CN1398301A - 标记核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种断裂和标记合成或天然核酸的方法，其包括以下步骤：提供含核酸、包含可检测标记的标记剂和至少一种多价金属阳离子在实质上为水溶液中的混合物；化学地断裂混合物中的核酸以生成多重核酸片段；和将至少一个标记连到至少一个核酸片段上以产生可检测地标记的核酸片段。

Description

标记核酸的方法
                         发明领域
本发明涉及一种标记核酸的新方法，并特别涉及一种同时断裂和标记核酸的化学方法。
                           背景
有很多方法用于标记核苷酸、寡核苷酸或核酸(本文用术语多核苷酸表示)。多核苷酸可以在合成过程中被标记(例如通过掺入至少一个标记的核苷酸)或在合成后给多核苷酸加上一个标记。例如，一种方法是将标记连到碱基上，无论后者是天然碱基或经修饰的碱基。第二种方法是标记连到糖上，也无论后者是天然糖或经修饰的糖。第三种方法是将标记连到磷酸上。优选的方法经常是将标记连到碱基或糖上，因为这样的方法更便利，并对标记提供更多的选择。参见，例如在EP-A-0.329.198，EP-A-0.302.175，EP-A-0.097.373，EP-A-0.063.879，US-A-5,449,767，US-A-5,328,824，WO-A-93/16094，DE-A-3.910.151和EP-A-0.567.841中公开的方法涉及碱基标记，或在EP-A-0.286.898中公开的方法涉及糖标记。将标记连到磷酸上更为复杂，因为核酸是水溶性的而磷酸在水溶液中的反应性是低的。但是，磷酸标记方法在EP-A-0.280.058中进行了描述，在该方法中，标记被连到磷酸上，所述磷酸对于脱氧核糖核苷酸，连到糖的3’和/或5’位，对于核糖核苷酸，则连到2’，3’和/或5’位上。标记的核苷酸可以在合成过程中被掺入多核苷酸或寡核苷酸。
然而，EP-A-0.280.058描述的标记未均匀地标记核酸。标记的核苷酸掺入多核苷酸不受控制，而是依赖于合成多核苷酸的组成。因此一些多核苷酸可能包含大量标记的核苷酸，而其他的可能完全不含。结果，这些标记的核酸发射的信号强度不均匀，使得在检测核酸时难以解释结果。
US-A-5,317,098描述的另一种方法涉及通过使用咪唑和连接臂在其5’端被标记的核酸(如15聚体)。此外，用激酶将磷酸连到核酸上，因此增加了至少一个附加的步骤。当这种方法用于标记更大的核酸时，其特异活性是低的，因为这种技术仅仅标记5’端。
在一些情况下，断裂标记的核酸也是所希望的，如通过减少标记的多核苷酸的长度以增加标记的片段与另一个核酸的杂交动力学。与此相比，用更大的标记的多核苷酸杂交可能造成信号在数量和质量上的丢失。也可能需要将标记的多核苷酸断裂以减少位阻。
核酸长度和二级结构的存在可以造成位阻。断裂帮助消除这些结构，因此优化杂交。位阻在包含高密度捕获探针的表面的杂交中起着特别重要的作用，例如，在高密度的探针阵列上，如“DNA芯片”(GENECHIP；Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)；(Chee等，1996，科学(Science)274：610-614；Caviani Pease等，1994，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91：5022-5026；US 5,445,934；US5,744,305；Ramsay，1998，自然生物技术(NatureBiotechnol.)16：40-44；Ginot，1997，人类突变(Human Mutation)10：1-10；Cheng等，1996，分子诊断(Molec.Diagnosis)1(3)：183-200；Livache等，1994，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)22(15)：2915-2921；Cheng等，1998，自然生物技术(NatureBiotechno1.)16：541-546；US 5,525,464，US 5,202,231，US5,807,522 and US 5,700,637)。
断裂核酸方法在本领域是已知的。例如，断裂可以是酶促的(即通过核酸酶，如DNA酶或RNA酶)，其生成具有3’-OH，5’-OH，3’-磷酸和5’-磷酸末端的小片段。或者，断裂可以是化学的，例如，对于DNA，可以将DNA脱嘌呤或脱嘧啶，然后在碱的存在下进行断裂(即“β-消除”)。DNA能通过氧化、烷化或自由基加成机制被断裂。金属阳离子，其通常与可以用作为化学催化剂的有机分子如咪唑联合，用于断裂RNA。该断裂优选在碱性介质中进行并生成具有3’-磷酸末端的片段。
不同的核酸断裂技术在Trawick等，1998，化学综述(Chem Rev.).98：939-960和Oivanen等，1998，化学综述(Chem Rev.).98：961-990中记载。
一种断裂和标记RNA的方法在WO-A-88/04300中记载，其中，用具有酶特性的RNA(核酶)进行断裂。通过核酶断裂释放出核酸(5’)HO末端和核酸(3’)HO-PO2末端。然后通过掺入源自GTP的放射性磷酸在5’OH末端进行放射性标记；在标记中没有使用断裂生成的磷酸。通过核酶进行断裂提示核酶与所裂解目标核酸之间的特异性，在断裂之后磷酸作为标记起作用。
基于核酸扩增技术的可靠的诊断性试验经常包括控制核酸污染的步骤所述核酸能另外作为进一步扩增的目标。已发展了一些去污染方法(Longo等，1990，基因(Gen.)93；125-128；Abravaya等，核酸扩增技术，第125-133页，(1997)Eds.Lee等(Eaton Publishing，1997)第125-133页；EP 0 709 468 A1和美国专利5,605,796)。这些方法通常通过降解可另外作为目标的核酸(如用照射、内切核酸酶、尿嘧啶DNA糖基化酶、引物修饰或光化学方法)，使得扩增的核酸产物不能作为进一步扩增的目标。这些技术中的一些难于实施，是低效的或在方法中引入附加的步骤和/或有毒化合物(如紫外线失活，光化学降解，引物修饰)。酶促方法用的酶经常是昂贵的，并与扩增和/或检测缓冲液不相容。因此仍需有效和便利的去除目标核酸的方法。
                        发明概述
本发明的一个方面是断裂和标记合成或天然核酸的方法，其包括如下步骤：提供含核酸、带可检测标记的标记剂和至少一种多价金属阳离子在实质上为水溶液中的混合物；化学地断裂该混合物中的核酸产生多重核酸片段；和将至少一个标记连到至少一个核酸片段上以产生可检测地标记的核酸片段。在本方法的一个实施方案中，所述核酸是DNA、RNA、嵌合DNA-RNA多聚体，包含至少一个硫代磷酸核苷酸的DNA或包含至少一个硫代磷酸核苷酸的RNA。在另一个实施方案中，将断裂和标记步骤中所用的试剂加入体外核酸扩增混合物中。根据另一个实施方案，将所述至少一个标记连到所述核酸片段的至少一个磷酸上，该方法可进一步包括在断裂及结合步骤后处理混合物的步骤以减少或消除未结合的标记剂。在一个实施方案中，处理步骤包括在断裂和结合步骤后向混合物中加入猝灭剂，优选的猝灭剂包括焦磷酸、硫醇衍生物、螯合剂、磷酸阴离子或碳酸阴离子。在另一个实施方案中，在断裂和结合步骤后，处理步骤物理地分离标记的核酸片段与混合物中未结合的标记剂。处理步骤可进一步包括在断裂和结合步骤后向混合物中加入酸。处理步骤的另一个实施方案进一步包括在断裂和结合步骤后向混合物中加入螯合剂。在一个实施方案中，处理步骤用有机溶剂将标记的核酸片段与未结合标记剂分开，优选的有机溶剂是1-丁醇、2-丁醇、异戊醇、1-戊醇或环己醇。在另一个实施方案中，处理步骤通过在固相支持体上用固相提取核酸片段将标记的核酸片段与未结合标记剂分开，优选的固相支持体是珠子、凝胶、离子交换树脂，反相树脂、硅基质或膜。在另一个实施方案中，用含甜菜碱的缓冲液将标记的核酸片段从固相支持体上洗脱。一个实施方案包括将标记的核酸片段在环境温度下从含甜菜碱、DTAB和未标记核酸的溶液中沉淀的处理步骤。另一个实施方案利用处理步骤稀释体外核酸扩增混合物。在一个实施方案中，断裂和结合步骤在单一反应混合物中进行，而在另一个实施方案中，断裂和结合步骤在单独的步骤中进行。在优选的实施方案中，标记步骤将标记连到内在或末端的硫代磷酸上或连到内在或末端的磷酸上。在一个实施方案中，断裂步骤还包括使用化学催化剂，优选化学催化剂是广义碱，选自咪唑、咪唑的取代的类似物，和包含咪唑环的化合物或咪唑环的取代的类似物。优选的化学催化剂选自N-甲基咪唑、MOPS、HEPES、PIPES和生物有机多胺。在本方法优选的实施方案中，所述核酸是RNA或包含至少一个硫代磷酸核苷酸的RNA；多价金属阳离子是Mg2+，Sr2+，Ba2+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Ru3+，Ce3+，Eu3+，Tb3+，Tm3+，Yb3+，或Lu3+。在另一个优选实施方案中，所述核酸是DNA，多价金属阳离子是Tb3+。在一个实施方案中，所述核酸是RNA或包含至少一个硫代磷酸核苷酸的RNA；多价金属阳离子是Mn2+，Cr3+，Ce3+，Yb3+，Tb3+，Eu2+，Zn2+或Pb2+。在另一个实施方案中，所述核酸是DNA或包含至少一个硫代磷酸核苷酸的DNA；多价金属阳离子是Mn2+，Zn2+，Be2+，Cr3+，Pb2+，In3+，Tb3+，Ce3+，Yb3+，或Ni2+。本方法的优选实施方案使用的多价金属阳离子是Mn2+，Zn2+，Tb3+或Ce3+。在优选的实施方案中，混合物包含标记剂的浓度在0.1mM到4mM之间，更优选在0.1mM到1mM之间。在优选的实施方案中，标记剂为0.3mM到0.55mM之间。优选混合物包含含有烷基卤化物或卤代乙酰胺反应基团的标记剂。优选的标记剂是5-(溴甲基)荧光素，6-(溴甲基)荧光素，6-碘乙酰胺荧光素或5-碘乙酰胺荧光素。
                       发明详述
本发明包括化学断裂核酸和同时用可检测标记如荧光化合物标记核酸片段的方法。标记的片段可用多种方法检测。该方法可用于制备标记的核酸，如要与固定探针或检测探针结合的片段。该方法能限制来自标记步骤的非特异信号，尤其当与用任何一种方法的核酸纯化步骤联合使用时。此外，该方法提供相对均匀标记的核酸片段。断裂过程生成了具有与用于检测断裂核酸的核酸探针杂交的最适大小的片段，因此使得检测步骤更迅速有效。
本发明涉及标记合成或天然核酸的方法，其特征在于用化学方法断裂核酸和将标记连到断裂的核酸上的步骤。该方法可任选包括处理标记混合物以减少其中标记剂的量。
“核酸”指的是DNA、RNA或嵌合DNA-RNA多聚体(单链，双链或部分双链)和部分或全部由可以出现在序列中的核苷酸类似物或脱碱基残基构成的核酸。DNA或RNA可以从天然来源中纯化(如从细胞中提取)或由合成制备(如通过化学、酶促或其他已知的合成方法)。在有些实施方案中，所述核酸是扩增的DNA、扩增的RNA或其混合物，它们可以进一步包括至少一个硫代磷酸核苷酸。磷酸可以是位于核酸片段的3’端和/或5’端的末端磷酸，内在磷酸或内在硫代磷酸。
术语核酸包括常规的RNA和DNA，以及其类似物。核酸“主链”可以由各种本领域已知的键合组成，包括一个或多个糖-磷酸二酯键合，肽-核酸键(有时用“肽核酸”表示，如Hydig-Hielsen等在PCT专利申请WO 95/32305中所述)，硫代磷酸键合，甲基磷酸键合或其组合。核酸中的糖部分可以是核糖或脱氧核糖，或有已知取代的类似化合物，如2’甲氧基取代和2’卤素取代(如2’-氟)。含氮的碱基可以是常规的碱基(A、G、C、T、U)，其已知的类似物(如肌苷或“I”，参见核酸生物化学(The Biochemistry of the Nucleic Acids)5-36，Adams等编著，第11版，1992)，已知的嘌呤或嘧啶碱基的衍生物(如N4-甲基脱氧鸟苷，脱氮-或氮-嘌呤和脱氮-或氮-嘧啶，在5或6位有取代基团的嘧啶碱基，在2，6或8位有改变的或置换的取代基的嘌呤碱基，2-氨基-6-甲氨基嘌呤，O6-甲基鸟嘌呤，4-硫代-嘧啶，4-氨基-嘧啶，4-二甲基肼-嘧啶和O4-烷基-嘧啶，参见Cook，PCT专利申请WO 93/13121)和“脱碱基”残基，其中对聚合物的一个或更多个残基其主链不包括含氮碱基。核酸可以仅仅包含DNA与RNA中发现的常规的糖、碱基和键合，或者可以包括常规组分和取代(如，常规碱基通过甲氧基主链连接，或者包括常规碱基和一个或多个碱基类似物的核酸)。
“扩增”指的是任何已知的获得多拷贝目标核酸序列或其互补序列或片段的方法。已知的扩增方法包括，如转录介导的扩增，复制酶介导的扩增，聚合酶链反应(PCR)扩增，连接酶链反应(LCR)扩增和链置换扩增(SDA)。复制酶介导的扩增用自我复制的RNA分子和复制酶如QB-复制酶(美国专利4,786,600；PCT专利申请WO 90/14439)。PCR扩增是广为人知的，其用DNA聚合酶、引物和热循环来合成多拷贝的DNA或cDNA的两条互补链。  (如参见美国专利4,683,195，4,683,202，4,800,159；酶学方法(Methods in Enzymology)，1987，Vol.155：335-350)。LCR扩增用至少四个单独的寡核苷酸通过多个循环的杂交、连接和变性来扩增目标核酸及其互补链(欧洲专利申请公开号0 320 308)。SDA方法中引物含有限制性内切核酸酶的识别位点，从而限制性内切核酸酶能在含目标序列的半修饰DNA双链的一条链上形成缺口，继之以一系列的引物延伸和链置换步骤进行扩增(Walker等，1992，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：392-396；和美国专利5,422,252)。转录相关的扩增是本发明优选的实施方案，然而，对于本领域技术人员来说用任何方法扩增的核酸都可应用于本发明中是显而易见的。
“转录介导的扩增”或“转录相关的扩增”指的是利用RNA聚合酶从核酸模板产生多个RNA转录物的任何类型的核酸扩增(见美国专利4,868,105和5,124,246，5,130,238，5,399,491和5,554,516，5,437,990和PCT申请WO 93/22461，WO 88/01302和WO 88/10315，WO 94/03472和WO 95/03430)。转录相关的扩增通常采用RNA聚合酶、DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸、核苷三磷酸，和启动子-模板互补寡核苷酸，还可以任选包括一种或多种类似寡核苷酸。优选的转录介导扩增(TMA)方法在美国专利5,399,491和5,554,516，和PCT申请WO93/22461，WO 94/03472和WO 95/03430中详细阐述。
化学断裂核酸通过利用至少一种多价金属阳离子进行，它可以与或可以不与化学催化剂组合。优选的多价金属阳离子包括二价和三价阳离子，镧系元素，IIA组，IV组和过渡金属(如，Mn2+，Mg2+，Sr2+，Ba2+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Cr3+，Ce3+，Eu3+，Lu3+，Ru3+，Tb3+，Tm3+，和Yb3+)或其组合。断裂和标记都可以在至少一种多价金属阳离子的存在下进行，如Mn2+，Zn2+或Pb2+，或镧系元素阳离子，如Tb3+或Ce3+。断裂过程中应用的化学催化剂是那些作为广义碱的物质，包括，如咪唑、取代的类似物(如N-甲基咪唑)，或包括咪唑环的化学化合物或其取代的类似物。另外可以用于核酸断裂的化学催化剂包括MOPS、HEPES、PIPES和生物有机多胺，如精胺、亚精胺和腐胺(Arkadiusz等，1999，核酸研究(Nucleic Acids Res.)27：3931-3937)。
在本发明的优选方法中，所要断裂的核酸是RNA，多价金属阳离子为Mn2+，Mg2+，Sr2+，Ba2+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Ru3+，Ce3+，Eu3+，Lu3+，Tb3+，Tm3+或Yb3+中的至少一种。在其他RNA被断裂的实施方案中，优选的多价金属阳离子是Mn2+，Zn2+，Eu2+，Pb2+，Ce3+，Cr3+，Tb3+或Yb3+中的至少一种。
在本发明优选方法中，所要断裂的核酸为DNA，多价金属阳离子为Mn2+，Zn2+，Be2+，Pb2+，Ni2+，Cr3+，Ce3+，Eu3+，In3+，Tb3+或Yb3+中的至少一种。在另一个优选实施方案中，所要断裂的核酸是包含至少一个硫代磷酸核苷酸的DNA，金属阳离子是Tb3+。
另外任选包含至少一个硫代磷酸核苷酸的DNA的化学断裂可以通过使用金属螯合剂(Sentagne等，光化学光生物学杂志(J.Photochem.Photobiol.)B.16：47-59)，可光活化的化合物(Nadji，1992，美国化学学会会志(Am.Chem.Soc.)112：9266-9269)和烷化剂(Povsic等，1990，美国化学学会会志(J.Am.Chem.Soc.)112：9428-9430)来实现。
“标记”指的的是将可检测标记连到核酸上以产生与核酸相关的可检测信号。包含标记的化合物是标记剂，已知的标记包括产生信号如通过比色法、荧光、发光的酶(如碱性磷酸酶)；发色团(如荧光和发光化合物和染料)；能用电子显微镜或通过测量电性质来检测的电子致密基团；能用光学或物理方法检测的大小依赖性可检测基团；以及放射性核素。
本发明的标记剂包括包含烷基卤(如溴烷基或溴甲基)和卤代乙酰胺反应基团(如碘乙酰胺基团)的化合物。此种标记剂包括，如5-(溴甲基)荧光素，6-(溴甲基)荧光素，6-碘乙酰胺荧光素和5-碘乙酰胺荧光素。本领域技术人员可以理解其他活性化合物基于其已知的化学活性可以同等应用，如肼、烷氧基胺，烷基卤或芳基卤和马来酰亚胺。标记剂的优选浓度在低限0.01mM和高限10mM的范围内，更优选在低限0.1mM和高限4mM的范围内。在一些优选的实施方案中，应用的标记剂浓度在0.1mM到1mM之间，在其他实施方案中浓度范围在0.3mM到0.55mM之间。当标记剂是5-(溴甲基)荧光素时，断裂和标记步骤优选在15mM到60mM的Mn2+，5mM到30mM的咪唑的存在下和6.8到7.2范围内的pH值下进行。在本发明的一个实施方案中，核酸断裂和标记在一个反应混合物中进行，另外提供了一种灭活目标核酸的方法，从而消除了检测后步骤以去除任何残余目标核酸的必要。例如，断裂和标记反应混合物中存在的RNA目标分子可被降解为短片段。
本发明的一个优点是核酸断裂和标记反应也作为去污染的工具。就是说，该方法断裂扩增混合物中存在的RNA分子，因此从体系中去除了能进一步扩增的潜在目标序列，因为断裂的RNA片段不能作为进一步扩增的目标序列。
在本发明的另一个实施方案中，断裂和标记在两个步骤中实现，使用扩增反应的全部体积或其一部分。
在本发明的另一个实施方案中，在断裂和标记步骤后包括一个处理步骤以减少或消除未反应的标记剂。该步骤限制或消除了由未反应标记的存在产生的非特异信号。这样的处理步骤可以包括向标记反应中加入猝灭剂化合物，或可以包括用各种方法物理分离标记的核酸片段与未反应的标记剂。
猝灭剂是一种化合物，它(1)与金属阳离子在反应混合物中形成可溶性络合物；(2)从反应混合物中沉淀金属阳离子；或(3)与残余的标记剂反应，因此有效地将它从混合物中去除。可溶性络合物可以通过如用螯合剂(如EDTA)形成。加入焦磷酸阴离子可以形成可沉淀的络合物，本领域技术人员可以基于与标记反应中涉及的特定反应基团的标准化学相互作用容易地选择猝灭剂化合物。优选的猝灭剂包括焦磷酸或硫醇衍生物(如二硫苏糖醇、胱氨酸、谷胱甘肽、巯基琥珀酸)。或者，或除用猝灭剂外，处理步骤可以通过物理分离未结合标记剂与标记的核酸的方法来去除未反应标记。分离未结合标记与标记的核酸片段可以包括将未反应标记抽提至至少一种有机溶剂中，如1-丁醇，2-丁醇，异戊醇、1-戊醇或环己醇。优选的溶剂是1-丁醇。另一个优选的抽提方法包括在溶剂萃取之前酸化标记混合物。或者，在萃取过程开始之前，将用于萃取的有机溶剂与乙二胺四乙酸(EDTA)混合。
根据另一个实施方案，不通过在乙酸钠和冷异丙醇混合物中沉淀核酸片段来进行处理步骤。
标记的核酸片段的纯化也可以通过用固相提取技术去除未结合标记来实现。用于该提取方法的固相支持体优选是珠子、凝胶-过滤树脂(如SephadexTM，SephacrylTM和BioGelTM)，凝胶或膜(如尼龙、硝酸纤维素、玻璃纤维或硅)。特别优选的固相提取介质包括凝胶-过滤树脂SephadexTMG-50，硅膜和硅珠。固相提取方法优选如下进行：用含有固相支持体的柱子，利用重力流动、真空抽吸，或如通过离心或利用连接于柱子顶端的注射器形成的正压来使溶液通过柱子。在将标记反应混合物用于固相介质进行提取之前，将螯合剂如EDTA加入混合物。在一个优选的实施方案中，固相是用硅包裹的顺磁颗粒，用甜菜碱洗脱被捕获的标记的核酸片段。
固相纯化方法是快速的，简单的，有效的而且不使用有机溶剂。而且，因为其结合能力的限制，固相支持体可适用于去除可能在检测步骤中引起信号饱和的过量的标记片段。
用于处理标记混合物以减少未反应标记剂的量的其他或可选择的方法包括在含甜菜碱、三烷基铵盐衍生物如DTAB(溴化十二烷基三甲铵)或CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)和外源DNA的盐水缓冲液中沉淀断裂的核酸。标记混合物也可以经稀释从而在检测步骤之前降低未反应标记剂的浓度。
尽管不希望受到任何特定机制的约束，本发明的断裂和标记核酸的方法可以将标记连到核酸的磷酸基团或硫代磷酸基团上。这种结合可以发生在聚合物的末端或内在磷酸或硫代磷酸基团。
通过下面阐述本发明的一些优选实施方案的实施例说明这些方法。
实施例1：  RNA扩增子的制备
为了生成断裂和标记用的核酸，进行以下的核酸扩增反应。这些反应用两种不同来源的核酸作为目标，一种来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，另一种来自人类免疫缺陷性病毒，HIV-1。
分枝杆菌16S扩增子
用转录介导的扩增(TMA)获得结核分枝杆菌(MycobacteriumTuberculosis)16S rRNA扩增子(Kacian等，美国专利5,399,491和5,554,516，Kacian等，PCT专利申请WO 93/22461，McDonough等，PCT专利申请WO 94/03472和Ryder等，PCT专利申请WO 95/03430)。扩增反应用106拷贝的目标rRNA(结核分枝杆菌16S)和结核分枝杆菌Direct(MTD)试剂盒(Gen-Probe Incorporated，San Diego，CA，USA)中的试剂和方法进行。在标题为“用核酸扩增检测分枝杆菌属的方法和组合物”的申请中公开了在TMA中应用的引物，该申请由本申请人在本申请的申请日之前一天单独提出。
简而言之，将目标核酸、引物和扩增物质混合后，将扩增混合物在42℃下温育1小时。通过在含7M尿素的6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳来分析TMA产物，分离的扩增子产物经溴化乙啶染色后观察，通过与凝胶上的RNA标准物比较来评价产物的大小和量。
HIV-1扩增子
HIV扩增子用聚合酶链式反应制备，如Kozal等(1996，自然医学(Nature Med)2(7)：753-759)所述。简而言之，通过首先用裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.3，2.5mM MgCl2，0.45％TweenTM-20，50mMKCl，0.1mg/ml蛋白酶K)在56℃处理细胞2小时，从106共培养细胞中提取DNA。
用一组嵌套式PCR反应扩增HIVl DNA。第一反应用大约1.0μg输入DNA和以下两个引物生成1200bp的扩增子：
aattaaccctcactaaagggagaCAGAGCCAACAGCCCCACCA′(SEQ ID NO：1，其中T3 RNA聚合酶启动子序列用小写字母表示)；
taatacgactcactatagggagaTTTCCCCACTAACTTCTGTATGTCATTGACA(SEQ ID NO：2，其中T7 RNA聚合酶启动子序列用小写字母表示)。
PCR反应在含100mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，1.5mM MgCl2，0.2mM各种dNTP，0.2μM引物(每种)和1.25单位TaqDNA聚合酶的反应混合物中进行。反应设置为94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 2分钟共25循环，最后一个循环72℃ 10分钟。
第二反应生成460bp的序列，该序列在第一次扩增的序列之内，使用第一次PCR中用的SEQ ID NO：1引物，和以下序列的第三个引物：
taatacgactcactatagggagaGGGCCA TCCATTCCTGGCTTTAATTT(SEQ ID NO：3)反应设置为94℃ 30秒，63℃ 30秒，72℃ 1分钟，共30循环，和最后一个循环72℃ 10分钟。用20U T3或T7 RNA聚合酶在含40mM TrisAc2，pH8.1，100mM KAc，30mM MgAc2，10mM DTT和1.25mM rNTPs的体外反应中转录PCR产物。
如上所述在凝胶上评价产物大小和量。
RNA扩增子不经进一步纯化用于标记反应。
实施例2：通过用有机溶剂萃取减少背景
咪唑和MnCl2购自Sigma-Aldrich Chimie(St Quentin Fallavier，法国)，5-(溴甲基)荧光素购自Molecular Probe(Eugene，OR，USA，编号B1355)。
如实施例1所述制备16S rRNA扩增子。每个标记反应(100μl)包括：RNA分子(5μl TMA反应混合物)，6μl咪唑(0.1M)，6μlMnCl2(1M)，2μl 5-(溴甲基)荧光素(50mM溶解在DMF中)和81μl纯水。将反应混合后在65℃温育30分钟。
用生产商(Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)提供的方案，在DNA芯片(GENECHIP)上的固定探针阵列上杂交、检测和分析产物。该DNA芯片针对检测和4-L tiling结核分枝杆菌的16S rRNA(M20940序列的213-425区域《Genbank》，如Troesch等在1999，临床微生物杂志(J.Clin.Microbiol.)，37(1)：49-55中所述)而设计。用GENECHIP软件(Affymetrix)上可用的功能得到的的结果包括：BC：核苷酸碱基信号(用百分比表示)；S：探针阵列单元的平均信号强度(用相对荧光单位RFU表示)；B：平均背景强度(用RFU表示)；和S/B：信号对背景的比值。对于该阵列，实现96.2％的碱基信号，和5488RFU的平均信号及2420 RFU的背景，S/B比为2.3。
该结果表明通过用仅仅5％的单次扩增反应生成的扩增子就能得到有用的碱基信号和信号强度，然而S/B比值相对较低。
在其他试验中，测试了更小体积的断裂和标记混合物。在这些试验中，如实施例1所述用TMA扩增制备16S rRNA扩增子。然后制备25μl和50μl的标记反应。25μl反应包括：RNA分子(5μl TMA反应混合物)，1.5μl咪唑(0.1M)，1.5μl MnCl2(1M)，2μl 5-(溴甲基)荧光素(50mM溶解在DMF中)和15μl纯水。50μl反应包括：RNA分子(5μl TMA反应混合物)，3μl咪唑(0.1M)，3μlMnCl2(1M)，2μl 5-(溴甲基)荧光素(50mM溶解在DMF中)和37μl纯水。分别将两个体积的反应体系混合后在65℃温育30分钟。
温育后，向各混合物中加入纯水，使得终体积为100μl。然后，根据生产商(GENECHIPAffymetrix，Santa Clara，CA，USA)提供的方案，利用如上所述的4-L tiling DNA芯片，将标记反应产物在DNA芯片上杂交、检测和分析。
结果如下所示。标记体积          BC％         S          B        S/B25μl             98.4        4532       2363      1.950μl             98.4        5682       2462      2.3
这些结果显示，标记反应可以在更小的体积中进行，而不影响碱基信号或强度水平。
为了增加S/B比值，在断裂和标记反应完成后包括一个纯化步骤。这里，用洗涤缓冲液中的有机溶剂减少用于DNA芯片以检测标记的RNA片段的混合物中的未结合标记剂的量。
按实施例1中所述制备结核分枝杆菌的16S rRNA扩增子。扩增子的断裂和标记如上所述在25μl反应体系中进行。断裂和标记后，加入纯水使得终体积达到100μl。然后，将反应产物如上所述在DNA芯片上杂交、检测和分析，但其中洗涤缓冲液包含5％(v/v)N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或5％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)
这些结果如下所示测定         说明          BC％    S      B      S/B1    无溶剂的洗涤缓冲液    96.8   1326   38420   1.62    含5％DMF的洗涤缓冲液  98.4   5748   1399    4.13    含5％DMSO的洗涤缓冲液 97.3   5900   1655    3.6
结果表明，洗涤缓冲液中加入有机溶剂减少了背景水平，可能是通过增加未结合的5-(溴甲基)荧光素标记在洗涤缓冲液中的溶解度，从而有效地将它从DNA芯片上去除。在含有DMSO或DMF的洗涤缓冲液的检测中碱基信号百分也是更高的。
作为另一种提高DNA芯片检测的方法，在杂交步骤之前用有机溶剂萃取断裂和标记反应混合物。该断裂和标记反应混合物包含：16SrRNA扩增子(50μl TMA)，15μl咪唑(0.1M)，15μl MnCl2(1M)，5μl 5-(溴甲基)荧光素(50mM在DMSO中)和纯水加至终体积为250μl。将反应混合物混合，并在65℃温育30分钟。
然后用900μl水饱和的1-丁醇萃取100μl的反应混合物。加入1-丁醇后，将溶液强烈涡旋混合并离心以分离水相和有机相。将100μl水相与700μl杂交缓冲液(5×SSPE，3M甜菜碱，5mM DTAB，250μg/ml鲑DNA)混合，如上所述在DNA芯片上进行杂交。用该方法，BC是98.4％，信号是2131 RFU和背景是314 RFU，得到的S/B比值是6.8。这些结果显示，断裂和标记反应后使用有机溶剂萃取减少了背景水平且不丢失碱基信号百分比。
为了确定更大体积的反应是否可以同样应用，用总共100μl的TMA反应体积。在这种情况下，将标记试剂如下直接加入TMA反应管中。向TMA反应(100μl)中加入：15μl咪唑(0.1M)，15μl MnCl2(1M)，5μl 5-(溴甲基)荧光素(50mM在DMF中)和纯水至终体积为250μl。将反应介质混合，在65℃温育30分钟。
或者，进行相同操作，继以基本如上所述进行的1-丁醇纯化。然后，对于两个操作(即有或没有机溶剂萃取)，将100μl反应产物如上所述在DNA芯片上杂交、检测和分析。这些结果显示如下。
              说明         BC％       S        B       S/B
       100μl体积，无萃取  97.8      1631     728      2.2
       100μl体积，有萃取  98.4      3634     753      4.8因为标记试剂在扩增后加入TMA管中，所以该方法使扩增子的断裂和标记无须将扩增子转移到另一个管中的附加转移步骤。
类似的测定用如实施例1所述生成的HIV-1扩增子进行。这些断裂和标记反应(250μl)包括：HIV-1蛋白酶RNA扩增子(50μl)，15μl咪唑(0.1M)，15μl MnCl2(1M)，5μl 5-(溴甲基)荧光素(100mM在DMSO中)和165μl纯水，混合并在60℃温育30分钟。对于有机溶剂萃取，如上所述用1-丁醇进行两次萃取，每次萃取用250、300、400或1000μl丁醇。然后，如上所述将反应产物在DNA芯片上杂交、检测和分析，用DNA芯片检测HIV-1蛋白酶基因(Kozal等，1996，自然医学(Nature Med.)2(7)：753-758)。这些结果显示如下，提示对所用的所有体积，两次有机溶剂萃取大为降低了背景。
 萃取体积 BC％ S  B  S/B
 2×250μl2×300μl2×400μl2×1000μl  98.295.396.696.6  900110315851003  274214271216  4.36.26.85.6
修改本方法，在1-丁醇萃取步骤之前，将EDTA(10mM)加入断裂和标记反应混合物中。该步骤增加了标记的RNA片段的溶解度，并避免了Mn2+金属离子引起的沉淀。如下所示，EDTA的加入提高了检测步骤中的BC并增加S/B比值。
    说明          BC％        S     B      S/B
 1-丁醇萃取      96.2       1160   251     4.6
 1-丁醇+EDTA萃取 98.4       1303   228     5.7
除了1-丁醇以外，用相似的萃取方法还测试了其他有机溶剂，用16S rRNA扩增子作为断裂和标记的目标核酸。每种溶剂的结果显示如下，表明能用多种有机溶剂有效地去除未结合的标记剂。
       萃取溶剂          BC％    S      B     S/B
        1-丁醇           94.1   5387    357   15.1
        2-丁醇           97.3   3289    291   11.3
        异戊醇           94.6   4505    488   9.2
        环己醇           94.6   4079    248   16.4
        1-戊醇           93.0   4166    398   10.5
        1-丁醇/硝基甲烷  93.0   4799    309   15.5
作为有机溶剂萃取未结合标记的替代，也测试了沉淀断裂的和标记的核酸片段。在该试验中，按实施例1所述制备HIV-1扩增子。每个反应包括：RNA扩增子(50μl)，6μl咪唑(0.1M)，6μl MnCl2(1M)，2μl 5-(溴甲基)荧光素(50mM在DMSO中)和纯水至终体积为100μl。混合的溶液在65℃温育30分钟。对照反应中断裂的RNA没有被沉淀，杂交和检测步骤如上所述用HIV-1特异性DNA芯片进行。试验反应包括沉淀步骤，该沉淀步骤先于芯片杂交进行。为了沉淀，将反应混合物与700μl杂交缓冲液(5×SSPE，3M甜菜碱，5mM DTAB，250μg/ml鲑精子DNA)在室温下涡旋混合。收集沉淀，去除上清。将沉淀重悬于500μl杂交缓冲液中，如上所述在HIV-1特异性DNA芯片上进行杂交、检测和分析。
两种操作结果显示如下
          说明       BC％      S      B     S/B
         无沉淀     94.6     2008    1297   1.5
         沉淀       96.6     2315    483    4.8
不经沉淀时，信号强度是高的，但S/B比值是低的(1.5)，通过沉淀，背景降低，S/B比值增加。
实施例3 固相提取未结合标记
在该实施例中，在核酸断裂和标记后，用固相提取物理分离标记的片段和未结合标记。
硅珠固相支持体
所用的固相试剂是磁性硅珠。目标核酸是16S rRNA扩增子，如实施例1所述制备。反应包括：50μl TMA反应混合物，9μl咪唑(0.1M)，9μl MnCl2(1M)和3μl 5-(溴甲基)荧光素(100mM在DMSO中)，将上述物质混合，在60℃温育30分钟。
用市售试剂，Wizard PureFactionTM质粒DNA纯化系统StarterPack(Promega，Madison，WI，USA)进行固相提取。在该操作中，将断裂和标记反应与25μl MagneSil顺磁颗粒及1ml 4/40洗涤液混合，剧烈搅动(用涡旋器)，然后将试管置于磁性支持物上使得磁珠靠在试管的侧壁。用1ml 80％乙醇洗涤磁珠，用100μl 10mM Tris-Cl，pH8.5洗脱标记的RNA片段。洗脱物如上所述在DNA芯片上杂交、检测和分析。该纯化操作的结果，与用1-丁醇萃取得到的结果相比，显示如下。
        纯化           BC％       S       B       S/B
     1-丁醇提取        99.5      1639    536      3.1
     磁珠纯化测试1     98.4      875     133      6.6
     磁珠纯化测试2     97.8      773     135      5.7
这些结果表明，利用硅珠进行固相提取减少了背景并增加了S/B值。
在一个独立的试验中，进行相似的硅珠固相提取，但是用甜菜碱(5M溶解在杂交缓冲液中，300μl)进行洗脱。然后杂交如上所述在DNA芯片上进行，用无甜菜碱的杂交缓冲液。当用甜菜碱洗脱的标记的片段杂交时，BC为99.5％，信号为2424RFU，背景为170RFU，S/B为14.3。
硅膜固相支持体
在一个独立的试验中，用硅膜替代磁性硅珠应用于标记后的纯化。在该试验中，断裂和标记反应按实施例2所述用16S rRNA扩增子在100μl体积反应体系中进行，并用硅膜(QIAQUICKTM NucleotideRemoval kit，Qiagen，Hilden，Germany)进行标记后的纯化。为了纯化，将0，15或75μl 0.5M EDTA和685μl PN缓冲液加入反应混合物中，将溶液剧烈涡旋。然后按生产商说明书对样本进行加工。如上所述在DNA芯片上杂交、检测和分析洗脱物。
这种纯化方法的结果，与用1-丁醇萃取得到的结果相比，显示如下，表明如果EDTA包含在用硅膜方法纯化的混合物中，硅膜纯化与用有机溶剂萃取未结合标记是可比的。
纯化           EDTA(mM)     BC％     S      B      S/B1-丁醇萃取         -          94.6    7390    294    25.1QIAQUICKTM纯化    0          88.1    391     225    1.7
                 15         95.7    8498    329    25.8
                 75         98.4    6754    246    27.5
相似的硅膜纯化方法用于一个单独的试验中，基本如上所述，但是从硅膜上用甜菜碱(5M)洗脱以回收标记的RNA片段。在该测定中，BC为94.6％，信号为15836RFU，背景为502RFU，S/B比为31.5。
QIAVAC TM 柱固相支持体
使用PCR纯化试剂盒用PN缓冲液以及真空系统(QIAVACTM6S系统)以吸引材料通过柱子(Qiagen，Hilden，Germany)进行另外一个纯化方法。在该测定中，按实施例2所述断裂和标记16S rRNA扩增子，然后将15μl 0.5M EDTA和685μl PN缓冲液加入反应混合物中，将溶液剧烈涡旋，并按生产商说明书加工。用1ml PE缓冲液洗涤柱子，并洗脱标记的核酸片段，如上所述在DNA芯片上杂交、检测和分析。
QIAVACTM纯化方法产生100％碱基信号，信号为15，984RFU，背景为390RFU，S/B比值为41。与此相比，用1-丁醇萃取纯化的相似的裂解和标记的片段产生94.6％碱基信号，信号为7390RFU，背景为294RFU，S/B比值为25.1。
凝胶过滤固相支持体
另外的固相提取方法使用小型旋转柱式的凝胶过滤树脂(测试了SEPHADEXTM，SEPHACRYLTM和BIOGELTM树脂)。这些树脂可使更大的分子(即标记的核酸片段)被选择性洗脱，而保留更小的分子(未反应的标记剂和其他混合物组分)。这些测定中用于测试的核酸是基本上按实施例1所述制备的16S rRNA扩增子，然后基本上按实施例2所述进行断裂和标记。通常的方法是用400μl缓冲液(如Tris-叠氮化物缓冲液，pH7.4)通过加入缓冲液然后离心(1000×g 1分钟)洗脱缓冲液来平衡含凝胶过滤树脂的市售旋转柱(如来自Pharmacia的SEPHADEXTM G-50旋转柱)，重复上述操作，最后用另外的400μl同样的缓冲液润湿树脂。然后将100μl反应混合物应用于准备好的柱子，通过1000×g离心柱子1分钟来洗脱标记的核酸片段。
为了从标记反应混合物中有效回收标记的核酸片段，在将反应混合物用于凝胶过滤树脂进行纯化之前，加入EDTA(25mM到125mM)并与反应混合物混合。当EDTA浓度为25mM或50mM时，观察到最佳的回收和检测(DNA芯片上，用S/B比值评价)；EDTA浓度为75mM及更高时，检测芯片上的背景增加。通常在标记混合物用于凝胶过滤树脂之前向其中加入50mM EDTA。
用该基本方法如上所述纯化从16S rRNA扩增子得到的标记的片段证实了该纯化方法的有效性。基本上按实施例2所述将其用于分枝杆菌特异性GENECHIP之后，检测该纯化的标记的片段(“纯化的+EDTA”)。为了比较，直接来自断裂和标记反应但不经凝胶过滤纯化(“未纯化的”)相同类型的标记片段，也应用相同的DNA芯片方法检测分析。也是为了比较，用相同类型的用凝胶过滤纯化的标记的片段进行测定，但在上柱之前没有向标记混合物中加入EDTA(“纯化的-EDTA”)。这些DNA芯片分析结果显示如下。
样本 ％BC 信号(平均) 背景 S/B比值
未纯化的  89.2  13396  10334  1.3
纯化的-EDTA  77.3  625  483  1.24
纯化的+EDTA  95.7  3820  1185  3.03
这些结果表明，凝胶过滤纯化在50mM EDTA存在下是一种快速和有效的方法，提供能在DNA探针阵列上容易检测的标记的核酸片段。
实施例4：5-(溴甲基)荧光素浓度对标记的效应
在该实施例中，在断裂和标记反应中使用不同量的标记剂以确定标记剂浓度是否影响测定。按实施例1所述制备16S rRNA扩增子，各反应包括：RNA(50μl TMA)，9μl咪唑(0.1M)，9μl MnCl2(1M)，不同量的5-(溴甲基)荧光素(50mM在DMF中)至终浓度为1mM(3μl)，2mM(6μl)或4mM(12μl)和纯水至终体积为150μl，将混合物混合，在60℃温育30分钟。然后，如上所述用1-丁醇萃取纯化标记反应混合物，将100μl纯化产物如实施例2所述在DNA芯片上杂交、检测和分析。结果报告如下，表明所有测试的标记剂浓度都有效地标记了断裂的RNA。标记剂浓度越高，产生的信号越高，而背景水平没有显著增加。[5-(溴甲基)荧光素]       BC％      S       B     S/B
     1mM              96.8      2178     311    7.0
     2mM              96.8      3511     556    6.3
     4mM              94.6      3836     421    9.1
实施例5：pH值对断裂和标记反应的效应
在这些试验中，将咪唑试剂的pH调至6、6.8和7.0用于断裂和标记反应，所述反应包括：16S rRNA扩增子(50μl TMA反应)，45μl pH调整的咪唑(20mM)和MnCl2(200mM)的混合物，5μl 5-(溴甲基)荧光素(100mM在DMSO中)和纯水至终体积150μl，将这些反应混合，60℃温育30分钟。然后，按实施例2所述在DNA芯片上进行杂交、检测和分析。不同pH条件下的反应结果显示如下。基于这些结果，所有测试的pH条件都产生可检测地标记的片段，提供碱基信号为98％或更高；pH7.0似乎是最佳的。
反应pH    BC％    S       B     S/B
6.0      98.9    2948    202    14.6
6.8      98.4    4052    210    19.3
7.0      100     4668    234    19.9
实施例6：多价金属阳离子和标记剂对DNA标记的影响
本实施例显示了在断裂和标记反应中应用不同的标记剂和多价金属阳离子，荧光标记不同的单链寡核苷酸的相对效力。比较了用5-(溴甲基)荧光素和6-碘乙酰胺荧光素在不同金属阳离子存在或不存在条件下标记DNA、含内在硫代磷酸核苷酸的DNA和有3’硫代磷酸的DNA。
用于断裂和标记试验的寡核苷酸如下：
GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT(SEQ ID NO：4)；
GCTCGTTGCGGGACTT-s-AACCCAACAT(SEQ ID NO：5)，其中(-s-)表示在16位和17位核苷酸之间的一个硫代磷酸。
GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT-s(SEQ ID NO：6)，其中(-s-)表示3’末端硫代磷酸。
反应缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH8.1，不同的多价金属阳离子是：Zn2+，Mn2+，Co2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+，Ce3+，Tb3+，Yb3+，Cr3+，In3+，Be2+，Sn2+，Rb+和Cs+(都在有平衡离子Cl-的溶液中)。阴性对照为不含多价阳离子的相同体积的纯水。溶解在干N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的标记剂是5-(溴甲基)荧光素和6-碘乙酰胺荧光素(MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR，USA)。通常将DMF溶解的化合物加入反应混合物，使得DMF在混合物中的终浓度为5％(v/v)。
典型的断裂和标记反应(100μl)包含(每种成分的终浓度在括号中标出)：30μl寡核苷酸(6.667 OD/ml；0.2 OD＝0.00932mM)，50μl 100mM Tris-HCl缓冲液(50mM)，10μl 10mM金属阳离子(1mM)或纯水，和10μl 2.5mM在DMF中的标记剂(0.25mM)。将反应混合物涡旋混合，60℃温育30分钟。通过将10μl 3M乙酸钠，pH5.0及150μl水饱和的1-丁醇先后加入标记反应混合物中，涡旋混合，来纯化标记产物。两相分开后，将水相(113μl)移到干净管中，向其中加入400μl乙醇，将溶液涡旋，在干冰上温育15分钟。将混合物在14,000rpm离心15分钟，去除上清，用100μl冷70％乙醇洗涤沉淀。将沉淀重悬于500μl 100mM碳酸钠缓冲液(pH9.5)中。用紫外分光光度法或反相HPLC和峰值积分测定产物(标记的DNA和未标记的DNA)。
在15种多价金属阳离子存在下，用5-(溴甲基)荧光素(“5-BMF”)和6-碘乙酰胺荧光素(“6-IA-F”)标记SEQ ID NO：5的寡核苷酸和SEQ ID NO：6的寡核苷酸的结果总结在表1。
表1荧光素掺入百分比(标记收率)
金属阳离子          SEQ ID NO：5        SEQ ID NO：6
    5-BMF     6-IA-F     5-BMF     6-IA-F
无(水)Yb3+Ce3+Tb3+In3+Pb2+Cr3+Zn2+Be2+Cd2+Co2+Sn2+Mn2+Ni2+Cs+Rb+     0.93378.762.951.844.843.624.521.112.64.383.943.592.701.701.171.04     3.1048.446.745.432.754.529.820.510.44.705.524.132.502.221.121.09     20.898.669.466.942.859.833.713.613.55.7217.223.128.419.522.020.4     58.660.956.564.234.169.062.336.027.022.361.250.263.767.058.757.8
相对于阴性对照，三价金属离子和二价Pb2+、Zn2+和Be2+的存在增强了用5-BMF或6-IA-F对含内在硫代磷酸的DNA(SEQ ID NO：5)的标记，而其他测试的金属阳离子则无此作用。当应用共同的金属阳离子时，两种标记剂之间几乎没有差异。相对于阴性对照，Pb2+和测试的三价金属阳离子的存在增强了5-BMF对带有3’-硫代磷酸的核酸(SEQID NO：6)的标记，但是没有被其他测试的阳离子增强。相对于阴性对照，6-IA-F对带有3’-硫代磷酸的核酸(SEQ ID NO：6)的标记主要被Pb2+和Ni2+增强。6-IA-F标记SEQ ID NO：6在没有金属阳离子的阴性对照中是相对高的。
对于所有测试的金属阳离子，不含硫代磷酸基团的寡核苷酸(SEQID NO：4)的标记收率低于10％。无硫代磷酸的DNA在缺乏金属阳离子时(即水对照)不被可检测地标记。
实施例7：金属阳离子和标记剂对RNA-α-s标记的影响
该实施例显示了用不同标记剂和金属阳离子，荧光素连到含硫代磷酸的RNA(RNA-α-s)上的相对结合。用两种标记剂6-IA-F和5-碘乙酰胺荧光素(5-IA-F)，在不同金属阳离子存在或不存在下，比较对含内在或3’-末端硫代磷酸的RNA的荧光素标记。
试验方案与实施例6描述的方案相似，但是所用的寡核苷酸是具有以下序列的RNA聚合物：
GCUCGUUGCGGGACUU-s-AACCCAACAU(SEQ ID NO：7)，其中-s-表示在16位和17位核苷酸之间的一个硫代磷酸。
GCUCGUUGCGGGACUUAACCCAACAU-s(SEQ ID NO：8)，其中-s-表示3’-末端硫代磷酸。
在这些标记反应中，测试的金属阳离子是Mg2+，Cr3+，Mn2+，Ni2+，Zn2+，In3+，Pb2+，Ce3+，Eu3+，Tb3+和Yb3+(所有都带Cl-平衡离子)；纯水是阴性对照。标记剂5-IA-F和6-IA-F各溶解在干DMF中。100μl反应包括(终浓度标在括号中)：50μl 100mM Tris-Cl缓冲液，pH8.1(50mM)，30μl 6.667 OD/ml寡聚体(0.2 OD＝0.00932mM终浓度)，10μl 10mM金属阳离子(1mM)或纯水，和10μl 2.5mM标记剂(0.25mM)；DMF终浓度为5％。将上述组合涡旋混合，60℃温育30分钟。
按实施例6所述用1-丁醇萃取纯化后，用乙醇沉淀120μl水相，将沉淀的核酸重悬于500μl 100mM碳酸钠缓冲液(pH 9.5)中。按实施例6所述用紫外分光光度法分析标记收率。结果总结在表2中，其中“ND”指没有测定。用Mn2+，Zn2+和In3+测试的结果没有包括在表中，因为它们表现出相对低的活性。
表2用不同标记剂、金属阳离子和寡核苷酸的荧光标记百分比
金属阳离子     SEQ ID NO：7     SEQ ID NO：8
5-IA-F  6-IA-F  5-IA-F  6-IA-F
 Cr3+ 11.3  23.0  19.2  31.2
 Ce3+ 28.1  19.2  30.2  20.1
 Pb2+ 26.5  ND  27.1  21.4
 Yb3+ 16.8  20.5  20.7  22.8
 Tb3+ 26.3  21.8  18.1  17.9
 Eu3+ 21.5  11.1  13.1  15.3
 Ni2+ 0  0  4.83  1.94
 Mg2+ 0  0  0.774  1.98
 H2O  0  0.090  1.11  4.35
类似DNA，标记RNA是对金属阳离子和标记剂敏感的。5-IA-F和6-IA-F两者对RNA-α-s的标记程度相似，3’-末端RNA-α-s的标记要稍好于含内在硫代磷酸的RNA。对于两种标记剂，相对于阴性对照，三价金属阳离子或Pb2+提供了最为增强的标记。
实施例8：金属阳离子对RNA断裂的效力
该实施例显示在不同金属阳离子的存在下RNA断裂的相对效率。在这些试验中，断裂的底物是具有以下序列的合成RNA寡核苷酸：
GCUCGUUGCGGGACUUAACCCAACAU(SEQ ID NO：9)，  和GCUCGUUGCGGGACUU-s-AACCCAACAU(SEQ ID NO：7)，其中-s-表示在16位和17位核苷酸之间的一个硫代磷酸。
合成互补于SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的合成的RNA序列并用于与适当的互补的寡核苷酸形成双链RNA。单链和双链RNA都用于断裂试验。
用于检测步骤的探针是一条互补于SEQ ID NO：9的26个核苷酸的序列，在16位和17位之间带有吖啶黄酯(acridinium ester)(AE)标记(在Nelson等，1996，核酸研究(Nucleic Acids Res.)24(24)：4998-5003中记载)。常用的方法包括在总体积100μl中断裂100fmol RNA(即反应中RNA终浓度为1fmol/μl)，断裂在50mM pH7.6的咪唑缓冲液中进行，缓冲液中含2.5μmol各种测试的金属阳离子。将反应在60℃温育30分钟后，加入相对于金属阳离子浓度的2到3倍摩尔过量的EDTA，pH8并在-20℃温育，以终止断裂反应。为了监测RNA断裂的量，将大约5fmol RNA从混合物中取出并与20倍过量的AE标记的探针杂交。所有探针杂交都在60℃下进行60分钟(在1×PACE2杂交缓冲液中，Gen-Probe，SanDiego CA，USA)。
探测断裂材料中少量的RNA还使得断裂混合物体积在杂交体系中充分稀释，以使断裂反应成分不影响探针与目标的杂交。大约200μlPACE2选择试剂(Gen-Probe Incorporated，SanDiego CA，USA)用于水解未杂交的探针。用发光计检测化学发光来检测杂交的探针(如先前由Nelson等描述，上文)。化学发光用相对光单位或RLU表示。
对于双链RNA，将大约160pmol SEQ ID NO：9与3倍过量的互补序列在1×PACE2杂交缓冲液中65℃下杂交30分钟。用3倍过量的互补链浓度以保证完全杂交。AE标记的探针有完全相同的序列，因此过量的链不会与探针结合。
无金属阳离子(即纯水替代)的对照反应平行进行，对照的化学发光信号用于计算断裂的百分比。
为断裂选择的金属阳离子可以大致分为三种不同类别：(1)非过渡金属，如Mg，Sr，Ba(II组)和Pb(IV组)；(2)过渡金属，如Zn，Cd，Mn，Fe，Co，Ni和Ru；和(3)镧系元素，如Ce，Eu，Tb，Tm，Yb和Lu。对于测试的所有金属阳离子，平衡离子是Cl-(都来自Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI，USA)。
表3显示0.25mM 18种不同的多价金属阳离子在50mM咪唑缓冲液(pH7.6)中对单链和双链RNA的断裂效率，其中反应在60℃温育30分钟。所有的结果表示为断裂百分比。
表3：金属阳离子断裂RNA百分比。
金属             单链RNA            双链RNA
SEQ ID NO：9  SEQ ID NO：7  SEQ ID NO：9  SEQ ID NO：7
 Mg2+ 18  62  71  63
 Sr2+ 26  74  72  63
 Ba2+ 38 ＜5  60  70
 Pb2+ 82  92  53  55
 Zn2+ 38  14  11  29
 Cd2+ 86 ＜5  62  60
 Mn2+ 38  10  72  65
 Fe2+ 62  7 ＜5 ＜5
 Co2+ 33  47  72  69
 Ni2+ 69  58  68  52
 Ru3+ 95  95  72  60
 Ce3+ 58  58 ＜5  27
 Eu3+ 52  35 ＜5  16
 Tb3+ 40  52 ＜5 ＜5
 Tm3+ 43  57 ＜5 ＜5
 Yb3+ 45  54 ＜5 ＜5
 Lu3+ 48  52 ＜5 ＜5
所有的镧系元素断裂单链RNA比双链RNA更有效。在过渡金属中，Zn和Fe断裂双链RNA不如单链RNA有效。大多数过渡金属和非过渡金属有效地断裂双链RNA。
实施例9：金属阳离子在扩增缓冲液存在下断裂单链RNA的效力
该实施例显示单链RNA的断裂也可以在其他缓冲液条件下完成，如在TMA溶液条件下。所用的方法除了以下的例外，与实施例8中描述的基本相同。
阴性TMA扩增反应在不存在目标RNA下按实施例1所述进行。将阴性扩增反应汇合到一起构成TMA溶液。然后将合成的RNA寡核苷酸(SEQ ID NO：7)加入到该TMA溶液中进行断裂反应。应用四种不同的断裂缓冲液，所有缓冲液的pH都在7.5：咪唑、MOPS、HEPES和PIPES(都来自Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI，USA)。缓冲液浓度从50mM到200mM不等，而含合成RNA寡核苷酸的TMA溶液稀释至1∶20或不稀释(比例1∶1)。测试三种不同的金属阳离子(Zn2+，Ce3+和Tb3+)，所有离子浓度都为5mM。
按实施例8所述确定断裂收率，1∶20稀释测定的结果总结在表4。TMA溶液未稀释，断裂收率低于10％。
表4：在扩增缓冲液中金属阳离子断裂单链RNA百分比
     咪唑      MOPS  HEPES  PIPES
金属 50mM  200mM  50mM  200mM  50mM  50mM
 Zn2+ 3  22  20  25  22  22
 Ce3+ 62  75  68  69  75  79
 Tb3+ 50  70  57  60  71  61
这些结果显示，在多价金属阳离子，尤其是Ce3+的存在下，在多种缓冲条件下也能有效地断裂RNA。
实施例10：由MALDI-TOF检测的RNA和DNA-α-s的断裂和标记
该实施例显示了，在金属阳离子存在及不存在下寡核苷酸片段的荧光素标记，以及断裂是否与标记相关。用吸收谱定量寡核苷酸上的荧光素结合并与MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离-飞行时间(matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight))质谱分析检测的寡核苷酸片段比较。
断裂反应用具有以下序列的合成的RNA和DNA寡核苷酸，基本上按实施例6所述进行：
GCUCGUUGCGGGACUU(SEQ ID NO：10)
GCUCGUUGCGGGACUU-s(SEQ ID NO：11)，其与SEQ ID NO：10相同，但包括一个3’-末端硫代磷酸。
GCUCGUUGCGGGACUU-s-AACCCAACAU(SEQ ID NO：7)，和GCTCGTTGCGGGACT T-s-AACCCAACAT(SEQ ID NO：5)，其中-s-表示在16位和17位碱基之间的一个硫代磷酸。
在这些测定中，缓冲液是咪唑，金属阳离子是Zn2+或Tb3+(两者均带Cl-平衡离子)；纯水为阴性对照。标记剂为在干DMF中的5-(溴甲基)荧光素或6-碘乙酰胺荧光素。100μl反应包括(终浓度如括号中所示)：50μl 100mM咪唑缓冲液，pH 7.6(50mM)，30μl 6.667 OD/ml寡聚体(0.2 OD＝0.00932mM终浓度)，10μl 25mM金属阳离子(2.5mM)或纯水，和10μl 2.5mM标记剂(0.25mM)或纯水(对于仅断裂的反应)。
将反应混合物用涡旋混合，60℃温育30分钟。纯化步骤后，加入10μl乙酸钠(3M，pH5.0)和150μl水饱和的1-丁醇，将混合物涡旋混合，然后在干冰上温育15分钟，14,000rpm离心15分钟，将沉淀用100μl冷的70％乙醇洗涤。将沉淀重悬于40μl纯水中，保留3μl用于MALDI-TOF检测。剩下部分用100mM碳酸钠缓冲液，pH9.5稀释成500μl，用于紫外-可见分光光度测定。
对于MALDI-TOF检测，用移液装置将3μl 5 OD/ml寡聚体(0.015OD)样本与1μl 30mM柠檬酸铵缓冲液，pH9.4和6μl 50mg/ml 3-羟基吡啶甲酸(HPA，基质)以及研磨成约10×的阳离子交换树脂混合。使树脂沉降，将2μl样本点到金支持体上，风干20分钟，用PerSeptiveBiosystems Voyager DE MALDI-TOF质谱仪收集质谱数据。质谱数据基于用SEQ ID NO：10寡核苷酸作为外标准。
有或没有阳离子Zn2+或Tb3+，用5-BMF和6-IA-F的MALDI-TOF标记和断裂反应结果总结在表5和6中。表5中，“-”代表未检测到荧光素标记的寡聚体，“+”代表检测到单荧光素标记的寡聚体，而“++”代表检测到双荧光素标记的寡聚体。在表6中，“-”代表未检测到断裂的产物，“+”代表检测到少量断裂产物/基团(2-5)，“++”代表检测到更多的(8-12)断裂产物，“+++”代表检测到大量断裂产物(＞15)，“ND”意思是未检测。
表5：由MALDI-TOF质谱分析法测定的RNA和DNA寡核苷酸的荧光素标记
标记剂                 金属 SEQ ID NQ：1(RNA) SEQ ID NO：1(RNA) SEQ ID NO：7(RNA) SEQ ID NO：5(DNA)
5-BMF Zn2+    + ++ + ++
Tb3+    - ND - +
无(水)    - - - -
6-IA-F Zn2+    - - + ++
Tb3+    - - ND -
无(水)    - - - -
表6：由MALDI-TOF质谱分析法测定的RNA和DNA寡核苷酸的断裂。
标记剂                  金属 SEQ ID NO：1(RNA) SEQ lD NO：1(RNA) SEQ ID NO：7(RNA)   SEQ ID NO：(DNA)
5-BMF Zn2+ ++ +++ ++ -
Tb3+ ++ ND +++ ++
无(水) - - + -
6-IA-F Zn2+ - - ++ -
Tb3+ ++ +++ ND ++
无(水) - - + -
Zn2+ +
无(水) +
用分光光度法检测的荧光素标记的量如表7所示，表示为在金属阳离子存在或不存在下结合至寡核苷酸的荧光素百分比。
表7：结合的荧光素百分比
标记剂               金属离子 SEQ ID NO：11(RNA) SEQ ID NO：1(RNA) SEQ ID NO：7(RNA) SEQ ID NO：(DNA)
5-BMF  Zn2+ 34.0  48.4  40.6  119
 Tb3+ 23.2  23.9  15.3  31.1
无(水) 5.21  0.511  5.05  0.683
 6-IA-F  Zn2+ 21.0  27.0  31.3  125
 Tb3+ 8.17  6.32  4.82  16.0
无(水) 3.88  0.579  0.939  1.63
这些结果显示：两种标记剂5-BMF和6-IA-F在Zn2+和Tb3+的存在下都能有效地标记RNA寡核苷酸，在不存在金属阳离子时，两种标记剂都只产生很少的标记。只有在标记效率分别大于30％和40％时，质谱分析才能检测单和双荧光素标记的寡核苷酸。在Zn2+存在下用5-BMF对所有测试的寡聚体和用6-IA-F对更长的RNA和DNA寡聚体的荧光标记是有效的。在Zn2+的存在下加上两种烷化剂之一，比没有烷化剂，发生显著更多的断裂。Tb3+加上烷化剂断裂DNA。
实施例11：用CeCl3作为金属阳离子来源断裂和标记HIV-1扩增子。
该实施例显示，Ce3+离子能有效地断裂HIV-1扩增子，所述HIV-1扩增子用荧光素标记在相同的反应混合物中被标记，从而提供在DNA芯片上检测的核酸片段。HIV-1蛋白酶序列扩增子按实施例1所述制备。对于断裂和标记，反应包括：50μl HIV-1 RNA扩增子，125μl咪唑缓冲液(0.1M)，12.5μl CeCl3(100mM)，6.25μl 5-(溴甲基)荧光素(10mM在DMSO中)，和纯水，使得最终反应体积为250μl。将溶液混合，在60℃温育30分钟。然后将反应产物按实施例2所述在HIV-1 DNA芯片上杂交、检测和分析。
结果显示碱基信号为98.1％，平均信号为1656RFU，背景为390RFU，提供S/B比值为4.2。因此，应用CeCl3可有效断裂和用5-(溴甲基)荧光素标记。
实施例12：用不同金属阳离子和标记剂浓度进行的标记
该实施例显示，伴随断裂的有效标记可通过使用相对于先前实施例降低浓度的标记剂来实现。在这些试验中，Mn2+是金属离子。通过同时改变标记剂、金属阳离子、咪唑的浓度和pH值，发现了用不同浓度试剂进行断裂和标记的最适条件，所用标记剂浓度在0.3mM到1.0mM范围内。当在反应混合物中使用更少的标记剂实现有效的标记时，减少了所得产物中过量的未结合标记剂，从而降低了标记后纯化的需要。
标记的核酸是16S rRNA扩增子，按实施例1所述用TMA制备。每个反应包括：50μl RNA扩增子，咪唑缓冲液，MnCl2，5-(溴甲基)荧光素(溶解在DMF中)，加入纯水使得最终反应体积为100μl。咪唑(“Im”)和pH值、MnCl2(“Mn2+”)和5-(溴甲基)荧光素(“5-BMF”)的浓度变化如表8所示。将溶液混合，在60℃温育30分钟。
标记后，将反应产物在实施例2所述的分枝杆菌DNA芯片上杂交、检测和分析，除了用含60mM HEPES，pH7.0的杂交缓冲液替代磷酸缓冲液。
      表8：用不同标记反应组成获得的标记结果
  Im，pH   Mn2+  5-BMF   BC％   信号RFU     背景RFU     S/B
  30mMpH6.8   30mM  0.55mM   96.8   3308     878     3.8
  30mMpH6.8   60mM  0.1mM   93.5   1059     395     2.7
  30mMpH6.8   30mM  0.55mM   97.8   3272     881     3.7
  30mMpH6.8   30mM  1.0mM   98.4   4270     1279     3.3
  15mMpH7.2   45mM  0.3mM   96.2   2085     633     3.3
  15mMpH7.2   15mM  0.3mM   94.1   1696     523     3.2
这些结果显示，即使标记剂的浓度相对较低(0.3M)也可以实现可检测核酸片段的有效标记，同时与用更高的标记剂浓度(0.55到1.0mM)获得的结果相比，保持相对恒定的S/B比值。
实施例13：作为去污染工具的断裂和标记
按实施例1所述进行TMA反应。在实施例2所述的条件下，除了在反应混合物中包括惰性硅油上层，用100μl来自结核分枝杆菌目标序列的TMA扩增子，在塑料管中进行断裂和标记反应。断裂和标记后，将反应混合物用2400μl 1-丁醇(水饱和的)萃取，如实施例2所述。水相和有机相分离后，从每层各取5μl进行TMA反应，并用含未标记目标的相同体积作为阳性对照。未标记目标产生预期的扩增产物，而用等分的水相或有机相液体进行的TMA反应中没有检测到扩增子。这些结果表明，断裂和标记反应过程中生成的片段在这些条件下不能被扩增。因此，所述断裂和标记过程可以作为一种去污染方法。
                            序列表
                            序列表<110>BIO MERIEUX
 GEN-PROBE INCORPORATED<120>标记核酸的方法<130>CLIVPUR<140><141><160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>43<212>DNA<213>HIV<400>1aattaaccct cactaaaggg agacagagcc aacagcccca  cca               43<210>2<211>54<212>DNA<213>HIV<400>2taatacgact cactataggg agatttcccc actaacttct gtatgtcatt gaca    54<210>3<211>49<212>DNA<213>HIV<400>3taatacgact cactataggg agagggccat ccattcctgg ctttaattt          49<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>4gctcgttgcg ggacttaacc caacat                                   26<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列说明：引物；在16位
 和17位核苷酸之间的磷酸是硫
 代磷酸<400>5gctcgttgcg ggacttaacc caacat                              26<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物；
 在3’端的磷酸是末端硫
 代磷酸<400> 6gctcgttgcg ggacttaacc caacat                              26<210>7<211>26<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物；在16位
 和17位核苷酸之间的磷酸是硫
 代磷酸<400>7gcucguugcg ggacuuaacc caacau                              26<210>8<211>26<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物；
 在3’端的磷酸是末端
 硫代磷酸<400>8gcucguugcg ggacuuaacc caacau                              26<210>9<211>26<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>9gcucguugcg ggacuuaacc  caacau                             26<210>10<211>16<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>10gcucguugcg ggacuu                                         16<210>11<211>16<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物；
 在3’端的磷酸是末端
 硫代磷酸<400>11gcucguugcg ggacuu                                         16

Claims (32)

1.一种断裂和标记合成或天然核酸的方法，其包括以下步骤：
提供含核酸、包含可检测标记的标记剂和至少一种多价金属阳离子在实质上为水溶液中的混合物；
化学地断裂混合物中的核酸以生成多重核酸片段；和
将至少一个标记连到至少一个核酸片段上以产生可检测地标记的核酸片段。
2.根据权利要求1的方法，其中所述核酸是DNA、RNA、嵌合DNA-RNA多聚体，包含至少一个硫代磷酸核苷酸的DNA或包含至少一个硫代磷酸核苷酸的RNA。
3.根据权利要求1的方法，其中将断裂和标记步骤中所用的试剂加入体外核酸扩增混合物中。
4.根据权利要求1的方法，其进一步包括在断裂和标记步骤后处理混合物的步骤以减少或消除未结合的标记剂。
5.根据权利要求4的方法，其中所述处理步骤中包括在断裂和标记步骤后将猝灭剂加入混合物。
6.根据权利要求5的方法，其中猝灭剂是焦磷酸、硫醇衍生物、螯合剂、磷酸阴离子或碳酸阴离子。
7.根据权利要求4的方法，其中所述处理步骤在断裂和标记步骤后物理分离标记的核酸片段与混合物中的未结合的标记剂。
8.根据权利要求7的方法，其中所述处理步骤进一步包括在断裂和标记步骤后向混合物中加入酸。
9.根据权利要求7或8的方法，其中所述处理步骤进一步包括在断裂和标记步骤后向混合物中加入螯合剂。
10.根据权利要求7-9中任一项的方法，其中所述处理步骤用一种有机溶剂分离标记的核酸片段与未结合的标记剂。
11.根据权利要求10的方法，其中所述有机溶剂是1-丁醇，2-丁醇，异戊醇、1-戊醇或环己醇。
12.根据权利要求7-9中任一项的方法，其中所述处理步骤通过在固相支持体上使用固相提取核酸片段来分离标记的核酸片段与未结合的标记剂。
13.根据权利要求12的方法，其中所述固相支持体是珠子、凝胶、离子交换树脂，反相树脂、硅基质或膜。
14.根据权利要求12或13的方法，其中用含甜菜碱的缓冲液将标记的核酸片段从固相支持体洗脱。
15.根据权利要求7-9中任一项的方法，其中所述处理步骤在室温下从含甜菜碱、DTAB和未标记核酸的溶液中沉淀标记的核酸片段。
16.根据权利要求7-9中任一项的方法，  其中所述处理步骤稀释体外核酸扩增混合物。
17.根据权利要求1-16中任一项的方法，其中断裂和标记步骤在单一反应混合物中进行。
18.根据权利要求1-16中任一项的方法，其中断裂和标记步骤在独立的步骤中实现。
19.根据权利要求1-18中任一项的方法，其中标记步骤将标记连到内在或末端硫代磷酸上或连到内在或末端磷酸上。
20.根据权利要求1-19中任一项的方法，其中断裂步骤进一步包括使用化学催化剂。
21.根据权利要求20的方法，其中所述化学催化剂是广义碱，选自咪唑、咪唑的取代的类似物和含咪唑环的化合物或咪唑环的取代的类似物。
22.根据权利要求20的方法，其中所述化学催化剂选自N-甲基咪唑、MOPS、HEPES、PIPES和生物有机多胺。
23.根据权利要求20-22中任一项的方法，其中所述核酸是RNA或包含至少一个硫代磷酸核苷酸的RNA，而多价金属阳离子是Mg2+，Sr2+，Ba2+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Ru3+，Ce3+，Eu3+，Tb3+，Tm3+，Yb3+或Lu3+。
24.根据权利要求20-22中任一项的方法，其中所述核酸是DNA而多价金属阳离子是Tb3+。
25.根据权利要求1-19中任一项的方法，其中所述核酸是RNA或包含至少一个硫代磷酸核苷酸的RNA，而多价金属阳离子是Mn2+，Cr3+，Ce3+，Yb3+，Tb3+，Eu2+，Zn2+或Pb2+。
26.根据权利要求1-19中任一项的方法，其中所述核酸是DNA或包含至少一个硫代磷酸核苷酸的DNA，而多价金属阳离子是Mn2+，Zn2+，Be2+，Cr3+，Pb2+，In3+，Tb3+，Ce3+，Yb3+或Ni2+。。
27.根据权利要求1-19中任一项的方法，其中所述多价金属阳离子是Mn2+，Zn2+，Tb3+或Ce3+。
28.根据权利要求1的方法，其中所述混合物包含标记剂浓度为0.1mM到4mM之间。
29.根据权利要求28的方法，其中所述混合物包含标记剂浓度为0.1mM到1mM之间。
30.根据权利要求28或29的方法，其中所述标记剂浓度在0.3mM到0.55mM之间。
31.根据权利要求1的方法，其中所述混合物包含含有烷基卤或卤代乙酰胺反应基团的标记剂。
32.根据权利要求1-31中任一项的方法，其中所述标记剂是5-(溴甲基)荧光素、6-(溴甲基)荧光素、6-碘乙酰胺荧光素或5-碘乙酰胺荧光素。
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