CN116716385A - 一种单细胞测序的方法及电子设备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单细胞测序的方法及电子设备，用于通过在RNA逆转录过程中添加特异性标签，来区分DNA和RNA信息。该方法包括：从遗传信息载体中提取核酸样本，所述核酸样本包括RNA序列和DNA序列；利用第一接头序列将所述RNA序列逆转录为cDNA序列，将DNA序列和cDNA序列确定为文库样本；所述第一接头序列包括第一标签序列和Oligo(dT)，所述第一接头序列和所述RNA序列通过Oligo(dT)互补配对，所述第一接头序列用于区分RNA序列和DNA序列；在所述文库样本的两端添加第二接头序列，通过所述第二接头序列连接测序芯片，利用所述测序芯片对所述文库样本的碱基信息进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及单细胞测序技术领域，特别涉及一种单细胞测序的方法及电子设备。
背景技术
单细胞测序是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析，它能够弥补传统高通量测序的局限性，揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性。单细胞水平的DNA和RNA测序，可以将DNA信息和RNA信息一一对应，更好的揭示遗传信息的传递和基因表达情况。
目前对于DNA和RNA同时建库，一般是先将RNA逆转录为cDNA后作为单一样本与DNA样本混合，然后经过DNA建库流程进行建库，对文库中的每个样本进行标签化，从而利用测序芯片对每个样本进行测序，但是无法区分样本中原始的DNA和RNA信息。
发明内容
本发明提供一种单细胞测序的方法及电子设备，用于通过在RNA逆转录过程中添加特异性标签，来区分DNA和RNA信息。
第一方面，本发明实施例提供的一种单细胞测序的方法，该方法包括：
从遗传信息载体中提取核酸样本，所述核酸样本包括RNA序列和DNA序列；
利用第一接头序列将所述RNA序列逆转录为cDNA序列，将DNA序列和cDNA序列确定为文库样本；所述第一接头序列包括第一标签序列和Oligo(dT)，所述第一接头序列和所述RNA序列通过Oligo(dT)互补配对，所述第一接头序列用于区分RNA序列和DNA序列；
在所述文库样本的两端添加第二接头序列，通过所述第二接头序列连接测序芯片，利用所述测序芯片对所述文库样本的碱基信息进行检测。
本实施例提供一种单细胞测序的方法，通过在RNA序列逆转录的过程中添加第一接头序列来区分RNA序列和DNA序列，即包含第一接头序列所在的文库样本为RNA序列逆转录得到的cDNA序列，从而推算出原始RNA序列信息。
作为一种可选的实施方式，所述从遗传信息载体中提取核酸样本，包括：
从遗传信息载体中提取核酸；
将所述核酸打断成多个核酸片段，将每个核酸片段确定为所述核酸样本。
作为一种可选的实施方式，所述利用第一接头序列将所述RNA序列逆转录为cDNA序列，包括：
在所述RNA序列的3′末端添加POLY(A)；
利用所述第一接头序列的Oligo(dT)捕获所述POLY(A)，并在逆转录酶的作用下，将所述RNA序列逆转录为cDNA序列。
作为一种可选的实施方式，所述在所述RNA序列的3′末端添加POLY(A)，包括：
在PolyA聚合酶的作用下，以所述RNA序列为模板，在所述RNA序列的3′末端添加多个A碱基。
作为一种可选的实施方式，所述在所述文库样本的两端添加第二接头序列之前，还包括：
使用具有核酸外切酶活性的酶，对所述文库样本进行末端补平处理，得到平末端结构的文库样本。
作为一种可选的实施方式，所述具有核酸外切酶活性的酶包括T4 DNA聚合酶和Klenow酶。
作为一种可选的实施方式，所述得到平末端结构的文库快样本之后，还包括：
在所述平末端结构的文库样本的5′末端进行磷酸化；
在所述平末端结构的文库样本的3′末端添加POLY(A)。
作为一种可选的实施方式，所述第二接头序列包括固定序列、第二标签序列和通用测序引物结合序列；
所述固定序列用于连接所述测序芯片，所述固定序列和所述测序芯片上的接头序列互补配对；所述第二标签序列用于区分不同的文库样本；所述通用测序引物结合序列用于结合通用测序引物。
作为一种可选的实施方式，所述方法还包括磁珠纯化和扩增富集：
通过富集引物，利用PCR技术，在dNTP和DNA聚合酶的作用下对所述文库样本中的碱基序列进行扩增。
作为一种可选的实施方式，所述利用所述测序芯片对所述文库样本的碱基信息进行检测，包括：
当利用所述测序芯片检测到第一接头序列时，确定所述文库样本为cDNA序列，对所述cDNA序列的碱基信息进行检测，并推算出对应的RNA序列的碱基信息；或，
当利用所述测序芯片未检测到第一接头序列时，确定所述文库样本为DNA序列，对所述DNA序列的碱基信息进行检测。
第二方面，本发明实施例提供的一种电子设备，包括处理器和存储器，所述存储器用于存储所述处理器可执行的程序，所述处理器用于读取所述存储器中的程序并执行如下步骤：
从遗传信息载体中提取核酸样本，所述核酸样本包括RNA序列和DNA序列；
利用第一接头序列将所述RNA序列逆转录为cDNA序列，将DNA序列和cDNA序列确定为文库样本；所述第一接头序列包括第一标签序列和Oligo(dT)，所述第一接头序列和所述RNA序列通过Oligo(dT)互补配对，所述第一接头序列用于区分RNA序列和DNA序列；
在所述文库样本的两端添加第二接头序列，通过所述第二接头序列连接测序芯片，利用所述测序芯片对所述文库样本的碱基信息进行检测。
作为一种可选的实施方式，所述处理器具体被配置为执行：
从遗传信息载体中提取核酸；
将所述核酸打断成多个核酸片段，将每个核酸片段确定为所述核酸样本。
作为一种可选的实施方式，所述处理器具体被配置为执行：
在所述RNA序列的3′末端添加POLY(A)；
利用所述第一接头序列的Oligo(dT)捕获所述POLY(A)，并在逆转录酶的作用下，将所述RNA序列逆转录为cDNA序列。
作为一种可选的实施方式，所述处理器具体被配置为执行：
在PolyA聚合酶的作用下，以所述RNA序列为模板，在所述RNA序列的3′末端添加多个A碱基。
作为一种可选的实施方式，所述在所述文库样本的两端添加第二接头序列之前，所述处理器具体还被配置为执行：
使用具有核酸外切酶活性的酶，对所述文库样本进行末端补平处理，得到平末端结构的文库样本。
作为一种可选的实施方式，所述具有核酸外切酶活性的酶包括T4 DNA聚合酶和Klenow酶。
作为一种可选的实施方式，所述得到平末端结构的文库快样本之后，所述处理器具体还被配置为执行：
在所述平末端结构的文库样本的5′末端进行磷酸化；
在所述平末端结构的文库样本的3′末端添加POLY(A)。
作为一种可选的实施方式，所述第二接头序列包括固定序列、第二标签序列和通用测序引物结合序列；
所述固定序列用于连接所述测序芯片，所述固定序列和所述测序芯片上的接头序列互补配对；所述第二标签序列用于区分不同的文库样本；所述通用测序引物结合序列用于结合通用测序引物。
作为一种可选的实施方式，所述处理器具体还被配置为执行磁珠纯化和扩增富集：
通过富集引物，利用PCR技术，在dNTP和DNA聚合酶的作用下对所述文库样本中的碱基序列进行扩增。
作为一种可选的实施方式，所述处理器具体被配置为执行：
当利用所述测序芯片检测到第一接头序列时，确定所述文库样本为cDNA序列，对所述cDNA序列的碱基信息进行检测，并推算出对应的RNA序列的碱基信息；或，
当利用所述测序芯片未检测到第一接头序列时，确定所述文库样本为DNA序列，对所述DNA序列的碱基信息进行检测。
第三方面，本发明实施例还提供一种单细胞测序的装置，该装置包括：
提取样本模块，用于从遗传信息载体中提取核酸样本，所述核酸样本包括RNA序列和DNA序列；
逆转录模块，用于利用第一接头序列将所述RNA序列逆转录为cDNA序列，将DNA序列和cDNA序列确定为文库样本；所述第一接头序列包括第一标签序列和Oligo(dT)，所述第一接头序列和所述RNA序列通过Oligo(dT)互补配对，所述第一接头序列用于区分RNA序列和DNA序列；
接头连接模块，用于在所述文库样本的两端添加第二接头序列，通过所述第二接头序列连接测序芯片，利用所述测序芯片对所述文库样本的碱基信息进行检测。
第四方面，本发明实施例还提供计算机存储介质，其上存储有计算机程序，该程序被处理器执行时用于实现上述第一方面所述方法的步骤。
本申请的这些方面或其他方面在以下的实施例的描述中会更加简明易懂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简要介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的一种单细胞测序的方法的实施流程图；
图2为本发明实施例提供的一种核酸片段化的示意图；
图3为本发明实施例提供的一种RNA逆转录的示意图；
图4为本发明实施例提供的一种末端修复的示意图；
图5为本发明实施例提供的一种添加接头序列的示意图；
图6为本发明实施例提供的一种单细胞测序的具体实施流程图；
图7为本发明实施例提供的一种电子设备的示意图；
图8为本发明实施例提供的一种单细胞测序的装置示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明实施例描述的应用场景是为了更加清楚的说明本发明实施例的技术方案，并不构成对于本发明实施例提供的技术方案的限定，本领域普通技术人员可知，随着新应用场景的出现，本发明实施例提供的技术方案对于类似的技术问题，同样适用。其中，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
需要说明的是，本实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。本实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
高通量测序技术又称为第二代测序技术(NGS)，是指一次并行对几十万到几百万条DNA(Deoxyribonucleic Acid，脱氧核糖核酸)或RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)分子进行序列测定的技术。高通量测序主要包括以下流程：样本的收集和核酸提取，靶向序列富集和测序文库构建，测序和结果分析。DNA测序主要用于鉴定和评估基因变异带来的致病性影响，而RNA测序多用于基因融合事件检测。将DNA检测与RNA检测相结合，可更大程度的提高临床获益率。
单细胞测序(single cell sequencing，简称scRNA-seq)，就是能对单个细胞进行测序，提供了在单细胞水平观测基因表达的方法，可以更好地研究这些组织及其中存在的不同类型的细胞，将达到单细胞水平的分辨率。单细胞测序是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析，它能够弥补传统高通量测序的局限性，揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性。单细胞水平的DNA和RNA测序，可以将DNA信息和RNA信息一一对应，更好的揭示遗传信息的传递和基因表达情况。
目前对于DNA和RNA同时建库，一般是将RNA先经过逆转录为cDNA(complementaryDNA，互补脱氧核糖核酸)后，与DNA混合，然后经过正常的DNA建库流程进行建库。建库的标签化是在DNA两端加标签，用以区分不同样本，而无法对单一样本的DNA和cDNA(即RNA)区分。
本实施例提供一种单细胞测序的方法，通过在RNA序列逆转录的过程中添加第一接头序列来区分RNA序列和DNA序列，即包含第一接头序列所在的文库样本为RNA序列逆转录得到的cDNA序列，从而推算出原始RNA序列信息。
如图1所示，本实施例提供的一种单细胞测序的方法的实施流程如下所示：
步骤100、从遗传信息载体中提取核酸样本，所述核酸样本包括RNA序列和DNA序列；
实施中，本实施例中的遗传信息载体为单细胞。可选的，本实施例中的遗传信息载体包括但不限于血液、细胞、唾液、骨髓、皮肤、动物组织、植物组织、土壤、细菌培养液等多种类型。
在一些实施例中，通过如下方式从遗传信息载体中提取核酸样本：
从遗传信息载体中提取核酸；将所述核酸打断成多个核酸片段，将每个核酸片段确定为所述核酸样本。
需要说明的是，本实施例中的RNA序列是对提取的原始的RNA打断成多个RNA片段得到的，本实施例中的DNA序列是对提取的原始的DNA打断成多个DNA片段得到的。
可选的，核酸提取所需的试剂包括但不限于：蛋白酶、核酸提取缓冲液、硅基磁珠、异丙醇、羧基磁珠、核酸提取洗脱液1、核酸提取洗脱液2、RNase water。
实施中，获得单细胞(遗传信息载体)后，使用磁珠法对单细胞进行DNA和RNA的提取。单细胞破裂后，在蛋白酶K的作用下，DNA和RNA释放到消化液中，加入硅基磁珠和高浓度的胍盐，DNA会吸附至硅基磁珠上，而RNA不吸附。加入羧基磁珠时，RNA会吸附至羧基磁珠上，从而达到分选的效果。吸附DNA或RNA的磁珠分别经过清洗去除杂质，最后用少量洗脱液或水洗脱出DNA和RNA，磁珠在磁场作用分离去除。对洗脱后的核酸(DNA和RNA)进行质量、纯度及完整性的评判。
本实施例还提供一种核酸提取的具体实施流程如下所示：
(1)向单细胞悬液中加入适量蛋白酶、核酸提取缓冲液和硅基磁珠，混匀，磁力架上吸附，分离上清液和磁珠分别用于提取RNA和DNA。向上清液中加入异丙醇和羧基磁珠，混匀，磁力架上吸附，吸弃溶液并保留磁珠。
(2)向磁珠中加入洗脱液1，混匀，磁力架上吸附，吸弃溶液。
(3)加入洗脱液2，混匀，磁力架上吸附，吸弃溶液。重复一次。
(4)晾干后用RNase(Ribonuclease，核糖核酸酶)water(水)，混匀，磁力架上吸附后收集上清液，得到DNA和RNA溶液。
(5)用紫外分光光度计对得到的核酸溶液进行纯度检测，DNA OD260/280≈1.8，RNA OD260/280≈2.0，有蛋白质污染时OD260/280会降低。OD260/230＜2.3说明有碳水化合物残留。
(6)用荧光染料法对核酸溶液中DNA和RNA的浓度进行测定，荧光染料与特异的靶分子选择性结合。
(7)DNA/RNA完整性可通过毛细管电泳的条带位置判定，降解的RNA会在低分子量的条带位置上呈现弥散状，而完整的RNA有明显的理想条带(18S、28S)，RIN值＞7代表RNA完整性高。
实施中，当提取出核酸后，使用超声打断仪将核酸打断成250～300bp大小的多个核酸片段，将每个核酸片段作为一个核酸样本进行后续检测。如图2所示，本实施例提供一种核酸片段化的示意图。
步骤101、利用第一接头序列将所述RNA序列逆转录为cDNA序列，将DNA序列和cDNA序列确定为文库样本；所述第一接头序列包括第一标签序列和Oligo(dT)，所述第一接头序列和所述RNA序列通过Oligo(dT)互补配对，所述第一接头序列用于区分RNA序列和DNA序列；
其中，Oligo(dT)为只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链，可选的，本实施例中的Oligo(dT)也可以用多聚胸腺嘧啶替代。
在一些实施例中，所述第一接头序列包括第一标签序列和Oligo(dT)，所述第一标签序列用于标识RNA序列；所述第一接头序列组成为“5’-n-TTTTTTT-3’”，其中n可能为包含4～10个随机核苷酸的第一标签序列，第一接头序列包括Oligo(dT)，本实施例对Oligo(dT)的数量不作过多限定，上述第一接头序列仅为一种示例，具体的n和Oligo(dT)的数量可以是随机确定的，本实施例对此不作过多限定。
实施中，第一接头序列的结构组成原则是，需要和RNA序列结构形成互补配对的结构。
可选的，通过如下方式利用第一接头序列将所述RNA序列逆转录为cDNA序列：
步骤a、在所述RNA序列的3′末端添加POLY(A)；
实施中，在每个RNA序列(即RNA片段)的3′末端添加多个POLY(A)，例如可以添加20～200个POLY(A)。
可选的，通过如下方式在所述RNA序列的3′末端添加POLY(A)：
在PolyA聚合酶的作用下，以所述RNA序列为模板，在所述RNA序列的3′末端添加多个A碱基POLY(A)。
实施中，添加poly(A)所需的试剂包括但不限于聚合缓冲液1、PolyA聚合酶、ddH2O等。具体通过如下操作方法添加POLY(A)：
(1)将片段化后的RNA序列、聚合缓冲液、PolyA聚合酶和ddH2O按照一定比例配置并混匀后，进行PCR反应。
(2)PCR反应条件参考如下：
| 温度 | 时间 |
| 37℃ | 60min |
| 85℃ | 5min |
步骤b、利用所述第一接头序列的Oligo(dT)捕获所述POLY(A)，并在逆转录酶的作用下，将所述RNA序列逆转录为cDNA序列。
实施中，加入第一接头序列(barcode1)，例如，barcode1序列组成为“5’-n-TTTTTTT-3’”，其中n为包含4～10个随机核苷酸的第一标签序列，T表示Oligo(dT)，Oligo(dT)的数量为多个，利用第一接头序列中的多个Oligo(dT)捕获新的RNA序列中的POLY(A)，在逆转录酶的作用下，RNA逆转录成cDNA。
实施中，RNA逆转录所需的试剂包括但不限于逆转录缓冲液、逆转录酶、聚合缓冲液2、DNA聚合酶、barcode1序列、ddH2O等。具体逆转录的实施步骤如下：
步骤b1、将双链cDNA合成所需组分，RNA、逆转录缓冲液、逆转录酶、barcode1序列和ddH2O按照一定比例配置并混匀后，进行PCR反应。
步骤b2、PCR进行第一链cDNA合成反应；
其中，反应条件参考如下：
| 温度 | 时间 |
| 25℃ | 10min |
| 42℃ | 15min |
| 70℃ | 15min |
步骤b3、取上一步的产物，与聚合缓冲液2、DNA聚合酶和ddH2O按照一定比例配置并混匀后，进行PCR反应。
步骤b4、PCR进行第二链cDNA合成反应；
反应条件参考如下：
| 温度 | 时间 |
| 16℃ | 30min |
| 65℃ | 15min |
如图3所示，本实施例还提供一种RNA逆转录的示意图，在片段化后的多个RNA序列的3′末端添加POLY(A)，然后利用第一接头序列(barcode1)的Oligo(dT)捕获新的RNA序列中的POLY(A)，形成互补配对的结构，在逆转录酶的作用下，将RNA序列逆转录为cDNA序列。需要说明的是，在RNA逆转录的过程中，不对DNA序列进行操作。
在一些实施例中，当将RNA序列逆转录为cDNA序列后，以及对提取的DNA进行片段化得到多个DNA序列后，将DNA序列和cDNA序列作为文库样本进行后续的检测。
可选的，得到文库样本后，先执行末端修复操作，具体实施步骤如下：
使用具有核酸外切酶活性的酶，对所述文库样本进行末端补平处理，得到平末端结构的文库样本。可选的，所述具有核酸外切酶活性的酶包括T4 DNA聚合酶和Klenow酶。
可选的，得到平末端结构的文库样本之后，还可以在所述平末端结构的文库样本的5′末端进行磷酸化；在所述平末端结构的文库样本的3′末端添加POLY(A)。
实施中，使用具有核酸外切酶活性的T4 DNA聚合酶及Klenow酶将DNA和从DNA末端悬垂结构补平为平末端，并在5’端进行磷酸化和3’端加dA尾。
可选的，末端修复所需的试剂包括但不限于：末端修复缓冲液、末端修复酶、ddH2O等，具体操作步骤如下：
实施中，将逆转录得到的cDNA序列和DNA序列、末端修复缓冲液、末端修复酶和ddH2O按照一定比例配置并混匀后，进行PCR反应。
其中，PCR反应条件参考如下：
| 温度 | 时间 |
| 20℃ | 30min |
| 65℃ | 30min |
| 4℃ | Hold |
如图4所示，本实施例提供一种末端修复的示意图，对文库样本的末端进行补平处理后，在所述平末端结构的文库样本的5′末端进行磷酸化，以及在所述平末端结构的文库样本的3′末端添加POLY(A)。
步骤102、在所述文库样本的两端添加第二接头序列，通过所述第二接头序列连接测序芯片，利用所述测序芯片对所述文库样本的碱基信息进行检测。
可选的，所述第二接头序列包括固定序列、第二标签序列和通用测序引物结合序列；
所述固定序列用于连接所述测序芯片，所述固定序列和所述测序芯片上的接头序列互补配对；所述第二标签序列用于区分不同的文库样本；所述通用测序引物结合序列用于结合通用测序引物。
实施中，在DNA连接酶的作用下，第二接头序列连接在DNA序列两端。第二接头序列的组成包括“P5/P7+barcode2+adaptor”，其中P5/P7(固定序列)与测序芯片上P5/P7序列互补，第二标签序列(barcode2)为包含4～10个随机核苷酸的序列，通用测序引物结合序列(adaptor)与通用测序引物结合，在dNTP和DNA聚合酶的作用下能够进行碱基的延伸。
需要说明的是，文库样本的两端第二接头序列的固定序列互补，即如果文库样本的一端的第二接头序列为“P5+barcode2+adaptor”，则该文库样本的另一端的第二接头序列为“P7+barcode2+adaptor”。
实施中，添加第二接头序列所需的试剂包括但不限于：接头连接缓冲液、连接酶、接头引物、ddH2O等；添加第二接头序列的具体操作方法如下：
将文库样本(末端修复产物)、接头连接缓冲液Buffer、连接酶DNA Ligase、第二接头序列和ddH2O按照一定比例配置并混匀后，进行PCR反应。
其中，PCR反应条件参考如下：
如图5所示，本实施例还提供一种添加第二接头序列的示意图，在文库样本的两端添加第二接头序列，其中第二接头序列包括固定序列(如P5/P7)、第二标签序列(barcode2)和通用测序引物结合序列(adaptor)。其中，在cDNA序列添加第二接头序列后，结构包括P5-barcode2-adaptor1-cDNA-barcode1-adaptor2-barcode2-P7。在DNA序列添加第二接头序列后，结构包括P5-barcode2-adaptor1-DNA-adaptor2-barcode2-P7。
在一些实施例中，还包括磁珠纯化和扩增富集：
通过如下方式对所述文库样本中的碱基序列进行扩增：
通过富集引物，利用PCR技术，在dNTP和DNA聚合酶的作用下对所述文库样本中的碱基序列进行扩增。
可选的，在文库样本的两端添加第二接头序列后，还进行文库纯化操作，文库纯化所需的试剂包括但不限于：纯化磁珠、80％乙醇、纯化洗脱液等；具体操作步骤如下所示：
(1)向接头连接后的PCR产物(添加接头序列的文库样本)中按照一定比例加入纯化磁珠，混匀后静置，磁力架上吸附，吸弃溶液。
(2)使用80％乙醇清洗2次，吸弃溶液。
(3)室温晾干后，用纯化洗脱液洗脱保存。
可选的，在执行文库纯化操作后，还执行文库扩增，对纯化后的接头连接产物(纯化后的文库样本)进行PCR扩增。实施中，文库扩增所需的试剂包括但不限于：扩增缓冲液、扩增引物、ddH2O等；具体操作方法如下：
将纯化产物、扩增缓冲液、扩增序列和ddH2O按照一定比例配置并混匀后，进行PCR反应。其中，PCR反应条件参考如下：
在本实施例中，barcode1和barcode2组合使用，用以区分样本中初始DNA和RNA信息，含有barcode1序列信息的所在序列为初始RNA逆转录的第一条cDNA，从而推算出原始RNA序列信息。barcode2用于文库混合测序时区分不同的文库样本。
在一些实施例中，利用所述测序芯片对所述文库样本的碱基信息进行检测，具体检测过程如下所示：
当利用所述测序芯片检测到第一接头序列时，确定所述文库样本为cDNA序列，对所述cDNA序列的碱基信息进行检测，并推算出对应的RNA序列的碱基信息；
当利用所述测序芯片未检测到第一接头序列时，确定所述文库样本为DNA序列，对所述DNA序列的碱基信息进行检测。
本实施例通过在RNA逆转录过程中引入barcode1标签，与接头连接过程中的barcode2标签组合，用以区分样本中原始DNA和RNA信息。含有barcode1序列信息的所在序列为初始RNA逆转录的第一条cDNA，从而推算出原始RNA序列信息。barcode2用于文库混合测序时区分不同的文库样本。
如图6所示，本实施例还提供一种单细胞测序的具体实施流程，如下所示：
步骤600、从遗传信息载体中提取核酸；
其中，所述核酸样本包括RNA序列和DNA序列；
步骤601、将核酸打断成多个核酸片段，将每个核酸片段作为核酸样本；
步骤602、在PolyA聚合酶的作用下，以RNA序列为模板，在RNA序列的3′末端添加多个POLY(A)；
步骤603、利用第一接头序列的Oligo(dT)捕获POLY(A)，并在逆转录酶的作用下，将RNA序列逆转录为cDNA序列；
步骤604、将DNA序列和cDNA序列确定为文库样本；
步骤605、使用具有核酸外切酶活性的T4 DNA聚合酶及Klenow酶，对文库样本进行末端补平处理，得到平末端结构的文库样本；
步骤606、在平末端结构的文库样本的5′末端进行磷酸化，在3′末端添加POLY(A)；
步骤607、在文库样本的两端添加第二接头序列，通过第二接头序列连接测序芯片，利用测序芯片对文库样本的碱基信息进行检测。
其中，第二接头序列包括固定序列、第二标签序列和通用测序引物结合序列；所述固定序列用于连接所述测序芯片，所述固定序列和所述测序芯片上的接头序列互补配对；所述第二标签序列用于区分不同的文库样本；所述通用测序引物结合序列用于结合通用测序引物。
本实施例旨在开发一种适用于单细胞测序DNA和RNA特异性标签化的方法，通过特异性标签，区分DNA和RNA信息；barcode1和barcode2组合使用，用以区分样本中初始DNA和RNA信息，含有barcode1序列信息的所在序列为初始RNA逆转录的第一条cDNA，从而推算出原始RNA序列信息。barcode2用于文库混合测序时区分不同的文库样本。同一细胞的基因组和转录组图谱，可以更好地分辨末分化细胞和发育轨迹上的细胞类型，揭示调控元件、基因序列和基因表达之间复杂的相互作用。具体应用场景可以是肿瘤早筛、预后和疾病预测。
基于相同的发明构思，本发明实施例还提供了一种电子设备，由于该电子设备即是本发明实施例中的方法中的电子设备，并且该电子设备解决问题的原理与该方法相似，因此该电子设备的实施可以参见方法的实施，重复之处不再赘述。
如图7所示，该电子设备包括处理器700和存储器701，所述存储器701用于存储所述处理器700可执行的程序，所述处理器700用于读取所述存储器701中的程序并执行如下步骤：
从遗传信息载体中提取核酸样本，所述核酸样本包括RNA序列和DNA序列；
利用第一接头序列将所述RNA序列逆转录为cDNA序列，将DNA序列和cDNA序列确定为文库样本；所述第一接头序列包括第一标签序列和Oligo(dT)，所述第一接头序列和所述RNA序列通过Oligo(dT)互补配对，所述第一接头序列用于区分RNA序列和DNA序列；
在所述文库样本的两端添加第二接头序列，通过所述第二接头序列连接测序芯片，利用所述测序芯片对所述文库样本的碱基信息进行检测。
作为一种可选的实施方式，所述处理器具体被配置为执行：
从遗传信息载体中提取核酸；
将所述核酸打断成多个核酸片段，将每个核酸片段确定为所述核酸样本。
作为一种可选的实施方式，所述处理器具体被配置为执行：
在所述RNA序列的3′末端添加POLY(A)；
利用所述第一接头序列的Oligo(dT)捕获所述POLY(A)，并在逆转录酶的作用下，将所述RNA序列逆转录为cDNA序列。
作为一种可选的实施方式，所述处理器具体被配置为执行：
在PolyA聚合酶的作用下，以所述RNA序列为模板，在所述RNA序列的3′末端添加多个A碱基。
作为一种可选的实施方式，所述在所述文库样本的两端添加第二接头序列之前，所述处理器具体还被配置为执行：
使用具有核酸外切酶活性的酶，对所述文库样本进行末端补平处理，得到平末端结构的文库样本。
作为一种可选的实施方式，所述具有核酸外切酶活性的酶包括T4 DNA聚合酶和Klenow酶。
作为一种可选的实施方式，所述得到平末端结构的文库快样本之后，所述处理器具体还被配置为执行：
在所述平末端结构的文库样本的5′末端进行磷酸化；
在所述平末端结构的文库样本的3′末端添加POLY(A)。
作为一种可选的实施方式，所述第二接头序列包括固定序列、第二标签序列和通用测序引物结合序列；
所述固定序列用于连接所述测序芯片，所述固定序列和所述测序芯片上的接头序列互补配对；所述第二标签序列用于区分不同的文库样本；所述通用测序引物结合序列用于结合通用测序引物。
作为一种可选的实施方式，所述处理器具体还被配置为执行磁珠纯化和扩增富集：
通过富集引物，利用PCR技术，在dNTP和DNA聚合酶的作用下对所述文库样本中的碱基序列进行扩增。
作为一种可选的实施方式，所述处理器具体被配置为执行：
当利用所述测序芯片检测到第一接头序列时，确定所述文库样本为cDNA序列，对所述cDNA序列的碱基信息进行检测，并推算出对应的RNA序列的碱基信息；或，
当利用所述测序芯片未检测到第一接头序列时，确定所述文库样本为DNA序列，对所述DNA序列的碱基信息进行检测。
基于相同的发明构思，本发明实施例还提供了一种单细胞测序的装置，由于该装置即是本发明实施例中的方法中的装置，并且该装置解决问题的原理与该方法相似，因此该装置的实施可以参见方法的实施，重复之处不再赘述。
如图8所示，该装置包括：
提取样本模块800，用于从遗传信息载体中提取核酸样本，所述核酸样本包括RNA序列和DNA序列；
逆转录模块801，用于利用第一接头序列将所述RNA序列逆转录为cDNA序列，将DNA序列和cDNA序列确定为文库样本；所述第一接头序列包括第一标签序列和Oligo(dT)，所述第一接头序列和所述RNA序列通过Oligo(dT)互补配对，所述第一接头序列用于区分RNA序列和DNA序列；
接头连接模块802，用于在所述文库样本的两端添加第二接头序列，通过所述第二接头序列连接测序芯片，利用所述测序芯片对所述文库样本的碱基信息进行检测。
作为一种可选的实施方式，所述提取样本模块800具体用于：
从遗传信息载体中提取核酸；
将所述核酸打断成多个核酸片段，将每个核酸片段确定为所述核酸样本。
作为一种可选的实施方式，所述逆转录模块801具体用于：
在所述RNA序列的3′末端添加POLY(A)；
利用所述第一接头序列的Oligo(dT)捕获所述POLY(A)，并在逆转录酶的作用下，将所述RNA序列逆转录为cDNA序列。
作为一种可选的实施方式，所述逆转录模块801具体用于：
在PolyA聚合酶的作用下，以所述RNA序列为模板，在所述RNA序列的3′末端添加多个A碱基。
作为一种可选的实施方式，所述在所述文库样本的两端添加第二接头序列之前，还包括末端修复模块具体用于：
使用具有核酸外切酶活性的酶，对所述文库样本进行末端补平处理，得到平末端结构的文库样本。
作为一种可选的实施方式，所述具有核酸外切酶活性的酶包括T4 DNA聚合酶和Klenow酶。
作为一种可选的实施方式，所述得到平末端结构的文库快样本之后，所述末端修复模块具体还用于：
在所述平末端结构的文库样本的5′末端进行磷酸化；
在所述平末端结构的文库样本的3′末端添加POLY(A)。
作为一种可选的实施方式，所述第二接头序列包括固定序列、第二标签序列和通用测序引物结合序列；
所述固定序列用于连接所述测序芯片，所述固定序列和所述测序芯片上的接头序列互补配对；所述第二标签序列用于区分不同的文库样本；所述通用测序引物结合序列用于结合通用测序引物。
作为一种可选的实施方式，还包括纯化扩增模块具体用于磁珠纯化和扩增富集：
通过富集引物，利用PCR技术，在dNTP和DNA聚合酶的作用下对所述文库样本中的碱基序列进行扩增。
作为一种可选的实施方式，所述接头连接模块802具体用于：
当利用所述测序芯片检测到第一接头序列时，确定所述文库样本为cDNA序列，对所述cDNA序列的碱基信息进行检测，并推算出对应的RNA序列的碱基信息；或，
当利用所述测序芯片未检测到第一接头序列时，确定所述文库样本为DNA序列，对所述DNA序列的碱基信息进行检测。
基于同一发明构思，本公开实施例提供一种计算机存储介质，计算机存储介质包括：计算机程序代码，当计算机程序代码在计算机上运行时，使得计算机执行如前文论述任一的单细胞测序的方法。由于上述计算机存储介质解决问题的原理与单细胞测序的方法相似，因此上述计算机存储介质的实施可以参见方法的实施，重复之处不再赘述。
在具体的实施过程中，计算机存储介质可以包括：通用串行总线闪存盘(USB，Universal Serial Bus Flash Drive)、移动硬盘、只读存储器(ROM，Read-Only Memory)、随机存取存储器(RAM，Random Access Memory)、磁碟或者光盘等各种可以存储程序代码的存储介质。
基于同一发明构思，本公开实施例还提供了一种计算机程序产品，该计算机程序产品包括：计算机程序代码，当该计算机程序代码在计算机上运行时，使得计算机执行如前文论述任一的单细胞测序的方法。由于上述计算机程序产品解决问题的原理与单细胞测序的方法相似，因此上述计算机程序产品的实施可以参见方法的实施，重复之处不再赘述。
计算机程序产品可以采用一个或多个可读介质的任意组合。可读介质可以是可读信号介质或者可读存储介质。可读存储介质例如可以是但不限于电、磁、光、电磁、红外线、或半导体的系统、装置或器件，或者任意以上的组合。可读存储介质的更具体的例子(非穷举的列表)包括：具有一个或多个导线的电连接、便携式盘、硬盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦式可编程只读存储器(EPROM或闪存)、光纤、便携式紧凑盘只读存储器(CD-ROM)、光存储器件、磁存储器件、或者上述的任意合适的组合。
本领域内的技术人员应明白，本发明的实施例可提供为方法、系统、或计算机程序产品。因此，本发明可采用完全硬件实施例、完全软件实施例、或结合软件和硬件方面的实施例的形式。而且，本发明可采用在一个或多个其中包含有计算机可用程序代码的计算机可用存储介质(包括但不限于磁盘存储器和光学存储器等)上实施的计算机程序产品的形式。
本发明是参照根据本发明实施例的方法、设备(系统)、和计算机程序产品的流程图和/或方框图来描述的。应理解可由计算机程序指令实现流程图和/或方框图中的每一流程和/或方框、以及流程图和/或方框图中的流程和/或方框的结合。可提供这些计算机程序指令到通用计算机、专用计算机、嵌入式处理机或其他可编程数据处理设备的处理器以产生一个机器，使得通过计算机或其他可编程数据处理设备的处理器执行的指令产生用于实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能的设备。
这些计算机程序指令也可存储在能引导计算机或其他可编程数据处理设备以特定方式工作的计算机可读存储器中，使得存储在该计算机可读存储器中的指令产生包括指令设备的制造品，该指令设备实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能。
这些计算机程序指令也可装载到计算机或其他可编程数据处理设备上，使得在计算机或其他可编程设备上执行一系列操作步骤以产生计算机实现的处理，从而在计算机或其他可编程设备上执行的指令提供用于实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能的步骤。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (12)
1.一种单细胞测序方法，其特征在于，该方法包括：
从遗传信息载体中提取核酸样本，所述核酸样本包括RNA序列和DNA序列；
利用第一接头序列将所述RNA序列逆转录为cDNA序列，将DNA序列和cDNA序列确定为文库样本；所述第一接头序列包括第一标签序列和Oligo(dT)，所述第一接头序列和所述RNA序列通过Oligo(dT)互补配对，所述第一接头序列用于区分RNA序列和DNA序列；
在所述文库样本的两端添加第二接头序列，通过所述第二接头序列连接测序芯片，利用所述测序芯片对所述文库样本的碱基信息进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述从遗传信息载体中提取核酸样本，包括：
从遗传信息载体中提取核酸；
将所述核酸打断成多个核酸片段，将每个核酸片段确定为所述核酸样本。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用第一接头序列将所述RNA序列逆转录为cDNA序列，包括：
在所述RNA序列的3′末端添加POLY(A)；
利用所述第一接头序列的Oligo(dT)捕获所述POLY(A)，并在逆转录酶的作用下，将所述RNA序列逆转录为cDNA序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在所述文库样本的两端添加第二接头序列之前，还包括：
使用具有核酸外切酶活性的酶，对所述文库样本进行末端补平处理，得到平末端结构的文库样本。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述具有核酸外切酶活性的酶包括T4 DNA聚合酶和Klenow酶。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述得到平末端结构的文库样本之后，还包括：
在所述平末端结构的文库样本的5′末端进行磷酸化；
在所述平末端结构的文库样本的3′末端添加POLY(A)。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二接头序列包括固定序列、第二标签序列和通用测序引物结合序列；
所述固定序列用于连接所述测序芯片，所述固定序列和所述测序芯片上的接头序列互补配对；所述第二标签序列用于区分不同的文库样本；所述通用测序引物结合序列用于结合通用测序引物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括磁珠纯化和扩增富集：
通过富集引物，利用PCR技术，在dNTP和DNA聚合酶的作用下对所述文库样本中的碱基序列进行扩增。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用所述测序芯片对所述文库样本的碱基信息进行检测，包括：
当利用所述测序芯片检测到第一接头序列时，确定所述文库样本为cDNA序列，对所述cDNA序列的碱基信息进行检测，并推算出对应的RNA序列的碱基信息；或，
当利用所述测序芯片未检测到第一接头序列时，确定所述文库样本为DNA序列，对所述DNA序列的碱基信息进行检测。
10.一种单细胞测序的装置，其特征在于，该装置包括：
提取样本模块，用于从遗传信息载体中提取核酸样本，所述核酸样本包括RNA序列和DNA序列；
逆转录模块，用于利用第一接头序列将所述RNA序列逆转录为cDNA序列，将DNA序列和cDNA序列确定为文库样本；所述第一接头序列包括第一标签序列和Oligo(dT)，所述第一接头序列和所述RNA序列通过Oligo(dT)互补配对，所述第一接头序列用于区分RNA序列和DNA序列；
接头连接模块，用于在所述文库样本的两端添加第二接头序列，通过所述第二接头序列连接测序芯片，利用所述测序芯片对所述文库样本的碱基信息进行检测。
11.一种电子设备，其特征在于，该电子设备包括处理器和存储器，所述存储器用于存储所述处理器可执行的程序，所述处理器用于读取所述存储器中的程序并执行权利要求1～9任一所述方法的步骤。
12.一种计算机存储介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，该程序被处理器执行时实现如权利要求1～9任一所述方法的步骤。
Priority Applications (1)
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| CN202310637331.5A CN116716385A (zh) | 2023-05-31 | 2023-05-31 | 一种单细胞测序的方法及电子设备 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202310637331.5A CN116716385A (zh) | 2023-05-31 | 2023-05-31 | 一种单细胞测序的方法及电子设备 |
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|---|---|
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