CN102560688B - 一种新的基于illumina测序平台的文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的基于illumina测序平台的文库构建方法，特别是小片段DNA文库构建方法，针对现有illumina测序平台的小片段DNA建库的上述缺陷，能够减少纯化步骤，降低文库的损失和浪费，减低成本，提高劳动效率。
Description
技术领域
本发明涉及基因组测序，特别是高通量基因组测序领域。更特别地本发明的方法涉及基于illumina测序平台的文库构建方法，特别是小片段文库的构建方法。
背景技术
脱氧核糖核酸(DNA)是两条核苷酸链以互补配对原则所构成的双螺旋结构的分子化合物，它是生命遗传信息的载体。对DNA核苷酸序列的测序分析不仅为基因表达、基因调控等生物学基础研究提供重要数据，而且在疾病诊断学、基因治疗等应用研究领域起着重要的作用[Gilbert W.DNA sequencing and gene structure.In：Forsén S.Nobel Lectures in Chemistry 1971-1980.1980.Singapore：WorldScientific Publishing Co，1993，408-426.Sanger F，Coulson A R.Arapid method for determining sequences in DNA by primed synthesiswith DNA polymerase[J].J Mol Biol，1975，94：441-448.]。DNA测序技术从早期Frederick Sanger的手工测序和基于Sanger法而开发的第一代自动化测序仪，到目前的广泛应用的第二代高通量测序平台，这一领域已经产生了质的飞跃[周晓光，任鲁风，李云涛等.下一代测序技术：技术回顾与展望[J].中国科学.2010，40(1)，23-37。Li RQ，Fanw，Tian g，et al，.The sequence and de novo assembly of the giantpanda genome[J].Nature，2010，463，311-317]。以边合成边测序技术和可逆阻断技术为基础的第二代高通量illumina测序平台避免了像传统Sanger法测序技术那样需要耗费大量的人力和物力，并具有测序通量高、准确度高和成本低的众多优点，该平台广泛应用于：全基因组测序，新物种测序，目标基因组测序，转录组和表观遗传分析等领域。
illumina测序平台的测序流程主要分为以下四个步骤[Illumina.Indexed paired-end sequencing user guide.]：1，文库制备；2，用ClusterStation对文库进行扩增；3，对成簇后的文库进行测序；4，数据处理和拼接。从测序的片段大小来分，illumina测序平台的文库分为小片段DNA的文库和大片段DNA的文库。本发明涉及内容主要为小片段文库的构建方法。
现有技术中小片段DNA的文库制备流程主要分为以下几个步骤：
I打断DNA到一定的片段大小，纯化；
II末端修复，纯化；
III在已修复的DNA片段的3’端加上一个“A”碱基，纯化；
IV用DNA连接酶将特异性接头连接至DNA片段的两端，纯化；
V加接头的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收一定大小的片段，纯化；
VI采用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA文库，纯化；
VII Agilent Bioanalyzer 2100和Q-PCR检测文库浓度及片段大小；
VIII使用illumina测序平台进行测序。
该制备流程图见图1。
随着第二代高通量illumina测序平台的广泛应用，以及多物种基因组测序和全基因组研究的大规模开展，降低测序成本，减少测序流程，提高劳动效率成为DNA测序技术的一个重要研究方向。在现有的illumina测序平台的小片段DNA建库流程步骤中，各个步骤都是独立制备，所以分别需要进行纯化的过程，以保证各个步骤之间不会互相干扰和污染。但是这也造成了DNA文库样品的在纯化过程中的不可避免的损失和浪费，并且存在操作过程繁琐，增加成本等缺点。因此，本领域需要新的小片段DNA建库流程以改进上述缺点。
发明内容
针对现有illumina测序平台的小片段DNA建库的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种新的illumina测序平台的文库构建方法和相关的试剂组合溶液，能够减少纯化步骤，降低文库的损失和浪费，减低成本，提高劳动效率。
本发明提供的illumina测序平台的文库构建新方法，见图3，包括以下步骤：
(1)将DNA打断至建库所需的DNA片段(200bp～800bp)，纯化，得到DNA片段。
(2)将(1)所得到的DNA片段与末端修复试剂混合，形成平末端的DNA片段，纯化，得到平末端DNA片段。
(3)将(2)所得到的平末端DNA片段与试剂I混合，得到3’端加“A”的DNA片段。
(4)将(3)所得到的3’端加“A”的DNA片段与试剂II以及接头混合，纯化，从而得到加接头的DNA片段。
(5)将(4)所得到的加接头的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收一定大小的片段；
(6)将(5)回收的到的片段采用PCR方法以扩增DNA文库，回收；
(7)将(6)所得到的PCR扩增产物采用Agilent Bioanalyzer 2100和Q-PCR检测文库浓度及片段大小；
(8)使用illumina测序平台进行测序。
所述步骤(1)中打断方式可以是超声波或者酶切的方式。
所述步骤(3)中试剂I的pH为7.6～7.9，溶剂是水，溶质为如下终浓度物质：10mM～100mM可溶性盐溶液，100mM～500mM缓冲盐溶液，10mM～50mM二硫苏糖醇，50～200mM MgCl2，5mM dATP，Klenow(3′-5′exo)酶。
所述步骤(3)中试剂I中缓冲盐溶液可以为Tris-HCl、磷酸盐等缓冲盐溶液。
所述步骤(3)中试剂I中可溶性盐溶液可以为氯化钠、氯化钾等溶液。DNA在一定浓度的氯化钠溶液中溶解度很高，Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐，这样能够使DNA溶解并且更加稳定。样品与试剂I混合必须在一定的温度下进行孵育，建议最适温度为12℃～40℃。
所述步骤(4)中试剂II的pH为7.6～7.9，溶剂是水，溶质为100mM～500mM缓冲盐溶液，MgCl2，10mM～50mM二硫苏糖醇，5～10mM ATP，T4DNA连接酶。
所述步骤(4)中试剂II中缓冲盐溶液可以为Tris-HCl、磷酸盐等缓冲盐溶液。
在步骤(4)中，ATP水解时可提供能量以催化DNA链的5′-PO4与另一DNA链的3′-OH生成磷酸二酯键。样品与试剂II混合必须在一定的温度下进行孵育，建议最适温度为4℃～22℃。
除上述具体描述的各个步骤内容外，未提及的其他步骤内容同现有技术中illumina测序平台的文库分为小片段DNA的文库的制备过程。
本发明的方法所制备的小片段DNA文库中，DNA片段大小和浓度与现有技术illumina测序平台的方法相当，参见实施例1。
本发明的小片段DNA的文库构建方法与现有技术illumina测序平台的方法相比较，在步骤4中减少了纯化过程，从而缩短实验时间，提高了劳动效率，并且降低成本；操作更加简便，提高了建库的成功率。
附图说明
图1.为基于illumina测序平台的小片段DNA建库流程。
图2.为Agilent Bioanalyzer 2100检测结果。
图3.为本发明的新illumina测序平台的文库构建方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
本发明一方面提供了一种基于illumina测序平台的文库构建方法，包括以下步骤：
(1)将DNA打断；
(2)将步骤(1)所得到的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；
(3)将步骤(2)所得到的平末端DNA片段与试剂I混合，得到3’端加“A”的DNA片段；
(4)将步骤(3)所得到的3’端加“A”的DNA片段与试剂II以及接头混合，纯化，从而得到加接头的DNA片段；
(5)将步骤(4)所得到的加接头的DNA产物回收；
(6)将步骤(5)回收的到的片段采用PCR方法以扩增DNA文库，回收；
其中所述步骤(3)中试剂I的pH为7.6～7.9优选的7.9，溶剂是水，溶质为如下终浓度物质：10mM～100mM，优选25mM～75mM，更优选50mM的可溶性盐溶液；10～300mM，优选50～200mM，更优选100mM的MgCl2；10mM～1000mM，优选50mM～500mM，更优选100mM的缓冲盐溶液；1mM～50mM，优选5mM～15mM，更优选10mM的二硫苏糖醇；1mM～10mM，优选2.5mM～7.5mM，更优选5mM的dATP，1U/ml～40U/ml，优选10U/ml～30U/ml，更优选20U/ml的Klenow(3′-5′exo)酶；
其中所述步骤(4)中试剂II的pH为7.6～7.9优选的7.6，溶剂是水，溶质为10～200mM，优选50～150mM，更优选100mM的缓冲盐溶液；1～100mM，优选10～90mM，更优选50mM的二硫苏糖醇；1～40mM，优选5～20mM，更优选10mM的ATP；10～400mM，优选50～200mM，更优选100mM的MgCl2；1U/ml～200U/ml，优选50U/ml～150U/ml，更优选72U/ml的DNA连接酶。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明的方法进一步包括步骤(7)：对步骤(6)所得到的PCR扩增产物检测文库浓度及片段大小；优选地采用Agilent Bioanalyzer 2100和Q-PCR检测文库浓度及片段大小。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明的方法进一步还包括步骤(8)：对PCR扩增产物进行测序，优选地使用illumina测序平台进行测序。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(1)中打断方式可以是超声波或者酶切的方式。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(1)中将DNA打断至建库所需的DNA片段，优选地打断至200bp～800bp的DNA片段。任选地，进一步包括纯化步骤，得到DNA片段。
在本发明的一个具体实施方式中，在步骤(2)通过如下方法进行末端修复：将步骤(1)所得到的DNA片段与末端修复试剂混合，形成平末端的DNA片段。任选地，进一步包括纯化步骤，得到平末端DNA片段。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(3)中试剂I中缓冲盐溶液可以为Tris-HCl、磷酸盐等缓冲盐溶液，优选是Tris-HCl。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(3)中试剂I中可溶性盐溶液可以为氯化钠、氯化钾等溶液，优选是氯化钠溶液。
在本发明的一个具体实施方式中，样品与试剂I混合在12℃～40℃的温度下进行孵育，优选的温度为37℃。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(4)中的接头包括为带有T碱基末端的任意接头，优选地是由如下正反两个序列组成的DNAIndex adapter：
DNA Index adapter F：
5-Phos/TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCAA；
DNA Index adapter R：
5-Phos/TTGGTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(4)中试剂II中缓冲盐溶液可以为Tris-HCl、磷酸盐等缓冲盐溶液，优选是Tris-HCl。
在本发明的一个具体实施方式中，样品与试剂II混合在4℃～22℃的温度下进行孵育，优选的温度为16℃。
在本发明的一个具体实施方式中，在步骤(5)中通过如下方法回收所得到的加接头的DNA产物：进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收一定大小的片段。
在本发明的一个具体实施方式中，步骤(5)中通过进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收一定大小的片段；切胶回收的片段大小是100-1000bp，例如200、400bp和800bp。
在本发明的一个具体实施方式中，步骤(6)中PCR方法所使用的引物是
Index Primer X：
5′CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCAATGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；
Primer 1.0：
5′AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。
在本发明另一方面中，本发明所述方法用于小片段DNA文库构建。
在本发明另一方面中提供了本发明所述方法构建的小片段DNA文库。
在本发明进一步的方面中，提供了一种试剂，其特征在于pH为7.6～7.9优选的7.9，溶剂是水，溶质为如下终浓度物质：10mM～100mM，优选25mM～75mM的，更优选50mM的可溶性盐溶液；10～300mM，优选50～200mM，更优选100mM的MgCl2；10mM～1000mM，优选50mM～500mM的，更优选100mM的缓冲盐溶液；1mM～50mM，优选5mM～15mM，更优选10mM的二硫苏糖醇；1mM～10mM，优选2.5mM～7.5mM，更优选5mM的dATP，1U/ml～40U/ml，优选10U/ml～30U/ml，更优选20U/ml Klenow(3′-5′exo)酶；所述试剂用作本发明所述方法中步骤(3)中的试剂I。其中所述缓冲盐溶液可以为Tris-HCl、磷酸盐等缓冲盐溶液，优选是Tris-HCl；其中所述可溶性盐溶液可以为氯化钠、氯化钾等溶液，优选是氯化钠溶液。
在本发明进一步的方面中，提供了一种试剂，其特征在于pH为7.6～7.9优选的7.6，溶剂是水，溶质为10～200mM，优选50～150mM，更优选100mM缓冲盐溶液；1～100mM，优选10～90mM，更优选50mM的二硫苏糖醇；1～40mM，优选5～20mM，更优选10mM的ATP；10～400mM，优选50～200mM，更优选100mM的MgCl2；1U/ml～200U/ml，优选50U/ml～150U/ml，更优选72U/ml DNA连接酶；所述试剂用作本发明所述方法中步骤(4)中的试剂II。其中所述缓冲盐溶液可以为Tris-HCl、磷酸盐等缓冲盐溶液，优选是Tris-HCl。
实施例
实施例一
1.1试剂
10×T4PNK buffer(Enzymatics)，dNTP(Enzymatics)，T4 DNApolymerase(Enzymatics)，T4PNK(Enzymatics)，Klenow Fragment(3’to 5’exo)(Enzymatics)，Klenow Fragment(Enzymatics)，10Xbluebuffer(Enzymatics)，DNA Ligase Buffer 10×(Enzymatics)，PhusionDNA polymerase(NEB)。
试剂I pH为7.9，溶剂是水，溶质为如下终浓度物质：50mM氯化钠溶液(国药集团化学试剂有限公司)，100mM Tris-HCl溶液(国药集团化学试剂有限公司)，100mM MgCl2(国药集团化学试剂有限公司)，10mM二硫苏糖醇(Sigma)，5mM dATP(Enzymatics)，20U/ml Klenow Fragment(3′-5′exo)。
试剂II pH为7.6，溶剂是水，溶质为如下终浓度物质：72U/ml T4DNA polymerase，10mM ATP，500mM Tris-HCl溶液，100mMMgCl2，50mM二硫苏糖醇；
1.2实验步骤
1.2.1吸取两份50ng/μl Fosmid样品(深圳华大基因研究院)各40μl置于Covaris样品管(Covaris公司)中，分别命名为X和Y，采用Covaris公司生产E210型号打断仪对样品进行打断，打断参数如下：
1.2.2打断后，用Agencourt公司的Ampure磁珠根据生产商的说明书回收纯化，最后每个样品分别溶于45ul超纯水中，取42ul进行后面的反应，将样品分别置于PCR管中。
1.2.3末端修复，将两份样品分别按照下面的表格配置反应体系：
在PCR仪上，20℃放置30min，Ampure磁珠纯化后，样品X，Y分别溶于20μl和32μl的超纯水中。
1.2.4加“A”，按照下表反应体系处理样品X和Y
反应温度：15℃～40℃，30min，将样品Y经过Ampure磁珠纯化后溶于37μl超纯水中。
1.2.5加“接头”(也称为“Adaptor”)
反应温度：16℃，过夜连接14-18h，加完接头后用Ampure磁珠进行纯化，超纯水溶解洗脱。
注：DNA Index adapter由如下正反两个序列组成：
DNA Index adapter F：
5-Phos/TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCAA；
DNA Index adapter R：
5-Phos/TTGGTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC。
1.2.6PCR反应
注：Index Primer X：
5′CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCAATGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；
Primer 1.0：
5′AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。
在PCR仪中运行下列程序：
98℃ 30s
72℃ 5min
4℃ ∞
然后再将样品分别纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳(2％)，并切胶回收400bp和800bp的片段，溶于30ul超纯水中。Q-PCR检测结果如下表：
样品X和Y的Q-PCR检测结果
从上表中数据可知，样品X(即本发明方法制备的样品)与样品Y(即现有技术中illumina测序平台的方法制备的样品)所得到的的相同DNA片段浓度相对比，二者没有显著差别。
实施例二
2.1试剂
10×blue buffer(Enzymatics)，pUC18DNA(Takara)。
试剂I同实施例一的1.1项所述的试剂I。
试剂II pH为7.6，溶剂是水，溶质为T4DNA连接酶(Enzymatics)，ATP(NEB)，100mM缓冲盐溶液，100mM MgCl2(国药集团化学试剂有限公司)，50mM二硫苏糖醇(Sigma)。
2.2实验步骤
2.2.1加“A”，分别吸取两份以pUC18DNA为模板扩增的PCR产物(200bp)(深圳华大基因研究院)置于EP管中，分别命名为X和Y，按照下列表格配置反应体系。
反应温度：37℃，30min，将样品Y经过DNA产物纯化试剂盒(QIAGEN公司QIAquick PCR Purification Kit)纯化后溶于16.4μlEB洗脱液中(柱纯化会损失2μl液体体积)。
2.2.5加“Adapter”，
注：DNA Index adapter如实施例一所述
反应温度：16℃，过夜连接18h，加完接头后用Ampure磁珠进行纯化，样品X和Y均用30μl EB液溶解洗脱。
然后再将两份样品进行Q-PCR检测，结果如下表：
两份样品的Q-PCR检测结果
根据上述两份样品中Q-PCR检测结果可以看出，样品X(即本发明方法制备的样品)与样品Y(即现有技术中illumina测序平台的方法制备的样品)的CT值未见明显差异，说明两种方法浓度相当。
实施例三
3.1试剂
T4DNA连接酶(Rapid，L603-HC-L)(Enzymatics)。
试剂I同实施例一的1.1项所述的试剂I。
试剂II pH为7.6，溶剂是水，溶质为T4DNA连接酶(Takara)，10mM ATP(NEB)，500mM Tris-HCl溶液，100mM MgCl2(国药集团化学试剂有限公司)，50mM二硫苏糖醇(Sigma)。
3.2实验步骤[Agilent Technologies.Sureselect target enrichmentsystem for illumina paired-end sequencing library.G3360-90020]
3.2.1吸取两份50ng/μl Fosmid样品(深圳华大基因研究院)各40μl置于Covaris样品管中，分别命名为X和Y，采用Covaris公司生产E210型号打断仪对样品进行打断，打断参数如下：
3.2.2末端修复操作详见安捷伦SureSelect platform操作手册G3360-90020。
3.2.2加“A”，按照下表反应体系处理样品X和Y。
反应温度：37℃，30min，将样品Y经过柱纯化后溶于37μl EB洗脱液中(柱纯化会损失2μl液体体积)。
3.2.3加“Adaptor”。
注：DNA Index adapter如实施例一所述
反应温度：16℃，过夜连接18h。
3.2.4PCR反应，操作步骤同1.2.6项。
然后再将两份样品的分别纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳(2％)，并切胶回收200bp的片段，溶于30ul超纯水中。Q-PCR检测结果如下表：
样品X和Y的Q-PCR检测结果
从上表中数据可知，样品X(即本发明方法制备的样品)与样品Y(即现有技术中illumina测序平台的方法制备的样品)所得到的200bpDNA片段CT值相对比，二者没有显著差别，提示二者浓度相当。
将实施案例一、二中的样品均匀混合，使用Agilent Bioanalyzer2100检测片段大小，结果见图2。从Agilent Bioanalyzer 2100结果显示本发明的方法片段与现有技术中illumina测序平台的方法片段大小均符合要求。可以看出，通过本发明的方法所构建的文库合格，并且实施例一和实施例二以及实施例三中，本发明的方法与现有技术中illumina测序平台的方法所分别构建的文库浓度没有显著差异说明两种建库方法没有显著差异，且后续测序数据结果都属正常，而本发明则具有较少的操作步骤和较低的成本。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (81)
1.一种基于illumina测序平台的文库构建方法，包括以下步骤：
(1)将DNA打断；
(2)将步骤(1)所得到的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；
(3)将步骤(2)所得到的平末端DNA片段与试剂I混合，得到3’端加“A”的DNA片段；
(4)将步骤(3)所得到的3’端加“A”的DNA片段与试剂II以及接头混合，纯化，从而得到加接头的DNA片段；
(5)将步骤(4)所得到的加接头的DNA产物回收；
(6)将步骤(5)回收 得到的片段采用PCR方法以扩增DNA文库，回收；
其中所述步骤(3)中试剂I的pH为7.6～7.9，溶剂是水，溶质为如下终浓度物质：10mM～100mM的可溶性盐溶液；10～300mM的MgCl2；10mM～1000mM的缓冲盐溶液；1mM～50mM的二硫苏糖醇；1mM～10mM的dATP；1U/ml～40U/ml的Klenow Fragment(3′-5′exo-)；
其中所述步骤(4)中试剂II的pH为7.6～7.9，溶剂是水，溶质为10～200mM的缓冲盐溶液；1～100mM的二硫苏糖醇；1～40mM的ATP；10～400mM的MgCl2；1U/ml～200U/ml的DNA连接酶。
2.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(3)中试剂I的pH为7.9。
3.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(3)中可溶性盐溶液为25mM～75mM。
4.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(3)中可溶性盐溶液为50mM。
5.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(3)中MgCl2为50～200mM。
6.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(3)中MgCl2为100mM。
7.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(3)中缓冲盐溶液为50mM～500mM。
8.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(3)中缓冲盐溶液为100mM。
9.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(3)中二硫苏糖醇为5mM～15mM。
10.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(3)中二硫苏糖醇为10mM。
11.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(3)中dATP为2.5mM～7.5mM。
12.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(3)中dATP为5mM。
13.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(3)中Klenow Fragment(3′-5′exo-)为10U/ml～30U/ml。
14.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(3)中Klenow Fragment(3′-5′exo-)为20U/ml。
15.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(4)中试剂II的pH为7.6。
16.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(4)中缓冲盐溶液为50～150mM。
17.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(4)中缓冲盐溶液为100mM。
18.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(4)中二硫苏糖醇为10～90mM。
19.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(4)中二硫苏糖醇为50mM。
20.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(4)中ATP为5～20mM。
21.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(4)中ATP为10mM。
22.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(4)中MgCl2为50～200mM。
23.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(4)中MgCl2为100mM。
24.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(4)中DNA连接酶为50U/ml～150U/ml。
25.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(4)中DNA连接酶为72U/ml。
26.权利要求1所述的方法，其进一步包括步骤(7)：对步骤(6)所得到的PCR扩增产物检测文库浓度及片段大小。
27.权利要求26所述的方法，其中采用Agilent Bioanalyzer2100和Q-PCR检测文库浓度及片段大小。
28.权利要求1所述的方法，其进一步还包括步骤(8)：对PCR扩增产物进行测序。
29.权利要求28所述的方法，其中使用illumina测序平台进行测序。
30.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(1)中打断方式是超声波或者酶切的方式。
31.权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述步骤(1)中将DNA打断至建库所需的DNA片段。
32.权利要求31所述的方法，其中打断至建库所需的200bp～800bp DNA片段。
33.权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述步骤(3)中试剂I中缓冲盐溶液为Tris-HCl或磷酸盐缓冲溶液。
34.权利要求33所述的方法，其中所述缓冲盐溶液为Tris-HCl 。
35.权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述步骤(3)中试剂I中可溶性盐溶液为氯化钠或氯化钾溶液。
36.权利要求35所述的方法，其中所述可溶性盐溶液为氯化钠溶液。
37.权利要求1-30中任一项所述的方法，其中样品与试剂I混合在12℃～40℃的温度下进行孵育。
38.权利要求37所述的方法，其中所述温度为37℃。
39.权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述步骤(4)中的接头包括为带有T碱基末端的任意接头。
40.权利要求39所述的方法，其中所述接头是由如下正反两个序列组成的DNA Index adapter：
DNA Index adapter F：
5-Phos/TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCAA；
DNA Index adapter R：
5-Phos/TTGGTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC。
41.权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述步骤(4)中试剂II中缓冲盐溶液为Tris-HCl或磷酸盐缓冲溶液。
42.权利要求41所述的方法，其中所述缓冲盐溶液为Tris-HCl。
43.权利要求1-30中任一项所述的方法，其中样品与试剂II混合在4℃～22℃的温度下进行孵育。
44.权利要求43所述的方法，其中所述温度为16℃。
45.权利要求1-30中任一项所述的方法，其中步骤(5)中通过进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收一定大小的片段；切胶回收的片段大小是100-1000bp。
46.权利要求45所述的方法，其中切胶回收的片段大小是200、400bp或800bp。
47.权利要求1-30中任一项所述的方法，其中步骤(6)中PCR方法所使用的引物是
Index Primer X：
5′CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCAATGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；
Primer1.0：
5′AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。
48.权利要求1-30中任一项所述的方法，其用于小片段DNA文库构建。
49.通过权利要求1-30中任一项所述的方法构建的小片段DNA文库。
50.一种试剂，其特征在于pH为7.6～7.9，溶剂是水，溶质为如下终浓度物质：10mM～100mM的可溶性盐溶液；10～300mM的MgCl2；10mM～1000mM的缓冲盐溶液；1mM～50mM的二硫苏糖醇；1mM～10mM的dATP，1U/ml～40U/ml的Klenow Fragment(3′-5′exo-)；所述试剂用作权利要求1所述方法中步骤(3)中的试剂I。
51.权利要求50所述的试剂，其中pH为7.9。
52.权利要求50所述的试剂，其中可溶性盐溶液为25mM～75mM。
53.权利要求50所述的试剂，其中可溶性盐溶液为50mM。
54.权利要求50所述的试剂，其中MgCl2为50～200mM。
55.权利要求50所述的试剂，其中MgCl2为100mM。
56.权利要求50所述的试剂，其中缓冲盐溶液为50mM～500mM。
57.权利要求50所述的试剂，其中缓冲盐溶液为100mM
58.权利要求50所述的试剂，其中二硫苏糖醇为5mM～15mM。
59.权利要求50所述的试剂，其中二硫苏糖醇为10mM。
60.权利要求50所述的试剂，其中dATP为2.5mM～7.5mM。
61.权利要求50所述的试剂，其中dATP为5mM。
62.权利要求50所述的试剂，其中Klenow Fragment(3′-5′exo-)为10U/ml～30U/ml。
63.权利要求50所述的试剂，其中Klenow Fragment(3′-5′exo-)为20U/ml的。
64.权利要求50所述的试剂，其中所述缓冲盐溶液为Tris-HCl或磷酸盐缓冲溶液。
65.权利要求64所述的试剂，其中所述缓冲盐溶液为Tris-HCl。
66.权利要求50所述的试剂，其中所述可溶性盐溶液为氯化钠或 氯化钾溶液。
67.权利要求66所述的试剂，其中所述可溶性盐溶液为氯化钠溶液。
68.一种试剂，其特征在于pH为7.6～7.9，溶剂是水，溶质为10～200mM的缓冲盐溶液；1～100mM的二硫苏糖醇；1～40mM的ATP；10～400mM的MgCl2；1U/ml～200U/ml的DNA连接酶；所述试剂用作权利要求1所述方法中所述步骤(4)中的试剂II。
69.权利要求68所述的试剂，其中pH为7.6。
70.权利要求68所述的试剂，其中缓冲盐溶液为50～150mM。
71.权利要求68所述的试剂，其中缓冲盐溶液为100mM。
72.权利要求68所述的试剂，其中二硫苏糖醇为10～90mM。
73.权利要求68所述的试剂，其中二硫苏糖醇为50mM。
74.权利要求68所述的试剂，其中ATP为5～20mM。
75.权利要求68所述的试剂，其中ATP为10mM。
76.权利要求68所述的试剂，其中MgCl2为50～200mM。
77.权利要求68所述的试剂，其中MgCl2为100mM。
78.权利要求68所述的试剂，其中DNA连接酶为50U/ml～150U/ml。
79.权利要求68所述的试剂，其中DNA连接酶为72U/ml。
80.权利要求68所述的试剂，其中所述缓冲盐溶液为Tris-HCl或磷酸盐缓冲溶液。
81.权利要求80所述的试剂，其中所述缓冲盐溶液为Tris-HCl。
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