CN115354069A - 一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒 - Google Patents

一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN115354069A
CN115354069A CN202210726997.3A CN202210726997A CN115354069A CN 115354069 A CN115354069 A CN 115354069A CN 202210726997 A CN202210726997 A CN 202210726997A CN 115354069 A CN115354069 A CN 115354069A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mixed solution
nucleic acid
acid detection
amplification
rapid nucleic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210726997.3A
Other languages
English (en)
Inventor
彭颖
李冬月
郭葳
尚剑
王洁
李玥颖
张旗
汤文学
郭永军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou University
Original Assignee
Zhengzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou University filed Critical Zhengzhou University
Priority to CN202210726997.3A priority Critical patent/CN115354069A/zh
Publication of CN115354069A publication Critical patent/CN115354069A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒，该扩增方法包括如下步骤：配置混合液A、混合液B和混合液C，将混合液B、混合液C和混合液A依次加入PCR管内混匀后扩增；该方法能够解决现目前快速核酸检测技术中假阳性率较高和有效检测浓度范围较窄的技术问题。

Description

一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体公开了一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒。
背景技术
适合用于现场检测、临床诊断的快速、高通量核酸检测技术是急于被需要的。目前已开发了多种特定核酸靶标检测方法，比如实验室最常用的聚合酶链式反应PCR，它利用耐热DNA聚合酶，通过三组不同反应的扩增周期来实现特定DNA靶标的指数级扩增。这三种反应发生在不同温度下，因此PCR需要精密的热循环系统，但这种大型且昂贵的仪器需要限制了它在资源有限的现场诊断、非专业场所的应用。由于扩增子长度和DNA聚合酶反应速度的限制，反应时间较长。此外，检测病毒RNA时需要额外的反转录即将RNA分子逆转录为cDNA，再用进行扩增过程，这增加了样品处理和污染风险，并且整个过程所需要时间较长。这些传统的核酸检测方法存在复杂的样品处理、消耗昂贵试剂、检测量小、所需时间长等缺点，阻碍了基于PCR的分子诊断在需要非常快的分析持续时间、大样本量和有限资源的情况下的应用，有待进一步的优化和完善。
近年来开发的简单、灵活、快速的等温核酸扩增技术具有扩增能力优异、反应方案简单、所需样品量少等优点，弥补了PCR的一些不足，即不需热循环，使用简单、便携的仪器。等温扩增技术是通过目标核酸分子来触发下游级联反应，从而产生放大信号，所需反应时间大大缩短。因此，这些优点使等温核酸扩增技术在快速现场分析中具有显著优势，被广泛应用，并成为有很高前景的PCR技术的替代方法。其中，指数扩增反应EXPAR 由于其扩增子长度比大多数等温核酸扩增方法的扩增子短，可在几分钟内将一段短寡核苷酸即触发序列指数放大，在短时间内具有较高的扩增效率而从众多等温核酸扩增技术中脱颖而出。EXPAR反应使用较少的酶和蛋白质，在中等温度下进行，只需一个模板(X`-X`模板：其序列由两个拷贝的触发序列X的互补序列组成，中间由产生切割酶识别和切割位点的少数碱基隔开)。EXPAR反应的核心由触发序列X引发，当触发序列X与单链模板杂交时，由DNA聚合酶延伸形成完整双链，然后缺口内切酶切割顶链，聚合酶的链置换活性释放出另一个相同的触发序列X。这些新形成的触发序列X启动新一轮的扩增，形成类似分子链式反应(一个反应的产物催化生成相同产物的进一步反应)，实现指数扩增，可用特异性染料SYBR Green 实时监测扩增过程。由于EXPAR具有快速、等温、高扩增效率、高灵敏度等特点，已被用于病毒与miRNA、酶活性、蛋白质等靶标的检测。
最近开发了一种新的、无需逆转录(RTF)、更快速、更简单的检测新冠病毒SARS-CoV-2的等温扩增方法，称为RTF-EXPAR。该方法利用核酸内切酶BstNI在病毒RNA与BinderDNA X形成杂合DNA/RNA双链时切割DNA链，生成触发序列X，触发下游EXPAR反应，从而放大病毒检测信号，避免了漫长的逆转录步骤，在一个体系里面完成RNA向DNA的转换和扩增步骤即“一步法”设置，该方法的检测时间、灵敏度均优于实验室常用的RT-qPCR和针对SARS-CoV-2开发的LAMP方法。
EXPAR反应中存在一个主要的限制性问题是在没有触发器存在时即反应仅包含除触发序列X外的所有成分时，仍具有较高的背景扩增信号。这种非特异性背景扩增现象限制了EXPAR反应的可分析灵敏度，阻碍了它在微量核酸检测中的应用。有研究探索了EXPAR反应非特异性背景扩增的机制，发现它是由一种非常规的DNA聚合酶活性引起的，这种现象在其他核酸扩增方法中也存在，但由于EXPAR的无限指数级正反馈设计使其效应更加明显。他们观察到聚合酶和EXPAR反应模板的预孵育会增加低温下模板的非特异性相互作用，从而显著加强背景扩增；而热启动可减少模板的非特异性相互作用，降低高背景扩增。另有研究证实非特异性模板相互作用导致DNA聚合酶对模板3`端非特异性延伸触发了背景扩增。在EXPAR反应中使用相对较高浓度的模板，这些模板会存在广泛的二级结构，这些二级结构易与聚合酶发生非特异性相互作用，而模板与反应中的其他核酸分子间存在的分子相互作用可能触发背景扩增，多个模板分子间相互作用也可触发聚合酶非特异性延伸，这些非特异性相互作用导致高背景信号的产生，降低反应扩增效率。
因此，需要开发有效的方法抑制EXPAR反应的高背景扩增信号，解决不良背景，提高该反应的灵敏度，确保反应的高扩增信号，促进EXPAR反应的实际应用。研究者们探索了保护单链模板以避免这种非特异性相互作用的策略，以抑制EXPAR的高背景信号，如使用单链DNA结合蛋白包覆单链模板。此外，氧化氢钴(CoOOH)纳米片已用于EXPAR，它可以利用其对单链和双链DNA的不同亲和力发挥物理阻断作用。这两种策略在抑制 EXPAR背景放大方面都表现出了有效性。然而，目前开发的EXPAR系统在检测相应靶点时仍具有较高的非特异性扩增，导致了严重的假阳性问题和较窄的有效检测浓度范围。
发明内容
本发明的第一目的在与提供一种用于快速核酸检测的体系，能够解决现目前快速核酸检测技术中假阳性率较高和有效检测浓度范围较窄的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种用于快速核酸检测的扩增方法，该方法能够解决现目前快速核酸检测技术中假阳性率较高和有效检测浓度范围较窄的技术问题。与现有技术相比，本发明至少具有如下的优点与积极效果：
本发明提供了一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒，本发明优化了快速核酸扩增技术EXPAR，旨在抑制其非特异性扩增，提高反应的特异性和可分析灵敏性，建立一个优化、灵活、快速的EXPAR系统，从而可以有效、方便地用于特定核酸分子的快速检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明中EXPAR反应的实时荧光监测，(A-C)使用无修饰模板X`-X`(2)，在不同起始浓度的触发序列X下进行EXPAR反应的荧光扩增曲线图。触发序列X的起始浓度设为：100nM、10nM、1nM、100pM、 10pM、1pM、0。T4 gp32蛋白的浓度设三个梯度：200ng/μL(A)、300ng/μL (B)、400ng/μL(C)，每10sec检测荧光反应，所有反应均用10U/μl的 Nt.BstNBI浓度；
图2为本发明中物理阻断结合化学阻断、减少缺口内切酶对EXPAR反应的影响，其中(A)EXPAR反应仅使用3`端己二醇修饰的单链模板X`-X` (1)时的荧光扩增曲线，(B-E)在使用3`端己二醇修饰的单链DNA模板 X`-X`(1)的EXPAR反应体系中分别加入1μg/μL(B)、3μg/μL(C)、5μg/μL (D)、7μg/μL(E)的CoOOH纳米片时的荧光扩增曲线，所有反应体系中均使用10U/μL的酶Nt.BstNBI浓度。(F-G)在使用己二醇化学修饰的模板 X`-X`(1)、加入1μg/μLLCoOOH纳米片的同时，改变缺口内切酶Nt.BstNBI 的使用浓度进行EXPAR反应，缺口内切酶Nt.BstNBI的使用浓度分别是 5U/μL(F)，2.5U/μL(G)；
图3为本发明中优化后的EXPAR体系示意图；
图4为本发明中建立的灵活、快捷、优化好的EXPAR体系用于病毒 RNA的检测的示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
本发明提供了一种用于快速核酸检测的体系，包括CoOOH、修饰模板序列和触发序列；所述CoOOH、修饰模板序列和触发序列的体积比为 (0.9-1.1):(0.7-0.8):(2.5-3.5)；所述修饰模板序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述触发序列的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
上述体系包括混合溶液A、混合溶液B和混合溶液C，所述混合液A 包括水、10×等温缓冲液、BSA、Bst DNA聚合酶和NT.BstNBI内切酶，所述水、10×等温缓冲液、Bst DNA聚合酶和NT.BstNBI内切酶的体积比为 (2.5-3.0):(4.5-5.0):(3.5-4.0):(0.7-0.8)；所述混合液B包括水、10×等温缓冲液、修饰模板序列、MgSO4、dNTPs、20×SYBR GreenⅠ、T4 gp32蛋白和CoOOH，所述水、10×等温缓冲液、修饰模板序列、MgSO4、dNTPs、 20×SYBR GreenⅠ、T4 gp32蛋白和CoOOH的体积比为(5.0-5.5):(2.0-3.0): (0.7-0.8):(2.2-2.5):(1.4-1.6):(0.7-0.8):(0.2-0.4):(0.9-1.1)；所述混合液C包括所述触发序列，所述混合溶液C与所述混合溶液A的体积比为(2.5-3.5):10。
上述10×等温缓冲液包括200mM Tris-HCl、100mM KCl、100mM(NH4) 2SO4、20mMMgSO4和1％Triton X-100，Tris-HCl的pH为8.8。
上述扩增方法包括如下步骤：配置混合液A、混合液B和混合液C，将混合液B、混合液C和混合液A依次加入PCR管内混匀后扩增。扩增的程序为：20-30℃、12-18s；45-55℃、10s、180个循环、每8-12s测一次荧光；4℃保存。
上述扩增的程序为：20-30℃、12-18s；45-55℃、8-12s、180个循环、每8-12s测一次荧光。
在上述混合液A中，BSA的初浓度为3.5-4.5mg/ml，Bst DNA聚合酶的初浓度为7.5-8.5U/μL，NT.BstNBI内切酶的初浓度为4.5-5.5U/μL。
在上述混合液B中，修饰模板序列的初浓度为0.8-1.2μM，MgSO4的初浓度为80-120mM，dNTPs的初浓度为8-12mM，T4 gp32蛋白的初浓度为380-420ng/μL，CoOOH的初浓度为0.8-1.2μg/μL。
在上述混合液C中，触发序列的初浓度为100fM-100nM。
上述混合溶液A、混合溶液B和混合溶液C均在冰上配制。在冰上配制以保证酶活性，其中混合溶液B需要避光，以避免染料SYBR Green受到光的影响。
本发明还提供了一种用于快速核酸检测的试剂盒，包括上述的用于快速核酸检测的体系。
实施例1
首先，在冰上按下面试剂顺序配制三种混合液A、B、C：
混合液A：2.7μL水，2.5μL 10×等温缓冲液(200mM Tris-HCl、100mM KCl、100mM(NH4)2SO4、20mM MgSO4和1％Triton X-100)，3.75μL BSA (4mg/ml)，0.3μLBst DNA聚合酶(8U/μL)，0.75μLNt.BstNBI(5U/μL)；
混合液B：5.3μL水，5μL 10×等温缓冲液(200mM Tris-HCl、100mM KCl、100mM(NH4)2SO4、20mM MgSO4和1％Triton X-100)，0.75 μLTemplateX`-X`(1)(1μM)，2.4μLMgSO4(100mM)，1.5μL dNTPs(10 mM)，0.75μL 20×SYBR GreenⅠ，0.3μL T4 gp32蛋白(400ng/μL)，1μL 1μg/μLCoOOH；
混合液C:3μL Trigger X(100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、1 pM、100fM、0)；
然后，在冰上，在避光条件下，按顺序将混合液B加到无酶的PCR八联排管中，再加混合液C，最后加混合液A，盖上盖子，混合均匀。
最后进行扩增步骤，其扩增程序如表1所示。
表1实施例1的扩增程序
温度 时间 循环 荧光检测
25℃ 15sec 0 否
50℃ 10sec 180个 是
4℃ ∞ 0 否
实施例2
首先，在冰上按下面试剂顺序配制三种混合液A、B、C：
混合液A：2.5μL水，2.0μL 10×等温缓冲液(200mM Tris-HCl、100mM KCl、100mM(NH4)2SO4、20mM MgSO4和1％Triton X-100)，3.5μL BSA (3.5mg/ml)，0.2μLBst DNA聚合酶(7.5U/μL)，0.7μLNt.BstNBI(4.5U/μL)；
混合液B：5.5μL水，4.5μL 10×等温缓冲液(200mM Tris-HCl、100mM KCl、100mM(NH4)2SO4、20mM MgSO4和1％Triton X-100)，0.7 μLTemplateX`-X`(1)(0.8μM)，2.2μLMgSO4(80mM)，1.4μL dNTPs(8 mM)，0.7μL 20×SYBR GreenⅠ，0.2μL T4 gp32蛋白(380ng/μL)，0.9μL 0.8μg/μLCoOOH；
混合液C(3μL):2.5μL Trigger X(100nM、10nM、1nM、100pM、 10pM、1pM、100fM、0)；
然后，在冰上，在避光条件下，按顺序将混合液B加到无酶的PCR八联排管中，再加混合液C，最后加混合液A，盖上盖子，混合均匀。
最后进行扩增步骤，其扩增程序如表2所示：
表2实施例2的扩增程序
温度 时间 循环 荧光检测
20℃ 12sec 0 否
45℃ 10sec 180个 是
4℃ ∞ 0 否
实施例3
混合液A：3.0μL水，3.0μL 10×等温缓冲液(200mM Tris-HCl、100mM KCl、100mM(NH4)2SO4、20mM MgSO4和1％Triton X-100)，4.0μL BSA (4.2mg/ml)，0.4μLBst DNA聚合酶(8.5U/μL)，0.8μLNt.BstNBI(5.5U/μL)；
混合液B：5.5μL水，5.5μL 10×等温缓冲液(200mM Tris-HCl、100mM KCl、100mM(NH4)2SO4、20mM MgSO4和1％Triton X-100)，0.8 μLTemplateX`-X`(1)(1.2μM)，2.5μLMgSO4(120mM)，1.6μL dNTPs (12mM)，0.8μL 20×SYBR GreenⅠ，0.4μL T4 gp32蛋白(420ng/μL)， 1.2μL 1.2μg/μLCoOOH；
混合液C:3.5μL Trigger X(100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、 1pM、100fM、0)。
然后，在冰上，在避光条件下，按顺序将混合液B加到无酶的PCR八联排管中，再加混合液C，最后加混合液A，盖上盖子，混合均匀。
最后进行扩增步骤，其扩增程序如表3所示：
表3实施例3的扩增程序
温度 时间 循环 荧光检测
30℃ 18sec 0 否
55℃ 10sec 180个 是
4℃ ∞ 0 否
试验例1
试验例1首先采用将模板和dNTPs来制备反应混合物，并将单链DNA 结合T4 gp32蛋白引入反应体系中以结合和稳定单链EXPAR模板，使用无修饰单链模板测试了EXPAR反应的速度和灵敏性。反应是在50℃进行，此温度下DNA聚合酶和缺口内切酶Nt.BstNBI保持扩增所需活性和稳定系，并用实施例1中的扩增程序进行扩增，即不使用触发序列、CoOOH和修饰序列进行扩增。通过染料SYBR GreenⅠ实时监测EXPAR反应扩增过程，在不同浓度的T4gp32蛋白、不同触发序列X起始浓度下，可观察到EXPAR 的荧光曲线快速上升，呈S型曲线，表明其扩增速度很快，且扩增起始时间与触发序列X起始浓度相关(图1A-C)。在触发序列X起始浓度从100nM 到1pM的10倍稀释梯度范围内均可有效扩增。特别是使用400ng/μL的 T4gp32蛋白浓度时，扩增时间表现出对触发序列X起始浓度的依赖性(图 1C)。因此，这些结果表明EXPAR反应是一个快速的核酸扩增过程，在五分钟左右快速扩增，而现有的实验室核酸检测技术所需时间目前普遍为60-120min左右，因此本发明提供的该方法相比目前的核酸检测方法时间更短，并具有高灵敏度，在较低触发序列浓度下仍可实现有效扩增。然而，在没有触发序列X存在的情况下，仍有很高的非特异性扩增。
试验例2
虽然EXPAR反应具有等温扩增、高扩增效率等优点，但如图1所示，在无触发序列的对照组中仍会产生较高的非特异性背景扩增现象，这会干扰所需特定触发的产生。纳米材料氢氧化钴(CoOOH)纳米片能与单链DNA 强结合，利用其对单双链DNA亲和力的差异可发挥物理阻断作用，减弱 DNA聚合酶对EXPAR模板的非特异性延伸作用。己二醇对EXPAR单链模板的3`端的化学修饰同样能够阻止聚合酶对模板3`端的非特异性延伸。因此试验例2将CoOOH纳米片和己二醇化学修饰引入到我们的EXPAR反应体系中，探索CoOOH纳米片的物理阻断结合模板3`端的化学修饰对EXPAR 反应高背景的影响。结果显示，在反应中加入1μg/μL的CoOOH纳米片时，与不加CoOOH纳米片的反应相比，对照组即不含触发序列X的扩增曲线出现拐点的时间被显著后移，而且与实验组最低浓度(100fM)触发序列X 相差几十个检测循环(图2A、B)。虽然在加入3μg/μL的CoOOH纳米片时，无触发序列组的扩增反应几乎被完全抑制，但1nM和100fM触发序列 X组反应也受影响，总体荧光强度降低，反应后管内会出现沉淀，可能是 CoOOH纳米片浓度饱和析出固体(图2C)。更高浓度的CoOOH纳米片会抑制整个EXPAR反应(图2D、E)。因此，这些结果表明CoOOH纳米片的物理阻断作用结合己二醇的化学修饰能减低EXPAR反应中的非特异性背景信号，增强EXPAR反应的高灵敏度。反应体系中应提供适量的CoOOH 纳米片来吸附EXPAR模板，过多会淬灭核酸结合，影响扩增反应。
另外还增加了两个Nt.BstNBI浓度梯度的扩增反应，发现5U/μL的 Nt.BstNBI使用浓度的EXPAR反应效果与10U/μL的相似，无触发序列组的非特异性扩增被很好的抑制，而且每个触发序列X浓度组之间的扩增曲线又相互显著区分(图2F、G)。因此，在采用己二醇修饰模板和1μg/μL 的CoOOH纳米片的EXPAR反应中，5U/μL是缺口内切酶Nt.BstNBI的一个最优浓度，也是一个更经济的选择。
本发明使用多种策略相结合优化了指数扩增反应EXPAR，优化好的体系如图3所示。优化好的EXPAR体系采用将模板、dNTP从混合物中分离来制备反应混合物，使用己二醇修饰的单链模板发挥化学阻断非特异性聚合酶延伸作用，加入1μg/μL的CoOOH纳米片与单链模板强结合以发挥物理阻断作用，加入400ng/μL的单链结合蛋白T4 gp32蛋白结合并稳定单链模板，将缺口内切酶Nt.BstNBI的使用浓度降低至5U/μL。使用这个优化后的EXPAR体系在抑制EXPAR的非特异性背景扩增现象方面取得了较好的抑制效果(图2F)。
表4序列表
Figure RE-GDA0003827477020000121
Figure RE-GDA0003827477020000131
其中*代表该序列中内切酶Nt.BstNBI缺口插入的位置。
综上所述：
本发明提供了一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒，可用于快速有效地检测特定核酸靶点，如包括新冠病毒在内的RNA病毒。我们拟使用优化好的这个EXPAR体系来定量检测DI病毒的细胞内复制状态。为了检测特异性RNA，通过参考RTF-EXPAR技术，引入了特异性核酸内切酶BstNI，BstNI在单链Binder DNA X(它的序列中一部分与靶标RNA的一段序列互补，一部分与EXPAR模板的X`序列互补即是触发序列X，中间是核酸内切酶BstNI的识别序列)与RNA序列依赖性结合形成杂合 DNA：RNA双链时切割DNA链，生成触发序列X，然后结合到己二醇修饰模板X`-X`上，在优化好的体系中触发下游EXPAR反应。完整RNA可以被模板化再生成更多触发器，促进核心EXPAR扩增反应，产生特异性扩增信号(图4)。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种用于快速核酸检测的体系，其特征在于，包括CoOOH、修饰模板序列和触发序列；所述CoOOH、修饰模板序列和触发序列的体积比为(0.9-1.1):(0.7-0.8):(2.5-3.5)；
所述修饰模板序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述触发序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的用于快速核酸检测的体系，其特征在于，包括混合溶液A、混合溶液B和混合溶液C，所述混合液A包括水、10×等温缓冲液、BSA、Bst DNA聚合酶和NT.BstNBI内切酶，所述水、10×等温缓冲液、Bst DNA聚合酶和NT.BstNBI内切酶的体积比为(2.5-3.0):(4.5-5.0):(3.5-4.0):(0.7-0.8)；所述混合液B包括水、10×等温缓冲液、修饰模板序列、MgSO4、dNTPs、20×SYBR GreenⅠ、T4 gp32蛋白和CoOOH，所述水、10×等温缓冲液、修饰模板序列、MgSO4、dNTPs、20×SYBR GreenⅠ、T4 gp32蛋白和CoOOH的体积比为(5.0-5.5):(2.0-3.0):(0.7-0.8):(2.2-2.5):(1.4-1.6):(0.7-0.8):(0.2-0.4):(0.9-1.1)；所述混合液C包括所述触发序列，所述混合溶液C与所述混合溶液A的体积比为(2.5-3.5):10。
3.根据权利要求2所述的用于快速核酸检测的体系，其特征在于，所述10×等温缓冲液包括200mM Tris-HCl、100mM KCl、100mM(NH4)2SO4、20mM MgSO4和1％Triton X-100，所述Tris-HCl的pH为8.8。
4.一种如权利要求2或3所述的用于快速核酸检测的扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：配置所述混合液A、所述混合液B和所述混合液C，将所述混合液B、所述混合液C和所述混合液A依次加入PCR管内混匀后扩增。
5.根据权利要求4所述的用于快速核酸检测的扩增方法，其特征在于，所述扩增的程序为：20-30℃、12-18s；45-55℃、10s、180个循环、每8-12s测一次荧光。
6.根据权利要求4所述的用于快速核酸检测的扩增方法，其特征在于，在所述混合液A中，所述BSA的初浓度为3.5-4.5mg/ml，所述Bst DNA聚合酶的初浓度为7.5-8.5U/μL，所述NT.BstNBI内切酶的初浓度为4.5-5.5U/μL。
7.根据权利要求4所述的用于快速核酸检测的扩增方法，其特征在于，在所述混合液B中，所述修饰模板序列的初浓度为0.8-1.2μM，所述MgSO4的初浓度为80-120mM，所述dNTPs的初浓度为8-12mM，所述T4 gp32蛋白的初浓度为380-420ng/μL，所述CoOOH的初浓度为0.8-1.2μg/μL。
8.根据权利要求4所述的用于快速核酸检测的扩增方法，其特征在于，在所述混合液C中，所述触发序列的初浓度为100fM-100nM。
9.根据权利要求4所述的用于快速核酸检测的扩增方法，其特征在于，所述混合溶液A、混合溶液B和混合溶液C均在冰上配制。
10.一种用于快速核酸检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-3任意一项所述的用于快速核酸检测的体系。
CN202210726997.3A 2022-08-31 2022-08-31 一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒 Pending CN115354069A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210726997.3A CN115354069A (zh) 2022-08-31 2022-08-31 一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210726997.3A CN115354069A (zh) 2022-08-31 2022-08-31 一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115354069A true CN115354069A (zh) 2022-11-18

Family

ID=84030533

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210726997.3A Pending CN115354069A (zh) 2022-08-31 2022-08-31 一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115354069A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6847496B2 (ja) 単一プローブプライマー伸長による標的濃縮
KR102648647B1 (ko) 짧은 호모폴리머릭 반복서열의 개선된 검출법
Ma et al. Application of real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)
JP2838084B2 (ja) Ｈｉｖ−１の検出のためのプライマー
US10858694B2 (en) Methods and reagents for reverse-transcription polymerase chain reaction
US10968478B2 (en) Methods and reagents for reverse-transcription polymerase chain reaction
Song et al. Self-priming hairpin-utilized isothermal amplification enabling ultrasensitive nucleic acid detection
Oh et al. Microparticle-based RT-qPCR for highly selective rare mutation detection
US10822645B1 (en) Methods and reagents for reverse-transcription polymerase chain reaction
CN111996292B (zh) 基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合和方法
AU2006226873B2 (en) Nucleic acid detection
EP2585615B1 (en) Highly sensitive method for detection of a target nucleic acid in a sample
JP3090100B2 (ja) ホウ素化ヌクレオチドを用いた鎖置換増幅
US20210262021A1 (en) Cleavable co-operative primers and method of amplifying nucleic acid sequences using same
CN114277109B (zh) 基于常温原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用
CN114250276B (zh) 基于指数扩增反应和Argonaute核酸酶的microRNA检测体系及方法
CN115354069A (zh) 一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒
AU2022264812A1 (en) Amplification of single stranded dna
US20090305288A1 (en) Methods for amplifying nucleic acids and for analyzing nucleic acids therewith
JP5887078B2 (ja) 合成ｓｉＲＮＡ検出方法
WO2023116373A1 (zh) 一种生成标记的核酸分子群的方法及其试剂盒
JP2007501005A (ja) ポリマー核酸を増幅するための方法
WO2023116376A1 (zh) 单细胞核酸标记和分析方法
WO2012009464A2 (en) Detection of nucleic acids by agglutination
WO2018232596A1 (zh) 定量pcr扩增引物对及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination