CN104480217A

CN104480217A - 一种简化基因组测序方法

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Publication number: CN104480217A
Application number: CN201410855165.7A
Authority: CN
Inventors: 孙子奎; 高文学; 丁方美; 王�锋; 唐嘉婕
Original assignee: SHANGHAI PERSONAL BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI PERSONAL BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2015-04-01

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种简化基因组测序方法，包含下述步骤：(1)以ⅡB型限制性内切酶对基因组DNA进行酶切；(2)对酶切产物连接接头一和接头二；(3)纯化连接产物；(4)对纯化后的产物进行PCR扩增；(5)纯化PCR产物，得到测序文库；(6)上机测序。本发明还提供了上述步骤(4)中对纯化后的连接产物进行扩增的PCR扩增体系及PCR程序，保证了本发明所提供的建库方法得以顺利实现且操作过程快捷。利用本发明所提供的方法对基因组DNA进行测序，得到的数据利用率较高、测序结果的准确可靠。

Description

一种简化基因组测序方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种简化基因组测序方法。

背景技术

简化基因组测序是一种对部分基因组进行序列测定的高通量测序方法。具体来说，它是指利用生物信息学方法，设计标记开发方案，富集特异性长度片段，然后应用高通量测序技术获得海量标签序列来代表目标物种全基因组信息的测序方法。

简化基因组测序常用的测序文库类型可以归纳为3个大类，①简化测序，包括简化文库和简化多态序列复杂性；②限制性酶切位点关联DNA测序；③低覆盖基因分型文库，包括多元鸟枪法基因分型和基于测序的基因分型。

基于Ⅱ B型限制性内切酶酶切的简化基因组测序，即2b-RAD，这个方法属于简化基因组测序方法中的限制性酶切位点关联DNA测序这一类。相比于其他类的简化基因组测序方法，2b-RAD在建库方法上有了新的改进，且成本更加便宜。该方法能涵盖基因组中的几乎全部限制酶切位点，不同于RRLs、CroPS和GBS等方法，仅仅能覆盖一个有限的区域，一般不超过500bp，所以可以更有效的进行PCR和测序。2b-RAD的操作方法比较简单，因此更适合于大批样本的同时分型。但是现有文献中记载的2b-RAD方法大多存在酶切不均匀导致标签数少，接头连接效率低和文库浓度低等不足之处。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种简化基因组测序方法，该测序方法步骤简捷易行、测序结果准确性高。

为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种简化基因组测序方法，包含下述步骤：(1)利用Ⅱ B型限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；(2)对酶切产物连接接头一和接头二，得到连接产物；(3)对连接产物进行纯化，得到纯化后的连接产物；(4)将纯化后的连接产物进行PCR扩增，得到PCR产物；(5)对PCR产物进行纯化，得到测序文库；(6)使用高通量测序平台对测序文库进行测序。

其中，步骤(4)中对纯化后的连接产物进行PCR扩增的反应体系如下所示：高保真DNA聚合酶1μL，5×HF Buffer 10μL，2.5mM dNTP 6μL，10μM SEQ ID NO：4(IC1-P5)所示的P5接头引物1μL，10μM SEQ ID NO：5(IC2-P7)所示的P7接头引物1μL，10μM SEQ ID NO：6(ILL-Mpx)所示的R2引物1μL，10μM带条形码序列的R1引物1μL，纯化后的连接产物20μL，ddH₂O 9μL，总50μL。其中(下述碱基序列中，*A和*T分别代表硫代修饰的A碱基和硫代修饰的T碱基)：

SEQ ID NO：4：5'-AATGATACGGCGACCACCG*A-3'

SEQ ID NO：5：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG*A-3'

SEQ ID NO：6：

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3'

此外，在上述扩增体系中，带条形码序列的R1引物的序列如SEQ ID NO：7(ILL-RAD-bc13)、SEQ ID NO：8(ILL-RAD-bc14)、SEQ ID NO：9 (ILL-RAD-bc15)或SEQ ID NO：10(ILL-RAD-bc16)所示(下述碱基序列中，*T代表硫代修饰的T碱基)：

SEQ ID NO：7：

5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC*T-3'

SEQ ID NO：8：

5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC*T-3'

SEQ ID NO：9：

5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC*T-3'

SEQ ID NO：10：

5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC*T-3'

本发明的实施方式所提供的简化基因组测序方法，首先采用ⅡB型限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，在基因组DNA的靶标位点上游和下游位点切断DNA,获得长度一致的酶切产物DNA片段。然后，在酶切产物DNA片段的两端再连接特异性接头一和接头二。在对酶切产物进行了接头连接之后，本发明的实施方式增加了对连接产物进行纯化的步骤(4)，以去除连接产物中的蛋白等杂质，防止这些杂质对后续PCR反应的影响。然后，本发明的实施方式对纯化后的连接产物进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化，进而得到用于测序的文库，并通过高通量测序平台进行测序。该建得的测序文库涵盖基因组中的几乎全部限制酶切位点，可以更有效地进行上机测序，该测序方法操作周期短，数据利用率较高、测序结果的准确性较高。

优选地，本发明的实施方式所提供的简化基因组测序方法，步骤(1) 中的ⅡB型限制性内切酶为BsaXI酶，且步骤(2)中的接头一由序列如SEQ ID NO：1(5ILL-NNN)和SEQ ID NO：2(anti-ILL)所示的两个核苷酸片段杂交合成、接头二由序列如SEQ ID NO：3(3ILL-NNN)和SEQ ID NO：2(anti-ILL)所示的两个核苷酸片段杂交合成(在下述碱基序列中，N代表一个任意碱基，*N代表该碱基N硫代修饰)：

SEQ ID NO：1：5'-CTACACGACGCTCTTCCGATCTNN*N-3'

SEQ ID NO：2：5'-/5Phos/AGATCGGAAGAGC/3InvdT/-3'

SEQ ID NO：3：5'-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNN*N-3'

如上所示，在杂交合成接头一或接头二的核苷酸片段中，SEQ ID NO：1(5ILL-NNN)和SEQ ID NO：3(3ILL-NNN)在3’末端都有硫代修饰；而SEQ ID NO：2(anti-ILL)的3’末端的羟基去除，这样可起到封闭作用，其目的是防止酶切后3’末端连续地加上多个接头。

优选地，本发明的实施方式所提供的简化基因组测序方法中，步骤(1)中采用BsaXI酶对基因组DNA进行酶切时，BsaXI酶的用量为：每500ng基因组DNA使用1.25μL BsaXI酶；且该酶切操作在PCR仪中进行，PCR程序为：37℃，4小时。本发明的实施方式所提供的ⅡB型限制性内切酶酶切的简化基因组建库方法中，在利用BsaXI酶对基因组DNA进行酶切时，提供了上述BsaXI酶的最佳用量和最佳酶切时间，具体来说：首先，对每500ng基因组DNA使用1.25μL BsaXI酶进行酶切，使酶切效果更明显，但又不会反过来抑制酶切效果；其次，本发明发现在利用BsaXI酶进行酶切1小时后，基因组DNA降解不明显；酶切4小时后，降解较明显；而如果酶切时间大于4h，并不会加强酶切效果，因此酶切时间设为4小时为最佳方案。相对于现有技术，本发明的实施方式在确保最终获得较好建库结果的前提下，实现了对建库时间和成本的有效控制。

优选地，本发明的实施方式所提供的简化基因组测序方法中，步骤(2) 中，杂交合成接头一或接头二的PCR程序为：95℃，5分钟，然后以0.1℃/秒的速度降至4℃。该PCR程序的设定可保证序列如SEQ ID NO：1(5ILL-NNN)和SEQ ID NO：2(anti-ILL)所示的两个核苷酸片段成功杂交合成接头一、同时序列如SEQ ID NO：3(3ILL-NNN)和SEQ ID NO：2(anti-ILL)所示的两个核苷酸片段成功杂交合成接头二，确保了后续实验的顺利进行。

优选地，本发明的实施方式所提供的简化基因组测序方法中，步骤(2)中对酶切产物连接接头一和接头二所采用的反应体系如下所示：酶切产物60μL，10×T4连接酶缓冲液10μL，10μM接头一2μL，10μM接头二2μL，T4DNA连接酶2μL，ddH₂O 24μL，总100μL。上述对酶切产物进行接头连接的反应体系为针对本发明的酶切产物和连接头所专门设定的，该连接反应于4℃过夜进行，保证了接头一、接头二与酶切产物两端之间的特异性连接。

优选地，本发明的实施方式所提供的简化基因组测序方法中，步骤(3)中采用磁珠法对连接产物进行纯化。相比于其他的纯化方法，采用磁珠法对连接产物进行纯化，可减少纯化过程中化学、物理因素对核酸的破坏降解，且减少纯化过程中引入误差和污染的可能性，进一步提高最终建得文库的准确性。

优选地，本发明的实施方式所提供的简化基因组测序方法中，步骤(4)中利PCR反应体系对连接产物进行扩增的反应程序如下所示：98℃30秒；以98℃10秒、65℃30秒、72℃30秒为一个循环，进行12个循环；然后72℃5分钟；最后4℃保存。本发明的实施方式所提供的PCR反应体系及反应程序，能保证对纯化后的连接产物完成扩增，扩增完成之后，采用琼脂糖凝胶电泳法对PCR产物进行纯化和胶回收，制备得到用于上机测序的文库。本发明的实施方式中，对制备得到的文库进行测序的高通量测序平台可选择Illumina HiSeq 2500或HiSeq 2000。

附图说明

图1是实施例1中的甜瓜基因组DNA检测电泳图，其中从左至右各泳道依次代表：Marker、1号甜瓜基因组DNA、2号甜瓜基因组DNA、3号甜瓜基因组DNA、4号甜瓜基因组DNA；

图2是实施例1中的酶切预实验电泳图，其中从左至右各泳道依次代表酶切时间为1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时和16小时的酶切结果图；

图3是实施例1中的PCR产物检测电泳图，其中从左至右各泳道依次代表Marker、1号甜瓜基因组文库、1号甜瓜基因组文库、2号甜瓜基因组文库、2号甜瓜基因组文库、3号甜瓜基因组文库、3号甜瓜基因组文库、4号甜瓜基因组文库、4号甜瓜基因组文库、Marker；

图4是实施例1中的文库2100检测图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。

实施例1

1、设计并合成下表中的接头与引物序列，以备在本实施例的建库过程中使用：

2、待测基因组DNA提取

分别提取来自不同个体甜瓜叶片的基因组NDA(分别为1号甜瓜基因组DNA、2号甜瓜基因组DNA、3号甜瓜基因组DNA、4号甜瓜基因组DNA)，作为本实施例的建库对象。提取操作简述如下：

2.1取100mg新鲜叶片组织，加入液氮充分研磨。

2.2利用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取。

2.3提取好的DNA进行质检。此处对其进行琼脂糖凝胶电泳检测，如附图1所示。

3、酶切

3.1预实验

取7份500ng甜瓜基因组DNA进行酶切预实验。体系如下：

酶切时间分别1h，2h，3h，4h，6h，8h和16h，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳图如附图2所示。

3.2正式酶切将1.5μg DNA等分成三份，每份500ng。用BsaXI酶对其进行酶切。酶切体系如下：

酶切于PCR仪中进行，PCR程序为：37℃，4h，酶切后将三份酶切产物均匀混合在一起。

4、连接接头

对上述酶切产物进行接头连接，具体操作分为下述两个子步骤。

4.1、将合成后的接头正反链进行杂交

先用1×EB将接头(anti-ILL，5ILL-NNN和3ILL-NNN)稀释到100μM，再用1×AB将其继续稀释到10μM。

杂交体系1(合成Adapter 1)：

杂交体系2(合成Adapter 2)：

杂交于PCR仪中进行。PCR程序为：95℃，5min，然后0.1℃/s的速度降至4℃。

4.2、接头连接

连接体系为：

连接反应与4℃过夜进行。

5、连接产物的纯化

1)震荡AMPure XP Beads至完全混匀。

2)加180ul珠子至末端修复产物的PCR管中。

3)调枪至200ul，轻柔吸打10次混匀。

4)室温孵育15min。

5)将PCR管置于磁力架上，室温孵育15min。珠子吸附成团，溶液将变透明。

6)调枪至140ul，转移140ul上清液，弃掉。不能碰到珠子。保持PCR管在磁力架上不要掉落。

7)重复上面步骤一次。

8)加入200ul 80％乙醇，不能碰到珠子。保持PCR管在磁力架上不要掉落。

9)室温孵育30S，弃掉废液。不能碰到珠子。

10)重复8-9步骤一次。

11)室温晾干10-15分钟。在观察到珠子出现裂纹后，将PCR管移下磁力架。

12)加入22.5ul Resuspension Buffer，用枪轻柔吸打10次混匀。盖上PCR管盖，室温孵育2min。

13)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min，可见珠子吸附成团，溶液将变透明。

14)转移20ul上清至新的PCR管。

6、PCR扩增

将纯化好的连接产物进行PCR扩增，PCR体系为：

PCR程序：

a)98℃for 30seconds

b)12 cycles of：

98℃for 10 seconds

65℃for 30 seconds

72℃for 30 seconds

c)72℃for 5 minutes

d)Hold at 4℃

7、PCR产物纯化

将PCR产物全部用于琼脂糖凝胶电泳(每份PCR产物分两次进行电泳)，并进行胶回收。PCR产物检测的琼脂糖凝胶电泳图如附图3。

8、文库质检

质检结果显示，所得文库用Agilent2100生物分析仪进行检测，质检结果如附图4所示，质检结果显示，文库条带很单一，浓度也较高，可见接头连接效率较高，酶切较彻底，纯化效果好。

9、上机测序

使用Illumina HiSeq 2500测序平台对制得的文库进行测序。测序数据初步统计见下表1所示，可以看出数据质量较好，可用数据即去掉接头后长度为33bp和34bp的序列比例很高，证明接头设计没有问题，酶切和连接效率也很高。

表1：测序数据初步统计表

chr05	1282661	G	T	55	41	63	43
								chr05	1309363	A	G	32	108	35	83
chr05	1312935	C	T	65	93	98	106
								ckr05	1319833	A	G	55	134	86	126
chr05	1329969	A	C	34	21	52	19
								chr05	1528473	C	T	26	15	20	16
chr05	1659197	A	G	50	20	35	34
								chr05	1659213	C	A	51	20	36	37
chr05	1664406	A	G	102	66	107	82

数据经信息分析，可见用此方法获得标签数分布较均匀，覆盖度也较深，遗传标记数统计表见下表2所示。

表2：遗传标记数统计表

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims

1.一种简化基因组测序方法，其特征在于，包含下述步骤：

(1)利用ⅡB型限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；

(2)对酶切产物连接接头一和接头二，得到连接产物；

(3)对连接产物进行纯化，得到纯化后的连接产物；

(4)将纯化后的连接产物进行PCR扩增，得到PCR产物；

(5)对PCR产物进行纯化，得到测序文库；

(6)使用高通量测序平台对测序文库进行测序；

其中，所述步骤(4)中对纯化后的连接产物进行PCR扩增的反应体系如下所示：

高保真DNA聚合酶1μL，5×HF Buffer 10μL，2.5mM dNTP 6μL，10μMSEQ ID NO：4所示的P5接头引物1μL，10μM SEQ ID NO：5所示的P7接头引物1μL，10μM SEQ ID NO：6所示的R2引物1μL，10μM带条形码序列的R1引物1μL，纯化后的连接产物20μL，ddH₂O 9μL，总50μL；

所述带条形码序列的R1引物的序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示。

2.根据权利要求1所述的简化基因组测序方法，其特征在于，所述步骤(1)中的ⅡB型限制性内切酶为BsaXI酶。

3.根据权利要求2所述的简化基因组测序方法，其特征在于，所述步骤(1)中对基因组DNA进行酶切时，BsaXI酶的用量为：每500ng基因组DNA使用1.25μL BsaXI酶进行酶切。

4.根据权利要求1所述的简化基因组测序方法，其特征在于，所述步骤(1)中的酶切在PCR仪中进行，PCR程序为：37℃，4小时。

5.根据权利要求1所述的简化基因组测序方法，其特征在于，所述步骤(2)中接头一由序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的两个核苷酸片段杂交合成；接头二由序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2所示的两个核苷酸片段杂交合成。

6.根据权利要求5所述的简化基因组测序方法，其特征在于，所述杂交合成接头一或接头二的PCR程序为：95℃，5分钟，然后以0.1℃/秒的速度降至4℃。

7.根据权利要求1所述的简化基因组测序方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对酶切产物连接接头一和接头二所采用的反应体系如下所示：

酶切产物60μL，10×T4连接酶缓冲液10μL，10μM接头一2μL，10μM接头二2μL，T4DNA连接酶2μL，ddH₂O 24μL，总100μL，该连接反应在4℃下过夜进行。

8.根据权利要求1所述的简化基因组测序方法，其特征在于，所述步骤(3)中采用磁珠法对连接产物进行纯化。

9.根据权利要求1所述的简化基因组测序方法，其特征在于，所述步骤(4)中对纯化后的连接产物进行PCR扩增的反应程序如下所示：98℃30秒；以98℃10秒、65℃30秒、72℃30秒为一个循环，进行12个循环；然后72℃5分钟；最后4℃保存。

10.根据权利要求1所述的简化基因组测序方法，其特征在于，所述步骤(6)中的高通量测序平台为Illumina HiSeq 2500或HiSeq 2000。