CN111521808A - 一种检测多氯联苯的生物传感器及其制备方法 - Google Patents

一种检测多氯联苯的生物传感器及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于金纳米粒子的DNA分子机器检测多氯联苯（PCB）的生物传感器，发卡探针HAP1通过polyA修饰到纳米金的表面和HAP2、拱形探针（由Walker链和APT杂交成的双链）通过polyA修饰到纳米金的表面；基于目标物PCB对适配体的亲和力，破坏拱形探针，释放Walker核酸链，通过toehold介导打开HAP1，进而打开HAP2，从而把Walker链挤掉，挤掉的Walker链与其他的HAP1杂交，依次循环直至HAP2全部被打开，暴露出G‑rich序列，在存在血红素时形成G‑四联体/血红素DNA酶。G‑四联体/血红素类辣根过氧化物酶催化鲁米诺产生化学发光，从而构建了生物传感器；该传感器反应只需一步，检测速度快，操作简便，价格低廉，检测限低，特异性高。

Description

一种检测多氯联苯的生物传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及传感器技术领域，特别涉及基于金纳米粒子的DNA分子机器检测多氯联苯的生物传感器，还涉及其制备方法。
背景技术
多氯联苯(PCBs)是一类广泛的合成有机化合物，被广泛用作杀虫剂和电器元件的流体绝缘体。多氯联苯由于其持久性和化学稳定性高，不易分解，可以通过食物链在人体组织中富集。多氯联苯即使在超微量水平也会严重危害人体健康和生命。因此，开发快速、低成本、高灵敏度和选择性的检测多氯联苯的分析方法是十分必要的。
发明内容
为了实现更加灵敏的、特异性的检测多氯联苯，本申请提出了一种基于催化发夹自组装的DNA分子机器检测多氯联苯的生物传感器。
一种检测多氯联苯的生物传感器，包括纳米金溶液、发卡探针HAP1和HAP2、Walker、APT、血红素、钾离子（K+）、目标物和缓冲液；
所述的序列为：
HAP1碱基序列如SEQ No.1所示；具体为:5’-AAAAAATTTTTTTTTTTTATTCTCCTTAAACATCC GTCGGAGAATGGGTAGGGCCGACGGAT GTTTAAG-3’；
HAP2碱基序列如SEQ No.2所示；具体为:5’-ATCCGTCGGCCCTACCCATTCTCCGACGGATGTTT AAGGAGAAT GGGTAGGGCGGGTTGGG-3’；
Walker碱基序列如SEQ No.3所示；具体为:5’-AAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGACGGATGTTTAAGGAGAATGG-3’；
APT碱基序列如SEQ No.4所示；具体为:5’-CACTCGGACCCCATTCTCCTTCCATCCCTCATCCGT CCAC-3’；
所述的目标物为多氯联苯。
上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备纳米金溶液；
（2）拱形探针的构建；
（3）将拱形探针和发卡探针HAP1修饰到金纳米粒子表面，得到功能化的纳米金溶液；
（4）均相反应：将多氯联苯、发卡探针HAP2、血红素、钾离子（K+）和功能化的纳米金溶液加入到均相中，混和均匀后孵育；
（5）荧光仪检测化学发光。
所述的步骤（1）中纳米金溶液的浓度为1 nM。
所述的步骤（2）拱形探针的构建步骤如下：
将灭菌水、5×PBS、Walker和APT加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为拱形探针，储存于-20 ℃备用。
所述的步骤（3）拱形探针和HAP1修饰到金纳米粒子表面的操作步骤如下：
① 将拱形探针和HAP1混合，得到混合溶液Q；
② 以3 μL/min的速度混合溶液Q加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4 ℃放置；
③ 以2 μL/min的速度将PB缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，10分钟后，以2 μL/min的速度将27 μL PBS缓冲液加入到纳米金溶液中，4 ℃放置；
④ 以2 μL/min的速度将PBS缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4 ℃放置；
⑤ 加入灭菌水洗脱未标记上的DNA链，4 ℃保存备用。
所述的步骤（4）均相反应操作步骤如下：
将发卡探针HAP2、血红素、缓冲液、功能化的纳米金溶液和多氯联苯加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴60 min。
所述的步骤（5）荧光仪设置激发波长为350 nm，发射波长设置为420 nm，检测范围设置350 nm-550 nm。
该发明的检测方式是化学发光法检测，基于目标物PCB对适配体特殊的亲和力，使得拱形探针被破坏，释放Walker核酸链，释放的Walker核酸链可以通过toehold介导打开HAP1，打开的HAP1又可以打开HAP2从而把Walker核酸链挤掉，挤掉的Walker链又可以与纳米金表面的其它HAP1杂交，依次循环直到所有的HAP2全部被打开，而打开的HAP2暴露出其G-rich序列，在存在血红素时形成G-四联体/血红素DNA酶，富集在纳米金颗粒周围。运用G-四联体/血红素类辣根过氧化物酶的催化性能催化鲁米诺产生化学发光。
本发明基于核酸适配体与目标物之间的特异性识别能力，DNA分子机器的特殊结构和催化发夹自组装实现目标循环放大，利用纳米金离子作为载体，实现对目标物灵敏检测的生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，灵敏度高等优点，可以弥补PCB现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
本发明的有益效果：
1、利用了多氯联苯与核酸适配体的特异型识别的特性进行检测；
2、利用了DNA Walker和催化发夹自组装，起到了信号放大的作用，提高了检测的灵敏度；
3、该传感器的反应条件温和，反应速度快；
4、检测原理的主要过程均是在均相溶液中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；
5、制备方法简单，性能稳定，适用于食品、土壤及饮用水中PCB的检测；
6、制备过程的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为该实验的原理图；
图2为实施例1检测结果图；
图3为实施例2检测结果图；
图4为实施例3检测结果图；
图5为实施例4传感器检测PCB 的工作曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
拱形探针的构建步骤如下：
将灭菌水、5×PBS、Walker和APT加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为拱形探针，储存于-20 ℃备用。
拱形探针和HAP1修饰到金纳米粒子表面的操作步骤如下：
① 将拱形探针和HAP1按照1:20的比例混合，得到混合溶液Q；
② 以3 μL/min的速度将150 µL混合溶液Q加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4 ℃放置24 h；
③ 以2 μL/min的速度将50 μL PB缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，10分钟后，以2 μL/min的速度将27 μL PBS缓冲液加入到纳米金溶液中，4 ℃放置48 h；
④ 以2 μL/min的速度将62μL PBS缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4 ℃放置；
⑤ 加入灭菌水洗脱未标记上的DNA链，4 ℃保存备用。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
将灭菌水、5×缓冲液（3 µL）、功能化的纳米金溶液（5 µL）、目标物（3 µL）、HAP2（3 µL）、K+（3 µL）、血红素（3 µL）（浓度分别为0.2 µM，0.4 µM，0.6 µM，0.8 µM，1.0 µM，1.2 µM）、鲁米诺（3 µL）、过氧化氢（3.33 µL）加入到预先准备好的灭菌的EP管中并震荡，放入37℃的恒温水浴锅孵育1 h.
荧光仪检测化学发光主要步骤如下：
将均相反应后的溶液（30 µL）稀释至100 µL，用荧光仪在420 nm处检测化学发光。荧光仪激发波长设置为350 nm，发射波长设置为420 nm，检测范围350 nm-550 nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
结果见图2，从图中可以看出，随着血红素浓度的增加，实验得到的化学发光强度不断增强，在血红素的浓度达到1.0 µM之后，化学发光强度基本不变。说明最适的血红素浓度是1.0 µM。
实施例2
拱形探针的构建步骤如下：
将灭菌水、5×PBS、Walker和APT加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为拱形探针，储存于-20 ℃备用。
拱形探针和HAP1修饰到金纳米粒子表面的操作步骤如下：
① 将拱形探针和HAP1按照1:20的比例混合，得到混合溶液Q；
② 以3 μL/min的速度将150 µL混合溶液Q加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4 ℃放置24 h；
③ 以2 μL/min的速度将50 μL PB缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，10分钟后，以2 μL/min的速度将27 μL PBS缓冲液加入到纳米金溶液中，4 ℃放置48 h；
④ 以2 μL/min的速度将62μL PBS缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4 ℃放置；
⑤ 加入灭菌水洗脱未标记上的DNA链，4 ℃保存备用。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
将灭菌水、5×缓冲液（3 µL）、功能化的纳米金溶液（5 µL）、目标物（3 µL）、HAP2（3 µL）、K+（3 µL）、血红素（3 µL）、鲁米诺（3 µL）（浓度分别为0.2 mM，0.4 mM，0.6 mM，0.8 mM，1.0 mM，1.5 mM，2.0 mM）、过氧化氢（3.33 µL）加入到预先准备好的灭菌的EP管中并震荡，放入37℃的恒温水浴锅孵育1 h。
荧光仪检测化学发光主要步骤如下：
将均相反应后的溶液（30 µL）稀释至100 µL，用荧光仪在420 nm处检测化学发光。荧光仪激发波长设置为350 nm，发射波长设置为420 nm，检测范围350 nm-550 nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
结果见图3，从图中可以看出，随着鲁米诺浓度的增加，实验得到的化学发光强度不断增强，在鲁米诺的浓度达到2.0 µM之后，化学发光强度基本不变或略有降低。说明最适的鲁米诺浓度是2.0 µM。
实施例3
拱形探针的构建步骤如下：
将灭菌水、5×PBS、Walker和APT加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为拱形探针，储存于-20 ℃备用。
拱形探针和HAP1修饰到金纳米粒子表面的操作步骤如下：
① 将拱形探针和HAP1按照1:20的比例混合，得到混合溶液Q；
② 以3 μL/min的速度将150 µL混合溶液Q加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4 ℃放置24 h；
③ 以2 μL/min的速度将50 μL PB缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，10分钟后，以2 μL/min的速度将27 μL PBS缓冲液加入到纳米金溶液中，4 ℃放置48 h；
④ 以2 μL/min的速度将62μL PBS缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4 ℃放置；
⑤ 加入灭菌水洗脱未标记上的DNA链，4 ℃保存备用。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
将灭菌水、5×缓冲液（3 µL）、功能化的纳米金溶液（5 µL）、目标物（3 µL）、HAP2（3 µL）、K+（3 µL）、血红素（3 µL）、鲁米诺（3 µL）、过氧化氢（3.33 µL）（浓度分别为2 mM，4 mM，6mM，8 mM，10 mM，12 mM，14 mM）加入到预先准备好的灭菌的EP管中并震荡，放入37℃的恒温水浴锅孵育1 h。
荧光仪检测化学发光主要步骤如下：
将均相反应后的溶液（30 µL）稀释至100 µL，用荧光仪在420 nm处检测化学发光。荧光仪激发波长设置为350 nm，发射波长设置为420 nm，检测范围350 nm-550 nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
结果见图3，从图中可以看出，随着过氧化氢浓度的增加，实验得到的化学发光强度不断增强，在过氧化氢的浓度达到10 mM之后，化学发光强度基本不变或略有降低。说明最适的过氧化氢浓度是10 mM。
实施例4
拱形探针的构建步骤如下：
将灭菌水、5×PBS、Walker和APT加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为拱形探针，储存于-20 ℃备用。
拱形探针和HAP1修饰到金纳米粒子表面的操作步骤如下：
① 将拱形探针和HAP1按照1:20的比例混合，得到混合溶液Q；
② 以3 μL/min的速度将150 µL混合溶液Q加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4 ℃放置24 h；
③ 以2 μL/min的速度将50 μL PB缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，10分钟后，以2 μL/min的速度将27 μL PBS缓冲液加入到纳米金溶液中，4 ℃放置48 h；
④ 以2 μL/min的速度将62μL PBS缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4 ℃放置；
⑤ 加入灭菌水洗脱未标记上的DNA链，4 ℃保存备用。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
将灭菌水、5×缓冲液（3 µL）、功能化的纳米金溶液（5 µL）、目标物（3 µL）（1 pg/ml、5pg/ml、10 pg/ml、20 pg/ml、50 pg/ml、100 pg/ml、200 pg/ml、500 pg/ml、1000 pg/ml、）、HAP2（3 µL）、K+（3 µL）、血红素（3 µL）、鲁米诺（3 µL）、过氧化氢（3.33 µL）加入到预先准备好的灭菌的EP管中并震荡，放入37℃的恒温水浴锅孵育1 h。
荧光仪检测化学发光主要步骤如下：
将均相反应后的溶液（30 µL）稀释至100 µL，用荧光仪在420 nm处检测化学发光。荧光仪激发波长设置为350 nm，发射波长设置为420 nm，检测范围350 nm-550 nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
检测结果如图5所示，图中我们可以看到，检测到的化学发光强度峰值随着多氯联苯浓度的增大而增大，当浓度超过1000 pg/ml后，化学发光强度趋于稳定。所以多氯联苯的最大检测浓度为1000 pg/ml。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种检测多氯联苯的生物传感器及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
aaaaaatttt ttttttttat tctccttaaa catccgtcgg agaatgggta gggccgacgg 60
atgtttaag 69
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
atccgtcggc cctacccatt ctccgacgga tgtttaagga gaatgggtag ggcgggttgg 60
g 61
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
aaaaaatttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttcga 60
cggatgttta aggagaatgg 80
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
cactcggacc ccattctcct tccatccctc atccgtccac 40

Claims (8)

1.一种检测多氯联苯的生物传感器，其特征在于，包括纳米金溶液、发卡探针HAP1和HAP2、Walker、APT、血红素、钾离子、目标物和缓冲液；
所述的序列为：
HAP1碱基序列如SEQ No.1所示；具体为:5’-AAAAAATTTTTTTTTTTTATTCTCCTTAAACATCC GTCGGAGAATGGGTAGGGCCGACGGAT GTTTAAG-3’；
HAP2碱基序列如SEQ No.2所示；具体为:5’-ATCCGTCGGCCCTACCCATTCTCCGACGGATGTTT AAGGAGAAT GGGTAGGGCGGGTTGGG-3’；
Walker碱基序列如SEQ No.3所示；具体为:5’-AAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGACGGATGTTTAAGGAGAATGG-3’；
APT碱基序列如SEQ No.4所示；具体为:5’-CACTCGGACCCCATTCTCCTTCCATCCCTCATCCGT CCAC-3’；
所述的目标物为多氯联苯。
2.权利要求1所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备纳米金溶液；
（2）拱形探针的构建；
（3）将拱形探针和发卡探针HAP1修饰到金纳米粒子表面，得到功能化的纳米金溶液；
（4）均相反应：将多氯联苯、发卡探针HAP2、血红素、钾离子和功能化的纳米金溶液加入到均相中，混和均匀后孵育；
（5）荧光仪检测化学发光。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中纳米金溶液的浓度为1 nM。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）拱形探针的构建步骤如下：
将灭菌水、5×PBS、Walker和APT加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为拱形探针，储存于-20 ℃备用。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（3）拱形探针和HAP1修饰到金纳米粒子表面的操作步骤如下：
① 将拱形探针和HAP1混合，得到混合溶液Q；
② 以3 μL/min的速度混合溶液Q加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4 ℃放置；
③ 以2 μL/min的速度将PB缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，10分钟后，以2 μL/min的速度将27 μL PBS缓冲液加入到纳米金溶液中，4 ℃放置；
④ 以2 μL/min的速度将PBS缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4 ℃放置；
⑤ 加入灭菌水洗脱未标记上的DNA链，4 ℃保存备用。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（4）均相反应操作步骤如下：
将发卡探针HAP2、血红素、缓冲液、功能化的纳米金溶液和多氯联苯加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴60 min。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（5）荧光仪设置激发波长为350 nm，发射波长设置为420 nm，检测范围设置350 nm-550 nm。
8.权利要求2的制备方法制备的生物传感器在检测多氯联苯上的应用。
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