CN117512075A - 一种基于切刻酶扩增与CRISPR/Cas12b结合的一体化核酸检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种核酸检测方法，所述方法基于切刻酶扩增与CRISPR/Cas12b，将能够快速扩增的切刻酶辅助扩增技术NEAR与核酸特异性识别工具CRISPR/Cas有机结合，实现对目标基因的快速可视化灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种基于切刻酶辅助扩增技术与CRISPR结合的一体化核酸检测方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)通过从一个特定DNA片段的单个副本中产生数百万个DNA序列副本，是实验室核酸检测的金标准。其主要原理是在热稳定DNA聚合酶的作用下，利用温度循环实现引物识别和延伸，完成特定DNA片段的体外扩增。仅需少量DNA，在经过循环指数扩增后就可达到可检测水平，这为分析人员的定量和定性分析提供了便利条件。但精确控制温度循环需要精密的设备，这导致该方法只能集中在实验室中进行。
近年来兴起的等温扩增技术填补了PCR技术的局限性，环介导等温扩增技术(LAMP)是利用嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)DNA聚合酶在60至65℃的等温条件下实现核酸大量复制的体外扩增反应，其可以在约30min实现目标核酸的检测。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是另外一种极具潜力的恒温扩增方法，RPA使用两个引物于37～42℃的恒定温度下在20～40分钟内实现目标序列的指数扩增。常温反应、简单的程序和短的扩增时间使得RPA成为核酸检测的有力技术。滚环扩增(RCA)是一种作用于环状DNA分子的等温扩增反应。RCA利用具有链置换活性的Phi 29噬菌体DNA聚合酶来延伸与环状DNA模板退火的单个或多个引物。聚合酶的链置换活性允许新合成的DNA模板置换先前产生的DNA分子从而释放ssDNA，RCA反应大多数是在37～40℃下约40分钟完成。
切刻酶辅助扩增技术(NEAR)是通过DNA聚合酶和切刻酶的协同作用实现的核酸扩增方法。相对于其他恒温扩增方法，NEAR具有极高的扩增效率，扩增产物可以在很短的时间内(～10分钟)以指数级积累108倍以上。与普通引物不同，用于NEAR反应的引物是专门设计的，其包括一个5’端随机序列区、切刻酶识别区(例如，5’-GAGTCNNNN-3’，Nt.BstNBI)和与靶核酸链互补的靶结合区。在NEAR过程中，聚合酶一次又一次地从缺口中延伸链，下游的靶序列被置换，切口酶不断地在双链DNA产物中产生缺口，这种重复的切刻、延伸和置换的循环使得靶标DNA得到指数式增长。但对于某些核酸目标，DNA双链的呼吸作用与聚合酶的强链置换活性不足以打开双链，引物难以嵌入到模版中导致特异性扩增失败，因此在靶片段上必须存在切刻酶的识别序列(例如，5’-GAGTCNNNN-3’，Nt.BstNBI)。然后根据所选择的片段进行引物设计，同时还应考虑Tm值、二级结构和引物二聚体、扩增片段大小等因素，因此需要综合考虑以确定某一特定靶标是否可用于NEAR反应。此外与LAMP和RPA相比，NEAR在反应中产生了大量的非特异性产物，这些副产物不仅严重抑制了正向反应的进展，而且极大地限制了检测灵敏度水平，极大的限制了NEAR的应用。
为推广NEAR的应用，将NEAR与其他分析方法结合使用，已经开发出具有各种信号输出工具的核酸传感器，如荧光、比色和电化学信号。NEAR可以用CdTe量子点作为荧光标记，分子信标可用作NEAR反应的报告器，与其他放大方法结合开发超低检测限双扩增检测方法。此外，NEAR反应也可用于传统可视化方法(如比色法)、经典的电化学DNA传感器系统的核酸检测。但特异性效果仍然有限，因此需要开发更为精确地序列特异性分析方法。
近年来CRISPR/Cas技术迅速发展，掀起了分子生物学领域的新变革，其高特异性、灵活、易于模块化分析的特点受到广泛关注，也逐渐被应用至扩增产物分析，成为新型的信号元件。CRISPR/Cas体系主要通过Cas效应蛋白与向导RNA的相互作用调动体系的反应机制。所有Cas效应蛋白都依赖crRNA来引导对靶标双链DNA、单链DNA或单链RNA底物的互补链的识别与结合，以实现顺式裂解活性。此外某些II类Cas蛋白如Cas12a，Cas12b，Cas13a等具备反式切割活性，可以在Cas效应蛋白顺式切割活性激活的同时，激活其反式切割活性，任意切割蛋白存在环境中的单链DNA或单链RNA，这一现象已被应用于核酸快速检测中。但其灵敏度有限，提高CRISPR/Cas核酸分析灵敏度的一种手段是将靶标扩增，当与等温扩增技术结合时将大大提高扩增产物检测的序列特异性，有望提高检测的特异性和灵敏度，同时实现现场可视化分析。
然而，当将CRISPR/Cas技术与等温扩增技术结合时，可能会出现一系列问题导致检测失败。第一，CRISPR/Cas技术与等温扩增技术反应成分不兼容，同时调节体系中的多个反应组分更可能导致检测失败。第二，由于Cas效应蛋白强烈的顺式与反式切割活性，会出现靶标和引物被Cas效应蛋白过度消耗致使扩增失败，从而使检测失败。在此过程中，不得不开盖的两步式操作还带来了气溶胶污染问题。因此，针对目前的现有技术中存在的开盖污染、复杂的序列设计、繁琐的操作步骤、较长的反应时间、反应体系不兼容等问题，亟需开发一种更准确、简便、无污染的可视化扩增产物分析手段。
发明内容
CRISPR/Cas体系的高度特异性靶标识别机制，为扩增条件苛刻的NEAR体系提供了更优的产物分析途径。其中如何解决两个体系的不兼容性，NEAR扩增效率与CRISPR/Cas体系的切割效率差异是实现一体化的关键突破步骤，具有一定的挑战性。因此，本发明的目的是开发出一种基于切刻酶扩增与CRISPR/Cas12b结合的一体化核酸检测方法，该方法反应效率高，并且可以在不打开反应容器的情况下进行检测过程和结果判定。
针对现有技术的不足，在第一方面，本发明提供了一种核酸检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)针对待检测目标DNA设计含有切刻酶识别位点的内引物对和外引物对，所述内引物对对应的上游内引物和下游内引物按5’至3’顺序包含三个部分：引物5’端为约11～13nt的随机序列区，紧接是切刻酶识别区GAGTCNNNN，其后是约13～18nt的模板特异性识别区，所述模板特异性识别区选取在目标DNA序列中Cas12b识别位点两侧；所述外引物对的上游外引物是位于距所述上游内引物的上游3nt的16～20nt的序列，所述外引物对的下游外引物是位于距所述下游内引物的下游3nt的16～20nt的序列；
(2)提取待测样品的基因组DNA；
(3)在所述基因组DNA中一次性加入所述内引物对和外引物对、dNTPs、缓冲液、切刻酶、Bst DNA聚合酶、靶向目标DNA的sgRNA、Cas12b蛋白、荧光标记的单链DNA报告子，以进行扩增切割一体化反应；
(4)根据荧光标记的单链DNA报告子类型对反应产物进行光照激发，从而判断所述目标DNA是否存在。
在第二方面，本发明提供了一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：针对待检测目标DNA设计的含有切刻酶识别位点的内引物对和外引物对、dNTPs、缓冲液、切刻酶、BstDNA聚合酶、Cas12b蛋白、靶向目标DNA的sgRNA、荧光标记的单链DNA报告子；
其中所述内引物对对应的上游内引物和下游内引物按5’至3’顺序包含三个部分：引物5’端为约11～13nt的随机序列区，紧接是切刻酶识别区GAGTCNNNN，其后是约13～18nt的模板特异性识别区，所述模板特异性识别区选取在目标DNA序列中Cas12b识别位点两侧；所述外引物对的上游外引物是位于距所述上游内引物的上游3nt的16～20nt的序列，所述外引物对的下游外引物是位于距所述下游内引物的下游3nt的16～20nt的序列；
任选地，所述试剂盒还包括RNase抑制剂。
在第三方面，本发明提供了根据本发明的第一方面或第二方面所述的方法或试剂盒的用途，其特征在于，其用于核酸检测。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明将核酸扩增和Cas12b切割检测集成在一个反应体系中，可以一次性添加所有反应组分而无需打开再次反应容器就可以实现对检测结果的裸眼观测，大大降低了气溶胶污染问题；
该反应操作简便，恒温反应，无需温度循环，可以实现序列特异性的现场可视化分析；
本发明反应时间短，最快可实现5min检测，灵敏度高，设计灵活，适用于多种对象与多元化场景。
附图说明
通过以下附图对本发明进行详细说明。
图1为一种基于切刻酶扩增与CRISPR/Cas12b结合的一体化防污染核酸可视化检测方法的实验操作流程示意图。当样本中含有目标序列时，内引物与外引物会对目标基因进行扩增，同时体系中与Cas12b蛋白结合的sgRNA识别扩增序列，进而激活Cas12b蛋白的附属切割活性，溶液在蓝光激发下发射绿色荧光。当样本中不含有目标序列时，没有扩增发生，Cas12b的附属切割活性无法被激活，溶液在蓝光激发下不发射荧光。
图2为使用本发明所述方法检测不同浓度的Omicron质粒基因组DNA的实验结果，本发明可以在30min内快速检测低至20copies/μL的质粒DNA。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施方案和附图，对本发明进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，本文所使用的全部技术和科学术语都具有与本文的主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
切刻酶辅助扩增技术(Nicking Enzyme Amplification Reaction，NEAR)是通过DNA聚合酶和切刻酶的协同作用实现的核酸扩增方法。与普通引物不同，用于NEAR反应的引物是专门设计的，通常包括内引物和外引物，当样本中含有目标序列时，内引物与外引物会对目标基因进行扩增。所述内引物按5’至3’顺序包括一个5’端随机序列区、切刻酶识别区和与靶核酸链互补的模板特异性识别区。所述内引物的模板特异性识别区选取在目标DNA序列中Cas12b识别位点两侧的13nt，在此特异性识别区外侧3nt处，选取16～20nt作为外引物。引物设计根据所选择的片段进行，同时还应考虑Tm值、二级结构和引物二聚体、扩增片段大小等因素。
在PCR反应中，引物通常分为“上游引物(或正向引物，F)”和“下游引物(或反向引物，R)”，它们是反向对称的，其中上游引物与双链DNA的一条链(5'-3'方向)的上游结合部位互补结合，下游引物与另一条互补链(3'-5'方向)的下游结合部位互补结合。
在本文中，切刻酶(Nicking endonu clease，NiE)，也被称为切刻内切酶、缺刻酶、切口酶，是一类能在DNA单链特定识别序列产生缺口并暴露出游离的3’端的限制性内切酶。当其被设计到DNA片段末端时，经过酶切和变性时，就能产生单链突出末端。Nt.BstNBI切刻酶能特异性地识别DNA序列5’-GAGTCNNNN-3’/5’-GACTCNNNN-3’,并且仅仅在距识别位点3’端4个核苷酸的位置切割含有识别序列的单链DNA。
在本文中，用于切刻酶扩增技反应的DNA聚合酶是可用于DNA链合成，同时具有链置换功能的DNA聚合酶，如Bst DNA聚合酶。
在本文中，术语“Crispr”、“crispr”或者“CRISPR”均指规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)，术语无论是大写还是小写或者是首字母大写，均是本领域常用的表述方式。相应的，CRISPR/Cas系统中因为字母大小写存在不同的表述。
本发明涉及的CRISPR/Cas12b体系主要依赖于Cas12b核酸酶。Cas12b核酸酶是依赖于RNA介导的内切核酸酶，在靶标DNA存在PAM的情况下，可特异地切割靶标双链DNA。Cas12b蛋白比Cas9和Cas12a更小，且来源于嗜酸耐热菌且切割活性较高的Alicyclobacillus acidoterrestris。Cas12b不仅可以应用于靶标dsDNA的切割，还可以用于靶标核酸的快速检测。与Cas9蛋白相似，Cas12b蛋白需要CRISPR RNA(crRNA)和反式激活的crRNA，以组合为sgRNA(small guide RNA，sgRNA)，用于DNA靶向。sgRNA属于一种小型非编码RNA，其在RNA编辑的过程中引导尿苷残基插入或缺失到动质体(kinetoplastid)中。靶DNA被Cas12b蛋白-sgRNA复合物识别后，激活的Cas12b蛋白具有反式核酸酶活性，能够对单链DNA报告子进行切割，同时释放荧光信号，为核酸检测提供了一个高效且实用的平台。
在本文中，核酸序列包括DNA或RNA，提及DNA序列也包括提及了其对应RNA序列，反之亦然。本领域技术人员知晓二者之间如何转换，并且知晓在具体的情形下使用DNA序列还是使用RNA序列。另外，当表示碱基时，如无特别说明，字母N和字母V所代表的碱基具有本领域通常的含义，即N代表随机或者任意碱基A、T、C或者G，V代表随机或者任意碱基A、C或者G。
在本文中，提及核酸序列包括提及的序列本身，也包括其反向互补序列，以及它们形成的互补双链序列。本领域技术人员知晓如何由一条核酸序列获得其反向互补序列。本文所指一条序列的功能，包括序列本身有此功能，或者其反向互补序列由此功能。在应用中，本领域技术人员会知晓选择序列本身或其反向互补序列，或者它们形成的双链。
在本文中，只要不与本领域常识相悖，提及核酸，等同提及了相应的DNA、RNA、DNA双链、RNA双链和DNA-RNA双链中的任意一项或多项。
因此，在第一方面，本发明提供了一种核酸检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)针对待检测目标DNA设计含有切刻酶识别位点的内引物对和外引物对，所述内引物对对应的上游内引物和下游内引物按5’至3’顺序包含三个部分：引物5’端为约11～13nt的随机序列区，例如12nt；紧接是切刻酶识别区GAGTCNNNN，其后是约13～18nt的模板特异性识别区，例如14、15、16或17nt；所述模板特异性识别区选取在目标DNA序列中Cas12b识别位点两侧；所述外引物对的上游外引物是位于距所述上游内引物的上游3nt的16～20nt的序列，例如17、18或19nt；所述外引物对的下游外引物是位于距所述下游内引物的下游3nt的16～20nt的序列；
(2)提取待测样品的基因组DNA；
(3)在所述基因组DNA中一次性加入所述内引物对和外引物对、dNTPs、缓冲液、切刻酶、Bst DNA聚合酶、靶向目标DNA的sgRNA、Cas12b蛋白、荧光标记的单链DNA报告子，以进行扩增切割一体化反应；
(4)根据荧光标记的单链DNA报告子类型对反应产物进行光照激发，从而判断所述目标DNA是否存在。
在一个实施方案中，在(3)中，孵育温度为43～58℃，孵育5～30min。在一个优选实施方案中，所述孵育温度为45～58℃。在一个更优选实施方案中，孵育温度为57℃。
在第二方面，本发明提供了一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：针对待检测目标DNA设计的含有切刻酶识别位点的内引物对和外引物对、dNTPs、缓冲液、切刻酶、BstDNA聚合酶、Cas12b蛋白、靶向目标DNA的sgRNA、荧光标记的单链DNA报告子；
其中所述内引物对对应的上游内引物和下游内引物按5’至3’顺序包含三个部分：引物5’端为约11～13nt的随机序列区，例如12nt；随机序列区后是切刻酶识别区GAGTCNNNN，切刻酶识别区后是约13～18nt的模板特异性识别区，例如14、15、16、或17nt；所述模板特异性识别区选取在目标DNA序列中Cas12b识别位点两侧；所述外引物对的上游外引物是位于距所述上游内引物的上游3nt的16～20nt的序列，例如17、18、或19nt；所述外引物对的下游外引物是位于距所述下游内引物的下游3nt的16～20nt的序列，例如17、18、或19nt；
任选地，所述试剂盒还包括RNase抑制剂。
在一个实施方案中，所述缓冲液包括Tris-HCl、BSA、Na+、K+、Mg2+。
在一个实施方案中，所述缓冲液包括Tris-HCl(PH＝7.9)、NaCl、BSA、Tris-HCl(PH＝8.8)、(NH4)2SO4、KCl、MgCl2、20。
在一个优选实施方案中，所述缓冲液包括30～80mM Tris-HCl(PH＝7.9)，80～120mM NaCl，80～120μg/mL BSA，5～20mM Tris-HCl(PH＝8.8)，2～10mM(NH4)2SO4，70～100mM KCl，5～15mM MgCl2，0.05％～0.2％20。
在一个更优选实施方案中，所述缓冲液包括50mM Tris-HCl(PH＝7.9)，90mMNaCl，90μg/mL BSA，10mM Tris-HCl(PH＝8.8)，5mM(NH4)2SO4，90mM KCl，10mM MgCl2，0.05％20。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包括RNase抑制剂，优选地，所述RNase抑制剂为TakaRa Ribonuclease Inhibitor。
在一个实施方案中，所述所述荧光标记的单链DNA报告子序列为：5’6-FAM-TTATTT-3’BHQ1，通过对反应产物进行蓝光照射来判断所述目标DNA是否存在。当样本中含有目标序列时，内引物与外引物会对目标基因进行扩增，同时与Cas12b蛋白结合的sgRNA识别扩增序列，进而激活Cas12b蛋白的附属切割活性，溶液在蓝光激发下发射绿色荧光。当样本中不含有目标序列时，没有扩增发生，Cas12b的附属切割活性无法被激活，溶液在蓝光激发下不发射荧光。
在一个实施方案中，所述切刻酶选自Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nb.BtsI。在一个优选实施方案中，所述切刻酶是Nt.BstNBI，所述切刻酶识别位点为GAGTC。
在一个实施方案中，在目标DNA序列中Cas12b识别位点的两侧选取13nt作为内引物的模板特异性识别区，在此特异性识别区外侧3nt处，选取16～20nt(例如17、18、或19nt)作为外引物。
在一个优选实施方案中，所述随机序列区为11～13nt，所述模板特异性识别区为13～17nt(Tm＝45～55℃)，例如14、15、或16nt。在一个更优选实施方案中，所述随机序列区为13nt，所述模板特异性识别区为13nt(Tm＝53℃)。
在一个实施方案中，所述Bst DNA聚合酶选自Bst 3.0DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶，大片段、Bst 2.0DNA聚合酶。在一个优选实施方案中，所述Bst DNA聚合酶是Bst 3.0DNA聚合酶。
在一个实施方案中，所述内引物对浓度为0.1～0.5μM，外引物对浓度为0.1～0.5μM，sgRNA浓度为0.5～1μM，单链DNA报告子浓度为0.5～1μM，Cas12b蛋白为0.1～0.2μM，切刻酶为8～10U、Bst DNA聚合酶为4～6U。
在一个优选实施方案中，内引物对浓度可以为0.1～0.3μM，外引物对浓度为0.2～0.4μM，sgRNA浓度为0.8～1μM，单链DNA报告子浓度为0.8～1μM。
在一个更优选实施方案中，内引物对浓度为0.1μM，外引物对浓度为0.2μM，sgRNA浓度为0.8μM，单链DNA报告子浓度为1μM，Cas12b蛋白为0.1μM，切刻酶为9U、Bst DNA聚合酶为5U。
在第三方面，本发明提供了根据本发明的第一方面或第二方面所述的方法或试剂盒的用途，其特征在于，其用于核酸检测。
在一个优选实施方案中，所述用途是检测Omicron质粒基因组DNA。
在一个优选实施方案中，所述内引物对的序列如SEQ.ID.NO1、SEQ.ID.NO2所示，所述外引物对序列如SEQ.ID.NO3、SEQ.ID.NO4所示，所述靶向目标序列的sgRNA序列如SEQ.ID.NO5所示。
在一个优选实施方案中，SEQ.ID.NO3、SEQ.ID.NO4的Tm为45～55℃。在一个更优选实施方案中，SEQ.ID.NO3、SEQ.ID.NO4的Tm为53℃。
在一个实施方案中，所述的sgRNA由T7体外转录得到。其中体外转录体系中引物序列为：
T7-sgRNA-F是T7启动子引物，序列为：TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ.ID.NO6)；
T7-sgRNA-R为含有cas12b识别的目标DNA序列的引物(SEQ.ID.NO7)；
AapCas12b-T7-gRNA是与Cas12b蛋白结合的sgRNA的骨架，序列为：TAATACGACTCACTATAGGGGTCTAGAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTG CCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGCTTCTCAAATCTGAG AAGTGGCAC(SEQ.ID.NO8)。
在一个优选实施方案中，含有切刻酶Nt.BstNBI识别位点GAGTC的内引物对浓度为0.1μM，外引物对浓度为0.2μM，sgRNA浓度为0.8μM，单链DNA报告子浓度为1μM；反应体系优选还包含0.2mM dNTPs，50mM Tris-HCl(PH＝7.9)，90mM NaCl，90μg/mLBSA，10mM Tris-HCl(PH＝8.8)，5mM(NH4)2SO4，90mM KCl，10mM MgCl2，0.05％20，9U Nt.BstNBI，5UBst3.0DNAPolymerase，5U RNase Inhibitor，0.1μM Cas12b蛋白，其余为超纯水。
实施例
实施例1：使用本发明所述的核酸检测方法检测不同浓度的Omicron质粒基因组DNA。
本发明的实施过程具体如下：
1.提取待测样品的基因组DNA；
2.设计并合成含有切刻酶Nt.BstNBI识别位点GAGTC的内引物对，外引物对；
3.设计并制备靶向目标DNA的sgRNA，所述的sgRNA由T7体外转录得到；
4.单链报告分子序列为：5’6-FAM-TTATTT-3’BHQ1；
5.基于CRISPR/Cas12b的一体化防污染核酸可视化检测Omicron质粒基因组DNA的体系为：
2.5μL步骤1)提取的基因组DNA作为模板，含有切刻酶Nt.BstNBI识别位点GAGTC的内引物对浓度为0.1μM；外引物对浓度为0.2μM；sgRNA浓度为0.8μM；单链DNA报告子浓度为1μM，0.2mM dNTPs，50mM Tris-HCl(PH＝7.9)，90mM NaCl，90μg/mLBSA，10mM Tris-HCl(PH＝8.8)，5mM(NH4)2SO4，90mM KCl，10mM MgCl2，0.05％20，9U Nt.BstNBI，5UBst3.0DNAPolymerase，5U RNase Inhibitor，0.1μM Cas12b蛋白，超纯水补至总体积为25μL，57℃孵育5～30min，通过荧光信号判断待测样品中是否含有目标基因。
其中：
含有切刻酶Nt.BstNBI识别位点GAGTC的内引物对序列为：
F：ATGGGTAGGTTGAGTCGGATAATGGTGTTGCAG(SEQ.ID.NO1)；
R：TGTATTGTATTGAGTCTGGTCATAAGTGGGTCG(SEQ.ID.NO2)；
外引物对序列为：
BF：AGGCCGGTAACAAACC(SEQ.ID.NO3)；
BR：TATGGTTGGTGACCAA(SEQ.ID.NO4)；
所述RNA酶抑制剂为Ribonuclease Inhibitor(TakaRa)；
所述靶向目标序列的sgRNA序列为：T-sgRNA：
5’-GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUU UCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACC UUUACGAUCAUAUAGUU-3’(SEQ.ID.NO5)；
所述的sgRNA由T7体外转录得到。体外转录体系中引物对序列为：
T7-sgRNA-F：TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ.ID.NO6)；
T7-sgRNA-R：AACTATATGATCGTAAAGGTGCCACTTCTCAGATTTGA(SEQ.ID.NO7)；
AapCas12b-T7-gRNA：TAATACGACTCACTATAGGGGTCTAGAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGCTTCTCAAATCTGAG AAGTGGCAC(SEQ.ID.NO8)；
6.结果判断
当样本中含有目标序列时，内引物与外引物会对目标基因进行扩增，同时体系中与Cas12b的蛋白结合的sgRNA识别扩增序列，进而激活Cas12b的附属切割活性，溶液在蓝光激发下发射绿色荧光。
当样本中不含有目标序列时，没有扩增发生，Cas12b的附属切割活性无法被激活，溶液在蓝光激发下不发射荧光。
结果显示：本发明可以在30min内快速检测低至20copies/μL的质粒DNA。
实施例2：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，内引物对浓度采用0.5μM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例3：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，外引物对浓度采用0.1μM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例4：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，外引物对浓度采用0.5μM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例5：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，sgRNA浓度采用0.5μM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例6：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，sgRNA浓度采用1μM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例7：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，单链DNA报告子浓度采用0.5μM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例8：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，dNTPs浓度采用0.5mM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例9：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，Tris-HCl(PH＝7.9)浓度采用30mM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例10：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，Tris-HCl(PH＝7.9)浓度采用80mM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例11：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，NaCl浓度采用80mM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例12：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，NaCl浓度采用120mM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例13：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，BSA浓度采用80μg/mL，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例14：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，BSA浓度采用120μg/mL，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例15：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，Tris-HCl(PH＝8.8)浓度采用5mM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例16：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，Tris-HCl(PH＝8.8)浓度采用20mM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例17：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，(NH4)2SO4浓度采用2mM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例18：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，(NH4)2SO4浓度采用10mM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例19：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，KCl浓度采用70mM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例20：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，KCl浓度采用100mM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例21：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，MgCl2浓度采用5mM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例22：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，MgCl2浓度采用15mM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例23：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，20浓度采用0.05％，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例24：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，20浓度采用0.2％，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例25：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，Nt.BstNBI用量采用8U，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例26：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，Nt.BstNBI用量采用10U，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例27：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，Bst 3.0DNA Polymerase用量采用4U，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例28：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，Bst 3.0DNA Polymerase用量采用6U，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例29：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，RNase Inhibitor用量采用4U，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例30：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，RNase Inhibitor用量采用6U，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例31：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，Cas12b浓度采用0.2μM，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例32：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，孵育温度采用43℃，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例33：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，孵育温度采用58℃，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例34：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，含有切刻酶Nt.BstNBI识别位点GAGTC的内引物的5’端为随机序列区取10nt，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例35：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，含有切刻酶Nt.BstNBI识别位点GAGTC的内引物的模板特异性识别区采用13nt，Tm约为45℃，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例36：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，含有切刻酶Nt.BstNBI识别位点GAGTC的内引物的模板特异性识别区采用17nt，Tm约为55℃，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例37：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，SEQ.ID.NO3、SEQ.ID.NO4的长度为16nt，Tm约为45℃，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例38：使用本发明所述的核酸检测方法检测Omicron质粒基因组DNA。
此实施例中，SEQ.ID.NO3、SEQ.ID.NO4的长度为20nt，Tm约为55℃，体系所用其他工作条件同实施例1。结果显示，Omicron阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
序列表：
SEQ.ID.NO1：ATGGGTAGGTTGAGTCGGATAATGGTGTTGCAG；
SEQ.ID.NO2：TGTATTGTATTGAGTCTGGTCATAAGTGGGTCG；
SEQ.ID.NO3：AGGCCGGTAACAAACC；
SEQ.ID.NO4：TATGGTTGGTGACCAA；
SEQ.ID.NO5：
5’-GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACCUUUACGAUCAUAUAGUU-3’；
SEQ.ID.NO6：TAATACGACTCACTATAGGG；
SEQ.ID.NO7：AACTATATGATCGTAAAGGTGCCACTTCTCAGATTTGA；
SEQ.ID.NO8：
TAATACGACTCACTATAGGGGTCTAGAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTG
CCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGCTTCTCAAATCTGAGAAGTGGCAC。
Claims (10)
1.一种核酸检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)针对待检测目标DNA设计含有切刻酶识别位点的内引物对和外引物对，所述内引物对对应的上游内引物和下游内引物按5’至3’顺序包含三个部分：引物5’端为约11～13nt的随机序列区，紧接是切刻酶识别区GAGTCNNNN，其后是约13～18nt的模板特异性识别区，所述模板特异性识别区选取在目标DNA序列中Cas12b识别位点两侧；所述外引物对的上游外引物是位于距所述上游内引物的上游3nt的16～20nt的序列，所述外引物对的下游外引物是位于距所述下游内引物的下游3nt的16～20nt的序列；
(2)提取待测样品的基因组DNA；
(3)在所述基因组DNA中加入所述内引物对和外引物对、dNTPs、缓冲液、切刻酶、BstDNA聚合酶、靶向目标DNA的sgRNA、Cas12b蛋白、荧光标记的单链DNA报告子，以进行扩增切割一体化反应；
(4)根据荧光标记的单链DNA报告子类型对反应产物进行光照激发，从而判断所述目标DNA是否存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在(3)中，反应温度为43～58℃，孵育5～30min；优选地，所述反应温度为45～58℃；更优选地，反应温度为57℃。
3.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：针对待检测目标DNA设计的含有切刻酶识别位点的内引物对和外引物对、dNTPs、缓冲液、切刻酶、Bst DNA聚合酶、Cas12b蛋白、靶向目标DNA的sgRNA、荧光标记的单链DNA报告子；
其中所述内引物对对应的上游内引物和下游内引物按5’至3’顺序包含三个部分：引物5’端为约11～13nt的随机序列区，紧接是切刻酶识别区GAGTCNNNN，其后是约13～18nt的模板特异性识别区，所述模板特异性识别区选取在目标DNA序列中Cas12b识别位点两侧；所述外引物对的上游外引物是位于距所述上游内引物的上游3nt的16～20nt的序列，所述外引物对的下游外引物是位于距所述下游内引物的下游3nt的16～20nt的序列；
任选地，所述试剂盒还包括RNase抑制剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括Tris-HCl、BSA、Na+、K+、Mg2+；优选地，所述缓冲液包括30～80mM Tris-HCl(PH＝7.9)，80～120mM NaCl，80～120μg/mLBSA，5～20mM Tris-HCl(PH＝8.8)，2～10mM(NH4)2SO4，70～100mM KCl，5～15mM MgCl2，0.05％～0.2％20；更优选地，所述缓冲液包括50mM Tris-HCl(PH＝7.9)，90mMNaCl，90μg/mL BSA，10mM Tris-HCl(PH＝8.8)，5mM(NH4)2SO4，90mM KCl，10mM MgCl2，0.05％/>20。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法或试剂盒，其特征在于，所述荧光标记的单链DNA报告子序列为：5’6-FAM-TTATTT-3’BHQ1，通过对反应产物进行蓝光照射来判断所述目标DNA是否存在。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法或试剂盒，其特征在于，所述切刻酶选自Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nb.BtsI；优选地，所述切刻酶是Nt.BstNBI，所述切刻酶识别位点为GAGTCNNNN。
7.根据权利要求1-4任一项所述的方法或试剂盒，其特征在于，在目标DNA序列中Cas12b识别位点的两侧选取13nt作为内引物的模板特异性识别区，在此特异性识别区外侧3nt处，选取16～20nt作为外引物；优选地，所述随机序列区为11～13nt，所述模板特异性识别区为13～17nt；更优选地，所述随机序列区为13nt，所述模板特异性识别区为13nt。
8.根据权利要求1-4任一项所述的方法或试剂盒，其特征在于，所述Bst DNA聚合酶选自Bst 3.0DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶，大片段、Bst 2.0DNA聚合酶；优选地，所述Bst DNA聚合酶是Bst 3.0DNA聚合酶。
9.根据权利要求1-4任一项所述的方法或试剂盒，其特征在于，所述内引物对浓度为0.1～0.5μM，外引物对浓度为0.1～0.5μM，sgRNA浓度为0.5～1μM，单链DNA报告子浓度为0.5～1μM，Cas12b蛋白为0.1～0.2μM，切刻酶为8～10U、Bst DNA聚合酶为4～6U；优选地，内引物对浓度可以为0.1～0.3μM，外引物对浓度为0.2～0.4μM，sgRNA浓度为0.8～1μM，单链DNA报告子浓度为0.8～1μM；更优选地，内引物对浓度为0.1μM，外引物对浓度为0.2μM，sgRNA浓度为0.8μM，单链DNA报告子浓度为1μM，Cas12b蛋白为0.1μM，切刻酶为9U、Bst DNA聚合酶为5U。
10.权利要求1-9任一项所述的方法或试剂盒的用途，其特征在于，其用于核酸检测；优选地，用于检测Omicron质粒基因组DNA，其中所述内引物对的序列如SEQ.ID.NO1、SEQ.ID.NO2所示，所述外引物对序列如SEQ.ID.NO3、SEQ.ID.NO4所示，所述靶向目标序列的sgRNA序列如SEQ.ID.NO5所示。
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