CN105349528B - 用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法 - Google Patents
用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法，其适用于中量级别(5～200ng)的起始样本量。该文库构建方法包括从5～200ng的基因组DNA得到片段化的基因组DNA；对上述片段化的基因组DNA进行重亚硫酸氢盐处理，得到单链的重亚硫酸氢盐处理产物；以上述单链的重亚硫酸氢盐处理产物为模板，使用含生物素标记的oligo1引物合成第一条链；使用核酸外切酶消化第一条链合成后体系中的单链DNA；使用链亲和素磁珠调取生物素标记的第一条链；以上述生物素标记的第一条链为模板，使用oligo2引物合成第二条链；以及，以所述第二条链作为模板进行PCR扩增，从而构建二代测序用DNA文库。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种适用于中量级别(5～200ng)的起始样本量的用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法。
背景技术
DNA甲基化是基因组DNA的一种最常见的表观遗传修饰，大量研究表明DNA甲基化修饰对于维持正常细胞功能、传递基因组遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生等起着至关重要的作用。伴随着高通量测序的诞生，对DNA甲基化的研究越来越深入，作为DNA甲基化检测的金标准，全基因组重亚硫酸氢盐测序(WGBS或BS-Seq，Whole Genome BisulfateSequencing)[1]，能够对全基因组DNA甲基化进行分析，并且具备了单碱基水平的检测灵敏度。然而，BS-Seq技术建库起始量要求μg以上，高起始量是限制BS-seq在临床样本应用的主要因素。
目前，BS-Seq技术主要用于已完成测序的物种，需要1～3μg基因组DNA起始构建文库。BS-Seq文库构建方法如下，详细流程参考Li等[1]：
(1)gDNA片段化：1～3μg基因组DNA起始量，采用超声波打断仪片段化gDNA，打断产物直接用于末端修复；
(2)末端修复：以dNTPs为单核苷酸来源，采用T4DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶和Klenow片段将打断产物修复成平末端，1.8倍Ampure磁珠纯化；
(3)加“A”：以dATP为单核苷酸来源，采用Klenow(3'-5'exo-)为平末端3'端加A，1.8倍Ampure磁珠纯化；
(4)加甲基化接头：采用T4DNA连接酶将带T的甲基化接头连接在含A的DNA片段两端，1.8倍Ampure磁珠纯化；
(5)重亚硫酸氢盐处理：采用EZ DNA Methylation-Gold Kit对胶回收产物进行重亚硫酸氢盐处理反应；
(6)片段筛选：采用琼脂糖凝胶电泳回收300～350bp范围内的片段，QIA-quickGel Extraction Kit进行胶纯化回收；
(7)PCR扩增：采用KAPA HiFi HotStart Uracil+Ready Mix对胶回收产物进行PCR扩增，扩增产物0.9倍Ampure磁珠纯化，文库构建完成。
2012年，Miura等[2]提出了Post-Bisulfite Adaptor Tagging(PBAT)全基因组甲基化建库方法，利用Bisulfite处理过程中的损伤作用片段化DNA，接着以单链的Bisulfite产物为模板，以含有生物素标记的Oligo1为引物合成一链(1轮反应)，核酸外切酶I消化合成不完全的单链DNA，再用链亲和素磁珠M280调取一链产物，以一链产物为模板和Oligo2引物合成二链，最后以Illumina公共PE引物和Index引物扩增出文库。2014年，Swallwood等[3]对PBAT法进行调整后，将基于两条链合成的BS建库方法应用到单细胞全基因组甲基化检测，并将其命名为scBS测序技术，该方法适于利用小量级别(1ng以下)的单细胞全基因组进行甲基化测序。
PBAT和scBS两种方法的原理相同，主要通过两个含Illumina接头序列的寡聚核苷酸引物，在两轮合成反应中添加接头序列，scBS文库构建方法如下，详细流程参考Swallwood等[3]：
(1)Bisulfite处理：对gDNA进行Bisulfite处理，利用此过程中的DNA损伤片段化gDNA；
(2)一链合成：以单链Bisulfite产物为模板，采用含生物素标记的oligo1引物合成第一条链，一链合成需要5轮反应，此时第一条链的5'端已含有接头序列；
(3)单链DNA消化：采用核酸外切酶Ⅰ消化一链合成后呈现单链的DNA序列；
(4)M280调取：采用链亲和素磁珠M280调取生物素标记的一链产物；
(5)二链合成：以第一条链为模板，采用Oligo2引物合成第二条链，此时第二条链的3'端和5'端均含有Illumina接头序列；
(6)以第二条链为模板，使用Illumin通用PCR引物和Index引物扩增得到最终文库。
但是，对于中量级别(5～200ng)的起始样本量，上述两种方法均不能有效适用。
参考文献
非专利文献
[1]Li,N.,et al.,Whole genome DNA methylation analysis based on highthroughput sequencing technology.Methods.2010.52(3):p.203-12.
[2]Miura.F,Enomoto.Y,Dairiki.R,et al.Amplification-free whole-genomebisulfate sequencing by post-bisulfite adaptor tagging.Nucleic AcidsResearch.2012,40(17),e136.
[3]Smallwood.S.A,Lee.H.J,Angermueller.C,et al.Single-cell genome-widebisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity.NatureMethods.2014,11(8):817-20.
发明内容
本发明人经研究发现，对于中量级别(5～200ng)的起始样本量，如果采用上述BS-Seq方法构建测序文库，则构建出的文库浓度偏低或者下机数据的冗余度太高；而如果采用上述PBAT或scBS方法构建测序文库，则存在最终文库有效数据利用率低的情况。需要说明的是，一般而言，希望最终文库片段主要分布在200～500bp之间，且峰值出现在300bp左右。
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种适用于中量级别的用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法。
本发明经过深入研究，在现有的文库构建方法的基础上，对文库构建步骤进行了巧妙的改进及优化，开发出了适用于中量级别(5～200ng)的起始样本量的用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建新方法，从而完成了本发明。
即，本发明包括：
1.一种用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法，该方法包括：
步骤A：将5～200ng的基因组DNA用超声波打断仪片段化，得到片段化的基因组DNA；
步骤B：对上述片段化的基因组DNA进行重亚硫酸氢盐处理，得到单链的重亚硫酸氢盐处理产物；
步骤C：以上述单链的重亚硫酸氢盐处理产物为模板，使用含生物素标记的oligo1引物合成第一条链；
步骤D：使用核酸外切酶消化第一条链合成后体系中的单链DNA；
步骤E：使用链亲和素磁珠调取生物素标记的第一条链；
步骤F：以上述生物素标记的第一条链为模板，使用oligo2引物合成第二条链；以及
步骤G：以所述第二条链作为模板进行PCR扩增，从而构建二代测序用DNA文库。
2.根据项1所述的文库构建方法，其中，
在所述步骤A中对得到的片段化的基因组DNA进行磁珠纯化；和/或
在所述步骤D中对消化处理后的体系进行磁珠纯化，得到纯化的生物素标记的第一条链；和/或
在所述步骤G中，对所述PCR扩增的产物进行磁珠纯化。
3.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤C中使用了10～100pmol的oligo1引物。
4.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤C中使用了40pmol的oligo1引物。
5.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤C中采用如下反应体系合成所述第一条链：
以50μL体系计
6.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤G中采用如下反应体系合成所述第二条链：
以50μL体系计，所述生物素标记的第一条链溶于
7.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤A中用超声波打断仪片段化的条件为：超声打断30秒，停30秒，重复22次。
8.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤A中将40～150ng的基因组DNA用超声波打断仪片段化。
9.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤A中将50～100ng的基因组DNA用超声波打断仪片段化。
10.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤A的所述基因组DNA为人类基因组DNA。
发明效果
根据本发明，提供一种适用于中量级别(5～200ng)的起始样本量的用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建新方法。
附图说明
图1为文库BSCS140100-1-79的质检结果。
发明的具体实施方式
首先，在一个方面中，本发明提供一种用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法(本发明的方法)，该方法包括：
步骤A：将5～200ng的基因组DNA用超声波打断仪片段化，得到片段化的基因组DNA；
步骤B：对上述片段化的基因组DNA进行重亚硫酸氢盐处理，得到单链的重亚硫酸氢盐处理产物；
步骤C：以上述单链的重亚硫酸氢盐处理产物为模板，使用含生物素标记的oligo1引物合成第一条链；
步骤D：使用核酸外切酶消化第一条链合成后体系中的单链DNA；
步骤E：使用链亲和素磁珠调取生物素标记的第一条链；
步骤F：以上述生物素标记的第一条链为模板，使用oligo2引物合成第二条链；以及
步骤G：以所述第二条链作为模板进行PCR扩增，从而构建二代测序用DNA文库。
这里，所述基因组DNA是基因组中存在甲基化修饰的物种的基因组DNA，例如哺乳动物基因组DNA或人基因组DNA。作为起始的基因组DNA的量优选为40～150ng，更优选为50～100ng。对于获得该基因组DNA的方式没有限制，例如可以从样本中提取，所述样本例如为血液。但需要说明的是，本发明的方法并不包含任何的介入性步骤，例如采血步骤。
在将所述基因组DNA片段化时，超声波打断仪的操作条件可以为：超声打断30秒，停30秒，重复22次。
所述步骤B中的重亚硫酸氢盐处理可以使用能够在scBS方法中使用的那些方法来进行，例如可以使用EZ DNA Methylation-Gold Kit(Zymo公司)进行。
在所述步骤C中，以上述单链的重亚硫酸氢盐处理产物为模板，使用含生物素标记的oligo1引物合成第一条链。本发明人经研究发现，所使用的oligo1引物的量会影响最终文库的片段大小。因此，为了更好地显现本发明的技术效果，优选使用10～100pmol的oligo1引物，更优选使用40pmol的oligo1引物。对于所述步骤C中采用的第一条链的合成体系及反应条件没有特殊限制，本领域技术人员可以适宜选择能够在scBS方法中使用的那些合成体系及反应条件。例如，可以采用如下体系：
以50μL体系计，
在第一条链的合成反应完毕后，体系中还会有一些DNA以单链形式存在，例如未用完的含生物素标记的oligo1引物。在所述步骤D中，使用核酸外切酶消化这些单链DNA，将其降解。所述消化的反应条件可以由本领域技术人员适当选择能够在scBS方法中使用的那些消化的反应条件。
然后，在所述步骤E中，使用链亲和素磁珠调取生物素标记的第一条链。这里，对于所述链亲和素磁珠的种类没有特殊限制，例如可以是M280磁珠(Dynal公司)。对于用于调取的条件没有特殊限制，本领域技术人员可以适当选择能够在scBS方法中使用的那些用于调取的条件。
接下来，在所述步骤F中，以调取到的生物素标记的第一条链为模板，使用oligo2引物合成第二条链。对于所述步骤F中采用的第二条链的合成体系及反应条件没有特殊限制，本领域技术人员可以适宜选择能够在scBS方法中使用的那些第二条链的合成体系及反应条件。例如，可以采用如下体系：
以50μL体系计，所述调取到的生物素标记的第一条链溶于
再接下来，在所述步骤G中，以所述第二条链作为模板进行PCR扩增，从而构建二代测序用DNA文库。对于所述PCR扩增的反应条件没有特殊限制，本领域技术人员可以适宜选择能够在scBS方法中使用的那些PCR扩增的反应条件。
优选地，在所述步骤A中可以对得到的片段化的基因组DNA进行磁珠纯化。在所述步骤D中可以对消化处理后的体系进行磁珠纯化，得到纯化的生物素标记的第一条链。和/或，在所述步骤G中，可以对所述PCR扩增的产物进行磁珠纯化。磁珠纯化可以使用本领域技术人员在scBS方法中能够使用的那些磁珠试剂来进行。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解，此处所描述的实施例是用于解释本发明，而非用于限定本发明。
实施例1采用本发明的方法构建用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库
(1)gDNA片段化：100ng基因组DNA起始量，采用超声波打断仪片段化gDNA超声打断30秒，停30秒，重复22次，打断产物1.8倍Ampure磁珠纯化，20μL ddH2O洗脱。
(2)Bisulfite处理：采用EZ DNA Methylation-Gold Kit(厂商Zymo公司)对上步产物进行Bisulfite处理，31μL EB洗脱。
(3)一链合成：按下表体系进行反应，将前4种试剂混匀后，置于65℃反应3分钟后，降至4℃后，加入4μL NEB Klenow exo-(28U/μL)，执行程序4℃下5分钟，每6秒钟升温0.5℃，一直升温至37℃，然后在37℃下反应60分钟。
(4)单链DNA消化：加入2μL(20U/μL)核酸外切酶I(Exonuclease I)，37℃反应1小时，0.9倍Ampure磁珠纯化，30μL EB洗脱。
(5)M280磁珠调取：20μL M280磁珠采用50μL Bead Binding Buffer重悬清洗两次，最后30μL Bead Binding Buffer重悬磁珠后，与上步中30μL洗脱产物结合调取，条件为20℃反应15分钟，温育仪每两分钟以600rpm转速震荡15秒。调取结束后，使用200μL BeadWash Buffer重悬振荡清洗2次，200μL EB(pH8.5)重悬振荡清洗2次，二链合成Mix溶解磁珠。
(6)二链合成：按下表体系进行反应，将带磁珠的反应液置于95℃，反应45秒后，立即转移至冰上，加入4μL Klenow exo-(28U/μL)，共50μL反应体系，执行程序先在4℃下保持5分钟，然后每6秒钟升温0.5℃，一直升温至37℃，然后在37℃下反应90分钟。
(7)PCR扩增：使用200μL EB(pH8.5)重悬清洗二链产物，弃上清，使用下表PCR扩增Mix溶解磁珠，并执行程序95℃2分钟；(94℃80秒，65℃30秒，72℃30秒)11循环；72℃3分钟；4℃保存。
(8)0.9倍Ampure磁珠纯化PCR扩增产物，至此已完成文库构建。
(9)文库质控：使用安捷伦2100生物分析仪对所构建的文库进行质检。如图1所示，所构建的文库的片段主要分布在200～500bp之间，且峰值出现在300bp左右。文库质检合格，将该文库命名为BSCS140100-1-79。
(10)根据需求选择测序策略和测序数据量。
各引物序列如下。
| 名称 | 序列 |
| Oligo1 | 5'-(Biotin)TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNN-3' |
| Oligo2 | 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNN-3' |
N为选自A、T、C、G的任意碱基。
Primer-R(Index)序列为：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(N)8GTGACTGGAGTTC-3'，
N为选自A、T、C、G的任意碱基。
对比例1不进行超声打断而构建用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库
按实施例1描述的方法构建用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库，不同的是：不进行上述步骤(1)。将所得文库命名为BSCS140097-1-41。
表1展示了BSCS140100-1-79和BSCS140097-1-41这两个文库的数据质控结果。可知对于中量级别(5～200ng)的起始样本量，采用本发明的方法构建的文库在Clean ReadsRate(有效数据率)和Unique mapped reads rate(唯一比对的序列)等方面明显优异。
表1
| Sample | BSCS140100-1-79 | BSCS140097-1-41 |
| Raw Reads | 14,377,752 | 14,045,656 |
| Clean Reads | 12,141,756 | 9,077,096 |
| Clean Reads Rate(％) | 84.448 | 64.626 |
| Low-quality Reads Rate(％) | 13.355 | 16.858 |
| Adapter Polluted Reads Rate(％) | 2.197 | 18.517 |
| Original Q30Bases Rate(％) | 89.93 | 86.348 |
| Clean Q30Bases Rate(％) | 95.064 | 90.464 |
| Unique mapped reads rate(％) | 64 | 48 |
还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
工业实用性
根据本发明，提供了一种适用于中量级别(5～200ng)的起始样本量的用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法。
Claims (4)
1.一种用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法，该方法包括：
步骤A：将5～200ng的基因组DNA用超声波打断仪片段化，得到片段化的基因组DNA；
步骤B：对上述片段化的基因组DNA进行重亚硫酸氢盐处理，得到单链的重亚硫酸氢盐处理产物；
步骤C：以上述单链的重亚硫酸氢盐处理产物为模板，使用含生物素标记的oligo1引物合成第一条链；
步骤D：使用核酸外切酶消化第一条链合成后体系中的单链DNA；
步骤E：使用链亲和素磁珠调取生物素标记的第一条链；
步骤F：以上述生物素标记的第一条链为模板，使用oligo2引物合成第二条链；以及
步骤G：以所述第二条链作为模板进行PCR扩增，从而构建二代测序用DNA文库；
其中，
所述步骤C中使用了10～100pmol的oligo1引物；
所述步骤A中用超声波打断仪片段化的条件为：超声打断30秒，停30秒，重复22次；
所述步骤A的所述基因组DNA为人类基因组DNA；
所述步骤C中采用如下反应体系合成所述第一条链：
所述步骤G中采用如下反应体系合成所述第二条链：
以50μL体系计，所述生物素标记的第一条链溶于
其中，所述Oligo1的序列为
5'-(Biotin)TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNN-3'，
所述Oligo2的序列为
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNN-3'，
N为选自A、T、C、G的任意碱基。
2.根据权利要求1所述的文库构建方法，其中，
在所述步骤A中对得到的片段化的基因组DNA进行磁珠纯化；和/或
在所述步骤D中对消化处理后的体系进行磁珠纯化，得到纯化的生物素标记的第一条链；和/或
在所述步骤G中，对所述PCR扩增的产物进行磁珠纯化。
3.根据权利要求1所述的文库构建方法，其中，所述步骤A中将40～150ng的基因组DNA用超声波打断仪片段化。
4.根据权利要求1所述的文库构建方法，其中，所述步骤A中将50～100ng的基因组DNA用超声波打断仪片段化。
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| Amplification-free whole-genome bisulfitesequencing by post-bisulfite adaptor tagging;Fumihito Miura et al.;《Nucleic Acids Research》;20120530;第40卷(第17期);e136 |
| Single-Cell Genome-Wide Bisulfite Sequencing for Assessing Epigenetic Heterogeneity;Sébastien A Smallwood et al.;《Nat Methods.》;20140831;第11卷(第8期);第2、5页以及附图1a |
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