CN108165646A - 一种适用于谷子的简化基因组建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适用于谷子的简化基因组建库方法，包括以下步骤，步骤一、利用限制性内切酶ApeKⅠ分别对若干谷子样品的基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；步骤二、将条形码接头F和通用接头R与酶切产物进行连接，得到连接产物；步骤三：将若干谷子样品的连接产物等体积混合进行纯化，得到纯化后的连接产物；步骤四、取纯化后的连接产物，用通用引物F以及1种或多种条形码引物R进行PCR扩增，获得PCR产物；步骤五、对PCR产物进行纯化，获得目标片段，得到测序文库；步骤六、使用高通量测序平台对测序文库进行测序。本发明检测通量高，成本低，建库稳定性好，测序结果准确可靠，同时，还简化基因组测序和建库的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及基因组测序技术，具体涉及一种适用于谷子的简化基因组建库方法。
背景技术
简化基因组测序(reduced-representation sequencing)是一种对部分基因组进行序列测定的高通量测序方法，主要包括RAD(restriction-site associated DNA)、GBS(genotyping-by-sequencing)、2b-RAD(type IIB restriction-site associated DNA)等技术。其基本原理是将样品DNA进行酶切处理后，进行上机测序。由于其测序数据量小、且又能够均匀分布于整个基因组上，所以这些技术受到越来越广泛的应用，已经被大量用于基因分型后的遗传连锁图构建、群体遗传多样性评估、种群进化分析等方面。但受制于通量低、成本高、测序质量不稳定等技术条件，谷子目前多采用基因组重测序等技术进行相关的研究，重测序的方式，建库步骤复杂，成本高，时间长且通量比较低，不能满足实际育种过程的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种适用于谷子的简化基因组建库方法，该方法检测通量高，成本低，建库稳定性好，且测序结果准确可靠，同时，还简化基因组测序方式，简化了建库的步骤。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种适用于谷子的简化基因组建库方法，包括以下步骤，
步骤一、利用限制性内切酶ApeK Ⅰ分别对若干谷子样品的基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；
步骤二、将条形码接头F和通用接头R与酶切产物进行连接，得到连接产物，所述连接产物上包含有1处条形码序列；每个谷子品种所用接头F上的条形码序列互不相同；
步骤三、将若干谷子样品经步骤二制得的连接产物等体积混合进行纯化，得到纯化后的连接产物；
步骤四、对步骤三纯化后的连接产物，采用通用引物F以及1种或多种条形码引物R进行PCR扩增，获得PCR产物，所述PCR产物为若干谷子样品PCR产物的混合物；每个谷子样品的所得PCR产物上均具有2处条形码序列；
步骤五、对步骤四所得的PCR产物进行纯化，获得目标片段，得到测序文库；
步骤六、使用高通量测序平台对测序文库进行测序。
进一步的，具体包括以下步骤：
步骤一、利用限制性内切酶ApeK Ⅰ分别对若干谷子样品的基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；
所用酶切体系为：NEB缓冲液2μL，5000U/ml的Apek Ⅰ 0.5μL，谷子基因组DNA500ng，加水至最终体系20μL，放于PCR仪中，反应程序为75℃，2h；
步骤二、将条形码接头F和通用接头R与酶切产物进行连接，得到连接产物，所述连接产物上包含有1处条形码序列；
所用连接体系：10xT4DNA连接酶反应缓冲液5μL，350U/μL的T4DNA连接酶2μL，接头F 5μL，接头R 5μL，加水至30μL，与步骤一酶切反应完成后的体系溶液混合，放置于PCR仪中，反应程序为22℃ 60min，65℃ 30min；
步骤三、将若干谷子样品经步骤二制得的连接产物等体积混合进行纯化，得到纯化后的连接产物；
步骤3-1、将若干谷子样品的经步骤二制得的连接产物等体积混合，按混合后的体系溶液与磁珠体积比1:1.5，在混合后的体系溶液中加入的磁珠，悬浮混匀，静置2min后将样品放于磁力架上，至溶液澄清，抛弃上清液，留磁珠；
步骤3-2、加入100μL体积浓度为80％乙醇，悬浮磁珠以便洗涤；
步骤3-3、用磁力架吸附磁珠，至溶液澄清；
步骤3-4、去除上清液，室温放置，至乙醇挥发干净；
步骤3-5、加入20μL DNA洗脱液，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA；
步骤3-6、用磁力架吸附磁珠后，将上清液转移至新管中，即得纯化后的连接产物溶液；
步骤四、取步骤三纯化后的连接产物，采用通用引物F和条形码引物R进行PCR扩增，获得PCR产物，所述PCR产物为若干谷子样品PCR产物的混合物；每个谷子样品的所得PCR产物上均具有2处条形码序列；
所用扩增体系：纯化后的连接产物溶液10μL，HiFi酶25μL，引物F 1μL，1种引物R或多种引物R的混合物1μL，加水至50μL；
所述PCR反应程序为：72℃ 5min；98℃ 30s；98℃ 10s，65℃ 30s，72℃ 30s，15个循环；72℃ 5min；
步骤五、对步骤四所得的PCR产物进行纯化，获得目标片段，得到测序文库；
步骤5-1、PCR扩增完成后，按PCR扩增体系的溶液与磁珠体积比1:0.6，在步骤四PCR反应完成后的体系溶液中加入磁珠，悬浮混匀，静置2min后移至磁力架上，至溶液澄清，然后吸取上清液至新的管中，得新的上清液；
步骤5-2、按步骤1)所述PCR扩增体系的溶液与磁珠体积比1:0.8，向步骤5-1所得新的上清液中加入磁珠，充分混匀，室温静置2min，用磁力架吸附磁珠，至溶液为澄清，吸取上清液，抛弃上清液，留磁珠；
步骤5-3、加入100μL体积浓度为80％新鲜配制的乙醇，悬浮磁珠以便洗涤，然后用磁力架吸附磁珠，至溶液澄清，去除上清液，室温放置，至乙醇挥发干净；
步骤5-4、加入20μL DNA洗脱液，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA，用磁力架吸附磁珠后，将所得上清液转移至新管中，即可；
步骤六、使用高通量测序平台对测序文库进行测序。
进一步的，步骤三和步骤五中所述磁珠为AMPure XP Beads。
进一步的，所述接头F的序列为：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGXXXXXX；所述XXXXXX为条形码序列；
所述接头R的序列为：GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC；
所述引物F的序列为：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG；
所述引物R的序列为：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATYYYYYYGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC；
所述YYYYYY为条形码序列。
更进一步的，所述接头F上的XXXXXX序列选自ATCACG、CGATGT、TTAGGC、TGACCA、ACAGTG、GCCAAT、CAGATC、ACTTGA、GATCAG、TAGCTT、GGCTAC、CTTGTA、AGTCAA、AGTTCC、ATGTCA、CCGTCC、GTAGAG、GTCCGC、GTGAAA、GTGGCC、GTTTCG、CGTACG、GAGTGG、GGTAGC、ACTGAT、ATGAGC、ATTCCT、CAAAAG、CAACTA、CACCGG、CACGAT、CACTCA、CAGGCG、CATGGC、CATTTT、CCAACA、CGGAAT、CTAGCT、CTATAC、CTCAGA、GACGAC、TAATCG、TACAGC、TATAAT、TCATTC、TCCCGA、TCGAAG、TCGGCA、GCTAGC、TAGTGT、GTCGAT、AGTGAG、CTACAT、GCGTCT、GTATCT、CGAGTC、GACTCG、TGCATC、GTACGT、ATATGA、GACTGA、ATCGAC、AGCAGT、GATGTA、TCAGAG、ACAGCT、CGTGAC、TCACGT、GCATGT、GCTCTC、CGCATA、CGACAG、ACACGA、CACTAC、GAGACG、ACGCAG中的任意一个；
步骤四所述引物R上的YYYYYY序列选自GTGCAT、ATGAGC、GGTAGC、GTAGAG中的任意一个。
进一步的，所述DNA洗脱液为10mM Tris-HCl溶液，pH 8.0-8.5。
与现有技术相比，本发明所取得的有益效果如下：
1、本发明仅需一套barcode-adapter体系，其最大的优势在于测序reads几乎可以全长使用，除了5’端前两个或前三个碱基为已知的酶切位点碱基，其余碱基序列都可用于开发SNP标记。
2、本发明采用Y行接头，即Primer F和Primer R在结构上形成Y型结构，避免普通引物间的双向互补；同时，条形码接头F和条形码引物R的使用，使得获得的PCR产物上具有2处区分样品的条形码序列，因此，数据量100％可以利用，提高了所建文库的数据利用率；此外，本发明设置了M种具有不同条形码序列的接头F，以及N种具有不同条形码序列的引物R，可以通过引物R上的条形码序列将获得的PCR产物进行分类，然后通过接头F上的条形码序列对每类的PCR产物进行进一步的区分，从而使得每一谷子品种均得到识别(换句话说，就是通过引物R(Primer R)上的条形码序列(Barcode序列)，区分测序数据，再根据接头F上的条形码序列(Barcode序列)进一步区分该测序结果为哪个样本的测序结果，依次类推，实现大量样本同时上机测序)；因此，从理论上，一次的测序通量可以达到M*N个，虽然本发明仅列举了76种接头F和4种引物R，但是且M和N并不限于76和4，还可以更多；大大提高测序文库的通量。
3、本发明不需要DNA片段的随机打断及末端修复等步骤，大大简化了文库构建流程，高度简化了文库制备步骤。
4、本发明获得连接产物后，先用1.5倍磁珠纯化，将纯化后的连接产物等质量混合后PCR，然后所得的PCR产物依次用0.6倍磁珠和0.8倍磁珠进行纯化，再次简化了建库步骤和流程。
本发明的测序文库通量高、成本低，产生的文库测序质量高，在实现谷子高通量SNP检测及标记开发、遗传图谱绘制、功能基因定位等研究中具有非常广阔的应用前景。
附图说明
图1为1号谷子样品的测序数据Q20分析结果图；
图2为2号谷子样品的测序数据Q20分析结果图；
图3为3号谷子样品的测序数据Q20分析结果图；
图4为4号谷子样品的测序数据Q20分析结果图；
图5为5号谷子样品的测序数据Q20分析结果图；
图6为6号谷子样品的测序数据Q20分析结果图；
图中，横坐标position along reads为片段上碱基的位置(其中每条read长300bp)；纵坐标perent为百分比。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行进一步详细的叙述。
实施例1为6个谷子样品的简化基因组建库方法，
材料的选择：选取6个谷子样品，提取谷子样品的基因组DNA，提取方法按照天根生化科技有限公司的新型植物提取试剂盒的操作手册进行；
限制性内切酶ApeK Ⅰ：Biolab公司；
NEB缓冲液(NEB Buffer)：Takara公司；
T4 DNA连接酶(T4 DNAigase)：Takara公司；
10xT4 DNAigase Reaction Buffer：Takara公司；
HiFi酶：Kakp公司；
AMPure XP Beads：诺唯赞生物科技有限公司
6个谷子样品的简化基因组建库方法具体包括以下步骤：
步骤一、利用限制性内切酶ApeK Ⅰ分别对若干谷子样品的基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；
所用酶切体系为：NEB缓冲液(NEB Buffer)2μL，Apek Ⅰ(5000U/ml)0.5μL，谷子基因组DNA 500ng，加水至最终体系20μL，放于PCR仪中，反应程序为75℃，2h；
步骤二、将条形码接头F和通用接头R与酶切产物进行连接，得到连接产物，所述连接产物上包含有1处条形码序列；每个谷子品种对应1种接头F(即每个谷子品种所用接头F上的条形码序列互不相同)；
所述接头F的序列为：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGXXXXXX；所述XXXXXX为条形码序列；6个谷子样品所用接头F的条形码序列，见表1；
表1 6个谷子样品所用接头F的条形码序列
所述接头R的序列为：GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC；
所用连接体系：10xT4 DNA连接酶反应缓冲液(10xT4 DNA Ligase ReactionBuffer)5μL，350U/μL的T4 DNA连接酶(T4 DNALigase)2μL，接头F 5μL，接头R 5μL，加水至30μL，与步骤一酶切反应完成后的体系溶液混合，放置于PCR仪中，反应程序为22℃ 60min，65℃30min；所述10x指10倍工作浓度；
步骤三、将若干谷子样品经步骤二制得的连接产物等体积混合后进行纯化，得到纯化后的连接产物；
步骤3-1、将若干谷子样品的经步骤二制得的连接产物等体积混合，按混合后的体系溶液与磁珠体积比1:1.5，在混合后的体系溶液中加入的磁珠，悬浮混匀，静置2min后将样品放于磁力架上，至溶液澄清，抛弃上清液，留磁珠；
步骤3-2、加入100μL体积浓度为80％乙醇，悬浮磁珠以便洗涤；
步骤3-3、用磁力架吸附磁珠，至溶液澄清；
步骤3-4、去除上清液，室温放置，至乙醇挥发干净；
步骤3-5、加入20μL DNA洗脱液(所述DNA洗脱液为10mM Tris-HCl溶液，pH 8.0-8.5)，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA；
步骤3-6、用磁力架吸附磁珠后，将上清液转移至新管中，即得纯化后的连接产物溶液；
步骤四、取步骤三纯化后的连接产物，采用通用引物F和条形码引物R进行PCR扩增，获得PCR产物，所述PCR产物为若干谷子样品PCR产物的混合物；每个谷子样品的所得PCR产物上均具有2处条形码序列；
所述引物F的序列为：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG；
本实施例所用引物R为1种，所述引物R的序列为：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATYYYYYYGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC；
所述YYYYYY序列为：GTGCAT；
所用扩增体系：纯化后的连接产物溶液10μL，HiFi酶25μL，引物F(Primer F)1μL，引物R(Primer R)1μL，加水至50μL；
所述PCR反应程序为：72℃ 5min；98℃ 30s；98℃ 10s，65℃ 30s，72℃ 30s，15个循环；72℃ 5min；
步骤五、对步骤四所得的PCR产物进行纯化，获得目标片段，得到测序文库；
步骤5-1、PCR扩增完成后，按PCR扩增体系的溶液(50μL)与磁珠体积比1:0.6，在步骤四PCR反应完成后的体系溶液中加入磁珠，悬浮混匀，静置2min后移至磁力架上，至溶液澄清，然后用移液器吸取上清液至新的管中，得新的上清液；
步骤5-2、按PCR扩增体系的溶液(50μL)与磁珠体积比1:0.8，向步骤5-1所得新的上清液中加入磁珠，充分混匀，室温静置2min，用磁力架吸附磁珠，至溶液为澄清，用移液器吸取上清液，抛弃上清液，留磁珠；
步骤5-3、加入100μL 80％新鲜配制的乙醇，悬浮磁珠以便洗涤，然后用磁力架吸附磁珠，至溶液澄清，去除上清液，室温放置，至乙醇挥发干净；
步骤5-4、加入20μL DNA洗脱液(所述DNA洗脱液为10mM Tris-HCl溶液，pH 8.0-8.5)，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA，用磁力架吸附磁珠后，将所得上清液转移至新管中，即可；
步骤六、使用高通量测序平台对测序文库进行测序。
采用illumina的测序仪器进行测序，在数据下机之后进行数据分析获得的6个样品的测序数据的Q20图，二代测序中的测序数据质量Q20非严格要求要达到85％以上，90％说明测序数据质量比较好，如图1～图6所示，本次6个谷子样品的测序数据质量值均在95％左右，说明测序数据质量较好。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
序列表
<110> 河北省农林科学院谷子研究所
<120> 一种适用于谷子的简化基因组建库方法
<141> 2017-12-25
<160> 82
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 23
acactctttc cctacacgac gctcttccgg agtgg 35
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 24
acactctttc cctacacgac gctcttccgg gtagc 35
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 25
acactctttc cctacacgac gctcttccga ctgat 35
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 26
acactctttc cctacacgac gctcttccga tgagc 35
<210> 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 27
acactctttc cctacacgac gctcttccga ttcct 35
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 28
acactctttc cctacacgac gctcttccgc aaaag 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 29
acactctttc cctacacgac gctcttccgc aacta 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 30
acactctttc cctacacgac gctcttccgc accgg 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 31
acactctttc cctacacgac gctcttccgc acgat 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 32
acactctttc cctacacgac gctcttccgc actca 35
<210> 33
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 33
acactctttc cctacacgac gctcttccgc aggcg 35
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 34
acactctttc cctacacgac gctcttccgc atggc 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 35
acactctttc cctacacgac gctcttccgc atttt 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 36
acactctttc cctacacgac gctcttccgc caaca 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 37
acactctttc cctacacgac gctcttccgc ggaat 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 38
acactctttc cctacacgac gctcttccgc tagct 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 39
acactctttc cctacacgac gctcttccgc tatac 35
<210> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 40
acactctttc cctacacgac gctcttccgc tcaga 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 41
acactctttc cctacacgac gctcttccgg acgac 35
<210> 42
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 42
acactctttc cctacacgac gctcttccgt aatcg 35
<210> 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 43
acactctttc cctacacgac gctcttccgt acagc 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 44
acactctttc cctacacgac gctcttccgt ataat 35
<210> 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 45
acactctttc cctacacgac gctcttccgt cattc 35
<210> 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 46
acactctttc cctacacgac gctcttccgt cccga 35
<210> 47
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 47
acactctttc cctacacgac gctcttccgt cgaag 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 48
acactctttc cctacacgac gctcttccgt cggca 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 49
acactctttc cctacacgac gctcttccgg ctagc 35
<210> 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 50
acactctttc cctacacgac gctcttccgt agtgt 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 51
acactctttc cctacacgac gctcttccgg tcgat 35
<210> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 52
acactctttc cctacacgac gctcttccga gtgag 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 53
acactctttc cctacacgac gctcttccgc tacat 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 54
acactctttc cctacacgac gctcttccgg cgtct 35
<210> 55
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 55
acactctttc cctacacgac gctcttccgg tatct 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 56
acactctttc cctacacgac gctcttccgc gagtc 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
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acactctttc cctacacgac gctcttccgg actcg 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 58
acactctttc cctacacgac gctcttccgt gcatc 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 59
acactctttc cctacacgac gctcttccgg tacgt 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
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acactctttc cctacacgac gctcttccga tatga 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
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acactctttc cctacacgac gctcttccgg actga 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
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acactctttc cctacacgac gctcttccga tcgac 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 63
acactctttc cctacacgac gctcttccga gcagt 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 64
acactctttc cctacacgac gctcttccgg atgta 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 65
acactctttc cctacacgac gctcttccgt cagag 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 66
acactctttc cctacacgac gctcttccga cagct 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 67
acactctttc cctacacgac gctcttccgc gtgac 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 68
acactctttc cctacacgac gctcttccgt cacgt 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
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acactctttc cctacacgac gctcttccgg catgt 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
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acactctttc cctacacgac gctcttccgg ctctc 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
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acactctttc cctacacgac gctcttccgc gcata 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
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acactctttc cctacacgac gctcttccgc gacag 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 73
acactctttc cctacacgac gctcttccga cacga 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
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acactctttc cctacacgac gctcttccgc actac 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
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acactctttc cctacacgac gctcttccgg agacg 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 76
acactctttc cctacacgac gctcttccga cgcag 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
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gtgactggag ttccttggca cccgagaatt c 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccg 54
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
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caagcagaag acggcatacg agatgtgcat gtgactggag ttccttggca cccgagaatt 60
c 61
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
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caagcagaag acggcatacg agatatgagc gtgactggag ttccttggca cccgagaatt 60
c 61
<210> 81
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
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caagcagaag acggcatacg agatggtagc gtgactggag ttccttggca cccgagaatt 60
c 61
<210> 82
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<212> DNA
<213> 人工序列(Setaria italica)
<400> 82
caagcagaag acggcatacg agatgtagag gtgactggag ttccttggca cccgagaatt 60
c 61
Claims (6)
1.一种适用于谷子的简化基因组建库方法，其特征在于，包括以下步骤，
步骤一、利用限制性内切酶ApeK Ⅰ分别对若干谷子样品的基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；
步骤二、将条形码接头F和通用接头R与酶切产物进行连接，得到连接产物，所述连接产物上包含有1处条形码序列；每个谷子品种所用接头F上的条形码序列互不相同；
步骤三、将若干谷子样品经步骤二制得的连接产物等体积混合进行纯化，得到纯化后的连接产物；
步骤四、对步骤三纯化后的连接产物，采用通用引物F以及1种或多种条形码引物R进行PCR扩增，获得PCR产物，所述PCR产物为若干谷子样品PCR产物的混合物；每个谷子样品的所得PCR产物上均具有2处条形码序列；
步骤五、对步骤四所得的PCR产物进行纯化，获得目标片段，得到测序文库；
步骤六、使用高通量测序平台对测序文库进行测序。
2.根据权利要求1所述的一种适用于谷子的简化基因组建库方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤一、利用限制性内切酶ApeK Ⅰ分别对若干谷子样品的基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；
所用酶切体系为：NEB缓冲液2μL，5000U/ml的Apek Ⅰ0.5μL，谷子基因组DNA 500ng，加水至最终体系20μL，放于PCR仪中，反应程序为75℃，2h；
步骤二、将条形码接头F和通用接头R与酶切产物进行连接，得到连接产物，所述连接产物上包含有1处条形码序列；
所用连接体系：10xT4 DNA连接酶反应缓冲液5μL，350U/μL的T4 DNA连接酶2μL，接头F5μL，接头R 5μL，加水至30μL，与步骤一酶切反应完成后的体系溶液混合，放置于PCR仪中，反应程序为22℃60min，65℃30min；
步骤三、将若干谷子样品经步骤二制得的连接产物等体积混合进行纯化，得到纯化后的连接产物；
步骤3-1、将若干谷子样品的经步骤二制得的连接产物等体积混合，按混合后的体系溶液与磁珠体积比1:1.5，在混合后的体系溶液中加入的磁珠，悬浮混匀，静置2min后将样品放于磁力架上，至溶液澄清，抛弃上清液，留磁珠；
步骤3-2、加入100μL体积浓度为80％乙醇，悬浮磁珠以便洗涤；
步骤3-3、用磁力架吸附磁珠，至溶液澄清；
步骤3-4、去除上清液，室温放置，至乙醇挥发干净；
步骤3-5、加入20μL DNA洗脱液，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA；
步骤3-6、用磁力架吸附磁珠后，将上清液转移至新管中，即得纯化后的连接产物溶液；
步骤四、取步骤三纯化后的连接产物，采用通用引物F和条形码引物R进行PCR扩增，获得PCR产物，所述PCR产物为若干谷子样品PCR产物的混合物；每个谷子样品的所得PCR产物上均具有2处条形码序列；
所用扩增体系：纯化后的连接产物溶液10μL，HiFi酶25μL，引物F 1μL，1种引物R或多种引物R的混合物1μL，加水至50μL；
所述PCR反应程序为：72℃5min；98℃30s；98℃10s，65℃30s，72℃30s，15个循环；72℃5min；
步骤五、对步骤四所得的PCR产物进行纯化，获得目标片段，得到测序文库；
步骤5-1、PCR扩增完成后，按PCR扩增体系的溶液与磁珠体积比1:0.6，在步骤四PCR反应完成后的体系溶液中加入磁珠，悬浮混匀，静置2min后移至磁力架上，至溶液澄清，然后吸取上清液至新的管中，得新的上清液；
步骤5-2、按PCR扩增体系的溶液与磁珠体积比1:0.8，向步骤5-1所得新的上清液中加入磁珠，充分混匀，室温静置2min，用磁力架吸附磁珠，至溶液为澄清，吸取上清液，抛弃上清液，留磁珠；
步骤5-3、加入100μL体积浓度为80％新鲜配制的乙醇，悬浮磁珠以便洗涤，然后用磁力架吸附磁珠，至溶液澄清，去除上清液，室温放置，至乙醇挥发干净；
步骤5-4、加入20μL DNA洗脱液，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA，用磁力架吸附磁珠后，将所得上清液转移至新管中，即可；
步骤六、使用高通量测序平台对测序文库进行测序。
3.根据权利要求2所述的一种适用于谷子的简化基因组建库方法，其特征在于，步骤三和步骤五中所述磁珠为AMPure XP Beads。
4.根据权利要求2所述的一种适用于谷子的简化基因组建库方法，其特征在于，所述接头F的序列为：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGXXXXXX；所述XXXXXX为条形码序列；
所述接头R的序列为：GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC；
所述引物F的序列为：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG；
所述引物R的序列为：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATYYYYYYGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC；
所述YYYYYY为条形码序列。
5.根据权利要求4所述的一种适用于谷子的简化基因组建库方法，其特征在于，
所述接头F上的XXXXXX序列选自ATCACG、CGATGT、TTAGGC、TGACCA、ACAGTG、GCCAAT、CAGATC、ACTTGA、GATCAG、TAGCTT、GGCTAC、CTTGTA、AGTCAA、AGTTCC、ATGTCA、CCGTCC、GTAGAG、GTCCGC、GTGAAA、GTGGCC、GTTTCG、CGTACG、GAGTGG、GGTAGC、ACTGAT、ATGAGC、ATTCCT、CAAAAG、CAACTA、CACCGG、CACGAT、CACTCA、CAGGCG、CATGGC、CATTTT、CCAACA、CGGAAT、CTAGCT、CTATAC、CTCAGA、GACGAC、TAATCG、TACAGC、TATAAT、TCATTC、TCCCGA、TCGAAG、TCGGCA、GCTAGC、TAGTGT、GTCGAT、AGTGAG、CTACAT、GCGTCT、GTATCT、CGAGTC、GACTCG、TGCATC、GTACGT、ATATGA、GACTGA、ATCGAC、AGCAGT、GATGTA、TCAGAG、ACAGCT、CGTGAC、TCACGT、GCATGT、GCTCTC、CGCATA、CGACAG、ACACGA、CACTAC、GAGACG、ACGCAG中的任意一个；
步骤四所述引物R上的YYYYYY序列选自GTGCAT、ATGAGC、GGTAGC、GTAGAG中的任意一个。
6.根据权利要求2所述的一种适用于谷子的简化基因组建库方法，其特征在于，所述DNA洗脱液为10mM Tris-HCl溶液，pH 8.0-8.5。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180615 |
|
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