ES2701403T3 - Traustoquítridos recombinantes que crecen en sacarosa, y composiciones, métodos de preparación y usos de los mismos - Google Patents

Traustoquítridos recombinantes que crecen en sacarosa, y composiciones, métodos de preparación y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un método de producción de un cultivo de células de traustoquítridos, que comprende: (a) transformar una célula de traustoquítridos con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una invertasa heteróloga, en la que la invertasa está unida a la membrana plasmática de la célula de traustoquítridos, y (b) cultivar la célula de traustoquítridos transformada en un medio de cultivo que comprende sacarosa como fuente de carbono.

Description

DESCRIPCIÓN
Traustoquítridos recombinantes que crecen en sacarosa, y composiciones, métodos de preparación y usos de los mismos
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere a traustoquítridos recombinantes que crecen en sacarosa y cultivos celulares que comprenden los traustoquítridos recombinantes, así como métodos de producción de cultivos celulares, biomasas, aceites microbianos y composiciones usando los traustoquítridos recombinantes.
Antecedentes
Los ácidos grasos se clasifican basándose en la longitud y características de saturación de la cadena de carbono. Los ácidos grasos se denominan ácidos grasos de cadena corta, de cadena media o de cadena larga basándose en el número de carbonos presentes en la cadena, se denominan ácidos grasos saturados cuando no hay dobles enlaces presentes entre los átomos de carbono, y se denominan ácidos grasos insaturados cuando hay dobles enlaces presentes. Los ácidos grasos de cadena larga insaturados están monosaturados cuando hay únicamente un doble enlace presente y están poliinsaturados cuando hay más de un doble enlace presente.
Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) se clasifican basándose en la posición del primer doble enlace desde el extremo metilo del ácido graso: los ácidos grasos omega-3 (n-3) contienen un primer doble enlace en el tercer carbono, mientras que los ácidos grasos omega-6 (n-6) contienen un primer doble enlace en el sexto carbono. Por ejemplo, el ácido docosahexaenoico ("DHA") es un ácido graso poliinsaturado de cadena larga omega-3 (LC-PUFA) con una longitud de cadena de 22 carbonos y 6 dobles enlaces, a menudo denominado "22:6 n-3". Otros LC-PUFA omega-3 incluyen ácido eicosapentaenoico ("EPA"), denominado "20:5 n-3" y ácido docosapentaenoico omega-3 ("DPA n-3"), denominado "22:5 n-3". DHA y EPA se han llamado ácidos grasos "esenciales". Los LC-PUFA omega-6 incluyen ácido araquidónico ("ARA"), denominado "20:4 n-6" y ácido docosapentaenoico omega-6 ("DPA n-6"), denominado "22:5 n-6".
Los ácidos grasos omega-3 son moléculas biológicamente importantes que afectan a la fisiología celular debido a su presencia en las membranas celulares, regulan la producción y la expresión génica de compuestos biológicamente activos y sirven como sustratos biosintéticos. Roche, H. M., Proc. Nutr. Soc. 58: 397-401 (1999). El DHA, por ejemplo, representa aproximadamente un 15 %-20 % de los lípidos en la corteza cerebral humana y un 30 %60 % de los lípidos en la retina, está concentrado en los testículos y el esperma y es un componente importante de la leche materna. Jean-Pascal Bergé & Gilles Barnathan, Fatty Acids from Lipids of Marine Organisms: Molecular Biodiversity, Roles as Biomarkers, Biologically Active Compounds, and Economical Aspects, in Marine Biotechnology I 49 (T. Scheper, ed., 2005). El DHA representa hasta un 97 % de los ácidos grasos omega-3 en el cerebro y hasta un 93 % de los ácidos grasos omega-3 en la retina. Además, el DHA es esencial para el desarrollo tanto fetal como infantil, así como para el mantenimiento de las funciones cognitivas en adultos. Id. Los ácidos grasos omega-3, incluyendo DHA y EPA, también poseen propiedades antiinflamatorias. Véase, por ejemplo, id. y Simopoulos, A.P., J. Am. Coll. Nutr. 21: 495-595 (2002). En particular, el EPA compite con el ácido araquidónico por la síntesis de eicosanoides tales como prostaglandinas y leucotrienos a través de ciclooxigenasas y lipoxigenasas. Id. Como los ácidos grasos omega-3 no se sintetizan de novo en el cuerpo humano, estos ácidos grasos deben obtenerse de fuentes nutritivas.
Los traustoquítridos, que son organismos microalgáceos del orden Thraustochytriales, están reconocidos como fuentes alternativas para la producción de lípidos. Por ejemplo, se ha informado de que cepas de especies de traustoquítridos producen ácidos grasos omega-3 como un alto porcentaje de los ácidos grasos totales producidos por los organismos. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.130.242; y Huang, J. et al., J. Am. Oil. Chem. Soc. 78: 605-610 (2001); Huang, J. et al., Mar. Biotechnol. 5: 450-457 (2003). Los traustoquítridos también se han reconocido como fuentes de lípidos para la producción de biocombustibles. Véase, por ejemplo, la publicación de Estados Unidos n.° 2009/0064567 y el documento WO 2008/067605.
Aunque los traustoquítridos metabolizan la glucosa y/o la fructosa, que son los dos componentes de azúcar de la sacarosa, no parecen metabolizar de forma natural la sacarosa. Véase, por ejemplo, Aki et al., JAOCS 80:789-794 (2003); Yokochi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:72-76 (1998); Honda et al., Mycol. Res. 4:439-448 (1998); Singh, World J. of Microbiology 12:76-81 (1996); Goldstein, American J. of Botany 50:271-279 (1963); y la Patente de Estados Unidos N.° 5.340.742. Por tanto, los cultivos de traustoquítridos incluyendo los cultivos comerciales e industriales, actualmente requieren jarabes de glucosa como fuentes de carbono y energía, en lugar de fuentes de carbohidratos más baratas que contienen sacarosa.
Existe una necesidad continuada de producción de traustoquítridos con la capacidad de crecer sobre fuentes de carbono alternativas tales como sacarosa para su uso en aplicaciones comerciales e industriales.
Breve sumario de la invención
La presente invención se refiere a un método de producción de un cultivo celular de traustoquítridos, que comprende: (a) transformar una célula de traustoquítridos con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una invertasa heteróloga, en la que la invertasa está unida a la membrana plasmática de la célula de traustoquítridos, y (b) cultivar la célula de traustoquítridos transformada en un medio de cultivo que comprende sacarosa como fuente de carbono. En algunas realizaciones, la invertasa está unida de forma funcional a un péptido señal. En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica la invertasa heteróloga es al menos un 90 % idéntica a la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el método comprende además transformar la célula de traustoquítridos con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un transportador de sacarosa heterólogo. En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica el trasportador de sacarosa heterólogo es al menos un 90 % idéntica a la secuencia polinucleotídica de n.° de acceso L47346. En algunas realizaciones, el traustoquítrido es un Schizochytrium o un Thraustochytrium.
La presente invención también se refiere a una célula de traustoquítridos que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una invertasa heteróloga, en la que la invertasa está unida a la membrana plasmática de la célula de traustoquítridos. En algunas realizaciones, la invertasa está unida de forma funcional a un péptido señal. En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica la invertasa heteróloga es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la célula comprende además una secuencia polinucleotídica que codifica un transportador de sacarosa heterólogo. En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica el transportador de sacarosa heterólogo es al menos un 90 % idéntica a la secuencia de polinucleotídica de N.° de acceso L47346. En algunas realizaciones, el traustoquítrido es un Schizochytrium o un Thraustochytrium.
La presente invención también se refiere a un cultivo de traustoquítridos que comprende: (a) cualquiera de las células de traustoquítridos de la invención y (b) un medio de cultivo celular que comprende sacarosa como fuente de carbono.
La presente invención también se refiere a un método de producción de una biomasa de traustoquítridos, que comprende: (a) cultivar cualquiera de las células de traustoquítridos de la invención en un medio de cultivo que comprende sacarosa como fuente de carbono, y (b) recoger la biomasa del medio de cultivo.
La presente invención también se refiere a un método de producción de un aceite microbiano, que comprende: (a) cultivar cualquiera de las células de traustoquítridos de la invención en un medio de cultivo que comprende sacarosa como fuente de carbono para producir una biomasa, y (b) extraer un aceite de la biomasa.
La presente invención también se refiere a un método de producción de un producto alimenticio, cosmético, composición industrial o composición farmacéutica para un animal o ser humano, que comprende: (a) cultivar cualquiera de las células de traustoquítridos de la invención en un medio de cultivo que comprende sacarosa como fuente de carbono, (b) recoger una biomasa del medio de cultivo y (c) preparar el producto alimenticio, cosmético, composición industrial o composición farmacéutica a partir de la biomasa. En algunas realizaciones, el método comprende además extraer un aceite de la biomasa y preparar el producto alimenticio, cosmético, composición industrial o composición farmacéutica a partir del aceite. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es una fórmula infantil. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es leche, una bebida, una bebida terapéutica, una bebida nutritiva o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es un aditivo para alimentos para animales o seres humanos. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es un suplemento nutritivo. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es un pienso para animales.
La invención se define por las reivindicaciones. La materia objeto fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo a título informativo.
Breve descripción de los dibujos/figuras
La FIG. 1 muestra una tabla de uso de codones para Schizochytrium.
La FIG. 2 muestra un mapa plasmídico de pSchiz-EPCT(+)-s1Suc2_CL0076, también denominado pCL0076 (SEQ ID NO: 2).
La FIG. 3 muestra el peso seco (g/l) de los sedimentos celulares de cultivos de Schizochytrium sp. ATCC 20888 transformado con pCL0076 cultivado en sacarosa-SSFM. Los transformantes se denominaron 1-1, 1-3, 1-24, 3-1, 3-2, 3-5, 3-21, 4-1, 4-24 y 4-31. “Control” se refiere a células de Schizochytrium sp. ATCC 20888 de tipo silvestre cultivadas en glucosa-SSFM.
La FIG. 4 muestra el contenido en grasa (expresado como el % en peso de la biomasa seca) en los sedimentos celulares de cultivos de Schizochytrium sp. ATCC 20888 transformado con pCL0076, cultivado en sacarosa-SSFM. Los transformantes se denominan 1-1, 1-3, 1-24, 3-1, 3-2, 3-5, 3-21, 4-1, 4-24 y 4-31. “Control” se refiere a células de Schizochytrium sp. ATCC 20888 de tipo silvestre cultivadas en glucosa-SSFM.
La FIG. 5 muestra el peso seco (g/l) de sedimentos celulares medido a lo largo del tiempo (días) para cultivos de Schizochytrium sp. ATCC 20888 transformado con pCL0076, cultivado en sacarosa-SSFM. Los transformantes se denominan 1-3 y 3-5. “Control” se refiere a células de Schizochytrium sp. ATCC 20888 de tipo silvestre cultivadas en glucosa-SSFM.
La FIG. 6 muestra el contenido en grasa (expresado como el % en peso de la biomasa seca) en sedimentos celulares de cultivos de dos transformantes cultivados en sacarosa-SSFM. Los transformantes se denominan 1-3 y 3-5. “Control” se refiere a células de Schizochytrium sp. ATCC 20888 de tipo silvestre cultivadas en glucosa-SSFM.
La FIG. 7 muestra el peso seco (g/l) de sedimentos celulares de cultivos de Schizochytrium cepa B76-32 transformada con pCL0076 y recogidos después de 2 días o 7 días de cultivo en sacarosa-SSFM. 2118* se refiere a un subaislado de células de Schizochytrium sp. ATCC 20888 de tipo silvestre cultivado en glucosa-SSFM. B76-32** se refiere a la cepa parental B76-32 cultivada en glucosa-SSFM.
La FIG. 8 muestra el contenido en grasa de sedimentos celulares de cultivos de Schizochytrium cepa B76-32 transformado con pCL0076 y recogidos después de 2 días o 7 días de cultivo en sacarosa-SSFM. La columna de más a la derecha muestra el contenido en grasa para cada muestra como % en peso de biomasa seca. La columna de más a la izquierda muestra para cada muestra el % de grasa total compuesta de grupos acilo con 18 o menos carbonos (gris claro) o 20 o más carbonos (gris medio). 2118* se refiere a un subaislado de células de Schizochytrium sp. ATCC 20888 de tipo silvestre cultivado en glucosa-SSFM. B76-32** se refiere a la cepa parental B76-32 cultivada en glucosa-SSFM.
La FIG. 9A muestra una transferencia de Western para la proteína invertasa y la FIG. 9B muestra el correspondiente gel de SDS-PAGE teñido con Coomassie. El control de invertasa de S. cerevisiae y los sobrenadantes de un cultivo de 3 días del transformante de pCL0076 1-3 se cargaron en cantidades de 5 |jg, 2,5 jg, 1,25 jg y 0,625 jg, respectivamente, como se indica en la parte superior de la transferencia de Western. La FIG. 10A muestra un ensayo de actividad de invertasa ilustrado por la velocidad de reacción en función de la concentración de sacarosa.
La FIG. 10B muestra una representación de Lineweaver-Burk convencional utilizada para calcular Km y Vmáx. La FIG. 11 muestra las estructuras de N-glucano detectadas en proteínas secretadas por Schizochytrium según se determina mediante NSI-Mapeo Total de Iones de N-glucanos permetilados.
La FIG. 12 muestra una tabla de especies de glucano obtenidas por NSI- Mapeo Total de Iones de N-glucanos permetilados.
La FIG. 13 muestra un mapa plasmídico de pCL0120 (SEQ ID NO: 5).
La FIG. 14 muestra una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 4) con codones optimizados que codifica el péptido señal de Sec1 de Schizochytrium fusionado con la invertasa Suc1 madura de Aspergillus niger (N.0 de acceso de GenBank S33920).
La FIG. 15 muestra un mapa plasmídico de pCL0137_EPCT(+)-s1Suc1, también denominado pCL0137.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a traustoquítridos recombinantes y cultivos celulares que comprenden los traustoquítridos recombinantes, así como métodos de producción de cultivos celulares, biomasas, aceites microbianos y composiciones usando los traustoquítridos recombinantes.
Traustoquítridos
De acuerdo con la presente invención, el término "traustoquítrido" se refiere a cualquier miembro el orden Thraustochytriales, que incluye la familia Thraustochytriaceae. La ubicación taxonómica actual de los traustoquítridos puede resumirse de la siguiente manera:
Reino: Stramenopila (Chromista)
Filo: Labyrinthulomycota (Heterokonta)
Clase: Labyrinthulomycetes (Labyrinthulae)
Orden: Labyrinthulales
Familia: Labyrinthulaceae
Orden: Thraustochytriales
Familia: Thraustochytriaceae
A fines de la presente invención, las cepas descritas como traustoquítridos incluyen los siguientes organismos: Orden: Thraustochytriales; Familia: Thraustochytriaceae; Géneros: Thraustochytrium (Especies: sp., arudimentale, aureum, benthicola, globosum, kinnei, motivum, multirudimentale, pachydermum, proliferum, roseum, striatum), Ulkenia (Especies: sp., amoeboidea, kerguelensis, minuta, profunda, radiata, sailens, sarkariana, schizochytrops, visurgensis, yorkensis), Schizochytrium (Especies: sp., aggregatum, limnaceum, mangrovei, minutum, octosporum), Japonochytrium (Especies: sp., marinum), Aplanochytrium (Especies: sp., haliotidis, kerguelensis, profunda, stocchinoi), Althornia (Especies: sp., crouchii) o Elina (Especies: sp., marisalba, sinorifica). A los fines de esta invención, las especies descrita dentro de Ulkenia se considerarán miembros del género Thraustochytrium. Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Botryochytrium, Parietichytrium y Sicyoidochytrium son géneros adicionales abarcados por la presente invención.
Las cepas de traustoquítridos incluyen, aunque sin limitación las cepas depositadas PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-9695, PTA-9696, PTA-9697, PTA-9698, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210, PTA-10211, Thraustochytrium sp. (23B) (ATCC 20891); Thraustochytrium striatum (Schneider) (ATCC 24473); Thraustochytrium aureum (Goldstein) (a Tc C 34304); Thraustochytrium roseum (Goldstein) (At CC 28210); y Japonochytrium sp. (L1) (ATCC 28207). Schizochytrium incluye, aunque sin limitación, Schizochytrium aggregatum, Schizochytríum limacinum, Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888), Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889), Schizochytrium sp. (LC-RM) (ATCC 18915), Schizochytrium sp. (SR 21), la cepa depositada a Tc C 28209 y la cepa depositada Schizochytrium limacinum IFO 32693.
En algunas realizaciones, la célula de traustoquítridos de la invención es una célula de Schizochytrium o Thraustochytrium. En algunas realizaciones, el traustoquítrido es de una especie seleccionada de Schizochytrium sp., Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium minutum, Thraustochytrium sp., Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum, Japonochytrium sp. y cepas derivadas de los mismos.
De acuerdo con la presente invención, el término "transformación" se usa para hacer referencia a cualquier método por el que una molécula de ácido nucleico (es decir, una molécula recombinante de ácido nucleico) puede insertarse en una célula de traustoquítridos de la invención. En sistemas microbianos, el término "transformación" se usa para describir un cambio hereditario debido a la adquisición de ácidos nucleicos exógenos por el microorganismo y es esencialmente sinónimo del término "transfección". Las técnicas adecuadas de transformación para introducir moléculas de ácido nucleico en células de traustoquítridos incluyen, aunque sin limitación, bombardeo de partículas, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, infección y fusión de protoplastos.
Aunque la expresión "molécula de ácido nucleico" se refiere principalmente a la molécula física de ácido nucleico y las expresiones "secuencia de ácido nucleico" o "secuencia polinucleotídica" se refieren principalmente a la secuencia de nucleótidos en la molécula de ácido nucleico, las expresiones se usan de forma intercambiable, especialmente con respecto a una molécula de ácido nucleico, secuencia polinucleotídica o una secuencia de ácido nucleico que es capaz de codificar una proteína. En algunas realizaciones, las moléculas aisladas de ácido nucleico descritas en este documento se producen usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o clonación) o síntesis química. De acuerdo con la presente invención, una molécula "aislada" de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que se ha retirado de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulación humana), siendo su medio natural el genoma o cromosoma en que se encuentra la molécula de ácido nucleico en la naturaleza. Por tanto, "aislada" no refleja necesariamente el grado al que se ha purificado la molécula de ácido nucleico, sino que indica que la molécula no incluye un genoma completo o un cromosoma completo en que la molécula de ácido nucleico se encuentra en la naturaleza. Una molécula aislada de ácido nucleico puede incluir ADN, ARN (por ejemplo, ARNm) o derivados de ADN o ARN (por ejemplo, ADNc). Las moléculas aisladas de ácido nucleico incluyen moléculas de ácido nucleico naturales y homólogos de las mismas, incluyendo, aunque sin limitación, variantes alélicas naturales y moléculas de ácido nucleico modificadas en que se han insertado, eliminado, sustituido y/o invertido, nucleótidos de tal manera que dichas modificaciones proporcionan el efecto deseado sobre la secuencia, la función y/o la actividad biológica del péptido o proteína codificado.
El término "proteína" incluye moléculas polipeptídicas de una sola cadena, así como complejos de múltiples polipéptidos en los que los polipéptidos constituyentes individuales están unidos por medios covalentes o no covalentes. El término "polipéptido" incluye péptidos de dos o más aminoácidos de longitud, típicamente que tienen más de 5, 10 o 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, un polipéptido como se describe en este documento es un polipéptido heterólogo. El término "heterólogo", como se usa en este documento, se refiere a una secuencia polipeptídica (o polinucleotídica), por ejemplo, que no se encuentra de forma natural en la célula de traustoquítridos de la invención.
Schizochytrium utiliza de forma natural azúcares de hexosa y glicerol como fuente de carbono en lugar de sacarosa. El examen de la base de datos genómica de Schizochytrium no revela genes necesarios para las etapas iniciales del catabolismo de la sacarosa, apoyando el hallazgo general de que los traustoquítridos metabolizan glucosa y/o fructosa, que son dos componentes de azúcar de la sacarosa, pero no metabolizan de forma natural sacarosa. Véase también, por ejemplo, Aki et al., JAOCS 80: 789-794 (2003); Yokochi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 72-76 (1998); Honda et al., Mycol. Res. 4: 439-448 (1998); Singh, World J. of Microbiology 12: 76-81 (1996); Goldstein, American J. of Botany 50: 271-279 (1963) y la Patente de Estados Unidos N.° 5.340.742.
La presente invención se refiere a una célula de traustoquítridos transformada con una molécula de ácido nucleico y comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido heterólogo asociado con el metabolismo de la sacarosa. El polipéptido es un polipéptido heterólogo. Una célula de traustoquítridos de la invención comprende una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden una o más secuencias polinucleotídicas que codifican una o más sacarasas heterólogas, que comprenden una invertasa. En algunas realizaciones, la célula de traustoquítridos comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una invertasa secretasa. Como se describe en este documento, la célula de traustoquítridos comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una sacarasa citoplasmática. Como se describe en este documento, la célula de traustoquítridos comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un transportador de sacarosa. En algunas realizaciones, la célula de traustoquítridos comprende una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican una o más sacarasas heterólogas y un transportador de sacarosa heterólogo. Como se describe en este documento, la célula de traustoquítridos comprende una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican una invertasa citoplasmática heteróloga y un transportador de sacarosa heterólogo. En algunas realizaciones, la célula de traustoquítridos comprende una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican una invertasa secretada heteróloga y un transportador de sacarosa heterólogo. En algunas realizaciones, la célula de traustoquítridos comprende una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican una invertasa citoplasmática heteróloga, una invertasa secretada heteróloga y un transportador de sacarosa heterólogo. En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica tiene codones optimizados para maximizar la eficacia de traducción en la célula de traustoquítridos. En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica codifica la sacarasa, el transportador de sacarosa o una combinación de los mismos, está integrada en el genoma de la célula de traustoquítridos. En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica la sacarasa, el transportador de sacarosa o una combinación de los mismos, está integrada de forma estable en el genoma de la célula de traustoquítridos. Las sacarasas son partes de una familia de enzimas conocidas como glucósido hidrolasa (también denominadas glucosidasas) que catalizan la hidrolisis de los enlaces glucosídicos para generar dos azúcares más pequeños. Como se describe en este documento, una “sacarasa” es cualquier enzima que cataliza la hidrólisis de la sacarosa (también conocida como azúcar común o azúcar de mesa) a fructosa y glucosa. Como se describe en este documento, la sacarasa puede ser una sacarasa-isomaltosa, una levanasa, sacridasa, beta-fructosidasa, betafructofuranosidasas, fructohidrolasa, sacarasa, inulinasa, sacarosa alfa-glucohidrolasa, alfa-D-glucosidasa o una combinación de las mismas. En el método de la invención la sacarasa es una invertasa. En algunas realizaciones la sacarasa es la invertasa SUC2 de Saccharomyces cerevisiae; la invertasa SacC de Zymomonas; la invertasa INV1 de Pichia; la invertasa INV de Debaryomyces; una invertasa de otras fuentes fúngicas, protistas, de algas, vegetales o eucarióticas; o cualquiera de las combinaciones de los mismas. En determinadas realizaciones, la sacarasa es de una fuente procariótica tal como las bacterias corineformes o Escherichia coli. En algunas realizaciones, una sacarasa expresada en una célula de traustoquítridos de la invención comprende un patrón de glucosilación distinto que cuando se expresa en el organismo del que procede la sacarasa. En algunas realizaciones, la sacarasa que se expresa en la célula de traustoquítridos es una glucoproteína que comprende oligosacáridos de alta manosa. En algunas realizaciones, la célula de traustoquítridos también comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una enzima necesaria para la sacarificación de materia prima de celulosa (por ejemplo, caña azúcar). Véase, por ejemplo, el documento U.S. 2009/0064567. En algunas realizaciones, la célula de traustoquítridos también comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una fructoquinasa, una glucoquinasa, una hexoquinasa o una combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, el sistema de expresión usado para la producción de sacarasa, un transportador de sacarosa, o una combinación de los mismos en una célula de traustoquítridos comprende elementos reguladores que se obtienen de secuencias de traustoquítridos. En algunas realizaciones, el sistema de expresión usado para la producción de una sacarasa, un transportador de sacarosa, o una combinación de los mismos en una célula de traustoquítridos comprende elementos reguladores que se obtienen de secuencias que no son de traustoquítridos, incluyendo secuencias derivadas de secuencias algáceas que no son de traustoquítridos. En algunas realizaciones, el sistema de expresión comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una sacarasa, un transportador de sacarosa, o la combinación de los dos en la que la secuencia polinucleotídica está unida de forma funcional a cualquier secuencia promotora, cualquier secuencia terminadora y/o cualquier otra secuencia reguladora que sea funcional en una célula de traustoquítridos. El sistema de expresión descrito en este documento comprende secuencias polinucleotídicas que codifican una sacarasa expresada citoplásmicamente y un transportador de sacarosa. Pueden usarse secuencias reguladoras inducibles o constitutivamente activas. Las secuencias reguladoras incluyen, aunque sin limitación, secuencias reguladoras de Schizochytrium descritas en la publicación de Estados Unidos n.° 2010/0233760, la patente de Estados Unidos n.° 7.001.772 y las publicaciones de Estados Unidos n.° 2006/0275904 y 2006/0286650, tales como: un promotor OrfC , un terminador OrfC, un promotor largo EF1 de promotor corto EF1, un promotor Sec1, promotor corto 60S, promotor largo 60S, un promotor de la acetolactato sintasa, un terminador de la acetolactato sintasa, un promotor de a-tubulina, un promotor de un sistema de policétido sintasa (PKS), un promotor de ácido graso desaturasa, un promotor de actina, un terminador de actina, un promotor del factor 1 de elongación alfa (efla), un terminador de efla, un promotor de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (gapdh), un terminador de gapdh y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, la sacarasa se secreta en el medio de fermentación por un traustoquítrido recombinante transformado con un gen de la sacarasa. En algunas realizaciones, la sacarasa es una proteína secretada que comprende un péptido señal. En algunas realizaciones, el péptido señal está asociado de forma natural con la sacarasa exógena (es decir, el péptido señal es la secuencia señal nativa de la sacarasa exógena). En algunas realizaciones, el péptido señal no está asociado de forma natural con la sacarasa exógena, pero es en cambio un péptido señal heterólogo, tal como un péptido señal procedente de un microorganismo del filo Labyrinthulomycota. En algunas realizaciones, el péptido señal es de un traustoquítrido. En algunas realizaciones, el péptido señal es de un Schizochytrium o un Thraustochytrium. En algunas realizaciones, el péptido señal es el péptido señal de Sec1 de Schizochytrium (SEQ ID NO: 3). Un “péptido señal” incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales del mismo, péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal de origen natural. Un homólogo de un péptido señal difiere de un péptido señal de origen natural en que al menos uno o varios, aunque sin limitación a uno o varios, aminoácidos se han delecionado (por ejemplo, una versión truncada de la proteína, tal como un péptido o fragmento), insertado, invertido, sustituido y/o derivatizado (por ejemplo, por glucosilación, fosforilación, acetilación, acilación (por ejemplo, miristoilación y palmitoilación), prenilación, amidación y/o adición de glucosilfosfatidil inositol). En algunas realizaciones, los homólogos de un péptido señal conservan actividad como una señal al menos en un traustoquítrido, aunque la actividad puede aumentarse, disminuirse o hacerse dependiente de determinados estímulos. En algunas realizaciones, la secuencia del péptido señal incluye, aunque sin limitación, una secuencia de Schizochytrium descrita en la Publicación de Estados Unidos N.° 2010/0233760, tal como: un péptido señal del transportador de Na/Pi, un péptido señal del transportador de Na/Pi acortado, un péptido señal de alfa-1,6-manosiltransferasa (ALG12), un péptido señal de una proteína de unión a inmunoglobulina (BiP), un péptido señal de alfa-1,3-glucosidasa (GLS2), un péptido señal similar a alfa-1,3-1,6-manosidasa, un péptido señal de similar a alfa-1,3-1,6-manosidasa n.° 1, un péptido señal de similar a alfa-1,2-manosidasa, un péptido señal de similar a betaxilosdidasa, un péptido señal de caroteno sintasa y un péptido señal de Sec1.
Como se describe en este documento, la sacarasa se expresa citoplasmáticamente junto con la expresión de un transportador de sacarosa. En algunas realizaciones, la sacarasa está unida a membrana, por ejemplo, la sacarasaisomaltasa, que tiene un dominio que se extiende en membrana N-terminal (anclaje de señal). En determinadas realizaciones, la sacarasa está localizada en el exterior de la membrana plasmática. Como se describe en este documento, la sacarasa está fusionada a un dominio que se extiende en membrana.
En algunas realizaciones, se usa un casete de expresión para la expresión de una sacarasa, un transportador de sacarosa o una combinación de los mismos en una célula de traustoquítridos. El diseño y la construcción de casetes de expresión usa técnicas convencionales de biología molecular conocidas para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a edición. En algunas realizaciones, la célula de traustoquítridos comprende un casete de expresión que contiene elementos genéticos, tales como al menos las siguientes, unidos de forma funcional de tal manera que son funcionales en la célula de traustoquítrido: un promotor; una secuencia codificante que comprende una sacarasa, un transportador de sacarosa o una combinación de los mismos; y una región terminadora. En algunas realizaciones, el casete de expresión comprende además una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido señal o un dominio de membrana unido de forma funcional a la sacarasa o el transportador de sacarosa. La expresión "dominio de membrana", como se usa en este documento, se refiere a cualquier dominio dentro de un polipéptido que dirige el polipéptido a una membrana y/o permite que el polipéptido mantenga su asociación con una membrana e incluye aunque sin limitación, un dominio transmembrana (por ejemplo, una región de un único o múltiples dominios de membrana), un dominio monotópico integrado, una secuencia de anclaje de señal, una secuencia señal de ER, una señal de transferencia de parada N-terminal o interna o C-terminal, un anclaje de glucosilfosfatidilinositol y combinaciones de los mismos. Un dominio de membrana puede estar localizado en cualquier posición en el polipéptido, incluyendo el extremo N-terminal, el extremo C-terminal o el centro de polipéptido. Un dominio de membrana puede asociarse con adhesión permanente o temporal de un polipéptido a una membrana. En algunas realizaciones, un vector recombinante comprende el casete de expresión. Los vectores recombinantes incluyen, aunque sin limitación, plásmidos, fagos y virus. En algunas realizaciones, el vector recombinante es un vector linealizado. En algunas realizaciones, el vector recombinante es un vector de expresión. Como se usa en este documento, la expresión "vector de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la producción de un producto codificado (por ejemplo, una sacarasa, un transportador de sacarosa o una combinación de los mismos). En algunas realizaciones, una secuencia polinucleotídica que codifica la sacarasa, el transportador de sacarosa, o una combinación de los mismos se inserta en el vector recombinante para producir una molécula de ácido nucleico recombinante. En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica la sacarasa, el transportador de sacarosa, o una de los mismos se inserta en el vector de tal manera que une de forma funcional la secuencia de ácido nucleico a secuencias reguladoras en el vector, lo que posibilita la transcripción y la traducción de la secuencia de ácido nucleico dentro del microorganismo recombinante. En algunas realizaciones, un marcador de selección posibilita la selección de un microorganismo recombinante en que se ha introducido satisfactoriamente una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención. Los marcadores de selección incluyen, aunque sin limitación, los marcadores de selección descritos en la publicación de Estados Unidos n.° 2010/0233760 y la patente de Estados Unidos n.° 7.001.772, tales como la acetolactato sintasa de Schizochytrium o ble bacteriana. En algunas realizaciones, el marcador de selección es un marcador auxotrófico, un marcador de selección dominante (tal como, por ejemplo, una enzima que degrada la actividad de antibiótico) u otra proteína implicada en la selección de transformación.
En algunas realizaciones, la célula de traustoquítridos está modificada genéticamente para introducir o delecionar genes implicados en las rutas biosintéticas asociadas con el transporte y/o síntesis de hidratos de carbono, incluyendo las implicadas en la glucosilación. Por ejemplo, la célula de traustoquítridos puede modificarse delecionando genes de glucosilación endógenos y/o insertando genes de glucosilación humanos o animales para permitir patrones de glucosilación que se asemejen de forma estrecha al de los seres humanos. La modificación de la glucosilación en levadura se ejemplifica en, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 7.029.872 y las Publicaciones de Estados Unidos N.° 2004/0171826, 2004/0230042, 2006/0257399, 2006/0029604 y 2006/0040353.
En algunas realizaciones, la célula de traustoquítridos incluye una célula en la que se emplean elementos víricos de
ARN para aumentar o regular la expresión génica.
Una secuencia polinucleotídica de cualquiera de los métodos de la invención codifica un polipéptido heterólogo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos menos un 99 % o que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido asociado con una invertasa. En algunas realizaciones, una secuencia polinucleotídica de cualquiera de los métodos de la invención codifica un polipéptido heterólogo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o que es idéntica a: las secuencia de aminoácidos de la invertasa SUC2 de Saccharomyces cerevisiae; la invertasa SacC de Zymomonas; la invertasa INV1 de Pichia; la invertasa INV de Debaryomyces; una invertasa de otras fuentes fúngicas, de protistas, de algas, vegetales o eucariótica; o una invertasa de una fuente procariótica como las bacterias corineformes o Escherichia coli. En algunas realizaciones, una secuencia polinucleotídica de cualquiera de los métodos de la invención codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o que es idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por el N.° de acceso L47346 .En algunas realizaciones, una secuencia polinucleotídica de cualquiera de los métodos de la invención codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o que es idéntica a la secuencia de aminoácidos codifica por la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una secuencia polinucleotídica de cualquiera de los métodos de la invención es al menos un 90 %, al menos un 91 menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos menos un 98 %, al menos un 99 % o que es idéntica a: la secuencia polinucleotídica del n.° de acceso L47346 o la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 1.
Cultivos de traustoquítridos, biomasas y aceites microbianos
La presente invención también se refiere a un cultivo celular de traustoquítridos que comprende cualquiera de las células de traustoquítridos de la invención como se describe en este documento y un medio de cultivo celular que comprende sacarosa como fuente de carbono.
En este documento se describe un método de producción de un cultivo celular que traustoquítridos, que comprende transformar una célula de traustoquítridos con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que comprende un polipéptido asociado con el metabolismo de sacarosa como se describe en este documento, seleccionar la célula de traustoquítridos transformada y cultivar la célula de traustoquítridos transformada en un medio de cultivo que comprende sacarosa como fuente de carbono, en el que se produce un cultivo celular de traustoquítridos. En este documento se describe un cultivo celular de traustoquítridos producido por el método.
En algunas realizaciones, la sacarosa es la fuente de carbono principal en el medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, la sacarosa es la única fuente de carbono en el medio de cultivo celular. Las fuentes de sacarosa incluyen, aunque sin limitación, caña de azúcar, remolacha azucarera y otras plantas. La composición de la sacarosa purificada o parcialmente purificada puede ser predominantemente sacarosa, es decir, sacarosa purificada/refinada, extractos de sacarosa crudos o una mezcla de sacarosa, glucosa y fructosa (por ejemplo, melaza).
En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende melaza, un jarabe o jugo de cualquier vegetal productor de sacarosa (por ejemplo, jugo de caña de azúcar o jugo de remolacha azucarera) o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende una materia prima que contiene celulosa, tal como bagazo de caña azúcar. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende una sacarasa. Como se describe en este documento, la célula de traustoquítridos secreta una sacarasa heteróloga en el medio de cultivo.
Las condiciones de cultivo para células de traustoquítridos incluyen, aunque sin limitación, un medio, biorreactor, temperatura, pH y condiciones de oxígeno eficaces que permiten la producción de proteínas y/o la recombinación.
Un medio eficaz se refiere a cualquier medio en que típicamente se cultiva una célula de traustoquítridos. Dicho medio típicamente comprende un medio acuoso que tiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y fosfato, así como sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas. Las fuentes de nitrógeno incluyen, aunque sin limitación, peptona, extracto de levadura, polipeptona, extracto de malta, extracto de carne, casaminoácidos, licor de macerado de maíz, fuentes de nitrógeno orgánico, glutamato de sodio, urea, fuentes de nitrógeno inorgánico, acetato de amonio, sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y sulfato de sodio.
Las condiciones de cultivo no limitantes adecuadas para traustoquítridos se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 5.340.742. también se describen diversos parámetros de fermentación para inocular, cultivar y recuperar la microflora, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 5.130.242. los medios líquidos o sólidos pueden contener agua salada natural o artificial. Las células de traustoquítridos de la presente invención pueden cultivarse en biorreactores de fermentación, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microvaloración y placas Petri.
El volumen de fermentación puede ser cualquier volumen usado para el crecimiento de traustoquítridos, incluyendo volúmenes comerciales e industriales. En algunas realizaciones, el volumen de fermentación (volumen de cultivo) es de al menos 2 l, al menos 10 l, al menos 50 l, al menos 100 l, al menos 200 l, al menos 500 l, al menos 1000 l, a menos 10000 l, al menos 20000 l, al menos 50000 l, al menos 100000 l, al menos 150000 l, al menos 200000 l, al menos 250000 l, al menos 300000 l, al menos 350000 l al menos 400000 l o al menos 500000 l. En algunas realizaciones, el volumen de fermentación es de 2 l a 2000000 l, de 2 l a 1000000 l, de 2 l a 500000 l, de 2 l a 200000 l, de 2 l a 100000 l, de 2 l a 50000 l, de 2 l a 25000 l, de 2 l a 20000 l, de 2 l a 15000 l, de 2 l a 10000 l, de 2 l a 5000 l, de 2 l a 1000 l, de 2 l a 500 l o de 2 l a 100 l.
La presente invención también se refiere a un método de producción de una biomasa de traustoquítridos, que comprende cultivar una célula de traustoquítridos de la invención en un medio de cultivo que comprende sacarosa como fuente de carbono, y recoger una biomasa del medio de cultivo. Una biomasa de traustoquítridos es una biomasa celular recogida obtenida por cualquier método convencional para el aislamiento de una biomasa de traustoquítridos, tal como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5.130.242 y la publicación de Estados Unidos n.° 2002/0001833. La biomasa recogida puede contener células de traustoquítridos, así como fragmentos celulares de traustoquítridos.
La presente invención también se refiere a un método de producción de un aceite microbiano que comprende cultivar una célula de traustoquítridos de la invención en un medio de cultivo que comprende sacarosa como fuente de carbono para producir una biomasa, y extraer un aceite de la biomasa. El aceite puede extraerse de una biomasa recién recogida o puede extraerse de una biomasa recogida previamente que se ha almacenado en condiciones que evitan el deterioro. Pueden usarse métodos conocidos para cultivar un traustoquítridos de la invención, para aislar una biomasa del cultivo, para extraer un aceite microbiano de la biomasa y para analizar el perfil de ácidos grasos de los aceites extraídos de la biomasa. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.130.242.
Un aceite microbiano puede ser cualquier aceite derivado de cualquier traustoquítridos, incluyendo, por ejemplo: un aceite crudo extraído de la biomasa de un traustoquítrido sin procesamiento adicional; un aceite refinado que se obtiene tratando un aceite crudo con procesamiento adicional tal como refinado, blanqueado y/o desodorizado; un aceite diluido obtenido diluyendo un aceite crudo o refinado; o un aceite enriquecido que se obtiene, por ejemplo, tratando un aceite crudo o refinado con métodos adicionales de purificación para aumentar la concentración de un ácido grado en el aceite.
En algunas realizaciones, el aceite crudo puede aislarse de un traustoquítrido usando técnicas convencionales, sin someterse a refinamiento o purificación adicional. Por ejemplo, el aceite crudo puede aislarse usando extracción con disolvente, tal como, aunque sin limitación, extracción con hexano o extracción con isopropanol. En algunas realizaciones, el aceite crudo puede aislarse usando métodos de extracción físicos y/o mecánicos tales como, aunque sin limitación, extracción a través del uso de un homogeneizador o por prensado.
En algunas realizaciones, el aceite crudo puede someterse a procesamiento adicional, tal como refinado, desolventización, desodorizado, hibernación, filtración en frio y/o blanqueado. Dichos aceites "procesados" incluyen aceites microbianos que se han sometido a extracción con disolvente y uno o más procesamientos adicionales. En algunas realizaciones, los aceites están mínimamente procesados. Aceites "mínimamente procesados" incluyen aceites microbianos que se han sometido a extracción con disolvente y filtración. En ciertas relaciones, los aceites mínimamente procesados se someten además a hibernación.
En algunas realizaciones, se usa un método similar al proceso FRIOLEX® (Westfalia Separator Industry GmbH, Alemania) para extraer los aceites microbianos producidos por los traustoquítridos. El proceso FRIOLEX® es un proceso de extracción física de aceite basado en agua, por el que la materia prima que contiene aceite puede usarse directamente para extraer aceite sin usar ningún método convencional de extracción con disolvente. En este proceso, puede usarse un disolvente orgánico soluble en agua como auxiliar del proceso y el aceite se separa del caldo de materia prima por separación de densidad usando la gravedad o fuerzas centrifugas. El documento WO 96/05278 divulga dichos métodos de extracción.
Después de haber extraído el aceite, el aceite puede recuperarse o separarse de los componentes no lipídicos por cualquier medio adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, se usan técnicas físicas y/o mecánicas de bajo coste para separar las composiciones que contienen lípidos de las composiciones no lipídicas. Por ejemplo, si se crean múltiples fases o fracciones por el método de extracción usado para extraer el aceite, donde una o más fases o fracciones contienen lípidos, un método para recuperar las fases o fracciones que contienen lípidos puede implicar la eliminación física de las fases o fracciones que contienen lípidos de las fases o fracciones no lipídicas, o viceversa. En algunas realizaciones, se usa un método de tipo FRIOLEX® para extraer los lípidos producidos por los microorganismos, y la fase ligera rica en lípidos después se separa físicamente de la fase pesada rica en proteínas (tal como por desnatado de la fase rica en lípidos que está en la parte superior de la fase pesada rica en proteínas después de la separación por densidad).
Los aceites microbianos producidos por traustoquítridos de la presente invención pueden recuperarse de la autolisis o lisis inducida exponiendo las células de traustoquítridos a una condición que incluye, aunque sin limitación, un cierto pH, una cierta temperatura, la presencia de una enzima, la presencia de un detergente, alteraciones físicas o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la lisis o autolisis de las células de traustoquítridos se realiza por el uso de fuerzas mecánicas. En realizaciones adicionales de la presente invención, la lisis o autolisis de las células de traustoquítridos va seguida por separación mecánica de los lípidos de las composiciones no lipídicas. Las enzimas adecuadas que pueden usarse para inducir la lisis de las células de traustoquítridos incluyen, aunque sin limitación, enzimas disponibles en el mercado o mezclas enzimáticas tales como proteinasa K o ALCALASE®. En algunas realizaciones, los traustoquítridos productores de aceite experimentan lisis inducida en presencia de un detergente, tal como detergentes iónicos (catiónicos o aniónicos), detergentes no iónicos, detergentes zwiteriónicos o combinaciones de los mismos. En realizaciones adicionales de la presente invención, los métodos de alteración física tales como molienda mecánica como homogeneización líquida, uso de ondas de sonido de alta frecuencia en sonicación, métodos de ciclos de congelación/descongelación, prensado, extrusión o molienda pueden usarse para inducir la lisis de los traustoquítridos productores de aceite. La extracción de los aceites puede tener lugar en los fermentadores al final de la fermentación por lisis en tanque de las células de traustoquítridos.
En algunas realizaciones, los cultivos celulares, biomasas y aceites microbianos producidos a partir de las células de traustoquítridos de la invención cultivados en sacarosa tienen las mismas características o características sustancialmente similares (por ejemplo, densidades celulares, pesos celulares en seco, productividades de ácido graso y perfiles de ácidos grasos) asociadas con cultivos, biomasa y aceites microbianos producidos a partir de las células de traustoquítridos no transformadas correspondientes cultivadas en glucosa y/o fructosa. En algunas realizaciones, el peso celular en seco de una biomasa producida a partir de un cultivo de traustoquítridos de la invención es mayor después de su crecimiento en sacarosa que el peso celular en seco obtenido en condiciones idénticas del crecimiento de un cultivo de las células de traustoquítridos no transformadas correspondientes en glucosa y/o fructosa. En algunas realizaciones, la cantidad total de ácidos grasos como porcentaje del peso celular en seco de la biomasa es mayor después del crecimiento de un traustoquítrido de la invención en sacarosa que la cantidad obtenida en condiciones idénticas del cultivo de una célula de traustoquítridos no transformada correspondiente en glucosa y/o fructosa.
Métodos de producción de composiciones
La presente invención también se refiere a un método de preparación de un producto alimenticio, cosmético, composición industrial o composición farmacéutica para animales o seres humanos, que comprende cultivar una célula de traustoquítridos de la invención en un medio de cultivo que comprende sacarosa como fuente de carbono para producir una biomasa, recoger la biomasa y preparar el producto alimenticio, cosmético, composición industrial o composición farmacéutica para animales o seres humanos a partir de la biomasa.
Las biomasas de traustoquítridos pueden secarse antes de su uso en una composición por métodos que incluyen, aunque sin limitación, secado por congelación, secado al aire, secado por pulverización, secado en embudo, secado al vacío (liofilización) o un proceso similar. Como alternativa, una biomasa recogida y lavada puede usarse directamente en una composición sin secado. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.130.242 y 6.812.009.
En algunas realizaciones, el método de preparación de un producto alimenticio, cosmético, composición industrial o composición farmacéutica para animales o seres humanos comprende además extraer un aceite de la biomasa. Los aceites microbianos pueden usarse como material de partida para producir de forma eficaz un producto enriquecido en un ácido graso tal como DHA o EPA. Por ejemplo, los aceites microbianos pueden someterse a diversas técnicas de purificación conocidas en la técnica, tales como destilación o aducción de urea, para producir un producto de potencia mayor con mayores concentraciones de DHA, EPA u otro ácido graso. Los aceites microbianos también pueden usarse en reacciones químicas para producir compuestos derivados de ácidos grasos en los aceites, tales como ésteres y sales de DHA EPA u otro ácido graso.
Cualquier traustoquítrido que se haya transformado como se describe en este documento para crecer en sacarosa puede seleccionarse para preparar cualquiera de las composiciones descritas basándose en un atributo deseable del traustoquítrido, tal como, aunque sin limitación, la densidad celular de un cultivo celular del traustoquítrido, los porcentajes y tipos de ácidos grasos asociados con la células seca de una biomasa del traustoquítrido, el perfil de ácidos grasos asociado con la biomasa y/o el aceite microbiano del traustoquítrido, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la biomasa o aceite microbiano de traustoquítridos comprende un mayor porcentaje de ácidos grasos poliinsaturados que ácidos grasos monoinsaturados. En algunas realizaciones, la biomasa o aceite microbiano de traustoquítridos comprende un porcentaje mayor de ácidos grasos omega-3 que ácidos grasos omega-6. En algunas realizaciones, la biomasa o aceite microbiano de traustoquítridos comprende un porcentaje mayor de DHA que otros ácidos grasos omega-3. En algunas realizaciones, la biomasa de traustoquítridos comprende un porcentaje mayor de DHA que otros ácidos grasos poliinsaturados. En algunas realizaciones, la biomasa o aceite microbiano de traustoquítridos comprende un mayor porcentaje de EPA que otros ácidos grasos omega-3. En algunas realizaciones, la biomasa o aceite microbiano de traustoquítridos comprende un porcentaje mayor de EPA que otros ácidos grasos poliinsaturados.
Una composición puede incluir uno o más excipientes. Como se usa en este documento, "excipiente" se refiere a un componente, o mezcla de componentes, que se usa en una composición para dar características deseables a la composición, incluyendo alimentos, así como composiciones farmacéuticas, cosméticas e industriales. Un excipiente puede describirse como un excipiente "farmacéuticamente aceptable" cuando se añade a una composición farmacéutica, lo que significa que el excipiente es un compuesto, material, composición, sal y/o forma de dosificación que es adecuada, dentro del alcance del criterio médico apropiado, para su contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesiva u otras complicaciones problemáticas sobre la duración deseada del contacto acorde con una relación de beneficio/riesgo razonable. En algunas realizaciones, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del Gobierno Federal o Estatal o enumerado en la farmacopea estadounidense u otra farmacopea internacional reconocida en líneas generales para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. Pueden usarse diversos excipientes. En algunas realizaciones, el excipiente puede ser, aunque sin limitación, un agente alcalino, un estabilizante, un antioxidante, un agente de adhesión, un agente de separación, un agente de recubrimiento, un componente de fase exterior, un componente de liberación controlada, un disolvente, un tensioactivo, un humectante, un agente tamponante, un relleno, un emoliente o combinaciones de los mismos. Los excipientes, además de los analizados en este documento, pueden incluir excipientes enumerados en, aunque sin limitación, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21.a ed. (2005).
En algunas realizaciones, la composición es un producto alimenticio. Un producto alimenticio es cualquier alimento para consumo por animales o seres humanos, e incluye composiciones tanto sólidas como líquidas. Un producto alimenticio puede ser un aditivo para alimentos para animales o seres humanos. Los alimentos incluyen, aunque sin limitación, alimentos comunes; productos líquidos, incluyendo leches, bebidas, bebidas terapéuticas y bebidas nutritivas; alimentos funcionales; suplementos; nutraceúticos; fórmulas infantiles, incluyendo fórmulas para bebés prematuros; alimentos para mujeres embarazadas o mujeres en periodo de lactancia; alimentos para adultos; alimentos geriátricos; y alimentos para animales.
En algunas realizaciones, una biomasa o aceite microbiano de traustoquítridos puede usarse directamente como o incluirse como un aditivo dentro de uno o más de: un aceite, materia grasa, producto para untar, otro ingrediente graso, bebida, salsa, alimento de base láctea o de soja (tal como leche, yogur, queso y helado), un alimento horneado, un producto nutritivo, por ejemplo, como un suplemento nutritivo (en forma de cápsula o comprimido), un suplemento vitamínico, un suplemento dietético, una bebida energética, un producto alimenticio en polvo acabo o semiacabado y combinaciones de los mismos.
Una lista parcial de composiciones alimenticias que pueden incluir un aceite microbiano incluye, aunque sin limitación, productos de base de soja (leches, helados, yogures, bebidas, cremas, productos para untar, blanqueadores); sopas y mezclas de sopa; pastas, masas y artículos alimenticios horneados incluyendo, por ejemplo, productos de pastelería fina, cereales de desayuno, tortas, pasteles de queso, empanadas, magdalenas, galletas, barritas, panes, rosquillas, bizcochos, muffins, pasteles, bollos, picatostes, tentempié, golosinas, pasteles de merienda, empanadas, barras de granola/aperitivo y pastas tostadas; dulces; confitería dura; chocolate y otro tipo de confitería; chicles; productos alimenticios líquidos, por ejemplo, leches, bebidas energéticas, fórmulas infantiles, bebidas carbonatadas, tés, comidas líquidas, zumos de frutas, bebidas basadas en frutas, bebidas basadas en hortalizas; jarabes multivitamínicos, sustitutos de comidas, alimentos medicinales y jarabes; mezclas de bebidas energéticas; pasta; producto de pescado procesados; productos de carne procesados; productos de aves de corral procesados; jugos y salsas; condimentos (salsa de tomate, mahonesa, etc.); productos para untar a base de aceite vegetal; productos lácteos; yogur; mantequillas; productos lácteos congelados; helados; postres congelados; yogures congelados; productos alimenticios semisólidos tales como alimentos para bebés; pudines y postres de gelatina; queso procesado y no procesado; mezclas de panqueques; barras alimenticias incluyendo barritas energéticas; mezclas de gofres; aderezos de ensalada; mezclas sustitutivas de huevo; frutos secos y aderezos basados en frutos secos; aperitivos salados tales como patatas fritas y otros fritos y crujientes, fritura de maíz, tortitas fritas, aperitivos extruidos, palomitas de maíz, galletas saladas, patatas fritas y frutos secos; especialmente aperitivos tales como salsas, aperitivos de frutos secos, aperitivos de carne, cortezas de cerdo, barritas alimenticias saludables y tortas de arroz/maíz.
En algunas realizaciones, un aceite microbiano puede usarse para complementar una fórmula infantil. La fórmula infantil puede complementarse con un aceite microbiano en solitario o en combinación con un aceite físicamente refinado derivado de un microorganismo que produce ácido araquidónico (ARA). Un microorganismo que produce ARA, por ejemplo, es Mortierella alpina o Mortierella sect. Schmuckeri. Como alternativa, las fórmulas infantiles pueden complementarse con un aceite microbiano en combinación con un aceite rico en ARA, incluyendo ARASCO® (Martek Biosciences, Columbia, MD).
En algunas realizaciones, la composición es un pienso para animales. Un "animal" significa cualquier organismo no humano que pertenece al reino Animalia e incluye, sin limitación, animales acuáticos y animales terrestres. La expresión "pienso para animales" o "alimento para animales" se refiere a cualquier alimento destinado a animales no humanos, sea para peces; peces comerciales; peces ornamentales; larvas de peces; bivalvos; moluscos; crustáceos; mariscos; camarón; larva de camarón; artemia, rotíferos, camarones en salazón; filtradores; anfibios; reptiles; mamíferos; animales domésticos; animales de granja; animales de zoológico; animales para deportes; de reproducción; animales de carreras; animales de exhibición; animales de crianza; animales raros o en peligro; animales de compañía; mascotas tales como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones o caballos; primates tales como monos (por ejemplo, cebus, macaco, verde africano, patas, cynomolgus y cercopithecus), simios, orangutanes, babuinos, gibones y chimpancés; cánidos tales como perros y lobos, félidos tales como gatos, leones y tigres; équidos tales como caballos, burros y cebras; animales para alimentación tales como vacas, ganado bovino, cerdos y ovejas; ungulados tales como ciervos y jirafas; roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y cobayas; y así sucesivamente. Un pienso para animales incluye, aunque sin limitación, un pienso de acuicultura, un pienso para animales domésticos incluyendo pienso para mascotas, un pienso para animales de zoológico, un pienso para animales de trabajo, un pienso para ganado o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la composición es un pienso o suplemento para piensos para cualquier animal cuya carne o productos se consumen por los seres humanos, tal como cualquier animal del que se obtiene carne, huevos o leche para consumo humano. Cuando se alimenta a dichos animales, pueden incorporarse nutrientes tales como LC-PUFA en la carne, la leche, los huevos u otros productos de dichos animales para aumentar su contenido de estos nutrientes.
En algunas realizaciones, la composición es un material secado por pulverización que puede desmenuzarse para formar partículas de un tamaño apropiado para su consumo por zooplancton, artemias, rotíferos y filtradores. En algunas realizaciones, el zooplancton, las artemias o los rotíferos alimentados por la composición se suministran a su vez a larvas de peces, peces, marisco, bivalvos o crustáceos.
En algunas realizaciones, la composición es una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas adecuadas incluyen, aunque sin limitación, una composición antiinflamatoria, un fármaco para el tratamiento de cardiopatía coronaria, un fármaco para el tratamiento de arteriosclerosis, un agente quimioterapéutico, un excipiente activo, un fármaco para la osteoporosis, un antidepresivo, un anticonvulsivo, un fármaco contra Helicobacter pylori, un fármaco para el tratamiento de enfermedad neurodegenerativa, un fármaco para el tratamiento de enfermedad hepática degenerativa, un antibiótico, una composición que reduce el nivel de colesterol y una composición que reduce el nivel de triglicéridos. En algunas realizaciones, la composición es un alimento médico. Un alimento médico incluye un alimento que está en una composición a consumirse o administrarse de forma externa bajo la supervisión de un médico y que está destinada para el tratamiento dietético específico de una afección, para la que se establecen necesidades nutritivas distintivas, basándose en los principios científicos reconocidos, por evaluación médica.
En algunas realizaciones, el aceite microbiano puede formularse en una forma de dosificación. Las formas de dosificación pueden incluir, aunque sin limitación, comprimidos, cápsulas, sobres, píldoras, pastillas, polvos y gránulos, y formas parenterales de dosificación, que incluyen, aunque sin limitación, soluciones, suspensiones, emulsiones y polvos secos que comprenden una cantidad eficaz del aceite microbiano. También es sabido en la técnica que dichas formulaciones también pueden contener diluyentes, rellenos, disgregantes, aglutinantes, lubricantes, tensioactivos, vehículos hidrófobos, vehículos hidrosolubles, emulsionantes, tampones, humectantes, hidratantes, solubilizantes, conservantes y similares farmacéuticamente aceptables. Las formas de administración pueden incluir, aunque sin limitación, comprimidos, grageas, cápsulas, comprimidos encapsulados y píldoras, que contienen el aceite microbiano y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados.
Para administración oral, el aceite microbiano puede combinarse con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos posibilitan que los aceites microbianos se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, compuestos líquidos, suspensiones y similares, para ingesta oral por un sujeto a tratar. En algunas realizaciones, la forma de dosificación es un comprimido, píldora o comprimido encapsulado. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse añadiendo un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea para obtener comprimidos o núcleos de gragea. Los excipientes adecuados incluyen, aunque sin limitación, rellenos tales como azúcares incluyendo, aunque sin limitación, lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, aunque sin limitación, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes tales como, aunque sin limitación, la polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio. Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen, aunque sin limitación, cápsulas de ajuste por presión hechas de gelatina, así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol.
En algunas realizaciones, la composición es un cosmético, los cosméticos incluyen, aunque sin limitación, emulsiones, cremas, lociones, máscaras, jabones, champús, limpiadores, cremas faciales, acondicionadores, maquillajes, agentes de baño y líquidos de dispersión. Los agentes cosméticos pueden ser medicinales o no medicinales.
En algunas realizaciones, la composición es una composición industrial. En algunas realizaciones, la composición es un material de partida para uno o más productos fabricados. Un producto fabricado incluye, aunque sin limitación, un polímero; un material fotosensible fotográfico; un detergente; un aceite industrial; o un detergente industrial. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 7.259.006 describe el uso de una grasa y aceite que contiene DHA para la producción de ácido behénico y la producción de materiales sensibles fotográficos usando ácido behénico.
Métodos de producción de biocombustibles
En este documento se describe un método para producir un biocombustible a partir de un traustoquítrido recombinante de la invención.
Como se usa en este documento, "biocombustible" se refiere a cualquier combustible que se produce a partir de y usando una biomasa o un aceite microbiano de un traustoquítrido de la invención incluyendo, aunque sin limitación, un biodiésel, un diésel renovable, un diésel renovable coprocesado, un biocombustible de aviones, un aceite de calefacción y un aditivo de combustible. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para generar un biocombustible a partir de las biomasas y aceites microbianos de los traustoquítridos de la presente invención incluyendo, aunque sin limitación, cualquier método descrito en el documento WO 2005/035693, la publicación de Estados Unidos n.° 2005/0112735, 2007/027633, el documento WO 2006/127512, la publicación de Estados Unidos n.° 2007/0099278, la publicación de Estados Unidos n.° 2007/0089356, el documento WO 2008/067605, la publicación de Estados Unidos n.° 2009/0035842 y la publicación de Estados Unidos n.° 2009/0064567. Cualquiera de los biocombustibles descritos en este documento puede mezclarse con un combustible fósil. Por ejemplo, un biodiésel puede mezclarse con un diésel fósil a relaciones de un 1 %-99 %. Como se describe en este documento un aceite microbiano de un traustoquítrido de la invención se usa como punto de partida para la producción de un biocombustible, aunque no se haya sometido a procesamiento convencional. Los ejemplos de procesamiento convencional que puede evitarse incluyen refinado (por ejemplo, refinado físico, refinado en sílice o refinado cáustico), desolventización, desodorizado, hibernación, filtración en frio y/o blanqueado. Por tanto, como se describe en este documento, los aceites no se han sometido a refinado, desolventización, desodorizado, hibernación, filtración en frio, blanqueado o una combinación de los mismos.
Como se describe en este documento el método de producción de un biocombustible comprende cultivar un traustoquítrido de la invención en un medio de cultivo que comprende sacarosa como fuente de carbono para producir una biomasa, extraer un aceite de la biomasa y producir un biocombustible transesterificando el aceite, craqueando el aceite, procesando el aceite por despolimerización térmica, añadiendo el aceite a un proceso de refinado de petróleo tradicional o una combinación de los mismos.
Como se describe en este documento el biocombustible se produce transesterificando el aceite. En algunas realizaciones, el biocombustible es un biodiésel. Se conocen diversas formas de biodiésel e incluyen, aunque sin limitación, biodiéseles descritos en el documento WO 07/061903, la patente de Estados Unidos n.° 7.172.635, la patente EP n.° 1227143, el documento WO 02/38709, el documento WO 02/38707 y la publicación de Estados Unidos n.° 2007/0113467. La transesterificación de los triglicéridos en el aceite produce ésteres de ácido graso de cadena larga, es decir, ésteres de alquilo y puede realizarse por cualquier método conocido en la técnica para la producción de biocombustibles. Como se describe en este documento el éter de alquilo es un éster de metilo o un éster de etilo. Como se describe en este documento la extracción del aceite de la biomasa de traustoquítridos y la transesterificación del aceite pueden realizarse simultáneamente. En algunas realizaciones, la extracción del aceite de la biomasa de traustoquítridos y la transesterificación del aceite se realizan por separado. Véase, por ejemplo, la publicación de Estados Unidos n.° 2009/0064567.
Como se describe en este documento la transesterificación se realiza usando un alcohol de alquilo inferior y un catalizador ácido o básico. Los alcoholes adecuados para su uso en la presente invención incluyen cualquier alcohol de alquilo inferior que contenga de 1 a 6 átomos de carbono (es decir, un alcohol de alquilo C1-6 , tal como alcoholes de metilo, etilo, isopropilo, butilo, pentilo, hexilo e isómeros de los mismos). Como se describe en este documento el alcohol comprende de un 5 % en peso a un 70 % en peso, de un 5 % en peso a un 60 % en peso, de un 5 % en peso a un 50 % en peso, de un 7 % en peso a un 40 % en peso, de un 9 % en peso a un 30 % en peso o de un 10 % en peso a un 25 % en peso de la mezcla de composición oleosa, el alcohol y una base catalítica. Como se describe en este documento la composición oleosa y la base pueden añadirse a etanol puro o metanol puro. La cantidad de alcohol usada puede variar con la solubilidad del aceite en el alcohol. Puede usarse cualquier base conocida en la técnica que sea adecuada para su uso como reactivo, incluyendo bases de la fórmula ROM, en la que M es un catión monovalente y RO es un alcóxido de un alcohol de alquilo C1-6. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen, aunque sin limitación, sodio elemental, metóxido de sodio, etóxido de sodio, metóxido de potasio y etóxido de potasio. Como se describe en este documento la base es etóxido de sodio. Como se describe en este documento la base se añade a la reacción con la composición oleosa y el alcohol en una cantidad de 0,05 a 2,0 equivalentes molares de triglicéridos en el aceite, de 0,05 a 1,5 equivalentes molares, de 0,1 a 1,4 equivalentes molares, de 0,2 a 1,3 equivalentes molares o de 0,25 a 1,2 equivalentes molares. El aceite que comprende triglicéridos, el alcohol y la base se hacen reaccionar juntos a una temperatura y durante una cantidad de tiempo que permite la producción de un éster a partir de los restos de ácido graso y el alcohol. Como se describe en este documento la reacción de la composición en presencia de un alcohol y una base se realiza a una temperatura de 20 °C a 140 °C, de 20 °C a 120 °C, de 20 °C a 110 °C, de 20 °C a 100 °C o de 20 °C a 90 °C. Como se describe en este documento la reacción de la composición en presencia de un alcohol y una base se realiza a una temperatura de al menos 20 °C, al menos 75 °C, al menos 80 °C, al menos 85 °C, al menos 90 °C, al menos 95 °C, al menos 105 °C o al menos 120 °C. Como se describe en este documento la reacción de la composición en presencia de un alcohol y una base se realiza a una temperatura de 20 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C, 95 °C, 105 °C o 120 °C. Como se describe en este documento la reacción de la composición en presencia de un alcohol y una base se realiza durante un tiempo de 2 horas a 36 horas, de 3 horas a 36 horas, de 4 horas a 36 horas, de 5 horas a 36 horas o de 6 horas a 36 horas. Como se describe en este documento la reacción de la composición en presencia de un alcohol y una base se realiza durante 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32 o 36. Como se describe en este documento la reacción de la composición oleosa, el alcohol y la base puede realizarse llevando a reflujo los componentes para producir los ésteres de ácido graso, tales como los ésteres de PUFA. Como se describe en este documento la reacción de la composición oleosa puede realizarse a una temperatura que no provoca el reflujo de los componentes de reacción. Por ejemplo, llevar a cabo la reacción de la composición oleosa a presiones mayores de la presión atmosférica puede aumentar el punto de ebullición de los disolventes presentes en la mezcla de reacción. En dichas condiciones, la reacción puede producirse a una temperatura en la que los disolventes hervirían a presión atmosférica, pero no provocaría el reflujo de los componentes de reacción. Como se describe en este documento la reacción se realiza a una presión de 34,47 kPa (5 libras por pulgada cuadrada (psi)) a 137,89 kPa (20 psi), de 48,26 kPa (7 psi) a 103,42 kPa (15 psi); o de 62,05 kPa (9 psi) a 82,73 kPa (12 psi). Como se describe en este documento la reacción se realiza a una presión de 48,26 kPa (7 psi), 55,15 kPa (8 psi), 62,05 kPa (9 psi), 68,94 kPa (10 psi), 75,84 kPa (11 psi) o 82,73 kPa (12 psi). Las reacciones realizadas a presión pueden realizarse a las temperaturas de reacción enumeradas anteriormente. Como se describe en este documento las reacciones realizadas a presión pueden realizarse al menos de 20 °C a 140 °C, de 20 °C a 120 °C, 20 °C 110 °C, de 20 °C a 100 °C o de 20 °C a 90 °C. Como se describe en este documento las reacciones realizadas a presión pueden realizarse a al menos 70 °C, al menos 75 °C, al menos 80 °C, al menos 85 °C o al menos 90 °C. Como se describe en este documento las reacciones realizadas a presión pueden realizarse a 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C o 90 °C.
Las cantidades reducidas de PUFA en un aceite usadas para producir un biocombustible, tal como un biodiésel pueden aumentar la densidad de energía del biocombustible y pueden reducir la cantidad de sitios para oxidación potencial o sulfatación. Como se describe en este documento la biomasa de traustoquítridos o aceite microbiano, o la fracción de triglicéridos del mismo, comprende un porcentaje mayor de ácidos grasos monoinsaturados que ácidos grasos poliinsaturados. Como se describe en este documento el aceite microbiano se fracciona para eliminar los ácidos grasos poliinsaturados. Como se describe en este documento el aceite se hidrogena para convertir los ácidos grasos poliinsaturados en ácidos grasos monoinsaturados. Para asegurar que pueden quemarse porcentajes mayores de biocombustible derivado de aceite microalgáceo, puede usarse cualquier método de hidrogenación parcial o total de aceites, como es rutinario en la fabricación de margarinas. Como se describe en este documento los traustoquítrido que producen niveles bajos de PUFA se usan para producir los aceites microbianos. Como se describe en este documento se seleccionan traustoquítridos de la invención que producen mayores cantidades de ácidos grasos monoinsaturados que ácidos grasos poliinsaturados. Como se describe en este documento menos de un 50 % de los ácidos grasos insaturados en el aceite biológico son PUFA. Como se describe en este documento los ácidos grasos insaturados en el aceite biológico contienen menos de un 40 %, menos de un 30 %, menos de un 20 %, menos un 10 % o menos de un 5 % de PUFA. Como se describe en este documento el aceite microbiano comprende menos de un 50 %, menos de un 40 %, menos de un 30 %, menos de un 20 %, menos de un 10 % o menos de un 5 % en peso de PUFA.
Además de los métodos de transesterificación descritos anteriormente, también pueden usarse otras técnicas de reducción de la viscosidad de los aceites microbianos para producir biocombustibles. Estas técnicas incluyen, aunque sin limitación, el uso de lipasas, catálisis supercrítica con metanol y el uso de sistemas de células completas que implican la sobreexpresión citoplasmática de lipasas en una célula hospedadora seguida por permeabilización del hospedador para permitir la catálisis de transesterificación de triglicéridos dentro del citoplasma. Como se describe en este documento una célula de traustoquítridos de la invención también comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una lipasa para la catálisis de transesterificación de triglicéridos dentro del citoplasma. Véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 7.226.771, la publicación de Estados Unidos n.° 2004/0005604, el documento WO 03/089620, el documento WO 05/086900, la publicación de Estados Unidos n.° 2005/0108789, el documento WO 05/032496, el documento WO 05/108533, la patente de Estados Unidos n.° 6.982.155, el documento WO 06/009676, el documento WO 06/133698, el documento WO 06/037334, el documento WO 07/076163, el documento WO 07/056786 y el documento WO 06/124818.
Como se describe en este documento el biocombustible se produce por craqueo del aceite. En algunas realizaciones, el biocombustible es un biocombustible de aviones. En la técnica se entiende que "craqueo" describe la reducción de la longitud de la cadena de los ácidos grasos en un aceite por métodos tales como los usados en la industria de aceites. Como se describe en este documento la presencia de una cantidad significativa de ácido graso poliinsaturado en el aceite proporcionará mayor flexibilidad y diversidad para la producción de hidrocarburos, ya que los múltiples sitios de insaturación en un ácido graso poliinsaturado proporcionan múltiples sitios para la escisión para generar hidrocarburos. Por ejemplo, ciertos combustibles de aviones requieren hidrocarburos con dos a ocho carbonos. Los ácidos grasos poliinsaturados pueden escindirse a través de procesos conocidos en la técnica, tales como craqueo para producir hidrocarburos más cortos de diversas longitudes de cadena.
Como se describe en este documento el biocombustible se produce por despolimerización térmica. En algunas realizaciones, el biocombustible es un diésel renovable. Como se usa en este documento la despolimerización térmica incluye cualquier proceso para la producción de diésel renovable usando agua sobrecalentada.
Como se describe en este documento el biocombustible se produce añadiendo el aceite a un proceso de refinado del petróleo durante la producción del combustible diésel. Como se describe en este documento el biocombustible es un diésel renovable coprocesado.
Habiendo descrito en líneas generales esta invención, puede obtenerse una comprensión adicional por acceso a los ejemplos proporcionados en este documento. Estos ejemplos son con fines ilustrativos únicamente y no pretenden ser limitantes.
Ejemplo 1
Construcción del vector de expresión pCL0076
El vector pAB0018 (N.° de acceso de ATCC PTA-9616) se digirió con BamHI y Ndel dando como resultado dos fragmentos de 838 pb y 9879 pb de longitud. El fragmento de 9879 pb se fraccionó mediante técnicas electroforéticas convencionales en un gel de agar, se purificó utilizado kits de purificación de ADN comerciales y se ligó a una secuencia (SEQ ID NO: 1) que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica la señal de secreción nativa de la proteína Sec1 de Schizochytrium sp. número de ATCC 20888 seguido de una secuencia sintética que codifica la proteína invertasa madura (SUC2) de Saccharomyces cerevisiae, con codones optimizados utilizando la tabla de uso de codones de Schizochytrium de la FIG. 1 (la optimización de codones se realizó en Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA). La secuencia de fusión que contiene las secuencias que codifican el péptido señal de Sec1 de Schizochytrium y la proteína invertasa secretada SUC2 de Saccharomyces cerevisiae (N.° de acceso de GenBank P00724) se insertó en el vector de Schizochytrium pSchiz, seguido de la digestión con BamHI y Ndel para producir la SEQ ID NO: 1.
Después, se utilizó el producto de ligamiento para transformar una cepa suministrada de forma comercial de células de E. coli DH5a (Invitrogen), utilizando los protocolos del fabricante. Se propagaron varios de los clones resultantes y sus plásmidos se extrajeron y purificaron. Estos plásmidos se exploraron después mediante digestiones de restricción y/o PCR para confirmar que el ligamiento generó los vectores plasmídicos esperados. Uno de tales vectores plasmídicos, resultante del ligamiento del fragmento de 9879 pb y la SEQ ID NO. 1, se verificó mediante secuenciación de Sanger y se denominó pCL0076 (SEQ ID NO: 2). Véase la FIG. 2.
Ejemplo 2
Crecimiento de Schizochytrium en sacarosa
Se cultivaron cultivos de Schizochytrium sp. ATCC 20888 y un derivado genéticamente modificado de Schizochytrium, denominado B76-32, en medio M2B que consiste en glucosa 10 g/l, (NH4)2SO40,8 g/l, Na2SO45 g/l, MgSO4^7H2O 2 g/l, KH2PO40,5 g/l, KCl 0,5 g/l, C a C b ^ O 0,1 g/l, MES 0,1 M (pH 6,0) metales PB26 al 0,1 % y vitaminas PB26 al 0,1 % PB26 (v/v). Las vitaminas PB26 consistían en vitamina B1250 mg/ml, tiamina 100 mg/ml, y Ca-pantotenato 100 mg/ml. Los metales PB26 se ajustaron a pH 4,5 y consistían en FeSO4^7H2O 3 g/l, MnCb^4H2O 1 g/l, ZnSO4^7H2O 800 mg/ml, CoCb^6 H2O 20 mg/ml, Na2MoO4^2H2O 10 mg/ml, CuSO4^5H2O 600 mg/ml y N¡SO4^6H2O 800 mg/ml. Las soluciones madre de PB26 se esterilización por filtración por separado y se añadieron al caldo después del tratamiento con autoclave. La glucosa, KH2PO4 y CaCb^2H2O se autoclavaron cada uno de forma separada de los ingredientes del caldo restantes, antes de mezclar, para impedir la precipitación de sales y la caramelización de los hidratos de carbono. Todos los ingredientes del medio se adquirieron en Sigma Chemical (St. Louis, MO). La cepa B76-32 es un derivado de Schizochytrium sp. ATCC 20888 diseñado técnicamente de acuerdo con la Patente de Estados Unidos N.° 7.211.418 y las Publicaciones de Estados Unidos N.° 2008/0022422 y 2008/0026434.
Los cultivos de Schizochytrium sp. ATCC 20888 y B76-32 se cultivaron hasta la fase logarítmica y se transformaron con el vector pCL0076 utilizando electroporación con un pretratamiento enzimático, como se describe a continuación.
Electroporación con pretratamiento enzimático - Las células se cultivaron en 50 ml de medio M50-20 (véase la publicación de Estados Unidos n.° 2008/0022422) en un agitador a 200 r.p.m. durante 2 días a 30 °C. Las células se diluyeron a 1:100 en medio M2B (véase el siguiente párrafo) y se cultivaron durante una noche (16-24 h), intentando alcanzar la fase semilogarítmica de crecimiento (DO600 de 1,5-2,5). Las células se centrifugaron en un tubo cónico de 50 ml durante 5 min a aproximadamente 3000 x g. El sobrenadante se retiró y las células se resuspendieron en manitol 1 M, pH 5,5, en un volumen adecuado para alcanzar una concentración final de 2 unidades DO600. Se separaron en alícuotas 5 ml de las células en un matraz de agitación de 25 ml y se modificó con Cacb 10 mM (solución madre 1,0 M, esterilizada en filtro) y 0,25 mg/ml de proteasa XIV (solución madre de 10 mg/ml, esterilizada en filtro; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los matraces se incubaron en un agitador a 30 °C y aproximadamente 100 r.p.m. durante 4 h. Las células se controlaron al microscopio para determinar el grado de formación de protoplastos, con las células individuales deseadas. Las células se centrifugaron durante 5 min a aproximadamente 2500 x g en tubos de fondo redondo (es decir, tubos Falco™ de 14 ml, BD Biosciences, San José, CA). El sobrenadante se retiró y las células se resuspendieron suavemente con 5 ml de glicerol al 10 % enfriado en hielo. Las células se volvieron a centrifugar durante 5 min a aproximadamente 2500 x g en tubos de fondo redondo. El sobrenadante se retiró y las células se resuspendieron suavemente con 500 pl de glicerol al 10 % enfriado en hielo, usando puntas de pipeta de orificio ancho. Se separaron en alícuotas 90 pl de células en una electrocubeta prerrefrigerada (cubeta Gene Pulser® - espacio de 0,1 cm o espacio de 0,2 cm Bio-Rad, Hercules, CA). Se añadió de 1 pg a 5 pg de ADN (en menos de o igual a un volumen de 10 pl) a la cubeta, se mezclaron suavemente con una punta de pipeta y se colocaron en hielo durante 5 min. Las células se sometieron a electroporación a 200 ohm (resistencia), 25 pF (capacitancia) y 250 V (para un espacio de 0,1 cm) o 500 V (espacio de 0,2 cm). Se añadieron 0,5 ml de medio M50-20 inmediatamente a la cubeta. Las células entonces se transfirieron a 4,5 ml de medio M50-20 en un matraz de agitación de 25 ml y se incubaron durante 2-3 h a 30 °C y aproximadamente 100 r.p.m. en un agitador. Las células se centrifugaron durante 5 min a aproximadamente 2500 x g en tubos de fondo redondo. El sobrenadante se retiró y el sedimento celular se resuspendió en 0,5 ml de medio M50-20. Las células se sembraron en placas en una cantidad apropiada (2 a 5) de placas M2B con selección apropiada (si era necesario) y se incubaron a 30 °C.
Los transformantes se seleccionaron para el cultivo en medio M2B SMM o se seleccionaron directamente para el cultivo en sacarosa, mediante la siembra en placas en MSFM sacarosa. Para la selección de MSFM sacarosa, después de 1-2 semanas se volvieron a sembrar colonias en placas con varios pases en medio que contenía sacarosa recién preparado. Se determinó que la expresión de invertasa se puede utilizar como un marcador de selección para colonias de traustoquítridos cultivadas en sacarosa como única fuente de carbono.
Para los siguientes experimentos, se seleccionaron transformantes primarios para el cultivo en medio M2B sólido que contenía agar 20 g/l (VWR, West Chester, PA) y SMM 10 pg/ml (Chem Service, Westchester, PA) después de 2­ 6 días de incubación a 27 °C. Todos los transformantes primarios se transfirieron de forma manual a placas de M2B con SMM recién preparadas. Después de 1 semana las colonias se transfirieron a MSFM y sacarosa 5 g/l sin SMM. Después de 1 semana, las colonias más grandes se transfirieron a placas de medio MSFM/sacarosa recién preparadas. Diez de los transformantes de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivados en sacarosa se seleccionaron para la caracterización adicional y se denominaron 1-1, 1-3, 1-24, 3-1, 3-2, 3-5, 3-21, 4-1, 4-24 y 4-31, respectivamente. Nueve de los transformantes de B76-32 cultivados en sacarosa se seleccionaron para la caracterización adicional y se denominaron B76-32 n.° 2, n.° 12, n.° 19, n.° 26, n.° 30, n.° 39, n.° 42, n.° 56 y n.° 61.
Las colonias cultivadas en sacarosa (1-1, 1-3, 1-24, 3-1, 3-2, 3-5, 3-21, 4-1, 4-24, 4-31) se retiraron de las placas utilizando un asa de siembra y se transfirieron a tubos de cultivo que contenían 5 ml de medio de sacarosa, y se cultivaron durante 4 días a 29 °C en un agitador. Se utilizaron 2 ml de este cultivo para inocular 50 ml de medio (MSFM o SSFM) en matraces de 250 ml y se cultivaron a 29 °C en un agitador a 200 rpm.
Los matraces de control de la cepa parental Schizochytrium sp. ATCC 20888 se cultivaron del mismo modo pero utilizando medio que contenía glucosa. Las células se recogieron 7 días después. Las células se centrifugaron y se lavaron con una mezcla de isopropanol:agua destilada al 50 %. Las células sedimentadas se liofilizaron, se pesaron, y se realizó el análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME, forma siglada de fatty acid methyl esters). Para el análisis de FAME, se extrajeron aceites de los cultivos celulares utilizando procedimientos convencionales y se analizaron en cuanto a la composición de ácidos grasos como porcentaje de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) totales. Véase, por ejemplo, la Publicación de Estados Unidos N.° 2010/0239533. Se sometió a ensayo el crecimiento y el contenido en grasa de los transformantes de CL0076 de Schizochytrium sp. ATCC 20888 o B76-32 de forma gravimétrica y mediante cromatografía de gases de los aceites derivatizados, como se describió anteriormente en la Publicación de Estados Unidos N.° 2008/0022422.
Los resultados se muestran en las Tablas 5-8. Los pesos secos y el contenido en grasa de los sedimentos procedentes de los cultivos en matraces de agitación de los transformantes, así como de las cepas parentales se muestran en las FIG. 3-8.
Medio SSFM: glucosa o sacarosa 50 g/l, Na2SO413,6 g/l, K2SO40,7 g/l, KCl 0,36 g/l, MgSO4^7H2O 2,3 g/l, MES 0,1 M (pH 6,0), (NH4)2SO4 1,2 g/l, glutamato monosódico 0,13 g/l, KH2PO4 0,056 g/l y C a C b ^ O 0,2 g/l. Se añadieron vitaminas a 1 ml/l a partir de una reserva que consistía en vitamina B12 0,16 g/l, tiamina 9,7 g/l y Capantotenato 3,3 g/l. Se añadieron oligoelementos a 2 ml/l a partir de una reserva que consistía en ácido cítrico 1 g/l, FeSO4^7H2O 5,2 g/l, M n C b ^ O 1,5 g/l, ZnSO4^7H2O 1,5 g/l, C o C b ^ O 0,02 g/l, Na2M oO4^O 0,02 g/l, CuSO4^5H2O 1,0 g/l y NiSO4^6H2O 1,0 g/l, ajustado a pH 2,5.
Medio SFM modificado (MSFM): glucosa o sacarosa 10 g/l, NaCl 25,0 g/l, KCl 1,0 g/l, (NH4)2SO4 0,2 g/l, 5 g/l, MgSO4^7H2O 5,0 g/l, KH2PO4 0,1 g/l, CaCl2^2H2O 0,3 g/l, HEPES 0,1 M (pH 7,0), metales PB26 al 0,1 % y Vitaminas PB260 al 1 % (v/v). Las vitaminas se añadieron a 2 ml/l a partir de una reserva que consistía de vitamina B12 0,16 g/l, tiamina 9,7 g/l y Ca-pantotenato 3,3 g/l. Se añadieron oligoelementos a 2 ml/l a partir de una reserva que consistía en ácido cítrico 1 g/l, FeSO4^7H2O 5,2 g/l, MnCl2^4H2O 1,5 g/l, ZnSO4^7H2O 1,5 g/l, CoCl2^6H2O 0,02 g/l, Na2MoO4^2H2O 0,02 g/l, CuSO4^5H2O 1,0 g/l y NiSO4^6H2O 1,0 g/l, ajustado a pH 2,5.
La Tabla 5 muestra el crecimiento y los niveles de grasa de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivado en MSFM con glucosa, fructosa, sacarosa o sin añadir una fuente de carbono.
La Tabla 6 muestra el peso seco y el % de ácidos grasos para Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivado en medio MSFM con glucosa (control) y para las líneas celulares transformadas de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivadas en medio MSFM con sacarosa.
La Tabla 7 muestra el peso seco y el % de ácidos grasos para Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivado en medio SSFM con glucosa (control) y para las líneas celulares transformadas de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivadas en medio SSFM con sacarosa.
La Tabla 8 muestra el peso seco y el % de ácidos grasos para Schizochytrium B76-32 cultivado en medio SSFM con glucosa (control) y para las líneas celulares transformadas de Schizochytrium B76-32 cultivadas en medio SSFM con sacarosa.
Tabla 5. Crecimiento y niveles de grasa en Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivado en MSFM con glucosa, fructosa sacarosa o sin añadir una fuente de carbono
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Tabla 6. Líneas celulares transformadas de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivadas en medio MSFM con sacarosa
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Tabla 7. Líneas celulares transformadas de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivadas en medio SSFM con sacarosa
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Tabla 8. Líneas celulares transformadas de B76-32 cultivadas en medio SSFM con sacarosa
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Ejemplo 3
Expresión de la invertasa en Schizochytrium
Se recogieron los sobrenadantes sin células de cultivos de matraces de agitación de 50 ml de Schizochytrium sp. ATCC 20888 clon 1-3 transformado con pCL0076 (Ejemplo 2) cultivado en SSFM durante 3 días (véase la Publicación de Estados Unidos N.° 2008/0022422) después de que los cultivos se centrifugaran a 5000 x g. Los sobrenadantes de cultivo se utilizaron de forma directa para SDS-PAGE o se concentraron de 50 a 100 veces utilizando concentradores disponibles en el mercado equipados con membranas permeables que permiten la concentración de todos los componentes más pesados que 10 kDa. La concentración de proteína total se midió mediante el ensayo de Bradford (Biorad). La expresión de la invertasa se verificó después mediante análisis de inmunotransferencia seguido de un procedimiento de inmunotransferencia convencional (Sambrook et al.). Brevemente, las proteínas (0,625 |jg a 5 |jg) se separaron en SDS-PAGE en un gel de bis-tris (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Después, las proteínas se tiñeron con azul de Coomassie (SimplyBlue Safe Stain, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) o se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno y se sondaron en cuanto a la presencia de proteína invertasa con un antisuero para invertasa (Open Biosystems, Huntsville, AL), obtenido de conejos que se habían inyectado con una preparación pura de invertasa de Saccharomyces cerevisiae (Sigma, St. Louis, m O). Posteriormente, la membrana se incubó con un anticuerpo secundario de ratón anti conejo acoplado a fosfatasa alcalina (Promega Corporation, Madison, WI). Después, la membrana se trató con solución de 5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato/nitro azul de tetrazolio (BCIP/NBT), de acuerdo con las instrucciones del fabricante (KPL, Gaithersburg, MD). En la FIG. 9 se presenta un ejemplo. En los paneles 9A y 9B se presentan, respectivamente, una inmunotransferencia anti invertasa y el correspondiente gel teñido con azul de Coomassie. De las cuatro bandas principales observadas en los sobrenadantes de cultivo del clon 1-3, solo una mostró reaccionar con el antisuero anti invertasa. La identidad de la proteína se confirmó mediante análisis de secuencia peptídica.
Ejemplo 4
Actividad invertasa en Schizochytrium
Se midió la actividad de sacarasa por la tasa de liberación de fructosa y glucosa a partir de sacarosa. El ensayo se realizó añadiendo sacarosa al sobrenadante del caldo de fermentación y se midió el contenido de glucosa/fructosa mediante HPLC.
Se cultivó Schizochytrium sp. B76-32 clone n.° 2 transformado con pCL0076 (ejemplo 2) en MSFM (con sacarosa) hasta que se alcanzó una DO600nm de aproximadamente 4 en matraces de agitación de 50 ml a 29 °C. Las células se centrifugaron durante 15 min a 4500 x g y se midió la actividad de invertasa en el sobrenadante. La invertasa se sometió a ensayo añadiendo sacarosa 0,1 M a volúmenes variables de caldo de fermentación y ajustando el volumen final a 1 ml. La reacción se incubó a 55 °C durante 3 min. La finalización de la reacción se realizó a 100 °C durante 10 min, y después se congeló antes de la cuantificación de la glucosa, fructosa y sacarosa mediante HPLC. La HPLC se realizó utilizando una versión modificada del procedimiento descrito en Liu et al., Food Sci. 28: 293-296 (2007). Brevemente, se separaron los mono- y disacáridos utilizando HPLC con una columna de NH2 Luna y se detectaron utilizando un RID (detector de índice de refracción). La identificación se llevó a cabo comparando los tiempos de retención con los de los patrones. La cuantificación se hizo mediante una calibración de patrón externo. En la FIG. 10A se muestra la velocidad de reacción en función de la concentración de sacarosa. La Km (33,4 mM) y la Vmáx (glucosa 6,98 mM/min) se calcularon a partir del diagrama de Lineweaver-Burk convencional. Véase la FIG.
10B.
Ejemplo 5
Glucosilación de la invertasa en Schizochytrium
Las proteínas de sobrenadante del Ejemplo 4 se separaron mediante SDS-PAGE en un gel de bis-tris al 4-12 % (Invitrogen). Las proteínas se tiñeron después con azul de Coomassie (SimplyBlue™ Safe Stain, Invitrogen, Carlsbad, CA). Las proteínas teñidas de interés se cortaron a partir del gel y los cortes se cortaron en pequeños trozos (~1 mm3), y se destiñeron de forma alterna con bicarbonato de amonio (BicAm) 40 mM y acetonitrilo al 100 % hasta que el color se volvió claro. Se volvió a aumentar el tamaño del gel desteñido en DTT 10 mM en BicAm 40 mM a 55 °C durante 1 h. La solución de DTT se cambió por yodoacetamida (IAM) 55 mM y se incubó en oscuridad durante 45 min. La incubación se siguió de lavado de forma alterna con BicAm 40 mM y acetonitrilo al 100 %, dos veces. Se volvió a aumentrar el tamaño del gel deshidratado con solución de tripsina (tripsina en BicAm 40 mM) en hielo durante 45 min, de forma inicial, y la digestión de las proteínas se llevó a cabo a 37 °C durante una noche. El sobrenadante se transfirió a otro tubo. Los péptidos y los glucopéptidos se extrajeron del gel en series de acetonitrilo al 20 % en ácido fórmico al 5 %, acetonitrilo al 50 % en ácido fórmico al 5 % y después acetonitrilo al 80 % en ácido fórmico al 5 %. Las soluciones de muestra se secaron y combinaron en un tubo. La digestión con tripsina extraída se pasó a través de un cartucho C18 Sep-Pak® (Waters Corporation, Milford, MA) y se lavó con ácido acético al 5 % para eliminar los contaminantes (tal como sales y SDS). Se eluyeron los péptidos y los glucopéptidos en series de isopropanol al 20 % en ácido acético al 5 %, isopropanol al 40 % en ácido acético al 5 % e isopropanol al 100 %, y se secaron en un concentrador de velocidad al vacío. Las muestras secas se combinaron y después se reconstituyeron con tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,5) y se calentaron a 100 °C durante 5 min para inactivar a tripsina. La digestión con tripsina se incubó con PNGasa F a 37 °C durante una noche para liberar los N-glucanos. Después de la digestión, la muestra se pasó a través de un cartucho C18 Sep-Pak® y la fracción de hidratos de carbono se eluyó con ácido acético al 5 % y se secó mediante liofilización. Los oligosacáridos unidos en N liberados se permetilaron basándose en el método de Anumula y Taylor (Anumula y Taylor, 1992) y se les realizó el perfil mediante espectrometría de masas. El análisis por espectrometría de masas se realizó siguiendo el método desarrollado en el Centro de Investigación de Hidratos de Carbono Complejos (Aoki K et al., J. Biol. Chem. 282: 9127-42 (2007). El análisis de masa se determinó usando NSI-LTQ/MSn. Brevemente, los glucanos permetilados se disolvieron en NaOH 1 mM en metanol al 50 % y se infundieron directamente en el instrumento (espectrometría de masas de trampa lineal de iones Finnigan™ LTQ™, Thermo Electron Corporation, Waltham, MA) a un caudal constante de 0,4 pl/min. El análisis de MS se realizó en el modo de ion positivo. Para el mapeo total de iones, se examinó el análisis de MS/MS automatizado (a una energía de colisión de 35), intervalo de m/z de 500 a 2000, en ventanas de 2,8 unidades de masas sucesivas que solapaban con la ventana anterior en 2 unidades de masa.
El mapeo total de iones se realizó para examinar la presencia de iones de fragmentos indicativos de glucanos. Se tomaron todos los datos de MS/MS de m/z 500 hasta m/z 2000 y se analizaron los datos brutos de forma manual. El cromatograma y la tabla de especies obtenidos mediante el mapeo total de iones-NSI se muestran en las FIG. 11 y FIG. 12. Este cromatograma se procesó mediante el filtro de exploración, una pérdida neutral de m/z 139, que es la de la pérdida neutral característica de los glucanos de tipo de alta manosa. El mapeo total de iones reveló que esta muestra contiene una serie de glucanos de tipo de alta manosa con cadenas de manosa largas.
Ejemplo 6
Expresión de la invertasa de Aspergillus niger en Schizochytrium
Se digirió el vector pAB0018 (N.° de acceso ATCC PTA-9616) con HindlII, se trató con nucleasa de frijol chino, se purificó y después se digirió adicionalmente con Kpnl, generando cuatro fragmentos de diversos tamaños. Se aisló un fragmento de 2552 pb mediante técnicas electroforéticas convencionales en un gel de agar y se purificó utilizando kits de purificación de ADN comerciales. Después se realizó una segunda digestión de pAB0018 con Pmel y Kpn. Se aisló y purificó un fragmento de 6732 pb a partir de la digestión y se ligó al fragmento de 2552 pb. Después se utilizó el producto del ligamiento para transformar cepas disponibles en el mercado de células E. coli DH5-a competentes (Invitrogen) utilizando el protocolo del fabricante. Se propagaron los plásmidos procedentes de clones resistentes a ampicilina, se purificaron y después se exploraron mediante digestiones de restricción o PCR para confirmar que el ligamiento había generado las estructuras plasmídicas esperadas. Un plásmido verificado se designó pCL0120. Véanse la FIG. 13 y la SEQ ID NO: 5.
A la secuencia polinucleotídica que codifica la forma madura de la proteína invertasa secretada Suc1 procedente del hongo Aspergillus niger (N.° de acceso de GenBank S33920) se le optimizaron los codones para la expresión en Schizochytrium utilizando la tabla de uso de codones de Schizochytrium de la FIG. 1 (la optimización de codones se realizó en Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA). Se sintetizó la secuencia con codones optimizados y la secuencia polinucleotídica resultante se fusionó a una secuencia polinucleotídica que codifica el péptido señal de Sec1 de Schizochytrium ("ss de Sec1”) como un líder N-terminal en lugar del péptido señal endógeno. La región codificante resultante de la secuencia de ácidos nucleicos "s1Suc1” (SEQ ID NO: 4) se muestra en la FIG. 14. El polinucleótido sISucl con codones optimizados se clonó en el vector pCL0120 utilizando sitios de restricción BamHI y Ndel en 5' y 3' para la inserción y ligamiento de acuerdo con técnicas convencionales. En la FIG. 15 se muestra un mapa plasmídico del vector resultante, pCL0137. Se transformó la cepa de tipo silvestre Schizochytrium sp. ATCC 20888 con este vector y los clones resultantes se seleccionaron en medio SSFM sólido que contenía SMM. Después, los clones resistentes a SMM se resembraron en placa en medio SSFM sólido que contenía sacarosa como única fuente de carbono para someterlos a ensayo en cuanto al crecimiento. Dependiendo del experimento de transformación, entre el 50 % y el 90 % de los transformantes primarios resistentes a SMM tuvieron la capacidad de crecer en medio de sacarosa.
Ejemplo 7
Expresión de la invertasa secretada, la invertasa citoplasmática y el transportador de sacarosa en Schizochytrium Se optimizaron los codones del gen del transportador de alfa-glucósido AGT1 de Saccharomyces cerevisiae (N.° de acceso de GenBank L47346) para la expresión en Schizochytrium y se insertó en el vector pCL0121 (SEQ ID NO: 6), que comprende un marcador de selección para ZEOCIN™, para producir el vector pCL0125 (SEQ ID NO: 7). Se optimizaron los codones del gen del transportador de sacarosa SUT1 de Solanum tuberosum (patata) (N.° de acceso de GenBank X69165) para la expresión en Schizochytrium y se insertó en el vector pCL0121 (SEQ ID NO: 6), que comprende un marcador de selección para ZEOCIN™, para producir el vector pCL0126 (SEQ ID NO: 8). Se optimizaron los codones de la secuencia polinucleotídica que codifica la proteína invertasa SUC2 citoplasmática de Saccharomyces cerevisiae (N.° de acceso de GenBank P00724) para la expresión en Schizochytrium y se insertó en el vector pCL0122 (SEQ ID NO: 9), que comprende un marcador de selección de paromomicina, para producir el vector pCL0127 (SEQ ID NO: 10).
Schizochytrium sp. B76-32 clon n.° 19 transformado con pCL0076 se transformó adicionalmente con pCL0125 o pCL0126, que comprendían el transportador de alfa-glucósido AGT1 y el transportador de sacarosa SUT1, respectivamente. Los transformantes se seleccionaron con antibióticos y la presencia de los genes transportadores se confirmó por PCR. Los transformantes se transformaron adicionalmente con pCL0127 que comprendía SUC2 citoplasmática, se seleccionaron con antibiótico y se analizaron en cuanto al crecimiento en sacarosa basándose en el peso seco y el contenido de FAME, como se describe en el Ejemplo 2. Se observó el crecimiento en sacarosa y la producción de ácidos grasos.
Se transformaron células de Schizochytrium sp. ATCC 20888 de tipo silvestre con: (1) pCL0125, que comprendía el transportador de alfa-glucósido AGT1, en combinación con pCL0127, que comprendía SUC2 citoplasmática; o (2)

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método de producción de un cultivo de células de traustoquítridos, que comprende:
(a) transformar una célula de traustoquítridos con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una invertasa heteróloga, en la que la invertasa está unida a la membrana plasmática de la célula de traustoquítridos, y
(b) cultivar la célula de traustoquítridos transformada en un medio de cultivo que comprende sacarosa como fuente de carbono.
2. Una célula de traustoquítridos que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una invertasa heteróloga, en la que la invertasa está unida a la membrana plasmática de la célula de traustoquítridos.
3. La célula de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la invertasa está unida de forma funcional a un péptido señal.
4. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 2-3, en la que la secuencia polinucleotídica que codifica la invertasa heteróloga es al menos el 90 % idéntica a la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO. 1.
5. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en la que la célula comprende adicionalmente una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un transportador de sacarosa heterólogo.
6. La célula de la reivindicación 5, en la que la secuencia polinucleotídica que codifica el transportador de sacarosa heterólogo es al menos el 90 % idéntica a la secuencia polinucleotídica de N.° de acceso L47346.
7. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en la que el traustoquítrido es un Schizochytrium o un Thraustochytrium.
8. Un cultivo de traustoquítridos que comprende:
(a) la célula de traustoquítridos de cualquiera de las reivindicaciones 2-7, y
(b) un medio de cultivo celular que comprende sacarosa como fuente de carbono.
9. Un método de producción de una biomasa de traustoquítridos, que comprende:
(a) cultivar la célula de traustoquítridos de cualquiera de las reivindicaciones 2-7 en un medio de cultivo que comprende sacarosa como fuente de carbono, y
(b) recoger la biomasa a partir del medio de cultivo.
10. Un método de producción de un aceite microbiano, que comprende:
(a) cultivar la célula de traustoquítridos de cualquiera de las reivindicaciones 2-7 en un medio de cultivo que comprende sacarosa como fuente de carbono para producir una biomasa, y
(b) extraer un aceite a partir de la biomasa.
11. Un método de producción de un producto alimenticio, cosmético, composición industrial o composición farmacéutica para un animal o ser humano, que comprende:
(a) cultivar la célula de traustoquítridos de cualquiera de las reivindicaciones 2-7 en un medio de cultivo que comprende sacarosa como fuente de carbono,
(b) recoger una biomasa a partir del medio de cultivo,
(c) preparar el producto alimenticio, cosmético, composición industrial o composición farmacéutica a partir de la biomasa.
12. El método de la reivindicación 11, que comprende adicionalmente extraer un aceite de la biomasa y preparar el producto alimenticio, cosmético, composición industrial o composición farmacéutica a partir del aceite.
13. El método de la reivindicación 11 o reivindicación 12, en el que el producto alimenticio se selecciona de (a) una fórmula infantil, (b) leche, (c) una bebida, (d) una bebida terapéutica, (e) una bebida nutritiva, (f) un aditivo para alimento de animales o seres humanos, (g) un suplemento nutritivo, (h) un pienso para animales y (i) una combinación de (b), (c), (d) y/o (e).
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