CN111996292B - 基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合和方法 - Google Patents

基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了基于DNA walker和G‑四链体‑血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合和方法，属于基因工程技术领域，包括DNA步行者探针、轨道分子、保护序列、序列1和序列2，核苷酸依次如SEQ ID No.1～5所示。采用本发明提供的序列组合和方法实现了待测物中低浓度EB病毒DNA的检测，提高了检测的灵敏度。

Description

基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合和方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合和方法。
背景技术
循环肿瘤DNA(ctDNA)，是循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性核酸，是由于肿瘤细胞增生活跃时的自动释放、肿瘤细胞凋亡、坏死等原因进入血液，并可用于肿瘤的无创诊断。ctDNA在血液中浓度低且存在高水平的正常循环DNA的干扰，因此建立特异性高、快速、高灵敏 ctDNA检测方法是一个很有挑战性的工作。为此，开发了具有信号扩增能力的各种策略，包括滚环扩增、链置换扩增、环介导等温扩增、荧光定量 PCR等。这些方法多为单重信号放大技术，难以实现超高灵敏循环核酸的检测，难以对肿瘤早期进行有效预测，同时这些方法扩增目标核酸需要蛋白酶(如DNA聚合酶)的参与，然而蛋白质酶易受实验条件(温度、pH和离子浓度)的影响，容易导致检测重现性和准确性差，另外还存在检测成本高、实验过程繁琐、需要昂贵的仪器设备等缺陷，而且标记荧光团的不完全猝灭可能导致背景很高，降低检测方法的灵敏度。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合和方法，采用本发明提供的序列组合和方法，提高了检测EB病毒的灵敏度。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合，包括DNA步行者探针、轨道分子、保护序列、序列1和序列2；
所述DNA步行者探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述轨道分子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述保护序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
所述序列1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述序列2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
本发明还提供了一种非诊断目的地基于上述技术方案所述的序列组合检测EB病毒的方法，包括以下步骤：
1)将所述DNA步行者探针和保护序列在95℃下处理5min、冷却，得到互补序列；
2)将所述轨道分子在95℃下处理5min、冷却，得到发夹结构；
3)将所述步骤1)得到的互补序列和步骤2)得到的发夹结构固定在微球上、封闭，得到固定有互补序列和发夹结构的微球；
4)将所述序列1固定在微球上、封闭，得到固定有序列1的微球；将所述序列2固定在微球上、封闭，得到固定有序列2的微球；
5)将所述步骤3)得到的固定有互补序列和发夹结构的微球与待测样品进行反应，得到反应物，将所述反应物离心，得到上清液；
6)将所述步骤4)得到的固定有序列1的微球与步骤5)得到的上清液杂交，得到杂交物；将所述步骤4)得到的固定有序列2的微球与 Cutsmart Buffer混合，得到混合物；将所述杂交物和混合物混合后进行孵育、离心，得到上清液；
7)将所述步骤6)得到的上清液与ABTS、双氧水混合后进行反应，在420nm处测量吸光度值，定义ΔA420nm＝A420nm-A0，其中A420nm为待测样品的吸光度值，A0为EB病毒DNA浓度为0时的吸光度值，将得到的ΔA420nm值代入ΔA420nm＝0.107+0.002CEB病毒DNA中，得到待测样品中EB病毒的含量。
优选的，所述步骤1)DNA步行者探针与保护序列的摩尔比为1:4～7。
优选的，所述步骤3)互补序列和发夹结构的摩尔比为1:15～25。
优选的，所述步骤3)固定的条件包括：所述固定的温度为25～30℃，所述固定的时间为30min。
优选的，所述步骤3)固定有互补序列和发夹结构的微球的表面修饰有 1.2×106～1.9×106个互补序列，修饰有2.8×107～2.9×107个发夹结构。
优选的，所述步骤4)固定的条件包括：所述固定的温度为25～30℃，
本发明提供的序列组合检测EB病毒的原理如下：所述固定的时间为 30min。
优选的，所述步骤5)反应的体系每20μL包括10μL固定有互补序列和发夹结构的微球、4μL 5×HEPES reaction buffer、0.5μL Zn2+、1.5μL DEPC-H2O和4μL待测样品；
所述反应的条件包括：在37℃下反应1h。
优选的，所述步骤6)固定有序列1的微球与上清液的体积比为1:1；所述固定有序列2的微球与Cutsmart Buffer的体积比为1:1。
优选的，所述步骤7)上清液与ABTS、双氧水的体积比为1:4.5:4.5；
所述反应的条件包括：在37℃下反应8min。
循环核酸识别体系如图1所示，DNA步行者探针与保护序列杂交后其携带的8-17DNA酶活性被封闭，然后与轨道分子同时修饰在微球1表面。 EB病毒DNA通过立足点交换反应(toehold exchange)定量移除保护序列，激活DNA步行者8-17DNA酶活性，由于其周围修饰有大量包含8-17DNA 酶切割位点的轨道分子，DNA步行者探针可以自动沿着三维表面上的轨道分子高速行走并切割及释放大量串联寡核苷酸重复级联扩增引发序列(第一次信号放大)。串联寡核苷酸重复级联扩增如图2所示，引发序列中包含 EcoRV核酸内切酶的识别序列，能够与修饰在微球2表面的序列1中 EcoRV核酸内切酶切割序列杂交，序列1包含1组EcoRV核酸内切酶切割序列(与引发序列匹配杂交)、4组SspI核酸内切酶识别序列以及1组G-四链体DNA酶形成序列。在EcoRV核酸内切酶作用下，序列1从微球2表面切割下来，切割下的序列1包含4组SspI核酸内切酶识别序列，能够与微球3表面修饰的序列2中SspI核酸内切酶切割序列杂交，序列2包含1 组SspI核酸内切酶切割序列(与SspI核酸内切酶识别序列杂交)、4组 EcoRV核酸内切酶识别序列以及1组G-四链体DNA酶形成序列。在SspI 核酸内切酶作用下，序列2从微球3表面切割下来，其包含的4组EcoRV 核酸内切酶识别序列能够与微球2表面修饰的序列1中EcoRV核酸内切酶切割序列杂交，从而引发循环切割，不断释放G-四链体DNA酶形成序列 (第二次信号放大)。反应完成后，取上清液，体系中加入氯化血红素，与G-四链体结合形成G-四链体-血红素-DNA酶，催化ABTS-H2O2反应体系显色(第三次信号放大)。由于G-四链体-血红素-DNA酶的数量与吸光度呈正相关，可对EB病毒DNA进行定量。该技术融入了多重信号放大技术，仅需要通过比色即可实现低浓度目标循环核酸的定量检测，操作简单、灵敏度高。在检测过程中，所有纳米DNA组件都限制在同一个微米空间内，反应物有效浓度得到极大的提高，因而该纳米机器能够实现检测信号的快速放大，从而能够检测到人体血清样本中少量的EB病毒DNA片段。
本发明将包含8-17核酶的DNA步行者信号放大技术、串联寡核苷酸重复级联扩增以及G-四链体-血红素-DNA酶酶促信号扩增三重信号放大技术有机结合起来，实现了高灵敏循环核酸的检测，该发明将三重信号放大技术有机整合，难度较大，干扰因素较多，容易导致信号难以有效放大等问题。该发明有效构建了3个反应体系，体系1：循环核酸识别技术体系( 包含EB病毒DNA通过立足点交换反应以及8-17核酶的DNA步行者信号放大技术)；体系2：串联寡核苷酸重复级联扩增技术体系；体系3：G-四链体-血红素-DNA酶酶促信号放大技术体系，各体系独立反应，有效降低了实际样品中干扰成分对信号放大体系的干扰，使得信号放大体系能够有效工作，能够检测a摩尔浓度级别的目标核酸，检测灵敏度极高，能够对肿瘤早期循环核酸进行有效监测。
附图说明
图1为三维DNA步行者探针切割示意图；
图2为串联寡核苷酸重复级联扩增示意图；
图3为EB病毒DNA检测回归曲线。
具体实施方式
本发明提供了基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合，包括DNA步行者探针、轨道分子、保护序列、序列1和序列2。
在本发明中，所述DNA步行者探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTGGAAATAGAACTCTTGTATATCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGT。
在本发明中，所述轨道分子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
Biotin- TTTTTTTTTTTTGATGTTCATTGAAATTGACCCACTATRAGTATACAAGATATCCTAACATC。
在本发明中，所述保护序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：
TACAAGA GTT CTA TTT CCA CTG CCC CATTCG GTCA。
在本发明中，所述序列1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：
Biotin-
AAAAAAAAAAAAGATGTTAGGATATCTTGTATAGGTCTAGTAATATTCT CAACAGTCTAGTAATATTCTCAACAGTCTAGTAATATTCTCAACAGTCTA GTAATATTCTCAACATGGGTAGGGCGGGTTGGGA。
在本发明中，所述序列2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下：
Biotin--
AAAAAAAAAAAATGTTGAGAATATTACTAGACGTATACAAGATATCCTA ACATCGTATACAAGATATCCTAACATCGTATACAAGATATCCTAACATCG TATACAAGATATCCTAACATCTGGGTAGGGCGGGTTGGGA。
本发明还提供了一种非诊断目的地基于上述技术方案所述的序列组合检测EB病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将所述DNA步行者探针和保护序列在95℃下处理5min、冷却，得到互补序列；
2)将所述轨道分子在95℃下处理5min、冷却，得到发夹结构；
3)将所述步骤1)得到的互补序列和步骤2)得到的发夹结构固定在微球上、封闭，得到固定有互补序列和发夹结构的微球；
4)将所述序列1固定在微球上、封闭，得到固定有序列1的微球；将所述序列2固定在微球上、封闭，得到固定有序列2的微球；
5)将所述步骤3)得到的固定有互补序列和发夹结构的微球与待测样品进行反应，得到反应物，将所述反应物离心，得到上清液；
6)将所述步骤4)得到的固定有序列1的微球与步骤5)得到的上清液杂交，得到杂交物；将所述步骤4)得到的固定有序列2的微球与 Cutsmart Buffer混合，得到混合物；将所述杂交物和混合物混合后进行孵育、离心，得到上清液；
7)将所述步骤6)得到的上清液与ABTS、双氧水混合后进行反应，在420nm处测量吸光度值，定义ΔA420nm＝A420nm-A0，其中A420nm为待测样品的吸光度值，A0为EB病毒DNA浓度为0时的吸光度值，将得到的ΔA420nm值代入ΔA420nm＝0.107+0.002CEB病毒DNA中，得到待测样品中EB病毒的含量。
本发明将所述DNA步行者探针和保护序列在95℃下处理5min、冷却，得到互补序列。在本发明中，所述冷却优选冷却到室温。在本发明中，所述DNA步行者探针与保护序列的摩尔比优选为1:4～7，更优选为1:5。
本发明将所述轨道分子在95℃下处理5min、冷却，得到发夹结构。在本发明中，所述冷却优选冷却到室温。在本发明中，所述发夹结构为轨道分子经过处理后形成的。
本发明将所述得到的互补序列和得到的发夹结构固定在微球上、封闭，得到固定有互补序列和发夹结构的微球。在本发明中，所述互补序列和发夹结构的摩尔比优选为1:15～25。在本发明中，所述固定的条件优选包括：所述固定的温度优选为25～30℃，所述固定的时间优选为30min。在本发明中，所述固定有互补序列和发夹结构的微球的表面优选修饰有1.2×106～ 1.9×106个互补序列，优选修饰有2.8×107～2.9×107个发夹结构。在本发明中，所述封闭的条件优选包括：在37℃下封闭1h。
本发明将所述序列1固定在微球上、封闭，得到固定有序列1的微球；将所述序列2固定在微球上、封闭，得到固定有序列2的微球。在本发明中，所述固定的条件优选包括：所述固定的温度优选为25～30℃，所述固定的时间优选为30min。在本发明中，所述封闭的条件优选包括：在37℃下封闭1h。
本发明将得到的固定有互补序列和发夹结构的微球与待测样品进行反应，得到反应物，将所述反应物离心，得到上清液。在本发明中，所述反应的体系优选每20μL包括10μL固定有互补序列和发夹结构的微球、4μL 5×HEPES reaction buffer、0.5μL Zn2+、1.5μLDEPC-H2O和4μL待测样品；所述反应的条件优选包括：在37℃下反应1h。在本发明中，所述 5×HEPES reaction buffer的组分为125mM HEPES和500mM NaCl，pH＝ 7.0。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规是市售即可。在本发明中，所述待测样品优选包括血清。在本发明中，所述离心的条件优选包括：在3500rpm下离心5min。
本发明将得到的固定有序列1的微球与得到的上清液杂交，得到杂交物；将得到的固定有序列2的微球与Cutsmart Buffer混合，得到混合物；将所述杂交物和混合物混合后进行孵育、离心，得到上清液。在本发明中，所述固定有序列1的微球与上清液的体积比优选为1:1；所述固定有序列2 的微球与Cutsmart Buffer的体积比优选为1:1。在本发明中，所述Cutsmart Buffer包含优选0.8U/μL～1.5U/μL的EcoRV核酸内切酶(内切酶可根据探针选择的酶切位点进行变更)和0.8U/μL～1.5U/μL的SspI核酸内切酶(内切酶可根据探针选择的酶切位点进行变更)。在本发明中，所述离心的条件优选包括：在3500rpm下离心5min。在本发明中，所述封闭的条件优选包括：在37℃下封闭1h。
本发明将得到的上清液与ABTS、双氧水混合后进行反应，在420nm 处测量吸光度值，定义ΔA420nm＝A420nm-A0，其中A420nm为待测样品的吸光度值，A0为EB病毒DNA浓度为0时的吸光度值，将得到的ΔA420nm值代入ΔA420nm＝0.107+0.002CEB病毒DNA中，得到待测样品中EB病毒的含量。在本发明中，所述上清液与ABTS、双氧水的体积比优选为1:4.5:4.5；所述反应的条件优选包括：在37℃下反应8min。在本发明中，所述ABTS的浓度优选为4mM，本发明对所述ABTS的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可；所述双氧水的浓度优选为4mM。在本发明中，所述所述CEB病毒DNA为EB病毒DNA浓度，单位为amol·L-1。
发展的基于DNA酶驱动三维DNA步行者(DNA walker)探针介导的串联寡核苷酸重复级联扩增和G-四链体-血红素DNA酶的信号放大新技术高灵敏检测EB病毒DNA
(1)DNA步行者探针8-17DNA酶活性的封闭
DNA步行者探针和保护序列以1:5的摩尔比在EP管里混合，将混合溶液加热至95℃处理5分钟后逐渐冷却至室温，充分互补杂交后DNA步行者探针包含的8-17DNA酶活性被封闭。
(2)轨道分子发夹结构的形成
将轨道分子在95℃下加热5分钟，然后逐渐冷却至室温(大约40分钟 )，充分形成发夹结构。
(3)微球功能化
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例使用到的序列如表1所示。
表1 DNA序列
Figure BDA0002666315060000081
实施例1
微球1功能化：取100μL微球(1％，直径为15.4μm，4.9×106个微球 /mL)于1.5mL的EP管中，3500rpm离心5min，去上清液。用150μL Binding/Wash Buffer(20mM Tris pH7.5,1M NaCl,1mM EDTA,0.0005％Triton X-100)洗涤三次，离心，去上清。将微球重新悬浮于30μL Binding/Wash Buffer中，加入4.5μL微球修饰探针(其中酶活性封闭后的 DNA步行者探针：轨道分子＝1:20(摩尔比))，再加入15.5μL Binding/Wash Buffer将溶液，最终体积为50μL。室温孵育30min，轻轻搅拌使其反应均匀，使用150μL Binding/Wash Buffer洗涤三次，去上清，通过离心洗涤方法去除未结合的分子。DNA步行者探针与轨道分子通过修饰的5端生物素与微球表面的亲和素特异性结合并固定在微球表面，从而形成了具有目标分子检测能力的功能化聚苯乙烯微球。每个微球表面修饰 3×107个生物素化的分子，因此每个微球表面修饰了1.4×106个酶活性封闭后的DNA步行者探针，以及2.8×107个轨道分子，微球1使用100μL 10％BSA TB Buffer(20mM Tris,140mM NaCl,5mM KCl,1mM MgCl2, 1mM CaCl2,10％BSA,pH7.4)于37℃下封闭微球1h，洗涤后将功能化微球悬浮于100μL Binding/WashBuffer，4℃下保存。
微球2、微球3功能化：分别取100μL微球(1％，直径为15.4μm， 4.9×106个微球/mL)于1.5mL的EP管中，3500rpm离心5min，去上清液。用150μL Binding/Wash Buffer洗涤三次，离心，去上清。将微球重新悬浮于30μL Binding/Wash Buffer中，分别加入4.5μL 10μM序列1和序列2，再加入15.5μL Binding/Wash Buffer将溶液，最终体积为50μL。室温孵育30min，轻轻搅拌使其反应均匀，使用150μL Binding/Wash Buffer洗涤三次，去上清，通过离心洗涤方法去除未结合的分子。微球2和微球3使用 100μL 10％BSA TB Buffer于37℃下封闭微球1h，洗涤后将功能化微球悬浮于100μL Binding/Wash Buffer，4℃下保存。
(4)不同浓度EB病毒DNA检测
构建20μL反应体系，包含10μL微球1、4μL 5×HEPES reaction buffer (125mMHEPES,500mM NaCl,pH＝7.0)、0.5μL Zn2+(50mM)、1.5μL DEPC-H2O和4μL一系列浓度的靶EB病毒DNA(0.1-1000amol/L)，在 37℃进行1小时，EB病毒DNA通过立足点交换反应(toeholdexchange) 定量移除保护序列，激活DNA步行者8-17DNA酶活性，对周围的轨道分子进行切割，释放串联寡核苷酸重复级联扩增引发序列至上清液中，3500 rpm离心5min，取上清备用。
将5μL的微球2和微球3分别放入2个单独的0.5ml EP试管中，用 10μL CutsmartBuffer(New England Biolabs)洗涤两次。在装有微球2的EP 管中加入5μL上清液，串联寡核苷酸重复级联扩增引发序列与微球2上的序列1匹配杂交。在装有微球3的EP管中加入5μLCutsmart Buffer(包含 0.8U/μL的EcoRV核酸内切酶(内切酶可根据探针选择的酶切位点进行变更)和0.8U/μL的SspI核酸内切酶(内切酶可根据探针选择的酶切位点进行变更))。最后，将两种经过处理的微球制剂混合在一起，并在37℃孵育30分钟，80℃处理20min灭活2种核酸内切酶，随后加入0.5μL0.4μ M的hemin，避光下37℃孵育20min，3500rpm离心5min，取上清备用。
移取10μL上述溶液，加入45μL ABTS(4mM)和45μL H2O2(4mM) ，37℃反应8min。选择420nm处的吸光度作为测量值，定义ΔA420nm＝A420nm-A0，其中A420nm为样品测量值，A0为EB病毒DNA浓度为0时的背景值。
EB病毒DNA浓度在0.1amol/L～100pmol/L之间呈现良好的线性关系 (图3)，回归方程为ΔA420nm＝0.107+0.002CEB病毒DNA(C:amol·L-1)，线性相关系数r2为0.997。以空白的3倍标准偏差除以标准曲线的斜率得到本方法的检出限为0.5amol/L。
实施例2
血清中EB病毒DNA检测，采用与实施例1相同的方法。
为考察检测体系对于实际样品中EB病毒DNA检测的性能，选用实际样品为人血清(混合型)，在0.2mL的EP管中，加入浓度为5、10和50 amol/L的EB病毒DNA与血清样品1:1混合，配制实际样品。
表2血清样品中EB病毒DNA加标回收实验结果
Figure BDA0002666315060000101
Figure BDA0002666315060000111
根据表2可知，人血清中EB病毒DNA的回收率在96.5％～109.6％之间， RSD在1.5％～3.7％之间。表明检测体系的抗干扰能力较强，此方法用于血清中EB病毒DNA检测仍具有良好的稳定性和准确度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南工程学院
<120> 基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合和方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttttttttt tttttttttt agtggaaata gaactcttgt atatccgagc cggtcgaaat 60
agtgggt 67
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttttttttt ttgatgttca ttgaaattga cccactatra gtatacaaga tatcctaaca 60
tc 62
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacaagagtt ctatttccac tgccccattc ggtca 35
<210> 4
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaaaaaaaa aagatgttag gatatcttgt ataggtctag taatattctc aacagtctag 60
taatattctc aacagtctag taatattctc aacagtctag taatattctc aacatgggta 120
gggcgggttg gga 133
<210> 5
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaaaaaaaa aatgttgaga atattactag acgtatacaa gatatcctaa catcgtatac 60
aagatatcct aacatcgtat acaagatatc ctaacatcgt atacaagata tcctaacatc 120
tgggtagggc gggttggga 139
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgaccgaatg gggcagtgga aatagaac 28

Claims (10)

1.基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合，包括DNA步行者探针、轨道分子、保护序列、序列1和序列2；
所述DNA步行者探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述轨道分子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述保护序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
所述序列1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述序列2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
2.一种非诊断目的地基于权利要求1所述的序列组合检测EB病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将所述DNA步行者探针和保护序列在95℃下处理5min、冷却，得到互补序列；
2)将所述轨道分子在95℃下处理5min、冷却，得到发夹结构；
3)将所述步骤1)得到的互补序列和步骤2)得到的发夹结构固定在微球上、封闭，得到固定有互补序列和发夹结构的微球；
4)将所述序列1固定在微球上、封闭，得到固定有序列1的微球；将所述序列2固定在微球上、封闭，得到固定有序列2的微球；
5)将所述步骤3)得到的固定有互补序列和发夹结构的微球与待测样品进行反应，得到反应物，将所述反应物离心，得到上清液；
6)将所述步骤4)得到的固定有序列1的微球与步骤5)得到的上清液杂交，得到杂交物；将所述步骤4)得到的固定有序列2的微球与Cutsmart Buffer混合，得到混合物；将所述杂交物和混合物混合后进行孵育、离心，得到上清液；
7)将所述步骤6)得到的上清液与ABTS、双氧水混合后进行反应，在420nm处测量吸光度值，定义ΔA420nm＝A420nm-A0，其中A420nm为待测样品的吸光度值，A0为EB病毒DNA浓度为0时的吸光度值，将得到的ΔA420nm值代入ΔA420nm＝0.107+0.002CEB病毒DNA中，得到待测样品中EB病毒的含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)DNA步行者探针与保护序列的摩尔比为1:4～7。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3)互补序列和发夹结构的摩尔比为1:15～25。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3)固定的条件包括：所述固定的温度为25～30℃，所述固定的时间为30min。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3)固定有互补序列和发夹结构的微球的表面修饰有1.2×106～1.9×106个互补序列，修饰有2.8×107～2.9×107个发夹结构。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤4)固定的条件包括：所述固定的温度为25～30℃，所述固定的时间为30min。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤5)反应的体系每20μL包括10μL固定有互补序列和发夹结构的微球、4μL 5×HEPES reactionbuffer、0.5μLZn2+、1.5μL DEPC-H2O和4μL待测样品；
所述反应的条件包括：在37℃下反应1h。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤6)固定有序列1的微球与上清液的体积比为1:1；所述固定有序列2的微球与Cutsmart Buffer的体积比为1:1。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤7)上清液与ABTS、双氧水的体积比为1:4.5:4.5；
所述反应的条件包括：在37℃下反应8min。
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