CN111440850A - 一种检测啶虫脒的化学发光传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于DNAzyme的DNA Walker的化学生物传感器。为了解决以上现有技术中检测啶虫脒的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题。一种基于DNAzyme的DNA Walker检测啶虫脒的化学生物传感器，利用DNAzyme裂解辅助实现循环放大，以及在金纳米颗粒形成许多模拟辣根过氧化物酶活性的G‑四联体。制备方法：制备金纳米颗粒；将Walker链与Lock链修饰到金纳米粒子表面；标记的纳米金颗粒溶液的均相反应；DNAzyme裂解反应、化学发光检测；利用核酸适配体对目标物啶虫脒的高特异性检测；利用DNAzyme裂解反应放大，实现信号放大的作用。

Description

一种检测啶虫脒的化学发光传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及传感器技术领域，特别涉及一种基于DNAzyme的DNA Walker检测啶虫脒的化学发光传感器，还涉及其制备方法。
背景技术
啶虫脒作为一种新烟碱类杀虫剂，由于其对常见的有机磷和氨基甲酸酯类农药没有交叉抗性，而广泛应用于农业生产过程中。啶虫脒一旦施用，主要被根系吸收，然后转移到生物体的各种组织中，包括花、叶和果实。从害虫防治的角度来看，与其他杀虫剂相比，啶虫脒具有更好的吸收率和易于使用的优点。然而，出于对人类暴露和生态友好性的考虑，啶虫脒无疑会影响可能与植物生产接触的非靶标生物。由于对杀虫剂的抗药性、对哺乳动物的威胁以及严重的环境污染，许多国家已经禁止使用啶虫脒。因此，在我国，对啶虫脒进行有效的分析是保护人们免受可能的危害，保护生态系统的迫切需要。
目前，用于检测啶虫脒的方法有很多，如高效液相色谱、气相色谱、液相色谱-质谱联用。这些方法具有较高的灵敏度、选择性和可靠性，但需要昂贵的仪器设备、专业的技术人员、操作复杂费时费力。
发明内容
本发明针对现有检测方法中操作复杂费时费力，需要专业的技术人员的缺点，提供了一种灵敏度高、特异性强、成本低、快速的检测啶虫脒的化学发光生物传感器。
本发明还提供了基于DNAzyme的DNA Walker检测啶虫脒的化学发光生物传感器的制备方法。
本发明是通过以下步骤得到的：
一种检测啶虫脒的化学发光生物传感器，包括：金纳米颗粒、HAP链、Walker链、Lock链、目标物；
所述的HAP链的碱基序列如SEQ No.1所示；具体为：5’-SH-TGGG TAGGG CGGG TTGGG CAC TAT rA GGA AGA GA AAAACCCG-3’；
所述的Lock链的碱基序列如SEQ No.2所示；具体为：5’-AA GAG A CTGA C AC CAT A TT ATG AAG A -3’；
所述的Walker链的碱基序列如SEQ No.3所示；具体为：5’-SH-(T)35 TCTTCATAAATTA G TCAGTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGT-3’；
所述的HAP链5’连接有-SH；所述的Walker链5’连接有-SH；所述的HAP链5’的第25位碱基序列连接有核糖核酸RNA腺嘌呤rA。
上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）金纳米颗粒的制备；
（2）将Walker链和HAP链修饰到金纳米颗粒表面；
（3）标记好的纳米金颗粒的均相反应；
（4）化学发光检测。
所述的步骤（1）金纳米颗粒的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备。
所述的步骤（2）将HAP和Walker链修饰到金纳米颗粒表面：
①首先将Walker链和Lock链混合反应，形成锁住的Walker链；
②将步骤①锁住的Walker链和HAP链混合，作为底物探针；
③向纳米金颗粒溶液中加入底物探针，4 ℃下放置；
④分多次以3 μL/min的速度加入PB缓冲液，搅拌， 4 ℃放置；
⑤48 h后分多次以2 μL/min的速度加入PBS缓冲液，4 ℃下放置；
⑥24 h后，加入灭菌水，离心除去上层清液，再离心除去上层清液。
所述的步骤（3）标好的纳米金颗粒的均相反应：将纳米金颗粒溶液、灭菌水、目标物、K+、Mn2+、缓冲液、血红素以及鲁米诺和过氧化氢加入到灭菌的离心管中并震荡，然后在37℃水浴锅中孵育2 h。
所述的步骤（4）化学发光检测：用荧光仪检测鲁米诺的化学发光信号，荧光仪激发波长设置为350 nm，发射波长设置为420 nm，检测范围设置350 nm-550 nm，读取荧光信号变化，检测待测目标物。
采用上述制备方法制备的化学发光传感器在检测啶虫脒上的应用。
所述的制备方法，均相内的反应：
均相中发生的反应主要有：Walker链与Lock链通过碱基互补配对形成双链。当啶虫脒存在的情况下，Lock链中的适配体序列会和啶虫脒结合，释放Walker链，导致Walker链中的DNAzyme链被激活，在二价金属离子Mn2+存在时，Walker链与HAP链中的DNAzyme底物序列特异性结合并在裂解位点rA处裂解，破坏了HAP的发夹结构，G-rich序列暴露出来；Walker链继续与AuNP表面的其它的HAP结合并裂解，最终AuNP表面暴露出许多G-rich，在添加K+和血红素后会形成模拟辣根过氧化物酶活性的G-四联体，然后加入鲁米诺和过氧化氢，会导致鲁米诺发光。
该发明的检测方式是化学发光法检测，利用荧光仪。
在检测之前，首先通过Au-S键将封闭的Walker链和HAP链修饰到金纳米颗粒表面，然后进行均相反应。取一定体积标记好的金纳米颗粒溶液，加入目标物啶虫脒后，Lock链中的适配体序列会和啶虫脒结合，释放Walker链，导致Walker链中的DNAzyme链被激活，在二价金属离子Mn2+存在时，Walker链与HAP链中的DNAzyme底物序列特异性结合并在裂解位点rA处裂解，破坏了HAP的发夹结构，G-rich序列暴露出来；Walker链继续与AuNP表面的其它的HAP结合并裂解，最终AuNP表面暴露出许多G-rich，实现放大过程。在添加K+和血红素后会形成模拟辣根过氧化物酶活性的G-四联体，然后加入鲁米诺和过氧化氢，会导致鲁米诺发光。最后，用荧光仪在激发波长为350 nm下，检测420 nm处鲁米诺的化学发光。
本发明中一共用到了3条DNA链，其序列分别是：
HAP：5’-SH-TGGG TAGGG CGGG TTGGG CAC TAT rA GGA AGA GA AAAACCCG-3’
Lock：5’-AA GAG A CTGA C AC CAT A TT ATG AAG A -3’
Walker：5’-SH-(T)35 TCTTCATAAATTA GTCAGTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGT-3’
HAP的5’末端修饰有-SH，通过Au-S键修饰到金纳米颗粒（AuNP）表面，其中下划线是G-rich序列；粗体部分是DNAzyme的底物序列，rA表示核糖核酸RNA腺嘌呤。
Lock和Walker的曲线部分是互补配对的；Lock的斜体部分是目标物的适配体序列；Walker的加粗部分是DNAzyem的序列，其中斜体部分是DNAzyme的催化活性中心。
HAP和Walker通过Au-S键修饰在纳米金颗粒(AuNP)表面。Lock的适配体部分可与啶虫脒特异性结合，释放Walker链，从而导致Walker中封闭的DNAzyme链被激活，在二价金属离子Mn2+存在时，Walker链与HAP特异性结合并在裂解位点rA处裂解，破坏了HAP的发夹结构，G-rich序列暴露出来；Walker链继续与AuNP表面的其它的HAP结合并裂解，最终AuNP表面暴露出许多G-rich，在添加K+和血红素后会形成模拟辣根过氧化物酶活性的G-四联体，然后加入鲁米诺和过氧化氢，会导致鲁米诺发光。
本发明中啶虫脒的检测是在均相溶液中，通过DNA Walker技术来实现信号的放大，从而实现啶虫脒的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。
均相中发生的反应主要有：Walker链与Lock链通过碱基互补配对形成双链。当啶虫脒存在的情况下，Lock链中的适配体序列会和啶虫脒结合，释放Walker链，导致Walker链中的DNAzyme链被激活，在二价金属离子Mn2+存在时，Walker链与HAP链中的DNAzyme底物序列特异性结合并在裂解位点rA处裂解，破坏了HAP的发夹结构，G-rich序列暴露出来；Walker链继续与AuNP表面的其它的HAP结合并裂解，最终AuNP表面暴露出许多G-rich，在添加K+和血红素后会形成模拟辣根过氧化物酶活性的G-四联体，然后加入鲁米诺和过氧化氢，会导致鲁米诺发光。
本发明基于核酸适配体与目标物之间的特异性识别能力，激活DNAzyme在金纳米颗粒表面杂交裂解反应，得到许多暴露的G-rich序列，在K+和血红素存在下形成许多模拟辣根过氧化物酶活性的G-四联体，实现放大作用。加入鲁米诺和过氧化氢，产生鲁米诺的化学发光。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补啶虫脒现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
本发明的有益效果：
1、利用了啶虫脒与核酸适配体的特异型识别的特性进行检测；
2、利用了DNAzyme裂解和DNA Walker技术，起到了信号放大的作用，提高了检测的灵敏度；
3、该传感器的反应条件温和，反应速度快；
4、检测原理的主要过程均是在均相溶液中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复
杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；
5、制备方法简单，性能稳定，适用于食品、土壤及饮用水中啶虫脒的检测；
6、制备过程的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为该实验的原理图；
图2为实施例1检测结果图；
图3为实施例2检测结果图；
图4为实施例3检测结果图；
图5为实施例4传感器检测啶虫脒的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）金纳米颗粒的制备；
（2）将含-SH的封闭的Walker链和HAP链修饰到金纳米颗粒表面；
（3）标记好的纳米金颗粒的均相反应；
（4）化学发光检测。
本发明需要合成金纳米颗粒，用于DNA Walker的载体。
所述金纳米颗粒的制备方法操作步骤如下：
采用柠檬酸三钠还原法制备，合成之前，所用的玻璃仪器都得提前用王水浸泡24 h，并用超纯水冲洗干净。然后，500 µL 0.04g·mL-1的HAuCl4加入到含有200mL超纯水的三口烧瓶中，加热至沸腾。在搅拌条件下，快速加入3mL 1%的柠檬酸三钠溶液，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15 min，撤去热源，慢慢冷却至室温，于4℃保存备用。取70µL金纳米颗粒溶液于微量比色皿中，使用UV-2550紫外可见分光光度计对其进行光吸收波谱扫描，根据波长在519nm处的摩尔消光系数8.78×108M-1cm-1计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nM。
所述的制备方法，含-SH的封闭Walker链和HAP链修饰到金纳米颗粒表面的操作步骤如下：（1）首先将含-SH的Walker链和Lock链按照摩尔比1:3混合反应，形成锁住的Walker链。
（2）含-SH锁住的Walker链和HAP链按照摩尔比1:20的比例均匀混合在一起，作为底物探针。
（3）取1 mL纳米金颗粒溶液于离心管中，离心10 min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300 µL灭菌水使纳米金溶液浓缩至3 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口。
（4）室温放置30 min后，加入150 µL浓度为30 µM的修饰了-SH的底物探针，（纳米金颗粒与底物链的摩尔比为1：5000）混合均匀后，4 ℃下放置24 h。
（5）24h后，分多次缓慢加入50 µL PB缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10 min后，继续加入27 µL PBS缓冲液。取出磁子，再放到王水中，4 ℃放置48 h。
（6）48 h后分多次缓慢加入62 µL PBS缓冲液，4 ℃下放置。
（7）24 h后，将标记好的金纳米颗粒移至离心管中，然后加入1mL灭菌水，15000rpm·min-1离心10 min，除去上层清液，再加入1mL灭菌水离心。此过程重复两次（为了洗脱未标记的DNA链）。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
①将灭菌水、目标物（3 µL）、纳米金溶液（5 µL）、Mn2+（3 µL）、K+（3 µL）、缓冲液（3 µL）、血红素（3 µL）（浓度分别为0.2 µM，0.4 µM，0.6 µM，0.8 µM，1.0 µM，1.2 µM）、鲁米诺（3 µL）、过氧化氢（3.3 µL）加入到预先准备好的灭菌的EP管中并震荡，放入37℃的恒温水浴锅孵育2 h。
②将①步反应后的溶液（30 µL）稀释至100 µL，用荧光仪在420 nm处检测化学发光。荧光仪激发波长设置为350 nm，发射波长设置为420 nm，检测范围350 nm-550 nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
结果见图2，从图中可以看出，随着血红素浓度的增加，实验得到的化学发光强度不断增强，在血红素的浓度达到1.0 µM之后，化学发光强度基本不变。说明最适的血红素浓度是1.0 µM。
实施例2
一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法：
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）金纳米颗粒的制备；
（2）将含-SH的封闭Walker链和HAP链修饰到金纳米颗粒表面；
（3）标记好的纳米金颗粒的均相反应；
（4）化学发光检测。
本发明需要合成金纳米颗粒，用于DNA Walker的载体。
所述金纳米颗粒的制备方法操作步骤如下：
采用柠檬酸三钠还原法制备，合成之前，所用的玻璃仪器都得提前用王水浸泡24 h，并用超纯水冲洗干净。然后，500 µL 0.04g·mL-1的HAuCl4加入到含有200mL超纯水的三口烧瓶中，加热至沸腾。在搅拌条件下，快速加入3mL 1%的柠檬酸三钠溶液，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15 min，撤去热源，慢慢冷却至室温，于4℃保存备用。取70µL金纳米颗粒溶液于微量比色皿中，使用UV-2550紫外可见分光光度计对其进行光吸收波谱扫描，根据波长在519nm处的摩尔消光系数8.78×108M-1cm-1计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nM。
所述的制备方法，含-SH的封闭的Walker链和HAP链修饰到金纳米颗粒表面的操作步骤如下：
（1）首先将含-SH的Walker链和Lock链按照摩尔比1:3混合反应，形成锁住的Walker链。
（2）含-SH锁住的Walker链和HAP链按照摩尔比1:20的比例均匀混合在一起，作为底物探针。
（3）取1 mL纳米金颗粒溶液于离心管中，离心10 min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300 µL灭菌水使纳米金溶液浓缩至3 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口。
（4）室温放置30 min后，加入150 µL浓度为30 µM的修饰了-SH的底物探针，（纳米金颗粒与底物链的摩尔比为1：5000）混合均匀后，4 ℃下放置24 h。
（5）24h后，分多次缓慢加入50 µL PB缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10 min后，继续加入27 µL PBS缓冲液。取出磁子，再放到王水中，4 ℃放置48 h。
（6）48 h后分多次缓慢加入62 µL PBS缓冲液，4 ℃下放置。
（7）24 h后，将标记好的金纳米颗粒移至离心管中，然后加入1mL灭菌水，15000rpm·min-1离心10 min，除去上层清液，再加入1mL灭菌水离心。此过程重复两次（为了洗脱未标记的DNA链）。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
①将灭菌水、目标物（3 µL）、纳米金溶液（5 µL）、Mn2+（3 µL）、K+（3 µL）、缓冲液（3 µL）、血红素（3 µL）、鲁米诺（3 µL）（浓度分别为0.2 mM，0.4 mM，0.6 mM，0.8 mM，1.0 mM，2.0mM，3.0 mM）、过氧化氢（3.3 µL）加入到预先准备好的灭菌的EP管中并震荡，放入37℃的恒温水浴锅孵育2 h。
②将①步反应后的溶液（30 µL）稀释至100 µL，用荧光仪在420 nm处检测化学发光。荧光仪激发波长设置为350 nm，发射波长设置为420 nm，检测范围350 nm-550 nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
结果见图3，从图中可以看出，随着鲁米诺浓度的增加，实验得到的化学发光强度不断增强，在鲁米诺的浓度达到2.0 µM之后，化学发光强度基本不变或略有降低。说明最适的鲁米诺浓度是2.0 µM。
实施例3
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）金纳米颗粒的制备；
（2）将含-SH的封闭的Walker链和HAP链修饰到金纳米颗粒表面；
（3）标记好的纳米金颗粒的均相反应；
（4）化学发光检测。
本发明需要合成金纳米颗粒，用于DNA Walker的载体。
所述金纳米颗粒的制备方法操作步骤如下：
采用柠檬酸三钠还原法制备，合成之前，所用的玻璃仪器都得提前用王水浸泡24 h，并用超纯水冲洗干净。然后，500 µL 0.04g·mL-1的HAuCl4加入到含有200mL超纯水的三口烧瓶中，加热至沸腾。在搅拌条件下，快速加入3mL 1%的柠檬酸三钠溶液，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15 min，撤去热源，慢慢冷却至室温，于4℃保存备用。取70µL金纳米颗粒溶液于微量比色皿中，使用UV-2550紫外可见分光光度计对其进行光吸收波谱扫描，根据波长在519nm处的摩尔消光系数8.78×108M-1cm-1计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nM。
所述的制备方法，含-SH的封闭的Walker链和HAP链修饰到金纳米颗粒表面的操作步骤如下：（1）首先将含-SH的Walker链和Lock链按照摩尔比1:3混合反应，形成锁住的Walker链。
（2）含-SH锁住的Walker链和HAP链按照摩尔比1:20的比例均匀混合在一起，作为底物探针。
（3）取1 mL纳米金颗粒溶液于离心管中，离心10 min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300 µL灭菌水使纳米金溶液浓缩至3 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口。
（4）室温放置30 min后，加入150 µL浓度为30 µM的修饰了-SH的底物探针，（纳米金颗粒与底物链的摩尔比为1：5000）混合均匀后，4 ℃下放置24 h。
（5）24h后，分多次缓慢加入50 µL PB缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10 min后，继续加入27 µL PBS缓冲液。取出磁子，再放到王水中，4 ℃放置48 h。
（6）48 h后分多次缓慢加入62 µL PBS缓冲液，4 ℃下放置。
（7）24 h后，将标记好的金纳米颗粒移至离心管中，然后加入1mL灭菌水，15000rpm·min-1离心10 min，除去上层清液，再加入1mL灭菌水离心。此过程重复两次（为了洗脱未标记的DNA链）。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
①将灭菌水、目标物（3 µL）、纳米金溶液（5 µL）、Mn2+（3 µL）、K+（3 µL）、缓冲液（3 µL）、血红素（3 µL）、鲁米诺（3 µL）、过氧化氢（3.3 µL）（浓度分别为2 mM，4 mM，6 mM，8 mM，10mM，15 mM，20 mM）加入到预先准备好的灭菌的EP管中并震荡，放入37℃的恒温水浴锅孵育2h。
②将①步反应后的溶液（30 µL）稀释至100 µL，用荧光仪在420 nm处检测化学发光。荧光仪激发波长设置为350 nm，发射波长设置为420 nm，检测范围350 nm-550 nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
结果见图3，从图中可以看出，随着过氧化氢浓度的增加，实验得到的化学发光强度不断增强，在过氧化氢的浓度达到15 mM之后，化学发光强度基本不变或略有降低。说明最适的过氧化氢浓度是15 mM。
实施例4
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）金纳米颗粒的制备；
（2）将含-SH的封闭的Walker链和HAP链修饰到金纳米颗粒表面；
（3）标记好的纳米金颗粒的均相反应；
（4）化学发光检测。
本发明需要合成金纳米颗粒，用于DNA Walker的载体。
所述金纳米颗粒的制备方法操作步骤如下：
采用柠檬酸三钠还原法制备，合成之前，所用的玻璃仪器都得提前用王水浸泡24 h，并用超纯水冲洗干净。然后，500 µL 0.04g·mL-1的HAuCl4加入到含有200mL超纯水的三口烧瓶中，加热至沸腾。在搅拌条件下，快速加入3mL 1%的柠檬酸三钠溶液，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15 min，撤去热源，慢慢冷却至室温，于4℃保存备用。取70µL金纳米颗粒溶液于微量比色皿中，使用UV-2550紫外可见分光光度计对其进行光吸收波谱扫描，根据波长在519nm处的摩尔消光系数8.78×108M-1cm-1计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nM。
所述的制备方法，含-SH的封闭的Walker链和HAP链修饰到金纳米颗粒表面的操作步骤如下：（1）首先将含-SH的Walker链和Lock链按照摩尔比1:3混合反应，形成锁住的Walker链。
（2）含-SH锁住的Walker链和HAP链按照摩尔比1:20的比例均匀混合在一起，作为底物探针。
（3）取1 mL纳米金颗粒溶液于离心管中，离心10 min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300 µL灭菌水使纳米金溶液浓缩至3 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口。
（4）室温放置30 min后，加入150 µL浓度为30 µM的修饰了-SH的底物探针，（纳米金颗粒与底物链的摩尔比为1：5000）混合均匀后，4 ℃下放置24 h。
（5）24h后，分多次缓慢加入50 µL PB缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10 min后，继续加入27 µL PBS缓冲液。取出磁子，再放到王水中，4 ℃放置48 h。
（6）48 h后分多次缓慢加入62 µL PBS缓冲液，4 ℃下放置。
（7）24 h后，将标记好的金纳米颗粒移至离心管中，然后加入1mL灭菌水，15000rpm·min-1离心10 min，除去上层清液，再加入1mL灭菌水离心。此过程重复两次（为了洗脱未标记的DNA链）。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
①将灭菌水、目标物（3 µL）（终浓度分别为0，10 pM，50 pM，100 pM，500 pM，1000 pM）、纳米金溶液（5 µL）、Mn2+（3 µL）、K+（3 µL）、缓冲液（3 µL）、血红素（3 µL）、鲁米诺（3 µL）、过氧化氢（3.3 µL）加入到预先准备好的灭菌的EP管中并震荡，放入37℃的恒温水浴锅孵育2h。
②将①步反应后的溶液（30 µL）稀释至100 µL，用荧光仪在420 nm处检测化学发光。荧光仪激发波长设置为350 nm，发射波长设置为420 nm，检测范围350 nm-550 nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
检测结果如图5所示，图中我们可以看到，当啶虫脒浓度在10 pM到1000 pM时化学发光值不断增加，反应稳定进行。在啶虫脒的浓度在10 pM到时1000 pM，啶虫脒的对数与化学发光强度值的大小成正比关系，拟合曲线：CL=248.7logC +715.1(CL是化学发光强度，C是啶虫脒浓度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种检测啶虫脒的化学发光传感器及其制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
tgggtagggc gggttgggca ctatggaaga gaaaaacccg 40
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
aagagactga caccatatta tgaaga 26
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttcttc ataaattagt cagtctcttc 60
tccgagccgg tcgaaatagt 80

Claims (7)

1.一种检测啶虫脒的化学发光生物传感器，其特征在于，包括：金纳米颗粒、HAP链、Walker链、Lock链、目标物；
所述的HAP链的碱基序列如SEQ No.1所示；具体为：5’-SH-TGGG TAGGG CGGG TTGGG CAC TAT rA GGA AGA GA AAAACCCG-3’；
所述的Lock链的碱基序列如SEQ No.2所示；具体为：5’-AA GAG A CTGA C AC CAT A TT ATG AAG A -3’；
所述的Walker链的碱基序列如SEQ No.3所示；具体为：5’-SH-(T)35 TCTTCATAAATTA GT CAGTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGT-3’；
所述的HAP链5’连接有-SH；所述的Walker链5’连接有-SH；所述的HAP链5’的第25位碱基序列连接有核糖核酸RNA腺嘌呤rA。
2.一种权利要求1所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）金纳米颗粒的制备；
（2）将Walker链和HAP链修饰到金纳米颗粒表面；
（3）标记好的纳米金颗粒的均相反应；
（4）化学发光检测。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）金纳米颗粒的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）将HAP和Walker链修饰到金纳米颗粒表面：
①首先将Walker链和Lock链混合反应，形成锁住的Walker链；
②将步骤①锁住的Walker链和HAP链混合，作为底物探针；
③向纳米金颗粒溶液中加入底物探针，4 ℃下放置；
④分多次缓慢加入PB缓冲液，搅拌，放到王水中，4 ℃放置；
⑤48 h后分多次缓慢加入PBS缓冲液，4 ℃下放置；
⑥24 h后，加入灭菌水，离心除去上层清液，再离心除去上层清液。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（3）标好的纳米金颗粒的均相反应：将纳米金颗粒溶液、灭菌水、目标物、K+、Mn2+、缓冲液、血红素以及鲁米诺和过氧化氢加入到灭菌的离心管中并震荡，然后在37℃水浴锅中孵育2 h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（4）化学发光检测：用荧光仪检测鲁米诺的化学发光信号，荧光仪激发波长设置为350 nm，发射波长设置为420 nm，检测范围设置350 nm-550 nm，读取荧光信号变化，检测待测目标物。
7.采用权利要求2所述的制备方法制备的化学发光传感器在检测啶虫脒上的应用。
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