CN106701737B - 一种具有片段选择性纯化能力的高效dna纯化磁珠试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有片段选择性纯化能力的高效DNA纯化磁珠试剂、以及使用该高效DNA纯化磁珠试剂的文库构建方法。即使以微量样本作为起始，也能够构建高质量二代测序用DNA文库。
Description
技术领域
本发明涉及DNA纯化试剂，具体涉及一种具有片段选择性纯化能力的高效DNA纯化磁珠试剂。
背景技术
目前基于磁珠法进行核酸纯化试剂主要有两类：一类为用于组织样本提取的磁珠提取核酸的试剂，此类试剂通过裂解细胞及溶解蛋白等有机组织，通过特异性的溶液及磁珠颗粒吸附分离核酸分子，对核酸分子进行无差别的回收与纯化。另一类是具有特异性片段选择性纯化能力的磁珠纯化试剂，此类试剂通过特殊的核酸沉淀剂及离子环境以及特异性修饰的纳米磁珠颗粒，可以完成对反应液中的DNA分子进行片段大小特异性的吸附，进而完成片段选择性的回收DNA分子的效果。此种试剂尤其适用于有小片段去除需求，如二代测序文库构建中去除引物二聚体、质粒构建中去除小片段产物等的反应。
另一方面，二代测序也称深度测序、大规模平行测序，其核心思想是边合成边测序。常规的测序前都需要将对待测DNA片段进行一定的处理，构建测序文库，使DNA符合测序平台的要求。
文库构建包含以下几个步骤：(1)待测DNA的片段化，使其适宜进行文库构建及测序；(2)末端修复，将片段化的DNA分子修补形成正常平末端的DNA分子；(3)平末端加A尾，使修复完成的DNA分子具有粘性A末端；(4)加接头，利用带有3'端含有一个突出T碱基的接头分子与带有A末端的DNA分子连接，组成接头连接产物；(5)根据需求进行PCR扩增0-20循环的PCR，完成文库分子的制备。上述5步反应的步骤之间以及文库PCR之后均需要通过例如磁珠纯化法纯化上步的反应产物，用于下步反应。
为了提高纯化效率，构建高品质的测序文库，技术人员对纯化步骤及磁珠纯化试剂进行了各种改进。
例如，中国专利申请公开号CN104099666A(专利文献1)公开了一种二代测序文库构建方法，该方法中合理安排了纯化步骤及纯化方式，获得了高质量的测序文库，且具有快速建库的优点。
再例如，非专利文献1公开了一种具有特异性片段选择性纯化能力的磁珠纯化试剂，其包含：0.1重量％的羧基修饰磁珠、18重量％的PEG8000、1M NaCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA(pH8.0)、以及0.05重量％的Tween20。该磁珠纯化试剂具有良好的纯化效率，是目前使用的经典的磁珠纯化试剂。
但是，由于纯化反应本身的效率问题，样本在多步的纯化过程中将逐步损失，并导致最终文库质量不高，此现象对于微量样本(10ng以下)影响尤为严重。
因此，迫切需要纯化效率更高的、更适用于微量样本的磁珠纯化试剂。
参考文献：
专利文献1 中国专利申请公开号CN104099666A；
非专利文献1 Cost-effective,high-throughput DNA sequencing(GenomeResearch，2012，22：939–946)。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种即使以微量样本作为起始，也能够构建高质量二代测序用DNA文库的具有片段选择性纯化能力的高效DNA纯化磁珠试剂、以及使用该高效DNA纯化磁珠试剂的文库构建方法。
本发明的发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现：在采用上述专利文献1公开的二代测序文库构建方法的基础上，使用特定的DNA纯化磁珠试剂，即使以微量样本(10ng以下)作为起始，也能够构建高质量二代测序用DNA文库，从而完成了本发明。
即，本发明包括：
1.一种DNA纯化磁珠试剂，其包含：
0.05～1重量％的羧基修饰磁珠，
15～30重量％的PEG10000～20000，
1～4M的NaCl，
1～100mM的Tris-HCl，以及
0.1～10mM的EDTA，
并且，该DNA纯化磁珠试剂的pH值为6.0～9.0。
2.根据项1所述的DNA纯化磁珠试剂，其中，
所述Tris-HCl的浓度为5～50mM。
3.根据项1所述的DNA纯化磁珠试剂，其中，
所述EDTA的浓度为0.5～5mM。
4.一种用于DNA纯化磁珠试剂的结合液，其包含：
15～30重量％的PEG10000～20000，
1～4M的NaCl，
1～100mM的Tris-HCl；以及
0.1～10mM的EDTA；
并且，该纯化磁珠试剂的pH值为6.0～9.0。
5.根据项4所述的结合液，其中，
所述Tris-HCl的浓度为5～50mM。
6.根据项4所述的结合液，其中，
所述EDTA的浓度为0.5～5mM。
7.一种二代测序文库快速构建方法，其包括：
步骤A：将希望进行测序的DNA片段进行末端修复并进行磁珠纯化，得到平末端DNA片段；
步骤B：将所述平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；
步骤C：将所述3'端加A的DNA片段加接头并进行结合液纯化，得到加接头DNA片段；和
步骤D：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物，对所述扩增产物进行结合液纯化，并洗脱与磁珠结合的所述扩增产物；
其中，所述磁珠纯化使用项1～3中任一项所述的DNA纯化磁珠试剂进行，所述结合液纯化使用项4～6中任一项所述的结合液进行。
8.根据项7所述的构建方法，其中，步骤A中的希望进行测序的DNA片段的量为0.1～10ng。
9.根据项7所述的构建方法，其中，所述步骤B中将所述平末端DNA片段进行3'端加A并进行结合液纯化，得到3'端加A的DNA片段。
10.一种测序方法，其中，以采用项7～9中任一项所述的构建方法构建的二代测序文库作为对象进行测序，所述测序利用Illumina平台进行。
发明效果
根据本发明，即使以微量样本作为起始，也能够构建高质量二代测序用DNA文库。
附图说明
图1：使用安捷伦2100生物分析仪对实施例1所得产物进行检测的结果
发明的具体实施方式
首先，在一个方面中，本发明提供一种DNA纯化磁珠试剂(本发明的DNA纯化磁珠试剂)，其包含：
0.05～1重量％的羧基修饰磁珠，
15～30重量％的PEG10000～20000，
1～4M、优选1.9～2.3M的NaCl，
1～100mM、优选5～50mM的Tris-HCl，以及
0.1～10mM、优选0.5～5mM的EDTA，
并且，该DNA纯化磁珠试剂的pH值为6.0～9.0。
本发明的DNA纯化磁珠试剂的配方经过了本发明人的反复优化及验证，从而解决了传统快速建库方法(例如专利文献1所述的方法)应用于微量起始样本时、所得最终文库质量不高的技术难题。
这里，所述羧基修饰磁珠的量优选为0.1～0.5重量％。羧基修饰磁珠通常具有片段选择性纯化能力。作为所述羧基修饰磁珠可以使用例如GE公司的Sera-Mag羧基修饰磁珠。所述PEG(聚乙二醇，其后的数字表示其重均分子量)的含量优选为20～25重量％，其重均分子量优选为10000～15000。所述NaCl的浓度优选为1.9～2.3M，所述Tris-HCl的浓度优选为5～50mM，所述EDTA的浓度优选为0.5～5mM。所述DNA纯化磁珠试剂的pH值优选为7.5～8.5。本发明的DNA纯化磁珠试剂中，除了所述羧基修饰磁珠以外，其他组分形成溶液，溶剂为水。
此外，在另一个方面中，本发明提供一种结合液(本发明的结合液)，其可用于制备本发明的DNA纯化磁珠试剂，该结合液包含：
15～30重量％的PEG10000～20000，
1～4M的NaCl，
1～100mM的Tris-HCl，以及
0.1～10mM的EDTA，
并且，该结合液的pH值为6.0～9.0。
这里，本发明的结合液为水溶液，其中的各组分及pH值的优选范围参见上述对本发明的DNA纯化磁珠试剂的描述。
此外，在另一个方面中，本发明提供一种基于磁珠绑定的二代测序文库快速构建方法，其包括：
步骤A：将希望进行测序的DNA片段进行末端修复并进行磁珠纯化，得到平末端DNA片段；
步骤B：将所述平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；
步骤C：将所述3'端加A的DNA片段加接头并进行结合液纯化，得到加接头DNA片段；和
步骤D：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物，对所述扩增产物进行结合液纯化，并洗脱与磁珠结合的所述扩增产物；
其中，所述磁珠纯化使用本发明的DNA纯化磁珠试剂进行，所述结合液纯化使用本发明的结合液进行。
在本说明书中，“磁珠绑定”是指在整个建库过程中均使磁珠与DNA处于同一个体系中，即不通过离心、过滤等操作将磁珠从体系中除去。
本发明人经过研究发现，本发明的DNA纯化磁珠试剂、以及本发明的结合液进行纯化的情况下，纯化效率提高，使得即使对于微量样本，也能够获得高质量的测序用DNA文库。在本说明书中，微量样本是指0.1～10ng、优选1～10ng的起始DNA片段量(希望进行测序的DNA片段的量)。对于步骤A中的“希望进行测序的DNA片段”没有特殊限制，从测序仪可接受的角度来看，优选是10～1000bp左右、更优选是20～800bp左右、更优选是30～750bp左右、更优选是40～700bp左右、更优选是50～650bp左右、更优选是100～600bp左右、更优选是150～550bp左右的DNA片段。
优选地，所述步骤B中可以将所述平末端DNA片段进行3'端加A并进行结合液纯化，得到3'端加A的DNA片段。
本发明中，对于磁珠纯化的方式没有特殊限制，例如可以按下述方式进行：
1)向DNA中按比例加入磁珠试剂，静置使DNA与磁珠结合，
2)吸附至磁力架，使磁珠吸附汇聚于磁力架一侧，
3)保持磁珠一直处于吸附状态，移去上清废液，并使用乙醇清洗磁珠，
4)移去上清废液，将磁珠于室温下晾干，
5)使用纯水或低盐的Tris-HCl溶液重悬磁珠，洗脱磁珠上结合的DNA。
本发明中，对于结合液纯化的方式没有特殊限制，例如可以按下述方式进行：
1)向包含磁珠和DNA的体系中加入结合液，混匀后静置使DNA与磁珠结合，
2)吸附至磁力架，使磁珠吸附汇聚于磁力架一侧，
3)保持磁珠一直处于吸附状态，移去上清废液，并使用乙醇清洗磁珠，
4)移去上清废液，将磁珠于室温下晾干，
5)使用纯水或低盐的Tris-HCl溶液重悬磁珠，洗脱磁珠上结合的DNA。
此外，在另一个方面中，本发明提供一种测序方法(本发明的测序方法)，其中，以采用本发明的构建方法构建的二代测序文库作为对象进行测序。
除了以采用本发明的构建方法构建的二代测序文库作为对象之外，本发明的测序方法可以采用本技术领域的常规方法来进行。优选地，本发明的测序方法可以利用例如Illumina平台(例如HiSeq 2500或NextSeq 500)进行。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解，此处所描述的实施例是用于解释本发明，而非用于限定本发明。:
实施例1 使用本发明的磁珠试剂用于DNA纯化及片段筛选
(以下试剂，未特殊说明的，均购自enzymatic公司)
磁珠试剂配方：
1)1重量％羧基修饰磁珠(GE公司购买)
2)22重量％PEG12000
3)2M NaCl
4)20mM Tris-HCl，pH8.0
5)1mM EDTA，pH8.0
洗脱液使用10mM pH8.5的Tris-HCl溶液。
待纯化样本为包含70bp、120bp、350bp、500bp、850bp的多种DNA片段混合而成的DNA样本。
DNA纯化过程：
1)向待纯化反应液(50μL)中加入样本不同倍数体积的磁珠试剂(如50μL样本中，1.8倍体积即加入90μL磁珠试剂，1.5倍体积即75μL磁珠试剂，依此类推)，充分吹打混匀，室温静置5分钟。加入体积比例分组如下表。
2)置于磁力架3-5分钟吸附磁珠颗粒，轻轻吸弃清液。
3)加入100μL75％乙醇，整个过程避免碰到磁珠。
4)静置2-3分钟，吸弃上清液。
5)重复步骤3、4，吸净残留的乙醇。
6)静置5分钟使乙醇蒸发干净。
7)加入50μL 10mM Tris-HCl(pH8.5)溶液，充分混匀静置5分钟洗脱DNA。
8)置于磁力架3-5分钟，将洗脱下的DNA溶液转移置新管中。
使用安捷伦2100生物分析仪对所得产物进行检测，结果如图1所示。
从图1的检测结果可以看出，磁珠试剂能够高效的回收溶液中的DNA，并且随着磁珠试剂用量不同，对于不同分子量大小的DNA片段具有选择性的回收能力。可以有效的去除小片段DNA分子。
实施例2 使用本发明的磁珠试剂用于构建测序用DNA文库
磁珠试剂配方：
1)0.1重量％羧基修饰磁珠(GE公司购买)
2)22重量％PEG12000
3)2M NaCl
4)20mM Tris-HCl，pH8.0
5)1mM EDTA，pH8.0
样本准备：准备2ng 200bp大小范围的DNA片段，加水稀释至41μL。DNA片段通过使用Biorupter打断基因组DNA获取。
一、补平末端：
1.利用末端修复体系，将片段化的DNA文库末端补平。补平末端反应体系为：
补平末端反应条件为：20℃，30分钟。
2.磁珠纯化：
1)向反应液中加入样本1.8倍体积的磁珠试剂(90μL)，充分吹打15次，混匀，室温静置5分钟。
2)打开管盖并置于磁力架3-5分钟吸附磁珠颗粒，轻轻吸弃清液。
3)加入100μL75％乙醇，注意整个过程不要碰到磁珠。
4)静置2-3分钟，吸弃上清液。
5)重复步骤3、4，这一步要把残留的乙醇吸干净。
6)静置5分钟使乙醇尽量蒸发干净。
7)加入22μL 10mM Tris-HCl(pH8.5)溶液，充分混匀静置5分钟洗脱DNA。
8)置于磁力架3-5分钟，将洗脱下的DNA溶液转移置新管中。
二、DNA文库末端加A尾：
1.利用末端加A体系将修复后的DNA片段末端加A。末端加A反应体系为：
将加A反应液加入上步反应产物磁珠中，
加A尾反应条件为：37℃，30分钟。
2.磁珠纯化：
1)向反应液中加入样本1.8倍体积的磁珠试剂(45μL)，充分吹打15次，混匀，室温静置5分钟。
2)打开管盖并置于磁力架3-5分钟吸附磁珠颗粒，轻轻吸弃清液。
3)加入100μL75％乙醇，注意整个过程不要碰到磁珠。
4)静置2-3分钟，吸弃上清液。
5)重复步骤3、4，这一步要把残留的乙醇吸干净。
6)静置5分钟使乙醇尽量蒸发干净。
7)加入26μL 10mM Tris-HCl(pH8.5)溶液，充分混匀静置5分钟洗脱DNA。
8)置于磁力架3-5分钟，将洗脱下的DNA溶液转移置新管中。
三、DNA文库加上接头：
1.使用接头链接体系将具有3'T末端的文库接头分子连接到具有A末端的DNA片段上。
接头连接反应体系为：
20℃，15分钟，注意PCR仪热盖要打开。
2.磁珠纯化：
1)向反应液中加入样本1.8倍体积的磁珠试剂(100μL)，充分吹打15次，混匀，室温静置5分钟。
2)打开管盖并置于磁力架3-5分钟吸附磁珠颗粒，轻轻吸弃清液。
3)加入100μL75％乙醇，注意整个过程不要碰到磁珠。
4)静置2-3分钟，吸弃上清液。
5)重复步骤3、4，这一步要把残留的乙醇吸干净。
6)静置5分钟使乙醇尽量蒸发干净。
7)加入24μL 10mM Tris-HCl(pH8.5)溶液，充分混匀静置5分钟洗脱DNA。
8)置于磁力架3-5分钟，将洗脱下的DNA溶液转移置新管中。
四、文库PCR反应：
1.使用文库PCR反应体系对完成接头连接的DNA分子进行文库扩增，反应体系及条件如下：
PCR反应体系：
将PCR反应液加入上步反应产物磁珠中，进行文库扩增PCR反应。
PCR反应条件：
| 步骤 | 反应温度 | 反应时间 |
| ① | 95℃ | 30秒 |
| ② | 95℃ | 10秒 |
| ③ | 65℃ | 30秒 |
| ④ | 72℃ | 30秒 |
| ⑤ | Go to② | 循环数:10 |
| ⑥ | 72℃ | 7分钟 |
| ⑦ | 4℃ | 待机 |
2.磁珠纯化去除接头二聚体：
1)向反应液中加入样本0.9倍体积的磁珠试剂(45μL)，充分吹打15次，混匀，室温静置5分钟。
2)打开管盖并置于磁力架3-5分钟，轻轻吸弃清液。
3)加入100μL75％乙醇，注意整个过程不要碰到磁珠。
4)静置2-3分钟，吸弃上清液。
5)重复步骤3、4，这一步要把残留的乙醇吸干净。
6)静置5分钟使乙醇尽量蒸发干净。
7)加入30μL 10mM Tris-HCl(pH8.5)溶液，充分混匀静置5分钟洗脱DNA。
8)置于磁力架3-5分钟，将洗脱下的DNA溶液转移置新管中。
至此，获得文库产物用于检测及测序。
对比例1
像实施例2那样进行，但使用磁珠试剂为非专利文献1所述的“MagNA kit”。
对比例2
像实施例2那样进行，但使用磁珠试剂为非专利文献1所述的“MagNA kit”，且样本起始量为100ng。
使用Qubit2.0荧光定量检测文库浓度，从而确定文库产量。上述实施例1、对比例1～2中的文库产量计算结果如表1所示。
表1 文库产量计算结果：
| 实施例2 | 580ng |
| 对比例1 | 130ng |
| 对比例2 | 565ng |
从以上数据结果可知，对比例2使用的现有技术磁珠试剂可以在较高起始量的样本条件下获得较高的文库产量，但是在对比例1中的微量样本条件下仅能获得少量的文库产物。使用本发明的磁珠试剂进行低起始量的文库样本构建可以获得500ng以上的文库产物，与原有技术使用的磁珠试剂相比能显著提高获得的文库产量。
实施例3
重复专利文献1的实施例1，不同在于：1)使用本发明的磁珠试剂及结合液代替原方法中商品化AMpure磁珠及PEG溶液；2)使用2ng的DNA片段样本起始构建文库，且PCR循环数使用10个循环。
磁珠试剂配方：
1)0.1重量％羧基修饰磁珠(GE公司购买)
2)22重量％PEG12000
3)2M NaCl
4)20mM Tris-HCl，pH8.0
5)1mM EDTA，pH8.0
结合液配方：
1)22重量％PEG12000
2)2M NaCl
3)20mM Tris-HCl，pH8.0
4)1mM EDTA，pH8.0
对比例3
重复专利文献1的实施例1，不同在于：1)使用非专利文献1中的“MagNA kit”替代专利文献方法中的AMpureXP磁珠2)使用2ng的DNA片段样本起始构建文库，且PCR循环数使用10个循环。
对比例4
重复专利文献1的实施例1，不同在于：使用2ng的DNA片段样本起始构建文库，且PCR循环数使用10个循环。
使用Qubit2.0荧光定量检测文库浓度，从而确定文库产量。上述实施例3、对比例3和对比例4中的文库产量计算结果如表2所示。
表2 文库产量计算结果：
| 实施例3 | 835ng |
| 对比例3 | 590ng |
| 对比例4 | 570ng |
从以上数据结果可知，对比例3的原有技术方法在低起始量样本的文库构建中尽管在原方法上增加了文库扩增循环数目，但获得的产物量仍然较低。但相对的，使用实施例3中本专利的试剂并配套其方法，可以使相同PCR条件下的文库产物量获得有效的提升，显著的提高了微量样本的文库构建效率。
还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
工业实用性
提供一种具有片段选择纯化能力的DNA纯化磁珠试剂，以及使用该高效DNA纯化磁珠试剂，即使以微量样本作为起始，也能够构建高质量二代测序用DNA文库的方法。
Claims (4)
1.一种二代测序文库快速构建方法，其包括：
步骤A：将希望进行测序的DNA片段进行末端修复并进行磁珠纯化，得到平末端DNA片段，所述希望进行测序的DNA片段的量为0.1～10ng；
步骤B：将所述平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；
步骤C：将所述3'端加A的DNA片段加接头并进行结合液纯化，得到加接头DNA片段；和
步骤D：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物，对所述扩增产物进行结合液纯化，并洗脱与磁珠结合的所述扩增产物；
其中，所述磁珠纯化使用下述DNA纯化磁珠试剂进行，所述结合液纯化使用下述结合液进行；
所述DNA纯化磁珠试剂是具有片段选择性纯化能力的DNA纯化磁珠试剂，其包含：
0.05～1重量％的羧基修饰磁珠，
20～25重量％的PEG10000～15000，
1.9～2.3M的NaCl，
5-50mM的Tris-HCl，以及
0.5～5mM的EDTA，
并且，该DNA纯化磁珠试剂的pH值为7.5～8.5；
所述结合液是用于具有片段选择性纯化能力的DNA纯化磁珠试剂的结合液，其包含：
20～25重量％的PEG10000～15000，
1.9～2.3M的NaCl，
5-50mM的Tris-HCl，以及
0.5～5mM的EDTA，
并且，该结合液的pH值为7.5～8.5。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其中，所述步骤B中将所述平末端DNA片段进行3'端加A并进行结合液纯化，得到3'端加A的DNA片段。
3.下述具有片段选择性纯化能力的DNA纯化磁珠试剂用于权利要求1所述的二代测序文库快速构建方法的用途，其中所述磁珠纯化使用该具有片段选择性纯化能力的DNA纯化磁珠试剂进行；
该具有片段选择性纯化能力的DNA纯化磁珠试剂包含：
0.05～1重量％的羧基修饰磁珠，
15～30重量％的PEG10000～15000，
1.9～2.3M的NaCl，
5-50mM的Tris-HCl，以及
0.5～5mM的EDTA，
并且，该具有片段选择性纯化能力的DNA纯化磁珠试剂的pH值为7.5～8.5。
4.下述用于具有片段选择性纯化能力的DNA纯化磁珠试剂的结合液用于权利要求1所述的二代测序文库快速构建方法的用途，其中所述结合液纯化使用该用于具有片段选择性纯化能力的DNA纯化磁珠试剂的结合液进行；
用于具有片段选择性纯化能力的DNA纯化磁珠试剂的结合液包含：
15～30重量％的PEG10000～15000，
1.9～2.3M的NaCl，
5-50mM的Tris-HCl，以及
0.5～5mM的EDTA，
并且，该用于具有片段选择性纯化能力的DNA纯化磁珠试剂的结合液的pH值为7.5～8.5。
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