CN101041856A - 华贵栉孔扇贝微卫星标记的构建方法 - Google Patents

华贵栉孔扇贝微卫星标记的构建方法 Download PDF

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CN101041856A CNA2007100276492A CN200710027649A CN101041856A CN 101041856 A CN101041856 A CN 101041856A CN A2007100276492 A CNA2007100276492 A CN A2007100276492A CN 200710027649 A CN200710027649 A CN 200710027649A CN 101041856 A CN101041856 A CN 101041856A
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Abstract

提供一种华贵栉孔扇贝微卫星标记的构建方法，包括DNA的提取；酶切连接接头以及杂交前预扩增；用生物素标记的微卫星探针和SAV磁珠杂交富集微卫星序列，得到富含微卫星序列的DNA片断，然后对片段进行扩增；构建富含微卫星片段的富集文库，并利用PCR进行微卫星序列筛选；对阳性克隆进行测序，得到DNA序列结果；对含有微卫星序列的片段进行质量分析比较，对优质微卫星序列片段设计引物；利用PAGE检测筛选微卫星的扩增性、多态性、稳定性，统计相应群体遗传学参数；它操作简单，安全，结果真实可靠，效率高，阳性率高；用于遗传变异分析、种质保护与管理、连锁图谱构建及优良亲本群体的筛选和遗传选育。

Description

华贵栉孔扇贝微卫星标记的构建方法
技术领域
本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及海洋经济贝类华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)微卫星(Microsatellites)标记的的构建方法。
技术背景
华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)为暖水性贝类，在我国分布于福建、广东，广西和海南沿海等地，是我国四种主要养殖扇贝之一。近几年来的病害发生和水环境的不良变化，已经导致华贵栉孔扇贝生产明显减产，威胁其产业稳定和健康发展。开展华贵栉孔扇贝遗传选育是解决这一问题和保障其产业稳定发展的根本之一。群体的遗传变异是生物对自然界的适应力(生活力、抗体、繁殖力等)的生物学基础；在选育过程中在由于随机漂变，近交和选择压的存在，可能产生遗传变异水平降低、性状退化、抗性减低等问题。因此遗传变异研究对养殖群体遗传监测、育种群体的选择和育种过程中遗传变异水平变化的监测等都具有重要意义。同时，由于不同的地理、环境等方面的影响，群体之间的多样性差别可能很大，导致遗传结构的存在，因此对这些不同区域群体进行种质保护、管理和遗传改良，遗传变异研究具有重要意义。利用与优良性状相关分子标记进行优良亲本群体的筛选及抗病抗逆品种培育，是解决性状退化问题的根本途径和关键。微卫星标记具有多态性高、共显性、在基因组中分布广泛、数量多、检测方便等优点，是最佳的分子标记之一。近年来，国内外学者采用多种筛选方法进行了微卫星分离开发，但华贵栉孔扇贝的微卫星还极少。由于遗传变异研究、开展基因连锁分析、分子生态学研究、种质资源鉴定等需要大量的微卫星标记，因此迫切需要开发更多的微卫星。传统的微卫星标记的构建方法是采用文库筛选的方法，大多要构建文库，然后筛选文库，需要用到放射性同位素或者生物素标记，步骤烦杂，工作量大。
发明的内容
本发明的目的是提供一种华贵栉孔扇贝微卫星标记的构建方法，要求方便高效，开发的微卫星标记有很高的多态性，利用这些标记可为华贵栉孔扇贝的研究提供有效的分子标记，对不同的地理，环境等的华贵栉孔扇贝种质保护、管理、遗传改良方面提供科学的依据和指导作用。
本发明的基本原理是(1)特殊的探针的设计(四种碱基重复设计的探针：即CA，GA，ATG，TATG 3’末端标记生物素)；(2)特殊四碱基内切酶和接头的设计；(3)利用链霉素亲和颗粒和生物素特异结合的性质，富集富含重复碱基的序列；(4)把富集的序列建立小片段克隆文库，并对克隆进行检测以确定是否含有微卫星序列；(5)对阳性克隆进行DNA测序，对含有微卫星序列的片段进行质量分析比较；(6)对优质微卫星序列片段设计引物；(7)利用PAGE检测筛选微卫星的扩增性、多态性、稳定性，统计相应群体遗传学参数。
本发明的目的是按照以下步骤实现的：(1)DNA的提取；(2)酶切连接接头以及杂交前预扩增；(3)用生物素标记的微卫星探针和SAV磁珠杂交富集微卫星序列，得到富含微卫星序列的DNA片断，然后对这些片段进行扩增；(4)构建富含微卫星片段的富集文库，并利用PCR进行微卫星序列筛选；(5)对筛选出来的阳性克隆进行测序，得到阳性克隆的DNA序列结果；(6)对含有微卫星序列的片段进行质量分析比较，对优质微卫星序列片段设计引物；(7)利用PAGE检测筛选微卫星的扩增性、多态性、稳定性，统计相应群体遗传学参数。
所述步骤(1)DNA的提取包括下列步骤：从冷冻的肌肉组织中取100-150mg剪碎后置于0.7ml的抽提缓冲液中，加入终浓度为0.1mg/ml的蛋白酶K，37℃消化过夜，或者50℃消化3-5个小时；用体积1∶1的苯酚/氯仿抽提反应物，用异丙醇进行沉淀，然后溶解于TE中；用RNase 37℃处理DNA杆品1小时，然后用苯酚/氯仿提取液进行DNA纯化；样品保存于-20℃待用；抽提缓冲液含有：6M尿素、10mM Tris-HCI(三羟基甲基氨基甲烷-盐酸)、125mM NaCl(氯化钠)、1％SDS(十二烷基肌氨酸钠)、10mM EDTA(乙二胺四乙酸pH 7.5)。
所述步骤(2)酶切连接接头以及杂交前预扩增包括：①酶切：用Mbo I、Dpn II或者Sau3AI(New England Biolabs，Inc.)消化基因组DNA暴露5′GATC，总体积为100μl：基因组DNA 10μg、10×buffer 10μl、10-20units of Mbo I、Dpn II或者Sau 3AI 1μl；加水至总体积为100μl，37℃消化4个小时到过夜；回收大小为400-1000bp的酶切片段；②连接：接头由两条OligoA、OligoB分别在94℃变性5分钟，室温下等量合并后冷却形成；用回收的酶切产物1μg、接头10pM、T4连接酶(Takara)36U、10×连接buffer 2μl，加水至总体积20μl，16℃连接过夜；③杂交前预扩增：连接产物用试剂盒BS354(上海生工)纯化后，作为模板，扩增体系：1×PCR buffer、0.2mM dNTP、1.5mM MgCl2，Oligo A 0.2pM、0.5u TaqPolymerase(Promega)；扩增程序：94℃2分钟，94℃40秒，60℃1分钟，25个循环72℃2分钟(如果连接产物1μg时可省略这一步)。
其中酶切液含MboI 1U、1×H buffer(H缓冲液)。10×H酶切缓冲液中含有500mM Tris-HCL(Tris碱-盐酸pH 7.5)、100mM Mgcl2(氯化镁)、10mM Dithiothreitol(DTT二硫苏糖醇)、1000mMKCL(氯化钾)。
连接缓冲液含有1×ligase缓冲液和10-20U(活性单位)的Taq DNA连接酶。
1×ligase缓冲液含有20mM Tris-HCl(三羟基甲基氨基甲烷-盐酸pH7.6)、25mMKAcO(醋酸钾)、10mM MgAcO(醋酸镁)、10mM DTT、1mM NAD(二氢尿嘧啶脱氢酶)和0.1％Triton X-100(曲拉通X-100)。
Oligo A：5′-GCG GTA CCC GGG AAG CTT GG-3′。
Oligo B：5′-GAT CCC AAG CTT CCC GGG TAC CGC-3′。
所述步骤(3)用生物素标记的微卫星探针和SAV磁珠杂交富集微卫星序列的步骤如下：①杂交：10-20mM探针，15μl 20×SSC，0.5μl 10％SDS，21μl去离子水68℃预热，加入12μl即276-300ng连接后的DNA，95℃5变性以后68℃杂交1小时；磁珠(晶美，SAV)的平衡：将磁珠轻轻摇匀，吸出100～500μl到离心管中，放在磁力架上(MPC)1～2分钟，轻轻吸出盐溶液；用200μl B&W洗液洗涤2次，再用200μl洗液I反复洗涤平衡，直到磁珠外观变得顺滑易洗脱；加入200μl洗液I，室温放置直到杂交完毕；②富集：将杂交完毕的杂交液加入已平衡好的磁珠中，25℃温育20min，并轻轻摇动，使生物素和链霉亲和素结合；温育结束后，将离心管放置到磁力架上，去除溶液；依次用洗液I，洗液II，洗液III洗涤磁珠，去除不含有微卫星的序列，洗涤方法是：洗液I在室温洗2次，每次静置10min；洗液II在68℃洗2次，每次静置10-15分钟；洗液III在室温快速洗2次；捕获含有微卫星序列的单链DNA用200μl 0.1×TE在室温快速洗2次，加入50μl 0.1×TE，95℃变性10min，释放出含有微卫星序列的单链DNA，放在磁力架上吸出备用。
磁珠上包被有链霉亲和素(Streptavidin)，可与探针上的生物素结合，从而通过磁力将探针连同所需的微卫星序列一同分离出来；
探针捕获试剂包括：探针，磁珠和探针捕获液探针10mM；磁珠的浓度为4mg/ml的链亲和素(SAV)免疫磁珠；探针捕获液含有6×SSC、0.1％SDS、1×Denhardt’s(100×Denhardt液：聚乙烯呲咯酮10g，牛血清白蛋白10g，聚蔗糖400 10g，加H2O至500ml过滤除菌，-40℃保存备用)溶液；
B&W结合和洗涤液：含有10mM Tris(pH 7.5)，1mM EDTA，1M NaCl；
洗液I：含有6×SSC，0.1％SDS；
洗液II：3×SSC，0.1％SDS；
洗液III：含有1×SSC；
5’-(CA)12GCTTGA-biotin-3’；
5’-(CA)12GCTTGA-biotin-3’；
5’-(ATG)6GCTTGA-biotin-3’；
5’-(TATG)4GCTTGA-biotin-3’。
所述步骤(4)中PCR扩增含有微卫星序列的DNA片段的方法是：PCR反应体系50μl，1×PCR buffer、0.2mM dNTP、1.5-2.0mM MgCl2、Oligo A 0.2pM、0.5-1.0unitsTaq Polymerase，94℃ 2分钟，94℃30-40秒，60℃ 1分钟，25个循环72℃2分钟；回收PCR产物电泳检测，并定量。
10×PCR反应缓冲液含有100mM Tris-HCL(pH 9.0)、500mM KCL(氯化钾pH 9.0)、1％Triton X-100(曲拉通X-100)。
所述步骤(5)将PCR产物克隆连接到T载体的步骤：10μl连接反应体系包括10×连接酶缓冲液1μl、pMD18-T vector 0.5μl(Takara)、插入DNA片段2-5μl、T4 DNA连接酶(4U/μl)，加无菌去离子水补足至10μl，16℃连接过夜；用自制的大肠杆菌电转化感受态DH10B进行转化，制备微卫星基因组文库，37℃培养过夜。
所述步骤(5)PCR筛选和微卫星克隆测序的步骤：筛选：挑取阳性克隆用M13F、M13R和扩增引物，95℃2分钟，95℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟，30-35个循环，72℃10分钟；取5μl在2％琼脂糖凝胶上电泳；出现两条或者两条以上的，挑出克隆培养过夜，用ABI377测序仪单向或双向测序。
所述步骤(6)序列分析与引物设计的步骤是：获得的具有微卫星序列按完美型，不完美型和混合型分类，并用引物设计软件Primer Premier 5.0 and DNA star，Primer select对所得含有完整侧翼序列和唯一的微卫星序列进行引物设计，设计引物要求：引物长度为17-25bp，GC含量大于40％，退火温度大于40℃，PCR产物长度200-300bp。
所述步骤(7)中PCR扩增的反应条件是：50-100ng基因组DNA、引物1μM、0.2mMdNTP、1×PCRbuffer、1.5-2.0mM的Mg2+、Taq酶；PCR的反应程序是94℃变性10分钟之后进入循环，94℃变性30，Tm退火30秒，72℃延伸1分钟，反应进行30-35个循环，4℃保存PCR产物。
所述步骤(7)中电泳检测的步骤是PCR扩增产物用8-10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压8-10V/cm，电泳完毕之后用终浓度0.5-0.6μg/ml EB染色20-30分钟，在凝胶成像系统下观察记录成像结果。
本发明的程序大致可以用图1表示。
本发明的优点和有益效果
我们在筛选的方法上进行了改良，采用双引物扩增的办法鉴定阳性克隆，一次筛选可以得到上百个阳性克隆，并且大多数都能设计引物用于PCR检测，操作简单，安全，结果真实可靠，一周时间就可以做完一个过程，大大提高了微卫星标记构建的效率。筛选过程简单快捷，筛选工作量也不很大，阳性率非常高。通过华贵栉孔扇贝基因组部分文库的构建、选择杂交微卫星富集途径，开发出了适当数量的微卫星标记，这些标记可用于华贵栉孔扇贝的遗传变异分析、种质保护与管理、连锁图谱构建及优良亲本群体的筛选和遗传选育，是这些研究和应用开发的重要分子生物学技术和工具。
附图说明
图1：富集文库的快速筛选微卫星的技术方法流程和原理示意图。
图2：Cnob11微卫星标记在群体中的扩增结果。
具体实施方法
下列实例是对本发明进一步的说明，不应该当作对本发明的限制。
1、DNA的提取
取华贵栉孔扇贝闭壳肌100mg，剪碎后置于0.7ml的抽提缓冲液中，加入蛋白酶K(终浓度为0.1mg/ml)，37℃消化过夜。用苯酚：氯仿(1∶1)抽提反应物，异丙醇进行沉淀，然后溶解于TE中。用RNase(20μg/ml)37℃处理DNA样品1小时，然后用苯酚/氯仿提取液进行DNA纯化。样品通过电泳检测，确定浓度之后保存于-20℃待用。
2、酶切连接接头以及杂交前预扩增
用Sau 3AI消化华贵栉孔扇贝基因组DNA，37℃消化过夜，总体积为100μl：基因组DNA 10μg，10×buffer，10μl，10u of DpnII，加水至总体积为100μl。回收大小为400-1000bp的酶切片断。连接接头：酶切产物1μg、OligoA加OligoB 10pM，T4连接酶(Takara)36U、10×连接buffer 2μl、加水至总体积20μl，16℃连接过夜，连接产物纯化后(BS354上海生工)作为模板扩增：1×PCR buffer、0.2mM dNTP、1.5mM MgCl2，OligoA 0.2pM、0.5units Taq Polymerase(Promega)；扩增程序：94℃ 2分钟，94℃40秒，60℃1分钟，25个循环72℃2分钟。
3、生物素标记的微卫星探针和SAV磁珠杂交并富集微卫星序列
10mM探针，15μl 20×SSC，0.5μl 10％SDS，21μl去离子水68℃预热，加入12μl(276ng)连接后的DNA，95℃ 5变性以后68℃杂交1小时。磁珠(JIANGMEI SAV)的平衡：将磁珠轻轻摇匀，吸出500μl到离心管中，放在磁力架上(MPC)1分钟，轻轻吸出盐溶液，用200μl B&W洗液洗涤2次，再用200μl洗液I反复洗涤平衡，直到磁珠外观变得顺滑易洗脱；加入200μl洗液I，室温放置直到杂交完毕。富集：将杂交完毕的杂交液加入已平衡好的磁珠中，25℃温育20min，并轻轻摇动，使生物素和链霉亲和素结合。磁珠上包被有链霉亲和素(Streptavidin)，可与探针上的生物素结合，从而通过磁力将探针连同所需的微卫星序列一同分离出来。
温育结束后，将离心管放置到磁力架上，去除溶液。依次用洗液I，洗液II，洗液III洗涤磁珠，去除不含有微卫星的序列。洗涤方法是：洗液I在室温洗2次，每次静置10min；洗液II在68℃洗2次，每次静置15分钟；洗液III在室温快速洗2次，即可基本将不含微卫星的序列去除干净。捕获含有微卫星序列的单链DNA用200μl 0.1×TE在室温快速洗2次，加入50μl0.1×TE，95℃变性10min，释放出含有微卫星序列的单链DNA，放在磁力架上吸出备用。
4、PCR扩增含有微卫星序列的DNA片段
PCR反应体系50μl，用MJ100型PCR仪进行扩增。扩增体系：1×PCR buffer、0.2mMdNTP、1.5mM MgCl2，Oligo A 0.2pM、0.5u Taq Polymerase(Promega)，94℃2分钟，94℃40秒，60℃1分钟，25个循环72℃2分钟。回收PCR产物(BS354上海生工)电泳检测，并定量。
5、连接T载体
克隆：10μl连接反应体系包括10×连接酶缓冲液1μl，pMD18-T vector 0.5μl(Takara)，插入DNA片段2μl，T4 DNA连接酶4U/μl)，加无菌去离子水补足10μl，16℃连接过夜。用自制的电转化感受态大肠杆菌DH10B进行转化，制备微卫星基因组文库，37℃培养过夜。
6、PCR筛选和微卫星克隆测序
挑取阳性克隆，用M13F、M13R和扩增引物扩增：95℃2分钟，95℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟，30个循环，72℃10分钟。取5μl在2％琼脂糖凝胶上电泳。出现两条或者两条以上的克隆样品，挑出培养过夜，用ABI377测序仪测序。
7、序列分析与引物设计
获得的具有微卫星序列按完美型，不完美型和混合型分类，并用引物设计软件DNA star，Primer select对所得含有完整侧翼序列进行引物设计。设计引物的时候采用以下的标准：(1)引物长度为17-25bp；(2)GC含量要求大于40％；(3)退火温度大于40℃；(4)预期的PCR产物长度为100-300bp。
8、PCR扩增
PCR的反应条件是：50ng基因组DNA，引物1μM、0.2mMdNTP、1×PCR buffer、1.5mM的Mg2+、Taq酶。PCR的反应程序是94℃变性10分钟之后进入循环，94℃变性30，Tm退火30秒，72℃延伸1分钟，反应进行35个循环。4℃保存PCR产物。
9、电泳检测
PCR扩增产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压是8V/cm，电泳完毕之后用EB(终浓度是0.5μg/ml)染色30分钟，在凝胶成像系统下观察记录成像结果，如图2所示。
10、微卫星标记特征分析
用40个体样本进行基因型分型，分析计算等位基因数、等位基因频率、观察和预期杂合度等参数。
本发明共获得10个微卫星标记(如表1)，均可以在不同种群的华贵栉孔扇贝扩增，结果稳定可靠，可以用于分子群体遗传学的研究。因此，充分证明本方法可以快速高效地筛选微卫星序列，从而实现短时间内获得适量的微卫星标记。
           表1：利用本发明获得的华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)微卫星标记
  微卫星标记   引物序列   PCR扩增退火温度     重复单元
    Cnob001   F：GGCCAAACCAAGCACAGATATTATR：ATCACCATTAGAACAACGGAACC     55     (CTCA)10
    Cnob002   F：GCG GTA CCC GGG AAG CTT GGR：AGC CTC GGT ACC CGG GGA TC     50     (CA)31
    Cnob003   F：GGCCAAACCAAGCACAGATAR：CATTAGAACAACGGAACCAACAGG     50     (GTGA)10
    Cnob011   F：GGAAGCTTGGGATCATCGGACAGT     50     (CA)4C(CA)6
    R：ACGGGAAAATCTAAAAAGGTTGAA
    Cnob013     F：TAGGCCTAGGCATAACACAR：AATCATCAAGGTACCAGCAGACTA     50     (AC)6TC(AC)8
    Cnob021     F：CCCTGTAAATGTGATGTAAAGAATR：GAGAGCCCACTAATGTCAAAAC     50     (ATC)21
    Cnob019     F：CCGTATGGCGAGGGGTTTGR：CGGTTTGTGTTTCTCG     52     (GTTT)6
    Cnob023     F：ACCCATTCACGCTTGTTCCR：TATCCGTTAATCTACGTCAGTTC     50     (GAT)24...(GCG)9
    Cnob026     F：TCGTTACATACATCTTCCTTGACAR：CGATGTTGTTATTGTTGTTGTTGA     50     (CAT)26CA(CCG)8...(TCG)6(TCA)12
    Cnob028     F：CATCCAGGCCCCGGTTGCTCAR：GACGACGACGACGACGACGACGAT     68     (TCA)6C(CAT)13(TCG)9

Claims (11)

1.一种华贵栉扇贝微卫星标记的构建方法，依次包括下列程序：(1)DNA的提取；(2)酶切连接接头以及杂交前预扩增；(3)用生物素标记的微卫星探针和SAV磁珠杂交富集微卫星序列，得到富含微卫星序列的DNA片断，然后对这些片段进行扩增；(4)构建富含微卫星片段的富集文库，并利用PCR进行微卫星序列筛选；(5)对筛选出来的阳性克隆进行测序，得到阳性克隆的DNA序列结果；(6)对含有微卫星序列的片段进行质量分析比较，对优质微卫星序列片段设计引物；(7)利用PAGE检测筛选微卫星的扩增性、多态性、稳定性，统计相应群体遗传学参数。
2.根据权利要求1中所述的一种华贵栉扇贝微卫星标记的构建方法，其特征是步骤(1)DNA的提取包括下列步骤：从冷冻的肌肉组织中取100-150mg剪碎后置于0.7ml的抽提缓冲液中，加入终浓度为0.1mg/ml的蛋白酶K，37℃消化过夜，或者50℃消化3-5个小时；用体积1∶1的苯酚/氯仿抽提反应物，用异丙醇进行沉淀，然后溶解于TE中；用RNase 37℃处理DNA样品1小时，然后用苯酚/氯仿提取液进行DNA纯化；样品保存于-20℃待用。
3.根据权利要求1中所述的一种华贵栉扇贝微卫星标记的构建方法，其特征是步骤(2)酶切连接接头以及杂交前预扩增包括：①酶切：用Mbo I、Dpn II或者Sau 3AI(New EnglandBiolabs，Inc.)消化基因组DNA暴露5′GATC，总体积为20-100μl：基因组DNA 10μg、10×buffer 2-10μl、10-20units of Mbo I、Dpn II或者Sau 3AI 1μl；加水至总体积为100μl，37℃消化4个小时到过夜；回收大小为400-1000bp的酶切片段；②连接：接头由两条OligoA、OligoB分别在94℃变性5分钟，室温下等量合并后冷却形成；用回收的酶切产物1μg、接头10pM、T4连接酶(Takara)36U、10×连接buffer 2μl，加水至总体积20μl，16℃连接过夜；③杂交前预扩增：连接产物1μl、1×PCR buffer、0.2mM dNTP、1.5mM MgCl2，Oligo A0.2-1pM、0.5u Taq Polymerase(Promega)；扩增程序：94℃2分钟，94℃40秒，60℃1分钟，25个循环72℃2分钟，如果连接产物1μg时省略这一步。
4.根据权利要求1中所述的一种华贵栉扇贝微卫星标记的构建方法，其特征是所述步骤(3)用生物素标记的微卫星探针和SAV磁珠杂交富集微卫星序列的步骤如下：①杂交：10-20mM探针，15μl 20×SSC，0.5μl 10％SDS，21μl去离子水68℃预热，加入12μl即276-300ng连接后的DNA，95℃5变性以后68℃杂交1小时；磁珠的平衡：将磁珠轻轻摇匀，吸出100～500μl到离心管中，放在磁力架上1～2分钟，轻轻吸出盐溶液；用200μl B&W洗液洗涤2次，再用200μl洗液I反复洗涤平衡，直到磁珠外观变得顺滑易洗脱；加入200μl洗液I，室温放置直到杂交完毕；②富集：将杂交完毕的杂交液加入已平衡好的磁珠中，25℃温育20min，并轻轻摇动，使生物素和链霉亲和素结合；温育结束后，将离心管放置到磁力架上，去除溶液；依次用洗液I，洗液II，洗液III洗涤磁珠，去除不含有微卫星的序列，洗涤方法是：洗液I在室温洗2次，每次静置10min；洗液II在68℃洗2次，每次静置10-15分钟；洗液III在室温快速洗2次；捕获含有微卫星序列的单链DNA用200μl 0.1×TE在室温快速洗2次，加入50μl 0.1×TE，95℃变性10min，释放出含有微卫星序列的单链DNA，放在磁力架上吸出备用。
5.根据权利要求1中所述的一种华贵栉扇贝微卫星标记的构建方法，其特征是所述步骤(4)中PCR扩增含有微卫星序列的DNA片段的方法是：PCR反应体系50μl，1×PCR buffer、0.2mM dNTP、1.5-2.0mM MgCl2、Oligo A 1-0.2pM、0.5-1.0unite Polymerase，94℃2分钟，94℃30-40秒，60℃1分钟，25个循环72℃2分钟；回收PCR产物电泳检测，并定量。
6.根据权利要求1中所述的一种华贵栉扇贝微卫星标记的构建方法，其特征是所述步骤(5)将PCR产物克隆连接到T载体的步骤：10μl连接反应体系包括10×连接酶缓冲液1μl、pMD18-T vector 0.5-1μl(Takara)、插入DNA片段2-5μl、T4DNA连接酶(4U/μl)，加无菌去离子水补足至10μl，16℃连接过夜；用自制的大肠杆菌电转化感受态DH10B进行转化，制备微卫星基因组文库，37℃培养过夜。
7.根据权利要求1中所述的一种华贵栉扇贝微卫星标记的构建方法，其特征是所述步骤(5)PCR筛选和微卫星克隆测序的步骤中的筛选程序：挑取阳性克隆用M13F、M13R和扩增引物，95℃2分钟，95℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟，30-35个循环，72℃10分钟；取5μl在2％琼脂糖凝胶上电泳；出现两条或者两条以上的，挑出克隆培养过夜，用ABI377测序仪单向或双向测序。
8.根据权利要求1中所述的一种华贵栉扇贝微卫星标记的构建方法，其特征是所述步骤(6)序列分析与引物设计的步骤是：获得的具有微卫星序列按完美型，不完美型和混合型分类，并用引物设计软件Primer Premier 5.0和DNA star，Primer select对所得含有完整侧翼序列和唯一的微卫星序列进行引物设计，设计引物要求：引物长度为17-25bp，GC含量大于40％，退火温度大于40℃，PCR产物长度200-300bp。
9.根据权利要求1中所述的一种华贵栉扇贝微卫星标记的构建方法，其特征是所述步骤(7)中PCR扩增的反应条件是：50-100ng基因组DNA、引物1μM、0.2mMdNTP、1×PCRbuffer、1.5-2.0mM的Mg2+、Taq酶；PCR的反应程序是94℃变性10分钟之后进入循环，94℃变性30，Tm退火30秒，72℃延伸1分钟，反应进行30-35个循环，4℃保存PCR产物。
10.根据权利要求1-10中所述的任何一种华贵栉扇贝微卫星标记的构建方法，其特征是所述步骤(7)中电泳检测的步骤是PCR扩增产物用8-10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压8-10V/cm，电泳完毕之后用终浓度0.5μg/ml EB染色20-30分钟，在凝胶成像系统下观察记录成像结果。
11.根据权利要求1中所述的一种华贵栉扇贝微卫星标记的构建方法，其特征是筛选到的微卫星标记的特异引物分别为：
Cnob001：F：GGCCAAACCAAGCACAGATATTAT，R：ATCACCATTAGAACAACGGAACC；
Cnob002：F：GCG GTA CCC GGG AAG CTT GG，R：AGC CTC GGT ACC CGG GGA TC；
Cnob003：F：GGCCAAACCAAGCACAGATA，R：CATTAGAACAACGGAACCAACAGG；
Cnob011：F：GGAAGCTTGGGATCATCGGACAGT，R：ACGGGAAAATCTAAAAAGGTTGAA；
Cnob013：F：TAGGCCTAGGCATAACACA，R：AATCATCAAGGTACCAGCAGACTA；
Cnob021：F：CCCTGTAAATGTGATGTAAAGAAT，R：GAGAGCCCACTAATGTCAAAAC；
Cnob019：F：CCGTATGGCGAGGGGTTTG，R：CGGTTTGTGTTTCTCG；
Cnob023：F：ACCCATTCACGCTTGTTCC，R：TATCCGTTAATCTACGTCAGTTC；
Cnob026：F：TCGTTACATACATCTTCCTTGACA，R：CGATGTTGTTATTGTTGTTGTTGA；
Cnob028：F：CATCCAGGCCCCGGTTGCTCA，R：GACGACGACGACGACGACGACGAT。
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