KR20000076363A - Ｄｎａ 라이브러리를 제조하기 위한 시험관내 방법 - Google Patents

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빈드제스퍼
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한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느
노보 노르디스크 에이/에스
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Abstract

많은 상이한 출발 DNA 주형 및 프라이머로부터, 폴리뉴클레오티드 합성중에 유도된 주형 쉬프트에 의하여, 재조합된 상동성 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 제조하는 시험관내 방법이 기재되어 있다. 이로써, A. a) DNA 주형이 변성되고, b) 프라이머가 주형에 아닐링되고, c) 중합효소를 사용함에 의해 상기 프라이머가 연장되고, d) 합성을 중단시키고, e) 연장된 프라이머가 주형으로부터 분리됨으로써 연장된 프라이머가 합성되고; B. a) 연장된 프라이머가 주형으로부터 분리되고 연장된 프라이머가 프라이머와 주형 두가지로서 사용되어 단계 A.b) 내지 A.e) 가 반복되거나, 또는 b) 단계 A.b) 내지 A.e) 가 반복됨으로써 주형 쉬프트가 유도되며; C. 단계 A. 와 B.a), A. 와 B.b), 또는 이것들의 조합 단계의 과정이 적당한 횟수만큼 진행된 후 과정이 종결된다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 관심의 상동성 폴리뉴클레오티드를 선택적으로 증폭시키기 위한 특이한 프라이머를 사용하여 표준 PCR 반응으로 증폭된다.

Description

ＤＮＡ 라이브러리를 제조하기 위한 시험관내 방법{AN IN VITRO METHOD FOR CONSTRUCTION OF A DNA LIBRARY}
일반적으로 특정한 생체내 활성을 수행하는 단백질이 속과 속 사이에서 특정한 변이(variation)를 나타내며, 심지어는 동일한 종의 구성원들사이에서도 차이가 존재할 수 있는 것으로 발견된다. 이러한 변이는 물론 게놈 수준에서는 훨씬 더 완연하다.
기본적으로 동일한 생체활성을 가지고 있는 단백질들을 코드하는 유전자들중의 이러한 자연적인 유전적 다양성은 자연계에서는 수백만년에 걸쳐서 생성된 것이고, 문제의 유기체의 주변환경의 관점에서 코드되는 단백질들의 자연적인 최적화를 반영한다.
오늘날의 사회에서, 생명의 조건은 자연적인 주변환경으로부터 막대하게 제거되며, 자연적으로 발생하는 생체활성 분자들은 인류에 의해 적용되는 다양한 용도, 특히 산업적인 목적으로 사용되는 경우에는 최적화된 것이 아니라는 것이 발견되었다.
그러므로 그것의 사용이 의도되는 용도와 관련하여 최적의 성질을 나타내는 그러한 생채활성 단백질들을 확인하는 것이 산업계에서는 관심의 대상이 되고 있다.
이러한 목적은 수년동안 천연 공급원을 스크리닝함에 의해, 또는 돌연변이생성의 사용에 의해 수행되어 왔다. 예를 들면, 예컨대 계면활성제에 사용하기 위한 효소의 기술적인 분야내에서 자연 발생적 단백질 분해효소, 지방 분해효소, 아밀라아제 및 셀룰라아제의 세탁 및/또는 식기세척 성능이 상기 효소들의 시험관내 변형에 의하여 상당히 개선되었다.
대부분의 경우에 이러한 개선은 그것들의 유형을 토대로 하거나 또는 성숙한 효소의 이차 또는 삼차 구조에서의 그것들의 위치를 토대로 한 특정 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 삽입을 유도하는 부위-특정 돌연변이생성에 의해 얻어졌다 (미국 특허 제 4,518,584 호 참조).
이런 방식으로 신규한 폴리펩티드 변이체 및 돌연변이체, 예컨대 변경된 특성, 예를 들면 특이적 활성, 기질 특이성, 열 안정성, pH 안정성 및 염 안정성, pH-최적치, pI, Km, Vmax등을 나타내는 신규한 변형된 효소들의 제조가 성공적으로 수행되어 성질이 개선된 폴리펩티드들이 얻어졌다.
예를 들어, 효소의 기술분야내에서 단백질 분해효소, 지방 분해효소, 아밀라아제 및 셀룰라아제와 같은 효소들의 세탁 및/또는 식기세척 성능은 상당히 개선되었다.
단백질과 효소를 변형시키기 위한 또 다른 일반적인 접근법은 무작위 돌연변이생성, 예를 들어 미국 특허 제 4,894,331 호 및 WO 93/01285 호에 개시된 것을 토대로 한 것이었다.
개선된 기능적 성질을 나타내는 폴리펩티드 변이체 또는 돌연변이체를 얻기 위한 과정이 번거롭고 시간 소모적이기 때문에, 변형된 폴리펩티드를 신속하게 제조하기 위한 몇가지 다른 대체 방법들이 제안되었다.
웨버 등은 두 개의 상동 유전자사이의 생체내 재조합에 의하여 유전자를 변형시키는 방법을 발표하였다 [Weber et al., (1983), Nucleic Acids Research, vol. 11, 5661]. 5'-단부에 알파-1 사람 인터페론을 코드화하는 DNA 서열과 3'-단부에 알파-2 사람 인터페론을 코드화하는 DNA 서열이 양옆에 있는 플라스미드 벡터를 포함하고 있는 선형 DNA 서열이 제조되고, 대장균(E. coli) 재조합체의 rec A 양성 스트레인에 형질전환된다. 재조합체들은 내성 마아커에 의하여 확인되고 단리된다.
폼폰 등은 포유동물의 시토크롬 P-450 의 유전자 도메인을, 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)을 단부를 채움으로써 선형화된 플라스미드, 및 상기 플라스미드의 단부들과 부분적으로 상동성인 DNA 단편으로 형질전환시킴으로써 맥주효모균에서 부분적으로 상동성인 서열들을 생체내 재조합시킴에 의하여, 셔플링하기 위한 방법을 설명하고 있다 [Pompon et al., (1989), Gene 83, p. 15-24].
WO 97/07205 에는 주형으로서 플라스미드의 DNA 를 사용하는 생체내 재조합에 의하여 상동성 DNA 서열들의 상이한 뉴클레오티드 서열을 셔플링함으로써 폴리펩티드 변이체가 제조되는 방법이 설명되어 있다.
미국 특허 제 5,093,257 호 (양수인: Genencor Int. Inc.)에는 생체내 재조합에 의하여 하이브리드 폴리펩티드를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 하이브리드 DNA 서열은 복제 서열, 하이브리드 폴리펩티드의 아미노-말단 부분을 코드화하는 첫 번째 DNA 서열, 상기 하이브리드 폴리펩티드의 카르복시-말단 부분을 코드화하는 두 번째 DNA 서열을 포함하고 있는 원형 벡터를 형성함으로써 제조된다. 원형 벡터는 원형 벡터가 그 안에서 증폭되는 rec 양성 미생물안에 형질전환된다. 그 결과 rec 양성 미생물의 자연 발생 재조합 메카니즘에 의해 중재된 상기 원형 벡터가 재조합된다. 그러한 rec 양성 미생물로는 바실러스 및 대장균과 같은 원시핵생물, 및 맥주효모균과 같은 진핵생물이 있다.
상동성 DNA 서열을 셔플링하는 한가지 방법이 문헌에 소개되어 있다 [Stemmer, (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 10747-10751; Stemmer, (1994), Nature, vol. 370, 389-391]. 이 방법은 시험관내 PCR 기법을 사용하여 상동성 DNA 서열을 셔플링하는 것에 관한 것이다. 셔플된 DNA 서열을 포함하고 있는 양성 재조합 유전자들은 발현된 단백질의 개선된 기능을 토대로 DNA 라이브러리로부터 선택된다.
상기 방법은 또한 WO 95/22625 호에 개시되어 있다. WO 95/22625 호는 상동성 DNA 서열을 셔플링하는 방법에 관한 것이다. WO 95/22625 호에 설명된 방법에서 중요한 단계는 상동성 주형 이중-가닥의 폴리뉴클레오티드를 원하는 크기의 무작위 단편들로 절단한 후, 단편들을 전체 길이의 유전자로 동종 재어셈블링하는 것이다.
그러나, WO 95/22625 호의 방법에 고유한 단점은 이 방법을 통해 생성된 다양성이 상동성 유전자 서열 (WO 95/22625 호에서 규정된 바와 같음)의 사용에 의해 제한된다는 것이다.
상기 방법의 또 다른 단점은 주형 이중-가닥의 폴리뉴클레오티드의 절단에 의한 무작위 단편들의 생성에 있다.
관심의 다른 문헌은 WO 95/17413 호로, 이것에는 합성된 이중-가닥 단편들의 재조합 또는 PCR 생성된 서열들의 재조합에 의하여 특정한 DNA 서열 - 소위 디자인 엘레먼트 (DE)를 재조합함으로써 디자인 엘레먼트들의 최소한 두 개의 엘레먼트를 포함하는 소위 기능적 엘레먼트 (FE)를 생성하는, 유전자 또는 DNA 셔플링 방법이 설명되어 있다. 이 방법에 따르면, 재조합은 재조합될 상이한 서열의 혼성화를 가능하게 하기에 충분한 서열 상동성을 가지고 있는 DNA 서열을 가지고 있는 디자인 엘레먼트들중에서 수행되어야 한다.
그러므로 WO 95/17413 호의 방법에는 또한 생성된 다양성이 상대적으로 제한된다는 단점이 수반된다. 나아가, 그 방법은 시간 소모적이고, 값비싸며, 자동화가 되기에는 부적당하다.
상기 방법들이 있음에도 불구하고 여전히 신규한 폴리펩티드 변이체를 제조하기 위한 훨씬 더 좋은 반복적인 시험관내 재조합 방법에 대한 요구가 존재한다. 그러한 방법들은 또한 적은 부피로도 수행될 수 있어야 하고, 자동화가 쉽게 될 수 있어야 한다.
(발명의 개요)
본 발명은 간단하게 설명하면, DNA 셔플링을 이루기 위하여 시험관내 DNA 합성중에 새롭게 합성된 DNA 가닥의 주형 쉬프트를 활용하는 것에 관한 것이다. 이 기법을 사용함으로써, 보다 유리한 방식으로 그러한 결과를 얻는 것이 가능하며, 어느 정도까지는 상기 언급된 방법들에서보다 훨씬 더 큰 변이를 얻는 것이 가능하다.
본 발명의 방법은 또한 자동화되기에 아주 적당하다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 기법은 에러-프론(error-prone) 중합효소와 조합되어 사용됨으로써, 생성된 라이브러리에 훨씬 더 큰 변이를 도입시킨다.
보다 구체적으로, 본 발명은 많은 상이한 출발 단일 또는 이중 가닥의 모 (parental) DNA 주형 및 프라이머들로부터, 중합효소를 사용한 시험관내 폴리뉴클레오티드 합성중에 유도된 주형 쉬프트에 의하여 재조합된 상동성 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 그 방법에 의하면
A. a) 이중 가닥의 모 DNA 주형이 변성되어 단일 가닥의 주형이 생성되고,
b) 상기 프라이머가 단일 가닥의 DNA 주형에 아닐링되고,
c) 상기 중합효소를 사용함에 의해 합성이 개시됨으로써 상기 프라이머가 연장되고,
d) 합성 중단이 유발되고, 그리고
e) 이중 가닥이 변성되어 연장된 프라이머가 주형으로부터 분리됨으로써
연장된 프라이머 또는 폴리뉴클레오티드가 합성되고;
B. a) 새롭게 합성된 단일 가닥의 연장된 프라이머가 주형으로부터 분리되고 상기 (A) 에서 생성된 연장된 프라이머가 프라이머와 주형 두가지로서 사용되어 단계 A.b) 내지 A.e) 가 반복되거나, 또는
b) 단계 A.b) 내지 A.e) 가 반복됨으로써
주형 쉬프트가 유도되며;
C. 단계 A. 와 B.a), A. 와 B.b), 또는 이것들의 조합 단계의 과정이 적당한 횟수만큼 진행된 후 과정이 종결되고, 그리고
D. 임의로 생성된 폴리뉴클레오티드는 관심의 상동성 폴리뉴클레오티드를 선택적으로 증폭시키기 위한 특이한 프라이머를 사용하여 표준 PCR 반응으로 증폭된다.
특정 구체예에서 본 발명의 방법에 다양한 변형이 만들어질 수 있다. 예를 들어, 주형에 비교하여 돌연변이를 도입시키기 위해서 에러-프론 중합효소, 또는 반응을 억제하기 위하여 아주 빨리 폴리뉴클레오티드 합성을 중지할 중합효소중 어느 하나의 결핍성 중합효소를 사용하는 것이 유리하다.
추가의 변형은 하기에서 설명될 것이다.
추가의 측면으로 본 발명은 동일한 생체활성을 나타내는 자연 발생적인 폴리펩티드와 비교하여 개선된 성질을 나타내는 폴리펩티드를 확인하는 방법에 관한 것으로, 그 방법에 의하면 상기 과정에 의하여 생성된 재조합된 상동 폴리뉴클레오티드의 라이브러리가 적절한 벡터안에 클론되고, 그런 다음 상기 벡터가 적당한 숙주 시스템안으로 형질전환되고, 상응하는 폴리펩티드로 발현되고 나타난 후, 상기 폴리펩티드가 적당한 검정으로 스크린되고 양성의 결과가 선택된다.
추가의 측면으로, 본 발명은 선행하는 방법으로 확인된 관심의 폴레핍티드를 생성하는 방법에 관한 것으로, 그 방법에 의하면 상기 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있는 벡터가 적당한 숙주안으로 형질전환되고, 상기 숙주는 성장하여 상기 폴리펩티티드를 발현하고, 발현된 폴리펩티드가 회수되어 정제된다.
최종적으로, 본 발명은 추가의 측면으로 본 발명에 따르는 방법중 어느 하나에 의하여 얻을 수 있고, 본원에 개시되는 서열 (하기 참조)을 포함하고 있는 재조합된/셔플된 단백질인 재조합된/셔플된 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 최종 측면에서, 용어 "얻을 수 있는" 은 상기 단백질이 본 발명에 따르는 방법에 의하여 얻어지는 것이 바람직한 것을 의미한다. 그러나 WO 95/22625 호 또는 WO 95/17413 호에 개시되어 있는 것과 같은 선행 기술의 공지된 재조합/셔플링 기법도 상기 재조합된 단백질을 얻기 위하여 단독으로, 또는 본 발명에 따르는 방법과 조합하여 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 최종 측면은 다음과 같다:
본 발명에 따르는 방법들중 어느 하나에 의하여 얻을 수 있고, 최소한 두 개의 상이한 야생형 단백질 분해효소로부터 얻어지는 최소한 두 개의 상이한 부분 서열을 함유하는 재조합된 서열을 포함하고 있는 재조합된/셔플링된 단백질 분해효소;
본 발명에 따르는 방법들중 어느 하나에 의하여 얻을 수 있고, 최소한 두 개의 상이한 부분 야생형 서열을 함유하는 재조합된 서열을 포함하고 있는 재조합된/셔플링된 지방 분해효소;
본 발명에 따르는 방법들중 어느 하나에 의하여 얻을 수 있고, 최소한 두 개의 상이한 야생형 슈도모나스-유도 지방 분해효소호부터 얻어지는 최소한 두 개의 상이한 부분 서열을 함유하는 재조합된 서열을 포함하고 있는 재조합된/셔플링된 슈도모나스-유도 지방 분해효소;
본 발명에 따르는 방법들중 어느 하나에 의하여 얻을 수 있고, 최소한 두 개의 상이한 야생형 크실라나제로부터 얻어지는 최소한 두 개의 상이한 부분 서열을 함유하는 재조합된 서열을 포함하고 있는 재조합된/셔플링된 크실라나제;
본 발명에 따르는 방법들중 어느 하나에 의하여 얻을 수 있고, 최소한 두 개의 상이한 야생형 셀룰라아제로부터 얻어지는 최소한 두 개의 상이한 부분 서열을 함유하는 재조합된 서열을 포함하고 있는 재조합된/셔플링된 셀룰라아제;
본 발명에 따르는 방법들중 어느 하나에 의하여 얻을 수 있고, 최소한 두 개의 상이한 야생형 아밀라아제로부터 얻어지는 최소한 두 개의 상이한 부분 서열을 함유하는 재조합된 서열을 포함하고 있는 재조합된/셔플링된 아밀라아제;
본 발명에 따르는 방법들중 어느 하나에 의하여 얻을 수 있고, 최소한 두 개의 상이한 야생형 락카아제 (laccase)로부터 얻어지는 최소한 두 개의 상이한 부분 서열을 함유하는 재조합된 서열을 포함하고 있는 재조합된/셔플링된 락카아제;
본 발명에 따르는 방법들중 어느 하나에 의하여 얻을 수 있고, 최소한 두 개의 상이한 야생형 피타아제 (phytase)로부터 얻어지는 최소한 두 개의 상이한 부분 서열을 함유하는 제조합된/셔플링된 피타아제.
정의
본 발명을 보다 상세하게 논의하기 전에 다음의 용어들을 먼저 정의하기로 한다.
"셔플링 (shuffling)": 용어 "셔플링"은 유입되는 폴리뉴클레오티드 (즉 출발 점(point) 상동 폴리뉴클레오티드)와 비교하여, 교환된 많은 뉴클레오티드 단편들을 가지고 있는 생성되는 폴리뉴클레오티드 (즉 셔플링 사이클이 수행된 폴리뉴클레오티드)를 유발하는 둘 또는 그 이상의 상동성 폴리뉴클레오티드간의 뉴클레오티드 서열 단편(들)의 재조합을 의미한다.
"DNA 서열 또는 폴리뉴클레오티드의 상동성": 본 명세서에서 DNA 서열의 상동성 정도는 두 번째 서열로부터 첫 번째 서열의 유도화를 나타내는 두 개의 서열들 사이의 동일성 정도로서 측정된다. 상동성은 당해기술분야에 공지되어 있는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 GCG 프로그램 팩키지에서 제공된 GAP [Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711][Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453]에 의하여 적절하게 측정될 수 있다.
"상동성": 용어 "상동성" 은 하나의 단일 가닥 핵산 서열이 상보하는 단일 가닥의 핵산 서열과 혼성화할 수 있음을 의미한다. 혼성화 정도는 서열간의 동일성의 크기 및 하기에서 논의되는 바와 같은 온도 및 염 농도와 같은 혼성화 조건을 포함한 많은 인자들에 좌우될 수 있다(하기 참조).
DNA 서열을 비교하기 위한 다음의 세팅: 0.5 의 GAP 생성 페널티 및 0.3 의 GAP 연장 페널티를 이용한 컴퓨터 프로그램 GAP(상기 참조)를 사용하여, 본 발명에서는 두 개의 DNA 서열이 만약 그것들이 상호적으로 바람직하게는 최소한 70 %, 보다 바람직하게는 최소한 80 %, 및 더욱 더 바람직하게는 최소한 85 % 의 동일성 정도를 나타낸다면 혼성화할 것으로 (하기에서 규정되는 바와 같은 엄격성이 낮은 혼성화 조건을 사용하여) 여겨진다.
"이종성": 만약 둘 또는 그 이상의 DNA 서열이 상호적으로 상기에서 규정된 것보다 낮은 정도의 동일성을 나타내면, 그것들은 본원에서 "이종성"으로 표현된다.
"혼성화": 관심의 둘 또는 그 이상의 DNA 서열이 혼성화하는지 또는 혼성화하지 않는지를 측정하기 위한 적당한 실험적 조건이, 하기에서 상세하게 설명되는 바와 같이 낮은 엄격성에서의 혼성화로서 규정된다.
올리고뉴클레오티드 프로브가 이들 조건하에서 혼성화하는 분자들은 X-선 필름 또는 포스포이미저 (phosphoimager)를 사용하여 검출된다.
"프라이머": 본원에서 특히 PCR 반응과 관련하여 사용되는 용어 "프라이머"는 당해 기술분야에 공지되어 있는 일반적인 표준 명세서 ("PCR A practical approach" IRL Press, (1991))에 따라 규정되고 구성된 올리고뉴클레오티드 (특히 "PCR-프라이머")이다.
"서열에 특정된 프라이머": 용어 "서열에 특정된 프라이머" 는 프라이머 (바람직하게는 PCR 반응에 사용되는 것)가 관심의 서열 단편과 최소한 80 % 정도의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 90 % 정도의 서열 동일성을 나타내도록 구성되고, 상기 프라이머가 결국에는 "그것으로 특정되는" 것을 의미한다. 프라이머는 주어진 온도에서 그것이 향하게 되는 서열 단편 또는 영역에서 특이하게 아닐되도록 디자인된다. 특히, 프라이머의 3' 단부에서의 동일성이 필수적이다.
"플랭킹": 본원에서 PCR-단편에 포함되는 DNA 서열과 관련하여 사용되는 용어 "플랭킹" 은 PCR-단편의 5' 쪽과 3' 쪽 두곳의 가장 바깥쪽 부분 서열을 의미한다.
"폴리펩티드": 아미노산의 중합체는 때로 단백질로서 언급된다. 아미노산의 서열은 폴리펩티드가 취하고 있는 접혀진 형태를 결정하며, 이것은 계속해서 생물학적 성질 및 활성을 결정한다. 어떤 폴리펩티드들은 단일한 폴리펩티드 사슬로 구성되는 한편 (단량체), 다른 것들은 여러개의 결합된 폴리펩티드들을 포함한다 (다량체). 모든 효소 및 항체들은 폴리펩티드이다.
"효소": 화학적 반응을 촉매할 수 있는 단백질을 말한다. 언급되는 효소들의 구체적인 유형은 예컨대 아밀라아제, 단백질 분해효소, 카르보하이드라아제, 지방 분해효소, 셀룰라아제, 산화환원 효소, 에스테라제 등이다. 본 발명과 관련하여 특별히 관심있는 것은 계면활성제에 사용된 효소들, 예컨대 단백질 분해효소, 지방 분해효소, 셀룰라아제, 아밀라아제, 등이다.
본 발명은 (a) "유전자들"의 큰 라이브러리를 생성하기 위한 소위 유전자- 또는 DNA 셔플링 (shuffling) 기법을 사용함에 의해 관심의 단백질을 코드화하는 유전자의 유전적 다양성을 인공적으로 생성하고, 상기 유전자들의 라이브러리를 적당한 발현 시스템에서 발현시키고, 발현된 단백질을 원하는 성질을 나타내는 그러한 단백질을 측정하기 위하여 특이한 특성의 관점에서 스크리닝함에 의해 관심의 단백질의 성질을 개선하기 위하여, 또는 (b) 프로모터와 터미네이터와 같은 조절 엘레먼트들의 라이브러리를 생성하고, 구조 유전자와 작동가능하게 연결되어 있는 라이브러리로 적당한 숙주를 형질전환시키고, 그 구조 유전자를 발현시킨 후, 조절 엘레먼트의 원하는 성질을 스크리닝함으로써 프로모터와 터미네이터와 같은 조절 엘레먼트들의 성질을 개선하기 위하여 DNA 서열을 최적화하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 첫 번째 측면으로 많은 상이한 출발 단일 또는 이중 가닥의 모 DNA 주형 및 프라이머로부터, 중합효소를 사용하는 시험관내 폴리뉴클레오티드 합성중에 유도된 주형 쉬프트에 의하여, 재조합된 상동성 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 제조하는 방법에 관한 것으로, 그 방법에 의하면
A. a) 이중 가닥의 모 DNA 주형이 변성되어 단일 가닥의 주형이 생성되고,
b) 상기 프라이머가 단일 가닥의 DNA 주형에 아닐링되고,
c) 상기 중합효소를 사용함에 의해 합성이 개시됨으로써 상기 프라이머가 연장되고,
d) 합성 중단이 유발되고, 그리고
e) 이중 가닥이 변성되어 연장된 프라이머가 주형으로부터 분리됨으로써
연장된 프라이머 또는 폴리뉴클레오티드가 합성되고;
B. a) 새롭게 합성된 단일 가닥의 연장된 프라이머가 주형으로부터 분리되고 상기 (A) 에서 생성된 연장된 프라이머가 프라이머와 주형 두가지로서 사용되어 단계 A.b) 내지 A.e) 가 반복되거나, 또는
b) 단계 A.b) 내지 A.e) 가 반복됨으로써
주형 쉬프트가 유도되며;
C. 단계 A. 와 B.a), A. 와 B.b), 또는 이것들의 조합 단계의 과정이 적당한 횟수만큼 진행된 후 과정이 종결되고, 그리고
D. 임의로 생성된 폴리뉴클레오티드는 관심의 상동성 폴리뉴클레오티드를 선택적으로 증폭시키기 위한 특이한 프라이머를 사용하여 표준 PCR 반응으로 증폭된다.
본 발명에 따르면 중합효소는 DNA 또는 RNA 중합효소일 수 있으며, 구체적인 중합효소로는 예컨대 T4 중합효소, T7 중합효소, 대장균 DNA 중합효소 I 또는 DNA 중합효소 I 의 클레노우 단편과 같은 DNA 중합효소, 또는 예컨대 Taq, Amplitaq, Vent, Pwo 와 같은 열안정성 중합효소들을 들 수 있다.
본 발명의 장점중 한 가지는, 본 발명으로 인해 편리한 방식으로 반응의 프라이머의 연장 길이가 조절되는 것이 가능하다는 것이다.
이것은 중합효소의 선택, 중합효소가 작용하는 동안의 물리적 및 화학적 조건, 예컨대 pH, 온도, 완충제, 염 농도, 및 다양한 화학약품의 첨가와 같은 다양한 수단에 의해 이루어질 수 있다.
다양한 중합효소들이 상이한 속도 (초 당 통합되는 뉴클레오티드)로 DNA 합성을 수행한다고 알려져 있다. 예를 들면 DNA 중합효소 I 의 클레노우 단편은 예컨대 Taq 중합효소와 비교하여 제한된 연장 속도를 가지고 있다 (Sambrook et al. 1989).
중합효소들은 또한 주형/연장된 프라이머로부터 중합효소가 분리되기 전에 통합된 뉴클레오티드의 평균 수인 처리능력에 차이를 나타낸다: 클레노우 중합효소가 제한된 처리능력을 가지고 있는 중합효소의 실예이다.
그러므로 중합효소의 선택은 프라이머의 평균 연장을 조절하는 중요한 수단이다.
이들 조건은 또한 셔플링과 돌연변이를 조합시키는데 유용한 매개변수인 중합효소의 정확도 (fidelty) (그것에 의해 점 돌연변이가 도입되는 속도; HIV 역전사효소가 정확도가 낮은 중합효소의 실예이다)에 영향을 미칠 수 있다.
특정한 구체예에서 본 발명의 방법에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들면, 주형에 비교하여 돌연변이를 도입시키기 위해서 에러-프론 중합효소, 또는 반응을 억제하기 위하여 아주 빨리 폴리뉴클레오티드 합성을 중지할 중합효소중 어느 하나의 결핍성 중합효소를 적용하는 것이 유리하다. 그러한 결핍성 중합효소로는 낮은 정확도를 가지고 있는 클레노우 중합효소를 들 수 있다.
발명의 다른 구체예에서 중합효소는 만약 사용된 중합효소가 열안정성이 아닌 경우 각 사이클 후에 첨가될 것이다.
본 발명에 따르면, 출발 단일 또는 이중 가닥의 모 주형들은 그것들이 동일한 천연 폴리뉴클레오티드 (유전자)에 상이한 점 돌연변이를 함유하고 있거나, 또는 PCR 에 의해 증폭될 수 있는, 천연으로부터 분리된 상동성 폴리뉴클레오티드 (유전자들)일 수 있거나, 또는 그것들의 조합일 수 있다는 점에서 상이할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 주형은 DNA 수준에서 예컨대 95 %, 이상, 90 % 이상, 85 % 이상, 80 % 이상, 75 % 이상, 70 % 이상, 65 % 이상, 60 % 이상, 55 % 이상, 또는 심지어 50 % 이상의 동일성을 나타내는 상동성의 것들이다.
관심의 개선된 성질을 가지는 돌연변이를 포함하고 있는 예비-선택된 주형들을 사용하는 것이 유리할 것이다. 본 발명의 재조합 방법은 그런 다음 관심의 성질의 추가의 개선까지도 계속해서 스크리닝하기 위하여 상기 개선된 돌연변이들을 조합할 것이다.
관심의 개선된 성질을 가지는 상기 예비-선택된 주형들은 예컨대 i) 관심의 주형의 에러-프론 PCR 과 이어서 ii) 관심의 개선된 성질을 가지는 주형에 대한 스크리닝/선택을 포함한, 당해기술분야의 표준 과정에 의해 확인될 수 있었을 것이다. 에러-프론 PCR 단계의 돌연변이 생성 빈도 (낮거나 높은 돌연변이생성 빈도)는 바람직하게는 계속되는 스크리닝 용량과 관련하여 조정된다, 즉 스크리닝 용량이 제한되면 에러-프론 PCR 빈도가 바람직하게도 낮다 (즉, 각 주형에 하나 내지 두 개의 돌연변이가 일어남) (WO 92/18645 호 참조).
상기 언급된 바와 같은 단계 A.d) 에서 중합효소 반응의 억제는 상이한 방법으로, 예컨대 온도를 상승시키거나, 또는 WO 95/17413 호에 기재되어 있는 바와 같이 특이한 시약을 첨가함에 의해 얻어질 수 있다.
이 목적을 위해 온도를 상승시키는 경우, 90 ℃ 에서 99 ℃ 사이의 온도를 사용하는 것이 바람직하다.
화학적 제제를 사용할 때에는 DMSO 가 가능한 제제이다. 적절한 과정은 WO 95/17413 호에 기재되어 있다.
본 발명의 방법은 단계 1.b 에서 프라이머와 주형과의 아닐링을 사용한다. 본 발명에서 아닐링은 무작위이거나 특이한 것일 수 있는데, 이것은 각각 폴리뉴클레오티드상의 어느 곳에서든지 또는 프라이머의 성질에 따라 특정 위치에서 일어나는 것을 의미한다.
또한, 사용되는 프라이머는 완전히 무작위 프라이머 (NNNNNNNNNNN)(N 은 4 개의 염기 (A, T, G, C)의 혼합물이 합성중에 프라이머의 특정 위치에서 사용되는 것을 의미한다), 반-무작위 프라이머, 또는 특이한 프라이머일 수 있다.
만약 생성된 연장된 프라이머가 과정중에 프라이머로부터 분리된다면, 분리를 위한 간단한 수단을 제공하기 위하여 표지된 주형을 사용하는 것이 편리하며, 바람직한 마아커는 비오틴 또는 디곡시게닌이다.
본 발명에 따르면 필요한 사이클의 수는 500 미만일 것이며, 대부분의 경우 200 미만, 정상적으로는 100 미만의 사이클일 것이다.
본 발명의 구체예에서, 상기 시험관내 셔플링은 WO 97/07205 호에서 설명되는 것과 같은 방법에 의하여 계속되는 생체내 셔플링과 조합된다.
본 발명은 두 번째 측면으로, 동일한 생체활성을 가지고 있는 자연 발생적 폴리펩티드와 비교하여 개선된 성질을 나타내는 폴리펩티드를 확인하는 방법에 관한 것으로, 그로써 상기 과정에 의해 생성된 재조합된 상동 폴리뉴클레오티드의 라이브러리가 적절한 벡터안으로 클론되고, 상기 벡터는 다음 단계로 적절한 숙주 시스템안에 형질전환되고, 그런 다음 폴리펩티드가 적당한 검정방법으로 스크린되고, 양성의 폴리펩티드가 선택된다.
구체예에서, 셔플된 라이브러리에 의해 코드화된 관심의 폴리펩티드가 상기 재조합된 폴리펩티드를 파지 또는 박테리아의 표면에 나타내기 위하여 적당한 융합 단백질로서 (예컨대 박테리오파지 M13/fd 의 gIII 와의 혼성체로서) 발현되는 것으로 예상된다.
세 번째 측면으로, 본 발명은 선행 과정으로 확인된 바와 같은 관심의 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것으로, 그 방법에 의하여 상기 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있는 벡터가 적당한 숙주 안으로 형질전환되고, 상기 숙주가 성장하여 상기 폴리펩티드를 발현하며, 폴리펩티드가 회수되고 정제된다.
DNA 합성에 대한 개시점으로서 부분적인 무작위 (반-무작위) 또는 완전 무작위 프라이머 (선택된 수의 염기의 혼합물 또는 프라이머의 모든 위치)를 사용함으로써, 셔플링과 무작위 돌연변이의 조합된 사용에 대한 특정한 신규한 가능성이 제공된다.
상대적으로 제한된 상동성을 나타내는 폴리뉴클레오티드의 시험관내 재조합을 얻기 위해서는 때로 어려움이 있다. 본 발명의 구체예를 사용함으로써 아주 다양한 폴리뉴클레오티드도 재조합될 수 있다.
구체예에 따르면, 최소한 두 개의 주형 (또는 다양한 주형의 두 개의 푸울)이 적용된다. 그러면 한 개의 폴리뉴클레오티드의 신규한 합성은 단지 하나의 가닥 (즉 센스 또는 안티-센스 가닥)만을 토대로 하여 이루어질 수 있고, 다른 폴리뉴클레오티드의 합성도 반대 가닥을 토대로 하여 이루어질 수 있다.
이것은 두 개의 주형으로부터 상보하는 가닥을 단리함으로써, 예컨대 비오틴에 의해 표지된 이들 가닥을 취함으로써 이루어질 수 있다. DNA 의 합성은 특이한, 부분적으로 무작위한 또는 완전히 무작위한 프라이머를 이들 주형에 아닐링하고 적당한 중합효소를 첨가함으로써 개시된다. 이것은 상이한 주형에 대한 별도의 반응으로서 또는 바로 그 하나의 반응안에서 수행될 수 있다. 합성은 바람직하게는 상대적으로 짧은 새로운 단편들의 생성을 우선적으로 가능하게 하는 조건하에서 수행되어야 한다. 이들 단편들은 계속해서 친화성 표지를 바탕으로 주형으로부터 단리될 수 있다. PCR 반응은 이들 단편상에서 수행되며, 출발 물질로서 두 개의 상이한 가닥으로부터 기원하고, 새롭게 합성된 단편들은 전체 길이의 PCR 생성물을 생성하기 위하여 재조합되어야 한다 - 강요된 재조합의 종류.
또한 이런 구체예를 위하여 짧거나 또는 전혀 연장되지 않은 시간이 소요되는 신속한 PCR 이 제조합을 증강시키기 위하여, 특히 만약 주형의 푸울이 두 개의 가닥에 대해 사용되는 경우에 유익하게 적용될 수 있다.
방법에 사용되는 프라이머의 길이와 아닐링 온도는, 무작위 프라이머가 아닐링되는지의 여부와 수용될 수 있는 주형과 프라이머사이의 미스매치의 수를 결정한다. 프라이머 길이와 아닐링 온도를 달리함으로써, 본 발명의 방법은 프라이머의 길이를 나타내는 특정 뉴클레오티드 윈도우내에서 무작위 돌연변이를 이루기 위한 수단을 제공한다. 그로써 본 발명의 방법은 다른 무작위 돌연변이 접근법에 비교하여 실질적인 이익, 특히 일차 서열에서 상호 밀접하게 여러개의 염기 치환의 높은 가능성을 제공할 것이다. 예컨대 주어진 실험 조건하에서 이론에 따를 완전히 무작위의 20 량체 (모두 20 곳의 위치에서 모든 네 개의 뉴클레오티드의 혼합물)의 사용으로 상호 밀접하게 여러 개의 염기가 치환될 특정한 타당하게 높은 가능성이 제공된다.
에러-프론 PCR (= 높은 돌연변이 빈도의 PCR)은 이런 가능성을 제공하지 않는다. 에러-프론 PCR 은 하나의 코돈 (번역된 폴리펩티드의 하나의 아미노산을 코드함)내에서 하나 이상의 염기 치환을 가지는 것에 대해 매우 낮은 가능성만을 제공한다.
명백하게 코돈 내에서의 단지 하나의 염기만의 치환은 DNA 수준에서 하나의 염기 치환에 의해 얻을 수 있는 단지 하나의 제한된 아미노산 치환 세트로서 전체적인 무작위 돌연변이생성 (단백질 수준에서)을 제공한다 (예컨대 ATG-코돈에 의해 코드화된 메티오닌은 시스테인을 코드화하는 TGT 또는 TGC-코돈이 되기 위해서는 3 개의 염기 치환을 필요로 한다).
그러므로 본 발명의 한 구체예에서, 방법은 6 내지 200 bp, 바람직하게는 10 내지 70 bp, 보다 바람직하게는 15 내지 40 bp 의 길이를 가지는 무작위 또는 반-무작위 프라이머를 사용함으로써 수행된다.
본 발명의 방법의 장점중 한 가지는 확고함 (robustness)이다. 일부의 구체예에서 완전한 길이의 주형의 일정한 존재는 PCR 로 인한 오염 문제를 피할 수 있는 추가의 장점을 제공한다. 나아가, 본 발명의 방법은 다른 언급된 방법들보다 손이 덜가는 훨씬 덜 노동적인 방법이며, 따라서 자동화에 대한 우수한 가능성을 제공한다.
PCR-프라이머:
PCR 프라이머는 당해 기술분야의 표준 설명에 따라 제조된다. 정상적으로 PCR 프라이머는 10 내지 75 염기쌍 (bp)의 길이이다. 그러나, 무작위 또는 반-무작위 프라이머를 사용하는 특정 구체예의 경우에는, 길이는 실질적으로 상기에서 언급된 것보다 더 길 수 있다.
PCR-반응:
만약 다른 언급이 없다면 본 발명에 따라 수행되는 PCR-반응은 당해 기술분야에 공지된 표준 프로토콜을 따라 수행된다.
용어 "PCR 단편의 단리" 는 단순히 PCR 단편을 함유하는 분취액에 이르기까지 넓은 용도로 사용되는 것으로 의도된다. 그러나 바람직하게는 PCR 단편은 프라이머의 나머지, 뉴클레오티드 주형, 등을 제거하는 정도로까지 단리된다.
발명의 한 구체예에서 DNA 단편(들)은 낮은, 중간의 또는 높은 무작위 돌연변이생성 빈도를 유발하는 조건하에서 제조된다.
낮은 돌연변이생성 빈도를 얻기 위해서는, (DNA 단편(들)을 포함하는) DNA 서열(들)이 표준 PCR 증폭 방법에 의해 제조될 수 있다 [미국 특허 제 4,683,202 호 또는 Sakai et al., (1988), Science 239, 487-491].
중간 또는 높은 돌연변이생성 빈도는 예를 들어 문헌에 설명되어 있는 바와 같이 뉴클레오티드의 잘못된 통합을 증가시키는 조건하에서 PCR 증폭을 수행함으로써 얻어질 수 있다 [Deshler, (1992), GATA 9(4), 103-106; Leung et al., (1989), Technique, Vol. 1, No. 1, 11-15].
또한 본 발명에 따르면 PCR 증폭을 (즉 이 구체예에 따르면 또한 DNA 단편 돌연변이도 포함) 적당한 물리적 또는 화학적 돌연변이유발제, 예컨대 전이, 전환, 역전, 스크램블링, 결실, 및/또는 삽입을 유도하는 제제를 사용하여 돌연변이생성 단계와 조합하는 것이 예상된다.
재조합 셔플된 서열로부터 재조합 단백질의 발현
본 발명의 두 번째 및 세 번째 측면에 따라 셔플된 서열에 의해 코드화된 재조합 단백질의 발현은, 당해 기술분야에 공지되어 있는 표준 발현 벡터 및 상응하는 발현 시스템을 사용함으로써 수행될 수 있다.
스크리닝 및 선택
본 발명에서 용어 "양성의 폴리펩티드 변이체"는 그 결과의 폴리펩티드 변이체가 상응하는 유입되는 DNA 서열로부터 생성될 수 있는 폴리펩티드와 비교할 때 개선된 기능적 성질을 소유하고 있음을 의미한다. 그러한 개선된 성질의 실예로는 예컨대 증강된 또는 저하된 생물학적 활성, 증가된 세척 성능, 열안정성, 산화 안정성, 기질 특이성, 항생물질 내성 등이 있다.
따라서, 양성 변이체를 확인하기 위해 사용되는 스크리닝 방법은 변화가 요구되는 문제의 폴리펩티드의 성질, 및 변화가 요구되는 방향에 따라 좌우된다. 원하는 생물학적 활성을 스크린 또는 선택하기 위한 많은 적당한 스크리닝 또는 선택 시스템이 당해 기술 분야에 설명되어 있다. 그것의 실예로는 다음과 같은 것들이 있다:
스트라우베르그 등은 칼슘-무관한 안정성을 가지고 있는 서브틸리신 변이체에 대한 스크리닝 시스템에 대해 설명하였다 [Strauberg et al., Biotechnology 13: 669-673 (1995)];
브리얀 등은 증강된 열안정성을 가지고 있는 단백질 분해효소에 대한 스크리닝 검정을 설명하였다 [Bryan et al., Proteins 1:326-334 (1986)]; 및
PCT-DK96/00322 호에는 세척 계면활성제에서 개선된 세척 성능을 가지고 있는 지방 분해효소에 대한 스크리닝 검정에 대해 설명되어 있다.
본 발명의 구체예는 재조합 단백질(들)의 스크리닝 또는 선택이 포함되어 있는데, 구체예에서는 식기-세척 또는 세탁용 세제에서 원하는 생물학적 활성이 성능을 보인다. 적당한 식기-세척 또는 세탁용 세제의 실예는 PCT-DK96/00322 호 및 WO 95/30011 에 개시되어 있다.
만약 예를 들어 문제의 폴리펩티드가 효소이고 원하는 개선된 기능성 성질이 세척 성능이라면, 스크리닝은 다음의 원리를 토대로 한 필터 검정을 사용함에 의해 편리하게 수행될 수 있다:
재조합 숙주 세포는 적당한 배지상에서 및 분비될 효소에 대한 적당한 조건하에서 인큐베이트되며, 이 때 배지에는 첫 번째 단백질-결합 필터와 그 위에 있는 낮은 단백질 결합 용량을 나타내는 두 번째 필터로 이루어지는 이중 필터가 제공되어 있다. 재조합 숙주 세포는 두 번째 필터위에 위치한다. 인큐베이션에 이어서, 재조합 숙주로부터 분비된 효소를 포함하고 있는 첫 번째 필터가 상기 세포를 포함하고 있는 두 번째 필터로부터 분리된다. 첫 번째 필터에 대해서는 원하는 효소 활성에 대해 스크리닝이 수행되고, 두 번째 필터위에 존재하는 상응하는 미생물 콜로니가 확인된다.
효소적 활성에 결합하기 위해 사용된 필터는 어떠한 단백질 결합 필터, 예컨대 나일론 또는 니트로셀룰로오스일 수 있다. 발현 유기체의 콜로니들을 포함하고 있는 상부-필터는 결합 단백질에 대한 친화성이 전혀 없거나 낮은 모든 필터일 수 있으며, 예컨대 셀룰로오스 아세테이트 또는 듀라포아 (Durapore) 이다. 필터는 스크리닝을 위해 사용될 조건들중 어느 것으로도 예비-처리될 수 있으며, 또는 효소 활성을 검출하는 중에 처리될 수도 있다.
효소 활성은 염료, 형광, 침전, pH 지시자, IR-흡광도 또는 효소 활성의 검출을 위한 어떠한 다른 공지된 기법에 의해 검출될 수 있다.
검출 화합물은 어떠한 고정화제, 예컨대 아가로오스, 아가, 젤라틴, 폴리아크릴아미드, 전분, 필터지, 의류일 수 있으며; 또는 상기 고정화제의 어떠한 조합이든지 사용될 수 있다.
만약 폴리펩티드의 개선된 기능성 성질이 한 사이클의 셔플링 후에 충분히 양호하지 않다면, 폴리펩티드에 대해 다른 사이클이 수행될 수 있다.
동일한 유전자의 많은 돌연변이를 나타내는 상동 폴리뉴클레오티드가 주형으로서 사용되는 본 발명의 구체예에서, 최소한 하나의 셔플링 사이클은 야생형 DNA 단편인 초기에 사용된 DNA 단편과 여교배하는 사이클이다. 이것으로 비-필수 골연변이가 제거된다. 비-필수 돌연변이는 또한 초기에 사용된 유입되는 DNA 물질로서 야생형 DNA 단편을 사용함으로써 제거될 수 있다.
또한 본 발명내에서 예상되는 것은 생물학적 활성을 가지고 있는 폴리펩티드, 예를 들면 인슐린, ACTH, 글루카곤, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 티모신, 부갑상선 호르몬, 하수체 호르몬, 소마토메딘, 에리트로포이에틴, 황체형성 호르몬, 융모막의 고나도트로핀, 시상하부 방출인자, 항이뇨성 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 렐락신, 인터페론, 트롬보포이에틴 (TPO) 및 프로락틴이다.
셔플링될 폴리펩티드(들)을 코드화하는 출발 모 DNA 서열에 대한 요구조건은 그것들이 최소한 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 또는 95 % 의 상동성을 가지고 있어야 하는 것이다. 상동성이 적은 DNA 서열들이 상호작용하여 재조합될 경향이 적을 것이다.
또한 본 발명에 따르면 상기 언급된 바와 같이 상이한 속의 야생형 유기체로부터 기원하는 상기 언급된 것과 상동성인 모 폴리뉴클레오티드가 셔플링되는 것이 예상된다.
나아가, 셔플링될 출발 모 주형은 약 50 bp 내지 20 kb, 바람직하게는 약 100 bp 내지 10 kb, 보다 바람직하게는 약 200 bp 내지 7 kb, 특히 약 400 bp 내지 2 kb 의 길이를 가질 것이다.
출발하는 모 DNA 서열은 야생형 DNA 서열, 변이체 또는 돌연변이체를 코드화하는 DNA 서열, 또는 그것들의 변형물, 예컨대 연장된 또는 신장된 DNA 서열을 포함한 모든 DNA 서열일 수 있으며, 또한 본 발명의 방법 또는 다른 어떠한 방법 (예컨대 선행 기술 부분에서 설명된 방법들중 하나)을 따라 하나 또는 그 이상의 셔플링 사이클이 수행되는 DNA 서열의 결과(즉, 생산 DNA서열)일 수 있다.
본 발명의 방법을 사용할 때, 그 결과의 재조합된 상동 폴리뉴클레오티드 (즉 셔플링된 DNA 서열)는 교환된 많은 뉴클레오티드 단편들을 가지고 있다. 이것은 만약 모 폴리펩티드와 비교한다면, 폴리펩티드 변이체내에서 최소한 하나의 아미노산의 교체를 유발한다. 또한 사일런트 (silent) 교환 (즉 아미노산 서열의 변화를 유발하지 않는 뉴클레오티드 교환)이 예상되는 것으로 여겨진다.
재료 및 방법
본 실시예에서 사용되는 구체적인 방법:
A) 동일한 유전자 또는 상동성 유전자들에 의해 코드화된 동일한 유형의 활성을 가지는 상이한 효소들의 상이한 효소 변이체를 코드화하는 DNA 가 혼합된다. DNA 는 PCR 단편, 플라스미드, 파지 또는 게놈 DNA 중 어느 하나로서 제공된다.
B) 그 결과의 DNA 의 푸울은 DNA 중합효소, dNTP, 적당한 완충제 및 프라이머 (무작위 올리고머 (6 내지 30 뉴클레오티드의 길이) 또는 특정 올리고머 (6 내지 50 뉴클레오티드의 길이) 또는 두가지 유형의 조합이다)와 혼합된다.
C) PCR 혼합물은 적당한 튜브에 담겨져 PCR 써모사이클러 (저온 또는 고온)에 넣어진다.
c1) 써모사이클러는 DNA 주형을 변성시키기 위하여 일정 기간동안 (전형적으로 1 내지 10 분) 90 내지 100 ℃ 의 온도로 가열된다.
c2) 그런 다음 다음의 과정 (사이클)이 계속된다 (반복된다): 주형은 변성된다 (전형적으로 90 내지 100 ℃ 에서 0 내지 5 분동안). 그런 다음 온도가 저하되어 (전형적으로 10 ℃ 와 90 ℃ 사이의 온도로 0 내지 5 분동안) 프라이머가 단일 가닥의 주형에 아닐링되는 것이 가능해진다. 온도는 다시 변성 온도 (90 내지 100 ℃)로 상승되어 프라이머의 작은 연장부가 램핑 (ramping)중에 DNA 중합효소에 의해 합성되는 것이 가능해진다. 또는 달리, 짧은 연장 기간 (전형적으로 70 내지 75 ℃ 에서 0 내지 30 초동안)이 도입되어 프라이머의 더 긴 연장부가 생성되는 것이 가능해진다. 온도가 변성이 일어나는 값에 도달하면, 연장된 프라이머 및 주형들은 다시 분리된다. 이 과정은 반복될 수 있다 (전형적으로 1 내지 99 사이클).
D) 원하는 횟수의 사이클을 수행함으로써 생성된 작은 DNA 중합체들이 프라이머로서 사용된 올리고머로부터 정제될 수 있다. 한가지 방법은 관심의 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 함유하고 있는 특정한 증폭된 밴드를 단리하고 적당한 벡터안에 클론하는 것이다. 이것은 아가로오스 겔 상에서 (전형적으로 50 내지 1000 염기쌍사이의 단편들을 분리함) 비이드에 의해 (주형 또는 프라이머중 어느 하나에대한 친화성 표지를 사용하여) 또는 칼럼을 통하여 이루어질 수 있다.
E) 그런 다음 정제된 (또는 정제되지 않은) DNA 중합체는 표준 PCR 반응으로 어셈블링될 수 있다 (예를 들어 94 ℃, 5 분, (94 ℃, 30 초; 55 ℃, 30 초; 72 ℃, 2 분)*25, 72 ℃, 5 분, 4 ℃).
특이한 프라이머들에 의해 생성된 특이한 프라이머 또는 DNA 중합체들은 관심의 유전자를 함유하고 있는 특이한 DNA 중합체를 생성하기 위하여 첨가될 수 있다. 이것은 D) 에서 언급된 바와 같이, 이 DNA 중합체는 정제되고 관심의 벡터안에 클론될 수 있다.
실시예 1
방법 1
본 실시예에서 예시되는 방법의 큰 장점은 모 주형의 일정한 존재로 인한 확고함 및 PCR 오염 문제가 없다는 것이다. 나아가, 이 방법은 선행 기술에서 설명된 방법들보다 노동적인 요구가 적으며, 따라서 자동화에 대한 우수한 가능성을 제공한다.
H. lanuginosa 의 지방 분해효소 유전자의 9 개의 상이한 변이체를 코드화하는 DNA 서열을 함유하고 있는 9 개의 상이한 플라스미드를 등몰량으로 혼합하였다. 변이체 유전자는 유전자 전체를 통하여 흩어져 있는 2 내지 7 개의 돌연변이를 함유하고 있었다.
H. lanuginosa 의 지방 분해효소 유전자의 DNA 서열 및 지방 분해효소의 아미노산 서열은 EP O 305 216 호에 개시되어 있다.
변이체들을 EP O 396 608 호 및 WO 97/07202 호에 설명되어 있는 바와 같이 표준 명명법에 따라 나타낸다.
다음의 9 개의 변이체 유전자들을 셔플링하였다:
1'. N94K + D96L + E99K
2'. SPPRRP + N94K + D96L + T231R + N233R + D234R + Q249R
3'. SPPRRP + A19C + C36A + N94K + D96L + Q249R
4'. STPRRP + N94R
5'. SCIRR + N94K + D96L + E239C + Q249R
6'. D137G + D167G + E210V
7'. D96L + E99K + V187A
8'. SPPRRP + D57G + N94K + D96L + Q249R
9'. N94R + F95L
다음의 성분들을 마이크로튜브안에서 혼합하였다:
2 ㎕ 의 플라스미드 혼합물 (0.15 ㎍/㎕), 유전자 플랭킹의 특이한 프라이머 (1 pmol/㎕), 2 ㎕ 의 2.5 mM dNTP, 2.5 mM 의 MgCl2, 2 ㎕ 의 10*taq 완충제 (Perkin Elmer), 0.5 ㎕ 의 taq 효소, 총 부피는 20 ㎕ 이다.
튜브를 퍼어킨 엘머 2400 써모사이클러에 세팅하였다. 다음의 PCR-프로그램을 작동시켰다: (94 ℃, 5 분) 1 사이클: (94 ℃, 30 초, 70 ℃, 0 초) 99 사이클 (72 ℃, 2 분, 4 ℃ 정하지 않음) 1 사이클.
PCR-반응을 1.5 % 아가로오스 겔 상에서 작동시켰다. 특이한 예상되는 크기의 DNA-밴드를 아가로오스 겔로부터 잘라내어 JETsorb (GENOMED Inc. 로부터 구입)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR-생성물을 TA-벡터 (Invitrogen 으로부터 구입, 원래의 TA 클로닝 키트)안에 클론하였다. 결찰된 생성물을 표준 대장균 스트레인 (DH5a)에 형질전환시켰다.
20 개의 형질전환체를 관심의 유전자를 가로질러 완전히 서열화하였다.
결과:
다음의 20 개의 변이체를 발견하였다:
1. D137G + D167G + E210V + Y213C
2. SPPRRP + D57G + N94K + D96L + Q249R
3. N94R + F95L
4. SPPRRP + D137G + D167G + E210V
5. N94K + D96L + E99K + V187A + T267I
6. D137G + D167G + E210V
7. N94K + D96L + E99K + V187A
8. D57G + N94R + F95L + Q249R
9. N94K + D96L + E99K + E210V
10. SPPRRP + A19C + C36A + N94K + D96L
11. N94R + F95L
12. D137G + D167G + E210V
13. N94K + D96L + Q249R
14. SPPRRP + Q15P + A19C + C36A + N94K + D96L
15. SPPRRP + N94K + D96L + T231R + N233R + D234R + Q249R
16. D137G + D167G + E210V
17. SCIRR + N94K + D96L + Q249R
18. N94K + D96L + E99K
19. N94R + F95L
20. SPPRRP + N94R + F95L + F113S + Q249R
표시된 것들중 거의 모든 (20 개중 19 개) 돌연변이들이 특이한 주형에 대한 편향을 거의 나타내지 않았다.
통계학:
셔플링되지 않음 최소한 2 개의 주형 사이에서 셔플링됨 최소한 3 개의 주형 사이에서 셔플링됨 10 8 2
그런 다음 셔플링된 서열들을 대장균 TA 벡터로부터 효모 벡터 pJS026 안으로 BamHI-XbaI 단편으로서 하위클론하였고 (WO 97/07205 호 참조), 예컨대 계면활성제에서의 개선된 성능을 가지고 있는 새로운 셔플링된 서열에 대해 스크린하였다 (WO 97/07205 호 참조).
실시예 2
방법 2:
10 개의 상이한 지방 분해효소 변이체 유전자들의 PCR 생성물을 상기와 같이 제조하고 등몰량으로 모았다.
다음의 10 개의 돌연변이 유전자를 셔플링하였다:
1'. D137G + D167G + E210V
2'. D96L + E99K + V187A
3'. N94K + D96L + E99K
4'. SPPRRP + D57G + N94K + D96L + Q249R
5'. D111N + F211A + G225P
6'. SPPRRP + N94K + D96L + T231R + N233R + D234R + Q249R
7'. SPPRRP + A19C + C36A + N94K + D96L + Q249R
8'. STPRRP + N94R
9'. N94R + F95L
10'. SCIRR + N94K + D96L + E239C + Q249R
다음의 혼합물을 적당한 튜브에서 만들었다:
1 ㎕ 의 PCR 혼합물 (0.1 ㎍), 10-량체의 무작위 프라이머 (300 pmol), 2 ㎕ 의 10*클레노우 완충제 (Promega), 0.25 mM 의 dNTP, 2.5 mM 의 MgCl2, 총 부피는 20 ㎕.
혼합물을 PE2400 써모사이클러에 세팅시키고 다음의 프로그램을 작동시켰다: 96 ℃ 5 분, 25 ℃ 5 분, 0.5 ml 의 클레노우 효소를 첨가하고 25 ℃ 60 분, 35 ℃ 90 분.
이 과정으로 유전자의 모든 부분으로부터 기원하는 매우 많은 작은 DNA 중합체들이 생성되었다.
10 ㎕ 를 시험을 위하여 취하여 아가로오스 겔 상에 놓았다.
10 ㎕ 의 PCR 혼합물 (0.25 mM 의 dNTP, 1 ㎕ 의 10*Taq 완충제 (Perkin Elmer), 2.5 mM 의 MgCl2, 0.5 ㎕ 의 Taq 효소)을 써모사이클러의 튜브에 담겨있는 10 ㎕ 에 첨가한 다음 다음의 표준 PCR-프로그램을 작동시켰다: (94 ℃, 5 분) 1 사이클, (94 ℃ 30 초, 45 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초) 25 사이클, 72 ℃ 7 분, 4 ℃ 정하지 않음.
PCR 생성물을 1.5 % 의 아가로오스 겔 상에서 작동시켰다. 명백한 편향되지 않은 얼룩을 볼 수 있었다. 400 bp 와 800 bp 사이의 DNA 를 겔로부터 단리하였다.
정제된 PCR 생성물의 절반을 튜브안에서 관심의 유전자 플랭킹에 있는 두 개의 특이한 프라이머 (40 pmol), 0.25 mM 의 dNTP, 2 ㎕ 의 10*Taq 완충제, 2.5 mM 의 MgCl2와 혼합하였다. 그런 다음 다음의 표준 PCR-프로그램을 작동시켰다: (94 ℃, 5 분) 1 사이클: (94 ℃ 30 초, 50 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초) 25 사이클, 72 ℃ 7 분, 4 ℃ 정하지 않음.
PCR 생성물을 1.5 % 아가로오스 겔 상에서 작동시켰다. 예상된 크기의 특이하지만 약한 밴드를 단리하였다. 추가의 PCR 을 클로닝전에 PCR-생성물을 증폭시키기 위하여 특이한 프라이머 (상기에서 언급된 바와 같음)를 사용하여 작동시켰다.
PCR-생성물과 원하는 벡터를 적절한 제한 효소 (BamHI/XhoI)로 절단하였다. 벡터와 PCR 생성물을 1.5 % 의 아가로오스 겔 상에서 작동시키고, 겔로부터 정제하였다.
절단된 PCR-생성물과 절단된 벡터를 결찰 효소 완충액중에서 T4 결찰 효소 (Promega)와 혼합하였다. 혼합물을 밤새 16 ℃ 에서 결찰되도록 방치한 후 대장균 스트레인 DH5a 안에 형질전환하였다.
19 개의 클론을 유전자를 가로질러 완전히 서열화하였다.
결과:
다음의 19 개의 변이체를 발견하였다:
1. STPRRP + N94R + N233R + D234R + Q249R
2. SPPRRP + N233R + D234R + Q249R
3. D96L + D167G + Q249R
4. N94R
5. D167G
6. SPPRRP + A19C + A28T + N94K + D96L + D111N + E239C
7. SPPRRP + A19C + C36A + N94K + D96L + Q249R
8. N94K + D96L
9. N25T + D57G + N94R + E99K + D167G + T231R + N233R + D234R + Q249R
10. N94R + Q249R
11. D167G
12. D167G
13. T32I + N94R + F95L + D167G + Q249R
14. E87K + N94K + D96L
15. N94R + F95L + Q249R
16. N94K + D96L + D111N
17. STPRRP + S17T
18. N94K + D96L + V187A
19. SPPRRP + D57G + N94K + D96L + D111N + L151S
모든 주형 변이체들은 특이한 주형에 대한 편향을 거의 보이지 않는 것으로 나타났다.
돌연변이 변화와 관련하여 외관상 나타나는 고온 반점은 없었고, 유전자를 따라 골고루 분포된 것으로 여겨진다.
통계학 :
셔플링되지 않음 최소한 2 개의 주형 사이에서 셔플링됨 최소한 3 개의 주형 사이에서 셔플링됨 최소한 4 개의 주형 사이에서 셔플링됨 최소한 5 개의 주형 사이에서 셔플링됨 최소한 6 개의 주형 사이에서 셔플링됨 1 10 6 1 0 1
그런 다음 셔플링된 서열들을 대장균 TA 벡터로부터 효모 벡터 pJS026 안으로 BamHI-XbaI 단편으로서 하위클론하였고 (WO 97/07205 호 참조), 예컨대 계면활성제에서의 개선된 성능을 가지고 있는 새로운 셔플링된 서열에 대해 스크린하였다 (WO 97/07205 호 참조).
실시예 3
아밀라아제 변이체 셔플링:
실시예 1 에서 H. lanuginosa 지방 분해효소의 많은 다중 변이체들이 어떻게 셔플링되었는지에 대해 알 수 있었다. 유사한 방식으로, 바실루스의 α-아밀라아제의 변이체들을 셔플링할 수 있다.
보다 앞선 특허 출원들은 바실루스 종으로부터 얻어진 다양한 α-아밀라아제의 변이체들이 특정 성질, 예컨대 열안정성, 칼슘-고갈된 조건하에서의 안정성, 개선된 세척-성능 등이 개선되었음을 확인한 바 있다 (WO 95/10603, WO 96/23874, WO 96/23873, 및 PCT/DK97/00197 참조).
바실루스 리케니포르미스 α-아밀라아제 amyL 의 변이체들을 다음과 같이 셔플링하였다. 변이체들은 모두 WO 95/10603 호에 설명되어 있는 고초균 발현 벡터 pDN1528 에 위치한다.
실험을 실시예 1 과 정확하게 동일한 조건하에서 수행하되, 단 DNA 합성을 개시하기 위하여 플랭킹의 27-량체 프라이머를 사용한 것이 상이하였다.
대략 1500 bp 의 PCR 증폭된 밴드를 아가로오스 겔로부터 정제하고 실시예 1 에서 설명된 바왁 같이 클론하였다. 또는 다르게, amyL 유전자내에 위치한 제한 부위들을 활용하여, 바실루스 플라스미드 pDN1528 또는 야생형 amyL 유전자를 함유하고 있는 대장균 벡터, 예컨대 WO 96/23874 에 설명되어 있는 pJeEN1 안에 셔플링된 유전자들의 라이브러리를 클론하였다.
실시예 4:
상동성 α-아밀라아제를 코드화하는 두 개의 유전자의 셔플링:
SEQ ID no. 2 (아미노산) 및 SEQ ID no. 5 (DNA) 에 의해 확인된 amyL 과 아밀라아제는 WO 96/23873 호에 설명되어 있다.
amyL 의 전방 가닥 (mRNA 와 동일함)을 표준 조건을 사용하여 PCR 로 증폭시킬 수 있었다.
전방 가닥을 스트렙트아비딘으로 코팅된 자기 비이드에 대한 친화성을 토대로 하여 역 가닥으로부터 분리하고, 두 개의 가닥을 NaOH 로 변성시켰다. 유사하게, SEQ ID no. 5 (WO 96/23873) 에 의해 코드화된 아밀라아제의 역 가닥 (mRNA 에 상보하는)을 증폭시키고 단리하였다.
두 개의 프라이머를 PCR 에서 주형으로서 사용하였다: (94 ℃ 5 분) + 99 사이클의 (94 ℃, 30 초; 60 ℃, 0 초) + (72 ℃, 5 분). 실시예 1 에서 설명된 바와 같이 다양한 길이의 무작위 프라이머들, Taq 중합효소 및 표준 완충 조건을 사용함.
그 결과 얻어진 대략 1500 bp 의 생성물을 실시예 1 에서 설명된 바와 같이 (그 결과의 클론의 서열의 증명을 위하여) TA 클로닝으로서 클론하거나, 또는 바실루스 벡터, pTVB110 안에 SfiI 및 PstI 제한 부위를 사용하여 클론하였다.
원래의 주형은 비오틴 꼬리를 토대로 하여 어느 단계에서든지 (예컨대 5, 10 또는 20 사이클 후에) PCR 로부터 제거될 수 있다.

Claims (27)

  1. 많은 상이한 출발 단일 또는 이중 가닥의 모 DNA 주형 및 프라이머로부터, 중합효소를 사용하는 시험관내 폴리뉴클레오티드 합성중에 유도된 주형 쉬프트에 의하여, 재조합된 상동성 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 제조하는 방법으로서,
    A. a) 이중 가닥의 모 DNA 주형이 변성되어 단일 가닥의 주형이 생성되고,
    b) 상기 프라이머가 단일 가닥의 DNA 주형에 아닐링되고,
    c) 상기 중합효소를 사용함에 의해 합성이 개시됨으로써 상기 프라이머가 연장되고,
    d) 합성 중단이 유발되고, 그리고
    e) 이중 가닥이 변성되어 연장된 프라이머가 주형으로부터 분리됨으로써
    연장된 프라이머 또는 폴리뉴클레오티드가 합성되고;
    B. a) 새롭게 합성된 단일 가닥의 연장된 프라이머가 주형으로부터 분리되고 상기 (A) 에서 생성된 연장된 프라이머가 프라이머와 주형 두가지로서 사용되어 단계 A.b) 내지 A.e) 가 반복되거나, 또는
    b) 단계 A.b) 내지 A.e) 가 반복됨으로써
    주형 쉬프트가 유도되며;
    C. 단계 A. 와 B.a), A. 와 B.b), 또는 이것들의 조합 단계의 과정이 적당한 횟수만큼 진행된 후 과정이 종결되고, 그리고
    D. 선택적으로, 생성된 폴리뉴클레오티드는 관심의 상동성 폴리뉴클레오티드를 선택적으로 증폭시키기 위한 특이한 프라이머를 사용하여 표준 PCR 반응으로 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 중합효소가 Taq, Amplitaq, Vent, Pwo 와 같은 열 안정성 DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 중합효소가 T4 중합효소, T7 중합효소, 대장균 DNA 중합효소 I 또는 DNA 중합효소 I 의 클레노우 단편과 같은 DNA 중합효소이고, 상기 중합효소는 각 사이클 후에 반응 혼합물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 중합효소가 RNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합효소가 HIV 역전사효소와 같은 역전사효소와 같은 에러-프론 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 출발 단일 또는 이중 가닥의 모 주형이 그것들이 동일한 천연 폴리뉴클레오티드 (유전자) 에 상이한 점 돌연변이를 함유하고 있거나, 또는 그것들이 천연으로부터 단리된 상동성 폴리뉴클레오티드 (유전자들)인 점에서 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 출발 단일 또는 이중 가닥의 모 주형이 DNA 수준에서 95 % 이상, 90 % 이상, 85 % 이상, 80 % 이상, 75 % 이상, 70 % 이상, 65 % 이상, 60 % 이상, 55 % 이상, 또는 심지어는 50 % 이상의 동일성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서, 단계 A.d) 에서의 중합효소 반응의 억제가 온도를 상승시킴에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 온도는 90 ℃ 내지 99 ℃ 사이의 온도, 바람직하게는 94 ℃ 의 온도로 상승되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서, 단계 1.d 에서의 중합효소 반응의 억제가 DMSO 와 같은 특정 시약을 첨가함으로써 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머들이 완전 무작위 프라이머들의 집합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머들이 반-무작위 프라이머들의 집합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머들이 특이한 프라이머들의 집합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머들이 바람직하게는 비오틴 또는 디곡시게닌으로 표지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 11 항, 제 12 항 또는 제 14 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 무작위 또는 반-무작위 프라이머들이 6 내지 500 bp, 바람직하게는 15 내지 300 bp, 보다 바람직하게는 25 내지 150 bp 의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 프라이머들이 6 내지 75 bp 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 출발 모 DNA 주형이 최소한 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 또는 95 % 상동성인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 출발 모 DNA 주형이 상이한 속의 야생형 유기체로부터 기원하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 출발 모 주형이 약 50 bp 내지 20 kb, 바람직하게는 약 100 bp 내지 10 kb, 보다 바람직하게는 약 200 bp 내지 7 kb, 가장 바람직하게는 약 400 bp 내지 2 kb 의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1 항 내지 제 19 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 출발 모 주형이 PCR 반응에 의하여 생성된 선형 DNA 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 출발 모 주형이 플라스미드와 같은 적당한 벡터안에 클론되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 출발 모 주형이 카르보닐 하이드롤라아제, 카르보하이드라아제, 또는 에스테라아제, 예컨대 프로테아제, 리파제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 산화효소, 산화환원 효소 등과 같은 효소를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 21 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 출발 모 주형이 생물학적 활성을 가지고 있는 폴리펩티드, 예컨대 인슐린, ACTH, 글루카곤, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 티모신, 부갑상선 호르몬, 하수체 호르몬, 소마토메딘, 에리트로포이에틴, 황체형성 호르몬, 융모막 고나도트로핀, 시상하부 방출 인자, 항이뇨성 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 렐락신, 인터페론, 트롬보포이에틴 (TPO) 및 프로락틴을 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 21 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 출발 모 주형이 전사 개시 (프로모터) 또는 종결, 번역 개시, 유전자의 발현과 관련된 오퍼레이터 부위와 같은 생물학적 기능을 함유하고 있는 폴리뉴클레오티드를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이클의 횟수가 500 미만, 200 미만, 또는 100 미만의 사이클인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 동일한 활성을 가지고 있는 자연 발생적인 또는 다른 공지의 폴리펩티드와 비교하여 개선된 성질을 나타내는 관심의 폴리펩티드를 확인하는 방법으로서,
    제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 생성된 재조합된 상동성 폴리뉴클레오티드의 라이브러리가 적절한 벡터에 클론되고, 상기 벡터는 상응하는 폴리펩티드로 발현되어 나타낼 적당한 숙주 시스템안에 형질전환되고, 상기 폴리펩티드는 적당한 검정법으로 스크린되고, 양성의 폴리펩티드가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 따라 확인된 관심의 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서,
    상기 확인된 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있는 벡터가 적당한 숙주안으로 형질전환되고, 상기 숙주가 성장하여 상기 폴리펩티드를 발현하고, 폴리펩티드가 회수되어 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1019997008465A 1997-03-18 1998-03-18 Ｄｎａ 라이브러리를 제조하기 위한 시험관내 방법 KR20000076363A (ko)

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