CN104342494B - 应用于焦磷酸测序的化学修饰引物介导的方向特异性单链dna制备 - Google Patents
应用于焦磷酸测序的化学修饰引物介导的方向特异性单链dna制备 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104342494B CN104342494B CN201410607086.4A CN201410607086A CN104342494B CN 104342494 B CN104342494 B CN 104342494B CN 201410607086 A CN201410607086 A CN 201410607086A CN 104342494 B CN104342494 B CN 104342494B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- primer
- pyrosequencing
- modification
- pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Abstract
本发明涉及应用于焦磷酸测序的化学修饰引物介导的方向特异性单链DNA制备。具体地说在PCR时一条引物用普通合成的引物，而另一条引物用可以抗酶切的化学修饰引物，PCR扩增后再利用有5’→3’切割功能的外切酶处理双链DNA，将未修饰的DNA单链消化掉，制备方向特异的单链模板DNA。应用这种方法制备单链DNA可以直接用于作为焦磷酸测序的模板，大大降低了焦磷酸测序的成本，减少了测序模板制备的繁琐步骤。
Description
技术领域
本发明属分子生物学领域；更具体地，本发明涉及应用于焦磷酸测序的化学修饰引物介导的方向特异性单链DNA制备。
背景技术
焦磷酸测序是不同于Sanger法的一种新型测序技术，它以单链DNA为模板，在DNA聚合酶存在的情况下加入与模板互补的引物和dNTP时发生延伸反应，释放出相应量的焦磷酸，在一系列底物的作用下产生与模板碱基数相应强度的荧光信号最终用于检测。与Sanger法相比焦磷酸测序可以快速生成序列数据，并且具有极高的准确度和可重复性。目前焦磷酸测序技术已经广泛应用于SNP检测、微生物分型、基因甲基化检测等领域，并且还应用到高通量DNA测序中，使测序技术发生了革命性变化。
焦磷酸测序需要单链的测序模板。目前，单链模板的制备主要应用链亲和素微球固相法。链亲和素微球固相法的原理是，首先利用生物素标记的引物对目的DNA片段进行PCR扩增，然后将扩增片段固定于链亲和素包被微球上，非生物素标记的链以NaOH变性，对DNA链进行洗脱和冲洗，去除其他所有反应组分后，加入测序引物并退火形成纯的单链DNA模板，该过程的操作步骤繁琐且效率低，昂贵的生物素标记引物、链亲和素包被微球的使用提高了检测成本，复杂的抽真空系统增加了仪器成本，而且单链制备过程也易引起样品交叉污染，这些问题严重影响了焦磷酸测序的应用和普及。
因此，本领域迫切需要改进焦磷酸测序技术，特别是开发获得单链模板的新方法，以简化操作难度和降低制备成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种化学修饰引物介导的方向特异性单链DNA制备方法。
在本发明的第一方面，提供一种用于焦磷酸测序的单链DNA制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)引物设计：根据目标DNA模板设计一对PCR扩增引物，其中一条扩增引物为普通引物；另一条扩增引物为5’末端化学修饰的引物，其不会被具有5’→3’外切酶活性的酶酶切；
(2)PCR扩增及酶切：利用(1)的扩增引物对目标DNA模板进行PCR扩增，获得扩增产物，该扩增产物中一条链存在5’末端修饰，而另一条链5’末端没有修饰；利用具有5’→3’外切酶活性的酶对扩增产物进行酶切，5’末端没有修饰的链被酶切降解，从而获得带有5’末端化学修饰的单链DNA产物；和
(3)获得的单链DNA产物直接用于焦磷酸测序或sanger测序。
在一个优选例中，所述的DNA模板包括：(重)亚硫酸氢盐处理的DNA或非(重)亚硫酸氢盐处理的DNA。
在另一优选例中，所述的DNA模板包括：基因组DNA或DNA片段。
在另一优选例中，所述的5’末端修饰是5’末端3个碱基进行的化学修饰为硫代磷酸化修饰或其它能够阻断核酸外切酶的化学修饰。
在另一优选例中，所述的5’末端修饰为PCR扩增引物对中的正向引物修饰，或为PCR扩增引物对中的反向引物修饰。
在另一优选例中，所述的具有5’→3’外切酶活性的酶：T7DNA外切酶或Lamda核酸外切酶或其它能够被化学修饰阻断的核酸外切酶。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、本发明实施方案中所描述的实验流程图。
图2、本发明实施例1中所描述的实验原理图。
图3、本发明实施例1中所描述的T7外切酶对不同硫代产物酶切电泳图。
图4、本发明实施例2中进行链亲和素微球固相法焦磷酸测序结果(4-1)和硫代引物法焦磷酸测序结果(4-2)。
具体实施方式
本发明提供了一种获得单链DNA的新方法，利用核酸的化学修饰可以抗拒酶切的特性，在PCR时只将其中的一条引物进行化学修饰，再用具有5’→3’外切酶活性的T7外切酶处理PCR产物，最终得到可以进行焦磷酸测序的单链DNA。本发明的方法避免了传统焦磷酸测序中昂贵的生物素标记引物和链亲和素包被微球的使用，大大降低了焦磷酸测序的成本，减少了测序模板制备的繁琐步骤，简洁快速、节省成本。
如本文所用，所述的“化学修饰”是指能够使核酸抵抗5’→3’外切酶酶切的修饰。较佳地，所述的修饰是“硫代磷酸化修饰”。
如本文所用，所述的“普通引物”是指未经修饰的引物，其由常规的A、T、C或G构成。
如本文所用，所述的“5’末端修饰”是指修饰位点存在于引物的5’末端处，较佳地是5’端第1个碱基起至少连续3个碱基进行硫代磷酸化修饰。
如本文所用，所述的“DNA模板”是指包含所需获得的目的单链序列的基因组DNA或DNA片段，其通常是双链的。其可以是(重)亚硫酸氢盐处理的DNA或非(重)亚硫酸氢盐处理的DNA。
亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后测序(bisulfite sequencing PCR，BSP)方法是检测基因中甲基化的经典方法，其原理为：用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)而发生甲基化的胞嘧啶则不变。因而，经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理核酸后，甲基化的位点产生类似于一个C/T的多核苷酸多态性(SNP)。基因组DNA经此处理后，扩增目的片段，此时尿嘧啶(U)全部转化为胸腺嘧啶(T)，最后对PCR产物进行测序就可以判断是否发生甲基化。
本发明的方法的创新性在于摈弃了目前单链模板的制备并被Qigen公司广泛采用的链亲和素微球固相法。其操作步骤繁琐且效率低，昂贵的生物素标记引物、链亲和素包被微球的使用提高了检测成本。
基于本发明的新方法，本发明还涉及一种用于制备单链DNA的试剂盒，包含以下组分：(a)根据DNA模板设计的一对PCR扩增引物，其中一条扩增引物为普通引物；另一条扩增引物为5’末端修饰的引物，其不会被具有5’→3’外切酶活性的酶酶切；(b)具有5’→3’外切酶活性的酶；较佳地为T7DNA外切酶。
较佳地，所述的试剂盒中还包括：PCR反应缓冲液；酶切反应缓冲液；和/或测序试剂等。更佳地还可包括说明应用上述试剂进行单链DNA制备及测序检测的使用说明书。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、硫代引物PCR产物的酶切验证及原理说明
为了验证硫代磷酸化修饰对PCR产物的保护效果，本发明人以重亚硫酸盐处理过的基因组为模板，利用不同的PCR引物将硫代磷酸化修饰引入到PCR产物中去，最后制作出末端具有不同硫代磷酸化修饰的PCR产物，如图2，包括四种：a.双端都没有硫代磷酸化修饰，b.反向有硫代磷酸化修饰，c.正向有硫代磷酸化修饰，d.双端都有硫代磷酸化修饰。图中N代表正常扩增产物而S代表硫代磷酸化修饰的扩增产物。
重亚硫酸氢钠处理基因组DNA：
使用Zymo-Research公司甲基化试剂盒处理基因组DNA，将1μg提取好的人类细胞系293T基因组DNA加入130μl CT转换试剂(CT Conversion Reagent)(含有重亚硫酸氢钠)中，将瞬离后的样品放入PCR仪，设定反应程序如下：98℃，10min；64℃，2.5h；4℃，∞。
将Zymo柱(Zymo-Spin(TM)IC Column)放入收集管(Collection Tube)中，加入600μl M-结合液(M-Binding Buffer)，然后加入反应后的样品，盖紧，颠倒混匀；12,000rpm(<10,000g)离心30s；加入100μl M-清洗液(M-Wash Buffer)，12,000rpm离心30s；加入200μlM-脱磺化液(M-Desulphonation Buffer)，室温(20～30℃)静置15～20min，12,000rpm离心30s；加入200μl M-清洗液(M-Wash Buffer)，12,000rpm离心30s，去除收集管中的废液；重复清洗一次；将柱子移入干净的1.5ml EP管中，在柱子底部加入10μl M-溶解液(M-ElutionBuffer)，12,000rpm离心30s，洗脱液备用。
应用的PCR引物如下：
正向硫代引物F1：5’TTAGTTAGGTTTAGAYGTAGGAT 3’(SEQ ID NO:1)(5’末端三个碱基硫代磷酸化修饰)；
正向正常引物F1’：5’TTAGTTAGGTTTAGAYGTAGGAT 3’(SEQ ID NO:1)；
反向硫代引物F2：5’CATAATATATCTCTACCTTACAAATC 3’(SEQ ID NO:2)(5’末端三个碱基硫代磷酸化修饰)；；
反向正常引物F2’：5’CATAATATATCTCTACCTTACAAATC 3’(SEQ ID NO:2)；
以：a.双端都没有硫代磷酸化修饰(正向正常引物F1’+反向正常引物F2’)，b.反向有硫代磷酸化修饰(正向正常引物F1’+反向硫代引物F2)，c.正向有硫代磷酸化修饰(正向硫代引物F1+反向正常引物F2’)，d.双端都有硫代磷酸化修饰(正向硫代引物F1+反向硫代引物F2)四组引物进行扩增，四种扩增产物经过T7外切酶处理后进行电泳鉴定，结果如图3，双端都没有硫代磷酸化修饰的PCR产物全部被T7外切酶消化干净(NN)，单端有硫代磷酸化修饰的PCR产物条带变弱并且上移(NS、SN)，而双端都有硫代磷酸化修饰的PCR产物无明显变化(SS)，该实验证实了可以通过在PCR引物中引入硫代磷酸化修饰的方法来保护PCR产物不被外切酶所切割，从而选择性地获得单链DNA。
实施例2、人293T细胞β-actin基因外显子焦磷酸测序
本实施例的操作流程如图1，具体包括：
1.重亚硫酸氢钠处理基因组DNA
使用Zymo-Research公司甲基化试剂盒处理基因组DNA，将1μg提取好的人类细胞系293T基因组DNA加入130μl CT转换试剂(CT Conversion Reagent)(含有重亚硫酸氢钠)中，将瞬离后的样品放入PCR仪，设定反应程序如下：98℃，10min；64℃，2.5h；4℃，∞。
将Zymo柱(Zymo-Spin(TM)IC Column)放入收集管(Collection Tube)中，加入600μl M-结合液(M-Binding Buffer)，然后加入反应后的样品，盖紧，颠倒混匀；12,000rpm(<10,000g)离心30s；加入100μl M-清洗液(M-Wash Buffer)，12,000rpm离心30s；加入200μlM-脱磺化液(M-Desulphonation Buffer)，室温(20～30℃)静置15～20min，12,000rpm离心30s；加入200μl M-清洗液(M-Wash Buffer)，12,000rpm离心30s，去除收集管中的废液；重复清洗一次；将柱子移入干净的1.5ml EP管中，在柱子底部加入10μl M-溶解液(M-ElutionBuffer)，12,000rpm离心30s，洗脱液备用。
2.PCR扩增
所使用的引物：
1)正向引物F1：5’TTAGTTAGGTTTAGAYGTAGGAT 3’(SEQ ID NO:1)；
2)测序引物F2(用于步骤5)：5’TAGATGGGTATAGTGTGGGTGATT3’(SEQ ID NO:3)；
3)反向硫代磷酸化修饰引物R1：5’CATAATATATCTCTACCTTACAAATC 3’(SEQ ID NO:2)(5’末端三个碱基硫代磷酸化修饰)；
4)反向生物素修饰引物R2：5’CATAATATATCTCTACCTTACAAATC 3’(SEQ ID NO:2)(5’末端生物素修饰，作为对照组反向引物用于传统焦磷酸测序)。
由于亚硫酸氢钠处理后的DNA中C转变为U，普通的高保真酶无法识别U从而造成处理后的片段无法扩增，此处使用KAPA公司生产的KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix(2X)(货号：KK2801，其中含有2×Taq DNA聚合酶以及进行PCR反应的其他试剂，以下简称2XkAPA Mix，加入适量引物、模板和水即可进行PCR扩增)进行扩增，可以克服这一问题。
在PCR管中加入下列试剂：
反应条件：
PCR产物经过电泳，确定有目标产物的扩增并且无非特异扩增后进行以下步骤。
3.实验组进行PCR产物液体纯化(对照组直接进行步骤5焦磷酸测序，忽略步骤3和4)
PCR产物经过液体回收后可以有效的去除体系中没有反应的多余引物和引物二聚体，也可以除掉体系中影响下一步反应的盐离子，本实验使用QIAGEN公司PCR回收试剂盒(MinElute PCR Purification Kit，货号：28006)回收PCR产物，具体的操作步骤为在PCR产物中加入5倍体积(1ml)缓冲液PB，轻弹充分混匀，瞬离，转至柱子中，13000rpm离心1min。去除洗脱液体。加入750μl缓冲液PE(已加乙醇)，13000rpm离心1min，同上去除液体。再加入500μl buffer PE，再次洗涤一次，去除液体，盖上盖子，空转2min，打开盖子，静置，晾干。加入30μl超纯水静置1-2min，13000rpm离心1min，洗脱液备用。
4.T7外切酶酶切制备单链DNA
T7外切酶为具有5’→3’外切酶活性的外切酶，在上一步的PCR反应中本发明人在反向引物上引入了硫代磷酸化修饰，这样经过T7外切酶的切割PCR产物的负链就能够保留下来。具体酶切体系如下：
25℃反应1个小时。
5.焦磷酸测序
1)实验组：反应1小时后重复步骤3进行液体纯化，目的是将反应体系中的T7酶以及盐离子等物质去掉，得到纯净的单链DNA模板(注意：溶解时直接用焦磷酸测序的变性缓冲液溶解)将上一步的酶切产物进行PCR，溶解时直接用焦磷酸测序的变性缓冲液溶解。进行焦磷酸测序时只需加入测序引物，按仪器提供的条件退火后即可进行焦磷酸测序。结果见图4-2。
2)对照组：需要进行链亲和素包被微球吸附纯化制备单链模板DNA，按照QIAGEN公司提供的实验方法进行制备。结果见图4-1。
6.结果分析
进行链亲和素微球固相法焦磷酸测序(对照组)结果如图4-1，进行硫代引物法进行焦磷酸测序(实验组)结果如图4-2，由图可见对照组三个CpG位点甲基化分别为94％、92％、76％，实验组三个CpG位点甲基化分别为92％、96％、76％，实验组与对照组结果差异在5％以内，而焦磷酸测序仪的精度在5％-95％，所以实验组结果与对照组结果相符，说明以硫代引物法制备单链用于焦磷酸测序同样能够准确的检测出目的基因甲基化水平，且采用该化学修饰法相对于传统链亲和素微球固相法成本则显著降低。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (4)
1.一种制备用于焦磷酸测序的单链DNA、测序及判断目标DNA甲基化水平的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)引物设计：根据目标DNA模板设计一对PCR扩增引物，其中一条扩增引物为普通引物；另一条扩增引物为5’末端化学修饰的引物，其不会被具有5’→3’外切酶活性的酶酶切；所述的DNA模板是重亚硫酸氢盐处理的DNA；
所述的5’末端化学修饰是5’末端3个碱基进行的化学修饰为硫代磷酸化修饰或其它能够阻断核酸外切酶的化学修饰；
所述的具有5’→3’外切酶活性的酶为T7DNA外切酶或Lamda核酸外切酶或其它能够被化学修饰阻断的核酸外切酶；
(2)PCR扩增及酶切：利用(1)的扩增引物对目标DNA模板进行PCR扩增，获得扩增产物，该扩增产物中一条链存在5’末端修饰，而另一条链5’末端没有修饰；进行PCR扩增产物液体纯化；利用具有5’→3’外切酶活性的酶对扩增产物进行酶切，5’末端没有修饰的链被酶切降解，进行液体纯化，获得带有5’末端化学修饰的单链DNA产物；和
(3)获得的单链DNA产物直接用于焦磷酸测序或sanger测序，判断目标DNA甲基化水平。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，酶切的温度是25℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DNA模板包括：基因组DNA或DNA片段。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5’末端修饰为PCR扩增引物对中的正向引物修饰，或为PCR扩增引物对中的反向引物修饰。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410607086.4A CN104342494B (zh) | 2014-10-31 | 2014-10-31 | 应用于焦磷酸测序的化学修饰引物介导的方向特异性单链dna制备 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410607086.4A CN104342494B (zh) | 2014-10-31 | 2014-10-31 | 应用于焦磷酸测序的化学修饰引物介导的方向特异性单链dna制备 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104342494A CN104342494A (zh) | 2015-02-11 |
| CN104342494B true CN104342494B (zh) | 2017-11-24 |
Family
ID=52498945
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410607086.4A Active CN104342494B (zh) | 2014-10-31 | 2014-10-31 | 应用于焦磷酸测序的化学修饰引物介导的方向特异性单链dna制备 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104342494B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104805074A (zh) * | 2015-04-20 | 2015-07-29 | 徐州医学院 | 一种制备粘性末端dna组装底物的方法 |
| CN112575071A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-03-30 | 北京思尔成生物技术有限公司 | 一种不依赖于纯化对PCR扩增产物直接进行Sanger测序的方法 |
-
2014
- 2014-10-31 CN CN201410607086.4A patent/CN104342494B/zh active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| The Use of Phosphorothioate Primers and Exonuclease Hydrolysis for the Preparation of Single-stranded PCR Products and their Detection by Solid-phase Hybridization;Theo T. Nikiforov et al.;《PCR Methods and Applications》;19941231;第3卷(第4期);第285-291页 * |
| 焦磷酸测序技术及其在DNA甲基化研究中的应用;任晓叶;《国际遗传学杂志》;20121015;第35卷(第5期);第272-276页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104342494A (zh) | 2015-02-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhao et al. | Isothermal amplification of nucleic acids | |
| EP3172321B1 (en) | Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems | |
| CN109477137B (zh) | 使用argonaute系统的多核苷酸富集和扩增 | |
| EP4095259A1 (en) | Method of nucleic acid enrichment using site-specific nucleases followed by capture | |
| WO2014152155A1 (en) | Massively multiplexed rna sequencing | |
| JP2016511007A (ja) | 鎖になったｒｎａまたはｄｎａのライブラリを生成するための方法、組成物およびキット | |
| US11401543B2 (en) | Methods and compositions for improving removal of ribosomal RNA from biological samples | |
| CN112105744A (zh) | 方法 | |
| CN110741092A (zh) | 扩增dna以维持甲基化状态的方法 | |
| CN104894233B (zh) | 一种多样本多片段dna甲基化高通量测序方法 | |
| US20170321253A1 (en) | Target sequence enrichment | |
| JP2023519782A (ja) | 標的化された配列決定の方法 | |
| CN107893109A (zh) | 一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法 | |
| US20140272967A1 (en) | Systems and methods for isolating nucleic acids | |
| JP6908615B2 (ja) | ヌクレアーゼ保護を使用する直接標的シーケンシングの方法 | |
| CN104342494B (zh) | 应用于焦磷酸测序的化学修饰引物介导的方向特异性单链dna制备 | |
| CN112301102A (zh) | 一种高特异性的环介导等温扩增方法及其应用 | |
| CN117070669A (zh) | 新型冠状病毒全基因组捕获试剂盒 | |
| US20230304069A1 (en) | Methods and compositions for single cell analysis | |
| CN115698319A (zh) | 用于制备核酸文库的方法和组合物 | |
| CN110468179A (zh) | 选择性扩增核酸序列的方法 | |
| CN110541040B (zh) | 一种利用arms-pcr技术检测甲基化水平的方法及其引物和试剂盒 | |
| CN117512075A (zh) | 一种基于切刻酶扩增与CRISPR/Cas12b结合的一体化核酸检测方法 | |
| WO2024013241A1 (en) | Variant allele enrichment by unidirectional dual probe primer extension | |
| KR20240005282A (ko) | Crispr/cas 기반의 핵산 검출용 키트 및 이에 기초한 핵산 검출 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |