CN113846129A - 生物油及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了生物油及其制备与应用。生物油优选采用含纤维素作为主要的碳源的原料，由一种或多种微生物经异养发酵进行制备。本发明还提供了制备脂质基生物燃料以及使用这些生物油的食品、营养品和药品的方法。
Description
本申请是申请日为2008年09月08日、申请号为200880115401.4且题目为“生物油及其制备与应用”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请根据35U.S.C.§1 19(e)的规定，要求2007年9月12日提交的美国临时申请60/960,037的优先权，通过引用将该申请全文纳入本文。
技术领域
本发明涉及生物油及其制备与应用。本发明的生物油优选采用含纤维素的原料，通过微生物发酵制备。本发明还涉及制备脂质基生物燃料和燃料添加剂以及使用这些生物油的食品、营养品和药品的方法。
背景技术
从诸如植物(包括油料种子)、微生物和动物等来源制备生物油在各种应用中必需的。例如，生物柴油的制备需要大量生物油。已提出使用生物柴油作为对石油基柴油的碳-中性液体燃料替代品。生物柴油最常见是采用简单的醇(例如甲醇、乙醇或异丙醇)由植物油脂质酰基基团酯交换形成。然后，产生的烷基酯可以在最现代的压燃式内燃机中直接燃烧而不需要任何机械改变。估计生物柴油的能量密度将达到石油柴油(或“化石柴油”)的95％。然而，生物柴油较高的润滑性(因而改良的燃料效率)产生与相等体积的化石或生物柴油得到的大约相等的英里数。
由于目前生物柴油主要由固定CO2的植物的种子油料获得，该燃料被视作“碳-中性”，因为不同于化石柴油，从燃烧的生物柴油逸出的所有CO2是近期已经存在于大气中的，而化石柴油燃烧时释放的碳不存在于大气中已有几百万年。因此，生物柴油和其他碳-中性燃料对降低温室气体(例如二氧化碳)排放在世界范围内具有突出贡献。
美国的一些州已经规定将生物柴油与该州销售的化石柴油混合，并且联邦政府也已设立目标使用可再生运输燃料。目前用于转化为生物柴油的植物油供应在符合这些规定方面遇到困难，导致许多油料种子植物，尤其是大豆价格较高。如果目前的趋势继续，重要的油料种子植物价格将显著攀升。最终的目标是用价格具有竞争性的生物基替代品取代所有化石燃料来源。不幸地，如果目前生物柴油的油料来源不发生显著改变，是不可能实现该目标的。
认识到这一挑战后，对制备生物柴油的替代油料来源进行了研究，包括研究从开放池塘中生长的光合作用藻类制备生物柴油的可行性。由于一些藻类含油并且生长非常快(对于一些藻类，从种殖到收获的时间不到2周)，每年每英亩的理论产油量可能比高等植物大几个数量级。应注意，大多数产油的高等植物中的少部分仅仅代表了植物总群体的一小部分，而光合作用的微藻作为适用于制备生物柴油的油料可能累积占其群体的较高百分数。然而，光合作用藻类技术存在严重的问题，妨碍其大规模生长，因而不能对化石柴油技术形成有效竞争。
光合作用微藻常常需要补充CO2以实现高油料产量。从生物修复的角度来说，这实际上是有益的，因为从燃煤或燃油电厂释放的过量二氧化碳将不再排放到大气中而是用作制备生物柴油的原料。显然该方法不能制备真实的碳中性燃料，因为从燃煤发电厂释放的二氧化碳最终仍然释放到大气中(在生物柴油燃烧之后)，但是该方法延迟了化石产生的二氧化碳的释放速率并且单位质量的化石燃料能产生更多有用的能量。事实上，已成立了一些公司投资这种技术，包括绿色燃料有限公司(Greenfuels Inc.)。绿色燃料公司特别使用封闭的光生物反应器系统，该系统能将来自化石-燃料-燃烧电厂的非常高浓度的二氧化碳溶解在光合作用藻类培养物中。由于自身遮蔽(self-shading)的生物物理限制，生物质的累积取决于总的光照表面积。因此，需要许多光生物反应器来制备甚至有限量的生物柴油。因此，虽然该技术适合用作隔绝来自化石-燃料燃烧电厂的碳(和其他温室气体)的生物修复方案，但不能放大规模以满足未来生物柴油需求的需要。
为了解决规模问题，其他机构选择进一步开发开放池塘技术来制备光养的源自藻类的生物柴油。开放池塘系统也依赖于补充CO2来实现油料累积的假设经济水平。因此，这些系统可更好地视作用于化石燃料产生的碳废料的生物排污的系统。这些系统中每英亩每年的有用油料的产量比源自油料种子植物的产量高几个数量级。从大多数前景来看，这些系统是解决生物柴油的有限供应的最佳方案。然而，存在尚未解决的显著问题。虽然每英亩每年的绝对理论产量非常高，但是开放池塘系统中累积的生物质的实际密度相对较稀。因此，需要加工处理大量的培养基以提取生物质中的油，这可能显著增加最终油品的生产成本。
用可再生替代品如乙醇代替汽油的一种途径较为简单。然而，应注意到压燃式发动机(燃烧化石柴油或生物柴油)和引燃式发动机(燃烧汽油或乙醇)的市场通常满足不同的需求。压燃式发动机具有优异的扭矩，使其比引燃式发动机更适合工业应用，引燃式内燃机能提供较大的加速度(因而在一般交换通勤(commuting)中更普遍)。因此，没有理由期望引燃式内燃机能够完全代替压燃式内燃机,即使完全采用可再生替代品代替汽油。
虽然存在某些缺点，利用乙醇代替汽油作为液体运输燃料已作出许多努力。巴西模型依赖于甘蔗作为原料进行乙醇发酵，常常被列举为生物燃料利用可能的开创性例子。不幸的是，美国的气候条件不能提供大规模乙醇生产所需的甘蔗生产力。最初放大美国乙醇发酵规模的努力采用玉米糖浆和玉米淀粉作为原料，但围绕这种安排的可持续性和可量测性存在争论。因此，近来的努力更多聚焦于采用糖的“纤维质”来源作为乙醇发酵中的原料。纤维质原料可以是任何含纤维素的原料。
因为大多数植物主要由结构多醣(纤维素和半纤维素)和木脂素组成，如果动用纤维素和其他结构多醣的糖单体作为乙醇发酵的原料则栽培面积将得到更有效的利用。这不同于使用玉米淀粉，玉米淀粉只存在于玉米植物仁中，占植物干重的百分比相对较低。此外，由于所有植物均包含纤维素，可使用生长较快且气候耐受性更强的植物作为纤维素基糖的主要来源。这种植物的例子包括：柳枝稷(Switchgrass)、芒(Miscanthus gigantus)和白杨(Poplar)。
与用于乙醇的玉米类似，当今主要的生物柴油作物的土地利用效率低下，因为只有来自生物柴油农作物种子的油料才可用于制备生物柴油。已经大范围采用纤维生产乙醇工艺，但是纤维生产的乙醇远未被广泛接受作为汽油的可持续、经济竞争性的可能替代品。纤维素原料已被视作可用于制造其他源自石油的产品(如塑料)。
专利申公开WO 2005/035693、US 2005/01 12735、WO 2007/027633、WO2006/127512、US 2007/0099278、US 2007/0089356和WO 2008/067605(其全部内容被纳入本文作为参考)均涉及生物柴油或生物燃料制备系统。
近来，研究微藻原始小球藻(Chlorella protothecoides)经发酵异养生长来制备生物柴油。中国北京清华大学的研究人员采用来自异养微藻原始小球藻的油进行生物柴油制备的研究。在这些研究中，采用葡萄糖或玉米粉水解物作为碳来源在发酵罐中培养微藻。然后提取微藻油，经酯交换制备生物柴油。参见Miao，X.和Wu，Q.，Bioresource Technology97：841-846(2006)；Xu，H.等，Journal of Biotechnology 126：499-507(2006)。虽然这些研究人员提出，淀粉和纤维素的水解溶液可能是作为发酵工艺中的碳源中葡萄糖的低成本替代品，他们也提出纤维素水解困难且成本昂贵。参见Li，X.等，“在生物反应器中通过异养培养，由微藻原始小球藻大规模制备生物柴油”(Large-scale biodiesel productionfrom microalga Chlorella protothecoids through heterotrophic cultivation inbioreactors)，Biotechnology和Bioengineering，Accepted Preprint，2007年4月20日。
除了生物柴油之外，另一种需要可再生可持续来源的油基燃料是喷气式发动机燃料。航空器依赖于使用各种类型的喷气燃料，包括煤油型喷气燃料和石脑油型喷气燃料。航空工业对石油基喷气燃料的严重依赖导致急需发现可再生的喷气生物燃料。
因此，需要制备脂质基生物燃料的低成本有效方法，该方法易于放大规模以替代化石柴油和喷气燃料。本文所述术语“脂质基生物燃料”表示由本发明生物油制备的任何燃料，包括但不限于生物柴油、喷气机生物燃料和专用燃料。为了满足这种需要，必须开发制备可转化为脂质基生物燃料的生物油的低廉简单方法。为了降低脂质基生物燃料的制备成本，需要采用丰富低廉原料如含纤维素的原料作为主要碳源来制备生物油的低成本方法。除了需要使用低廉原料，还需要旨在降低生物油制备过程中的成本的改进的工艺。制备这些生物油的改进方法不仅能够降低脂质基生物燃料的制备成本，而且能够降低在许多其他应用中，包括食品、营养品和药品中与使用这些生物油的使用有关的成本。
例如，希望提高生物油中存在的许多有益营养物质的膳食摄取。尤其有益的营养物质包括脂肪酸，例如ω-3和ω-6长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)及其酯。Ω-3PUFA被认为是防止动脉硬化和冠心病的重要化合物，用于缓解炎症和延缓肿瘤细胞的生长。Ω-6PUFA不仅能够用作人体中的结构脂质，而且还是许多炎症因子如前列腺素、白三烯和羟脂(oxylipin)的前体。长链ω-3和ω-6PUFA是PUFA的重要类型。
根据最接近脂肪酸甲基末端的双键位置，存在两种主要的LC-PUFA系列或家族：ω-3系列在3位碳包含双键，而ω-6系列直到6位碳才具有双键。因此，二十二碳六烯酸("DHA")具有22个碳的链长和从甲基末端的第3个碳开始的6个双键，称为“22:6n-3”。其他重要的ω-3LC-PUFA包括二十碳五烯酸("EPA")，称为“20:5n-3”和ω-3二十二碳五烯酸(“DPAn-3”)，称为“22:5n-3”。重要的ω-6LC-PUFA包括花生四烯酸("ARA")，称为“20:4n-6”和ω-6二十二碳五烯酸(“DPA n-6”)，称为“22:5n-6”。
因为人和许多其他动物不能直接合成ω-3和ω-6必需脂肪酸，它们必需从膳食中获取。传统的PUFA膳食来源包括植物油、海洋动物油、鱼油和油料种子。此外，发现由某些微生物产生的油富含LC-PUFA。为了降低与PUFA膳食来源的制备有关的成本，需要制备包含PUFA的生物油的低成本且有效方法。为了降低含PUFA的生物油的成本，需要开发采用低廉原料(例如含纤维素的原料)来制备这些生物油的方法以及设计成降低制备成本的改进工艺。
发明内容
本发明提供了一种制备生物油的方法，该方法包括采用包含纤维素作为碳源的原料经异养发酵培养假菌界(Stramenopile)微生物，其中所述生物油中约11-99％的不饱和脂肪酸是多不饱和脂肪酸。在本发明的一些实施方式中，生物油中大于约50％的不饱和脂肪酸是多不饱和脂肪酸。
本发明中使用的微生物可包括但不限于破囊壶菌门(Thraustochytrid)，优选选自下组：裂殖壶菌属微生物(Schizochytrium)、破囊壶菌属微生物(Thraustochytrium)和吾肯氏壶菌属微生物(Ulkenia)。
在本发明的一些实施方式中，所用微生物能够糖化纤维素。优选地，本发明微生物能够降解选自下组的原料组分或耐受这些组分：木质素、半纤维素、植物油、植物胞外多醣以及它们的组合。在本发明的一些实施方式中，微生物是遗传修饰的微生物。
本发明微生物可产生甘油三酯形式的油，产量约为其生物质干重的25-85重量％。在本发明一些实施方式中，在溶解氧浓度约为10％-100％的条件下进行微生物生物质的培养。例如，在溶解氧浓度为0％-10％的条件下由微生物制备生物油。微生物可以在约15-45℃的温度下进行培养。
在本发明的一些实施方式中，制备生物油的方法进一步包括：在微生物产生约为其生物质干重的30-90重量％的油之后进行微生物的自溶或诱导裂解。微生物的诱导裂解可通过使微生物处于有利于裂解的条件来实现，这些条件包括pH、温度、酶的存在、去污剂的存在、物理破裂以及它们的组合。
在本发明的一些实施方式中，含纤维素的发酵原料包括选自下组的纤维素来源：草、甘蔗、农业废料、废纸、污水、木材、绿色植物界(viridiplantae)生物以及它们的组合。
在本发明优选的实施方式中，发酵在无菌发酵罐中进行。在本发明的一些实施方式中，发酵在选自下组的发酵罐中进行：纤维增强的聚合物发酵罐、金属基质复合材料发酵罐、陶瓷基质复合材料发酵罐、热塑性复合材料发酵罐、金属发酵罐、环氧化物内衬的碳钢发酵罐、塑料内衬的碳钢发酵罐、塑料发酵罐、玻璃纤维发酵罐和混凝土发酵罐。
在本发明的一些实施方式中，发酵在浸没在水中的发酵罐中进行。发酵可以在具有串联的冷却系统的发酵罐中进行，使得从第一发酵罐或一组串联的发酵罐中流出的冷却水可用作第二发酵罐或串联的发酵罐组中的冷却水供应。类似地，发酵可以在具有串联的气体系统的发酵罐中进行，使得从第一发酵罐或一组串联的发酵罐中排出的喷射气体可用作第二发酵罐或串联的发酵罐系列中的气体供应。
本发明还提供了一种制备生物柴油的方法，该方法包括：(a)采用包含纤维素作为碳源的原料经异养发酵培养假菌界(Stramenopile)微生物来制备生物油，其中所述生物油中约11-99％的不饱和脂肪酸是多不饱和脂肪酸；和(b)使生物油进行酯交换形成生物柴油。在本发明的一些实施方式中，生物油中大于约50％的不饱和脂肪酸是多不饱和脂肪酸。
生物油的酯交换可以采用源自醇制备工艺的醇进行。在本发明的一些实施方式中，生物油酯交换产生的甘油可用作后续发酵工艺的碳源来制备醇或生物油。在本发明的一些实施方式中，后续发酵工艺培养能够使用甘油作为碳源的微生物。
本发明还提供了一种制备喷气式发动机生物燃料的方法，该方法包括：(a)采用包含纤维素作为碳源的原料经异养发酵培养假菌界(Stramenopile)微生物来制备生物油，其中所述生物油中约11-99％的不饱和脂肪酸是多不饱和脂肪酸；和(b)裂解(cracking)生物油产生喷气式发动机生物燃料。在本发明的一些实施方式中，用于制备喷气式发动机生物燃料的生物油包含约10-75重量％的多不饱和脂肪酸。
本发明提供了一种脂质基生物燃料组合物，其包含约1-75重量％具有等于或大于20个碳原子的长链脂肪酸的烷基酯。在本发明的一些实施方式中，脂质基生物燃料组合物的熔化温度约为30℃到约-50℃。
本发明还提供了一种制备生物油的方法，该方法包括：(a)采用包含纤维素作为碳源的原料，通过异养发酵来同时或按顺序培养两种或更多种微生物，其中一种或多种微生物能够糖化所述纤维素。
本发明还提供了一种制备生物柴油的方法，该方法包括采用包含纤维素作为碳源的原料，经异养发酵培养的两种或更多种微生物产生的生物油发生酯交换，其中一种或多种微生物能够糖化纤维素。为制备喷气式发动机生物燃料，可对采用包含纤维素作为碳源的原料，经异养发酵培养的两种或更多种微生物产生的生物油进行裂解，其中一种或多种微生物能够糖化纤维素。
本发明提供了一种制备生物油的方法，该方法包括在无菌发酵罐中经异养发酵培养微生物。在本发明的一些实施方式中，生物油在无菌发酵罐中的制备速率约为5-70克/升/天，优选约30-70克/升/天。
在本发明的一些实施方式中，在无菌发酵罐中培养微生物可实现的细胞密度约为10-300克/升，优选约为150-250克/升。优选地，微生物的培养包括使用纤维素作为碳源。
本发明还提供一种制备生物柴油的方法，该方法包括：(a)在无菌发酵罐中培养微生物以制备生物油；和(b)使生物油进行酯交换以制备生物柴油。本发明还提供了一种制备喷气式发动机生物燃料的方法，该方法包括：(a)在无菌发酵罐中培养微生物以制备生物油；和(b)裂解生物油以制备喷气式发动机生物燃料。
本发明提供一种制备生物柴油的方法，该方法包括：(a)采用包含再循环培养基的营养物质培养微生物以制备生物油；和(b)使生物油酯交换以制备生物柴油。再循环的培养基可以是但不限于以下：去脂化生物质、水解的生物质、部分水解的生物质、再循环金属、再循环盐、再循环氨基酸、再循环胞外碳水化合物、再循环甘油、再循环酵母生物质以及它们的组合。优选地，培养微生物包括使用纤维素作为碳源。
本发明还提供了一种制备喷气式发动机生物燃料的方法，该方法包括：(a)采用包含再循环的培养基的营养物质培养微生物以制备生物油；和(b)裂解生物油以制备喷气式发动机生物燃料。
本发明的一些实施方式提供了一种制备生物柴油的方法，该方法包括：(a)采用包括连续接种阶段(seed stage)和脂质产生阶段的发酵系统培养微生物以制备生物油；和(b)使生物油进行酯交换以制备生物柴油。优选地，连续的接种阶段产生微生物生物质，从而在连续的接种阶段实现约10-95％总的微生物生物质制备。在本发明的一些实施方式中，脂质产生阶段以批量进料工艺形式进行。优选地，脂质产生阶段产生的脂质使得在脂质产生期间实现了约10-95％总的微生物脂质制备。在本发明的一些实施方式中，微生物的培养包括使用纤维素作为碳源。
本发明还提供了一种制备喷气式发动机生物燃料的方法，该方法包括：(a)采用包括连续的接种阶段和脂质产生阶段的发酵系统培养微生物以制备生物油；和(b)裂解生物油以制备喷气式发动机生物燃料。
附图简要说明
图1显示了根据本发明制备生物油和生物柴油的方法的各种实施方式。
图2显示了根据本发明发酵系统设计的一个例子。
图3显示了在实施例4所述无菌和有菌条件下培养微生物(ATCC 20888)时，细胞干重、脂质的重量百分数、DHA的重量百分数、每升发酵液产生的脂质的量随时间的变化。
图4显示了在实施例4所述的无菌和有菌条件下培养微生物(ATCC 20888)时，糖消耗速率、油产生速率(克/升发酵液/天)、生物质产生速率(克/升/天)、不含脂质的生物质的量随时间的变化。
图5显示了包括连续的接种阶段和批量进料脂质累积阶段的两段发酵工艺。
具体实施方式
本发明提供了生物油及其制备与应用。本发明的一些实施方式提供了适合通过发酵将碳直接从纤维素基或木质-维生素基糖转化成用于生物柴油制造的植物油的油质、异养生物和方法。本发明方法的规模性和可持续性更强，能产生比目前使用或研究的工艺(例如种子油料生物柴油或光合藻类生物柴油)更具成本竞争性的生物柴油。
本发明的一些方面涉及采用糖化纤维素原料对两种油脂性微生物进行高密度培养。例如，原生生物裂殖壶菌属和油脂酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)适用于这种工艺，因为这两种微生物均具有用于调节微生物的成熟开发的转化系统并能够通过发酵产生高水平的脂质。本发明的一些方面提供了能够在各种纤维素和木质-纤维素基质上生长的油脂性破囊壶菌和真菌，以及天然进行联合的糖化和发酵及木质素降解或抗性的生物。
本发明还涉及改进的生物菌株和通过分子、生物、经典遗传和生理学方式利用纤维素基基质进行油料制备的方法。本发明的一些实施方式提供了将细胞酰基甘油转化为生物柴油的发酵方法的经济放大。本发明还提供了用于实施本发明方法的生物和化学反应器设计与结构，以及商业制备方案。
可使用各种生物来制备本发明的生物油，包括微生物。微生物可以是藻类、细菌、真菌或原生生物。培养微生物的微生物来源和方法是本领域已知的(工业微生物学与生物技术(Industrial Microbiology和Biotechnology)，第2版，1999，美国微生物学协会)。例如，可以在发酵罐中用发酵培养基培养微生物。微生物产生的油可用于本发明的方法和组合物。在一些实施方式中，微生物包括选自下组的微生物：金色藻(如假菌界(Stramenopiles)的微生物)、绿藻、硅藻、腰鞭毛虫(如甲藻纲的微生物，包括甲藻属(Crypthecodinium)的成员，例如隐甲藻(Crypthecodinium cohnii))、酵母(例如耶氏酵母属(Yarrowia)的成员(例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))、隐球菌属(Cryptococcus)(例如白色隐球菌(Cryptococcus albidus))、毛孢子菌属(Trichosporon)、念珠菌属(Candida)、油脂酵母属(Lipomyces)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)和红酵母属(Rhodotorula))、毛霉属(Mucor)和被孢霉属(Mortierella)的真菌，包括但不限于高山被孢霉(Mortierella alpina)和被孢霉变种菌(Mortierellasect.Schmuckeri)。假菌界微生物(Stramenopile)包括：微藻(microalgae)和类似藻的微生物，包括以下微生物：汉姆门(Hamatores)，普罗特蒙门(Proteromonads)，欧帕门(Opalines)，德维尔派门(Develpayella)，戴普罗弗门(Diplophrys)，拉普利门(Labrinthulids)，破囊壶菌门(Thraustochytrids)，拜尔瑟门(Biosecids)，水霉门(Oomycetes)，海植戴尔门(Hypochytridiomycetes)，康曼门(Commation)，瑞可罗门(Reticulosphaera)，普莱格门(Pelagomonas)，普莱格可门(Pelagococcus)，欧里可拉门(Ollicola)，奥瑞可门(Aureococcus)，小壳藻门(Parmales)，硅藻门(Diatoms)，黄藻门(Xanthophytes)，褐藻门(Phaeophytes)，黄绿藻门(Eustigmatophytes)，绿鞭藻门(Raphidophytes)，新纽门(Synurids)，爱科斯汀门(Axodines)(包括瑞佐克姆纲(Rhizochromulinaales)，硅鞭藻纲(Pedinellales)，硅鞭藻纲(Dictyochales)，克里索达纲(Chrysomeridales)，萨西诺达纲(Sarcinochrysidales)，水树藻目(Hydrurales)，蟄居金藻目(Hibberdiales)和色金藻目(Chromulinales)。破囊壶菌门(Thraustochytrids)包括：裂殖壶菌属(Schizochytrium)(种包括黃金石斛(aggregatum)、黎姆萘瑟(limnaceum)、芒格(mangrovei)、迷你藻(minutum)、欧托(octosporum))，破囊壶菌属(Thraustochytrium)(种包括阿迪门多(arudimentale),奥雷姆(aureum)，碧席考拉(benthicola)，格罗波(globosum)，凯尼(kinnei)，摩迪(motivum)，茂迪待(multirudimentale)，派凯(pachydermum)，普罗弗(proliferum)，罗素(roseum)，斯托特(striatum))，吾肯氏壶菌属(Ulkenia)(种包括埃摩拜迪(amoeboidea)，科格尼斯(kerguelensis)，米钮塔(minuta)，普罗弗达(profunda)，雷迪安(radiate)，塞仑(sailens)，赛卡瑞那(sarkariana)，斯佐凯(schizochytrops)，维格斯(visurgensis),优克尼斯(yorkensis))，破囊壶菌属(Aplanochytrium)(种包括海罗迪(haliotidis)，科格仑斯(kerguelensisi)，普罗弗达(profunda)，斯托凯(stocchinoi))，日本壶菌属(Japonochytrium)(种包括麦尼(marinum))，阿尔托尼氏壶菌属(Althornia)(种包括克劳迪(crouchii))和埃氏壶菌属(Elina)(种包括玛瑞萨(marisalba)，欣诺瑞弗卡(sinorifica))。拉普利门(Labrinthulids)包括拉普利属(Labyrinthula)(种包括埃格瑞尼(algeriensis)，考诺赛斯(coenocystis)，查托尼(chattonii)，玛克赛斯(macrocystis)，大西洋玛克赛斯(macrocystis atlantica)，双重玛克赛斯(macrocystismacrocystis)，玛瑞那(marina)，迈纽塔(minuta)，罗斯科弗尼(roscoffensis)，凡卡诺维(valkanovii)，维丽那(vitellina)，太平洋维丽那(vitellina pacifica),双重维丽那(vitellina vitellina)，佐普菲(zopfi))，拉普利索属(Labyrinthomyxa)(种包括玛瑞那(marina))，拉普利诺属(Labyrinthuloides)(种包括海罗迪(haliotidis)，优克尼斯(yorkensis))，戴普罗弗属(Diplophrys)(种包括阿凯瑞(archeri))，皮霍索属(Pyrrhosorus*)(种包括玛瑞纽斯(marinus))，索罗迪普罗属(Sorodiplophrys*)(种包括斯特考瑞(stercorea))，克莱米多属(Chlamydomyxa*)(种包括拉普利诺(labyrinthuloides)，蒙塔那(montana))。(*＝对于这些属的准确分类学定位目前尚未达成一致)。
本发明的一些实施方式提供了制备生物油的方法，该方法包括采用包含纤维素作为碳源的原料经异养发酵培养假菌界微生物。在本发明的一些实施方式中，生物油包含不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸中显著部分是多不饱和脂肪酸。如过去所述，某些多不饱和脂肪酸如ω-3和ω-6长链多不饱和脂肪酸是尤其重要的膳食化合物。因此，希望制备具有显著量的多不饱和脂肪酸的生物油。在本发明的一些实施方式中，生物油转化为脂质基生物燃料。对于这些应用，希望制备各种链长的烃，尤其是适合喷气式发动机生物燃料应用。用于制备脂质基生物燃料的生物油中显著量的多不饱和脂肪酸的存在将提供烃制备过程中更大的灵活性和更多的类别，因为多不饱和脂肪酸中多个不饱和位点提供了裂解形成烃的多个位点。例如，某些喷气式发动机燃料要求具有2-8个碳的烃。可通过本领域已知的方式(例如(裂解)分裂多不饱和脂肪酸以制备各种链长度的较短的烃。
在一些实施方式中，通过本发明方法制备的生物油包含不饱和脂肪酸，生物油中约11-99％的不饱和脂肪酸是多不饱和脂肪酸。本发明生物油可包含不饱和脂肪酸，生物油中不饱和脂肪酸中约20-99％、约26-99％、约30-99％、约40-99％、约51-99％、约60-99％、约70-99％、约80-99％、或约90-99％是多不饱和脂肪酸。在本发明的一些实施方式中，生物油中大于约10％、大于约20％、大于约25％、大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、或大于约90％的不饱和脂肪酸是多不饱和脂肪酸。
在本发明的一些实施方式中，生物油包含约10-75重量％的多不饱和脂肪酸。对于某些应用，生物油优选包含约20-75％、约30-75％、约40-75％、约50-75％、或约60-75重量％的多不饱和脂肪酸。在本发明的一些实施方式中，生物油包含至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、或至少约70重量％的多不饱和脂肪酸。根据本发明制备生物油的方法可任选地进一步包括从微生物收集生物油。
本文所用术语“纤维素”包括未经糖化或未经水解的纤维素以及糖化或水解的纤维素。在本发明的一些实施方式中，所用微生物是破囊壶菌。优选地，微生物是裂殖壶菌属、破囊壶菌或吾肯氏壶菌属的微生物。在本发明的一些实施方式中，所用微生物是耶氏酵母属(例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))、隐球菌属(Cryptococcus)(例如白色隐球菌(Cryptococcus albidus))、毛孢子菌属(Trichosporon)、念珠菌属(Candida)、油脂酵母属(Lipomyces)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)或红酵母属(Rhodotorula))。专利申请公开WO 2004/101757(其内容被纳入本文作为参考)揭示了这些酵母的例子。
本发明还考虑使用两种或更多种微生物的组合来制备生物油或生物油掺混物。为了降低发酵成本，优选在相同发酵条件下培养两种或更多种微生物。当两种或更多种不同的微生物组合以制备生物油时，一种或多种微生物可在发酵期间累积油。一种或多种微生物可能通过以下活动促进另一种微生物的培养和累积油，这些活动包括但不限于：原料组分裂解形成不稳定的糖单体(例如纤维素的糖化作用)，抑制另一种微生物生长的原料组分的裂解(例如代谢或降解原料组分如木质素、半纤维素(例如木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、葡甘露聚糖和木糖葡聚糖)、植物油、植物胞外多醣等)，促进另一种微生物生长的组分的合成(例如有利于微生物生长的某些酶的合成)。
适用于代谢半纤维素的生物体包括但不限于：产琥珀酸拟杆菌(Fibrobactersuccinogenes)、隐球菌属酵母(例如白色隐球菌(Cryptococcus albidus)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus))、毛孢子菌属(Trichosporon)、念珠菌属(Candida)、油脂酵母属(Lipomyces)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)和红酵母属(Rhodotorula))。其他适用于代谢半纤维素的生物体包括：毕赤酵母属(Pichia)(例如树干毕赤酵母(Pichiastipitis))、气单胞菌属(Aeromonas)、曲霉(Aspergillus)、链霉菌属(Streptomyces)、红球菌属(Rhodococcus)、杆菌(Bacillus)(例如枯草杆菌(枯草芽孢杆菌)、短芽胞杆菌(Bacillus brevis)和迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentis))、大肠杆菌(Echerichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)和木霉属的生物。适用于代谢木质素的生物体包括但不限于：黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)或其他“白腐状(white rot)”真菌。专利申请公开WO 91/018974(其内容被纳入本文作为参考)揭示了具有半纤维素活性的生物体的例子。
适用于本发明由木质纤维素生物质产生游离糖和寡糖的方法参见例如专利申请公开US 2004/0005674，其内容被纳入本文作为参考。这些方法包括：用分解木质纤维素的酶(例如纤维素酶、木聚糖酶、木质素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂酶和葡糖醛酸糖苷酶)将木质纤维素生物质转化为游离糖和小分子寡糖。这些酶可由商业来源获得或重组制备，例如通过在微生物、真菌，即酵母或植物中表达。
本发明优选使用油脂性微生物。如本文所用，“油脂性微生物”指能够累积超过20％细胞干重的脂质形式的微生物。在本发明的一些实施方式中，微生物产生是其生物质干重约30-95重量％的脂质。优选地，本发明微生物产生是其生物质干重约35-93％、约40-90％、约45-88％、约50-85％、约55-83％、约60-80％、约65-78％或约70-75重量％的脂质。在本发明的一些实施方式中，微生物产生是其生物质干重的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％或至少约70重量％的脂质。
当采用两种或更多种微生物来制备本发明的生物油时，一种或多种微生物可产生生物油。在本发明的一些实施方式中，当组合使用两种或更多种微生物来制备生物油时，第一种微生物产生的油与第二种微生物产生的油的重量比约为1:9到约1:1，从约1:9到约2:3，从约1:9到约3:7，或从约1:9到约1:4。
优选地，本发明微生物产生甘油三酯形式的油，产量是其生物质干重的约25-85重量％，是其生物质干重的约30-85重量％，是其生物质干重的约35-85重量％，是其生物质干重约40-85重量％，是其生物质干重约45-85重量％，是其生物质干重约50-85重量％，是其生物质干重约55-85重量％，是其生物质干重约60-85重量％，是其生物质干重约60-80重量％，是其生物质干重约65-80重量％，是其生物质干重约65-75重量％，或是其生物质干重约70-75重量％。在本发明的一些实施方式中，微生物产生甘油三酯形式的油，产量是其生物质干重至少约为25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％或至少约70重量％。
本文所用术语“甘油三酯”是指具有化学通式CH2(OOCR1)CH(OOCR2)CH2(OOCR3)的三个脂肪酸残基和甘油的酯，其中OOCR1、OOCR2和OOCR3各自代表一个脂肪酸残基。在本发明的一些实施方式中，合适的甘油三酯可包含至少一个PUFA。在一些实施方式中，PUFA链长至少是18个碳。这些PUFA在这里也称为长链PUFA或LC PUFA。在一些实施方式中，PUFA可以是二十二碳六烯酸C22:6n-3(DHA)、ω-3二十二碳五烯酸C22:5n-3(DPA(n-3))、ω-6二十二碳五烯酸C22:5n-6(DPA(n-6))、花生四烯酸C20:4n-6(ARA)、二十碳五烯酸C20:5n-3(EPA)、十八碳四烯酸(SDA)、亚麻酸(LLA)、α亚麻酸(ALA)、γ亚麻酸(GLA)、偶联的亚麻酸(CLA)、二十碳四烯酸(C20:4n-3)、同型-α和-γ亚麻酸(C20:3n-6和20:3n-3)、二十二碳四烯酸(C22:4n-6)、二十八碳八烯酸(C28:8)或它们的混合物。PUFA也可以天然脂质常见形式中的任一种存在，包括但不限于三酰甘油，二酰甘油，单酰甘油，磷脂，游离脂肪酸，或这些脂肪酸天然或合成的衍生物形式(例如，脂肪酸的钙盐等)。本发明使用的包含具有PUFA残基的甘油三酯的油或其他组合物可表示包含只有一种类型的PUFA残基如DHA的甘油三酯的组合物，或者包含具有多于一种类型的PUFA残基如DHA、EPA和ARA的甘油三酯的组合物。
在本发明优选的实施方式中，微生物能够实现高密度细胞生长。在本发明的一些实施方式中，微生物能够实现的细胞密度至少约为10克/升、至少约15克/升、至少约20克/升、至少约25克/升、至少约30克/升、至少约50克/升、至少约75克/升、至少约100克/升、至少约125克/升、至少约135克/升、至少约140克/升、至少约145克/升或至少约150克/升。在本发明的一些实施方式中，微生物能够实现的细胞密度约为10-300克/升、约15-300克/升、约20-300克/升、约25-300克/升、约30-300克/升、约50-300克/升、约75-300克/升、约100-300克/升、约125-300克/升、约130-290克/升、约135-280克/升、约140-270克/升、约145-260克/升、或约150-250克/升。可以通过调节发酵条件(例如温度、pH、离子浓度和气体浓度)来提高本发明微生物的高密度生长。
本发明提供了生物油的高效制备。在本发明的一些实施方式中，生物油产量至少约为5克/升/天、至少约10克/升/天、至少约20克/升/天、至少约30克/升/天、至少约40克/升/天、至少约50克/升/天、至少约60克/升/天或至少约70克/升/天。在本发明的一些实施方式中，生物油产量约为5-70克/升/天、约10-70克/升/天、约20-70克/升/天或约30-70克/升/天。
在本发明的一些实施方式中，用于制备生物油的微生物是分解纤维素的微生物，因而能够对纤维素或木质纤维素原料的纤维素进行糖化。纤维素或木质纤维素原料包括任何包含纤维素的来源。这些来源包括但不限于：草、甘蔗、农业废料、废纸、污水、木材、任何绿色植物界生物或其产物。优选地，所用纤维素来自除树基纤维素来源之外的来源。适合用作纤维素来源的草类型包括但不限于：锯齿草、小麦草、稻谷草、柳枝稷(switch grasses)和芒(Miscanthus)型草。
为使微生物能够利用纤维素作为碳源，必须将纤维素分解成其组成糖单体。纤维素是通过β-糖苷键连接的葡萄糖聚合物，是高度稳定的线型结构。纤维素裂解形成糖单体(也称为糖化纤维素)是一种高难度的挑战，并且许多尝试都未能实现这种裂解。纤维素的酶法水解是降解纤维素的一种途径。纤维素完全水解通常需要：分裂纤维素聚合物内部区域的内切葡聚糖酶；从纤维素聚合物的末端分裂纤维二糖单元的外切葡聚糖酶；和将纤维二糖分裂成葡萄糖亚基的β-糖苷酶。纤维素酶可具有实现内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-糖苷酶活性的多重络合物。里氏木霉(Trichoderma reesei)是用于制备纤维素酶的一种重要的生物体。将纤维素裂解成糖单体的其他方法包括：热化学分解(进行或不进行机械破碎)，包括但不限于水、蒸气爆炸、酸处理和/或氨纤维爆炸。
在本发明的一些实施方式中，用于制备生物油的微生物与糖化纤维素的微生物相同。在本发明的一些实施方式中，可同时或相继培养两种或更多种微生物，使用含纤维素作为主要碳源的原料以制备生物油。根据本发明，同时或相继发酵两种或更多种微生物时，一种或多种微生物能够糖化纤维素。在本发明的一些实施方式中，在纤维素酶的存在下微生物可经历异养发酵以提高发酵期间纤维素的糖化作用。在一些实施方式中，至少一种微生物来自假菌界，优选是通常称为破囊壶菌的生物。
适用于本发明的微生物也可以耐受高温和/或强酸或强碱环境，使其在高温和/或酸性介质中的生长不受抑制并且在一些情况下甚至增强。在本发明的一些实施方式中，在有利于纤维素降解的温度和/或pH下，使用含纤维素的原料进行异养发酵来培养微生物。在本发明的一些实施方式中，在约15-70℃，约20-40℃，或约25-35℃的温度下进行发酵。在本发明的其他实施方式中，在pH约为3-11、约3-10、约4-9.5、约4-9、约5-7、或约6-9的条件下进行发酵。在本发明生物油的制备过程中，采用纤维素酶、化学和/或机械破碎以及氨纤维爆炸预处理含纤维素的原料也可以在原料使用之前进行。或者，不需要进行预处理。
原料预处理方法的一些例子参见以下专利申请公开：US2007/0161095、WO05/053812、WO06/086757、US2006/0182857、US2006/177551、US2007/0110862、WO06/096834、WO07/055735、US2007/0099278、WO06/119318、US2006/0172405和US2005/0026262，其内容被纳入本文作为参考。
适用于消化纤维素的酶的例子参见以下专利或专利申请公开：US2003/0096342、WO 03/012109、US 7059993、WO 03/012095、WO 03/012090、US 2003/0108988、US 2004/0038334、US 2003/0104522、EP 1 612 267和WO06/003175，其内容被纳入本文作为参考。
在本发明的一些实施方式中，用于培养微生物的纤维质原料中纤维素的含量约为碳原料干重的5-100％、约10-95％、约20-90％、约30-85％、约40-80％、约50-75％、或约60-70％。在本发明的一些实施方式中，纤维质原料中纤维素的含量占碳原料干重至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、或至少约70％。
优选地，本发明中使用的微生物耐受原料组分或能够降解这些组分：木脂素、半纤维素、植物油、植物胞外多醣以及它们的组合。降解或耐受这些原料组分可确保微生物的发酵过程不会因为这些组分的存在而受到抑制。
在本发明的一些实施方式中，用于培养微生物的纤维质原料包含约1-50％、约5-40％、或约10-30重量％选自木质素、半纤维素或其组合的组分。在本发明的一些实施方式中，用于培养微生物的纤维质原料包含至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、或至少约30重量％选自木质素、半纤维素或其组合的组分。
合适的微生物可从各种来源获得，包括从自然环境收集。如本文所用，任何生物或微生物的任何特定类型包括野生型、突变体或重组类型。这些生物体的培养条件是本领域已知的，这些微生物中至少一些适当的培养条件例如在美国专利5,130,242，美国专利5,407,957，美国专利5,397,591，美国专利5,492,938，美国专利5,711,983和美国专利6,607,900中描述，所有专利的全部内容被纳入本文作为参考。
使用微生物油时，微生物在本文定义的能够促进油的产生的任何有效介质中培养。优选地，有效介质还能促进微生物快速生长。可以常规发酵模式培养微生物，包括但不限于间歇(batch)、间歇进料(fed-batch)、半连续和连续方式。如本文所用，“半连续”模式是指在完成发酵过程后不从发酵罐获取包含微生物的一部分发酵培养物的发酵模式。发酵罐中剩余的发酵液部分可用于接种随后的发酵过程。在本发明的一些实施方式中，完成发酵过程后将约1-50体积％、约1-25体积％、约1-15体积％、约1-10体积％、或约2-8体积％的发酵液留在发酵罐中以接种随后的发酵过程。
在本发明的一些实施方式中，发酵过程包括目标是微生物的生物质累积的第一阶段和目标是微生物的脂质累积的第二阶段。优选地，生物质累积阶段期间无营养限制。脂质累积阶段优选在有氮限制下用碳源进行。
用于制备生物柴油的本发明方法可包括：(a)采用包括连续接种阶段和脂质产生阶段的发酵系统来培养微生物以制备生物油，和(b)通过本领域已知的方式将生物油转化为生物柴油，例如通过使生物油发生酯交换以制备生物柴油。连续的接种阶段的目标是生物质累积，通过向接种容器(具有初始接种的容器)内提供连续的营养物质进料来进行。接种容器内的发酵液排出并转移至脂质产生阶段的容器，如分批进料工艺那样将碳源输送至批料以维持整个运行过程中的目标糖浓度。
可采用类似的两阶段发酵工艺来制备用于喷气式发动机生物燃料的生物油。在本发明的一些实施方式中，制备喷气式发动机生物燃料的方法包括通过本领域已知的方法将采用该发酵系统制备的生物油转化为喷气式发动机生物燃料，利用诸如裂解的工艺以助于生物油转化为喷气式发动机生物燃料。
两段发酵工艺提高了生物油制备工艺的效率，因而有助于降低脂质基生物燃料制备的成本。制备脂质基生物燃料的改进的发酵系统在实现生物油的最大效率大规模生产方面尤其有利，因而对于由生物油更具商业可行性制备脂质基生物燃料具有显著贡献。根据具体应用的要求，两段发酵工艺可用于制备高含量或低含量的多不饱和脂肪酸的生物油。
在本发明的一些实施方式中，生物质累积阶段(如连续的接种阶段)产生微生物生物质，在该阶段使总微生物的生物质产生达到约10-95％，约20-95％，约30-95％，约40-95％，或约50-95％。在本发明的其他实施方式中，在生物质累积阶段，总微生物的生物质产生达到约60-95％，约70-95％，或约80-95％。在本发明的一些实施方式中，生物质累积阶段产生微生物生物质，在该阶段使得至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，或至少约95％总的微生物生物质制备在生物质累积阶段期间实现。优选地，在生物质累积阶段实现约50-95％总的微生物的生物质产生。
在本发明的一些实施方式中，脂质累积阶段产生脂质，使得在脂质累积阶段实现约10-95％，约20-95％，约30-95％，约40-95％，或约50-95％总的微生物的脂质产生。
在本发明的其他实施方式中，在脂质累积阶段期间实现约60-95％，约70-95％，或约80-95％总的微生物的脂质产生。在本发明的一些实施方式中，脂质累积阶段产生脂质，使得在脂质累积阶段期间实现至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，或至少约95％总的微生物的脂质产生。优选地，在脂质累积阶段期间实现约50-95％总的微生物的脂质产生。
遗传修饰的微生物也适用于本发明。本发明微生物经遗传修饰以提高其以低成本制备生物油的能力(例如，通过提高使用纤维素基原料作为主要碳源的能力)。这些遗传修饰的微生物可包括但不限于：经遗传修饰后提高糖化纤维素或纤维质原料的能力的微生物，提高油产量的微生物，能够降解木质素或耐受木质素的微生物，能够在对相应的野生型生物不是最佳的培养条件下培养的微生物(如高温或强酸性培养基)。例如，可遗传修饰微生物以引入或提高对内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和/或β-糖苷酶的活性。
可将来自诱导纤维素酶的生物体的基因引入微生物以提高其糖化纤维素的能力。例如，可将来自木霉属、梭菌属、纤维单胞菌属、热纤维菌属(Thermobifida)、热酸菌属(Acidothermus)、裂殖壶菌属或破囊壶菌属生物体的编码纤维素酶组分的基因通过重组基因技术引入本发明微生物以产生能够直接糖化纤维素的微生物。优选地，将来自里氏木霉(Trichoderma reesei)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)或聚生裂殖壶菌(Schizochytrium aggregatum)的编码纤维素酶组分的基因引入本发明的微生物并在该微生物中表达。在本发明的一些实施方式中，将来自一种生物体的纤维素酶克隆到另一种生物体中。
微生物的遗传转化技术是本领域公知的，参见例如，Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Labs Press)。适用于隐甲藻的腰鞭毛虫通用转化技术可详见Lohuis和Miller,The Plant Journal(1998)13(3):427-435。破囊壶菌门的通用遗传转化技术在2003年9月4日公开的美国专利申请公开20030166207中详述。
在本发明的一些实施方式中，在低浓度溶解氧的条件下进行微生物发酵以制备生物油。微生物在低浓度溶解氧的条件下生长和产生油的能力可降低发酵所需能量输入，因而也可降低发酵成本。在本发明的一些实施方式中，在溶解氧浓度约为4％-100％、约10％-100％、约10％-80％、约10-70％、约10-60％、约15-50％、或约20-40％的条件下进行微生物生物质的培养(生物质累积阶段)。可以在溶解氧浓度例如为0％-10％、0％-8％、约1％-5％、或约1％-3％的条件下进行微生物生物油的制备(脂质累积阶段)。
为降低与发酵罐冷却有关的能量成本，本发明所用微生物优选耐受宽温度范围。在本发明的一些实施方式中，微生物可以在约15-45℃、约20-45℃、约25-45℃、约30-45℃、或约35-45℃的温度下生长和产生油。
通常，微生物的发酵通常在无菌环境中进行以避免可能干扰微生物的生物质生长和/或脂质累积的污染物。在无菌条件下进行发酵会增加由微生物产生生物油的成本。为了降低发酵成本，本发明提供了在有菌发酵罐中经发酵制备生物油的出乎意料的方案。使用有菌发酵罐由微生物产生油尤其适用于制备用于脂质基生物燃料目的的油，因为这种方案可以显著降低油品生产成本并使脂质基生物燃料制备更具商业应用价值。根据具体应用的要求，也可使用有菌发酵罐来制备多不饱和脂肪酸含量或高或低的生物油。
优选地，发酵过程中可采用低成本发酵罐，包括纤维增强的聚合物发酵罐、金属基质复合材料发酵罐、陶瓷基质复合材料发酵罐、热塑性复合材料发酵罐、金属发酵罐、环氧树脂内衬的碳钢发酵罐、塑料内衬的碳钢发酵罐、塑料发酵罐、玻璃纤维发酵罐、混凝土发酵罐、由聚合物(如聚丙烯(PP)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、kynar和尼龙)制成的发酵罐。低成本发酵罐也可由上述材料的组合构成。根据本发明还可采用低成本罐清洁技术来进一步降低发酵成本。低成本罐清洁技术包括但不限于：使用甲醇盐或乙醇盐来化学擦洗发酵罐。
在本发明的一些实施方式中，在有菌发酵罐中生物油的生产率约为5-70克/升/天。优选地，在有菌发酵罐中产生的生物油的量至少约为5克/升/天、至少约10克/升/天、至少约20克/升/天、至少约30克/升/天、至少约40克/升/天、至少约50克/升/天、至少约60克/升/天或至少约70克/升/天。在本发明的一些实施方式中，在有菌发酵罐中产生的生物油的量约为10-70克/升/天、约20-70克/升/天或约30-70克/升/天。
在有菌发酵罐中培养微生物优选实现的高细胞密度至少约为10克/升、至少约15克/升、至少约20克/升、至少约25克/升、至少约30克/升、至少约50克/升、至少约75克/升、至少约100克/升、至少约125克/升、至少约135克/升、至少约140克/升、至少约145克/升或至少约150g/或至少约200克/升。在本发明的一些实施方式中，在有菌发酵罐中进行发酵的微生物能够实现的细胞密度约为10-300克/升、约15-300克/升、约20-300克/升、约25-300克/升、约30-300克/升、约50-300克/升、约75-300克/升、约100-300克/升、约125-300克/升、约130-290克/升、约135-280克/升、约140-270克/升、约145-260克/升、或约150-250克/升。
在本发明的一些实施方式中，根据生物油的预定用途，可改变微生物的发酵条件(例如pH、温度、溶解的氧浓度、离子比等)来改变所得油的脂肪酸分布特征。根据本发明生物油的预定用途，可调节发酵条件，例如促进或阻碍微生物产生甘油三酯形式的脂质，促进或阻碍微生物产生特定的脂肪酸或脂肪酸掺混物(例如特定链长或不饱和度的脂肪酸)，促进或阻碍每单位体积油提供的能量水平高或低的油，或促进或阻碍微生物产生油中的某些副产物的累积。用于脂质基生物燃料目的的本发明生物油的各种用途包括但不限于：用作取暖用油、运输用生物柴油、喷气发动机燃料和燃料添加剂。在本发明的一些实施方式中，发酵培养基中可使用氘来提供超低容量、极高值的专用燃料或润滑剂的制备。在本发明的一些实施方式中，生物油转化为脂质基生物燃料涉及本领域已知的化学工艺和精制技术，这些工艺和技术也可制备或用于制备类似于油馏出物的专用化合物(如塑料组分)。
这些专用化学品的销售利润也可抵消脂质基生物燃料制备的成本。生物油的各种其他用途被考虑在本发明范围内。例如，本发明的生物油可以在任何合适的食品、营养品或药品中使用。
本发明还提供了在浸没在诸如水等冷却液中的发酵罐中进行发酵的方法。在本发明的一些实施方式中，发酵设备可串联设置以最大程度降低能量用量。例如，自一系列发酵罐中的冷却流出液和喷射废气可分别用作冷却水和气体供应(或部分供应)，用于该系列管线内下游或上游一发酵罐。发酵系统可设置成冷却水来自湖泊、池塘或海洋等天然水系。发酵系统可设计成将发酵罐的冷却系统串联使得从该串联中的第一发酵罐或发酵罐组流出的冷却水可用作该串联中第二发酵罐或发酵罐组的冷却供应水。类似地，发酵系统可设计成将发酵罐的气体供应串联使得从该串联中的第一发酵罐或发酵罐组喷出的排气可用作该系列中第二发酵罐或发酵罐组的气体供应。第一发酵罐或发酵罐组迟早与第二发酵罐或发酵罐组相互串联。本发明发酵优选以间歇式、分批进料、半连续或连续模式进行。
虽然在本发明的一些实施方式中，包含甘油三酯的生物油可以是原油(下文更详细讨论)，适用于本发明的其他这类油可通过本领域已知的任何合适的方式从其来源获得。例如，可采用诸如氯仿、己烷、二氯甲烷、甲醇等溶剂进行萃取，或者通过超临界流体提取或通过无溶剂提取方法回收油。在本发明的一些实施方式中，采用己烷萃取回收生物油。或者，可采用萃取技术提取油，例如美国专利6,750,048和PCT专利申请序列号US01/01806所述，这两份申请在2001年1月19日以“无溶剂提取方法(Solventless ExtractionProcess)”提交，其全部内容被纳入本文作为参考。其他提取和/或纯化技术参见：2001年4月12日提交的题为“含油和极性脂质的天然原料的分馏方法(Method for theFractionation of Oil and Polar Lipid-Containing Native Raw Materials)的PCT专利申请序列号PCT/IB01/00841；2001年4月12日提交的题为“采用水溶性有机溶剂进行含油和极性脂质的天然原料的分馏与离心方法(Method for the Fractionation of Oil andPolar Lipid-Containing Native Raw Materials Using Water-Soluble OrganicSolvent and Centrifugation)的PCT专利申请序列号PCT/IB01/00963；2001年5月14日提交的题为“含有来自植物种子和微生物的十八碳四烯酸和γ-亚麻酸的富含脂质的极性馏分的制备与应用(Production and Use of a Polar Lipid-Rich Fraction ContainingStearidonic Acid and Gamma Linolenic Acid from Plant Seeds and Microbes)的美国临时专利申请序列号60/291,484；2001年5月14日提交的题为“含有来自微生物、遗传改造的植物种子和海洋生物的ω-3和/或ω-6高度不饱和脂肪酸的极性脂质馏分的制备与应用(Production and Use of a Polar-Lipid Fraction Containing Omega-3 and/orOmega-6 Highly Unsaturated Fatty Acids from Microbes,Genetically ModifiedPlant Seeds and Marine Organisms的美国临时专利申请序列号60/290,899；2000年2月17日提交并于2002年6月4日授权的题为“含有来自甘油三酯混合物的二十二碳六烯酸残留成分的甘油三酯的分离方法(Process for Separating a Triglyceride Comprising aDocosahexaenoic Acid Residue from a Mixture of Triglycerides)的美国专利6,399,803；和2001年1月11日提交的题为“制备富含多不饱和脂肪酸酯混合物的方法(Processfor Separating a Triglyceride Comprising a Docosahexaenoic Acid Residue froma Mixture of Triglycerides)的PCT专利申请序列号US01/01010；其全部内容被纳入本文作为参考。提取的油经减压蒸发得到浓缩的油料的样品。回收脂质的生物质酶处理方法参见：2002年5月3日提交的题为“由生物质酶释放得到的高品质脂质及其制备方法(HIGH-QUALITY LIPIDS AND METHODS FOR PRODUCING BY ENZYMATIC LIBERATION FROMBIOMASS)的美国临时专利申请60/377,550；2003年5月5日提交的题为“由生物质酶释放得到的高品质脂质及其制备方法(HIGH-QUALITY LIPIDS AND METHODS FOR PRODUCING BYENZYMATIC LIBERATION FROM BIOMASS)的PCT/US03/14177；2004年10月22日提交的题为“由生物质酶释放得到的高品质脂质及其制备方法(HIGH-QUALITY LIPIDS AND METHODSFOR PRODUCING BY LIBERATION FROM BIOMASS)的共同待批美国专利申请10/971,723；题为”利用离心力从天然物质混合物提取非水溶性天然产物的方法(Process forextracting native products which are not水-soluble from native substancemixtures by centrifugal force)的欧洲专利公开0 776 356和美国专利5,928,696，所有文献的内容被纳入本文作为参考。可通过压榨提取油。
在一些实施方式中，根据本发明的方法，从上述来源获得的油即使在未经常规加工处理的情况也可用作进一步改性(例如酯交换或裂解)的原料。可避免的这种常规工艺的例子包括精制(例如物理精制、硅胶精制或苛性精制)、脱溶剂化、除臭、冬藏、冷滤和/或漂白。因此，在某些实施方式中，包含甘油三酯的油未进行选自下组的一种或多种处理：精制、脱溶剂、除臭、冬藏、冷滤和漂白，在其他实施方式中，油未进行精制、脱溶剂、除臭、冬藏、冷滤和漂白中任一种处理。
在一些实施方式中，原油可利用标准技术从微生物分离，而不需要进一步的精制或纯化。例如，油可以是仅仅经过溶剂萃取，例如己烷萃取、异丙醇萃取等处理的微生物油。在本发明的一些实施方式中，原油可以利用物理和/或机械提取方法(例如通过使用匀浆器，或通过压榨)从微生物分离，未经进一步的精制或纯化处理。
在其它实施方式中，包含具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物，例如上述的油，可经过进一步的加工步骤，例如精制、脱溶剂、除臭、冬化、冷滤和/或漂白。这种“经处理”的油包括经过溶剂萃取以及一种或多种这些附加的加工步骤的微生物油。在一些实施方式中，油经过最少处理。“最少处理的”油包括经溶剂萃取和过滤的微生物油。在某些实施方式中，经最少加工处理的油进一步进行冬藏处理。
在本发明的一些实施方式中，采用类似于
(德国外斯法拉分离工业有限公司(Westfalia Separator Industry GmbH))工艺的方法来提取微生物产生的生物油。
是一种水基物理油提取工艺，其中含油原料可直接用于提取油而不需要使用任何常规的溶剂萃取方法。.在该工艺中，使用水溶性有机溶剂作为操作助剂，利用重力或离心力通过密度分离从原料发酵液分离油。专利申请公开WO 01/76715和WO 01/76385(其内容被纳入本文作为参考)揭示了这种提取方法。
提取油之后，通过本领域已知的任何合适的方法从非脂质组分回收或分离油。在本发明优选的实施方式中，采用低成本物理和/或机械技术从非脂质组合物分离含脂质组合物。例如，如果用于提取油的提取方法产生了多个相或馏分，其中一个或多个相或馏分包含脂质，用于回收含脂质相或馏分的方法可包括从非脂质相或馏分物理去除含脂质相或馏分，或者相反。在本发明的一些实施方式中，采用
型方法来提取微生物产生的脂质，然后将富含脂质的轻质相从富含蛋白质的重质相物理分离(例如通过在密度分离后撇去富含蛋白质的重质相顶部富含脂质的相)。
本发明微生物产生的生物油可通过使微生物处于以下条件导致微生物自发裂解或诱导裂解进行回收，这些条件包括但不限于：特定pH、特定温度、酶的存在、去污剂的存在、物理破碎或它们的组合。在本发明的一些实施方式中，使微生物处于这些条件下以促进其产生油之后的自发裂解或诱导裂解，裂解量是其生物质干重的约30-90重量％、约40-90重量％、约50-90重量％、约60-90重量％、约65-85重量％、约70-85重量％、或约75-80重量％。在本发明的其他实施方式中，微生物处于这些条件下，导致产生油之后的自发裂解或诱导裂解为其生物质干重的至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约75重量％。在本发明的一些实施方式中，采用机械力实现微生物的裂解或自发裂解。在本发明的其他实施方式中，微生物裂解或自发裂解之后，从非脂质组合物机械分离脂质。
可用于诱导产油微生物裂解的合适的酶包括但不限于：市售酶或酶混合物，如蛋白酶K或Alcalase。本发明范围内考虑对微生物进行遗传修饰以引入能够诱导另一种微生物发生裂解或自动裂解的酶的活性。在本发明的一些实施方式中，在去污剂如离子(阴离子或阴离子)去污剂、非离子去污剂、两性离子去污剂或其组合的存在下，产油微生物经历诱导裂解。在本发明的其他实施方式中，物理破碎方法如机械研磨、液体匀质化、采用高频声波的声波降解法、冻融循环方法、压榨、挤出、或研磨可用于诱导产油微生物的裂解。优选地，发酵结束后通过产油微生物的罐内裂解在发酵罐中进行油的提取。
一旦根据本发明制备了生物油，可采用本领域已知的各种方法将生物油转化为脂肪酸酯，用作生物柴油、喷气发动机生物燃料、或用作食品或药品中的成分。在本发明的一些实施方式中，脂肪酸酯的制备包括使微生物产生的生物油发生酯交换。在本发明的一些实施方式中，在一步的方法中，从微生物提取生物油和油的酯交换可以同时进行。例如，含产油微生物的培养物可处于能够促进油的提取和油的酯交换的条件下或进行处理(或者条件或处理的组合)。这些条件或处理可包括但不限于：pH、温度、压力、溶剂的存在、水的存在、催化剂或酶的存在、去污剂的存在以及物理/机械力。可将两组条件或处理组合来产生提取油并使其酯交换的一步方法，其中一组条件或处理有利地促进油的提取而另一组条件或处理有利地促进油的酯交换，只要这两组条件或处理能够组合而不会导致油的提取效率或酯交换效率的显著降低。在本发明的一些实施方式中，可对全细胞生物质直接进行水解和酯交换。在本发明的其它实施方式中，油的提取可作为独立于油的酯交换步骤的一个步骤。
优选地，采用酸或碱催化剂进行这些酯交换反应。在本发明的一些实施方式中，使生物油酯交换形成用作生物柴油或用作食品或药品中的成分的脂肪酸酯的方法包括在醇和碱的存在下使含甘油三酯的生物油反应以制备具有甘油三酯的残基的脂肪酸酯。
适用于本发明的醇包括含1-6个碳原子的任何低级烷基醇(即C1-6烷基醇，如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、己醇及其异构体)。不希望受理论约束，相信在本发明的一些实施方式中，在本发明方法中使用低级烷基醇可产生脂肪酸残基的低级烷基酯。例如，使用乙醇产生乙酯。在某些实施方式中，醇是甲醇或乙醇。在这些实施方式中，产生的脂肪酸酯分别是脂肪酸残基的甲酯和乙酯。在本发明方法中，油组合物、醇和碱的混合物中醇的用量通常为约5-70重量％、约5-60重量％、约5-50重量％、约7-40重量％、约9-30重量％或约10-25重量％。在某些实施方式中，可将组合物和碱加入纯乙醇或纯甲醇中。通常，所用醇的量可根据醇中含甘油三酯的油或组合物的溶解度而变化。
本发明可使用本领域已知的任何碱作为反应试剂。通式RO-M的碱尤其适用于本发明，其中M是单价阳离子，RO是C1-6烷基醇的醇盐。合适的碱的例子包括：元素钠、甲醇钠、乙醇钠、甲醇钾和乙醇钾。在一些实施方式中，碱是乙醇钠。在本发明方法中，在具有组合物和醇的反应步骤中，碱的用量通常约为甘油三酯摩尔当量的0.05-2.0、约0.05-1.5、约0.1-1.4、约0.2-1.3、或约0.25-1.2。
包含甘油三酯的组合物、醇和碱在能使脂肪酸残基和醇产生酯的温度和持续时间下进行反应。合适的反应时间和温度可由本领域技术人员确定以制备酯。不希望受理论约束，相信从甘油三酯的甘油骨架分裂脂肪酸残基并在反应步骤期间形成各脂肪酸残基的酯。在某些实施方式中，在约20-140℃、约20-120℃、约20-110℃、约20-100℃、或约20-90℃的温度下进行醇和碱存在下组合物的反应步骤。在其他实施方式中，在至少约20℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、105℃或120℃的温度下在醇和碱存在下进行组合物反应步骤。在本发明的一些实施方式中，在约20℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、105℃或120℃的温度下进行醇和碱存在下组合物的反应步骤。在一些实施方式中，在醇和碱存在下进行组合物的反应步骤，持续时间约为2-36小时、约3-36小时、约4-36小时、约5-36小时、或约6-36小时。在某些实施方式中，在醇和碱存在下进行组合物的反应步骤，持续时间约为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、10、12、16、20、24、28、32或36小时。
在一个实施方式中，通过将各组分回流进行油组合物、醇和碱的反应步骤以制备脂肪酸酯如PUFA酯。在其他实施方式中，在不会导致反应组分回流的温度下进行油组合物的反应步骤。例如，在大于大气压的压力下进行油组合物的反应步骤可提高反应混合物中存在的溶剂的沸点。在这些条件下，当溶剂在大气压下发生沸腾的温度下进行反应，但不会导致反应组分的回流。在一些实施方式中，在约5-20磅/平方英寸(psi)；约7-15psi；或约9-12psi的压力下进行反应。在某些实施方式中，在7、8、9、10、11或12psi的压力下进行反应。压力下进行反应可以在上述反应温度下进行。在一些实施方式中，压力下进行反应可以在至少约70℃、75℃、80℃、85℃或90℃的温度下进行。在一些实施方式中，压力下进行反应可以在70℃、75℃、80℃、85℃或90℃进行。
包含脂肪酸酯的反应混合物可进一步加工以从混合物获得脂肪酸酯。例如，混合物可以冷却，用水稀释，用溶剂如己烷提取水性溶液以制备包含脂肪酸酯的组合物。洗涤和/或提取粗品反应混合物的技术是本领域已知的。
在本发明的一些实施方式中，采用产生低水平PUFA的微生物来制备生物油，尤其适用于生物柴油制备。该方法可降低生物柴油的生产成本。在本发明的一些实施方式中，生物油中小于约50％的不饱和脂肪酸是PUFA。对于某些生物燃料应用，生物油中不饱和脂肪酸优选含有小于约40％，小于约30％，小于约20％，小于约10％或小于约5％PUFA。在本发明的一些实施方式中，生物油中PUFA的含量小于约50重量％、小于约40重量％、小于约30重量％、小于约20重量％、小于约10重量％或小于约5重量％。
更具价值的PUFA酯可通过蒸馏回收以产生高效能PUFA酯，然后销售以降低生物柴油产品的总的制备成本。
改良的脂质制备系统的例子参见以下专利申请公开：WO 06/031699，US2006/0053515，US 2006/0107348和WO 06/039449，其内容被纳入本文作为参考。
在本发明的一个实施方式中，通过蒸馏组合物从反应混合物分离脂肪酸酯以回收包含脂肪酸酯的馏分。这样，可从反应混合物分离并回收包含感兴趣脂肪酸酯的反应混合物的目标馏分。
在某些实施方式中，蒸馏在真空下进行。不希望受理论约束，真空蒸馏使得能够在比不采用真空时更低的温度下实现蒸馏，从而防止酯的降解。典型的蒸馏温度约为120-170℃。在一些实施方式中，蒸馏步骤在小于约180℃、小于约175℃、小于约170℃、小于约165℃、小于约160℃、小于约155℃、小于约150℃、小于约145℃、小于约140℃、小于约135℃或小于约130℃的温度下进行。典型的真空蒸馏压力约为0.1-10mm Hg。在一些实施方式中，真空蒸馏的压力至少约为0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5或4mm Hg。在本发明的一些实施方式中，真空蒸馏的压力约为0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5或4mm Hg。
在本发明的一些实施方式中，通过生物油的酯交换产生的脂肪酸酯通过尿素加合进一步分离。尿素可溶解在包含脂肪酸酯的培养基中，形成包含脂肪酸酯和溶解的尿素的培养基。然后冷却或浓缩该培养基，形成包含尿素和至少一部分饱和脂肪酸酯的沉淀以及包含至少大部分多不饱和脂肪酸酯的液体馏分。然后将沉淀和液体馏分离，分裂饱和或多不饱和脂肪酸酯。在本发明的一些实施方式中，将包含脂肪酸酯和溶解尿素的培养基冷却至约20℃到约-50℃、约10℃到约-40℃、或约0℃到约-30℃。美国专利6,395,778(其内容被纳入本文作为参考)揭示了尿素加合后的酯交换方法。
除了上述酯交换方法，降低本发明生物油的粘度的其他技术也可结合到本发明方法中以制备脂质基生物燃料。这些技术包括但不限于：利用脂肪酶、超临界甲醇催化、和使用全细胞系统，该系统包括在宿主细胞中胞质过度表达脂肪酶，然后透化宿主以实现胞质内甘油三酯的酯交换催化。专利或专利申请公开US 7226771、US 2004/0005604、WO 03/089620、WO 05/086900、US 2005/0108789、WO 05/032496、WO 05/108533、US 6982155、WO06/009676、WO 06/133698、WO 06/037334、WO 07/076163、WO 07/056786和WO 06/124818(其内容被纳入本文作为参考)揭示了将脂质转化为生物柴油的方法的例子。
破囊壶菌门，具体是裂殖壶菌属类似于许多海洋和河口微藻和原生生物，因为它们在其细胞脂质中累积一定量的多不饱和脂肪酸(PUFA)。低水平PUFA是有用的，因为它们能够降低燃料胶凝点，使其更适合寒冷气候。潜在的消费者关于在效率低下的引擎中燃烧含PUFA的生物柴油(使部分氧化的燃料进入排气)产生气味的抱怨可以在一定程度上通过以下方式抵消，微藻生物柴油燃料可以1-99％的比例与化石柴油掺混以尽可能减小该问题。为了确保100％微藻油衍生的生物柴油在燃烧过程中不存在显著的消费者问题，可使用部分或完全的油氢化反应，如同人造黄油制造中常规使用的那样。在本发明的一些实施方式中，可使用裂解技术(例如油工业中已知的裂解方法)来减小脂肪酸链的长度。一旦根据本发明方法制备了生物油，可进行生物油的裂解以产生所需的脂质基生物燃料。对于某些需要各种较短烃的脂质基生物燃料，例如喷气发动机生物燃料，高水平的PUFA是有用的，能使PUFA可以在多个位点发生裂解形成各种烃。
本发明的脂质基生物燃料组合物以低成本制备，是石油柴油或喷气燃料的有效替代品。在本发明的一些实施方式中，脂质基生物燃料组合物包含约1-75重量％具有20个或更多个碳的长链PUFA的烷基酯。在本发明的其他实施方式中，生物柴油组合物包含约2-50％、约4-25％、或约5-10重量％具有20个或更多个碳的长链PUFA的烷基酯。
在本发明的一些实施方式中，脂质基生物燃料组合物(100％脂质基生物燃料，未掺混石油柴油或喷气发动机燃料)的熔化温度约为30℃到约-60℃、约30℃到约-50℃、约25℃到约-50℃、约20℃到约-30℃、约20℃到约-20℃、约20℃到约-10℃、约10℃到约-10℃、或约0℃到约-10℃。在本发明的其他实施方式中，生物柴油组合物释放约30-45兆焦耳/升、约35-40兆焦耳/升、或约38-40兆焦耳/升。揭示了各种形式的生物柴油，例如参见专利或专利申请公开WO 07/061903，US 7172635，EP 1 227 143，WO 02/38709，WO 02/38707和US2007/01 13467，其内容被纳入本文作为参考。
本发明还提供了规模化脂质基生物燃料生产设备，该设备可与乙醇生产设备(例如纤维素乙醇设备)协同定位。与非脂质基燃料(如乙醇)生产有关的藻类体系的例子参见专利或专利申请公开US 7135308和WO 02/05932，其内容被纳入本文作为参考。
在本发明的一些实施方式中，原料处理与纤维素乙醇和纤维质脂质基生物燃料发酵类似或相同。例如，在纤维素生物柴油发酵之后，可对油进行提取和酯交换(同时或相继进行)以制备生物柴油。酯交换中使用的醇可来自乙醇生产工艺(例如纤维素乙醇生产工艺)，生物柴油酯交换剩余的甘油可用作乙醇发酵工艺的补充碳源(或者用于生物柴油工艺本身，因为诸如裂殖壶菌属等生物体易于代谢甘油)。在本发明优选的实施方式中，本发明使用的微生物能够利用甘油作为碳源。含氮废料(如酵母生物质)也可用作生物柴油发酵中的氮源(大多数破囊壶菌能够利用酵母提取物作为氮源)。诸如去脂化微生物生物质等的废料可循环用于随后的发酵过程，燃烧发热或发电，或用作提供纤维素原料的农作物的肥料。所得生物柴油或废气可用作生物柴油或乙醇生产设备的燃料，使它们成为能量独立性的。此外，设备中的泵可由回收的废气驱动。
在本发明的一些实施方式中，生产脂质基生物燃料的方法包括采用包含循环培养基的营养物质培养微生物来制备生物油。循环培养基包括但不限于：去脂化生物质、水解的生物质、部分水解的生物质、金属、盐、氨基酸、胞外糖、甘油、循环酵母生物质或它们的组合，所有这些均从上一发酵工艺或其他工艺循环获得。例如，残留的酵母生物质和水解的假菌界去脂化生物质废料可循环进入蒸气预处理、氨纤维爆炸、分离步骤、或进入酶水解、分离和蒸发步骤，如图1所示。部分水解的生物质可与培养基一起循环回到这些步骤用于进一步的水解。根据于具体应用的要求，使用循环培养基可用于生产多不饱和脂肪酸含量或高或低的生物油。
本发明纤维素基(低成本碳)技术可用于降低通过酵母或假菌界微生物(如破囊壶菌)，包括遗传修饰的微生物发酵制备的任何化合物的生产成本。采用本发明方法制备的化合物的例子包括但不限于：PUFA、PUFA酯、蛋白质(包括酶和治疗性蛋白)、羟脂、类胡萝卜素和脂质。
在一些实施方式中，本发明方法可用于制备包含高百分比的PUFA或PUFA酯的组合物。例如，这些组合物可包含约50-100重量％PUFA或PUFA的酯，在其他实施方式中，组合物可包含至少约50重量％、至少约55重量％、至少约60重量％、至少约65重量％、至少约70重量％、至少约75重量％、至少约80重量％、至少约85重量％、至少约90重量％、至少约95重量％、至少约99重量％PUFA或PUFA的酯。
本发明包含PUFA或PUFA酯的组合物可用于药品。在一些实施方式中，药品可包含PUFA或PUFA酯而没有其他药物活性成分。在其它实施方式中，药品可包含药物活性剂。药物活性剂的例子包括：他汀类、抗高血压药、抗糖尿病药、抗-痴呆药、抗抑郁药、抗肥胖药、食欲抑制剂、以及增强记忆和/或认知功能的药物。药品还包含任何药学上可接受的赋形剂、载体、粘合剂或本领域已知的其他制剂组分。
本发明方法制备的PUFA或PUFA酯适合用作治疗剂或实验试剂。本发明实施方式包括用于治疗PUFA-缺乏婴儿的PUFA或PUFA酯的制备。可包含在胃肠外制剂中的PUFA或PUFA酯，可通过胃肠外途径给予婴儿以加强婴儿的PUFA供应。优选的胃肠外途径包括但不限于：皮下、皮内、静脉内、肌内和腹膜内途径。胃肠外制剂可包含本发明的PUFA或PUFA酯以及适用于胃肠外递送的载体。本文所用术语“载体”是指适合用作将分子或组合物递送至合适的体内作用部位的运载体的任何物质。这种载体的例子包括但不限于：水、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液、右旋糖溶液、含血清溶液、汉克斯溶液和其他水性生理学平衡液。合适的载体还包括油基载体、非水溶液、、混悬液和乳液。例子包括：丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射的有机酯如油酸乙酯、聚乙氧基化蓖麻油(cremaphor)和本领域已知的其他物质。以有效方式给予PUFA或PUFA酯的可接受的方案包括单次剂量大小、给药次数、给药频率和给药模式。这种方案可由本领域技术人员根据婴儿体重和PUFA缺乏程度等各种参数进行确定。本发明的另一个实施方式包括用于成人，尤其是孕妇治疗的PUFA或PUFA酯的制备。将PUFA或PUFA酯给予成人的可接受的方案包括：胃肠外给药技术或将本发明PUFA或PUFA酯包封到胶囊中，如明胶(即，可消化的)胶囊，用于口服给药和/或配制在液体膳食制剂中。液体膳食制剂可包含含有适用于补充膳食的营养物质或足以作为完整膳食的营养物质的液体组合物。
本发明方法制备的PUFA或PUFA酯也可用于治疗具有高水平甘油三酯的对象(例如人或动物)，包括患有高甘油三酯血症的对象。例如，甘油三酯水平等于或高于500mg/dL的对象可受益于本发明PUFA或PUFA酯的治疗。在一些实施方式中，可将单独的PUFA或PUFA酯给予对象以治疗高甘油三酯水平。在某些实施方式中，PUFA或PUFA酯可以是DHA或ARA。在其它实施方式中，可将PUFA或PUFA酯的组合给予对象以治疗高甘油三酯水平。在某些实施方式中，PUFA或PUFA酯的组合可包含ω-3和ω-6PUFA如DHA和DPA n-6。在一些实施方式中，PUFA或PUFA酯可占给予对象的组合物的约90％。PUFA或PUFA酯可与其他组分和赋形剂(例如上文所述的载体)一起给予。PUFA或PUFA酯还可用于治疗患有与高水平甘油三酯相关的疾病，例如心血管病或高血压的对象。
本发明方法制备的PUFA酯可用于制备PUFA盐。在一些实施方式中，可以在碱性金属碱如碱土金属氢氧化物(例如氢氧化钾)的存在下，使本发明PUFA酯反应产生PUFA盐。本发明PUFA酯形成的PUFA盐可用于各种应用，例如食品、饮品和药品。在一些实施方式中，采用本发明PUFA酯制备的PUFA盐是水溶性的，可直接用于食品、饮品和药品。
本发明方法制备的PUFA或PUFA酯可用于任何动物食材，尤其是人用食材，从而得到PUFA浓度提高的食品。食品中天然存在的脂肪酸含量根据食品类型而不同。本发明食品可具有正常量的PUFA或改进量的PUFA。在前一种情况下，可用本发明的PUFA或PUFA酯代替一部分天然产生的脂质。在后一种情况下，可用本发明PUFA或PUFA酯补充天然产生的脂质。
可将PUFA或PUFA酯加入婴儿食品，如婴儿配方和幼儿食品中。根据本发明，婴儿指小于约2岁的婴幼儿，尤其包括早产婴儿。因为婴儿的快速生长(即在1岁过程中体重增倍或三倍增长)，某些PUFA是婴儿配方和幼儿食品中尤其重要的组分。补充婴儿配方的PUFA或PUFA酯的有效量是指接近人母乳中PUFA浓度的量。加入婴儿配方或幼儿食品中的PUFA或PUFA酯的优选用量约为0.1-1.0％脂肪酸总量，更优选约0.1-0.6％脂肪酸总量，甚至更优选约0.4％脂肪酸总量。
本发明的另一方面包括含有与本发明PUFA或PUFA酯组合的食材的食品。可将PUFA或PUFA酯加入食材中，得到PUFA浓度提高的食品。本文所用术语“食材”是指给予人或非人动物的任何食物类型。本发明范围内还包括食品的制备方法，该方法包括将本发明生产的PUFA或PUFA酯加入食材中。
适用于本发明食品制备的合适的食材包括动物饲料。术语“动物”表示属于动物界的任何生物体，包括但不限于灵长类(例如人和猴)、家禽类和家庭宠物。术语“食品”包括给予这类动物的任何产品。人消费的优选食材包括婴儿配方和幼儿食品。家庭宠物消费的优选食材包括狗粮。
可以在各个制备阶段将本发明方法制备的PUFA或PUFA酯加入诸如烘焙食品、维生素补充剂、饮食补充剂、粉末饮料等的各种产品中。许多成品或半成品的粉末化食品可采用本发明组合物进行制备。
包含本发明产品的食品的部分列表包括：生面团；稀面糊；烘焙食品，包括例如蛋糕、芝士蛋糕、馅饼、纸托蛋糕、小甜饼、长条形面包、面包、小白面包、饼干、松饼、面粉糕饼、烤饼和烤面包片；液体食品，例如饮料、能量饮品、婴儿配方、液体膳食、果汁、多重维生素的糖浆、膳食替代品、药用食品和糖浆；半固体食品，例如幼儿食品、酸奶酪、芝士、谷类、薄煎饼混合物；食品棒状物，包括能量棒；经过加工的肉；冰淇淋；冷冻甜品；冷冻酸乳酪；威化混合物；色拉酱；和替代鸡蛋混合物。还包括烘焙食品，例如小甜饼、薄脆饼干、甜品、点心、馅饼、格兰诺拉麦片/点心棒和烤馅饼皮；盐腌点心如薯片、玉米片、格兰诺拉麦片、挤压成形的点心、爆米花、椒盐脆饼、炸薯片和坚果；特制点心如调味液、干果点心、肉品点心、猪肉卷、健康食品棒和稻米/玉米蛋糕；和糕饼点心如糖果。
本发明的另一个产品实施方式是药用食品。药用食品包括在医师监督下外部消费和给予的制剂中的食品，以及基于认可的科学原理，根据由医学评估确立的独特营养需求进行疾病或病症的特定饮食控制的食品。
虽然根据具体方法、产品和生物体描述了本发明，这些描述旨在包括根据本文所述内容可获得并且有用的所有这种方法、产品和生物体，包括本领域技术人员已知的所有替代形式、改进形式和优化形式。提供下面的实施例和测试结果是为了阐述目的而不是限制本发明的范围。
实施例
实施例1
采用2升发酵罐，在典型发酵条件下，用糖化纤维素源培养野生型裂殖壶菌属或破囊壶菌(Thraustochytrium)的培养物。用含碳(糖化纤维素)、氮、磷、盐、痕量金属和维生素的培养基分批处理各发酵罐。可用典型的种子培养物接种各发酵罐，然后培养72-120小时，培养期间输送碳(糖化纤维素)进料和氮进料。氮进料只有在生长阶段输送和消耗，而碳(糖化纤维素)在整个发酵过程中输送和消耗。72-120小时后，收集各发酵罐，自发裂解或水解。将水解产物分离形成油和生物质馏分。然后对油进行酯交换并与甘油分离。单烷基酯经水洗得到最终产品。
典型的发酵控制条件：
温度：20–40℃
pH：3.0-10.0
搅拌：100-400cps
气流：0.25-3.0vvm
糖化纤维素：5-35g/L(罐内浓度)
接种物：1％-50％
实施例2
采用10升发酵罐，在典型发酵条件下，用液化纤维素源培养野生型或转基因裂殖壶菌属或破囊壶菌培养物。生物体将产生必需的酶，同时糖化纤维素和代谢葡萄糖、木糖、半纤维素和木质素。用含碳(液化纤维素)、氮、磷、盐、痕量金属和维生素的培养基分批处理各发酵罐。可用典型的种子培养物接种各发酵罐，然后培养72-120小时，培养期间给予碳(液化纤维素)进料和氮进料。氮进料只有在生长阶段输送和消耗，而碳(液化纤维素)在整个发酵过程中输送和消耗。72-120小时后，收集各发酵罐，自发裂解或水解。将水解产物分离形成油和生物质馏分。然后对油进行酯交换并与甘油分离。单烷基酯经水洗得到最终产品。
典型的发酵条件：
温度：20–40℃
pH：3.0-10.0
搅拌：100-400cps
气流：0.25-3.0vvm
液化纤维素：5-35g/L(罐内浓度)
接种物：1％-50％
实施例3
可采用现有的转化系统(例如公开的专利申请WO 2002/083869 A2所述)培育实施例2的转基因裂殖壶菌属或破囊壶菌，表达编码已知和合适的纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、糖运载体、差向异构酶和糖异构酶的基因。或者，过去未表征的纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、糖运载体、差向异构酶和糖异构酶可从现有的基因组数据库分离或通过用未表征或表征程度较低的生物体实施标准基因发现战略，包括基于同源基因保守区域的简并引物进行PCR，或者质量测序并挖掘表达的序列标签(EST)或基因组序列，或者其他技术。合适的基因表达和基因产物活性可采用标准技术如凝胶电泳、Northern和Western印迹、酶联免疫吸附试验(ELISA)和底物转化试验进行验证。
实施例4
采用2-升发酵罐，在典型发酵条件下，培养两株野生型裂殖壶菌属培养物(ATCC20888)，比较无菌和有菌条件下的脂肪酸分布特征和脂质产率。用含碳、氮、磷、盐、痕量金属和维生素的培养基分批处理各发酵罐。无菌发酵罐经高压灭菌120分钟，所有培养基组分在发酵罐中灭菌或者在高压灭菌后以无菌溶液的形式添加。用自来水分批处理无菌发酵罐，将所有成分加入发酵罐中，接种之前不进行灭菌。可用典型的种子培养物接种各发酵罐，然后培养50小时，培养期间给予碳进料和氮进料。氮进料只有在生长阶段输送和消耗，而碳在整个发酵过程中输送和被消耗。50小时后，在每个发酵罐取样、离心、冻干、转化为脂肪酸甲酯，并通过气相色谱进行分析。
典型的发酵条件：
温度：28–30℃
pH：5.0-7.5
搅拌：100-300cps
气流：0.25-2.0vvm
葡萄糖：5-55g/L(浓度)
接种物：1％-30％
结果如下：
| 条件 | 无菌 | 有菌 |
| 菌株 | ATCC 20888 | ATCC 20888 |
| Log小时 | 50 | 50 |
| 样品 | BN25 8.08,14 | BN26 8.08,14 |
| ％12:0 | 0.21 | 0.12 |
| ％13:0 | 0.16 | 0.16 |
| ％14:0 | 9.73 | 6.14 |
| ％15:1 | 0.59 | 0.79 |
| ％16:0 | 39.93 | 36.26 |
| ％16:1 | 0.13 | 0.07 |
| ％17:0 | 0.17 | 0.28 |
| ％18:0 | 1.13 | 1.16 |
| ％18:1n-9 | 0.13 | 0.08 |
| ％18:1n-7 | 0.10 | 0.00 |
| ％18:3n-6 | 0.10 | 0.12 |
| ％18:3n-3 | 0.04 | 0.07 |
| ％18:4n-3 | 0.12 | 0.13 |
| ％20:0 | 0.10 | 0.10 |
| ％20:3n-6 | 0.27 | 0.33 |
| ％20:4ARA | 0.37 | 0.32 |
| ％20:5EPA | 0.45 | 0.56 |
| ％22:5n-6 | 12.61 | 14.52 |
| ％22:6DHA | 32.67 | 37.43 |
| ％脂肪(Fat) | 40.92 | 35.79 |
| ％未知 | 0.98 | 1.10 |
| ％饱和 | 51.44 | 44.23 |
| ％单不饱和 | 0.81 | 0.87 |
| ％多不饱和 | 46.64 | 53.48 |
图3和4显示了该实验的结果。
实施例5
采用5-升发酵罐，在低成本发酵条件下，培养野生型裂殖壶菌属(ATCC20888)以评价采用低成本有菌条件异养产生藻类生物质的效能。有菌发酵罐包括低碳钢容器、聚丙烯膜内衬、管喷雾器、一个排气管路和一个另外的管路。用自来水和含碳、氮、磷、盐、痕量金属和维生素的培养基分批处理有菌发酵罐。将各成分加入发酵罐中，接种之前无需灭菌。用自250毫升培养瓶的50毫升培养液接种发酵罐。发酵罐培养6天，培养期间(接种后)发酵罐中不添加任何物质。6天后，在发酵罐取样、冻干、转化为脂肪酸甲酯，并通过气相色谱进行分析。
典型的发酵条件：
温度：28–30℃
pH：不控制
搅拌：无
气流：2.0-4.0vvm
葡萄糖：80g/L(初始浓度；无另外进料)
接种物：1％
有菌分批培养基：
结果如下：
实施例6：
微生物的异养发酵过程中可采用两阶段发酵系统。第一阶段(接种阶段)生物质的目标累积，第二阶段(脂质产生阶段)脂质的目标累积。下面描述了发酵系统的一个例子。
下述发酵系统包括连续的接种容器和以分批进料模式运行的多个脂质产生容器。基于以下假设，接种容器的工作体积为xx加仑，是脂质产生阶段容器(xxx加仑)的八分之一：
1)6小时细胞倍增时间，
2)各脂质产生阶段批料进行24小时的填充时间
3)各脂质产生批料的初始体积(填充后)是收获体积的1/2
连续的接种阶段
初始接种/生长到稳态后，种子容器以恒定速率(xx GPM，每小时约1/48收获体积)接受连续的无菌营养物进料。发酵液以与营养物进料相同的速率从容器排出并转移至脂质产生阶段容器。该产生容器中达到所需起始体积后(约24小时填充后，约为1/2的收获体积)，接种容器连接至下一可用的脂质产生容器。
营养物进料将包括碳源(纤维质原料和/或简单的糖)、氮源(例如NH3)、盐、维生素和痕量金属，浓度能够维持合适的生长(后者支持最优的脂质产生)。循环的去脂化生物质和甘油可用作营养物的一部分以降低原料成本。稳态时，生物质浓度很可能达到至少约50-100克/升。
供应气流以提供细胞生长所需的足量氧。气流需要约为0.5-1.0vvm以实现约50-150毫摩尔/升/小时OUR(氧摄取速率)。预期该过程将产生大量代谢热，需要充分去除热量以维持目标工艺温度(例如约25-35℃)。通常采用0.113千卡/毫摩尔O2摄取的关系评价微生物的代谢产热，估计产热约6-17千卡/升/小时。部分热量可通过气流去除，但仍然需要大的热量去除容量以维持目标温度。可能需要用酸(例如硫酸)和/或碱(苛性)进行pH控制以维持最优生长的pH目标。由于接种阶段的特性，培养基和工艺条件可能非常有利于污染物生长；因此，非常需要低污染风险的系统设计。两阶段工艺可以在有菌发酵罐中通过选择不利于污染物生长的条件下进行。另一种选择是在无菌条件下进行连续的接种阶段而在有菌条件下进行脂质产生阶段(可以在营养物限制如氮限制条件下进行)。
脂质产生阶段(分批进料)
脂质产生阶段容器以分批进料工艺运行。大多数营养物从接种阶段接受(24小时填充时间过程)，碳源输送给批料以维持整个运行期间的目标糖浓度。
各脂质产生批料的总循环时间为120小时，24小时用于填充(从接种容器接受发酵液)，72小时用于产生脂质，24小时用于收获和周转。因此，各接种容器应能够提供用于5个脂质产生阶段容器的接种物。如上所述，预期种子转移速率约为xxxGMP(每小时1/48pf的收获体积)。24小时填充时间之后，所述产生容器应具有约1/2的目标收获体积。加入碳源如纤维素原料(约70％糖浓度)以维持大部分运行时间过程中的目标糖浓度。需要时加入消泡剂以减少泡沫。收获时，可实现至少约150克/升或至少约300克/升的生物质浓度，生物质中60-80％是油。
可采用连续或半连续的生产战略进行脂质制备。在连续方法中，以填充脂质产生容器相同的速率收获生物质。在半连续方法中，以规律间隔收获生物质，收获的生物质的量取决于脂质产生循环。例如，在72小时脂质产生循环中，每36小时收获为含生物质的制备罐的一半；类似地，每18小时收获25％制备罐中的生物质，每54小时收获75％制备罐中的生物质，依此类推。
细胞维持和脂质产生需要氧，供应气流以提供足量的氧传递。气流需求约为0.5-1.0vvm以实现约40-150毫摩尔/升/小时的OUR(氧摄取速率)。预期该工艺产生显著的代谢热量。通常采用0.113千卡/毫摩尔O2摄取的关系评价微生物的代谢产热，估计产热约6-17千卡/升/小时。部分热量通过气流去除，但仍然需要大的热量去除容量以维持目标温度。可能需要用酸(例如硫酸)和/或碱(苛性)进行pH控制以维持高脂质生产力的pH目标。
其他信息/考虑
如果发酵废料(例如脂质培养基或去脂化生物质)可有效循环，则可降低发酵成本。
糖转化为生物质的转化率约为45-55％(以摩尔计)，糖转化为油的转化率约为30-40％。
为尽可能减少设备失效或批料异常导致的潜在的停工，厂房设计中应考虑额外的种子和脂质产生容器。
上述内容描述了本发明的原理、优选的实施方式和操作模式。然而，本发明旨在保护的范围不应解释为限于所描述的具体形式，这些具体形式应视作示例性而非限制性的。本领域技术人员能够进行改变和改进而不背离本发明的精神。因此，上述实现本发明的最佳模式应视作示例性而非限制本发明的范围和精神，本发明的范围和精神由所附权利要求书所限定。
Claims (44)
1.一种制备生物油的方法，该方法包括采用包含纤维素作为碳源的原料经异养发酵培养假菌界微生物，其中所述生物油中约11-99％的不饱和脂肪酸是多不饱和脂肪酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，生物油中大于约50％的不饱和脂肪酸是多不饱和脂肪酸。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物是破囊壶菌。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物选自：裂殖壶菌属微生物、破囊壶菌属微生物和吾肯氏壶菌属微生物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物糖化所述纤维素。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物耐受或能够降解选自下组的原料组分：木脂素、半纤维素、植物油、植物胞外多醣以及它们的组合。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物是基因修饰的微生物。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物产生甘油三酯形式的油，产量约为其生物质干重的25-85重量％。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在所述微生物产生约为其生物质干重的30-90重量％的甘油三酯形式的油之后进行所述微生物的自发裂解或诱导裂解。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过使所述微生物处于有利于裂解的条件而诱导所述微生物发生裂解，这些条件选自pH、温度、酶的存在、去污剂的存在、物理破裂以及它们的组合。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有纤维素的原料包括选自下组的纤维素来源：牧草、甘蔗、农业废料、废纸、污水、木材、绿色植物界生物以及它们的组合。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵在有菌发酵罐中进行。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵在选自下组的发酵罐中进行：纤维增强的聚合物发酵罐、金属基质复合材料发酵罐、陶瓷基质复合材料发酵罐、热塑性复合材料发酵罐、金属发酵罐、环氧树脂内衬的碳素钢发酵罐、塑料内衬的碳素钢发酵罐、塑料发酵罐、玻璃纤维发酵罐和混凝土发酵罐。
14.如权利要求1所述的，其特征在于，所述发酵在浸没在水中的发酵罐中进行。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵在具有串联的冷却系统的发酵罐中进行，使得从第一发酵罐或一组串联的发酵罐中流出的冷却水可用作第二发酵罐或串联的发酵罐系列中的冷却供应水。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵在具有串联的气体系统的发酵罐中进行，使得从第一发酵罐或一系列串联的发酵罐中排出的排气可用作第二发酵罐或串联的发酵罐组中的气体供应。
17.一种制备生物柴油的方法，所述方法包括：
(a)采用包含纤维素作为碳源的原料经异养发酵培养假菌界微生物以制备生物油，其中所述生物油中约11-99％的不饱和脂肪酸是多不饱和脂肪酸；和
(b)使所述生物油酯交换形成生物柴油。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，生物油中大于约50％的不饱和脂肪酸是多不饱和脂肪酸。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述生物油的酯交换可以采用源自醇制备工艺的醇进行。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法还包括采用所述生物油酯交换产生的甘油作为碳源用于后续发酵过程以制备醇或生物油。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述后续发酵过程培养能够利用所述甘油作为碳源的微生物。
22.一种制备喷气发动机生物燃料的方法，所述方法包括：
(a)采用包含纤维素作为碳源的原料经异养发酵培养假菌界微生物以制备生物油，其中所述生物油中约11-99％的不饱和脂肪酸是多不饱和脂肪酸；和
(b)使所述生物油裂解形成喷气发动机生物燃料。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述生物油包含约10-75重量％的多不饱和脂肪酸。
24.一种脂质基生物燃料组合物，其包含约1-75重量％具有等于或大于20个碳原子的长链脂肪酸的烷基酯。
25.如权利要求24所述的脂质基生物燃料组合物，其特征在于，所述脂质基生物燃料组合物的熔化温度约为30℃到约-50℃。
26.一种制备生物油的方法，该方法包括采用包含纤维素作为碳源的原料，通过异养发酵同时或按顺序培养两种或更多种微生物，其中一种或多种微生物能够糖化所述纤维素。
27.一种制备生物油的方法，该方法包括在有菌发酵罐中经异养发酵培养微生物。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述生物油以约5-70克/升/天的速率进行制备。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述生物油以约30-70克/升/天的速率进行制备。
30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，培养所述微生物可实现约10-300克/升细胞密度。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，培养所述微生物可实现约150-250克/升细胞密度。
32.如权利要求27所述的方法，其特征在于，培养所述微生物包括使用纤维素作为碳源。
33.一种制备生物柴油的方法，所述方法包括：
(a)在有菌发酵罐中培养微生物以制备生物油；和
(b)使所述生物油酯交换以制备生物柴油。
34.一种制备喷气发动机生物燃料的方法，该方法包括：
(a)在有菌发酵罐中培养微生物以制备生物油；和
(b)使所述生物油裂解形成喷气发动机生物燃料。
35.一种制备生物柴油的方法，所述方法包括：
(a)采用包含循环培养基的营养物培养微生物以制备生物油；和
(b)使所述生物油酯交换以制备生物柴油。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述循环培养基选自：去脂化生物质、水解的生物质、部分水解的生物质、循环金属、循环盐、循环氨基酸、循环胞外碳水化合物、循环甘油、循环酵母生物质以及它们的组合。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，培养所述微生物包括使用纤维素作为碳源。
38.一种制备喷气发动机生物燃料的方法，该方法包括：
(a)采用包含循环培养基的营养物培养微生物以制备生物油；和
(b)使所述生物油裂解形成喷气发动机生物燃料。
39.一种制备生物柴油的方法，所述方法包括：
(a)采用包括连续的接种阶段和脂质产生阶段的发酵系统培养微生物以制备生物油；
(b)使所述生物油酯交换以制备生物柴油。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述连续的接种阶段产生所述微生物的生物质，使得在连续的接种阶段实现约10-95％的所述微生物的总生物质产生。
41.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述脂质产生阶段以批量进料工艺形式进行。
42.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述脂质产生阶段产生脂质，使得在所述脂质产生阶段期间实现约10-95％的所述微生物的总脂质产生。
43.如权利要求39所述的方法，其特征在于，培养所述微生物包括使用纤维素作为碳源。
44.一种制备喷气发动机生物燃料的方法，该方法包括：
(a)采用连续的接种阶段和脂质产生阶段的发酵系统培养微生物以制备生物油；
(b)使所述生物油裂解形成喷气生物燃料。
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