자 및/또는 수크로스 인버타제 유전자를 발현할 수 있다. 이하의 실시예 11은 내인성 SAD의 표적화된 절제 또는 녹아웃을 함유하며 유전자이식 프로토테카 세포를 기재하는데, 이는 티오에스터라제 및 수크로스 인버타제를 선호하는 녹나무 C14를 발현한다. 이 경우에, 유전자이식 프로토테카 세포는 탤로에서 발견되는 지질 프로파일에 거의 근접하는 지질 프로파일을 생성한다. 탤로는 제공된 소고기 또는 양고기 지방으로부터 전형적으로 유래되며, 실온에서 고체이고, 음식, 화장품, 및 화학물질 산업에서 다양한 용도로 이용된다. 탤로의 지방산 프로파일은 4% C14:0; 26% C16:0; 3% C16:1; 14% C18:0; 41% C18:1; 3% C18:2; 및 1% C18:3이다. 이하의 실시예 11에서 나타내는 바와 같이, 내인성 SAD의 표적화된 절제 또는 녹아웃을 갖는 유전자이식 프로토테카 세포의 클론 및 녹나무 C14-선호 티오에스터라제의 발현은 다음의 지질 프로파일을 가진다: 1% C12 미만 및 더 짧은 탄소 쇄 길이 지방산; 2.74% 내지 6.13% C14:0; 23.07% 내지 25.69% C16:0; 7.02% 내지 11.08% C18:0; 42.03% 내지 51.21% C18:1; 및 9.37% 내지 13.45% C18:2(면적%로 표현). 일부 경우에, 유전자이식 프로토테카 세포는 다음의 지질 프로파일을 가진다: 3-5% C14:0; 25-27% C16:0; 10-15% C18:0; 및 40-45% C18:1.
따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 아실-ACP 티오에스터라제, 아실-CoA/알데하이드 환원효소, 지방 아실-CoA 환원효소, 지방 알데하이드 환원효소, 지방 알데하이드 데카보닐라제, 또는 자연적으로 공동 발현된 아실 운반체 단백질로부터 선택된 하나 이상의 외인성 유전자를 발현하도록 유전자 조작된다. 적합한 발현 방법은 특히 유도성 발현 및 구분된 발현을 포함하는 리파제 유전자의 발현에 대해 상기 기재되었다. 지방 아실-ACP 티오에스터라제는 지질 합성 동안 아실 운반체 단백질(ACP)로부터 지방산을 절단한다. 추가적 효소 처리를 통해, 그 다음에 절단된 지방산은 조효소와 조합되어 아실-CoA 분자를 수득한다. 이런 알데하이드를 수득하기 위한 아실-CoA는 지방 아실-CoA 환원효소의 효소 활성을 위한 기질뿐만 아니라 알코올을 수득하기 위한 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소이다. 상기 확인한 지방 아실-CoA 환원효소의 작용에 의해 생성된 알데하이드는 알코올을 수득하기 위한 지방 알데하이드 환원효소, 또는 알칸 또는 알켄을 수득하기 위한 지방 알데하이드 데카보닐라제 중 하나에 의한 추가 효소 활성을 위한 기질이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 만들어지는 지방산, 글라이세로지질, 또는 대응하는 1차 알코올, 알데하이드, 알칸 또는 알켄은 8, 10, 12, 또는 14개의 탄소 원자를 함유한다. 디젤, 바이오디젤, 재생 디젤, 또는 제트 연료의 생산을 위한 바람직한 지방산, 또는 산업적 용도를 위한 대응하는 1차 알코올, 알데하이드, 알칸 및 알켄은 8 내지 14개의 탄소 원자를 함유한다. 특정 실시형태에서, 상기 지방산뿐만 아니라 다른 대응하는 탄화수소 분자는 포화되고(탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합이 없다); 단일불포화되며(하나의 이중 결합); 다중불포화되고(2 이상의 이중 결합); 선형(고리형이 아님) 또는 분지형이다. 연료 생산을 위해, 더 큰 포화도가 바람직하다.
상기 직접 기재된 효소는 특정 수의 탄소 원자를 함유하는 기질의 가수분해에 대해 우선적인 특이성을 갖는다. 예를 들어, 지방 아실-ACP 티오에스터라제는 ACP로부터 12개의 탄소 원자를 갖는 지방산을 절단하는 것을 선호할 수 있다. 일부 경우에, ACP 및 쇄 특이적 티오에스터라제는 이들이 조합체로서 특히 유용하게 하는 서로에 대해 친화성을 가질 수 있다(예를 들어, 외인성 ACP 및 티오에스터라제 유전자는 이들이 유래하는 특정 조직 또는 유기체에서 자연적으로 동시 발현될 수 있다). 따라서, 다양한 양태에서, 본 발명의 재조합 프로토테카 세포는 기질내 함유된 탄소 원자수와 관련하여 효소적 활성을 촉매하기 위한 특이성(예를 들어, ACP로부터 지방산의 절단, 아실-CoA의 알데하이드 또는 알코올로 환원, 또는 알데하이드의 알칸으로 전환)을 갖는 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 함유할 수 있다. 다양한 양태에서 효소적 특이성은 8 내지 34개의 탄소 원자, 바람직하게는 8 내지 18개의 탄소 원자 및 더 바람직하게는 8 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 기질에 대한 것일 수 있다. 바람직한 특이성은 즉 18개 탄소 원자보다 적은, 즉, 12개를 갖는 기질에 대한 것이다.
본 발명의 미생물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 다른 지방 아실-ACP 티오에스터라제는 표 4에 열거된 것을 제한 없이 포함한다
지방 아실-ACP 티오에스터라제 및 GenBank 등록번호
캘리포니아 월계수 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #AAC49001)(서열번호 203)
녹나무 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #Q39473)
캘리포니아 월계수 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #Q41635)
육두구나무(Myristica fragrans) 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #AAB71729)(서열번호 224)
육두구나무 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #AAB71730)(서열번호 222)
인도네시아 기름야자 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #ABD83939)(서열번호 204)
인도네시아 기름야자 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #AAD42220)
팝퓰러스 토멘토사(Populus tomentosa) 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #ABC47311)(서열번호 207)
아라비돕시스 탈리아나 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #NP_172327)(서열번호 208)
아라비돕시스 탈리아나 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #CAA85387)(서열번호 209)
아라비돕시스 탈리아나 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #CAA85388)(서열번호 210)
멕시코목화(Gossypium hirsutum) 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #Q9SQI3)(서열번호 211)
쿠페아 란세올라타(Cuphea lanceolata) 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #CAA54060)(서열번호 212)
쿠페아 후커리아나 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #AAC72882)(서열번호 202)
쿠페아 칼로필라 아종 메조스테몬(Cuphea calophylla subsp. mesostemon) 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #ABB71581)(서열번호 213)
쿠페아 란세올라타 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #CAC19933)
인도네시아 기름야자 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #AAL15645)(서열번호 206)
쿠페아 후커리아나 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #Q39513)
멕시코 목화 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #AAD01982)(서열번호 214)
비티스 비니훼라(Vitis vinifera) 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #CAN81819)(서열번호 215)
가르시니아 망고스타나 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #AAB51525)
브라씨카 준세아(Brassica juncea) 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #ABI18986)(서열번호 216)
마드후카 롱기폴리아(Madhuca longifolia) 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #AAX51637)(서열번호 217)
브라씨카 나푸스(Brassica napus) 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #ABH11710)
오리자 사티바(Oryza sativa)(인디카(indica) 품종 그룹) 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #EAY86877)(서열번호 218)
오리자 사티바(자포니카(japonica) 품종 그룹) 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #NP_001068400)(서열번호 219)
오리자 사티바(인디카 품종 그룹) 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #EAY99617)(서열번호 220)
쿠페아 후커리아나 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #AAC49269)
미국 느릅나무 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #AAB71731)
쿠페아 란세올라타 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #CAB60830)(서열번호 221)
쿠페아 팔루스트리스 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #AAC49180)
아이리스 게르마니카 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #AAG43858)
아이리스 게르마니카 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #AAG43858.1)
쿠페아 팔루스트리스 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #AAC49179)
육두구나무 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank# AAB71729)
육두구나무 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank# AAB717291.1)
쿠페아 후커리아나 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #U39834)(서열번호 197)
캘리포니아 월계수 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank # M94159)(서열번호 285)
녹나무 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #U31813)(서열번호 223)
쿠페아 라이티 지방 아실-ACOP 티오에스터라제(GenBank #U56103)(서열번호 183)
피마자(Ricinus communis) 지방 아실-ACP 티오에스터라제(GenBank #ABS30422)(서열번호 198)
하기 실시예는 프로토테카 종 중에서 쿠페아 후커리아나, 캘리포니아 월계수, 녹나무, 쿠페아 팔루스트리스, 쿠페아 란세올라타, 아이리스 게르마니카, 미리스티카 프라그란스 및 미국 느릅나무 유래의 이종성 지방 아실-ACP 티오에스터라제의 성공적인 표적화 및 발현을 기재한다. 추가로, 지방산 프로파일 중의 변형은 숙주 세포 발현에서 이들 이종성 지방 아실-ACP 티오에스터라제 내에서 확인되었다. 이들 결과는 일반적으로 조류와 고등 식물 티오에스터라제 간에 서열 상동성의 부재 및 프로토테카 모리포르미스 지방 아실-ACP 티오에스터라제와 상기 열거된 이종성 지방-아실-ACP 티오에스터라제 간의 서열 상동성의 부재를 고려할 때 전혀 예상치 못한 것이었다.
예에서 나타내는 바와 같이 프로토테카 중에서 이들 이종성 티오에스터라제의 발현은 상업적 종자 작물로부터 현재 입수가능하지 않은 정말 독특한 지방산 프로파일을 갖는 오일/지질, 몇몇 종자 작물 오일의 배합도 생성할 수 있는 이식유전자 미세조류를 만들어낸다. 표 5는 보통의 상업적 종자 오일의 지방산 프로파일을 나타낸다. 이하의 모든 상업적 종자 오일 데이터는 문헌[US Pharmacopeias Food and Chemicals Codes, 7th Ed. 2010-2011]으로부터 편집된다. 탤로 데이터는 문헌[National 부터 얻는다.
Figure 112018108415035-pat00009
예로서, 이들 보통의 종자 오일 중 어떤 것 고량의 C8 또는 C10 지방산을 함유하지 않으며, 코코넛 오일 및 팜커넬 오일은 가장 큰 공급원이 되지만 둘의 비는 1:1(C8:C10 지방산)이다. 예에서 나타내는 바와 같이, 쿠페아 팔루스트리스 C8 선호 티오에스터라제로 형질전환된 프로토테카는 12% 이상의 C8 지방산 수준을 달성할 수 있을 뿐만 아니라 C8:C10 지방산의 비는 약 5:1이 되었다. 지방산 수준의 변화는 다양한 상업적 용도를 위한 맞춤 지방산 프로파일을 함유하는 오일을 생성하는데 유용하다. 추가적으로, 상이한 지방산 쇄 길이 사이 비의 변화는 더 저렴한 화학 공정(예컨대 에스터화, 증류, 부분 분리, 및 재에스터화)을 통하지 않은 오일 중에서 상업적으로 입수가능하지 않은 어떤 것에 있다. 다른 예에서, 팜 오일은 가장 높은 C16:0 지방산(32-47%) 함유 오일이지만, 팜 오일은 C14:0 지방산이 거의 없다. 미국 느릅나무 티오에스터라제를 함유하는 프로토테카는 약 33-38% C16:0 지방산 및 10-16% C14:0 지방산(약 2:1 C16:0 대 C14:0 비)을 달성하였다. 16:0 지방산이 높은 종자 오일은 보통 많은 14:0 지방산을 함유하지 않기 때문에 상업적 수준에서 존재하는 오일의 배합을 통해서 이런 지방산 프로파일은 달성가능하지 않다.
이하의 예는 또한 처음으로 하나의 클론에서 적어도 2개의 지방 아실-ACP 티오에스터라제의 성공적인 표적화 및 발현을 기재한다. 지방산 프로파일의 변형은 이들 클론에서 확인되었고, 2개의 티오에스터라제가 하나의 클론 내에서 공동 발현된 것에 의존하여, 지방산 프로파일은 상이한 방법으로 영향을 미쳤다. 예로서, 상기 표 5로부터, 코코넛 오일 및 팜커넬 오일은 거의 3:1의 C12:C14 비를 가진다. 이하의 예에서 기재하는 바와 같이, 2개의 이종성 티오에스터라제 유전자를 함유하는 프로토테카 형질전환체는 거의 5:1의 C12:C14 지방산 수준을 생성할 수 있었다. C12:C14 지방산 비의 이런 종류는, 지금까지 상업적 수준에서 달성가능하지 않았다(즉, 종자 오일의 배합을 통함).
유전자이식 미세조류에 의해 생성된 오일의 다른 신규한 양태는 지방산의 포화정도이다. 팜 오일은 52% 내지 48의 포화 내지 불포화를 갖는 현재 포화 오일의 가장 큰 공급원이다. 이하의 예에서 나타내는 바와 같이, 미국 느릅나무 및 녹나무로부터 유래된 이종성 티오에스터라제를 갖는 프로토테카는 그것이 생성된 오일 중에서 60% 이상의 전체 포화 수준을 달성하였다. 또한 이하의 예에서, 미국 느릅나무로부터 유래된 이종성 티오에스터라제를 갖는 프로토테카는 그것이 생성된 오일 중에서 86% 이상의 전체 포화 수준을 달성하였다는 것을 나타내었다.
본 발명의 미생물 및 방법에 의한 사용에 적합한 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소는, 제한 없이, 표 6에서 열거된 것을 포함한다.
Figure 112018108415035-pat00010
본 발명의 미생물 및 방법과 함께 사용에 적합한 지방 아실-CoA 환원효소는 표 7에서 열거된 것을 포함한다.
Figure 112018108415035-pat00011
본 발명의 미생물 및 방법과 함께 사용에 적합한 지방 알데하이드 데카보닐라제는, 제한 없이, 표 8에서 열거되는 것을 포함한다.
Figure 112018108415035-pat00012
자연적으로 공동발현된 지방 아실-ACP 티오에스터라제 및 아실-ACP 티오에스터라제 및 아실 운반체 단백질의 조합은 본 발명의 미생물 및 방법과 함께 사용에 적합하다.
탄화수소 또는 지질 변형 효소의 추가의 예는 미국 특허 제6,610,527호; 제6,451,576호; 제6,429,014호; 제6,342,380호; 제6,265,639호; 제6,194,185호; 제6,114,160호; 제6,083,731호; 제6,043,072호; 제5,994,114호; 제5,891,697호; 제5,871,988호; 제6,265,639호 중 어느 하나에 포함되거나 참조되거나, 함유되거나 참조된 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하고 추가로 GenBank 등록 번호 AAO18435; ZP_00513891; Q38710; AAK60613; AAK60610; AAK60611; NP_113747; CAB75874; AAK60612; AAF20201; BAA11024; AF205791; 및 CAA03710에 기재되어 있다.
지질 생합성 경로 내 다른 효소는 또한 본 발명의 미생물 및 방법과 함께 사용에 적합하다. 예를 들어, 케토 아실-ACP 신타제(keto acyl-ACP synthase, Kas) 효소는 지질 생합성 경로 내에서 상기 열거된 효소의 일부와 함께 작동한다. 상이한 부류의 Kas 효소가 있으며: Kas I은 계속 늘어나는 아실 ACP 쇄 및 말로닐-ACP 사이의 계속적인 축합 단계에 참여한다. Kas II는 전형적으로 말로닐-ACP를 포함하는 C16:0-ACP 내지 C18:0-ACP를 유발하는 최종 축합 단계에 참여한다. 이와 같이, 고차의 식물 및 일부 미세조류 종/균주에서 이는 C16-C18:0 지방산(및 그것의 불포화 유도체)을 우선적으로 합성하며, Kas II 효소는 FatA 유전자의 생성물(아실-ACP 티오에스터라제)과 상호작용한다.
아실-ACP 티오에스터라제는 더 고차 식물(및 일부 미세조류 종) 지방산 생합성의 종결자이며, 대부분의 식물 종에서, 이는 FatA 유전자 패밀리의 구성원에 의해 수행되고, 전체 역할은 C16:0 대 C18:0 단계에서 연장을 종결하는 것이다. 더 짧은 지방산을 합성하는 종에서(예컨대 쿠페아, 엘래이스, 미리스티카, 또는 엄벨루라리아), FatB 유전자에 의해 암호화되는 아실-ACP 티오에스터라제의 상이한 군은 이 종결 단계를 수행한다(예를 들어 코코스 누시페라 FatB3-B의 코돈 최적화된 암호 영역, 서열번호 189). Kas II 효소와 아실-Acp 티오에스터라제 사이의 상호작용은 지방산 쇄 연장의 정확한 종결을 위해 중요하다. 결과로서, 더 짧은 쇄 지질 생합성이 가능한 FatB 유전자가 발달된 고차 식물 종(및 미세조류 종)에서 Kas IV 유전자로 칭해지는 Kas 유전자의 추가적인 부류의 대응하는 공진화(co-evolution)가 있었다. Kas IV 유전자는 길이로 4-14개 탄소인 특정 크기 범위의 지방산의 쇄 길이 연장을 초래한다.
본 발명의 미생물 및 방법과 사용하기에 적합한 다른 효소는 표 4, 6 내지 8에 열거된 단백질 중 하나와 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖고 대응하는 목적하는 효소 활성(예를 들어, 아실 운반 단백질로부터 지방산의 절단, 아실-CoA의 알데하이드 또는 알코올로의 환원 또는 알데하이드의 알칸으로의 전환)을 나타내는 것들을 포함한다. 추가의 양태에서, 효소적 활성은 상기된 서열 중 하나와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 서열 중에 존재하고 이 모두는 완전하게 제시된 것처럼 본 명세서에 참조로서 인용된다.
발현되는 외인성 유전자의 목적하는 조합을 선택함에 의해, 수성 바이오매스로부터 추출될 수 있는 미생물에 의해 생산되는 생성물을 절단 개조할 수 있다. 예를 들어, 상기 미생물은 다음을 함유할 수 있다: (i) 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 외인성 유전자; 및, 임의로, (ii) 천연적으로 동시 발현된 아실 운반 단백질 또는 지방 아실-ACP 티오에스터라제(또는 역으로)에 대해 친화성을 또한 갖는 아실 운반 단백질; 및, 임의로, (iii) 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소 또는 지방 아실-CoA 환원효소를 암호화하는 외인성 유전자; 및, 임의로, (iv) 지방 알데하이드 환원효소 또는 지방 알데하이드 데카보닐라제를 암호화하는 외인성 유전자. 본 명세서에 기재된 배양 조건하의 미생물은 ACP에 연결된 지방산을 합성하고 지방 아실-ACP 티오에스터라제는 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매하여 추가의 효소적 가공을 통해 지방 아실-CoA 분자를 생산한다. 존재하는 경우, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소는 아실-CoA의 알코올로의 환원을 촉매한다. 유사하게, 존재하는 경우 지방 아실-CoA 환원효소는 아실-CoA의 알데하이드로의 환원을 촉매한다. 지방 아실-CoA 환원효소를 암호화하는 외인성 유전자가 존재하고 알데하이드 생성물을 생산하기 위해 발현되는 상기 양태에서, 제3 외인성 유전자에 의해 암호화된 지방 알데하이드 환원효소는 알데하이드의 알코올로의 환원을 촉매한다. 유사하게, 지방 알데하이드 데카보닐라제는 존재하는 경우 알데하이드의 알칸 또는 알켄으로의 전환을 촉매한다.
다른 실시형태에서, 미생물은 (i) 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 외인성 유전자; (ii) 선택적으로, 자연적으로 공동 발현된 아실 운반체 단백질 또는 지방산 아실-ACP 티오에스터라제에 대한 친화도를 가지는 아실 운반체 단백질; (iii) 돌연변이된 내인성 불포화효소 유전자(돌연변이는 불포화효소 녹아웃과 같은 불포화효소 유전자 또는 불포화효소 단백질 불활성을 제공한다); (iv) 내인성 스테아릴 아실 운반체 단백질 불포화효소의 과발현 또는 이종성 SAD의 발현; 및 (v) 앞서 언급한 것의 임의의 조합을 함유할 수 있다.
아실 ACP 티오에스터라제와 같은 이러한 효소를 암호화하는 유전자는 클로렐라 프로토테코이데스와 같이 상당한 지질생산을 나타내는 것으로 이미 공지된 세포로부터 수득될 수 있다. 지질 생산에 역할을 하는 것으로 이미 공지된유전자, 예를 들어, 이중 결합을 포화시키는 효소를 암호화하는 유전자를 개별적으로 수용 세포에 형질전환시킬 수 있다. 그러나, 본 발명을 실시하기 위해 어느 유전자가 요구되는지에 관해 우선적으로 추측할 필요는 없다. 미세조류 내 지질 생산을 변형(개선)시킬 수 있는 유전자를 동정하는 방법은 국제특허출원 공개 번호 제2008/151149호에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명은 동일 종의 야생형 세포에 비해 변화된 수준에서 지질 경로 효소를 발현하도록 유전자 조작된 미생물 유기체(예를 들어, 프로토테카 세포)를 제공한다. 일부 경우에, 상기 세포는 세포가 둘 다 동일한 조건하에서 성장하는 경우 야생형 세포에 비해 더 많은 세포를 생산한다. 일부 경우에, 상기 세포는 야생형 세포보다 높은 수준에서 지질 경로 효소를 발현하도록 유전자 조작되고/되거나 선택되었다. 일부 경우에, 지질 경로 효소는 파이루베이트 탈수소효소, 아세틸-CoA 카복실라제, 아실 운반 단백질 및 글라이세롤-3 포스페이트 아실트랜스퍼라제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 경우에, 상기 세포는 야생형 세포 보다 낮은 수준에서 지질 경로 효소를 발현하도록 유전자 조작되고/되거나 선택된다. 세포가 보다 낮은 수준에서 지질 경로 효소를 발현하는 하나 이상의 실시형태에서, 지질 경로 효소는 시트레이트 신타제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 세포는 야생형 세포와 비교하여 변화된 수준에서 지방산 합성의 범용 조절제를 발현하도록 유전자 조작되고/되거나 선택됨으로써 다수의 지방산 합성 유전자의 발현 수준은 야생형 세포와 비교하여 변화된다. 일부 경우에, 지질 경로 효소는 지방산을 변형시키는 효소를 포함한다. 일부 경우에, 지질 경로 효소는 스테아로일-ACP 불포화효소 및 글라이세로지질 불포화효소로부터 선택된다. 일부 경우에, 해당 세포는 유전자 조작되고/되거나 선택되어 더 낮은 지질 경로 효소 수준을 발현하거나, 특정 지질 경로를 전혀 발현하지 않는다(즉, 여기서 지질 경로 효소는 녹아웃이었거나, 외인성 유전자로 대체되었다).
일부 미세조류는 예를 들어 다당류와 같은 비지질 대사산물의 상당한 양을 생성한다. 다당류 생합성이 세포에 대해 이용가능한 전체 대사 에너지의 상당 부분을 사용할 수 있기 때문에, 지질-생성 세포의 돌연변이유발 다음에 감소된 또는 제거된 다당류 생성을 위한 스크리닝은 더 높은 지질 수율을 생성할 수 있는 신규한 균주를 만들어낸다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 외인성 유전자를 함유하는 오일 생산 미생물에 관한 것이고 여기서, 외인성 유전자는 지방 아실-ACP 티오에스터라제, 지방 아실-CoA 환원효소, 지방 알데하이드 환원효소, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소, 지방 알데하이드 데카보닐라제, 불포화효소 및 아실 운반 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질(들)을 암호화한다. 다른 실시형태에서, 외인성 불포화효소 유전자는 상기 외인성 유전자 중 하나 이상을 함유하는 미생물 내에서 과발현된다. 한 실시형태에서, 외인성 유전자는 자극에 응하여 유도성이거나 억제성인 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 경우에, 상기 자극은 외부적으로 제공되는 소분자, 가열, 냉각 및 배양 배지에서 제한되거나 부재인 질소로 이루어진 군로부터 선택된다. 일부 경우에, 외인성 유전자는 세포 구획에서 발현된다. 일부 경우에, 세포 구획은 엽록체, 플라스티드 및 미토콘드리아로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 경우에 미생물은 프로토테카 모리포미스, 프로토테카 크루가니, 프로토테카 스타그노라 또는 프로토테카 좁피이다.
한 실시형태에서, 외인성 유전자는 지방산 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화한다. 일부 경우에, 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스터라제는 아실 운반 단백질(ACP)로부터 8 내지 18개의 탄소 지방산의 절단을 촉매한다. 일부 경우에, 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스터라제는 ACP로부터 10 내지 14개 탄소 지방산의 절단을 촉매한다. 하나의 양태에서, 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스터라제는 ACP로부터 12-탄소 지방산의 절단을 촉매한다.
한 실시형태에서, 외인성 유전자는 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소를 암호화한다. 일부 경우에, 외인성 유전자에 의해 암호화되는 환원효소는 8 내지 18-탄소 지방 아실-CoA를 대응하는 1차 알코올로 환원을 촉매한다. 일부 경우에, 외인성 유전자에 의해 암호화되는 환원효소는 10 내지 14-탄소 지방 아실-CoA를 대응하는 1차 알코올로 환원을 촉매한다. 한 실시형태에서, 외인성 유전자에 의해 암호화되는 환원효소는 12-탄소 지방 아실-CoA를 도데칸올로 환원을 촉매한다.
본 발명은 또한 2개의 외인성 유전자를 함유하는 재조합 프로토테카 세포를 제공하고 여기서, 제1 외인성 유전자는 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하고 제2 외인성 유전자는 지방 아실-CoA 환원효소, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소, 및 아실 운반 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질을 암호화한다. 일부 경우에, 2개의 외인성 유전자는 각각 자극에 응하여 유도성인 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 경우에, 각각의 프로모터는 배양 배지 내 제한된 질소 또는 질소 부재와 같은 동일한 자극에 응답하여 유도성이다. 배양 배지에서 질소의 제한 또는 완전한 부재는 프로토테카 종과 같은 몇몇 미생물에서 오일 생산을 자극하고 높은 수준으로 오일 생산을 유도하기 위한 유발제로서 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 유전자 조작 방법과 조합하여 사용되는 경우, 건조 세포 중량%로서 지질은 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 및 적어도 75%와 같은 높은 수준으로 상승될 수 있고; 본 명세서에 기재된 방법은 상기 수준의 지질을 갖는 세포에 대해 제공하고, 여기서 지질은 적어도 1%-5%, 바람직하게는 적어도 4%의 C8-C14, 적어도 0.25%-1%, 바람직하게는 적어도 0.3%의 C8, 적어도 1%-5%, 바람직하게는 적어도 2%의 C10, 적어도 1%-5%, 바람직하게는 적어도 2%의 C12, 및 적어도 1%-5%, 바람직하게는 적어도 2%의 C14이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 건조 세포 중량으로 25% 초과의 지질이고 10% 이상, 15% 이상, 20% 또는 25% 이상의 지질이며, 적어도 5%, 적어도 10% 또는 적어도 15%인 C8-C14, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25% 또는 적어도 30%인 C8-C14, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35% 또는 적어도 40%인 C8-C14, 5%-40%, 바람직하게는 10-30%, C8-C14 및 10%-40%, 바람직하게는 20-30%인 C8-C14인 지질을 함유한다.
본 명세서에 기재된 신규 오일은 중간쇄 지방산(예를 들어, 팜 오일, 팜커넬 오일 및 코코넛 오일)의 함량이 높은 다른 자연적으로 존재하는 오일과는 구분된다. 예를 들어, 카로테노이드와 같은 오염물 수준은 본 발명의 오일에서보다 팜 오일 및 팜커넬 오일에서보다 높다. 특히 팜 오일 및 팜커넬 오일은 본 발명의 오일에서보다 더 높은 양으로 알파 및 베타 카로틴 및 라이코펜을 함유한다. 추가로, 20개 초과의 상이한 카로테노이드가 팜 오일 및 팜커넬 오일에서 발견된 반면 실시예는 본 발명의 오일이 매우 소수의 카로테노이드 종을 매우 낮은 수준으로 함유한다는 것을 입증한다. 추가로, 토코트라이에놀과 같은 비타민 E 화합물의 수준은 본 발명의 오일에서 보다 팜 오일, 팜커넬 및 코코넛 오일에서 훨씬 높다.
하나의 양태에서, 제1 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스터라제는 ACP로부터 8 내지 18-탄소 지방산의 절단을 촉매한다. 일부 경우에, 제2 외인성 유전자는 8 내지 18-탄소 지방 아실-CoA의 대응하는 1차 알코올로의 환원을 촉매하는 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소를 암호화한다. 몇몇 경우에, 제1 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스터라제는 ACP로부터 10 내지 14-탄소 지방산의 절단을 촉매하고 제2 외인성 유전자에 의해 암호화된 환원효소는 10 내지 14-탄소 지방 아실-CoA의 대응하는 1차 알코올로의 환원을 촉매하고 여기서, 티오에스터라제 및 환원효소는 동일한 탄소 쇄 길이상에 작용한다. 하나의 양태에서, 제1 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스터라제는 ACP로부터 12-탄소 지방산의 절단을 촉매하고 제2 외인성 유전자에 의해 암호화된 환원효소는 12-탄소 지방 아실-CoA의 도데칸올로의 환원을 촉매한다. 일부 경우에, 제2 외인성 유전자는 8 내지 18-탄소 지방 아실-CoA의 대응하는 알데하이드로의 환원을 촉매하는 지방 아실-CoA 환원효소를 암호화한다. 일부 경우에, 제2 외인성 유전자는 천연적으로 지방 아실-ACP 티오에스터라제와 함께 동시 발현되는 아실 운반 단백질을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 제2 외인성 유전자는 지방 아실-CoA 환원효소를 암호화하고 상기 미생물은 추가로 지방 알데하이드 데카보닐라제를 암호화하는 제3 외인성 유전자를 함유한다. 일부 경우에, 제1 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스터라제는 ACP로부터 8 내지 18-탄소 지방산의 절단을 촉매하고 제2 외인성 유전자에 의해 암호화된 환원효소는 8 내지 18-탄소 지방 아실-CoA의 대응하는 지방 알데하이드로의 환원을 촉매하고 제3 외인성 유전자에 의해 암호화된 데카보닐라제는 8 내지 18-탄소 지방 아실-CoA의 대응하는 지방 알데하이드의 대응하는 알칸으로의 전환을 촉매하고, 여기서, 티오에스터라제, 환원효소 및 데카보닐라제는 동일한 탄소 쇄 길이에 대해서 작용한다.
일부 실시형태에서, 제2 외인성 유전자는 아실 운반 단백질을 암호화하고 상기 미생물은 지방 아실-CoA 환원효소 및 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 제3 외인성 유전자를 함유한다. 몇몇 경우에 제3 외인성 유전자는 지방 아실-CoA 환원효소를 암호화하고 상기 미생물은 지방 알데하이드 데카보닐라제를 암호화하는 제4 외인성 유전자를 추가로 함유한다.
본 발명은 또한 배양 배지에서 재조합 미생물 유기체(예를 들어, 프로토테카 세포)의 집단을 배양 단계를 포함하는 알코올의 생성 방법을 제공하고, 여기서, 상기 세포는 (i) 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 제1 외인성 유전자, 및 (ii) 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소를 암호화하는 제2 외인성 유전자를 함유하고 상기 세포는 아실 운반 단백질(ACP)에 연결된 지방산을 합성하고 지방 아실-ACP 티오에스터라제는 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매하여 추가의 가공을 통해 지방 아실-CoA를 생성하고 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소는 아실-CoA의 알코올로의 환원을 촉매한다.
본 발명은 또한 프로토테카 세포에서 지질 분자를 생산하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 배양 배지에서 미생물 유기체(예를 들어, 프로토테카 세포) 집단을 배양하는 단계를 포함하고, 상기 세포는 (i) 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 제1 외인성 유전자, 및 (ii) 지방 아실-CoA 환원효소를 암호화하는 제2 외인성 유전자를 함유하고 상기 미생물은 아실 운반 단백질(ACP)에 연결된 지방산을 합성하고 지방 아실-ACP 티오에스터라제는 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매하여 추가 처리를 통해 지방 아실-CoA를 생성하고 지방 아실-CoA 환원효소는 아실-CoA의 알데하이드로의 환원을 촉매한다.
본 발명은 또한 프로토테카 세포에서 특정된 탄소 쇄 길이를 갖는 지방산 분자를 생성 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 배양 배지에서 지질 생성 미생물 유기체(예를 들어, 프로토테카 세포) 집단을 배양하는 단계를 포함하고 여기서 상기 미생물은 8, 10, 12 또는 14개 탄소 원자와 같은 특정 탄소 쇄 길이에 특이적이거나 우선적인 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 외인성 유전자를 함유하고, 상기 미생물은 아실 운반 단백질(ACP)에 연결된 지방 산을 합성하고 상기 티오에스터라제는 지방산이 특정 탄소 쇄 길이로 합성되는 경우 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매한다.
상기된 다양한 양태에서, 상기 미생물 유기체(예를 들어, 프로토테카 세포)는 지질 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 유전자를 함유할 수 있다. 몇몇 경우에, 지질 경로 효소는 스테아로일-ACP 불포화효소, 글라이세로지질 불포화효소, 파이루베이트 탈수소효소, 아세틸-CoA 카복실라제, 아실 운반 단백질 및 글라이세롤-3 포스페이트 아실트랜스퍼라제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 경우에, 프로토테카 세포는 지방 아실-ACP 티오에스터라제, 지방 아실-CoA/알데하이드 환원효소, 지방 아실-CoA 환원효소, 지방 알데하이드 환원효소, 지방 알데하이드 데카보닐라제 및/또는 아실 운반 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 지질 변형 효소를 함유한다.
다양한 지질 경로 효소 및 지질 변형 효소를 발현하는데 사용되는 다수의 예시적 형질전환 카세트 또는 구성체는 실시예에서 제공된다. 다른 유용한 구성체는, 제한 없이, 이하의 표 37에 열거한다.
예시적 형질전환 구성체, 코돈 최적화된 암호화 영역, 및 효소
형질전환 구성체/암호화 영역/효소 서열번호
쿠페아 후커리아나 C10:0 특이적 티오에스터라제 구성체 243
쿠페아 후커리아나 C10:0 특이적 티오에스터라제에 대한 암호화 영역(코돈 최적화됨) 244
쿠페아 후커리아나 KAS IV효소 구성체 245
쿠페아 후커리아나 KAS IV 효소에 대한 암호화 영역(코돈 최적화됨) 246
쿠페아 후커리아나 KAS IV 효소 247
쿠페아 후커리아나 C10:0 특이적 티오에스터라제 + 쿠페아 후커리아나 KAS IV 효소 구성체 248
UTEX 1435 D12 지방산 불포화효소와 함께 쿠페아 란세올라타 C10:0 특이적 티오에스터라제에 대한 암호화 영역 249
캘리포니아 월계수 C12:0 특이적 티오에스터라제 구성체 250
캘리포니아 월계수 C12:0 특이적 티오에스터라제에 대한 암호화 영역(코돈 최적화됨) 251
가르시니아 망고스타나 C16:0 티오에스터라제 구성체 252
가르시니아 망고스타나 C16:0 티오에스터라제에 대한 암호화 영역(코돈 최적화됨) 253
브라씨카 나푸스 C18:0 티오에스터라제 구성체 254
브라씨카 나푸스 C18:0 티오에스터라제에 대한 암호화 영역(코돈-최적화됨) 255
올리아 유로페아 스테아로일-ACP 불포화효소 구성체 256
올리아 유로페아 스테아로일-ACP 불포화효소에 대한 암호화 영역(코돈-최적화됨) 257
쿠페아 후커리아나 C16:0 티오에스터라제 구성체 258
쿠페아 후커리아나 C16:0 티오에스터라제에 대한 암호화 영역(코돈-최적화됨) 259
인도네시아 기름야자 C16:0 티오에스터라제 구성체 260
인도네시아 기름야자 C16:0 티오에스터라제에 대한 암호화 영역(코돈-최적화됨) 261
Δ12 지방산 불포화효소 좌위 구성체에서 카르타무스 틴토리우스 ACP-티오에스터라제 262
카르타무스 틴토리우스 ACP-티오에스터라제에 대한 암호화 영역 (코돈-최적화됨) 263
육두구나무 C14:0-C18:0 넓은 특이성의 티오에스터라제 구성체 264
육두구나무 C14:0-C18:0 넓은 특이성 티오에스터라제에 대한 암호화 영역(코돈-최적화됨) 265
육두구나무 C:14:0 특이적 티오에스터라제에 대한 암호화 영역 266
D12 FAD 수송 펩타이드와 함께 육두구나무 C14:0 특이적 티오에스터라제 267
피마자 ACP-티오에스터라제 구성체 268
피마자 ACP-티오에스터라제에 대한 암호화 영역(코돈-최적화됨) 269
녹나무 C14:0 티오에스터라제 구성체 270
녹나무 C14:0 티오에스터라제에 대한 암호화 영역(코돈-최적화됨) 271
녹나무 C14:0 특이적 티오에스터라제 구성체 272
녹나무 C14:0 특이적 티오에스터라제 구성체 273
SAD 좌위에서 미국 느릅나무 C10:0-C16:0 특이적 티오에스터라제 274
미국 느릅나무 C10:0-C16:0 특이적 티오에스터라제에 대한 암호화 영역(코돈-최적화) 275
쿠페아 라이티 KASA1 + 쿠페아 라이티 FatB2 티오에스터라제 + suc2 구성체 276
쿠페아 라이티 KASA1에 대한 암호화 영역(코돈-최적화) 277
쿠페아 라이티 FatB2 티오에스터라제에 대한 암호화 영역(코돈-최적화) 278
VI. 연료 및 화학물질 생성
본 발명의 방법에 따른 연료의 생산을 위해, 본 발명의 세포에 의해 생산된 지질을 수거하거나 다르게는 임의의 편리한 수단에 의해 채취한다. 지질은 전체 세포 추출에 의해 분리될 수 있다. 상기 세포를 우선 파쇄시키고 이어서 세포 내 및 세포막/세포벽 연합 지질 및 세포외 탄화수소를, 예를 들어 상기된 바와 같은 원심분리를 사용하여 세포 덩어리로부터 분리할 수 있다. 미생물 내에서 생성된 세포 내 지질은 몇몇 양태에서 미생물의 세포를 용해시킨 후 추출된다. 일단 추출된 후 지질을 추가로 정련하여 오일, 연료 또는 유성화학물질을 생성한다.
배양을 완료 한 후, 미생물을 발효 브로스로부터 분리할 수 있다. 선택적으로, 상기 분리는 원심분리로 수행하여 농축된 페이스트를 생성한다. 원심분리는 미생물로부터 상당한 양의 세포 내 물을 제거하지 못하고 건조 단계가 아니다. 이어서 상기 바이오매스는 임의로 세척액(예를 들어, 탈이온수)으로 세척하여 발효 브로스 및 잔해를 제거할 수 있다. 임의로 세척된 미생물 바이오매스는 또한 세포 분쇄 전에 건조(오븐 건조, 동결 건조 등)시킬 수 있다. 또한, 세포는 발효가 완료된 경우 발효 브로스의 일부 또는 전부로부터 분리 없이 용해시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 세포가 용해된 경우 세포 외 액체에 대한 세포의 비율이 1:1(v:v) 미만일 수 있다.
액체를 함유하는 미생물은 용해시켜 용해물을 생성시킬 수 있다. 본 명세서에 상세하게 기재된 바와 같이 미생물 용해시키는 단계(또한 세포 용해로서 언급됨)는 열-유도된 용해, 염기의 첨가, 산의 첨가, 프로테아제와 같은 효소 및 아밀라제와 같은 다당류 분해 효소의 사용, 초음파, 기계적 용해의 사용, 삼투압 쇼크의 사용, 용해성 바이러스에 의한 감염 및/또는 하나 이상의 용해성 유전자의 발현을 포함하는 임의의 간편한 수단에 의해 달성될 수 있다. 용해를 수행하여 미생물에 의해 생성된 세포 내 분자를 방출시킨다. 미생물을 용해시키기 위한 이들 방법 각각은 단일 방법으로 또는 동시에 또는 연속적으로 조합하여 사용할 수 있다. 세포 파괴 정도는 현미경 분석에 의해 관찰할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 중 하나 이상을 사용하여, 전형적으로 70% 초과의 세포 파괴가 관찰된다. 바람직하게, 세포 파괴는 80% 초과, 더 바람직하게는 90% 초과 및 가장 바람직하게는 약 100%이다.
특정 실시형태에서, 미생물은 예를 들어, 추출 또는 추가의 가공을 위해 세포 지질 및/또는 탄화수소의 노출을 증가시키기 위해 성장 후 용해시킨다. 리파제 발현 및 세포 용해 시간(예를 들어, 유도성 프로모터를 통한)은 지질 및/또는 탄화수소의 수율을 최적화하기 위해 조정될 수 있다. 다수의 용해 기술은 이하에 기재한다. 이들 기술은 개별적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 한 실시형태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 미생물을 함유하는 세포 현탁액의 가열을 포함한다. 이러한 양태에서, 미생물을 함유하는 발효 브로스(또는 발효 브로스로부터 분리된 미생물 현탁액)는 미생물, 즉 미생물의 세포벽 및 막이 분해하거나 파괴될 때까지 가열한다. 전형적으로, 적용되는 온도는 적어도 50℃이다. 더 효율적인 세포 용해를 위해, 더 고온, 예를 들어, 적어도 30℃, 적어도 60℃, 적어도 70℃, 적어도 80℃, 적어도 90℃, 적어도 100℃, 적어도 110℃, 적어도 120℃, 적어도 130℃ 또는 그 이상을 사용한다. 가열 처리에 의한 세포 용해는 미생물을 비등시킴에 의해 수행할 수 있다. 또는, 열 처리(비등 없이)는 오토클레이브에서 수행할 수 있다. 열 처리된 용해물은 추가의 처리를 위해 냉각시킬 수 있다. 세포 파쇄는 또한 증기 처리, 즉 가압된 증기의 부가를 통해 수행할 수 있다. 세포 파쇄를 위한 미세조류의 증기 처리는, 예를 들어, 미국 특허 제6,750,048호에 기재되어 있다. 몇몇 양태에서, 증기 처리는 발효기로 증기를 살포하고 브로스를 약 90분 미만, 바람직하게는 약 60분 미만 및 더 바람직하게는 약 30분 미만 동안 원하는 온도에 유지하는 것에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 염기를, 미생물을 함유하는 세포 현탁액에 첨가함을 포함한다. 상기 염기는 사용되는 미생물의 단백질성 화합물의 적어도 일부를 가수분해하기에 충분히 강해야만 한다. 단백질을 가용화시키기 위해 유용한 염기는 화학 기술 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 방법에 유용한 예시적인 염기는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘의 수산화물, 카보네이트 및 바이카보네이트 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 염기는 KOH이다. 세포 파쇄를 위한 미세조류의 염기 처리는 예를 들어, 미국 특허 제6,750,048호에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 산을, 미생물을 함유하는 세포 현탁액에 첨가함을 포함한다. 산 용해는 10-500 mN 또는 바람직하게 40-160 nM의 농도로 산을 사용하여 수행할 수 있다. 산 용해는 바람직하게 실온 이상(예를 들어, 40 내지 160℃, 및 바람직하게 50 내지 130℃)에서 수행한다. 적당한 온도(예를 들어, 실온 내지 100℃ 및 특히 실온 내지 65℃)에 대해서, 산 처리는 통상적으로 초음파 처리 또는 다른 세포 파괴 방법과 조합할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 효소를 사용함에 의해 미생물을 용해시키는 것을 포함한다. 미생물을 용해시키기 위해 바람직한 효소는 프로테아제 및 다당류-분해 효소, 예를 들어, 헤미셀룰라제(예를 들어, 아스퍼질러스 니거; 미주리주 세인트 루이스에 소재한 Sigma Aldrich; #H2125), 펙티나제(예를 들어, 리조푸스 종 유래의 펙티나제; 미주리주 세인트 루이스에 소재한 Sigma Aldrich; #P2401), 만나웨이(Mannaway) 4.0ℓ(노보자임(Novozymes)), 셀룰라제(예를 들어, 트라이코더마 비리드 유래의 셀룰라제; 미주리주 세인트 루이스에 소재한 Sigma Aldrich; #C9422), 및 드리셀라제(예를 들어, 바시디오마이세테스 종 유래의 드리셀라제; 미주리주 세인트 루이스에 소재한 Sigma Aldrich; #D9515)이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 용해는 예를 들어, 임의로 클로렐라 또는 클로렐라 바이러스 유래의 다당류 분해 효소와 같은 셀룰라제 또는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제, 키모트립신, 프로테이나제 K, 문헌[Degradation of Polylactide by Commercial Proteases, Oda Yet al., Journal of Polymers 및 the Environment, Volume 8, Number 1, January 2000 , pp. 29-32(4)]에 열거된된 프로테아제, 알칼라제 2.4 FG(노보자임), 및 플라보우르짐 100ℓ(노보자임)과 같은 프로테아제와 같은 효소를 사용하여 달성한다. 프로테아제 및 다당류-분해 효소의 임의의 조합은 또한 이전의 프로테아제 및 다당류 분해 효소의 임의의 조합을 포함하여 사용할 수 있다.
또 다른 양태에서, 용해는 익스펠러 프레스를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 공정에서, 바이오매스는 고압에서 스크류형 장치를 통해 강제 주입하고 세포를 용해시키고 세포 내 지질이 방출되고 세포 내 단백질 및 섬유(및 기타 성분)로부터 분리되도록 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 초음파, 즉, 초음파 처리를 사용하여 수행한다. 따라서, 세포는 또한 고주파 음파로 용해시킬 수 있다. 상기 음파는 전기적으로 생성될 수 있고 금속 팁을 통해 적당히 농축된 세포 현탁액으로 운반된다. 상기 음파 처리(또는 초음파 처리)는 세포 현탁액 내 공극의 형성을 기준으로 세포 통합성을 붕괴시킨다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 기계적 용해에 의해 수행한다. 세포는 기계적으로 용해시키고 균질화하여 탄화수소(예를 들어, 지질) 수집을 용이하게할 수 있다. 예를 들어, 압력 분쇄기를 사용하여 세포 함유 슬러리를 제한된 오리피스 밸브를 통과하도록 펌핑시킬 수 있다. 고압(1500 바 이하)을 적용함에 이어서 출구 노출을 통해 즉시 확장시킨다. 세포 분쇄는 3개의 상기한 메커니즘에 의해 달성한다: 밸브 상에 충돌, 오리피스내 액체 고전단, 및 방출시 급작스런 압력 강하로 세포 분해의 유도. 상기 방법은 세포 내 분자를 방출시킨다. 또는, 볼 밀을 사용할 수 있다. 볼 밀에서, 세포는 비드와 같은 작은 연마 입자와 함께 현탁 상태로 진탕시킨다. 전단력 때문에 세포는 분해되고 비드 사이에서 분쇄되며 비드와 충돌한다. 상기 비드는 세포를 파쇄하여 세포 내용물을 방출시킨다. 세포는 예를 들어, 블렌딩의 사용과 함께(예를 들어, 고속 또는 와링 블렌더(Waring blender)), 프레치 프레스 또는 심지어 약한 세포 벽의 경우에 세포 파쇄를 위한 원심분리의 사용과 같은 전단력에 의해 파쇄될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 삼투압 쇼크를 적용함으로써 수행한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 용해성 바이러스로 미생물을 감염시키는 것을 포함한다.
광범위한 바이러스는 본 발명에 사용하기 위해 적합한 미생물을 용해시키는 것으로 공지되어 있고 특정 미생물에 대한 특정 용해성 바이러스의 선택 및 용도는 당업계의 기술 범위 내에 있다. 예를 들어, 파라메시움 부르사리아 클로렐라 바이러스(Paramecium bursaria chlorella virus, PBCV-1)는 특정 단일 세포 진핵 클로렐라형 녹색 조류 내에서 복제하고 이를 용해시키는 대형의 20면체 플라크 형성 이중가닥의 DNA 바이러스의 원형이다(필코드나비리대(Phycodnaviridae) 계열, 클로로바이러스(Chlorovirus) 속). 따라서, 임의의 민감성 미세조류는 적합한 클로렐라 바이러스로 배양물을 감염시킴에 의해 용해시킬 수 있다. 클로렐라 바이러스로 클로렐라 종을 감염시키는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Adv. Virus Res. 2006;66:293-336; Virology, 1999 Apr 25;257(1): 15-23; Virology, 2004 Jan 5;318(1):214-23; Nucleic Acids Symp. Ser. 2000;(44): 161-2; J. Virol. 2006 Mar;80(5):2437-44; 및 Annu. Rev. Microbiol. 1999;53:447-94]을 참조한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 자가용해를 포함한다. 상기 양태에서, 본 발명에 따른 미생물은 미생물을 용해시키는 용해성 단백질을 생성하도록 유전자 조작한다. 상기 용해성 유전자는 유도성 프로모터를 사용하여 발현시켜 세포가 처음에 발효기내에서 목적하는 밀도로 성장한 후 프로모터를 유도하여 용해성 유전자를 발현시키는 것에 의해 세포를 용해시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 용해성 유전자는 다당류-분해 효소를 암호화한다. 특정 다른 양태에서, 상기 용해성 유전자는 용해성 바이러스 유래의 유전자이다. 따라서, 예를 들어, 클로렐라 바이러스 유래의 용해성 유전자는 조류 세포에서 발현시킬 수 있고 문헌[Virology 260, 308-315 (1999); FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45-53; Virology 263, 376-387(1999); 및 Virology 230, 361-368 (1997)]을 참조한다. 용해성 유전자의 발현은 바람직하게 유도성 프로모터, 예를 들어, 소분자, 광, 열과 같은 자극 및 다른 자극의 존재 하에 유도되는 미세조류에서 활성인 프로모터를 사용하여 수행한다.
상기 방법에 의해 생성된 세포 용해물로부터 지질을 분리하기 위한 다양한 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 지방 알데하이드, 지방 알코올 및 탄화수소(예를 들어, 알칸)와 같은 지질 및 지질 유도체는 헥산과 같은 소수성 용매로 추출할 수 있다(문헌[Frenz et al. 1989, Enzyme Microb. Technol., 11:717] 참조). 지질 및 지질 유도체는 또한 액화(문헌[Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17:33-39 및 Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6(4):269-274] 참조); 오일 액화(예를 들어, 문헌[Minowa et al. 1995, Fuel 74(12): 1735-1738] 참조); 및 초임계 CO2 추출(예를 들어, 문헌[Mendes et al. 2003, Inorganica Chimica Acta 356:328-334] 참조)을 사용하여 추출할 수 있다. 미아오(Miao) 및 우(Wu)는 클로렐라 프로토테오코이데스의 배양으로부터 미세조류 지질 회수의 프로토콜을 기재하고 있고, 여기서 상기 세포는 원심분리에 의해 수거되고 증류수로 세척되며 동결 건조에 의해 건조시킨다. 수득한 세포 분말을 모르타르에서 분쇄하고 이어서 n-헥산으로 추출한다. 문헌[Miao and Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846].
따라서, 본 발명의 미생물에 의해 생성된 지질, 지질 유도체 및 탄화수소는 유기 용매로 추출하여 회수할 수 있다. 몇몇 경우에, 바람직한 유기 용매는 헥산이다. 전형적으로, 유기 용매는 용해 성분의 사전 분리 없이 용해물에 직접 첨가한다. 하나의 양태에서, 상기된 하나 이상의 방법에 의해 생성된 용해물은 지질 및/또는 탄화수소 성분이 유기 용매와 용액을 형성하도록 하기에 충분한 시간 동안 유기 용매와 접촉시킨다. 몇몇 경우에, 상기 용액을 이어서 추가로 정련하여 특정 목적하는 지질 또는 탄화수소 성분을 회수한다. 헥산 추출 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 명세서에 기재된 세포에 의해 생성된 지질 및 지질 유도체, 예컨대 지방 알데하이드, 지방 알코올, 및 탄화수소 알칸은 상기된 바와 같은 리파제를 포함하는 하나 이상의 효소의 사용에 의해 변형될 수 있다. 탄화수소가 세포의 세포 외 환경에 존재하는 경우, 하나 이상의 효소는, 효소가 탄화수소를 변형시키거나 탄화수소 전구체로부터 이의 합성을 완성하도록 하는 조건하에서 상기 환경에 첨가할 수 있다. 또는, 상기 탄화수소는 효소와 같은 하나 이상의 촉매의 첨가 전에 세포 물질로부터 부분적으로 또는 완전하게 분리될 수 있다. 상기 촉매는 외인성으로 첨가되고 이들의 활성은 세포 외부에서 또는 시험관 내에서 발생한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생체내 세포에 의해 생성되거나 시험관내에서 효소적으로 변형된 지질 및 탄화수소는 임의로 통상적인 수단에 의해 추가로 가공될 수 있다. 상기 가공은 탄화수소의 크기를 감소시키고 이어서 이의 수소화 비율을 증가시키기 위한 "크랙킹(cracking)"을 포함할 수 있다. 촉매 및 열 크랙킹 방법은 통상적으로 탄화수소 및 트라이글라이세라이드 오일 가공에 사용한다. 촉매 방법은 고체 산 촉매와 같은 촉매의 사용을 포함한다. 상기 촉매는 실리카-알루미나 또는 제올라이트일 수 있고 이로써 탄소-탄소 결합을 이종용해 또는 비대칭 분해시켜 카보양이온(carbocation) 및 수소화물 음이온을 수득할 수 있다. 이들 반응성 중간체를 이어서 또 다른 탄화수소와 함께 재정렬하거나 수소화 전달을 진행시킨다. 상기 반응은 따라서 중간체를 재생성시켜 자가-증폭 쇄 메커니즘을 유도할 수 있다. 또한 탄화수소는 여기서 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합의 수가 선택적으로 0까지 감소하도록 처리될 수 있다. 또한 탄화수소를 가공하여 여기서 고리 또는 사이클릭 구조를 제거할 수 있다. 탄화수소를 또한 처리하여 수소화 비율을 증가시킬 수 있다. 이것은 수소의 첨가("수소화") 및/또는 탄화수소의 보다 작은 탄화수소로 "크랙킹"을 포함할 수 있다.
열 방법은 탄화수소 크기를 감소시키기 위한 상승된 온도 및 압력의 용도를 포함한다. 약 800℃의 승온 및 약 700kPa의 압력을 사용할 수 있다. 이들 조건은 때때로 수소 풍부 탄화수소 분자(양성자 플럭스와는 구분되는 바와 같이)를 언급하는데 사용되는 용어 '가벼운 탄화수소 분자'를 생성하고 또한 축합에 의해 상대적으로 수소가 고갈된 보다 무거운 탄화수소 분자를 생성한다. 상기 방법은 등방성 또는 대칭적 절단을 제공하고 상기된 바와 같이 임의로 효소적으로 포화될 수 있는 알켄을 생성한다.
촉매 및 열 방법은 탄화수소 가공 및 오일 정련을 위한 식물에서의 표준 방법이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포에 의해 생성된 탄화수소가 수거될 수 있고 통상적인 수단에 의해 가공되거나 수집될 수 있다. 미세조류 생산 탄화수소의 수소 크랙킹에 대한 보고에 대해 문헌[Hillen et al. (Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIV: 193-205 (1982))]을 참조한다. 또 다른 양태에서, 상기 분획물은 또 다른 촉매, 예를 들어, 유기 화합물, 열 및/또는 무기 화합물로 처리한다. 지질의 바이오디젤로의 가공을 위해, 에스터결합전이 공정은 이 부분의 이하에 기재되는 바와 같이 사용된다.
본 발명의 방법을 통해 생성되는 탄화수소는 다양한 산업 응용 분야에서 유용하다. 예를 들어, 거의 모든 유형의 세제 및 세정제에서 사용되는 음이온 게면활성제인 직쇄 알킬벤젠 설포네이트(LAS)의 생산은 일반적으로 10 내지 14개의 탄소 공급원자 쇄를 포함하는 탄화수소를 사용한다. 예를 들어, 미국 특허 번호: 제6,946,430호; 제5,506,201호; 제6,692,730호; 제6,268,517호; 제6,020,509호; 제6,140,302호; 제5,080,848호; 및 제5,567,359호를 참조한다. LAS와 같은 계면활성제는 퍼스널 케어 조성물 및 세제, 예컨대, 미국 특허 제5,942,479호; 제6,086,903호; 제5,833,999호; 제6,468,955호; 및 제6,407,044호에 기재된 것의 제조에 사용할 수 있다.
관심이 고조되고 있는 것은 화석 연료로부터 유래된 출발 물질을 대체할 수 있는 재생가능한 생물학적 출발 물질이 가용하고 이의 사용이 바람직할 수 있기 때문에 바이오디젤, 재생가능한 디젤 및 제트 연료와 같은 연료에서의 생물학적 기원의 탄화수소 성분의 용도에 대한 것이다. 생물학적 물질로부터 탄화수소 성분을 생산하기 위한 방법이 시급히 요구되고 있다. 본 발명은 바이오디젤, 재생가능한 디젤 및 제트 연료를 제조하기 위해 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된, 생물학적 재료로서의 지질을 사용하여, 바이오디젤, 재생가능한 디젤 및 제트 연료의 생산 방법을 제공하여 상기 필요성을 충족시킨다.
통상적인 디젤 연료는 파라핀 탄화수소가 풍부한 석유 증류물이다. 이들은 370° 내지 780℉ 정도로 넓은 비등 범위를 갖고 이는 디젤 엔진 승용차와 같은 압착 점화 엔진에서 연소용으로서 적합하다. 미국재료시험협회(The American Society of Testing and Materials, ASTM)은 세탄수, 혼탁점, 플래쉬 포인트, 점도, 아닐린 포인트, 황 함량, 물 함량, 재 함량, 구리 스트립 부식 및 탄소 잔기와 같은 허용 가능한 범위의 다른 연료 성질과 함께 비등 범위에 따라 디젤 등급을 확립한다. 기술적으로, 적당한 ASTM 세부항목을 충족하는 바이오매스 또는 기타로부터 유래된 임의의 탄화수소 증류 재료는 디젤 연료(ASTM D975), 제트 연료(ASTM D1655), 또는 이것이 지방산 메틸 에스터인 경우 바이오디젤(ASTM D6751)로 정의될 수 있다.
추출 후, 본 명세서에 기재된 미생물 바이오매스로부터 회수된 지질 및/또는 탄화수소 성분은 디젤 승용차 및 제트 엔진에 사용하기 위한 연료를 제조하기 위해 화학적 처리에 적용될 수 있다.
바이오디젤은 금색에서 암갈색으로 생산 공급원료에 따라 색상이 다양한 액체이다. 이것은 실제로 수불혼화성이고 고융점 및 저증기압을 갖는다. 바이오디젤은 디젤-엔진 승용차에 사용하기 위한 디젤-등가의 가공된 연료를 언급한다. 바이오디젤은 생분해성이고 비독성이다. 통상적인 디젤 연료에 비해 바이오디젤의 추가의 이득은 보다 낮은 엔진 마모이다. 전형적으로, 바이오디젤은 C14-C18 알킬 에스터를 포함한다. 다양한 가공은 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성되고 분리된 바이오매스 또는 지질을 디젤 연료로 전환시킨다. 바이오디젤을 생산하기 위한 바람직한 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이 지질의 에스터결합전이에 의한 것이다. 바이오디젤로서 사용하기 위한 바람직한 알킬 에스터는 메틸 에스터 또는 에틸 에스터이다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 바이오디젤은 대부분의 모뎀 디젤-엔진 승용차에서 임의의 농도로 단독으로 사용하거나 통상적인 디젤 연료와 배합하여 사용될 수 있다. 통상적인 디젤 연료(석유 디젤)와 배합되는 경우, 바이오디젤은 약 0.1% 내지 약 99.9%로 존재할 수 있다. 많은 국가에서는 임의의 연료 혼합물에서 바이오디젤의 양을 지칭하기 위해 "B" 인자로서 공지된 시스템을 사용한다. 예를 들어, 20% 바이오디젤을 함유하는 연료는 B20으로 표시된다. 순수한 바이오디젤은 B100으로 언급된다.
바이오디젤은 또한 가정용 및 상업용 보일러에서 가열 연료로서 사용될 수 있다. 기존의 오일 보일러는 고무 구성품을 함유할 수 있고 바이오디젤상에서의 운행을 위해서는 전환을 필요로 할 수 있다. 전환 과정은 일반적으로 비교적 단순하고 바이오디젤이 강한 용매임으로 고무 구성품의 합성 구성품으로의 교환을 포함한다. 이의 강한 용해력 때문에, 바이오디젤의 연소는 보일러의 효율을 증가시킨다. 바이오디젤은 수순한 울트라-로우 황디젤(ULSD) 연료의 윤활성을 증가시키기 위해 디젤 제형 중에 첨가제로서 사용될 수 있고, 이는 이것이 실제로 황을 내포하지 않기 때문에 유리하다. 바이오디젤은 석유 디젤 보다 양호한 용매이고 이전에 석유 디젤 상에서 운행된 자동차 연료 라인 중에 잔류 침전물을 분해시키는데 사용될 수 있다.
바이오디젤은 오일 풍부 바이오매스중에 함유된 트라이글라이세라이드의 에스터결합전이에 의해 생성될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 바이오디젤을 생산하기 위한 방법이 제공된다. 바람직한 양태에서, 바이오디젤을 생산하는 방법은 (a) 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 지질 함유 미생물을 배양하는 단계, (b) 지질 함유 미생물을 용해시켜 용해물을 생성하는 단계, (c) 용해된 미생물로부터 지질을 분리하는 단계 및 (d) 지질 조성물을 에스터결합전이에 의해 바이오디젤을 생성하는 단계를 포함한다. 미생물의 성장 방법, 미생물을 용해시켜 용해물을 생성하는 방법, 유기 용매를 포함하는 배지에서 용해물을 처리하여 이종성 혼합물을 형성시키는 방법 및 처리된 용해물을 지질 조성물로 분리하는 방법은 상기 기재되었고 또한 바이오디젤을 생산하는 방법에 사용될 수 있다.
바이오디젤의 지질 프로파일은 일반적으로 공급원료 오일의 지질 프로파일과 고도로 유사하다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공된 다른 오일은 에스터결합전이에 의해 바이오디젤을 생산할 수 있고 이때 지질 프로파일은 (a) 적어도 1%-5%, 바람직하게는 적어도 4%의 C8-C14; (b) 적어도 0.25%-1%, 바람직하게는 적어도 0.3%의 C8; (c) 적어도 1%-5%, 바람직하게는 적어도 2%의 C10; (d) 적어도 1%-5%, 바람직하게는 적어도 2%의 C12; 및 (3) 적어도 20%-40%, 바람직하게는 적어도 30%의 C8-C14를 포함한다.
지질 조성물은 에스터결합전이로 바이오디젤로서 유용한 장쇄의 지방산 에스터를 생산할 수 있다. 바람직한 에스터결합전이는 이하에 약술되고 염기 촉매된 에스터결합전이 및 재조합 리파제를 사용하는 에스터결합전이 반응을 포함한다. 염기 촉매된 에스터결합전이 공정에서, 트라이아실글라이세라이드는 알칼린 촉매인, 전형적으로 수산화칼륨의 존재 하에 메탄올 또는 에탄올과 같은 알코올과 반응시킨다. 상기 반응은 부산물로서 메틸 또는 에틸 에스터 및 글라이세린(글라이세롤)을 형성한다.
동물 및 식물 오일은 전형적으로 트라이하이드릭 알코올인 글라이세롤과 유리된 지방산의 에스터인 트라이글라이세라이드로 구성된다. 에스터결합전이에서, 트라이리세라이드(TAG) 중의 글라이세롤은 메탄올 또는 에탄올과 같은 단쇄 알코올로 대체한다. 전형적인 반응 계획은 다음과 같다:
Figure 112018108415035-pat00013
상기 반응에서, 상기 알코올은 염기로 탈양성자화되어 보다 강한 친핵성이 된다. 통상적으로, 에탄올 또는 메탄올은 매우 과량(50배 까지)으로 사용된다. 정상적으로 상기 반응은 상당히 느리게 진행하거나 전혀 진행하지 않는다. 산 또는 염기뿐만 아니라 열을 사용하여 반응의 보다 신속한 진행을 도와줄 수 있다. 산 또는 염기는 에스터결합전이 반응에 의해 소비되지 않고 따라서 이들은 반응물이 아니고 촉매이다. 거의 모든 바이오디젤은 이것이 단지 저온 및 저압을 요구하고 98% 이상의 전환 수율을 나타내므로(단, 출발 오일은 수분 및 유리된 지방산이 낮아야 한다) 염기 촉매 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
에스터결합전이는 또한 염기 대신 리파제와 같은 효소를 사용하여 수행하였다. 리파제-촉매된 에스터결합전이는 예를 들어, 실온 내지 80℃의 온도 및 1:1 초과, 바람직하게는 약 3:1인 TAG 대 저급 알코올의 몰비에서 수행할 수 있다. 에스터결합전이에 사용하기에 적합한 리파제는 표 9에 기재된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 에스터결합전이를 위해 유용한 리파제의 다른 예는 예를 들어, 미국 특허 제4,798,793호; 제4,940,845호; 제5,156,963호; 제5,342,768호; 제5,776,741호 및 WO89/01032에서 찾을 수 있다. 상기 리파제는 리조푸스 (Rhizopus), 아스퍼질러스(Aspergillus), 칸디다(Candida), 뮤코(Mucor), 슈도모나스(Pseudomonas), 리조뮤코(Rhizomucor), 칸디다 및 휴미콜라(Humicola)에 의해 생성된 리파제 및 췌장 리파제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
에스터결합전이에서 사용에 적합한 리파제
아스퍼질러스 니거 리파제 ABG73614, 칸디다 안탁티카(Candida antarctica) 리파제 B(노보자임-435) CAA83122, 칸디다 실린드라새(Candida cylindracea) 리파제 AAR24090, 칸디다 리폴리티카(Candida lipolytica) 리파제(리파제 L; Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), 칸디다 루고사(Candida rugosa) 리파제(예를 들어, Meito Sangyo Co., Ltd.의 리파제), 뮤코 미에헤이(Mucor miehei) 리파제(리포자임 IM 20), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 리파제 AAA25882, 리조푸스 자포니카스(Rhizopus japonicas) 리파제(릴리파스 A-10FG) Q7M4U7_1, 리조뮤코 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 리파제 B34959, 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae) 리파제(리파제 F) AAF32408, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 리파제(SM 효소) ABI13521, 써모마이세스 라누기노사(Thermomyces lanuginosa) 리파제 CAB58509, 리파제 P(Nagase ChemteX Corporation), 및 리파제 QLM (일본 나고야에 소재한 Meito Sangyo Co., Ltd.)
바이오디젤 용으로 적합한 지방산 에스터의 제조를 위해 리파제를 사용하는 문제는 리파제 가격이 강염기 공정에 의해 사용되는 수산화나트륨(NaOH)의 가격보다 훨씬 고가라는 것이다. 상기 문제점은 재활용될 수 있는 고정화된 리파제를 사용함으로써 해결되었다. 그러나, 고정화된 리파제의 활성은 리파제-기본 공정이 생산 단가의 측면에서 강염기 공정과 경쟁을 위해서는 최소의 주기동안 재사용된 후 유지되어야만 한다. 고정화된 리파제는 에스터결합전이에 전형적으로 사용되는 저급 알코올에 의해 독성이 된다. 미국 특허 제6,398,707호(우 등에게 2002년 6월 4일자로 발행됨)는 고정화된 리파제의 활성을 증진시키는 방법 및 감소된 활성을 갖는 고정화된 리파제를 재생시키는 방법을 기재하고 있다. 몇몇 적합한 방법은 일정 기간의 시간, 바람직하게는 0.5 내지 48시간 및 보다 바람직하게는 0.5 내지 1.5시간 동안 3개 이상의 탄소 원자수를 갖는 알코올 중에 고정화된 리파제를 침지시키는 것을 포함한다. 몇몇 적합한 방법은 또한 3개 이상의 탄소 원자 수를 갖는 알코올과 불활성화된 고정화된 리파제를 세척함에 이어서 식물성 오일 중에 0.5 내지 48시간 동안 불활성화된 고정화된 리파제를 침지시키는 것을 포함한다.
특정 양태에서, 재조합 리파제는 리파제가 작용하는 지질을 생산하는 동일한 미생물 내에서 발현된다. 적합한 재조합 리파제는 표 9에 상기 열거되고/되거나 표 9에 상기 열거된 GenBank 등록번호를 갖는 것들, 또는 표 9에 상기 열거된 리파제중 하나와 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖고 리파제 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 포함한다. 추가의 양태에서, 효소 활성은 상기된 서열중 하나와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열 중에 존재하고 상기 서열 모두는 완전히 제시된 바와 같이 참조로서 인용된다. 리파제 및 선택가능한 마커를 암호화하는 DNA는 바람직하게 코돈 최적화된 cDNA이다. 미세조류 중에서 발현하기 위해 유전자를 재암호화하는 방법은 미국 특허 제7,135,290호에 기재되어 있다.
바이오디젤에 대한 통상의 국제 표준은 EN 14214이다. ASTM D6751은 미국 및 캐나다에서 참조되는 가장 공통된 바이오디젤 표준이다. 독일은 DIN EN 14214를 사용하고 UK는 BS EN 14214를 준수할 것으로 요구한다. 생성물이 이들 표준에 부합하는지의 여부를 결정하기 위한 기본 산업적 시험은 전형적으로 가스 크로마토그래피, HPLC 등을 포함한다. 품질 표준을 충족하는 바이오디젤은 매우 비독성이고 독성 등급(LD50)은 50 ㎖/㎏을 초과한다.
ASTM 표준을 충족하는 바이오디젤이 비독성이어야 하지만 결정화하고/하거나 침전하고 용액으로부터 침강하는 경향이 있는 오염물이 있을 수 있다. 침강물 형성은 특히 바이오디젤이 보다 저온에서 사용되는 경우 문제이다. 침강 또는 침전은 연료 흐름을 감소시키고, 연료 라인을 막히게 하고 여과기를 막히게 하는 것과 같은 문제를 유발할 수 있다. 고품질의 생성물을 제조하기 위해 바이오디젤에서 상기 오염물 및 침강물을 제거하는 것과 관련된 공정들은 당업계에 널리 공지되어 있다. 상기 공정들의 예는 인지질 및 유리 지방산과 같은 오염물을 제거하기 위한 오일의 전처리(예를 들어, 정련, 부식성 정련 및 실리카 흡착 여과) 및 냉각 여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 냉각 여과는 생성 후 바이오디젤에 존재하는 임의의 미립자 및 침강물을 제거하기 위해 특별히 개발된 공정이다. 상기 공정은 바이오디젤을 냉각시키고 연료가 보다 저온에서 사용되는 경우 형성될 수 있는 임의의 침강물 또는 침전물을 여과 제거한다. 상기 공정은 당업계에 널리 공지되어 있고 미국 특허원 공개번호 제2007-0175091호에 기재되어 있다. 적합한 방법은 바이오디젤을 약 38℃ 미만의 온도로 냉각시켜 불순물 및 오염물이 바이오디젤 액체 중에서 미립자로서 침전하는 단계를 포함할 수 있다. 이어서 규조토 또는 다른 여과 재료를 냉각된 바이오디젤에 첨가하여 슬러리를 형성시킬 수 있고 이것은 이어서 압력 리프(pressure leaf) 또는 다른 유형의 여과기를 통해 여과하여 미립자를 제거할 수 있다. 이어서 여과된 바이오디젤은 가연성 여과기에 통과시켜 임의의 잔류 침강물 및 규조토를 제거하여 최종 바이오디젤 생성물을 생성할 수 있다.
실시예 13는 프로토테카 모리포르미스로부터 트라이글라이세라이드를 사용하는 바이오디젤의 제조법을 기재하였다. 실시예 13에서 제조된 바이오디젤의 ASTM D6751 A1 방법에 의한 냉각 담금 여과능(Cold Soak Filterability)은 300㎖의 부피에 대해 120초이었다. 상기 시험은 16시간 동안 40℉로 냉각시키고 실온으로 가온되도록 방치하고 스테인레스 강철 지지체를 가진 0.7 마이크론 유리 섬유 필터를 사용하여 진공 여과하는, 300㎖의 B100의 여과를 포함한다. 본 발명의 오일은 120초 미만, 100초 미만 및 90초 미만의 냉각 담금 시간과 함께 에스터교환되어 바이오디젤을 생성할 수 있다.
후속 공정은 또한 바이오디젤이 특히 냉온에서 사용되는 경우 사용될 수 있다. 상기 공정은 동결방지처리(winterization) 및 부분 분리를 포함한다. 2개 공정은 혼탁점(바이오디젤이 결정화하기 시작하는 온도)을 저하시킴에 의해 연료의 냉각 흐름 및 동결방지 수행능을 개선시키도록 설계된다. 바이오디젤의 동결방지처리에는 다수의 방법이 있다. 한 가지 방법은 바이오디젤을 석유 디젤과 배합하는 것이다. 또 다른 방법은 바이오디젤의 혼탁점을 저하시킬 수 있는 첨가제를 사용하는 것이다. 또 다른 방법은 첨가제 중에 혼합하고 포화물이 결정화하도록 방치하고 이어서 결정을 여과 제거함에 의해 무분별하게 포화된 메틸 에스터를 제거하는 것이다. 부분 분리는 선택적으로 메틸 에스터를 개별 성분 또는 분획으로 분리하여 특정 메틸 에스터가 제거 또는 포함되도록 할 수 있다. 부분 분리 방법은 우레아 부분 분리, 용매 부분 분리 및 열 증류를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 제공될 수 있는 또 다른 가치있는 연료는 C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 및 C18:0과 같은 알칸을 포함하여 바이오디젤과는 구분될 수 있는 재생가능한 디젤이다. 고품질의 재생가능한 디젤은 ASTM D975 표준에 부합한다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질은 공급원료로서 작용하여 재생가능한 디젤을 생성할 수 있다. 따라서 본 발명의 또 다른 측면에서,재생가능한 디젤을 생성하는 방법이 제공된다. 재생가능한 디젤은 3개 이상의 공정에 의해 생성될 수 있다: 열수 가공(수소 처리); 수소화처리; 및 간접적인 액화. 이들 공정으로 비-에스터 증류물을 수득한다. 이들 공정 동안에, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성되고 분리된 트라이아실글라이세라이드는 알칸으로 전환된다.
한 실시형태에서, 재생가능한 디젤을 생성하는 방법은 (a) 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 지질 함유 미생물을 배양하는 단계, (b) 미생물을 용해시켜 용해물을 생성하는 단계, (c) 용해된 미생물로부터 지질을 분리하는 단계, (d) 지질을 탈산화하고 수소화처리하여 알칸을 생성함으로써 재생가능한 디젤이 생성되도록 하는 단계를 포함한다. 재생가능한 디젤을 제조하기에 적합한 지질은 헥산과 같은 유기 용매를 사용하거나 미국 특허 제5,928,696호에 기재된 것들과 같은 다른 방법을 통해 미생물 바이오매스로부터 추출을 통해 수득할 수 있다. 몇몇 적합한 방법은 기계적 프레싱 및 원심분리를 포함할 수 있다.
일부 방법에서, 미생물 지질은 먼저 수소화처리와 연계하여 크랙킹하여 각각 탄소쇄 길이를 감소시키고 이중 결합을 포화시킨다. 상기 물질을 또한 이어서 수소화처리와 연계하여 이성질체화한다. 이어서 나프타 분획을 증류를 통해 제거함에 이어서 추가 증류하여 디젤 연료에 요구되는 성분을 증발시키고 증류시킴으로써 ASTM D975에 충족하도록 하고 D975 표준을 충족시키기 위해 요구되는 것 보다 무거운 성분을 잔류시킨다. 트라이글라이세라이드 오일을 포함하는 화학적으로 변형된 오일의 수소 처리, 수소 크랙킹, 탈산소화 및 이성질체화 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허 출원 EP1741768(A1); EP1741767(A1); EP1682466(A1); EP1640437(A1); EP1681337(A1); EP1795576(A1); 및 미국 특허 제7,238,277호; 제6,630,066호; 제6,596,155호; 제6,977,322호; 제7,041,866호; 제6,217,746호; 제5,885,440호; 제6,881,873호를 참조한다.
재생가능한 디젤을 생성하기 위한 방법의 하나의 양태에서, 알칸을 생성하기 위한 지질의 처리는 지질 조성물의 수소 처리에 의해 수행한다. 열수 가공에서, 전형적으로 바이오매스는 승온 및 승압에서 물 중에서 반응시켜 오일 및 잔류 고체를 형성시킨다. 전환 온도는 전형적으로 300℉ 내지 660℉이고, 이때 압력은 주로 액체로서 물을 유지하게 충분한 100 내지 170 표준 대기압(atm)이다. 반응 시간은 15 내지 30분 정도이다. 반응을 종결한 후 유기물을 물로부터 분리한다. 이에 의해 디젤에 적합한 증류물이 생성된다.
재생가능한 디젤을 제조하는 일부 방법에서, 트라이글라이세라이드를 처리하는 제1 단계는 이중 결합을 포화시키기 위한 수소 처리에 이어서 수소 및 촉매의 존재 하에 승온에서 탈산소화시키는 것이다. 몇몇 방법에서, 수소화 및 탈산소화는 동일한 반응에서 발생한다. 다른 방법에서 탈산소화는 수소화 전에 수행한다. 이어서 이성질체화는 임의로 또한 수소 및 촉매의 존재 하에서 수행한다. 나프타 성분은 바람직하게 증류를 통해 제거한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,475,160호(트라이글라이세라이드의 수소화); 제5,091,116호(탈산소화, 수소화 및 기체 제거); 제6,391,815호(수소화); 및 제5,888,947호(이성질체화)를 참조한다.
트라이글라이세라이드의 수소화를 위한 하나의 적합한 방법은 구리, 아연, 마그네슘 및 란탄염의 수용액 및 알칼리금속 또는 바람직하게 탄산암모늄의 또 다른 용액을 제조하는 것을 포함한다. 상기 2가지의 용액을 약 20℃ 내지 약 85℃의 온도로 가열하고 침전 용기 내 pH가 5.5 내지 7.5로 유지되어 촉매를 형성하도록 하는 비율로 침전 용기 내로 함께 계량하여 부가할 수 있다. 추가의 물은 초기에 침전 용기 내에 사용할 수 있거나 염 용액 및 침전 용액과 동시에 첨가할 수 있다. 이어서 수득한 침전물을 약 300℃에서 세척하고 건조시키고 하소시키고 약 100℃ 내지 약 400℃의 온도 범위에서 수소중에서 활성화시킬 수 있다. 이어서 하나 이상의 트라이글라이세라이드는 반응기 내 상기된 촉매의 존재 하에 수소와 접촉시키고 반응시킬 수 있다. 상기 반응기는 트라이클 상 반응기, 고정 상 가스-고체 반응기, 팩킹된 기포 칼럼 반응기, 연속 교반 탱크 반응기, 슬러리 상 반응기 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 반응기 유형일 수 있다. 상기 방법은 배치식으로 또는 연속식으로 수행할 수 있다. 반응 온도는 전형적으로 약 170℃ 내지 약 250℃의 범위이고 반응 압력은 전형적으로 약 300 psig 내지 약 2000 psig 범위이다. 더욱이, 본 발명의 방법에서 수소 대 트라이글라이세라이드의 몰 비는 전형적으로 약 20:1 내지 약 700:1의 범위이다. 상기 방법은 전형적으로 중량 시간 공간 속도(WHSV)에서 수행하고 이의 범위는 약 0.1시간-1 내지 약 5시간-1이다. 당업자는 반응을 위해 요구되는 시간은 사용되는 온도, 수소 대 트라이글라이세라이드의 몰비 및 수소 분압에 따라 다양함을 인지할 것이다. 상기 수소화 공정에 의해 생성되는 생성물은 지방 알코올, 글라이세롤, 미량의 파라핀 및 미반응 트라이글라이세라이드를 포함한다. 이들 생성물은 전형적으로 예를 들어, 증류, 추출, 여과, 결정화 등과 같은 통상적인 수단에 의해 분리한다.
석유 정련업자는 수소화처리를 사용하여 공급물을 수소로 처리하는 것에 의해 불순물을 제거한다. 수소화처리 전환 온도는 전형적으로 300℉ 내지 700℉이다. 상기 압력은 전형적으로 40 내지 100atm이다. 상기 반응 시간은 전형적으로 10 내지 60분 정도이다. 고체 촉매를 사용하여 특정 반응 속도를 증가시키고, 특정 생성물에 대한 선택성을 개선시키며 수소 소모를 최적화한다.
오일의 탈산소화를 위해 적합한 방법은 오일을 약 350℉ 내지 약 550℉ 범위의 온도로 가열하고 연속적으로 가열된 오일을 약 5분 이상 동안 적어도 약 대기압 이상의 압력하에서 수소와 접촉시키는 단계를 포함한다.
이성질체화를 위해 적합한 방법은 알칼리 이성질체화 및 당업계에 공지된 다른 오일 이성질체화를 사용하는 단계를 포함한다.
수소 처리 및 수소 가공은 궁극적으로 트라이글라이세라이드 공급물의 중량 감소를 유도한다. 상기 트라이글라이세라이드 분자는 수소 가공 조건하에 4개의 탄화수소 분자, 즉 프로판 분자 및 전형적으로 C8 내지 C18 범위의 3개의 더 무거운 탄화수소 분자로 감소한다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명의 지질 조성물 상에서 수행되는 하나 이상의 화학 반응(들)의 생성물은 ASTM D975 재생가능한 디젤을 포함하는 알칸 혼합물이다. 미생물에 의한 탄화수소의 생성은 문헌[Metzger et al. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66: 486-496 and A Look Back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species Program: Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann and Paul Roessler (1998)]에 의해 검토되었다.
디젤 연료의 증류 성질은 T10-T90 (각각 10% 및 90%의 부피가 증류되는 온도)의 관점에서 기재한다. 재생가능한 디젤은 프로토테카 모리포미스 트라이글라이세라이드로부터 생성되고 실시예 13에 기재된다. 실시예 13에 생성된 물질의 T10-T90은 57.9℃였다. 본 명세서에 기재된 오일의 수소 처리, 이성질체화 및 본 명세서에 기재된 다른 공유 변형 방법 및 증류 및 본 명세서에 기재된 부분 분리(예를 들어, 냉각 여과) 방법을 사용하면서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성된 트라이글라이세라이드를 사용하여 재생가능한 디젤 조성물을 생성할 수 있고 이때 다른 T10-T90 범위는 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 및 65℃이다.
실시예 13에서 생성된 물질의 T10은 242.1℃이다. 본 명세서에 개시된 오일의 수소 처리, 이성질체화 및 다른 공유 변형 방법 및 본 명세서에 개시된 증류 및 부분분리(예컨대 냉각 여과) 방법을 사용하여 재생가능한 디젤 조성물을 생성할 수 있고 이때 다른 T10 값은 예를 들어, 180 내지 295, 190 내지 270, 210 내지 250, 225 내지 245, 및 적어도 290의 T10이다.
실시예 13에서 생성된 물질의 T90은 300℃이다. 본 명세서에 기재된 오일의 수소 처리, 이성질체화 및 다른 공유 변형 방법 및 본 명세서에 기재된 증류 및 부분 분리(냉각 여과와 같은) 방법을 사용하여 재생가능한 디젤 조성물을 생성할 수 있고 이때 다른 T90 값은 예를 들어, 280 내지 380, 290 내지 360, 300 내지 350, 310 내지 340, 및 적어도 290의 T90이다.
실시예 13에서 생성된 물질의 FBP는 300℃이다. 본 명세서에 기재된 오일의 수소 처리, 이성질체화 및 다른 공유 변형 방법 및 본 명세서에 기재된 증류 및 부분 분리(냉각 여과와 같은) 방법을 사용하여 재생가능한 디젤 조성물을 생성할 수 있고 이때 다른 FBP 값은 예를 들어, 290 내지 400, 300 내지 385, 310 내지 370, 315 내지 360, 및 적어도 300의 FBP이다.
본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공된 기타 오일은 수소화처리, 이성질체화 및 다른 공유 변형의 조합에 적용될 수 있고 (a) 적어도 1%-5%, 바람직하게는 적어도 4%의 C8-C14; (b) 적어도 0.25%-1%, 바람직하게는 적어도 0.3%의 C8; (c) 적어도 1%-5%의 바람직하게는 적어도 2%의 C10; (d) 적어도 1%-5%, 바람직하게는 적어도 2%의 C12; 및 (3) 적어도 20%-40%, 바람직하게는 적어도 30% C8-C14를 포함하는 지질 프로파일을 갖는 오일을 포함한다.
전통적인 초-저 황 디젤은 2단계 공정에 의해 임의의 형태의 바이오매스로부터 생성될 수 있다. 먼저, 바이오매스를 수소 및 일산화탄소가 풍부한 가스 혼합물인 합성가스로 전환한다. 이어서, 합성가스를 촉매적으로 액체로 전환한다. 전형적으로, 액체의 생성은 피셔-트로프쉬(Fischer-Tropsch, FT) 합성을 사용하여 달성한다. 상기 기술은 석탄, 천연 가스 및 중유에 적용한다. 따라서, 재생가능한 디젤을 생성하기 위한 방법의 여전히 또 다른 바람직한 양태에서, 알칸을 생성하기 위한 액체 조성물의 처리는 액체 조성물의 간접적인 액화에 의해 수행된다.
본 발명은 또한 제트 연료를 제조하는 방법을 제공한다. 제트 연료는 스트로 색상으로 투명하다. 가장 일반적인 연료는 국제 표준 세트의 세부 항목으로 제조되는 항공기 A-1로서 분류되는 무연/석유 오일계 연료이다. 제트 연료는 다수의 상이한, 가능하게는 수천 개 이상의 많은 상이한 탄화수소의 혼합물이다. 이들의 크기 범위(분자량 또는 탄소수)는 생성물에 대한 요건, 예를 들어, 동결점 또는 발연점에 의해 제한된다. 케로손형(Kerosone-type) 항공기 연료(제트 A 및 제트 A-1을 포함함)는 약 8 내지 16개 탄소 수의 탄소 수 분포를 갖는다. 와이드-컷 또는 나프타형 항공기 연료(제트 B를 포함)는 전형적으로 약 5 내지 15개 탄소의 탄소 수 분포를 갖는다.
항공기(제트 A 및 제트 B)는 둘 다 다수의 부가제를 함유할 수 있다. 유용한 부가제는 항산화제, 대전방지제, 부식 억제제, 및 연료 시스템 아이싱 억제제(FSII)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항산화제는 검화(gumming)를 방지하고 일반적으로 알킬화된 페놀, 예를 들어, AO-30, AO-31, 또는 AO-37을 기초로 한다. 대전방지제는 정전기를 소멸시켜 스파킹을 차단한다. 활성 성분으로서 다이노닐나프틸설폰산(dinonylnaphthylsulfonic acid, DINNSA)을 갖는 Stadis 450이 하나의 예이다. 부식 억제제, 예를 들어, DCI-4A는 대중 및 군사 연료용으로 사용되고 DCI-6A는 군사 연료용으로 사용된다. FSII 제제는 예를 들어, Di-EGME를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 제트 연료는 기존의 제트 연료와 조류 연료를 배합하는 것에 의해 제조된다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질은 공급원료서 작용하여 제트 연료를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 제트 연료를 제조하는 방법이 제공된다. 이와 함께 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질로부터 제트 연료를 제조하는 2가지 방법으로서 유동 촉매 크랙킹(fluid catalytic cracking, FCC); 및 수소탈산소화(hydrodeoxygenation, HDO)가 제공된다.
유동 촉매 크랙킹(FCC)은 중질 분획물 기원의 올레핀, 특히 프로필렌을 제조하기 위해 사용되는 하나의 방법이다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질은 올레핀으로 전환할 수 있다. 상기 방법은 FCC 영역을 통해 생성된 지질을 유동시키고 제트 연료로서 유용한 올레핀으로 구성된 생성물 스트림을 수거함을 포함한다. 생성된 지질은 크랙킹 조건에서 크랙킹 촉매와 접촉시켜 제트 연료로서 유용한 올레핀 및 탄화수소를 포함하는 생성물 스트림을 제공한다.
한 실시형태에서, 제트 연료를 제조하는 방법은 (a) 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 지질 함유 미생물을 배양하는 단계, (b) 지질 함유 미생물을 용해시켜 용해물을 생성하고, (c) 용해물로부터 지질을 분리하는 단계, (d) 지질 조성물을 처리함으로써 제트 연료를 생성하는 단계를 포함한다. 제트 연료를 제조하는 방법의 한 실시형태에서, 상기 지질조성물은 유체 촉매 크랙킹 영역을 통류할 수 있고 이는 하나의 양태에서 지질 조성물을 크랙킹 조건에서 크랙킹 촉매와 접촉시켜 C2-C5 올레핀을 포함하는 생성물을 제공하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법의 특정 양태에서, 지질 조성물에 존재할 수 있는 임의의 오염물을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 유체 촉매 크랙킹 영역을 통해 지질 조성물을 유동시키기 전에, 지질 조성물을 전처리한다. 전처리는 지질 조성물을 이온 교환 수지와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이온 교환 수지는 산성 이온 교환 수지, 예를 들어 Amberlyst(상표명)-15이고 지질 조성물이 통류(상향 통류 또는 하향 통류)하는 반응기 내 상으로서 사용될 수 있다. 다른 전처리는 액체 조성물을 산, 예를 들어, 황산, 아세트산, 질산 또는 염산과 접촉시킴에 의한 약산 세척을 포함할 수 있다. 접촉은 일반적으로 주위 온도 및 대기압에서 희석 산 용액과 수행된다.
임의로 전처리된 지질 조성물은 탄화수소 성분이 올레핀으로 크랙킹되는 FCC 영역으로 유동한다. 촉매 크랙킹은 반응 영역중의 지질 조성물을 미분된 미립자 물질로 구성된 촉매와 접촉시킴에 의해 달성한다. 상기 반응은 수소 크랙킹과는 반대로 촉매 크랙킹이고 부가되는 수소의 부재 또는 수소의 소비에서 수행한다. 크랙킹 반응이 진행함으로써 상당한 양의 코크가 촉매상에 침착된다. 상기 촉매는 재생 영역에서 촉매 기원의 코크를 연소시킴에 의해 고온에서 재생된다. 본 명세서에서, "코크 촉매"로서 언급되는 코크 함유 촉매는 반응 영역으로부터 재생될 재생 영역으로 연속으로 수송되고 재생 영역 기원의 필수적 코크 부재의 재생된 촉매에 의해 대체된다. 다양한 가스 스트림에 의한 촉매 입자의 유동화는 반응 영역과 재생 영역간에 촉매의 수송을 허용한다. 촉매의 유동화 스트림에서 본 명세서에 기재된 지질 조성물의 탄화수소와 같은 탄화수소를 크랙킹하고, 반응 영역 및 재생 영역간에 촉매를 수송하고 재생기내 코크를 연소시키는 방법은 FCC 방법 기술 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다. C2-C5 올레핀을 제조하기 위해 지질 조성물을 크랙킹하는데 유용한 예시적인 FCC 적용 및 촉매는 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된 미국 특허 제6,538,169호 및 제7,288,685호에 기재되어 있다.
적합한 FCC 촉매는 일반적으로 동일한 매트릭스에 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 2개 이상의 성분을 포함한다. 몇몇 양태에서, 2개의 성분 둘 다는 전체 반응 용기를 거쳐 순환할 수 있다. 제1 성분은 일반적으로 유동화된 촉매 크랙킹의 분야에 사용되는 임의의 널리 공지된 촉매를 포함하고, 예를 들어, 활성 무정형 점토형 촉매 및/또는 고활성의 결정 분자체가 있다. 분자체 촉매는 목적하는 생성물에 대한 이의 매우 개선된 선택성 때문에 무정형 촉매 보다 바람직할 수 있다. 몇몇 바람직한 양태에서, 제올라이트는 FCC 공정에서 분자체로서 사용할 수 있다. 바람직하게, 제1 촉매 성분은 실리카 또는 알루미나 및 카올린과 같은 불활성 충전제를 포함하는, 대형 공극 제올라이트, 예를 들어, Y형 제올라이트, 활성 알루미나 물질, 결합제 물질을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 지질 조성물의 크랙킹은 FCC 영역의 상위 부문 또는 리프트 부문에서 발생한다. 상기 지질 조성물은 노즐에 의해 상부로 도입되어 지질 조성물의 신속한 증발을 유도한다. 촉매와 접촉시키기 전에, 상기 지질 조성물은 통상적으로 약 149℃ 내지 약 316℃(300℉ 내지 600℉)의 온도를 갖는다. 상기 촉매는 배합 용기로부터 상부로 유동하며, 여기서 이것은 약 2초 이하의 시간 동안 지질 조성물과 접촉한다.
배합된 촉매 및 반응된 지질 조성물 증기는 이어서 출구를 통해 상부로부터 배출되고 올레핀, 및 상당한 양의 코크로 덮여지고 일반적으로 "코크된 촉매"로 언급되는 촉매 입자의 수거물을 포함하는 크랙킹된 생성물 증기로 분리된다. 목적하는 생성물이 바람직하지 못한 다른 생성물로 추가로 전환되는 것을 촉진시킬 수 있는, 지질 조성물과 촉매의 접촉시간을 최소화하기 위한 일환으로 스월 암 정렬 장치(swirl arm arrangement)와 같은 임의의 정렬된 분리기를 사용하여 생성물 스트림으로부터 신속하게 코크된 촉매를 제거할 수 있다. 분리기, 예를 들어, 스월 암 분리기는 챔버의 하한부에 위치한 스트립핑 영역(stripping zone)과 함께 챔버의 챔버의 상한부에 위치한다. 스월 암 정렬 장치에 의해 분리된 촉매는 스트립핑 영역으로 적가된다. 가벼운 올레핀 및 몇몇 촉매를 포함하는 크랙킹된 탄화수소를 포함하는 크랙킹된 생성물 증기는 사이클론과 소통하는 도관을 통해 챔버로부터 배출된다. 상기 사이클론은 생성물 증기로부터 잔류 촉매 입자를 제거하여 입자 농도를 매우 낮은 수준으로 감소시킨다. 이어서 상기 생성물 증기는 분리 용기의 상부를 상부로부터 배출된다. 사이클론에 의해 분리된 촉매는 분리 용기에 이어서 스트립팅 영역으로 복귀한다. 스트립핑 영역은 증기와의 역류 접촉에 의해 촉매 표면으로터 흡착된 탄화수소를 제거한다.
낮은 탄화수소 분압은 가벼운 올레핀이 우선적으로 생성되도록 작용한다. 따라서, 상부압은 약 172 내지 241 kPa(25 내지 35 psia)로 설정되고 탄화수소 분압은 약 35 내지 172 kPa(5 내지 25 psia)이고 바람직한 탄화 수소 분압은 약 69 내지 138 kPa(10 내지 20 psia)이다. 탄화수소에 대한 상대적 낮은 분압은 희석제가 지질 조성물의 10중량% 내지 55중량% 및 바람직하게는 지질 조성물의 약 15중량% 정도인 희석제로서 증기를 사용함에 의해 달성된다. 다른 희석제, 예를 들어, 무수 가스를 사용하여 등가의 탄화수소 분압에 도달할 수 있도록 할 수 있다.
상부 출구에서 크랙킹된 증기의 온도는 약 510℃ 내지 621℃ (950℉ 내지 1150℉)이다. 그러나, 566℃(1050℉) 초과의 상부 출구 온도는 보다 무수의 가스 및 더 많은 올레핀을 생성시킨다. 반면에, 566℃(1050℉) 미만의 상부 출구 온도는 에틸렌 및 프로필렌을 적게 생성시킨다. 따라서, 약 566℃ 내지 약 630℃의 바람직한 온도, 약 138 kPa 내지 약 240 kPa (20 내지 35 psia)의 바람직한 압력에서 FCC 공정을 수행하는 것이 바람직하다. 상기 공정의 또 다른 조건은 약 5 내지 약 20 및 바람직하게는 약 10 내지 약 15로 다양할 수 있는 지질 조성물에 대한 촉매 비이다.
제트 연료를 생성하는 방법의 하나의 양태에서, 상기 지절 조성물은 FCC 반응기의 리프트 부문으로 도입된다. 리프트 부문에서 온도는 매우 고온이고 약 700℃(1292℉) 내지 약 760℃ (1400℉)의 범위이고 지질 조성물에 대한 촉매의 비율은 약 100 내지 약 150이다. 이것은 지질 조성물의 리프트 부문으로의 도입이 상당한 양의 프로필렌 및 에틸렌을 생성할 것으로 예상된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 지질 조성물 또는 지질을 사용하여 제트 연료를 생성시키는 방법의 또 다른 양태에서, 지질 조성물 또는 지질의 구조는 수소탈산소화(HDO)로 언급되는 공정에 의해 파괴된다. HDO는 수소에 의한 산소의 제거를 의미하는데, 즉 산소는 물질의 구조를 파괴시키면서 제거된다. 올레핀 이중 결합을 수소화시키고 임의의 황 및 질소 화합물을 제거한다. 황 제거는 소위 수소탈황화(hydrodesulphurization, HDS)로 불린다. 원료(지질 조성물 또는 지질)의 전처리 및 순도는 촉매의 작용 수명에 기여한다.
일반적으로, HDO/HDS 단계에서, 수소는 공급 스톡(지질 조성물 또는 지질)과 혼합하고 이어서 상기 혼합물을 단일상 또는 2개 상 공급 스톡으로서 동시 유류물로서 촉매상에 통과시킨다. HDO/HDS 단계 후, 생성물 분획을 분리하고 별도의 이성질체화 반응기에 통과시킨다. 생물학적 출발 물질용 이성질체화 반응기는 동시 유류 반응기로서 문헌(FI 100 248)에 기재되어 있다.
탄화수소 공급물, 예를 들어, 본 명세서에서의 지질 조성물 또는 지질을 수소화시키는 단계에 의한 연료의 제조 방법은 또한 지질 조성물 또는 지질을 동시 유류물로서 제1 수소화 영역을 통해 수소 가스와 함께 통과시킴으로써 수행될 수 있고 이후 탄화수소 유출물은, 수소 가스를 탄화수소 유출물과는 반대로 역류 유동물로서 제2 수소화 영역에 통과시킴으로써 제2 수소화 영역에서 추가로 수소화시킨다. 지질 조성물을 크랙킹하여 C2-C5 올레핀을 제조하는데 유용한 예시적인 HDO 적용 및 용매는 전문이 본 명세서에 참조로서 인용되는 미국 특허 제7,232,935호에 기재되어 있다.
전형적으로, 수소탈산소화 단계에서, 본 명세서에서의 지질 조성물 또는 지질과 같은 생물학적 성분의 구조는 산소, 질소, 인 및 황 화합물로 분해되고 가스로서의 가벼운 탄화수소가 제거되며 올레핀 결합은 수소화된다. 상기 방법의 제2 단계에서, 즉 소위 이성질체화와 단계에서, 이성질체화는 낮은 온도에서 탄화수소 쇄를 측쇄화하고 파라핀의 수행능을 개선시키는 단계에 의해 수행된다.
제1 단계, 즉 크랙킹 공정의 HDO 단계에서 수소 가스, 및 수소화되어야만 하는 본 명세서의 지질 조성물 또는 지질은 HDO 촉매상 시스템에 동시 유류물로서 또는 역류물로서 통과시키고 상기 촉매상 시스템은 하나 이상의 촉매상, 바람직하게 1 내지 3개의 촉매상을 포함한다. HDO 단계는 전형적으로 동시 유류 방식으로 작동한다. 2개 이상의 촉매상을 포함하는 HDO 촉매상 시스템의 경우에, 상기 상 중 하나 이상은 역류물 원칙을 사용하여 작동할 수 있다. HDO 단계에서, 압력은 20 내지 150 bar, 바람직하게는 50 내지 100 bar로 다양하고 온도는 200 내지 500℃, 바람직하게는 300 내지 400℃로 다양하다. HDO 단계에서, 원소 주기율표의 VII 족 및/또는 VIB족 금속을 함유하는 공지된 수소화 촉매가 사용될 수 있다. 바람직하게, 수소화 촉매는 지지된 Pd, Pt, Ni, NiMo 또는 CoMo 촉매이고, 상기 지지체는 알루미나 및/또는 실리카이다. 전형적으로, NiMo/Al2O3 및 CoMo/Al2O3 촉매가 사용된다.
HDO 단계 전에, 본 명세서에서 지질 조성물 또는 지질은 임의로 보다 온화한 조건하에서 예비수소화로 처리하여 이중결합의 부반응을 회피할 수 있다. 상기 예비수소화는 50 내지 400℃의 온도 및 1 내지 200 바의 수소 압력, 바람직하게는 150 내지 250℃의 온도 및 10 내지 100 바의 수소 압력에서 수행한다. 상기 촉매는 원소주기율표의 VIII족 및/또는 VIB족 기원의 금속을 함유할 수 있다. 바람직하게, 예비소화 촉매는 지지된 Pd, Pt, Ni, NiMo 또는 CoMo 촉매이고 상기 지지체는 알루미나 및/또는 실리카이다.
수소를 함유하는 HDO 단계 기원의 가스 기류를 냉각시킴에 이어서 일산화탄소, 이산화탄소, 질소, 인 및 황 화합물, 가벼운 가스 탄화수소 및 다른 불순물을 이로부터 제거한다. 압착시킨 후 정제된 수소 또는 재활용된 수소를 제1 촉매상으로 및/또는 촉매상 사이로 복귀시켜 인출된 기류를 구성하도록 한다. 물은 축합 액체로부터 제거한다. 상기 액체는 제1 촉매상 또는 촉매상 사이로 통과시킨다.
HDO 단계 후, 생성물은 이성질체화 단계에 적용한다. 이것은 탄화수소를 이성질체화 촉매와 접촉시키기전에 불순물을 가능한 완전히 제거하는 공정을 위해 필요하다. 상기 이성질체화 단계는 임의의 교반 단계를 포함하고, 이때, HDO 단계 기원의 반응 생성물은 수증기 또는 가벼운 탄화수소, 질소 또는 수소와 같은 적합한 가스 증기를 스트립핑함으로써 정제될 수 있다. 임의의 스트립핑 단계는 이성질체화 촉매의 상부 유닛에서 역류 방식(여기서, 여기서, 가스 및 액체는 서로 접촉한다)으로 수행되거나 역류 원칙을 사용하는 별도의 스트립핑 유닛 역류 원리에서 실제 이성질체화 반응기 전에 수행한다.
스트립핑 단계 후, 수소 가스 및 본 명세서에서의 수소화된 지질 조성물 또는 지질 및 n-파라핀 혼합물을 하나 이상의 촉매상(들)을 포함하는 반응성 이성질체화 유닛에 통과시킨다. 이성질체화 단계의 촉매상은 동시 유류 또는 역류 방식으로 작동할 수 있다.
역류 원리가 이성질체화 단계에 적용되는 것은 상기 공정을 위해 중요하다. 이성화체 단계에서, 이것은 임의의 스트립핑 단계 또는 이성질체화 반응 단계 중 하나 또는 둘 다를 역류 방식으로 진행하는 것으로 수행한다. 이성질체화 단계에서, 압력은 20 내지 150 bar, 바람직하게는 20 내지 100 bar로 다양하고, 온도는 200 내지 500℃, 바람직하게는 300 내지 400℃이다. 이성질체화 단계에서, 당업계에 공지된 이성질체화 촉매가 사용될 수 있다. 적합한 이성질체화 촉매는 분자체 및/또는 VII족 금속 및/또는 운반체를 함유한다. 바람직하게, 이성질체화 촉매는 SAPO-11 또는 SAPO41 또는 ZSM-22 또는 ZSM-23 또는 페리어라이트(ferrierite) 및 Pt, Pd 또는 Ni 및 Al2O3 또는 SiO2를 함유한다. 전형적인 이성질체화 촉매는 예를 들어, Pt/S APO-11/Al2O3, Pt/ZSM-22/Al2O3, Pt/ZSM-23/Al2O3 및 Pt/SAPO-11/SiO2이다. 이성질체화 단계 및 HDO 단계는 동일한 압력 용기 또는 별도의 압력 용기에서 수행할 수 있다. 임의의 예비수소화는 별도의 압력 용기 또는 HDO 및 이성질체화 단계와 동일한 압력 용기에서 수행할 수 있다.
따라서, 한 실시형태에서, 하나 이상의 화학 반응의 생성물은 HRJ-5를 포함하는 알칸 혼합물이다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 화학적 반응 생성물은 ASTM D1655 제트 연료를 포함하는 알칸 혼합물이다. 일부 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부 항목을 준수하는 조성물은 10 ppm 미만의 황 함량을 갖는다. 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 205℃ 미만의 증기 곡선의 T10값을 갖는다. 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 300℃ 미만의 최종 비점(FBP)을 갖는다. 또 다른 양태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 38℃ 이상의 인화점을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 염료의 세부항목을 준수하는 조성물은 775K/M3 내지 840K/M3의 밀도를 갖는다. 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 -47℃ 미만의 빙점을 갖는다. 다른 양태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 42.8 MJ/K 이상의 총 연소열을 갖는다. 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 13.4 질량% 이상의 수소 함량을 갖는다. 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 Hg의 3㎜ 미만인, 260℃에서의 정량적 정량적 중량 JFTOT에 의한 시험시 열 안정성을 갖는다. 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 7㎎/㎗ 미만인 실제 검을 갖는다.
따라서, 본 발명은 미세조류 지질의 화학적 변형으로 다양한 산업적 및 다른 적용 분야에 유용한 생성물을 수득하는 다양한 방법을 기재하고 있다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 오일을 변형시키는 방법의 예는 오일 가수분해, 오일의 수소화처리 및 오일의 에스터화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 미세조류 지질의 다른 화학적 변헝은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 에폭시화, 산화, 가수분해, 황산화, 술폰산화, 에톡실화, 프로폭실화, 아미드화 및 비누화를 포함한다. 미세조류 오일의 변형은 기본 함유화학물질을 생성하고 이는 추가로 목적하는 기능을 위해 선택된 유도체 함유화학물질로 변형시킬 수 있다. 연료 생성 공정과 관련하여 상기된 것과 유사한 방식으로, 이들 화학적 변형은 또한 본 명세서에 기재된 미생물 배양으로부터 생성된 오일상에서 수행할 수 있다. 기본 함유화학물질의 예는 비누, 지방산, 지방 에스터, 지방 알코올, 지방 질소 화합물, 지방산 메틸 에스터 및 글라이세롤을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유도체 함유화학물질의 예는 지방 니트릴, 에스터, 이량체 산, 쿠아트(quat), 계면활성제, 지방 알칸올아마이드, 지방 알코올 설페이트, 수지, 유화제, 지방 알코올, 올레핀, 굴착 이수, 폴리올, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트, 고무, 양초, 화장품, 금속성 비누, 비누, 알파-설폰화된 메틸 에스터, 지방 알코올 설페이트, 지방 알코올 에톡실레이트, 지방 알코올 에터 설페이트,이미다졸린, 계면활성제, 세정제, 에스터, 쿠아트, 오존분해 생성물, 지방 아민, 지방 알칸올아마이드, 에톡시설페이트, 모노글라이세라이드, 다이글라이세라이드, 트라이글라이세라이드(중간쇄 트라이글라이세라이드를 포함), 윤활제, 작동유, 그리스, 유전성 유체, 이형제, 금속가공유제, 열전달유체, 기타 기능성 유체, 산업적 화학물질(예를 들어 세정제, 텍스타일 가공 보조제, 가소제, 안정제, 첨가제), 표면 코팅, 페인트 및 라커, 전기 배선 절연 및 고급 알칸을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 글라이세로지질 기원의 지방산 성분의 가수분해는 다른 유용한 화학물질을 생성하도록 유도체화될 수 있는 유리된 지방산을 생성시킨다. 가수분해는 산 또는 염기일 수 있는 물 및 촉매의 존재 하에 수행한다. 유리된 지방산을 유도체화하여 다음에 보고되는 바와 같은 다양한 생성물을 수득할 수 있다: 미국특허 제5,304,664호(고도로 황화된 지방산); 제7,262,158호(세정 조성물); 제7,115,173호(직물 연화 조성물); 제6,342,208호(피부 처리용 에멀젼); 제7,264,886호(방수 조성물); 제6,924,333호(페인트 첨가제); 제6,596,768호 (지질 풍부 반추동물 공급원료); 및 제6,380,410호(세제 및 세정제용 계면활성제).
본 발명의 하나의 양태에서 가수분해와 관련하여 트라이글라이세라이드 오일은 임의로 먼저 물 또는 수산화나트륨과 같은 액체 매질 중에서 가수분해하여 글라이세롤 및 비누를 수득한다. 다양한 적합한 트라이글라이세라이드 가수분해 방법이 있고 여기에는 비누화, 산 가수분해, 알칼린 가수분해, 효소 가수분해(본 명세서에서 분할으로서 언급됨), 및 고온 압착수를 사용한 가수분해가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 당업자는 트라이글라이세라이드 오일이 함유화학물질을 생성하기 위해 가수분해될 필요가 없고 차라리 상기 오일이 다른 공지된 방법에 의해 목적하는 함유화학물질로 직접 전환될 수 있다. 예를 들어, 트라이글라이세라이드 오일은 에스터화를 통해 메틸 에스터 지방산으로 직접 전환될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 오일의 촉매 가수분해는 오일을 글라이세롤 및 지방산으로 분리시킴으로써 발생한다. 상기 논의된 바와 같이, 지방산은 이어서 여러 다른 변형을 통해 수득된 유도체 함유화학물질로 추가로 가공될 수 있다. 예를 들어 한 실시형태에서, 지방산은 아민화 반응하도록 진행시켜 지방 질소 화합물을 생성할 수 있다. 다른 실시형태에서, 지방산은 일염기성 및 이염기성 산을 생성하도록 오존용해에 적용될 수 있다.
다른 양태에서, 가수분해는 오일 분리를 통해 발생하여 함유화학물질을 생성할 수 있다. 본 발명의 몇몇 바람직한 양태에서, 트라이글라이세라이드 오일은 다른 공정을 수행하기 전에 분리될 수 있다. 당업자는 많은 적합한 트라이글라이세라이드 분리 방법이 존재한다는 것을 인지할 수 있고 상기 방법은 효소 분리 및 압력 분리를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 효소적 오일 분리 방법은 물/오일 혼합물에 대해 작용하는 생촉매로서 효소인 리파제를 사용한다. 효소적 분리는 그 다음에 오일 또는 지방을 글라이세롤 및 유리된 지방산으로 분리한다. 상기 글라이세롤은 수층으로 이동하는 반면 상기 유기층에는 유리된 지방산이 풍부해진다.
효소 분할 반응은 일반적으로 유기 및 수성 상간의 경계상에서 일어나고 여기서 효소는 단지 경계상에 존재한다. 이어서 경계상과 만나는 트라이글라이세라이드는 분리 반응에 기여하거나 이에 관여한다. 반응이 진행됨에 따라, 유리된 지방산과는 대조적으로 여전히 글라이세라이드로 화학적으로 결합되어 있는 지방산의 작업 밀도 또는 농도는 경계상에서 감소하여 반응은 느려진다. 특정 양태에서, 효소 분할은 실온에서 일어날 수 있다. 당업자는 오일을 원하는 지방산으로 분리시키는데 적합한 조건에 정통하고 있다.
예로서, 반응 속도는 상호 경계 표면을 증가시키는 것으로 가속화될 수 있다. 일단 반응이 완료되면, 유리된 지방산을 이어서 효소로부터 유리된 유기상으로부터 분리하고 글라이세라이드로 여전히 화학적으로 결합되어 있는 지방산을 함유하는 잔사는 역 공급되거나 재활용되고 새로운 오일 또는 지방과 혼합되어 분리방법에 적용시킨다. 이어서 상기 방식으로 재활용된 글라이세라이드는 추가의 효소적 분할 방법에 적용된다. 몇몇 양태에서, 유리된 지방산은 상기 방식으로 부분적으로 분리된 오일 또는 지방으로부터 추출된다. 상기 방식으로, 화학적으로 결합된 지방산(트라이글라이세라이드)이 분리 공정으로 복귀하거나 역 공급되는 경우 효소 소비는 급격히 감소할 수 있다.
분할 정도는 측정된 산 값을, 소정의 오일 또는 지방에 대해 계산될 수 있는 이론적으로 가능한 산 값으로 나눈 비율로서 결정한다. 바람직하게, 산 값은 표준 일반 방법에 따른 적정을 사용하여 측정한다. 또한, 수성 글라이세롤 상의 밀도는 분리 정도에 대한 척도로서 취할 수 있다.
한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 분리 방법은 또한 생성된 오일의 알칼리 정련 공정 기원의 소위 비누-스톡에 함유된 모노-, 다이- 및 트라이글라이세라이드에 적합하다. 상기 방식으로, 비누 스톡은 사전 비누화 없이 천연 오일의 지방산으로 정량적으로 전환될 수 있다. 상기 목적을 위해, 비누에 화학적으로 결합된 지방산을 바람직하게는 분리 전에 산의 부가를 통해 방출시킨다. 특정 양태에서, 완충제은 분할 공정을 위한 물 및 효소에 추가로 사용된다.
한 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 생성된 오일은 또한 가수분해 방법으로서 비누화에 적용될 수 있다. 동물성 및 식물성 오일은 트라이하이드릭 알코올인 글라이세롤과 지방산의 에스터인 트라이아실글라이세롤(TAG)로 이루어진다. 알칼린 가수분해 반응에서, TAG내 글라이세롤이 제거되어 3개의 카복실산 음이온이 생성되고 이는 나트륨 또는 칼륨과 같은 알칼리 금속 양이온과 연합하여 지방산 염을 생성할 수 있다. 상기 기획에서, 카복실산 성분들은 글라이세롤 잔기로부터 절단되고 하이드록실 그룹으로 대체된다. 상기 반응에 사용되는 염기(예를 들어, KOH)의 양은 목적하는 비누화 정도에 의해 측정된다. 예를 들어, 상기 목적이 본래 TAG 조성물중에 존재하는 오일의 일부를 포함하는 생성물을 제조하기 위한 것인 경우, 모든 TAG를 지방산 염으로 전환시키기에 불충한 양의 염기가 반응 혼합물로 도입된다. 통상적으로, 상기 반응은 수용액중에 수행하여 서서히 진행시키지만 가열에 의해 촉진될 수 있다. 지방산 염의 침전은 수용성 알칼리 금속 할라이드(예를 들어, NaCl 또는 KCl)와 같은 염을 반응 혼합물에 부가하여 촉진될 수 있다. 바람직하게, 상기 염기는 알칼리 금속 수산화물(예를 들어, NaOH 또는 KOH)이다. 대안으로, 예를 들어 트라이에탄올아민 및 아미노메틸프로판올을 포함하는 알칸올아민과 같은 다른 염기가 상기 반응 계획에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 이들 대안은 투명한 비누 생성물을 제조하는데 바람직할 수 있다. 한 실시형태에서 비누화되는 지질 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 탤로 모방체(즉, 탤로와 유사한 지질 조성물), 또는 탤로 모방체와 다른 트라이글라이세라이드 오일의 배합물이다.
몇몇 방법에서, 화학적 변형의 제1 단계는 수소 및 촉매의 존재 하에 승온에서 이중 결합을 포화시키기 위한 수소화처리 후에 탈산소화하는 것이다. 다른 방법에서, 수소화 및 탈산소화는 동일한 반응중에서 일어날 수 있다. 여전히 다른 방법에서, 탈산소화는 수소화 전에 발생한다. 이어서 이성질체화는 또한 수소 및 촉매의 존재 하에서 임의로 수행할 수 있다. 최종적으로, 가스 및 나프타 성분은 경우에 따라 제거할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,475,160호(트라이글라이세라이드의 수소화); 제5,091,116호(탈산소화, 수소화 및 가스 제거); 제6,391,815호(수소화); 및 제5,888,947호(이성질체화)를 참조한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 트라이글라이세라이드 오일은 부분적으로 또는 완전히 탈산소화된다. 탈산소화 반응은 지방산, 지방 알코올, 폴리올, 케톤 및 알데하이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 원하는 생성물을 생성시킨다. 일반적으로, 임의의 특정 이온에 구애되지 않고 탈산소화 반응은, 지방산 또는 지방산 에스터로부터 산소를 적어도 부분적으로 제거하여 추가의 공정에 의해 목적하는 화학물질로 용이하게 전환될 수 있는 지방 알코올과 같은 반응 생성물을 생성시키는 반응으로서, 제한 없이 수소용해, 수소생성, 연속 수소화-수소용해, 연속 수소용해-수소화 및 조합된 수소화-수소용해 반응을 포함하는 다양하고 상이한 반응 경로의 조합을 포함한다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 지방 알코올은 FCC 반응을 통해 올레핀으로 또는 축합 반응을 통해 고급 알칸으로 전환될 수 있다.
하나의 상기 화학적 변형은 글라이세로지질 또는 유리 지방산의 지방산 성분에서 이중 결합으로 수소를 첨가하는 수소화이다. 수소화 반응으로 액체 오일은 특정 응용을 위해 보다 적합할 수 있는 반고체 또는 고체 지질로 전환될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 오일의 수소화는 하기에 보고된 바와 같이 본 명세서에 제공된 방법 및/또는 재료 중 하나 이상과 연계하여 수행할 수 있다: 미국 특허 제7,288,278호 (식품 첨가제 또는 의약); 제5,346,724호(윤활 생성물); 제5,475,160호(지방 알코올); 제5,091,116호(식용 오일); 제6,808,737호(마가린 및 스프레드용 구조적 지방); 제5,298,637호(감소된 칼로리 지방 대용물); 제6,391,815호(수소화 촉매 및 황 흡착제); 제5,233,099호 및 제5,233,100호(지방 알코올); 제4,584,139호(수소화 촉매); 제6,057,375호(소포제); 및 제7,118,773호(식용 에멀젼 스프레드).
당업자는 탄수화물을 수소화시키기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 하나의 적합한 방법은 수소화 반응기에서 수소화된 생성물을 형성하기 위해 충분한 조건하에서 적합한 가스 및 촉매와 혼합된 수소, 또는 수소와 탄수화물을 접촉시키는 단계를 포함한다. 수소화 촉매는 일반적으로 단독으로, 또는 W, Mo, Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, B, P, Bi, 및 합금 또는 이의 조합체와 같은 촉진제와 함께 Cu, Re, Ni, Fe, Co, Ru, Pd, Rh, Pt, Os, Ir, 및 합금 또는 이의 조합체를 포함할 수 있다. 다른 효과적인 수소화 촉매 물질은 지지된 니켈 또는 레늄으로 변형된 루테늄을 포함한다. 하나의 양태에서, 수소화 촉매는 또한 촉매의 목적하는 기능성에 따라, 지지체 중 임의의 하나를 포함한다. 수소화 촉매는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.
일부 실시형태에서, 수소화 촉매는 지지된 VIII족 금속 촉매 및 금속 스폰지 물질(예를 들어, 스폰지 니켈 촉매)을 포함한다. 라니 니켈은 본 발명에 사용하기에 적합한 활성화된 스폰지 니켈 촉매의 예를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명의 수소화 반응은 니켈-레늄 촉매 또는 텅스텐-변형된 니켈 촉매를 포함하는 촉매를 사용하여 수행한다. 본 발명의 수소화 반응을 위해 적합한 촉매의 예는 탄소 지지된 니켈-레늄 촉매이다.
하나의 양태에서, 적합한 라니 니켈 촉매는 예를 들어, 약 25중량%의 수산화나트륨을 함유하는 알칼리 수용액으로 대략 균등 중량의 니켈 및 알루미늄의 합금을 처리함에 의해 제조할 수 있다. 상기 알루미늄은 선택적으로 알칼리 수용액에 의해 용해되어 알루미늄이 최소량인 대부분 니켈을 포함하는 스폰지형 물질을 수득한다. 초기 합금은 약 1 내지 2중량%가 형성된 스폰지 니켈 촉매중에 잔류하도록 하는 양으로 촉진제 금속(즉, 몰리브덴 또는 크로뮴)을 포함한다. 또 다른 양태에서, 수소화 촉매는 물중에서 루테늄(III) 니트로실니트레이트, 루테늄(III) 클로라이드의 용액을 사용하여 적합한 지지체 물질을 침지시키기 위해 제조한다. 이어서 상기 용액을 건조시켜 수분 함량이 약 1중량% 미만인 고체를 형성한다. 상기 고체는 이어서 4시간 동안 회전볼 로내 300℃(하소되지 않음) 또는 400℃(하소됨)에서 수소 스트림 중에 대기압으로 감소시킬 수 있다. 촉매를 냉각시키고 질소로 촉매가 불활성이도록 한 후, 질소 중에 5 부피%의 산소를 2시간 동안 촉매 상에 통과시킨다.
특정 양태에서, 본 명세서에 기재된 촉매는 촉매 지지체를 포함한다. 상기 촉매 지지체는 촉매를 안정화시키고 지지한다. 사용되는 촉매 지지체의 유형은 선택된 촉매 및 반응 조건에 따라 다양하다. 본 발명에 적합한 지지체는 탄소, 실리카, 실리카-알루미나, 지르코니아, 티타니아, 세리아, 바나디아, 질화물, 질화붕소, 헤테로폴리산, 하이드록시애퍼타이트, 산화아연, 크로미아, 제올라이트, 탄소 나노튜브, 탄소 플러렌 및 이들의 임의의 조합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용되는 촉매는 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 방법은 초기 습윤화, 증발 침지, 화학적 증착, 세척-피복, 마그네트론 스퍼터링 기술 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
수소화 반응을 수행하기 위한 조건은 출발 물질 및 원하는 생성물의 유형에 따라 다양하다. 당업자는 본 명세서의 이점과 함께 적당한 반응 조건을 인식할 것이다. 일반적으로, 수소화 반응은 80℃ 내지 250℃ 및 바람직하게는 90℃ 내지 200℃, 및 가장 바람직하게는 100℃ 내지 150℃의 온도에서 수행한다. 일부 실시형태에서, 수소화 반응은 500 KPa 내지 14000 KPa에서 수행한다.
본 발명의 수소용해 반응에 사용되는 수소는 외부 소수, 재활용된 수소, 동일계 생성 수소 및 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "외부 수소"는 바이오매스 반응 자체 기원이 아니고 또 다른 공급원으로부터 시스템에 첨가되는 수소를 언급한다.
본 발명의 몇몇 양태에서, 출발 탄수화물을, 목적하는 고급 탄화수소로 보다 용이하게 전환될 수 있는 소분자로 전환시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 전환을 위해 적합한 하나의 방법은 수소용해 반응을 통한 것이다. 다양한 방법이 탄수화물의 수소용해를 수행하기 위해 공지되어 있다. 하나의 적합한 방법은 소분자 또는 폴리올을 포함하는 반응 생성물을 형성하기에 충분한 조건하에서 수소용해 반응기내에서 적합한 가스 및 수소용해 촉매와 혼합된 수소, 또는 수소와 탄수화물을 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "소분자 또는 폴리올"은 출발 탄수화물보다 소수의 탄소 공급원자 또는 산소 원자를 포함할 수 있는, 소분자량을 갖는 임의의 분자를 포함한다. 하나의 양태에서, 반응 생성물은 폴리올 및 알코올을 포함하는 더 작은 분자를 포함한다. 당업자는 수소용해 반응을 수행하기 위한 적당한 방법을 선택할 수 있다
일부 실시형태에서, 5 및/또는 6개 탄소 당 또는 당 알코올은 수소용해 촉매를 사용하여 프로필렌 글라이콜, 에틸렌 글라이콜 및 글라이세롤로 전환될 수 있다. 수소용해 촉매는 단독으로 또는 Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, Bi, B, O, 및 이의 합금 또는 이의 조합체와 같은 촉진제와 함께 Cr, Mo, W, Re, Mn, Cu, Cd, Fe, Co, Ni, Pt, Pd, Rh, Ru, Ir, Os, 및 이의 합금 또는 조합체를 포함할 수 있다. 수소용해 촉매는 또한 전이 금속(예를 들어, 크로뮴, 몰리브덴, 텅스텐, 레늄, 망간, 구리, 카드뮴) 또는 VIII족 금속(예를 들어, 철, 코발트, 니켈, 백금, 팔라듐, 로듐, 루테늄, 이리듐 및 오스뮴)을 함유하는 탄소성 파이로중합체를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 수소용해 촉매는 알칼린 토금속 산화물과 배합되거나 촉매적 활성 지지체에 부착된 임의의 상기 금속을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 수소용해 반응에 기재된 촉매는 수소화 반응을 위해 상기된 바와 같은 촉매 지지체를 포함할 수 있다.
수소용해 반응을 수행하기 위한 조건은 출발 물질 및 목적하는 생성물의 유형에 따라 다양하다. 당업자는 본 명세서의 이득과 함께 반응을 수행하기 위해 사용하는 적당한 조건을 인지할 것이다. 일반적으로, 이들 수소용해 반응은 110℃ 내지 300℃ 및 바람직하게는 170℃ 내지 220℃, 및 가장 바람직하게는 200℃ 내지 225℃의 온도에서 수행한다. 일부 실시형태에서, 수소용해 반응은 염기성 조건, 바람직하게는 pH 8 내지 13, 및 보다 더 바람직하게는 pH 10 내지 12에서 수행한다. 일부 실시형태에서, 수소용해 반응은 60 KPa 내지 16500 KPa, 및 바람직하게는 1700KPa 내지 14000 KPa의 범위, 및 더 바람직하게는 4800 KPa 내지 11000 KPa의 압력에서 수행한다.
본 발명의 수소용해 반응에 사용되는 수소는 외부 수소, 재활용된 수소, 인시츄 생성 수소 및 이의 임의의 조합체를 포함할 수 있다.
몇몇 양태에서, 상기 논의된 반응 생성물은 축합 반응기에서 축합 반응을 통해 고급 탄화수소로 전환할 수 있다. 상기 양태에서, 반응 생성물의 축합은 고급 탄화수소를 형성할 수 있는 촉매의 존재 하에 수행한다. 본 이론에 의해 구속되지 않고, 고급 탄화수소의 생산은 탄소-탄소 또는 탄소-산소 결합의 형성을 포함하는 단계적 부가 반응을 통해 진행하는 것으로 믿어진다. 수득한 반응 생성물은 하기에 더 상세하게 기재되는 상기 잔기를 함유하는 임의의 수의 화합물을 포함한다.
특정 양태에서, 적합한 축합 촉매는 산 촉매, 염기 촉매 또는 산/염기 촉매를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "산/염기 촉매"는 산 및 염기 기능 둘 다를 갖는 촉매를 언급한다. 몇몇 양태에서, 상기 축합 촉매는 제한 없이, 제올라이트, 카바이드, 질화물, 지르코니아, 알루미나, 실리카, 알루미노실리케이트, 포스페이트, 산화티탄, 산화아연, 산화바나듐, 산화란탄, 산화이트륨, 산화스칸듐, 산화마그네슘, 산화세륨, 산화바륨, 산화칼슘, 수산화물, 헤테로폴리산, 무기산, 산 변형된 수지, 염기 변형된 수지 및 이들의 임의의 조합체를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 축합 촉매는 또한 변형제를 포함할 수 있다. 적합한 변형제는 La, Y, Sc, P, B, Bi, Li, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba, 및 이들의 임의의 조합체를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 축합 촉매는 또한 금속을 포함할 수 있다. 적합한 금속은 Cu, Ag, Au, Pt, Ni, Fe, Co, Ru, Zn, Cd, Ga, In, Rh, Pd, Ir, Re, Mn, Cr, Mo, W, Sn, Os, 합금 및 이들의 임의의 조합체를 포함한다.
특정 양태에서, 축합 반응에 기재된 촉매는 수소화 반응을 위해 상기된 바와 같은 촉매 지지체를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 축합 촉매는 자가 지지형이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "자가 지지형"은 촉매가 지지체로서 작용하기 위해 또 다른 물질을 필요로 하지 않는 것을 의미한다. 특정 양태에서, 상기 축합 촉매는 촉매를 현탁하기에 적합한 별도의 지지체와 함께 사용된다. 하나의 양태에서, 축합 촉매 지지체는 실리카이다.
응축 반응을 수행하는 조건은 출발 물질 및 목적하는 생성물의 유형에 따라 다양하다. 당업자는 본 명세서의 이점과 함께 반응을 수행하는 적당한 조건을 인지할 것이다. 몇몇 양태에서, 응축 반응은 제안된 반응에 대한 열역학이 선호될 수 있는 온도에서 수행한다. 응축 반응을 위한 온도는 특정 출발 폴리올 또는 알코올에 따라 다양하다. 일부 실시형태에서, 응축 반응을 위한 온도는 80℃ 내지 500℃ 및 바람직하게는 125℃ 내지 450℃ 및 가장 바람직하게는 125℃ 내지 250℃의 범위이다. 일부 실시형태에서, 응축 반응은 0 Kpa 내지 9000 KPa 범위, 및 바람직하게는 0 KPa 내지 7000 KPa 범위, 및 더욱더 바람직하게는 0 KPa 내지 5000 KPa 범위의 압력에서 수행한다.
본 발명에 의해 형성되는 고급 알칸은 4 내지 30개의 탄소 공급원자를 갖는 측쇄 또는 직쇄 알칸, 4 내지 30개의 탄소 공급원자를 갖는 측쇄 또는 직쇄 알켄, 5 내지 30개의 탄소 공급원자를 갖는 사이클로알칸, 5 내지 30개의 탄소 공급원자를 갖는 사이클로알켄, 아릴, 융합된 아릴, 알코올 및 케톤을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 알칸은 뷰탄, 펜탄, 펜텐, 2-메틸뷰탄, 헥산, 헥센, 2-메틸펜탄, 3-메틸펜탄, 2,2-디메틸뷰탄, 2,3-디메틸뷰탄, 헵탄, 헵텐, 옥탄, 옥텐, 2,2,4-트라이메틸펜탄, 2,3-디메틸헥산, 2,3,4-트라이메틸펜탄, 2,3-디메틸펜탄, 노난, 노넨, 데칸, 데센, 운데칸, 운데센, 도데칸, 도데센, 트라이데칸, 트라이데센, 테트라데칸, 테트라데센, 펜타데칸, 펜타데센, 노닐데칸, 노닐데센, 에이코산, 에이코센, 운데이코산, 운데이코센, 도에이코산, 도에이코센, 트라이에이코산, 트라이에이코센, 테트라에이코산, 테트라에이코센 및 이들의 이성질체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 생성물 중 일부는 연료용으로 적합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 비치환된다. 다른 양태에서, 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 1치환 된다. 여전히 또 다른 양태에서, 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 다치환된다. 치환된 사이클로알칸 및 사이클로알켄을 포함하는 양태에서, 치환된 그룹은 제한 없이, 1 내지 12개의 탄소 공급원자를 갖는 측쇄 또는 직쇄 알킬, 1 내지 12개의 탄소 공급원자를 갖는 측쇄 또는 직쇄 알킬렌, 페닐 및 이의 조합체를 포함한다. 적합한 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 사이클로펜탄, 사이클로펜텐, 사이클로헥산, 사이클로헥센, 메틸-사이클로펜탄, 메틸-사이클로펜텐, 에틸-사이클로펜탄, 에틸-사이클로펜텐, 에틸-사이클로헥산, 에틸-사이클로헥센, 이들의 이성질체 및 임의의 조합체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 형성된 아릴은 비치환된다. 또 다른 양태에서, 형성된 아릴은 1치환된다. 치환된 아릴을 포함하는 양태에서, 치환된 그룹은 제한없이 1 내지 12개의 탄소 공급원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬, 1 내지 12개의 탄소 공급원자를 갖는 측쇄 또는 직쇄의 알킬렌, 페닐, 및 이들의 임의의 조합체를 포함한다. 본 발명을 위해 적합한 아릴은 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸 벤젠, 파라실렌, 메타실렌 및 이들의 조합체를 포함한다.
본 발명에서 생성된 알코올은 4 내지 30개의 탄소 공급원자를 갖는다. 몇몇 양태에서, 알코올은 사이클릭이다. 다른 양태에서, 알코올은 측쇄이다. 또 다른 양태에서, 알코올은 직쇄이다. 본 발명의 적합한 알코올은 뷰탄올, 펜탄올, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, 운데칸올, 도데칸올, 트라이데칸올, 테트라데칸올, 펜타데칸올, 헥사데칸올, 헵틸데칸올, 옥틸데칸올, 노닐데칸올, 에이코산올, 우네이코산올, 도에이코산올, 트라이에이코산올, 테트라에이코산올 및 이들의 이성질체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 생성된 케톤은 4 내지 30개의 탄소 원자를 갖는다. 하나의 양태에서, 케톤은 사이클릭이다. 또 다른 양태에서, 상기 케톤은 측쇄이다. 또 다른 양태에서, 케톤은 직쇄이다. 본 발명을 위해 적합한 케톤은 뷰타논, 펜타논, 헥사논, 헵타논, 옥타논, 노나논, 데카논, 운데카논, 도데카논, 트라이데카논, 테트라데카논, 펜타데카논, 헥사데카논, 헵틸데카논, 옥틸데카논, 노닐데카논, 에이코사논, 우네이코사논, 도에이코사논, 트라이에이코사논, 테트라에이코사논, 및 이들의 이성질체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 상기 화학적 변형은 상호에스터화가다. 천연적으로 생성된 글라이세로지질은 지방산 성분의 균일한 분포를 갖지 않는다. 오일과 관련하여, 상호에스터화는 상이한 글라이세로지질의 2개의 에스터간의 아실 라디칼의 교환을 언급한다. 상호 에스터화 공정은 글라이세로지질의 혼합물의 지방산 성분이 재정렬되어 분포 패턴을 변형시킬 수 있는 메커니즘을 제공한다. 상호 에스터화는 널리 공지된 화학적 공정이고 일반적으로 알칼리 금속 또는 알칼리 금속 알킬레이트(예를 들어, 나트륨 메톡시드)와 같은 촉매의 존재 하에 일정 시간(예를 들어, 30분) 동안 오일의 혼합물을 가열(약 200℃로)하는 단계를 포함한다. 이러한 공정을 사용하여 오일 혼합물의 지방산 성분의 분포 패턴을 무작위화 할 수 있거나 원하는 분포 패턴을 생성하도록 할 수 있다. 지질의 화학적 변형에 대한 상기 방법은, 지질로서 건조 세포 중량%가 적어도 20%인 미생물 바이오매스와 같은 본 명세서에 제공된 물질에 대해 수행할 수 있다.
지방산의 특정 분포 패턴이 요구되는 직접적인 상호 에스터화는 존재할 수 있는 몇몇 TAG의 융점 미만의 온도에서 오일을 유지시킴에 의해 수행할 수 있다. 이것은 이들 TAG를 선택적으로 결정화하고 이는 이들의 결정화에 의해 반응 혼합물로부터 이들을 효과적으로 제거한다. 상기 방법은 예를 들어, 오일 중 대부분의 지방산이 침전할 때까지 계속할 수 있다. 지시된 상호 에스터화 방법은 예를 들어 장쇄 지방산의 단쇄 대응물로 치환을 통해 더 낮은 칼로리 함량을 갖는 생성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 직접적인 상호 에스터화는 또한 원치않는 트랜스 이성질체를 생성시킬 수 있는 수소화에 의지하는 것 없이 식품 부가물 또는 제품(예를 들어, 마가린)에서 요구되는 목적하는 융점 특성 및 구조적 특징을 제공할 수 있는 지방 혼합물을 갖는 생성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 오일의 상호에스터화는 하기에 보고된 바와 같이 방법 및/또는 물질 중 하나 이상과 연계하여 또는 생성물을 생성하기 위해 수행할 수 있다: 미국 특허 제6,080,853호(비분해성 지방 대용물); 제4,288,378호(피넛 버터 안정제); 제5,391,383호(식용 스프레이 오일); 제6,022,577호(식품 생성물에 대한 식용 지방); 제5,434,278호(식품 생성물에 대한 식용 지방);제 5,268,192호(저칼로리 너트 생성물); 제5,258,197호(감소된 칼로리의 식용 조성물); 제4,335,156호(식용 지방 생성물); 제7,288,278호(식품 부가물 또는 의약); 제7,115,760호(분획 방법); 제6,808,737호(구조적 지방); 제5,888,947호(엔진 윤활제); 제5,686,131호(식용 오일 혼합물); 및 제4,603,188호(경화성 우레탄 조성물).
본 발명에 따른 하나의 양태에서, 이어서 상기된 바와 같은 오일의 에스터결합전이는 미국 특허 제6,465,642호에 보고된 바와 같이 에스터결합전이된 생성물을 폴리올과 반응시켜 폴리올 지방산 폴리에스터를 생성시킨다. 상기 에스터화 및 포화 공정은 하기와 같은 단계를 포함할 수 있다: 저급 알킬 에스테를 비누의 존재 하에 폴리올과 반응시키는 단계; 생성물 혼합물로부터 잔여 비누를 제거하는 단계; 생성물 혼합물을 물 세척 및 건조시켜 불순물을 제거하는 단계; 정련을 위해 생성물 혼합물을 표백시키는 단계; 생성물 혼합물중에 폴리올 지방산 폴리에스터로부터 미반응된 저급 알킬 에스터의 적어도 일부를 분리하는 단계; 및 분리된 미반응된 저급 알킬 에스터를 재사용하는 단계.
에스터결합전이는 또한 미국 특허 제6,278,006호에 보고된 바와 같은 단쇄 지방산 에스테를 갖는 미생물 바이오매스상에서 수행할 수 있다. 일반적으로, 에스터결합전이는 단쇄 지방산 에스터를 적합한 촉매의 존재 하에 오일에 부가하고 혼합물을 가열시킴에 의해 수행할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 오일은 약 5중량% 내지 약 90중량%의 반응 혼합물을 포함한다. 몇몇 양태에서, 단쇄 지방산 에스터는 반응 혼합물의 약 10중량% 내지 약 50중량%일 수 있다. 촉매의 비제한적인 예는 염기 촉매, 나트륨 메톡사이드, 황산 및 산성화된 점토와 같은 무기산, 메탄 설폰산, 벤젠설폰산 및 톨루엔설폰산과 같은 유기산 및 Amberlyst 15와 같은 산성 수지를 포함하는 산 촉매를 포함한다. 나트륨 및 마그네슘과 같은 금속 및 금속 수소화물은 또한 유용한 촉매이다.
또 다른 당해 화학적 변형은 하이드록실화이고 이는 물을 이중 결합으로 부가하여 하이드록실 잔기의 포화 및 혼입을 유도한다. 상기 하이드록실화 공정은 글라이세로지질의 하나 이상의 지방산을 하이드록시 지방산으로 전환하기 위한 메커니즘을 제공한다. 하이드록실화는, 예를 들어 미국 특허 제5,576,027호에 보고된 바와 같은 방법을 통해 수행할 수 있다. 피마자 오일을 포함하는 하이드록실화된 지방산 및 이의 유도체는 식품 첨가제, 계면활성제, 안료 습윤제, 소포제, 방수 첨가제, 가소화제, 화장품 유화제 및/또는 탈취제를 포함하는 다수의 산업 응용 분야 및 전자, 약제, 페인트, 잉크, 접착제 및 윤활제에서 성분으로서 유용하다. 글라이세라이드의 하이드록실화가 수행되는 방법의 한 가지 예는 다음과 같다: 지방이 헵탄과 함께 바람직하게는 약 30 내지 50℃로 가열되고, 30분 이상 동안 그 온도에서 유지하며; 그 다음에 아세트산을 혼합물에 첨가한 후 황산 수용액, 과산화수소 수용액을 점진적 증가량으로 1시간 이상 동안 혼합물에 첨가하고; 수성 과산화수소 후에 온도를 이어서 약 60℃ 이상으로 증가시키고 6시간 이상 동안 교반하며; 교반 후 상기 혼합물이 침강하도록 두고, 반응에 의해 형성된 저급 수성 층을 제거하면서 반응에 의해 형성된 상부 헵탄층을 약 60℃의 온도를 갖는 고온수로 세척할 수 있고; 세척된 헵탄 층을 이어서 수산화칼륨 수용액을 사용하여 pH 약 5 내지 7로 중화시키고 이어서 진공 증류에 의해 제거할 수 있고; 반응 생성물을 이어서 100℃에서 진공 건조시킬 수 있고 건조된 생성물을 진공 조건하에 증기 탈취시키고 규조토를 사용하여 약 50℃ 내지 60℃에서 여과한다.
본원에 기재된 방법에 의해 생성된 미생물 오일의 하이드록실화는 하기에 보고된 바와 같이 상기 방법 및/또는 물질의 하나 이상과 연계하여 또는 생성물을 생성하기 위해 수행할 수 있다: 미국 특허 제6,590,113호(오일계 피복 및 잉크); 제4,049,724호(하이드록실화 반응); 제6,113,971호(올리브유 버터); 제4,992,189호 (윤활제 및 루브 첨가제); 제5,576,027호(하이드록실화된 우유); 및 제6,869,597호 (화장품).
하이드록실화된 글라이세로지질은 에스톨라이드로 전환시킬 수 있다. 에스톨라이드는 글라이세로지질로 이루어지고 여기서, 하이드록실화된 지방산 성분은 또 다른 지방산 분자에 에스터화시켰다. 하이드록실화된 글라이세로리피드의 에스톨라이드의 전환은 글라이세로지질 및 지방산의 혼합물을 가온하고 상기 혼합물을 문헌[Isbell et al., JAOCS 71(2): 169-174 (1994)]에 기재된 바와 같이 무기산과 접촉하는 것으로 수행할 수 있다. 에스톨라이드는, 제한없이 하기에 보고된 것들을 포함하는, 다양한 응용 분야에서 유용하다: 미국 특허 제7,196,124호(탄성 물질 및 바닥덮개); 제5,458,795호(고온 응용을 위한 증점 오일); 제5,451,332호(산업적 응용을 위한 유체); 제5,427,704호(연료 첨가제); 및 제5,380,894호(윤활제, 그리스, 기가소제 및 인쇄 잉크).
다른 이러한 화학적 변형은 올레핀 복분해이다. 올레핀 복분해에서, 촉매는 알켄(올레핀) 내 알킬리덴 탄소를 자르며, 상이한 알킬리덴 탄소와 그것들 각각을 짝지음으로써 새로운 알켄을 형성한다. 올레핀 복분해 반응은 에텐올분해(ethenolysis)에 의해 알켄에서 불포화 지방산 알킬쇄를 절단하는 단계, 자기-복분해에 의한 알켈 연결을 통해 지방산을 가교하는 단계, 유도체화된 알켄에 의한 교차-복분해로 지방산 상에 새로운 작용기를 포함하는 단계와 같은 공정을 위한 메커니즘을 제공한다.
에스터결합전이 및 수소화와 같은 다른 반응과 함께, 올레핀 복분해는 불포화 글라이세로지질을 다양한 최종 생성물로 전환할 수 있다. 이들 생성물은 왁스를 위한 글라이세로지질 올리고머; 윤활제를 위한 단쇄 글라이세로지질; 화학물질 및 폴리머를 위한 호모- 및 헤테로-2작용성 알킬쇄; 생물연료를 위한 단쇄 에스터; 및 제트 연료를 위한 단쇄 탄화수소를 포함한다. 올레핀 복분해는, 예를 들어 미국특허 제7,119,216호, 미국특허 공개번호 제2010/0160506호, 및 미국특허 공개번호 제2010/0145086호에 보고된 촉매 및 방법을 사용하여 트라이아실글라이세롤 및 지방산 유도체 상에서 수행될 수 있다.
바이오-오일의 올레핀 복분해는 일반적으로 다른 알켄의 존재(교차-복분해) 또는 부재(자기-복분해)에서 불포화 지방산 에스터에 대해 비활성인 조건 하에 약 10 내지 250 ppm의 부하에서 Ru 촉매 용액을 첨가하는 단계를 포함한다. 반응은 전형적으로 몇 시간 내지 며칠에 진행시키며, 궁극적으로 알켄 생성물의 분포를 얻는다. 올레핀 복분해가 지방산 유도체 상에서 수행될 수 있는 방법의 한 가지 예는 다음과 같다: 222 ppm의 촉매 부하에서 톨루엔 내 제1 세대 그럽스 촉매(Grubbs Catalyst)(다이클로로[(1-메틸에톡시-α-O)페닐]메틸렌-α-C](트라이사이클로헥실-포스핀) 용액이 탈기되고 건조된 메틸 올레이트를 함유하는 용기에 첨가될 수 있다. 그 다음에 용기는 약 60 psig의 에틸렌 기체와 함께 가압될 수 있고 약 30℃에서 또는 미만에서 3시간 동안 유지되며, 이에 의해 대략 50% 수율의 메틸 9-데세노에이트가 생성될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법으로 생성된 오일의 올레핀 복분해는 한 가지 이상의 방법 및/또는 재료와 함께, 또는 생성물을 생성하기 위해 다음에 보고되는 바와 같이 수행될 수 있다: 국제특허출원 PCT/US07/081427(α-올레핀 지방산) 및 미국특허 출원 제12/281,938호(페트로륨 크림), 12/281,931(페인트볼 건 캡슐), 12/653,742(가소제 및 윤활제), 12/422,096(2작용성 유기 화합물), 및 11/795,052(양초 왁스).
미생물 오일상에서 수행될 수 있는 다른 화학적 반응은 미국 특허 제6,051,539호에 보고된 바와 같이 트라이아실글라이세롤과 사이클로프로판화제와 반응시켜 유동성 및/또는 산화성 안정을 향상시키는 것; 미국 특허 제6,770,104호에 보고된 바와 같이 트라이아실글라이세롤로부터 왁스를 제조하는 것; 및 문헌["The effect of fatty acid composition on the acrylation kinetics of epoxidized triacylglycerols", Journal of the American Oil Chemists' Society, 79:1, 59-63, (2001) 및 Free Radical Biology and Medicine, 37:1, 104-114 (2004)]에 보고된 바와 같이 트라이아실글라이세롤을 에폭시화시키는 것을 포함한다.
상기된 바와 같이 연료 및 화학적 생성물에 대한 오일 함유 마생물 바이오매스의 생성은 탈지된 바이오매스 음식물을 생성시킨다. 탈지된 음식물은 조류 오일을 제조하는데 있어서의 부산물이고 농장 동물, 예를 들어, 반추동물, 가금류, 돼지 및 양식물고기에 대한 동물 사료로서 유용하다. 수득한 밀은 오일 함량이 감소하였지만 여전히 단백질, 탄수화물, 섬유, 재, 잔류 오일 및 동물 사료에 적당한 다른 영양물 함량이 높다. 세포는 주로 오일 분리공정에 의해 용해되기 때문에 탈지된 음식물은 상기 동물에 의해 쉽게 소화될 수 있다. 탈지된 음식물은 임의로 동물 사료에서 곡물과 같은 다른 성분과 배합될 수 있다. 탈지된 음식물은 분말성 점도를 갖기 때문에, 이것은 압출기 또는 확장기 또는 상업적으로 입수가능한 다른 유형의 기계를 사용하여 펠렛으로 압착될 수 있다.
상기에서 상세하게 기재된 본 발명은 하기의 실시예에 예시되지만 이는 청구된 발명을 설명하기 위해 제공되지만, 이에 제한되지 않는다.
VII. 실시예
실시예 1: 프로토테카의 배양 방법
프로토테카 균주는 건조 세포 중량을 기준으로 높은 %의 오일을 달성하기 위해 배양하였다. 동결보존된 세포를 실온에서 해동시키고 500㎕의 세포를 4.5㎖의 배지(4.2g/ℓ K2HPO4, 3.1g/ℓ NaH2PO4, 0.24g/ℓ MgSO4·7H2O, 0.25g/ℓ 시트르산 1수화물, 0.025g/ℓ CaCl2 2H2O, 2g/ℓ 효모 추출물) + 2% 글루코스에 첨가하고 6웰 플레이트에서 진탕(200rpm)과 함께 7일 동안 28℃에서 배양하였다. 건조 세포 중량은 1㎖의 배양물을 사전 칭량한 에펜도르프 튜브에서 5분 동안 14,000 rpm에서 원심분리하여 결정하였다. 배양 상청액을 버리고 수득한 세포 펠렛을 1㎖의 탈이온수로 세척하였다. 배양물을 다시 원심분리하고 상청액을 버리고 세포 펠렛을 동결될 때까지 -80℃에 두었다. 이어서 샘플을 24시간 동안 동결건조시키고 건조 세포 중량을 계산하였다. 배양물 중 총 지질을 결정하기 위해, 3㎖의 배양물을 제거하고 제조업자의 프로토콜에 따라 Ankom 시스템(뉴욕주 메이스던에 소재한 Ankom Inc.)을 사용하여 분석하였다. 샘플은 제조업자의 프로토콜에 따라 Amkom XT10 추출기로 용매 추출에 적용하였다. 총 지질은 산 가수분해된 건조 샘플 및 용매 용매 추출된 건조 샘플 간의 샘플 차이로서 결정하였다. 오일 건조 세포 중량 % 측정은 표 10에 나타낸다.
건조세포 중량으로 오일%
종 균주 오일%
프로토테카 스타그노라 UTEX 327 13.14
프로토테카 모리포미스 UTEX 1441 18.02
프로토테카 모리포미스 UTEX 1435 27.17
프로토테카 속 유래의 다양한 균주로부터의 미세조류 샘플을 유전자형으로 분류하였다. 게놈 DNA를 다음과 같이 조류 바이오매스로부터 분리하였다. 세포(대략 200㎎)를 14,000 x g에서 5분 동안 배양물로부터 원심분리하였다. 세포를 이어서 멸균 증류수에 재현탁시키고 14,000 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버렸다. 직경이 약 2㎜인 단일 유리 비드를 바이오매스에 첨가하고 튜브를 15분 이상 동안 -80℃에 위치시켰다. 샘플을 제거하고 150㎕의 분쇄 완충제(1% 사르코실(Sarkosyl), 0.25 M 수크로스, 50 mM NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, RNase A 0.5㎍/㎕)를 첨가하였다. 펠렛을 간단히 교반하여 재현탁시키고 이어서 40㎕의 5M NaCl를 첨가하였다. 샘플을 간단하게 교반하고 이어서 66㎕의 5% CTAB(세틸 트라이메틸암모늄 브로마이드)를 첨가하고 최종적으로 간단하게 교반하였다. 다음에 샘플을 10분 동안 65℃에서 배양하고 이후 이들을 10분 동안 14,000 x g에서 원심분리하였다. 상기 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 300㎕의 페놀:클로로포름:아이소아밀알코올 12:12:1로 1회 추출함에 이어서 14,000 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 수득한 수성 상을 0.7 용적의 아이소프로판올(약 190㎕)을 함유하는 새로운 튜브로 옮기고 뒤집어서 혼합하고 30분 동안 실온에서 또는 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. DNA를 10분 동안 14,000 x g에서 원심분리를 통해 회수하였다. 이어서 수득한 펠렛을 70% 에탄올로 2회 세척함에 이어서 100% 에탄올로 최종 세척하였다. 펠렛을 실온에서 20분 내지 30분 동안 공기 건조시킨 후 50㎕의 1OmM TrisCl, 1mM EDTA (pH 8.0)중에 현탁시켰다.
상기된 바와 같이 제조된 5㎕의 총 조류 DNA를 10mM Tris(pH 8.0)중에서 1:50으로 희석시켰다. 최종 용적 20㎕의 PCR 반응물을 다음과 같이 셋-업하였다. 10㎕의 2 x iProof HF 마스터 믹스(BIO-RAD)를 0.4㎕의 프라이머 SZ02613(10mM 스톡 농도에서 5'-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3'(서열번호9))에 첨가하였다. 상기 프라이머 서열은 GenBank 등록번호 L43357에서 567번 내지 588번이고 고등 식물 및 조류 플라스티드 게놈에서 고도로 보존되어 있다. 이어서 0.4㎕의 프라이머 SZ02615(10mM 스톡 농도에서 (5'-CAGTGAGCTATTACGCACTC-3'(서열번호10))를 첨가하였다. 상기 프라이머 서열은 GenBank 등록번호 L43357에서 1112번 내지 1093번 위치에 상보적이고 고등 식물 및 조류 플라스티드 게놈에서 고도로 보존되어 있다. 다음에, 5㎕의 희석된 총 DNA 및 3.2㎕의 dH2O를 첨가하였다. PCR 반응을 다음과 같이 수행하였다: 35주기 동안 98℃, 45"; 98℃, 8"; 53℃, 12"; 72℃, 20" 에 이어서 1분 동안 72℃에서 수행하고 25℃에 유지시킨다. PCR 생성물의 정제를 위해, 20㎕의 10 mM Tris(pH 8.0)를 각각의 반응물에 첨가하고 이어서 40㎕의 페놀:클로로포름:아이소아밀 알코올 12:12:1로 추출하고, 교반하고 5분 동안 14,000 x g에서 원심분리한다. PCR 반응을 S-400 칼럼(GE Healthcare)에 적용하고 3,000 x g에서 2분 동안 원심분리하였다. 정제된 PCR 생성물을 이어서 PCR8/GW/TOPO으로 TOPO 클로닝하고 포지티브 클론을 LB/Spec 플레이트를 위해 선택하였다. 정제된 플라스미드 DNA를 M13 전방 및 역방향 프라이머를 사용하여 양 방향으로 서열 분석하였다. 전체적으로, 12개의 프로토테카 균주는 서열분석된 이들의 23S rRNA DNA를 갖도록 선택하고 상기 서열을 서열 목록중에 열거한다. 균주 및 서열 번호에 대한 요약은 하기에 포함된다. 상기 서열은 UTEX 1435(서열번호 15) 서열로부터 총 분기점에 대해 분석하였다. 2개의 쌍(UTEX 329/UTEX 1533 및 UTEX 329/UTEX 1440)이 가장 분기된 것으로서 나타났다. 양 경우에, 쌍 형성 정렬은 75.0% 쌍 형성 서열 동일성을 나타내었다. UTEX 1435에 대한 서열 동일성%는 또한 하기에 포함된다.
Figure 112018108415035-pat00014
상기된 균주의 서브셋트 기원의 지질 샘플은 HPLC를 사용하여 지질 프로파일에 대해 분석하였다. 결과는 하기 표 11에 나타낸다.
프로토테카 종에서 지질 쇄의 다양성
균주 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1
UTEX 327 0 12.01 0 0 50.33 17.14 0 0 0
UTEX 1441 1.41 29.44 0.70 3.05 57.72 12.37 0.97 0.33 0
UTEX 1435 1.09 25.77 0 2.75 54.01 11.90 2.44 0 0
프로토테카 모리포미스 UTEX 1435로부터 추출된 오일(용매 추출을 통해 또는 익스펠러 프레스를 사용하여)을 카르테노이드, 엽록소, 토코페롤, 기타 스테롤 및 토코트라이엔올에 대해 분석하였다. 결과를 이하의 표 12에 요약한다.
프로토테카 모리포미스(UTEX 1435)로부터 추출된 오일 내 카로테노이드, 엽록소, 토코페롤/스테롤 및 토코트라이엔올
압축 오일
(mcg/㎖)		 용매 추출 오일(mcg/㎖)
시스-루테인 0.041 0.042
트랜스-루테인 0.140 0.112
트랜스-제아잔틴 0.045 0.039
시스-제아잔틴 0.007 0.013
t-알파-크립토잔틴 0.007 0.010
t-베타-크립토잔틴 0.009 0.010
t-알파-카로텐 0.003 0.001
c-알파-카로텐 검출되지 않음 검출되지 않음
t-베타-카로텐 0.010 0.009
9-시스-베타-카로텐 0.004 0.002
라이코펜 검출되지 않음 검출되지 않음
전체 카로테노이드 0.267 0.238
엽록소 <0.01 ㎎/㎏ <0.01 ㎎/㎏
토코페롤 및 스테롤
압축 오일 (㎎/100g) 용매 추출 오일 (㎎/100g)
감마 토코페롤 0.49 0.49
캄페스테롤 6.09 6.05
스티그마스테롤 47.6 47.8
베타-시토스테롤 11.6 11.5
기타 스테롤 445 446
토코트라이엔올
압축 오일 (㎎/g) 용매 추출 오일 (㎎/g)
알파 토코트라이엔올 0.26 0.26
베타 토코트라이엔올 <0.01 <0.01
감마 토코트라이엔올 0.10 0.10
델타 토코트라이엔올 <0.01 <0.01
전체 토코트라이엔올 0.36 0.36
4개의 별개의 로트로부터 프로토테카 모르포미스로부터 추출한 오일을 정제하고 표쥰 식물 오일 처리 방법을 사용하여 표백하였다. 간략하게, 프로토테카 모르포미스로부터 추출한 미정제 오일을 수평 디캔터 내에서 정제하며, 고체를 오일로부터 분리하였다. 그 다음에 정제한 오일을 시트르산 및 물과 함께 탱크에 옮겼고, 대략 24시간 동안 방치하였다. 24시간 후, 탱크 내 혼합물은 2개의 별개의 층을 형성하였다. 바닥층은 물 및 검을 포함하였고, 그 다음에 디캔테이션으로 제거한 후, 탈검화된 오일을 표백 탱크에 옮겼다. 그 다음에 다른 용량의 시트르산과 함께 가열하였다. 그 다음에 표백토를 표백 탱크에 첨가하였고, 혼합물을 진공 하에 추가로 가열하여 존재하는 어떤 물을 증발시켰다. 그 다음에 표백토를 제거하기 위하여 혼합물을 잎 여과기를 통해 펌핑하였다. 이어서 여과한 오일을 최종 5㎛ 폴리슁 필터를 통과시킨 다음, 사용까지 저장을 위해 수집하였다. 그 다음에 정제하고 표백한(refined and bleached, RB) 오일을 카로테노이드, 엽록소, 스테롤, 토코트라이엔올 및 토코페롤에 대해 분석하였다. 이들 분석의 결과를 이하의 표 13에 요약한다. "Nd"는 검출되지 않음을 의미하며 검출의 민감도는 이하에 열거한다:
검출의 민감도
카로테노이드(mcg/g) nd = <0.003 mcg/g
엽록소(mcg/g) nd = <0.03 mcg/g
스테롤(%) nd = 0.25%
토코페롤(mcg/g); nd = 3 mcg/g
정제 및 표백한 프로토테카 모리포미스 오일로부터 유래된 카로테노이드 , 엽록소, 스테롤, 토코트라이엔 및 토코페롤 분석
로트 A 로트 B 로트 C 로트 D
카로테노이드 ( mcg /g)
루테인 0.025 0.003 nd 0.039
제아잔틴 nd nd nd nd
시스-루테인/제아잔틴 nd nd nd nd
트랜스-알파-크립토잔틴 nd nd nd nd
트랜스-베타-크립토잔틴 nd nd nd nd
트랜스-알파-카로텐 nd nd nd nd
시스-알파-카로텐 nd nd nd nd
트랜스-베타-카로텐 nd nd nd nd
시스-베타-카로텐 nd nd nd nd
라이코펜 nd nd nd nd
미확인 0.219 0.066 0.050 0.026
전체 카로테노이드 0.244 0.069 0.050 0.065
엽록소 ( mcg /g)
엽록소 A 0.268 0.136 0.045 0.166
엽록소 B nd nd nd nd
전체 엽록소 0.268 0.136 0.045 0.166
스테롤 ( % )
브라시카스테롤 nd nd nd nd
캄페스테롤 nd nd nd nd
스티그마스테롤 nd nd nd nd
베타-시토스테롤 nd nd nd nd
전체 스테롤 nd nd nd nd
토코페롤 ( mcg /g)
알파-토코페롤 23.9 22.8 12.5 8.2
베타-토코페롤 3.72 nd nd nd
감마-토코페롤 164 85.3 43.1 38.3
델타-토코페롤 70.1 31.1 18.1 14.3
전체 토코페롤 262 139.2 73.7 60.8
토코트라이엔올 ( mcg /g)
알파-토코트라이엔올 190 225 253 239
베타-토코트라이엔올 nd nd nd nd
감마-토코트라이엔올 47.3 60.4 54.8 60.9
델타-토코트라이엔올 12.3 16.1 17.5 15.2
전체 토코트라이엔올 250 302 325 315
프로토테카 포리포미스의 동일한 4가지 로트를 또한 미량원소에 대해 분석하였고, 결과를 이하의 표 14에 요약한다.
정제 및 표백한 프로토테카 모리포미스 오일의 원소 분석
로트 A 로트 B 로트 C 로트 D
원소 분석(ppm)
칼슘 0.08 0.07 < 0.04 0.07
인 < 0.2 0.38 < 0.2 0.33
나트륨 < 0.5 0.55 < 0.5 < 0.5
칼륨 1.02 1.68 < 0.5 0.94
마그네슘 < 0.04 < 0.04 < 0.04 0.07
망간 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05
철 < 0.02 < 0.02 < 0.02 < 0.02
아연 < 0.02 < 0.02 < 0.02 < 0.02
구리 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05
황 2.55 4.45 2.36 4.55
납 < 0.2 < 0.2 < 0.2 < 0.2
규소 0.37 0.41 0.26 0.26
니켈 < 0.2 < 0.2 < 0.2 < 0.2
유기 염화물 < 1.0 < 1.0 < 1.0 2.2
무기 염화물 < 1.0 < 1.0 < 1.0 < 1.0
질소 4.4 7.8 4.2 6.9
리튬 < 0.02 < 0.02 < 0.02 < 0.02
붕소 0.07 0.36 0.09 0.38
알루미늄 -- < 0.2 < 0.2 < 0.2
바나듐 < 0.05 < 0.05 <0.05 < 0.05
로비본드 색도( °L )
적색 5.0 4.3 3.2 5.0
황색 70.0 70.0 50.0 70.0
HPLC에 의한 모노 및 다이글라이세라이드 ( % )
다이글라이세라이드 1.68 2.23 1.25 1.61
모노글라이세라이드 0.03 0.04 0.02 0.03
유리 지방산(Free fatty acid, FFA) 1.02 1.72 0.86 0.83
비누 0 0 0
산화 및 폴리머화된 트라이글라이세라이드
산화된 트라이글라이세라이드(%) 3.41 2.41 4.11 1.00
폴리머화된 트라이글라이세라이드(%) 1.19 0.45 0.66 0.31
과산화물값(meg/kg) 0.75 0.80 0.60 1.20
p-아니시딘값(무차원)
 5.03 9.03 5.44 20.1
물 및 기타 불순물( % )
카를 피셔 수분 0.8 0.12 0.07 0.18
전체 극성 화합물 5.02 6.28 4.54 5.23
불검화물 0.92 1.07 0.72 1.04
불용성 불순물 <0.01 <0.01 0.01 < 0.01
전체 오일( % )
중성오일 98.8 98.2 99.0 98.9
실시예 2: 프로토테카의 바이오리스틱 형질전환을 위한 일반적 방법
Seashell Gold Microcarriers 550 나노미터를 제조업자의 프로토콜에 따라 제조하였다. 플라스미드(20㎍)를 50㎕의 결합 완충제와 60㎕(30 mg)의 S550d 골드 캐리어와 혼합하고 얼음 상에서 1분 동안 인큐베이션하였다. 침전 완충제(100㎕)를 첨가하고 상기 혼합물을 또 다른 1분 동안 얼음에서 인큐베이션하였다. 교반한 후, DNA-코팅된 입자를 10초 동안 에펜도르프 5415C 소형 원심분리기 내에서 10,000rpm으로 회전시켜 펠렛화하였다. 상기 골드 펠렛을 500㎕의 차가운 100% 에탄올로 1회 세척하고, 소형 원심분리기에서 간단히 회전시켜 펠렛화하고 50㎕의 빙냉 에탄올과 함께 재현탁하였다. 간략한 (1 내지 2초) 초음파 처리 후, 10㎕의 DNA-코팅된 입자를 즉시 캐리어 막에 이동시켰다.
프로토테카 균주를 이의 세포 밀도가 2 x 106 세포/㎖가 될 때까지 회전 진탕기 상에서 2% 글루코스와 함께 프로테오스 배지(2g/ℓ 효모 추출물, 2.94mM NaNO3, 0.17mM CaCl2ㆍ2H2O, 0.3mmMgSO4ㆍ7H2O, 0.4mM K2HPO4, 1.28mM KH2PO4, 0.43mM NaCl) 중에서 성장시켰다. 상기 세포를 채취하고 멸균 증류수로 1회 세척하고 50㎕의 배지에 재현탁시켰다. 1 x 107 세포를 비선택적 프로테오스 배지 플레이트의 삼등분의 가운데 지점에 도말하였다. 상기 세포를 PDS-1000/He 유전자 주입 입자 전달 시스템(Biolistic Particle Delivery system)(Bio-Rad)으로 충격을 가했다. 파열 디스크(1350 psi)를 사용하고 플레이트를 스크린/마크로캐리어 조립체 6㎝ 아래에 위치시킨다. 상기 세포가 12 내지 24시간 동안 25℃에서 회복하도록 방치하였다. 회수 시 상기 세포를 고무 스패튤라를 사용하여 플레이트로부터 긁어내어 100㎕의 배지와 혼합하고 적당한 선택 항생제를 함유하는 플레이트상에 도말하였다. 배양 7 내지 10일 후에 25℃에서, 플레이트 상에 형질전환 세포를 나타내는 콜로니가 확인되었다. 콜로니를 집어내고 두 번째 선택용 선택(항생제 또는 탄소 공급원 중 하나) 한천 플레이트상에 스팟팅하였다.
실시예 3: 클로렐라의 형질전환
벡터 구성
CMV 프로모터, 하이드로마이신 내성 cDNA, 및 CMV 3'UTR(서열번호 152, pCAMBIA1380 벡터의 하위 서열, 호주 캔버라 캄비아)을 함유하는 BamHI-SacII 단편을 pBluescript의 BamHI 및 SacII 부위에 클로닝하였고, 본 명세서에서 pHyg로 언급한다.
클로렐라의 바이오리스틱 형질전환
Seashell Technology제의 S550d 골드 캐리어를 제조업자의 프로토콜에 따라서 제조하였다. 선형화된 pHyg 플라스미드(20㎍)를 50㎕의 결합 완충제와 60㎕(30 mg)의 S550d 골드 캐리어와 혼합하고 얼음 상에서 1분 동안 인큐베이션하였다. 침전 완충제(100㎕)를 첨가하고 상기 혼합물을 또 다른 1분 동안 얼음에서 인큐베이션하였다. 교반한 후, DNA-코팅된 입자를 10초 동안 에펜도르프 5415C 소형 원심분리기 내에서 10,000rpm으로 회전시켜 펠렛화하였다. 상기 골드 펠렛을 500㎕의 차가운 100% 에탄올로 1회 세척하고, 소형 원심분리기에서 간단히 회전시켜 펠렛화하고 50㎕의 빙냉 에탄올과 함께 재현탁하였다. 간략한 (1 내지 2초) 초음파 처리 후, 10㎕의 DNA-코팅된 입자를 즉시 캐리어 막에 이동시켰다.
클로렐라 프로토테카 배양물(Univeristy of Texas Culture Collection 250)을 이의 세포 밀도가 2 x 106 세포/㎖가 될 때까지, 75㎛ol 광자 m-2 sec-1의 연속적 빛 하에 선회 진탕기 상에서 프로테오스 배지(2g/ℓ 효모 추출물, 2.94mM NaNO3, 0.17mM CaC12ㆍ2H2O, 0.3mmMgSO4ㆍ7H2O, 0.4mM K2HPO4, 1.28mM KH2PO4, 0.43mM NaCl) 중에서 성장시켰다. 상기 세포를 채취하고 멸균 증류수로 1회 세척하고 50㎕의 배지에 재현탁시켰다. 1 x 107 세포를 비선택적 프로테오스 배지 플레이트의 삼등분의 가운데 지점에 도말하였다. 상기 세포를 PDS-1000/He 유전자 주입 입자 전달 시스템(Biolistic Particle Delivery system)(Bio-Rad)으로 충격을 가했다. 파열 디스크(1100 및 1350 psi)를 사용하고 플레이트를 스크린/마크로캐리어 조립체 9 및 12㎝ 아래에 위치시킨다. 상기 세포가 12 내지 24시간 동안 25℃에서 회복하도록 방치하였다. 회수 시 상기 세포를 고무 스패튤라를 사용하여 플레이트로부터 긁어내어 100㎕의 배지와 혼합하고 하이그로마이신 함유 플레이트 상에 도말하였다(200㎍/㎖). 25℃에서 배양 7 내지 10일 후에, 1100 및 1350 psi 파열 디스크로부터 및 9 및 12㎝ 거리로부터 플레이트상에 형질전환 세포를 나타내는 콜로니가 확인되었다. 콜로니를 집어내고 두 번째 선택용 선택 한천 플레이트 상에 스팟팅하였다.
전기천공에 의한 클로렐라의 형질전환
클로렐라 프로토테코이데스 배양물을 세포 밀도가 2 x 106 세포/㎖가 될 때까지 75㎛ol 광자 m-2 sec-1의 연속적 빛 하에 선회 진탕기 상에서 프로테오스 배지 중에서 성장시켰다. 상기 세포를 채취하고 멸균 증류수로 1회 세척하고 50mM 수크로스를 함유하는 트리스-인산염 완충제(20mM Tris-HCl, pH 7.0; 1 mM 인산칼륨) 중에서 4 x 108세포/㎖ 밀도로 재현탁하였다. 약 250㎕ 세포 현탁액(1x108 세포)를 4㎜ 갭의 일회용 전기천공 큐벳에 넣었다. 세포 현탁액에, 5㎍의 선형화된 pHyg 플라스미드 DNA 및 200㎍의 운반 DNA(절단한 연어 정자 DNA)를 첨가하였다. 그 다음에 전기천공 큐벳을 16℃ 수욕 내에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 Gene Pulser II(캘리포니아주 허큘리스에 소재한 Bio-Rad Labs) 전기천공 장치를 사용하여 전기적 펄스(1100 V/cm)를 25 μF(전기천공에 사용되는 분류기는 없다)의 정전 용량에서 큐벳에 적용하였다. 그 다음에 큐벳을 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 세포 현탁액을 50㎖의 프로테아제 배지에 옮겼으며, 2일 동안 선회 진탕기 상에서 진탕하였다. 회수 후, 세포를 저속에서 원심분리로 채취하였고, 프로테오스 배지 내에서 재현탁하였으며, 200㎍/㎖ 하이그로마이신으로 보충한 플레이트 상에서 저밀도로 플레이팅하였다. 플레이트를 75㎛ol 광자 m-2 sec-1에서 연속적 빛 하에 인큐베이션하였다. 형질전환체는 1 내지 2주 내 콜로니로 나타났다. 콜로니를 집어내고 두 번째 선택용 선택 한천 플레이트상에 스팟팅하였다.
지노타이핑
2차 선택에서 살아남은 콜로니의 서브세트를 작은 부피로 배양하였고 채취하였다. 대략 5 내지 10㎕ 부피를 50㎕의 10mM NaEDTA 중에서 재현탁한 다음, 100℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 튜브를 간단히 교반하였고 10초 동안 음파처리한 다음, 12,000 x g에서 1분 동안 원심분리하였다. 주형으로서 2㎕의 상청액을 50㎕ PCR 반응 중에서 사용하였다. 지노타이핑을 위해 사용한 프라이머는 서열번호 153 및 서열번호 154이었다. PCR 조건은 다음과 같다: 95℃ 5 분 x 1 주기; 95℃ 30 초 - 58℃ 30 초 - 72℃ 1 분 30초 x 35 주기; 72℃ 10 분 x 1 주기. 예상한 992 bp 단편을 바이오리스틱 방법으로부터 및 단일 전기천공 콜로니로부터 10개 중 6개 콜로니에서 발견하였다. 더 작은 크기의 비특이적 밴드가 모든 레인에 존재하였다. 증폭된 992bp 단편의 동일성을 확인하기 위하여, 2개의 바이오리스틱 밴드 및 전기천공 밴드를 겔로부터 절단하였고, 개별적으로 시퀀싱하였다. 모든 3개의 밴드 서열은 예상한 992 bp 단편에 대응한다(DNA 래더: Bionexus(등록상표) All Purpose Hi-Lo(등록상표) DNA 래더 카탈로그 # BN2050).
실시예 4: 미세조류에서 사용을 위한 조류-유래 프로모터 및 유전자
A. 클로렐라 프로토테코이데스 유래의 5'UTR 및 프로모터 서열
cDNA 라이브러리를 표준 기술을 사용하여 혼합영양(mixotrophically)으로 성장한 클로렐라 프로토테코이데스(UTEX 250)로부터 생성하였다. cDNA 서열을 기준으로, 씨진의 DNA 워킹 키트(Seegene's DNA Walking kit)(매릴랜드주 락빌에 소재)를 사용하여 암호화 영역의 상류를 "워크(walk)"하기 위해 특정 공지된 하우스키핑(housekeeping) 유전자에서 설계하였다. 분리된 서열은 액틴(서열번호 155) 및 연장 인자-1a(EF1a)(서열번호 156) 프로모터/UTR를 포함하고 이 둘 다는 인트론(하한부에 나타낸 바와 같이) 및 엑손(이탤릭체의 대문자) 및 예측된 개시 부위(볼드체) 및 2개의 베타-튜불린 프로모터/UTR 요소, 아이소폼 A(서열번호 157) 및 아이소폼 B(서열번호 158)를 함유한다.
B. 클로렐라 프로토테코이데스 유래의 지질 생합성 효소 및 플라스티드 표적화 서열
상기된 cDNA 라이브러리로부터, 클로렐라 프로토테코이데스(UTEX 250)에서 지질 대사에서 작용성인 단백질을 암호화하는 3개의 cDNA를 상기된 바와 동일한 방법을 사용하여 클로닝하였다. 아실 ACP 불포화효소(서열번호 159 및 160) 및 2개의 게라닐 게라닐 디포스페이트 신타제(서열번호 161 내지 164)에 대한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 하기 서열목록에 포함된다. 추가로, 플라스티드에 표적화하는 추정 신호 서열을 갖는 3개의 cDNA를 또한 클로닝하였다. 글라이세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(서열번호 165 및 166)에 대한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열, 산소 방출 복합 단백질 OEE33(서열번호 167 및 168) 및 CIp 프로테아제(서열번호 169 및 170)은 하기 서열목록에 포함된다. 추정 플라스티드 표적화 서열은 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 둘 다에 밑줄쳐 있다. 상기 플라스티드 표적화 서열은 지질 변형 효소와 같은 전이유전자 생성물을 미생물의 플라스티드에 표적화하는데 사용될 수 있다.
실시예 5: 외인성 수크로스 인버타제를 발현하기 위한 클로렐라 프로토테코이데스의 유전자조작
균주 및 배지: 클로렐라 프로토테코이데스(UTEX 250)를 텍사스 유니버시티의 조류 배양물 수집 기관(미국 텍사스주 오스틴에 소재한 Culture Collection of Alga at the University of Texas)으로부터 얻었다. 변형 프로테오스 배지 상에서 보존 배양을 유지하였다. 변형 프로테오스 배지는 0.25 g NaNO3, 0.09 g K2HPO4, 0.175 g KH2PO4 0.025 g, 0.025 g CaCl2·2H2O, 0.075 g MgSO4·7H2O, 및 리터 당 2 g의 효모 추출물(g/ℓ)로 이루어진다.
플라스미드 구성: 클로렐라 프로토테코이데스 내 인버타제의 분비 형태를 표현하기 위하여, 사카로마이세스 세레비시애 SUC2 유전자를 3개의 상이한 프로모터 대조군 하에 두었다: 카울리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터(CMV), 클로렐라 바이러스 프로모터(NC-1A), 및 클로렐라 HUP1 프로모터. 클로렐라 프로토테코이데스에 대해 최적화된 코돈 사용빈도를 수용하기 위해 효모 SUC2 유전자를 합성하였고, 인버타제의 세포외 분비를 지시하는데 필요한 단일 서열을 포함한다. pBluescript KS+, 및 EcoRI/AscI, AscI/XhoI, 및 XhoI/BamHI 부위에 구성된 각 구성체는 특정 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 각 프로모터, 인버타제 유전자, 및 CMV 3'UTR에 각각 도입되었다. 정제된 PCR 생성물을 순차적으로 클로닝하였다.
클로렐라 프로테코이데스의 형질전환: 클로렐라 프로테코이데스 배양물을 세포 밀도가 6 x 106 세포/㎖가 될 때까지 75㎛ol 광자 m-2 sec-1의 연속적 빛 하에 선회 진탕기 상에서 프로테오스 배지 중에서 성장시켰다.
바이오리스틱 형질전환을 위하여, Seashell Technology제의 S550d 골드 캐리어를 제조업자의 프로토콜에 따라서 제조하였다. 간략하게, BsaI로 선형화된 구성체(20㎍)를 50㎕의 결합 완충제와 60㎕(3 ㎎)의 S550d 골드 캐리어와 혼합하고 얼음 상에서 1분 동안 인큐베이션하였다. 침전 완충제(100㎕)를 첨가하고 상기 혼합물을 또 다른 1분 동안 얼음에서 인큐베이션하였다. 약하게 교반한 후, DNA-코팅된 입자를 10초 동안 에펜도르프 원심분리기 내에서 10,000rpm으로 회전시켜 펠렛화하였다. 상기 골드 펠렛을 500㎕의 차가운 100% 에탄올로 1회 세척하고, 소형 원심분리기에서 간단히 회전시켜 펠렛화하고 50㎕의 빙냉 에탄올과 함께 재현탁하였다. 간략한 (1 내지 2초) 초음파 처리 후, 10㎕의 DNA-코팅된 입자를 즉시 캐리어 막에 이동시켰다. 세포를 채취하였고, 멸균증류수로 1회 세척하였으며, 50㎕의 배지(1 x 107 세포) 중에서 재현탁하였으며, 비선택적 프로테오스 플레이트의 삼등분의 가운데 지점에 도말하였다. 상기 세포를 PDS-1000/He 유전자 주입 입자 전달 시스템(Bio-Rad)으로 충격을 가했다. 파열 디스크(1100 및 1350 psi)를 사용하고 플레이트를 스크린/마크로캐리어 조립체 9 및 12㎝ 아래에 위치시킨다. 상기 세포가 12 내지 24시간 동안 25℃에서 회복하도록 방치하였다. 회수 시, 상기 세포를 고무 스패튤라를 사용하여 플레이트로부터 긁어내어 100㎕의 배지와 혼합하고 적당한 1% 수크로스가 있는 변형 프로테오스 플레이트 상에 도말하였다. 암실 내 25℃에서 배양 7 내지 10일 후에, 형질전환 세포를 나타내는 콜로니가 플레이트 상에 보였다.
전기천공에 의한 형질전환을 위하여, 세포를 채취하였고, 멸균 증류수로 1회 세척하고 50mM 수크로스를 함유하는 트리스-인산염 완충제(20mM Tris-HCl, pH 7.0; 1 mM 인산칼륨) 중에서 4 x 108세포/㎖ 밀도로 재현탁하였다. 약 250㎕ 세포 현탁액(1x108 세포)을 4㎜ 갭의 일회용 전기천공 큐벳에 넣었다. 세포 현탁액에, 5㎍의 선형화된 플라스미드 DNA 및 200㎍의 운반 DNA(절단한 연어 정자 DNA)를 첨가하였다. 그 다음에 전기천공 큐벳을 16℃ 수욕 내에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 Gene Pulser II(캘리포니아주 허큘리스에 소재한 Bio-Rad Labs) 전기천공 장치를 사용하여 전기적 펄스(1100 V/cm)를 25 μF(전기천공에 사용되는 분류기는 없다)의 정전 용량에서 큐벳에 적용하였다. 그 다음에 큐벳을 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 세포 현탁액을 50㎖의 프로테아제 배지에 옮겼으며, 2일 동안 선회 진탕기 상에서 진탕하였다. 회수 후, 세포를 저속에서(4000 rpm) 원심분리로 채취하였고, 프로테오스 배지 내에서 재현탁하였으며, 1% 수크로스와 함께 변형 프로테오스 플레이트 상에서 저밀도로 플레이팅하였다. 암실 내 25℃에서 인큐베이션의 7 내지 10일 후, 형질전환 세포를 나타내는 콜로니가 플레이트 상에 보였다.
스크리닝 형질전환체 및 지노타이핑: 콜로니를 1% 수크로스가 있는 암실 성장-변형 프로테오스 플레이트로부터 선택하였고, 대략 동일한 양의 세포를 1% 수크로스와 함께 1㎖의 변형 프로테오스 액체 배지를 함유하는 24 웰-플레이트에 옮겼다. 배양물을 암실에서 유지하였고, Labnet(영국 버크셔 소재)제의 오비탈 진탕기로 430 rpm에서 5일 동안 교반하였다.
클로렐라 형질전환체에 도입된 인버타제 유전자의 존재를 증명하기 위하여, 각 형질전환체의 DNA를 분리하였고, 한 세트의 유전자 특이적 프라이머(CMV 구성체: 전방 프라이머 (CAACCACGTCTTCAAAGCAA)(서열번호 153)/역방향 프라이머(TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(서열번호 171), CV 구성체: 전방 프라이머(TTGTCGGAATGTCATATCAA)(서열번호 172)/역방향 프라이머(TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(서열번호 171), 및 HUP1 구성체: 전방 프라이머(AACGCCTTTGTACAACTGCA)(서열번호 173)/역방향 프라이머(TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(서열번호 171))로 증폭하였다. 빠른 DNA 분리를 위해, 세포 부피(크기로 대략 5-10㎕)를 50㎕의 10 mM Na-EDTA 중에서 재현탁하였다. 세포 현탁액을 100℃에서 10분 동안 인큐베이션하였고 10초 동안 음파처리하였다. 12000g에서 1분 동안 원심분리 후, 3㎕의 상청액을 PCR 반응을 위해 사용하였다. PCR 증폭을 DNA 열 사이클러(Perkin-Elmer GeneAmp 9600) 내에서 수행하였다. 반응 혼합물(50㎕)은 제조업자의 설명서에 따라서 3㎕ 추출 DNA, 상기 설명한 각 프라이머 각각의 100 pmol, 200 uM dNTP, 0.5 유닛의 태그 DNA 폴리머라제(NEB), 및 태그 DNA 폴리머라제 완충제를 함유하였다. 제1 주기를 위해 95℃에서 5분 동안 DNA 변성을 수행한 다음, 30초 동안 수행하였다. 프라이머 어닐링 및 확장 반응을 58℃에서 30초 동안 및 72℃에서 1분 동안 각각 수행하였다. 그 다음에 PCR 생성물을 브롬화 에티듐으로 염색한 1% 아가로스 겔 상에서 시각화하였다.
액체 배양물 내 성장: 암실에서 5일 성장 후, 유전자형-포지티브 형질전환체는 암실에서 최소 액체 프로테오스 배지 + 1% 수크로스 상에서 성장을 나타낸 반면, 야생형 세포는 암실 내 동일 배지 중에서 성장을 나타내지 않았다.
실시예 6: 사카로마이세스 세레비시애로부터 유래된 분비된 인버타제에 의한 조류 균주의 형질전환
분비된 인버타제: 각각 EcoR I/Asc I 및 Xho/Sac I 카세트로서 카울리플라워 모자이크 바이러스 35s 프로모터 및 3' UTR을 소유하는 pUC19 유도체 내로 후속하여 서브클로닝된 1599 bp Asc I-Xho 단편으로서 분비된 수크로스 인버타제를 암호화하는 유전자(사카로마이세스 세레비시애로부터 유래된 Gen Bank 등록번호 NP_012104)를 데노보 합성하였다.
조류 세포의 성장: 이들 실험에 사용한 배지는 액체 기본 배지(2g/ℓ 효모 추출물, 2.94mM NaNO3, 0.17mm CaCl2·2H2O, 0.3mmMgSO4·7H2O, 0.4mM K2HPO4, 1.28mM KH2PO4, 0.43mM NaCl) 및 1%의 최종 농도에서 수크로스 또는 글루코스(지정됨) 형태로 고정된 탄소를 함유하는 고체 기본 배지(+ 1.5% 아가로스)이었다. 이 실험에 사용한 균주는 추가적인 고정 탄소 공급원의 부재에서 암실 내 기본 배지 상에서 성장하지 않았다. 종들을 플레이트 상에서 퇴출시켰고, 암실 내 28℃에서 성장시켰다. 단일 콜로니를 선택하였고, 1 % 글루코스를 함유하는 500㎖의 액체 기본 배지를 접종하기 위하여 사용하였으며, 중기 로그기까지 암실 내에서 성장시키고, 각 날짜에 세포수를 측정하였다. 각각의 다음 균주를 암실 내 단독 탄소 공급원으로서 수크로스 상의 성장에 대해 이전에 시험하였으며, 이는 성장을 나타내지 않았고, 따라서 분비된 인버타제로 형질전환을 위해 선택하였다: (1) 클로렐라 프로토테코이데스(UTEX 31); (2) 클로렐라 미누티시마(UTEX 2341); 및 (3) 클로렐라 에머소니(CCAP 211/15).
유전자총을 통한 조류의 형질전환: 충분한 배양물을 원심분리하여 대략 1-5 x 108개의 전체 세포를 제공하였다. 결과 펠렛을 고정 탄소 공급원을 첨가하지 않은 기본 배지로 세척하였다. 세포를 다시 원심분리하였고, 펠렛을 5 x 107 내지 2 x 108 세포/㎖를 제공하기에 충분한 기본 배지 부피 중에서 재현탁하였다. 그 다음에 250-1000㎕의 세포를 1% 수크로스로 보충한 고체 기본 배지 상에 플레이팅하고, 멸균 후드 내 플레이트 상에서 건조시켰다. 플라스미드 DNA를 제조업자의 설명서(캘리포니아주 라호야에 소재한 Seashell Technology)에 따라서 금 입자에 침전시켰다. 파열판 홀더로부터 9㎝에 설정된 거대운반체 조립체가 있는 1350 psi 파열판을 사용하는 BioRad PDS He-1000 입자 전달 시스템을 사용하여 형질전환을 수행하였다. 형질전환 후, 플레이트를 28℃에서 암실 내에서 인큐베이션하였다. 모든 균주는 다양한 형질전환체 콜로니를 만들어냈다. 대조군 플레이트는 인버타제 삽입물로 형질전환되지 않았지만, 다르게는 콜로니를 함유하지 않는 동일한 방식으로 제조하였다.
클로렐라 프로토테코이데스 형질전환체의 분석: 게놈 DNA를 클로렐라 프로토테코이데스 야생형 세포 및 다음과 같은 형질전환체 콜로니로부터 추출하였다: 세포를 100 ㎕ 추출 완충제(87.5 mm Tris Cl, pH 8.0, 50 mm NaCl, 5 mm EDTA, pH 8.0, 0.25% SDS) 중에서 재현탁하였고, 30분 동안 전화를 통해 가끔식 혼합하면서 60℃에서 인큐베이션하였다. PCR을 위해, 샘플을 20 mM Tris Cl, pH 8.0 내 1:100으로 희석하였다.
WT, 형질전환체 및 플라스미드 DNA로부터 추출한 게놈 DNA 상에서 지노타이핑을 행하였다. 샘플을 마커 유전자에 대해 지노타이핑하였다. 프라이머 2383(5' CTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGC 3')(서열번호 174) 및 2279(5' CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3')(서열번호 175)을 이런 지노타이핑 PCR에서 사용하였다. 사용한 PCR 프로파일은 다음과 같다: 5분 동안 94℃ 변성; 35주기의 94℃-30초, 60℃-30초 72℃-3분 72℃-5분. 동일 크기의 밴드를 양성 대조군(플라스미드) 및 클로렐라 프로토테코이데스(UTEX 31)의 2개 형질전환체로부터 증폭하였다.
클로렐라 미누티시마 및 클로렐라 에머소니 형질전환체의 분석: 게놈 DNA를 클로렐라 WT로부터 추출하였고, 형질전환체는 다음과 같다: 세포를 100㎕ 추출 완충제(87.5 mM Tris Cl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.0, 0.25% SDS) 중에서 재현탁하였고, 30분 동안 전화를 통해 가끔식 혼합하면서 60℃에서 인큐베이션하였다. PCR을 위해, 샘플을 20 mM Tris Cl, pH 8.0 내 1:100으로 희석하였다. WT, 형질전환체 및 플라스미드 DNA로부터 추출한 게놈 DNA 상에서 지노타이핑을 행하였다. 샘플을 마커 유전자에 대해 지노타이핑하였다. 프라이머 2336(5' GTGGCCATATGGACTTACAA 3')(서열번호 176) 및 2279(5' CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3')(서열번호 175)는 프라이머 세트 2(1215 bp의 예상된 생성물)를 지정한 반면, 프라이머 2465(5' CAAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACG 3')(서열번호 177) 및 2470(5' CACCCGTCGTCATGTTCACGGAGCCCAGTGCG 3')(서열번호 178)은 프라이머 세트 4(1442 bp의 예상된 생성물)을 지정하였다. 사용한 PCR 프로파일은 다음과 같다: 2분 동안 94℃ 변성; 29주기의 94℃-30초, 60℃-30초 72℃-1분 30초; 72℃-5분. 분비 인버타제를 함유하는 플라스미드 대조군을 PCR 대조군으로 사용하였다.
인버타제 구성체의 서열은 서열번호 8에 대응한다.
실시예 7: 프로토테카 종 내 상동성 재조합
이식유전자의 상동성 재조합은 몇몇 이점을 가진다. 첫째로, 세포에 도입되는 플라스미드 복제물 수 이상의 대조군이 없기 때문에 상동성 재조합이 없는 이식유전자의 도입은 예측가능하지 않다. 또한 상동성 재조합이 없는 이식유전자의 도입은 안정하지 않은데, 플라스미드가 에피솜으로 남아있을 수 있고, 후속하는 세포 분할을 거쳐서 상실되기 때문이다. 상동성 재조합의 다른 이점은 "녹-아웃"유전자 표적에 대한 능력이며, 이는 에피토프 태그, 내인성 유전자의 스위치 프로모터를 도입하고, 다르게는 유전자 표적을 변경한다(예를 들어 점 돌연변이의 도입).
두 벡터를 프로토테카 모리포미스(UTEX 1435) 게놈의 특정 영역을 사용하여 구성하였고, KE858을 지정하였다. KE858은 1.3 kb이며, 단백질의 전달 RNA(tRNA)와 상동성을 공유하는 단백질에 대해 암호 영역 부분을 포함하는 게놈 단편이다. 사우던 블롯은 KE858 서열이 프로토테카 모리포미스(UTEX 1435) 게놈에서 단일 복사체 중에 존재한다는 것을 나타냈다. 구성된 제1 유형의 벡터는 SZ725(서열번호 179)를 지정하며, 최적화된 효모 인버타제(suc2) 유전자를 또한 함유하는 pUC19 벡터 백본 내로 클로닝된 전체 1.3 kb KE858 단편으로 이루어진다. KE858 단편은 표적 구성체 내 다른 어느 곳에도 생기지 않는 독특한 SnaB1 부위를 함유한다. 구성된 제2 유형의 벡터는 SZ726(서열번호 180)를 지정하며, KE858 게놈 서열 내 SnaB1 부위에서 효모 인버타제 유전자(suc2)의 전화에 의해 파쇄된 KE858 서열로 이루어진다. 효모 인버타제 유전자 옆에 있는 KE858 서열을 함유하는 전체 DNA 단편은 EcoRI에 의한 소화에 의해 벡터 백본으로부터 절단될 수 있는데, 이는 KE858 영역 말단 중 하나에서 절단된다.
두 벡터는 모두 프로토테카 모리포미스(UTEX 1435) 게놈의 대응하는 KE858 영역 내로 효모 인버타제 유전자(suc2)의 직접적인 상동성 재조합을 사용하였다. 상동성 재조합을 위해 표적화된 게놈 영역과 상동성인 선형 DNA 말단은 SnaB1이 있는 벡터 구성체 SZ725 및 EcoRI가 있는 벡터 구성체 SZ726를 분해하는 것으로 노출되었다. 그 다음에 분해된 벡터 구성체는 상기 기재한 방법을 사용하여 프로토테카 모리포미스 배양물 내로 도입하였다. 그 다음에 각 벡터 구성체로부터 유래된 형질전환체를 수크로스 플레이트를 사용하여 선택하였다. 각 벡터 형질전환으로부터 10개의 독립적인, 클론적으로 순수한 형질전환체를 원하는 게놈 위치(사우던 블롯을 사용) 내로 효모 인버타제 유전자의 성공적인 조합을 위해 및 이식유전자 안정성을 위해 분석하였다.
SZ725 형질전환체의 사우던 블롯 분석은 분석을 위해 선택한 10개의 형질전환체 중 4개가 예측된 재조합 밴드를 함유한다는 것을 나타내었고, 이는 하나의 크로스오버 사건이 벡터 상의 KE858 서열과 게놈 내 KE858 서열 사이에 일어났다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 모두 10개의 SZ726 형질전환체는 예측된 재조합체 밴드를 나타내었고, 이는 이중 크로스오버 사건이 효모 인버타제 이식유전자 옆에 있는 KE858 서열을 운반하는 pSZ726의 EcoRI 단편과 게놈의 대응하는 KE858 영역 사이에 일어났다는 것을 나타낸다.
선택의 부재에서 15 세대에 거쳐서 형질전환체를 성장시킴으로써 수크로스 인버타제 발현 및 이식유전자 안정성을 평가하였다. 사우던 블롯에 의해 이식유전자에 양성인 4개의 SZ725 형질전환체 및 10개의 SZ276 형질전환체를 선택하였고, 형질전환체 각각으로부터 48개의 단일 콜로니를, 우선 글루쿠스 함유 배지에서 선택 없이, 그 다음에 단일 탄소 공급원으로서 수크로스를 함유하는 배지 내 선택과 함께 단계적으로 성장시켰다. 모든 10개의 SZ276 형질전환체(100%)는 15세대 후 수크로스 상에서 성장하는 능력을 보유한 한편, SZ725 형질전환체의 약 97%는 15세대 후 수크로스 상에서 성장하는 능력을 보유하였다. 이중 크로스오버 사건에 의해 도입된 이식유전자(SZ726 벡터)는 세대 배가를 거쳐서 극도로 높은 안정성을 가진다. 대조적으로, 단일 크로스오버 사건에 의해 도입된 이식유전자(SZ725 벡터)는 세대배가를 거쳐서 일부 불안정성을 초래할 수 있는데, 이는 이식유전자의 탠덤 복제물이 도입되고, 이식유전자 옆의 반복된 상동성 영역은 그것들 사이에 위치된 유전자이식 DNA를 재조합하고 절단할 수 있기 때문이다.
이들 실험은 유기체의 핵 염색체 내로 안정하게 도입되는 이종성 수크로스 인버타제를 함유하는 프로토테카 형질전환체를 만들기 위한 상동성 재조합의 성공적인 사용을 증명한다. 상동성 재조합의 성공은 유전자 결실, 점 돌연변이 및 원하는 유전자 생성물을 태그하는 에피토프를 포함하여, 프로토테카 내 다른 게놈 변경을 가능하게 한다. 이들 실험은 또한 진핵 미세조류의 핵 게놈 내 상동성 재조합을 위한 제1 기록 시스템을 증명한다.
내인성 포로토테카 모리포미스 유전자을 녹- 아웃하기 위한 상동성 재조합의 사용: 프로토테카 모리포미스 cDNA/게놈 스크리닝에서, 실시예 4에 기재한 것과 같이, 내인성 스테아릴 ACP 불포화효소(SAPD) cDNA를 확인하였다. 스테아릴 ACP 불포화효소는 지질 합성 경로의 부분이며 그것은 지방 아실 쇄 내로 이중결합을 도입하는 작용을 한다. 일부 경우에, 지방산 프로파일을 변경시키기 위하여 지질 경로 효소의 발현을 녹-아웃하거나 감소시키는 것이 유리하다. 내인성 스테아릴 ACP 불포화효소의 발현이 감소될 수 있는지(또는 녹아웃될 수 있는지) 여부 및 불포화된 지방산 내 대응하는 감소가 숙주 세포의 지질 프로파일에서 관찰될 수 있는지 여부를 평가하기 위하여 상동성 재조합 구성체를 만들었다. 프로토테카 모리포미스(UTEX 1435)의 스테아릴 ACP 불포화효소 유전자의 대략 1.5kb 암호화 서열을 확인하였고 클로닝하였다(서열번호 181). 5'말단(5'표적 부위)에서 0.5kb의 SAPD 암호화 서열을 사용한 다음, 클로렐라 불가리스 3'UTR이 있는 코돈-최적화된 효소 수크로스 인버타제 suc2 유전자를 구동하는 클라미도모나스 레인하르티 β-튜불린 프로모터를 사용하여 상동성 재조합 구성체를 구성하였다. 그 다음에 나머지(~1kb) 프로토테카 모리포미스 SAPD 암호화 서열 클로렐라 불가리스 3'UTR 다음에 삽입하여 3'표적 부위를 구성하였다. 이 상동성 재조합 카세트에 대한 서열은 서열번호 182에 열거한다. 상기 나타낸 바와 같이, 핵 게놈 내 상동성 재조합 카세트의 도입을 위한 성공률은 미세조류를 형질전환하기 전 카세트를 선형화하고, 노출된 말단을 남김으로써 증가될 수 있다. 프로토테카 모리포미스 내 내인성 SAPD 효소를 표적화하는 상동성 재조합 카세트는 선형화한 다음 숙주 세포(프로토테카 모리포미스, UTEX 1435) 내로 형질전환한다. 성공적인 통합은 이중 상호 재조합 사건을 통해 숙주 게놈으로부터 내인성 SAPD 효소 암호화 영역을 제거하는 한편, 새로 삽입된 suc2 유전자의 발현은 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터에 의해 조절될 것이다. 결과 클론은 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스를 함유하는 플레이트/배지를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 상동성 재조합 카세트의 성공적인 도입을 함유하는 클론은 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스 상에서 성장하는 능력을 가질 것이며, 지질 프로파일 내 지방산의 전반적인 포화도 변화는 부차적인 확인 인자로 작용할 것이다. 추가적으로 효모 수크로스 인버타제 suc2 유전자 및 RT-PCR에 특이적인 프로브를 사용하는 사우던 블롯팅 분석은 또한 포지티브 클론 내 인버타제 유전자의 존재 및 발현을 확인할 수 있다. 대안으로서, β-튜불린 프로모터가 없는 동일 구성체를 내인성 SAPD 효소 암호화 영역을 절단하기 위하여 사용할 수 있다. 이 경우에, 새로 삽입된 효모 수크로스 인버타제 suc2 유전자는 내인성 SAPD 프로모터/5'UTR에 의해 조절될 것이다.
실시예 8: 프로토테카 내 다양한 티오에스터라제의 발현
프로토테카 종 내 이종성 티오에스터라제 유전자를 발현하는 방법 및 효과는 본 명세서에 참조로 포함되는 국제특허출원 PCT/US2009/66142에 앞서 기재되었다. 고등 식물 종으로부터 다른 티오에스터라제 유전자/유전자 생성물의 효과를 추가로 조사하였다. 이들 티오에스터라제는 다음의 고등 식물로부터 유래된 티오에스터라제를 포함한다:
Figure 112018108415035-pat00015
모든 경우에, 각각의 상기 티오에스터라제 구성체는 바이오리스틱 유전자총을 사용하여 프로토테카 모리포미스(UTEX 1435) 내로 형질전환하였다. 국제특허 출원 PCT/US2009/66142에 개시된 상동성 재조합을 포함하는 다른 형질전환 방법은 또한 관심의 이종성 유전자 발현에 적합하다. 각각의 상기 티오에스터라제 구성체에 의한 프로토테카 모리포미스(UTEX 1435)의 형질전환은 실시예 2에 기재한 방법을 사용하여 수행하였다. 각각의 구성체는 NeoR 유전자를 함유하였고 100㎍/㎖ G418을 사용하여 포지티브 클론에 대한 선택을 수행하였다. 모든 암호화 영역은 프로토테카 모리포미스 UTEX 1435(표 2) 핵 유전자 내 고유한 코돈 바이어스를 반영하도록 최적화되었다. 구성체에 대한 아미노산 서열과 cDNA 서열은 둘 다 서열 동일성 목록에서 열거한다. 각각의 고등 식물 티오에스터라제에 대한 수송 펩타이드를 프로토테카 모리포미스 델타 12 지방산 불포화효소(서열번호 48)로부터의 또는 클로렐라 프로토코이데스 스테아릴 ACP 불포화효소(서열번호 49)로부터의 조류 코돈 최적화된 수송 펩타이드로 대체하였다. 모든 티오에스터라제 구성체는 클라미도모나스 레인하르티 베타-튜불린 프로모터/5'UTR에 의해 구동되었다. 선택한 포지티브 클론의 성장 및 지질 생성을 야생형(형질전환되지 않음) 프로토테카 모리포미스(UTEX 1435)와 비교하였다. 야생형 및 선택한 포지티브 클론을 2% 글루코스 G418 플레이트에서 성장시켰다. 각 구성체에 대해 선택한 포지티브 클론 상의 지질 프로파일 분석을 이하의 표 15에서 요약한다(면적%로 표현).
다양한 이종성 티오에스터라제를 발현시키는 프로토테카 모리포미스의 지질 프로파일
지방산 UTEX 1435
wt 		티오에스터라제
캘리포니아 월계수 녹나무 아이리스 게르마니카 미리스티카 프라그란스 쿠페아 팔루스트리스 C8:0 쿠페아 후커리아나 쿠페아 란세올라타 쿠페아 팔루스트리스 C14:0 미국 느릅나무
C8:0 0 0 0 0 3.1 1.8 0 0 .09
C10:0 0.02 .07 .02 .01 .09 .56 6.85 1.91 .01 2.85
C12:0 0.05 14 1.82 .09 .05 .25 .2 .29 .06 .74
C14:0 1.65 3 17.3 2.59 5.31 1.45 1.8 1.83 2.87 10.45
C16:0 28.0 21.4 24.3 26.52 31.08 22.84 23.9 25.55 27.23 33.3
C18:0 2.9 2.9 2.7 3.11 2.71 3.24 2.8 3.26 3.62 3.47
C18:1 53.8 45.2 41.3 49.96 39.77 56.62 49.8 55.43 51.04 38.71
C18:2 10.95 10 9.7 11.86 14.17 8.24 9.7 8.17 10.81 7.38
C18:3 α 0.8 .86 .8 .40 .64 .61 .9 .58 .97 .52
전체 포화도
( 면적% ) 		32.62 44.97 46.14 32.32 39.24 31.44 37.35 32.84 33.79 50.9
결과는 모든 티오에스터라제가 일정 수준으로 영향받은 프로파일을 발현한다는 것을 나타낸다. "전체 포화도" 열을 보면, 포화도는 캘리포니아 월계수, 녹나무 및 가장 현저하게는 미국 느릅나무로부터 유래된 것을 포함하는 몇몇 티오에스터라제의 발현에 의해 크게 영향받는다. 전체 포화도%의 이런 변화는 고등 식물로부터의 티오에스터라제의 이종성 발현이 단지 지질 쇄 길이보다 더 명확하게 영향을 미칠 수 있다는 것을 예상치 못했는데; 이는 또한 미세조류에 의해 생성된 지질 프로파일의 다른 속성, 즉 지방산의 포화도에 영향을 미칠 수 있다.
쿠페아 팔루스트리스 C8 티오에스터라제, 쿠페아 후커리아나 티오에스터라제, 캘리포니아 월계수 및 녹나무 티오에스터라제에 의해 형질전환된 선택 클론을 다양한 양의 G418(25㎎/ℓ 내지 50㎎/ℓ) 및 다양한 온도(22℃ 내지 25℃)에서 추가로 성장시켰으며, 이들 클론에 대해 지질 프로파일을 결정하였다. 표 16은 각각의 티오에스터라제를 함유하는 대표적인 클론의 지질 프로파일(면적%)을 요약한다. 미국 느릅나무 티오에스터라제를 함유하는 제2 구성체를 구성하였고 상기 기재한 바이오리스틱 방법을 사용하여 프로토테카 모리포미스(UTEX 1435) 내로 형질전환하였다. 이런 제2 구성체를 상동성 재조합을 통해 세포 내로 도입하였다. 프로토테카 종 내 상동성 재조합 방법은 국제특허출원 PCT/US2009/66142에서 앞서 기재되었다. 사용한 상동성 DNA는 프로토테카 모리포미스 UTEX 1435로부터의 6S rRNA의 게놈 DNA 서열로부터 유래되었다. 선택 작용제는 클라미도모나스 레인하르티 베타-튜불린 프로모터에 의해 구동된 사카로마이세스 세레비시애로부터 유래된 코돈 최적화 suc2 유전자를 사용하여 수크로스 상에서 성장하는 능력이 있다. 본래의 미국 느릅나무 수송 펩타이드를 클로렐라 프로토테코이데스(UTEX 250) 스테아릴 ACP 불포화효소 수송 펩타이드로 대체하였다. 이 구성체의 cDNA를 서열번호 50으로서 서열목록에 열거한다. 포지티브 클론의 선택을 2% 수크로스 플레이트 상에서 수행하였고, 지질 프로파일 결정을 위한 결과 배양물을 또한 2% 수크로스 함유 배지 상에서 성장시켰다. 상동적으로 재조합된 이종성 미국 느릅나무 티오에스터라제를 함유하는 이런 프로토테카 모리포미스 균주에 대한 대표적인 지질 프로파일을 표 16에 요약한다.
이종성 티오에스터라제 유전자를 함유하는 프로토테카 모리포미스 균주의 지질 프로파일
쿠페아 팔루스트리스 C8 쿠페아 후커리아나 녹나무 미국 느릅나무 2
C8:0 12.28 2.37 0 0
C10:0 2.17 12.09 0.02 4.69
C12:0 0.34 0.33 3.81 1.02
C14:0 1.59 2.08 32.73 16.21
C16:0 15.91 20.07 24.03 38.39
C18:0 1.59 1.57 1.21 2.83
C18:1 50.64 41.80 18.64 27.22
C18:2 13.02 16.37 16.57 7.65
C18:3 α 1.52 1.75 1.66 0.74
전체 포화도 33.88 38.51 61.80 63.14
상기 기재한 클론과 같이, 이종성 티오에스터라제 유전자를 함유하는 모든 형질전환체는 일정한 수준으로 영향받은 지방상 프로파일을 나타내었고, 야생형(형질전환되지 않음) 프로토테카 모리포미스와 비교하여 포화된 지방산의 전체%는 또한 변하였다. 상동성 재조합으로 도입된 미국 느릅나무 티오에스터라제를 함유하는 프로토테카 모리포미스는 전체 포화도의 가장 큰 증가를 가졌다.
추가적으로 외인성 쿠페아 후커리아나, 녹나무, 캘리포니아 월계수 또는 미국 느릅나무 티오에스터라제를 함유하는 유전자이식 클론을 신규한 지질 프로파일에 대해 평가하였다. 쿠페아 후커리아나 티오에스터라제 함유 클론은 22℃에서 2% 글루코스, 25㎎/㎖ G418에서 성장할 때 다음의 지질 프로파일을 달성하였다: 5.10% C8:0; 18.28% C10:0; 0.41% C12:0; 1.76% C14:0; 16.31% C16:0; 1.40% C18:0; 40.49% C18:1; 및 13.16% C18:2. 녹나무 티오에스터라제-함유 클론(또한 외인성 수크로스 인버타제를 함유)는 25℃에서 2% 수크로스 중에서 성장시킬 때 다음의 지질 프로파일을 달성하였다: 0.04% C10:0; 6.01% C12:0; 35.98% C14:0; 19.42 C16:0; 1.48% C18:0; 25.44% C18:1; 및 9.34% C18:2. 캘리포니아 월계수 티오에스터라제 함유 클론은 22℃에서 2% 글루코스, 25-100 ㎎/㎖ G418 중에서 성장시킬 때 다음의 지질 프로파일을 달성하였다: 0% C8:0; 0.11% C10:0; 34.01% C12:0; 5.75% C14:0; 14.02% C16:0; 1.10% C18:0; 28.93% C18:1; 및 13.01% C18:2. 미국 느릅나무 티오에스터라제 함유 클론은 28℃에서 2% 글루코스 중에서 성장시킬 때 다음의 지질 프로파일을 달성하였다: 1.54% C10:0; 0.43% C12:0; 7.56% C14:0; 39.45% C16:0; 2.49% C18:0; 38.49% C18:1; 및 7.88% C18:2.
실시예 9: 다수의 외인성 이종성 티오에스터라제 유전자를 갖는 프로토테카의 형질전환
미세조류 균주 프로토테카 모리포미스(UTEX 1435)를 상기 개시한 방법을 사용하여 형질변환하여 단일 클론 중에서 다수의 티오에스터라제를 발현시켰다. 단일 클론 내 다양한 티오에스터라제의 발현은 임의의 단일 티오에스터라제가 단독으로 발현될 때 미세조류가 상술한 것과 완전히 상이한 지방산 프로파일을 갖는 오일을 생성하도록 한다(상기 예에서 증명). 상동성 재조합을 사용하여 사카로마이세스 세레비시애(선택은 수크로스 상에서 성장하는 능력임)로부터의 suc2인 수크로스 인버타제 유전자와 함께 프로토테카 모리포미스(UTEX 1435)를 녹나무 티오에스터라제(C14 선호 티오에스터라제)로 우선 형질전환하였다. 이 상동성 재조합 구성체에 사용된 DNA는 상기 부문 III에 기재한 것과 같은 프로토테카 모리포미스 게놈 DNA의 KE858 영역으로부터 유래된다. 이 구성체의 상대적 부분은 서열번호 51로 서열목록에 열거한다. 포지티브 클론을 수크로스-함유 플레이트 상에서 스크리닝하였다. 그 다음에 수크로스-함유 플레이트 상에서 스크리닝하였다. 그 다음에 3개 중 하나의 카세트로 재형질전환하였고, 이들 각각은 항생제 G418뿐만 아니라 추가적인 티오에스터라제에 대한 내성을 암호화한다: (1) 쿠페아 후커리아나의 티오에스터라제 유전자(C8-10 선호), 서열번호 52; (2) 캘리포니아 월계수의 티오에스터라제 유전자(C12 선호), 서열번호 53; 또는 미국 느릅나무의 티오에스터라(넓음; C10-C16 선호), 서열번호 54. 서열목록은 각 구성체의 적절한 서열 부분을 포함한다. 티오에스터라제 유전자를 발현시키는 클론을 50㎍/㎖ G418을 갖는 배지를 함유하는 수크로스 상에 스크리닝하였다. 포지티브 클론을 선택하였고, 성장 및 지질 프로파일을 분석하였다. 표 17은 대표적인 포지티브 클론의 지질 프로파일(면적%로 표현)을 요약한다.
다양한 티오에스터라제로 형질전환된 프로토테카 모리포미스의
지질 프로파일
지방산 UTEX 1435 UTEX 1435 +
녹나무 TE 		UTEX 1435 + 녹나무 TE 유전적 배경
+
쿠페아 후커리아나 TE 		+
캘리포니아 월계수 TE 		+
미국 느릅나무 TE
C8:0 0 0 0.19 0 0.06
C10:0 0.02 0.02 2.16 0.07 1.87
C12:0 0.05 0.66 0.53 13.55 1.61
C14:0 1.65 10.52 7.64 8.0 14.58
C16:0 28.0 22.56 22.31 19.98 29.53
C18:0 2.9 6.67 3.23 2.24 2.93
C18:1 53.8 47.78 48.54 42.55 37.3
C18:2 10.95 12.3 11.76 10.13 8.9
C18:3 α 0.8 0.93 0.91 0.91 0.76
전체 포화도
(면적 %) 		32.62 40.43 36.06 43.84 50.58
추가적으로 녹나무와 캘리포니아 월계수 티오에스터라제를 갖는 이중 티오에스터라제를 22℃에서 50㎎/ℓ G418을 갖는 배지를 함유하는 2% 수크로스 내에서 성장시켰다. 성장 조건 하에 이 균주로부터 얻은 지방산 프로파일은 C8:0(0); C10:0(0.10); C12:0(31.03); C14:0(7.47); C16:0(15.20); C18:0(0.90); C18:1(30.60); C18:2(12.44); 및 C18:3α(1.38)이며, 54.7의 전체 포화도를 가진다.
녹나무 티오에스터라제를 함유하는 2개의 이종성 재조합 구성체(하나는 6S 영역을 표적화하며, 나머지는 KE858 영역을 표적화함)를 갖는 이중 티오에스터라제 클론를 생성하였다. 대표적인 포지티브 클론은 0% C8:0; 0.06% C10:0; 5.91% C12:0; 43.27% C14:0; 19.63% C16:0; 0.87% C18:0; 13.96% C18:1; 및 13.78% C18:2의 지방산 프로파일을 가지며, 69.74%의 전체 포화도를 가진다. 이 클론은 49% 이상으로 C12-C14 수준을 가지는데, 이는 야생형 세포에서 C12-C14 수준의 37배 이상이다.
상기 데이터는 다양한 티오에스터라제가 미세조류 내에서 성공적으로 공동발현될 수 있다는 것을 나타낸다. 다양한 티오에스터라제의 공동발현은 야생형 균주뿐만 아니라 임의의 개개의 티오에스터라제의 발현에 의해 얻어지는 지방산 프로파일과 상당히 다른 변경된 지방산 프로파일을 초래한다. 중복 쇄 길이 특이성을 갖는 다양한 티오에스터라제의 발현은 특정 지방산에서 누적적인 증가를 초래할 수 있다.
프로토테카 모리포미스에서 이종성 티오에스터라제의 발현(단독으로 또는 조합으로)은 숙주 균주에서 지방산/지질 프로파일을 변경시킬 뿐만 아니라, 다양한 종자 식물로부터 현재 이용가능한 오일과 비교할 때(표 5), 이들 프로파일은 다른 현재 이용가능한 시스템에서 발견되는 정말 독특한 오일을 가진다. 유전자이식 균주는 미번역 야생형 균주와 상당한 차이를 나타낼 뿐만 아니라, 표 5에서 나타내는 임의의 상업적 오일과 현저하게 상이한 프로파일을 가진다. 예로서, 코코넛 오일과 팜커넬 오일은 둘 다 5.5-17% 범위의 C8-C10 지방산 수준을 가진다. 쿠페아 팔루스트리스 C8-선호 티오에스터라제 또는 쿠페아 후커리아나 C10-선호 티오에스터라제를 발현하는 유전자이식 균주는 각각 3.66 내지 8.65% 어디에서나 축적된다. 이들 C8-C10 지방산 수준은 코코넛 오일 및 팜커넬과 유사하지만, 유전자이식 조류 균주는 상대적으로 더 높은 C12:0 지방산이 없으며, 그것들은 극도로 높은 C16:0 (각각 유전자이식에서 23% 대 코코넛 오일 또는 팜커넬 오일에서 11-16%) 및/또는 18:1(각각 유전자이식에서 50-57% 대 코코넛 또는 팜커넬 오일에서 8-19%).
실시예 10: 내인성 질소-의존적 프로토테카 프로모터의 확인
A. 내인성 질소-의존적 프로코터의 확인 및 특징화
cDNA 라이브러리는 표준 기술을 사용하여 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)로부터 만들었다. 상기 프로토테카 모리포르미스를 질소 풍부 조건하에서 48시간 동안 성장시켰다. 이어서 5%의 접종물(v/v)을 낮은 질소로 이동시키고 상기 세포를 7일 동안 24시간 마다 채취하였다. 배양 약 24시간 후, 배지 내 질소 공급은 완전히 고갈되었다. 수거된 샘플은 무수 얼음 상 및 아이소프로판올을 사용하여 즉시 동결시켰다. 후속적으로 전체 RNA는 냉동 세포 펠렛 샘플로부터 분리하고 각각의 샘플의 일부는 RT-PCR 연구를 위해 보존하였다. 상기 샘플로부터 수거된 총 RNA의 나머지는 폴리A 선택에 적용하였다. 이어서 각각의 조건으로부터 동몰량의 폴리A 선택된 RNA를 모으고 이를 사용하여 벡터 pcDNA 3.0(Invirogen) 중에서 cDNA 라이브러리를 만들었다. 대략적으로 1200개 클론을 무작위로 수득한 모아진 cDNA 라이브러리로부터 집어내고 양쪽 가닥 상의 서열분석에 적용하였다. 대략적으로 68개의 상이한 cDNA는 이들 1200개의 서열로부터 선택하고 이를 사용하여 실시간 RT-PCR 연구에 사용하기 위한 cDNA 특이적 프라이머를 설계하였다.
보존된 세포 펠렛 샘플로부터 분리된 RNA를 상기 생성된 cDNA 특이적 프라이머를 사용한 실시간 RT-PCR 연구에서 기질로서 사용하였다. 상기 보존된 RNA를 cDNA로 전환시키고 68개 유전자 특이적인 프라이머 세트 각각에 대한 RT-PCR의 기질로서 사용하였다. 역치 사이클 또는 CT 수를 사용하여 시간 전반에 걸쳐 수거된 각각의 RNA 샘플 내에서 68개 cDNA 각각에 대한 상대적인 전사체 풍부함을 나타내었다. 질소 풍부와 질소 고갈된 조건간의 상당한 증가(3배 초과)를 나타내는 cDNA는 잠재적인 유전자로서 플래그하고 이의 발현은 질소 고갈에 의해 상향조절된다. 명세서에서 논의된 바와 같이, 질소 고갈/제한은 유지성 미생물에서 지질 합성의 공지된 유도인자이다.
질소 고갈/제한 동안에 발현이 상향조절되는 cDNA 기원의 추정 프로모터/5'UTR 서열을 동정하기 위해, 총 DNA를 질소 풍부 조건하에서 성장한 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)로부터 분리하고 이어서 454 서열분석 기술(Roche)을 사용하는 서열분석에 적용하였다. 상기 RT-PCR 결과에 의해 상향 조절된 바와 같은 플래그된 cDNA는 454 게놈 서열분석 판독으로부터 비롯된 조립된 콘티그에 대한 BLAST를 사용하여 비교하였다. cDNA의 5' 말단은 특이적 콘티그로 맵핑하고 가능한 경우 500bp 초과의 5' 옆에 있는 DNA를 사용하여 추정적으로 프로모터/UTR을 동정하였다. 이어서 프로모터/5'UTR의 존재는 게놈 DNA의 PCR 증폭을 사용하여 확인하고 클로닝하였다. 개별 cDNA 5' 말단을 사용하여 3' 프라이머를 설계하고 454 콘티그 조립체의 5' 말단을 사용하여 5' 유전자 특이적 프라이머를 설계하였다.
제1 스크리닝으로서, 추정 프로모터중 하나인 Aat2(암모늄 수송체, 서열번호 63)로부터 분리된 5'UTR/프로모터를 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 불포화효소 수송 펩타이드와 함께 녹나무 C14 티오에스테라제 구성체에 클로닝하여 클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 탈수소효소 프로모터를 대체한다. 상기 구성체을 서열번호 81로서 나타낸다. 추정 프로모터를 시험하기 위해, 티오에스테라제 구성체를 프로토테카 모리포르미스 세포로 형질전환시켜 상기된 방법을 사용하여 낮은/무 질소 조건하에서 C14/C12 지방산 증가에 대해 스크리닝하여 실제 프로모터 활성을 확인하였다. cDNA/게놈 스크리닝으로부터 분리된 추정 질소 조정된 프로모터의 유사한 실험은 동일한 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
cDNA/게놈 스크리닝으로부터 분리된 또 다른 추정 질소-조절된 프로모터/5' UTR은 다음과 같다:
Figure 112018108415035-pat00016
배수 증가는 낮은 질소 배지 내 배양의 24시간 후 cDNA 존재도의 몇 배 증가를 말한다.
이들 추청 프로모터/5'UTR의 잠재적 조절에 대해 추가로 파악하기 위하여, 8개의 서열을 추가 시험을 위해 선택하였다: (1) FatB/A; (2) SulfRed 설파이트 환원효소; (3) SugT 당 수송체; (4) Amt02-암모늄 수송체 02; (5) Aat01-아미노산 수송체 01; (6) Aat03-아미노산 수송체 03; (7) Aat04-아미노산 수송체 04; 및 (8) Aat05-아미노산 수송체 05. Illumina 서열 판독을 이용하는 고해상도 전사체를 다양한 시점에 프로토테카 모리포미스 세포로부터 분리한 RNA 상에서 수송하였다: 종자로부터 접종 후 T0(종자); 20 시간; 32 시간; 48 시간; 62 시간; 및 114 시간. T0(종자) 배지는 질소가 풍부한 반면, 20시간 이상의 시점에서, 배지는 질소를 거의 함유하지 않았다. 그 다음에 각 시점에 분리한 RNA로부터 만들어진 조립체화된 전사 콘티그를 앞서 확인한 각각 8개의 전사물과 함께 독립적으로 BLAST 분석을 하였다. 결과를 이하의 표 18에 요약한다.
8개의 추정 프로모터/ 5'UTR에 대한 전사체 발현 프로파일
cDNA TS T20 T32 T48 T62 T114
aa 트랜스_01 절대 98 96 321 745 927 1300
상대 1 0.98 3.28 7.61 9.47 13.28
aa 트랜스_03 절대 7 21 51 137 102 109
상대 1 2.95 7.2 19.42 14.47 15.45
aa 트랜스_04 절대 1 6 25 90 131 160
상대 1 5.16 21.29 74.97 109.35 133.31
aa 트랜스_05 절대 109 88 123 210 214 273
상대 1 0.81 1.13 1.93 1.97 2.51
ammon 트랜스_02 절대 683 173 402 991 1413 1397
상대 1 0.25 0.59 1.45 2.07 2.04
fatA/B-1_cDNA 절대 13 36 654 617 544 749
상대 1 2.8 51.57 48.65 42.9 59.1
sug 트랜스_01 절대 25 25 106 261 266 251
상대 1 1 4.22 10.4 10.63 10
설파이트 환원효소_01 절대 634 238 138 145 163 155
상대 1 0.38 0.22 0.22 0.26 0.24
상기 요약한 결과로부터, 흥미롭게도 설페이트 환원효소 mRNA가 시간에 걸쳐 mRNA 축적의 분명한 감소를 나타내지만, 몇몇 전사는 시간에 걸쳐 증가된 축적을 나타내었다.
이들 8개의 추정 프로모터/5'UTR 영역은 본래의 수송 펩타이드가 빠지거나 클로렐라 프로토테코이데스(UTEX 250) 스테아릴 ACP 불포화효소로부터의 수송 펩타이드로 치환된 녹나무 티오에스터라제 암호화 영역의 상류를 클로닝하였다. 각각의 추정 프로모터/5'UTR 영역 구성체를 6S rRNA의 게놈 서열로부터 DNA를 사용하는 상동성 재조합을 통해 프로토테카 모리포미스 UTEX 1435 내로 도입하였다. 또한 배지/플레이트를 함유하는 수크로스 상에서 포지티브 클론의 선택을 위해 구성체 내에 사카로마이세스 세레비시애로부터 유래된 suc2 수크로스 인버타제 유전자를 함유한다. Aat01에 대한 구성체의 상대적 부분에 대한 cDNA 서열은 서열번호 67로 서열목록에서 열거한다. 다른 구성체에 대해, 동일한 백본을 사용하였고, 유일한 변수는 추정 프로모터/5'UTR 서열이었다. 추가적인 대조군 유전자이식 균주를 만들었으며, 이때 클라미도모나스 레인하르드티 베타 튜불린 프로모터를 녹나무 티오에스터라제 유정자의 발현을 구동하기 위하여 사용하였다. 이 프로모터는 관심의 유전자의 구성적 발현을 구동하는 것으로 나타났고, 따라서 시험한 다양한 추정적 N-조절 프로모터/5'UTR에 의해 구동될 때 동일한 티오에스터라제의 발현을 측정하기에 유용한 대조군을 제공한다.
일단 유전자이식 클론이 만들어지면, 3가지 별개의 실험을 수행하였다. 첫 번째 2가지 실험은 RT-PCR을 통해 고정적 상태의 티오에스터라제 mRNA 수준, 배양 상청액 내 지방산 프로파일 및 암모니아 수준을 측정함으로써 모두 8개의 추정적 프로모터의 잠재적 질소 조절능력을 평가한다. 클론을 초기에 질소가 풍부한 배지(1g/ℓ 질산암모늄-암모니아로서 15mM 질소, 4g/ℓ 효소 추출물) 내에서 28℃에서 교반(200rpm)과 함께 24시간 내지 48시간 동안 성장시켰으며, 이 시점에 20 OD 유닛(A750)은 50㎖의 저질소 배지(0.2g/ℓ 황산암모늄-암모니아로서 3mM 질소, 0.2g/ℓ 효소 추출물)를 접종하기 위하여 사용하였다. 6일 동안 24시간마다 세포를 샘플링하였고, 또한 샘플을 정확하게 수집한 후 저 질소 조건으로 전환하였다. 그 다음에 전체 RNA 추출을 위해 트라이졸 시약을 사용하여 각 샘플로부터 세포 일부를 사용하였다(제조업자의 제시 방법에 따라). 암모니아 분석은 저 질소 배지 내에서 24시간 후 상청액 내 암모니아 수준이 검출 한계(~ 100㎛) 이하로 떨어졌음을 나타내었다.
실시간 RT-PCR을 위해, 모든 RNA 수준을 각 시점에 프로토테카 모리포미스(UTEX 1435) 내에서 발현된 내부 대조군 RNA 수준으로 정상화하였다. cd189로 칭해지는 내부 대조군 RNA는 N-아세틸 오르니틴 아미노트랜스퍼라제를 암호화하는 ARG9 유전자의 생성물이다. 이 실험에서 실시간 RT-PCR을 위해 사용한 프라이머 세트는 하기와 같다:
특이적인 유전자 프라이머 서열 5'-3' 서열번호
녹나무 TE 전방 TACCCCGCCTGGGGCGACAC 서열번호 68
녹나무 TE 역방향 CTTGCTCAGGCGGCGGGTGC 서열번호 69
cd189 전방 CCGGATCTCGGCCAGGGCTA 서열번호 70
cd189 역방향 TCGATGTCGTGCACCGTCGC 서열번호 71
각 시점에 각각의 형질전환체로부터 지질 프로파일을 또한 만들었고 RT-PCR 결과와 비교하였다. 암모니아 수준, RT-PCR 결과 및 C12-C14 지방산 수준의 변화를 기준으로, 아미노산 수송체 01(Aat-01), 아미노산 수송체 04(Aat-04), 및 암모늄 수송체 02(Amt-02) 서열은 기능적 질소-조절가능 프로모터/5'UTR를 함유하는 것으로 결론을 내렸다.
RT-PCR 결과로부터, Aat-01은 대조군(클라미도모나스 레인하르드티 베타 튜불린 프로모터)보다 4배까지 더 큰 정상상태 녹나무 티오에스터라제 mRNA를 구동하는 능력을 증명하였다. 또한 mRNA 수준은 질소 제한 및 C12-C14 지방산 수준의 표시 증가와 관련되었다. 이들 결과는 Aat-01 프로모터와 관련된 5'UTR이 대조군 클라미도모나스 레인하르드티 프로모터보다 지질 생합성 하에서 단백질 합성 구종에 더 효율적일 수 있다는 것을 증명한다. Aat-01 프로모터와 같이, Aat-04 프로모터는 클라미도모나스 레인하르드티 대조군 프로모터보다 5배까지 더 큰 mRNA 축적을 구동할 수 있었다. 그러나, Aat-04 프로모터 구성체는 단지 C12-C14 지방산 수준에 영향을 미치는 보통의 능력을 생성하였다. 이들 데이터는 Aat-04 프로모터가 질소 고갈에 의해 조절가능하지만, UTR은 번역 인핸서로서 불량하게 작용할 수 있다는 것을 증명하였다. 최종적으로, Amt-02 프로모터는 Aat-01 프로모터와 유사하며, 즉, 대조군 프로모터보다 3배까지 더 큰 mRNA 축적을 구동할 수 있었다. mRNA 수준은 질소 제한 및 C12-C14 지방산 수준의 표시된 증가와 관련되었다. 모두 합쳐서, 모두 3가지의 이들 프로모터는 질소-조절되는 것임을 증명하였다.
B. 암모늄 수송체 3( amt03 ) 프로모터의 추가적인 특징 및 다양한 티오에스터라제의 발현 .
상기 기재한 바와 같이, 암모늄 수송체 02 및 03(amt02 및 amt03)으로 칭해지는 부분적 cDNA를 확인하였다. 이들 2개의 부분적 cDNA와 함께, 수송체 01(amt01)로 칭해지는 제3의 부분적 cDNA를 확인하였다. 부분적 cDNA 및 추정적 번역 아미노산 서열의 정렬을 비교하였다. 결과는 amt01이 3개의 서열과 더 멀리 관련된 한편, amt02 및 amt03은 단지 하나의 아미노산이 다르다는 것을 나타낸다.
프로모터/5'UTR은 상기 기재한 바와 같이 Roche 454 게놈 DNA 조립체 및 Illumina 전사체 조립체에 대한 부분적 cDNA 서열을 블라스팅함으로써 처음에 인실리코로 만들었다. amt01, amt02, 및 amt03을 암호화하는 cDNA와 동일성을 나타내는 전사 코팅을 확인하였지만, 전사 코팅 서열은 3개 모두에 의해 공유되는 콘티그 함유 서열로서 3개의 mRNA 사이에 구별될 수 없었다. Roche 454 게놈 DNA 조립체는 amt02 및 amt03 cDNA 서열에 타격을 주며, N-말단 단백질 서열을 함유하였다. PCR은 5'옆에 있는 영역의 클로닝을 수행하였다. amt02 및 amt03 프로모터/UTR을 입증하기 위하여 사용한 PCR 프라이머는 하기와 같다:
Amt03 전방: 5'-GGAGGAATTCGGCCGACAGGACGCGCGTCA-3'(서열번호 85)
Amt03 역방향:5'-GGAGACTAGTGGCTGCGACCGGCCTGTG-3'(서열번호 86)
Amt02 전방: 5'-GGAGGAATTCTCACCAGCGGACAAAGCACCG-3'(서열번호 87)
Amt02 역방향: 5'-GGAGACTAGTGGCTGCGACCGGCCTCTGG-3'(서열번호 88)
두 경우에, 5' 및 3'프라이머는 이들 프로모터/5'UTR 영역의 기능성을 입증하기 위하여 발현 벡터 내에 참여된 클로닝을 위한 유용한 제한 부위를 함유하였다.
이 조합된 인실리코 및 PCR-기반 방법을 통해 클로닝한 DNA와 amt02(서열번호 61) 및 amt03(서열번호 60)를 암호화하는 본래의 cDNA 사이의 쌍 정렬(Pair wise alignment)을 수행하였다. 이들 정렬 결과는 본래의 cDNA와 클로닝된 게놈 서열 사이의 상당한 차이를 보여주었으며, 이는 암모늄 수송체가 다양한 유전자 패밀리를 표시한다는 것을 나타낸다. 추가적으로, amt03에 대한 조합 방법을 기반으로 한 프로모터/5'UTR 클론은 본래의 amt03 서열과 상이한 반면, amt02 서열은 동일하였다. amt03 프로모터/UTR 서열(서열번호 89)을 특징화하는 추가 실험을 수행하였고 이하에 기재한다
상기 확인한 amt03 프로모터/UTR 서열(서열번호 89)을 이런 추정 프로모터/UTR 서열을 클로닝하여 4개의 상이한 티오에스터라제 발현을 구동함으로써 시험하였다. 발현 카세트는 게놈의 6S 좌위에 상류 및 하류의 상동성 재조합 서열을 함유하였다(각각 서열번호 82 및 84). 카세트는 또한 수크로스 함유 배지 상에서 포지티브 클론에 대한 선택을 가능하게 하는 사카로마이세스 세레비시애 SUC2 수크로스 인버타제 cDNA를 함유한다. 수크로스 인버타제 발현은 클라미도모나스 레인하르드티 베타 튜불린 프로모터에 의해 구동되었고, 또한 클로렐라 불가리스 나이트레이트 환원효소 3'UTR을 함유하였다. 그 다음에 amt03 프로모터/UTR 서열은 수크로스 인버타제 카세트의 하류 다음에 4개의 티오에스터라제 유전자: (1) 녹나무의 C14 티오에스터라제; (2) 캘리포니아 월계수의 C12 티오에스터라제; (3) 미국 느릅나무의 C10-C16 티오에스터라제; 또는 (4) 쿠페아 후커리아나의 C10 티오에스터라제 중 하나의 뼈대가 완성된 티오에스터라제 cDNA 서열을 클로닝하였고, 클로렐라 불가리스 나이트레이트 환원효소 3'UTR을 함유하였다. C14 녹나무 티오에스터라제, C12 캘리포니아 월계수 티오에스터라제, 및 C10-C16 미국 느릅나무 모두는 클로렐라 프로토테코이데스 스테아릴 ACP 불포화효소로부터의 수송 펩타이드를 함유하였다. C10 쿠페아 후커리아나 티오에스터라제는 프로토테카 모리포미스 델타 12 지방산 불포화효소(FAD)의 수송 펩타이드를 함유하였다. 모든 경우에, 서열은 프로토테카 모리포미스에서 발현에 대해 코돈 최적화되었다. 앞서 언급한 티오에스터라제 구성체에 대한 서열을 하기 서열목록에 기재한다:
amt03 프로모터/UTR::녹나무 티오에스터라제 구성체 서열번호 90
녹나무 티오에스터라제 구성체 서열번호 91
캘리포니아 월계수 티오에스터라제 구성체 서열번호 92
미국 느릅나무 티오에스터라제 구성체 서열번호 93
쿠페아 후커리아나 티오에스터라제 구성체 서열번호 94
실시예 2에서 상기 기재한 바이오리스틱 형질전환 방법을 통해 유전자이식 계통을 야생형 프로토테카 모리포미스 세포로 만들었고, 수크로스 함유 플레이트/배지 상에서 선택을 수행하였다. 그 다음에 지방산 프로파일이 변경되는 정도에 대해 포지티브 계통을 스크리닝하였다. 그 다음에 각각 4개의 상기 기재한 구성체에 의한 형질전환으로부터 초래된 것인 4개의 계통에 추가적인 분석을 실시하였다. 계통 76은 녹나무 C14 티오에스터라제를 발현하였고, 계통 37은 캘리포니아 월계수 C12 티오에스터라제를 발현하였으며, 계통 60은 미국 느릅나무 C10-C16 티오에스터라제를 발현하였고, 계통 56은 쿠페아 후커리아나 C10 티오에스터라제를 발현하였다. 각 계통을 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스를 함유하는 배지 내에서 48시간 동안 성장시켰고, 지방산 메틸 에스터로 직접적인 에스터결합전이 및 후속하는 GC-FID(상기 기재)에 의한 분석을 통한 지방산 프로파일의 결정을 위해 및 전체 RNA의 분리를 위해 세포의 샘플을 14, 24, 36 및 48 시간(종자 배양물)에 제거하였다. 48시간의 마지막에, pH 5.0(완충된 시트레이트, 0.05M 최종 농도) 또는 pH 7.0(완충된 HEPES, 0.1M 최종 농도)에서 유지한 질소 수준이 없거나 낮은 배양물을 접종하기 위하여 이들 세포를 사용하였다. 배양물 샘플을 지방산 프로파일링 및 전체 RNA의 분리를 위해 12, 24, 72 및 108 시간(지질 생성)에 제거하였다. 이들 배양물의 암모니아 분석은 암모니아 수준이 저 질소 배지 내에서 24시간 후 검출 한계(약 100㎛) 미만으로 떨어진 것을 나타내었다.
티오에스터라제 mRNA 수준 상의 실시간 RT-PCR을 상기 수집한 각각의 시점으로부터의 전체 RNA에서 수행하였고, 모든 mRNA 수준을 내부 대조군 RNA(cd189)의 수준으로 정상화하였다. 실시간 PCR에서 사용한 프라이머를 이하의 표 19에 나타낸다:
프라이머는 실시간 PCR을 설정한다
특이적 유전자 프라이머 서열 5'-3' 서열번호
녹나무 TE 전방 TACCCCGCCTGGGGCGACAC 서열번호 68
녹나무 TE 역방향 CTTGCTCAGGCGGCGGGTGC 서열번호 69
캘리포니아 월계수 TE 전방 CTGGGCGACGGCTTCGGCAC 서열번호 95
캘리포니아 월계수 TE 역방향 AAGTCGCGGCGCATGCCGTT 서열번호 96
미국 느릅나무 TE 전방 CCCAGCTGCTCACCTGCACC 서열번호 97
미국 느릅나무 TE 역방향 CACCCAAGGCCAACGGCAGCGCCGTG 서열번호 98
쿠페아 후커리아나 TE 전방 TACCCCGCCTGGGGCGACAC 서열번호 99
쿠페아 후커리아나 TE 역방향 AGCTTGGACAGGCGGCGGGT 서열번호 100
cd189 역방향 TCGATGTCGTGCACCGTCGC 서열번호 71
cd189 전방 CCGGATCTCGGCCAGGGCTA 서열번호 70
종자 배양물 층에서 각 시점에 지방산 프로파일로부터의 결과는 티오에스터라제로부터의 영향이 매우 적다는 것을 나타내었다. 지질 생성층의 시작으로, 지방산 프로파일은 상당히 영향을 받았으며, 배양물에 대해 훨씬 더 극적인 증가는 pH 5.0에서 배양물과 비교하여 pH 7.0에서 유지되었다. pH 7.0과 5.0 사이의 차이의 중대성이 시험한 각 티오에스터라제와 다른 지방산 축적을 표적화하는 반면, 전반적인 효과는 동일하였다: pH 5.0에서 성장한 세포는 상당히 더 낮은 축적된 표적 지방산을 나타내었지만, 대조군 야생형 세포와 비교할 때 더 높았다.
이들 동일한 샘플로부터 분리된 RNA 분석은 지방산 프로파일 데이터와 매우 상관관계가 있을 것이며, 즉 각각의 티오에스터라제의 정상상태 mRNA 수준 상에서 배양물 pH의 분명한 영향이 있었다. 지방산 축적 데이터와 mRNA 데이터는 함께, amt03 프로모터/UTR에 의해 구동되는 티오에스터라제 유전자 발현의 pH 조절을 전사 수준, mRNA 안정성에서 또는 둘 다에서 분명히 매개하였다. 추가적으로, 캘리포니아 월계수 mRNA의 정상상태 수준은 쿠페아 후커리아나 mRNA의 정상상태 수준과 비교하여 4 로그 더 낮다는 것을 관찰하였다. 이 관찰은 개개의 mRNA 서열이 발연을 제어하는 역할을 할 수 있다는 가설과 일치한다. 이들 데이터는 수송체의 amt03 패밀리에 의한 프로토테카 모리포미스의 암모늄 흡수가 pH에 직접적으로 결합된다는 것을 암시한다.
미국 느릅나무 C10-C16 티오에스터라제의 발현을 구동하는 구성체 amt03 프로모터/UTR에 의한 프로토테카 모리포미스 세포의 형질전환으로부터 만들어진 12개의 계통상에서 추가적인 지방산 프로파일 분석을 수행하였다. 상기 기재한 계통 60은 다음의 분석의 부분이다. 이하의 표 20은 야생형 대조군과 함께 분석한 12개의 계통 중 3개의 지질 프로파일을 나타낸다.
amt03 프로모터/UTR에 의해 구동되는 미국 느릅나무 TE를 함유하는
형질전환체의 지방산 프로파일
면적% C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 전체 포화도
야생형 0.00 0.01 0.04 1.27 27.20 3.85 58.70 7.18 32.36
계통 40 2.38 20.61 3.41 28.41 29.92 1.91 8.57 3.74 86.64
계통 44 1.50 20.16 4.44 31.88 26.66 1.88 6.95 5.42 86.50
계통 60 0.98 14.56 3.15 27.49 31.76 2.14 12.23 6.36 80.06
상기 표에서 나타내는 바와 같이, 전체 포화도 수준은 야생형과 비교하여 계통 40의 경우에 야생형의 2.6배 이상으로 극적으로 상승되었다(12 계통으로부터 전체 포화도를 약 63% 내지 86% 범위로 분석하였다). 추가적으로, 이 수준에서 발현될 때, 미국 느릅나무 티오에스터라제는 불포화도 수준, 특히 C18:1 및 C18:2(계통 40 및 44)를 극적으로 감소시켰으며, 계통 44에서, C18:1 수준은 야생형과 비교하여 8배 이상으로 감소되었다. 또한, 미국 느릅나무 티오에스터라제(amt03 프로모터에 의해 구동됨)는 중간쇄 지방산의 수준을 크게 증가시켰다. 계통 44는 야생형 균주에서 보이는 수준보다 더 큰 56% 초과, 대략 42배 더 큰 C10:0-C14:0 수준 및 및 57% 초과의 C8:0-C14:0 수준을 나타낸다. 미국 느릅나무 티오에스터라제의 발현을 구동하는 Amt03 프로모터의 구성체로 형질전환된 추가적인 균주는 0.23% C8:0; 9.64% C10:0; 2.62% C12:0; 31.52% C14:0; 37.63% C16:0; 5.34% C18:0; 7.05% C18:1; 및 5.03% C18:2의 대표적인 지질 프로파일을 가지며, 전체 포화도%는 86.98%이다.
추가적인 지질 프로파일을 쿠페아 후커리아나 C10 티오에스터라제(서열번호 94)의 발현을 구동하는 구성체 amt03 프로모터/UTR(서열번호 89)에 의한 프로토테카 모리포미스 세포의 형질전환으로부터 만들었다. 이 구성체를 발현하는 포지티브 클론을 선택하였고 pH 7.0 조건에서 성장시켰다. 포지티브 클론으로부터의 대표적인 지질 프로파일은 9.87% C8:0; 23.97% C10:0; 0.46% C12:0; 1.24% C14:0; 10.24% C16:0; 2.45% C18:0; 42.81% C18:1; 및 7.32% C18:2이다. 이 클론은 33.84%의 C8-C10을 가진다.
모두 합쳐서, 데이트는 amt03 프로모터/UTR, 및 그것과 유사한 다른 프로모터가 잠재적으로 독성인 화합물의 발현에 특히 유용하고 유전자 발현의 엄격한 시행이 필요한 완전히 조절된 프로모터로서 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 넓은 범위의(적어도 pH 5.0 내지 7.0) pH 섭생 하에 성장하기 위한 프로토테카 모리포미스의 능력은 이 유기체를 amt03 프로모터/UTR과 같은 조절 요소와 조합하여 특히 유용하게 한다. 추가적으로, 상기 지질 프로파일 데이터는 유전자 발현을 구동하기 위한 amt03 프로모터/UTR의 인상적인 능력을 증명한다.
실시예 11: 미세조류 프로토테카 모리포미스 내 포화된 지방산의 수준 변경
cDNA에 기반한 생물정보학 기반 접근을 사용하는 게놈 스크리닝의 부분으로서, 프로토테카 모리포미스로(UTEX 1435부터 유래된 게놈 DNA의 Illumia 전사체 및 Roche 454 시퀀싱, 지방산 불포화에 수반된 유전자의 2개의 특정 군을 확인하였다: 스테아릴 ACP 불포화효소(SAD) 및 델타 12 지방산 불포화효소(Δ12 FAD). 스테아릴 ACP 불포화효소 효소는 지질 합성 경로의 부분이며, 그것들은 지방 아실 쇄에 이중 결합을 도입하는, 예를 들어 C18:0 지방산으로부터 C18:1 지방산의 합성하는 작용을 한다. 델타 12 지방산 불포화효소는 또한 지질 합성 경로의 부분이며, 그것들은 이미 불포화된 지방산 내로 이중 결합을 도입하는, 예를 들어 C18:1 지방산으로부터 C18:2 지방산의 합성하는 작용을 한다. 생물정보학적 노력 동안 확인한 2 부류의 지방산 불포화효소 유전자에 기반한 프로브를 사용하는 사우던 블롯 분석은 각 부류의 불포화효소 유전자가 다수의 패밀리 구성원을 포함할 가능성이 있다는 것을 나타내었다. 추가적으로 스테아릴 ACP 불포화효소를 암호화하는 유전자는 2개의 별개의 패밀리로 나뉜다. 이들 결과를 기반으로, 불포화효소의 각 패밀리 내에 더 고도로 보존된 암호화 영역을 표적화함으로써 다수의 유전자 패밀리 구성원을 파괴하도록 3개의 유전자 파쇄 구성체를 설계하였다.
3개의 상동성 재조합 표적 구성체를 다음을 사용하여 설계하였다: (1) 델타 12 지방산 불포화효소(d12FAD) 패밀리 구성원의 암호화 서열의 고도로 보존된 일부 및 (2) 각각의 2개의 별개의 SAD 패밀리를 표적화하는 2개의 구성체(각각은 각 패밀리로부터 암호화 서열 영역을 보존하였다). 이 전략은 고전적 유전자 대체 전략보다 이런 고도로 보존된 암호화 영역(다수의 패밀리 구성원을 표적화)에 선택가능한 마커 유전자(수크로스를 가수분해하는 능력을 전달하는 사카로마이세스 세레비시애로부터 유래된 suc2 수크로스 인버타제 카세트)를 포매하되, 해당 상동성 재조합은 표적화된 유전자의 옆에 있는 영역을 표적화하였다.
상기 기재한 방법을 사용하여 모든 구성체를 바이오리스틱 형질전환에 의해 세포 내에 도입하였고, 구성체를 선형화한 후 세포 내로 쏘았다. 형질전환체를 플레이트/배지를 함유하는 수크로스 상에서 선택하였고, 지질 프로파일 상의 변화를 상기-기재한 방법을 사용하여 분석하였다. 각각 3개의 표적화 구성체로부터의 상대적 서열을 이하에 열거한다.
설명 서열번호
표적화 구성체로부터의 d12FAD 암호화영역의 5'서열 서열번호 72
표적화 구성체로부터의 d12FAD 암호화영역의 3'서열 서열번호 73
구성체 cDNA 서열을 표적화하는 d12FAD 서열번호 74
SAD2A의 암호화 영역의 5' 서열 서열번호 75
SAD2A의 암호화 영역의 3'서열 서열번호 76
구성체 cDNA 서열을 표적화하는 SAD2A 서열번호 77
SAD2B의 암호화 영역의 5'서열 서열번호 78
SAD2B의 암호화 영역의 3'서열 서열번호 79
구성체 cDNA 서열을 표적화하는 SAD2B 서열번호 80
각각의 구성체에 의한 형질전환의 대표적인 포지티브 클론을 선택하였고, 이들 클론에 대한 지질 프로파일을 결정하였으며(면적%로 표현), 이하의 표 21에서 요약한다.
불포화효소 녹아웃을 위한 지질 프로파일
지방산 d12FAD KO SAD2A KO SAD2B KO wt UTEX 1435
C8:0 0 0 0 0
C10:0 0.01 0.01 0.01 0.01
C12:0 0.03 0.03 0.03 0.03
C14:0 1.08 0.985 0.795 1.46
C16:0 24.42 25.335 23.66 29.87
C18:0 6.85 12.89 19.555 3.345
C18:1 58.35 47.865 43.115 54.09
C18:2 7.33 10.27 9.83 9.1
C18:3 알파 0.83 0.86 1 0.89
C20:0 0.48 0.86 1.175 0.325
각각의 구성체는 원하는 부류의 지방산에서 측정가능한 영향을 가지며, 모두 3가지 경우에 C18:0 수준은, 특히 2번의 SAD 녹아웃에 의해 현저하게 증가하였다. 양한 클론과 SAD 녹아웃의 추가적인 비교는 SAD2B 녹아웃 계통이 SAD2A 계통과 함께 관찰한 C18:1 지방산 수준보다 C18:1 지방산에서 상당히 더 큰 감소를 가진다는 것을 나타낸다.
추가적인 Δ12 지방산 불포화효소(FAD) 녹아웃을 상기 기재한 방법을 사용하여 프로토테카 모리포미스 배경에서 만들었다. Δ12FAD의 잠재적 상동성을 확인하기 위하여, 다음의 프라이머를 사용하여 추정 FAD를 암호화하는 게놈 영역을 증폭하였다:
프라이머 1 5'-TCACTTCATGCCGGCGGTCC-3' 서열번호 101
프라이머 2 5'- GCGCTCCTGCTTGGCTCGAA-3' 서열번호 102
상기 프라이머를 사용하는 프로토테카 모리포미스 게놈 DNA의 게놈 증폭으로부터 초래된 서열은 매우 유사하였지만, Δ12FAD의 다양한 유전자 또는 대립유전자가 프로토테카에 존재한다는 것을 나타내었다.
이 결과를 기준으로, 2개의 유전자 파쇄 구성체를 하나 이상의 Δ12FAD 유전자를 불활성화하는 것을 추구하도록 설계하였다. 전략은 수크로스 인버타제(사카로마이세스 세레비시애 유래의 (suc2) 카세트를 포매하는 것이며, 따라서 이는 고전적 유전자 대체 전략의 사용보다 고도로 보존된 암호화 영역 내에 선택가능한 마커로서 수크로스를 가수분해하는 능력을 부여한다. pSZ1124로 칭해지는 제1 구성체는 사카로마이세스 세레비시애 suc2 유전자와 클로렐라 불가리스 나이트레이트 3'UTR(사카로마이세스 세레비시애 suc2 카세트)의 발현을 구동하는 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터 옆에 있는 5' 및 3'게놈 표적화 서열을 함유하였다. pSZ1125로 칭해지는 제2 구성체는 사카로마이세스 세레비시애 suc2 유전자 및 클로렐라 불가리스 나이트레이트 환원효소 3'UTR의 발현을 구동하는 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터 옆에 있는 5' 및 3'게놈 표적화 서열을 함유하였다. 구성체의 상대적 서열은 서열 목록에서 열거한다:
pSZ1124 (FAD2B) 5' 게놈 표적화 서열 서열번호 103
pSZ1124 (FAD2B) 3' 게놈 표적화 서열 서열번호 104
사카로마이세스 세레비시애 suc2 카세트 서열번호 105
pSZ1125 (FAD2C) 5' 게놈 표적화 서열 서열번호 106
pSZ1125 (FAD2C) 3' 게놈 표적화 서열 서열번호 107
pSZ1124 및 pSZ1125를 각각 프로토테카 모리포미스 배경에 도입하였고, 수크로스를 가수분해하는 능력을 기반으로 포지티브 클론을 선택하였다. 표 22는 pSZ1124 및 pSZ1125 표적화 벡터를 이용한 2개의 유전자이식 계통에서 얻은 지질 프로파일을 요약한다(면적%, 상기 기재한 방법을 사용하여 만든다).
Δ12 FAD 녹아웃의 지질 프로파일
C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3α
모체 0.01 0.03 1.15 26.13 1.32 4.39 57.20 8.13 0.61
FAD2B 0.02 0.03 0.80 12.84 1.92 0.86 74.74 7.08 0.33
FAD2C 0.02 0.04 1.42 25.85 1.65 2.44 66.11 1.39 0.22
FAD2B(pSZ1124) 구성체를 함유하는 유전자이식은 지질 프로파일에서 매우 흥미로우며 예상치 못한 결과를 제공하였고, 즉 감소할 것으로 예상되는 C18:2 수준은 단지 하나의 면적%에 대해서만 감소되었다. 그러나, C18:1 지방산 수준은 상당히 감소된 C16:0 수준을 훼손시키면서 거의 배타적으로 상당히 증가하였다. FAD2C(pSZ1125) 구성체를 함유하는 유전자이식은 또한 지질 프로파일의 변화를 제공하였다: C18:2 수준은 C18:1 수준의 대응하는 증가와 함께 상당히 감소되었다.
우지 모방체
상기 기재한 바와 같은 상기 SAD2B 녹아웃으로부터 만든 하나의 포지티브 클론을 C14-선호 지방 아실-ACP 티오에스터라제 유전자의 추가 도입을 위해 배경으로 사용하도록 선택하였다. 녹나무 C14-선호 티오에스터라제를 도입하는 구성체는 6S rRNA 게놈 영역에 대한 표적화 서열(상동성 재조합을 통해 DNA를 형질전환하는 표적화된 도입을 허용)을 함유하였고, 발현 구성체는 클로렐라 불가리스 나이트레이트 환원효소 3'UTR로 neoR 유전자의 발현을 구동하는 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터, 다음에 제2 클로렐라 불가리스 나이트레이트 환원효소 3'UTR로 클로렐라 프로토테코이데스 스테아릴 ACP 불포화효소 수송 펩타이드에 의한 코돈-최적화된 녹나무 티오에스터라제의 발현을 구동하는 제2 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터를 함유하였다. 5' 6S rRNA 게놈 공여체 서열을 서열번호 82에 열거하며; 3' 6S rRNA 게놈 공여체 서열을 서열번호 84에 열거하고; 녹나무 티오에스터라제에 대한 적절한 발현 구성체를 서열번호 83에 열거한다.
상기 기재한 바와 같은 바이오리스틱 방법을 사용하여 형질전환을 수행하였고, 세포를 2% 수크로스를 함유하는 플레이트 상에서 24 시간 동안 회수하였다. 이 시간 후, 세포를 재현탁하였고, 선택을 위해 2% 수크로스 및 50㎍/㎖ G418를 함유하는 플레이트 상에 재플레이팅하였다. 만든 포지티브 클론 중 9개의 클론을 지질 생성 및 지질 프로파일을 위해 선택하였다. 9개의 유전자이식 클론(SAD2B KO 및 발현 녹나무 C14-선호 티오에스터라제를 지님)을 상기 기재한 바와 같이 배양하였고, 지질 프로파일에 대해 분석하였다. 결과를 이하의 표 23에 요약한다. 탤로에 대한 지질 프로파일을 또한 이하의 표 23에 포함한다(National Research Council 1976: Fat Content and Composition of Animal Product).
티오에스터라제 형질전환된 클론의 지질 프로파일
C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20
SAD2BKO
녹나무 TE 클론 1		 0.01 0.33 6.13 24.24 0.19 11.08 42.03 13.45 0.98 0.73
SAD2BKO
녹나무 TE 클론 2		 0.01 0.16 3.42 23.80 0.40 9.40 50.62 10.2 0.62 0.70
SAD2BKO
녹나무 TE 클론 3		 0.01 0.20 4.21 25.69 0.40 7.79 50.51 9.37 0.66 0.63
SAD2BKO
녹나무 TE 클론 4		 0.01 0.21 4.29 23.57 0.31 9.44 50.07 10.07 0.70 0.70
SAD2BKO
녹나무 TE 클론 5		 0.01 0.18 3.87 24.42 0.32 9.24 49.75 10.17 0.71 0.71
SAD2BKO
녹나무 TE 클론 6		 0.01 0.28 5.34 23.78 0.33 9.12 49.12 10.00 0.68 0.70
SAD2BKO
녹나무 TE 클론 7		 0.01 0.15 3.09 23.07 0.32 10.08 51.21 10.00 0.66 0.74
SAD2BKO
녹나무 TE 클론 8		 0.01 0.29 5.33 24.62 0.37 7.02 49.67 10.74 0.69 0.70
SAD2BKO
녹나무 TE 클론 9		 0.01 0.12 2.74 25.13 0.30 10.17 50.18 9.42 0.71 0.71
wt UTEX 1435 0.01 0.02 0.96 23.06 0.79 3.14 61.82 9.06 0.46 0.27
SAD2BKO 0.01 0.03 0.80 23.66 0.13 19.56 43.12 9.83 1.00 1.18
탤로 0.00 0.00 4.00 26.00 3.00 14.00 41.00 3.00 1.00 0.00
표 23에서 나타내는 바와 같이, 유전자이식 계통의 지질 프로파일은 탤로의 질 프로파일과 상당히 유사하다. 종합적으로, 해당 데이터는 이 경우에, 즉 C14-선호 티오에스터라제(녹나무 유래)에 의한 SAD2B 녹아웃에서 탤로의 지질 프로파일과 유사한 오일을 생성하는 유전자이식 조류 균주를 만드는 특정 유전자이식 배경을 조합하는 효용을 증명한다.
표적화된 녹-아웃 접근에 의한 β- 케토아실 신타제 II( KASII )의 발현을 하향조절하기 위하여 사용된 구성체
표적화된 녹-아웃 접근에 의한 벡터 하향조절 KASII 유전자 발현을 UTEX 1435, S1331의 고전적으로 돌연변이유발된 유도체 내에 도입하였다. 사카로마이세스 세레비시애 인버타지 유전자를 선택가능한 마커로서 이용하여, 수크로스상에서 성장 능력을 부여하였다. 클라미도모나스 레인하르드티 B-튜불린 프로모터의 제어 하에 인버타제 발현 카세트를 315bp의 긴 KASII 게놈 영역의 중간에 삽입하여 표적화된 통합을 허용하였다(pSZ1503).
pSZ1503 내 적절한 제한 부위를 소문자, 볼드체 및 밑줄로 나타내었고, 이는 각각 5'-3' BspQ 1, Kpn I, AscI, Xho I, Sac I, BspQ I이었다. BspQI 부위는 DNA를 형질전환하는 5' 및 3'말단의 범위를 정한다. 볼드체, 소문자 서열은 상동성 재조합을 통해 KASII 좌위에서 표적화된 통합을 허용하는 S1331으로부터의 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3'방향으로 진행하면, 효모 수크로스 인버타제 유전자의 발현을 구동하는 클라미도모나스 레인하르드티 B-튜불린 프로모터(수크로스를 대사하는 S1331의 능력을 부여)는 박스로 표시된다. 인버타제에 대한 개시자 ATG 및 종결자 TGA를 대문자, 볼드 이탤릭체로 표시하는 한편, 암호화 영역을 소문자 이탤릭체로 표시하였다. 클로렐라 불가리스 나이트레이트 환원효소 3' UTR을 소문자 밑줄로 표시한다.
pSZ1503_[KASII_btub-y.inv-nr_KASII]에 함유된 DNA를 형질전환하는 뉴클레오타이드 서열:
Figure 112018108415035-pat00017
KAS II 대립유전자 1 및 대립유전자 2의 cDNA를 각각 서열번호 279 및 280에서 확인하였다. 대립유전자 1 및 2의 아미노산 서열을 서열번호 281 및 282에서 각각 확인하였다.
지질 조성물에서 KASII 불활성화의 영향을 결정하기 위하여, pSZ1503 벡터 DNA를 S1331로 형질전환하여 표적화된 KASII 녹-아웃 표현형을 만들어냈다. 처음에 하나의 클론을 분리하였고, pH5.0에서 표준 지질 생성 조건 하에 성장시켰다. 가장 대표적인 클론 및 야생형 세포의 결과 프로파일을 이하의 표 31에 나타낸다.
Figure 112018108415035-pat00018
실시예 12: 대안의 선택가능한 마커에 의한 프로토테카 유전자조작
A. 프로토테카 모리포미스 내 분비성 α-갈락토시다제의 발현
프로토테카 종 내 이종성 수크로스 인버타제 유전자의 발현 방법 및 효과는 본 명세서에 참조로 포함되는 국제특허출원 PCT/US2009/66142에서 앞서 기재되었다. 다른 이종성 다당류 분해 효소의 발현은 이 실시예에서 시험하였다. α-갈락토시다제를 암호화하는 다음의 외인성 유전자 외의 프로토테카 모리포미스 UTEX 1435에 의한 멜리비오스(α-D-gal-glu)를 성장시키는 능력을 시험하였다: 사카로마이세스 카를베젠시스(Saccharomyces carlbergensis) 유래의 MEL1 유전자(NCBI 등록번호 P04824에 대응하는 아미노산 서열(서열번호 108)), 아스퍼질러스 니거로부터 유래된 AglC 유전자(NCBI 접수번호 Q9UUZ4에 대응하는 아미노산 서열(서열번호 116)), 및 고등 식물로부터의 α-갈락토시다제(구아콩)(NCBI 접수번호 P14749에 대응하는 아미노산 서열(서열번호 120). 상기 접수 번호 및 대응하는 아미노산 서열을 본 명세서에 참조로 포함한다. 모든 경우에, 프로토테카 모리포미스에서 선호되는 코돈 사용빈도에 따라서 유전자를 최적화하였다. 발현 카세트의 적절한 일부를 서열목록 번호와 함께 이하에 열거한다. 모든 발현 카세트는 안정한 게놈 통합을 위한 5'및 3'Clp 상동성 재조합 표적화 서열, 클라미도모나스 레인하르티 TUB2 프로모터/5'UTR, 및 클로렐라 불가리스 나이트레이트 환원효소 3'UTR을 사용하였다.
Figure 112018108415035-pat00019
프로토테카 모리포미스 세포를 상기 실시예 2에 기재한 바이오리스티기 형질전환 방법을 사용하여 사카로마이세스 카를베젠시스 MEL1, 아스퍼질러스 니거 AlgC, 또는 시아몹시스 테트라고노볼라 α-갈락토시다제 유전자를 함유하는 각각 3개의 발현 카세트로 형질전환하였다. 포지티브 클론을 유일한 탄소 공급원으로서 2% 멜리비오스를 함유하는 플레이트를 사용하여 스크리닝하였다. 콜로니는 시아몹시스 테트라고노볼라 발현 카세트 형질전환체에 대한 플레이트 상에 나타나지 않았다. 포지티브 클론을 사카로마이세스 카를베젠시스 MEL1 형질전환체 및 아스퍼질러스 니거 AlgC 형질전환체를 함유하는 플레이트로부터 취했다. 표적화하는 프라이머에 의해 PCR을 사용하여 형질전환 DNA의 통합을 클로렐라 불가리스 3'UTR 및 3' Clp 상동성 재조합 표적 서열의 일부를 확인하였다.
5' 프라이머 클로렐라 불가리스 3'UTR:하류 Clp 서열(서열번호 123)
ACTGCAATGCTGATGCACGGGA
3'프라이머 클로렐라 불가리스 3'UTR:하류 Clp 서열(서열번호 124)
TCCAGGTCCTTTTCGCACT
음성 대조군으로서, 미번역 프로토테카 모리포미스 세포로부터의 게놈 DNA를 또한 프라이머 세트를 증폭하였다. 생성물은 야생형 세포로부터의 게놈 DNA로부터 증폭되지 않았다.
각각의 사카로마이세스 카를베젠시스 MEL1 형질전환체 및 아스퍼질러스 니거 AlgC 형질전환체으로부터의 몇몇 포지티브 클론(PCR로 확인)을 액체 배지 내 유일한 탄소 공급원으로서 멜리비오스를 성장시키는 능력에 대해 시험하였다. 이 분비 클론을 유일한 탄소 공급원으로서 멜리비오스와 함께 상기 실시예 1에 기재한 조건 및 기본 배지 중에서 3일 동안 성장시켰다. α-갈락토시다제-암호화 유전자 중 하나를 함유하는 모든 클론이 이 시간 동안 강하게 성장하는 한편, 형질전환되지 않은 사카로마이세스 세레비시애 SUC2 수크로스를 발현시키는 야생형 균주와 프로토테카 모리포르미스는 둘 다 멜리비오스 배지 상에서 불량하게 성장한다. 이들 결과는 α-갈락토시다제 암호화 유전자가 형질전환을 위한 선택가능한 마커로서 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 또한, 이들 데이터는 사카로마이세스 카를베젠시스 MEL1(서열번호 109) 또는 아스퍼질러스 니거 AlgC(서열번호 117)에 존재하는 본래의 신호 펩타이드가 프로토테카 모리포미스 세포 내 주변세포질에 단백질을 표적화하는데 유용하다는 것을 나타낸다.
B. THIC 유전자는 프로토테카 내에서 티아민 영양요구성을 보완한다
프로토테카 모리포미스 세포 내 티아민 원영양성(prototrophy)을 외인성 THIC 유전자의 발현을 사용하여 시험하였다. 식물 및 조류 내 티아민 생합성은 전형적으로 플라스티드 내에서 수행되며, 따라서 그것의 생성에 수반되는 대부분의 핵 암호화된 단백질이 플라스티트로 효율적으로 표적화될 필요가 있을 것이다. 프로토테카 모리포미스의 DNA 시퀀싱 및 전사체 시퀀싱은 티아민 생합성 효소를 암호화하는 모든 유전자가 THIC의 발현과 함께 게놈 내에 존재하는 것을 나타내었다. 생화학 수준에서 티아민 영양요구성을 초래하는 손상을 나누기 위하여, 5개의 상이한 섭생 하에: (1) 2㎛ 티아민 하이드로클로라이드의 존재 하에; (2) 티아민 없이; (3) 티아민은 없지만, 2㎛ 하이드록시에틸 티아졸(hydroxyethyl thiazole, THZ)과 함께; (4) 티아민은 없지만, 2㎛ 2-메틸-4-아미노-5-(아미노메틸)피리미딘(2-methyl-4-amino-5-(aminomethyl)pyrimidine, PYR); 및 티아민은 없지만, 2㎛ THZ 및 2㎛ PYR과 함께 프로토테카 모리포미스 세포의 성장을 시험하였다. 5개의 상이한 조건 하에서 성장 실험으로부터의 결과는 프로토테카 모리포미스 세포는 드노보 합성을 할 수 있지만, PYR 전구체가 제공된다면 단지 티아민 파이로포스페이트(TPP)를 생성할 수 있는 것으로 나타났다. 이는 프로토테카 모리포미스의 티아민 영양요구성이 THIC 효소에 의해 전환을 촉매하는 아미노이미다졸 리보뉴클레오타이드로부터 하이드록시메틸피리미딘 포스페이트(hydroxymethylpyrimidine phosphate, HMP-P)를 합성할 수 없음에 기인한다는 것과 일치한다.
프로토테카 모리포미스 세포를 실시예 2에서 상기 지재한 바이오리스틱 형질전환 방법을 사용하여 형질전환하였으며, 이는 콕코믹사 C-169 THIC(JGI 단백질 ID 30481에 대응하는 아미노산 서열, 본 명세서에 참조로 포함됨) 및 선택적 마커로서 사카로마이세스 세레비시애 SUC2 수크로스 인버타제를 발현한다. 이 발현 구성체는 콕코믹사 C-169 THIC의 본래의 수송 펩타이드 서열, 게놈 DNA의 6S 영역에 대한 상류 및 하류의 상동성 재조합 표적 서열, 클라미도모나스 레인하르드티 TUB2 프로모터/5'UTR 영역(서열번호 104), 및 클로렐라 불가리스 나이트레이트 환원효소 3'UTR(서열번호 115)을 함유하였다. 사카로마이세스 세레비시애 SUC2 발현은 또한 클라미도모나스 레인하르드티 TUB2 프로모터/5'UTR 영역(서열번호 114)에 의해 구동되었고 클로렐라 불가리스 나이트레이트 환원효소 3'UTR(서열번호 115)을 함유하였다. 유전자는 프로토테카 모리포미스에서 바람직한 코톤 사용빈도에 따라서 최적화되었다. 적절한 발현 카세트 서열을 서열목록에서 열거하며, 이하에서 상술한다:
콕코믹사 C-169 THIC 아미노산 서열 서열번호 125
콕코믹사 C-169 THIC 아미노산 서열 본래의 수송 펩타이드 서열번호 126
콕코믹사 C-169 THIC 형질전환 카세트 서열번호 127
콕코믹사 C-169 THIC 서열(코돈 최적화) 서열번호 128
사카로마이세스 세레비시애 SUC2 서열(코돈 최적화) 서열번호 129
5'6S 상동성 재조합 표적 서열 서열번호 82
3'6S 상동성 재조합 표적 서열 서열번호 84
포지티브 클론의 선택을 티아민 없이 플레이트 상에서 수행하였고 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스를 함유하였다. 콕코믹사 C-169 THIC 유전자 내에서 결합하는 5'프라이머 및 6S 좌위 내 형질전환 DNA의 하류를 어닐링하는 3' 프라이머에 의한 PCR을 사용하여 포지티브 클론을 확인하였다. 또한 사우던 블롯 분석을 사용하여 PCR 확인 포지티브 클론을 확인하였다.
야생형 프로토테카 모리포미스 세포의 티아민 영양요구성을 관찰하기 위하여, 내부 티아민을 보유하는 제1 고갈 세포가 필요하다. 티아민이 없는 배지 내에서 성장을 시험하기 위하여, 2㎛ 티아민을 함유하는 배지 내 고정상에 대해 세포를 우선 성장시킨 다음 해당 세포를 티아민이 없는 배지 내 750㎚에서 대략 0.05의 광학 밀도(OD750)로 희석하였다. 그 다음에 희석한 세포를 티아민이 없는 배지 내 고정상에 대해 한번 더 성장시켰다(약 2-3일). 이들 티아민-고갈 세포를 티아민이 없는 배지 내에서 성장 연구를 위한 배양물을 접종하기 위하여 사용하였다. 야생형 세포를 탄소 공급원으고서 글루코스와 함께 매지 내에서 성장시켰고(티아민과 함께 또는 티아민 없이), 본래의 수송 펩타이드 콕코믹사 C-169 THIC 구성체가 있는 포지티브 클론을 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스와 함께 배지 내에서 성장시켰다. 750㎚에서 흡광도를 모니터링함으로써 성장을 측정하였다. 성장 실험의 결과는 무티아민 배지 내 야생형 세포와 비교하여 이식유전자를 발현시키는 균주의 무티아민 배지 내 실질적으로 더 큰 성장을 나타내었다. 그러나, 형질전환체는 티아민-함유 배지 내 야생형 세포의 성장속도 및 세포밀도를 달성하지 못하였다. 또한 무티아민 배지 내 형질전환체 클론의 성장량과 통합된 콕코믹사 효소의 복제물 수 사이에는 강한 상관관계가 있었다(즉, 이식유전자의 더 많은 복제물 수, 무티아민 배지 내 더 많은 세포 성장).
추가적인 형질전환체를 콕코믹사 THIC를 함유하는 발현 구성체, 아라비돕시스 탈리아나(애기장대) THIC 유전자, 및 시네코시스티스 속 PCC 6803 thiC 유전자를 사용하여 만들었다. 콕코믹사 및 아라비돕시스 탈리아나 THIC 유전자의 경우에, 본래의 수송 펩타이드 서열을 클로렐라 프로토테코이데스 스테아릴-ACP 불포화효소(SAD) 유전자로부터의 수송 펩타이드 서열로 대체하였다. 시네코시스티스 속은 시아노박테리아이며, thiC 단백질은 본래의 수송 펩타이드 서열을 함유하지 않는다. 시네코시스티스 속 thiC 구성체에서, 클로렐라 프로토테코이데스 SAD 유전자로부터의 수송 펩타이드 서열을 시테코시스티스 속 thiC의 N-말단에 융합하였다. 모든 경우에, 프로토테카 모리포미스의 발현을 위해 서열을 코돈 최적화하였다. 앞서 언급한 구성체 3가지 모두는 게놈의 6S에 대한 상류 및 하류의 상동성 재조합 표적 서열(서열번호 82 및 84), 클로렐라 프로토테코이데스 액틴 프로모터/5' UTR, 및 클로렐라 프로토테코이데스 EF1A 유전자 3'UTR을 함유하였다. 3가지 구성체 모두는 클라미도모나스 레인하르드티 TUB2 프로모터/5'UTR(서열번호 114)에 의해 구동되는 neoR 유전자를 함유하였고, 클로렐라 불가리스 3'UTR(서열번호 115)을 함유하였으며, G418에 의한 선택을 부여하였다. 아라비돕시스 탈리아나 THIC의 아미노산 서열은 NCBI 접수 번호 NP_180524에 대응하며 및 시네코시스티스 속 thiC 의 아미노산 서열은 NCBI 접수 번호 NP_442586에 대응하며, 둘 다 본 명세서에 참조로 포함된다. 적절한 발현 카세트 서열은 서열 목록에서 열거하며, 이하에 상세하게 설명한다:
Figure 112018108415035-pat00020
G418을 함유하는 플레이트 상에서 포지티브 클론을 스크리닝 하였고, 각 형질전환으로부터 몇몇 클론을 PCR로 확인을 위해 선택하였다. 콕코믹사 C-169(클로렐라 프로토테코이데스 수송 펩타이드를 가짐), 아라비돕시스 탈리아나 및 시네코시스티스 속 PCC 6803 THIC 유전자를 각각 함유하는 형질전환 DNA 구성체의 게놈의 6S 좌위에 통합을 다음의 프라이머에 의한 PCR 분석을 사용하여 확인하였다:
5' THIC 콕코믹사 확인 프라이머 서열(서열번호 141)
ACGTCGCGACCCATGCTTCC
3' THIC 확인 프라이머 서열(서열번호 142)
GGGTGATCGCCTACAAGA
5' THIC 아라비돕시스 탈리아나 확인 프라이머 서열(서열번호 143)
GCGTCATCGCCTACAAGA
5' thiC 시네코시스티스 속. 확인 프라이머 서열(서열번호 144)
CGATGCTGTGCTACGTGA
G418을 함유하는 배지 내 각각의 상이한 구성체의 형질전환체로부터 선택 확인한 포지티브 클론을 사용하여 티아민 고갈 세포 상의 성장 실험(상기 기재)을 수행하였다. 모든 형질전환체를 (다양한 정도의 견고성으로) 무티아민 배지 내에서 성장시킬 수 있었다. 무티아민 배지 내 형질전환체의 성장과 티아민 함유 배지 상에서 야생형 세포의 성장의 비교는 무티아민 배지 내 성장을 지원하는 능력에 대한 다음의 순위를 나타내었다: (1) 아라비돕시스 탈리아나 형질전환체; (2) 콕코믹사 C-169(클로렐라 프로토테코이데스 수송 펩타이드를 가짐) 형질전환체; 및 (3) 시네코시스티스 속 형질전환체. 이들 결과는 아라비돕시스 탈리아나 THIC의 단일 복제물이 프로토테카 모리포미스 세포, 다양한 콕코믹사 C-169 복제물(본래의 수송 펩타이드 서열 또는 클로렐라 프로토테코이데스로부터의 수송 펩타이드 서열 중 하나를 가짐) 및 시네코시스티스 속에서 티아민 영양요구성을 보완할 수 있다는 것을 시사한다. 티아민의 부재에서 THIC는 빠른 성장을 가능하게 할 것을 필요로 한다. 상이한 공급원으로부터 상이한 THIC 결과의 변동성이 주어지면, 프로토테카 종에 존재하는 손상을 완전히 보완하기 위한 임의의 특정 THIC 유전자 능력은 예측가능하지 않다.
3개의 THIC 아미노산 서열의 정렬을 수행하였다. 콕코믹사 및 아라비돕시스 탈리아나의 THIC와 비교하여 시네코시스티스 속의 thiC 사이에 상당한 서열 보존이 존재하지만(아미노산 수준에서 41% 동일성), 시아노박테리아 단백질은 조류 및 식물 단백질에 잘 보존된 N-말단에서 도메인을 상실한다. 상실 도메인(및 추정적으로 구조적 차이를 초래)에도 불구하고, 시테코시스티스 속 thiC를 발현시키는 구성체는 프로토테카 모리포미스 세포 내 티아민 원영양성을 적어도 부분적으로 회복할 수 있었다.
실시예 13: 연료 생산
A. 익스펠러 프레스 및 프레스 보조기를 사용한 미세조류로부터 오일의 추출
DCW를 기준으로 38%의 오일을 함유하는 미세조류 바이오매스는 드럼 건조기로 건조시켜 5 내지 5.5%의 수분함량을 초래하였다. 상기 바이오매스는 프렌치 L250 프레스에 공급하였다. 30.4 kg (67 lbs.)의 바이오매스를 프레스를 통해 공급하고 오일을 회수하였다. 프레스 보조기로서 다양한 %의 스위치그래스와 조합된 동일한 건조된 미세조류 바이오매스를 프레스를 통해 공급하였다. 건조된 미생물 바이오매스와 20% w/w의 스위치그래스의 조합으로 최고 오일을 회수%를 수득하였다. 프레스된 케이크를 이어서 헥산 추출에 적용하고 20% 스위치그래스 조건에 대한 최종 수율은 총 61.6%의 가용 오일(중량으로 계산하여)이었다. 상기 50% 오일 건조 세포 중량을 갖는 바이오매스는 오일을 유리시키기 위해 스위치그래스와 같은 프레싱 보조기의 사용을 요구하지 않는다. 익스펠러 프레스를 사용하여 미세조류로부터 오일을 추출하는 다른 방법은 국제특허출원 PCT/US2010/031108에 기재되며, 본 명세서에 참조로 포함된다.
B. 프로토테카 오일로부너 바이오디젤의 생성
상기 기재한 방법에 따라서 생성된 프로토테카 모리포미스 UTEX 1435의 탈검 오일에 에스터결합전이를 실시하여 지방산 메틸 에스터를 생성하였다. 결과를 이하의 표 24에 나타낸다.
오일의 지질 프로파일은 하기와 같다:
C10:0 0.02
C12:0 0.06
C14:0 1.81
C14.1 0.07
C16:0 24.53
C16:1 1.22
C18:0 2.34
C18:1 59.21
C18:2 8.91
C18:3 0.28
C20:0 0.23
C20:1 0.10
C20:1 0.08
C21:0 0.02
C22:0 0.06
C24:0 0.10
프로토테카 모리포미스 트라이글라이세라이드 오일로부터의 바이오디젤 프로파일
방법 시험 결과 단위
ASTM D6751 A1 바이오디젤 배합 연료의 콜드 소킹 여과성 여과시간 120 초
여과된 부피 300 ㎖
ASTM D93 펜스키 마텐스(Pensky-Martens) 밀폐컵 인화점 사용한 절차 A
보정한 인화점 165.0 ℃
ASTM D2709 중질유 연료 내 물 및 침전물
(원심분리 방법)		 침전물 및 물 0.000 Vol %
EN 14538 ICP OES에 의한 Ca 및 Mg 함량의 결정 (Ca 및 Mg)의 합 <1 ㎎/㎏
EN 14538 ICP OES에 의한 Ca 및 Mg 함량의 결정 (Na 및 K)의 합 <1 ㎎/㎏
ASTM D445 동적/역학적 점성도 104 ℉/40 ℃에서 동적 점성도 4.873 ㎟/s
ASTM D874 윤활오일 및 첨자제로부터의 황산회분 황산회분 < 0.005 Wt %
ASTM D5453 자외선 형광에 의한 경질탄화수소, 불꽃점화 엔진 연료, 디젤 엔진 연료, 및 엔진 오일의 전체 황 결정 황, ㎎/㎏ 1.7 mg/kg
ASTM D130 부식- 구리 스트립 바이오디질-Cu 부식 50℃(122℉)/3시간 1a
ASTM D2500 혼탁점 혼탁점 6 ℃
ASTM D4530 미세 탄소 잔류물 평균 미분화 방법 탄소 잔류물 < 0.10 Wt %
ASTM D664 전위차 적정에 의한 석유제품의 산가 사용한 절차 A
산가 0.20 mg KOH/g
ASTM D6584 기체 크로마토그래피에 의한 B-100 바이오디젤 내 유리 글라이세린 및 전체 글라이세린의 결정 유리 글라이세린 <0.005 Wt %
전체 글라이세린 0.123 Wt %
ASTM D4951 ICP-AES에 의한 윤활 오일 내 추가적인 요소 인 0.000200 Wt %
ASTM D1160 감압에서 석유 제품의 증류 IBP 248 ℃
% 회수에서 AET 336 ℃
10% 회수에서 AET 338 ℃
20% 회수에서 AET 339 ℃
30% 회수에서 AET 340 ℃
40% 회수에서 AET 342 ℃
50% 회수에서 AET 344 ℃
60% 회수에서 AET 345 ℃
70% 회수에서 AET 347 ℃
80% 회수에서 AET 349 ℃
90% 회수에서 AET 351 ℃
95% 회수에서 AET 353 ℃
FBP 362 ℃
회수% 98.5 %
손실% 1.5 %
잔류% 0.0 %
콜드 트랩 부피 0.0 ㎖
IBP

 248 ℃
EN 14112 산화 안정성의 결저(가속화된 산화 시험) 산화 안정성 > 12 시간
작동 온도(보통 110℃) 110 ℃
ASTM D4052 디지털 밀도계에 의한 액체 밀도 60℉에서 API 비중 29.5 °API
ASTM D 6890 점화지연(Ignition Delay, ID) 및 유도 세탄가(Derived Cetane Number, DCN)의 결정 유도 세탄가(DCN) > 61.0
바이오디젤의 지질 프로파일은 공급원료 오일의 지질 프로파일과 매우 유사하였다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공되는 다른 오일은 에스터결합전이로 (a) 적어도 4% C8-C14; (b) 적어도 0.3% C8; (c) 적어도 2% C10; (d) 적어도 2% C12; 및 (3) 적어도 30% C8-C14를 포함하는 지질 프로파일을 가지는 바이오디젤을 얻을 수 있다.
생성된 바이오디젤의 ASTM D6751 A1 방법에 의한 콜드소킹 여과성은 300㎖의 부피에 대해 120초 이었다. 이 시험은 300㎖의 B100의 여과를 수반하며, 16시간 동안 40℉로 냉각시켰고, 실온으로 가온하며, 스테인레스 스틸 지지체를 가지는 0.7 마이크론 유리 섬유 필터를 사용하여 진공하에 여과하였다. 본 발명의 오일은 에스터결합전이에 의해 120초 미만, 100초 미만, 및 90초 미만의 콜드 소킹 시간으로 바이오디젤을 만들수 있다.
C. 재생 디젤의 생성
상기 기재한 방법에 따라서 생산되고 본 실시예에서 바이오디젤을 만들기 위하여 사용한 오일과 동일한 지질 프로파일을 가지는 프로토테카 모리포미스 UTEX 1435의 탈검 오일에 에스터결합전이를 실시하여 재생 디젤을 생성하였다.
오일을 우선 수소처리하여 산소 및 글라이세롤 백본을 제거하였고, n-파라핀을 수득하였다. 그 다음에 n-파라핀에 크래킹 및 이성질체화를 실시하였다. 물질의 크로마토그램을 도 1에 나타낸다. 그 다음에 물질에 냉각 여과를 실시하여, C18 물질의 약 5%를 제거하였다. 냉각 여과 후, 전체 부피 물질은 인화점이 바뀌었고, 인화점, ASTM D-86 증류 분포, 혼탁도 및 점성도를 평가하였다. 인화점은 63℃이었고; 점성도는 2.86 cSt(센티스톡, centistokes)이었으며; 혼탁도는 4℃이었다. ASTM D86 증류값을 표 25에 나타낸다:
ASTM D86 증류 값
℃로 판독
부피 온도
IBP 173
5 217.4
10 242.1
15 255.8
20 265.6
30 277.3
40 283.5
50 286.6
60 289.4
70 290.9
80 294.3
90 300
95 307.7
IBP 331.5
생성된 물질의 T10-T90는 57.9℃이었다. 수소처리, 이성질체화, 및 본 명세서에 개시된 다른 공유적 변형 방법뿐만 아니라 본 명세서에 개시된 증류 및 부분분리(예컨대 냉각 여과)는 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 생성된 트라이글라이세라이드 오일을 사용하여 다른 T10-T90 범위, 예컨대 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 및 65℃를 가지는 재생 디젤 조성물을 만드는데 사용될 수 있다.
생성된 물질의 T10은 242.1℃이었다. 수소처리, 이성질체화, 및 본 명세서에 개시된 다른 공유적 변형 방법뿐만 아니라 본 명세서에 개시된 증류 및 부분분리(예컨대 냉각 여과)는 다른 T10값, 예컨대 180 내지 295, 190 내지 270, 210 내지 250, 225 내지 245, 및 적어도 290의 T10을 가지는 재생 디젤 조성물을 만드는데 사용될 수 있다.
생성된 물질의 T90은 300℃이었다. 수소처리, 이성질체화, 및 본 명세서에 개시된 다른 공유적 변형 방법뿐만 아니라 본 명세서에 개시된 증류 및 부분분리(예컨대 냉각 여과)는 다른 T90값, 예컨대 280 내지 380, 290 내지 360, 300 내지 350, 310 내지 340, 적어도 290의 T90을 가지는 재생 디젤 조성물을 만드는데 사용될 수 있다.
생성된 물질의 FBP는 300℃이었다. 수소처리, 이성질체화, 및 본 명세서에 개시된 다른 공유적 변형 방법뿐만 아니라 본 명세서에 개시된 증류 및 부분분리(예컨대 냉각 여과)는 다른 FBP값, 예컨대 290 내지 400, 300 내지 385, 310 내지 370, 315 내지 360, 적어도 300의 FBP를 가지는 재생 디젤 조성물을 만드는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공된 다른 오일은 수소처리, 이성질체화, 및 다른 공유적 변형의 조합이 실시되며, (a) 적어도 4% C8-C14; (b) 적어도 0.3% C8; (c) 적어도 2% C10; (d) 적어도 2% C12; 및 (3) 적어도 30% C8-C14를 포함하는 지질 프로파일을 갖는 오일을 포함한다.
실시예 14: 맞춤 오일의 생성
본 명세서에 개시된 방법 및 물질을 사용하여, 다양한 맞춤 오일을 생성하였다. 표 32는 균주, 유전자 및 표현형을 부여하는 유전자의 genbank 등록 번호 및 표시된 균주에 의해 생성된 다양한 지방산 프로파일을 나타낸다. 균주 A 및 B는 둘 다 프로토테카 모리포미스(UTEX 1435) 균주이며, 이들 둘 다 오일 수율을 개선하기 위하여 행위별수가 연구에 의해 고전적으로 돌연변이유발된다. 그 다음에 균주 A 및 B는 원하는 유전자를 발현시키기 위하여 적절한 DNA 구성체와 함께 본 명세서에 기재된 바와 같이 유전자 조작한다. 또한 균주를 표시한 바와 같은 내인성 불포화효소를 불활성화하기 위하여 유전자조작하였다. 티오에스터라제의 뉴클레오타이드 서열을 프로토테카에서 발현 및 사용을 위해 코돈 최적화하였다.
유전자 조작하지 않은 프로토테카의 야생형 지방산 프로파일을 표 32의 첫 번째 라인에 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 지방산 프로파일은 상이한 균주에서 상이한 방법으로 극적으로 변경되었다. 예를 들어 비유전적으로 유전자조작된 프로토테카 모리포미스 세포에 의해 생성된 C8:0의 백분율은 0%이다. 그러나, 쿠페아 후커리아나 티오에스터라제를 발현시키기 위하여 유전자 조작된 프로토테카 모리포미스 세포는 전체 트라이글라이세라이드의 0% 내지 13.2%로 C8:0 생성을 증가시켰다. 다른 예에서, 유전자 조작된 균주의 C8:0 및 C10:0의 전체 합한 양은 전체 지방산의 약 39%이었다. 대조적으로, 야생형 세포 내 C8:0 및 C10:0의 전체 합한 양은 0.01%이다. 다른 예에서, 포화된 지방산의 전체 양은 내인성 SAD2b의 발현이 파쇄되는 세포 내 미국 느릅나무 티오에스터라제의 발현에 의해 약 32% 내지 약 90%로 증가하였다. 이는 거의 300%의 증가이다.
이하에 개시된 다양한 지방산 프로파일은 트라이글라이세라이드 오일을 수반하는 무수히 많은 용도에서 유용하다. 예를 들어, 트라이글라이세라이드를 포함하는 더 낮은 탄소 쇄 길이 포화된 지방산(C12:0, C14:0, C16:0)의 높은 수준은 재생 제트 연료 생성에서 특히 유용하다. 바이오디젤 생성을 위해, 고량의 C18:1이 바람직하다. 바형(bar) 비누 생성을 위해, 포화 수준과 더 짧은 쇄의 지방선 사이의 적절한 균형을 제어하고 달성하는 것은 바람직하다. 예로서, 고량의 C12:0는 비누거품 특성에 바람직한 반면, 더 긴 쇄 길이는 더 구조적이며, 한편으로 트라이글라이세라이드를 함유하는 리놀레산 및 리놀렌산은 그것들이 산화적 불안정성에 기여하기 때문에 덜 바람직하다. 액체 비누에 대해, 고량의 C12:0 및 C14:0이 바람직하다. 추가적으로, 바형 비누와 액체 비누 제품 둘 다에 대해, C6:0, C8:0 및 C10:0의 낮은 양이 바람직한데, 이들 더 낮은 쇄 트라이글라이세라이드는 피부 자극물이기 때문이다.
Figure 112018108415035-pat00021
Figure 112018108415035-pat00022
팜커넬 오일
본 발명자들은 팜커넬 오일(PKO)과 유사한 미생물 팜커넬 오일 모방체를 생산하였다. 팜커넬 오일 모방체에, 플라스미드를 구성하였고, 사용하여 균주 A를 형질전환하였고, 오일 생성을 수행하였다. 구성체, pSZ1413(서열번호 231)은 코돈 최적화 쿠페아 라이티 FATB2 유전자(서열번호 284)(Gen bank 등록번호 U56106) 및 SAD2B (스테아릴 ACP 불포화효소) 유전자 파쇄를 포함하였다.
이하의 표 33에서 나타내는 바와 같이, 팜 커넬 오일 모방체는 팜커넬 오일과 유사하였다. PKO 모방체의 3가지의 가장 흔한 지방산(C12:0, C14:0 및 C18:1)의 백분율은 팜 커넬 오일의 10%와 동일하거나 그 이내이다.
팜커넬 오일 모방체의 트라이글라이세라이드 프로파일
C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2
인도네시아 기름야자
(팜 커넬) 		3.0-5.0 2.5-6.0 40-52 14.0-18.0 7.0-10.0 1.0-3.0 11.0-
19.0		 0.5-4.0
pSZ1413 8.33 37.45 18.22 13.52 1.25 15.29 4.95
팜커넬
본 발명자들은 팜커넬 오일과 유사한 미생물 팜커넬 오일을 생성하였다. 몇몇 상이한 플라스미드를 구성하였고, 개별적으로 균주 A로 형질전환되었으며, 오일 생성을 수행하였다. 구성체, pSZ1503(서열번호 283)을 내인성 KASII 유전자를 파쇄하기 위하여 설계하였다. 구성체, pSZ1439(서열번호 237)는 코돈 최적화 인도네시아 기름야자 TE 유전자(서열번호 205)(Gen bank 등록번호 AAD42220.2)를 포함하였다. 구성체, pSZ1420(서열번호 225)은 코돈 최적화 쿠페아 후커리아나 TE 유전자(서열번호 201)(Gen Bank 등록번호 Q39513)를 포함하였다. 구성체, pSZ1119(서열번호 227)는 코돈 최적화 쿠페아 후커리아나 KAS IV 유전자(서열번호 186)(Gen Bank 등록번호 AF060519)뿐만 아니라 쿠페아 라이티 FATB2 유전자(서열번호 184)(Gen Bank 등록번호 U56104)를 포함하였다.
이하의 표 34에서 나타내는 바와 같이, 팜 커넬 오일 모방체는 팜 오일과 유사하였다. 팜 오일 모방체의 3가지 가장 흔한 지방산(C16:0, C18:1 및 C18:2)의 백분율은 팜 오일의 10%와 동일하거나 그 이내이었다.
팜 오일 모방체의 트라이글라이세라이드 프로파일
C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2
인도네시아 기름야자
(팜) 		0 0 0.5-5.9 32.0-47.0 2.0-8.0 34-44 7.2-12.0
pSZ1503 0.01 0.01 0.83 38.36 2.21 48.31 7.60
pSZ1439 0.01 0.04 1.88 43.50 3.32 39.95 9.16
pSZ1420 0.02 0.04 2.44 48.04 2.76 35.62 8.91
pSZ1119 1.77 0.40 7.85 35.45 2.47 42.85 8.15
코코아 버터
본 발명자들은 코코아 버터와 유사한 미생물 코코아 버터 모방체를 생성하였다. 구성체, pSZ1451를 구성하였고, 균주 A로 형질전환하였으며, 오일 생성을 수행하였다. 구성체, pSZ1451(서열번호 239)은 코돈 최적화 카타무스 틴토리우스(Carthamus tinctorus) TE 유전자(서열번호 187)(Gen Bank 등록번호 AAA33019.1)를 포함하였다.
이하의 표 35에서 나타내는 바와 같이, 코코아 버터 오일 모방체는 코코아 버터와 유사하였다. 코코아 버터 모방체의 3가지(C16:0, C18:0 및 C18:1) 가장 흔한 지방산의 백분율은 코코아 버터와 동일하거나 10% 이내이었다.
코코아 버터 모방체의 트라이글라이세라이드 프로파일
C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2
코코아 버터 0 0-1 0-1 0-4 22-38 24-37 29-38 0-3
pSZ1451 0.05 0.14 0.99 28.34 27.39 29.40 10.26
본 발명자들은 라드와 유사한 미생물 라드 모방체를 생성하였다. 몇몇 상이한 플라스미드를 구성하였고, 개별적으로 균주 A로 형질전환하였으며, 오일 생성을 수행하였다. 구성체, pSZ1493(서열번호 241)을 내인성 SAD 2B 유전자를 파괴하고 코돈 최적화 캘리포니아 월계수 TE 유전자(서열번호 285)(Gen Bank 등록번호 M94159)를 동시에 발현하도록 설계하였다. 구성체, pSZ1452(서열번호 240)를 내인성 SAD 2B 유전자를 파괴하고 코돈 최적화 가르시니아 망고스타나 TE 유전자(서열번호 196)(Gen Bank 등록번호 AAB51525.1)를 발현하도록 설계하였다. 구성체, pSZ1449(서열번호 238)를 브라씨카 나푸스 TE 유전자(서열번호 195)(Gen Bank 등록번호 CAA52070.1)를 발현하도록 설계하였다. 구성체 pSZ1458의 폴리뉴클레오타이드 서열은 쿠페아 후커리아나 티오에스터라제(Gen Bank 등록번호 U39834)를 암호화하는 코돈 최적화 폴리뉴클레오타이드를 브라씨카 나푸스 TE 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열(서열번호 195)(Gen Bank 등록번호 CAA52070.1)로 대신하는 것을 제외하고 pSZ1449와 동일하였다.
이하의 표 36에서 나타낸 바와 같이, 라드 모방체는 라드와 유사하였다. 라드 모방체의 3가지 가장 흔한 지방산(C16:0, C18:0 및 C18:1)은 라드의 10%와 동일하거나 그 이내에 있다.
라드 모방체의 트라이글라이세드 프로파일
C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2
라드 3-4 22-26 13-18 39-45 8-15
pSZ1493 1.32 24.79 17.49 41.87 10.01
pSZ1452 1.16 24.49 17.94 45.49 8.05
pSZ1449 1.16 23.98 15.79 47.88 8.29
본 발명은 그것의 특정 실시형태와 함께 기재되지만, 추가 변형이 가능한 것으로 이해될 것이다. 일반적으로 본 발명의 원칙에 따르는 본 출원은 본 발명의 변형, 사용, 또는 적용 중 어떤 것을 다루며, 본 발명이 속하는 당업계에서 공지되고 관례적인 실행 내에서 실현되며, 본 명세서에서 설명하는 필수 특징으로 적용될 수 있는 본 발명으로부터의 일탈을 포함한다.
특허, 특허 출원, 및 간행물을 포함하며, Genbank 등록번호를 포함하는 본 명세서에서 인용되는 모든 참조문헌은 이전에 구체적으로 포함되었든 그렇지 않든 그것의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 언급된 간행물은 본 발명과 함께 사용될 수 있는 시약, 방법 및 개념을 기개하고 개시하는 목적을 위해 인용된다. 이들 참조문헌은 본 명세서에 기재된 본 발명에 관하여 선행기술이라는 용인으로서 해석되어서는 안 된다. 특히, 다음의 특허 출원은 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참조로 포함된다: 2008년 6월 2일 출원된 국제특허출원 PCT/US2008/065563(발명의 명칭:"Production of Oil in Microorganisms"), 2010년 4월 14일 출원된 국제특허출원 PCT/US2010/31108(발명의 명칭 "Methods of Microbial Oil Extraction and Separation") 및 2009년 11월 30일 출원된 국제특허출원 PCT/US2009/066142(발명의 명칭: "Production of Tailored Oils in Heterotrophic Microorganisms").
SEQUENCE LISTING <110> SOLAZYME, INC. <120> Tailored Oils Produced from Recombinant Heterotrophic Microorganisms <130> 057518-406220 <140> PCT/US11/038463 <141> 2011-05-27 <150> US 61/349,774 <151> 2010-05-28 <150> US 61/374,992 <151> 2010-08-18 <150> US 61/414,393 <151> 2010-11-16 <150> US 61/428,192 <151> 2010-12-29 <160> 287 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1187 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chlorella species <400> 1 gatcagacgg gcctgacctg cgagataatc aagtgctcgt aggcaaccaa ctcagcagct 60 gcttggtgtt gggtctgcag gatagtgttg cagggcccca aggacagcag gggaacttac 120 accttgtccc cgacccagtt ttatggagtg cattgcctca agagcctagc cggagcgcta 180 ggctacatac ttgccgcacc ggtatgaggg gatatagtac tcgcactgcg ctgtctagtg 240 agatgggcag tgctgcccat aaacaactgg ctgctcagcc atttgttggc ggaccattct 300 gggggggcca gcaatgcctg actttcgggt agggtgaaaa ctgaacaaag actaccaaaa 360 cagaatttct tcctccttgg aggtaagcgc aggccggccc gcctgcgccc acatggcgct 420 ccgaacacct ccatagctgt aagggcgcaa acatggccgg actgttgtca gcactctttc 480 atggccatac aaggtcatgt cgagattagt gctgagtaag acactatcac cccatgttcg 540 attgaagccg tgacttcatg ccaacctgcc cctgggcgta gcagacgtat gccatcatga 600 ccactagccg acatgcgctg tcttttgcca ccaaaacaac tggtacaccg ctcgaagtcg 660 tgccgcacac ctccgggagt gagtccggcg actcctcccc ggcgggccgc ggccctacct 720 gggtagggtc gccatacgcc cacgaccaaa cgacgcagga ggggattggg gtagggaatc 780 ccaaccagcc taaccaagac ggcacctata ataataggtg gggggactaa cagccctata 840 tcgcaagctt tgggtgccta tcttgagaag cacgagttgg agtggctgtg tacggtcgac 900 cctaaggtgg gtgtgccgca gcctgaaaca aagcgtctag cagctgcttc tataatgtgt 960 cagccgttgt gtttcagtta tattgtatgc tattgtttgt tcgtgctagg gtggcgcagg 1020 cccacctact gtggcgggcc attggttggt gcttgaattg cctcaccatc taaggtctga 1080 acgctcactc aaacgccttt gtacaactgc agaactttcc ttggcgctgc aactacagtg 1140 tgcaaaccag cacatagcac tcccttacat cacccagcag tacaaca 1187 <210> 2 <211> 1414 <212> DNA <213> Chlorella ellipsoidea <400> 2 cgctgcgcac cagggccgcc agctcgctga tgtcgctcca aatgcggtcc cccgattttt 60 tgttcttcat cttctccacc ttggtggcct tcttggccag ggccttcagc tgcatgcgca 120 cagaccgttg agctcctgat cagcatcctc aggaggccct ttgacaagca agcccctgtg 180 caagcccatt cacggggtac cagtggtgct gaggtagatg ggtttgaaaa ggattgctcg 240 gtcgattgct gctcatggaa ttggcatgtg catgcatgtt cacaatatgc caccaggctt 300 tggagcaaga gagcatgaat gccttcaggc aggttgaaag ttcctggggg tgaagaggca 360 gggccgagga ttggaggagg aaagcatcaa gtcgtcgctc atgctcatgt tttcagtcag 420 agtttgccaa gctcacagga gcagagacaa gactggctgc tcaggtgttg catcgtgtgt 480 gtggtggggg ggggggggtt aatacggtac gaaatgcact tggaattccc acctcatgcc 540 agcggaccca catgcttgaa ttcgaggcct gtggggtgag aaatgctcac tctgccctcg 600 ttgctgaggt acttcaggcc gctgagctca aagtcgatgc cctgctcgtc tatcagggcc 660 tgcacctctg ggctgaccgg ctcagcctcc ttcgcgggca tggagtaggc gccggcagcg 720 ttcatgtccg ggcccagggc agcggtggtg ccataaatgt cggtgatggt ggggaggggg 780 gccgtcgcca caccattgcc gttgctggct gacgcatgca catgtggcct ggctggcacc 840 ggcagcactg gtctccagcc agccagcaag tggctgttca ggaaagcggc catgttgttg 900 gtccctgcgc atgtaattcc ccagatcaaa ggagggaaca gcttggattt gatgtagtgc 960 ccaaccggac tgaatgtgcg atggcaggtc cctttgagtc tcccgaatta ctagcagggc 1020 actgtgacct aacgcagcat gccaaccgca aaaaaatgat tgacagaaaa tgaagcggtg 1080 tgtcaatatt tgctgtattt attcgtttta atcagcaacc aagttcgaaa cgcaactatc 1140 gtggtgatca agtgaacctc atcagactta cctcgttcgg caaggaaacg gaggcaccaa 1200 attccaattt gatattatcg cttgccaagc tagagctgat ctttgggaaa ccaactgcca 1260 gacagtggac tgtgatggag tgccccgagt ggtggagcct cttcgattcg gttagtcatt 1320 actaacgtga accctcagtg aagggaccat cagaccagaa agaccagatc tcctcctcga 1380 caccgagaga gtgttgcggc agtaggacga caag 1414 <210> 3 <211> 512 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Yeast sequence <400> 3 Met Thr Asn Glu Thr Ser Asp Arg Pro Leu Val His Phe Thr Pro Asn 1 5 10 15 Lys Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Trp Tyr Asp Glu Lys Asp 20 25 30 Ala Lys Trp His Leu Tyr Phe Gln Tyr Asn Pro Asn Asp Thr Val Trp 35 40 45 Gly Thr Pro Leu Phe Trp Gly His Ala Thr Ser Asp Asp Leu Thr Asn 50 55 60 Trp Glu Asp Gln Pro Ile Ala Ile Ala Pro Lys Arg Asn Asp Ser Gly 65 70 75 80 Ala Phe Ser Gly Ser Met Val Val Asp Tyr Asn Asn Thr Ser Gly Phe 85 90 95 Phe Asn Asp Thr Ile Asp Pro Arg Gln Arg Cys Val Ala Ile Trp Thr 100 105 110 Tyr Asn Thr Pro Glu Ser Glu Glu Gln Tyr Ile Ser Tyr Ser Leu Asp 115 120 125 Gly Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Gln Lys Asn Pro Val Leu Ala Ala 130 135 140 Asn Ser Thr Gln Phe Arg Asp Pro Lys Val Phe Trp Tyr Glu Pro Ser 145 150 155 160 Gln Lys Trp Ile Met Thr Ala Ala Lys Ser Gln Asp Tyr Lys Ile Glu 165 170 175 Ile Tyr Ser Ser Asp Asp Leu Lys Ser Trp Lys Leu Glu Ser Ala Phe 180 185 190 Ala Asn Glu Gly Phe Leu Gly Tyr Gln Tyr Glu Cys Pro Gly Leu Ile 195 200 205 Glu Val Pro Thr Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Tyr Trp Val Met Phe 210 215 220 Ile Ser Ile Asn Pro Gly Ala Pro Ala Gly Gly Ser Phe Asn Gln Tyr 225 230 235 240 Phe Val Gly Ser Phe Asn Gly Thr His Phe Glu Ala Phe Asp Asn Gln 245 250 255 Ser Arg Val Val Asp Phe Gly Lys Asp Tyr Tyr Ala Leu Gln Thr Phe 260 265 270 Phe Asn Thr Asp Pro Thr Tyr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ala Trp Ala 275 280 285 Ser Asn Trp Glu Tyr Ser Ala Phe Val Pro Thr Asn Pro Trp Arg Ser 290 295 300 Ser Met Ser Leu Val Arg Lys Phe Ser Leu Asn Thr Glu Tyr Gln Ala 305 310 315 320 Asn Pro Glu Thr Glu Leu Ile Asn Leu Lys Ala Glu Pro Ile Leu Asn 325 330 335 Ile Ser Asn Ala Gly Pro Trp Ser Arg Phe Ala Thr Asn Thr Thr Leu 340 345 350 Thr Lys Ala Asn Ser Tyr Asn Val Asp Leu Ser Asn Ser Thr Gly Thr 355 360 365 Leu Glu Phe Glu Leu Val Tyr Ala Val Asn Thr Thr Gln Thr Ile Ser 370 375 380 Lys Ser Val Phe Ala Asp Leu Ser Leu Trp Phe Lys Gly Leu Glu Asp 385 390 395 400 Pro Glu Glu Tyr Leu Arg Met Gly Phe Glu Val Ser Ala Ser Ser Phe 405 410 415 Phe Leu Asp Arg Gly Asn Ser Lys Val Lys Phe Val Lys Glu Asn Pro 420 425 430 Tyr Phe Thr Asn Arg Met Ser Val Asn Asn Gln Pro Phe Lys Ser Glu 435 440 445 Asn Asp Leu Ser Tyr Tyr Lys Val Tyr Gly Leu Leu Asp Gln Asn Ile 450 455 460 Leu Glu Leu Tyr Phe Asn Asp Gly Asp Val Val Ser Thr Asn Thr Tyr 465 470 475 480 Phe Met Thr Thr Gly Asn Ala Leu Gly Ser Val Asn Met Thr Thr Gly 485 490 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moriformis <400> 9 tgttgaagaa tgagccggcg ac 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 10 cagtgagcta ttacgcactc 20 <210> 11 <211> 541 <212> DNA <213> Prototheca kruegani <400> 11 tgttgaagaa tgagccggcg agttaaaaag agtggcatgg ttaaagaaaa tactctggag 60 ccatagcgaa agcaagttta gtaagcttag gtcattcttt ttagacccga aaccgagtga 120 tctacccatg atcagggtga agtgttagta aaataacatg gaggcccgaa ccgactaatg 180 ttgaaaaatt agcggatgaa ttgtgggtag gggcgaaaaa ccaatcgaac tcggagttag 240 ctggttctcc ccgaaatgcg tttaggcgca gcagtagcag tacaaataga ggggtaaagc 300 actgtttctt ttgtgggctt cgaaagttgt acctcaaagt ggcaaactct gaatactcta 360 tttagatatc tactagtgag accttggggg ataagctcct tggtcaaaag ggaaacagcc 420 cagatcacca gttaaggccc caaaatgaaa atgatagtga ctaaggatgt gggtatgtca 480 aaacctccag caggttagct tagaagcagc aatcctttca agagtgcgta atagctcact 540 g 541 <210> 12 <211> 573 <212> DNA <213> Prototheca wickerhamii <400> 12 tgttgaagaa tgagccggcg acttaaaata aatggcaggc taagagattt aataactcga 60 aacctaagcg aaagcaagtc 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misc_feature <222> (382)..(382) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 26 Leu Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Asn Gly Val Ile Trp Gly Pro Pro Val 1 5 10 15 Trp Gly His Ser Thr Ser Lys Asp Leu Val Asn Trp Val Pro Gln Pro 20 25 30 Leu Thr Met Glu Pro Glu Met Ala Ala Asn Ile Asn Gly Ser Trp Ser 35 40 45 Gly Ser Ala Thr Ile Leu Pro Gly Asn Lys Pro Ala Ile Leu Phe Thr 50 55 60 Gly Leu Asp Pro Lys Tyr Glu Gln Val Gln Val Leu Ala Tyr Pro Lys 65 70 75 80 Asp Thr Ser Asp Pro Asn Leu Lys Glu Trp Phe Leu Ala Pro Gln Asn 85 90 95 Pro Val Met Phe Pro Thr Pro Gln Asn Gln Ile Asn Ala Thr Ser Phe 100 105 110 Arg Asp Pro Thr Thr Ala Trp Arg Leu Pro Asp Gly Val Trp Arg Leu 115 120 125 Leu Ile Gly Ser Lys Arg Gly Gln Arg Gly Leu Ser Leu Leu Phe Arg 130 135 140 Ser Arg Asp Phe Val His Trp Val Gln Ala Lys His Pro Leu Tyr Ser 145 150 155 160 Asp Lys Leu Ser Gly Met Trp Glu Cys Pro Asp Phe Phe Pro Val Tyr 165 170 175 Ala Asn Gly Asp Gln Met Gly Val Asp Thr Ser Ile Ile Gly Ser His 180 185 190 Val 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gagaggcggt 6960 ttgcgtattg ggcgctcttc c 6981 <210> 91 <211> 1152 <212> DNA <213> Cinnamomum camphora <400> 91 atggccaccg catccacttt ctcggcgttc aatgcccgct gcggcgacct gcgtcgctcg 60 gcgggctccg ggccccggcg cccagcgagg cccctccccg tgcgcgggcg cgcccccgac 120 tggtccatgc tgttcgccgt gatcaccacc atcttctccg ccgccgagaa gcagtggacc 180 aacctggagt ggaagcccaa gcccaacccc ccccagctgc tggacgacca cttcggcccc 240 cacggcctgg tgttccgccg caccttcgcc atccgcagct acgaggtggg ccccgaccgc 300 tccaccagca tcgtggccgt gatgaaccac ctgcaggagg ccgccctgaa ccacgccaag 360 tccgtgggca tcctgggcga cggcttcggc accaccctgg agatgtccaa gcgcgacctg 420 atctgggtgg tgaagcgcac ccacgtggcc gtggagcgct accccgcctg gggcgacacc 480 gtggaggtgg agtgctgggt gggcgcctcc ggcaacaacg gccgccgcca cgacttcctg 540 gtgcgcgact gcaagaccgg cgagatcctg acccgctgca cctccctgag cgtgatgatg 600 aacacccgca cccgccgcct gagcaagatc cccgaggagg tgcgcggcga gatcggcccc 660 gccttcatcg acaacgtggc cgtgaaggac gaggagatca agaagcccca gaagctgaac 720 gactccaccg ccgactacat ccagggcggc ctgacccccc 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<400> 100 agcttggaca ggcggcgggt 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 101 tcacttcatg ccggcggtcc 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 102 gcgctcctgc ttggctcgaa 20 <210> 103 <211> 733 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 103 gctcttcgag acgtggtctg aatcctccag gcgggtttcc ccgagaaaga aagggtgccg 60 atttcaaagc agagccatgt gccgggccct gtggcctgtg ttggcgccta tgtagtcacc 120 ccccctcacc caattgtcgc cagtttgcgc aatccataaa ctcaaaactg cagcttctga 180 gctgcgctgt tcaagaacac ctctggggtt tgctcacccg cgaggtcgac gcccagcatg 240 gctatcaaga cgaacaggca gcctgtggag aagcctccgt tcacgatcgg gacgctgcgc 300 aaggccatcc ccgcgcactg tttcgagcgc tcggcgcttc gtagcagcat gtacctggcc 360 tttgacatcg cggtcatgtc cctgctctac gtcgcgtcga cgtacatcga ccctgcgccg 420 gtgcctacgt gggtcaagta tggcgtcatg tggccgctct actggttctt ccaggtgtgt 480 gtgagggttg tggttgcccg tatcgaggtc ctggtggcgc gcatggggga gaaggcgcct 540 gtcccgctga cccccccggc taccctcccg gcaccttcca 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<213> Aspergillus niger <400> 117 Met Ile Gly Ser Ser His Ala Val Val Ala Leu Gly Leu Phe Thr Leu 1 5 10 15 Tyr Gly His Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ile Gly Ala 20 25 <210> 118 <211> 2244 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 118 atgatcggct cctcccacgc ggtcgtcgcc ctgggcctgt tcaccctgta cggccactcc 60 gccgccgcgc ccgccatcgg cgcctccaac tcccagacca tcgtcacgaa cggcacctcc 120 ttcgccctga acggcgacaa cgtgtcctac cgcttccacg tgaactcctc cacgggcgac 180 ctgatctccg accacttcgg cggcgtggtg tccggcacca tcccctcccc cgtggagccc 240 gcggtcaacg gctgggtggg catgcccggc cgcatccgcc gcgagttccc cgaccagggc 300 cgcggcgact tccgcatccc cgcggtgcgc atccgcgagt ccgccggcta caccgtctcc 360 gacctgcagt acgtgtccca cgaggtgatc gagggcaagt acgcgctgcc cggcctgccc 420 gccacgttcg gcgacgccca ggacgccacc accctggtgg tgcacctgta cgacaactac 480 tcctccgtcg cggccgacct gtcctactcc atcttcccca agtacgacgc gatcgtccgc 540 tccgtgaacg tgaccaacca gggccccggc aacatcacca tcgaggcgct ggcctccatc 600 tccatcgact tcccctacga ggacctggac atggtgtccc tgcgcggcga ctgggcccgc 660 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cgccgcgcca 60 tcatgcgcct gctggaggac gcgctggccg agcgcatgct cgccggcgac gtcaaggagg 120 gcgactcggt catcatggac gtcgatggcg atggcgccat cagcgtcctc aacggagacc 180 gcacccacac caccaccatc gactcctccc cggcgggcat ctcgtagacg cgagagggag 240 ggagggagga ttttcagagg gagatgagac gaggactggg ccgggggcct tggggcgctg 300 ctggagcgtg gtgagagcgc ggcggacgtg ccttttcttc ttccgtgcgc gcgctcttgg 360 ccattgatcc ccgattcgcg cccgcatccc cccactgccc ccatcatctt gcctgttgtc 420 gtggcactga cataaacccc ctgcgctgcg ctgctccgct actattgata taggtctcac 480 gcgccaatct tttttgctcc gggtaaccgt ctggacgcca gaattccttt cttgcgctat 540 gacacttcca gcaaaaggta gggcgggctg cgagacggct tcccggcgct gcatgcaaca 600 ccgatgatgc ttcgaccccc cgaagctcct tcggggctgc atgggcgctc cgatgccgct 660 ccagggcgag cgctgtttaa atagccaggc ccccgattgc aaagacatta tagcgagcta 720 ccaaagccat attcaaacac ctagatcact accacttcta cacaggccac tcgagcttgt 780 gatcgcactc cgctaagggg gcgcctcttc ctcttcgttt cagtcacaac ccgcaaacac 840 tagtatgatc ggctcctccc acgcggtcgt cgccctgggc ctgttcaccc tgtacggcca 900 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cgagacggct tcccggcgct gcatgcaaca 600 ccgatgatgc ttcgaccccc cgaagctcct tcggggctgc atgggcgctc cgatgccgct 660 ccagggcgag cgctgtttaa atagccaggc ccccgattgc aaagacatta tagcgagcta 720 ccaaagccat attcaaacac ctagatcact accacttcta cacaggccac tcgagcttgt 780 gatcgcactc cgctaagggg gcgcctcttc ctcttcgttt cagtcacaac ccgcaaacac 840 tagtatggcc acccactact ccatcatcgg cggcatgatc atcgtcgtcc tgctgatgat 900 catcggctcc gagggcggcc ggctgctgga gaagaagaac cgcacctccg ccgaggcgga 960 gcactacaac gtgcgccgct acctggccga gaacggcctg ggccagaccc cccccatggg 1020 ctggaactcc tggaaccact tcggctgcga catcaacgag aacgtcgtcc gcgagacggc 1080 ggacgccatg gtgtccaccg gcctggccgc cctgggctac cagtacatca acctggacga 1140 ctgctgggcg gagctgaacc gcgactccga gggcaacatg gtgcccaacg ccgccgcgtt 1200 cccctccggc atcaaggcgc tggcggacta cgtccactcc aagggcctga agctgggcgt 1260 ctactccgac gcgggcaacc agacctgctc caagcgcatg cccggctccc tgggccacga 1320 ggagcaggac gcgaagacgt tcgcctcctg gggcgtcgac tacctgaagt acgacaactg 1380 cgagaacctg ggcatctccg tgaaggagcg ctaccccccc 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Chlorella protothecoides <400> 133 acggagcgtc gtgcgggagg gagtgtgccg agcggggagt cccggtctgt gcgaggcccg 60 gcagctgacg ctggcgagcc gtacgccccg agggtccccc tcccctgcac cctcttcccc 120 ttccctctga cggccgcgcc tgttcttgca tgttcagcga c 161 <210> 134 <211> 6306 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 134 gctcttcgcc gccgccactc ctgctcgagc gcgcccgcgc gtgcgccgcc agcgccttgg 60 ccttttcgcc gcgctcgtgc gcgtcgctga tgtccatcac caggtccatg aggtctgcct 120 tgcgccggct gagccactgc ttcgtccggg cggccaagag gagcatgagg gaggactcct 180 ggtccagggt cctgacgtgg tcgcggctct gggagcgggc cagcatcatc tggctctgcc 240 gcaccgaggc cgcctccaac tggtcctcca gcagccgcag tcgccgccga ccctggcaga 300 ggaagacagg tgaggggggt atgaattgta cagaacaacc acgagccttg tctaggcaga 360 atccctacca gtcatggctt tacctggatg acggcctgcg aacagctgtc cagcgaccct 420 cgctgccgcc gcttctcccg cacgcttctt tccagcaccg tgatggcgcg agccagcgcc 480 gcacgctggc gctgcgcttc gccgatctga ggacagtcgg ggaactctga tcagtctaaa 540 cccccttgcg cgttagtgtt gccatccttt gcagaccggt gagagccgac ttgttgtgcg 600 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acctgggctt catctacacc tccttccagg agcgcgccac cttcatctcc 720 cacggcaaca ccgcccgcca ggccaaggag cacggcgaca tcaagctggc ccagatctgc 780 ggcaccatcg ccgccgacga gaagcgccac gagaccgcct acaccaagat cgtggagaag 840 ctgttcgaga tcgaccccga cggcaccgtg ctggccttcg ccgacatgat gcgcaagaag 900 atctccatgc ccgcccacct gatgtacgac ggccgcgacg acaacctgtt cgaccacttc 960 tccgccgtgg cccagcgcct gggcgtgtac accgccaagg actacgccga catcctggag 1020 ttcctggtgg gccgctggaa ggtggacaag ctgaccggcc tgtccgccga gggccagaag 1080 gcccaggact acgtgtgccg cctgcccccc cgcatccgcc gcctggagga gcgcgcccag 1140 ggccgcgcca aggaggcccc caccatgccc ttctcctgga tcttcgaccg ccaggtgaag 1200 ctgatggact acaaggacca cgacggcgac tacaaggacc acgacatcga ctacaaggac 1260 gacgacgaca agtga 1275 <210> 148 <211> 424 <212> PRT <213> Ricinus communis <400> 148 Met Ala Thr Ala Ser Thr Phe Ser Ala Phe Asn Ala Arg Cys Gly Asp 1 5 10 15 Leu Arg Arg Ser Ala Gly Ser Gly Pro Arg Arg Pro Ala Arg Pro Leu 20 25 30 Pro Val Arg Gly Arg Ala Ala Ser Thr Leu Lys Ser Gly Ser Lys Glu 35 40 45 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naturally occurring amino acid <400> 216 Met Val Ala Thr Ser Ala Thr Ser Leu Phe Phe Pro Leu Pro Ser Ser 1 5 10 15 Ser Leu Asp Pro Asn Xaa Lys Thr Asn Asn Arg Val Thr Ser Thr Asn 20 25 30 Phe Ala Gly Leu Gly Pro Thr Pro Asn Ser Gly Gly Arg Met Lys Val 35 40 45 Lys Pro Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys Ile Asn Gly Lys Lys Val Gly 50 55 60 Leu Pro Gly Ser Val Glu Ile Glu Thr Ser Gln Gln Gln Gln Pro Ala 65 70 75 80 Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met Leu Leu Ala 85 90 95 Ala Ile Thr Thr Val Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp Met Met Leu 100 105 110 Asp Trp Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met Ile Met Glu Pro Phe Gly Leu 115 120 125 Gly Arg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Gln Asn Phe Ser Ile 130 135 140 Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser Ile Glu Thr Val 145 150 155 160 Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu Asn Xaa Val Lys Thr Ala Gly 165 170 175 Leu Leu Gly Asp Gly Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met Val Lys Lys Xaa 180 185 190 Leu Ile Trp Val Val Thr Arg Met Gln Val Val Val Asp Thr 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fragrans <400> 222 Pro Asp Trp Ser Met Leu Leu Ala Ala Ile Thr Thr Ile Phe Leu Ala 1 5 10 15 Ala Glu Lys Gln Trp Thr Asn Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Pro Asp 20 25 30 Met Leu Val Asp Phe Asp Pro Phe Ser Leu Gly Arg Phe Val Gln Asp 35 40 45 Gly Leu Ile Phe Arg Gln Asn Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly 50 55 60 Ala Asp Arg Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu Met Asn His Leu Gln Glu 65 70 75 80 Thr Ala Leu Asn His Val Arg Cys Ile Gly Leu Leu Asp Asp Gly Phe 85 90 95 Gly Ser Thr Pro Glu Met Thr Arg Arg Asp Leu Ile Trp Val Val Thr 100 105 110 Arg Met Gln Val Leu Val Asp Arg Tyr Pro Ser Trp Gly Asp Val Ile 115 120 125 Glu Val Asp Ser Trp Val Thr Pro Ser Gly Lys Asn Gly Met Lys Arg 130 135 140 Glu Trp Phe Leu Arg Asp Cys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ala 145 150 155 160 Thr Ser Val Trp Val Met Met Asn Lys Arg Thr Arg Arg Leu Ser Lys 165 170 175 Ile Pro Glu Glu Val Arg Val Glu Ile Glu Pro Tyr Phe Val Glu His 180 185 190 Gly Val Leu Asp Glu Asp Ser Arg Lys Leu Pro Lys Leu Asn Asp Asn 195 200 205 Thr 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ccaccacccc caaggagcgc atcgccctcc agtccgccct caagttcaac 120 ggcggtggtg agtgaatttc gcgaatgtcg gctcaccgcg acgcgattac gaatccgcta 180 actctaacac tttgctgcgg gggatgtgca ggtcacatca accactccct cttctggaag 240 aacctcgccc cagccaagtc tgagggcaag ggaaacggcg gcgccatcaa ggacggcccc 300 ctcaagtcgg cgatcgagca gaactttggt tccgtcgacg tcttcatcaa ggagttcaac 360 gcgaccaccg cgtccatcca gggctccggc tggggctggc tcgtgagtct tctcttctgc 420 gatcggaagg cgcatccggt gttatggtcg cgcgctgcac gcgtgtctcg cttcggctcc 480 gccgtcgaag cgctgatacc gagaccgatc tgctgcaaat catttgcgct gcgatagagc 540 tccgggggct ttaacccttc gttccatgtg ataagaccgc gtctgaccgg gtggtgtttt 600 ctatcgcagg gtctcaaccc ggcgaccaag cgcctcgaga tcacgacgac ggccaaccag 660 gaccctctcc tcacgcacgt ccccatcatc ggcgtcgaca tctgggagca cgcgttc 717 <210> 285 <211> 1561 <212> DNA <213> Umbellularia californica <400> 285 agagagagag agagagagag agctaaatta aaaaaaaaac ccagaagtgg gaaatcttcc 60 ccatgaaata acggatcctc ttgctactgc tactactact actacaaact gtagccattt 120 atataattct atataatttt caacatggcc accacctctt tagcttccgc tttctgctcg 180 atgaaagctg taatgttggc tcgtgatggc cggggcatga aacccaggag cagtgatttg 240 cagctgaggg cgggaaatgc gccaacctct ttgaagatga tcaatgggac caagttcagt 300 tacacggaga gcttgaaaag gttgcctgac tggagcatgc tctttgcagt gatcacaacc 360 atcttttcgg ctgctgagaa gcagtggacc aatctagagt ggaagccgaa gccgaagcta 420 ccccagttgc ttgatgacca ttttggactg catgggttag ttttcaggcg cacctttgcc 480 atcagatctt atgaggtggg acctgaccgc tccacatcta tactggctgt tatgaatcac 540 atgcaggagg ctacacttaa tcatgcgaag agtgtgggaa ttctaggaga tggattcggg 600 acgacgctag agatgagtaa gagagatctg atgtgggttg tgagacgcac gcatgttgct 660 gtggaacggt accctacttg gggtgatact gtagaagtag agtgctggat tggtgcatct 720 ggaaataatg gcatgcgacg tgatttcctt gtccgggact gcaaaacagg cgaaattctt 780 acaagatgta ccagcctttc ggtgctgatg aatacaagga caaggaggtt gtccacaatc 840 cctgacgaag ttagagggga gatagggcct gcattcattg ataatgtggc tgtcaaggac 900 gatgaaatta agaaactaca gaagctcaat gacagcactg cagattacat ccaaggaggt 960 ttgactcctc gatggaatga tttggatgtc aatcagcatg 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Gly Ser Ala Val Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Gly Ser Leu Asp Thr Gln Glu Asp Thr Ser Ser Ser Ser 65 70 75 80 Ser Pro Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met Leu 85 90 95 Leu Ser Ala Ile Thr Thr Val Phe Val Ala Ala Glu Lys Gln Trp Thr 100 105 110 Met Leu Asp Arg Lys Ser Lys Arg Pro Asp Thr Leu Met Asp Pro Phe 115 120 125 Gly Val Asp Arg Val Val Gln Asp Gly Val Val Phe Arg Gln Ser Phe 130 135 140 Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Thr Ala Ser Ile Glu 145 150 155 160 Thr Leu Met Asn Ile Phe Gln Glu Thr Ser Leu Asn His Cys Lys Ser 165 170 175 Ile Gly Leu Leu Asn Asp Gly Phe Gly Arg Thr Pro Glu Met Cys Lys 180 185 190 Arg Asp Leu Ile Trp Val Val Thr Lys Met His Ile Glu Val Asn Arg 195 200 205 Tyr Pro Thr Trp Gly Asp Thr Ile Glu Val Asn Thr Trp Val Ser Glu 210 215 220 Ser Gly Lys Thr Gly Met Gly Arg Asp Trp Leu Ile Ser Asp Cys His 225 230 235 240 Thr Gly Glu Ile Leu Ile Arg Ala Thr Ser Val Cys Ala Met Met Asn 245 250 255 Gln Thr Thr Arg Arg Phe Ser Lys Phe Pro Tyr Glu Val 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Val Lys Ala Ser Ser Gln Ala Pro Pro Lys 1 5 10 15 Leu Asn Gly Ser Asn Val Gly Leu Val Lys Ser Ser Gln Ile Val Lys 20 25 30 Lys Gly Asp Asp Thr Thr Ser Pro Pro Ala Arg Thr Phe Ile Asn Gln 35 40 45 Leu Pro Asp Trp Ser Met Leu Leu Ala Ala Ile Thr Thr Leu Phe Leu 50 55 60 Ala Ala Glu Lys Gln Trp Met Met Leu Asp Trp Lys Pro Lys Arg Pro 65 70 75 80 Asp Met Leu Val Asp Pro Phe Gly Leu Gly Arg Phe Val Gln Asp Gly 85 90 95 Leu Val Phe Arg Asn Asn Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala 100 105 110 Asp Arg Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu Met Asn His Leu Gln Glu Thr 115 120 125 Ala Leu Asn His Val Lys Ser Val Gly Leu Leu Glu Asp Gly Leu Gly 130 135 140 Ser Thr Arg Glu Met Ser Leu Arg Asn Leu Ile Trp Val Val Thr Lys 145 150 155 160 Met Gln Val Ala Val Asp Arg Tyr Pro Thr Trp Gly Asp Glu Val Gln 165 170 175 Val Ser Ser Trp Ala Thr Ala Ile Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Glu 180 185 190 Trp Ile Val Thr Asp Phe Arg Thr Gly Glu Thr Leu Leu Arg Ala Thr 195 200 205 Ser Val Trp Val Met Met Asn Lys Leu Thr Arg Arg Ile Ser Lys Ile 210 215 220 Pro Glu Glu Val Trp His Glu Ile Gly Pro Ser Phe Ile Asp Ala Pro 225 230 235 240 Pro Leu Pro Thr Val Glu Asp Asp Gly Arg Lys Leu Thr Arg Phe Asp 245 250 255 Glu Ser Ser Ala Asp Phe Ile Arg Xaa Gly Leu Thr Pro Arg Trp Ser 260 265 270 Asp Leu Asp Ile Asn Gln His Val Asn Asn Val Lys Tyr Ile Gly Trp 275 280 285 Leu Leu Glu Ser Ala Pro Pro Glu Ile His Glu Ser His Glu Ile Ala 290 295 300 Ser Leu Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu 305 310 315 320 Asn Ser Ala Thr Lys Val Ser Asp Ser Ser Gln Leu Gly Lys Ser Ala 325 330 335 Val Glu Cys Asn His Leu Val Arg Leu Gln Asn Gly Gly Glu Ile Val 340 345 350 Lys Gly Arg Thr Val Trp Arg Pro Lys Arg Pro Leu Tyr Asn Asp Gly 355 360 365 Ala Val Val Asp Val Xaa Ala Lys Thr Ser 370 375

Claims (69)

  1. 프로토테카(Prototheca) 속의 재조합 미세조류로부터 수득된 미세조류 트라이글라이세라이드 오일 조성물로서, 여기서 상기 오일의 지방산 프로파일은 C10:0, C12:0 및 C14:0을 가지는 적어도 40% 포화된 지방산을 포함하고, 상기 오일은 상기 재조합 미세조류의 스테롤을 추가로 포함하며, 상기 재조합 미세조류는 조작되지 않은 미세조류에 비해 낮은 수준 또는 높은 수준에서 적어도 하나의 지질 경로 효소를 발현하도록 유전적으로 조작되고, 상기 지질 경로 효소는 불포화효소, 케토아실 신타제 및 아실-ACP 티오에스터라제로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 오일의 지방산 프로파일은 적어도 4% C10:0, 적어도 10% C12:0, 또는 적어도 10% C14:0을 포함하고,
    상기 적어도 하나의 지질 경로 효소는 조작되지 않은 미세조류에 비해 낮은 수준에서 발현되는 내인성 지질 경로 효소이거나, 또는
    상기 적어도 하나의 지질 경로 효소는 조작되지 않은 미세조류에 비해 높은 수준에서 발현되는 외인성 지질 경로 효소인, 미세조류 트라이글라이세라이드 오일 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 불포화효소는 스테아로일-ACP 불포화효소 또는 지방 아실 불포화효소인, 미세조류 트라이글라이세라이드 오일 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 오일의 지방산 프로파일은 적어도 70% 포화된 지방산을 포함하는 것인, 미세조류 트라이글라이세라이드 오일 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미세조류가 쿠페아 라이티(Cuphea wrightii), 쿠페아 칼로필라(Cuphea callophylla), 및 미국 느릅나무(Ulmus americana)로 이루어진 군으로부터 선택된 종 유래의 아실-ACP 티오에스터라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함할 때, 상기 오일의 지방산 프로파일은 C10:0, C12:0 및 C14:0의 전체 조합량을 적어도 50% 포함하는 것인, 미세조류 트라이글라이세라이드 오일 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미세조류가 캘리포니아 월계수(Umbellularia californica) 및 녹나무(Cinnamomum camphora) 유래의 아실-ACP 티오에스터라제 단백질을 암호화하는 적어도 2개의 외인성 유전자를 포함하거나; 또는 상기 재조합 미세조류가 쿠페아 라이티(Cuphea wrightii) 유래의 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 외인성 유전자 및 케토 아실-ACP 신타제를 암호화하는 외인성 유전자를 포함할 때, 상기 오일은 적어도 5:1의 C12:0 : C14:0 지방산의 비를 가지는 것인, 미세조류 트라이글라이세라이드 오일 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미세조류가 쿠페아 라이티(Cuphea wrightii) 또는 쿠페아 칼로필라(Cuphea callophylla) 유래의 아실-ACP 티오에스터라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함할 때, 상기 오일은 50% 이상의 C12:0-C14:0 수준을 가지는 것인, 미세조류 트라이글라이세라이드 오일 조성물.
  9. 제1항, 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세조류 오일은 프로토테카 모리포미스(Prototheca moriformis) 오일인, 미세조류 트라이글라이세라이드 오일 조성물.
  10. 제1항, 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 오일 조성물을 생성하는 재조합 미세조류 세포.
  11. a) 프로토테카(Prototheca) 속의 재조합 미세조류를 배양하는 단계로서, 여기서 상기 재조합 미세조류는 조작되지 않은 미세조류에 비해 낮은 수준 또는 높은 수준에서 적어도 하나의 지질 경로 효소를 발현하도록 유전적으로 조작되고, 상기 지질 경로 효소는 불포화효소, 케토아실 신타제 및 아실-ACP 티오에스터라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    b) 트라이글라이세라이드 오일 조성물을 분리하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 오일의 지방산 프로파일은 C10:0, C12:0 및 C14:0을 가지는 적어도 40% 포화된 지방산을 포함하고, 상기 오일은 상기 재조합 미세조류의 스테롤을 추가로 포함하고,
    상기 적어도 하나의 지질 경로 효소는 조작되지 않은 미세조류에 비해 낮은 수준에서 발현되는 내인성 지질 경로 효소이거나, 또는
    상기 적어도 하나의 지질 경로 효소는 조작되지 않은 미세조류에 비해 높은 수준에서 발현되는 외인성 지질 경로 효소인, 트라이글라이세라이드 오일 조성물의 생성방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제11항에 있어서, 상기 불포화효소는 스테아로일-ACP 불포화효소 또는 지방 아실 불포화효소인, 오일 조성물의 생성방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 오일의 지방산 프로파일은 적어도 70% 포화된 지방산을 포함하는 것인, 오일 조성물의 생성방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 오일의 지방산 프로파일은 적어도 4% C10:0을 포함하는 것인, 오일 조성물의 생성방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 오일의 지방산 프로파일은 적어도 10% C12:0을 포함하는 것인, 오일 조성물의 생성방법.
  18. 제11항에 있어서, 상기 오일의 지방산 프로파일은 적어도 10% C14:0을 포함하는 것인, 오일 조성물의 생성방법.
  19. 제11항에 있어서, 상기 재조합 미세조류가 쿠페아 라이티(Cuphea wrightii), 쿠페아 칼로필라(Cuphea callophylla), 및 미국 느릅나무(Ulmus americana)로 이루어진 군으로부터 선택된 종 유래의 아실-ACP 티오에스터라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함할 때, 상기 오일의 지방산 프로파일은 C10:0, C12:0 및 C14:0의 전체 조합량을 적어도 50% 포함하는 것인, 오일 조성물의 생성방법.
  20. 제11항에 있어서, 상기 재조합 미세조류가 캘리포니아 월계수(Umbellularia californica) 및 녹나무(Cinnamomum camphora) 유래의 아실-ACP 티오에스터라제 단백질을 암호화하는 적어도 2개의 외인성 유전자를 포함하거나; 또는 상기 재조합 미세조류가 쿠페아 라이티(Cuphea wrightii) 유래의 아실-ACP 티오에스터라제를 암호화하는 외인성 유전자 및 케토 아실-ACP 신타제를 암호화하는 외인성 유전자를 포함할 때, 상기 오일은 적어도 5:1의 C12:0 : C14:0 지방산의 비를 가지는 것인, 오일 조성물의 생성방법.
  21. 제11항에 있어서, 상기 재조합 미세조류가 쿠페아 라이티(Cuphea wrightii) 또는 쿠페아 칼로필라(Cuphea callophylla) 유래의 아실-ACP 티오에스터라제 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함할 때, 상기 오일은 50% 이상의 C12:0-C14:0 수준을 가지는 것인, 오일 조성물의 생성방법.
  22. 제11항, 및 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세조류 오일은 프로토테카 모리포미스 오일인, 오일 조성물의 생성방법.
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