CN110542674A

CN110542674A - 一种检测谷胱甘肽的生物传感器及其制备方法

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Publication number: CN110542674A
Application number: CN201910887031.6A
Authority: CN
Inventors: 王玉; 李莎莎; 刘素; 黄加栋; 张儒峰; 赵一菡; 瞿晓南; 张雪; 宋晓蕾; 王海旺; 王敬锋
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2019-09-19
Filing date: 2019-09-19
Publication date: 2019-12-06
Anticipated expiration: 2039-09-19
Also published as: CN110542674B

Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，基于金纳米粒子的DNA分子机器检测谷胱甘肽（GSH）的生物传感器，包括发卡探针HAP（茎部修饰二硫键）、复合探针P通过polyA修饰到纳米金的表面、P3探针、血红素、钾离子、目标物GSH、纳米金和缓冲液；基于目标物GSH对二硫键的裂解功能，使得发夹结构被破坏，释放Walker核酸链，释放的Walker核酸链和P₃探针可以通过支点介导的链置换反应将P2从复合探针P上置换下来，P2为富含G‑四联体的序列，在存在血红素时形成G‑四联体/血红素DNA酶，从而构建了适体生物传感器，该传感器反应只需要一步，因此具有检测速度快，操作简便，价格低廉，检测限低，特异性高等优点。

Description

一种检测谷胱甘肽的生物传感器及其制备方法

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，特别涉及基于金纳米粒子的DNA分子机器检测谷胱甘肽的生物传感器，还涉及其制备方法。

背景技术

谷胱甘肽是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。存在于几乎身体的每一个细胞，在真核和革兰氏阴性菌中广泛分布，但在乳酸菌等革兰氏阳性菌中几乎不存在。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巯基为其活性基团，易与某些药物、毒素等结合，而具有整合解毒作用。作为细胞中最丰富的非蛋白分子，GSH水平的升高通常出现在许多类型的人类癌症中，包括黑色素瘤、乳腺癌、肺癌和白血病。GSH水平的升高不仅促进了癌症的生长，而且增加了癌细胞对化疗药物的抵抗力。因此，对谷胱甘肽水平的检测对于癌症诊断和治疗反应具有重要的意义。

传统的GSH检测方法有多种包括分光光度法，高效液相色谱法，碘量法等，然而，它们需要复杂的程序，并且耗时且灵敏度差，很难普遍化。为了克服以上缺陷，一些基于比色和荧光的GSH检测方法发展起来，这些新技术给GSH检测方面带来了巨大的进步；但要实现更加灵敏、特异性检测GSH还有待进一步改善。

发明内容

为了实现更加灵敏的、特异性的检测谷胱甘肽，本申请提出了一种基于金纳米粒子的DNA分子机器检测谷胱甘肽的生物传感器。

一种检测谷胱甘肽的生物传感器，包括纳米金溶液、发卡探针HAP、复合探针P、P3探针、血红素、钾离子（K⁺）、谷胱甘肽和缓冲液；

所述的Walker探针是发夹探针HAP的部分序列；

所述的HAP序列如SEQ No.1所示；所述的HAP序列中，3’端第六个碱基和第七个碱基间修饰S-S键；

所述的Walker序列如SEQ No.2所示；

所述的P0序列如SEQ No.3所示；

所述的P1序列如SEQ No.4所示；

所述的P2序列如SEQ No.5所示；

所述的P3序列如SEQ No.6所示。

所述的目标物为GSH。

上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备纳米金溶液；

（2）复合探针P的构建；

（3）将复合探针P修饰到金纳米粒子表面，得到修饰后的纳米金溶液(AuNPs-P)；

（4）均相反应：将谷胱甘肽、发卡探针HAP、P3探针、血红素、钾离子（K⁺）和修饰好的纳米金溶液(AuNPs-P)加入到均相中，混和均匀后孵育；

（5）荧光仪检测化学发光强度。

所述的步骤（1）中纳米金溶液的浓度为1 nM。

所述的步骤（2）复合探针P的构建步骤如下：

将灭菌水、10×PBS、P0探针、P1探针与P2探针加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为探针，储存于-20 ℃备用。

所述的步骤（3）复合探针P修到金纳米粒子表面的操作步骤如下：

a 按照2.5μL/min的速度加入P复合探针，搅拌均匀，4 ℃放置48 h；

b 按照1μL/min的速度加入50 μL PB缓冲液，搅拌均匀，1μL/min的速度加入27 μL PBS缓冲液，4 ℃放置48 h；

c 按照1μL/min的速度加入62μL PBS缓冲液，搅拌均匀，4 ℃放置；

d 加入灭菌水洗脱未标记上的DNA链，4 ℃保存待用。

所述的步骤（4）均相反应操作步骤如下：

将发卡探针HAP (3μL，1μM)、P3探针 (3μL，1μM)、血红素 (3μL，1μM)、3μL离子 (K⁺)、缓冲液 (3 μL)、AuNPs-P (3μL，0.3nM)和3 μL谷胱甘肽（10⁴ pM）加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴60 min。

所述的步骤（5）荧光仪设置激发波长为350 nm。

所述的序列为：

HAP:5’-CCTAGTTGATTACCGTATGAGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTAGTTGATTACCGTATGAGC(S-S)TCATAC-3’

Walker:5’-CCTAGTTGATTACCGTATGAGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTAGTTGATTACCGTATGAGC-3’

P₀: 5’-GCTCATACGGTAATCAACTAGGTAGATACCCAACCCGC-3’

P₁: 5’-TATCTACCTAGTTGATTACC-3’

P₂: 5’-AAAAAATTTTTTTTTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’

P₃: 5’-GCGGGTTGGGTATCTACCTAGTTGATTACCGT-3’

所述的HAP序列中，3’端第六个碱基和第七个碱基间修饰S-S键。

该发明的检测方式是化学发光法检测，基于目标物GSH对二硫键（S-S）的裂解功能，使得发夹结构被破坏，释放Walker核酸链(发卡探针HAP的部分序列，序列两端反向对称)，释放的Walker核酸链可以分别绑定复合探针P的末端立足点区域，将P1从复合探针P上置换下来，同时暴露第二个立足区域，核酸链P3通过暴露的立足区域与其杂交，进一步将P2和Walker核酸链置换下来，释放的Walker核酸链进行循环利用，最后纳米金上的P2全部释放，在存在血红素时形成G-四联体/血红素DNA酶，富集在纳米金的表面。运用G-四联体/血红素类辣根过氧化物酶的催化性能催化鲁米诺产生化学发光。

本发明基于GSH的特异性切割、DNA分子机器的特殊结构和支点介导的链置换实现目标循环放大，利用纳米金离子作为载体，实现对目标物灵敏检测的生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，灵敏度高等优点，可以弥补GSH现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1、检测周期短，灵敏度高

利用了谷胱甘肽对二硫键的特异性识别，利用DNA分子机器的特殊结构和支点介导的链置换实现了对目标物的循环放大；由于该传感器无需酶的参与，其检测方法操作简便、检测周期短，检测灵敏度高。

2、方法简单，性能稳定

该传感器的构建仅需一步，有效地避免了多步加入样品可能带来的污染，同时具有操作简便、反应速度快等优势；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测。

3、反应温和，适于工业化

该传感器的反应条件温和，反应速度快；制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为本生物传感器的工作原理图；

图2为实施例1 P2浓度优化检测结果图；

图3为实施例2 血红素浓度优化检测结果图；

图4为实施例3 反应时间优化检测结果图；

图5为实施例4 传感器检测GSH的工作曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

所述的化学发光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

复合探针P的构建步骤如下：

将18 μL灭菌水、3 μL 10×PBS、3 μL 100 μM的P0探针、3 μL 100 μM的P1探针与3 μL100 μM的P2探针加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为探针，储存于-20 ℃备用。

复合探针P修饰到金纳米粒子表面的操作步骤如下：

a、取1 mL纳米金溶液于离心管中，离心15 min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300 μL灭菌水使纳米金溶液浓缩至1 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口。室温放置30 min后，加入150 μL浓度为10 μM的复合探针P，混合均匀后，4 ℃下放置24 h。

b、分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液。取出磁子（再放到王水里），4 ℃放置48 h。

c、48 h后再分多次缓慢加入62μL PBS缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡，边加边搅拌）。取出磁子（再放到王水里），4 ℃放置24h。

d、将标记好的纳米金溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1 mL，离心10 min，去除上清液。再加入1 mL灭菌水离心，此过程重复两次（为了洗脱未标记上的DNA链），4 ℃保存。

均相反应操作步骤如下：

将发卡探针HAP (3μL，1μM)、P3探针 (终浓度分别为0.4μM，0.6μM，0.8μM，1.0μM，1.2μM，1.4μM)、血红素 (3μL，1μM)、3μL离子 (K⁺)、缓冲液 (3 μL)、AuNPs-P (3μL，0.3nM)和3 μL谷胱甘肽（10⁴ pM）加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴60 min。

荧光仪检测化学发光强度主要步骤如下：

将均相反应后的溶液（30 μL）稀释至100 μL，用荧光仪在420 nm处检测化学发光峰值强度。荧光仪激发波长设置为350nm，检测范围350nm-550nm，读取化学发光信号变化，检测目标物。

结果见图2，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着P3浓度的增大而增大，当浓度超过1.0 μM后，化学发光强度趋于稳定。所以H1的最佳终浓度为1.0 μM。

实施例2

所述的化学发光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

复合探针P的构建步骤如下：

复合探针P修饰到金纳米粒子表面的操作步骤如下：

均相反应操作步骤如下：

将发卡探针HAP (3μL，1μM)、P3探针 (3μL，1μM)、3μL不同浓度血红素（终浓度分别为0.01μM，0.05μM，0.1μM，0.5μM，1μM，5μM，10μM）、3μL离子 (K⁺)、缓冲液 (3 μL)、AuNPs-P (3μL，0.3nM)和3 μL谷胱甘肽（10⁴ pM）加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴60 min。

荧光仪检测化学发光强度主要步骤如下：

结果见图3，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着血红素的浓度增大而减小，当浓度超过1.0 μM后，化学发光强度趋于稳定。所以血红素的最佳终浓度为1.0 μM。

实施例3

所述的化学发光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

复合探针P的构建步骤如下：

复合探针P修饰到金纳米粒子表面的操作步骤如下：

均相反应操作步骤如下：

将发卡探针HAP (3μL，1μM)、P3探针 (3μL，1μM)、血红素 (3μL，1μM)、3μL离子 (K⁺)、缓冲液 (3 μL)、AuNPs-P (3μL，0.3nM)和3 μL谷胱甘肽（10⁴ pM）加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴30 min，45 min，60min，75 min，90 min，105 min，120min。

荧光仪检测化学发光强度主要步骤如下：

结果见图4，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着反应时间的延长而减小，当反应时间超过90 min后，化学发光强度趋于稳定。所以最佳的均相反应时间为90min。

实施例4

所述的化学发光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

复合探针P的构建步骤如下：

复合探针P修饰到金纳米粒子表面的操作步骤如下：

均相反应操作步骤如下：

将发卡探针HAP (3μL，1μM)、P3探针 (3μL，1μM)、血红素 (3μL，1μM)、3μL离子 (K⁺)、缓冲液 (3 μL)、AuNPs-P (3μL，0.3nM)和3 μL谷胱甘肽（5×10⁴ pM、10⁴ pM、5×10³ pM、10³pM、5×10² pM、10² pM、5×10¹ pM、10pM、1pM、0pM）加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴90min。

荧光仪检测化学发光强度主要步骤如下：

结果见图5，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着谷胱甘肽浓度的增大而增大，当浓度超过10⁴ pM后，化学发光强度趋于稳定。所以谷胱甘肽的最佳终浓度为10⁴pM。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 济南大学

<120> 一种检测谷胱甘肽的生物传感器及其制备方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 1

cctagttgat taccgtatga gccttttttt tttttttttt ttttttccta gttgattacc 60

gtatgagctc atac 74

<210> 2

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 2

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gtatgagc 68

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 3

gctcatacgg taatcaacta ggtagatacc caacccgc 38

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 4

tatctaccta gttgattacc 20

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 5

aaaaaatttt ttttttgggt agggcgggtt ggg 33

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 6

gcgggttggg tatctaccta gttgattacc gt 32

Claims

1.一种检测谷胱甘肽的生物传感器，其特征在于，包括纳米金溶液、发卡探针HAP、复合探针P、P3探针、血红素、钾离子、谷胱甘肽和缓冲液；

所述的复合探针P由P0探针、P1探针与P2探针通过碱基互补配对结合形成；

所述的Walker探针是发夹探针HAP的部分序列；

所述的Walker序列如SEQ No.2所示；

所述的P0序列如SEQ No.3所示；

所述的P1序列如SEQ No.4所示；

所述的P2序列如SEQ No.5所示；

所述的P3序列如SEQ No.6所示。

2.一种权利要求1所述的检测谷胱甘肽的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备纳米金溶液；

（2）复合探针P的构建；

（3）将复合探针P修饰到金纳米粒子表面，得到修饰后的纳米金溶液AuNPs-P；

（4）均相反应：将谷胱甘肽、发卡探针HAP、P3探针、血红素、钾离子K⁺和修饰好的纳米金溶液AuNPs-P加入到均相中，混和均匀后孵育；

（5）荧光仪检测化学发光强度。

3.根据权利要求2所述的检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述的步骤（1）中纳米金溶液的浓度为1 nM。

4.根据权利要求2所述的检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述的步骤（2）复合探针P的构建操作步骤如下：

5.根据权利要求2所述的检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述的步骤（3）复合探针P修饰到金纳米粒子表面的操作步骤如下：

d 加入灭菌水洗脱未标记上的DNA链，4 ℃保存待用。

6.根据权利要求2所述的检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述的步骤（4）均相反应操作步骤如下：

将发卡探针HAP、P3探针、血红素、3μL离子、缓冲液、AuNPs-P和3 μL谷胱甘肽加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴60 min。

7.根据权利要求2所述的检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述的步骤（5）荧光仪设置激发波长为350 nm。