BRPI0309391B1 - vetor compreendendo ácido nucléico que codifica polipeptídeo com atividade de fosfolipase, célula transformada, preparado de proteína, método de preparação e métodos relacionados - Google Patents

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Abstract

"fosfolipases, ácidos nucléicos codificando-as e métodos para preparar e usá-las". a invenção fornece novos polipeptídeos tendo atividade de fosfolipase, incluindo, por exemplo, atividade de fosfolipase a, b, c e d, atividade de patatina, atividade de lipídeo de acil hidrolase (lah), ácidos nucléicos codificando-os e anticorpos que ligam-se a eles. métodos industriais, por exemplo, desengomamento de óleo, e produtos compreendendo o emprego destas fosfolipases são também fornecidos.

Description

(54) Título: VETOR COMPREENDENDO ÁCIDO NUCLÉICO QUE CODIFICA POLIPEPTÍDEO COM ATIVIDADE DE FOSFOLIPASE, CÉLULA TRANSFORMADA, PREPARADO DE PROTEÍNA, MÉTODO DE PREPARAÇÃO E MÉTODOS RELACIONADOS (51) IntCI.: C12N 9/18; C12N 15/00; C07H 21/04; A61K 38/46.
(30) Prioridade Unionista: 19/04/2002 US 60/374,313.
(73) Titular(es): DSM IP ASSETS B.V..
(72) lnventor(es): SVETLANA GRAMATIKOVA; GEOFF HAZELWOOD; DAVID LAM; NELSON BARTON.
(86) Pedido PCT: PCT US2003012556 de 21/04/2003 (87) Publicação PCT: WO 2003/089620 de 30/10/2003 (85) Data do Início da Fase Nacional: 19/10/2004 (57) Resumo: FOSFOLIPASES, ÁCIDOS NUCLÉICOS CODIFICANDO-AS E MÉTODOS PARA PREPARAR E USÁ-LAS. A invenção fornece novos polipeptídeos tendo atividade de fosfolipase, incluindo, por exemplo, atividade de fosfolipase A, B, C e D, atividade de patatina, atividade de lipídeo de acil hidrolase (LAH), ácidos nucléicos codificando-os e anticorpos que ligam-se a eles. Métodos industriais, por exemplo, desengomamento de óleo, e produtos compreendendo o emprego destas fosfolipases são também fornecidos.
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VETOR COMPREENDENDO ÁCIDO NUCLÉICO QUE CODIFICA POLIPEPTÍDEO COM ATIVIDADE DE FOSFOLIPASE, CÉLULA TRANSFORMADA, PREPARADO DE PROTEÍNA, MÉTODO DE PREPARAÇÃO E MÉTODOS RELACIONADOS
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se geralmente às enzimas de fosfolipase, polinucleotídeos codificando as enzimas, métodos de preparar e usar estes polinucleotídeos e polipeptídeos. Em particular, a invenção fornece novos polipeptídeos tendo atividade de fosfolipase, ácidos nucléicos codifi10 cando-as e anticorpos que se ligam a elas. Métodos industriais e produtos compreendendo o uso destas fosfolipases são também fornecidos. ANTECEDENTES
Fosfolipases são enzimas que hidrolizam as ligações de éster de fosfolipídios. Correspondendo a sua importância no metabolismo de fosfoli15 pídios , estas enzimas são estendidas entre procariotas e eucariotas. As fosfolipases afetam o metabolismo, construção e reorganização de membranas biológicas e estão envolvidas em cascatas de sinal. Vários tipos de fosfolipases são conhecidos os quais diferem-se em sua especificidade de acordo com a posição da ligação investida na molécula de fosfolipídio. Fos20 folipase A1 (PLA1) remove o ácido graxo de posição 1 para produzir ácido graxo livre e 1 -liso-2-acilfosfolipídio. Fosfolipase A2 (PLA2) remove o ácido graxo de posição 2 para produzir o ácido graxo livre e 1-acil-2lisofosfolipídio. Enzimas de PLA1 e PLA2 podem ser intra- ou extracelular, ligadas por membrana ou solúveis. PLA2 intracelular é encontrada em qua25 se todas as células de mamíferos. Fosfolipase C (PLC) remove a porção de fosfato para produzir 1,2 diacilglicerol e base de fosfo. Fosfolipase D (PLD) produz grupo de base e 1,2-diacilglicerofosfato. PLC e PLD são importantes na função de célula e sinalização. PLD foi a fosfolipase dominante em biocatálise (observe, por exemplo, Godfrey, T. e West S. (1996) Industrial enzymology, 299 - 300, Stockton Press, New York). Patatinas são outro tipo de fosfolipase, pensaram trabalhar como uma PLA (observe por exemplo, Hirschberg HJ, e outro, (2001), Eur J Biochem 268(19):5037 - 44).
Petição 870180057583, de 03/07/2018, pág. 9/15
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Sementes oleaginosas, tais como sojas, semente de colza, sementes de girassol, sésamo e amendoim são usadas como fontes de óleos e cargas de alimentação (feedstock). No processo de extração de óleo, as sementes são mecanicamente e termicamente tratadas. O óleo é separado e dividido da refeição por um solvente. Usando a destilação, o solvente é então separado do óleo e recuperado. O óleo é desengomado e refinado. O teor de solvente na refeição pode ser evaporado por tratamento térmico em uma torradeira dessolventizadora, seguido por secagem e resfriamento da refeição. Depois que um solvente foi separado por destilação, o óleo cru produzido é processado em óleo comestível, usando procedimentos de desengomação especiais e refinamento físico. Pode também ser utilizado como carga de alimentação para a produção de ácidos graxos e éster de metila. A refeição pode ser usada para rações animais.
A desengomação é a primeira etapa no refinamento de óleo vegetal e é designada para remover os fosfatídeos contaminantes que são extraídos com o óleo porém interfere com o processamento de óleo subseqüente. Estes fosfatídeos são solúveis no óleo vegetal apenas em uma forma anidra e podem ser precipitados e removidos se eles são simplesmente hidratados. A hidratação é usualmente realizada misturando-se uma pequena proporção de água continuamente com óleo substancialmente seco. Tipicamente, a quantidade de água é de 75% do teor de fosfatídeos, que é tipicamente 1 a 1,5%. A temperatura não é altamente crítica, embora a separação das gomas hidratadas seja melhor se a viscosidade do óleo for reduzida em 50°C a 80°C.
Muitos métodos para a desengomação do óleo são correntemente usados. O processo de desengomação do óleo pode ser enzimaticamente assistido usando-se as enzimas de fosfolipase. As fosfolipases A1 e A2 foram usadas para desengomação do óleo em vários processos comerciais, por exemplo, ΈΝΖΥΜΑΧ® degumming (Lurgi Life Science Technologies GmbH, Germany). Fosfolipase C (PLC) também foi considerada para desengomação de óleo porque a porção de fosfato gerada por sua ação em fosfolipídios é muito solúvel em água e fácil de remover e o diglicerídeo
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3/279 permanecería com o óleo e reduziria as perdas; observe, por exemplo, Godfrey, T. e West S. (1996) Industrial Enzymology, pp.299 - 300, Stockton Press, New York; Dahlke (1998) An enzymatic process for the physical refining of seed oils, Chem. Eng. Technol. 21:278 - 281; Clausen (2001) Enzymatic oil degumming by a novel microbial phospholipase, Eur. J. Lipid Sei. Technol. 103:333-340.
Óleos de fosfatídeo elevados tais como de soja, de canola e de girasol são processados diferentemente do que outros óleos tais como de palma. Ao contrário do processo de refinamento físico ou vapor para óleos de fosfatídeos baixos, estes óleos de fósforo altos requerem tratamentos mecânicos e químicos especiais para remover os fosfolipídios contendo fósforo. Estes óleos são tipicamente refinados quimicamente em um processo que vincula neutralizar os ácidos graxos livres para formar sabão e uma fração de goma insolúvel. O processo de neutralização é altamente eficaz na remoção de ácidos graxos livres e fosfolipídios porém este processo também resulta em perdas de produção significantes e perdas na qualidade. Em alguns casos, o óleo cru de fosfatídeo alto é desengomado em uma etapa de neutralização cáustica precedente. Isto é o caso para óleo de soja utilizado para lecitina onde o óleo é primeiro água ou ácido desengomado.
Fitosteróis (esteróis de planta) são membros da família de triterpeno de produtos naturais, que incluem mais do que 100 fitosteróis diferentes e mais do que 4000 outros tipos de triterpenos. Em geral, os fitosteróis são pensados estabilizar as membranas da planta, com um aumento na ração de fosfolipídio/esterol levando a rigidificação da membrana. Quimicamente, os fitosteróis intimamente se parecem com colesterol na estrutura. Os fitosteróis principais são β-sitosterol, campesterol e estigmasterol. Outros incluem estigmastanol (β-sitostanol), sitostanol, desmosterol, calinasterol, poriferasterol, clionasterol e brassicasterol.
Esteróis de planta são produtos agrícolas importantes para indústrias nutricionais e saúde. Eles são emulsificadores úteis para fabricantes de cosméticos e fornecem a maioria de intermediários esteroidais e precursores para a produção de produtos farmacêuticos de hormônio. Os aná19/02/2018, pág. 20/316
4/279 logos saturados de fitosteróis e seus ésteres foram sugeridos como agentes de redução de colesterol eficazes com benefícios à saúde cardiológicos. Esteróis de planta reduzem os níveis de colesterol do soro inibindo-se a absorção de colesterol no lúmen intestinal e têm propriedades de imunomodulação em concentrações extremamente baixas, incluindo resposta celular realçada de linfócitos T e capacidade citotóxica de células exterminadoras naturais contra uma linhagem de célula de câncer. Além disso, seu efeito terapêutico foi demonstrado em estudos clínicos para o tratamento de tuberculose pulmonar, artrite reumatóide, controle de pacientes infestados por HIV e inibição de tensão imune em corredores de maratona.
Ésteres de esterol de planta, também referidos como ésteres de fitosterol, foram aprovados como GRAS (Geralmente Reconhecido Como Seguro) pela US Food and Drug Administration (FDA) para uso em margarinas e distribuídos em 1999. Em Setembro de 2000, a FDA também emitiu uma norma provisória que permite a rotulagem das reivindicações de saúde de alimentos contendo éster de fitosterol. Conseqüentemente, o enriquecimento de alimentos com ésteres de fitosterol é altamente desejado para aceitação do consumidor.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados compreendendo uma seqüência de ácido nucléico tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) em um ácido nucléico exemplar da invenção, por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ
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ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105 sobre uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, ou mais resíduos, codificam pelo menos um polipeptídeo tendo uma fosfolipase, por exemplo, uma atividade de fosfolipase A, C ou D, e as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por uma inspeção visual.
A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados compreendendo uma seqüência de ácido nucléico tendo pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) em SEQ ID NO:1 sobre uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 mais resíduos consecutivos, onde os ácidos nucléicos codificam pelo menos um polipeptídeo tendo uma fosfolipase, por exemplo, uma atividade de fosfolipase A, B, C ou D e as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por uma inspeção visual.
A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados compreendendo uma seqüência de ácido nucléico tendo pelo menos 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) em SEQ ID NO:3 sobre uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300,
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350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 mais resíduos consecutivos, onde os ácidos nucléicos codificam pelo menos um polipeptideo tendo uma fosfolipase, por exemplo, uma atividade de fosfolipase A, B, C ou D e as identidades de sequência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de sequência ou por uma inspeção visual.
A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados compreendendo uma sequência de ácido nucléico tendo pelo menos 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de sequência completa (100%) em SEQ ID NO:5 sobre uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 mais resíduos consecutivos, onde os ácidos nucléicos codificam pelo menos um polipeptideo tendo uma fosfolipase, por exemplo, uma atividade de fosfolipase A, B, C ou D e as identidades de sequência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de sequência ou por uma inspeção visual.
A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados compreendendo uma sequência de ácido nucléico tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%,
64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%,
77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,
90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de sequência completa (100%) em SEQ ID NO:7 sobre uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 mais resíduos consecutivos, onde os ácidos nucléicos codificam pelo menos um polipeptídeo tendo uma fosfolipase, por exemplo, uma atividade de fosfolipase A, B, C ou D e as identidades de sequência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de sequência ou por uma inspeção visual.
Em aspectos alternativos, o ácido nucléico recombinante ou isolado codifica um polipeptideo compreendendo uma sequência como mencionada em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, ou SEQ ID NO:8. Em
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7/279 um aspecto, estes polipeptídeos têm uma fosfolipase, por exemplo, uma atividade de fosfolipase A, B, C ou D.
Em um aspecto, o algoritmo de comparação de seqüência é um algoritmo de BLAST, tal como algoritmo de BLAST versão 2.2.2. Em um aspecto, o parâmetro de filtragem é estabelecida em blastall -p blastp -d nr pataa -F F e todas as outras opções são estabelecidas em default (padrão).
Em um aspecto, a atividade de fosfolipase compreende catalisar hidrólise de uma ligação de éster de glicerolfosfato (isto é, divagem de ligações de éster de glicerolfosfato). A atividade de fosfolipase pode compreender catalisar hidrólise de uma ligação de éster em um fosfolipídio em um óleo vegetal. O fosfolipídio de óleo vegetal pode compreender um fosfolipídio de semente oleaginosa. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de fosfolipase C (PLC), uma atividade de fosfolipase A (PLA), tal como uma atividade de fosfolipase A1 ou fosfolipase A2, uma atividade de fosfolipase D (PLD), tal como fosfolipase D1 ou uma atividade de fosfolipase D2, ou atividade de patatina. A atividade de fosfolipase pode compreender a hidrólise de uma glicoproteína, por exemplo, como uma glicoproteína encontrada em um tubérculo de batata. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade enzimática de patatina. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de hidrolase de acila de lipídio (LAH).
Em um aspecto, o ácido nucléico recombinante ou isolado codifica um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase que é termostável. O polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase sob condições compreendendo uma faixa de temperatura dentre cerca de 37°C a cerca de 95°C; entre cerca de 55°C a cerca de 85°C, entre cerca de 70°C a cerca de 95°C, ou, entre cerca de 90°C a cerca de 95°C. Em outro aspecto, o ácido nucléico recombinante ou isolado codifica um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase que é termotolerante. O polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase depois da exposição em uma temperatura na faixa de maior do que 37°C a cerca de 95°C ou em qualquer lugar na faixa de mais do que 55°C a cerca de 85°C. Em um aspecto, o polipeptídeo mantém
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8/279 uma atividade de fosfolipase depois da exposição em uma temperatura na faixa de mais do que 90°C a cerca de 95°C em pH 4,5.
O polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase sob condições compreendendo cerca de pH 7, pH 6,5, pH 6,0, pH 5,5, pH 5, ou pH 4,5. O polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase sob condições compreendendo uma faixa de temperatura dentre cerca de 40°C a cerca de 70°C.
Em um aspecto, o ácido nucléico recombinante ou isolado compreende uma seqüência que hibridiza sob condições severas em uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, ou SEQ ID NO:7, onde o ácido nucléico codifica um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase. O ácido nucléico pode ser de pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 ou mais resíduos no comprimento ou o tamanho natural do gene ou transcrição, com ou sem uma seqüência de sinal, como descrito aqui. As condições severas podem ser altamente severas, moderadamente severas ou de baixa severidade, como descrito aqui. As condições severas podem incluir uma etapa de lavagem, por exemplo, uma etapa de lavagem compreendendo uma lavagem em 0,2X de SSC em uma temperatura de cerca de 65°C durante cerca de 15 minutos.
A invenção fornece uma sonda de ácido nucléico para identificar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo com uma fosfolipase, por exemplo, uma atividade de fosfolipase, onde a sonda compreende pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, ou mais, bases consecutivas de uma seqüência da invenção, por exemplo, uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, ou SEQ ID NO:7, e a sonda identifica o ácido nucléico por ligação ou hibridização. A sonda pode compreender um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 40 a 80, ou cerca de 60 a 100 bases consecutivas de uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 e /ou SEQ ID NO:7.
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A invenção fornece uma seqüência de ácido nucléico para identificar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo com uma fosfolipase, por exemplo, uma atividade de fosfolipase, onde a sonda compreende um ácido nucléico da invenção, por exemplo, um ácido nucléico tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 e /ou SEQ ID NO:7, ou uma subseqüência deste, sobre uma região de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 ou mais resíduos consecutivos, onde as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual.
A invenção fornece um par de seqüência de iniciador de amplificação para amplificar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase, onde o par de iniciador é capaz de amplificar um ácido nucléico compreendendo uma seqüência da invenção, ou fragmentos ou subseqüências destes. Um ou cada membro do par de seqüência de iniciador de amplificação pode compreender um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos cerca de 10 a 50 bases consecutivas da seqüência, ou cerca de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 bases consecutivas de seqüência.
A invenção fornece pares de iniciador de amplificação, onde o par de iniciador compreende um primeiro membro tendo uma seqüência como mencionada por cerca dos primeiros ( o 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 resíduos de um ácido nucléico da invenção, e um segundo membro tendo uma seqüência como mencionada por cerca dos primeiros (o 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 resíduos do filamento complementar do primeiro membro.
A invenção fornece fosfolipases geradas por amplificação, por
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10/279 exemplo, reação da cadeia da polimerase (PCR), usando um par de iniciador de amplificação. A invenção fornece métodos de preparar uma fosfolipase por amplificação, por exemplo, reação da cadeia da polimerase (PCR), usando um par de iniciador de amplificação da invenção. Em um aspecto, o par de iniciador de amplificação amplifica um ácido nucléico de uma biblioteca, por exemplo, uma biblioteca de gene, tal como uma biblioteca ambiental.
A invenção fornece métodos de amplificar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase compreendendo amplificação de um ácido nucléico padrão com um par de seqüência de iniciador de amplificação capaz de amplificar uma seqüência de ácido nucléico da invenção, ou fragmentos ou subseqüências destes. O par de iniciador de amplificação pode ser um par de iniciador de amplificação da invenção.
A invenção fornece cassetes de expressão compreendendo um ácido nucléico da invenção ou uma subseqüência deste. Em um aspecto, o cassete de expressão pode compreender o ácido nucléico que é operavelmente ligado a um promotor. O promotor pode ser um promotor viral, bacteriano, mamífero ou planta. Em um aspecto, o promotor de planta pode ser um promotor da batata, arroz, milho, trigo, tabaco ou cevada. O promotor pode ser um promotor consecutivo. O promotor consecutivo pode compreender CaMV35S. Em outro aspecto, o promotor pode ser um promotor induzível. Em outro aspecto, o promotor pode ser um promotor específico de tecido ou um promotor ambientalmente regulado ou um desenvolvimentalmente regulado. Desse modo, o promotor pode ser, por exemplo, um promotor específico de semente, um específico de folha, um específico de raiz, um específico de tronco ou um induzido por abscissão. Em um aspecto, o cassete de expressão pode também compreender uma planta ou vetor de expressão de vírus de planta.
A invenção fornece clonar veículos compreendendo um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) da invenção ou um ácido nucléico da invenção. O veículo de clonagem pode ser um vetor viral, um plasmídeo, um
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11/279 fago, um fagomídio, um cosmídio, um fosmídio, um bacteriófago ou um cromossoma artificial. O vetor viral pode compreender um vetor de adenovírus, um vetor retroviral ou um vetor viral adeno-associado. O veículo de clonagem pode compreender um cromossoma artificial bacteriano (BAC), um plasmídeo, um vetor derivado de P1 de bacteriófago (PAC), um cromossoma artificial de levedura (YAC), ou um cromossoma artificial de mamífero (MAC).
A invenção fornece célula transformada compreendendo um ácido nucléico da invenção ou um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) da invenção, ou um veículo de clonagem da invenção. Em um aspecto, a célula transformada pode ser uma célula bacteriana, uma célula de mamífero, uma célula fúngica, uma célula de levedura, uma célula de inseto ou uma célula de planta. Em um aspecto, a célula de planta pode ser uma célula de batata, trigo, arroz, milho, tabaco ou cevada.
A invenção fornece animais não humanos transgênicos compreendendo um ácido nucléico da invenção ou um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) da invenção. Em um aspecto, o animal é um camundongo.
A invenção fornece plantas transgênicas compreendendo um ácido nucléico da invenção ou um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) da invenção. A planta transgênica pode ser uma planta de milho, planta de batata, uma planta de tomate, uma planta de trigo, uma planta de semente oleaginosa, uma planta de semente de colza, uma planta de soja, uma planta de arroz, uma planta de cevada ou uma planta de tabaco. A invenção fornece sementes transgênicas compreendendo um ácido nucléico da invenção ou um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) da invenção. A semente transgênica pode ser uma semente de milho, uma semente de trigo, uma semente oleaginosa, uma semente de colza (uma planta de canola), uma semente de soja, uma semente de palma, uma semente de girassol, uma semente de sésamo, uma semente de amendoim ou uma de planta de tabaco.
A invenção fornece um oligonucleotídeo anti-sentido compreen19/02/2018, pág. 28/316
12/279 dendo uma seqüência de ácido nucléico complementar a ou capaz de hibrizar sob condições severas em um ácido nucléico da invenção. A invenção fornece métodos de inibir a translação de uma mensagem de fosfolipase em uma célula compreendendo administrar à célula ou expressar na célula um oligonucleotídeo anti-sentido compreendendo uma seqüência de ácido nucléico complementar a ou capaz de hibrizar sob condições severas em um ácido nucléico da invenção.
A invenção fornece um oligonucleotídeo anti-sentido compreendendo uma seqüência de ácido nucléico complementar a ou capaz de hibrizar sob condições severas em um ácido nucléico da invenção. A invenção fornece métodos de inibir a translação de uma mensagem de fosfolipase em uma célula compreendendo administrar à célula ou expressar na célula um oligonucleotídeo anti-sentido compreendendo uma seqüência de ácido nucléico complementar a ou capaz de hibrizar sob condições severas em um ácido nucléico da invenção. O oligonucleotídeo anti-sentido pode estar entre cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 40 a 80, cerca de 60 a 100, cerca de 70 a 110, ou cerca de 80 a 120 bases no comprimento.
A invenção fornece métodos de inibir a translação de uma fosfolipase, por exemplo, uma mensagem de fosfolipase em uma célula compreendendo administrar à célula ou expressar na célula um oligonucleotídeo anti-sentido compreendendo uma seqüência de ácido nucléico complementar a ou capaz de hibridizar sob condições severas em um ácido nucléico da invenção. A invenção fornece moléculas de RNA inibidoras (RNAi) de filamento duplo compreendendo uma subseqüência de uma seqüência da invenção. Em um aspecto, o RNAi é de cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos dúplices no comprimento. A invenção fornece métodos de inibir a expressão de uma fosfolipase, por exemplo, uma fosfolipase, em uma célula compreendendo administrar à célula ou expressar na célula um RNA inibidor (iRNA) de filamento duplo, onde o RNA compreende uma subseqüência de uma seqüência da invenção.
A invenção fornece um polipeptídeo recombinante ou isolado
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13/279 compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%,
63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,
76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,
89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais , ou identidade de seqüência completa (100%) em um peptídeo ou polipeptídeo exemplar da invenção sobre uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 ou mais resíduos, ou sobre o tamanho natural do polipeptídeo, e as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por uma inspeção visual. Seqüências de peptídeo ou polipeptídeo exemplares da invenção incluem SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:8. Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo recombinante ou isolado compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) em SEQ ID NO:2. Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo recombinante ou isolado compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) em SEQ ID NO:4. Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo recombinante ou isolado compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou seqüência de identidade completa (100%) em SEQ ID NO:6. Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo recombinante ou isolado compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%,
59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%,
72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
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98%, 99%, ou mais, ou identidade de sequência completa (100%) em SEQ ID NO:8. A invenção fornece polipeptídeos recombinantes ou isolados codificados por um ácido nucléico da invenção. Em aspectos alternativos, o polipeptídeo pode ter uma sequência como mencionada em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, ou SEQ ID NO:8. O polipeptídeo pode ter uma atividade de fosfolipase, por exemplo, uma atividade de fosfolipase A, B, C ou D.
A invenção fornece polipeptídeos recombinantes ou isolados compreendendo um polipeptídeo da invenção necessitando de uma sequência de sinal. Em um aspecto, o polipeptídeo necessitando de uma sequência de sinal tem pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência para resíduos 30 a 287 de SEQ ID NO:2, uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de sequência para resíduos 25 a 283 de SEQ ID NO:4, uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de sequência para resíduos 26 a 280 de SEQ ID NO:6, ou, uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%,
71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%,
84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99%, ou mais identidade de sequência para os resíduos 40 a
330 de SEQ ID NO:8. As identidades de sequência podem ser determinadas por análise com um algoritmo de comparação de sequência ou por inspeção visual.
Outro aspecto da invenção fornece um peptídeo ou polipeptídeo recombinante ou isolado incluindo pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100 ou mais bases consecutivas de uma sequência de peptídeo ou polipeptídeo da invenção, sequências subs19/02/2018, pág. 31/316
15/279 tancialmente idênticas também, e as seqüências complementares também. O peptídeo pode ser, por exemplo, um fragmento imunogênico, um motivo (por exemplo, um sítio de ligação) ou um sítio ativo.
Em um aspecto, o polipeptídeo recombinante ou isolado da invenção (com ou sem uma seqüência de sinal) tem uma atividade de fosfolipase. Em um aspecto, a atividade de fosfolipase compreende catalisar a hidrólise de uma ligação de éster de glicerolfosfato (isto é, divagem de ligações de éster de glicerolfosfato). A atividade de fosfolipase pode compreender catalisar hidrólise de uma ligação de éster em um fosfolipídio em um óleo vegetal. O fosfolipídio de óleo vegetal pode compreender um fosfolipídio de semente oleaginosa. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de fosfolipídio C (PLC), uma atividade de fosfolipase A (PLA), tal como atividade de fosfolipase A1 ou fosfolipase A2, uma atividade de fosfolipase D (PLD), tal como atividade de fosfolipase D1 ou uma fosfolipase D2. A atividade de fosfolipase pode compreender hidrólise de uma glicoproteína, por exemplo, como uma glicoproteína encontrada em um tubérculo de batata. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade enzimática de patativa. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de hidrolase de acila de lipídio (LAH).
Em um aspecto, a atividade de fosfolipase é termostável. O polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase sob condições compreendendo uma faixa de temperatura dentre cerca de 37°C a cerca de 95°C, entre cerca de 55°C a cerca de 85°C, entre cerca de 70°C a cerca de 95°C, ou entre cerca de 90°C a cerca de 95°C. Em outro aspecto, a atividade de fosfolipase pode ser termotolerante. O polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase depois da exposição a uma temperatuta na faixa de maior do que 37°C a cerca de 95°C, ou na faixa maior do que 55°C a cerca de 85°C. Em um aspecto, o polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase depois da exposição a uma temperatura na faixa maior do que 90°C a cerca de 95°C em pH 4,5.
Em um aspecto, o polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase sob condições compreendendo cerca de pH 6,5, pH 6, pH 5,5,
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16/279 pH 5, pH 4,5 ou pH 4. Em outro aspecto, o polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase sob condições compreendendo cerca de pH 7, pH 7,5, pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5 ou pH 11.
Em um aspecto, o polipeptídeo recombinante ou isolado pode compreender o polipeptídeo da invenção que necessita de uma seqüência de sinal. Em um aspecto, o polipeptídeo recombinante ou isolado pode compreender o polipeptídeo da invenção compreendendo uma seqüência de sinal heteróloga, tal como uma seqüência de sinal de não-fosfolipase ou fosfolipase heteróloga.
A invenção fornece peptídeos recombinantes ou isolados compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de seqüência para resíduos 1 a 29 de SEQ ID NO: 2, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de seqüência para resíduos 1 a 24 de SEQ ID NO:4, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de seqüência para resíduos 1 a 25 de SEQ ID NO:6, ou pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de seqüência para resíduos 1 a 39 de SEQ ID NO:8, e para outras seqüências de sinal como mencionada na listagem de SEQ ID, onde as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual. Estes peptídeos podem agir como seqüências de sinal em sua fosfolipase endógena, em outra fosfolipase, ou uma proteína heteróloga (uma enzima de não-fosfolipase ou outra proteína). Em um aspecto, a invenção fornece proteínas quiméricas compreendendo um primeiro domínio compreendendo uma seqüência de sinal da invenção e pelo menos um segundo domínio. A proteína pode ser uma proteína de fusão. O segundo domínio pode compreender uma enzima. A enzima pode ser uma fosfolipase.
A invenção fornece polipeptídeos quiméricos compreendendo pelo menos um primeiro domínio compreendendo um peptídeo de sinal (SP) da invenção ou um domínio catalítico (CD), ou sítio ativo, de uma fosfolipase da invenção e pelo menos um segundo domínio compreendendo um peptídeo ou polipeptídeo heterólogo, onde o peptídeo ou polipeptídeo heterólogo
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17/279 não está naturalmente associado com o peptídeo de sinal (SP) ou domínio catalítico (CD). Em um aspecto, o peptídeo ou polipeptídeo heterólogo não é uma fosfolipase. O peptídeo ou polipeptídeo heterólogo pode ser terminal de amino para, terminal de carbóxi para ou em ambas as extremidades do peptídeo de sinal (SP) ou domínio catalítico (CD).
A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados codificando um polipeptídeo quimérico, onde o polipeptídeo quimérico compreende pelo menos um primeiro domínio compreendendo peptídeo de sinal (SP) ou um domínio catalítico (CD), ou sítio ativo, de um polipeptídeo da invenção, e pelo menos um segundo domínio compreendendo um peptídeo ou polipeptídeo heterólogo, onde o peptídeo ou polipeptídeo heterólogo não está naturalmente associado com o peptídeo de sinal (SP) ou domínio catalítico (CD).
Em um aspecto, a atividade de fosfolipase compreende uma atividade específica em cerca de 37°C na faixa de cerca de 100 a cerca de 1000 unidades por miligrama de proteína. Em outro aspecto, a atividade de fosfolipase compreende uma atividade específica de cerca de 500 a cerca de 750 unidades por miligrama de proteína. Alternativamente, a atividade de fosfolipase compreende uma atividade específica em 37°C na faixa de cerca de 500 a cerca de 1200 unidades por miligrama de proteína. Em um aspecto, a atividade de fosfolipase compreende uma atividade específica em 37°C na faixa de cerca de 750 a cerca de 1000 unidades por miligrama de proteína. Em outro aspecto, a termotolerâncida compreende retenção de pelo menos metade da atividade específica da fosfolipase em 37°C depois de ser aquecida à temperatura elevada. Alternativamente, a termotolerância pode compreender a retenção de atividade específica em 37°C na faixa de cerca de 500 a cerca de 1200 unidades por milograma de proteínas depois de serem aquecidas à temperatura elevada.
A invenção fornece o polipeptídeo recombinante ou isolado da invenção, onde o polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de glicosilação. Em um aspecto, a glicosilação pode ser uma glicosilação ligada por N. Em um aspecto, o polipeptídeo pode ser glicosilado depois de ser ex19/02/2018, pág. 34/316
18/279 presso em uma P. pastoris ou uma S. pombe.
A invenção fornece preparações de proteína compreendendo um polipeptídeo da invenção, onde a preparação de proteína compreende um líquido, um sólido ou um gel.
A invenção fornece heterodímeros compreendendo um polipeptídeo da invenção e uma segunda proteína ou domínio. O segundo membro do heterodímero pode ser uma fosfolipase diferentes, uma enzima diferente ou outra proteína. Em um aspecto, o segundo domínio pode ser um polipeptídeo e o heterodímero pode ser uma proteína de fusão. Em um aspecto, o segundo domínio pode ser um epítopo ou um alvo. Em um aspecto, a invenção fornece homodímeros compreendendo um polipeptídeo da invenção.
A invenção fornece polipeptídeos imobilizados tendo uma atividade de fosfolipase, onde o polipeptídeo compreende um polipeptídeo da invenção, um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção, ou um polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo da invenção e um segundo domínio. Em um aspecto, o polipeptídeo pode ser imobilizado em uma célula, um metal, uma resina, um polímero, uma cerâmica, um vidro, um microeletrodo, uma partícula grafítica, uma conta, um gel, uma placa, uma disposição ou um tubo capilar.
A invenção fornece disposições compreendendo um polipeptídeo imobilizado, onde o polipeptídeo é uma fosfolipase da invenção ou é um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção. A invenção fornece disposições compreendendo um ácido nucléico imobilizado da invenção. A invenção fornece uma disposição compreendendo um anticorpo imobilizado da invenção.
A invenção fornece anticorpos recombinantes ou isolados que especificamente ligam-se a um polipeptídeo da invenção ou a um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou um policlonal. A invenção fornece hibridomas compreendendo um anticorpo da invenção.
A invenção fornece métodos de isolar ou identificar um polipeptídeo com uma atividade de fosfolipase compreendendo as etapas de: (a)
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19/279 fornecer um anticorpo da invenção; (b) fornecer uma amostra compreendendo polipeptídeos; e, (c) pôr em contato a amostra da etapa (b) com o anticorpo da etapa (a) sob condições onde o anticorpo pode especificamente ligar ao polipeptídeo, desse modo isolando ou identificando uma fosfolipase. A invenção fornece métodos de preparar um anticorpo de antifosfolipase compreendendo administrar em um animal não humano um ácido nucléico da invenção, ou um polipeptídeo da invenção, em uma quantidade suficiente para gerar uma resposta imune humoral, desse modo preparando um anticorpo de antifosfolipase.
A invenção fornece métodos de produzir um polipeptídeo recombinante compreendendo as etapas de: (a) fornecer um ácido nucléico da invenção operavelmente ligado a um promotor; e, (b) expressar o ácido nucléico da etapa (a) sob condições que permitam a expressão do polipeptídeo, desse modo produzindo um polipeptídeo recombinante. O ácido nucléico pode compreender uma seqüência tendo pelo menos 85% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 1 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 3 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 5 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, ou tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 7 sobre uma região de pelo menos 100 resíduos, onde as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual. O ácido nucléico pode compreender um ácido nucléico que hibridiza sob condições severas para um ácido nucléico como mencionado em SEQ ID NO: 1, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 3, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 5, ou uma subseqüência desta; ou, uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 7, ou uma subseqüência desta. O método pode também compreender transformar uma célula hospedeira com o ácido nucléico de etapa (a) seguido por expressão do ácido nucléico da etapa (a), desse modo produzindo um polipeptídeo recombinante em uma célu19/02/2018, pág. 36/316
20/279 la transformada. O método pode também compreender inserir em um animal não humano hospedeiro o ácido nucléico da etapa (a) seguido por expressão do ácido nucléico da etapa (a), desse modo produzindo um polipeptídeo recombinante no animal não humano hospedeiro.
A invenção fornece métodos para identificar um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção, ou um fragmento ou variante deste, (b) fornecer um substrato de fosfolipase; e, (c) pôr em contato o polipeptídeo ou um fragmento ou variantes deste da etapa (a) com o substrato da etapa (b) e detectar um aumento na quantidade de substrato ou um decréscimo na quantidade do produto de reação, onde um decréscimo na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade do produto de reação detecta um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase. Em aspectos alternativos, o ácido nucléico compreende uma seqüência tendo pelo menos 85% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 1 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 3 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, ou tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 5 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, ou tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 7 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, onde as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual. Em aspectos alternativos, o ácido nucléico hibridiza sob condições severas uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 1, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 3, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 5, ou uma subseqüência desta; ou, uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 7, ou uma subseqüência desta.
A invenção fornece métodos para identificar um substrato de fosfolipase compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da
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21/279 invenção; (b) fornecer um substrato teste; e, (c) pôr em contato o polipeptídeo da etapa (a) com o substrato teste da etapa (b) e detectar um aumento na quantidade de substrato ou um decréscimo na quantidade do produto de reação, onde um decréscimo na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade do produto de reação identifica o substrato teste como um substrato de fosfolipase. Em aspectos alternativos, o ácido nucléico pode ter pelo menos 85% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 1 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, pelo menos 80% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 3 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, pelo menos 80% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 5 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, ou, pelo menos 70% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 7 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, onde as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual. Em aspectos alternativos, o ácido nucléico hibridiza sob condições severas para uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 1, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 3, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 5, ou uma subseqüência desta; ou, uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 7, ou uma subseqüência desta.
A invenção fornece métodos de determinar se um composto especificamente liga em uma fosfolipase compreendendo as seguintes etapas: (a) expressar um ácido nucléico ou um vetor compreendendo o ácido nucléico sob condições permissivas para a translação do ácido nucléico em um polipeptídeo, onde o ácido nucléico e vetor compreendem um ácido nucléico ou vetor da invenção; ou, fornecer um polipeptídeo da invenção (b) pôr em contato o polipeptídeo com o composto teste; e, (c) determinar se o composto teste especificamente liga ao polipeptídeo, desse modo determinando que o composto especificamente liga à fosfolipase. Em aspectos alternativos, a seqüência de ácido nucléico tem pelo menos 85% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 1 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, pelo menos 80% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 3 sobre
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22/279 uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, pelo menos 80% de identidade de sequência em SEQ ID NO: 5 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, ou, pelo menos 70% de identidade de sequência em SEQ ID NO: 7 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, onde as identidades de sequência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de sequência ou por inspeção visual. Em aspectos alternativos, o ácido nucléico hibridiza sob condições severas para uma sequência como mencionada em SEQ ID NO: 1, ou uma subseqüência desta; uma sequência como mencionada em SEQ ID NO: 3, ou uma subseqüência desta; uma sequência como mencionada em SEQ ID NO: 5, ou uma subseqüência desta; ou, uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 7, ou uma subseqüência desta.
A invenção fornece métodos para identificar um modulador de uma atividade de fosfolipase compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptideo da invenção ou um polipeptideo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um composto teste; (c) pôr em contato o polipeptideo da etapa (a) com o composto teste da etapa (b); e, avaliar uma atividade da fosfolipase, onde uma alteração na atividade de fosfolipase avaliada na presença do composto teste comparada à atividade na ausência do composto teste fornece uma determinação que o composto teste modula a atividade de fosfolipase. Em aspectos alternativos, o ácido nucléico pode ter pelo menos 85% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 1 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, pelo menos 80% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 3 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, pelo menos 80% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 5 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, ou, pelo menos 70% de identidade de seqüência em SEQ ID NO: 7 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, onde as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual. Em aspectos alternativos, o ácido nucléico pode hibridizar sob condições severas para uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo consistindo em uma seqüência co19/02/2018, pág. 39/316
23/279 mo mencionada em SEQ ID NO: 1, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 3, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 5, ou uma subseqüência desta; e, uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 7, ou uma subseqüência desta.
E um aspecto, a atividade de fosfolipase é avaliada fornecendose um substrato de fosfolipase e detectando-se um aumento na quantidade do substrato ou um decréscimo na quantidade de um produto de reação. O decréscimo na quantidade do substrato ou o aumento na quantidade do produto de reação com o composto teste quando comparado à quantidade de substrato ou produto de reação sem o composto teste identifica o composto teste como um ativador da atividade de fosfolipase. O aumento na quantidade do substrato ou o decréscimo na quantidade do produto de reação com o composto teste quando comparada à quantidade de substrato ou produto de reação sem o composto teste identifica o composto teste como um inibidor de atividade de fosfolipase.
A invenção fornece sistemas de computador compreendendo um processador e um dispositivo de armazenagem de dados onde o referido dispositivo de armazenagem de dados tem armazenado nesse uma seqüência de polipeptídeo da invenção ou uma seqüência de ácido nucléico da invenção.
Em um aspecto, o sistema de computador pode também compreender um algoritmo de comparação de seqüência e um dispositivo de armazenagem de dados tendo pelo menos uma seqüência de referência armazenada nesse. O algoritmo de comparação de seqüência pode compreender um programa de computador que indica polimorfismos. O sistema de computador pode também compreender um identificador que identifica um ou mais aspectos na referida seqüência.
A invenção fornece veículos legíveis por computador tendo armazenado nesses uma seqüência compreendendo uma seqüência de polipeptídeo da invenção ou uma seqüência de ácido nucléico da invenção.
A invenção fornece métodos para identificar um aspecto em
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24/279 uma seqüência compreendendo as etapas de: (a) ler a seqüência usando um programa de computador que identifica um ou mais aspectos em uma seqüência, onde a seqüência compreende uma seqüência de polipeptídeo da invenção ou uma seqüência de ácido nucléico da invenção; e, (b) identificar um ou mais aspectos na seqüência com o programa de computador.
A invenção fornece métodos para comparar uma primeira seqüência a uma segunda seqüência compreendendo as etapas de: (a) ler a primeira seqüência e a segunda seqüência através do uso de um programa de computador que compara as seqüências, onde a primeira seqüência compreende uma seqüência de polipeptídeo da invenção ou uma seqüência de ácido nucléico da invenção; e, (b) determinar as diferenças entre a primeira seqüência e a segunda seqüência com o programa de computador. Em um aspecto, a etapa de determinar diferenças entre a primeira seqüência e a segunda seqüência também compreende a etapa de identificar os polimorfismos. Em um aspecto, o método também compreende um identificador (e uso do identificador) que identifica um ou mais aspectos em uma seqüência. Em um aspecto, o método compreende ler a primeira seqüência usando um programa de computador e identificar um ou mais aspectos na seqüência.
A invenção fornece métodos de isolar ou recuperar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo com uma atividade de fosfolipase de uma amostra ambiental compreendendo as etapas de: (a) fornecer um par de seqüência de iniciador de amplificação para amplificar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo com uma atividade de fosfolipase, onde o par de iniciador é capaz de amplificar um ácido nucléico da invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 1, ou uma subseqüência desta; SEQ ID NO: 3, ou uma subseqüência desta; SEQ ID NO: 5, ou uma subseqüência desta; ou SEQ ID NO: 7, ou uma subseqüência desta, etc.); (b) isolar um ácido nucléico da amostra ambiental ou tratar a amostra ambiental tal que o ácido nucléico na amostra é acessível para hibridização ao par de iniciador de amplificação; e, (c) combinar o ácido nucléico da etapa (b) com o par de iniciador de amplificação da etapa (a) e amplificar o ácido nucléico da amostra ambiental, des19/02/2018, pág. 41/316
25/279 se modo isolando ou recuperando um ácido nucléico codificando um polipeptídeo com uma atividade de fosfolipase de uma amostra ambiental. Em um aspecto, cada membro do par de seqüência de iniciador de amplificação compreende um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos cerca de 10 a 50 bases consecutivas de uma seqüência de ácido nucléico da invenção. Em um aspecto, o par de seqüência de iniciador de amplificação é um par de amplificação da invenção.
A invenção fornece métodos para isolar ou recuperar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo com uma atividade de fosfolipase de uma amostra ambiental compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma sonda de polipeptídeo compreendendo uma seqüência de ácido nucléico da invenção, ou uma subseqüência desta; (b) isolar um ácido nucléico da amostra ambiental ou tratar a amostra ambiental tal que o ácido nucléico na amostra é acessível para hibridização para uma sonda de polipeptídeo da etapa (a); (c) combinar o ácido nucléico isolado ou a amostra ambiental tratada da etapa (b) com a sonda de polipeptídeo da etapa (a); e, (d) isolar um ácido nucléico que especificamente hibridiza com a sonda de polipeptídeo da etapa (a), desse modo isolando ou recuperando um ácido nucléico codificando um polipeptídeo com uma atividade de fosfolipase da amostra ambiental. Em aspectos alternativos, a amostra ambiental compreende uma amostra de água, uma amostra de líquido, uma amostra de solo, uma amostra de ar ou uma amostra biológica. Em aspectos alternativos, a amostra biológica é derivada de uma célula bacteriana, uma célula de protozoário, uma célula de inseto, uma célula de levedura, uma célula de planta, uma célula fúngica ou uma célula de mamífero.
A invenção fornece métodos de gerar uma variante de um ácido nucléico codificando uma fosfolipase compreendendo as etapas de: (a) fornecer um ácido nucléico padrão compreendendo um ácido nucléico da invenção; (b) modificar, deletar ou adicionar um ou mais nucleotídeos na seqüência padrão, ou uma combinação destes, para gerar uma variante do ácido nucléico padrão.
Em um aspecto, o método também compreende expressar o
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26/279 ácido nucléico variante para gerar um polipeptídeo de fosfolipase variante. Em aspectos alternativos, as modificações, adições ou deleções são introduzidas por PCR propensa ao erro, embaralhamento, mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo, PCR de agrupamento, mutagênese de PCR sexual, mutagênese em vivo, mutagênese específica de cassete, mutagênese de conjunto recorrente, mutagênese de conjunto exponencial, mutagênese específica de sítio, reagrupamento de gene, mutagênese saturada de sítio de gene (GSSM), reagrupamento de ligação sintética (SLR) e/ou uma combinação destes. Em aspectos alternativos, as modificações, adições ou deleções são introduzidas por um método selecionado do grupo consistindo em recombinação, recombinação de seqüência recorrente, mutagênese de DNA modificada por fosfotioato, mutagênese padrão contendo uracila, mutagênese de dúplex aberto, mutagênese de reparo de ligação imperfeita pontual, mutagênese de cepa hospedeira deficiente de reparo, mutagênese química, mutagênese radiogênica, mutagênese por deleção, mutagênese de seleção de restrição, mutagênese de purificação de restrição, síntese de gene artificial, mutagênese de conjunto, criação de multímero de ácido nucléico quimérico e/ou uma combinação destes.
Em um aspecto, o método é iterativamente repetido até que uma fosfolipase tendo uma atividade diferente ou alterada ou uma estabilidade diferente ou alterada daquela de uma fosfolipase codificada pelo ácido nucléico padrão seja produzida. Em um aspecto, a atividade diferente ou alterada é uma atividade de fosfolipase sob uma condição acídica, onde a fosfolipase codificada pelo ácido nucléico padrão não é ativa sob condição acídica. Em um aspecto, a atividade diferente ou alterada é uma atividade de fosfolipase sob uma temperatura alta, onde a fosfolipase codificada pelo ácido nucléico padrão não é ativa sob a temperatura alta. Em um aspecto, o método é iterativamente repetido até que uma fosfolipase codificando seqüência tendo um uso de códon alterado daquele do ácido nucléico padrão seja produzida. O método pode ser iterativamente repetido até que um gene de fosfolipase tendo nível superior ou inferior de estabilidade ou expressão de mensagem daquele do ácido nucléico padrão seja produzido.
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A invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nucléico codificando uma fosfolipase para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira, o método compreendendo (a) fornecer um ácido nucléico da invenção codificando uma fosfolipase; e, (b) identificar um códon não preferido ou um menos preferido no ácido nucléico da etapa (a) e substituí-lo com códon preferido ou neutralmente usado codificando o mesmo aminoácido como o códon substituído, onde um códon preferido é um códon super-representado em seqüências de codificação em genes na célula hospedeira e um códon não preferido ou menos preferido é um códon subrepresentado em seqüências de codificação em genes na célula hospedeira, desse modo modificando o ácido nucléico para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira.
A invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nucléico codificando uma fosfolipase, o método compreendendo (a) fornecer um ácido nucléico da invenção codificando uma fosfolipase; e, (b) identificar um códon no ácido nucléico da etapa (a) e substituindo-o com um códon diferente codificando o mesmo aminoácido como o códon substituído, desse modo modificando os códons em um ácido nucléico codificando uma fosfolipase.
A invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nucléico codificando uma fosfolipase para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira, o método compreendendo (a) fornecer um ácido nucléico da invenção codificando uma fosfolipase; e, (b) identificar um códon não preferido ou um menos preferido no ácido nucléico da etapa (a) e substituí-lo por um códon preferido ou neutralmente usado codificando o mesmo aminoácido como o códon substituído, onde um códon preferido é um códon super-representado em seqüências de codificação em genes na célula hospedeira e um códon não preferido ou menos preferido é um códon subrepresentado em seqüências de codificação em genes na célula hospedeira, desse modo modificando o ácido nucléico para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira.
A invenção fornece métodos para modificar um códon em um
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28/279 ácido nucléico codificando uma fosfolipase para diminuir sua expressão em uma célula hospedeira, o método compreendendo (a) fornecer um ácido nucléico da invenção codificando uma fosfolipase; e, (b) identificar pelo menos um códon preferido no ácido nucléico da etapa (a) e substituí-lo por um códon não preferido ou menos preferido codificando o mesmo aminoácido como o códon substituído, onde um códon preferido é um códon superrepresentado em sequências de codificação em genes em uma célula hospedeira e um códon não preferido ou menos preferido é um códon subrepresentado em sequências de codificação em genes na célula hospedeira, desse modo modificando o ácido nucléico para diminuir sua expressão em uma célula hospedeira. Em aspectos alternativos, a célula hospedeira é uma célula bacteriana, uma célula fúngica, uma célula de inseto, uma célula de levedura, uma célula de planta ou uma célula de mamífero.
A invenção fornece métodos para produzir uma biblioteca de ácidos nucléicos codificando uma pluralidade de sítios ativos do fosfolipase modificados ou sítios de ligação de substrato, onde os sítios ativos modificados ou sítios de ligação de substrato são derivados de um primeiro ácido nucléico compreendendo uma seqüência codificando um primeiro sítio ativo ou um primeiro sítio de ligação de substrato, o método compreendendo: (a) fornecer um primeiro ácido nucléico codificando um primeiro sítio ativo ou primeiro sítio de ligação de substrato, onde a primeira seqüência de ácido nucléico compreende um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um grupo de oligonucleotídeos mutagênicos que codifica variantes de aminoácido de ocorrência natural em uma pluralidade de códons alvejados no primeiro ácido nucléico; e, (c) usar o grupo de oligonucleotídeos mutagênicos para gerar um grupo ácidos nucléicos de variante codificando sítio de ligação de substrato ou codificando sítio ativo codificando uma faixa de variações de aminoácido em cada códon de aminoácido que foi mutagenizado, desse modo produzindo uma biblioteca de ácidos nucléicos codificando uma pluralidade de sítios ativos de fosfolipase modificados ou sítios de ligação de substrato. Em aspectos alternativos, o método compreende mutagenizar o primeiro ácido nucléico da etapa (a) por um método compreendendo um sistema de
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29/279 evolução direcionado otimizado, mutagênese de saturação de sítio de gene (GSSM), e reagrupamento de ligação sintética (SLR). O método pode também compreender mutagenizar o primeiro ácido nucléico da etapa (a) ou variantes por um método compreendendo PCR propensa ao erro, embaralhamento, mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo, PCR de agrupamento, mutagênese de PCR sexual, mutagênese em vivo, mutagênese de cassete, mutagênese de conjunto recorrente, mutagênese de conjunto exponencial, mutagênese específica de sítio, reagrupamento de gene, mutagênese saturada de sítio de gene (GSSM), reagrupamento de ligação sintética (SLR) e uma combinação destes. O método pode também compreender mutagenizar o primeiro ácido nucléico da etapa (a) ou variantes por um método compreendendo recombinação, recombinação de seqüência recorrente, mutagênese de DNA modificada por fosfotioato, mutagênese padrão contendo uracila, mutagênese de dúplex aberto, mutagênese de reparo de ligação imperfeita pontual, mutagênese de cepa hospedeira deficiente de reparo, mutagênese química, mutagênese radiogênica, mutagênese por deleção, mutagênese de seleção de restrição, mutagênese de purificação de restrição, síntese de gene artificial, mutagênese de conjunto, criação de multímero de ácido nucléico quimérico e uma combinação destes.
A invenção fornece métodos para preparar uma pequena molécula compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma pluralidade de enzimas biossintéticas capazes de sintetizar ou modificar uma pequena molécula, onde uma das enzimas compreende uma enzima de fosfolipase codificada por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um substrato para pelo menos uma das enzimas da etapa (a); e, (c) reagir o substrato da etapa (b) com as enzimas sob condições que facilitam uma pluralidade de reações biocatalíticas para gerar uma pequena molécula por uma série de reações biocatalíticas.
A invenção fornece métodos para modificar uma pequena molécula compreendendo as etapas: (a) fornecer uma enzima de fosfolipase codificada por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma pequena molécula; e, (c) reagir a enzima da etapa (a) com a pequena molécula da etapa
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30/279 (b) sob condições que facilitam uma reação enzimática catalisada pela enzima de fosfolipase, desse modo modificando uma pequena molécula por uma reação enzimática de fosfolipase. Em um aspecto, o método compreende fornecer uma pluralidade de substratos de pequena molécula para a enzima da etapa (a), desse modo gerando uma biblioteca de pequenas moléculas modificadas por pelo menos uma reação enzimática catalisada pela enzima de fosfolipase. Em um aspecto, o método também compreende uma pluralidade de enzimas adicionais sob condições que facilitam uma pluralidade de reações biocatalíticas pelas enzimas para formar uma biblioteca de pequenas moléculas modificadas pela pluralidade de reações enzimáticas. Em um aspecto, o método também compreende a etapa de testar a biblioteca para determinar se uma molécula pequena modificada particular que exibe uma atividade desejada está presente dentro da biblioteca. A etapa de testar a biblioteca pode também compreender as etapas de sistematicamente eliminar tudo porém uma das reações biocatalíticas usadas para produzir uma porção da pluralidade das pequenas moléculas modificadas dentro da biblioteca testando-se a porção da pequena molécula modificada quanto a presença ou ausência da pequena molécula modificada particular com uma atividade desejada, e identificar pelo menos uma reação biocatalítica específica que produz a pequena molécula modificada particular de atividade desejada.
A invenção fornece métodos para determinar um fragmento funcional de uma enzima de fosfolipase compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma enzima de fosfolipase compreendendo uma seqüência de aminoácido da invenção; e, (b) deletar uma pluralidade de resíduos de aminoácido da seqüência da etapa (a) e testar a subseqüência restante para uma atividade de fosfolipase, desse modo determinando um fragmento funcional de uma enzima de fosfolipase. Em um aspecto, a atividade de fosfolipase é avaliada fornecendo-se um substrato de fosfolipase e detectando um aumento na quantidade do substrato ou um decréscimo na quantidade de um produto de reação. Em um aspecto, um decréscimo na quantidade de um substrato de enzima ou um aumento na quantidade do produto de reação
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31/279 com o composto teste quando comparada à quantidade de substrato ou produto de reação sem o composto teste identifica o composto teste como um ativador de atividade de fosfolipase.
A invenção fornece métodos para clivar uma ligação de éster de glicerolfosfato compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase, onde o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido da invenção, ou o polipeptídeo é codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo uma ligação de éster de glicerollfosfato; e, (c) pôr em contato o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob condições onde o polipeptídeo cliva a ligação de éster de glicerolfosfato. Em um aspecto, as condições compreendem entre cerca de pH 5 a cerca de 5,5, ou entre cerca de pH 4,5 a cerca de 5,0. Em um aspecto, as condições compreendem uma temperatura entre cerca de 40°C e cerca de 70°C. Em um aspecto, a composição compreende um óleo vegetal. Em um aspecto, a composição compreende um fosfolipídio de semente oelaginosa. Em um aspecto, a reação de divagem pode gerar uma base fosforilada extraível de água e um diglicerídeo.
A invenção fornece métodos para desengomar óleo compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase, onde o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido da invenção, ou o polipeptídeo é codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo um óleo vegetal; e, (c) pôr em contato o polipeptídeo da etapa (a) e o óleo vegetal da etapa (b) sob condições onde o polipeptídeo pode clivar as ligações de éster no óleo vegetal, desse modo desengomando o óleo. Em um aspecto, o óleo vegetal compreende semente oleaginosa. O óleo vegetal pode compreender óleo de palma, óleo de semente de colza, óleo de soja, óleo de canola, óleo de sésamo, óleo de amendoim ou óleo de girassol. Em um aspecto, o método também compreende a adição de uma fosfolipase da invenção, outra fosfolipase ou uma combinação destes.
A invenção fornece métodos para converter um fosfolipídio não
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32/279 hidratável para uma forma hidratável compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase, onde o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido da invenção, ou o polipeptídeo é codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo um fosfolipídio não hidratável; e, (c) pôr em contato o polipeptídeo da etapa (a) e o fosfolipídio não hidratável da etapa (b) sob condições onde o polipeptídeo pode clivar as ligações de éster no fosfolipídio não hidratável, desse modo convertendo um fosfolipídio não hidratável para uma forma hidratável.
A invenção fornece métodos para desengomar um óleo compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção tendo uma atividade de fosfolipase ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo uma gordura ou um óleo compreendendo um fosfolipídio; e (c) pôr em contato o polipeptídeo da etapa (a) e a composição da etapa (b) sob condições onde o polipeptídeo pode desengomar a composição compreendendo fosfolipídio (sob condições onde o polipeptídeo da invenção pode catalisar a hidrólise de um fosfolipídio). Em um aspecto, a composição compreendendo óleo compreende um óleo de planta, um de animal, um de alga ou um de peixe. O óleo de planta pode compreender um óleo de soja, um óleo de semente de colza, um óleo de milho, um óleo de uma semente de palma, um óleo de canola, um óleo de girassol, um óleo de sésamo ou um óleo de amendoim. O polipeptídeo pode hidrolizar um fosfatídeo de um fosfolipídio hidratável e/ou um não hidratável na composição compreendendo óleo. O polipeptídeo pode hidrolizar um fosfatídeo em uma ligação de fosfoéster de glicerila para gerar um composto de fosfato solúvel em água e diglicerídeo. O polipeptídeo pode ter uma atividade de fosfolipase C, B, A ou D. Em um aspecto, uma atividade de fosfolipase D e uma enzima de fosfatase são adicionadas. O contato pode compreender hidrólise de um fosfolipídio hidratada em um óleo. As condições de hidrólise podem compreender uma temperatura de cerca de 20°C a 40°C em um pH alcalino. As condições alcalinas podem compreender um pH de cerca de pH 8 a pH 10.
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As condições de hidrólise podem compreender um tempo de reação de cerca de 3 a 10 minutos. As condições de hidrólise podem compreender hidrólise de fosfolipídios hidratáveis e não hidratáveis em óleo em uma temperatura de cerca de cerca de 50°C a 60°C, em um pH a cerca do pH 5 ao pH 6,5 usando um tempo de reação de cerca de 30 a 60 minutos. O polipeptídeo pode ser encontrado em um filtro e o óleo ou gordura contendo fosfolipídio é passado através do filtro. O polipeptídeo pode ser adicionado em uma solução compreendendo o óleo ou gordura contendo fosfolipídio e em seguida a solução é passada através de um filtro.
A invenção fornece métodos para converter um fosfolipídio não hidratável para uma forma hidratável compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma composição compreendendo um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase da invenção, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo um fosfolipídio não hidratável; e, (c) pôr em contato o polipeptídeo da etapa (a) e a composição da etapa (b) sob condições onde o polipeptídeo converte o fosfolipídio não hidratável para uma forma hidratável. O polipeptídeo pode ter a atividade de fosfolipase C. O polipeptídeo pode ter uma atividade de fosfolipase D e uma enzima de fosfatase é também adicionada.
A invenção fornece métodos para refinar cáustico de uma composição contendo fosfolipídio compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção tendo uma atividade de fosfolipase, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo um fosfolipídio; e, (c) pôr em contato o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) antes, durante ou depois do refinamento de cáustico. O polipeptídeo pode ter a atividade de fosfolipase C. O polipeptídeo pode ser adicionado antes do refinamento de cáustico e a composição compreendendo o fosfolipídio pode compreender uma planta e o polipeptídeo pode ser expresso transgenicamente na planta, o polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase pode ser adicionado durante a trituração de uma semente ou outra parte da planta, ou, o polipeptídeo tendo uma atividade de fosfoli19/02/2018, pág. 50/316
34/279 pase é adicionado seguindo a trituração ou antes de refinar. O polipeptídeo pode ser adicionado durante o refinamento de cáustico em níveis variantes de ácido e cáustico pode ser adicionado dependendo dos níveis de fósforo e níveis de ácidos graxos livres. O polipeptídeo pode ser adicionado depois do refinamento de cáustico: em um misturador intenso ou misturador de retenção antes da separação; seguindo uma etapa de aquecimento, em uma centrífuga; em uma matéria-prima de sabão; em uma água de lavagem; ou, durante as etapas de desodorização ou alvejamento.
A invenção fornece métodos para purificação de um fitosterol ou um triterpeno compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção tendo uma atividade de fosfolipase, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo um fitosterol ou um triterpeno; e (c) pôr em contato o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob condições onde o polipeptídeo pode catalisar a hidrólise de um fosfolipídio na composição. O polipeptídeo pode ter a atividade de fosfolipase C. O fitosterol ou um triterpeno pode compreender um esterol de planta. Este esterol de planta pode ser derivado de um óleo vegetal. O óleo vegetal pode compreender um óleo de coco, óleo de canola, óleo de manteiga de cacau, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de linhaça, azeita de oliveira, óleo de palma, óleo de amendoim, óleo derivado de um farelo de arroz, óleo de açafroa, óleo de sésamo, óleo de soja ou um óleo de girassol. O método pode compreender o uso de solventes não polares para quantitativamente extrair fitosteróis livres e ésteres de ácido graxo de fitosterila. O fitosterol ou um triterpeno pode compreender um β-sitosterol, um campesterol, um estigmasterol, um estigmastanol, um β-sitostanol, um sitostanol, um desmosterol, um calinasterol, um poriferasterol, um clionasterol ou um brassicasterol.
A invenção fornece métodos para refinar um óleo bruto compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção tendo uma atividade de fosfolipase, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma
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35/279 composição compreendendo um óleo compreendendo um fosfolipídio; e (c) pôr em contato o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob condições onde o polipeptídeo pode catalisar a hidrólise de um fosfolipídio na composição. O polipeptídeo pode ter a atividade de fosfolipase C. O fosfolipídio pode ter uma atividade de fosfolipase em uma solução de água que é adicionada à composição. O nível de água pode estar entre cerca de 0,5 a 5%. O tempo de processo pode ser menor do que cerca de 2 horas, menor do que cerca de 60 minutos, menor do que cerca de 30 minutos, menor do que 15 minutos, ou menor do que 5 minutos. As condições de hidrólise podem compreender uma temperatura dentre cerca de 25°C - 70°C. As condições de hidrólise podem compreender uso de cáusticos. As condições de hidrólise podem compreender um pH dentre cerca do pH 3 e pH 10, entre cerca do pH 4 e pH 9, ou entre cerca do pH 5 e pH 8. As condições de hidrólise podem compreender a adição de emulsificadores e/ou misturar depois do contato da etapa (c). Os métodos podem compreender a adição de um desmembrador de emulsão e/ou aquecimento para promover a separação de uma fase aquosa. Os métodos podem compreender desengomar antes da etapa de contato para coletar lecitina por centrifugação e em seguida adicionar uma PLC, uma PLC e/ou uma PI_A para remover fosfolipídios não hidratáveis. Os métodos podem compreender a desengomação de água de óleo bruto para menos do que 10 ppm para óleos comestíveis e o refinamento físico subsequente para menos do que cerca de 50 ppm para óleos de biodiesel. Os métodos podem compreender a adição de ácido para promover a hidratação de fosfolipídios não hidratáveis.
Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são mencionados nos desenhos acompanhantes e na descrição abaixo. Outros aspectos, objetivos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e desenhos, e a partir das reivindicações.
Todas as publicações, patentes, pedidos de patente, sequências GenBank e depósitos ATCC, citados aqui são por meio destes expressamente incorporados por referência para todos os propósitos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
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Os seguintes desenhos são ilustrativos das modalidades da invenção e não são referidos para limitar o escopo da invenção como abrangidos pelas reivindicações.
Figura 1 é um diagrama de bloco de um sistema de computador, como descrito em detalhe, abaixo.
Figura 2 é um diagrama de fluxo ilustrando um aspecto de um processo 200 para comparar uma nova seqüência de proteína ou nucleotídeo com uma base de dados de seqüências a fim de determinar os níveis de homologia entre a nova seqüência e a seqüência na base de dados, como descrito em detalhe, abaixo.
Figura 3 é um diagrama de fluxo ilustrando uma modalidade de um processo em um computador para determinar se duas seqüências são homólogas, como descrito em detalhe, abaixo.
Figura 4 é um diagrama de fluxo ilustrando um aspecto de um processo identificador para detectar a presença de um aspecto em uma seqüência, como descrito em detalhe, abaixo.
Figuras 5A, 5B e 5C esquematicamente ilustram um sistema de duas fases modelo para simulação de desengomação mediada por PLC, como descrito em detalhe no Exemplo 2, abaixo.
Figura 6 esquematicamente ilustra um processo de refinamento de óleo vegetal exemplar usando as fosfolipases da invenção.
Figura 7 esquematicamente ilustra um processo de desengomação exemplar da invenção para óleos fisicamente refinados, como discutido em detalhe, abaixo.
Figura 8 esquematicamente ilustra hidrólise de fosfatídeo com uma fosfolipase C da invenção, como discutido em detalhe, abaixo.
Figura 9 esquematicamente ilustra a aplicação de uma fosfolipase C da invenção como um Caustic Refining Aid (Long Mix Caustic Refining), como discutido em detalhe, abaixo.
Figura 10 esquematicamente ilustra a aplicação de uma fosfolipase C da invenção como um ajudante de desengomação, como discutido em detalhe, abaixo.
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Símbolos de referência semelhantes nos vários desenhos indicam elementos semelhantes.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece fosfolipases (por exemplo, fosfolipase A, B, C, D, enzimas de patatina), polinucleotídeos codificando-as e métodos para preparar e usá-las. A invenção fornece enzimas que eficientemente clivam ligação de éster de glicerolfosfato em óleos, tais como óleos vegetais, por exemplo, fosfolipídios de semente oelaginosa, para gerar uma base fosforilada extraível de água e um diglicerídeo. Em um aspecto, as fosfolipases da invenção têm uma atividade de hidrolase de acila de lipídio (LAH). Em aspectos alternativos, as fosfolipases da invenção podem clivar as ligações de éster de glicerolfosfato em fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina e esfindomielina.
Uma fosfolipase da invenção (por exemplo, fosfolipase A, B, C, D, enzimas de patatina) pode ser usada para desengomação enzimática de óleos vegetais porque a porção de fosfato é solúvel em água e fácil de remover. O produto de diglicerídeo permanecerá no óleo e portanto reduzirá as perdas. As PLCs da invenção podem ser usadas além de ou no lugar de PLA1s e PLA2s na desengomação de óleo comercial, tal como no processo ENZYMAX®, onde os fosfolipídios são hidrolizados por PLA1 e PLA2.
Em um aspecto, as fosfolipases da invenção são ativas em baixa temperatura e/ou em alta, ou, sobre uma ampla faixa de temperatura, por exemplo, elas podem ser ativas nas temperaturas variando entre 20°C a 90°C, entre 30°C a 80°C, ou entre 40°C a 70°C. A invenção também fornece fosfolipases da invenção, tem atividade em pHs alcalinos ou em pHs acídicos, por exemplo, baixa acidez da água. Em aspectos alternativos, as fosfolipases da invenção podem ter atividade em pHs acídicos tão baixos quanto pH 6,5, pH 6,0, pH 5,5, pH 5,0, pH 4,5, pH 4,0 e pH 3,5. Em aspectos alternativos, as fosfolipases da invenção podem ter atividade em pHs alcalinos tão altos quanto pH 7,5, pH 8,0, pH 8,5, pH 9,0, e pH 9,5. Em um aspecto, as fosfolipases da invenção são ativas na faixa de temperatura dentre cerca de 40°C a cerca de 70°C sob condições de baixa atividade de água (baixo
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38/279 teor de água).
A invenção também fornece métodos para também modificar as fosfolipases exemplares da invenção para gerar enzimas com propriedades desejáveis. Por exemplo, as fosfolipases geradas pelos métodos da invenção podem ter especificidades de substrato alteradas, especificidades de ligação de substrato, padrões de divagem de substrato, estabilidade térmica, pH/perfil de atividade, pH/perfil de estabilidade (tal como estabilidade aumentada em baixa, por exemplo, pH<6 ou pH<5, ou alta, por exemplo pH>9, valores de pH), estabilidade em direção à oxidação, dependência de Ca2+, atividade específica e similares. A invenção fornece para alterar qualquer propriedade de interesse. Por exemplo, a alteração pode resultar em uma variante que, quando comparada a uma fosfolipase de origem, tem pH alterado e perfil de atividade de temperatura.
Em um aspecto, as fosfolipases da invenção são usadas em várias etapas de processamento de óleo vegetal, tal como em extração de óleo vegetal, particularmente, na remoção de gomas de fosfolipídio em um processo chamado desengomação de óleo, como descrito aqui. A produção de óleos vegetais de várias fontes, tal como sojas, semente de colza, amendoim, sésamo, girassol e milho. As enzimas de fosfolipase da invenção podem ser usadas em vez de PLA, por exemplo, fosfolipase A2, em qualquer etapa de processamento de óleo vegetal.
Definições
O termo fosfolipase abrange enzimas tendo qualquer atividade de fosfolipase, por exemplo, clivando uma ligação de éster de glicerolfosfato (catalisando a hidrólise de uma ligação de éster de glicerolfosfato), por exemplo, em um óleo, tal como um óleo vegetal. A atividade de fosfolipase da invenção pode gerar uma base fosforilada extraível de água e um diglicerídeo. A atividade de fosfolipase da invenção também inclui hidrólise de ligações de éster de glicerolfosfato em altas temperaturas, baixas temperaturas, pHs alcalinos e em pHs acídicos. O termo atividade de fosfolipase também inclui clivar um éster de glicerolfosfato para gerar uma base fosforilada extraível de água e um diglicerídeo. O termo uma atividade de fosfolipase
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39/279 também inclui cortar ligações de éster de glicerina e ácido fosfórico em fosfolipídios. O termo atividade de fosfolipase também inclui outras atividades, tal como a capacidade de ligar a um substrato, tal como um óleo, por exemplo, um óleo vegetal, substrato também incluindo fosfatidilcolinas de animal e planta, fosfatidil-etanolaminas, fosfatidilsserinas e esfingomielinas. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de fosfolipase C (PLC), uma atividade de fosfolipase A (PLA), tal como uma atividade de fosfolipase A1 ou fosfolipase A2, uma atividade de fosfolipase B (PLB), tal como atividade de fosfolipase B1 ou fosfolipase B2, uma atividade de fosfolipase D (PLD), tal como uma atividade de fosfolipase D1 ou uma fosfolipase D2. A atividade de fosfolipase pode compreender hidrólise de uma glicoproteína, por exemplo, como uma glicoproteína encontrada em um tubérculo de batata ou qualquer planta do gênero Solanum, por exemplo, Solanum tuberosum. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade enzimática de patatina, tal como atividade de esterase patatina (observe, por exemplo, Jimenez (2002) Biotechnol. Prog. 18:635-640). A atividade de fosfolipase pode compreender uma hidrolase de acila de lipídio (LAH).
O termo anticorpo inclui um peptídeo ou polipeptídeo derivado de, modelado depois ou substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina ou genes de imunoglobulina, ou fragmentos destes, capazes de especificamente ligar um antígeno ou epitopo, observe, por exemplo, Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267 - 273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97. O termo anticorpo inclui porções de ligação de antígeno, isto é, sítios de ligação de antígeno, (por exemplo, fragmentos, subseqüências, regiões de determinação complementar (CDRs)) que mantém a capacidade de ligar antígeno, incluindo (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo em domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd consistindo em domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo em domínios VL e VH de uma subdivisão simples de
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40/279 um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward e outros, (1989) Nature 341: 544 - 546), que consiste de um domínio VH; e (vi) uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR). Anticorpos de cadeia simples são também incluídos por referência no termo anticorpo.
Os termos arranjo ou microarranjo ou biocircuito ou circuito como usados aqui é uma pluralidade de elementos alvo, cada elemento alvo compreendendo uma quantidade definida de um ou mais polipeptídeos (incluindo anticorpos) ou ácidos nucléicos imobilizados sobre uma área definida de uma superfície de substrato, como discutido com mais detalhes, abaixo.
Como usado aqui, os termos computador, programa de computador e processador são usados aqui em seus contextos gerais mais amplos e incorporam todos os tais dispositivos, como descrito em detalhe, abaixo.
Uma seqüência de codificação de ou uma seqüência codifica uma proteína ou polipeptídeo particular, é uma seqüência de ácido nucléico que é transcrita e transladada em uma proteína ou polipeptídeo quando colocada sob o controle de seqüências reguladoras apropriadas.
O termo cassete de expressão como usado aqui se refere a uma seqüência de nucleotídeo que é capaz de afetar a expressão de um gene estrutural (isto é, uma seqüência de codificação de proteína, tal como uma fosfolipase da invenção) em um hospedeiro compatível com tais seqüências. Cassetes de expressão incluem pelo menos um promotor operavelmente ligado com a seqüência de codificação de polipeptídeo; e, opcionalmente, com outras seqüências, por exemplo, sinais de terminação de transcrição. Fatores adicionais necessários ou úteis na execução da expressão podem também ser usados, por exemplo, realçadores. Operavelmente ligado como usado aqui se refere à ligação de um promotor a jusante de uma seqüência de DNA tal que o promotor media a transcrição da seqüência de DNA. Desse modo, os cassetes de expressão também incluem plasmídeos, vetores de expressão, viroses recombinates, qualquer forma de um vetor de DNA nu recombinante, e similares. Um vetor compreende um
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41/279 ácido nucléico que pode afetar, transfectar, transitoriamente ou permanentemente transduzir uma célula. Será reconhecido que um vetor pode ser um ácido nucléico nu, ou um ácido nucléico complexado com proteína ou lipídio. O vetor opcionalmente compreende ácidos nucléicos bacterianos ou virais e/ou proteínas, e/ou membranas (por exemplo, uma membrana de célula, um envelope de lipídio viral, etc.). Vetores incluem, porém não estão limitados aos replicons (por exemplo, replicons de RNA, bacteriófagos) aos quais os fragmentos de DNA podem estar ligados e tornam-se replicados. Vetores desse modo incluem, porém não estão limitados ao RNA, DNA ou RNA linear ou circular de auto-replicação autônomo (por exemplo, plasmídeos, viroses, e similares, observe, por exemplo, Patente U.S. No. 5.217.879), e incluem igualmente a expressão e plasmídeos de não expressão. Onde um microorganismo recombinante ou cultura de célula é descrito como hospedeiro de um vetor de expressão, isto inclui igualmente DNA linear e circular extracromossômico e DNA que foi incorporado no(s) cromossoma(s). Onde um vetor é mantido por uma célula hospedeira, o vetor pode ser estavelmente replicado pelas células durante a mitose como uma estrutura autônoma, ou ser incorporado dentro do genoma do hospedeiro.
Plasmídeos são designados por um caso inferior p precedido e/ou seguido por números e/ou letras maiúsculas. Os plasmídeos de partida aqui estão comercialmente disponíveis, publicamente disponíveis em uma base não restrita, ou podem ser construídos de plasmídeos disponíveis de acordo com os procedimentos publicados. Além disso, plasmídeos equivalentes àqueles descritos aqui são conhecidos na técnica e serão evidentes ao técnico ordinariamente versado.
O termo gene significa o segmento de DNA envolvido na produção de uma cadeia de polipeptídeo, incluindo, inter alia, regiões precedendo e seguindo a região de codificação, tal como líder e trailer, promotores e realçadores, bem como, onde aplicáveis, seqüências de intervenção (íntrons) entre segmentos de codificação individuais (éxons).
As frases ácido nucléico ou seqüência de ácido nucléico como usadas aqui se referem a um oligonucleotídeo, nuceotídeo, polinucleotí19/02/2018, pág. 58/316
42/279 deo, ou a um fragmento de quaisquer destes, ao DNA ou RNA (por exemplo, mRNA, rRNA, tRNA, iRNA) de origem sintética ou genômica que podem ser de filamento único ou filamento duplo e podem representar um filamento anti-sentido ou sentido, em ácido nucléico de peptídeo (PNA), ou em qualquer material como RNA ou como DNA, natural ou sintético na origem, incluindo, iRNA, ribonucleoproteínas (por exemplo, iRNAs de filamento duplo, por exemplo, iRNPs). O termo abrange ácidos nucléicos, isto é, oligonucleotídeos, contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais. O termo também abrange estruturas como ácido nucléico com cadeias principais sintéticas, observe, por exemplo, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: 189 - 197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692 - 8698; Samstag (1996) Antisense NucleicAcid Drug Dev6: 153-156.
Aminoácido ou seqüência de aminoácido como usado aqui se refere a um oligopeptídeo, peptídeo, polipeptídeo, ou seqüência de proteína, ou a um fragmento, porção, ou subunidade de quaisquer destes, e às moléculas sintéticas ou de ocorrência natural.
Os termos polipeptídeo e proteína como usados aqui, se referem aos aminoácidos unidos um ao outro por ligações de peptídeo ou ligações de peptídeo modificadas, isto é, isoésteres de peptídeo, e podem conter aminoácidos modificados exceto os 20 aminoácidos codificados por gene. O termo polipeptídeo também inclui fragmentos de polipeptídeo e peptídeos, motivos e similares. O termo também inclui peptídeos glicosilados. Os peptídeos e polipeptídeos da invenção também incluem todas as formas miméticas e peptidomiméticas, como descritas em maiores detalhes, abaixo.
Como usado aqui, o termo isolado significa que o material é removido de seu ambiente original (por exemplo, ambiente natural se ele for de ocorrência natural). Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo de ocorrência natural presente em um animal vivo não é isolado, porém o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo, separado de alguns ou todos os materiais co-existentes no sistema natural, é isolado. Tais polinucleotídeos podem ser parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeo ou polipeptídeos po19/02/2018, pág. 59/316
43/279 dem ser parte de uma composição, e ainda serem isolados em que tal vetor ou composição não é parte de seu ambiente natural. Como usado aqui, uma composição ou material isolado pode também ser uma composição purificada, isto é, não requer pureza absoluta; de preferência, é destinada como uma definição relativa. Ácidos nucléicos individuais obtidos a partir de uma biblioteca podem ser convencionalmente purificados em homogeneidade eletroforética. Em aspectos alternativos, a invenção fornece ácidos nucléicos que foram purificados a partir de DNA genômico ou de outras seqüências em uma biblioteca ou outro ambiente por pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, ou mais ordens de magnitude.
Como usado aqui, o termo recombinante significa que o ácido nucléico é adjacente a um ácido nucléico de cadeia principal ao qual não é adjacente em seu ambiente natural. Em um aspecto, ácidos nucléicos representam 5% ou mais do número de inserções de ácido nucléico em uma população de moléculas de cadeia principal de ácido nucléico. Moléculas de cadeia principal de acordo com a invenção incluem ácidos nucléicos tais como vetores de expressão, ácidos nucléicos de auto-replicação, viroses, ácidos nucléicos de integração, e outros vetores ou ácidos nucléicos usados para manter ou manipular uma inserção de ácido nucléico de interesse. Em um aspecto, os ácidos nucléicos enriquecidos representam 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do número de inserções de ácido nucléico na população de moléculas de cadeia principal recombinantes. Polipeptídeos ou proteínas recombinantes se referem aos polipeptídeos ou proteínas produzidos por técnicas de DNA recombinante; por exemplo, produzidos de células transformadas por um constructo de DNA exógeno codificando o polipeptídeo ou proteína desejada. Polipeptídeos ou proteína sintéticos são aqueles preparados por síntese química, como descrito em mais detalhes, abaixo.
Uma seqüência promotora é operavelmente ligada a uma seqüência de codificação quando RNA polimerase que inicia a transcrição no promotor transcreverá a seqüência de codificação em mRNA, como discutido também, abaixo.
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Oligonucleotídeo se refere a um polidesoxinucleotídeo de filamento único ou dois filamentos de polidesoxinucleotídeo complementar que podem ser quimicamente sintetizados. Tais oligonucleotídeos sintéticos não tem 5' fosfato e desse modo não ligará a outro oligonucleotídeo sem adicionar um fosfato com um ATP na presença de uma cinase. Um oligonucleotídeo sintético ligará a um fragmento que não foi desfosforilado.
A frase substancialmente idêntico no contexto de dois ácidos nucléicos ou polipeptídeos, se refere a duas ou mais seqüências que têm pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or 99% de identidade de resíduo (seqüência) de aminoácido, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, quando avaliadas usando um qualquer algoritmo de comparação de seqüência, como discutido em detalhe abaixo, ou por inspeção visual. Em aspectos alternativos, a invenção fornece seqüências de polipeptídeo e ácido nucléico tendo identidade substancial em uma seqüência exemplar da invenção, por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, etc., sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, 150 resíduos, 200 resíduos, 300 resíduos, 400 resíduos, ou uma região variando dentre cerca de 50 resíduos ao tamanho natural do ácido nucléico ou polipeptídeo. Seqüências de ácido nucléico da invenção podem ser substancialmente idênticas sobre o comprimento completo de uma região de codificação de polipeptídeo.
Adicionalmente, uma seqüência de aminoácido substancialmente idêntica é uma seqüência que se difere de uma seqüência de referência por uma ou mais inserções, deleções ou substituições de aminoácido não conservadoras ou conservadoras, particularmente quando uma tal substituição ocorre em um sítio que não seja o sítio ativo da molécula, e contanto que o polipeptídeo essencialmente mantenha suas propriedades funcionais. Uma substituição de aminoácido conservadora, por exemplo, substitui um aminoácido para outro da mesma classe (por exemplo, substituição de um aminoácido hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina, ou metionina, para outro, ou substituição de um aminoácido polar para outro, tal como
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45/279 substituição de arginina para lisina, ácido glutâmico para ácido aspártico ou glutamina para asparagina). Um ou mais aminoácidos podem ser deletados, por exemplo, de um polipeptídeo de fosfolipase, resultando na modificação da estrutura do polipeptídeo, sem significantemente alterar sua atividade biológica. Por exemplo, aminoácidos de terminal de carboxila ou de amino que não são requeridos para atividade biológica de fosfolipase podem ser removidos. Seqüências de polipeptídeo modificadas da invenção podem ser ensaiadas quanto à atividade biológica de fosfolipase por qualquer número de métodos, incluindo contatar a seqüência de polipeptídeo modificada com um substrato de fosfolipase e determinando se o polipeptídeo modificado diminui a quantidade de substrato específico no ensaio ou aumenta os bioprodutos da reação enzimática de uma fosfolipase funcional com o substrato, como discutido também, abaixo.
Hibridização se refere ao processo pelo qual um filamento de ácido nucléico junta-se com um filamento complementar através do empareIhamento de base. As reações de hibridização podem ser sensíveis e seletivas de modo que uma seqüência particular de interesse possa ser identificada ainda em amostras em que ela está presente em baixas concentrações. Condições adequadamente severas podem ser definidas pelas, por exemplo, concentrações de sal ou formamida nas soluções de préhibridização e hibridização, ou pela temperatura de hibridização, e são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, a severidade pode ser aumentada reduzindo-se a concentração de sal, aumentando a concentração de formamida, ou elevando a temperatura de hibridização, alterando o tempo de hibridização, como descrito em detalhe, abaixo. Em aspectos alternativos, os ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua capacidade de hibridizar sob várias condições de severidade (por exemplo, alta, média, e baixa), como mencionadas aqui.
O termo variante se refere aos polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção modificados em um ou mais pares de base, códons, íntrons, éxons, ou resíduos de aminoácido (respectivamente) todavia ainda mantém a atividade biológica de uma fosfolipase da invenção. Variantes
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46/279 podem ser produzidas por qualquer número de meios incluindo métodos tais como, por exemplo, PCR propensa ao erro, embaralhamento, mutagénese direcionada ao oligonucleotídeo, PCR de agrupamento, mutagénese de PCR sexual, mutagénese em vivo, mutagénese de cassete, mutagénese de conjunto recorrente, mutagénese de conjunto exponencial, mutagénese específica de sítio, reagrupamento de gene, GSSM e quaisquer combinações destes. As técnicas para produzir fosfolipases variantes tendo atividade em um pH ou temperatura, por exemplo, que seja diferente de uma fosfolipase tipo silvestre, estão incluídas aqui.
O termo mutagénese de saturação ou GSSM inclui um método que usa degenerar os iniciadores de oligonucleotídeo para introduzir mutações pontuais em um polinucleotídeo, como descrito em detalhe, abaixo.
O termo sistema de evolução direcionado otimizado ou evolução direcionada otimizada inclui um método para re-montar fragmentos de seqüências de ácido nucléico relacionadas, por exemplo, genes relacionados, e esclarecido em detalhe, abaixo.
O termo reagrupamento de ligação sintética ou SLR inclui um método de ligar fragmentos de oligonucleotídeo em um aspecto não estocástico, e esclarecido em detalhe, abaixo.
Geração e Manipulação de Ácidos Nucléicos
A invenção fornece ácidos nucléicos (por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NQ:101, SEQ ID NQ:103,
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SEQ ID NO: 105 exemplares), incluindo cassetes de expressão tais como vetores de expressão, codificando os polipeptídeos e fosfolipases da invenção. A invenção também inclui métodos para descobrir novas seqüências de fosfolipases usando os ácidos nucléicos da invenção. Também fornecidos são métodos para modificar os ácidos nucléicos da invenção por, por exemplo, reagrupamento de ligação sintética, sistema de evolução direcionada otimizada e/ou mutagênese de saturação.
Os ácidos nucléicos da invenção podem ser feitos, isolados e/ou manipulados por, por exemplo, clonagem e expressão de bibliotecas de cDNA, amplificação de mensagem ou DNA genômico por PCR, e similares. Na prática dos métodos da invenção, genes homólogos podem ser modificados manipulando-se um ácido nucléico padrão, como descrito aqui. A invenção pode ser praticada junto com qualquer método ou protocolo ou dispositivo conhecido na técnica, que são bem descritos na biblioteca da patente e científica.
Técnicas Gerais
Os ácidos nucléicos usados para praticar esta invenção, se RNA, iRNA, ácido nucléico anti-sentido, cDNA, DNA genômico, vetores, viroses ou híbridos destes, podem ser isolados a partir de uma variedade de fontes, geneticamente construídas, amplificadas, e/ou expressas/geradas recombinantemente. Polipeptídeos recombinantes gerados destes ácidos nucléicos podem ser individualmente isolados ou clonados e testados quanto a uma atividade desejada. Qualquer sistema de expressão recombinante pode ser usado, incluindo sistemas de expressão de célula de planta, inseto, levedura, mamífero ou bacterianos.
Alternativamente, estes ácidos nucléicos podem ser sintetizados in vitro por técnicas de síntese química bem conhecidas, como descritas em, por exemplo, Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radie. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; U.S. Patent No. 4.458.066.
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Técnicas para a manipulação de ácidos nucléicos, tal como, subclonagem, sondas de rotulagem (por exemplo, rotulagem de iniciador aleatório usando polimerase de Klenow, translação de entalhe, amplificação), sequenciamento, hibridização e similares são bem descritas na literatura da patente e científica, observe, por exemplo, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2A ED.), Volumes 1 - 3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).
Outro meio útil de obter e manipular ácidos nucléicos usados para praticar os métodos da invenção é clonar de amostras genômicas, e, se desejado, avaliar e reclonar inserções isoladas ou amplificadas de, por exemplo, clones genômicos ou clones de cDNA. As fontes de ácido nucléico usadas nos métodos da invenção incluem bibliotecas de cDNA ou genômicas contidas em, por exemplo, cromossomas artificiais de mamíferos (MACs), observe, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.721.118; 6.025.155; cromossomas artificiais humanos, observe, por exemplo, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15: 333 - 335; cromossomas artificiais de levedura (YAC); cromossomas artificiais bacterianas (BAC); cromossomas artificiais de P1, observe, por exemplo, Woon (1998) Genomics 50:306 - 316; Vetores derivados de P1 (PACs), observe, por exemplo, e.g., Kern (1997) Biotechniques 23:120 -124; cosmídeos, vírus recombinantes, fagos ou plasmídeos.
Em um aspecto, um ácido nucléico codificando um polipeptídeo da invenção é montado em fase apropriada com uma seqüência líder capaz de direcionar a segregação do polipeptídeo transladado ou fragmento deste.
A invenção fornece proteínas de fusão e ácidos nucléicos codificando-as. Um polipeptídeo da invenção pode ser fundido em um polipeptídeo ou peptídeo heterólogo, tal como peptídeos de identificação de terminal N que concede características desejadas, tais como estabilidade aumentada ou purificação simplificada. Os peptídeos e polipeptídeos da invenção po19/02/2018, pág. 65/316
49/279 dem também ser sintetizados e expressos como proteínas de fusão com um ou mais domínios adicionais ligados também para, por exemplo, produzir um peptídeo mais imunogênico, ou mais facilmente isolar um peptídeo recombinantemente sintetizado, para identificar e isolar anticorpos e células B expressando anticorpo, e similares. A detecção e purificação facilitando domínios incluem, por exemplo, peptídeos de quelação de metal tal como tratos de poliistidina e moléculas de triptofano de histidina que permitem purificação em metais imobilizados, domínios de proteína A que permitem a purificação em imunoglobulina imobilizada, e o domínio utilizado no sistema de purificação de extensão/afinidade de FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA). A inclusão de uma seqüência ligadora clivável tal como Fator Xa e enterocinase (Invitrogen, San Diego CA) entre um domínio de purificação e o polipeptídeo ou peptídeo compreendendo motivo para facilitar a purificação. Por exemplo, um vetor de expressão pode incluir uma seqüência de ácido nucléico codificando o epítopo ligada a seis resíduos de histidina seguido por uma tiorredoxina e um sítio de divagem de enterocinase (observe, por exemplo, Williams (1995) Biochemistry 34:1787 - 1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404- 414). Os resíduos de histidina facilitam a detecção e purificação enquanto o sítio de divagem de enterocinase fornece um meio para purificar o epítopo do restante da proteína de fusão. A tecnologia pertencente aos vetores codificando proteínas de fusão e aplicação de proteínas de fusão é bem descrita na bibliografia da patente e científica, observe por exemplo, Kroll (1993) DNACell. Biol., 12:441-53.
Seqüências de controle translacional e transcricional
A invenção fornece seqüências de ácido nucléico (por exemplo,
DNA) da invenção operavelmente ligadas à(s) seqüência(s) de controle de expressão (por exemplo, transcricional ou translacional), por exemplo, promotores ou realçadores, para conduzir ou modular síntese/expressão de RNA. A seqüência de controle de expressão pode estar em um vetor de expressão. Promotores bacterianos exemplares incluem lacl, lacZ, T3, T7, gpt, PR de lambda, PL e trp. Promotores bacterianos exemplares incluem o precoce imediato CMV, HSV timidina cinase, SV40 tardio e precoce, LTRs de
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50/279 retrovírus, e metalotioneína de camundongo I.
Promotores adequados para expressar um polipeptídeo em bactérias incluem os promotores lac ou trp de E. coli, o promotor lacl, o promotor lacZ, o promotor T3, o promotor T7, o promotor gpt, o promotor PR de lambda, o promotor PL de lambda, promotores de óperons codificando enzimas glicolíticas tais como 3-fosfoglicerato cinase (PGK), e o promotor de ácido fosfatase. Promotores eucarióticos incluem o promotor precoce imediato CMV, o promotor de cinase de timidina HSV, promotores de choque térmico, o promotor SV40 tardio e precoce, LTRs de retrovírus, e o promotor de metalotioneína-1 de camundongo. Outros promotores conhecidos para controlar expressão de genes em células eucarióticas ou procarióticas ou suas viroses podem também ser usados.
Vetores de expressão e veículos de clonagem
A invenção fornece vetores de expressão e veículos de clonagem compreendendo ácidos nucléicos da invenção, por exemplo, seqüências codificando as fosfolipases da invenção. Vetores de expressão e veículos de clonagem da invenção podem compreender partículas virais, baculovírus, fago, plasmídeos, fagomídios, cosmídios, fosmídios, cromossomas artificiais bacterianos, DNA viral (por exemplo, vacínia, adenovírus, vírus da varíola nocivo, psedo-raiva e derivados de SV40), cromossomas artificiais baseados em P1, plasmídeos de levedura, cromossomas artificiais de levedura e quaisquer outros vetores artificiais para hospedeiros específicos de interesse (tais como bacilos, Aspergillus e levedura). Vetores da invenção podem incluir seqüências de DNA cromossômicas, não cromossômicas e sintéticas. Números grandes de vetores adequados são conhecidos por aqueles de versados na técnica, e estão comercialmente disponíveis. Vetores exemplares incluem: bacterianos: vetores QE (Qiagen), plasmídeos pBluescript, vetores pNH, (vetores lambda-ΖΑΡ (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eucarióticos: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Entretanto, qualquer outro plasmídeo ou outro vetor pode ser usado contanto que eles sejam replicáveis e viáveis no hospedeiro. Vetores com número de cópia baixo
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51/279 e número de cópia podem ser empregados com a presente invenção.
O vetor de expressão pode compreender um promotor, sítio de ligação de ribossoma para iniciação de translação e um terminador de transcrição. O vetor pode também incluir seqüências apropriadas para amplificar a expressão. Vetores de expressão de mamífero podem compreender uma origem de replicação, quaisquer sítios de ligação de ribossoma necessários, um sítio de poliadenilação, doador de união e sítios aceptores, seqüências de terminação transcricional, e seqüências não transcritas de flanqueamento 5'. Em alguns aspectos, as seqüências de DNA derivadas da união de SV40 e sítios de poliadenilação podem ser usadas para fornecer os elementos genéticos não transcritos requeridos.
Em um aspecto, os vetores de expressão contêm um ou mais genes marcadores selecionáveis para permitir a seleção de células hospedeiras contendo o vetor. Tais marcadores selecionáveis incluem genes codificando diidrofolato reductase ou genes conferindo resistência à neomicina para cultura de célula eucariótica, genes conferindo resistência à ampicilina ou tetraciclina em E. coli, e o gene TRP1 de S. cerevisiae. As regiões de promotor podem ser selecionadas de qualquer gene desejado usando vetores de cloranfenicol transferase (CAT) ou outros vetores com marcadores selecionáveis.
Vetores para expressar o polipeptídeo ou fragmento deste em células eucarióticas podem também conter realçadores para aumentar níveis de expressão. Realçadores são elementos de atuação cis de DNA, usualmente de cerca de 10 a cerca de 300 bp no comprimento que agem sobre um promotor para aumentar sua transcrição. Exemplos incluem o realçador SV40 sobre o lado atrasado da origem de replicação bp 100 a 270, o realçador de promotor precoce de citomegalovírus, o realçador de polioma sobre o lado atrasado da origem de replicação, e os realçadores de adenovírus.
Uma seqüência de DNA pode ser inserida em um vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, a seqüência de DNA está ligada à posição desejada no vetor seguindo a digestão da inserção e do vetor com
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52/279 endonucleases de restrição apropriadas. Alternativamente, extremidades sem corte igualmente na inserção e no vetor podem estar ligadas. Uma variedade de técnicas de clonagem é conhecida na técnica, por exemplo, como descrito por Ausubel e Sambrook. Tais procedimentos e outros são supostos estarem dentro do escopo daqueles versados na técnica.
O vetor pode ser na forma de um plasmídeo, uma partícula viral, ou um fago. Outros vetores incluem seqüências de DNA cromossômicas, não cromossômicas e sintéticas, derivados de SV40; plasmídeos bacterianos, DNA de fago, baculovírus, plasmídeos de levedura, vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago, DNA viral tal como vacínia, adenovírus, vírus da varíola da ave e pseudo-raiva. Uma variedade de vetores de expressão e clonagem para uso com hospedeiros eucarióticos e procarióticos é descrita por, por exemplo, Sambrook.
Vetores bacterianos particulares que podem ser usados para incluir os plasmídeos comercialmente disponíveis compreendendo elementos genéticos do vetor de clonagem bem conhecido pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wl, USA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 e pCM7. Vetores eucarióticos particulares incluem pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, e pSVL (Pharmacia). Entretanto, qualquer outro vetor pode ser usado contanto que ele seja replicável e viável na célula hospedeira.
Células Hospedeiras e células transformadas
A invenção também fornece uma célula transformada compreendendo uma seqüência de ácido nucléico da invenção, por exemplo, uma seqüência codificando uma fosfolipase da invenção, um vetor da invenção. A célula hospedeira pode ser quaisquer das células hospedeiras familiares por aqueles versados na técnica, incluindo células procarióticas, células eucarióticas, tal como células bacterianas, células fúngicas, células de levedura, células de mamífero, células de inseto, ou células de planta. Células bac19/02/2018, pág. 69/316
53/279 terianas exemplares incluem E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e várias espécies dentro do gênero Pseudomonas, Streptomyces, e Staphylococcus. Células de inseto exemplares incluem Drosophila S2 e Spodoptera Sf9. Células de animais exemplares incluem CHO, COS ou melanoma de Bowes ou qualquer linhagem de célula humana e de camundongo. A seleção de um hospedeiro apropriado está dentro das aptidões daqueles versados na técnica.
O vetor pode ser introduzido nas células hospedeiras usando qualquer de uma variedade de técnicas, incluindo transformação, transfecção, transdução, infecção viral, armas de gene, ou transferência de gene mediada por Ti. Métodos particulares incluem transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-Dextrana, lipofecção, ou eletroporação (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Onde apropriado, as células hospedeiras construídas podem ser cultivadas em veículos de nutriente convencionais modificados quando apropriados para ativar promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes da invenção. Seguindo a transformação de uma cepa hospedeira adequada e crescimento da cepa hospedeira em uma densidade de célula apropriada, o promotor selecionado pode ser induzido por meios apropriados (por exemplo, mudança de temperatura ou indução química) e as células podem ser cultivadas durante um período adicional para permiti-las produzir o polipeptídeo desejado ou fragmento deste.
As células podem ser colhidas por centrifugação, rompidas por meios químicos ou físicos, e o extrato bruto resultante é mantido para outra purificação. As células microbianas empregadas para expressão de proteínas podem ser rompidas por qualquer método conveniente, incluindo ciclagem de congelamento - descongelamento, sonicação, rompimento mecânico, ou uso de agentes de lise de célula. Tais métodos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. O polipeptídeo expresso ou fragmento deste pode ser recuperado e purificado de culturas de célula recombinante por métodos incluindo sulfato de amônio ou precipitação de etanol, extração
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54/279 de ácido, cromatografia de permuta de cátion ou ânion, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. As etapas de redobragem de proteína podem ser usadas, quando necessário, na conclusão da configuração do polipeptídeo. Se desejado, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) pode ser empregada para etapas de purificação final.
Vários sistemas de cultura de célula de mamífero podem também ser empregados para expressar proteína recombinante. Exemplos de sistemas de expressão de mamífero incluem as linhagens COS-7 de fibroblastos de rim de macaco e outras linhagens de células capazes de expressar proteínas de um vetor compatível, tal como as linhagens de célula C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK.
Os constructos em células hospedeiras podem ser usadas de uma maneira convencional para produzir o produto de gene codificado pela seqüência recombinante. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, os polipeptídeos produzidos por células hospedeiras contendo o vetor podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Os polipeptídeos da invenção podem ou não podem também incluir um resíduo de aminoácido de metionina inicial.
Sistemas de translação livres de célula podem também ser empregados para produzir um polipeptídeo da invenção. Os sistemas de translação livres de célula podem usar mRNAs transcritos de um constructo de DNA compreendendo um promotor operavelmente ligado a um ácido nucléico codificando o polipeptídeo ou fragmento deste. Em alguns aspectos, o constructo de DNA pode ser linearizado antes de conduzir uma reação de transcrição in vitro. O mRNA transcrito é em seguida incubado com um extrato de translação livre de célula apropriado, tal como um extrato de reticulócito de coelho, para produzir o polipeptídeo desejado ou fragmento deste.
Os vetores de expressão podem conter um ou mais genes marcadores selecionáveis para fornecer uma característica fenotípica para sele19/02/2018, pág. 71/316
55/279 ção de células hospedeiras transformadas tais como diidrofolato reductase ou resistência à neomicina para cultura de célula eucariótica, ou tal como resistência à ampicilina ou tetraciclina em E. coli.
Amplificação de Ácidos Nucléicos
Na prática da invenção, ácidos nucléicos codificando os polipeptídeos da invenção, ou ácidos nucléicos modificados, podem ser reproduzidos por, por exemplo, amplificação. A invenção fornece pares de sequência de iniciador de amplificação para amplificar ácidos nucléicos codificando polipeptídeos com uma atividade de fosfolipase. Em um aspecto, os pares de iniciador são capazes de amplificar sequências de ácido nucléico da invenção, por exemplo, incluindo SEQ ID NO: 1 exemplar, ou uma subseqüência desta; uma sequência como mencionada em SEQ ID NO: 3, ou uma subseqüência desta; uma sequência como mencionada em SEQ ID NO: 5, ou uma subseqüência desta; e, uma subseqüência como mencionada em SEQ ID NO:7, ou uma subseqüência desta, etc. Alguém versado na técnica pode planejar pares de seqüência de iniciador de amplificação para qualquer parte de ou o tamanho natural destas seqüências.
A invenção fornece um par de seqüência de iniciador de amplificação par amplificar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase, onde o par de iniciador é capaz de amplificar um ácido nucléico compreendendo uma seqüência da invenção, ou fragmentos ou subseqüências destes. Um ou cada membro do par de seqüência de iniciador de amplificação pode compreender um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos cerca de 10 a 50 bases consecutivas da seqüência, ou cerca de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 bases consecutivas da seqüência.
A invenção fornece pares de iniciador de amplificação, onde o par de iniciador compreende um primeiro membro tendo uma seqüência como mencionada por cerca dos primeiros (os 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 resíduos de um ácido nucléico da invenção, e um segundo membro tendo uma seqüência como mencionada por cerca dos primeiros (os 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 re19/02/2018, pág. 72/316
56/279 síduos do filamento complementar do primeiro membro. A invenção fornece fosfolipases geradas por amplificação, por exemplo, reação da cadeia da polimerase (PCR), usando um par de iniciador de amplificação da invenção. A invenção fornece métodos de preparar uma fosfolipase por amplificação, por exemplo, reação da cadeia da polimerase (PCR), usando um par de iniciador de amplificação da invenção. Em um aspecto, o par de iniciador de amplificação amplifica um ácido nucléico de uma biblioteca, por exemplo, uma biblioteca de gene, tal como uma biblioteca ambiental.
Reações de amplificação podem também ser usadas para quantificar a quantidade de ácido nucléico em uma amostra (tal como a quantidade de mensagem em uma amostra de célula), rotular o ácido nucléico (por exemplo, aplicá-lo em um arranjo ou uma mancha), detectar o ácido nucléico, ou quantificar a quantidade de um ácido nucléico específico em uma amostra. Em uma amostra da invenção, mensagem isolada de uma célula ou uma biblioteca de cDNA é amplificada. O técnico versado pode selecionar e projetar iniciadores de amplificação de oligonucleotídeo adequados. Métodos de amplificação são também bem conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, reação da cadeia da polimerase, PCR (observe, por exemplo, PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) e PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., reação da cadeia da ligase (LCR) (observe, por exemplo, Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117); amplificação de transcrição (observe, por exemplo, Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:1173); e, replicação de seqüência auto-sustentada (observe, por exemplo, Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:1874); amplificação de Q Beta replicase (observe, por exemplo, Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477 - 1491), ensaio de amplificação de Q-beta replicase automatizado (observe, por exemplo, Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257 - 271) e outras técnicas mediadas por RNA polimerase (por exemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); observe também Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307 - 316; Sambrook; Ausubel; Patente dos Estados Unidos Nos. 4.683.195 e
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4.683.202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563 - 564.
Determinação do grau da identidade de seqüência
A invenção fornece ácidos nucléicos compreendendo seqüências tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%,
57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%,
70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%,
83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) em um ácido nucléico exemplar da invenção (por exemplo, SEQ ID
NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID
NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ
ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID
NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103,
SEQ ID NO: 105, e ácidos nucléicos codificando SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32,
SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ
ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NQ:100, SEQ ID NQ:102, SEQ ID NQ:104, SEQ ID NQ:106)
Petição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 74/316
58/279 sobre uma região de pelo menos cerca de 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 ou mais, resíduos. A invenção fornece polipeptídeos compreendendo seqüências tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%,
57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%,
70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%,
83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) em um polipeptídeo exemplar da invenção. A extensão da identidade de seqüência (homologia) pode ser determinada usando qualquer programa de computador e parâmetros associados, incluindo aqueles descritos aqui, tal como BLAST 2.2.2. ou FASTA versão 3.0t78, com os parâmetros básicos.
Em modalidades alternativas, a identidade de seqüência pode estar sobre uma região de pelo menos cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 resíduos consecutivos, ou o tamanho natural do ácido nucléico ou polipeptídeo. A extensão da identidade de seqüência (homologia) pode ser determinada usando qualquer programa de computador e parâmetros associados, incluindo aqueles descritos aqui, tais como BLAST 2.2.2. ou FASTA versão 3.0t78, com os parâmetros básicos.
As seqüências homólogas também incluem seqüências de RNA em que uridinas substituem as timinas nas seqüências de ácido nucléico. As seqüências homólogas podem ser obtidas usando quaisquer dos procedimentos descritos aqui ou podem resultar da correção de um erro de seqüenciamento. Será avaliado que as seqüências de ácido nucléico como mencionadas aqui podem ser representadas no formato de caractere simples tradicional (observe, por exemplo, Stryer, Lubert. Biochemistry, 3a Ed., W. H Freeman & Co., New York) ou qualquer outro formato que registra a identidade dos nucleotídeos em uma seqüência.
Vários programas de comparação de seqüência identificados aqui são usados neste aspecto da invenção. Identidades de seqüência de
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59/279 ácido nucléico e/ou proteína (homologias) podem ser avaliadas usando qualquer da variedade dos algoritmos de comparação de seqüência e programas conhecidos na técnica. Tais algoritmos e programas incluem, porém não estão limitados a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, e CLUSTALW (Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85(8):2444 - 2448, 1988; Altschul e outros, J. Mol. Biol. 215(3):403 - 410, 1990; Thompson e outros, Nucleic Acids Res. 22(2):4673- 4680, 1994; Higgins e outros, Methods Enzymol. 266:383 - 402, 1996; Altschul e outros, J. Mol. Biol. 215(3):403410, 1990; Altschul e outros, Nature Genetics 3:266-272, 1993).
Homologia ou identidade pode ser avaliada usando o software (por exemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). Tal software emparelha seqüências similares designando-se graus de homologia em várias deleções, substituições e outras modificações. Os termos homologia e identidade no contexto de dois ou mais ácidos nucléicos ou seqüências de polipeptídeo, se referem a duas ou mais seqüência ou subseqüências que são as mesmas ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos quando comparados e alinhados para correspondência máxima sobre uma janela de comparação ou região designada como avaliada usando qualquer número de algoritmos de comparação de seqüência ou por alinhamento manual e inspeção visual. Para comparação de seqüência, uma seqüência pode agir como uma seqüência de referência (uma seqüência exemplar SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, etc.) em que as seqüências teste são comparadas. Quando usando um algoritmo de comparação de seqüência, as seqüências de referência e teste são registradas em um computador, as coordenadas de subseqüência são designadas, se necessário, e os parâmetros de programa de algoritmo de seqüência são designados. Os parâmetros de programa básicos podem ser usados, ou os parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de seqüência em seguida calcula as identidades de seqüência em percen19/02/2018, pág. 76/316
60/279 tual para as seqüências teste relativas à seqüência de referência, baseada nos parâmetros do programa.
Uma janela de comparação, como usado aqui, inclui a referência em um segmento de qualquer dentre o número de resíduos contíguos. Por exemplo, em aspectos alternativos da invenção, resíduos contíguos variando em qualquer lugar de 20 ao tamanho natural de uma seqüência exemplar da invenção, por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, etc., são comparadas a uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguas depois que as duas seqüências são idealmente alinhadas. Se a seqüência de referência tem a identidade de seqüência requisito em uma seqüência exemplar da invenção, por exemplo, 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%,
65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%,
78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de seqüência em uma seqüência da invenção, por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, etc., essa seqüência está dentro do escopo da invenção. Em modalidades alternativas, as subseqüências variando de cerca de 20 a 600, cerca de 50 a 200, e cerca de 100 a 150 são comparadas a uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguas depois que as duas seqüências são idealmente alinhadas. Os métodos de alinhamento de seqüência para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de seqüências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Watennan, Adv, Appl. Math. 2: 482, 1981, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970, pela pesquisa quanto à similaridade do método de person & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei USA 85: 2444, 1988, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), ou por
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61/279 alinhamento manual e inspeção visual. Outros algoritmos para determinar a homoiogia ou identidade incluem, por exemplo, além de um programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node) BLIMPS (BLocks IMProved Searcher), FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS algoritmo de Smith-Waterman, DARWIN, algoritmo de Las Vegas, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison) LALIGN (Local Sequence Alignment), LCP (Local Content Program), MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench), MAP (Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, ΡΙΜΑ (Pattern-lnduced Multi-sequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) e WHAT-IF. Tais programas de alinhamento podem da mesma forma ser usados para avaliar as bases de dados do genoma para identificar as seqüências de polinucleotídeo tendo seqüências substancialmente idênticas. Várias bases de dados de genoma estão disponíveis, por exemplo, uma porção substancial do genoma humano está disponível como parte do Human Genome Sequencing Project (Gibbs, 1995). Vários genomas foram seqüenciados, por exemplo, M. genitalium (Fraser e outros, 1995), M. jannaschii (Bult e outros, 1996), H. influenzae (Fleischmann e outros, 1995), E. coli (Blattner e outros, 1997), e levedura (S. cerevisiae) (Mewes e outros, 1997), e D. melanogaster (Adams e outros, 2000). Progresso significante foi da mesma forma feito no sequenciamento dos genomas do organismo modelo, tal como, Arabadopsis sp. e C. efegans, de camundongo. As bases de dados contendo informação genômica anotada com alguma informação funcional são mantidas por organização diferente e são acessíveis via internet.
Os algoritmos de BLAST, BLAST 2.0 e BLAST 2.2.2 são da
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62/279 mesma forma usados para praticar a invenção. Eles são descritos, por exemplo, em Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389 - 3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403 - 410. O software para realizar as análises de BLAST esta publicamente disponível através de National Center for Bio5 technology Information. Este algoritmo envolve primeiro identificar pares de seqüência de classificação elevada (HSPs) identificando-se palavras curtas de comprimento W na seqüência de interrogação, que comparam ou satisfazem algum escore limiar de valor positivo T quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência de base de dados. T é referido como o valor limiar de escore da palavra vizinha (Altschul (1990) supra). Estes impactos de palavra vizinha inicial atuam como sementes para iniciar as pesquisas para encontrar HSPs mais longos contendo-os. Os impactos de palavra são estendidos em ambas direções ao longo de cada seqüência até o escore de alinhamento cumulativo poder ser aumentado. Os escores cumulativos são calculados empregando-se, para seqüências de nucleotídeo, os parâmetros M (escore de recompensa para um par de resíduos de comparação; sempre > 0). Para seqüências de aminoácido, uma matriz de classificação é usada para calcular o escore cumulativo. A extensão dos impactos de palavra em cada direção é detida quando: o escore de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X de seu máximo valor obtido; o escore cumulativo vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de classificação negativa; ou o término de cada seqüência é alcançado. Os parâmetros de algoritmo de BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa
BLASTN (para seqüências de nucleotídeo) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4 e uma comparação de ambos filamentos. Para as seqüências de aminoácido, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra de 3, e expectativas (E) de 10, e a matriz de classificação BLOSUM62 (observe,
Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, e uma comparação de ambos filamentos. O algoritmo de BLAST da mesma forma realiza uma anáPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 79/316
63/279 lise estatística da similaridade entre duas seqüências (observe, por exemplo, Karlin &Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873). Uma avaliação de similaridade fornecida pelo algoritmo de BLAST é a probabilidade de soma menor (P(N)), que fornece uma adição da probabilidade pela qual uma comparação entre duas seqüências de aminoácido ou de nucleotídeo ocorrería por alteração. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma seqüência de referências se a probabilidade de soma menor em uma comparação do ácido nucléico de teste ao ácido nucléico de referência é menos do que cerca de 0,2, mais preferivelmente menos do que cerca de 0,01, e mais preferivelmente menos do que cerca de 0,001. Em um aspecto, as homologias de seqüência de ácido nucléico e proteína são avaliadas empregando-se o Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Por exemplo, cinco programas BLAST específicos podem ser usados para realizar a seguinte tarefa: (1) BLASTP e BLAST3 compara uma seqüência de interrogação de aminoácido contra uma base de dados de seqüência de proteína; (2) BLASTN compara uma seqüência de interrogação de nucleotídeo contra uma base de dados de seqüência de nucleotídeo; (3) BLASTX compara os produtos de translação conceituai de seis estruturas de uma seqüência de nucleotídeo de interrogação (ambos filamentos) contra uma base de dados de seqüência de proteína; (4) TBLASTN compara uma seqüência de proteína de interrogação contra uma base de dados de seqüência de nucleotídeo transladada em todas as seis estruturas de leitura (ambos filamentos); e, (5) TBLASTX compara as translações de seis estruturas de uma seqüência de interrogação de nucleotídeo contra as translações de seis estruturas de uma base de dados de seqüência de nucleotídeo. Os programas BLAST identificam seqüências homólogas identificando-se segmentos similares, que são aqui referidos como pares de segmento de classificação elevada, entre uma seqüência de ácido nucléico ou aminoácido de interrogação e uma seqüência de teste que é preferivelmente obtida a partir de uma base de dados de seqüência de ácido nucléico ou proteína. Os pares de segmento de classificação elevada são preferivelmente identificados (isto é, alinhados) por meios de uma matriz de classificação, muitos dos quais são conhecidos
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64/279 na técnica. Preferivelmente, a matriz de classificação empregada é a matriz BLOSUM62 (Gonnet e outros, Science 256:1443 - 1445, 1992; Henikoff e Henikoff, Proteins 17:49 - 61, 1993). Menos preferivelmente, as matrizes PAM ou PAM250 podem da mesma forma ser usadas (observe, por exemplo, Schwartz e Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation).
Em um aspecto da invenção, para determinar se o ácido nucléico tem a identidade de seqüência requisito para estar dentro do escopo da invenção, os programas NCBI BLAST 2.2.2 são empregados como opções default para blastp. Existem cerca de 38 opções parâmetro no programa BLAST 2.2.2. Neste aspecto exemplar da invenção, todos os valores default são usados a não ser que o parâmetro de filtragem default (isto é, todos os parâmetros estabelecidos em default exceto filtragem que é estabelecida em OFF); em seu lugar um parâmetro -F F seja usado, o que incapacita a filtragem. O uso de filtragem default freqüentemente resulta em violações de Karlin-Altschul devido ao curto comprimento da seqüência.
Os valores default usados neste aspecto exemplar da invenção incluem: Filtro para baixa complexidade: ON > Tamanho de palavra: 3 > Matriz: Blosum62 > Custos de descontinuidade (Gap Costs): Existência: 11 > Extensão: 1
Outros parâmetros default são filtro para baixa complexidade OFF, tamanho de palavra de 3 de proteína, matriz BLOSUM62, penalidade de existência de descontinuidade de -11 e uma penalidade de extensão de descontinuidade de -1.
Um parâmetro de programa NCBI BLAST 2.2.2 exemplar é mencionado no Exemplo 1, abaixo. Note que a opção -W padroniza em 0. Isto significa que, se não estabelecido, o tamanho de palavra padroniza em 3 para proteínas e 11 para nucleotídeos.
Sistemas de computador e produtos de proqrama de computador
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Para determinar e identificar identidades de seqüência, homologias estruturais, motivos e similares in silico a seqüência da invenção podem ser armazenados, registrados e manipulados em qualquer veículo que possa ser lido e acessado por um computador. Conseqüentemente, a invenção fornece computadores, sistemas de computador, veículos legíveis pelo computador, produtos de programas de computador e similares registraram e armazenaram nisso, seqüências de polipeptídeo e ácido nucléico da invenção, por exemplo, uma seqüência exemplar da invenção, por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, etc. Como aqui empregado, as palavras registrado e armazenado se refere a um processo para armazenar informação em um veículo de computador. Um técnico versado pode facilmente adotar quaisquer métodos conhecidos para registrar informação em um veículo legível pelo computador para gerar fabricações compreendendo uma ou mais das seqüências de polipeptídeo e /ou ácido nucléico da invenção.
Outro aspecto da invenção é um veículo legível pelo computador tendo registrado nesse pelo menos uma seqüência de polipeptídeo e /ou ácido nucléico da invenção. Os veículos legíveis pelo computador incluem veículos magneticamente legíveis, veículos opticamente legíveis, veículos eletronicamente legíveis e veículos magnéticos/ópticos. Por exemplo, os veículos legíveis pelo computador podem ser um disco rígido, disco flexível, uma fita magnética, CD-ROM, Digital Versatile Disk (DVD), Random Access Memory (RAM), ou Read Only Memory (ROM) bem como outros tipos de outros veículos conhecidos por aqueles versados na técnica.
Os aspectos da invenção incluem sistemas (por exemplo, sistemas com base na internet), particularmente sistemas de computador, que armazenam e manipulam as seqüências e informação de seqüência aqui descrita. Um exemplo de um sistema de computador 100 é ilustrado em forma de diagrama de bloco na Figura 1. Como aqui empregado, um sistema de computador se refere aos componentes de hardware, componentes de software e componentes de armazenagem de dados empregados para analisar uma seqüência de polipeptídeo ou nucleotídeo da invenção. O sis19/02/2018, pág. 82/316
66/279 tema de computador 100 pode incluir um processador para processar, acessar e manipular os dados de seqüência. O processador 105 pode ser qualquer tipo bem conhecido de unidade de processamento central, tal como, por exemplo, a Pentium III da Intel Corporation, ou processador similar de Sun, Motorola, Compaq, AMD ou International Business Machines. O sistema de computador 100 é um sistema de propósito geral que compreende o processador 105 e um ou mais componentes de armazenagem de dados internos 110 para armazenagem de dados e um ou mais dispositivos de recuperação de dados para recuperar os dados armazenados nos componentes de armazenagem de dados. Um técnico versado pode facilmente apreciar que qualquer um dos sistemas de computador atualmente disponíveis é adequado.
Em um aspecto, o sistema de computador 100 inclui o processador 105 conectado a um barramento que está conectado a uma memória principal 115 (preferivelmente implementada como RAM) e um ou mais dispositivos de armazenagem de dados internos 110, tal como, um drive rígido e /ou outros veículos legíveis pelo computador tendo dados registrados nestes. O sistema de computador 100 pode também incluir um ou mais dispositivo de recuperação de dados 118 para ler os dados armazenados nos dispositivos de armazenagem de dados internos 110.
O dispositivo de recuperação de dados 118 pode representar, por exemplo, um drive de disco flexível, um drive de disco compacto, um drive de fita magnética, ou um modem capaz de conexão em um sistema de armazenagem de dados remoto (por exemplo, via internet), etc. Em algumas modalidades, o dispositivo de armazenagem de dados interno 110 é um veículo legível pelo computador removível tal como, um disco flexível, disco compacto, uma fita magnética, etc. contendo lógica de controle e /ou dados registrados neste. O sistema de computador 100 pode vantajosamente incluir ou ser programado por software apropriado para ler a lógica de controle e /ou dados do componente de armazenagem de dados uma vez inseridos no dispositivo de recuperação de dados.
O sistema de computador 100 inclui um display 120 que é usado
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67/279 para exibir o rendimento a um usuário de computador. Da mesma forma, seria notado que o sistema de computador 100 pode ser ligado a outros sistemas de computador 125a-c em uma rede ou rede de área ampla para fornecer acesso centralizado ao sistema de computador 100. O software para acessar e processar as seqüências de aminoácido ou nucleotídeo da invenção pode residir na memória principal 115 durante a execução.
Em alguns aspectos, o sistema de computador 100 pode também compreender um algoritmo de comparação de seqüência para comparar uma seqüência de ácido nucléico da invenção. O algoritmo e seqüência(s) podem ser armazenados em um veículo legível pelo computador. Um algoritmo de comparação de seqüência se refere a um ou mais programas que implementados (localmente ou remotamente) no sistema de computador 100 para comparar uma seqüência de nucleotídeo com outras seqüências de nucleotídeo e /ou compostos armazenados dentro de um recurso de armazenagem de dados. Por exemplo, o algoritmo de comparação de seqüência pode comparar as seqüências de nucleotídeo de uma seqüência exemplar, por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, etc. armazenadas em um veículo legível pelo computador para identificar homologias ou motivos estruturais.
Os parâmetros empregados com os algoritmos acima podem ser adaptados dependendo do comprimento de seqüência e grau de homologia estudado. Em alguns aspectos, os parâmetros podem ser os parâmetros default usados pelos algoritmos na ausência de instruções do usuário. A Figura 2 é um diagrama de fluxo ilustrando um aspecto de um processo 200 para comparar uma nova seqüência de proteína ou nucleotídeo com uma base de dados de seqüências a fim de determinar os níveis de homologia entre a nova seqüência e as seqüências na base de dados. A base de dados de seqüências pode ser uma base de dados privada armazenada dentro do sistema de computador 100, ou uma base de dados publica tal como, GENBANK que está disponível através da Internet. O processo 200 começa em um estado inicial 201 e em seguida move-se para um estado 202 onde a
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68/279 nova seqüência a ser comparada é armazenada em uma memória em um sistema de computador 100. Como anteriormente discutido, a memória pode ser qualquer tipo de memória, incluindo RAM ou um dispositivo de armazenagem interno.
O processo 200 em seguida move-se para um estado 204 onde a base de dados de seqüência é aberta para análise e comparação. O processo 200 em seguida move-se para um estado 206 onde a primeira seqüência armazenada na base de dados é lida em uma memória no computador. Uma comparação é em seguida realizada a um estado 210 para determinar se a primeira seqüência é a mesma como a segunda seqüência. É importante notar que esta etapa não está limitada a realizar uma comparação exata entre a nova seqüência e a primeira seqüência na base de dados. Os métodos bem conhecidos são conhecidos por aqueles versados na técnica para comparar duas seqüências de proteína ou nucleotídeo, mesmo se elas não são idênticas. Por exemplo, os espaços são introduzidos em uma seqüência a fim de aumentar o nível de homologia entre as duas seqüências testadas. Os parâmetros que controlam se os espaços ou outros aspectos são introduzidos em uma seqüência durante a comparação, são normalmente registrados pelo usuário do sistema de computador.
Uma vez que uma comparação das duas seqüências foi realizada no estado 210, uma determinação é feita em um estado de decisão 210 se as duas seqüências são as mesmas. Evidente, o termo mesmas não é limitado às seqüências que são absolutamente idênticas. As seqüências que estão dentro dos parâmetros de homologia registrados pelo usuário, serão marcadas como mesmas no processo 200. Se a determinação é concluída que as duas seqüências são as mesmas, o processo 200 move-se para um estado 214 onde o nome da seqüência da base de dados é exibido ao usuário. Este estado informa ao usuário que a seqüência com o nome exibido preenche as limitações de homologia que foram registradas. Uma vez que o nome da seqüência armazenada é exibido ao usuário, o processo 200 move-se para um estado de decisão 218 onde uma determinação é feita se mais seqüências existem na base de dados. Se não existem mais seqüên19/02/2018, pág. 85/316
69/279 cias na base de dados, em seguida o processo 200 termina em um estado final 220. Entretanto, se existem mais seqüências na base de dados, em seguida o processo 200 move-se para um estado 224 onde um indicador é movido para a próxima seqüência na base de dados a fim de que possa ser comparada à nova seqüência. Desta maneira, a nova seqüência é alinhada e comparada com cada seqüência na base de dados.
Seria notado que se uma determinação foi feita no estado de decisão 212 que, as seqüências não foram homólogas, em seguida o processo 200 se movería imediatamente ao estado de decisão 218 a fim de determinar se quaisquer outras seqüências estão disponíveis na base de dados para comparação. Conseqüentemente, um aspecto da invenção é um sistema de computador compreendendo um processador, um dispositivo de armazenagem de dados tendo armazenado nele uma seqüência de ácido nucléico da invenção e um comparador de seqüência para conduzir a comparação. O comparador de seqüência pode indicar um nível de homologia entre as seqüências comparadas ou identificar motivos estruturais, ou pode identificar motivos estruturais nas seqüências que são comparadas a esses códigos de ácido nucléico e códigos de polipeptídeo.
A Figura 3 é um diagrama de fluxo ilustrando uma modalidade de um processo 250 em um computador para determinar se as duas seqüências são homologas. O processo 250 começa em um estado inicial 252 e em seguida move-se em um estado 254 onde uma primeira seqüência a ser comparada é armazenada em uma memória. A segunda seqüência a ser comparada é em seguida armazenada em uma memória em um estado 256. O processo 250 em seguida move-se para um estado 260 onde o primeiro caractere na primeira seqüência é lido e em seguida a um estado 262 onde o primeiro caractere da segunda seqüência é lido. Seria entendido que se a seqüência é uma seqüência de nucleotídeo, em seguida o caractere normalmente seria A, T, C, G ou U. Se a seqüência é uma seqüência de proteína, em seguida pode ser um código de aminoácido de letra simples a fim de que as primeira e segunda seqüências possam ser facilmente comparadas. Uma determinação é em seguida feita em um estado de decisão 264 se os
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70/279 dois caracteres são os mesmos. Se eles são os mesmos em seguida o processo 250 move-se a um estado 268 onde os próximos caracteres nas primeira e segunda seqüências são lidos. Uma determinação é em seguida feita se os próximos caracteres são os mesmos. Se eles são, em seguida o processo 250 continua este loop até que os dois caracteres não sejam os mesmos. Se uma determinação é feita que os próximos dois caracteres não são os mesmos, o processo 250 move-se para um estado de decisão 274 para determinar se existem mais caracteres ou seqüência para ler. Se não existem mais caracteres para ler, em seguida o processo 250 move-se para um estado 276 onde o nível de homologia entre a primeira e segunda seqüências é exibido ao usuário. O nível de homologia é determinado calculando-se a proporção de caracteres entre as seqüências que foram as mesmas fora do número total de seqüências na primeira seqüência. Desta maneira, se cada caractere em uma seqüência de 100 nucleotídeos é alinhado com cada caractere em uma segunda seqüência, o nível de homologia seria 100%.
Alternativamente, o programa de computador pode comparar uma seqüência de referência a uma seqüência da invenção para determinar se as seqüências diferem em uma ou mais posições. O programa pode registrar o comprimento e identidade de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos inseridos, deletados ou substituídos com respeito à seqüência da referência ou da invenção. O programa de computador pode ser um programa que determina se uma seqüência de referência contém um polimorfismo de nucleotídeo simples (SNP) com respeito a uma seqüência da invenção, ou, se uma seqüência da invenção compreende um SNP de uma seqüência conhecida. Desta maneira, em alguns aspectos, o programa de computador é um programa que identifica os SNPs. O método pode ser implementado pelos sistemas de computador anteriormente descritos e pelo método ilustrado na Figura 3. O método pode ser realizado lendo-se a seqüência da invenção e as seqüências de referências através do uso do programa de computador e identificando-se as diferenças com o programa de computador.
Em outros aspectos, os sistemas com base no computador
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71/279 compreendem um identificador para identificar aspectos dentro de um ácido nucléico ou polipeptídeo da invenção. Um identificador se refere a um ou mais programas que identificam certos aspectos dentro de uma seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, um identificador pode compreender um programa que identifica uma estrutura de leitura aberta (ORF) em uma seqüência de ácido nucléico. A Figura 4 é um diagrama de fluxo ilustrando um aspecto de um processo identificador 300 para detectar a presença de um aspecto em uma seqüência. O processo 300 começa em um estado inicial 302 e em seguida move-se para um estado 304 onde uma primeira seqüência que deve ser checada quanto aos aspectos, é armazenada em uma memória 115 no sistema de computador 100. O processo 300 em seguida move-se a um estado 306 onde uma base de dados de aspectos da seqüência é aberta. Uma tal base de dados incluiría uma lista de cada atributo do aspecto junto do nome do aspecto. Por exemplo, um nome do aspecto pode ser Códon de Iniciação e o atributo seria ATG. Outro exemplo seria o nome do aspecto Caixa TAATAA e o atributo do aspecto seria TAATAA. Um exemplo de uma tal base de dados é produzido pela University of Wisconsin Genetics Computer Group. Alternativamente, os aspectos podem ser motivos de polipeptídeo estruturais tais como, hélices alfa, folhas beta, ou motivos de polipeptídeo funcionais tais como, sítios ativos enzimáticos, motivos helix-turn-helix ou outros motivos conhecidos por aqueles versados na técnica. Uma vez que a base de dados de aspectos é aberta no estado 306, o processo 300 move-se para um estado 308 onde o primeiro aspecto e lido a partir da base de dados. Uma comparação do atributo do primeiro aspecto com a primeira seqüência é em seguida feita em um estado 310. Uma determinação é em seguida feita em um estado de decisão 316 se o atributo do aspecto foi constatado na primeira seqüência. Se o atributo foi constatado, em seguida o processo 300 move-se para um estado 318 onde o nome do aspecto constatado é exibido ao usuário. O processo 300 em seguida move-se para um estado de decisão 320 onde a determinação é feita se os aspectos em movimento existem na base de dados. Se mais aspectos existem, em seguida processo 300 termina em um estado final 324. Entretanto,
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72/279 se mais aspectos existem na base de dados, em seguida o processo 300 lê o próximo aspecto da seqüência em um estado 326 e retorna ao estado 310 onde o atributo do próximo aspecto é comparado contra a primeira seqüência. Se o atributo do aspecto não é constatado na primeira seqüência no estado de decisão 316, o processo 300 move-se diretamente para o estado de decisão 320 a fim de determinar se mais aspectos existem na base de dados. Desta maneira, em um aspecto, a invenção fornece um programa de computador que identifica estruturas de leitura aberta (ORFs).
Uma seqüência de ácido nucléico ou polipeptídeo da invenção pode ser armazenada e manipulada em uma variedade de programas processadores de dados em uma variedade de formatos. Por exemplo, uma seqüência pode ser armazenada como texto em um arquivo de processamento de palavra, tal como, MicrosoftWORD ou WORDPERFECT ou como um arquivo ASCII em uma variedade de programas de base de dados familiar àqueles versados na técnica, tal como DB2, SYBASE, ou ORACLE. Além disso, muitas bases de dados e programas de computador podem ser usadas como algoritmos de comparação de seqüência, identificadores ou fontes de seqüências de nucleotídeo de referência ou seqüências de polipeptídeo a serem comparadas a uma seqüência de ácido nucléico da invenção. Os programas e bases de dados usadas para praticar a invenção incluem, porém não são limitados a: MacPattern (EMBL), DiscoveryBase (Molecular Applications Group), GeneMine (Molecular Applications Group), Look (Molecular Applications Group), MacLook (Molecular Applications Group), BLAST e BLAST2 (NCBI), BLASTN e BLASTX (Altschul e outros, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990), FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 2444, 1988), FASTDB (Brutlag e outros, Comp. App. Biosci. 6:237 - 245, 1990), Catalyst (Molecular Simulations Inc.), Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Cerius2.DBAccess (Molecular Simulations Inc.), HypoGen (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations Inc.), Discover (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Felix (Molecular Simulations Inc.), DelPhi, (Molecular Simulations Inc.), QuanteMM, (Molecular Simulations Inc.), Homology (Molecular Simulations
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Inc.), Modeler (Molecular Simulations Inc.), ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WebLab (Molecular Simulations Inc.), WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.), SeqFold (Molecular Simulations Inc.), a base de dados MDL Available Chemicals Directory, a base de dados MDL Drug Data Report, a base de dados Comprehensive Medicinal Chemistry, base de dados World Drug Index de Derwent, a base de dados BioByteMasterFile, a base de dados Genbank, e a base de dados Genseqn. Muitos outros programas e bases de dados seriam aparente para alguém versado na técnica dada à presente descrição.
Os motivos que podem ser detectados empregando-se os programas acima incluem seqüências codificando zíper de leucina, motivos helix-turn-helix, sítios de glicosilação, sítios de ubiquitinação, hélices alfa e folhas beta, seqüências de sinal codificando peptídeos de sinal que direcionam a secreção das proteínas codificadas, seqüências implicadas na regulagem de transcrição tal como, homeoboxes, estiramentos acídicos, sítios ativos enzimáticos, sítios de ligação de substrato e sítios de divagem enzimáticos.
Hibridização de ácidos nucléicos
A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados que hibridizam sob condições severas em uma seqüência exemplar da invenção, por exemplo, uma seqüência como mencionado em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95,
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SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO: 105, ou um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo compreendendo uma seqüência como mencionado em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106. As condições severas podem ser condições altamente severas, condições severas de veículo, condições severas inferiores, incluindo as condições de severidade reduzidas e elevadas aqui descritas. Em modalidades alteranativas, os ácidos nucléicos da invenção como definido por sua capacidade de hibridizar sob condições severas pode ser entre cerca de cinco resíduos e o tamanho natural da molécula, por exemplo, um ácido nucléico exemplar da invenção. Por exemplo, eles podem ser pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 resíduos em comprimento. Os ácidos nucléicos mais curtos do que o tamanho natural são da mesma forma incluídos. Estes ácidos nucléicos são úteis como, por exemplo, sondas de hibridização, sondas de rotulagem, sondas de oligonucleotídeo de PCR, iRNA (de filamento simples ou duplo), anti-sentido ou seqüências codificando peptídeos de ligação de anticorpo (epítopos), motivos, sítios ativos e similares.
Em um aspecto, os ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua capacidade de hibridizar sob severidade elevada, compreendem condições de cerca de 50% de formamida a cerca de 37°C a 42°C. Em um aspecto, os ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua capacidade
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75/279 de hibridizar sob severidade reduzida compreendendo condições em cerca de 35% a 25% de formamida a cerca de 30°C a 35°C. Alternativamente, os ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua capacidade de hibridizar sob severidade elevada compreendendo condições a 42°C em 50% de formamida, 5X de SSPE, 0,3% de SDS e uma seqüência repetitiva bloqueando ácido nucléico, tal como, cot-1 ou DNA de esperma de salmão (por exemplo, 200 n/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e cisalhado). Em um aspecto, os ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua capacidade de hibridizar sob condições de severidade reduzida compreendendo 35% de formamida em uma temperatura reduzida de 35°C.
Seguindo a hibridização, o filtro pode ser lavado com 6X de SSC, 0,5% de SDS a 50°C. Estas condições são consideradas ser condições moderadas acima de 25% de formamida e condições inferiores abaixo de 25% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização moderada é quando a hibridização é conduzida em 30% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização de severidade inferior é quando a hibridização acima é conduzida em 10% de formamida.
A faixa de temperatura correspondente a um nível particular de severidade pode ser também restringida calculando-se a relação de purina para pirimidina do ácido nucléico de interesse e ajustando-se a temperatura conseqüentemente. Os ácidos nucléicos da invenção são da mesma forma definidos por sua capacidade de hibridizar sob condições elevados, médias e inferiores como mencionado em Ausubel e Sambrook. As variações das condições e faixas acima são bem conhecidas na técnica. As condições de hibridização são também discutidas abaixo.
Sondas de oligonucleotídeos e métodos para usá-las
A invenção da mesma forma fornece sondas de ácido nucléico para identificar ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo com uma atividade de fosfolipase. Em um aspecto, a sonda compreende pelo menos 10 bases consecutivas de uma seqüência como mencionado em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11,
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SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO: 105. Alternativamente, uma sonda da invenção pode ser pelo menos cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60 cerca de 30 a 70, bases consecutivas de uma seqüência como mencionado em uma seqüência da invenção. As sondas identificam um ácido nucléico por ligação ou hibridização. As sondas podem ser usadas em disposições da invenção, observe, a discussão abaixo, incluindo, por exemplo, disposições capilares. As sondas da invenção podem da mesma forma ser usadas para isolar outros ácidos nucléicos ou polipeptídeos.
As sondas da invenção podem ser empregadas para determinar se a amostra biológica, tal como, amostra de solo, contém um organismo tendo uma seqüência de ácido nucléico da invenção ou um organismo do qual o ácido nucléico foi obtido. Em tais procedimentos, uma amostra biológica potencialmente abrigando o organismo do qual o ácido nucléico foi isolado é obtida e ácidos nucléicos são obtidos da amostra. Os ácidos nucléicos são contatados com a sonda sob condições que permitem a sonda especificamente hibridizar para quaisquer seqüências complementares presentes na amostra. Onde necessário, as condições que permitem a sonda especificamente hibridizar para seqüências complementares podem ser determinadas colocando-se a sonda em contato com seqüências complementares de amostras conhecidas por conter a seqüência complementar, bem como seqüências de controle que não contêm a seqüência complementar.
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As condições de hibridização, tal como, a concentração de sal do tampão de hibridização, a concentração de formamida do tampão de hibridização, ou a temperatura de hibridização, pode ser variada para identificar condições que permitam a sonda hibridizar especificamente para ácidos nucléicos complementares (observe, discussão sobre condições de hibridização específicas).
Se a amostra contém o organismo do qual o ácido nucléico foi isolado, a hibridização específica da sonda é em seguida detectada. A hibridização pode ser detectada rotulando-se a sonda com um agente detectável tal como, um isótopo radioativo, uma tintura fluorescente ou uma enzima capaz de catalisar a formação de um produto detectável. Muitos métodos para empregar as sondas rotuladas para detectar a presença de ácidos nucléicos complementares em uma amostra são familiares por aqueles versados na técnica. Estes incluem Southern blots, Northern blos, procedimentos de hibridização de colônia e manchas em ponto. Os protocolos para destes procedimentos são fornecidos em Ausubel e Sambrook.
Alternativamente, mais do que uma sonda (pelo menos uma das quais é capaz de especificamente hibridizar para quaisquer seqüências complementares que estão presentes na amostra de ácido nucléico), pode ser usada em uma reação de amplificação para determinar se a amostra contém uma seqüência de ácido nucléico da invenção (por exemplo, um organismo do qual o ácido nucléico foi isolado). Em um aspecto, as sondas compreendem oligonucleotídeos. Em um aspecto, a reação de amplificação pode compreender uma reação de PCR. Os protocolos de PCR são descritos em Ausubel e Sambrook (observe, a discussão sobre reações de amplificação). Em tais procedimentos, os ácidos nucléicos na amostra são conectados com as sondas, a reação de amplificação é realizada e qualquer produto de reação resultante é detectado. O produto de amplificação pode ser detectado realizando-se eíetroforese em gel sobre os produtos de reação e manchando-se o gel com um intercalador tal como, brometo de etídio. Alternativamente, uma ou mais das sondas podem ser rotuladas com um isótopo radioativo e a presença de um produto de amplificação radioativo pode ser detectada por auto-radiografia após eíetroforese em gel.
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As sondas derivadas da seqüência perto das extremidades 3' ou 5' de uma seqüência de ácido nucléico da invenção podem da mesma forma ser usadas em procedimentos de marcha de cromossoma para identificar clones contendo adicional, por exemplo, seqüências genômicas. Tais métodos permitem o isolamento de genes que codificam proteínas adicionais de interesse do organismo hospedeiro.
Em um aspecto, as seqüências de ácido nucléico da invenção são empregadas como sondas para identificar e isolar ácidos nucléicos relacionados. Em alguns aspectos, os ácidos nucléicos relacionados assim identificados podem ser cDNAs ou DNAs genômicos de organismos diferentes daquele do qual o ácido nucléico da invenção foi primeiro isolado. Em tais procedimentos, uma amostra de ácido nucléico é contatada com a sonda sob condições que permitem a sonda especificamente hibridizar para seqüências relatadas. A hibridização da sonda para ácidos nucléicos do organismo relatado é em seguida detectada empregando-se quaisquer dos métodos anteriormente descritos.
Em reações de hibridização de ácido nucléico, as condições são empregadas para obter um nível particular de severidade variará, dependendo da natureza dos ácidos nucléicos sendo hibridizados. Por exemplo, o comprimento, o grau de complementariedade, composição de seqüência de nucleotídeo (por exemplo, teor de GC v. AT), e tipo de ácido nucléico (por exemplo, RNA v. DNA) das regiões de hibridização dos ácidos nucléicos podem ser considerados na seleção das condições de hibridização. Uma consideração adicional é se um dos ácidos nucléicos é imobilizado, por exemplo, em um filtro. A hibridização pode ser realizada sob condições severidade inferior, severidade moderada ou severidade elevada. Como um exemplo de hibridização de ácido nucléico, uma membrana de polímero contendo ácidos nucléicos desnaturados imobilizados é pré-hibridizada durante 30 minutos a 45°C em uma solução consistindo em 0,9 M de NaCI, 50 mM de NaH2PO4, pH 7,0, 5,0 mM de Na2EDTA, 0.5% de SDS, 10X de Denhardfs, e 0,5 mg/ml de ácido polirriboadenílico. Aproximadamente, 2 X 107 cpm (atividade específica 4-9 X 108 cpm/ug) de sonda de oligonucleotídeo
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79/279 rotulada na extremidade 32P são em seguida adicionados à solução. Após 12-16 horas de incubação, a membrana é lavada durante 30 minutos em temperatura ambiente (TA) em 1X de SET (150 mM de NaCI, 20 mM de cloridrato de Tris, pH 7,8, 1 mM de Na2EDTA) contendo 0,5% de SDS, seguido por uma lavagem de 30 minutos em 1X de SET fresco em Tm-10°C para a sonda de oligonucleotídeo. A membrana é em seguida exposta à película de auto-radiografia para detecção de sinais de hibridização.
Variando-se a severidade das condições de hibridização empregadas para identificar ácidos nucléicos, tais como, cDNAs ou DNAs genômi10 cos, que hibridizam para a sonda detectável, ácidos nucléicos tendo diferentes níveis de homologia para a sonda poder ser identificada e isolada. A severidade pode ser variada conduzindo-se a hibridização variando-se as temperaturas abaixo das temperaturas de fusão das sondas. A temperatura de fusão, Tf, é a temperatura (sob pH e resistência iônica definidos) em que
50% da seqüência alvo hibridiza para uma sonda perfeitamente complementar. Muitas condições de severidade devem ser selecionadas iguais a ou cerca de 5°C mais baixas do que a Tf para uma sonda particular. A temperatura de fusão da sonda pode ser calculada empregando-se as seguintes fórmulas exemplares. Para sondas entre 14 e 70 nucleotídeos em compri20 mento, a temperatura de fusão (Tf) é calculada empregando-se a fórmula: Tf = 81,5 + 16,6(log [Na+]) + 0,41 (fração G + C)-(600/N) onde N é o comprimento da sonda. Se a hibridização é realizada em uma solução contendo formamida, a temperatura de fusão pode ser calculada empregando-se a equação: Tf = 81,5 + 16,6(log [Na+]) + 0,41 (fração G + C)-(0,63% de for25 mamida)-(600/N) onde N é o comprimento da sonda. A pré-hibridização pode ser realizada em 6X de SSC, 5X de reagente de Denhardt, 0,5% de SDS, 100pg de DNA de esperma de salmão fragmentado desnaturado ou 6X de SSC, 5X de reagente de Denhardt, 0,5% de SDS, 100pg de DNA de esperma de salmão fragmentado desnaturado, 50% de formamida. As fórmulas para SSC e Denhardfs e outras soluções são listadas por exemplo, em Sambrook.
A hibridização é conduzida adicionando-se a sonda detectável
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80/279 às soluções de pré-hibridização acima listadas. Onde a sonda compreende DNA de filamento duplo, ela é desnaturada antes da adição à solução de hibridização. O filtro é contatado com a solução de hibridização durante um período suficiente de tempo que permite a sonda hibridizar para cDNAs ou DNAs genômicos contendo seqüências complementares a isso ou homólogos a isso. Para sondas além de 200 nucleotídeos em comprimento, a hibridização pode ser realizada a 15 - 25°C abaixo da Tf. Para sondas mais curtas, tais como, sondas de oligonucleotídeo, a hibridização pode ser conduzida a 5 - 10°C abaixo da Tf. Em um aspecto, as hibridizações em 6X de SSC são conduzidas a aproximadamente 68°C. Em um aspecto, as hibridizações em 50% de formamida contendo soluções são conduzidas a aproximadamente 42°C. Todas as hibridizações anteriores seriam consideradas estar sob condições de severidade elevada.
Seguindo a hibridização, o filtro é lavado para remover qualquer sonda detectável não especificamente ligada. A severidade usada para lavar os filtros pode da mesma forma variada dependendo da natureza dos ácidos nucléicos sendo hibridizados, do comprimento dos ácidos nucléicos sendo hibridizados, do grau de complementariedade, da composição da seqüência de nucleotídeo (por exemplo, teor de GC v. AT), e do tipo de ácido nucléico (por exemplo, RNA v. DNA). Os exemplos de lavagens com condições de severidade progressivamente mais elevadas são como segue: 2X de SSC, 0,1% de SDS em temperatura ambiente dados durante 15 minutos (severidade inferior); 0,1X de SSC, 0,5% de SDS em temperatura ambiente durante 30 minutos a 1 hora (severidade moderada); 0,1X de SSC, 0,5% de SDS durante 15 a 30 minutos entre a temperatura de hibridização e 68°C (severidade elevada); e 0,15M de NaCI durante 15 minutos a 72°C (severidade muito elevada). Uma lavagem com severidade inferior final pode ser conduzida em 0,1X de SSC em temperatura ambiente. Os exemplos acima são meramente ilustrativos de um grupo de condições que podem ser usadas para lavar filtros. Alguém versado na técnica sabería que existem numerosas receitas para diferentes lavagens severas.
Os ácidos nucléicos que têm hibridizado para a sonda, podem
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81/279 ser identificados por auto-radiografia ou outras técnicas convencionais. O procedimento acima pode ser modificado para identificar ácidos nucléicos tendo níveis decrescentes de homologia para a seqüência da sonda. Por exemplo, para obter ácidos nucléicos de homologia decrescente para a sonda detectável, condições menos severas podem ser usadas. Por exemplo, a temperatura de hibridização pode ser diminuída em incrementos de 5°C de 68°C a 42°C em um tampão de hibridização tendo uma concentração de Na+ de aproximadamente 1M. Seguindo a hibridização, o filtro pode ser lavado com 2X de SSC, 0,5% de SDS na temperatura de hibridização. Estas condições são consideradas ser condições moderadas acima de 50°C e condições inferiores abaixo de 50°C. Um exemplo das condições de hibridização moderada é quando a hibridização acima é conduzida a 55°C. Um exemplo de condições de hibridização com severidade inferior é quando a hibridização acima é conduzida a 45°C.
Alternativamente, a hibridização pode ser realizada em tampões, tal como, 6X de SSC, contendo formamida em uma temperatura de 42°C. Neste caso, a concentração de formamida no tampão de hibridização pode ser reduzida em 5% de incrementos de 50% a 0% para identificar clones tendo níveis decrescentes de homologia para a sonda. Seguindo a hibridização, o filtro pode ser lavado com 6X de SSC, 0,5% de SDS a 50°C. Estas condições são consideradas ser condições moderadas acima de 25% de formamida e condições inferiores abaixo de 25% de formamida. Um exemplo das condições de hibridização moderada é quando a hibridização acima é conduzida em 30% de formamida. Um exemplo de condições de hibridização com severidade inferior é quando a hibridização acima é conduzida em 10% de formamida.
Estas sondas e métodos da invenção podem ser usados para isolar ácidos nucléicos tendo uma seqüência com pelo menos 99%, 98%, 97%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, ou pelo menos 50% em homologia para uma seqüência de ácido nucléico da invenção compreendendo pelo menos cerca
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82/279 de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ou 500 bases consecutivas disto, e as sequências complementares a isso. A homologia pode ser avaliada empregando-se um algoritmo de alinhamento, como aqui discutido. Por exemplo, os polinucleotídeos homólogos podem ter uma seqüência de codificação que é uma variante alélica de ocorrência natural de uma das seqüências de codificação aqui descritas. Tais variantes alélicas podem ter uma substituição, deleção ou adição de um ou mais nucleotídeos quando comparadas aos ácidos nucléicos da invenção.
Adicionalmente, as sondas e métodos da invenção podem ser usados para isolar ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos tendo pelo menos cerca de 99%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, ou pelo menos 50% de identidade de seqüência (homologia) para um polipeptídeo da invenção compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos disto como determinado empregando-se um algoritmo de alinhamento de seqüência (por exemplo, tal como, o algoritmo de FASTA versão 3.0t78 com os parâmetros padrão ou um programa BLAST 2.2.2 com parâmetros exemplares como aqui mencionado).
Expressão de Inibição de Fosfolipases
A invenção também fornece ácidos nucléicos complementares (por exemplo, seqüências anti-sentido) aos ácidos nucléicos da invenção, por exemplo, ácidos nucléicos codificando fosfolipase. As seqüências antisentido são capazes de inibir o transporte, união ou transcrição de genes codificando fosfolipase. A inibição pode ser executada através do alvejamento de DNA genômico ou RNA mensageiro. A transcrição ou função do ácido nucléico alvejado pode ser inibida, por exemplo, por hibridização e /ou divagem. Um grupo particularmente útil de inibidores fornecido pela presente invenção inclui oligonucleotídeos que são capazes de ligar mensagem ou gene de fosfolipase, em cada caso prevenindo ou inibindo a produção ou função de enzima de fosfolipase. A associação pode ser contudo hibridização específica de seqüência. Outra classe útil de inibidores inclui oligonu19/02/2018, pág. 99/316
83/279 cleotídeos que causam inativação ou divagem de mensagem de fosfolipase. O oligonucleotídeo pode ter atividade de enzima que causa tal divagem, tal como, ribozimas. O oligonucleotídeo pode ser quimicamente modificado ou conjugado em uma enzima ou composição capaz de clivar o ácido nucléico complementar. Alguém pode avaliar um grupo de tais oligonucleotídeos muito diferentes para aqueles com atividade desejada.
A inibição de expressão de fosfolipase pode ter uma variedade de aplicações industriais. Por exemplo, inibição de expressão de fosfolipase pode retardar ou impedir o refugo. O refugo pode ocorrer quando lipídios ou polipeptídeos, por exemplo, polipeptídeo ou lipídios estruturais, são enzimaticamente degradados. Isto pode levar a deterioração, ou podridão de frutas ou vegetais. Em um aspecto, o uso de composições da invenção que inibem a expressão e /ou atividade de fosfolipase, por exemplo, anticorpos, oligonucleotídeos anti-sentido, ribozimas e RNAi, é empregado para retardar ou impedir o refugo. Desta maneira, em um aspecto, a invenção fornece métodos e composições compreendendo aplicação em uma planta ou produto da planta (por exemplo, uma fruta, semente, raiz, folha, etc.) anticorpos, oligonucleotídeo anti-sentido, ribozimas e RNAi da invenção para retardar ou impedir o refugo. Estas composições da mesma forma podem ser expressas pela planta (por exemplo, uma planta transgênica) ou outro organismo (por exemplo, bactéria ou outro organismo transformado com um gene de fosfolipase da invenção).
As composições da invenção para a inibição de expressão de fosfolipase (por exemplo, anti-sentido, iRNA, ribozimas, anticorpos) podem ser usadas como composições farmacêuticas.
Oligonucleotídeos Anti-sentido
A invenção fornece oligonucleotídeos anti-sentido capaz de ligar mensagem de fosfolipase que pode inibir a atividade de fosfolipase alvejando-se mRNA. As estratégias para planejar oligonucleotídeos anti-sentido são bem descritas na literatura de patente e científica, e o técnico versado pode planejar tais oligonucleotídeos de fosfolipase empregando-se os novos reagentes da invenção. Por exemplo, protocolo de mapeamento de
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RNA/marcha de gene para avaliar quanto aos oligonucleotídeos anti-sentido eficazes são bem conhecidos na técnica, observe, por exemplo, Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168 - 183, descrevendo um ensaio de mapeamento de RNA, que é baseado nas técnicas moleculares padrões para fornecer um método fácil e seguro para seleção de seqüência anti-sentido potente. Observe, da mesma forma Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sei. 11:191 - 198. Os ácidos nucléicos de ocorrência natural são usados como oligonucleotídeos anti-sentido. Os oligonucleotídeos anti-sentido podem ser de qualquer comprimento; por exemplo, em aspectos alternativos, os oligonucleotídeos anti10 sentido são entre cerca de 5 a 100, cerca de 10 a 80, cerca de 15 a 60, cerca de 18 a 40. O comprimento ideal pode ser determinado por avaliação de rotina. Os oligonucleotídeos anti-sentido podem estar presentes em qualquer concentração. A concentração ideal pode ser determinada por avaliação de rotina. Uma ampla variedade de nucleotídeo de ocorrência não natu15 ral, sintético e análogos de ácido nucléico é conhecida a qual pode endereçar este problema potencial. Por exemplo, ácidos nucléicos de peptídeo (PNAs) contendo cadeias principais não-iônicas, tais como, unidades de N(2-aminoetil) glicina podem ser usados. Os oligonucleotídeos anti-sentido tendo ligações de fosforotioato podem ser empregados, como descrito em
WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189 - 197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996). Os oligonucleotídeos anti-sentido tendo análogos de cadeia principal de DNA sintético fornecidos pela invenção podem da mesma forma incluir ácidos nucléicos de fosforo-ditioato, metilfosfonato, fosforamidato, fosfotriés25 ter de alquila, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno(metilimino), 3'-N-carbamato, e morfolino carbamato, como anteriormente descrito.
A metodologia química combinatorial pode ser usada para criar vastos números de oligonucleotídeos que podem ser rapidamente avaliados quanto aos oligonucleotídeos específicos que têm especificidades e afinida30 des e ligação apropriadas com respeito a qualquer alvo, tal como, seqüências de fosfolipase anti-sentido e sentido da invenção (observe, por exemplo, Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270:13581 -13584).
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Ribozimas Inibidoras
A invenção leva em consideração as ribozimas capazes de ligar a mensagem de fosfolipase que pode inibir a atividade de enzima de fosfolipase alvejando mRNA. As estratégias para planejar ribozinas e selecionar a seqüência anti-sentido específica de fosfolipase para alvejamento são bem descritas na literatura de patente e científica e o técnico versado pode planejar tais ribozimas empregando-se os novos reagentes da invenção. As ribozimas agem ligando-se a um RNA alvo através da porção de ligação de RNA de uma ribozima que é sustentada na proximidade imediata e uma porção enzimática do RNA que cliva o RNA alvo. Desta maneira, a ribozima reconhece e liga um RNA alvo através de emparelhamento de base complementar e uma vez que ligado ao sítio correto, age enzimaticamente para clivar e inativar o RNA alvo. A divagem de um RNA alvo em uma tal maneira destruirá sua capacidade de direcionar a síntese de uma proteína codificada se a divagem ocorre na seqüência de codificação. Após a ribozima ter ligado e clivado seu RNA alvo, ela é tipicamente liberada desse RNA e assim pode ligar e clivar novos alvos repetidamente.
Em algumas circunstâncias, a natureza enzimática de uma ribozima pode ser vantajosa sobre outras tecnologias, tal como, tecnologia anti20 sentido (onde uma molécula de ácido nucléico simplesmente liga-se a um alvo de ácido nucléico para bloquear sua transcrição, translação ou associação com outra molécula) como a concentração eficaz de ribozima necessária para realizar um tratamento terapêutico pode ser menor do que aquela de oligonucleotídeos anti-sentido. Esta vantagem potencial reflete a capaci25 dade da ribozima agir enzimaticamente. Desta maneira, uma molécula de ribozima simples é capaz de clivar muitas moléculas de RNA alvo. Além disso, a ribozima é tipicamente um inibidor altamente específico, com a especificidade da inibição depender não apenas do mecanismo de emparelhamento de base de ligação, porém da mesma forma do mecanismo pelo qual a molécula inibe a expressão do RNA ao qual liga-se. Isto é, a inibição é causada por divagem do RNA alvo e assim a especificidade é definida como a relação da taxa de divagem do RNA alvo sobre a taxa de divagem de RNA
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86/279 não alvejado. Este mecanismo de divagem é dependente dos fatores adicionais àqueles envolvidos no emparelhamento de base. Desta maneira, a especificidade de ação de uma ribozima pode ser maior do que aquela do oligonucleotídeo anti-sentido ligando o mesmo sítio de RNA.
A molécula de RNA de ribozima enzimática pode ser formada em um motif de cabeça de martelo, porém pode da mesma forma ser formada no motif de um grampo de cabelo, vírus da hepatite delta, íntron do grupo I ou RNA tipo RNaseP (em associação com uma seqüência guia de RNA). Os exemplos de tais motivos de cabeça de martelo são descritos por
Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183; motivos de grampo de cabelo por Hampel (1989) Biochemistry 28: 4929, e Hampel (1990) Nuc. Acids Res. 18:299; o motif do vírus da hepatite delta por Perrotta (1992) Biochemistry 31: 16; o motif de RNaseP por Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849; e o íntron do grupo I por Cech Patente dos Estados Uni15 dos No. 4.987.071. A reação destes motivos específicos não é pretendida ser limitante; aqueles versados na técnica reconhecerão que uma molécula de RNA enzimática desta invenção tem um sítio de ligação de substrato específico complementar a uma ou mais regiões de RNA de gene alvo, e tem uma seqüência de nucleotídeo dentro ou circundando esse sítio de ligação de substrato que comunicam uma atividade de divagem de RNA à molécula. Interferência de RNA (RNAi)
Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula inibidora de RNA, uma molécula assim chamada RNAi, compreendendo uma seqüência de fosfolipase da invenção. A molécula de RNAi compreende uma molé25 cuia de RNA de filamento duplo (dsRNA). O RNAi pode inibir a expressão de um gene de fosfolipase. Em um aspecto, o RNAi é cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos dúplex em comprimento. Ao mesmo tempo que, a invenção não é limitada por qualquer mecanismo particular de ação, o RNAi pode entrar em uma células e causar a degradação de um RNA de filamento simples (ssRNA) de seqüências idênticas ou similares, incluindo mRNAs endógenos. Quando uma célula é exposta ao RNA de filamento duplo (dsRNA), mRNA do gene homólogo é seletivamente degraPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 103/316
87/279 dado por um processo chamado interferência de RNA (RNAi). Um mecanismo básico possível atrás do RNAi é o rompimento de um RNA de filamento duplo (dsRNA) comparando uma seqüência de gene específica em pequenos pedaços chamados RNA de interferência curto, que ativa a degradação de mRNA que comparada sua seqüência. Em um aspecto, os RNAi's da invenção são usados em terapêuticos de silenciamento de gene, observe, Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040 - 1046. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para seletivamente degradar RNA empregando-se os RNAi's da invenção. O processo pode ser praticado in vitro, en vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de RNAi da invenção podem ser usadas para gerar uma mutação de perda de função em uma célula, um órgão ou um animal. Os métodos para preparar e usar moléculas de RNAi para seletivamente degradar RNA são bem conhecidos na técnica, observe, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 6.506.559; 6.511.824; 6.515.109;
6.489.127.
Modificação de Ácidos Nucléicos
A invenção fornece métodos de gerar variantes dos ácidos nucléicos da invenção, por exemplo, aqueles codificando uma enzima de fosfolipase. Estes métodos podem ser repetidos ou usados em várias combina20 ções para gerar enzimas de fosfolipase tendo uma atividade diferente ou alterada ou uma estabilidade diferente ou alterada daquela de uma fosfolipase codificada pelo ácido nucléico padrão. Estes métodos podem da mesma forma ser repetidos ou usados em várias combinações, por exemplo, pare gerar variações em expressão de mensagem/gene, translação de men25 sagem ou estabilidade de mensagem. Em outro aspecto, a composição genética de uma célula é alterada por, por exemplo, modificação de um gene homólogo ex vivo, seguido por sua reinserção na célula.
Um ácido nucléico da invenção pode ser alterado por quaisquer recursos. Por exemplo, métodos estocástico ou aleatório, ou, métodos de evolução direcionada ou não estocástico.
Os métodos para mutação aleatória de genes são bem conhecidos na técnica, observe, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No.
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5.830.696. Por exemplo, mutagênicos podem ser usados para aleatoriamente mutar um gene. Os mutagênicos incluem, por exemplo, radiação gama ou luz ultravioleta ou um mutagênico químico, por exemplo, mitomicina, ácido nitroso, psoralenos fotoativados, sozinhos ou em combinação, para induzir rompimentos de DNA tratáveis para reparar por recombinação. Outros mutagênicos químicos incluem, por exemplo, , bissulfito de sódio, ácido nitroso, hidroxilamina, hidrazina ou ácido fórmico. Outros mutagênicos são análogos de precursores de nucleotídeo, por exemplo, nitrosoguanidina, 5bromouracila, 2-aminopurina, ou acridina. Estes agentes podem ser adicio10 nados a uma reação de PCR no lugar do precursor de nucleotídeo desse modo mutando a seqüência. Agentes de intercalação tais como, proflavina, acriflavina, quinacrina e similares podem ser usados.
Qualquer técnica em biologia molecular pode ser usada, por exemplo, mutagénese de PCR aleatória, observe, por exemplo, Rice (1992)
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5467 - 5471; ou, mutagénese de cassete múltipla combinatorial, observe, por exemplo, Crameri (1995) Biotechniques 18:194 - 196. Alternativamente, os ácidos nucléicos, por exemplo, genes podem ser reagrupados após fragmentação estocástica ou aleatória observe, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Nos. 6.291.242; 6.287.862;
6.287.861; 5.955.358; 5.830.721; 5.824.514; 5.811.238; 5.605.793. Em aspectos alternativos, modificações, adições ou deleções são introduzidas por PCR propensa a erro, embaralhamento, mutagénese direcionada a oligonucleotídeo, PCR por agrupamento, mutagénese de PCR sexual, mutagénese in vivo, mutagénese de cassete, mutagénese em conjunto recorrentea, mu25 tagênese em conjunto exponencial, mutagénese sítio-específica, reagrupamento de gene, mutagénese saturada de sítio de gene (GSSM), reagrupamento por ligação sintética (SLR), recombinação, recombinação de seqüência recorrentea, mutagénese de DNA modificado por fosfotioato, mutagênese padrão contendo uracila, mutagénese de dúplex aberto, mutagénese de reparo de ligação imperfeita pontual, mutagénese de cepa hospedeira deficiente de reparo, mutagénese química, mutagénese radiogênica, mutagênese por deleção, mutagénese por restrição-seleção, mutagénese por restriPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 105/316
89/279 ção-purificação, síntese de gene artificial, mutagênese em conjunto, criação de multímero de ácido nucléico quimérico e /ou uma combinação destes e outros métodos.
As seguintes publicações descrevem uma variedade de méto5 dos e /ou procedimentos de recombinação recorrente a que podem ser incorporados nos métodos da invenção: Stemmer (1999) Molecular breeding of viruses for targeting and other clinicai properties Tumor Targeting 4:1 -4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893 - 896; Chang (1999) Evolution of a cytokine using DNA family shuffling Nature Biotechnology 17:793 - 797;
Minshull (1999) Protein evolution by molecular breeding Current Opinion in Chemical Biology 3:284 - 290; Christians (1999) Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling Nature Biotechnology 17:259 - 264; Crameri (1998) DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution Nature 391:288 15 291; Crameri (1997) Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling, Nature Biotechnology 15:436 - 438; Zhang (1997) Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4504 - 4509; Patten e outros. (1997) Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vac20 cines Current Opinion in Biotechnology 8:724 - 733; Crameri e outros. (1996) Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling Nature Medicine 2:100 - 103; Crameri e outros. (1996) Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling Nature Biotechnology 14:315 - 319; Gates e outros. (1996) Affinity selective isola25 tion of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor 'headpiece dimer' Journal of Molecular Biology 255:373 - 386; Stemmer (1996) Sexual PCR and Assembly PCR In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York, pp.447 - 457; Crameri e Stemmer (1995) Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates ali the permu30 tations of mutant and wildtype cassettes BioTechniques 18:194 - 195; Stemmer e outros. (1995) Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides Gene, 164:49 - 53;
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Stemmer (1995) The Evolution of Molecular Computation Science 270: 1510; Stemmer (1995) Searching Sequence Space Bio/Technology 13:549 - 553; Stemmer (1994) Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling Nature 370:389 - 391; e Stemmer (1994) DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747 -10751.
Os métodos mutacionais de gerar diversidade incluem, por exemplo, mutagenesis sítio-direcionada (Ling e outros. (1997) Approaches to DNA mutagênese: an overview Anal Biochem. 254(2): 157 - 178; Dale e outros. (1996) Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method Methods Mol. Biol. 57:369 - 374; Smith (1985) In vitro mutagênese Ann. Rev. Genet. 19:423 - 462; Botstein & Shortle (1985) Strategies and applications of in vitro mutagenesis Science 229:1193 1201; Carter (1986) Site-directed mutagenesis Biochem. J. 237:1 - 7; e
Kunkel (1987) The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin)); mutagênese empregando-se padrões contendo uracila (Kunkel (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel e out20 ros. (1987) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection Methods in Enzymol. 154, 367 - 382; e Bass e outros. (1988) Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities Science 242:240245); mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo (Methods in Enzymol. 100: 468 - 500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329 - 350 (1987); Zoller &
Smith (1982) Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the produetion of point mutations in any DNA fragment Nucleic Acids Res. 10:6487 - 6500; Zoller & Smith (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors Methods in Enzymol. 100:468 - 500; e Zoller & Smith (1987)
Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template Methods in Enzymol. 154:329 - 350); mutagênese de DNA modificado por fosforotioato (Taylor e
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91/279 outros. (1985) The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA Nucl. Acids Res. 13: 8749 - 8764; Taylor e outros. (1985) The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA Nucl. Acids
Res. 13: 8765 - 8787 (1985); Nakamaye (1986) Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis Nucl. Acids Res. 14: 9679 - 9698; Sayers e outros. (1988) Ύ-Τ Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis Nucl. Acids Res. 16:791 - 802; e Sayers e outros. (1988) Strand specific cleavage of phosphorothioate-contendo DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide Nucl. Acids Res. 16: 803 - 814); mutagênese empregando-se DNA dúplex aberto (Kramer e outros. (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction Nucl. Acids Res. 12: 9441
- 9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA 154:350 - 367; Kramer e outros. (1988) Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations Nucl. Acids Res. 16: 7207; e Fritz e outros. (1988) Oligonucleotide-directed con20 struction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro Nucl. Acids Res. 16: 6987 - 6999).
Os protocolos adicionais empregados nos métodos da invenção incluem reparo de ligação imperfeita pontual (Kramer (1984) Point Mismatch Repair Cell 38:879 - 887), mutagênese empregando-se cepas hospedei25 ras deficientes de reparo (Carter e outros. (1985) Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors Nucl. Acids Res. 13: 4431 4443; e Carter (1987) Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors Methods in Enzymol. 154: 382 - 403), mutagênese por deleção (Eghtedarzadeh (1986) Use of oligonucleotides to generate large deletions
Nucl. Acids Res. 14: 5115), restrição-seleção e restrição-seleção e restriçãopurificação (Wells e outros. (1986) Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition State of subtilisin Phil. Trans. R. Soc. Lond. A
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317: 415 - 423), mutagênese por síntese de gene total (Nambiar e outros. (1984) Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein Science 223: 1299 - 1301; Sakamar e Khorana (1988) Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer seg5 ment guanine nucleotide-binding protein (transducin) Nucl. Acids Res. 14: 6361 - 6372; Wells e outros. (1985) Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites Gene 34:315 323; e Grundstrom e outros. (1985) Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316), reparo de rompimento de filamento duplo (Mandecki (1986); Arnold (1993) Protein engineering for unusual environments Current Opinion in Biotechnology 4:450-455. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:7177 - 7181). Os detalhes adicionais em muitos dos métodos anteriormente mencionados podem ser encontrados em Enzymology Volume 154, que da mesma forma descreve controles úteis para diagnósticos e solução de problemas com vários métodos de mutagênese.
Observe, da mesma forma Patente dos Estados Unidos Nos.
5.605.793 em Stemmer (25 de Fevereiro, 1997), Methods for In Vitro Recombination; Patente dos Estados Unidos No. 5.811.238 em Stemmer e outros. (22 de Setembro, 1998) Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination; Patente dos Estados Unidos No. 5.830.721 em Stemmer e outros. (3 de No25 vembro, 1998), DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly; Patente dos Estados Unidos No. 5.834.252 em Stemmer, e outros. (10 de Novembro, 1998) End-Complementary Polymerase Reaction; Patente dos Estados Unidos No. 5.837.458 em Minshull, e outros. (17 de Novembro, 1998), Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engi30 neering; WO 95/22625, Stemmer e Crameri, Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly; WO 96/33207 by Stemmer and Lipschutz End Complementary Polymerase Chain Reaction; WO 97/20078 por
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Stemmer e Crameri Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination; WO 97/35966 por Minshull e Stemmer, Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering; WO 99/41402 por Punnonen e outros. Targeting of Genetic
Vaccine Vectors; WO 99/41383 por Punnonen e outros. Antigen Library Immunization; WO 99/41369 por Punnonen e outros. Genetic Vaccine Vector Engineering; WO 99/41368 por Punnonen e outros. Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines; EP 752008 por Stemmer e Crameri, DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reas10 sembly; EP 0932670 por Stemmer Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination; WO 99/23107 por Stemmer e outros, Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling; WO 99/21979 por Apt e outros, Human Papillomavirus Vectors; WO 98/31837 por dei Cardayre e outros. Evolution of Whole Cells and Organ15 isms by Recursive Sequence Recombination; WO 98/27230 por Patten e Stemmer, Methods and Compositions for Polypeptide Engineering; WO 98/27230 por Stemmer e outros, Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection, WO 00/00632, Methods for Generating Highly Diverse Libraries, WO 00/09679, Methods for Obtain20 ing in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences, WO 98/42832 por Arnold e outros, Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers, WO 99/29902 por Arnold e outros, Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences, WO 98/41653 por Vind, An in Vitro Method for Construction of a
DNA Library, WO 98/41622 por Borchert e outros, Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling, e WO 98/42727 por Pati e Zarling, Sequence Alterations using Homologous Recombination.
Certos pedidos dos Estados Unidos fornecem detalhes adicionais quanto aos vários métodos de geração de diversidade, incluindo
SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES por Patten e outros, depositado em 28 de Setembro, 1999, (U.S. Ser. No. 09/407.800); EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE REPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 110/316
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COMBINATION por dei Cardayre e outros, depositado em 15 de Julho, 1998 (U.S. Ser. No. 09/166,188), e 15 de Julho, 1999 (U.S. Ser. No. 09/354,922); OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION por Crameri e outros, depositado em 28 de Setembro, 1999 (U.S. Ser. No. 09/408,392), e OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC
ACID RECOMBINATION por Crameri e outros, depositado em 18 de Janeiro, 2000 (PCT/US00/01203); USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING por Welch e outros, depositado em 28 de Setembro, 1999 (U.S. Ser. No. 09/408,393); METHODS
FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS por Selifonov e outros, depositado em 18 de Janeiro, 2000, (PCT/US00/01202) e, por exemplo, METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS por Selifonov e outros, depositado em 18 de Julho, 2000 (U.S. Ser. No. 09/618,579); METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS por Selifonov e Stemmer, depositado em 18 de Janeiro, 2000 (PCT/US00/01138); e SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC
ACID FRAGMENT ISOLATION por Affholter, depositado em 6 de Setembro, 2000 (U.S. Ser. No. 09/656,549).
Os métodos de evolução direcionada ou não estocásticos incluem, por exemplo, mutagênese de saturação (GSSM), reagrupamento por ligação sintética (SLR), ou uma combinação destes são empregados para modificar os ácidos nucléicos da invenção para gerar fosfolipases com propriedades novas ou alteradas (por exemplo, atividade sob condições alcalinas ou altamente acídicas, temperaturas elevadas, e similares). Os polipeptídeos codificados pelos ácidos nucléicos modificados podem ser avaliados quanto a uma atividade antes de testar quanto a uma fosfolipase ou outra atividade. Qualquer protocolo ou modalidade de teste pode ser usado, por exemplo, empregando-se uma plataforma de disposição capilar. Observe, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos Nos. 6.280.926; 5.939.250.
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Mutagênese por saturação, ou, GSSM
Em um aspecto da invenção, modificação de gene não estocástica, um processo de evolução direcionada, é usado para gerar fosfolipases por propriedades novas ou alteradas. As variações deste método foram denominadas mutagênese de saturação de sítio de gene, mutagênese de saturação de sítio, mutagênese de saturação ou simplesmente GSSM. Elas podem ser empregadas em combinação com outros processos de mutagenização. Observe, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos Nos. 6.171.820; 6.238.884. Em um aspecto, GSSM compreende fornecer um po10 linucleotídeo padrão e uma pluralidade de oligonucleotídeos, onde cada oligonucleotídeo compreende uma seqüência homóloga ao polinucleotídeo padrão, desse modo alvejando uma seqüência específica do polinucleotídeo padrão, e uma seqüência que é uma variante do gene homólogo; gerando polinucleotídeos descendentes compreendendo variações de seqüência não estocástica reproduzindo-se o polinucleotídeo padrão com os oligonucleotídeos, desse modo gerando polinucleotídeos compreendendo variações de seqüência de gene homólogo.
Em um aspecto, os iniciadores de códon contendo uma seqüência de N,N,G/T degenerada são usados para introduzir mutações pontuais em um polinucleotídeo, a fim de gerar um grupo de polipeptídeos descendentes em que uma faixa completa de substituições de aminoácido simples é representada em cada posição de aminoácido, por exemplo, um resíduo de aminoácido em um sítio ativo de enzima ou sítio de ligação de ligando alvejado a ser modificado. Estes oligonucleotídeos podem compreender uma primeira seqüência homóloga contígua, uma seqüência de N,N,G/T degenerada, e, opcionalmente, uma segunda seqüência homóloga. Os produtos translacionais descendentes a jusante do uso de tais oligonucleotídeos incluem todas as alterações de aminoácido possíveis em cada sítio de aminoácido junto ao peptídeo, porque a degeneração da seqüência N,N,G/T inclui códons para todos os 20 aminoácidos. Em um aspecto, um tal oligonucleotídeo degenerado (compreendido de, por exemplo, um cassete de N,N,G/T) é usado para submeter cada códon original em um padrão de poliPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 112/316
96/279 nucleotídeo parental em uma faixa completa de substituições de códon. Em um aspecto, pelo menos dois cassetes degenerados são usados - no mesmo oligonucleotídeo ou não, para submeter pelo menos dois códons originais em um padrão de polinucleotídeo parenteral em uma faixa completa de substituições de códon. Por exemplo, mais do que uma seqüência de N,N,G/T pode estar contida em um oligonucleotídeo para introduzir mutações de aminoácido em mais do que um sítio. Esta pluralidade de seqüências de N,N,G/T pode ser diretamente contígua ou separada por uma ou mais seqüências de nucleotídeo adicional. Em outro aspecto, os oligonucle10 otídeos aproveitáveis para introduzir adições e deleções podem ser usados sozinhos ou em combinação com os códons contendo uma seqüência de N,N,G/T, para introduzir qualquer combinação ou permutação de adições de aminoácido, deleções e /ou substituições.
Em um aspecto, mutagênese simultânea de duas ou mais posi15 ções de aminoácido contíguas é feita empregando-se um oligonucleotídeo que contém tripletos N,N,G/T contíguos, isto é, uma seqüência de (N,N,G/T)n degenerada. Em outro aspecto, cassetes degenerados tendo menos degeneração do que a seqüência de N,N,G/T são usados. Por exemplo, pode ser desejável em alguns casos usar (por exemplo, em um oligonucleotídeo) uma seqüência de tripleto degenerada compreendida de apenas um N, onde o referido N pode estar na primeira, segunda ou terceira posição do tripleto. Quaisquer outras bases incluindo quaisquer combinações ou permutações destas podem ser usadas nas duas posições restantes do tripleto. Alternativamente, pode ser desejável em alguns casos usar (por exemplo, em um oligo) uma seqüência de tripleto N,N,G/T degenerado.
Em um aspecto, o uso de tripletos degenerados (por exemplo, tripletos N,N,G/T) leva em conta a fácil geração e sistemática de uma faixa completa de aminoácidos naturais possíveis (para um total de 20 aminoácidos) a cada e toda a posição de aminoácido em um polipeptídeo (em aspec30 tos alternativos, os métodos da mesma forma incluem geração de menos do que todas as substituições possíveis por resíduo de aminoácido, ou códon, posição). Por exemplo, para um polipeptídeo de 100 aminoácidos, 2000 esPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 113/316
97/279 pécies distintas (isto é, 20 aminoácidos possíveis por posição X 100 posições de aminoácido) podem ser geradas. Através do uso de um oligonucleotídeo ou grupo de oligonucleotídeos contendo um tripleto N,N,G/T degenerado, 32 seqüências individuais podem codificar para todos os 20 aminoáci5 dos naturais possíveis. Desta maneira, em um vaso de reação no qual uma seqüência de polinucleotídeo parental é submetida à mutagênese por saturação empregando-se pelo menos um tal oligonucleotídeo, existem 32 polinucleotídeos descendentes distintos gerados codificando 20 polipeptídeos distintos. Em contraste, o uso de um oligonucleotídeo não degenerado na mutagênese sítio-dirigida leva a apenas um produto de polipeptídeo descendente por vaso de reação. Os oligonucleotídeos não degenerados podem opcionalmente ser usados em combinação com iniciadores degenerados descobertos; por exemplo, oligonucleotídeos não degenerados podem ser usados para gerar mutações pontuais específicas em um polinucleotídeo de funcionamento. Isto fornece um recurso para gerar mutações pontuais silenciosas específicas, mutações pontuais levando a alterações de aminoácido correspondentes e mutações pontuais que causam a geração de códons de terminação e a expressão correspondente de fragmentos de polipeptídeo.
Em um aspecto, cada vaso de reação de mutagênese por saturação contém polinucleotídeos codificando pelo menos 20 moléculas de polipeptídeo descendentes (por exemplo, fosfolipase) tal que todos os 20 aminoácidos naturais são representados em uma posição de aminoácido específica correspondente à posição do códon mutagenizada no polinucleotídeo parental (outros aspectos usam menos do que todas as 20 combinações naturais). Os polipeptídeos descendentes degenerados 32 vezes gerados de cada vaso de reação de mutagênese por saturação podem ser submetidos à amplificação clonal (por exemplo, clonados em um hospedeiro adequado, por exemplo, hospedeiro de E. coli, empregando-se, por exemplo, um vetor de expressão) e submetidos à avaliação de expressão. Quando um polipeptídeo descendente individual é identificado avaliando-se para exibir uma alteração favorável na propriedade (quando comparado ao polipeptídeo paPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 114/316
98/279 renteral, tal como, atividade de fosfolipase aumentada sob condições acídicas ou alcalinas), ele pode ser seqüenciado para identificar a substituição de aminoácido correspondentemente favorável contida nisso.
Em um aspecto, na mutagenização cada e toda a posição de aminoácido em um polipeptídeo parenteral empregando-se mutagênese por saturação como aqui descrito, alterações de aminoácido favoráveis podem ser identificadas em mais do que uma posição de aminoácido. Uma ou mais novas moléculas descendentes podem ser geradas as quais contêm uma combinação de todas ou parte destas substituições de aminoácido favorá10 veis. Por exemplo, se 2 alterações de aminoácido favoráveis específicas são identificadas em cada das 3 posições de aminoácido em um polipeptídeo, as permutações incluem 3 possibilidades em cada posição (nenhuma alteração do aminoácido original, e cada das duas alterações favoráveis) e 3 posições. Desta maneira, existem 3 x 3 x 3 ou 27 possibilidades totais, incluindo 7 que foram previamente examinadas - 6 mutações pontuais simples (isto é, 2 em cada das três posições) e nenhuma alteração em qualquer posição.
Em outro aspecto, a mutagênese por saturação de sítio pode ser empregada juntamente com outros recursos estocásticos ou não estocásticos, por exemplo, reagrupamento por ligação sintética (observe, abaixo), embaralhamento, quimerização, recombinação e outros processos de mutagenização e agentes de mutagenização. Esta invenção fornece o uso de qualquer(quaisquer) processo(s) de mutagenização, incluindo mutagênese por saturação, de uma maneira iterativa.
Reagrupamento por Ligação Sintética (SLR)
A invenção fornece um sistema de modificação de gene não estocástica denominado reagrupamento por ligação sintética ou simplesmente SLR, um processo de evolução direcionada para gerar fosfolipases com novas ou propriedades alteradas. SLR é um método de ligar fragmentos de oligonucleotídeo juntos não estocasticamente. Este método dife30 re do embaralhamento de oligonucleotídeo estocástico em que os bloqueios de construção de ácido nucléico não são embaralhados, concatenados ou quimerizados aleatoriamente, porém de preferência são agrupados não esPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 115/316
99/279 tatisticamente. Observe, por exemplo, Pedido de Patente Serial dos Estados Unidos No. (USSN) 09/332.835 entitulado Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution e depositado em 14 de Junho, 1999 (USSN 09/332.835). Em um aspecto, SLR compreende as seguintes etapas: (a) fornecer um polinucleotídeo padrão, onde o polinucleotídeo padrão compreende a seqüência codificando um gene homólogo; (b) fornecer uma pluralidade de polinucleotídeos de bloqueio de construção, onde os polinucleotídeos de bloqueio de construção são designados reagrupar cruzado com o polinucleotídeo padrão em uma seqüência predeterminada, e um polinucleo10 tídeo de bloqueio de construção compreende uma seqüência que é uma variante do gene homólogo e uma seqüência homóloga ao polinucleotídeo padrão flanqueando a seqüência variante; (c) combinar um polinucleotídeo de bloqueio de construção com um polinucleotídeo padrão tal que os reagrupamentos cruzados de polinucleotídeo de bloqueio de construção com o polinucleotídeo padrão geram polinucleotídeos compreendendo variações de seqüência de gene homólogo.
SLR não depende da presença de níveis elevados de homologia entre polinucleotídeos a serem reagrupados. Desta maneira, este método pode ser usado para não estocasticamente gerar bibliotecas (ou grupos) de moléculas descendentes compreendidas de mais de 101θθ diferentes quimeras. SLR pode ser usado para gerar bibliotecas compreendidas de mais de 101θθθ diferentes quimeras descendentes. Desta maneira, os aspectos da presente invenção incluem métodos não estocásticos de produzir um grupo de molécula de ácido nucléico quimérica finalizada compartilhando um agru25 pamento total a fim de que seja selecionado por projeto. Este método inclui as etapas de gerar por projeto uma pluralidade de bloqueios de construção de ácido nucléico específico tendo extremidades ligáveis mutuamente compatíveis aproveitáveis, e agrupando estes bloqueios de construção de ácido nucléico, tal que uma ordem de agrupamento total designada é obtida.
As extremidades ligáveis mutuamente compatíveis dos bloqueios de construção de ácido nucléico a serem agrupadas são consideradas ser aproveitáveis para este tipo de agrupamento ordenado se elas permiPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 116/316
100/279 tem os bloqueios de construção serem acoplados em ordens determinadas. Desta maneira, a ordem de agrupamento total na qual os bloqueios de construção de ácido nucléico podem ser acoplados é especificada pelo planejamento das extremidades ligáveis. Se mais do que uma etapa de agrupamen5 to deve ser usada, em seguida a ordem de agrupamento total na qual os bloqueios de construção de ácido nucléico podem ser acoplados, é da mesma forma especificada pela ordem sequencial da(s) etapas(s) de agrupamento. Em um aspecto, os pedaços de construção anelados são tratados com uma enzima, tal que uma ligase (por exemplo, T4 DNA ligase), obtém ligação covalente dos pedaços de construção.
Em um aspecto, o planejamento dos bloqueios de construção de oligonucleotídeo é obtido analisando-se um grupo de padrões de seqüência de ácido nucléico do progenitor que serve como uma base para produzir um grupo de descendentes de polinucleotídeos quiméricos finalizados. Estes padrões de oligonucleotídeo parental servem como uma fonte de informação de seqüência que auxilia no planejamento dos bloqueios de construção de ácido nucléico que devem ser mutagenizados, por exemplo, quimerizados ou embaralhados.
Em uma modalidade deste método, as seqüências de uma plu20 ralidade de padrões de ácido nucléico parental são alinhadas a fim de selecionar um ou mais pontos de demarcação. Os pontos de demarcação podem estar localizados em uma área de homologia, e são compreendidos de um ou mais nucleotídeos. Estes pontos de demarcação são preferivelmente compartilhados por pelo menos dois padrões de progenitores. Os pontos de demarcação podem desse modo ser usados para delinear as fronteiras dos bloqueios de construção de oligonucleotídeo a serem gerados a fim de redispor os polinucleotídeos parentais. Os pontos de demarcação identificados e selecionados nas moléculas progenitoras servem como pontos de quimerização potencial no agrupamento das moléculas descendentes quiméricas finais. Os pontos de demarcação podem ser uma área de homologia (compreendida de pelo menos uma base de nucleotídeo homólogo) compartilhada por pelo menos duas seqüências de polinucleotídeo parental. AlternatiPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 117/316
101/279 vamente, um ponto de demarcação pode ser uma área de homologia que é compartilhada por pelo menos metade das seqüências de polinucleotídeo parental, ou, pode ser uma área de homologia que é compartilhada por pelo menos dois terços das seqüências de polinucleotídeo parental. Ainda mais preferivelmente um ponto de demarcação aproveitável é uma área de homologia que é compartilhada por pelo menos três quartos das seqüências de polinucleotídeo parenteral, ou, pode ser compartilhada por quase todas as seqüências de polinucleotídeo parenteral. Em um aspecto, um ponto de demarcação é uma área de homologia que é compartilhada por todas as se10 qüências de polinucleotídeo parenteral.
Em um aspecto, um processo de reagrupamento por ligação é realizado exaustivamente a fim de gerar uma biblioteca exaustiva de polinucleotídeos quiméricos descendentes. Em outras palavras, todas as combinações ordenadas possíveis dos bloqueios de construção de ácido nucléico são representadas no grupo de moléculas de ácido nucléico quiméricas finalizadas. Ao mesmo tempo, em outra modalidade, a ordem de agrupamento (isto é, a ordem de agrupamento de cada bloqueio de construção na seqüência de 5' a 3 de cada ácido nucléico quimérico finalizado) em cada combinação é por planejamento (ou não estocástica) como anteriormente descrito. Por causa da natureza não estocástica desta invenção, a possibilidade de produtos laterais indesejáveis é grandemente reduzida.
Em outro aspecto, o método de reagrupamento por ligação é realizado sistematicamente. Por exemplo, o método é realizado a fim de gerar uma biblioteca sistematicamente compartimentada de moléculas des25 cendentes, com compartimentos que podem ser avaliados sistematicamente, por exemplo, um por um. Em outras palavras esta invenção fornece que, através do uso judicioso e seletivo de bloqueios de construção de ácido nucléico, acoplados com o uso judicioso e seletivo de reações de agrupamento seqüencialmente escalonadas, um planejamento pode ser obtido onde gru30 pos específicos de produtos descendentes são feitos em cada dos vários vasos de reação. Isto permite um procedimento de avaliação e exame ser realizado. Desta maneira, estes métodos permitem um número potencialPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 118/316
102/279 mente muito grande de moléculas descendentes a serem examinadas sistematicamente em grupos menores. Por causa de sua capacidade de realizar quimerizações de uma maneira que é altamente flexível ainda exaustiva e sistemática igualmente, particularmente quando existe um baixo nível de homoiogia entre as moléculas progenitoras, esses métodos fornecem a geração de uma biblioteca (ou grupo) compreendida de um grande número de moléculas descendentes. Por causa da natureza não estocástica da invenção de reagrupamento de ligação instantânea, as moléculas descendentes geradas preferivelmente compreendem uma biblioteca de moléculas de áci10 do nucléico quiméricas finalizadas tendo uma ordem de agrupamento total que é selecionada por planejamento. Os métodos e evolução direcionada otimizada e mutagênese por saturação da mesma forma podem ser usados para gerar diferentes espécies moleculares descendentes. É apreciado que a invenção fornece liberdade de escolha e controle com respeito à seleção de pontos de demarcação, o tamanho e o número de bloqueios de construção de ácido nucléico, e o tamanho e planejamento das acoplagens. É apreciado, além disso, que o requerimento para homoiogia intermolecular é altamente relaxado para a operabilidade desta invenção. De fato, os pontos de demarcação podem ainda ser selecionados em áreas de pouca ou ne20 nhuma homoiogia intermolecular. Por exemplo, por causa da oscilação do códon, isto é, a degeneração de códons, substituições de nucleotídeo podem ser introduzidas em bloqueios de construção de ácido nucléico sem alterar o aminoácido originalmente codificado no padrão progenitor correspondente. Alternativamente, um códon pode ser alterado tal que a codifica25 ção para um aminoácido originalmente é alterada. Esta invenção fornece que tais substituições podem ser introduzidas no bloqueio de construção de ácido nucléico a fim de aumentar a incidência de pontos de demarcação intermolecularmente homólogos e desta maneira permite um número aumentado de acoplamentos a serem obtidos entre os bloqueios de constru30 ção, que sucessivamente permite um número maior de moléculas quiméricas progênicas a serem geradas.
Em outro aspecto, a natureza sintética da etapa na qual os bloPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 119/316
103/279 queios de construção são gerados permite o planejamento e introdução de nucleotídeos (por exemplo, um ou mais nucleotídeos, que podem ser, por exemplo, códons, íntrons ou seqüências reguladoras) que podem mais tarde ser opcionalmente removidos em um processo in vitro (por exemplo, muta5 gênese) ou em um processo in vivo (por exemplo, utilizando-se a capacidade de união do gene de um organismo hospedeiro. É apreciado que em muitos casos a introdução destes nucleotídeos pode da mesma forma ser desejável por muitas outras razões além do benefício potencial de criar um ponto de demarcação aproveitável.
Em um aspecto, um bloqueio de construção de ácido nucléico é usado para introduzir um íntron. Desta maneira, os íntrons funcionais são introduzidos em um gene feito pelo homem fabricado de acordo com os métodos aqui descritos. O(s) íntrons artificialmente introduzido(s) pode(m) ser funcional(is) em células hospedeiras para união do gene de uma tal maneira que os íntrons de ocorrência natural sejam úteis funcionalmente na união do gene.
Sistema de Evolução Direcionada Otimizada
A invenção fornece um sistema de modificação e gene não estocástico denominado sistema de evolução direcionada otimizada para gerar fosfolipases com novas ou propriedades alteradas. A evolução direcionada otimizada é direcionada ao uso de ciclos repetidos de reclassificação, recombinação e seleção que leva em conta a evolução molecular direcionada de ácidos nucléicos através da recombinação. A evolução direcionada otimizada permite a geração de uma grande população de seqüências qui25 méricas evoluídas, onde a população gerada é significantemente enriquecida para seqüências que tenham um número predeterminado de eventos com cruzamento.
Um evento com cruzamento é um ponto em uma seqüência quimérica onde um deslocamento na seqüência ocorre da variante parental para outra variante parental. Um tal ponto está normalmente na junção de onde oligonucleotídeos de duas origens são ligados juntos para formar uma seqüência simples. Este método permite o cálculo das concentrações correPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 120/316
104/279 tas de seqüências de oligonucleotídeo para que a população quimérica final de seqüências seja enriquecida para o número selecionado de eventos com cruzamento. Isto fornece mais controle sobre a seleção de variantes quiméricas tendo um número predeterminado de eventos com cruzamento.
Além disso, este método fornece um recurso conveniente para explorar uma quantidade tremenda do espaço de variante de proteína possível em comparação a outros sistemas. Previamente, se algum gerou, por exemplo, 1013 de moléculas quiméricas durante a reação, seria extremamente difícil testar um tal número elevado de variantes quiméricas para uma atividade particular. Além disso, uma porção significante da população descendente teria um número muito elevado de eventos com cruzamento que resultou em proteínas que foram menos prováveis de ter níveis aumentados de uma atividade particular. Empregando-se estes métodos, a população de moléculas quiméricas pode ser enriquecida para aquelas variantes que têm um número particular de eventos com cruzamento. Desta maneira, embora algum possa ainda gerar 1013 de moléculas quiméricas durante a reação, cada qual das moléculas selecionadas para outra análise mais provavelmente tem, por exemplo, apenas três eventos com cruzamento. Porque a população descendente resultante pode ser inclinada a ter um número predeter20 minado de eventos com cruzamento, as fronteiras sobre a variedade funcional entre as moléculas quiméricas são reduzidas. Isto fornece um número mais manejável de variáveis quando calculando qual oligonucleotídeo dos polinucleotídeos parentais originais podem ser responsáveis por afetar uma característica particular.
Um método para criar uma seqüência de polinucleotídeo descendente quimérica é criar oligonucleotídeos correspondentes aos fragmentos ou porções de cada seqüência parental. Cada oligonucleotídeo preferivelmente inclui uma única região de superposição para que misturar os oligonucleotídeos juntos resulte em uma nova variante que tenha cada frag30 mento de oligonucleotídeo agrupado na ordem correta. A informação adicional pode da mesma forma ser constatada em USSN 09/332.835. O número de oligonucleotídeos gerados para cada variante parental suporta uma relaPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 121/316
105/279 ção para o número total de cruzamentos resultantes na molécula quimérica que é finalmente criada. Por exemplo, três variantes seqüência de nucleotídeo parental podem ser fornecidas para suportar uma reação de ligação a fim de descobrir uma variante quimérica tendo, por exemplo, maior atividade em temperaturas elevadas. Como um exemplo, um grupo de 50 seqüências de oligonucleotídeo pode ser gerado correspondente a cada porção de cada variante parental. Conseqüentemente, durante o processo de reagrupamento de ligação pode ser até 50 eventos com cruzamento dentro de cada das seqüências quiméricas. A probabilidade que cada dos polinucleotídeos qui10 méricos gerados conterá oligonucleotídeos de cada variante parental em ordem alternante é muito baixa. Se cada fragmento de oligonucleotídeo está presente na reação de ligação na mesma quantidade molar, é provável que em algumas posições, oligonucleotídeos do mesmo polinucleotídeo parental se ligarão próximo a um outro e desta maneira não resultará em um evento com cruzamento. Se a concentração de cada oligonucleotídeo de cada origem é mantida constante durante qualquer etapa de ligação neste exemplo, existe 1/3 de chance (assumindo 3 origens) que um oligonucleotídeo da mesma variante parental se ligará dentro da seqüência quimérica e não produzirá cruzamento.
Conseqüentemente, uma função de densidade de probabilidade (PDF) pode ser determinada para predizer a população de eventos com cruzamento que estão provavelmente a ocorrer durante cada etapa em uma reação de ligação, dado um número de grupo de variantes parentais, um número de oligonucleotídeos correspondentes a cada variante e as concen25 trações de cada variante durante cada etapa na reação de ligação. A estatística e matemática através da determinação do PDF são descritas abaixo. Utilizando-se estes métodos, alguém pode calcular uma tal função de densidade de probabilidade e desta maneira enriquecer a população de descendente quimérica para um número predeterminado de eventos com cruza30 mento resultante de uma reação de ligação particular. Além disso, um número alvo de eventos com cruzamento pode ser predeterminado e o sistema em seguida programado para calcular as quantidades de partida de cada
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106/279 oligonucleotídeo parental durante cada etapa na reação de ligação para resultar em uma função de densidade de probabilidade que se centra sobre o número predeterminado de eventos com cruzamento. Estes métodos são direcionados ao uso de ciclos repetidos de seleção, recombinação e reclas5 sificação redutiva que leva em conta a evolução molecular direcionada de um ácido nucléico codificando um polipeptideo através de recombinação. Este sistema permite a geração de uma grande população de seqüências quiméricas evoluídas, onde a população gerada é significantemente enriquecida para seqüências que têm um número predeterminado de eventos com cruzamento. Um evento com cruzamento é um ponto em uma seqüência quimérica onde uma mudança ocorre da variante parental para outra variante parental. Um tal ponto está normalmente na junção de onde oligonucleotídeos de duas origens são ligados juntos para formar uma seqüência simples. O método permite o cálculo das concentrações corretas de se15 qüências de oligonucleotídeos a fim de que a concentração quimérica final de seqüências seja enriquecida para o número escolhido de eventos com cruzamento. Isto fornece mais controle sobre a escolha das variantes quiméricas tendo um número predeterminado de eventos com cruzamento.
Além disso, estes métodos fornecem um recurso conveniente para explorar uma quantidade tremenda do espaço de variante de proteína possível em comparação a outros sistemas. Empregando-se os métodos aqui descritos, a população de moléculas quiméricas pode ser enriquecida para essas variantes que têm um número particular de eventos com cruzamento. Desta maneira, embora algum possa ainda gerar 1013 de moléculas quiméricas durante a reação, cada qual das moléculas selecionadas para outra análise mais provavelmente tem, apenas três eventos com cruzamento. Porque a população descendente resultante pode ser inclinada a ter um número predeterminado de eventos com cruzamento, a fronteira sobre a variedade funcional entre as moléculas quiméricas é reduzida. Isto fornece um número mais manejável de variáveis quando calculando que o oligonucleotídeo dos polinucleotídeos parentais originais pode ser responsável por afetar uma característica particular.
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Em um aspecto, o método cria uma seqüência de polinucleotídeo descendente quimérica criando-se oligonucleotídeos correspondentes aos fragmentos ou porções de cada seqüência parental. Cada oligonucleotídeo preferivelmente inclui uma única região de superposição a fim de que a mistura dos oligonucleotídeos juntos resulte em uma nova variante que tem cada fragmento de oligonucleotídeo agrupado na ordem correta. Observe, da mesma forma USSN 09/332.835.
O número de oligonucleotídeos gerado para cada variante parental suporta uma relação para o número total de cruzamentos resultantes na molécula quimérica que é ultimamente criada. Por exemplo, três variantes de seqüência de nucleotídeo parental pode ser fornecida para sofrer uma reação de ligação a fim de descobrir uma variante quimérica tendo, por exemplo, maior atividade em alta temperatura. Como um exemplo, um grupo de 50 seqüências de oligonucleotídeo podem ser geradas correspondendo a cada porção de cada variante parental. Conseqüentemente, durante a ligação o processo de reagrupamento pode ser até 50 eventos com cruzamento dentro de cada das seqüências quiméricas. A probabilidade que cada dos polinucleotídeos quiméricos gerados conterão oligonucleotídeos de cada variante parental em ordem alternante é muito baixa. Se cada fragmento de oligonucleotídeo está presente na reação de ligação na mesma quantidade molar é provável que em algumas posições os oligonucleotídeos do mesmo polinucleotídeo parental ligarão próximos um ao outro e desse modo não resulta em um evento de cruzamento. Se a concentração de cada oligonucleotídeo de cada paciente é mantida constante durante qualquer etapa de ligação neste exemplo, existe uma chance de 1/3 (assumindo 3 origens) que um oligonucleotídeo da mesma variante parental ligará dentro da seqüência quimérica e não produzir cruzamento.
Conseqüentemente, uma função de densidade de probabilidade (PDE) pode ser determinada para prognosticar a população de eventos com cruzamento que são prováveis de ocorrer durante cada etapa em uma região de ligação dada em um número determinado de variantes parentais, vários oligonucleotídeos correspondendo a cada variante, e as concentrações
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108/279 de cada variante durante cada etapa na região de ligação. A estatística e matemática atrás da determinação da PDF são descritas abaixo. Alguém pode calcular uma tal função de densidade de probabilidade, e desse modo enriquecer a população de descendência quimérica para um número prede5 terminado de eventos com cruzamento resultando de uma reação de ligação particular. Além disso, um número alvo de eventos com cruzamento pode ser predeterminado, e o sistema então programado para calcular as quantidades de partida de cada oligonucleotídeo parental durante cada etapa na reação de ligação para resultar em uma função de densidade de probabili10 dade que centra sobre o número predeterminado de eventos com cruzamento.
Determinação de Eventos com Cruzamento
Modalidades da invenção incluem um sistema e software que recebe uma função de densidade de probabilidade de cruzamento desejado (PDF), o número de genes origem a ser reagrupados, e o número de fragmentos no reagrupamento como entradas. A saída deste programa é uma PDF de fragmento que pode ser usada para determinar uma receita para produzir genes reagrupados, e a PDF de cruzamento estimada daqueles genes. O processamento descrito aqui é preferivelmente realizado em MA20 TI_AB® (The Mathworks, Natick, Massachusetts) uma linguagem de programação e ambiente de desenvolvimento para computação técnica.
Processos Iterativos
Na prática da invenção, estes processos podem ser iterativamente repetidos. Por exemplo, um ácido nucléico (ou, o ácido nucléico) res25 ponsável por um fenótipo de fosfolipase alterado é re-isolado, novamente modificado, retestado para atividade. Este processo pode ser iterativamente repetido até que um fenótipo desejado seja construído. Por exemplo, uma trilha catabólica ou anabólica bioquímica completa pode ser construída em uma célula, incluindo atividade de fosfolipase.
Similarmente, se é determinado que um oligonucleotídeo particular não tem de modo algum nenhum efeito sobre a característica desejada (por exemplo, um novo fenótipo de fosfolipase), ele pode ser removido como
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109/279 uma variável sintetizando-se oligonucleotídeos parentais maiores que incluem a seqüência a ser removida. Visto que a incorporação da seqüência dentro de uma seqüência maior previne quaisquer eventos com cruzamento, não mais existirá qualquer variação desta seqüência nos polinucleotídeos de descendência. Esta prática iterativa de determinar quais oligonucleotídeos estão mais relacionados à característica desejada, e quais não estão relacionados, permite a exploração mais eficiente de todas as variantes de proteína possíveis que poderia ser fornecida em uma atividade ou característica particular.
Embaralhamento in vivo
O embaralhamento in vivo das moléculas é o uso em métodos da invenção que fornecem variantes de polipeptídeos da invenção, por exemplo, anticorpos, enzimas de fosfolipase, e similares. O embaralhamento in vivo pode ser realizado utilizando a propriedade natural de células para recombinar os multímeros. Enquanto a recombinação in vivo tem fornecido a rotina natural principal para diversidade molecular, a recombinação genética permanece um processo relativamente complexo que envolve 1) o reconhecimento das homologias; 2) divagem do filamento, invasão do filamento, e etapas metabólicas levando à produção de quiasma recombinante; e final20 mente 3) a resolução de quiasma em moléculas recombinadas distintas. A formação do quiasma requer o reconhecimento de seqüências homólogas.
Em um aspecto, a invenção fornece um método para produzir um polinucleotídeo híbrido de pelo menos um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo. A invenção pode ser usada para produzir um poli25 nucleotídeo híbrido introduzindo-se pelo menos um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo que compartilha pelo menos uma região da homologia de seqüência parcial em uma célula hospedeira adequada. As regiões da homologia de seqüência parcial promovem processos que resultam na reorganização da seqüência produzindo um polinucleotídeo híbrido.
O termo polinucleotídeo híbrido, como usado aqui, é qualquer seqüência de nucleotídeo que resulta do método da presente invenção e contém seqüência de pelo menos duas seqüências de polinucleotídeo originais. Tais
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110/279 polinucleotídeos híbridos podem resultar dos eventos de recombinação intermoleculares que promovem a integração da seqüência entre moléculas de DNA. Além disso, tais polinucleotídeos híbridos podem resultar de processos de reclassificação redutivos intramoleculares que utilizam seqüên5 cias repetidas para alterar uma seqüência de nucleotídeo dentro de uma molécula de DNA.
Produção de variantes de seqüência
A invenção também fornece métodos de preparar variantes de seqüência das seqüências de fosfolipase e de ácido nucléico da invenção ou isolar enzima de fosfolipase, por exemplo, fosfolipase, variantes de seqüência usando os ácidos nucléicos e polipeptídeos da invenção. Em um aspecto, a invenção fornece para variantes de um gene de fosfolipase da invenção, que pode ser alterado por quaisquer meios, incluindo, por exemplo, métodos estocástico ou aleatório, ou não estocástico, ou evolução conduzida, métodos, como descrito anteriormente.
As variantes isoladas podem ser de ocorrência natural. A variante pode também ser criada in vitro. As variantes podem ser criadas usando técnicas de construção genética tais como mutagênese direcionada ao sítio, mutagênese química aleatória, procedimentos por deleção de Exonuclease
III, e técnicas de clonagem padrão. Alternativamente, tais variantes, fragmentos, análogos, ou derivados podem ser criados usando procedimentos de modificação ou síntese química. Outros métodos de preparar variantes são também familiares àqueles versados na técnica. Estes incluem procedimentos em que as seqüências de ácido nucléico obtidas de isolados natu25 rais são modificadas para gerar ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos tendo características que realçam seu valor em aplicações em laboratório ou industriais. Em tais procedimentos, um grande número de seqüências variantes tendo uma ou mais diferenças de nucleotídeo com respeito à seqüência obtida do isolado natural é gerado e caracterizado. Estas diferen30 ças de nucleotídeo podem resultar em mudanças de aminoácido com respeito aos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucléicos dos isolados naturais.
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Por exemplo, as variantes podem ser criadas usando PCR propensa ao erro. Em PCR propensa ao erro, PCR é realizada sob condições onde a fidelidade da cópia do DNA polimerase é baixa, tal que uma taxa alta de mutações pontuais é obtida ao longo do comprimento inteiro do produto de PCR. PCR propensa ao erro é descrita, por exemplo, em Leung, D.W., e outros, Technique, 1:11-15, 1989) e Caldwell, R. C. & Joyce G.F., PCR Methods Applic., 2:28 - 33, 1992. Resumidamente, em tais procedimentos, ácidos nucléicos a serem mutagenizados são misturados com iniciadores de PCR, tampão de reação, MgCI2, MnCI2, Taq polimerase e uma concentra10 ção apropriada de dNTPs para obter uma taxa alta de mutação pontual ao longo do comprimento inteiro do produto de PCR. Por exemplo, a reação pode ser realizada usando 20 fmoles de ácido nucléico a ser mutagenizado, 30 pmoles de cada iniciador de PCR, um tampão de reação compreendendo 50mM de KCI, 10mM de Tris HCI (pH 8,3) e 0,01% de gelatina, 7mM de
MgCI2, 0,5mM de MnCI2, 5 unidades de Taq polymerase, 0,2mM de dGTP, 0,2mM de dATP, 1 mM de dCTP, e 1 mM de dTTP. A PCR pode ser realizada em 30 ciclos de 94° C durante 1 min, 45° C durante 1 min, e 72° C durante 1 min. Entretanto, será avaliado que estes parâmetros podem ser variados quando apropriado. Os ácidos nucléicos mutagenizados são clonados em um vetor apropriado e as atividades dos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucléicos mutagenizados são avaliadas.
As variantes podem também ser criadas usando mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo para gerar mutações específicas ao sítio em qualquer DNA clonado de interesse. A mutagênese de oligonucleotídeo é descrita, por exemplo, em Reidhaar-Olson (1988) Science 241:53-57. Resumidamente, em tais procedimentos uma pluralidade de oligonucleotídeos de filamento duplo suportando uma ou mais mutações a serem introduzidas no DNA clonados é sintetizada e inserida no DNA clonados a ser mutagenizado. Os clones contendo o DNA mutagenizado são recuperados e as ativi30 dades dos polipeptídeos que eles codificam são avaliadas.
Outro método para gerar variantes é PCR de agrupamento. PCR de agrupamento envolve o agrupamento de um produto de PCR de uma
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112/279 mistura de pequenos fragmentos de DNA. Um grande número de reações de PCR diferentes ocorre em paralelo no mesmo frasconete, com os produtos de uma reação preparando os produtos de outra reação. PCR de agrupamento é descrita em, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No.
5.965.408.
Ainda outro método de gerar variantes é a mutagênese de PCR sexual. Em mutagênese de PCR sexual, a recombinação homóloga forçada ocorre entre as moléculas de DNA de diferente porém de seqüência de DNA altamente relacionado in vitro, como um resultado de fragmentação aleatória da molécula de DNA baseada na homologia de seqüência, seguido por fixação do cruzamento por extensão do iniciador em uma reação de PCR. Mutagênese de PCR sexual é descrita, por exemplo, em Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 10747 - 10752. Resumidamente, em tais procedimentos uma pluralidade de ácidos nucléicos a ser recombinado é digerida com Dnase para gerar fragmentos tendo um tamanho médio de 50 - 200 nucleotídeos. Os fragmentos do tamanho médio desejado são purificados e ressuspensos em uma mistura de PCR. PCR é conduzida sob condições que facilitam a recombinação entre os fragmentos de ácido nucléico. Por exemplo, PCR pode ser realizada ressuspendendo-se os fragmentos purifi20 cados em uma concentração de 10 - 30 ng/μΙ em uma solução de 0,2mM de cada dNTP, 2,2mM de MgCfc, 50mM de KCL, 10mM de Tris HCI, pH 9,0, e 0.1% de Triton X-100. 2,5 unidades de Tag polimerase por 100 : 1 de mistura de reação são adicionadas e PCR é realizada usando o seguinte regime: 94°C durante 60 segundos, 94°C durante 30 segundos, 50 - 55°C durante
30 segundos, 72°C durante 30 segundos (30 - 45 vezes) e 72°C durante 5 minutos. Entretanto, será avaliado que estes parâmetros podem ser variados quando apropriado. Em alguns aspectos, os oligonucleotídeos podem ser incluídos nas reações de PCR. Em outros aspectos, o fragmento de Klenow de DNA polimerase I pode ser usado em um primeiro grupo de reações de PCR e Taq polimerase pode ser usada em um grupo subseqüente de reações de PCR. As seqüências recombinantes são isoladas e as atividades dos polipeptídeo que eles codificam são avaliadas.
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As variantes podem também ser criadas por mutagênese in vivo. Em algumas modalidades, as mutações aleatórias em uma seqüência de interesse são geradas por propagação da seqüência de interesse em uma cepa bacteriana, tal como uma cepa de E. coli, que carrega mutações em uma ou mais das trilhas de reparo de DNA. Tal cepa mutadora tem uma taxa de mutação aleatória mais alta do que aquela de uma origem tipo silvestre. Propagação em DNA em uma destas cepas eventualmente gerará mutações aleatórias dentro do DNA. Cepas mutadoras adequadas para uso em mutagênese in vivo são descritas, por exemplo, em Publicação PCT n°
WO 91/16427.
As variantes podem também ser geradas usando cassete de mutagênese. Em mutagênese de cassete, uma pequena região de uma molécula de DNA de filamento duplo é substituída por um cassete de oligonucleotídeo sintético que difere da seqüência da seqüência nativa. O oligonu15 cleotídeo freqüentemente contém completamente e/ou parcialmente seqüência nativa aleatorizada.
Mutagênese de conjunto recorrente pode também ser usada para gerar variantes. Mutagênese de conjunto recorrente é um algoritmo para a construção de proteína (mutagênese de proteína) desenvolvido para produzir populações diversas de mutantes fenotipicamente relacionadas cujo membros diferem-se em seqüência de aminoácido. Este método usa um mecanismo de realimentação para controlar ciclos sucessivos de controle de mutagênese de cassete combinatorial. Mutagênese de conjunto recorrente é descrita, por exemplo, em Arkin (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:7811 25 7815.
Em algumas modalidades, variantes são criadas usando mutagênese de conjunto exponencial. Mutagênese de conjunto exponencial é um processo para gerar bibliotecas combinatoriais com uma alta porcentagem de mutantes funcionais e únicos, onde pequenos grupos de resíduos são aleatorizados em paralelo para identificar, em cada posição alterada, aminoácidos que levam às proteínas funcionais. Mutagênese de conjunto exponencial é descrita, por exemplo, em Delegrave (1993) Biotechnology Res.
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11: 1548 - 1552. Mutagênese direcionada ao sítio e aleatória são descritas, por exemplo, em Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4: 450455.
Em algumas modalidades, as variantes são criadas usando pro5 cedimentos de embaralhamento onde as porções de uma pluralidade de ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos distintos são fundidas juntas para criar seqüências de ácido nucléico quiméricas que codificam polipeptídeos quiméricos como descrito em, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Nos. 5.965.408; 5.939.250.
A invenção também fornece variantes de polipeptídeos da invenção compreendendo seqüências em que um ou mais resíduos de aminoácido (por exemplo, de um polipeptídeo exemplar da invenção) são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (por exemplo, resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido substituído pode ou não pode ser um codificado pelo código genético. As substituições conservadoras são aquelas que substituem um dado aminoácido em um polipeptídeo por outro aminoácido de características similares. Desse modo, os polipeptídeos da invenção incluem aqueles com substituições conservadoras de seqüências da invenção, incluindo porém não limita20 dos às seguintes substituições: substituições de um aminoácido alifático tal como Alanina, Valina, Leucina e Isoleucina por outro aminoácido alifático; substituição de Serina por uma Treonina ou vice-versa; substituição de um resíduo acídico tal como ácido Aspártico e ácido Glutâmico por outro resíduo de acídico; substituição de um resíduo carregando um grupo de amida, tal como Asparagina e Glutamina, por outro resíduo carregando um grupo de amida; permuta de um resíduo básico tal como Lisina e Arginina por outro resíduo básico; e substituição de um resíduo aromático tal como Fenilalanina, Tirosina por outro resíduo aromático. Outras variantes são aquelas em que um ou mais dos resíduos de aminoácido dos polipeptídeos da invenção incluem um grupo substituinte.
Outras variantes dentro do escopo da invenção são aqueles em que o polipeptídeo está associado com outro composto, tal como um comPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 131/316
115/279 posto para aumentar a meia vida do polipeptídeo, por exemplo, polietileno glicol.
Variantes adicionais dentro do escopo da invenção são aquelas em que os aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo, tal como uma seqüência líder, uma seqüência secretora, uma seqüência de proproteína ou uma seqüência que facilita a purificação, enriquecimento, ou estabilização do polipeptídeo.
Em alguns aspectos, as variantes, fragmentos, derivados e análogos dos polipeptídeos da invenção mantêm a mesma atividade ou função biológica como os polipeptídeos exemplares, por exemplo, uma atividade de fosfolipase, como descrito aqui. Em outros aspectos, a variante, fragmento, derivado, ou análogo inclui uma proproteína, tal como a variante, fragmento, derivado, ou análogo pode ser ativado por divagem da porção de proproteína para produzir um polipeptídeo ativo.
Códons de otimização para obter níveis altos de expressão de proteína nas células hospedeiras.
A invenção fornece métodos para modificação dos ácidos nucléicos codificando a fosfolipase para modificar o uso de códon. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nu20 oléico codificando uma fosfolipase para aumentar ou diminuir sua expressão em uma célula hospedeira. A invenção também fornece ácidos nucléicos codificando uma fosfolipase para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira, enzimas de fosfolipase desse modo modificadas, e métodos de preparar as enzimas de fosfolipase modificadas. O método compreende identificar um códon não preferido ou um menos preferido em ácido nucléico de codificação de fosfolipase e substituir um ou mais códons não preferidos ou menos preferidos com um códon preferido codificando o mesmo aminoácido como o códon substituído e pelo menos um códon não preferido ou menos preferido no ácido nucléico foi substituído por um códon preferido codificando o mesmo aminoácido. Um códon preferido é um códon superrepresentado nas seqüências de codificação em genes na célula hospedeira e um códon não preferido ou um menos preferido é um sub-representado
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116/279 nas seqüências de codificação em genes na célula hospedeira.
As células hospedeiras para expressar os ácidos nucléicos, cassetes de expressão e vetores da invenção incluem bactérias, levedura, fungos, células de planta, células de inseto e células de mamífero. Desta ma5 neira, a invenção fornece métodos para otimizar o uso de códon em todas essas células, ácidos nucléicos alterados por códon e polipeptídeos feitos pelos ácidos nucléicos alterados por códon. As células hospedeiras incluem bactérias gram negativas, tais como, Escherichia coli e Pseudomonas fluorescens-, bactérias gram positivas, tais como, Streptomyces diversa, Lacto10 bacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Bacillus subtilis. Células hospedeiras exemplares também incluem organismos eucarióticos, por exemplo, várias leveduras, tal como Saccharomyces sp., incluindo Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, e Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Aspergillus niger, e células de mamíferos e linhagens de célula e células de inseto e linhagens de célula. Desse modo, a invenção também inclui ácidos nucléicos e polipetídeos otimizados para expressão nestes organismos e espécies.
Por exemplo, os códons de um ácido nucléico codificando uma fosfolipase isolada de uma célula bacteriana são modificadas tal que o ácido nucléico é idealmente expresso em uma célula bacteriana diferente das bactérias das quais a fosfolipase foi derivada, uma levedura, um fungo, uma célula de planta, uma célula de inseto ou uma célula de mamífero. Métodos para otimizar códons são bem conhecidos na técnica, observe, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 5.795.737; Baca (2000) Int. J. Parasitol.
30:113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253. Observe, também Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250 -7253, descrevendo o códon de otimização em sistemas de camundongo; Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18 - 24, descrevendo optimização de códons em levedura; Feng (2000) Biochemistry 39:15399 30 15409, descrevendo o códon de otimização em E. colr, Humphreys (2000)
Protein Expr. Purif. 20:252-264, descrevendo uso do códon de otimização que afeta a segregação em E. coli.
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Animais não humanos transgênicos
A invenção fornece animais não humanos transgênicos compreendendo um ácido nucléico, um polipeptídeo, um cassete ou vetor de expressão ou uma célula transfectada ou transformada da invenção. Os ani5 mais não humanos transgênicos podem ser, por exemplo, cabras, coelhos, carneiro, porcos, vacas, ratos e camundongos, compreendendo os ácidos nucléicos da invenção. Estes animais podem ser empregados, por exemplo, como modelos in vivo para estudar a atividade de fosfolipase, como modelos para análise quanto a moduladores de atividade de fosfolipase in vivo.
As seqüências de codificação para os polipeptídeos a serem expressos nos animais não humanos transgênicos podem ser planejadas para serem constitutivas, ou, sob o controle de fatores reguladores transcricionais específicos de tecido, específicos de desenvolvimento ou induzíveis. Os animais não humanos transgênicos podem ser planejados e gerados empregando-se qualquer método conhecido na técnica; veja, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos N°s 6.211.428; 6.187.992, 6.156.952, 6.118.044, 6.111.166; 6.107.541, 5.959.171, 5.922.854, 5.892.070, 5.880.327, 5.891.698,
5.639.940, 5.573.933, 5.387.742, 5.087.571, descrevendo a criação e emprego de células e ovos transformados e camundongos, ratos, coelhos, car20 neiro, porcos e vacas transgênicos. Veja também, por exemplo, Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157, descrevendo a produção de proteínas recombinantes no leite de animais leiteiros transgênicos; Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17:456-461, demonstrando a produção de cabras transgênicas. A Patente dos Estados Unidos N° 6.211.428 descreve a cria25 ção e emprego de mamíferos não humanos transgênicos os quais expressam em seus cérebros um constructo de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de DNA. A Patente dos Estados Unidos N° 5.387.742 descreve a injeção de seqüências de DNA sintético ou recombinante clonado em ovos de camundongo fertilizados, implante dos ovos injetados em fê30 meas pseudo-grávidas, e desenvolvimento a termo de camundongos transgênicos cujas células expressam proteínas relacionadas à patologia da doença de Alzheimer. A Patente dos Estados Unidos N° 6.187.992 descreve a
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118/279 criação e emprego de um camundongo transgênico cujo genoma compreende um rompimento da proteína precursora de amilóide codificando gene (APP).
Animais eliminados podem também ser empregados para pra5 ticar os métodos da invenção. Por exemplo, em um aspecto, os animais transgênicos ou modificados da invenção compreendem um animal eliminados, por exemplo, um camundongo eliminado, construído para não expressar ou para ser incapaz de expressar uma fosfolipase.
Plantas e Sementes Transgênicas
A invenção fornece plantas e sementes transgênicas compreendendo um ácido nucléico, um polipeptídeo (por exemplo, uma fosfolipase), um cassete ou vetor de expressão ou uma célula transfectada ou transformada da invenção. A invenção também fornece produtos de planta, por exemplo, óleos, sementes, folhas, extratos e similares, compreendendo um ácido nucléico e /ou polipeptídeo (por exemplo, uma fosfolipase) da invenção. As plantas transgênicas podem ser dicotiledôneas (um dicotilédone) ou monocotiledôneas (um monocotilédone). A invenção também fornece métodos de criação e emprego destas plantas e sementes transgênicas. A planta ou célula de planta transgênica expressando um polipeptídeo da invenção pode ser construída de acordo com qualquer método conhecido na técnica. Veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos N° 6.309.872.
Ácidos nucléicos e constructos de expressão da invenção podem ser introduzidos em uma célula de planta por quaisquer meios. Por exemplo, ácidos nucléicos ou constructos de expressão podem ser introdu25 zidos no genoma de um desejado hospedeiro de planta, ou, os ácidos nucléicos ou constructos de expressão podem ser epissomas. A introdução no genoma de uma desejada planta pode ser de modo que a produção de fosfolipase do hospedeiro seja regulada por elementos de controle translacional ou transcricional endógenos. A invenção também fornece plantas elimina30 das onde a inserção de seqüência de gene por, por exemplo, recombinação homóloga, interrompeu a expressão do gene endógeno. Métodos para gerar plantas eliminadas são bem conhecidos na técnica, veja, por exemplo,
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Strepp (1998) Proc Natl. Acad. Sei. USA 95:4368-4373; Miao (1995) Plant J 7:359-365. Veja a discussão sobre plantas transgênicas, abaixo.
Os ácidos nucléicos da invenção podem ser empregados para conferir desejadas características sobre essencialmente qualquer planta, por exemplo, sobre plantas contendo semente de óleo, tais como grãos de soja, semente de colza, sementes de girassol, sésamo e amendoins. Os ácidos nucléicos da invenção podem ser empregados para manipular trilhas metabólicas de uma planta a fim de otimizar ou alterar a expressão de fosfolipase do hospedeiro. Isto pode alterar a atividade de fosfolipase em uma planta.
Alternativamente, uma fosfolipase da invenção pode ser empregada na produção de uma planta transgênica para produzir um composto não produzido naturalmente por aquela planta. Isto pode diminuir custos de produção o criar um novo produto.
Em um certo aspecto, a primeira etapa na produção de uma planta transgênica envolve a preparação de uma construção de expressão para expressão em uma célula de planta. Estas técnicas são bem conhecidas na técnica. Elas podem incluir seleção e clonagem de um promotor, uma seqüência de codificação para facilitação de ligação eficiente de ribossomas a mRNA e seleção das seqüências de terminador de gene adequa20 das. Um promotor constitutivo exemplar é CaMV35S, do vírus mosaico da couve-flor, que geralmente resulta em um grau elevado de expressão em plantas. Outros promotores são mais específicos e respondem a estímulos no ambiente interno ou externo da planta. Um promotor induzível à luz exemplar é o promotor do gene cab, codificando a principal proteína de liga25 ção de clorofila a/b.
Em um certo aspecto, o ácido nucléico é modificado para obterse expressão maior em um célula de planta. Por exemplo, uma seqüência da invenção é provável ter uma porcentagem mais elevada de pares de nucleotídeos A-T comparada àquela observada em uma planta, algumas das quais preferem pares de nucleotídeos G-C. Por conseguinte, nucleotídeos A-T na seqüência de codificação podem ser substituídos com nucleotídeos G-C sem alterar significantemente a seqüência de aminoácidos para realçar
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120/279 a produção do produto de gene nas células de planta.
Gene marcador selecionável pode ser adicionado o constructo de gene a fim de identificar células ou tecidos de planta que têm de forma bem-sucedida integrado o transgene. Isto pode ser necessário porque a ob5 tenção de incorporação e expressão de genes em células de planta é um raro evento, ocorrendo em apenas algumas porcentagens dos tecidos ou células alvejados. Genes marcadores selecionáveis codificam proteínas que fornecem resistência a agentes que são normalmente tóxicos às plantas, tais como antibióticos ou herbicidas. Somente células de planta que têm in10 tegrado o gene marcador selecionável sobrevivem quando cultivadas em um veículo contendo o antibiótico ou herbicida apropriado. No que diz respeito a outros genes inseridos, genes marcadores também requerem seqüências promotoras e de terminação para função apropriada.
Em um certo aspecto, a preparação de plantas ou sementes transgênicas compreende a incorporação de seqüências da invenção e, opcionalmente, genes marcadores em uma construção de expressão alvo (por exemplo, um plasmídeo), juntamente com o posicionamento do promotor e das seqüências terminadoras. Isto pode envolver transferência do gene modificado na planta por meio de um método adequado. Por exemplo, um constructo pode ser introduzido diretamente no DNA genômico da célula de planta empregando-se técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de célula de planta, ou os constructos podem ser introduzidos diretamente em tecido de planta empregando-se métodos balísticos, tais como bombardeio de partícula de DNA. Por exemplo, veja, por exemplo,
Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35: 197-203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6: 17-30; Klein (1987) Nature 327: 70-73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72: 63-69, discutindo o uso de bombardeio de partícula para introduzir transgenes no trigo; e Adam (1997) supra, quanto ao uso de bombardeio de partícula para introduzir YACs em células de planta. Por exem30 pio, Rinehart (1997) supra, usou bombardeio de partícula para gerar plantas de algodão transgênicas. Mecanismo para aceleração de partículas é descrito na Patente dos Estados Unidos N° 5.015.580; e o instrumento de acePetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 137/316
121/279 leração de partícula BioRad (Biolistics) PDS-2000; veja também, John, Patente dos Estados Unidos N° 5.608.148; e Ellis, Patente dos Estados Unidos N° 5.681.730, descrevendo a transformação de gimnoespermas mediada por partícula.
Em um certo aspecto, protoplastos podem ser imobilizados e injetados com ácidos nucléicos, por exemplo, um constructo de expressão. Embora a regeneração de planta a partir de protoplastos não seja fácil com cereais, a regeneração de planta é possível em legumes empregando-se embriogênese somática de calo derivado de protoplasto. Tecidos organiza10 dos podem ser transformadas com DNA nu empregando-se a técnica de pistola de gene, onde o DNA é revestido em microprojéteis de tungstênio, disparo 1/100 do tamanho das células, que transportam o DNA profundamente nas células e organelas. O tecido transformado é em seguida induzido a regenerar, geralmente por embriogênese somática. Esta técnica tendo sido bem-sucedida em várias espécies de cereais incluindo milho e arroz.
Ácidos nucléicos, por exemplo, construções de expressão, podem também ser introduzidos nas células de planta empregando-se viroses recombinantes. Células de planta podem ser transformadas empregando-se vetores virais, tais como, por exemplo, vetores derivados de vírus mosaico do tabaco (Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999), veja Porta (1996) Use of viral replicons for the expression of genes in plants, Mol. Biotechnol. 5: 209-221.
Alternativamente, ácidos nucléicos, por exemplo, um constructo de expressão, podem ser combinados com regiões de flanqueamento de T25 DNA adequadas e introduzidos em um vetor convencional de hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens. As funções de virulência do hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens dirigem a inserção do constructo e marcador adjacente no DNA celular da planta quando a célula é infectada pelas bactérias. Técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluindo desarmamento e uso de vetores binários, são bem conhecidas na literatura científica. Veja, por exemplo, Horsch (1984) Science 233: 496-498; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 4803 (1983); Gene Transferto
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Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlim 1995). O DNA em uma célula de A. tumefaciens está contido no cromossoma bacteriano assim como em outra estrutura conhecida como um plasmídeo de Ti (indução de tumor). O plasmídeo de Ti contém uma extensão de DNA chamada T-DNA (~20 quilo5 bytes de duração) que é transferida para a célula da planta no processo de infecção e uma série de genes de vir (virulência) que dirigem o processo de infecção. A. tumefaciens somente pode infectar uma planta através de ferimentos: quando uma raiz ou caule da planta está ferido ela transmite certos sinais químicos, em resposta aos quais, os genes de vir de A. tumefaciens tornam-se ativos e dirigem uma série de eventos necessários para a transferência da T-DNA do plasmídeo de Ti para o cromossoma da planta. A TDNA então entra na célula da planta através do ferimento. Uma especulação é que a T-DNA espera até que o DNA da planta esteja sendo replicado ou transcrito, e então insere a si próprio no DNA da planta exposta. A fim de empregar A. tumefaciens como um vetor de transgene, a seção de indução de tumor de T-DNA tem que ser removida, embora mantendo as regiões de fronteira de T-DNA e os genes de vir. O transgene é em seguida inserido entre as regiões de fronteira de T-DNA, onde ele é transferido para a célula da planta e torna-se integrado no cromossomas da planta.
A invenção provê a transformação de plantas monocotiledôneas empregando-se os ácidos nucléicos da invenção, incluindo importantes cereais, veja Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35: 205-218. Veja também, por exemplo, Horsch, Science (1984) 233: 496; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sei USA 80: 4803; Thykjaer (1997) supra; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32: 113525 1148, discutindo a integração de T-DNA em DNA genômico. Veja também
D'Halluin, Patente dos Estados Unidos N° 5.712.135, descrevendo um processo para a integração estável de um DNA compreendendo um gene que é funcional em uma célula de um cereal, ou outra planta monocotiledônea.
Em um certo aspecto, a terceira etapa pode envolver seleção e regeneração de plantas inteiras capazes de transmissão do gene alvo incorporado para a geração seguinte. Tais técnicas de regeneração dependem da manipulação de certos fito-hormônios em um veículo de desenvolvimento
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123/279 de cultura de tecido, tipicamente dependendo de um marcador de biocida e /ou herbicida que tenha sido introduzido juntamente com as seqüências de nucleotídeos desejadas. A regeneração de planta a partir de protoplastos cultivados é descrita em Evans e outros, Protoplasts Isolation and Culture,
Handbook of Plant Cell Culture, páginas 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, páginas 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. A regeneração pode também ser obtida a partir de calo de planta, explantes, órgãos, ou partes destes. Tais técnicas de regeneração estão descritas geralmente em Klee (1987) Ann. Rev. Of Plant Phys. 38: 467-486. Para se obter plantas inteiras a partir de tecidos transgênicos tais como embriões imaturos, elas podem ser desenvolvidas sob condições ambientais controladas em uma série de veículos contendo nutrientes e hormônios, um processo conhecido como cultura de tecido. Assim que plantas inteiras são geradas e produzem se15 mente, a avaliação da progênito começa.
Depois que o cassete de expressão está estavelmente incorporado em plantas transgênicas, ele pode ser introduzido em outras plantas por cruzamento sexual. Qualquer de várias técnicas de reprodução pode ser empregada, dependendo da espécie a ser cruzada. Uma vez que a expres20 são transgênica dos ácidos nucléicos da invenção leva a alterações fenotípicas, plantas compreendendo os ácidos nucléicos recombinantes da invenção podem ser sexualmente cruzadas com uma segunda planta para se obter um produto final. Por conseguinte, a semente da invenção pode ser derivada de um cruzamento entre duas plantas transgênicas da invenção, ou um cruzamento entre uma planta da invenção e outra planta. Os efeitos desejados (por exemplo, expressão dos polipeptídeos da invenção para produzir uma planta na qual o comportamento de floração é alterado) podem ser realçados quando ambas as plantas parentais expressam os polipeptídeos (por exemplo, uma fosfolipase) da invenção. Os efeitos desejados podem ser passados para futuras gerações da planta por métodos padrão de propagação.
Os ácidos nucléicos e polipeptídeos da invenção são expressos
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124/279 em ou inseridos em qualquer planta ou semente. As plantas transgênicas da invenção podem ser dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Exemplos de plantas transgênicas monocotiledôneas da invenção são capim, gramas, tais como grama do prado (grama azul, Poa), grama de forragem tal como festu5 ca, lolium, grama temperada, tal como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, e milho (grão). Exemplos de plantas transgênicas dicotiledôneas da invenção são tabaco, legumes, tremoços, batata, beterraba açucareira, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve-flor, semente de colza, e o organismo
Arabidopsis thaliana de modelo estreitamente relacionado. Por conseguinte, as plantas e sementes transgênicas da invenção incluem uma ampla faixa de plantas, incluindo, mas não limitada a, espécies dos gêneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucúrbita, Daucus, Elaeis, Fra15 garia, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis,
Vigna, e Zea.
Em modalidades alternativas, os ácidos nucléicos da invenção são expressos em plantas (por exemplo, como plantas transgênicas), tais como plantas contendo semente de óleo, por exemplo, soja, semente de colza, sementes de girassol, sésamo e amendoins. Os ácidos nucléicos da invenção podem ser expressos em plantas que contêm células de fibra, incluindo, por exemplo, algodão, árvore de algodão da seda (Sumaúma, Ceiba pentandra), salgueiro do deserto, arbusto chaparral (creosote bush), winterfat, balsa, ramie, kenaf, cânhamo, roselle, juta, bananeira de sisal e linho. Em modalidades alternativas, as plantas transgênicas da invenção podem ser membros do gênero Gossypium, incluindo membros de qualquer espécie de Gossypium, tais como G. arboreum, G. herbaceum, G. barbadense, e G. hirsutum.
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A invenção também provê plantas transgênicas para serem empregadas para a produção de grandes quantidades dos polipeptídeos (por exemplo, uma fosfolipase ou anticorpo) da invenção. Por exemplo, veja Palmgren (1997) Trends Genet. 13:348; Chong (1997) Transgenic Res.
6:289-296 (produção de beta-caseína de proteína de leite humano em plantas de batata transgênicas empregando-se um promotor de sintase (masT,2') de mannopine bidirecional, induzível por auxina com métodos de transformação de disco de folha mediados por Agrobacterium tumefaciens).
Empregando-se procedimentos conhecidos, alguém de versatili10 dade pode avaliar as plantas da invenção detectando o aumento ou diminuição de proteína ou mRNA de transgene em plantas transgênicas. Métodos para a detecção e quantificação de mRNAs ou proteínas são bem conhecidos na técnica.
Polipeptídeos e peptídeos
A invenção fornece polipeptídeos isolados ou recombinantes tendo uma identidade de seqüência (por exemplo, pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%,
65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%,
78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%)) a uma seqüência exemplar da invenção, por exemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ
ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO:
72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ
ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ
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ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106. Como discutido acima, a identidade pode ser sobre o tamanho natural do polipeptídeo, ou, a identidade pode ser sobre uma subseqüência deste, por exemplo, uma região de pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250,
300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 ou mais resíduos. Polipeptídeos da invenção podem também ser menores do que o tamanho natural de polipeptídeos exemplares (por exemplo, SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8, etc.). Em modalidade alternativa, a invenção fornece polipeptídeos (peptídeos, fragmentos) variando em tamanho entre cerca de
5 e o tamanho natural de um polipeptídeo, por exemplo, uma enzima, tal como uma fosfolipase, por exemplo, fosfolipase; tamanhos exemplares sendo de cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 ou mais resíduos, por exemplo, resíduos contíguos das fosfolipases exemplares de SEQ ID NO: 2;
SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8, etc.. Peptídeos da invenção podem ser úteis como, por exemplo, sondas de rotulação, antígenos, tolerogênicos, motivos, sítios ativos de fosfolipase.
Em um certo aspecto, o polipeptídeo tem uma atividade de fosfolipase, por exemplo, divagem de uma ligação de éster de glicerolfosfato, a capacidade para hidrolisar ligações de éster de fosfato, incluindo patatina, hidrolase de acila de lipídeo (LAH), fosfolipase A, B, C e/ou atividade de fosfolipase D. Em um certo aspecto, polipeptídeos exemplares da invenção têm uma atividade de fosfolipase tal como apresentado na Tabela 1, abaixo:
Tabela 1
SEQ ID NO: Tipo de enzima
103, 104 Patatina
11, 12 Patatina
13, 14 Patatina
17, 18 Patatina
25, 26 Patatina
27, 28 Patatina
33, 34 Patatina
35, 36 Patatina
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SEQ ID NO: Tipo de enzima
43, 44 Patatina
45, 46 Patatina
55, 56 Patatina
59, 60 Patatina
65, 66 Patatina
71, 72 Patatina
77, 78 Patatina
86, 87 Patatina
87, 88 Patatina
91, 92 Patatina
95, 96 Patatina
99, 100 Patatina
1,2 PLC
101, 102 PLC
105, 106 PLC
3,4 PLC
31, 32 PLC
5, 6 PLC
7,8 PLC
81, 82 PLC
89, 90 PLC
9, 10 PLC
93, 94 PLC
97, 98 PLC
15, 16 PLD
19, 20 PLD
21,22 PLD
23, 24 PLD
29, 30 PLD
37, 38 PLD
39, 40 PLD
41,42 PLD
47, 48 PLD
49, 50 PLD
51, 52 PLD
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128/279
SEQ ID NO: Tipo de enzima
53, 54 PLD
57, 58 PLD
61,62 PLD
63, 64 PLD
67, 68 PLD
71, 72 PLD
73, 74 PLD
75, 76 PLD
79, 80 PLD
83, 84 PLD
Polipeptídeos e peptídeos da invenção podem ser isolados de fontes naturais, ser sintéticos, ou ser polipeptídeos recombinantemente gerados. Os peptídeos e proteínas podem ser recombinantemente expressos in vitro ou in vivo. Os peptídeos e polipeptídeos da invenção podem ser fei5 tos e isolados empregando-se qualquer método conhecido na técnica. Polipeptídeo e peptídeos da invenção podem também ser sintetizados, o todo ou em parte, empregando-se métodos químicos bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215 223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A. K.,
Therapeutic Peptides and Proteínas, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA. Por exemplo, síntese de peptídeo pode ser realizada empregando-se várias técnicas de fase sólida (veja, por exemplo, Roberge (1995) Science 269: 202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:313) e síntese automatizada pode ser obtida, por exemplo, empregando-se o ABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.
Os peptídeos e polipeptídeos da invenção podem também ser glicosilados. A glicosilação pode ser adicionada pós-translacionalmente ou quimicamente ou por mecanismos biossintéticos celulares, onde o último incorpora o uso de motivos de glicosilação conhecidos, que podem ser nativos à seqüência ou podem ser adicionados como um peptídeo ou adicionados na seqüência de codificação de ácido nucléico. A glicosilação pode ser
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129/279 ligada por O ou ligada por N.
Os peptídeos e polipeptídeos da invenção, como acima definidos, incluem todas as formas miméticas e peptidomiméticas. Os termos mimético e peptidomimético referem-se a um composto químico sintético que tem substancialmente as mesmas características estruturais e/ou funcionais dos polipeptídeos da invenção. O mimético pode ser ou inteiramente composto de análogos não naturais, sintéticos de aminoácidos, ou, é uma molécula quimérica de aminoácidos de peptídeo parcialmente natural e análogos parcialmente não naturais de aminoácidos. O mimético pode também incorporar qualquer quantidade de substituições conservativas de aminoácido natural contanto que tais substituições também não alteram substancialmente a estrutura e/ou atividade do mimético. Como com os polipeptídeos da invenção que são variantes conservativas, experimentação de rotina determinará se um mimético inclui-se no escopo da invenção, isto é, que sua estrutura e/ou função não seja substancialmente alterada. Desse modo, em um aspecto, uma composição mimética inclui-se no escopo da invenção se ela tiver uma atividade de fosfolipase.
As composições miméticas de polipeptídeo da invenção podem conter qualquer combinação de componentes estruturais não naturais. Em um aspecto alternativo, as composições miméticas da invenção incluem um ou todos os seguintes três grupos estruturais: a) grupos de ligação de resíduo exceto as ligações de união de amida natural (ligação de peptídeo); b) resíduos não naturais no lugar de resíduos de aminoácido de ocorrência natural; ou c) resíduos que induzem mímicas estruturais secundárias, isto é, para induzir ou estabilizar uma estrutura secundária, por exemplo, um ciclo beta, ciclo gama, lâmina beta, conformação de hélice alfa, e similares. Por exemplo, um polipeptídeo da invenção pode ser caracterizado como um mimético quando todos ou alguns de seus resíduos são unidos por meios químicos exceto ligações de peptídeo natural. Os resíduos peptidomiméticos individuais podem ser ligados por ligações de peptídeo, exceto ligações químicas ou meios de acoplamento, tais como, por exemplo, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, maleimidas bifuncionais, N,N'Petição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 146/316
130/279 diciclohexilcarbodiimida (DCC) ou Ν,Ν'-diisopropilcarbodiimida (DIC). Os grupos de ligação que podem ser uma alternativa para as ligações de união de amida tradicional (ligação de peptídeo) incluem, por exemplo, cetometileno (por exemplo, -C(=O)-CH2- para -C(=O)-NH-), aminometileno (CH25 NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH2-O), tioéter (CH2-S), tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tioamida, ou éster (veja, por exemplo, Spatola (1983) em Chemistry and Biochemistry de Amino Acids, Peptides and Proteínas, Volume 7, pp 267 - 357, Pepetide Backbone Modifications, Marcell Dekker, NY).
Um polipeptídeo da invenção pode também ser caracterizado como um mimético por conter todos ou alguns resíduos não naturais em lugar de resíduos de aminoácido de ocorrência natural. Os resíduos não naturais são bem descritos na literatura científica e de patente; algumas composições não naturais exemplares úteis como miméticos de resíduos de aminoácido natural e diretrizes são descritas abaixo. Miméticos de aminoácidos aromáticos podem ser gerados por substituição, por exemplo, por Dou L-nafilalanina; D- ou L-fenilglicina; D- ou L-2 tienoilalanina; D- ou L-1, -2-, -3-, ou -4-pireneilalanina; D- ou L-3-tienoilalanina; D- ou L-(2-piridinil)alanina; D- ou L-(3-piridinil)-alanina; D- ou L-(2-pirazinil)-alanina; D- ou L-(420 isopropil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilglicina; D(trifluorometil)fenilalanina; D-p-flúor-fenilalanina; D- ou L-p-bifenilfenilalanina; K- ou L-p-metóxi-bifenilfenilalanina; D- ou L-2-indol(alquil)alaninas; e, D- ou L-alquilaininas, onde a alquila pode ser substituídas ou não-substituída metila, etila, propila, hexila, butila, pentila, isopropila, iso-butila, sec-isotila, iso25 pentila, ou um aminoácido não acídico. Anéis aromáticos de um aminoácido não natural incluem, por exemplo, anéis aromáticos de tiazolila, tiofenila, pirazolila, benzimidazolila, naftila, furanila, pirrolila, e piridila.
Miméticos de aminoácidos acídicos podem ser gerados por substituição, por exemplo, por aminoácidos não carboxilados ao mesmo tempo que mantendo uma carga negativa; (fosfono)alanina; treonina sulfatada. Grupos laterais de carboxila (por exemplo, aspartila ou glutamila) podem ser também seletivamente modificados por reação com carbodiimidas
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131/279 (R-N-C-N-R') tais como, por exemplo, 1-ciclohexil-3(2-morfolinil-(4etil)carbodiimida ou 1-etil-3(4-azonia-4,4-dimetolpentil)carbodiimida. Aspartila ou glutamila pode também ser convertida em resíduos de asparaginila e glutaminila por reação com íons de amônio. Miméticos de aminoácidos bási5 cos podem ser gerados por substituição com, por exemplo, (em adição à lisina e arginina) as de aminoácidos ornitina, citrulina, ou ácido (guanidino)acético, ou ácido (guanidino)alquil-acético, onde a alquila é como definida acima. O derivado de nitrila (por exemplo, contendo a porção CN em lugar de COOH) pode ser substituído por asparagina ou glutamina. Os resí10 duos de asparaginila e glutaminila podem ser desaminados para os resíduos de aspartila ou glutamila correspondentes. Os miméticos de resíduo de arginina podem ser gerados reagindo-se arginila com, por exemplo, um ou mais reagentes convencionais, incluindo, por exemplo, fenilglioxal, 2,3butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona, ou ninhidrina, preferivelmente sob con15 dições alcalinas. Os miméticos de resíduo de tirosina podem ser gerados reagindo-se tirosila com, por exemplo, compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. N-acetilimidizol e tetranitrometano podem ser empregados para formar espécies de tirosila de O-acetila e derivados de 3-nitro, respectivamente. Os miméticos de resíduo de cisteína podem ser gerados reagindo20 se resíduos de cisteinila com, por exemplo, alfa-haloacetatos tais como ácido 2-cloroacético ou cloroacetamida e aminas correspondentes; para produzir os derivados de carboximetila ou carboxiamidometila. Os miméticos de resíduo de cisteína podem também ser gerados reagindo-se os resíduos de cisteinila com, por exemplo, bromo-trifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta25 (5-imidozoil)propiônico; fosfato de cloroacetila, N-alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridila; dissulfeto de metil-2-piridila; p-cloromercuribenzoato; 2cloromercuri-4-nitrofenol; ou cloro-7-nitrobenzo-oxa-1,3-diazol. Os miméticos de lisina podem ser gerados (e os resíduos de terminal de amino podem ser alterados) reagindo-se lisinila com, por exemplo, anidridos de ácido sucínico ou outro carboxílico. Miméticos de resíduo de lisina ou outros contendo alfaamino podem também ser gerados por reação com imidoéstseres, tais como picolinimidato de metila, fosfato piridoxal, piridoxal, cloroboroidreto, ácido
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132/279 trinitro-benzenossulfônico, O-metilisouréia, 2,4-pentanodiona, e reações catalisadas por transamidase com glioxilato. Miméticos de metionina podem ser gerados por reação com, por exemplo, sulfóxido de metionina. Os miméticos de prolina incluem, por exemplo, ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, prolina de 3- ou 4-hidróxi, desidroprolina, 3- ou 4-metilprolina, ou 3,3-dimetilprolina. Os miméticos de resíduo de histidina podem ser gerados reagindo-se histidila com, por exemplo, dietilprocarbonato ou brometo de para-bromofenacila. Outros miméticos incluem, por exemplo, aqueles gerados por hidroxilação de prolina e lisina; fosforilação dos grupos de hidroxila de resíduos de serila ou treonila; metilação dos grupos de alfa-amino de lisina, arginina e histidina; acetilação da amina N-terminal; metilação de resíduos de amida de cadeia principal ou substituição com aminoácidos de Nmetila; ou amidação de grupos de carboxila de terminal C.
Um resíduo, por exemplo, um aminoácido, de um polipeptídeo da invenção pode também ser substituído por um aminoácido (ou resíduo peptidomimético) da quiralidade oposta. Desse modo, qualquer aminoácido de ocorrência natural na configuração L (que pode também ser referida como a R ou S, dependendo da estrutura da entidade química) pode ser substituído com o aminoácido do mesmo tipo estrutural químico ou um peptido20 mimético, porém da quiralidade oposta, referida como o D-aminoácido, porém também pode ser referido como a forma R ou S.
A invenção também fornece métodos para modificar os polipeptídeos da invenção por quaisquer processos naturais, tais como processamento pós-translacional (por exemplo, fosforilação, acilação, etc), ou por técnicas de modificação química, e os polipeptídeos modificados resultantes. Modificações podem ocorrer em qualquer lugar no polipeptídeo, incluindo a cadeia principal de peptídeo, as cadeias laterais de aminoácido e as terminações de amino ou carboxila. Será apreciado que o mesmo tipo de modificações possa estar presente no mesmo ou em variáveis graus em diversos sítios em um determinado polipeptídeo. Além disso, um determinado polipeptídeo pode ter muitos tipos de modificações. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de
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133/279 flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, ligação covalente de um fosfatidilinositol, ciclização de ligação cruzada, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoliação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfação e adição mediada por RNA de transferência de aminoácidos à proteína tal como arginilação. Ver, por exemplo, Creighton, T.E., Proteínas Structure and Molecular Properties, Segunda Edição, W. H. Freeman and Company, Nova Iorque (1993); Posttranslational Covalent Modification de Proteínas, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, pp. 1-12 (1983).
Métodos de síntese de peptídeo químico de fase sólida podem também ser empregados para sintetizar o polipeptídeo ou fragmentos da invenção. Tal método é conhecido na técnica desde os anos de 1960 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 - 2154, 1963) (Veja também Stewart, J. M. e Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, Segunda Edição,
Pierce Chemical Co., Rockford, 111., pp. 11-12)) e foi recentemente empregado em kits de síntese e projeto de peptídeo de laboratório comercialmente disponível (Cambridge Research Biochemicals). Tais kits de laboratório comercialmente disponíveis têm geralmente utilizado os ensinamentos de H. M. Geysen e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 3998 (1984) e provêem peptídeos de sintetização sobre as extremidades de uma multidão de bastões ou alfinetes todos os quais são conectados a uma única placa. Quando um tal sistema é utilizado, uma placa de bastões ou alfinetes é invertida e inserida em uma segunda placa de cavidades ou reservatórios correspondentes, que contêm soluções para ligar ou ancorar um aminoácido apropriado às pontas dos alfinetes ou bastões. Repetindo-se uma tal etapa de processo, isto é, invertendo-se e inserindo-se as pontas dos bastões e alfinetes nas soluções apropriadas, os aminoácidos são construídos em
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134/279 peptídeos desejados. Além disso, diversos sistemas de síntese de peptídeo FMOC disponíveis estão disponibilizados. Por exemplo, montagem de um polipeptídeo ou fragmento pode ser realizada sobre um suporte sólido empregando-se um sintetizador de peptídeo automatizado Applied Biosystems,
Inc. Model 431A®. Tal equipamento fornece pronto acesso aos peptídeos da invenção, ou por síntese direta ou por síntese de uma série de fragmentos que podem ser acoplados empregando-se outras técnicas conhecidas. Enzimas de fosfolipase
A invenção fornece novas fosfolipases, ácido nucléicos codifi10 cando-as, anticorpos que as ligam, peptídeos representando os sítios antigênicos da enzima (epítopos) e sítios ativos, e métodos para preparar e empregá-los. Em um aspecto, os polipeptídeos da invenção têm uma atividade de fosfolipase, como acima descrito (por exemplo, divagem de uma ligação de éster de glicerolfosfato). Em aspectos alternativos, as fosfolipases da invenção têm atividades que foram modificadas daquelas das fosfolipases exemplos aqui descritas. A invenção inclui fosfolipases com ou sem seqüências sinal e as próprias seqüências sinal. A invenção inclui fosfolipases imobilizadas, anticorpos antifosfolipase e fragmentos destes. A invenção inclui heterocomplexos, por exemplo, proteínas de fusão, heterodímeros, etc., compreendendo as fosfolipases da invenção.
Determinando os peptídeos representando os sítios antigênicos da enzima (epítopos), sítios ativos, sítios de ligação, seqüências de sinal, e similares podem ser feitos por protocolos de avaliação de rotina.
As enzimas da invenção são catalisadores altamente seletivos.
Como com outras enzimas, elas catalisam reações com estereo-, regio- e quimio-seletividades refinadas, que são incomparáveis em química sintética convencional. Além disso, as enzimas da invenção são notavelmente versáteis. Elas podem ser adaptadas para funcionar em solventes orgânicos, operar em pHs extremos (por exemplo, pHs elevados e pHs baixos), temperatu30 ras extremas (por exemplo, temperaturas elevadas e baixas temperaturas), níveis de salinidade extremos (por exemplo, salinidade elevada e baixa salinidade), e catalisar reações com compostos que são estruturalmente não
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135/279 relacionados com seus substratos fisiológicos, naturais. Enzimas da invenção podem ser designadas para ser reativas com uma ampla faixa de substratos naturais e não naturais, desse modo possibilitando a modificação de virtualmente qualquer composto de chumbo orgânico. Enzimas da invenção podem também ser designadas ser altamente enantio- e regio-seletivas. O elevado grau de especificidade de grupo funcional exibido por estas enzimas possibilita alguém não perder de vista cada reação em uma seqüência sintética induzindo a um novo composto ativo. Enzimas da invenção podem também ser designados para catalisar quaisquer reações diversas não relacio10 nadas com sua função fisiológica nativa em natura.
A presente invenção explora as únicas propriedades catalíticas de enzimas. Enquanto que o uso de biocatalisadores (isto é, enzimas purificadas ou brutas, células não vivas ou vivas) em transformações químicas normalmente requer a identificação de um biocatalisador particular que rea15 ge com um composto de partida específico. A presente invenção emprega biocatalisadores selecionados, isto é, as enzimas da invenção, e condições de reação que são específicas para grupos funcionais que estão presentes em muitos compostos de partida. Cada biocatalisador é específico para um grupo funcional, ou diversos grupos funcionais relacionados, e pode reagir com muitos compostos de partida contendo este grupo funcional. As reações biocatalíticas produzem uma população de derivados de um composto de partida simples. Estes derivados podem ser submetidos a outro ciclo de reações biocatalíticas para produzir uma segunda população de compostos derivados. Milhares de variações do composto original podem ser produzi25 das com cada iteração de derivação biocatalítica.
As enzimas reagem em sítios específicos de um composto de partida sem afetar o restante da molécula, um processo que é muito difícil de obter empregando-se métodos químicos tradicionais. Este elevado grau de especificidade biocatalítica fornece os métodos de identificar uma enzima ativa simples dentro de uma biblioteca. A biblioteca é caracterizada pela série de reações biocatalíticas empregadas para produzi-la, uma assim chamada história biossintética. Analisando a biblioteca quanto às atividades
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136/279 biológicas e traçando a história biossintética identifica-se a seqüência de reação específica produzindo o composto ativo. A seqüência de reação é repetida e a estrutura do composto sintetizado determinada. Este modo de identificação, ao contrário de outros métodos de síntese e avaliação, não requer tecnologias de imobilização, e os compostos podem ser sintetizados e testados livres em solução empregando-se virtualmente qualquer tipo de ensaio de avaliação. É importante observar, que o elevado grau de especificidade de reações de enzima sobre os grupos funcionais provê o acompanhamento de reações enzimáticas específicas que compõem a biblioteca biocataliticamente produzida.
A invenção também fornece métodos de descobrir novas fosfolipases empregando-se os ácidos nucléicos, polipeptídeos e anticorpos da invenção. Em um aspecto, as bibliotecas de fago lambda são analisadas quanto a descoberta com base na expressão de fosfolipases. O uso de bi15 bliotecas de fago lambda em avaliação permite a detecção de clones tóxicos; acesso melhorado ao substrato; necessidade reduzida para construir um hospedeiro, desvio do potencial para qualquer tendência resultante de excisão de massa da biblioteca; e, crescimento mais rápido em baixas densidades de clone. Avaliação em fase líquida fornece maior flexibilida de em condições de ensaio; flexibilidade de substrato adicional; sensibilidade mais elevada para clones fracos; e facilidade de automação sobre avaliação de fase sólida.
Muitas das etapas de procedimento são realizadas empregandose automação robótica possibilitando a execução de muitos milhares de re25 ações biocatalíticas e ensaios de avaliação por dia, bem como assegurando um nível elevado de precisão e reproducibilidade (veja discussão de disposições, abaixo). Como um resultado, uma biblioteca de compostos derivados pode ser produzida em semanas. Para maiores ensinamentos sobre a modificação de moléculas, incluindo moléculas pequenas, veja a
PC/US94/09174.
Seqüências de sinal de fosfolipase e domínios catalíticos.
A invenção fornece seqüências sinal de fosfolipase (por exemPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 153/316
137/279 pio, peptídeos sinal (SPs)) e domínios catalíticos (CDs). A invenção fornece ácidos nucléicos codificando estes domínios catalíticos (CDs) e seqüências sinal (SPs, por exemplo, um peptídeo tendo uma seqüência compreendendo/ consistindo em resíduos de terminal amino de um polipeptídeo da inven5 ção). Em um aspecto, a invenção fornece uma seqüência sinal compreendendo um peptídeo compreendendo/ consistindo em uma seqüência como mencionados nos resíduos 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 28, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32 ou 1 a 33 de um polipeptídeo da invenção, por exemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6,
SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID
NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96,
SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106.
Seqüências sinal exemplares são mencionadas na listagem de listagem SEQ ID, por exemplo, resíduos 1 a 24 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6; resíduos 1 a 29 de SEQ ID NO: 8; resíduos 1 a 20 de
SEQ ID NO: 10; resíduos 1 a 19 de SEQ ID NO: 20; resíduos 1 a 28 de SEQ ID NO: 22; resíduos 1 a 20 de SEQ ID NO :32; resíduos 1 a 23 de SEQ ID NO: 38; veja listagem SEQ ID para outras seqüências sinal exemplares da invenção.
As seqüências sinal de fosfolipases da invenção podem ser pep30 tídeos isolados, ou, seqüências ligadas à outra fosfolipase ou um polipeptídeo de não-fosfolipase, por exemplo, como uma proteína de fusão. Em um aspecto, a invenção fornece polipeptídeos compreendendo seqüências sinal
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138/279 de fosfolipase da invenção. Em um aspecto, polipeptídeos compreendendo seqüências sinal de fosfolipase da invenção compreendem seqüências heterólogas a uma fosfolipase da invenção (por exemplo, uma proteína fusão compreendendo uma seqüência sinal de fosfolipase da invenção e seqüên5 cias de outra fosfolipase ou uma proteínade não fosfolipase). Em um aspecto, a invenção fornece fosfolipases da invenção com seqüências sinal heterólogas, por exemplo, seqüências com uma seqüência sinal de levedura. Uma fosfolipase da invenção pode compreender uma seqüência sinal heteróloga, por exemplo, em um vetor, por exemplo, um vetor série pPIC (Invi10 trogen, Carlsbad, CA).
Em um aspecto, as seqüências sinal da invenção são identificadas seguindo a identificação de novos polipeptídeos de fosfolipase. As trilhas pelas quais as proteínas são classificadas e transportadas para sua localização celular apropriada são freqüentemente referidas como as trilhas de alvejamento de proteína. Um dos elementos mais importantes em todos estes sistemas de alvejamento é uma seqüência de aminoácido curta na terminal amino de um polipeptídeo recentemente sintetizado chamado a seqüência sinal. Esta seqüência sinal direciona uma proteína para sua localização apropriada na célula e é removida durante o transporte ou quando a proteína alcança seu destino final. A maioria das proteínas lissosômicas, de membrana ou secretadas tem uma seqüência sinal de terminal amino que as marca para a translocação dentro do lúmen do retículo endoplásmico. Mais do que 100 seqüências sinal para proteínas neste grupo foram determinadas. As seqüências sinal podem variar em tamanho de 13 a 36 resí25 duos de aminoácido. Vários métodos de reconhecimento de seqüências sinal são conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, em um aspecto, novos peptídeos de sinal de fosfolipase são identificados por um método referido como SignalP. O SignalsP emprega umarede reural combinada que reconhece igualmente os peptídeos de sinal e seus sítios de cliva30 gem. (Nielsen, e outros, Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction de their cleavage sites. Protein Engineering, volume 10, n° 1, pp. 1-6 (1997).
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Deve ser entendido que em alguns aspectos, as fosfolipases da invenção podem não ter seqüências sinal. Em um aspecto, a invenção fornece as fosfolipases da invenção sem toda ou parte de uma seqüência sinal. Em um aspecto, a invenção fornece uma seqüência de ácido nucléico codificando uma seqüência sinal de uma fosfolipase operavelmente ligada a uma seqüência de ácido nucléico de uma fosfolipase diferente ou, opcionalmente, uma seqüência sinal de uma proteína de não fosfolipase pode ser desejada.
A invenção também fornece polipeptídeos isolados ou recombi10 nantes compreendendo seqüências sinal (SPs) e domínios catalíticos (CDs) da invenção e seqüências heterólogas. As seqüências heterólogas são seqüências não associadas naturalmente (por exemplo, a uma fosfolipase) com uma SP e/ou CD. A seqüência à qual a SP e/ou CD não são associadas naturalmente pode estar sobre a extremidade de terminal amino de SP e/ou CD, extremidade de terminal carbóxi, e/ou sobre ambas as extremidades da SP e/ou CD. Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo isolado ou recombinante compreendendo (ou consistindo em) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência sinal (SP) e/ou domínio catalítico (CD) da invenção com a condição de que não seja associado com qualquer se20 qüência à qual é naturalmente associado (por exemplo, uma seqüência de fosfolipase). Similarmente em um aspecto, a invenção fornece ácidos nucléicos isolados ou recombinantes codificando estes polipeptídeos. Desse modo, em um aspecto, o ácido nucléico isolado ou recombinante da invenção compreende seqüência de codificação para uma seqüência sinal (SP) e/ou domínio catalítico (CD) da invenção e uma seqüência heteróloga (isto é, uma seqüência não naturalmente associada com uma seqüência sinal (SP) e/ou domínio catalítico (CD) da invenção). A seqüência heteróloga pode estar sobre a extremidade de terminal 3', extremidade de terminal 5', e/ou sobre ambas as extremidades da SP e/ou seqüência de codificação CD.
Ensaios para a atividade de fosfolipase
A invenção fornece polipeptídeos isolados ou recombinantes tendo uma atividade de fosfolipase e ácidos nucléicos codificando-os.
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Quaisquer dos muitos ensaios de atividade de fosfolipase conhecidos na técnica podem ser empregados para determinar se um polipeptídeo tem uma atividade de fosfolipase e inclui-se no escopo da invenção. Os protocolos de rotina para determinar a fosfolipase A, B, D e C, atividades de acila de lipídio ou patatina são bem conhecidas na técnica.
Ensaios de atividade exemplares incluem ensaios de turbidez, ensaios de fosfocolina de metilumbeliferila (fluorescente), ensaios de fosfolipase vermelho Amplex (fluorescente), ensaios de cromatografia de camada fina (TLC), ensaios citolíticos e ensaios p-nitrofenilfosforilcolina. Empregan10 do-se estes ensaios os polipeptídeos podem ser rapidamente analisados quanto à atividade de fosfolipase.
A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de hidrolase de acila de lipídeo (LAH). Veja, por exemplo, Jimenez (2001) Lipids 36: 1169 - 1174, descrevendo um ensaio micelar misto com base em éter de monododecila de octaetileno glicol para determinar a atividade de hidrolase de acila de lipídeo de uma patatina. Pinsirodom (2000) J. Agric. Food Chem. 48:155-160, descreve uma atividade de patatina de hidrolase de acila de lipídeo exemplar (LAH).
Os ensaios de turbidez para determinar a atividade de fosfoli20 pase são descritos, por exemplo, em Kauffmann (2001) Conversion of Bacillus thermocatenulatus lipase into an efficient fosfolipase with increased activity towards long-chain fatty acyl substrates by directed evolution and rational design, Protein Engineering 14: 919 - 928; Ibrahim (1995) Evidence implicating fosfolipase as a virulence factor de Candida albicans, In25 fect. Immun. 63:1993-1998.
Os ensaios de fosfocolina de metilumbeliferila (fluorescente) para determinar a atividade de fosfolipase são descritos, por exemplo, em Goode (1997) Evidence for cell surface and internai fosfolipase activity in ascidian eggs, Develop. Growth Differ. 39: 655 - 660; Diaz (1999) Direct fluo30 rescence-based lipase activity assay, BioTechniques 27: 696 - 700.
Ensaios de fosfolipase de Vermelho Amplex (fluorescente) para determinar a atividade de fosfolipase são disponibilizados como kits, por
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141/279 exemplo, a detecção de fosfolipase específica de fosfatidilcolina empregando-se um Kit de ensaio de fosfolipase específica de fosfatidilcolina Vermelho Amplex de Molecular Probes Inc. (Eugene, OR), de acordo com as instruções do fabricante. A fluorescência é medida em uma leitora de microplaca de fluorescência empregando-se excitação a 560 ± 10 nm e detecção de fluorescência a 590 ±10 nm. O ensaio é sensível em concentrações de enzima muito baixas.
Ensaios de cromatografia de camada fina (TLC) para determinar a atividade de fosfolipase são descritos, por exemplo, em Reynolds (1991)
Methods in Enzymol. 197: 3-13; Taguchi (1975) Phospholipase from Clostridium novyi type A.l, Biochim. Biophys. Acta 409: 75-85. A cromatografia de camada finas (TLC) é uma técnica amplamente empregada para a detecção de atividade de fosfolipase. Várias modificações deste método têm sido empregadas para extrair os fosfolipídeos das misturas de ensaio aquo15 sas. Em alguns ensaios de PLC, a hidrólise é paralisada pela adição de clorofórmio/metanol (2:1) à mistura de reação. O material de partida não reagido e o diacilglicerol são extraídos na fase orgânica e podem ser fracionados por TLC, enquanto o produto de grupo de leitura permanece na fase aquosa. Para medição mais precisa da digestão de fosfolipídeo, os substratos radiorotulados podem ser empregados (veja, por exemplo, Reynolds (1991) Methods in Enzymol. 197: 3-13). As relações de produtos e reagentes podem ser empregadas para calcular o número real de moles de substrato hidrolisado por unidade de tempo. Se todos os componentes são extraídos igualmente, quaisquer perdas na extração afetarão todos os componentes igualmente. Separação de produtos de digestão de fosfolipídeo pode ser obtido por TLC de sílica gel com clorofórmio/metanol/água (65:25:4) empregado como um sistema solvente (veja, por exemplo, Taguchi (1975) Biochim. Biophys. Acta 409: 75 - 85).
Os ensaios de p-Nitrofenilfosforilcolina para determinar a ativi30 dade de fosfolipase são descritos, por exemplo, em Korbsrisate (1999) Cloning and characterization of a nonhemolytic fosfolipase gene from Burkholderia pseudomallei, J. Clin. Microbiol. 37: 3742-3745; Berka (1981) Studies
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142/279 de fosfolipase (heat labile hemolysin) in Pseudomonas aeroginosa, Infect. Immun. 34: 1071-1074. Este ensaio é com base em hidrólise enzimática do análogo de substrato p-nitrofenilfosforilcolina para liberar um composto cromogênico amarelo p-nitrofenol, detectável a 405 nm. Este substrato é con5 veniente para avaliação de produtividade elevada.
Um ensaio citolítico pode detectar fosfolipases com atividade citolítica com base na lise de eritrócitos. As fosfolipases tóxicas podem interagir com membranas de célula eucariótica e hidrolisar a fosfatidilcolina e esfingomielina, induzindo à lise de célula. Veja, por exemplo, Titball (1993)
Microbiol. Rev. 57: 347-366.
Bibliotecas de peptídeo e fosfolipases híbridas (quiméricas)
Em um aspecto, a invenção fornece fosfolipases híbridas e proteínas de fusão, incluindo bibliotecas de peptídeo, compreendendo seqüências da invenção. As bibliotecas de peptídeo da invenção podem ser empre15 gadas para isolar moduladores de peptídeo (por exemplo, ativadores ou inibidores) de alvos, tais como substratos de fosfolipase, receptores, enzimas. As bibliotecas de peptídeo da invenção podem ser empregadas para identificar parceiros de ligação formal de alvos, tais como ligandos, por exemplo, citocinas, hormônios e similares. Em um aspecto, a invenção fornece proteí20 nas quiméricas compreendendo uma seqüência sinal (SP) e/ou domínio catalítico (CD) da invenção e uma seqüência heteróloga (veja acima).
A invenção também fornece métodos para gerar fosfolipases híbridas e melhoradas empregando-se os ácidos nucléicos e polipeptídeos da invenção. Por exemplo, a invenção fornece métodos para gerar enzimas que têm atividade, por exemplo, atividade de fosfolipase (tal como, por exemplo, atividade de fosfolipase A, B, C ou D, atividade de esterase de patatina, divagem de uma ligação de éster de glicerolfosfato, divagem de uma ligação de éster em um fosfolipídeo em um óleo vegetal) em pHs alcalinos extremos e/ou pHs acídicos, temperaturas elevada e baixa, condições osmóticas e similares. A invenção fornece métodos para gerar enzimas híbridas (por exemplo, fosfolipases híbridas).
Em um aspecto, os métodos da invenção produzem novos poliPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 159/316
143/279 peptídeos híbridos utilizando processos celulares que integram a seqüência de um primeiro polinucleotídeo tal que os polinucleotídeos híbridos resultantes codificam polipeptídeos demonstrando atividades derivadas dos primeiros polipeptídeos biologicamente ativos. Por exemplo, os primeiros polinu5 cleotídeos podem ser uma seqüência de ácido nucléico exemplar (por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, etc.) codificando uma fosfolipase exemplar da invenção (por exemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, etc.). O primeiro ácido nucléico pode codificar uma enzima de um organismo que funciona eficaz10 mente sob uma condição ambiental particular, por exemplo, salinidade elevada. Ele pode ser integrado com uma enzima codificada por um segundo polinucleotídeo de um organismo diferente que funciona eficazmente sob uma condição ambiental diferente, tal como temperaturas extremamente elevadas. Por exemplo, quando os dois ácidos nucléicos podem produzir uma molécula híbrida por exemplo, por recombinação e/ou reclassificação redutiva. Um polinucleotídeo híbrido contendo seqüências do primeiro e segundo polinucleotídeos originais pode codificar uma enzima que exibe características de ambas as enzimas codificadas pelos polinucleotídeos originais. Desse modo, a enzima codificada pelo polinucleotídeo híbrido pode funcionar eficazmente sob condições ambientais compartilhadas por cada das enzimas codificadas pelos primeiro e segundo polinucleotídeos, por exemplo, elevada salinidade e temperaturas extremas.
Alternativamente, um polipeptídeo híbrido resultando deste método da invenção pode exibir atividade de enzima especializada não exibida nas enzimas originais. Por exemplo, seguindo a recombinação e/ou reclassificação redutiva de polinucleotídeos codificando atividades de fosfolipase, o polipeptídeo híbrido resultante codificado por um polinucleotídeo híbrido pode ser analisado quanto às atividades especializadas obtidas de cada das enzimas originais, isto é, o tipo de ligação sobre a qual a fosfolipase atua e a temperatura na qual a fosfolipase funciona. Desse modo, por exemplo, a fosfolipase pode ser analisada para verificar aquelas funcionalidades químicas que distinguem a fosfolipase híbrida das fosfolipases originais, tais coPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 160/316
144/279 mo: (a) amida (ligações de peptídeo), isto é, fosfolipases; (b) ligações de éster, isto é, amilases e lipases; (c) acetais, isto é, glicosidases e, por exemplo, a temperatura, pH ou concentração de sal na qual o polipeptídeo híbrido funciona.
Fontes dos polinucleotídeos a serem integrados com ácidos nucléicos da invenção podem ser isoladas de organismos individuais (isolados), coleções de organismos que foram desenvolvidos em veículos definidos (culturas de enriquecimento), ou, organismos não cultivados (amostras ambientais). O uso de um método independente de cultura para derivar polinucleotídeos codificando novas bioatividades de amostras ambientais é mais preferível uma vez que ele permite alguém acessar recursos não absorvidos de biodiversidade. Bibliotecas ambientais são geradas de amostras ambientais e representam os genomas coletivos de organismos de ocorrência natural arquivados em vetores de clonagem que podem ser pro15 pagados em hospedeiros procarióticos adequados. Por que o DNA clonado é inicialmente extraído diretamente de amostras ambientais, as bibliotecas não são limitadas a pequena fração de procariotas que podem ser desenvolvidos em cultura pura. Adicionalmente, uma normalização do DNA ambiental presente nestas amostras poderia permitir representação mais unifor20 me do DNA de todas as espécies presentes na amostra original. Isto pode dramaticamente aumentar a eficácia de descobrir genes interessantes de constituintes menores da amostra que podem ser sub-representado por diversas ordens de magnitude comparada às espécies dominantes.
Por exemplo, as bibliotecas de gene geradas de um ou mais microorganismos não cultivados são analisadas quanto a uma atividade de interesse. As trilhas potenciais codificando moléculas bioativas de interesse são primeiro capturadas em células procarióticas na forma de bibliotecas de expressão de gene. Os polinucleotídeos codificando atividades de interesse são isoladas de tais bibliotecas e introduzidas em uma célula hospedeira. A célula hospedeira é desenvolvida sob condições que promovem a recombinação e/ou reclassificação redutiva criando biomoléculas potencialmente ativas com atividades novas ou realçadas.
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Os microorganismos dos quais os polinucleotídeos híbridos podem ser preparados incluem microorganismos procarióticos, tais como Eubacteria e Archaebacteria, e microorganismos eucarióticos menores tais como fungos, algumas algas e protozoários. Os polinucleotídeos podem ser isolados de amostras ambientais. O ácido nucléico pode ser recuperado sem cultura de um organismo ou recuperado de um ou mais organismos cultivados. Em um aspecto, tais microorganismos podem ser extremófilos, tais como hipertermófilos, psicrófilos, psicrotrófos, halófilos, barófilos e acidófilos. Em um aspecto, os polinucleotídeos codificando enzimas de fosfoli10 pase isoladas de microorganismos extremofílicos são empregados para preparar enzimas híbridas. Tais enzimas podem funcionar em temperaturas acima de 100°C em, por exemplo, fontes de calor terrestres e passagens térmicas do mar profundas, em temperaturas abaixo de 0°C em, por exemplo, águas árticas, no ambiente de sal saturado de, por exemplo, o Mar Mor15 to, em valores de pH em torno de 0, por exemplo, em depósitos de carvão e fontes ricas em enxofre geotérmico, ou em valores de pH maiores do que 11, por exemplo, em lamas de esgoto. Por exemplo, as fosfolipases clonadas e expressas de organismos extremofílicos podem mostrar elevada atividade em toda uma ampla faixa de temperaturas e pHs.
Os polinucleotídeos selecionados e isolados como aqui descrito, incluindo pelo menos um ácido nucléico da invenção, são introduzidos em uma célula hospedeira adequada. Uma célula hospedeira adequada é qualquer célula que é capaz de promover a recombinação e/ou reclassificação redutiva. Os polinucleotídeos selecionados podem estar em um vetor que inclui seqüências de controle apropriadas. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica maior, tal como uma célula mamífera, ou uma célula eucariótica menor, tal como uma célula de levedura, ou preferivelmente, a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana. A introdução da construção na célula hospedeira pode ser afe30 tada por transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAEDextrano, ou eletroporação (Davis e outros, 1986).
Como exemplos representativos de hospedeiros apropriados,
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146/279 pode ser mencionado: células bacterianas, tais como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células fúngicas, tais como levedura; células de inseto tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células animais tais como CHO, COS ou melanoma de Bowes; adenoviroses; e células de planta. A seleção de um hospedeiro apropriado para a recombinação e/ou reclassificação redutiva ou justamente para expressão de proteína recombinante é suposta incluir-se no escopo daqueles versados na técnica dos ensinamentos inclusos. Os sistemas de cultura de célula mamífera que podem ser empregados para recombinação e/ou reclassificação redutiva ou justamente para expressão de proteína recombinante incluem, por exemplo, as linhagens COS-7 de fibroblastos de rim de macaco, descritas em SV40transformed simian cells support the replication de early SV40 mutants (Gluzman, 1981), as linhagens de célula C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK. Os vetores de expressão mamíferos podem compreender uma origem de repli15 cação, um promotor e realçador adequados, e sítios de ligação de ribossoma necessários, sítio de poliadenilação, sítios doadores e aceptores de união, e seqüências de terminação transcricional, e seqüências não transcritas de flanqueamento 5'. As seqüências de DNA derivadas da união de SV40, e sítios de poliadenilação podem ser empregados para fornecer os elementos genéticos não transcritos requeridos.
As células hospedeiras contendo os polinucleotídeos de interesse (para recombinação e/ou reclassificação redutiva ou justamente para expressão de proteína recombinante) podem ser cultivadas em veículos de nutriente convencional modificados como apropriado para promotores de ativação, selecionando os genes transformantes ou de amplificação. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, são aquelas previamente empregadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e será evidente para o técnico ordinariamente experiente. Os clones que são identificados como tendo a atividade de enzima especificada podem então ser seqüenciados para identificar a seqüência de polinucleotídeo codificando uma enzima tendo a atividade realçada.
Em outro aspecto, os ácidos nucléicos e métodos da presente
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147/279 invenção podem ser empregados para gerar novos polinucleotídeos para trilhas bioquímicas, por exemplo, trilhas de um ou mais óperons ou fixes de gene ou porções destes. Por exemplo, bactérias e muitos eucariotas têm um mecanismo coordenados para os genes de regulação cujos produtos são envolvidos em processos relacionados. Os genes são agrupados, em estruturas referidas como feixes de gene em um único cromossoma e são transcritos juntos sob o controle de uma única seqüência reguladora, incluindo um único promotor que inicia a transcrição do feixe inteiro. Desse modo um feixe de gene é um grupo de genes adjacentes que são ou idênticos ou relacionados, usualmente como para sua função.
O DNA de feixe de gene pode ser isolado de organismos diferentes e ligados em vetores, particularmente vetores contendo seqüências reguladoras de expressão que podem controlar e regular a produção de uma proteína detectável ou atividade de disposição relacionada com a proteína dos feixes de gene ligados. O uso de vetores que têm uma capacidade excepcionalmente grande para introdução de DNA exógeno é particularmente apropriado para uso com tais feixes de gene e é descrito por meio de exemplo aqui para incluir o fator f (ou fator de fertilidade) de E. coli. Este fator f de E. coli é um plasmídeo que afeta transferência de freqüência elevada dele próprio durante a conjugação e é ideal para obter e estavelmente propagar grandes fragmentos de DNA, tal como feixes de gene de amostras microbianas mistas. Fosmídeos, cosmídeos ou vetores de cromossoma artificial bacterianos (BAC) podem ser empregados como vetores de clonagem. Estes são derivados de fator f de E. coli que é capaz de estavelmente integrar grandes segmentos de DNA genômico. Quando integrado com DNA de uma amostra ambiental não cultivada mista, isto torna possível obter grandes fragmentos genômicos na forma de uma biblioteca de DNA ambiental estável. Os vetores cosmídeos foram originalmente designados para clonar e propagar grandes segmentos de DNA genômico. A clonagem em vetores cosmídeos é descrita em detalhes em Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Spring Harbor Laboratory Press (1989). Uma vez ligados em um vetor apropriado, dois ou mais vetoPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 164/316
148/279 res contendo diferentes feixes de gene de sintase de policetídeo podem ser introduzidos em uma célula hospedeira adequada. Regiões de homologia de seqüência parcial compartilhadas pelos feixes de gene promoverão processos que resultam em reorganização de seqüência resultando em um feixe de gene híbrido. O novo feixe de gene híbrido pode então ser analisado quanto às atividades realçadas não ssencontradas nos feixes de gene originais.
Desse modo, em um aspecto, a invenção refere-se a um método para produzir um polipeptídeo híbrido biologicamente ativo empregando10 se um ácido nucléico da invenção e analisando o polipeptídeo quanto a uma atividade (por exemplo, atividade realçada):
(1) introduzindo pelo menos um primeiro polinucleotídeo (por exemplo, um ácido nucléico das invenção) em ligação operável e um segundo polinucleotídeo em ligação operável, o referido pelo menos primeiro poli15 nucleotídeo e segundo polinucleotídeo compartilhando pelo menos uma região de homologia de seqüência parcial, em uma célula hospedeira adequada;
(2) desenvolvendo a célula hospedeira sob condições que promovem a reorganização de seqüência resultando em um polinucleotídeo híbrido em ligação operável;
(3) expressar um polipeptídeo híbrido codificado pelo polinucleotídeo híbrido;
(4) analisar o polipeptídeo híbrido sob condições que promovem a identificação da atividade biológica desejada (por exemplo, atividade de fosfolipase realçada); e (5) isolar um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo híbrido. Métodos para analisar várias atividades de enzima são conhecidos por aqueles versados na técnica e são descritos em todo o presente relatório descritivo. Tais métodos podem ser empregados quando isolando os polipeptídeos e polinucleotídeos da invenção.
Reclassificação in vivo pode ser focalizada sobre processos intermoleculares coletivamente referidos como recombinação. Em bactérias
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149/279 ela é geralmente revista como um fenômeno dependente de RecA. A invenção pode contar com processos de recombinação de uma célula hospedeira para recombinar e reclassificar seqüências, ou a capacidade das células para mediar processos redutivos para diminuir a complexidade de se5 qüências quasi-repetidas na célula por deleção. Este processo de reclassificação redutiva ocorre por um processo independente de RecA, intramolecular. Desse modo, em um aspecto da invenção, empregando-se os ácidos nucléicos da invenção novos polinucleotídeos são gerados pelo processo de reclassificação redutiva. O método envolve a geração de construc10 tos contendo seqüências consecutivas (seqüências de codificação original), sua inserção em um vetor apropriado, e sua introdução subseqüente em uma célula hospedeira apropriada. A reclassificação das entidades moleculares individuais ocorre por processos combinatoriais entre as seqüências consecutivas nas regiões de homologia possuindo o constructo, ou entre unidades quasi repetidas. O processo de reclassificação recombina e/ou reduz a complexidade e extensão das seqüências repetidas, e resulta na produção de novas espécies moleculares.
Vários tratamentos podem ser aplicados para realçar a taxa de reclassificação. Estes poderíam incluir tratamentos com luz ultravioleta, ou químicas de dano ao DNA, e/ou o uso de linhagens de célula hospedeira exibindo níveis realçados de instabilidade genética. Desse modo o processo de reclassificação pode envolver recombinação homóloga ou a propriedade natural de seqüências quase-repetidas para direcionar sua própria evolução.
Seqüências repetidas ou quase-repetidas desempenham um papel em instabilidade genética. Quase-repetições são repetições que não são restritas à sua estrutura unitária original. Unidades quasi-repetidas podem ser apresentadas como uma disposição de seqüências em um constructo; unidades consecutivas de seqüências similares. Uma vez ligadas, as junções entre as seqüências consecutivas tornam-se essencialmente invisíveis e a natureza quase-repetitiva do constructo resultante é agora contínua no nível molecular. O processo de deleção que a célula realiza para reduzir
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150/279 a complexidade do constructo resultante opera entre as seqüências quase repetidas. As unidades quase repetidas fornecem um reportório praticamente ilimitado de padrões no qual os eventos de escorregamento podem ocorrer. Os constructos contendo as quase-repetições desse modo eficazmente fornecem elasticidade molecular suficiente para que eventos de deleção (e potencialmente inserção) possam ocorrer virtualmente em qualquer lugar dentro das unidades quase repetitivas. Quando as seqüências quaserepetidas são todas ligadas na mesma orientação, por exemplo da cabeça para o rabo ou vice-versa, a célula não pode distinguir unidades individuais.
Conseqüentemente, o processo redutivo pode ocorrer em todas as seqüências. Ao contrário, quando por exemplo, as unidades são apresentadas cabeça a cabeça, em vez de cabeça ao rabo, a inversão delineia os pontos finais da unidade adjacente de modo que a formação de deleção favorecerá a perda de unidades discretas. Desse modo, em um aspecto da invenção, as seqüências a serem reclassificadas estão na mesma orientação. A orientação aleatória de seqüências quase-repetidas resultará na perda de eficiência de reclassificação, ao mesmo tempo que orientação consistente das seqüências oferecerá a maior eficiência. Entretanto, ao mesmo tempo que tendo a mais rara das seqüências contíguas na mesma orientação diminui a eficiência, pode também fornecer elasticidade suficiente para a recuperação eficaz de novas moléculas. Os constructos podem ser feitas com as seqüências quase-repetidas na mesma orientação para permitir eficiência mais elevada.
Seqüências podem ser agrupadas em uma orientação da cabe25 ça para o rabo empregando-se quaisquer de diversos métodos, incluindo o seguinte: a) Iniciadores que incluem uma cabeça poli-A e rabo poli-T, que quando feitos de filamento único forneceriam orientação, podem ser utilizados. Isto é realizado tendo as primeiras poucas bases dos iniciadores feitas de RNA e em conseqüência RNase H facilmente removida, b) Iniciadores que incluem sítios de divagem de restrição únicos podem ser utilizados. Sítios múltiplos, uma bateria de seqüências únicas, e síntese repetida e etapas de ligação seriam requeridos, c) As poucas bases internas do iniciador
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151/279 poderíam ser tioladas e uma exonuclease empregada para produzir moléculas apropriadamente adaptadas.
A recuperação das seqüências reclassificadas conta com a identificação de vetores de clonagem com um índice repetitivo reduzido (RI). As seqüências de codificação reclassificadas podem então ser recuperadas por amplificação. Os produtos são reclonados e expressos. A recuperação de vetores de clonagem com RI reduzido pode ser afetada pelo: 1) Uso de vetores apenas estavelmente mantidos quando o constructo é reduzida em complexidade. 2) Recuperação física de vetores encurtados por procedi10 mentos físicos. Neste caso, o vetor de clonagem seria recuperado empregando-se procedimentos de isolamento de plasmídeo padrão e tamanho fracionado sobre ou um gel de agarose, ou coluna com um corte de peso molecular baixo utilizando procedimentos padrão. 3) Recuperação de vetores contendo genes interrompidos que podem ser selecionados quando o tamanho do inserto diminui. 4) Uso de técnicas de seleção direta com um vetor de expressão e a seleção apropriada.
Seqüências de codificação (por exemplo, genes) de organismos relacionados podem demonstrar um grau elevado de homologia e codificam produtos de proteína bastante diversos. Estes tipos de seqüências são parti20 cularmente úteis na presente invenção como quase-repetições. Entretanto, este processo não é limitado a tais repetições quase idênticas.
O seguinte é um método exemplar da invenção. As seqüências de ácido nucléico de codificação (quasi-repetições) são derivadas de três (3) espécies, incluindo um ácido nucléico da invenção. Cada seqüência codifica uma proteína com um grupo distinto de propriedades, incluindo uma enzima da invenção. Cada das seqüências difere em alguns ou um único par de base em uma posição única na seqüência. As seqüências quase-repetidas são separada ou coletivamente amplificadas e ligadas em montagens aleatórias tal que todas as permutações e combinações possíveis estejam dis30 poníveis na população de moléculas ligadas. O número de unidades de quase-repetição pode ser controlado pelas condições de montagem. O número médio de unidades quase repetidas em um constructo é definido como
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152/279 o índice repetitivo (RI). Uma vez formados, os constructos podem, ou não podem ser de tamanho fracionado em um gel de agarose de acordo com protocolos publicados, inserido em um vetor de clonagem, e transferidos em uma célula hospedeira apropriada. As células são então propagadas e re5 classificação redutiva é realizada. A taxa do processo de reclassificação redutiva pode ser estimulada pela introdução de dano de DNA se desejado. Se a redução em RI é mediada por deleção, formação entre as seqüências repetidas por um mecanismo intramolecular, ou mediada por eventos tipo recombinação através de mecanismos intermoleculares é insignificante. O resultado final é uma reclassificação das moléculas em todas as combinações possíveis. Em um aspecto, o método compreende a etapa adicional de avaliação dos membros de biblioteca do lago emaranhado para identificar membros de biblioteca emaranhados tendo a capacidade de ligar-se ou de outro modo interagir, ou catalisar uma reação particular (por exemplo, tal como domínio catalítico de uma enzima) com uma macromolécula predeterminada, tal como por exemplo um receptor proteináceo, um oligossacarídeo, vírion, ou outro composto ou estrutura predeterminada. Os polipeptídeos, por exemplo, fosfolipases, que são identificados de tais bibliotecas podem ser empregados para vários propósitos, por exemplo, os processos industriais aqui descritos e/ou podem ser submetidos a um ou mais ciclos adicionais de emaranhamento e/ou seleção.
Em outro aspecto, é considerado que antes de ou durante a recombinação ou reclassificação, os polinucleotídeos gerados pelo método da invenção podem ser submetidos a agentes ou processos que promovem a introdução de mutações nos polinucleotídeos originais. A introdução de tais mutações aumentaria a diversidade de polinucleotídeos híbridos resultantes e polipeptídeos codificados por eles. Os agentes ou processos que promovem mutagênese incluem, porém não estão limitados a: (+)-CC-1065, ou um análogo sintético tal como (+)-CC-1065-(N3-Adenina (Veja Sun e Hurley, (1992); um aduzido de 4'-flúor-4-aminobifenila N-acetilado ou desacetilado capaz de inibir a síntese de DNA (Veja, por exemplo, van de Poli e outros (1992)); ou um aduzido de 4-aminobifenila N-acetilada ou desacetilada caPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 169/316
153/279 paz de inibir a síntese de DNA (Veja também, van de Poli e outros (1992), pp. 751-758); cromo trivalente, um sal de cromo trivalente, um aduzido de DNA de hidrocarboneto aromático policíclico (PAH) capaz de inibir a replicação de DNA, tal como 7-bromometil-benz[a]antraceno (BMA), tris(2,35 dibromopropil)fosfato (Tris-BP), 1,2-dibromo-3-cloropropano (DBCP), 2bromoacroleína (2BA), benzo[a]pireno-7,8-diidrodiol-9-10-epóxido (BPDE), um sal de halogênio de platina(ll), N-hidróxi-2-amino-3-metilimidazo[4,5-t]quinolina (N-hidróxi-IQ), e N-hidroxi-2-amino-1-metil-6-fenilimidazo[4,5-t]piridina (N-hidroxi-PhlP). Métodos especialmente preferidos para reduzir ou deter amplificação de PCR consiste em luz UV (+)-CC-1065 e (+)-CC1065-(N3-Adenina). Métodos particularmente abrangidos são aduzidos de DNA ou polinucleotídeos compreendendo os adutos de DNA dos polinucleotídeos ou lagos de polinucleotídeos, que podem ser liberados ou removidos por um processo incluindo aquecer a solução compreendendo os polinucleo15 tídeos antes de outro processamento.
Metodologias de Avaliação e Dispositivos de Monitoração On line.
Na prática dos métodos da invenção, uma variedade de mecanismos e metodologias pode ser empregada em conjunto com os polipeptídeos e ácidos nucléicos da invenção, por exemplo, para analisar polipeptí20 dos quanto à atividade de fosfolipase, para analisar compostos como moduladores potenciais de atividade (por exemplo, potenciação ou inibição de atividade de enzima), para anticorpos que ligam-se a um polipeptídeo da invenção, para ácidos nucléicos que hibridizam para um ácido nucléico da invenção, e similares.
Suportes Sólidos de Enzima Imobilizada
As enzimas de fosfolipase, fragmentos destas e ácidos nucléicos que codificam as enzimas e fragmentos podem ser afixados a um suporte sólido. Isto é frequentemente econômico e eficiente no uso de fosfolipases em processos industriais. Por exemplo, um consórcio ou coquetel de enzimas de fosfolipases (ou fragmentos ativos destas), que são empregadas em uma reação química específica, podem ser ligados a um suporte sólido e embebidos em um tonel de processo. A reação enzimática pode ocorrer. Em
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154/279 seguida, o suporte sólido pode ser retirado do tonel, juntamente com as enzimas afixadas a ele, para uso repetido. Em uma modalidade da invenção, um ácido nucléico isolado da invenção é afixado a um suporte sólido. Em outra modalidade da invenção, o suporte sólido é selecionado do grupo de um gel, uma resina, um polímero, uma cerâmica, um vidro, um microeletrodo e qualquer combinação destes.
Por exemplo, suportes sólidos úteis nesta invenção incluem géis. Alguns exemplos de géis incluem Sefarose, gelatina, glutaraldeído, glutaraldeído tratado com quitosana, albumina-glutaraldeído, quitosana10 Xantano, gel de toyopearl (gel de polímero), alginato, alginato-polilisina, carragenina, agarose, agarose de glioxila, agarose magnética, dextranoagarose, hidrogel de poli(Carbamoil Sulfonato), hidrogel de BSA-PEG, álcool de polivinila fosforilada (PVA), monoaminoetil-N-aminoetila (MANA), amino, ou qualquer combinação destes.
Outro suporte sólido útil na presente invenção são resinas ou polímeros. Alguns exemplos de resinas ou polímeros incluem celulose, acrilamida, náilon, raiom, poliéster, resina de troca de ânion, AMBERLITE® XAD-7, AMBERLITE® XAD-8, AMBERLITE® IRA-94, AMBERLITE® IRC-50, polivinila, poliacrílico, polimetacrilato, ou qualquer combinação destes.
Outro tipo de suporte sólido útil na presente invenção é a cerâmica. Alguns exemplos incluem cerâmica não porosa, cerâmica porosa, S1O2, AI2O3. Outro tipo de suporte sólido útil na presente invenção é o vidro. Alguns exemplos incluem vidro não poroso, vidro poroso, vidro de aminopropila ou qualquer combinação destes. Outro tipo de suporte sólido que pode ser empregado é um microeletrodo. Um exemplo é uma magnetita revestida por polietilenoimina. Partículas grafíticas podem ser empregadas como um suporte sólido.
Outro exemplo de um suporte sólido é uma célula, tal como uma célula vermelha do sangue.
Métodos de imobilização
Existem muitos métodos que seriam conhecidos por alguém versado na técnica para imobilizar enzimas ou fragmentos destas, ou ácidos
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155/279 nucléicos, sobre um suporte sólido. Alguns exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, geração de gotícula eletrostática, métodos eletroquímicos, por meio de adsorção, por meio de ligação covalente, por meio de reticulação, por meio de uma reação ou processo químico, por meio de encapsula5 ção, por meio de captura, por meio de alginato de cálcio, ou por meio de poli(2-hidroxietil metacrilato). Igualmente, são descritos métodos em Methods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells, Part C. 1987. Academic Press. Editada por S. P. Colowick e N. O. Kaplan. Volume 136; e Immobilization of Enzymes and Cells. 1997. Humana Press. Editada por G. F.
Bickerstaff. Série: Methods in Biotechnology, Editada por J. M. Walker. Disposições Capilares
Disposições capilares, tais como GIGAMATRIX®, Diversa Corporation, San Diego, CA, podem ser empregadas nos métodos da invenção. Ácidos nucléicos ou polipeptídeos da invenção podem ser imobilizados a ou aplicados a uma disposição, incluindo disposições capilares. Disposições podem ser empregadas para analisar ou monitorar bibliotecas de composições (por exemplo, moléculas pequenas, anticorpos, ácidos nucléicos, etc.) quanto a sua capacidade de ligar-se a ou modular a atividade de um ácido nucléico ou um polipeptídeo da invenção. As disposições capilares fornecem outro sistema para preparar ou analisar amostras. Por exemplo, um mecanismo de avaliação de amostra pode incluir diversos capilares formados em uma disposição de capilares adjacentes, onde cada capilar compreende pelo menos uma parede definindo um lúmen para reter uma amostra. O mecanismo pode também incluir material intersticial disposto entre capilares adja25 centes na disposição, e um ou mais indícios de referência formados dentro do material intersticial. Um vaso capilar para analisar uma amostra, onde o vaso capilar é adaptado para ser ligado em uma disposição de capilares, pode incluir uma primeira parede definindo um lúmen para reter a amostra, e uma segunda parede formada de um material de filtragem, para filtrar ener30 gia de excitação fornecida para o lúmem para excitar a amostra.
Um polipeptídeo ou ácido nucléico, por exemplo, um ligando, pode ser introduzido em um primeiro componente em pelo menos uma porPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 172/316
156/279 ção de um vaso capilar de uma disposição de vaso capilar. Cada vaso capilar da disposição capilar pode compreender pelo menos uma parede definindo um lúmem para reter o primeiro componente. Uma borbulha de ar pode ser introduzida no vaso capilar atrás do primeiro componente. Um se5 gundo componente pode ser introduzido no vaso capilar, onde o segundo componente é separado do primeiro componente pela borbulha de ar. Uma amostra de interesse pode ser introduzida como um primeiro líquido rotulado com uma partícula detectável em um vaso capilar de um disposição capilar, onde cada capilar da disposição capilar compreende pelo menos uma pare10 de definindo um lúmem para reter o primeiro líquido e a partícula detectável, e onde a pelo menos uma parede é revestida com um material de ligação para ligar a partícula detectável a pelo menos uma parede. O método pode também incluir remover o primeiro líquido do tubo capilar, onde a partícula detectável de ligação é mantida dentro do vaso capilar, e introduzindo um segundo líquido no tubo capilar.
A disposição de capilar pode incluir uma pluralidade de capilares individuais compreendendo pelo menos uma parede externa definindo um lúmem. A parede externa do vaso capilar pode ser uma ou mais paredes fundidas uma à outra. Similarmente, a parede pode definir um lúmem que é cilíndrico, quadrado, hexagonal ou qualquer outra forma geométrica contanto que as paredes formem um lúmem para retenção de um líquido ou amostra. Os vasos capilares da disposição capilar podem ser mantidos juntos em proximidade íntima para formar uma estrutura plana. Os vasos capilares podem ser ligados um ao outro, sendo fundidos (por exemplo, onde os capila25 res são feitos de vidro), colados, ligados, ou grampeados lado a lado. A disposição de capilar pode ser formada de qualquer número de capilares individuais, por exemplo, uma faixa de 100 a 4,000,000 capilares. Uma disposição capilar pode formar uma placa de microtítulo tendo cerca de 100,000 ou mais capilares individuais ligados um ao outro.
Disposições, ou BioChips
Ácidos nucléicos ou polipeptídeos da invenção podem ser imobilizados a ou aplicados a uma disposição. As disposições podem ser emprePetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 173/316
157/279 gadas para analisar ou monitorar bibliotecas de composições (por exemplo, moléculas pequenas, anticorpos, ácidos nucléicos, etc.) quanto a sua capacidade de ligar-se a ou modular a atividade de um ácido nucléico ou um polipeptídeo da invenção. Por exemplo, em um aspecto da invenção, um pa5 râmetro monitorado é expressão de transcrição de um gene de fosfolipase. Uma ou mais, ou, todas as transcrições de uma célula podem ser avaliadas por hibridização de uma amostra compreendendo transcrições da célula, ou, ácidos nucléicos representativos de ou complementares às transcrições de uma célula, por hibridização aos ácidos nucléicos imobilizados em uma dis10 posição, ou biochip. Empregando-se uma disposição de ácidos nucléicos em um microchip, algumas ou todas as transcrições de uma célula podem ser simultaneamente quantificadas. Alternativamente, as disposições compreendendo ácido nucléico genômico podem também ser empregadas para determinar o genótipo de uma linhagem recentemente construída feita pelos métodos da invenção. Disposições de polipeptídeo podem também ser empregadas para simultaneamente quantificar uma pluralidade de proteínas.
A presente invenção pode ser praticada com qualquer disposição conhecida, também referida como uma microdisposição ou disposi20 ção de ácido nucléico ou disposição de polipeptídeo ou disposição de anticorpo ou biochip, ou variação destes. As disposições são genericamente uma pluralidade de pontos ou elementos alvo, cada elemento alvo compreendendo uma quantidade definida de uma ou mais moléculas biológicas, por exemplo, oligonucleotídeos, imobilizadas sobre uma área defini25 das de uma superfície de substrato para ligação específica a uma molécula amostra, por exemplo, trnscrições de RNAm.
Na prática dos métodos da invenção, qualquer disposição conhecida e/ou método de preparação e emprego das disposições pode ser incorporado no todo ou em parte, ou variações destes, como descrito, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos nos 6.277.628, 6.277.489, 6.261.776, 6.258.606, 6.054.270; 6.048.695, 6.045.996, 6.022.963,
6.013.440, 5.965.452, 5.959.098, 5.856.174, 5.830.645, 5.770.456,
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5.632.957, 5.556.752, 5.143.854, 5.807.522, 5.800.992, 5.744.305,
5.700.637, 5.556.752, 5.434.049, veja também, por exemplo, WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958; veja também , por exemplo, Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques
23:1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; Solinas-Toldo (1997)
Genes, Chromosomes & Câncer 20:399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21:25-32. veja também pedidos de patente dos Estados Unidos publicados nos 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.
Anticorpos e métodos de análise com base em anticorpo
A invenção fornece anticorpos isolados ou recombinantes que especificamente ligam-se a uma fosfolipase da invenção. Estes anticorpos podem ser empregados para isolar, identificar ou quantificar as fosfolipases da invenção ou polipeptídeos relacionados. Estes anticorpos podem ser empregados para inibir a atividade de uma enzima da invenção. Estes anticorpos podem ser empregados para polipeptídeos isolados relacionados com aqueles da invenção, por exemplo, enzimas de fosfolipase relacionadas.
Os anticorpos podem ser empregados em imunoprecipitação, manchamento (por exemplo, FACS), colunas de imunoafinidade, e similares. Se desejado, as seqüências de ácido nucléico codificando para antígenos específicos podem ser geradas por imunização seguida por isolamento de polipeptídeo ou ácido nucléico, amplificação ou clonagem e imobilização de polipeptídeo sobre uma disposição da invenção. Alternativamente, os méto25 dos da invenção podem ser empregados para modificar a estrutura de um anticorpo produzido por uma célula a ser modificada, por exemplo, uma afinidade de anticorpo pode ser aumentada ou diminuída. Além disso, a capacidade de criar ou modificar anticorpos pode ser um fenótipo construído em uma célula pelos métodos da invenção.
Os métodos de imunização, produzindo e isolando anticorpos (policlonais e monoclonais) são conhecidos por aqueles versados na técnica e descritos na literatura científica e de patente, veja, por exemplo, Coligan,
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CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7a ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA (Stites); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2a ed.) Academic Press, Nova Iorque,
NY (1986); Kohler (1975) Nature 256: 495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Nova Iorque. Os anticorpos podem também ser gerados in vitro, por exemplo, empregandose sítio de ligação de anticorpo recombinante expressando bibliotecas de exibição de fago, em adição aos métodos in vivo tradicionais empregando animais. Veja, por exemplo, Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15: 6270; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 27-45.
Os polipeptídeos podem ser empregados para gerar anticorpos que ligam-se especificamente aos polipeptídeos da invenção. Os anticorpos resultantes podem ser empregados em procedimentos de cromatografia de imunoafinidade para isolar ou purificar o polipeptideo ou para determinar se o polipeptideo está presente em uma amostra biológica. Em tais procedimentos, uma preparação de proteína, tal como um extrato, ou uma amostra biológica é contactada com um anticorpo capaz de especificamente ligar-se a um dos polipeptídeos da invenção.
Em procedimentos de imunoafinidade, o anticorpo é ligado a um suporte sólido, tal como uma conta ou outra matriz de coluna. A preparação de proteína é colocada em contato com o anticorpo sob condições em que o anticorpo especificamente liga-se a um dos polipeptídeos da invenção. Após um banho para remover proteínas ligadas não-especificamente, os polipep25 tídeos especificamente ligados são eluídos.
A capacidade de proteínas em uma amostra biológica para se ligar ao anticorpo pode ser determinada usando qualquer de uma variedade de procedimentos familiares àqueles versados na técnica. Por exemplo, ligação pode ser determinada por rotulagem do anticorpo com um rótulo de30 tectável tal como um agente fluorescente, um rótulo enzimático, ou um radioisótopo. Alternativamente, ligação do anticorpo à amostra pode ser detectada usando um anticorpo secundário tendo tal rótulo detectável nisso. EnPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 176/316
160/279 saios particulares incluem ensaios de ELISA, ensaios de sanduíche, radioimunoensaios, e Western blot.
Anticorpos policlonais gerados contra os polipeptídeos da invenção podem ser obtidos por injeção direta dos polipeptídeos em um animal ou por administração dos polipeptídeos a um animal, por exemplo, um nãohumano. O anticorpo assim obtido ligar-se-á então o polipeptídeo sozinho. Dessa maneira, até uma seqüência codificando somente um fragmento do polipeptídeo pode ser empregado para gerar anticorpos que podem se ligar ao polipeptídeo nativo integral. Tais anticorpos podem então ser usados pa10 ra isolar o polipeptídeo das células expressando aquele polipeptídeo.
Para preparação de anticorpos monoclonais, qualquer técnica que fornece anticorpos produzidos por culturas de linhagem de célula contínua pode ser usada. Exemplos incluem a técnica de hibridoma, a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de célula B humana, e a técnica hibridoma
EBV (ver, por exemplo, Cole (1985) em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).
Técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples (ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples para os poli20 peptídeos da invenção. Alternativamente, camundongos transgênicos podem ser usados para expressar anticorpos humanizados para estes polipeptídeos ou fragmentos dos mesmos.
Anticorpos gerados contra os polipeptídeos da invenção podem ser usados em análise para polipeptídeos similares de outros organismos e amostras. Em tais técnicas, polipeptídeos do organismo são contatados com o anticorpo e aqueles polipeptídeos que especificamente ligam-se ao anticorpo são detectados. Qualquer um dos procedimentos descritos acima pode ser usado para detectar ligação de anticorpo.
Kits
A invenção fornece kits compreendendo as composições, por exemplo, ácidos nucléicos, cassetes de expressão, vetores, células, polipeptídeos (por exemplo, fosfolipases) e /ou anticorpos da invenção. Os kits
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161/279 também podem conter material instrutivo ensinando as metodologias e empregos industriais da invenção, tais como descritos aqui.
Empregos Industriais e Médicos das Enzimas da Invenção
A invenção fornece muitos empregos industriais e aplicações médicas para as enzimas da invenção, por exemplo, fosfolipases A, B, C e D, incluindo a conversão de um fosfolipídeo não hidratável para uma forma hidratável, desengomamento de óleo, processamento de óleos de plantas, peixe, algas e similares, para mencionar apenas algumas aplicações. Métodos de emprego de enzimas de fosfolipase em aplicações industriais são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as fosfolipases e métodos da invenção podem ser empregados para o processamento de gorduras e óleos tal como descrito, por exemplo, em Publicação de Pedido de Patente JP H6306386, descrevendo a conversão de fosfolipídeos presentes nos óleos e gorduras em substâncias solúveis em água contendo grupos de ácido fosfó15 rico.
Fosfolipases da invenção podem ser empregadas para processar óleos de planta e fosfolipídeos tais como aqueles derivados ou isolados de soja, canola, palma, caroço de algodão, milho, semente de palmeira, côco, amendoim, sésamo, girassol. Fosfolipases da invenção podem ser empregadas para processar óleos essenciais, por exemplo, aqueles provenientes de óleos de semente de fruta, por exemplo, semente de uva, damasco, borragem, etc. Fosfolipases da invenção podem ser empregadas para processar óleos e fosfolipídeos em diferentes formas, incluindo formas brutas, desengomados, gomas, água de lavagem, argila, sílica, matéria25 prima de sabão, e similares. Os fosfolipídeos da invenção podem ser empregados para processar óleos altamente fosforosos, óleos de peixe, óleos animais, óleos de planta, óleos de algas e similares. Em qualquer aspecto da invenção, a qualquer hora uma fosfolipase C pode ser empregada, uma alternativa compreende o emprego de uma fosfolipase D da invenção e uma fosfatase (por exemplo, empregando-se uma combinação de PLD/fosfatase para melhorar a produção em um óleo de fósforo elevado, tal como um óleo de soja).
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Fosfolipases da invenção podem ser empregadas para processar e fabricar óleos comestíveis, óleos biodieseis, lipossomas para a farmacêutica e a cosmética, fosfolipídeos estruturados e lipídeos estruturados. Fosfolipases da invenção podem ser empregadas na extração de óleo.
Fosfolipases da invenção podem ser empregadas para processar e fabricar diferentes sabões.
Refinação cáustica
Em um processo exemplar da invenção, fosfolipases são empregadas como auxiliares de refinação cáustica. Mais particularmente uma
PLC ou PLD e uma fosfatase são empregadas nos processos como uma inclusão casual, ou antes, durante, ou após um processo de refinação de neutralização cáustica (refinação ou contínua ou de batelada). A quantidade de enzima adicionada pode variar de acordo com o processo. O nível de água empregado no processo deve ser baixo, por exemplo, cerca de 0,5 a
5%. Alternativamente, cáustico deve ser adicionado ao processo múltiplas vezes. Além disso, o processo pode ser executado em diferentes temperaturas (25°C a 70°C), com diferentes ácidos ou cáusticos, e em pH variável (412). Os ácidos que podem ser empregados em um processo de refinação cáustica incluem, mas não estão limitados a, ácidos fosfóricos, cítricos, as20 córbicos, sulfúricos, fumáricos, maléicos, clorídricos e /ou acéticos. Os ácidos são empregados para hidratar fosfolipídeos não hidratáveis. Os cáusticos que podem ser empregados incluem, mas não estão limitados a, KOHe NaOH. Os cáusticos são empregados para neutralizar ácidos graxos livres. Alternativamente, fosfolipases, ou mais particularmente uma PLC ou uma
PLD e uma fosfatase, são empregadas para a purificação de fito-esteróis da matéria-prima de sabão/goma.
Uma modalidade alternativa da invenção para adicionar antes da refinação cáustica é expressar a fosfolipase em uma planta. Em outra modalidade, a fosfolipase é adicionada durante o esmagamento da planta, sementes ou outra parte da planta. Alternativamente, a fosfolipase é adicionada em seguida ao esmagamento, porém antes da refinação (isto é, em recipientes de manutenção). Além disso, a fosfolipase é adicionada como
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163/279 um pré-tratamento de refinação, ou com ou sem ácido.
Outra modalidade da invenção, já descrita, é adicionar a fosfolipase durante um processo de refinação cáustica. Neste processo, os níveis de ácido e cáustico são variados dependendo do nível de fosforosos e do nível de ácidos graxos livres. Além disso, amplas faixas de temperatura e pH são empregadas no processo, dependendo do tipo de enzima empregado.
Em outra modalidade da invenção, a fosfolipase é adicionada após a refinação cáustica (Figura 9). Em um exemplo, a fosfolipase é adicionada em um misturador intenso ou em um misturador de retenção, antes da separação. Alternativamente, a fosfolipase é adicionada em seguida à etapa de aquecimento. Em outra modalidade, a fosfolipase é adicionada na etapa de centrifugação. Em uma modalidade adicional, a fosfolipase é adicionada à matéria-prima de sabão. Alternativamente, a fosfolipase é adicionada à água de lavagem. Em outro exemplo, a fosfolipase é adicionada duran15 te as etapas de alvejamento e/ou desodorizante.
Desengomamento de óleo e processamento de óleo vegetal
As fosfolipases da invenção podem ser empregadas em várias etapas de processamento de óleo vegetal, tais como em extração de óleo vegetal, particularmente, na remoção de gomas de fosfolipídeo em um processo chamado desengomamento de óleo, tal como descrito acima. A invenção fornece métodos para o processamento de óleos vegetais de várias fontes, tais como soja, semente de colza, amendoins e outras nozes, sésamo, girassol, palma e milho. Os métodos podem ser empregados em conjunção com processos baseados na extração com por exemplo hexano, com subseqüente refinação dos extratos brutos para óleos comestíveis, incluindo o emprego dos métodos e enzimas da invenção. A primeira etapa na seqüência de refinação é o então chamado processo de desengomamento, o qual serve para separar fosfatídeos pela adição de água. O material precipitado por desengomamento é separado e também processado para misturas de lecitinas. As lecitinas comerciais, tais como lecitina de soja e lecitina de girassol, são materiais semi-sólidos ou muito viscosos. Elas consistem em uma mistura de lipídeos polares, principalmente fosfolipídeos, e
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164/279 óleo, principalmente triglicerídeos.
As fosfolipases da invenção podem ser empregadas em qualquer procedimento de desengomamento, incluindo desengomamento de água, desengomamento de óleo ALCON (por exemplo, para soja), desen5 gomamento de safinco, super desengomamento, desengomamento de UF, desengomamento de TOP, uni-desengomamento, desengomamento a seco e desengomamento de ENZYMAX®. Veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos 6.355.693; 6.162.623; 6.103.505; 6.001.640; 5.558.781; 5.264.367. Vários procedimentos de desengomamento incorporados pelos métodos da invenção estão descritos em Bockisch, M. (1998) em Fats and Oils Handbook, The extraction of Vegetable Oils (Capítulo 5), 345-445, AOCS Press, Champaign, Illinois. As fosfolipases da invenção podem ser empregadas na aplicação industrial de desengomamento enzimático de óleos de triglicerídeos tal como descrito, por exemplo, na EP 513 709.
As fosfolipases da invenção podem ser empregadas na aplicação industrial de desengomamento enzimático tal como descrito, por exemplo, em CA 1102795, que descreve um método de isolamento de lipídeos polares de lipídeos de cereal pela adição de pelo menos 50% em peso de água. Este método é um desengomamento modificado no sentido de que ele utiliza o princípio da adição de água a uma mistura de óleo cru.
Em um certo aspecto, a invenção fornece processos enzimáticos compreendendo o emprego de fosfolipases da invenção (por exemplo, uma PLC) compreendendo hidrólise de fosfolipídeos hidratados em óleo a uma temperatura de cerca de 20°C a 40°C, em um pH alcalino, por exemplo, um pH de cerca de pH 8 a pH 10, empregando-se um tempo de reação de cerca de 3 a 10 minutos. Isto pode resultar em níveis de fósforo do óleo final menores do que 10 ppm. A invenção também fornece processos enzimáticos compreendendo o emprego de fosfolipases da invenção (por exemplo, uma PLC) compreendendo hidrólise de fosfolipídeos hidratáveis e não hidra30 táveis em óleo a uma temperatura de cerca de 50°C a 60°C, a um pH ligeiramente abaixo de neutro, por exemplo, de cerca de pH 5 a pH 6,5, empregando-se um tempo de reação de cerca de 30 a 60 minutos. Isto pode resulPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 181/316
165/279 tar em níveis de fósforo do óleo final menores do que 10 ppm.
Em um certo aspecto, a invenção fornece processos enzimáticos que utilizam uma enzima de fosfolipase C para hidrolisar uma ligação de fosfoéster de glicerila e desse modo permitir o retorno da porção de diacilgli5 cerídeo de fosfolipídeos novamente ao óleo, por exemplo, um óleo vegetal, de peixe ou de algas (um auxiliar de refinação cáustica de fosfolipase C (PLC)); e, reduzem o conteúdo de fosfolipídeo em uma etapa de desengomamento a níveis suficientemente baixos para óleos altamente fosforosos a serem fisicamente refinados (um auxiliar de desengomamento de fosfoli10 pase C (PLC)). As duas metodologias podem gerar diferentes valores e têm diferentes aplicações alvo.
Em vários processos exemplares da invenção, várias etapas distintas compõem o processo de desengomamento precedendo os processos de refinação de branqueamento e desodorização de núcleo. Estas eta15 pas incluem aquecimento, mistura, manutenção, separação e secagem. Seguindo a etapa de aquecimento, água e frequentemente ácido são adicionados e misturados para permitir a goma de fosfolipídeo insolúvel aglomerarse em partículas que podem ser separadas. Embora a água separe muitos dos fosfatídeos em desengomamento, porções dos fosfolipídeos são fosfa20 tídeos não hidratáveis (NHPs) presentes como sais de cálcio ou magnésio. Processos de desengomamento voltam-se para estes NHPs pela adição de ácido. Seguindo a hidratação de fosfolipídeos, o óleo é misturado, mantido e separado por centrifugação. Finalmente, o óleo é secado e armazenado, transportado ou refinado, tal como ilustrado, por exemplo, na Figura 6. As gomas resultantes são ou processadas de novo para produtos de lecitina ou adicionados novamente na alimentação.
Em vários processos exemplares da invenção níveis de fósforo são reduzidos o suficiente para a refinação física. O processo de separação pode resultar em perdas de produção potencialmente mais elevadas do que a refinação cáustica. Adicionalmente, os processos de desengomamento podem gerar produtos de resíduos que não podem ser vendidos como lecitina comercial, veja, por exemplo, a Figura 7 com relação a um processo de
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166/279 desengomamento exemplar para óleos fisicamente refinados. Por conseguinte, estes processos não têm alcançado uma significante parte do mercado e processos de refinação cáustica continuam a dominar a indústria com relação a soja, canola e girassol. Nota-se entretanto, que uma enzima de fosfolipase C empregada em um processo de desengomamento especial diminuiría a formação de goma e retornaria a porção de diglicerídeo do fosfolipídeo novamente ao óleo.
Em um certo aspecto, uma enzima de fosfolipase C da invenção hidrolisa um fosfatídeo em uma ligação de fosfoéster de glicerila para gerar um diglicerídeo e composto de fosfato solúvel em água. O fosfatídeo hidrolisado move-se para a fase aquosa, deixando o diglicerídeo na fase de óleo, tal como ilustrado na Figura 8. Um objetivo do Auxiliar de Refinação Cáustica de PLC é converter as gomas de fosfolipídeo formadas durante a neutralização em um diacilglicerídeo o qual migrará novamente para a fase de óleo. Em contraste, um objetivo do Auxiliar de Desengomamento de PLC é reduzir os fosfolipídeos no óleo bruto para um equivalente fosforoso de menos que 10 partes por milhão (ppm).
Em um certo aspecto, uma enzima de fosfolipase C da invenção hidrolisa o fosfatídeo de ambos os fosfolipídeos hidratável e não hidratável em óleos brutos e desengomados neutralizados antes do alvejamento e desodorização. A enzima alvo pode ser aplicada como um produto de inclusão casual no processo de neutralização cáustica existente, tal como ilustrado na Figura 9. Neste aspecto, a enzima não será exigida resistir a níveis de pH extremos se ela é adicionada após a adição de cáustico.
Em um certo aspecto, uma fosfolipase da invenção permite fósforo a ser removido a níveis baixos aceitáveis em refinação física. Em um certo aspecto, uma PLC da invenção hidrolisa o fosfatídeo de ambos os fosfolipídeos hidratável e não hidratável em óleos brutos antes do alvejamento e desodorização. A enzima alvo pode ser aplicada como um produto de in30 clusão casual na operação de desengomamento existente, veja, por exemplo, a Figura 10. Dada a mistura subideal em equipamento comercial, é provável que ácido seja requerido para levar os fosfolipídeos não hidratáveis
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167/279 em contato com a enzima na interface óleo/água. Por conseguinte, em um certo aspecto, uma PLC estável em ácido da invenção é empregada.
Em um certo aspecto, um processo Auxiliar de Desengomamento de PLC da invenção pode eliminar perdas em uma, ou todas as três, áreas mencionadas na Tabela 2. Perdas associadas em um processo de PLC podem ser avaliadas ser cerca de 0,8% versus 5,2% sobre uma base de massa devido à remoção do fosfatídeo.
Tabela 2: Perdas Motivadas por Produtos de PLC
Auxiliar de Refinação Cáustica Auxiliar de Desengomamento
1) Perda de óleo na formação e separação de goma 2,1% X X
2) Óleo saponificado em adição cáustica 3,1% X
3) Óleo capturado em argila no branqueamento* <1,0% X X
Perda Total de Produção -5,2% -2,1% -5,2%
Benefícios potenciais adicionais deste processo da invenção incluem os seguintes:
Adsorventes reduzidos - menos adsorbentes requeridos com fósforo mais reduzido (< 5 ppm)
Emprego de produtos químicos mais reduzido - menores custos químicos e de processamento associados com hidratação de fosfolipídeos não hidra15 táveis
Menor geração de resíduos - menos água requerida para remover o fósforo do óleo
Óleos processados (por exemplo, desengomados) pelos métodos da invenção incluem sementes oleosas de planta, por exemplo, óleo de soja, óleo de semente de colza e óleo de girassol. Em um certo aspecto, o Auxiliar de Refinação Cáustica de PLC da invenção pode economizar 1,2% sobre processos de refinação cáustica existentes. A aplicação do auxiliar de refinação volta-se para o óleo de soja que foi desengomado para lecitina e estes são também excluídos dos cálculos de valor/carga.
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Os alvos de desempenho dos processos da invenção podem variar de acordo com as aplicações e mais especificamente o ponto de adição de enzima, veja Tabela 3.
Tabela 3: Alvos de Desempenho por Aplicação
Auxiliar de Refinação Cáustica Auxiliar de Desengomamento
Níveis de Fósforo do Óleo de Entrada <200 ppm* 600-1,400 ppm
Níveis de Fósforo do Óleo Final <10 ppm* <10 ppm
Gomas Hidratáveis e Não Hidratáveis Sim Sim
Tempo de Residência 3-10 minutos 30 minutos*
Formulação Líquida Sim Sim
pH Alvo 8-10*« 5,0-5,5**
Temperatura Alvo 20-40°C ~50-60°C
Conteúdo de Água <5% 1-1,25%
Pureza da Formulação de Enzima Nenhuma lípase/protease1 Nenhuma lípase/protease
Outros Exigências Chave Remoção de Fe Remoção de Fe
*Óleo desengomado de água t Níveis alvo obtidos em etapa de neutralização cáustica a montante, porém deve ser mantido t Existência de 1 a 2 horas tt Desengomamento de ácido requer uma enzima que seja estável em condições muito mais acídicas: pH em 2,3 para ácido cítrico a 5% tttQ pH do óleo neutralizado NÃO é neutro. Teste em POS indica que o pH será na faixa alcalina de 6,5 a 10 (9 de dezembro de 2002). A faixa de pH típica necessita ser determinada.
Outros processos que podem ser empregados com uma fosfolipase da invenção, por exemplo, uma fosfolipase Ai podem converter fosfolipídeos nativos não hidratáveis para uma forma hidratável. Em um certo aspecto, a enzima é sensível ao calor. Isto pode ser desejável, uma vez que o aquecimento do óleo pode destruir a enzima. Entretanto, a reação de de10 sengomamento deve ser ajustada para pH 4 a 5 e 60°C para acomodar esta enzima. Em dosagem de saturação de óleo de 300 unidades/kg, este processo exemplar é bem-sucedido admitindo-se previamente o conteúdo de
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169/279 fósforo do óleo desengomado em água até =10 ppm de P. As vantagens podem ser o conteúdo de H2O diminuído e a economia resultante em uso, manuseio e resíduos. A Tabela 4 lista aplicações exemplares para empregos industriais para as enzimas da invenção:
Tabela 4: Aplicação Exemplar
Auxiliar de Refinação Cáustica Auxiliar de Desengomamento
Resíduos de óleo de soja/produção de lecitina X
Óleo de soja refinado químico, óleo de Girassol, óleo de Canola X X
Óleos fosfatídeo baixos (por exemplo palma) X
Em adição a estes vários processos de desengomamento, as fosfolipases da invenção podem ser usadas em qualquer etapa de processamento de óleo vegetal. Por exemplo, enzimas de fosfolipase da invenção podem ser usadas no lugar de PI_A, por exemplo, fosfolipase A2, em qual10 quer etapa de processamento de óleo vegetal. Óleos que são processados ou desengomados nos métodos da invenção incluem óleos de soja, óleos de semente de colza, óleos de milho, óleo de grãos de palma, óleos de canola, óleos de girassol, óleos de sésamo, óleos de amendoim, e similares. Os produtos principais desse processo incluem triglicerídeos.
Em um processo exemplar, quando a enzima é adicionada e reagida com um óleo bruto, a quantidade de fosfolipase empregada é cerca de 10 - 10.000 unidades, ou, alternativamente, cerca de, 100 - 2.000 unidades, por 1 kg de óleo cru. O tratamento de enzima é conduzido durante 5 min a 10 horas em uma temperatura de 30°C a 90°C, ou, alternativamente, cerca de, 40°C a 70°C. As condições podem variar dependendo da temperatura ideal da enzima. A quantidade de água adicionada para dissolver a enzima é 5 - 1.000 partes em peso por 100 partes em peso de óleo bruto, ou, alternativamente, cerca de, 10 a 200 partes em peso por 100 partes em peso de óleo bruto.
Na conclusão de tal tratamento de enzima, a enzima líquida é
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170/279 separada com um meio apropriado tal como um separador centrífugo e o óleo processado é obtido. Compostos contendo fósforo produzidos por decomposição de enzima de substâncias gomosas em tal processo são praticamente todos transferidos na fase aquosa e removidos da fase de óleo. Na conclusão do tratamento de enzima, se necessário, o óleo processado pode ser adicionalmente lavado com água ou ácido orgânico ou inorgânico tal como, por exemplo, ácido acético, ácido fosfórico, ácido sucínico, e similares, ou com soluções de sal.
Em um processo exemplar para desengomamento de ultra10 filtragem, a enzima é ligada a um filtro ou a enzima é adicionada a um óleo antes da filtragem ou uma enzima é usada para periodicamente limpar os filtros.
Em um processo exemplar para um auxílio de refinamento físico mediado por fosfolipase, água e enzima são adicionadas a óleo cru. Em um aspecto, um PLC ou um PLD e uma fosfatase são usados no processo. Em refinamento físico mediado por fosfolipase, o nível de água pode ser baixo, isto é 0,5 - 5 % e o tempo de processo deve ser curto (menos que 2 horas, ou, menos que 60 minutos, ou, menos que 30 minutos, ou, menos que 15 minutos, ou, menos que 5 minutos). O processo pode ser conduzido em temperaturas diferentes (25°C a 70°C), usando cáusticos e/ou ácidos diferentes, em diferente pHs (por exemplo, 3-10).
Em aspectos alternados, desengomamento de água é desempenhado primeiro para coletar lecitina por centrifugação e então PLC ou PLC e PLA é adicionada para remover fosfolipídeos não-hidratáveis (o pro25 cesso deve ser desempenhado sob baixa concentração de água). Em outro aspecto, desengomamento de água de óleo bruto a menos que 10 ppm (óleos comestíveis) e refinamento físico subseqüente (menos que 50 ppm para biodiesel) é desempenhado. Em um aspecto, um emulsificante é adicionado e/ou o óleo bruto é submetido a um misturador intenso para promover mistura. Alternativamente, um quebrador de emulsão é adicionado e/ou o óleo bruto é esquentado para promover a separação da fase aquosa. Em outro aspecto, um ácido é adicionado para promover hidratação de fosfolipíPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 187/316
171/279 deos não-hidratáveis. Adicionalmente, fosfolipases podem ser usadas para mediar purificação de fitosteróis da goma/matéria-prima de sabão.
As enzimas da invenção podem ser usadas em qualquer método de processamento de óleo, por exemplo, desengomamento ou processos equivalentes. Por exemplo, as enzimas da invenção podem ser usadas em processos como descrito nas Patentes dos Estados Unidos N°s 5.558.781; 5.264.367; 6.001.640. O processo descrito em USPN 5.558.781 usa ou fosfolipase A1, A2 ou B, essencialmente destruindo lecitina no óleo que se comporta como um emulsificante.
As enzimas e métodos da invenção podem ser usados em processos para a redução de componentes contendo fósforo em óleos comestíveis compreendendo uma quantidade elevada de fósforo não-hidratável por uso de uma fosfolipase da invenção, por exemplo, um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase A e/ou B, como descrito, por exemplo, no
Número de Patente EP: EP 0869167. Em um aspecto, o óleo comestível é um óleo bruto, um assim chamado óleo não-desengomado. Em um aspecto, o método trata um óleo não-desengomado, incluindo óleos prensados ou óleos extraídos, ou uma mistura dos mesmos, a partir de, por exemplo, semente de colza, soja, sésamo, amendoim, milho ou girassol. O conteúdo de fosfatídeo em um óleo bruto pode variar de 0,5 a 3% peso/peso correspondendo a um conteúdo de fósforo na faixa de 200 a 1200 ppm, ou, na faixa de 250 a 1200 ppm. À parte dos fosfatídeos, o óleo bruto pode também conter pequenas concentrações de carboidratos, compostos de açúcar e complexos de ácido fosfatídeo/metal de Ca, Mg e Fe. Em um aspecto, o proces25 so compreende tratamento de um fosfolipídeo ou lisofosfolipídeo com a fosfolipase da invenção a fim de hidrolisar grupos de acila graxa. Em um aspecto, o fosfolipídeo ou lisofosfolipídeo compreende lecitina ou lisolecitina. Em um aspecto do processo o comestível óleo possui um conteúdo de fósforo entre cerca de 50 a 250 ppm, e o processo compreende tratamento do óleo com uma fosfolipase da invenção a fim de hidrolisar uma maior parte do fosfolipídeo e separação de uma fase aquosa contendo o fosfolipídeo hidrolisado do óleo. Em um aspecto, antes do processo de desengomamento enPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 188/316
172/279 zimático o óleo é desengomado por água. Em um aspecto, os métodos fornecem para a produção de um alimento de animal compreendendo mistura da fosfolipase da invenção com as substâncias de alimento e pelo menos um fosfolipídeo.
As enzimas e métodos da invenção podem ser usados em processos de desengomamento de óleo como descrito, por exemplo, no WO 98/18912. As fosfolipases da invenção podem ser usadas para reduzir o conteúdo de fosfolipídeo em um óleo comestível. O processo pode compreender tratamento do óleo com uma fosfolipase da invenção para hidrolisar uma maior parte do fosfolipídeo e separação de uma fase aquosa contendo o fosfolipídeo hidrolisado do óleo. Esse processo é aplicável para a purificação de qualquer óleo comestível, que contém um fosfolipídeo, por exemplo óleos vegetais, tais como óleo de soja, óleo de semente de colza e óleo de girassol, óleos de peixe, óleos de animal e algas e similares. Antes do tra15 tamento enzimático, o óleo vegetal é de preferência pré-tratado para remover lodo (mucilagem), por exemplo por refinamento úmido. O óleo pode conter 50-250 ppm de fósforo como fosfolipídeo no início do tratamento com fosfolipase, e o processo da invenção pode reduzir esse valor para abaixo de 5-10 ppm.
As enzimas da invenção podem ser usadas em processos como descrito em Pedido JP N°: H5-132283, arquivado 25 de abril de 1993, que compreende um processo para a purificação de óleos e gorduras compreendendo uma etapa de conversão de fosfolipídeos presentes nos óleos e gorduras em substâncias solúveis em água contendo grupos de ácido fosfó25 rico e removendo-os como substâncias solúveis em água. Uma ação de enzima é usada para a conversão em substâncias solúveis em água. Uma enzima tendo uma atividade de fosfolipase C é de preferência usada como a enzima.
As enzimas da invenção podem ser usadas em processos des30 critos como o Processo de Refinamento Orgânico, (ORP) (IPH, Omaha, NE) que é um método de refinamento de óleos de semente. ORP pode ter vantagens sobre refinamento químico tradicional, incluindo produção de óleo
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173/279 refinado melhorado, co- produtos de valor adicionado, custos de capital reduzidos e menores custos ambientais.
As enzimas da invenção podem ser usadas em processos para o tratamento de um óleo ou gordura, animal ou vegetal, bruto, semi5 processado ou refinado, compreendendo adição a tal óleo ou gordura pelo menos uma enzima da invenção que permite hidrólise e/ou despolimerização dos compostos não-glicerídicos contidos no óleo, como descrito, por exemplo, em Pedido EP número: 82870032.8. Os métodos exemplares da invenção para hidrólise e/ou despolimerização de compostos não10 glicerídicos em óleos são:
1) A adição e mistura em óleos e gorduras de uma enzima da invenção ou complexos de enzima previamente dissolvidos em uma quantidade pequena de solvente apropriado (por exemplo, água). Um certo número de solventes são possíveis, mas um solvente adequado e não-tóxico para a enzima é escolhido. Essa adição pode ser feita em processos com cargas sucessivas, assim como em processos contínuos. A quantidade de enzima(s) necessária(s) para ser adicionada a óleos e gorduras, de acordo com esse processo, pode variar, dependendo das enzimas e os produtos a serem processados, de 20 a 400 ppm, isto é, de 0,02 kg a 0,4 kg de enzima para 1000 kg de óleo ou gordura, e de preferência de 20 a 100 ppm, isto é, de 0,02 a 0,1 kg de enzima para 1000 kg de óleo, estes valores sendo entendidos para serem para enzimas concentradas, isto é, sem diluente ou solvente.
2) Passagem do óleo ou gordura através de um leito de filtragem insolúvel ou fixo de enzima(s) da invenção em suportes sólidos ou semisólidos, de preferência apresentando uma estrutura porosa ou fibrosa. Nessa técnica, as enzimas são capturadas nas microcavidades da estrutura porosa ou fibrosa dos suportes. Estes consistem, por exemplo, em resinas ou polímeros sintéticos, carbonatos de celulose, geles tais como agarose, fila30 mentos de polímeros ou copolímeros com estrutura porosa, capturando pequenas gotículas de enzima em solução em suas cavidades. No que diz respeito à concentração de enzima, é possível elevar a saturação dos suporPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 190/316
174/279 tes.
3) Dispersão dos óleos e gorduras na forma de gotículas finas, em uma solução enzimática diluída, de preferência contendo 0,2 a 4% em volume de uma enzima da invenção. Essa técnica é descrita, por exemplo, na patente belga N° 595.219. Uma coluna cilíndrica com uma altura de vários metros, com tampa cônica, é enchida com uma solução enzimática diluída. Para esse propósito, um solvente que é não-tóxico e não-miscível no óleo ou gordura a ser processada, de preferência água, é escolhido. O fundo da coluna é equipado com um sistema de distribuição em que o óleo ou gordura é continuamente injetado em uma forma extremamente dividida (aproximadamente 10.000 fluxos por m2). Assim um número infinito de gotículas de óleo ou gordura é formado, que lentamente eleva-se na solução de enzimas e encontra-se na superfície, a ser evacuada continuamente no topo da tampa cônica do reator.
Óleo de palma pode ser pré-tratado antes do tratamento com uma enzima da invenção. Por exemplo, cerca de 30 kg de óleo de palma bruto são esquentados a +50°C. Soluções a 1 % foram preparadas em água destilada com celulases e pectinases. 600 g de cada um destes foram adicionados a soluções aquosas do óleo sob agitação forte durante alguns minu20 tos. O óleo é então deixado em +50°C sob agitação moderada, durante um tempo de reação total de duas horas. Então, a temperatura é aumentada para +90°C para desativar as enzimas e preparar a mistura para filtragem e processamento adicional. O óleo é secado sob vácuo filtrado com um auxílio de filtragem.
As enzimas da invenção podem ser usadas em processos como descrito na patente EP 0 513 709 B2. Por exemplo, a invenção fornece um processo para a redução do processo de conteúdo para a redução do conteúdo de componentes contendo fósforo em óleos de animais e vegetais por decomposição enzimática usando uma fosfolipase da invenção. Um óleo de animal e vegetal pré-desmucilaginado com um conteúdo de fósforo de 50 a 250 ppm é agitado com um ácido carboxílico orgânico e o valor do pH da mistura resultante fixada em pH 4 a pH 6, uma solução de enzima que conPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 191/316
175/279 tém fosfolipase Ai, A2, ou B da invenção é adicionada a mistura em um vaso de mistura sob agitação turbulenta e com a formação de gotículas finas, onde uma emulsão com 0,5 a 5 % em peso relativo ao óleo é formada, a referida emulsão sendo conduzida através de pelo menos um vaso de reação subsequente sob movimento turbulento durante um tempo de reação de 0,1 a 10 horas em temperaturas na faixa de 20 a 80° C e onde o óleo tratado, após a separação da solução aquosa, possui um conteúdo de fósforo sob 5 ppm.
O processo de refinamento orgânico é aplicável a ambos óleo bruto e desengomado. O processo usa adição em série de um ácido orgânico sob condições de processo controlados, em conjunção com separação centrífuga convencional. A água separada naturalmente dos fosfolipídeos de óleo vegetal (VOP) é reciclada e reusada. O uso de água total pode ser substancialmente reduzido como um resultado do Processo de Refinamento
Orgânico.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser usados no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 6.162.623. Nesses métodos exemplares, a invenção fornece uma enzima anfifílica. Pode ser imobilizada, por exemplo, por preparação de uma emulsão contendo uma fase hidrofóbica contínua e uma fase aquosa dispersa contendo a enzima e um portador para a enzima e remoção da água da fase disperso até essa fase transformar-se em partículas revestidas de enzima sólida. A enzima pode ser uma lipase. A lipase imobilizada pode ser usada para reações catalisadas por lipase tal como interesterificação de mono-, di- ou triglicerídeos, desacidificação de um óleo de triglicerídeo, ou remoção de fosfolipídeos de um óleo de triglicerídeo quando a lipase é uma fosfolipase. A fase aquosa pode conter um líquido de fermentação, um óleo de triglicerídeo comestível pode ser a fase hidrofóbica, e veículos incluem açúcares, amido, dextrano, derivados de celulose solúveis em água e resíduos de fermentação. Esse método exemplar pode ser usado para processar triglicerídeos, diglicerídeos, monoglicerídeos, glicerol, fosfolipídeos ou ácidos graxos, que pode ser na fase
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176/279 hidrofóbica. Em um aspecto, o processo para a remoção de fosfolipídeos de óleo de triglicerídeo compreendendo mistura de um óleo de triglicerídeo contendo fosfolipídeos com uma preparação contendo uma fosfolipase da invenção; hidrólise dos fosfolipídeos para lisofosfolipídeo; separação dos fos5 folipídeos hidrolisados do óleo, em que a fosfolipase é uma fosfolipase imobilizada.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser usados no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 6.127.137. Esse método exem10 piar hidrolisa ambos grupos de acila graxa em fosfolipídeo intacto. A fosfolipase da invenção usada nesses métodos não possui atividade de lipase e é ativa em pH muito baixo. Estas propriedades tornam isso muito adequado para uso em desengomamento de óleo, como hidrólise enzimática e alcalina (saponificação) do óleo podem ser suprimidas juntas. Em um aspecto, a in15 venção fornece um processo para hidrólise de grupos de acila graxa em um fosfolipídeo ou lisofosfolipídeo compreendendo tratamento do fosfolipídeo ou lisofosfolipídeo com a fosfolipase que hidrolisa ambos grupos de acila graxa em um fosfolipídeo e é essencialmente livre de atividade de lipase. Em um aspecto, a fosfolipase da invenção possui uma temperatura ideal em cerca de 50°C, medida em pH 3 a pH 4 durante 10 minutos, e um pH ideal de cerca de pH 3, medido em 40°C durante cerca de 10 minutos. Em um aspecto, o fosfolipídeo ou lisofosfolipídeo compreende lecitina ou lisolecitina. Em um aspecto, após hidrólise de uma maior parte do fosfolipídeo, uma fase aquosa contendo o fosfolipídeo hidrolisado é separada do óleo. Em um aspecto, a invenção fornece um processo para remoção de fosfolipídeo de um óleo comestível, compreendendo tratamento do óleo em pH 1,5 a 3 com uma dispersão de uma solução aquosa da fosfolipase da invenção, e separação de uma fase aquosa contendo o fosfolipídeo hidrolisado do óleo. Em um aspecto, o óleo é tratado para remover mucilagem antes do tratamento com a fosfolipase. Em um aspecto, o óleo antes do tratamento com a fosfolipase contém o fosfolipídeo em uma quantidade correspondendo a 50 a 250 ppm de fósforo. Em um aspecto, o tratamento com fosfolipase é feito a 30°C
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177/279 a 45°C durante 1 a 12 horas em uma dosagem de fosfolipase de 0,1 a 10 mg/l na presença de 0,5 a 5 % de água.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser usados no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 6.025.171. Nesses métodos exemplares, enzimas da invenção são imobilizadas por preparo de uma emulsão contendo uma fase hidrofóbica contínua, tal como um óleo de triglicerídeo, e uma fase aquosa dispersa contendo uma enzima anfifílica, tal como lipase ou uma fosfolipase da invenção, e material de portador que é parcialmente dissolvido e parcialmente não-dissolvido na fase aquosa, e remoção de água da fase aquosa até a fase transformar-se em partículas de portador revestido de enzima sólidas. A parte não-dissolvida do material de portador pode ser um material que é insolúvel em água e óleo, ou um material solúvel em água em forma não-dissolvido, porque a fase aquosa já é saturada com o material solúvel em água. A fase aquosa pode ser formada com um líquido de fermentação de lipase bruto contendo fermentação de resíduos e biomassa que podem servir como materiais de portador. Lipase imobilizada é útil para desacidificação e redisposição de éster em óleos. Após uma reação, a enzima imobilizada pode ser regenerada para uma subseqüente reação por adição de água para obter dissolução parcial do portador, e com a enzima resultante e fase aquosa contendo portador disperso em uma fase hidrofóbica evaporando água para novamente formar partículas de portador revestidas de enzima.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser usa25 dos no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 6.143.545. Esse método exemplar é usado para redução do conteúdo de fósforo contendo componentes em um óleo comestível compreendendo uma quantidade elevada de conteúdo de fósforo não-hidratável usando uma fosfolipase da invenção. Em um aspecto, o método é usado para reduzir o conteúdo de fósforo contendo componentes em um óleo comestível tendo um conteúdo de fósforo nãohidratável de pelo menos 50 ppm medido por pré-tratamento do óleo comesPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 194/316
178/279 tível, em 60°C, por adição de uma solução compreendendo monoidrato de ácido cítrico em água (água adicionada vs. óleo igual a 4,8% peso/peso; (ácido cítrico) em fase de água = 106 mM, em emulsão de óleo/água = 4,6 mM) durante 30 minutos; transferência de 10 ml da água pré-tratada em emulsão de óleo para um tubo; aquecimento da emulsão em um banho água em ebulição durante 30 minutos; centrifugação em 5000 rpm durante 10 minutos, transferência de cerca de 8 ml da fase superior (óleo) para um novo tubo e deixá-la assentar durante 24 horas; e extração de 2 g da fase clara superior para medição do conteúdo de fósforo não-hidratável (ppm) no óleo comestível. O método também pode compreender contato de um óleo em um pH de cerca de pH 5 a 8 com uma solução aquosa de uma fosfolipase A ou B da invenção (por exemplo, PLA1, PLA2, ou um PLB), e essa solução é emulsificada no óleo até que o conteúdo de fósforo do óleo é reduzido para menos que 11 ppm, e então separando a fase aquosa do óleo tratado.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser usados no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 5.532.163. A invenção fornece processos para o refinamento de óleo e gordura pelos quais os fosfolipídeos no óleo e gordura a serem tratados podem ser decompostos e removidos eficientemente. Em um aspecto, a invenção fornece um processo para o refinamento de óleo e gordura que compreende reação, em uma emulsão, do óleo e gordura com uma enzima da invenção, por exemplo, uma enzima tendo uma atividade para decompor ligações de éster de ácido graxo - glice25 rol em glicerofosfolipídeos (por exemplo, um PLA2 da invenção); e outro processo no qual a gordura e óleo tratado por enzima são lavados com água ou uma solução aquosa acídica. Em um aspecto, a solução aquosa acídica a ser usada na etapa de lavagem é uma solução de pelo menos um ácido, por exemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido fosfórico e sais dos mesmos.
Em um aspecto, a condição emulsificada é formada usando 30 partes em peso ou mais de água por 100 partes em peso do óleo e gordura. Uma vez que o óleo e gordura possam ser purificados sem emprego da etapa de refiPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 195/316
179/279 namento de álcali convencional, geração de resíduo industrial e água de resíduo de lavagem pode ser reduzida. Além disso, o produto de recuperação de óleo é melhorado por causa da perda de gordura e óleo neutro devido à sua inclusão nestes resíduos não ocorrer no processo inventivo. Em um aspecto, a invenção fornece um processo para refinamento de óleo e gordura contendo cerca de 100 a 10.000 ppm de fosfolipídeos que compreende: reação, em uma condição emulsificada, referido óleo e gordura com uma enzima da invenção tendo atividade para decompor ligações de éster de ácido graxo - glicerol em glicerofosfolipídeos. Em um aspecto, a invenção fornece processos para refinamento de óleo e gordura contendo cerca de 100 a 10.000 ppm de fosfolipídeos que compreende reação, em uma condição emulsificada, óleo e gordura com uma enzima da invenção tendo atividade para decompor ligações de éster de ácido graxo - glicerol em glicerofosfolipídeos; e subsequentemente lavagem da gordura e óleo tratado com uma água de lavagem.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser usados no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 5.264.367. O conteúdo de componentes contendo fósforo e o conteúdo de ferro de um óleo de animal ou vegetal comestível, tal como um óleo, por exemplo, óleo de soja, que foi refinado úmido para remover mucilagem, são reduzidos por decomposição enzimática por contato do óleo com uma solução aquosa de uma enzima da invenção, por exemplo, uma fosfolipase A1, A2, ou B, e então separação da fase aquosa do óleo tratado. Em um aspecto, a invenção fornece um méto25 do enzimático para diminuição do conteúdo de componentes contendo fósforo e ferro em óleos, que foram refinados para remover mucilagem. Um óleo, que foi refinado para remover mucilagem, pode ser tratado com uma enzima da invenção, por exemplo, fosfolipase C, Α1, A2, ou B. Os conteúdos de fósforo abaixo de 5 ppm e conteúdos de ferro abaixo de 1 ppm po30 dem ser alcançados. O conteúdo de ferro baixo pode ser vantajoso para a estabilidade do óleo.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser usaPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 196/316
180/279 dos para preparação de óleos transesterificados, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 5.288.619. A invenção fornece métodos para transesterificação enzimática para prepação de um óleo de margarina tendo igualmente conteúdo de ácido graxo de cadeia intermediária bai5 xo e trans- ácido baixo. O método inclui as etapas de fornecimento de uma mistura de reação de transesterificação contendo um material de fonte de ácido esteárico e um óleo vegetal líquido comestível, transesterificação do material de fonte de ácido esteárico e o óleo vegetal usando uma lipase específica de posição 1, 3, e então finalmente hidrogenação da mistura de áci10 do graxo para fornecer um reciclo de material de fonte de ácido esteárico para uma reação recíclica com o óleo vegetal. A invenção também fornece um método de contracorrente para preparação de um óleo transesterificado. O método inclui as etapas de fornecimento de uma zona de reação de transesterificação contendo uma lipase específica de posição 1, 3, introduzindo um óleo vegetal na zona de transesterificação, introduzindo um material de fonte de ácido esteárico, conduzindo um fluido de contracorrente de gás liquefeito subcrítico ou gás supercrítico, realizando uma reação de transesterificação do corrente de triglicerídeo com o ácido esteárico ou corrente de monoéster de ácido esteárico na zona de reação, retirando-se uma corrente de óleo de margarina de triglicerídeo transesterificado, retirando-se uma fase de fluido de contracorrente, hidrogenando o ácido esteárico transesterificada ou monoéster de ácido esteárico para fornecer um material de fonte de ácido esteárico de reciclo hidrogenado, e introduzindo o material de fonte ácido esteárico de reciclo hidrogenado na zona de reação.
Em um aspecto, o composto de fosfolipídeo altamente insaturado pode ser convertido em um triglicerídeo por uso apropriado de uma fosfolipase C da invenção para remover o grupo de fosfato na posição sn-3, seguido por síntese de éster de acila de lipase 1,3. O fosfolipídeo 2-substituído pode ser usado como um ingrediente de alimento funcional diretamente, ou pode ser subsequentemente seletivamente hidrolisado em reator 160 usando uma fosfolipase C imobilizada da invenção para produzir um 1- diglicerídeo, seguido por esterificação enzimática como descrito aqui para produzir
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181/279 um produto de triglicerídeo tendo um componente de ácido graxo poliinsaturado 2-substituído.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser usados em um processo de desengomamento enzimático de óleo vegetal como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos N° 6.001.640. Esse método da invenção compreende uma etapa de desengomamento na produção de óleos comestíveis. Óleos vegetais dos quais fosfatídeos hidratáveis foram eliminados por um processo de desengomamento aquoso prévio são tornados livres de fosfatídeos não- hidratáveis por tratamento enzimáti10 co usando uma fosfolipase da invenção. O processo pode ser suave, econômico e amistoso ao ambiente. Fosfolipases que somente hidrolisam lisolecitina, mas não lecitina, são usadas nesse processo de desengomamento.
Em um aspecto, para permitir a enzima da invenção agir, ambas fases, a fase de óleo e a fase aquosa que contêm a enzima, devem ser inti15 mamente misturadas. Pode não ser suficiente simplesmente agitar. Boa dispersão da enzima no óleo é auxiliada se para dissolvida em uma pequena quantidade de água, por exemplo, 0,5-5 peso-% (relativo ao óleo), e emulsificada no óleo nessa forma, para formar gotículas de menos que 10 micrometros em diâmetro (média de peso). As gotículas podem ser menores que
1 micrometro. Agitação turbulenta pode ser feita com velocidades radiais acima de 100 cm/s. O óleo também pode ser circulado no reator usando uma bomba giratória externa. A fase aquosa contendo a enzima pode também ser finamente dispersa por meio de ação de ultrassom. Um aparato de dispersão pode ser usado.
A reação enzimática provavelmente ocorre na superfície da fronteira entre a fase de óleo e a fase aquosa. É a meta de todas estas medições misturar para criar a maior superfície possível para a fase aquosa que contém a enzima. A adição de tensoativos aumenta a microdispersão da fase aquosa. Em alguns casos, por esse motivo, tensoativos com valores de
HLB acima de 9, tal como sulfato de Na-dodecila, são adicionados à solução de enzima, como descrito, por exemplo, na EP-A 0 513 709. Um método efetivo similar para melhoramento de emulsificação é a adição de lisolecitiPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 198/316
182/279 na. As quantidades adicionadas podem se situar na faixa de 0,001% a 1%, com referência ao óleo. A temperatura durante tratamento de enzima é não crítico. Temperaturas entre 20°C e 80°C podem ser usadas, mas a última pode somente ser aplicada durante um curto tempo. Nesse aspecto, uma fosfolipase da invenção tendo uma boa temperatura e/ou tolerâcia de pH baixa é usada. Temperaturas de aplicação entre 30°C e 50°C são ideais. O período de tratamento depende da temperatura e pode ser mantido menor com um aumento de temperatura. Tempos de 0,1 a 10 horas, ou, 1 a 5 horas são geralmente suficientes. A reação ocorre em um reator de desengo10 mamento, que pode ser dividida em etapas, como descrito, por exemplo, em DE-A 43 39 556. Por esse motivo operação contínua é possível, junto com operação em batelada. A reação pode ser realizada em etapas de temperatura diferentes. Por exemplo, incubação pode ocorrer durante 3 horas a 40°C, então durante 1 hora a 60°C. Se a reação procede em etapas, isso também abre a possibilidade de ajuste de valores de pH diferentes nas etapas individuais. Por exemplo, na primeira etapa o pH da solução pode ser ajustada para 7, por exemplo, e em uma segunda etapa para 2,5, por adição de ácido cítrico. Em pelo menos uma etapa, entretanto, o pH da solução de enzima deve ser abaixo de 4, ou, abaixo de 3. Se o pH foi subseqüentemen20 te ajustado abaixo desse nível, uma deterioração do efeito pode ser encontrada. Por esse motivo o ácido cítrico pode ser adicionado à solução de enzima antes do último ser misturado no óleo.
Após conclusão do tratamento de enzima, a solução de enzima, junta com os produtos de decomposição do NHP contido nisso, pode ser separada da fase de óleo, em bateladas ou continuamente, por exemplo, por meio de centrifugação. Uma vez que as enzimas são caracterizadas por um elevado nível de estabilidade e a quantidade dos produtos de decomposição contidos na solução é insignificante (podem precipitar como suspensão) a mesma fase de enzima aquosa pode ser usada várias vezes. Há também a possibilidade de liberação da enzima da suspensão, ver, por exemplo, DE-A 43 39 556, de modo que uma solução enzima que é essencialmente livre de suspensão pode ser usada novamente. Em um aspecto
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183/279 desse processo de desengomamento, óleos que contêm menos que 15 ppm de fósforo são obtidos. Uma meta é conteúdo de fósforo de menos de 10 ppm; ou, menos que 5 ppm. Com conteúdo de fósforo abaixo de 10 ppm, adicional processamento do óleo de acordo com o processo de desacidifica5 ção distilativo é facilmente possível. Vários outros íons, tais como magnésio, cálcio, zinco, assim como ferro, podem ser removidos do óleo, por exemplo, abaixo de 0,1 ppm. Dessa forma, esse produto possui pré-requisitos ideais para boa resistência à oxidação durante aramzenagem e processamento adicional.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser usados para redução da quantidade de componentes contendo fósforo em óleos de animais e vegetais como descrito, por exemplo, na patente EP 0513709. Nesse método, o conteúdo de componentes contendo fósforo, especialmente fosfatídeos, tais como lecitina, e o conteúdo de ferro em óleos de animais e vegetais, que foram previamente desenlamear, por exemplo óleo de soja, são reduzidos por esgotamento enzimático usando uma fosfolipase Α1, A2 ou B da invenção.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser usados para refinamento de gordura ou óleos como descrito, por exemplo, na
JP 06306386. A invenção fornece processos para refinamento de uma gordura ou óleo compreendendo uma etapa de conversão de um fosfolipídeo em uma gordura ou um óleo em uma substância contendo grupo fosfórico solúvel em água e remoção dessa substância. A ação de uma enzima da invenção (por exemplo, um PLC) é utilizada para converter o fosfolipídeo na substância. Dessa forma, é possível refinar uma gordura ou óleo sem realização de uma etapa de refinamento de álcali da qual resíduos industriais contendo água de resíduo alcalino e uma grande quantidade de óleo são produzidos. Melhoramento de produções pode ser realizado porque a perda de óleo ou gordura neutra do escapamento com os resíduos pode ser redu30 zida a zero. Em um aspecto, substâncias gomosas são convertidas em substâncias solúveis em água e removidas como substâncias solúveis em água por adição de uma enzima da invenção tendo uma atividade de fosfolipase
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C na etapa de desengomamento do óleo bruto e condução de tratamento enzimático. Em um aspecto, a fosfolipase C da invenção possui uma atividade que rompe ligações de éster de glicerina e ácido fosfórico em fosfolipídeos. Se necessário, o método pode compreender lavagem do óleo tratado por enzima com água ou uma solução aquosa acídica. Em um aspecto, a enzima da invenção é adicionada e reagida com o óleo bruto. A quantidade de fosfolipase C empregada pode ser 10 a 10.000 unidades, ou, cerca de 100 a 2.000 unidades, por 1 kg de óleo bruto.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser usa10 dos para processos de desengomamento de água como descrito, por exemplo, em Dijkstra, Albert J., e outros, Oleagineux, Corps Gras, Lipides (1998), 5(5), 367-370. Nesse método exemplar, o processo de desengomamento de água é usado para a produção de lecitina e para processos de desengomamento secos usando um ácido de desengomamento e terra de branquea15 mento. Esse método pode ser economicamente praticável somente para óleos com um conteúdo de fosfatídeo baixo, por exemplo, óleo de palma, óleos láuricos, etc. Para óleos de semente tendo um conteúdo de NHP elevado, o processo de refinamento de ácido é usado, por meio do qual esse processo é realizado no moinho de óleo para permitir remoção de goma por meio da alimentação. Em um aspecto, esse óleo refinado por ácido é uma operação de polimento possível a ser realizada antes de refinamento físico.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser usados para processos de desengomamento como descrito, por exemplo, em
Dijkstra, e outros, Res. Dev. Dep., N.V. Vandemoortele Coord. Cent., Izegem, Belg. JAOCS, J. Am. Oil Chem. Soc. (1989), 66:1002-1009. Nesse método exemplar, o processo de desengomamento total envolve dispersão de um ácido tal como H3PO4 ou ácido cítrico em óleo de soja, permitindo um tempo de contato, e então mistura de uma base tal como soda cáustica ou silicato de Na na emulsão de ácido-em-óleo. Isso mantém o grau de neutralização baixo o bastante para evitar formação de sabões, porque isso levaria a perda de óleo aumentada. Subsequentemente, o óleo passou para um
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185/279 separador centrífugo onde a maioria das gomas é removida da corrente de óleo para produzir uma fase de goma com conteúdo de óleo mínimo. A corrente de óleo é então passada para um segundo separador centrífugo para remover todas gomas restantes para produção de uma fase de goma diluí5 da, que é reciclada. Lavagem e secagem ou refinamento de álcali em série completam o processo. Após a absorção do processo de desengomamento total, em comparação com o processo de refinamento de álcali clássico, um melhoramento de produção total de cerca de 0,5% é realizado. O óleo totalmente desengomamento pode ser subseqüentemente álcali refinado, al10 vejado e desodorizado, ou alvejado e fisicamente refinado.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser usados para a remoção de fosfolipídeos não-hidratáveis de um óleo de planta, por exemplo, óleo de soja, como descrito, por exemplo, em Hvolby, e outros, Sojakagefabr., Copenhagen, Den., J. Amer. Oil Chem. Soc. (1971) 48:50315 509. Nesse método exemplar, óleo desengomado por água é misturado em valores de pH fixos diferentes com soluções de tampão com e sem Ca++, reagentes de ligação de Mg/Ca, e tensoativos. Os fosfolipídeos nãohidratáveis podem ser removidos em um estado não-convertido como um componente de micelas ou de emulsicantes misturados. Além disso, os fos20 folipídeos não-hidratáveis são removíveis por conversão em formas dissociadas, por exemplo, por remoção de Mg e Ca dos fosfatidatos, que podem ser executados por acidulação ou por tratamento com reagentes de precipitação de Mg/Ca ou complexação de Mg/Ca. Remoção ou conversão química dos fosfolipídeos não-hidratáveis pode resultar em formação de emulsão reduzida e em separação melhorada do óleo desacidifiçado da camada de emulsão e a matéria-prima de sabão.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser usadas para o desengomamento de óleos vegetais como descrito, por exemplo, Buchold, e outros, Frankfurt/Main, Alemanha. Fett Wissenschaft Technolo30 gie (1993), 95(8), 300-304. Nesse processo exemplar da invenção para o desengomamento de óleos vegetais comestíveis, suspensões aquosas de uma enzima da invenção, por exemplo, fosfolipase A2, são usadas para hiPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 202/316
186/279 drolisar o ácido graxo ligado na posição sn2 do fosfolipídeo, resultando em 1-acil-lisofosfolipídeos que são insolúveis em óleo e assim mais receptivos à separação física. Mesmo que a adição de pequenas quantidades correspondendo a cerca de 700 unidades de lecitase/ kg de óleo resulta em uma concentração de P residual menor do que 10 ppm, de modo que o refinamento químico seja substituído pelo refinamento físico, eliminando a necessidade de neutralização, divisão de matéria-prima de sabão, e tratamento com água de resíduos.
A fosfolipase e métodos da invenção podem também ser em10 pregado para o desengomamento de óleos vegetais como descrito, por exemplo, por EnzyMax. Dahlke, Klaus. Dept. G-PDO, Lurgi Ol-Gas, Chemie, GmbH, Frankfurt, Alemanha. Oleagineux, Corps Gras, Lipides (1997), 4(1), 55-57. Este exemplo de processo é um processo de desengomamento para o refinamento físico de quase todo o tipo de óleo. Por uma hidrólise catali15 zada enzimática, os fosfatídeos são convertidos para lisofosfatídeos solúveis em água que são separados do óleo por centrifugação. O conteúdo fosforoso residual no óleo enzimaticamente desengomado pode ser tão baixo quanto 2 ppm P.
A fosfolipase e métodos da invenção podem também ser em20 pregado para o desengomamento de óleos vegetais como descrito, por exemplo, por Cleenewerck, e outros, N.V. Vamo Mills, Izegem, Belg. Fett Wissenschaft Technologie (1992), 94:317-22; e, Clausen, Kim; Nielsen, Munk. Novozymes A/S, Den. Dansk Kemi (2002) 83(2):24-27. A fosfolipase e os métodos da invenção podem incorporar o pré-refinamento de óleos ve25 getais com ácidos como descrito, por exemplo, por Nilsson-Johansson, e outros, Fats Oils Div., Alfa-Laval Food Eng. AB, Tumba, Swed. Fett Wissenschaft Technologie (1988), 90(11), 447-51; e, Munch, Ernst W. Cereol Deutschland GmbH, Mannheim, Alemanha. Redator(s): Wilson, Richard F. Proceedings of the World Conference on Oilseed Processing Utilization,
Cancun, México, 12-17 de novembro de 200 (2001), Data do Encontro 17-20 de 2000.
A fosfolipase e métodos da invenção podem também ser emPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 203/316
187/279 pregados para o desengomamento de óleos vegetais como descrito, por exemplo, por Jerzewska, e outros, Inst. Przemyslu Miesnego i Tluszczowego, Warsaw, Pol., Tluszcze Jadalne (2001), 36(3/4), 97-110. Neste processo da invenção, o desengomamento enzimático de óleo de colza de ácido erú5 cico baixo hidratado é pelo uso de uma fosfolipase A2 da invenção. A enzima pode catalisar a hidrólise das ligações do éster de ácido graxo ao átomo de carbono central da porção de glicerol nos fosfolipídeos. Pode hidrolisar fosfolipídeos não hidratáveis para o seu liso-composto hidratável correspondente. Com uma preparação de enzima não purificada, resultados melhores podem ser obtidos com a adição de 2% de preparação durante 4 horas (87% de remoção de P).
Purificação de fitoesteróis de óleos vegetais
A invenção fornece métodos para a purificação de fitoesteróis e triterpenos, ou esteróis de planta, de óleos vegetais. Os fitoesteróis que po15 dem ser purificados empregando fosfolipase e métodos da invenção incluem β-sitoesterol, campesterol, estigmasterol, estigmastanol, β-sitoestanol, sitoestanol, desmosterol, calinasterol, poriferasterol, clionasterol e brassicasterol. Os esteróis de planta são produtos agrícolas importantes para a saúde e indústria de nutricionais. Desse modo, a fosfolipase e métodos da invenção são empregados para preparar emulsificadores para fabricantes de cosméticos e intermediários e precursores esteroidais para a produção de farmacêuticos de hormônio. A fosfolipase e métodos da invenção são empregados para preparar (por exemplo, purificar) análogos de fitoesteróis, e seus ésteres para uso como agentes de redução de colesterol com benefícios cardiológicos à saúde. A fosfolipase e métodos da invenção são empregados para purificar os esteróis de planta para reduzir os níveis de colesterol do soro inibindo-se a absorção de colesterol no lúmen intestinal. A fosfolipase e métodos da invenção são empregados para purificar os esteróis de planta que têm propriedades de imunomodulação em concentrações extre30 mamente baixas, incluindo resposta celular realçada de linfócitos T e capacidade citotóxica das células exterminadoras naturais contra uma linhagem de célula de câncer. A fosfolipase e métodos da invenção são empregados
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188/279 para purificar os esteróis de planta para o tratamento de tuberculose pulmonar, artrite reumatóide, controle dos pacientes infestados por HIV e inibição de tensão imune, por exemplo, em corredores de maratona.
A fosfolipase e os métodos da inenção são empregados para purificar os componentes de esterol presentes nas frações de esterol de óleos vegetais de utilidade (por exemplo, óleo de coco, canola, manteiga de cacau, milho, algodão, linhaça, oliva, palma, amendoim, farelo de arroz, açafroa, sésamo, soja, girassol), tal como sitoesterol (40,2-92,3%), campesterol (2,6- 38,6%), estigmasterol (0-31%) e 5-avenasterol (1,5-29%).
Os métodos da invenção podem incorporar isolamento de esteróis derivados de plantas em sementes oleaginosas pela extração do solvente com clorofórmio-metanol, hexano, cloreto de metilano, ou acetona, seguido pela saponificação e purificação cromatográfica para obter esteróis totais enriquecidos. Alternativamente, as amostras de planta podem ser ex15 traídas por extração de fluido supercrítico com dióxido de carbono supercrítico para obter extratos de lipídeo totais dos quais os esteróis podem ser enriquecidos e isolados. Para caracterização e quantificação subseqüente dos compostos de esterol, o isolado bruto pode ser purificado e separado por uma ampla variedade de técnicas cromatográficas incluindo cromatogra20 fia de coluna (CC), cromatografia de gás, cromatografia em camada fina (TLC), cromatografia líquida de alto desempenho de fase normal (HPLC), HPLC de fase reversa e eletrocromatografia capilar. De todas as técnicas de separação e isolamento cromatográfico, os procedimentos CC e TLC empregam a mais acessível, proprocionável e adequada para limpeza, purifica25 ção, ensaios qualitativos e estimativas preliminares da amostra dos esteróis nas amostras teste.
Os fitoesteróis são perdidos nos óleos vegetais, perdidos como subproduto durante o processo de refinamento de óleo comestível. A fosfolipase e métodos da invenção emprega fitoesteróis isolados de tais subprodu30 tos para preparar produtos fitoesterol enriquecido isolados de tais subprodutos. Os métodos de purificação e isolamento de fitoesterol da invenção podem incorporar subprodutos de indústria de processamento de óleo e poPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 205/316
189/279 dem compreender operações tal como destilação molecular, extração de líquido por líquido e cristalização.
Os métodos da invenção podem incorporar processos para a extração de lipídeos para extrair fitoesteróis. Por exemplo, os métodos da invenção podem empregar solventes não polares como hexano (comumente empregado para extrair a maioria dos tipos de óleos vegetais) quantitativamente para extrair fitoesteróis livres e ésteres de ácido graxo de fitoesterila. Os glicosídeos de esterila e glicosídeos de esterila acilada graxa são parcial e somente extraídos com hexano, e aumentando a polaridade do solvente, determinou um percentual maior de extração. Um procedimento que pode ser empregado é o método de clorofórmio-metanol Bligh e Dyer para a extração de todas as classes de lipídeo de esterol, incluindo fosfolipídeos. Um exemplo de método para igual qualitativamente separar e quantitativamente analisar as classes de lipídeo de fitoesterol compreende injeção do extrato de lipídeo no sistema de HPLC.
A fosfolipase e os métodos da invenção podem ser empregados para remover os esteróis das gorduras e óleos, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. N° 6.303.803. Este é um método para reduzir o conteúdo de esterol de gorduras e óloes contendo esterol. É um processo de custo eficaz e eficiente com base na afinidade do colesterol e outros esteróis com moléculas antipáticas que formam bicamadas de fluido hidrofóbicas, tal como bicamadas de fosfolipídeo. Os agregados de fosfolipídeos são contatados com, por exemplo, uma gordura ou óleo contendo esterol em um abiente aquoso, e em seguida misturados. A estrutura molecular desta mistura de fosfolipídeo agregada tem uma afinidade elevada com o colesterol e outros esteróis, e pode seletivamente remover tais moléculas de gorduras e óleos. A mistura de separação aquosa é misturada durante um tempo suficiente para seletivamente reduzir o teor de esterol do produto de gordura/óleo através da divisão do esterol na porção de agregados de fosfolipídeos. A gordu30 ra ou óleo de esterol reduzido é separado da mistura de separação aquosa. Alternativamente, a fração correspondentemente enriquecida de esterol também pode ser isolada da mistura de separação aquosa. Essas etapas
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190/279 podem ser realizadas em temperatura ambiente, os custos envolvidos no aquecimento são minimizados, quando há a possibilidade de degradação térmica do produto.
Adicionalmente, uma quantidade mínima do equipamento é re5 querida, e mesmo que todos os materiais requeridos sejam de grau alimentício, os métodos não requerem nenhuma precaução especial com respeito à manipulação, remoção de resíduo, ou contaminação do(s) produto(s) final(is).
A fosfolipase e métodos da invenção podem ser empregados para remover os esteróis das gorduras e óleos, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. N° 5.880.300. Os agregados de fosfolipídeo são contatdos, por exemplo, com uma gordura ou óleo contendo esterol em um ambiente aquoso, e em seguida misturados. Seguinte à mistura adequada, a gordura ou óleo de esterol reduzido é separada da mistura de separação aquosa.
Alternativamente, o fosfolipídeo de esterol correspondentemente enriquecido também pode ser isolado da mistura de separação aquosa. Os óleos de planta (por exemplo, vegetal) contêm esteróis de planta (fitoesteróis) que também podem ser removidos empregando os métodos da presente invenção. Este método é aplicável a um produto de gordura/ óleo em qualquer estágio de um ciclo de processamento comercial. Por exemplo, o processo da invenção pode ser aplicado ao óleo refinado, alvejado e desodorizado (óleos RBD), ou a qualquer estágio do processo antes da obtenção do estado RBD. Embora o óleo RBD possa ter uma densidade alterada comparada com o óleo pré-RBD, os processos são facilmente adaptados ou ao óleo
RBD ou ao óleo pré-RBD, ou a vários outros produtos de gordura/ óleo, pela variação de conteúdo de fosfolipídeo, composição de fosfolipídeo, relações de fosfolipídeo: água, temepratura, pressão, condições de mistura, e condições de sepração como descrito abaixo.
Alternativamente, as enzimas e métodos da invenção podem ser empregados para isolar os fitoestróis ou outros esteróis em etapas intermediárias no processamento do óleo. Por exemplo, sabe-se que os fitoesteróis são perdidos durante a desodorização dos óleos de planta. Uma fração desPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 207/316
191/279 tilada contendo esterol, por exemplo, de um estágio intermediário do processamento pode ser submetida aos procedimentos de extração de esterol descritos acima. Isto fornece uma lecitina enriquecida de esterol ou outro material de fosfolipídeo que possa ser também processado a fim de recupe5 rar os esteróis extraídos.
Composições Detergentes
A invenção fornece composições detergentes compreendendo uma ou mais fosfolipase da invenção, e métodos para preparar e usar essas composições. A invenção incorpora todos os métodos da preparação e uso das composições detergentes, observe, por exemplo, Patentes U.S. N° 6.413.928; 6.399.561; 6.365.561; 6.380.147. As composições detergentes podem ser de uma composição aquosa de uma e duas partes, uma composição líquida não-aquosa, um sólido fundido, uma forma granular, uma forma particulada, um tablete comprimido, um gel e/ou uma pasta e uma forma de suspensão. A invenção também fornece métodos capazes de uma rápida remoção das sujeiras volumosa do alimento, películas do resíduo do alimento e outras composições menores do alimento empregando essas composições detergentes. A fosfolipase da invenção pode facilitar a remoção das manchas por meio de hidrólise catalítica dos fosfolipídeos. A fosfolipase da invenção pode ser empregada em detergentes de lavagem de louça em detergentes de lavanderia de têxteis.
O conteúdo de enzima ativa atual depende do método de fabricação de uma composição detergente e não é crítico, assumindo que a solução detergente tenha a atividade enzimática desejada. Em um aspecto, a quantidade de fosfolipase presente na solução final varia de cerca de 0,001 mg a 0,5 mg por grama da composição detergente. A enzima particular escolhida para uso no processo e nos produtos desta invenção depende das condições de utilidade final, incluindo a forma física do produto, pH de uso, temperatura de uso, e tipos de sujeiras a serem degradadas ou alteradas. A enzima pode ser escolhida para fornecer estabilidade e atividade ótimas para qualquer determinado grupo de condições de utilidade. Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção são ativos nas faixas de pH de cerca
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192/279 de 4 a cerca de 12 e na faixa de temperatura de cerca de 20°C a cerca de 95°C. Os detergentes da invenção podem compreender tensoativos catiônicos, semipolares não-iônicos ou híbridos; ou misturas destes.
A fosfolipase da presente invenção pode ser formulada em de5 tergentes líquidos e em pó tendo pH entre 4,0 e 12,0 em níveis de cerca de 0,01 a cerca de 5% (preferivelmente 0,1% a 0,5%) em peso. Essas composições detergentes podem também incluir outras enzimas tal como proteases, celulases, lipases ou endoglicosidases conhecidas, bem como reforçadores e estabilizadores. A adição de fosfolipase da invenção às composi10 ções de limpeza convencionais não cria qualquer limitação de uso especial. Em outras palavras, qualquer temperatura e pH adequado para o detergente, é também adequado para as presentes composições contanto que o pH esteja incluído na faixa acima, e que a temperatura seja abaixo da temperatura de desnaturação da enzima descrita. Além disso, os polipeptídeos da invenção podem ser empregados em uma composição de limpeza sem detergentes, novamente ou sozinhos ou em combinação com reforçadores e estabilizadores.
A presente invenção fornece composições de limpeza, incluindo as composições detergentes para limpeza de superfícies rígidas, composi20 ções detergentes para limpeza de tecidos, composições para a lavagem de louça, composições de limpeza oral, composições de limpeza de dentadura, e soluções de limpeza de lentes de contato.
Em um aspecto, a invenção fornecer um método para lavar um objeto compreendendo contatar o objeto com uma fosfolipase da invenção sob condições suficientes para lavagem. Uma fosfolipase da invenção pode ser incluída como um aditivo de detergente. A composição detergente da invenção pode, por exemplo, ser formulada como uma composição detergente de lavanderia com máquina ou a mão compreendendo uma fosfolipase da invenção. Um aditivo de lavanderia adequado para pré-tratamento de tecidos sujos pode compreender uma fosfolipase da invenção. Uma composição amaciante de tecido pode compreender uma fosfolipase da invenção. Alternativamente, uma fosfolipase da invenção pode ser formulada
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193/279 como uma composição detergente para uso em operações domésticas de limpeza de superfície rígida gerais. Em aspectos alternativos, os aditivos detergentes e composições detergentes da invenção podem compreender uma ou mais outras enzimas tal como uma protease, uma lipase, uma cuti5 nase, outra fosfolipase, uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma manase, uma arabinase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, por exemplo, uma lactase, e/ou uma peroxidase. As propriedades da enzima(s) da invenção são escolhidas para serem compatíveis com o detergente selecionado (isto é, pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes en10 zimáticos e não enzimáticos, etc.) e a(s) enzima(s) está(ão) presente(s) em quantidades eficazes. Em um aspecto, as enzimas de fosfolipase da invenção são empregadas para remover materiais malcheirosos dos tecidos. Várias composições detergentes e métodos para a fabricação deles que podem ser empregados na prática da invenção são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 6.333.301; 6.329.333; 6.326.341; 6.297.038; 6.309.871; 6.204.232; 6.197.070; 5.856.164.
Tratamento de Resíduos
As fosfolipases da invenção podem ser empregadas no tratamento de resíduos. Em um aspecto, a invenção fornece um processo de digestão de resíduo sólido empregando as fosfolipases da invenção. Os métodos podem compreender a redução da massa e do volume do resíduo sólido substancialmente não tratado. O resíduo sólido pode ser tratado com um processo digestivo enzimático na presença de uma solução enzimática (incluindo fosfolipase da invenção) em uma temperatura controlada. O resí25 duo sólido pode ser convertido em um resíduo liquefeito e qualquer resíduo sólido residual. O resíduo liquefeito resultante pode ser separado de qualquer referido resíduo solidificado residual. Observe, por exemplo, Patente U.S. N° 5.709.796.
Outras utilizações para as fosfolipase da invenção
As fosfolipases da invenção podem também ser empregadas para estudar o sistema de sinalização de fosfoinositídeo (PI); na diagnose, proagnose e desenvolvimento de tratamentos para distúrbios bipolares (obPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 210/316
194/279 serve, por exemplo, Pandey (2002) Neuropsychopharmacology 26:216-228); como antioxidantes; como fosfolipídeos modificados; como agentes de gelificação e espumantes; para gerar lipídeos angiogênicos para tecidos de vascularização; para identificar fosfolipase, por exemplo PLA, PLB, PLC,
PLD e/ou moduladores de patatina (agonistas ou antagonistas), por exemplo, inibidores para uso como antineoplásticos, anti-inflamatórios e como agentes analgésicos. Eles podem ser empregados para gerar fosfolipídeos acídicos para o controle do paladar amargo em alimentos e farmacêuticos. Eles podem ser empregados na purificação de gordura. Eles podem ser empregados para identificar inibidores de peptídeo para o tratamento de doenças virais, inflamatórias, alérgicas e cardiovasculares. Eles podem ser empregados para a preparação de vacinas. Eles podem ser empregados para o preparo de glicerídeos de ácido graxo polidessaturado e fosfatidilgliceróis.
As fosfolipases da invenção, por exemplo, enzimas PLA e PLC, são empregadas para gerar imunotoxinas e vários terapêuticos para tratamentos anticâncer.
As fosfolipases da invenção podem ser usadas em conjunção com outras enzimas para descoloração (isto é remoção de clorofila) e em detergentes (ver acima), por exemplo, em conjunção com outras enzimas (por exemplo, lipases, proteases, esterases, fosfatases). Por exemplo, em qualquer caso onde um PLC é usado, um PLD e uma fosfatase podem ser usados em combinação, para produzir o mesmo resultado tal como um PLC sozinho.
A invenção será também descrita com referência aos seguintes exemplos; entretanto, deve ser entendido que a invenção não é limitada a tais exemplos.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: PROGRAMA BLAST USADO PARA PERFIL DE IDENTIDADE
DE SEQÜÊNCIA
Esse exemplo descreve um programa de identidade de seqüência exemplar para determinar se um ácido nucléico está dentro do escopo
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195/279 da invenção. Um programa NCBI BLAST 2.2.2 é usado, opções default para blastp. Todos valores default foram usados exceto para o parâmetro de filtragem default (isto é, todos parâmetros fixados em default exceto filtragem que é fixada em OFF); no seu lugar um parâmetro -F F é usado, o qual desabilita a filtragem. Uso de filtragem default frequentemente resulta em violações de Karlin-Altschul devido a curto tamanho de seqüência. Os valores default usados nesse exemplo:
Filtro para baixa complexidade: ON > Tamanho de Palavra: 3 > Matriz: Blosum62 > Custos de Gap·. Existência: 11 > Extensão: 1
Outros parâmetros default foram: filtro para baixa complexidade OFF, tamanho de palavra de 3 para proteína, matriz BLOSUM62, penalidade de existência de gap de -11 e uma penalidade de extensão de gap de -1. A opção -W foi fixada em default até 0. Isso significa que, se não fixado, os defaults tamanho de palavra em 3 para proteínas e 11 para nucleotídeos. A leitura dos parâmetros:
«README.bls.txt» >-------------------------------------------------------------------------> argumentos de blastall:
>
> -p Nome do Programa [String] > -d Banco de dados [String] > default = nr > -i Arquivo de Consulta [File Iri] > default = stdin > -e Valor de expectativa (E) [Real] > default = 10,0 > -m opções de visão de alinhamento:
> 0 = em pares, > 1 = ancorado à consulta mostrando identidades,
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196/279 > 2 = ancorado à consulta não mostrando identidades, > 3 = ancodrado à consultda uniforme, apresenta identidades, >4 = ancorado à consulta uniforme, nenhuma identidade, > 5 = ancorado à consulta - nenhuma identidade e extremidades embotadas, > 6 = ancorado à consulta uniforme, nenhuma identidade e extremidades embotadas, > 7 = Saída Blast XML , > 8 = tabular, >9 tabular com linhas de comentário [Inteiro] > default = 0 > -o Arquivo de Saída de relato BLAST [arquivo de saída] Opcional > default = stdout > -F Seqüência de consulta de filtro (DUST com blastn, SEG com outros) [String] > default = T > -G Custo para abrir um gag (zero invoca comportamento de default) [Inteiro] > default = 0 > -E Custo para estender um gap (zero invoca comportamento de default) [Inteiro] > default = 0 > -X X Valor de queda para alinhamento em intervalos (em bits) 25 (zero invovs default > comportamento) [Inteiro] > default = 0 > -I Mostrar Gl's em deflines [T/F] > default = F > -q Penalty for a nucleotide mismatch (blastn somente) [Inteiro] > default = -3 > -r Prêmio para uma comparação de nucleotídeo (blastn soPetição 870180013069, de 19/02/2018, pág. 213/316
197/279 mente) [Inteiro] > default = 1 > -v Number de seqüências de dase de dados para mostrar descrições on-line para (V) > [Inteiro] > default = 500 > -b Número de seqüência base de dados para mostrar alinhamentos para (B) [Inteiro] > default = 250 > -f Limite para estender impactos, default se zero [Inteiro] > default = 0 > -g Realizar alinhamento em intervalos (não disponível com tblastx) [T/F] > default = T > -Q código genético de Query a usar [Inteiro] > default = 1 > -D código genético de DB (para tblast[nx] somente) [Inteiro] > default = 1 > -a Número de processadores a usar [Inteiro] > default = 1 > -O arquivo SeqAlign [Arquivo de Saída] Opcional > -J Credenciar a query defline [T/F] > default = F > -M Matriz [String] > default = BLOSUM62 > -W Tamanho de palavra, default se zero [Inteiro] > default = 0 > -z Tamanho efetivo do banco de dados (usar zero para o tamanho real) > [String] > default = 0 > -K Número dos melhores impactos de uma região manter
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198/279 (desligado parda default, se usado um > valor de 100 é recomendado) [Inteiro] > default = 0 > -P 0 para múltiplos impactos 1-passagem, 1 para único impac5 to 1-passagem, 2 para 2-passagens.
> [Inteiro] > default = 0 > -Y Tamanho efetivo do espaço de busca (usar zero para o tamanho real) > [Real] > default = 0 > -S Fitas de consulta para pesquisar contra base de dados (para blast[nx], e > tblastx). 3 é ambos, 1 é topo, 2 é base [Inteiro] > default = 3 > -T Produz saída em HTML [T/F] > default = F > -I Restringe pesquisa de base de dados para lista de Gl's [String] Opcional > -U Usa filtragem de letra minúscula de seqüência FASTA [T/F]
Opcional > default = F > -y Queda (X) para extensões de blast em bits (0,0 invoca procedimento default >) [Real] > default = 0,0 > -Z X valor de queda para alinhamento gapped final (em bits) [Inteiro] > default = 0 > -R arquivo de checagem PSI-TBLASTN [File In] Opcional > -n busca MegaBlast [T/F] > default = F
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199/279 > -L Localização na seqüência de query [String] Opcional > -A tamanho de janela de múltiplos hits (zero para algoritmo de hit simples) [Inteiro] > default = 40
EXEMPLO 2: SIMULAÇÃO DE DESENGOMAMENTO MEDIADO POR PLC.
Esse exemplo descreve a simulação de desengomamento mediado por fosfolipase C (PLC).
Devido à sua solubilidade pobre em água, fosfatidilcolina (PC) foi originalmente dissolvida em etanol (100 mg/ml). Para teste inicial, uma solução de matéria-prima de PC em 50 mM de ácido 3morfolinopropanossulfôlico ou 60 mM de ácido cítrico/NaOH em pH 6 foi preparada. A solução de matéria-prima de PC (10 pi, 1 pg/μΙ) foi adicionada a 500 μΙ de óleo de soja refinado (água a 2%) em um tubo de Eppendorf. Para gerar uma emulsão o conteúdo do tubo foi misturado durante 3 min por vortexando (ver Fig. 5A). A fase de água e óleo foi separada por centrifugação durante 1 min a 13.000 rpm (Fig. 5B). Os tubos de reação foram préincubados na temperatura desejada (37°C, 50°C, ou 60°C) e 3 μΙ de PLC de Bacillus cereus (0.9 U/μΙ) foram adicionados à fase de água (Fig. 5C). O desaparecimento de PC foi analisado por TLC usando clorofór20 mio/metanol/água (65:25:4) como um sistema de solvente (ver, por exemplo, Tagushi (1975) supra) e foi visualizado após exposição a vapor de b.
A Figura 5 esquematicamente ilustra um modelo de sistema de duas fases para simulação de desengomamento mediado por PLC. Fig. 5A: Geração de emulsão por mistura de óleo bruto com água a 2% para hidratar os fosfatídeos contaminantes (P). Fig. 5B: As fases de água e óleo são separadas após centrifugação e PLC é adicionado à fase de água, que contém os fosfatídeos precipitados (gomas). A hidrólise de PLC ocorre na fase de água. Fig. 5C: O curso do tempo da reação é monitorado retirando-se alíquotas da fase de água e analisando-as por TCL.
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1/4

Claims (2)

REIVINDICAÇÕES
1. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de ácido nucléico como apresentada na SEQ ID NO:1, em que o ácido nucléico codifica pelo menos um po5 lipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase.
2. Célula transformada caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de ácido nucléico como apresentada na SEQ ID NO:1, em que o ácido nucléico codifica pelo menos um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase, em que a célula é uma célula bacteriana, uma célu10 la de fungos, ou uma célula de levedura.
3. Preparado de proteína caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo que possui uma atividade de fosfolipase em que o polipeptídeo tem (i) SEQ ID NO:2, ou (ii) é codificado por um ácido nucléico compreendendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:1, em
15 que a preparação de proteína compreende um líquido, um sólido ou um gel.
4. Método de produção de um polipeptídeo recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecimento de um ácido nucléico operavelmente ligado a um promotor, em que o ácido nucléico compreende uma seqüência de ácido nucléico como apresentada na
20 SEQ ID NO:1, em que o ácido nucléico codifica pelo menos um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase; e (b) expressão do ácido nucléico da etapa (a) sob condições que permitem expressão do polipeptídeo, desse modo produzindo um polipeptídeo recombinante, também compreendendo transformação de uma célula hospedeira com o ácido nucléico da etapa (a)
25 seguida por expressão do ácido nucléico da etapa (a), desse modo produzindo um polipeptídeo recombinante em uma célula transformada, em que a célula transformada é uma célula bacteriana, uma célula de fungos, ou uma célula de levedura.
5. Método para hidrolizar, partir ou romper uma composição
30 compreendendo fosfolipídeo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
(a) fornecer um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase
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2/4 em que o polipeptideo tem (i) SEQ ID NO:2, ou (ii) é codificado por um ácido nucléico compreendendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:1;
(b) fornecer uma composição compreendendo um fosfolipídeo; e
5 (c) contactar o polipeptideo da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob condições onde a fosfolipase hidrolisa, parte ou rompe a composição compreendendo fosfolipídeo.
6. Método para liquefazer ou remover uma composição compreendendo fosfolipídeo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguin10 tes etapas:
(a) fornecer um polipeptideo tendo uma atividade de fosfolipase, em que o polipeptideo tem (i) SEQ ID NO:2, ou (ii) é codificado por um ácido nucléico compreendendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:1;
15 (b) fornecer uma composição compreendendo um fosfolipídeo; e (c) contactar o polipeptideo da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob condições onde a fosfolipase remove ou liquefaz a composição compreendendo fosfolipídeo.
7. Método para desengomar um óleo, caracterizado pelo fato de 20 que compreende as seguintes etapas:
(a) fornecer uma composição compreendendo um polipeptideo, tendo uma atividade de fosfolipase em que o polipeptideo tem (i) SEQ ID NO:2, ou (ii) é codificado por um ácido nucléico compreendendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:1;
25 (b) fornecer uma composição compreendendo um óleo ou gordura contendo fosfolipídeo; e (c) contactar o polipeptideo da etapa (a) e a composição da etapa (b) sob condições onde o polipeptideo pode catalizar a hidrólise de um fosfolipídeo na composição.
30
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo óleo compreende uma planta, um animal, uma alga ou uma gordura ou óleo de peixe.
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9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o óleo de planta compreende um óleo de soja, um óleo de semente de colza, um óleo de milho, um óleo de um grão de palma, um óleo de canola, um óleo de girassol, um óleo de sésamo, ou um óleo de amen5 doim.
10. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo hidroliza um fosfatídeo de um fosfolipídeo hidratável e/ou um não hidratável na composição compreendendo óleo.
11. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo 10 fato de que o polipeptídeo hidroliza um fosfatídeo em uma ligação de fosfoéster de glicerila para gerar um diglicerídeo e composto de fosfato solúvel em água.
12. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem uma atividade de fosfolipase C.
15
13. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o contato compreende a hidrólise de um fosfolipídeo hidratado em um óleo.
14. Método para converter um fosfolipídeo não hidratável a uma forma hidratável, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes
20 etapas:
(a) fornecer uma composição compreendendo um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase, em que o polipeptídeo tem (i) SEQ ID NO:2, ou (ii) é codificado por um ácido nucléico compreendendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:1;
25 (b) fornecer uma composição compreendendo um fosfolipídeo não hidratável; e (c) contactar o polipeptídeo da etapa (a) e a composição da etapa (b) sob condições onde o polipeptídeo converta o fosfolipídeo não hidratável em uma forma hidratável.
30 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem uma atividade de fosfolipase C.
16. Método para o refino cáustico de uma composição contendo
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4/4 fosfolipídeo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
(a) fornecer uma composição compreendendo um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase, em que o polipeptídeo tem (i) SEQ ID
5 NO:2, ou (ii) é codificado por um ácido nucléico compreendendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:1;
(b) fornecer uma composição compreendendo um fosfolipídeo; e (c) contactar o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) antes, durante ou após o refino cáustico.
10 17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem uma atividade de fosfolipase C.
18. Método para refinar um óleo cru, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
(a) fornecer uma composição compreendendo um polipeptídeo
15 tendo uma atividade de fosfolipase em que o polipeptídeo tem (i) SEQ ID
NO:2, ou (ii) é codificado por um ácido nucléico compreendendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:1;
(b) fornecer uma composição compreendendo um óleo compreendendo um fosfolipídeo; e
20 (c) contactar o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob condições onde o polipeptídeo pode catalizar a hidrólise de um fosfolipídeo na composição.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem uma atividade de fosfolipase C.
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