KR102572191B1

KR102572191B1 - 지질 축적량이 향상된 변이 균주

Info

Publication number: KR102572191B1
Application number: KR1020180048700A
Authority: KR
Inventors: 정기준; 이용재; 이경수
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2018-04-26
Filing date: 2018-04-26
Publication date: 2023-08-30
Also published as: KR20190124570A

Abstract

화학적 돌연변이에 의해 유도된, 휘발성 지방산을 단일 탄소원으로 배양하였을 때 지질 축적량이 향상된 신규 변이 균주인 기탁번호 KCTC 13250BP로 기탁된 트리코스포론 올레아기노수스(Trichosporon oleaginosus)에 관한 것으로, 상기 변이 균주는, 음식물 쓰레기와 같이 종래 유기성 폐자원으로 분리되는 휘발성 지방산을 효과적으로 활용하여 지질의 생산 효율을 획기적으로 증가시킬 수 있어 바이오 디젤 생산 효율 향상에 이바지할 수 있다.

Description

지질 축적량이 향상된 변이 균주{High lipid producing Trichosporon oleaginosus mutant}

본 발명은 지질 축적량이 향상된 변이 균주에 관한 것으로, 더 상세하게는 휘발성 지방산을 단일 탄소원으로 배양하였을 때 지질 축적량이 향상된 신규 변이 균주에 관한 것이다.

휘발성 지방산 (Volatile Fatty Acid)은 총 4가지의 선형 카르복실산 (아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산)을 가리키며, 음식물 쓰레기와 같은 유기성 폐자원의 분해 과정에서 발생하는 악취의 주 원인이 되는 분자들이다. 일반적으로 휘발성 지방산은 산도로 인해 세포 성장에 저해가 되는 물질로 알려져 있다. 그러나 일부 지질 생산 효모 균주에서 휘발성 지방산을 소모하여 성장하고 지질을 생산할 수 있다는 일부 연구 결과가 보고되었으며, 이 연구들의 공통된 궁극적인 지향점은 음식물 쓰레기와 같은 값싼 원료 물질로부터 발생하는 휘발성 지방산을 이용하여 바이오 디젤 생산 단가를 절감할 수 있다는 것이다.

일반적으로 혐기성 발효는 산소가 차단된 조건 하에서 박테리아에 의해 유기성 물질이 분해되어 메탄, 이산화탄소와 같은 가스로 전환되는 과정을 말한다. 이 과정에서 부산물로 휘발성 지방산이 생산되는데, 발효 과정의 온도, pH 등과 같은 조건에 따라 각 휘발성 지방산의 구성 비율에 차이가 발생하지만, 대부분의 경우 아세트산이 가장 주된 구성 성분이 된다. 하기 표 1은 우리나라에서 발생한 음식물 쓰레기를 2 리터 규모의 실험실 배양기에서 발효시킨 결과를 나타낸다(Lim, S. J. et al. Bioprocess Engineering, 2000, 22, 543-545). 표 1의 상단부터 4개의 항목이 차례대로 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산의 농도를 나타내며, 1kg의 원료 물질당 최대 400g의 휘발성 지방산이 생산되었음을 알 수 있다.

이러한 휘발성 지방산을 효율적으로 활용하기 위한 연구로, 여러 지질 생산 효모 균주에서 휘발성 지방산을 탄소원으로 공급하여 세포 내 지질을 생산하는 연구들이 진행되었다. 하기 표 2는 대표적인 지질 생산 효모 균주 중 하나인 Cryptococcus albidus에 여러 가지 조성과 농도를 가지는 휘발성 지방산을 단일 탄소원으로 공급하였을 때 생산된 지질의 농도 (g/L) 및 건조질량 대비 함량 (w/w)을 보여준다(Fei, Q. et al., Bioresource Technology, 2011, 102(3), 2695-2701).

휘발성 지방산 기반 미생물 지질 생산에 대한 경제성 평가에 관한 한 연구에서는, 기존의 바이오 디젤 생산 전략인 대두유 (1.04 USD/L), 팜유 (0.851 USD/L), 미세조류 (1.4 USD/L)와 비교하여 신규 기술 (0.526 ~ 0.809 USD/L)이 더 낮은 생산 단가를 가질 것으로 전망하였다(Park, G.W. et al., Biotechnology Journal, 2014, 9(12), 1536-1546). 또한, 향후 지질 생산 균주의 유전자 조작 및 대량생산 공정의 최적화 등을 통해 추가적인 생산단가 감소가 가능할 것으로 예측하였다.

효모 균주 트리코스포론 올레기노수스(Trichosporon oleaginosus)는 기존에는 크립토코커스 쿠르바투스(Cryptococcus curvatus)라는 명칭으로 지칭되어 왔으며, 특히 아세트산 섭취 및 지질 생산 능력에 있어 최대 약 73.4 % (건조질량 대비 지질 함량)에 달하는 높은 효율을 보인다(Gong, Z. et al., Biotechnology for Biofuels, 2015, 8:189). 또한, 휘발성 지방산을 이 균주에 단일 탄소원으로 공급했을 때의 경우, 최대 약 57 %의 건조질량 대비 지질 함량을 얻을 수 있다고 보고되었다(Liu, J. et al., Bioresource Technology, 2017, 241, 645-651).

해당 균주의 전체 염기서열은 2011년에 공개되었으며, 이후 지질 생산성 증가를 주 목적으로 유전공학적 연구 및 대량생산 최적화 연구가 시도되었으나, 균주에 대한 정보 부족으로 인해 실제 외래 유전자를 도입한 유전자 조작 사례는 아직까지 단 한 건이 보고되었다(Gorner, C. et al., Green Chemistry, 2016, 18, 2037).

이에, 본 발명에서는, 유기성 폐자원인 휘발성 지방산을 효율적으로 활용하면서 균주 내 지질 축적량이 현저히 향상된 신규한 변이 균주를 개발하고자 화학적 돌연변이를 유도하였으며, 이중 일부 변이 균주에서 지질 축적량이 야생형 균주에 비해 3배 향상되었음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 지질 축적량이 향상된 신규 변이 균주를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 균주를 이용하여 지질을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KCTC 13250BP로 기탁된 트리코스포론 올레아기노수스(Trichosporon oleaginosus) 변이 균주를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 변이 균주를 이용한 지질 생산방법을 제공한다.

본 발명에 따른 변이 균주는, 음식물 쓰레기와 같이 종래 유기성 폐자원으로 분리되는 휘발성 지방산을 효과적으로 활용하여 지질의 생산 효율을 획기적으로 증가시킬 수 있는바, 친환경 에너지로 각광받는 바이오 디젤 생산 효율 향상에 이바지할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 신규 효모 변이체를 발굴하는 과정에 있어, 세포 내 지질 함량을 형광 세기로 분별하기 위하여 세포 내 지질을 형광 염료로 염색했을 때, 세포 내 지질 함량 (빨간색 : 8.53%, 초록색 : 19.09%, 파란색 : 30.07%, 보라색 : 39.4%)에 따른 형광 세기를 유세포형광분석장비 (flow cytometry)를 이용하여 측정한 것이다.
도 2는 초고속 형광유세포분리장비 (FACS)를 이용하여 변이 집단 중에서 높은 형광 신호를 가지는 변이숙주들을 분리하는 과정을 반복할 때, 각 단계에서 얻은 형광 신호값을 비교한 것이다. WT, Original Lib., 1^st sorted, 2^nd sorted은 각각 야생형 균주, 초기 변이 집단, 첫 분리 후 결과, 두 번째 분리 후 결과를 나타내며, 점선은 야생형 균주의 평균 형광세기 값에 대한 기준선이다.
도 3은 초고속 형광유세포분리장비 (FACS)를 이용하여 최종 분리한 변이 균주들 중 임의로 선별된 15개의 후보 균주가 야생형 균주와 비교하여 가지는 형광 세기를 비교한 것이다. WT는 야생형 균주, 나머지 숫자는 15개의 개별 후보 균주를 의미하며, 점선은 야생형 균주의 형광 세기에 대한 기준선이다.
도 4는 도 3에서 높은 형광 세기를 보이는 세 개의 후보 변이 균주를 선별하여 야생형 균주와 동일한 조건에서 각각 배양한 뒤, 세포 내 지질 함량을 분석한 결과이다. 세로축은 세포 건조질량 대비 전체 지질 함량 (%)을 의미한다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서 사용된 효모 균주는 트리코스포론 올레아기노수스(Trichosporon oleaginosus)는 기존에는 크립토코커스 쿠르바투스(Cryptococcus curvatus)라는 명칭으로도 지칭되었으며, 아세트산 섭취 및 지질 생산 능력이 높고, 휘발성 지방산을 이 균주에 단일 탄소원으로 공급했을 때 지질 함량이 증가하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는 야생형으로도 지질 축적량이 우수한 트리코스포론 올레아기노수스(Trichosporon oleaginosus)에 돌연변이를 유도하여 지질 축적량을 향상시키고자 하였다. 이를 위하여 에틸메틸설포네이트를 처리하여 화학적 돌연변이를 유도하고 변이 균주 내 지질 축적량이 증가되는 균주를 선별하였으며, 특히 휘발성 지방산을 포함하는 배지에서 배양하였을 때, 균주 내 지질 축적량이 야생형에 비해 3배 향상된 변이 균주를 확보하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 기탁번호 KCTC 13250BP로 기탁된 트리코스포론 올레아기노수스(Trichosporon oleaginosus) 변이 균주에 관한 것으로, 상기 변이 균주는 지질 축적량이 향상된 것을 특징으로 한다.

본 발명은 다른 관점에서 상기 변이 균주를 이용한 지질의 생산방법을 제공한다.

상기 방법은,

(a) 상기 변이 균주를 휘발성 지방산을 포함하는 배지에서 배양하여 지질을 생성시키는 단계; 및

(b) 변이 균주로부터 상기 생성된 지질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, 휘발성 지방산은 아세트산, 프로피온산, 부티르산 및 발레르산로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이리 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서, 휘발성 지방산은 아세트산:프로피온산:부티르산이 4~6:0.5~2:0.5~2의 부피비로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 5:1:1의 부피비로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 배지 내 단일 탄소원으로 휘발성 지방산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 유기성 폐자원 유래 휘발성 지방산을 근접하게 모사한 비율로, 본 발명에 따른 균주 트리코스포론 올레아기노수스(Trichosporon oleaginosus)는 프로피온산과 부티르산도 성장 및 지질 축적하는 데 이용하지만, 주로 아세트산을 성장 및 지질 축적에 활용하는 성질을 가지기에, 상기 부피비의 휘발성 지방산을 활용하는 것이 바람직하다.

이 경우 본 발명에 따른 변이 균주는 휘발성 지방산을 포함하는 배지에서 지방 축적능이 현저히 개선되는 특징이 있다.

본 발명에서, 변이 균주에 의해 축적되는 지질은 스테아르산(stearic acid) 및 올레산(oleic acid)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 "지질"은 세포내에서 합성하여 축적하는 에너지 저장물질을 말하며, 본 발명에서 상기 지질은 지방산(fatty acid)일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서 생산되는 지질은 바이오 디젤의 전구물질로 활용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 효모 균주의 화학적 돌연변이 유도

야생형 효모 균주인 트리코스포론 올레아기노수스(Trichosporon oleaginosus(ATCC 20509)를 30mL YPD 배지(효모 추출물 10 g/L, 펩톤 10 g/L, 포도당 20 g/L)를 포함하는 250 mL 삼각 플라스크에 담아 25℃℃에서 200rpm으로 배양하였다. 24시간 배양 이후, 5mL의 배양액을 분리하여 8000rpm에서 2분간 원심분리한 뒤 100mM의 인산나트륨 용액(pH 7.0)으로 세척하고, 다시 같은 용액 1.7mL에 세포를 재현탁하였다. 여기에 50μμL의 에틸메틸설포네이트(EMS)를 첨가하여 30℃℃에서 200rpm으로 1시간 동안 반응시켜 화학적 돌연변이를 유도하였다. 반응 종료를 위하여 8mL의 5% 티오황산나트륨(sodium thiosulfate)을 첨가하였고, 다시 100mM의 인산나트륨 용액을 이용하여 세척 후 재현탁하였다.

실시예 2. 지질 축적량이 향상된 효모 변이체 선별 과정

화학적 돌연변이를 유도한 후, 이후 배양은 6g/L의 휘발성 지방산(아세트산, 프로피온산 및 부티르산를 5:1:1의 부피비로 포함) 및 [표 3] 배지 성분을 포함하는 배지에서 25℃℃, 200rpm 조건으로 배양하였다.

항목	농도
KH₂PO₄	2.7 g/L
Citric acidH₂O	0.52 g/L
Yeast Extract	0.1 g/L
CaCl₂6H₂O	40 mg/L
FeSO₄7H₂O	5.5 mg/L
ZnSO₄7H₂O	4 mg/L
MnSO₄H₂O	3 mg/L
18M H₂SO₄(aq)	1 μL/L
NH₄Cl	0.5 g/L

72시간 배양 이후, 세포내 지질 함량이 향상된 변이체를 선별하고자, BODIPY 염색법을 이용하여 형광 염색한 후 초고속 형광 유세포 분리장비(FACS)를 이용하여 높은 형광신호를 가지는 변이숙주를 분리하고 다시 배양하는 과정을 두 차례 반복하였다.

구체적으로, 배양 후 1mL의 샘플을 회수하여 8000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 세포 고형분을 수득하였으며, 상기 세포를 1mL의 1X PBS를 이용하여 재현탁하였다. 세포 내 지질 염색을 위해 5μμM의 농도로 BODIPY 505/515 (4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen)(Sigma Aldrich, 미국)를 첨가하였으며, 상온에서 5분 동안 반응하며, 1분에 한 번씩 볼텍싱하였다. 이후, 동일한 조건으로 원심분리, 상등액 제거 후 1mL의 1X PBS를 첨가하여 2번 세척 과정을 반복하였다. 최종적으로 1X PBS에 현탁된 염색된 세포를 이용하여 형광 분석을 진행하였다. 형광 분석은 MoFlo^TM XDP (Beckman Coulter, Inc.) 장비에 488nm의 파장을 갖는 레이져를 사용하였으며, 530/40 nm 파장 필터를 이용하여 형광 신호를 검출하였다. 세포의 형광 세기를 분석함으로써 세포내 지질 함량을 확인하였다.

지질친화성 형광염료인 BODIPY를 사용해서 지질 축적 효모를 5분간 염색하였을 때, 지질 축적량에 따라 서로 다른 형광신호를 보이는 것을 확인하였고, 형광신호의 세기는 지질 축적량에 비례하여 변화하는 것을 확인하였다(도 1). 즉, 첫번째 그래프에서 볼 수 있듯이, 지질 함량이 증가할수록 형광 분포가 높은 것으로 나타났고, 두번째 그래프에서 볼 수 있듯이, 각 실험군에 대해 형광 분포를 측정한 뒤 평균 형과세기를 측정하였을 때 지질 함량이 증가할수록 평균 형광세기가 증가하였으며, 이 경우 두 번째 그래프의 추세선의 R제곱 값이 1에 아주 근접하게 나타나, 4개의 지점 사이의 범위에서, 형광 세기가 실제 지질 함량을 아주 높은 정확도로 반영하는 것을 알 수 있었다. 따라서 형광 세기를 바탕으로 높은 형광을 가지는 세포를 분리하여 높은 지질 함량의 세포를 분리할 수 있었다.

초기 분석 결과 중, 형광 신호에 있어 상위 1%의 세포만을 분리하였으며 분리된 세포들은 앞서 언급된 6g/L의 휘발성 지방산을 포함하는 배지에 옮겨져 배양을 새로 시작하였다. 위 분리과정을 두 번 반복하고, 각 단계의 세포 형광값을 비교하였다.

이 과정에서 점차 변이 균주들이 야생형 균주와 비교하여 높은 형광 신호를 가짐을 확인할 수 있었으며, 최종 단계에서 야생형보다 현저히 높은 형광 신호를 보이는 변이 균주를 확보하였다(도 2).

실시예 3. 선별된 변이 균주의 지질 함량 분석

현저히 높은 형광 신호를 보이는 변이 균주를 임의로 15개 분리하여 BODIPY로 염색한 야생형 균주와의 형광 신호 차이를 확인하고, 야생형 대비 가장 높은 형광 신호를 보이는 9번, 14번, 15번 변이 균주를 선택하였다.

이들 세 변이 균주 및 야생형 균주를 각각 실시예 2의 휘발성 유기산 배양 조건에서 배양한 후, 세포 내 지질 분석을 진행하였다.

구체적으로, 각 실험군에서 세포가 가지는 실제 지질 함량 측정을 위해 먼저 배양 종료된 세포를 원심분리 (8000rpm, 5분)하여 회수한 뒤, 동결건조 장비를 이용하여 4일간 영하 50℃℃에서 건조하였다. 세포 내 지질의 추출을 위해, 10 mg 내외의 건조 세포에 2mL의 클로로포름-메탄올 용액 (2:1 부피비)을 처리하여 5분간 격렬히 볼텍싱하였다. 이후, 1mL의 메탄올과 300μμL의 황산을 처리하여 115℃℃에서 20분간 반응을 통해 추출된 지방산을 에스테르화 하였다. 여기에 1mL의 증류수를 첨가한 뒤, 5분간 격렬히 볼텍싱하고, 4000rpm에서 5분간 상온에서 원심분리하여 수용액 층과 유기층을 분리하였다. 이 중 유기층만을 가스 크로마토그래피 (HP6890, Agilent)를 이용하여 분석하였으며, 농도 결과는 각 시료에 포함된 내부표준물질 (0.5 mg/mL)과 비교하여 산출하였다.

그 결과, 본 발명에서 화학적 돌연변이에 의해 유도된 변이 균주에서는 야생형 균주에 비해 지질 축적량이 현저히 증가한 것으로 확인되었고, 특히 14번 균주는 야생형 균주에 비해 지질 축적량이 3배 이상 향상된 것을 확인할 수 있었다(도 3, 도 4).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC13250BP

수탁일자 : 2017418

Claims

기탁번호 KCTC 13250BP로 기탁된 트리코스포론 올레아기노수스(Trichosporon oleaginosus) E14 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 지질 축적량이 향상된 것을 특징으로 하는 균주.
다음 단계를 포함하는 지질의 생산방법:
(a) 제1항의 균주를 휘발성 지방산을 포함하는 배지에서 배양하여 지질을 생성시키는 단계; 및
(b) 균주로부터 상기 생성된 지질을 회수하는 단계.
제3항에 있어서, 휘발성 지방산은 아세트산, 프로피온산, 부티르산 및 발레르산로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 휘발성 지방산은 아세트산:프로피온산:부티르산이 5:1:1의 부피비로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 배지 내 단일 탄소원으로 휘발성 지방산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 지질은 스테아르산(stearic acid) 및 올레산(oleic acid)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.